( PDF ) Caracterização e propriedades tecnológicas de Staphylococcus xylosus isoladas de salames artesanais e aplicação como cultura iniciadora em salame tipo milano

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ÂNGELA MARIA FIORENTINI

CARACTERIZAÇÃO E PROPRIEDADES TECNOLÓGICAS DE Staphylococcus

xylosus ISOLADAS DE SALAMES ARTESANAIS E APLICAÇÃO COMO

CULTURA INICIADORA EM SALAME TIPO MILANO

Tese apresentada à Banca do programa de Pós

Graduação em Ciência dos Alimentos da

Universidade Federal de Santa Catarina (SC),

como requisito final para a obtenção do grau de

Doutor em Ciência dos Alimentos.

Orientador: Dr. Ernani S. Sant´Anna

Co- Orientadora: Dra. Teresinha Marisa Bertol

Florianópolis/SC

2008

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F518c Fiorentini, Ângela Maria.

Caracterização e propriedades tecnológicas de Staphylococcus xylosus

isoladas de salames artesanais e aplicação como cultura iniciadora em

salame tipo Milano / Ângela Maria Fiorentini. – Florianópolis, 2008. –

113 f.

Tese (Doutorado em Ciência dos Alimentos) – Universidade Federal

de Santa Catarina, 2008.

Orientação: Ernani S. Sant´Anna.

1. Staphylococcus xylosus. 2. Cultivos iniciadores. 3. Salame tipo

Milano. I. Sant´Anna, Ernani S. II. Título

CDU: 664

664.92

Patrícia da Rosa Corrêa

CRB10 / 1652

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CARACTERIZAÇÃO E PROPRIEDADES TECNOLÓGICAS DE Staphylococcus

xylosus ISOLADAS DE SALAMES ARTESANAIS E APLICAÇÃO COMO

CULTURA INICIADORA EM SALAME TIPO MILANO

Por

Ângela Maria Fiorentini

Tese apresentada como requisito final para a obtenção do título de Doutor no

Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos, pela Comissão formada

por:

Presidente: _________________________________________________________

Dra. Ana Carolina Maisonave Arisi

Membro: ___________________________________________________________

Dra. Teresinha Marisa Bertol

Membro: ___________________________________________________________

Dr. Nelcindo Nascimento Terra

Membro: ___________________________________________________________

Dr. Carlos Ricardo Soccol

Membro: ___________________________________________________________

Dr. César Damian

Florianópolis

2008

AGRADECIMENTOS

Ao Professor Doutor Ernani Sebastião Sant’Anna, pela orientação, apoio e

confiança.

À Embrapa Suínos e Aves, pelo apoio financeiro para a viabilização deste trabalho e

em especial à Doutora Teresinha Marisa Bertol, pela co-orientação, estímulo e

amizade. Ao Técnico Anildo Cunha Júnior pela colaboração nas análises físico-

químicas.

À Professora Doutora Ana Carolina Maisonave Arisi, pela importante colaboração na

viabilização das análises de caracterização molecular, pelo incentivo e contribuições

constantes.

À Doutora Maristela Cortez Sawitzki, pela amizade e companheirismo em todos os

momentos e apoio absoluto para a realização deste trabalho. Pelas constantes

informações, estímulo, por tudo.

Aos integrantes do laboratório de Biotecnologia alimentar/Biologia molecular

(UFSC): Andréia Dinon, Márcia Regina Pelisser, Caroline Tagliari, pelo apoio e

orientações recebidas e em especial ao Fábio Cristiano Angonesi Brod pela

amizade, pelas informações e importantes contribuições para a viabilização da

pesquisa.

Ao professor Doutor César Rombaldi e ao professor Doutor Wladimir Padilha pela

confiança, estímulo e por disponibilizar os laboratórios de Biotecnologia e

Microbiologia da UFPel. Aos Doutores Luciano Lucchetta e Márcio Zanuzo pelas

importantes contribuições em biologia molecular que possibilitaram o início da

viabilização da pesquisa.

À UNIJUÍ, pelo auxílio recebido e em especial ao Departamento de Biologia e

Química por viabilizar a realização de análises nos laboratórios de Microbiologia e

Físico-química e aos técnicos dos laboratórios do Núcleo de Alimentos: Liziane

Schittler, Gislaine Hermanns e Leidi Daiana Preichardt, como também aos bolsistas

e estagiários do curso de Química Industrial de Alimentos que acompanharam o

trabalho.

À Ingrid Boesche Tomazelli - LANAL - Microbiologia do SENAI/Chapecó, pela

viabilização das análises de enterotoxinas estafilocócicas.

À professora Doutora Renata Dias de Mello Castanho Amboni, pelo apoio na área

de análise sensorial.

Ao professor Doutor Eduardo Carasek da Rocha e Dilma Budziak do Departamento

de Química - UFSC, pelas orientações sobre as análises químicas.

A todos meus amigos e colegas da UFSC e UNIJUÍ, pelo carinho e amizade.

Aos meus familiares, pelo apoio e incentivo.

A todos que contribuíram e me apoiaram no decorrer do curso de Doutorado,

viabilizando a realização deste trabalho.

LISTA DE TABELAS

TABELA 1. Testes bioquímicos para a identificação de Staphylococcus

isolados de embutidos naturalmente fermentados

........................

TABELA 2.

Perfil de fermentação de carboidratos de Staphylococcus

isolados de embutidos naturalmente fermentados

........................

TABELA 3.

Caracterização de Staphylococcus xylosus (caldo BHI) isolados

de embutidos naturalmente fermentados

........................................

TABELA 4.

Atividade lipolítica de Staphylococcus xylosus isolados de

embutido naturalmente fermentado

..................................................

TABELA 5.

Contagens de linhagens S. xylosus AD1 e U5 após a liofilização

(inicial) e durante o periodo de estocagem a - 50

......................

TABELA 6.

Atividade antagonista e antimicrobiana de linhagens de S.

xylosus isoladas e linhagem de referência contra linhagens

selecionadas

........................................................................................

TABELA 7. Variações nas análises físico-químicas durante a fermentação e

maturação de salame tipo Milano

......................................................

TABELA 8. Evolução do conteúdo de ácidos graxos durante a fermentação

e maturação de salame tipo Milano

..................................................

TABELA 9. Parâmetros de CIE L*, a* e b* em salame Milano após 40 dias

de maturação

.......................................................................................

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1. Processo básico dos embutidos fermentados

...............................

FIGURA 2. Reações químicas características da formação da cor dos

produtos cárneos curados

................................................................

FIGURA 3. Hidrólise da uréia catalizada por urease microbiana

....................

FIGURA 4. Efeitos dos nitratos e/ou nitritos na cor da carne curada, com

ação de bactérias nitrato redutoras

..................................................

FIGURA 5. Degradação do peróxido de hidrogênio

..........................................

FIGURA 6. Degradação de L-leucina

...................................................................

FIGURA 7. Ação de bactérias GCC

durante a fermentação

...........................

FIGURA 8.

Crescimento de linhagens de Staphylococcus xylosus (log

UFC/mL) isoladas de embutidos naturalmente fermentados em

diferentes concentrações de NaCl

........................................

FIGURA 9.

Crescimento de linhagens de Staphylococcus xylosus (log

UFC/mL) isoladas de embutidos naturalmente fermentados em

diferentes concentrações de NaNO

...............................................

FIGURA 10.

Crescimento (log UFC/mL) de linhagens de Staphylococcus

xylosus isoladas de embutidos naturalmente fermentados, em

caldo adicionado de NaCl e NaNO

.................................................

FIGURA 11.

Amplificação PCR com iniciadores para gênero

TstaG422/Tstag765, usando 50 ng de DNA molde

........................

FIGURA 12.

Amplificação PCR com iniciadores para gênero

TstaG422/Tstag765 usando 2 µL de DNA

......................................

FIGURA 13.

Amplificação PCR com iniciadores espécie-específico

XYLF/XYLR

. ........................................................................................

FIGURA 14.

Fermentação de Staphylococcus xylosus AD1 e U5 em caldo

BHI a 35

...........................................................................................

FIGURA 15.

Evolução da microbiota durante maturação de salame

.................

FIGURA 16.

Mudanças na concentração de nitrato e nitrito durante a

fermentação e maturação de salame tipo Milano

...........................

RESUMO

A produção de embutidos cárneos destaca-se entre as alternativas

econômicas para a região Noroeste do Estado do Rio Grande do Sul, os quais, na

sua grande maioria, são produzidos artesanalmente condimentados e processados

conforme as preferências do manipulador, e muitas vezes são influenciadas pela sua

origem (descendentes de italianos ou alemães). A fermentação acontece pela ação

de uma microbiota natural variável e adaptada às condições ambientais. A qualidade

do produto cárneo naturalmente fermentado é influenciada pelo crescimento dessa

microbiota típica que geralmente pertence ao grupo de bactérias ácido lácticas (BAL)

e grupo de cocos Gram positivos catalase positivo (GCC

) da Família

Micrococcaceae (Staphylococcus e Kokuria). O objetivo desta pesquisa foi

caracterizar linhagens de Staphylococcus xylosus isoladas de salames artesanais

produzidos na região Noroeste do Rio Grande do Sul, estudar algumas propriedades

tecnológicas e de segurança e sua viabilidade para uso como cultivo iniciador em

embutidos cárneos. Como também, avaliar a ação do cultivo iniciador selecionado

quanto às propriedades físico-químicas, microbiológicas e sensoriais em salame tipo

Milano. Linhagens nativas de Micrococcaceae foram isoladas de 38 amostras de

embutidos artesanais procedentes de 21 cidades da Região Noroeste do Rio Grande

do Sul. Depois de isoladas e purificadas foram submetidas aos testes iniciais de

coloração de Gram, catalase e coagulase. Em seguida, usou-se o sistema API Staph

(BioMérieux) para a caracterização fenotípica e pela técnica de PCR (Reação em

cadeia da polimerase) as linhagens foram caracterizadas molecularmente.

Atividades tecnológicas foram avaliadas como: efeito da temperatura, pH,

concentrações de NaCl, tolerância para NaCl e NaNO

, capacidade para reduzir

nitritos, atividade lipolítica e atividade antagonística. A viabilidade das linhagens

quanto ao processo fermentativo em caldo e posterior liofilização e armazenamento

também foi avaliado. Aspectos relativos à segurança foram observados pela

detecção de enterotoxinas. E por fim, foi processado salame tipo Milano inoculado

com a linhagem selecionada de S. xylosus U5 isolada de embutidos artesanais para

verificar a influência da mesma nas características microbiológicas, físico-quimicas e

sensoriais do produto. Dos 89 isolados que apresentaram atividades positiva para

catalase e negativa para coagulase, 25 linhagens foram aleatoriamente

selecionadas para caracterização fenotípica. Nove dessas linhagens pertencentes à

espécie S. xylosus, por API STAPH, apresentaram habilidade para reduzir nitratos e

nitritos, crescimento satisfatório das linhagens foi verificado na presença de NaCl, e

NaNO

e atividade de catalase positivo e lipolítica. As linhagens foram ainda

avaliadas quanto ao gênero e espécie através da PCR, e duas linhagens foram

identificadas como S. xylosus (AD1 e U5). Ambas apresentaram viabilidade para a

fermentação e estabilidade no processo de liofilização e armazenamento e reação

negativa para enterotoxinas estafilocócicas, ausência de antagonismo para com os

patógenos testados, porém apresentou sinergismo com as BAL. As enzimas da

linhagem S. xylosus U5 inoculada em salame tipo Milano que mostraram eficiente

atividade sob as condições encontradas no produto, foram catalase, nitrito e nitrato

redutase, contribuindo para as propriedades físico-químicas e sensoriais do produto.

Não houve diferenças significativas na composição geral dos ácidos graxos livres

entre as amostras, enquanto os parâmetros de cor foram superiores no salame

inoculado e esse foi também o produto preferido pelos degustadores.

Palavras-chave: Staphylococcus xylosus, cultivos iniciadores, salame tipo Milano

ABSTRACT

The production of sausages is one of the main economical alternatives for the

Northwest Region of the State of Rio Grande do Sul, which are produced mainly by

artisanal processes and manufactured according to the manipulator's preferences

being influenced by its origin (descending from Italians or Germans). The

fermentation is carried out due to the activity of a variable natural microflora adapted

to the environmental conditions. The quality of the meat product naturally fermented

is influenced by the growth of that typical microflora usually belonging to the lactic

acid bacteria group (LAB) and Gram positive, catalase positive cocci group (GCC

) of

the Micrococcaceae family (Staphylococcus and Kokuria). The aim of this research

was to characterize Staphylococcus xylosus strains isolated of artisanal salami

produced in the Northwest Region of Rio Grande do Sul, in order to study some

technological and safety properties and their viability for using as starter cultures in

sausages. Activity of the selected starter cultures concerning to physicochemical,

microbiological and sensorial properties in Milano salami was also evaluated. Wild

strains of Micrococcaceae were isolated from 38 samples of artisanal sausages

collected in 21 cities of the Northwest Region of Rio Grande do Sul. After isolation

and purification steps, strains were submitted to the initial tests of Gram coloration,

catalase and coagulase. API Staph system was then used (BioMérieux) for

phenotypic characterization. Molecular characterization was performed by

Polymerase Chain Reaction (PCR). The following technological activities were

evaluated: temperature effect, pH, concentrations of NaCl, NaCl and NaNO

tolerance, nitrite reducing capacity, lipolytic activity and antagonistic activity. Viability

of strains for fermentative process in broth followed by freeze-drying and storage was

also evaluated. Safety was evaluated through enterotoxins detection. Finally, Milano

salami was manufactured by inoculating the isolated strains of S. xylosus U5 from

artisanal sausages in order to investigate the influence of the selected strain in the

microbiological, physiochemical and sensorial properties of the final product. Twenty

five out of eighty nine strains that presented activities for catalase- positive and

coagulase- negative were randomly selected for phenotypic characterization. Nine

out of the twenty five strains were characterized, by API STAPH, as belonging to the

S. xylosus species and presented ability to reduce nitrates and nitrites; satisfactory

growth was verified in the presence of NaCl, and NaNO

and also catalase-positive

and lipolytic activity. The strains were also evaluated by genus and species PCR,

and two strains were identified as S. xylosus (AD1 and U5). Both strains presented

viability for the fermentation, stability after freeze-drying process and storage,

negative reaction for staphylococcal enterotoxins, absence of antagonism to the

pathogenic bacteria tested. However, they presented synergism with LAB. The

enzymes of the S. xylosus U5 strain, inoculated in Milano salami, that showed

efficient activity under the conditions of the product, were catalase, nitrite and nitrate

reductase, contributing for sensory and physiochemical properties of the product.

There were not significant differences in the general composition of the free fatty

acids among samples, while the color parameter was superior in the inoculated

salami. This was also the preferred salami for tasters.

Key words: Staphylococcus xylosus, starter cultures, milano salami

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO.................................................................................................

1 REFERENCIAL TEÓRICO...........................................................................

1.1 CARACTERÍSTICAS DE PRODUÇÃO DE CARNE SUÍNA E

AGROINDUSTRIALIZAÇÃO DE EMBUTIDOS CÁRNEOS...........................

1.1.1 Embutido fermentado - Salame tipo Milano.......................................

1.1.2 Bactérias envolvidas na fermentação de embutidos........................

1.1.3 Fermentação com cultivos iniciadores..............................................

1.2 MICRORGANISMOS DA FAMÍLIA MICROCOCCACEAE.......................

1.2.1 Propriedades tecnológicas de linhagens de Staphylococcus

xylosus ..........................................................................................................

REFERÊNCIAS ..............................................................................................

2 CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E MOLECULAR DE

Staphylococcus xylosus: POTENCIAL TECNOLÓGICO PARA USO EM

EMBUTIDOS FERMENTADOS (Artigo 1)......................................................

3 VIABILIDADE DE LINHAGENS DE Staphylococcus xylosus

ISOLADAS DE EMBUTIDOS ARTESANAIS PARA APLICAÇÃO COMO

CULTIVOS INICIADORES EM PRODUTOS CÁRNEOS (Artigo 2)..............

4 INFLUÊNCIA DE LINHAGEM NATIVA DE Staphylococcus xylosus

NAS CARACTERÍSTICAS MICROBIOLÓGICAS, FÍSICO-QUÍMICAS E

SENSORIAIS EM SALAME TIPO MILANO (Artigo 3)...................................

CONSIDERAÇÕES FINAIS ...........................................................................

113

INTRODUÇÃO

A produção de embutidos cárneos destaca-se entre as alternativas

econômicas para a região Fronteira Noroeste do estado do RS

, os quais, na sua

grande maioria, são produzidos artesanalmente, condimentados e processados

conforme as preferências do manipulador, muitas vezes influenciadas pela sua

cultura/origem (descendentes de italianos ou alemães), obtendo-se as

denominações de salame e lingüiça. Isto possibilita agregar valor à carne suína

gerando alternativas para a sua comercialização e, conseqüentemente, contribui

para a diversidade de produtos disponíveis na região.

A região Fronteira Noroeste pertence à mesorregião do Noroeste Rio-

Grandense, distante 500 km da capital Porto Alegre e faz fronteira com a Argentina a

Oeste. É composta por 20 municípios, abrangendo uma área total de 4.689 km

com uma população estimada em torno de 210 mil habitantes. A região tem no

agronegócio o ponto central de sua matriz de geração de renda, com atividades

voltadas para a agricultura e a pecuária. Produtos oriundos do setor primário são

processados por muitas agroindústrias da região, entre elas destacam-se

agroindústrias processadoras de embutidos cárneos (DALLABRIDA e

BÜTTENBENDER, 2007).

Os embutidos cárneos tradicionais são elaborados predominantemente com

carne e gordura suína, que são misturados e processados com sal e especiarias,

sem a adição de cultivos iniciadores. A fermentação desses produtos somente

acontece pela ação de uma microbiota natural, cuja composição é variável e seu

crescimento promovido pelas condições ambientais. Esta microbiota é composta por

uma ampla variedade de microrganismos derivados da matéria-prima contaminada

durante o abate e, por isso, pode contaminar a massa, os produtos ou o ambiente

das unidades de processamento.

A qualidade do produto cárneo naturalmente fermentado é influenciada pelo

crescimento dessa microbiota típica isolada de embutidos artesanais que,

geralmente, pertence ao grupo de bactérias ácido lácticas (BAL) e grupo de cocos

Gram positivos catalase positivo (GCC

) representados pelos gêneros

Staphylococcus e Kokuria, pertencentes à Família Micrococcaceae. A multiplicação

Classificação dos Conselhos Regionais de Desenvolvimento - COREDES - RS.

dessas bactérias durante o processo de maturação dos embutidos resulta na

produção de metabólitos que podem inibir o desenvolvimento de microrganismos

indesejáveis e levar à formação de aromas característicos.

O uso de cultivos iniciadores em embutidos cárneos tem proporcionado a

obtenção de um produto com boas propriedades organolépticas. A cor, o

desenvolvimento de textura e a qualidade higiênico-sanitária são características

influenciadas positivamente pelos cultivos iniciadores comerciais. No entanto, essas

culturas presentes no mercado muitas vezes não realçam suficientemente as

propriedades de flavor, com vistas a atender às expectativas de um consumidor

cada vez mais exigente. Assim, a seleção de cepas com boas características para

cultivos iniciadores, ou seja, com alto potencial para a produção de aromas, é de

fundamental importância para produtos cárneos fermentados. Os microrganismos

mais promissores para uso como cultivos iniciadores são aqueles isolados da

microbiota natural de produtos tradicionais, pois essas culturas tendem a ter

capacidades metabólicas mais altas que podem afetar vantajosamente a qualidade

do produto. Provavelmente, a seleção natural os tenha favorecido dotando-os de

vantagens ecológicas para que possam melhor competir com os demais

microrganismos do alimento.

Por isso, isolar bactérias GCC

de produtos cárneos artesanais, realizar sua

identificação e caracterização é o que poderá garantir a aplicação desses

microrganismos como cultivos iniciadores em embutidos cárneos. Desta forma se

poderia manter a característica artesanal do produto, mas com controle da

fermentação e do processo de cura. Seria uma alternativa de processamento, pois,

além da obtenção de um produto estável à temperatura ambiente, as reações

enzimáticas produzidas pelas linhagens de Micrococcaceae auxiliariam na formação

de flavor característico e diferenciado.

O estudo tem o objetivo de caracterizar linhagens de Staphylococcus xylosus

isoladas de salames artesanais produzidos na região Fronteira Noroeste do Rio

Grande do Sul, estudar propriedades tecnológicas e de segurança e sua viabilidade

para uso como cultura iniciadora em embutidos cárneos. E mais: avaliar a ação do

cultivo iniciador selecionado quanto às propriedades físico-químicas, microbiológicas

e sensoriais em salame tipo Milano, através da identificação fenotípica e molecular

de linhagens de Staphylococcus xylosus presentes na microbiota de embutidos

cárneos artesanais; obtenção de cultivo iniciador a partir da linhagem de

Staphylococcus xylosus selecionada (U5); determinação de produção de

enterotoxinas e atividade antagonística e elaboração de salame tipo Milano

inoculado com o cultivo iniciador.

A definição do microrganismo em estudo justifica-se por ser o Staphylococcus

xylosus uma espécie predominante da microbiota de embutidos fermentados

naturalmente em muitos países, como Itália, Espanha, Grécia, Brasil e outros, assim

como pelo importante potencial tecnológico em embutidos cárneos: na formação e

estabilização da cor por redução de nitrato a nitrito; na decomposição de peróxidos

pela ação da enzima catalase; e na formação do flavor do produto, devido às

atividades lipolíticas e proteolíticas.

A presente pesquisa fez parte do projeto Desenvolvimento de cultivos

iniciadores para o processamento de embutidos cárneos artesanais, atendendo

aos conceitos norteadores do Macroprograma 3 - EMBRAPA, Código: 03.03.2.33.00,

coordenado pela Doutora Teresinha Marisa Bertol (EMBRAPA Suínos e Aves) com

uma equipe interinstitucional: Ângela Maria Fiorentini (UNIJUÍ), Maristela Cortez

Sawitzki (UERGS), Ernani S. Sant´Anna (UFSC). Duas linhas de pesquisas foram

desenvolvidas: Caracterização fenotípica e molecular de Staphylococcus xylosus e

investigação de propriedades tecnológicas sob a responsabilidade de Ângela Maria

Fiorentini e Caracterização fenotípica e molecular de Lactobacillus plantarum e

investigação de propriedades tecnológicas de responsabilidade de Maristela Cortez

Sawitzki. A pesquisa deu continuidade ao projeto Desenvolvimento e aplicação de

cultivos iniciadores em produtos cárneos fermentados sob responsabilidade da

Universidade Regional do Noroeste do Rio Grande do Sul (UNIJUÍ), o qual

possibilitou a identificação fenotípica dos microrganismos isolados a partir da

microbiota de produtos cárneos artesanais e gerou um banco de culturas composto

de bactérias ácido lácticas e Micrococcaceae, mantido pela UNIJUÍ. Participaram

deste projeto os pesquisadores Ângela Maria Fiorentini (UNIJUÍ), Maristela Cortez

Sawitzki (UNIJUÍ/UERGS), Ernani S. Sant´Anna (UFSC) e Nelcindo Nascimento

Terra (UFSM), em convênio com a Secretaria de Ciência e Tecnologia do Estado do

Rio Grande do Sul.

A Tese está organizada, primeiramente, com a explicitação do referencial

teórico sobre os temas relevantes ao estudo; na seqüência, a pesquisa realizada foi

dividida em artigos, como se segue: Artigo 1 - Caracterização fenotípica e molecular

de Staphylococcus xylosus e a investigação de algumas propriedades tecnológicas;

Artigo 2 - Estudo da viabilidade da linhagem Staphylococcus xylosus isolada de

embutidos artesanais para aplicação como cultivo iniciador em produtos cárneos;

Artigo 3 - Processamento de salame tipo Milano para verificar a influência de

linhagem nativa de Staphylococcus xylosus nas características microbiológicas,

físico-químicas e sensoriais do produto. E por fim, considerações finais sobre a

pesquisa desenvolvida, bem como sua continuidade.

1 REFERENCIAL TEÓRICO

1.1 Características de produção de carne suína e agroindustrialização de

embutidos cárneos

A carne suína é a mais produzida no mundo, atingindo 104.990 milhões de

toneladas em 2006. A produção nacional cresceu quase 6% neste período, atingindo

2,86 milhões de toneladas, e a estimativa é de superar três milhões de toneladas em

2007. O Brasil vem aumentando suas exportações de carne suína, sendo

responsável por 12% das exportações mundiais, num total de 528.195,0 t em 2006.

(ABIPECS, 2007).

Dados estatísticos sobre o consumo mundial de carne revelam, em primeiro

lugar, a carne suína, com um consumo de 16,5 kg/pessoa. No Brasil, a previsão

para 2007 do consumo per capita de carne suína é de 12,47 kg/habitante (ACSURS,

2007). Mais de 50% deste consumo corresponde a produtos processados (POF -

2002/2003, 2008).

O Rio Grande do Sul possui o terceiro maior rebanho de suínos do país, cuja

cultura integra a cadeia produtiva associada à agroindustrialização da carne,

importante cadeia produtiva do Estado (SEPLAG, 2007), atingindo o percentual de

70% no consumo de carne industrializada e 30% de carne in natura (ACSURS,

2007).

Como uma alternativa econômica, com vistas a agregar valor ao produto os

produtores, industrializam embutidos cárneos, diversificando-os quanto às

tecnologias de produção e às características sensoriais e ainda, visando atender às

expectativas do consumidor. A elaboração dos mesmos consiste na trituração da

carne e gordura misturados aos ingredientes como conservadores (sais de cura),

sal, açúcares e especiarias, embutidos em invólucros naturais ou artificiais,

defumados ou não, cru ou cozidos. Muitos produtos cárneos são comercializados,

como lingüiça, salame, copa, morcela, salsicha, mortadela com sua diversidade e

variações.

Entre os embutidos cárneos fermentados comercializados, destaca-se a

produção de salames, com uma produção/dia aproximada de 110 a 120 toneladas

(NIELSEN, 2001 apud TERRA et al., 2004). No Brasil, temos normas e padrões que

estabelecem a classificação dos diversos tipos de salames - Regulamento Técnico

de Identidade e Qualidade de Salames, objetivando fixar a identidade das

características mínimas de qualidade para este produto cárneo (BRASIL, 2000).

Embutidos fermentados caracterizam-se pelo seu baixo teor de umidade e

atividade de água e a presença de ácido láctico. Em conseqüência à fermentação do

embutido durante o seu processamento, características são conferidas ao produto

tais como segurança, vida de prateleira, fatiabilidade, aroma e sabor próprio

(BUCKENHÜSKES, 1993).

Para tanto, faz-se necessária a utilização de métodos combinados de

preservação, com a redução da atividade de água e do pH do produto, garantindo

um produto estável á temperatura ambiente (NASSU et al., 2002).

Os embutidos fermentados são classificados como produtos secos ou semi-

secos e em geral não são emulsionados. Seu processamento consiste basicamente

da seleção e corte da carne e da gordura, adição de condimentos e aditivos.

Normalmente, os embutidos semi-secos são defumados e submetidos a altas

temperaturas (63°C), enquanto que os secos fermentam a temperaturas de 15 e

26°C e podem ser defumados ou não, sendo mais secos e firmes que os semi-secos

(ORDÓÑEZ et al., 1999). As principais transformações que ocorrem na etapa de

fermentação podem ser resumidas em: mudanças da microbiota inicial, redução de

pH, redução de nitratos a nitritos, formação de nitrosomioglobina, solubilização e

gelificação de proteínas miofibrilares e sarcoplasmáticas, fenômenos de oxidação,

hidrólise e desidratação, inibindo o desenvolvimento de microrganismos indesejáveis

(LIZASO et al., 1999).

A preferência em consumir embutidos fermentados está incorporada no hábito

alimentar do brasileiro, sendo que, dentre eles, os salames são os mais consumidos

e populares (ANTONI, 2005). É um produto que consiste da mistura de carne

cortada em pedaços ou triturada, toucinho (gordura), sais, agentes de cura,

condimentos, embutido em tripas, fermentado e desidratado (FERNÁNDEZ et al.,

2001). É durante a maturação e secagem que se pode obter um produto seguro e

estável, pois nessa etapa que ocorrem os processos físicos, bioquímicos e

microbiológicos importantes, desenvolvendo o aroma típico e a estabilização da cor

e, durante a secagem, com a redução da atividade de água, contribui para o

desenvolvimento da textura.

A elaboração de todos os produtos fermentados comporta uma tecnologia

básica.

Fonte: Varnan e Sutherland (1995).

Figura 1 - Processo básico dos embutidos fermentados.

Um grande avanço observado na indústria de produtos cárneos fermentados

se deu com a utilização de microrganismos desejáveis no início do processamento.

Linhagens de Bactérias ácido lácticas (BAL) e Micrococcaceae estão disponíveis

comercialmente e são denominadas, pela Legislação Brasileira, de cultivos

iniciadores (BRASIL, 2000). Bactérias Ácido Lácticas são responsáveis pela rápida

fermentação de carboidratos provocando a diminuição do pH e bactérias do grupo

Micrococcaceae podem reduzir nitrato e nitrito, influenciando na qualidade do

produto. Esses processos são responsáveis por conferir a cor vermelha

Semi secos

Dessecados

Secagem

(defumação)

Secagem e

maturação

NaCl, açúcares,

sais de cura, etc..

cultivos

iniciadores

matéria-prima

trituração/ moagem

embutimento

fermentação

embalagem

Distribuição/mercado

característica e provocar o desdobramento e transformação de proteínas, lipídios e

carboidratos, garantindo aroma e sabor característico dos embutidos

fermentados/maturados (PARDI et al., 1996).

1.1.1 Embutido fermentado - salame tipo Milano

De acordo com a Instrução Normativa n

22/2000, entende-se por salame tipo

Milano o produto cárneo industrializado, elaborado de carnes suínas ou mistas

(suínas e bovinas), toucinho, adicionado de outros ingredientes, com granulometria

média entre 3 e 6 mm, embutido em envoltórios naturais ou artificiais, curado,

defumado ou não, fermentado, maturado e dessecado por tempo determinado pelo

processo de fabricação. Para a obtenção dos fatores essenciais de qualidade, o

tempo de maturação é de grande importância, variando de acordo com o processo

utilizado e, principalmente, com o calibre, indicado um período de maturação de, no

mínimo, 35 dias para salames com calibre de 70 mm (BRASIL, 2000).

Para a formulação do produto, é necessário o uso de ingredientes obrigatórios

como: carne de suíno (mín. 60%), toucinho, sal, nitrito e/ou nitrato de sódio e/ou

potássio. Os ingredientes opcionais consistem de: carne bovina; leite em pó;

açúcares; maltodextrinas; proteínas lácteas; aditivos intencionais; vinho;

condimentos, aromas e especiarias; substâncias glaceantes (revestimento externo).

É regulamentada a aplicação de coadjuvantes de tecnologia, como os cultivos

iniciadores (starters). Os padrões de identidade e qualidade do salame tipo milano,

quanto às características físico-químicas, prevêem os seguintes valores: Atividade

de água - Aw (máx.): 0,90; Umidade (máx.): 35 %; Gordura (máx.): 35 %; Proteína

(mín.): 23 %; Carboidratos totais (máx.): 4,0 % (BRASIL, 2000).

Produtos cárneos fermentados são ricos em lipídios e, no caso de salame tipo

Milano, um significativo percentual deles é representado por ácidos graxos

monoinsaturados (em torno de 45%) e polinsaturados (aproximadamente 13%)

(ZANARDI et al., 2004).

Ingredientes usados na formulação de salame tipo Milano

- Sal (cloreto de sódio)

É um componente básico de todas as misturas de cura, cuja ação é

potencializar o sabor dos produtos. É extremamente solúvel em água e quando em

contato com a carne se dissolve rapidamente no suco superficial (PARDI, et al.,

1996).

O seu papel em embutidos cárneos envolve: a) retardar o crescimento

microbiano, devido ao aumento da pressão osmótica desidratando o produto,

mediante a adição em geral de concentrações de 2 a 3% em embutidos crus; b)

auxiliar na solubilização das proteínas miofibrilares que influenciam na textura de

produtos cárneos picados; c) aumentar a capacidade de retenção de água em

conseqüência da solubilidade das proteínas; d) contribuir para o aroma dos

alimentos, possivelmente devido à sua interação com os tecidos magros e/ou gordos

para produzir compostos aromáticos desejáveis (ORDÓÑEZ et al., 2005; PEARSON

e GILLET, 1999).

- Sais de cura

O nitrato de sódio (NaNO

) e o nitrito de sódio (NaNO

) são usados para

combater os efeitos adversos do sal na cor da carne, produzindo pigmentos

estáveis. Porém, o nitrito requer menos etapas na estabilização da cor, uma vez que

o nitrato deve ser reduzido primeiro a nitrito, como mostra a figura 2.

NaNO

redução

→ NaNO

(1)

NaNO

meio ácido: pH 5,7

→ HNO

(2)

HNO

redução

→ H

O + N

(3)

redução

→ NO + NO

(4)

redução

→ NO + O

(5)

O NO N

N N N N N N

NO + Fe++ → Fe++ → Fe++

globina (6) globina (7) globina desnaturada (8)

MIOGLOBINA MIOGLOBINA NITROSA HEMOCROMO

Fonte: Forrest et al. (1979).

Figura 2 - Reações químicas características da formação da cor dos produtos cárneos

curados.

O nitrito é convertido, na carne, em ácido nitroso, o qual é reduzido a óxido

nítrico. O óxido nítrico é o componente ativo que se combina com a mioglobina para

formar mioglobina nitrosa, pigmento vermelho característico de produtos cárneos

curados. Pela ação do aquecimento, a mioglobina nitrosa forma um pigmento

estável, o hemocromo, também denominado nitroso hemocromogênio (Figura 2). O

nitrato não possui atividade antioxidante, mas torna-se funcional na redução para

nitrito. As funções importantes do nitrito incluem estabilizar a cor, contribuir para

desenvolver o flavor característico da carne curada, inibir o crescimento de algumas

bactérias (principalmente Clostridium botulinum) e retardar o desenvolvimento da

rancificação (GRAY e PEARSON, 1984; KILLDAY et al., 1988; OSADA et al., 2000).

A quantidade mínima de nitrito requerida para produzir a cor adequada na

carne e em todos os produtos cárneos é estimada entre 30 e 50 mg.kg,

-1

enquanto

que, para produzir aroma típico de curado em um produto cárneo são necessários

de 20 a 40 mg.kg.

-1

Ambos os efeitos devem-se às reações com nitritos e óxido

nítrico nos produtos cárneos (ORDÓÑEZ et al., 2005).

Algumas espécies de microrganismos causadores de toxinfecção, como

Clostridium botulinum e Staphylococcus coagulase positivo, têm seu crescimento

inibido a concentrações de nitritos de 80 a 150 mg.kg

-1

(ORDÓÑEZ et al., 2005).

Segundo Branen e Davidson (1983) apud Terra et al. (2004), o mecanismo de

inibição envolve o bloqueio de sítios sulfidrílicos dentro da célula bacteriana. O

transporte ativo, o recebimento de oxigênio e a fosforilação oxidativa são inibidos

pelo nitrito. A inibição de Clostridium botulinum pode ocorrer pela reação de óxido

nítrico com um composto essencial que contenha ferro, ferrodoxina, dentro de

células germinativas.

O efeito antioxidante do nitrito, provavelmente, é devido à ação quelante do

nitrito para com o ferro não heme liberado durante o corte e moagem da matéria-

prima (ZANARDI et al., 2004). Uma concentração de nitrito de 20 a 50 mg.kg

-1

seria

suficiente para a efetivação da ação antioxidante de nitritos (LÜCKE, 2000).

No produto final, podem ser encontrados de 10 a 20% do nitrito adicionado na

elaboração do produto (THIEMIG et al., 2000). A legislação brasileira (BRASIL,

2000) estabelece um limite máximo residual de nitrito de 30 mg . kg

-1

de produto.

Esse controle se deve em razão de que, em determinadas concentrações,

apresentam riscos de provocar doenças como hipertensão e carcinogênesis

(CAMMACK et al., 1999; PAIK et al., 2005).

- Açúcares

O açúcar também é um conservante que proporciona o aroma de carne

curada e permite o desenvolvimento de algumas bactérias desejáveis, produtoras de

aroma. As condições redutoras criadas pelo açúcar influem na cor da carne curada

porque estabilizam o Fe,

na redução de nitratos a nitritos e ainda destes, a óxido

nítrico. A quantidade de açúcar simples normalmente utilizada fica em torno de 1%,

suficiente para prevenir a oxidação dos pigmentos cárneos, que impede a formação

de derivados indesejáveis durante o processo de cura e, também, serve de fonte de

energia para microrganismos desejáveis (ORDÓÑEZ et al., 2005).

- Condimentos

Os condimentos contribuem para realçar o sabor e o desenvolvimento de

flavor em embutidos secos, mas tem sido demonstrado que possuem atividade

antioxidante e antimicrobiana. Alecrim, orégano, sálvia, cebola, alho pimenta-da-

jamaica e cravo-da-índia são alguns dos condimentos com significativas

propriedades antioxidantes em produtos alimentícios (MADHAVI et al., 1996).

Em alimentos processados sob adequadas condições higiênico-sanitárias e

contendo reduzido número de população microbiana, o efeito antimicrobiano dos

condimentos pode ser efetivo, fornecendo uma proteção contra fungos, bactérias

Gram-positivas e Gram-negativas (DÍAZ et al., 2002). Também contribuem para o

aroma através da formação de compostos voláteis.

- Antioxidantes

A função específica do antioxidante é a de retardar ou impedir a

deteriorização dos alimentos, evitando formação de ranço pelo processo de

oxidação. O ácido ascórbico e eritórbico e seus sais estabilizam alimentos com

gordura, função esta garantida por apresentarem função de seqüestradores de

oxigênio (ORDÓÑEZ et al., 2005).

O ascorbato, geralmente utilizado, previne a oxidação, enquanto o nitrito pode

potencializar a proteção, assim como o uso de cultivos iniciadores também está

relacionado com a atividade antioxidante quando presentes as enzimas catalase e

nitrato redutase.

1.1.2 Bactérias envolvidas na fermentação de embutidos

Hammes e Knauf (1994) destacam que a diversidade de embutidos cárneos

produzidos nas diferentes regiões do mundo teve origem, ao longo dos anos, pela

manipulação artesanal e empírica dos ingredientes e matérias-primas utilizados na

fabricação de salames, cujo processo de fermentação se dava pela ação de

bactérias presentes naturalmente na carne.

Atualmente, a produção de embutidos em pequena escala continua usando o

método tradicional de fermentação espontânea sem adição de cultivos iniciadores.

Os microrganismos originados da própria carne ou do ambiente constituem a

denominada microbiota caseira (PINTO, 2001). De acordo com Moretti et al., (2004),

ao analisarem salame típico Siciliano no Norte da Itália, constataram que tais

embutidos são freqüentemente de qualidade superior comparados a fermentações

controladas inoculadas com cultivos iniciadores, distinguível quanto à análise

sensorial, em parte devido às propriedades da matéria-prima e às características da

tecnologia usada, mas também pela composição específica da microbiota caseira.

Os cultivos iniciadores hoje disponíveis comercialmente, na sua maioria são

compostos de mais de um microrganismo, com a finalidade de somar suas ações

para se obter o efeito desejado no produto final. Dentre as alterações desejáveis

promovidas pelos cultivos iniciadores destacam-se a redução do pH, a produção de

catalase, a redução de nitratos e a produção de enzimas proteolíticas e lipolíticas,

cujas ações promovem a formação de compostos aromáticos típicos de embutidos

fermentados (HOLZAPFEL et al., 1995). No entanto, a aptidão dos mesmos quando

aplicados a um tipo particular de embutido é questionável, posto que uma cultura

eficiente em um tipo de embutido fermentado não necessariamente tem o mesmo

desempenho em outro tipo. Por exemplo, cultivos iniciadores comerciais na Europa,

principalmente produzidos em países do Norte Europeu, nem sempre são capazes

de competir com a microbiota caseira presente em planta de embutidos cárneos no

Sul da Europa, de forma que seu uso freqüentemente resulta em perdas de

características sensorias desejáveis (SAMELIS et al., 1998).

Os microrganismos presentes naturalmente nos produtos artesanais são

Bactérias ácido lácticas (BAL) e cocos Gram positivo catalase positivo (GCC

Espécies GCC

predominantes em embutidos cárneos naturalmente fermentados

pertencem aos gêneros Staphylococcus e Kokuria. S. xylosus, S. carnosus, S.

saprophyticus foram as espécies isoladas como dominantes, mas outras também

ocorrem, como S. equorum, S. warneri, S. epidermidis e S. lentus (MONTEL et al.,

1992, 1996; SAMELIS et al., 1998; COPPOLA et al., 2000; GARCIA-VARONA et.al.,

2000; COCOLIN et al., 2001; ROSSI et al., 2001; PAPAMANOLI et al., 2002;

AYMERICH et al, 2003; GARDINI et al., 2003; BLAIOTTA et al., 2004; MAURIELLO

et al., 2004; DROSINOS et al., 2005; ESSID et al., 2007; FIORENTINI et al., 2007).

Também Kokuria varians foi isolado de embutidos naturalmente fermentados, porém

em menores quantidades (COPPOLA et al., 1997; ENCINAS et al., 2000; OLESEN e

STAHNKE, 2000). Entre as espécies de BAL que aparecem mais freqüentemente e

que foram isoladas de produtos com fermentação natural estão:

Lactobacillus

curvatus, L. sakei e L. plantarum (PARENTE et al., 2001; AYMERICH et al., 2003;

AMMOR et al., 2005; AMMOR et al., 2006; RANTSIOU et al., 2005; DROSINOS et

al., 2007; SAWITZKI et al., 2007).

A grande quantidade de embutidos artesanais fermentados de origens

diferentes representa um potencial da biodiversidade que pode ser explorada para a

obtenção de um cultivo iniciador com características competitivas para dominar o

processo fermentativo. Um dos desafios principais é explorar essa biodiversidade de

produtos e introduzir linhagens que, naturalmente, dominam as fermentações

tradicionais e tendem a ter capacidades metabólicas mais altas que podem afetar

vantajosamente a qualidade do produto, por exemplo, em relação à formação de

aroma ou segurança do produto (AYAD et al., 2000).

Dentre os grupos biológicos estão os microrganismos, cujo desenvolvimento

morfológico é limitado; no entanto, possuem características fisiológicas bem

diversas. Assim, para caracterizar os microrganismos diferentes metodologias são

utilizadas visando à identificação fenotípica e molecular.

Isolamento, identificação e caracterização de Micrococcaceae de produtos

cárneos artesanais asseguram sua aplicação como cultivo iniciador em embutidos

mantendo sua característica artesanal e ao mesmo tempo controlando a

fermentação e os processos de maturação. É uma alternativa de processamento,

porque permite um produto estável à temperatura ambiente e as reações

enzimáticas realizadas por Micrococcaceae influenciam o flavor típico de embutidos

naturalmente fermentados. Porém, a caracterização de tais microrganismos é

necessária para garantir seu uso seguro como cultivos iniciadores e para explorar

sua máxima potencialidade.

A identificação fenotípica é realizada a partir de provas bioquímicas que

consistem na verificação das transformações químicas que ocorrem num substrato

pela ação de um determinado microrganismo. Todo microrganismo produz

alterações nos meios em que se desenvolvem decorrentes das atividades

metabólicas. A maioria das transformações ocorre pela ação de enzimas produzidas

por microrganismos, ou é apenas fisiológica, sem a participação enzimática

(RIBEIRO e SOARES, 1998).

Cada microrganismo possui um sistema enzimático específico, resultando

num perfil bioquímico que possibilita a caracterização de gêneros e espécies

bacterianas. As provas bioquímicas baseiam-se, principalmente, na utilização, pelos

microrganismos, de fontes de carbono e nitrogênio pelas vias metabólicas de

oxidação ou fermentação.

Com o avanço da biologia molecular nos últimos anos, novas metodologias

são aplicadas para a análise de ácidos nucléicos. A classificação dos

microrganismos com base na informação genética tem como vantagem a unificação

do conceito de espécie, a estabilidade da classificação e a obtenção de bons

esquemas de identificação (SILVEIRA et al., 2000).

Para a detecção e identificação de microrganismos em alimentos, os métodos

moleculares vêm sendo amplamente utilizados em procedimentos de caracterização:

RAPD (Amplificação Randômica de DNA Polimórfico) (ROSSI et al., 2001; MARTÍN

et al., 2005), PCR espécie-específica (AYMERICH et al., 2003; MOROT-BIZOT et

al., 2003; RANTSIOU et al., 2005), PCR multiplex (MOROT-BIZOT et al., 2003).

Vários métodos de tipagem/tipificação têm sido igualmente utilizados para a

caracterização de Staphylococcus, como eletroforese em gel de campo pulsado

(PFGE) (SNOPKOVA et al., 1994), eletroforese em gel com gradiente desnaturante

(DGGE) de fragmentos do gene 16S RNAr (COCOLIN et al., 2001; RANTSIOU et al.,

2005) e amplificação da região intergênica 16S-23S (ROSSI et al., 2001; BLAIOTTA

et al., 2003).

A biotecnologia industrial necessita, freqüentemente, identificar uma linhagem

em particular e discriminá-la das outras. A utilização industrial de microrganismos é

uma prática antiga. Entre os produtos industriais gerados pelos microrganismos

estão: 1) Alimentos e suplementos (queijos e iogurtes, carnes fermentadas, picles);

2) Bebidas; 3) Ácidos orgânicos; 4) Enzimas. Hoje, com os avanços da biologia

molecular e da engenharia genética têm-se avançado na utilização de

microrganismos em diversos campos do dia-a-dia do ser humano (MELO, 2002).

Várias pesquisas têm sido conduzidas para a identificação de espécies

bacterianas de Lactobacillus e Staphylococcus coagulase negativo em produtos

cárneos, aplicando a técnica de PCR e/ou suas variações. Morot-Bizot et al. (2003;

2006) desenvolveram iniciadores específicos para identificação de Staphylococcus

xylosus, aplicando PCR específico e PFGE. Aymerich et al. (2003), detectaram seis

espécies de BAL e seis de Staphylococcus coagulase negativo isoladas de

embutidos artesanais e identificaram as mesmas por PCR espécie-específico. Comi

et al., (2004) caracterizaram linhagens de microrganismos starters isolados de

embutidos produzidos artesanalmente pela metodologia de PCR-RAPD. Linhagens

de Staphylococcus spp. isoladas de embutidos cárneos foram caracterizadas pelo

método PCR-DGGE (RANTSIOU et al, 2005).

Como as linhagens de bactérias isoladas de alimentos estão diretamente

envolvidas com a qualidade de produtos fermentados, ou seja, poderão ser usadas

como cultivos iniciadores em embutidos cárneos, é imprescindível optar pela

identificação molecular, pois a identificação fenotípica da microbiota de embutidos

fermentados é insuficiente para caracterizar um microrganismo, uma vez que isto

pode ser incerto devido a uma interpretação subjetiva e ambígua do perfil

colorimétrico resultado de testes bioquímicos, os quais refletem apenas uma

pequena parte da informação genética do microrganismo (QUERE et al., 1997;

BLAIOTTA et al., 2003; AYMERICH et al., 2003).

Segundo Drosinos et al., (2005), as linhagens iniciadoras mais promissoras

são aquelas isoladas de produtos cárneos naturalmente fermentados onde elas

estão bem adaptadas e, na maioria dos produtos é a população dominante. A

seleção de linhagens que apresentam características desejáveis é necessária para

obter embutidos fermentados com propriedades tecnológicas e sensoriais

apropriadas. O primeiro critério na seleção de linhagens para o uso como cultivos

iniciadores é a redução de nitrato, uma vez que influencia na formação da cor

(GARCIA-VARONA et al., 2000). Outros critérios secundários também devem ser

avaliados, como produção de acetoína e atividade de urease (Figura 3). Há

controvérsias em relação a produção de acetoína, alguns autores como Drosinos et

al., (2005), considera desejável pois a partir da acetoína as bactérias podem gerar 2-

3 butanodiol por via oxidativa contribuindo para o flavor, enquanto Garcia-Varona et

al. (2000) considera uma característica negativa pela habilidade das bactérias de

produzirem por redução, o diacetil, que poderá desenvolver flavor indesejável aos

produtos.

(NH

)

CO + H

Figura 3 - Hidrólise da uréia catalisada por urease microbiana.

1.1.3 Fermentação com cultivos iniciadores

Os cultivos iniciadores hoje comercializados consistem, geralmente, da

interação de mais de um microrganismo, buscando potencializar as características

de cada um para a obtenção do efeito desejado no produto final. Dois grupos de

bactérias considerados tecnologicamente importantes e freqüentemente

encontrados em embutidos cárneos são as bactérias ácido lácticas (BAL) e cocos

Gram positivos e catalase positivos (GCC

) da família Micrococcaceae.

Os cultivos iniciadores são adicionados em embutidos cárneos para garantir a

segurança em termos de saúde pública e a redução no tempo de fermentação,

obtendo-se um produto final de qualidade e padronizado, com atributos sensoriais

diferenciados e extensa vida de prateleira (NASSU et al., 2002).

As espécies selecionadas de microrganismos devem garantir qualidade e

homogeneidade ao produto, bem como é essencial que os mesmos sejam tolerantes

entre si, ou, preferencialmente, que cresçam sinergicamente (VARNAN e

SUTHERLAND, 1995). As espécies mais utilizadas na fermentação de carnes são

Lactobacillus e Pediococcus, do grupo de BAL responsáveis pela acidificação dos

produtos cárneos e bactérias do gênero Staphylococcus coagulase negativo e

Kocuria (formalmente Micrococcus), as quais produzem quantidades muito limitadas

de ácido e são utilizadas para a estabilização da cor, o desenvolvimento de flavor

através da prevenção da rancificação e, ainda, a produção de vários compostos

aromáticos, pela sua atividade lipolítica e proteolítica (HOLZAPFEL et al., 1995).

O desenvolvimento de microrganismos no produto depende da formulação e

das condições de processamento, cujos parâmetros mais importantes são

+ 2 NH

amônia

urease

microbiana

temperatura, aw, presença de nitrato/nitrito, concentração de carboidratos e

cuidados higiênicos.

As culturas são disponibilizadas na forma liofilizada ou congelada. A

liofilização é considerada um dos melhores métodos para preservar a viabilidade de

microrganismos. A mais importante vantagem de cultivos iniciadores liofilizados é a

excelente estabilidade de estocagem e fácil manipulação, distribuição e aplicação.

A cultura, quando liofilizada, deve ser diluída antes de sua utilização como

inóculo. Deve-se usar, como diluente, água ou água peptonada 0,1%, isenta de

metais pesados, com redução de cloro e esterilizada. Após a diluição, a cultura deve

ficar em repouso durante 30 minutos. O inóculo não deve ser misturado diretamente

com os demais ingredientes, pois o contato com o sal e sal de cura pode reduzir a

viabilidade e atividade das células (BUSANI,1990).

1.2 MICRORGANISMOS DA FAMÍLIA MICROCOCCACEAE

As espécies da família Micrococcaceae utilizadas em cultivos iniciadores

comerciais são Staphylococcus xylosus, Staphylococcus carnosus e Kocuria varians

(JESSEN, 1995). Apresentam características de cocos Gram positivos, aeróbios

facultativos, catalase positivas, desenvolvem-se a temperaturas ótimas de 25-35

em pH 5,0 a 5,5 e em substratos com 10% de NaCl, são nitrato redutores e não são

produtoras de ácido láctico ( FRAZIER, 1993).

De acordo com Bergey´s Manual of Sistematic Bacteriology, o gênero

Staphylococcus consta de 33 espécies (SCHELEIFER e KLOOS, 2002). Entre as

linhagens de Staphylococcus spp estão muitas bactérias conhecidas por serem

responsáveis por doenças em humanos (Staphylococcus aureus, Staphylococcus

epidermidis). Outras, no entanto, denominadas Staphylococcus coagulase negativa

(SCN), tornaram-se importantes para a indústria de produtos cárneos, sendo usadas

como coadjuvantes de tecnologia durante a fermentação dos produtos (PEREIRA,

2001).

Linhagens de SCN são caracterizadas pelo complexo enzimático que

proporcionam, para muitas espécies, a capacidade lipolítica, a proteolítica, a

produção de nitrato redutase e a catalase. Assim, os efeitos desenvolvidos por

esses microrganismos nos produtos cárneos são a formação e estabilização da cor

em conseqüência da ação de nitrato redutase; a catalase, que evita a formação de

compostos lipídicos de sabor e aroma indesejáveis ao produto final; e a formação de

compostos químicos de sabor característicos de salames, pela ação lipolítica e

proteolítica dos estafilococos, mais a geração de diferentes compostos voláteis

(LÜCKE, 2000; HAMMES e KNAUF, 1994).

Muitas pesquisas realizadas, principalmente em países da Europa,

envolvendo o isolamento de estafilococos de salames, resultaram na identificação

das seguintes espécies: S. xylosus e S. saprophyticus foram dominantes em

embutido fermentado grego (SAMELIS et al., 1998; PAPAMANOLI et al., 2002;

DROSINOS et al., 2005). S. xylosus foi a espécie dominante em embutidos

espanhóis (GARCIA-VARONA et al., 2000). Aymerich et al, (2003) identificaram S.

xylosus, S. carnosus e S. epidermidis em embutidos de baixa acidez. A microbiota

estafilocócica foi mais diversificada em embutidos italianos, em que espécies como

S. xylosus, S. saprophyticus, S. equorum seguidas por S. warneri, S. epidermidis e

S. lentus foram identificadas (COPPOLA et al., 2000; COCOLIN et al., 2001; ROSSI

et al., 2001). Em tradicional embutido francês fermentado e seco, as espécies

dominantes foram S. xylosus, S. carnosus, S. warneri e S. saprophyticus (MONTEL

et al., 1992, 1996).

A origem dessas espécies é atribuída à pele suína e/ou humana, da qual

esses microrganismos fazem parte da microbiota natural (PEREIRA, 2001). S.

saprophyticus e S. epidermidis são as espécies dominantes encontradas em pele de

humanos e, ocasionalmente, isoladas da pele de animais domésticos. Essas

espécies são provavelmente adquiridas da pele da carne de suínos ou de

manipulação humana durante o processamento de embutidos. Uma vez que S.

saprophyticus e S. epidermidis são reconhecidos como patógenos oportunistas

isolados do trato urinário humano, não são recomendados para o uso como cultivos

iniciadores.

Staphylococcus xylosus é uma das espécies freqüentemente utilizadas em

cultivos iniciadores comerciais para aplicação em embutidos fermentados. Esse

microrganismo possui características fisiológicas e tecnológicas importantes para a

fermentação de salames, como a produção de catalase; não produção de

coagulase; formação de ácido a partir de glicose, sacarose, maltose, manose,

lactose, xylose, cerca de 80% das linhagens reduzem nitrato; 40-70% possuem

atividade lipolítica; a maioria possui atividade proteolítica; e crescimento em 7,5%,

10% e 15% de NaCl e em temperaturas de 15 e 45

C (SCHLEIFER e KLOOS,

2002).

1.2.1 Propriedades tecnológicas de linhagens de Staphylococcus xylosus

As linhagens de Staphylococcus coagulase negativa destacam-se pela

importância tecnológica na fermentação de embutidos. Durante esse processo

em embutidos, muitas funções são atribuídas aos estafilococos, principalmente

na formação e estabilização da cor, decomposição de peróxidos e na formação

do flavor do produto.

- Atividade nitrato e nitrito redutase

Na elaboração de produtos fermentados são adicionados sais de cura, como

nitrato e/ou nitrito de sódio, os quais, além do efeito conservante e redução da

rancidez lipídica, conferem aos produtos as características típicas de produto

curado: cor, sabor e aroma (PINTO et al, 2001). A reação de cura requer a presença

de nitrato redutase, que é uma enzima produzida pela bactéria. As linhagens de

Micrococcaceae possuem esta enzima intracelular localizada na membrana

plasmática, cuja atividade possibilita de forma mais rápida o desenvolvimento da cor.

A ação de estafilococos está relacionada ao metabolismo aeróbio facultativo

dos mesmos, possibilitando a redução bacteriana de nitrato a nitrito, a partir do qual

se formará óxido nítrico (NO), que reagirá com a mioglobina para a formação de

nitrosomioglobina, pigmento que fornece a cor característica de produtos curados,

porém instável, que por sua vez, se transforma, por secagem ou cozimento, em

nitrosohemocromogênio, de cor vermelha estável (Figuras 4 e 7) (ALLY et al, 1992).

Em decorrência da adição de sais de cura nos produtos cárneos, é neles

detectada a presença de nitrito residual, composto com ação carcinogênica pela

provável formação de nitrosaminas. Espécies de Staphylococcus possuem atividade

nitrato e nitrito redutase (BERDAGUÉ et al., 1993) e, ainda deve-se registrar que a

ação da enzima nitrito redutase é fundamental para reduzir os níveis de nitrito

residual no produto. Observa-se, além dessas, mais uma ação de linhagens

Micrococcaceae, a capacidade de redução de nitrito, demonstrada pela ausência de

nitrosaminas em produtos cárneos fermentados (PINTO et al., 2001).

Papamanoli et al., (2002) observaram que todas as linhagens de S. xylosus

reduziram nitratos a nitritos a 20 e 30

C. A maioria das linhagens testadas reduziu

nitratos a nitritos quando obtidas pelo método ágar em placas a 18

C (temperatura

freqüentemente usada durante a maturação de embutidos fermentados) (ESSID et

al., 2007). Quando a redução de nitrato para nitrito por linhagens de Staphylococcus

foi detectada por espectrofotômetro e método ágar em placas, diferenças

significativas foram apresentadas entre a atividade determinada a 20 e 30

C para

todas as linhagens testadas. Os resultados obtidos por espectrofotometria

mostraram que todas as linhagens são capazes de reduzir nitrato a 15, 20 e 30

enquanto que para nitrito a maior quantidade foi liberada a 30

C (CASABURI et al.,

2005).

Nitrato

Nitrito NO + H

NO + Mb NOMb

NO + MetMb NOMetMb

NOMetMb NOMb

NOMb + calor + fumaça NO - hemocromogênio

Fonte: Ordóñez et al. (2005).

Figura 4 - Efeitos dos nitratos e/ou nitritos na cor da carne curada, com ação de bactérias

nitrato redutoras. Mb: mioglobina; MetMb: metamioglobina; NOMb: nitrosomioglobina;

NOmetMb: óxido nítrico metamioglobina; NO - hemocromogênio: nitroso-hemocromogênio.

- Ação da catalase

Os estafilococos possuem também a enzima intracelular, catalase, importante

na decomposição de peróxido de hidrogênio (Fig. 5), impedindo a formação de

hidroperóxidos e, assim, previnem a oxidação lipídica. Essa atividade antioxidante

Nitritos

Ausência de luz e ar

Condições favoráveis

Organismos redutores

contribui para o desenvolvimento de um produto com cor, aroma e sabor desejáveis

(FRANCIS, 1993; BARRIÉRE et al., 2001).

O peróxido de hidrogênio pode estar presente em salames em conseqüência

do metabolismo de algumas linhagens de bactérias lácticas presentes no produto. É

um composto indesejável pela sua ação oxidante da mioglobina e de lipídios da

matéria-prima (HAMMES e KNAUF, 1994).

Essa importante atividade tecnológica foi informada em estudos prévios de

Mauriello et al., (2004) e Essid et al., (2007), em que todas as espécies de

Staphylococcus pesquisadas mostraram atividade antioxidante dependente das

linhagens, prevenindo a produção de off-flavors pela oxidação lipídica durante

maturação de embutidos. Em contrapartida, relatos de Casaburi et al., (2005)

demonstram que a mesma atividade nas linhagens testadas apresentou-se

bastante variável.

Figura 5 - Reação de degradação do peróxido de hidrogênio.

- Atividade proteolítica e lipolítica

Para assegurar a qualidade sensorial de embutidos fermentados, é preciso

a contribuição de GCC

(HUGAS e MONFORT, 1997). Staphylococcus spp

podem contribuir para o flavor do produto final não apenas por prevenir a

formação de compostos indesejáveis (atividade da catalase), mas também sendo

responsáveis pela formação de compostos importantes para o flavor de produtos

curados ou de seus precursores (Figura 7), incluindo peptídios, aminoácidos,

aldeídos, aminas e ácidos graxos livres, resultado da ação de proteases e lípases

estafilocócicas sobre proteínas e lipídios da carne (LÜCKE, 2000; MAURIELLO et

al., 2004).

O flavor é a combinação de sabor e aroma e é um fator importante para a

aceitação de um produto, uma vez que é o principal atributo de qualidade. A

característica de flavor dos embutidos fermentados é dada pela combinação de

diferentes compostos voláteis e não voláteis. Alguns são originados da adição de

Catalase

O + O

microbiana

especiarias, outros são metabólitos ou produtos químicos derivados de carboidratos,

lipídios e proteínas durante o período de fermentação e cura do produto. O

crescimento microbiano no embutido, juntamente com a atividade enzimática da

carne e dos lipídios, é certamente responsável por muitos desses compostos

(STAHNKE, 1994).

Leistner (1991) também cita que muitos destes compostos são formados, no

produto, por reações químicas e enzimáticas durante o processo de maturação e

estocagem, e destaca que o perfil aromático de embutidos fermentados curados

consiste de uma ampla variedade de compostos, tais como hidrocarbonetos,

aldeídos, ácidos, cetonas, álcoois, ésteres, sulfídicos, nitritos e outros. A proporção

entre esses compostos é influenciada pelas linhagens de Staphylococcus e contribui

para o flavor dos embutidos. Por essa razão, para a produção de embutidos com

flavor típico de um produto fermentado curado, é necessário selecionar cultivos

iniciadores pelo seu potencial aromático.

Fonte: Buckenhüskes (1993), com modificações.

Figura 7 - Ação de bactérias GCC

durante a fermentação de embutidos.

Berdagué et al. (1993) foram os primeiros a sugerir que Staphylococus spp

são os maiores responsáveis pelo efeito de aromas em embutidos fermentados.

Linhagens de Staphylococcus spp, adicionadas como cultivos iniciadores em

embutidos fermentados, além de reduzir nitratos a nitritos e produzir catalase,

Enzimas

lipolíticas

ausência de

oxidação lipídica

ácidos

graxos

peptídios e

aminoácidos

secagem

HNO

Enzimas

proteolíticas

Nitrato redutase

Catalase

nitrosomioglobina

mioglobina

nitrosohema

Flavor

cor vermelha

podem influenciar o nível de muitos compostos aromáticos, contribuindo para o

desenvolvimento do flavor típico.

Lipólises ocorrem, em embutidos, pela ação de enzimas endógenas (carne e

gordura) e/ou pela atividade de microrganismos, geralmente GCC

, considerados os

responsáveis pela quebra de lipídios em embutidos fermentados (SAMELIS et al.,

1993; MONTEL, 1998). Os compostos de aroma produzidos pela degradação de

lipídios ocorrem durante os períodos de fermentação e maturação pela hidrólise de

frações de lipídios, originando a liberação de ácidos graxos livres por triglicerídios e

fosfolipídios (MOLLY et al., 1997). Os ácidos graxos livres, que resultam de

processos lipolíticos, representam um papel importante no desenvolvimento do

sabor típico em embutidos fermentados, e são, além disso, os precursores dos

ésteres, aldeídos, cetonas, lactonas e dos álcoois, que podem contribuir

consideravelmente ao perfil sensorial final dos embutidos (SAMELIS et al., 1993;

HIERRO et al., 1997).

Entre os ácidos graxos livres de cadeia longa encontrados em estudos de

Galgano et al. (2003) e Zuber et al. (2007) em embutidos inoculados de bactérias

Lactobacillus sakei e S. xylosus, estão o ácido oléico (predominante nas amostras),

linoléico, palmítico, esteárico e mirístico. Já os ácidos graxos livres de cadeia curta

foram representados por ácido acético, butírico, capróico e propiônico.

Os produtos cárneos fermentados são ricos em lipídios e, no caso de salame

tipo Milano, por exemplo, uma porcentagem significativa deles é composta de ácidos

graxos monoinsaturados (45%) e polinsaturados (aproximadamente 13%) (ZANARDI

et al., 2004). A geração e a transformação, principalmente de ácidos graxos livres

insaturados, são consideradas muito importantes para o desenvolvimento de flavor

no embutido fermentado, devido às diferentes conversões oxidativas de ácidos em

componentes de aroma (CHIZZOLINI, NOVELLI e ZANARDI, 1998).

Os ácidos graxos livres são mais suscetíveis à oxidação do que os

triglicerídios e fosfolipídios, comprovado pelo aumento de sua quantidade no final da

fase de maturação de embutidos (COUTRON-GAMBOTTI e GANDEMER, 1999).

Compostos originados da autooxidação de lipídios como hexanal e octanal são

importantes não para o flavor, mas contribuem para o aroma de ranço (STAHNKE,

2000). É importante considerar que um excesso de oxidação lipídica origina

produtos que podem desencadear reações secundárias, resultando em compostos

indesejáveis característicos de rancidez e/ou tóxicos, com possíveis perigos para a

saúde humana (ZANARDI et al., 2004).

Determinados fatores interferem no grau de lipólise, como o pH, que pode ser

decisivo; a temperatura de fermentação, que, quanto mais elevada, maior produção

de ácidos graxos livres; e os níveis de sais, em que valores reduzidos desencadeiam

maior produção de ácidos graxos livres (STAHNKE, 1995; SORENSEN e

JAKOBSEN, 1996). O potencial de lipólise apresentado pelos microrganismos pode

ser afetado pelo pH do embutido cárneo, pois, em virtude da sensibilidade ao pH por

GCC

, seu número pode reduzir e sua atividade enzimática pode ser comprometida

(SONDERGAARD e STAHNKE, 2002).

Staphylococcus, em particular S. xylosus e S. carnosus, produzem o aroma

pela conversão de aminoácidos (particularmente de cadeia ramificada, aminoácidos

leucina, isoleucina e valina) (STAHNKE et al., 2002; BECK et al., 2004; OLESEN et

al., 2004; TJENER et al., 2004). Montel et al. (1998) e Stahnke et al. (2002)

estudaram a formação de compostos aromáticos pela degradação de proteínas, e o

metabolismo de aminoácidos (leucina, isoleucina, fenilalanina), aldeídos e produtos

secundários: ácidos, álcoois e ésteres. Os microrganismos Micrococcaceae,

responsáveis por essas conversões produzem 2 e 3-metilbutanal, 2-metilpropanal,

metional, fenilacetaldeído, e muitos outros (BERDAGUÉ et al. (1993);

STAHNKE(1994); MONTEL et al. (1996).

O aldeído 3-metilbutanal é derivado da degradação microbiológica da L-

leucina (Figura 6), constatado após a adição desta em meio de cultura inoculado

com Staphylococcus xylosus, observando-se um aumento na quantidade de 3-

metilbutanal e 3-metilbutanóico em relação ao controle (MOLLER et al., 1998). Os

mesmos metabólitos foram obtidos por Larrouture et al. (2000) quando o

aminoácido foi adicionado em meio de cultura contendo S.carnosus e S. xylosus.

Muitas pesquisas têm sido realizadas e os resultados divulgados, referentes a

compostos aromáticos isolados de embutidos fermentados. Berdagué et al. (1993)

mostraram que embutidos produzidos com diferentes cultivos iniciadores

pertencentes à família Micrococcaceae têm diferentes padrões aromáticos,

indicando que eles resultariam em embutidos com diferente perfil sensorial. Assim

também, a pesquisa desenvolvida por Tjener et al. (2003) demonstrou que a

produção de aromas em embutidos fermentados com culturas de Pediococcus

pentosaceus e Staphylococcus xylosus resulta da formação de compostos

desejáveis para o sabor de embutido maturado.

Fonte: Larrouture et al. (2000).

Figura 6 - Degradação microbiológica de L-leucina.

A natureza das culturas iniciadoras tem uma grande influência na composição

volátil e nas características sensoriais, contribuindo para o flavor de embutidos

curados. A proteólise é uma das reações enzimáticas que, além de contribuir para o

desenvolvimento de odor (compostos voláteis), também é responsável, em parte, na

formação do flavor particular no produto cárneo (BERDAGUÉ et al., 1993).

O uso de linhagens bem selecionadas que geram altas quantidades de

compostos aromáticos pode permitir alcançar melhor qualidade sensorial e/ou

acelerar o processo de fermentação da carne. A seleção de Staphylococcus

apropriados para aplicação é crucial. Linhagens de S. xylosus, por exemplo,

predominam em salames no Sul da Europa, os quais são caracterizados por um

aroma arredondado e um gosto menos ácido, sendo recomendadas quando a

intenção é a produção de embutidos muito aromáticos (SAMELIS et al., 1998). As

linhagens produziram, entre outros, os seguintes compostos: 3-metil-1-butanol,

diacetil, 2-butanona, acetoína, benzaldeido e metil-cetonas (STAHNKE, 1999;

SONDERGAARD e STAHNKE, 2002). Dados divulgados por OLESEN et al., (2004)

confirmam a teoria de que linhagens de Staphylococcus, utilizadas como cultivos

Aminoácido oxi

dase

Leucina + alfa-cetoácido

ácido hidroxi alfa

cetoisocapróico

ácido alfa-cetoisocapróico

aminoácido

alfa

cetoácido aminotransferase

dehidrogenase

ácido alfa

cetoisocapróico

complexo

multienzimático

alfa-cetoácido

dehidrogenase

3- metilbutanal

descarboxilase

ácido 3-metilbutanóico 3-metilbutanol

álcool

dehidrogenase

aldeído

dehidrogenase

iniciadores, são fundamentais para a formação de importantes compostos voláteis

em embutidos fermentados.

- Atividade antagonista

Esta propriedade é a combinação de efeitos de diferentes fatores biológicos,

resultado de atividades metabólicas de microrganismos e suas interações

competitivas. Microrganismos benéficos (BAL e Micrococcaceae) garantem a

segurança de embutidos fermentados, pois, durante o processo fermentativo, são

capazes de produzir metabólitos com propriedades antimicrobianas, tais como ácido

acético, peróxido de hidrogênio e bacteriocinas (HOLZAPFEL, 2002).

Segundo Lauková e Mareková (1993), essa atividade ocorre devido à

capacidade de GCC

de produzir bacteriocinas, observada pela atividade inibitória

de S. xylosus contra Listeria monocytogenes e outras bactérias Gram positivas.

Simonová et al. (2006) testaram linhagens de S. xylosus e S. carnosus que também

mostraram atividade inibitória contra L. innocua e Pseudomonas sp.

A maioria das linhagens de S. xylosus testadas por Essid et al., (2007) apresentou

ação antimicrobiana contra quatro bactérias indesejáveis: Salmonella arizonae,

Escherichia coli, Pseudomonas aeuroginosa e Enterococcus faecalis. Mesmo que

resultados positivos tenham sido demonstrados sobre a atividade inibitória de SCN

contra diferentes patógenos, a eficácia da atividade antimicrobiana das linhagens

precisa ser confirmada em produtos cárneos fermentados, pois fatores ambientais

no alimento específico podem afetar a produção de substâncias antimicrobianas

(PAPAMANOLI et al., 2002)

1.2.2 Efeitos adversos de linhagens de Staphylococcus spp

- Produção de enterotoxinas

As enterotoxinas estafilocócicas (SE) são uma família de nove principais tipos

sorológicos, termoestáveis, resistentes à pepsina, com peso molecular em torno de

26.000 a 29.600 Da. Causam gastroenterites como resultado do consumo de

alimentos contaminados, incluindo vômito com ou sem diarréia (BALABAN e

RASOOLY, 2000; CARMO et al., 2002).

Algumas linhagens de GCC

(S. xylosus, S. saprophyticus) originadas de

alimentos podem produzir enterotoxinas (RODRÍGUEZ et al.,1996; PADMAPRIYA et

al., 2003). Linhagens de Staphylococcus spp. coagulase negativo que produzem

enterotoxinas têm sido isoladas, mas há muito pouca informação sobre seu papel

em alimentos contaminados (CARMO et al., 2002).

SEs podem ser detectadas in vitro ou pelas suas atividades biológicas in vivo.

No entanto, a detecção de rotina é por métodos imunológicos, como imunodifusão,

radioimunoensaio, aglutinação em látex, ensaios imunoenzimáticos (ELISA -

Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Um método alternativo para verificar a

capacidade enterotoxigênica de linhagens de estafilococos é a detecção específica

de genes de toxinas através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) (FREIRAS

et al., 2004). No entanto, apenas a presença desses genes não indica,

necessariamente, a capacidade de o microrganismo produzir toxina biologicamente

ativa suficiente para induzir manifestações clínicas (McLAUCHLIN et al., 2000).

Por outro lado, segundo Rodríguez et al. (1996), a presença de gens deve ser

considerada para todas as linhagens de Staphylococcus, especialmente quando as

mesmas são selecionadas para uso como cultivo iniciador em alimentos.

- Produção de aminas biogênicas (AB)

São compostos resultantes da decarboxilação ácida de aminoácidos por

microrganismos. Algumas ABs podem estar presentes, naturalmente, em baixas

concentrações em muitos alimentos e relativamente alto conteúdo em alimentos

fermentados (BOVER-CID et al., 1999). A produção de AB é uma característica de

diversos grupos de microrganismos, tais como Enterobacteriaceae, Pseudomonas

spp, Micrococcaceae, enterococos e BAL. As principais aminas encontradas em

alimentos são as histaminas, tiramina, putrescina e cadaverina, responsáveis pela

presença de odores desagradáveis.

A concentração de ABs em produtos fermentados tende a aumentar com o

aumento do período de maturação e com a atividade proteolítica da microbiota

superficial do produto (PINTO et al., 2001). Entretanto, não foi verificada nenhuma

correlação entre o índice de proteólise e a produção de aminas biogênicas durante o

processo de fermentação de embutidos inoculados com culturas de S. carnosus e S.

xylosus (BOVER-CID et al., 1999). A ausência de formação de ABs deve ser um

critério importante quando da seleção de cultivos iniciadores para embutidos

fermentados. Masson et al., (1996) relataram que S. carnosus e S. xylosus podem

ser usados como cultivos iniciadores seguros pela sua produção de tiramina in vitro.

No entanto, Straub et al. (1995) observaram que S. carnosus tem um potencial

notável para formar ABs, mas o mesmo não foi percebido para S. xylosus.

Existem enzimas capazes de degradar ABs. São as denominadas amino

oxidases, encontradas em bactérias, fungos e células de animais e vegetais,

capazes de catalisar a desaminação oxidativa de aminas com a produção de

aldeídeos, peróxido de hidrogênio e amônia (COOPER, 1997).

Estudos de Martuscelli et al. (2000) relatam a capacidade para degradar ABs

in vitro de muitas linhagens de S. xylosus isoladas de embutidos fermentados

artesanais no Sul da Itália. Entre as linhagens testadas, S. xylosus S81 mostrou uma

alta capacidade de histamina oxidase e foi capaz de degradar uma parte de tiramina.

Gardini et al. (2002) observaram, em suas pesquisas que a presença de ABs em

alimentos é conseqüência de um complexo equilíbrio entre o ambiente do embutido

e as atividades enzimáticas da população microbiana. Estes resultados sugerem que

a presença e relativa atividade de amino oxidases devem ser consideradas como

uma importante característica distintiva na seleção de cultivos iniciadores para a

produção de alimentos fermentados.

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2 CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E MOLECULAR DE Staphylococcus

xylosus: POTENCIAL TECNOLÓGICO PARA USO EM EMBUTIDOS

FERMENTADOS

Artigo 1

Artigo com aceite para publicação em:

Brazilian Archives of Biology and Technology

Caracterização fenotípica e molecular de Staphylococcus xylosus:

Potencial tecnológico para uso em embutidos fermentados

Ângela Maria Fiorentini,

1 2

Maristela Cortez Sawitzki,

1 4

Teresinha Marisa Bertol,

Fábio Cristiano Angonesi Brod,

Márcia Regina Pelisser,

Ana Carolina Maisonnave

Arisi,

Ernani Sebastião Sant’Anna.

RESUMO

Linhagens de Micrococcaceae são aplicadas em embutidos cárneos

fermentados como culturas iniciadoras, onde vários membros desta família são

naturalmente encontrados. O objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar

Staphylococcus xylosus de embutidos cárneos artesanais produzidos na região Sul

do Brasil. Dos 89 isolados que apresentaram atividades positiva para catalase e

negativa para coagulase, 25 cepas foram selecionadas para caracterização

fenotípica. Nove cepas identificadas como Staphylococcus xylosus por API STAPH

foram avaliadas para capacidade de redução de nitratos e o crescimento satisfatório

das cepas foi verificado na presença de nitrito e NaCl, demonstrando seu potencial

para utilização como culturas iniciadoras em embutidos cárneos fermentados. As

linhagens foram ainda avaliadas quanto ao gênero e espécie através da reação de

polimerase em cadeia (PCR), e apenas duas linhagens foram identificadas como S.

xylosus, diferindo dos resultados encontrados na caracterização fenotípica.

Palavras-chave: Staphylococcus xylosus, embutido fermentado, cultivos iniciadores,

PCR

ABSTRACT

Phenotypic and molecular characterization of Staphylococcus xylosus:

Technological potencial for use in fermented sausage.

Micrococcaceae strains are applied to fermented sausage as starter cultures,

where several members of this family are naturally found. The aim of the present

work was to isolate and characterize Staphylococcus xylosus from artisanal

sausages produced in South Region of Brazil. From 89 isolates presenting catalase

positive and coagulase negative activities, 25 strains were selected for phenotypic

Depto. de Ciência e Tecnologia de Alimentos, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal de

Santa Catarina, Rod. Admar Gonzaga, 1346, 880034-001, Florianópolis, SC, Brasil

Depto. de Biologia e Química - UNIJUÍ RS 344, km 39, 98900-000, Santa Rosa, RS, Brasil

EMBRAPA SUÍNOS e AVES, BR 153, km 110, 89700-000, Concórdia, SC, Brasil

Universidade Estadual do Rio Grande do Sul, Rua Nelsis Ribas Fritsch, 1111, 98.200-000, Ibirubá,

RS, Brasil.

characterization. Nine strains identified as Staphylococcus xylosus by API STAPH

were evaluated for its nitrate reduction capacity and satisfactory growth of the strains

was verified in the presence of nitrite and sodium chloride, demonstrating their

potential for use as starter cultures in fermented sausage. The strains were also

evaluated through genus and species-specific PCR and only two were identified as

S. xylosus, differing from results found in phenotypic characterization.

Key words: Staphylococcus xylosus, fermented sausage, starter cultures, PCR.

INTRODUÇÃO

Bactérias ácido lácticas (BAL) e cocos Gram positivo catalase positivo (GCC

)

(Micrococcaceae) são as bactérias mais importantes encontradas em embutidos

cárneos, sendo fundamentais para a tecnologia de fabricação. Elas são usadas

como cultivos iniciadores em produtos cárneos, sendo as BAL responsáveis pela

produção de ácido láctico e prevenção do crescimento de patógenos e a família

Micrococcaceae, principalmente linhagens de Staphylococcus e Kocuria, são

conhecidas por proporcionar a formação e estabilização da cor e prevenção da

oxidação lipídica em produtos cárneos fermentados. Além disso, estas linhagens

também influenciam o nível de compostos aromáticos devido à sua atividade

lipolítica e proteolítica (TALON et al., 2002; AYMERICH et al., 2003; SPRICIGO e

PIANOVSKY, 2005).

Várias espécies estafilocócicas foram isoladas de embutidos fermentados.

Linhagens de S. xylosus e S. saprophyticus foram dominantes em embutido

fermentado grego (Samelis et al., 1998; Papamanoli et al., 2002; Drosinos et al.,

2005). Em embutidos espanhóis, S. xylosus foi a espécie dominante (GARCIA-

VARONA et.al., 2000). Aymerich et al. (2003) identificaram S. xylosus, S. carnosus e

S. epidermidis em embutidos de baixa acidez. A microbiota estafilocócica foi mais

diversificada em embutidos italianos, em que espécies como S. xylosus, S.

saprophyticus e S. equorum seguidas por S. warneri, S. epidermidis e S. lentus

foram identificadas (COPPOLA et al., 2000; COCOLIN et al., 2001a; ROSSI et al.,

2001). Em tradicional embutido francês fermentado e seco, as espécies dominantes

foram S. xylosus, S. carnosus, S. warneri e S. saprophyticus (MONTEL et al., 1992,

1996).

S. xylosus é usada na indústria cárnea como um cultivo iniciador para

embutidos fermentados, uma vez que assegura a formação da cor e contribui para o

desenvolvimento de flavor (Martín et al., 2005). As linhagens iniciadoras mais

promissoras são aquelas isoladas de produtos cárneos naturalmente fermentados,

em que elas estão mais bem adaptadas e constituem a população dominante

(DROSINOS et al., 2005).

Isolamento, identificação e caracterização de Micrococcaceae de produtos

cárneos artesanais asseguram sua aplicação como cultivo iniciador em embutidos,

mantendo sua característica artesanal mediante o controle da fermentação e dos

processos de maturação. É considerada uma boa alternativa de processamento

porque permite um produto estável à temperatura ambiente e as reações

enzimáticas realizadas por Micrococcaceae influenciam o flavor típico de embutidos

naturalmente fermentados. Porém, a caracterização de tais microrganismos é

necessária para garantir seu uso seguro como cultivos iniciadores.

A identificação da microbiota de embutidos cárneos somente através de

métodos fenotípicos é insuficiente para caracterizar um microrganismo, uma vez que

existe incerteza (BLAIOTTA et al, 2003), devido a uma interpretação subjetiva e

ambígua do perfil colorimétrico resultante de testes bioquímicos (fermentação de

carboidratos) (QUERE et al., 1997). Por isso, os métodos moleculares vêm sendo

amplamente utilizados em procedimentos de caracterização: RAPD (Randomly

Amplified Polymorphic DNA) (ROSSI et al., 2001; MARTÍN et al., 2005), PCR

espécie-específica (AYMERICH et al., 2003; MOROT-BIZOT et al., 2003;

RANTSIOU et al., 2005), PCR multiplex (MOROT-BIZOT et al., 2003). Vários

métodos de tipagem/tipificação têm sido igualmente utilizados para a caracterização

de Staphylococcus, como gel de eletroforese em campo pulsado (PFGE)

(SNOPKOVA et al., 1994), gradiente desnaturante em gel de eletroforese (DGGE)

de fragmentos do gene 16S RNAr (COCOLIN, et.al., 2001b; RANTSIOU, et.al.,

2005) e amplificação da região intergênica 16S-23S (ROSSI et.al., 2001; BLAIOTTA

et al., 2003).

O objetivo do presente trabalho foi isolar e caracterizar Staphylococcus

xylosus de embutidos artesanais produzidos na Região Sul do Brasil por meio de

métodos fenotípicos e moleculares, como também caracterizar seu potencial

tecnológico para uso como cultivos iniciadores em embutidos fermentados.

MATERIAL E MÉTODOS

Isolamento de Micrococcaceae

Linhagens selvagens de Micrococcaceae foram isoladas de trinta e oito (38)

amostras de embutidos artesanais coletadas em vinte e uma (21) cidades da Região

Sul do Brasil. Depois de remover o invólucro, 25 g de cada amostra foram

homogeneizadas em 225 mL de água peptonada 0,1%. Diluições decimais foram

preparadas com posterior plaqueamento utilizando ágar BHI (Brain Heart Infusion),

incubadas a 35

C/48 horas e, então, purificadas pelo método de esgotamento por

estrias em ágar BHI (Merck). As linhagens isoladas foram imediatamente submetidas

aos testes de coloração de Gram, catalase e coagulase, para assegurar sua

classificação na Família Micrococcaceae e armazenadas a –50

C em caldo BHI com

20% de glicerol.

Caracterização fenotípica

As linhagens isoladas foram submetidas ao teste de produção de coagulase

usando plasma de coelho em EDTA (Merck). Galerias do sistema API Staph

(BioMérieux) foram, igualmente, usadas. O sistema provê os seguintes testes:

produção de uréia, arginina, acetil-glucosamina, redução de nitrato, formação de

acetoína e fermentação de carboidratos (maltose, d-manitol, d-mannose, lactose,

sucrose, rafinose, d-trealose, d-xylose, d-glucose, d-fructose). Conforme instruções

do fornecedor, a suspensão bacteriana foi inoculada nas galerias e incubada a 36

durante 18-24 horas.

Efeito da temperatura, pH e concentrações de cloreto de sódio (NaCl)

O efeito de pH foi testado através do crescimento em caldo BHI (Merck),

ajustado para valores de pH de 5,0 e 5,5. Efeito de diferentes concentrações de

NaCl foi avaliado pelo crescimento em caldo BHI (Merck), suplementado com 10% e

15% de NaCl. Ambos os testes foram avaliados pela habilidade de crescimento em

diferentes temperaturas: 15ºC e 45ºC.

Tolerância para NaCl e nitrito de sódio (NaNO

)

A tolerância para NaCl e NaNO

foi testada através de crescimento em ágar

BHI (Merck), suplementado com diferentes concentrações de NaCl (1,5%, 2,0%,

2,5% e 3,0%) e NaNO

(80, 100, 120, 150 e 200 µg/g) e incubados a 35ºC/48h. Foi

examinada a tolerância simultânea de linhagens para NaCl e NaNO

em ágar BHI

(Merck), suplementados com NaCl (3%) e NaNO

(200 µg/g) incubadas a 35°C/48h.

Capacidade para reduzir nitritos

A habilidade de linhagens para reduzir nitritos foi testada em caldo BHI

(Merck) com pH 5,0, suplementado com 156 e 300 µg/g de NaNO

e incubadas a

35°C/48h. O nível de nitrito residual foi medido po r espectrofotometria a 474 nm

(HARRIGAN e MCCANCE, 1976).

Atividade lipolítica

A atividade lipolítica das linhagens foi testada de acordo com Kouker e Jaeger

(1987) e Haba et al. (2000). O meio, contendo 0,8% de caldo nutriente (BBL), 0,4%

de NaCl e 1% de ágar-ágar, foi ajustado a pH 7, autoclavado (121ºC por 15 min) e

esfriado a 60ºC. O azeite de oliva extra-virgem, concentração final de 2,5%, foi

esterilizado separadamente em autoclave e 10 mL de Rodamina B (1mg/mL, Sigma)

dissolvida em água destilada esterilizada por filtração foi adicionada ao meio. Após a

homogeneização, usada para uma correta emulsificação, o meio de cultura foi

dispensado em placas de Petri. A atividade de lipase foi identificada nas placas

como um halo fluorescente laranja sob luz UV a 350 nm após 24-26 h de incubação

a 37°C.

Caracterização molecular

As linhagens isoladas caracterizadas fenotipicamente como Staphylococcus

xylosus e a linhagem de referência ATCC 29971 foram multiplicadas overnight em

caldo BHI a 35

C. Alíquotas de 1 mL de cada cultura foram centrifugadas a 13.000 g

por 2 minutos, sob refrigeração, e a extração de DNA foi realizada a partir do

precipitado das células, conforme o protocolo do kit Wizard



Genomic DNA

Purification (Promega).

Amplificações foram executadas com os iniciadores TstaG422/Tstag765

(Martineau et al., 2001) e XYLF/XYLR (MOROT-BIZOT et al., 2003; CORBIÉRE

MOROT-BIZOT et al., 2004) permitindo a identificação do gênero Staphylococcus e

da espécie S. xylosus, respectivamente. Os iniciadores TstaG422/Tstag765 e

XYLF/XYLR amplificam fragmentos de 370 bp e 539 bp, respectivamente (MOROT-

BIZOT et al., 2003). Além disso, uma linhagem de referência de Lactobacillus

plantarum (ATCC 8014) foi usada como controle negativo em todas as reações de

PCR.

Para a identificação molecular ao nível de gênero, reações de PCR foram

realizadas em um volume final de 25 µL contendo 2 µL de DNA extraído, 2,5 mM de

MgCl

, 0,2 µM de cada iniciador TstaG422/Tstag765, 200 µM de cada dNTP e 1,25

U de Taq DNA polimerase em tampão 1X, de acordo com as instruções do

fabricante (Promega). Amplificações foram executadas em um Minicycler

(MJ

Research, Inc. Watertown, MA), sob as seguintes condições: 3 min a 96ºC, 40 ciclos

de 30 s a 95ºC, 60 s a 55ºC, 30 s a 72ºC e uma extensão final de 3 min a 72ºC

(MOROT-BIZOT et al., 2003; MARTINEAU et al., 2001).

Para a identificação molecular ao nível de espécie, reações de PCR foram

realizadas em um volume final de 25 µL contendo 2 µL de DNA extraído, 1,5 mM de

MgCl

, 0,2 µM de cada iniciador XYLF/XYLR, 200 µM de cada dNTP e 1,25 U de

Taq DNA polimerase em tampão 1X, de acordo com as instruções do fabricante

(Promega). Amplificações foram executadas em um Minicycler

(MJ Research, Inc.

Watertown, MA), sob as seguintes condições: 5 min a 94ºC, 40 ciclos de 60 s a

94ºC, 60 s a 55ºC, 3 min a 72ºC e uma extensão final de 6 min a 72ºC (MOROT-

BIZOT et al, 2003; CORBIÉRE MOROT-BIZOT et al., 2004).

Os produtos de PCR (10 µL da reação + 2 µL de tampão de carga) foram

separados por electroforese a 400mA e 80V por 50 min em gel de agarose 2,5%,

com tampão TBE 1X corado com brometo de etídio. A visualização foi executada em

transiluminador UV e as imagens registradas com uma máquina fotográfica digital

(Canon Powershot A70).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

De um total de 175 linhagens de Micrococcaceae isoladas de embutidos

naturalmente fermentados, 89 (50,8%) são catalase positivo e coagulase negativo.

Destas, 25 linhagens foram escolhidas aleatoriamente e submetidas ao sistema API

STAPH, para a caracterização fenotípica das mesmas (Tabelas 1 e 2). Vinte e uma

(84%) das vinte e cinco linhagens foram identificadas como Staphylococcus ssp,

uma linhagem (4%) foi identificada como Kocuria varians e três (12%) apresentaram

perfil duvidoso. Considerando as linhagens identificadas como Staphylococcus,

Staphylococcus xylosus foi a espécie dominante (42,8%), seguida por S.

saprophyticus (28,5%), S. lentus (19%), S. epidermidis (4,7%) e S. warneri (4,7%).

Papamanoli et al. (2002) encontraram S. saprophyticus como a espécie dominante,

seguida por S. xylosus, S. carnosus em embutido fermentado seco. Samelis et al.

(1998) mostraram que S. saprophyticus e S. xylosus dominaram a população de

Micrococcaceae em salame tradicional grego. Essas espécies ocorrem em várias

regiões da Europa e são relatadas em alguns estudos sobre isolamento e

caracterização fenotípica de micrococos em produtos cárneos: S. saprophyticus

(SEAGER et al., 1986; COPPOLA et al., 2000), S. epidermidis (KOTZEKIDOU, 1992;

COPPOLA et al., 2000) e S. xylosus (MIRALLES et al., 1996; COPPOLA et al.,

2000).

S. xylosus é a espécie dominante na maioria de embutidos fermentados

secos, sendo usada como cultivo iniciador por causa de sua contribuição na

formação do flavor e da cor. Por outro lado, S. saprophyticus e S. epidermidis são as

espécies dominantes encontradas na pele de humanos e, ocasionalmente, isoladas

da pele de animais domésticos. Essas espécies são provavelmente adquiridas da

pele e da carne de suínos, ou de manipulação humana durante o processamento de

embutidos. Uma vez que S. saprophyticus e S. epidermidis são reconhecidos como

patógenos oportunistas isolados do trato urinário humano, não são recomendados

para o uso como cultivos iniciadores.

A maioria das linhagens identificadas como S. xylosus apresentou as

características típicas das espécies (Tabelas 1 e 2), como redução de nitrato

(88,8%), produção de acetoína (77,7%), produção de ácido a partir de xilose (77,7%)

e manose (88,8%), mas não de rafinose (11,1%). Algumas linhagens identificadas

como S. xylosus não fermentaram xilose e manose, como também relatado por

Drosinos et al. (2005) e Samelis et al. (1998). Poucas linhagens identificadas como

S. saprophyticus foram capazes de reduzir nitrato (33,3%), enquanto 83,3%

produziram acetoína. As linhagens identificadas como S. saprophyticus, em sua

maioria, não produziram ácido pela fermentação de manose e xilose, mas foram

capazes de fermentar maltose e trealose.

A seleção de linhagens que apresentam características desejáveis é

necessária para obter embutidos fermentados com propriedades tecnológicas e

sensoriais apropriadas. O primeiro critério na seleção de linhagens para uso como

cultivos iniciadores é redução de nitrato, uma vez que influencia na formação da cor

(GARCIA-VARONA et al., 2000). Outros critérios secundários também devem ser

avaliados como produção de acetoína e atividade de urease. No presente trabalho,

linhagens identificadas como S. xylosus apresentaram características desejáveis,

também informadas por Drosinos et al. (2005): atividades de nitrato redutase e

urease e produção de acetoína. De acordo com Smith e Palumbo (1983), tolerância

para NaCl e NaNO

e crescimento entre 27°C e 43°C são outras caracte rísticas

importantes. Linhagens testadas no presente trabalho mostraram atividades de

catalase positivo e coagulase negativo, crescimento a 15°C e 45°C, nas

concentrações de NaCl (10% e 15%) e nos valores de pH 5,0 e 5,5 em caldo BHI

(Tabela 3).

Tabela 1

Testes bioquímicos para a identificação de Staphylococcus isolados de embutidos

naturalmente fermentados

Identificação Isolados

Redução

Nitrato

Uréia Acetoína

Acetil-

glucosamina

Arginina Catalase Coagulase

S. xylosus

9(36) 8(88,8) 4(44,4) 7(77,7) 8(88,8) 8(88,8) 9(100) 0

saprophyticus

6(24) 2(33,3) 5(83,3) 5(83,3) 4(66,6) 0 6(100) 0

S. lentus

4(16) 3(75) 0 0 4(100) 1(25) 4(100) 0

S. epidermidis

1(4) 1(100) 1(100) 0 1(100) 1(100) 1(100) 0

S. warneri

1(4) 1(100) 1(100) 0 1(100) 0 1(100) 0

Perfil duvidoso

3(12) 2(66,6) 1(33,3) 0 0 2(66,6) 3(100) 0

Obs: Os valores entre parênteses representam % de isolados positivos.

O crescimento das linhagens não foi inibido em substrato sólido (ágar BHI)

sob diferentes concentrações de NaCl, mostrando tolerância a uma concentração de

3% deste sal (Figura 1). A linhagem AD1 mostrou acentuada diminuição no

crescimento, de 7 log UFC/mL para 8 log UFC/mL. Sete (7) das nove (9) linhagens

toleraram uma concentração de 200 µg/g de NaNO

e seu crescimento não foi

mudado considerando a ausência de NaNO

(Figura 2).

Tabela 2

Perfil de fermentação de carboidratos de Staphylococcus isolados de embutidos

naturalmente fermentados

Identificação Glucose Mannose Maltose Lactose Trealose Manitol Xylose Sucrose Rafinose

S. xylosus

9(100) 8(88,8) 9(100) 8(88,8) 9(100) 9(100) 7(77,7) 8(88,8) 1(11,1)

saprophyticus

6(100) 3(50) 6(100) 5(83,3) 6(100) 4(66,6) 1(16,6) 6(100) 0

S. lentus

4(100) 4(100) 4(100) 4(100) 4(100) 4(100) 3(75) 4(100) 4(100)

S. epidermidis

1(100) 1(100) 1(100) 0 0 1(100) 0 1(100) 0

S. warneri

1(100) 1(100) 1(100) 1(100) 1(100) 1(100) 0 1(100) 0

Perfil duvidoso

3(100) 2(66,6) 3(100) 1(33,3) 2(66,6) 3(100) 1(33,3) 2(66,6) 1(33,3)

Obs: Os valores entre parênteses representam % de isolados positivos.

Tabela 3

Caracterização de Staphylococcus xylosus (caldo BHI) isolados de embutidos naturalmente

fermentados

AB1 AC3 R1 S4 AD5 AD1 Q3 M4 U5

5,5 + + + + + + + + +

5,0 + + + + + + + + +

Temperatura

+ + + + + + + + +

NaCl

10% + + + + + + + + +

20% + + + + + + + + +

Obs: + representa crescimento positivo.

As linhagens AB1 e AC3 mostraram diminuição do crescimento na presença

de 200 µg/g de NaNO

, de 8 log UFC/mL para 3 log UFC/mL. Ao mesmo tempo sete

(7) das nove (9) linhagens não apresentaram diferenças no crescimento quando

NaCl e NaNO

foram usados simultaneamente, mostrando apropriada tolerância

(Figura 3).

7,9

8,1

8,2

8,3

8,4

8,5

8,6

8,7

8,8

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

% NaCl

log CFU/mL

AB1

AC3

AD5

AD1

Figura 1 - Crescimento de linhagens de Staphylococcus xylosus (log UFC/mL) isoladas de

embutidos naturalmente fermentados em diferentes concentrações de NaCl.

0 50 100 150 200 250

NaNO

(

µµ

g/g)

log CFU/mL

AB1

AC3

AD5

AD1

Figura 2 - Crescimento de linhagens de Staphylococcus xylosus (log UFC/mL) isoladas de

embutidos naturalmente fermentados em diferentes concentrações de NaNO

AB1 AC3 R1 S4 AD5 AD1 Q3 M4 U5

Strains

log CFU/mL

NaCl 3% + NaNO2 200

g/g

Figura 3 - Crescimento (log UFC/mL) de linhagens de Staphylococcus xylosus isoladas

de embutidos naturalmente fermentados, em caldo adicionado de NaCl e NaNO

Linhagens

A presença de sais de cura, como nitrato e nitrito de sódio, melhoram a cor do

produto e possuem uma importante ação bacteriostática contra Clostridium

botulinum e microrganismos patogênicos. No entanto, mesmo que a redução de

nitrito assegure a formação de cor em embutidos fermentados, é necessário que

no produto final estejam presentes baixos níveis de nitrito residual diminuindo o

risco de formação de nitrosaminas, porém não é recomendado que esses níveis

atinjam valores muito reduzidos para que possa manter a proteção do produto

(HUGAS E MONFORT, 1997). A capacidade de cultivos iniciadores em reduzir

nitritos pode dever-se à atividade enzimática de nitrito redutase ou pela redução do

pH. Medidas espectrofotométricas não apresentaram níveis detectáveis de nitrito

residual em testes realizados e no controle nem apresentaram variações na

concentração inicial de NaNO

. Considerando-se que o pH foi ajustado para 5,0 e

a atividade de nitrito redutase não foi avaliada, podemos supor que a redução de

nitrito ocorreu por ação de linhagens de S. xylosus.

As linhagens de S. xylosus também apresentaram atividades lipolítica e

proteolítica (HAMES e HERTEL, 1998). No presente trabalho a atividade lipolítica

foi testada nas nove (9) linhagens isoladas e em todas elas foi constatada e

identificada em placas testes como um halo laranja fluorescente sob luz UV

(Tabela 4). Martín et al. (2005) observaram tal atividade em 99 linhagens de S.

xylosus isoladas de embutidos ligeiramente fermentados, num total de 194

microrganismos.

Tabela 4

Atividade lipolítica de Staphylococcus xylosus isolados de embutido naturalmente

fermentado

AB1 AC3 R1 S4 AD5 AD1 Q3 M4 U5 Atividade

lipolítica

+ + + + + + + + +

Obs: + representa atividade lipolítica positiva (halo laranja sob luz fluorescente UV).

Para executar a caracterização molecular de linhagens de S. xylosus isoladas

de embutidos naturalmente fermentados, iniciadores que ampliam fragmentos

específicos do gênero Staphylococcus e da espécie de S. xylosus foram usados.

Nove linhagens identificadas como S. xylosus e uma como S. epidermidis foram

selecionadas para análises de PCR, uma vez que a identificação pelo método

fenotípico tem limitações e pode resultar em identificação equivocada (RHODEN e

MILLER, 1995; BLAIOTTA et al., 2003; MOROT-BIZOT et al., 2006). Nove entre

dez linhagens apresentaram o fragmento esperado quando iniciadores

TstaG422/Tstag765 foram usados, confirmando que as linhagens isoladas

pertencem ao gênero Staphylococcus (Figuras 4 e 5). A figura 4 mostra uma

reação em que 50 ng de DNA molde foram usados. Como algumas linhagens não

apresentaram o fragmento esperado, a reação foi repetida com 2 µL de DNA

molde sem diluição (Figura 5). Concentração de DNA molde parece influenciar a

reação com iniciadores TstaG422/Tstag765. Tal influência não foi observada em

reações onde iniciadores XYLF/XYLR foram usados (Figura 6).

Figura 4 - Amplificação PCR com iniciadores para gênero TstaG422/Tstag765, usando 50

ng de DNA molde. Linhas 1 e 14: marcador 50 bp (Promega); linha 2: controle (S. xylosus

ATCC 29971); linha 3: controle (água); linhas 4 – 13: linhagens selvagens de GCC+ isolados

de embutidos fermentados naturalmente.

Somente duas linhagens confirmaram pertencer à espécie S. xylosus, uma

vez que estas foram as únicas linhagens que deram um produto de PCR esperado

de 539 bp quando usados iniciadores espécie-específicos para S. xylosus (Figura 6).

As outras linhagens não apresentaram nenhum fragmento, sugerindo que

pertençam a outras espécies de Staphylococcus e estejam em discordância com a

caracterização fenotípica. Resultados semelhantes foram relatados por Morot-Bizot

et al., (2003), cujas pesquisas identificaram como S. xylosus 7 de 27 linhagens

isoladas de alimentos pelo sistema API STAPH e caracterizadas molecularmente

por PCR espécie-específico. Em contraste, Di Maria et. al. (2002) obtiveram

concordância entre as caracterizações fenotípica e genotipíca das linhagens

submetidas.

350bp

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Figura 5 - Amplificação PCR com iniciadores para gênero TstaG422/Tstag765 usando 2 µL

de DNA (em torno de 215 ng). Linhas 1 e 15: marcador 50 bp (Promega); linha 2: controle

positivo

(S. xylosus ATCC 29971); linha 3: controle negativo (água); linhas 4 – 13: linhagens

selvagens de GCC+ isoladas de embutidos fermentados naturalmente; linha 14: controle negativo (L.

plantarum ATCC).

Figura 6 - Amplificação PCR com iniciadores espécie-específico XYLF/XYLR. Linha 1:

marcador 1 kb (Invitrogen); linha 2: controle negativo (água); linha 3: controle positivo (S.

xylosus ATCC 29971); linhas 4 – 13: linhagens selvagens de GCC

isoladas de embutidos

fermentados naturalmente.

CONCLUSÃO

Esses resultados demonstram que os métodos moleculares são

significativamente importantes para identificação ao nível de espécie, uma vez que

permitiram uma identificação precisa de linhagens de S. xylosus. A presença

destas espécies na microbiota de embutidos naturalmente fermentados produzidos

na Região Sul do Brasil indicam uma boa capacidade de adaptação das mesmas

neste tipo de produto. As duas linhagens de S. xylosus caracterizadas

molecularmente, mostraram atividade das enzimas nitrato redutase, catalase e

lipase, crescimento satisfatório na presença de NaCl e NaNO

e capacidade de

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

539

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

350b

redução de nitritos, apresentando, portanto, potencial para uso como cultivos

iniciadores em embutidos fermentados.

AGRADECIMENTOS

Esta pesquisa foi apoiada por EMBRAPA, UNIJUÍ e UFSC.

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3 VIABILIDADE DE LINHAGENS DE Staphylococcus xylosus ISOLADAS DE

EMBUTIDOS ARTESANAIS PARA APLICAÇÃO COMO CULTIVOS INICIADORES

EM PRODUTOS CÁRNEOS

Artigo 2

Artigo com aceite para publicação em:

Brazilian Journal of Microbiology

Viabilidade de linhagens de Staphylococcus xylosus isoladas de

embutidos artesanais para aplicação como cultivos iniciadores em

produtos cárneos

Ângela Maria Fiorentini,

Maristela Cortez Sawitzki,

Teresinha Marisa Bertol,

Ernani S. Sant’Anna

RESUMO

Investigamos a viabilidade de linhagens de Staphylococcus xylosus (AD1 e

U5) isoladas de embutidos com fermentação natural, para aplicação como cultivos

iniciadores em embutidos fermentados produzidos na Região Sul do Brasil. O estudo

demonstrou que cepas de Staphylococcus xylosus (AD1 e U5) apresentaram

crescimento significativo durante a fermentação, estabilidade no processo de

liofilizacão e conservação, ausência de produção de enterotoxinas e viabilidade para

aplicação como cultivo iniciador simples ou associado com bactérias lácticas na

elaboração de embutidos fermentados.

Palavras-chave: Staphylococcus xylosus, cultivos iniciadores, embutidos cárneos.

SUMMARY

Viability of Staphylococcus xylosus isolated from artisanal sausages for

application as starter cultures in meat products

We investigated the viability of Staphylococcus xylosus strains AD1 and U5

isolated from natural fermented sausages for application as starter cultures in

fermented sausages produced in the South Region of Brazil. The study

demonstrated that the Staphylococcus xylosus strains AD1 and U5 showed

significant growth during fermentation, stability over freeze-dried process and

negative reaction for staphylococcal enterotoxins and viability for using as a single-

strain culture or associated with lactic acid bacteria for production of fermented

sausages.

Key words: Staphylococcus xylosus, starter cultures, sausages.

Depto. de Ciência e Tecnologia de Alimentos, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal de Santa

Catarina, Rod. Admar Gonzaga, 1346, 880034-001, Florianópolis, SC, Brasil.

Depto. de Biologia e Química - UNIJUÍ RS 344, km 39, 98900-000, Santa Rosa, RS, Brasil.

EMBRAPA SUÍNOS e AVES, BR 153, km 110, 89700-000, Concórdia, SC, Brasil.

INTRODUÇÃO

Diferentes microrganismos advindos de matérias-primas e do ambiente são

contaminantes naturais de misturas de embutidos secos (LARROUTURE et al.,

2000). Linhagens de Micrococcaceae e também de Bactérias Ácido Lácticas (BAL)

são microrganismos importantes usados como cultivos iniciadores em fermentações

de carnes. A adição das mesmas em embutidos cárneos pode melhorar a segurança

e a estabilidade do produto estendendo a vida de prateleira, além de proporcionar a

diversidade resultando em novas propriedades sensoriais (LÜCKE, 2000).

A bactéria Staphylococcus xylosus (Micrococcaceae) é uma das espécies de

estafilococos prevalecentes, encontradas naturalmente na maioria dos embutidos

fermentados produzidos na Itália e Espanha (BLAIOTTA et al., 2004; GARCIA-

VARONA et al., 2000), em produtos cárneos da Slovákia (SIMONOVÀ et al., 2006) e

em produtos cárneos salgados tradicionais Tunisianos (ESSID et al., 2007). Na

indústria de carne, esta espécie é usada como um cultivo iniciador para embutidos

fermentados, em virtude de suas propriedades tecnológicas, uma vez que melhora o

desenvolvimento de cor pela atividade nitrito e nitrato redutase, previne a

rancificação e igualmente a formação de off-flavor pela atividade de catalase e

contribui para o desenvolvimento de flavor devido às atividades proteolítica e

lipolítica (MARTÍN et al., 2005; GALGANO et al., 2003). A seleção de microbiota

nativa para formulação de cultivos iniciadores pode ser uma ferramenta para

preservar as características típicas desses produtos (MAURIELLO et al., 2004). Isso

porque, os cultivos iniciadores mais promissores são aqueles isolados de produtos

cárneos naturalmente fermentados onde eles estão mais bem adaptados e

representam a população dominante (DROSINOS et al., 2005).

Porém, para selecionar uma linhagem apropriada com vistas a empregá-la

como cultivo iniciador, não só as propriedades tecnológicas são importantes, mas

também os aspectos relativos à segurança devem ser considerados. Um dos

aspectos se refere à capacidade de estafilococos coagulase negativo (SCN) produzir

substâncias antagônicas contra bactérias patogênicas (SIMONOVÀ et al., 2006;

PAPAMALONI et al, 2002), cuja propriedade pode ser importante para a segurança

de embutidos. Por outro lado, algumas linhagens de S. xylosus, S. saprophyticus e

Staphylococcus spp. originadas de alimentos podem produzir enterotoxinas

(RODRÍGUEZ et al., 1996; PADMAPRIYA et al., 2003). As enterotoxinas

estafilocócicas (ES) são uma família de nove principais tipos sorológicos de

enterotoxinas estáveis ao calor que causam gastroenterites como resultado do

consumo de alimento contaminado (BALABAN e RASOOLY, 2000). De acordo com

McLauchlin et al. (2000), a presença de genes de toxinas verificada pelo método de

PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) não indica necessariamente, a capacidade

do microrganismo de produzir toxina biologicamente ativa suficiente para induzir

manifestações clínicas. Todavia, deve ser demonstrado que não são produzidas

enterotoxinas por linhagens de SCN quando selecionadas para uso como cultivo

iniciador em produtos cárneos (RODRÍGUEZ et al., 1996).

Para a seleção de um microrganismo Micrococcaceae como um cultivo

iniciador para embutidos fermentados, é importante que o mesmo não apresente

atividade de inibição contra BAL, em virtude da contribuição desse grupo ser

importante, principalmente para a produção de ácido láctico, que inibe crescimento

de patógenos (LÜCKE, 2000). Os cultivos iniciadores utilizados na produção

industrial de embutidos fermentados secos consistem de misturas de bactérias ácido

lácticas e Micrococcaceae (BUCKENHÜSKES, 1993). Assim, o sinergismo entre

esses dois grupos é essencial.

Para preservar essas bactérias isoladas por longos períodos de tempo, é

necessário usar métodos que mantenham as culturas viáveis e menos sujeitas às

variações. A liofilização é considerada como um dos melhores processos para

preservar a viabilidade de microrganismos, e particularmente, de bactérias e fungos

(FIGUEIREDO, 2001). As vantagens mais importantes da liofilização na preparação

de culturas é a excelente estabilidade de armazenamento e a fácil manipulação

durante o armazenamento, a distribuição e aplicação (BUCKENHÜSKES, 1993).

O objetivo do presente trabalho foi investigar a viabilidade de linhagens de

Staphylococcus xylosus (AD1 e U5) isoladas de embutidos naturalmente

fermentados, para uso adicional como cultivo iniciador em embutidos fermentados,

como também avaliar os aspectos de segurança.

MATERIAL E MÉTODOS

Linhagens bacterianas

A bactéria Staphylococcus xylosus foi a espécie dominante (42,8%) entre as

linhagens isoladas de embutidos naturalmente fermentados na Região Sul do Brasil,

quando caracterizadas fenotipicamente e duas linhagens (AD1 e U5) foram

confirmadas pela caracterização molecular como espécie S. xylosus (FIORENTINI et

al., 2007a). Ambas as linhagens foram selecionadas para esse estudo, considerando

as suas propriedades: atividade catalase positivo, capacidade para reduzir nitrito e

nitrato e atividade lipolítica. As linhagens de referência usadas nos testes foram

adquiridas da Coleção da Fundação André Tosello (Brasil): Lactobacillus plantarum

ATCC 8014, Listeria monocytogenes NTC 098630, Escherichia coli ATCC 25922,

Staphylococcus aureus ATCC 12598. Uma linhagem de Lactobacillus plantarum

isolada de embutido artesanal, fabricado sem adição de cultivo iniciador na região

Sul (Brasil), também foi usada nos testes (SAWITZKI, et al., 2007).

Cultivo das linhagens

Os cultivos foram iniciados de culturas estoques plaqueadas em ágar BHI

(Brain Heart Infusion, MERCK) e incubadas a 35°C/18h. Uma colônia foi tr ansferida

para caldo BHI (MERCK) e incubada a 35°C/18h, segui da pela transferência de 1%

de inóculo de células em suspensão para caldo BHI (MERCK). Finalmente, 1% de

inóculo foi transferido a um fermentador (New Brusnswick Scientific, modelo Bioflo

2000, EUA), com 4,5 L de caldo BHI (MERCK). A fermentação foi conduzida sob as

seguintes condições: temperatura de 35ºC±0,1ºC, agitação de 100 rpm e aeração de

0.7 vvm (L de ar/L meio/minuto) por 24 horas.

As amostras, em triplicata, foram assepticamente coletadas em frascos

estéreis a cada 2 horas durante o período de fermentação. Contagem de células

viáveis foi realizada através de cultivo em placas, em ágar BHI (MERCK) e incubada

a 35

C/48h. Leituras de densidade óptica (DO) do meio de fermentação foram

executadas em espectrofotômetro (Hitachi U 2010) a 630 nm, de acordo com

Kanasaki et al. (1975).

Fermentação e liofilização

As linhagens de Staphylococcus xylosus (AD1 e U5) (inóculo inicial - 9 log

UFC. mL

-1

) foram cultivadas em 4,5 L de caldo BHI (MERCK) em um fermentador

(New Brusnswick Scientific, modelo Bioflo 2000, E.U.A) sob as seguintes condições:

C± 0,1ºC, agitação de 100 rpm e aeração de 0.7 vvm (L de ar/L meio/minuto), por

10 a 12 h.

As células foram concentradas por centrifugação a 4000 x g, 30 min, 4°C

(Novatécnica RC, modelo NT825, Brasil), ressuspensas a 1/50 do volume de caldo

original em leite desnatado reconstituído (10% m.v

-1

) como crioprotetor e congelado

a - 20

C. A liofilização foi executada em um liofilizador (Terroni Fauvel, modelo LT

1000/8, Brasil) por 18 a 24 h. As culturas liofilizadas foram armazenadas a -20°C,

até o uso na preparação de embutidos. Os experimentos de fermentação e

liofilização como também estudos de estabilidade foram realizados em duplicata,

para cada linhagem.

Estabilidade de armazenamento

As culturas liofilizadas foram armazenadas a -20

C por dois diferentes

períodos: até quatro semanas ou seis meses. Após o período de armazenamento,

as culturas liofilizadas foram ressuspensas em água peptonada estéril 0,1%

(MERCK) (10mg/100 mL e diluições subseqüentes), crescidas em placas com ágar

BHI (MERCK) (35

C/48 h). A população bacteriana foi determinada por análise de

contagem em placas para avaliar a estabilidade das culturas a -20ºC.

Detecção de enterotoxina

Para a detecção de enterotoxina, um auto-analisador VIDAS (Biomeriéux,

Brasil) e um kit VIDAS® Staph enterotoxina (Biomeriéux, Brasil) foram usados. O

princípio deste sistema Enzyme Linked Fluorescent Assay (ELFA) é o uso de

anticorpos de anti-enterotoxinas policlonais e, sete sorotipos de enterotoxinas (SEA,

SEB, SEC1, 2, 3, SED e SEE) (BERGDOLL, 1983). As linhagens foram cultivadas

em caldo BHI overnight e seguiu-se o protocolo de extração conforme orientações

do fornecedor. Resultados foram expressos como valor relativo de fluorescência

(VRF), calculado pela diferença das duas medidas (leitura do branco e após a

incubação do substrato com enzima). Esse cálculo aparece na folha de resultados.

O VRF obtido é interpretado pelo sistema VIDA, como segue: quando TV (Teste

Valor) < 0, 13, interpretação negativa e TV ≥ 0, 13, interpretação positiva.

Atividade antagonística

Efeitos antagonísticos de isolados de S. xylosus (AD1 e U5) foi detectada,

seguindo a técnica em gota (spot on the lawn) (LEWUS et al., 1991; OKEREKE, e

MONTVILLE, 1991). Em placas com ágar TSAYE (Trypticase Soy Agar - MERCK),

acrescido de 0,6% extrato de levedura (Yeast Extract - MERCK), foi gotejado na

superfície central 2L de cada caldo BHI com culturas em overnight, contendo as

linhagens de S. xylosus (AD1 e U5) e incubou-se anaerobiamente a 35

C por 48h.

Depois do período de incubação com conseqüente crescimento, uma sobrecamada

de aproximadamente 8 mL de caldo BHI (MERCK), contendo 1% de ágar (MERCK)

e 5 - 6 log UFC.mL

-1

dos seguintes microrganismos L. plantarum ATCC 8014, L.

plantarum isolada de embutido artesanal, L. monocytogenes NTC 098630, E. coli

ATCC 25922, e S. aureus ATCC 12598, foi adicionada em cada placa. As placas

com a sobrecamada e uma placa controle (sem adição de microrganismo) foram

incubadas anaerobiamente a 30ºC por 48h. Um halo de inibição formado ao redor do

crescimento do microrganismo teste, indicou a atividade antagonística.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

As linhagens de Staphylococcus xylosus AD1 e U5 cultivadas em caldo BHI

(MERCK), foram monitoradas pela contagem de células viáveis e leituras de

densidade ótica (DO), durante um período de 24 horas. Na figura 1b, a evolução da

Curva de Absorbância demonstra que, no período de 10 horas de fermentação das

linhagens AD1 e U5, foram obtidos 1.346 e 1.702 de absorbância relativa à

contagem de células viáveis de 11 log UFC. mL

-1

, respectivamente (Figura. 1a). O

pH do meio de fermentação apresentou uma pequena redução no período inicial (2 -

6 horas), permanecendo constante até o final da fermentação (Figura 1c).

A fermentação foi monitorada por leituras de DO e interrompida em 10 h (fase

de crescimento logarítmica), quando os valores obtidos por leitura

espectrofotométrica a 630 nm alcançaram a contagem relativa de células viáveis de

11 log UFC. mL

-1

- 12 log UFC. mL

-1

O nível de inóculo de cultivos iniciadores a ser acrescentado à fermentação

de embutidos depende do potencial de crescimento do organismo no produto, sendo

considerado necessário em torno de 6 - 8 log UFC por grama de produto (LÜCKE,

2000). Então, para uso das linhagens AD1 e U5 como cultivos iniciadores em

embutidos, será necessário um período de aproximadamente 10 horas de

fermentação para obter o número desejado de células. Há poucas publicações sobre

cultivo de Micrococcaceae, embora muitas espécies de Staphylococcus sejam

usadas como cultivos iniciadores na indústria de produtos cárneos.

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 24

tempo (horas)

log (ufc/mL)

S.xylosus AD1 S.xylosus U5

0,5

1,5

2,5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 24

tempo (horas)

absorbancia (DO)

S. xylosus AD1 S. xylosus U5

5,5

6,5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 24

tempo (horas)

S. xylosus AD1 S. xylosus U5

Figura 1 - Fermentação de Staphylococcus xylosus AD1 e U5 em caldo BHI a 35

a) Contagem de células viáveis durante o tempo de fermentação; b) Curva de Absorbância

relativa ao tempo de fermentação (D.O.); c) Variação de pH do meio de fermentação.

Condições desejáveis de armazenamento para iniciadores liofilizados são:

temperaturas abaixo de -15°C e a ausência de oxigên io e umidade. Sob essas

condições, a atividade ótima do cultivo iniciador será garantida durante 8 meses

(BUCKENHÜSKES, 1993). Neste estudo, depois de 1 mês e 6 meses de

armazenamento a - 20

C, culturas de S. xylosus (AD1 e U5) apresentaram boa

estabilidade ao processo de liofilização. Pequena diminuição foi observada no

número de células durante o armazenamento, permanecendo a 11 log UFC. mL

-1

(Tabela 1).

Essa estabilidade, provavelmente, é devida ao efeito positivo das condições

de armazenamento, assim como do crioprotetor usado (leite desnatado). De acordo

com Carvalho et al. (2004), leite desnatado pode prevenir dano celular estabilizando

a membrana da célula e provendo uma camada protetora para as células.

(a)

(b)

)

Tabela 1

Contagens de linhagens S. xylosus AD1 e U5 após a liofilização (inicial) e durante o periodo

de estocagem a - 50

Inicial

(log UFC. g

-1

)

1 mês

(log UFC. g

-1

)

6 meses

(log UFC. g

-1

)

S. xylosus AD1 11,47 11,41 11,04

S. xylosus U5 11,62 11,60 11,54

Não foram encontradas enterotoxinas estafilocócicas nas linhagens de S.

xylosus (AD1 e U5), isto é, observaram-se reações negativas para as sete

enterotoxinas estafilocócicas testadas por ELFA (dados não apresentados). A não

produção de enterotoxinas é uma característica importante das espécies usadas

como cultivos iniciadores, porque vários estudos demonstraram a capacidade de

estafilococos coagulase negativo (SCN) produzir enterotoxinas (CRASS e

BERGDOLL, 1986; VALLE et al., 1990), uma característica relacionada às espécies

coagulase positivas. Porém, poucos estudos foram realizados para determinar a

capacidade enterotoxigênica de SCN em alimentos. Noventa amostras de salames

industrializados foram analisadas por Pereira e Pereira (2006), tendo-se constatado

que nenhuma das 266 linhagens de SCN produziu enterotoxinas. Destas, 252

linhagens foram identificadas e aproximadamente 90% delas resultaram em S.

xylosus e S. carnosus.

As linhagens isoladas de S. xylosus (AD1 e U5) não exibiram atividade

antimicrobiana contra os seguintes microrganismos patogênicos nas condições

testadas: L. monocytogenes NTC 098630, E. coli ATCC 25922 e S. aureus ATCC

12598. Igualmente, uma vez que não foi observado um halo de inibição ao redor da

colônia analisada (Tabela 2), linhagens de S. xylosus não apresentaram atividade

antagônica contra L. plantarum ATCC 8014 e uma linhagem isolada de L. plantarum.

Resultados semelhantes foram relatados por Drosinos et al. (2007), em que

nenhuma linhagem Staphylococcus spp apresentou atividade antimicrobiana contra

L. monocytogenes NCTC 10527, S. aureus NCBF 1499 e E. coli O157: H7 NCTC

12079.

As duas linhagens testadas não apresentaram halo de inibição para com as

linhagens de Lactobacillus plantarum, comprovando um sinergismo entre esses dois

grupos, o que é importante para futuras aplicações dessas linhagens em embutidos

fermentados.

Tabela 2

Atividade antagonista e antimicrobiana de linhagens de S. xylosus isoladas e linhagem de

referência contra linhagens selecionadas

S. xylosus AD1 S. xylosus U5

L. plantarum ATCC 8014 - -

L. plantarum strain Isolated - -

S. aureus ATCC 12598 - -

E. coli ATCC 25922 - -

L. monocytogenes NTC 098630 - -

Símbolos:

+, ampla zona de inibição (≥ 3.0 mm); (+), pequena zona de inibição (≤ 3.0 mm);

- nenhuma zona de inibição.

Mauriello et al. (2004) e Fiorentini et al. (2007), constataram que muitas

linhagens de S. xylosus possuem propriedades tecnológicas que as qualificam como

cultivos iniciadores para produtos cárneos fermentados. Em particular, linhagens

AD1 e U5 apresentaram crescimento significativo durante a fermentação em caldo

BHI, estabilidade no processo de liofilização e conservação e boa atividade nas

propriedades estudadas, como ausência de atividade antagônica contra bactérias

ácido lácticas e reação negativa para enterotoxinas estafilocócicas.

O estudo demonstrou a viabilidade de linhagens de Staphylococcus xylosus

AD1 e U5 para aplicação como cultivos iniciadores simples ou associados com

bactérias ácido lácticas (BAL) na produção de embutidos fermentados. Como

também a segurança de seu uso, uma vez que não houve produção de

enterotoxinas pelas mesmas.

AGRADECIMENTOS

Esta pesquisa foi apoiada por EMBRAPA, UNIJUÍ e UFSC.

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4 INFLUÊNCIA DE LINHAGEM NATIVA DE Staphylococcus xylosus NAS

CARACTERÍSTICAS MICROBIOLÓGICAS, FÍSICO-QUIMICAS E SENSORIAIS

EM SALAME TIPO MILANO

Artigo 3

Artigo submetido para publicação em:

Brazilian Archives of Biology and Technology

Influência de linhagem nativa de Staphylococcus xylosus nas

características microbiológicas, físico-químicas e sensoriais em

salame tipo Milano

Ângela Maria Fiorentini,

1,2*

Maristela Cortez Sawitzki,

Teresinha Marisa Bertol,

Anildo Cunha Júnior,

Ernani S. Sant’Anna.

RESUMO

A análise da influência de culturas iniciadoras nativas nas características

microbiológicas, físico-químicas e sensoriais de salame tipo Milano foi o objeto deste

estudo. Foram produzidos dois grupos de salame tipo Milano: Grupo A - com

aplicação de linhagem Staphylococcus xylosus U5 enquanto o controle, Grupo B, foi

produzido sem cultivos iniciadores. O salame tipo Milano foi caracterizado pela

importante atividade microbiana de estafilococos coagulase negativo (SCN), que

resultou em significativo crescimento no Grupo A durante a maturação, com

contagem inicial de 7,60 ufc.g

-1

e alcançando um crescimento de 9,84 cfu.g

-1

depois

de 14 dias. As enzimas bacterianas que mostraram eficiente atividade sob as

condições encontradas no salame tipo Milano foram catalase, nitrito e nitrato

redutase, contribuindo para as propriedades físico-químicas e sensoriais do produto.

Não houve diferenças significativas na composição geral dos ácidos graxos livres

entre as amostras, enquanto os parâmetros de cor (L*, a* e b*) obtidos no salame

inoculado (Grupo A) diferiram significativamente em relação ao controle (Grupo B) e

foi o grupo preferido pelos degustadores.

Palavras- chave: Staphylococcus xylosus, cultivos iniciadores, salame tipo Milano

ABSTRACT

Influence of native strain Staphylococcus xylosus on the microbiological,

physicochemical and sensorial characteristics in Milano salami type

The influence of native starter cultures on the microbiological, physicochemical

and sensorial characteristics of Milano salami type was studied. Two batches of

Milano salami type were produced: Batch A, added of Staphylococcus xylosus U5

and Batch B (control), produced without starter culture. The Milano salami type was

characterized by an important microbial activity of coagulase-negative staphylococci

(CNS) that resulted, in Batch A, in substantial growth during ripening with an initial

count of 7.60 log CFU.g

-1

and reached in 9.84 log CFU.g

-1

after 14 days. Bacterial

enzymes that showed efficient activity under conditions found in Milano salami type

were catalase, nitrite and nitrate reductase, contributing for sensory and

physicochemical properties of the product. There were not significant differences in

Depto. de Ciência e Tecnologia de Alimentos, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal de

Santa Catarina, Rod. Admar Gonzaga, 1346, 880034-001, Florianópolis, SC, Brasil

Depto. de Biologia e Química - UNIJUÍ RS 344, km 39, 98900-000, Santa Rosa, RS, Brasil

EMBRAPA SUÍNOS e AVES, BR 153, km 110, 89700-000, Concórdia, SC, Brasil

afiore@unijui.tche.br

general free fatty acids composition among batches, while color parameters (L *, a *

and b *) in the inoculated salami (Batch A) presented significantly higher values in

relation to control (Batch B). Moreover, batch A had the higher preference in

sensorial analysis.

Key words: Staphylococcus xylosus, starter cultures, milano salami type

INTRODUÇÃO

Embutidos fermentados podem ser definidos como produtos cárneos que

consistem em uma mistura de carne e partículas de gordura, sal, agentes de cura,

especiarias (temperos), etc. os quais adquirem suas propriedades características por

um processo no qual microrganismos são envolvidos (HAMMES, 1990).

Fermentações espontâneas foram aplicadas por milhares de anos, primeiramente

como um método para preservação dos gêneros alimentícios ao longo do ano e,

secundariamente, como um modo para obter alimentos condimentados e

aromatizados (DROSINOS et al., 2007).

Geralmente, Bactérias Ácido Lácticas (BAL) e Micrococcaceae são os dois

principais grupos envolvidos na fermentação de embutidos curados secos (LÜCKE e

HECHELMANN, 1987; COVENTRY e HICKEY, 1991).

A fabricação de embutidos fermentados tem uma longa história no Brasil.

Fruto da influência da imigração italiana no princípio do século vinte, ainda mantém

relação com suas tradições de origem. Por exemplo, apesar do uso de cultivos

iniciadores ter-se tornado comum na fabricação de vários tipos de produtos

fermentados, muitos embutidos artesanais típicos são ainda produzidos com

tecnologias tradicionais sem a utilização de iniciadores selecionados.

Uma grande diversidade de microrganismos já foi isolada desse tipo de

fermentação por métodos tradicionais, principalmente representados por

estafilococos coagulase negativo (SCN) pertencentes às espécies Staphylococcus

xylosus, S. saprophyticus e S. carnosus (COPPOLA et al., 1997; GARCIA-VARONA

et.al., 2000; PAPAMANOLI et al., 2002; MAURIELLO et al., 2004; DROSINOS et al.,

2005), e uma grande variedade de linhagens foi isolada e caracterizada em termos

de suas propriedades tecnológicas, principalmente proteólise (FADDA et al., 1998;

BOVER-CID et al., 1999), lipólise (MOLLY et al., 1996; MAURIELLO et al., 2004),

produção de compostos antimicrobianos (AYMERICH et al., 2000; MESSENS et al.,

2003, DROSINOS et al., 2007), decarboxilação de aminoácidos específicos

(MARTUSCELLI et al. 2000; BOVER-CID et al., 2001) e outros (MAURIELLO et al.,

2004).

SCN tem um papel importante no desenvolvimento do aroma como também

no flavor e cor de produtos cárneos fermentados (JESSEN, 1995). Eles têm várias

vantagens tecnológicas, como atividade nitrito e nitrato redutase, consumo de

oxigênio e atividade de catalase, que melhoram a estabilidade de cor e diminui o

desenvolvimento de ranço no produto (GEISEN, LÜCKE e KRÖCKEL, 1992;

BARRIÉRE et al., 2001). Berdagué et al. (1993), estabelece uma correlação entre o

tipo de cultivo iniciador e o flavor de embutidos fermentados, e Montel et al. (1996)

provaram que Staphylococcus contribuem à geração de flavor típico de embutidos

fermentados, possivelmente pela capacidade proteolítica e lipolítica (RODRÍGUEZ et

al., 1998; BERDAGUÉ et al., 1993).

S. xylosus é uma das espécies de Staphylococcus prevalecentes encontradas

na maioria de embutidos fermentados naturalmente (MONTEL et al., 1992;

COPPOLA et al., 1997; REBECCHI et al., 1998; COCOLIN et al., 2001), e, de fato,

em estudos prévios, comprovou-se a presença dessas linhagens em embutidos

artesanais na região Sul do Brasil (FIORENTINI et al., 2007a).

Com respeito a essas propriedades, S. xylosus é considerado um candidato

satisfatório como um cultivo iniciador, ou para uso na produção de embutidos. Na

seleção de um cultivo iniciador satisfatório, deve ser levado em conta que a

linhagem tem que competir com as mesmas espécies, ou com espécies

relacionadas, acontecendo em um único ambiente, denominado house flora

(SANTOS et al., 1998).

Na produção de embutidos fermentados tradicionais, devido a uma baixa

variabilidade na microbiota presente, é importante usar cultivos iniciadores

selecionados, consistindo em linhagens isoladas de produtos locais e, assim, bem

adaptadas ao produto em particular e à tecnologia de produção específica (PAPA e

GRAZIA, 1990). Além de estarem bem adaptados no microambiente eles poderiam

dominar a microbiota dos produtos cárneos fermentados (PAPAMANOLI et al.,

2003). De acordo com a legislação brasileira, o uso de cultivos iniciadores é

permitido e eles são considerados como coadjuvantes de tecnologia (BRASIL,

2000).

Em estudos prévios, realizou-se a identificação da linhagem S. xylosus U5,

isolada da microbiota de embutidos naturalmente fermentados, e em virtude do seu

potencial tecnológico (FIORENTINI et al, 2007a), da viabilidade da mesma no

processo fermentativo, estabilidade na liofilização e reação negativa para

enterotoxinas (FIORENTINI et al., 2007b) é recomendado para uso como cultivo

iniciador em embutidos fermentados. Por essa razão, o objetivo do presente trabalho

foi investigar a influência do cultivo iniciador Staphylococcus xylosus U5 nas

características microbiológicas, físico-químicas e sensoriais em salame tipo Milano.

MATERIAL E MÉTODOS

Microrganismo

O microrganismo Staphylococcus xylosus U5 pertence ao grupo de

microrganismos isolados de embutidos artesanais coletados em vinte e uma cidades

da Região Sul do Brasil. Essa linhagem foi selecionada para uso como cultivo

iniciador com base na sua atividade de catalase positiva, capacidade para reduzir

nitrito e nitrato, atividade lipolitica e nenhuma produção de enterotoxinas em caldo.

Também foi submetida à caracterização fenotipica e molecular (FIORENTINI et al.,

2007a; FIORENTINI et al., 2007b).

Preparação de cultivos iniciadores

A cultura liofilizada de Staphylococcus xylosus U5 foi ressuspensa em água

destilada estéril ausente de cloro, depois, adicionada à mistura de carne na

concentração de 9 log UFC por grama de matéria-prima. Seguiu-se a recomendação

de Terra (1998) em que a concentração da cultura iniciadora a ser adicionada deve

ser superior em dois ciclos logarítmicos à contagem inicial de microrganismos

presentes na matéria-prima.

Preparação de salame tipo Milano

O salame tipo Milano foi fabricado em um local de indústria sob condições

tradicionais, matérias-primas selecionadas e boas práticas de fabricação. Os

embutidos tiveram a seguinte composição: carne suína (53,5%); carne bovina

(17,8%); toucinho lombar (17,8%); NaCl (2,8%); nitrato e nitrito de sódio (0,45%); e

demais ingredientes como: maltodextrinas, eritorbato de sódio, leite em pó

desnatado; vinho tinto e mistura de condimentos.

Os embutidos fermentados foram preparados a partir da moagem/trituração

das carnes e da gordura suína, adicionando-se os demais ingredientes. Depois de

misturados, dois grupos foram preparados: Grupo A: adicionado da cultura S.

xylosus U5 (9 log UFC.g

-1

de matéria-prima); e Grupo B (controle): sem nenhuma

cultura adicionada. Na seqüência foram embutidos em invólucro de colágeno (70

mm de diâmetro). Após, os embutidos, com aproximadamente 800 g cada, foram

transferidos à sala de maturação e então de acordo com os parâmetros de umidade

relativa e temperatura, submetidos às seguintes condições durante o processo de

maturação, respectivamente: 25 °C e 95% (1º dia), 2 4°C /93% (2º dia), 23°C / 90%

(3º dia), 22°C / 85% (4º dia), 21°C / 80% (5º dia), 20°C / 75% (6º dia) e 18°C /75%

(7º dia), com a manutenção dessas condições (18°C / 75%) até o 42

dia, em que se

completa a maturação.

Procedimento de amostragem

Dois grupos de embutidos preparados conforme descrições anteriores foram

usados para os experimentos conduzidos pelo período de 42 dias. Amostras foram

tomadas, aleatoriamente, de cada grupo ao 1

, 7

, 14

, 21

, 28

e 42

dias após

formulação para a realização das respectivas análises. Duas repetições foram

realizadas por tratamento.

Análises microbiológicas

As amostras foram submetidas a análises microbiológicas para monitorar a

dinâmica de variações durante armazenamento de embutidos e a sua qualidade

higiênica. Em particular, foram transferidos 25 g de cada amostra em uma bolsa de

stomacher estéril e 225 mL de água peptonada estéril na concentração de 0,1%

(Oxoid) foram adicionados e misturados por 1 min em homogeneizador Stomacher

(ITR, mod.MK 1204). Diluições decimais consecutivas em água peptonada 0,1%

foram preparadas e 1 mL ou 0,1mL de amostras de diluições apropriadas foi vertido

ou esparramado em placas, em duplicata. As análises foram determinadas de

acordo com APHA (1992): (a) contagens de aeróbios mesófilos foram determinadas

em Plate Count Agar - PCA (Oxoid), incubados em 48-72 h a 30

C; (b) BAL em ágar

MRS (De Man Rogosa and Sharp, Oxoid) com incubação por 72 h a 30

C sob

condições anaeróbias; (c) Cocos Gram positivo, catalase positivo em ágar BHI

(Brain Heart Infusion, Oxoid) incubados por 48 h a 35

C; (d) coliformes totais em

caldo Brilhant Green Bile (2%) (BGBB, Oxoid) por 48 h a 37

C (método NMP); (e)

coliformes termotolerantes em caldo EC (Oxoid) incubados por 24 h a 42

C (método

NMP); (f) Staphylococcus aureus (coagulase positivo) em meio BP (Baird-Parker,

Oxoid) com emulsão de telurito adicionada de gema de ovo (Oxoid), incubados por

24-48 h a 37

C; (g) leveduras e bolores em ágar batata glicose (Oxoid),

suplementados com tetraciclina (1 mg/mL, Sigma) com incubação durante 5-7 dias a

C; (h) Clostridium sulfito-redutor em ágar Base Perfringens - TSC (Oxoid),

incubado anaerobiamente por 48 h a 37

C; (i) para a detecção de Salmonella ssp.,

pré-enriquecimento foi feito suspendendo 25 g de amostra em 225 mL de água

peptonada tamponada 1% (Merck) e incubação por 16-20 h a 37

C. O

enriquecimento seletivo foi realizado transferindo 0,1 mL do meio pré-enriquecido

para 10,0 mL do caldo Rappaport-Vassiliadis (Merck) e para 10,0 mL do caldo base

Selenite Cystine (Oxoid), respectivamente. Em seguida, todos os tubos foram

incubados por 24 h a 42

C. Após a incubação, cada caldo seletivo enriquecido foi

semeado em ágar modificado BPLS (Merck) e agar XLD (Merck). Em seguida, todas

as placas foram incubadas por 24 a 48h a 37

C; (j) para a detecção de Listeria ssp,

o enriquecimento foi realizado adicionando 25,0 g da amostra em 225,0 mL de caldo

Fraser (Merck), seguido da incubação por 24 h a 30ºC. Então, 0,1 mL da cultura

enriquecida foi estriado sobre ágar Palcam (Merck) e ágar Oxford (Merck) incubado

por 48 h a 30

Os testes foram realizados em duplicata e os resultados da contagem da

população microbiana foram expressos em log UFC. g

-1

(unidades formadoras de

colônias por grama de amostra), ou número mais provável por grama de amostra

(NMP . g

-1

Análises físico-químicas

As amostras foram trituradas e misturadas em um multiprocessador (Tecnal

Turratec TE-102) e liofilizadas (Virtis Unitop/1000L). Para monitorar as mudanças

químicas dinâmicas, durante e no final do processo (42 dias) de

fermentação/maturação do salame tipo Milano, a intervalos de 7 dias, foram

analisados: umidade, cinzas (forno mufla), proteína bruta (nitrogênio Kjeldahl),

lipídios (extrato etéreo), valores de peróxidos, acidez (% de ácido láctico), (1 mL de

NaOH

(0,1N )

= 0,0090 g ácido láctico) e conteúdo de nitrato e nitrito foi realizado de

acordo com AOAC (2002).

A atividade de água (aw) foi determinada utilizando-se o equipamento Testo

400 CE (Testo GMBH & CO, Brasil). O pH foi medido através de potencial elétrico,

usando um pHmetro digital (Digimed) conectado com um eletrodo inserido

diretamente na amostra em suspensão em temperatura equilibrada para 25 ºC.

De acordo com Granadillo et al. (1995), análises de ferro e sódio foram

realizadas. Foram pesados aproximadamente 500 mg de amostras em um tubo de

digestão (22 x 250 mm), adicionado de 6,0 mL de HNO

:HClO

8:1 (v/v) e aquecido

de acordo com o seguinte: 90ºC.30 min

-1

, 160ºC.40 min

-1

(rampa de 10ºC. min

-1

180ºC .20 min

-1

; depois, esfriado sob temperatura ambiente até o desaparecimento

de vapor branco. Após a digestão, foram adicionados 2,5 mL de HCl

(6M)

completado o volume para 25 mL com água deionizada. A análise de Ferro (Fe) foi

determinada por meio de espectrometria de absorção atômica: amostras diluídas

foram diretamente aspiradas para o espectrômetro (Varian SpectrAA 220) equipado

com lâmpada cátodo-oco, usando chama de ar/acetileno. A quantidade de sódio

(Na) foi determinada em fotômetro de chama (Micronal B262). Ambos, ferro e sódio,

foram quantificados conforme parâmetros operacionais recomendados pelo

fabricante dos respectivos equipamentos.

Determinação de ácidos graxos livres

Inicialmente, as amostras foram liofilizadas (Virtis Unitop/1000L) e depois os

lipídios foram extraídos de acordo com Folch, Less e Stanley (1957). Deste extrato,

foi retirada uma alíquota de 10 mL e a concentração total de lipídios foi determinado

gravimetricamente. Uma alíquota adicional, contendo aproximadamente 100 mg de

lipídio foi esterificada e a composição de ácidos graxos determinada através de

cromatografia gasosa.

O extrato seco de lipídios foi esterificado com uma solução de cloreto de

amônio e ácido sulfúrico em metano (HARTMAN e LAGO, 1973). Ésteres metílicos

de ácidos graxos foram analisados em cromatógrafo gasoso (CG) (Shimadzu GC-

2010) acoplado a um espectrômetro de massa (Shimadzu QP2010). A separação foi

executada em uma coluna capilar MS-5 (30 m;·0,25 mm I.D. x 0.25 µm film

thickness) (Restec Rtx®). Gás Hélio ultrapuro foi utilizado como gás de arraste com

um fluxo de 1,0 mL . min

-1

. O programa de temperatura foi de 150

C elevando-se

para 220

C (2

C min

-1

), mantida por 15 min. Foram injetadas amostras de 1 µl em

modo de split (100:1) e a temperatura do injetor foi de 250

C. Foram obtidos

espectros de massa sob as seguintes condições: 70 eV de impacto eletrônico com

energia do elétron, modo scan com m/z de 40-400 u. Fonte de íons aconteceu a

temperatura de 220

C e interface a 250

Por comparação dos respectivos espectros de massa com o banco de dados

da biblioteca (NIST05) os ácidos graxos livres foram identificados, considerando-se

uma similaridade superior a 90%. Os resultados foram expressos em percentual de

área normalizada. A quantificação estimada foi determinada por normalização e

transformação do porcentual de área em g . 100 g

-1

de amostra, usando o fator de

conversão para lipídios (F). Um valor de F de 0,956 foi utilizado para os produtos

cárneos processados baseado em Holland et al. (1994).

Duas medidas independentes foram feitas para cada amostra, obtendo-se a

média e o desvio padrão.

Avaliação de Cor

A avaliação de cor foi determinada para os Grupos A e B de salame tipo

Milano ao término do período de maturação, usando o colorímetro (Chroma Meter

CR-300, Minolta). Foram realizadas medidas de cor do CIE Lab, L* (lightness -

luminosidade/brilho), a

(redness - vermelho) e b

(yellowness - amarelo), em três

pontos da superfície de duas fatias (10mm). Ao todo, foram obtidas seis medidas

para cada amostra.

Detecção de enterotoxinas

Para a detecção de enterotoxinas foi usado um auto-analizador VIDAS

(Biomeriéux) e um kit VIDAS® Staph enterotoxina (Biomerieux). A extração de

enterotoxinas das amostras (Grupos A e B) foi procedido como descrito no protocolo

para produtos cárneos, instruções de acordo com o manual (SET 2 kit). O valor

relativo de fluorescência (VRF) obtido foi interpretado pelo sistema VIDAS como

segue: quando VT (Valor de Teste) < 0,13, interpretação negativa (ausência de

enterotoxinas) e VT ≥ 0,13, interpretação positiva (presença de enterotoxinas).

Análise sensorial

A análise foi realizada ao término do período de maturação dos embutidos por

um painel de 70 degustadores no laboratório de análise sensorial. Estes eram

estudantes e professores do Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos e

não foram treinados previamente para avaliação sensorial de produtos cárneos. O

método usado foi a ordenação de preferência (ABNT/NBR12994/1993 e

NBR13170/1994), solicitando para que as amostras fossem degustadas pelos

participantes e ordenadas em seqüência de maior para menor preferência. Todos os

participantes assinaram o TCLE – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, em

conformidade com o Projeto 189/05: Desenvolvimento de cultivos iniciadores para a

produção de embutidos cárneos artesanais, aprovado em 27 de junho de 2005, pelo

Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Universidade Federal de

Santa Catarina.

Análise estatística

Os dados foram avaliados através de análise de variância (ANOVA) aplicando

o Teste - t para determinar diferenças entre as médias ao nível de significância de

5% (p< 0,05), utilizando o programa STATISTICA Versão 6.0.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados das análises microbiológicas de salame tipo Milano durante a

fermentação e maturação são apresentados na Figura 1. Inicialmente, contagens de

aeróbios mesófilos foram ligeiramente baixos no Grupo B, enquanto o Grupo A

apresentou um número inicial mais alto. Após o período de 14 dias, as contagens

foram de 8,62 log UFC.g

-1

e 6,49 log UFC.g

-1

, respectivamente nos grupos A e B

(Figura 1b).

Para os cocos Gram positivo, catalase positivo - Staphylococcus Coagulase-

negativo (SCN) as contagens no grupo inoculado (Grupo A) mostraram considerável

crescimento durante a maturação. Com uma contagem inicial de 7,60 log UFC.g

-1

alcançaram valores de 9,84 log UFC.g

-1

depois de 14 dias. No controle (Grupo B),

esses microrganismos foram encontrados em concentrações muito baixas, e depois

de 14 dias alcançaram valores de 6,95 log UFC.g

-1

(Figura 1a). Este substancial

crescimento no Grupo A (2 log) foi contemplado pela baixa concentração de

bactérias ácido lácticas (BAL) durante a fermentação e maturação, alcançando

níveis máximos em torno de 6,34 log UFC.g

-1

(Figura 1c), não afetando a

sensibilidade de Micrococcaceae na presença de alta acidificação (PALUMBO e

SMITH, 1977; LÜCKE, 1985). De acordo com trabalhos de Comi et al. (1992) e

Samelis et al. (1993) em embutidos fermentados fabricados em escala artesanal,

Micrococcaceae pode ser mais competitivo e alcançar contagens mais altas, 1-2 log,

no caso de um pH final de 5,5. BAL não foram utilizadas como cultivo iniciador,

assim, contagens das mesmas não foram diferentes nas amostras inoculadas e no

controle; na realidade, diversas espécies de BAL fazem parte da microbiota da

carne.

Coliformes totais e termotolerantes (<3 NMP) foram semelhantes em ambos

os grupos; entretanto, nas amostras inoculadas (Grupo A), o número destes

microrganismos diminuiu nitidamente e, depois de 7 dias de maturação, nenhuma

célula viável de coliformes totais e termotolerantes foi detectado. Enquanto que, no

controle, coliformes totais e termotolerantes estiveram presentes após 7 dias e só

depois de 21 dias de maturação não foram detectáveis, ambos estavam ausentes no

produto final. Bolores e leveduras não apresentaram nenhuma função significante

nos embutidos, estiveram presentes a níveis máximos de cerca de 2,77 log UFC.g

-1

e, na maioria dos casos, não foram detectados. Estes resultados no produto final

estão de acordo com a legislação brasileira para os padrões microbiológicos de

produtos cárneos maturados (BRASIL, 2001), e comprovam a necessidade de boas

práticas de fabricação, para obter reduzida contaminação de microrganismos

indesejáveis em produtos cárneos.

0 7 14 21 28 42

tempo (dias)

lo g cfu/g

Batch A

control

0 7 14 21 28 42

tempo (dias)

lo g c fu /g

Batch A

control

0 7 14 21 28 42

tempo (dias)

log cfu/g

Batch A

control

Figura 1 - Evolução da microbiota durante maturação de salame Milano. a) Cocos Gram

positivo, catalase positivo; b) aeróbios mesófilos; c) BAL.

Ambos os grupos estavam livres de Salmonella e Listeria após formulação,

como também números de Clostridium sulfito redutores (<1) e Staphylococcus

coagulase positivo (<2) durante a maturação e no produto final. De acordo com

Drosinos et al. (2005), isto indica a importância de selecionar matérias-primas de

boa qualidade microbiológica para produção de embutido seco.

Os resultados das análises físico-químicas do salame tipo Milano durante a

fermentação e maturação são apresentados na Tabela 1. As medidas dos valores de

pH durante a maturação não variaram entre os grupos (A e B). Provavelmente, pelas

baixas contagens de BAL, responsáveis pela redução de pH devido à produção de

ácido láctico e o pequeno efeito das linhagens de Staphylococcus no

desenvolvimento de pH nos embutidos. De acordo com Olesen et al. (2004), as

linhagens de Staphylococcus produzem quantidades muito limitadas de ácido.

Inicialmente, as medidas de pH de ambos os grupos foi em torno de 5,6 e, então,

diminuíram para valores de 5,2 depois de 7 dias de maturação; foi observado um

leve aumento no pH do produto final, com valores ao redor de 5,3 entre os grupos,

de acordo com resultados de Galgano et al., (2003). Isto poderia ser atribuído à

produção de amônia e outros compostos básicos como peptídeos, aminoácidos,

aldeídos, aminas e ácidos graxos livres oriundos da atividade proteolítica

(MAURIELLO et al., 2004).

Na tabela 1, verifica-se que atividade de água (aw) e umidade mostraram uma

diminuição constante durante a maturação, e proteína, gordura, cinza, NaCl, Na e Fe

)

aumentaram o conteúdo durante a maturação em conseqüência da desidratação

ocorrida no produto. Esses resultados, no produto acabado (42 dias), estão

conformes à legislação brasileira - Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade

de salame tipo Milano (BRASIL, 2000).

O baixo percentual de ácido láctico (%) (Tabela 1) provavelmente é resultado

da atividade de SCN, que produz quantidades muito limitadas de ácido, ou pela

presença de LAB, as quais fazem parte da microbiota da carne.

Nitrato e nitrito curam e preservam carnes. O nitrato não apresenta atividade

antioxidante, mas torna-se funcional na redução de nitritos (TERRA et al., 2004).

Assim, durante a preparação, nitrato é reduzido a nitrito, que é o principal

ingrediente ativo nessas misturas de sais de cura (CAMMACK, 1999). Nitratos e

nitritos diminuíram em concentração durante a fermentação e maturação de salame

tipo Milano e os valores no salame inoculado (Grupo A) foram estatisticamente

diferentes (p < 0,05) em relação ao controle (Figura 2). Atribui-se essa diferença às

bactérias Micrococcaceae, pois estudos mostraram que S. xylosus possui uma boa

habilidade para reduzir nitrato, pela ação da enzima nitrato redutase o que torna

possível a redução do mesmo até nitrito no produto (MONTEL et al., 1996; TALON

et al., 1999; MAURIELLO et al., 2004; FIORENTINI et al., 2007. As concentrações

de nitrito necessárias para a ocorrência dos vários efeitos em embutidos seriam de

30 a 50ppm para o desenvolvimento da cor; de 20 a 40ppm para o desenvolvimento

do aroma, de 80 a 150ppm para o efeito conservador (MÜLLER, 1991; ORDÓÑEZ et

al., 2005), e entre 20 a 50ppm para o efeito antioxidante; porém, esses valores

dependem do tipo de produto cárneo (LÜCKE, 2000). Em produtos fermentados, o

nitrito é reduzido para óxido nítrico, devido à ação da enzima nitrito redutase,

também presente em representantes da família Micrococcaceae, tendo reação mais

rápida em pH inferior a 5,6 e redução da velocidade em pH maior que 6,2 (ARNAU

et al., 1998). Para a enzima nitrito redutase agir como agente redutor, as contagens

de Micrococcaceae devem ser em torno de 6 log UFC.g

-1

(CAMPBELL-PLATT e

COOK, 1995).

Durante a fermentação e maturação de salame tipo Milano, a redução no

nível de nitrito em ambos os tratamentos pode ter acontecido pela ação da enzima

nitrito redutase presente nas espécies de Micrococcaceae, sendo mais acentuada

no Grupo A (7 a 28 dias) (Figura 2) devido às contagens de cocos Gram poisitivo,

catalase positivo, serem iguais ou superiores a 6 log.UFC.g,

-1

enquanto no grupo B

ficaram em torno de 14 a 21 dias (Figura 1).

A capacidade de redução de nitrito é mais uma ação de linhagens

Micrococcaceae, demonstrada pela ausência de nitrosaminas em produtos cárneos

fermentados (PINTO et al., 2001).

O índice convencional de oxidação lipídica, valor de peróxidos, também foi

avaliado neste estudo. Durante a maturação foram observados valores reduzidos no

Grupo A em relação ao Grupo B, estatisticamente significativos (p < 0,05),

demonstrando a atividade da catalase da linhagem S. xylosus U5 (catalase positivo)

(Tabela 1). A oxidação conduz à formação de peróxidos e os mesmos são reduzidos

quando estão presentes microrganismos com alta atividade de catalase (VARNAN e

SUTHERLAND, 1995). A atividade de catalase é considerada por ser importante na

remoção de peróxido de hidrogênio, que pode ser formado como um metabólito por

LAB e outras espécies de bactérias em embutidos.

De acordo com Cornforth (1996), os níveis de nitrito em embutidos também

têm efeito na inibição do desenvolvimento da rancidez. Produtos cárneos

tradicionais, como embutidos fermentados secos são interessantes modelos para

investigações, por serem um produto exposto significativamente às condições pró-

oxidantes. Os valores de peróxidos encontrados neste estudo estão dentro de níveis

aceitáveis (isto é, ao redor 2-4 mequivO

-1

) para uma boa qualidade de

embutidos fermentados secos e nenhum odor rançoso censurável (FERNÁNDEZ e

RODRÍGUEZ, 1991; JOHANSSON et al., 1994; GHIRETTI et al., 1997; NOVELLI et

al., 1998; ZANARDI et al., 1998).

Tabela 1

Variações nas análises físico-químicas durante a fermentação e maturação de salame tipo

Milano

Análises Dia 1

Dia 7

Dia 14

Dia 21

Dia 28

Dia 42

Umidade (%)

Grupo A

Grupo B

52,88±0,43

52,4± 0,3

42,6± 0,33

44± 0,28

42,5±0,35

41,7± 0,45

40,5±0,27

35,4± 0,53

35,9±0,10

32,09± 0,08

28,4±0,08

28,05± 0,1

Cinza (%)

Grupo A

Grupo B

4,1±0,2

4,6±0,1

5,1±0,4

5±0,4

5,2±0,1

5,3±0,38

5,4±0,01

5,8±0,27

5,8±0,06

5,8±0,12

6,2±0,3

6,4±0,8

Gordura (%)

Grupo A

Grupo B

21,9±0,37

22±0,2

25±0,03

24,9±0,08

24,1±0,2

24,8±0,11

24,6±0,04

26,4±0,09

26,6±0,41

28,1±0,15

29,01±0,07

30,02±0,18

Proteina (%)

Grupo A

Grupo B

19,09±0,2

18,95±0,06

n.d.

32,82±0,07

32,01±0,86

NaCl (%)

Grupo A

Grupo B

3,21±0,0

3,24±0,03

n.d.

4,80±0,12

4,91±0,01

Grupo A

Grupo B

0,954±0,10

0,963±0,07

0,932±0,22

0,932±0,35

0,901±0,18

0,906±0,27

0,9±0,09

0,903±0,13

0,87±0,18

0,87±0,28

0,821±0,06

0,832±0,31

Grupo A

Grupo B

5,6±0,2

5,68±0,03

5,24±0,12

5,34±0,07

5,28±0,14

5,38±0,05

5,25±0,03

5,21±0,08

5,21±0,0

5,20±0,03

5,3±0,03

5,25±0,06

Fe (mg/100g)

Grupo A

Grupo B

1±0,08

1±0,09

1,2±0,55

1,1±0,1

1,4±0,78

1,1±0,8

1,2±0,02

1,2±0,75

1,2±0,05

1,2±0,06

1,5±0,10

1,7±0,08

Na (mg100g)

Grupo A

Grupo B

2049,3±1,90

2061,2±2,1

2301,1±1,42

2174,7±1,79

2427±0,96

2321,6±1,35

2483,2±0,88

2476,5±1,98

2518,3±1,02

2734,6±0,97

2522,7±0,66

2865,9±1,11

Ácido

láctico (%)

Grupo A

Grupo B

0,26±0,03

0,25±0,01

0,57±0,02

0,51±0,06

0,64±0,09

0,63±0,08

0,7±0,05

0,66±0,03

0,83±0,10

0,86±0,03

1±0,64

0,86±0,05

Peróxidos

(mEq.kg

-1

)

Grupo A

Grupo B

0,65±0,03

0,66±0,02

0,73±0,07

0,95±0,05

1,29±0,05

1,52±0,03

1,48±0,05

2,23±0,00

2,07±0,03

3,59±0,06

2,86±0,06

3,89±0,02

Os valores informados são as médias de três repetições. Os valores na direita referem-se ao desvio

padrão (D.S.). Grupo A: adição de S. xylosus Grupo B: controle.

* Valores de peróxidos apresentaram diferença significativa entre os tratamentos.

100

150

200

250

300

0 7 14 21 28 42

Tempo (dias)

Nitrato (mg/kg)

Grupo A Grupo B

100

120

140

0 7 14 21 28 42

Tempo (dias)

Nitrito (mg/kg)

Grupo A Grupo B

Figura 2 - Mudanças na concentração de nitrato e nitrito durante a fermentação e

maturação de salame tipo Milano. Grupo A: adição de S. xylosus Grupo B: controle

Os principais ácidos graxos livres encontrados nos produtos e transformados

durante a maturação foram: C14:0; C16:0; C16:1 (9); C17:0; C18:0; C18:1 (9); C18:1

(11); C18:2 (9,12), como apresentado na tabela 2. Em ambos os grupos houve um

aumento progressivo na concentração de ácidos graxos com o transcorrer do

período de maturação, porém, pequenas diferenças puderam ser observadas entre

os tratamentos, não apresentando diferença significativa ao nível de 5%.

Mesmo considerando que linhagens de Staphylococcus é a principal causa da

lipólise em embutidos fermentados (SAMELIS et al., 1993), os valores indicam que a

cultura Staphylococcus xylosus U5 não desenvolveu ação significativa nas

transformações químicas de ácidos graxos livres. Resultados semelhantes foram

relatados por Montel, et al., (1993) em embutidos preparados assepticamente, o

grupo inoculado com linhagens de Staphylococcus teve um conteúdo de ácidos

graxos livres similares ao apresentado no grupo controle, sendo assim, processos

lipolíticos não puderam ser atribuídos a Staphylococcus. Molly et al. (1997)

estudando a lipólise em embutidos mostrou que a atividade das bactérias nesses

produtos é pequena, em virtude de que as condições do meio não oferecem

condições favoráveis para as lípases bacterianas. Em controvérsia, Stahnke (1994)

obteve resultados onde mais de 60% dos ácidos graxos livres foram resultantes do

processo lipolítico em embutidos com S. xylosus comparados aos embutidos

elaborados sem cultivos iniciadores. Isto indica que as linhagens de S. xylosus são

realmente lipolíticas como mostrado por outros trabalhos (COMI et al., 1992;

SORENSEN et al., 1993). Embora várias bactérias, selecionadas pela sua atividade

lipolítica são usadas como culturas iniciadoras comerciais, a adição de lipases

freqüentemente não afeta a avaliação sensorial de embutidos fermentados

(FERNÁNDEZ et al., 1991). Além disso, a atividade lipolítica bacteriana é

influenciada por vários fatores, inclusive o estado fisiológico da cultura usada, o tipo

de substrato, pH, temperatura, etc. (TALON et al., 1992). Mesmo que a linhagem

Staphylococcus xylosus U5 tenha apresentado atividade lipolítica (FIORENTINI et

al., 2007a), nas condições encontradas em salame tipo Milano, pouca atividade foi

demonstrada. Galgano et al., (2003) e Zuber et al., (2007) quando verificaram a

influência de várias linhagens de S. xylosus em embutidos, nenhum efeito foi

perceptível sobre a composição de ácidos graxos em embutidos inoculados em

relação ao controle.

Na figura 3 são apresentadas as percentagens relativas de ácidos graxos

livres saturados, monoinsaturados e polinsaturados, após 40 dias de maturação. Em

comparação com a amostra controle (Grupo B), a adição de cultivos iniciadores

(Grupo A) não causou significativas modificações nas percentagens relativas de

ácidos graxos livres. Em ambos os grupos os ácidos graxos monoinsaturados foram

predominantes, 46,99 e 45,08% sendo o ácido C 18:1 encontrado em maiores

concentrações, seguido pelo C 16:1 e em menores proporções os ácidos graxos

100

polinsaturados, 9,37 e 7,81, respectivamente. Os ácidos graxos livres insaturados

são importantes precursores do flavor em produtos cárneos fermentados maturados

(MOLLY et al., 1997; CHIZZOLINI et al., 1998).

A percentagem de ácidos graxos saturados foi de 39,92 e 37,38% para o

salame controle e inoculado, respectivamente, representados com maior percentual

os ácidos C16:0 e C18:0. É desejável um reduzido percentual desses ácidos em

alimentos, visto que os mesmos influenciam no aumento do nível de colesterol

sangüíneo. Resultados similares são informados na literatura para outros embutidos

fermentados comparáveis ao tempo de maturação (DOMÍNGUEZ-FERNÁNDEZ e

ZUMALACÁRREGUI, 1991; HIERRO et al., 1997; GALGANO et al., 2003; ZUBER et

al., 2007) e em salames tipo Milano (ZANARDI et al., 2002; CAMPOS et al., 2006).

Tabela 2

Evolução do conteúdo de ácidos graxos durante a fermentação e maturação de salame tipo

Milano

Ácidos

graxos

(g/100g)

Grupos

Tempo/dias

1 7 14 21 28 42

C14:0

C16:0

C 17:0

C18:0

C16:1(9)

C18:1(9)

C18:1(11)

C18:2(9, 12)

0,32±0,03

0,31±0,06

5,17±0,16

5,07±0,16

0,09±0,01

2,79±0,45

3,08±0,05

0,42±0,03

0,39±0,03

8,62±0,65

9,77±0,01

0,59±0,06

0,69±0,04

2,10±0,38

2,57±0,09

0,36±0,04

0,35±0,08

5,70±1,28

5,69±1,03

0,10±0,02

0,10±0,01

3,03±0,99

3,12±0,26

0,46±0,11

0,36±0,06

9,39±2,09

9,82±0,11

0,63±0,11

0,67±0,08

2,65±0,78

2,75±0,06

0,38±0,07

0,36±0,00

5,80±0,09

5,78±0,25

0,05±0,04

0,06±0,01

2,84±0,07

3,05±0,50

0,47±0,06

0,47±0,02

9,61±0,23

9,93±0,34

0,61±0,23

0,68±0,02

2,76±0,43

2,66±0,21

0,36±0,01

0,40±0,25

5,72±1,29

6,16±1,51

0,05±0,01

0,07±0,00

3,03±0,69

3,32±0,15

0,46±0,09

0,50±0,09

9,33±3,02

10,32±0,49

0,65±0,16

0,72±0,5

2,37±1,17

2,78±0,78

0,39±0,11

0,43±0,03

6,31±0,74

6,74±0,06

0,06±0,01

0,05±0,00

3,42±0,04

3,54±0,06

0,49±0,01

0,53±0,02

10,52±0,04

11,22±0,04

0,75±0,17

0,76±0,01

2,62±0,21

2,92±0,40

0,42±0,01

0,42±0,08

6,52±1,35

7,13±0,38

0,12±0,05

0,07±0,01

3,35±1,03

3,38±0,25

0,55±0,08

0,55±0,01

11,18±2,03

12,12±0,42

0,82±0,06

0,87±0,01

2,17±0,87

2,70±0,36

Os valores informados são as médias de três repetições. Os valores na direita referem-se ao desvio

padrão (D.S.). Grupo A: adição de S. xylosus Grupo B: controle.

101

saturados monoinsaturados polinsaturados

Àcidos graxos

Percentagem relativa (%)

Grupo A

Grupo B

Figura 3 - Composição de ácidos graxos em salame tipo Milano: percentagem relativa

depois de 40 dias de maturação. Grupo A: adição de S. xylosus Grupo B: controle

Quanto aos parâmetros de cor obtidos em salame tipo Milano, houve

diferenças entre as cores dos Grupos A e B no produto final (Tabela 3). O Grupo A

mostrou valores significativamente mais altos (p < 0,05) de L

(brilho)

, a

(vermelho)

(amarelo)

em relação ao controle (Grupo B). Provavelmente a ação enzimática de

S. xylosus U5 influenciou nos valores de L

e a

, pois esta ação envolve a atividade

bacteriana de nitrato redutase que reduz nitrato a nitrito aumentando a

disponibilidade de NO que conduz à formação de nitrosomioglobina (coloração

vermelha). Outra contribuição de S. xylosus U5 está relacionada à produção de

catalase que degradando o peróxido de hidrogênio, impede o esverdeamento do

produto em conseqüência da reação de peróxido de hidrogênio com a mioglobina.

Os valores de b * são devido a conseqüente redução da oximioglobina em função do

consumo de oxigênio pelos microrganismos.

DELLAGLIO et al. (1996) estudando salame Felino, um embutido curado seco

italiano, encontrou valores semelhantes de L* (39,10±47,27), mais alto para a*

(22,13±30,08) mas mais baixos para b * (5,68±8,90). Pagan-Moreno et al. (1992),

em outro tipo de chorizo, encontrou valores mais baixos para L* (34,72±41,53) e a*

(13,87± 17,55), sendo os valores de b* mais semelhantes (9,33±14,10). Em carnes e

produtos cárneos, a luminosidade (L*) parece ser o parâmetro mais informativo para

variações de cor (MIELNIK e SLINDE, 1983), mas a importância do vermelho (a*)

não deveria ser ignorada (FERREIRA, FERNANDES e YOTSUYANAGI, 1994).

102

Tabela 3

Parâmetros de CIE L*, a* e b* em salame Milano após 40 dias de maturação

L* (brilho) a* (vermelho) b* (amarelo)

Grupo A (S. xylosus U5) 49,46 (1,90) 18,26 (0,78) 9,79 (0,90)

Grupo B (controle) 42,27 (1,21) 13,59 (0,81) 8,06 (0,61)

Valores médios (com desvio padrão entre parênteses).

No presente estudo, não foi encontrado enterotoxinas estafilocócicas em

salame tipo Milano (Grupos A e B), o que descarta a possibilidade de produção de

enterotoxinas pela cultura inoculada (S. xylosus U5) ou por SCN presentes nos

produtos, garantindo assim um produto seguro para o consumo. A intoxicação

alimentar estafilocócica ocorre pela ingestão de enterotoxinas pré-formadas no

alimento, contaminado essencialmente pela manipulação humana ou matéria-prima

procedente de animais portadores. Cunha et al., (2006) analisou um total de 88

amostras de alimentos e quatro isolados de CNS foram positivos para genes de

enterotoxinas, quando detectados por Reação de Polimerase em Cadeia (PCR),

embora nenhuma produção de enterotoxina fosse detectada pelo método de

aglutinação em látex (RPLA). Muito pouco se conhece, porém, sobre o crescimento

de SCN em alimentos. Em concordância com os resultados obtidos no presente

trabalho, Pereira e Pereira (2006) analisaram 90 amostras de salames

industrializados, pertencentes a seis diferentes marcas, foram analisadas visando a

enumeração, identificação e verificação do potencial enterotoxigênico das espécies

de estafilococos coagulase negativa (SCN). Entre os 266 isolados de SCN nenhum

produziu enterotoxina, e dos 252 identificados cerca de 90% eram S. xylosus e S.

carnosus.

A avaliação sensorial indicou a preferência para o salame inoculado (72,5%)

em relação ao controle. A linhagem S. xylosus U5 possui um perfil enzimático

comprovado capaz de promover propriedades sensoriais desejáveis no salame, as

quais interferem na aceitabilidade do produto. É possível afetar a qualidade sensorial

do produto final pelo tipo de cultivo iniciador (BERDAGUÉ et al., 1993). As espécies

de Micrococcaceae são as maiores contribuintes na formação de flavor e cor em

produtos cárneos (MONTEL et al., 1996; STAHNKE et al., 2002). O flavor, que

acontece devido à capacidade de lípases e proteases estafilocócicas formando

compostos químicos característicos de salames, assim como, à capacidade de

produção de catalase impedindo a formação de compostos indesejáveis, e a cor,

103

pela produção da enzima nitrato redutase são atributos importantes para a

aceitabilidade de um embutido.

Em conclusão, a linhagem de Staphylococcus xylosus U5 estudada obteve

um bom crescimento durante a fermentação e maturação de salame tipo Milano. As

enzimas bacterianas, que mostraram eficiente atividade sob as condições

encontradas no salame, foram catalase, nitrito e nitrato redutase, em conseqüência

às propriedades físico-químicas e sensoriais apresentadas pelo produto. Os

parâmetros de cor foram superiores no salame inoculado e foi o produto preferido

pelos degustadores, porém não houve diferenças significativas na composição geral

dos ácidos graxos livres para este tipo específico de embutido. A linhagem S.

xylosus U5 pode ser usada como um cultivo iniciador simples em embutidos

fermentados ou em sinergismo com BAL, como sugere a ausência de antagonismo

entre ambas. No entanto, estudos adicionais são ainda necessários para avaliar

demais propriedades tecnológicas (atividade proteolítica, produção de compostos

aromáticos) de linhagens nativas de S. xylosus em embutidos fermentados.

AGRADECIMENTOS

Esta pesquisa foi apoiada por EMBRAPA, UNIJUÍ e UFSC.

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CONSIDERAÇÕES FINAIS

Os embutidos artesanais possuem uma microbiota típica e diversificada. O

entendimento da dinâmica dessa população nos produtos elaborados pode melhorar

o processo de fermentação, a segurança e a padronização de tais produtos e,

conseqüentemente reduzir perdas econômicas, reforçando deste modo sua posição

em um mercado caracterizado pela crescente industrialização. Além disso, os

produtos de diferentes origens possuem diferente qualidade sensorial, sendo

apreciados pelo seu alto valor gastronômico.

As mais recentes pesquisas buscam explorar a biodiversidade presente em

produtos artesanais na busca de linhagens industrialmente importantes, que

possibilitam melhorar e aperfeiçoar o processo de fermentação de embutidos e

garantir produtos com melhores características organolépticas, mais seguros, e mais

saudáveis.

No presente estudo, isolou-se linhagens de Staphylococcus xylosus de

embutidos artesanais e depois de caracterizadas muitas propriedades tecnológicas

puderam ser comprovadas tais como: viabilidade para a fermentação e estabilidade

no processo de liofilização e armazenamento, reação negativa para enterotoxinas

estafilocócicas, sinergismo com as BAL, eficiente atividade de catalase, nitrito e

nitrato redutase, contribuindo para as propriedades microbiológicas, físico-químicas

e sensoriais do produto.

A pesquisa proporcionou o domínio da técnica de isolamento, a

caracterização e obtenção das culturas como cultivos iniciadores, porém a

continuidade dos estudos se faz necessária, como o desenvolvimento de um meio

de cultura alternativo para reduzir custos de produção das linhagens em larga escala

e avaliar a viabilidade econômica da aplicação destas culturas em embutidos,

comparando com o uso de uma cultura iniciadora comercial.

É fundamental a investigação de demais propriedades dessas linhagens,

entre elas, a atividade proteolítica e a produção de compostos aromáticos. Cabe

destacar a influência de Staphylococcus xylosus na formação de compostos

aromáticos em embutidos fermentados, o que as torna com potencial para aplicação

na produção de embutidos artesanais, visando um produto com característica

regional, identidade cultural e muito apreciado pelo consumidor.

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