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ASPECTOS
ESTRUTURAIS
DA
INTERAÇÃO
DE
BACTÉRIAS
DIAZOTRÓFICAS
ENDOFÍTICAS
E
CANA-DE-AÇÚCAR
(Saccharum
hyb.)
LÚCIA GRACINDA DA SILVA
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO RIO DE JANEIRO
DARCY RIBEIRO - UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
Junho - 2005
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ASPECTOS
ESTRUTURAIS
DA
INTERAÇÃO
DE
BACTÉRIAS
DIAZOTRÓFICAS
ENDOFÍTICAS
E
CANA-DE-AÇÚCAR
(Saccharum
hyb.)
LÚCIA GRACINDA DA SILVA
Tese apresentada ao Centro de
Biociências e Biotecnologia da
Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das
exigências para obtenção do grau de
Doutor em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. Fábio Lopes Olivares
Co-Orientador: Prof. Dr. Flávio Costa Miguens
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
Junho – 2005
III
ASPECTOS
ESTRUTURAIS
DA
INTERAÇÃO
DE
BACTÉRIAS
DIAZOTRÓFICAS
ENDOFÍTICAS
E
CANA-DE-AÇÚCAR
(Saccharum hyb.)
LÚCIA GRACINDA DA SILVA
Tese apresentada ao Centro de
Biociências e Biotecnologia da
Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das
exigências para obtenção do grau de
Doutor em Ciências.
Aprovada em 03 de Junho de 2005
Comissão Examinadora:
Dr. José Ivo Baldani (PhD., Microbiologia) – Embrapa Agrobiologia
Drª. Verônica Massena Reis (PhD., Microbiologia) – Embrapa Agrobiologia
Prof. Drª. Maura da Cunha (DSc., Anatomia Vegetal) - UENF
Prof. Dr. Flávio Costa Miguens (DSc., Ciências Biológicas) - UENF
Co-Orientador
Prof. Dr. Fábio Lopes Olivares (PhD., Microbiologia) – UENF
Orientador
IV
À minha maravilhosa e louca família.
Ao meu amado marido Luís Cláudio por termos um amor à
prova de quatro teses, seis orientadores e muitas ausências de bolsa.
A todos os amigos que me amam, que acreditam em mim e
que souberam entender a minha ausência em suas vidas...
V
Agradecimentos
A Deus, por sempre demonstrar seu amor por mim.
Ao Curso de Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia, em especial à Drª. Andréa
Arnoudt, atual coordenadora do curso e membro da banca de avaliação do meu plano de
tese, por ter-me aceitado como aluna de doutorado desta instituição.
Ao Laboratório de Biologia Celular e Tecidual/CBB/UENF Darcy Ribeiro Campus Leonel
Brizola por ter dado condições para a realização deste trabalho.
À Embrapa Agrobiologia pelo exemplo de colaboração científica.
À UFRRJ Campos Leonel Miranda pela colaboração ímpar no desenvolvimento de
experimentos. Destaque merecido ao meu caro amigo Josil.
A todos os órgãos de fomento responsáveis pela minha viabilidade financeira (CAPES,
CNPq, PRONEX, FAPERJ, FENORTE, BOLSAS UENF) e, principalmente à FAPERJ e ao
CNPq por terem aprovado e liberado recursos para o “Dr. Fabinho”, meu orientador em
início de carreira e com uma aluna de doutorado nas mãos...
Ao Dr. Fábio Lopes Olivares, meu orientador, amigo e irmão, OBRIGADA SEMPRE E PRA
SEMPRE. Parafraseando Ana Carolina: - Eu não quero nem saber em qual rua a minha vida
encontrou a tua. Mas isto, com certeza, faz parte de um plano Dele. Vamos voltar pra
bancada!!!!! Vamos escrever muitos trabalhos!!!!!! Trabalhar juntos é muito bom!!! Acabou!
IEIÉ!!!
Ao Dr. Flávio Costa Miguens. Meu outro orientador. Poderia te agradecer por ter me
aceitado como aluna, por ter tido a brilhante idéia de incluir criotécnicas na minha tese, por
ter me dado a oportunidade de começar a dar aula, por garantir que eu tivesse condições
financeiras de acabar esta tese e por me dar atenção e carinho em inúmeros momentos.
Mas vou te agradecer por esta tese não ser in memoriam do meu querido orientador.
Obrigada por estar vivo hoje. Super valeu!
À Drª. Rosana Rodrigues (LMGV/CCTA/UENF) por ter estado presente no início dos
trabalhos desta tese me emprestando seus meios, suas estufas e seu laboratório. E, por no
final, ter sido uma revisora atenciosa em todos os sentidos. Obrigada pela aura de paz que
me trouxestes!
Ao Dr. José Ivo Baldani. Obrigada por desde sempre querer fazer parte da minha banca de
doutorado e, com isto me encher de orgulho e pânico. Obrigada pelo exemplo de
profissionalismo a ser seguido.
À Drª. Verônica Massena Reis (Meu nome é trabalho!). Obrigada por fazer parte da minha
banca (Isto parece um filme!), e por ter demonstrado em vários momentos sua confiança
VI
profissional em mim. Porém, acima de tudo obrigada por dizer sempre aquilo que eu preciso
ouvir da maneira certa e no momento certo. Obrigada MESMO!
À Drª. Maura Da Cunha por ter sido uma amiga desde a minha chegada à UENF e por ter
estado presente e contribuído de forma decisiva em momentos cruciais da minha vida de
doutoranda. Você entrou para a história da minha vida!
Aos demais membros de minhas bancas de defesa de projeto e qualificação, professores
Drª. Maria Luíza, Drª. Valdirene, Dr. Silvaldo e Dr. Gonçalo pela valiosa contribuição à minha
formação acadêmica.
Aos professores do LBCT pelo companheirismo e aprendizado profissional.
Ao Arnoldo pela sua confiança em meu talento profissional, que me ajudou muito em muitas
horas difíceis. Obrigada por todas as considerações feitas. Espero poder contar contigo
sempre.
Ao Geraldo Baeta. JAMAIS, JAMAIS, teria conseguido dar conta de tudo sem a tua
presença na minha vida. Você não é só o lado direito do meu cérebro. Você é praticamente
o lado direito todo!!!!
À Beatriz Ferreira, por estar sempre ao meu lado desde o primeiro dia em que pisei no
laboratório me auxiliando no preparo e corte de mil amostras. Você preencheu com maestria
este coração partido por estar longe de antigos amigos...
À Márcia Adriana, pela valiosa amizade e pela paciência e devoção na revelação de todas
as minhas fotos!!! Calma que ainda tem mais!!!
À Giovana por me auxiliar nos trabalhos de crio-ultramicrotomia, por alegrar o dia a dia e por
cuidar da minha beleza...
Ao Ricardo Teixeira e ao Noil. Por terem sido presentes e atuantes em todos os momentos
que se fizeram necessários para a realização dos trabalhos desta tese. Contanto que os
aparelhos estivessem funcionando..., Claro!
À Adrianinha, por ter entendido, não sem sofrimento, a chegada de muitas placas, vidrinhos,
jornais, geladeiras, meios de cultura coloridos, muito material para esterilizar!!!
A todos os demais técnicos do laboratório. Como diria Franklin Delano Roosevelt: - São os
soldados que ganham as guerras não os generais. Muito obrigada por tudo.
Ao Jorge, secretário da Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Biociências e
Biotecnologia por toda a preocupação, força, atenção e entusiasmo com cada etapa
ultrapassada por mim para a defesa desta tese. Obrigada por todos os telefonemas!!!!!!!!
À Soraia, por ser minha amiga, por ter me ajudado muito a entender a UENF e por tomar
conta direitinho do nosso Cachinhos de Anjo. Confio em você amiga!!!
VII
À Rosane Mota Costa por me mostrar que é muito fácil ter marido, três filhos, cachorro,
cuidar da casa, estudar, dar aula, fazer experimento, defender tese, corrigir tese, conferir
referências bibliográficas de uma certa amiga alucinada viciada em ABNT e manter o bom
humor!!! UFA!!
Ao Erineudo, Erimyfriend, sua chegada ao nosso grupo de pesquisa me deu a tranqüilidade
que eu precisa para acabar esta tese. Obrigada pelo carinho, atenção e pela atuação
decisiva na conferência das minhas referências.
Ao Ricardo Alexandre pelo companheirismo e auxílio inestimável nas atividades
microscópicas finais desta tese.
À Siva por, além da amizade e companheirismo sempre, ter sido responsável por toda a
parte bucrocrática relacionada à defesa desta tese. Quanta competência!!!
À Fabiana por ser responsável por um dos momentos mais felizes da minha vida. E pela
amizade, também, claro.
Ao meu querido amigo idolatrado salve, salve, Jorge André, por dividir comigo todos os
momentos bons e maus desta jornada que parecia infindável do doutorado. Obrigada por
tudo mesmo. Como diz nossa amiga Rosane: - Todo mundo tem o amigo Jorge André que
merece. Nós, graças a Deus temos o próprio. Para o infinito e além!!!!!!!!!!!!!!!!
À Drª. Tecia (UFRJ) e à minha amiga Dorimar (Embrapa Agrobiologia) por fazerem
verdadeiras escavações arqueológicas na busca de todos os artigos datados de
19emuitacoisalápratrás.
E a todas as demais pessoas que contribuíram de alguma forma para a realização deste
trabalho.
VIII
“At last, my PhD thesis!
When I arrived in Wageningen, five years ago, to start my thesis, I thought
that PhD was only about science…
Fortunately I was mistaken!
During this period I learn a lot about science, but also about myself, about
people and about life.
It was certainly a rewarding experience.”
Texto extraído dos agradecimentos da tese da minha amiga Drª. Joana Falcão Salles
defendida em 13/04/2005 no Netherlands Institute of Ecology. Faço dessas minhas palavras.
IX
SUMÁRIO
Páginas
RESUMO GERAL......................................................................................
XVIII
GENERAL ABSTRACT.............................................................................
XX
1. INTRODUÇÃO GERAL............................................................................. 1
2. REVISÃO DE LITERATURA.....................................................................
5
2.1. A Cana-de-Açúcar: características gerais, histórico e
importância no Brasil........................................................................
5
2.2. Interações Bactéria-Planta...............................................................
8
2.3. Influência dos Microrganismos no Crescimento Vegetal............. 13
2.4. Fixação Biológica de Nitrogênio na Cultura da Cana-de-Açúcar.
17
2.5. Bactérias Endofíticas………………………………………………...... 19
2.5.1. Bactérias diazotróficas endofíticas relacionadas à cana-de-
açúcar....................................................................................... 21
2.5.1a. Gluconacetobacter diazotrophicus.................................
21
2.5.1b. Herbaspirillum seropedicae............................................
24
2.5.1c. Herbaspirillum rubrisubalbicans……………………….....
26
CAPÍTULO I: ESTABELECIMENTO
IN
VITRO
DE
BACTÉRIAS
DIAZOTRÓFICAS
ENDOFÍTICAS
EM
PLÂNTULAS
MICROPROPAGADAS
DE
CANA-DE-AÇÚCAR
SOB
SISTEMAS
MONOXÊNICOS
DE
LONGA
DURAÇÃO.................................................... 29
1. RESUMO................................................................................................... 30
2. ABSTRACT................................................................................................
31
3. INTRODUÇÃO...........................................................................................
32
4. MATERIAL E MÉTODOS..........................................................................
34
4.1 Estirpes Bacterianas Utilizadas....................................................... 34
4.2 Obtenção das Plântulas Micropropagadas..................................... 35
4.3 Inoculação das Plântulas..................................................................
35
4.4. Avaliações no Sistema Monoxênico de Longa Duração.............. 35
4.4.1. Delineamento experimental e análise do desenvolvimento das
plântulas......................................................................................
37
4.4.2. Quantificação da população de bactérias associadas às
raízes.......................................................................................... 37
4.4.3. Técnicas microscópicas e imunológicas aplicadas à detecção
das bactérias em tecidos vegetais..…………….....................…. 38
4.4.3a. Microscopia óptica e eletrônica de transmissão................ 38
4.4.3b. Microscopia eletrônica de varredura................................. 39
4.4.3c. Imunolocalização das bactérias utilizando anticorpos
secundários marcados com fluorocromos......................... 39
4.4.3d. Imunolocalização da enzima nitrogenase......................... 40
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................
42
6. CONCLUSÕES.........................................................................................
62
CAPÍTULO II: ASPECTOS ULTRA-ESTRUTURAIS DE Herbaspirillum
seropedicae E H. rubrisubalbicans E DA INTERAÇÃO DE H. seropedicae
Z67 COM PLÂNTULAS MICROPROPAGADAS DE CANA-DE-AÇÚCAR
(var. RB72454).............................................................................................. 64
1. RESUMO................................................................................................... 65
2. ABSTRACT............................................................................................... 66
3. INTRODUÇÃO...........................................................................................
67
4. MATERIAL E MÉTODOS..........................................................................
72
4.1. Crescimento Bacteriano...................................................................
72
X
4.1.1. Estirpes bacterianas utilizadas....................................................
72
4.1.2. Em condições de não fixação de nitrogênio............................... 72
4.1.3. Em condições de fixação de nitrogênio...................................... 73
4.2. Plântulas Micropropagadas de Cana-de-Açúcar........................... 73
4.3. Inoculação com Bactérias Diazotróficas Endofíticas....................
73
4.3.1. Para a realização de congelamento em alta pressão............... 73
4.4. Criotécnicas.......................................................................................
74
4.4.1. Criofratura de suspensões bacterianas................................. 74
4.4.2. Crio-imobilização por congelamento em alta pressão............ 75
4.4.3. Fixação por substituição a frio................................................ 75
4.4.4. Crio-ultramicrotomia................................................................
76
4.4.4a Imunomarcação com ouro para a detecção da enzima
nitrogenase...................................................................... 76
4.5. Detecção de Carboidratos Ácidos.................................................. 77
4.6. Imunolocalização da Enzima Nitrogenase após Crio-
imobilização e Criofrixação........................................................... 78
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................... 79
5.1. Análise Ultra-estrutural de Herbaspirillum spp. Crescidas em
Meio de Cultivo por Criofratura Convencional 79
5.2. Análise Ultra-estrutural da Associação de H. seropedicae com
Plântulas Micropropagadas de Cana-de-açúcar por
Criotécnicas.................................................................................... 93
5.3. Imunolocalização da Enzima Nitrogenase e Detecção de Sítios
Aniônicos na Superfície da Bactéria.............................................
108
6. CONCLUSÕES.........................................................................................
112
CAPÍTULO III: ASPECTOS ULTRA-ESTRUTURAIS DE
Gluconacetobacter diazotrophicus E DE SUA INTERAÇÃO COM
PLÂNTULAS MICROPROPAGADAS
DE CANA-DE-AÇÚCAR (var.
RB72454)...................................................................................................... 114
1. RESUMO................................................................................................... 115
2. ABSTRACT............................................................................................... 116
3. INTRODUÇÃO...........................................................................................
117
4. MATERIAL E MÉTODOS......................................................................... 121
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................
122
5.1. Análise Ultra-estrutural de G. diazotrophicus em Diferentes
Condições de Crescimento..................................................................
122
5.2. Análise Ultra-estrutural G. diazotrophicus em Interação com
Plântulas Micropropagadas de Cana-de-Açúcar................................
134
6. CONCLUSÕES........................................................................................ 142
CONSIDERAÇÕES FINAIS.......................................................................... 145
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................
146
XI
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO
I
Figura 1: Vidros contendo plântulas micropropagadas de cana-de-açúcar (var. SP70-1143)
inoculadas com diferentes estirpes das bactérias G. diazotrophicus, H. seropedicae e H.
rubrisubalbicans, crescidas em meio ágar (5%) com ¼ dos sais do meio LGI-P por 11
meses sem adição posterior de nutrientes e com fotoperíodo controlado..............................
36
Figura 2: Plântulas micropropagadas de cana-de-açúcar (var. SP70-1143) inoculadas com
diferentes estirpes de Herbaspirillum seropedicae, H.rubrisubalbicans e G. diazotrophicus,
crescidas em meio ágar (5%) com ¼ dos sais do meio LGI-P por 4 meses sem adição
posterior de nutrientes e com fotoperíodo controlado.............................................................
42
Figura 3: Número total de folhas senescentes (palha) nas plântulas micropropagadas de
cana-de-açúcar var. SP70-1143, inoculadas com as bactérias G. diazotrophicus (PR2 e
PAL3), H. seropedicae (Z67 e HRC54) e H. rubrisubalbicans (HCC103 e M4) e controle,
avaliadas 30 dias após a inoculação. Letras diferentes, dentro de cada barra, diferem pelo
teste de Tukey a 5%................................................................................................................
44
Figura 4: Número total de plantas micropropagadas de cana-de-açúcar var. SP70-1143,
inoculadas com as bactérias G. diazotrophicus (PR2 e PAL3), H. seropedicae (Z67 e
HRC54) e H. rubrisubalbicans (HCC103 e M4) e controle avaliadas 30 dias após a
inoculação. Letras diferentes, dentro de cada barra, diferem pelo teste de Tukey a
5%...........................................................................................................................................
44
Figura 5: Número de indivíduos por classe de tamanho de plântulas micropropagadas de
cana-de-açúcar var. SP70-1143, inoculadas com as bactérias G. diazotrophicus (PR2 e
PAL3), H. seropedicae (Z67 e HRC54) e H. rubrisubalbicans (HCC103 e M4) e controle
avaliadas 30 dias após a inoculação. Letras diferentes, dentro de cada barra, diferem pelo
teste de Tukey a 5%................................................................................................................
46
Figura 6: Número total de perfilhos observados nas plântulas micropropagadas de cana-
de-açúcar var. SP70-1143, inoculadas com as bactérias G. diazotrophicus (PR2 e PAL3),
H. seropedicae (Z67 e HRC54) e H. rubrisubalbicans (HCC103 e M4) e controle avaliados
30 dias após a inoculação.......................................................................................................
46
Figura 7: Número total de raízes das plântulas micropropagadas de cana-de-açúcar var.
SP70-1143, inoculadas com as bactérias G. diazotrophicus (PR2 e PAL3), H. seropedicae
(Z67 e HRC54) e H. rubrisubalbicans (HCC103 e M4) e controle avaliados 30 dias após a
inoculação. Letras diferentes, dentro de cada barra, diferem pelo teste de Tukey a
5%...........................................................................................................................................
48
Figura 8: Número total de raízes secundárias das plântulas micropropagadas de cana-de-
açúcar var. SP70-1143, inoculadas com as bactérias G. diazotrophicus (PR2 e PAL3), H.
seropedicae (Z67 e HRC54) e H. rubrisubalbicans (HCC103 e M4) e controle avaliados 30
dias após a inoculação. Letras diferentes, dentro de cada barra, diferem pelo teste de
Tukey a 5%.............................................................................................................................
48
Figura 9: Crescimento (cm) da parte aérea e das raízes de plântulas micropropagadas de
cana-de-açúcar var. SP70-1143, inoculadas com as bactérias G. diazotrophicus (PR2 e
PAL3), H. seropedicae (Z67 e HRC54) e H. rubrisubalbicans (HCC103 e M4) e controle
avaliados 11 meses após a inoculação. Letras diferentes, dentro de cada barra, diferem
pelo teste de Tukey a 5%........................................................................................................
49
Figura 10: Massa (g) de raízes, folhas e folha senescentes (palha) frescas de plântulas
micropropagadas de cana-de-açúcar var. SP70-1143, inoculadas com as bactérias G.
diazotrophicus (PR2 e PAL3), H. seropedicae (Z67 e HRC54) e H. rubrisubalbicans
(HCC103 e M4) e controle avaliados 11 meses após a inoculação. Letras diferentes, dentro
de cada estrutura, diferem pelo teste de Tukey a 5%.............................................................
51
Figura 11: Massa (g) de raízes, folhas e folha senescentes (palha) secas de plântulas
micropropagadas de cana-de-açúcar var. SP70-1143, inoculadas com as bactérias G.
diazotrophicus (PR2 e PAL3), H. seropedicae (Z67 e HRC54) e H. rubrisubalbicans
(HCC103 e M4) e controle avaliados 11 meses após a inoculação. Letras diferentes, dentro
de cada estrutura, diferem pelo teste de Tukey a 5%.............................................................
51
XII
Figura 12: Controle não inoculado e sem a utilização de Azul de Toluidina antes da
imunomarcação.......................................................................................................................
54
Figuras 13 e 14: H. seropedicae aderida à superfície das paredes periclinais externas de
raízes. Observar as bactérias colonizando as junções entre as células da epiderme
(setas)......................................................................................................................................
54
Figura 15: Herbaspirillum seropedicae (Z67) (pontos verdes) colonizando a região de
formação de raiz secundária/pêlo radicular (estrela)...............................................................
54
Figura 16, 17 e 18: Herbaspirillum seropedicae (Z67) colonizando a zona pilífera da raiz
(zp). Observar adesão das bactérias à superfície das paredes periclinais externas dos
pêlos........................................................................................................................................ 54
Figura 19: Corte transversal de raiz primária. Notar a integridade dos diferentes sistemas
de tecido vegetais. Notar emissão de raiz secundária (seta) em destaque. MO.....................
56
Figura 20: Adesão de células de H. seropedicae (setas) à superfície das paredes
periclinais externas do pêlo radicular (p). Observar maior concentração de células na base
do pêlo. MO.............................................................................................................................
56
Figura 21: Adesão de micro-colônias de H. seropedicae (setas) nas junções das células da
epiderme (ep). MO...................................................................................................................
56
Figura 22: Herbaspirillum seropedicae (Z67) no interior do apoplasto da região cortical
radicular. Parede celular vegetal (pcv), bactéria (b), espaço intercelular (ei), grânulo de
PHB (seta). MET.......................................................................................
56
Figura 23: Herbaspirillum seropedicae (Z67) no interior do apoplasto da região cortical
radicular. Observar partículas de ouro referentes à imunolocalização da enzima
nitrogenase (setas), MET........................................................................................................
56
Figura 24: Colônias (c) em crescimento na superfície das paredes periclinais externas da
raiz. MEV.................................................................................................................................
59
Figura 25: Observação de detalhe da referida colônia onde é possível a visualização da
existência de matriz fibrosa (setas) setas envolvendo todas as células da mesma.
MEV.........................................................................................................................................
59
Figura 26: Outro detalhe da colônia onde pode ser observada a presença de polimorfimos
(estrelas) das células bacterianas. SEM.................................................................................
59
Figuras 27: Detalhes de parte da colônia próxima à superfície das paredes periclinais
externas da raiz. Note a grande quantidade de matriz fibrosa (setas) envolvendo as
mesmas. MEV.........................................................................................................................
59
Figura 28: Colônias (c) em crescimento na superfície das paredes periclinais externas da
raiz. MEV.................................................................................................................................
59
Figuras 29: Colônia localizada próxima à superfície das paredes periclinais externas da
raiz e totalmente envolta pela matriz (asteriscos)...................................................................
59
Figura 30: Colônias (c) de H. rubrisubalbicans (HCC103) formadas na superfície de meio
NFB3X sólido. MEV.................................................................................................................
61
Figura 31: Observação de detalhe da colônia onde podemos observar as células
bacterianas em intima associação (estrelas). MEV.................................................................
61
Figuras 32 e 33: Observação de detalhe da colônia onde se pode observar a ocorrência
reduzida de matriz fibrosa (setas pretas e brancas) entre algumas células que compõem a
colônia. MEV...........................................................................................................................
61
Figura 34: Detalhe de células presentes na colônia onde podemos observar a
ornamentação da parede celular bacteriana. Observe pequenos “brotamentos” (setas) em
duas células. MEV...................................................................................................................
61
Figura 35: Visualização da face externa da parede bacteriana, onde podemos observar a
existência de pequenas projeções (“brotamentos”) (setas). MEV...........................................
61
CAPÍTULO II
Figura 1: Plântulas micropropagadas de cana-de-açúcar (híbridos interespecíficos de
Saccharum sp.) crescidas em meio de cultivo MS..................................................................
74
Figura 2: Célula de H. rubrisubalbicans crescida em meio DYGS. Observar a ocorrência
de compartimentalização em determinas regiões (setas).......................................................
84
Figura 3: Célula de H. rubrisubalbicans crescida em meio JNFb semi-sólido. Observar
região com menor densidade de partículas (estrela)..............................................................
84
XIII
Figura 4: Célula de H. rubrisubalbicans crescida em meio DYGS. Observar região que
sugere a ocorrência de divisão celular (seta)..........................................................................
84
Figura 5: Célula de H. rubrisubalbicans crescida em meio JNFb semi-sólido. Observar a
ocorrência de distribuição homogênea de partículas na superfície
celular......................................................................................................................................
84
Figura 6: Célula de H. rubrisubalbicans crescida em meio JNFb semi-sólido. A fratura
expôs as faces P (FP) e externa (asterisco) da membrana celular. pb – parede
bacteriana................................................................................................................................
84
Figura 7: Célula de H. rubrisubalbicans crescida em meio DYGS. Observar regiões que
podem indicar o início de compartimentalização verificada na figura 2..................................
84
Figura 8: Células crescidas em meio DYGS líquido sob condições de não fixação de
nitrogênio. Observar a presença de deformações tipo agulha (setas)...................
86
Figura 9: Células crescidas em meio DYGS líquido sob condições de não fixação de
nitrogênio. Observar a presença de deformações tipo cogumelo (setas)................................
86
Figuras 10 e 11: Células crescidas em meio JNFb semi-sólido sob condições de fixação
de nitrogênio. Observar a presença de deformações tipo agulha (setas)...............................
86
Figura 12: H. seropedicae crescida em meio DYGS. Notar a semelhança de sua superfície
com a de H. rubrisubalbicans crescida nas mesmas condições.............................................
88
Figura. 13: H. seropedicae em meio DYGS. Notar orientação das partículas (setas brancas
e pretas) em sua superfície.....................................................................................................
88
Figura. 14: H. seropedicae em meio JNFb semi-sólido. Notar semelhança com a figura 5 e
com H. rubrisubalbicans crescida nas mesmas condições.....................................................
88
Figura. 15: H. seropedicae em meio JNFb semi-sólido. Notar que a fratura expôs região da
célula bacteriana com menor incidência de partículas (estrela).............................................
88
Figura 16: H. seropedicae crescida em meio DYGS onde podemos observar a ocorrência
de várias deformações do tipo agulha (setas) sofridas pelos grânulos de PHB/PHA em seu
citoplasma. Notar a nítida formação da estrutura radiada que ancora o núcleo dúctil
(cabeça de seta)......................................................................................................................
90
Figura. 17: Detalhe da deformação tipo agulha ocorrida em grânulos de PHB/PHA
homopolímeros. Notar região de ancoramento (dupla seta)...................................................
90
Figura. 18: H. seropedicae em meio JNFb semi-sólido. Notar a redução do diâmetro da
estrutura radiada e a ausência do núcleo dúctil (seta)............................................................
90
Figura. 19: H. seropedicae em meio JNFb semi-sólido. Observe a presença de dois
grânulos de PHB onde deve ter ocorrido a perda total do conteúdo do mesmo.....................
90
Figuras 20, 21 e 22: H. seropedicae após criofratura. O observar a formação de
aglomerados de partículas no citoplasma bacteriano (setas).................................................
92
Figuras 23 e 24: Imunomarcação com ouro coloidal visando à localização da enzima
nitrogenase em células de H. seropedicae (HRC54) após crio-ultramicrotomia. Observar a
alta densidade destas partículas (setas).................................................................................
92
Figura 25: Observe vários e volumosos grânulos de poli-β-hidroxi-butirato (PHB) no
citoplasma bacteriano. Visão geral da parede celular bacteriana (seta).................................
97
Figura 26: Célula bacteriana próxima à parede celular vegetal (pcv). As setas indicam
estruturas que parecem ser oriundas da parede celular bacteriana.......................................
97
Figura 27: Célula bacteriana aderida à parede celular vegetal (pcv). Observe que ambos
os limites celulares desaparecem (seta).................................................................................
97
Figure 28: Célula bacteriana imersa na parede celular vegetal (seta branca).......................
97
Figura 29: Célula bacteriana próxima à parede celular vegetal (pcv). Observe estrutura tipo
vesícula que parece se originar da parede celular vegetal.....................................................
97
Figura 30: Observe detalhe da estrutura vesicular evidenciada na figura anterior................
97
Figuras 31 e 32: Células de Herbaspirillum seropedicae (Z67) em região dos meatos
celulares (m). Notar o baixo número populacional no interior dos mesmos....
99
Figuras 33: Células de Herbaspirillum seropedicae (Z67) em região dos meatos celulares.
Notar o grande número de células presentes nos meatos e o alargamento dos mesmos.
Observar elétron-densidade em diversas áreas da parede celular (setas).............................
99
Figuras 34 e 35: Células de Herbaspirillum seropedicae (Z67) colonizando o xilema
foliar.........................................................................................................................................
99
XIV
Figura 36 e 37: Células bacterianas localizadas próximas à parede celular vegetal (pcv)
onde podemos observar a presença de substância envolvendo as mesmas como uma
membrana (seta). Esta substância parece originar-se da parede celular vegetal
adjacente.................................................................................................................................
103
Figura 38: Célula bacteriana próxima a material elétron-denso que, aparentemente, se
origina a partir da parede celular vegetal como resposta à presença da bactéria..................
103
Figura 39: Células bacterianas aderidas à parede celular vegetal. Note a polarização das
células em relação ao local de adesão das mesmas à parede celular vegetal
(seta)........................................................................................................................................
103
Figure 40: Célula bacteriana aderida à parede celular vegetal onde verificamos a
existência de pequena projeção (seta) oriunda da célula bacteriana e que se dirige em
direção à parede celular vegetal..............................................................................................
103
Figure 41: Célula bacteriana aderida à parede celular vegetal. Note que o limite entre as
duas paredes parece desaparecer (seta)................................................................................
103
Figura 42: Grupos de células bacterianas envoltas por matriz de aspecto denso e
homogêneo. Observe que esta matriz parece estar relacionada a grupos específicos de
células (setas). Note, também, a presença de matriz de aspecto fibroso que parece se
originar da parede celular vegetal (estrela)..............................................................................
105
Figura 43: Células bacterianas em local próximo a meatos celulares (m). Note a presença
de bactérias no interior destes meatos. Novamente podem ser observados os dois tipos de
matriz (fibrosa – estrela, homogênea – setas).........................................................................
105
Figura 44: Dois grupos celulares distintos onde se observa a presença de matriz densa e
homogênea envolvendo os grupos separadamente (asterisco)..............................................
105
Figura 45: Grupos celulares, ressaltando-se o início da formação da matriz entre as
células......................................................................................................................................
105
Figura 46: Células bacterianas próximas à parede celular vegetal onde se visualiza a
formação da matriz fibrosa que envolve as células próximas. Note ligação desta matriz com
a parede celular vegetal (seta) e a presença de grupos de bactérias envoltas pela matriz
densa (asterisco).....................................................................................................................
105
Figura 47: Aglomerado celular onde se observa a presença de polimorfismo e a pouca
definição nos limites celulares.................................................................................................
105
Figuras 48: Células bacterianas organizadas em fileiras próximas à parede celular vegetal
(pcv), podendo-se observar algumas células aderidas à mesma (seta). Todas as células
encontram-se envoltas pela matriz fibrosa (asterisco)............................................................
105
Figuras 49 e 50: Grupo de células bacterianas próximas à parede celular vegetal (pc).
Observa-se a presença de matriz fibrosa (asterisco) envolvendo as células bacterianas.......
107
Figura 51: Células bacterianas próximas à parede celular vegetal (pcv) observando-se a
presença de polimorfismo e a pouca definição nos limites celulares. Comparar com a figura
47.............................................................................................................................................
107
Figuras 52: Notar a presença de partículas de FC em todo o perímetro da célula (seta).......
111
Figuras 53: Notar a presença de partículas de FC na região entre duas células adjacentes.
Notar, também, um adensamento da marcação nesta região se comparado ao restante da
célula (seta). Interessante notar que a célula adjacente não apresenta marcação................
111
Figuras 54: Notar a presença partículas de FC (seta) no local de divisão celular, indicando
alteração de carga nesta região..............................................................................................
111
Figura 55: Imunolocalização da enzima nitrogenase. Notar marcação próxima aos
grânulos de PHB (seta)...........................................................................................................
111
Figura 56: Detalhe da imunolocalização da enzima nitrogenase no citoplasma celular.
Observe região próxima à membrana celular com adensamento de partículas de ouro
(cabeça de seta)......................................................................................................................
111
Figura 57: Interior citoplasmático de H. seropedicae evidenciando intensa marcação para
a enzima nitrogenase (setas)..................................................................................................
111
XV
CAPÍTULO III
Figura 1: Notar que o plano de fratura expôs a membrana celular e parte do citoplasma
(c). Neste encontra-se uma região que parece indicar a existência de porção diferenciada
na periferia do citoplasma (seta). A concentração de partículas encontra-se reduzida em
ambas as faces expostas, apesar da existência de pequena concentração das mesmas na
membrana celular bacteriana (cabeça de seta).....................................................................
127
Figura 2: O plano de fratura expôs as faces interna e externa da parede celular bacteriana.
Notar em ambas a presença de aspecto ondulado da estrutura e a baixa concentração de
partículas. Presença de estrutura vesicular na periferia do citoplasma (seta).........................
127
Figura 3: O plano de fratura indica estado de divisão celular. Notar região de
estrangulamento entre as duas células com aspecto superficial diferenciado (seta)..............
127
Figura 4: Célula de G. diazotrophicus em divisão celular. Notar a manutenção de
intercomunicação das duas células no interior celular (seta)..................................................
127
Figura 5: Plano de fratura evidenciando o citoplasma bacteriano. Notar regiões de
organização diferenciada próximas à periferia da célula (setas)............................................
127
Figuras 6 e 7: O plano de fratura evidenciou a existência de estrutura em forma de
vesícula (seta) na região periférica das células......................................................................
129
Figura 8: Célula de G. diazotrophicus em divisão. O plano de fratura evidenciou a
existência de estrutura em forma de vesícula (setas) que parece estar tanto relacionada à
membrana celular quanto ao citoplasma. Notar enfileiramento de partículas na região de
divisão celular na figura em destaque (cabeças de seta).......................................................
129
Figuras 9: O plano de fratura evidenciou a existência de estrutura em forma de vesícula na
região periférica das células. Notar a presença de partículas associadas à mesma
(setas)......................................................................................................................................
129
Figura 10: Superfície da parede bacteriana de G. diazotrophicus. Notar a baixa freqüência
de partículas na mesma..........................................................................................................
131
Figuras 11 e 14: Região da parede celular bacteriana onde pode ser observada uma maior
freqüência de partículas. Notar aspecto estrutural diferenciado na Figura 11 (setas
pequenas)................................................................................................................................
131
Figura 12: Superfície da parede celular bacteriana onde pode ser observada em duas
regiões de fratura distintas partes da membrana celular.........................................................
131
Figura 13: Célula de G. diazotrophicus onde pode ser observada parte da parede e da
membrana celular bacteriana. Observar a diferença de concentração de partículas nas
faces expostas.........................................................................................................................
131
Figura 15: Célula de G. diazotrophicus onde pode ser observada a parede celular
bacteriana (pb) e o interior citoplasmático (c)..........................................................................
131
Figura 16: Célula de G. diazotrophicus onde foram evidenciadas as regiões envolvidas
com o envoltório celular. Notar que o citoplasma celular apresenta aspecto homogêneo......
133
Figuras 17: Células de G. diazotrophicus com estruturas em forma de vesículas na região
periférica do citoplasma onde podemos observar regiões do mesmo sem a presença de
partículas (asterisco). Notar partículas associadas às vesículas (setas).................................
133
Figura 18: Região do citoplasma (c) bacteriano onde podem ser observadas a presença
de vesículas. ...........................................................................................................................
133
Figura 19: Região do citoplasma (c) bacteriano onde podem ser observadas a presença
de vesículas (asterisco). Notar região do citoplasma sem a presença de partículas () e a
existência das mesmas associadas às estruturas vesiculares. Destaque para região com
aspecto listrado (setas)............................................................................................................
133
Figuras 20 e 21: Células de G. diazotrophicus crescidas em condição de fixação de
nitrogênio. Notar estruturas tipo membranas no citoplasma celular (setas)............................
133
Figuras 22 e 23: Células de G. diazotrophicus com estruturas em forma de vesículas na
região periférica do citoplasma (setas)....................................................................................
133
XVI
Figura 24: Colonização de G. diazotrophicus no espaço intercelular, onde é possível
observar a intensa formação de vesículas (v) a partir da parede celular vegetal adjacente.
Presença de polimorfismo celular bacteriano. Verificar no detalhe células em aparente
divisão celular (setas)..............................................................................................................
137
Figura 25: Detalhe de outra região apoplástica colonizada por G. diazotrophicus. Observar
matriz adjacente à região de formação das vesículas onde ocorre a presença bacteriana
(asterisco)................................................................................................................................
137
Figura 26: Célula de G. diazotrophicus em aparente estado de divisão celular. Note a
aparente polarização celular e o início da formação vesicular a partir da parede
(seta)........................................................................................................................................
137
Figura 27: Células de G. diazotrophicus próximas à parede celular vegetal. Notar que além
da presença de vesículas pode ser observado a presença de dois tipos diferentes de
matrizes. Uma mais homogênea (asterisco), similar às observadas nas figura 28, e outra
próxima à parede (estrela).......................................................................................................
137
Figura 29: Célula de G. diazotrophicus em contato com vesícula. Notar aspecto alongado
da célula...................................................................................................................................
137
Figura 30: Célula de G. diazotrophicus entre duas paredes celulares vegetais. Notar a
presença de vesículas e de matriz diferenciada a partir da parede vegetal e adjacente à
célula bacteriana e vesículas..................................................................................................
137
Figura 31: Células de G. diazotrophicus próximas à parede celular vegetal. Notar células
em divisão e polarização celular nas mesmas (setas)............................................................
139
Figura 32: Detalhe de uma célula de G. diazotrophicus em contato com matriz (asterisco)
adjacente à parede celular vegetal..........................................................................................
139
Figura 33: Células de G. diazotrophicus em contato e imersas em matriz como a
visualizada na figuras 31 e 32. Observar os pares de células ao longo da parede (setas).
Presença de material eletron-denso entre as paredes próximas à colonização
bacteriana................................................................................................................................
139
Figura 34: Células de G. diazotrophicus (g) enfileiradas em região adjacente à parede
celular vegetal. Presença de material eletron-denso sobre a parede oposta à colonização
(setas)......................................................................................................................................
139
Figura 35: Células de G. diazotrophicus (g) imersas em ampla camada de matriz em
região contígua à parede celular vegetal................................................................................
139
Figura 36: Numerosas células de G. diazotrophicus formando biofilme sobre a parede
periclinal externa da epiderme radicular. Notar a presença de estrutura não identificada
imersa no biofilme (seta) e adjacente às células. Parede celular com regiões mais eletron-
densas (ed). Na face oposta da parede verifica-se a presença de região que pode indicar a
formação de vesícula (cabeça de seta)..................................................................................
141
Figura 37: Detalhe de região do biofilme onde se verifica que as células se encontram
imersas em matriz com aspecto fibrilar (estrela). Notar aspecto frágil das células e região
elétron-densa da parede celular vegetal (ed)..........................................................................
141
Figuras 38, 39 e 40: Presença de biofilme bacteriano na paredes periclinais externas da
epiderme da raiz. Notar regiões elétron-densa (ed) na parede celular (destaque na figura
38) e a presença de vesículas intensamente elétron-densa (asterisco branco). Material
fibrilar é encontrado em meio às células que compõem o biofilme (setas).............................
141
Figuras 41 e 42: Detalhes de regiões do biofilme evidenciando a presença de material
fibrilar em meio às células (seta).............................................................................................
141
XVII
“Vivo só no meu cantinho
Da grandeza sempre longe...
Fujo sempre à hipocrisia, à sandice, à fidalguia...
...só rendo obediência
À virtude, à inteligência...”
Luís Gama (1830-1882)
Poeta Abolicionista
XVIII
RESUMO GERAL
A colonização das raízes de cana-de-açúcar por bactérias diazotróficas dos
gêneros Herbaspirillum e Gluconacetobacter tem sido estudada em sistemas
monoxênicos de curta duração (até 15 dias) utilizando-se plântulas
micropropagadas, enquanto que as técnicas microbiológicas e microscópicas têm
demonstrado uma associação predominantemente endofítica, ressaltando seus
aspectos básicos (vias de infecção e colonização). O conhecimento aprofundado
das bases estruturais dessa interação poderia contribuir para a maximização do
potencial de promoção de crescimento vegetal estimulado por estirpes selecionadas.
Com base nessa premissa, no primeiro capítulo deste trabalho, foi avaliado um
sistema monoxênico, sem adição de nutrientes, de longa duração (11 meses) para
avaliar a interdependência metabólica na interação de estirpes selecionadas de
bactérias dos gêneros Herbaspirillum e Gluconacetobacter com plântulas micro-
propagadas de cana-de-açúcar. Os resultados indicaram o estabelecimento efetivo e
metabolicamente ativo dessas bactérias na superfície das paredes periclinais
externas das células epidérmicas dos pêlos radiculares e o interior das raízes, bem
como a redução da mortalidade das plântulas e o incremento na biomassa de raízes
e da parte aérea, quando comparadas a plântulas-controle, não inoculadas. Com
base na efetividade da interação bactéria-planta e do processo de promoção de
crescimento vegetal, nos demais capítulos deste trabalho foram avaliados os sítios
(micro-hábitats) ocupados por essas bactérias e a ultra-estrutura dessa interação,
comparando-se bactérias crescidas in vitro em meio de cultura com fontes orgânicas
de nitrogênio e sob condição de fixação biológica de nitrogênio (FBN). Assim, as
bactérias dos gêneros Herbaspirillum e Gluconacetobacter foram observadas em
microscopia eletrônica de transmissão (MET), a partir de réplicas platina/carbono
XIX
obtidas em criofratura. Paralelamente, amostras de raízes e de folhas de plântulas
de cana-de-açúcar inoculadas foram submetidas à imobilização por congelamento
em alta pressão, seguida de fixação por substituição a frio para a descrição ultra-
estrutural da associação (fase endofítica). Sítios aniônicos e a nitrogenase foram
detectados, respectivamente, pelo uso de ferritina cationizada e de anticorpos
policlonais combinados à técnica de imuno-ouro. A criofratura permitiu maior
detalhamento da ultra-estrutura dos extratos topográficos dessas bactérias, tanto em
função da espécie, quanto da condição de cultivo. Alterações ultra-estruturais
intracitossólicas, associadas à imunolocalização da nitrogenase, sugerem a
compartimentalização metabólica do processo de FBN no citoplasma. A análise da
interação de H. seropedicae e da cana-de-açúcar sob fixação física e
criosubstituição detalhou a ultra-estrutura dos sítios ocupados por esta bactéria, não
evidenciados em amostras fixadas quimicamente. Alterações na superfície externa
de G. diazotrophicus mostraram uma clara relação aos estados metabólicos
estudados, e sua colonização caracterizou-se pelo polimorfismo em diferentes sítios,
pela presença de numerosas vesículas originárias da parede celular vegetal no
apoplasto e por uma matriz entre a parede e as células bacterianas. Os detalhes
ultra-estruturais aqui descritos reforçam a existência de comunicação bioquímica
entre as células envolvidas que pode ser estudada com enfoque na biologia celular
utilizando-se técnicas imuno-cito-histoquímicas adicionais.
Palavras-Chave: G. diazotrophicus, Herbaspirillum spp., criotécnicas, ultra-
estrutura, promoção de crescimento vegetal.
XX
GENERAL ABSTRACT
The colonization of the sugarcane roots by Herbaspirillum and
Gluconacetobacter diazotrophic bacteria has been studied in short-term monoxenic
systems (until 15 days) using micropropagated plantlets whereas microbial and
microscopic techniques have been demonstrating the predominantly endophytic
association between grasses and those bacteria, standing out the basic aspects of
that association (infection thread and colonization). The ultrastructural basis of that
interaction could contribute to the higher potential of growth promotion of selected
strains. For this purpose, strains of Herbaspirillum and Gluconacetobacter were
inoculated at sugarcane micropropagated plantlets, growing for 11 months in a
monoxenic system, with no nutrient addition, to evaluate the metabolic
interdependence in the interaction. We observed the mortality reduction of inoculated
plants and the increment in the dry mass of roots and shoots, as compared to control,
indicating the effective and metabolic active establishment of those bacteria, that
colonizes the surface of epidermic cells, of root hair and the inner tissues of the roots.
Thus, basing on these results, we evaluated the sites (micro-habitats) explored by
bacterial cells and ultra-structural characteristics of the interaction, by comparison of
bacteria grown at in vitro culture medium with organic nitrogen sources and under
biological nitrogen fixation (BNF). Herbaspirillum spp. and G. diazotrophicus were
observed in TEM, using platinum/carbon freeze-fracture replicas. Concomitantly root
and leaf samples from H. seropedicae and G. diazotrophicus inoculated sugarcane
plantlets were submitted to high pressure freezing, followed by fixation as cryo-
substitution for ultrastructural description of the endophytic phase association.
Anionic sites and nitrogenase were detected, respectively, by using cationized ferritin
and polyclonal antibodies combined with imuno-gold techniques. The freeze-fracture
XXI
technique allowed the differentiated and detailed ultra-structural analysis of the
topographical extracts of these bacteria, as well as structural differences in response
to bacterial species and growing. Intracitosolic ultra-structural variation, combined to
nitrogenase immunolocalization suggests the metabolic compartmentalization of BNF
process in the cytoplasm. The analysis of H. seropedicae cells interaction and sugar-
cane under physical fixation and cryosubstitution allowed the observation of details of
ultra-structure of the sites occupied by this bacterium, not evidenced in chemically
fixed samples, including stages of the process of cellular adhesion, polarized
structural alterations of the bacterial cell, structural alterations in the host cellular wall,
as well as the formation of bacterial aggregates, actives in the nitrogenase synthesis,
and wrapped up for a homogeneous matrix, inside the cells of the root cortex
parenchyma. Alterations observed in the external surface of G. diazotrophicus cells
show a clear relationship with the metabolic state of the same ones. The colonization
of G. diazotrophicus was characterized by the polymorphism in different site
colonization, the presence of a wide range of cell wall vesicles and a matrix among
cell wall and the bacterial cells. The described ultra-structural details reinforce the
existence of biochemical communication among the involved cells that can be
studied focusing the cellular biology using immuno-cito-histochemical techniques.
Key-words: G. diazotrophicus, Herbaspirillum spp., cryo-techniques, ultra-structure,
vegetable growth promotion.
1. INTRODUÇÃO GERAL
Desde 1948 tem sido demonstrado que bactérias podem habitar tecidos
sadios de plantas, incluindo frutas, tubérculos, raízes, sementes e óvulos (M
C
I
NROY
&
K
LOEPPER
, 1995 b). Com o avanço do conhecimento científico, tem sido
demonstrando que as plantas podem ser consideradas micro-ecossistemas
complexos, possuindo diferentes hábitats, explorados por uma ampla variedade de
bactérias (M
C
I
NROY
&
K
LOEPPER
, 1995 a e b). Estes hábitats incluem tanto a
superfície externa do vegetal, onde bactérias denominadas epifíticas predominam,
quanto dentro dos tecidos vegetais, onde predominam bactérias endofíticas
(L
ODEWYCKX
et al., 2002). Para tanto, as bactérias desenvolveram várias estratégias
para se adaptarem aos micro-hábitats vegetais, o que inclui a existência de
interações benéficas (simbióticas e não simbióticas) e interações maléficas
(bactérias fitopatogênicas) (M
ONTESINOS
et al., 2002).
Por outro lado, muitas espécies bacterianas têm sido isoladas de diferentes
tecidos vegetais sadios (H
ALLMANN
et al., 1997; S
TURZ
et al., 2000; L
ODEWYCKX
et al.,
2002). Essas bactérias, presentes endofiticamente, não são consideradas
patogênicas, pois não incitam sintomas de doenças, podendo conferir vários
benefícios ao seu hospedeiro, como promoção do crescimento vegetal e resistência
contra patógenos e parasitas (H
ALLMANN
et al., 1997).
Desde os anos de 1950 vêm sendo realizados estudos relacionados a
bactérias fixadoras de nitrogênio associadas à cana-de-açúcar (D
ÖBEREINER
&
R
USCHEL
, 1958; D
ÖBEREINER
&
A
LVAHYDO
, 1959). Estes últimos autores isolaram a
bactéria Beijerinckia fluminensis da rizosfera de cana-de-açúcar, crescida em solos
tropicais, demonstrando o potencial de diazotróficos em associar-se com gramíneas.
Porém, somente após a descrição do gênero Azospirillum por D
ÖBEREINER
& D
AY
(1976), um maior número de cientistas se interessou pelas bactérias diazotróficas
2
associadas às gramíneas. Durante as duas últimas décadas muitas bactérias
fixadoras de N
2
foram isoladas e identificadas, sendo a maior parte dos isolados de
regiões tropicais, especialmente no Brasil. O interesse na associação de
diazotróficos com gramíneas destacou a importância do processo de fixação
biológica de N
2
(FBN) em sistemas de agricultura sustentável no Brasil (D
ÖBEREINER
,
1997; R
EIS
et al., 2000; B
ALDANI
et al., 2002(a); B
ODDEY
et al., 2003).
Novos gêneros de bactérias fixadoras de N
2
foram identificadas
principalmente dentro dos tecidos vegetais (C
AVALCANTE
& D
ÖBEREINER
,
1988;
D
ÖBEREINER
, 1992; B
ALDANI
et al., 1997), incluindo Gluconacetobacter diazotrophicus
(C
AVALCANTE
& D
ÖBEREINER
,
1988;
G
ILLIS
et al., 1989; Y
AMADA
et al., 1998), Azoarcus
spp. (R
EINHOLD
-H
UREK
et al., 1993), Herbaspirillum seropedicae (B
ALDANI
et al.,
1986), H. rubrisubalbicans (G
ILLIS
et al., 1991; B
ALDANI
et al., 1996), Burkholderia
tropica (R
EIS
et al., 2004).
No Brasil, em 2004, foi registrada uma produtividade de 753 kg de cana ha
-1
,
maior que a média mundial, porém inferior a de outros países produtores (FAO,
2005). Neste contexto, a utilização de bactérias fixadoras de N
2
, capazes de
promover o crescimento vegetal, induzir a resistência a doenças e ainda atuar como
vetores para a expressão de genes na planta pode ser agronomicamente relevante e
a chave para a sustentabilidade desta cultura.
Neste contexto, a importância do estudo da associação da cana-de-
açúcar/bactérias diazotróficas endofíticas vem merecendo destaque. Desde 1999
está em andamento o programa denominado SUCEST (Sugarcane Expressed
Sequence Tag) (FAPESP, 2000) que estuda os aspectos relacionados tanto ao
genótipo como ao fenótipo da cana. Estes estudos também incluem a expressão de
genes em plantas associadas às bactérias G. diazotrophicus e H. rubrisubalbicans.
Além disso, projetos genômicos relacionados a estas bactérias vêm sendo
realizados (G. diazotrophicus – RIOGENE/FAPERJ; H. seropedicae –
GENOPAR/CNPq). O conhecimento gerado a partir destes estudos irá contribuir na
maximização do potencial desta associação.
Apesar de estudos realizados há algumas décadas, pouco se sabe a respeito
da interação cana-de-açúcar e bactérias diazotróficas quando se compara com os
avanços alcançados no estudo da simbiose soja/rizóbio. Portanto, o entendimento
do modo como as células das bactérias diazotróficas endofíticas Gluconacetobacter
diazotrophicus e Herbaspirillum spp. interagem com as células de cana-de-açúcar
3
podem elucidar mecanismos chaves desta interação. Estes resultados podem
permitir tanto uma melhor compreensão da biologia celular da interação quanto
propiciar um futuro manejo da mesma, como a produção de inoculantes, visando
uma melhor produtividade agrícola.
Nos trabalhos a seguir apresentados serão avaliados a sustentabilidade
temporal e funcional da interação endofítica e o potencial de promoção crescimento
de vegetal das bactérias Herbaspirillum seropedicae, Herbaspirillum rubrisubalbicans
e Gluconacetobacter diazotrophicus inoculadas em plantas micropropagadas de
cana-de-açúcar em sistemas monoxênicos de longa-duração. Além disso,
procuraremos caracterizar alguns aspectos da ultra-estrutura da interação das
bactérias diazotróficas Herbaspirillum seropedicae e H. rubrisubalbicans, G.
diazotrophicus com plantas de cana-de-açúcar. Verificaremos, também, alguns
aspectos e alterações ocorridas nas células bacterianas e vegetais, in vivo e in vitro,
além de aspectos ultra-estruturais da interação. Para tanto, serão utilizadas, dentre
outras, criotécnicas, como método de preparo das amostras associadas à
microscopia eletrônica, visando à possibilidade de evidenciar novos detalhes
estruturais e suas possíveis implicações com a funcionalidade da associação.
4
Colhi um ramo de flores de outras pessoas.
Nada além dos fios que as une são meus.
Michel Montagne
5
2.
REVISÃO
DE
LITERATURA
2.1. A Cana-de-Açúcar: características gerais, histórico e importância no Brasil
A cana-de-açúcar é uma gramínea perene de metabolismo fotossintético C
4
,
própria de climas tropicais e subtropicais. Sua cultura se estende para ambos os
lados do Equador até, aproximadamente, 35° de latitudes Norte e Sul, desde o nível
do mar até 1000 m de altitude (M
ALAVOLTA
, 1994).
Taxonomicamente, a cana-de-açúcar pertence à família Poaceae (C
RONQUIST
,
1988; APGII, 2003). Esta família é considerada de extrema importância ecológica
por possuir representantes em todos os climas e biomas terrestres, representando
20% de toda a cobertura vegetal do globo (R
OYAL
B
OTANIC
G
ARDEN
, 2004).
O gênero Saccharum é a base genética das principais variedades cultivadas
comercialmente no mundo, apresentando um total de 18 espécies. Dentro deste
gênero, e fazendo parte do chamado “Complexo Saccharum” destacam-se seis
espécies (Saccharum officinarum L., S. robustum Jeswiet, S. spontaneum L., S.
sinense Roxb, S. barberi Jeswiet e S. edule Hask) (C
LEMENTS
, 1980).
P
IMENTEL
G
OMES
&
L
IMA
(1964) citam que a origem provável da cana-de-açúcar
seja o sudeste da Ásia, nas regiões de Assam e Bengala. Dentre as zonas para as
quais a cana-de-açúcar se expandiu no Ocidente, foi nas Américas onde mais se
desenvolveu, ocupando extensas áreas e constituindo, desde os tempos coloniais, a
principal atividade econômica dessas regiões.
Para J
UNQUEIRA
&
D
ANTAS
(1964), a história da cana-de-açúcar no Brasil - e
com ela, a do açúcar e da aguardente - começa com a história do país, constituindo
mesmo um dos primeiros ciclos de sua economia. Apesar disto, não se conhece
6
precisamente o local na costa brasileira onde teria sido cultivada pela primeira vez e
nem a data da sua primeira importação.
Antonio Pigafetta, navegador italiano que participou da expedição de Fernão de
Magalhães, em dezembro de 1519, assinalou a presença de “canas doces” no Rio
de Janeiro
(J
UNQUEIRA
&
D
ANTAS
, 1964). Pio Corrêa, em seu Dicionário das Plantas
Úteis do Brasil (C
ORRÊA
, 1926), menciona a sua possível introdução desde o ano de
1502. Para C
ALMON
(1935, apud J
UNQUEIRA
&
D
ANTAS
, 1964) já havia plantações de
cana-de-açúcar, desde a segunda década após o descobrimento (1510 -1520) e a
primeira exportação do produto, para a metrópole portuguesa, ter-se-ia realizado em
1521, por Pero de Cápico.
Porém, o primeiro grande empreendimento para o estabelecimento da cultura
da cana, com apoio oficial do Rei D. João III, foi efetuado em 1532. Martin Affonso
de Souza trouxe, em sua grande expedição, mudas originárias da Ilha da Madeira e
as plantou nos arredores do nascente povoado de São Vicente (M
ACHADO
et al.,
1987). Ali, a indústria açucareira teve, de início, alguma prosperidade, mas depois
regrediu, devido aos embates com índios e castelhanos, e também, pela falta de
capital (J
UNQUEIRA
&
D
ANTAS
, 1964).
Dois anos após, Duarte Coelho Pereira recebeu, como donatário, a Capitania
Hereditária de Pernambuco, desenvolvendo a plantação de cana e a produção de
açúcar (J
UNQUEIRA
&
D
ANTAS
, 1964). O primeiro engenho de açúcar de Pernambuco
– Engenho Nossa Senhora da Ajuda, depois denominado Forno da Cal - foi fundado
por Jerônimo de Albuquerque nas proximidades de Olinda no ano de 1534.
Outro núcleo que recebeu nítida orientação para o cultivo da cana foi o da
Capitania de São Tomé ou da Paraíba do Sul. Pero de Góes, seu donatário,
conseguiu em Portugal reforço de capital e reergueu engenhos na região da atual
cidade de Campos dos Goytacazes. Estes engenhos e as plantações de cana
sofreram um retrocesso devido a problemas entre os habitantes locais com os
piratas franceses (J
UNQUEIRA
&
D
ANTAS
, 1964), vindo a se reerguer anos mais tarde.
A primeira variedade de cana-de-açúcar cultivada comercialmente era
conhecida como “cana criola” - resultado do cruzamento de variedades do grupo
Mungo (S. barberi) e uma cana nobre (S. officinarum), introduzida na América por
Cristóvão Colombo -, tendo sido cultivada por mais de 250 anos (P
ÉREZ
et al., 1999).
Seguiu-se a Bourban e, mais tarde, devido ao ataque de inúmeras doenças, foi
7
substituída pela variedade Cheribom. Muitos anos mais tarde, a descoberta de que a
cana-de-açúcar era fértil, deu início aos trabalhos independentes de melhoramento
em Java e Barbados no ano de 1888. Já em 1921, Jeswiet obteve a famosa
POJ2878, que rapidamente ocupou os canaviais de Java e se estendeu pelo mundo
(S
TEVENSON
, 1965 apud P
ÉREZ
et al., 1999).
No Brasil, por muito tempo a variedade Caiana foi amplamente cultivada, até
ser substituída pela variedade Manteiga, resultado do cruzamento entre a Cana
Caiana e a Cana Mole (P
INTO
, 1965). Em 1930, estas, e algumas outras, foram
substituídas pelas variedades desenvolvidas em Java e Coimbatore, na Índia, por
serem mais produtivas e resistentes ao mosaico (C
ASCUDO
, 1971 apud G
OMES
,
2002).
Em 2004, a área plantada com cana-de-açúcar no país foi de 5,4 milhões de
ha, representando 26,5% da área destinada a esta cultura no mundo. Com uma
produção nacional de 411 milhões de toneladas em 2004 (FAO, 2005). Este
resultado mantém o Brasil como o maior produtor mundial de açúcar (24,8 milhões
de toneladas; 16% da produção mundial) produzindo 28,6% da cana mundial (FAO,
2005). Além disso, segundo R
IPOLI
&
R
IPOLI
(2004) o setor canavieiro no Brasil
absorve mais de 1 milhão de trabalhadores diretos e, em torno de 300.000 indiretos,
sendo responsável por 3,5% do PIB nacional. Soma-se a isto uma alta tecnologia,
brasileira e internacional, para o aproveitamento de vários de seus subprodutos,
muitos dos quais biodegradáveis, diferente do que ocorre com os derivados do
petróleo (R
IPOLI
&
R
IPOLI
,
2004). De acordo com a ÚNICA (2003), podemos citar
como exemplo que para cada 17,1 kg de bagaço pode-se obter 1 kg de plástico
biodegradável, utilizando-se como solventes outros subprodutos desta mesma
cultura.
A
ZEREDO
et al. (1986) demonstraram que em cana-planta, poucos
experimentos apresentaram resposta significativa à aplicação de N fertilizante. No
caso de cana-soca, as respostas são mais freqüentes, sugerindo que algumas
variedades brasileiras poderiam se beneficiar da FBN (D
ÖBEREINER
et al., 1972;
R
USCHEL
et al., 1975; P
ATRIQUIN
et al., 1980; S
AMPAIO
et al. 1984). L
IMA
et al. (1987)
e U
RQUIAGA
et al. (1992) demonstraram que certas variedades de cana podem obter
mais de 60% de N via FBN, sugerindo que a capacidade de fixar N
2
possa estar
relacionada ao genótipo. Extrapolando resultados para o campo, B
ODDEY
et al.
(1995) sugeriram que cerca de 150 kg de N ha
-1
poderiam ser incorporados aos
8
tecidos da cana via FBN. Estudos mais recentes utilizando a abundância natural de
15
N têm sido realizados, mas seus resultados não são conclusivos (B
ODDEY
et al.,
2001; H
OESFSLOOT
et al., 2005).
A criação do Programa Brasileiro do Álcool Combustível (PRÓ-ÁLCOOL –
decreto nº. 76.593) - o maior programa de biocombustível do mundo - em 1975, deu
grande impulso à cultura canavieira no Brasil (B
ODDEY
, 1995). Apesar da extinção
deste, M
ACEDO
(2000) enfatiza que uma das razões para que a atual agro-indústria
brasileira mantenha a produção de biocombustível, a partir da cana-de-açúcar, é o
seu balanço energético positivo. No Brasil, este fato é justificado, em parte, pelo fato
da cana-de-açúcar ter sido melhorada para cultivo em solos pobres em N e com
pouca adição do mesmo (R
USCHEL
&
V
OSE
, 1982; U
RQUIAGA
et al., 1992; D
ÖBEREINER
et al., 1995b). De fato, dentre os países grandes produtores agrícolas, o Brasil é o
que utiliza as menores quantidades de N fertilizante, o que contribuiu para que a
nossa agricultura se tornasse economicamente viável e competitiva no mundo
(D
ÖBEREINER
, 1997).
Hoje o Brasil se tornou, com significativa contribuição do etanol, autônomo
quanto aos combustíveis líquidos. O etanol se tornou altamente competitivo em
relação à gasolina, graças à impressionante redução dos custos de sua produção e
ao aumento do preço internacional do petróleo. Bastaria esta condição para que se
tornasse inevitável à expansão da produção de etanol. Porém, já está em gestão
uma transformação nas motivações da demanda de combustíveis, cujo elemento
decisivo será a sustentabilidade. E sob esse aspecto, o fator preponderante será o
controle da emissão de gases de efeito estufa (CO
2
, N
2
O, CH
4
). Visando a
diminuição da taxa de emissão destes gases devemos usar, produzir e expandir as
tecnologias e técnicas relacionadas às energias renováveis. Devemos ressaltar que
os únicos energéticos limpos capazes de substituir adequadamente os derivados de
petróleo são os obtidos a partir da biomassa.
2.2. Interações Bactéria-Planta
Alguns autores levantam a hipótese de que, durante a evolução das interações
relativas à patogenicidade e ao parasitismo, o primeiro encontro de procarióticos
com tecidos vegetais possa ter ocorrido com tecidos vegetais em fase de
decomposição (W
OESE
, 1987). Estes organismos, caracterizados como saprofíticos,
9
apresentaram uma vantagem seletiva na utilização destes substratos através de
seus sistemas enzimáticos. Porém, esta hipótese ignora os ancestrais procarióticos
endossimbiontes que co-evoluíram junto às plantas vivas, enfatizando os
procariontes que “descobriram as plantas” posteriormente (W
OESE
et al., 1985). Por
outro lado, e no extremo oposto da relação nutricional, estão os organismos
classificados como simbiotróficos e usualmente denominados de epífitos, que
desenvolveram a habilidade de utilizar materiais que são exudados de superfícies
foliares e radiculares vivas.
Contudo, as relações nutricionais nem sempre podem ser definidas de forma
clara e objetiva. Como exemplo podemos citar a interação de organismos
denominados endófitos, caracterizados por colonizarem os diferentes sistemas de
tecidos da planta hospedeira. Estes indivíduos utilizam os produtos originados do
floema, xilema ou outros constituintes das células vivas. Outros procariontes
endofíticos podem ser simbiontes recebendo benefícios do seu hospedeiro. Alguns
procariontes podem obter nutrientes do seu hospedeiro sem que ocorra benefício
para a planta, sendo considerados como a flora normal das mesmas. Por outro lado,
mecanismos metabólicos mais invasivos, visando à liberação de nutrientes celulares,
podem ter se desenvolvido em interações bactéria-bactéria antes das plantas terem
evoluído. Estas técnicas incluem princípios físicos, enzimáticos ou tóxicos,
provavelmente resultando em danos ao hospedeiro – definindo o início da patogenia
(K
AISER
, 2004).
Procariontes endofíticos que causam dano ao hospedeiro são classificados
como patógenos e são conhecidos pelos cientistas desde a segunda metade do
século XIX. Para que ocorra a interação do tipo patogênica é necessário que haja
compatibilidade genética entre a bactéria fitopatogênica e a planta hospedeira
suscetível e que o ambiente apresente condições favoráveis a esta interação
(R
OMEIRO
,
1995;
A
GRIOS
,
1997;
M
ONTESINOS
et al., 2002). Porém, como destacado
por (M
ITHÖFER
, 2002), a disseminação de doenças nas espécies vegetais é limitada,
pois a interação patógeno-hospedeiro é específica e as plantas possuem diversos
mecanismos de defesa contra os ataques microbianos.
H
ALLMANN
et al. (1997) sugerem que, evolutivamente, as bactérias endofíticas
são intermediárias em relação às saprófitas e patogênicas. Especulam, ainda, a
possibilidade das bactérias endofíticas serem mais evoluídas que as patogênicas.
De fato, D
JORDJEVIC
et al. (1987) já haviam proposto uma seqüência evolutiva na
10
qual consideram que a mais bem sucedida interação microrganismo-planta explora
os vegetais como fonte nutritiva como uma interação patogênica que se “amenisou”
através do tempo.
Todavia, apesar do aparente antagonismo das interações patogênicas e
simbióticas, existem mecanismos comuns entre estes grupos de bactérias que
facilitam a colonização de hábitats endofíticos. Um dos mais estudados tem sido o
quorum-sensing (QS) (S
URETTE
&
B
ASSLER
, 1998; W
HITHERS
& N
ORDSTRÖM
, 1998;
B
ASSLER
, 1999; F
RAY
,
1999;
O
TTO
et al., 1999; S
PERANDIO
et al., 1999; S
URETTE
et
al., 1999; D
E
K
IEVIT
et al., 2001; W
HITEHEAD
et al., 2001; F
RAY
et al., 2002; M
ITSUMORI
et al., 2003; L
ERAT
&
M
ORAN
, 2004). Este é um mecanismo de comunicação que,
utilizando sinais químicos, permite que a população bacteriana possa se adaptar
metabolicamente às diversas condições encontradas no hábitat a ser colonizado.
Estes sinais permitem que células bacterianas individuais se adaptem ao ambiente
de crescimento de acordo, inclusive, com a densidade populacional. Esta adaptação
ocorre por um mecanismo que pode ser resumido na expressão constitutiva de dois
genes. Um atua como codificador de uma proteína ativadora, e o outro como
codificador de uma proteína de membrana, que é receptora específica da primeira. O
conjunto ativador-sensor aumenta os níveis próprios de expressão (tipo feedback), o
que amplifica o sinal decodificado, e atua na expressão de outros genes, úteis em
situações específicas (B
ASSLER
, 1999).
Como exemplo podemos citar os sistemas descritos em bactérias Gram-
negativas - Vibrio fischeri (LuxI-LuxR), Pseudomonas aeruginosa (LasI/LasR-
RhlI/RhlR), Agrobacterium tumefaciens (TraI/TraR), Erwinia carotovora (ExpI/ExpR) -
onde moléculas do tipo N-acil-homoserina lactonas (AHL) predominam como
moléculas sinalizadoras de QS. Para as bactérias Gram-positivas predomina a
sinalização via peptídeos (K
LEEREBEZEM
&
Q
UADRI
,
2001;
W
HITEHEAD
et al.,
2001).
Trabalhos têm demonstrado que um único organismo pode utilizar várias
moléculas sinalizadoras de QS, pertencentes a uma ou mais diferentes classes
químicas, para regular a expressão gênica (H
OLDEN
et al., 2000). De fato, o QS é um
sistema bastante útil, pois permite, entre outros processos, a colonização de tecidos
da planta hospedeira, até se alcançar populações elevadas, sem a expressão de
fatores de virulência requeridos para a colonização de tecidos vegetais. Sendo
assim, apenas depois de se alcançar altos níveis populacionais os fatores
bacterianos de virulência são ativados através do QS e uma colonização efetiva dos
11
tecidos vegetais é atingida antes que os mecanismos de defesa sejam mobilizados
de forma eficiente. Neste caso, existe, também, uma economia energética da
bactéria, pois os genes envolvidos na interação com os hospedeiros possuem baixa
relevância fora deste contexto (K
EEN
, 1999).
Estes genes atuam, por exemplo, no processo de quimiotaxia, adesão das
células na superfície das paredes periclinais externas das raízes, comunicação
bioquímica com a planta hospedeira, modificações nas funções celulares, adaptação
ao ambiente endofítico, entre outras. Muitos dos genes identificados possuem
similaridade (em relação à seqüência de aminoácidos) entre diversos gêneros de
bactérias, incluindo algumas patogênicas, sugerindo que os passos iniciais da
interação com a planta sejam conservados. Assim, destaca-se que o
estabelecimento efetivo de uma espécie é dependente da competição no ambiente
de rizosfera e da sua estabilidade no local de atividade, ao longo do tempo
(S
TEENHOUDT
&
V
ANDERLEYDEN
, 2000).
Além disso, bactérias fitopatogênicas e simbiontes, conseguem modular o
ambiente hospedeiro pela liberação de moléculas efetoras pelo mecanismo de
secreção do tipo III, que interferem diretamente nas funções celulares do hospedeiro
(B
ÜTNER
&
B
ONAS
, 2002; R
OMANTSCHUCK
et al., 2001). Estas proteínas sinalizadoras
podem atuar na atividade enzimática de fosfatases, na inibição de fagocitose, causar
danos diretos ao tecido hospedeiro ou agir como fatores de virulência tanto em
animais e em vegetais. Convém destacar que, recentemente, foi identificado um
sistema de secreção do tipo III funcional no simbionte Mesorhizobium loti, porém seu
papel na simbiose ainda é desconhecido (H
ENTSCHEL
et al., 2000). Bactérias
promotoras de crescimento também têm sido alvo de estudos voltados à
identificação de genes relacionados a este sistema de secreção (P
RESTON
et al.,
2001).
Freqüentemente têm sido observadas bactérias associadas a plantas formando
agregados, microcôlonias ou biofilmes em superfícies de folhas e raízes, e nos
espaços intercelulares de tecidos vegetais. M
ORRIS
&
M
ONIER
(2003) consideram que
biofilmes podem se disseminar pelo ar e a diversidade de bactérias associadas às
plantas pode influenciar estratégias para o controle biológico de doenças.
Como as bactérias crescem e se dividem após a adesão a uma superfície,
estas podem originar a formação de clusters com aspecto alongado ou de cogumelo
12
(C
OSTERTON
et al., 1995). A estrutura tridimensional formada penetra por canais
anastomosados e, acredita-se, promove um sistema circulatório que controla a oferta
de O
2
e outros nutrientes e elimina restos metabólicos. Em condições favoráveis,
pode-se formar biofilmes com altas densidades populacionais, onde o ponto chave é
a interação. Células em biofilmes são encontradas em estágios regulatórios
diferentes daquelas fora do biofilme (K
AISER
, 2004) e podem apresentar uma maior
resistência a antibióticos, com produção mais exuberante de polissacarídeos e
enzimas para a biossíntese de exopolissacarídeos (C
OSTERTON
et al., 1995).
Em ambientes naturais, o primeiro passo para a colonização é o entorno físico
entre a bactéria e a planta hospedeira. Este passo pode ocorrer ativamente, através
dos mecanismos de motilidade do microrganismo e pelo crescimento das raízes, ou
de forma passiva quando o microrganismo é transportado pela solução do solo. A
movimentação dos microrganismos em direção às raízes das plantas ocorre quando
existe um reconhecimento químico (quimiotaxia), e acredita-se que os
microrganismos sejam atraídos pelo gradiente de fontes de carbono (exudatos
radiculares) existente entre o solo e a rizosfera (B
ENIZRI
et al., 2001).
A partir deste reconhecimento, a colonização da superfície das paredes
periclinais externas das raízes ocorre por duas etapas independentes: uma fraca
adsorção inicial (reversível), e um ancoramento irreversível dirigido por proteínas
extracelulares de origem bacteriana (M
ICHIELS
et al., 1991), que pode estar sob o
comando de sinais moleculares emitidos pelas raízes da planta hospedeira (B
UELL
&
A
NDERSON
, 1993). O alcance de tecidos vegetais torna-se praticamente uma
conseqüência.
Logo, vemos que a existência de colônias microbianas na superfície das raízes
acaba por inserir células destes organismos em hábitats mais protegidos. Ressalta-
se que este hábitat, considerado endofítico, pode compreender células corticais
mortas onde estas bactérias penetram pela via apoplástica. Neste contexto, a
separação entre microrganismos exo ou endo-radiculares (exo ou endofíticos) se
torna uma questão controversa (
VAN
P
EER
et al., 1990). M
C
C
ULLY
(2001) define como
o verdadeiro hábitat endofítico apenas os espaços intercelulares de tecido
parenquimático, não considerando outros tecidos potencialmente colonizáveis.
Avaliações mais detalhadas sobre a estrutura de comunidades microbianas
associadas às plantas, bem como sua função e localização, ainda precisam ser
13
determinadas para um melhor entendimento das relações ecológicas e metabólicas.
Interações positivas entre microrganismos endofíticos e a planta hospedeira podem
resultar em vários efeitos benéficos similares ou complementares aos produzidos por
organismos de rizosfera (S
TURZ
&
N
OWAK
, 2000).
2.3. Influência dos Microrganismos no Crescimento Vegetal
Bactérias que podem aumentar a produtividade agrícola e o crescimento
vegetal são conhecidas há mais de um século (B
ROWN
, 1974). Estas são
encontradas colonizando a rizosfera e os tecidos de culturas tais como arroz, trigo e
cana-de-açúcar (M
IRZA
et al., 2001). Algumas destas associações beneficiam as
bactérias pelos exudatos secretados pelas raízes, como podem as mesmas influir
beneficamente sobre o metabolismo vegetal, de maneira direta ou indireta,
resultando na estimulação do crescimento das plantas (B
LOEMBERG
&
L
UGTENBERG
,
2001).
A expressão “rizobactérias promotoras de crescimento” foi usada pela
primeira vez por K
LOEPPER
&
S
CHROTH
(1978) ao se referirem a bactérias que tinham
atividade antagônica a dos fitopatógenos e, desta forma, contribuíam para o
crescimento vegetal. Segundo B
ASHAN
&
H
OLGUIN
(1998) esta expressão restringe-se
a bactérias da rizosfera e não inclui bactérias promotoras de crescimento
endofíticas, ou seja, que se encontram no interior dos tecidos vegetais. Neste caso,
estes autores sugerem a substituição do termo “rizobactéria” por “bactéria”, criando a
expressão “bactérias promotoras de crescimento vegetal” (BPCV). Estas possuem
grande potencial de uso na agricultura e podem induzir aumentos de rendimento em
uma grande variedade de culturas (O
KON
&
I
TZIGSOHN
, 1995).
Bactérias promotoras de crescimento vegetal, de vida livre ou associativas,
podem afetar o crescimento das plantas de vários modos. Nos sistemas naturais os
mecanismos de promoção de crescimento podem ocorrer por via direta ou indireta.
Os de ação direta incluem a FBN, a produção de fitoreguladores, a solubilização de
fósforo e a aceleração dos processos de mineralização. Os de ação indireta incluem
a indução de resistência sistêmica nos vegetais, a síntese de sideróforos, a
diminuição de fatores de estresse como o etileno endógeno, a produção de
antibióticos e o antagonismo a fitopatógenos (O
LIVEIRA
et al., 2003).
14
Bactérias endofíticas promotoras de crescimento vegetal podem atuar
através de mecanismos indiretos como a eliminação de microrganismos deletérios
por competição ou antibiose (B
ROOKS
et al., 1994; C
HEN
et al., 1995; N
EJAD
&
J
OHNSON
, 2000). Como estas bactérias podem colonizar os mesmos micro-hábitats
ocupados por espécies fitopatogênicas, esta função de “biocontrole” pode ser uma
arma de proteção das plantas.
Além da atuação direta das bactérias endofíticas sobre a atividade de
organismos patogênicos, a ocorrência de colonização endofítica pode induzir
respostas sistêmicas de resistência nas plantas (Systemic Aquired Resistance -
SAR). Este fenômeno ocorre após a exposição da planta a um agente indutor que
ativa os mecanismos de defesa sistêmica (S
TICHER
et al., 1997). O agente indutor
pode ser um ativador químico, extratos de células de microrganismos ou
microrganismos vivos, quase sempre classificados como rizobactérias promotoras
de crescimento (K
LOEPPER
, 1996; K
LOEPPER
et al., 1997).
Existem casos comprovados de que a inoculação com BPCV na rizosfera
torna a parte aérea mais resistente a patógenos (K
LOEPPER
, 1996; L
IU
et al., 1995;
W
EI
et al., 1996). Pesquisas têm demonstrado que certas BPCV parecem atuar
como agentes indutores de resistência sistêmica, no sentido da planta ficar protegida
contra mais de um patógeno (W
EI
et al., 1996).
Já com relação à resposta hipersensível desencadeada por bactérias, esta
se inicia pela percepção dos eliciadores bacterianos (proteínas de baixo peso
molecular) na superfície ou no interior do vegetal. A célula vegetal possui receptores
na plasmalema que interagem com as moléculas eliciadoras, desencadeando a
resposta hipersensível que por sua vez inicia a resistência sistêmica (H
E
, 1996). As
moléculas eliciadoras podem ser o ácido salicílico, peptídeos (sisteminas), ácido
jasmônico e metil-jasmônico e o etileno (E
NYEDI
et al., 1992). R
OMEIRO
(2003)
destaca a experiência chinesa, onde desde a década de 1960 até os dias atuais,
existe o uso rotineiro de rizobactérias como ativadoras de defesas e como
promotoras de crescimento.
As rizobactérias promotoras de crescimento vegetal podem ser usadas como
inoculantes para biofertilização, fitoestimulação e biocontrole de fitopatógenos. O
uso em larga escala de BPCV como inoculantes em grandes culturas tem como
15
atrativo, a redução do uso de fertilizantes químicos e pesticidas, os quais poluem o
meio ambiente (B
LOEMBERG
&
L
UGTENBERG
, 2001).
As raízes das plantas podem apresentar modificações no seu desenvolvimento
em resposta a um estímulo ambiental (gravidade, luz, contato e invasão por
microrganismos) (B
ALDANI
et al., 1999). Considerando seu possível papel no
crescimento radicular, as bactérias diazotróficas poderiam promover efeitos
benéficos sobre a morfologia radicular através de alguns possíveis mecanismos, tais
como, indução da expressão de genes que são responsáveis pelo crescimento de
pêlos e raízes secundárias, por mudanças nos níveis de fitorreguladores (J
AIN
&
P
ATRIQUIN
, 1985; B
ASHAN
&
L
EVANONY
, 1990; F
ERREIRA
, 2002), mudanças na
absorção de nutrientes minerais (L
IN
et al., 1983) ou ainda através da indução da
extrusão de prótons (B
ASHAN
, 1990). Não se sabe até que ponto a formação de
pêlos radiculares depende de fatores genéticos, ambientais e/ou da produção de
substâncias promotoras de crescimento, as quais, hoje, sabe-se que são também
produzidas pela maioria das bactérias diazotróficas endofíticas (M
IRZA
et al., 2001;
R
ADWAN
et al., 2002).
A promoção de crescimento vegetal por bactérias tem sido atribuída à
produção de fitorreguladores capazes de promover o desenvolvimento e proliferação
das raízes, resultando numa absorção eficiente de água e de nutrientes (M
IRZA
et al.,
2001). Tradicionalmente, os fitorreguladores mais estudados dividem-se em:
auxinas, citocininas, etileno, ácido abcísico e giberelinas (R
AVEN
et al., 2001).
D
OBBELAERE
et al., (1999) ao avaliar a promoção de crescimento de plantas
de trigo associadas à Azospirillum brasilense verificaram que esta bactéria é capaz
de produzir auxina (ácido indolacético-AIA) e que manipulações genéticas,
envolvendo genes da biossíntese de AIA, podem ser usadas para melhorar os
efeitos benéficos que a bactéria pode ter sobre a planta.
Segundo F
UENTES
-R
AMÍREZ
et al. (1993), a bactéria G. diazotrophicus
também é capaz de induzir a produção do AIA, o que sugere que em adição à
capacidade de fixar nitrogênio, esta bactéria pode promover a proliferação das
raízes e um maior crescimento da cana-de-açúcar (S
EVILLA
et al., 2001). Z
AHIR
et al.
(2001) demonstram que espécies pertencentes aos gêneros Azotobacter e
Pseudomonas são capazes de produzir citocinas e que podem aumentar o
rendimento da cultura de arroz. B
ENIZRI
et al. (1998) mostraram que na associação
16
de milho com a rizobactéria Pseudomonas fluorescens, os compostos secretados
pelas raízes na rizosfera podem estimular a produção de auxinas pela bactéria.
Várias substâncias produzidas por BPCV possuem efeito de controle sobre os
danos causados por fitopatógenos. Como exemplo podemos citar os sideróforos que
são secretados por microrganismos em resposta à baixa disponibilidade de ferro em
solução e que atuam como promotores de crescimento pela capacidade de prevenir
a proliferação de fitopatógenos no ambiente rizosférico (N
EILANDS
&
L
EONG
, 1986).
Outro exemplo, considerado dos mais eficientes, é a produção de antibióticos, pois
atuam em baixas concentrações. As espécies microbianas mais estudadas e
consideradas as mais eficientes no controle de patógenos, através da produção de
antibióticos, pertencem ao gênero Pseudomonas. Diversos compostos metabólicos,
de baixo peso molecular, produzidos por BPCV possuem atividade antifúngica, tais
como, por exemplo, o cianeto de hidrogênio produzido por Pseudomonas. Bactérias
como Cladosporium wernekii, Pseudomonas (Burkholderia) cepacia e P.
solanacearum possuem a capacidade de hidrolisar o ácido fusárico inibindo,
prevenindo os danos causados aos vegetais e permitindo a ativação dos
mecanismos de defesa vegetais (G
LICK
&
B
ASHAN
, 1997). Algumas BPCV produzem
enzimas que atuam na lise de células fúngicas, como quitinases, α-1.3-glucanase,
proteases e lipases (C
HET
&
I
NBAR
, 1994).
A competição por nutrientes, micro-hábitats e nichos ecológicos, na superfície
ou em tecidos internos dos vegetais, pode ocorrer concomitantemente aos
mecanismos de antibiose, produção de sideróforos, metabólicos fúngicos e enzimas,
amplificando o potencial de proteção contra fitopatógenos. O principal fator pode ser
a capacidade de metabolizar compostos específicos produzidos pelas plantas (i.e.
exudatos radiculares), transformando-os em compostos inibitórios aos patógenos.
Uma característica importante da competitividade no controle de patógenos é a
capacidade dos organismos permanecerem e proliferarem no ambiente controle.
Como existe um número limitado de sítios de infecção, bactérias saprofíticas que
competem por esses mesmos sítios podem diminuir a incidência de doenças (G
LICK
&
B
ASHAN
, 1997).
Outro processo ativado pelas BPCV seria a estimulação de próton ATPases
(H
+
-ATPases) de membrana plasmática e do tonoplasto, e as proto-pirofosfatases
(H
+
-PPases) encontradas na membrana do vacúolo. Estas enzimas exercem papel
17
crucial nos mecanismos de transporte de açúcares e nutrientes, controlando
processos moleculares e iônicos nas células (S
ERRANO
&
V
ILLALBA
, 1993).
A indução das ATPases em plantas por bactérias diazotróficas endofíticas
pode estar relacionada com o aumento do aporte de nutrientes e com a expansão
celular. A acidificação do meio externo, causada pela ativação da H
+
-ATPase de
membrana plasmática, inicia a expansão celular, durante o crescimento vegetal
(S
OMMARIN
et al., 1994). Este mecanismo conhecido como “Teoria do Crescimento
Ácido” é dependente da auxina, mas ainda não foi totalmente elucidado, pois falta
determinar os compostos secretados pela bactéria ou induzidos pela interação,
responsáveis pela estimulação da atividade das H
+
-ATPases e seus efeitos sobre o
acúmulo de biomassa.
2.4. Fixação Biológica de Nitrogênio na Cultura da Cana-de-Açúcar
Para D
ÖBEREINER
(1997), era de se esperar que a agricultura nas regiões
tropicais fosse mais dependente de fertilizantes nitrogenados que as regiões
temperadas, em face da ocorrência de fortes chuvas, altas taxas de decomposição
de matéria orgânica, lixiviação intensa e, conseqüentemente, rápidas perdas do
fertilizante nitrogenado aplicado.
D
ÖBEREINER
(1997) ainda cita que no Brasil o custo dos insumos é elevado, já
que não é subsidiado pelo governo, o que poderia tornar a agricultura improdutiva.
Em função disto, ao longo do tempo, em algumas culturas nacionais, foram
selecionados genótipos de plantas que apresentassem altos rendimentos com
baixas aplicações de N fertilizante. A baixa aplicação do fertilizante nitrogenado
tornou nossa agricultura economicamente viável e competitiva no mundo.
Neste contexto, a cultura da cana-de-açúcar é responsável pelo consumo de
1/5 do total de adubos vendidos no país, sendo o adubo nitrogenado o que mais
onera os seus custos. Para D
ÖBEREINER
(1993), sua substituição pela fixação
biológica de nitrogênio (FBN) pode representar a chave para uma agricultura
moderna e mais econômica.
S
AMPAIO
et al. (1984) demonstraram que a cultura da cana-de-açúcar acumula
entre 100 e 200 kg de N ha
-1
, por estação de crescimento. Demonstraram, também,
que praticamente todo o nitrogênio incorporado na planta é removido do campo de
cultivo na época da coleta, seja na retirada dos colmos ou na queima da folha
18
senescente antes do corte. Desse modo, deveria se esperar uma queda nos níveis
de nitrogênio total do solo, associado à queda na produtividade da cultura, o que não
ocorre, sugerindo que esta cultura possa se beneficiar da FBN. Um reforço a esta
hipótese é a falta de resposta à adubação nitrogenada em cana-de-açúcar plantada
em solos pobres em N. A
ZEREDO
et al. (1986) coletaram resultados referentes a 135
experimentos de campo, conduzidos nas mais importantes regiões canavieiras do
Brasil e mostraram que, no caso de cana-planta, apenas 19% dos experimentos
apresentaram resposta significativa à aplicação de N fertilizante. No caso de cana-
soca, as respostas à fertilização nitrogenada são mais freqüentes, porém raramente
as quantidades de N aplicado são maiores que a metade do N acumulado pela
cultura.
Muitas evidências têm sugerido que algumas variedades brasileiras podem
fixar nitrogênio atmosférico, como foi determinado pela utilização de gás
15
N
2
(R
USCHEL
et al., 1975; M
ATSUI
et al., 1981) e pela atividade da redução de acetileno
(D
ÖBEREINER
et al., 1972; P
ATRIQUIN
et al., 1980). Estes resultados foram
confirmados em um experimento de balanço de nitrogênio em solo marcado com
15
N
em potes (L
IMA
et al., 1987) e em tanque de concreto (U
RQUIAGA
et al., 1992),
mostrando que certas variedades de cana (híbridos interespecíficos de Saccharum
spp. var. CB 45-3 e SP70-1143 e de S. spontaneum var. Krakatau) podem obter
mais de 60% de N via FBN.
Estes experimentos evidenciaram que a capacidade de fixar nitrogênio pode
estar relacionada ao genótipo. Extrapolando resultados para o campo, B
ODDEY
et al.
(1995) sugeriram que cerca de 150 kg de N ha
-1
foram incorporados aos tecidos da
cana via FBN. S
INGH
(1994), estimou a contribuição da FBN utilizando a técnica de
diluição isotópica de
15
N, chegando a valores de 60% para Saccharum spontaneum,
4% para S. sinense e de 35% para S. barberi.
O
LIVEIRA
et al. (1994) demonstraram, em um experimento de balanço de N,
em condições de plantação comercial, que a variedade comercial CB 45-3
apresentou ganhos equivalentes a uma média de 30-55 kg N ha
-1
apesar de não ter
ocorrido irrigação. As variedades brasileiras respondem à aplicação de molibdênio
sendo esta uma característica típica de culturas que se beneficiam da FBN, devido
aos requerimentos deste nutriente como co-fator enzimático na atividade da
nitrogenase. Recentemente, Y
ONEYAMA
et al. (1997) estudaram variedades de cana-
de-açúcar de vários locais do Brasil, Japão e Filipinas e sugeriram uma baixa
19
abundância natural de
15
N nestas variedades, se comparadas às plantas do entorno.
Estas observações sugerem que, em muitos casos, a cana-de-açúcar pode obter
significantes doses de N oriundas da fixação. Porém, estudos mais rigorosos
utilizando esta técnica são necessários (B
ODDEY
et al., 2001 e 2003; P
OLIDORO
et al.,
2001).
Naturalmente, qualquer tecnologia que envolva a FBN irá se tornar mais
aceitável quando a alternativa de se utilizar fertilizantes nitrogenados ficar mais cara
ou inviável. Se isto ocorrer, a demanda por este tipo de tecnologia aumentará, sendo
de responsabilidade dos cientistas que trabalham em pesquisas agrícolas terem
estas tecnologias prontas para serem implantadas (B
ODDEY
et al., 1997).
2.5. Bactérias Endofíticas
Bactérias endofíticas têm sido reconhecidas por mais de 50 anos em
diferentes tecidos vegetais sem causar sintomas de doença (T
ERVET
&
H
OLLIS
,
1948). Apesar das numerosas investigações a respeito desses microrganismos,
muitos questionamentos e controvérsias ainda necessitam ser elucidados. O próprio
conceito de bactéria endofítica (revisado por J
AMES
&
O
LIVARES
, 1998; B
ALDANI
et al.,
2002(b); S
TURZ
et al., 2000; L
ODEWYCKX
et al., 2002) é bastante discutido e sujeito a
diferentes interpretações na literatura.
K
ADO
(1992) definiu bactérias endofíticas como aquelas que colonizam os
tecidos de plantas sem causar danos ou receber benefícios da interação. Esse
conceito é bastante restritivo, pois desconsidera a possibilidade de ocorrerem
associações benéficas ou maléficas entre endófitos e plantas. Por outro lado,
Q
UISPEL
(1992) considera como endofíticas apenas as bactérias que estabelecem
uma endossimbiose com a planta hospedeira. Posteriormente, H
ALLMANN
et al.
(1997) agrupam essas definições considerando endofíticas as bactérias que podem
ser isoladas de tecidos vegetais desinfetados superficialmente ou extraídas do
interior de plantas e que não causem mal ao hospedeiro. Essa definição inclui tanto
as associações neutras como as benéficas.
J
AMES
&
O
LIVARES
(1998) consideram todas as bactérias que colonizam os
tecidos de plantas como endofíticas, incluindo patógenos latentes, pois muitas
bactérias encontradas em tecidos vegetais assintomáticos são patogênicas em
outros locais.
20
A origem, forma de penetração, colonização e transmissão de bactérias
endofíticas ainda são bastante discutidas. Para H
ALLMANN
et al. (1997), bactérias
endofíticas provavelmente se originam de sementes, material propagado
vegetativamente, rizosfera e filoplano. A penetração pode ocorrer por aberturas
naturais (estômatos, hidatódios, nectários, lenticelas) e por ferimentos causados
principalmente pela emergência de raízes laterais, sendo a penetração ativa relatada
em bactérias que secretam celulases e pectinases (H
ALLMANN
et al., 1997; R
EINHOLD
-
H
UREK
&
H
UREK
, 1998; S
TURZ
et al., 2000).
A colonização realizada por bactérias endofíticas pode ser local, em um tecido
específico da planta, como o córtex, ou pode ser sistêmica, sendo transportadas
através da via aploplástica (p.ex. vasos do xilema) (J
AMES
et al., 1994). A
colonização é preferencialmente intercelular, com apenas poucos relatos de
colonização intracelular (H
ALLMANN
et al., 1997).
O estudo de bactérias endofíticas, por muitos anos utilizou-se dos métodos de
isolamento e contagem microbiológica. Amostras vegetais eram desinfestadas
superficialmente, utilizando-se diferentes produtos químicos, como hipoclorito de
sódio e peróxido de hidrogênio (revisado por L
ODEWYCKX
et al., 2002) e
posteriormente eram trituradas, ou centrifugadas, ou submetidas a vácuo para
isolamento bacteriano. Essas bactérias eram cultivadas em meios artificiais e a
população era estimada através da contagem das colônias, considerando o fator de
diluição ou aplicando a técnica do Número Mais Provável (H
ALLMANN
et al., 1997).
Apesar da importância que o método de isolamento adquiriu para identificar
bactérias em diferentes órgãos vegetais, e mesmo aliado às novas técnicas
moleculares, há certas limitações que o torna inviável para caracterizar a associação
endófitos-planta.
A desinfestação superficial não é totalmente eficaz. Os produtos químicos
utilizados podem penetrar nos tecidos vegetais e matar as bactérias endofíticas,
subestimando a população bacteriana no interior da planta (H
ALLMANN
et al., 1997).
Por outro lado, muitas bactérias epifíticas, que estão envoltas por mucilagem ou
aderidas fortemente à parede periclinal externa do tecido dérmico, podem
permanecer na planta após a desinfestação. Neste caso, seriam consideradas
erroneamente como endofíticas, superestimando o resultado (R
EINHOLD
-H
UREK
&
H
UREK
, 1998).
21
O cultivo em meios artificiais somente considera viáveis as bactérias
capazes de utilizarem os nutrientes daquele meio, logo, os microrganismos
considerados podem representar apenas uma pequena fração do total da população
endofítica (H
ALMANN
et al., 1997).
O isolamento, portanto, caracteriza-se por ser um método indireto na
geração de evidências da colonização endofítica em tecidos vegetais. Porém, há a
necessidade da confirmação dessa interação através de estudos microscópicos
(R
EINHOLD
-H
UREK
&
H
UREK
,
1998).
Evidências de associações endofíticas eficientes de plantas e bactérias foram
discutidas por K
LOEPPER
et al. (1992). B
ALDANI
et al. (1997) sugeriram uma nova
classificação para bactérias fixadoras de N
2
que colonizam gramíneas, em três
categorias: (1) organismos da rizosfera (colonizam a superfície das paredes
periclinais externas de raízes, como Azotobacter paspali, Beijerinckia spp.); (2)
endófitos facultativos (colonizam tanto a superfície como a interior das raízes,
incluindo, principalmente quatro espécies de Azospirillum, excluíndo-se A.
halopraeferaens) e; (3) endófitos obrigatórios (diazotróficos isolados recentemente
como G. diazotrophicus, Herbaspirillum spp. e Azoarcus spp., que colonizam o
interior de raízes e tecidos aéreos de plantas).
2.5.1. Bactérias diazotróficas endofíticas relacionadas à cana-de-açúcar
2.5.1a. Gluconacetobacter diazotrophicus (G
ILLIS
et al., 1989) Y
AMADA
et al.,
1998)
C
AVALCANTE
&
D
ÖBEREINER
(1988) isolaram esta espécie de bactéria como
sendo capaz de crescer em um meio de cultura LGI (C
AVALCANTE
&
D
ÖBEREINER
,
1988), cujos teores de sacarose e pH são semelhantes aos encontrados na
composição do caldo da cana-de-açúcar. Esse meio de cultivo foi, posteriormente,
modificado por R
EIS
et al. (1994) quando inovaram a metodologia para o isolamento
desta bactéria, adicionando uma menor quantidade de caldo de cana-de-açúcar ao
meio de cultivo desenvolvido.
Esta bactéria é uma α-Proteobacteria e a primeira identificada, da família
Acetobacteriaceae, a fixar N
2
. É uma bactéria Gram-negativa, aeróbica, porém fixa
N
2
em condições de microaerofilia (0.2 kPa) (R
EIS
&
D
ÖBEREINER
,
1998). Excretando
22
uma boa quantidade de ácidos em seu metabolismo, acarreta uma queda do pH
com o seu crescimento, continuando a fixar N
2
em meio de cultivo mesmo nestas
condições (pH < 3,0) (S
TEPHAN
et al., 1991). Destaca-se pela capacidade de fixar N
2
na presença de concentrações de nitrato superiores a 25 mM e não possuir a
enzima redutase do nitrato, sendo parcialmente inibida pela presença de amônia
(especialmente em altas concentrações de sacarose) e aminoácidos (R
EIS
et al.,
1990; B
ODDEY
et al., 1991 e S
TEPHAN
et al., 1991). Esta bactéria também tolera altas
concentrações de sacarose (10-25%) e apresenta colônias de coloração marrom em
placas de meio batata com 10% de sacarose (D
ÖBEREINER
et al.,
1995a).
C
OJHO
et al. (1993) estudaram um sistema de cultivo desta bactéria com uma
levedura. Estes autores observaram que cerca de 50% do N fixado por ela foi
transferido para a levedura, desde o início do crescimento da cultura. Este sistema
de cultivo misto vem sendo usado como modelo para explicar a rápida transferência
do N fixado pela bactéria para a planta. Posteriormente, C
RUZ
et al. (1995)
determinaram a quantidade de NH
3
excretada por G. diazotrophicus em condições
de fixação de N
2
.
Desde os trabalhos de D
ÖBEREINER
et al. (1990) que se sabe que G.
diazotrophicus não sobrevive por longo tempo nos solos, sendo transferida por meio
dos toletes. Usando uma fusão de genes lac-Z, C
ARUZO
et al. (1995), observaram
que esta bactéria não pôde ser encontrada no solo 2 dias após a inoculação,
embora sobreviva por até 10 dias em solo estéril. Mais recentemente, O
LIVEIRA
et al.
(2004) demonstraram que o teor de umidade do solo possui maior influência nas
espécies endofíticas, em comparação às espécies associativas. Neste trabalho, os
autores avaliaram o efeito da umidade do solo na sobrevivência de três espécies de
bactérias diazotróficas e verificaram que o teor de umidade apresentou pouca
influência na sobrevivência de A. brasilense, considerada uma espécie cosmopolita,
enquanto A. amazonense e G. diazotrophicus, consideradas endofíticas,
aumentaram o período de culturabilidade na presença de umidade no solo. Esta
bactéria também não foi encontrada em plantas invasoras de canaviais (D
ÖBEREINER
et al., 1993), cujos resultados foram confirmados utilizando-se um “primer” espécie-
específico para a detecção de G. diazotrophicus (R
EIS
et al., 1995). Apesar disto,
B
ARBOSA
et al. (1997) conseguiram re-isolar esta bactéria após pré-germinar toletes
de cana-de-açúcar de plantas oriundas de micropropagação após 3 e/ou 10 meses
no campo.
23
Estudos iniciais da ocorrência deste diazotrófico mostraram que o mesmo
possuía poucos hospedeiros tendo sido principalmente encontrado em associação
com plantas ricas em açúcar como cana-de-açúcar (C
AVALCANTE
&
D
ÖBEREINER
,
1988; R
EIS
et al., 1994), batata-doce (P
AULA
et al., 1993), capim Cameroon
(D
ÖBEREINER
et al., 1993), café (J
IMENEZ
-S
ALGADO
et al., 1997) e abacaxi (T
APIA
-
H
ERNANDEZ
et al., 2000). Esta bactéria coloniza raízes, colmos e folhas de cana-de-
açúcar em números de até 10
6
células g
-1
de massa fresca ou mais (R
EIS
et al.,
1994; B
ODDEY
et al., 1998 e R
EIS
J
UNIOR
et al., 2000); em batata doce foi encontrado
em números de até 10
5
células g
-1
peso da matéria fresca (P
AULA
et al., 1993). Fora
do Brasil, esta bactéria foi encontrada na Austrália (L
I
&
M
AC
R
AE
, 1991; B
ODDEY
et
al., 1998), México (F
UENTES
-R
AMIREZ
et al., 1993), Cuba (D
ONG
et al., 1994),
Argentina (B
ELLONE
et al., 1997) e Índia (M
ADHAIYAN
et al., 2004). Todas estas
características levaram ao reconhecimento de seu caráter endófito obrigatório
(B
ALDANI
et al., 1997), sendo o estudo desta associação vital para se compreender
os elevados ganhos de N pela cana-de-açúcar (R
EIS
, 1994; B
ODDEY
et al., 1995).
O processo de infecção e colonização da cana-de-açúcar, por G.
diazotrophicus, foi estudado por J
AMES
et al. (1994) e por R
EIS
J
UNIOR
et al. (1995).
As bactérias se concentraram na superfície das paredes periclinais externas das
raízes e ao redor da junção da raiz lateral, infectando as plantas nestes locais.
Dentro das raízes, a bactéria foi observada em células epidérmicas aparentemente
intactas, aumentadas, e também nos elementos de vaso na base do colmo, por
onde, aparentemente a bactéria migra para outros tecidos. A confirmação de que G.
diazotrophicus coloniza os espaços intercelulares do parênquima do colmo de cana-
de-açúcar vem do trabalho de D
ONG
et al. (1994) que mostrou a presença destas
bactérias em números de 10
4
células.mL
-1
em fluidos do apoplasto.
Recentemente, duas outras espécies de Gluconacetobater – G. johannae e G.
azotocaptans – foram descritas como associadas a plantas de café (Coffea arabica)
no México (F
UENTES
-R
AMIREZ
et al., 2001). Uma outra espécie de Gluconacetobacter
– G. sacchari – foi isolada de cochonilhas rosadas - Saccharicoccus sacchari
(Cockerell) - e de bainhas das folhas cana-de-açúcar em Queensland (Austrália).
Porém, não existem evidências desta espécie ser capaz de fixar nitrogênio (F
RANKE
et al., 1999).
24
2.5.1b. Herbaspirillum seropedicae (B
ALDANI
et al., 1986)
A primeira bactéria diazotrófica com características endofíticas foi isolada em
de rizosfera, raízes lavadas e da superfície esterilizada de raízes de milho, sorgo, e
arroz sendo primeiramente denominada Azospirillum seropedicae (B
ALDANI
et al.,
1984). Posteriormente, estudos de homologia DNA:DNA demosntraram que está
bactéria pertencia a outro gênero, tendo sido denomionada Herbaspirillum
seropedicae (B
ALDANI
et al., 1986). Esta é uma bactéria Gram-negativa, de aspecto
curvo, com flagelo polar e que cresce melhor na presença de ácidos dicarboxílicos,
gluconato, glicose e manitol, fixando nitrogênio numa faixa de pH entre 5,3 e 8,0
(B
ALDANI
et al., 1986; U
RETA
et al., 1995). Esta bactéria também tolera, e continua
fixando N
2
, em concentrações de sacarose superiores a 10%, apesar de não
metabolizar este substrato (B
ALDANI
et al., 1992; U
RETA
et al., 1995). Não é clara,
porém, qual a forma de composto carbônico que é utilizada por esta bactéria.
B
ODDEY
et al. (1995), sugeriram que ácidos orgânicos, originados da fermentação
realizada por G. diazotrophicus, possam ser uma possibilidade. Esta bactéria tolera
uma relativamente alta pressão de oxigênio (3%), sem afetar a sua taxa de fixação
(B
ALDANI
et al., 1986). Diferentemente do observado para a bactéria G.
diazotrophicus, H. seropedicae expressa a enzima redutase do nitrato, não fixando
N
2
na presença de N (extrato de levedura, NO
3
-
), embora a atividade da nitrogenase
seja somente parcialmente inibida por concentrações superiores a 20 mM de amônia
(F
U
&
B
URRIS
, 1989).
Esta bactéria apresenta especificidade hospedeira mais ampla que G.
diazotrophicus tendo sido isolada de muitas gramíneas no Brasil como cana-de-
açúcar (O
LIVARES
et al.,
1996;
R
EIS
J
UNIOR
et al.,
2000),
milho, sorgo, arroz (B
ALDANI
et al., 1986; D
ÖBEREINER
,
1993;
D
ÖBEREINER
et al., 1993). Também foi isolada de
outras plantas não leguminosas inclusive palmeiras (F
ERREIRA
et al., 1995). Foi
encontrada em raízes e folhas de gramíneas (D
ÖBEREINER
et al., 1994), mas não
dentro de folhas de cana-de-açúcar colhidas do campo (O
LIVARES
et al., 1996). A
inoculação artificial da cana-de-açúcar com H. seropedicae mostrou que esta
bactéria localiza-se nos elementos de vaso das folhas próximos ao local da
inoculação (O
LIVARES
et al., 1997). O padrão de colonização das raízes de cana-de-
açúcar por H. seropedicae é bastante semelhante ao observado para G.
diazotrophicus.
25
O mecanismo de disseminação natural de H. seropedicae não está claro,
embora pareça ocorrer principalmente pelas sementes, em função de ter sido
isolada ocasionalmente de sementes de cereais (B
ALDANI
et al., 1992). Em plantas
que se propagam vegetativamente como a cana-de-açúcar, pode ser transmitida da
mesma maneira como observada para G. diazotrophicus. Isto foi confirmado pela
presença destas bactérias em plantas de cana-de-açúcar que se originam do
processo de micropropagação onde o meristema apical não foi cuidadosamente
removido (O
LIVARES
et al., 1996).
Como outros endófitos, H. seropedicae não sobrevive bem em solo natural,
sendo menos afetado em solo estéril, o que indica que fatores bióticos possam
interferir na sua sobrevivência. O
LIVARES
et al. (1996) observaram que o
reisolamento de estirpes de H. seropedicae e H. rubrisubalbicans inoculadas em
solo, somente ocorre na presença da planta hospedeira. Este fato provavelmente
ocorre em função da liberação na rizosfera de substâncias que sinalizem à bactéria.
Não obstante, a sobrevivência de H. seropedicae em solo estéril e natural é melhor
que o observado para G. diazotrophicus (C
ARUSO
&
B
ALDANI
, 1995). Apesar disto,
A
RCANJO
et al. (2000) não conseguiu reisolar estirpes de Herbaspirillum de amostras
de solo oriundas de canaviais utilizando plântulas de cana-de-açúcar
micropropagadas como planta isca.
Nos anos 90 iniciaram-se os estudos relacionados à organização e regulação
dos genes desta espécie (S
OUZA
et al., a e b). Atualmente, o genoma desta bactéria
é estudado por GENOPAR Consortion of Paraná State. Este consórcio envolve 16
laboratórios do Paraná, 3 de Santa Catarina, 2 do Rio de Janeiro e 1 do Rio Grande
do Sul. O objetivo deste projeto é entender as via metabólicas de H. seropedicae
com o intuito de incrementar a eficiência da interação planta/bactéria.
2.5.1c. Herbaspirillum rubrisubalbicans (C
HRISTOPHER
&
E
DGERTON
, 1930)
B
ALDANI
et al., 1996
Outra bactéria do gênero Herbaspirillum encontrada em cana-de-açúcar, é H.
rubrisubalbicans. Esta bactéria - fixadora de nitrogênio e endofítica obrigatória- foi
inicialmente classificada como Pseudomonas rubrisubalbicans, sendo agente causal
da doença denominada “estria mosqueada”. Existem variedades de cana-de-açúcar
suscetíveis á esta doença em vários países, exceto no Brasil (P
IMENTEL
et al., 1991).
26
Baseando-se na homologia DNA-rRNA, em algumas características fisiológicas e
também na incorporações de gás
15
N
2
, esta bactéria foi incluída no gênero
Herbaspirillum (G
ILLIS
et al., 1991; B
ALDANI
et al., 1996). A inoculação de H.
rubrisubalbicans em folhas da cana-de-açúcar variedade B-4362, suscetível à estria
mosqueada, resultou no aparecimento de sintomas desta doença (O
LIVARES
et al.,
1993), porém nenhum sintoma foi observado nas variedades comerciais brasileiras
desta cultura (CB 45-3, NA 56-79 ou SP70-1143) inoculadas com esta mesma
bactéria. A inoculação destas variedades e da variedade B-4362, com H.
seropedicae não produziu nenhum sintoma da doença, somente apresentando
pontos necróticos (O
LIVARES
et al., 1993).
Estudos da colonização de cana-de-açúcar por este endófito demonstraram
que este se concentrou principalmente nos tecidos aéreos e protoxilema (O
LIVARES
et al., 1993). No caso da variedade B-4362, H. rubrisubalbicans foi encontrada
bloqueando completamente alguns elementos de vasos e colonizando os espaços
intercelulares no mesofilo. Por outro lado, na variedade SP70-1143 - resistente à
estria-mosqueada - as bactérias colonizam também o xilema, mas em agrupamentos
de 10 a 20 células encapsuladas por material eletron-denso, provavelmente
originário da planta (O
LIVARES
et al., 1997).
O padrão de colonização das raízes de cana-de-açúcar mostrou-se
semelhante a H. seropedicae. Resultados preliminares na colonização das raízes de
arroz por H. rubrisubalbicans mostraram que as bactérias se concentram no ponto
de emergência das raízes secundárias e primeiro colonizam as células da epiderme
e da hipoderme onde começam a se multiplicar e a colonizar a parte superior da
planta, provavelmente pelo xilema.
Esta espécie possui características fisiológicas e metabólicas bastante
semelhantes aos isolados de H. seropedicae, além de fixar N
2
, (G
ILLIS
et al., 1991).
Difere de H. seropedicae por utilizar o substrato “meso-erithritol” e por sua
temperatura ótima de crescimento ser de 32 °C.
Quanto à sua sobreviência no solo, O
LIVARES
et al. (1996) também
observaram o reisolamento de estirpes de H. rubrisubalbicans inoculadas em solo e
descrevem para esta bactéria comportamento semelhante ao demonstrado por H.
seropedicae.
27
O gênero Herbaspirillum foi recentemente expandido com a descrição de uma
nova espécie denominada H. frisingense, isolada de raízes e folhas de gramíneas
forrageiras da Alemanha e do Brasil (K
IRCHHOOF
et al., 2001). Bactérias relacionadas
ao gênero Herbaspirillum foram detectadas em variedades selvagens e comerciais
de arroz no Japão, entretanto, não foram encontradas relações com nenhuma das
espécies conhecidas de Herbaspirillum (E
LBELTAGY
et al., 2001).
28
“M
UTUAL AID IS MET WITH EVEN AMIDST THE LOWEST ANIMALS
,
AND WE MUST BE PREPARED
TO LEARN SOME DAY
[…]
FACTS OF UNCONSCIOUS MUTUAL SUPPORT
,
EVEN FROM THE LIFE
OF MICROORGANISMS
”
P. Kropotkin, 1902.
29
CAPÍTULO I
ESTABELECIMENTO IN VITRO DE BACTÉRIAS DIAZOTRÓFICAS
ENDOFÍTICAS EM PLÂNTULAS MICROPROPAGADAS DE CANA-DE-AÇÚCAR
SOB SISTEMAS MONOXÊNICOS DE LONGA DURAÇÃO.
30
1. RESUMO
A colonização das raízes de cana-de-açúcar por bactérias diazotróficas dos
gêneros Herbaspirillum e Gluconacetobacter tem sido estudada em sistemas
monoxênicos de curta duração, utilizando plantas micropropagadas. No presente
experimento, estirpes de H. seropedicae (Z67, HRC54), de H. rubrisubalbicans
(HCC103, M4) e de G. diazotrophicus (Pal3, PR2) foram inoculadas de forma isolada
em plântulas micropropagadas de cana-de-açúcar var. SP70-1143, sendo mantidas
em sistema de cultivo monoxênico, sem adição de macro e micronutrientes, por 11
meses. O objetivo foi testar a viabilidade dessa associação pelo estabelecimento de
uma interdependência metabólica planta/bactéria. O estabelecimento endofítico das
bactérias inoculadas foi avaliado pela adaptação de um método de monitoramento in
situ da colonização radicular, utilizando anticorpos policlonais combinados com
microscopia ótica, epifluorescente, microscopia eletrônica de transmissão (MET) e
de varredura (MEV). O sistema demonstrou-se adequado para essa avaliação de
longa duração, sendo observado que, além da redução da mortalidade em plantas
inoculadas, houve incremento no peso da massa das raízes e da parte aérea secas
com relação ao controle não inoculado. A população de bactérias diazotróficas
associada às raízes das plantas, aos 330 dias após a inoculação, foi medida pelo
crescimento em meio de cultura semi-sólido e semi-específico. Os resultados
demonstraram uma população entre 10
2
e 10
4
células. grama
-1
de raiz, indicando o
estabelecimento efetivo, e metabolicamente ativo, dessas bactérias no sistema
proposto. As análises estruturais revelaram que as bactérias colonizaram,
predominantemente sob a forma de agregados, a superfície das paredes periclinais
externas das células epidérmicas da raiz e dos pêlos radiculares, bem como o
interior das raízes, via apoplasto. Comparações entre observações microscópicas
obtidas em experimentos monoxênicos de curta e de longa duração sugerem a
existência de um padrão no relacionamento estrutural bactéria-planta que independe
da escala temporal. A técnica de imunofluorescência aplicada neste estudo se
mostrou eficiente para a localização rápida e específica das bactérias, bem como
sua distribuição espacial na superfície externa dos tecidos radiculares. Em adição, o
sistema monoxênico proposto permitiu o estabelecimento sustentável de uma
interação de longa duração entre a bactéria e a planta, possibilitando os estudos de
interdependência metabólica, que poderiam, hipoteticamente, levar ao
estabelecimento de simbioses artificiais.
31
2. ABSTRACT
Micropropagated sugarcane plants have been used as a model system to
evaluate plant colonization by the diazotrophic bacteria Herbaspirillum and
Gluconacetobacter under short-term monoxenic assays (i.e. less than 15 days after
inoculation). At the present experiment, micropropagated sugarcane plants cv. SP70-
1143 were inoculated with selected strains from H. seropedicae (Z67, HRC54), H.
rubrisubalbicans (HCC103, M4) and G. diazotrophicus (PAL3, PR2). After
inoculation, the gnotobiotic system was maintained for eleven months without adding
macro and micronutrients. The aim of this study was to evaluate the association
viability by establishing a metabolic interdependence between the partners. The root
colonization of the inoculated bacteria was evaluated using a protocol for in situ
localization considering polyclonal antibodies coupled with epifluorescent
microscopy, as well as light and electron microscopy. The system developed seems
to be suitable over eleven months experimental plant-bacteria association. It was
observed that the bacterial inoculation reduced plant mortality and increased dry
weight of the roots and aerial parts related to control. The population size of the
diazotrophic bacteria in roots determined by isolation in semi-solid N-free medium
ranged from 10
2
to 10
4
cells.g
-1
of fresh root after 330 days, indicating the viability of
the bacteria over the assay. Structural studies had shown that all bacterial strains
were seen colonizing epidermal cells and root hair surface, mainly forming
aggregates, such as the inner tissue via apoplast. Comparison of microscopical
observation between short and long-term experiments suggests that the pattern of
structural relationship bacteria-plant maintain no dependence with time scale. The
immuno-fluorescence approach was satisfactory for a rapid and specific location, as
well as spatial distribution of the inoculated bacteria in the root cell surface.
Moreover, the proposed monoxenic system allowed the sustainable establishment of
the interaction plant-bacteria for long duration, opening opportunities for detailed
studies involving metabolic interdependence, which potentially could lead to
establishment of artificial symbiosis.
32
3.
INTRODUÇÃO
Os estudos envolvendo a biologia das interações endofíticas em gramíneas
tropicais foram alavancados por D
ÖBEREINER
(1992). Esta autora destacou o hábitat
endofítico como favorável para que as bactérias possam influenciar mais
eficientemente no crescimento e desenvolvimento vegetal. Isto se deve ao fato de se
acreditar que, comparado ao ambiente rizosférico, o interior do vegetal seja menos
sujeito a flutuações ambientais e à competição microbiana. Além da possibilidade de
estabelecimento de uma interface de troca metabólica mais direta.
Entretanto, a complexidade dos sistemas naturais dificulta a interpretação dos
processos envolvidos na relação microrganismo-planta-ambiente. Sistemas que
utilizem modelos simplificados podem facilitar o estudo isolado de cada
microrganismo e elucidar alguns desses processos. No caso de bactérias
diazotróficas, por exemplo, o sistema de fixação biológica de N
2
, pode ser, em tese,
analisado passo a passo. Esta análise periódica pode facilitar a descrição dos
eventos parciais que resultam no estabelecimento do endófito. Neste contexto,
sistemas de cultivo monoxênicos, utilizando plantas micropropagadas de cana-de-
açúcar inoculadas com estirpes selecionadas, têm permitido avanços no
entendimento estrutural desta interação (J
AMES
et al.,1994; O
LIVARES
, 1997; J
AMES
et
al., 2001).
Diferentes trabalhos, utilizando técnicas microscópicas, estudaram a
colonização endofítica de raízes de gramíneas. Estes têm demonstrado que as
bactérias diazotróficas colonizam o interior vegetal por meio de penetração passiva,
através de ferimentos e aberturas naturais, como sítios de emergência de raízes
laterais e a região de interação entre a coifa e o sistema dérmico. A colonização dos
tecidos radiculares ocorre pela via apoplástica, se instalando nos espaços
intercelulares das células da hipoderme, córtex radicular, tecido vascular e parede
do aerênquima, este último em plantas de arroz (R
EINHOLD
et al.,
1986;
L
EVANONY
et
al.,
1989;
H
UREK
et al.,
1994;
J
AMES
et al., 1994, 2002; O
LIVARES
et al., 1996;
O
LIVARES
et al., 1997; J
AMES
&
O
LIVARES
, 1998; R
EINHOLD
-H
UREK
&
H
UREK
, 1998;
G
YANESHWAR
et al., 2001, 2002).
Quase a totalidade dos estudos acima citados foram baseados em ensaios de
curta duração, com períodos de interação não superiores a 15 dias após a
inoculação da bactéria. Ensaios de longa duração em sistemas monoxênicos têm
33
sido propostos como estratégia para o estudo da fixação biológica de nitrogênio
(FBN) em diferentes espécies vegetais, pelo estabelecimento de associações
artificiais, como os conduzidos por B
ERG
et al. (1979) para Azospirillum e por
C
ARLSON
&
C
HALEFF
(1974) para Azotobacter vinelandii. Muitos dos estudos se
baseiam na manipulação, por sucessivas repicagens, de células não diferenciadas
(“callus”) ou plantas oriundas de cultura de tecidos inoculadas com a bactéria alvo.
Uma interdependência metabólica entre os membros da associação foi demonstrada
de tal modo que a planta é suprida com uma fonte de carbono não metabolizável
pela bactéria, em meio de crescimento com baixos teores de nitrogênio.
No presente estudo objetivou-se avaliar a sustentabilidade temporal e
funcional da interação endofítica e a promoção do crescimento de plantas
micropropagadas de cana-de-açúcar inoculadas com Herbaspirillum seropedicae,
Herbaspirillum rubrisubalbicans e Gluconacetobacter diazotrophicus em sistemas
monoxênicos de longa-duração. Para tanto, foram considerados os seguintes
objetivos específicos:
• Avaliar o crescimento das plântulas micropropagadas de cana-de-açúcar em
função da presença de diferentes espécies/estirpes de bactérias diazotróficas
endofíticas;
• Avaliar possíveis alterações morfológicas e estruturais tanto na planta como
na bactéria em função do longo período de interação;
• Caracterizar estruturalmente o mico-ambiente criado a partir do
estabelecimento da relação bactéria/planta de cana-de-açúcar neste sistema
monoxênico de longo prazo.
34
4. MATERIAL E MÉTODOS
A primeira parte dos trabalhos a que se refere este capítulo, ou seja,
instalação e manutenção dos experimentos monoxênicos de longa duração, foi
realizada durante o ano de 1999 na Embrapa Agrobiologia. A partir da obtenção das
amostras os trabalhos foram realizados no Laboratório de Biologia Celular e
Tecidual/CBB/UENF.
4.1. Estirpes Bacterianas Utilizadas
Os dados relativos às estirpes das bactérias diazotróficas endofíticas
utilizadas neste trabalho encontram-se listados na tabela 1.
Tabela 1: Origem e designação das estirpes de bactérias diazotróficas utilizadas
Nome Científico Estirpes Origem Referências
PR2
∗
BR11200
♦
ATCC 49039
#
LMG 8067
Saccharum sp.
, raiz
Rio de Janeiro, Brasil
Gluconacetobacter diazotrophicus
PAL3
BR11280
LMG
8066
Saccharum sp.
, raiz
Alagoas, Brasil
(G
ILLIS
et al., 1989)
Y
AMADA
et al., 1998
Z67
(estirpe tipo)
BR11175
ATCC 35892
DSM 6445
LMG 6513
Oryza sativa, raiz
Brasil
B
ALDANI
et al., 1986
Herbaspirillum seropedicae
HRC54
BR11335
Saccharum sp.
Raiz var. SP70-1143
Brasil
B
ALDANI
et al., 1996
M4
(estirpe tipo)
B579
BR11192
ATCC 19308
DSM 9440
LMG 2286
Saccharum sp.
USA
(C
HRISTOPHER
&
E
DGERTON
,
1930)
B
ALDANI
et al., 1996
Herbaspirillum rubrisubalbicans
HCC103
BR11504
Saccharum sp.
Colmo var. SP70-1284
Brasil
B
ALDANI
et al., 1996
Designação das estirpes nas referidas coleções:
∗
∗∗
∗
Embrapa Agrobiologia, Seropédica-RJ, Brasil.
♦
ATCC-American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA.
•
DSMZ-Deutsche
SammLung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweing, Germany.
#
##
#
BCCM
/LMG-Bacteria Collection, Universiteit Gent, Laboratorium voor Mikrobiologie, Gent, Bélgica.
Híbridos interespecíficos.
35
4.2. Obtenção das Plântulas Micropropagadas
Plântulas micropropagadas de cana-de-açúcar (híbridos interespecíficos de
Saccharum) da variedade SP70-1143 (gentilmente cedidas pela COPERSUCAR,
SP) foram obtidas a partir do cultivo de meristemas. O método utilizado para a
obtenção de plântulas enraizadas seguiu o protocolo descrito por H
ENDRE
et al.
(1983). As plântulas foram produzidas em meio básico de cultivo MS, modificado
quanto à concentração de fitorreguladores usada para promover a multiplicação da
parte aérea (MS2) e o enraizamento (MS3) (M
URASHIGUE
&
S
KOOG
, 1962), durante
50 a 60 dias. Após a fase de enraizamento, e perfilhamento, as mesmas foram
transferidas para novo meio líquido MS (1/10) [2% de sacarose], sem hormônios e
sem vitaminas, e com a concentração de sais e sacarose reduzida 10 vezes (R
EIS
et
al., 1999). Em todas as fases as plântulas foram cultivadas em vidros tipo
“maionese” (volume total 250 mL) contendo 50 mL dos referidos meios (Figura 1),
mantidas em câmara de crescimento a 25 °C (± 2 °C), sob luz artificial (3000 lux)
com um fotoperíodo de 12 h.
4.3. Inoculação das Plântulas
Após um período de três dias no meio MS 1/10 (R
EIS
et al., 1999), as plântulas
foram inoculadas com 100 µL de uma suspensão contendo 10
6
a 10
7
células mL
-1
das bactérias G. diazotrophicus (PR2 e PAL3), H. seropedicae (Z67e HRC54) e H.
rubrisubalbicans (M4 e HCC103) crescidas em meio DYGS (R
ODRIGUES
N
ETO
et al.,
1986) líquido por 24 h a 32 °C. Após este período, alíquotas de 100 µL desta
suspensão foram centrifugadas a 6.000 rpm/5 min. O tratamento controle recebeu a
mesma alíquota após esterilização do inóculo em autoclave (121 ºC por 30 minutos).
4.4. Avaliações no Sistema Monoxênico de Longa Duração.
Plântulas micropropagadas de cana-de-açúcar enraizadas foram inoculadas
com as seis estirpes das bactérias presentes na Tabela 1 do item 4.1. Sete dias
após a inoculação, as plântulas foram transferidas para vidros com capacidade para
3 L litros contendo 1 L de meio ágar (5%) com ¼ dos sais do meio LGI-P
(C
AVALCANTE
&
D
ÖBEREINER
, 1988), sem a adição de fonte de carbono e de
36
nitrogênio (S
ILVA
et al., 1997). Os vidros foram vedados com rolha de algodão,
recobertas por gaze, para que ocorresse livre troca gasosa com a atmosfera.
Conforme descrito anteriormente não ocorreu a adição posterior de nutrientes. As
mesmas foram mantidas a 25 °C sob luz artificial (3000 lux) com um fotoperíodo de
12 horas por um período de 11 meses. Visando a estimulação do fototropismo
negativo das raízes a base dos vidros foi forrada com papel alumínio (Figura 1). O
mesmo procedimento foi adotado para plântulas micropropagadas de cana-de-
açúcar enraizadas não inoculadas (controle).
Figura 1: Vidros contendo plântulas micropropagadas de cana-de-açúcar (var. SP70-1143)
inoculadas com diferentes estirpes das bactérias G. diazotrophicus, H. seropedicae e H.
rubrisubalbicans, crescidas em meio ágar (5%) com ¼ dos sais do meio LGI-P por 11 meses sem
adição posterior de nutrientes e com fotoperíodo controlado.
37
4.4.1. Delineamento experimental e análise do desenvolvimento das plântulas
Foram utilizados 7 tratamentos ({6 estirpes bacterianas [PR2 e PAL3 (G.
diazotrophicus); Z67 e HRC54 (H. seropedicae); M4 e HCC103 (H. rubrisubalbicans)]
X plântulas de cana-de-açúcar)} + a plântula controle não inoculada). Foram
utilizados 6 vidros para cada tratamento, cada um com 4 plântulas (24 plântulas para
cada tratamento).
A primeira avaliação foi realizada visando analisar o desenvolvimento das
plântulas, sem a alteração do sistema de crescimento utilizado. Para tanto, foram
realizadas observações não destrutivas das parcelas 30 dias após a implantação do
experimento. Cada parcela foi analisada por meio de observação direta sob
iluminação focal e com o auxílio de régua. As variáveis analisadas foram: (1)
produção de folha senescente por planta; (2) número de plântulas mortas; (3)
número total de plântulas; (4) comprimento das raízes e folhas; (5) número de
perfilhos e (6) número de raízes.
A segunda avaliação ocorreu aos 11 meses após a implantação do
experimento. As plântulas foram retiradas do meio e lavadas com água destilada
estéril e secas. Foram analisadas as variáveis peso da biomassa fresca/seca e
comprimento (cm) da parte aérea e das raízes.
O delineamento experimental foi o inteiramente casualisado (6 estirpes
bacterianas + controle sem bactérias) X 6 repetições (recipientes de vidro),
perfazendo um total de 42 parcelas. Foi efetuada a ANOVA (teste F de Snedecor) e,
quando necessário, o teste de separação de médias (Tukey p ≤ 0,05) de todos as
variáveis estudadas em ambas as datas de avaliação.
4.4.2. Quantificação da população de bactérias associadas às raízes
Amostras de raízes lavadas (100 mg) foram obtidas aos quatro (experimento
teste) e 11 meses para estimativa da população das diferentes estirpes inoculadas.
Para tanto, as amostras vegetais foram diluídas serialmente em solução salina até
10
-9
e de cada diluição foram retiradas alíquotas de 0,1 mL e inoculadas em frascos
com meio de cultura semi-sólido isentos de nitrogênio, semi-específicos para
Herbaspirillum spp. (meio JNFb, B
ALDANI
et al., 1992) e para G. diazotrophicus (meio
LGI-P, R
EIS
et al., 1994). Os frascos foram incubados a 30 ºC por 5-8 dias. Após
38
este período, o crescimento bacteriano foi avaliado verificando-se o aparecimento de
película aerotáxica característica (D
ÖBEREINER
et al., 1995b). A estimativa da
população foi obtida pela consulta a tabela de McCrady para três frascos por diluição
através do método de Número Mais Provável (NMP) (P
OCHON
&
T
ARDIEUX
, 1962).
4.4.3. Técnicas microscópicas e imunológicas aplicadas à detecção das
bactérias no tecido da planta
4.4.3a. Microscopia óptica e eletrônica de transmissão
Aos 11 meses após a implantação do experimento, amostras (0,5-1,0 cm
comprimento) de raízes inoculadas (região de alongamento, absorção e emissão de
raízes secundárias) foram obtidas das plantas de todos os tratamentos. Estas
amostras, utilizadas para microscopia óptica (MO) e microscopia eletrônica de
transmissão (MET), foram obtidas e imediatamente fixadas em glutaraldeído 2,5%,
em solução tampão fosfato por 24 h à temperatura ambiente. Após a fixação, as
amostras foram lavadas três vezes no mesmo tampão e desidratadas em série
etanólica crescente (15, 30, 50, 70, 80, 90, 2x 100% v/v), permanecendo por 15
minutos em cada mistura. Após a desidratação, as amostras foram embebidas em
resina acrílica L.R. White medium grade (London Resin Company, Inglaterra)
durante um período de sete dias a 4 ºC, e posteriormente emblocadas em cápsulas
de gelatina contendo resina e postas para polimerizar em estufa a 60 ºC por um
período de 18 h. Das cápsulas polimerizadas foram obtidas seções semi-finas (0,7–
1,0 µm) e ultra-finas (50–80 nm) utilizando-se o ultramicrótomo (Reichert Ultracut S,
Leica), respectivamente para MO e MET. As seções semi-finas foram coletadas em
lâminas de vidro e coradas com azul de toluidina solução (0,1%), para exame em
microscópio óptico (Axioplan, Zeiss). Já, as seções ultra-finas foram recolhidas em
grades hexagonais (200 ou 300 mesh) de cobre, cobertos com Formvar 15/95
(Shawinigan Resins Corporation, Springfield, Massachusetts, EUA), em seguida
contrastadas com acetato de uranila (5% em água) por 20 min e citrato de chumbo
por 3 a 5 min e examinadas no microscópio eletrônico de transmissão (EM 900,
Zeiss).
39
4.4.3b. Microscopia Eletrônica de Varredura
Amostras de raízes de plântulas micropropagadas da variedade SP70-1143
inoculadas com a bactéria diazotrófica H. rubrisubalbicans (HCC103) foram
seccionadas em tampão fostato [0,1 M, pH 6,8] e prontamente fixadas em
paraformaldeído [4%], glutaraldeído [2,5%] em tampão fostato [0,1 M, pH 6,8]. Em
seguida, foram lavadas em triplicata em tampão fostato [0,1 M] e pós-fixadas com
Tetróxido de Ósmio [1%] em tampão fostato [0,1 M] por 30 min. Procedeu-se nova
lavagem no mesmo tampão. Logo após, foram desidratadas em série acetônica
crescente (15, 30, 50, 70, 90, 2x 100% e super seca) e, posteriormente
completamente secas pelo ponto crítico do dióxido de carbono no Critical Point Dryer
(CPD 030, BAL-TEC, Alemanha). Foram aderidas com cola de prata a suportes
próprios (stubs) para observação ao microscópio eletrônico de varredura.
Posteriormente, foram metalizadas pela deposição de ouro coloidal no aparelho
Sputer Coater (SCD 050, BAL-TEC, Alemanha) com uma camada de
aproximadamente 20 nm, para permitir uma melhor condutividade. A observação foi
realizada no Microscópio Eletrônico de Varredura (DSEM 962, Carl Zeiss,
Alemanha).
Nos estudos envolvendo comparação de agregados bacterianos em meio de
cultura e associados à planta, colônias de H. rubrisubalbicans crescidas em meio
NFB 3X sólido foram seguidos os passos citados acima, somente se alterando a
concentração tampão fostato para [50 mM, pH 6,8].
4.4.3c. Imunolocalização das bactérias utilizando anticorpos secundários
marcados com fluorocromos
Para a detecção e localização específica das diferentes estirpes bacterianas,
amostras de raízes das plântulas foram lavadas em água destilada estéril e
seccionadas em pedaços de 1-2 cm em tampão fosfato (TPO
4
) [50 mM]. Foram,
então, postas em tubos (Eppendorf) de 500 µL e incubadas por 3 min em azul de
toluidina [0,01%] à temperatura ambiente. Decorrido este período, foram lavadas
uma vez com tampão fosfato [50 mM, pH 6,8]. Procedeu-se então o bloqueio das
reações inespecíficas utilizando-se uma solução contendo tampão Phosphate Buffer
Solution – Bovine Serum Albumine (PBS-BSA) [3%] por 30 min a 37 ºC. Após esta
40
etapa as amostras foram incubadas com anticorpos primários específicos, contras as
referidas bactérias, produzidos e purificados de acordo com S
ILVA
(1999), e diluído
1:10 em PBS-BSA [1%] por 30 min a 37 ºC. Lavou-se três vezes em solução tampão
fosfato e posteriormente incubou-se com anticorpo secundário biotinilado (IgG anti-
coelho biotinilado, Amershan Life Sciences) diluído 1/100 em PBS-BSA [1%] por 40
min a 37 ºC. Após esta etapa, as amostras foram novamente lavadas por três vezes
em tampão fosfato e incubadas com Streptavidina FITC 1/10 em PBS-BSA [1%]
(Streptavidina Fluoresceína, Amershan Life Science) por 20 min a 37 ºC. Estas
foram novamente lavadas por cinco vezes em tampão fosfato. Após esta etapa as
amostras foram montadas em lâmina e lamínula e observadas ao Microscópio
Óptico de Epifluorescência (Zeiss Axioplan). Em substituição ao óleo especial anti-
fadiga do fluorocromo, utilizado para a observação do material no microscópio,
utilizou-se uma solução de PBS-Glicerol (1:1). Os controles utilizados foram: (1)
amostras não inoculadas; (2) não incubação com anticorpo primário; (3) não
incubação com anticorpo secundário; (4) sem azul de Toluidina.
4.4.3d. Imunolocalização da enzima nitrogenase
As amostras foram preparadas como descrito em 4.4.4a para MET, diferindo
apenas na fixação em solução de paraformaldeído [4%] em tampão fosfato por 24
horas. Cortes ultrafinos foram recolhidos em grades hexagonais (200 mesh) de
níquel, cobertos com Formvar e postas em placa de Petri com água destilada. As
etapas seguintes foram conduzidas utilizando-se como suporte tiras de parafilme M
(Americam Company) e uma pinça para a manipulação das grades. Primeiramente,
procedeu-se o bloqueio das reações inespecíficas utilizando-se 30 µL de solução de
bloqueio IGL (Immunogold Labbeling) (BSA [10 g.L
-1
], Tween 20 [1 mL.L
-1
] diluídos
em PBS [0,01 M, pH7,2]) por 1 h (J
AMES
et al., 1994). Em seguida as grades foram
incubadas a 4 ºC com 50 µL do anti-soro primário anti-nitrogenase (anti-proteína
Fe(Nif H) de nitrogenase de Rhodospirillum rubrum, doado por P.W. Ludden,
Madison, Wisconsin, USA) diluído 1:100 em PBS por um período de 2 h e lavadas
por 30 segundos em água destilada estéril. Após esta lavagem, as grades foram
imersas em 25 µL de anticorpo secundário diluído 1:100 PBS-BSA (1%) (IgG anti-
coelho marcada com partículas de ouro de 15 nm, Auro Probe
tm
EM GAR G15,
Amersham Life Science) por 1h à temperatura ambiente. Após a incubação, as
41
grades foram lavadas em água destilada estéril e, posteriormente, imersas em uma
gota de tampão IGL (etapa repetida três vezes). Em seguida, foram postas para
secar sobre papel filtro e contrastadas com acetato de uranila e citrato de chumbo.
Os espécimes foram examinados em Microscópio Eletrônico de Transmissão (Zeiss
EM 900). Os controles utilizados consistiram da substituição do anticorpo primário
pela solução IGL e pelo soro pré-imune.
42
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Diversos trabalhos têm reportado que a inoculação de plântulas
micropropagadas de cana-de-açúcar, com diferentes estirpes de bactérias,
endofíticas pode estimular o crescimento vegetal e estabelecer eficientemente o
sistema de fixação de N
2
(M
IRZA
et al., 2001). De fato, nos últimos anos, trabalhos
realizados neste sentido têm demonstrado que este sistema pode vir a ser usado
como uma etapa inicial em plantações com objetivos comerciais (C
ANUTO
et al.,
2003,
O
LIVEIRA
et al.,
2002). Neste sentido, ou seja, visando gerar mais
conhecimento a respeito da interação estirpe bacteriana/variedade de cana, que
foram montados os experimentos deste trabalho.
Inicialmente, a viabilidade da condução do ensaio de longa duração, foi pré-
avaliada em um sistema no qual as plântulas micropropagadas de cana-de-açúcar
cresceram monoxenicamente por quatro meses. Neste estudo, verificou-se que as
plantas apresentaram crescimento satisfatório, dentro das limitações físicas dos
frascos utilizados (250 mL), apresentando aspecto visual saudável e resposta de
crescimento positiva à inoculação (Figura 2). Os resultados obtidos com o método do
Número Mais Provável (NMP) demonstraram que as populações de H. seropedicae,
H. rubrisubalbicans e G. diazotrophicus, após quatro meses de crescimento no
substrato, variaram entre 10
6
e 10
8
células g
-1
de biomassa fresca. Neste ensaio não
foram aferidos os valores relativos ao comprimento das plântulas.
Figura 2: Plântulas micropropagadas de cana-de-açúcar (var. SP70-1143) inoculadas com diferentes
estirpes de Herbaspirillum seropedicae, H.rubrisubalbicans e G. diazotrophicus, crescidas em meio
ágar (5%) com ¼ dos sais do meio LGI-P por 4 meses sem adição posterior de nutrientes e com
fotoperíodo controlado.
43
Com base nas observações obtidas aos 4 meses, quando se verificou a
viabilidade do sistema in vitro utilizado, resolveu-se proceder um experimento a
longo prazo. Neste, a mesma variedade de cana-de-acúcar foi submetida a
inoculações individualizadas de estirpes de G. diazotrophicus, H. seropedicae e H.
rubrisubalbicans visando um melhor entendimento da contribuição de cada estirpe
no crescimento e desenvolvimento vegetal.
Após 30 dias da implantação do experimento, procedeu-se uma análise
qualitativa, não destrutiva, do desenvolvimento das plantas. Esta indicou que as
plântulas inoculadas apresentaram um melhor desempenho em todas as variáveis
avaliadas com relação ao tratamento controle, excetuando-se a produção de folha
senescente (Figura 3). Este dado pode indicar que as plântulas do tratamento
controle tiveram que remobilizar mais ativamente seus nutrientes anteriormente
incorporados às folhas, acelerando o processo de senescência das mesmas.
Diferentemente das plantas inoculadas, que podem ter se beneficiado da associação
com a bactéria para melhorar o seu estado nutricional. Esta afirmativa é corroborada
pelo alto índice de mortalidade de plantas controle. Importante destacar o fato dos
tratamentos com as estirpes de H. seropedicae terem apresentado taxa de
mortalidade nula e, também o maior número de plantas por parcela aos 30 DAI
(Figura 4). Tais observações podem ser explicadas pela rápida indução ao
enraizamento das plântulas, estimulada pela síntese e excreção de compostos
estimuladores de enraizamento, dentre os quais se destaca o fitorregulador auxina
(F
UENTES
-R
AMIREZ
, 1993; M
UTHUKUMARASAMY
et al., 1999; M
IRZA
et al., 2001).
Trabalhos recentes com a variedade RB72454 inoculadas com G. diazotrophicus
(PAL5) e H. seropedicae (HRC54) apresentaram resultados semelhantes (F
ERREIRA
,
2002). Diferentes experimentos com plântulas micropropagadas de cana-de-açúcar
têm evidenciado o papel das bactérias diazotróficas na redução da mortalidade de
mudas em fase de aclimatação (R
EIS
, 1994; O
LIVARES
, 1997, F
ERREIRA
, 2002).
44
Figura 3: Número total de folhas senescentes (palha) nas plântulas micropropagadas de cana-de-
açúcar var. SP70-1143, inoculadas com as bactérias G. diazotrophicus (PR2 e PAL3), H. seropedicae
(Z67 e HRC54) e H. rubrisubalbicans (HCC103 e M4) e controle, avaliadas 30 dias após a inoculação.
Letras diferentes, dentro de cada barra, diferem pelo teste de Tukey a 5%.
Figura 4: Número total de plantas micropropagadas de cana-de-açúcar var. SP70-1143, inoculadas
com as bactérias G. diazotrophicus (PR2 e PAL3), H. seropedicae (Z67 e HRC54) e H.
rubrisubalbicans (HCC103 e M4) e controle avaliadas 30 dias após a inoculação. Letras diferentes,
dentro de cada barra, diferem pelo teste de Tukey a 5%.
45
Ensaios sob condições de casa de vegetação e campo têm evidenciado os
efeitos positivos da inoculação de estirpes selecionadas na promoção do
crescimento de gramíneas. Como exemplos recentes podem ser citadas as
contribuições de trabalhos nos quais foram realizadas inoculações de estirpes de
bactérias diazotróficas endofíticas. G
UIMARÃES
et al. (2003) realizaram experimentos
com a variedade de arroz Guarani (sequeiro) e observaram um aumento na
produção de grãos de até (25%) nas plantas crescidas em casa de vegetação e de
até 50% nas plantas crescidas no campo e inoculadas com a estirpe ZAE94 de H.
seropedicae. C
ANUTO
et al. (2003) inocularam diferentes estirpes (isoladas e
combinadas) de G. diazotrophicus, Azospirillum sp e Herbaspirillum em plântulas
micropropagadas de cana-de-açúcar (var. SP70-1143). Os autores afirmam que a
resposta à inoculação foi bastante variável e dependente de vários fatores incluindo
o genótipo vegetal e o ambiente.
Plântulas inoculadas com a estirpe PR2 de G. diazotrophicus apresentaram
aos 30DAI um reduzido número de plantas. Porém, neste tratamento foi observado o
desenvolvimento de plântulas com maior comprimento total (raiz + parte aérea)
(Figura 5). A ausência de nitrogênio no meio, que num primeiro momento pode ter
causado a morte das plântulas, em um momento seguinte, poderia ter favorecido o
desenvolvimento desta estirpe e a conseqüente colonização das plântulas e
estímulo do crescimento vegetal pela produção diferencial de ácido indol-acético
(AIA) e giberelina (GA) (M
UTHUKUMARASAMY
et al., 1999; O
LIVEIRA
et al., 2002;
C
ANUTO
et al., 2003).
De um modo geral as plântulas inoculadas com H. seropedicae tenderam a
apresentar um maior número de perfilhos (Figura 6), enquanto que as plântulas
inoculadas com G. diazotrophicus tenderam a apresentar um desempenho inferior
devido à baixa resposta da inoculação com a estirpe PR2. Neste caso, pode estar
ocorrendo um estímulo diferencial de fitorreguladores produzidos por estes dois
gêneros de bactérias. Como descrito anteriormente por B
ASTIÁN
et al. (1998), as
estirpes do gênero Herbaspirillum poderiam estar produzindo mais giberelina (GA)
do que AIA (ácido indol-acético) e esta diferença poderia estar agindo na indução de
perfilhamento, ou seja, na germinação das gemas da base do colmo.
46
Figura 5: Número de indívíduos por classe de tamanho de plântulas micropropagadas de cana-de-
açúcar var. SP70-1143, inoculadas com as bactérias G. diazotrophicus (PR2 e PAL3), H. seropedicae
(Z67 e HRC54) e H. rubrisubalbicans (HCC103 e M4) e controle avaliadas 30 dias após a inoculação.
Letras diferentes, dentro de cada barra, diferem pelo teste de Tukey a 5%.
Figura 6: Número total de perfilhos observados nas plântulas micropropagadas de cana-de-açúcar
var. SP70-1143, inoculadas com as bactérias G. diazotrophicus (PR2 e PAL3), H. seropedicae (Z67 e
HRC54) e H. rubrisubalbicans (HCC103 e M4) e controle avaliados 30 dias após a inoculação.
47
Quanto ao número de raízes (Figura 7), tem-se que somente plântulas
inoculadas com a estirpe PAL3 de G. diazotrophicus apresentaram um menor
número de raízes aos 30 dias após a implantação do experimento. Porém, os
valores apresentados não diferem estatisticamente dos apresentados pelas
plântulas inoculadas com a outra estirpe de G. diazotrophicus utilizada. De fato, com
relação ao número de raízes, apesar das plântulas inoculadas com estirpes de
Herbaspirillum apresentarem maior desenvolvimento radicular que o apresentado
pelas inoculadas por G. diazotrophicus, os valores apresentados pelas estirpes de
Herbaspirillum são muito próximos. Ressalta-se, porém, que todas as estirpes de
Herbaspirillum estimularam mais efetivamente as plântulas quanto à emissão de
raízes, quando comparadas às inoculadas com as estirpes de G. diazotrophicus.
Por outro lado, o estímulo à produção de raízes secundárias somente se
mostrou mais proeminente nas plântulas inoculadas com as estirpes PR2 de G.
diazotrophicus e HCC103 de H. rubrisubalbicans (Figura 8). Este fato pode estar
associado a uma estimulação mais efetivas das auxinas produzidas por estas
estirpes na indução de sítios mitóticos relativos à emissão de raízes secundárias.
F
ERREIRA
(2002) demonstrou que a inoculação de diferentes genótipos de cana-de-
açúcar com estirpes selecionadas de G. diazotrophicus geraram alterações
anatômicas e fisiológicas na planta hospedeira - aumento dos sítios mitóticos
relacionados à emissão de raízes laterais e o incremento do número de raízes finas.
Além disto, ocorrer aumento na atividade das H
+
-ATPases na fração microssomal
das células radiculares e do conteúdo de proteínas. Além disso, estudos relativos à
atividade fotossintética de plantas inoculadas com bactérias endofíticas
demonstraram que a fotossíntese, a condutância estomal e a taxa de respiração não
são afetadas pelo estabelecimento do endófito (O
LIVARES
et al., 2002).
48
Figura 7: Número total de raízes das plântulas micropropagadas de cana-de-açúcar var. SP70-1143,
inoculadas com as bactérias G. diazotrophicus (PR2 e PAL3), H. seropedicae (Z67 e HRC54) e H.
rubrisubalbicans (HCC103 e M4) e controle avaliados 30 dias após a inoculação. Letras diferentes,
dentro de cada barra, diferem pelo teste de Tukey a 5%.
Figura 8: Número total de raízes secundárias das plântulas micropropagadas de cana-de-açúcar var.
SP70-1143, inoculadas com as bactérias G. diazotrophicus (PR2 e PAL3), H. seropedicae (Z67 e
HRC54) e H. rubrisubalbicans (HCC103 e M4) e controle avaliados 30 dias após a inoculação. Letras
diferentes, dentro de cada barra, diferem pelo teste de Tukey a 5%.
49
Onze meses após a implantação do experimento todas as plântulas foram
coletadas. Procedeu-se a mensuração das variáveis comprimento da raiz/parte
aérea e peso da biomassa fresca e seca, bem como o processamento dos
segmentos radiculares para as observações microscópicas.
Com relação ao comprimento das raízes, constatou-se que a maioria dos
tratamentos inoculados apresentou um melhor desenvolvimento quando
comparados ao controle. Convém ressaltar, também, a maior freqüência de raízes
secundárias das plântulas inoculadas com a estirpe HCC103 (H. rubrisubalbicans) e
PR2 (G. diazotrophicus) comportamento observado e mantido desde a análise aos
30 DAI (Figura 9). Este aspecto do desenvolvimento vegetal é um dos mais
importantes aspectos da utilização do solo pelas plantas e de suma importância no
papel das bactérias promotoras de crescimento.
Figura 9: Crescimento (cm) da parte aérea e das raízes de plântulas micropropagadas de cana-de-
açúcar var. SP70-1143, inoculadas com as bactérias G. diazotrophicus (PR2 e PAL3), H. seropedicae
(Z67 e HRC54) e H. rubrisubalbicans (HCC103 e M4) e controle avaliados 11 meses após a
inoculação. Letras diferentes, dentro de cada barra, diferem pelo teste de Tukey a 5%.
50
Para a variável biomassa fresca (Figura 10) não foi possível observar nenhum
padrão de comportamento entre as estirpes de uma mesma espécie. Porém,
observou-se que as plântulas inoculadas com as estirpes PR2 e PAL3 (G.
diazotrophicus) e HRC54 (H. seropedicae) apresentaram maiores valores para as
raízes. Não foi observada diferença estatística relativa ao peso da biomassa fresca
de folhas entre os tratamentos inoculados e controle.
Em termos de massa da matéria seca observou-se que a maioria dos
tratamentos apresentou maiores valores em raiz, depois folha e folha senescente. A
exceção ocorreu com o tratamento controle que apresentou os mais altos valores
para folha, mantendo o padrão de relação parte aérea/raiz observado nas demais
variáveis estudadas (Figura 11). Este fato pode ser devido a um maior empenho das
plantas em aumentar os seus produtos de fotossíntese, já que, como nenhum
tratamento recebeu nitrogênio, ou outro nutriente, somente as plântulas inoculadas
tiveram um aporte extra de nutrientes. Convém ressaltar que a biomassa seca das
raízes das plântulas inoculadas com G. diazotrophicus foi superior a todos os demais
tratamentos e que as plântulas inoculadas com a estirpe PAL3 desta mesma espécie
foi a que apresentou os maiores valores em folha.
51
Figura 10: Massa (g) de raízes, folhas e folhas senescentes (palha) frescas de plântulas
micropropagadas de cana-de-açúcar var. SP70-1143, inoculadas com as bactérias G. diazotrophicus
(PR2 e PAL3), H. seropedicae (Z67 e HRC54) e H. rubrisubalbicans (HCC103 e M4) e controle
avaliados 11 meses após a inoculação. Letras diferentes, dentro de cada estrutura, diferem pelo teste
de Tukey a 5%.
Figura 11: Massa (g) de raízes, folhas e folhas senescentes (palha) secas de plântulas
micropropagadas de cana-de-açúcar var. SP70-1143, inoculadas com as bactérias G. diazotrophicus
(PR2 e PAL3), H. seropedicae (Z67 e HRC54) e H. rubrisubalbicans (HCC103 e M4) e controle
avaliados 11 meses após a inoculação. Letras diferentes, dentro de cada estrutura, diferem pelo
teste de Tukey a 5%.
52
Em função dos resultados de promoção de crescimento obtidos (número total
de raízes, número total de perfilhos), a interação da cana-de-açúcar/H. seropedicae
(Z67) foi selecionada para estudos de microscopia. Por meio de observações dos
segmentos frescos de raízes imunomarcados ao microscópio epifluorescente, foi
possível observar que as bactérias colonizaram a superfície das paredes periclinais
externas das células da epiderme radicular, ao longo de todo seu eixo, sem a
aparente existência de um sítio específico de adesão. Apesar disto, foi possível a
visualização de várias bactérias nas junções de paredes celulares adjacentes
(Figuras 13 e 14). Também foi observada a presença bacteriana na superfície das
paredes periclinais externas de pêlos radiculares (Figura 16, 17 e 18). Microcolônias
foram observadas na junção entre duas células epidérmicas e em zonas de
emergência de raízes secundárias (Figura 15).
Este padrão de colonização, exemplificado pela adesão da estipe Z67, já foi
observado em diversos trabalhos que evidenciam a colonização da superfície das
paredes periclinais externas das raízes por bactérias diazotróficas (A
SSMUS ET AL
,
1995;
O
LIVARES
,
1997;
P
ERIN
et al.,
2003). Portanto, isto pode indicar que, apesar do
longo tempo do experimento, em interdependência metabólica extrema, o padrão de
adesão observado por outros autores se manteve.
Em microscopia de fluorescência convencional, é comum ocorrerem problemas
de autofluorescência dos tecidos vegetais, que podem mascarar os resultados e ser
fator limitante na utilização desta técnica. Em nosso estudo, utilizando-se raízes de
cana-de-açúcar micropropagada, verificou-se, também, a ocorrência de
autofluorescência tanto nas raízes principais como nos pêlos (Figura 12). No
entanto, isto pode ser controlado, pelo uso de vários extratores e gelatina-RhITC
(B
OHLOOL
&
S
CHMIDT
, 1980), assim como o uso de outros fluorocromos e sistemas
de filtro. Neste trabalho, para minimizar o problema, utilizou-se uma solução de azul
de toluidina (0,01%) antes do início da imunomarcação e uma solução de PBS-
Glicerina (1:1) sobre a amostra na hora da visualização ao microscópio de
epifluorescência (Comparar Figuras 12 com 13e 14). A imagem relativa ao controle
não inoculado e com adição de azul de toluidina não foi adicionado aos resultados
por se apresentar visualização idêntica a observada na Figura 12.
53
Legenda: Colonização da superfície das paredes periclinais externas de raízes de
plântulas micropropagadas de cana-de-açúcar (var. SP70-1143) 11 meses após a
inoculação com Herbaspirillum seropedicae (Z67) e crescimento em meio mínimo
sob condições monoxênicas de longa duração. Células bacterianas evidênciadas
pela marcação específica com anticorpo anti-Z67 [purificado em coluna de proteína
A e eluído em pH 3,0, concentração de proteínas = 0,473 mg de proteína.mL
-1
].
Figura 12: Controle não inoculado e sem a utilização de Azul de Toluidina antes da
imunomarcação.
Figuras 13 e 14: H. seropedicae aderida à superfície das paredes periclinais
externas de raízes. Observar as bactérias colonizando as junções das células
epidérmicas (setas).
Figura 15: Herbaspirillum seropedicae (Z67) (pontos verdes) colonizando a região
de formação de raiz secundária/pêlo radicular (estrela).
Figura 16, 17 e 18: Herbaspirillum seropedicae (Z67) colonizando a zona pilífera da
raiz (zp). Observar adesão das bactérias à superfície das paredes periclinais
externas dos pêlos.
54
12
13
14
16
18
17
15
SR
ZP
ZP
ZP
50 µ
µµ
µm
50 µ
µµ
µm
50 µ
µµ
µm
50 µ
µµ
µm
50 µ
µµ
µm
50 µ
µµ
µm
50 µ
µµ
µm
12
13
14
16
18
17
15
SR
ZP
ZP
ZP
50 µ
µµ
µm
50 µ
µµ
µm
50 µ
µµ
µm
50 µ
µµ
µm
50 µ
µµ
µm
50 µ
µµ
µm
50 µ
µµ
µm
55
Legenda: Colonização da superfície das paredes periclinais externas de raízes de
plântulas micropropagadas de cana-de-açúcar (var. SP70-1143) com Herbaspirillum
seropedicae (Z67) e crescimento em meio mínimo sob condições monoxênicas de
longa duração. MO = Microscopia Óptica; MET – Microscopia Eletrônica de
Transmissão.
Figura 19: Corte transversal de raiz primária. Notar a integridade dos diferentes
sistemas de tecidos vegetais. Em destaque a emissão de raiz secundária (seta), MO.
Figura 20: Adesão de células de H. seropedicae (setas) à superfície das paredes
periclinais externas do pêlo radicular (p). Observar maior concentração de células na
base do pêlo, MO.
Figura 21: Adesão de microcolônias de H. seropedicae (setas) nas junções das
células da epiderme (ep), MO.
Figura 22: Herbaspirillum seropedicae (Z67) no interior do apoplasto da região
cortical radicular. Parede celular vegetal (pcv), bactéria (b), espaço intercelular (ei),
grânulos de PHB (seta), MET.
Figura 23: Herbaspirillum seropedicae (Z67) no interior do apoplasto da região
cortical radicular. Observar partículas de ouro referentes à imunolocalização da
enzima nitrogenase (setas), MET.
56
19
23
21
22
20
100 µ
µµ
µm
1 µ
µµ
µm
20 µ
µµ
µm
0,5 µ
µµ
µm
20 µ
µµ
µm
p
b
b
pcv
ei
19
23
21
22
20
100 µ
µµ
µm
1 µ
µµ
µm
20 µ
µµ
µm
0,5 µ
µµ
µm
20 µ
µµ
µm
p
bb
bb
pcv
ei
57
Em função dos valores relativos ao comprimento das raízes das plântulas
inoculadas com a estirpe HCC103 de H. rubrisubalbicans (Figura 9), elegeu-se esta
estirpe para avaliar as características estruturais de agregação destas bactérias à
superfície das raízes. Colônias crescidas em meio de cultura foram utilizadas como
controle. A análise dos resultados nos permitiu verificar que quando em contato com
a superfície das paredes periclinais externas das raízes, as células se organizaram
formando biofilmes com formato distinto do observado em meio de cultura (Figuras
24 e 28). Numa análise detalhada das células que compõem o biofilme colônia-raiz
observamos a existência de matriz fibrosa envolvendo todas as células da mesma. A
presença desta matriz vem sendo observada por vários autores quando em
detalhamento da adesão de bactérias em superfícies vegetais (O
LIVARES
et al., 1996;
J
AMES
&
O
LIVARES
, 1998; J
AMES
et al., 1997). Contudo, os trabalhos não provam que
a presença desta matriz seja uma resposta relacionada ao tipo de superfície em que
este biofilme está se desenvolvendo. Outro detalhe importante foi a observação da
presença de polimorfismos das células bacterianas. Este fato pode estar relacionado
a uma diferenciação metabólica das células pertencentes a este biofilme. De fato, a
literatura relativa à formação de biofilmes destaca que o metabolismo destes pode
ser caracterizado como o de um organismo multicelular, devido à interdependência
das células que formam o mesmo (M
ORRIS
et al., 1998; D
E
K
IEVIT
et al., 2001;
M
ORRIS
&
M
ONIER
, 2003; J
EFFERSON
, 2004; F
ETT
&
C
OOKE
, 2005; H
OUDT
&
M
ICHIELIS
,
2005)
A fim de verificar se a presença da matriz fibrosa era uma característica
intrínsica de biofilmes-colônia desta estirpe bacteriana foram observadas células
após a formação destes na superfície de meio de cultura NFB3X sólido.
Observações realizadas em microscópio eletrônico de varredura evidenciaram que
as células pertencentes ao biofilme colônia-NFB3x apresentaram dimensões mais
homogêneas e a ocorrência desprezível de células com matriz fibrosa (Figuras 30 a
33). Quando as células deste biofilme foram visualizadas, com maior detalhamento,
pode-se observar a ornamentação da parede celular bacteriana e a presença de
pequenos “brotamentos” em algumas células (Figuras 34 e 35).
Os dados obtidos indicam que as características observadas no biofilme-
colônia-raiz estão relacionadas a uma adaptação das células bacterianas à
superfície das paredes periclinais externas da raiz, que podem ter consequências
importantes para a funcionalidade da associação.
58
Legenda: Células de Herbaspirillum rubrisubalbicans (HCC103) em formação de
biofilme-colônia na superfície das paredes periclinais externas de raízes de plântulas
micropropagadas após sete dias de inoculação. Observação realizada em
microscópio eletrônico de varredura (MEV).
Figura 24: Colônia (c), em formato alongado, na superfície das paredes periclinais
externas de raiz.
Figura 25: Observação de detalhe da referida colônia onde é possível a visualização
da existência de matriz fibrosa (setas brancas) envolvendo todas as células.
Figura 26: Outro detalhe da colônia onde pode ser observada a presença de
polimorfimos (estrelas) das células bacterianas.
Figuras 27: Detalhes de parte da colônia próxima à superfície das paredes
periclinais externas da raiz. Note a grande quantidade de matriz fibrosa (setas)
envolvendo as mesmas.
Figura 28: Superfície das paredes periclinais externas de raiz onde podemos
observar colônias (c) em fase inicial de desenvolvimento.
Figuras 29: Colônia localizada próxima à superfície das paredes periclinais externas
da raiz e totalmente envolta pela matriz (asteriscos).
59
24
28
27
26
25
29
c
c
c
SR
*
*
24
28
27
26
25
29
c
c
c
SR
*
*
60
Legenda: Células de Herbaspirillum rubrisubalbicans (HCC103) em formação de
biofilme-colônia após crescimento em meio NFB3X sólido. Observação realizada em
microscópio eletrônico de varredura (MEV).
Figura 30: Colônias (c) de H. rubrisubalbicans (HCC103) formadas na superfície de
meio NFB3X sólido.
Figura 31: Observação de detalhe da colônia onde podemos observar as células
bacterianas em intima associação (estrelas).
Figuras 32 e 33: Observação de detalhes da colônia onde se pode observar a
ocorrência reduzida de matriz fibrosa (cabeças de setas pretas e brancas) entre
algumas células que compõem a colônia.
Figura 34: Detalhe de células presentes na colônia onde podemos observar a
ornamentação da parede celular bacteriana. Observe pequenos “brotamentos”
(setas) em duas células.
Figura 35: Visualização da face externa da parede bacteriana, onde podemos
observar a existência de pequenas projeções (“brotamentos”) (setas).
61
30
34
33
32
31
35
c
c
30
34
33
32
31
35
c
c
62
6. CONCLUSÕES
- O sistema monoxênico proposto permitiu o estabelecimento autosustentável
de uma interação de longa duração entre a planta e a bactéria, com o
crescimento de uma população metabolicamente ativa das bactérias
diazotróficas nas plântulas de cana-de-açúcar, bem como a ocorrência de
promoção de crescimento do vegetal;
- A inoculação das bactérias diazotróficas reduziu a mortalidade, bem como
gerou incrementos significativos para altura das plantas, biomassa de raiz
fresca, biomassa de folha e raízes secas, relativos ao controle não inoculado;
- As diferentes estirpes de G. diazotrophicus e Herbaspirillum spp.
apresentaram comportamento diferenciado com relação ao incremento das
características de crescimento avaliadas;
- As análises estruturais revelaram que as bactérias colonizaram a superfície
das paredes periclinais externas das células epidérmicas da raíz e dos pêlos
radiculares, predominantemente formando agregados, bem como o interior
das raízes via apoplasto;
- A comparação entre as observações microscópicas obtidas no presente
estudo, de longa duração, e outros de curta duração, sugerem, a princípio, a
existência de um padrão no relacionamento estrutural bactéria-planta que
independa da escala temporal;
- A técnica adaptada de imunofluorescência, aplicada neste estudo,
demonstrou ser eficiente para localização rápida e específica, bem como a
distribuição espacial das bactérias na superfície das paredes periclinais
externas das raízes.
- Diferenças relacionadas às características estruturais das células presentes
nos agregados crescidas em meio de cultura e associados à superfície da
planta foram observadas, indicando uma resposta adaptativa das bactérias à
superfície radicular.
63
Se realmente entendemos o problema, a resposta virá dele.
Porque a resposta não está separada do problema.
Jiddu Krishnamurt
(1895-1986
)
64
CAPÍTULO
II
ASPECTOS
ULTRA-ESTRUTURAIS
DE
Herbaspirillum seropedicae
E
H.
rubrisubalbicans
E
DA
INTERAÇÃO
DE
H. seropedicae
Z67
COM
PLÂNTULAS
MICROPROPAGADAS
DE
CANA-DE-AÇÚCAR
(
VAR
.
RB72454)
65
1. RESUMO
Técnicas microbiológicas e microscópicas têm evidenciado a associação
predominantemente endofítica entre gramíneas e Herbaspirillum spp. Embora
aspectos básicos sejam conhecidos, a elucidação das bases estruturais dessa inter-
relação, integrados aos estudos de genômica e proteômica de Herbaspirillum,
poderia contribuir para a maximização do potencial de promoção de crescimento de
estirpes selecionadas. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi caracterizar ultra-
estruturalmente as bactérias diazotróficas H. seropedicae e H. rubrisubalbicans em
meio de cultura e colonizando plantas de cana-de-açúcar por meio de técnicas de
microscopia associadas à criotécnicas. Para tanto, as bactérias foram crescidas in
vitro sob duas condições de cultivo: em meio de cultura com fontes orgânicas de
nitrogênio, e em condição de fixação biológica de nitrogênio (FBN). Em seguida,
foram observadas ao microscópio eletrônico de transmissão, a partir de réplicas
platina/carbono obtidas em criofratura. Paralelamente, amostras de raízes e de
folhas de plântulas de cana-de-açúcar inoculadas com H. seropedicae, foram
submetidas a congelamento em alta pressão seguido de fixação por substituição a
frio, para fins da descrição ultra-estrutural da associação endofítica sob cultivo
monoxênico. Sítios aniônicos e a enzima nitrogenase foram detectados,
respectivamente, pelo uso de ferritina cationizada e de anticorpos policlonais
combinados à técnica de imunomarcação com ouro.
A técnica de criofratura permitiu
uma análise ultra-estrutural de Herbaspirillum (envoltórios celulares, espaço
periplásmico, plasmalema, citoplasma e inclusões). O detalhamento estrutural dos
grânulos de poli-β-hidroxibutirato, permitiu a elaboração de inferências quanto à sua
composição e relação com a condição de fixação de nitrogênio. Alterações ultra-
estruturais citoplasmáticas, associadas aos resultados da imunolocalização da
nitrogenase, sugerem a compartimentalização metabólica do processo de FBN. A
análise da interação de H. seropedicae/cana-de-açúcar, permitiu a observação de
detalhes da ultra-estrutura dos sítios ocupados por esta bactéria. Também foram
observadas diferentes etapas do processo de adesão celular, alterações estruturais
bacterianas e na parede celular vegetal. Nas células do cótex radicular foi
identificada a presença de agregados bacterianos, ativos na síntese da nitrogenase,
e envoltos por uma matriz homogênea. Estes resultados reforçam a existência de
comunicação bioquímica entre essas células, podendo ser estudada com enfoque
na biologia celular e utilizando-se técnicas imuno-cito-histoquímicas adicionais.
66
2. ABSTRACT
An endophytic interaction between Herbaspirillum spp. and grasses has been well
demonstrated by microbiology and microscopy techniques. Although those basic
aspects such as ways of infection and colonization have been described, there is a
lack of fine structural knowledge of this association, which could integrate genomic
and proteomic approaches applied for Herbaspirillum, leading to plant-growth
promoting effects maximization from selected strains. The aim of this study was to
describe H. seropedicae and H. rubrisubalbicans at ultrastructural level under
cultivation conditions or endophytic associated with sugarcane plantlets using
cryotecnique approaches combined to transmission electron microscopy (TEM).
Bacterial cells were grown under in vitro biological nitrogen fixation (BNF) condition
(or its absence), and observed by TEM from platinum/carbon coated replicas after
cryofracture. In parallel, sugarcane roots and leaves, inoculated with H. seropedicae
were fixed under high pressure freezing followed by freeze substitution to be viewed
by TEM. Anionic sites as well as nitrogenase were respectively detected using
cationic ferritin and polyclonal antibody coupled with Immunogold technique. Results
obtained from cryofracture represent an overall improvement for the fine structure
from Herbaspirillum, revealing no described details from the cell topology, which
includes external cell wall domain, periplasmatic space, cell membrane, cytoplasm
and inclusion bodies. The relationship between the PHB granules appearance after
fracture and the chemical composition (homo or hetero-polymeric) was deduced, and
was affect by growing conditions. Cytosolic ultra-structural changes characterized by
membrane internalization linked with dense nitrogenase immuno-localization could
suggest metabolic compartmentalization of BNF process. H. seropedicae inoculated-
sugarcane samples prepared by physical fixation followed by freeze substitution
brought completely new ultra-structural insights for the endophytic interaction,
including different steps of the attachment process, polar structural changes at the
bacteria cells, and changes in the plant cell wall, such as development of organized
bacterial aggregates, mainly observed into the lumen of parenchyma cell of the root
cortex, which were strongly labeled for nitrogenase. The overall fine structures
described in this work bring more evidences for a refined biochemical dialogue
between the partners. Furthermore, under the cell biology perspective, these results
encourage more detailed studies involving immuno-cyto-histochemical techniques.
67
3. INTRODUÇÃO
A primeira espécie descrita do gênero Herbaspirillum - subclasse β-
Proteobacteria - foi Herbaspirillum seropedicae (B
ALDANI
et al., 1986). A segunda,
Herbaspirillum rubrisubalbicans (B
ALDANI
et al., 1996), era anteriormente classificada
como [Pseudomonas] rubrisubalbicans (C
HRISTOPHER
&
E
DGERTON
, 1932) e é o
agente causal da doença estria-mosqueada em variedades suscetíveis de cana-de-
açúcar. Recentemente novas espécies foram isoladas de Miscanthus sinensis e
Pennisetum purpureum (H. frisingense, K
IRCHHOF
et al., 2001) e de nódulos
radiculares de Phaseolus vulgaris (H. lusitanum, V
ALVERDE
et al., 2003). Com base
em relações moleculares, um grupo de bactérias hábeis em degradar clorofenóis
também foi incluído neste gênero como Herbaspirillum chlorophenolicum (I
M
et al.,
2004). Outro grupo, este de três isolados clínicos não fixadores de nitrogênio (EF
grupo1), foi incluído devido a relações moleculares e fisiológicas sendo
denominados “espécies 3” (G
ILLIS
et al.,
1991;
F
ALSEN
,
1996
).
Espécimes deste gênero foram encontrados colonizando diversas plantas da
família Poaceae (Gramineae) (B
ALDANI
et al., 1996; O
LIVARES
, 1997; E
LBELTAGY
et
al., 2000, 2001). Herbaspirillum seropedicae foi primeiramente isolada de plantas de
milho, arroz e sorgo por B
ALDANI
et al. (1986). Esta espécie apresenta um amplo
espectro hospedeiro, tendo sido isolada também de cana-de-açúcar (O
LIVARES
et al.,
1996;
S
ILVA
, 1999; R
EIS
J
R
.
et al.,
2000,),
dentre outras gramíneas forrageiras no
Brasil (B
ALDANI
et al., 1986; D
ÖBEREINER
et al., 1993). Também foi isolada de
palmeiras (F
ERREIRA
et al., 1995) e de raízes e colmos de diferentes cultivares de
banana (Musa spp.) e de abacaxi (Ananas comosus (L.) Merril [W
EBER
et al., 1999 e
2001; C
RUZ
et al., 2001]).
Espécies de Herbaspirillum são colonizadores do interior de raízes,
estabelecendo-se sistemicamente em toda a planta. Estas possuem, além da
habilidade de fixar nitrogênio, a de produzir fitorreguladores apresentando com isso
amplo potencial para a promoção de crescimento vegetal (B
ALDANI
et al., 1995;
B
ODDEY
et al., 1995; B
ÁSTIAN
et al., 1998; J
AMES
, 2000; L
AMBRECHT
et al., 2000;
O
LIVEIRA
et al.,
2002;
F
ERREIRA
,
2002;
C
ANUTO
et al.,
2003).
Utilizando-se sistemas monoxênicos em diferentes plantas observou-se uma
estimulação significativa no desenvolvimento das raízes quando da inoculação com
H. seropedicae (B
ALDANI
et al., 1993) e com H. frisingense (E
CKERT
, 2003). Porém,
68
até agora poucos experimentos de campo têm sido realizados com estirpes de
Herbaspirillum. Diversos autores demonstraram aumento significativo na produção
de sorgo e arroz (aumento da biomassa seca e na produtividade de grãos)
inoculados com várias estirpes de H. seropedicae (P
EREIRA
et al., 1988; D
ÖBEREINER
&
B
ALDANI
,
1998;
B
ALDANI
et al., 2000). O crescimento e a quantidade de N
incorporado em variedades de arroz tolerantes a alumínio foram estimulados quando
as mesmas foram inoculadas com estirpes de H. seropedicae (G
YANESHWAR
et al.,
2002).
Em nível estrutural, a interação de Herbaspirillum com seus hospedeiros
tem recebido especial atenção nos últimos quinze anos. Estudos microscópicos,
baseados em amostras quimicamente fixadas de raízes e parte aérea, têm
demonstrado que estas bactérias colonizam randomicamente o apoplasto
(espaços intercelulares, a parede celular e o lúmen de elementos de vaso) como
anteriormente mencionado na forma de células isoladas ou microcolônias
(O
LIVARES
et al., 1997; J
AMES
et al., 1997; J
AMES
&
O
LIVARES
,
1998; E
LBELTAGY
et
al., 2001; E
CKERT
, 2003). Também foi possível demonstrar que H. rubrisubalbicans
localiza-se nos espaços intercelulares do xilema e em cavidades sub-estomáticas
de variedades de cana-de-açúcar susceptíveis à estria mosqueada (var B4362).
Nestes locais as células bacterianas encontram-se em microcolônias encapsuladas
com material provavelmente de origem vegetal (O
LIVARES
et al., 1997). Estes
estudos têm demonstrado claramente a natureza endofítica da interação planta-
Herbaspirillum (B
ALDANI
et al. 1992; O
LIVARES
et al., 1996).
Esses estudos microscópicos descreveram aspectos básicos destas
interações endofíticas, como os modos de infecção, colonização e os sítios de
estabelecimento, utilizando marcadores moleculares para a identificação específica
das bactérias nos tecidos da planta hospedeira (J
AMES
et al,1994; R
EINHOLD
-H
UREK
&
H
UREK
, 1998; R
ONCATO
-M
ACCARI
et al., 2003;).
Apesar dos avanços na descrição do relacionamento espacial da
associação, ainda se conhece muito pouco sobre as bases moleculares,
bioquímicas e estruturais que levam ao estabelecimento da interação mutuamente
benéfica entre bactérias diazotróficas endofíticas e plantas de cana-de-açúcar
(N
OGUEIRA
et al., 2001). O seqüenciamento completo dos genomas de H.
seropedicae (GENOPAR) e Gluconacetobacter diazotrophicus (RIOGENE),
associados aos dados de proteoma de G. diazotrophicus e transcriptoma da cana-
69
de-açúcar (SUCEST) oferecem um cenário favorável para estudos pós-genômicos.
Neste contexto, existe uma demanda clara por investigações mais refinadas, que
permitam, inclusive, a detecção de biomacromoléculas envolvidas nas diferentes
etapas da associação, tanto na planta hospedeira como na bactéria.
A quase totalidade dos estudos estruturais finos é realizada com espécimes
quimicamente fixados. Embora contribuições de enorme valor para a biologia
estrutural tenham sido alcançadas, não se pode deixar de destacar uma gama de
artefatos como alterações de volume, formato e conteúdo de muitos componentes
celulares (S
TUDER
et al., 1989). Além disto, a totalidade dos fixadores químicos
utilizados reage de forma relativamente lenta com o material biológico, portanto, não
são hábeis em preservar muitos de seus componentes que podem ser tanto
perdidos quanto assumirem outra distribuição durante o processo.
A fixação física por congelamento surgiu como solução aos problemas
apresentados. No início da segunda metade do século passado, iniciaram-se os
estudos na área de congelamento de material biológico. B
ENCHIMOL
(1996) destaca
que a realização de criotécnicas deve ocorrer quando se deseja: (1) comparar dados
estruturais fornecidos pela fixação química tradicional; (2) estudar as relações das
atividades enzimáticas; (3) analisar a composição química do material biológico (i.e.
micro-análise por raios-X); (4) localizar antígenos, sítios metabólicos específicos e
receptores celulares e sub-celulares; (5) obter novas informações a respeito da
estrutura e subestrutura celulares. Desse modo, reações imunocitoquímicas podem
ser realizadas em cortes, sem a interferência de outros agentes químicos (ósmio,
acetona, etanol, epon) e físicos (impermeabilidade das enzimas) (Q
UINTANA
, 1994;
B
ENCHIMOL
, 1998).
A utilização de métodos de criopreparação, para a microscopia eletrônica de
espécimes biológicos, tem aumentado nas últimas duas décadas e levou a uma
revisão parcial dos conceitos e modelos relativos à ultra-estrutura celular (H
YDE
et
al., 1991; S
AMUELS
et al., 1995, L
ANDINSKY
et al., 1999; Z
HENG
&
S
TAEHELIM
, 2001).
Exemplos mais específicos da utilização e vantagens da crioproteção podem ser
encontrados nos trabalhos de M
ONAGHAN
et al. (2003), M
ULLER
-R
EICHERT
et al.
(2003), S
AWAGUCHI
et al. (2003) e M
ORPHEW
&
M
CINTOSH
(2003).
Entre 1950 e 1960 foram realizados os primeiros trabalhos na área de freeze-
fracture e freeze-etching (H
ALL
, 1950; S
TEERE
; 1957; H
AGGIS
; 1965 e M
OOR
et al.,
1961). A importância desta técnica para o estudo da parede celular bacteriana é de
70
caráter inestimável. Como exemplo, podemos ressaltar os trabalhos realizados por
B
EVERIDGE
(1981),
B
AYER
&
R
EMSEM
(1970)
e
R
ISCO
&
P
INTO DA
S
ILVA
(1998)
que
ressaltaram a importância desta técnica para a análise tridimensional da parede e
das relações moleculares entre os componentes da mesma. Uma importante
contribuição desta técnica pode ser destacada no que diz respeito à elucidação da
ultra-estrutura dos diversos tipos de grânulos de PHA/PHB bacterianos pelos
trabalhos realizados por K
RAUSE
et al. (1996), S
UDESH
et al. (1999; 2000 (a, b); 2002
(a, b)).
Outra variante das criotécnicas, o congelamento sob alta pressão a frio (“High
Pressure Freezing”-HPF), tem sido considerado como procedimento ideal, e uma
alternativa, visando a minimização da ocorrência de artefatos causados pelas
técnicas de microscopia tradicionais. Entretanto, como destacado por H
AWES
(1994),
esta tecnologia não é livre de produzir seus próprios artefatos. Baseado neste
princípio, o congelamento por alta pressão foi inicialmente introduzido em 1968
como uma preparação de espécimes aquosos para a microscopia eletrônica por
M
OOR
&
R
IEHLE
(1968 apud H
OHENBERG
et al., 2003). De início foi considerada
supersofisticada e desnecessária. Porém, foi ganhando importância, pois a beleza e
alta definição das imagens geradas incrementaram a manufatura e comercialização
de novos aparelhos e o aprimoramento de novas técnicas preparatórias. Estudos
envolvendo a aplicação de crio-imobilização como etapa inicial do preparo de
amostras para microscopia têm demonstrado que este método pode ser aplicado
aos mais variados tipos de materiais biológicos. Apesar de este método estar
comercialmente disponível há mais de 20 anos, e de existirem cerca de 50
equipamentos para HPF no mundo, havia apenas cerca de 100 trabalhos científicos
publicados até 2003 (H
ESS
, 2003).
Das várias técnicas disponíveis, realizadas após a crio-imobilização, a
criosubstituição tem se mostrado uma das mais frutíferas para a pesquisa em ultra-
estrutura celular (N
ICOLAS
, 1991; G
ILKEY
&
S
TAEHELIN
, 1986; K
ELLENBERGER
, 1991;
H
ESS
, 2003), sendo particularmente boa para a análise de estruturas bacterianas
(G
RAHAM
, 1992). Além disso, tem sido capaz de gerar informações ultra-estruturais
adicionais e consistentes com dados bioquímicos por reter uma informação mais
acurada da distribuição espacial dos componentes celulares.
Nos trabalhos a seguir apresentados, tivemos como objetivo geral caracterizar
ultra-estruturalmente a interação das bactérias diazotróficas Herbaspirillum
71
seropedicae e Herbaspirillum rubrisubalbicans com plantas de cana-de-açúcar. Para
tanto, foram utilizadas criotécnicas, como método de preparo das amostras,
associadas à microscopia eletrônica, visando a possibilidade de evidenciar novos
detalhes estruturais e suas possíveis implicações com a funcionalidade da
associação. Os objetivos especificas foram:
• Descrição geral da organização ultra-estrutural de células de Herbaspirillum spp.
visualizadas por criofratura convencional;
• Avaliação comparativa da ultra-estrutura das bactérias Herbaspirillum
seropedicae e H. rubrisubalbicans, crescidas em meio de cultura, na presença de
fontes orgânicas de nitrogênio (NFix-) e sob condições de fixação biológica de N
2
(NFix +) visualizadas por criofratura;
• Descrição ultra-estrutural da inter-relação entre H. seropedicae e plântulas de
cana-de-açúcar, em condições in vitro;
• Imuno-localização da enzima nitrogenase em bactérias crescidas em meio de
cultura e colonizando endofiticamente plantas de cana-de-açúcar;
• Detecção de domínios aniônicos em bactérias submetidas a diferentes condições
de crescimento utilizando ferritina cationizada.
72
4. MATERIAL E MÉTODOS
Todas as etapas abaixo foram desenvolvidas no Laboratório de Biologia
Celular e Tecidual do Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade
Estadual do Norte Fluminense. Os detalhes omitidos nesta seção podem ser
verificados no mesmo item do capítulo anterior.
4.1. Crescimento Bacteriano
4.1.1. Estirpes Bacterianas Utilizadas
Os dados relativos às estirpes das bactérias diazotróficas endofíticas utilizadas
neste trabalho encontram-se listados na tabela 2.
Tabela 2: Origem e designação das estirpes de bactérias diazotróficas
utilizadas
Nome Científico
Estirpes Origem Referências
Z67
(estirpe tipo)
∗
BR11175
♦
ATCC 35892
•
DSM 6445
#
LMG 6513
Oryza sativa
raiz
Brasil
B
ALDANI
et al., 1986
Herbaspirillum seropedicae
HRC54
BR11335
Saccharum hyb.
raiz var. SP70-1143
Brasil
B
ALDANI
et al., 1996
H. rubrisubalbicans
HCC103
BR11504
Saccharum hyb.
colmo var. SP70-1284
Brasil
B
ALDANI
et al., 1996
Legenda:
∗
∗∗
∗
Embrapa Agrobiologia, Seropédica-RJ, Brasil.
♦
ATCC-American Type Culture
Collection, Manassas, Virginia, USA.
•
DSMZ-Deutsche SammLung von Mikroorganismen
und Zellkulturen GmbH, Braunschweing, Germany.
#
BCCM
/LMG-Bacteria Collection,
Universiteit Gent, Laboratorium voor Mikrobiologie, Gent, Bélgica.
Híbridos interespecíficos.
4.1.2. Em condições de não fixação de nitrogênio
As bactérias diazotróficas endofíticas Herbaspirillum seropedicae (HRC54 e
Z67) e H. rubrisubalbicans (HCC103) foram crescidas em meio DYGS (R
ODRIGUES
N
ETO
et al., 1986) líquido por 24 h a 32 °C (condição d e não fixação de N
2
). Após
73
este período, alíquotas de 3 mL desta suspensão foram centrifugadas a 6.000 rpm/5
min. O pellet recolhido foi posteriormente submetido ao processo de criofratura
descrito a seguir.
4.1.3 Em condições de fixação de nitrogênio
As estirpes, crescidas conforme descrito no item anterior, foram inoculadas
(alíquotas de 0,1 mL) em meio JNFB semi-sólido (B
ALDANI
et al., 1992). Após a
inoculação foram incubadas por cinco dias a 32 °C. A película bacteriana obtida foi
submetida ao processo de criofratura descrito a seguir.
4.2. Plântulas Micropropagadas de Cana-de-Açúcar
Plântulas micropropagadas de cana-de-açúcar (híbridos interespecíficos de
Saccharum sp.), das variedades RB72454 (Biofábrica da UFRRJ – Campus Leonel
Miranda, Campos dos Goytacazes) foram obtidas a partir do cultivo de meristemas.
O método utilizado para a obtenção de plântulas enraizadas foi descrito por H
ENDRE
et al. (1983). As plântulas foram produzidas em meio básico de cultivo MS
(M
URASHIGUE
&
S
KOOG
, 1962) modificado quanto à concentração de fitoreguladores
usada para promover a multiplicação da parte aérea (MS2) e o enraizamento (MS3),
durante 50 a 60 dias. Após a fase de enraizamento, e perfilhamento, as mesmas
foram transferidas para novo meio líquido MS (1/10), sem hormônios e sem
vitaminas, e com a concentração de sais e sacarose reduzida 10 vezes (R
EIS
et al.,
1999). Em todas as fases as plântulas foram ensaiadas em vidros contendo 50 mL
dos referidos meios (Figura 1). As mesmas foram mantidas em câmara de
crescimento a 25 (± 2) °C, sob luz artificial (3000 lux) com um fotope ríodo de 12 h.
4.3. Inoculação com Bactérias Diazotróficas Endofíticas
4.3.1. Para a realização de congelamento em alta pressão
Após um período de três dias no meio MS (1/10), as plântulas de cana-de-
açúcar foram inoculadas com 100 µL de uma suspensão contendo 10
6
-10
7
células
mL
-1
das bactérias diazotróficas Herbaspirillum seropedicae (Z67) crescidas
74
conforme item 4.1.2. As plântulas foram mantidas por um período de sete dias em
câmara de crescimento a 25 (± 2) °C, sob luz artificial (3000 lux) com um fotope ríodo
de 12 horas.
Figura 1: Plântulas micropropagadas de cana-de-açúcar (híbridos interespecíficos
de Saccharum sp.) crescidas em meio de cultivo MS.
4.4 Criotécnicas
4.4.1. Criofratura de suspensões bacterianas
Foram utilizadas as estirpes bacterianas crescidas conforme os itens 4.1.2 e
4.1.3. Nas células obtidas conforme a descrição do item 4.1.3, realizou-se a
separação da película bacteriana formada, onde se encontravam as bactérias que
estavam fixando N
2
, no meio semi-sólido. Esta separação ocorreu por retirada, por
"pipetagem", do meio de cultura logo abaixo da linha de formação da película.
Para a fixação do material utilizou-se solução fixadora contendo formaldeído [4
%] (VETEC, Brasil), glutaraldeído [2,5%] (grade I, SIGMA Chemical Co., St. Louis,
EUA), em TPO
4
[50 mM] onde permaneceram overnight a 4 ºC. Após este período
foram lavadas três vezes em TPO
4
[50 mM]. Em seguida as bactérias
permaneceram no mesmo tampão, ao qual foram acrescidos 100 µL de uma solução
75
contendo glicerol [40%] (MERCK, Alemanha) em TPO
4
[0,1 M], a intervalos de 30
seg., durante 20 min, até se alcançar o dobro do volume inicial, com o objetivo de
não se alterar bruscamente a osmolaridade das bactérias. Logo após, procedeu-se a
centrifugação e as bactérias foram suspensas diretamente em solução contento
glicerol [40%] em TPO
4
[0,1 M] permanecendo overnight a 4 °C. Findo este período
realizou-se nova centrifugação e o sobrenadante foi descartado. Alíquotas do pellet
foram colocadas em suporte de ouro e posteriormente congeladas em Freon a –175
°C e, em seguida, em nitrogênio líquido. A amostra congelada foi inserida no Freeze
Etching System BAF 060 (BAL-TEC AG, Alemanha) para a realização da fratura. A
amostra fraturada foi retirada do aparelho e as réplicas de platina e carbono (Pt/C)
foram colocadas em solução de ácido crômico [30%] por sete dias com a finalidade
de digerir o material orgânico aderido à amostra e, ao final, foram lavadas com
hipoclorito de sódio (MERCK, Alemanha). As réplicas livres de material orgânico
foram lavadas em água destilada e coletadas em grades de cobre de 300 mesh.
4.4.2. Crio-imobilização por congelamento em alta pressão
Uma semana após a inoculação, fragmentos de raízes foram coletados e
fracionados em dimensões que variaram de 0,1 a 0,6 mm. Estes fragmentos foram
coletados com papel-filtro e colocados em suporte de alumínio com o crioprotetor
hexadeceno (Fluka Chemie). Posteriormente, foram congeladas à temperatura de –
196 ºC (2.100 Bar) no interior do aparelho HPM 010 (High Pressure Freezing
Machine, Baltec, Alemanha).
4.4.3. Fixação por Substituição a Frio
Subseqüentemente, as amostras preparadas no item anterior, congeladas e
aderidas ao suporte, foram transferidas para o Freezer Substitution Apparatus
(Baltec, Alemanha) a -85 ºC para a fixação do material. Após a evaporação do
nitrogênio líquido, as amostras foram introduzidas em uma solução contendo OsO
4
[2%] em acetona [100%] por 24 h (-85 °C / 8 h, -60 °C / 8 h e –20 °C / 8 h). As
amostras permaneceram por 30 min à temperatura ambiente antes da lavagem, em
duplicata, em acetona [99,99%], para se iniciar o protocolo padrão de infiltração com
a resina SPURR [ERL-4206, D.E.R. 736, nonenyl succinic anhydride (NSA), S-1
76
accelerator] (S
PURR
, 1969). Procedeu-se a obtenção de cortes ultrafinos para
microscopia eletrônica de transmissão, coletados em grades de níquel cobertas com
formvar.
4.4.4. Crio-ultramicrotomia
Uma suspensão contendo G. diazotrophicus (PAL5) com 10 dias de
crescimento (item 4.1.2), foi fixada em formaldeído [4%] (nascente), glutaraldeído
[0,1%] (grau 1), sacarose [3,5 %] em tampão PHEM [0,1 M], pH 7,2 por 10 minutos.
Após, procedeu-se lavagem em triplicata no mesmo tampão. Em seguida, adicionou-
se a solução crioprotetora contendo PVP [3,5%] em sacarose [2,0 M] (VETEC,
Brasil) permanecendo nesta solução overnight. Após este período as amostras
foram congeladas em nitrogênio líquido e montadas em suporte específico do crio-
ultramicrótomo (Reichert Ultracut S, Leica). Os cortes obtidos foram coletados em
grades cobertas com formvar e imersos em PBS (pH 7,2)/BSA [3%] (SIGMA).
4.4.4a. Imunomarcação com ouro para a detecção da enzima nitrogenase
As etapas deste protocolo foram realizadas em câmara úmida tendo como
suporte tiras de parafina (Parafilme “M”, Americam Company). Os cortes acima
obtidos e imersos em 50 µL PBS/BSA [3 %] foram subseqüentemente postos em 50
µL PBS/BSA [2 %] e [1 %], permanecendo por 5 min em cada solução. Após este
procedimento os mesmos foram imersos em 50 µL PBS puro por mais 5 min. Em
seguida, incubou-se em 50 µL de solução bloqueadora de cloreto de amônia [50
mM] por 1 h com a finalidade de bloquear os grupamentos aldeídicos. Foram, então,
novamente incubados em 50 µL PBS/BSA [3 %] por 10 min. Seguiu-se a incubação
em 50 µL do anti-soro policlonal anti-Pal5 diluído 1:100 em PBS/BSA [1%] por um
período de 2 h. Após nova lavagem (PBS/BSA [3%, 2%, 1% e puro, 5 min em cada).
Finalmente, as grades foram incubadas em 50 µL do anticorpo secundário (IgG anti-
coelho marcado com partículas de ouro de 15 nm, Auro Probe
tm
EM GAR G15,
Amersham Life Science) diluído 1:50 em PBS/BSA [1%] por 1 h. Nova lavagem
(PBS/BSA [3%, 2%, 1% e puro, 5 min em cada) seguida de 3X em 50 µL de água
destilada estéril. Procedeu-se, então, ao processo de contratação em 50 µL de
solução contendo acetato de uranila [5%]-PVA (Polyvinyl Alcohol) [3%] na proporção
77
de 1:9 por 10 min. Os cortes utilizados como controle foram incubados somente com
a solução de diluição dos anti-soros utilizados e com soro pré-imune, nas etapas
correspondentes aos mesmos.
4.5. Detecção de Carboidratos Ácidos
Células da estirpe HRC54 de H. seropedicae foram crescidas overnight a 32 °C
em meio DYGS (R
ODRIGUES
N
ETO
, et al., 1986) contendo, em g.L
-1
: ácido málico
[2,0], peptona bacteriológica [1,5], extrato de levedura [2,0], K
2
HPO
4
[0,5],
MgSO
4
.7H
2
0 [0,5], ácido glutâmico [1,5] em pH 6,0 por 24 horas. Após a obtenção
das culturas crescidas, estas foram submetidas ao protocolo para localização de
sítios aniônicos segundo
DE
S
OUZA
(1998) adaptado para células bacterianas. As
células foram centrifugadas por 10 min, a 6000 rpm e suspendidas em solução
fixadora contendo glutaraldeído [2,5%] em tampão fosfato [50 mM] por 30 min. à
temperatura ambiente. Após, as mesmas foram lavadas por 2X em PBS (pH7,2) por
10 min. Procedeu-se a incubação em solução de cloreto de amônia (Merck) [50mM]
em TPO
4
[50mM] por 2h - para bloqueio de grupamentos aldeídicos. Em seguida,
incubou-se em solução de ferritina cationizada (FC) (SIGMA- n. cat .F7879) [100
µg.mL
-1
] em TPO
4
[50mM] por 1h à temperatura ambiente. Ocorreu nova lavagem ao
final deste período (2X em PBS (pH7,2), por 10 min). Os tratamentos controle
consistiram da não adição de cloreto de amônia e/ou ferritina cationizada. A pós-
fixação foi realizada com OsO
4
[1%] em TPO
4
[50mM] por 10 min. à temperatura
ambiente em condições de escuridão. Nova lavagem por 2X em PBS (pH 7,2) por 10
min cada uma. Prosseguiu-se com a realização da série cetônica de desidratação
(30%, 50%, 70%, 90%, 2X 100% e super seca). Na seqüência, as amostras foram
submetidas ao protocolo de inclusão em resina EPON (EMBed-812, EMS, USA)
(L
UFT
, 1961). Procedeu-se a obtenção de cortes ultrafinos (70 nm), para microscopia
eletrônica de transmissão, obtidos utilizando-se faca de diamante em ultramicrótomo
Reichert Ultracts, Leica. Os mesmos foram coletados em grades de cobre. A
observação das amostras referentes aos itens 4 e 5 foi realizada no Microscópio
Eletrônico de Transmissão (EM900, Carl Zeiss, Alemanha).
78
4.6. Imunolocalização da enzima nitrogenase em material após crio-
imobilização e criofixação.
As amostras oriundas dos itens 4.2 e 4.3 submetidas a cortes ultrafinos e os
mesmos foram recolhidos em grades hexagonais (200 mesh) de níquel, cobertos
com formvar e postas em placa de petri com água destilada. As etapas seguintes
foram conduzidas utilizando-se como suporte tiras de parafilme M (Americam
Company) e uma pinça para a manipulação das grades. Primeiramente,
bloquearam-se as reações inespecíficas utilizando-se 30 µL de solução de bloqueio
IGL (Immunogold Labbeling) (BSA [10 g L
-1
], Tween 20 [1 mL L
-1
] diluídos em PBS
[0,01M, pH7,2]) por 1h (J
AMES
et al., 1994). Em seguida as grades foram incubadas
a 4 ºC com 50 µL do anti-soro primário anti-nitrogenase (anti-proteína Fe(Nif H) de
nitrogenase de Rhodospirillum rubrum, doado por P.W. Ludden, Madison, Wisconsin,
USA) diluído 1:100 em PBS por um período de 2 h e lavadas por 30 segundos em
água destilada estéril. Após esta lavagem, as grades foram imersas em 25 µL de
anticorpo secundário diluído 1:100 PBS-BSA (1%) (IgG anti-coelho marcada com
partículas de ouro de 15 nm, Auro Probe
tm
EM GAR G15, Amersham Life Science)
por 1h à temperatura ambiente. Após a incubação, as grades foram lavadas em
água destilada estéril e posteriormente imersas em 50 µL de tampão IGL (etapa
repetida três vezes). Em seguida, foram postas para secar sobre papel filtro e
contrastadas com acetato de uranila e citrato de chumbo. Os espécimes foram
examinados em microscópio eletrônico de transmissão Zeiss EM 900. Os controles
utilizados consistiram da substituição do anticorpo primário pela solução IGL e pelo
soro pré-imune.
79
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1- Análise Ultra-estrutural de Herbaspirillum spp. Crescidas em Meio de
Cultivo por Criofratura Convencional.
Estudos têm demonstrado a presença de Herbaspirillum seropedicae e H.
rubrisubalbicans colonizando tecidos de plantas de cana-de-açúcar (O
LIVARES
, 1997;
J
AMES
&
O
LIVARES
, 1998). Nestes estudos, a utilização de técnicas microscópicas
tradicionais (baseadas no uso da fixação química) tem permitido avanços no
entendimento das etapas que resultam no estabelecimento endofítico das bactérias.
Porém, por limitações inerentes às próprias técnicas, estas poderiam potencialmente
introduzir/mascarar alterações ultra-estruturais, tanto na aparência da célula
bacteriana, como na organização celular e tecidual da planta hospedeira, limitando
os avanços de uma descrição mais realista da biologia celular da interação.
Neste contexto, foram realizados ensaios com o intuito de avaliar as
características ultra-estruturais destas células bacterianas em vida livre (sob
diferentes condições metabólicas) e quando em associação com plântulas
micropropagadas de cana-de-açúcar. Para tanto foram utilizadas criotécnicas que
preservam as células em um estado mais próximo ao seu estado natural.
De uma maneira geral, ao se observar as réplicas de platina/carbono (Pt/C),
de espécimes criofixados/criofraturados e crescidos em meio de cultura, constatou-
se, primeiramente, que as dimensões e as formas características das células de
Herbaspirillum não foram alteradas. Ou seja, se apresentaram semelhantes às
descrições anteriormente encontradas em trabalhos que utilizaram técnicas
microscópicas de observação in vivo em material quimicamente fixado (B
ALDANI
et
al.,1986; O
LIVARES
et al., 1997).
Entretanto, a análise de micrografias das células de Herbaspirillum, obtidas
pela técnica de criofratura, revelou detalhes da ultraestrutura celular destas bactérias
que não haviam sido evidenciados anteriormente quando da utilização de técnicas
convencionais. Os aspectos revelados das diferentes faces das membranas das
células bacterianas, permitem seu estudo sob diferentes perspectivas de observação
(Figuras 2 a 22).
Foi observado que a organização geral da parede celular das duas bactérias
do gênero Herbaspirillum apresentam características semelhantes, com grande
80
densidade de partículas distribuídas homogeneamente por toda a superfície da
membrana. Este padrão de distribuição, foi observado para ambas espécies, nas
duas condições propostas (Nfix+ e Nfix-) (Figuras 2 a 7 e 12 a 15).
Com relação à organização do citoplasma foram observadas, no caso de H.
rubrisubalbicans, diferenças no arranjo de partículas citoplasmáticas. Foram
observados que, com alguma freqüência, células crescidas em meio líquido DYGS
(Nfix -), apresentaram o que se pode chamar de compartimentalização em
determinadas regiões de seu citoplasma (Figuras 2 e 7). Esta compartimentalização
pode, inclusive, estar relacionada aos brotamentos observados nas células desta
estirpe bacteriana como visualizado nas figuras 34 e 35 do Capítulo I.
Por outro lado, sob condição de fixação de N
2
, algumas células apresentaram
regiões com uma distribuição diferenciada de partículas (Figura 3). Assumindo a
natureza protéica destas partículas intracelulares, pressupõe-se que esta alteração
estrutural possa estar relacionada a algum fenômeno celular relacionado ao
processo de fixação biológica de nitrogênio. Além disso, aspectos estruturais
relacionados a importantes eventos do metabolismo bacteriano puderam ser
visualizados como, por exemplo, o processo de divisão celular (Figura 4).
Infelizmente não foi possível a realização de uma análise comparativa entre
as espécies de Herbaspirillum quanto à distribuição de partículas intramembranares
nas faces E (face interna do folheto externo membrana) e P (face externa do folheto
interno da membrana) (B
OZZOLA
&
R
USSELL
, 1999). Apesar disto, o grande número
de células fraturadas observadas sugere que exista uma resistência à fratura destes
domínios das células de Herbaspirillum, tão comumente expostos em células
animais e vegetais.
Inclusões citoplasmáticas como grânulos de poli-β-hydroxyalkanoato (PHA) e
poli-β-hydroxybutirato (PHB) foram freqüentes em amostras criofraturadas de
Herbaspirillum em todos os tratamentos. Estes grânulos são polímeros
termoplásticos que apresentam um alto grau de ductibilidade e que podem ser
distendidos extensivamente quando criofraturados. Em função de suas propriedades
físicas, grânulos criofraturados podem exibir aparência estrutural de natureza distinta
das conhecidas (Figuras 8 a 11 e 16 a 19), gerando erros de identificação. Análises
posteriores, porém, mostraram que tais estruturas se referiam aos mesmos grânulos
PHB/PHA, que em função de sua composição química, apresentam graus distintos
de resistência à fratura.
81
Desse modo, quando crescidas em meio líquido DYGS (com glicose e ácido
málico como fontes de carbono) e em condições de não fixação de nitrogênio, H.
rubrisubalbicans apresentou um elevado número de grânulos de PHB/PHA. Neste
caso, a aparência destas estruturas após a criofratura se parece com o que S
UDESH
et al. (2000a) chamou de deformação tipo agulha. Este tipo de deformação se refere
a grânulos de PHB de composição homogênea, ou seja, os denominados
homopolímeros. Também foi observada, nestas condições de crescimento, a
presença de deformações tipo cogumelo, que segundo este mesmo autor se refere à
presença de grânulos de PHB com polímeros associados, os então denominados co-
polímeros.
Por outro lado, quando H. rubrisubalbicans foi submetida a condições de
crescimento que favorecem a FBN, o número de grânulos de PHB/PHA detectados
decaiu grandemente e somente observamos a presença de grânulos que sofreram
deformações do tipo agulha (Figuras 10 e 11).
Alguns trabalhos têm demonstrado (B
ABEL
, 1992; K
ADOURI
et al., 2002) que a
composição destes grânulos pode ser alterada de acordo com a espécie bacteriana,
com a fonte de carbono utilizada pela bactéria ou como uma resposta a condições
de estresse ambiental. Neste caso, sob condições de fixação de nitrogênio, H.
rubrisubalbicans não produziu mais grânulos PHB/PHA/co-polímeros. Nas duas
condições de crescimento utilizadas, os grânulos de PHB/PHA homopolímeros
observados apresentaram a estrutura radiada que envolve um núcleo central
conforme descrito na literatura (S
UDESH
et al., 2000 a e b; M
AYER
, 1992). Estas duas
regiões, que compõem o grânulo de PHB/PHA, apresentam propriedades físicas
diferentes, onde a parte externa age como uma âncora para a parte central que é
mais dúctil.
Por outro lado, H. seropedicae, submetida às mesmas condições de
crescimento descritas anteriormente, apresentou menor número de grânulos com
deformações tipo agulha sob condições de não fixação de nitrogênio. E, em
condições de fixação de nitrogênio, foi observada a presença de inclusões com
aspecto radial estriado, mas sem a presença de um núcleo dúctil. Este fato pode
estar relacionado à habilidade desta espécie/estirpe de Herbaspirillum alterar suas
reservas de carbono como uma resposta à condição de fixação biológica de
nitrogênio. Também foi verificada a presença de vesículas com estrutura mais
proximamente relacionada ao que é visualizado em microscopia convencional. Este
82
fato pode indicar que o conteúdo destas possa ser um PHB/PHA de composição
diferente das que apresentam as deformações anteriormente mencionadas, ou
mesmo que estas vesículas sejam as partes complementares dos grânulos
fraturados livres de seu conteúdo, como explicitado por S
UDESH
et al. (2000) (Figuras
8, 9 e 19).
K
RAUSE
et al. (1996) observaram a presença de inclusões similares às
estruturas de PHB/PHA quando criofraturadas e, examinado sua composição,
sugeriram que houvesse proteínas associadas às mesmas. De fato, como pode ser
verificado em trabalhos relacionados à utilização de polímeros de PHB/PHA de
diferentes composições na indústria farmacêutica existe grande afinidade entre estes
polímeros e estruturas protéicas. Estas, por sua vez, podem contribuir, juntamente a
outras características físico-químicas para a determinação da morfologia interna e
externa de micropartículas de PHB (M
ARTIN
et al., 2000).
Interessante ressaltar a presença de agregados de partículas no citoplasma
de células de H. seropedicae (estirpe HRC54) crescidas sob condição de fixação de
nitrogênio (Figuras 20, 21 e 22). Acrescenta-se a este fato os resultados obtidos
para imunolocalização da enzima nitrogenase (Figuras 22 e 23). Nos cortes obtidos
por ultracriomicrotomia de células desta mesma estirpe, e crescida nestas mesmas
condições, verifica-se a existência de marcação intensa e concentrada, que pode
estabelecer uma ligação entre as duas observações. Ou seja, os agregados de
partículas observados em amostras criofraturadas podem estar relacionados a uma
nucleação de enzimas nitrogenases, quando efetivamente ativas, isto é, em
condições de fixação de nitrogênio.
Uma vez confirmada esta ligação, este seria o segundo relato do
estabelecimento de sítios de recrutamento do complexo protéico da nitrogenase
topologicamente organizado no interior do citoplasma bacteriano, similar aquele
descrito por (H
UREK
et al., 1995), em estruturas descritas como diazossomos para
Azoarcus.
83
Legenda: Superfície celular de H. rubrisubalbicans visualizada após criofratura
convencional. As células foram crescidas em meio líquido DYGS sob condição de
não fixação de nitrogênio (Fix -) e em meio JNFb semi-sólido que favorece a FBN
(Fix +). FP – face externa do folheto interno da membrana celular. Observação
realizada em microscopia eletrônica de transmissão.
Figura 2: Célula de H. rubrisubalbicans crescida em meio DYGS. Observar a
ocorrência de compartimentalização em determinas regiões (setas).
Figura 3: Célula de H. rubrisubalbicans crescida em meio JNFb semi-sólido.
Observar região com menor densidade de partículas (estrela).
Figura 4: Célula de H. rubrisubalbicans crescida em meio DYGS. Observar região
que sugere a ocorrência de divisão celular ou compartimentalização (seta).
Figura 5: Célula de H. rubrisubalbicans crescida em meio JNFb semi-sólido.
Observar a ocorrência de distribuição homogênea de partículas na superfície celular.
Figura 6: Célula de H. rubrisubalbicans crescida em meio JNFb semi-sólido. A
fratura expôs as faces P (FP) e externa (asterisco) da membrana celular. PB –
parede bacteriana.
Figura 7: Célula de H. rubrisubalbicans crescida em meio DYGS. Observar regiões
que podem indicar o início de compartimentalização ou divisão celular (seta).
84
0.09 µm
0.15µm
0.15 µ
µµ
µm
0.09µm
0.15µm
0.15µm
2
7
6
5
4
3
PB
FE
*
0.09 µm
0.15µm
0.15 µ
µµ
µm
0.09µm
0.15µm
0.15µm
2
7
6
5
4
3
PB
FE
*
85
Legenda: Células de H. rubrisubalbicans visualizadas após criofratura convencional,
com ênfase na distribuição de partículas no citoplasma e grânulos intracelulares.
Figura 8: Células crescidas em meio DYGS líquido sob condições de não fixação de
nitrogênio. Observar a presença de grânulos de PHB com deformações tipo agulha
(setas).
Figura 9: Células crescidas em meio DYGS líquido sob condições de não fixação de
nitrogênio. Observar a presença de grânulos de PHB com deformações tipo
cogumelo (setas).
Figuras 10 e 11: Células crescidas em meio JNFb semi-sólido sob condições de
fixação de nitrogênio. Observar a presença de grânulos de PHB com deformações
tipo agulha (setas).
86
0,25 µm
0,15 µm
0,1 µm
0,15 µm
8
11
10
9
0,25 µm
0,15 µm
0,1 µm
0,15 µm
8
11
10
9
87
Legenda: Células de H. seropedicae visualizadas após criofratura convencional.
Observação realizada em microscopia eletrônica de transmissão.
Figura 12: H. seropedicae crescida em meio DYGS. Notar a semelhança de sua
superfície com a de H. rubrisubalbicans crescida nas mesmas condições.
Figura 13: H. seropedicae em meio DYGS. Notar orientação das partículas (setas
brancas e pretas) em sua superfície.
Figura 14: H. seropedicae em meio JNFb semi-sólido. Notar semelhança com a
figura 5 e com H. rubrisubalbicans crescida nas mesmas condições.
Figura 15: H. seropedicae em meio JNFb semi-sólido. Notar que a fratura expôs
região da célula bacteriana com menor incidência de partículas (estrela).
88
0.15 µ
µµ
µm
0.15 µ
µµ
µm
0.15 µ
µµ
µm
0.09 µ
µµ
µm
12
15
14
13
0.15 µ
µµ
µm
0.15 µ
µµ
µm
0.15 µ
µµ
µm
0.09 µ
µµ
µm
12
15
14
13
89
Legenda: Células de H. seropedicae visualizadas após criofratura convencional.
Figura 16: H. seropedicae crescida em meio DYGS onde podemos observar a
ocorrência de várias deformações do tipo agulha (setas) sofridas pelos grânulos de
PHB/PHA em seu citoplasma. Notar a nítida formação da estrutura radiada que
ancora o núcleo dúctil (cabeça de seta).
Figura 17: Detalhe da deformação tipo agulha ocorrida em grânulos de PHB/PHA
homopolímeros. Notar região de ancoramento (dupla seta).
Figura 18: H. seropedicae em meio JNFb semi-sólido. Notar a redução do diâmetro
da estrutura radiada e a ausência do núcleo dúctil (seta).
Figura 19: H. seropedicae em meio JNFb semi-sólido. Observe a presença de dois
grânulos de PHB onde deve ter ocorrido a perda total do conteúdo do mesmo.
90
0,1 µ
µµ
µm
0,1µ
µµ
µm
0,15 µ
µµ
µm
0,1 µ
µµ
µm
16
19
18
17
PHB
PHB
0,1 µ
µµ
µm
0,1µ
µµ
µm
0,15 µ
µµ
µm
0,1 µ
µµ
µm
16
19
18
17
PHB
PHB
91
Legenda: Células de H. seropedicae crescidas em condição de fixação biológica de
nitrogênio (meio JNFb semi-sólido). Observação realizada em microscopia eletrônica
de transmissão.
Figuras 20, 21 e 22: H. seropedicae após criofratura. Observe a formação de
aglomerados de partículas no citoplasma bacteriano (setas).
Figuras 23 e 24: Imunomarcação com ouro coloidal visando à localização da enzima
nitrogenase em células de H. seropedicae (HRC54) após crio-ultramicrotomia.
Observar a alta densidade destas partículas (setas).
92
0,15µ
µµ
µm
0,05 µ
µµ
µm
0,25 µ
µµ
µm
0,09 µ
µµ
µm
0,09 µ
µµ
µm
20
22
21
24
23
0,15µ
µµ
µm
0,05 µ
µµ
µm
0,25 µ
µµ
µm
0,09 µ
µµ
µm
0,09 µ
µµ
µm
20
22
21
24
23
93
5.2. Análise Ultra-estrutural da Associação de Herbaspirillum seropedicae com
Plântulas Micropropagadas de Cana-de-Açúcar por Criotécnicas.
Plântulas micropropagadas de cana-de-açúcar (var. RB72454) foram colhidas
após sete dias da inoculação com uma suspensão de 10
6
-10
7
células. mL
-1
de H.
seropedicae estirpe Z67. As amostras de folhas e raízes foram submetidas ao
processo de fixação física por congelamento à alta pressão/criosubstituição.
Observando-se as amostras de folhas, fixadas pelo processo acima descrito,
foi possível visualizar células de H. seropedicae colonizando o apoplasto em
contacto com a parede celular vegetal de células do parênquima vascular. A
facilidade de observar Herbaspirillum em tecidos foliares, contrasta com
observações feitas por O
LIVARES
et al.
(1996)
e
B
ALDANI
et al.
(1997) que em estudos
de ocorrência ecológica e de microscopia, associados a ensaios de
fitopatogenicidade, relataram que os tecidos foliares de cana-de-açúcar eram
incompatíveis a colonização por H. seropedicae. A explicação para tal controvérsia
pode estar no modo de preparo da amostra para estudos que envolvam a utilização
de criotécnicas, que remove poucas bactérias dos sítios de colonização, facilitando
sua localização.
Todas as células de H. seropedicae, que ocorreram com mais freqüência
como células isoladas, apresentavam vários e volumosos grânulos de PHB/PHA no
citoplasma. Estes grânulos são estruturas de reserva normalmente encontradas
nestas bactérias e, neste caso, se apresentaram muito bem preservados e com um
aspecto pseudo-3D (Figuras 25 e 26), o que não é observado com o preparo da
amostra em condições tradicionais (O
LIVARES
et al., 1997; J
AMES
et al.,1997). Nestas
mesmas amostras, a presença de material eletron-denso aparentemente originando-
se da bactéria (Figuras 42 a 47), parece estar envolvida no processo de adesão à
parede celular da planta. Em algumas situações, foi observada ausência de limite na
interface de adesão célula-célula (Figuras 27 e 41). A adesão tem sido amplamente
reconhecida como etapa fundamental no estabelecimento efetivo de associações
entre plantas e microrganismos, sejam elas de natureza patogênica ou simbióticas
(A
GRIOS
, 1997; B
EATTY
& L
INDOW
, 1999; B
RESSAN
, 2002, C
OCKING
, 2003).
Diferentes estudos de cinética de adsorção (B
ASHAN
et al., 1986; B
ASHAN
,
1990; P
INHEIRO
et al., 2002; L
EVANONY
et al., 1989), revelam que a adesão se
processa em duas fases em A. brasilense. A primeira fase é inespecífica e
94
caracterizada por ligações fracas. A segunda fase é específica e mediada por
lectinas presentes na planta e na bactéria. Nesta segunda fase ocorre o envolvendo
de estruturas adesivas como microfibrilas de celulose e formação de uma placa de
adesão por modificações na superfície da parede celular da planta hospedeira.
Este fato foi observado por nós como pode ser verificado na figura 28. Nesta,
nota-se que a bactéria está imersa na parede celular em uma região com aspecto de
uma matriz eletron-densa. É presumível que esta matriz tenha sido formada pela
célula vegetal como uma resposta a possíveis sinalizações originárias da célula
bacteriana.
A presença de estruturas “tipo vesículas”, com conteúdo desconhecido, que
se originam da parede celular em regiões próximas à bactéria, são indícios auxiliares
para subsidiar a hipótese anterior (Figuras 29 e 30).
Comparada às da parte aérea, nas observações realizadas em amostras de
raízes pudemos visualizar mais facilmente células de H. seropedicae (Z67) nos
diferentes cortes seriados obtidos. Este fato pode indicar a existência de uma maior
população desta estirpe associada às raízes. Fato que pode ser explicado por uma
maior adaptação desta estirpe a este micro-hábitat. Nestas mesmas amostras
também foi possível, inclusive, a observação de colonização dos espaços
intercelulares das células de parênquima do córtex radicular (Figuras 31 a 33; 36 a
41).
Células bacterianas isoladas, ou em discretos agregados, próximas à parede
celular vegetal, foram freqüentemente observadas em três situações: (1) envoltas
por uma fina camada de material amorfo eletron-denso (Figuras 36 e 37). Este
material parece originar-se da parede celular vegetal adjacente; (2) associadas
fisicamente à parede por uma projeção eletron-densa que, aparentemente, se
origina a partir da parede celular vegetal como resposta à presença da bactéria,
formando uma ponte de ligação (Figura 38); (3) associada por contacto direto da
parede de ambas (Figuras 39, 40 e 41).
O processo de adesão celular foi amplamente detectado nas amostras
criofixadas, e estabeleceram uma perspectiva diferente daquela observada para
amostras preparadas por meio de fixação química. No último caso, não é raro
observar bactérias isoladas livres no apoplasto, não sendo notada nenhuma
estrutura de ligação célula-célula, nem tão pouco depositos elétron-densos no local
95
de ligação ou mesmo alterações na célula bacteriana (J
AMES
et al., 1994; J
AMES
et
al., 2002, K
LOEPPER
,
1996;
K
LOEPPER
et al., 1999).
No presente estudo, invariavelmente, nas bactérias aderidas à parede celular
vegetal, ocorreu uma nítida alteração nos domínios da parede celular bacteriana em
relação ao sítio de adesão na parede celular vegetal (Figuras 27, 28, 38, 41).
Projeções oriundas da bactéria e em direção à parede celular vegetal,
também foram observadas, como pode ser visto na figura 26.
Um outro padrão de adesão observado foi a atenuação do limite entre as
duas paredes celulares, como demonstrado na figura 27 em células que colonização
os tecidos foliares. Este padrão parece ser uma etapa posterior no processo de
interação destas células.
96
Legenda: Microscopia eletrônica de transmissão de H. seropedicae (Z67)
colonizando o apoplasto em contacto com células do parênquima vascular de tecido
foliar de plântulas micropropagadas de cana-de-açúcar (var. RB72454). Amostras
obtidas sete dias após a inoculação e submetidas ao processo de fixação física por
congelamento à alta pressão/criosubstituição.
Figure 25: Observe vários e volumosos grânulos de poli-β-hidroxi-butirato (PHB) no
citoplasma bacteriano. Visão geral da parede celular bacteriana (seta).
Figure 26: Célula bacteriana próxima à parede celular vegetal (pcv). As setas
indicam estruturas que parecem ser oriundas da parede celular bacteriana.
Figure 27: Célula bacteriana aderida à parede celular vegetal (pcv). Observe que
ambos os limites celulares desaparecem (seta).
Figure 28: Célula bacteriana imersa na parede celular vegetal (pcv) (seta branca).
Figure 29: Célula bacteriana próxima à parede celular vegetal (pcv). Observe
estrutura tipo vesícula que parece se originar da parede celular vegetal.
Figure 30: Observe detalhe da estrutura vesicular evidenciada na figura anterior.
97
25
26
27
28
29
30
pcv
pcv
pcv
pcv
pcv
PHB
PHB
PHB
PHB
PHB
0,09 µ
µµ
µm
0,15 µ
µµ
µm
0,15 µ
µµ
µm
0,15 µ
µµ
µm
0,09 µ
µµ
µm
0,09 µ
µµ
µm
25
26
27
28
29
30
pcv
pcv
pcv
pcv
pcv
PHB
PHB
PHB
PHB
PHB
0,09 µ
µµ
µm
0,15 µ
µµ
µm
0,15 µ
µµ
µm
0,15 µ
µµ
µm
0,09 µ
µµ
µm
0,09 µ
µµ
µm
98
Legenda: Células de Herbaspirillum seropedicae (Z67) colonizando regiões do
apoplasto de plântulas micropropagadas de cana-de-açúcar sete dias após a
inoculação. Amostras submetidas a crio-imobilização (HPF)/criosubstituição.
Observação realizada em microscopia eletrônica de transmissão.
Figuras 31 e 32: Células de Herbaspirillum seropedicae (Z67) em região dos meatos
celulares (m). Notar o baixo número populacional no interior dos mesmos.
Figuras 33: Células de Herbaspirillum seropedicae (Z67) em região dos meatos
celulares. Notar o grande número de células presentes nos espaços intercelulares e
o alargamento dos mesmos. Observar elétron-densidade em diversas áreas da
parede celular (setas).
Figuras 34 e 35: Células de Herbaspirillum seropedicae (Z67) colonizando o
elemento de vaso foliar.
99
1.1 µm
0.4 µm
0.6 µm
1.1 µm
1.1 µm
31
32
35
34
33
m
m
m
1.1 µm
0.4 µm
0.6 µm
1.1 µm
1.1 µm
31
32
35
34
33
m
m
m
100
Em sítios onde foi verificada a existência de alta densidade de células
bacterianas foram observados dois tipos distintos de materiais relacionados à
presença das mesmas. O primeiro tipo, de aspecto homogêneo e “compacto”, é
observado quando grupos de células desta estirpe encontram-se próximas umas das
outras, independente de estarem em íntimo contato com a parede celular (Figuras
42 a 47). O segundo tipo, uma matriz fibrilar, ocorrendo quando as bactérias
encontram-se próximas à parede celular e, de fato, parece se originar desta última
como resposta à presença da bactéria (Figuras 42, 43, 46, 48 a 50).
Como pode ser observado na figura 45 ocorre o que se pode chamar de início
da formação desta matriz homogênea quando mais de duas células estão em
contato. Porém, como existem células para as quais não foi observada a presença
desta matriz, parece que a formação da mesma pode estar relacionada a algum
estímulo específico não conhecido. Este estímulo pode estar relacionado a
mecanismos de quorum-sensing envolvidos no estabelecimento endofítico em micro-
hábitats definidos dentro da raiz desta variedade, como aqueles descritos para
outras bactérias organizadas em biofilmes (D
E
K
IEVIT
et al., 2001).
Podem ser facilmente observados grupos bem delimitados de células
bacterianas embebidas nesta matriz de aspecto denso e homogêneo. Curiosamente
estas unidades contendo discretos agregados de bactérias ocupam o interior das
células de parênquima cortical. A natureza intracelular destas estruturas não pode
ser ratificada pela presente observação, nem tão pouco a natureza membranar da
matriz associada. Ressaltamos que a descrição de tais estruturas é inédita na
literatura mundial dedicada às associações benéficas entre gramíneas e bactérias
endofíticas. Os poucos trabalhos evidenciando agregação coordenada de bactérias,
demonstram a presença de uma fina matriz fibrilar envolvendo bactérias dispersas
em um lúmen eletron-transparente como observado por J
AMES
et al. (1997).
Na figura 44 foi possível a observação do que parece ser o processo de união
de grupos específicos de células bacterianas. Esta união pode ser reflexo da
dinâmica temporal de comunicação celular, onde existem células livres e células
agregadas pela matriz. Este padrão de agregação parece ocorrer apenas em sítios
específicos da célula, não sendo, por exemplo, observado nos meatos das células
corticais da raiz (Figura 43). Nestes meatos verificamos que bactérias isoladas estão
associadas a uma fina matriz, delimitando um halo eletron-transparente ao redor da
bactéria. Ressalta-se que é comum observar um aumento de volume dos espaços
101
intercelulares do parênquima cortical colonizados por Herbaspirillum, causado pelo
rompimento da junção das lamelas médias de células vegetais adjacentes. Além
disso, a formação da matriz parece ser dependente da presença de mais de três
células bacterianas no sítio de indução.
Com relação ao segundo tipo de matriz observada, esta pode vir a ser uma
evolução das estruturas originadas a partir da parede celular vegetal e destacadas
nas figuras 36, 37 e 38. Além disso, foram localizadas células bacterianas próximas
à parede celular vegetal onde podemos observar a formação da matriz fibrosa que
envolve as mesmas. Aglomerados celulares também foram localizados onde é
possível observar a presença de polimorfismo e a pouca definição nos limites
celulares planta-bactéria (Figuras 47 e 51). Também foram observadas células
bacterianas organizadas em um padrão enfileirado, e envoltas pela matriz fibrosa,
localizada próximas à parede celular vegetal, onde se verificam algumas células
aderidas à mesma (Figuras 48 e 50).
102
Legenda: H. seropedicae (Z67) colonizando o apoplasto de células parenquimáticas
corticais de raízes de plântulas micropropagadas de cana-de-açúcar (var. RB72454).
Amostras obtidas sete dias após a inoculação e submetidas ao processo de fixação
física por congelamento à alta pressão/criosubstituição.
Figure 36 e 37: Células bacterianas localizadas próximas à parede celular vegetal
(pcv) onde podemos observar a presença de uma substância de natureza
desconhecida envolvendo-as como uma membrana (seta). Esta substância parece
originar-se da parede celular vegetal adjacente.
Figure 38: Célula bacteriana próxima a material elétron-denso que, aparentemente,
se origina a partir da parede celular vegetal (pcv) como resposta à presença da
bactéria.
Figure 39: Células bacterianas aderidas à parede celular vegetal (pcv). Note a
polarização das células em relação ao local de adesão das mesmas à parede celular
vegetal (seta).
Figure 40: Célula bacteriana aderida à parede celular vegetal (pcv) onde verificamos
a existência de pequena projeção (seta) oriunda da célula bacteriana e que se dirige
em direção à parede celular vegetal.
Figure 41: Célula bacteriana aderida à parede celular vegetal. Note que o limite
entre as duas paredes parece desaparecer (seta).
103
36 37
38 39
40 41
PHB
PHB
PHBPHB
PHB
PHB
pcv
pcv
pcv
pcv
pcv
pcv
0,25 µ
µµ
µm
0,09 µ
µµ
µm
0,25 µ
µµ
µm
0,15 µ
µµ
µm
0,15 µ
µµ
µm
0,09 µ
µµ
µm
36 37
38 39
40 41
PHB
PHB
PHBPHB
PHB
PHB
pcv
pcv
pcv
pcv
pcv
pcv
0,25 µ
µµ
µm
0,09 µ
µµ
µm
0,25 µ
µµ
µm
0,15 µ
µµ
µm
0,15 µ
µµ
µm
0,09 µ
µµ
µm
104
Legenda: H. seropedicae (Z67) colonizando tecidos internos de raízes de plântulas
micropropagadas de cana-de-açúcar (var. RB72454). Amostras obtidas sete dias
após a inoculação e submetidas ao processo de fixação física por congelamento à
alta pressão/criosubstituição. Visualização da matriz densa e amorfa que envolve as
bactérias. Observação realizada em microscopia eletrônica de transmissão.
Figura 42: Grupos de células bacterianas envoltas por matriz de aspecto denso e
homogêneo. Observe que esta matriz parece estar relacionada a grupos específicos
de células (setas). Note, também, a presença de matriz de aspecto fibroso que
parece se originar da parede celular vegetal (pcv) (estrela).
Figura 43: Células bacterianas em local próximo a meatos celulares (m). Note a
presença de bactérias no interior destes meatos. Novamente podem ser observados
os dois tipos de matriz (fibrosa – estrela, homogênea – setas).
Figura 44: Dois grupos celulares distintos onde se observa a presença de matriz
densa e homogênea envolvendo os grupos separadamente (asterisco).
Figura 45: Grupos celulares, ressaltando-se (asterisco) o início da formação da
matriz entre as células.
Figura 46: Células bacterianas próximas à parede celular vegetal (pcv) onde se
visualiza a formação da matriz fibrosa que envolve as células próximas. Note ligação
desta matriz com a parede celular vegetal (seta) e a presença de grupos de
bactérias envoltas pela matriz densa (asterisco).
Figura 47: Aglomerado celular onde se observa a presença de polimorfismo e a
pouca definição nos limites celulares.
105
pcv
*
*
0,4 µm
0,25 µm
0,6 µm
0,25 µm
42
47
45
46
pcv
m
pcv
pcv
*
*
*
44
1,1 µm
43
0,6 µm
pcv
*
*
0,4 µm
0,25 µm
0,6 µm
0,25 µm
42
47
45
46
pcv
m
pcv
pcv
*
*
*
44
1,1 µm
43
0,6 µm
106
Legenda: H. seropedicae (Z67) colonizando tecidos internos de raízes de plântulas
micropropagadas de cana-de-açúcar (var. RB72454). Amostras obtidas sete dias
após a inoculação e submetidas ao processo de fixação física por congelamento à
alta pressão/criosubstituição. Visualização da matriz fibrosa que envolve as bactérias
e que parece ser produzida pela parede celular vegetal como resposta à presença
das células bacterianas. Observações realizadas em microscopia eletrônica de
transmissão.
Figuras 48: Células bacterianas organizadas em fileiras próximas à parede celular
vegetal (pcv), A seta indica o local de adesão de algumas células à parede celular
vegetal. Todas as células encontram-se envoltas pela matriz fibrosa (asterisco).
Figuras 49 e 50: Grupo de células bacterianas próximas à parede celular vegetal
(pcv). Observa-se a presença de matriz fibrosa (asterisco) envolvendo as células
bacterianas.
Figura 51: Células bacterianas próximas à parede celular vegetal (pcv) onde se
observa a presença de polimorfismo e a pouca definição nos limites celulares.
Comparar com a figura 47.
107
0,6 µ
µµ
µm
0,4 µ
µµ
µm
0,25 µ
µµ
µm
0,4 µ
µµ
µm
48
51
50
49
pcv
*
pcv
pcv
pcv
pcv
*
*
*
*
0,6 µ
µµ
µm
0,4 µ
µµ
µm
0,25 µ
µµ
µm
0,4 µ
µµ
µm0,4 µ
µµ
µm
48
51
50
49
pcv
*
pcv
pcv
pcv
pcv
*
*
*
*
108
5.3. Imunolocalização da Enzima Nitrogenase e Detecção de Sítios Aniônicos
na Superfície da Bactéria.
Considerando-se os dados estruturais inéditos obtidos a partir da análise da
associação H. seropedicae/cana-de-açúcar por criotécnicas, destaca-se a
necessidade de acoplamento das alterações estruturais descritas com alterações
fisico-químicas, que permitam avançar no entendimento integrado das interações
endofíticas. Diferentes técnicas histoquímicas e citoquímicas podem contribuir para
elucidação da natureza química de diferentes estruturas funcionais na interação
endofítica. Uma dos métodos utilizados foi a detecção da alteração das cargas de
superfície utilizando-se a marcação com partículas de ferritina cationizada (FC).
Observando as figuras 52 a 54, nota-se a marcação de sítios na superfície de
H. seropedicae estirpe Z67 com partículas de FC. Nenhuma marcação com aspecto
semelhante à FC foi encontrada no controle. Na figura 54 observa-se que ocorreu a
deposição acentuada de moléculas de FC no sítio de divisão celular. Este fato pode
ser devido à presença, neste local, de sítios aniônicos, originados das alterações
estruturais da parede em processo de fissão binária. Esta marcação específica pode
ser interpretada como uma resposta da superfície celular ao estado metabólico e
energético da célula indo de encontro ao proposto por B
LAIR
& A
NDERSON
(1998).
O padrão polarizado de marcação ocorrida no espaço entre duas células
bacterianas pode refletir a presença de compostos envolvidos na comunicação e
reconhecimento mútuo. Interessante notar que, neste caso a presença de moléculas
de FC é mais acentuada na região próxima à outra célula (Figura 53). Em outras
regiões do perímetro da célula a marcação caracteriza-se por pequenos agregados
descontínuos. Esta observação é igualmente válida para células bacterianas na
figura 53. Nestas observa-se que a marcação foi muito mais intensa em uma das
células, o que supostamente apontaria que estas duas células estejam em
condições metabólicas diferentes, apesar de fazerem parte da mesma cultura
celular. Uma, por exemplo, poderia estar se preparando para se dividir e isto poderia
estar se refletindo de maneira efetiva em sua superfície. Fatores fisiológicos como a
síntese de proteínas, produção de ATP ou formação de parede celular também
podem estar envolvidos (B
LAIR
&
A
NDERSON
, 1998).
Em células isoladas, observa-se uma marcação ao longo da superfície da
mesma. Esta marcação, porém, não é contínua e sim em pequenos grumos não
109
muito distantes uns dos outros, o que pode indicar uma ligação a sítios aniônicos de
complexos moleculares da superfície bacteriana. Também observou-se marcação de
estruturas próximas à célula, mas que não puderam ser identificadas. Neste caso, as
moléculas de FC se dispõem de forma circular ao redor da estrutura não identificada
(dados não mostrados). Nenhuma internalização de moléculas de FC foi observada,
fato anteriormente observado por A
NDERSON
(1998) em diferentes espécies
bacterianas.
Embora a detecção de sítios aniônicos tenha se mostrado eficiente para
agregar novas informações à interação H. seropedicae/cana-de-açúcar, nenhuma
consideração pode ser feita em relação à quais moléculas e/ou complexos protéicos
estariam relacionados à marcação com FC, já que pouco se sabe a respeito da
composição específica da superfície de H. seropedicae. Inferências neste sentido
podem ser feitas somente com relação aos compostos mais comumente presentes
neste grupo de microrganismos (p.ex.: peptideoglinacanas, lipopolissacarídeos, N-
acetilglicosamina, ácido N-acetilmurâmico). Entretanto, novos ensaios deverão ser
conduzidos, principalmente testando o comportamento diferenciado das cargas de
superfície em condição de fixação biológica de nitrogênio.
Com relação à imunolocalização da enzima nitrogenase, podemos verificar
que esta enzima pôde ser localizada próxima a grânulos de PHB (Figura 55).
Também observamos a presença da mesma no citoplasma e um adensamento
enfileirado em região próxima à membrana celular (Figura 56). De fato, em algumas
células ocorreu intensa marcação para a enzima nitrogenase no citoplasma celular.
(Figura 57). Como mencionado anteriormente esta enzima também pode ser
imunolocalizada em cortes obtidos por ultracriomicrotomia de células da estirpe
HRC54 (Figuras 23 e 23). Ressaltamos que ambos os ensaios de imunolocalização
foram realizados em cortes obtidos de células crescidas sob condições de fixação de
nitrogênio. Ou seja, estes resultados podem estar sugerindo que ocorra um arranjo
específico de enzimas nitrogenases, quando efetivamente ativas. Uma vez
confirmada esta ligação, este seria o segundo relato do estabelecimento de sítios de
recrutamento do complexo protéico da nitrogenase topologicamente organizado no
interior do citoplasma bacteriano, similar àquele descrito por (H
UREK
et al., 1995), em
estruturas descritas como diazossomos para Azoarcus.
110
Legendas: Figuras 52 a 54: Células de Herbaspirillum seropedicae (HRC54)
crescida em meio DYGS, ensaiadas com uma concentração de FC [100 µg/ml] e
incluídas em EPON. Figuras 55 a 57: Imunolocalização da enzima nitrogenase em
células de Herbaspirillum seropedicae (Z67) colonizando regiões do apoplasto de
plântulas micropropagadas de cana-de-açúcar sete dias após a inoculação.
Amostras submetidas a crio-imobilização (HPF)/criosubstituição. Observações
realizadas em microscopia eletrônica de transmissão.
Figuras 52: Notar a presença de partículas de FC em todo o perímetro da célula
(seta).
Figuras 53: Notar a presença de partículas de FC na região entre duas células
adjacentes. Notar, também, um adensamento da marcação nesta região se
comparado ao restante da célula (seta). Interessante notar que a célula adjacente
não apresenta marcação.
Figuras 54: Notar a presença partículas de FC (seta) no local de divisão celular,
indicando alteração de carga nesta região.
Figura 55: Imunolocalização da enzima nitrogenase. Notar marcação próxima aos
grânulos de PHB (seta).
Figura 56: Detalhe da imunolocalização da enzima nitrogenase no citoplasma
celular. Observe região próxima à membrana celular com adensamento de partículas
de ouro (cabeça de seta).
Figura 57: Interior citoplasmático de H. seropedicae evidenciando intensa marcação
para a enzima nitrogenase (setas).
111
52
55
57
56
53
54
0,15 µ
µµ
µm
0,15 µ
µµ
µm0,15 µ
µµ
µm
PHB
0,25 µ
µµ
µm
0,4 µ
µµ
µm
52
55
57
56
53
54
0,15 µ
µµ
µm
0,15 µ
µµ
µm0,15 µ
µµ
µm
PHB
0,25 µ
µµ
µm
0,4 µ
µµ
µm
112
6. CONCLUSÕES
- Foi possível evidenciar a ocorrência de grande concentração de partículas na
superfície externa da parede bacteriana de Herbaspirillum seropedicae e de
H. rubrisubalbicans.
- O aspecto externo da superfície celular das bactérias estudadas não variou
nas condições experimentais avaliadas (diferentes fontes de carbono e
favorecimento da fixação de N).
- O detalhamento estrutural dos grânulos de PHB permitiu verificar que H.
seropedicae e H. rubrisubalbicans apresentam grânulos de composição
diferenciada (homo e hetero polímeros).
- A composição dos grânulos de PHB variou nas condições experimentais
utilizadas, de acordo com o padrão de deformação apresentado pelos
mesmos.
- A presença de marcação para nitrogenase em domínios específicos do
citoplasma da bactéria H. seropedicae, associado à presença de
compartimentos citoplasmáticos ou estruturas membranares, indicam a
ocorrência de compartimentalização metabólica citoplasmática.
- A utilização de criotécnicas permitiu a observação de detalhes da
ultraestrutura dos sítios (micro-hábitats) ocupados por H. seropedicae
anteriormente não evidenciados em amostras fixadas quimicamente. Nestes,
verificamos o desaparecimento dos limites celulares entre as paredes
bacterianas e vegetais, a formação de estruturas na parede bacteriana, na
região de adesão à célula vegetal, formação de matriz fibrosa pela parede
celular vegetal que engloba as células bacterianas em formação.
- Foi verificada a presença de células de H. seropedicae no apoplasto e
xilemas foliares.
- A presença de agregados bacterianos organizados, envoltos por uma matriz
homogênea e de limites bem definidos, associados à expressiva marcação da
enzima nitrogenase, sugerem que este micro-hábitat é um sítio potencial para
fixação biológica de nitrogênio em interações endofíticas de Herbaspirillum e
cana-de-açúcar.
113
Acreditar estar sendo sincero não é tão perigoso quanto a convicção de que se está
com a razão. Todos nós achamos que a razão está conosco, mas há vinte anos
pensávamos a mesma coisa e, no entanto, hoje sabemos que nem sempre
estávamos certos.
Igor Straninsky
114
CAPÍTULO
III
ASPECTOS
ULTRA-ESTRUTURAIS
DE
Gluconacetobacter diazotrophicus
E
DE
SUA
INTERAÇÃO
COM
PLÂNTULAS
MICROPROPAGADAS
DE
CANA-DE-AÇÚCAR
(
VAR
.
RB72454)
115
1.
RESUMO
Diferentes estudos utilizando técnicas microbiológicas e microscópicas têm
demonstrado a associação predominantemente endofítica entre plantas da família
Poaceae e Gluconacetobacter diazotrophicus. Aspectos básicos desta associação,
como as vias de infecção e colonização da bactéria já são conhecidos, porém um
aprofundamento no conhecimento de suas bases estruturais, integrado aos estudos
genômicos e proteômicos de G. diazotrophicus e da cana-de-açúcar ainda são
incipientes. Avanços nesta área poderiam contribuir para a maximização do
potencial de promoção de crescimento dessa bactéria. Assim, o objetivo deste
trabalho foi caracterizar ultra-estruturalmente a interação da bactéria diazotrófica G.
diazotrophicus e plântulas de cana-de-açúcar cultivadas in vitro, por meio de
técnicas de microscopia associadas à criotécnicas. Foi realizada uma descrição
ultra-estrutural da inter-relação entre G. diazotrophicus e plântulas de cana-de-
açúcar (fase endofítica), que foram comparadas à ultra-estrutura desta bactéria,
após crescimento em meio de cultura (vida livre). As alterações ocorridas na
superfície externa das células de G. diazotrophicus indicam uma relação clara com
seu estado metabólico. A criofratura nas células crescidas em vida livre, na presença
ou ausência de fixação biológica de nitrogênio, possibilitou a visualização de
aspectos ultra-estruturais provavelmente relacionados ao metabolismo do carbono e
do nitrogênio. Estruturas citoplasmáticas semelhantes aos diazossomos foram
visualizadas sob condição de fixação de N
2
. O padrão de colonização de G.
diazotrophicus foi diferente do observado para H. seropedicae. Células de G.
diazotrophicus, quando no interior de tecidos de plântulas micropropagadas de cana-
de-açúcar (RB72454), apresentaram polimorfismo em diferentes sítios de
colonização, sendo possível a visualização de numerosas vesículas originárias da
parede celular vegetal em regiões do apoplasto. Além da formação de estruturas
similares a vesículas, foi verificada a presença freqüente de uma matriz entre a
parede celular vegetal e G. diazotrophicus em algumas regiões. Os detalhes ultra-
estruturais descritos neste trabalho, somados às recentes descobertas sobre os
compostos por este bactéria, sugerem a existência de diálogo bioquímico relativo ao
estabelecimento de uma interação tipicamente endofítica.
116
2. ABSTRACT
Different studies using microbiological and microscopic techniques have been
demonstrating the interaction predominantly endophytic between Poaceae plants and
Gluconacetobacter diazotrophicus. Basic aspects of this association, such as the way
of infection and colonization of the bacteria are already known, but there are
demands for more knowledge of its structural bases integrated to the genomic and
proteomic data from G. diazotrophicus and its association with sugarcane.
Progresses in this area could contribute to maximization of the potential of growth
promotion of these bacteria. The aim of this work was to characterize the ultra-
structure of the interaction between the diazotrophic bacteria G. diazotrophicus and
in vitro sugarcane plants. We used microscopic techniques associated with
cryotecniques. It was made an ultrastructural description of the interrelation between
G. diazotrophicus and sugarcane plantlets (endophytic phase), as compared to the
ultra-structure of this bacterium, growing in culture medium. Transmission electronic
microscopy (TEM) revealed structural changes at the bacterial/plant host cell wall
clearly related with metabolic state. Cryofracture perspectives allowed visualizing
different layers of the bacterial cells and its unique organization. Under contrasting
growth conditions, meaning growing in nitrogen fixation conditions or in its absence,
clear ultra-structural differences were obtained probably due to carbon and nitrogen
metabolism. Cytoplasmic structures similar to diazossomes were visualized in cells
grown under condition of N
2
-fixation. The pattern of colonization of G. diazotrophicus
was distinct from the observed for H. seropedicae. Cells of G. diazotrophicus within
micro-propagated sugar cane plantlets (var. RB72454) had shown polymorphic cells
in different colonization niches, providing the visualization of numerous vesicles-like
structures coming from plant cell wall and accumulating at the apoplast associated
bacteria. Besides the emission of vesicles we verified the presence of a well
frequently matrix between the G. diazotrophicus cells and some areas aside of the
plant cell wall surface. The described ultra-structural details suggest the existence of
biochemical dialogue that lead to a typical endophytic interaction.
117
3. INTRODUÇÃO
Baseados em características morfológicas, fisiológicas e bioquímicas
C
AVALCANTE
&
D
ÖBEREINER
(1988) descreveram um novo gênero denominado
Saccarobacter com a descrição de uma nova espécie denominada S. nitrocaptans.
Entretanto, a análise dos resultados obtidos com a homologia DNA:DNA e
hibridação rRNA demonstraram que esta bactéria apresentava características mais
próximas ao rRNA do gênero Acetobacter com muitas características similares a A.
liquefaciens. Sendo assim, esta bactéria foi incluída no gênero Acetobacter sendo
rebatizada de Acetobacter diazotrophicus (G
ILLIS
et al., 1989). Posteriormente,
baseados na seqüência do rDNA da subunidade 16S da produção de um tipo
predominante de ubiquinona, esta bactéria foi descrita como sendo
Gluconacetobacter diazotrophicus, (Y
AMADA
et al. 1997, 1998), pertencendo à sub-
classe α-Proteobacteria e a primeira identificada da família Acetobacteriaceae a fixar
N
2
.
Esta nova bactéria é capaz de crescer em um meio de cultura, cujos teores de
sacarose e pH são semelhantes aos encontrados na composição do caldo da cana-
de-açúcar (C
AVALCANTE
&
D
ÖBEREINER
, 1988). É caracterizada como Gram-negativa
e aeróbica, porém fixa N
2
em condições de micro-aerofilia (0,2 kPa) (R
EIS
&
D
ÖBEREINER
,
1998). Excreta uma boa quantidade de ácidos em seu metabolismo,
acarretando diminuição do pH (pH < 3,0), sem afetar a fixação N
2
(S
TEPHAN
et al.,
1991). Destaca-se pela capacidade de fixar N
2
na presença de concentrações de
nitrato superiores a 25 mM e não possuir a enzima redutase do nitrato, sendo
parcialmente inibida pela presença de amônia (especialmente em altas
concentrações de sacarose) e aminoácidos (R
EIS
et al., 1990; B
ODDEY
et al., 1991 e
S
TEPHAN
et al., 1991). Esta bactéria também tolera altas concentrações de sacarose
(até 25% com 10% sendo o ótimo) e apresenta colônias de coloração marrom em
placas de meio batata com 10% sacarose (D
ÖBEREINER
et al.,
1995a). C
OJHO
et al.
(1993) estudaram um sistema de cultivo desta bactéria com uma levedura e
observaram que cerca de 50% do N fixado por ela foi transferido para a levedura,
desde o início do crescimento da cultura, sendo este sistema de cultivo misto usado
como modelo para explicar a rápida transferência do N fixado pela bactéria para a
planta. Mais recentemente, C
RUZ
et al. (1995) determinaram a quantidade de NH
3
excretada por G. diazotrophicus em condições de fixação de N
2
.
118
Desde os trabalhos de D
ÖBEREINER
et al. (1990) se conhece que G.
diazotrophicus não sobrevive por longo tempo nos solos, sendo transferida por meio
dos toletes. Usando uma fusão de genes lac-Z, C
ARUSO
et al. (1995), observaram
que esta bactéria não pôde ser encontrada no solo dois dias após a inoculação,
embora sobreviva por até 10 dias em solo estéril. Esta bactéria também não foi
encontrada em plantas invasoras de canaviais (D
ÖBEREINER
et al., 1993), cujos
resultados foram confirmados utilizando-se um “primer” espécie-específico para a
detecção de G. diazotrophicus (R
EIS
et al., 1995). Apesar disto, B
ARBOSA
et al.
(1997) conseguiram re-isolar esta bactéria após pré-germinar toletes de cana-de-
açúcar de plantas oriundas de micropropagação após três e/ou 10 meses no campo.
Mais recentemente, O
LIVEIRA
et al. (2004) demonstraram que G. diazotrophicus
aumentou o seu período de culturabilidade na presença de umidade no solo.
Estudos iniciais da ocorrência deste diazotrófico mostraram que o mesmo
possuía poucos hospedeiros tendo sido principalmente encontrado em associação
com plantas ricas em açúcar como cana-de-açúcar, batata-doce e capim Cameroon,
todas apresentando propagação vegetativa (D
ÖBEREINER
, 1992). Esta bactéria
coloniza raízes, colmos e folhas de cana-de-açúcar em números de até 10
6
células
g
-1
de massa fresca ou mais (R
EIS
et al., 1994; B
ODDEY
et al., 1998; S
ILVA
, 1999 e
R
EIS
J
UNIOR
et al., 2000); em batata doce foi encontrado em números de até 10
5
células g
-1
peso da matéria fresca (P
AULA
et al., 1993). Fora do Brasil esta bactéria
foi encontrada na Austrália (L
I
&
M
AC
R
AE
, 1991; B
ODDEY
et al., 1998), México
(F
UENTES
-R
AMIREZ
et al., 1993), Cuba (D
ONG
et al., 1994), Argentina (B
ELLONE
et al.,
1997) e Índia (M
ADHAIYAN
et al., 2004). Todas estas características levaram ao
reconhecimento de seu caráter endófito obrigatório (B
ALDANI
et al., 1997), sendo o
seu estudo vital para a compreensão dos elevados ganhos de N pela cana-de-
açúcar (R
EIS
, 1994; B
ODDEY
et al., 1995).
Diversos estudos relataram o comportamento populacional de G.
diazotrophicus (L
I
&
M
AC
R
EI
, 1991; R
EIS
J
UNIOR
et al., 1995, S
ILVA
et al, 1995 e 1999)
e o processo de infecção e colonização (J
AMES
et al. 1994 e 2001) em variedades de
cana-de-açúcar. Nestes estudos foi evidenciado que as bactérias se concentraram
na superfície das paredes periclinais externas das raízes, ao redor da junção da raiz
lateral e na coifa. Dentro das raízes, a bactéria foi observada em células epidérmicas
aparentemente intactas, aumentadas, e também na base do colmo nos vasos
xilemáticos, por onde, aparentemente a bactéria migra para outros tecidos. A
119
confirmação de que G. diazotrophicus coloniza os espaços intercelulares do
parênquima cortical do colmo de cana-de-açúcar vem do trabalho de D
ONG
et al.
(1994) que mostrou a presença destas bactérias em números de 10
4
células mL
-1
em fluidos do apoplasto.
Os estudos descritos acima apontaram claramente as vias de
estabelecimento endofítico de G. diazotrophicus em plantas de cana-de-açúcar,
com ênfase na localização tecidual específica da bactéria utilizando marcadores
moleculares (J
AMES
et al.,1994; R
EINHOLD
-H
UREK
&
H
UREK
, 1998; R
ONCATO
-
M
ACCARI
et al., 2003). Entretanto, raros esforços têm sido realizados no sentido de
caracterizar a ultra-estrutura destas bactérias diazotróficas em diferentes
condições de crescimento, por exemplo, ex-planta e in-planta. Acrescenta-se a
isto, que com o término do seqüenciamento do genoma de G. diazotrophicus
diversos trabalhos surgiram com abordagens pós-genômicas (N
OGUEIRA
et al.,
2001; E
VARISTO
et al.,
2004; H
EMERLY
et al., 2004). Sendo assim, existe hoje uma
demanda urgente por investigações estruturais refinadas. Estas permitiriam, a
ampliação dos conhecimentos sobre as bases estruturais das interações
endofíticas e, inclusive, a localização específica de biomacromoléculas (i.e.
proteínas estruturais, enzimas, carboidratos, etc.) envolvidas nas diferentes etapas
da associação, tanto na planta hospedeira como na bactéria.
Uma das alternativas mais promissoras para estudar espécimes biológicos
passa pela fixação física por congelamento. B
ENCHIMOL
(1996) destaca que, dentre
outras vantagens, as criotécnicas se prestam para comparar dados estruturais
fornecidos pela fixação química tradicional; localizar antígenos, sítios metabólicos
específicos e receptores celulares e sub-celulares, bem como obter novas
informações a respeito da estrutura e subestrutura celulares.
Diante do exposto acima, os trabalhos que serão descritos a seguir tiveram
como objetivo a descrição dos aspectos da ultraestrutura de Gluconacetobacter
diazotrophicus e de sua interação com plantas de cana-de-açúcar. Para tanto, foram
utilizadas criotécnicas, como método de preparo de amostras, associados à
microscopia eletrônica, visando a possibilidade de evidenciar novos detalhes
estruturais finos e suas possíveis implicações com a funcionalidade desta
associação.
120
Sendo assim, os objetivos específicos perseguidos foram:
• Descrição ultra-estrutural de células de Gluconacetobacter diazotrophicus
observadas por criofratura convencional;
• Avaliação comparativa da ultra-estrutura de Gluconacetobacter diazotrophicus
crescida em meio de cultura, sob condições de fixação biológica de N
2
ou N-
orgânico;
• Descrição ultra-estrutural da inter-relação entre Gluconacetobacter
diazotrophicus e plântulas de cana-de-açúcar (fase endofítica).
121
4. MATERIAL E MÉTODOS
Todas as etapas abaixo foram desenvolvidas no Laboratório de Biologia
Celular e Tecidual do Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade
Estadual do Norte Fluminense.
Todos os experimentos realizados neste trabalho seguiram os protocolos já
descritos no capítulo anterior. A exceção fica por conta do meio de cultura utilizado
quando as células de G. diazotrophicus (Tabela 3) foram submetidas à condição de
fixação de nitrogênio. Para tanto, células crescidas em meio DYGS foram inoculadas
(alíquotas de 0,1 mL) em meio semi-sólido semi-específico LGI-P (C
AVALCANTE
&
D
ÖBEREINER
, 1988). Após a inoculação foram incubadas por 5 a 10 dias a 32 °C.
Para detalhamento dos métodos remetam-se ao item Material e Métodos do Capítulo
II.
Tabela 3: Origem e designação da estirpe bacteriana utilizada.
Nome Científico
Estirpes Origem Referências
Gluconacetobacter diazotrophicus
PAL5
(estirpe tipo)
∗
BR11281
♦
ATCC49037
#
LMG 7603
•
DSM 5601
Saccharum hyb.
Raiz,
Alagoas, Brasil
(
G
ILLIS
et al., 1989)
Y
AMADA
et al., 1998
Legenda:
∗
Embrapa Agrobiologia, Seropédica-RJ, Brasil.
♦
ATCC-American Type Culture
Collection, Manassas, Virginia, USA.
•
DSMZ-Deutsche SammLung von Mikroorganismen
und Zellkulturen GmbH, Braunschweing, Germany.
#
BCCM
/LMG-Bacteria Collection,
Universiteit Gent, Laboratorium voor Mikrobiologie, Gent, Bélgica.
Híbridos interespecíficos.
122
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Avaliação da Ultra-estrutura de Células de G. diazotrophicus em Diferentes
Condições de Crescimento em Meio de Cultura.
Estudos microscópicos envolvendo G. diazotrophicus têm dado ênfase à
descrição anatômica e estrutural da inter-relação desta bactéria com plantas de
cana-de-açúcar. Nestes trabalhos são destacados os eventos relacionados à
adesão, vias de infecção e estabelecimento da colonização endofítica. Apesar da
inestimável contribuição destes trabalhos, os resultados apresentados por eles têm-
se baseado na observação de amostras quimicamente fixadas (J
AMES
et al. 1994;
D
ONG
et al.,1997; F
UENTES
-R
AMIREZ
et al.,1999; J
AMES
et al., 2001).
Nos trabalhos aqui realizados foram avaliados detalhes ultra-estruturais desta
bactéria após crescimento em meio de cultura sob condições favoráveis, ou não, à
FBN e em associação com a planta hospedeira. Para tanto, as amostras foram
preparadas por meio de criotécnicas visando às avaliações microscópicas. As
potencialidades destes grupos de técnicas na preservação do material biológico têm
sido amplamente discutidas (S
TUDER
et al., 1989 e 2001; D
ELACROIX
, 1998;
M
ONAGHAN
et al., 1998; S
EMMLER
et al., 1998;
S
HIMONI
&
M
ULLER
,
1998; M
EYER
&
R
ICHTER
, 2001; F
ARTMANN
et al., 2003; G
IDDINGS
,
2003; H
ESS
, 2003; W
ALTHER
, 2003),
e invariavelmente têm permitido avanços no conhecimento sobre a estrutura de
diferentes organismos e suas associações (T
SEKOS
&
R
EISS
, 1993; F
UJIMOTO
et al.,
1996; S
OUTHWORTH
et al., 1997; S
UDESH
et al., 1999 e 2002(b); M
ORAES
N
ETO
et al.,
2001; M
IMS
et al., 2002 e 2003; M
ÜLLER
-R
EICHERT
et al., 2003; P
FEIFER
et al., 2003;
Z
AMPHIGH
et al., 2003; R
OSTAING
et al., 2004).
Uma visão geral das réplicas, obtida após a criofratura de G. diazotrophicus
estirpe PAL5, revelou que a forma e as dimensões da bactéria são similares àquelas
obtidas por outros métodos microscópicos (J
AMES
et al.,1994 e 2000). Entretanto,
aspectos ultra-estruturais anteriormente não revelados da organização da parede
celular desta bactéria puderam ser constatados. Após crescimento em meio de
cultura DYGS líquido (Fix- ;malato e glicose como fonte de carbono) pode-se
verificar, em réplicas Pt/C obtidas por criofratura, que a parede celular desta bactéria
exibiu aspecto ondulado (Figuras 1 a 5). , sendo possível a visualização de reduzido
número de partículas. Este aspecto externo ondulado da parede bacteriana e o
123
baixo número de partículas observado se apresentam totalmente diferente do
observado em células de H. seropedicae (HRC54) e H. rubrisubalbicans (HCC103)
crescidas neste mesmo meio (ver Resultados e Discussão do Capítulo II).
Deve ser destacado que quando G. diazotrophicus cresceu sob condições de
fixação de N
2
(Fix +; sacarose como fonte de carbono), o aspecto ondulado da
superfície da parede não foi observado (Figuras 10 a 15). Este padrão diferenciado,
que aparentemente dependente das condições do meio de crescimento, não foi
constatado para as bactérias do gênero Herbaspirillum. Reconhecendo, nesta
situação, que o metabolismo de carbono e nitrogênio poderiam estar relacionados a
este fenômeno, diferentes fontes de N e C, alterariam qualitativamente e
quantitativamente o pool de proteínas estruturais e funcionais de G. diazotrophicus
e, conseqüentemente, sua aparência superficial. Como esta bacteria não utiliza
diretamente a sacarose, a atividade sacarolítica da invertase, secretada por esta
bactéria (S
TEPHAN
et al., 1991), poderia estar relacionada a esta alteração da
superfície celular. Este aspecto metabólico, associado à baixa concentração de
oxigênio do meio semi-sólido, que favorece a atividade da nitrogenase, podem estar
diretamente relacionados à alteração da superfície bacteriana.
E
VARISTO
et al. (2004) avaliando o perfil protéico de G. diazotrophicus em
diferentes condições nutricionais, demonstraram que em células crescidas em meio
DYGS, a concentração e o número de proteínas extraíveis totais foram
marcadamente superiores aos obtidos em meio LGI-P. Ainda neste trabalho, cerca
de 50 proteínas exclusivamente expressas em células crescidas em meio DYGS,
foram obtidas em gel bidimensional. Hipoteticamente, um grupo de proteínas que
podem ser diferencialmente expressas são as responsáveis pela utilização da
sacarose (i.e. levansucrose, diferentes isoformas de sacarases, invertases) ou
enzimas que catalisem o processo de oxidação da glicose a ácido glucônico, e
outras relacionadas à via das pentoses-fosfato.
Por razões desconhecidas, observou-se que a parede e a membrana
plasmática das células de G. diazotrophicus se mostraram mais suscetíveis à fratura
do que as do gênero Herbaspirillum. Para G. diazotrophicus, as imagens obtidas da
observação das réplicas Pt/C revelaram as faces de todos os folhetos Pudemos
observar a face interna da parede bacteriana, as duas faces dos folhetos que
compõem a membrana celular e parte do citoplasma. Além disso, várias inclusões e
prováveis invaginações da membrana citoplasmática também foram observadas
124
(Figuras 1 e 2; 6 a 9; 16 a 18). A concentração de partículas presentes em ambas as
faces expostas da parede é pequena, sem a presença de um padrão aparente de
distribuição (Figuras 1 a 5 e 9 a 15) ocorrendo, ainda, na face E da membrana
plasmática.
Maior freqüência de células em divisão celular foi notada para G.
diazotrophicus em relação à Herbaspirillum spp.. De fato, foi possível observar, em
alguns casos, detalhes desta região em que a parede bacteriana apresentou um
aspecto superficial diferenciado (Figuras 3, 4 e 8). Em células crescidas sob
condição de FBN foi possível, inclusive, a visualização de partículas enfileiradas na
região de estrangulamento entre as duas células (Figura 8), o que pode indicar a
participação das mesmas no processo de divisão celular.
Com relação ao compartimento citoplasmático, diferentemente do que ocorre
para bactérias de outros gêneros (i.e. Rhizobium, Azospirillum e Herbaspirillum) esta
bactéria não apresenta como estrutura de reserva grânulos de PHB/PHA
(C
AVALCANTE
&
D
ÖBEREINER
, 1988; G
ILLIS
et al., 1989; A
TTWOOD
et al, 1991; S
TEPHAN
et al.,
1991;
F
ONTAINE
et al., 1995; A
RRIETA
et al., 1996; P
REVIATO
et al., 1998; R
EIS
&
D
ÖBEREINER
, 1998; Y
AMADA
et al., 1997, 1998;
H
ERNÁNDEZ
et al., 1999; M
ENÉNDEZ
et
al., 2004). Apesar disto, puderam ser observadas, em várias células, invaginações
de membrana, e até de forma surpreendente, compartimentos intracitoplasmáticos
semelhantes a vesículas, com aspecto e forma variáveis, localizadas em regiões
periféricas do citoplasma (Figuras 1 e 2; 6 a 9; 16-19; 22 e 23). Nestas estruturas,
nota-se a presença de partículas associadas à superfície das mesmas.
Na grande maioria das células observadas, o citoplasma se apresentou com
aspecto granular homogêneo (Figuras 1 a 9 e 12 a 18). Apesar disto, foi possível a
observação de regiões totalmente desprovidas de partículas e a existência das
mesmas associadas às estruturas vesiculares (Figuras 9, 17 e 19). Este aspecto
ultra-estrutural pode estar relacionado a uma segregação de funções metabólicas
realizadas no citoplasma bacteriano. Apesar dos organismos procariontes não
apresentarem organelas, onde funções metabólicas possam ser realizadas de forma
mais eficiente, não significa que as mesmas não tenham evolutivamente
“compartimentalizado” a realização de alguns processos metabólicos.
S
TUART
& N
EUPERT
(2000) destacam que em bactérias Gram-negativas
diversas enzimas podem ser tanto produzidas como estocadas no espaço
periplásmico (espaço entre a parede e a membrana plasmática), antes de serem
125
exocitadas, além da ocorrência de uma gama de processos metabólicos nesta
região. Portanto, as estruturas aqui visualizadas podem estar relacionadas a estes
processos. Por outro lado, mecanismos de proteção ao oxigênio relacionados à
FBN, ocorridos quando esta bactéria cresceu no meio semi-sólido LGI-P sem
nitrogênio, poderiam contribuir para os diferentes padrões ultra-estruturais
observados pelas células de G. diazotrophicus.
Ao observarmos a Figura 19 notamos uma região no citoplasma com aspecto
listrado. Esta região pode vir a ser a mesma observada em células de G.
diazotrophicus crescidas sob condição de fixação de nitrogênio (Figuras 20 e 21) e
estar associada a uma organização de proteínas (p. ex. nitrogenase) ligadas ao
processo de fixação de nitrogênio. De fato, uma organização em forma de listras
e/ou fileiras foi observada por nós em células de H. seropedicae (Z67) igualmente
crescidas sob condição de fixação (Figuras 56 e 57 do Capítulo II). Estes dois
ensaios de imunolocalização foram realizados em cortes obtidos de células de
ambas as espécies crescidas sob condições de fixação de nitrogênio. Como
mencionado no Capítulo anterior, estes resultados podem estar sugerindo um
arranjo específico de enzimas nitrogenases, quando efetivamente ativas. No caso de
também confirmado este arranjo para G. diazotrophicus teríamos, então o terceiro
relato da existência de sítios para a nitrogenase na forma ativa. O primeiro relato de
estruturas subcelulares relacionadas à fixação biológica de nitrogênio bacteriana foi
realizado por H
UREK
et al. (1995) com relação à observações realizadas na bactéria
Azoarcus sp. BH72, isolada da gramínea Kallar grass. Estes autores relacionaram a
formação do complexo membranar intracitoplasmático possam estar relacionados a
uma estratégia de proteção contra o gás O
2
. Assim como em nossas observações,
estes complexos somente foram encontrados em células em estado de fixação de N
2
ativa.
126
Legenda: Observação da superfície celular de G. diazotrophicus criofraturadas após
crescimento em meio DYGS em condições de não fixação de nitrogênio. Notar em
todas as células o aspecto ondulado da superfície externa da parede celular
bacteriana. Observações realizadas em microscopia eletrônica de transmissão.
Figura 1: Notar que o plano de fratura expôs parte do citoplasma (c). Neste
encontra-se uma região que parece indicar a existência de porção diferenciada na
periferia do citoplasma (seta). A concentração de partículas encontra-se reduzida em
ambas as faces expostas, apesar da existência de pequena concentração das
mesmas na membrana celular bacteriana (cabeça de seta).
Figura 2: O plano de fratura expôs as faces interna e externa da parede celular
bacteriana. Notar em ambas a presença de aspecto ondulado da estrutura e a baixa
concentração de partículas. Presença de estrutura vesicular na periferia do
citoplasma (seta).
Figura 3: O plano de fratura indica estado de divisão celular. Notar região de
estrangulamento entre as duas células com aspecto superficial diferenciado (seta).
fe – face interna do folheto externo da membrana celular.
Figura 4: Célula de G. diazotrophicus em divisão celular. Notar a manutenção de
intercomunicação das duas células no interior celular (seta).
Figura 5: Plano de fratura evidenciando o citoplasma bacteriano. Notar regiões de
organização diferenciada próximas à periferia da célula (setas).
127
0.25 µm
0.25 µm
0.15 µm
0,25 µm
0,15 µm
1
4
3
5
2
pb
c
pb
pb
pb
fe
c
pb
pb
c
0.25 µm
0.25 µm
0.15 µm
0,25 µm
0,15 µm
1
4
3
5
2
pb
c
pb
pb
pb
fe
c
pb
pb
c
128
Legenda: Observação da superfície celular de G. diazotrophicus criofraturadas após
crescimento em meio DYGS em condições de não fixação de nitrogênio. Notar a
superfície lisa da parede celular em todas as células bacterianas. Observação
realizada em microscopia eletrônica de transmissão.
Figuras 6 e 7: O plano de fratura evidenciou a existência de estrutura em forma de
vesícula (seta) na região periférica das células. pb – parede celular bacteriana.
Figuras 8: Célula de G. diazotrophicus em divisão. O plano de fratura evidenciou a
existência de estrutura em forma de vesícula (setas) que parece estar tanto
relacionada à membrana celular quanto ao citoplasma. Notar enfileiramento de
partículas na região de divisão celular na figura em destaque (cabeças de seta).
Figuras 9: O plano de fratura evidenciou a existência de estrutura em forma de
vesícula na região periférica das células. Notar a presença de partículas associadas
à mesma (setas). pb – parede celular bacteriana, c – citoplasma.
129
0,15 µ
µµ
µm
0,15 µ
µµ
µm
0,15 µ
µµ
µm
0,15 µ
µµ
µm
0,15 µm
6
9
9
8
7
pb
pb
pb
pb
c
c
c
c
0,15 µ
µµ
µm
0,15 µ
µµ
µm
0,15 µ
µµ
µm
0,15 µ
µµ
µm
0,15 µm
6
9
9
8
7
pb
pb
pb
pb
c
c
c
c
130
Legenda: Observação de G. diazotrophicus criofraturadas após crescimento em
meio LGI-P semi-sólido em condições de fixação de nitrogênio. Notar em todas as
células o desaparecimento do aspecto ondulado da superfície externa da parede
celular bacteriana. Observação realizada em microscopia eletrônica de transmissão.
Figura 10: Superfície externa da parede bacteriana (pb) de G. diazotrophicus. Notar
a baixa freqüência de partículas na mesma.
Figuras 11 e 14: Regiões da parede celular bacteriana (pb) onde pode ser
observada uma maior freqüência de partículas. Notar aspecto estrutural diferenciado
(setas pequenas). c – citoplasma.
Figura 12: Superfície externa da parede celular bacteriana onde podem ser
observadas duas regiões distintas de fratura que permitem a visualização do interior
celular (setas).
Figura 13: Célula de G. diazotrophicus onde pode ser observada parte da parede
celular bacteriana (pb).. Observar a diferença de concentração de partículas nas
faces expostas. fcpb - face citoplasmática da parede bacteriana;c – citoplasma; fi –
face citoplasmática da membrana celular.
Figura 15: Célula de G. diazotrophicus onde pode ser observada a parede celular
bacteriana (pb) e o interior citoplasmático (c).
131
0,15 µ
µµ
µm
0,05 µ
µµ
µm
0,15 µ
µµ
µm
0,25 µ
µµ
µm
0,15 µ
µµ
µm
0,09 µ
µµ
µm
10
15
14
13
12
11
pb
pb
pb
c
c
pb
pb
fi
fcpb
pb
c
c
0,15 µ
µµ
µm
0,05 µ
µµ
µm
0,15 µ
µµ
µm
0,25 µ
µµ
µm
0,15 µ
µµ
µm
0,09 µ
µµ
µm
10
15
14
13
12
11
pb
pb
pb
c
c
pb
pb
fi
fcpb
pb
c
c
132
Legenda: Observação da superfície celular de G. diazotrophicus criofraturadas após
crescimento em meio LGI-P semi-sólido em condições de fixação de nitrogênio.
(parede – pb; fcm – face citoplasmática da membrana; fcpb – face citoplasmática da
parede bacteriana; c – citoplasma).
Figura 16: Célula de G. diazotrophicus onde foram evidenciadas as regiões
envolvidas com o envoltório celular. Notar que o citoplasma celular apresenta
aspecto homogêneo.
Figuras 17: Células de G. diazotrophicus com estruturas em forma de vesículas na
região periférica do citoplasma onde podemos observar regiões do mesmo sem a
presença de partículas (asterisco). Notar partículas associadas às vesículas (setas).
Figura 18: Região do citoplasma (c) bacteriano onde podem ser observadas a
presença de vesículas.
Figura 19: Região do citoplasma (c) bacteriano onde podem ser observadas a
presença de vesículas (asterisco). Notar região do citoplasma sem a presença de
partículas () e a existência das mesmas associadas às estruturas vesiculares.
Destaque para região com aspecto listrado (setas).
Figuras 20 e 21: Células de G. diazotrophicus crescidas em condição de fixação de
nitrogênio. Notar estruturas tipo membranas no citoplasma celular (setas).
Figuras 22 e 23: Células de G. diazotrophicus com estruturas em forma de
vesículas na região periférica do citoplasma (setas).
133
0,15 µm
0,15 µm 0,15 µm
0,09 µ
µµ
µm
0,15 µm
0,15 µm
0,09 µm
0,09 µm
16
23
22
19 21
20
18
17
pb
c
fcm
fcpb
fcpb
c
c
c
pb
pb
c
fcpb
c
fcpb
pb
c
pb
c
*
*
*
0,15 µm
0,15 µm 0,15 µm
0,09 µ
µµ
µm
0,15 µm
0,15 µm
0,09 µm
0,09 µm
16
23
22
19 21
20
18
17
pb
c
fcm
fcpb
fcpb
c
c
c
pb
pb
c
fcpb
c
fcpb
pb
c
pb
c
*
*
*
134
5.2. Avaliação da Ultra-estrutura de Células de G. diazotrophicus em Interação
com Plântulas Micropropagadas de Cana-de-Açúcar
Plântulas de cana-de-açúcar micropropagadas e inoculadas com G.
diazotrophicus foram fixadas fisicamente pela técnica de “High Pressure Freezing” e
pós-fixadas por “Freezer Substitution”. Analisando-se as amostras de raízes, obtidas
sete dias após a inoculação, constatou-se a presença desta bactéria colonizando
endofiticamente os tecidos e os espaços intercelulares de células do parênquima
cortical (Figuras 24 a 30). As bactérias nesta região ocorreram como células isoladas
ou agregados discretos, envoltos por uma matriz fibrilar eletron-densa ou uma matriz
homogênea, com algumas bactérias em estado de divisão celular (Figuras 24, 26 e
31).
Diferente do observado na colonização por células de Herbaspirillum spp.,
onde os eventos de adesão foram bastante característicos, G. diazotrophicus não
estabeleceu contato direto com a parede celular da planta hospedeira nos meatos
celulares, estando preferencialmente associada à matriz presente no apoplasto
(Figuras 24 a 30). Foram observadas células que parecem estar iniciando o
processo de penetração na matriz (Figuras 32 e 33). Em outros locais também foi
possível a visualização de bactérias já imersas em ampla camada de matriz em
região contígua à parede celular vegetal (Figura 35). Neste sítios, grande número de
estruturas circulares associadas à parede foram observadas, sugerindo um
transporte ativo do conteúdo citoplasmático, a partir da parede celular (Figura 24 e
25). Estas estruturas similares a vesículas podem ser uma resposta da célula
vegetal à presença do microrganismo, e vice-versa, e estar relacionada a
mecanismos de secreção tipo III (S
PERANDIO
et al., 1999; B
ÜTTNER
&
B
ONAS
, 2002;
P
RESTON
et al., 2001; R
OMANTSCHUCK
et al., 2001).
Notou-se em algumas situações uma divisão celular orientada, associada à
disposição das bactérias aos pares ao longo da parede celular vegetal (Figuras 24
detalhe, 27 e 33). Este padrão repetitivo de orientação pode estar relacionado a
processos de sinalização envolvendo mecanismos de “quorum-sensing”. Neste caso,
as células podem estar se organizando desta forma como resultado de um diálogo
químico entre as mesmas (S
URETTE
&
B
ASLER
, 1998; W
HITHERS
&
N
ORDSTRÖN
, 1998;
B
ASSLER
, 1999; S
URETTE
et al., 1999; O
TTO
et al., 1999; S
PERANDIO
et al., 1999;
DE
K
IEVIT
et al., 2001; W
HITEHEAD
et al., 2001; F
RAY
, 2002; M
ITSUMORI
et al., 2003).
135
Em adição, células de G. diazotrophicus no ambiente endofítico apresentaram
alto grau de polimorfismo, o que não foi observado para as bactérias obtidas nas
condições de crescimento utilizadas neste trabalho. Por outro lado, levando-se em
conta as observações de M
UTHUKUMARASAMY
et al. (2002) - que constataram a
ocorrência de polimorfismo após o crescimento em meio LGI-P [25 mM de nitrato de
amônio] - a ocorrência deste em células de G. diazotrophicus em ambiente
endofítico pode estar relacionada à concentração diferenciada de compostos
nitrogenados oriundos da FBN nestes micro-hábitats.
Foram igualmente observados agregados bacterianos associados à superfície
externa das células da epiderme radicular. Esses agregados estavam envoltos por
uma tênue nuvem eletron-densa, e associados a inúmeras estruturas não
identificadas (Figuras 36 e 37). Estas estruturas se parecem com “fitas” elétron-
densas com aparência similar a membranas biológicas dispostas umas sobre as
outras (Figuras 39 a 42). Nestes agregados, observamos também, uma
estratificação na disposição das bactérias, com inúmeras células com aspecto não
característico ao das células de G. diazotrophicus (Figuras 36, 37 e 41). Embora não
possamos descartar a hipótese de contaminação do sistema com outros
microrganismos, devemos igualmente considerar a possibilidade de que o
polimorfismo seja uma resposta da organização da colônia bacteriana. Interessante
ressaltar que F
UENTES
-R
AMIREZ
et al. (1999) estudando a habilidade de G.
diazotrophicus em colonizar plantas de cana de açúcar utilizando bactérias
marcadas com β-glucoronidase (GUS), relataram ter encontrado bactérias
morfologicamente diferentes de G. diazotrophicus.
136
Legenda: G. diazotrophicus (Pal5) colonizando tecidos de raízes de plântulas
micropropagadas de cana-de-açúcar (var. RB72454). Amostras obtidas sete dias
após a inoculação e submetidas ao processo de fixação física por congelamento à
alta pressão/criosubstituição. Observações realizadas em microscopia eletrônica de
transmissão.
Figura 24: Colonização de G. diazotrophicus no espaço intercelular, onde é possível
observar a intensa formação de vesículas (v) a partir da parede celular vegetal
adjacente. Presença de polimorfismo celular bacteriano. Verificar no detalhe células
em aparente divisão celular (setas).
Figura 25: Detalhe de outra região apoplástica colonizada por G. diazotrophicus.
Observar matriz adjacente à região de formação das vesículas onde ocorre a
presença bacteriana (asterisco).
Figura 26: Célula de G. diazotrophicus em aparente estado de divisão celular. Note
a aparente polarização celular e o início da formação vesicular a partir da parede
(seta).
Figura 27: Células de G. diazotrophicus próximas à parede celular vegetal. Notar
que além da presença de vesículas pode ser observada a presença de dois tipos
diferentes de matrizes. Uma mais homogênea (asterisco), similar às observadas na
figura 28, e outra próxima à parede (estrela).
Figura 29: Célula de G. diazotrophicus em contato com vesícula. Notar aspecto
alongado da célula.
Figura 30: Célula de G. diazotrophicus entre duas paredes celulares vegetais. Notar
a presença de vesículas e de matriz diferenciada a partir da parede vegetal e
adjacente à célula bacteriana e vesículas.
137
1,7 µm
0,25 µm
0,4 µm0,09 µm
0,25 µm
0,25 µm
0,25 µm
0,25 µm
24
30
29
28
26
25
27
*
*
v
v
v
v
v
*
*
pcv
pcv
pcv
pcv
pcv
v
v
v
v
v
*
pcv
b
b
b
b
1,7 µm
0,25 µm
0,4 µm0,09 µm
0,25 µm
0,25 µm
0,25 µm
0,25 µm
24
30
29
28
26
25
27
*
*
v
v
v
v
v
*
*
pcv
pcv
pcv
pcv
pcv
v
v
v
v
v
*
pcv
b
b
b
b
138
Legenda: G. diazotrophicus (Pal5) colonizando tecidos de raízes de plântulas
micropropagadas de cana-de-açúcar (var. RB72454). Amostras obtidas sete dias
após a inoculação e submetidas ao processo de fixação física por congelamento à
alta pressão/criosubstituição. Observações realizadas em microscopia eletrônica de
transmissão.
Figura 31: Células de G. diazotrophicus próximas à parede celular vegetal (pcv).
Notar células em divisão e polarização celular nas mesmas (setas).
Figura 32: Detalhe de uma célula de G. diazotrophicus em contato com matriz
(asterisco) adjacente à parede celular vegetal.
Figura 33: Células de G. diazotrophicus em contato e imersas em matriz como a
visualizada na figuras 31 e 32. Observar os pares de células ao longo da parede
(setas). Presença de material elétron-denso entre as paredes próximas à
colonização bacteriana.
Figura 34: Células de G. diazotrophicus (
G
) enfileiradas em região adjacente à
parede celular vegetal. Presença de material elétron-denso sobre a parede oposta à
colonização (setas).
Figura 35: Células de G. diazotrophicus (
G
) imersas em ampla camada de matriz em
região contígua à parede celular vegetal.
139
0,25 µm
0,09 µm
0,4 µm
0,4 µm
1,1 µm
31
33
34
35
32
pcv
pcv
*
pcv
pcv
*
*
G
G
G
*
pcv
G
G
G
0,25 µm
0,09 µm
0,4 µm
0,4 µm
1,1 µm
31
33
34
35
32
pcv
pcv
*
pcv
pcv
*
*
G
G
G
*
pcv
G
G
G
140
Legenda: G. diazotrophicus (Pal5) colonizando a parede periclinal externa da
epiderme radicular de plântulas micropropagadas de cana-de-açúcar (var.
RB72454). Amostras obtidas sete dias após a inoculação e submetidas ao processo
de fixação física por congelamento à alta pressão/criosubstituição. Observações
realizadas em microscopia eletrônica de transmissão.
Figura 36: Numerosas células de G. diazotrophicus formando biofilme sobre a
superfície das paredes periclinais externas da epiderme radicular. Notar a presença
de estrutura não identificada imersa no biofilme (seta) e adjacente às células. Parede
celular com regiões mais elétron-densas (ed). Na face oposta da parede verifica-se a
presença de região que pode indicar a formação de vesícula (cabeça de seta).
Figura 37: Detalhe de região do biofilme onde se verifica que as células se
encontram imersas em matriz com aspecto fibrilar (asterisco). Notar aspecto frágil
das células e região elétron-densa da parede celular vegetal (ed).
Figuras 38, 39 e 40: Presença de biofilme bacteriano na superfície das paredes
periclinais externas da epiderme da raiz. Notar regiões elétron-densas (ed) na
parede celular e a presença de vesículas intensamente elétron-densas (asterisco
branco). Material fibrilar é encontrado em meio às células que compõem o biofilme
(setas).
Figuras 41 e 42: Detalhes de regiões do biofilme evidenciando a presença de
material fibrilar em meio às células (seta).
141
2,5 µm
0,4
µ
m
0,4 µm
1,1 µm
0,4 µm
0,4
µ
m
1,7 µm
0,25 µm
36
42
41
40
38
37
39
pcv
pcv
pcv
*
pcv
pcv
ed
ed
ed
*
ed
ed
ed
ed
ed
ed
2,5 µm
0,4
µ
m
0,4 µm
1,1 µm
0,4 µm
0,4
µ
m
1,7 µm
0,25 µm
36
42
41
40
38
37
39
pcv
pcv
pcv
*
pcv
pcv
ed
ed
ed
*
ed
ed
ed
ed
ed
ed
142
CONCLUSÕES
- A ocorrência de ondulações na superfície externa das células de G.
diazotrophicus quando em condições de não-fixação de N em presença de
glicose indicam uma relação clara com o estado metabólico das mesmas.
- As células de G. diazotrophicus se apresentaram mais susceptíveis à fratura
de seu sistema de revestimento.
- A utilização de criofratura nas células crescidas em vida livre sob condições
Nfix +/- possibilitou a visualização de aspectos ultra-estruturais provavelmente
relacionados ao metabolismo do carbono/nitrogênio.
- Estruturas citoplasmáticas semelhantes aos denominados diazossomos
podem ser visualizadas em células de G. diazotrophicus crescidas sob
condição de fixação de N.
- O padrão de colonização de G. diazotrophicus se apresenta diferente do
observado para H. seropedicae.
- Células de G. diazotrophicus quando no interior de tecidos de plântulas
micropropagadas de cana-de-açúcar (RB72454) apresentam polimorfismo em
diferentes sítios de colonização.
- É possível a visualização de numerosas vesículas originárias da parede
celular vegetal em regiões do apoplasto colonizadas por G. diazotrophicus.
- É possível a constatação da ocorrência de uma matriz entre a parede e as
células de G. diazotrophicus em algumas regiões. Células de G.
diazotrophicus parecem ter habilidade metabólica para penetrar nesta matriz
em direção à parede celular vegetal.
143
“Estou sempre mudando, porque só se pára quando se morre.
A evolução, a mudança, isso é o natural da vida.
“Porém, não se pode esquecer que existe também uma constante de estabilidade
sem a qual as transformações não podem ocorrer.”
Maurice-Jean Berger
Maurice Béjart
tt
t
144
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A pesquisa na área da Fixação Biológica de Nitrogênio (FBN) em Gramíneas
no Brasil iniciou-se há mais de 40 anos sob a liderança da pesquisadora Johanna
Döbereiner. Um dos fatos importantes nestas pesquisas foram as descobertas,
dentre outras, das bactérias endofíticas Herbaspirillum seropedicae, H.
rubrisubalbicans, Gluconacetobacter diazotrophicus, utilizadas nos trabalhos
realizados nesta tese. O papel destas bactérias diazotróficas em associação com as
gramíneas tem sido estudado e muito se avançou sobre os aspectos ecológicos,
fisiológicos, bioquímicos e genéticos.
Dentre estes avanços podemos destacar um melhor entendimento dos
mecanismos de colonização e infecção dos tecidos vegetais, além da determinação
da contribuição da FBN para o sistema solo-planta. Estudos de inoculação com
bactérias diazotróficas, têm mostrado que as bactérias endofíticas apresentam um
maior potencial para a promoção do crescimento vegetal e que o genótipo da planta
influencia no sucesso da associação da planta/bactéria.
Neste sentido, o sistema monoxênico testado neste trabalho permitiu o
estabelecimento sustentável de uma interação de longa duração entre a planta e a
bactéria, o que pode permitir sua utilização em estudos futuros, como, por exemplo,
os que se referem ao entendimento e manipulação dos agentes envolvidos na
interação endofítica. Os nossos resultados, obtidos neste sistema, demonstraram a
ocorrência do estabelecimento de uma população metabolicamente ativa das
bactérias diazotróficas em plântulas de cana-de-açúcar. Esta população
estabelecida foi capaz de gerar a promoção de crescimento das plântulas, além de
reduzir a taxa de mortalidade. A constatação de que as diferentes estirpes de G.
diazotrophicus e Herbaspirillum spp. apresentaram comportamento diferenciado com
relação ao incremento das características de crescimento avaliadas podem servir de
subsídio numa futura utilização destas bactérias como inóculos.
Face o exposto acima, estudos que evidenciem a estrutura das células
bacterianas e vegetais, além da interação destas bactérias nos tecidos da cana-de-
açúcar são extremamente valiosos. Neste trabalho revelamos aspectos relacionados
às alterações das superfícies das células; à composição e estrutura de
compartimentos intracelulares e/ou moléculas envolvidas com o metabolismo
145
energético (p.ex. grânulos de PHA/PHB); a localização da enzima nitrogenase em
domínios específicos do citoplasma bacteriano (possível ocorrência de
diazossomos); a localização de compartimentos citoplasmáticos ou estruturas
membranares que indicam a ocorrência de compartimentalização metabólica
citoplasmática; detalhamento da ultraestrutura dos sítios (micro-hábitats) ocupados
pelas bactérias (p.ex.: o aparente desaparecimento dos limites celulares entre as
paredes bacterianas e vegetais e a formação de estruturas na parede bacteriana, na
região de adesão à célula vegetal); formação de matriz fibrosa pela parede celular
vegetal que engloba as células bacterianas; a presença de agregados bacterianos
organizados, envoltos por uma matriz homogênea e de limites bem definidos.
Cremos que os resultados encontrados neste trabalho poderão ajudar no avanço de
um maior entendimento e exploração destas associações endofíticas.
No presente momento parece prematuro a utilização de inóculos com estas
bactérias visando à promoção de crescimento em escala comercial. Porém, com a
continuidade dos estudos estruturais, juntamente com os resultados obtidos nos
programas de seqüenciamento do genoma (RIOGENE - Gluconacetobacter
diazotrophicus e GENOPAR - Herbaspirillum seropedicae) o objetivo de se converter
este potencial numa prática padrão de inoculação deve ser alcançado em breve.
Esperamos ter contribuído um pouco para isto.
146
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