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SANDRA REGINA PAULON AVANCINI
CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA, MICROBIOLÓGICA E
TOXICOLÓGICA DA ÁGUA DA FERMENTAÇÃO DO AMIDO
DE MANDIOCA
FLORIANÓPOLIS, SC
2007
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DE ALIMENTOS
Sandra Regina Paulon Avancini
CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA, MICROBIOLÓGICA E
TOXICOLÓGICA DA ÁGUA DA FERMENTAÇÃO DO AMIDO DE
MANDIOCA
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciência dos Alimentos, Universidade Federal de
Santa Catarina, como requisito final à obtenção do
Grau de Doutor em Ciência dos Alimentos.
Orientadora: Profª Drª Edna Regina Amante
Florianópolis – SC
2007
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CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA, MICROBIOLÓGICA E
TOXICOLÓGICA DA ÁGUA DA FERMENTAÇÃO DO AMIDO DE
MANDIOCA
Sandra Regina Paulon Avancini
Tese aprovada como requisito final para a obtenção do título de Doutor no
programa de Pós-graduação em Ciência dos Alimentos, pela Comissão formada por:
Presidente ___________________________________________________
Prof. Dra. Edna Regina Amante (UFSC)
Membro: _____________________________________________________
Prof. Dra Deborah Helena Markowicz Bastos (USP)
Membro: _____________________________________________________
Prof. Dra Rosemary Hoffman Ribani (UFPR)
Membro: ______________________________________________________
Prof. Dra Regina Vasconcelos Antônio (CCB- UFSC)
Membro: ______________________________________________________
Prof. Dr.Ernani Sebastião Sant’Anna (UFSC)
Membro: ______________________________________________________
Prof. Dra Vera Regina Cardoso Garcia Tramonte (CCS-UFSC)
FLORIANÓPOLIS, julho/2007
Aos meus pais
Ao Sidney, meu maior incentivador pelo
amor, carinho, ajuda, compreensão, e
paciência
Aos meus queridos filhos
AGRADECIMENTOS
A todos que contribuíram para realização deste trabalho, meu sincero
reconhecimento e agradecimento, em especial:
Ao Prof Antonio J. S. Hamad (in memorian), que sob sua orientação iniciei este
doutorado, pelo seu grande incentivo.
À Professora Edna Regina Amante, pela dedicada orientação e confiança na
realização deste trabalho, por sua paciência, compreensão e amizade.
Às Professoras Renata Dias de Mello Castanho Amboni e Elane Shwinden
Prudêncio colaboradora, “revisora” e amigas.
À Professora Vera Lúcia C. G. Tramonte do Departamento de Nutrição por sua
atenção, assistência e amizade.
Ao professor Ricardo Tramonte pela colaboração nas análises histológicas.
Ao professor Paulo Ogliari pelas orientações nas análises estatísticas.
À Dra. Valeria Reginatto pelas análises de Demanda Química de Oxigênio.
À Universidade Federal de Santa Catarina e ao Departamento de Nutrição pela
minha liberação para a realização do doutorado.
Ao Gerson L Faccin do Laboratório de Nutrição Experimental da UFSC, pela
assistência e grande apoio durante o desenvolvimento e decorrer do ensaio
toxicológico.
Ao Hospital Universitário pelas análises hematológicas e bioquímicas em especial a
Professora Maria de Lourdes Rovaris e os técnicos Nicéia e Erico.
Aos amigos e colaboradores do Laboratório de Frutas e Hortaliças Rossana, Karina
Tramonte, Karina Simas, Eloísa, Thiago, Paula Janete e Iolanda, pela amizade,
apoio e inestimável contribuição na elaboração deste trabalho.
À Manuela Alano Vieira, minha grande incentivadora pela amizade e apoio na
execução deste trabalho.
À “anja” que sempre esteve presente no desenvolvimento deste trabalho,
ÂngelaAngeloni Rovaris, bolsista de iniciação científica.
À Renata Angeloni Búrigo pela colaboração na coleta dos materiais biológicos para
a analise toxicológica.
À Eunice C Ilha pela amizade e colaboração na execução das análises
microbiológicas.
Ao Professor. Ernani S. Sant’Anna pela gentileza ao ceder o Laboratório De
Biotecnologia Alimentar para a realização das análises microbiológicas.
Aos professores e funcionários do Programa de Pós-Graduação em Ciência de
Alimentos, em especial ao Sérgio, ao Carlos, ao Bento e à Inês.
Aos colegas de pós-graduação, pelos momentos de companheirismo.
Ao Rodrigo e Eria Cardoso pela grande colaboração e apoio nas visitas às
polvilharia e coleta das amostras em Santa Rosa.
As polvilharias Finardi, Machado, Sevenhani e Inquil pelo fornecimento da matéria
prima.
A todas as pessoas citadas e aquelas que possa ter esquecido o meu carinho e
amizade. MUITO OBRIGADO!
AVANCINI, S.R.P. Caracterização quimica, microbiológica e toxicológica da
água de fermentação do amido de mandioca 2007, Tese (Doutorado em Ciência
dos Alimentos), Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos,
Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis.
RESUMO
O amido fermentado de mandioca (polvilho azedo), apesar da sua importância, ainda
é obtido de maneira empírica, com uma fermentação prolongada e praticamente sem
nenhum controle. A fermentação é do tipo submersa, normalmente com uma lâmina
de 20 cm de água na superfície. As águas resultantes da fermentação do amido,
descartadas ao final do processo, são ainda pouco estudadas, sendo até hoje
consideradas como efluente poluidor, no entanto compostos ácidos, aromáticos,
vitaminas e muitos outros podem ser formados pelas bactérias láticas e leveduras
durante o processo fermentativo. Neste trabalho foram avaliadas as características
químicas, microbiológicas e toxicológicas deste resíduo para contribuir para sua
conversão em matéria-prima para outros produtos. A água residual da fermentação,
em laboratório, do amido de mandioca proveniente de três regiões diferentes do
Estado de Santa Catarina, e a água coletada em uma polvilharia apresentaram pH
entre 3,0 e 3,7, índice de acidez de 21 a 68,0 mL de NaOH N por 100mL; 0,19 a
0,62 g de ácido lático por 100mL, respectivamente. A produtividade de 15,00 mg de
ácido lático/g de amido representa uma porcentagem de bioconversão de apenas
1,5%. O teor de sólidos totais deste resíduo (1.700 a 6.000 mg/L) é muito baixo e
também apresentou uma composição muito pobre. A contagem de bactéria lática ao
final da fermentação variou de 5,27 a 7,84 log UFC/mL, ocorrendo em menor
número nas fermentações com amido proveniente de Rio do Sul. Valores
semelhantes foram encontrados para bactérias mesófilas totais (6,39 a 8,02 log
UFC/mL) e bolores e leveduras (5,92 a 6,99 log UFC/mL), mas não diferiram entre
as diferentes fermentações. Esta água apresentou baixa toxicidade aguda em
camundongos (>5,0 g/Kg de peso) e sua ingestão por 28 dias em concentrações de
0, 25%, 50% e 100% durante 28 dias não causou alterações clínicas e
hematológicas significativas nos animais. Mais estudos ainda são necessários para
avaliar a utilização deste resíduo tanto para produção de ácidos orgânicos como
para o desenvolvimento de produtos probióticos.
Palavras-chave: amido de mandioca, fermentação, água residual, ácido lático,
toxicologia
AVANCINI, S.R.P. Chemical, microbiologic and toxicological characterization of
cassava starch fermentation wastewater
ABSTRACT
The sour cassava starch (“polvilho azedo”), even though its importance, is still
obtained at empiric form, in a prolonged fermentation and without any control. The
fermentation is of the submerse kind, normally with a 20 cm layer of water in surface.
The cassava starch wastewater has not been fully studied and until today considered
as polluting wastewater, nevertheless, acids, aromatic, vitamins and other
compounds can be produced by lactic bacterial and yeast during the fermentative
process. In this work were evaluated the chemical, microbiologic and toxicological
characteristics of this wastewater with the aim of contribute for its conversion in a
new raw material for other products. The cassava starch fermentation wastewater
produced in laboratory from three different places of the Santa Catarina State, and
the collected in a industry, presented pH between 3.0 and 3.7, acidity index of 21.0 to
68.0 mL of NaOH N by 100 mL; 0.19 to 0.62 g of lactic acid by 100 mL. The
productivity of 15.00 mg of lactic acid.g
-1
of starch means a bioconversion of only
1.5%. Total solids content from this wastewater is very short and also presented a
poor composition. The lactic bacterial count at the final of fermentation varied from
5.27 to 7.84 log cfu.mL
-1
, lower number being observed in fermentation with starch
from Rio do Sul region. Similar values were observed for total mesophylic bacterial
and yeasts, but were not different between several fermentations. This wastewater
presented low acute toxicity in mice (>5.0 g.Kg-1 of weight) and its ingestion during
28 days in concentrations of 0, 25, 50 and 100% did not cause significant clinical and
haematological changes in animals. More studies are necessary to evaluate the
utilization of this wastewater for organic acid production or probiotic products
development.
Keywords: cassava starch, fermentation, wastewater, lactic acid, toxicology.
LISTA DE FIGURAS
Figuras
Páginas
Figura 1 Formação de cianídeos a partir da linamarina
21
Figura 2 Esquema geral da fermentação da glicose
29
Figura 3 Processo de produção de amido de mandioca fermentado
40
Figura 4 Crescimento dos animais submetidos ao teste de toxicidade
aguda da água residual da fermentação do amido de mandioca.
71
Figura 5 Consumo de líquido dos animais em mL/kg/dia durante os
28 dias de experimento.
74
Figura 6 Consumo de líquido residual da fermentação do amido de
mandioca em g de sólidos totais por Kg de peso do animal por dia
durante os 28 dias de experimento.
75
Figura 7 Aparência da mucosa intestinal do intestino delgado dos
diversos grupos experimentais
85
LISTA DE TABELAS
Tabelas
Páginas
Tabela 1 Área colhida e quantidade produzida de mandioca no
mundo e nos principais países produtores.
16
Tabela 2 Área colhida e produção de mandioca no Brasil e nos
principais estados
17
Tabela 3 Composição química da raiz da mandioca
19
Tabela 4 Composição de alguns produtos da mandioca típicos do
Brasil
23
Tabela 5 Composição da água vegetal gerada no processo de
produção de polvilho em Santa Rosa do Sul (SC)
46
Tabela 6 Composição do resíduo líquido de uma fábrica de farinha
de mandioca
47
Tabela 7 Sólidos totais, cinzas e nitrogênio total na água residual da
fermentação do amido de mandioca.
57
Tabela 8 Composição média das águas residuais da extração do
amido de mandioca
58
Tabela 9 Origem da fécula, época do ano, tempo de fermentação
acidez e pH da água de fermentação do amido de mandioca na
produção do polvilho azedo.
59
Tabela 10 Produção do ácido lático usando amido como fonte de
carbono em condições controladas e em fermentação natural
61
Tabela 11 Tempo de fermentação (TF), acidez, pH e contagem de
bactérias ácido láticas (BAL), bactérias mesófilas e bolores e
leveduras da água residual da fermentação do amido de mandioca.
64
Tabela 12 Características bioquímicas das colônias isoladas da água
de fermentação do amido de mandioca.
66
Tabela 13 Fermentação de carboidratos das colônias isoladas da
água de fermentação do amido de mandioca.
67
Tabela 14 Caracterização Fenotípica das colônias isoladas da água
de fermentação do amido de mandioca.
68
Tabela 15 Composição química da água residual da fermentação do
amido de mandioca RS+TB.
70
Tabela 16 Contagem de bactérias ácido láticas, mesófilos totais e
bolores e leveduras da água residual da fermentação do amido de
mandioca (UFC/mL) RS+TB
70
Tabela 17 Valores de ganho de peso, consumo de ração e líquido e
peso do fígado absoluto e relativo (g/100 g de peso corporal) das
fêmeas submetidas à toxicidade aguda (14 dias).
72
Tabela 18 Ganho de peso, consumo de ração e líquido dos animais
em 28 dias de experimento.
73
Tabela 19 Peso relativo dos órgãos dos animais com 28 dias de
experimento em g/100g de peso corporal.
76
Tabela 20 Valores de hemograma dos ratos machos e fêmeas no
final do período experimental de 28 dias (média ± DP).
78
Tabela 21 Tempo de protrombina (TAP) dos ratos no final do período
experimental de 28 dias (média ± DP)
79
Tabela 22 Parãmetros bioquímicos do sangue dos ratos machos e
fêmeas no final do período experimental de 28 dias (média ± DP).
81
Tabela 23 Resultados da análise histopatológica do corte intestinal
dos animais após 28 dias de experimento.
84
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
13
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
15
2.1 Mandioca
15
2.2 Toxicidade da mandioca
19
2.3 Fermentação da mandioca
26
2.4 Bactérias ácido-láticas
27
2.4.1 Lactobacillus
31
2.5 Probióticos
32
2.6 Produtos fermentados de mandioca
35
2.6.1 Gari 35
2.6.2 Fufu 36
2.6.3 Lafun 37
2.6.4 Attieke 37
2.6.5 Ckickwangue 37
2.6.6 Agbelima 37
2.6.7 Mandioca Puba 38
2.6.8 Fécula de mandioca fermentada 38
2.7. Resíduos do processamento da mandioca
45
2.8 Análise toxicológica
48
2.9 Tecnologia Limpa e o processamento de alimentos
50
3 MATERIAL E MÉTODOS
51
3.1 Material
51
3.2 Obtenção da água de fermentação do amido de
mandioca
51
3.3 Caracterização química da água de fermentação do
amido de mandioca em laboratório
51
3.4 Análises Microbiológicas
52
3.5 Análise de micotoxinas
53
3.6 Teste de toxicidade
53
3.6.1 Animais 53
3.6.2 Toxicidade aguda 54
3.6.3 Toxicidade subcrônica ou dose repetida-28 dias 54
3.6.4 Parâmetros bioquímicos e hematológicos 55
3.6.5 Análise histológica 55
3.6.6 Análise estatística 56
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
57
4.1 Composição química da água residual da
fermentação do amido de mandioca
57
4.2 Análises microbiológicas
63
4.3 Micotoxinas
69
4.4 Análise toxicológica
69
4.4.1 Toxicidade aguda 70
4.4.2 toxicidade subcrônica 72
5 CONCLUSÕES
87
6 SUGESTÕES
88
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
89
ANEXOS
103
13
1 INTRODUÇÃO
A mandioca (Manihot esculenta Crantz) é uma planta de origem brasileira,
considerada um importante alimento em países da América Latina, África e Ásia,
devido a sua grande capacidade de adaptação a várias condições agro-ecológicas.
Cultivada em todo o território brasileiro, é utilizada tanto na alimentação humana e
animal, bem como matéria-prima em inúmeros produtos industriais, dentre eles, os
mais importantes são a farinha de mandioca, a fécula e o polvilho azedo.
O amido fermentado de mandioca (polvilho azedo) é um amido naturalmente
modificado através da fermentação e secagem ao sol, resultando em produto com a
peculiar propriedade de expansão, sem glúten e sem fermento, para a elaboração
de inúmeros produtos de panificação. Apesar da sua importância, ainda é obtido de
maneira empírica, apenas com o conhecimento prático dos fabricantes, com uma
fermentação prolongada e quase sem nenhum controle. A fermentação é do tipo
submersa, normalmente com uma lâmina de 20 cm de água. No entanto, os
produtores de Santa Catarina utilizam um volume de água muito menor,
principalmente os do sul do Estado.
O trabalho realizado por Marcon (2004) indicou que a adição do xarope de
glicose, durante o processo fermentativo, pode contribuir para incrementar a
produtividade do polvilho azedo sem comprometer a expansão. O processo envolve,
obrigatoriamente, a manutenção da lâmina de água na superfície do amido em
fermentação.
O processo fermentativo tem início com a geração de açúcares a partir do
amido, por microrganismos amilolíticos. A partir desta fonte de carbono, bactérias e
leveduras passam a atuar gerando compostos ácidos, aromáticos, vitaminas e
muitos outros.
As águas resultantes da fermentação do amido, descartadas ao final do
processo, são ainda pouco estudadas, sendo até hoje consideradas efluentes com
elevada Demanda Química e Bioquímica de Oxigênio (DQO e DBO). As poucas
considerações existentes, dizem respeito ao seu potencial poluidor. Os efluentes da
fermentação do amido de mandioca diferem das águas residuais da extração do
amido de mandioca a partir das raízes, comumente denominadas de manipueira.
14
Apesar da literatura ser vasta em estudos sobre a manipueira, são
praticamente inexistentes trabalhos relacionados à caracterização química,
microbiológica e toxicológica da água residual do processo de fabricação do polvilho
azedo.
A água residual da fermentação representa um volume expressivamente
menor comparativamente a manipueira, mas pode conter uma composição
interessante para ser aproveitada na elaboração de outros produtos, o que
significaria maiores rendimentos para o produtor do polvilho azedo.
O Grupo de Pesquisa em Tecnologias Limpas no Processamento de
Alimentos, do Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos, Centro de
Ciências Agrárias, UFSC, tem procurado contribuir para a redução do impacto
ambiental das agroindústrias propondo tecnologias que valorizem as matérias-
primas e minimizem a emissão de resíduos sólidos, líquidos e gasosos. Sendo a
maioria dos projetos inéditos internacionalmente, requerendo elevado investimento
em pesquisa com a finalidade de assegurar sugestões de usos aos produtos
considerados resíduos.
Através do presente trabalho, as águas da fermentação do amido de
mandioca foram caracterizadas com a finalidade de sugerir aplicações que
contribuam para a conversão de um resíduo industrial em matéria-prima para a
elaboração de novos produtos. Foram avaliadas as características químicas,
microbiológicas e toxicológicas da água de fermentação do amido de mandioca
obtidas em polvilharias e em laboratório.
15
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Mandioca
A mandioca (Manihot esculenta Crantz), originária da região amazônica
brasileira, foi introduzida na África durante o século 16 e na Ásia no século 18.
Planta arbustiva, composta de uma parte aérea e uma subterrânea formada por
raízes tuberosas, que consiste na parte comestível. Pode apresentar 5 a 20 raízes
com 20 a 80 cm de comprimento, diâmetro de 5 a 10 cm e o peso fresco de cada
raiz pode variar de 100 a 5000 g (PANDEY et al., 2000).
Devido à sua grande capacidade de adaptação a várias condições agro-
ecológicas, como por exemplo, a resistência à seca e sem nenhuma necessidade
específica para crescimento, seus aspectos agrícolas têm recebido atenção nos
últimos anos, visando aumentar sua produção. A mandioca é o sexto alimento mais
produzido no mundo e representa o alimento básico para mais de 700 milhões de
pessoas em diversos países (KATO; SOUZA, 1987; SOCCOL, 1996, citado por
PANDEY et al., 2000).
A África é responsável por 53,8% da produção mundial, seguida pela Ásia,
com 29,4% e a América do Sul com 16,9%. Entre os países produtores destacam-se
a Nigéria, responsável por 19,92% da produção total, seguido do Brasil, com
11,76%, a Indonésia, com 9,77%, a Tailândia, com 9,75%, a República Democrática
do Congo, com 8,89% e Gana com 5,29%. Estes países contribuem com cerca de
65% do volume mundial produzido (Tabela 1) (Vieira, 2004a). Cerca de 60 % da
produção mundial de mandioca é utilizada para consumo humano, 33% na
alimentação animal e 7 % nas indústrias têxteis, papel, alimentos e fermentação
(PANDEY et al., 2000).
O cultivo da mandioca está associado ao Brasil desde o seu descobrimento,
sendo atualmente cultivada em todos os Estados brasileiros, (CEREDA, 2001;
CARDOSO; SOUZA, 2002).
16
Tabela 1 Área colhida e quantidade produzida de mandioca no mundo e nos
principais países produtores.
Área colhida
(1000 ha)
Quantidade produzida
(1000 t)
Pais
00/01 01/02 02/03 00/01 01/02 02/03
Mundo 17.184
17.353
17.184
184.985
186.391
189.100
Angola 573
593
573
5.394
5.620
5.699
Brasil 1.667
1.692
1.646
22.577
23.131
22.147
Rep. Dem. Congo 1.902
1.840
1.902
15.436
14.929
14.929
Gana 726
794
726
8.966
9.731
10.000
Índia 270
270
270
6.900
7.000
7.100
Indonésia 1.318
1.277
1.318
17.055
16.913
18.474
Moçambique 834
1.020
834
5.988
5.925
6.150
Nigéria 3.430
3.455
3.430
32.586
34.476
33.379
Tailândia 1.049
988
1.049
18.396
16.868
18.430
Tanzânia 661
660
661
6.884
6.888
6.888
Uganda 390
398
390
5.265
5.373
5.400
Demais paises 4.364
4.366
4.385
39.538
39.537
40.504
Fonte: FAO/ jun 04 (Vieira, 2004a)
Segundo Vieira (2004b), a produção nacional dessa cultura, na safra 2004,
conforme as estimativas de outubro de 2004 pelo Instituto Brasileiro de Geografia e
Estatística (IBGE) (Tabela 2) foi cerca de 24 milhões de toneladas com rendimento
médio de 13,6 toneladas de raízes por hectare. A Região Nordeste lidera a
produção, com 8,75 milhões de toneladas, seguida, em ordem de importância, pelas
regiões: Norte, com 6,44 milhões de toneladas; Sul, com 4,04 milhões de toneladas;
Sudeste, com 2,45 milhões de toneladas e Centro-Oeste, com 1,33 milhão de
toneladas (VIEIRA, 2004b).
17
Tabela 2 Área colhida e produção de raiz de mandioca no Brasil e nos principais
estados nas safras de 2002/2003 e 2003/2004.
Área colhida (mil ha) Quantidade produzida (mil t)
Discriminação
02/03 03/04 Var % 02/03 03/04 Var %
Brasil 1.645,7 1.769,9 7,55 22.146,8 24.003,6 8,38
Bahia 330,6 335,8 1,56 3.908,3 4.201,6 7,50
Pará 292,6 298,6 2,04 4.468,6 4.309,3 -3,57
Paraná 110,7 163,8 47,98 2.351,2 3.210,0 36,53
Maranhão 164,6 172,9 5,05 1.241,7 1.291,7 4,03
Amazonas 83,8 82,8 (1,13) 804,9 795,8 -1,13
Rio Grande do Sul 88,9 88,2 (0,81) 1.315,2 1.232,9 -6,26
Ceará 82,1 81,2 (0,99) 857,9 756,5 -11,81
Minas Gerais 60,6 59,0 (2,72) 850,6 885,6 4,12
Pernambuco 41,8 46,2 10,55 440,4 473,9 7,55
São Paulo 36,7 43,8 19,38 864,2 1.086,4 25,71
Piauí 39,8 40,8 2,63 358,8 435,6 21,38
Santa Catarina 28,4 32,3 13,52 538,9 593,0 10,03
Rio Grande do Norte 37,2 52,2 41,97 385,8 591,7 53,36
Mato Grosso do Sul 22,9 29,6 29,30 485,3 510,6 5,22
Mato Grosso 25,8 37,3 44,97 356,0 536,1 50,60
FONTE: IBGE.(1) Safra 03/04 – Dados preliminares (LSPA, outubro de 2004), citado por VIEIRA
(2004b).
A safra catarinense de mandioca em 2004 apresentou uma área plantada de
32,3 mil hectares, obtendo 593 mil toneladas e rendimento médio de 18.382 Kg por
hectare (Tabela 2). O rendimento médio industrial obtido na produção da farinha, do
polvilho azedo e da fécula, na região Sul Catarinense, atingiu a média de 322 Kg de
farinha por tonelada de raiz processada; o segmento de polvilho azedo oscilou entre
180 e 200 Kg por tonelada de raiz. No Alto Vale do Itajaí, a produção de fécula
alcançou 254,8 Kg por toneladas de raiz (VIEIRA, 2004b).
Quando o processamento é grande, os subprodutos podem representar sérios
problemas ambientais, pois mesmo as pequenas unidades fabris como as casas de
farinha podem gerar quantidades significativas de resíduos, uma vez que
normalmente se reúnem em um dado local ou município. Além do aspecto ambiental
18
o despejo indevido dos subprodutos de mandioca constitui um desperdício de
rendimento para o produtor, quando se considera as quantidades geradas e a
composição (CEREDA, 2001). Segundo CEREDA (2001), os subprodutos da
mandioca são partes constituintes da própria planta, gerados em função do processo
tecnológico adotado, sendo que a qualidade e a quantidade dos subprodutos variam
em função do cultivar, idade da planta, tempo após a colheita, tipo e regulagem do
equipamento industrial e outros fatores.
Considerando os principais tipos de processamento das raízes da mandioca,
fabricação de farinha e extração de fécula, os subprodutos gerados podem ser
sólidos (casca marrom, entrecasca, descarte, crueira, fibra, bagaço e varredura) ou
líquidos (água de lavagem das raízes, água de prensa ou água vegetal da
fabricação de farinha e manipueira diluída ou água de extração da fécula) (CEREDA,
2001).
Os resíduos líquidos geram, em média, um volume de 2,62 m
3
com a água de
lavagem das raízes e 3,68 m
3
com a água de extração da fécula por tonelada de
raízes processadas. Sendo esta última composta pela água de constituição das
raízes mais a água utilizada para a extração (CEREDA, 2001).
Apesar de sua importância, a expansão da cultura da mandioca é limitada
pela rápida deterioração de suas raízes após a colheita, baixo conteúdo de proteína
e potencial toxigênico (Tabela 3), o que demanda um eficiente processamento pós-
colheita (MOORTHY; MATHEW, 1998; NOUT; SARKAR, 1999; WESTBY, 2002).
19
Tabela 3 Composição química da raiz da mandioca.
Composição Peso úmido
Peso seco
Energia (Kcal/100g) 135,00
335,00
Umidade (g/100g) 65,50
15,70
Proteína (g/100g) 1,00
1,40
Lipídios (g/100g) 0,20
0,50
Amido (g/100g) 32,40
80,60
Fibra (g/100g) 1,10
1,20
Cinzas (g/100g) 0,90
1,80
Cálcio (mg/100g) 26,00
96,00
Fósforo (mg/100g) 32,00
81,00
Ferro (mg/100g) 0,90
7,90
Sódio (mg/100g) 2,00
-
Potássio (mg/100g) 394,00
-
Vitamina B2 (mg/100g) 0,04
0,06
Vitamina C (mg/100g) 34,00
0,00
Niacina (mg/100g) 0,60
0,80
Cianídeos (% m/m) -
1,60
Fonte: Pandey (2000).
A mandioca é consumida de diversas maneiras, variando conforme o país. O
processamento normal inclui cocção em água fervente, fatiamento e secagem,
torração e conversão a outras formas de alimento, após a extração de amido e
produção de farinha. Outra forma de processamento consiste na fermentação das
raízes e subseqüente produção de diferentes produtos, como gari, fufu, placali e
farinha, na África; pan de yuca, pan de bono, polvilho azedo na América Latina e
Tape Katella nos países orientais, entre muitos outros (MOORTHY; MATHEW,
1998).
2.2 Toxicidade da mandioca
A planta da mandioca difere de outras tuberosas amiláceas por conter
glicosídeos potencialmente hidrolisáveis a cianeto (CEREDA, 2001). Os glicosídeos
cianogênicos são produtos do metabolismo secundário das plantas e são compostos
20
por uma α-hidroxinitrila tipo aglicona e um açúcar (principalmente D-glicose)
(VETTER, 2000).
A linamarina é o glicosídeo mais representativo (93%) e a lotaustralina, o
menos freqüente (7%) (KAMALU, 1995; CEREDA, 2001). Estes glicosídeos,
presentes em todos os tecidos da planta, em presença de ácidos e temperatura
adequada ou enzimas sofrem hidrólise e liberam ácido cianídrico (HCN), substância
tóxica e potente inibidora da atividade de enzimas da cadeia respiratória
(CARVALHO; CARVALHO, 1979).
A mandioca é geralmente classificada em brava ou amarga quando apresenta
níveis de HCN superiores a 50 ppm e mansa ou doce quando contém níveis
inferiores (CARVALHO; CARVALHO, 1979). O limite seguro de cianogênicos tem
sido delimitado em 10 mg equivalentes de cianeto por quilograma de peso fresco (10
ppm) (PADMAJA, 1995).
A dosagem para efeito letal do cianeto de potássio em humanos, segundo
Montgomery (1969), citado por Ezeala e Okoro (1986), via oral, está estimada entre
1,0 e 7,0 mg/kg de peso. Carvalho e Carvalho (1979) relatam que a dose letal de
ácido cianídrico é de 50 a 60 mg para uma pessoa adulta de 50 kg, enquanto
Padmaja (1995) considera doses de 50 a 100 mg letais para adultos.
A quantidade de glicosídeos cianogênicos na raiz de mandioca é dependente
do cultivar. Muitos cultivares apresentam teores de glicosídeos na raiz menores que
100 mg/kg de peso fresco, outros contém mais de 500 mg/kg. Nenhum cultivar de
mandioca sem estes glicosídeos foi identificado (VETTER, 2000). Por ser a
concentração de cianídeos na raiz afetada pelas condições ambientais durante o
cultivo, algumas cultivares, geralmente consideradas mansas ou doces podem
apresentar alto potencial cianogênico sob certas condições (WESTBY, 2002).
A formação de cianídeos a partir da linamarina é um processo em duas
etapas (Figura 1), envolvendo a deglicolisação inicial da linamarina e a sua clivagem
a acetona cianohidrina para formar acetona e cianídeos. Estas reações são
catalisadas pela linamarase (β-glicosidase) e a α-hidroxinitrila-liase (HNL). A etapa
final é a quebra da cetona formando cianídeos e cetonas. Pode ocorrer
espontaneamente (temperaturas maiores que 35°C ou p H acima de 4,0) ou
catalisadas pela enzima hidroxinitrila-liase (HNL). No entanto, tem sido demonstrado
que a expressão genética desta enzima ocorre principalmente nas folhas, com
21
pouca atividade nas raízes (WESTBY, 2002). As plantas cianogênicas intactas não
liberam HCN (VETTER, 2000).
As enzimas hidrolíticas capazes de liberar cianídeos dos glicosídeos
cianogênicos estão presentes na mandioca devidamente compartimentadas, para
evitar contato com os glicosídeos em condições normais. Qualquer processo de
ruptura das células fará com que a enzima entre em contato com os glicosídeos
liberando cianídeos (PADMAJA, 1995).
A linamarina é quimicamente estável, solúvel em água e resistente a fervura
em meio ácido. A cetona cianohidrina também é solúvel em água e tem um ponto de
ebulição de 82°C. O ácido cianídrico livre é voláti l a 27,5°C, sendo rapidamente
volatilizado na temperatura ambiente em regiões tropicais. Estes conhecimentos são
utilizados para um processamento adequado da mandioca reduzindo a níveis
adequados estes compostos cianogênicos (WESTBY, 2002). O total de cianogênicos
ou potencial cianogênico de uma amostra é a soma da quantidade de linamarina,
cetona cianohidrina e HCN/CN expresso em mg de equivalentes de HCN por
quilograma de peso fresco (BRADBURY; EGAN; BRADBURY, 1999). Produtos
derivados da mandioca que não foram processados adequadamente e que
Figura 1
Formação de cianídeos a partir da linamarina.
Fonte: McMahon et al (1995) citado por Vetter (2000)
22
apresentam níveis residuais não tóxicos de cianeto podem conter três tipos de
compostos: as cianohidrinas, a linamarina e o HCN. As cianohidrinas remanescentes
podem ser quebradas pelo pH alcalino do intestino produzindo cianídeos, já a
linamarina acredita-se que possa ser quebrada por ação de enzimas microbianas no
intestino. No entanto, conforme relata Kamalu (1995), uma quantidade significante
da linamarina ingerida permanece intacta, sendo absorvida desta maneira e
excretada pela urina, mas se esses produtos são consumidos por períodos
prolongados, podem levar a intoxicações crônicas (PADMAJA, 1995).
De acordo com Kamalu (1993), a linamarina absorvida de dietas com
mandioca causa inibição da Na-K-ATPase, provocando um desequilíbrio de
eletrólitos com depleção de Potássio levando a desidratação celular, vacuolização e
ruptura das células epiteliais dos túbulos proximais, resultando em proteinúria com
baixa concentração de albumina sérica. A produção de radicais livres por ciclos de
hipoxia e normoxia (isquemia/reperfusão) criados pela liberação de cianetos da
linamarina causa peroxidação lipídica da membrana celular. A quantidade de lesão
está relacionada com a quantidade de linamarina ingerida rotineiramente a níveis
subletais (KAMALU, 1995). Diversos casos de envenenamento foram relatados na
Nigéria após o consumo de produtos de mandioca, como o gari (AKINTONWA et al.,
1994; OSUNTOKUN, 1973 citados por VETTER, 2000).
Oluwole, Onabolu e Sowunmi (2002), em um estudo para determinar se o gari
era uma fonte de exposição a cianetos, verificaram que a quantidade de cianeto no
plasma após uma única ingestão era muito pequena para causar intoxicação aguda
e que o longo tempo de trânsito do cianeto absorvido no plasma sugere que a
ingestão freqüente de gari pode causar acúmulo no plasma.
Durante muitos anos, o consumo diário de alimentos a base de mandioca
contendo compostos cianogênicos residuais, em regiões da África Central foi
associado a doenças crônicas como o bócio, cretinismo, neuropatia tropical e a
diabete tropical, embora esse mecanismo não tenha sido demonstrado
experimentalmente (OKE, 1969; OSUNTOKUN, 1981). Segundo Cagnon, Cereda e
Pantarotto (2002), estudos recentes revelam que tais doenças estão mais
relacionadas com o desequilíbrio nutricional e não com a ingestão constante de
mandioca.
A mandioca também contém um agente bociogênico potencial, que pode
agravar desordens por deficiência de iodo, como bócio e cretinismo (OKE, 1980).
23
Grande parte do cianeto da dieta é convertido a tiocianato, sendo que seus sintomas
imitam a deficiência de iodo por impedirem a captação deste mineral pela glândula
tireóide. Experimentos sobre valores séricos de tiocianato em amostras de urina
humana indicam que a conversão de cianetos a tiocianato é uma via significante no
metabolismo do HCN (EMINEDOKI et al.,1994, citado por VETTER, 2000).
No processamento da mandioca para extração da fécula, a quantidade de
água utilizada carreia grandes concentrações do glicosídeo cianogênico, fazendo
com que o líquido residual apresente elevados níveis de cianeto (SOBRINHO, 1975,
citado por CEREDA, 2001). Conforme Argueda e Cooke (1982), citado por Cereda
(2001), a massa ralada para extração de fécula apresenta 76% do HCN original da
raiz, na água de extração restariam 74%, na fécula úmida 2% e na fécula seca
menos de 1%. Segundo Cereda e Mattos (1996), a mandioca processada
consumida no Brasil apresenta níveis seguros de cianídeos (Tabela 4).
Tabela 4 Composição de alguns produtos da mandioca típicos do Brasil.
Produto
Componentes
Farinha Amido Polvilho
azedo
Chips
Umidade (%) 1,2 1,1 1,6 0,9
Matéria seca(%)
Carboidratos 93 97,3 95,6 94
Proteínas 1,3 0,6 1,5 1,7
Lipídios 0,1 0,3 0,3 0,3
Fibra bruta 3,3 0,6 0,7 1,1
Cinzas 1,1 0,1 0,3 0,4
Cianídeos 0 0 0 1,6
Fonte: Cereda e Takahashi (1996)
Tradicionalmente, as raízes de mandioca são processadas por inúmeros
métodos que variam enormemente de região para região. Estas técnicas geralmente
são utilizadas com o objetivo de reduzir a toxicidade, melhorar a aceitabilidade e o
armazenamento. Processamento adequado é primordial para converter a mandioca
em alimento seguro (PADMAJA, 1995). Uma dessas técnicas é a fermentação, tanto
24
da raiz quanto da fécula para obtenção de vários produtos fermentados (SILVEIRA;
CARVALHO; PILON, 1999).
Ezeala e Okoro (1986), analisaram o teor de HCN em produtos de mandioca,
processados por diferentes técnicas, consumidos na Nigéria como a mandioca
fermentada por 4 dias e torrada (gari); a mandioca macerada em água por 4 dias,
desintegrada, retirada a água e cozida a 100°C por 25 a 30 minutos (fufu);
desintegrada com eliminação posterior do suco e a fritura da massa em óleo a 100-
150°C (torta de mandioca) e mandioca cozida em água em ebulição por 40 minutos,
deixado em água corrente por uma noite e parcialmente seca (chips) e não
encontraram níveis detectáveis de cianídeos. Portanto a incidência de neuropatia
atáxica poderia não ser devido à ingestão prolongada de produtos de mandioca.
Segundo Essers, Van der Grift e Voragen (1996), a redução efetiva dos níveis
de cianídeos requer dois tratamentos. O primeiro para aumentar o contato
linamarina-linamarase, através da desintegração do tecido, como esmagamento,
moagem ou degradação enzimática (microbiana) e o segundo para degradar as
cianohidrinas formadas e a volatilização do HCN, por aquecimento ou secagem e pH
adequado.
Iwuoha, Banigo e Okwelum (1997), observaram uma redução nos níveis de
cianídeos da mandioca de 81,5 % em farinha de mandioca obtida após fatiamento
da raiz, cocção por 35 minutos e maceração por 48 horas e 84,2% de redução na
farinha de mandioca obtida por maceração por 24 horas, trituração e novamente
maceração por 48 horas e extração da água. Também encontraram que os níveis de
cianetos residuais foram maiores em produtos secos em estufas (50 a 80°C) do que
em produtos secos ao sol, principalmente com a mandioca triturada. Uma área
superficial maior e um período maior a temperaturas que favorecem a atividade
endógena da linamarase podem ser responsáveis pela maior eficiência da secagem
ao sol.
Obilie, Tano-Debrah e Amoa-Awua (2004), avaliaram a quebra dos
glicosídeos cianogênicos durante o processamento da mandioca em akyele, um
produto consumido em Gana que consiste na fermentação da mandioca moída,
eliminação da água, passagem por peneira e cocção a vapor do produto granular.
Ocorreu redução do potencial cianogênico durante todo o processo em cerca de
97%. A maior perda ocorreu durante a trituração e a fermentação. No final da
25
fermentação, nenhum glicosídeo cianogênico foi encontrado exceto cianohidrinas e
cianetos livres.
Segundo Amoa-Awua, Appoh e Jakobsen (1996), embora algumas bactérias
e leveduras isoladas da fermentação da mandioca possam produzir linamarase, a
redução de glicosídeos cianogênicos, em mandioca fermentada, se deve ao fato de
alguns microrganismos romper os tecidos da mandioca, facilitando o contato entre a
linamarase e o glicosídeo cianogênico. Para Vasconcelos et al. (1990), citados por
Wood (1991), a hidrólise do glicosídeo cianogênico ocorre devido às enzimas da
planta e não à presença de bactérias durante a fermentação. A hidrólise é muito
rápida, pois 95% da linamarina é hidrolisada até 3 horas após o início da
fermentação e a torração do gari reduz os níveis de cianeto e cianohidrinas.
Para avaliar os efeitos do tempo de fermentação e o método de eliminação do
líquido (desagüagem) sobre a quantidade de cianídeos no gari, Onabolu et al.
(2002), fermentaram a mandioca triturada para a produção do gari, durante 7 dias,
com extração contínua de líquido e com a extração somente no final da fermentação.
Este estudo mostrou que os dois parâmetros estão associados ao nível de
cianohidrinas no gari e que o método de extração contínua, processamento mais
aceito pelos consumidores, apresentou níveis mais elevados de cianohidrinas e que
para utilização deste processo é necessário maior tempo de fermentação (no mínimo
144 horas).
O crescimento de fungos também é comum em produtos secos de mandioca,
ocorrendo durante a secagem, estocagem e quando submetidos à fermentação.
Quando ocorre crescimento de fungos potencialmente micotoxigênicos pode ocorrer
formação de micotoxinas. Diversos fungos micotoxigênicos como Aspergillus flavus,
Aspergillus ochraceus, Aspergillus versicolor e Penicillium sp., já foram encontrados
na mandioca, mas o risco potencial associado as micotoxinas ainda não foi
completamente avaliado. Em produtos de mandioca fermentados não tem sido
encontradas micotoxinas (WESTBY, 2002).
26
2.3 Fermentação da mandioca
O termo fermentação, utilizando uma definição rigorosamente química é
aplicado para descrever processos estritamente anaeróbios, no entanto, este termo
é utilizado geralmente para descrever processos aeróbios e anaeróbios da quebra
de carboidratos (CAPLICE; FITZGERALD, 1999).
A produção de alimentos por fermentação é um dos mais antigos processos
conhecidos pelo homem. Registros de métodos para fermentação do leite, carnes e
vegetais têm sido encontrados com data de 6000 a.C., tendo como principal objetivo
a preservação dos alimentos. No entanto, com o desenvolvimento de novas
tecnologias para preservação, esses alimentos são fabricados pelo seu sabor,
aroma e textura característicos, muito apreciados. Mesmo assim, as condições
geradas na fermentação são essenciais para garantir a vida de prateleira e a
segurança do produto (CAPLICE; FITZGERALD, 1999). Em muitos países a
fermentação é considerada essencial, sendo ainda realizada mais de forma
artesanal do que industrial, (CAPLICE; FITZGERALD, 1999).
Muitos alimentos fermentados dependem das bactérias ácido-láticas para
mediar o processo fermentativo. Os produtos finais do catabolismo dos carboidratos
pelas bactérias, geralmente ácidos, álcoois e dióxido de carbono, além de contribuir
para a preservação, conferem sabor, aroma e textura proporcionando características
únicas para o produto (CAPLICE; FITZGERALD, 1999).
Diversos microrganismos estão associados aos produtos da fermentação da
mandioca, sendo uma importante técnica de processamento utilizada na África e
América Latina. Modificações nas características bioquímicas ocorrem durante o
processo de fermentação, como a diminuição da toxicidade, com a remoção dos
cianídeos, queda do pH e conseqüente aumento da acidez, variando com as
condições de fermentação e produção de ácidos orgânicos, sendo o ácido lático o
mais comum em todas as fermentações (MOORTHY; MATTHEW, 1998). A
composição do substrato e os requerimentos nutricionais da cepa afetam
consideravelmente a performance da fermentação. O crescimento microbiano
também depende de fatores ambientais, como pH, temperatura e acúmulo de
produtos finais do metabolismo destas bactérias. Alimentos obtidos pela
fermentação ácido lática são caracterizados por um sabor ácido, atribuído
27
principalmente à produção de ácido láctico e acético pelas vias homo ou
heterofermentativas (CHARALAMPOPOULOS; PANDIELLA; WEBB, 2002a).
As bactérias envolvidas com a fermentação da mandioca são Lactobacillus,
Pediococcus, Clostridium, Propionibacterium e Bacillus sp, predominando as
espécies de Lactobacillus (L. plantarum, L. fermentum, L. delbrueckii e L.
manihotvorans) no final da fermentação (MIAMBI; GUYOT; AMPE, 2003). Leveduras
também têm sido identificadas como microrganismos predominantes na fermentação
da mandioca (OYEWOLE; ODUNFA, 1990). Segundo Oyewole (2001), leveduras
parecem ter um importante papel na sobrevivência e atividades de bactérias ácido
láticas durante a fermentação da mandioca. Através da sua atividade amilolítica,
estão envolvidas na quebra do amido da mandioca em açúcares simples, que são
convertidos pelas bactérias acido láticas em ácidos orgânicos. Somente bactérias
ácido láticas e leveduras parecem sobreviver à acidez encontrada nos estágios finais
da fermentação submersa (OYEWOLE; ODUNFA, 1990).
2.4 Bactérias ácido-láticas
As bactérias ácidas láticas (BAL) constituem um grupo de diversos
microrganismos amplamente distribuídos na natureza associados com plantas
(couve, milho, cevada), carnes, laticínios, mingaus e silagens. Conhecidas como
culturas iniciadoras no processamento de produtos lácteos tais como, leites
fermentados, iogurtes, queijos e manteigas, são importantes comercialmente
também na fabricação de embutidos, carnes curadas, vinhos, cervejas, picles e
outros. No entanto, estas bactérias podem ser um problema para as indústrias de
alimentos, como contaminantes, podendo produzir sabores e aromas estranhos aos
produtos (CARR; CHILL; MAIDA, 2002).
As BAL consistem de bastonetes ou cocos gram-positivos e compreendem os
gêneros: Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus e, mais recentemente, o gênero
Lactococcus. Estas bactérias são geralmente mesófilas, mas podem crescer tanto a
5 °C quanto a 45 °C. Da mesma maneira, enquanto alg umas crescem a pH 4,0 - 4,5,
outras são ativas a pH 9,6 ou 3,2 (CAPLICE; FITZGERALD, 1999). São oxidases
negativas, benzidinas negativas, catalase negativas com exceção de algumas que
28
produzem uma pseudo catalase e necessitam de porfirina férrica (CARR; CHILL;
MAIDA, 2002).
As BAL têm sido caracterizadas principalmente pela sua habilidade em formar
vários isômeros de ácido lático pela fermentação da glicose. O ácido lático pode ser
extraído de produtos fermentados e analisado quanto a sua habilidade em girar a luz
polarizada. Se a rotação for para a direita recebe o nome de dextrógero (
D
), se for
para a esquerda, levógero (
L
), ou uma mistura de ambos, denominada racêmica
(CAPLICE; FITZGERALD, 1999, CARR; CHILL; MAIDA, 2002). O ácido lático
D
(-)
não é metabolizado pelos humanos (CAPLICE; FITZGERALD, 1999).
As BAL são agrupadas em homofermentativas ou heterofermentativas de
acordo com o produto final da sua fermentação (Figura 2) (CAPLICE; FITZGERALD,
1999; CARR; CHILL; MAIDA, 2002). As homofermentativas produzem ácido lático
como principal produto da fermentação da glicose, apresentam a enzima aldolase,
que fermenta glicose diretamente a ácido láctico, gerando 2 moles de lactato por mol
de glicose. As heterofermentativas produzem outros produtos além do ácido láctico,
incluindo dióxido de carbono, ácido acético e etanol da fermentação da glicose,
utilizando a via alternativa da pentose monofosfato, convertendo as hexoses (açúcar
de 6 carbonos) em pentoses (5 carbonos) pela enzima fosfocetolase, produzindo no
processo aldeídos e diacetil, substâncias altamente desejáveis para formação de
aromas (CAPLICE; FITZGERALD, 1999; CARR; CHILL; MAIDA, 2002). As BAL
homofermentativas incluem o gênero Streptococcus (produz
L
(+) lactato) e
Pediococcus (produz
DL
lactato). As heterofermentativas abrangem o gênero
Leuconostoc e um subgrupo do gênero Lactobacillus, a Betabactéria. O Leuconostoc
produz
D
(-) lactato e a Betabactéria
DL
lactato (CARR; CHILL; MAIDA, 2002).
As BAL têm sido consideradas agentes etiológicos de doenças como
endocardites, bacteremias e septcemia em pacientes com sistema imune deprimido,
mas pesquisas recentes sugerem que estas bactérias podem fornecer uma
microbiota intestinal transitória que competirá com organismos potencialmente
perigosos, prevenindo doenças de natureza estabelecida (ADAMS, 1999; CARR;
CHILL; MAIDA, 2002).
29
GLICOSE
HOMOLÁTICA
HETEROLÁTICA
Glicose-6-P
Glicose-6-P
Futose-6-P
6-Fosfogliconato
Frutose-1-6-DP
Ribulose-5-P
Gliceraldeído-3-P Dihidroxicetona-P
Xilulose-5-P
H
2
O
Gliceraldeído-3-P
Acetil
-P
2 Piruvatos
Piruvato
Acetaldeído
2 Lactatos Lactato
Etanol
Figura 2. Esquema geral da fermentação da glicose
Fonte: CAPLICE e FITZGERALD (1999)
30
A inibição de certos microrganismos por outros membros do habitat, ou
interferência microbiológica, envolve mecanismos que inclui competição de
nutrientes, geração de ambiente desfavorável e competição pelo local de ataque ou
adesão. Na atividade antimicrobiana das BAL, estão envolvidas as produções de
ácidos orgânicos, peróxido de hidrogênio, dióxido de carbono, diacetil,
antimicrobiano como reuterinas e bacteriocinas (ADAMS, 1999; CAPLICE;
FITZGERALD, 1999).
O antagonismo dos ácidos orgânicos, incluindo o lático, acético e propiônico,
produzidos pelas bactérias durante a fermentação, pode ser resultado da ação
destes ácidos sobre a membrana citoplasmática das bactérias, interferindo com o
potencial de membrana e inibindo o transporte ativo. O ácido acético é mais inibidor
que o lático e pode inibir leveduras, fungos e bactérias, enquanto o ácido propiônico
pode inibir fungos e bactérias. A contribuição do acetaldeído e do etanol é mínima
por sua baixa concentração nestes produtos. (CAPLICE; FITZGERALD, 1999).
Nas BAL a falta de catalase para quebrar o peróxido de hidrogênio gerado na
presença de oxigênio, pode levar ao acúmulo desta substância o que poderia inibir
alguns microrganismos pelo forte efeito oxidante da membrana lipídica e proteínas
celulares (CAPLICE; FITZGERALD, 1999).
O dióxido de carbono formado nas fermentações heteroláticas pode criar um
ambiente anaeróbio, tóxico para microrganismos aeróbios, através da ação sobre a
membrana celular e a redução do pH (CAPLICE; FITZGERALD, 1999).
O diacetil raramente está presente em alimentos fermentados em quantidades
suficientes para produzir um efeito antibacteriano. No metabolismo do citrato, sua
produção é reprimida pela fermentação das hexoses (CAPLICE; FITZGERALD,
1999).
As reuterinas são produzidas na fase estacionária durante o crescimento
anaeróbio do
Lactobacillus reuteri
em uma mistura de glicose e glicerol ou
gliceraldeído, afetando vírus, fungos, protozoários e bactérias, provavelmente pela
inibição da enzima ribonucleotídeo redutase (CAPLICE; FITZGERALD, 1999).
Bacteriocinas são substâncias primárias liberadas extracelularmente ou
produtos modificados da síntese ribossomal das bactérias, que apresentam atividade
antimicrobiana. O alvo das bacteriocinas é a membrana citoplasmática das bactérias
(CAPLICE; FITZGERALD, 1999).
31
2.4.1
Lactobacillus
Lactobacilos são microrganismos muito exigentes que requerem carboidratos
fermentescíveis, aminoácidos, vitaminas do complexo B, ácidos nucléicos e minerais
para crescimento, além dos nutrientes específicos de cada cepa (GOMES;
MALCATA, 1999).
O gênero
Lactobacillus
pode ser subdividido em três grupos: betabactérias,
streptobactérias e thermobactérias, baseados na temperatura de crescimento e
reações bioquímicas (CARR; CHILL; MAIDA, 2002).
As Betabactérias crescem à temperatura de 15°C, são consideradas
heterofermentativas porque produzem CO
2
na fermentação da glicose e
freqüentemente hidrolisam arginina. São importantes na produção de alimentos
fermentados (
L. brevis, L. fermentum, L. carnis, L. sanfrancisco, L. helviticus, L.
fermentum
) (CARR; CHILL; MAIDA, 2002).
As streptobactérias também possuem uma temperatura ótima de crescimento
de 15°C, são homofermentativas e são capazes de for mar CO
2
a partir
do gluconato
e não da glicose. Inclui um grande número de microrganismos utilizados
extensivamente na produção de alimentos e fermentações industriais e são
encontrados naturalmente associados a vários vegetais como repolho (
L. plantarum
),
milho (
Streptococcus lactis
), leite (
L. casei
) e queijos (
L. plantarum e L. lactis
)
(CARR; CHILL; MAIDA, 2002).
As Termobactérias (
L. delbruecckii
sp.
bulgaricus
e
L. delbrueccki
i sp.
lactis
),
são homofermentativas e crescem a 45°C. São importa ntes em bebidas
fermentadas, em vários queijos e outros produtos lácteos (CARR; CHILL; MAIDA,
2002).
Com o objetivo de identificar os principais fatores que influenciam o
crescimento e a atividade metabólica de bactérias ácido lácticas em substrato de
cereal, Charalampopoulos, Pandiella e Webb (2002a) estudaram o crescimento de
quatro bactérias ácido lácticas (
L. fermentum, L. reuteri, L. acidophilus
e
L.
plantarum
), potencialmente probióticas em culturas de malte, cevada e trigo sem
controle do pH. O meio de cultura com malte foi o que proporcionou o melhor
crescimento de todas as cepas, devido a sua composição química, ou seja, por
apresentar maior conteúdo de açúcar e de nitrogênio amino livre. O
L. plantarum
e o
L. fermentum
foram mais resistentes às condições ácidas do que o
L. reuteri
e o
L.
32
acidophilus.
Em todas as fermentações o crescimento cessou com valores de pH
entre 3,73 e 4,88, valores menores do que os observados na fermentação com
malte, o que sugere que a deficiência do substrato em açúcares e nitrogênio amino
livre contribuiu para a limitação do crescimento.
2.5 Probióticos
A palavra probiótico, do grego “para a vida”, nos últimos anos tem sido
utilizada de diversas formas (GOMES; MALCATA, 1999). Foi originalmente proposta
para descrever compostos produzidos por um protozoário que estimulavam o
crescimento de outros. Na década de 70 foi expandida para abranger extratos
vegetais que estimulavam o crescimento microbiano e, mais tarde, utilizada para
descrever suplementos alimentares para animais que exerciam efeito benéfico ao
hospedeiro, contribuindo para o seu balanço microbiano intestinal. Atualmente,
probiótico é definido como microrganismos viáveis que exercem um efeito benéfico
sobre a saúde de seu hospedeiro, após sua ingestão, melhorando as propriedades
de sua microbiota intestinal (GOMES; MALCATA, 1999).
A
Food and Agriculture Organization
(FAO, 2001) define probiótico como
microrganismos vivos que administrados em quantidades adequadas produzem
efeitos benéficos à saúde do hospedeiro.
Os efeitos benéficos dos probióticos podem ocorrer através de um efeito
antagonista contra grupos específicos de organismos (enterobactérias patogênicas),
resultando na sua diminuição, afetando seu metabolismo no intestino ou pela
estimulação da imunidade (FULLER, 1989; KALANTZOPOULOS, 1997). Os
possíveis modos de ação dos probióticos estão relacionados com a supressão de
células viáveis, através da produção de compostos antibacterianos, competição por
nutrientes e competição pelos sítios de adesão; alteração do metabolismo
microbiano, com o aumento ou diminuição da atividade enzimática e estimulação da
imunidade, com um aumento dos níveis de anticorpos e da atividade macrofágica
(FULLER, 1989).
Muitas bactérias ácido lácticas são consideradas probióticas por
proporcionarem efeitos benéficos em humanos e animais, por aumentarem a
microbiota normal no trato gastrintestinal (FULLER, 1989; ADAMS, 1999). Acredita-
33
se que a presença destas bactérias pode prevenir infecções intestinais virais inibindo
as patogênicas. Estudos duplo-cego placebo controlado suportam o argumento de
que essas bactérias promovem a saúde aumentando a barreira da mucosa intestinal
contra patógenos (CARR; CHILL; MAIDA, 2002).
A ingestão de probióticos tem sido considerada efetiva contra alergias
alimentares, na redução da severidade da dermatite atópica, doença de Crohn, colite
ulcerativa, diarréia associada a antibiótico e gastroenterite aguda devido ao
rotavírus. O
Lactobacillus GG
tem sido associado com um aumento no nível da
resposta imune em relação ao rotavírus, um aumento no total de células secretoras
de anticorpos bem como no nível de imunogobulina A (Ig A) (CARR; CHILL; MAIDA,
2002).
As bactérias probióticas, utilizadas atualmente em produtos comercializados,
são principalmente do gênero
Lactobacillus
e
Bifidobacterium
(GOMES; MALCATA,
1999; HELLER, 2001; CHARALAMPOPOULOS, et al., 2002b). As espécies de
L
actobacillus
de maior interesse são
L. acidophilus, L. casei, L. crispatus, L.
gallinarum, L. gasseri, L. johnsonii, L. murinus, L. intestinalis, L. plantarum, L. reuteri,
L. ruminis, L. rhamnosus
e
L. salivarus
. Do gênero das
Bifidobacterium
são
B.bifidum, B. longum, B. infantis
e
B. animalis
(KLAENHAMMER; KULLEN, 1999).
Diversos estudos têm sido realizados para verificar os efeitos terapêuticos dos
probióticos nos distúrbios e infecções intestinais, atividade antitumorogênica, ação
hipocolesterolêmica, principalmente de leites fermentados com
Bifidobacterium
e
Lactobacillus acidophillus
(FULLER, 1989; KALANTZOPOULOS, 1997; GOMES;
MALCATA, 1999), mas estudos clínicos adicionais ainda são necessários para
confirmação.
Uma longa história de consumo, dados epidemiológicos disponíveis, testes
clínicos e estudos de toxicidade aguda sugerem que as bactérias ácido-láticas
normalmente encontradas nos alimentos fermentados e utilizadas na fabricação de
probióticos são seguras. No entanto, a introdução de novas cepas probióticas deve
ter uma avaliação mais detalhada quanto a sua segurança, principalmente, as cepas
modificadas geneticamente ou de origem animal (ADAMS, 1999).
As propriedades mais importantes para um bom probiótico incluem tolerância
à acidez e à bile, para manter o número de células viáveis adequado durante o
armazenamento e durante a passagem pelo trato gastrointestinal e aderência à
34
mucosa intestinal para colonização e produção de substâncias antimicrobianas com
concomitante inibição de patógenos (FULLER,1989; GOMES; MALCATA, 1999).
Considera-se que as bactérias ácido láticas são efetivas como probióticos
quando os níveis no cólon intestinal de 10
6
UFC (Unidades Formadoras de Colônias)
são mantidos (CARR et al., 2002). Gomes e Malcata (1999), relatam que é essencial
que os produtos probióticos fermentados contenham um número satisfatório de
células ativas no momento do consumo, ou seja, ao menos 10
6
UFC/mL, pois a
dose terapêutica mínima diária é considerada de 10
8
a 10
9
células viáveis obtidas
através da ingestão de 100 g de produto, contendo 10
6
a 10
7
células viáveis por mL
e que ainda, é necessário que estes produtos sejam consumidos regularmente para
manter o efeito desses microrganismos sobre a composição da microbiota intestinal.
Segundo Shah (2000) a maioria dos países não estabeleceu padrões para a
contagem de células viáveis em produtos probióticos. No Japão, a Associação dos
Produtores de Leites e Bebidas Lácteas Fermentadas, estabeleceu que este tipo de
produto deve conter 10
7
células viáveis por mL. A legislação brasileira também não
estabelece padrão para estes produtos (BRASIL, 2002).
A incorporação de cepas probióticas em alimentos tem sido muito utilizada na
indústria de laticínios na produção de leites fermentados, iogurtes e queijos
(GOMES; MALCATA, 1999; CHARALAMPOPOULOS, et al., 2002 b), no entanto,
segundo Mattila-Sandholm et al. (2002), a aplicação de culturas probióticas em
alimentos não lácteos representa um grande desafio.
A viabilidade de um probiótico em uma matriz alimentícia depende de fatores
como pH, temperatura de estocagem, nível de oxigênio e presença de
microrganismos competidores e inibidores (MATTILA-SANDHOLM et al., 2002).
Muitos alimentos tradicionais de fermentação ácido lática, além dos leites
fermentados, são disponíveis e raramente considerados como carreadores de
probióticos.
Lactobacillus
crescem espontaneamente em cereais fermentados como
a
Togwa
, uma bebida fermentada feita de sorgo e milho, consumida regularmente
por bebês na Tanzânia. Esta bebida aumenta a barreira da mucosa intestinal em
crianças de 6 a 25 meses com diarréia aguda (MOLIN, 2001).
Segundo Sanni, Morlon-Guyot e Guyot (2002), as fermentações tropicais
podem ser exploradas como fontes de novos probióticos, pois estas cepas
apresentam tolerância a sais biliares e pH igual a 2, indicando que podem sobreviver
à passagem pelo estômago antes de chegar ao intestino humano. Estes autores
35
relatam que cepas de
L. fermentum
e
L. plantarum
com estas características foram
isolados de uma pasta de milho fermentada produzida em Gana.
Um produto probiótico a base de farinha de aveia fermentada com L.
plantarum
299v e misturado ao suco de fruta em uma concentração de 5%,
contendo aproximadamente 5x10
10
UFC/mL no produto final, foi lançado na Suécia
em 1994. O
L
.
plantarum
é encontrado em alimentos fermentados de origem vegetal
(MOLIN, 2001), sendo que nos países africanos a mandioca é principalmente
consumida após fermentação ácido lática, na qual o
L
.
plantarum
é normalmente a
bactéria predominante (MOORTHY; MATHEW, 1998, OYEWOLE; ODUNFA,1990).
Nsofor et al. (1996), produziram iogurte de soja utilizando como inóculo,
exsudato de mandioca fermentada por 24 a 48 horas a 42°C, apresentando um gel
firme e aroma similar ao do iogurte. O inóculo continha bacilos e cocos gram
positivos e, não foram dependentes de lactose para adequada produção de ácido. A
ausência de constituintes do leite em iogurte de soja manufaturado com essa cultura
iniciadora pode ser vantajosa para pessoas alérgicas ao leite de vaca.
As características da fermentação do amido de mandioca e as águas
resultantes do processo podem apresentar propriedades probióticas, porém até os
dias de hoje, apenas uma citação prática indica esta possibilidade.
2.6 Produtos fermentados de mandioca
2.6.1
Gari
O
gari
é um dos produtos mais pesquisados entre os vários produtos
fermentados derivados da mandioca, pois é um alimento básico na África. É
produzido a partir de raízes de mandioca amargas, recém colhidas, descascadas,
lavadas e raladas ou trituradas. A polpa é mantida em sacos de juta, sob pedras,
para facilitar o escoamento do líquido durante a fermentação por 4 dias. O resíduo é
tostado em panelas de ferro e apresenta um fraco sabor ácido (PADMAJA, 1995;
IUWOHA; EKE, 1996). O suco extraído contém a maior parte dos glicosídeos
cianogênicos tóxicos e é descartado (PADMAJA, 1995)
Na fermentação do Gari, observa-se no período inicial um rápido crescimento
de bactérias, enquanto no período final de fermentação as leveduras são
36
predominantes. Inicialmente os microrganismos
Corynebacterium
sp. e
Geotrichun
candidum
foram considerados responsáveis pela formação de ácido, sabor e aroma.
Estudos posteriores demonstraram que o
Lactobacillus plantarum
produzia o
conjunto sabor aroma mais típico do gari. Cinco gêneros estão envolvidos com a
fermentação do gari: o
Leuconostoc,
o
Alcaligenes,
o
Corynebacterium,
o
Lactobacillus e
a
Cândida
.
Lactobacillus plantarum
e
Leuconostoc mesenteroids
estavam presente em grande número durante as 96 horas de fermentação e
Corynebacterium manihot
e
Geotrichun candidum
somente nas primeiras 48 horas.
Portanto, as bactérias ácido láticas parecem predominar durante a fermentação
(MOORTHY; MATHEW, 1998). Segundo Okafor, Umeh e Lbenegbu (1998),
L.
delbruckii, L. coryneformis, e Saccharomyces
sp., isolados na fermentação do gari,
foram considerados os maiores produtores de linamarina, lisina e amilase.
2.6.2
Fufu
O
fufu
é um alimento fermentado popular na África, produzido pela maceração
das raízes de mandioca, descascadas, lavadas e cortadas em pedaços de 20 cm,
colocadas em potes de cerâmica com água ou em um pequeno fluxo de água, por 4
a 5 dias. Durante este período a mandioca fermenta e amacia, liberando ácido
cianídrico na água de maceração e produzindo sabor e aroma característicos. A
mandioca é então desintegrada e passada por peneira, ficando em repouso por 3 a
4 horas. A água é decantada e o sedimento é colocado em sacos e submetido à
pressão para eliminar o restante da água (IUWOHA; EKE, 1996; MOORTHY;
MATHEW, 1998). O sedimento é o
fufu
que pode ser consumido após gelatinização
com água para formar uma pasta (IUWOHA; EKE, 1996). A sua produção envolve
fermentação por bactérias láticas (
Bacillus, Lactobacillus, Klebsiella, Leuconostoc
e
Corynebacterium
) e pela levedura
Candida
sp, dos quais apenas o
Bacillus
sp,
e
Corynebacterium
hidrolisam o amido (OKAFOR; IJIOMA; OYOLU , 1984; DEMIATE;
OETERRER; WOSIACKI, 1994; MOORTHY; MATHEW, 1998). Segundo Oyewole e
Odunfa (1990),
Lactobacillus plantarum
foi a bactéria ácido lática predominante
durante a produção do
fufu
.
37
2.6.3
Lafun
O lafun é uma farinha de mandioca fermentada e seca (semelhante à farinha
de mandioca puba brasileira), consumida na Nigéria. Raízes inteiras ou pedaços de
mandioca descascadas e lavadas são macerados em água por 4 a 5 dias, para
fermentação e amaciamento. Após este período, são secas ao sol por 2 dias,
moídas e peneiradas. A farinha é adicionada à água em ebulição com agitação
constante até formar uma pasta, que é servida com sopas (IUWOHA; EKE, 1996;
MOORTHY; MATHEW, 1998). Os cinco grupos microbianos encontrados na
fermentação deste produto são similares a outros produtos de mandioca fermentada:
Bacillus
sp.,
Klebsiella
sp.,
Leuconostoc
sp.,
Corynebacterium
sp., Cândida sp. e
Lactobacillus sp. (MOORTHY; MATHEW, 1998).
2.6.4
Attieke
Produto fermentado popular em Gana semelhante ao fufu, com uma diferença
nos estágios finais, quando é submetido ao vapor (MOORTHY; MATHEW, 1998).
2.6.5
Ckickwangue
É o mais popular produto de mandioca processado no Zaire. As raízes são
descascadas, maceradas por 3 a 5 dias até o amaciamento. As fibras são removidas
da polpa, que é mantida em uma prateleira para posterior fermentação ou cobertas
com folhas e pressionadas utilizando objetos pesados para drenar o excesso de
líquido. A polpa é então triturada sobre uma pedra ou mortar, envolvida em folhas de
plantain
ou espécies da família Zingiberaceae, amarradas firmemente e cozidas ao
vapor. O produto final é uma pasta mais espessa que o fufu (MOORTHY; MATHEW,
1998).
2.6.6
Agbelima
Produto de mandioca fermentado muito consumido em alguns países da
África (Gana, Benin e Togo). É uma farinha fermentada de mandioca, onde um
inóculo produzido a partir da própria mandioca fermentada por 2 a 4 dias (Kudeme),
38
é triturado junto com a mandioca descascada e deixado fermentar por 2 a 3 dias
(AMOA-AWUA; JACOBSEN, 1995). A microbiota encontrada tanto no inóculo quanto
na pasta fermentada foi
Bacillus
sp.
, Lactobacillus plantarum, Leuconostoc
mesenteroides
e
Lactobacillus brevis
(AMOA-AWUA; JACOBSEN, 1995; AMOA-
AWUA; APPOH; JAKOBSEN et al., 1996).
2.6.7 Mandioca Puba
Processo utilizado pelos índios brasileiros, absorvido pelos escravos e
transferido para o continente africano (SILVEIRA; CARVALHO; PILON, 1999). As
raízes são colocadas diretamente em água estagnada ou dentro de um saco
mantido em água corrente, permanecendo assim de 3 a 7 dias, até que amoleçam e
comecem a soltar a casca. O período de maceração depende do cultivar, da idade
das raízes, da temperatura e do pH da água. Em seguida, as raízes são esmagadas
em peneiras ou cochos de madeira e secas ao sol ou em forno. Segundo Almeida
(1992), citado por Silveira, Carvalho e Pilon (1999), os microrganismos envolvidos
com a fermentação da mandioca puba são do tipo enterobactérias, corinebactérias,
lactobacilos, leuconostoc, enterococos e leveduras formadoras de películas,
ocorrendo alterações na população microbiana durante a fermentação. Também
estão envolvidas na fermentação: enzimas amilolíticas e pectinolíticas, degradação
do glicosídeo cianogênico, o metabolismo das dextrinas e de açúcares em
compostos como ácidos, álcoois, aldeídos, ésteres e cetonas.
2.6.8 Fécula de Mandioca fermentada (polvilho azedo)
A substância amilácea extraída de raízes da mandioca através de
decantação, centrifugação ou outros processos tecnológicos adequados recebe o
nome de fécula (BRASIL, 1978).
O amido da mandioca é utilizado na produção de diversos produtos tanto na
indústria alimentícia, na produção de polvilho doce, polvilho azedo (utilizados na
confecção de pães de queijo, biscoitos), massas alimentícias e panificáveis
(macarrão, pão, bolachas e bolos), espessantes (em sopas, pudins, alimentos
infantis), sagu, tapioca, como na indústria de papel, têxteis, ligas cerâmicas,
cosméticos, medicamentos entre outros (EL-DASH, 1987; VILELA; FERREIRA,
39
1987). Os teores de amido das raízes da mandioca variam de 20 a 30 % na matéria
úmida e de 80 a 90 % na matéria seca (VILELA; FERREIRA, 1987).
O processo de produção do amido consiste na colheita, lavagem,
descascamento, picagem e/ou ralação das raízes, prensagem e tamisação da
massa sob água corrente. O bagaço acumulado é eliminado e, a fécula é arrastada
pela água e separada desta por decantação em tanques ou por centrifugação. A
fécula obtida é então desidratada em secadores de túnel ou
flash-dryer
(VILELA;
FERREIRA, 1987).
A fécula fermentada, conhecida como polvilho azedo no Brasil é obtida pela
fermentação natural da fécula doce da mandioca (DEMIATE, et al., 1999). A
legislação brasileira classifica o polvilho em doce e azedo, tendo como base apenas
a acidez titulável, que para alimentos fermentados deve ser no máximo de 5,0 mL de
NaOH N/100g (BRASIL, 1978).
O polvilho azedo é um produto tipicamente regional, produzido principalmente
nos estados de Minas Gerais, Paraná, São Paulo e Santa Catarina, sendo
processado, muitas vezes, por pequenas indústrias rurais (WESTBY; CEREDA,
1994). Este produto é utilizado na fabricação do biscoito de polvilho e pão de queijo.
Apesar do baixo teor de proteína sua expansão é excelente (FIGUEROA; DAVILA;
POURQUIÉ, 1995).
O processo fermentativo altera o grânulo do amido, conferindo ao polvilho
azedo características peculiares, como modificação de sabor e aroma e alteração da
sua reologia (PARADA; FABRIZIO; MARTINEZ, 1996; DEMIATE et al., 1999). A
atividade microbiana durante a fermentação promove modificações nas propriedades
funcionais do amido, que são essenciais para que a massa do biscoito se expanda
durante a cocção (RIVERA, 1996)
A produção do polvilho azedo (Figura 3), apresenta basicamente o mesmo
processo que a extração da fécula. Após a separação da fécula por decantação,
esta é transferida para tanques de fermentação, recobertas por uma camada de
água com cerca de 20 cm, onde deve permanecer por um intervalo de tempo de 20
a 60 dias, variando de acordo com as condições climáticas. Considera-se o processo
acabado quando há formação de espuma na superfície e formação de bolhas
persistentes no interior da massa com desprendimento de forte odor característico,
queda rápida do pH e aumento da acidez titulável.
40
Figura 3 Processo de produção de amido de mandioca fermentado (adaptado de
Marder et al., 1996).
..............Rota alternativa durante a entressafra da mandioca
Leite de
amido
Água residual
Raiz de Mandioca
Lavação
Água
residual
Água
Desintegração
Separação
(2º estágio )
Polpa
Líquido
reciclado
Água
residual
Separação
(1º estágio)
Água
Filtração
Sedimentação
Água
residual
Fermentação
Água
Amido de
mandioca
comercial
Água
Secagem
polvilho azedo
41
A secagem é feita ao sol, por um período de 8 a 14 horas, dependendo das
condições climáticas (NAKAMURA; MORAES; MARTUCCI, 1976; CEREDA, 1987;
WESTBY; CEREDA, 1994; SILVEIRA et al., 2000, 2003). A secagem do polvilho
azedo ao sol é essencial para a elevada expansão ao forno e provavelmente se
deve a degradação oxidativa (DEMIATE, et al., 2000). A maioria dos produtores
inicia o processamento pela raiz da mandioca, no entanto, muitos fermentam o
polvilho doce extraído e armazenado durante a safra (CEREDA, 1987; WESTBY;
CEREDA, 1994).
O polvilho azedo é tradicionalmente produzido por fermentação natural
(DEMIATE, et al., 1999), a partir da microbiota normal presente na fécula de
mandioca. O tempo de fermentação é variável e a qualidade do produto é irregular
(PARADA; FABRIZIO; MARTINEZ, 1996), sendo impossível obter um produto com
as mesmas características, mesmo tendo igual origem (FIGUEIROA, 1991, citado
por SILVEIRA, etal., 2000). Segundo Figueroa, Davila e Pourquié (1995), devido à
ausência de agitação e aeração e ao alto teor de sólidos (cerca de 50%), condições
anaeróbicas prevalecem durante todo o processo.
As diferentes condições climáticas brasileiras selecionam a microbiota
predominante nos processos fermentativos, ocorrendo diferenças na acidez e
composição de ácidos orgânicos em polvilho azedo produzidos em diferentes
estados brasileiros (SILVEIRA et al., 2003). Segundo Cereda (1987), a temperatura
de 30°C favorece a fermentação butírica com predomínio do
Clostridium butyricum
,
mas em temperaturas de 12 a 20°C a fermentação láti ca é favorecida, com
predomínio da microbiota lática, principalmente
Lactobacillus
, bactérias esporulantes
Gram positivas e leveduras.
Para acelerar a fermentação e reduzir o tempo de permanência da fécula nos
tanques de fermentação, alguns produtores utilizam como inóculo o polvilho da safra
anterior deixando os tanques sujos de uma safra para outra ou colocando no fundo
do tanque um pouco de fécula fermentada (CEREDA, 1987). No início da
fermentação, o amido é a principal fonte de açúcar fermentável e várias cepas de
bactérias ácido láticas isoladas da fermentação natural do amido de mandioca
apresentam atividade amilolítica (BRABET et al.,1996; SANNI; MORLON-GUYOT;
GUYOT, 2002). O processo fermentativo do amido foi estudado por diversos
autores, sendo predominantemente lática (CÁRDENAS; BUCKLE, 1980;
42
CARVALHO et al., 1996; PARADA; FABRIZIO; MARTINEZ, 1996; SILVEIRA et al.,
2003).
Marcon (2004) desenvolveu um método de fermentação, no qual é adicionado
maior quantidade de água e glicose melhorando o processo fermentativo. A adição
de glicose na concentração de 0,5 % ao meio de fermentação, contribuiu para
duplicar a velocidade de fermentação, passando de 40 dias (sem adição de glicose)
para 20 dias (com 0,5 % de glicose).
No processo de fermentação do amido de mandioca, um ambiente ácido é
alcançado após 2 ou 3 dias de fermentação. Durante este período o pH diminui de
6,5 para 3,5, permanecendo estável por até 20 dias. O principal ácido orgânico
encontrado é o ácido lático (66 a 82%), o que demonstra o papel das bactérias ácido
láticas no processo, os ácidos remanescentes são ácido acético e butírico
(CÁRDENAS; BUCKLE, 1980).
Bangou (1995) citado por Demiate et al., (1999), estudou a fermentação do
amido de mandioca a duas diferentes temperaturas, 20 e 35°C, por um período de
15 dias e determinou o conteúdo de ácido lático e butírico. A 35°C o ácido butírico foi
encontrado em maior quantidade (1,38 mg/g), seguida do ácido lático (0,93 mg/g). A
20°C, ocorreu o contrário, ou seja, o componente em maior concentração foi o ácido
lático (2,47 mg/g).
Demiate et al. (1999), ao analisarem 29 amostras de amido de mandioca
fermentado da região sul e sudeste adquiridos diretamente das fábricas ou do
comércio, obtiveram os seguintes resultados: das 8 amostras do estado do Paraná,
somente uma não apresentou ácido butírico na sua composição; das 11 amostras de
Santa Catarina, 6 apresentaram os ácidos típicos do amido de mandioca fermentado
(ácidos láctico, acético, butírico e propiônico) e 5 apresentaram ácido lático e acético
ou somente ácido lático; das 6 amostras de Minas Gerais, 5 apresentaram ácido
lático e acético e, somente uma apresentou ácido butírico em sua composição,
demonstrando assim, uma grande heterogeneidade no perfil de ácidos orgânicos
obtidos na fermentação do polvilho azedo.
A microbiota encontrada por Cárdenas e Buckle (1980), no amido de
mandioca fermentado esteve predominantemente constituída por bastonetes Gram-
positivos, identificados como bactérias ácido láticas, sendo que o
Lactobacillus
plantarum
foi o mais comum em várias amostras examinadas, sozinho ou
acompanhado do
Lactobacillus casei
. Colônias de leveduras também foram
43
encontradas, assim como o fungo
Geotrichum cândida
. Uma vez que nenhum
inóculo foi acrescentado, estes microrganismos podem estar presentes no ambiente,
tanques de fermentação ou em equipamentos.
Figueroa, Davila e Pourquié (1995) identificaram uma sucessão de bactérias
durante a fermentação, apresentando inicialmente uma população de cepas
heterofermentativas e a segunda população de homofermentativas com
predominância do
Lactobacillus plantarum
.
CEREDA (1973) citado por DEMIATE et al. (1999), dividiu a fermentação do
amido em três fases distintas. Na primeira fase, os microorganismos responsáveis
por estabelecer condições favoráveis à fermentação incluem
Achromobacter,
Escherichia, Pseudomonas, Alcaligenes, Bacillus
e
Clostridium.
Na segunda fase,
aparecem os microrganismos acidogênicos mais exigentes nutricionalmente
(microrganismos microaerófilos, facultativos ou anaeróbios estritos). Na terceira fase,
aparecem os microrganismos saprófitas e contaminantes como
Bacillus
e alguns
fungos. Nesta etapa, ocorre a formação de compostos responsáveis pelo aroma e
sabor do polvilho.
Carvalho et al. (1996), ao verificarem as condições de processamento de
polvilho azedo relacionaram 590 culturas das quais 23 (3,9 %) perderam a
viabilidade de crescimento durante a fermentação. Estes pesquisadores
identificaram 567 dos isolados, sendo que 3,1 % eram bactérias gram negativas; 2,2
%, leveduras; 7,8 %, bactérias dos gêneros
Bacillus
e
Corynebacterium
; 2,4 %,
Staphylococcus
e
Micrococcus
, possivelmente como contaminantes do processo e
80,6 % como bactérias ácido-láticas. Mesmo com o decréscimo do pH do meio de
fermentação (6,97 para 3,87), não foi verificado alteração no número de
microrganismos totais durante todo o processamento do polvilho azedo (CARVALHO
et al.,1996).
A contagem total de microrganismos aeróbios mesófilos, realizadas em duas
fecularias em Minas Gerais por Silveira et al. (2003), não sofreram alterações
significativas durante a fermentação da fécula (contagem média de 10
8
UFC/g),
sendo somente observada uma mudança na microbiota devido a diminuição do pH.
A microbiota ácido-lática foi predominante, com maior participação do gênero
Lactobacillus
, seguido de
Streptococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Pediococcus e
Lactococcus
.
44
Parada, Fabrizio e Martinez (1996), estudaram a microbiota de amido de
mandioca fermentado na mesma época em dois anos consecutivos de duas
pequenas unidades de produção na Colômbia. Os principais microrganismos
encontrados foram
Bacillus
sp.
, Streptococcus, Enterococcus, Lactobacillus,
Saccharomyces, Penicllium
e
Aspergillus,
sendo que nenhum coliforme foi
encontrado. No final da fermentação, somente microrganismos ácido-tolerantes
sobreviveram. A composição e densidade microbiana das amostras de dois
diferentes produtores foram muito semelhantes. O maior produto da fermentação foi
ácido lático (60 a 62%), seguido do ácido acético (5 a 10%) e ácido butírico (0 a
3
%).
Duas novas cepas de
Lactobacillus
homofermentativos e com atividade
amilolítica foram isoladas do amido de mandioca fermentada na Colômbia por
Morlon-Guyot et al. (1998), denominadas
Lactobacillus
manihotivorans
. Ampe
(2000), utilizando sondas de hibridização com base em seqüências de rRNA,
concluiu que este
Lactobacillus
representava cerca de 20% do total de BAL.
Lacerda (2002), isolaram os seguintes
Lactobacillus
em polvilharias de Minas
Gerais:
L. jensenii-similar
,
L. manihotivorans
, em aerobiose e
L. acidophilus
e
L.
manihotivorans
em anaerobiose. A espécie heterolática mais freqüente encontrada
em aerobiose e anaerobiose foi o
L. plantarum
. As leveduras identificadas foram
Galactomyces geothricum, Issatchenkia scutulata var. exígua-similar
e
Cândida
ethanolica.
As leveduras parecem ter um importante papel na sobrevivência e
atividades de bactérias ácido láticas durante a fermentação da mandioca, pois
através da sua atividade amilolítica, estão envolvidas na quebra do amido em
açúcares simples, os quais são convertidos pelas bactérias ácido láticas em ácidos
orgânicos (CARDENAS; BUCKLE, 1980; OYEWOLE, 2001).
Mante, Sakyi-Dawson e Amoa-Awua (2003), concluíram em um estudo sobre
interações microbianas entre espécies envolvidas na fermentação da mandioca, que
a espécie dominante,
L. plantarum
foi capaz de inibir o crescimento de outros
Lactobacillus
e que nenhuma inibição de leveduras foi observada, o que eles
atribuem a um provável efeito sinergístico.
45
2.7 Resíduos do processamento da mandioca
As principais formas de processamento da mandioca no Brasil são a farinha
de mandioca e extração do amido. A primeira gera principalmente resíduos sólidos,
enquanto a segunda, resíduos líquidos. Os resíduos sólidos são a casca marrom, a
casca interna, raízes não utilizáveis, farelo, bagaço e restos de farinha. Os resíduos
líquidos são gerados durante a prensagem da mandioca para fabricar a farinha e
durante a extração do amido e são denominados manipueira. Na extração do amido
a manipueira (água vegetal) é diluída pela água utilizada no processo, reduzindo sua
carga orgânica e o conteúdo de cianídeos (CEREDA; TAKAHASHI, 1996).
O volume médio de manipueira por fábrica de extração do amido é 3,68 m
3
/t
de raízes (CEREDA; TAKAHASHI, 1996; PANDEY et al., 2000;). O conteúdo de
cianogênicos tende a ser alto, uma vez que quase todos os glicosídeos cianogênicos
da raiz desintegrada são carreados pelas substâncias solúveis e insolúveis em
suspensão neste resíduo, variando de acordo com o cultivar. A descarga orgânica,
também é alta e varia com o tipo de processamento. Fecularias geram em torno de
600 litros de manipueira diluída por tonelada de mandioca, com menos de 5% de
matéria orgânica, 60 ppm de cianeto (CN) e Demanda Bioquímica de Oxigênio
(DBO) de 5000 mg O
2
/L (CEREDA; MATTOS, 1996). Segundo Sobrinho (1975),
citado por Cereda e Mattos (1996), o resíduo líquido despejado no solo ou em
cursos d´água causa poluição equivalente a produzida por 150 a 250 habitantes por
dia. Em Santa Catarina, a poluição causada por estes resíduos corresponde a 460
habitantes por dia (ANRAIN, 1983 citado por CEREDA; TAKAHASHI, 2002).
Lima (2001), avaliando a produção de resíduos por três fecularias localizadas
em Santa Rosa do Sul (SC), observou uma variação na produção de resíduos
líquidos (água vegetal) de 3768 Kg a 7147 Kg/ton de mandioca processada
contendo aproximadamente 11000 mg/L de sólidos totais, 10,5 a 13 mg/L de cianeto
e uma demanda química de oxigênio (DQO) de 11864 a 15570 mg/L e (Tabela 5).
46
Tabela 5 Composição da água vegetal gerada no processo de produção de polvilho
em Santa Rosa do Sul (SC)
Parâmetros
Empresas
A B C
DQO (mg/L) 14.097 15.570 11.864
N (mg/L) 439,95 443,20 343,20
P(mg/L) 4,93 6,28 0,85
Sólidos totais(mg/L) 11.967 11.692 10.999
CN(mg/L) 10,50 13 11
Sólidos sedimentáveis(mg/L) 74 96 54
PH 4,9 3,7 5,5
Fonte: Lima (2001).
Siller e Winter (1998), relatam que dependendo do teor de glicosídeos
cianogênicos da mandioca utilizada na fabricação do amido, a concentração de
cianídeos no líquido residual pode chegar até a 200 mg/L.
A presença de cianeto ou compostos cianogênicos na água tem efeito
significativo sobre a atividade biológica dos ecossistemas. A maioria das indústrias
de processamento de mandioca utiliza como única forma de tratamento, a
degradação natural, que consiste no confinamento do efluente sob a ação natural
dos seguintes fatores: volatilização de HCN, hidrólise do cianeto livre e complexado,
fotodecomposição, precipitação de compostos insolúveis e ação microbiana local.
Este processo é lento e acarreta a retenção destes resíduos nestes locais por longo
tempo (PANTAROTO; CEREDA, 2001)
A manipueira foi sempre desprezada sem qualquer aproveitamento
econômico. Mas, atualmente, tem sido vista como subproduto passível de ser
aproveitado em outras atividades (PANTAROTO; CEREDA, 2001)
Conforme Damasceno et al. (2003), alternativas para utilização dos resíduos
são necessárias para diminuir a poluição ambiental e aumentar o valor destes
resíduos. Pesquisas têm sido realizadas para encontrar aplicações úteis dos
efluentes das indústrias de produtos de mandioca. O resíduo líquido pode ser fonte
de material bruto para processos fermentativos, como a produção de biomassa
lipídica, produção de biogás, ácido cítrico e fertirrigação (PANTAROTO; CEREDA,
2001).
47
A composição do resíduo líquido de uma indústria de farinha de mandioca em
São Paulo, analisada por Damasceno et al. (2003), pode ser visualizada na Tabela
6. Uma das alternativas para a utilização deste resíduo é como substrato para o
cultivo de
Geotrichum fragrans
, um microrganismo aeróbio também isolado do
resíduo líquido, resistente ao cianídeo. Este microrganismo produz aroma de frutas a
partir de compostos voláteis (DAMASCENO et al., 2003). Os compostos voláteis
identificados por Damasceno et al. (2003), utilizando este resíduo para o cultivo de
Geotrichum fragrans
após 72 horas de fermentação foram: 1-butanol, 3-metil 1-
butanol (álcool isoamílico), 2-metil 1-butanol, 1-3 butanodiol e feniletanol, acetato de
etila, propionato de etila, 2-metil etil propionato e ácido 2-metil propanóico
Tabela 6 Composição do resíduo líquido de uma fábrica de
farinha de mandioca (São Paulo)
Componentes Concentração
pH
sólidos totais (g/L)
Açúcares totais (g/L)
Açúcares redutores(g/L)
Frutose(g/L)
Glicose (g/L)
Maltose (g/L)
Açúcares não redutores(g/L)
Dextrinas (g/L)
Sacarose (g/L)
Nitrogênio total (g/L)
Fósforo (mg/L)
Potássio (mg/L)
Cálcio (mg/L)
Magnésio (mg/L)
Enxofre (mg/L)
Ferro (mg/L)
Cobre (mg/L)
5,5
62
58,2
38
14,9
22,3
0,8
20,2
1,5
18,7
1,6
83,3
895
184
173
38
8
0,8
Fonte: Damasceno et al. (2003)
48
Cárdenas e Buckle (1980), relatam que na fermentação do amido de
mandioca na Colômbia, durante a fermentação, uma camada escura formada na
superfície do amido é retirada até a superfície ficar clara. Este resíduo é denominado
“Mancha” e consiste de amido e material protéico, sendo utilizado para alimentação
animal.
2.8 Análise toxicológica
A Resolução nº16 de 30 de abril de 1999 (BRASIL, 1999) define como
alimentos novos e/ou novos ingredientes, os alimentos ou substâncias sem histórico
de consumo no País, ou alimentos com substâncias já consumidas, e que,
entretanto venham a ser adicionadas ou utilizadas em níveis muito superiores aos
alimentos utilizados na dieta regular e estabelece a exigência de comprovação de
segurança de uso através de ensaios nutricionais e ou fisiológicos e ou toxicológicos
em animais de experimentação, ensaios bioquímicos, entre outros.
Os estudos de toxicidade são geralmente divididos em três categorias:
estudos de toxicidade aguda, envolvendo a administração de uma dose única da
substância teste ou diversas administrações em um período de 24 horas; estudos
sub-agudos e subcrônicos, onde repetidas administrações são feitas em um período
correspondente a 10 % da vida média da espécie animal utilizada (3 meses no rato)
e estudos crônicos cujo período de experimentação envolve a vida toda do animal
ou a maior fração dela (24 meses no rato) (BRITO, 1994; LU, 1996).
Os estudos de toxicidade aguda são utilizados para uma avaliação
toxicológica preliminar, fornecendo informações sobre os riscos resultantes de uma
exposição de curta duração e para a determinação da dose letal mediana (DL
50
), isto
é, a dose necessária (mg/kg de peso) da substância em estudo para provocar a
morte de 50 % dos animais submetidos ao teste. Estes estudos também servem de
guia para as doses a serem utilizadas em estudos mais prolongados (BRITO, 1994;
LU, 1996, BARLOW, et al., 2002).
Os animais utilizados para os testes de toxicidade aguda são o rato e o
camundongo, macho e fêmea, jovem ou adulto, em número não inferior a 10 para
cada dose experimental (BRITO, 1994; LU, 1996). Segundo LU (1996), quando os
valores de DL
50
forem muito diferentes nestes dois animais e quando o padrão ou
49
taxa de biotransformação é significantemente diferente em humanos, é desejável
realizar o teste com uma espécie não roedora.
Geralmente, a via de administração da substância tóxica a ser utilizada deve
ser a mesma via a que o ser humano estará exposto. A via oral é a mais utilizada,
apesar de apresentar desvantagens, pois a substância em estudo pode não ser
totalmente absorvida e os compostos ativos podem ser seqüestrados pelo fígado. A
substância teste é administrada em dose única por gavagem, utilizando-se sonda
gástrica ou cânula apropriada (LU, 1996).
A dose a ser administrada de uma só vez, depende da espécie e do porte dos
animais utilizados. Para roedores, quando a via escolhida for oral ou intraperitoneal,
esse volume não deve exceder 1mL/100g de peso corporal, para o caso de
substâncias aquosas (BRITO, 1994).
Após a administração da substância teste, além de avaliar o número de
mortes para o cálculo da DL
50
, é muito importante avaliar os sintomas de toxicidade
gerais, efeito sobre a locomoção, comportamento, respiração, entre outros (LU,
1996).
O período de observação usualmente é de 7 a 14 dias, mas depende das
condições dos animais. Se estes demonstrarem muito sofrimento devem ser
sacrificados. Todos os animais, inclusive os que morrerem durante o teste ou foram
removidos devem ser submetidos à necropsia (BRITO, 1994; LU, 1996; OECD,
2001). Necropsia e análise histopatológica pode indicar os órgãos alvos da
toxicidade, auxiliando nos testes subseqüentes (BARLOW, et al., 2002).
Como os seres humanos estão mais freqüentemente expostos a níveis muito
menores do que as doses que causam toxicidade aguda e por longos períodos, os
estudos de dose repetida ou toxicidade subcrônica fornecem dados mais realistas de
toxicidade (LU, 1996; BARLOW, et al., 2002). O objetivo principal deste teste é
determinar os efeitos da exposição diária a um alimento ou substância química
durante períodos de um mês ou mais (BARLOW, et al., 2002).
Nos estudos, realizados após a obtenção dos dados de toxicidade aguda, é
avaliado o peso corpóreo dos animais, consumo de alimentos, observações da
aparência e comportamento, testes laboratoriais, análises patológicas e histológicas
(LU, 1996), por um período experimental de 28 ou 90 dias (BRITO, 1994; LU, 1996;
OECD, 2001; BARLOW, et al., 2002).
50
2.9 Tecnologia Limpa e o processamento de alimentos
A consideração com os resíduos industriais vem crescendo nos últimos anos,
principalmente devido aos alertas ambientais que a natureza tem oferecido. Em
1992, no Rio de Janeiro, representantes de todo o mundo estiveram reunidos, na
Rio 92, para traçar ações mais efetivas para a manutenção da qualidade ambiental
do planeta (JORDAN, 1994).
Novos projetos industriais, obrigatoriamente, consideram o programa de
minimização de resíduos tão importantes quanto o próprio processamento do
produto alvo. Para a indústria de alimentos, as obrigações não são diferentes
(AMANTE, 1997). A maioria dos projetos que visam a minimização do impacto
ambiental realiza tratamento de resíduos, empregando as chamadas
end-of-pipe
technologies
. Porém, a prática tem mostrado, que muitos resíduos sólidos,
suspensos ou solúveis nos efluentes industriais, podem servir de matérias-primas.
Adicionalmente, o comportamento dos envolvidos com o processo, pode contribuir
para sistemas, mesmo antigos, porém, repensados sob o ponto de vista do
desperdício, que culmina com poluição (AMANTE, 1997).
Sob os conceitos da Tecnologia Limpa (
Cleaner Technology
) ou Produção
Limpa (
Cleaner Production
), cada etapa do processo é analisada, chegando aos
resíduos gerados e às suas características para utilização como matérias-primas em
outros produtos (HUISINGH; BAAS, 1991).
As pequenas empresas, tais como as processadoras de polvilho azedo, não
devem ficar fora destas tendências. Cardoso, (2005), indica as vantagens e
desvantagens para o emprego da manipueira na agricultura. No entanto, devido à
pequena quantidade liberada, as águas sobrenadantes da produção do polvilho
azedo, não têm sido alvo de pesquisas.
51
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material
O amido de mandioca utilizado para a fermentação em laboratório, foi obtido
das fecularias de Rio do Sul e Tubarão (Santa Catarina). A água da fermentação
industrial foi coletada em uma polvilharia de Santa Rosa.
3.2 Obtenção da água de fermentação do amido de mandioca em
Laboratório
Amido de mandioca foi submetido à fermentação natural em triplicata, com a
adição de 0,5% de glicose em relação ao leite de amido, conforme Marcon (2004),
em recipientes plásticos, contendo 6,4 Kg de amido, 24 litros de água e 140 g de
glicose. O índice de acidez e o pH foram medidos diariamente até que atingissem a
acidez mínima de 2 mL de NaOH N/100mL. Esta água foi então removida, filtrada
em pano dessorador, envasada em garrafas de vidro, fechadas com rolhas de
cortiça e armazenadas sob refrigeração em disposição aleatória para posterior
análise.
As águas residuais das polvilharias, foram coletadas ao término da
fermentação, conforme o produtor, em triplicata, filtradas e armazenadas da mesma
forma que as águas obtidas em laboratório. O pH e a acidez foram medidos no prazo
máximo de 24 horas.
3.3 Caracterização química da água de fermentação do amido de
mandioca em laboratório
A determinação do pH foi realizada com pH-metro (Pocket Ad 110 pH) e o
índice de acidez calculado em mL de NaOH N por 100 mL e em gramas de ácido
lático por 100 mL (AOAC, 1998), lipídios, proteínas, cinzas e sólidos totais foram
determinados conforme metodologia descrita na AOAC (1998). A determinação de
52
sólidos totais foi realizada através de secagem em estufa a 60°C até peso constante
e os carboidratos totais determinados por diferença.
A Demanda Química de Oxigênio (DQO) foi determinada pelo método de
refluxo conforme metodologia recomendada pela APHA (1995), para análise de
água e água residual.
A concentração de HCN foi determinada através método colorimétrico de
leitura visual utilizando o Kit CHEMets
cianeto K-3810 (CHEMetrics) baseado no
procedimento ácido isonicotínico/ácido barbitúrico (NAGASHIMA,1981). Cloro é
adicionado a uma amostra que tenha sido tamponada para pH 6. O cloreto
resultante reage com ácidos para formar uma cor azul. Os resultados são expressos
em mg/L (ppm) CN, sendo que a faixa de detecção de CN deste método é de 0 a 1
ppm.
O teor de açúcares redutores foi determinado pelo método
espectrofotométrico do ácido 3, 5 dinitrossalicílico (DNS) (VILELA; BACILA;
TASTALDI, 1973).
As fermentações, as coletas e as análises das águas residuais foram
realizadas em triplicata e os resultados expressos como média e desvio padrão.
3.4 Análises Microbiológicas
As amostras industriais foram coletadas diretamente dos tanques de
fermentação, em frascos esterilizados, em uma polvilharia de Santa Rosa, localizada
no Sul de Santa Catarina quando indicado pelo produtor como término da
fermentação e mantido sob refrigeração por no máximo 24 horas para análise. As
amostras da fermentação em laboratório foram coletadas diretamente das cubas de
fermentação ao término da fermentação e incubadas em meio apropriado.
A contagem de bactérias mesófilas, bactérias láticas, bolores e leveduras do
líquido sobrenadante no final da fermentação, foi realizada através de metodologia
descrita pela APHA (2001). A contagem de bactérias ácido láticas foi realizada em
agar MRS (De Man, Rogosa & Sharp Agar, Biolife Italiana Srl) em jarro sob
anaerobiose (Anaerogen, Oxoid) temperatura de 32°C por 48 horas, bactérias
mesófilas aeróbias em ágar padrão para contagem - PCA (Plate Count Agar, Oxoid
CMO 325), em aerobiose a temperatura de 32°C por 48 horas e a contagem de
53
bolores e leveduras em Agar Dextrose Batata (Potato Dextrose Agar, Oxoid CMO
139), acidificado com ácido tartárico, em aerobiose a 25°C por 3 a 5 dias.
Para identificação das bactérias ácido láticas, as colônias foram isoladas, e
purificadas em Agar MRS e diferenciadas em grupos através de microscopia, reação
de gram, teste de catalase, motilidade, produção de gás de glicose. Os lactobacilos
foram identificados através do Kit Api 50 CHL (Biomerieux).
Para avaliar a ocorrência de diferença significativa no número de bactérias
láticas, mesófilas e bolores e leveduras, entre as diferentes fermentações, foi
realizada análise de variância (ANOVA) seguida do teste de Tukey.
3.5 Análise de micotoxinas
Para verificar a presença de micotoxinas na água de fermentação foi utilizado
o método de análise de multitoxinas por cromatrografia de camada delgada
conforme Soares e Rodriguez-Amaya (1989), cujo limite de detecção é de 2
µ
g/Kg
para Aflatoxinas, 5
µ
g/Kg para Ocratoxina A e 55
µ
g/Kg para Zearalenona. As
análises foram realizadas em triplicata no Laboratório de Micotoxinas e
Contaminantes Alimentares da Universidade Federal de Santa Catarina
3.6 Teste de toxicidade
3.6.1 Animais
Os protocolos experimentais foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso
de Animais da Universidade Federal de Santa Catarina sob protocolo nº 302/CEUA e
23080.016129/2004-24/UFSC. Camundongos (
Mus musculus),
fêmeas, pesando
entre 24 e 28 g e ratos (
Rattus norvergicus,
linhagem Wistar) pesando entre 60 e 75
g, de ambos os sexos foram fornecidos pelo Biotério Central da Universidade
Federal de Santa Catarina e os experimentos realizados no Laboratório de Nutrição
Experimental da mesma Universidade. Os animais foram mantidos por uma semana
em grupos de 3-5 animais, em gaiolas de polipropileno de 410 mm x 340 mm x 180
mm, com uma grade de cobertura em aço inox e forradas com maravalha,
54
recebendo água e ração comercial (Nuvilab CR-1, Nuvital®) à vontade, em ambiente
climatizado (22 a 24° C, iluminação artificial, com ciclo claro/escuro de 12 horas).
3.6.2 Toxicidade aguda
Para os ensaios de toxicidade aguda, camundongos foram divididos em dois
grupos de seis animais, sendo que um grupo (grupo teste) recebeu a água residual
da fermentação do amido de mandioca proveniente de Rio do Sul obtida em
laboratório, concentrada por liofilização, via gavagem, na dose de 5 g por quilograma
de peso, veiculada em água destilada e outro grupo (grupo controle) recebeu,
também por gavagem, água destilada no mesmo volume administrado ao grupo
teste. Após a aplicação, os animais foram mantidos em grupos de três animais, em
gaiolas de polipropileno, permanecendo em jejum nas primeiras quatro horas. Os
sinais clínicos de toxicidade (alteração de pêlos, pele e mucosas, comportamento;
tremores, diarréia, convulsões, respiração, cianose, etc), foram observados em
intervalos de cinco e 30 minutos, uma, duas, quatro e vinte e quatro horas e a cada
24 horas por 14 dias após a administração do produto. Após este período os animais
foram submetidos à eutanásia, em sala isolada, em câmaras de saturação com éter
e o fígado retirado e pesado (BRITO, 1994).
3.6.3 Toxicidade subcrônica ou dose repetida - 28 dias
Após uma semana de aclimatação os ratos foram distribuídos em quatro
grupos de 10 animais (5 machos e 5 fêmeas), alocados individualmente em gaiolas
metabólicas de aço inoxidável recebendo oralmente a água extraída do processo de
fermentação do amido de mandioca, em três concentrações diferentes, 0 %
(somente água), 25 %, 50 % e 100% do produto, diluídas em água potável e ração
comercial à vontade durante 28 dias. O peso corporal foi registrado no início do
experimento e semanalmente durante todo o período experimental. O consumo de
alimentos foi medido duas vezes por semana e de líquido diariamente e calculados
como consumo médio diário por rato. O comportamento e sinais clínicos foram
observados diariamente durante todo o experimento. No final do experimento, após
jejum de 16 horas, os animais foram anestesiados com éter etílico e amostras de
sangue foram coletadas por punção cardíaca, para análises bioquímicas e
55
hematológicas. Os animais foram então sacrificados através de inalação de éter
etílico e submetidos a uma autópsia geral. Os órgãos: fígado, rim esquerdo,
coração, baço e pulmão foram retirados e pesados (OECD, 1995; BRITO, 1994).
3.6.4 Parâmetros bioquímicos e hematológicos
Os seguintes parâmetros hematológicos foram medidos em amostras de
sangue coletadas utilizando EDTA (ácido etilenodiaminotetracético
)
como
anticoagulante: leucócitos (LEU), eritrócitos (ERI), hemoglobina (HGB), hematócrito
(HCT), volume corpuscular médio (VCM), hemoglobina corpuscular média (HCM),
concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM), plaquetas (PLQ), volume
médio de plaquetas (VMP), linfócitos (LIN), monócitos (MON), neutrófilos (NEU),
eosinófilos (EOS), basófilos (BAS). Todos os parâmetros foram medidos em um
analisador hematológico de 26 parâmetros automatizado ABX PENTRA 120
(HORIBA ABX Diagnostics). As análises do tempo de ativação da protrombina (TAP)
foram feitas em amostras de sangue coletadas em tubos contendo citrato de sódio
como anticoagulante utilizando analisador automatizado de coagulação sanguínea
Sysmex® CA-1500 (Sysmex America, Inc.).
Medidas de colesterol (CHOL), lipoproteína de baixa densidade (LDL),
lipoproteína de alta densidade (HDL), triglicerídeos (TGL), creatinina (CREA),
fosfatase alcalina (ALP), glicose (GLU), aspartato transaminase (AST), alanina
aminotransferase (ALT), proteínas totais (PT), albumina (ALB), sódio (Na),
potássio(K), cloreto (Cl) foram determinadas no soro após a centrifugação (2500 rpm
por 15 minutos) das amostras de sangue, utilizando um sistema de química clínica
DADE Dimension
RXL(Dade International Inc.).
Todas as análises sanguíneas foram realizadas no Laboratório de Análises
Clínicas do Hospital Universitário da Universidade Federal de Santa Catarina.
3.6.5 Analise histológica
Para avaliação histológica, foram retirados fragmentos de intestino
delgado de 2 cm de comprimento, em ponto localizado a 5 cm distalmente ao ângulo
de TREITZ. As peças retiradas foram imersas em solução aquosa de cloreto de
sódio a 0,9% e fixadas em solução de formol a 10%. A seguir, as peças foram
56
submetidas ao processo de inclusão em parafina, seccionadas em micrótomo para
obtenção de cortes histológicos de 10 µm de espessura segundo um mesmo plano
de corte transversal. As lâminas foram coradas empregando-se o método da
Hematoxilina-Eosina. A análise das lâminas foi realizada em microscópio óptico
convencional, utilizando-se objetiva de 4x e 10x. Os parâmetros de análise
histopatológica utilizados foram ausência ou presença de lesão tecidual, tais como:
perda de revestimento epitelial (lesão leve); presença de infiltrado inflamatório na
lâmina própria da mucosa (lesão moderada); destruição das vilosidades intestinais
com presença de infiltrado inflamatório (lesão intensa).
3.6.6 Análise estatística
Todos os resultados do teste de toxicidade são apresentados como média e
desvio padrão. O ganho de peso e o peso do fígado dos camundongos no teste de
toxicidade aguda foram analisados através do teste t de Student. A comparação
entre os grupos do teste subaguda foram feitas através de análise de variância
(ANOVA) de uma via, considerando um nível de significância de p <0,05, com pós
teste de Dunnett para comparação com o controle. Para verificação das suposições
do modelo foram utilizados a análise de resíduos e o teste de Bartlet. Quando
ocorreu heterogeneidade de variâncias foi utilizado o teste não paramétrico de
Kruskal Wallis, seguido do teste de Mann-Whitney.
57
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Composição química da água residual da fermentação do amido
de mandioca
A fermentação do amido de mandioca pode ocorrer com baixo nível de água
ou com água em excesso, ou seja, uma camada de água de 20 cm
aproximadamente. A adição de excesso de água é prática comum nas indústrias de
polvilho azedo do Brasil e da Colômbia (CARDENAS ; BUCKLE, 1980), no entanto
algumas indústrias utilizam-na apenas para iniciar o processo, apesar desta prática
comprometer a qualidade do polvilho azedo, devido à distribuição heterogênea dos
microrganismos envolvidos na fermentação.
A água residual da fermentação do amido de mandioca apresentou pobre
composição, quando comparada à do processo de extração do amido de mandioca.
A Tabela 7 apresenta a composição da água residual da fermentação do amido de
mandioca obtido neste estudo.
Tabela 7 Sólidos totais, cinzas e nitrogênio total na água residual da fermentação do
amido de mandioca.
Fécula
Sólidos totais
(mg/L)
Cinzas
(mg/100mL)
N total
(mg/100mL)
Rio do Sul 1.700
±
500
7,00
±
2,00
1,00
±
0,01
Santa Rosa 6.000
±
100
65,00
±
3,00
-
Tubarão 3.600
±
600
19,00
±
1,00
1,30
±
0,01
Tubarão + Rio do
Sul
2.200
±
300
19,00
±
1,00
0,60
±
0,10
58
Enquanto a manipueira apresenta teores de sólidos totais entre 5.800 e
56.460 mg/L, de acordo com Lamo e Menezes (1979) (Tabela 8), a água residual da
fermentação do polvilho azedo estudada neste trabalho apresentou valores entre
1700 e 6000 mg/L (Tabela 7). A avaliação da Demanda Química de Oxigênio
revelou que a água da fermentação do amido de mandioca apresentou valores de
5.186,8 a 7204,1 mg/L, o que está próximo dos valores mínimos encontrados para a
manipueira, conforme pode ser observado na Tabela 8. Os valores médios para
açúcares redutores foram 2,75
±
0,56 mg/100g, próximos ao limite inferior dos
valores publicados para os efluentes de fecularias, apresentados na Tabela 8.
Tabela 8 Composição média da água residual da extração do amido de mandioca.
pH 3,8 – 5,2
Volume (m
3
) 10 a 13
Acidez em ácido lático (g/100 mL) ND
Sólidos totais (mg/L) 5.800 – 56.460
DQO (mg/L) 6.280 – 51.200
DBO (mg/L) 1.400 – 34.300
Nitrogênio Total (mg/L) 140 – 1.150
Minerais (mg/L) 350 - 800
Açúcares redutores (mg/100g) 2,30 – 8,20
Adaptado de Lamo e Menezes (1979) ND – não determinado.
Não foi detectado ácido cianídrico nestas águas residuais com a metodologia
utilizada, uma vez que a fermentação em laboratório foi realizada a partir do amido
de mandioca comercial e praticamente todo o ácido cianídrico é eliminado durante a
extração do amido (CEREDA, 2001). Além disso, diversos autores relataram a
eliminação deste composto nos processos de fermentação da mandioca (AMOA-
AWUA; APPOH; JAKOBSEN, 1996; ONABOLU et al., 2002, OBILIE; TANO-
DEBRAH; AMOA-AWUA, 2004).
Os resultados das diferentes condições de fermentação realizadas neste
estudo e a respectiva acidez em mL de NaOH N/100mL e a correspondente
concentração de ácido lático (gramas de ácido lático/100mL) estão apresentados na
Tabela 9. Ressalta-se que as fermentações realizadas em laboratório foram mais
59
rápidas, devido ao uso da fermentação modificada segundo Marcon (2004) enquanto
o da indústria ocorreu pelo método tradicional, sem o emprego de xarope de
glucose.
O pH variou de 3,0 a 3,7 e a acidez de 0,19 a 0,62 g de ácido lático /100mL. A
água residual obtida na polvilharia de Santa Rosa com 30 dias de fermentação foi a
que apresentou maior acidez, e o menor pH ocorreu na fermentação do amido
procedente de Rio do Sul. No entanto, o pH não parece estar relacionado com o
tempo de fermentação, uma vez que as fermentações de 11 (Rio do Sul) e 12
(Tubarão) dias apresentaram pH de 3,4 e 3,8 respectivamente.
Tabela 9 Origem da fécula, época do ano, tempo de fermentação acidez e pH da
água de fermentação do amido de mandioca na produção do polvilho azedo.
Fécula
Local de
fermentação
Época
do ano
Tempo de
fermentação
(dias)
Acidez
(mL NaOH
N/100mL)
Acidez
(g ácido
lático/100mL)
pH
Rio do Sul LFH abril 17
2,79 ± 0,15 0,25± 0,013 3,0 ± 0,06
Rio do Sul LFH out 17
2,60 ± 0,27 0,23 ± 0,024 3,2 ± 0,12
Santa Rosa Polvilharia maio 22
3,17± 0,47 0,28 ± 0,43 3,4 ± 0,06
Santa Rosa Polvilharia julho 30
6,85 ± 0,26 0,62 ± 0,24 3,2 ± 0,03
Tubarão LFH out 12
2,54 ± 0,34 0,22 ± 0,032 3,4 ± 0,0
Rio do Sul LFH fev 11
2,51 ± 0,53 0,22 ± 0,047 3,7 ± 0,06
Tubarão +
Rio do sul
LFH fev 17
2,11 ± 0,13 0,19 ± 0,012 3,2 ± 0,17
LFH = Laboratório de Tecnologia de Frutas e Hortaliças
O acompanhamento do processo de produção do polvilho azedo, pelo método
tradicional e com glicose, realizado por Marcon (2004), indicou intensa redução do
pH nos quatro primeiros dias de fermentação, com reduções menores até a
estabilização, entre o décimo e o décimo terceiro dia de fermentação, variável
segundo a origem da fécula em fermentação. Esta variação entre diferentes amidos
também foi encontrada por outros autores (CEREDA; LIMA, 1981; CEREDA, 1987,
1993; CEREDA; BONASSI, 1985; CEREDA; GIAJ-LEVRA, 1987; ASCHIERI;
VILELA, 1995; SRIROTH et al., 1999; DEMIATE et al, 1999; CHATAKANONDA et
al., 2003).
60
Segundo Marcon (2004), ao contrário do ocorrido com o pH, o valor de
acidez titulável na água de fermentação aumenta, ocorrendo variações entre o
tempo de fermentação e o índice de acidez sendo, então, utilizado um índice de
acidez de 2 mL de NaOH N como padrão para determinar o final da fermentação.
A acidez e o pH das águas da fermentação do amido de mandioca estão de
acordo com os valores da literatura. Cárdenas e Buckle (1980), acompanharam a
acidez das águas do processamento do polvilho azedo, obtendo valores de acidez
em ácido lático ao redor de 0,42 e 0,64 g/100 mL. Demiate et al. (1999) encontraram
valores entre 0,013 e 0,813 g/100g para o polvilho azedo, enquanto para este
trabalho a acidez determinada para as águas residuais esteve entre 0,19 e 0,62
g/100 mL. De acordo com Cereda et al. (2003), variações na acidez são atribuídas
aos processos de fermentação não controlados que predominam na obtenção do
polvilho azedo.
Demiate et al. (1999) analisando 30 amostras de polvilho azedo encontraram
uma predominância de ácido lático, variando de 38,2 a 100 % dos ácidos orgânicos
analisados. Outros ácidos orgânicos encontrados em menores concentrações foram:
acético, propiônico e butírico. A proporção de 38,2 % de ácido lático encontrado por
Demiate et al. (1999), foi uma exceção. Em todas as outras 29 amostras analisadas,
o ácido lático representou uma proporção superior a 67,2 %. Portanto, considera-se
que o ácido lático é responsável por cerca de 50 % da acidez das águas residuais
da produção do polvilho azedo. As amostras estudadas pelos autores foram
amostras de polvilho azedo e não das águas da fermentação, objetivo deste
trabalho. A concentração de ácido lático no polvilho azedo é geralmente mais alta
comparativamente às águas estudadas. Considerando os resultados para o
conteúdo de ácidos orgânicos da fermentação do amido encontrados na literatura,
as águas da fermentação do polvilho azedo, por solubilizarem estes ácidos, podem
representar uma alternativa para a produção do ácido lático.
A fermentação do amido tem sido estudada em condições controladas para a
produção de ácidos orgânicos, por vários pesquisadores (ALTAF; NAVEENA;
REDDY, 2007; ANURADHA; SURESH; VENKATESH, 1999; JOHN; NAMPOOTHIRI;
PANDEY, 2006). John, Nampoothiri e Pandey (2006), descreveram que um dos
principais obstáculos para a produção do ácido lático em grande escala está no
custo das matérias-primas. Os autores empregaram resíduos da indústria do açúcar
e do amido de mandioca para produzir ácido lático através de fermentação semi-
61
sólida, usando
Bacillus delbrueckii
como inóculo, produzindo aproximadamente 250
mg de ácido lático por grama de sólidos em um processo otimizado de fermentação,
com um coeficiente de conversão maior do que 99 % do açúcar total disponível para
ácido lático.
Através de sacarificação e fermentação simultânea, Anuradha, Suresh e
Venkatesh (1999), obtiveram produtividade de 1,21 g/L de ácido lático usando 250
g/L de amido de batata no meio de cultura. Altaf, Naveena e Reddy (2007),
produziram ácido lático de amido de lentilha vermelha como fonte de carbono e
obtiveram, sob condições controladas, 13,5 g de ácido lático/15,2 g de amido.
É importante considerar que os trabalhos descritos foram desenvolvidos em
processos de fermentação controlados para a produção do ácido lático, enquanto os
ácidos orgânicos produzidos na fermentação do polvilho azedo não são valorizados
como produtos, são considerados como carga orgânica poluente em um efluente
industrial.
Os resultados apresentados na Tabela 10 comparam a produção do ácido
lático sob condições controladas, no polvilho azedo e nas águas residuais do seu
processo de produção.
Tabela 10 Produção do ácido lático usando amido como fonte de carbono em
condições controladas e em fermentação natural
Fermentação
Matéria-prima
Produtividade
(mg ácido/g matéria
seca)
Referência
Amido de batata 756
Anuradha et al.
(1999)
Farinha de
lentilha vermelha
890 Altaf et al. (2007)
Controlada
Bagaço de cana
e de mandioca
240 John et al. (2006)
Fermentação do
amido de
mandioca, não
controlada
Amido de
mandioca
4,0
Demiate et al.
(1999)
*Água residual da
fermentação do
amido de
mandioca, não
controlada
Amido de
mandioca
15,04 Trabalho atual
*Tanque de fermentação 26,66 g de amido por 100 mL de água [15,04 = (0,19+0,62)/2/26,66]; 0,19 e
0,62 – Dados da Tabela 9.
62
A produtividade de 15,04 mg de ácido lático/g de amido obtido em laboratório
foi pequena, 1,5 %. Esta baixa percentagem de bioconversão é devido à hidrólise
natural do amido, sendo pequena a quantidade de açúcar resultante da ação das
enzimas amilolíticas quando comparada às fermentações controladas, realizadas
com meio MRS com açúcares diretamente fermentescíveis, onde podem ser
registrados rendimentos de até 78 % (OHKOUCHI; INOUE, 2007). Porém este ácido
não representa o único produto da fermentação. Outros ácidos orgânicos como o
propiônico, butírico e acético são típicos para este tipo de fermentação (DEMIATE et
al., 1999), apesar de não estarem sendo considerados nesta oportunidade.
Publicações recentes (DING; TAN, 2006; SINGH et al., 2006) tratam de
fermentações controladas, o que contrasta com a produção natural do ácido lático a
partir das águas da fermentação do amido de mandioca na produção do polvilho
azedo.
Comparativamente às outras fontes de carbono (Tabela 10), o amido de
mandioca utilizado no processo fermentativo para a produção do polvilho azedo,
dentre os trabalhos publicados, apresenta o menor rendimento em ácido lático. No
entanto a concentração é maior na água residual do que o encontrado no trabalho
de Demiate et al. (1999) no polvilho azedo, o que pode indicar estudos posteriores
devido à presença deste importante aditivo químico nas águas residuárias do
processo de produção do polvilho azedo, ainda considerado como poluente
orgânico.
O uso industrial da água nos tanques de fermentação está em torno de 0,12
m
3
por tonelada de amido. Considerando a produção do polvilho azedo em regiões
específicas, com uma grande concentração de pequenas unidades industriais na
Argentina, Colômbia, Equador, Paraguai e Brasil, o uso destas águas residuais
poderia ser estudado para novas aplicações e oportunidades para aumentar a renda
de pequenas empresas. Pequenas indústrias poderiam fornecer as águas residuais
como matéria-prima para novas unidades com tecnologias adequadas para a
exploração dos ácidos orgânicos destes efluentes.
De acordo com Chuzel (2001), a produção anual de polvilho azedo no Brasil
está em torno de 22.000 a 24.000 toneladas, com algumas unidades processando
de 2 a 5 toneladas de raiz e outras 100 toneladas por dia. A perda media diária de
ácido lático como poluente por tonelada de polvilho azedo produzido está em 15,04
kg. As águas residuais de uma região produtora poderiam justificar futuros estudos
63
técnicos e econômicos com a finalidade de conversão deste resíduo em matéria-
prima na produção de ácidos orgânicos.
Adicionalmente aos ácidos orgânicos, apesar da baixa concentração dos
sólidos totais, as células microbianas e os demais compostos presentes nas águas
devem ser investigados com o interesse na conversão desta água residual em um
novo produto para as polvilharias. O polvilho azedo poderia ser produzido em uma
indústria com base biotecnológica, transformando o atual processo empírico em um
processo adequado para a utilização completa dos derivados, sem geração de
resíduos.
Sob o ponto de vista da concentração de material orgânico, efluentes
agroindustriais têm sido considerados materiais indesejáveis, no entanto poucos
efluentes têm sua composição estudada, de modo que sólidos solúveis e insolúveis
analisados sob os conceitos das Tecnologias Limpas, da valorização e minimização
de resíduos, possam ser convertidos em matérias-primas. De acordo com este
trabalho, as águas residuais da produção do polvilho azedo devem ser estudadas,
contribuindo para novas oportunidades de negócios para as agroindústrias.
As bactérias láticas estão sendo associadas a alimentos benéficos à saúde
humana (LUCKOW; DELAHUNTY, 2004; RAKIN et al., 2007). Esta tendência indica
a necessidade de estudos de caracterização microbiológica de materiais produzidos
através da fermentação lática tais como o polvilho azedo.
4.2 Análises microbiológicas
A contagem de bactérias em meio MRS (BAL) e em PDA (bolores e
leveduras), em log UFC/mL das amostras de águas residuais das diversas
fermentações de amido de mandioca realizadas em laboratório (Rio do Sul, Tubarão
e Tubarão + Rio do Sul) e obtidas em uma polvilharia (Santa Rosa), o respectivo
tempo de fermentação (dias) e acidez (% ácido lático) são apresentados na Tabela
11.
64
Tabela 11 Tempo de fermentação (TF), acidez, pH e contagem de bactérias ácido
láticas (BAL), bactérias mesófilas e bolores e leveduras da água residual da
fermentação do amido de mandioca.
Origem
TF
(dias)
Acidez
(g/100mL ácido
lático)
pH
BAL
(UFC/mL)
Bactérias
Mesófilas
(UFC/mL)
Bolores e
leveduras
(UFC/mL)
Rio do Sul
17
0,23 ± 0,024
3,3 5,27
a
6,92 6,99
Santa Rosa
30
0,62 ± 0,24
3,2 7,84
b
8,02 5,92
Tubarão
12
0,22 ± 0,032
3,4 7,73
b
n.d. 5,56
Rio do Sul
11
0,22 ± 0,047
3,8 5,80
a
6,57 6,15
TB+ RS
*
17
0,19 ± 0,012
3,3 7,59
b
6,39 6,37
Letras diferentes na mesma coluna diferem a p<0,05 (Teste Tukey)
*
Mistura de féculas de Tubarão e Rio do Sul
n.d.:não determinado
O número de bactérias láticas ao final da fermentação variou de 5,27 a 7,84
log UFC/mL, sendo que a população de bactérias foi maior na fermentação com
fécula de Santa Rosa, Tubarão e no “pool” Tubarão e Rio do Sul (TB+Rio do Sul). A
água residual de Santa Rosa teve um período de fermentação maior que as
fermentações desenvolvidas em Laboratório, além de uma maior concentração de
ácido Lático (0,62g/100mL), no entanto, a contagem de bactérias láticas da água
residual foi semelhante às águas das fermentações de Tubarão e TB+Rio do Sul,
cujo tempo de fermentação foi de 12 e 17 dias e a acidez em torno de 0,20 (g de
ácido Lático/100 mL). A contagem de bolores e leveduras foi semelhante entre as
diferentes águas das fermentações.
A contagem elevada de bactérias mesófilas pode indicar falta de condições
higiênico – sanitárias durante a fermentação, mas segundo Lacerda (2002), estes
números podem representar mais a microbiota total, uma vez que o meio de cultura
utilizado (PCA), possibilita o crescimento de diversos microrganismos. O
crescimento de bactérias láticas, leveduras e
Bacillus
sp foi observado neste meio
(AMOA-AWUA, JAKOBSEN, 1995; CARVALHO et al.,1996,).
Os trabalhos encontrados na literatura (CARDENAS, BUCKLE, 1980;
CARVALHO et al.,1996; LACERDA, 2002) relatam contagem total de bactérias
láticas no amido fermentado em torno de 10
8
UFC/g durante todo o processo
fermentativo.
65
Lacerda (2002), monitorou as fermentações de amido de mandioca de duas
polvilharias na Região de Conceição dos Ouros (MG), 45 dias na polvilharia A e 29
dias na polvilharia B e obteve contagens de bactérias láticas de 10
6
- 10
7
UFC/g, na
pasta de amido fermentado, mesmo com tempo de fermentação diferentes. Neste
estudo também observaram que a contagem de bolores e leveduras, em torno de
10
5
UFC/g, reduziu após 14 dias de fermentação em uma das polvilharias e após 25
dias na outra, sendo que nessa polvilharia a contagem de bolores e leveduras
aumentou após 40 dias de fermentação.
No presente estudo a contagem de bactérias láticas e bolores e leveduras
foram realizadas na água residual da fermentação diferentemente dos trabalhos
citados acima. Podemos observar que a contagem de microrganismos foi
semelhante à obtida no amido fermentado.
A fermentação do amido de mandioca para produção de polvilho azedo é
tradicionalmente realizada a partir da microbiota natural presente no amido de
mandioca. Esta microbiota é constituída principalmente por bastonetes gram-
positivos, identificados como bactérias láticas, homo e heterofermentativas com
predominância do
Lactobacillus plantarum
(CARDENAS, BUCKLE, 1980;
FIGUEROA; DAVILA; POURQUIÉ, 1995; CARVALHO et al.,1996; PARADA;
FABRIZIO; MARTINEZ, 1996; SILVEIRA et al, 2003; LACERDA, 2002).
Colônias da água da fermentação do amido de mandioca proveniente de Rio
do Sul (RS) realizada no Laboratório, e da água obtida na polvilharia de Santa Rosa
(SR) com 17 a 22 dias de fermentação isoladas em agar MRS foram identificadas
como cocos ou bastonetes gram-positivos, catalase negativas, homo e
heterofermentativos (Tabela 12). .
66
Tabela 12 Características bioquímicas das colônias isoladas da água de
fermentação do amido de mandioca.
Amostra Colônias
Formação de
gás da
glicose
catalase Gram Morfologia
RS 1 2 positivo negativo positivo cocobacilos
RS 2 1 positivo negativo positivo
cocobaciloss
SR1 4 negativo negativo positivo cocobacilos
SR2 1 1 negativo negativo positivo
bastonetes isolados
ou diplo
SR2 1 4 negativo negativo positivo
bastonetes isolados
e agrupados
SR2 2 1 negativo negativo positivo
bastonetes + finos
e compridos
SR2 2 2 negativo negativo positivo
bastonetes finos
e agrupados
SR2 2 3 negativo negativo positivo
bastonetes isolados
e agrupados
SR2 3 1 negativo negativo positivo bastonetes em cadeia
SR2 3 2 negativo negativo positivo
bastonetes isolados
ou diplo
SR- Santa Rosa; RS- Rio do Sul
Dez colônias selecionadas (bastonetes anaeróbios, gram(+), catalase (-), não
esporulados que cresceram em Agar MRS) foram analisadas quanto ao perfil de
fermentação de carboidratos pelo kit Api (Tabela 13). Todas as colônias testadas
fermentaram galactose, glicose, frutose, manose, manitol,maltose, sacarose, frutose.
Apenas uma não fermentou a lactose
67
Tabela 13 Fermentação de carboidratos das colônias isoladas da água de
fermentação do amido de mandioca.
Colônias
SR1
4
SR2-3
2
SR2-1
1
SR2-2
3
RS2
1
RS1
2
SR2-2
1
SR2-3
1
SR2-1
4
SR2-2
2
L-arabinose
- - ? - - - - - - +
D-ribose
+ + - + + + + + ? +
D-xilose
- - - - + - - - - -
D-galactose
+ + + + + + + + + +
D-glicose
+ + + + + + + + + +
D-frutose
+ + + + + + + + + +
D-manose
+ + + + + + + + + +
L-ramnose
- - - ? - - - - - ?
Dulcitol
+ + - - - - + - - -
D-manitol
+ + + + + + + + + +
D-sorbitol
+ + - + - + + + - +
Metil D-
manopiranosideo
- - + + - - - - - -
N-
acetilglicosamina
+ + + + + + + + + +
amigdalina
+ + + + + + + + + +
Arbutina
+ + + + + + + + + +
Esculina
+ + + + + + + + + +
Salicina
+ + + + + + + + + +
D-celobiose
+ + + + + + + + + +
D-maltose
+ + + + + + + + + +
D-lactose
+ + + + - + + + + +
Melobiose
+ + + + - + + + + +
D-sacarose
+ + + + + + + + + +
D-trealose
+ + + + + + + + + +
D-melozitose
- - - + - + - - - +
Rafinose
+ + + + - ? + ? ? +
Amido
? - - - ? - - - ? -
Gentobiose
+ + + + + + + - + +
Arabitol
? ? - - - - ? - - ?
Gluconato de
potássio
? ? ? ? ? - ? - ? ?
SR- Santa Rosa; RS- Rio do Sul
A interpretação do perfil de fermentação foi facilitada pela utilização da base
de dados “API-WEB” (BioMérieux) na qual a identificação de um organismo é
acompanhada pela porcentagem de identificação (%ID) que é uma estimativa da sua
proximidade relativa com os diferentes taxons da base de dados (Tabela 14). Este
sistema considera uma boa identificação quando a %ID é acima de 80%. Das
colônias de Santa Rosa analisadas, 5 tem o perfil do
Lactobacillus plantarum
com
boa identificação (Santa Rosa), 2 tiveram baixa %ID como
Lactobacillus plantarum
e
uma com baixa %ID como
Lactococcus lactis ssp lactis.
Das colônias isoladas de
Rio do Sul, uma apresentou baixa % ID como
Lactococcus lactis ssp lactis.
Durante
a fermentação ocorre uma sucessão de diferentes bactérias (FIGUEROA, DAVILA;
68
POURQUIÉ, 1995; CEREDA,1973, citado por DEMIATE, 1999), sendo que no final
da fermentação, somente microrganismos ácido-tolerantes sobrevivem (PARADA;
FABRIZIO; MARTINEZ, 1996).
Tabela 14 Caracterização Fenotípica das colônias isoladas da água de fermentação
do amido de mandioca utilizando o Api-web.
API 50CHL
Colônias
% ID Caracterização fenotípica
SR1-4
88,4
Lactobacillus plantarum
SR2-3-2
88,5
Lactobacillus plantarum
SR2-1-1
98,7
Lactobacillus plantarum
SR2-2-3
99,9
Lactobacillus plantarum
RS2-1
71,8
Lactococcus lactis ssp lactis
RS1-2
n.d
SR2-2-1
69,3
28,6
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus brevis
SR2-3-1
71,8
17,7
Lactobacillus plantarum
Lactococcus lactis ssp lactis
SR2-1-4
Baixa discriminação
SR2-2-2
99,3
Lactobacillus plantarum
SR- Santa Rosa; RS- Rio do Sul
n.d.- não determinado
LACERDA (2002), avaliando duas polvilharias diferentes, observou que na
polvilharia B aos 29 dias de fermentação só foram encontrados
L. acidophilus e L.
manihotivorans. L. plantarum
só foi encontrado até 23 dias de fermentação, na
polvilharia A,
L. fermentum
,
L. acidophilus e L. manihotivorans. L. plantarum
, foram
encontrados com 45 dias de fermentação. Isto demonstra a dificuldade de se
estabelecer um tempo adequado de fermentação para se obter um produto com
determinada microbiota.
Muitas bactérias ácido-láticas são consideradas probióticas por
proporcionarem efeitos benéficos em humanos e animais, aumentando a microbiota
normal no trato gastrointestinal e inibindo as bactérias patogênicas (FULLER,1989,
ADAMS, 1999). Segundo Sanni, Morlon-Guyot e Guyot (2002), as fermentações
69
tropicais podem ser exploradas como fontes de novos probióticos, pois apresentam
cepas tolerantes a sais biliares e pH igual a 2. Nsofor et al. (1996), produziram
iogurte de soja, utilizando como inóculo, exsudato de mandioca fermentada por 24 a
48 horas.
Os resultados obtidos neste estudo sugerem que as águas residuais da
fermentação de amido de mandioca podem ser direcionadas para produção de
bactérias probióticas.
4.3 Micotoxinas
A água residual das fermentações em laboratório com o amido de mandioca
proveniente de Rio do Sul foram analisadas quanto à presença de micotoxinas. Não
foram detectadas Aflatoxinas B1, B2, G1, G2, Ocratoxina A e Zearalenona nestas
amostras. Segundo Westby (2002), micotoxinas não tem sido encontradas em
produtos de mandioca fermentados.
4.4 Análise toxicológica
Para a avaliação toxicológica da água residual da fermentação do amido de
mandioca, foi efetuada a fermentação de uma mistura do amido de mandioca obtido
na região de Rio do Sul e Tubarão (RS+TB). A composição química e a contagem
de bactérias láticas, mesófilas totais e bolores e leveduras encontradas nesta água
são apresentados nas tabelas 15 e 16. A água residual desta fermentação
apresentou baixa concentração de sólidos totais, representado principalmente por
proteínas, açúcares e ácido lático (Tabela 15). A água de fermentação apresentou
em média de 10
6
a 10
7
UFC/mL de bactérias láticas, mesófilas totais e bolores e
leveduras (Tabela 16).
70
Tabela 15 Composição química da água residual da fermentação do amido de
mandioca RS+TB
Parâmetros g/100mL
Sólidos totais
0,21
±
0,035
Lipídios ND
Proteína
1,354
±
0,255
Cinzas
Carboidratos
0,015
±
0,001
0,194
±
0,032
Acidez em ácido lático
0,190
±
0,012
pH
3,2
±
0,17
ND – não detectado
Tabela 16 Contagem de bactérias ácido láticas, mesófilas totais e bolores e
leveduras da água residual da fermentação do amido de mandioca (UFC/mL)
RS+TB.
Bactérias Final
1
30 dias
2
Bactérias Mesófilas totais
Bactérias láticas
Bolores e Leveduras
7,05
±
10,78 x10
6
3,73
±
4,03x 10
6
4,13
±
1,73 x10
7
5,35
±
1,06 x10
6
2,78
±
2,76 x10
6
2,76
±
2,88 x10
6
1
Contagem no final da fermentação
2
Após 30 dias de armazenamento sob refrigeração
4.4.1. Toxicidade aguda
Em estudos toxicológicos, um efeito adverso ou “anormal” tem sido definido
como valores diferentes da variação “normal” observada em um grupo controle não
tratado e expressos em termos estatísticos com um limite de confiança da média de
95%. Efeitos adversos podem ser definidos como as alterações que ocorrem com
exposição continuada ou intermitente que resultam em falha na capacidade
funcional, determinado por parâmetros anatômicos, fisiológicos, bioquímicos ou
comportamentais (DYBING et al., 2002)
Os sinais de toxicidade sistêmica são manifestados através da redução no
desenvolvimento ponderal dos animais, consumo de água e de ração, alterações no
comportamento e má condição da pelagem como a presença de pelos arrepiados,
71
bem como alterações da massa relativa dos órgãos, alterações hematológicas e
bioquímicas do sangue (LU, 1996).
Nenhum animal morreu ou apresentou sinais clínicos de toxicidade ou de
modificação de comportamento durante os 14 dias do experimento. No entanto, os
animais do grupo teste que receberam a água residual da fermentação do amido de
mandioca liofilizado (5 mg/ Kg de peso), apresentaram um ganho de peso menor
que o grupo controle (Tabela 15) que recebeu somente água destilada. Comparando
a curva de crescimento dos animais (Figura 4), pode ser observado que ocorreu uma
perda de peso após a ingestão do produto voltando a crescer em seguida, mas só
alcançaram um crescimento em torno de 59% do crescimento do grupo controle. O
consumo médio de ração do grupo teste foi inferior e o de líquido superior ao do
controle. Não houve diferença significativa em relação ao peso do fígado (absoluto
ou relativo) dos dois grupos (Tabela 17).
20,00
22,00
24,00
26,00
28,00
30,00
32,00
34,00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
dias
peso (g)
controle
teste
Figura 4 Crescimento dos animais submetidos ao teste de toxicidade aguda da água
residual da fermentação do amido de mandioca.
72
Tabela 17 Valores de ganho de peso, consumo de ração e líquido e peso do fígado
absoluto e relativo (g/100 g de peso corporal) das fêmeas submetidas à toxicidade
aguda (14 dias) da água da fermentação do amido de mandioca.
Grupo Controle Teste
Dose (g/Kg)
Ganho de peso(g)
Consumo de ração (g/dia)*
Consumo de líquido (mL/dia)*
Peso do fígado (g)
Peso relativo do fígado (g/100 g)
4,8
±
0,13
6,73
±
0,80
a
14,32
±
2,25
6,66
±
0,00
1,93
±
0,13
5,93
±
0,54
5,01
±
0,22
3,98
±
0,75
b
11,71
±
0,17
9,37
±
0,29
1,90
±
0,09
6,16
±
0,46
Valores são média ± DP (n=6). Médias com letras sobrescritas diferentes na mesma linha são
significativamente diferentes (P<0,05).
*
consumo médio aproximado de 2 caixas (3 animais por caixa)
A redução no ganho de peso dos animais, que receberam a água residual no
teste de toxicidade aguda, pode estar relacionada com um menor consumo de
ração, provavelmente por alguma irritação gástrica provocada pela alta acidez do
produto, uma vez que nenhum outro sinal de toxicidade foi observado. Assim os
resultados obtidos neste experimento demonstram que a água residual da
fermentação do amido de mandioca apresenta baixa toxicidade aguda (>5000mg/Kg
de peso).
Como os seres humanos estão mais freqüentemente expostos a níveis muitos
menores do que as doses que causam toxicidade aguda e por longos períodos, os
estudos de dose repetida ou toxicidade subcrônica fornecem dados mais realistas de
toxicidade (LU, 1996; BARLOW et al., 2002).
4.4.2 Toxicidade subcrônica
Observações clínicas e de crescimento
As doses para o estudo de dose repetida de 28 dias foram estabelecidas de
acordo com a forma possível de consumo da água residual: adicionado a um outro
líquido (25 e 50%) ou ingerida diretamente como uma bebida (100%), que expressa
em gramas de sólidos totais/ kg de peso representa doses de 0,07, 0,15 e 0,30 g/Kg.
A ingestão destas concentrações do resíduo da fermentação da fécula de mandioca
73
não causou nenhuma morte e não foi observada alteração significativa nas
condições gerais dos animais relacionadas ao material testado.
A ingestão dos três níveis de concentração da água de fermentação da fécula
de mandioca não causou diferenças significativas no ganho de peso dos animais
quando comparado ao controle (Tabela 18).
Consumo de líquido e alimento
O consumo médio de ração e líquido durante os 28 dias foi semelhante ao do
controle sendo que os machos consumiram mais do que as fêmeas. A ingestão
média do resíduo analisado em g de sólidos totais por Kg de peso ficou dentro do
esperado (Tabela 18). No entanto ocorreram variações durante os 28 dias.
Tabela 18 Ganho de peso, consumo de ração e líquido dos animais em 28 dias de
experimento.
Dose
(%)
Ganho de peso
(g)
Consumo de
ração
(g/d/rato)
Consumo de
líquido
(mL/d/rato)
Ingestão média do
resíduo
(g/Kg de peso)*
Fêmea
0
25
50
100
116,24
±
8,19
104,96
±
12,66
106,64
±
6,99
109,18
±
13,95
17,54
±
0,70
17,13
±
1,31
18,48
±
1,67
17,73
±
1,75
20,97
±
1,33
20,08
±
0,99
19,86
±
1,15
19,03
±
2,4
-
0,07
±
0,01
0,15
±
0,02
0,30
±
0,02
Macho
0
25
50
100
180,04
±
8,58
200,16
±
16,14
173,94
±
11,95
192,90
±
12,23
21,60
±
1,36
23,28
±
1,68
21,41
±
1,06
22,01
±
0,72
25,74
±
3,57
26,07
±
2,79
25,25
±
0,95
24,85
±
2,64
-
0,07
±
0,00
0,15
±
0,01
0,38
±
0,00
Valores são média ± desvio padrão (n=5). Não ocorreram diferenças significativas em relação ao
controle.
*Valores correspondem a g de sólidos totais ingeridos por Kg de peso.
74
A média de ingestão de líquido na primeira semana variou de 161 a 220
mL/Kg de peso/ dia para os machos e de 157 a 186 mL/Kg de peso/ dia para as
fêmeas e na última semana a ingestão foi de 99 - 120 mL/Kg de peso/ dia nos
machos e 115 a 130 mL/Kg de peso/ dia nas fêmeas (Figura 5), o que levou a uma
redução da ingestão do resíduo pelos animais durante o período experimental. Esta
redução foi mais acentuada nos grupos que receberam 100 % da água residual da
fermentação do polvilho azedo, principalmente nos machos (Figura 6). Na última
semana a ingestão do resíduo em sólidos totais foi de 0,06, 0,012 e 0,20 g/Kg /peso
para os grupos 25, 50 e 100 respectivamente.
consumo de líquido - fêmeas
0
50
100
150
200
250
1 2 3 4
semana
mL/kg/dia
consumo de líquido - machos
0
50
100
150
200
250
1 2 3 4
semana
mL/Kg/dia
0 25 50 100
Figura 5 Consumo de líquido dos animais em mL/kg/dia durante os 28 dias de
experimento.
75
consumo do resíduo -fêmeas
0
0,1
0,2
0,3
0,4
1 2 3 4
semana
g sólidos/Kg/dia
consumo do resíduo- machos
0
0,1
0,2
0,3
0,4
1 2 3 4
semana
g de sólidos/kg/dia
25 50 100
Figura 6 Consumo de líquido residual da fermentação do amido de mandioca em g
de sólidos totais por Kg de peso do animal por dia durante os 28 dias de
experimento.
A avaliação patológica ao final de um estudo para analisar os potenciais
riscos à saúde, permite a identificação de alterações orgânicas e teciduais
(alterações morfológicas) enquanto que as medidas bioquímicas identificam as
alterações funcionais (LOEB e QUIMBY, 1989, 1989).
Os pesos relativos dos órgãos (Tabela 19), foram semelhantes para todos os
grupos com exceção do pulmão nas fêmeas que receberam a dose de 50%, cujo
valor é maior que o controle (p=0,021) e do fígado nos animais machos da dose
100%, que foi menor que do grupo controle (p=0,020). Visto que não verificou-se
uma dose dependência e que não está correlacionado com nenhum outro
parâmetro, pode representar apenas uma variação normal e não sinal de toxicidade.
76
Tabela 19 Peso relativo dos órgãos dos animais com 28 dias de experimento em
g/100g de peso corporal.
Dose
(%)
Fígado
(g %)
Pulmão
(g%)
Rim
(g%)
Baço
(g%)
Coração
(g%)
Fêmea
0
25
50
100
3,08 ± 0,16
3,06 ± 0,21
3,11 ± 0,12
3,16 ± 0,25
0,50 ± 0,05
0,51 ± 0,05
0,62 ± 0,06*
0,52 ± 0,07
0,76 ± 0,03
0,75 ± 0,02
0,74 ± 0,05
0,81 ± 0,03
0,26 ± 0,03
0,26 ± 0,02
0,24 ± 0,03
0,24 ± 0,03
0,39 ± 0,01
0,37 ± 0,03
0,38 ± 0,03
0,39 ± 0,02
Macho
0
25
50
100
3,45 ± 0,17
3,66 ± 0,15
3,51 ± 0,14
3,16 ± 0,13*
0,49 ± 0,02
0,47 ± 0,05
0,53 ± 0,05
0,45 ± 0,07
0,75 ± 0,03
0,77 ± 0,03
0,81 ± 0,03
0,71 ± 0,04
0,25 ± 0,03
0,25 ± 0,03
0,26 ± 0,03
0,22 ± 0,02
0,39 ± 0,03
0,37 ± 0,03
0,39 ± 0,02
0,34 ± 0,04
Valores são média ± desvio padrão (n=5).
* diferente do grupo controle ao nível de significância de p<0,05 (Dunnett).
Hemograma e bioquímica do sangue
Durante a coleta de sangue para as análises alguns animais foram perdidos
ou tiveram o sangue hemolisado o que levou a grupos com diferentes números de
animais como demonstrado nas tabelas 20, 21 e 22.
Em condições fisiológicas o equilíbrio qualitativo e quantitativo das células
sangüíneas, com estreitas variações, é mantido pelo balanço entre a produção e a
destruição das mesmas. Qualquer fator físico, químico ou biológico que interfira
neste balanço, pode se refletir em alterações no sangue periférico. O hemograma é
o exame de rotina destinado a avaliar aspectos qualitativos, em termos morfológicos,
e quantitativos das células do sangue periférico (FAILACE, 2003).
Uma contagem deprimida de hemácias, concentrações baixas de
hemoglobina e hematócrito baixo pode indicar anemia, sobrecarga de líquido ou
hemorragia além de 24 horas. Baixos VCM e CHCM indicam anemias microcíticas
hipocrômicas causadas por anemia por deficiência de ferro, anemia sideroblástica ou
talassemia. Um VCM alto sugere anemias macrocíticas causadas por anemias
megaloblásticas, devido à deficiência de ácido fólico ou vitamina B12, desordens
77
congênitas de DNA ou reticulocitose. (MILLER, 1995; RAVEL, 1997; FAILACE,
2003).
Nenhum dos parâmetros analisados no sangue das fêmeas, que receberam
as diferentes doses na bebida foi significativamente diferentes dos valores obtidos
para os animais controles. No entanto, os machos que receberam 100% do resíduo
apresentaram um valor médio de hemoglobina inferior ao grupo controle (p= 0,04)
(Tabela 20), no entanto, os valores se encontram dentro da faixa de variação para
estes animais (WOLFORD et al.1986).
Os leucócitos (glóbulos brancos) formam a primeira linha de defesa contra
microrganismos invasores. Os neutrófilos e os monócitos respondem através do
processo de fagocitose, enquanto os linfócitos produzem anticorpos Uma contagem
elevada de leucócitos (leucocitose) com aumento concomitante de neutrófilos
freqüentemente assinalam uma infecção bacteriana como, por exemplo, um
abscesso, meningite, apendicite ou amigdalite. Uma contagem alta de leucócitos
pode também resultar de leucemia e necrose tecidual devido a queimaduras, infarto
do miocárdio ou gangrena. Já a leucopenia (diminuição dos leucócitos) indica
depressão da medula óssea, que pode resultar de infecções virais ou de reações
tóxicas, como, por exemplo, as que acompanham o tratamento com antineoplásicos,
ingestão de mercúrio ou outros metais pesados, ou exposição ao benzeno ou
arsênicos. A monocitose (aumento dos monócitos) é freqüente na endocardite
bacteriana e a eusinofilia (eosinófilos aumentados) está mais associado a infestação
por parasitas, mas pode aparecer em algumas infecções bacterianas (RAVEL,
1997). A ingestão da água da fermentação do amido de mandioca não apresentou
alterações significativas no hemograma dos animais
78
Tabela 20 Valores de hemograma dos ratos machos e fêmeas, no final do período experimental de 28 dias (média ± DP).
Parâmetros Machos Fêmeas
Dose 0
(n=5)
25%
(n=5)
50%
(n=5)
100%
(n=3)
0
(n=4)
25%
(n=5)
50%
(n=3)
100%
(n=4)
LEU (10
3
/mm
3
) 10,88 ± 1,93
8,34 ± 1,70
9,2 ± 2,27 8,33 ± 1,75
5,27 ± 0,68
4,96 ±1,34
6,40 ± 2,42
6,60 ±1,54
ERI (10
6
/mm
3
) 7,33 ± 0,11
7,22 ± 0,15
7,26 ± 0,39
7,08 ± 0,25
7,45 ± 0,33
7,57 ± 0,3
7,86 ± 0,29 7,14 ± 0,35
HGB (g/dl) 14,8 ± 0,34
14,8 ± 0,33
14,9 ± 0,61
13,9 ± 0,55* 15,05 ± 0,47
15,02 ± 0,72
15,33 ± 0,81
14,55 ± 0,31
HCT (%) 44,2 ±1,28
43,8 ± 0,72 44,2 ± 2,18 41,9 ± 1,6 43,90 ± 1,47 43,88 ±1,85 45,06 ± 2,14 42,12 ±1,06
VCM (µm
3
) 60,4 ±1,14
60,6 ± 0,55
61 ± 1,41
59 ± 0,0
59,00 ± 1,41
57,8 ± 0,84
57,33 ±1,53
59,00 ± 2,00
HCM (pg) 20,16 ± 0,29 20,58 ± 0,23 20,54 ± 0,33 19,6 ± 0,35 20,18 ± 0,49 19,86 ± 0,30 19,5 ± 0,70 20,43 ± 0,81
CHCM (g/dl) 33,46 ± 0,26
33,88 ± 0,26
33,68 ± 0,34
33,1 ± 0,53
34,25 ± 0,1
34,24 ± 0,26
34 ± 0,30
34,6 ± 0,25
PLQ (10
3
/mm
3
) 916 ± 74 1002 ± 92 852 ± 81 770 ± 75 793 ± 159 815 ±163 950 ±17 864,00 ± 42
VMP (µm
3
) 7,28 ± 0,82 7,88 ± 0,68 8,18 ± 0,99 6,77 ± 0,06 7,32 ± 0,55 7,08 ± 0,75 6,53 ± 0,15 7,02 ± 0,58
LIN (%) 89,2 ±1,65 90,3 ± 3,33 88,3 ± 5,33 89,1 ± 2,44 86,50 1,56 83,9 ± 2,60 83,30 ± 6,00 83,77 ± 4,04
MON (%) 2,48 ± 0,18 2,14 ± 0,46 2,12 ± 0,37 2,43 ± 0,5 2,70 ± 0,75 2,90 ± 0,64 2,80 ± 0,26 2,82 ± 0,45
NEU (%) 7,6 ±1,41
7,38 ± 3,05
7,16 ± 1,3
7,4 ± 1,37
9,97 ±1,54
12,94 ± 2,56
11,20 ± 3,12
11,4 ± 2,50
EOS (%) 0,58 ± 0,70 0,14 ± 0,05 0,68 ± 0,57 0,96 ± 1,50 0,67 ± 0,46 0,14 ± 0,09* 1,47± 2,10 1,92 ± 1,84
BAS (%) 0,1 ± 0,1 0,08± 0,04 0,12 ± 0,04 0,13 ± 0,06 0,15 ± 0,06 0,10 ± 0,07 0,17 ± 0,11 0,075 ± 0,05
*diferente do grupo controle ao nível de significância de p<0,05 (Dunnett).
LEU = leucócitos; ERI = eritrócitos; HGB = hemoglobina; HCT = hematócrito; VCM = volume corpuscular médio;
HCM = hemoglobina corpuscular
média; CHCM = concentração de hemoglobina corpuscular média; PLQ = plaquetas;VMP= volume médio das plaquetas;
LIN = linfócitos;
MON = monócitos; NEU = neutrófilos; EOS = eosinófilos; BAS = basófilos.
79
A coagulação sanguínea se desenvolve em três estágios fundamentais. Em
resposta a uma lesão vascular ou a um dano ao próprio sangue forma-se uma
substância ou complexo de substâncias designadas de “ativadores de protrombina”
que catalisa a conversão da protrombina em trombina, que por sua vez converte o
fibrinogênio em filamentos de fibrina que englobam plasma e elementos figurados do
sangue na formação do coágulo. A protrombina é formada continuamente pelo
fígado, se este órgão reduzir sua produção o teor sanguíneo cairá em 24 horas
abaixo do nível necessário para a coagulação. Os valores médios do tempo de
protrombina foram semelhantes para todos os grupos independentes do sexo do
animal (Tabela 21).
Tabela 21 Tempo de protrombina (TAP) dos ratos no final do período experimental
de 28 dias (média ± DP)
Dose Machos Fêmeas
0 10,04 ± 0,34
(n=5)
10,28 ± 1,28
(n=4)
25% 10,10 ± 0,62
(n=5)
9,34 ± 0,53
(n=5)
50% 9,60 ± 0,74
(n=5)
10,17 ± 0,31
(n=3)
100% 10,12 ± 0,96
(n=5)
8,98 ± 0,34
(n=4)
As plaquetas também contribuem para a coagulação sanguínea, pois aderem
às paredes de vasos sangüíneos lesados (adesão plaquetária) formando o tampão
plaquetário, secretam várias moléculas bioativas (agregação e secreção plaquetária)
e contribuem para a geração de trombina (PARISE; SMITH; COLLER, 2001). A
trombocitose pode ocorrer em anemias por deficiência de ferro, em períodos pós-
hemorrágicos, em processos inflamatórios, nas síndromes mieloproliferativas e após
traumas enquanto que a trombocitopenia pode estar associada a infecções virais,
aplasia medular, anemias por deficiência de vitamina B12 e ácido fólico,
quimioterapia entre outras causas (FAILACE, 2003). Alterações funcionais
adquiridas podem ser devidas a doenças sistêmicas como a uremia e hepatopatias
80
crônicas e a desordens hematológicas, entre outras (SHATTIL; ABRAMS;
BENNETT, 2001). Não ocorreram alterações significativas na contagem de
plaquetas com a ingestão por 28 dias da água residual da fermentação do amido de
mandioca (Tabela 20).
Quanto às análises bioquímicas, os animais machos apresentaram valores de
colesterol, albumina e sódio superiores ao do grupo controle, no grupo que recebeu
25 % do resíduo e os triglicerídeos nos grupos que receberam 25 e 50 % (Tabela
22).
Apesar dos valores médios de glicose se encontrarem dentro da faixa de
normalidade para estes animais (87-146 mg/dl) (WOLFORD et al., 1986), a média
dos animais dos grupos testes foi superior ao controle, com o grupo 25%
apresentando os maiores valores. O mesmo não ocorreu com as fêmeas.
Em condições normais, o teor de glicose no sangue mantém-se dentro de
limites bastante estreitos. Os níveis de glicemia são regulados pela intervenção de
diversos hormônios, sobressaindo, por sua maior atividade a insulina, cuja ação
reduz a taxa glicêmica. Em condições patológicas, ou sobrecarga do sistema
regulatório, pode ocorrer um desequilíbrio levando a estado de hiper ou hipoglicemia
(MILLER, 1995; HENRY, 1995).
Inúmeras síndromes e doenças estão associadas com altos níveis de glicose
plasmáticas em jejum, tais como diabetes mellitus, pancreatites, doenças
endócrinas, hepáticas, estresse, entre outras. A hipoglicemia pode ser causada por
hipotireoidismo, hiperinsulinismo, distúrbios na absorção intestinal, anorexia nervosa,
diarréia, esforço muscular intenso entre outros (LIMA et al., 1992; MOURA et al.,
1997).
A dosagem de triglicerídeos constitui um parâmetro importante na detecção
de distúrbios no metabolismo lipídico. (HENRY,1995). A taxa dos triglicerídeos é
elevada no diabetes, na síndrome nefrótica, na pancreatite, interferência bacteriana,
estrógenos, álcool. A hipotrigliceremia pode estar relacionada com o uso de algumas
drogas, má-absorção, desnutrição (LIMA, 1992; MOURA, 1987). Nos animais
machos os valores de triglicerídeos foram superiores ao do controle nos grupos 25 e
50% e nas fêmeas somente o valor médio do grupo 50% foi menor do que o do
grupo controle.
81
Tabela 22 Parâmetros bioquímicos do sangue dos ratos,machos e fêmeas, no final do período experimental de 28 dias (média ±
DP).
Parâmetros Machos Fêmeas
Dose 0%
(n=5)
25%
(n=5)
50%
(n=5)
100%
(n=4)
0%
(n=4)
25%
(n=5)
50%
(n=3)
100%
(n=4)
CHOL (mg/dl) 54,80 ± 4,76
67,2±15,51
79,2±9,81*
67,00±9,09
75,00±18,46
93,20±29,81
63,33±8,62
102,00±16,57
LDL (mg/dl) 42,64 ±10,78
42,34±10,25
40,32±9,55
39,70±8,28
55,85±23,95
64,24±23,03
43,13±10,74
63,93±12,76
HDL (mg/dl) 11,20 ±4,21
16,80 ± 5,22
14,80±6,06
12,00±5,23
17,00±6,68
17,20±6,34
15,33±4,51
21,75±4,27
TGL (mg/dl) 56,00±16,55
90,20±14,53*
94,40±22,29*
71,25±18,73
79,50±12,97
58,60±18,93 47,33±11,93*
81,50±25,16
CREA (mg/dl) 0,20±0,07
0,26±0,09
0,26±0,09
0,18±0,05
0,23±0,10
0,24±0,15
0,30±0,00
0,30±0,08
ALP (U/L) 80,40±16,86
92,00±23,51
99,40±25,08
75,25±18,71
59,50±5,07
63,80±24,90
64,33±10,41
78,00±8,12
GLU (mg/dl) 63,6±2,70
108,80±17,08*
88,60±9,07*
83,00±7,12*
76,00±14,76
59,60±11,72
61,00±5,57
84,75±11,03
AST (U/L) 76,40±12,70
73,80±9,96
86,20±19,64
70,25±10,10
76,00±4,08
93,50±7,76*
99,00±16,00*
85,33±2,49
ALT (U/L) 28,40±1,52
31,20±3,11
28,80±3,96
28,25±3,86
26,00±3,37
24,80±4,32
28,66±0,58
28,00±0,82
TP (g/dl) 3,56±0,55
4,78±0,87
4,24±0,77
3,58±0,71
4,43±0,85
4,06±1,28
4,47±5,23
5,23±0,53
ALB (g/dl) 0,68±0,13
1,04±0,25*
0,88±0,19
0,75±0,17
0,98±0,22
0,86±0,29
1,10±0,10
1,13±0,15
Na (mmol/L) 94,8±10,85
118,6±14,89*
109,6±14,15
99,25±10,72
114,25±15,97
104,00±21,97
109,33±8,08
127,75±8,62
K (mmol/L) 3,16±0,34
3,86±0,35
3,56±0,55
3,33±0,62
3,95±0,66
3,54±0,68
4,30±0,20
4,18±0,25
Cl (mmol/L) 65,80±8,17
83,20±12,11
77,40±10,78
69,50±7,42
82,75±13,38
73,80±17,82
77,33±6,43
93,25±7,14
n = número de animais. * diferente do grupo controle ao nível de significância de p<0,05 (Dunnett).
CHOL= colesterol, LDL = lipoproteína de baixa densidade,
HDL
= lipoproteína de alta densidade, TGL = triglicerídeos , CREA =creatinina, ALP = fosfatase
alcalina, GLU = glicose, AST = aspartato transaminase,
ALT= alanina aminotransferase, TP = proteína total, ALB= albumina, Na = sódio, K = potássio,
Cl = cloreto
82
A hipercolesterolemia pode ocorrer no diabetes, com taxas elevadíssimas, no
hipotireoidismo, distúrbios no trato biliar, anestesia por éter, dentre outros. A
hipocolesterolemia pode ser causada por hipertireoidismo, anemia perniciosa,
hepatites, má-absorção intestinal (HENRY, 1995). Os valores médios de colesterol
foram maiores que o do controle somente nos animais que receberam a dose de
50%.
As alterações ocorridas nos parâmetros bioquímicos no sangue como
colesterol, triglicerídeos, nos machos; triglicerídeos, glicose e aspartato
transaminase nas fêmeas não demonstram ser dose dependente e encontram-se
dentro da faixa de normalidade para a espécie (WOLFORD et al, 1986).
As medidas da atividade das enzimas séricas podem auxiliar nas conclusões
sobre a localização e a natureza das alterações patológicas (BURTIS; ASHWOOD;
TIETZ, 1998). Um aumento da atividade de enzimas séricas acima da variação
normal pode significar um aumento da sua produção pelas células ou diminuição da
taxa de depuração destas enzimas da circulação (LOEB; QUIMBY, 1989, BURTIS;
ASHWOOD; TIETZ, 1998).
A Fosfatase alcalina está acentuadamente elevada em doenças biliares, no
entanto um aumento do nível sérico desta enzima não é uma indicação definitiva da
atividade tecidual (LOEB; QUIMBY, 1989; BURTIS; ASHWOOD; TIETZ, 1998). A
aspartato transaminase é largamente distribuída em diversos tecido nos ratos, com
as mais altas concentrações no fígado, coração, músculo esquelético e rim. A
alanina aminotransferase
é uma enzima específica do fígado em ratos, por isso o
aumento da atividade sérica é indicativo de dano hepatocelular e necrose
hepática.(LOEB; QUIMBY, 1989). Neste estudo somente os níveis da enzima
aspartato transaminase nas fêmeas que receberam as doses de 25 e 50% foram
maiores que o grupo controle.
Os valores obtidos para creatinina, proteínas totais, albumina, sódio, potássio
e cloreto neste experimento (Tabela 22) estão abaixo dos valores de referência para
esses animais (WOLFORD et al, 1986; CHARLES RIVER,1998), no entanto estes
animais não apresentaram outros sinais clínicos que pudessem estar relacionados
com estes valores baixos. Somente os animais machos que ingeriram a dose de 50
% apresentaram um nível de sódio maior que o grupo controle. Segundo Loeb e
Quimby (1989), os efeitos de um composto sobre os parâmetros bioquímicos deve
83
ser avaliado comparando com um grupo controle, pois ocorre uma grande variação
entre os animais experimentais o que dificulta a utilização de valores de referência.
A creatinina é filtrada nos rins e pode ter seus níveis aumentados no sangue
quando este órgão está alterado. Medidas de albumina sérica, cuja concentração
sérica na maioria dos animais de laboratório variam de 2,42 a 4,19 g/dl, é importante
para o diagnóstico do estado nutricional, integridade do sistema vascular e função
hepática (LOEB; QUIMBY, 1989). Uma redução nos níveis de albumina sérica pode
ser interpretada como desnutrição, doença hepática crônica, doença renal e
intestinal (LOEB; QUIMBY, 1989; BURTIS; ASHWOOD; TIETZ, 1998). No entanto a
sua concentração pode estar reduzida no animal em jejum por 18 horas (LOEB;
QUIMBY, 1989). Os valores de proteína total tende a cair quando a análise é
realizada após o congelamento da amostra, possivelmente pela crioprecipitação de
alguma proteína.(LOEB; QUIMBY, 1989).
Os eletrólitos como potássio, sódio, cloreto, cálcio e magnésio são
responsáveis pela manutenção da pressão osmótica, distribuição da água nos
compartimentos do organismo, manutenção do pH e regulação das funções
cardíacas. A hiponatremia (concentração reduzida de sódio no plasma) pode ocorrer
por vômitos prolongados, diarréia, enteropatias e poliúria, bem como na retenção
excessiva de água no caso de edema, ascite, cirrose e desnutrição (BURTIS;
ASHWOOD; TIETZ, 1998). Sinais clínicos como os citados acima não foram
observados nos animais deste estudo.
Análise histopatológica
O intestino delgado é a região onde ocorrem os principais processos de
digestão e absorção de alimentos. A mucosa intestinal é a principal barreira a
potenciais patógenos e substancias toxigenicas. A degradação da mucosa intestinal
tem sido usada como marcador de toxicidade por bactérias (SALMINEN et al. 1998).
Os resultados da análise histopatológica apresentados na Tabela 23 mostram
que a maioria dos animais machos apresentou apenas lesões histológicas leves na
região intestinal analisada, com perda de revestimento epitelial. Apenas um animal
do grupo que recebeu 100% da água residual apresentou lesão intensa com
destruição das vilosidades intestinais e presença de infiltrado inflamatório. No
entanto nas fêmeas, todos os animais avaliados no grupo controle e no grupo 100 %
84
apresentaram lesões intensas, enquanto os animais que receberam as outras doses
praticamente não apresentaram lesões. Não foi possível, entretanto concluir que a
lesão foi ocasionada pela bebida ingerida, uma vez que o grupo controle também
apresentou estas lesões e os animais não apresentaram sintomas como perda de
peso, vômitos ou diarréia.. Doenças inflamatórias do trato intestinal são muito
comuns em animais de laboratório e são freqüentemente associadas com bactérias,
vírus, e parasitas, e em muitos casos são de etiologia desconhecidas (McCLURE, et
al., 1978). As lesões observadas nos animais experimentais podem ser vistas na
Figura 7. As causas destas lesões não foram analisadas.
Tabela 23 Resultados da análise histopatológica do corte intestinal dos animais
após 28 dias de experimento.
Lesões
Sexo Dose
Nº de
animais
Normal Leve Moderada Intensa
Machos
0%
25%
50%
100%
5
5
3
5
5
0
1
0
0
5
2
4
0
0
0
0
0
0
0
1
Fêmeas
0%
25%
50%
100%
5
5
5
5
0
4
5
0
0
1
0
0
0
0
0
0
5
0
0
5
85
Figura 7. Aparência da mucosa intestinal do intestino delgado dos diversos
grupos experimentais. A - mucosa intestinal normal com as vilosidades
intestinais preservadas e ausência de infiltrado inflamatório na mucosa (aumento
10x); B - lesão leve da mucosa intestinal com perda das pontas das vilosidades
intestinais (aumento de 10x); C- lesão moderada da mucosa intestinal com
lesões das vilosidades e presença de nódulos linfáticos abundantes na mucosa
(aumento de 4x)e D - lesão intensa da mucosa intestinal com destruição
completa das vilosidades intestinais e grande quantidade de infiltrado
inflamatório (aumento de 4x).
Segundo Adams (1999), as bactérias láticas normalmente encontradas nos
alimentos fermentados e utilizadas na fabricação de probióticos são seguras.
KE et al (2005), avaliaram a toxicidade de uma bebida antioxidante derivada
da fermentação de arroz não polido, mamão e alga marinha com bactéria lática,
levedura e bactéria fotossintética e não encontraram nenhuma alteração no
crescimento, consumo, comportamento, parâmetros hematológicos ou bioquímicos,
bem como na inspeção histológica do coração, fígado, baço e pulmão, em ratos
alimentados por 90 dias com doses de 150, 100 e 50 vezes a dose diária
recomendada.
10x
10x
4x
4x
A
B
C
D
86
Estudos de dose repetida de 28 dias em ratos tratados com 2000mg/kg de
peso de microrganismos desidratados não demonstraram efeitos adversos
relacionados ao tratamento (KITANO et al, 2004).
Avaliação da toxicidade realizada em diversas cepas puras de bactérias
láticas, para sua utilização como probiótico, tem demonstrado que mesmo em
grandes quantidades não produzem efeitos adversos quando analisados em ratos
(HUANG et al,2003; TSAI et al, 2004a;TSAI et al, 2004b).
Os resultados obtidos neste estudo indicam que a água residual da
fermentação do amido de mandioca para a produção de polvilho azedo, nas doses
avaliadas, não apresenta toxicidade. Este resultado pode ser, em grande parte,
atribuído ao baixo teor de sólidos totais característico das águas da fermentação do
amido de mandioca, as quais, se forem consumidas em um novo produto, não irão
sofrer concentração que venha a comprometer a segurança. No entanto, um estudo
mais prolongado e com maior número de animais pode ser necessário para
assegurar a utilização deste resíduo, bem como avaliar possíveis propriedades
probióticas.
O objetivo deste estudo foi avaliar as águas da fermentação do polvilho azedo
da forma como é eliminada, como resíduo agroindustrial. A partir da intenção de uso
destas águas, provavelmente como uma nova bebida, ela não sofrerá concentração,
o que poderia ser economicamente inviável, ou mesmo alterar as características
microbiológicas encontradas.
87
5 CONCLUSÕES
- A água residual da fermentação do amido de mandioca apresenta uma composição
muito pobre com baixa quantidade de sólidos totais e conseqüentemente de
nutrientes;
- A conversão do amido de mandioca fermentado em ácido lático é baixa
representando uma produtividade de 1,5%;
- As contagens totais de bactérias láticas na água residual da fermentação do amido
de mandioca variaram de 5,27 a 7,84 log UFC/mL; e nas amostras analisadas estas
bactérias foram identificadas principalmente como
Lactobacillus plantarum
, o que
pode significar que este resíduo pode ser utilizado para produção de bactérias
probióticas;
- Como o tipo de fermentação deste estudo ocorre de forma espontânea, são
necessários mais estudos para estabelecer parâmetros adequados de fermentação
para se obter um produto com a microbiota desejada;
- A água residual da fermentação do amido de mandioca apresentou baixa
toxicidade aguda (> 5,0 g/kg de peso);
- A ingestão de diferentes concentrações da água de fermentação do amido de
mandioca durante 28 dias não causou alterações clínicas e hematológicas
significativas nos animais;
- Estudos mais prolongados de toxicidade incluindo análises histológicas de outros
órgãos, devem ser realizados para garantir a segurança deste resíduo para
desenvolvimento de produtos.
88
6 SUGESTÕES
- Apesar da baixa concentração de sólidos totais, os demais compostos presentes
nas águas residuais da fermentação do amido de mandioca, como por exemplo, a
presença de vitaminas produzidas por microrganismos e oligossacarídeos deve ser
investigada;
- Uma caracterização mais aprofundada da microbiota presente nestas águas em
diferentes épocas do ano e diferentes regiões, visando um maior controle da
fermentação;
- Análise da viabilidade econômica para produção de ácidos orgânicos;
- Desenvolvimento de bebidas probióticas aproveitando a presença de bactérias
láticas;
- Desenvolvimento de inóculo para fermentações mais controladas e produção de
polvilho azedo de melhor qualidade.
89
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