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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DOS ALIMENTOS
COMPOSTOS FENÓLICOS, ÁCIDOS GRAXOS E CAPACIDADE
ANTIOXIDANTE DO BAGAÇO DA VINIFICAÇÃO DE UVAS TINTAS
(Vitis vinifera L. e Vitis labrusca L.)
Ismael Ivan Rockenbach
Florianópolis
2008
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Ismael Ivan Rockenbach
COMPOSTOS FENÓLICOS, ÁCIDOS GRAXOS E CAPACIDADE
ANTIOXIDANTE DO BAGAÇO DA VINIFICAÇÃO DE UVAS TINTAS
(Vitis vinifera L. e Vitis labrusca L.)
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Ciência dos
Alimentos do Centro de Ciências
Agrárias, Universidade Federal de
Santa Catarina, como requisito final
para a obtenção do grau de Mestre em
Ciência dos Alimentos.
Orientadora: Prof.
a
Dr.
a
Roseane Fett
Florianópolis
2008
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AGRADECIMENTOS
Ao Mestre dos Mestres, o Senhor Deus, pela força, confiança e benção.
À Professora Dra. Roseane Fett pela oportunidade concedida, pela acolhida, pelo
estímulo, consideração e amizade.
À família, pai Selmar, mãe Jacinta e irmã Daniele, que foram o porto seguro nos
momentos de insegurança, que sempre acreditaram na minha capacidade e que me apoiaram
incondicionalmente. Muito obrigado!
Ao amigo e Professor da graduação Raul Vicenzi, pelo estímulo, apoio e
encaminhamento.
Aos amigos Fábio e Lílian Brod, pela acolhida e pela amizade, pelos chimarrões e pelo
apoio que nunca faltou.
Ao colega Eliseu pela parceria e por todos os objetivos alcançados com sua ajuda. Pela
dedicação e comprometimento com este trabalho.
Ao técnico, amigo, e “guru” do laboratório Luciano Valdemiro Gonzaga pela amizade
e parceria nas análises. Pela convivência e experiência transmitida.
À pesquisadora, amiga e instrutora Eugênia Marta Kuskoski pelos primeiros
aprendizados nas metodologias, incentivo e amizade.
Ao Programa de Pós-Graduação pela oportunidade concedida e pelo apoio.
Ao pesquisador Vinícius Caliari da Estação Experimental de Videira da EPAGRI,
Santa Catarina, pela viabilização das amostras para o trabalho.
Ao secretário Sérgio pelo apoio burocrático e amizade.
Aos colegas de turma Estela, Karina, Jéferson, Ana Cristina, Fabiane, Júnior, colegas
de laboratório Melissa, Érika, Márcia, Ciriele, Lucas, Graciela Lessa, Fred, Camila e Analú, e
aos colegas de Pós-Graduação pela convivência e amizade.
Às primas Ana Paula e Monique e aos amigos Fábio e Nádia, pela parceria e amizade.
Ao Professor Dr. Jorge Mancini Filho, técnica Rosângela Pavan e doutorando
Alessandro Lima da USP pela parceria nas análises.
Aos Professores Gustavo Micke e Marcelo Maraschin pelos esforços para a
identificação de compostos fenólicos.
À CAPES pela concessão da bolsa e a todos que de alguma forma contribuíram na
minha caminhada os mais sinceros agradecimentos.
“Se chorei ou se sorri, o importante é que emoções eu vivi”
Roberto Carlos
a
ROCKENBACH, I. I. Compostos fenólicos, ácidos graxos e capacidade antioxidante do
bagaço da vinificação de uvas tintas (Vitis vinifera L. e Vitis labrusca L.). 112 p.
Dissertação (Mestrado em Ciência dos Alimentos) – Centro de Ciências Agrárias,
Universidade Federal de Santa Catarina, 2008.
RESUMO
A vitivinicultura no Brasil está concentrada nas regiões Sul, Sudeste e Nordeste, sendo uma
atividade consolidada e com significativa importância sócio-econômica. Em Santa Catarina, a
vitivinicultura apresenta expressão econômica principalmente na região do Vale do Rio do
Peixe, onde a maior parte da produção de uvas destina-se à elaboração de vinhos de mesa.
Esta importante atividade econômica gera grandes quantidades de resíduos sólidos, como o
bagaço de uva, os quais são descartados ou subaproveitados. O objetivo deste trabalho foi
avaliar o conteúdo de compostos fenólicos, atividade antioxidante, estabilidade das
antocianinas e a composição em ácidos graxos do óleo extraído do bagaço de uva de
diferentes variedades Vitis vinifera L. e Vitis labrusca L. produzidas na região de Videira,
Santa Catarina. Na primeira etapa do trabalho foi otimizada a metodologia de extração, onde
foram avaliados diferentes sistemas solventes de acetona e etanol. Também foi realizada a
avaliação da estabilidade das antocianinas do resíduo seco e desengordurado obtido a partir de
bagaços de uva. Determinou-se ainda o perfil de ácidos graxos do bagaço de todas as
variedades de uva utilizadas e foram identificados os ácidos fenólicos presentes no bagaço de
algumas variedades. A quantificação de compostos fenólicos totais foi realizada pelo método
de Folin-Ciocalteu e quantificação dos ácidos fenólicos por cromatografia gasosa,
antocianinas monoméricas totais pelo método de diferença de pH e atividade antioxidante
pelos métodos ABTS (ácido 2,2´-azino-bis (3-etilbenzotiazolin)-6-ácido sulfônico), DPPH
(2,2- difenil-1-picrilhidrazila), FRAP (poder antioxidante de redução do ferro) e sistema β-
caroteno/ácido linoléico. Na otimização da extração verificou-se que o sistema solvente
acetona, nas concentrações de 50 e 70 % em meio aquoso, apresentou maior eficiência na
extração de compostos fenólicos totais, na atividade antioxidante e no poder redutor, enquanto
que os sistemas solventes alcoólicos apresentaram maior teor de antocianinas monoméricas
totais extraídas e maior eficiência na inibição do processo de oxidação do sistema β-
caroteno/ácido linoléico. Com o extrato etanólico observou-se maior sinergismo na aplicação
conjunta de extratos de bagaço de uva e BHT. A estabilidade das antocianinas, avaliada no
período de 298 dias, mostrou tempos de meia-vida de 1680 e 1306 dias para as variedades
Ancelota e Tannat; e de 868 e 343 dias para as variedades Regente e Pinot Noir. O óleo do
bagaço de todas as variedades de uvas avaliadas apresentou uma composição de ácidos graxos
com alta concentração em ácido linoléico (47,63 a 60,02 %) e oléico (9,48 a 16,81 %). Na
avaliação dos ácidos fenólicos dos bagaços de uva verificaram-se teores expressivos de ácido
protocatecuico nas frações de ácidos fenólicos livres e de ácido gálico nas frações de ácidos
fenólicos esterificados. Observou-se correlação significativa entre o teor de fenólicos totais e
atividade antioxidante, e entre atividade antioxidante e teor de ácidos fenólicos. Assim, os
bagaços das diferentes variedades apresentam grande potencial como fonte de compostos
fenólicos antioxidantes e de corantes naturais.
Palavras-chave: bagaço de uva, compostos fenólicos, atividade antioxidante.
ROCKENBACH, I. I. Phenolic compounds, fatty acids and antioxidant capacity of red
grape (Vitis vinifera L. and Vitis labrusca L.) pomace. 2008. 112 p. Dissertation (Master
Degree in Food Science) – Agricultural Sciences Center, Federal University of Santa
Catarina, 2008.
ABSTRACT
The wine production in Brazil is located mostly in Southern, Southeastern and Northeastern
regions, being a well-established and of significant social and economical importance. In
Santa Catarina state, vitiviniculture presents economical expression mainly in Vale do Rio do
Peixe where majority of grape production is destined to table wine manufacture. This
important economical activity produces high amounts of solid residues such as pomace which
is discarded or misused. The aim of this work was to evaluate the content of phenolic
compounds, antioxidant activity, anthocyanin stability and fatty acid composition of the oil
extracted from grape pomace of different varieties of Vitis vinifera L. and Vitis labrusca L.
produced in the region of Videira, Santa Catarina. As a first step, extraction methodology was
optimized by testing different solvent systems of acetone and ethanol. Evaluation of
anthocyanin stability was carried out in dried and defatted residue obtained from grape
pomace. Fatty acid profile was also determined for all grape varieties tested. Phenolic acids
present in of some varieties were identified too. Quantification of total phenolic compounds
was determined by Folin-Ciocalteu method and quantification of phenolic acids was
performed by gas chromatography. Total monomeric anthocyanins was determined by pH
difference and antioxidant activity by ABTS (2,2′-azinobis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonic
acid), DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhidrazil radical), FRAP (ferric reducing antioxidant
power) and β-carotene/linoleic acid system methods. In optimization of extraction it was
verified that acetone, in concentrations of 50 % and 70 % in aqueous system, presented higher
yield in extracting total phenolic compounds and in antioxidant activity and reducing power
while alcoholic systems presented higher monomeric anthocyanin contents and efficiency in
inhibiting oxidation of β-carotene/linoleic acid system. Ethanolic extract presented higher
synergism on concomitant application of grape pomace extract and BHT. Anthocyanin
stability, evaluated during 298 days, presented half-life times of 1680 and 1306 days for
Ancelota and Tannat varieties and of 868 and 343 days for Regente and Pinot Noir varieties.
Pomace oil of all grape varieties evaluated presented a fatty acid composition with high
amounts of linoleic (47.63 % to 60.02 %) and oleic (9.48 % to 16.81 %) acids. Evaluation of
phenolic acids from grape pomaces showed expressive contents of protocatechuic acid in
fractions of free phenolic acids and of galic acid in fractions of esterified phenolic acids. It
was observed a significant correlation between total phenolic content and antioxidant activity
and between antioxidant activity and phenolic acids content. Thus, pomaces from different
varieties present large potential as a source of antioxidant phenolic compounds and of natural
colorants.
Key-words. grape pomace, phenolic compounds, antioxidant activity.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Separação do bagaço de uva durante a vinificação............................................
13
Figura 2. Distribuição majoritária dos principais compostos fenólicos na uva.................
14
Figura 3. Estrutura genérica das moléculas dos flavonóides.............................................
17
Figura 4. Estrutura genérica das maiores classes dos flavonóides....................................
17
Figura 5. Exemplos de ácidos hidroxibenzóicos (a) e hidroxicinâmicos (b).....................
19
Figura 6. Estrutura química da antocianina majoritária das uvas: a malvidina-3-
glicosídeo........................................................................................................................... 20
Figura 7. Atividade antioxidante dos extratos acetônico, etanólico e metanólico do
bagaço de uva variedade Regente determinada pela oxidação acoplada do β-caroteno/
ácido linoléico....................................................................................................................
68
Figura 8. Atividade antioxidante dos extratos acetônico, etanólico e metanólico do
bagaço de uva variedade Pinot Noir determinada pela oxidação acoplada do β-
caroteno/ ácido linoléico.................................................................................................... 69
Figura 9. Rendimento de extratos de bagaço de uva (média e intervalo de confiança,
P<0,05)..............................................................................................................................
100
Figura 10. Correlação entre o conteúdo total de fenólicos e atividade antioxidante pelo
método ABTS e pelo método DPPH e entre o conteúdo total de fenólicos e o poder
redutor pelo método FRAP................................................................................................ 103
Figura 11. Poder de inibição da oxidação de extratos de bagaço de uva e BHT (butil
hidroxitolueno) a 100 ppm pelo sistema de co-oxidação de substratos β-caroteno/ácido
linoléico. C = Cabernet Sauvignon; M = Merlot; B = Bordô; I = Isabel...........................
105
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Compostos fenólicos totais de extratos de bagaço de uva (g GAE.100g
-1
peso
seco)...................................................................................................................................
47
Tabela 2. Antocianinas totais de extratos de bagaço de uva (g.100g
-1
peso seco)............
48
Tabela 3. Atividade antioxidante e Poder Redutor (µMol.g
-1
) em peso seco de extratos
de bagaço de uva................................................................................................................
50
Tabela 4. Percentual de inibição da oxidação pelo sistema de co-oxidação de substratos
β-caroteno/ácido linoléico................................................................................................. 52
Tabela 5. Conteúdo de polifenóis totais (PT) e Atividade antioxidante (ABTS e DPPH)
de extratos de bagaço de uva variedade Pinot Noir (solventes a 50% em meio aquoso
acidificado com HCl 0,1% v/v)......................................................................................... 66
Tabela 6. Conteúdo de polifenóis totais (PT) e Atividade antioxidante (ABTS e DPPH)
de extratos de bagaço de uva variedade Regente (solventes a 50% em meio aquoso
acidificado com HCl 0,1% v/v)......................................................................................... 66
Tabela 7. Estabilidade do Conteúdo de Fenólicos Totais (FT) e Atividade Antioxidante
(TEAC) de bagaços de uva (Vitis vinifera L.) após 298 dias............................................
79
Tabela 8. Perfil de Ácidos Graxos (%) da fração lipídica de amostras de bagaço de uva
(Vitis vinifera L.)...............................................................................................................
88
Tabela 9. Conteúdo de Fenólicos Totais (FT), Antocianinas Monoméricas Totais
(AMT), Atividade Antioxidante (ABTS e DPPH) e Poder Redutor (FRAP) de extratos
de bagaços de uvas tintas (Vitis vinifera L. e Vitis labrusca L.)....................................... 101
Tabela 10. Concentrações de ácidos fenólicos (mg.g
-1
) de bagaços de uvas tintas das
variedades C. Sauvignon, Merlot, Bordô e Isabel............................................................. 106
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ..................................................................................................................................................... 9
CAPÍTULO 1....................................................................................................................................................... 11
REVISÃO
BIBLIOGRÁFICA ......................................................................................................................... 11
1.1
VITIVINICULTURA
E
SEUS
SUBPRODUTOS ............................................................................. 12
1.2
COMPOSTOS
FENÓLICOS ............................................................................................................. 15
1.2.1
Flavonóides ................................................................................................................................... 16
1.2.2
Ácidos fenólicos............................................................................................................................. 18
1.2.3
Antocianinas.................................................................................................................................. 20
1.3
RADICAIS
LIVRES
E
ANTIOXIDANTES ...................................................................................... 21
1.4
EXTRAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS ................................................................................ 24
1.5
ANÁLISE
E
QUANTIFICAÇÃO
DE
COMPOSTOS
FENÓLICOS................................................. 25
1.6
MÉTODOS
DE
AVALIAÇÃO
DA
ATIVIDADE
ANTIOXIDANTE .............................................. 27
1.6.1
Método ABTS................................................................................................................................. 28
1.6.2
Método DPPH ............................................................................................................................... 29
1.6.3
Método FRAP................................................................................................................................ 29
1.6.4
Método da co-oxidação do β-caroteno/ácido linoléico.................................................................. 30
1.7
REFERÊNCIAS
BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................................... 30
CAPÍTULO 2....................................................................................................................................................... 40
INFLUÊNCIA
DO
SOLVENTE
NO
CONTEÚDO
TOTAL
DE
POLIFENÓIS,
ANTOCIANINAS
E
ATIVIDADE
ANTIOXIDANTE
DE
EXTRATOS
DE
BAGAÇO
DE
UVA
(V
ITIS VINIFERA
L.)
VARIEDADES
TANNAT
E
ANCELOTA ...................................................................................................... 40
CAPÍTULO 3....................................................................................................................................................... 60
ATIVIDADE
ANTIOXIDANTE
DE
EXTRATOS
DE
BAGAÇO
DE
UVA
DAS
VARIEDADES
REGENTE
E
PINOT
NOIR
(VITIS
VINIFERA
L.) ............................................................................................................. 60
CAPÍTULO 4....................................................................................................................................................... 73
ESTABILIDADE
DE
ANTOCIANINAS,
COMPOSTOS
FENÓLICOS
E
ATIVIDADE
ANTIOXIDANTE
DE
BAGAÇOS
DE
UVA
(VITIS
VINIFERA
L.) .............................................................................................. 73
CAPÍTULO 5....................................................................................................................................................... 84
PERFIL
DE
ÁCIDOS
GRAXOS
DE
BAGAÇOS
DE
UVAS
TINTAS
(VITIS
VINIFERA
L.
E
VITIS
LABRUSCA
L.)................................................................................................................................................ 84
CAPÍTULO 6....................................................................................................................................................... 92
COMPOSTOS
FENÓLICOS
E
ATIVIDADE
ANTIOXIDANTE
DE
BAGAÇOS
DA
VINIFICAÇÃO
DE
UVAS
TINTAS
(VITIS
VINIFERA
L.
E
VITIS
LABRUSCA
L.)........................................................... 92
CONSIDERAÇÕES FINAIS............................................................................................................................ 112
a
9
INTRODUÇÃO
A crescente demanda por alimentos seguros vem sendo fortemente acompanhada pela
busca por processos limpos de produção, acarretando para a indústria de alimentos custos
cada vez maiores para o tratamento dos resíduos líquidos e sólidos que são gerados. Esse é o
caso da indústria vinícola, que responde por um volume substancial de resíduos orgânicos
sólidos: o bagaço de uva como subproduto representa aproximadamente 20% das uvas
colhidas (LAUFENBERG, KUNZ e NYSTROEM, 2003).
A uva, após a laranja, é a fruta de maior produção mundial, com mais de 61 milhões
de toneladas ao ano, cultivadas principalmente como Vitis vinifera para a produção de vinho
(SCHIEBER, STINTZING e CARLE, 2002). Os principais subprodutos da vinificação são
separados durante as etapas de esmagamento e prensagem das uvas, e apenas pequenas
quantidades desses resíduos são valorizados ou aproveitados (TORRES et al., 2002). A
recuperação de compostos a partir dos desperdícios contínuos da indústria de vinho poderia
representar um avanço significativo na manutenção do equilíbrio do meio ambiente, visto que
nas vinícolas as grandes quantidades de resíduos gerados apresentam sérios problemas de
armazenagem, de transformação, ou de eliminação, em termos ecológicos e econômicos. Esta
situação explica o interesse crescente em explorar os subprodutos da vinificação (ALONSO et
al., 2002).
Em comparação aos estudos químicos envolvendo os constituintes dos vinhos, o
bagaço de uva tem sido muito pouco investigado, sendo, no entanto, rico em polifenóis
(AMICO et al., 2004), que são considerados compostos bioativos, ou seja, constituintes extra-
nutricionais que ocorrem tipicamente em pequenas quantidades nos alimentos e possuem
efeitos para a saúde (KRIS-ETHERTON et al., 2002). É de conhecimento científico o
potencial antioxidante dos polifenóis, atuando como redutores de oxigênio singleto, na
inibição das reações de oxidação lipídica e na quelação de metais. Além disso, apresentam
uma ampla gama de propriedades farmacológicas, como anti-alergênicas, anti-arteriogênicas,
anti-inflamatórias, antimicrobianas, anti-trombóticas e também efeitos cardioprotetores e
vasodilatadores (PUUPPONEN-PIMIÄ et al., 2001; MANACH, MAZUR e SCALBERT,
2005). Estudos clínicos e epidemiológicos têm mostrado evidências de que antioxidantes
fenólicos de cereais, frutas e vegetais são os principais fatores que contribuem para a
significativa redução da incidência de doenças crônicas e degenerativas encontradas em
10
populações cujas dietas são altas na ingestão desses alimentos. Por este motivo, a importância
da pesquisa sobre antioxidantes naturais tem aumentado muito nos últimos anos (ROESLER
et al., 2007).
Os antioxidantes sintéticos, como BHT (butil hidroxitolueno), BHA (butil
hidroxianisol) e TBHQ (terc-butil-hidroxiquinona), são usados em muitos alimentos para
inibir a oxidação química de seus componentes. No entanto, a preocupação cada vez maior
dos consumidores em relação a estes aditivos sintéticos tem motivado a investigação acerca
de novas fontes e dos benefícios de antioxidantes naturais como seus possíveis substituintes
nos alimentos (FORMANEK et al., 2001). Neste contexto, os compostos fenólicos presentes
nos resíduos industriais da vinificação justificam o aproveitamento deste resíduo, pela
agregação de valor e pela contribuição na diminuição do impacto ambiental provocado pelo
seu descarte, além dos seus benefícios para a saúde.
Na literatura a grande maioria dos trabalhos avaliou o potencial antioxidante e os
compostos fenólicos das partes constituintes do bagaço separadamente, como sementes,
cascas e engaços. Em contrapartida, outras partes do conjunto das uvas que são rejeitadas
durante o processo de vinificação, como os engaços, recebem muito menos atenção, embora
contenham grande quantidade de polifenóis (SOUQUET et al., 2000). Poucos estudos
focalizam o potencial antioxidante do bagaço em sua totalidade (ALONSO et al., 2002;
LOULI, RAGOUSSIS e MAGOULAS, 2004). Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o
potencial antioxidante do bagaço de uva resultante da produção de vinho na região vinícola de
Videira, Santa Catarina, conhecida como região do Vale do Rio do Peixe, abrindo novos
mercados para a aplicação desse subproduto agroindustrial, agregando valor ao mesmo e
oferecendo assim uma nova possibilidade de aproveitamento deste resíduo agroindustrial.
11
CAPÍTULO 1
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
12
1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1 VITIVINICULTURA E SEUS SUBPRODUTOS
No Brasil a exploração vitivinícola é uma atividade bastante antiga, conforme
demonstram os registros de cultivo de uva pelos jesuítas no Estado do Rio Grande do Sul, no
século XVII. Em 1864, a vitivinicultura foi introduzida em Santa Catarina, sendo que o início
do cultivo na principal região produtora do Estado, o Vale do Rio do Peixe, data do ano de
1913, ocorrendo uma intensificação a partir de 1930, notadamente pelos colonizadores de
origem italiana que imigraram do Rio Grande do Sul (ROSIER e LOSSO, 1997).
Atualmente a produção de uvas e vinhos no Brasil está concentrada nas regiões Sul,
Sudeste e Nordeste, sendo uma atividade consolidada e com significativa importância sócio-
econômica. Aproximadamente 50 % da produção nacional de uvas é destinada à elaboração
de vinhos, sucos e outros derivados. Neste contexto, os Estados do Rio Grande do Sul e Santa
Catarina respondem, respectivamente, por 90 e 5 % da produção nacional de vinho,
destacando-se como os maiores produtores. Em Santa Catarina, a maior parte da produção
destina-se a elaboração de vinhos de mesa, com aumento na área plantada de 18,04 % em
2006. Nesse estado a vitivinicultura apresenta expressão econômica principalmente na região
do Vale do Rio do Peixe, que possui grande similaridade com a região da Serra Gaúcha
quanto à estrutura fundiária, topografia e tipo de exploração vitícola. A área média das
propriedades dessa região é de aproximadamente 30 ha, sendo destes 2,14 ha com vinhedos.
São propriedades com áreas acidentadas, nem sempre aproveitáveis integralmente para a
agricultura. Em 2007, a produção de uvas no Brasil foi de 1.354.960 toneladas, 11,04 %
superior ao ano de 2006. Houve redução na produção de uvas nos estados de São Paulo e em
Minas Gerais. Nos demais estados ocorreu aumento na produção. O maior acréscimo da
produção ocorreu no estado da Bahia, seguido pelos estados de Santa Catarina e Rio Grande
do Sul. Do total de uvas produzidas no Brasil em 2007, 47,02 % foram destinados à
elaboração de vinhos, sucos e outros derivados, 35,35 % a mais que em 2006, quando o total
da uva destinada ao processamento representou 38,32 %. (MELLO, 2000, 2007 e 2008).
Como conseqüência da expressiva atividade agroindustrial brasileira, assim como em
outros setores, os produtores e indústrias da área vitivinícola enfrentam o problema de
13
descarte da biomassa residual, que, embora seja biodegradável, necessita de um tempo
mínimo para ser mineralizada, constituindo-se numa fonte de poluentes ambientais. Dados da
indústria mostram que para 100 L de vinho produzidos geram-se 31,7 kg de resíduos, dos
quais 20 kg são de bagaço (CAMPOS, 2005). Dessa forma existe atualmente um interesse
crescente na exploração dos resíduos gerados pela indústria do vinho, que na maioria das
vezes são descartados ou subaproveitados (ARVANITOYANNIS, LADAS e
MAVROMATIS, 2006).
Figura 1. Separação do bagaço de uva durante a vinificação.
Os subprodutos da vinificação são identificados como sendo o bagaço, as sementes, o
folhelho, o engaço, as borras e o sarro. O bagaço (Figura 1) é originado da prensagem das
matérias-primas da vinificação, constituídas pelas partes sólidas das uvas e pelo mosto. Como
resíduo da prensagem, o bagaço representa 12 a 15 % em peso da matéria-prima inicial,
contendo na sua composição açúcares e outros glicídios, proteínas e, nas sementes, um
elevado teor de lipídios. Em relação à composição química do bagaço ocorre uma grande
variação de acordo com a natureza das castas de onde ele provém, a forma de vinificação,
condições atmosféricas que presidem a vegetação da vinha, tendo marcada influência na
14
composição das uvas, os sistemas de condução da vinha e o estado sanitário das uvas no
momento da vindima, o que influencia também a composição dos seus subprodutos (SILVA,
2003).
O bagaço de uva representa uma importante fonte de óleo. As sementes de uva
possuem de 10 a 20% de óleo, que é especialmente rico em ácidos graxos insaturados. Ácidos
graxos poliinsaturados, como os ácidos linoléico e linolênico, são essenciais para o corpo
humano porque este não é capaz de sintetizá-los. Desta forma, o óleo das sementes e do
bagaço de uva, rico em ácido linoléico, pode representar uma fonte valiosa de óleo dietético
(GÖKTÜRK BAYDAR, ÖZKAN e ÇETIN, 2007).
Além de representar uma importante fonte de óleo, os subprodutos da vinificação são
caracterizados pelo elevado conteúdo de compostos fenólicos (NEGRO, TOMMASI e
MICELI, 2003; KAMMERER et al., 2004; GONZALEZ-PARAMAS et al., 2004). A uva é
uma das maiores fontes de compostos fenólicos. Os principais fenólicos presentes na uva são
os flavonóides (antocianinas, flavanóis e flavonóis), os estilbenos (resveratrol), os ácidos
fenólicos (derivados dos ácidos hidroxicinâmicos e hidroxibenzóicos) e uma larga variedade
de taninos (FRANCIS, 2000). A distribuição dos principais compostos fenólicos nas uvas está
representada na Figura 2.
Figura 2. Distribuição majoritária dos principais compostos fenólicos na uva.
Os compostos fenólicos presentes nas uvas passam para o vinho com intensidade que
depende das características do processo de vinificação. Mas, independentemente desta
transferência, e considerando que a maior parte destes compostos é encontrada nas partes
15
sólidas da uva, uma grande proporção permanece nos resíduos ou subprodutos da vinificação
(ALONSO et al., 2002).
1.2 COMPOSTOS FENÓLICOS
Uma importante característica das plantas é sua capacidade de sintetizar uma grande
diversidade de compostos com baixo peso molecular, denominados metabólitos secundários,
que apresentam um papel essencial ou não ao metabolismo vegetal. Aproximadamente 20 a
30 % dos vegetais superiores têm sido investigados quanto aos seus constituintes do
metabolismo secundário, permitindo a elucidação da estrutura química de cerca de 50.000
compostos (DE LUCA e ST PIERRE, 2000).
Os compostos do metabolismo secundário são substâncias que geralmente não fazem
parte do metabolismo básico da planta e possuem características químicas muito variadas e, às
vezes, bastante complexas (TAIZ e ZEIGER, 1998). Durante muito tempo acreditou-se que os
metabólitos secundários fossem produzidos sem uma função específica, simplesmente como
produtos finais das reações e/ou erros do metabolismo. Esta visão tem mudado
substancialmente, na medida em que descobertas sobre a função desses compostos,
notadamente em relação aos processos de desenvolvimento vegetal, e seu papel como
mediadores das interações entre as plantas e outros organismos têm sido alcançadas
(ESABIO, 2002).
No metabolismo secundário das plantas são gerados os compostos fenólicos, que se
encontram largamente distribuídos nas plantas e constituem um grupo muito diversificado de
fitoquímicos derivados da fenilalanina e tirosina. Englobam desde moléculas simples até
moléculas com alto grau de polimerização. Estão presentes nos vegetais na forma livre ou
ligados a açúcares (glicosídeos) e proteínas, e são essenciais para o crescimento e reprodução
das mesmas. Além disso, estes compostos se formam em condições de estresse, como
infecções, ferimentos, radiações UV, dentre outras (BRAVO, 1998; NACZK e SHAHIDI,
2004). Historicamente foram considerados como componentes antinutricionais, porque
alguns, como os taninos, eram apresentados como tendo efeitos adversos ao metabolismo
humano. No entanto, recentemente, o reconhecimento das propriedades antioxidantes destes
compostos tem evocado uma nova visão em direção aos efeitos benéficos para a saúde que
estes compostos podem apresentar (KAUR e KAPOOR, 2001).
16
Os compostos fenólicos são incluídos na categoria de neutralizadores de radicais
livres, sendo muito eficientes na prevenção da autoxidação. Em alimentos, são responsáveis
pela cor, adstringência, aroma e estabilidade oxidativa. As principais fontes de compostos
fenólicos são frutas cítricas, como limão, laranja e tangerina, além de outras frutas como
cereja, uva, ameixa, pêra, maçã e mamão, sendo encontrados em maiores quantidades na
polpa do que no suco da fruta (ANGELO e JORGE, 2007).
Quimicamente, os fenólicos são definidos como substâncias que possuem anel
aromático com um ou mais substituintes hidroxílicos, incluindo seus grupos funcionais (LEE
et al., 2005). Os compostos fenólicos de maior ocorrência natural apresentam-se conjugados
com mono e polissacarídeos, através de um ou mais dos grupos fenólicos, e podem também
ocorrer como derivados funcionais, como ésteres e metil ésteres. A atividade antioxidante dos
compostos fenólicos depende da sua estrutura, particularmente do número e posição dos
grupos hidroxila e da natureza das substituições nos anéis aromáticos. Existem cerca de 8.000
diferentes compostos fenólicos, que de acordo com sua estrutura química são divididos em
classes: ácidos fenólicos, flavonóides, estilbenos e taninos. Dentre as classes de compostos
fenólicos presentes em plantas e reconhecidos como componentes da dieta estão
principalmente os flavonóides e os ácidos fenólicos (BALASUNDRAM, SUNDRAM e
SAMMAN, 2006).
1.2.1 Flavonóides
Os flavonóides constituem o maior grupo de compostos fenólicos de plantas. São
polifenóis que ocorrem naturalmente em alimentos de origem vegetal e são comuns em dietas
do mundo inteiro. Ocorrem quase que exclusivamente em plantas superiores, onde são
responsáveis pela coloração das flores e dos frutos. Existem também relatos de sua presença
em algumas algas e fungos (ZUANAZZI e MONTANHA, 2003).
São compostos de baixo peso molecular, consistindo de 15 átomos de carbono
arranjados em uma configuração C6-C3-C6. Sua estrutura consiste essencialmente de dois
anéis aromáticos A e B ligados por uma ponte de três carbonos, usualmente na forma de anel
heterocíclico (Figura 3). O anel aromático A é derivado da via metabólica do
acetato/malonato, enquanto que o anel B é derivado da fenilalanina através da via metabólica
do shikimato. Variações nas configurações de substituição do anel C resultam na maioria das
17
subclasses dos flavonóides: flavonas, flavanonas, isoflavonas, flavonóis, flavanóis e
antocianinas. (Figura 4) (MERKEN e BEECHER, 2000; HOLLMAN e ARTS, 2000;
BALASUNDRAM, SUNDRAM e SAMMAN, 2006). Na dieta se consome principalmente
flavonóides glicosilados que são classificados em antocianinas, flavanóis (catequinas),
flavonas, flavanonas, e flavonóis. Flavonóides têm demonstrado atividade contra alergias,
hipertensão, viroses, inflamações, artrites, mutações e carcinogênese, câncer e AIDS
(MERKEN e BEECHER, 2000; KATSUBE et al., 2003).
Figura 3. Estrutura genérica das moléculas dos flavonóides.
Fonte: BALASUNDRAM, SUNDRAM e SAMMAN, 2006.
Figura 4. Estrutura genérica das maiores classes dos flavonóides.
Fonte: BALASUNDRAM, SUNDRAM e SAMMAN, 2006.
O
B
C
A
1'
2'
3'
4'
5'
6'
2
3
4
5
6
7
8
O
+
OH
Antocianidina
O
O
Flavona Flavonol
Flavanona
O
OH
Flavanol
O
OH
O
O
OH
18
Os flavonóides, particularmente as antocianinas, são efetivos doadores de hidrogênio.
Seu potencial antioxidante é dependente do número e da posição dos grupos de hidrogênio e
suas conjugações, e também devido à presença de elétrons nos anéis benzênicos (MILLER e
RICE-EVANS, 1997; CAO, SOFIC e PRIOR, 1997). Mas as relações de estrutura e atividade
dos flavonóides são geralmente mais complicadas que, por exemplo, as dos ácidos fenólicos,
devido à relativa complexidade das moléculas dos flavonóides. Dois exemplos disso são: a
presença de grupos hidroxila nas posições 3, 4 e 5 do anel B tem sido descrita como
responsável por aumentar a atividade antioxidante dos flavonóides em comparação a dos
compostos com apenas um grupo hidroxila. No entanto, em algumas condições, tais
compostos podem agir como pró-oxidantes, agindo contra o efeito antioxidante. A conversão
do composto 3,4-dihidroxifenil para 3,4,5-trihidroxifenil, por exemplo, aumenta a atividade
antioxidante para antocianidinas mas diminui a atividade para as catequinas. Outro exemplo é
a substituição de grupos hidroxila no anel B por grupos metoxila, que altera o potencial redox,
afetando a capacidade de captura de radicais livres dos flavonóides (BALASUNDRAM,
SUNDRAM e SAMMAN, 2006).
1.2.2 Ácidos fenólicos
Os ácidos fenólicos são compostos simples formados por um anel aromático e os
substituintes ligados à sua estrutura, conferindo capacidade de seqüestrar espécies reativas,
como o radical hidroxila e o oxigênio singleto (MARINOVA e YANISHLIEVA, 2003). São
divididos em dois grupos. O primeiro é composto pelos ácidos hidroxibenzóicos, que
possuem sete átomos de carbono (C6-C1) e são os ácidos fenólicos mais simples encontrados
na natureza. Incluem os ácidos gálico, p-hidroxibenzóico, protocatecuico, vanílico e siríngico.
O segundo é formado pelos ácidos hidroxicinâmicos, que possuem nove átomos de carbono
(C6-C3), sendo sete os mais comumente encontrados no reino vegetal. Incluem os ácidos
caféico, ferúlico, p-cumárico e sinápico (Figura 5). Os ácidos fenólicos, além de se
apresentarem sob sua forma livre, podem também estar ligados entre si ou com outros
compostos (BRAVO, 1998; SOARES, 2002).
19
Figura 5. Exemplos de ácidos hidroxibenzóicos (a) e hidroxicinâmicos (b).
Fonte: BALASUNDRAM, SUNDRAM e SAMMAN, 2006.
A atividade antioxidante dos ácidos fenólicos depende do número e posição de grupos
hidroxila em relação ao grupo funcional carboxila. Ácidos monohidroxibenzóicos com o
grupo OH ligado nas posições orto ou para em relação ao grupo COOH não apresentam
atividade antioxidante, porém, isso não acontece para o ácido m-hidroxibenzóico. A atividade
antioxidante dos ácidos fenólicos aumenta com o aumento do grau de hidroxilação, como é o
caso do trihidroxilado ácido gálico, que apresenta alta atividade antioxidante. Em
contrapartida, a substituição dos grupos hidroxila nas posições 3 e 5 por grupos metoxila,
como no caso do ácido siríngico, reduz a atividade. Os ácidos hidroxicinâmicos apresentam
maior atividade antioxidante que os ácidos hidroxibenzóicos correspondentes. Isso pode ser
devido ao grupo CH=CH-COOH, que garante maior habilidade de doar íons H
+
e estabilizar
radicais que o grupo COOH (BALASUNDRAM, SUNDRAM e SAMMAN, 2006).
b
COOH
OH
OH
OH
COOH
H
3
CO
OH
OCH
3
Ácido siríngico
COOH
H
OH
OH
Ácido protocatecuico
COOH
H
OH
H
Ácido p-hidroxibenzóico
H
OH
H
COOH
Ácido p-cumárico
H
OH
OH
COOH
Ácido caféico
H
OH
H
3
CO
COOH
Ácido ferúlico Ácido sinápico
Ácido gálico
a
OH
OCH
3
COOH
OH
3
C
20
1.2.3 Antocianinas
As antocianinas são flavonóides que se encontram largamente distribuídos na natureza
e são responsáveis pela maioria das cores azul, violeta e quase todas as tonalidades de
vermelho que aparecem em flores, frutos, algumas folhas, caules e raízes de plantas
(VINSON et al., 1999). Nas videiras, as antocianinas se acumulam nas folhas durante a
senescência e são responsáveis pela coloração das cascas das uvas tintas, sendo encontradas
também na polpa de algumas variedades de uvas (RENAUD e DE LORGERIL, 1992). Os
conteúdos de antocianinas nas uvas variam de acordo com a espécie, variedade, maturidade,
condições climáticas e cultivar (MAZZA, 1995; SHAHIDI e NACZK, 1995).
Figura 6. Estrutura química básica das antocianinas.
As antocianinas estão presentes também em diferentes alimentos, com destaque para
os vinhos tintos, sendo, portanto, um constituinte comum na dieta humana. Seu uso como
corante tem sido de grande interesse devido a suas características e propriedades, e atualmente
muito mais devido a sua capacidade antioxidante. E levando-se em conta que os antioxidantes
sintéticos podem apresentar efeitos adversos para a saúde, a substituição destes por derivados
de produtos naturais pode ser uma opção muito importante (KUSKOSKI et al., 2004).
O potencial antioxidante das antocianinas pode chegar a ser duas vezes maior que os
antioxidantes disponíveis comercialmente como, por exemplo, a (+)-catequina e outros
compostos como vitamina E (SEERAM et al., 2002), podendo chegar a apresentar melhor
atividade antioxidante que o butil hidroxianisol (BHA) e o butil hidroxitolueno (BHT)
(ESPÍN et al., 2000). Além disso, as antocianinas têm uma aparente habilidade por serem
fortemente polares e poderem substituir os antioxidantes lipofílicos como, por exemplo, a
vitamina E (RAMIREZ-TORTOZA et al., 2001).
O
+
OH
OH
OH
OCH
3
OCH
3
OH
B
A
C
21
A atividade antioxidante dos compostos fenólicos, como os flavonóides, ácidos
fenólicos e antocianinas, é devido à habilidade desses compostos de doar elétrons ou átomos
de hidrogênio, ou quelar cátions metálicos, ou de capturar radicais livres (BALASUNDRAM,
SUNDRAM e SAMMAN, 2006).
1.3 RADICAIS LIVRES E ANTIOXIDANTES
Os radicais livres são classificados como moléculas orgânicas, inorgânicas ou átomos
que contêm um ou mais elétrons não pareados, tendo estas moléculas existências
independentes (BOYCE, 1999). Esse tipo de estrutura faz com que os radicais livres sejam
moléculas de alta instabilidade, tendo meia-vida curta e sendo muito reativos. Levando-se em
consideração a manutenção de muitas das funções fisiológicas normais, a presença dos
radicais livres é crítica (POMPELLA, 1997).
Estas espécies promovem uma oxidação prejudicial que pode danificar membranas e
conteúdos celulares. As LDLs (lipoproteínas de baixa densidade) são partículas formadas por
lipídios, colesterol e proteínas em geral, e que podem se oxidar por ação dos radicais livres.
Em um fenômeno em série, conseqüentemente, podem afetar as moléculas do colesterol e dos
ácidos graxos que compõe cada LDL (HALLIWELL, 2003). Radicais livres podem ser
gerados no citoplasma, nas mitocôndrias ou na membrana, e o seu alvo celular (proteínas,
lipídios, carboidratos e DNA) está relacionado com o seu sítio de formação (YU e
ANDERSON, 1997). Estão associados às doenças degenerativas, como câncer, doenças
cardiovasculares, queda do sistema imunológico, disfunções cerebrais, catarata, entre outras,
devido aos danos oxidativos que provocam no DNA, proteínas e outras macromoléculas que
são acumuladas com a idade. São geralmente menos estáveis do que os compostos não-
radicais, embora suas reatividades variem (ARUOMA, 1994; CHEUNG, CHEUNG e OOI,
2003).
Apesar dos seres humanos dependerem da oxidação biológica como fonte de energia
para a sobrevivência e atividade, a ação do oxigênio é ambígua. A reatividade poderosa das
espécies reativas de oxigênio (EROs), tais como o radical superóxido (O
2
), peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
) e radical hidroxil (OH
•
), pode causar danos funcionais ao homem (HAMID
et al., 2002). Os danos oxidativos aos tecidos biológicos são modulados por muitos fatores,
incluindo a composição do substrato, concentração de oxigênio e pró-oxidantes. A formação
22
de radicais livres in vivo ocorre via ação catalítica de enzimas, durante os processos de
transferência de elétrons que ocorrem no metabolismo celular e pela exposição a fatores
exógenos. Contudo, na condição de pró-oxidante a concentração desses radicais pode
aumentar devido a maior geração intracelular ou pela deficiência dos mecanismos
antioxidantes (CERUTTI, 1994). O desequilíbrio entre moléculas oxidantes e antioxidantes
que resulta na indução de danos celulares pelos radicais livres tem sido chamado de estresse
oxidativo (DÁVALOS, GOMEZ-CORDOVÉS e BARTOLOMÉ, 2003).
O estresse oxidativo tem como principal conseqüência a peroxidação lipídica, que
desencadeia uma série de mudanças nos sistemas biológicos, tais como a ruptura das
membranas celulares (bombas Na/K e Ca/Mg), mutações na estrutura do ácido
desoxirribonucléico (DNA), oxidação dos lipídeos insaturados, formação de resíduos
químicos como o malondialdeído, comprometimento de componentes da matriz extracelular
(HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999) e apoptose (CHIDAMBARA-MURTHY,
JAYAPRAKASHA e SINGH, 2002). Um número crescente de estudos sugere que o estresse
oxidativo é fator etiológico crucial no desenvolvimento e agravamento de algumas doenças
crônicas humanas como: diabete mellitus, catarata, doença de Parkinson, danos cerebrais na
doença de Wilson, doença de Alzheimer, isquemia cerebral, esclerose lateral amiotrófica,
ataxia de Friedeich, câncer, aterosclerose, artrite, doenças neurodegenerativas e no
aceleramento do processo de envelhecimento (HERMES-LIMA, 2004).
Levando-se em consideração esses fatores, a identificação de compostos antioxidantes,
substâncias que quando presentes em baixas concentrações em comparação à concentração de
uma substância oxidável retardam ou inibem a velocidade de oxidação de biomoléculas, vem
despertando grande interesse, uma vez que tais compostos podem manter o equilíbrio
dinâmico entre a produção de oxidantes e a concentração de compostos antioxidantes,
minimizando danos oxidativos no organismo (CHIDAMBARA-MURTHY,
JAYAPRAKASHA e SINGH, 2002).
Antioxidantes são compostos químicos com capacidade de reagir com os radicais
livres e assim restringir seus efeitos maléficos ao organismo. São substâncias que retardam a
velocidade de oxidação, através de um ou mais mecanismos, como inibição de radicais livres
e complexação de metais. Assim, os possíveis mecanismos antioxidantes são: alteração da
23
produção de radicais; eliminação de precursores de radicais; quelação de metais; e elevação
dos níveis de antioxidantes endógenos (PIMENTEL, FRANCKI e BOIAGO, 2005).
Os antioxidantes podem ser classificados em primários, que atuam como doadores de
prótons, impedindo o processo de iniciação desencadeado pelos radicais livres. Nesta classe
de antioxidantes encontramos os compostos fenólicos, o tocoferol, os aminoácidos, os
carotenóides e os antioxidantes sintéticos. A maioria dos flavonóides tem a capacidade de
reagir com radicais livres e exercer funções antioxidantes no organismo. Os antioxidantes
podem também ser classificados como secundários, atuando no bloqueio da decomposição
dos peróxidos e hidroperóxidos e convertendo-os na forma inativa por ação de agentes
redutores, bloqueando a reação em cadeia através da captação de intermediários reativos
como os radicais peroxila e alcooxila. Nesta classe estão os antioxidantes sintéticos, as
vitaminas A, C e E, e também os compostos fenólicos (DONELLI e ROBINSON, 1995;
PIETTA, 2000).
Antioxidantes também têm sido apresentados como tendo função conservadora em
alimentos. Eles têm sido definidos pelo FDA (US Food and Drug Administration) como
substâncias usadas para conservar os alimentos pelo retardamento da deterioração, rancidez
ou descoloração causada pela oxidação. A peroxidação lipídica é uma importante reação
deteriorativa dos alimentos durante o processamento e armazenamento. Substâncias tóxicas
formadas pela peroxidação lipídica podem levar a efeitos adversos como carcinogênese,
mutação do DNA celular e envelhecimento. Antioxidantes, portanto, de acordo com seu modo
de ação, também têm sido classificados como os compostos que neutralizam a cadeia de
radicais livres na oxidação lipídica pela doação de elétrons ou de átomos de hidrogênio às
gorduras que contém um radical livre, para a formação de um complexo entre a cadeia
lipídica e o radical. Antioxidantes interrompem a cadeia de radicais livres das reações
oxidativas doando hidrogênios dos grupos fenólicos hidroxila, formando eles mesmos radicais
livres estabilizados que não iniciam ou propagam futuras oxidações lipídicas (Free radical
terminators). Alguns dos importantes antioxidantes sintéticos desta classe são o butil
hidroxianisol (BHA), butil hidroxitolueno (BHT), tert-butilhidroxiquinona (TBHQ), propil
galato (PG) e tocoferóis. Quando testados em óleos comestíveis e em produtos à base de
peixe, carne e aves, extratos ricos em compostos fenólicos têm demonstrado atividade
antioxidante comparável a dos antioxidantes sintéticos. (KAUR e KAPOOR, 2001;
BALASUNDRAM, SUNDRAM e SAMMAN, 2006).
24
Nem toda a atividade antioxidante é conferida por interceptadores de radicais livres.
Agentes redutores que transferem átomos de hidrogênio também têm sido classificados como
eliminadores de oxigênio (oxygen scavengers). Alguns desses são sulfitos, ácido ascórbico,
glicose oxidase e ácido eritórbico. Para serem efetivos em alimentos eles precisam ser
adicionados durante a fabricação ou nos produtos acabados. Nenhum antioxidante
individualmente oferece proteção contra a deterioração oxidativa em todos os produtos
alimentares. A seleção de um antioxidante apropriado é determinada pela compatibilidade
entre o efeito do antioxidante e as propriedades alimentares do produto. Tocoferol e ácido
ascórbico têm sido extensivamente utilizados como antioxidantes naturais, mas sua atividade
é bem menor que a dos antioxidantes sintéticos (KAUR e KAPOOR, 2001).
Embora os antioxidantes sintéticos sejam amplamente utilizados pela indústria
alimentícia, existem alguns argumentos com relação a sua segurança e efeitos adversos destas
substâncias quando usadas como aditivos alimentares. Enquanto isso, os antioxidantes
naturais como as vitaminas e os polifenóis podem apresentar papéis importantes na prevenção
de doenças associadas aos radicais livres (SOARES, ANDREAZZA e SALVADOR, 2003).
1.4 EXTRAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS
A extração de compostos fenólicos de materiais vegetais é influenciada pela natureza
química desses compostos, pelo método de extração empregado, pelo tamanho das partículas
da amostra, pelo tempo de armazenamento e condições, bem como pela presença de
substâncias interferentes (NACZK e SHAHIDI, 2004).
A solubilidade dos fenólicos é governada por sua natureza química na planta, que pode
variar de substâncias simples até altamente polimerizadas. Há a possibilidade de interação dos
fenólicos com outros componentes da planta, como carboidratos e proteínas. Estas interações
podem levar a formação de complexos que podem ser quase insolúveis. A solubilidade dos
fenólicos também é afetada pela polaridade dos solventes utilizados. Portanto, é muito difícil
desenvolver um procedimento de extração apropriado para a extração de todos os fenólicos.
Os extratos fenólicos de materiais vegetais são sempre uma mistura diversificada de fenólicos
solúveis no sistema solvente utilizado (NACZK e SHAHIDI, 2006). Solventes como metanol,
etanol, propanol, acetona, acetato de etila e suas combinações têm sido utilizados para a
25
extração de compostos fenólicos, freqüentemente com diferentes proporções de água
(ANTOLOVICH et al., 2000).
O tempo de extração e fatores relacionados também influenciam a extração de
compostos fenólicos de materiais vegetais. Prolongados tempos de extração aumentam a
chance de oxidação dos fenólicos, a menos que agentes redutores sejam adicionados ao
sistema solvente. Além disso, a razão amostra/solvente também influencia diretamente a
recuperação de compostos fenólicos de plantas (NACZK e SHAHIDI, 2004).
Krygier, Sosulski e Hogge (1982) propuseram um método de extração de ácidos
fenólicos livres e esterificados usando uma mistura dos solventes metanol, acetona e água
(7:7:6, v/v/v) à temperatura ambiente. No método sugerido por estes autores os ácidos
fenólicos livres são extraídos com éter etílico e o extrato é então tratado com NaOH 4 M
sobre nitrogênio para liberação de ácidos fenólicos esterificados. O hidrolisado é acidificado e
os ácidos fenólicos liberados são extraídos com éter etílico. O resíduo da primeira extração
exaustiva com a mistura metanol, acetona e água também é tratado com NaOH 4 M sobre
nitrogênio para a liberação de ácidos fenólicos esterificados insolúveis.
Antocianinas também são freqüentemente extraídas de materiais vegetais, como os
resíduos de uva, sendo usualmente utilizados solventes orgânicos acidificados, mais
comumentemente o metanol. Este sistema solvente destrói as membranas celulares,
dissolvendo simultaneamente as antocianinas e estabilizando-as (NACZK e SHAHIDI, 2006).
1.5 ANÁLISE E QUANTIFICAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS
Diferentes métodos de análise de polifenóis têm sido publicados (ANTOLOVICH et
al., 2000; TSAO e DENG, 2004). No entanto, a estratégia analítica apropriada para o estudo
de fenólicos bioativos em vegetais depende do propósito do estudo bem como da natureza da
amostra e do analito. Os métodos utilizados para a análise de fenólicos podem ser
classificados como aqueles que quantificam o conteúdo total de fenólicos ou como aqueles
que determinam um grupo específico ou classe de compostos fenólicos (ROBARDS, 2003).
Assim como a extração, a quantificação de compostos fenólicos também é
influenciada pela natureza química dos compostos, pelo método de extração empregado,
26
tamanho das partículas das amostras, tempo e condições de armazenamento, bem como pelo
método de análise, seleção de padrões e presença de substâncias interferentes (NACZK e
SHAHIDI, 2006).
Vários métodos espectrofotométricos para quantificação de compostos fenólicos em
alimentos têm sido desenvolvidos (ANGELO e JORGE, 2007). O método de Folin-Denis é
um dos mais utilizados para a determinação de fenólicos totais em vegetais (NACZK e
SHAHIDI, 2004). Este método descrito por Swain e Hills (1959) baseia-se na redução do
ácido fosfomolíbdico-fosfotúngstico pelas hidroxilas fenólicas, produzindo um complexo de
coloração azul que absorve entre 620 e 740 nm com um comprimento de onda máximo em
725 nm. A reação ocorre em meio alcalino e a solução saturada de carbonato de sódio é a base
mais indicada. O método de Folin-Denis, no entanto, não é um método específico, pois
determina todos os fenólicos presentes, além de substâncias redutoras adicionadas aos
alimentos ou naturalmente presentes que podem interferir nos resultados (ANGELO e
JORGE, 2007).
Muitas vezes o reagente de Folin-Denis é substituído pelo de Folin-Ciocalteu
(SINGLETON e ROSSI, 1965). Este último é mais sensível à redução pelos fenóis e diminui
a tendência à precipitação. As principais diferenças entre estes dois reagentes é o uso de
sulfato de lítio, a presença de ácido hidroclorídrico e o longo tempo de aquecimento para a
preparação do reagente de Folin-Ciocalteu (ANGELO e JORGE, 2007). Para ambos os testes,
o número de grupos hidroxilas ou de grupos potencialmente oxidáveis controla a quantidade
de cor formada. O grupo fenólico deve estar na forma de fenolato para os ânions molibdo e
tungstofosfato produzirem a oxidação. As moléculas reduzidas são azuis e as não reduzidas
são amarelas. Estas últimas se decompõem vagarosamente em pH alcalino, o qual é
necessário para a manutenção do fenol na forma de fenolato (SHAHIDI e NACZK, 1995).
Este método espectrofotométrico, independente do tipo de reagente utilizado, Folin-Denis ou
Folin-Ciocalteu, não é um método específico, pois detecta todos os grupos fenólicos presentes
no extrato, incluindo as proteínas extraíveis (NACZK e SHAHIDI, 2004).
A cromatografia gasosa (CG) e a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) são
técnicas usadas tanto na separação quanto na quantificação de compostos fenólicos. A
elucidação de estruturas tem sido realizada através da combinação de CG e CLAE com a
espectrometria de massa, além de outras técnicas relevantes (ANGELO e JORGE, 2007). Para
27
a separação e quantificação de ácidos fenólicos diferentes técnicas de cromatografia gasosa
podem ser empregadas (KRYGIER, SOSULSKI e HOGGE, 1982; DABROWSKI e
SOSULSKI, 1984). Inovações na CG como colunas de alta temperatura, controladores de
pressão e detectores eletrônicos melhoraram significativamente a resolução e também têm
aumentado o alcance de substâncias de alto peso molecular que podem ser analisadas por CG
(ANGELO e JORGE, 2007).
Há algumas metodologias descritas para a análise de compostos fenólicos por CG,
baseadas nas suas características de polaridade. Os ácidos fenólicos são substâncias que
possuem alta polaridade e baixa pressão de vapor. Tais características levaram alguns autores
a descrever processos distintos para derivatização e condições de análises cromatográficas,
objetivando uma melhor técnica de isolamento e caracterização destes compostos (MOREIRA
e MANCINI-FILHO, 2004).
1.6 MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
Existe uma grande diversidade de métodos para medir atividade antioxidante dos
alimentos ou das amostras biológicas, seja in vitro ou in vivo (ANTOLOVICH et al., 2002;
TSAO e DENG, 2004). A avaliação da atividade antioxidante nos sistemas alimentares se
trata de avaliar a eficiência dos antioxidantes no sentido de proteger os alimentos da oxidação,
que está relacionada com a deterioração do alimento, como é o caso de óleos e gorduras, ou
com a perda do valor vitamínico. Assim, a medida da atividade antioxidante de alimentos,
particularmente frutas, vegetais e bebidas, indica seu potencial como protetores frente à
oxidação. No caso da bioatividade, se trata de destacar como os antioxidantes previnem a
oxidação de estruturas biológicas (ANTOLOVICH et al., 2002).
Na avaliação da atividade antioxidante, a fonte da espécie reativa de oxigênio (ERO) e
do substrato deve ser sempre considerada. Um antioxidante pode proteger os lipídios contra o
estresse oxidativo, como pode acelerar o dano de outras moléculas biológicas. Assim, quando
se analisa a capacidade antioxidante de uma amostra ou de um protetor, se deve considerar o
objetivo do estudo e estabelecer uma série de questões que servem como guia na avaliação da
eficácia antioxidante. Não existe um sistema perfeito capaz de medir a atividade antioxidante
real de uma amostra dada (MEZADRI, 2005).
28
O tipo de solvente e a polaridade podem afetar a transferência de elétrons e a
transferência de átomos de hidrogênio, que são aspectos chaves na medida da capacidade
antioxidante. A presença de compostos não antioxidantes nas soluções testadas também pode
afetar os resultados (PÉREZ-JIMÉNEZ e SAURA-CALIXTO, 2006).
Além disso, o conhecimento do potencial antioxidante em alimentos não indica
necessariamente sua capacidade antioxidante in vivo. Os efeitos de cooperação que existem
entre diferentes antioxidantes (sinergismo), significam que o efeito do conjunto de
antioxidantes é maior que a soma da atividade de um antioxidante individual. Por esta razão,
os métodos de quantificação são também conhecidos como Atividade Antioxidante Total, que
é um parâmetro que quantifica a capacidade de uma amostra (tanto de um produto natural ou
artificial) para impedir radicais livres em um meio determinado. Tais métodos consideram a
atividade antioxidante como uma característica global do produto em questão,
independentemente de sua composição particular (MEZADRI, 2005).
Tanto os métodos in vitro como os métodos in vivo que têm sido usados na avaliação
da atividade antioxidante possuem suas vantagens e limitações. Alguns métodos podem ser
utilizados com extratos hidrossolúveis enquanto que outros são mais apropriados para frações
lipossolúveis (KAUR e KAPOOR, 2001).
A maioria dos métodos de determinação da atividade antioxidante in vitro aplicados
atualmente tem como base a formação de radicais livres, os quais são capturados ao ser
adicionado o composto antioxidante, ou por inibir a formação de radicais livres, ou então do
consumo de oxigênio por esta e/ou a formação de produtos de oxidação. Os radicais livres
podem ser gerados por diversos tipos de compostos cromógenos como, por exemplo, o
composto azo ABTS (ácido 2,2´-azino-bis (3-etilbenzotiazolin)-6-ácido sulfônico) ou DPPH
(2,2- difenil-1-picrilhidrazila) (ARENA, FALLICO e MACCARONE, 2001; ANTOLOVICH
et al., 2002).
1.6.1 Método ABTS
O radical ABTS
•+
(ácido 2,2´-azino-bis (3-etilbenzotiazolin)-6-ácido sulfônico) pode
ser gerado por enzimas como a peroxidase ou quimicamente, com dióxido de manganês,
persulfato de potássio ou ABAP (2,2´-azobis- (2-amidinopropano) HCl) (ARNAO, 2000).
29
Segundo metodologia desenvolvida por Re et al. (1999) o radical ABTS
•+
pode ser formado
por uma reação química com persulfato de potássio que pode chegar a formar mais de 60 %
de radicais livres depois de 16 horas de incubação. Os resultados obtidos das análises
antioxidantes são equiparados ao Trolox (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromo-2-ácido
carboxílico 97%), antioxidante sintético, hidrossolúvel e similar à vitamina E, e são
expressados em TEAC (quantidades equivalentes a Trolox) (RICE-EVANS, MILLER e
PAPAGANDA, 1996).
O ensaio original TEAC pode medir somente antioxidantes hidrossolúveis. Como os
alimentos geralmente contêm compostos hidrossolúveis e lipossolúveis, um grande esforço foi
realizado para medir também componentes lipossolúveis pela sua solubilização no meio
aquoso de reação do ensaio TEAC utilizando solventes adequados. Para a aplicação deste
ensaio em alimentos contendo antioxidantes hidro e lipossolúveis a escolha de solventes
adequados para a extração e solubilização desses compostos em sistemas aquosos tem sido
avaliada (KAUR e KAPOOR, 2001).
1.6.2 Método DPPH
Método de seqüestro de radicais livres desenvolvido por Brand-Willams, Cuvelier e
Berset (1995), está baseado na descoloração de uma solução composta de radicais estáveis
DPPH
•
(2,2-difenil-1-picrilhidrazil) de cor violeta quando da adição de substâncias que
podem ceder um átomo de hidrogênio ou na transferência de elétrons de um composto
antioxidante para um oxidante. Os resultados são expressos em TEAC ou mais
comumentemente em IC
50
, ou seja, a quantidade necessária de antioxidante para reduzir em
50 % a absorbância inicial do radical.
1.6.3 Método FRAP
Este teste não é baseado na capacidade de captura de radicais livre, mas sim na
habilidade de redução do Ferro. Em meio ácido o complexo férrico tripiridiltriazina é
reduzido a sua forma ferrosa de intensa cor azul na presença de antioxidantes, causando um
aumento na absorbância a 595 nm. A absorbância final é interpolada em uma curva padrão de
Trolox, e os resultados são expressos como TEAC (PÉREZ-JIMÉNEZ e SAURA-CALIXTO,
2006). No método original, a absorbância foi monitorada até 4 minutos, mas neste tempo a
30
reação não foi completada, sendo sugerido por Pulido, Bravo e Saura-Calixto (2000) que o
monitoramento seja realizado até 30 minutos.
1.6.4 Método da co-oxidação do β-caroteno/ácido linoléico
Avalia a atividade de inibição de radicais livres gerados durante a peroxidação do
ácido linoléico. O método está fundamentado em medidas espectrofotométricas da
descoloração (oxidação) do β-caroteno induzida pelos produtos de degradação oxidativa do
ácido linoléico. Determina a atividade de uma amostra ou composto de proteger um substrato
lipídico da oxidação (MARCO, 1968; MILLER, 1971; DUARTE-ALMEIDA et al., 2006).
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40
CAPÍTULO 2
INFLUÊNCIA DO SOLVENTE NO CONTEÚDO TOTAL DE
POLIFENÓIS, ANTOCIANINAS E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE
EXTRATOS DE BAGAÇO DE UVA (Vitis vinifera L.) VARIEDADES
TANNAT E ANCELOTA
Artigo aceito para publicação.
ROCKENBACH, I. I; SILVA, G. L.; RODRIGUES, E.; KUSKOSKI, E. M.; FETT, R.
Influência do solvente no conteúdo total de polifenóis, antocianinas e atividade antioxidante
de extratos de bagaço de uva (Vitis vinifera L.) variedades Tannat e Ancelota. Ciência e
Tecnologia de Alimentos, v. xx, p. xx-xx, 2008.
41
INFLUÊNCIA DO SOLVENTE NO CONTEÚDO TOTAL DE POLIFENÓIS,
ANTOCIANINAS E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE EXTRATOS DE BAGAÇO
DE UVA (Vitis vinifera L.) VARIEDADES TANNAT E ANCELOTA
Ismael Ivan ROCKENBACH
1*
, Graciela Lessa da SILVA
1
, Eliseu RODRIGUES
1
, Eugênia
Marta KUSKOSKI
1
, Roseane FETT
1
1
Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos, Centro de Ciências Agrárias,
Universidade Federal de Santa Catarina – UFSC, Rod. Admar Gonzaga 1346, Itacorubi,
Florianópolis, Brasil. CEP: 88034-001.
*
A quem a correspondência deve ser enviada
e-mail: [email protected]
RESUMO
Diferentes sistemas solventes foram aplicados para determinar a eficiência de extração de
compostos com capacidade antioxidante em bagaço de uva, importante subproduto do
processo de vinificação. Realizou-se a quantificação de compostos fenólicos totais,
antocianinas totais e atividade antioxidante nos extratos de bagaço de uva Vitis vinifera L. das
variedades Tannat e Ancelota, provenientes da região de Videira, Santa Catarina. A atividade
antioxidante foi determinada pelos métodos ABTS, FRAP e β-caroteno/ácido linoléico.
Conteúdos de compostos fenólicos totais em acetona 50 e 70 % foram maiores nas duas
variedades, enquanto que os conteúdos de antocianinas totais extraídos em ambas as
variedades foram maiores no solvente etanol em concentrações de 50 e 70 %. Pelo método
ABTS a atividade antioxidante foi maior nas concentrações de 50 e 70 % de acetona para a
variedade Tannat e 50 e 70 % de acetona e etanol para a variedade Ancelota. Em relação ao
poder redutor pelo método FRAP, este foi maior em solvente acetona 70 % para as duas
variedades. No ensaio do poder de inibição da oxidação a adição de 100 e 200 µL de extratos
etanólicos a 50 % das variedades Tannat e Ancelota apresentou maior eficiência, sendo quase
duas vezes superior aos extratos acetônicos testados.
Palavras-chave: subprodutos, extração, oxidação, poder redutor.
ABSTRACT
Different solvent systems were applied in order to determine the extraction efficiency of
compounds with antioxidant capacity from grape pomace, an important by-product of wine
42
production. Quantification of total phenolics, anthocyanins and antioxidant activity were
carried out in grape pomace extracts of Tannat and Ancelota varieties from Videira region,
Santa Catarina. Antioxidant activity was determined by ABTS, FRAP and β-carotene/linoleic
acid system methods. Extracts from acidified aqueous solutions of acetone and ethanol in
different concentrations (v.v
-1
) showed higher yield in aqueous solutions of acetone 50 % and
70 % for Tannat variety and acetone/ethanol 50 % for Ancelota variety. Total phenolic
contents in acetone 50 % and 70 % were higher in both varieties, while anthocyanin contents
from these varieties were higher in ethanol 50 % and 70 %. Antioxidant activity was higher in
acetone 50 % and 70 % for Tannat variety and acetone/ethanol 50 % and 70 % for Ancelota
variety by ABTS method. Regarding to reduction power, performed by FRAP method, it was
higher in acetone 70 % for both varieties. In oxidation inhibition power assay, addition of 100
µL and 200 µL of ethanolic extracts 50 % of Tannat and Ancelota varieties showed higher
efficiency, being almost two times higher than acetonic extracts.
Keywords: byproducts, extraction, oxidation, reduction power.
1 INTRODUÇÃO
É de conhecimento científico o potencial antioxidante dos compostos fenólicos,
atuando como redutores de oxigênio singleto, nas reações de oxidação lipídica e na quelação
de metais. Apresentam uma ampla gama de propriedades farmacológicas, como anti-
alergênicas, anti-arteriogênicas, antiinflamatórias, antimicrobianas, anti-trombóticas e
também efeitos cardio-protetores e vasodilatadores (PUUPPONEN-PIMIÄ et al, 2001;
MANACH, MAZUR e SCALBERT, 2005).
A uva é fonte de diversos compostos fenólicos em elevadas concentrações e os
subprodutos da vinificação, em sua maioria, podem manter quantidades apreciáveis,
principalmente de fenólicos, que pertencem ao grupo dos flavonóides. Os glicosídeos de
flavonóis e as antocianinas estão entre os compostos fenólicos mais determinados e estudados
nas uvas, por sua destacada atividade antioxidante e por suas propriedades antiinflamatórias e
anticancerígenas (NEGRO, TOMMASI e MICELI, 2003; AMICO et al, 2004; SILVA,
MATIAS e NUNES, 2005).
O processo de fabricação do vinho gera uma quantidade estimada de resíduo sólido de
20% do peso inicial (GÓMEZ-PLAZA, MIÑANO e LÓPEZ-ROCA, 2006). Alguns estudos a
respeito dos subprodutos da vinificação focalizam principalmente a composição de polifenóis
das sementes, que são muito ricas em flavonóis (YILMAZ e TOLEDO, 2004; GUENDEZ et
al, 2005b). As sementes representam em torno de 15% do resíduo sólido produzido e contêm
43
de 14 a 17% de óleo, o que depende da variedade da uva (GÖKTÜRK BAYDAR e
AKKURT, 2001; LUQUE-RODRÍGUEZ, LUQUE DE CASTRO e PÉREZ-JUAN, 2005).
Outros estudos focalizam o potencial antioxidante do bagaço em sua totalidade,
composto de sementes e das cascas (ALONSO et al, 2002; LOULI, RAGOUSSIS e
MAGOULAS, 2004; KAMMERER et al, 2005; PINELO et al, 2005). Outras partes do
conjunto da uva são rejeitadas durante o processo de vinificação, como os engaços, e recebem
muito menos atenção, embora contenham uma quantidade importante de polifenóis
(SOUQUET et al, 2000).
A recuperação de compostos antioxidantes dos desperdícios contínuos da indústria de
vinho poderia representar um avanço significativo na manutenção do equilíbrio do meio
ambiente, visto que nas vinícolas as grandes quantidades de resíduos gerados apresentam
sérios problemas de armazenagem, de transformação, ou de eliminação, em termos ecológicos
e econômicos. Esta situação explica o interesse crescente em explorar os subprodutos da
vinificação (ALONSO et al, 2002).
Diversos métodos e sistemas de solventes vêm sendo usados para a extração de
polifenóis de matérias vegetais (CHAVAN, SHAHIDI e NACZK, 2001) visando determinar a
capacidade antioxidante (GOLI, BARZEGA e SAHARI, 2004; PRIOR, WU e SCHAICH,
2005). O tipo de solvente e a polaridade podem afetar a transferência de elétrons e de átomos
de hidrogênio, que são aspectos chaves na medida da capacidade antioxidante. A presença de
compostos não antioxidantes nas soluções testadas também pode afetar os resultados
(PÉREZ-JIMÉNEZ e SAURA-CALIXTO, 2006). O rendimento da extração depende tanto do
solvente utilizado (OU, HAMPSCH-WOODILL e PRIOR, 2001; GRAY et al, 2002; YU et
al, 2002; SUN e HO, 2005; YILMAZ e TOLEDO, 2006) como do método aplicado, que pode
ser baseado em mecanismos químicos diferentes. Além do rendimento há grande variação na
composição do extrato em função do sistema solvente utilizado (MOURE et al, 2001).
O objetivo deste estudo foi avaliar o conteúdo total de fenólicos, antocianinas e a
capacidade antioxidante do extrato de bagaço de uva (Vitis vinifera L.) de duas variedades,
Tannat e Ancelota, utilizando diferentes sistemas solventes.
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Amostras
Foram utilizadas amostras de bagaço das uvas tintas Vitis vinifera L., var. Tannat e
Ancelota, coletadas na região de Videira, Santa Catarina. As amostras são resultantes da safra
de 2005/2006, sendo cedidas pela EPAGRI (Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão
44
Rural de Santa Catarina) de Videira, Santa Catarina. Tendo por objetivo preservar as
propriedades gerais dos bagaços, os exemplares foram acondicionados em caixas isotérmicas
contendo gelo e encaminhadas imediatamente ao laboratório, onde foram armazenados à
temperatura de -18,0 ± 0,2 °C e posteriormente analisadas.
2.2 Métodos
2.2.1 Preparação dos extratos
As amostras de bagaço de uva das variedades Tannat e Ancelota foram submetidas a
tratamento térmico em estufa de ar circulante a 80
o
C, num período de 10 min, para inativação
enzimática (VALDERRAMA, MARANFONI e CLEMENTE, 2001; TROIANI, TROPIANI
e CLEMENTE, 2003). Posteriormente foram secas em estufa de ar circulante, a temperatura
de 50
o
C por 24 horas. Após resfriamento em dessecador, as amostras foram trituradas (60
mesh) e desengorduradas em extrator Soxhlet, utilizando solvente hexano, durante 6 horas a
60 °C. O resíduo do bagaço foi submetido à extração com diferentes sistemas solventes. Os
extratos foram preparados com 2,5 g de material seco desengordurado, utilizando como
solventes extratores soluções etanol/água e acetona/água a 0, 30, 50, 70 e 100 % (v.v
-1
),
acidificados com HCl a 0,1 %. A extração (3 x 25 mL) foi procedida sob agitação mecânica e
ao abrigo da luz no intervalo de 2 horas, sendo posteriormente filtrados em papel filtro
Whatman nº 1 e transferidos para balão volumétrico com volume final ajustado para 50 mL.
2.2.2 Determinação de fenólicos totais
O conteúdo total de polifenóis em cada extrato foi determinado
espectrofotometricamente de acordo com o método de Folin-Ciocalteau (ROSSI e
SINGLETON, 1965) com a leitura da absorbância em 765 nm, e os resultados expressos em
gramas de equivalente a ácido gálico (GAE) por 100 gramas de bagaço seco. Uma alíquota de
0,1 mL da amostra diluída foi misturada com 0,5 mL do reagente de Folin-Ciocalteau e 1,5
mL de carbonato de sódio 20 % em balão volumétrico de 10 mL, completando o volume com
água destilada. A concentração do conteúdo de fenólicos totais foi medida após 2 horas de
repouso da mistura e seu valor comparado com o do padrão de ácido gálico.
2.2.3 Determinação do conteúdo total de antocianinas
A análise do conteúdo total de antocianinas foi realizada seguindo-se o método de
diferença de pH (GIUSTI e WROLSTAD, 2001). Os extratos foram diluídos para que a
amostra atingisse uma absorbância entre 0,100 e 1,200 no comprimento de onda de 520 nm.
45
Para uma alíquota de 0,2 mL de amostra diluída foram adicionados 1,8 mL da solução de
cloreto de potássio (pH 1) em tubos de ensaio, homogeneizado e armazenado por 10 minutos
em ausência de luz, sendo realizado procedimento equivalente com solução de acetato de
sódio (pH 4,5). A absorbância foi medida no comprimento de onda máximo e em 700 nm, e o
branco feito com água destilada. Os resultados foram expressos como concentração de
pigmentos monoméricos (g.100g
-1
) e expressos em equivalente a malvidina-3-glicosídeo (ε =
29500, PM = 562,5).
2.2.4 Determinação da capacidade antioxidante – Método ABTS
•
••
•+
Para determinar a atividade antioxidante utilizou-se o método descrito por RE et al
(1999). O radical ABTS
•+
foi formado pela reação de 2,45 mM de persulfato de potássio com
7 mM de 2,2´azino-bis-(3-etilbenzotiazolin 6-ácido sulfônico), armazenado no escuro, à
temperatura ambiente, durante por 16 horas. Uma vez formado, o radical ABTS
•+
foi diluído
em etanol até obter-se uma medida de absorbância de 0,70 (± 0,02) em comprimento de onda
de 754 nm, a uma temperatura de equilíbrio de 30 ºC (KUSKOSKI et al, 2004). A
absorbância foi medida em espectrofotômetro modelo Hewlett-Packard 8425A, no tempo de 7
minutos após a adição da amostra 0,70 (± 0,02) no comprimento de onda de 754 nm. A
capacidade antioxidante total da amostra foi calculada em relação à atividade do antioxidante
sintético Trolox, nas mesmas condições, e os resultados foram expressos em µMol TEAC.g
-1
(atividade antioxidante equivalente ao Trolox) (RICE-EVANS, MILLER e PAGANGA,
1996).
2.2.5 Determinação do poder redutor - Método FRAP
Utilizou-se o método descrito por BENZIE e STRAIN (1996), com modificações de
ARNOUS, MAKRIS e KEFALAS (2002). Este se baseia na medida direta da habilidade dos
antioxidantes (redutores) da amostra em reduzirem, em meio ácido (pH 3,6), o complexo Fe
3+
/tripiridiltriazina (TPTZ), para formar Fe
2+
, de intensa cor azul e absorção máxima a 593 nm.
As amostras de extrato do bagaço de uva foram diluídas em água destilada, acrescentados a
0,1 mL da amostra um volume de 0,1 mL de cloreto férrico 3 mM (em ácido cítrico 5 mM). A
mistura foi mantida em banho-maria a 37 ºC por 30 minutos. Após este tempo, adicionou-se
1,8 mL de solução TPTZ (2,4,6-tri(2-piridil)-s-triazina) 1 mM em HCl 0,05 M. Transcorridos
10 minutos a absorbância foi medida em comprimento de onda de 620 nm. O valor de P
R
foi
46
calculado de acordo com a curva de calibração previamente preparada, sendo os resultados
expressos em µMol TEAC.g
-1
(atividade antioxidante equivalente ao Trolox).
2.2.6 Determinação da capacidade antioxidante - Sistema de co-oxidação do β-
caroteno/ácido linoléico
A avaliação da atividade antioxidante foi realizada em meio emulsionado, através da
técnica de co-oxidação de substratos, segundo MARCO (1968) e modificada por MILLER
(1971). O método colorimétrico é realizado em comprimento de onda de 470 nm e baseia-se
na leitura referente à descoloração da solução preparada de β-caroteno e ácido linoléico, em
meio aquoso.
Uma alíquota de 20 µL da solução de β-caroteno (20 mg.mL
-1
em clorofórmio) foi
colocada em um frasco erlenmeyer de 250 mL com 40 µL de ácido linoléico, 1 mL de
clorofórmio e 20 mg de Tween 40. O clorofórmio foi completamente evaporado com
nitrogênio. Ao erlenmeyer foram adicionados 150 mL de água deionizada (previamente
submetida a tratamento com atmosfera de oxigênio, durante 30 minutos). A emulsão
apresentou-se límpida e sua absorbância foi ajustada entre 0,7 a 0,6 nm a 470 nm. Diferentes
alíquotas dos extratos a 100 ppm (50, 100 e 200 µL) foram comparadas ao controle (sem
antioxidante) e ao BHT (butil hidroxitolueno), utilizado como antioxidante padrão. Além
disso, o efeito sinérgico foi avaliado utilizando misturas das amostras com BHT nas mesmas
concentrações do extrato puro. Uma leitura inicial da absorbância foi feita imediatamente
após a adição das amostras e do padrão ao sistema visando a determinação do tempo zero.
Posteriormente, a absorbância foi monitorada a cada 15 min, durante o período de 2 h. As
cubetas foram mantidas em banho-maria a 50 ºC durante as leituras.
A capacidade antioxidante foi calculada em termos de percentual de inibição.
2.3 Análise Estatística
A análise dos dados foi realizada pela aplicação da ANOVA e o teste Tukey visando
identificar diferenças significativas entre as médias, usando o software Statistica
®
6.0. O nível
de significância considerado para a diferença entre as médias foi de 5 % (P<0,05). Todas as
análises foram realizadas em triplicata e os resultados apresentados como média ± desvio
padrão.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
47
3.1 Compostos fenólicos totais
Os conteúdos de fenólicos totais extraídos com acetona e etanol nas diferentes
concentrações estão indicados na Tabela 1. Os valores obtidos na extração com os sistemas
solventes acetona 50 e 70 % (v.v
-1
) apresentaram maior conteúdo fenólico para as duas
variedades de uva analisadas: 7,95 e 7,56 g GAE.100g
-1
em peso seco para variedade
Ancelota e 6,59 e 6,90 g GAE.100g
-1
em peso seco para a variedade Tannat. Assim, as
características físico-químicas destes sistemas solventes assemelham-se em maior grau às
características da maioria dos compostos fenólicos presentes nas amostras avaliadas. Não
houve diferença significativa entre as concentrações de 50 e 70 % (v.v
-1
) em cada variedade
estudada (P<0,05). Esses resultados estão de acordo com o estudo feito por YILMAZ e
TOLEDO (2006), que relataram que misturas aquosas de acetona a 50 e 75 % (v.v
-1
) foram
mais eficientes na extração de constituintes fenólicos em semente de uva que os sistemas
etanol 60 % e metanol 70 % (v.v
-1
).
Tabela 1. Compostos fenólicos totais de extratos de bagaço de uva
*
(g GAE.100g
-1
peso
seco).
Solventes usados na extração Ancelota
Tannat
Água 1,48 ± 0,03 a 1,50 ± 0,13 a
Etanol 30 %
5,41 ± 0,02 c,d 3,96 ± 0,22 b
Etanol 50 %
7,32 ± 0,31 e
5,84 ± 0,14 c
Etanol 70 %
5,86 ± 0,12 d
5,59 ± 0,06 c
Etanol 100 %
2,73 ± 0,02 b
3,73 ± 0,02 b
Acetona 30 %
5,22 ± 0,10 c
3,63 ± 0,04 b
Acetona 50 %
7,95 ± 0,25 f
6,59 ± 0,12 d
Acetona 70 %
7,56 ± 0,06 e,f
6,90 ± 0,04 d
Acetona 100 %
1,82 ± 0,23 a
1,32 ± 0,16 a
*Valores expressos como média ± desvio padrão.
Letras diferentes na mesma coluna apresentam diferença estatística entre si (Tukey HSD,
P<0,05).
Em uma recente pesquisa desenvolvida por LLOBERA e CAÑELLAS (2007), com o
bagaço de uvas tintas variedade “Manto Negro” (Vitis vinifera L.), os teores médios de
compostos fenólicos extraídos seqüencialmente com metanol a 50 % e acetona a 70 % (v.v
-1
)
oscilaram entre 2,63 a 11,6 g GAE.100g
-1
em peso seco. NEGRO, TOMMASI e MICELI
(2003), estudando os resíduos da vinificação de uva da variedade “Negro amaro” na extração
48
com etanol a 80 % (v.v
-1
) acidificado, encontraram conteúdos de compostos fenólicos de 3,33,
8,58 e 4,19 g GAE.100g
-1
em peso seco na casca, semente e bagaço, respectivamente.
GÖKTÜRK BAYDAR, ÖZKAN e SAGDIÇ (2004), também estudando sementes e bagaço
de uva obtiveram 4,54 g GAE.100g
-1
em peso seco de compostos fenólicos totais em bagaço
de uva utilizando acetato de etila:metanol:água (60:30:10) como sistema solvente e 2,95 g
GAE.100g
-1
com sistema solvente etanol a 95 % (v.v
-1
).
Diversos autores concluíram que não é uma tarefa fácil encontrar um método único
que é adequado para a análise de um grupo diverso de fenólicos devido à diversidade das
estruturas químicas e variação de sensibilidade dos compostos às condições de extração
(ANTOLOVICH et al, 2000). Os teores de compostos fenólicos presentes no bagaço de uva
representam uma grande variedade de compostos, incluindo os flavonóides. Entre estes,
destacando-se as antocianinas (ORAK, 2007). KAMMERER et al (2004) caracterizaram os
compostos fenólicos de 14 diferentes amostras de bagaço de uva utilizando metanol
acidificado como solvente extrator, sendo identificados 13 tipos de antocianinas, 11 ácidos
fenólicos, 13 catequinas e flavonóis e 2 estilbenos.
3.2 Antocianinas Totais
As antocianinas estão localizadas nas células próximas à superfície das plantas e são
facilmente extraídas de materiais vegetais por solventes orgânicos. Tradicionalmente,
soluções acidificadas de metanol, etanol, acetona, água e misturas de acetona/metanol/água
têm sido usadas para a extração de antocianinas (JU e HOWARD, 2003).
Tabela 2. Antocianinas totais de extratos de bagaço de uva
*
(g.100g
-1
peso seco)
1
.
Solventes usados na extração Ancelota
Tannat
Água 0,13 ± 0,02 a 0,04 ± 0,00 a,b
Etanol 30 % 1,30 ± 0,04 e 0,50 ± 0,03 d
Etanol 50 % 1,95 ± 0,02 f 0,77 ± 0,02 e
Etanol 70 % 1,93 ± 0,06 f 0,77 ± 0,03 e
Etanol 100 % 0,42 ± 0,00 c 0,14 ± 0,03 b,c
Acetona 30 % 0,83 ± 0,07 d 0,19 ± 0,00 c
Acetona 50 % 0,50 ± 0,03 c 0,37 ± 0,01 d
Acetona 70 % 0,30 ± 0,00 b 0,22 ± 0,04 c
Acetona 100 % nd nd
49
*Valores expressos como média ± desvio padrão.
Letras diferentes na mesma coluna apresentam diferença estatística entre si (Tukey HSD,
P<0,05).
nd = não detectado
1
Equivalente a malvidina-3-glicosídeo.
Em nosso estudo utilizando acetona e etanol como sistemas solventes, os extratos do
bagaço da uva apresentaram concentrações de antocianinas mais elevadas em meio
hidroalcoólico: 1,93 g.100g
-1
em peso seco na concentração de 70 % e 1,95 g.100g
-1
em peso
seco na concentração de 50 % para a variedade Ancelota; e 0,77 g.100g
-1
nas concentrações
de 70 e 50 % para a variedade Tannat (Tabela 2). Não houve diferença significativa entre as
concentrações de 50 e 70 % (v.v
-1
) em cada variedade estudada (P<0,05). Esses teores foram
mais de duas vezes superiores aos teores obtidos com o sistema solvente acetona para as duas
variedades avaliadas. Esta maior eficiência na extração justifica a utilização, em diversos
trabalhos, dos solventes hidroalcoólicos metanol e etanol em meio acidificado para a extração
de antocianinas de resíduos do processo de vinificação.
Concentrações similares às encontradas em nosso estudo foram obtidas em recente
trabalho publicado pelos pesquisadores RUBERTO et al (2007), que relataram extrair do
bagaço de diferentes cultivares de uva, usando solvente metanol acidificado, valores médios
de antocianinas totais na faixa de 0,38 a 2,9 g.100g
-1
em peso seco. NEGRO, TOMMASI e
MICELI (2003) encontraram conteúdos de antocianinas totais de 0,98 g (equivalente a
malvidina).100g
-1
em peso seco.
Entre outras funções, as antocianinas são contribuintes para as propriedades
antioxidantes de alimentos (EINBOND et al, 2004). Segundo GÓMEZ-PLAZA, MIÑANO e
LÓPEZ-ROCA (2006), água e solventes hidroalcoólicos são preferidos quando o objetivo é
obter corantes ou produtos antioxidantes para a indústria de alimentos.
3.3 Atividade Antioxidante e Poder Redutor
A atividade antioxidante e o poder redutor para os extratos da variedade Ancelota e
Tannat são apresentados na Tabela 3. A variação da atividade antioxidante foi expressiva em
relação às concentrações de solventes utilizadas no experimento. Níveis de atividade
antioxidante mais elevados para a variedade Tannat são observados nos extratos obtidos com
solvente acetona nas concentrações de 50 e 70 % (v.v
-1
), de 466,4 e 476,2 µMol TEAC.g
-1
respectivamente, sem diferença significativa entre si (P<0,05). Para a variedade Ancelota os
maiores valores de atividade antioxidante foram obtidos com solvente nas concentrações de
50
50 e 70 % (v.v
-1
), de 400,7 e 389,9 µMol TEAC.g
-1
para etanol e 403,4 e 393,9 µMol
TEAC.g
-1
para acetona, respectivamente, sem diferença significativa entre todos esses
tratamentos (P<0,05).
A atividade antioxidante pode depender de vários fatores, incluindo as propriedades
coloidais dos substratos, as condições e etapas de oxidação, a formação e estabilidade dos
radicais, assim como a possível localização dos antioxidantes e estabilidade em distintas fases
do processamento nos alimentos. Como descrevem PÉREZ-JIMÉNEZ e SAURA-CALIXTO
(2006), as diferenças observadas na atividade antioxidante quando são utilizados diferentes
solventes extratores podem ser maiores se a amostra analisada for um alimento, visto que a
mesma representa uma matriz complexa de diferentes componentes, que podem estabelecer
entre si e com os solventes inúmeras e diferentes interações. Esses autores encontraram
diferenças significativas na atividade antioxidante pelo método ABTS, influenciadas pela
polaridade e pelo pH do solvente, com valores maiores em solventes mais polares e pHs
maiores. Utilizando-se o método ABTS em nosso estudo, o coeficiente de regressão r
2
entre o
conteúdo de fenólicos totais e atividade antioxidante foi de 0,9199 e 0,9817 para as
variedades Ancelota e Tannat, respectivamente. Esses valores confirmam os dados
apresentados por diversos estudos, mostrando que a capacidade antioxidante é dependente do
teor de compostos fenólicos presentes (ALONSO et al, 2002; GUENDEZ et al, 2005a;
GÓMEZ-PLAZA, MIÑANO e LÓPEZ-ROCA, 2006; THAIPONG et al, 2006; MAKRIS,
BOSKOU e ANDRIKOPOULOS, 2007).
Tabela 3. Atividade antioxidante e Poder Redutor (µMol.g
-1
) em peso seco de extratos de
bagaço de uva*.
Ancelota Tannat
Amostras
ABTS (TEAC)
FRAP (TEAC) ABTS (TEAC)
FRAP (TEAC)
Água
66,1 ± 0,9 b 218,7 ± 1,2 b 37,1 ± 1,0 a 201,7 ± 2,3 a
Etanol 30 %
293,5 ± 0,1 d 515,1 ± 2,3 d 234,3 ± 1,5 b 384,1 ± 5,5 b
Etanol 50 %
400,7 ± 4,2 f 686,4 ± 3,7 f 341,5 ± 3,5 c 531,7 ± 3,7 c
Etanol 70 %
389,9 ± 3,8 f 671,1 ± 5,7 f 398,1 ± 2,8 d 592,4 ± 6,3 d
Etanol 100 %
158,8 ± 2,3 c 334,1 ± 4,7 c 226,2 ± 2,6 b 395,1 ± 5,7 b
Acetona 30 %
338,2 ± 1,8 e 565,7 ± 4,3 e 223,1 ± 3,8 b 381,1 ± 2,3 b
Acetona 50 %
403,4 ± 3,4 f 710,1 ± 6,7 g 466,4 ± 2,2 e 647,7 ± 6,3 e
Acetona 70 %
393,9 ± 0,8 f 746,7 ± 1,3 h 476,2 ± 3,9 e
684,7 ± 4,7 f
Acetona 100 %
17,2 ± 0,4 a 164,4 ± 1,7 a
48,2 ± 1,3 a 204,1 ± 1,7 a
51
*Valores expressos como média ± desvio padrão.
Letras diferentes na mesma coluna apresentam diferença estatística entre si (Tukey HSD,
P<0,05).
Em estudo realizado por PASTRANA-BONILLA et al (2003) foram encontrados
valores semelhantes aos de nosso estudo para a atividade antioxidante média, sendo de 326,3
µMol TEAC.g
-1
em peso fresco para extratos metanólicos (80 % em 6 N HCl) de sementes de
uva de diferentes variedades, pelo método ABTS (leitura em 6 minutos).
Os maiores valores de poder redutor obtidos pelo método FRAP foram de 746,7 e
684,7 µMol TEAC.g
-1
em solvente acetona a 70 % (v.v
-1
) para as variedades Ancelota e
Tannat, respectivamente. No estudo realizado por PULIDO, BRAVO e SAURA-CALIXTO
(2000) observou-se que a utilização de diferentes solventes influencia o poder redutor da
amostra a ser analisada. Segundo esses autores, a eficiência antioxidante determinada pelo
método FRAP depende do potencial redox dos compostos analisados, caracterizado pela
complexidade de suas moléculas. O coeficiente de regressão r
2
entre o conteúdo de fenólicos
totais e poder redutor foi de 0,951 e 0,9805 para Ancelota e Tannat, respectivamente,
indicando a significativa relação entre esses parâmetros.
Em estudo realizado por SHUI e LEONG (2006) o valor de FRAP encontrado em
resíduo de carambola foi de 510,3 µMol.g
-1
em peso seco. No estudo de GUO et al (2003)
com diversos tipos de frutas, o poder redutor de uva tinta foi equivalente a 670,5 µMol.g
-1
em
peso fresco.
3.4 Poder de inibição da oxidação
Os extratos de bagaço de uva das variedades Ancelota e Tannat de concentração 50 %
(v.v
-1
) também foram testados pelo ensaio da inibição da oxidação de substratos β-
caroteno/ácido linoléico (Tabela 4). Os extratos etanólicos apresentaram melhor percentual
de inibição da oxidação, com 55,77 e 53,29 % na adição de 200 µL dos extratos das
variedades Tannat e Ancelota, respectivamente. Na seqüência, a adição de 100 µL dos
extratos etanólicos apresentou 40,35 e 42,98 % de inibição da oxidação, também para Tannat
e Ancelota, respectivamente. Os extratos obtidos com acetona apresentaram poder de inibição
da oxidação menor, aproximadamente metade do percentual obtido com adição de 200 µL dos
extratos etanólicos. Esses valores foram de 24,29 e 29,62 % para Tannat e Ancelota
respectivamente, na adição de 200 µL. Isto demonstra que para os extratos analisados o
sistema solvente extrator influenciou a composição de substâncias com capacidade
52
antioxidante presentes. JAYAPRAKASHA, SINGH e SAKARIAH (2001), utilizando
diferentes sistemas solventes em extratos de semente de uva, obtiveram 89,3 % de inibição
com acetato de etila em meio aquoso (proporção 17:3). NEGRO, TOMMASI e MICELI
(2003) relataram 73,50 % de inibição da oxidação na utilização de 200 µL de extrato de
bagaço de uva de concentração fenólica de 80 ppm.
Tabela 4. Percentual de inibição da oxidação pelo sistema de co-oxidação de substratos β-
caroteno/ácido linoléico
*
.
Extrato BHT BHT + Extrato
Extratos
50 µL 100 µL 200 µL 50 µL 100 µL 200 µL 25/25 50/50 100/100
EtT
13,17±1,54 40,35±0,12 55,77±0,80
83,17±1,74
89,33±2,38 94,88±0,87 72,10±0,59 82,92±2,44 91,89±1,18
AcT
13,22±1,18 23,68±3,61 24,29±2,25 85,41±0,69 95,52±1,70 99,00±1,47 62,62±6,32 84,94±1,41 91,28±1,05
EtA
7,63±2,02 42,98±5,06 53,29±2,39 81,51±1,30 88,93±1,32 97,93±2,60 62,12±0,32 82,81±2,11 89,65±0,93
AcA
6,11±2,16 15,49±1,86 29,62±3,42 84,99±0,45 91,35±0,58 92,95±1,95 66,02±0,96 79,88±2,41 89,25±0,54
EtT = extrato etanólico Tannat; EtA = extrato etanólico Ancelota; AcT = extrato acetônico Tannat; AcA =
extrato acetônico Ancelota.
*Valores expressos como média ± desvio padrão.
O BHT apresentou maior eficiência em comparação com os extratos analisados.
Observa-se que a mistura de BHT e extrato produziu efeito sinérgico, mantendo os
percentuais de inibição semelhantes aos obtidos com o antioxidante sintético aplicado
isoladamente, uma vez que a inibição obtida pelos extratos foi menos expressiva.
4 CONCLUSÃO
Os resultados deste trabalho demonstram que o sistema solvente utilizado na extração
de bagaço de uva influencia diretamente os conteúdos de fenólicos totais, antocianinas e
atividade antioxidante dos extratos. Compostos fenólicos totais foram melhor extraídos em
solvente acetona (50 e 70 %), enquanto que as antocianinas foram melhor extraídas em
solvente etanol (50 e 70 %).
Para obtenção de dados ainda mais conclusivos devem ser realizados trabalhos
posteriores com outros cultivares difundidos no setor vitivinícola brasileiro e outros solventes
indicados na literatura.
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AGRADECIMENTOS
59
Ao CNPq/Capes pelo auxílio financeiro, e a EPAGRI (Empresa Catarinense de
Pesquisa Agropecuária) de Videira, Estado de Santa Catarina, pelo fornecimento das
amostras.
60
CAPÍTULO 3
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE EXTRATOS DE BAGAÇO DE UVA
DAS VARIEDADES REGENTE E PINOT NOIR (VITIS VINIFERA L.)
Artigo publicado.
ROCKENBACH, I. I; SILVA, G. L.; RODRIGUES, E.; GONZAGA, L. V.; FETT, R.
Atividade antioxidante de extratos de bagaço de uva das variedades Regente e Pinot Noir
(Vitis vinifera L.). Revista do Instituto Adolfo Lutz, v. 66, n. 2, p. 158-163, 2007.
61
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE EXTRATOS DE BAGAÇO DE UVA
DAS VARIEDADES REGENTE E PINOT NOIR (VITIS VINIFERA L.)
Ismael Ivan ROCKENBACH*, Graciela Lessa da SILVA, Eliseu RODRIGUES, Luciano
Valdemiro GONZAGA, Roseane FETT
* Endereço para correspondência: Centro de Ciências Agrárias, Rod. Admar Gonzaga 1346,
Itacorubi, CEP: 88034-001, Florianópolis, SC, e-mail: [email protected]
Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos do Centro de Ciências Agrárias da
Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, Santa Catarina, Brasil.
RESUMO
Bagaço de uva (Vitis vinifera L.) das variedades Pinot Noir e Regente, coletadas no município
de Videira, Santa Catarina, foram analisadas quanto ao conteúdo total de polifenóis e
capacidade antioxidante. Foram utilizados sistemas solventes aquosos a 50% (v/v) de
metanol, etanol e acetona acidificados (HCl 0,1%). O conteúdo de fenólicos totais foi
determinado pelo método de Folin-Ciocalteau e a atividade antioxidante pelos métodos de
seqüestro de radicais livres ABTS e DPPH e pelo método β-caroteno/ácido linoléico. A
acetona apresentou maior conteúdo de polifenóis totais, atingindo, em peso seco, 7852 mg
GAE/100g na variedade Pinot Noir e 5334 mg GAE/100g na variedade Regente. A atividade
antioxidante média das variedades Pinot Noir e Regente foi, respectivamente, de 477 e 419
µMol TEAC/g pelo método ABTS e 480 e 479 µMol TEAC/g pelo método DPPH. No ensaio
da co-oxidação do β-caroteno/ácido linoléico os extratos etanólicos apresentaram maior
sinergismo quando associados ao BHT, com 92,6% e 90,9% de inibição da oxidação com 200
µL para a variedade Regente e Pinot Noir, semelhante ao BHT com 200 µL, apresentando
91,7% de inibição da oxidação. Os extratos de bagaço de uva apresentaram potencial
antioxidante atuando como inibidores de radicais livres, ou atuando em sinergismo com o
antioxidante sintético.
Palavras-chave. Atividade antioxidante, polifenóis, bagaço de uva.
ABSTRACT
Grape (Vitis vinifera L.) pomace from Pinot Noir and Regente varieties, collected in Videira,
Santa Catarina, were evaluated in order to determine its total polyphenol content and
62
antioxidant capacity. Acidified (HCl 0.1%) aqueous solvent systems of 50% (v.v
-1
) methanol,
ethanol and acetone were used. Total polyphenol content was determined by Folin-Ciocalteu
method and antioxidant activity was determined by ABTS, DPPH and β-carotene/linoleic acid
methods. Acetone presented the higher total polyphenol content, reaching, in dry matter, 7852
mg GAE/100g in Pinot Noir variety and 5334 mg GAE/100g in Regente variety. Averaged
antioxidant activity of Pinot Noir and Regente varieties was, respectively, of 477 and 419
µMol TEAC/g by ABTS method and 480 and 479 µMol TEAC/g by DPPH method. In β-
carotene/linoleic acid method, ethanolic extracts presented higher synergism when associated
to BHT, with 92.6% and 90.9% of inhibition of the oxidation with 200 µL for Regente and
Pinot Noir varieties, similar to BHT with 200 µL, presenting 91.7% of inhibition of the
oxidation. Extracts of grape pomace presented antioxidant potential, acting as inhibitors of
free-radicals or in synergism with a synthetic antioxidant.
Keywords: Antioxidant activity, polyphenols, grape pomace.
1 INTRODUÇÃO
O crescente interesse nas propriedades antioxidantes dos compostos fenólicos em
vegetais e frutas deriva de sua forte atividade e baixa toxicidade comparada com antioxidantes
fenólicos sintéticos, tal como o BHT (butil hidroxitolueno), BHA (butil hidroxianisol), PG
(Propil Galato) e TBHQ (terc-butil-hidroxiquinona)
1,2
.
Os resíduos da produção de vinho são caracterizados por conter altos teores de
compostos fenólicos devido à extração insuficiente durante a vinificação. Segundo
Shrikhande
3
os extratos de cascas de uva, consistindo de antocianinas das cascas e
procianidinas das sementes, são fontes importantes de polifenóis. Sementes e cascas são
normalmente descartadas nas operações de suco e vinho branco antes do processamento.
Esses resíduos não fermentados tornam-se então valiosos para a extração de polifenóis. Os
subprodutos obtidos após exploração da vinificação, tanto as sementes como o bagaço,
constituem uma fonte muito barata para a extração de flavonóides antioxidantes, podendo ser
utilizados como suplementos alimentares, ou na produção de fitoquímicos, proporcionando
vantajosa importância econômica
4,5,6
.
A proposta deste trabalho foi avaliar a atividade antioxidante de extratos dos resíduos
do processo de vinificação das variedades Regente e Pinot Noir, cultivadas no município de
Videira, Santa Catarina.
2 MATERIAL E MÉTODOS
63
2.1 Material
Foram utilizadas amostras de bagaço de uvas vermelhas (Vitis vinifera L., variedades
Pinot Noir e Regente) coletadas no município de Videira, Santa Catarina, resultantes da safra
de 2005/2006, cedidas pela EPAGRI (Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de
Santa Catarina). O município de Videira localiza-se a uma latitude de 27°00', longitude de
51°09', estando a uma altitude de 779,1 metros acima do nível do mar
7
, possui clima úmido
do tipo temperado, com as estações bem definidas e temperaturas médias que variam de 35°C
no verão a 0°C no inverno.
Com o objetivo de preservar as propriedades gerais dos bagaços, os exemplares foram
acondicionados em caixas isotérmicas contendo gelo, sendo encaminhadas imediatamente
para laboratório, onde foram armazenados à temperatura de -18,0 ± 0,2°C por 15 dias até as
análises.
2.2 Métodos
2.2.1 Preparação dos extratos
O conteúdo em peso seco dos bagaços foi obtido em estufa a 105°C, até peso
constante. Para obtenção dos extratos, as amostras do bagaço de uva das variedades Pinot
Noir e Regente foram submetidas a tratamento térmico à 80°C, num período de 10 min, para
inativação enzimática
8,9
. Posteriormente, foram secas em estufa de ar circulante, a
temperatura de 50°C, por 24 horas. Após resfriamento em dessecador, as amostras foram
trituradas (60 mesh) e desengorduradas em extrator de Soxhlet, utilizando-se hexano, durante
6 horas. Os extratos foram preparados com 1,5 g de material seco e 2 x 25mL de solvente,
utilizando soluções aquosas a 50% (v/v) de metanol, etanol e acetona acidificados com HCl a
0,1% sob agitação mecânica e ao abrigo da luz, durante um período de 2 horas. Os extratos
foram filtrados em papel filtro Whatman nº 1 e transferidos para balão volumétrico, sendo o
volume final ajustado para 50 mL.
2.2.2 Determinação do Conteúdo de Polifenóis Totais (PT)
O conteúdo total de polifenóis em cada extrato de bagaço de uva foi determinado
espectrofotometricamente de acordo com o método de Folin-Ciocalteu
10
, com a leitura da
absorbância em 764 nm, e os resultados expressos em miligramas de equivalentes a ácido
gálico (GAE) por 100 gramas de extrato seco.
2.2.3 Determinação da capacidade antioxidante – seqüestro de radicais livres do ABTS
•
••
•+
64
Para determinar a atividade antioxidante utilizou-se o método ABTS (2,2´azino-bis-3-
etilbenzotiazolin 6-ácido sulfônico) descrito por Re et al.
11
. A absorbância foi medida em
espectrofotômetro modelo Hewlett-Packard 8425A, no tempo de 7 minutos após a adição da
amostra. A capacidade antioxidante total da amostra foi calculada em µMol/g de TEAC
(atividade antioxidante equivalente ao Trolox)
12
.
2.2.4 Determinação da capacidade antioxidante – método DPPH
.
Desenvolvido por Brand-Willams et al.
13
, o método DPPH tem como base a redução
da absorbância na região visível de comprimento de onda de 515 nm do radical DPPH
•
(2,2-
difenil-1-picrilhidrazil) por antioxidantes. Foram aplicadas modificações de Kim et al.
14
, que
utilizam o método com base na absorbância do radical DPPH
•
100 µM (2,9 mL) dissolvido
em metanol a 80% no comprimento de onda de 517 nm. Os resultados são expressos em
Trolox (µMol TEAC/g de amostra).
2.2.5 Determinação da capacidade antioxidante - sistema de co-oxidação do β-
caroteno/ácido linoléico
A capacidade antioxidante também foi avaliada pelo método de descoramento do β-
caroteno descrito por Marco
15
e modificado por Miller
16
. Uma alíquota de 20 µL da solução
de β-caroteno (20 mg/mL em clorofórmio) foi colocada em um frasco erlenmeyer de 250 mL
com 40 µL de ácido linoléico, 1 mL de clorofórmio e 20 mg de Tween 40. Após
homogeneização, o clorofórmio foi completamente evaporado com nitrogênio. Ao erlenmeyer
foram adicionados 150 mL de água deionizada (previamente submetida a tratamento com
atmosfera de oxigênio, durante 30 minutos). A emulsão apresentou-se límpida e sua
absorbância foi ajustada entre 0,6 e 0,7 a 470 nm. Diferentes alíquotas (50, 100 e 200 µL) de
soluções a 100 ppm dos extratos foram comparadas ao controle (sem antioxidante) e à solução
de BHT (butil hidroxitolueno) a 100 ppm, utilizado como antioxidante padrão. Além disso, o
efeito sinérgico foi avaliado utilizando-se misturas das soluções de extratos com a solução de
BHT (1:1). Uma leitura inicial da absorbância foi feita imediatamente após a adição das
soluções de extratos e do padrão ao sistema. Posteriormente, a absorbância foi monitorada a
cada 15 min, durante 2 horas. As cubetas foram mantidas em banho-maria a 50ºC durante as
leituras. A atividade antioxidante foi calculada em termos de percentual de inibição, relativo
ao controle, de acordo com a seguinte equação:
65
% inibição =
−
−
− 100100 x
CC
AA
fi
fi
controlesoluçãodafinalaabsorbânciC
controlesoluçãodainicialaabsorbânciC
extratodesoluçãodafinalaabsorbânciA
extratodesoluçãodainicialaabsorbânciA
f
i
f
i
=
=
=
=
2.3 Análise Estatística
Realizou-se análise de variância (ANOVA) e o teste de Tukey para identificar
diferenças significativas entre as médias através do software Statistica
®
6.0, ao nível de 5% de
significância (P<0,05).
Todas as análises foram realizadas em triplicata e os resultados apresentados como
média ± desvio padrão.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Conteúdo de Polifenóis Totais
A concentração de polifenóis totais foi maior no extrato aquoso de acetona, seguido
pelo extrato etanólico e metanólico para as variedades Pinot Noir e Regente (Tabelas 5 e 6),
respectivamente. Houve diferença estatisticamente significativa (P<0,05) apenas para o
extrato metanólico da variedade Regente, que apresentou menor teor de compostos fenólicos.
Llobera e Cañellas
17
realizaram um estudo com o bagaço de uvas vermelhas variedade
Manto Negro (Vitis vinifera L.) e encontraram valores de compostos fenólicos de 2630 mg
GAE/100g em peso seco, sendo estes valores inferiores aos encontrados em nosso estudo. Em
outro estudo Yilmaz e Toledo
18
determinaram o conteúdo de polifenóis totais em semente de
uva utilizando diferentes sistemas solventes. Foram encontrados valores, em peso seco, em
torno de 2800 mg GAE/100g utilizando soluções aquosas de etanol (50, 60 e 70%), 3000 mg
GAE/100g em soluções aquosas metanólicas (60 ou 70%) e valores em torno de 4000 mg
GAE/100g quando utilizadas soluções aquosas de acetona (50 ou 75%).
Levando em consideração que as concentrações de polifenóis totais encontradas em
nosso estudo atingem, em peso seco, 7852 mg GAE/100g no extrato acetônico da variedade
Pinot Noir, pode-se dizer que os subprodutos da vinificação, como cascas e sementes,
66
representam uma fonte rica de produtos de alto valor, sendo caracterizados pelo elevado
conteúdo de polifenóis
4,5,19,6
.
Tabela 5
. Conteúdo de polifenóis totais (PT) e Atividade antioxidante (ABTS e DPPH) de
extratos de bagaço de uva variedade Pinot Noir (solventes a 50% em meio aquoso acidificado
com HCl 0,1% v/v).
PT
(mg GAE/100g de bagaço)
Amostras
PS
a
PF
b
DPPH – TEAC
c
ABTS – TEAC
c
Etanol 7173 ± 381 a 1650 ± 88 a 450 ± 14 a 471 ± 12 a
Metanol 7073 ± 389 a 1627 ± 89 a 438 ± 11 a 436 ± 57 a
Acetona 7852 ± 291 a 1806 ± 67 a 551 ± 7 b 523 ± 24 a
Resultados expressos como média ± desvio padrão, n = 3.
a
PS: Peso seco;
b
PF: Peso fresco (77% de umidade);
c
TEAC: atividade antioxidante
equivalente ao Trolox (µMol TEAC/g).
Letras diferentes em uma mesma coluna representam diferença estatística (Tukey HSD, P
<0,05).
Kuskoski et al.
20
realizaram pesquisa com a polpa de abacaxi, cupuaçu, maracujá,
graviola e uva, e encontraram valores de compostos fenólicos de 21,7; 20,5; 20,0; 84,3 e
117,1 mg GAE/100g em peso fresco.
Em outro estudo Sun et al.
21
encontraram em frutas
como uva (182,0 ± 2,6 mg/100g), morango (147,8 ± 1,1 mg/100g) e abacaxi (40,4 ± 1,0
mg/100g), valores de compostos fenólicos totais, em peso fresco, inferiores aos encontrados
em nosso estudo com bagaço de uva, que foram de 1806 e 1067 mg GAE/100g, para Pinot
Noir e Regente, respectivamente.
Tabela 6
. Conteúdo de polifenóis totais (PT) e Atividade antioxidante (ABTS e DPPH) de
extratos de bagaço de uva variedade Regente (solventes a 50% em meio aquoso acidificado
com HCl 0,1% v/v).
PT
(mg GAE/100g de bagaço)
Amostras
PS
a
PF
b
DPPH – TEAC
c
ABTS – TEAC
c
Etanol 5230 ± 96 b 1046 ± 19 b 439 ± 18 a 357 ± 12 a
Metanol
4354 ± 98 a 871 ± 20 a 443 ± 12 a 454 ± 20 b
Acetona 5334 ± 13 b 1067 ± 3 b 556 ± 12 b 447 ± 15 b
Resultados expressos como média ± desvio padrão, n = 3.
a
PS: Peso seco;
b
PF: Peso fresco (80% de umidade);
c
TEAC: atividade antioxidante
equivalente ao Trolox (µMol TEAC/g).
Letras diferentes em uma mesma coluna representam diferença estatística (Tukey HSD, P
<0,05).
67
3.2 Atividade Antioxidante pelos métodos ABTS e DPPH
Os valores médios encontrados em nosso estudo considerando-se os diferentes
solventes são, respectivamente, 477 e 419 µMol TEAC/g pelo método ABTS e 480 e 479
µMol TEAC/g pelo método DPPH para Pinot Noir e Regente (Tabelas 5 e 6),
respectivamente. Para a variedade Pinot Noir o extrato acetônico apresentou maior atividade
pelo método DPPH, não havendo diferença significativa entre os extratos pelo método ABTS
(P<0,05). Para a variedade Regente o extrato acetônico apresentou maior atividade pelo
método DPPH. Enquanto que pelo método ABTS o extrato metanólico apresentou maior
atividade em relação ao extrato acetônico, porém sem apresentar diferença significativa
(P<0,05).
A atividade antioxidante média encontrada no bagaço das uvas é relativamente elevada
quando comparada com frutas ricas em antocianinas, como morango (20,6 µMol TEAC/g
peso fresco ORAC), descrita por Kalt et al.
22
, suco de uva e de amora (8,11 – 38,29 µMol
TEAC/g peso fresco pelo método ABTS), descrita por Sellappan et al.
23
; polpa de açaí (48,6
µMol/mL ORAC), determinada por Del Pozo-Insfran et al.
24
; e suco de uva tinta (14,6 – 25,0
µMol TEAC/mL), descrita por Dávalos et al.
25
.
Em outro estudo Kuskoski et al.
26
determinaram atividade antioxidante das polpas de
frutas de grande consumo no mercado sul brasileiro (amora, uva, açaí, goiaba, morango,
acerola, abacaxi, manga, graviola, cupuaçu e maracujá), aplicando método ABTS. Os valores
de atividade antioxidante equivalente ao Trolox obtidos oscilam entre valores mínimos e
máximos de 2,0 e 67,6 µMol TEAC/g em peso fresco.
3.3 Atividade Antioxidante através do sistema β-caroteno/ ácido linoléico
A ação antioxidante dos extratos acetônico, etanólico e metanólico do bagaço das duas
variedades de uva também foi avaliada através do sistema modelo
β
-caroteno/ácido linoléico.
O método avalia a atividade de inibição de radicais livres gerados durante a peroxidação do
ácido linoléico. A Figura 7 mostra as porcentagens de inibição da oxidação dos extratos
acetônico, etanólico e metanólico da variedade Regente. O extrato metanólico teve maiores
valores de atividade antioxidante, que indicou com 200
µ
L a melhor proteção contra o
processo de oxidação, com uma média de 67,5%, seguido por 53,5% de inibição da oxidação
pela mesma amostra com 100
µ
L. Na variedade Pinot Noir (Figura 8) o extrato etanólico teve
maiores valores de atividade antioxidante, indicando com 200
µ
L a melhor proteção contra o
68
processo de oxidação com uma média de 63,6%, seguido por 41,1% de inibição da oxidação
pela mesma amostra com 100
µ
L.
* BHT - butil hidroxitolueno
Figura 7
. Atividade antioxidante dos extratos acetônico, etanólico e metanólico do bagaço de
uva variedade Regente determinada pela oxidação acoplada do
β
-caroteno/ ácido linoléico.
Estes resultados são inferiores aos dados apresentados no estudo de Moreira e
Mancini-Filho
27
, onde o extrato aquoso de mostarda a 200 ppm apresentou 72% de inibição
da oxidação, e o extrato etéreo de canela indicou 83% de atividade antioxidante. Em outro
estudo Jayaprakasha et al.
28
, utilizando diferentes sistemas solventes em extratos de semente
de uva, obtiveram 89,3% de inibição com acetato de etila em meio aquoso (proporção 17:3).
Os dados demonstram que o percentual de inibição da oxidação é dose-dependente, ou
seja, aumenta com a elevação do volume de solução de extrato aplicada. Outro fato relevante
a ser observado é que, ao contrário dos resultados de ABTS e DPPH, os extratos acetônicos
foram menos efetivos no ensaio do sistema
β
-caroteno/ácido linoléico em comparação com os
extratos metanólico e etanólico. Este fato pode estar relacionado com a composição fenólica
dos extratos, provavelmente determinada pelas características de afinidade polar entre
solvente e compostos fenólicos. Frankel et al.
29
observaram que antioxidantes de caráter polar
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
BHT* Acetona Etanol Metanol BHT +
Acetona
BHT +
Etanol
BHT +
Metanol
% inibição
50 µL
100 µL
200 µL
69
apresentaram maior capacidade antioxidante em sistemas de caráter mais apolar, sendo
observado o contrário para antioxidantes de caráter apolar.
* BHT - butil hidroxitolueno
Figura 8
. Atividade antioxidante dos extratos acetônico, etanólico e metanólico do bagaço de
uva variedade Pinot Noir determinada pela oxidação acoplada do
β
-caroteno/ ácido linoléico.
Além disso, o extrato etanólico das duas variedades foi o que melhor apresentou
sinergismo quando associado ao BHT. A mistura, com volume de 200
µ
L, de antioxidante
sintético e extrato (1:1) teve uma performance na inibição da oxidação semelhante, de 92,6%
para a variedade Regente e 90,9% para a variedade Pinot Noir, ao BHT puro quando aplicado
o mesmo volume, com 91,7% de inibição nos ensaios para as duas variedades.
4 CONCLUSÃO
Considerando que o bagaço de uva é resíduo obtido a partir da separação do mosto na
vinificação, o conteúdo total de compostos fenólicos que permanece no bagaço é elevado,
comparando-se com a polpa de algumas frutas como abacaxi, cupuaçu, maracujá, graviola e
uva.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
BHT* Acetona Etanol Metanol BHT +
Acetona
BHT +
Etanol
BHT +
Metanol
% inibição
50 µL
100 µL
200 µL
70
Os extratos de bagaço de uva avaliados apresentaram potencial antioxidante atuando
como inibidores de radicais livres, ou atuando em sinergismo com o antioxidante sintético
BHT.
AGRADECIMENTOS
Ao CNPq/Capes pelo auxílio financeiro, e a EPAGRI (Empresa Catarinense de
Pesquisa Agropecuária) de Videira, Estado de Santa Catarina, pelo fornecimento das
amostras.
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73
CAPÍTULO 4
ESTABILIDADE DE ANTOCIANINAS, COMPOSTOS FENÓLICOS E
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE BAGAÇOS DE UVA (VITIS
VINIFERA L.)
Artigo submetido à publicação na Revista Brazilian Journal of Food Technology do
Instituto de Tecnologia de Alimentos – ITAL - SP.
74
ESTABILIDADE DE ANTOCIANINAS, COMPOSTOS FENÓLICOS E ATIVIDADE
ANTIOXIDANTE DE BAGAÇOS DE UVA (VITIS VINIFERA L.)
Ismael Ivan ROCKENBACH*; Eliseu RODRIGUES; Luciano Valdemiro GONZAGA;
Roseane FETT
Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos do Centro de Ciências Agrárias da
Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, Santa Catarina, Brasil.
*Endereço para correspondência: Centro de Ciências Agrárias, Rod. Admar Gonzaga 1346,
RESUMO
O bagaço de uva, subproduto da vinificação, é caracterizado como fonte de compostos
fenólicos antioxidantes e de antocianinas. As antocianinas remanescentes no resíduo da
vinificação constituem uma fonte potencial de corantes naturais, apresentando, contudo,
problemas de estabilidade. O objetivo deste trabalho foi avaliar a estabilidade das
antocianinas, compostos fenólicos totais e atividade antioxidante total de resíduos secos e
desengordurados obtidos a partir do bagaço de uva (Vitis vinifera L.) das variedades Ancelota,
Tannat, Regente e Pinot Noir. No estudo da estabilidade das antocianinas no período de 298
dias, foram obtidos tempos de meia-vida de 1680, 1306, 868 e 343 dias para as variedades
Ancelota, Tannat, Regente e Pinot Noir, respectivamente. Observou-se queda significativa
(P<0,05) dos teores de fenólicos totais e atividade antioxidante, com exceção da variedade
Tannat. A partir dos dados obtidos, conclui-se que as antocianinas do bagaço apresentaram
boa estabilidade, com tempos de meia-vida que permitem o armazenamento e aproveitamento
do bagaço como fonte natural de corantes e antioxidantes em períodos de entressafra da uva.
Palavras-chave:
resíduo, antocianinas, corantes naturais, tempo de meia-vida.
ABSTRACT
Grape pomace, a vinification byproduct, is known as a source of phenolics, antioxidants and
anthocyanins. Pomace remaining anthocyanins consist of a potential source of natural
colorants that present problems of stability. The aim of this work was to evaluate stability of
anthocyanins, total phenolics compounds and total antioxidant activity of dry and defatted
residues from pomace of the following grape varieties: Ancelota, Tannat, Regente and Pinot
75
Noir. Studying the anthocyanins stability during 298 days, half-life times of 1680, 1306, 868
and 343 days were obtained for varieties Ancelota, Tannat, Regente and Pinot Noir,
respectively. Decreasing in total phenolics compounds and antioxidant activity was also
observed (P<0.05), with the exception for Tannat variety. Anthocyanins of analyzed pomaces
presented good stability, with half-life times that allows the storage and using of pomace as a
natural source of colorants and antioxidants in inter-harvest periods.
Keywords
: residue, anthocyanins, natural colorants, half-life time.
1 INTRODUÇÃO
Os principais fenólicos presentes na uva são os flavonóides (antocianinas, flavanóis e
flavonóis), os estilbenos (resveratrol), os ácidos fenólicos (derivados dos ácidos cinâmicos e
benzóicos) e uma larga variedade de taninos (FRANCIS, 2000). O bagaço da uva, por sua
vez, é caracterizado pelo alto conteúdo de compostos fenólicos que permanecem após o
processo de vinificação (ARVANITOYANNIS et al., 2006). Os compostos fenólicos dos
resíduos da vinificação possuem alta capacidade antioxidante, tendo, como conseqüência,
potenciais benefícios para a saúde (ALONSO et al., 2002).
Entre esses compostos estão as antocianinas, que permanecem em grande quantidade
no bagaço, visto que durante o contato das cascas da uva com o mosto na fermentação não há
uma extração completa desses pigmentos (SINGLETON & ESAU, 1969). As antocianinas
são flavonóides que se encontram largamente distribuídos na natureza e são responsáveis pela
maioria das cores azul, violeta e todas as tonalidades de vermelho que aparecem em flores,
frutos, algumas folhas, caules e raízes de plantas (MARKAKIS, 1982; VINSON et al., 1999).
São consideradas potenciais substitutos aos corantes sintéticos devido ao seu brilho, cor
atrativa e solubilidade em água, que permite sua incorporação em uma variedade de matrizes
alimentares (BORDIGNON-LUIZ et al., 2007), sendo de interesse para a indústria de
alimentos, cosméticos e farmacêutica (GÓMEZ-PLAZA et al., 2006). Apesar de largamente
disseminadas na natureza são poucas as fontes comercialmente utilizáveis de antocianinas.
Entre essas fontes pode-se citar o resíduo da fabricação do vinho e do suco de uva que produz
o pigmento usado em alimentos com o nome de enocianina (MALACRIDA & MOTTA,
2006).
Embora as antocianinas apresentem grande potencial para serem utilizadas como
corantes naturais, elas apresentam problemas de estabilidade (GÓMEZ-PLAZA et al., 2006).
Segundo SARNI-MANCHADO et al. (1996), a presença de luz implica na perda significativa
da cor das antocianinas. De acordo com FRANCIS (1989), os principais fatores que
76
influenciam a estabilidade das antocianinas são a estrutura química, o pH, a temperatura, a
luz, a presença de oxigênio, a degradação enzimática e as interações com os componentes dos
alimentos, tais como ácido ascórbico, íons metálicos, açúcares e copigmentos.
Neste trabalho o objetivo foi avaliar a estabilidade das antocianinas, dos compostos
fenólicos e da atividade antioxidante do bagaço de uva de diferentes variedades (Vitis vinifera
L.).
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Material
Foram utilizadas amostras de bagaço das uvas tintas Vitis vinifera L., variedades
Tannat, Ancelota, Regente e Pinot Noir, coletadas na região de Videira, Santa Catarina. As
amostras foram resultantes da safra de 2005/2006, sendo cedidas pela EPAGRI (Empresa de
Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina). Tendo por objetivo preservar as
propriedades gerais dos bagaços, os exemplares foram acondicionados em caixas isotérmicas
contendo gelo e encaminhados imediatamente ao laboratório, onde foram armazenados à
temperatura de -18,0±0,2°C e posteriormente analisados.
2.2 Métodos
2.2.1 Preparo das amostras
As amostras de bagaço de uva foram submetidas a tratamento térmico de 80
o
C por 10
minutos em estufa com circulação de ar para inativação enzimática (VALDERRAMA et al.,
2001; TROIANI et al., 2003). Posteriormente foram secas em temperatura de 50
o
C, por 24
horas. Após resfriamento em dessecador, as amostras foram trituradas (60 mesh) e
desengorduradas em extrator Soxhlet, utilizando solvente hexano, durante 6 horas. Os
resíduos obtidos foram acondicionados em tubos de ensaio com rosca protegidos da luz, em
ambiente seco e arejado, e em temperatura de 25ºC.
2.2.2 Preparo dos extratos
Os conteúdos de fenólicos totais e atividade antioxidante foram analisados no início e
no final do experimento. Para isso, os extratos foram preparados com 2,5 g de material seco.
Utilizou-se como solvente extrator solução de etanol 50 % (v.v
-1
) (CACACE & MAZZA,
2003), acidificada com HCl a 0,1 % (REVILLA et al., 1998). A extração (3 x 25 mL) foi
procedida sob agitação e ao abrigo da luz no intervalo de 2 horas, seguida de filtração com
papel filtro Whatman nº 1.
77
Para a avaliação da estabilidade das antocianinas foram preparados extratos com água
deionizada acidificada (HCl 0,1 % v.v
-1
), mantendo-se 150 minutos de agitação ao abrigo da
luz.
2.2.3 Avaliação da estabilidade
A avaliação da estabilidade das antocianinas foi realizada considerando-se que a
reação de degradação das antocianinas segue cinética de primeira ordem (CORMIER et al.,
1997; DEL POZO-INSFRAN et al., 2004). Assim, foram determinados os valores da
constante de velocidade da reação de degradação (k) e o tempo de meia-vida (t ½) dos
pigmentos antociânicos (GARZÓN & WROLSTAD, 2001) a partir dos resultados obtidos nas
leituras de absorbância dos extratos em um período de 298 dias, através das Equações 1 e 2:
(
)
( )
tk
taAbsorbânci
taAbsorbânci
×=
0
ln
(Equação 1)
2
1
693,0
t
k
= (Equação 2)
Sendo,
A
tx
= absorbância em função do tempo
A
t0
= absorbância no tempo zero
k = constante de velocidade de degradação
t = tempo (dias, horas, minutos, segundos)
t ½ = tempo de meia-vida.
2.2.4 Determinação do conteúdo de fenólicos totais
O conteúdo de fenólicos totais em cada extrato foi determinado
espectrofotometricamente de acordo com o método de Folin-Ciocalteau (ROSSI &
SINGLETON, 1965) com a leitura da absorbância em 764 nm, e os resultados expressos em
gramas de equivalentes a ácido gálico (GAE) por 100 gramas de extrato seco.
2.2.5 Determinação da atividade antioxidante
Para determinar a atividade antioxidante utilizou-se o método ABTS (2,2´azino-bis-(3-
etilbenzotiazolin 6-ácido sulfônico)) descrito por RE et al. (1999). A absorbância foi medida
78
em espectrofotômetro modelo Hewlett-Packard 8425A, no tempo de 7 minutos. A atividade
antioxidante total da amostra foi calculada em relação à atividade do antioxidante sintético
Trolox, nas mesmas condições, e os resultados foram expressos em µMol TEAC.g
-1
(atividade antioxidante equivalente ao Trolox) (RICE-EVANS et al., 1996).
2.3 Análise Estatística
A análise dos dados foi realizada pela aplicação da ANOVA e o teste t visando
identificar diferenças significativas entre as médias, usando o software Statistica
®
6.0. O nível
de significância considerado para a diferença entre as médias foi de 5 % (P<0,05). O
experimento e as análises foram realizados em triplicata e os resultados apresentados como
média ± desvio-padrão.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os tempos de meia-vida das antocianinas foram, respectivamente, de 1680, 1306, 868
e 343 dias para as variedades Ancelota, Tannat, Regente e Pinot Noir. As variedades Regente
e Pinot Noir apresentaram tempo de meia-vida bastante inferior às demais. Esses valores são
elevados na comparação com os valores observados no estudo de FALCÃO et al. (2004), que
relataram tempo de meia-vida de 42 dias de extratos antociânicos de casca de uva Cabernet
Sauvignon em pH 3,0, temperatura de 29 ºC, ausência de luz e presença de oxigênio. Também
são superiores ao tempo de meia-vida de pigmentos antociânicos obtidos de uva e adicionados
em “sorbet”, uma espécie de sorvete, que foi de 234 dias no estudo de GRIS et al. (2004).
Foram ainda bastante superiores ao tempo de meia-vida de 11 dias de extratos antociânicos na
ausência de luz avaliados no estudo de PROVENZI et al. (2006).
Outros estudos realizados avaliaram estabilidade de pigmentos antociânicos levando
em consideração diferentes fatores que interferem na estabilidade dos mesmos. No estudo de
BORDIGNON-LUIZ et al. (2007) avaliou-se a estabilidade de antocianinas usando a
copigmentação. Esses autores relataram aumento do tempo de meia-vida de antocianinas
adicionadas de ácido tânico em sistema modelo, de aproximadamente 55 para 128 dias na
ausência de luz e oxigênio, com grande influência do controle de fatores como temperatura,
luz, pH e atmosfera. O aumento da estabilidade das antocianinas ao descoramento pode,
portanto, ser realizada através da copigmentação, especialmente com os flavonóis, que
exercem uma ação protetora sobre as moléculas de antocianinas (LIMA et al., 2000).
O sistema em que as antocianinas estão presentes influencia fortemente sua
estabilidade, como demonstrado no estudo de GARZÓN & WROLSTAD (2002), com taxa de
79
degradação maior na polpa em comparação com o suco de morango. O tempo de meia-vida
observado foi de 3,5 dias na polpa e 8 dias no suco. Nesses sistemas, o tempo de meia-vida
dos pigmentos foi bem menor que o observado em nosso estudo, no qual a matriz original da
parede vegetal do resíduo de uva auxilia na preservação de condições necessárias para a
estabilidade dos pigmentos.
A presença de antocianinas em sistemas com reduzida atividade de água, como no
resíduo de bagaço de uva seco e desengordurado, favorece a estabilidade desses pigmentos de
acordo com o estudo de GARZÓN & WROLSTAD (2001), que demonstraram uma relação
direta entre o aumento da atividade de água e a degradação de antocianinas. Esses autores
também afirmam que devido à complexidade das reações químicas que ocorrem em sistemas
naturais, como sucos, polpas, doces e geléias, torna-se difícil isolar um fator único que
justifique as mudanças nas antocianinas. A degradação das antocianinas pode ocorrer ainda
pela ação de enzimas endógenas presentes nos tecidos das plantas, tais como glicosidases,
polifenol oxidases e peroxidases (FRANCIS, 1989). O processo de inativação enzimática
aplicado na preparação das amostras do bagaço de uva pode ter contribuído, portanto, para a
maior conservação dos pigmentos no resíduo do bagaço.
Os valores de fenólicos totais e atividade antioxidante observados no início e no final
do experimento são apresentados na
Tabela 7
.
Tabela 7
. Estabilidade do Conteúdo de Fenólicos Totais (FT) e Atividade Antioxidante
(TEAC) de bagaços de uva (Vitis vinifera L.).
FT
1
(g GAE.100g
-1
) ABTS – TEAC
2
(µMol.g
-1
)
Variedade
0 dias 298 dias 0 dias 298 dias
Ancelota
7,32±0,31 a
5,20±0,13 b 400,67±6,18 a 364,66±9,53 b
Tannat
5,84±0,14 a
5,34±0,28 a 341,49±3,50 a 340,90±7,21 a
Regente 5,23±0,63 a 4,37±0,14 b 453,55±20,16 a 255,54±18,98 b
Pinot Noir 7,17±0,31 a 5,74±0,25 b 470,59±11,69 a 328,75±13,12 b
Valores, em peso seco, expressos como média ± desvio-padrão, n = 3.
Letras diferentes na mesma linha para valores inicial e final em cada parâmetro representam
diferença estatisticamente significativa (P<0,05).
1
Equivalente a ácido gálico.
2
Atividade antioxidante equivalente ao Trolox.
A diminuição nos teores de compostos fenólicos totais dos resíduos foi significativa
(P<0,05), acompanhada pela queda da atividade antioxidante. Para estes parâmetros não
houve diminuição significativa apenas para a variedade Tannat, evidenciando a relação entre
o teor de fenólicos totais e a atividade antioxidante, demonstrada em diversos estudos.
80
4 CONCLUSÕES
As antocianinas presentes nos bagaços apresentaram boa estabilidade, com tempos de
meia-vida que permitem o armazenamento e aproveitamento do bagaço como fonte natural de
corantes e antioxidantes.
Durante o armazenamento os teores de fenólicos totais e atividade antioxidante
apresentaram diminuição significativa para a maioria das variedades avaliadas.
A obtenção de dados ainda mais conclusivos relativos ao bagaço de uva tinta podem
ser alcançados em trabalhos posteriores com outros cultivares difundidos no setor vitivinícola
brasileiro.
AGRADECIMENTOS
Ao CNPq/Capes pelo auxílio financeiro, e a EPAGRI (Empresa Catarinense de
Pesquisa Agropecuária) pelo fornecimento das amostras.
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84
CAPÍTULO 5
PERFIL DE ÁCIDOS GRAXOS DE BAGAÇOS DE UVAS TINTAS
(VITIS VINIFERA L. e VITIS LABRUSCA L.)
Artigo submetido à publicação na Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas.
85
PERFIL DE ÁCIDOS GRAXOS DE BAGAÇOS DE UVAS TINTAS (VITIS VINIFERA
L. e VITIS LABRUSCA L.)
Ismael Ivan ROCKENBACH
1*
; Eliseu RODRIGUES
1
;
Luciano Valdemiro GONZAGA
1
;
Rosângela Pavan TORRES
2
; Jorge MANCINI-FILHO
2
; Roseane FETT
1
1
Universidade Federal de Santa Catarina,
Centro de Ciências Agrárias, Departamento de
Ciência e Tecnologia de Alimentos. Rod. Admar Gonzaga, 1346, Itacorubi, CEP: 88034-001,
Florianópolis, SC, Brasil.
2
Universidade de São Paulo, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Departamento de
Alimentos e Nutrição Experimental. Av. Prof. Lineu Prestes, 580, Bloco 14, Butantan, CEP:
05508-900, São Paulo, SP, Brasil.
* Correspondência ao autor: Tel +55 - 48 - 3721 - 5374
e-mail: [email protected]; rf[email protected]
RESUMO
O bagaço é caracterizado como subproduto da vinificação, contendo principalmente sementes
e cascas. As sementes contêm a maior parte do óleo da uva, que nelas representa 14 a 17 %,
variando conforme a variedade. Neste trabalho foi determinado o perfil de ácidos graxos do
óleo obtido a partir do bagaço de oito variedades de uva (Pinot Noir, Regente, Ancelota,
Tannat, Merlot, Bordô, Isabel e Cabernet Sauvignon) coletadas na cidade de Videira, Santa
Catarina. Os ácidos graxos encontrados com maior abundância foram o linoléico (47,63 a
60,02 %), oléico (9,48 a 16,81 %), palmítico (6,17 a 8,46 %) e o esteárico (2,89 a 4,08 %). Os
resultados obtidos demonstram que o óleo do bagaço das diferentes variedades analisadas é
similar e apresenta alto teor de ácidos graxos poliinsaturados.
Palavras-chave:
bagaço de uva, sementes, óleo, ácidos graxos.
ABSTRACT
Grape pomace is characterized as a by-product of winemaking that contains, mainly, seeds
and peels. Seeds enclose the major content of oil in the fruit, ranging between 14 and 17 %,
depending on the variety. This work determined the fatty acid profile of the oil obtained from
pomace of eight grape varieties (Pinot Noir, Regente, Ancelota, Tannat, Merlot, Bordô, Isabel
and Cabernet Sauvignon) collected in Videira, Santa Catarina. Fatty acids found in higher
concentration were linoleic (47.63 to 60.02 %), oleic (9.48 to 16.81 %), palmitic (6.17 to 8.46
86
%) and stearic (2.89 to 4.08 %). The results show that the oil obtained from the pomace of the
eight grape varieties is similar and presents high content of polyunsaturated fatty acids.
Uniterms:
grape pomace, seeds, oil, fatty acids.
1 INTRODUÇÃO
O Brasil é um país de grande atividade agrícola, com geração de expressivas
quantidades de resíduos. Atualmente existe um interesse crescente na exploração dos resíduos
gerados pela indústria do vinho (ARVANITOYANNIS, LADAS e MAVROMATIS, 2006).
Os subprodutos da vinificação são caracterizados como sendo o bagaço, que consiste
principalmente de sementes e cascas de uvas, as grainhas, o folhelho, o engaço, as borras e o
sarro (SILVA, 2006).
As sementes representam em torno de 15 % do resíduo sólido produzido e contêm de
14 a 17 % de óleo, dependendo da variedade da uva (GÖKTÜRK BAYDAR e AKKURT,
2001). O principal interesse pelo óleo de semente de uva deve-se a seu alto conteúdo de
ácidos graxos insaturados, como o ácido linoléico, (72 a 76 %, m/m), maior que em outros
óleos como girassol (60 a 62 %) e soja (50 a 55 %) (CAO e ITO, 2003).
Ácidos graxos poliinsaturados são essenciais para o corpo humano porque não podem
ser sintetizados pelo organismo. Dessa forma, o óleo de semente de uva é uma fonte valiosa
de gordura dietética. Estudos têm demonstrado que o óleo de semente de uva apresenta
diversas atividades farmacológicas, como propriedades contra a oxidação das lipoproteínas de
baixa densidade (LDLs), prevenção de trombose, doenças cardiovasculares, redução do
colesterol, dilatação dos vasos sangüíneos, e regulação do sistema nervoso autônomo (CAO e
ITO, 2003).
Desde 1930 o óleo de semente de uva vem sendo usado como óleo comestível.
Alemanha, França e Itália foram os primeiros países a beneficiarem a semente de uva,
enquanto que na América do Sul foram Argentina e Chile. Os maiores produtores mundiais de
óleo de semente de uva são Estados Unidos, Espanha e Itália (MIGUEL, 1983). O óleo de
semente de uva pode ser usado na produção de ácido linoléico conjugado. Estudos têm
demonstrado que esse ácido sintético é um efetivo agente na inibição do câncer de mama, pele
e outros em modelos experimentais, devido a sua ação sobre a atividade dos linfócitos (CAO
e ITO, 2003).
O objetivo deste trabalho foi determinar o perfil de ácidos graxos presente na fração
lipídica do bagaço de oito variedades de uvas tintas (Vitis vinifera L. e Vitis labrusca L.).
87
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Amostras
Foram utilizadas amostras de bagaço de uvas tintas (Vitis vinifera L. e Vitis labrusca
L.) de oito diferentes variedades: Pinot Noir, Regente, Ancelota, Tannat, Merlot, Bordô,
Isabel e Cabernet Sauvignon. As amostras foram coletadas no município de Videira, Santa
Catarina, sendo resultantes da safra de 2005/2006, e doadas pela EPAGRI (Empresa de
Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina). O município de Videira localiza-
se a uma latitude de 27°00', longitude de 51°09', estando a uma altitude de 779,1 m acima do
nível do mar, possui clima úmido do tipo temperado, com as estações bem definidas e
temperaturas médias que variam de 35 °C no verão a 0 °C no inverno. Com o objetivo de
preservar as propriedades gerais dos bagaços, os exemplares foram acondicionados em caixas
isotérmicas contendo gelo, sendo encaminhados imediatamente para laboratório, onde foram
armazenados à temperatura de -18,0±0,2 ºC e posteriormente analisados.
2.2 Métodos
2.2.1 Preparação das amostras e extração da fração lipídica
As amostras de bagaço de uva foram submetidas a tratamento térmico em estufa de ar
circulante a 80 ºC, por 10 min, para inativação enzimática (TROIANI, TROPIANI e
CLEMENTE, 2003). Posteriormente, foram secas em estufa de ar circulante, a 50 ºC, por 24
horas. Após resfriamento em dessecador, as amostras foram trituradas em moinho IKA, A11
Basic e tamisadas (Tamis 60 Mesh). A fração lipídica foi obtida através do método de
FOLCH, LEES e SLOANNE STANLEY (1957).
2.2.2 Esterificação, identificação e quantificação por cromatografia gasosa
A fração lipídica foi submetida à esterificação dos ácidos graxos de acordo com o
método descrito por HARTMAN e LAGO (1973). Foi utilizado um cromatógrafo a gás GC
17 A Shimadzu/Class GC 10 com coluna cromatográfica de sílica fundida SP-2560
(biscianopropil polisiloxana) de 100 m e 0.25 mm. de d.i. Condições de análise usadas foram:
programação de temperatura da coluna isotérmico a 140 °C por 5 min e então aquecimento a
4 °C/min até 240 °C, permanecendo nesta temperatura por 20 min; temperatura do
vaporizador de 250 °C; temperatura de detector de 260 °C; razão de divisão da amostra no
injetor = 1/50. Utilizou-se hélio como gás de arraste (1 mL/min). A identificação dos ácidos
graxos foi realizada utilizando padrões de ésteres metílicos de ácidos graxos. A quantificação
88
foi feita por normalização de área, expressando-se o resultado em percentual de cada ácido
sobre o total de ácidos graxos.
2.3 Análise Estatística
Todas as análises foram realizadas em triplicata e os resultados apresentados como
média ± desvio padrão. Realizou-se análise de variância (ANOVA) e o teste de Tukey para
identificar diferenças significativas entre as médias através do software Statistica
®
6.0. O
nível de significância considerado para a diferença entre as médias foi de 5 % (P<0,05).
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O perfil de ácidos graxos dos bagaços de uva é apresentado na Tabela 8. Os ácidos
graxos encontrados em maior abundância foram o linoléico, oléico, palmítico e esteárico. A
composição em ácidos graxos do bagaço de uva é similar a de óleos como açafroa, girassol,
soja, milho e semente de algodão. Os dados obtidos são inferiores aos encontrados por
GÖKTÜRK BAYDAR, ÖZKAN e ÇETIN (2007) que avaliaram bagaços de outras
variedades de uva.
Tabela 8. Perfil de Ácidos Graxos (%) da fração lipídica de amostras de bagaço de uva (Vitis
vinifera L. e Vitis labrusca L.).
Ácidos Graxos Ancelota Tannat Regente Pinot Noir
C14:0 (Mirístico) 0,11 ± (0,02)
a
0,15 ± (0,00)
b
0,14 ± (0,00)
b
0,18 ± (0,01)
c
C16:0 (Palmítico) 6,17 ± (1,10)
a
6,62 ± (0,07)
a,b
6,91 ± (0,09)
a,b,c
7,04 ± (0,75)
a,b,c
C16:1 (Palmitoléico) 0,17 ± (0,03)
a
0,21 ± (0,00)
b
0,22 ± (0,00)
b,c
0,34 ± (0,04)
e
C18:0 (Esteárico) 3,43 ± (0,61)
a,b
4,08 ± (0,03)
b
3,51 ± (0,05)
a,b
3,05 ± (0,32)
a
C18:1 (Elaídico) 0,71 ± (0,12)
a,b,c
0,72 ± (0,01)
a,b,c
0,73 ± (0,01)
a,b,c
0,85 ± (0,09)
c,d
C18:1 (Oléico) 9,48 ± (1,70)
a
12,53 ± (0,14)
b
11,84 ± (0,16)
b
13,33 ± (1,40)
b
C18:2 (Linoléico) 57,65 ± (10,27)
a,b
59,35 ± (0,66)
a,b
51,47 ± (0,86)
a,b
58,09 ± (5,90)
a,b
C20:0 (Araquídico) 0,35 ± (0,06)
a
0,37 ± (0,04)
a
0,51 ± (0,01)
c
0,40 ± (0,04)
a,b
C20:1 (Gondóico) 0,16 ± (0,03)
a
0,20 ± (0,02)
a
0,19 ± (0,03)
a
0,20 ± (0,05)
a
C18:3 (α – Linolênico) 1,13 ± (0,20)
a,b
0,99 ± (0,00)
a
1,26 ± (0,04)
b,c
0,94 ± (0,08)
a
C22:0 (Beênico) 0,28 ± (0,05)
a
0,27 ± (0,01)
a
0,60 ± (0,01)
d
0,43 ± (0,03)
b,c
C24:0 (Lignocérico) 0,26 ± (0,05)
a,b
0,20 ± (0,06)
a
0,62 ± (0,06)
e
0,35 ± (0,07)
b,c
C24:1 (Nervônico) 0,22 ± (0,04)
b
0,11 ± (0,00)
a
0,31 ± (0,01)
c
0,22 ± (0,01)
b
Totais: Saturados 10,60 11,69 12,29 11,45
Monoinsaturados 10,74 13,77 13,29 14,94
Poliinsaturados 58,78 60,34 52,73 59,03
Insaturados 69,52 74,11 66,02 73,97
89
Médias de amostras analisadas em triplicata com desvio-padrão entre parêntesis. Médias com
letras diferentes na mesma linha significam diferenças estatisticamente significativas
(P<0,05). nd = não detectado.
Continuação. Tabela 8. Perfil de Ácidos Graxos (%) da fração lipídica de amostras de bagaço
de uva (Vitis vinifera L. e Vitis labrusca L.).
Ácidos Graxos Bordô Merlot Isabel
Cabernet
Sauvignon
C14:0 (Mirístico) 0,19 ± (0,00)
c
nd
0,19 ± (0,01)
c
0,41 ± (0,01)
d
C16:0 (Palmítico) 8,24 ± (0,11)
c,d
6,75 ± (0,14)
a,b
7,86 ± (0,07)
b,c,d
8,46 ± (0,01)
d
C16:1 (Palmitoléico) 0,30 ± (0,01)
d,e
nd
0,26 ± (0,01)
c,d
0,57 ± (0,01)
f
C18:0 (Esteárico) 3,34 ± (0,05)
a
3,39 ± (0,07)
a,b
2,89 ± (0,02)
a
3,43 ± (0,01)
a,b
C18:1 (Elaídico) 0,91 ± (0,01)
d
0,69 ± (0,01)
a,b
0,82 ± (0,01)
b,c,d
0,64 ± (0,01)
a
C18:1 (Oléico) 16,81 ± (0,17)
c
11,36 ± (0,23)
a,b
13,07 ± (0,08)
b
11,68 ± (0,04)
a,b
C18:2 (Linoléico) 57,23 ± (0,66)
a,b
60,02 ± (1,18)
b
49,77 ± (0,25)
a,b
47,63 ± (0,18)
a
C20:0 (Araquídico) 0,49 ± (0,01)
c
0,61 ± (0,01)
d
0,46 ± (0,01)
b,c
0,39 ± (0,00)
a,b
C20:1 (Gondóico) 0,21 ± (0,01)
a
0,17 ± (0,01)
a
0,15 ± (0,01)
a
nd
C18:3 (α – Linolênico) 1,66 ± (0,02)
d
1,42 ± (0,03)
c
1,76 ± (0,01)
d
1,67 ± (0,06)
d
C22:0 (Beênico) 0,37 ± (0,01)
b
0,49 ± (0,03)
c
0,45 ± (0,01)
c
0,47 ± (0,01)
c
C24:0 (Lignocérico) 0,24 ± (0,01)
a,b
0,42 ± (0,02)
c,d
0,28 ± (0,01)
a,b
0,52 ± (0,02)
d,e
C24:1 (Nervônico) nd 0,22 ± (0,02)
b
nd 0,32 ± (0,01)
c
Totais: Saturados 12,87 11,66 12,13 13,68
Monoinsaturados 18,23 12,44 14,30 13,21
Poliinsaturados 58,89 61,44 51,53 49,30
Insaturados 77,12 73,88 65,83 62,51
Médias de amostras analisadas em triplicata com desvio-padrão entre parêntesis. Médias com
letras diferentes na mesma linha significam diferenças estatisticamente significativas
(P<0,05). nd = não detectado.
Os resultados indicaram alto teor do ácido linoléico (47,63 a 60,02 %), sem diferença
significativa entre as variedades analisadas (P<0,05), exceto entre as variedades Merlot e
Cabernet Sauvignon. CAO e ITO (2003) encontraram valores de ácido linoléico no óleo de
semente de uva entre 48 e 57,2 %. GÖKTÜRK BAYDAR e AKKURT (2001) estudando 18
diferentes variedades de uva encontraram teores de ácido linoléico no óleo da semente entre
60,1 e 70,1 %. OHNISHI et al. (1990) obtiveram 69,2 a 80,5 % de ácido linoléico em
sementes de cinco diferentes variedades de uva, apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos bagaços de uva avaliados em nosso trabalho. O ácido oléico mostrou-se em
segundo lugar em termos quantitativos nos óleos derivados do bagaço, com valor médio de
90
12,51 %. Este ácido graxo também apresenta importância em termos nutricionais e na
estabilidade oxidativa de óleos (APARÍCIO et al., 1999).
O grau médio de insaturação foi de 70,37 %, atingindo valor máximo de 77,12 % para
a variedade Bordô. O grau de insaturação é relativamente alto, porém, inferior aos 86,42 %
encontrados por GÖKTÜRK BAYDAR, ÖZKAN e ÇETIN (2007) avaliando bagaços
derivados de quatro outras variedades de uva. GÖKTÜRK BAYDAR e AKKURT (2001)
também encontraram valores superiores (89,3 %) avaliando apenas as sementes de diferentes
variedades de uva. Os altos níveis de insaturação apresentam grande relevância, visto que
exibem um importante papel na redução do colesterol sanguíneo e também no tratamento da
aterosclerose (AXTELL, 1981).
4 CONCLUSÃO
As oito variedades de uva apresentam perfil de ácidos graxos similar. O óleo extraído
dos bagaços de uvas tintas caracteriza-se por conter alto teor de ácidos graxos poliinsaturados,
predominando o ácido linoléico.
AGRADECIMENTOS
À CAPES e à EPAGRI.
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92
CAPÍTULO 6
COMPOSTOS FENÓLICOS E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE
BAGAÇOS DA VINIFICAÇÃO DE UVAS TINTAS (VITIS VINIFERA L.
E VITIS LABRUSCA L.)
Artigo submetido à publicação no periódico internacional International Journal of Food
Science and Technology.
93
COMPOSTOS FENÓLICOS E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE BAGAÇOS DA
VINIFICAÇÃO DE UVAS TINTAS (VITIS VINIFERA L. E VITIS LABRUSCA L.)
Ismael I. Rockenbach
1*
; Eliseu Rodrigues
1
; Luciano V. Gonzaga
1
; Vinícius Caliari
2
;
Alessandro Lima
3
; Jorge Mancini Filho
3
; Roseane Fett
1
1
Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos, Centro de Ciências Agrárias,
Universidade Federal de Santa Catarina - UFSC, Florianópolis, SC, Brasil.
2
Laboratório de Controle de Qualidade de Bebidas e Vinagres, Estação Experimental de
Videira, Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina S.A. –
EPAGRI, Videira, SC, Brasil.
3
Departamento de Alimentos e Nutrição Experimental, Faculdade de Ciências Farmacêuticas,
Universidade de São Paulo – USP, São Paulo, SP, Brasil.
*Correspondente: Fone: +55 - 48 - 3721 – 5374.
e-mail: [email protected]
RESUMO
O bagaço de uva é caracterizado por altos teores de compostos fenólicos devido à extração
insuficiente durante a produção de vinho, o que lhe confere propriedades antioxidantes. O
objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antioxidante e os principais ácidos fenólicos de
bagaços das seguintes variedades de uvas produzidas em Santa Catarina: Cabernet Sauvignon
e Merlot (Vitis vinifera L.) e Bordô e Isabel (Vitis labrusca L.). Aplicaram-se os métodos
ABTS, DPPH, FRAP e
β
-caroteno/ácido linoléico para avaliar atividade antioxidante e
cromatografia gasosa para identificar os ácidos fenólicos. O bagaço da variedade Cabernet
Sauvignon apresentou maior atividade antioxidante, exceto no método
β
-caroteno/ácido
linoléico, onde a variedade Bordô mostrou-se superior. Neste método foi observado
sinergismo aplicando-se conjuntamente antioxidantes extraídos do bagaço e o sintético BHT.
A variedade Bordô apresentou ainda maior concentração de antocianinas monoméricas totais.
Foram observados teores expressivos de ácido protocatecuico nas frações de ácidos fenólicos
livres e de ácido gálico nas frações de ácidos fenólicos esterificados dos bagaços de uva.
Observou-se correlação significativa entre o teor de fenólicos totais e atividade antioxidante, e
entre atividade antioxidante e teor de ácidos fenólicos. Assim, os bagaços das variedades
Cabernet Sauvignon e Bordô apresentam grande potencial como fonte de compostos
antioxidantes e de corantes naturais, respectivamente.
94
Palavras-Chave:
Bagaço de uva, compostos fenólicos, atividade antioxidante, ácidos
fenólicos, sinergismo.
ABSTRACT
Grape pomace is characterized by its high contents of phenolic compounds due to an
insufficient extraction in wine production, giving to pomace antioxidant properties. The aim
of the present work was to evaluate antioxidant activity and determine the main phenolic
acids in pomace from the following grape varieties: Cabernet Sauvignon and Merlot (Vitis
vinifera L.) and Bordô and Isabel (Vitis labrusca L.), all produced in Santa Catarina state. The
ABTS, DPPH, FRAP and
β
-carotene/linoleic acid methods were applied in order to evaluate
antioxidant activity and gas chromatography to identify phenolic acids. Cabernet Sauvignon
pomace presented the highest antioxidant activity with the exception for
β
-carotene/linoleic
acid, where Bordô variety presented higher. In this method a synergism was observed when
BHT was applied concomitantly with antioxidants extracted from pomace. Bordô variety
presented the highest content of total monomeric anthocyanins. Expressive contents of
protocatechuic acid were observed in free phenolic acids fraction and of gallic acid in
esterified phenolic acids fraction. A significant correlation was observed between total
phenolics content and antioxidant activity and between antioxidant activity and phenolic acids
content. So, pomace from Cabernet Sauvignon and Bordô varieties present high potential as a
source of antioxidant compounds and natural colorants, respectively.
Keywords.
Grape pomace, phenolic compounds, antioxidant activity, phenolic acids,
synergism.
1 INTRODUÇÃO
A associação entre uma dieta rica em frutas e vegetais e a diminuição do risco de
doenças cardiovasculares e certas formas de câncer é demonstrada por consideráveis
evidências epidemiológicas o que, por hipótese, é devido ao conteúdo de antioxidantes
(Goodwin & Brodwick, 1995; Hollman & Katan, 1999; German & Walzem, 2000; Yang et
al., 2001; Kaur & Kapoor, 2001; García-Alonso et al., 2004). A ação dos compostos
antioxidantes está relacionada à atenuação de eventos oxidativos que podem contribuir para a
patofisiologia dessas doenças (Halliwell et al., 1995; Pietta, 2000). Dentre os compostos
antioxidantes destacam-se os flavonóides e os ácidos fenólicos nas formas livres ou
complexadas. Estes compostos foram identificados e quantificados nas mais diferentes frutas
95
e vegetais, apresentando alta correlação com a atividade antioxidante demonstrada pelas
mesmas (King & Young, 1999; Hollman & Arts, 2000; Soares, 2002; Einbond et al., 2004).
Uvas e vinhos contêm grandes quantidades de compostos fenólicos, principalmente
altas concentrações de flavonóides. A maioria dos compostos fenólicos encontrados no vinho
pode atuar como antioxidantes (Yildirim et al., 2005). Da mesma forma, os resíduos da
produção de vinho também são caracterizados por altos teores de compostos fenólicos devido
à extração insuficiente durante a vinificação. Segundo Shrikhande (2000) os extratos de
cascas de uva, consistindo de antocianinas das cascas e procianidinas das sementes, são fontes
importantes de polifenóis. Sementes e cascas são normalmente descartadas nas operações de
suco e vinho branco antes do processamento. Esses resíduos não fermentados tornam-se então
valiosos para a extração de polifenóis. Os subprodutos obtidos após exploração da
vinificação, tanto as sementes como o bagaço, constituem uma fonte muito barata para a
extração de flavonóides antioxidantes, podendo ser utilizados como suplementos alimentares,
ou na produção de fitoquímicos, proporcionando vantajosa importância econômica (Alonso et
al., 2002; Negro et al., 2003; González-Paramas et al., 2004).
Antioxidantes fenólicos sintéticos tais como BHT (butil hidroxitolueno), BHA (butil
hidroxianisol) e TBHQ (terc-butil-hidroxiquinona) inibem efetivamente a oxidação lipídica.
No entanto, a preocupação dos consumidores em relação a estes aditivos sintéticos tem
motivado a investigação acerca dos benefícios dos antioxidantes naturais como substituintes
aos sintéticos (Formanek et al., 2001). Extratos de sementes de uva (0,02 %) foram mais
efetivos que alguns antioxidantes naturais como extrato de orégano e oleoresina de alecrim no
retardamento do processo de oxidação lipídica em carne cozida refrigerada (Rojas & Brewer,
2007). No entanto, a grande maioria dos trabalhos da literatura avaliou o potencial
antioxidante e os compostos fenólicos das partes constituintes do bagaço separadamente,
como sementes, cascas e engaço. A proposta deste trabalho foi determinar a atividade
antioxidante in vitro e alguns dos compostos fenólicos presentes em bagaços de uvas tintas
(Vitis vinifera L. e Vitis labrusca L.), incluindo cascas, sementes e engaço, visando avaliar o
potencial deste subproduto como fonte de antioxidantes e corantes naturais para aplicação em
alimentos.
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Reagentes
2,2´-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico) (ABTS), 2,2-difenil-1-
picrilhidrazil (DPPH),
β
-caroteno, ácido linoléico, BHT (2,6-di-tert-butil-4-metil fenol),
96
Trolox (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-ácido carboxílico), ácido gálico, cinâmico, t-
cinâmico, o-cumárico, protocatecuico, ferúlico, caféico, quínico, p-cumárico, propilgalato,
sinápico, elágico, gentísico foram adquiridos da Sigma-Aldrich Chemie (Steinheim,
Alemanha). Reagente Folin-Ciocalteu, 2,4,6-Tri(2-piridil)-s-triazina (TPTZ) e Tween 40
foram adquiridos da Fluka Chemie AG (Buchs, Suíça). Metanol, hexano, clorofórmio, cloreto
férrico, carbonato de sódio, éter etílico, acetona, acetato de etila, tetrahidrofurano, ácido
clorídrico, hidróxido de sódio e persulfato de potássio foram adquiridos da Vetec (São Paulo,
Brasil).
2.2 Amostras
Foram utilizadas amostras de bagaços de uvas tintas das variedades: Cabernet
Sauvignon e Merlot (Vitis vinifera L.) e Bordô e Isabel (Vitis labrusca L.). As amostras foram
coletadas na região vinífera de Videira, Santa Catarina, Brasil, sendo resultantes da safra de
2006/2007, e doadas pela EPAGRI (Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de
Santa Catarina). O município de Videira localiza-se a uma latitude de 27°00', longitude de
51°09', estando a uma altitude de 779,1 m acima do nível do mar. Possui clima úmido do tipo
temperado, com as estações bem definidas e temperaturas médias que variam de 35 °C no
verão a 0 °C no inverno. No transporte até o laboratório, as propriedades gerais dos bagaços
foram mantidas pelo acondicionamento dos exemplares em caixas isotérmicas contendo gelo,
onde foram armazenados à temperatura de -18,0 ± 0,2 ºC por 14 dias até serem analisados.
2.3 Preparo dos extratos
Para obtenção dos extratos, as amostras dos bagaços de uva foram submetidas a
tratamento térmico de 80 °C, num período de 10 min, para inativação enzimática (Valderrama
et al., 2001; Troiani et al., 2003). Posteriormente, foram secas em estufa de ar circulante à
temperatura de 50 °C até peso constante. Após resfriamento em dessecador, as amostras
foram trituradas em moinho analítico (IKA modelo A11), peneiradas (Tamis 60 mesh) e
desengorduradas em extrator Soxhlet, utilizando hexano durante 6 horas. Os extratos foram
preparados com 1,00 g de material seco e desengordurado e 50 mL de metanol acidificado
(HCl 0,1%) em banho de ultra-som (USC-1400 Unique) pelo tempo de 30 min, à temperatura
ambiente (± 25 °C). Os extratos foram filtrados com papel filtro Whatman nº 1. Para a
determinação do rendimento dos extratos utilizou-se a metodologia oficial da AOAC, número
967.03.
97
2.4 Determinação de compostos fenólicos totais
O conteúdo total de fenólicos em cada extrato foi determinado
espectrofotometricamente (espectrofotômetro modelo Hewlett-Packard 8452 A) de acordo
com o método de Folin-Ciocalteu (Singleton & Rossi, 1965), com a leitura da absorbância em
765 nm. Os resultados, em peso seco de bagaço, foram expressos em mg.g
-1
equivalente a
ácido gálico (GAE).
2.5 Determinação do conteúdo total de antocianinas
A análise do conteúdo total de antocianinas foi realizada seguindo o método de
diferença de pH (Giusti & Wrolstad, 2001). A absorbância foi medida no comprimento de
onda de máxima absorção e em 700 nm, sendo o branco feito com água deionizada. Os
resultados, em peso seco de bagaço, foram expressos como concentração de pigmentos
monoméricos em mg.g
-1
equivalente a malvidina-3-glicosídeo (
ε
= 29500, PM = 562,5).
2.6 Atividade antioxidante - Método ABTS
O método ABTS (2,2´azino-bis-3-etilbenzotiazolin 6-ácido sulfônico) foi realizado
conforme descrito por Re et al. (1999). A absorbância foi medida a 734 nm no tempo de 7
min após a adição do extrato. A atividade antioxidante total do bagaço, em peso seco, foi
calculada em µMol.g
-1
de TEAC (atividade antioxidante equivalente ao Trolox) (Rice-Evans
et al., 1996).
2.7 Atividade antioxidante - Método DPPH
O método DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil) foi aplicado com modificações descritas
por Kim et al. (2002). Avaliou-se a redução da absorbância do radical DPPH
•
100 µM (2,9
mL) dissolvido em metanol a 80% no comprimento de onda de 515 nm após 30 min da adição
de cada extrato. A atividade antioxidante total do bagaço, em peso seco, foi calculada em
µMol.g
-1
de TEAC (atividade antioxidante equivalente ao Trolox).
2.8 Poder Redutor - Método FRAP
Descrito por Benzie & Strain (1996), com modificações de Arnous et al. (2002), o
método é baseado na medida direta da habilidade dos antioxidantes (redutores) da amostra em
reduzirem em meio ácido (pH 3,6) o complexo Fe
3+
/tripiridiltriazina (TPTZ) para formar Fe
2+
,
de intensa cor azul. A absorbância foi medida em comprimento de onda de 620 nm. O valor
98
do poder redutor, em peso seco de bagaço, foi expresso em µMol.g
-1
de TEAC (atividade
antioxidante equivalente ao Trolox).
2.9 Poder de inibição da oxidação - Método de co-oxidação do β-caroteno/ácido linoléico
O poder de inibição da oxidação foi avaliado pelo método de descoramento do sistema
β
-caroteno/ácido linoléico descrito por Marco (1968) e modificado por Miller (1971). Uma
alíquota de 20 µL da solução de
β
-caroteno (20 mg.mL
-1
em clorofórmio) foi colocada em um
frasco erlenmeyer de 250 mL com 40 µL de ácido linoléico, 1 mL de clorofórmio e 20 mg de
Tween 40. Após homogeneização o clorofórmio foi completamente evaporado com
nitrogênio. Adicionou-se água deionizada (previamente submetida a tratamento com
atmosfera de oxigênio durante 30 min) até a formação de uma emulsão límpida e com
absorbância entre 0,6 e 0,7 a 470 nm. Alíquotas de 100 µL dos extratos e do antioxidante
sintético BHT (butil hidroxitolueno) na concentração de 100 mg.L
-1
foram adicionadas a 5
mL da emulsão em cubetas de vidro (10 mm de caminho óptico). Após a leitura inicial, a
absorbância foi monitorada a cada 15 min, durante 2 horas, sendo as cubetas mantidas em
banho-maria a 50 ºC. A redução da absorbância foi comparada ao controle (sem
antioxidante). Além disso, o efeito sinérgico foi avaliado a partir de 100 µL de misturas a 100
mg.L
-1
dos extratos com a solução de BHT na razão 1:1. A atividade antioxidante foi
calculada em termos de percentual de inibição, relativo ao controle, de acordo com a seguinte
equação:
% inibição =
−
−
− 100100 x
CC
AA
fi
fi
controlesoluçãodafinalaabsorbânciC
controlesoluçãodainicialaabsorbânciC
extratodesoluçãodafinalaabsorbânciA
extratodesoluçãodainicialaabsorbânciA
f
i
f
i
=
=
=
=
2.10 Extração dos ácidos fenólicos
Para a extração dos ácidos fenólicos seguiu-se metodologia descrita por Krygier et al.
(1982), com algumas modificações, obtendo-se de forma seqüencial as frações de ácidos
fenólicos livres (AFL), ácidos fenólicos esterificados (AFES) e ácidos fenólicos insolúveis
(AFI), conforme descrito a seguir:
99
Ácidos fenólicos livres (AFL)
Pesou-se 1 g da amostra seca e desengordurada e extraiu-se com solvente tetrahidrofurano
(THF) (6 x 20 mL). Cada extrato foi centrifugado a 3000 x g e o sobrenadante filtrado com papel
filtro Whatman nº 1 sob sulfato de sódio anidro. O solvente foi evaporado em rota-evaporador e a
fração AFL ressuspensa em 5 mL de metanol.
Ácidos fenólicos esterificados (AFES)
A amostra, após extração com THF na etapa anterior, foi extraída (6 x 20 mL) com
metanol/acetona/água (7:7:6). Após centrifugação de cada extrato a 3000 x g, o sobrenadante era
filtrado e desidratado com sulfato de sódio anidro, e evaporado em rota-evaporador até a fase
aquosa. Com o objetivo de liberar estéreis solúveis esterificados com proteínas ou polipeptídios
adicionou-se à fase aquosa o mesmo volume de NaOH (4 M) para propiciar a hidrólise destas
interações. A hidrólise foi conduzida durante 4 h, sob agitação, à temperatura ambiente (±25 °C) e
protegida da luz. Após ajuste do pH para 2 (± 0,1) com HCl (6 M), procedeu-se lavagem (5 x)
com volume igual de hexano para eliminação de ácidos graxos livres e/ou outros contaminantes
(glicosídeos). Realizou-se nova extração (6 x) com igual volume da mistura éter etílico/acetato de
etila/THF (1:1:1). A fase da mistura éter etílico/acetato de etila/THF (1:1:1), filtrada e desidratada
com sulfato de sódio anidro, foi evaporada em rota-evaporador e a fração AFES ressuspensa em 5
mL de metanol.
Ácidos fenólicos insolúveis (AFI)
A amostra, após extração com metanol/acetona/água (7:7:6) na etapa anterior, foi
hidrolisada com 15 mL de NaOH (4 M) durante 4h, à temperatura ambiente (±25 °C) e
protegida da luz. O ajuste do pH e as etapas seguintes para obtenção da fração AFI foram
iguais as da fração AFES descritas anteriormente.
2.11 Derivatização dos ácidos fenólicos
Alíquotas de 0,5 mL das frações de ácidos fenólicos obtidas foram transferidas para
vials contendo 0,1 mL de padrão interno (éster metila de ácido heptadecanóico) e o metanol
foi evaporado com nitrogênio gasoso. Realizou-se então o processo de derivatização pela
adição de BSA (N,O-bis(trimetilsilil)acetamida) (0,2 mL). Este processo de derivatização fez-
se necessário a fim de esterificar os ácidos fenólicos para uma melhor separação por
cromatografia gasosa. Para a completa derivatização, a solução foi incubada a 60 ºC por 30
min, obtendo-se as amostras prontas para serem injetadas no cromatógrafo.
100
0
5
10
15
20
25
30
C. Sauv
i
gnon
Me
r
lot
Bo
r
dô
Is
a
b
e
l
Rendimento da extração
(g.100 g-1)
2.12 Identificação e quantificação dos ácidos fenólicos
A identificação dos ácidos fenólicos foi realizada em cromatógrafo a gás marca
Shimadzu, modelo 17 A, equipado com detector de ionização de chama e coluna capilar DB-5
(J&W) de 30 m de comprimento por 0,25 mm de diâmetro interno. Foi utilizada mistura de
padrões de ácidos fenólicos para identificar os ácidos fenólicos nas diferentes frações, pelos
respectivos tempos de retenção. O hélio foi utilizado como gás de arraste a uma razão de
fluxo de 3 mL.min
-1
. As condições cromatográficas seguiram os procedimentos descritos por
Moreira & Mancini Filho (2003): temperatura inicial da coluna a 150 ºC, isotérmica por três
minutos; de 150 ºC para 300 ºC, aumentando 5 ºC.min
-1
; isotérmica a 300 ºC por três min. A
temperatura da câmara de injeção foi de 250 ºC e a do detector foi de 300 ºC.
2.13 Análise Estatística
A análise dos dados foi realizada pela aplicação da ANOVA e o teste Tukey visando
identificar diferenças significativas entre as médias, usando o software Statistica
®
versão 6.0.
O nível de significância considerado para a diferença entre as médias foi de 5 % (P<0,05).
Foram analisadas três amostras de bagaço (n = 3) de cada variedade de uva, sendo todas as
análises executadas em triplicata.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Rendimento e compostos fenólicos totais
O rendimento obtido nas extrações dos bagaços de uva é apresentado na
Figura 9
, e
como pode ser observado, o extrato da variedade Cabernet Sauvignon apresentou maior
conteúdo de sólidos solúveis (P<0,05). Não houve diferença significativa (P<0,05) entre o
conteúdo extraído nos extratos das variedades Merlot e Bordô.
Figura 9.
Rendimento de extratos de bagaço de uva (média e intervalo de confiança, P<0,05).
101
O conteúdo total de compostos fenólicos nos extratos apresentou diferença
significativa (P<0,05) entre as variedades avaliadas (
Tabela 9)
, o que é esperado, visto que a
concentração de fenólicos nas uvas depende do tipo de vinificação e de diversos fatores
genéticos, ambientais e culturais (Doshi et al., 2006). O extrato da variedade Cabernet
Sauvignon apresentou maior conteúdo de fenólicos totais, sendo mais de duas vezes superior
ao conteúdo observado no extrato da variedade Isabel. A variedade Cabernet Sauvignon
também apresentou teor maior de compostos fenólicos totais que as variedades Pinot Noir
(73,66 mg.g
-1
) e Regente (49,73 mg.g
-1
), produzidas também na região de Videira, Santa
Catarina, e avaliadas por nós em estudo anterior (Rockenbach et al., 2007).
Tabela 9. Conteúdo de Fenólicos Totais (FT), Antocianinas Monoméricas Totais (AMT), Atividade
Antioxidante (ABTS e DPPH) e Poder Redutor (FRAP) de extratos de bagaços de uvas tintas (Vitis
vinifera L. e Vitis labrusca L.).
Variedade
FT
1
(mg.g
-1
)
AMT
2
(mg.g
-1
)
ABTS
3
(
µ
Mol.g
-1
)
DPPH
3
(
µ
Mol.g
-1
)
FRAP
3
(
µ
Mol.g
-1
)
Cabernet
Sauvignon
74,75 ± 2,22 a 3,51 ± 0,16 b 485,42 ± 3,72 a 505,52 ± 4,62 a 249,46 ± 1,92 a
Merlot 46,23 ± 1,63 c 1,97 ± 0,07 c 318,16 ± 1,90 c 328,39 ± 3,15 c 169,19 ± 0,62 c
Bordô 63,31 ± 2,40 b 5,61 ± 0,25 a 355,06 ± 2,35 b 361,12 ± 2,89 b 208,43 ± 2,20 b
Isabel 32,62 ± 0,68 d 0,92 ± 0,03 d 193,36 ± 2,14 d 188,02 ± 2,50 d 117,79 ± 1,33 d
Valores em base seca de bagaço de uva expressos como média ± desvio-padrão, n = 3.
Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença significativa (P<0,05).
1
Expresso em mg GAE.g
-1
(equivalente a ácido gálico).
2
Expresso em equivalente a malvidina-3-glicosídeo.
3
Expresso em µMol.g
-1
de TEAC (Atividade antioxidante equivalente ao Trolox).
Sánchez-Alonso et al. (2008), avaliando o conteúdo de polifenóis totais extraído da
fibra dietética obtida a partir de bagaço de uva da variedade Airén, produzida na Espanha,
encontraram 78,5 mg.g
-1
. Esse teor é superior aos teores observados em nosso estudo, com
pequena diferença no caso da variedade Cabernet Sauvignon. Na Turquia, Bozan et al. (2008)
encontraram 103,7 e 105,7 mg.g
-1
de compostos fenólicos totais em sementes de uvas das
variedades Cabernet Sauvignon e Merlot, respectivamente. Em outro estudo recente de Yemis
et al. (2008) com sementes de uvas cultivadas também na Turquia, foram obtidos valores
médios de fenólicos totais, em peso seco, de 49,31 mg.g
-1
para cinco diferentes variedades de
uvas brancas, e de 50,41 mg.g
-1
para sete diferentes variedades de uvas tintas. Estes teores em
sementes de uvas são superiores aos teores de fenólicos totais nos bagaços das variedades
Merlot e Isabel, mas não superam o conteúdo fenólico observado nos bagaços das variedades
Cabernet Sauvignon e Bordô. Portanto, o conjunto das partes que formam o bagaço da
vinificação de uvas pode ser considerado, assim como as sementes, uma fonte importante de
102
polifenóis e, dependendo da finalidade de sua utilização, podem ser dispensadas etapas
preliminares de separação das partes constituintes do bagaço.
3.2 Antocianinas Monoméricas Totais
Na
Tabela 9
também são apresentados os conteúdos de antocianinas monoméricas
totais dos extratos avaliados. Foram observadas diferenças significativas entre os extratos
(P<0,05) e, diferentemente do conteúdo de fenólicos totais, o bagaço da variedade Bordô
apresentou maior teor de antocianinas, sendo cinco vezes superior ao da variedade Isabel. O
bagaço da variedade Bordô também apresentou maior teor de antocianinas na comparação
com uvas da variedade Sharad Seedless cultivadas na Índia, que apresentaram 3,9 mg.g
-1
de
antocianinas monoméricas totais, em peso de baga fresca, no fim do estágio de maturação e
desenvolvimento completo dos pigmentos (Doshi et al., 2006). Em outro estudo que avaliou
bagaços de uvas de diferentes variedades produzidas na Itália (Ruberto et al., 2007), foram
extraídos conteúdos de 3,75 a 45,27 mg.g
-1
de antocianinas totais. Considerando-se que o
bagaço de uva pode ser utilizado como uma fonte para a extração de corantes naturais, o
bagaço da variedade Bordô apresenta maior potencial para esta finalidade entre as variedades
avaliadas em nosso estudo.
Os coeficientes de correlação entre o teor de antocianinas monoméricas totais e a
atividade antioxidante dos bagaços pelos métodos ABTS, DPPH e FRAP (R = 0,6002, 0,5869
e 0,7283, respectivamente) são menores que os coeficientes obtidos entre o teor de fenólicos
totais e a atividade antioxidante (apresentados mais adiante). Isto ocorre porque as
antocianinas representam apenas um dos grupos de compostos que formam o conjunto de
fenólicos totais dos bagaços de uva. Já o coeficiente de correlação entre o conteúdo total de
antocianinas e o poder dos extratos de inibir a oxidação no sistema
β
-caroteno/ácido linoléico
(R = 0,8867) foi maior que o coeficiente de correlação entre o poder de inibição e o conteúdo
de fenólicos totais dos extratos (R = 0,7868).
3.3 Atividade antioxidante e Poder redutor
A determinação da atividade antioxidante dos extratos foi realizada pelos métodos
ABTS e DPPH e o poder redutor pelo método FRAP (
Tabela 9
). A partir dos dados obtidos
observa-se forte relação positiva entre o teor de fenólicos totais e a atividade antioxidante
medida; e entre o teor de fenólicos e o poder redutor. Os coeficientes de correlação (
Figura
10
) foram significativos (P<0,05), sendo a maior correlação obtida entre o conteúdo de
fenólicos totais e o poder redutor (R = 0,9952).
103
Figura 10. Correlação entre o conteúdo total de fenólicos e atividade antioxidante pelo método ABTS
e pelo método DPPH e entre o conteúdo total de fenólicos e o poder redutor pelo método FRAP.
A variedade Cabernet Sauvignon apresentou maior atividade antioxidante (485,42 e
505,52
µ
Mol TEAC.g
-1
pelos métodos ABTS e DPPH, respectivamente) e maior poder
redutor (249,46
µ
Mol TEAC.g
-1
pelo método FRAP) em relação às demais variedades
avaliadas. Houve diferença significativa (P<0,05) entre as diferentes variedades. Em nosso
estudo anterior com bagaços de uvas tintas das variedades Regente e Pinot Noir (Rockenbach
et al., 2007), foram obtidos, respectivamente, valores médios de 419 e 477
µ
Mol TEAC.g
-1
pelo método ABTS e 479 e 480
µ
Mol TEAC.g
-1
pelo método DPPH. Em outro estudo recente
de Pérez-Jiménez et al. (2008), bagaços de uvas tintas produzidas na região de Manzanares,
na Espanha, apresentaram atividade antioxidante menor, de 124,4
µ
Mol TEAC.g
-1
pelo
método ABTS, em relação aos dados obtidos em nosso estudo; e poder redutor maior, de
273,9
µ
Mol TEAC.g
-1
pelo método FRAP, o qual é atribuído aos potenciais redox dos
compostos fenólicos individuais e suas propriedades estruturais, como o grau de hidroxilação
104
e a extensão das suas conjugações (Pulido et al., 2000). No estudo de Sánchez-Alonso et al.
(2008) a fibra dietética obtida a partir de bagaço de uva da variedade Airén, produzida na
Espanha, apresentou atividade antioxidante de 284
µ
Mol TEAC.g
-1
pelo método ABTS, valor
inferior em relação à atividade observada em nosso estudo para a maioria das variedades.
3.4 Poder de inibição da oxidação
Além de apresentarem boa atividade antioxidante pelos métodos ABTS e DPPH, e
significativo poder redutor pelo método FRAP, os extratos de bagaço de uva apresentaram
capacidade de inibir a oxidação no ensaio do sistema
β
-caroteno/ácido linoléico, como pode
ser observado na
Figura 11
. Este método avalia o mecanismo de descoramento do
β
-caroteno
em um fenômeno mediado por radicais livres formados a partir do ácido linoléico. A presença
de extratos com atividade antioxidante pode inibir a extensão da perda de cor do
β
-caroteno
pela neutralização dos radicais livres formados no sistema, sendo dose-dependente o
percentual de inibição da oxidação.
As quedas de absorbância nos sistemas adicionados dos extratos de bagaço de uva
foram, em ordem decrescente: Isabel > Merlot > Cabernet Sauvignon > Bordô, com
percentuais finais de inibição da oxidação de 21,46; 34,38; 35,56 e 41,13 %, respectivamente.
A associação entre o antioxidante sintético BHT (butil hidroxitolueno) e os extratos de bagaço
de uva apresentou efeito sinergístico na inibição do processo de oxidação, com percentuais de
inibição maiores no caso das variedades Bordô (88,83 %), Cabernet Sauvignon (89,29 %) e
Merlot (88,37 %) em comparação ao percentual de inibição obtido com a aplicação do BHT
puro (87,23 %). No estudo de Jardini & Mancini Filho (2007) também foi observado efeito
sinergístico na aplicação conjunta de BHT e extratos de polpa e semente de romã. Esses dados
são interessantes à medida que comprovam a capacidade de extratos naturais de atuarem em
sinergismo com aditivos sintéticos, como o BHT, viabilizando sua utilização em substituição
parcial aos antioxidantes sintéticos comercialmente utilizados. Assim, os resultados obtidos
sugerem significativo poder dos extratos de bagaços de uvas em inibir os processos oxidativos
em meio emulsionado, apresentando sinergismo ao atuarem na presença de BHT.
105
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 20 40 60 80 100 120
Tempo (m inutos)
Absorbância a 470 nm
Controle BHT C M B
I BHT + C BHT + M BHT + B BHT + I
Figura 11. Poder de inibição da oxidação de extratos de bagaço de uva e BHT (butil hidroxitolueno) a
100 ppm pelo sistema de co-oxidação de substratos β-caroteno/ácido linoléico. C = Cabernet
Sauvignon; M = Merlot; B = Bordô; I = Isabel.
3.5 Ácidos fenólicos
As concentrações dos ácidos fenólicos identificados nas frações dos bagaços de uva
são apresentadas na
Tabela 10
. A variedade Cabernet Sauvignon apresentou maior teor total
de ácidos fenólicos nos bagaços (6,05 mg.g
-1
), seguida pelas variedades Bordô (4,69 mg.g
-1
),
Merlot (3,36 mg.g
-1
) e Isabel (2,89 mg.g
-1
). O ácido gálico, que possui três grupos hidroxila
ligados ao anel aromático, foi identificado em concentrações expressivas nas frações AFES,
principalmente na variedade Cabernet Sauvignon, com 2,19
mg.g
-1
. Em relação ao ácido
protocatecuico, este foi encontrado em concentrações expressivas principalmente nas frações
AFL das amostras, como na variedade Bordô, com 2,01
mg.g
-1
. Sroka & Cisowski (2003)
demonstraram que a atividade antioxidante e anti-radical dos ácidos fenólicos está
correlacionada positivamente com o número de grupos hidroxila ligados ao anel aromático.
Esses autores observaram maior atividade antioxidante e anti-radical para o ácido gálico (três
grupos hidroxila ligados ao anel aromático), seguido pelo ácido protocatecuico (dois grupos
hidroxila ligados ao anel aromático).
Bonilla et al. (1999) também observaram maior atividade antioxidante do ácido gálico,
seguido pelo ácido protocatecuico no ensaio do tempo de indução da oxidação em óleo de
106
oliva. Esses autores testaram também antioxidantes sintéticos, sendo estes mais eficientes na
comparação com antioxidantes naturais testados nas mesmas concentrações. No entanto, de
acordo com os mesmos, os fenólicos obtidos de fontes naturais, para terem sua eficácia
aumentada, podem ser adicionados em maior concentração em relação aos sintéticos, que
possuem limite de adição estabelecido na legislação.
Tabela 10. Concentrações de ácidos fenólicos (mg.g
-1
) de bagaços de uvas tintas das variedades C.
Sauvignon, Merlot, Bordô e Isabel.
Valores em base seca de bagaço de uva expressos como média ± desvio-padrão, n = 3.
AFL = ácidos fenólicos livres; AFES = ácidos fenólicos esterificados; AFI = ácidos fenólicos insolúveis.
nd = não detectado.
A análise dos dados permite verificar que os coeficientes de correlação obtidos entre a
atividade antioxidante pelos métodos ABTS e DPPH e o conteúdo total de ácidos fenólicos
dos bagaços das diferentes variedades de uva (R = 0,9495 e 0,9424, respectivamente), e entre
o poder redutor pelo método FRAP e o conteúdo total de ácidos fenólicos (R = 0,9667), foram
C. Sauvignon
AFL AFES AFI
Cinâmico
nd nd nd
t-cinâmico
nd nd nd
o-cumárico
0,40 ± 0,01 nd nd
Protocatecuico
1,33 ± 0,29 0,26 ± 0,03 0,09 ± 0,00
Ferúlico
nd nd nd
Caféico
nd nd nd
Quínico
0,05 ± 0,01 0,25 ± 0,01 0,14 ± 0,00
p-cumárico
nd 0,11 ± 0,00 0,09 ± 0,00
Gálico
nd 2,19 ± 0,08 0,32 ± 0,02
Propilgalato
0,21 ± 0,01 nd nd
Sinápico
nd nd nd
Elágico
0,46 ± 0,01 nd nd
Gentísico
0,15 ± 0,02 nd nd
Merlot
AFL AFES AFI
Cinâmico
0,11 ± 0,00 0,11 ± 0,01 0,14 ± 0,00
t-cinâmico
0,05 ± 0,00 nd nd
o-cumárico
0,07 ± 0,00 nd nd
Protocatecuico
1,43 ± 0,04 nd 0,11 ± 0,01
Ferúlico
0,05 ± 0,01 nd nd
Caféico
0,05 ± 0,00 nd nd
Quínico
nd 0,13 ± 0,01 0,16 ± 0,01
p-cumárico
nd nd 0,03 ± 0,01
Gálico
nd 0,49 ± 0,05 0,35 ± 0,06
Propilgalato
nd nd nd
Sinápico
nd nd nd
Elágico
nd nd nd
Gentísico
nd 0,08 ± 0,01 nd
Bordô
AFL AFES AFI
Cinâmico
0,11 ± 0,03 nd nd
t-cinâmico
nd nd nd
o-cumárico
0,15 ± 0,03 nd nd
Protocatecuico
2,01 ± 0,24 nd 0,07 ± 0,02
Ferúlico
nd nd nd
Caféico
nd 0,22 ± 0,02 0,20 ± 0,02
Quínico
0,14 ± 0,03 0,16 ± 0,02 0,14 ± 0,01
p-cumárico
0,04 ± 0,02 0,16 ± 0,55 0,19 ± 0,04
Gálico
0,19 ± 0,02 0,59 ± 0,04 0,26 ± 0,01
Propilgalato
nd nd nd
Sinápico
nd nd nd
Elágico
nd nd nd
Gentísico
nd 0,06 ± 0,01 nd
Isabel
AFL AFES AFI
Cinâmico
nd nd nd
t-cinâmico
nd nd nd
o-cumárico
nd nd nd
Protocatecuico
0,73 ± 0,03 nd 0,16 ± 0,00
Ferúlico
nd nd nd
Caféico
nd nd 0,11 ± 0,00
Quínico
0,10 ± 0,00 nd 0,15 ± 0,01
p-cumárico
nd 0,11 ± 0,02 0,28 ± 0,06
Gálico
0,13 ± 0,01 0,55 ± 0,11 0,39 ± 0,00
Propilgalato
0,11 ± 0,01 nd nd
Sinápico
0,07 ± 0,03 nd nd
Elágico
nd nd nd
Gentísico
nd nd nd
107
significativos (P<0,05). Esses resultados confirmam a forte relação entre a presença desses
compostos nos bagaços de uva e a atividade antioxidante total apresentada pelos mesmos. No
entanto, os ácidos fenólicos não são os únicos compostos fenólicos com capacidade de
atuarem como antioxidantes nos bagaços de uva. Outros componentes, como flavonóides não-
antociânicos e proantocianidinas, podem ter contribuído significativamente, principalmente na
capacidade dos extratos de bagaço de uva de atuarem na inibição do processo oxidativo
induzido do sistema
β
-caroteno/ácido linoléico, o que pode ser inferido, uma vez que a
correlação apresentada entre o conteúdo total de ácidos fenólicos e o percentual de inibição
dos diferentes extratos nesse sistema foi menor (R = 0,6378), porém significativa (P<0,05).
4 CONCLUSÃO
Os bagaços de uva avaliados apresentaram elevados teores de fenólicos totais, ácidos
fenólicos e atividade antioxidante, estando estes teores significativamente correlacionados
(P<0,05). As variedades Cabernet Sauvignon e Bordô apresentaram, respectivamente, maior
potencial para a extração de antioxidantes e de corantes naturais. O efeito sinergístico
observado na aplicação conjunta dos extratos de bagaço de uva e BHT na inibição do
processo oxidativo em meio emulsionado é um indicativo da viabilidade da utilização em
alimentos desses extratos em substituição parcial aos antioxidantes sintéticos comercialmente
utilizados.
AGRADECIMENTOS
À CNPq/Capes pelo auxílio financeiro, e à EPAGRI (Empresa Catarinense de
Pesquisa Agropecuária) de Videira, Estado de Santa Catarina, pelo fornecimento das
amostras.
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CONSIDERAÇÕES FINAIS
O bagaço de uva representa uma fonte de compostos fenólicos que possuem elevada
atividade antioxidante in vitro. Além disso, o óleo obtido a partir do bagaço de uva,
proveniente basicamente das sementes, é rico em ácidos graxos insaturados de alto valor
nutritivo. Estas características conferem a este resíduo grande potencial de aproveitamento.
Como próximo passo, os extratos de bagaço de uva devem ser testados em sistemas
modelos de alimentos a fim de avaliar sua eficácia antioxidante, visando à aplicação desse
subproduto agroindustrial, agregando valor ao mesmo e oferecendo assim uma nova
possibilidade de aproveitamento do resíduo. Também devem ser realizados testes in vivo para
avaliar os possíveis benefícios da utilização desta matéria-prima para a saúde humana.
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