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FERDINAN ALMEIDA MELO
ALTERAÇÕES DA MATRIZ EXTRACELULAR DO FÍGADO, BAÇO E
LINFONODOS CERVICAIS DE CÃES NATURALMENTE INFECTADOS COM
Leishmania (Leishmania) chagasi
BELO HORIZONTE
Setembro 2008
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE ANATOMIA PATOLÓGICA E MEDINA LEGAL
TESE DE DOUTORADO
ALTERAÇÕES DA MATRIZ EXTRACELULAR DO FÍGADO, BAÇO E
LINFONODOS CERVICAIS DE CÃES NATURALMENTE INFECTADOS COM
Leishmania (Leishmania) chagasi
BELO HORIZONTE
Setembro 2008
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FERDINAN ALMEIDA MELO
ALTERAÇÕES DA MATRIZ EXTRACELULAR DO FÍGADO, BAÇO E
LINFONODOS CERVICAIS DE CÃES NATURALMENTE INFECTADOS COM
Leishmania (Leishmania) chagasi
Tese apresentada ao curso de Pós-Graduação em
Patologia da Universidade Federal de Minas Gerais,
como requisito para obtenção do grau de Doutor em
Patologia.
Área de concentração: Patologia Geral
Orientador: Prof. Dr. Wagner Luiz Tafuri.
Co-orientadora: Prof. Dra. Kátia da Silva Calabrese
Belo Horizonte
Faculdade de Medicina – UFMG
2008
Melo, Ferdinan Almeida.
M528a Alterações da matriz extracelular do fígado, baço e linfonodos
cervicais de cães naturalmente infectados com Leishmania (Leishmania)
chagasi [manuscrito]. / Ferdinan Almeida Melo. - - Belo Horizonte: 2008.
101f.: il.
Orientador: Wagner Luiz Tafuri.
Co-orientadora: Kátia da Silva Calabrese.
Área de concentração: Patologia Geral.
Tese (doutorado): Universidade Federal de Minas Gerais, Faculdade de
Medicina.
1. Leishmaniose/patologia. 2. Matriz Extracelular. 3. Dissertações
Acadêmicas. I. Tafuri, Wagner Luiz. II. Calabrese, Kátia da Silva. III.
Universidade Federal de Minas Gerais, Faculdade de Medicina. IV. Título
NLM: QX 70
Aos meus pais,
Domingos Melo e Zulmira Melo
À Weverton Marcos Sampaio
“in memoriam”
À professora Dra. Ana Margarida Miguel Ferreira Nogue ra i
“in memoriam”
"Há homens que lutam um dia e são bons.
Há outros que lutam um ano e são melhores.
Há os que lutam muitos anos e são muito bons.
Porém, há os que lutam toda a vida.
Esses são os imprescindíveis."
Bertolt Brecht
AGRADECIMENTOS
A Deus.
Aos meus pais, irmãos e familiares pelo apoio, compreensão e carinho de sempre.
À Árina Ribeiro, com todo carinho.
A Eliane Perlatto e família, uma irmã que ganhei em Minas... Cíntia Alves, Raul Ribeiro,
Wanderson Lima, Felipe Cosenza que fizeram parte da equipe de trabalho nessa longa e árdua
jornada. Hoje, amigos pra toda a vida.
Ao professor Wagner Tafuri, meu orientador, meu amigo. Agradeço pela amizade, oportunidade e
confiança com a qual me recebeu para o Doutorado. Agradeço pelos conselhos, ensinamentos, pelos
valiosos momentos que proporcionou a toda família NIPE, ao abrir as portas de sua casa, de sua
família. Ao senhor, o meu muito obrigado.
À minha Co-orientadora Dra. Kátia da Silva Calabrese por todo apoio, amizade, incentivo e
confiança desde o início do doutorado.
Ao Prof. Washington Luiz Tafuri, pelo exemplo de vida.
À Fernando Andrande e Hélio Martins e famíliares, meus amigos-irmãos. Juntos enfrentamos as
batalhas da vida, desde a Graduação e agora na Pós-Graduação. Sem eles, com certeza, não seria
nada fácil. Obrigado pelo apoio e amizade.
À Maria Letícia, Sandra Moura, Maria Noviello, Marta Figueiredo, Vanessa, Luana
Dourado, Cláudia Brant, Silvia Cangussu, Isabel, Carolina, Letícia, Mirna, amigos da Pós-
Graduação e do laboratório que tornam o dia-a-dia de trabalho mais alegre. Jamais esquecerei
vocês.
Ao Departamento de Pós-Graduação em Patologia, da Faculdade de Medicina.
Às funcionárias do Departamento de Patologia/ICB, sempre prontas a nos ajudar: Regina,
Vânia, Olinda e Jaqueline, obrigado pela amizade.
Aos amigos da Fiocruz-RJ: Dr. Sylvio Celso Gonçalves da Costa, Celeste Souza, Luiz Otávio,
Flávia.
Aos amigos Talmir Quinzeiro, Lilian Jordão, Frankmar Fonseca, Emizael Ângelo, Priscilla
Sherloski, Patrícia Santana, Fabrício Otoni.
Aos professores da Pós-Graduação em Patologia Geral/ICB do Departamento de Anatomia
Patológica e Medicina legal da Faculdade de Medicina/UFMG. Em especial à professora Dra.
Ana Margarida Nogueira “in memoriam”, uma mulher brilhante, de fibra que transpirava a
dignidade de seu trabalho.
Às professoras Dra. Denise Carmona Cara Machado e Dra. Rosa Arantes, pelo convívio,
amizade e ensinamentos constantes.
Ao CNPq e FAPEMIG pela bolsa concedida.
À Universidade Estadual do Maranhão – UEMA
Aos amigos da Universidade Estadual do Maranhão pelo apoio e amizade: Professora Dra. Ana
Lúcia Abreu Silva, Professor MSc.José Gomes Pereira, Professor MSc. Cláudio Luís Nina
Gomes, Professora Dra. Maria Inez Silva, Professor Dr. Hamilton Santos, Professor Dr. Fábio
Henrique Andrade, Professora Dra. Alcina Carvalho Neta, Professora MSc. Maria do Socorro,
Professor MSc. Haílton Rogeris, Professor MSc. Francisco Carneiro, Iracema Gomes.
Ao professor Dr. Geovanni Dantas Cassali, pela amizade e dedicação à arte de ensinar.
Ao professor Marcelo Vidigal Caliari pela amizade e pela contribuição na construção das macros
para as análises das imagens.
Aos professores Dr. Anilton César Vasconcelos e Dr. Gregory Thomas Kitten, relatores da minha
qualificação, pelos ensinamentos e conselhos dados para o aprimoramntos desta pesquisa.
Ao professor Dr. Hélio Chiarini-Garcia pelo auxílio na confecção das pranchas e pela
aprendizagem.
À Everton Carvalho “in memorian”.
Ao meu grande amigo Weverton Sampaio “in memoriam” que partiu deixando uma imensa
saudade.
A todos que contribuíram direta ou indiretamente para realização deste trabalho.
Obrigado!
Ferdinan Almeida Melo
ÍNDICE
1. INTRODUÇÃO..................................................................................................
01
1.1. Leishmanioses............................................................................................ 01
1.2. Leishmaniose Visceral Humana (LVH)........................................................ 03
1.3. Leishmaniose Visceral Canina (LVC) ......................................................... 04
1.3.1. Aspectos clínicos e patológicos da LVC................................................ 06
1.4. Interação Leishmania hospedeiro vertebrado............................................. 08
1.5. Alterações da Matriz Extracelular (MEC) ................................................... 10
1.5.1. Sistema Colágeno................................................................................. 14
1.5.2. Fibronectina (FN) .................................................................................. 16
1.5.3. Laminina (LN) ....................................................................................... 18
2. OBJETIVOS.......................................................................................................
20
2.1. Objetivos Gerais.......................................................................................... 20
2.2. Objetivos Específicos.................................................................................. 20
3. MATERIAL E MÉTODOS..................................................................................
21
3.1. Aprovação do Comitê de Ética em Experimentação Animal....................... 21
3.2. Animais........................................................................................................ 21
3.2.1. Critérios de inclusão no estudo............................................................. 21
3.3. Grupos Experimentais................................................................................. 21
3.4. Coleta e processamento histológico do material......................................... 22
3.4.1. Punção de medula óssea...................................................................... 22
3.4.2. Eutanásia dos animais.......................................................................... 22
3.4.3. Coleta de fragmentos dos órgãos......................................................... 23
3.4.4. Avaliação histopatológica dos órgãos................................................... 23
3.4.5. Técnica da hematoxilina-Eosina (H&E) ................................................ 24
3.4.6. Avaliação da densidade de parasitos nos órgãos................................. 24
3.4.7.Técnica da estreptoavidina-peroxidase para detecção de formas
amastigotas de Leishmania...................................................................
24
3.4.8. Caracterização imuno-histoquímica da laminina (LN) e do infiltrado
inflamatório nos órgãos pela técnica da estreptoavidina-peroxidase....
25
3.4.9. Caracterização imuno-histoquímica da Fibronectina (FN).................... 26
3.5. Estudo do colágeno..................................................................................... 28
3.6. Análise morfométrica das fibras colágenas, laminina, fibronectina e da
expressão das CR3 positivas.......................................................................
29
3.7. Análise estatística.................................................................................... 31
4. RESULTADOS..................................................................................................
32
4.1. Avaliação clínica dos animais..................................................................... 32
4.2. Fígado........................................................................................................
33
4.2.1. Macroscopia.......................................................................................... 33
4.2.2. Microscopia .......................................................................................... 35
4.2.3. Avaliação dos parâmetros bioquímicos hepáticos ............................... 37
4.2.4. Avaliação das fibras reticulares hepáticas pela prata amoniacal de
Gomori...................................................................................................
39
4.2.5. Correlação entre o parasitismo hepático e a deposição de colágeno 41
4.2.6. Avaliação da laminina (LN) hepática..................................................... 42
4.2.7. Correlação entre a expressão da laminina e o parasitismo hepático.... 44
4.2.8. Avaliação da fibronectina (FN) hepática................................................ 45
4.3. Baço............................................................................................................
47
4.3.1. Macroscopia............................................................................................. 47
4.3.2. Microscopia.............................................................................................. 48
4.3.3. Avaliação das fibras colágenas esplênicas pela Prata amoniacal de
Gomori......................................................................................................
52
4.3.3.1. Espessura da cápsula esplênica........................................................
52
4.3.3.2. Correlação entre o parasitismo esplênico e a espessura da cápsula
do baço...............................................................................................
53
4.3.3.3. Deposição de colágeno no parênquima esplênico............................. 54
4.3.3.4. Correlação entre o parasitismo esplênico e a deposição de
colágeno no parênquima esplênico....................................................
56
4.3.4. Avaliação da laminina (LN) esplênica....................................................... 57
4.3.4.1. Correlação entre a expressão da laminina e o parasitismo
esplênico.........................................................................................
59
4.3.5. Avaliação da Fibronectina (FN) esplênica................................................ 60
4.4. Linfonodo Cervical....................................................................................
62
4.4.1.Macroscopia........................................................................................... 62
4.4.2. Microscopia........................................................................................... 63
4.4.3. Avaliação das fibras colágenas dos linfonodos cervicais pela Prata
Amoniacal de Gomori............................................................................
67
4.4.3.1. Correlação entre o parasitismo do linfonodo cervical e a
deposição de colágeno................................................................
69
4.4.4. Expressão da Laminina (LN) no linfonodo cervical.............................. 71
4.4.4.1. Correlação a expressão da laminina (LN) e parasitismo no
linfonodo cervical................................................................................
73
4.4.5. Avaliação da Fibronectina (FN) nos linfonodos cervicais...................... 74
4.4.6. Caracterização do infiltrado inflamatório nos órgãos ........................... 76
5. DISCUSSÃO.................................................................................................
78
6. CONCLUSÕES.............................................................................................
88
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................
89
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C
C
O
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S
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Gráfico 1. Valores percentuais do número de animais naturalmente infectados com
Leishmania chagasi (assintomáticos e sintomáticos) que apresentaram sinais
clínicos durante a avaliação,,,,,,,,,,,....................................................................
32
Gráfico 2. Alterações histopatológicas observadas no fígado de cães naturalmente
infectados por L. chagasi, grupos assintomáticos e sintomáticos. Critérios
adotados.............................................................................................................
37
Gráfico 3. Número de amastigotas marcadas pela imuno-histoquímica no fígado dos
cães dos grupos assintomáticos e sintomáticos (* p<0,05 Teste T não
pareado)..............................................................................................................
38
Gráfico 4. Deposição de colágeno no fígado de cães nos diferentes grupos estudados.
Prata Amoniacal de Gomori , (ANOVA * p<0,0001)……...................................
41
Gráfico 5. Correlação entre o parasitismo hepático e a deposição de colágeno no fígado
de cães naturalmente infectados com L. chagasi. Pearson (r=0,7124,
p<0,0001)...........................................................................................................
41
Gráfico 6. Análise morfométrica da expressão de laminina hepática pela técnica imuno-
histoquímica cães nos diferentes grupos estudados.........................................
44
Gráfico 7. Correlação entre a carga parasitária hepática e a expressão da laminina no
parênquima hepático. (Pearson, r=,04838, p= 0,0068).....................................
44
Gráfico 8. Análise morfométrica da fibronectina no fígado................................................. 47
Gráfico 9. Alterações histopatológicas observadas no baço de cães naturalmente
infectados, sintomáticos e assintomáticos..........................................................
51
Gráfico 10. Número de amastigotas marcadas pela imuno-histoquímica no baço dos cães
sintomáticos e assintomáticos, (*p = 0,0014 Teste T não pareado)...................
51
Gráfico 11. Espessura da cápsula esplênica nos grupos estudados. Prata Amoniacal de
Gomori,(*** p<0.001; * P<0.05, Teste T de Tukey)........................................
53
Gráfico 12. Correlação entre o parasitismo esplênico de cães naturalmente infectados
com L. (L.) chagasi (avaliado por imuno-histoquímica) e a espessura da
cápsula do baço (Prata Amoniacal de Gomori).................................................
53
Gráfico 13. Deposição de colágeno no parênquima esplênico dos grupos de cães
estudados..........................................................................................................
56
Gráfico 14.
Correlação entre o parasitismo esplênico de cães naturalmente infectados
com L. (L.) chagasi (avaliado por imuno-histoquímica) e a deposição de
colágeno na cápsula do baço (Prata Amoniacal de Gomori)............................
56
Gráfico 15. Análise morfométrica da expressão de laminina esplênica pela técnica imuno-
histoquímica em cães nos diferentes grupos estudados....................................
59
Gráfico 16. Correlação entre a carga parasitária esplênica e a expressão da laminina no
parênquima esplênico. Pearson, r=0,6159, p= 0,0003......................................
59
Gráfico 17 – Análise morfométrica da expressão de fibronectina esplênica nos diferentes
grupos estudados..............................................................................................
62
Gráfico 18. Alterações histopatológicas observadas no linfonodo cervical de cães
naturalmente infectados por L. chagasi nos grupos sintomáticos e
assintomáticos....................................................................................................
66
Gráfico 19. Número de amastigotas marcadas pela imuno-histoquímica nos linfonodos
cervicais nos grupo de cães sintomáticos e assintomáticos não significativos,
(p = 0,1767, Teste T não pareado).....................................................................
67
Gráfico 20. Deposição de colágeno no parênquima de linfonodo cervical (região cortical e
paracortical) nos diferentes grupos de cães estudados. Prata Amoniacal de
Gomori, (*p=0,0265).........................................................................................
69
Gráfico 21. Correlação entre o parasitismo dos linfonodos cervicais de cães naturalmente
infectados com L. (L.) chagasi (avaliado por imuno-histoquímica); A -
Deposição de colágeno na região cortical. B - deposição de colágeno no
parênquima dos linfonodos cervicais (Prata Amoniacal de
Gomori)..............................................................................................................
70
Gráfico 22. Análise morfométrica da expressão de laminina nos linfonodos cervicais de
cães pela técnica imuno-histoquímica nos diferentes grupos
estudados..........................................................................................................
73
Gráfico 23. Correlação entre o parasitismo dos linfonodos cervicais de cães naturalmente
infectados com L. (L.) chagasi e a carga parasitária. Pearson (r=0,4612,
p=0,0103).........................................................................................
73
Gráfico 21. Análise morfométrica da expressão de fibronectina nos linfonodos cervicais
nos diferentes grupos estudados.......................................................................
76
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B
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A
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Tabela 1. Peso relativo (peso do fígado/peso corporal) dos fígados dos animais dos
grupos assintomáticos, sintomáticos naturalmente infectados com L.
chagasi e grupo controle...............................................................................
33
Tabela 2. Avaliação dos parâmetros bioquímicos e enzimáticos em cães
naturalmente infectados com L. chagasi e animais não infectados...............
38
Tabela 3. Peso relativo (peso do baço/peso corporal) dos baços dos animais dos
grupos assintomáticos, sintomáticos naturalmente infectados com
L.chagasi e do grupo controle......................................................................
48
Tabela 4. Peso relativo (peso do linfonodo cervical/peso corporal) dos linfonodos
cervicais dos cães dos grupos assintomáticos, sintomáticos naturalmente
infectados com L.chagasi e do grupo controle...............................................
63
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Figura 1 – Imagens para os comandos mostradas pelo software KS300 para determinação da
deposição de colágeno no parênquima hepático. (A) Digitalização da imagem; (B)
Seleção dos pixels das fibras colágenas; (C) Obtenção da imagem binária para
posterior obtenção da área correspondente ao colágeno; (D) Imagem da área
correspondente ao colágeno..........................................................................................
30
Figura 2: Fígado de cão sintomático naturalmente infectado com Leishmania (Leishmania)
chagasi (órgão fixado em formol 10%) Observar superfície irregular caracterizada
por lesões de coloração escura após fixação, mas que anteriormente eram
brancacentas a fresco (setas brancas). Essas lesões são distribuídas difusamente
em todos os lobos, de tamanhos e formas variados, e por vezes promovendo áreas
de depressões na superfície. .........................................................................................
34
Figura 3A-F: Cortes histológicos parafinados de fígado de cães naturalmente infectados com L.
(L) chagasi. A e B – Cão assintomático. (A)- Espaço portal com infiltrado celular de
plasmócitos (setas), linfócitos e macrófagos. Notar hepatócitos em degeneração
hidrópica (cabeça de seta). Congestão sinusoidal pode ser observada (CS). , e em
(B) Observar formas amastigotas de Leishmania nos macrófagos (seta larga) e
hepatócitos vacuolizados (células baloniformes) (cabeças de seta). (C) Cão
sintomático. Granuloma intralobular contendo macrófagos (células epitelióides)
(setas largas), plasmócitos e linfócitos (seta pequena). Hepatócitos com
degeneração hidrópica (cabeça de seta). (D,E)- Cão assintomático. (D) Presença de
granuloma intralobular contendo células epitelióides com núcleos alongados ou ovais
(seta larga), linfócitos (seta pequena) e plasmócitos (cabeça de seta), e em (E)
mesmo campo mostrando amastigotas no interior dos macrófagos dos granulomas
(setas). (F)- Cão sintomático: Notar no campo, células de Kupffer intensamente
parasitadas (setas largas). DB- ducto biliar; LV-vaso linfático; VP- veia porta; S-
sinusóide; ES-esteatose; C: congestão. A,C,D-H&E; B,E,F- Estreptoavidina-
peroxidase. Todas as barras =16µm..............................................................................
36
Figura 4A-F: Cortes histológicos parafinados de fígado de cães controle e cães naturalmente
infectados com Leishmania (Leishmania) chagasi. (A) Cão controle. Observar
delicada trama de fibras colágenas (reticulares) intralobulares delineando os
sinusóides (setas). (B) Cão sintomático. Observar fibras colágenas intralobulares
com espessamento marcante (setas). (C,D) Cão assintomático. (C) Notar fibras
reticulares espessadas partindo do espaço porta em direção ao lóbulo evidenciando
os sinusóides. (D) Detalhe da figura anterior mostrando fibras reticulares espessadas
ressaltando os sinusóides. (E) Cão assintomático: Granuloma intralobular (seta)
mostrando raras fibras colágenas no seu interior (cabeças de seta). (F) Cão
sintomático: Observar um notável espessamento das fibras colágenas e por vezes
com enclausuramento de uma única célula (hepatócito) (setas brancas).
Hematoxilina-Eosina. (VP) Veia Porta; (DB) Ducto Biliar; (S) Sinusóides. Prata
Amoniacal de Gomori. Barras (A,B,D,E e F) = 16µm e em (C) = 32µm. .......................
40
Figura 5A-F – Cortes congelados de fígado de cães controle e naturalmente infectados com
Leishmania chagasi. (A,B) Cão Controle: Expressão da laminina em células de
estruturas da região portal (setas). (C,D): Cão Assintomático: (C) Presença de
laminina nas estruturas vasculares e em (D) granuloma com poucas células
positivas para laminina (setas). (E,F): Cão Sintomático: Presença de marcação nos
sinusóides (setas) de forma difusa. No canto direito inferior observar um granuloma
sem marcação com amastigotas (seta), e em (F) Notar forte marcação da laminina
nos sinusóides. Estrepto-avidina-peroxidase. Todas as Barras = 50 µm......................
43
Figura 6A-C: Cortes histológicos congelados de fígado de cães controle e de cães naturalmente
infectados com Leishmania (Leishmania) chagasi: (A) Cão Controle:Presença
discreta de fibronectina no lóbulo hepático; (B) Cão assintomático: Marcação positiva
para fibronectina no lóbulo hepático. Observar no centro da figura forte marcação ao
redor de um ramo de um grande vaso portal; (C) Cão Sintomático: Marcação
exuberante e difusa no lóbulo hepático. Imunofluorescência para detecção de
fibronectina Todas as Barras 50=µm.........................................................................
46
2
Figura 7 – Cortes Histológicos de baço de cães naturalmente infectados com Leishmania
(Leishmania) chagasi: (A,B,C) Cão Assintomático: (A) observar cápsula espessada
(cabeças de seta), polpa vermelha congesta (setas) e polpa branca reativa,
apresentado folículo linfóide evidente. (B,C) detalhes da figura anterior, sendo em (B)
região da polpa vermelha contendo macrófagos hipertróficos e vacuolizados, sendo
alguns deles repletos de formas amastigotas de Leishmania (setas). Em (C): detalhe
das células do folículo linfóide (polpa branca reativa). (D) Cão Sintomático: folículo
linfóide sem formação de centro germinativo e com diminuição numérica de
linfócitos, sendo esses substituídos por macrófagos intensamente parasitados por
formas amastigotas de Leishmania (setas). (E,F) Cão Assintomático: Notar a
presença de formas amastigotas imunomarcadas na polpa vermelha (setas); e em
(F) observar parasitismo na intimidade da trabécula esplênica (cabeças de seta) e
nos macrófagos localizados no interior da mesma (seta). Presença de (A-D)
Hematoxilina-Eosina; (E-F) Estreptoavidina-Peroxidase. Barras (A) Barra = 32µm ;
(B,C,D,E,F) (Barra = 16µm). FL (Folículo Linfóide); PB (Polpa Branca); PV (Polpa
Vermelha); AC (Arteríola Central); TE (Trabécula Esplênica). .....................................
50
Figura 8 – Cortes histológicos parafinados de baço de cães controle e naturalmente infectados
com Leishmania (Leishmania) chagasi:: (A) Cão controle: Observar a espessura de
cápsula de acordo com a seta dupla; (B) Cão Sintomático: Notar um evidente
espessamento da cápsula (seta dupla), sendo essa formada por fibras colágenas
(reticulares) espessadas e dispostas em várias direções (seta larga). Prata
Amoniacal de Gomori. (A) Barra= 64µm; (B) Barra = 16µm. .........................................
52
Figura 9A-D: Cortes histológicos parafinados de baço de cães controle (A) e cães naturalmente
infectados com Leishmania (Leishmania) chagasi (B,C,D): (A): Cão Controle. Notar
delicada rede de fibras reticulares (setas). (B):Cão assintomático: Fibras colágenas
mais proeminentes podem ser observadas (setas); (C,D) Cão sintomático: Fibras
reticulares espessadas e mais evidentes podem ser observadas (setas). Prata
Amoniacal de Gomori. Todas as Barrras = 16µm. ........................................................
55
Figura 10A-D – Cortes congelados de baço de cães controle e naturalmente infectados com
Leishmania chagasi. (A) Cão Controle: Expressão da laminina em células da polpa
vermelha (setas). (B): Cão Assintomático: Presença de laminina em estruturas
vasculares na polpa vermelha; (C,D) Cão Sintomático: Presença de forte marcação
em células da polpa vermelha em relação ao controle (A) (setas). Estrepto-avidina-
peroxidase para marcação da laminina. (AC) Arteríola Central Todas as Barras = 50 µm.....
58
Figura 11A-C: Cortes congelados de baço de cão controle (A) e de cães naturalmente
infectados com Leishmania (Leishmania) chagasi (B,C): (A) Cão Controle:Presença
discreta de fibronectina no parênquima do baço (polpa vermelha) ; (B) Cão
Assintomático: Observar forte marcação positiva para fibronectina no parênquima
esplênico no centro inferior da figura.; (C) Cão Sintomático: Marcação exuberante e
difusa no parênquima esplênico. Imunofluorescência para detecção de fibronectina
Todas as Barras 50=µm.................................................................................................
61
3
Figura 12A-F Cortes histológicos parafinados de linfonodos cervicais de cães naturalmente
infectados com Leishmania (Leishmania) chagasi: (A,B) Cão Assintomático: (A)
Observar cápsula espessada (setas), seios subcapsulares com células inflamatórias
(cabeças de setas) e região da cortical exibindo folículos linfóides; e em. (B)
Presença de inúmeras formas amastigotas na espessura da cápsula (setas);
(C,D,E,F) Cão Sintomático: (C) Visão panorâmica da região da medular exibindo
hipertrofia e hiperplasia das células dos cordões e dos seios. Em (D) detalhe da
figura anterior mostrando predominância de plasmócitos (setas grandes),
macrófagos (cabeças de seta) e linfócitos (setas pequenas). Em (E) observar
macrófagos hipertróficos com núcleos vesiculosos e citoplasma abundante; e em (F)
Macrófagos parasitados nos cordões (setas grandes) e seios (setas pequenas).
(A,C) Hematoxilina-Eosina. Barras = 32µm ; (B,F) Estreptoavidina-imunoperoxidase.
Barra = 16µm; (D,E) Barra = 16µm. C (Cápsula); SS (Seios Subcapsulares); FL
(Folículo Linfóide); CM (Cordões Medulares); SM (Seios Medulares); VS (Vasos
Sanguíneos)....................................................................................................................
65
Figura 13A-D: Cortes histológicos parafinados de linfonodo cervical de cães controle (A) e cães
naturalmente infectados com Leishmania (Leishmania) chagasi (B,C,D): (A): Cão
Controle. Notar delicada rede de fibras reticulares (setas) na região da cortical.
(B,C,D):Cão sintomático: (B) Fibras colágenas mais proeminentes podem ser
observadas (setas) na região da cortical; Em (C) Cápsula com fibras reticulares
espessadas e bem evidentes podem ser observadas (seta), e em (D) fibras
reticulares evidenciadas nos seios (cabeças de setas) e cordões (setas) medulares.
Prata Amoniacal de Gomori. Todas as Barrras = 16µm. ...............................................
68
Figura 14A-D: – Cortes congelados de linfonodo cervical de cães naturalmente infectados com
Leishmania (Leishmania) chagasi. (A,B) Cão Assintomático: Imunomarcação da
laminina em células da região subcapsular (setas) e em células da parede dos vasos
(cabeças de seta). (C,D): Cão Sintomático: (C) Observar inúmeras células marcadas
na região da subcapsular e cortical (seta), (D) Detalhe da figura anterior
evidenciando a forte expressão de laminina (setas) Estrepto-avidina-peroxidase.
(FL) Folículo Linfóide; (VS) Vasos Sanguíneos; (CC) Camada Cortical; (CM) Camada
Medular Barras = 50 µm ................................................................................................
72
Figura 15 – Imunofluorescência para detecção de FN no Linfonodo cervical. A - Cão controle. B
- Fibronectina no linfonodo cervical de cão assintomático. C - Fibronectina em
linfonodo de cão sintomático. ........................................................................................
75
Figura 16 – Cortes histológicos congelados de fígado, baço e linfonodo de cães naturalmente
infectados com Leishmania (Leishmania) chagasi. (A) Expressão celular de CR3
(CD11b) no nas células sinusoidas (macrófagos); (B) Expressão celular de CR3
(CD11b) na polpa vermelha (macrófagos); (C) Expressão celular de CR3 (CD11b)
nos cordões e seios medulares (macrófagos). Estrepto-avidina-peroxidase. Todas as
Barras = 16µm.................................................................................................................
77
4
LISTA DE ABREVIATURAS
CR – Receptor do complemento
CETEA – Comitê de Ética em Experimentação Animal
CCZ – Centro de Controle de Zoonoses
HSC – Célula estelada hepática
ELISA - Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
Gp63 – Glicoproteína 63
IgG – Imunoglobulina G
LDU – Leishman Donovan Units
MEC/ECM – Matriz Extracelular
FN – Fibronectina
LN - Laminina
LPG – Lipofosfoglinano
GAG - Glicosaminoglicana
LV – Leishmaniose Visceral
LVC – Leishmaniose Visceral Canina
LVH – Leishmaniose Visceral Humana
SMM – Sistema Monocítico Mononuclear
TGO – Aminotransferase Alcalina
TGO – Aminotransferase de aspartato
ALP – Fosfatase Alcalina
TGF – Fator de Crescimento Transformante
MMP – Metaloproteinase de Matriz
TIMP – Inibidor Tecidual de Metaloproteinase
PDGF – Fator de Crescimento derivado de Plaquetas
WHO - World Health Organization
5
REGRAS GERAIS PARA DEFESA DE TESE
6
RESUMO
Este trabalho teve como objetivo estudar as alterações da matriz extracelular
em fígado, baço e linfonodos cervicais em cães naturalmente infectados com
Leishmania (Leishmania) chagasi correlacionando estes achados com os
aspectos clínicos, histopatológicos, parasitológicos e imunológicos. Para este
estudo foram utilizados 30 cães, divididos em três grupos: dez animais não
infectados (grupo controle) e vinte animais infectados. Todos sem raça e idade
definidas, provenientes da região do Município de Sabará/MG e de Belo
Horizonte/MG. Os animais infectados foram divididos em dois grupos: grupo
denominado assintomático composto por dez animais que não apresentavam
sinais clínicos da doença; grupo denominado sintomático: composto por 10
animais que apresentavam sinais clínicos clássicos da doença como lesões de
pele (alopecia, eczemas, seborréia, ulcerações), perda de peso e
linfadenopatias. Foram coletados em necropsia, fragmentos de baço, fígado,
linfonodos cervicais, fixados em solução de formol a 10% tamponado e em
seguida processados pelas técnicas rotineiras de histopatologia. Cortes
parafinados dos diversos tecidos foram corados pela Hematoxilina e Eosina
(H&E); Prata amoniacal de Gomori, para marcação das fibras reticulares e pela
técnica imuno-histoquímica da estreptoavidina-peroxidase para detecção de
formas amastigotas de Leishmania. Os cortes dos mesmos tecidos foram
criopreservados e corados pela técnica imuno-histoquímica estrepto-avidina-
peroxidase para marcação de laminina (LN) e imuno-histoquímica de
imunofluorescência a qual foi utilizada para marcação da fibronectina (FN)
tecidual. As análises morfométricas foram feitas utilizando o programa KS300 e
o pelo sistema de análise de imagens Kontron Elektronic/Carl Zeiss, Germany.
Os resultados mostram que há um aumento significativo da deposição de fibras
colágenas no fígado, baço e linfonodos cervicais dos animais infectados
quando comparadas aos animais controles, revelando diferenças significativas
entre os animais sintomáticos e assintomáticos. Foram encontradas
correlações positivas entre a presença do parasitismo tecidual e a deposição
de colágeno no fígado, baço e na região medular dos linfonodos cervicais dos
animais infectados. De fato, animais sintomáticos apresentaram uma maior
deposição de colágeno nestes órgãos que pode estar associado ao maior
parasitismo tecidual encontrado. A expressão das fibras adesivas laminina (LN)
e fibronectina (FN) no fígado, baço e linfonodos cervicais foi também mais
elevada nos animais infectados, principalmente, no grupo de animais
sintomáticos. Não houve diferença estatística significativa quando comparamos
a expressão de LN no baço e linfonodos cervicais entre os grupos de animais
sintomáticos e assintomáticos, mas a expressão de FN foi significante estes
grupos. Nossos resultados demonstram que na leishmaniose visceral canina há
uma fibrogênese no fígado, baço e linfonodos, associada ao parasitismo
tecidual e a processos degenerativos.
7
ABSTRACT
The aim of this work was study the extracellular matrix alterations in liver,
spleen and cervical lymph nodes in dogs naturally infected with Leishmania
(Leishmania) chagasi correlating with clinical aspects, histological,
parasitological and immunological. This study was carried out with 30 dogs,
divided at three groups: ten not infected animals (group control) and twenty
infected animals. All them was mongrel dogs with undefined age, obtained from
the municipality of Belo Horizonte, MG, metropolitan area. Infected animals
were divided in two groups: asymptomatic group composed by ten animals
without clinical signs of the disease; group denominated symptomatic:
composed by ten animals with classical clinical signals of the disease as skin
lesions (alopecia, eczemas and ulcers), loss weight and lymphopathy. During
necropsy, spleen, liver and cervical lymph nodes fragments were collected and
fixed in buffer formaldehyde solution to 10% for histological analyses.
Paraffined sections of the tissues were stained by Hematoxylin-Eosin (HE);
Gomori's Ammoniacal Silver staining for reticular fibers and strepto-avidin
peroxidase Immunohistochemical method for tissue Leishmania amastigotes
detection. Frozen tissue sections of organs were stained by strepto-avidin
peroxidase Immunohistochemical method for laminin (LN) tissue
characterization and immunofluorescence technique for fibronectina (FN). The
tissue images were transferred to a computer video screen by means of the
software KS300 and relayed to a computer-assisted image analysis system
(Kontron Elektronic/Carl Zeiss, Germany) for morphometrical analysis.
Significant increase collagens deposition in liver, spleen and cervical lymph
nodes of infected dogs when compared to controls animals. There was
significant difference between symptomatic and asymptomatic dogs collagen
deposition in organs. Positive correlation between the parasite load and
collagen deposition in liver, spleen and cervical lymph nodes of infected
animals. In fact, symptomatic animals showed increase collagen deposition in
these organs, it’s can be associate to parasite burden. Adhesive fibers LN and
FN expression in liver, spleen and cervical lymph nodes was higher in
symptomatic animals than in asymptomatic. No significant statistical difference
when we compare LN expression in the spleen and cervical lymph nodes
between symptomatic and asymptomatic groups. While in all organs studied of
infected animals FN expression demonstrated significant differences in these
groups. Our results demonstrate that in canine visceral leishmaniasis induces
fibrogenesis in liver, spleen and lymph nodes attached the parasite load and
degenerative processes.
8
1
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1.1 - Leishmanioses
As leishmanioses são doenças infecto-parasitárias causadas por
protozoários pertencentes à ordem Kinetoplastida, à família Trypanosomatidae
e ao gênero Leishmania (ROSS, 1903; SUNDAR & RAI, 2002). Esses parasitos
possuem ciclo de vida digenético (heteroxênico), vivendo alternadamente em
hospedeiros vertebrados, na forma amastigota e em insetos vetores - dípteros
da subfamília Phlebotominae, pertencentes aos gêneros Lutzomyia – no Novo
Mundo e Phlebotomus – no Velho Mundo, na forma promastigota (LAINSON et
al., 1987; KILLICK-KENDRICK, 1990).
Agrupam-se no gênero cerca de 30 espécies, sendo aceito que,
aproximadamente 21 tenham a capacidade produzir alterações patológicas na
espécie humana (Herwaldt, 1999; Ashford, 2000). As leishmanioses incluem
várias doenças que são determinadas pela espécie do parasito e das
interações entre esses parasitos e seus hospedeiros. De fato, no homem a
doença manifesta-se em formas clássicas descritas como a leishmaniose
cutânea, cutâneo-mucosa, cutânea disseminada, cutânea difusa, a dérmica
pós-calazar e a leishmaniose visceral (ASHFORD, 2000).
O ciclo biológico do parasito inicia-se no momento em que fêmeas do
inseto vetor, ao fazerem o repasto sangüíneo em um hospedeiro vertebrado
infectado, ingerem macrófagos-monócitos contendo amastigotas. Essas
amastigotas, na luz do trato digestivo, diferenciam-se em formas flageladas
denominadas promastigotas procíclicas. As formas promastigotas multiplicam-
se por divisão binária no trato digestivo do inseto e possuem uma camada de
moléculas de lipofosfoglicanos (LPG) em sua superfície, consistindo de um
núcleo glicana, uma âncora lipídica altamente conservada e unidades variáveis
de oligossacárides. Interações envolvendo LPG com lectinas e moléculas tipo
lectinas presentes no intestino do inseto, impedem que as formas
promastigotas procíclicas sejam eliminadas juntamente com o bolo alimentar.
Durante a metaciclogênese, essas formas sofrem uma extensa modificação
estrutural, envolvendo o tamanho e a expressão de açúcares de LPG,
1
transformando-se em promastigotas metacíclicas. A expressão de grande
quantidade de LPG, bem como de outros glicoconjugados, como a
metaloprotease - gp63, na superfície do parasito é capaz de protegê-lo da ação
das enzimas hidrolíticas presentes no intestino do flebotomíneo (KILLICK-
KENDRICK, 1990; ALEXANDER et al., 1999). As promastigotas metacíclicas
apresentam reduzida afinidade de ligação às lectinas, levando ao seu
desligamento do epitélio intestinal e migração para a probóscida do inseto.
Durante o próximo repasto sangüíneo, a forma infectiva é passada para o
hospedeiro vertebrado, sendo então internalizada pelos macrófagos, processo
este, mediado por receptores (CUNNINGHAM, 2002; De ALMEIDA, 2003). As
promastigotas são incorporadas em fagolisossomas, onde se diferenciam em
formas amastigotas. Dentro das células do sistema monocítico-mononuclear
(SMM) as amastigotas multiplicam-se por divisão binária. O processo
ininterrupto de divisão rompe, eventualmente, o macrófago infectado liberando
as amastigotas, que são capazes de infectar novas células. O flebotomíneo, ao
fazer novo repasto sangüíneo, ingere os macrófagos infectados, perpetuando,
assim, o ciclo.
A Organização Mundial de Saúde estima que a incidência anual da
doença seja em torno de 12 milhões de casos em todo o mundo e que 350
milhões de pessoas apresentam o risco de adquirir uma das formas da doença.
Por esta razão, as leishmanioses encontram-se entre as seis doenças
infecciosas tropicais de grande importância na Saúde Pública (DESJEUX,
2004).
Em humanos, a infecção causada por Leishmania resulta em doença de
amplo espectro dependendo da espécie envolvida e da eficiência da resposta
imune do hospedeiro contra o parasito (TURK & BRYCESON, 1971). Dentre
as formas clínicas de apresentação reconhecidas, a Leishmaniose Visceral
(LV) é a mais grave, progressiva e quase sempre fatal quando não tratada
(BRYCESON, 1996).
2
1.2 - Leishmaniose Visceral Humana (LVH)
A leishmaniose visceral ocorre em vastas áreas tropicais e subtropicais
do globo, distribuída em todos os continentes, a exceção da Oceania e
Antártica, onde apresenta aspectos epidemiológicos variados (WHO, 2007). A
leishmaniose visceral humana (LVH) também conhecida como calazar pode ser
causada por três espécies do parasito. A espécie L. (Leishmania) donovani
(LAVERAN & MESNIL, 1903) é responsável pela doença na Índia, Paquistão,
China Oriental, Bangladesh, Nepal, Sudão e Kênia. Nestas regiões o homem
atua como reservatório do parasito tendo a doença um perfil antroponótico
(TAVARES et al., 2003). Já a espécie L. (L.) infantum (NICOLLE, 1908), agente
etiológico da leishmaniose visceral na Ásia Central e sudoeste, nordeste da
China, norte da África e Europa Mediterrânea tem caráter zoonótico. No Novo
Mundo a espécie L. (L) chagasi (CUNHA E CHAGAS, 1937) é o agente da
leishmaniose visceral que apresenta, também, caráter zoonótico. Estudos
utilizando técnicas bioquímicas e moleculares consideram a L. chagasi e L.
infantum como sendo uma única espécie (MAURÍCIO et al., 2000). Shaw
(2006) sugere o uso do nome Leishmania (Leishmania) infantum chagasi para
o agente etiológico da leishmaniose visceral americana. Como não existe ainda
um consenso a respeito desse assunto, neste trabalho optou-se pela
denominação L. chagasi ao parasito em questão, por se tratar de estudo
realizado no Brasil.
As estimativas mundiais, em relação à leishmaniose visceral, indicam
que cerca de 200 milhões de pessoas encontram-se sob risco de adquirir a
infecção e que 500 mil pessoas se infectam a cada ano. No ano de 2000 foram
estimadas, na população mundial, 41 mil mortes causadas pela doença
(GUERIN, et al., 2002). Aproximadamente 90% dos casos mundiais de LVH
estão notificados em Bangladesh, Brasil, Índia, Nepal e Sudão (GUERIN, et al.,
2002; WHO, 2004).
A emergência da leishmaniose visceral, como um crescente problema de
Saúde Pública, deve-se principalmente a fatores demográficos e ecológicos.
Na América Latina a leishmaniose visceral está presente em locais onde
anteriormente não ocorria. Na América do Sul, especialmente no Brasil,
Colômbia e Venezuela, a migração e urbanização contribuem fortemente para
3
o aumento da doença. As precárias condições sanitárias e nutricionais da
população migrante, a presença de animais domésticos, atuando como
reservatórios do parasito e fonte alimentar para os flebotomíneos, no domicílio
e peridomicílio, além da capacidade de adaptação do vetor ao ambiente urbano
são fatores fundamentais no estabelecimento e expansão da doença (WHO,
2004).
No Brasil, a incidência de LVH aumentou de 1977 casos em 1998 para
3624 casos em 1999 chegando a 4858 casos em 2000. (BRASIL - Ministério da
Saúde, 2006). Entretanto, após este período, observou-se uma diminuição na
incidência de LVH no país, com 3203 casos em 2005. A leishmaniose visceral
tem maior taxa de incidência nas regiões Nordeste e Norte, tendo crescido em
todas as regiões (com exceção da região Nordeste) no período de1990 a 2005,
o que sugere que a doença encontra-se em expansão. Em número de casos, a
região Nordeste concentrou na década de 1990 a 2000, quase 90% dos casos
do Brasil. Esta participação tem diminuído na década atual, chegando a 55%
de casos da doença, seguida pelas regiões Sudeste (21,5%) e Norte (15,9%),
em 2005. O aumento do número de casos nas demais regiões tem limitado a
queda das taxas nacionais. (BRASIL- Ministério da Saúde, 2006).
Em Belo Horizonte – Minas Gerais, o número de casos de leishmaniose
vem crescendo a cada ano (MARGONARI et al., 2006). Em 2006 foram
relatados 113 casos de LVH com 10 óbitos e 8000 casos de leishmaniose
visceral canina (Secretaria Municipal de Saúde - Belo Horizonte, 2007).
1.3 - Leishmaniose Visceral Canina (LVC)
Do ponto de vista epidemiológico, a leishmaniose visceral canina
(LVC) tem sido considerada mais importante do que a doença humana, visto
que tem a maior prevalência e muitos animais assintomáticos de áreas
endêmicas têm sido detectados com parasitos na pele (MARZOCHI et al.,
1985). Um estudo realizado em cães naturalmente infectados por L. chagasi
na Espanha, concluiu-se que animais assintomáticos foram igualmente
infectantes para os vetores (MOLINA, 1994).
4
Estudos pioneiros realizados por Chagas et al. (1937 e 1938), na região
Norte do Brasil, mostraram a existência de cães naturalmente parasitados nos
mesmos locais onde ocorria a infecção humana. Todavia, a leishmaniose
canina no Brasil só teve relevância quando foi estudada em uma área de
grande endemicidade: o nordeste brasileiro. No Ceará, Deane (1955), em
estudo comparativo entre a infecção humana e canina, encontrou Leishmania
na pele de 16,3% dos indivíduos e em 77,6% dos cães naturalmente
infectados. Além disso, verificou que a infecção experimental de flebotomíneos
era mais freqüente e intensa quando os insetos se alimentavam em cães (75%)
do que em pacientes humanos (28,5%). Estas observações, bem como as de
outros trabalhos que têm estudado a doença canina em áreas endêmicas de
LVH, mostram o cão como a principal fonte de infecção para os flebotomíneos
(MARGONARI et al., 2006). Isto se deve a alta prevalência da doença no
animal nessas regiões e pela presença do parasito na sua pele, o que favorece
a infecção do inseto vetor e, conseqüentemente, a transmissão ao homem
(BRENER, 1957; ALENCAR, 1959; DEANE & DEANE, 1962; IVERSSON et al.,
1983; MARZOCHI, et al., 1985).
Os cães são considerados os principais mantenedores e
disseminadores da L. chagasi no meio urbano. A LVC caracteriza-se por
apresentar um largo espectro de lesões que variam desde a infecção clínica
silenciosa até uma forma clinica manifesta, levando o animal à morte. Os
principais sinais clínicos da LVC são: (1) lesões cutâneas que compreendem a
seborréia, alopecia generalizada ou localizada preferencialmente ao redor da
órbita ocular denominada “máscara leishmaniótica”, ulcerações e a
onicogrifose; (2) linfadenopatia caracterizada pela hipertrofia dos linfonodos
tornando-os facilmente palpáveis clinicamente, como os cervicais e poplíteos;
(3) hepatoesplenomegalia; (4) perda de peso progressiva (caquexia); (5)
edema das patas; (6) lesões oculares como a opacidade córnea e a blefarite
(LONGSTAFFE & GUY, 1995; FERRER, 1992; CIARAMELLA et al., 1997;
LIMA et al., 2004; XAVIER et al., 2006).
A L. (L.) chagasi e/ou L. (L.) infantum são conhecidas como
causadoras da forma visceral em seres humano e em cães, todavia os cães
além de manifestarem a forma visceral podem desenvolver vários tipos
diferentes de lesões cutâneas, que variam desde alopecia até a formação de
5
úlceras semelhantes àquelas apresentadas pelo homem nos casos de
leishmaniose cutânea (FERRER et al., 1986). A presença de parasitos
(formas amastigotas), principalmente na derme superficial da pele (MOURA et
al., 2008) serve como fonte para o vetor, que se infecta ao picar o animal
doente e, posteriormente inocula a forma promastigota na epiderme ou derme
superficial do homem e cães sadios (PINELLI et al., 1994, DA COSTA-VAL et
al., 2007 MICHALSKY et al., 2007).
1.3.1 – Aspectos clínicos e patológicos da LVC
O espectro patológico da LVC é muito diverso devido às diferenças na
relação parasito-hospedeiro em conseqüência das variações na resposta
imune individual do hospedeiro. São várias as formas clínicas (aguda,
subaguda e crônica, assintomáticas e sintomáticas), sendo que o período de
incubação é incerto, podendo variar de três meses até vários anos (GENARO,
1993). Assim, os sinais clínicos e o tempo de aparecimento da doença são
variáveis oscilando entre ausência total de sinais até uma síndrome clínica
caracterizada por febre, descamação e eczema, principalmente no focinho e
orelha, pêlo opaco e ulcerações leves localizadas freqüentemente nas orelhas,
focinho, cauda e articulações, úlcera de decúbito. Com grande freqüência
observa-se, nas fases mais adiantadas da doença, esplenomegalia, alopecia
generalizada, ulcerações mais acentuadas na pele, onicogrifose,
ceratoconjuntivite, coriza, apatia, diarréia, melena ou hematoquesia, edema
das patas, vômito, além do aparecimento de áreas de hiperqueratose
especialmente na ponta do focinho. Na fase final da infecção ocorrem, em
geral, paraparesia, caquexia, inanição e óbito do animal (DEANE & DEANE,
1955; ALENCAR, 1959; SLAPPENDEL & GREENE, 1990; GENARO, 1993;
CIARAMELLA, 1997; ALVAR, 2004; DA COSTA VAL et al, 2004).
As principais lesões da leishmaniose visceral, observadas em cães no
Velho e Novo Mundo, ocorrem em órgãos ricos em células do sistema
monocítico mononuclear como o baço, fígado, linfonodos, medula óssea, rins,
pulmões, intestinos e a pele (BOGLIOLO, 1956; ALENCAR, 1959; GENARO,
1993; TAFURI et al., 1996; TAFURI et al., 2001; LIMA et al., 2004).
6
O baço pode apresentar tamanho normal, discretamente aumentado ou
hipertrofiado (FAURE-BRAC, 1933; DONATIEN & LESTOQUARD, 1935;
ALENCAR, 1959). Neste órgão ocorre diminuição do número de linfócitos e
proliferação de macrófagos na bainha linfóide periarteriolar, hiperplasia folicular
e aumento da polpa vermelha com agregados de macrófagos e células
plasmáticas (KEENAN et al., 1984; GENARO, 1993; TAFURI et al., 1996,
SANTANA et al., 2007).
No fígado, observa-se infiltrado plasmo-linfocitário e hiperplasia das
células de Küpffer. Pode ocorrer uma hepatite difusa, reação inflamatória
exsudativa com infiltrado linfo-plasmocitário nos espaços portais e
interlobulares além da presença de granulomas intralobulares com célula
epitelióides parasitados ou não (GENARO, 1993; TAFURI et al, 1996; TAFURI
et al, 2001; MELO et al., 2008).
Slappendel (1998) demonstrou em seus estudos que em cães
naturalmente infectados com L. chagasi ocorre um aumento da atividade sérica
da Aminotransferase de alanina (ALT/TGP), da aminotransferase de aspartato
(AST/TGO) e da Fosfatase Alcalina (ALP), observados em 82% dos casos.
Estas alterações foram atribuídas aos severos danos hepáticos que ocorrem
leishmaniose canina (Ferrer, 1991). A maior quantidade da TGP é encontrada
nos hepatócitos de cão, gato, rato e coelho. É considerada específica para
lesão hepática nestes animais. Seu aumento no soro está relacionado com
lesão hepática de natureza inflamatória, tóxicas e degenerativas. Os níveis de
sua elevação dependem do grau e duração da lesão. A TGO está localizada no
hialoplasma e nas mitocôndrias das células. É a enzima de eleição para
indicação de lesões hepáticas em animais, principalmente nos de grande porte.
Nos linfonodos, o aumento do número e tamanho dos folículos linfóides
e a marcante hipertrofia e hiperplasia dos macrófagos medulares (cordões e
seios) justificam a linfadenopatia observada clinicamente (LIMA et al., 2004;
COSTA et al., 2008).
A medula óssea encontra-se hiperplásica, podendo ou não conter
parasitos (KEENAN et al, 1984).
Na pele, observa-se processo inflamatório de células mononucleares
(macrófagos, plasmócitos e linfócitos) com graus variados de intensidade
podendo apresentar-se distribuído ao redor dos anexos ou difusamente na
7
derme (SANTOS et al., 2004; SOLANO-GALLEGO et al., 2004; GIUNCHETTI
et al., 2006; XAVIER et al., 2006). Acantose, hiperceratose com presença ou
não de pérolas córneas, paraceratose e degenerações celulares são alterações
histopatológicas comumente observadas na leishmaniose visceral canina.
O envolvimento renal, glomerulonefrite causada pela deposição de
imunocomplexos, é freqüente e os sinais clínicos apenas se tornam evidentes
quando a lesão renal já é grave. Em alguns casos a insuficiência renal é o
único sintoma observado e nestes casos o óbito pode ocorrer em poucos dias
(MARCUSSEN et al., 1989; NIETO et al., 1992; TAFURI et al., 1996; FONT &
CLOSA, 1997; CIARAMELLA et al, 1997; TAFURI et al., 2001).
Nos pulmões ocorre pneumonite intersticial crônica com espessamento
dos septos inter-alveolares (TRYPHONAS et al, 1977; ANDERSON, 1980;
DUARTE et al, 1986; GONÇALVES, 2003).
No intestino a hiperplasia linfóide das placas de Payer, associada ou não
ao parasitismo, pode ocorrer nos intestinos delgado, jejuno e íleo, grosso, ceco
e cólon (TOMÉ 1956; BRENER, 1957; KEENAN et al, 1984; SILVA et al, 2001).
1.4 - Interação Leishmania hospedeiro vertebrado
A interação Leishmania-macrófago envolve mecanismos complexos,
dependentes de fatores múltiplos dos hospedeiros vertebrados e invertebrados,
bem como do próprio parasito. O sucesso da infecção em ambos os
hospedeiros não ocorre ao acaso. De acordo com Killick-Kendrick (1979), os
vetores dos parasitos do gênero Leishmania são espécie-específicos, bem
definidos e variações nas moléculas de superfície dos protozoários facilitam o
sucesso da infecção no vetor apropriado (SCHLEIN, 1993). O hospedeiro
vertebrado, por sua vez, possui mecanismos de defesa que são ativados na
presença do parasito. Sabe-se que os macrófagos são as células hospedeiras
primárias das promastigotas, o que significa que esses parasitos possuem
mecanismos de adaptação aos fatores hostis do hospedeiro, antes, durante e
após sua internalização na célula (RUSSEL & TALAMAS-ROHANA, 1989;
OLIVIER et al., 2005).
8
Durante o repasto sangüíneo, a fêmea hematófoga (vetor) introduz a
proboscida no hospedeiro vertebrado dilacerando proteínas estruturais da
matriz intersticial, inclusive atingindo a parede de pequenos vasos sagüíneos,
promovendo lesões hemorrágicas. A formação dessas lesões decorre tanto da
ação mecânica da proboscida, quanto da ação da saliva do inseto. De fato,
componentes da saliva como maxadilan - potente agente vasodilatador e
imunomodulador, adenosina, prostaglandinas, dentre outros, auxiliam o vetor
na aquisição do sangue. Por outro lado, ocorre a ativação de mecanismos de
defesa natural, no hospedeiro, como o sistema do complemento, trombina,
plaquetas, anticorpos naturais, fagócitos, dentre outros (RIBEIRO et al., 1987;
GILLESPIE et al., 2000). A sobrevivência do parasito, na sua forma infectante,
é fortemente influenciada pelos elementos presentes nesse microambiente
tecidual.
Os macrófagos contêm, em sua superfície, um complexo arranjo de
receptores capazes de mediar a ligação de uma ampla diversidade de ligantes.
Dentre eles deve-se destacar os receptores pertencentes à família das
integrinas 2 que parecem ter importância fundamental na interação
Leishmania-macrófagos (TALAMAS-ROHANA et al., 1990; MOSSER &
ROSENTHAL, 1993; CUNNINGHAM, 2002; HANDMAN & BULLEN, 2002; De
ALMEIDA et al., 2003).
As integrinas são moléculas de adesão cujas funções envolvem
interações célula-célula ou célula-matriz extracelular, fundamentais para a
ativação leucocitária (SPRINGER, 1990; PATARROYO et al., 1990). As
integrinas 2 específicas de leucócitos (CD11/CD18), consistem de três
heterodímeros com cadeias específicas (CD11a,b,c) e uma cadeia comum
(CD18).
A integrina CD11b/CD18, conhecida como receptor para o terceiro fator
do complemento (CR3) ou MAC-1, é um receptor heterodimérico expresso em
monócitos, macrófagos, neutrófilos e células natural killer, sendo que a sua
expressão antigênica é especificamente maior durante a maturação
monocítica. A função do CR3 foi inicialmente descrita como a habilidade de se
ligar à forma inativa do complemento C3bi, mediando desta forma, a fagocitose
e lise de eritrócitos opsonizados com este fator, além de aumentar a atividade
9
das células natural killer contra células alvos opsonizadas com C3bi
(ROTHLEIN & SPRINGER, 1985; RAMOS et al., 1988).
A ligação Leishmania-macrófagos pode se dar, portanto, de maneira
direta ou indireta, envolvendo moléculas específicas, já mencionadas,
presentes na superfície de ambos, que estimulam o processo de internalização
(CHANG, 1979).
Na interação direta, moléculas do parasito ligam-se aos receptores
presentes na superfície dos macrófagos: LPG liga-se aos receptores CR3 e
CR4 (TALAMAS-ROHANA et al.,1990); gp63 liga-se ao receptor CR3 (RUSSEL
& WRIGHT, 1988) e alguns carbohidratos ligam-se aos receptores de manose
e fucose (MOSSER, 1993).
Na interação indireta, a opsonização do parasito, com os elementos
presentes no soro do hospedeiro como imunoglobulinas, fibronectina e fatores
do complemento, facilita sua internalização, através da ligação com receptores
específicos presentes no macrófago, mediando assim, a sobrevivência da
Leishmania. Dentre os receptores de macrofágicos deve-se ressaltar aqueles
pertencentes à família das integrinas 2, em especial o receptor CR3
(MOSSER, 1993; KANE & MOSSER, 2000).
A importância dos receptores CR3 na LVC tem sido demonstrada por
Gonçalves et al., (2005) e Sampaio et al., (2007). De fato, esses autores
trabalhando com monócitos circulantes e macrófagos peritoneais de cães
naturalmente infectados com L. chagasi demonstraram uma maior
internalização de promastigotas de L. chagasi, além da maior sobrevida de
amastigotas em sistemas “in vitro”, associado à análise por citometria de fluxo.
1.5 - Alterações da Matriz Extracelular (MEC)
A matriz extracelular (MEC) é um complexo estrutural que cerca e
apóia as células encontradas nos tecidos. A MEC é referida geralmente como
tecido conjuntivo. É composta principalmente por glicosaminoglicanas (GAGs)
que formam grandes agregados através de ligações com proteínas, compostos
por três classes maiores de biomoléculas: (1) as proteínas estruturais
constituindo o colágeno e elastina; (2) as proteínas especializadas ou
moléculas adesivas formadas pela fibronectina, laminina e fibrilina as quais
10
funcionam como moléculas de adesão através de ligações específicas para
GAG e (3) outras proteínas da matriz e moléculas de superfícies de células, o
que a permite exercer importantes funções relacionadas à adesão, migração ou
reconhecimento celular do micro ambiente e das proteoglicanas (GAGs
sulfatadas que ao estabelecerem ligações covalentes com um núcleo de
proteína). As proteoglicanas por sua vez formam uma família de
macromoléculas constituída por uma proteína central a qual se adere à cadeia
longa de dissacarídeos repetidos denominado de glicosaminoglicanas (GAGs)
formando componentes complexos de alto peso molecular da MEC. Muitas
proteoglicanas, especialmente a agrecana (encontrada na cartilagem e no
tecido conjuntivo propriamente dito), ligam-se ao ácido hialurônico (RHOADS &
FETTERER, 1997).
As GAGs são polissacarídeos não flexíveis e não ramificados que
dividem-se em dois grupos: (1) as não sulfatadas (ácido hialurônico), uma
macromolécula muito grande que não forma ligações covalentes com
moléculas de proteínas, e (2) as sulfatadas (queratan sulfato, heparan sulfato,
heparina, dermatan sulfato e os sulfatos de condroitino-4 e sulfato de
condroitino-6) (MARTIN et al., 1985).
Além disso, as moléculas multifuncionais presentes na matriz têm a
capacidade de interagir com vários outros componentes, apresentando em
especial uma afinidade pelos fatores de crescimento e receptores celulares. A
adesão de microorganismos à superfície da célula do hospedeiro é um passo
importante para o estabelecimento de uma infecção e normalmente esta
adesão é mediada por proteínas de superfície ou adesinas (BEACHEY, 1981).
A maior parte das interações envolve as proteínas da matriz extracelular
(MEC) do hospedeiro. Isto ocorre graças ao turnover celular, injúrias ou
agentes invasores (WESTERLUND & KORHONEN, 1993).
Pesquisas têm mostrado que certas enzimas como as
metaloproteinases podem modificar a função da matriz extracelular não
somente pela degradação de proteínas da matriz, mas também por afetarem
fatores de crescimento, citocinas e moléculas de adesão (YAMADA &
KEMLER, 2002).
Estudos recentes mostram a ocorrência de alterações de MEC em
lesões cutâneas e em linfonodos drenantes, causadas por Leishmania (L.)
11
amazonensis em diferentes linhagens de camundongos (ABREU-SILVA et al.,
2004).
A formação e a degradação da matriz extracelular são processos
dependentes e balanceados do mesmo tipo de célula. O excesso de acúmulo
de MEC que leva a fibrose ocorre quando a formação excede a degradação.
Nas inflamações crônicas, em conseqüência comum das infecções parasitárias
é um potente promotor de formação de matriz extracelular. Ao remover a
causa, a inflamação é diminuída e a degradação do excesso intersticial
predomina, resultando no remodelamento ou restabelecimento do parênquima
o mais próximo do normal. Quanto mais jovem for a fibrose mais rapidamente
esta pode ser degradada. O processo de degradação matricial também pode
ocorrer em fibroses de longa duração, entretanto, a passos lentos (ANDRADE
et al., 1991).
Segundo Cobertt et al., (1991), a completa resolução da fibrose
intralobular difusa devido a leishmaniose visceral humana foi documentada
através de biópsias tomadas sete dias e dois anos após tratamento
quimioterápico para leishmaniose. As mudanças observadas na última biópsia
consistiam no desaparecimento da fibrose intralobular, assim como da
hiperplasia das células de Kupffer e do parasitismo.
A fibrose hepática ou a acumulação progressiva de matriz extracelular
(MEC) fibrilar no fígado, é a conseqüência de danos teciduais repetidos devido
à infecções (principalmente por vírus B e C), induzida por drogas, causas
metabólicas e auto-imunes, e à ativação crônica da reação de cicatrização de
feridas (SCHUPPAN et al., 1999; ROCHEY,2000; VALKOVA, 2002; PINZANI &
ROMBOUTS, 2004). A fibrose hepática não resulta somente de mudanças na
MEC, mas também de alterações na sua degradação, que significa uma perda
do balanço funcional dinâmico entre fibrogênese e fibrólise (VALKOVA, 2002).
Como o fígado torna-se fibrótico, há mudanças quantitativas e qualitativas na
composição da ECM. As fontes celulares dos componentes do tecido
conjuntivo em fibrose hepática têm sido um tema de controvérsia, mas as
células hepáticas esteladas (HSC) ou células de Ito são provavelmente as que
mais contribuem para esse processo, quando o dano hepatocelular é limitado
ou concentrado dentro do lóbulo hepático (PINZANI & ROMBOUTS, 2004). Há
12
evidências têm sido obtidas que células precursoras circulantes, chamadas
fibrócitos do sangue circulante migram para o sítio da lesão, mas ainda não foi
demonstrado o seu papel no desenvolvimento de fibrose hepática (GUYOT et
al., 2005).
Segundo Corbett et al., (1993) na leishmaniose visceral humana
(LVH), além da ativação das células de Ito devido à estase e a persistência do
antígeno, a estimulação crônica das células de Kupffer também estimularia
uma reação intersticial no espaço de Disse, acompanhada da alta ativação
dessas células estreladas. Além disso, o autor ainda discute se a presença de
antígenos de Leishmania nos espaços de Disse e quanto de Imunoglobulina G
(IgG), estimulariam a síntese e secreção de produtos da matriz.
Alguns autores como Andrade (1994); Rochey (2000) e Valkova, 2002
afirmam que a fibrogênese das células de Ito gira em torno da interação dessas
células e outros componentes celulares do fígado, citocinas, peptídeos e a
MEC. A própria MEC modula o estado de ativação das HSC, e proteínas
degradantes da matriz. Dentre as citocinas envolvidas nesse processo, o fator
de crescimento transformante (TGF-) exerce um papel central (CLÉMENT et
al., 1993; VALKOVA, 2002; SCHUPPAN et al., 2003; GUI et al., 2005), pois
inicia a sinalização através de sua interação com receptores heterodiméricos
tipo e na superfície das HSC, que propagam sinais através da fosforilação
de mediadores citoplasmáticos, que irão ativar os genes que codificam o
colágeno fibrilar (principalmente o colágeno tipo e o colágeno tipo ). Além
disso, o TGF- induz uma inibição (down-regulation) dos genes que codificam
as metaloproteinases da matriz (MMP-1) e estimulam (up-regulation) o gene
para inibidor tecidual de metaloproteinase (TIMP-1) (PINZANI & ROMBOUTS,
2004; BHOGAL & BONA, 2005). Nesse contexto ainda, a proliferação das HSC
é um importante componente da ativação da cascata, por amplificar a resposta
à injúria, dentre outros fatores de crescimento (fator de crescimento epidermal,
fator de crescimento de fibroblastos, endotelina-1, trombina, TGF-) o fator de
crescimento derivado de plaquetas (PDGF) é o principal mitógeno e
quimioatraente para HSC (ROCHEY, 2000; PINZANI & ROMBOUTS, 2004;
SHI et al., 2005).
13
1.5.1 - Sistema Colágeno
Os colágenos são as proteínas mais abundantes encontradas no reino
animal, sendo as maiores proteínas constitutivas da MEC. O sistema colágeno
é formado por vários tipos de colágenos geneticamente distintos que ocorrem
em diferentes tecidos conjuntivos (VON DER MARK et al., 1976). Pelo menos
vinte tipos de colágenos são conhecidos hoje. Todos os tipos de colágeno até
agora descritos originam-se de uma molécula precursora denominada
tropocolágeno, a qual é constituída por três cadeias polipeptídicas , que se
enrolam entre si numa configuração estrutural de tríplice hélice. As moléculas
de tropocolágeno dão origem às fibrilas colágenas, que por sua vez se
dispõem paralelamente para formar fibras colágenas propriamente ditas (VON
DER MARK et al., 1976).
O colágeno do tipo I representa o mais comum dos colágenos, forma
fibras grosseiras e está presente no tecido conjuntivo propriamente dito, padrão
normal da pele, tendão, osso, dentina e cemento. Já o tipo II de colágeno,
forma fibras delgadas e está presente quase exclusivamente nas matrizes da
cartilagem hialina e elástica. O colágeno do tipo III, freqüentemente associado
ao tipo I, é denominado, também, de fibra reticular mais delgada. O colágeno
do tipo IV não constitui fibras, estando presente nas lâminas basais, em que
forma uma rede de moléculas de pró-colágeno mantidas unidas, e formando
uma base de sustentação da lâmina basal. O colágeno do tipo V existe em
pequena quantidade e origina fibrilas muito delgadas, sendo encontrado
associado com o colágeno do tipo I, presente na maioria do tecido intersticial,
assim como o colágeno do tipo VI. O colágeno do tipo VII constitui pequenos
agregados conhecidos como fibrilas de ancoragem, onde também dão
sustentação à lâmina basal para os feixes subjacentes de fibras colágenas do
tipo I e do tipo II. O colágeno tipo XI é encontrado nas cartilagens hialina e
elástica, participando da estrutura das fibrilas de colágenos, juntamente com o
colágeno tipo II (MONTES, 1996).
Abreu-Silva et al. (2004) demonstraram em trabalhos com infecção
experimental em camundongos com L. amazonensis que na pele houve
14
substituição do colágeno do tipo I pelo tipo III com o decorrer da infecção, com
alterações da arquitetura normal deste órgão.
A ocorrência do colágeno tipo III também foi demonstrada em
granulomas de camundongos infectados com L. donovani (GOSHI et al.,
1999). Todavia Tafuri et al., (1996) descreveram histologicamente a presença
de apenas alguns traços de colágeno do tipo III em granulomas de cães
naturalmente infectados com L. chagasi.
Lira et al. (1997) mostraram através de experimentos com formas
promastigotas de L. (L.) mexicana que estas podiam se ligar ao colágeno tipo
I, indicando que esta interação poderia ser importante na patogênese da
infecção.
Estudos mostram que Staphylococcus aureus possui um receptor de
superfície para o colágeno tipo II, expressão a qual parece ser um
requerimento necessário e suficiente para a invasão da cartilagem na
osteomielite ou artrite séptica (SWITALSKI et al., 1993).
Estudos de Gonçalves et al. (2003) trabalhando com cães
naturalmente infectados com L. chagasi com pneumonite intersticial crônica,
demonstrou-se a presença abundante de fibras reticulares (colágeno tipo III)
no interior dos septos alveolares. As fibras reticulares foram intensamente
coradas e formavam estruturas densas emaranhadas ou enoveladas
denominadas pelos os autores como estruturas semelhantes a “tacos de
golfe”. As fibras reticulares foram observadas com maior intensidade nas áreas
onde o infiltrado inflamatório era mais intenso e onde o septo pulmonar
apresentava-se mais espessado quando comparado com os pulmões dos
animais controle normais. Os autores demonstraram ainda uma fibrogênese
pulmonar significativa em relação aos animais assintomáticos.
15
1.5.2 - Fibronectina (FN)
A aderência é um pré-requisito para o estabelecimento e manutenção
da população de patógenos nos hospedeiros mamíferos. O enfoque geral para
entender os mecanismos de reconhecimento da célula hospedeira e a
aderência pelo patógeno é baseada na consideração da interação inicial
protéica. Através de vários estudos têm-se destacado o potencial papel de
resíduos de açúcares como ligantes para a aderência de parasitos protozoários
(JUNGERY, 1985; MARKWELL, 1980), em particular, no possível papel da
fibronectina (FN) nas interações células-patógenos.
As fibronectinas são um grupo de glicoproteínas encontradas na forma
solúvel no plasma, líquido cefalorraquidiano, líquido sinovial e amniótico,
líquido seminal, na saliva e no exsudato inflamatório (MOSHER, 1984). A forma
insolúvel está presente na superfície celular e na matriz extracelular, onde se
liga a fibras diméricas através de ligações covalentes (PROCTOR, 1987a). A
fibronectina é a mais abundante glicosaminoglicana (GAG) na matriz
extracelular hepática, sendo encontrada nos septos, na tríade portal, espaço de
Disse e localizada junto às fibras colágenas (MARTINEZ-HERNANDEZ et al.,
1995)
A fibronectina promove aderência de célula-célula, aderência da célula
ao plasma, célula à membrana basal e a outros componentes da matriz;
estimula a migração das células endoteliais, favorecendo a neovasculogênese;
orienta a deposição de outros componentes da matriz como colágeno, heparan
sulfato, proteoglicanas, sulfato de condroitina (MOSHER, 1984); aumenta a
capacidade fagocítica de macrófagos e neutrófilos, uma vez que induz a
quimiotaxia e a adesão do fagócito ao patógeno (PROCTOR, 1987b).
Fibronectina é considerada como um componente chave em vários
processos biológicos (WYLER, 1987). Essa possui domínios funcionais que
facilitam interações com células, heparina, fibrina, colágeno, imunoglobulinas e
também com parasitas (WYLER, 1985).
A aderência à célula hospedeira é particularmente importante para
aqueles parasitas com uma fase de crescimento e multiplicação intracelular.
Existem grandes evidências em que a fibronectina poderia exercer um papel
importante na adesão e ligação de parasitas nas células hospedeiras, incluindo
16
a ligação entre as formas promastigotas de Leishmania e macrófagos
hospedeiros. (BLACKWELL et al., 1984). Estudos mostram, por exemplo, que a
FN tem um papel importante em certas doenças parasitárias. Leishmania e
Trypanosoma cruzi prendem-se à FN do hospedeiro facilitando sua associação
com as células de seus parasitos (WYLER et al., 1987). De fato a aderência
mediada pela fibronectina em promastigotas de Leishmania amazonensis e
amastigotas em monócitos humanos tem sido demonstrada por Wyler et al.,
(1985). Além disso, esses autores têm demonstrado que anticorpos policlonais
anti-fibronectina poderiam inibir a adesão do parasito às células do hospedeiro
e tem-se sugerido, então, o envolvimento do receptor de fibronectina em
macrófagos (FnR) no reconhecimento nas células hospedeiras.
Adicionalmente, Rizvi et al., (1988), descrevem em seu trabalho que a
metaloproteína majoritária de Leishmania sp. denominada gp63 (glicoproteína
63) é uma molécula semelhante a FN que possui características biológicas e
moleculares semelhantes à fibronectina. Além disso, tem-se observado a
reação cruzada entre a gp63 e a fibronectina através do uso de anticorpos
policlonais e monoclonais.
Em estudos com Entamoeba histolytica e Schistosoma spp. foi verificado
que estes parasitos produzem proteases que degradam as fibronectinas e
outras proteínas da matriz, facilitando assim, a penetração na barreira da
mucosa intestinal (WYLER, 1987).
17
1.5.3 - Laminina (LN)
As lamininas compreendem uma família de proteínas com várias
isoformas (1, 2, 4, 8,10), das quais as isoformas 2 e 4 são observadas no
fígado. A expressão excessiva da laminina reflete processos inflamatórios e
denerativos em tecidos. Alguns trabalhos mostram que a laminina é secretada
durante a regeneração hepática após hepatectomia radical ou na cirrogênese.
A laminina assume um papel importante no processo de capilarização dos
sinusóides (MARTINEZ-HERNADEZ et al., 1995). As células de Ito (células
esteladas) no fígado e as células endoteliais são consideradas as fontes
primárias de laminina (ODENTHAL et al., 1993).
A laminina é uma glicoproteína de alto peso molecular (900 kDa)
encontrada em maior quantidade na membrana basal. A análise ultraestrutural
revelou que a laminina possui a forma de cruz assimétrica, com três braços de
tamanho idênticos e um braço longo (ENGEL et al., 1981). A conformação
estrutural da laminina permite que ela atravesse a membrana basal e ligando-
se de um lado com os receptores específicos da superfície celular (integrinas) e
do outro lado aos componentes da matriz (COTRAN et al., 2000).
A laminina é a primeira proteína da matriz extracelular encontrada
durante a embriogênese, sendo sintetizada precocemente já na fase de dois
blastômeros. Ela desempenha várias atividades biológicas, tais como:
aderência das células, crescimento e diferenciação de vários tipos celulares e
múltiplas interações com a membrana basal (TIMPL & BROWN, 1994).
De acordo com Bandyopadhyay et al., (2002), a migração da leishmania
através da MEC precede a adesão aos macrófagos e que a entrada na célula é
mediada pela interação da laminina com os receptores laminina/parasita.
Os estudos das alterações da matriz intersticial na leishmaniose visceral
são, sobretudo, aqueles relacionados ao colágeno quer seja no homem
(BOGLIOLO, 1956; ANDRADE e ANDRADE, 1966; RAY et al., 1992), ou no
cão (MELO et al., 2008). Alterações referentes à fibronectina (FN) e laminina
nos diversos órgãos durante a infecção parecem inexistentes. Todavia, o
trabalho recente de Kulkarni et al. (2008) “in vitro”, descreve alterações da
fibronectina na presença de promastigotas e amastigotas de três espécies de
Leishmania: (1) Leishmania amazonensis (LV7B), (2) Leishmania
18
major (MHOM/SN/74/Seidman) e, (3) Leishmania donovani
(MHOM/N/1983/AG83). Os autores demonstraram que as diferentes espécies
de Leishmania não foram só capazes de degradar a FN, mas simultaneamente
interferir negativamente na produção de radicais livres de oxigênio originados
de macrófagos ativados, conferindo assim mais possível um mecanismo de
escape desse parasito no hospedeiro vertebrado. Por outro lado, Pinheiro et al.
(2006) demonstraram que macrófagos murinos infectados com cepas de
Leishmania braziliensis (MHOM/BR/3456) e de L. amazonensis (Leila strain,
MHOM/BR88/BA-125) são menos aderentes as proteínas da matriz intersticial
como o colágeno, fibronectina (FN) e laminina (LN). Os autores sugerem que
protozoários intracelulares do gênero Leishmania são capazes de alterar a
função das integrinas da família β-1 responsáveis pela interação dos leucócitos
a matriz intersticial.
Assim, neste trabalho propomos um estudo das alterações da matriz
intersticial em diversos órgãos de cães infectados com Leishmania chagasi
buscando correlacionar essas alterações a achados clínicos e aos processos
anátomo-patológicos e parasitológicos encontrados nos diversos órgãos de
cães naturalmente infectados com L. chagasi.
19
2
2
–
–
O
O
B
B
J
J
E
E
T
T
I
I
V
V
O
O
S
S
2.1 - Objetivos Gerais:
Avaliar as alterações da matriz extracelular nos grupos de cães
assintomáticos e sintomáticos em relação ao grupo controle, associado
às análises das alterações histológicas.
Correlacionar os aspectos clínicos da leishmaniose visceral canina
(LVC) com os processos imuno-histopatológicos encontrados no fígado,
baço, linfonodos cervicais dos cães naturalmente infectados com
Leishmania (Leishmania) chagasi.
2.2 - Objetivos Específicos
Avaliar a deposição de fibras colágenas no fígado, baço e linfonodos
cervicais dos animais dos três grupos estudados, correlacionando com a
carga parasitária e aos aspectos clínicos.
Avaliar as alterações histológicas no fígado, baço e linfonodos cervicais
dos animais naturalmente infectados com Leishmania chagasi.
Determinar a carga parasitária utilizando a técnica imuno-histoquímica
para detecção de formas amastigotas de Leishmania, no fígado, baço e
linfonodos cervicais.
Quantificar as fibras adesivas: fibronectina (FN) e laminina (LN) nos
diferentes grupos de estudo.
Identificar a expressão da integrina CR3 (CD11b/CD18) nos diferentes
órgãos correlacionando com parasitismo.
20
3
3
–
–
M
M
A
A
T
T
E
E
R
R
I
I
A
A
L
L
E
E
M
M
É
É
T
T
O
O
D
D
O
O
S
S
3.1 – Aprovação do Comitê de Ética em Experimentação Animal
Esse estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação
Animal CETEA da UFMG, registrado no protocolo 190/06 em anexo.
3.2 - Animais
Foram utilizados trinta cães provenientes do Centro de Controle de
Zoonoses de Belo Horizonte - MG, Brasil, sendo que vinte cães com exames
sorológicos positivos para Leishmania através de testes de imunofluorescência
indireta (RIFI) e imunoenssaio enzimático (ELISA - enzyme linked
immunoaborbent assay) e dez cães com sorologia e exame parasitológico
negativo para Leishmania.
3.2.1- Critérios de inclusão no estudo
Foram incluídos, neste estudo, animais portadores ou não de sinais
clínicos de leishmaniose visceral, leves ou moderados, com boa condição
corporal, ausência de patologias concorrentes, com avaliações laboratoriais
normais e diagnóstico parasitógico (mielograma ou mielocultura) positivo.
3.3 - Grupos Experimentais
Grupo 1 - Cães Sintomáticos
Dez animais adultos, todos sem raça e idade definidas, com vários sinais
clássicos da doença, tais como: anemia, caquexia, alterações cutâneas
(alopecia, eczemas ou úlceras), onicogrifose, ceratoconjuntivite, linfadenopatia,
rigidez dos membros posteriores.
21
Grupo 2 - Assintomáticos
Dez animais, sem raça e idade definidas sem sinais clínicos da doença.
Grupo 3 – Animais-Controle
Dez cães adultos, sem idade e raça definidas, com exame sorológico e
parasitológico negativos para Leishmania.
3.4 - Coleta e processamento histológico do material:
3.4.1 – Punção de medula óssea
Os animais foram tranqüilizados com Acepromazina 1%, na dosagem de
0,1 mL/kg de peso por via intravenosa. Após 10 minutos, foi administrado
anestésico geral, Tiopental Sódico 2,5%, na dose de 0,5 mL/kg de peso pela
via intravenosa (MELO et al., 2008). Depois de atingido o plano anestésico
adequado foi realizada a tricotomia e anti-sepsia (Iodopovidine líquido a 1%) da
região alvo. O aspirado medular foi obtido por punção da extremidade inferior
do esterno ou da fossa intercondília da tíbia. O conteúdo medular foi aspirado
com agulha descartável, 12x40, acoplada à seringa descartável de 20 mL. Os
esfregaços medulares, por sua vez, foram confeccionados em duplicata e
corados por solução de Giemsa a 10%.
3.4.2 – Eutanásia dos animais
Os animais foram eutanaziados conforme Resolução nº 714, de 20 de
junho de 2002, do Conselho Federal de Medicina Veterinária, que dispõe sobre
os procedimentos e métodos de eutanásia em animais. O procedimento inclui
tranqüilização dos animais com Acepromazina 1%, na dosagem de 0,1 mL/kg
de peso por via intravenosa e após 10 minutos, aplicação de anestésico geral,
Thiopental Sódico 2,5%, na dose de 0,5 mL/kg de peso por via intravenosa.
Depois de atingido o plano anestésico adequado foi administrado uma dose
letal (0,3 mL/Kg) de T-61
. (MELO et al., 2008). Após a comprovação da morte
22
do animal foram iniciados os procedimentos para a necropsia e retirados os
órgãos a serem analisados.
3.4.3 – Coleta de fragmentos dos órgãos
Os órgãos foram analisados macroscopicamente levando-se em
consideração critérios como tamanho, peso e presença de lesões. Em seguida,
foram retirados fragmentos de fígado, baço, linfonodo cervical, pele de orelha e
costela. Foram realizados esfregaços por aposição e os fragmentos foram
preservados em formol tamponado a 10% - pH 7,2 para inclusão em parafina e
uma outra parte criopreservada a -70ºC em Tissue Tek
®
.
3.4.4 – Avaliação histopatológica dos órgãos
As lâminas contendo cortes parafinados de fígado, baço, linfonodo
cervical foram coradas pela técnica da hematoxilina e eosina (descrita no ítem
3.4.5) e analisadas por microscopia óptica. As alterações avaliadas no baço
foram o espessamento e inflamação da cápsula, hipertrofia e hiperplasia da
polpa branca e da polpa vermelha, congestão, deposição de hemossiderina e
depleção de áreas T dependentes na polpa branca. No fígado obsevou-se a
presença de granulomas, inflamação portal, fenômenos degenerativos,
inflamação da cápsula, congestão sinusoidal, hipertrofia e hiperplasia das
células de Kupffer e deposição de hemossiderina. No linfonodo avaliou-se a
linfadenite capsular, inflamação dos seios subcapsulares, hiperplasia e
hipertrofia dos nódulos linfóides e dos macrófagos, congestão e presença de
hemossiderina.
As alterações histopatológicas foram avaliadas de forma semi-quantitativa,
levando-se em consideração a extensão das alterações em todo o corte
histológico, sendo assim classificadas: (1) Ausência de alteração; (2) Alteração
discreta; (3) Alteração moderada; (4) Alteração intensa.
23
3.4.5 - Técnica da Hematoxilina-Eosina (HE)
As lâminas foram inicialmente desparafinadas em xilol, hidratadas em
soluções de álcoois decrescentes, e a seguir, lavadas com água corrente. Logo
após, foram coradas em hematoxilina e, após nova lavagem, novamente
coradas em eosina. As lâminas foram, então, imersas em água corrente,
desidratadas em soluções de álcool crescente e posteriormente diafanizadas
em xilol e montadas em bálsamo sintético.
3.4.6 – Avaliação da densidade de parasitos nos órgãos
A presença de parasitos nos órgãos foi avaliada pelo método de imuno-
histoquímica, utilizando-se a técnica da estreptoavidina-peroxidase (descrita no
item 3.4.7). A análise foi quantitativa levando-se em conta o número de
amastigotas encontrado em vinte campos observados (440x) ao microscópio
óptico.
3.4.7 - Técnica da estreptoavidina-peroxidase para detecção de formas
amastigotas de Leishmania.
A Imuno-histoquímica para marcação de formas amastigotas de
Leishmania em material embebido em parafina (Tafuri et al., 2004), nos vários
órgãos estudados, visando correlacionar as lesões com a presença do parasito
nos órgãos. Na seqüência, as lâminas, contendo cortes parafinados de tecidos,
foram desparafinadas em xilol por 20 minutos, hidratadas em soluções de
álcoois decrescentes (álcool absoluto, 90
o
, 80
o
e 70
o
respectivamente) e
submetidas a um banho em PBS (“Phosphate Buffer Saline”-pH 7,2, 0,01M) a
10%. Posteriormente fez-se o bloqueio da peroxidase endógena adicionando-
se ao banho de PBS o peróxido de hidrogênio (30 volumes diluída a 4% em
PBS), por 30 minutos à temperatura ambiente. As lâminas foram, então,
cobertas com solução de bloqueio (Leite em pó desnatado diluído em PBS -12g
de leite em 200 mL de PBS) e incubadas em câmara úmida por 30 minutos à
temperatura ambiente. Logo após, o anticorpo primário (soro de cão infectado
24
com L. chagasi, na diluição de 1/100 em BSA – soro albumina bovina) foi
adicionado em quantidade suficiente para recobrir os fragmentos, sendo as
lâminas incubadas por 18 a 24 horas em câmara úmida a 4ºC. A seguir,
adicionou-se o anticorpo secundário biotinilado (anticorpo biotinilado de cabra
anti-coelho e anti-camundongo na diluição de 1/100 - DAKO - LSAB 2 System,
Peroxidase – K0675, segundo Tafuri et al, 2004) e as lâminas foram
novamente incubadas em câmara úmida por 30 minutos à temperatura
ambiente. Adicionou-se, então, o complexo estreptoavidina peroxidase seguido
de incubação por 30 minutos em câmara úmida à temperatura ambiente. A
reação foi revelada utilizando-se solução de Diaminobenzidina (DAB) a 0,024%
em PBS acrescida de solução de peróxido de hidrogênio 40 volumes a 0,16%
em PBS, por cinco minutos à temperatura ambiente. Posteriormente fez-se a
lavagem das lâminas em água corrente e contra-coloração com Hematoxilina
de Harris. As lâminas foram então desidratadas em álcoois crescentes (70
o
, 80
o
90
o
e álcool absoluto), diafanizadas em xilol, e montadas com bálsamo
sintético.
Para cada bateria de 20 lâminas utilizou-se um controle negativo e um
positivo. Como controle negativo, utilizou-se PBS, em substituição aos
anticorpos primários. Como controle positivo foi utilizado uma lâmina com corte
histológico de pele de orelha de um cão naturalmente infectado com
Leishmania.
3.4.8 – Caracterização Imuno-histoquímica da laminina (LN) e do infiltrado
inflamatório nos órgãos pela técnica da estreptoavidina-peroxidase
Para caracterização Imuno-histoquímica da laminina (LN) nos órgãos
utlizou-se o anticorpo de coelho anti-laminina (AHP420T Serotec®), e para
caracterização das células inflamatórias teciduais Mouse anti canine Anti
CD11b e Mouse anti canine Anti CD18 em seções histológicas de 4m
criopreservadas (Quadro 1).
Os fragmentos dos órgãos fixados na solução criopreservadora Tissue
Tek
foram cortados em criostato a 4,0 m de espessura e fixados em lâminas
previamente desengorduradas com solução álcool-éter. Posteriormente, os
25
cortes de tecido foram hidratados em álcoois decrescentes (álcool absoluto,
90
o
, 80
o
e 70
o
respectivamente) e submetidas a um banho em PBS
(“Phosphate Buffer Saline”- pH 7,2, 0,01M) a 10%. Posteriormente fez-se o
bloqueio da peroxidase endógena adicionando-se ao banho de PBS o peróxido
de hidrogênio (30 volumes diluída a 4% em PBS), por 30 minutos à
temperatura ambiente. As lâminas foram, então, cobertas com solução de
bloqueio (Leite em pó desnatado diluído em PBS -12g de leite em 200 mL de
PBS) e incubadas em câmara úmida por 30 minutos à temperatura ambiente.
Logo após, o anticorpo primário específico (descritos no quadro 1) foi
adicionado em quantidade suficiente para recobrir os fragmentos, sendo as
lâminas incubadas por 18 a 24 horas em câmara úmida a 4ºC. A seguir,
adicionou-se o anticorpo secundário biotinilado (anticorpo biotinilado de cabra
anti camundongo e anti coelho, na diluição de 1/100 - DAKO - LSAB 2 System,
Peroxidase – K0675, segundo Tafuri et al, 2004) e as lâminas foram
novamente incubadas em câmara úmida por 30 minutos à temperatura
ambiente. Adicionou-se, então, o complexo estreptoavidina peroxidase seguido
de incubação por 30 minutos em câmara úmida à temperatura ambiente. A
reação foi revelada utilizando-se solução de Diaminobenzidina (DAB) a 0,024%
em PBS acrescida de solução de peróxido de hidrogênio 40 volumes a 0,16%
em PBS, por cinco minutos à temperatura ambiente. Posteriormente fez-se a
lavagem das lâminas em água corrente e contra-coloração com Hematoxilina
de Harris. As lâminas foram então desidratadas em álcoois crescentes (70
o
, 80
o
90
o
e álcool absoluto), diafanizadas em xilol, e montadas com bálsamo
sintético. Como controle negativo, utilizou-se PBS, em substituição aos
anticorpos primários.
3.4.9 – Caracterização imuno-histoquímica da Fibronectina (FN)
Para a caracterização Imuno-histoquímica da fibronectina (LN) nos
órgãos, em seções histológicas de 4m, criopreservadas a -70ºC utilizou-se o
anticorpo de coelho anti-fibronectina humana, conforme descrito no quadro 1.
Após a biopsia os fragmentos dos tecidos foram incluídos em meio
especial para tecido congelado (OCT Tissue Teck- meio para congelamento de
material de biopsia, Milles Inc., USA) e armazenados em freezer a –70ºC onde
26
permaneceram até o processamento. Os cortes histológicos para essa técnica
foram feitos em criostato à temperatura de –30 ºC, a 4m de espessura,
fixados em etanol gelado por 15 minutos. Após os tecidos atingirem a
temperatura ambiente, a área dos cortes foi demarcada. Em seguida os cortes
foram bloqueados com PGN puro (PBS + 0,25% de gelatina em pó + 0,1% de
azida em pó) durante 15 minutos. Sendo em seguida depositados 30µL do
segundo anticorpo primário diluído em PGN+saponina, para fibronectina foi
utilizado o anticorpo monoclonal coelho anti-fibronectina 1:400 (F 3648 -
Sigma), encubou-se em câmara úmida por 40 minutos e logo após lavou-se
com PBS 3 vezes por cinco minutos cada lavagem. Enxugaram-se os cortes e
colocou-se o anticorpo secundário (cabra anti-camundongo conjugado com
Isotiocianato de Fluoresceína). Encubou-se por 40 minutos em câmara úmida
ao abrigo da luz. Lavou-se em PBS. As lâminas foram montadas com glicerina
e seladas com esmalte. Observadas ao microscópio de imunofluorescência.
QUADRO 1
Anticorpos utilizados
Anticorpo Diluição Marca
Mouse anti canine Anti CD11b 1/100 MCA 1777S - Serotec
Mouse anti canine Anti CD18 1/100 MCA 1780S - Serotec
Rabbit anti Laminina 1/400 AHP 420T - Serotec
Rabbit anti Fibronectina 1/400 F3648 - Sigma
27
3.5 - Estudo do colágeno
Utilizou-se para marcação das fibras colágenas a técnica histoquímica
Prata Amoniacal de Gomori na quais as fibras são destacadas em preto.
As
lâminas foram desparafinizadas em xilol por cerca de 20 minutos, em seguidas
hidradatas em ordem decrescente de álcoois (absoluto ao álcool 70%) até o
banho de 5 minutos em água corrente. Cada lâmina foi coberta com a solução
aquosa de permanganato de potássio 0,5% durante 2 minutos, em seguida
lavou-se rapidamente as lâminas até atingirem a cor marrom claro. O passo
seguinte foi pingar solução aquosa de ácido oxálico 3% até os cortes ficarem
embranquecidos e em seguida foram lavadas em água corrente rapidamente.
Encubar as lâminas com sulfato férrico amoniacal 2% por 2 minutos e lavar
com água destilada e em seguida corou-se as lâminas com a Prata amoniacal
de Gomori por cerca de dois minutos, lavando-se em seguida e cobrindo os
cortes com solução aquosa de formol a 20%, até observar o enegrecimento
das seções histológicas. Lavar rapidamente e mergulhar as lâminas na solução
aquosa de cloreto de ouro 0,2% por três minutos e lavar em seguida com água
destilada. Cobrir os cortes com hipossulfito de sódio 2% por um minuto e lavar
rapidamente com água destilada. Para a contra coloração cobriu-se os cortes
com Verde Luz 1 % por 30 segundos e lavaram-se as lâminas com água
destilada. Seguiu-se, então com a desidratação das lâminas em álcool 70% até
os absoluto I e II e diafanização rapidamente em xilol por no máximo 10
minutos. Lâminas motadas em Entellan
.
Os cortes histológicos do fígado, baço e linfonodos corados pela
coloração pela Prata Amoniacal de Gomori foram analisados para quantificar
as fibrilas colágenas e reticulares quantificadas. Assim, esse programa de
computador, permitiu que as estruturas fossem marcadas e quantificadas
através de sua coloração diferencial com outras estruturas. Cada estrutura
corada de interesse foi selecionada manualmente, e o computador criou uma
imagem negativa da mesma (binarização da imagem), e na seqüência as
medidas foram realizadas de modo automático (Figura 1) e os resultados
expressos em m
2
.
28
3.6 - Análise morfométrica das fibras colágenas, laminina, fibronectina e
da expressão das CR3 positivas.
Após cada marcação, foram capturadas 20 imagens aleatórias do corte
histológico de cada animal, utilizando-se uma micro-câmera JVC TK-1270/RGB
e, em seguida, digitalizadas na objetiva de 40X para a criação de um banco de
imagens. Todas os campos marcados foram contados com o auxílio do
software KS300 contido no analisador de imagens Kontron Elektronick / Carl
Zeiss. Os métodos morfométricos utilizados estão descritos no livro “Princípios
de morfometria digital KS300 para iniciantes” (CALIARI, 1997).
29
C D
A B
Figura 1 – Imagens para os comandos mostradas pelo software KS300 para determinação da
deposição de colágeno no parênquima hepático. (A) Digitalização da imagem; (B) Seleção dos
pixels das fibras colágenas; (C) Obtenção da imagem binária para posterior obtenção da área
correspondente ao colágeno; (D) imagem de área correspondente ao colágeno.
30
3.7 - Análise estatística
Todas as análises estatísticas inferências ou descritivas foram
realizadas utilizando-se dos softwares INSTAT3 for Windows e PRISM versão
3.0.
Baseando-se na natureza da distribuição não paramétrica dos dados
obtidos para o parasitismo dos animais, para análises de inferência entre dois
dos grupos estudados foi utilizado o teste de Mann-Whitney e para análises de
correlação o teste aplicado foi o Coeficiente de Correlação de Spearman.
Dados obtidos para a expressão da laminina, fibronectina e das fibras
reticulares apresentaram distribuição normal, sendo as inferências desses
dados quando para dois grupos realizados pelo teste-T, para mais de dois
grupos realizados no teste de variância da Tabela ANOVA e as análises de
correlação pelo Coeficiente de Correlação de Pearson e pela matriz de
correlação de Pearson com índice de significância menor que 5%.
31
4
4
–
–
R
R
E
E
S
S
U
U
L
L
T
T
A
A
D
D
O
O
S
S
4.1 - Avaliação clínica dos animais
Os principais sinais clínicos apresentados pelos cães utilizados nesse
trabalho estão demonstradas no gráfico 1. As lesões mais freqüentemente
encontradas foram a linfadenomegalia, caquexia e as alterações cutâneas, tais
como: descamação, dermatite seborréica, alopecia, úlceras e onicogrifose.
40
40
60
70
15
20
35
15
20
40
20
75
50
60
55
20
40
020406080
Alopécia generalizada
Alopécia localizada
Apatia
Caquexia
Ceratite
Conjuntivite
Dermatite
Descarga ocular mucosa
Descarga ocular purulenta
Ectoparasitos
Hipertermia
Linfadenomegalia
Mucosas aparentes anêmicas
Onicogrifose
Pele seca e descamando
Seborréia
Úlceras na pele
Gráfico 1 - Valores percentuais do número de animais naturalmente infectados
com Leishmania chagasi (assintomáticos e sintomáticos) que apresentaram sinais
clínicos durante a avaliação.
32
4.2 - Fígado
4.2.1 - Macroscopia
As principais alterações macroscópicas observadas no fígado foram o
aumento de peso e volume do órgão (hepatomegalia), coloração vermelho-
escuro, bordas espessadas sugerindo congestão. Ao corte o órgão deixava fluir
considerável quantidade de sangue caracterizando o quadro de congestão.
Houve em alguns casos a presença de nódulos de coloração
brancacenta, tamanhos variando de 0,2 a 0,5 cm, distribuídos aleatoriamente
na superfície do órgão, sem predileção por um lóbulo hepático ou outro.
Todavia, estes não se aprofundavam à superfície de corte. Essas lesões
sugeriam a presença de granulomas.
Em um caso o fígado apresentou um aspecto peculiar. A superfície era
irregular caracterizada por lesões de coloração clara ou brancacenta, de
formas e tamanhos variados irregulares promovendo depressões, e distribuídas
difusamente, mas que não se aprofundavam ao corte (Figura 2).
Os dados obtidos em relação aos pesos relativos dos fígados estão
demonstrados na Tabela 1. Houve diferença estatística em relação ao peso
relativo (%) do fígado entre os grupos analisados (ANOVA p<0,0001).
Tabela 1- Peso relativo (peso do fígado/peso corporal) dos fígados dos
animais dos grupos assintomáticos, sintomáticos naturalmente infectados com
L. chagasi e grupo controle.
Grupos
Controle
Assintomático
Peso relativo (%)
(média ± SR)
2,460 ± 0,6518
a
3,380 ± 0,5770
b
Sintomático
4,160 ± 0,6518
c
Os resultados expressos como médias dos valores erro padrão. As diferenças
estatisticamente significativas referem-se às letras a,b e c. ANOVA p<0,0001.
33
Figura 2: Fígado de cão sintomático naturalmente infectado com
Leishmania (Leishmania) chagasi (órgão fixado em formol 10%)
Observar superfície irregular caracterizada por lesões de coloração
escura após fixação, mas que anteriormente eram brancacentas a
fresco (setas brancas). Essas lesões são distribuídas difusamente em
todos os lobos, de tamanhos e formas variados, e por vezes
promovendo áreas de depressões na superfície.
34
4.2.2 - Microscopia
Ao exame microscópico, os fragmentos de fígado de todos os animais
naturalmente infectados, independentemente do grupo clínico estudado,
apresentaram-se com lesões qualitativamente muito semelhantes, variando
apenas em intensidade. Assim, os principais achados histopatológicos foram:
(1) inflamação portal e da cápsula variando de discreta a intensa, com
predomínio de células mononucleares (plasmócitos, macrófagos e linfócitos) e
raros polimorfonucleares de permeio. Os macrófagos estavam parasitados ou
não com formas amastigotas de Leishmania (Figura 3A,B); (2) presença de
granulomas de localização preferencialmente intralobular e mais raramente nos
espaços-porta hepáticos. Os granulomas eram constituídos principalmente de
macrófagos, parasitados ou não, plasmócitos, linfócitos e raros
polimorfonucleares neutrófilos e/ou eosinófilos. (Figura 3C,D,E); (3) hiperplasia
e hipertrofia das células de Kupffer (Figura 3F), muitas das quais parasitadas
por amastigotas; (4) degeneração hidrópica e esteatose microvesicular (Figuras
3A,C,D); (5) congestão sinusoidal e hemossiderose difusa, mas pouco
significativas. As análises das lesões foram semi-quantitativas como mostra o
Gráfico 2 (página 37).
35
Figura 3A-F: Cortes histológicos parafinados de fígado de cães naturalmente infectados com
L. (L) chagasi.
A e B – Cão assintomático. (A)- Espaço portal com infiltrado celular de
plasmócitos (setas), linfócitos e macrófagos. Notar hepatócitos em degeneração hidrópica
(cabeça de seta). Congestão sinusoidal pode ser observada (CS). , e em (B) Observar formas
amastigotas de Leishmania nos macrófagos (seta larga) e hepatócitos vacuolizados (células
baloniformes) (cabeças de seta). (C)
Cão sintomático. Granuloma intralobular contendo
macrófagos (células epitelióides) (setas largas), plasmócitos e linfócitos (seta pequena).
Hepatócitos com degeneração hidrópica (cabeça de seta). (D,E)- Cão assintomático. (D)
Presença de granuloma intralobular contendo células epitelióides com núcleos alongados ou
ovais (seta larga), linfócitos (seta pequena) e plasmócitos (cabeça de seta), e em (E) mesmo
campo mostrando amastigotas no interior dos macrófagos dos granulomas (setas). (F)-
Cão
sintomático: Notar no campo, células de Kupffer intensamente parasitadas (setas largas). DB-
ducto biliar; LV-vaso linfático; VP- veia porta; S- sinusóide; ES-esteatose; C: congestão. A,C,D-
H&E; B,E,F- Estreptoavidina-peroxidase. Todas as barras =16µm.
36
0
1
2
3
4
5
Assintomáticos
Sintomáticos
Degeneração
Inflam.
cápsula
Inflam.
portal
Congestão
Céls.
Kuppfer
Hemos
siderina
Granulomas
Grau de intensidade
Gráfico 2 - Alterações histopatológicas observadas no fígado de cães naturalmente
infectados por L. chagasi, grupos assintomáticos e sintomáticos.
4.2.3 - Avaliação dos parâmetros bioquímicos hepáticos
Um cão do grupo assintomático apresentou aumento da
aminotransferase de aspartato (AST) e seis animais do grupo de sintomáticos
apresentaram valores acima do normal para cães (80mg/dL). Nenhum cão do
grupo de assintomáticos apresentou aumento dos níveis de amininotransferase
de alanina (ALT), porém sete cães do grupo de sintomáticos apresentaram
elevação para esse parâmetro.
A tabela apresenta os resultados da avaliação bioquímica hepática em
cães naturalmente infectados por L.chagasi e não infectados. A análise dos
dados revelou que houve diferença significativa na dosagem da ALT entre os
grupos de animais controles e sintomáticos (p<0,01, teste T de Tukey) e entre
animais dos grupos assintomáticos e sintomáticos (p<0,05, teste T de Tukey)
para o mesma enzima. Não houve diferença significativa para o parâmetro AST
entre os grupos estudados (Tabela 2).
37
Tabela 2 - Avaliação dos parâmetros bioquímicos e enzimáticos em cães
naturalmente infectados com L. chagasi e animais não infectados
Grupos Parâmetro Bioquímico (mg/dL)
AST / TGO ALT / TGP
Controle
61,70 8,46 29,70 7,32
c
Assintomático
68,60 21,23 41,90 11,31
a
Sintomático
95,30 38,97 130,00 110,59
b
Os resultados expressos como média dos valores desvio padrão. As diferenças
estatisticamente significativas (p<0,01 e p<0,05) referem-se as letras a,b e c.
O do parasitismo hepático foi então caracterizado pela técnica da
imunoistoquímica, e posteriormente quantificado o número de amastigotas
imuno-marcadas pela técnica em vinte campos analisados na objetiva de 40X.
Houve diferença estatística significativa de acordo com o Teste T não pareado
(p<0,05) entre os dados do parasitismo nos grupos clínicos estudados, sendo
que nos animais sintomáticos o parasitismo foi mais elevado (Gráfico 3).
0
10
20
30
assintomático
sintomático
*
* p=0,0158
amastigotas imunomarcadas
Gráfico 3 – Número de amastigotas marcadas por imuno-histoquímica no fígado dos
cães dos grupos assintomáticos e sintomáticos (* p<0,05 Teste T não pareado).
38
4.2.4 - Avaliação das fibras colágenas (reticulares) hepáticas pela prata
amoniacal de Gomori
As fibras reticulares hepáticas dos cães sintomáticos encontravam-se
nitidamente mais espessadas em relação ao grupo controle. Essas foram
facilmente observadas na região do espaço porto-biliar e na parede dos
sinusóides dos lóbulos hepáticos. Essas fibras eram dispostas difusamente em
várias direções formando uma trama mais espessa (Figura 4A,B) e por vezes
dando a impressão de estarem partindo dos espaço-porta para o centro do
lóbulo (Figuras 4C,D). Conforme comentado, anteriormente, a presença de
granulomas intralobulares foi um achado freqüente, mas raras fibras reticulares
puderam ser observadas dentro dessas estruturas como mostrado na
Figura 4E.
Em dois animais foi observada uma fibrose difusa peculiar. Essas fibras
circundavam grupos de hepatócitos ou mesmo uma só célula, adquirindo o
aspecto da cirrose monocelular de Natan-Larrier, (1918) e, de modo difuso,
principalmente em determinadas áreas, semelhante a chamada “Cirrose de
Rogers”, descrita por Rogers em 1908 no calazar indiano (Figura 4F).
Os resultados da quantificação do colágeno hepático mostraram
aumento significativo da deposição do colágeno hepático em ambos os grupos
de animais infectados (sintomáticos e assintomáticos), em relação aos animais
controle (ANOVA p<0,0001). Entretanto, animais sintomáticos mostraram uma
fibrilopoiese mais intensa quando comparamos aos grupos de animais
assintomáticos e controle (Gráfico 4 – pág. 42).
39
Figura 4A-F: Cortes histológicos parafinados de fígado de cães controle e cães naturalmente
infectados com Leishmania (Leishmania) chagasi. (A) Cão controle. Observar delicada trama de fibras
colágenas (reticulares) intralobulares delineando os sinusóides (setas). (B)
Cão sintomático. Observar
fibras colágenas intralobulares com espessamento marcante (setas). (C,D)
Cão assintomático. (C)
Notar fibras reticulares espessadas partindo do espaço porta em direção ao lóbulo evidenciando os
sinusóides. (D) Detalhe da figura anterior mostrando fibras reticulares espessadas ressaltando os
sinusóides. (E)
Cão assintomático: Granuloma intralobular (seta) mostrando raras fibras colágenas no
seu interior (cabeças de seta). (F)
Cão sintomático: Observar um notável espessamento das fibras
colágenas e por vezes com enclausuramento de uma única célula (hepatócito) (setas brancas). (VP)
Veia Porta; (DB) Ducto Biliar; (S) Sinusóides. Prata Amoniacal de Gomori. Barras (A,B,D,E e F) =
16µm e em (C) = 32µm.
40
Sintomático
A
ssintomático Controle
0
2500
5000
7500
Grupos de cães
Quantidade de colágeno
no fígado por
m
2
*
Gráfico 4 - Deposição de colágeno no fígado de cães nos diferentes grupos estudados.
Prata Amoníacal de Gomori , (ANOVA * p<0,0001).
4.2.5 - Correlação entre o parasitismo hepático e a deposição de colágeno
As análises de correlação entre a deposição de colágeno hepático e a
carga parasitária no fígado mostraram correlação positiva. Considerada
extremamente significativa ao teste de correlação de Pearson (r= 0,7124,
p<0,0001) como mostra o Gráfico 5.
R
2
= 0,5076
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
0 1020304
carga parasitária hepática
Deposição de colágeno
0
Gráfico 5 - Correlação entre o parasitismo hepático e a deposição de colágeno no fígado de
cães naturalmente infectados com L. chagasi. Pearson (r=0,7124, p<0,0001).
41
4.2.6 - Avaliação da laminina (LN) hepática
A laminina hepática encontrada no fígado principalmente nas regiões
portais e na parede das veias centrais (Figura 5A, B). Na parede dos
sinusóides foi descontínua (Figura 5E,F), e mais acentuada nos grupos de
animais sintomáticos e assintomáticos.
Na quantificação da LN hepática observou-se aumento significativo da
deposição do colágeno hepático nos animais do grupo sintomáticos e
assintomáticos em relação aos animais do grupo controle (ANOVA p<0,0001).
Nos animais do grupo sintomático esse aumento foi mais acentuado e
estatisticamente significativo (p<0,001, teste T tukey) quando comparamos aos
grupos de animais assintomáticos e controle. (Gráfico 6 – pág. 44).
42
Figura 5A-F – Cortes congelados de fígado de cães controle e naturalmente infectados com
Leishmania chagasi. (A,B) Cão Controle: Expressão da laminina em células de estruturas da região
portal (setas). (C,D):
Cão Assintomático: (C) Presença de laminina nas estruturas vasculares e em (D)
granuloma com poucas células positivas para laminina (setas). (E,F):
Cão Sintomático: Presença de
marcação nos sinusóides (setas) de forma difusa. No canto direito inferior observar um granuloma sem
marcação com amastigotas (seta), e em (F) Notar forte marcação da laminina nos sinusóides.
Estrepto-avidina-peroxidase. Todas as Barras = 50 µm.
43
sintomáticos assintomático
s
controles
0
1000
2000
3000
4000
**
*
***
***p<0,001,**, * p<0,05 teste T de Tukey
Expressão de laminina /
2
Gráfico 6 – Análise morfométrica da expressão de laminina hepática pela técnica imuno-
histoquímica cães nos diferentes grupos estudados.
4.2.7 - Correlação entre a expressão da laminina e o parasitismo hepático.
A Correlação entre a expressão da laminina e a carga parasitária no
fígado foi considerada positiva (Gráfico 7), estatisticamente significativa pelo
teste de correlação de Pearson (r=0,4838, p=0,0068).
R
2
= 0,234
0
1000
2000
3000
4000
0 1020304
Carga parasitária hepática
Expressão de laminina
0
Gráfico 7 – Correlação entre a carga parasitária hepática e a expressão da laminina no
parênquima hepático. Pearson, r=0,4838, p= 0,0068.
44
4.2.8 - Avaliação da Fibronectina (FN) Hepática
A Fibronectina no fígado nos grupos estudados, assim com a laminina,
encontrava-se distribuída, principalmente, nas regiões portais e sinusoidais.
Nos animais infectados a marcação da fibronectina foi observada com maior
intensidade em relação ao grupo controle (Figura 6A-C). Houve um aumento
significativo da deposição de FN nos animais infectados dos grupos
sintomáticos e assintomáticos em relação aos do grupo controle (ANOVA
p<0,0001). Nos animais do grupo sintomático este aumento foi mais acentuado
e significativo (p<0,001; teste T Tukey) quando comparado aos grupos de
animais assintomáticos e controles. Também, houve diferenças estatísticas
significativas quando comparamos a deposição de FN entre todos os grupos
(Gráfico 8 – pág.47 ).
45
50
50
50
C
B
A
Figura 6A-C:
Cortes histológicos congelados de fígado de cães controle e de
cães naturalmente infectados com Leishmania (Leishmania) chagasi: (A) Cão
Controle:Presença discreta de fibronectina no lóbulo hepático; (B) Cão
assintomático: Marcação positiva para fibronectina no lóbulo hepático. Observar
no centro da figura forte marcação ao redor de um ramo de um grande vaso
portal; (C)
Cão Sintomático: Marcação exuberante e difusa no lóbulo hepático.
Imunofluorescência para detecção de fibronectina Todas as Barras 50=µm.
46
0
1000
2000
3000
4000
5000
Sintomáticos
Assintomáticos
Controles
***
**
**
***p<0,0001; **p<0,01, teste T de Tukey
Fibronectina /
2
Gráfico 8. Análise morfométrica da deposição de fibronectina no fígado
4.3 - Baço
4.3.1 - Macroscopia
Em geral, as alterações macroscópicas observadas nos cães dos grupos
sintomáticos e assintomáticos foram o aumento de volume do órgão
(esplenomegalia), o espessamento das bordas, o aspecto rugoso e irregular da
superfície e a coloração vermelho-escura sugerindo um quadro de congestão.
Ao corte este fato se comprovava, pois a polpa vermelha era friável e muitas
vezes difluente. A polpa branca, na grande maioria dos casos, era facilmente
visualizada como pontos de coloração brancacenta, de tamanho variando de
0,2 a 0,5 cm de diâmetro, distribuídos difusamente na superfície do órgão,
indicando a hipertrofia e hiperplasia dos folículos de Malpighi (hiperplasia
folicular).
O peso relativo do baço dos animais assintomáticos e sintomáticos e dos
cães do grupo controle estão demonstrados na Tabela 3. Não houve diferença
estatística em relação ao peso relativo do baço entre os animais dos grupos
47
assintomáticos e sintomáticos. Entretanto, houve diferença significativa dos
pesos relativos dos baços desses dois grupos quando comparados ao controle.
Tabela 3- Peso relativo (peso do baço/peso corporal) dos baços dos animais
dos grupos assintomáticos, sintomáticos naturalmente infectados com
L.chagasi e do grupo controle.
Grupos
Controle
Assintomático
Peso relativo (%)
(média ± SR)
0,107 ± 0,0234
b
0,215 ± 0,0596
a
Sintomático
0,224 ± 0,0734
a
Os resultados expressos como médias dos valores erro padrão. As diferenças
estatisticamente significativas referem-se às letras a,b. ANOVA p<0,0001.
Nota: Foram mensuradas três medidas de cada órgão: o comprimento e duas larguras
(extremidades maior e menor).
4.3.2 - Microscopia
As alterações histopatológicas observadas no baço dos cães foram o
espessamento e inflamação da cápsula, a hiperplasia e hipertrofia da polpa
branca e da polpa vermelha, a congestão da polpa vermelha, a deposição de
pigmentos de hemossiderina e a depleção da bainha periarteriolar na polpa
branca, em alguns casos (Figura 7A-D).
Em geral, os fragmentos de baço analisados apresentaram
espessamento e inflamação da cápsula, com graus variados de intensidade. A
polpa branca era evidente apresentando folículos linfóides constituídos por
células dispostas em diferentes camadas, de acordo com sua afinidade
tintorial. As células mais centrais eram claras com núcleos vesiculosos e
citoplasma acidófilo contendo ou não parasitos. As células mais periféricas
eram mais escuras evidenciando seus núcleos bem corados pela Hematoxilina.
Interessantemente, esse quadro de hiperplasia e hipertrofia da polpa branca foi
mais intenso no grupo dos animais sintomáticos.
A polpa vermelha sofreu modificações, em decorrência do aumento
considerável do número de células, tanto de macrófagos marginais dos seios
quanto dos cordões de Billroth e da pronunciada neoformação conjuntiva
(fibroblastos jovens e fibrócitos), levando, no conjunto, à redução da luz dos
48
seios. Todos os cães dos grupos sintomáticos e assintomáticos analisados
apresentaram quadro de hiperplasia e hipertrofia da polpa vermelha. Parasitos
imuno-marcados foram facilmente visualizados nos macrófagos sinusoidais
(Figura 7E,F). A congestão dos seios medulares e a presença de pigmentos de
hemossiderina (confirmado pela coloração do Azul da Prússia) foi um achado
freqüente nos cães do grupo de sintomáticos. As lesões foram analisadas de
forma semi-quantitativa, classificadas como alterações discretas, moderadas e
intensas como mostra o Gráfico 9 (pág. 51).
49
Figura 7 –
Cortes Histológicos de baço de cães naturalmente infectados com Leishmania
(Leishmania) chagasi: (A,B,C) Cão Assintomático: (A) observar cápsula espessada (cabeças
de seta), polpa vermelha congesta (setas) e polpa branca reativa, apresentado folículo linfóide
evidente. (B,C) detalhes da figura anterior, sendo em (B) região da polpa vermelha contendo
macrófagos hipertróficos e vacuolizados, sendo alguns deles repletos de formas amastigotas
de Leishmania (setas). Em (C): detalhe das células do folículo linfóide (polpa branca reativa).
(D)
Cão Sintomático: folículo linfóide sem formação de centro germinativo e com diminuição
numérica de linfócitos, sendo esses substituídos por macrófagos intensamente parasitados por
formas amastigotas de Leishmania (setas). (E,F)
Cão Assintomático: Notar a presença de
formas amastigotas imunomarcadas na polpa vermelha (setas); e em (F) observar parasitos na
intimidade da trabécula esplênica (cabeças de seta) e nos macrófagos localizados no interior
da mesma (seta). (A-D) Hematoxilina-Eosina; (E-F) Estreptoavidina-Peroxidase. Barras (A)
Barra = 32µm ; (B,C,D,E,F) (Barra = 16µm). FL (Folículo Linfóide); PB (Polpa Branca); PV
(Polpa Vermelha); AC (Arteríola Central); TE (Trabécula Esplênica).
50
Gráfico 10 – Número de amastigotas marcadas por imuno-histoquímica
no baço entre grupo de cães sintomáticos e assintomáticos, (*p = 0,0014
Teste T não pareado).
0
1
2
3
4
5
Assintomáticos
Sintomáticos
Espes.
cápsula
Inf lam.
cápsula
Polpa
branca
Polpa
vermelha
Congestão
Hemossiderina
Grau de intensidade
Gráfico 9 - Alterações histopatológicas observadas no baço de cães
naturalmente infectados, sintomáticos e assintomáticos.
A presença de amastigotas de Leishmania, avaliado pela imuno-
histoquímica, e amastigotas e determinado pela contagem de parasitos por um
determinado número de campos foi analisado pelo Teste T não pareado
mostrou diferença significativa entre os grupos de cães sintomáticos e
assintomáticos (p=0,0014) (Gráfico 10).
0
500
1000
1500
assintomático
sintomático
*
* p<0,05, teste T não pareado
amastigotas imunomarcadas
51
4.3.3 Avaliação das fibras colágenas (reticulares) esplênicas pela Prata
amoniacal de Gomori
As principais alterações da matriz intersticial encontradas no baço dos
cães dos grupos sintomático e assintomático foi o aumento significativo, tanto
da espessura, quanto da quantidade de colágeno depositado na cápsula, assim
como o aumento da deposição de fibras reticulares no parênquima esplênico
quando comparamos ambos os grupos com o grupo controle.
4.3.3.1- Espessura da cápsula esplênica
A análise estatística da espessura das cápsulas esplênicas pelo teste
ANOVA demonstrou que houve diferença significativa na deposição de
colágeno entre os três grupos (p<0,001, ANOVA, Gráfico 11). Entretanto, nos
cães do grupo sintomático foi onde observamos este aumento mais acentuado
(Figura 8 A,B).
B
A
Figura 8 – Cortes histológicos parafinados de baço de cães controle e naturalmente infectados com
Leishmania (Leishmania) chagasi:: (A) Cão controle: Observar a espessura de cápsula de acordo
com a seta dupla; (B) Cão Sintomático: Notar um evidente espessamento da cápsula (seta dupla),
sendo essa formada por fibras colágenas (reticulares) espessadas e dispostas em várias direções
(seta larga). Prata Amoniacal de Gomori. (A) Barra= 64µm; (B) Barra = 16µm.
52
sintomático Assintomático Controle
0
50
100
150
Grupos de cães
Espessura da cápsula
esplênica em
m
***
**
*
Gráfico 11 - Espessura da cápsula esplênica nos grupos estudados.
Prata Amoniacal de Gomori,(*** p<0.001; * P<0.05, Teste T de Tukey).
4.3.3.2 - Correlação entre o parasitismo esplênico e a espessura da
cápsula do baço
A espessura da cápsula mostrou correlação positiva e significativa, com
o parasitismo do baço (Gráfico 12) (Teste de correlação de Pearson; r=0,7617;
p<0,0001).
R
2
= 0,5801
0
50
100
150
200
0 500 1000 1500
carga parasitária esplênica
espessura da cápsula
esplênica
Gráfico 12 - Correlação entre o parasitismo esplênico de cães
naturalmente infectados com
L. (L.) chagasi (avaliado por imuno-
histoquímica) e a espessura da cápsula do baço (Prata Amoniacal de
Gomori).
53
4.3.3.3 - Deposição de colágeno (fibras reticulares) no parênquima
esplênico
O baço dos animais sintomáticos e assintomáticos apresentaram maior
depósito de fibras reticulares distribuídos por todo o parênquima esplênico,
assim como as fibras mais espessadas em relação aquelas observadas no
baço dos animais controles (Figura 9A-D). Houve diferença estatística
significativa entre os grupos sintomáticos e assintomáticos (p<0,0001, ANOVA;
teste T p<0,01). Também, observamos significância entre os animais do grupo
sintomático e controle. Assim, não houve diferença apenas quando
comparamos a deposição das fibras reticulares entre os grupos de cães
assintomáticos e controle (Gráfico 13 – pág. 56).
54
Figura 9A-D: Cortes histológicos parafinados de baço de cães controle (A) e cães
naturalmente infectados com Leishmania (Leishmania) chagasi (B,C,D): (A): Cão Controle.
Notar delicada rede de fibras reticulares (setas). (B):
Cão assintomático: Fibras colágenas mais
proeminentes podem ser observadas (setas); (C,D)
Cão sintomático: Fibras reticulares
espessadas e mais evidentes podem ser observadas (setas). Prata Amoniacal de Gomori.
Todas as Barrras = 16µm.
55
sintomático assintomático controle
0
2500
5000
7500
**
*
*
**p<0,001, *p>0,05, teste T de Tukey
grupo de cães
Deposição de colágeno no
parênquima esplênico/
2
Gráfico 13 – Deposição de colágeno no parênquima esplênico dos
4.3.3.4 - Correlação entre o parasitismo esplênico e a deposição de
A deposição de colágeno na cápsula corada pela técnica da prata
amoniacal de Gomori, mostrou correlação
grupos de cães estudados.
colágeno no parênquima esplênico.
positiva com o parasitismo do baço
(Gráfico 14). A correlação foi significativa ao teste de correlação de Pearson
(r=0,6205, p=0,0003).
R
2
= 0,385
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
0 500 1000 1500
carga parasitária esplênica
deposição de colágeno
esplênico
Gráfico 14 - Correlação entre o parasitismo esplênico de cães
naturalmente infectados com
L. (L.) chagasi (avaliado por
imuno-histoquímica) e a deposição de colágeno na cápsula do
baço (Prata Amoniacal de Gomori).
56
4.3.4 - Avaliação da laminina (LN) esplênica
ente nas áreas de maior
vascul
A laminina foi encontrada principalm
arização (Figura 10). Na polpa branca não foi observada marcação de
LN, somente em volta dos nódulos e/ou folículos linfóides. Essa marcação foi
mais acentuada nos animais do grupo sintomático e assintomático (Figura 10).
Houve aumento significativo de LN no parênquima esplênico dos animais dos
grupos sintomáticos e assintomáticos em relação aos animais do grupo
controle (ANOVA p<0,0001; teste T p<0,001). Entre os grupos de animais
sintomáticos com os assintomáticos não houve diferença estatística (p>0,05),
como demonstra o gráfico 15, (pág. 59).
57
Figura 10A-D – Cortes congelados de baço de cães controle e naturalmente infectados com
Leishmania chagasi. (A) Cão Controle: Expressão da laminina em células da polpa
vermelha (setas). (B):
Cão Assintomático: Presença de laminina em estruturas vasculares na
polpa vermelha; (C,D)
Cão Sintomático: Presença de forte marcação em células da polpa
vermelha em relação ao controle (A) (setas). Estrepto-avidina-peroxidase para marcação da
laminina. (AC) Arteríola Central Todas as Barras = 50 µm.
58
sintomático assintomático controle
0
1000
2000
3000
**p<0,001, teste T de Tukey
**
**
*
Expressão de laminina/
2
Gráfico 15 – Análise morfométrica da expressão de laminina esplênica em
cães pela técnica imuno-histoquímica nos diferentes grupos estudados.
4.3.4.1 - Correlação entre a expressão da laminina e o parasitismo
esplênico.
A Correlação entre a expressão da laminina esplênica e a carga
parasitária no fígado foi considerada positiva (Gráfico 16), estatisticamente
significativa demonstrado pelo teste de correlação de Pearson (r=0,6159,
p=0,0003).
R
2
= 0,3793
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 500 1000 1500
Carga parasitária esplênica
Expressão de laminina
Gráfico 16 - Correlação entre a carga parasitária esplênica e a expressão da laminina no
parênquima esplênico Pearson, r=0,6159, p= 0,0003.
59
4.3.5 - Avaliação da Fibronectina (FN) esplênica
A fibronectina (FN) esplênica foi detectada em todo o parênquima do
órgão, com exceção da polpa branca onde a marcação foi menos evidente.
Nos animais sintomáticos e assintomáticos observamos que a deposição de FN
era mais acentuada em relação aos animais controles não infectados (Figura
11). Houve um aumento significativo de marcação no parênquima dos baços
dos animais dos grupos sintomáticos e assintomáticos em relação aos animais
controle (ANOVA p<0,0001; teste T p<0,001) e entre os grupos de animais
infectados (sintomáticos e assintomáticos), (p<0,001; Teste T de Tukey), como
demonstra o gráfico 17 (pág. 62).
60
A
50
B
50
C
50
Figura 11A-C: Cortes congelados de baço de cão controle (A) e de cães naturalmente
infectados com Leishmania (Leishmania) chagasi (B,C): (A) Cão Controle:Presença discreta de
fibronectina no parênquima do baço (polpa vermelha) ; (B)
Cão Assintomático: Observar forte
marcação positiva para fibronectina no parênquima esplênico no centro inferior da figura.; (C)
Cão Sintomático: Marcação exuberante e difusa no parênquima esplênico. Imunofluorescência
para detecção de fibronectina Todas as Barras 50=µm .
61
0
1000
2000
3000
4000
Fibronectina esplênica/
2
Sintomáticos Assintomáticos Controles
**
***
*
***p<0,001; **p<0,01, Teste T de Tukey
Gráfico 17 – Análise da morfométrica da expressão de fibronectina esplênica nos
diferentes grupos estudados
4.4 - Linfonodo Cervical
4.4.1 – Macroscopia
O motivo de escolha de escolha do linfonodo cervical supercial para
estudo nesta pesquisa deveu-se pelo fato de que estes linfonodos nos cães
assintomáticos e sintomáticos apresentavam-se em maior tamanho e com
maior reatividade em detrimento aos outros inspecionados durante as
necropsias e de acordo com a experiência científica do grupo (LIMA et al.,
2004).
Em geral, os linfonodos cervicais de todos os animais infectados eram
clinicamente palpáveis. À necropsia eles apresentaram aumento de peso e
tamanho (linfadenopatia) de superfície lisa e brilhante e ao corte exibiam um
líquido fluente de aspecto leitoso, indicando edema do tipo exsudato. A camada
cortical do órgão era notável e de fácil discernimento da camada medular,
devido à presença de formações nodulares, de coloração brancacenta,
sugerindo hiperplasia folicular. Esses nódulos, por sua vez, podiam ser
confluentes originando áreas de superfície mais extensas.
Não houve diferença estatística em relação ao peso relativo do órgão
entre os grupos sintomáticos e assintomáticos avaliados (p<0,05; Test T de
Tukey). A diferença estatística foi observada quando comparamos cada um dos
62
grupos de animais infectados, sintomáticos ou assintomáticos com os
linfonodos cervicais de animais controles (p<0,05; teste T de Tukey). (Tabela 4)
Tabela 4 - Peso relativo (peso do linfonodo cervical/peso corporal) dos
linfonodos cervicais dos cães do grupo assintomático, sintomático e
naturalmente infectados com L. chagasi e do grupo controle.
Grupos
Controle
Assintomático
Peso relativo (%)
(média ± SR)
0,0130 ± 0,0045
a
0,0395 ± 0,0039
b
Sintomático
0,0399 ± 0,0116
b
Os resultados expressos como médias dos valores erro padrão. As diferenças
estatisticamente significativas referem-se às letras a,b. ANOVA p=0,0253.
4.4.2 - Microscopia
As alterações mais marcantes foram a linfadenite capsular, a inflamação
dos seios subcapsulares, a hiperplasia e hipertrofia dos nódulos linfóides, a
hiperplasia e hipertrofia das células dos cordões e seios medulares
(principalmente macrófagos) e a congestão dos vasos nos cordões e seios
medulares com ou sem a presença de pigmentos de hemossiderina (Figuras
12A,B,C e D).
A linfadenite capsular e o aumento da celularidade dos seios
subcapsulares, com graus variados de intensidade foram achados freqüentes
nos cães assintomáticos e sintomáticos. Houve diferença significativa entre os
grupos estudados, assim como houve diferenças entre os grupos sintomáticos
e assintomátcos para os parâmetros congestão e deposição de hemossiderina
como mostra o Gráfico 18 (p <0,05, Kruskall-Wallis).
Em relação aos nódulos linfóides observou-se reação folicular com
formação de centro germinativo. Não raro, os folículos linfóides eram
coalescente, em correspondência ao observado à macroscopia, e as células
centrais apresentavam-se claras, com núcleo vesiculosos e citoplasma amplo.
A área periférica era constituída de células pequenas com cromatina densa
características de linfócitos. Observou-se também reação intensa da cortical
profunda, paracortical, levando a formação de verdadeiros mantos constituídos
de células mononucleares com núcleos densos e células fusiformes com
63
prolongamentos citoplasmáticos, sugerindo serem células dendríticas. Um
outro achado freqüente foi hiperplasia e hipertrofia de macrófagos dos seios e
cordões medulares, associada à presença de áreas eosinofílicas, acelulares e
amorfas indicando líquido de edema do tipo exsudato.
Não houve diferença significativa entre os grupos analisados em relação
à hiperplasia e hipertrofia dos cordões medulares e dos nódulos linfóides
(Gráfico 18) (pág. 66)
64
Figura 12A-F Cortes histológicos parafinados de linfonodos cervicais de cães naturalmente
infectados com Leishmania (Leishmania) chagasi: (A,B) Cão Assintomático: (A) Observar cápsula
espessada (setas), seios subcapsulares com células inflamatórias (cabeças de setas) e região da
cortical exibindo folículos linfóides; e em. (B) Presença de inúmeras formas amastigotas na
espessura da cápsula (setas); (C,D,E,F)
Cão Sintomático: (C) Visão panorâmica da região da
medular exibindo hipertrofia e hiperplasia das células dos cordões e dos seios. Em (D) detalhe da
figura anterior mostrando predominância de plasmócitos (setas grandes), macrófagos (cabeças de
seta) e linfócitos (setas pequenas). Em (E) observar macrófagos hipertróficos com núcleos
vesiculosos e citoplasma abundante; e em (F) Macrófagos parasitados nos cordões (setas grandes)
e seios (setas pequenas). (A,C) Hematoxilina-Eosina. Barras = 32µm ; (B,F) Estreptoavidina-
imunoperoxidase. Barra = 16µm; (D,E) Barra = 16µm. C (Cápsula); SS (Seios Subcapsulares); FL
(Folículo Linfóide); CM (Cordões Medulares); SM (Seios Medulares); VS (Vasos Sanguíneos).
65
0
1
2
3
4
5
Assintomáticos
Sintomáticos
Espes.
cápsula
Inf lam.
cápsula
Polpa
branca
Polpa
vermelha
Congestão
Hemossiderina
Grau de intensidade
Gráfico 18 - Alterações histopatológicas observadas no linfonodo cervical de cães
naturalmente infectados por L. chagasi., grupos sintomáticos e assintomáticos.
O parasitismo avaliado pela imuno-histoquímica para amastigotas e
observado pela contagem de parasitas por um determinado número de campos
e analisado pelo Teste T não pareado não demonstrou diferença significativa
entre os grupos (Gráfico 19) de cães sintomáticos e assintomáticos (p=0,1767,
Teste T não pareado ).
O número maior de amastigotas imuno-marcadas foi encontrado nos
linfonodos cervicais dos cães sintomáticos.
66
0
50
100
150
assintomáticos sintomáticos
p=0,1767
Amastigotas iminomarcadas
Gráfico 19 – Número de amastigotas marcadas pela imuno-histoquímica nos linfonodos
cervicais nos grupo de cães sintomáticos e assintomáticos não significativos, (p = 0,1767,
Teste T não pareado).
4.4.3 - Avaliação das fibras colágenas dos linfonodos cervicais pela
Prata amoniacal de Gomori.
As fibras reticulares nos linfonodos cervicais dos cães infectados, além
de uma notável deposição, apresentaram-se mais espessadas e enoveladas
em relação ao grupo controle (Figura 13A-D). É importante ressaltar que a
fibrilopoiese ocorreu, sobretudo, na região medular, pois na da região cortical,
onde se concentravam os nódulos linfóides, observamos presença discreta de
fibras reticulares (Figura 13C). À medida que se afastava da região, a
deposição colagênica era mais intensa, difusa e as fibras apresentavam-se
mais espessadas em relação às encontradas nos linfonodos dos animais
controles (Figura 13B,D).
A quantificação da deposição de colágeno nos linfonodos cervicais nos
diferentes grupos estudados, analisados pela ANOVA mostrou diferença
estatística significativa entre os grupos sintomáticos e controle (p<0,05). Não
houve diferenças estatísticas significativas quando comparamos os grupos
cães assintomáticos e controle, nem entre assintomáticos e sintomáticos
(Gráfico 20 – pág. 69).
67
Figura 13A-D: Cortes histológicos parafinados de linfonodo cervical de cães controle (A) e
cães naturalmente infectados com Leishmania (Leishmania) chagasi (B,C,D): (A): Cão
Controle. Notar delicada rede de fibras reticulares (setas) na região da cortical. (B,C,D):Cão
sintomático: (B) Fibras colágenas mais proeminentes podem ser observadas (setas) na região
da cortical; Em
(C) Cápsula com fibras reticulares espessadas e bem evidentes podem ser
observadas (seta), e em (D) fibras reticulares evidenciadas nos seios (cabeças de setas) e
cordões (setas) medulares. Prata Amoniacal de Gomori. Todas as Barrras = 16µm.
68
sintomático assintomático controle
0
2500
5000
7500
*
*p<0,05, teste T de Tukey.
grupos de cães
Deposição de colágeno em
lindonodo cervical/
2
Gráfico 20 – Deposição de colágeno no parênquima de linfonodo cervical
(região cortical e paracortical) nos diferentes grupos de cães estudados.
Prata Amoniacal de Gomori, (*p=0,0265).
4.4.3.1 - Correlação entre o parasitismo do linfonodo cervical e a
deposição de colágeno.
A avaliação da deposição de colágeno da região cortical corada pela
técnica da prata amoniacal de Gomori demonstrou correlação negativa em
relação à carga parasitária do órgão (Gráfico 21 - A). A correlação não foi
considerada significativa ao teste de correlação de Pearson (r=-0,3018,
p=0,1050) (Gráfico 19).
Por outro lado, houve correlação positiva entre a deposição de colágeno
na região medular e a carga parasitária nos linfonodos (Gráfico 21 – B). Esta
correlação foi considerada significativa ao teste de correlação de Pearson
(r=0,4064, p=0,0259).
69
A - Cortical
R
2
= 0,0911
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
0 50 100 150 200 250
carga parasitária do linfonodo cervical
deposição de colágeno
na região cortical
B- Medula
r
R
2
= 0,1651
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
0 50 100 150 200 250
carga parasitária do linfonodo cervical
deposição de colágeno
Gráfico 21 - Correlações entre o parasitismo dos linfonodos cervicais de cães
naturalmente infectados com
L. (L.) chagasi (avaliado por imuno-histoquímica) e a
deposição colagênica; A - Região cortical. B – Região medular dos linfonodos cervicais
(Prata Amoniacal de Gomori).
70
4.4.4 - Expressão da Laminina (LN) no linfonodo cervical
A laminina imuno-marcada nos linfonodos cervicais foi encontrada
principalmente na região subcapsular (células e matriz) circundando os
folículos (Figura 14A-D). Nos animais infetados houve maior marcação na
membrana basal dos vasos o quais se apresentavam ectásicos (Figura 14B).
A quantificação da laminina nos linfonodos cervicais mostrou aumento
significativo da expressão da laminina nos animais do grupo sintomáticos e
assintomáticos em relação aos animais do grupo controle (ANOVA p<0,0001,
teste T p<0,001). Quando comparamos a expressão da laminina nos
linfonodos dos grupos de animais sintomáticos e assintomáticos não houve
diferença estatística entre eles (p>0,05), como demonstra o gráfico 22, (pág.
73)
71
Figura 14A-D: – Cortes congelados de linfonodo cervical de cães naturalmente infectados com
Leishmania (Leishmania) chagasi. (A,B) Cão Assintomático: Imunomarcação da laminina em
células da região subcapsular (setas) e em células da parede dos vasos (cabeças de seta).
(C,D):
Cão Sintomático: (C) Observar inúmeras células marcadas na região da subcapsular e
cortical (seta), (D) Detalhe da figura anterior evidenciando a forte expressão de laminina (setas)
Estrepto-avidina-peroxidase. (FL) Folículo Linfóide; (VS) Vasos Sanguíneos; (CC) Camada
Cortical; (CM) Camada Medular Barras = 50 µm .
72
sintomáticos assintomático
s
controles
0
1000
2000
3000
**p<0,001, *p<0,05 teste T de Tukey
**
*
**
Expressão de laminina/
2
Gráfico 22 – Análise morfométrica da expressão de laminina nos
linfonodos cervicais de cães pela técnica imuno-histoquímica nos
diferentes grupos estudados.
4.4.4.1 - Correlação a expressão da laminina (LN) e parasitismo no
linfonodo cervical.
A Correlação entre a deposição da laminina hepática e a carga
parasitária no fígado foi considerada positiva (Gráfico 23), estatisticamente
significativa demonstrado pelo teste de correlação de Pearson (r=0,4612,
p=0,0103).
R
2
= 0,2127
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
0 50 100 150 200 250
Carga parasitária no linfonodo cervical
Expressão de laminina
Gráfico 23 - Correlação entre o parasitismo dos linfonodos cervicais de cães
naturalmente infectados com
L. (L.) chagasi e a carga parasitária. Pearson (r=0,4612,
p=0,0103).
.
73
4.4.5 - Avaliação da Fibronectina (FN) no Linfonodo cervical.
A expressão da fibronectina (FN) foi mais evidente na medular dos
linfonodos cervicais dos animais infectados com Leishmania. Nos animais
controles essa marcação era mais discreta ou pouco evidente (Figura 15 A,B e
C). A marcação da FN na região cortical dos linfonodos foi observada,
principalmente, em volta dos folículos linfóides.
Os resultados da quantificação da FN nos linfonodos cervicais
demonstraram aumento significativo da expressão da FN nos animais
infectados em relação aos animais do grupo controle (ANOVA p<0,0001; teste
T; p<0,001). A expressão de FN entre os grupos de animais sintomáticos e
assintomáticos mostrou que houve diferenças estatísticas significativas
(p<0,001), como demonstra o gráfico 24 (Pág. 76)
74
A
A
50
B
50
C
50
Figura 15 – Imunofluorescência para detecção de FN no Linfonodo cervical. A - Cão
controle. B - Fibronectina no linfonodo cervical de cão assintomático. C - Fibronectina em
linfonodo de cão sintomático.
75
0
1000
2000
3000
4000
Sintomáticos Assintomáticos Controles
Fibronectina/
2
***
**
*
***p<0,001; **p<0,01, Teste T de Tukey
Gráfico 24 – Análise morfométrica da expressão de Fibronectina nos
linfonodos cervicais de cães nos diferentes grupos estudados.
4.4.6 - Caracterização do infiltrado inflamatório nos órgãos
Houve um aumento do número de células marcadas nos órgãos (Figura
16) entre animais infectados. A maior expressão de CR3 em cães naturalmente
infectados com L. chagasi foi demonstrada qualitativamente no baço de
animais naturalmente e experimentalmente infectados com L. chagasi. Nos
animais sintomáticos essa expressão era maior quando comparados aos
assintomáticos.
Observamos uma maior expressão de CR3 nos diversos órgãos
estudados nos cães naturalmente infectados em relação aos controles. A
expressão de CR3 foi medida através da contagem do número de células
encontradas nos órgãos dos animais acometidos (dados não mostrados).
No baço, o padrão de marcação das células CR3 era ao redor da polpa
branca (zona marginal) e na polpa vermelha, com marcação celular superficial
de CR3 (marcação de membrana celular). No fígado, as células imuno-
marcadas estavam distribuídas no lóbulo hepático e no espaço porta e ao redor
do parênquima hepático. Nos linfonodo cervicais a células CR3 positivas
econtravam-se, predominantemente, na região dos cordões medulares.
76
A
B
C
Figura 16 – Cortes histológicos congelados de fígado, baço e linfonodo de cães naturalmente
infectados com Leishmania (Leishmania) chagasi. (A) Expressão celular de CR3 (CD11b) no
nas células sinusoidas (macrófagos); (B) Expressão celular de CR3 (CD11b) na polpa
vermelha (macrófagos); (C) Expressão celular de CR3 (CD11b) nos cordões e seios
medulares (macrófagos). Estrepto-avidina-peroxidase. Todas as Barras = 16µm.
77
5
5
–
–
D
D
I
I
S
S
C
C
U
U
S
S
S
S
Ã
Ã
O
O
A Leishmaniose visceral canina (LVC) é uma doença de caráter crônico
e de grande importância epidemiológica, sendo o cão o principal reservatório
urbano para a doença humana (MARZOCHI et al., 1994; ASHFORD, 2000). Os
estudos relacionados à patogênese da doença canina têm se intensificado com
intuito de um melhor esclarecimento dos mecanismos envolvidos na formação
dos sinais clínicos e lesões apresentadas pelos animais infectados (CHAGAS,
1938; DEANE E DEANE, 1955; CIARAMELLA et al., 1997; PALATINIK et al.,
2004; GUIANETTI, et al., 2006).
Atualmente, os cães são considerados os principais mantenedores e
disseminadores da Leishmania chagasi no meio urbano. A LVC caracteriza-se
por apresentar um largo espectro de lesões que varia desde a infecção
inaparente até uma forma clinica grave, que normalmente leva à morte do
animal. As principais manifestações clínicas são as lesões de pele, hipertrofia
generalizada dos linfonodos, hepatoesplenomegalia e perda de peso
(FERRER, 1992).
Um amplo espectro de lesões e alterações histopatológicas pode ser
observado durante a infecção pela L. chagasi. Em cães, as alterações
associadas à pele, como descritas na literatura, foram amplamente
encontradas, destacando-se a descamação seca 55 e a alopecia 40 .
Além disso, quando consideramos as alterações da pele em conjunto
(descamação, alopecia, seborréia e ulcerações), essas passam a ser
predominantes, o que está de acordo com o descrito por Ciaramella et al.,
(1997); Ferrer et al., (1999), Lima et al., (2004), Giunchetti et al., (2006) e
Moura et al., (2008). A dermatite esfoliativa observada estava associada à
formação de caspas de coloração brancacenta acometendo principalmente a
região das orelhas, cabeça e extremidades. Nesses casos a alopecia (perda de
pêlos parcial ou completa) foi um achado comumente associado.
No fígado dos animais assintomáticos e sintomáticos, em geral,
observamos a presença da reação inflamatória crônica, caracterizada pela
grande presença de infiltrado de células mononucleares nos espaço-porta e no
parênquima hepático (lóbulos). O exsudato inflamatório observado formava
78
arranjos especiais, que são caracterizados por alguns autores como
granulomas intralobulares hepáticos. Os granulomas eram mais freqüentes e
em maiores quantidades nos animais do grupo de cães assintomáticos. Esse
achado é descrito em modelos murinos da leishmaniose visceral (MURRAY et
al., 2001), em cães experimentalmente infectados com L. donovani e L. chagasi
(GONZALEZ et al. 1988; OLIVEIRA et al. 1993; TAFURI et al., 1996), em cães
naturalmente infectados com L. chagasi (TAFURI et al., 1996 e SANCHEZ et
al. 2004).
Estudos realizados por Sanchez et al. (2004) em cães naturalmente
infectados com L. chagasi demonstraram diferenças na resposta imunológica
observada no baço e fígado. Estes autores relatam que no baço a resposta
imune dos cães sintomáticos e assintomáticos foi muito similar. No fígado,
entretanto, os cães assintomáticos mostraram uma imunidade efetiva, com
granulomas bem formados contendo células T efetoras e numerosas moléculas
ativadoras, ao passo que, os animais sintomáticos apresentavam granulomas
não organizados compostos por infiltrado de células T, numerosas células de
Kupffer parasitadas e baixa expressão de moléculas ativadoras. Estes autores
também observaram menor parasitismo no baço, em relação ao observado no
fígado. Esses resultados, no entanto, contrastam com os achados de Tafuri et
al. (1996); Sant’Ana et al. (2007) e Lima et al., (2007) que ao estudarem cães
naturalmente e experimentalmente infectados, observaram granulomas
intralobulares bem organizados, no fígado de todos os animais estudados,
independente da forma clínica.
A deposição de fibras colágenas avaliadas pela técnica histoquímica
Prata Amoniacal de Gomori, no fígado dos cães sintomáticos e assintomáticos
estudados esteve aumentada quando comparamos a deposição dessas fibras
no fígado dos animais do grupo controle. Esses dados foram estatisticamente
significativos. De fato, em todos os animais houve a deposição de fibras
colágenas no interior dos lóbulos hepáticos, mesmo que em variado grau de
intensidade. Nos fígados dos animais sintomáticos a neoformação conjuntiva
era extremamente intensa, sendo que as fibras colágenas distribuíam-se
difusamente e em várias direções, mas sem isolar partes do parênquima ou
grupos de lóbulos hepáticos como acontece em outras hepatopatias fibrosantes
79
(Bogliolo, 1956). Essas fibras colágenas mostravam espessuras bem variadas,
sendo mais espessadas em determinadas áreas lobulares do que outras. Esse
fato poderia indicar que a deposição intralobular estaria em fase evolutiva
distinta, mesmo o processo atingindo todos os lóbulos hepáticos.
Adicionalmente, o colágeno nos espaço porta hepáticos e o da cápsula de
Glisson era proeminente, mas sem indicar continuidade com a fibrose
intralobular.
As fibras reticulares intralobulares foram bem evidenciadas pela
coloração negra, visualizadas dispostas em várias direções, ora mais espessas
ou ora mais delgadas, paralelas, oblíquas ou perpendiculares aos sinusoídes,
formando uma rede compacta em certos pontos. Em dois casos, as fibras
circundavam pequenos grupos de hepatócitos ou mesmo uma só célula,
adquirindo o aspecto da cirrose monocelular de Natan-Larrier (1918) e, de
modo difuso, principalmente em determinadas áreas, semelhante à cirrose
hepática de Rogers (1908). Achados semelhantes aos de Melo et al., (2008).
em fígados de animais naturalmente infectados com L. chagasi .
O quadro hepático apresentado pelos animais dos grupos de cães
assintomáticos e principalmente, nos animais sintomáticos assemelha-se a
fibrose intralobular difusa. Entretanto, isso difere da cirrose, pois não há
formação de nódulos regenerativos no parênquima hepáticos, constituídos por
conjuntivo neoformado que insulam partes do parênquima, grupos de lóbulos
ou mesmo parte desses, como ocorre no quadro de cirrose verdadeira, como
preconizado pela Organização Mundial de Saúde. Segundo Corbett et al.,
(1993) na leishmaniose visceral humana (LVH), além da ativação das células
de Ito devido à estase e a persistência do antígeno, a estimulação crônica das
células de Kupffer também estimularia uma reação intersticial no espaço de
Disse, acompanhada da alta ativação dessas células estreladas. Além disso, o
autor ainda discute que tanto a presença de antígenos de Leishmania nos
espaços de Disse, quanto de Imunoglobulina G (Ig G), estimulariam a síntese e
secreção de produtos da matriz.
Nesse trabalho foi encontrada correlação positiva entre a deposição de
colágeno hepático nos animais naturalmente infectados e a carga parasitária.
Assim, os cães infectados apresentam maior colanogênese hepática (fibrose
80
intralobular) que está provavelmente estimulada pela presença do parasito,
como sugerido por Bogliolo (1956) e Corbett et al., (1993) na leishmaniose
visceral humana.
Tanto a expressão de laminina, quanto a de fibronectina no fígado foi
maior nos animais sintomáticos e assintomáticos em relação aos animais do
grupo controle. Houve diferenças estatísticas entre todos os grupos avaliados,
existindo ainda, uma correlação positiva entre a expressão de laminina e
fibronectina hepática nos animais naturalmente infectados e a carga parasitária
apresentada nesse órgão. A expressão excessiva de laminina e fibronectina no
fígado de animais parasitados é um reflexo de processos inflamatórios e
degenerativos locais. Alguns trabalhos mostram que tanto a laminina, quanto a
fibronectina é secretada durante a regeneração hepática após uma
hepatectomia radical ou na cirrogênese. Nesse casos essas fibras assumem
um papel importante no processo de capilarização dos sinusóides e
remodelação local (MARTINEZ-HERNADEZ et al., 1995).
O perfil bioquímico hepático demonstrou o aumento sérico da atividade
das enzimas aminotransferase de aspartato (AST) e Amininotransferase de
alanina (ALT) nos animais infectados, principalmente nos sintomáticos. O
motivo do aumento pode ser explicado pelas várias injúrias hepáticas causadas
por Leishmania. Esses resultados corroboram com os estudos de Ferrer et al.,
(1991) com cães naturalmente infectados com Leishmania chagasi, o qual
verificou o aumento dessas enzimas correlacionado às alterações hepáticas.
A fibrose hepática ou a acumulação progressiva de matriz extracelular
(ECM) fibrilar no fígado, é a conseqüência de danos teciduais repetidos devido
à infecções (principalmente por vírus B e C), induzida por drogas, causas
metabólicas e auto-imunes, e à ativação crônica da reação de cicatrização de
feridas (Schuppan et al., 1999; Rochey,2000; Valkova, 2002; Pinzani &
Rombouts, 2004). A fibrose hepática não resulta somente de mudanças na
ECM, mas também de alterações na sua degradação, que significa uma perda
do balanço funcional dinâmico entre fibrogênese e fibrólise (Valkova, 2002).
Como o fígado torna-se fibrótico, há mudanças quantitativas e qualitativas na
composição da ECM. As fontes celulares dos componentes do tecido
conjuntivo em fibrose hepática têm sido um tema de controvérsia, mas as
81
células hepáticas estreladas (HSC) ou células de Ito são provavelmente as que
mais contribuem para esse processo, quando o dano hepatocelular é limitado
ou concentrado dentro do lóbulo hepático (Pinzani & Rombouts, 2004).
Evidências têm sido obtidas que células precursoras circulantes, chamadas
fibrócitos do sangue circulante migram para o sítio da lesão, mas ainda não foi
demonstrado o seu papel no desenvolvimento de fibrose hepática (Guyot et al.,
2005).
De acordo com Rochey (2000), a fibrose hepática representa a
cicatrização de uma ferida em resposta ao agente agressor, sendo similar à
resposta de outros órgãos à injúrias recorrentes, ou seja, independente das
causas, os mecanismos gerais de fibrose são similares. Há uma cascata de
eventos após a injúria, frequëntemente com um componente do stress
oxidativo, seguido por mobilização de células inflamatórias, que liberam
citocinas, que contribuem diretamente (e indiretamente) para a ativação das
células efetoras, como as células estreladas hepáticas (HSC). As HSC quando
ativadas liberam citocinas como a proteína quimiotática para monócito-1 (MCP-
1) e peptídeos biologicamente ativos que amplificam a resposta (Rochey, 2000;
Pinzani & Rombouts, 2004). No fígado normal essas células perisinusoidais,
também chamadas células de Ito ou lipócitos, correspondem a 5-8% do total de
células. Elas são distribuídas através do lóbulo hepático e servem como um
sítio principal de estocagem para retinóides (metabólitos da vitamina A), e
quando ativadas perdem o conteúdo lipídico, adquirindo um fenótipo
miofibroblástico (Guyot et al., 2005). Esse fenótipo é caracterizado por um alto
potencial proliferativo e por produzir um excesso de ECM (Schuppan et al.,
1999).
No baço a congestão era observada macroscopicamente pela coloração
e a fluidez de sangue ao corte do órgão, foi um achado comum e comprovado
quando observado ao microscópio óptico. O espessamento da cápsula, assim
como, a inflamação capsular e subcapsular foram observados, principalmente,
nos animais sintomáticos. Todavia, a hipertrofia e hiperplasia da polpa branca
ocorreram em todos os grupos estudados, principalmente nos animais
sintomáticos e assintomátcos. Essas alterações encontram-se descritas em
trabalhos na literatura como os de Veress et al., (1977) no homem, Tafuri et al.,
82
(1996) para animais naturalmente infectados e Tafuri et al. (1996) em animais
experimentalmente infectados. Depleção de áreas T dependentes, bainha
periarteriolar da polpa branca, no baço de hamsters e cães experimentalmente
infectados com L. donovani (CORBETT et al., 1992; KEENAN et al., 1994), tem
sido amplamente descritos na literatura, sendo que esses animais certamente
desenvolvem algum grau de imunodepressão. Nesse trabalho, essa alteração
foi observada em dois animais sintomáticos. Todavia, na região de polpa
vermelha, grande número de macrófagos parasitados pôde ser observado em
animais tanto de perfil sintomático quanto de perfil assintomático. A presença
de macrófagos, altamente parasitados no parênquima de órgãos linfóides de
animais assintomáticos, é também descrita por outros autores como Abranches
et al. (1991), Lima et al. (2004) e Xavier et al., (2006).
Na leishmaniose visceral
ocorre o desenvolvimento de uma resposta imune órgão-específico em dois
principais órgãos alvos de infecção - o baço e o fígado. Estudos indicam que o
baço, considerado local inicial da geração da resposta imune mediada por
células, também parece ser o local de persistência do parasito associada com
modificações imunopatológicas. Estas incluem esplenomegalia e distúrbios na
arquitetura tecidual que parecem contribuir para o estado de
imunocompetência do hospedeiro (
STANLEY & ENGWERDA, 2007; LIMA et
al., 2007).
Evidenciamos em nosso estudo a maior deposição de fibras reticulares
no baço dos cães dos grupos de animais sintomáticos e assintomáticos em
relação ao grupo de animais controle. Resultados estatisticamente
significativos ao compararmos a deposição colagênica entre todos os grupos.
No baço dos animais sintomáticos foi onde quantificamos a maior deposição,
sendo que nesses animais, as fibras reticulares esplênicas, apresentavam-se
mais espessadas, formando uma trama mais compacta. Outro achado
relevante no baço foi a espessura de cápsula que variou de acordo com o
grupo de animais estudados. Nos animais sintomáticos e assintomáticos essa
espessura era bem maior quando comparada com a espessura média da
cápsula dos animais controles, resultados estatisticamente significativos.
Adicionalmente, houve correlação positiva na deposição de fibras colágenas no
83
parênquima esplênico, na espessura da cápsula quando comparamos com a
carga parasitária neste órgão.
O excesso de acúmulo de MEC que leva a fibrose ocorre quando a
formação excede a degradação. Nas inflamações crônicas, conseqüência
comum das infecções parasitárias é um potente promotor de formação de
matriz extracelular (ANDRADE et al., 1991). Então, a colagênese intensa
observada nos baços dos animais infectados (sintomáticos e assintomáticos)
estaria diretamente relacionada ao parasitismo e às alterações histológicas
encontradas. Adicionalmente, a esplenomegalia foi mais preponderante nos
animais sintomáticos que apresentaram maior carga parasitária. Outro fato que
explicaria.
Outro fato que explicaria a intensa congestão e colapso estrutural do
parênquima que contribuiria para o aumento de peso e de tamanho esplênico,
assim como a deposição de fibras reticulares na leishmaniose visceral canina
postulado por Weiss et al., (1986) e Alexandre - Pires et al., (2006) é que a
presença de maior número de células reticulares que formam o leito de filtração
sinusoidal seria responsável por vários mecanismos como controle da
circulação do baço através da contração, alinhamento da expansão das células
dendríticas e reticulares promovendo a síntese de colágeno do tipo III (fibras
reticulares). Sob condições de parasitismo na leishmaniose visceral, uma
importante rede formando uma barreira dessas fibras extracelulares pode ser
vista. Esta nova condição formada está provavelmente envolvida no
impedimento ou na diminuição do fluxo de elementos sangüíneos através do
leito de filtração e conseqüentemente o trânsito dos parasitos pelo baço. Este
mecanismo reticular parece ser efetivo na origem da condição de stress pela
queda no fluxo de sangue, assim como no mecanismo imunológico esplênico.
O colapso da arquitetura sinusoidal pode ser responsável pelo processo
congestivo inicial e aumento massivo típico do órgão na leishmaniose visceral.
A expressão de laminina esplênica também foi superior nos animais
sintomáticos e assintomáticos em relação aos animais controles, porém não
houve diferenças estatísticas de expressão entre os grupos de animais
sintomáticos e assintomáticos e sim quando comparamos a expressão desses
grupos com o grupo controle. Em relação a expressão de fibronectina no baço
84
dos animais infectados observou-se um aumento estatisticamente significativo
de expressão nos animais dos grupos sintomáticos e assintomáticos. Nesses
órgãos podemos inferir que estas fibras adesivas possuem grande participação
na resposta desenvolvida contra a doença neste órgão. Em resposta a injúria
tecidual quantidades elevadas de fator de crescimento transformante (TGF-) e
de fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF) liberados pelos
macrófagos podem induzir à fibrogênese pela excessiva produção de Matriz
extracelular (JONES et al., 1992). Houve correlação positiva entre a expressão
de laminina e a carga parasitária apresentada pelos baços dos animais
naturalmente infectados com Leishmania.
Na LVC a linfadenopatia é um achado clínico freqüente (CIARAMELLA
et al, 1997; COSTA VAL, 2004; LIMA et al., 2004). Nossos resultados estão de
acordo com estes autores, pois a linfadenopatia, especialmente dos lifonodos
cervicais, foi o sinal clínico mais prevalente verificado nos cães deste
experimento. Lima et al. (2004) relatam que a linfadenopatia, observada em
cães naturalmente infectados com L. chagasi, relaciona-se principalmente com
a hipertrofia e hiperplasia dos macrófagos medulares (cordões e seios).
Adicionalmente, esses autores observaram que os linfonodos cervicais
apresentam mais alterações que os axilares e poplíteos. Segundo Ciaramella
et al. (1997) a maior reatividade dos linfonodos cervicais deve-se à sua posição
anatômica, uma vez que estes drenam as regiões cutâneas e subcutâneas da
cabeça e orelha (COSTA et al., 2008).
Na cápsula o desarranjo estrutural com neo-formação conjuntiva
associada a quadros inflamatórios é descrito não só para cães naturalmente
infectados como para animais experimentalmente infectados (Tafuri et al.,
1995). Alterações inflamatórias no seio subcapsular e a hipertrofia e hiperplasia
de macrófagos foram às alterações mais freqüentes, assim como os descritos
por Lima et al., (2004).
Os pesos relativos dos linfonodos cervicais nos grupos sintomáticos e
assintomáticos foram maiores, porém não foram estatisticamente significativos.
Somente quando comparamos os linfonodos cervicais nos animais infectados
em relação aos animais controles observamos esta diferença. As alterações
histopatológicas como linfadenite capsular, congestão e depósito de
85
hemossiderina observadas foram maiores nos animais sintomáticos quando
comparado aos assintomáticos. Todavia, não houve diferenças significativas
entre as cargas parasitárias entre os grupos de animais sintomáticos e
assintomáticos.
O parasitismo correlacionou-se positivamente com a linfadenite capsular
e com o quadro de hipertrofia e hiperplasia dos nódulos linfóides, sugerindo
que a reatividade das células dos linfonodos estejam associadas à maior
estimulação antigênica decorrente da carga parasitária. Os centros
germinativos são histologicamente definidos como agregados de células
blásticas constituindo áreas de células B, no tecido linfóide, após estimulação
antigênica. Eles estão associados com o desenvolvimento de células B de
memória e células plasmáticas, especialmente secundário a IgG e IgA (KRAAL
et al.,1982). Sabe-se que na LVC a resposta imune humoral desenvolvida é
bastante intensa, traduzindo-se na presença de elevados títulos de anticorpos
anti-Leishmania (ALVAR, 2004).
Nos linfonodos cervicais avaliados, a deposição de fibras colágenas foi
maior nos animais sintomáticos, porém não houve diferenças estatísticas
quando comparamos com a deposição colagênica nos animais assintomáticos.
Essa diferença só foi constatada quando comparamos os linfonodos cervicais
dos animais sintomáticos com os dos animais controles. Outro achado
interessante foi que na região medular dos linfonodos cervicais dos animais
sintomáticos e assintomáticos a deposição de colágeno foi mais escassa,
devido ao grande número de nódulos linfóides da região. Quando avaliávamos
a região cortical a deposição de colágeno aumentava substancialmente nos
linfonodos desses animais. A deposição era observada tanto nos cordões,
quanto nos seios medulares. Esses achados, somados com as alterações aqui
descritas devem contribuir para o aumento de tamanho e volume dos
linfonodos cervicais, quadro clínico o qual poderíamos denominar de linfadenite
reacional em animais naturalmente infectados com L.chagasi. Encontramos
também, correlação positiva entre a deposição de fibras colágenas nos
linfonodos e a carga parasitária deste órgão.
Evidenciamos um aumento da expressão da laminina nos linfonodos dos
animais sintomáticos e assintomáticos, entretanto estes resultados não foram
considerados estatisticamente significativos. Quando comparamos essa
86
expressão com as apresentadas pelos animais controles, temos então
resultados significativos. Houve correlação positiva entre a expressão de
laminina e a carga parasitária dos linfonodos cervicais.
Abreu-Silva et al. (2004) demonstraram em pesquisas com infecção
experimental em camundongos com L. amazonensis que não houve alteração
na expressão da laminina nos linfonodos poplíteos de camundongos após
noventa dias de infecção. Os resultados da expressão da fibronectina nos
linfonodos cervicais foram maiores nos animais dos grupos sintomáticos e
assintomáticos quando comparamos ao grupo controle. Estes dados
demonstram que componentes da matriz, como fibronectina e laminina estão
envolvidos diretamente na patogênese da leishmaniose visceral.
A maior expressão de CR3 (CD11CD18) em cães infectados com
L. chagasi foi demonstrada qualitativamente no baço de animais naturalmente
e experimentalmente infectados por Tafuri et al. (2006). Considerando que os
animais sintomáticos têm expressão aumentada de CR3 no baço e nos
linfonodos cervicais, e existe correlação positiva com o parasitismo tecidual
desses órgãos (dados não mostrados), podemos inferir que macrófagos CR3
positivos seriam mais uma fonte de perpetuação da infecção causada por L.
chagasi. Estes órgãos podem estar relacionados com a contínua produção de
fatores de crescimentos envolvidos na fibrogênese apresentada pelos órgãos
estudados (JONES et al., 1992; LIMA et al., 2007). Em animais naturalmente
infectados por Leishmania (Leishmania) chagasi há maior expressão de
receptores do complemento do tipo três (CR3) no baço, fígado e linfonodos,
expressos na superfície de macrófagos teciduais, podendo este achado estar
relacionado também à fibrogênese observada nestes órgãos na LVC.
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Nossos resultados permitiram concluir que os animais naturalmente
infectados por Leishmania (Leishmania) chagasi apresentam aumento
da deposição de matriz extracelular do baço, fígado e linfonodos em
relação ao grupo controle, não infectados.
Tanto o parasitismo tecidual, quanto o caráter inflamatório encontrado
nos tecidos estudados correlacionam-se com as alterações da matriz
extracelular nos tecidos dos animais infectados.
Existe correlação positiva entre o parasitismo tecidual do fígado, baço e
linfonodos cervicais de animais naturalmente infectados e a deposição
de colágeno, laminina (LN) e fibronectina (FN) nestes órgãos.
Os animais naturalmente infectados do grupo sintomáticos
apresentaram maior grau de alterações de matriz intersticial.
Animais naturalmente infectados por Leishmania (Leishmania) chagasi
apresentam maior expressão de receptores do complemento do tipo três
(CR3) no baço, fígado e linfonodos podendo este achado estar
relacionado também à fibrogênese observada nestes órgãos na LVC.
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101
ANEXO
102
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