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KARINA EUGÊNIA SCHIMITH BIER
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE AMOSTRAS DE Acinetobacter baumannii
MULTIRRESISTENTES ISOLADAS DE PACIENTES INTERNADOS NO HOSPITAL
DE CLÍNICAS DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ (HC-UFPR)
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação
em Microbiologia, Parasitologia e Patologia, Setor de
Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Federal
do Paraná, como requisito parcial à obtenção do título
de Mestre em Microbiologia, Parasitologia e Patologia.
Orientadora: Prof
a
. Dr
a
. Libera Maria Dalla Costa
CURITIBA
2008
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ
SISTEMA DE BIBLIOTECAS – BIBLIOTECA CENTRAL
COORDENAÇÃO DE PROCESSOS TÉCNICOS
Bier, Karina Eugênia Schimith
Caracterização molecular de amostras de Acinetobacter baumannii
multirresistentes isoladas de pacientes internados no Hospital de Clínicas da
Universidade Federal do Paraná (HC – UFPR) / Karina Eugênia Schimith
Bier. – Curitiba, 2008.
96f. : il. algumas color., tabs.
Inclui bibliografia
Orientadora: Profª Drª Libera Maria Dalla Costa
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Paraná, Setor de
Ciências Biológicas e de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação
em Microbiologia, Parasitologia e Patologia.
1. Acinetobacter baumannii. 2. Infecções por Bactérias Gram-Negativas.
3. Infecção hospitalar – Curitiba – 2002-2005. 4. Universidade Federal do
Paraná. Hospital de Clínicas. I. Dalla Costa, Libera Maria. II. Universidade
Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-
Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia. III. Título.
CDD 616.92
Andrea Carolina Grohs CRB 9/1.384
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Dedico este trabalho e todo meu amor a meu filho, meu marido e meus
familiares.
Agradeço a Deus, que me dá vida a cada dia. Ao meu marido Sandro,
por me amar e apoiar acima de tudo. A meu filho Gustavo pelo amor e carinho. Aos
meus pais, por terem me dado incentivo aos estudos. Aos amigos Mara Cristina
Scheffer, Roberto Ribeiro dos Santos e Andréa Lucena, por me auxiliarem na
execução deste trabalho. A orientadora Libera Maria Dalla Costa pelo incentivo e
dedicação ao trabalho. Aos funcionários da Seção de Bacteriologia, Biologia
Molecular e da Central de Meios e Soluções do HC-UFPR, por terem colaborado na
realização deste trabalho.
RESUMO
As infecções nosocomiais constituem uma das maiores causas de mortalidade entre
os pacientes hospitalizados, configurando um grave problema de saúde pública.
Neste contexto, Acinetobacter baumannii destaca-se como um dos principais
patógenos oportunistas no ambiente hospitalar, ocupando o 2º lugar entre os
principais microrganismos causadores de pneumonias hospitalares, além de outras
infecções. O uso extensivo de terapia antimicrobiana nos hospitais tem contribuído
para a seleção e aumento no número de isolados de A. baumannii resistentes a uma
ampla variedade de antimicrobianos, inclusive aos carbapenêmicos. As opções
terapêuticas em isolados de A. baumannii multirresistentes limitam-se a colistina e
polimixina B. O presente trabalho teve como objetivo principal caracterizar o perfil
genotípico de 227 amostras de A.baumannii multirresistentes isoladas de pacientes
do Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná (HC–UFPR), no período
de outubro de 2002 a maio de 2005. Foram avaliados os principais testes de
detecção fenotípica de metalo-β-lactamase (MβL), dentre estes, teste de duplo-disco
difusão, disco combinado e Etest® MβL. A presença dos genes bla
SPM-1
e bla
IMP-1
foi
confirmada por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). A suscetibilidade dos
isolados frente à tigeciclina e ampicilina-sulbactam foi determinada pelos métodos
de disco difusão e diluição em ágar. O teste de disco combinado utilizando
imipenem com EDTA mostrou melhor desempenho, e foi positivo em três das 227
amostras. Uma destas apresentou produto de PCR para gene bla
IMP-1
. Os valores
de CIM
50
e CIM
90
para a tigeciclina foram de 16 µg/ml, sendo todos os isolados de
A. baumannii resistentes a este antimicrobiano. Os resultados comparativos entre os
métodos de disco difusão e ágar diluição para ampicilina-sulbactam apresentaram
discrepâncias que não recomendam o teste de disco difusão. Através da
Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE) as 227 amostras analisadas foram
classificadas em oito perfis e 31 subtipos diferentes. Os oito perfis foram nomeados
como A a H. Dentre estes A, C, F, G e H correspondem aos isolados resistentes aos
carbapenêmicos produtores de β–lactamase OXA-23, enquanto que B, D e E aos
isolados sensíveis a imipenem e/ou meropenem. A presença de apenas três clones
entre 96% das amostras de A. baumannii resistentes aos carbapenêmicos sugere
transmissão cruzada como principal mecanismo de disseminação destes isolados,
evidenciando a necessidade de melhorar as estratégias de controle de infecção no
hospital.
Palavras-chave: Acinetobacter baumannii, resistência aos carbapenêmicos, PFGE,
metalo-β-lactamases, oxacilinases.
ABSTRACT
Many times nosocomial infections are the main cause of mortality among
hospitalized patients, configuring a serious public health problem. In this context,
Acinetobacter baumannii is one of the main opportunistic pathogen in hospital
environment, ranked second among the main nosocomial pathogens related to
pneumonia in intensive care units, besides other infections. The extensive use of
antimicrobial chemotherapy within hospitals has contributed to the selection and
increase in the number of A. baumannii strains resistant to a wide range of
antibiotics, including the carbapenems. The treatment options in multidrug-resistant
A. baumannii strains are limited to colistin (polymyxin E) and polymyxin B. The main
objective of the present work was to characterize the genotypic profile of 227
multidrug-resistant A. baumannii samples isolated from patients at the Hospital de
Clínicas da Universidade Federal do Paraná (HC-UFPR), between October 2002 and
May 2005. The main tests for phenotyping detection of metallo-β-lactamase (MβL)
were evaluated, among these, double disk synergy test, combined disk and
Etest®MβL. The presence of the genes bla
SPM-1
and bla
IMP-1
was confirmed by
Polymerase Chain Reaction (PCR). The susceptibility to tigecycline and
ampicilin/sulbactam was determined by disk diffusion and agar dilution methods. The
combined disk with imipenem and EDTA was the best test for screening the
presence of MβL among those investigated in the present study, and it was positive
in three of the 227 samples. One of these presented PCR product for gene bla
IMP-1
.
The MIC
50
and MIC
90
values for tigecycline were 16 µg/ml, all the strains of isolated
being A. baumannii resistant to this antimicrobial. The comparative results between
the disk diffusion and agar dilution methods for ampicilin/sulbactam presented
discrepancies that do not advise the disk diffusion method. The Pulsed Field Gel
Electrophoresis (PFGE) classified the 227 samples in eight profiles and 31 different
subtypes. The eight profiles were nominated from A to H. Among these A, C, F, G
and H correspond to the carbapenem resistant and OXA-23 β–lactamase producing
isolated, whereas B, D and E to the imipenem and/or meropenem sensible isolated.
The presence of only three clones among 96% of the carbapenem-resistant
A. baumannii samples suggests that cross-transmission is the main dissemination
mechanism of these isolates, thus highlighting the need to improve infection-control
strategies in this hospital.
Key words: Acinetobacter baumannii, carbapenem resistance, PFGE, metallo-β-
lactamases, oxacillinases
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1 -
ESTRUTURA ESQUEMÁTICA DE INTEGRON DE CLASSE 1 ................
23
FIGURA 2 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DE DISTÂNCIAS, SUBSTRATOS
E AGENTES QUELANTES TESTADOS PARA A DETECÇÃO
FENOTÍPICA DE AMOSTRAS PRODUTORAS DE MβL...........................
49
FIGURA 3 - COMPARAÇÃO DO HALO DE INIBIÇÃO EM mm COM A CIM EM
µg/ml DA AMPICILINA-SULBACTAM FRENTE AOS ISOLADOS DE
A. baumannii .............................................................................................
56
FIGURA 4 - EXEMPLO DE TESTES DE TRIAGEM POSITIVOS PARA DETECÇÃO
DE MβL EM AMOSTRA DE A. baumannii ISOLADA NO HC-UFPR........
57
FIGURA 5 - EXEMPLO DE TESTE DE DISCO COMBINADO POSITIVO COM IPM/
IPM+EDTA EM AMOSTRA DE A. baumannii ISOLADA NO HC-UFPR ...
59
FIGURA 6 - COMPARAÇÃO DO HALO DE INIBIÇÃO COM O AUMENTO DO HALO
DE INIBIÇÃO EM mm PRODUZIDOS PELO DISCO DE IMIPENEM +
EDTA EM ISOLADOS DE A. baumannii.....................................................
59
FIGURA 7 - PRODUTOS DE AMPLIFICAÇÃO DO GENE bla
IMP-1
OBTIDO DO
ISOLADO DE A. baumannii MβL POSITIVO .............................................
60
FIGURA 8 - PERFIS ELETROFORÉTICOS DE PFGE ENCONTRADOS EM
AMOSTRAS DE A. baumannii ISOLADAS NO HC-UFPR.........................
61
FIGURA 9 - DISTRIBUIÇÃO TEMPORAL DOS PERFIS DE RESISTÊNCIA A, C e F
ENCONTRADOS NAS AMOSTRAS DE A.baumannii ..............................
62
FIGURA 10 - COMPARAÇÃO ENTRE O PERFIL DE PFGE UTILIZANDO ApaI DOS
ISOLADOS DESTE ESTUDO (4,5,6,7) COM O DESCRITO POR Dalla
Costa et al. (2003)......................................................................................
63
FIGURA 11 - DENDROGRAMA CONFECCIONADO COM BASE NO POLMORFISMO
DOS FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO EM PFGE UTILIZANDO A
ENZIMA ApaI DE 227 ISOLADOS DE A. baumannii..................................
64
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - ANTIBIOTIPOS ENCONTRADOS E DISTRIBUIÇÃO DO NÚMERO DE
ISOLADOS DE A. baumannii MULTIRRESISTENTES ISOLADOS DO
HC-UFPR....................................................................................................
43
TABELA 2 - CRITÉRIOS DE INTERPRETAÇÃO DE SUSCETIBILIDADE DO TESTE
DE DISCO DIFUSÃO PARA AMOSTRAS DE A. baumannii e CEPAS
CONTROLE.................................................................................................
45
TABELA 3 - CRITÉRIOS DE INTERPRETAÇÃO DE SUSCETIBILIDADE DO TESTE
DE DILUIÇÃO EM ÁGAR PARA AMOSTRAS DE A. baumannii e CEPAS
CONTROLE FRENTE À TIGECICLINA ....................................................
46
TABELA 4 - PERFIL DE SUSCETIBILIDADE Á TIGECICLINA PELOS MÉTODOS
DE DISCO DIFUSÃO E DILUIÇÃO EM ÁGAR DAS 227 AMOSTRAS DE
A. baumanni MR ISOLADAS NO HC-UFPR SEGUNDO CRITÉRIOS DE
USFDA E JONES, 2007..............................................................................
54
TABELA 5 - RESULTADOS DOS DIVERSOS MÉTODOS DE DETECÇÃO
FENOTÍPICA DE PRESENÇA DE MβL EM 40 AMOSTRAS DE
A. baumannii ISOLADAS NO HC –UFPR POSITIVAS NO TDDD E 30
NEGATIVAS POR PCR ..............................................................................
58
TABELA 6 - DISTRIBUIÇÃO DOS ISOLADOS DE A. baumannii ESTUDADOS NOS
DIFERENTES PERFIS ELETROFERÉTICOS E SUBTIPOS
ENCONTRADOS EM PFGE POR ApaI.....................................................
62
TABELA 7 - ANÁLISE DO DENDROGRAMA OBTIDO SOB COEFICIENTE DE DICE
DE 70%DOS 227 ISOLADOS DE A. baumannii MR ESTUDADOS...........
65
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
A. baumannii – Acinetobacter baumannii
ASM – American Society for Microbiology – Sociedade Americana de
Microbiologia
ATCC – American Type Culture Collection
BHI – Brain Heart Infusion – Caldo de infusão de cérebro e coração
CDC – Centers for Disease Control and Prevention
CIM – Concentração Inibitória Mínima
CLSI – Clinical and Laboratory Standards Institute
DC – Disco combinado
DD – Disco difusão
dNTP – Desoxinucleosideos trifosfato
EDTA – Ácido etilenodiaminotetracético
ESBL – β-lactamase de espectro estendido
HC-UFPR – Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná
IPM – Imipenem
IMP – Imipenemase
Kb – Kilobases
LBA – Lavado bronco-alveolar
MβL – Metalo-β-lactamase
MgCl
2
– Cloreto de Magnésio
MR – Multirresistente
MER – Meropenem
mg – Miligrama
ml – Mililitro
MPA – Ácido 2-mercaptopropiônico
MYSTIC – Meropenem Yearly Susceptibility Test Information Collection
NNISS – National Nosocomial Infection Surveillance System – Sistema
Nacional de Vigilância de Infecções Nosocomiais
P. aeruginosa – Pseudomonas aeruginosa
pb – Pares de base
PBP – Proteína ligadora de penicilina
PCR – Polymerase Chain Reaction - Reação em cadeia da
polimerase
PFGE – Pulsed Field Gel Electrophoresis - Eletroforese em gel de
campo pulsado
rpm – Rotações por minuto
SE – Salina EDTA
SPM – São Paulo metalo-β-lactamase
Taq polimerase – Thermus aquaticus polimerase
TBE – Tris-Borato-EDTA
TE – Tris EDTA
TSA – Ágar tríptico de soja
TSB – Caldo Tripticase-Soja
TSDD – Teste de sinergismo de duplo-disco
UFC – Unidade Formadora de Colônia
UI – Unidade Internacional
U.S. FDA – U.S. Food and Drug Administration
UV – Ultravioleta
UTI – Unidade de Terapia Intensiva
VAP – Pneumonia associada ao uso de ventilação mecânica
VIM – Verona imipenemase
µ – Micro
µg – Micrograma
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO............................................................................. ...................
12
1.1 OBJETIVO GERAL........................................................................................ 14
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS......................................................................... 14
2 REVISÃO DE LITERATURA............................................................................ 15
2.1 O MICRORGANISMO................................................................................... 15
2.2 EPIDEMIOLOGIA.......................................................................................... 17
2.3 PATOGENICIDADE....................................................................................... 20
2.4 RESISTÊNCIA AOS ANTIMICROBIANOS................................................... 22
2.5 MECANISMOS DE RESISTÊNCIA............................................................... 25
2.5.1 Beta-lactamase Classe A......................................................................... 26
2.5.2 Beta-lactamase Classe B........................................................................... 26
2.5.3 Beta-lactamase Classe C .......................................................................... 29
2.5.4 Beta-lactamase Classe D .......................................................................... 30
2.5.5 Outros mecanismos .................................................................................. 33
2.6 TRATAMENTO ............................................................................................. 34
2.7 TIPAGEM MOLECULAR .............................................................................. 38
3 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................. 41
3.1 AMOSTRAS BACTERIANAS....................................................................... 41
3.1.1 Caracterização preliminar das amostras de A. baumannii......................... 42
3.2 TESTE DE SUSCETIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS –
TIGECICLINA E AMPICILINA-SULBACTAM ..............................................
44
3.2.1 Disco difusão ............................................................................................. 44
3.2.1.1 Agentes antimicrobianos......................................................................... 44
3.2.1.2 Inóculo ................................................................................................... 44
3.2.1.3 Inoculação no ágar ................................................................................ 44
3.2.1.4 Leitura dos halos ................................................................................... 44
3.2.2 Diluição em ágar................................................................................ ........ 45
3.2.2.1 Agente antimicrobiano............................................................................ 45
3.2.2.2 Diluição do antimicrobiano em Placas de Ágar Mueller-Hinton............... 46
3.2.2.3 Preparo do Inoculo Bacteriano ............................................................... 47
3.2.2.4 Diluição em Ágar.................................................................................... 47
3.2.2.5 Determinação dos Pontos de Corte nos Testes de Diluição em Ágar .... 47
3.3 DETECÇÃO FENOTÍPICA DE METALO-β-LACTAMASE............................ 48
3.3.1 Teste de Duplo-disco Difusão (TDDD) ..................................................... 49
3.3.2 Teste do Disco Combinado (DC) ............................................................... 50
3.3.3 Etest® MβL ...............................................................................................
50
3.4 DETECÇÃO GENOTÍPICA DE METALO-β-LACTAMASE.......................... 50
3.5 ELETROFORESE EM GEL DE CAMPO PULSADO (PFGE)....................... 52
3.5.1 Preparo dos blocos com DNA ................................................................... 52
3.5.2 Clivagem do DNA com Enzima de Restrição ............................................ 53
3.5.3. Eletroforese .............................................................................................. 53
4 RESULTADOS ............................................................................................... 55
4.1 PERFIL DE SUSCETIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS ....................... 55
4.2 DETECÇÃO FENOTÍPICA DE METALO-β-LACTAMASE ........................... 57
4.3 DETERMINAÇÃO GENOTÍPICA DE METALO-β-LACTAMASE ................. 60
4.4 RESULTADOS DA ELETROFORESE EM GEL DE CAMPO PULSADO.... 61
5 DISCUSSÃO ................................................................................................... 66
5.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS ........................................................................ 66
5.2 TESTE DE SUSCETIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS –
TIGECICLINA E AMPICILINA-SULBACTAM ...............................................
67
5.3 DETECÇÃO DE METALO-β-LACTAMASE .................................................. 69
5.4 CARACTERIAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS DE A. baumannii MR.. 73
6 CONCLUSÃO .................................................................................................. 77
REFERÊNCIAS .................................................................................................. 78
ANEXOS ............................................................................................................. 87
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