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Danilo Elias Xavier
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE SISTEMAS DE EFLUXO PARA
A RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA ENTRE AMOSTRAS
CLÍNICAS DE Pseudomonas aeruginosa
Tese apresentada à Universidade Federal
de São Paulo – Escola Paulista de
Medicina para obtenção do Título de
Mestre em Ciências
São Paulo
2008
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Danilo Elias Xavier
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE SISTEMAS DE EFLUXO PARA
A RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA ENTRE AMOSTRAS
CLÍNICAS DE Pseudomonas aeruginosa
Tese apresentada à Universidade Federal
de São Paulo – Escola Paulista de
Medicina, para obtenção do Título de
Mestre em Ciências pelo programa de
pós-graduação em Ciências Básicas das
Doenças Infecciosas e Parasitárias
Orientadora: Ana Cristina Gales
São Paulo
2008
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Xavier, Danilo Elias
Avaliação da expressão de sistemas de efluxo para resistência
antimicrobiana entre amostras clínicas de Pseudomonas aeruginosa./Danilo
Elias Xavier – São Paulo, 2008.
Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista
de Medicina. Programa de Pós-graduação Ciências Básicas em Infectologia.
Título em inglês: Evaluation of efflux pumps expression for antimicrobial
resistance among Pseudomonas aeruginosa clinical isolates.
1. Bombas de efluxo. 2. Resistência antimicrobiana. 3. Expressão gênica.
4. Pseudomonas aeruginosa.
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MEDICINA
DISCIPLINA DE INFECTOLOGIA
Chefe do Departamento: Dr. Ângelo Amato Vincenzo de Paola
Coordenador do Curso de Pós-graduação: Dr. Maria Lucia O. S. Formigoni
iv
Danilo Elias Xavier
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE SISTEMAS DE EFLUXO PARA
A RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA ENTRE AMOSTRAS
CLÍNICAS DE Pseudomonas aeruginosa
Presidente da banca:
Profa. Dra. Ana Cristina Gales
Banca examinadora:
Titular: Profa. Dra. Anna Sara Shafferman Levin
Titular: Dr. Jorge Luiz Mello Sampaio
Titular: Dr. Guilherme Henrique Campos Furtado
Suplente: Profa. Dra. Sílvia Figueiredo Costa
v
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, Profa. Dra. Ana Cristina Gales, pela confiança,
aprendizado e dedicação. Muito obrigado por compartilhar conosco sua
experiência.
A toda minha família, principalmente minha mãe Nevinha, minha tia Terezinha,
aos meus irmãos, Fabiano, Ana e seus cônjuges, e as minhas sobrinhas Olívia
e Júlia. Muito obrigado por tudo.
Aos Prof. Dr. Lauro Santos Filho e Profa. Dra. Iolanda Santos, pela iniciação
científica, aprendizado e amizade.
Ao Prof. Dr. Antônio Carlos C. Pignatari pela acolhida, ensinamentos e
dedicação dispensada aos jovens cientistas do Laboratório Especial de
Microbiologia Clínica.
Aos amigos Mariana Castanheira e Rodrigo Mendes pelo breve período de
convivência, porém rico em aprendizado.
À Renata Picão, pela acolhida, amizade e por todos os momentos. Você que
veio a se tornar para mim uma referência nesta cidade.
Aos amigos Fernando Bizerra, Yoko, Frank, Tarcísio, Laura, Tharcila, Luciana
Garrido, Sheila, Chica, Marquinhos, Marie, Jairo, Adilson, Lúcio, Fábio,
Raphael, Sara, Sabrina, Gisela, Patrício Godoy, Luana, Tati, Lahys, Marcelo,
Guilherme, Fernanda, Lígia e Joyce pelo apoio, companheirismo e pelas
incontáveis horas que passamos juntos, repletas de muita alegria.
Aos amigos do Laboratório LEMC/ALERTA, Raquel Girardello, Eloiza, Adriana,
Anderson, Paula Peraro, Paula Ignez, Andréa Pereira, Andréia Penteado, Ana
Paula Takano, Lorena, Rodrigo Cayô, Paulo Bispo, Jussimara, Kelly Santiago,
Rosana, Loren, Karen, Fernanda Marques, Fernanda Inoue, Soraya, Jacira,
Alline, Martha, Neide, Thais, Mirian, Cecília, Bruna, Vinícius, Liana e Jéssica
pelo apoio, conversas e pelos momentos agradáveis.
Aos professores e funcionários da Disciplina de Infectologia – UNIFESP e do
Instituto Paulista de Doenças Infecciosas e Parasitárias (IDIPA), em especial
ao amigo Charlys Costa.
À cidade de São Paulo que me acolheu como a todos que aqui chegam e às
pessoas que aqui conheci.
vi
Esse trabalho foi realizado com o auxílio da
Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior (CAPES) e da
Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado de São Paulo - (FAPESP, processo
2006/06171-8).
vii
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................ 1
1.1 Objetivos ..................................................................................................... 4
1.1.2 Objetivo principal .................................................................................... 4
1.1.3 Objetivos específicos.............................................................................. 4
2 REVISÃO DA LITERATURA .......................................................................... 5
2.1 Sistemas de efluxo de drogas ................................................................... 5
2.2 Sistemas de efluxo em bactérias .............................................................. 6
2.2.1 Família ABC ........................................................................................... 8
2.2.2 Família MFS ........................................................................................... 9
2.2.3 Família SMR ........................................................................................... 9
2.2.4 Família MATE ....................................................................................... 10
2.2.5 Família RND ......................................................................................... 11
2.3 Sistemas de efluxo de drogas em P. aeruginosa ................................... 16
2.3.1 MexAB-OprM ........................................................................................ 17
2.3.2 MexCD-OprJ ........................................................................................ 20
2.3.3 MexEF-OprN ........................................................................................ 22
2.3.4 MexXY-OprM ........................................................................................ 24
2.3.5 MexJK .................................................................................................. 25
2.3.6 MexGHI-OpmD e MexVW .................................................................... 26
2.4 Funções fisiológicas dos sistemas de efluxo RND ............................... 27
2.5 Importância clínica dos sistemas de efluxo em bactérias .................... 29
2.5.1 Efluxo como mecanismo de resistência bacteriana .............................. 29
2.5.2 Inibidores de sistema de efluxo ............................................................ 31
3 MÉTODOS .................................................................................................... 34
3.1 Amostras bacterianas .............................................................................. 34
3.2 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos .......................................... 36
3.3 Teste de hidrólise enzimática .................................................................. 38
3.4 Detecção dos genes codificadores de carbapenemases pela técnica de
PCR .................................................................................................................. 39
viii
3.5 Tipagem molecular pela técnica de eletroforese em campo pulsátil
(PFGE) ............................................................................................................. 41
3.5.1 Preparação dos blocos de gel de agarose ........................................... 42
3.5.2 Digestão do DNA bacteriano ................................................................ 43
3.5.3 Eletroforese em campo pulsátil ............................................................ 44
3.6 Quantificação da expressão gênica ........................................................ 44
3.6.1 Extração de RNA e síntese de cDNA ................................................... 45
3.6.2 Reação de polimerase em cadeia em tempo real (qRT-PCR) ............. 47
3.6.3 Análise da expressão gênica ................................................................ 49
4 RESULTADOS .............................................................................................. 51
4.1 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos .......................................... 51
4.2 Teste de hidrólise enzimática .................................................................. 52
4.3 Detecção dos genes codificadores de carbapenemases pela técnica de
PCR .................................................................................................................. 53
4.4 Tipagem molecular pela técnica de eletroforese em campo pulsátil
(PFGE) ............................................................................................................. 54
4.5 Quantificação da expressão gênica ........................................................ 57
5 DISCUSSÃO ................................................................................................. 67
6 CONCLUSÕES ............................................................................................. 78
7 ANEXOS ....................................................................................................... 80
8. REFERÊNCIAS ............................................................................................ 91
ABSTRACT .................................................................................................... 106
ix
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Extrusão ativa de drogas por várias famílias de sistemas de efluxo. A
família “ATP-binding cassette” (ABC) utiliza hidrólise de adenosina tri-
fosfato (ATP) como fonte de energia. Os outros sistemas de efluxo de
droga, como, os da família “Major facilitator superfamily” (MFS),
“Multidrug and toxic compound exporters” (MATE), “Small multidrug
resistance" (SMR) e “Resistance-nodulation-division” (RND) utilizam o
antiporte de íons H
+
ou Na
+
do gradiente iônico através da membrana
citoplasmática. O sistema RND de efluxo possui múltiplos componentes
em bactérias Gram-negativas e pode transportar substratos tanto do
citoplasma quando do espaço periplasmático através da membrana
citoplasmática e da membrana externa. Fonte: Nat Rev Microbiol. 2005;
3 (7): 566-72..............................................................................................7
Figura 2. Organização genética dos operons mexR-mexAB-oprM, mexT-
mexEF-oprN, nfxB-mexCD-oprJ, mexZ-mexXY e mexL-mexJK de P.
aeruginosa. Cada operon contém os genes que codificam os
componentes dos respectivos sistemas de efluxo: proteína de fusão
periplasmática (em laranja), proteína de membrana interna, bomba (em
azul) e proteína de membrana externa, canal extrusivo (em verde).
Adjacente, à montante, está representado o gene regulador proximal de
cada operon (em lilás) que exercem a função ativadora (+) ou repressora
(-) da transcrição dos genes contidos no operon. Fonte: Pathol Biol
(Paris). 2004; 52(10): 607-16..................................................................20
Figura 3. Distribuição por unidade hospitalar do complexo do Hospital São
Paulo das 60 amostras de P. aeruginosa isoladas de infecção da
corrente sanguínea no período entre junho e dezembro de
2005........................................................................................................35
x
Figura 4. Distribuição dos 60 pacientes com ICS por P. aeruginosa por sexo e
idade em anos.........................................................................................36
Figura 5. Eletroforese em gel de agarose do produto de amplificação da reação
de PCR multiplex para detecção da presença dos genes codificadores
de MβL entre as 28 amostras clínicas de P. aeruginosa resistentes aos
carbapenens. ..........................................................................................54
Figura 6. Expressão gênica das bombas de eluxo mexB (A), mexD (B), mexF
(C) e mexY (D) dos 60 isolados clínicos de P. aeruginosa em relação às
cepas referência P. aeruginosa ATCC 27853 e PAO1.......................... 60
xi
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Oligonucleotídeos iniciadores (primers) utilizados para detecção dos
genes que codificam genes de MβLs por PCR multiplex........................41
Tabela 2. Oligonucleotídeos iniciadores (primers) utilizados na reação de qRT-
PCR para os genes alvos mexB, mexD, mexF, mexY, oprD e ampC e
para o gene de referência rpsL...............................................................48
Tabela 3. Perfil de sensibilidade a antimicrobianos das 60 amostras clínicas de
P. aeruginosa isoladas de pacientes com infecção de corrente
sanguínea hospitalizados no complexo HSP ente janeiro e junho de
2005. .................................................................................................... 52
Tabela 4. Perfil clonal das 38 amostras de P. aeruginosa geneticamente
relacionadas............................................................................................56
Tabela 5. Média da expressão dos genes estudados nas 60 amostras clínicas
de P. aeruginosa em relação às cepas P. aeruginosa ATCC 27853 e
PAO1.......................................................................................................57
Tabela 6. Hiperexpressão dos sistemas de efluxo entre 60 isolados de P.
aeruginosa em relação à P. aeruginosa ATCC 27853............................62
xii
Tabela 7. Redução da expressão da porina OprD e hiperexpressão de AmpC
nos 60 isolados clínicos de P. aeruginosa em relação as cepas
referência PAO1 e P. aeruginosa ATCC 27853 de acordo com o perfil de
sensibilidade aos β-lactamicos testados.................................................66
xiii
LISTA DE ABREVIATURAS
ABC - “ATP Binding Cassette”
ATCC - “Americam Type Culture Collection”
ATP - Adenosina Tri-Fosfato
CIM - Concentração Inibitória Mínima
CLSI - “Clinical and Laboratory Standards Institute”
DPEC - Dietilpirocarbonato
EDTA - Ácido Etilenodiaminotetracético
ESβL - “Extended Spectrum β-Lactamase”
EUA - Estados Unidos da América
IMP - Imipenemase
LB - Luria-Bertani
LEMC - Laboratório Especial de Microbiologia Clínica
MATE - “Multidrug and Toxic Compound Extrusion”
MFS- “Major Facilitator Superfamily”
MβL - Metalo-β-Lactamase
PCR - Reação da Polimerase em Cadeia
PFGE - Eletroforese em Campo Pulsátil
RND - “Resistance Nodulation- Division”
SMR - “Small Multidrug Resistance”
SPM - São Paulo Metalo-β-Lactamase
UNIFESP - Universidade Federal de São Paulo
xiv
RESUMO
Objetivo: A expressão de sistemas de efluxo tem sido reconhecida com um
importante mecanismo de resistência antimicrobiana entre isolados clínicos de
P. aeruginosa. Este estudo investigou a expressão de sistemas de efluxo entre
amostras clínicas de P. aeruginosa. Métodos: Sessenta amostras clínicas de
P. aeruginosa isoladas de infecção da corrente sanguínea de pacientes
hospitalizados no Hospital São Paulo/UNIFESP entre julho e dezembro de
2005 foram avaliadas. O perfil de sensibilidade bacteriana foi determinado
utilizando-se da técnica de ágar diluição de acordo com as recomendações do
CLSI 2006. A quantificação da expressão gênica foi determinada pela técnica
de qRT-PCR para os genes dos quatro sistemas de efluxo avaliadas bombas
de efluxo (mexB, mexD, mexF, mexY), oprD and ampC e comparada à
expressão desses genes nas cepas de P. aeruginosa ATCC 27853 e PAO1. A
presença de genes codificadores de metalo-β-lactamases (MβL) foi investigada
através do teste de hidrólise enzimática dos carbapenens e confirmada por
PCR. A relação genética entre os isolados foi avaliada pela técnica de PFGE.
Resultados: O aztreonam (MIC
50
, 8 µg/mL; 65% de sensibilidade) demonstrou
possuir a melhor atividade in vitro contra os isolados de P. aeruginosa testadas.
Somente 48,4% dos isolados de P. aeruginosa eram sensíveis ao imipenem e
meropenem (MIC
50
, 8 µg/mL). A presença dos genes bla
SPM
e bla
IMP
, que
codificam MβL, foi detectada em 23,3% e 1,7% dos isolados de P. aeruginosa,
respectivamente. A hiperexpressão do sistema de efluxo MexXY-OprM (60%)
foi a mais freqüente entre os isolados, seguida pela hiperexpressão dos
sistema MexAB-OprM (31,7%) e MexCD-OprJ (18,3%). A hiperexpressão
xv
simultânea dos sistemas MexAB-OprM e MexXY-OprM foi observado em
16,7% dos isolados de P. aeruginosa. Nenhum dos isolados avaliados
apresentaram hiperexpressão do sistema MexEF-OprN. A β-lactamase AmpC
estava hiperexpressa em 90% dos isolados clínicos avaliados, enquanto, a
redução da expressão de OprD foi observada em 35% das P. aeruginosa
testadas e em 50% daquelas que apresentaram resistência aos carbapenens.
Conclusão: Esse estudo sugere que a hiperexpressão dos sistemas de efluxo
em P. aeruginosa, está associada a outros mecanismos de resistência, como a
hiperexpressão de AmpC e produção de MβL, e contribui efetivamente para o
fenótipo de resistência a múltiplos antimicrobianos em amostras clínicas de P.
aeruginosa.
Introdução 1
1 INTRODUÇÃO
Pseudomonas aeruginosa é um bacilo Gram-negativo, não fermentador
de glicose e representa um patógeno oportunista humano ubíquo de notória
significância clínica e representa uma das principais causas de infecções
relacionadas à assistência a saúde (37). Seu sucesso ecológico deve-se a
características como a grande capacidade de adaptação ao meio ambiente, a
mínina exigência nutricional, a resistência intrínseca e a habilidade de
desenvolver resistência a maioria dos antimicrobianos. Certamente, esses
fatores contribuíram para que esta bactéria se tornasse um importante
patógeno desde o último século (143).
A resistência antimicrobiana, além de constituir um desafio clínico, é
atualmente considerada um grande problema de saúde pública. As bactérias
Gram-negativas, entre as quais se inclui a P. aeruginosa, dispõem de um
arsenal de mecanismos de resistência aos antimicrobianos utilizados na prática
clínica. Os β-lactâmicos são usualmente utilizados para o tratamento de
infecções causadas por P. aeruginosa; entretanto, diversos mecanismos de
resistência a essa classe de drogas foram descritos, entre os quais se
destacam: i) os mecanismos de impermeabilidade às drogas, por alteração
estrutural e/ou na expressão de proteínas de membrana externa ou por
bombas de efluxo; ii) modificação do sítio de ação da droga, como alteração de
proteínas ligadoras de penicilinas e iii) a produção de β-lactamases, enzimas
capazes de clivar o núcleo ativo destes agentes, inativando sua ação
antimicrobiana (118, 156).
Introdução 2
Estudos recentes destacam a implicação da permeabilidade da célula
bacteriana às drogas como um fator determinante de resistência aos
antimicrobianos em diversos grupos de microrganismos (30, 41, 85). A
diminuição na permeabilidade da membrana externa bacteriana limita a entrada
de antimicrobianos no interior da célula comprometendo a atividade desses
fármacos e contribuindo para a diminuição da sensibilidade desses
microrganismos às drogas. Porém, para levar a níveis de resistência
significativos a diminuição da permeabilidade da membrana celular bacteriana
depende de mecanismos adicionais que funcionam concomitantemente, como,
a produção de enzimas hidrolíticas, por exemplo, β-lactamases (5) e sistemas
de efluxo, que possuem grande importância por serem codificados por genes
cromossômicos e possuírem uma ampla variedade de substratos, podendo
exportar para o exterior da célula compostos estruturalmente distintos,
promovendo desta maneira, resistência a classes de antimicrobianos não
relacionadas (75). Portanto, o efluxo é um mecanismo comum, complexo e
eficiente, que contribui para o fenótipo de multirresistência observado em
amostras de P. aeruginosa (117).
Dada a importância das bombas de efluxo é essencial que se conheça
com que freqüência é observada a hiperexpressão desses sistemas, como
ocorre detalhadamente a regulação da sua expressão gênica e qual a sua
função fisiológica. O conhecimento da prevalência destes sistemas é de suma
importância entre isolados clínicos, pois altas taxas de resistência têm sido
observadas entre P. aeruginosa que hiperexpressam sistemas de efluxo (17,
46, 47, 84, 145).
Introdução 3
Embora existam muitos estudos sobre o tema, poucos avaliaram a
contribuição da expressão de sistemas de efluxo para a resistência bacteriana
entre amostras clínicas hospitalares (17, 46, 131). O presente estudo avalia a
expressão dos principais sistemas de efluxo entre amostras clinicas de P.
aeruginosa e, até onde sabemos, é o primeiro estudo realizado em nosso meio.
Desta maneira, pretendemos compreender o possível papel que a
hiperexpressão dos sistemas de efluxo podem desempenhar na resistência
antimicrobiana entre amostras clínicas de P. aeruginosa isolados em hospital
universitário brasileiro.
Introdução 4
1.1 Objetivos
1.1.2 Objetivo principal
Avaliar a expressão de sistemas de efluxo entre amostras clínicas de
P. aeruginosa isoladas de pacientes com infecção da corrente sanguínea
hospitalizados no Hospital São Paulo/UNIFESP no período entre junho e
dezembro de 2005.
1.1.3 Objetivos específicos
1. Determinar o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos das
amostras de P. aeruginosa estudadas
2. Determinar a relação clonal entre as amostras de P. aeruginosa
isoladas de infecções da corrente sanguínea durante o período estudado.
3. Avaliar a expressão gênica dos sistemas de efluxo MexAB-OprM,
MexCD-OprJ, MexEF-OprN e MexXY-OprM entre amostras de P. aeruginosa
estudadas.
4. Avaliar a expressão da proteína de membrana externa OprD e a sua
contribuição para a resistência antimicrobiana.
5. Avaliar a expressão da β-lactamase cromossômica AmpC e sua
relação com a resistência bacteriana aos antimicrobianos.
Revisão da Literatura 5
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Sistemas de efluxo de drogas
As membranas biológicas provavelmente surgiram precocemente
durante a evolução dos seres vivos, para isolar o conteúdo citoplasmático do
meio hidrofílico circundante, permitindo assim que as reações catalíticas
ocorressem eficientemente. As biomembranas constituem uma barreira eficaz
contra moléculas hidrofílicas, e muitos desses compostos somente penetram
no interior da célula através de um sistema específico de transporte ou através
da restrita via de endocitose. Entretanto, as membranas biológicas são
facilmente transpostas por compostos anfipáticos, que se difundem através dos
domínios hidrofóbicos e hidrofílicos da bicamada fosfolipídica. Assim, não é
surpreendente observar que mecanismos de proteção celular contra a invasão
desordenada de moléculas de propriedades anfipáticas, muitas das quais
dotadas de atividade biológica que levariam a efeitos prejudiciais à célula,
fossem desenvolvidos desde os primórdios do aparecimento de qualquer forma
de vida no planeta. A maioria desses mecanismos é constituída pelo transporte
ativo de moléculas para o exterior da célula, denominado: efluxo (64, 110).
Uma vez que muitos fármacos apresentam características anfipáticas,
o que garante sua ampla distribuição pelos tecidos e/ou sua penetração no
interior dos compartimentos celulares protegidos por membrana, não é
extraordinário notar que esses compostos são suscetíveis à ação do
mecanismo de efluxo de drogas, dirigindo-os para o exterior desses
compartimentos. Apesar de o mecanismo de efluxo ser conhecido há muito
Revisão da Literatura 6
tempo, somente recentemente tem sido reconhecida a sua importância em
conferir resistência aos antimicrobianos. Nos últimos anos numerosos sistemas
de efluxo foram caracterizados como sendo envolvidos no transporte de um
número surpreendente de drogas (103, 107, 152, 159).
O primeiro sistema de efluxo descrito em procariotos foi o sistema Tet
de Escherichia coli responsável pela diminuição da sua sensibilidade a
tetraciclina (6, 79, 94). Posteriormente, o sistema de efluxo QacA foi
identificado em Staphylococcus aureus como determinante de resistência a
compostos de amônio quaternário (129). Desde então, os sistemas de efluxo
de codificação plasmidial e cromossomal vêm sendo identificados com maior
freqüência em bactérias dos mais variados gêneros e espécies, e implicados
tanto na resistência intrínseca quanto na adquirida desses microrganismos a
agentes antimicrobianos (119). O efluxo ativo de drogas foi o último mecanismo
de resistência antimicrobiana a ser identificado.
2.2 Sistemas de efluxo em bactérias
Os sistemas de efluxo são classificados levando em consideração três
critérios básicos: a fonte de energia utilizada pelo sistema, a relação
filogenética com outros sistemas de efluxo e a especificidade de substratos,
isto é, capacidade de transportar diferentes compostos pela membrana. São
dessa forma agrupados em cinco famílias: ABC ("ATP binding cassette"), MFS
("major facilitator superfamily"), SMR ("small multidrug resistance"), MATE
("multidrug and toxic compound extrusion") e RND ("resistance-nodulation-
Revisão da Literatura 7
division"), distribuídos tanto em bactérias Gram-negativas, como também em
Gram-positivas (Figura 1) (119).
Figura 1. Extrusão ativa de drogas por várias famílias de sistemas de efluxo. A
família “ATP-binding cassette” (ABC) utiliza hidrólise de adenosina tri-fosfato
(ATP) como fonte de energia. Os outros sistemas de efluxo de droga, como, os
da família “Major facilitator superfamily” (MFS), “Multidrug and toxic compound
exporters” (MATE), “Small multidrug resistance" (SMR) e “Resistance-
nodulation-division” (RND) utilizam o antiporte de íons H
+
ou Na
+
do gradiente
iônico através da membrana citoplasmática. O sistema RND de efluxo possui
múltiplos componentes em bactérias Gram-negativas e pode transportar
substratos tanto do citoplasma quando do espaço periplasmático através da
membrana citoplasmática e da membrana externa. Fonte: Nat Rev Microbiol.
2005; 3 (7): 566-72 (67).
Revisão da Literatura 8
2.2.1 Família ABC
Os sistemas de efluxo da família ABC são o principal mecanismo de
efluxo em eucariotos, em contraste com os procariotos. Como sugere o nome
da classe, é dependente da hidrólise de ATP para prover a energia necessária
ao transporte de compostos para o exterior da célula. A essa família pertencem
diversos sistemas que transportam fármacos, açúcares, aminoácidos, cátions,
peptídeos, etc. Embora poucos sistemas de efluxo pertencentes a essa família
tenham sido descritos em procariotos, estudos indicam que o papel dos
sistemas de efluxo da família ABC na resistência antimicrobiana é atualmente
subestimado (81).
Alguns sistemas de efluxo desta família foram identificados e
implicados com a resistência bacteriana a antimicrobianos de uso clínico, entre
eles está incluso: o sistema LmrA de Lactococcus lactis, que está relacionado à
diminuição da sensibilidade aos aminoglicosídeos, aos macrolídeos, às
quinolonas, ao cloranfenicol, às estreptograminas, às tetraciclinas, aos β-
lactâmicos, entre outras drogas, sendo esse o primeiro sistema de efluxo da
família ABC identificado em procarioto (69). Nesta família, ainda estão incluídos
os sistemas DrrAB de Streptomyces peuceticus (61); o MsrA relacionado a
resistência de Staphylococcus epidermidis e S. aureus à eritromicina (128); o
Lsa, presente em Enterococcus faecalis que possuem como substratos as
lincosamidas, as estreptograminas e a quinupristina-dalfopristina (139); MsrC
presente em E. faecium, relacionado à resistência aos macrolídeos; VgaA e
VgaB encontrados no gênero Sthaphylococcus spp. e os sistemas de
transporte MacAB/TolC e McbEF em E. coli, envolvidos no efluxo de
macrolídeos e fluorquinolonas, respectivamente (11, 81).
Revisão da Literatura 9
2.2.2 Família MFS
A família MFS é uma das mais antigas e maiores, em diversidade e
números de sistemas de transporte de drogas. É encontrada em todas as
classes de organismos vivos e está envolvida no simporte, antiporte ou
uniporte de vários substratos como íons essenciais, nutrientes, metabólitos e
drogas (135).
Os sistemas de efluxo de drogas que pertencem a essa família estão
divididos em duas subfamílias: DHA12 e DHA14, formados por uma única
proteína de membrana que diferem no número de segmentos transmembrana.
O transporte de drogas para o exterior celular por esses sistemas ocorre
através de antiporte com íons hidrogênio (H
+
), portanto são dependentes da
força próton-motriz (153).
Os sistemas de efluxo desta família que são capazes de ejetar fármacos
são classificados em duas subfamílias: DHA12 e DHA14: o QacA e NorA de S.
aureus (8, 33); TetA, EmrB, MdfA e MdtD de E. coli (166); o LmrP de L. lactis e
o Bmr de Bacillus subtilis (93).
2.2.3 Família SMR
A família SMR é dividida em dois grupos filogenéticos, aparentemente
apenas um deles está relacionada à extrusão de drogas e, como a família
MFS, utiliza o gradiente proto-iônico como fonte de energia para ejetar drogas
para o exterior da célula (125).
Revisão da Literatura 10
Nessa família está contida uma série de pequenas proteínas com quatro
segmentos transmembrana que, acopladas ao potencial de membrana, na
forma oligomérica, muitas vezes como trímeros, expulsam antimicrobianos e
detergentes, entre outros compostos para o exterior da célula. Pertencem a
essa família os transportadores Smr de S. aureus e EmrE (ou MvrC) de E. coli,
o melhor sistema de efluxo caracterizado e que representa um modelo para
essa família de sistema de efluxo. Outro sistema de efluxo da família SMR
denominado EmrE
Pae
que possui identidade com o EmrE de E. coli, foi
caracterizado recentemente em P. aeruginosa. Este sistema mostrou ter um
importante papel na resistência ao brometo de etídio e aos aminoglicosídeos
(74).
2.2.4 Família MATE
Os sistemas de efluxo da família MATE são similares em tamanho aos
sistemas da família MFS; porém, diferem quanto à seqüência de aminoácidos.
Essa família de sistemas de efluxo foi caracterizada recentemente com a
identificação de NorM, um sistema de transporte antiporte que acopla cátions
sódio (Na
+
) em Vibrio parahaemolyticus, e que confere resistência aos
detergentes, às fluorquinolonas e aos aminoglicosídeos. Um sistema de efluxo
homólogo ao NorM foi descrito em Neisseria gonorrhoeae e Neisseria
menigitidis (99, 130).
Adicionalmente, o sistema de efluxo YdhE foi caracterizado em E. coli
como pertencente a essa família e demonstrou relação com a diminuição da
Revisão da Literatura 11
sensibilidade dessa espécie bacteriana a antimicrobianos catiônicos, como os
compostos de amônio quaternário (165).
Apesar de ter sido encontrado com ampla distribuição em procariotos,
leveduras e plantas, o conhecimento sobre os transportadores da família MATE
é relativamente recente e escasso. Porém, essa situação tem mudado
rapidamente com a elucidação da estrutura e da regulação dos transportadores
dessa família, especialmente porque os transportadores MATE parecem estar
envolvidos na resistência a antimicrobianos de relevância clínica (93).
2.2.5 Família RND
A família RND de sistemas de efluxo é a mais ampla em especificidade
de substratos frente a antimicrobianos de relevância clínica e desempenha um
importante papel na resistência intrínseca e adquirida em diversas bactérias
Gram-negativas. Geralmente, os genes que codificam os sistemas de efluxo
pertencentes a essa família estão localizados no cromossomo bacteriano;
porém, a expressão de genes desses sistemas de efluxo presentes em
plasmídios foi reportada (68).
Através de antiporte de íons H
+
, os sistemas RND de efluxo exportam
grande variedade de substratos entre os quais se incluem antibióticos,
antissépticos, desinfetantes, detergentes, corantes, ácidos graxos tóxicos, sais
biliares, inibidores da síntese de ácidos graxos, homoserina lactona, e
compostos aromáticos, como os solventes (119).
Diferente das outras famílias de efluxo, que são constituídas por um
componente simples, os sistemas de efluxo RND, prevalentes em bactérias
Revisão da Literatura 12
Gram-negativas, estão organizados em três partes, formados por: i) uma
proteína transportadora inserida na membrana citoplasmática e que
desempenha a função de bomba; ii) uma proteína de membrana externa ou
porina, que forma o canal extrusivo e iii) o terceiro, um componente essencial
que é uma proteína de fusão localizada no espaço periplasmático que une os
outros dois constituintes, ou seja a bomba e o canal de extrusão (117).
Os dois sistemas de efluxo dessa família mais estudados em bactérias
Gram-negativas são o AcrAB-TolC e o MexAB-OprM que confere resistência a
várias drogas antimicrobianas em E. coli e P. aeruginosa, respectivamente.
Ambos são de expressão gênica constitutiva, e os seus respectivos genes
estão localizados em operons, os quais são passiveis de regulação da
expressão gênica (119).
A análise do genoma de E. coli revelou a presença de sete sistemas de
efluxo da família RND (106). Cinco desses foram caracterizados e implicados
no efluxo de drogas: AcrAB, AcrEF, AcrD, YhiUV e MdtABC.
AcrAB-TolC é o sistema de efluxo da família RND mais estudado e
prevalente em E. coli, onde AcrB é a proteína de membrana interna; AcrA, a
proteína de fusão periplasmática; e TolC a porina localizada na membrana
externa e que forma o canal extrusivo. Os genes acrA e acrB, estão localizados
em um mesmo operon, enquanto o gene que codifica a porina TolC está
localizado em um operon distinto (38). A atividade desse sistema de efluxo
resulta na diminuição da sensibilidade de E. coli à tetraciclina, ao cloranfenicol,
às fluorquinolonas, aos β-lactâmicos, à eritromicina, entre outros
Revisão da Literatura 13
antimicrobianos, e também a outros compostos como detergentes, compostos
orgânicos e solventes.
Todos os sistemas RND estudados em E. coli são encontrados em
associação com a proteína de membrana externa TolC. O sistema AcrD foi
identificado originalmente como uma bomba de composição simples que
conferia resistência aos aminoglicosídeos (127). Porém, posteriormente
observou-se que AcrA e TolC estão associados a AcrD e transportam sais
biliares e novobiocina, além dos aminoglicosídeos (126). AcrEF não é expresso
em células selvagens de E. coli, mas sua expressão é observada em mutantes
resistentes às fluoroquinolonas que perderam o sistema AcrAB.
Interessantemente, a proteína AcrF funciona em associação com AcrA e TolC
no efluxo de solventes, sugerindo que componentes do complexo RND possam
estar associados com várias bombas de efluxo (54). Quando hiperexpresso,
YhiUV é responsável pela resistência à eritromicina. Enquanto MdtABC confere
resistência a sais biliares e novobiocina (102). Extraordinariamente, MdtABC
contém duas diferentes proteínas que funcionam como bomba, MdtB e MdtC, e
ambas são necessários para a extrusão de drogas (62).
TolC também funciona como canal extrusivo para sistemas de efluxo
pertencentes a outras famílias que não a RND, funcionando em cooperação
com outros sistemas, como, o EmrB, implicado na resistência de E. coli ao
ácido nalidíxico; com o sistema MdfA, responsável pela resistência ao
cloranfenicol, e com o sistema EmrE, implicado na resistência a compostos de
amônio quaternário (148).
Revisão da Literatura 14
Além de E. coli e P. aeruginosa, os sistemas de efluxo são também
reportados em outras bactérias de relevância clínica. Burkhoderia cepacia,
originalmente identificada como um patógeno de plantas, surgiu como um
importante patógeno humano oportunista, especialmente em pacientes com
fibrose cística. Esta espécie bacteriana expressa o sistema de efluxo CeoAB-
OpcM, que é homologo ao sistema MexAB-OprM de P. aeruginosa. CeoAB-
OpcM está relacionado com a resistência ao cloranfenicol, às fluorquinolonas e
ao trimetoprim (43). Adicionalmente, Burkholderia pseudomallei, causadora de
melioidose, possui resistência intrínseca aos β-lactâmicos, aos macrolídeos, à
polimixina e aos aminoglicosídeos, o que dificulta o tratamento de infecções
causadas por este patógeno. Acredita-se que parte desse perfil de resistência é
conseqüência da expressão dos dois sistemas de efluxo identificados nesse
patógeno: AmrAB-OprA e BpeAB-OprB, ambos conferindo resistência aos
aminoglicosídeos e, em menor grau, aos macrolídeos, além de exercer
influência em seus fatores de virulência (19).
Stenotrophomonas maltophilia possui dois sistemas RND de efluxo:
SmeABC e SmeDEF, os quais são homólogos ao sistema MexAB-OprM de P.
aeruginosa (4, 20). O sistema SmeDEF está envolvido no efluxo da
eritromicina, da tetraciclina, dos macrolídeos, do cloranfenicol e das
fluoroquinolonas (168), enquanto que o sistema SmeABC é responsável pela
resistência intrínseca aos β-lactâmicos, aos aminoglicosídeos e às
fluoroquinolonas (76).
Neisseria gonorrhoeae também expressa de forma constitutiva um
sistema de fluxo da família RND denominado MtrCDE, também localizado em
operon, é hiperexpresso em bactérias que apresentam mutação do gene
Revisão da Literatura 15
regulador provocando resistência aos antimicrobianos da classe das
penicilinas, dos macrolídeos, da rifampicina, detergentes e sais biliares (130).
Três diferentes sistemas de efluxo dessa família foram caracterizados
em Serratia marcescens. A expressão exacerbada de SdeAB nessa bactéria foi
detectada em isolados clínicos resistentes às fluoroquinolonas, que também
eram capazes de induzir a expressão de SdeAB, como observado in vitro,
levando ao aumento da resistência às fluoroquinolonas, como também ao
cloranfenicol e aos detergentes. O segundo sistema de efluxo de S.
marcescens chamado SdeXY é homólogo ao sistema AcrAB-TolC de E. coli e
possui como substratos a norfloxacina e a tetraciclina. O terceiro sistema de
efluxo identificado nessa espécie foi o SdeCD, homólogo ao sistema MdtABC
de E. coli, entretanto, ainda não foram descritos os compostos ejetados por
esse sistema (9, 91, 138).
Considerada uma das principais causas de infecções relacionadas à
assistência a saúde, Acinetobacter baumannii apresenta alto grau de
resistência a vários antimicrobianos que incluem β-lactâmicos,
aminoglicosídeos e quinolonas. O primeiro sistema de efluxo identificado em A.
baumannii foi denominado AdeABC, um sistema de efluxo pertencente a
família RND que também confere resistência às fluorquinolonas, às
tetraciclinas, ao cloranfenicol, à eritromicina e ao trimetoprim (132).
Posteriormente, AdeDE foi caracterizado como outro sistema RND de efluxo
presente neste agente infeccioso. Este sistema é capaz de ejetar
antimicrobianos de classes distintas como: amicacina, ceftazidima,
cloranfenicol, ciprofloxacina, eritromicina, meropenem, rifampicina e tetraciclina
(22, 83).
Revisão da Literatura 16
A resistência de Salmonella spp. às fluoroquinolonas, também pode ser
conseqüente à presença de bombas de efluxo. Um sistema homólogo ao
AcrAB de E. coli, foi encontrado em S. enterica serovar Typhimurium como
responsável pela resistência à tetraciclina, ao cloranfenicol, à carbenicilina, à
cefoxitina e às fluoroquinolonas (7).
Estudos com isolados clínicos de Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca,
Enterobacter cloacae e E. aerogenes demonstraram que a hiperrexpressão de
sistemas AcrAB nessas cepas estavam envolvidos na resistência a múltiplos
agentes antimicrobianos (12, 39, 44, 144). Em Campylobacter jejuni dois
diferentes sistemas RND de efluxo, CmeABC e CmeDEF, foram reportados. O
primeiro sendo capaz de transportar fluoroquinolonas, sais biliares, brometo de
etídio e metais pesados (123).
2.3 Sistemas de efluxo de drogas em P. aeruginosa
O seqüenciamento do genoma de P. aeruginosa permitiu a identificação
de 12 sistemas de efluxo da família RND denominados Mex, do inglês
“m
ultidrug efflux pump”, de expressão constitutiva codificada por operons,
sempre regulados pelo produto de um gene regulador proximal. Sete desses
sistemas foram caracterizados até o momento: MexAB-OprM, MexCD-OprJ,
MexEF-OprN, MexXY-OprM, MexJK-OprM, MexGHI-OpmD e MexVW-OprM
(119).
P. aeruginosa apresenta resistência intrínseca a vários antimicrobianos
devido em parte a sua impermeabilidade a drogas, como também devido à
Revisão da Literatura 17
presença de sistemas constitutivos de efluxo. O primeiro sistema de efluxo do
tipo RND caracterizado nesse microrganismo foi o MexAB-OprM (121). Dos
sistemas RND de efluxo caracterizados em P. aeruginosa, somente MexAB-
OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN e MexXY-OprM têm sido relacionados, até o
momento, à resistência intrínseca e adquirida a uma ampla variedade de
drogas antimicrobianas de importância clínica. Os outros sistemas Mex de P.
aeruginosa provavelmente possuem limitada significância clínica, uma vez que,
são capazes de ejetar um número menor de antimicrobianos e sua expressão
não foi detectada entre isolados clínicos (119).
Distintamente do que é observado em E. coli, em que somente a
proteína de membrana externa TolC une o canal extrusivo à diferentes
bombas, existem pelo menos 18 proteínas de membrana externa homólogas à
OprM associadas às diversas bombas de efluxo em P. aeruginosa (57).
Uma abordagem detalhada sobre os principais sistemas de efluxo Mex
de P. aeruginosa é apresentada nos tópicos subseqüentes.
2.3.1 MexAB-OprM
O sistema MexAB-OprM é o sistema mais importante em P. aeruginosa,
expresso constitutivamente desempenha um importante papel na resistência
intrínseca e adquirida a múltiplos antimicrobianos em cepas selvagens de P.
aeruginosa (90).
Os substratos dessa bomba incluem β-lactâmicos, inibidores de β-
lactamases, fluoroquinolonas, macrolídeos, tetraciclinas, cloranfenicol,
novobiocina, sulfonamidas, trimetoprim e tiolactomicinas, bem como outros
Revisão da Literatura 18
compostos não relacionados tais como detergentes, corantes, triclosan e
compostos orgânicos (105). É interessante notar que o sistema MexAB-OprM
exporta β-lactâmicos, uma classe de antimicrobianos pouco comum como
substratos de sistemas de efluxo, incluindo os carbapenens, exceto imipenem
(167).
A expressão do sistema MexAB-OprM é regulada pela proteína MexR, a
qual é codificada pelo gene mexR, que está localizado montante à mexAB-
oprM (Figura 2). A proteína MexR, na forma de dímero, insere-se na dupla
hélice de DNA na região entre os genes mexR e mexA, correspondente a
região promotora do operon mexAB-oprM. Dessa maneira, ela auto-regula a
sua expressão e atua como repressor da expressão do sistema MexAB-OprM.
(136).
A hiperexpressão do sistema MexAB-OprM é observada em três tipos de
cepas de P. aeruginosa mutantes: nalB, nalC e nalD. Os mutantes nalB
apresentam alterações na seqüência de DNA do gene mexR (137), enquanto
nos mutantes nalC e nalD a hiperexpressão do operon mexAB-oprM é
determinada por alterações em outros genes reguladores. As cepas mutantes
nalC carregam uma mutação no gene PA3721, também chamado de nalC, que
codifica um repressor da transcrição do operon formado pelos genes PA3720-
PA3719. O produto da expressão de PA3719, aparentemente, possui a
capacidade de inibir a atividade repressora de MexR. Dessa forma, um
aumento na expressão de PA3719, em conseqüência a alterações genéticas
no seu gene regulador PA3721 ou nalC, pode levar a uma hiperexpressão do
operon mexAB-oprM. (13, 32).
Revisão da Literatura 19
Recentemente, uma mutação no gene denominado nalD foi descrita
como responsável pela hiperrexpressão de MexAB-OprM em uma cepa de P.
aeruginosa que apresentava resistência a múltiplas drogas. Foi demonstrado
que NalD apresenta atividade regulatória negativa direta sobre mexAB-oprM
ligando-se à sua região promotora e que mutações nesse gene regulador
resultam na resistência de P. aeruginosa a múltiplas drogas devido a repressão
diminuída de mexAB-oprM. Esses achados sugerem que a expressão de
MexAB-OprM é influenciada por múltiplos reguladores (140).
A hiperexpressão do sistema de fluxo MexAB-OprM entre isolados
clínicos de P. aeruginosa é bastante comum. Uma investigação em hospital
francês revelou que 46% de isolados clínicos de P. aeruginosa
hiperexpressavam o sistema MexAB-OprM (51). Outro estudo epidemiológico
realizado em hospital britânico que avaliou isolados clínicos de P. aeruginosa
observou a hiperexpressão de MexAB-OprM em cerca de 80% dos isolados de
P. aeruginosa que apresentava resistência à carbenicilina (68). Esses estudos
sugerem que a exposição de P. aeruginosa a antimicrobianos pode resultar na
seleção de mutantes resistentes a múltiplas drogas, e que a hiperrexpressão
de MexAB-OprM parece ser o principal contribuinte para o desenvolvimento do
fenótipo de multirresistência (10).
Revisão da Literatura 20
Figura 2. Organização genética dos operons mexR-mexAB-oprM, mexT-
mexEF-oprN, nfxB-mexCD-oprJ, mexZ-mexXY e mexL-mexJK de P.
aeruginosa. Cada operon contém os genes que codificam os componentes dos
respectivos sistemas de efluxo: proteína de fusão periplasmática (em laranja),
proteína de membrana interna, bomba (em azul) e proteína de membrana
externa, canal extrusivo (em verde). Adjacente, à montante, está representado
o gene regulador proximal de cada operon (em lilás) que exercem a função
ativadora (+) ou repressora (-) da transcrição dos genes contidos no operon.
Fonte: Pathol Biol (Paris). 2004; 52(10): 607-16 (16).
2.3.2 MexCD-OprJ
O sistema MexCD-OprJ não é expresso em cepas selvagens de P.
aeruginosa, e assim não contribui para resistência intrínseca. Porém sua
expressão pode ser observada entre mutantes nfxB, resultante de mutação no
gene repressor da transcrição desse sistema de efluxo, localizado na região
montante ao operon mexCD-oprJ (Figura 2). Esses mutantes demonstram
Revisão da Literatura 21
resistência às quinolonas, às tetraciclinas, ao cloranfenicol, à acriflavina, ao
brometo de etídio, ao triclosan e aos solventes orgânicos (88, 120).
Os mutantes nfxB são classificados em dois tipos: nfxB tipo A, que
apresenta resistência à ofloxacina, à eritromicina e às cefalosporinas de quarta
geração, e nfxB tipo B resistentes à tetraciclina e ao cloranfenicol, em adição
aos agentes mencionados para o tipo A (23). Os mutantes nfxB tipo B são de
quatro a oito vezes mais sensíveis a algumas penicilinas, carbapenens e
aminoglicosídeos que as cepas selvagens de P. aeruginosa. A sensibilidade
aumentada desses mutantes aos β-lactâmicos provavelmente se deve à
concomitante diminuição da expressão do sistema MexAB-OprM, que exporta
vários antimicrobianos dessa classe, e também resultado da redução da
expressão da β-lactamase cromossomal AmpC em mutantes que
hiperexpressam o sistema MexCD-OprJ (42, 89, 108). Adicionalmente, o
aumento da sensibilidade dos mutantes nfxB aos aminoglicosídeos, que é um
dos principais substratos do sistema de efluxo MexXY-OprM, sugere que a
expressão desse último sistema também está reduzida entre esses mutantes
(119).
A seleção de mutantes nfxB pode ser realizada in vitro através da
exposição de P. aeruginosa a fluorquinolonas, como a trovafloxacina (163), e
sua freqüência é relativamente alta em pacientes com fibrose cística,
provavelmente, conseqüência à exposição prolongada à ciprofloxacina (56).
A expressão de MexCD-OprJ parece ser induzível por compostos que
não possuem atividade antimicrobiana como rodamina 6G, brometo de etídio,
tetrafenil-fosfórico e acriflavina, sugerindo que a expressão de MexCD-OprJ
Revisão da Literatura 22
possivelmente está relacionada a extrusão de outros compostos tóxicos a
célula bacteriana (90, 108). Os desinfetantes a base de gluconato de
clorexidina e cloreto de belzalcômio de uso clínico também são capazes de
selecionar mutantes nfxB de P. aeruginosa (119). Entretanto, a ocorrência de
mutantes nfxB entre isolados clínicos de P. aeruginosa é ainda pouco
reportada (47, 55).
2.3.3 MexEF-OprN
A expressão de MexEF-OprN também parece estar quiescente em
cepas selvagens de P. aeruginosa. MexEF-OprN é expresso em cepas
denominadas nfxC, que apresentam resistência a múltiplas drogas.
Originalmente detectado como um mutante resistente às fluorquinolonas,
observou-se, posteriormente, que mutantes nfxC também desenvolviam
resistência ao cloranfenicol e ao trimetoprim, como conseqüência da extrusão
direta desses antimicrobianos, e indiretamente ao imipenem (36, 53). A seleção
de mutantes nfxC pode ser observada in vitro após a exposição às
fluorquinolonas e acredita-se que esses mutantes também possam ser
selecionados clinicamente (68).
Os mutantes nfxC, que hiperexpressam o sistema MexEF-OprN,
apresentam aumento da sensibilidade aos β-lactâmicos e aos aminoglicosídeos
como resultado da diminuição da expressão de MexAB-OprM e MexXY-OprM,
os quais possuem expressão co-regulada por esse sistema (108, 164).
A transcrição de mexEF-oprN é dependente da presença de MexT, uma
proteína ativadora da sua transcrição, codificada por um gene localizado à
Revisão da Literatura 23
montante ao operon de MexEF-OprJ e que parece está suprimido em cepas
selvagens de P. aeruginosa (Figura 2). A transcrição de mexT é suficiente para
ativar a expressão desse operon. Entretanto, acredita-se que como os outros
reguladores do tipo LysR, a transcrição de mexT é ativada pela ligação de
moléculas efetoras, sugerindo que a expressão do complexo MexEF-OprN é
resultado da interação dessas moléculas que normalmente induz sua
expressão na presença de seus substratos fisiológicos (63, 86). Variações em
mexT são observadas entre cepas mutantes que hiperexpressam MexEF-
OprN, porém a atividade regulatória de mexT parece está relacionada ao
produto de um gene localizado à montante, recentemente caracterizado e
denominado mexS. Contudo, os mecanismos de regulação da expressão de
MexEF-OprN não foram totalmente elucidados até o momento (141).
Além de possuir propriedade ativadora da expressão gênica, acredita-se
que MexT possui uma função regulatória repressora, implicada da inibição pós-
transcricional da expressão de OprD, uma proteína de membrana externa ou
porina que permite a entrada de imipenem na célula bacteriana. Assim, a
resistência ao imipenem exibida pelos mutantes nfxC é explicada pela redução
da expressão de OprD e não como conseqüência direta da extrusão do
imipenem pelo sistema de efluxo MexEF-OprN (35, 65, 161). Além disso, é
observada a supressão da expressão de fatores de virulência em P. aeruginosa
concomitante à hiperexpressão de MexEF-OprN em mutantes nfxC (87).
Revisão da Literatura 24
2.3.4 MexXY-OprM
Em contraste com os outros operons que codificam sistemas de efluxo
em P. aeruginosa, o operon mexXY não possui o gene que codifica a proteína
de membrana externa, para essa função o sistema MexXY utiliza a OprM, que
também exerce a função de canal extrusivo para vários outros sistemas de
efluxo identificados em P. aeruginosa (117).
A deleção dos genes mexXY em cepas selvagens de P. aeruginosa
resulta no aumento da sensibilidade aos aminoglicosídeos, à tetraciclina e à
eritromicina, indicando que esse sistema é responsável pela resistência
intrínseca de P. aeruginosa a essas drogas (3). A expressão de mexXY em P.
aeruginosa é induzida na presença dos aminoglicosídeos, assim, acredita-se
que o efluxo ativo de drogas pelo sistema MexXY-OprM seja o mecanismo
responsável pela resistência adaptativa de P. aeruginosa aos
aminoglicosídeos, uma vez que, foi observado que a exposição prolongada de
cepas selvagens de P. aeruginosa sensíveis aos aminoglicosídeos resulta no
desenvolvimento de resistência a essas drogas conseqüente à hiperexpressão
desse sistema de efluxo (52).
O sistema MexXY-OprM quanto está hiperexpresso em cepas mutantes
de P. aeruginosa também é capaz de causar resistência às fluoroquinolonas,
apesar de não contribuir para a resistência intrínseca de P. aeruginosa às
fluoroquinolonas (98).
Uma recente comparação entre cepas mutantes de P. aeruginosa que
hiperexpressam o sistema MexXY-OprM e cepas que tiveram o gene mexXY
Revisão da Literatura 25
silenciado revelou que esse sistema de fluxo também é capaz de ejetar
macrolídeos, cloranfenicol e um limitado número de β-lactâmicos (90, 109).
Um gene denominado mexZ foi identificado à montante ao operon
mexXY que aparentemente codifica um repressor desse operon (Figura 2) (92).
A contribuição da expressão de MexXY-OprM para resistência a
aminoglicosídeos foi destacada em um estudo com isolados clínicos de P.
aeruginosa resistentes a esses agentes antimicrobianos oriundos de pacientes
com fibrose cística em que a maioria possuíam mutação no gene mexZ;
entretanto, a hiperexpressão de MexXY-OprM também foi observada
independente da alteração do seu gene regulador proximal, sugerindo a
existência de um outro mecanismo de indução da expressão desse sistema de
efluxo (155).
Existem relatos da acomodação de β-lactâmicos de dupla carga, como
cefepima e cefpiroma, a sistemas de efluxo ativo em P. aeruginosa (90). Uma
correlação positiva da expressão de MexXY com a resistência a cefepima foi
observada em um estudo que avaliou isolados clínicos de P. aeruginosa
oriundas de um hospital francês, que apresentavam resistência à cefepima e
sensibilidade à ceftazidima. A hiperexpressão do sistema de efluxo MexXY-
OprM foi o mecanismo responsável por este fenótipo de resistência (50).
2.3.5 MexJK
O sistema de efluxo MexJK exibe a mais restrita especificidade de
substratos dos sistemas RND de P. aeruginosa; ejetam somente triclosan,
eritromicina e tetraciclina (25).
Revisão da Literatura 26
Essa bomba foi identificada como resultado da exposição ao triclosan,
uma droga com atividade antibacteriana comumente utilizada em vários
produtos de uso doméstico. A exposição ao triclosan foi capaz de selecionar
organismos que apresentavam mutação do gene mexL, localizado
imediatamente à montante e cujo produto de sua expressão exerce a função
regulatória do operon mexJK-opmD. Esse fato serve como exemplo de que o
uso de substâncias com atividade antimicrobiana no ambiente doméstico pode
selecionar microrganismos resistentes a múltiplas drogas e que, possivelmente,
pode selecionar microrganismos resistentes aos antimicrobianos de relevância
clínica (24, 26).
O sistema MexJK apresenta uma peculiaridade em relação aos outros
sistemas de efluxo de P. aeruginosa, utiliza diferentes proteínas de membrana
externa como canal extrusivo dependendo do composto a ser ejetado. Para a
extrusão de eritromicina e tetraciclina é utilizada a OprM, enquanto que OmpH
é utilizada para a extrusão de triclosan (25, 25).
A ocorrência de mutantes que hiperexpressam o sistema MexJK não foi
documentada entre amostras clínicas e a sua contribuição para o
desenvolvimento do fenótipo de resistência a antimicrobianos no ambiente
hospitalar permanece ainda desconhecida (26, 68).
2.3.6 MexGHI-OpmD e MexVW
O sistema MexGHI-OpmD contém uma proteína de fusão MexH
localizada no espaço periplasmático, uma proteína de membrana interna MexI
Revisão da Literatura 27
que funciona como bomba e uma proteína de membrana externa OpmD que
representa o canal extrusivo. Esse sistema também apresenta uma pequena
proteína, MexG, cuja função é desconhecida (2).
Diversos estudos observaram que a expressão de MexGHI-OpmD
confere resistência à norfloxacina, ao brometo de etídio, à acriflavina e à
rodamina 6G, além de estar envolvido na comunicação entre as células e na
expressão de fatores de virulência. Este sistema de efluxo parece estar
presente em cepas selvagens de P. aeruginosa (1).
O sistema MexVW foi o sistema de efluxo da família RND mais
recentemente caracterizado em P. aeruginosa e mostrou funcionar em conjunto
com a proteína de membrana externa OprM conferindo resistência às
fluoroquinolonas, à tetraciclina, ao cloranfenicol, à eritromicina, ao brometo de
etídio e à acriflavina (77).
Até o momento, não se conhece a relevância clínica dos sistemas de
efluxo MexGHI-OpmD e MexVW que podem exercer em relação à resistência
bacteriana (68).
2.4 Funções fisiológicas dos sistemas de efluxo RND
A função natural dos diferentes sistemas de efluxo da família RND é
ainda um assunto em discussão. Foi originalmente proposto como um
mecanismo de defesa de bactérias Gram-negativas contra os antimicrobianos
do meio e outras toxinas. Entretanto, um estudo filogenético apontou a
presença de similaridade entre bombas de efluxo da família RND presentes em
Revisão da Literatura 28
bactérias Gram-negativas com àquelas encontradas em bactérias Gram-
positivas e, até mesmo bombas de efluxo de células humanas. Assim foi
estabelecido que proteínas transportadoras da família RND são parte de uma
família ancestral de proteínas encontradas em seres vivos de todos os reinos
(150).
O sistema AcrAB, expresso constitutivamente em E. coli, possui alta
afinidade por sais biliares, como demonstrado através da hipersensibilidade a
esses composto observada em cepas de E. coli que sofreram deleção do gene
acrAB. O habitat natural da E. coli é o trato intestinal e esse sistema de efluxo
protege-a da ação dos sais biliares presente nesse meio (147). De forma
semelhante, a função de proteção é atribuída à expressão do sistema de efluxo
MtrCDE de N. gonorrhoeae, que lhe proporciona resistência aos lipídios fecais
(154). Outras funções naturais atribuídas aos sistemas de efluxo incluem: a
remoção de toxinas e de metabólitos possivelmente tóxicos, produtos de
processos fisiológicos, como, os da fermentação (45).
Um recente estudo sugere a correlação entre a expressão de AcrAB-
TolC em amostras de E. coli e a concentração intracelular de íons cálcio,
importante para processos fisiológicos como quimiotaxia, divisão celular e
transdução de sinal de procariotos. Adicionalmente, alguns estudos revelam
que a concentração de íons Ca
++
livre no interior da célula bactéria pode
regular a expressão de diversos genes em E. coli e Bacillus subtilis (58).
Os sistemas de efluxo da família RND também estão envolvidos no
processo de sinalização entre as células, “quorum-sensing”. Estudos sugerem
que os sistemas MexAB-OprM e MexGHI-OpmD de P. aeruginosa estão
Revisão da Literatura 29
envolvidos na homeostase de N-acil-homoserina-lactona, uma molécula do
mecanismo de “quorum-sensing” (1). Observa-se uma redução na virulência
regulada por “quorum-sensing” em amostras de P. aeruginosa em que o
sistema MexAB-OprM está hiperexpresso, em conseqüência à diminuição da
concentração de homoserina lactona acetilada no interior da célula (116).
Adicionalmente, amostras de P. aeruginosa secretam uma substância
sinalizadora de quinolonas designada PQS, do inglês, “P
seudomonas
q
uinolone signal”, que atua no “quorum-sensing”, que se encontra alterado em
mutantes de hiperexpressam o sistema MexEF-OprN (112).
Evidências que relacionem os sistemas de efluxo à virulência das
bactérias também têm sido encontradas. MexAB-OprM demonstrou ter um
importante papel na exteriorização de invasinas e fatores de aderência de P.
aeruginosa. Observou-se que mutantes que perderam o sistema MexAB-OprM
apresentavam capacidade invasiva limitada (58, 116).
2.5 Importância clínica dos sistemas de efluxo em bactérias
2.5.1 Efluxo como mecanismo de resistência bacteriana
A resistência intrínseca a certos agentes antimicrobianos é conferida
pela expressão basal de sistemas de efluxo. Entretanto, a resistência adquirida
de bactérias que usualmente apresentam-se como sensíveis a certos
antimicrobianos pode ser atribuída a um aumento da expressão de bombas de
efluxo (124).
Revisão da Literatura 30
Uma permanente falha na regulação da expressão desses sistemas de
efluxo pode ocorrer por diferentes mecanismos como: i) mutação no gene
regulador proximal; ii) mutação em genes do mecanismo global de regulação
da expressão gênica, que geralmente codifica um ativador da transcrição; iii)
mutação na região promotora dos genes que codificam bombas de efluxo e iv)
inserção de seqüências de DNA na região adjacente aos genes que codificam
os sistemas de efluxo levando ao aumento da sua expressão (119).
A resistência de cepas mutantes em que se observa um aumento da
concentração inibitória mínima (CIM) de três ou mais antimicrobianos quando
comparada à CIM da cepa de origem pode sugerir expressão aumentada ou
hiperexpressão de sistemas de efluxo. As CIMs dos agentes antimicrobianos
observada em mutantes clínicos que hiperexpressam sistemas de efluxo são,
geralmente, duas a oito vezes maiores que aquelas observadas entre cepas
sensíveis. Um aumento de até 100 vezes na CIM pode ser observado em
cepas mutantes que hiperexpressam os sistemas de efluxo e que possuem
outros mecanismos de resistência associados, como a produção de enzimas
que inativam os agentes antimicrobianos ou alteração no sítio de ação dos
antimicrobianos, o que ressalta a importância dos sistemas de efluxo de droga
e da sua associação com outros mecanismos de resistência bacteriana.
Todavia, há exemplos claros de que a CIM de antimicrobianos utilizados na
clínica pode ultrapassar os pontos de corte para resistência como resultado
somente da expressão de sistemas de efluxo. Esse fenômeno é
freqüentemente observado na resistência às fluoroquinolonas (117, 118).
Os substratos que são ejetados por sistemas de efluxo como resultado
de sua hiperrexpressão em bactérias incluem uma ampla variedade de
Revisão da Literatura 31
moléculas estruturalmente distintas. Porém, os substratos de cada sistema
variam de acordo com o tipo de bomba e com a espécie bacteriana (73).
Apesar de os sistemas de efluxo RND já terem sido estudados em
detalhes, adicionais estudos têm sido conduzidos com o intuito de se conhecer
melhor a regulação da sua expressão gênica, a interação de seus
componentes e as suas funções fisiológicas. Muito do conhecimento atual
sobre os sistemas de fluxo RND foi determinado em E. coli e P. aeruginosa;
porém, o entendimento sobre sistemas de efluxo em outras bactérias de
interesse clínico, agrícola ou industrial permanece escasso (68).
2.5.2 Inibidores de sistema de efluxo
Como demonstrado, os sistemas de efluxo da família RND de bactérias
Gram-negativas possuem grande importância na resistência bacteriana a
antimicrobianos de uso clínico, assim, esses sistemas de efluxo exercem um
papel importante no processo de pesquisa e desenvolvimento de drogas
antimicrobianas, uma vez que esse representa um importante alvo para o
desenvolvimento de novas drogas (142).
Os achados que comprovaram que a sensibilidade de P. aeruginosa a
muitos antimicrobianos de importância clínica está aumentada em mutantes
que não expressam sistemas de efluxo têm conduzido esforços para a
pesquisa de compostos inibidores de bombas de efluxo como uma estratégia
alternativa para diminuir o grau de resistência intrínseca e restaurar a
sensibilidade aos antimicrobianos em cepas resistentes. A inibição dos
sistemas de fluxo pode ser realizada por diferentes mecanismos, como: i)
Revisão da Literatura 32
inibição da ligação da droga com a própria bomba de efluxo; ii) inibição da
interação entre componentes que formam o sistema de efluxo; iii) restrição da
fonte de energia ou iv) inibição da expressão gênica dos sistemas de efluxo
(73, 82).
Na ultima década, uma série de inibidores de bombas de efluxo foram
identificados. O fenil-arginina-β-naftilamida (PAβN) foi o primeiro inibidor de
amplo espectro ao qual foi atribuída a capacidade de potencializar de oito a 64
vezes a atividade de levofloxacina contra cepas mutantes que
hiperexpressavam o sistema MexAB-OprM quanto comparadas às cepas
selvagens de P. aeruginosa (59).
Vários outros compostos inibidores dos sistemas de efluxo mostraram-se
capazes de potencializar a atividade antibacteriana de drogas contra P.
aeruginosa e E. coli que hiperexpressam bombas de efluxo. E,
interessantemente, reduziram drasticamente a emergência de cepas
resistentes à levofloxacina durante experimentação em modelo animal (66).
Não há disponíveis no mercado antimicrobianos associados a inibidores
de sistemas de efluxo, mas está claro que esses compostos representam uma
promessa para o desenvolvimento de terapia combinada com os
antimicrobianos restabelecendo a sua eficiência. Contudo, o desenvolvimento
desses novos medicamentos representa um desafio devido ao efeito
indesejado que os inibidores de efluxo exercem contra as células eucarióticas.
Além da toxicidade apresentada por esses compostos ocorre a também
inibição dos transportadores das células do hospedeiro, além da inibição dos
Revisão da Literatura 33
sistemas de efluxo de procariotos, que são similares em estrutura e função
(104).
O recente avanço na análise do genoma dos seres vivos, a descoberta
de novas moléculas e o conhecimento exato do funcionamento e regulação dos
sistemas de efluxo irão facilitar a exploração desse mecanismo como alvo para
novas drogas (80).
Métodos 34
3 MÉTODOS
3.1 Amostras bacterianas
Foram avaliadas amostras de P. aeruginosa isoladas da corrente
sanguínea de pacientes hospitalizados no Hospital São Paulo/UNIFESP, entre
junho e dezembro de 2005. As amostras foram identificadas utilizando métodos
de rotina no Laboratório de Bacteriologia dessa unidade de assistência a
saúde. As amostras encontravam-se armazenadas no Banco de
Microorganismos do Laboratório Especial de Microbiologia Clínica (LEMC), da
Disciplina de Infectologia, UNIFESP/EPM. Para o estudo foram excluídas
outras amostras de P. aeruginosa isoladas do mesmo paciente.
Foram coletadas 67 amostras de P. aeruginosa isoladas de pacientes
hospitalizados no Hospital São Paulo, entre junho e dezembro de 2005, com
infecção de corrente sanguínea (ICS). Destas amostras, 60 foram avaliadas
nesse estudo, pois sete amostras não apresentaram crescimento após
subcultivo em ágar sangue. Estas amostras foram isoladas de pacientes
internados nas seguintes unidades hospitalares: unidade de terapia intensiva
(39 amostras, 65%), pronto-socorro (17 amostras, 28,3%) e oncologia
pediátrica (04 amostras, 6,7%), cujas proporções estão representadas na
Figura 3.
Métodos 35
Figura 3. Distribuição por unidade hospitalar do Hospital São Paulo das 60
amostras de P. aeruginosa isoladas de pacientes com infecção da corrente
sanguínea no período entre junho e dezembro de 2005.
A maioria das amostras foi coletada de pacientes adultos, maiores de 18
anos de idade (83,3%) e do sexo masculino (51,7%). A idade dos pacientes
variou de um ano a 90 anos de idade. A distribuição da idade por sexo dos
pacientes é mostrada na Figura 4.
Métodos 36
Figura 4. Distribuição dos 60 pacientes com ICS por P. aeruginosa por sexo e
idade em anos.
3.2 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos
O perfil de sensibilidade das amostras analisadas foi determinado pela
técnica de ágar diluição de acordo com as recomendações do “Clinical and
Laboratory Standards Institute” (CLSI) 2006 (28). O teste de ágar diluição foi
realizado por meio da incorporação de concentrações seriadas dos
antimicrobianos em placas individuais de Petri, as quais continham ágar
Müeller-Hinton (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra).
Soluções estoque dos antimicrobianos testados foram preparadas e
armazenadas sob refrigeração a -70 °C e no instante inicial do ensaio foram
adicionadas a tubos contendo ágar Mueller-Hinton fundido previamente
Métodos 37
estabilizados em banho-maria a 56 °C. Após homogeneização, o conteúdo foi
vertido em placas de Petri de 90 x 15 mm, descartáveis e previamente
identificadas e utilizadas imediatamente após sua confecção. Cada placa
representava uma única concentração de antibiótico. Foram testados os
seguintes antimicrobianos nas respectivas concentrações: amicacina (0,5 - 32
µg/mL), aztreonam (0,5 - 32 µg/mL), cefepima (0,5 - 32 µg/mL), ceftazidima
(0,5 - 32 µg/mL) ciprofloxacina (0,12 – 32 µg/mL), gentamicina (0,12 – 256
µg/mL), imipenem (0,12 - 32 µg/mL) e meropenem (0,12 - 32 µg/mL).
Uma suspensão de células bacterianas das amostras testadas contendo
aproximadamente 1 x 10
8
UFC/mL foi diluída em água destilada estéril na
proporção de 1:10 mL, resultando em um inóculo de aproximadamente 1 x 10
7
UFC/mL. As amostras bacterianas foram inoculadas simultaneamente sobre a
superfície do ágar utilizando multi-inoculador, o qual dispensa de 1 a 3 µL do
inóculo, correspondente ao inoculo final de 10
4
UFC. As placas inoculadas
foram incubadas por 18-24 horas, a 35-37 ºC. A CIM foi determinada como a
menor concentração de antimicrobiano que inibiu o crescimento bacteriano.
As amostras de P. aeruginosa foram classificadas como sensível
(S), intermediário (I) ou resistente (R) aos antimicrobianos de acordo com os
critérios de sensibilidade do CLSI (27). Para o controle de qualidade, foram
incluídas nos testes de sensibilidade as amostras Pseudomonas aeruginosa
ATCC
®
27853 e Escherichia coli ATCC
®
25922.
Métodos 38
3.3 Teste de hidrólise enzimática
O teste de hidrólise foi utilizado com o objetivo detectar a presença de
mecanismos enzimáticos de resistência aos carbapenens. Após o isolamento
da amostra, cerca de 10 colônias foram inoculadas em tubo cônico contendo
10 mL de caldo de triptona de soja (TSB, Becton, Le Pont de Claix, França). Os
tubos foram incubados em estufa a 37 °C sob agitação durante 12 horas.
A suspensão bacteriana foi centrifugada por 15 minutos a 6.000 rpm, e,
em seguida, o sobrenadante foi desprezado e o sedimento ressuspenso em 1
mL de tampão de amostra (Tris-HCL 1mM e ZnSO
4
1mM, pH 7,0). As amostras
suspensas foram ultrasonicadas em quatro pulsos de 30 segundos. O lisado
celular, produto do processo de sonicação, foi transferindo para tubo de
microcentrífuga de 1,5 mL e, então, centrifugado durante 3 minutos a 4 ºC sob
rotação de 10.000 x g. O sobrenadante contento o extrato protéico bruto das
células bacterianas foi transferido para um novo tubo e mantido em gelo até o
momento da execução do ensaio.
Soluções de imipenem e meropenem foram preparadas em tampão de
amostra de forma a se obter de 1,5 a 2 unidades de absorbância a um
comprimento de onda de 299 nm. Para o teste, foi adicionado 900 µL da
solução do antimicrobiano em cubeta de quartzo. A este, foi adicionado 100 µL
do extrato protéico bruto. O monitoramento da variação de absorbância foi
realizada em espectrofotômetro Biomate 5 UV-Visible (Termo Spectronic,
Cambridge, Inglaterra) durante os dois minutos seguintes. A diminuição
gradativa da absorbância e valores negativos de variação de absorbância
(∆abs/min, calculada através da diferença entre o valor de absorbância final e o
Métodos 39
valor absorbância inicial do tempo monitorado) foram considerados resultados
positivos para hidrólise do agente β-lactâmico por carbapenemases.
As amostras que apresentaram resultado positivo para o teste de
hidrólise enzimática foram submetidas ao teste de inibição da atividade
enzimática pelo EDTA. Neste caso, 235 µL do extrato protéico foi incubado à
temperatura ambiente durante 20 minutos juntamente com 15 µL de EDTA 500
mM pH 8,0. Como controle positivo para a reação de inibição, 235 µL do
extrato protéico de cada amostra foi incubado com 15µL de tampão de amostra
a temperatura ambiente por 20 minutos. O teste em que se observou a
ausência de variação da absorbância do extrato incubado com EDTA foi
considerado positivo para inibição, sugestivo da produção de carbapenemases
do tipo MβL pelas amostras bacterianas testadas.
3.4 Detecção dos genes codificadores de carbapenemases pela
técnica de PCR
As reações de PCR foram realizadas, inicialmente, para a detecção de
genes codificadores de metalo-β-lactamases (MβL) e outras carbapenemases
para as amostras de P. aeruginosa resistentes a pelo menos um dos
carbapenens testados (CIM ≥ 16 µg/mL), independente do resultado do teste
de hidrólise enzimática.
A detecção dos genes codificadores de MβL foi realizada feita
através da PCR multiplex, proposto por Mendes e colaboradores (96), que
consiste em agregar iniciadores para as diferentes MβLs já descritas em uma
única reação.
Métodos 40
As amostras foram cultivadas em ágar McConkey (Oxoid, Basingstoke,
Inglaterra) e, após isolamento de colônias puras, três a cinco colônias de cada
amostra foram transferidas para um tubo de microcentrífuga contendo 200 µL
de água estéril deionizada. Esta suspensão foi utilizada diretamente para a
etapa de amplificação do gene. Em fluxo laminar, uma solução-mãe foi
preparada contendo master-mix (GoTaq
®
Green Master Mix, Promega,
Madison, EUA), água estéril (Water, Molecular Biology Grade, Eppendorf AG,
Hamburg, Alemanha) e iniciadores na concentração de acordo com prévia
padronização (96). A solução foi mantida a, aproximadamente, 4 °C durante
seu preparo e, após leve agitação 19 µL foi transferido para cada tubo de
amplificação, que continha 1 µL da suspensão da bactéria-teste. As condições
para amplificação do DNA foram: desnaturação a 94 ºC por 5 minutos,
seguidos por 35 ciclos de 94 ºC por 30 segundos, 53 ºC por 45 segundos, 72
ºC por 30 segundos. A etapa de extensão final foi realizada por 10 minutos a
72 ºC. Após amplificação do DNA, a revelação do produto amplificado foi
realizada por eletroforese em gel de agarose a 1,5% (Ultrapure
TM
Agarose,
Invitrogen, Carlsbad, EUA), seguida por visualização sob luz ultravioleta.
Foram utilizados iniciadores para amplificar regiões especificas dos
genes codificadores das MβLs (Tabela 1), os quais, foram sintetizados pela
“Integrated DNA Tecnologies Inc.” (IDT, Coralville, EUA).
Como controles para as reações de amplificação dos genes
codificadores de MβL, foram utilizadas as seguintes cepas, sabidamente
produtoras de MβL: P. aeruginosa 48-1997A produtora de SPM (149); P.
aeruginosa 75-5671 produtora de GIM (15), P. aeruginosa A1254 produtora de
Métodos 41
VIM (95); P. aeruginosa 101-4704 produtora de IMP (97) e A. baumannii
YMC03/9/T104 produtora de SIM (71).
Tabela 1. Oligonucleotídeos iniciadores (primers) utilizados para detecção dos
genes que codificam genes de MβLs por PCR multiplex
MβL
Primer Seqüência (5’- 3’)
Tamanho do
produto
amplificado (pb)
bla
IMP
IMPgen-F1 GAATAGRRTGGCTTAAYTCTC
188
IMPgen-R1 CCAAACYACTASGTTATC
bla
VIM
VIMgen-F2 GTTTGGTCGCATATCGCAAC
382
VIMgen-R2 AATGCGCAGCACCAGGATAG
bla
GIM
GIM-F1 TCAATTAGCTCTTGGGCTGAC
72
GIM-R1 CGGAACGACCATTTGAATGG
bla
SIM
SIM-F1 GTACAAGGGATTCGGCATCG
569
SIM-R1 TGGCCTGTTCCCATGTGAG
bla
SPM
SPM-F1 CTAAATCGAGAGCCCTGCTTG
798
SPM-R1 CCTTTTCCGCGACCTTGATC
16S
16S-8F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
1499
16S-1493R ACGGCTACCTTGTTACGACTT
3.5 Tipagem molecular pela técnica de eletroforese em campo
pulsátil (PFGE)
As amostras bacterianas foram submetidas a técnica de eletroforese em
campo pulsado (PFGE – “Pulsed Field Gel Eletrophoresis”) para a
determinação da relação genética entre elas.
Métodos 42
3.5.1 Preparação dos blocos de gel de agarose
As amostras foram cultivadas em ágar sangue para o isolamento de
colônias puras, das quais, três a cinco colônias foram incubadas em 10 mL de
caldo TSB por 18 a 24 horas sob agitação. Após o tempo incubação e
crescimento, as culturas bacterianas em caldo foram centrifugadas por 20
minutos a 8.000 x g, e os sobrenadantes desprezados. O sedimento foi então
ressuspenso em 1 mL de solução salina, homogeneizado e transferido para
tubo de microcentrífuga previamente pesado em balança eletrônica semi-
analítica. Os tubos foram centrifugados por 5 minutos a 10.000 x g e todo o
sobrenadante foi removido. O sedimento foi novamente ressuspenso em
solução salina, na proporção 1:1 entre o volume de diluente e a massa do
material celular obtido pela centrifugação. Este último valor foi calculado pela
subtração da massa do tubo vazio pela massa do tubo contendo o precipitado
celular. Cinco microlitros desta suspensão bacteriana foi transferido para um
novo tubo, ao qual foi adicionado 300 µL de tampão TEN (Tris 100 mM pH 7.5,
EDTA 100 mM e NaCl 150 mM), e posteriormente, 340 µL de agarose 2%
(Ultrapure
TM
Low Melting Point Agarose, Invitrogen, Carlsbad, EUA). Esta
mistura foi homogeneizada com o auxilio de uma pipeta e, então, colocada em
moldes, evitando-se a formação de bolhas nos blocos de agarose em
formação, incubados a temperatura ambiente por 30 minutos.
Solidificados, os blocos foram transferidos para uma placa e incubados a
37
o
C, por 10 a 12 horas em tampão EC (Tris 6 mM pH 6,5, NaCl 1M, EDTA
0,01M, Brij 58 0,5%, Sarcosil 0,5% e Deoxiglicolato 0,2%). Após a remoção do
tampão EC, os blocos foram lavados, por 2 vezes, com 2 mL de CHEF-TE (Tris
Métodos 43
0,1M pH 7,5, EDTA 0,1M). Os blocos foram então cobertos com 2 mL de
tampão ES (EDTA 0,4M pH 9,3 e Sarcosil 10%) contendo 1 mg/mL de
proteinase K (USB Corporation, Cleveland, EUA), e, então, incubados durante
12 horas a 50
o
C. Após o tratamento com proteinase K, foram realizadas quatro
lavagens com 2 mL de CHEF-TE, com uma hora de intervalo entre cada
lavagem. Os blocos de gel foram armazenados em CHEF-TE, a 5 ºC, até o
momento da digestão do DNA bacteriano.
3.5.2 Digestão do DNA bacteriano
Os blocos de gel foram cortados de acordo com o tamanho do suporte
em três partes iguais, e somente uma parte de cada bloco foi transferida para
uma placa de microdiluição, onde havia contido 200 µL da solução DNS (Tris
20mM pH 8,0 e cloreto de magnésio 1mM) em cada poço. Esta solução foi
imediatamente substituída por uma nova alíquota da solução DNS e a parte do
gel selecionada foi incubada por uma hora à temperatura ambiente. Esta
lavagem foi repetida quatro vezes. Após a última lavagem e a remoção do
tampão DNS, os blocos foram incubados por 1 hora a 5 ºC com o tampão de
enzima de restrição (5 µL do tampão 10 vezes da enzima, neste caso, tampão
NEB 2, 0,5 µL de BSA, e 44,5 µL de água destilada). O DNA bacteriano contido
nos blocos de agarose foi então submetido à clivagem com a enzima SpeI
(New England Biolabs, Ipswich, EUA), a 37
o
C por 12 a 18 horas. O volume
final da solução que continha a enzima foi de 50 µL, e continha 5 µL do tampão
NEB 2 10X, 0,5 µL de BSA, 1,5 µL da enzima 10 U/µL e 43 µL de água
destilada.
Métodos 44
3.5.3 Eletroforese em campo pulsátil
A eletroforese foi realizada em gel de agarose 1%, em TBE 0,5x (Tris
0,089M, Ácido Bórico 0,089M e EDTA 0,002M), no sistema CHEF-DR III (Bio-
Rad Laboratories Inc., Hercules, EUA) à temperatura de 13
o
C e corrente
elétrica de 200 V (6 V/cm). O gel foi corado com brometo de etídio 0,08 µL/mL
e fotografado em sistema de fotodocumentação sob a incidência de luz
ultravioleta.
A análise dos perfis eletroforéticos foi realizada por comparação visual, e
o critério para interpretação destes perfis considerou como idênticas, ou seja,
pertencentes a um mesmo clone ou subtipo, as amostras que apresentaram
todas as bandas iguais no perfil eletroforético. Foram consideradas
semelhantes às cepas que obtiveram até três bandas diferentes, e distintas
aquelas com número maior que três bandas de diferença (113).
3.6 Quantificação da expressão gênica
A quantificação da expressão dos genes que codificam componentes
dos sistemas de efluxo de P. aeruginosa avaliados, mexB, mexD, mexF, mexY;
do gene que codifica a proteína de membrana externa oprD e da β-lactamase
cromossômica ampC nas 60 amostras clínicas de P. aeruginosa estudadas, foi
realizada pela técnica de PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) e
comparada com a expressão nas cepas P. aeruginosa ATCC 27853 e PAO1.
Métodos 45
3.6.1 Extração de RNA e síntese de cDNA
Para extração e isolamento do RNA total, as amostras foram semeadas
em placas contendo ágar McConkey (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra) durante
24 horas à 37 ºC. Posteriormente, os isolados de cada amostra foram
cultivados em 10 mL de caldo LB (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra) a 37 ºC sob
agitação e o crescimento monitorado em espectrofotômetro até atingir o estágio
médio da fase logarítmica de crescimento correspondente a 1,5 a 2,0 unidades
de absorbância a um comprimento de onde de 600nm (DO
600nm
= 0,5 – 0,6).
Uma alíquota de 0,25 mL dessa cultura, correspondente a 5,0 x 10
8
células foi adicionado a 0,5 mL de “RNAeasy Bacteria Protect Reagent”
(Qiagen, Hilden, Alemanha) em tubo de microcentrífuga e incubado durante
cinco minutos após agitação vigorosa. Essa suspensão foi centrifugada por 10
minutos a 10.000 x g e o sobrenadante desprezado. O sedimento de células
bacterianas foi armazenado a -20 ºC até a execução da extração do RNA total.
O isolamento de RNA total a partir do sedimento de células bacterianas
das amostras em estudo foi processado com a utilização do “RNAeasy Mini Kit”
de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen, Hilden, Alemanha).
Durante o processo de extração de RNA total as amostras foram
tratadas com desoxiribonuclease (DNAse) para eliminar a possível
contaminação residual com DNA bacteriano. Foi utilizado o kit “RNase-Free
DNase Set”, seguindo as recomendações e instruções do fabricante (Qiagen,
Hilden, Alemanha).
Métodos 46
O RNA total isolado foi eluído em 30 µL de água DEPC e sua
concentração determinada em espectrofotômetro NanoDrop
®
ND-1000 UV-Vis
(Thermo Fisher Scientific, Wilmington, EUA), em contraste com água DEPC,
nos comprimentos de onda de 260 e 280 nm. A quantificação de RNA de cada
amostra foi estimada utilizando a correlação de 1 unidade de densidade óptica
a 260 nm equivalente a 40 µg de RNA por mililitro de solução. A relação entre
as unidades de absorbância a 260 e 280 nm (A260/280) foi calculada para
determinação da pureza da amostra de RNA, considerando valores aceitáveis
em torno de 2,0. A integridade do RNA foi avaliada por eletroforese em gel de
agarose desnaturante (1,2% agarose, 6,7% de formaldeído, 200 mM de MOPS,
50 mM de acetato de sódio, 10 mM de EDTA, água DEPC) e visualizado em
equipamento de foto documentação.
Adicionalmente, foi realizada, para cada amostra de RNA total, uma
PCR utilizando oligonucleotídeos iniciadores que amplificam uma seqüência do
DNA ribossomal de eubactérias, com o intuito de confirmar a ausência de
resíduos de DNA bacteriano contaminante na solução de RNA. Em fluxo
laminar, uma solução-mãe foi preparada contendo master-mix (GoTaq
®
Green
Master Mix, Promega, Madison, EUA), água estéril (Water, Molecular Biology
Grade, Eppendorf AG, Hamburg, Alemanha) e o par de iniciadores que
amplifica seqüência do DNA ribossomal 16S-8-F e 16S-1943-R na
concentração final de 2 mM de cada oligonucleotídeo. A solução mãe foi
mantida a aproximadamente 4 °C durante seu preparo e, após leve agitação,
19 µL foi transferido para cada tubo de amplificação, que continha 1 µL da
solução de RNA a ser testada. As condições para amplificação foram de 35
ciclos de 94 ºC por 30 segundos, 53 ºC por 45 segundos, 72 ºC por 30
Métodos 47
segundos. A etapa de extensão final foi realizada por 10 minutos a 72 ºC. Após
ciclagem, a revelação do produto da PCR foi realizada por eletroforese em gel
de agarose 1,0% (Ultrapure
TM
Agarose, Invitrogen, Carlsbad, EUA), seguida
por visualização sob luz ultravioleta. A ausência de amplificação confirmava a
ausência de DNA residual contaminante.
A síntese de cDNA foi realizada através da reação de transcriptase
reversa utilizando o “High-Capacity cDNA Archive Kit” seguindo as
recomendações do fabricante (Applied Biosystems, Foster City, EUA). Uma
reação contendo 5 µg de RNA total da amostra e os reagentes fornecidos pelo
kit utilizado que correspondiam a 10 µL de tampão, 4 µL de dNTPs, 10 µL de
oligonucleotídeos randômicos, 250 U da enzima transcriptase reversa e água
destilada livre de nucleases q. s. p. 50 µL foi incubada a 25 ºC por 10 minutos
seguidos imediatamente por uma segunda etapa de incubação a 37 ºC durante
120 minutos. O cDNA, produto da reação de transcriptase reversa, foi
armazenado a -20 ºC até o momento do seu processamento em uma etapa
posterior.
3.6.2 Reação de polimerase em cadeia em tempo real (qRT-PCR)
A quantificação relativa da expressão dos genes estudados foi realizada
pela técnica de qRT-PCR, cujo princípio do método baseia-se na detecção da
fluorescência no tubo de reação à medida que a dupla fita DNA é gerada.
As seqüências dos iniciadores foram determinadas utilizando a versão
do programa GeneFisher Interactive Primer Design, disponível na internet
(http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher/old.html), de acordo com as
Métodos 48
seqüência dos genes em estudo, depositadas e publicadas na rede mundial de
computadores no GeneBank. As seqüências de oligonucleotídeos foram
sintetizadas pela “Integrated DNA Tecnologies Inc.” (IDT, Coralville, EUA) e são
apresentadas na Tabela 2.
Tabela 2. Oligonucleotídeos iniciadores (primers) utilizados na reação de qRT-
PCR para os genes alvos mexB, mexD, mexF, mexY, oprD e ampC e para o
gene de referência rpsL.
Genes Primers Seqüência 5' - 3'
mexB
mexB-F GTGTTCGGCTCGCAGTACTC
mexB-R AACCGTCGGGATTGACCTTG
mexD
mexD-F CGAGCGCTATTCGCTGC
mexD-R GGCAGTTGCACGTCGA
mexF
mexF-F CGCCTGGTCACCGAGGAAGAGT
mexF-R TAGTCCATGGCTTGCGGGAAGC
mexY
mexY-F CCGCTACAACGGCTATCCCT
mexY-R AGCGGGATCGACCAGCTTTC
oprD
oprD-F TCCGCAGGTAGCACTCAGTTC
oprD-R AAGCCGGATTCATAGGTGGTG
ampC
ampC-F CTGTTCGAGATCGGCTC
ampC-R CGGTATAGGTCGCGAG
rpsL
rpsL-F GCAAGCGCATGGTCGACAAGA
rpsL-R CGCTGTGCTCTTGCAGGTTGTGA
As reações de PCR em tempo real para cada gene avaliado foram feitas
em triplicada utilizando a mistura para PCR em tempo real “qRT-PCR
Platinum
®
SYBR
®
Green qPCR SuperMix-UDG” (Invitrogen, Carlsbad, EUA).
Para amplificação dos respectivos genes, foi adicionado 2 µL da solução de
cDNA da amostra teste à 12,5 µL da mistura para qRT-PCR, 1 µL de cada par
de oligonucleotídeos inicidadores a uma concentração de 10 µM e água DEPC
q. s. p. 25 µL. As reações foram previamente incubadas em termociclador
Métodos 49
Eppendorf Mastercycler
®
Realplex4 (Eppendorf, Hamburg, Alemanha) a 50 ºC
por 2 minutos, seguidos de mais 2 minutos a 95 ºC. As condições de
termociclagem a seguir foram: 40 ciclos de 95 ºC durante 15 segundos e 60 ºC
por 30 segundos, de acordo com as recomendações técnicas do fabricante. A
curva de desnaturação (“melting curve”) foi determinada no final da
termociclagem para se certificar que havia a presença de uma única seqüência
de DNA, resultado da reação de amplificação.
3.6.3 Análise da expressão gênica
O gene ribossomal rpsL foi utilizado como gene de referência para
normalização da expressão dos genes alvos. A análise da expressão foi feita
utilizando a planilha qGene e o modelo matemático proposto por Muller e
colaboradores (101), onde, a expressão normalizada (EN) é calculada de
acordo com a fórmula: EN = (E
gene alvo
)
C
T
gene alvo
/(E
rpsL
)
C
T
rpsL
; onde, E é a
eficiência da reação de amplificação para os genes testados; C
T
é ciclo em que
foi detectado fluorescência durante a amplificação na reação de qRT-PCR,
acima do limite basal de fluorescência observada no inicio na reação .
A eficiência (E) das reações de amplificação dos genes estudados foi
determinada de acordo com a fórmula: E = 10
(-1/slope)
, onde o “slope”
representa a inclinação da reta no gráfico da regressão linear das médias dos
valores de C
T,
observadas nas três reações de PCR em tempo real para as
diluições seriadas da solução de cDNA da amostra de P. aeruginosa PAO1. A
EN dos genes pelas amostras foi calculada de acordo com os valores de C
T
Métodos 50
observados nas reações de qRT-PCR, realizadas em triplicata. A média da
expressão normalizada (MEN) dos genes foi calculada a partir dos valores de
EN dos genes pelas amostras estudadas.
A expressão relativa dos genes em cada isolado clínico de P. aeruginosa
foi calculada em relação à cepa de P. aeruginosa ATCC 27853 e à cepa PAO1,
dividindo a MEN de cada gene, pela MEN dos respectivos genes nas amostras
utilizadas como referência. Assim, o resultado da expressão gênica relativa
indica quantas vezes um gene é expresso em uma amostra em relação à sua
expressão da cepa de referência utilizada.
Nas amostras clínicas avaliadas, foram consideradas significativas
alterações na expressão gênica relativa de no mínimo duas e quatro vezes
para os genes que codificam os sistemas de efluxo e da β-lactamase
cromossomal AmpC de P. aeruginosa, respectivamente, quando comparadas à
expressão nas cepas referências. Qualquer alteração na expressão relativa do
gene oprD pelas amostras clínicas foi considerada significativa (48, 50, 78) .
Resultados 51
4 RESULTADOS
4.1 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos
Na Tabela 3 estão representados os dados referentes à potência e ao
perfil de sensibilidade aos antimicrobianos testados contra as 60 amostras de P.
aeruginosa.
Apesar de o imipenem, o meropenem e o aztreonam exibirem a mesma
potência in vitro (CIM
50
, 8 µg/mL) contra as amostras de P. aeruginosa
avaliadas, o aztreonam foi o antimicrobiano que demonstrou possuir maior
porcentagem de sensibilidade (65,0%) seguido pelo imipenem (48,4%) e
meropenem (48,4%). As cefalosporinas testadas apresentaram baixa atividade
in vitro (CIM
50
, 32 µg/mL) e exibiram porcentagens de sensibilidade
semelhantes, 43,3% e 41,6% das amostras de P. aeruginosa foram sensíveis à
ceftazidima e à cefepima, respectivamente.
Apesar da gentamicina (CIM
50
, 32 µg/mL) ser duas vezes mais potente
que a amicacina (CIM
50
, 64 µg/mL), uma maior porcentagem de resistência à
gentamicina (55,0%) foi observada quando comparada à amicacina (51,7%).
A ciprofloxacina também demonstrou baixa potência in vitro (CIM
50,
16
µg/mL) e apenas 36,7% dos isolados de P. aeruginosa testados foram sensíveis
a essa fluoroquinolona.
Resultados 52
Tabela 3. Perfil de sensibilidade a antimicrobianos das 60 amostras clínicas de
P. aeruginosa isoladas de pacientes com infecção de corrente sanguínea
hospitalizados no complexo HSP entre julho e dezembro de 2005.
Antimicrobianos
CIM
a
(µg/mL):
% por categoria
b
CIM
50
CIM
90
Variação
Sensível Resistente
Amicacina 64
> 256
1 - > 256
41,7
51,7
Aztreonam 8
32
2 - > 32
65,0
20,0
Cefepima 32
> 32
1 - > 32
41,6
53,4
Ceftazidima 32
256
1 - > 256
43,3
51,7
Ciprofloxacina 16
> 32
0,25 - > 32
36,7
60,0
Gentamicina 32
> 256
0,5 - > 256
31,7
55,0
Imipenem 8
> 32
0,25 - > 32
48,4
46,7
Meropenem 8
> 32
≤ 0,25 - > 32
48,4
45,0
a. A CIM foi determinada pela técnica de diluição em ágar (CLSI, 2006).
b. As porcentagens de sensibilidade e resistência foram calculadas de acordo com os
limites estabelecidos pelo CLSI (2007).
4.2 Teste de hidrólise enzimática
Das 60 amostras de P. aeruginosa estudadas, 15 (25,0%) apresentaram
hidrólise enzimática dos dois carbapenens testados. O EDTA foi capaz de inibir
a atividade enzimática do extrato protéico bruto desses 15 isolados contra o
imipenem e o meropenem, sugerindo assim a produção de MβL.
Esses 15 isolados apresentaram-se resistentes ao imipenem (CIM, > 32
µg/mL) e ao meropenem (CIM, > 32 µg/ml), bem como às cefalosporinas
testadas, cefepima (CIM, > 32 µg/mL) e ceftazidima (CIMs, 128 a > 256 µg/mL).
Entretanto, 11 dos 15 isolados (73,3%) demonstraram sensibilidade in vitro ao
aztreonam (CIM, 8 µg/mL). Três desses isolados apresentaram sensibilidade
reduzida ao aztreonam (CIMs, 16 µg/mL) e apenas um foi classificado como
Resultados 53
resistente a esse antimicrobiano (CIM > 32 µg/mL), de acordo com os limites
estabelecidos pelo CLSI 2007.
4.3 Detecção dos genes codificadores de carbapenemases pela
técnica de PCR
A detecção de genes codificadores de metalo-β-lactamases (MβL) e
outras carbapenemases foi realizada para as 28 amostras de P. aeruginosa
resistentes a pelo menos um dos carbapenens testados, Esse ensaio revelou
que as 15 amostras que apresentaram atividade hidrolítica contra os
carbapenens eram produtoras de MβL, correspondendo a 25% do total de
amostras estudadas. Sendo, 14 dessas, produtoras da MβL do tipo SPM e
apenas uma produtora de uma MβL do tipo IMP (Figura 5).
O gene da β-lactamase de espectro estendido (ESβL) tipo GES foi
detectado em sete (11,7%) dos 60 isolados de P. aeruginosa avaliados. Todas
as amostras de P. aeruginosa produtoras de GES encontradas apresentaram
resistência ou sensibilidade reduzida à cefepima e à ceftazidima, enquanto três
dessas amostras apresentaram resistência ao imipenem e ao meropenem.
Resultados 54
Figura 5. Eletroforese em gel de agarose do produto de amplificação da reação
de PCR multiplex para detecção da presença dos genes codificadores de MβL
entre as 28 amostras clínicas de P. aeruginosa resistentes aos carbapenens.
4.4 Tipagem molecular pela técnica de eletroforese em campo
pulsátil (PFGE)
Para a análise da similaridade genética dos 60 isolados de P. aeruginosa
foi realizada a tipagem molecular pela técnica de PFGE. Das 60 amostras de P.
aeruginosa, 38 apresentaram relação genética com outras amostras testadas e
foram agrupadas em seis padrões distintos de PFGE (A, B, C, D, E e F).
Dezessete dos 60 isolados de P. aeruginosa não apresentaram relação de
similaridade com qualquer outro isolado avaliado neste estudo, de acordo com
os critérios de interpretação adotados, sendo assim, classificados como não
relacionados. Cinco amostras foram classificadas como não tipáveis pela técnica
de PFGE. Estas amostras foram isoladas na UTI entre julho e novembro de
2005.
Resultados 55
A análise do perfil eletroforético relevou a predominância do perfil A. As
amostras pertencentes e esse grupo foram divididas em dois subtipos: A1 (15
isolados) e A2 (um isolado). Das 15 amostras de P. aeruginosa produtoras de
SPM, 14 pertenciam ao padrão de PFGE A. Embora as amostras de P.
aeruginosa produtoras de SPM tenham sido isoladas em diferentes unidades do
Hospital São Paulo, a maioria delas (11 amostras), foi isolada na unidade de
terapia intensiva (Tabela 3).
As amostras de P. aeruginosa produtoras de GES (sete isolados) foram
agrupadas nos perfis B1 (duas amostras), C1 (quatro amostras) e C2 (uma
amostra) e foram isoladas nas unidades de pronto-socorro e terapia intensiva.
Resultados 56
Tabela 4. Distribuição dos padrões de PFGE das 60 amostras de P. aeruginosa
de acordo com a unidade e a data de isolamento.
Padrão Amostra Unidade Data β-lactamase
A1 6223 UTI 12/07/2005 -
A1 6324 Pronto-socorro 16/08/2005 -
A1 6663 Pronto-socorro 17/12/2005 -
A1 6343 Oncologia Pediátrica 23/08/2005 SPM
A1 6380 UTI 06/09/2005 SPM
A1 6409 UTI 20/09/2005 SPM
A1 6512 UTI 27/10/2005 SPM
A1 6543 UTI 10/11/2005 SPM
A1 6585 UTI 22/11/2005 SPM
A1 6594 Pronto-socorro 29/11/2005 SPM
A1 6645 UTI 15/12/2005 SPM
A1 6646 UTI 15/12/2005 SPM
A1 6664 UTI 17/12/2005 SPM
A1 6668 UTI 18/12/2005 SPM
A1 6669 Oncologia Pediátrica 20/12/2005 SPM
A2 6247 UTI 15/07/2005 SPM
B1 6208 Pronto-socorro 06/07/2005 GES
B1 6318 UTI 12/08/2005 GES
B1 6323 UTI 16/08/2005 -
B1 6424 UTI 23/09/2005 -
B1 6507 UTI 26/10/2005 -
B1 6516 Pronto-socorro 01/11/2005 -
B2 6474 Pronto-socorro 18/10/2005 -
C1 6200 UTI 05/07/2005 GES
C1 6332 Pronto-Socorro 17/08/2005 GES
C1 6403 UTI 20/09/2005 GES
C1 6529 UTI 08/11/2005 GES
C2 6281 Pronto-Socorro 02/08/2005 GES
D1 6417 Pronto-Socorro 20/09/2005 -
D1 6580 UTI 22/11/2005 -
D1 6379 UTI 06/09/2005 -
D2 6197 UTI 05/07/2005 -
E1 6192 Pronto-Socorro 01/07/2005 -
E2 6518 UTI 01/11/2005 -
E3 6390 UTI 20/09/2005 -
F1 6475 UTI 18/10/2005 -
F2 6367 Oncologia Pediátrica 30/08/2005 -
F3 6662 UTI 17/12/2005 -
G 6195 UTI 05/07/2005 -
H 6285 UTI 03/08/2005 -
I 6327 UTI 16/08/2005 -
J 6355 Pronto-socorro 25/08/2005 -
L 6397 UTI 20/09/2005 -
M 6408 Oncologia Pediátrica 20/09/2005 -
N 6432 Pronto-socorro 27/09/2005 -
O 6489 UTI 19/10/2005 -
P 6499 Pronto-socorro 21/10/2005 -
Q 6504 Pronto-socorro 26/10/2005 -
R 6515 UTI 01/11/2005 -
S 6528 Pronto-socorro 04/11/2005 -
T 6557 UTI 17/11/2005 IMP
U 6579 UTI 22/11/2005 -
V 6581 Pronto-socorro 22/11/2005 -
X 6608 Pronto-socorro 02/12/2005 -
Z 6615 UTI 06/12/2005 -
NT 6196 UTI 05/07/2005 -
6213 UTI 07/07/2005 -
6231 UTI 14/07/2005 -
6451 UTI 06/10/2005 -
6598 UTI 29/11/2005 -
NT: não determinado
Resultados 57
É importante notar que as amostras de P. aeruginosa com diferentes
padrões de PFGE circulam nas unidades de emergência e terapia intensiva do
Hospital São Paulo.
4.5 Quantificação da expressão gênica
Os valores da média da expressão normalizada (MEN) dos genes, de
cada isolado clínico e das cepas utilizadas como referência, são apresentados
no Anexo 1. A média geral da expressão relativa dos genes estudados nas 60
amostras clínicas em relação às cepas referências são apresentados na Tabela
4.
Tabela 5. Média da expressão relativa dos genes estudados nas 60 amostras
clínicas de P. aeruginosa em relação às cepas P. aeruginosa ATCC 27853 e
PAO1.
P. aeruginosa
PAO1
ATCC 27853
Gene
Média
DP
Intervalo
Média
DP
Intervalo
mexB
1,7 1,7 0,2 - 10
2,0 2,1 0,30 - 12,0
mexD
1,5 3,0 0 - 18
1,7 3,4 0,01 - 20,4
mexF
15,6 26,2 0,7 – 175
0,2 0,3 0,01 - 2,2
mexY
9,0 11,0 0,3 – 41
8,9 10,9 0,30 – 40,8
oprD
0,6 0,7 0 – 3,4
2,5 2,6 0,04 – 13,4
ampC
24,5 83,4 0 – 402
47 963,4 115 384,0 0,01 – 513 713
DP: Desvio padrão
A média da expressão relativa dos genes que codificam das bombas de
efluxo MexB, MexD, MexY para as 60 amostras clínicas de P. aeruginosa é
semelhante quando comparadas com a cepa P. aeruginosa ATCC 27853 e
Resultados 58
PAO1. Verificou-se que as amostras clínicas expressam o gene mexB
aproximadamente duas vezes mais que as amostras utilizadas como referência,
em média. Para os genes mexD, observa-se um aumento médina expressão em
torno de 1,5 e 1,7 vezes em relação às cepas de referência P. aeruginosa ATCC
27853 e PAO1, respectivamente. A expressão do gene mexY é, em média,
cerca nove vezes mais nas amostras clínicas em relação às cepas utilizadas
como referência.
Porém, as médias da expressão relativa de mexF, oprD e ampC nas
mesmas amostras não se aproximam quando comparadas com a expressão na
P. aeruginosa ATCC 27853 e na PAO1. A média da expressão relativa da
bomba de efluxo MexF nas 60 amostras clínicas é maior quando comparada à
PAO1 (15,6 vezes) que quando comparado com P. aeruginosa ATCC 27853 (0,2
vezes). A média da expressão relativa da β-lactamase cromossomial AmpC nas
60 amostras é menor quando comparada foi menor quando compara à PAO1
(24,5 vezes) e P. aeruginosa ATCC 27853 (> 40 mil vezes). As amostras clínicas
expressavam, em média, 2,5 vezes mais o gene oprD que a cepa P. aeruginosa.
Por outro lado, a expressão de OprD foi 0,6 vezes aquela exibida pela cepa
PAO1.
Uma comparação entre a expressão de mexF nas cepas P. aeruginosa
ATCC 27853 e PAO1 sugere que mexF está expresso cerca de 81 vezes mais
na P. aeruginosa ATCC 27853; enquanto que o gene oprD foi menos expresso
na cepa de P. aeruginosa ATCC 27853 (0,3 vezes) – dados não mostrados. A
expressão de ampC é menor na cepa PAO1, enquanto, a expressão dos outros
genes estudados foi semelhante entre as duas cepas-controle.
Resultados 59
A expressão relativa dos genes que codificam as bombas de efluxo mexB,
mexD, mexF e mexY nos 60 isolados de P. aeruginosa estudados em relação à
P. aeruginosa ATCC 27853 e à PAO1 é apresentada na Figura 6. Em 31,7% dos
60 isolados de P. aeruginosa foi observado aumento significativo na expressão
relativa do gene mexB, isto é, maior que duas vezes em comparação às cepas
utilizadas como referência. Três isolados clínicos (6379, 6615 e 6432)
apresentaram expressão relativa do gene mexB superior àquela apresentada
pelas outras amostras clínicas (Figura 6A). As amostras 6379 e 6615, isoladas
de pacientes internados na UTI, porém, não relacionadas geneticamente,
tiveram a expressão de mexB aumentada, respectivamente, em torno de 6 e 9
vezes em relação à P. aeruginosa ATCC 27853. A amostra 6379 apresentou
redução na expressão da porina OprD e resistência ao imipenem (CIM, 16
µg/mL), ao meropenem (CIM, 16 µg/mL) e à amicacina (CIM, 32 µg/mL);
enquanto, o isolado 6615 apresentou hiperexpressão de AmpC, redução na
expressão de OprD e resistência intermediária ao aztreonam (CIM, 16 µg/mL). O
isolado 6432 apresentou expressão de mexB aumentada em 12 vezes
comparada à P. aeruginosa ATCC 27853. Esse isolado foi coletado de um
paciente atendido no pronto-socorro e apresentou resistência à gentamicina
(CIM, 256 µg/mL), à amicacina (CIM, 256 µg/mL), e à ciprofloxacina (CIM, > 32
µg/mL).
Resultados 60
Figura 6. Expressão relativa dos genes que codificam as bombas de efluxo
mexB (A), mexD (B), mexF (C) e mexY (D) nos 60 isolados clínicos de P.
aeruginosa em relação às cepas referência P. aeruginosa ATCC 27853 e PAO1.
Das 60 amostras clínicas de P. aeruginosa, amostras 12 (20%)
espressavam mexD, no mínimo, duas vezes mais que as cepas controles. Em
contraste, 70% dos isolados tiveram a expressão de mexD menor que aquela
observada entre as cepas referência (Figura 6B). A amostra de P. aeruginosa
6668, isolado de um paciente internado na UTI, teve a expressão de mexD
aumentada em 20 vezes em relação à P. aeruginosa ATCC 27853. Essa
A
B
C
D
Resultados 61
amostra carregava também o gene bla
SPM
e apresentou resistência a todos os
antimicrobianos testados
A análise da expressão do gene mexF, quando comparado com a
expressão PAO1 revelou que 90% dos isolados hiperexpressavam esse gene.
Esta hiperexpressão variou de duas vezes até 175 vezes em relação à P.
aeruginosa PAO1. Entretanto, quando a expressão de mexF nas amostras
clínicas é comparada com a sua expressão na cepa de P. aeruginosa ATCC
27853, observa-se um aumento de duas vezes na expressão de mexF em
apenas um isolado, de número 6231, que era sensível a todos os
antimicrobianos testados (Figura 6C).
A hiperexpressão do sistema MexXY-OprM foi a mais freqüentemente
observada entre os isolados clínicos em relação às cepas de referência
utilizadas. Cerca de 60% dos isolados expressam o gene mexY em no mínino
duas vezes mais que as cepas P. aeruginosa ATCC 27853 e PAO1, chegando a
um aumento de até 41 vezes (Figura 6D).
A Tabela 6 mostra a porcentagem dos isolados que apresentaram um
aumento de, no mínimo, duas vezes na expressão dos genes que codificam as
bombas de efluxo em relação à cepa de P. aeruginosa ATCC 27853, de acordo
com o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos. Nela, observamos uma
porcentagem maior de isolados que hiperexpressavam os genes mexB e mexY
entre as amostras resistentes ao aztreonam (50,0% e 75,0%, respectivamente),
enquanto, nas amostras sensíveis a este antimicrobiano, 25,6% e 56,4%
hiperexpressavam respectivamente os genes mexB e mexY. Entre os isolados
sensíveis ao aztreonam, uma porcentagem maior de isolados que
Resultados 62
hiperexpressavam mexD e mexF foi observada (23,1% e 2,6%,
respectivamente).
Tabela 6. Hiperexpressão dos sistemas de efluxo entre os 60 isolados de P.
aeruginosa em relação à P. aeruginosa ATCC 27853 de acordo com o perfil de
sensibilidade aos antimicrobianos.
Antimicrobianos
Categoria
% de isolados com expressão aumentada
a
mexB
mexD mexF mexY
Aztreonam S (39)
25,6
23,1
2,6
56,4
I (09)
44,4
11,2
0
66,7
R (12)
50,0
16,7
0
75,0
Imipenem S (29)
27,6
10,3
3,4
41,4
I (03)
0
0
0
66,7
R (28)
42,9
32,1
0
82,1
Meropenem S (29)
20,7
10,3
3,4
37,9
I (04)
100,0
50,0
0
100,0
R (27)
37,0
25,9
0
81,5
Cefepima S (25)
28,0
16,0
4,0
32,0
I (03)
33,3
33,3
0
66,7
R (32)
37,5
21,9
0
84,4
Ceftazidima S (26)
30,8
23,1
3,8
38,5
I (03)
33,3
0,0
0
33,3
R (31)
35,5
19,4
0
83,9
Amicacina S (25)
24,0
20,0
4
32,0
I (04)
25,0
25,0
0
25,0
R (31)
41,9
19,4
0
90,3
Gentamicina S (19)
21,1
21,1
5,3
31,6
I (08)
37,5
25,0
0
37,5
R (33)
39,4
18,2
0
84,8
Ciprofloxacina S (22)
18,2
22,7
4,5
27,3
I (02)
50,0
50,0
0
50,0
R (36)
41,7
16,7
0
83,3
a
Expressão em no mínimo duas vezes mais que a cepa referência P. aeruginosa ATCC 27853.
Entre as amostras resistentes ao imipenem, a porcentagem de isolados
que hiperexpressavam os genes mexB (42,9%), mexD (32,1%) e mexY (82,1%)
foi maior que aquela observada entre os isolados sensíveis ao imipenem (27,6%,
10,3% e 41,4%, respectivamente). A hiperexpressão de mexB, mexD e mexY
Resultados 63
ocorreu em 37,0%, 25,9%, e 81,5%, respectivamente; das amostras resistentes
ao meropenem e foi maior que aquela observada nas amostras sensíveis.
Os quatro isolados que apresentaram resistência intermediária ao
meropenem (CIM, 8 µg/mL) hiperexpressavam os genes mexB e mexY. Dois
desses isolados (6323 e 6324) apresentaram sensibilidade ao imipenem (CIM, 2
µg/mL). Na amostra 6323 observamos um aumento em torno de quatro vezes na
expressão de mexB em relação a P. aeruginosa ATCC 27853 e um aumento na
expressão de mexY em torno de 17 vezes, além da hiperexpressão da β-
lactamase cromossomal AmpC. Assim como a amostra 6323, o isolado de
número 6324 hiperexpessava o gene mexB (2,3 vezes), mexY
(aproximadamente 13 vezes) e AmpC, além disso, a expressão de mexD por
essa amostra foi 1,41 vezes maior que na cepa referencia P. aeruginosa ATCC
27853. As outras duas amostras (6355 e 6223) que apresentaram resistência
intermediária ao meropenem, também eram resistentes ao imipenem. Ambas
tinham a expressão de mexB duas vezes maior que a cepa referência e mexY
estava expresso em torno de duas e 4,7 vezes mais nas amostras 6355 e 6223
que na cepa P. aeruginosa ATCC 27853, respectivamente. Estas amostras
também hiperexpressavam mexD e não expressavam a porina OprD.
Entre os 28 isolados resistentes aos carbapenens, 15 possuiam genes
que codificam MβLs, e quatro desses possuiam o gene que codifica uma ESβL
do tipo GES. Nas outras nove amostras resistentes aos carbapenens, porém,
não produtoras de carbapenemases, foi observada a hiperexpressão de mexY,
mexB e mexD em seis, cinco e quatro desses isolados, respectivamente.
Resultados 64
A hiperexpressão do gene mexY foi observada em 84,4% e 32,0% das
amostras de P. aeruginosa resistentes e sensíveis à cefepima, respectivamente.
De forma semelhante, uma maior porcentagem de amostras de P. aeruginosa,
que hiperexpressavam mexY foi observada entre os isolados resistentes à
ceftazidima (83,9%), quando comparada àquela apresentada pelos isolados
sensíveis à esse antimicrobiano (38,5%). Entre as 37 (62%) amostras que
hiperexpressavam o gene mexY, apenas três apresentaram resistância à
cefepima e sensibilidade à ceftazidima, duas dessas amostras expressavam
certa de sete vezes mais o gene mexY que a P. aeruginosa ATCC 27853,
enquanto, a outra, apenas duas vezes mais.
Sete amostras (11,6%) exibiam o fenótipo de resistência à cefepima e
sensibilidade à ceftazidima expressão relativa de mexY nessas amostras variou
de 0,29 a 7,21 vezes, em relação a P. aeruginosa ATCC 27853; e a sua
hiperexpressão foi observada em três dos sete isolados com resistência à
cefepima e sensibilidade à ceftazidima. Um destes isolados possuíam o gene
bla
GES
e todas as amostras que apresentaram esse fenótipo pertenciam a
padrões distintos de PFGE.
A porcentagem de isolados que hiperexpressavam mexB não variou
significativamente entre os isolados resistentes e sensíveis à cefepima e à
ceftazidima. O gene mexB estava hiperexpresso em 37,5% e 28,0% dos
isolados resistentes e sensiveis à cefepima, respectivamente. A hiperexpressão
de mexB ocorreu em 35,5% dos isolados resistentes à ceftazidima e em 30,8%
dos isolados sensíveis a ceftazidima. Das 32 amostras resistentes à cefepima,
sete eram produtoras de GES e outras 15 produziam uma MβL.
Resultados 65
Para os aminoglicosídeos testados, a proporção de cepas que
hiperexpressavam o gene mexB foi maior entre os isolados resistentes. A
expressão de mexY estava aumentada, em no mínimo duas vezes, para a
maioria dos isolados resistentes a amicacina (90,3%) e gentamicina (84,8%) em
comparação àquelas dos isolados sensíveis a essas agentes antimicrobianos
(32% e 31,6%, respectivamente).
A hiperexpressão de mexB e mexY foi observada em 41,7 e 83,3% dos
isolados resistentes à ciprofloxacina. Enquanto se observa entre os isolados
sensíveis à ciprofloxacina que os genes mexB e mexY são hiperexpressos em
18,2 e 27,3%, respectivamente.
A expressão da porina OprD nas 60 amostras estudas foi menor que a
sua expressão na PAO1 em 49 (81,7%) dos isolados clínicos de P. aeruginosa.
Destes, 29 isolados (59,2%) apresentaram resistência ou sensibilidade reduzida
ao imipenem e ao meropenem. Trinta e três isolados clínicos que apresentaram
redução na expressão do gene oprD estavam agrupados nos padrões de PFGE
A (14 isolados); B (cinco isolados), C (cinco isolados); D (três isolados), E (três
isolados) e F (três isolados). Dos 49 isolados com expressão reduzida de OprD,
quatro foram classificados como não tipáveis e 12 amostras não possuiam
relação genética pela técnica de PFGE.
A Tabela 7 mostra a proporção dos isolados de P. aeruginosa que
apresentaram redução na expressão da porina OprD e um aumento, de no
mínimo, quatro vezes na expressão da β-lactamase cromossomal AmpC em
relação às cepas P. aeruginosa ATCC 27853 e PAO1, de acordo com o perfil de
sensibilidade aos antimicrobianos. Os achados revelam que a proporção de
Resultados 66
isolados que tem redução na expressão da porina OprD é maior entre aqueles
que apresentam resistência aos agentes β-lactâmicos testados, com exceção do
aztreonam. De forma inversa, foi observada uma porcentagem maior de isolados
que hiperexpressavam o gene ampC entre os isolados de P. aeruginosa
resistentes aos β-lactâmicos.
Tabela 7. Redução da expressão da porina OprD e hiperexpressão de AmpC
nas nos 60 isolados clínicos de P. aeruginosa em relação as cepas referência
PAO1 e P. aeruginosa ATCC 27853 de acordo com o perfil de sensibilidade aos
β-lactamicos testados.
Antimicrobianos Categoria
% de isolados
PAO1
ATCC 27853
oprD
a
ampC
b
oprD
a
ampC
b
Aztreonam S (39)
82,1
5,1
33,3
94,9
I (09)
88,9
22,2
33,3
100,0
R (12)
75,0
25,0
33,3
91,7
Imipenem S (29)
69,0
6,9
20,7
93,1
I (03)
66,7
0
33,3
100,0
R (28)
96,4
17,9
46,4
96,4
Meropenem S (29)
69,0
6,9
24,1
93,1
I (04)
75,0
0
50,0
100,0
R (27)
96,3
18,5
40,7
96,3
Cefepima S (25)
68,0
4,0
20,0
92,0
I (03)
66,7
66,7
33,3
100,0
R (32)
93,8
12,5
43,8
96,9
Ceftazidima S (26)
65,4
0
23,1
92,3
I (03)
66,7
33,3
0
100
R (31)
96,8
19,4
19,4
96,8
a
Porcentagem de isolados que apresentaram expressão de OprD menor que as cepas
referências.
b
Expressão de AmpC aumentada em no mínimo quatro vezes em relação as cepas referências.
Resultados 67
A porcentagem de amostras em que se observou redução na expressão
de OprD em relação à PAO1 é menor entre os isolados que apresentaram
resistência ao aztreonam (75,0%) em comparação aos isolados que eram
sensíveis a este antimicrobiano (82,1%). Observa-se também que 25,0% das
amostras de P. aeruginosa resistentes ao aztreonam tiveram a expressão de
AmpC, em relação à PAO1, aumentada em no mínimo quatro vezes; enquanto,
apenas 5,1 dos isolados sensíveis ao aztreonam hiperexpressavam o gene
ampC.
Para as amostras de P. aeruginosa estudadas observa-se uma diminuição
da expressão de OprD comparada com a PAO1 em 96,3% dos isolados
resistentes ao imipenem. Porém, essa redução também foi observada entre
69,0% dos isolados sensíveis.
Discussão 67
5 DISCUSSÃO
As infecções da corrente sangüínea (ICS) estão entre as mais freqüentes
no ambiente hospitalar. Representam uma grave complicação dos pacientes
críticos e estão associadas a elevadas taxas de mortalidade e prolongamento do
tempo de hospitalização (151). Nas últimas décadas, tem sido observado um
aumento na incidência das ICS refletindo, entre outros fatores, a freqüente
utilização de recursos invasivos no tratamento e monitoração dos pacientes mais
graves. Esse aumento se refere, particularmente, ao uso de cateter venoso
central, que é considerado um dos principais fatores de risco ao
desenvolvimento deste tipo de infecção (60).
O isolamento de bactérias multirresistentes vem sendo observado nos
últimos anos (21). Vários agentes antimicrobianos têm se tornado menos ativos,
reduzindo o número de opções terapêuticas disponíveis para o tratamento das
ICS. Nos EUA, o surgimento de microrganismos multirresistentes tem maior
destaque entre os cocos Gram-positivos e Candida spp., enquanto no Brasil, o
surgimento de organismos multirresistentes é mais preocupante entre as
bactérias Gram-negativas. Dentre as preocupações relacionadas à resistência
antimicrobiana, destacam-se os estafilococos resistentes à oxacilina, os
enterococos resistentes à vancomicina, a produção de ESβL por enterobactérias
e a resistência aos carbapenens entre os bacilos Gram-negativos não
fermentadores (70, 72).
P. aeruginosa é o terceiro agente causador de infecções da corrente
sanguínea entre as bactérias Gram-negativas e o quinto agente causador de ICS
Discussão 68
entre as bactérias Gram-negativas e Gram-positivas, na América Latina (133).
Entre 2004-2006, 6325 patógenos bacterianos foram coletados de hospitais
brasileiros, pelo Programa SENTRY Antimicrobial Surveillance Program. P.
aeruginosa foi o quarto patógeno mais freqüentemente isolado de pacientes com
ICS (Sader HS – comunicação pessoal*). A sua importância como agente
etiológico nas ICS é destacada por representar a segunda causa de mortalidade
dos pacientes acometidos por ICS entre todos os patógenos causadores de ICS
(160).
Fatores que dificultam o tratamento de ICS causadas por P. aeruginosa
incluem: o rápido curso da enfermidade, com 35% a 50% dos pacientes
morrendo durante o primeiro dia após o diagnóstico de ICS; a escassez de
agentes antimicrobianos com atividade anti-pseudomonas; e a capacidade da P.
aeruginosa adquirir rapidamente resistência antimicrobiana às drogas
disponíveis para o tratamento das ICS durante a terapia (60). As ICS causadas
por P. aeruginosa acometem freqüentemente pacientes gravemente enfermos e
que foram expostos a terapia antimicrobiana prévia (60).
A maioria dos isolados de P. aeruginosa avaliada nesse estudo foram
coletadas de unidades de terapia intensiva (65%). Entretanto, de acordo com os
dados coletados pelo Laboratório de Bacteriologia do Hospital São Paulo;
observamos uma alta proporção de amostras de P. aeruginosa isoladas de
pacientes atendidos na unidade de pronto-socorro (28,3%). Não foi o objetivo
deste estudo avaliar o modo de aquisição de ICS por esses pacientes. Porém,
este achado, talvez, possa ser explicado pela hospitalização de pacientes no
Discussão 69
próprio pronto-socorro, enquanto aguardavam a disponibilidade de leitos nas
enfermarias, ou pela readmissão de pacientes.
Os dados coletados pelo presente estudo confirmam as altas taxas de
resistência aos antimicrobianos, como previamente observadas, entre as
amostras de P. aeruginosa causadoras de ICS (133).
A alta taxa de resistência aos carbapenens observada entre as amostras
avaliadas pode ser parcialmente explicada pela produção de MβLs, uma vez
que, 15 dos 28 (53,6%) isolados de P. aeruginosa eram produtoras de MβL. O
teste da hidrólise dos carbapenens e sua inibição com EDTA foi capaz de
detectar todas as amostras produtoras de MβL, demonstrando que essa técnica
representa um bom método fenotípico para triagem de amostras produtoras
dessas enzimas como reportado anteriormente (157).
O gene bla
SPM-1
foi detectado em 14 isolados produtores de MβL,
enquanto a presença de bla
IMP
foi observada em apenas uma dessas amostras.
A maior prevalência do gene bla
SPM-1
entre as amostras de P. aeruginosa
produtoras de MβL isoladas no Brasil foi anteriormente reportada (134). Ainda, a
análise genética desses isolados através da técnica de PFGE nos permitiu
observar que o gene bla
SPM-1
encontra-se em um clone endêmico de P.
aeruginosa, como reportado em estudo anterior que avaliou amostras de P.
aeruginosa isoladas de diferentes regiões brasileiras (37).
Adicionalmente, quatro dos isolados resistentes aos carbapenens eram
produtores de uma β-lactamase do tipo GES, e também apresentavam
resistência à ceftazidima e à cefepima. A produção da ESβL do tipo GES foi
Discussão 70
observada em mais três isolados de P. aeruginosa avaliados, entretanto, essas
amostras apresentavam sensibilidade aos carbapenens. A diferença entre o
perfil de sensibilidade aos carbapenens poderia ser decorrente da variante
alélica do gene que codifica a β-lactamases do tipo GES produzida pelas
amostras. As variantes alélicas de GES diferem quanto à especificidade de
substrato, enquanto a GES-1 é capaz de hidrolisar apenas cefalosporinas de
amplo espectro, a GES-5 também é capaz de hidrolisar carbapenens (158).
Portanto, é possível que as amostras avaliadas produtoras de GES carregassem
variantes alélicas distintas do gene bla
GES
. Infelizmente a seqüência de
nucleotídeos desse gene não foi determinada. A presença de amostras de P.
aeruginosa produtoras de GES-1 e GES-5 na UTI do Hospital São
Paulo/UNIFESP foi reportada anteriormente (14, 115) e em outros hospitais
brasileiros (31, 111).
Os sete isolados de P. aeruginosa nos quais foi detectada a presença do
gene bla
GES
estavam distribuídos em dois padrões distintos de PFGE. O gene
que codifica a GES geralmente está localizado em integrons e a sua presença
foi reportada em plasmídeos, o que possibilita a sua mobilização entre diversas
espécies de bactérias Gram-negativas (158). É possível que o integron que
carrega o gene bla
GES
entre os isolados de P. aeruginosa estudados esteja se
disseminando entre amostras de bactérias Gram-negativas geneticamente não
relacionadas. Porém, a presença de uma cepa endêmica de P. aeruginosa
produtora de GES foi observada na UTI do Hospital São Paulo/UNIFESP entre
setembro e novembro de 2005.
Discussão 71
As amostras de P. aeruginosa não tipáveis pela técnica de PFGE
poderiam também representar a disseminação de uma cepa endêmica, pois,
foram isoladas de pacientes hospitalizados na UTI entre julho e novembro de
2005. O controle da resistência bacteriana é complexo e exige atuação em
vários setores; sendo que as medidas mais eficazes envolvem o controle da
disseminação horizontal de bactérias resistentes e uma política de uso racional
de
antimicrobianos (29). Porém, para que essas medidas sejam executadas de
forma adequada, é necessário entender como ocorre a disseminação dos
diferentes mecanismos de resistência antimicrobiana, e que os laboratórios
estejam preparados para detectar os diferentes tipos de resistência (114). Por
outro lado, para que os antimicrobianos sejam utilizados adequadamente,
especialmente no tratamento empírico, é necessário o conhecimento dos
mecanismos de resistência envolvidos e como estes responderão a pressão
seletiva exercida por diferentes classes de antimicrobianos, ou mesmo por
diferentes drogas de uma mesma classe. Como existe um grande número de
variáveis envolvidas é importante que as medidas de controle sejam baseadas
em estudos locais.
Um dos principais fatores que resulta no alto grau de resistência entre
amostras clínicas de P. aeruginosa aos antimicrobianos é a associação de
diferentes mecanismos de resistência, como, a redução da permeabilidade e o
efluxo ativo de drogas do interior da célula viam bombas de efluxo da família
RND (118). Em patógenos como P. aeruginosa, a expressão de bombas possui
incontestável significância clínica, já que elas são capazes de ejetar a maioria
dos antimicrobianos utilizados para o tratamento de infecções causadas por
esse patógeno (41). Nesse estudo, os genes de P. aeruginosa que codificam os
Discussão 72
sistemas de efluxo foram considerados hiperexpressos quando a sua expressão
era duas vezes maior que nas amostras de referência utilizadas, P. aeruginosa
ATCC 27853 e PA01, como sugerido por Hocquet e colaboradores (50). Porém,
não existe um critério universalmente aceito que correlacione o aumento da
expressão dos genes que codificam estes sistemas com o surgimento de
resistência bacteriana (elevação das CIMs) que possua significado clínico.
Adicionalmente, não há um consenso que defina os limites de hiperexpressão
dos sistemas de efluxo. Estudos adicionais são necessários para o
estabelecimento destes critérios para que os laboratórios possam detectar a
presença de hiperexpressão de efluxo entre amostras clínicas, auxiliando na
escolha da terapia antimicrobiana e gerando dados epidemiológicos que
permitam conhecer a distribuição desse fenômeno no ambiente hospitalar.
No presente trabalho observamos uma maior porcentagem de cepas que
hiperexpressavam os sistemas de efluxo da família RND entre as amostras de P.
aeruginosa resistentes aos antimicrobianos testados, em comparação ao grupo
de amostras sensíveis, com exceção dos genes mexD e mexF que foram
hiperexpressos em maior porcentagem das amostras sensíveis ao aztreonam.
MexXY-OprM foi o sistema de efluxo cuja hiperexpressão foi mais
freqüentemente detectada entre os isolados avaliados e entre aqueles que
apresentaram resistência aos antimicrobianos testados. Entre as amostras P.
aeruginosa avaliadas nesse estudo, a hiperexpressão de MexXY-OprM foi
observada em 90% dos isolados resistentes à amicacina, em 84,8% das
amostras resistentes à gentamicina, em 83,3% dos isolados de P. aeruginosa
resistentes à ciprofloxacina e 84,4% entre os isolados resistentes à cefepima. O
Discussão 73
sistema MexXY-OprM é um dos principal mecanismo de resistência de P.
aeruginosa aos aminoglicosídeos, sua expressão pode ser induzida na presença
desses antimicrobianos e mutantes de P. aeruginosa que hiperexpressam esse
sistema de efluxo podem ser selecionados após exposição às fluoroquinolonas e
às cefalosporinas, como a cefepima e cefpiroma (100). Em um estudo anterior,
que avaliou isolados clínicos de P. aeruginosa, a hiperexpressão do sistema de
efluxo MexXY-OprM foi reportada com bastante freqüente entre aqueles isolados
resistentes à cefepima, porém sensíveis à ceftazidima (50). Além disso, Hocquet
e colaboradores observaram uma associação entre o uso de antimicrobianos e o
aumento da incidência de isolados clínicos de P. aeruginosa que
hiperexpressavam o sistema MexXY-OprM (49). Em nosso estudo, apenas três
amostras que hiperexpressavam o sistema MexXY-OprM apresentaram
resistência à cefepima e sensibilidade à ceftazidima e pertenciam a padrões
distintos de PFGE.
O sistema MexAB-OprM expresso entre cepas selvagens de P.
aeruginosa contribui significativamente para a resistência aos antimicrobianos
(119), já que é capaz de ejetar uma ampla variedade de antimicrobianos. É
responsável, muitas vezes, pela resistência de P. aeruginosa aos β-lactâmicos,
com exceção do imipenem (119). Para amostras de clínicas de P. aeruginosa
avaliadas nesse estudo, a resistência aos antimicrobianos β-lactâmicos testados
parece ter relação positiva com a expressão do sistema de efluxo MexAB-OprM,
uma vez que a freqüência de isolados que hiperexpressam esse sistema de
efluxo é maior entre àquelas amostras que apresentaram-se resistentes aos β-
lactâmicos.
Discussão 74
A expressão do sistema MexCD-OprJ foi a menos significativa entre as
amostras estudadas. Em média, a expressão do gene mexD foi de somente 1,7
vezes maior nas amostras clínicas, quando comparada à da P. aeruginosa
ATCC 27853. As cepas que hiperexpressavam este sistema de efluxo foram
mais freqüentes entre os isolados de P. aeruginosa que apresentaram
sensibilidade ao aztreonam, à ceftazidima e à ciprofloxacina; resistência
intermediária ao meropenem, à cefepima, à amicacina e à gentamicina; e
resistência ao imipenem. Cepas de P. aeruginosa que hiperexpressam o sistema
MexCD-OprJ apresentam sensibilidade ao imipenem e aminoglicosídeos (162).
No entanto, esse perfil de sensibilidade não foi detectado entre as amostras
clínicas avaliadas. Provavelmente devido à associação de outros mecanismos
que conferem resistência aos aminoglicosídeos e ao imipenem e que não foram
avaliados no presente estudo.
A hiperexpressão do sistema MexEF-OprN nas amostras estudadas não
apresentou relação com o fenótipo de resistência às drogas antimicrobianas
testadas. Nesse estudo, apenas uma amostra, sensível a todos os
antimicrobianos testados, apresentou hiperexpressão do gene mexF em
comparação à expressão deste sistema na cepa de P. aeruginosa ATCC 27853.
Interessantemente, foi observado uma diferença na expressão de mexF entre as
cepas utilizadas como referência. P. aeruginosa ATCC 27853 expressava o
gene mexF cerca de 81 vezes mais que à cepa PAO1, além de apresentar
concomitante redução na expressão de OprD e AmpC, como é observado nos
mutantes que hiperexpressam o sistema de efluxo MexEF-OprN (119). Em
estudo realizado por Tam e colaborados, foi observado que a cepa de P.
aeruginosa ATCC 27853 apresentava mutação no gene regulador ampR,
Discussão 75
envolvido na regulação global da expressão gênica e que regula a expressão de
ampC e lasR, entre outros genes (146). A expressão de lasR, que codifica um
regulador da transcrição gênica em P. aeruginosa, exerce, por sua vez,
influência sob a transcrição de mexEF-oprN (34). Essa seria uma hipótese que
justificaria a diferença na expressão de MexEF-OprN, OprD e AmpC entre as
cepa de P. aeruginosa ATCC 27853 e PAO1. Uma análise mais detalhada da
expressão de MexEF-OprN na cepa de P. aeruginosa ATCC 27853 e do seu
mecanismo de regulação gênica é necessária para que esse achado seja
esclarecido.
A redução na expressão da porina OprD e a hiperexpressão da β-
lactamase cromossomal AmpC representam importantes mecanismos de
resistência aos β-lactâmicos, além da produção de β-lactamases pelas amostras
clínicas de P. aeruginosa (118). A expressão de OprD estava reduzida em mais
de 90% das amostras de P. aeruginosa resistentes aos β-lactâmicos. Nas
amostras de P. aeruginosa em que não foi detectado a presença dos genes que
codificam carbapenemases foi observada redução na expressão de OprD para
100% dessas amostras, e assim, configurou-se como um dos principais
mecanismo de resistência ao imipenem, em associação com a hiperexpressão
de AmpC e dos sistemas de efluxo nessas amostras. Entretanto, 37 das 49
amostras clínicas de P. aeruginosa que apresentaram redução na expressão de
OprD possuíam relação genética pela técnica de PFGE; e apenas 12 isolados
não foram relacionadas geneticamente, indicando a disseminação de clones de
P. aeruginosa que apresentam redução na expressão da porina OprD.
Discussão 76
A detecção de patógenos bacterianos em hemoculturas é considerada um
indicador da disseminação de um processo infeccioso e tem sido reconhecida
como um importante recurso diagnóstico nos episódios de ICS. Conhecer as
bactérias mais freqüentes e o seu perfil de suscetibilidade é essencial ao
direcionamento apropriado da terapia antimicrobiana nos pacientes com ICS,
contribuindo, assim, para a redução da mortalidade (114).
Uma vez que os sistemas de efluxo da família RND de P. aeruginosa
ampla especificidade de substratos e a habilidade de promover resistência a
múltiplas drogas e atua em associação com outros mecanismos de resistência
entre amostras clínicas de P. aeruginosa (117), é impossível determinar a real
contribuição dos sistemas de efluxo para a resistência aos diferentes
antimicrobianos.
Este foi o primeiro estudo que avaliou a expressão dos sistemas de efluxo
entre amostras clínicas de P. aeruginosa isoladas de um hospital brasileiro. É
importante notar que um único mecanismo de resistência não é inteiramente
responsável pelo fenótipo de resistência a múltiplas drogas, e que existe a
associação de diferentes mecanismos. Desta maneira, a identificação do
mecanismo de resistência a partir do perfil de sensibilidade aos antimicrobianos
é muito difícil e pode levar a conclusões errôneas. Por isso, é impossível estimar
a real contribuição da hiperexpressão dos sistemas de efluxo para a resistência
antimicrobiana entre isolados clínicos de P. aeruginosa.
O impacto da expressão dos sistemas de efluxo para a resistência
bacteriana aos antimicrobianos somente pode ser determinado in vitro,
comparando a expressão desses sistemas e o fenótipo de resistência às drogas
Discussão 77
apresentado por cepas bacterianas que são mutantes isogênicos, desenvolvidos
em laboratório. Porém, como observado nesse estudo e em estudos anteriores
(18, 40, 51, 122, 155), a hiperexpressão dos sistemas de efluxo da família RND
de P. aeruginosa é mais freqüente entre isolados clínicos que apresentaram
resistência aos mais variados antimicrobianos. O conhecimento sobre a
ocorrência de isolados clínicos que hiperexpressam os sistemas de efluxo entre
amostras clínicas e o modo como esses mutantes são selecionados são cruciais
para barrar o surgimento de amostras clínicas de P. aeruginosa resistentes a
múltiplas drogas. O desenvolvimento de um método acurado para a detecção da
hiperexpressão dos sistemas de efluxo é necessário.
Conclusões 78
6 CONCLUSÕES
• Altas taxas de resistência aos antimicrobianos testados foram detectadas
entre as amostras de P. aeruginosa, coletadas de hemocultura entre julho e
dezembro de 2005 no Hospital São Paulo/UNIFESP.
• A produção de MβL foi observada em 25% das amostras clínicas de P.
aeruginosa avaliadas e em 53,6% das amostras resistentes aos carbapenens.
A MβL mais freqüente entre as amostras de P. aeruginosa avaliadas foi SPM-1.
As amostras produtoras de SPM-1 pertenciam ao mesmo padrão de PFGE e
encontram-se disseminadas por diferentes unidades do Hospital São
Paulo/UNIFESP
• A presença do gene bla
GES
foi detectada em 11,7% dos isolados de P.
aeruginosa estudados pertencentes a dois perfis genéticos distintos.
• Dentre as bombas de efluxo da família RND de P. aeruginosa avaliadas
nesse estudo, entre os isolados resistentes aos antimicrobianos testados a
hiperexpressão do sistema MexXY-OprM apresentou maior freqüência, seguida
pela hiperexpressão do sistema MexAB-OprM.
• Não foi observada relação entre a hiperexpressão de MexCD-OprJ e
MexEF-OprN com a resistência das amostras clínicas de P. aeruginosa
testadas.
• A hiperexpressão de AmpC e a redução na expressão da porina OprD
desempenham um importante papel na resistência aos β-lactâmicos nas
amostras avaliadas.
Conclusões 79
• A expressão ou hiperexpressão de sistemas de efluxo não foi o principal
mecanismo de resistência aos antimicrobianos entre as amostras de P.
aeruginosa estudadas, porém representa um mecanismo coadjuvante para a
resistência aos antimicrobianos.
Anexos 80
7 ANEXOS
Anexo 1 81
Anexo 1 Gráficos gerados pela planilha qGene que representa a expressão
normalizada dos genes que codificam as bombas de efluxo MexB, MexD, MexF,
MexY; da porina OprD e da β-lactamases cromossomal AmpC.
mexB
Anexo 1 (continuação) 82
mexD
Anexo 1 (continuação) 83
mexF
Anexo 1 (continuação) 84
mexY
Anexo 1 (continuação) 85
oprD
Anexo 1 (continuação) 86
ampC
Anexo 2 87
Anexo 2. Expressão relativa dos genes avaliados nas 60 amostras clínicas de P.
aeruginosa em comparação à cepa referência P. aeruginosa ATCC 27853.
Amostras
Genes
mexB
mexD
mexF
mexY
oprD
ampC
6192 0,6
0,3
0,1
0,4
2,2
662,4
6195 1,0
0,6
0,1
8,1
6,8
43,8
6196 3,5
6,1
0,0
5,8
1,2
> 10 000
6197 1,1
0,5
0,1
2,4
5,1
> 10 000
6200 3,2
0,1
0,0
1,6
0,9
> 10 000
6208 2,7
0,4
0,1
3,8
3,3
168,8
6213 0,5
0,0
0,0
24,1
0,3
> 10 000
6223 2,9
4,3
0,2
4,8
0,5
1 391,1
6231 5,0
2,2
2,2
20,3
5,9
14,8
6247 2,9
1,2
0,6
11,5
2,0
3 342,1
6281 2,0
0,7
0,3
6,9
0,6
> 10 000
6285 0,7
0,4
0,1
0,9
4,6
1 073,4
6318 1,1
1,3
0,5
3,5
0,5
> 10 000
6323 4,0
0,3
0,1
17,4
2,4
1 172,1
6324 2,3
1,4
0,4
13,0
5,5
> 10 000
6327 0,6
0,4
0,1
0,4
1,9
> 10 000
6332 1,1
0,2
0,1
9,8
1,2
260,9
6343 2,1
2,5
0,2
40,9
0,4
2 344,1
6355 2,0
6,6
0,2
2,1
0,1
189,8
6367 1,0
0,1
0,7
0,5
0,0
47,5
6379 6,6
0,1
0,0
0,5
1,1
44,5
6380 3,1
0,8
0,2
13,4
0,2
88,6
6390 1,5
1,6
0,0
7,4
0,3
398,5
6397 1,1
0,2
0,1
0,8
5,4
672,3
6403 1,2
0,2
0,1
6,2
3,4
60,6
6408 3,7
0,4
0,1
1,6
12,1
35,6
6409 0,8
0,3
0,3
26,5
1,2
7 494,9
6417 0,9
0,3
0,4
4,8
0,9
0,0
6424 2,9
0,6
0,2
21,3
4,8
> 10 000
6432 12,0
0,1
0,0
26,1
5,7
2 048,1
6451 0,8
0,8
0,0
3,5
3,1
505,1
6474 0,6
0,2
0,0
0,8
13,4
6 359,8
6475 0,3
0,1
0,0
7,2
2,0
465,4
6489 0,9
1,0
0,3
30,4
1,2
> 10 000
6499 0,4
0,3
0,1
1,5
2,8
66,2
6504 1,6
1,7
0,0
0,9
1,0
162,3
6507 0,8
0,2
0,1
0,4
3,0
> 10 000
6512 1,2
0,2
0,1
25,8
1,8
1 936,0
Anexo 2 (continuação) 88
Amostras
Genes
mexB
mexD
mexF
mexY
oprD
ampC
6515 0,7
0,2
0,0
0,3
2,1
64,2
6516 0,8
3,1
0,0
0,5
0,4
212,6
6518 2,0
0,1
0,0
7,2
0,9
4,0
6528 2,5
8,2
1,1
11,5
1,7
> 10 000
6529 1,1
5,4
0,0
1,1
0,6
630,2
6543 1,2
0,2
0,2
19,6
1,1
1 687,0
6557 0,4
0,3
0,1
5,7
3,3
> 10 000
6579 0,6
0,2
0,0
0,3
0,6
> 10 000
6580 0,6
0,2
0,0
0,5
2,0
140,5
6581 0,5
0,2
0,0
0,4
2,5
114,5
6585 1,1
0,2
0,0
2,8
0,9
86,7
6594 0,8
0,2
0,0
2,3
1,8
23,5
6598 0,6
13,3
0,6
0,8
2,4
0,0
6608 1,9
0,8
0,2
1,5
2,9
106,1
6615 9,1
1,2
0,0
0,5
1,0
226,2
6645 4,9
0,9
0,1
15,8
3,3
7,9
6646 2,0
0,7
0,1
4,6
0,8
> 10 000
6662 1,8
0,1
0,1
0,8
3,4
221,3
6663 0,9
0,2
0,0
0,9
6,3
81,3
6664 3,3
3,2
0,2
32,1
0,3
1 016,8
6668 2,2
20,5
0,3
40,8
2,5
601,2
6669 1,1
4,2
0,1
30,9
0,5
> 10 000
Anexo 3 89
Anexo 3. Expressão gênica relativa nas 60 amostras clínicas de P. aeruginosa
em comparação à cepa referência P. aeruginosa PAO1.
Amostras
Genes
mexB
mexD
mexF
mexY
oprD
ampC
6192
0,5
0,2
7,2
0,5
0,5
0,0
6195
0,8
0,6
11,0
8,3
1,7
0,0
6196
2,9
5,5
3,9
5,9
0,3
>10 000
6197
0,9
0,5
10,5
2,4
1,3
0,1
6200
2,7
0,1
3,6
1,6
0,2
0,2
6208
2,2
0,4
7,3
3,8
0,8
0,0
6213
0,4
0,0
1,1
24,7
0,1
14,2
6223
2,4
3,9
12,2
4,9
0,1
0,0
6231
4,1
2,0
175,4
20,7
1,5
0,0
6247
2,4
1,1
52,0
11,7
0,5
0,0
6281
1,6
0,7
28,0
7,0
0,2
0,2
6285
0,6
0,3
6,3
0,9
1,2
0,0
6318
0,9
1,2
37,8
3,6
0,1
>10 000
6323
3,3
0,3
8,5
17,7
0,6
0,0
6324
1,9
1,3
33,6
13,3
1,4
0,8
6327
0,5
0,4
6,5
0,4
0,5
0,1
6332
0,9
0,2
5,5
10,0
0,3
0,0
6343
1,8
2,3
14,0
41,8
0,1
0,0
6355
1,7
6,0
19,4
2,2
0,0
0,0
6367
0,9
0,1
54,7
0,5
0,0
0,0
6379
5,5
0,1
2,4
0,5
0,3
0,0
6380
2,6
0,7
17,5
13,7
0,1
0,0
6390
1,3
1,4
1,8
7,6
0,1
0,0
6397
0,9
0,2
4,2
0,8
1,4
0,0
6403
1,0
0,1
5,7
6,3
0,9
0,0
6408
3,1
0,4
7,5
1,6
3,1
0,0
6409
0,7
0,2
22,0
27,1
0,3
0,1
6417
0,7
0,3
31,9
4,9
0,2
0,0
6424
2,4
0,5
17,3
21,8
1,2
0,6
6432
10,1
0,1
2,1
26,7
1,5
0,0
6451
0,6
0,7
2,6
3,6
0,8
0,0
6474
0,5
0,2
3,1
0,8
3,4
0,0
6475
0,2
0,1
2,6
7,4
0,5
0,0
6489
0,8
0,9
23,7
31,0
0,3
1,8
6499
0,3
0,2
11,2
1,5
0,7
0,0
6504
1,4
1,5
1,7
0,9
0,3
0,0
6507
0,6
0,2
4,8
0,4
0,8
23,9
6512
1,0
0,1
6,4
26,4
0,5
0,0
Anexo 3 (continuação) 90
Amostras
Genes
mexB
mexD
mexF
mexY
oprD
ampC
6515
0,6
0,1
2,7
0,3
0,5
0,0
6516
0,7
2,8
0,7
0,5
0,1
0,0
6518
1,7
0,1
2,2
7,3
0,2
0,0
6528
2,1
7,5
85,6
11,7
0,4
2 660,3
6529
0,9
4,9
2,4
1,1
0,1
0,0
6543
1,0
0,2
16,2
20,0
0,3
0,0
6557
0,4
0,2
4,8
5,8
0,8
0,1
6579
0,5
0,2
3,2
0,3
0,2
> 10 000
6580
0,5
0,1
1,9
0,5
0,5
0,0
6581
0,4
0,2
4,0
0,4
0,6
0,0
6585
0,9
0,1
2,5
2,8
0,2
0,0
6594
0,7
0,2
2,3
2,4
0,5
0,0
6598
0,5
12,1
48,3
0,8
0,6
0,0
6608
1,6
0,8
20,1
1,5
0,7
0,0
6615
7,6
1,1
1,7
0,5
0,2
0,0
6645
4,1
0,8
9,2
16,1
0,8
0,0
6646
1,6
0,6
6,0
4,7
0,2
0,2
6662
1,5
0,1
5,1
0,8
0,9
0,0
6663
0,7
0,2
3,8
0,9
1,6
0,0
6664
2,7
2,9
18,9
32,8
0,1
0,0
6668
1,8
18,6
25,0
41,7
0,6
0,0
6669
1,0
3,9
11,1
31,6
0,1
> 10 000
Referências 91
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Abstract 106
Abstract
Multidrug efflux pumps have become increasingly recognized as a major
component of resistance among P. aeruginosa. This study investigated the
expression level of efflux systems among clinical isolates of P. aeruginosa.
Sixty P. aeruginosa isolates were collected from patients with bloodstream
infections hospitalized at a Brazilian teaching hospital between July and
December 2005. Antimicrobial susceptibility profile was determined by CLSI
agar dilution. Genetic relatedness among P. aeruginosa isolates was accessed
by PFGE. Transcription levels of four efflux pumps (mexB, mexD, mexF, mexY),
oprD and ampC were measured by real time PCR and compared to those of P.
aeruginosa ATCC 27853. Detection of acquired metallo-β-lactamases (MβL)
was carried out by PCR. Aztreonan (MIC
50
, 8 µg/mL; 65% susceptible)
exhibited the highest in vitro activity against P. aeruginosa. Only 48.4% of the P.
aeruginosa strains were susceptible to imipenem (MIC
50
, 8 µg/mL) and
meropenem (MIC
50
, 8 µg/mL). The MβL genes bla
SPM
and bla
IMP
were detected
in 23.3% and 1.7% P. aeruginosa isolates, respectively. The overexpression of
MexXY-OprM (60%) system was the most frequently detected followed by those
of MexAB-OprM (31.7%) and MexCD-OprJ (18.3%) systems. Overexpression of
both MexAB-OprM and MexXY-OprM efflux systems was observed in 16.7% of
P. aeruginosa isolates. None of the strains overexpressed MexEF-OprN.
Hyperexpression of AmpC beta-lactamase was observed in 90% of P.
aeruginosa. In contrast, a decrease in the OprD expression was observed in
35% of P. aeruginosa tested and in 50% of the carbapenem-resistant P.
Abstract 107
aeruginosa isolates. This study shows that the overexpression of efflux systems
coupled with AmpC and MβL production effectively contributes to the multi-drug
resistant phenotype exhibited by P. aeruginosa clinical strains.
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