( PDF ) Mutações no gene LRRK2 como causa da doença de Parkinson em pacientes brasileiros

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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO

CENTRO BIOMÉDICO

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOPATOLOGIA CLÍNICA E EXPERIMENTAL

“MUTAÇÕES NO GENE LRRK2 COMO CAUSA DA DOENÇA DE

PARKINSON EM PACIENTES BRASILEIROS”

Karla Cristina Vasconcelos Moura

Rio de Janeiro

2008

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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO

CENTRO BIOMÉDICO

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOPATOLOGIA CLÍNICA E EXPERIMENTAL

“MUTAÇÕES NO GENE LRRK2 COMO CAUSA DA DOENÇA DE

PARKINSON EM PACIENTES BRASILEIROS”

Karla Cristina Vasconcelos Moura

Dissertação apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em

Fisiopatologia Clínica e Experimental, da

Universidade do Estado do Rio de Janeiro

(UERJ), visando à obtenção do título de

Mestre em Ciências.

Rio de Janeiro

2008

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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO

CENTRO BIOMÉDICO

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOPATOLOGIA CLÍNICA E EXPERIMENTAL

“MUTAÇÕES NO GENE LRRK2 COMO CAUSA DA DOENÇA DE

PARKINSON EM PACIENTES BRASILEIROS”

Karla Cristina Vasconcelos Moura

Orientadoras: Profª.Drª. Márcia Mattos Gonçalves Pimentel

Profª.Drª. Cíntia Barros Santos-Rebouças

Aprovada em 02 de julho de 2008 pela banca examinadora:

____________________________________________________________

Profª.Drª. Jacyara Maria Brito Macedo

____________________________________________________________

Prof. Dr. João Santos Pereira

____________________________________________________________

Profª. Drª. Teresa de Souza Fernandez

Rio de Janeiro

2008

CATALOGAÇÃO NA FONTE

UERJ/REDE SIRIUS/ BIBLIOTECA CB/A

M929 Moura, Karla Cristina Vasconcelos. .

Mutações no gene LRRK2 como causa da doença de Parkinson em

pacientes brasileiros / Karla Cristina Vasconcelos Moura.- 2008.

xiv,114f. : il.

Orientador : Márcia Mattos Gonçalves Pimentel.

Co-orientador : Cíntia Barros Santos-Rebouças.

Dissertação (mestrado) – Universidade do Estado do Rio de

Janeiro, Faculdade de Ciências Médicas.

Bibliografia : f. 85-109.

1. Parkinson, Doença de - Aspectos genéticos - Teses. 2.

Parkinson, Doença de - Etiologia - Teses. 3. Mutação (Biologia) -

Teses. I. Pimentel, Márcia Mattos Gonçalves. II. Santos-Rebouças,

Cíntia Barros. III. Universidade do Estado do Rio de Janeiro.

Faculdade de Ciências Médicas. IV. Título.

CDU 616.858-008.6:575.1

AGRADECIMENTOS

A Deus, por me dar força e saúde para encarar todos os desafios do dia a

dia.

Aos meus pais, por serem meus amores incondicionais e verdadeiros, e por

sempre me incentivarem em todas as decisões da minha vida.

A Digo, meu irmão, que soube compreender meus momentos de angústia e

de “monopólio” de nosso micro (rs). Além de ajudar com as figuras desta

dissertação.

À Profª Drª Márcia Mattos Gonçalves Pimentel, por ter me dado a

oportunidade de ingressar no mestrado e voltar a fazer parte da equipe do

SERVGEN, além de acreditar no meu potencial como pesquisadora.

À Profª Drª Cíntia Barros Santos-Rebouças, pela co-orientação e pelo

agradável convívio desde a época da graduação.

Aos médicos Dr. João Santos Pereira, Drª. Ana Lúcia Zuma de Rosso, Drª.

Denise Hack Nicaretta e Drª. Izabel Cristina Constantino Bastos, pela

grandiosa colaboração e pelo convívio durante estes dois anos.

À Cláudia, por ser uma grande amiga e estar sempre presente com uma

palavra de consolo nos momentos mais importantes da minha vida. Sem

contar os momentos maravilhosos de descontração que sempre esteve do

meu lado. É uma pessoa fundamental em todos os aspectos.

Ao saudoso “Marinho”, por ser um grande amigo e estar sempre disposto a

ajudar e a colaborar com qualquer coisa. Mesmo distante nunca poderia

deixar de agradecer pelos belos momentos de convívio durante todos estes

anos no laboratório, além dos agradáveis temas polêmicos!

À Jussara, por ser uma pessoa prestativa e sempre disposta a ajudar.

Ao Richard e ao Fábio, pelas novas amizades conquistadas, pelos debates na

copa e pelo agradável convívio diário. Valeu Richard pela ajuda no sumário!

À Adriana, Cris, Natália e Juliana, por serem ótimas colegas de trabalho e

pessoas maravilhosas de se conviver.

Às meninas da “IC” Karen, Paloma, Marcela e Andressa, por proporcionarem

um convívio agradável no laboratório.

Às mais novas alunas do SERVGEN, Mariana e Beatriz, sejam muito bem-

vindas à nossa equipe!

Aos pacientes do SERVGEN, sem os quais este trabalho não teria sido

realizado, e aos seus familiares, por entenderem a importância das

investigações genéticas.

À Plataforma Genômica – Seqüenciamento de DNA/PDTIS – FioCruz, pela

utilização do Sistema de Seqüenciamento Automático.

À FAPERJ, pelo apoio financeiro.

Aos professores e funcionários do Programa de Pós Graduação em

Fisiopatologia Clínica e Experimental da UERJ, sem os quais, a minha

formação não seria possível.

vii

LISTA DE TABELAS

Página

Tabela 1: Formas monogênicas conhecidas da Doença de Parkinson.

Tabela 2: Freqüência de mutações no gene LRRK2 em diferentes

populações.

Tabela 3: Estudos que realizaram o cálculo de penetrância da

mutação p.G2019S.

Tabela 4: Condições utilizadas na PCR para a amplificação dos

fragmentos correspondentes aos exons 31 e 41 do gene LRRK2.

Tabela 5: Resultados das análises moleculares do gene LRRK2 em

154 pacientes, de ambos os sexos, com DP idiopática.

Tabela 6: Características clínicas dos pacientes com a mutação

p.G2019S em heterozigose.

Tabela 7: Análise da mutação p.G2019S no gene LRRK2 em sete

familiares de dois pacientes com esta alteração.

Tabela 8a: Alelos de marcadores do cromossomo 12q12 em

indivíduos com a mutação p.G2019S no gene LRRK2.

Tabela 8b: Alelos de marcadores do cromossomo 12q12 em

familiares, sem a mutação p.G2019S no gene LRRK2, de pacientes

com DP.

viii

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Página

Figura 1: As principais regiões do cérebro afetadas na DP

(sombreado amarelo). Seção lateral de um cérebro humano com a

porção anterior para a esquerda.

Figura 2: Esquema do cromossomo 12, mostrando a região onde se

encontra o gene LRRK2 (12q12), e da estrutura do gene LRRK2 e de

sua proteína, a dardarina.

Figura 3: Representação esquemática da estrutura dos domínios da

proteína LRRK2.

Figura 4: A mutação p.G2019S no gene LRRK2 surgiu de um efeito

fundador ancestral comum que parece ter se originado no Norte da

África e se difundido para outros continentes (setas brancas) através

da migração humana.

Figura 5: Esquema representativo da digestão dos produtos da PCR

com a enzima SfcI.

Figura 6: Eletroferogramas gerados pelo seqüenciamento do produto

da PCR.

Figura 7: Gel da digestão dos produtos da PCR (exon 41 do gene

LRRK2) com a enzima SfcI.

Figura 8: Heredograma da família do probando PAR1306.

Figura 9: Heredograma da família da paciente PAR1398.

Figura 10: Heredograma da família do paciente PAR1455

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

A – adenina

AD – autossômica dominante

AR – autossômica recessiva

ATP13A2 – gene da ATPase tipo 13A2

C - citosina

°C - grau Celsius

cM – centi Morgan

CONEP – Comissão Nacional de Ética em Pesquisa

COR – domínio C-terminal a Roc

dATP - 2’ desoxiadenosina 5’ trifosfato

dCTP - 2’ desoxicitidina 5’ trifosfato

DG - doença de Gaucher

dGTP - 2’ desoxiguanosina 5’ trifosfato

DNA - ácido desoxirribonucléico

dNTPs – desoxirribonucleotídeos

DP - Doença de Parkinson

dTTP - 2’ desoxitimidina 5’ trifosfato

EDTA - ácido etileno-diamino tetracético

G – guanina

GBA – gene da glucocerebrosidase

HTRA2 – gene da HTRA serina peptidase 2

kb - quilobase

kDa – quilodalton

KRS - síndrome Kufor-Rakeb

LRR - região rica em repetições leucina

LRRK2 – gene da quinase rica em repetições leucina 2

M – molar

MAPKs – MAP quinase quinase quinase

mL - mililitro

mM – milimolar

MPTP - metil-4-fenil1-1,2,3,6-tetrahidropiridina

OMIM - Online Mendelian Inheritance in Men

p - braço curto de um cromossomo

pb - par de bases

PCR - reação em cadeia da polimerase

PDTIS - Programa de Desenvolvimento Tecnológico em Insumos para Saúde

PINK1 – gene da quinase induzida por proteína 1

pmol – picomol

PRKN – gene parkin

q - braço longo de um cromossomo

RFLP – Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos de DNA

RNA - ácido ribonucléico

RNAm - ácido ribonucléico mensageiro

rpm - rotações por minuto

SNCA – gene da α-sinucleína

SNP – Polimorfismo de base única

T - timina

TBE - tampão tris-ácido bórico-EDTA

TEMED - N’-N-N’-N’ tetrametiletilenodiamina

Tris - trihidroximetil aminometano

U – unidade

UCHL1 – gene da ubiquitina carboxil-terminal esterase L1

UERJ - Universidade do Estado do Rio de Janeiro

UFRJ – Universidade Federal do Rio de Janeiro

V - volt

μg - micrograma

μL - microlitro

μM - micromolar

ng - nanograma

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS ..................................................................................VII

LISTA DE ILUSTRAÇÕES.........................................................................VIII

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS ........................................................IX

RESUMO..................................................................................................XIII

ABSTRACT ..............................................................................................XIV

1 – INTRODUÇÃO ..................................................................................1

1.1 – A DOENÇA DE PARKINSON ...........................................................2

1.2 – CAUSAS AMBIENTAIS DA DP ........................................................3

1.3 – CAUSAS GENÉTICAS DA DP ..........................................................4

1.3.1 – PRKN ...............................................................................................7

1.3.2 – PINK1 ..............................................................................................8

1.3.3 – DJ1..................................................................................................9

1.3.4 – ATP13A2 .......................................................................................11

1.3.5 – HTRA2...........................................................................................11

1.3.6 – SNCA .............................................................................................12

1.3.7 – UCHL1...........................................................................................14

1.3.8 – GBA ...............................................................................................15

1.4 – O GENE LRRK2 E SEU PRODUTO: A DARDARINA........................16

1.4.1 – Variantes patogênicas no gene LRRK2 ........................................20

1.4.2 – O efeito das mutações na proteína dardarina .............................30

1.5 – EFEITO FUNDADOR....................................................................31

1.6 – CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS ASSOCIADAS

À MUTAÇÃO P.G2019S.......................................................................33

1.7 – PENETRÂNCIA DA MUTAÇÃO P.G2019S......................................34

1.8 – OBJETIVOS ................................................................................37

2 – METODOLOGIA .............................................................................38

xii

2.1 – PACIENTES...................................................................................39

2.2 – ANÁLISE MOLECULAR..................................................................40

2.2.1 – Extração do DNA genômico ......................................................40

2.2.2 – Estimativa da concentração do DNA.........................................41

2.2.3 – Rastreamento de mutações no exon 31 do gene LRRK2 ............42

2.2.3.1 – Reação em cadeia da polimerase (PCR)................................................42

2.2.3.2 – Avaliação da qualidade dos fragmentos amplificados e do

rendimento da reação.....................................................................................44

2.2.3.3 – Purificação dos produtos da PCR ............................................................44

2.2.3.4 – Seqüenciamento automático......................................................................45

2.2.4 – Rastreamento de mutações no exon 41 do gene LRRK2 ............46

2.2.4.1 – Reação em cadeia da polimerase para o seqüenciamento .........46

2.2.4.2 – PCR-RFLP .............................................................................................................47

2.2.4.3 – Análise dos fragmentos da digestão em gel de poliacrilamida.48

2.2.5 – Cálculo da penetrância da mutação p.G2019S .........................51

2.2.6 – Análise de haplótipo.................................................................51

3 – RESULTADOS ................................................................................52

4 – DISCUSSÃO...................................................................................73

5 – CONCLUSÃO..................................................................................83

6 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................85

7 - ANEXOS.......................................................................................110

xiii

RESUMO

A doença de Parkinson (DP), caracterizada pela degeneração

progressiva de neurônios dopaminérgicos, é a desordem neurodegenerativa

motora mais comum e possui uma prevalência maior que 1% em indivíduos

com mais de 65 anos de idade. Apesar das causas desta disfunção

permanecerem obscuras, conhecimentos recentes sobre a base genética da

DP evidenciam, claramente, que os fatores genéticos desempenham um

papel importante na etiologia desta desordem. Mutações no gene Leucine-rich

repeat kinase 2 (LRRK2) são reconhecidas como uma das causas mais

comuns da DP entre pacientes de diferentes origens geográficas. Neste

estudo, nós avaliamos a presença de mutações nos exons 31 e 41 do gene

LRRK2, através do seqüenciamento automático, em uma amostra de 154

pacientes brasileiros não aparentados com DP familiar ou esporádica,

incluindo casos de manifestação precoce ou tardia da doença. A mutação

LRRK2 p.G2019S foi identificada em heterozigose em três probandos (~2%),

e em três outros parentes de um paciente. Nenhum portador desta mutação

foi encontrado entre 250 cromossomos controles analisados. Clinicamente,

todos os pacientes portadores da mutação apresentavam um fenótipo DP

típico e uma boa resposta ao levodopa. A análise de segregação da mutação

p.G2019S realizada em alguns membros de uma genealogia, revelou uma

penetrância de 60%. Além disso, através da análise genotípica de cinco SNPs

localizados no gene LRRK2, identificamos um haplótipo mínimo (T-A-G-A-A)

compartilhado pelos indivíduos portadores da mutação p.G2019S, o que

sugere fortemente que o alelo mutante p.G2019S tem uma mesma origem.

Nossos achados sugerem que a mutação LRRK2 p.G2019S contribui de

forma substancial na susceptibilidade à DP na população brasileira e

adiciona novas informações à pesquisa desta doença. Consideramos ainda,

que a penetrância incompleta desta mutação é um fator relevante a ser

considerado no aconselhamento genético.

xiv

ABSTRACT

Parkinson’s disease (PD) is characterized by the progressive

degeneration of dopaminergic neurons and is the most common motor

neurodegenerative disorder, with a prevalence higher than 1% in individuals

with more than 65 years old. Although the causes of this dysfunction have

not been clear, recent findings about the PD genetic mechanism show clearly

that genetics factors have an important role in the etiology of this disorder.

Mutations in the Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) gene are known as a

common cause of PD among patients from different geographic origins. In

this study, we evaluated the prevalence of LRRK2 mutations in exons 31 and

41 by direct sequencing in a cohort of 154 consecutive, unrelated Brazilian

patients with familial or sporadic PD, including early and late onset patients.

The LRRK2 p.G2019S mutation was present in heterozygous state in three

index cases (~2%), and in three additional relatives. No carriers of this

mutation were found among 250 control chromosomes. All mutation-positive

patients presented a typical PD phenotype and a good response to levodopa.

The p.G2019S segregation analysis, accomplished in some members of a

genealogy, showed a penetrance of 60%. Through the genotypic analysis of

five SNPs located in the LRRK2 gene, we also identified one minimal

haplotype (TAGAA) shared by individuals with mutation p.G2019S, what

strongly suggests that the mutant allele p.G2019S has the same origin. Our

findings indicate that the LRRK2 p.G2019S mutation has a substantial

contribution to PD susceptibility among Brazilian population and add new

clues to current research of this disease. Still, we consider that the

incomplete penetrance of this mutation is a relevant factor to be considered

in the genetic counseling.

1 – INTRODUÇÃO

____________________________________________________________INTRODUÇÃO

1.1 – A Doença de Parkinson

A Doença de Parkinson (DP; OMIM 168600) é a desordem

neurodegenerativa motora mais comum, caracterizada pela degeneração

progressiva de neurônios dopaminérgicos dentro da substância negra nos

gânglios basais (de Rijk et al., 1997). A cada ano, 16-19 por 100.000

pessoas são diagnosticadas com doença de Parkinson (DP), sendo sua

prevalência associada à idade. Basicamente, a DP é um distúrbio de início

tardio, com idade média de manifestação aos 54 anos, embora possa se

manifestar antes dos 50 anos de idade (Van Den Eeden et al., 2003).

Aproximadamente 1% da população é afetada aos 65 anos, aumentando

para 4-5% aos 85 anos de idade (Fahn, 2003). Não existe cura para a DP e

as opções de tratamento permanecem amplamente sintomáticas, sendo

que os pacientes costumam apresentar resposta positiva à terapia com

levodopa (Fahn, 2003). A degeneração progressiva do sistema

nigroestriatal implica numa disfunção grave (Samii et al., 2004), o que

representa um fator que influencia na qualidade de vida do paciente e

resulta em custos consideráveis, diretos e indiretos, para a comunidade

(Lindgren et al., 2005).

Clinicamente, pacientes com DP exibem como sintomas principais:

(i) tremor em repouso; (ii) bradicinesia; (iii) rigidez muscular e

instabilidade postural. Outras características não motoras também

observadas nos pacientes incluem disfunção autonômica, ansiedade,

depressão, distúrbios do sono e disfunção cognitiva (Samii et al., 2004).

____________________________________________________________INTRODUÇÃO

Muitas outras condições neurológicas podem apresentar sintomas

e sinais de parkinsonismo, embora existam, atualmente, critérios

diagnósticos clínicos confiáveis para diferenciar a DP (Litvan et al., 2003).

Entretanto, o diagnóstico definitivo, capaz de distinguir a DP de outras

formas de parkinsonismo, requer análises histopatológicas de tecido

cerebral, no qual se visualiza a perda neuronal e a despigmentação da

substância negra, além da presença de inclusões protéicas intracelulares

(corpúsculos de Lewy) no cérebro [Hughes et al., 2002).

A etiologia da DP é pouco conhecida, sendo considerada, na

maioria dos casos, idiopática. No entanto, existem evidências que sugerem

que tanto fatores ambientais como hereditários desempenham uma

função no desenvolvimento da DP. Seguindo a hipótese multifatorial da

doença, é possível que a interface entre os fatores genéticos, ambientais e

o estilo de vida (incluindo fatores de risco e fatores protetores) culminem

numa probabilidade única do indivíduo desenvolver a doença (Rocca,

2005; Gosal et al., 2006; Klein & Schossmacher, 2006).

1.2 – Causas ambientais da DP

Com a descoberta do parkinsonismo induzido pelo metil-4-fenil1-

1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) em usuários de drogas intravenosas em

1983, especulou-se que outros fatores ambientais poderiam causar a DP

(Langston et al., 1983). O parkinsonismo possui uma variedade de

____________________________________________________________INTRODUÇÃO

etiologias, incluindo distúrbios vasculares (Horner et al., 1997;

Demirkiran et al., 2001), exposições a substâncias tóxicas (Langston et al.,

1983; Aquilonius & Hartvig, 1986; Tanner & Langston, 1990; Semchuk et

al., 1992), doenças infecciosas (Poskanzer & Schwab, 1961), tumores do

lóbulo frontal (Imai & Hirayama, 1975; Kaijima et al., 1978; Majchrzak et

al., 1979) e defeitos ou variações nas vias metabólicas (Barbeau et al.,

1985; Steventon et al., 1989; Tanner, 1991; Armstrong et al., 1992;

Johnson, 2001).

Estudos epidemiológicos demonstraram que a vida rural, o uso de

pesticidas, o consumo de água de poço e certas ocupações, como a

mineração e a soldagem, estão associadas a um risco aumentado de DP

(Priyadarshi et al., 2001; Firestone et al., 2005; Jankovic, 2005). Mais

recentemente, Hancock e colaboradores (2008) reportaram uma

associação positiva entre a exposição a pesticidas e a DP, porém o

consumo de água de poço e a vida/trabalho no campo não se mostraram

associados à doença. Em contrapartida, tem sido noticiado efeitos

protetores do tabaco, do álcool e da cafeína, não estando claro, entretanto,

como estes agentes influenciam o risco da doença (Allam et al., 2004).

1.3 – Causas genéticas da DP

Ao contrário do que se imaginava, estudos sinalizam que os fatores

genéticos desempenham um importante papel na etiologia da DP,

____________________________________________________________INTRODUÇÃO

evidenciados pela agregação familiar, por estudos de associação genética e

pela identificação de famílias com uma clara herança mendeliana da

doença (Duvoisin, 1998). Estudos genéticos da DP começaram em 1997,

com a descoberta de mutações missense patogênicas no gene SNCA, que

segregavam de forma autossômica dominante em algumas famílias com

DP (Polymeropoulos et al., 1997). Nos últimos 11 anos, pelo menos treze

loci cromossômicos ligados à DP foram identificados e neles mapeiam nove

genes associados a formas monogênicas da doença, incluindo os genes

SNCA (Polymeropoulos et al., 1997), UCHL1 (Leroy et al., 1998), PRKN

(Matsumine et al., 1997; Kitada et al., 1998), DJ-1 (Bonifati et al., 2003),

PINK1 (Valente et al., 2004a), LRRK2 (Paisán-Ruíz et al., 2004; Zimprich et

al., 2004), GBA (Aharon-Peretz et al., 2005), HTRA2 (Strauss et al., 2005) e

ATP13A2 (Di Fonzo et al., 2007) (Tabela 1).

____________________________________________________________INTRODUÇÃO

Tabela 1 - Formas monogênicas conhecidas da Doença de Parkinson.

Locus gênico

(posição

cromossômica)

Gene*

Modo de

herança**

Idade de

manifestação da

OMIM

***

PARK1 (=PARK4)

(4q21)

SNCA AD

38-65 anos

24-48 anos

168601

PARK2

(6q25.2-q27)

PRKN AR ~30 anos 600116

PARK3

(2p13)

- - - 602404

PARK5

(4p14)

UCHL1 AD 55-58 anos 191342

PARK6

(1p36)

PINK1 AR 20-40 anos 605909

PARK7

(1p36)

DJ1 AR 20-40 anos 606324

PARK8

(12q12)

LRRK2 AD 50-70 anos 607060

PARK9

(1p36)

ATP13A2

AR - 606693

PARK10

(1p)

- - - 606852

PARK11

(2q21.2)

- - - 607688

PARK12

(Xq21-q25)

- - - 300557

PARK13

(2p12)

HTRA2 - - 606441

1q21 GBA AD - 606463

* SNCA, α-synuclein; PRKN, parkin; UCHL1, ubiquitin carboxyl-terminal esterase L1;

PINK1, PTEN-induced putative kinase 1; DJ1, oncogene DJ1; LRRK2, leucin-rich repeat

kinase 2; ATP13A2, ATPase type 13A2; HTRA2, HTRA serine peptidase 2; GBA,

Glucocerebrosidase. Fonte: Adaptado de Belin & Westerlund (2008).

** AD – Autossômica dominante/ AR – Autossômica recessiva.

*** OMIM

, Online Mendelian Inheritance in Man

____________________________________________________________INTRODUÇÃO

Dos genes identificados, quatro deles estão associados a formas

recessivas de parkinsonismo: PRKN, PINK1, DJ1 e ATP13A2. Mutações

nestes genes como causa da DP são relativamente raras e resultam na

ausência de função da proteína, o que leva à manifestação prematura da

doença, com progressão lenta e boa resposta ao tratamento com levodopa

(Abou-Sleiman et al., 2004; Mata et al., 2004). As formas recessivas de

parkinsonismo tendem a resultar em uma perda mais seletiva de

neurônios dopaminérgicos do que aquelas associadas com a DP

esporádica de início tardio (Farrer, 2006). Outros quatro genes clonados,

SNCA, UCHL1, GBA e LRRK2, estão associados a formas dominantes da

doença. O gene HTRA2 ainda não foi associado a um tipo determinado de

herança.

1.3.1 – PRKN

Mutações no gene parkin (PRKN, OMIM 602544), que se localiza

em 6q, foram originalmente identificadas em famílias japonesas com

parkinsonismo juvenil, segregando de forma autossômica recessiva

(Kitada et al., 1998) e representam a causa mais comum de DP de início

precoce. O grande número e o amplo espectro de mutações em parkin

inclui alterações em todos os seus 12 exons (Hedrich et al., 2001).

Mutações pontuais neste gene são as lesões genéticas mais freqüentes,

embora rearranjos de exons, deleções e duplicações também sejam

comuns (Mata et al., 2004).

____________________________________________________________INTRODUÇÃO

Dados epidemiológicos em relação à freqüência populacional de

mutações no gene parkin são limitados, mas é sabido que a probabilidade

de mutações em PRKN está inversamente associada à idade e parece ser

maior que 50% em indivíduos com parkinsonismo abaixo dos 25 anos

(Lücking et al., 2000; Lohmann et al., 2003).

Este gene codifica uma proteína de 465 aminoácidos com um

domínio N-terminal similar à ubiquitina e dois domínios RING-finger.

Supõe-se que a proteína PARKIN funcione como uma ligase E3 que está

envolvida na degradação proteossômica de proteínas alvo (Shimura et al.,

2000). Ela é expressa em processos pré-sinápticos e pós-sinápticos e no

corpo celular de muitos neurônios (Schlossmacher et al., 2002).

O fato da proteína PARKIN ser um componente do sistema

ubiquitina-proteossomo reforça a hipótese de que a disfunção

proteossômica e a agregação resultante de proteínas sejam eventos

centrais na DP (Betarbet et al., 2005).

1.3.2 – PINK1

O gene PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1, OMIM 608309) está

localizado em 1p36 e contém 8 exons que compreendem,

aproximadamente, 1,8 kb (Valente et al., 2004a). Duas mutações no gene

PINK1 foram, inicialmente, detectadas em três famílias consangüíneas

com DP de início prematuro (Valente et al., 2004a). A freqüência de

mutações neste gene varia de 1-9% (Bonifati et al., 2005; Healy et al.,

____________________________________________________________INTRODUÇÃO

2004; Klein et al., 2005; Li et al., 2005; Rogaeva et al., 2004; Valente et

al., 2004b), de acordo com o grupo étnico estudado.

Este gene codifica uma proteína de 581 aminoácidos com uma

massa molecular de 62,8 kDa, que apresenta 95% de similaridade entre a

forma humana e a do camundongo (Unoki & Nakamura, 2001; Nakajima

et al., 2003). Em camundongos adultos, a proteína pink1 é amplamente

expressa nos tecidos, com uma expressão mais alta no cérebro (Nakajima

et al., 2003).

A maioria das mutações descritas em PINK1 está localizada perto

ou dentro do domínio funcional serina/treonina quinase da proteína

(Klein et al., 2005) e acredita-se que elas resultem em perda de função. A

proteína PINK1 selvagem funciona como uma quinase com uma possível

atividade na mitocôndria; desse modo, reforça-se a idéia entre a disfunção

mitocondrial e o estresse oxidativo na patogênese da DP (Beilina et al.,

2005; Cookson, 2005; Silvestri et al., 2005).

1.3.3 – DJ1

Bonifati e colaboradores (2003) identificaram em duas famílias

consangüíneas da Holanda e da Itália, ambas com DP autossômica

recessiva de início prematuro, duas alterações no gene DJ1 (OMIM

602533), uma deleção e uma mutação de ponto, que segregavam com a

doença. Mutações missense e deleções foram rastreadas através de outros

____________________________________________________________INTRODUÇÃO

estudos. Entretanto, são raras, causando <1% do parkinsonismo de início

prematuro (Hering et al., 2004; Lockhart et al., 2004).

O gene DJ1 contém oito exons que compreendem 24 kb e está

localizado distalmente 25 cM do gene PINK1 (Bonifati et al., 2003). Ele é

amplamente expresso em diversos tecidos, como fígado, músculo

esquelético e rins, e, no cérebro, ocorre um alto nível de expressão nas

regiões que são mais afetadas pela DP (Bonifati et al., 2003). Este gene foi,

inicialmente, descrito em associação com oncogênese (Nagakubo et al.,

1997) e infertilidade em ratos machos (Cookson, 2003).

O produto do gene DJ1 é uma proteína membro da família

ThiJ/PfpI de moléculas chaperones, que são induzidas durante o estresse

oxidativo, apresenta-se na forma de um dímero e está localizado nas

mitocôndrias (Tao & Tong, 2003; Zhang et al., 2005). Além disso, foi

descoberto, em camundongos, que a proteína dj1 está envolvida na

sinalização in vivo do receptor D2 de dopamina (Goldberg et al., 2005).

É possível especular que as proteínas PARKIN, PINK1 e DJ1

estejam criticamente envolvidas na percepção de uma disfunção

mitocondrial e no estresse oxidativo e, com isso, ativem um programa

integrado de resposta celular (Bonifati et al., 2003; Goldberg et al., 2003;

Canet-Aviles et al., 2004; Palacino et al., 2004; Greene et al., 2005; Kim et

al., 2005; Silvestri et al., 2005). A principal finalidade desta resposta

conjunta pode ser a manutenção da integridade das mitocôndrias,

facilitando com isso a sobrevivência de neurônios em risco durante o

envelhecimento humano.

____________________________________________________________INTRODUÇÃO

1.3.4 – ATP13A2

O nono locus (PARK9) ligado à DP está localizado em 1p36

(Hampshire et al., 2001), onde mapeia o gene ATP13A2. Este possui 29

exons e codifica uma ATPase tipo-P de 1.180 aminoácidos, de expressão

predominantemente neuronal, e que está localizada nos lisossomos

(Ramirez et al., 2006). Em 2006, mutações neste gene foram detectadas

em pacientes de duas famílias com a síndrome Kufor-Rakeb (KRS) (Najim

al-Din et al., 1994; Ramirez et al., 2006). Os pacientes afetados exibem

uma forma autossômica recessiva de parkinsonismo responsivo a

levodopa, com degeneração piramidal e disfunção cognitiva, mas também

possuem características não visualizadas na DP (Williams et al., 2005).

Recentemente, um estudo realizado em 46 pacientes com parkinsonismo

de manifestação precoce identificou três mutações missense (c.G1510C,

c.G1597A e c.C35T) no gene ATP13A2 (Di Fonzo et al., 2007). Todas as

mutações identificadas neste estudo resultam em substituição de resíduos

de aminoácidos altamente conservados na proteína ATP13A2 e se

mostraram ausentes em 249 indivíduos controles saudáveis.

1.3.5 – HTRA2

O gene que codifica a proteína HTRA serina peptidase 2, HTRA2,

possui 8 exons que compreendem 3,8 kb e mapeia no locus PARK13,

localizado em 2p13. A proteína HTRA2 é expressa na região

____________________________________________________________INTRODUÇÃO

intermembrana das mitocôndrias, sendo liberada no citosol durante a

apoptose (Strauss et al., 2005). Em um estudo caso-controle envolvendo

indivíduos de origem germânica com DP esporádica, estes autores

identificaram duas variantes gênicas, p.A141S e p.G399S, sendo estes os

primeiros achados de associação entre alterações no gene HTRA2 e uma

desordem neurodegenerativa em humanos. Verificou-se que estas

variantes causavam prejuízo na atividade proteolítica da enzima,

induzindo à disfunção mitocondrial in vitro. Desta forma, estes resultados

forneceram indícios da existência de uma relação funcional entre o

estresse proteolítico e a função mitocondrial.

1.3.6 - SNCA

Estudos genéticos da DP tiveram início a partir da descoberta de

mutações missense patogênicas no gene alpha-synuclein (SNCA, OMIM

163890) que codifica a proteína α-sinucleína (Polymeropoulos et al.,

1997). O gene SNCA foi mapeado em 4q21 e contém 6 exons que

compreendem, aproximadamente, 117 kb (Touchman et al., 2001).

A α-sinucleína, o principal componente dos corpúsculos de Lewy

(Spillantini et al., 1997), é uma proteína citoplasmática neuronal, que

possui 140 aminoácidos, sendo expressa em todo o cérebro, com funções

potenciais no aprendizado, na plasticidade sináptica, na dinâmica de

vesículas e na síntese de dopamina (Lotharius & Brundin, 2002; Sidhu et

____________________________________________________________INTRODUÇÃO

al., 2004). A proteína selvagem é um potente inibidor da fosfolipase D2,

que participa em diversas funções na transdução de sinais e na dinâmica

do citoesqueleto. É também um inibidor competitivo da tirosina

hidroxilase, um passo limitante na biossíntese de tirosina à levodopa

(Farrer, 2006).

A mutação c.209G>A no gene SNCA foi identificada através de

extensos estudos de ligação em várias famílias com parkinsonismo

autossômico dominante (Polymeropoulos et al., 1997; Bostantjopoulou et

al., 2001) e duas outras mutações missense (c.88G>C e c.188G>A) foram

subseqüentemente encontradas (Kruger et al., 1998; Zarranz et al., 2004).

Além destas três mutações de ponto, algumas famílias com DP

foram, recentemente, identificadas carreando triplicações do alelo ou

duplicações que incluíam o gene SNCA (Chartier-Harlin et al., 2004). A

gravidade do fenótipo parece depender da dosagem do gene e pacientes

com duplicações possuem maior semelhança clínica com pacientes com

DP idiopática em relação aos pacientes com triplicações. Entretanto,

ambos os eventos, mutações missense e multiplicações, são extremamente

raros (Berg et al., 2005a). Tais rearranjos levam a um aumento

proporcional do RNAm da α-sinucleína e de sua proteína no tecido

cerebral (Farrer et al., 2004). O mecanismo pelo qual a elevação dos níveis

de α-sinucleína leva à morte neuronal e à formação dos corpúsculos de

Lewy ainda é desconhecido.

____________________________________________________________INTRODUÇÃO

1.3.7 – UCHL1

O gene ubiquitin carboxyl-terminal esterase L1 (UCHL1, OMIM

191342) está localizado em 4p14 e foi primeiramente associado com a DP

através da identificação de uma mutação de ponto autossômica

dominante c.279C>G em dois pacientes aparentados (Leroy et al., 1998). A

mutação c.279C>G parece diminuir a atividade enzimática da proteína,

sugerindo que a perda de função seja o mecanismo que leva à doença.

Este gene contém 9 exons que compreendem 10 kb (Day et al.,

1990), produz um transcrito de 1,3 kb, expresso apenas no cérebro,

particularmente, na substância negra (Leroy et al., 1998), e codifica uma

proteína de 212 aminoácidos chamada PGP 9,5 (Day & Thompson, 1987).

A proteína PGP 9,5 é uma enzima neuronal abundante de função

ainda desconhecida, embora tenham sido reconhecidas atividades

hidrolase e ubiquitil ligase desta proteína, o que caracteriza uma

participação na degradação de proteínas através do proteossomo, um

processo crítico para a morte neuronal (Liu et al., 2002).

Embora todos estes achados sejam consistentes com a hipótese de

que a patogênese da DP envolve o prejuízo dos sistemas da ubiquitina,

mais estudos são necessários para elucidar como mutações que afetam o

gene UCHL1 conseguem causar a morte dos neurônios dopaminérgicos.

____________________________________________________________INTRODUÇÃO

1.3.8 – GBA

Mutações no gene GBA, que possui 11 exons e está localizado em

1q21, têm surgido como um fator de risco que predispõe à DP (Aharon-

Peretz et al., 2005). Este gene codifica a enzima lisossomal

glicocerebrosidase, que normalmente hidrolisa o glicocerebrosídeo em

glicose e ceramida. A deficiência desta enzima resulta na doença de

Gaucher (DG), uma desordem de armazenamento de glicolipídeo, herdada

recessivamente (Grabowski, 1993), que leva ao acúmulo do

glicocerebrosídeo nos macrófagos e ao envolvimento de múltiplos órgãos

(Grabowski, 1993).

Relatos de alguns pacientes com DG que apresentavam

parkinsonismo constituíram as primeiras evidências de uma relação

positiva entre a DG e a DP (Neudorfer et al., 1996; Tayebi et al., 2001).

Posteriormente, estudos familiares revelaram uma incidência acima da

esperada de parkinsonismo entre parentes de pacientes com a DG (Tayebi

et al., 2003; Goker-Alpan et al., 2004) e estudos genéticos, que

identificaram alterações no gene GBA em uma freqüência elevada entre

probandos com parkinsonismo, sugeriram que mutações neste gene, em

heterozigose, poderiam ser um fator de risco para a DP (Aharon-Peretz et

al., 2004; Sidransky, 2005).

Inicialmente, o estudo conduzido por Lwin e colaboradores (2004)

revelou uma freqüência bastante elevada de mutações no gene GBA em

amostras de tecido cerebral de pacientes com DP confirmada postmortem.

____________________________________________________________INTRODUÇÃO

Estudos subseqüentes avaliaram a presença de alterações no gene GBA

em pacientes com DP de diferentes populações e revelaram freqüências

acima das esperadas (Aharon-Peretz et al., 2004; Clark et al., 2005; Sato

et al., 2005; Eblan et al., 2006; Toft et al., 2006; Spitz et al., 2007; Ziegler

et al., 2007).

Esses dados preliminares apontam para uma associação positiva

entre mutações no gene GBA e a DP e enfatizam a importância de um

número maior de estudos sobre este gene em outras populações

(Sidransky, 2006).

A grande recente descoberta relativa à identificação de genes

associados à DP refere-se ao gene LRRK2, o que representa um marco na

investigação desta doença. Como este gene parece ter um papel bastante

significativo na etiologia dessa enfermidade, surgem novas perspectivas

para o estudo, o diagnóstico, a terapêutica e o aconselhamento genético

da doença (Paisán-Ruíz et al., 2004; Zimprich et al., 2004). Devido à sua

importância para este trabalho, este gene será discutido mais

detalhadamente no item 1.4.

1.4 – O gene LRRK2 e seu produto: a dardarina

O gene Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2, OMIM 609007) foi

recentemente adicionado à lista de genes que estão implicados na etiologia

da DP. Ele está localizado na região cromossômica 12q12 (Paisán-Ruíz et

____________________________________________________________INTRODUÇÃO

al., 2004; Zimprich et al., 2004; Funayama et al., 2005), sendo expresso

em humanos em diversos tecidos/órgãos, como coração, fígado, cérebro

adulto, pulmão, placenta, músculo esquelético, pâncreas e rins (Paisán-

Ruíz et al., 2004). No cérebro, a expressão do LRRK2 se concentra na

substância negra, no núcleo caudatum e no putamen (Zimprich et al.,

2004) (Figura 1).

Figura 1 – As principais regiões do cérebro afetadas na DP (sombreado amarelo).

Seção lateral de um cérebro humano com a porção anterior para a esquerda.

Fonte: Farrer, 2006.

O gene LRRK2 contém 51 exons (Figura 2), que compreendem

uma região genômica de 144 kb de extensão, e codifica uma proteína de

2.527 aminoácidos com massa molecular de 286 kDa (Paisán-Ruíz et al.,

2004), chamada dardarina (termo derivado da palavra dardara de origem

____________________________________________________________INTRODUÇÃO

Basca que significa tremor), que possui vários domínios conservados e

uma função ainda desconhecida (Zimprich et al., 2004). A proteína LRRK2

existe, predominantemente, in vivo, em uma conformação dimérica e a

interação entre os monômeros é, provavelmente, forte (Greggio et al.,

2008).

A dardarina (Figura 2) pertence ao grupo de proteínas ROCO

dentro da superfamília Ras/GTPase e contém cinco domínios conservados:

um domínio ROC (Ras em proteínas complexas), um domínio COR (C-

terminal a ROC), uma região rica em repetições leucina (LRR), um domínio

WD40 e um domínio catalítico de tirosina quinase (MAPKKK) (Bosgraaf &

Van Haastert, 2003).

Figura 2 – Esquema do cromossomo 12, mostrando a região onde se encontra o

gene LRRK2 (12q12), e da estrutura do gene LRRK2 e de sua proteína, a

dardarina. LRR – domínio rico em repetições leucina; ROC – domínio ROC; COR –

domínio COR; MAPKKK – domínio de tirosina quinase; WD40 – domínio WD40.

12q12

____________________________________________________________INTRODUÇÃO

Todas as regiões da proteína dardarina podem estar envolvidas em

múltiplas funções, incluindo ligação ao substrato, fosforilação protéica e

interações proteína-proteína (Mata et al., 2005b). A proteína LRRK2 possui

duas propriedades enzimáticas, apresentando atividades de GTPase e de

quinase (Guo et al., 2007). Além disso, a autofosforilação da dardarina é

estimulada através da ligação de GTP, sugerindo que essa proteína é uma

quinase ativada, intramolecularmente, por sua atividade GTPase (Guo et

al., 2007).

Domínios ROC/GTPase de diferentes proteínas estão envolvidos na

reorganização do citoesqueleto de actina em resposta a estímulos

externos. Eles também possuem funções na transformação de células pela

Ras, assim como atuam na citocinese, na formação de adesão focal e na

estimulação de quinases ativadas por estresse (Ridley, 2001).

Proteínas que contêm regiões ricas em repetições leucina (LRRs)

estão associadas a diversas funções que envolvem interação proteína-

proteína, como interações com receptores de hormônios, inibição de

enzimas, adesão celular, tráfego celular, processamento de RNA e ligação

a substratos para ubiquitinação (Kobe & Kajava, 2001).

Domínios WD40 têm sido implicados na transdução de sinais, no

processamento de pré-RNAm e no arranjo do citoesqueleto (Smith et al.,

1999), enquanto o domínio COR possui uma função ainda desconhecida.

Enzimas com domínios MAPKKK pertencem a uma extensa família

de proteínas que compartilham um centro catalítico conservado comum a

proteínas serina/treonina quinases e tirosina quinases. Elas exercem sua

____________________________________________________________INTRODUÇÃO

função catalisando a transferência de γ-fosfato do ATP para resíduos de

tirosina em substratos proteicos (Hubbard & Till, 2000). Diversos

estímulos externos provocam uma cascata de reações celulares onde uma

quinase ativa outra quinase através de fosforilações sucessivas.

Substratos de MAPKs ativadas incluem fatores de transcrição e proteínas

mitocondriais, além de proteínas citosólicas (Johnson et al., 2005; Meylan

& Tschopp, 2005).

1.4.1 – Variantes patogênicas no gene LRRK2

Amplos estudos mostram que mutações pontuais (Figura 3) no

gene LRRK2 segregam de forma dominante e constituem uma causa

importante da DP (Paisán-Ruíz et al., 2004; Zimprich et al., 2004; Di

Fonzo et al., 2005; Hernandez et al., 2005; Kachergus et al., 2005; Mata et

al., 2005b; Zabetian et al., 2005; Kay et al., 2006; Nichols et al., 2007;

Gaig et al., 2008). Entre estas mutações, algumas já tiveram o seu caráter

patogênico confirmado: c.4321C>T (p.R1441C), c.4321C>G (p.R1441G),

c.5096A>G (p.Y1699C), c.6055G>A (p.G2019S) e c.6059T>C (p.I2020T)

(Haugarvoll et al., 2008).

____________________________________________________________INTRODUÇÃO

Figura 3 – Representação esquemática da estrutura dos domínios da proteína

LRRK2. As posições de todas as substituições de aminoácidos possivelmente

patogênicas reportadas até o momento estão destacadas em rosa, enquanto as

substituições de aminoácidos que segregam com a DP estão destacadas em

verde, e os números dos exons correspondentes estão em preto. Abreviações:

COR, C terminal a Ras; Ex, exon; LRR, leucine-rich repeat domain; MAPKKK,

domínio de tirosina quinase; ROC, Ras em proteínas complexas (GTPase); WD40,

domínio WD40.

A maioria das mutações no gene LRRK2 associadas à DP,

identificadas até o momento, está localizada dentro dos cinco domínios da

proteína dardarina (Mata et al., 2005b) (Figura 3), sendo que os exons 31

e 41 codificam parte dos domínios ROC e MAPKKK, respectivamente, onde

estão presentes as principais variantes patogênicas encontradas.

O completo rastreamento da região codificante do gene LRRK2

revelou mutações em aproximadamente 10% dos casos de DP com história

familiar compatível com uma herança autossômica dominante (Berg et al.,

2005b; Khan et al., 2005; Mata et al., 2005b; Di Fonzo et al., 2006a). Esse

dado, por si só, indica que o gene LRRK2 é a causa genética conhecida

mais comum da doença.

____________________________________________________________INTRODUÇÃO

No entanto, a freqüência de mutações no gene LRRK2 varia muito

de acordo com a origem geográfica da população estudada, como mostram

vários estudos conduzidos em diferentes populações mundiais (Tabela 2).

Tabela 2 – Freqüência de mutações no gene LRRK2 em diferentes populações.

Mutações Frequência % (n)ª Familiar (%) Isolado (%) População (referências)

p.G2019S

41 (17) 100 0 Árabes do Norte da África (Lesage et al., 2005a)

39 (59) 17 83 Árabes do Norte da África (Lesage et al., 2006)

18,3 (120) 31 69 Judeus Ashkenazi (Ozelius et al., 2006)

7,6 (105) 15 85 Espanhóis (Infante et al., 2006)

6,6 (61) 100 0 Italianos, brasileiros e portugueses (Di Fonzo et al., 2005, 2006a)

6,52 (138) 22,5 77,5 Portugueses (Ferreira et al., 2007)

6 (128) 20 80 Portugueses (Bras et al., 2005)

5 (767) IND IND Norte-americanos (Nichols et al., 2005)

4,3 (302) 31,1 68,9 Espanhóis (Gaig et al., 2006)

3,5 (83) 47 53 Brasileiros (Munhoz et al., 2008)

3 (166) 82,5 17,5 Chilenos (Perez-Pastene et al., 2007)

3 (66) 59 41 Portugueses (Bras et al., 2008)

2,8 (248) 100 0 Americanos, europeus e asiáticos (Kachergus et al., 2005)

2,8 (174) 100 0 Europeus (Lesage et al., 2005a)

2,2 (225) 22,2 77,8 Espanhóis (Mata et al., 2006)

2,2 (274) 31 69 Russos (Pchelina et al., 2008)

2,1 (629) 28 72 Italianos (Goldwurm et al., 2005)

2 (435) 15 85 Noruegueses (Aasly et al., 2005)

2 (405) IND IND Americanos (Ross et al., 2006)

1,6 (482) 0 100 Ingleses (Gilks et al., 2005)

1,6 (121) 42 48 Canadenses (Paisán-Ruíz et al., 2005)

1,3 (1425) IND IND Americanos (Kay et al., 2006)

1,2 (326) 46 54 Norte-americanos (Deng et al., 2005)

1 (719) IND IND Europeus (Hernandez et al., 2005)

0,8 (371) 19,9 80,1 Americanos (Zabetian et al., 2005)

0,74 (806) IND IND Noruegueses, irlandeses e poloneses (Kachergus et al., 2005)

0,5 (786) 30 70 Norte-americanos (Farrer et al., 2005)

0,25 (390) 13,5 86,5 Alemães (Berg et al., 2005b)

0,12 (800) 10 90 Indianos (Punia et al., 2006)

0 (675) 8,6 91 Chineses (Tan et al., 2005)

0 (624) 0 100 Chineses (Lu et al., 2005)

0 (174) 12 88 Poloneses (Bialecka et al., 2005)

Tabela 2 – Continuação

Mutações Frequencia % (n)ª Familiar (%) Isolado (%) População (referências)

p.R1441C

3,4 (61) 100 0 Italianos, brasileiros e portugueses (Di Fonzo et al., 2005, 2006a)

0,5 (346) 12 88 Alemães (Zimprich et al., 2004)

0,4 (274) 31 69 Russos (Pchelina et al., 2008)

0,26 (371) 19,9 80,1 Americanos (Zabetian et al., 2005)

0,16 (629) 28 72 Italianos (Goldwurm et al., 2005)

0 (105) 15 85 Espanhóis (Infante et al., 2006)

0 (128) 20 80 Portugueses (Bras et al., 2005)

0 (800) 10 90 Indianos (Punia et al., 2006)

p.R1441G

8 (137) 22 78 Espanhóis (Paisán-Ruíz et al., 2004)

2,7 (225) 22 78 Espanhóis (Mata et al., 2005a)

0 (629) 28 72 Italianos (Goldwurm et al., 2005)

0 (105) 15 85 Espanhóis (Infante et al., 2006)

0 (128) 20 80 Portugueses (Bras et al., 2005)

0 (800) 10 90 Indianos (Punia et al., 2006)

p.R1441H

0,26 (371) 19,9 80,1 Americanos (Zabetian et al., 2005)

0 (128) 20 80 Portugueses (Bras et al., 2005)

0 (800) 10 90 Indianos (Punia et al., 2006)

p.G2385R

10 (608) IND IND Chineses de Taiwan (Di Fonzo et al., 2006b)

p.Y1699C

0,26 (346) 12 88 Alemães (Zimprich et al., 2004)

0 (629) 28 72 Italianos (Goldwurm et al., 2005)

p.I2020T

0,52 (189) IND IND Japoneses (Funayama et al., 2005)

0,26 (346) 12 88 Alemães (Zimprich et al., 2004)

0,25 (390) 13,5 86,5 Alemães (Berg et al., 2005b)

0 (624) 0 100 Chineses (Lu et al., 2005)

0 (800) 10 90 Indianos (Punia et al., 2006)

Tabela 2 – Continuação

Mutações Frequencia % (n)ª Familiar (%) Isolado (%) População (referências)

p.I1122V

0,26 (346) 12 88 Alemães (Zimprich et al., 2004)

p.R793M

0,76 (390) 13,5 86,5 Alemães (Berg et al., 2005)

p.S1228T

0,25 (390) 13,5 86,5 Alemães (Berg et al., 2005)

p.R1067Q

0,16 (630) 25 75 Chineses (Skipper et al., 2005)

p.I1371V

0,82 (121) 42 48 Canadenses (Paisán-Ruíz et al., 2005)

p.M1869T

0,12 (786) 30 70 Norte-americanos (Farrer et al., 2005)

ª (n), número de indivíduos analisados; IND, indisponível

Adaptado de Punia et al., 2006.

____________________________________________________________INTRODUÇÃO

O mais importante hot spot mutacional identificado no gene LRRK2

está localizado no exon 41, e possui três mutações descritas na literatura:

c.6035T>C (p.I2012T), c.6055G>A (p.G2019S) e c.6059T>C (p.I2020T),

sendo que apenas as duas últimas possuem um caráter patogênico

confirmado (Paisán-Ruíz et al., 2004; Zimprich et al., 2004; Berg et al.,

2005b; Funayama et al., 2005; Li et al., 2005; Kay et al., 2006; Perez-

Pastene et al., 2007).

A mutação c.6055G>A (p.G2019S) é a variante patogênica mais

freqüente identificada no gene LRRK2 (DiFonzo et al., 2005, 2006a; Gilks

et al., 2005; Mata et al., 2005b; Nichols et al., 2005). Esta mutação leva à

substituição do aminoácido glicina pela serina na proteína dardarina,

sendo responsável por uma proporção surpreendentemente alta de casos

familiares e isolados da DP. Estudos familiares e populacionais (Tabela 2)

indicam que esta mutação encontra-se difundida em diversas populações

mundiais, constituindo a causa mais comum de DP (Aasly et al., 2005;

Bras et al., 2005; Gaig et al., 2006; Goldwurm et al., 2006; Infante et al.,

2006; Kay et al., 2006; Lesage et al., 2005a; 2006; Mata et al., 2006;

Ozelius et al., 2006; Punia et al., 2006; Zabetian et al., 2006b; Ferreira et

al., 2007; Xiromerisiou et al., 2007).

Uma prevalência extremamente alta da mutação p.G2019S foi

encontrada entre pacientes árabes do Norte da África (37% de casos

familiares e 41% de casos esporádicos) (Lesage et al., 2006) e entre

pacientes judeus Ashkenazi (~29% de casos familiares e ~13% de casos

esporádicos) (Ozelius et al., 2006).

____________________________________________________________INTRODUÇÃO

A alteração p.G2019S está presente em uma baixa freqüência em

pacientes com DP do Norte da Europa (Aasly et al., 2005; Bialecka et al.,

2005; Carmine et al., 2006; Pchelina et al., 2006; Williams-Gray et al.,

2006) em comparação com pacientes do Sul da Europa, como Itália (~5%

de casos familiares e ~1% de casos esporádicos) (Goldwurm et al., 2005;

2006), e Espanha e Portugal (cerca de ~6-18% de casos familiares e ~3-6%

de casos esporádicos) (Bras et al., 2005; Gaig et al., 2006; Infante et al.,

2006; Mata et al., 2006). Entre os países europeus, estes dois últimos são

os que apresentam a maior prevalência da mutação p.G2019S entre

indivíduos com DP (Bras et al., 2005; Gaig et al., 2006; Infante et al.,

2006; Mata et al., 2006; Ferreira et al., 2007). A região de Cantabria, na

Espanha, registra a maior freqüência desta mutação (Infante et al., 2006).

Em Coimbra, Bras e colaboradores (2005) encontraram uma

freqüência da mutação p.G2019S de ~9% nos casos familiares e ~5% nos

casos esporádicos, enquanto um outro estudo, mais recente, realizado em

Lisboa (Ferreira et al., 2007), verificou uma prevalência de ~16% nos

casos familiares e 3,7% nos casos esporádicos.

Na América do Norte, a freqüência da mutação p.G2019S varia de

0,5-5% (Deng et al., 2005; Farrer et al., 2005; Nichols et al., 2005; Kay et

al., 2006; Johnson et al., 2007). Em um estudo norte-americano (Nichols

et al., 2005) foi encontrado um paciente com DP que possuía duas cópias

do alelo mutado, sendo que sua apresentação clínica, idade de

manifestação e progressão da doença não diferiam dos outros indivíduos

heterozigotos mutados.

____________________________________________________________INTRODUÇÃO

Cabe ressaltar que estudos do gene LRRK2 conduzidos em grandes

amostras de pacientes com DP de origem asiática (Lu et al., 2005; Tan et

al., 2005; Zabetian et al., 2006b) evidenciam que mutações neste gene são

raras (<0,4%) nas populações deste continente. A mutação p.G2019S não

foi identificada em três amplos estudos em pacientes chineses (Lu et al.,

2005; Tan et al., 2005; Fung et al., 2006) e, é raramente encontrada em

indianos (Punia et al., 2006) e em pacientes japoneses (Tomiyama et al.,

2006; Zabetian et al., 2006b).

O primeiro estudo relativo ao gene LRRK2 conduzido em pacientes

com DP da América Latina foi realizado em Santiago, no Chile (Perez-

Pastene et al., 2007), onde a maioria da população é composta por uma

mistura espanhola/européia-ameríndia (Acuña et al., 2002). Neste

trabalho, os autores encontraram a mutação p.G2019S em 5 dos 166

pacientes analisados (3%) e em nenhum indivíduo controle, uma

freqüência comparável àquela observada na Espanha e em Portugal (~2-

7%) (Bras et al., 2005; Gaig et al., 2006; Infante et al., 2006; Mata et al.,

2006; Ferreira et al., 2007).

Muito recentemente, foi publicado um estudo realizado em

Curitiba/Paraná relacionado ao gene LRRK2 em pacientes com DP de

manifestação precoce e/ou história familiar positiva (Munhoz et al., 2008).

Estes autores identificaram a mutação p.G2019S em 3 dos 83 pacientes

com DP analisados (3,5%), dos quais um deles tinha um irmão gêmeo

monozigótico com esta mesma alteração.

____________________________________________________________INTRODUÇÃO

No gene LRRK2 foram identificadas três mutações diferentes que

afetam um mesmo resíduo da proteína (c.4321C>T, p.R1441C;

c.4321C>G, p.R1441G; c.4322G>A, p.R1441H) (Zimprich et al., 2004;

Mata et al., 2005b; Zabetian et al., 2005; Di Fonzo et al., 2006a),

constituindo esta posição um hot spot mutacional.

A mutação c.4321C>G (p.R1441G) tem sido associada à DP com

uma incidência aparentemente alta apenas em populações de origem

basca (Paisán-Ruíz et al., 2004) e em regiões vizinhas do norte da

Espanha, como as Astúrias (Mata et al., 2005a). Já a mutação c.4321C>T

(p.R1441C) foi encontrada numa freqüência de 3,4% entre 60 pacientes

com história familiar da DP de herança autossômica dominante (Di Fonzo

et al., 2006a). A outra mutação neste códon, c.4322G>A (p.R1441H), é

bem menos freqüente, e ainda não teve seu caráter patogênico

confirmado.

Uma variante no gene LRRK2, c.7153G>A (p.G2385R), foi

recentemente descoberta como sendo um fator de risco comum para a DP

entre asiáticos (Di Fonzo et al., 2006b; Fung et al., 2006; Farrer et al.,

2007; Funayama et al., 2007; Tan, 2007; Tan et al., 2007). Em 2006, Di

Fonzo e colaboradores encontraram essa variante em, aproximadamente,

10% da população chinesa de Taiwan com DP e em 5% dos indivíduos

controles, não sendo a mesma observada entre ocidentais (Berg et al.,

2005b; Khan et al., 2005; Di Fonzo et al., 2006b). Desta forma, foi

proposto que a mutação c.7153G>A (p.G2385R) seja um fator comum de

risco para a DP específico da população asiática (Di Fonzo et al., 2006b).

____________________________________________________________INTRODUÇÃO

Diversas outras mutações já foram identificadas na proteína

dardarina (p.Y1699C, p.I1122V, p.R793M, p.S1228T, p.R1067Q, p.I1371V

e p.M1869T), mas suas incidências são relativamente raras (Tabela 2).

1.4.2 – O efeito das mutações na proteína dardarina

As mutações p.G2019S, p.I2020T e p.I2012T no gene LRRK2

ocorrem no domínio MAPKKK (Figura 3), dentro do segmento de ativação

da função quinase da proteína, sendo este altamente conservado nas

proteínas ortólogas à dardarina e em todas as quinases de eucariotos

(Hernandez et al., 2005; Nichols et al., 2005). Uma conseqüência dessas

substituições é o aumento da atividade quinase da proteína e a introdução

de novos sítios potenciais de auto-fosforilação (Gloeckner et al., 2006),

conferindo um ganho de função à proteína mutante, compatível com o

padrão de herança dominante observado nas famílias com mutações em

LRRK2 (Kachergus et al., 2005).

Além dessas, as mutações patogênicas p.R1441C e p.R1441G,

localizadas no domínio GTPase (ROC) (Figura 3), também aumentam a

atividade quinase da proteína dardarina (Greggio et al., 2008). Outras

mutações no gene LRRK2, fora dos domínios quinase e GTPase, podem

afetar a conformação da proteína ou a sua interação com cofatores que

regulam a especificidade e a atividade quinase da dardarina (West et al.,

2005).

____________________________________________________________INTRODUÇÃO

O fato dessas mutações afetarem diretamente a atividade quinase

e a especificidade da proteína ao substrato sinaliza que inibidores de

quinases específicos possam ser efetivos no tratamento ou na prevenção

da DP associada a mutações no gene LRRK2. Estudos experimentais

focados na atividade quinase da dardarina encontram-se em andamento

(Mathiasen et al., 2004; Wang et al., 2004; West et al., 2005; Gloeckner et

al., 2006; Cookson et al., 2007; Luzón-Toro et al., 2007; Greggio et al.,

2008) e podem levar ao desenvolvimento de novas drogas com grande

potencial terapêutico, direcionadas para grupos específicos de pacientes

(Albrecht, 2005; Goldwurm et al., 2005; Mata et al., 2005b; Toft et al.,

2005; Cookson et al., 2007; Luzón-Toro et al., 2007; Greggio et al., 2008).

1.5 – Efeito Fundador

A análise de marcadores genéticos ligados ao gene LRRK2 mostrou

que a maioria dos pacientes árabes do Norte da África, judeus Ashkenazi e

os de origem européia ou americana com DP, portadores da mutação

p.G2019S, compartilha um haplótipo ancestral fundador comum

(Goldwurm et al., 2005; Kachergus et al., 2005; Lesage et al., 2005b;

Ozelius et al., 2006). Este parece ter se originado no Norte da África ou no

Oriente Médio há aproximadamente 2.000 anos e se difundido através da

migração humana para outros países e continentes (Zabetian et al.,

2006a) (Figura 4).

____________________________________________________________INTRODUÇÃO

Um segundo haplótipo foi detectado em alguns pacientes

portadores da mutação p.G2019S de origem européia [Zabetian et al.,

2006a], enquanto um terceiro haplótipo foi encontrado em pacientes

japoneses [Zabetian et al., 2006b]. A ocorrência da mutação p.G2019S

ligada a, pelo menos, três diferentes haplótipos sugere um efeito fundador

extremamente antigo e um hot spot mutacional (Bonifati, 2007).

Figura 4 – A mutação p.G2019S no gene LRRK2 surgiu de um efeito fundador

ancestral comum que parece ter se originado no Norte da África e se difundido

para outros continentes (setas brancas) através da migração humana. Os valores

em porcentagem representam as freqüências da mutação p.G2019S em

diferentes continentes e em países como o Chile e o Brasil.

Fonte do mapa: http://www.eb1-recovelas.rcts.pt/mundo.gif.

Brasil

39%

0,5-5%

<0,4%

0,2-7,6%

Chile

3,5 %

____________________________________________________________INTRODUÇÃO

1.6 – Características clínicas associadas à mutação

p.G2019S

As características motoras de pacientes com DP portadores da

mutação p.G2019S são indistinguíveis da forma clássica da doença

(Paisán-Ruíz et al., 2004; Zimprich et al., 2004; Gilks et al., 2005; Gaig et

al., 2006), porém a neuropatologia pode se apresentar de forma bastante

heterogênea (Zimprich et al., 2004). A perda neuronal dopaminérgica e

gliose da substância negra são características comuns da DP observadas

em pacientes que carreiam esta variante gênica (Zimprich et al., 2004).

Além disso, corpúsculos de Lewy foram encontrados na maioria dos casos,

mas em alguns pacientes havia ausência de inclusões, ou apenas

inclusões tau-positivas ou ubiquitina-positivas (Wszolek et al., 1997;

2004; Khan et al., 2005; Giasson et al., 2006; Rajput et al., 2006; Ross et

al., 2006; Gaig et al., 2007; Giordana et al., 2007).

A idade de manifestação dos sintomas nos pacientes com a

mutação p.G2019S é altamente variável (35 a 80 anos), mesmo em

indivíduos de uma mesma família, sendo a idade média aos 55 anos

(Nichols et al., 2005; Clark et al., 2006; Goldwurm et al., 2006; Kay et al.,

2006). Todos os pacientes portadores desta mutação apresentam uma boa

resposta ao tratamento com levodopa, sendo observadas freqüentes

discinesias induzidas pelo tratamento prolongado com a droga (Goldwurm

et al., 2005; Kachergus et al., 2005).

____________________________________________________________INTRODUÇÃO

O fato do fenótipo clínico associado à mutação p.G2019S ser

indistinguível daqueles com a DP idiopática (Aasly et al., 2005) sugere que

uma estratégia terapêutica direcionada para os portadores da mutação

p.G2019S possa ter implicações também no tratamento dos pacientes sem

a mutação.

1.7 – Penetrância da mutação p.G2019S

Um ponto relevante a ser abordado refere-se à penetrância da

mutação p.G2019S, considerando ser este um importante fator avaliado

no aconselhamento genético. Estudos mostram que ela é incompleta e

está relacionada à idade (Kachergus et al., 2005; Lesage et al., 2005a;

Clark et al., 2006; Di Fonzo et al., 2006a; Ozelius et al., 2006; Goldwurm

et al., 2007) (Tabela 3).

____________________________________________________________INTRODUÇÃO

Tabela 3 – Estudos que realizaram o cálculo de penetrância da mutação

p.G2019S.

Referência N População

Penetrância

p.G2019S

Kachergus et al., 2005 34

Européia e

Norte-Americana

17% aos 50 anos/

85% aos 70 anos

Lesage et al., 2005a 21

Européia, Norte

da África e

Americana

33% aos 55 anos/

100% >76 anos

Clark et al., 2006

Judeus e

Norte-

Americanos

24% aos 80 anos

Di Fonzo et al., 2006a 15

Itália, Brasil e

Portugal

15% aos 40 anos/

78% aos 65 anos

Ozelius et al., 2006 22

Judeus

Ashkenazi

~32%

(1 chance em 3)

Goldwurm et al., 2007 36 Itália

32% aos 80 anos

(1 chance em 3)

Os primeiros estudos (Kachergus et al., 2005; Di Fonzo et al.,

2006a) estimaram a penetrância da mutação p.G2019S pelo método

tradicional, dividindo-se o número de indivíduos com DP portadores da

mutação pelo número total de portadores (afetados + não-afetados), e

obtiveram valores que variaram de 17% aos 50 anos a 85% aos 70 anos

(Kachergus et al., 2005) e de 15% aos 40 anos a 78% aos 65 anos (Di

Fonzo et al., 2006a).

Outras estimativas da penetrância desta mutação, utilizando os

métodos de Kaplan-Meier, Kin-cohort, odds ratio, forneceram valores de

24% entre pacientes com DP norte-americanos (Clark et al., 2006) e ~32%

____________________________________________________________INTRODUÇÃO

entre pacientes judeus Ashkenazi (Ozelius et al., 2006) e pacientes

italianos (Goldwurm et al., 2007). Essa baixa penetrância encontrada

explicaria a alta prevalência da mutação p.G2019S entre pacientes com

DP esporádica. Essas observações indicam, ainda, que embora esta

alteração no gene LRRK2 represente um importante fator de risco para a

DP, outros fatores, genéticos e/ou ambientais, são necessários para a

manifestação da doença (Kay et al., 2005; Gaig et al., 2006).

Dessa forma, são necessários outros estudos, conduzidos em

famílias de diferentes populações onde a mutação p.G2019S segrega com

o fenótipo da DP, para que se possa refinar o cálculo da penetrância desta

alteração no gene LRRK2.

____________________________________________________________INTRODUÇÃO

1.8 – Objetivos

Este estudo teve como objetivos principais:

9 Determinar a freqüência de mutações no gene LRRK2, através do

rastreamento de alterações nos exons 31 e 41, em pacientes com

doença de Parkinson;

9 Estabelecer correlações genótipo-fenótipo entre os pacientes Parkinson

com mutações em LRRK2 (incluindo idade de manifestação e

progressão da doença);

9 Realizar a análise de segregação das mutações encontradas nas

famílias de forma a calcular a penetrância das alterações encontradas.

9 Realizar a análise de haplótipo nos indivíduos portadores de mutações

no gene LRRK2, de modo a verificar a origem ancestral das alterações

encontradas.

2 – METODOLOGIA

__________________________________________________________METODOLOGIA

2.1 – Pacientes

Neste estudo foram incluídos 154 pacientes não aparentados, de

ambos os sexos (54 mulheres e 100 homens; faixa etária: 33 a 86 anos),

portadores da DP idiopática, com ou sem história familiar da doença,

sendo 7 de nacionalidade portuguesa e 147 brasileiros, todos residentes

no Estado do Rio de Janeiro. Eles foram avaliados por médicos

neurologistas especialistas em distúrbios do movimento ligados a

importantes hospitais públicos do Rio de Janeiro: Hospital Universitário

Pedro Ernesto/UERJ, Hospital Universitário Clementino Fraga

Filho/UFRJ, Instituto de Neurologia Deolindo Couto/UFRJ e Santa Casa

de Misericórdia do Rio de Janeiro. Os médicos neurologistas procederam à

análise clínica, seguindo os critérios clínicos/patológicos aceitos para a

DP (Hughes et al., 2001), e levantaram a história familiar do probando.

Foram incluídos na pesquisa apenas os casos de DP idiopática, sendo os

casos de parkinsonismo secundário excluídos.

Os pacientes selecionados foram esclarecidos com relação aos

objetivos da pesquisa e convidados a participar do estudo. A coleta de

material biológico para a análise molecular teve início somente após a

autorização do paciente, mediante assinatura do termo de consentimento

livre e esclarecido (Anexo 1). As condutas adotadas neste projeto

seguiram as normas éticas do CONEP/Ministério da Saúde (Resolução

196/96) que regem as pesquisas envolvendo seres humanos. Este projeto

__________________________________________________________METODOLOGIA

foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade do Estado

do Rio de Janeiro (REG. 04.1.2006) (Anexo 2).

Além dos pacientes com DP, foram recrutados 125 indivíduos

voluntários saudáveis (100 mulheres e 25 homens; faixa etária: 51 a 84

anos), sem sinais ou sintomas da DP ou de qualquer outra desordem

neurodegenerativa e sem história familiar de parkinsonismo, para fazerem

parte da nossa amostra controle.

2.2 – Análise Molecular

A triagem de mutações no gene LRRK2 foi realizada no Serviço de

Genética Humana da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ),

situado no Campus do Maracanã/Rio de Janeiro/RJ.

2.2.1 – Extração do DNA genômico

Para a extração do DNA foram coletados 5 mL de sangue periférico

de cada indivíduo, utilizando-se tubos vacutainer contendo anti-

coagulante EDTA. A coleta de sangue foi realizada por um técnico em

análises clínicas, seguindo normas de plena assepsia.

O DNA genômico foi extraído utilizando-se o Kit comercial GFX

Genomic Blood DNA Purification Kit (GE Healthcare), seguindo o protocolo

__________________________________________________________METODOLOGIA

descrito pelo fabricante. Após a extração, o DNA foi armazenado a 4ºC em

tubos de 1,5 mL.

2.2.2 – Estimativa da concentração do DNA

Para avaliar a qualidade do DNA e estimar a concentração das

amostras, estas foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 0,8%

(INVITROGEN) diluída em tampão TBE 1X [Tris 89 mM (INVITROGEN),

ácido bórico 89 mM (MERCK), EDTA 2 mM (USB)]. Ao gel de agarose foi

adicionado 0,6 μL de brometo de etídeo a 10 μg/μL (SIGMA). No preparo

das amostras, 1 μL da alíquota de DNA foi acrescentado a 1 μL de corante

de corrida [azul de bromofenol 0,25% (SIGMA), xileno cianol 0,25%

(MERCK), glicerol 30% (MERCK)] e a 8 μL de água MilliQ.

A eletroforese foi realizada a 60 V, por 1 hora em cuba horizontal

[Horizon 58 (INVITROGEN)], utilizando-se como tampão de corrida TBE

1X. Após a corrida, o gel foi visualizado em um transiluminador de luz

ultravioleta [modelo TM 20 (UVP)]. A quantidade de DNA foi estimada

através da comparação da intensidade da banda de cada amostra com o

padrão de DNA de Bacteriófago λ (INVITROGEN) de 100 ηg/μL.

__________________________________________________________METODOLOGIA

2.2.3 – Rastreamento de mutações no exon 31 do gene LRRK2

2.2.3.1 – Reação em cadeia da polimerase (PCR)

Para a amplificação do fragmento gênico correspondente ao exon

31 (405 pb), que codifica parte do domínio ROC/GTPase do gene LRRK2,

foram utilizados os oligonucleotídeos 31F (5’ TCT GAA GTC TGC TAG TTT

CTC 3’) e 31R (5’ TCT GAC ATT TCT AGG CAG TTG 3’) descritos por Di

Fonzo e colaboradores (2005). As condições finais das reações incluíram

100 ηg de DNA genômico, tampão de reação 1X [KCl 5 mM, Tris HCl 7,5

mM - pH 9,0, (NH

)

2 mM (BIOTOOLS)], MgCl

4 mM (BIOTOOLS),

dATP 200 μM, dTTP 200 μM, dCTP 200 μM, dGTP 200 μM (GE

HEALTHCARE), 0,8 μM de oligonucleotídeo 31F, 0,8 μM de

oligonucleotídeo 31R e 1 U de Taq DNA polimerase para um volume final

de reação de 25 μL (Tabela 4).

__________________________________________________________METODOLOGIA

Tabela 4 - Condições utilizadas na PCR para a amplificação dos fragmentos

correspondentes aos exons 31 e 41 do gene LRRK2.

Regiões do gene LRRK2

Reagentes

Exon 31 Exon 41

tampão de reação

(BIOTOOLS)

1X 1X

dNTPs

(GE HEALTHCARE)

200μM 200μM

MgCl

(BIOTOOLS)

4,0 mM 1,5 mM

Oligonucleotídeo F

0,8 μM 0,8 μM

Oligonucleotídeo R

0,8 μM 0,8 μM

Taq DNA polimerase

(BIOTOOLS)

1,0 U 1,0 U

DNA

100 ηg 100 ηg

Volume final

25 μL 25 μL

As condições de ciclagem utilizadas incluíram: desnaturação

inicial a 95°C por 10 minutos; 35 ciclos de desnaturação a 95°C por 1

minuto, pareamento a 61°C por 1 minuto, extensão a 72°C por 2 minutos;

e extensão final a 72°C por 10 minutos. As reações foram conduzidas em

um termociclador PTC-100 (MJ RESEARCH). Após a amplificação, os

produtos da PCR foram armazenados a -20°C.

__________________________________________________________METODOLOGIA

2.2.3.2 – Avaliação da qualidade dos fragmentos amplificados e do

rendimento da reação

Para a avaliação da qualidade dos fragmentos amplificados e do

rendimento da reação, as amostras foram submetidas à eletroforese em

gel de agarose 0,8% (INVITROGEN), conforme descrito no item 2.2.2. No

preparo das amostras, 4 μL da alíquota da reação de PCR foram

adicionados a 2 μL de corante de corrida. A eletroforese foi realizada a 80

V, por 1 hora em cuba horizontal (Horizon 58 - INVITROGEN), utilizando

como tampão de corrida TBE 1X. O gel foi visualizado em um

transiluminador de luz ultravioleta (modelo TM 20 - UVP).

Para confirmação do tamanho do amplicon foi utilizado o padrão

de peso molecular 1 kb DNA ladder (INVITROGEN).

2.2.3.3 – Purificação dos produtos da PCR

Após a amplificação, 20 μL do produto da PCR foram purificados

utilizando-se o Kit de purificação [AccuPrep® PCR Purification Kit

(BIONEER)], seguindo o protocolo descrito pelo fabricante.

__________________________________________________________METODOLOGIA

2.2.3.4 – Seqüenciamento automático

As reações de seqüenciamento foram preparadas em um volume

final de 20 μL, utilizando-se o Kit Big Dye Terminator V3.1 (APPLIED

BIOSYSTEMS), contendo: 1 μL de oligonucleotídeo a 3,2 pmol (senso ou

anti-senso), 1,5 μL do tampão diluente (APPLIED BIOSYSTEMS), 60 ηg do

DNA purificado e 1 μL do Kit Big Dye Terminator. As reações foram

conduzidas no termociclador PTC-100 (MJ RESEARCH) e a ciclagem

compreendeu 35 ciclos de desnaturação a 96°C por 15 segundos,

anelamento a 50°C por 10 segundos e extensão a 60°C por 4 minutos.

Para a precipitação das reações de seqüenciamento, foram

adicionados ao produto da reação 64 μL de etanol absoluto gelado

(ISOFAR) e 16 μL de água MilliQ. O material foi homogeneizado em um

agitador para tubos (PHOENIX) e deixado à temperatura ambiente por 15

minutos para a precipitação. Após este tempo, os tubos foram

centrifugados a 14.000 rpm por 20 minutos (microcentrífuga CIENTEC). O

sobrenadante foi descartado e ao precipitado foram adicionados 250 μL de

etanol 70% (ISOFAR). O material foi novamente homogeneizado e levado à

centrifugação por 20 minutos a 14.000 rpm. O sobrenadante foi retirado e

as amostras precipitadas foram protegidas da luz e deixadas à

temperatura ambiente por 12 horas para a secagem. As amostras secas

foram conservadas à -20°C.

O material precipitado foi ressuspenso em 10 μL de solução de

formamida [Hi Di Formamida (APPLIED BIOSYSTEMS)] e transferido para

__________________________________________________________METODOLOGIA

a placa de seqüenciamento contendo 96 poços (APPLIED BIOSYSTEMS).

Em seguida, a placa contendo as amostras foi levada ao termociclador

PTC-100 (MJ RESEARCH) por 5 minutos a 95°C para a desnaturação e,

imediatamente, incubada em gelo para permitir a manutenção da

desnaturação das amostras. A placa foi levada ao seqüenciador

automático ABI Prism 3100 (APPLIED BIOSYSTEMS) para o

processamento das amostras. Esta etapa foi realizada na Plataforma

Genômica (PDTIS - Instituto Oswaldo Cruz - Fiocruz).

A análise das seqüências foi realizada através dos programas

Chromas Lite versão 2.0 (TECHNELYSIUM) e BioEdit Sequence Alignment

Editor versão 6.0.6 (Isis Pharmaceuticals, Inc). As seqüências obtidas

foram alinhadas com o fragmento correspondente à seqüência selvagem

do gene LRRK2. Os indivíduos que apresentaram variação nas seqüências

tiveram uma nova alíquota do DNA analisada para a confirmação da

variante encontrada.

2.2.4 – Rastreamento de mutações no exon 41 do gene LRRK2

2.2.4.1 – Reação em cadeia da polimerase para o seqüenciamento

Para a amplificação do fragmento gênico correspondente ao exon

41 (337 pb), que codifica parte do domínio MAPKKK do gene LRRK2, foram

utilizados os oligonucleotídeos DKFZp434 40F (5’ TTT TGA TGC TTG ACA

__________________________________________________________METODOLOGIA

TAG TGG AC 3’) e DKFZp434 40R (5’ CAC ATC TGA GGT CAG TGG TTA

TC 3’) descritos por Paisán-Ruíz e colaboradores (2004). As condições

finais das reações incluíram 100 ηg de DNA genômico, tampão de reação

1X [KCl 5 mM, Tris HCl 7,5 mM - pH 9,0, (NH

)

2 mM (BIOTOOLS)],

MgCl

1,5 mM (BIOTOOLS), dATP 200 μM, dTTP 200 μM, dCTP 200 μM,

dGTP 200 μM (GE HEALTHCARE), 0,8 μM de oligonucleotídeo DKFZp 40F,

0,8 μM de oligonucleotídeo DKFZp 40R e 1 U de Taq DNA polimerase para

um volume final de reação de 25 μL (Tabela 4).

As condições de ciclagem utilizadas incluíram: desnaturação

inicial a 95°C por 6 minutos; 30 ciclos de desnaturação a 95°C por 1

minuto, anelamento a 63°C por 1 minuto e extensão a 72°C por 2

minutos; e extensão final a 72°C por 7 minutos. As reações foram

conduzidas em um termociclador PTC-100 (MJ RESEARCH). Após a

amplificação, os produtos da PCR foram armazenados a -20°C.

Para a avaliação da qualidade dos fragmentos amplificados e do

rendimento da reação utilizou-se o mesmo procedimento adotado no item

2.2.3.2. O produto de amplificação foi purificado e seqüenciado de acordo

com os procedimentos descritos nos itens 2.2.3.3 e 2.2.3.4.

2.2.4.2 – PCR-RFLP

Para avaliar a presença da mutação c.6055G>A (p.G2019S) no

exon 41 do gene LRRK2 nos indivíduos controles e também para confirmar

__________________________________________________________METODOLOGIA

os resultados positivos obtidos através do seqüenciamento automático foi

realizada a técnica de PCR-RFLP. A reação em cadeia da polimerase foi a

mesma descrita no item 2.2.4.1 seguida da digestão dos produtos da PCR

com a enzima de restrição SfcI (NEW ENGLAND). As amostras da digestão

foram preparadas com 15,5 µL de água MilliQ, 10 µL do produto de PCR, 3

µL de tampão da enzima (1X NEBuffer 4) (NEW ENGLAND) e 5 U da

enzima SfcI e foram mantidas por 18 horas em banho de aquecimento

(Modelo 100 - FANEM) a 37ºC.

2.2.4.3 - Análise dos fragmentos da digestão em gel de poliacrilamida

Os produtos digeridos da PCR foram submetidos à eletroforese em

gel de poliacrilamida 5% não-desnaturante. O gel foi composto por 1,25

mL de solução de acrilamida (PHARMACIA BIOTECH):bis acrilamida

(PHARMACIA BIOTECH) 20% (19:1), 0,25 mL de tampão TBE 10X, 35 μL

de persulfato de amônio 10% (USB), 5 μL de TEMED (INVITROGEN) e 3,46

mL de água MilliQ. Oito microlitros do produto da digestão foram

adicionados a 2,0 μL de corante de corrida e a preparação foi aplicada no

gel. A eletroforese foi realizada em uma cuba vertical Mini-Protean (BIO

RAD) a uma voltagem de 110 V por aproximadamente 1 hora.

Ao término da corrida eletroforética, o gel foi imerso sob agitação

moderada em uma solução fixadora [ácido acético 0,5% (ISOFAR), etanol

10% (ISOFAR)] por 2 minutos, corado em uma solução de nitrato de prata

__________________________________________________________METODOLOGIA

[ácido acético 0,5% (ISOFAR), etanol 10% (ISOFAR), AgNO

0,2%

(MERCK)]

por 10 minutos e lavado em água destilada por 20 segundos. Após a

lavagem, o gel foi revelado em uma solução contendo 3% de hidróxido de

sódio (ISOFAR) e 0,1% de formaldeído (MERCK) por 10 minutos e fixado

em uma solução fixadora [ácido acético 0,5% (ISOFAR), etanol 10%

(ISOFAR)] por 2 minutos.

Foi utilizado o padrão de peso molecular 1 kb DNA ladder

(INVITROGEN), uma amostra de DNA não-digerida e uma amostra de um

paciente, sabidamente positivo para a mutação c.6055G>A (p.G2019S),

para fins comparativos (Figura 5).

O fragmento da PCR de 337 pb é clivado na presença do alelo G

(selvagem) em dois fragmentos de 228 e 109 pb. Na presença do alelo A

(mutado) ele é clivado em três fragmentos de 207, 109 e 21 pb (que é

perdido no gel) (Figura 5).

__________________________________________________________METODOLOGIA

Figura 5 – Esquema representativo da digestão dos produtos da PCR com a

enzima SfcI (NEW ENGLAND). Linha 1: Padrão de peso molecular 1 kb DNA

ladder; linha 2: Fragmento referente ao produto de PCR não digerido; linha 3:

Fragmentos referentes à digestão de uma amostra de um paciente sem a

mutação c.6055G>A (p.G2019S); linha 4: Fragmentos da digestão de uma

amostra de um paciente com a mutação c.6055G>A (p.G2019S) no gene LRRK2.

O fragmento de 21 pb não está representado.

__________________________________________________________METODOLOGIA

2.2.5 – Cálculo da penetrância da mutação p.G2019S

Para avaliar a penetrância da mutação p.G2019S em relação ao

fenótipo da DP, realizamos a triagem desta mutação em alguns membros

da família PAR1306. A penetrância foi calculada dividindo-se o número de

indivíduos com a mutação p.G2019S que manifestaram a doença pelo

número total de indivíduos com a mutação (afetados e não-afetados).

2.2.6 – Análise de haplótipo

Para determinar se os indivíduos carreadores da mutação

p.G2019S no gene LRRK2 compartilhavam um haplótipo comum, eles

foram genotipados para polimorfismos de nucleotídeo único (SNP - Single

Nucleotide Polymorphism) em cinco loci, através de PCR e seqüenciamento

automático (vide item 2.2.3.4). Os quatro SNPs exônicos analisados foram:

rs7966550 (exon 22), rs1427263 (exon 34), rs11176013 (exon 34) e

rs11564148 (exon 34), além do SNP intrônico rs28903073 (IVS13 +

104G/A).

3 – RESULTADOS

_________________________________________________________RESULTADOS

A análise molecular do gene LRRK2 foi realizada em 154

pacientes com DP idiopática (idade média 62,6 ± 11,1) (Tabela 5). A

idade de manifestação média da DP entre os pacientes avaliados foi de

54,0 ± 11,7 anos, variando de 14 a 83 anos. Dentre estes pacientes, 23

(15%) relataram história familiar da DP em parentes de 1º ou 2º graus

(idade média: 62,9 ± 10,0 anos/ idade de manifestação média da

doença: 54,5 ± 10,2); os outros 131 pacientes (85%) eram casos isolados

(idade média: 62,6 ± 11,3 / idade de manifestação média da doença:

54,0 ± 12,0). Cinqüenta e três pacientes manifestaram a DP antes dos

50 anos de idade, enquanto que 101 pacientes manifestaram a doença

após os 50 anos.

Tabela 5 – Resultados das análises moleculares do gene LRRK2 em 154 pacientes, de ambos os sexos, com DP

idiopática.

Nº

Registro do

paciente

Idade

(anos)

Idade de

manifestação da

Sexo

F/I *

EXON 41 EXON 31

1 PAR1142 64 55 M I Normal Normal

2 PAR1143 68 63 F I Normal Normal

3 PAR1144 69 65 M F Normal Normal

4 PAR1145 74 69 M I Normal Normal

5 PAR1146 79 73 M I Normal Normal

6 PAR1147 47 35 M I Normal Normal

7 PAR1148 48 42 M F Normal Normal

8 PAR1149 65 64 F I Normal Normal

9 PAR1152 74 70 M I Normal Normal

10 PAR1153 54 51 M I Normal Normal

11 PAR1154 70 66 M I Normal Normal

12 PAR1155 55 51 M I Normal Normal

13 PAR1156 56 52 M I Normal Normal

14 PAR1157 76 65 M I Normal Normal

15 PAR1158 64 60 M F Normal Normal

16 PAR1159 71 53 M I Normal Normal

17 PAR1160 68 58 M F Normal Normal

18 PAR1161 59 49 M I Normal Normal

19 PAR1162 64 47 M I Normal Normal

20 PAR1163 83 65 F I Normal Normal

21 PAR1164 64 57 M I Normal Normal

22 PAR1168 66 62 M I Normal Normal

Continua

Tabela 5 - Continuação

Nº

Registro do

paciente

Idade

(anos)

Idade de

manifestação da

Sexo

F/I *

EXON 41 EXON 31

23 PAR1169 74 71 M I Normal Normal

24 PAR1170 57 43 F I Normal Normal

25 PAR1171 65 55 M I Normal Normal

26 PAR1172 74 61 F I Normal Normal

27 PAR1173 62 44 F I Normal Normal

28 PAR1174 55 54 F F Normal Normal

29 PAR1175 75 71 M I Normal Normal

30 PAR1176 57 49 F I Normal Normal

31 PAR1177 77 55 M I Normal Normal

32 PAR1182 39 26 F I Normal Normal

33 PAR1183 58 44 F I Normal Normal

34 PAR1184 69 66 M I Normal Normal

35 PAR1185 62 50 M I Normal Normal

36 PAR1186 57 45 F I Normal Normal

37 PAR1190 55 54 F I Normal Normal

38 PAR1191 72 60 M I Normal Normal

39 PAR1192 69 50 M I Normal Normal

40 PAR1193 72 68 F I Normal Normal

41 PAR1194 72 67 F I Normal Normal

42 PAR1195 79 60 F I Normal Normal

43 PAR1196 47 40 F I Normal Normal

44 PAR1203 74 73 M F Normal Normal

Continua

Tabela 5 - Continuação

Nº

Registro do

paciente

Idade

(anos)

Idade de

manifestação da

Sexo

F/I *

EXON 41 EXON 31

45 PAR1208 63 52 F I Normal Normal

46 PAR1209 55 51 F F Normal Normal

47 PAR1210 62 57 M I Normal Normal

48 PAR1211 57 58 F I Normal Normal

49 PAR1218 55 45 F I Normal Normal

50 PAR1219 74 64 M I Normal Normal

51 PAR1220 85 73 M I Normal Normal

52 PAR1221 55 46 M I Normal Normal

53 PAR1223 78 74 M I Normal Normal

54 PAR1224 65 55 M I Normal Normal

55 PAR1229 56 43 M I Normal Normal

56 PAR1230 71 65 M I Normal Normal

57 PAR1231 66 56 M I Normal Normal

58 PAR1232 54 43 M I Normal Normal

59 PAR1247 48 46 F I Normal Normal

60 PAR1248 70 58 F I Normal Normal

61 PAR1263 67 66 M I Normal Normal

62 PAR1270 73 60 F F Normal Normal

63 PAR1280 67 59 M I Normal Normal

64 PAR1287 56 40 M I Normal Normal

65 PAR1288 66 59 F I Normal Normal

66 PAR1292 66 54 M F Normal Normal

Continua

Tabela 5 - Continuação

Nº

Registro do

paciente

Idade

(anos)

Idade de

manifestação da

Sexo

F/I *

EXON 41 EXON 31

67 PAR1293 53 48 F I Normal Normal

68 PAR1294 61 45 F I Normal Normal

69 PAR1295 77 68 M I Normal Normal

70 PAR1296 58 42 F I Normal Normal

71 PAR1297 57 43 M I Normal Normal

72 PAR1304 65 63 F I Normal Normal

73 PAR1305 38 36 F I Normal Normal

74 PAR1306 65 55 M F c.6055G>A Normal

75 PAR1307 54 44 M I Normal Normal

76 PAR1308 56 50 F I Normal Normal

77 PAR1314 72 69 F I Normal Normal

78 PAR1315 63 58 M F Normal Normal

79 PAR1319 64 48 M F Normal Normal

80 PAR1320 54 51 F I Normal Normal

81 PAR1321 50 40 F F Normal Normal

82 PAR1322 54 48 M I Normal Normal

83 PAR1323 54 47 F I Normal Normal

84 PAR1324 64 63 M I Normal Normal

85 PAR1325 67 64 M I Normal Normal

86 PAR1329 71 64 F I Normal Normal

87 PAR1330 33 31 M I Normal Normal

88 PAR1335 61 50 M I Normal Normal

Continua

Tabela 5 - Continuação

Nº

Registro do

paciente

Idade

(anos)

Idade de

manifestação da

Sexo

F/I *

EXON 41 EXON 31

89 PAR1344 56 52 M I Normal Normal

90 PAR1345 33 14 M I Normal Normal

91 PAR1355 64 48 M I Normal Normal

92 PAR1358 76 60 M I Normal Normal

93 PAR1359 59 53 M I Normal Normal

94 PAR1366 71 58 F I Normal Normal

95 PAR1375 64 57 M I Normal Normal

96 PAR1376 78 69 M I Normal Normal

97 PAR1377 48 38 F I Normal Normal

98 PAR1386 49 46 M I Normal Normal

99 PAR1394 43 38 F I Normal Normal

100 PAR1397 53 50 F I Normal Normal

101 PAR1398 67 53 F I c.6055G>A Normal

102 PAR1399 42 39 M I Normal Normal

103 PAR1401 43 37 F F Normal Normal

104 PAR1402 71 47 M I Normal Normal

105 PAR1404 62 48 M I Normal Normal

106 PAR1405 38 35 F I Normal Normal

107 PAR1406 77 69 M I Normal Normal

108 PAR1407 58 43 M I Normal Normal

109 PAR1408 66 60 M F Normal Normal

110 PAR1409 47 33 M I Normal Normal

Continua

Tabela 5 - Continuação

Nº

Registro do

paciente

Idade

(anos)

Idade de

manifestação da

Sexo

F/I *

EXON 41 EXON 31

111 PAR1410 82 72 F I Normal Normal

112 PAR1420 72 57 M I Normal Normal

113 PAR1426 68 67 M I Normal Normal

114 PAR1427 63 57 M I Normal Normal

115 PAR1428 71 70 M F Normal Normal

116 PAR1435 79 78 M I Normal Normal

117 PAR1436 41 35 M I Normal Normal

118 PAR1437 71 62 M I Normal Normal

119 PAR1438 42 37 M I Normal Normal

120 PAR1440 69 59 M I Normal Normal

121 PAR1441 62 50 M I Normal Normal

122 PAR1442 43 38 M F Normal Normal

123 PAR1443 61 44 F I Normal Normal

124 PAR1444 69 53 F I Normal Normal

125 PAR1445 70 66 M F Normal Normal

126 PAR1447 57 52 M I Normal Normal

127 PAR1448 58 52 M I Normal Normal

128 PAR1449 74 70 F I Normal Normal

129 PAR1450 34 26 F I Normal Normal

130 PAR1451 68 55 F I Normal Normal

131 PAR1452 64 47 M I Normal Normal

132 PAR1453 48 36 M I Normal Normal

Continua

Tabela 5 - Continuação

Nº

Registro do

paciente

Idade

(anos)

Idade de

manifestação da

Sexo

F/I *

EXON 41 EXON 31

133 PAR1454 61 57 M I Normal Normal

134 PAR1455 57 47 M F c.6055G>A Normal

135 PAR1456 70 43 F F Normal Normal

136 PAR1457 80 50 M F Normal Normal

137 PAR1458 59 45 F I Normal Normal

138 PAR1459 46 42 M I Normal Normal

139 PAR1460 60 42 M I Normal Normal

140 PAR1461 71 59 M I Normal Normal

141 PAR1462 59 53 M I Normal Normal

142 PAR1463 53 46 F I Normal Normal

143 PAR1464 74 67 M I Normal Normal

144 PAR1493 74 69 M I Normal Normal

145 PAR1494 64 63 M I Normal Normal

146 PAR1495 61 52 F I Normal Normal

147 PAR1499 77 68 M I Normal Normal

148 PAR1503 76 72 M I Normal Normal

149 PAR1504 70 60 F I Normal Normal

150 PAR1510 73 71 M I Normal Normal

151 PAR1511 71 65 F F Normal Normal

152 PAR1512 54 50 M I Normal Normal

153 PAR1602 61 59 M F Normal Normal

154 PAR1613 86 83 M I Normal Normal

* F/I: F – casos familiares da DP; I – casos isolados da DP.

_________________________________________________________RESULTADOS

Dentre os 154 indivíduos analisados foram identificados três

pacientes (PAR1306, PAR1398 e PAR1455) (1,95%) portadores da

mutação c.6055G>A (p.G2019S) em heterozigose (Figura 6 e 7), sendo

dois casos familiares e um isolado (Tabela 5). Não foram detectados

indivíduos homozigotos para a mutação p.G2019S e nenhuma alteração

foi encontrada no exon 31 do gene LRRK2.

Figura 6: Eletroferogramas gerados pelo seqüenciamento do produto da

PCR. A) Seqüência selvagem do gene LRRK2. B) Variante c.6055G>A

encontrada no paciente PAR1306. Esta mesma alteração foi encontrada

nos pacientes PAR1398 e PAR1455.

_________________________________________________________RESULTADOS

Figura 7 – Gel da digestão dos produtos da PCR (exon 41 do gene

LRRK2) com a enzima SfcI. Linha 1: Padrão de peso molecular 1 kb DNA

ladder; linhas 2, 3, 5 e 6: Pacientes sem a mutação c.6055G>A

(p.G2019S); linha 4: Paciente com a mutação p.G2019S no gene LRRK2.

Para fins comparativos, a mutação p.G2019S foi triada e se

mostrou ausente em 250 cromossomos controles de voluntários

brasileiros sadios da mesma região geográfica (100 mulheres e 25

homens; faixa etária: 51 a 84 anos; média 64,0 ± 7,9 anos) sem sinais

de DP ou de qualquer outra doença neurodegenerativa e sem história

familiar de parkinsonismo entre parentes de primeiro e segundo grau.

_________________________________________________________RESULTADOS

As características clínicas dos pacientes com a mutação

p.G2019S estão resumidas na Tabela 6. Os três probandos são

brasileiros e exibem sinais típicos da DP clássica, com idades de

manifestação variando de 47 a 55 anos. Em todos os pacientes a

manifestação dos sintomas ocorreu de forma assimétrica e, em dois

deles (PAR1398 e PAR1455), a bradicinesia foi o primeiro sintoma

manifestado, enquanto rigidez foi o primeiro sintoma observado no

paciente PAR1306. Disfunção autonômica e distúrbios psiquiátricos ou

cognitivos não foram observados e todos apresentavam uma boa

resposta terapêutica ao tratamento com levodopa. Os sintomas clínicos

apresentados por eles foram indistinguíveis dos observados no grupo de

pacientes sem mutações no gene LRRK2, como citado em outros

estudos (Gilks et al., 2005; Kachergus et al., 2005; Goldwurm et al.,

2006; Kay et al., 2006; Ferreira et al., 2007).

_________________________________________________________RESULTADOS

Tabela 6 – Características clínicas dos pacientes com a mutação p.G2019S em

heterozigose.

PAR1306 PAR1398 PAR1455

História familiar da DP + - +

Consangüinidade - - -

Sexo * M F M

Nacionalidade Brasileira Brasileira Brasileira

Ancestralidade Mista Mista Mista

Idade (anos) 65 67 57

Idade de manifestação (anos) 55 53 47

Bradicinesia + 1

sintoma 1

sintoma

Tremor de repouso + + +

Rigidez 1

sintoma + +

Instabilidade postural + + +

Assimetria de manifestação + + +

Distonia - - -

Anormalidades

comportamentais

- - -

Resposta ao levodopa + + +

Declínio cognitivo - - -

* Sexo: M- masculino; F- feminino

_________________________________________________________RESULTADOS

O paciente PAR1306 possui 65 anos e manifestou a doença aos

55 anos de idade, sendo a rigidez muscular o primeiro sintoma da

doença. Este indivíduo tem uma história familiar positiva da DP (Figura

8), com uma irmã e uma prima materna, já falecidas, acometidas pela

doença.

Figura 8: Heredograma da família do probando PAR1306 (indicado pela seta).

IM – idade de manifestação da DP; + - indivíduos positivos para a mutação p.G2019S; - - indivíduos negativos para a

mutação p.G2019S.

____________________________________________________________RESULTADOS

Os pais do probando PAR1306 (indivíduos I.1 e I.2) (Figura 8)

morreram com 62 e 89 anos, respectivamente, sem nenhum sinal ou

sintoma da doença. A irmã do paciente (II.7) exibiu sintomas consistentes

com a DP durante 19 anos antes de sua morte aos 69 anos, e a prima

materna do probando (II.20) também faleceu aos 73 anos com sintomas

típicos da DP. Além do probando, foi realizada a análise molecular em 6 de

seus irmãos (II.2, II.8, II.9, II.10, II.11, II.14) e a mutação p.G2019S

também foi encontrada em heterozigose em três deles: II.9, II.10 e II.11

(Figura 8 e Tabela 7). Na avaliação clínica dos irmãos do probando, o

indivíduo II.9 (70 anos) mostrou sinais de parkinsonismo (tremor de

repouso e bradicinesia, ambos com manifestação assimétrica) e os outros

dois irmãos (II.10, 68 anos; II.11, 67 anos) permanecem assintomáticos.

Tabela 7 – Análise da mutação p.G2019S no gene LRRK2 em sete familiares de

dois pacientes com esta alteração.

Registro do Familiar Idade (anos) Sexo EXON 41

1306A (II.9) 70 M c.6055G>A

1306B (II.10) 68 M c.6055G>A

1306C (II.11) 67 M c.6055G>A

1306D (II.2) 79 M Normal

1306E (II.8) 72 M Normal

1306F (II.14) 60 M Normal

1398A* 26 M Normal

* não está representado no heredograma da figura 9.

____________________________________________________________RESULTADOS

A paciente PAR1398, um caso isolado da doença, é uma mulher de

67 anos que manifestou a DP há 14 anos, sendo seu primeiro sintoma a

bradicinesia. Seu pai faleceu aos 70 anos e sua mãe está com 85 anos de

idade, ambos sem sinais de parkinsonismo. Seus cinco irmãos são

indivíduos saudáveis (Figura 9). Um de seus filhos (1398A, de 26 anos)

(Tabela 7) manifestou o desejo de participar da triagem da mutação

p.G2019S, não tendo sido identificada a alteração em seu DNA. Não foi

possível coletar o sangue de outros membros desta família.

Figura 9 – Heredograma da família da paciente PAR1398 (seta). IM – idade de

manifestação da DP; + - indivíduo positivo para a mutação p.G2019S; m - meses.

O paciente PAR1455 é do sexo masculino, tem 57 anos e

manifestou bradicinesia aos 47 anos de idade, um caso típico de início

prematuro da DP. Ele possui história familiar, pois relata que sua mãe, já

falecida, também apresentava DP (Figura 10), entretanto, não foi possível

obter maiores informações sobre a evolução da doença na mãe do

____________________________________________________________RESULTADOS

probando. Até o momento, não foi possível a realização das análises

moleculares em outros membros desta genealogia.

A análise de segregação da mutação p.G2019S realizada em

alguns membros da família PAR1306, incluindo a irmã falecida do

probando que tinha DP, revelou uma penetrância de 60% (3/5). Neste

cálculo, consideramos essa irmã falecida como uma provável portadora da

mutação p.G2019S.

Figura 10 - Heredograma da família do paciente PAR1455 (seta). IM – idade de

manifestação da DP; + - indivíduo positivo para a mutação p.G2019S.

A análise de SNPs (Tabela 8a) do gene LRRK2 em indivíduos com a

mutação p.G2019S mostrou que todos são carreadores heterozigotos da

variante IVS13 + 104G/A (SNP rs28903073), que está em desequilíbrio de

ligação com a p.G2019S (Goldwurm et al., 2005). Para o marcador

rs7966550, a maioria dos carreadores da mutação p.G2019S são

homozigotos (T/T), com exceção da paciente PAR1398 que é heterozigota

____________________________________________________________RESULTADOS

(T/C). Em relação aos SNPs rs1427263 e rs11176013 todos os indivíduos

da família 1306 analisados apresentam os mesmos alelos em homozigose:

A/A e G/G, respectivamente. Já os pacientes PAR1398 e PAR1455 são

heterozigotos para esses loci (A/C e G/A, respectivamente). A genotipagem

do marcador rs11564148 revelou que os indivíduos da família 1306 com a

mutação p.G2019S compartilham os mesmos alelos A/A neste locus mas

os outros dois pacientes são heterozigotos A/T. Esses resultados apontam

para a existência de um haplótipo mínimo comum (T-A-G-A-A) entre os

pacientes com a mutação p.G2019S delineado através da análise de cinco

marcadores mostrados na Tabela 8a, incluindo 4 SNPs exônicos e um

intrônico (rs28903073). Estes achados sugerem fortemente que o alelo

mutante p.G2019S nestes pacientes possui uma mesma origem.

Tabela 8a – Alelos de marcadores do cromossomo 12q12 em indivíduos com a

mutação p.G2019S no gene LRRK2.

Famílias

Marcador 1306

1306A

1306B

1306C

1398 1455

rs7966550 T T T T T/C T

rs1427263 A A A A A/C A/C

rs11176013 G G G G G/A G/A

rs11564148 A A A A A/T A/T

rs28903073 A/G A/G A/G A/G A/G A/G

correspondem aos indivíduos II.9 (1306A), II.10 (1306B) e II.11 (1306C).

____________________________________________________________RESULTADOS

Para fins comparativos, foram genotipados também três indivíduos

controles, sem a mutação p.G2019S, sendo dois irmãos do probando

PAR1306 (1306D e 1306E) e o filho da paciente PAR1398 (1398A) (Tabela

8b).

Tabela 8b – Alelos de marcadores do cromossomo 12q12 em familiares, sem a

mutação p.G2019S no gene LRRK2, de pacientes com DP.

Famílias

Marcador 1306D 1306E 1398A

rs7966550 T T T/C

rs1427263 A A A/C

rs11176013 G G G/A

rs11564148 A/T A/T A/T

rs28903073 G G G

Em relação aos SNPs avaliados o único marcador que foi

esclarecedor em relação à origem ancestral foi o SNP intrônico

rs28903073,

pois os três familiares sem a mutação p.G2019S analisados

possuem os dois alelos selvagens (G). Os indivíduos 1306D e 1306E

seguem o mesmo padrão alélico de seu irmão (PAR1306) para os

marcadores rs7966550, rs1427263 e rs11176013, mas diferem quanto ao

SNP rs11564148 por serem heterozigotos A/T. O indivíduo 1398A possui

____________________________________________________________RESULTADOS

os mesmos alelos que sua mãe (PAR1398) em todos os loci exônicos

analisados.

4 – DISCUSSÃO

______________________________________________________________DISCUSSÃO

Este foi o primeiro estudo brasileiro sobre rastreamento de

mutações nos exons 31 e 41 do gene LRRK2 em uma população com DP

oriunda do Estado do Rio de Janeiro. Foram encontrados, em nossa série,

três pacientes heterozigotos para a mutação c.6055G>A (p.G2019S) no

exon 41 do gene LRRK2 (probandos PAR1306, PAR1398 e PAR1455),

sendo dois casos familiares e um caso isolado, o que representa

aproximadamente 2% da amostra analisada (Tabela 5). Nossos achados

são consistentes com àqueles relatados em grandes séries de pacientes da

Itália (1,7%) (Goldwurm et al., 2006) e dos Estados Unidos (1,3%) (Kay et

al., 2006), sendo também similares aos encontrados na população chilena

(3%) (Perez-Pastene et al., 2007).

Devemos levar em consideração que estudos epidemiológicos sobre

freqüência da mutação p.G2019S entre indivíduos com DP no Brasil são

escassos. Por isso, não temos como inferir se a freqüência encontrada

neste estudo é representativa da população brasileira ou, até mesmo, da

região sudeste. Considerando que o único estudo epidemiológico brasileiro

que se tem conhecimento é o de Munhoz e colaboradores (2008), podemos

deduzir que a freqüência da mutação p.G2019S encontrada em nossa

população do Rio de Janeiro (~2%) é semelhante à prevalência desta

alteração encontrada na população do Paraná (3,5%).

Dentro de um país com proporções continentais, como o Brasil, a

composição populacional varia amplamente entre as regiões. De fato a

população brasileira é considerada uma das mais heterogêneas do mundo,

sendo resultado de cinco séculos de cruzamentos interétnicos entre povos

______________________________________________________________DISCUSSÃO

de três continentes: europeus, africanos e ameríndios (Parra et al., 2003).

Na chegada da frota lusitana ao Brasil, em 1500, os portugueses

encontraram aproximadamente 2,5 milhões de índios habitando as terras

brasileiras (Ribeiro, 1995). A miscigenação entre portugueses e indígenas

começou imediatamente após a chegada dos primeiros colonizadores. Mais

tarde, essa mistura serviu como estratégia para o aumento populacional e

para a ocupação do território nacional (Mörner, 1967). Escravos africanos

chegaram ao Brasil, em meados do século XVI, para trabalhar nas

lavouras de cana-de-açúcar, no cultivo do café e na exploração de ouro e

diamantes. Estima-se que, entre 1551 e 1850 (quando foi abolido o

comércio escravo), 3,5 milhões de africanos foram trazidos para o

território brasileiro (Klein, 2002). Neste mesmo período, com a imigração

européia, aproximadamente 500.000 portugueses chegaram ao país

(Ribeiro, 1995). Posteriormente, com a abertura dos portos brasileiros, o

Brasil recebeu mais 4 milhões de imigrantes de todas as partes do mundo.

Os portugueses mantiveram-se como a origem mais importante da

mistura do nosso povo, seguido por italianos, espanhóis e alemães

(Pimenta et al., 2006). Assim, é de extrema importância verificar a

freqüência de mutações no gene LRRK2 em diferentes regiões brasileiras,

já que ocorre uma predominância de ameríndios na região amazônica

(norte), uma preponderância de linhagens africanas no nordeste do país,

um equilíbrio no sudeste e uma dominância européia no sul (Parra et al.,

2003). Deste modo, estudos adicionais de todo o gene LRRK2 em uma

______________________________________________________________DISCUSSÃO

série maior de pacientes, incluindo indivíduos de outros estados do Brasil,

são necessários para verificarmos a dispersão geográfica da p.G2019S.

Chama atenção, entretanto, que apesar da forte ancestralidade

portuguesa da população brasileira, a prevalência da mutação p.G2019S

seja três vezes menor do que aquela encontrada entre pacientes

portugueses com DP (~6%) (Bras et al., 2005; Ferreira et al., 2007). Em

alguns estudos, conduzidos em populações da Espanha e em Judeus

Ashkenazi, foi encontrada uma freqüência ainda maior da mutação

p.G2019S, variando de 4,3% a 18,3% (Gaig et al., 2006; Infante et al.,

2006; Ozelius et al., 2006).

Tem sido verificada uma alta freqüência da mutação p.G2019S em

casos com história familiar da DP (6,4-29,7%) em comparação com casos

isolados da doença (3,4-13,3%) (Gaig et al., 2006; Infante et al., 2006;

Ozelius et al., 2006). Em nosso estudo, encontramos esta mutação em

uma freqüência aproximadamente onze vezes maior entre os casos

familiares (8,70% - 2/23) comparada à incidência entre os casos isolados

da DP (0,76% - 1/131).

Em nossa casuística, não encontramos mutações no exon 31 do

gene LRRK2, de forma semelhante ao encontrado pela maioria dos estudos

populacionais (Farrer et al., 2005; Cossu et al., 2007; Perez-Pastene et al.,

2007; Bras et al., 2008). Diferentemente, Paisán-Ruíz e colaboradores

(2004) identificaram a variante p.R1441G em 8% dos pacientes com DP de

início tardio na população basca do norte da Espanha. Na região vizinha,

em Astúrias, foi encontrada uma freqüência mais baixa para esta

______________________________________________________________DISCUSSÃO

alteração (2,7%) em casos esporádicos da doença (Mata et al., 2005a). A

outra mutação também comum neste resíduo da proteína (p.R1441C) foi

encontrada em uma prevalência de 3,4% em um estudo que avaliou 60

famílias com DP predominantemente italianas (Di Fonzo et al., 2006a).

A ausência de mutações no exon 31, especialmente da variante

patogênica p.R1441G, na nossa população e em muitas outras indica que

essa mutação está geograficamente restrita às regiões do norte da

Espanha (Gaig et al., 2006; Mata et al., 2005a; Paisan-Ruiz et al., 2004),

possivelmente devido a um evento mutacional mais recente ocorrido na

população basca, que é um grupo étnico relativamente homogêneo e

historicamente isolado (Gaig et al., 2006). Além disso, a inexistência de

outras mutações no exon 41 do gene LRRK2 em nossa amostra sugere

também que demais alterações não são tão prevalentes neste exon quanto

a p.G2019S, corroborando dados de outros estudos (Zimprich et al., 2004;

Goldwurm et al., 2005).

Entretanto, nós não podemos excluir totalmente a possibilidade de

que estes pacientes sejam portadores de outras mutações, uma vez que a

análise molecular não foi realizada em toda a extensão do gene LRRK2.

Recentemente, Nichols e colaboradores (2007) investigaram regiões ainda

não exploradas deste gene em uma amostra de 430 pacientes com DP sem

a mutação p.G2019S e identificaram novas variantes gênicas,

potencialmente patogênicas, incluindo duas na região N-terminal, na qual

nenhuma mutação tinha sido até então identificada.

______________________________________________________________DISCUSSÃO

Com relação aos três pacientes portadores da mutação p.G2019S

encontrados em nossa amostra, verificamos que todos apresentam um

fenótipo indistinguível daqueles pacientes com DP sem mutações no gene

LRRK2 (Tabela 6), o que está de acordo com relatos da literatura (Khan et

al., 2005; Munhoz et al., 2008). De maneira semelhante, Munhoz e

colaboradores (2008) identificaram três pacientes com DP portadores da

mutação p.G2019S, cujos sintomas clínicos, assim como os de nossos

pacientes, manifestaram-se de forma assimétrica, além de todos

responderem bem ao tratamento com levodopa.

A análise de segregação da mutação p.G2019S na família

PAR1306 revelou outro importante achado em nosso estudo: a

identificação da mutação p.G2019S em heterozigose em três irmãos

saudáveis do probando PAR1306, com 70, 68 e 67 anos de idade. Na

análise clínica dos irmãos, um deles (o de 70 anos) demonstrou sinais

iniciais de parkinsonismo, sendo os outros dois irmãos assintomáticos.

Estes achados sugerem uma penetrância da mutação p.G2019S de 60%

(3/5), resultado este que se assemelha aos descritos na literatura, como

os de Kachergus e colaboradores (2005) e o de Lesage e colaboradores

(2005), que encontraram valores mais altos de penetrância.

Como incluímos em nosso cálculo da penetrância a irmã afetada

do probando e a consideramos como sendo portadora da mutação

p.G2019S, encontramos um valor de 60%. Se a excluíssemos do cálculo,

encontraríamos uma penetrância de 50% (2/4), mais próxima de

estimativas recentes (Clark et al., 2006; Ozelius et al., 2006; Goldwurm et

______________________________________________________________DISCUSSÃO

al., 2007). Seria necessário avaliar outros membros desta genealogia e das

outras famílias nas quais a mutação p.G2019S foi encontrada para se ter

um cálculo mais fidedigno da penetrância desta variante em nossa

casuística.

Os dois indivíduos da família PAR1306, portadores da mutação

p.G2019S, que não manifestam sinais clínicos de parkinsonismo,

permanecem sob risco de desenvolver a DP, considerando que nenhum

deles atingiu a idade máxima de manifestação da doença. A presença da

p.G2019S em indivíduos de risco assintomáticos deve ser interpretada

com cuidado, pois além da penetrância incompleta das mutações em

LRRK2 ocorre uma variabilidade nas idades de manifestação (Kachergus et

al., 2005).

Desta forma, ainda não é possível fornecer um risco preciso de

desenvolvimento da doença para portadores assintomáticos de mutações

neste gene (Foroud, 2005). Alguns estudos identificaram portadores da

mutação p.G2019S com idade superior a 75 anos sem nenhum sinal de

parkinsonismo (Gaig et al., 2006; Cossu et al., 2007; Goldwurm et al.,

2007). Em 2006, Gaig e colaboradores reportaram o caso da mãe de um

paciente com DP, portadora da mutação p.G2019S, que tinha 91 anos e

permanecia sem nenhum sinal ou sintoma de parkinsonismo. Kachergus

e colaboradores (2005) encontraram dois indivíduos portadores desta

variante, pertencentes a uma mesma família, os quais manifestaram

sintomas iniciais da doença aos 39 e 78 anos de idade. Penetrância

reduzida associada à idade e variabilidade fenotípica são características de

______________________________________________________________DISCUSSÃO

vários genes de susceptibilidade à DP (Di Fonzo et al., 2005; Kachergus et

al., 2005; Bonifati, 2007), inclusive o LRRK2.

Uma penetrância incompleta dependente da idade já havia sido

sugerida para a mutação p.G2019S em estudos anteriores (Kachergus et

al., 2005; Clark et al., 2006; Di Fonzo et al., 2006a; Ozelius et al., 2006;

Goldwurm et al., 2007). Em estudos iniciais, nos quais foram calculadas a

penetrância da mutação p.G2019S, foram encontrados valores altos de

penetrância: 17% aos 50 anos e 85% aos 70 anos (Kachergus et al., 2005),

e 33% aos 55 anos e 100% aos 75 anos (Lesage et al., 2005a). Entretanto,

os pacientes estudados eram selecionados de séries familiares

autossômicas dominantes e os probandos eram incluídos na análise.

Estimativas recentes sobre a penetrância da mutação p.G2019S ao longo

da vida, utilizando-se novos métodos de cálculo, forneceram valores que

variam entre 24 e 33% (Clark et al., 2006; Ozelius et al., 2006; Goldwurm

et al., 2007). Vários fatores podem ter contribuído para uma baixa

estimativa da penetrância: os probandos foram escolhidos sem o

conhecimento da história familiar de DP; famílias de “alto risco” não foram

selecionadas para o estudo; não foram observados portadores homozigotos

nos probandos e seus parentes foram estimados ser portadores

heterozigotos devido à baixa freqüência populacional da mutação

p.G2019S (Clark et al., 2006).

Através da análise genotípica de cinco SNPs localizados no gene

LRRK2 (Tabela 7) identificamos um haplótipo mínimo (T-A-G-A-A)

compartilhado pelos indivíduos portadores da mutação p.G2019S. Nossos

______________________________________________________________DISCUSSÃO

resultados corroboram os dados da literatura (Kachergus et al., 2005;

Lesage et al., 2005b) que encontraram o mesmo haplótipo e sugerem

fortemente que o alelo mutante p.G2019S tem uma mesma origem.

A mutação p.G2019S foi primeiramente associada ao mesmo

haplótipo em diferentes populações, indicando a existência de um efeito

fundador comum (Kachergus et al., 2005; Lesage et al., 2005b; Goldwurm

et al., 2006). Dados de cinco estudos com 90 portadores da mutação

p.G2019S não-aparentados, de origem européia ou do norte da África,

revelou que todos compartilhavam o mesmo haplótipo mínimo (T-254-A-

G-A-154), consistente com um efeito fundador comum (Goldwurm et al.,

2005; Kachergus et al., 2005; Lesage et al., 2005b; 2006; Ozelius et al.,

2006). Mais recentemente, no entanto, foi verificada a existência de outros

dois haplótipos, um em pacientes de origem japonesa (294-C-G-T-252-T-

C-A-T-G-154-T-140) (Zabetian et al., 2006b) e outro em pacientes

europeus (188-181-249-291-C-G-216-T-254-C-A-G-A-T-A-G-G-154-G-C-138-248-

323-211) (Zabetian et al., 2006a). Estes achados evidenciam que os

processos genéticos e demográficos que moldaram a distribuição da

mutação p.G2019S ao redor do mundo são muito mais complexos do que

os anteriormente descritos.

Desde a descrição do primeiro gene envolvido na etiologia da DP

(Polymeropoulos et al., 1997) novas descobertas sobre a fisiopatologia

desta desordem têm sido feitas, resultando em um maior conhecimento

sobre os mecanismos moleculares associados à doença. A compreensão

das funções biológicas da proteína LRRK2 e de sua função nas células

______________________________________________________________DISCUSSÃO

neuronais são importantes para o desenvolvimento de novas estratégias

terapêuticas para a DP que possam resultar em uma melhor qualidade de

vida para os pacientes (Klein, 2006).

5 – CONCLUSÃO

_____________________________________________________________CONCLUSÃO

¾ Na população estudada, a única mutação encontrada foi a p.G2019S

nos exons 31 e 41 do gene LRRK2, com uma prevalência de ~2%. A

freqüência da mutação p.G2019S foi onze vezes maior entre os casos

familiares (8,70%) comparada à incidência entre os casos isolados da

DP (0,76%);

¾ Os pacientes com DP portadores da mutação p.G2019S no gene

LRRK2 exibem o mesmo fenótipo que os pacientes que não possuem

mutações em LRRK2;

¾ A penetrância da mutação p.G2019S foi incompleta e estimada em

60%.

¾ Identificamos um haplótipo mínimo (T-A-G-A-A) compartilhado pelos

indivíduos portadores da mutação p.G2019S, o que sugere fortemente

que o alelo mutante p.G2019S tem uma mesma origem;

¾ Nossos resultados acrescentam novos conhecimentos sobre a

prevalência da mutação p.G2019S em relação à DP na América Latina

e, em particular, na população brasileira.

6 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Neuroscience Letters 433 (2008) 17–21

A study of LRRK2 mutations and Parkinson’s disease in Brazil

arcia Mattos Gonc¸alves Pimentel

a,∗

, Karla Cristina Vasconcelos Moura

audia Bueno Abdalla

,Jo

ao Santos Pereira

, Ana L

ucia Zuma de Rosso

Denise Hack Nicaretta

b,d

ario Campos Junior

, Richard Morais de Almeida

Jussara Mendonc¸a dos Santos

, Izabel Cristina Constantino Bastos

Maria Filomena Xavier Mendes

, Henryk Maultasch

, Flavio Henrique de Rezende Costa

Ant

onio Luiz dos Santos Werneck

ıntia Barros Santos-Rebouc¸as

Servi¸co de Gen´etica Humana, Departamento de Biologia Celular e Gen´etica, Instituto de Biologia Roberto Alcˆantara Gomes, Universidade do

Estado do Rio de Janeiro, Rua S˜ao Francisco Xavier, 524, PHLC – sala 500, Maracan˜a 20550-013, Rio de Janeiro, RJ, Brazil

Faculdade de Ciˆencias M´edicas, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil

Hospital Universit´ario Clementino Fraga Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil

Santa Casa de Miseric´ordia do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil

Instituto de Neurologia Deolindo Couto, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil

Received 22 October 2007; received in revised form 12 December 2007; accepted 14 December 2007

Abstract

Mutations in the Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) gene are known as a common cause of Parkinson’s disease (PD) among patients from

different geographic origins. In this study, we evaluated the prevalence of LRRK2 mutations in exons 31 and 41 in a cohort of 154 consecutive,

unrelated Brazilian patients with familial or sporadic PD, including early and late onset patients. The LRRK2 p.G2019S mutation was present

in heterozygous state in three index cases (∼2%), and in three additional relatives. No carriers of this mutation were found among 250 control

chromosomes. Clinically, all mutation-positive patients presented a typical PD phenotype and a good response to levodopa. Mutation segregation

analysis in a large sibling showed incomplete penetrance of the p.G2019S. Our ﬁndings suggest that the LRRK2 p.G2019S mutation has a substantial

contribution to PD susceptibility among Brazilian population and add new clues to current research of this disease.

Keywords: Parkinson’s disease; Leucine-rich repeat kinase 2; LRRK2; p.G2019S mutation; Dardarin

Parkinson’s disease (PD) is a complex neurodegenerative move-

ment disorder characterized by bradykinesia, resting tremor,

rigidity and postural instability [25]. Its pathological features

include selective loss of dopaminergic neurons in the substantia

nigra pars compacta and the presence of intracellular inclusions

(Lewy bodies) in the surviving neurons [28].

Although the causes of PD remain mostly unknown, cur-

rent evidences shown that mitochondrial dysfunction, oxidative

stress and protein mishandling have a central role in PD

pathogenesis, and also reinforce that important genetic factors

are associated to pathological processes underlying the dis-

ease [1]. The study of monogenic forms of PD has given an

∗

Corresponding author. Tel.: +55 21 25877567; fax: +55 21 25877377.

E-mail address: [email protected] (M.M.G. Pimentel).

important contribution to the understanding of the molecular

pathways associated to neurodegeneration, and has also pro-

vided novel therapeutic targets [2,9,26]. PD-related mutations

were identiﬁed in α-synuclein (SNCA) [36], parkin [22], DJ-

1 [3], PTEN-induced kinase 1 (PINK1) [38] and Leucine-rich

repeat kinase 2 (LRRK2) [32,41] genes. Dominant single muta-

tions in the LRRK2 gene are associated with parkinsonism that

is clinically indistinguishable from typical, idiopathic late-onset

PD [6,7,12,32,37,41].

LRRK2 mutations as cause of PD are frequent and spread

through different populations. However, the prevalence of

LRRK2 missense mutations identiﬁed in familial and sporadic

cases varies greatly between distinct populations, and some of

them (p.R1441C, p.R1441G, p.I2012T, p.G2019S, p.I2020T),

encoded by exons 31 and 41, account for a number of PD cases

[7,27,32,41]. Among these pathogenic amino-acid substitutions,

doi:10.1016/j.neulet.2007.12.033

18 M.M.G. Pimentel et al. / Neuroscience Letters 433 (2008) 17–21

the p.G2019S, resulting from c.6055G>A transition, is particu-

larly a common cause of the disease in patient cohorts of different

ethnic origins [37]. The LRRK2 p.G2019S mutation is an impor-

tant genetic determinant of PD among Arab patients from North

Africa [23,24], Ashkenazi Jews [31], Europeans [6,12,15] and

North Americans [21,29]. Current evidence indicates Iberian

populations from Portugal [4,10] and Spain [19] among those

with the highest prevalence of the p.G2019S mutation worldwide

(overall prevalence 2.2–7.6%), after the North African Arabs

(39%) [23,24] and Ashkenazi Jews (18.3%) [31]. An exten-

sive study using genetic markers conﬁrmed the founder event

of p.G2019S mutation and showed that the genetic and demo-

graphic processes that have shaped the current distribution of

p.G2019S across the world are more complex than previously

recognized [39].

The LRRK2 gene encodes a complex protein with multiple

domains, also known as dardarin [32,41], whose biological func-

tion is unknown, but there is evidence that it is cytoplasmic,

associated with mitochondria, and capable of autophospho-

rylation [13]. It is not clear how mutations in dardarin lead

to neurodegeneration, however, evidence demonstrates toxic

effects of mutant protein when expressed within target cells,

leading to formation of intraneuronal protein aggregations and

cell death [17].

It is clearly established that LRRK2 mutations cause PD in

many geographical areas and ethnic groups, and that their preva-

lence in familial and sporadic cases varies greatly across nations.

In this sense, data about the frequency of LRRK2 mutations in

Latin America countries are scarce [34], and in Brazil the preva-

lence of these mutations remained undeﬁned until now. Brazilian

population, as a whole, is formed by extensive admixture, result-

ing from interethnic crosses between Europeans, Amerindians

and Africans, and, among European ancestry, Portugal remained

by far the most important source, followed by Italy, Spain, and

Germany [33,35]. In this study, we looked for mutations in exons

41 and 31 of LRRK2 gene among Brazilian PD patients.

We screened 154 consecutive, unrelated patients with PD

(100 males and 54 females), ranging from 33 to 86 years (mean

62.6 ± 11.1 years). Sixty-six percent of them had typical late

onset PD (≥50 years) and the remaining expressed the dis-

ease before 50 years (early onset); the mean age at onset was

54.0 ± 11.7 years (range 14–83). Excepted for seven Portuguese

index cases (4.5%), all patients were Brazilian. All probands

live in the urban area of Rio de Janeiro, located in Southeast-

ern Brazil, and were recruited from the movement disorders

clinics of four major institutions of Rio de Janeiro State (Pedro

Ernesto University Hospital, Clementino Fraga Filho University

Hospital, Deolindo Couto Neurology Institute and Santa Casa

de Miseric

ordia). The patients were examined by neurologists

specialized in movement disorders, through the use of a stan-

dard protocol, and fulﬁlled criteria established for the clinical

diagnosis of PD [18]. Cases of secondary and atypical parkin-

sonism were excluded from the study. Family history and ethnic

background data were collected. Amongst patients, 23 (15%)

self-reported a family history of PD (mean age: 62.9 ± 10.0

years/mean age onset: 54.5 ± 10.2, range 37–73 years) and 131

(85%) were sporadic cases (mean age: 62.6 ± 11.3 years/mean

age onset: 54.0 ± 12.0, range 14–83 years). The proband’s

families were mostly of mixed ancestry (n = 136), Portuguese

(n = 12), Italian (n = 3), Spanish (n = 1), Polish (n = 1) and Swiss

descent (n = 1). The research protocol was approved by the insti-

tutional ethics committees, and written informed consent was

obtained from all subjects.

Genomic DNA was isolated from peripheral blood using stan-

dard procedures, and exons 31 and 41 of the LRRK2 gene were

ampliﬁed by PCR according to Di Fonzo et al. [6]. Puriﬁed

amplicons were sequenced in both directions using Big Dye Ter-

minator Kit (Applied Biosystems) and resolved on an ABI 3730

Genetic Analyzer automatic sequencer (Applied Biosystems),

following the manufacturer’s instructions.

Among the studied PD probands (male to female ratio

1.9:1.0), we identiﬁed three heterozygous carriers (PD1306,

PD1398 and PD1455) of the p.G2019S mutation (1.95%),

including 2 familial and 1 sporadic case. Homozygous-

p.G2019S individuals were not detected. For comparative

purposes, this mutation was screened and not found between

250 control chromosomes from healthy Brazilian volunteers

from the same population (25 males and 100 females), aged

from 51 to 84 years (mean 64.0 ± 7.9 years), without PD signs

or any other neurodegenerative disorder, and no family history

of parkinsonism among ﬁrst- and second-degree relatives. No

mutations along LRRK2 exon 31 were seen.

The clinical features of the three p.G2019S-positive index

cases are summarized in the table (Table 1). All are Brazilian

and exhibited typical signs of PD classical form, with onset

ages ranging from 47 to 55 years. The symptoms at onset

were asymmetrical in all cases, and, in two of them, bradyki-

nesia was the ﬁrst symptom at onset, whereas rigidity was

seen in the third. Autonomic dysfunction and cognitive or psy-

chiatric disturbances were not observed, and all presented a

good therapeutic response to levodopa. Their clinical symptoms

were indistinguishable from the remaining LRRK2 mutations-

Table 1

Clinical features summary of the three Brazilian PD index cases with heterozy-

gous LRRK2 p.G2019S mutation

Features Patient

PD1306 PD1398 PD1455

Family history for PD + − +

Consanguinity −−−

Sex M F M

Ethnic origin Brazilian Brazilian Brazilian

Ancestry Mixed Mixed Mixed

Age at examination (years) 65 67 57

Age at onset (years) 55 53 47

Bradykinesia + First symptom First symptom

Resting tremor + + +

Rigidity First symptom + +

Postural instability + + +

Asymmetry at onset + + +

Dystonia −−−

Behavioral abnormalities −−−

Levodopa response + + +

Cognitive decline −−−

Sex is speciﬁed as male (M) or female (F).

M.M.G. Pimentel et al. / Neuroscience Letters 433 (2008) 17–21 19

Fig. 1. Pedigree of family PD1306 with p.G2019S mutation. Full black symbols: individuals affected by Parkinson’s disease. Half solid square: individual with

signs of parkinsonism. Numbers bellow symbols denote age at examination or age of death (years); OA, onset age (years); (+) carriers of p.G1019S mutation; (−)

individuals without p.G2019S mutation.

negative group, as observed in other studies [10,12,15,20,21].

The patient PD1398 is a sporadic case. Her father died at age

of 71 years and her mother has 83 years, both without signs

of parkinsonism. All ﬁve proband’s siblings are healthy indi-

viduals. Two patients (PD1455 and PD1306) have a positive

family history for PD. The individual PD1455 expressed the

early-onset form of the disease and his died mother also had

PD, but detailed information is unavailable. Concerning family

PD1306 (see Fig. 1), relatives reports revealed that proband’s

parents (I.1 and I.2) died at ages of 62 and 89 years without any

symptoms of the disease and that one proband’s sister (subject

II.7) exhibited symptoms consistent with PD during 19 years

before her death at 69 years. Segregation analysis of p.G2019S

was performed in six available proband’s siblings (II.2, II.8, II.9,

II.10, II.11, II.14) and the mutation was found in a heterozygous

state in three of them (II.9, II.10 and II.11). On clinical evalu-

ation, the subject II.9 (70 years) showed signs of parkinsonism

(resting tremor and bradykinesia, both with asymetrical onset)

and subjects II.10 and II.11 (68 and 67 years) remain asymp-

tomatic, even having 13 and 12 years beyond the proband’s age

at onset. Based on these ﬁndings, it is likely that the sister of

patient PD1306 (subject II.7) also carried the p.G2019S muta-

tion, although phenocopies have previously been detected in

families with LRRK2 mutations [7,29,41].

Two mutation carriers of family PD1306 (subjects II.10 and

II.11, aged 68 and 67 years) have not manifested clinical signs of

parkinsonism, but they are still at risk of developing PD, consid-

ering that none of them had reached the maximum age of onset.

The presence of p.G2019S in asymptomatic at-risk persons

should be interpreted with caution and the PD risk assessment

for mutation carriers is currently difﬁcult, because of incomplete

penetrance of LRRK2 mutations and variability of onset ages,

both within and between families [11]. Several studies report

p.G2019S carriers over 73 years of age with no sign of parkinson-

ism [16,20,23]. Kachergus et al. [20] found two LRRK2 G2019S

carriers in a same family who presented PD initial symptoms at

39 and 78 years. Reduced age-associated penetrance and pheno-

type variability are characteristics of several PD susceptibility

genes, including LRRK2 mutations [2,6,20,23], which suggest

the existence of a complex interaction between genetic and/or

environmental factors in the disease manifestation. Recent esti-

mates of the lifetime penetrance of the p.G2019S mutation

yielded values between 24 and 33% [5,16,31]. In the present

study, molecular investigation of some at-risk members from

family PD1306 suggests a penetrance of 60% (3/5), but this esti-

mative should be reﬁned based on the analysis of other members

in the pedigrees.

Our ﬁndings represent signiﬁcant data about LRRK2 muta-

tions screening conducted in a representative series of Brazilian

PD patients and increase the knowledge of LRRK2 p.G2019S

mutation prevalence in Latin American population [34].Wehave

shown that this mutation is present in an overall frequency of

∼2%, being more prevalent amongst PD familial than sporadic

cases (8.7% vs. 0.76%). This prevalence is three times lower than

that found among Portuguese PD patients (∼6%) [4,10]. There-

fore, despite Brazilian population has a hallmark Portuguese

ancestry, our ﬁndings are more consistent with those reported

in large patient series from Italy (1.7% overall; 4.2% familial;

1% sporadic) [15] and United States (1.3% overall; 3% familial;

0.7% sporadic) [21]. Our results are also similar to those found

in Chilean population (3%) [34].

Brazil is a populous nation of Latin America and one of the

most heterogeneous populations in the world, as supported by

studies using ancestry-informative markers [35]. It is expected

that the number of Brazilian individuals with PD will double

over the next 25 years [8]. Using a screening strategy focused

on two hot spots for LRRK2 mutations, we have identiﬁed the

p.G2019S mutation in a signiﬁcant proportion of unrelated PD

patients from Southeastern Brazil. The absence of other muta-

tions in exons 31 and 41 of the LRRK2 gene indicates that these

mutations are not so prevalent than p.G2019S in our sample,

which corroborates data from other studies [14,41]. However,

we could not completely exclude the possibility that the patients

carry other mutations, because molecular analysis was not car-

ried out in whole LRRK2 gene. Recently, Nichols et al. [30]

performed a comprehensive study in a cohort of 430 PD families

without the p.G2019S mutation and identiﬁed novel, potentially

pathogenic variants in LRRK2, including two in the N-terminal

region of gene, where no pathogenic substitutions have been

reported.

It must be emphasized that, in countries of continental size,

such as Brazil, the population genetic background differ among

distinct regions [33,40], being the most pronounced levels of

admixture observed in the Southeastern region [33]. By this way,

additional studies of the entire gene on larger patient series from

other regions of our country are needed to verify the geographical

dispersion of p.G2019S and other tendencies. In conclusion, our

data point that LRRK2 p.G2019S has a substantial contribution

to PD susceptibility among Brazilian population, and add news

clues to PD current research.

20 M.M.G. Pimentel et al. / Neuroscience Letters 433 (2008) 17–21

Acknowledgments

We thank the patients, their families and healthy volunteers.

We also thank Dr. Vincenzo Bonifati for helpful communica-

tion concerning the PCR procedures and D

ebora Torres Valenc¸a

for technical assistance. We are also grateful to the “Plataforma

Gen

omica - Sequenciamento de DNA/PDTIS-FIOCRUZ” for

the aid with the automatic sequencing system. This study

was supported by grants from PPSUS-MS/CNPq/FAPERJ (E-

26/171.560/2006), CAPES and CEPUERJ.

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