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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS
MESTRADO EM PATOLOGIA TROPICAL
ESTUDO COMPARATIVO ENTRE TÉCNICAS PARA
AVALIAÇÃO DE ATIVIDADES ANTIOXIDANTES DE
ESPÉCIES DE PLANTAS DA AMAZÔNIA
FABIANO DE SOUSA VARGAS
MANAUS
2008
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS
MESTRADO EM PATOLOGIA TROPICAL
FABIANO DE SOUSA VARGAS
ESTUDO COMPARATIVO ENTRE TÉCNICAS PARA
AVALIAÇÃO DE ATIVIDADES ANTIOXIDANTES DE
ESPÉCIES DE PLANTAS DA AMAZÔNIA
Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado
em Patologia Tropical da Universidade Federal do
Amazonas, como requisito para a obtenção do título
de Mestre.
Orientador: Profº Dr. Emerson Silva Lima
MANAUS
2008
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Ficha Catalográfica
(Catalogação realizada pela Biblioteca Central da UFAM)
V297e
Vargas, Fabiano de Sousa
Estudo comparativo entre técnicas para avaliação de
atividades antioxidantes de espécies de plantas da Amazônia /
Fabiano de Sousa Vargas. - Manaus: UFAM, 2008.
103 f.; il.
Dissertação (Mestrado em Patologia Tropical) ––
Universidade Federal do Amazonas, 2008.
Orientador: Prof
o
. Emersom Silva Lima, D.Sc.
1. Antioxidantes 2. Plantas – Amazônia - Utilização 3.
Plantas medicinais - Amazônia I. Lima, Emerson Silva II.
Universidade Federal do Amazonas III. Título
CDU 633.88(811.3)(043.3)
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FABIANO DE SOUSA VARGAS
ESTUDO COMPARATIVO ENTRE TÉCNICAS PARA
AVALIAÇÃO DE ATIVIDADES ANTIOXIDANTES DE
ESPÉCIES DE PLANTAS DA AMAZÔNIA
Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado
em Patologia Tropical da Universidade Federal do
Amazonas, como requisito para a obtenção do título
de Mestre.
Aprovada em 29 de julho de 2008.
BANCA EXAMINADORA
Profº. Dr. Emerson Silva Lima Presidente.
Universidade Federal do Amazonas
Profº. Dr. Adrian Martin Pohlit, Membro.
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
Profª. Dr. Maria Meneses Pereira, Membro.
Universidade Federal do Amazonas
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"Dedico este trabalho a minha
querida família, pois ela foi a maior
incentivadora para a realização
deste trabalho..."
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AGRADECIMENTOS
- A Deus, pela saúde que me permitiu realizar este trabalho e todas as outras façanhas.
- Aos meus pais e minha querida irmã, por todo o apoio e pelos conselhos fundamentais que
me mantiveram na linha.
- A minha esposa Gisele por todo o apoio e credito dados a mim, mesmo nas horas mais
difíceis.
- A minha filha, Isadora, pelo seu sorriso único que me acorda pelas manhãs.
- Ao meu orientador, Doutor Emerson Silva Lima, pela forma singular em compartilhar todo
seu conhecimento com quem busca o saber e por sua imensurável capacidade para pesquisa.
- A todos os amigos e funcionários do Laboratório de Estresse Oxidativo e Aterogênese da
Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Amazonas pelo convívio
harmonioso e espírito de grupo.
- Aos professores e colegas do programa de Mestrado em Patologia Tropical que contribuíram
muito para o meu aprimoramento intelectual e pelas novas e maravilhosas amizades
adiquiridas.
- À UFAM e CNPq que financiaram e forneceram a estrutura para a realização deste estudo.
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"Quando o Senhor está no
comando tudo dá certo, Glória a
Deus..."
Ana Maria Cavalcante de Souza
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RESUMO
Tem sido crescente a busca por novas substâncias antioxidantes, principalmente aquelas
derivadas de plantas. Neste sentido, o estabelecimento de protocolos para caracterizar
atividades antioxidantes de extratos vegetais tem ganhado importância na exploração do
potencial biotecnológico da biodiversidade amazônica. O presente trabalho teve como
objetivo principal comparar metodologias utilizadas na caracterização de atividades
antioxidantes de extratos de plantas amazônicas, a fim de elaborar um protocolo baseado em
ensaios químicos e biológicos. A atividade antioxidante de extratos de folhas ou cascas de
sete espécies de plantas amazônicas foi avaliada por cinco metodologias diferentes. As
espécies estudadas foram Byrsonima japurensis A. Juss. (Malpighiaceae), Calycophyllum
spruceanum Benth. (Rubiaceae), Derris floribunda Benth. (Fabaceae), Maytenus guianensis
Klotzch. (Celastraceae), Passiflora nitida Kunth L. (Passifloraceae), Petiveria alliacea L.
(Phytolacaceae) e a Ptychopetalum olacoides Benth. (Olacaceae). Inicialmente, foram obtidos
extratos secos por maceração a frio, utilizando-se etanol e água como solventes, e secagem
em rotaevaporador seguida de liofilização. Para caracterização da atividade antioxidante dos
extratos foram realizados os ensaios químicos de varredura dos radicais
1,1-difenil-2-(2,4,6-
trinitrofenil)hidrazila
(DPPH
•
), 2,2’-azinobis (3-etilfenil-tiazolina-6-sulfonato) (ABTS
+
), ânion
radical superóxido (AVS), oxigênio singlete (
1
∆
g
O
2
). Também foi feito o método para
caracterização de polifenóis totais nas amostras para comparação entre os ensaios. Os extratos
foram avaliados em diferentes concentrações para cada método e a concentração capaz de
inibir 50% (CI
50
) a oxidação do radical foi calculada através de regressão linear simples. Os
testes foram correlacionados entre si. Foram realizados também ensaios biológicos por meio
de modelos de estresse oxidativo com a levedura Saccharomyces cerevisiae. E com a amostra
que apresentou maior atividade antioxidante em todos os ensaios, realizou-se o ensaio de
indução do estresse em ratos da espécie Wistar. Para efeito de comparação com os resultados
obtidos, foram utilizados padrões com efeitos antioxidantes conhecidos, tais como: ácido
ascórbico, ácido gálico, DABCO
®
, TROLOX
®
, quercertina, BHA, BHT, α-Tocoferol e β-
Caroteno. Nos testes de varredura de radicais, as espécies C. spruceanum e de M. guianensis
foram as que apresentaram melhores resultados. O extrato etanólico da espécie C.
spruceanum apresentou CI
50
= 7,5±0,9, 5,03±0,1, 18,19±3,0 e 92,43±24,8 µg/mL nos ensaios
de DPPH, ABTS, AVS e oxigênio singlete, respectivamente. Foi observada correlação
positiva entre os testes antioxidantes realizados nos ensaios químicos, sendo o teste com
DPPH
•
o único que se correlacionou com todos os demais testes. O método utilizando a S.
cerevisiae não se mostrou adequado, visto que a maioria dos extratos apresentou atividade
antifúngica o que inviabilizou o uso do mesmo. No teste com rato Wistar a espécie C.
spruceanum foi capaz de alterar os níveis séricos e teciduais de marcadores do estresse
oxidativo como MDA (malondialdeído) e GPx (glutationa peroxidase). Foi possível conhecer
o potencial antioxidante através de cinco diferentes testes in vitro de extratos de sete espécies
de plantas até então pouco exploradas quanto a este potencial. A partir da realização deste
trabalho, foi possível organizar um protocolo experimental para estudo do potencial
antioxidante de extratos vegetais utilizando ensaios químicos e biológicos.
Uni termos: DPPH, ABTS, Superóxido, Oxigênio Singlete, Polifenóis totais, MDA, GPx,
Saccharomyces cerevisiae e Ratos Wistar.
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ABSTRACT
It has been increasing the search for new substances antioxidants, particularly those derived
from plants. In this sense, the establishment of protocols to characterize antioxidant activity of
plant extracts has gained importance in exploiting the potential of biotechnology Amazonian
biodiversity. This study aimed to compare main methodologies used to characterize the
antioxidant activity of extracts of plants Amazon to develop a protocol based on tests in vitro
and in vivo. The antioxidant activity of extracts of leaves or bark of seven species of
Amazonian plants was assessed by five different methodologies. The species studied were
Byrsonima japurensis A. Juss. (Malpighiaceae), Calycophyllum spruceanum Benth.
(Rubiaceae), Derris floribunda Benth. (Fabaceae), Maytenus guianensis Klotzch.
(Celastraceae), Passiflora nitida Kunth L. (Passifloraceae), Petiveria alliacea L.
(Phytolacaceae) and Ptychopetalum olacoides Benth. (Olacaceae). Initially, dried extracts
were obtained by the cold maceration, using ethanol and water as solvents and drying in
rotaevaporador followed by lyophilization. To characterize the antioxidant activity of the
extracts were carried out chemical tests of radical sweep of 1,1-diphenyl-2-(2,4,6-trinitrofenil)
hidrazila (DPPH
•
), 2.2-azinobis(3-ethylphenyl-thiazoline-6-sulfonate) or ABTS
+
, superoxide
anion radical (AVS), singlet oxygen (
1
Δ
g
O
2
). Also was made the method for determination of
total phenols in the samples to compare the tests. The extracts were evaluated in different
concentrations for each method and the concentration able to inhibit 50% (IC
50
) to the radical
oxidation was calculated using simple linear regression. The tests were correlated with each
other. We also conducted tests biological agents through models of oxidative stress in the
yeast Saccharomyces cerevisiae. And with the sample that showed higher antioxidant activity
in all the tests were carried out test of induction of stress in Wistar rats of the species. For
purposes of comparison with results for all tests were used patterns known as antioxidants,
such as: ascorbic acid, galic acid, DABCO
®
, TROLOX
®
, quercertin, BHA, BHT, α-
Tocopherol and β-carotene . In test-scanning radicals, the species C. spruceanum and M.
guianensis were those that showed better results. The ethanol extract of the species C.
spruceanum presented IC
50
= 7.5±0.9, 5.03±0.1, 18.19±3.0 e 92.43±24.8 µg/mL in the trials of
DPPH, ABTS, AVS and singlet oxygen, respectively. There was a positive correlation
between the antioxidants in vitro tests performed, and the test of DPPH
•
the only one who was
correlated with all other tests. The method using the S. cerevisiae was not appropriate, since
most extracts showed antifungal activity which prevented the use of it. In the test with the
Wistar rat species C. spruceanum was able to alter the levels of serum and tissue markers of
oxidative stress as MDA (malondialdehyde) and GPx (glutathione peroxidase). It was
possible to know the potential antioxidant through five different tests in vitro of extracts from
seven species of plants hitherto little explored in this potential. From this work, it was
possible to organize an experimental protocol to study the potential of antioxidant plant
extracts using chemical and biological tests.
Key words: DPPH, TEAC, Superoxide, Singlet Oxygen, Total Polyphenol, MDA, GPx,
Saccharomyces cerevisiae and rats Wistar
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LISTA DE FIGURAS E ILUSTRAÇÕES
Figura 1 Substâncias antioxidantes de origem vegetal: (1) ácido gálico, (2) BHA, (3)
BHT, (4) Quercertina, (5) α-Tocoferol e (6) β-Caroteno .................................
30
Figura 2
Estrutura química da Fenilalanina (1), Tirosina (2) e Triptofano (3) ...............
31
Figura 3
Estrutura química do Ácido ascórbico ou vitamina C ......................................
32
Figura 4
Estrutura química do Retinol ou Vitamina A ...................................................
32
Figura 5
Estrutura química do Licopeno ........................................................................
33
Figura 6
Estrutura química do TROLOX
®
.....................................................................
35
Figura 7
Estrutura química da Xantina Oxidase .............................................................
37
Figura 8 Estrutura do radical 2,2’-azinobis (3-etilfenil-tiazolina-6-sulfonato) ou
ABTS
•+
.............................................................................................................
38
Figura 9
Estrutura do radical 1,1-difenil-2-(2,4,6-trinitrofenil) hidrazila ou DPPH
•
.....
39
Figura 10
Estrutura química do (5,6,11,12-tetrafenilnaptaceno) ou Rubreno ..................
40
Figura 11
Estrutura química do DABCO .........................................................................
41
Figura 12
Estrutura química do acido linoléico ................................................................
41
Figura 13
Estrutura química do acido úrico .....................................................................
42
Figura 14
Estrutura química da Fluoresceína ...................................................................
43
Figura 15
Estrutura química da Phycoerythrin (PE) ou Ficoeritrina ................................
44
Figura 16
AAPH ou 2,2’-Azobis (2-metilpropanoamidina) ............................................
44
Figura 17 Phenazine methosulfate (PMS) e Nicotinamina Adenina Dinucleotídeo
(NADH) ...........................................................................................................
45
Figura 18 Estrutura química do radical NBT
+
(Nitro Blue Tetrazolium), utilizada no
ensaio para caracterização de atividade varredora de ânion radical
superóxido ........................................................................................................
46
Figura 19
Principais agentes estressores utilizados em ensaios biológicos: (1) tetracloreto de
carbono, (2) APAP ou paracetamol, (3) Paraquat e (4) Aloxano ................................
48
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Figura 20
Estrutura química da estreptozootocina ...........................................................
50
Figura 21
Estrutura química da N-acetilcisteína ..............................................................
50
Figura 22
Lago do Purupuru, Careiro Castanho – AM ....................................................
55
Figura 23
Processo de preparação de extratos de plantas (folhas e raízes) ......................
56
Figura 24
Modelo de adaptação de ensaio in vitro para caracterização de atividade
antioxidante de espécies de plantas para realização em microplacas................
58
Figura 25
Ensaio para caracterização de atividade varredora de anion radical
superóxido em espécies de plantas realizado em microplacas..........................
61
Figura 26
Método do Rubreno para caracterização de atividade antioxidante e
fotoprotetora de espécies de plantas amazônicas com leitura em
espectrofotômetro .............................................................................................
62
Figura 27
Modelo qualitativo de ensaio com leveduras Saccharomyces cerevisiae para
detecção de atividade antifúngica presente nos extratos testados.....................
65
Figura 28
Câmara asséptica para realização de ensaio com leveduras da espécie
Saccharomyces cerevisiae................................................................................
65
Figura 29
Modelo Quantitativo de ensaio in vivo em microplacas com leveduras
Saccharomyces cerevisiae para caracterização de atividade antioxidante
presente nos extratos testados...........................................................................
67
Figura 30
Extrato de espécie de planta amazônica (Callycophyllum spruceanum)
preparado em solução com água destilada para teste de atividade
antioxidante com animais (ratos da espécie Wistar) ........................................
69
Figura 31
Coleta de material biológico (punção cardíaca e amostra de tecido hepático)
dos animais (ratos Wistar) para realização de dosagens de biomarcadores do
estresse oxidativo - MDA e GPx.......................................................................
70
Figura 32
Curva de absorbância do acido gálico, absorbância em relação à
concentração (µg/mL) ......................................................................................
72
Figura 33
Curva de atividade antioxidante característica da espécie Callycophyllum
spruceanum pelo método DPPH ......................................................................
74
Figura 34
Curva de atividade antioxidante característica da espécie Callycophyllum
spruceanum pelo método ABTS ......................................................................
76
Figura 35
Curva de atividade antioxidante característica da espécie Callycophyllum
spruceanum pelo método de AVS ....................................................................
77
Figura 36 Curva de atividade antioxidante característica da espécie Callycophyllum
spruceanum pelo método de Rubreno ..............................................................
79
Ilustração 1
Preparação de inóculo inicial de Saccharomyces cerevisiae ...........................
63
Ilustração 2
Preparação do inóculo final em meio liquido YPD para teste em microplacas
64
Fluxograma
Protocolo experimental de realização de ensaios para caracterização de
atividades farmacológicas
84
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Métodos de extração para cada espécie de planta selecionada ..............................
56
Tabela 1
Percentagem de Polifenóis presente nas espécies de plantas estudadas e como
mg de EAG (equivalentes de acido gálico) por g de extrato .................................
65
Tabela 2
Miliequivalência (mEq) de Acido Ascórbico de extratos de plantas amazônicas
no método de DPPH e % de atividade antioxidante em amostras com
concentração de 20 μg/mL .....................................................................................
66
Tabela 3
Miliequivalência (mEq) de TROLOX
®
de extratos de plantas amazônicas pelo
método de ABTS
+
e percentagem de atividade antioxidante (%) em amostras
com concentração de 20 μg/mL .............................................................................
67
Tabela 4
Miliequivalência (mEq) de Acido Gálico de extratos de plantas amazônicas no
método de varredura de anion radical superóxido (AVS) e % de atividade
antioxidante em amostras com concentração de 50 μg/mL ...................................
69
Tabela 5
Miliequivalência (mEq) de DABCO de extratos de plantas amazônicas no
método de Rubreno e % de atividade antioxidante em amostras com
concentração de 100 μg/mL ...................................................................................
70
Tabela 6
Concentrações inibitórias 50% (CI
50
) dos extratos de plantas testados, os
resultados estão expresso em µg/mL .....................................................................
72
Tabela 7
Resultados do ensaio qualitativo utilizando leveduras da espécie Saccharomyces
cerevisiae para determinação de atividade antifúngica dos extratos......................
73
Tabela 8
Resultados do ensaio com Saccharomyces cerevisiae para determinação de
atividade protetora dos extratos contra estresse oxidativo por incubação
peróxido de hidrogênio 2 mM.................................................................................
73
Tabela 9
Níveis de antioxidantes séricos (μg/dL) em ratos tratados com CCl
4
....................
74
Tabela 10
Níveis antioxidantes teciduais (μg/dL) em ratos tratados com CCl
4
.....................
75
Tabela 11
Teste de correlação de PEARSON ........................................................................ 75
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LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
ABTS
+
- 2,2’-azinobis (3-etilfenil-tiazolina-6-sulfonato)
AAPH - 2,2’-Azobis (2-metilpropanoamidina)
APAP - paracetamol / acetoaminofeno
ARS - anion radical superóxido
BHA - Butylated Hydroxyanisole
BHT - Butylated HydroxyToluene
CAT - capacidade oxidante total
COT - capacidade antioxidante total
DABCO - 1,4-diazabiciclo(2,2,2)octano
DCM - diclorometano
DNA - ácido desoxirribonucléico
DTNB - 5,5 – ditiobis-(2-ácido nitrobenzóico)
DPPH - 2,2-difenil-1-(2,4,6-trinitrofenil)hidrazila
EDTA - sal sódico do ácido etilenodiaminotetracético
ERN - espécie reativa do nitrogênio
ERO - espécie reativa do oxigênio
Fe - ferro metal
Fe
2
+
- íon ferroso
Fe
3
+ -
íon férrico
FRAP - capacidade de redução do ferro sérico
GPx - glutationa peroxidase
GSH - glutationa reduzida
HOO• - radical hidroperoxila
HPLC - cromatografia liquida de alta eficiência
INPA - instituto nacional de pesquisas da amazônia
LDL - low density lipoprotein (lipoproteína de baixa densidade)
LPO - lipoperoxidação ou peroxidação lipídica
MDA - malondialdeído
mEq - miliequivalente
MeOH - metanol
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NADH - nicotinamina adenina dinucleotídeo
NADPH - nicotinamina adenina dinucleotídeo fosfato reduzido
NCCLS - National Committee for Clinical Laboratory Standards
NOS - óxido nitrito sintase
NO
3
-
- peroxinitrito
O
2
-•
- ânion radical superóxido
OMS - Organização Mundial da Saúde
PE - Phycoerythrin (fitocoeritrina)
PMS - Phenazine Metho-Sulfate
rpm - rotações por minuto
Rubreno - 5,6,11,12-tetrafenilnaptaceno
SOD - superóxido dismutase
TBA - ácido tiobarbitúrico
TBARs - substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico
TEAC - TROLOX
®
equivalent antioxidant capacity (capacidade antioxidante
equivalente ao TROLOX
®
)
TRAP - potencial total de absorção de radicais
TROLOX
® -
2-carbóxi-6-hidróxi-2,5,7,8-tetrametilcromano
UFAM - Universidade Federal do Amazonas
USP - Universidade de São Paulo
WHO - World Health Organization
XOD - Xantina Oxidase
1
Δ
g
O
2
- oxigênio singlete
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SUMÁRIO
1.
INTRODUÇÃO.................................................................................................................
16
2.
REVISÃO DA LITERATURA .......................................................................................
19
2.1 Plantas medicinais.......................................................................................................
19
2.2 Espécies amazônicas ..................................................................................................
21
2.2.1 Família Malpigliaceae ....................................................................................
21
2.2.2 Família Rubiaceae ..........................................................................................
22
2.2.3 Família Fabaceae ............................................................................................
23
2.2.4 Família Celastraceae .......................................................................................
24
2.2.5 Família Passifloraceae ....................................................................................
25
2.2.6 Família Phytolacaceae ....................................................................................
25
2.2.7 Família Olacaceae ..........................................................................................
26
2.3 Atividade antioxidante de plantas............................................................................
27
2.4 Ensaios para caracterização de atividades antioxidantes de extratos de plantas 32
2.4.1 Ensaios químicos ............................................................................................
33
2.4.2 ABTS
•+
...........................................................................................................
35
2.4.3 DPPH
•
............................................................................................................
37
2.4.4 Rubreno ..........................................................................................................
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2.4.5 Sistema β-caroteno/ácido linoléico ................................................................
40
2.4.6 FRAP...............................................................................................................
41
2.4.7 TRAP...............................................................................................................
42
2.4.8 ORAC .............................................................................................................
43
2.4.9 Atividade Varredora de Superóxido (AVS) ...................................................
45
2.4.10 Ensaios biológicos ........................................................................................
47
2.4.11 Saccharomyces cerevisiae ............................................................................ 47
2.4.12 Modelo de estresse em ratos Wistar .............................................................
49
3.
OBJETIVOS................................................................................................................
51
3.1 Geral.......................................................................................................................
51
3.2 Específicos..............................................................................................................
51
4.
MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................................
52
4.1 Modelo de estudo........................................................................................................
52
4.2 Obtenção das amostras..............................................................................................
52
4.2.1 Plantas.............................................................................................................
52
4.2.2 Identificação das plantas................................................................................. 53
4.2.3 Coleta das plantas............................................................................................ 53
4.2.4 Obtenção dos extratos.....................................................................................
54
4.3 Caracterização da atividade antioxidante................................................................
55
4.3.1 Determinação de polifenóis totais ..................................................................
55
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4.3.2 Teste do 2,2-difenil-1-(2,4,6-trinitrofenil)hidrazila ou DPPH
⋅
........................
56
4.3.3 Teste de varredura do radical ABTS
+
..............................................................
58
4.3.3.1 Preparo dos reagentes .........................................................................
50
4.3.3.2 Preparo das amostras ..........................................................................
49
4.3.3.3 Realização do ensaio ............................................................................
50
4.3.4 Atividade varredora de radical anion superóxido (AVS) ...............................
50
4.3.5 Teste de varredura do oxigênio singlete..........................................................
52
4.3.6 Teste da Saccharomyces cerevisiae ...............................................................
53
4.3.6.1 Teste qualitativo ................................................................................
54
4.3.6.2 Teste quantitativo .............................................................................. 56
4.3.7 Atividade antioxidante ex vivo .......................................................................
58
4.3.7.1 Dosagem do malondialdeído (MDA) .................................................
61
4.3.7.2 Dosagem de Glutationa Peroxidase (GPx) ........................................
61
4.5 Análise dos resultados ...............................................................................................
62
5. RESULTADOS ............................................................................................................
63
6. DISCUSSÃO .................................................................................................................
76
7. CONCLUSÃO ..............................................................................................................
85
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................................
86
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1. INTRODUÇÃO
Radical livre é definido como qualquer átomo ou molécula que contém elétrons
desemparelhados e tem existência independente. A retirada ou a adição de um elétron a uma
molécula não-radicalar pode (ou não) converter esta em espécie radicalar. Os radicais livres
são espécies químicas extremamente reativas, e que podem causar dano ou morte celular. Eles
são continuamente produzidos pelo organismo, sendo a maioria por reações bioquímicas
envolvendo oxigênio, que ocorrem normalmente no metabolismo (fontes endógenas) como na
cadeia transportadora de elétrons, na mitocôndria, na hipóxia, na explosão respiratória pelos
macrófagos, sendo também formados por fagocitose, como parte do controle da reação
inflamatória (HERMES-LIMA, 2004).
Todos os organismos aeróbicos são expostos a espécies reativas de oxigênio (EROs)
como ânion radical superóxido (O
2
-•
), oxigênio singlete (
1
O
2
ou
1
Δ
g
O
2
), peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
), ânion hipoclorito (OCl
-
) e radical hidroxila (
-
OH) bem como espécies
reativas de nitrogênio (ERNs) como óxido nítrico (
-
NO) e peroxinitrito (ONOO
-
) gerados pelo
metabolismo. O acúmulo de ERO ou de ERN causa danos à estrutura das biomoléculas,
gerando estresse oxidativo, que também pode ser definido como qualquer distúrbio celular no
equilíbrio entre oxidantes e antioxidantes, em favor dos oxidantes. Em condições normais, o
organismo mantém o equilíbrio entre a formação de radicais livres e a sua remoção por
antioxidantes - incluindo a capacidade das células de reparar os danos oxidativos
(GUTTERIDGE, 1995).
Muitas doenças estão associadas com o aumento na geração de radicais livres ou no
decréscimo da capacidade antioxidante ou ambos. O equilíbrio entre oxidantes e antioxidantes
limita a saúde e a condição de doença, incluindo doenças neurodegenerativas, inflamação,
aterosclerose, lesão de reperfusão, doenças cardiovasculares, artrite reumatóide e diabetes
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(JONES, 2006). Algumas espécies reativas de oxigênio parecem contribuir para os sinais e
sintomas apresentados nas doenças tropicais, logo a avaliação do estresse oxidativo gerado
nestas patologias pode ajudar a entender o mecanismo de atuação das doenças e suas
conseqüências (BILDIK et al., 2004; GANTT et al., 2001; NOOR et at., 2002; PAL et al.,
2006; RAY et al., 1999).
Acredita-se que o estresse oxidativo seja de extrema importância na gênese e
desenvolvimento de doenças como a hipercolesterolemia, hiperglicemia, hipertensão e
alterações na atividade plaquetária. Inúmeras plantas amazônicas são tradicionalmente
conhecidas por diversos usos tradicionais como hipoglicemiantes e antiaterogênicas, sendo
que essas propriedades podem estar relacionadas com atividades antioxidantes, sugerindo a
presença de compostos químicos com importantes ações farmacológicas, e ainda
desconhecidos. Algumas destas plantas já tiveram seus efeitos estudados e comprovados
mediante a identificação de seus princípios ativos, como o alto teor de ácido ascórbico
encontrado em várias espécies de frutos (GUO et al., 2003; GARCÍA-ALONSO et al., 2004).
A geração de espécies radicalares está diretamente relacionada com a oxidação de
lipídeos e substratos biológicos, por isso é tão importante a busca por novas fontes de
substâncias antioxidantes, capazes de “varrer” ou inativar radicais livres (SANCHEZ-
MORENO, 2002). Assim, apesar de se conhecer bastante os seus usos populares, a utilização
de ensaios específicos para a caracterização de atividades antioxidantes em espécies
amazônicas é uma área pouco desenvolvida na região. O desenvolvimento de testes capazes
de caracterizar estas atividades de extratos vegetais por meio de ensaios químicos e biológicos
é de extrema importância para elaboração de produtos biotecnológicos derivados de fontes
naturais.
Aproveitando a rica biodiversidade local e o interesse comercial em desenvolver
novos produtos com ação antioxidante, por exemplo, o crescimento do mercado de
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fitoterápicos pode gerar nova fonte de renda e inovação em saúde, contribuindo futuramente
para melhoria de qualidade de vida de pacientes portadores de doenças relacionadas com o
estresse oxidativo. É importante também ressaltar que a identificação de novas atividades
biológicas de produtos naturais poderá aumentar significativamente o valor comercial do
referido produto ou espécie e, desta forma, servir como uma fonte de renda para a população
local, contribuindo para o desenvolvimento sustentável da Amazônia. Neste sentido, é
fundamental que se tenha um protocolo bem estabelecido para realização de testes in vitro e in
vivo, sabendo-se correlacionar os resultados obtidos. E com isto poder comprovar a
capacidade antioxidante de diversas plantas da região amazônica.
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2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Plantas medicinais
O conhecimento acerca das plantas tem acompanhado a evolução do homem através
dos tempos. As civilizações primitivas, cedo, tomaram conhecimento das plantas comestíveis
e de outras dotadas de maior ou menor toxicidade que, ao serem experimentadas no combate à
doença, revelaram, embora empiricamente, o seu potencial curativo. Esse conhecimento foi
desenvolvendo-se juntamente com as civilizações até chegar aos dias atuais, onde é sabido
que as ações farmacológicas das plantas estão relacionadas à presença de compostos
biologicamente ativos (DI STASI et al., 1989).
A correlação entre a estrutura química destes compostos e a ação fisiológica tem dado
suporte à descoberta de novas moléculas naturais com elevada atividade farmacológica.
Também o desenvolvimento da química analítica, pelo emprego dos modernos métodos
cromatográficos, espectrofotométricos, e rádio imunológicos, apoiados em aparelhos cada vez
mais sofisticados, tem permitido um melhor conhecimento da composição química dos
fármacos vegetais e da estrutura dos seus componentes ativos (DI STASI et al., 1989).
Nos últimos anos, em virtude dos progressos alcançados pelos métodos analíticos, os
conhecimentos sobre as plantas medicinais foram, consideravelmente, aumentados
referendados em revistas especializadas da área. Um elevado número de novos constituintes
isolados, estudos farmacológicos e mecanismos que envolvem a bioformação desses
constituintes em plantas medicinais estão descritos. A Amazônia, com sua enorme
biodiversidade, possui um grande potencial para produzir estes novos compostos (SILVA et
al., 2007).
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20
Contudo, isto é uma pequena parte do que se pode fazer, pois é significativo o número
de plantas ainda não estudadas, tanto no sentido de uma utilização direta, como da obtenção
de novos constituintes ativos que possam servir para preparar por semi-síntese compostos
farmacologicamente ativos.
O Brasil possui cerca de dez por cento de toda a flora mundial. E apesar de ter
proporcionado à humanidade produtos com propriedades extraordinárias como os curares, a
emetina, a pilocarpina, entre outros, continua a ser um país com muitas potencialidades neste
campo, considerando-se que menos de um por cento das espécies vegetais brasileiras já foram
analisadas sob o ponto de vista químico e farmacológico (FERREIRA, 2002).
A utilização de plantas com fins medicinais - para tratamento, cura e prevenção de
doenças - é uma das mais antigas formas de prática medicinal da humanidade. No início da
década de 1990, a Organização Mundial de Saúde (OMS) divulgou que entre 65 e 80% da
população dos países em desenvolvimento dependiam das plantas medicinais como única
forma de acesso aos cuidados básicos de saúde (VEIGA-JR et al., 2005).
Medicamentos à base de plantas medicinais têm sido cada vez mais utilizados. Dados
do setor mostram que os fitoterápicos já representam sete por cento do segmento farmacêutico
no Brasil, movimentando cerca de US$ 700 milhões por ano. Esta expansão é atribuída ao
potencial que esses produtos têm de prevenir e tratar doenças, com menos efeitos colaterais
que os remédios alopáticos (CORREA JR. e SCHEFFER, 2006).
Os produtos oriundos da Amazônia, em especial os fitoterápicos, apresentam um
potencial de abastecimento de mercado de exportação, bem como de originar um segmento de
trabalhadores que de outra maneira dificilmente trabalhariam.
Desta maneira, a validação científica dos medicamentos de origem natural, ao associar
estritamente o controle de qualidade à fabricação dos mesmos, vem conferir um poderoso
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21
instrumento para o desenvolvimento de produtos dentro de tecnologias aceitáveis e
competitivas no mercado.
A introdução de um novo produto fitoterápico, baseado no uso tradicional de uma
planta, pode ser abreviada, a partir da sua validação científica, que lhe confere a autenticidade
requerida para o suporte ético do medicamento planejado. Este processo é efetuado a partir da
comprovação da atividade farmacológica da espécie, associada ao controle de sua composição
botânica e química e de sua toxicidade, estipulada dentro dos patamares aceitáveis.
Há, na Amazônia, uma necessidade crescente de estabelecimento de estratégias
políticas para o desenvolvimento de ações visando à busca dos potenciais terapêuticos de
plantas amazônicas. Fato inteiramente relacionado à visão do desenvolvimento sustentável,
trazendo uma fonte de renda para os detentores da terra onde a planta é coletada diretamente
da natureza ou cultivada.
2.2 Espécies Amazônicas
2.2.1 Família Malpigliaceae
No Brasil, a maior parte das espécies da família Malpigliaceae é conhecida por ser
utilizada com finalidade terapêutica e como alimento. Desse modo, há uma crescente
necessidade de mais estudos fitoquímicos com essas espécies. As espécies do gênero
Byrsonima são conhecidas popularmente como “muricis” e, em geral, são plantas nativas do
norte, nordeste e região central do Brasil, podendo também serem encontradas em algumas
regiões serranas do Sudeste. As espécies da família Malpighiaceae podem variar entre árvores
e arbustos, e compreendem cerca de 60 gêneros e 1200 espécies. As folhas são simples,
geralmente opostas e, freqüentemente, têm glândulas emparelhadas com o pecíolo ou base do
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caule. São plantas com caracteres típicos das plantas do cerrado, geralmente arbóreas, com
galhos retorcidos e porte médio.
Os “muricis” do Brasil são muitos e variados, distinguindo-se pelas cores e locais de
ocorrência. São plantas de fácil adaptação, desenvolvendo-se bem em solos areno-argilosos,
com clima quente e boa ventilação. Muitas espécies de murici fornecem frutos bastante
consumidos e apreciados (por exemplo, a reputada acerola, rica em vitamina C), que são base
da alimentação de algumas populações nas mais variadas preparações culinárias (no Nordeste,
por exemplo, frutos da espécie Byrsonima crassifolia, amassados com farinha, fornecem a
“cambica de murici”, rica em gorduras e de alto teor nutritivo). No estado do Pará, há um
grande interesse em desenvolver pesquisas agronômicas com os muricizeiros, devido ao
grande consumo das frutas dessas plantas nessa região (DAVID e SANTOS, 2003).
2.2.2 Família Rubiaceae
A espécie Callycophyllum spruceanum Benth., comumente conhecida como
“mulateiro” ou “pau-mulato” no Brasil, é da família das Rubiáceas. Este gênero já foi
registrado na literatura por possuir inúmeros compostos metabólitos secundário, tais como
alcalóides, iridóides, triterpenos e antraquinonas que possuem atividades antioxidantes
importantes. É uma árvore de crescimento lento, que pode atingir 15-40 metros de altura e 4-5
metros de diâmetro de copa colunar. As folhas são grandes e semi-caducas. A floração produz
flores brancas entre maio e junho. O tronco é retilíneo com a casca lisa e brilhante da cor
bronzeada. É uma planta de difícil reprodução (CARDOSO et al., 2008).
O Callycophyllum spruceanum é uma enorme árvore da Amazônia que tem sido
utilizada tradicionalmente para o tratamento de inúmeras doenças humanas, como: micoses,
viroses, diversas infecções, câncer e doenças da pele, isto em toda a ''Amazônia Legal'', que
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23
inclui o Brasil, Peru, Bolívia e Colômbia. Diversas partes da planta são usadas na medicina
caseira: da casca se faz um emplasto, de uso tópico, para tratar cortes, feridas e queimaduras;
o córtex, em infusão, é usado para infecções oculares, diabetes e males do ovário; em
emplastos, como cicatrizante e antimicótico; a seiva é considerada antibacteriana,
antioxidante, antiparasítica, repelente e inseticida, sendo empregada em cosméticos para
eliminação de manchas e cicatrizes e prevenção de rugas. A árvore é extremamente
ornamental, podendo ser empregada na formação de aléias, alamedas e cercas vivas. Ademais,
é indicada para plantios mistos em áreas ciliares degradadas. Na Amazônia Peruana, uma
decocção da casca é utilizada contra a chamada ''sarna negra'', uma infecção subcutânea
causada por um aracnídeo. Na Amazônia brasileira, esta espécie é conhecida no tratamento de
problemas estomacais, infecções diversas e tumores uterinos. Estas espécies são popularmente
utilizadas como cicatrizante para lesões cutâneas e como antifúngicas de uso tópico. Existem
algumas pesquisas relacionando esta espécie a atividades antimicrobiana, antifúngica,
antioxidante e inseticida (ZULETA et al., 2003).
2.2.3 Família Fabaceae
A espécie Derris floribunda é da família das Fabaceae. Fabaceae é uma das maiores
famílias botânicas, também conhecida como Leguminosae (leguminosas), de ampla
distribuição geográfica. São aproximadamente 18.000 espécies em mais de 650 gêneros. Uma
característica típica dessa família é apresentar o fruto do tipo legume, também conhecido
como vagem (há exceções). É subdivididas em 3 subfamílias muito distintas: Faboideae (ou
Papilionoideae), Caesalpinioideae (ou Caesalpiniaceae) e Mimosoideae (ou Mimosaceae). A
variação no nome se deve à coexistência atual de mais de um sistema de classificação. Dentre
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as substâncias que predominam nas espécies vegetais da família Fabaceae encontram-se os
flavonóides que são considerados poderosos antioxidantes (RIBEIRO e KAPLAN, 2002).
2.2.4 Família Celastraceae
A espécie Maytenus guianensis Klotzch., pertencente à família das Celastraceae, é
considerada uma árvore medicinal na Amazônia. Na região Amazônica, encontram-se duas
espécies principais, Maytenus ebenifolia Reissek. e Maytenus guyanensis Klotzch., que são
tradicionalmente conhecidas pelos nomes chichuá (xixuá) no Brasil e chuchuhuasi no Peru.
Estas espécies são utilizadas como analgésicos e relaxantes musculares, para alívio de artrite,
reumatismo, hemorróidas, inchaço nos rins, erupções cutâneas, como bem como prevenção do
câncer de pele, e tratamento de constipações, diarréias e bronquites e finalmente como
afrodisíacas e estimulantes tônicos. É utilizada medicinalmente como estimulante, tônico e
relaxante muscular, para o alívio de artrite, reumatismo, hemorróidas, rim inchado, erupções
de pele, prevenção do câncer de pele, entre outros. As cascas secas pulverizadas apresentam
letalidade às larvas de Artemia franciscana Leach., bem como atividade antioxidante em
testes in vitro baseados na varredura do radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazil ou DPPH
•
.
Extratos etanólicos liofilizados apresentaram efeito protetor solar parcial na região da luz
UVB (MACARI et al., 2004; MACARI et al., 2006).
Em estudos com Maytenus spp. foram isoladas substâncias como: triterpenos,
flavonóides, sesquiterpenos e alcalóides. Estudos sobre a atividade biológica revelaram
atividades antitumorais, antimicrobianos e por último compostos inseticidas. De modo mais
geral, sesquiterpenos alcalóides foram isolados de Maytenus spp., demonstrou-se ter atividade
citotóxica e inseticida (KUO et al., 1990; KUO et al., 1994; ORABI et al., 2001; MACARI et
al., 2006).
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2.2.5 Família Passifloraceae
A Passiflora nitida L. é conhecida popularmente como maracujá-do-mato. Trata-se
de uma espécie comestível rústica originária da flora amazônica, cujos frutos apresentam
sabor exótico e são bastante apreciados para consumo in natura. Pertence ao subgênero
Passiflora, série Laurifoliae e está dispersa por todo o norte da América do Sul. E muito
popular o uso de preparações farmacêuticas a partir de suas folhas, que são ótimas fontes de
componentes flavonoídicos. No Brasil a espécie tem sido utilizada como ansiolítico,
sedativo, diurético e um analgésico (OGA et al., 1984). Um largo número de estudos tem
demonstrado recentemente que os polifenóis possuem propriedades antioxidantes, podendo
participar na prevenção de vários processos patofisiológicos associados com estresse
oxidativo, tais como câncer, doenças neurodegenerativas e cardiovasculares (SOUZA et al.,
2007; VERZA et al., 2007; SOARES, 2002; SHAMI e MOREIRA, 2002).
2.2.6 Família das Phytolacaceae
A Petiveria alliacea L., pertencente à família das Phytolacaceae, possui muitas ações
farmacológicas, tais como: atividade infectológica, antiinflamatória e oncológica (REVILLA,
2002). Petiveria alliaceae (Phytolacaceae), conhecida popularmente como ″tipi″ ou ″mucura-
caa″, é originária da África, América do Sul e Central. É uma planta que habita locais úmidos
e sombrios. Estudos anteriormente realizados com as raízes desta espécie revelaram a
presença de mercaptanas com atividades antifúngica, acaricida e inseticida (JOHNSON et al.,
1997; BENEVIDES et al., 2001). O infuso das raízes apresentou ação anticonceptiva e
mostrou uma ação anestésica local. Os extratos da raiz e da folha possuem efeito abortivo e o
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do caule efeito zigotóxico. Foi comprovada também sua ação depressora do sistema nervoso
central, sendo o efeito anticonvulsivante o mais importante (DI STASI et al., 1989).
2.2.7 Família Olacaceae
As diversas partes da espécie Ptychopetalum olacoides Benth., pertencentes à família
das Olacaceae, são de grande importância medicinal, apresentando diferentes princípios ativos
com indicações terapêuticas. Segundo o uso medicinal popular, suas cascas e raízes são
usadas na forma de chás para tratamento da impotência sexual, para problemas
neuromusculares, gripe, reumatismo e astenia cardíaca e gastrintestinal. É também usada
externamente na forma de banhos para tratamento da paralisia e do beribéri. Sua reputação de
planta afrodisíaca é bem conhecida de longa data. Seu efeito neuromuscular para o tratamento
dos sintomas do sistema nervoso central, incluindo a doença de Parkinson, os déficits da
memória e as conseqüências do curso e ainda seu poder anti-reumático para soluções de
desordens gastrintestinais, é, igualmente, bem conhecido; propriedades confirmadas por um
estudo farmacológico publicado em 1925 (PINHEIRO et al., 2003).
Estudos conduzidos para determinar componentes ativos da espécie Ptychopetalum
olacoides Benth, iniciado nos anos 20, encontraram ácidos graxos de cadeia longa (como o
ácido araquidônico), taninos, esteróides, cumarinas, alcalóides (principalmente muirapuamine
0,05%), óleos essenciais, álcool triterpênico e lupeol. Foram, também, observados os efeitos
afrodisíacos da planta, estando, hoje, listada na Farmacopéia Britânica, tornando-se parte da
medicina herbal (PINHEIRO et al., 2003).
Entre suas propriedades farmacológicas, verificou-se que nos extratos alcoólicos e
hidroalcoólicos há um bloqueio nos tremores induzidos por harmalinae eserina; e catatonia,
induzida por perfenazina. Verificou-se ainda que os extratos reverteram o quadro de
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hiperatividade induzida por reserpina. Por promover uma ativação da digestão, é indicado em
casos de inapetência, dispepsia e atonia gástrica. A excitação que causa sobre o sistema
nervoso central justifica a indicação em casos de depressão, esgotamento e outras doenças de
nível neurológico (PINHEIRO et al., 2003).
2.3 Atividade antioxidante de plantas
A busca por novas alternativas terapêuticas e produção de novos fármacos
provenientes de produtos naturais, tem estimulado os estudos acerca dos princípios ativos de
plantas, chamando a atenção para regiões com uma flora abundante, especialmente a região
Amazônica. O interesse pela descoberta de novos antioxidantes a partir de fontes naturais vem
crescendo nos últimos anos, principalmente por prevenir a deteriorização de alimentos e
minimizar o dano oxidativo às células vivas (PEREIRA, 1996; ALCARAZ e CARVALHO,
2004).
Todos os seres vivos que, em seu metabolismo, utilizam oxigênio para a geração de
energia liberam radicais livres no organismo. A priori, isso é incompatível com a vida a
menos que haja um mecanismo compensatório e de defesa contra estas espécies. Esta defesa é
então realizada por meio dos antioxidantes. É considerada como tal, qualquer substância que,
em baixas concentrações, possua uma afinidade maior que qualquer outra molécula para
interagir com os radicais livres prevenindo a oxidação do seu substrato (BACALLAO et al.,
2001).
A produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), de nitrogênio (ERN), entre outras
espécies reativas, é parte integrante do metabolismo humano e é observada em diversas
condições fisiológicas. ERO e ERN têm importante função biológica, como na fagocitose
fenômeno em que essas espécies são produzidas para eliminar o agente agressor. Por outro
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28
lado, quando sua produção é exacerbada, o organismo dispõe de um eficiente sistema
antioxidante que consegue controlar e restabelecer o equilíbrio. O estresse oxidativo resulta
do desequilíbrio entre o sistema pró e antioxidante, com predomínio dos oxidantes, com dano
conseqüente. A célula, unidade da vida é uma verdadeira usina de pró-oxidantes e
antioxidantes (VASCONCELOS et al., 2007).
O sistema de defesa antioxidante dos organismos aeróbicos atua contra os danos
causados pela injúria dos radicais livres, conhecidos também como espécies reativas de
oxigênio (EROs) e nitrogênio (ERNs) nos organismos vivos (DOTAN et al., 2004). O excesso
das EROs e ERNs produzidas in vivo é prejudicial às proteínas, ao DNA, aos lipídios e a
outras moléculas, tendo um papel crucial na patogênese de diversas doenças humanas, tais
como o câncer, artrite reumatóide, doenças hepáticas, neurodegenerativas e pulmonares
(HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999).
Um antioxidante, ao reagir com um radical livre, cede-lhe um elétron e o inativa, e em
alguns casos – como ocorre com a vitamina E – podendo regenerar-se a sua forma inicial pela
ação de outros antioxidantes e, assim, continuar com seu efeito “varredor” de radicais livres.
Mas nem todos os antioxidantes atuam desta maneira, os enzimáticos catalisam e aceleram as
reações químicas que utilizam radicais livres.
A busca por um estilo de vida benéfico à saúde do indivíduo tem impulsionando as
pesquisas científicas em busca de novos antioxidantes, principalmente de origem natural, que
possam ser utilizados nas indústrias alimentícia, farmacêutica, cosmética entre outras (MELO,
1989; KIM et al., 1997; MATIUCCI, 1998; MENSOR, 1999; MOREIRA, 1999; FREITAS,
2000).
Entre as inúmeras classificações existentes, os antioxidantes são principalmente
classificados como exógenos (oriundos dos alimentos ingeridos) e endógenos (sintetizados
pelo próprio organismo). As substâncias antioxidantes presentes nas plantas podem ser de
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vários tipos: antocianidinas, cumarinas, compostos fenólicos, flavonóides, licopeno, terpenos
entre outros (Figura 1).
Figura 1 – Substâncias antioxidantes de origem vegetal: (1) ácido gálico, (2) BHA, (3) BHT, (4)
Quercertina, (5) α-Tocoferol e (6) β-Caroteno.
Os principais compostos antioxidantes encontrados nas plantas são os fenólicos, entre
eles os flavonóides. No Brasil e recentemente na região amazônica, o interesse em
antioxidantes polifenólicos derivados de plantas tem aumentado notavelmente na última
década, devido a seu elevado poder de remoção de radicais livres associados com várias
doenças (SILVA et al., 2005; SOUZA et al., 2008).
Os polifenóis têm capacidade comprovada de doar hidrogênios e quelar íons metálicos
como ferro e cobre, inibindo a oxidação das lipoproteínas de baixa densidade (LDL)
(SOARES, 2002; VILLANO et al., 2007). A quantificação espectrométrica de compostos
fenólicos pode ser realizada por meio de uma variedade de técnicas, todavia, as que utilizam o
reagente de Folin-Ciocalteu figuram entre as mais extensivamente utilizadas (LIMA et al.,
2004; LIMA et al., 2006; PRADO et al., 2005; SINGLETON e ROSSI, 1965; SOUZA et al.,
2007; VELIOGLU et al., 1998).
HO
HO
OH
O
OH
(1)
(2)
OH
OCH
3
OH
(3)
OHO
OH O
OH
OH
OH
(4)
O
HO
(5)
(6)
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30
Compostos fenólicos são produzidos pelo metabolismo secundário de plantas a partir
da glicose que é processada e usada para gerar os metabólitos secundários, originados a partir
de aminoácidos aromáticos, como o triptofano, fenilalanina e a tirosina (Figura 2),
precursores de compostos aromáticos. Alguns metabólitos secundários derivados do acetato
são produzidos pela combinação desses intermediários ou de seus derivados, como:
flavonóides, antraquinonas e taninos. Nas plantas, os compostos fenólicos funcionam como
componente estrutural, possuindo também excelentes atividades antioxidante,
antimicrobianas e antivirais (HERMES-LIMA, 2004).
Figura 2 – Estrutura química da Fenilalanina (1), Tirosina (2) e Triptofano (3).
O ácido ascórbico (Figura 3), ou popularmente conhecido como vitamina C, é uma
vitamina hidrossolúvel com ação antioxidante. Tem um efeito mediado pela interação direta
com o oxigênio de várias espécies incluindo o ozônio e o óxido nítrico; neutraliza outras
espécies reativas como o ácido hipocloroso e regenera a forma ativa de outros antioxidantes
diretos. O ácido ascórbico também inibe diretamente a reação de formação de EROs mediado
pelo ferro das ferroproteínas e pelo peróxido de hidrogênio (BACALLAO et al., 2001).
OH
H
H
2
N
O
O
OH
HH
2
N
OH
N
H
OH
O
H
2
N
H
(1)
(2)
(3)
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31
Figura 3 – Ácido ascórbico ou vitamina C.
O ácido ascórbico é ainda considerada um dos mais importantes antioxidantes
presente em fluidos extracelulares. No organismo, esta vitamina atua em defesa contra a ação
das EROs, evitando a oxidação dos lipídeos insaturados. Porém, em elevadas concentrações
ou na presença de metais (ferro ou cobre) poderá exercer função pró-oxidante, promovendo a
lipoperoxidação (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1989).
Os carotenóides são grupos de pigmentos naturais responsáveis pela coloração de
inúmeros vegetais. Um dos principais carotenóides é o β-Caroteno (Figura 1), também
conhecido como pró-vitamina A, pois, em nosso organismo, ele se transforma em vitamina A
(Figura 4), de acordo com a necessidade. Substância também pertencente ao grupo dos
carotenóides, o licopeno (Figura 5) é um dos mais potentes antioxidantes estudados
atualmente. Acredita-se que o seu consumo previne alguns tipos de cânceres, em especial, o
de próstata, sendo sugerido na prevenção da carcinogênese e aterogênese por proteger
moléculas como lipídios, lipoproteínas de baixa densidade (LDL), proteínas e DNA
(AGARWAL e RAO, 2000).
Figura 4 – Retinol ou Vitamina A
O
O
OH
HO
HO
HO
OH
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32
Figura 5 - Licopeno
A vitamina A (Figura 4) tem uma forte ação antioxidante que se reconhece
principalmente pela neutralização do oxigênio no estado singlete por um mecanismo de
transferência de energia do radical com a formação de um tripleto de vitamina A e posterior
dissipação desta energia com a regeneração da vitamina. Mas, quando comparada ao β-
Caroteno e aos carotenóides presentes em plantas, a vitamina A é menos eficiente em sua
ação antioxidante por apresentar menor quantidade de insaturações em sua estrutura
(BACALLAO et al., 2001).
O α-tocoferol ou vitamina E (Figura 1) é um importante agente seqüestrador de
radicais peróxidos, oxigênio no estado singlete e outras espécies reativas de oxigênio nas
fases lipídicas biológicas das membranas e lipoproteínas, efeito muito importante em nível de
determinados tecidos como o nervoso e muscular.
A vitamina E pode aliviar situações de estresse, particularmente as geradas pelo
oxigênio. Este tipo de vitamina atua por meio do bloqueio das moléculas instáveis de
oxigênio singlete. Esta previne a oxidação espontânea dos elementos poliinsaturados e
protege, em termos funcionais, estruturas celulares importantes dos tecidos, supostamente
mediante a inibição da peroxidação lipídica (BACALLAO et al., 2001).
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33
2.4 Ensaios para caracterização de atividades antioxidantes de extratos de plantas
Atualmente, com o crescente interesse da comunidade científica em caracterizar a
eficiência antioxidante dos alimentos naturais e dos sistemas biológicos, os testes para
caracterização de atividades antioxidantes são o centro das atenções. Antioxidantes são
compostos que atuam inibindo e/ou diminuindo os efeitos desencadeados pelos radicais livres
e compostos oxidantes. Diferentes métodos podem ser utilizados para obter a diferenciação,
seja qualitativa ou quantitativa, da capacidade antioxidante de compostos, tanto pelo emprego
de testes sem a utilização de células (ensaios químicos) como pelo uso de culturas celulares e
organismos vivos (ensaios biológicos).
Embora exista uma grande variedade de métodos utilizados para estes fins, não há
métodos normatizados. Muitos protocolos são atualmente utilizados para avaliar antioxidantes
de interesse na alimentação e nutrição, saúde e doença. Obviamente, a significância e
relevância destes testes na avaliação de alimentos ou sistemas biológicos dependem da
escolha adequada do método de ensaio. Os resultados inconsistentes têm sido obtidos por um
grande número de antioxidantes conhecidos dependendo dos métodos usados para testar sua
atividade (FRANKEL e MEYER, 2000; WANG et al., 2004).
2.4.1 Ensaios Químicos
A caracterização da atividade antioxidante/redutora por métodos químicos tem sido
largamente utilizada pelos fitoquímicos em extratos de origem vegetal (BONDET et al., 1997;
BACALLAO et al., 2001; MENSOR et al., 2001; ARTS et al., 2004; EREL, 2004;
MOLYNEUX, 2004; YANG et al., 2007; ZHU et al., 2004). Esta atividade pode ser
determinada utilizando-se substâncias conhecidas, capazes de serem reduzidos na presença de
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34
antioxidantes. Segundo ARNAO (2000), os principais passos para realização de um ensaio
químico para caracterização dessa atividade são:
(1) dissolver um cromógeno em meio apropriado;
(2) adicionar o antioxidante (extrato/fração);
(3) medir a perda fotométrica do cromógeno radical observando a diminuição na
absorbância de luz em um comprimento de onda conhecido;
(4) as diminuições podem ser correlacionadas em uma curva da dose-resposta com um
antioxidante padrão, expressando a atividade antioxidante como equivalente ao do
antioxidante padrão, por exemplo: TROLOX
®
(Figura 6) ou o ácido ascórbico (Figura 3).
O
CH
3
CO
2
H
CH
3
OH
CH
3
C
H
3
Figura 6 – Estrutura do TROLOX
®
Fonte: Adaptado de BIOMOL (2006).
De acordo com o tipo de mecanismo de ação dos antioxidantes, os testes in vitro,
utilizados para caracterizar atividades antioxidantes, podem ser agrupados em quatro tipos
básicos: (1) seqüestradores de radicais; (2) inibidores de reações de oxidação ou auto-
oxidação; (3) medidores de potencial de oxi-redução e (4) de ressonância magnética nuclear
de spin de elétron (DAVID et al., 2004).
Os ensaios mais utilizados são os seqüestradores de radicais que se baseiam na
medição da capacidade de uma substância (pressupostamente antioxidante) em seqüestrar os
radicais livres. O provável potencial benéfico na saúde das substancias antioxidantes
presentes em frutas e legumes levaram a uma explosão da investigação sobre as propriedades
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35
antioxidantes dos compostos polifenólicos, especialmente os flavonóides, que constituem
aproximadamente 4000 diferentes compostos (FRANKEL e MEYER, 2000).
Uma grande variedade de métodos unidimensionais foi desenvolvida utilizando uma
ampla gama de condições, com variedade de sistemas de geração de radicais, métodos de
oxidação e observação de pontos finais. Esta diversidade metodológica utilizada para avaliar
antioxidantes naturais de extratos vegetais e compostos fenólicos puros levou a ampla gama
de resultados que são extremamente difíceis de interpretar. Estes não levam em conta o
complexo mecanismo de ação antioxidante dos compostos fenólicos, as reações, bem como as
suas múltiplas ações em sistemas biológicos complexos, e a significância dos efeitos do
substrato sobre a eficácia antioxidante (FRANKEL e MEYER, 2000).
Quanto aos ensaio para a caracterização de atividade varredora de radicais, podem ser
citados os métodos de DPPH
•
e ABTS
•
+
que empregam radicais estáveis em solução colorida.
Após a adição do antioxidante com capacidade de seqüestrar esses radicais que foram
produzidos, ocorre mudança de coloração da solução. Essas soluções são submetidas a
análises espectrofotométricas, e os resultados comparados quantitativamente com padrões de
antioxidantes comerciais e/ou naturais (ARNAO, 2000; ARTS et al., 2004).
Os inibidores de reações de oxidação ou auto-oxidação avaliam a atividade
antioxidante de uma determinada substância com acompanhamento da concentração das
substâncias a serem protegidas. Os medidores de potencial de oxi-redução têm este nome por
avaliarem, primeiramente, o potencial de oxidação e redução. Teoricamente, a capacidade
antioxidante da substância é proporcional ao valor do potencial de redução (CARVALHO,
2004).
A ressonância de spin de elétron é um método que utiliza substâncias com
propriedades paramagnéticas. Ex: radicais superóxido (O
2
−•
) produzidos in situ pela xantina
oxidase (XOD) (Figura 7).
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36
Figura 7 – Xantina Oxidase
Na literatura, encontram-se vários trabalhos que utilizam os métodos de varredura de
radicais DPPH
•
e ABTS
+
em paralelo para avaliar a capacidade antioxidante de várias
categorias de amostras (SHUI e LEONG, 2002; GORINSTEIN et al., 2003; KATALINIC et
al., 2004; MILIAUSKAS et al., 2004). Estes dois métodos são os mais utilizados para avaliar
o potencial antioxidante de materiais biológicos por apresentarem excelente estabilidade em
determinadas condições do ensaio e serem fáceis de implementar em laboratórios
fitoquímicos (ARNAO, 2000).
2.4.2 ABTS
•+
Segundo RE e colaboradores (1998), quando o método utilizando o cátion radical
ABTS
+
[2,2’-azinobis (3-etilfenil-tiazolina-6-sulfonato)] (Figura 8) tem como referencial
comparativo o antioxidante padrão chamado de TROLOX
®
(2-carbóxi-6-hidróxi-2,5,7,8-
tetrametilcromano), um análogo hidrossolúvel da vitamina E, o ensaio passa a ser conhecido
como TEAC - Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (capacidade antioxidante equivalente
a do TROLOX
®
). O TROLOX
®
(figura 1) é uma substância solúvel em tampão e considerada
um potente antioxidante. A atividade dos compostos testados é expressa em valores de TEAC,
definido como a concentração de
TROLOX
®
que possui a mesma atividade que 1 mM da
substância em teste
(
ARTS et al., 2004, OBÓN et al., 2005).
HN
N
H
N
H
N
O
O
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37
N +
S
C
2
H
5
N N
N
S
C
2
H
5
SO
3
-
-O
3
S
NH
4
+
NH
4
+
.
Figura 8 – Estrutura do cátion radical [2,2’-azinobis (3-etilfenil-tiazolina-6-sulfonato)] ou ABTS
+
Fonte: Adaptado de TAKEBAYASHI et al. (2006).
Neste teste, a solução de ABTS
+
tem a função de formar um radical colorido; então, a
esta solução adiciona-se um antioxidante (extrato que se pretende testar), e, depois de um
tempo determinado, dosa-se por espectrofotometria a concentração de radicais formados do
ABTS
+
restante na solução, medindo-se a absorbância em comprimento de onda de 734 nm.
Então se faz o mesmo com uma amostra de TROLOX
®
e comparam-se os resultados. Assim,
uma curva similar da dose-resposta pode ser obtida com ambos os cromógenos quando estes
antioxidantes são usados como padrão (EREL, 2004; ARTS et al., 2004).
O ABTS
+
é solúvel tanto em meio aquoso quanto em meio orgânico, e pode medir a
capacidade antioxidante de compostos tanto de natureza hidrofílica quanto lipofílica. Sua
solubilidade e estabilidade são tão boas quanto às reações com ele geradas.
2.4.3 DPPH
•
O radical DPPH
•
(Figura 9) é um radical livre gerado de forma similar ao ABTS
+
, por
reações químicas ou enzimáticas. Ele é solúvel apenas em meio orgânico, isto é uma limitação
importante quando se trata de antioxidantes de origem hidrofílica. É um cromógeno muito
estável que apresenta um pico de absorbância em 515nm, mais as metodologias utilizadas
podem variar bastante (ARNAO, 2000; ZHUANG et al., 1999).
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38
N
NO
2
NO
2
O
2
N
N
.
Figura 9 – Estrutura do radical 1,1-difenil-2-(2,4,6-trinitrofenil) hidrazila ou DPPH
•
.
Fonte: Adaptado de TAKEBAYASHI et al. (2006).
No método de DPPH
•
, O radical livre 1,1-difenil-2-(2,4,6-trinitrofenil) hidrazila ou
DPPH
•
é um radical estável, o radical livre DPPH
•
(Figura 3) é produzido diretamente no
meio orgânico e quando em contato com substâncias antioxidantes, há o seqüestro do radical
DPPH
•
o que é evidenciado por meio da descoloração da solução, caracterizando a reação de
redução (MOLYNEUX, 2004).
MENSOR e colaboradores (2001) consideraram o método DPPH
•
rápido e fácil para
avaliar a presença de antioxidante na amostra. A grande vantagem deste método consiste na
sua rápida preparação realizada em temperatura ambiente, eliminando, assim, qualquer risco
de degradação térmica das moléculas em estudo (BONDET et al., 1997). O mecanismo
reacional entre o antioxidante e o DPPH
•
depende da conformação estrutural do antioxidante
(BRAND-WILLIAWS et al., 1995). Para melhor compreensão dos mecanismos que
envolvem o DPPH
•
e o antioxidante é importante à caracterização química das substâncias
intermediárias e finais da reação.
A reação de determinados compostos com DPPH
•
acontece rapidamente e, no caso de
compostos fenólicos, parece que a redução do número de moléculas de DPPH
•
está associada
ao número de hidroxila disponível na amostra. A impossibilidade da dissolução do DPPH• em
meio aquoso torna-se uma limitação para estudo de antioxidantes hidrofílicos. No entanto, é
um excelente método in vitro para investigar a atividade seqüestradora de radicais de
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39
moléculas que possuam em seu mecanismo de ação a capacidade de doar átomos de
hidrogênio para o radical (ARNAO, 2000).
2.4.4 Rubreno
Outra forma de realização da caracterização antioxidante é pelo método do 5,6,11,12-
tetrafenilnaptaceno ou rubreno (Figura 10). Este método já foi utilizado para testar atividade
antioxidante de substâncias isoladas de plantas (GREGIANINI et al., 2003) ou de frutos (OH
et al., 2006). O rubreno é um hidrocarboneto policíclico sensível à radiação UV, emitida pela
luz branca visível. Pode ser preparado em solução com clorofórmio, tendo coloração
alaranjada e que, ao ser exposta à luz, reage formando oxigênio singlete que oxida a solução e
faz com que esta se torne transparente. A perda na coloração é proporcional à intensidade de
exposição à luz (GREGIANINI et al., 2003).
Figura 10 – Estrutura química do
(5,6,11,12-tetrafenilnaptaceno) ou
Rubreno.
Fonte: Adaptado de ARELLANO (2006).
Ao se adicionar uma substância que tenha capacidade antioxidante ou mais
especificamente, varredor de oxigênio singlete, espera-se que ela detenha os efeitos da foto-
oxidação da solução de rubreno. Para efeito de comprovação, utiliza-se uma substância com
reconhecida ação varredora de oxigênio singlete como padrão antioxidante.
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40
Uma destas substâncias é o 1,4-diazabiciclo (2,2,2) octano (DABCO) (figura 11), um
antioxidante conhecido na literatura pelo seu efeito anti-oxigênio singlete. Contudo, o β-
caroteno, que também possui este efeito, pode ser utilizado como padrão no ensaio
(GREGIANINI et al., 2003).
N
N
Figura 11 – Estrutura química do DABCO
Fonte: Adaptado de KRATZERT e IBOLD (2000).
2.4.5 Sistema β-caroteno/ácido linoléico
Um outro sistema de rápida seleção de substâncias e/ou misturas de antioxidantes é o
sistema de co-oxidação do β-caroteno (Figura 1) com o ácido linoléico (Figura 12). Este
método avalia a atividade de inibição de radicais livres gerados durante a peroxidação do
ácido linoléico. O método está fundamentado em medidas espectrofotométricas de
descoloração (oxidação) do β-caroteno induzidas pelos produtos de degradação oxidativa do
ácido linoléico (DUARTE-ALMEIDA et al., 2006).
Figura 12 – Estrutura química do acido linoléico
O
H
O
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41
2.4.6 FRAP
O método de FRAP (habilidade de redução do ferro sérico) é outro método simples
para caracterizar a capacidade antioxidante total do plasma, medindo a eficiência dos
antioxidantes contidos na amostra em reduzir o ferro na presença de diferentes fatores
enzimáticos e não enzimáticos. O método avalia diretamente a capacidade de antioxidantes
em reduzir um complexo férrico (Fe
3+
) a complexo ferroso (Fe
2+
) em pH baixo. O resultado
em coloração azul pode ser medido espectrofotometricamente em 593nm e tida como
linearmente relacionadas com a total redução da capacidade de doar elétrons dos
antioxidantes (OU et al., 2002; GUO et al., 2003).
A principal desvantagem desta abordagem é que a medida da capacidade redução não
necessariamente reflete a atividade antioxidante. Uma vez que o método não inclui um
substrato oxidável, não fornece informações sobre a propriedade de proteção dos
antioxidantes. A vitamina C (Figura 3) e o ácido úrico (Figura 13), por exemplo, reduzem
Fe
3+
a Fe
2+
. Já um antioxidante que reduz efetivamente um pró-oxidante não reduz,
necessariamente, Fe
3+
a Fe
2+
. As limitações do método são: nem todo redutor que é hábil para
reduzir Fe
3+
a Fe
2+
é antioxidante; nem todo antioxidante tem a habilidade específica para
reduzir Fe
3+
a Fe
2+
, como por exemplo, a glutationa (FRANKEL e MEYER, 2000;
VASCONCELOS et al., 2007).
Figura 13 – Estrutura química do acido úrico.
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42
2.4.7 TRAP
O método de TRAP (potencial de absorção de radicais), introduzido por WAYNER et
al. (1985), é utilizado para determinar o potencial de absorção total de radicais livres
circulantes. É baseado na determinação do intervalo de tempo que o soro pode resistir à
indução de peroxidação lipídica. Mede-se a formação de radicais peróxidos, que podem ser
detectados por meio da reação de quimiluminescência. Pode ser um marcador de início de um
desequilíbrio entre oxidantes e antioxidantes no soro ou plasma. Quando um extrato vegetal é
testado pelo método de TRAP, a reação é inibida por um tempo diretamente proporcional ao
potencial antioxidativo do radical peróxido capturado pela amostra (NICULESCU et al.,
2001; WAYNER et al., 1985).
2.4.8 ORAC
O método de ORAC foi desenvolvido e validado utilizando fluoresceína (Figura 15)
como prova fluorescente (OU et al., 2001). Esta modificação fornece uma medida direta
rompendo a cadeia hidrofílica, e determina a capacidade antioxidante contra radical peróxido.
Pode-se utilizar também a proteína Phycoerythrin (PE) ou Ficoeritrina (Figura 16),
fotossintética, marcadora de fluorescência, como alvo dos radicais.
Figura 14 – Estrutura química da Fluoresceína
O
O
HO
N
C
S
OHO
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43
Figura 15 – Estrutura química da Phycoerythrin (PE) ou Ficoeritrina
O ORAC mede a diminuição da emissão de fluorescência de PE adicionada ao plasma
em presença de um composto azo, gerador de radicais. A habilidade antioxidante do plasma é
calculada a partir da medida da área sob a curva de decaimento da fluorescência (“Area Under
the Fluorescence Decay Curve” – AUC, com emissão a 565 nm) comparada ao padrão que, na
maioria das vezes, é o TROLOX
®
. A PE também pode ser oxidada utilizando-se AAPH ou
2,2’-Azobis (2-metilpropanoamidina) (Figura 17) para gerar radical peroxila, ou ainda,
adicionando-se íons Cu
+
como redutores para gerar radicais hidroxila (VASCONCELOS et
al., 2007).
Figura 16 – AAPH ou 2,2’-Azobis (2-metilpropanoamidina)
No entanto, normalmente não é possível determinar diretamente a contribuição dos
fitonutrientes para o valor total de ORAC. O método fornece informações substanciais no que
diz respeito à capacidade antioxidante de compostos puros, tais como antocianidinas,
flavonóides, cafeína e matriz alimentar complexa tais como vegetais, frutos e chás, e aveia.
N
H
N
H
N H
2
N
H
O
O
OH
OH
H
O
N
N
N
H
N
NH
2
H
2
N
H
2HCl
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44
Além disso, o método de ORAC é útil para avaliar a influência das temperaturas de cultivo e
armazenagem sobre a atividade antioxidante de morangos (CAO et al., 1993; CAO et al.,
1998).
2.4.9 Atividade Varredora de Superóxido (AVS)
Há também o ensaio para avaliação da atividade varredora do ânion radical superóxido
(O
2
−•
) onde estas são geradas durante o metabolismo de organismos aeróbicos, seja como
produtos finais de reações enzimáticas ou acidentalmente como produtos celulares
secundários de reações redoxes. Estes radicais são uma fonte potencial de lesões, pois podem
agir diretamente sobre alvos biológicos ou indiretamente iniciando a produção de espécies
altamente reativas de oxigênio, como o
1
Δ
g
O
2
(oxigênio singlete) ou OH
-
(radical hidroxila).
Neste ensaio, o ânion radical superóxido (O
2
-•
) é gerado pelo sistema PMS-NADH (Phenazine
methosulfate e Nicotinamina Adenina Dinucleotídeo) (Figuras 18), reduzidos pela oxidação
do Nitro Blue Tetrazolium (NBT) (Figura 19) (EWING e JANERO, 1995; OZTURK et al.,
2007).
Figura 17 - Phenazine methosulfate (PMS) e Nicotinamina Adenina Dinucleotídeo (NADH)
NN
CH
3
OSO
3
(1)
(2)
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45
Figura 18 –
Estrutura química do radical NBT
+
(Nitro Blue Tetrazolium), utilizada no ensaio
para caracterização de atividade varredora de ânion radical superóxi
do.
Fonte: Adaptado de ARELLANO (2006).
A primeira linha de defesa contra a toxicidade do oxigênio é, portanto, a remoção de
radical ânion superóxido antes que a formação de outros produtos nocivos possa ocorrer. As
superóxido dismutases são considerados como as principais enzimas de defesa presentes nas
células, pois varrem o radical ânion superóxido (POLLE et al., 1989).
Embora o radical ânion superóxido não possa iniciar diretamente a oxidação lipídica,
ele é parte integrante deste processo. Este ensaio utiliza a varredura de O
2
−•
, pois, na presença
de íons metálicos, os radicais hidroxila altamente reativos, podem ser gerados pela reação de
Fenton, ilustrada abaixo:
O
2
-
+ Fe
3+
→ O
2
-
+ Fe
2+
Fe
2+
+ H
2
O
2
→ Fe
3+
+ OH
-
+ OH
•
Contudo, a varredura de O
2
−•
não é o único mecanismo de inibição da oxidação
lipídica em sistemas biológicos. Portanto, sistemas de alimentos e compostos fenólicos em
extratos vegetais tendo propriedades as varredoras de O
2
−•
não são necessariamente eficazes
na prevenção de oxidação lipídica, mas podem ser consideradas uma espécie de antioxidante
especifico para uma espécie radicalar importante no estresse oxidativo de organismos vivos, o
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46
radical hidroxila. As propriedades varredoras de O
2
−•
foram empregadas para avaliar a
atividade dos polifenóis. Para além destas insuficiências, medições da capacidade varredora
de superóxido devem ser interpretadas com cautela, pois não pode haver equilíbrio alcançado
quando são gerados radicais superóxido continuamente durante o ensaio (FRANKEL e
MEYER, 2000).
2.4.10 Ensaios biológicos
Os testes químicos são mais rápidos e simples de serem executados, mas embora estes
sejam relativamente simples para avaliação da capacidade antioxidante, não são muito
representativos das condições celulares do homem. Por outro lado, ensaios microbianos,
utilizando-se, principalmente, células eucarióticas da levedura Saccharomyces cerevisiae têm
se mostrado muito adequado para determinação da capacidade antioxidante de diferentes
compostos, fornecendo resultados rápidos, reprodutíveis e passíveis de serem correlacionados
ao observado no homem (SOARES et al., 2005).
A avaliação da capacidade antioxidante empregando animais de laboratório é, em
geral, de difícil execução e necessita de um número elevado de animais para assegurar
resultados estatisticamente significativos. Já os ensaios realizados com microorganismos são
fáceis, rápidos e podem utilizar um grande número de células com as mesmas características
genéticas.
2.4.11 Saccharomyces cerevisiae
Várias razões tornaram a levedura Saccharomyces cerevisiae um dos melhores
modelos de sistema eucariótico unicelular para estudos de estresse oxidativo. Seu
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47
metabolismo é semelhante ao de eucarióticos superiores, com mecanismos próprios de
ativação metabólica (citocromo P450) e de detoxificação, que não estão presentes em
bactérias. Os ensaios em células eucarióticas permitem a avaliação da atividade antioxidante
de inúmeros compostos de forma rápida, econômica e reprodutível e os resultados obtidos
podem ser mais facilmente extrapolados para o homem do que os obtidos em testes in vitro
(SOARES et al., 2005).
A avaliação da capacidade antioxidante pode ser feita pela medida da sobrevivência de
células tratadas com os antioxidantes em presença e ausência de agentes estressores (Figura
20), como por exemplo, a apomorfina e o paraquat (BENZIE e SZETO, 1999; WANG et al.,
1999; ESPIN et al., 2000; SOARES et al., 2005). A Saccharomyces cerevisiae é um
microorganismo que pode ser modificado geneticamente de modo a se tornar sensível à
oxidação. O uso desses microorganismos como modelo biológico é particularmente atrativo
por causa da facilidade na manipulação genética, na disponibilidade da seqüência genômica
completa da Saccharomyces cerevisiae e da conservação aparente de mecanismos
moleculares entre a levedura e as células humanas. Aproximadamente 30% dos genes
associados a doenças humanas combinam significativamente genes da levedura e, no
contraste com seres humanos, os genes da levedura podem facilmente ser manipulados com as
técnicas de biologia molecular (SILVA et al., 2005).
Figura 19 – Principais agentes estressores utilizados em ensaios biológicos: (1) tetracloreto de
carbono, (2) APAP, acetoaminofeno ou paracetamol, (3) Paraquat e (4) Aloxano.
C
Cl
Cl
Cl
Cl
(1)
HO
NH
O
(2)
N
N
H
3
C
CH
3
Cl Cl
(3)
N
N
O
O
OO
H
H
(4)
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48
2.4.12 Modelo de estresse em ratos Wistar
Os ensaios biológicos também podem ser realizados com roedores como o rato Wistar,
onde algumas substâncias são utilizadas para gerar lesão tecidual, denominadas agentes
estressores, pois induzem à formação de radicais livres e, conseqüentemente, estresse
oxidativo, causando, como dano primário, alterações nos constituintes plasmáticos, devido
principalmente a peroxidação de lipídeos (FERREIRA e MATSUBARA, 1997).
O Paracetamol (Figura 19), ou APAP, é a droga de escolha para lesar os hepatócitos
por mecanismo oxidativo. É um antipirético e analgésico eficaz quando utilizado em nível
terapêutico, mas uma overdose aguda ou crônica pode causar lesões severas no fígado, com a
possibilidade de falência do órgão. Além de sua relevância clínica, o APAP é utilizado
extensivamente como modelo de toxina para avaliar agentes hepatoprotetores. Doses tóxicas
de APAP levam ao estresse oxidativo do fígado (NORIEGA et al., 2000).
O tetracloreto de carbono (Figura 19) possui uma ação parecida com a do paracetamol
(APAP), causando lesão no fígado, alterando constituintes do plasma e elevando os níveis de
biomarcadores do estresse oxidativo, tais como o MDA (malondialdeído). Isto é facilmente
caracterizado por meio das dosagens de biomarcadores tais como Malondialdeído (MDA),
Hidroperóxidos, entre outros (DADKHAH et al., 2006; KADIISKA et al., 2005a; KADIISKA
et al., 2005b; WANG et al., 2007).
O acetoaminofeno, o aloxano e a estreptozootocina (Figura 20) são substâncias
comumente utilizadas quando o estudo visa testar também drogas hipoglicemiantes e que
possam combater os efeitos do diabetes. Essas drogas também levam a alteração de
marcadores do estresse oxidativo em ratos. Eles atuam sobre as células β do pâncreas,
danificando-as, e levando a uma hiperglicemia diabética induzida por estresse oxidativo
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49
(Figura ) (COSTA et al., 2004; DELFINO et al., 2002; KIM et al., 2006; MAZZANTI et al.,
2003).
Figura 20 – Estrutura química da estreptozootocina.
Em todos os casos de estresse induzido, os animais são tratados por grupos. Um grupo
controle negativo composto por ratos saudáveis e que não recebem nenhum tratamento, cujos
valores obtidos nas dosagens dos biomarcadores de estresse oxidativo, servirão de valores
basais para todos os outros grupos. Um grupo controle positivo, composto por animais que
recebem droga de indução do estresse, fornecerá valores usados como referência dos danos
causados pelo estresse induzido, como o tetracloreto de carbono (CCl
4
), aloxano e a
estreptozootocina. Os animais são tratados com o antioxidante do qual se pretende
caracterizar a atividade antioxidante, seja um antioxidante padrão de atividade conhecida,
como a N-acetilcisteína, ou um extrato vegetal a ser testado. As dosagens dos biomarcadores
de estresse medidos são comparados entre os grupos, e então é estimada a eficácia de cada
amostra (CAO et al., 1998; KADIISKA et al., 2005a; KADIISKA et al., 2005b).
SHO
OH
HN
O
Figura 21 - Estrutura química da N-acetilcisteína.
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50
3. OBJETIVOS
3.1 Geral
Comparar metodologias utilizadas na caracterização de atividades antioxidantes de
espécies de plantas amazônicas.
3.2 Específicos
3.2.1 Realizar ensaios químicos (DPPH, ABTS, AVS e Rubreno) e biológicos (indução de
estresse em leveduras Saccharomyces cerevisiae e ratos Wistar) capazes de caracterizar as
atividades antioxidantes de extratos de plantas amazônicas;
3.2.2 Comparar as atividades antioxidantes entre as espécies: Byrsonima japurensis A.
Juss., Calycophyllum spruceanum Benth., Derris floribunda Benth., Maytenus guianensis
Klotzch., Passiflora nitida Kunth L., Petiveria alliacea L. e Ptychopetalum olacoides Benth.;
3.2.3 Elaborar um protocolo experimental para caracterização da atividade antioxidante em
extratos vegetais.
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51
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Materiais
4.1.1 reagentes
Água miliq, utilizada foi preparada usando um Millipore Milli-RO 12 plus (sistema
Millipore Corp, MA, EUA). Todos os reagentes e solventes foram da mais alta pureza
disponível, tendo sido obtidos a partir da Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, EUA).
4.1.2 Equipamentos
Espectrofotômetros utilizados: Ultrospec 2000 UV/Vis Spectrophotometer (Pharmacia
Biotech, Cambridge, England); CELM modelo E-225D (CELM, Barueri – São Paulo, Brasil)
e leitor de microplacas Thermoplate (TP-Reader, Thermoplate, Itália). Auto-analizador de
bioquímica Cobas
®
Mira plus (Roche
®
Corporation). Pipetas monocanal e multicanal
Eppendorf (Eppendorf do Brasil Ltda. – São Paulo, Brasil). Autopurificador de água
Millipore Milli-RO 12 plus (Millipore Corp, MA, EUA).
4.2 Modelo de Estudo
O modelo de estudo utilizado foi do tipo experimental e prospectivo, visando
comparar técnicas de caracterização de atividades antioxidantes de espécies de plantas da
Amazônia.
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52
4.3 Obtenção das Amostras
4.3.1 Plantas
A escolha das plantas foi efetuada por meio de estudos fitoquímicos prévios e
atividades biológicas correntes na literatura científica. Após elaboração dos extratos, foi
realizado um teste rápido, (qualitativo) para determinação da presença de antioxidantes nos
extratos. Este teste baseou-se na borrifação da placa cromatográfica, previamente eluída e
seca contendo o extrato vegetal, com uma solução 0,2 % de 2,2-difenil-1-(2,4,6-trinitrofenil)
hidrazila (DPPH) em metanol (MeOH). Após 5 min, a placa adquiriu a coloração púrpura, que
contrastou ou não com um tom amarelo quando da presença de antioxidantes nas amostras
previamente eluídas na mesma (AL-DABBAS et al., 2006; CUENDET e HOSTETTMANN,
1997). A seguir, a relação de plantas das quais foram preparados extratos brutos utilizados
neste trabalho com seus respectivos números de depósitos:
• Byrsonima japurensis A. Juss. (127281), família Malpighiaceae (Saratudo);
• Calycophyllum spruceanum Benth. (174714), família Rubiaceae (Mulateiro);
• Derris floribunda Benth. (120839), família Fabaceae (Timbó-rana);
• Maytenus guianensis Klotzch. (157502), família Celastraceae (Chichuá);
• Passiflora nitida Kunth L. (209547), família Passifloraceae (Maracujá-do-
mato);
• Petiveria alliacea L. (204569), família Phytolacaceae (Mucura-caã);
• Ptychopetalum olacoides Benth. (138278), família Olacaceae (Muirapuama).
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53
4.3.2. Identificação das plantas
As plantas coletadas foram identificadas taxonomicamente pelo MSc. Carlos Alberto
Cid Ferreira e MSc. Carlos Henrique Franciscon, ambos do CPBO/INPA, e as suas
respectivas exsicatas foram depositadas no herbário do Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazônia (INPA) e no herbário da Universidade Federal do Amazonas (UFAM).
4.3.3. Coleta das plantas
As amostras das plantas foram coletadas em diversos locais. A espécie Derris
floribunda Benth. (Fabaceae) foi coletada na Praia Dourada, na cidade de Manaus-AM. As
espécies Calycophyllum spruceanum Benth. (Rubiaceae), Byrsonima japurensis A. Juss.
(Malpighiaceae), Passiflora nitida Kunth L. (Passifloraceae) e Petiveria alliacea L.
(Phytolacaceae) foram coletadas no Lago do Purupuru no município de Careiro Castanho, no
interior do Estado do Amazonas. As espécies Maytenus guianensis (Xixuá) e Ptychopetalum
olacoides Benth. (Olacaceae) foram coletados em região próxima à cidade de Benjamin
Constant, no estado do Amazonas. As amostras das espécies e suas respectivas exsicatas
foram depositadas no herbário do INPA.
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54
Figura 7 - Lago do Purupuru, Careiro Castanho - AM
Fonte - Google Earth, 2007.
4.3.4 Obtenção dos extratos
Para a preparação de seus respectivos extratos, as folhas ou cascas foram limpas,
separadas e secas em temperatura ambiente, e, nos caso de algumas das espécies utilizadas,
secas em estufa com circulação de ar em temperatura de 45°C por 48 horas. Em seguida
trituradas com auxílio de um moinho de facas e deixadas sob maceração, primeiro com etanol
na proporção de 2% (p/v) e depois com água. Com algumas espécies a extração foi auxiliada
pelo uso de ultra-som por 20 min e repetido duas vezes para cada solvente. A solução
extrativa foi filtrada e o solvente evaporado em evaporador rotativo sob pressão reduzida e
baixa temperatura, e em seguida liofilizado até a obtenção de um pó seco o qual foi utilizado
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55
nos ensaios antioxidantes (CANNELL, 1998; SIMÕES et al., 2004). O procedimento de
extração encontra-se detalhado na tabela 1 e ilustrado na Figura 8.
Tabela 1 – Métodos de extração para cada espécie de planta selecionada.
Espécies estudadas
Parte
utilizada
Solvente Secagem Extração Tempo
Evaporação de
solventes
Byrsonima japurensis A.
Juss. (Malpighiaceae)
Casca
EtOH e
H
2
O
Estufa – T.A. Maceração a frio. 48h
Rotaevaporador e
liofilização
Calycophyllum
spruceanum Benth.
(Rubiaceae)
Casca
EtOH e
H
2
O
Estufa – T.A. Maceração a frio. 48h
Rotaevaporador e
liofilização
Derris floribunda Benth.
(Fabaceae)
Folha
EtOH e
H
2
O
Estufa - ar
quente (45ºC /
48h)
Maceração, com
auxilio de banho
em ultra-som.
20min
Rotaevaporador e
liofilização
Maytenus guianensis
Klotzch. (Celastraceae)
Casca EtOH
Estufa - ar
quente (45ºC /
48h)
Maceração, com
auxilio de banho
em ultra-som.
20min
Rotaevaporador e
liofilização
Passiflora nitida Kunth
L. (Passifloraceae)
Folha
EtOH e
H
2
O
Estufa – T.A.
Maceração a frio. 48h
Rota evaporador e
liofilização
Petiveria alliacea L.
(Phytolacaceae)
Folha
EtOH e
H
2
O
Estufa – T.A.
Maceração a frio. 48h
Rota evaporador e
liofilização
Ptychopetalum olacoides
Benth. (Olacaceae)
Folha
EtOH e
H
2
O
Estufa - ar
quente (45ºC /
48h)
Maceração, com
auxilio de banho
em ultra-som.
20min
Rota evaporador e
liofilização
1. SECAGEM 2. TRITURAÇÃO
4. ROTAEVAPORADOR 3. ULTRASSON
Figura 23 - Processo de preparação de extratos de plantas (folhas e raízes).
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56
4.4 Realização de ensaios antioxidantes
4.4.1 Determinação de polifenóis totais
A determinação do teor de fenóis totais presentes nas amostras de extrato etanólico das
espécies estudadas foi feita por meio de espectrofotometria utilizando o método de Folin–
Ciocalteu segundo SINGLETON e ROSSI (1965) com modificações. Sucintamente, utilizou-
se uma amostra de 100µL de extrato vegetal colocando-se em um tubo de ensaio. Em seguida
adicionou-se 400µL de H
2
O destilada e 160µL do reativo de Folin-Ciocalteau. Após
homogeneizar em vortex adicionou-se 4mL de carbonato de sódio a 10,6%. Incubou-se por 3
min, e mediu-se absorbância em 715nm em espectrofotômetro (E-225D, CELM, Barueri –
São Paulo, Brasil). O teor de polifenóis totais (FT) foi expresso como miligrama (mg) de
EAG (equivalentes de acido gálico) por grama (g) de extrato. Todas as análises foram
realizadas em triplicata (SINGLETON e ROSSI, 1965; VELIOGLU et al., 1998).
O teor de polifenóis totais (FT) também foi apresentado em percentagem (%) de
polifenóis presentes na amostra, obtido por meio da fórmula:
% Polifenóis = Abs
amostra
x 100
Abs
padrão
4.4.2 Teste do 2,2-difenil-1-(2,4,6-trinitrofenil)hidrazila ou DPPH
•
O ensaio foi realizado segundo MOLYNEUX (2004) com pequenas modificações o
qual foi adaptado para realização em microplaca de 96 poços. Inicialmente preparou-se uma
solução de DPPH 0,8 mM em metanol (MeOH). Com o auxilio de pipetas multicanal, cada
poço da microplaca recebeu um volume final de 350 µL, sendo 250 µL do extrato dissolvido
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57
em metanol ou somente metanol para o poço controle e 100 µL de DPPH a 0,8 mM. Todas as
amostras foram testadas em triplicata. Inicialmente foi realizada uma leitura apenas do extrato
que foi utilizada como branco no teste. Após a adição do DPPH, incubou-se em temperatura
ambiente e no escuro por 30 min e fez-se a leitura em um leitor de microplacas (TP-Reader,
Thermoplate, Itália) em 517 nm (Figura 9). Utilizou-se o ácido ascórbico como antioxidante
padrão, e como controle 250 µL de MeOH. Os resultados de atividade antioxidante foram
obtidos no Excel, através da seguinte fórmula:
%AA= 100 - Abs
amostra
– Abs
branco
x 100
Abs
controle
A atividade antioxidante de cada extrato foi expressa como equivalentes g de ácido
ascórbico / g de extrato seco. Foi considerado com forte atividade antioxidante, qualquer
extrato com valor superior a 20 mEq g ácido ascórbico / g de extrato seco (BONDET et al.,
1997; MENSOR et al., 2001; MOLYNEUX, 2004; TIEPPO et al., 2006).
1 – MICROPLACAS COM TESTES 2 – LEITORA DE MICROPLACAS
Figura 24 - Modelo de adaptação de ensaio in vitro para caracterização de atividade antioxidante de
espécies de plantas para realização em microplacas.
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58
4.43 Teste de varredura do radical 2,2’-azinobis (3-etilfenil-tiazolina-6-sulfonato) ou ABTS
+
O método foi baseado na redução do ABTS [2,2’-azinobis (3-etilfenil-tiazolina-6-
sulfonato)] e realizado segundo RE et al. (1998).
4.4.3.1 Preparo dos reagentes
Sucintamente, realizou-se o ensaio com uma solução de ABTS
+
oxidado obtida através
da dissolução de 10mg de ABTS em 5ml de água adicionada a uma solução de persulfato de
potássio 5 mmol/L. A solução de persulfato de potássio (K
+
) a 5mmol/L foi preparada
adicionando-se 0,0676g de persulfato de K
+
em 50mL de H
2
O. O reativo, então, foi preparado
adicionando-se partes iguais (1:1) da solução de ABTS
+
e da solução de persulfato de K
+
5mmol/L. A mistura foi incubada a T.A. e ao abrigo da luz por 24h (RE et al., 1998).
4.4.3.3 Realização do ensaio
O ensaio foi realizado em microplacas de 96 poços, onde, com o auxilio de pipetas
multicanal, cada poço recebeu 40μL de ABTS
+
oxidado, 60μL de água deionizada e 250µL do
extrato vegetal na concentração de 0,1 a 10 mg/mL em água deionizada ou somente água no
poço controle. Todas as amostras foram testadas em triplicata. Inicialmente foi realizada uma
leitura apenas do extrato que foi utilizada como branco no teste. Após a adição do ABTS,
incubou-se em temperatura e luz ambiente por 15min, fez-se a leitura em um leitor de
microplacas (TP-Reader, Thermoplate, Itália) em 714nm (RE et al., 1998). Utilizou-se o
TROLOX
®
como antioxidante padrão. A atividade antioxidante foi calculada pela seguinte
fórmula:
%AA= 100 - Abs
amostra
– Abs
branco
x 100
Abs
controle
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59
A atividade antioxidante de cada extrato fora expressa como mEquivalentes g de
TROLOX
®
/ g de extrato seco. Considerou-se como atividade antioxidante, qualquer extrato
com valor superior a 20 mEq TROLOX
®
/grama de extrato seco (ARTS et al., 2004; CAI et
al., 2004; EREL, 2004; RE et al., 1998).
4.4.4 Atividade varredora de ânion radical superóxido (AVS)
O método utilizado para avaliar a capacidade varredora de ânions radicais superóxido
foi o de OZTURK et al. (2007) com pequenas modificações nos volumes para realização do
ensaio em microplacas (figura 9).
4.4.4.1 Preparo dos reagentes e amostras
Utilizou-se um solvente preparado com tampão TRIS-HCl (16mM), adicionando-se
0,1936g de TRIS em 100 mL de tampão, com pH ajustado para 8,0 adicionando-se ácido
clorídrico (HCl). O reagente Nitro Blue Tetrazolium (250 μM), foi preparado dissolvendo-se
1 tablete de NBT em 60 mL do tampão TRIS-HCl. O reagente NADH (390 µM) foi
preparado adicionando-se 5,5 mg de NADH a 20 mL de tampão TRIS-HCl. O Phenazine
methisulfate (PMS) 10 µM foi preparado dissolvendo-se 3 mg em 100 mL de tampão TRIS-
HCl. As amostras de extrato vegetal foram preparadas nas concentrações de 0,1 a 10 mg/mL
em água deionizada ou somente água no poço controle.
4.4.4.2 Realização do ensaio
Com o auxilio de pipetas multicanal, em cada poço de um microplaca adicionou-se 50
μL de amostra dos extratos a serem testados, e em seguida 100 μL da solução de NBT
(250μM), em seguida 100μL da solução de NADH (390μM). Realizou-se a leitura da
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60
absorbância da placa em leitor de microplacas (TP-Reader, Thermoplate, Itália) em 560nm
(A1). Em seguida adicionou-se 100μL da solução PMS (10μM) e incubou-se por 5min a 25
ºC e realizou-se nova leitura das absorbâncias (A2) (OZTURK et al., 2007). O cálculo de
inibição foi feito de acordo com a seguinte fórmula:
%AA= 100 - Abs
amostra
– Abs
branco
x 100
Abscontrole
Figura 25 – Ensaio para caracterização de atividade varredora de ânion radical superóxido em
espécies de plantas realizado em microplacas.
4.4.5 Teste de varredura do oxigênio singlete
O teste do rubreno foi realizado segundo condições previamente padronizadas. O
rubreno é uma substância capaz de formar oxigênio singlete, ele oxida com a incidência de
luz visível. Sua solução preparada em clorofórmio (CHCl
3
) tem uma coloração
laranja/avermelhada, e ao oxidar torna-se incolor. O princípio deste teste é adicionar uma
substância que tenha capacidade fotoprotetora/antioxidante, espera-se que ela proteja a
solução de rubreno contra a fotooxidação pelo oxigênio singlete formado com a exposição à
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61
luz. Utilizou-se uma substância antioxidante padrão para efeito de comparação, a substância
de escolha foi o DABCO, rotineiramente usado em testes diagnósticos de agentes químicos e
bioquímicos envolvidos em processos oxidativos (GREGIANINI et al., 2003).
O testes foi realizado segundo GREGIANINI et al. (2003). Utilizou-se uma solução de
rubreno preparada em clorofórmio (CHCl
3
) a 0,8 mM, sem incidência de luz. O teste foi
executado em tubo de ensaio de vidro transparente, cada tubo contendo 2mL de solução de
Rubreno (0,8mM) e 20µL de extrato das espécies vegetais a serem testadas. Em seguida os
tubos foram mantidos a 20 cm de uma lâmpada fluorescente de 40 Watts por 120min a
temperatura ambiente. Utilizou-se o DABCO como antioxidante padrão. As absorbâncias das
soluções foram medidas, antes e após a exposição da luz em espectrofotômetro (E-225D,
CELM, Barueri – São Paulo, Brasil) em 440nm. Todos os ensaios foram realizados em
triplicata (figura 11). O cálculo de inibição foi realizado de acordo com a seguinte fórmula:
% Inibição = 100 – (A
2
amostra – A
1
amostra / A
2
controle– A
1
controle) x 100
1 – ESPECTROFOTOMETRO 2 – METODO DO RUBRENO
Figura 26 - Método do Rubreno para caracterização de atividade antioxidante e fotoprotetora de
espécies de plantas amazônicas com leitura em espectrofotômetro.
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4.4.6 Teste da Saccharomyces cerevisiae
O teste biológico para avaliação de atividade antioxidante dos extratos de plantas foi
realizado com cepas de leveduras da espécie Saccharomyces cerevisiae modificadas
geneticamente excluindo-se o gene que codifica a enzima catalase, tornando-as sensíveis ao
peróxido de hidrogênio. As cepas foram doadas pelo Prof. Luiz Netto do Instituto de Biologia
da Universidade de São Paulo - USP. As leveduras foram cultivadas em estufa, no laboratório
de micologia do Curso de Farmácia da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da UFAM.
Para a realização do teste, as amostras foram padronizadas a fim de se obter um
número conhecido de células para cada teste realizado, seguindo-se o protocolo M27-A2 da
NCCLS/CLSI – National Comitee For Clinical Laboratories Standars / Clinical and
Laboratory Standards Institute (NCCLS, 2002). Portanto, fez-se um repique de uma nova
cultura em meio YPD ágar (sólido), com no mínimo de 24h e no máximo de 48h de incubação
a 37ºC. Retirou-se uma pequena amostra deste cultivo, inoculando-a em 5 mL de soro
fisiológico estéril (inóculo A). A solução foi agitada em vortex com velocidade baixa por 5
min e foi lida a absorbância em espectrofotômetro (E-225D, CELM, Barueri – São Paulo,
Brasil) em 530 nm. Preparou-se a solução com absorbância em torno de 0,100 (= à
aproximadamente 1 a 5x10
6
células / mL).
Ilustração 1 – Preparação de inóculo inicial de Saccharomyces cerevisiae.
“VORTEX 15”
DENSIDADE CELULAR
ESPECTROFOTÔMETRO 530nm
SOLUÇÃO = 0,5 Mc FARLAND
INÓCULO A
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63
A partir do inóculo inicial, transferiu-se 0,3 mL deste inóculo já ajustado (0,100 de
absorbância) para um tubo contendo 2,7 mL de caldo YPD (diluição 1:10). Em seguida,
transferiu-se 2,5 mL da solução acima para um tubo falcon contendo 47,5 mL de caldo YPD
(diluição 1:20).
Ilustração 2 – Preparação do inóculo final em meio liquido YPD para teste em microplacas.
4.4.6.1 Teste qualitativo
Primeiramente, realizou-se um ensaio qualitativo para a verificação de uma possível
atividade antifúngica dos extratos. O teste executado foi bem simples e rápido, simplesmente
incubando-se amostras da levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae com os extratos que
pretendiam ser testados. O teste fora realizado em câmara asséptica pré-irradiada com luz
U.V. onde as cepas de Saccharomyces cerevisiae foram inoculadas em placas de Petri com
ágar YPD junto com os extratos das espécies de plantas a serem testadas. Adicionou-se 300
μL de inóculo com 10 μL de extrato vegetal diluído (10mg/mL) diluído em H
2
O-bidestilada.
Com o auxilio de uma alça de platina homogenizou-se a mistura por toda a superfície da
placa. Após a incubação por 24h em estufa a 37ºC, foi realizada a contagem de colônias para
determinar o nível de sobrevivência (figura 12 e 13).
2,7 ml
INÓCULO
CALDO YPD
0,3 ml
47,5 ml CALDO YPD + S. cerevisiae
2,5 ml
300 μl
Microplaca
Estéril
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64
Figura 27 - Modelo Qualitativo de ensaio com leveduras Saccharomyces cerevisiae para detecção de
atividade antifúngica presente nos extratos testados.
1 – CÂMARA ASSÉPTICA (U.V.) 2 – ESTUFA DE INCUBAÇÃO
Figura 28 - Câmara asséptica para realização de ensaio com leveduras da espécie Saccharomyces
cerevisiae.
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65
Os extratos que apresentaram atividade antifúngica seguiram diretamente para o teste
com indução de estresse oxidativo em animais (ratos Wistar) e foram descartados do teste
para caracterização de atividade protetora antioxidante com leveduras.
4.4.6.2 Teste quantitativo
Para os extratos que não apresentaram atividade antifúngica, a atividade antioxidante
foi avaliada após a incubação deste numa cultura de leveduras submetida a um sistema de
geração de estresse oxidativo por adição de peróxido de hidrogênio.
Com o auxilio de pipetas multicanal, distribuiu-se nas microplacas estéreis como
controle positivo 300 µL da solução acima. Cada poço contendo 300 µL de inóculo C (ou
caldo YPD para controle neg.), 40 µL de oxidante (H
2
O
2
18-20 mM ou H
2
O bidestilada para o
branco) e 10 µL de amostra a ser testada (extrato 300µg/mL em H
2
O bidestilada). Incubou-se
em estufa a 37ºC por 24h e fez-se a leitura em leitor de microplaca (TP-Reader, Thermoplate,
Itália). Para a realização do teste, todas as amostras foram realizadas em triplicata e
distribuídas nas microplacas da seguinte forma:
♦ Uma amostra controle
–
- somente caldo YPD;
♦ Uma amostra de controle
+
- YPD caldo e leveduras;
♦ Uma amostra de controle
+
com peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
2mM) - YPD
caldo com leveduras e H
2
O
2
;
♦ Um controle
+
e solvente utilizado na solução de extrato vegetal a ser testado -
H
2
O bidestilada;
♦ Um branco para controle da planta - controle
+
com amostra de extrato vegetal;
♦ O teste propriamente dito - controle
+
, extrato de planta (300µg/mL) e H
2
O
2
.
♦ Uma amostra padrão – controle
+
, ácido ascórbico (300µg/mL) e H
2
O
2
.
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66
Após o período de incubação (24h e 48h), compararam-se os níveis de sobrevivência
da levedura, medido no espectrofotômetro com comprimento de onda de 530nm, na presença
e ausência de extrato vegetal que se supõe ter atividade antioxidante. A determinação da
“turvação” do meio líquido indicou a presença de células vivas (leveduras). Um valor de
absorção igual a 1,0 contém de 2 a 5x10
6
células (NCCLS, 2002).
Figura 29 - Modelo quantitativo de ensaio in vivo em microplacas com leveduras Saccharomyces
cerevisiae para caracterização de atividade antioxidante presente nos extratos testados.
Nas amostras onde não houve turvação do meio (meio apresenta-se límpido), houve
morte celular por falta de atividade antioxidante do extrato testado. Foram considerados com
efeito antioxidante aqueles extratos que promoverem uma proteção maior que 10% da
atividade antioxidante do ácido ascórbico (SILVA et al., 2005).
4.4.7 Atividade antioxidante ex vivo
A fim de confirmar o resultado dos testes in vitro, foi realizado o ensaio antioxidante
em ratos Wistar com as espécies Callycophyllum spruceanum (Mulateiro) e Maytenus
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67
guianensis (Xixuá), conforme descrito abaixo (DADKHAH et al., 2006; KANTER et al.,
2005; MAZZANTI et al., 2003).
Foram elaborados seis grupos contendo 5 animais em cada grupo, com peso corporal
em torno de 200 g. Estes grupos foram distribuídos da seguinte forma:
♦ Grupo 1 - N-Acetilcisteina 200 mg/kg e CCl
4
(1200mg/kg de peso);
♦ Grupo 2 - C. spruceanum (+) 400 mg//kg;
♦ Grupo 3 - C. spruceanum 400 mg/kg + CCl
4
;
♦ Grupo 4 - C. spruceanum 200 mg/kg + CCl
4
;
♦ Grupo 5 - Controle (-) – animais não receberão nada;
♦ Grupo 6 - Controle (+) – animais receberão CCl
4
(azeite de oliva).
O Grupo 1 recebeu a solução de N-Acetilcisteina (solução de 1000 mg dissolvida em
500 mL de H
2
O destilada) como padrão antioxidante e hepatoprotetor, estimando-se uma dose
de 200 mg por kg ao dia para cada animal (figura 15). Os Grupos 2 e 3 receberam o extrato
etanólico de C. spruceanum (2000 mg de extrato para 500 mL H
2
O destilada) durante 4 dias
seguidos estimando-se uma dose de 400 mg por kg de peso corporal (figura 15). O Grupo 4
recebeu o extrato etanólico de C. spruceanum (1000 mg de extrato para 500 mL H
2
O
destilada) durante 4 dias seguidos, estimando-se uma dose de 200 mg por kg de peso corporal
(figura 15).
Os animais dos grupos 1, 2, 3 e 4 receberam os respectivos extratos durante 4 dias. As
dosagens foram estimadas levando-se em consideração um volume de aproximadamente 20
mL por dia de extrato consumido por cada rato Wistar com peso corporal em torno de 200 mg
de peso corporal. No 4º dia de tratamento, os grupos 1, 3, 4 e 5 receberam uma única dose de
tetracloreto de carbono (CCl
4
) 1200 mg/kg de peso diluído em azeite de oliva numa proporção
1:1 administrado por injeção intraperitonial, obedecendo ao volume máximo de 1,5 mL por kg
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68
de peso (CHANDAN et al., 2007; JODYNIS-LIEBERT et al., 2005; MURUGESH et al.,
2006).
Após 24 horas da administração do CCl
4
, os animais foram sacrificados com injeção
intraperitonial de hidrato de cloral a 30% para a coleta das amostras de 3 mL de sangue
venoso utilizando-se heparina por punção intracardíaca. As amostras foram imediatamente
processadas e analisadas para dosagem dos principais biomarcadores de estresse oxidativo
(MDA e GPx). Foram coletadas também amostras de tecido hepático reservadas em recipiente
contendo soro fisiológico refrigerado e mantidas em freezer a -4º C que foram posteriormente
analisadas por preparo de homogenato de tecido. Destas soluções também foram feitas
dosagens de MDA e GPx (CHANDAN et al., 2007; JODYNIS-LIEBERT et al., 2005;
MURUGESH et al., 2006).
As amostras colhidas para análise do estresse oxidativo foram imediatamente
processadas no Laboratório de Bioquímica Clínica do Curso de Farmácia da Universidade
Federal do Amazonas. As análises bioquímicas foram realizadas em um auto-analizador
Cobas Mira Plus (Roche corp.
®
).
Figura 30 – Extrato de espécie de planta amazônica (C. spruceanum) preparado em solução com água
destilada para teste de atividade antioxidante com animais (ratos da espécie Wistar).
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69
Figura 31 – Coleta de material biológico, sangue por punção cardíaca e amostra de tecido hepático,
dos animais (ratos Wistar) para realização de dosagens de biomarcadores do estresse oxidativo - MDA
e GPx.
4.4.7.1 Dosagem do malondialdeído (MDA)
O malondialdeído é um produto secundário da peroxidação lipídica, proveniente da β-
oxidação de ácidos graxos poliinsaturados com mais de duas duplas ligações, tais como ácido
linoléico, araquidônico e docosaexanóico. Atualmente, o MDA é considerado um candidato
potencial para ser escolhido como um biomarcador geral de dano oxidativo em plasma. O
MDA foi o foco de atenção da peroxidação lipídica durante muitos anos, pelo fato de poder
ser medido livre, utilizando-se o ácido tiobarbitúrico (TBA). O MDA reage com TBA e forma
um cromógeno de cor rosa fluorescente, cuja absorção ocorre em comprimento de onda de
532 nm e fluorescência em 553 nm (KADIISKA et al., 2005a; KADIISKA et al., 2005b).
A dosagem dos níveis plasmáticos de malondialdeído foi realizada segundo
ARGUELLES et al. (2004). Para determinação dos níveis de MDA adicionaram-se 100 mL
de amostra a 1 mL de uma solução contendo ácido tricloroacético a 15%, ácido tiobarbitúrico
a 0,38% em ácido clorídrico 0,25N. Esta mistura foi então aquecida em banho-maria por 30
minutos, e depois centrifugada. A absorbância do sobrenadante foi medida a 535nm. A
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70
concentração das amostras foi determinada a partir da leitura de uma amostra com
concentração conhecida (padrão) de malondialdeído a 4 µmol/L.
4.4.7.2 Dosagem de glutationa peroxidase (GPx)
Os níveis de glutationa peroxidase foram determinados no plasma e no lavado de
plaquetas utilizando a metodologia de Paglia e Valentine (1967) (kit Randox laboratories
ltda.). Neste método a GPx catalisa a oxidação da glutationa (GSH) com óxido hidrocloroso
de cumeno. Em presença de glutationa redutase e NADPH, a glutationa oxidada (GSSG) é
imediatamente reduzida com concomitante oxidação de NADPH à NADP
+
, produzindo um
decréscimo na absorbância em 340nm. A absorbância foi determinada após 1, 2 e 3 min
(PAGLIA e VALENTINE, 1967).
4.5 Análise dos resultados
Os resultados obtidos foram analisados utilizando o programa Microcal™ Origin
®
Versão 6.0 da Microcal Software Inc., e apresentados na forma gráfica por utilização do
Programa Excel (Microsoft Word., St.Louis, MO, EUA). Os valores médios para
concentração inibitória de 50% (CI
50
) e os valores de miliequivalência (mEq) foram obtidos
mediante a tabulação dos resultados no programa Excel for Windows. A concentração
inibitória 50% foi obtida por regressão linear simples utilizando o programa Microcal™
Origin
®
Versão 6.0 da Microcal Software Inc. Os resultados dos ensaios químicos foram
correlacionados por meio do teste de Pearson. Nos ensaios biológicos os grupos foram
comparados pelo teste de Mann-whitney utilizando o programa Sigma Stat
®
da Systat
Software Inc. (San Jose, Califórnia, USA). O nível de significância foi de p<0,05.
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71
5. RESULTADOS
O presente estudo avaliou por diferentes metodologias as atividades antioxidantes de
extratos aquosos e etanólicos de sete espécies de plantas amazônicas, sendo as seguintes
espécies: Byrsonima japurensis (Saratudo), Callycophyllum spruceanum (Mulateiro), Derris
floribunda, Maytenus guianensis (Chichuá), Passiflora nítida (Maracujá-do-mato), Petiveria
alliacea(Mucuracaã) e Ptychopetalum olacoides benth (Muirapuama).
Após obtenção dos extratos e confirmação da presença de atividade redutora pelo
método do DPPH• qualitativo foi realizada a determinação do teor de compostos fenólicos.
Este teste foi realizado utilizando o método de Folin–Ciocalteu com modificações (LIMA et
al., 2004; LIMA et al., 2006; PRADO et al., 2005; SOUZA et al., 2007). A espécie que
apresentou maior proporção de compostos fenólicos foi a C. spruceanum seguida da B.
japanurensis com 6% e 5,9% de polifenóis totais, respectivamente, conforme apresentado na
tabela 1: Os valores de equivalência foram calculados a partir da curva padrão obtida com
ácido gálico (Figura 17).
Ácido Gálico
R
2
= 0,9995
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0
Concentração (µg/mL)
Figura 32 - Curva de absorbância do ácido gálico, absorbância em relação à concentração (µg/mL).
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72
Tabela 1 - Percentagem de Polifenóis presente nas espécies de plantas estudadas e
como mg de EAG
(equivalentes de ácido gálico) por g de extrato
.
Espécie de planta % Polifenóis
Totais
mEq (mg de ác. gálico / g de extrato
seco)
Byrsonima japurensis - (Et) 5,9 59,4
Callycophyllum spruceanum - (Et) 6,0 60,2
Derris floribunda - (Et) 0,8 8,3
Maytenus guianensis - (Et) 5,8 58,7
Passiflora nítida - (Et) 0,3 3,2
Petiveria alliacea - (Et) 0,7 7,5
Ptychopetalum olacoides benth - (Et) 0,2 2,1
Nota: (Et) = Extratos Etanólicos.
A fim de otimizar as atividades a serem realizadas para caracterização de atividades
antioxidantes em plantas, os testes utilizados seguiram uma seqüência adotando-se critérios
tais como estabilidade de reativos, custo de realização do método e especificidade de reação.
Por isso, o método que inicia o nosso protocolo para realização de ensaios
antioxidantes foi o de varredura de radicais DPPH
•
. Este é de menor custo e é um reativo de
ótima estabilidade. Pelo método de DPPH
•
calculamos os resultados em miliequivalência
(mEq) em relação ao ácido ascórbico, e a atividade de cada extrato em uma concentração de
20 μg/mL expressos na tabela 3. A espécie que obteve o melhor resultado foi a
Callycophyllum spruceanum (figura 18).
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73
Tabela 2 – Miliequivalência (mEq) de ácido Ascórbico de extratos de plantas amazônicas no método
de DPPH
•
e % de atividade antioxidante em amostras com concentração de 20 μg/mL.
Extrato Vegetal mEq (g Ac. Ascórbico / g de extrato) % atividade
(20 µg/mL)
Maytenus guianensis – (Et) 0,122 36,0
Callycophilum spruceanum – (Et) 0,461 91,73
Callycophilum spruceanum – Aq 0,208 61,64
Byrsonima japurensis – (Et) 0,412 87,43
Byrsonima japurensis – Aq 0,131 55,19
Derris Floribunda – (Et) 0,080 16,62
Derris Floribunda – Aq 0,011 5,98
Petiveria alliacea - (Et) 0,002 3,87
Ptychopetalum olacoides benth. - (Et) 0,116 16,5
Passiflora nítida – (Et) 0,070 24,9
Obs. (Et) = Extratos Etanólicos, (Aq) Extrato Aquoso.
C. spruceanum
R
2
= 0,9715
CI
50
= 7,50 µg/mL
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25 30
Concentrações (µg/mL)
atividade antioxidante (%)
Figura 33 - Curva de atividade antioxidante característica da espécie C. spruceanum pelo método
DPPH.
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74
O método utilizado a seguir foi o de varredura de radicais ABTS
+
. Este também é um método
de baixo custo, mais o seu radical não é tão estável quanto o de DPPH
·
.
A tabela 3 apresenta os
resultados de inibição dos extratos etanólicos e aquosos no método do ABTS+ e mostra a
percentagem de inibição dos extratos numa concentração de 20 μg/mL e os valores de mEq
em relação ao TROLOX. No presente teste, o extrato mais ativo foi o extrato etanólico de C.
spruceanum, seguido também
do extrato etanólico de M. guianensis. Uma curva típica obtida
por este método está representada pelo extrato etanólico do C. spruceanum e apresentada na
Figura 19.
Tabela 3 – Miliequivalência (mEq) de TROLOX
®
de extratos de plantas amazônicas pelo método de
ABTS
+
e percentagem de atividade antioxidante (%) em amostras com concentração de 20 μg/mL.
EXTRATO VEGETAL mEq (g TROLOX / g extrato) % atividade
(20 µg/mL)
Maytenus guianensis – (Et) 0,484 76,55
Callycophilum spruceanum – (Et) 0,787 98,31
Callycophilum spruceanum – Aq 0,370 81,48
Byrsonima japurensis – (Et) 0,321 74,6
Byrsonima japurensis – Aq 0,149 46,73
Derris Floribunda – (Et) 0,098 25,82
Derris Floribunda – Aq 0,043 16,52
Petiveria alliacea - (Et) 0,006 4,26
Ptychopetalum olacoides benth. - (Et) 0,453 85,18
Passiflora nítida – (Et) 0,103 30,8
Obs. (Et) = Extratos Etanólicos, (Aq) Extrato Aquoso.
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C. spruceanum
R
2
= 0,9386
CI
50
= 5,03 µg/mL
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25 30
Concentrações (µg/mL)
atividade antioxidante (%)
Figura 34 - Curva de atividade antioxidante característica da espécie C. spruceanum pelo método
ABTS.
No método seguinte levou-se em consideração uma maior especificidade de atividade. Este
ensaio avalia a varredura de ânion radical superóxido (
O
2
−•
) dos extratos testados. O
s resultados
deste teste, apresentados na tabela 4, estão expressos em mEq de ácido gálico e mostram a
porcentagem de atividade dos extratos numa concentração de 50 μg/mL. O extrato mais ativo
foi o extrato etanólico de C. spruceanum, seguido também
do extrato etanólico de M.
guianensis. Uma curva típica obtida por este método está representada pelo extrato etanólico
do C. spruceanum e apresentada na Figura 20.
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Tabela 4 – Miliequivalência (mEq) de ácido Gálico de extratos de plantas amazônicas no método de
varredura de ânion radical superóxido (AVS) e % de atividade antioxidante em amostras com
concentração de 50 μg/mL.
EXTRATO VEGETAL mEq (g Ac. Gálico/g extrato) % atividade
(50 μg/mL)
Maytenus guianensis – (Et) 0,223 65,52
Callycophilum spruceanum – (Et) 0,432 85,0
Callycophilum spruceanum – Aq 0,186 58,6
Byrsonima japurensis – (Et) 0,175 55,85
Byrsonima japurensis – Aq 0,199 59,5
Derris Floribunda – (Et) 0,027 11,27
Derris Floribunda – Aq 0,129 38,91
Petiveria alliacea - (Et) 0,099 37,12
Ptychopetalum olacoides benth. - (Et) 0,055 24,44
Passiflora nítida – (Et) 0,078 30,55
Obs. (Et) = Extratos Etanólicos, (Aq) Extrato Aquoso.
C. Spruceanum
R
2
= 0,9897
CI
50
= 18,19 μg/mL
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Concentrações (μg/mL)
atividade antioxidante (%)
Figura 35 - Curva de atividade antioxidante característica da espécie C. spruceanum pelo método de
AVS.
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O último ensaio químico realizado, foi o método com rubreno. Os resultados do teste,
apresentados na tabela 5, estão expressos em mEq de DABCO e em porcentagem de atividade
dos extratos em uma concentração de 100 μg/mL. Os extratos mais ativos foram o extrato
etanólico e aquoso de C. spruceanum, seguido também
do extrato etanólico de M. guianensis,
conforme apresentado na Figura 21.
Tabela 5 – Miliequivalência (mEq) de DABCO de extratos de plantas amazônicas no método de
Rubreno e % de atividade antioxidante em amostras com concentração de 100 μg/mL.
EXTRATO VEGETAL mEq (g DABCO / g extrato) % atividade
(100ug/mL)
Maytenus guianensis – (Et) 0,101 9,51
Callycophilum spruceanum – (Et) 0,631 59,25
Callycophilum spruceanum – (Aq) 0,518 49,32
Byrsonima japurensis – (Et) 0,004 21,60
Byrsonima japurensis – (Aq) 0,015 12,25
Derris Floribunda – (Et) --- S.A.
Derris Floribunda – (Aq) --- S.A.
Petiveria alliacea - (Et) 0,007 7,13
Ptychopetalum olacoides benth. - (Et) 0,007 3,88
Passiflora nítida – (Et) --- S.A.
Obs. (Et) = Extratos Etanólicos, (Aq) = Extrato Aquoso, N.D. = não desenvolvido e S.A. = sem atividade.
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C. spruceanum
R
2
= 0,9948
CI
50
= 92,47 μg/mL
0
10
20
30
40
50
60
70
0 15 30 45 60 75 90 105
Concentrações (μg/mL)
atividade antioxidante (%)
Figura 36 - Curva de atividade antioxidante característica da espécie C. spruceanum pelo método do
Rubreno.
Os valores da concentração inibitória de 50% (CI
50
) de todas as amostras de extratos
vegetais ou padrões antioxidantes (utilizados para efeitos de comparação) estão representados
na tabela 6.
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Tabela 6 – Concentrações inibitórias 50% (CI
50
) dos extratos de plantas testados, os resultados estão
expresso em µg/mL.
PLANTA - EXTRATO ABTS DPPH AVS RUBRENO
Maytenus guianensis – (Et) 8,19 ± 0,3 28,44 ± 0,8 35,28 ± 3,0 517 ± 70,8
Callycophilum spruceanum – (Et) 5,03 ± 0,1 7,50 ± 0,9 18,19 ± 3,0
92,43 ± 24,8
Callycophilum spruceanum –
(Aq)
10,70 ± 0,5 16,60 ± 2,2 42,12 ± 0,7
112,57 ± 17,5
Byrsonima japurensis – (Et) 12,33 ± 0,2 8,4 ± 0,6 44,92 ± 6,4 1408,24 ±
113,5
Byrsonima japurensis – (Aq) 26,60 ± 0,8 26,36 ± 2,8 39,45 ± 4,5 361,13 ± 165,7
Derris Floribunda – (Et) 40,70 ± 0,9 26,34 ± 3,4 289,33 ±
21,8
S.A.
Derris Floribunda – (Aq) 91,70 ± 3,7 296,52 ± 5,3 60,65 ± 4,0 S.A.
Petiveria alliacea - (Et) 574,63 ± 5,8 2432,97 ± 191,0 78,96 ± 5,6 743,23 ± 8,9
Ptychopetalum olacoides benth. -
(Et)
8,73 ± 0,3 29,73 ± 0,3 142,42 ±
16,5
715,16 ± 195,6
Passiflora nítida – (Et) 38,49 ± 1,9 49,93 ± 0,1 100,25 ±
9,9
S.A.
α-Tocoferol 12,48 ± 0,6 10,44 ± 0,4 179,9 ±
14,4
N.D.
BHA 2,83 ± 0,2 6,03 ± 0,1 S.A. N.D.
BHT 9,97 ± 0,4 176,33 ± 1,3 S.A. N.D.
TROLOX 3,96 ± 0,1 5,66 ± 0,2 S.A. N.D.
QUERCERTINA 2,53 ± 0,1 2,57 ± 0,1 15,75 ± 1,5
121,00 ± 12,5
AC. ASCÓRBICO 4,84 ± 0,3 2,74 ± 0,3 32,91 ± 1,6 N.D.
AC. GALICO 1,035 ± 0,1 1,14 ± 0,2 7,85 ± 1,2 N.D.
ß-CAROTENO N.D. N.D. S.A. 9,24 ± 0,1
DABCO N.D. N.D. S.A.
58,4 ± 6,0
Obs. (Et) = Extratos Etanólicos, (Aq) = Extrato Aquoso, N.D. = não desenvolvido e S.A. = sem atividade.
Para correlacionar os ensaios in vitro realizamos o teste de Pearson adotando-se
p<0,05. O resultado esta apresentado na tabela a seguir (tabela 7).
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Tabela 7 – Indice de correlação entre os ensaios obtido por meio do teste de correlacao de
Pearson.
ABTS DPPH SUPEROXIDO RUBRENO POLIFENÓIS
ABTS - 0,726* 0,607* 0,535 0,630
DPPH - 0,778* 0,737* 0,829*
SUPEROXIDO - 0,707* 0,904*
RUBRENO - 0,550
POLIFENÓIS -
* p<0,05
Em seguida realizaram-se ensaios in vitro em microplacas com leveduras da espécie
Saccharomyces cerevisiae. A primeira parte deste ensaio foi qualitativa, utilizada para
verificar possíveis atividades antifúngicas dos extratos; foi realizado de forma simples, apenas
incubando os extratos com a cepa, e após 24h fazendo uma contagem de colônias (tabela 8).
O segundo ensaio foi quantitativo, para determinação de atividade protetora dos extratos
contra estresse oxidativo causado por incubação peróxido de hidrogênio 2 mM (tabela 9).
Tabela 8 – Resultados do ensaio qualitativo utilizando leveduras da espécie Saccharomyces cerevisiae
para determinação de atividade antifúngica dos extratos.
Extrato / Amostra nº de colônias (unid.) % Inibição do Crescimento
Controle* 60 0
C. spruceanum (Et) 46 23,33
C. spruceanum (Aq) 50 19,36
Byrsonima japurensis (Et) 51 15,0
Byrsonima japurensis (Aq) 55 11,29
Derris Floribunda (Et) 57 5,38
Derris Floribunda (Aq) 60 3,23
Petiveria alliacea (Et) 51 17,74
Ptychopetalum olacoides benth. (Et) 52 16,13
Passiflora nítida (Et) 55 11,30
Maytenus guianensis (Et) 50 19,36
Obs. (Et) = Extratos Etanólicos, (Aq) = Extrato Aquoso, N.D. = não desenvolvido e S.A. = sem atividade. * =
controle é composto somente por caldo YPD e Levedura, onde o crescimento é igual a 100%.
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81
Tabela 9 – Resultados do ensaio com Saccharomyces cerevisiae para determinação de atividade
protetora dos extratos contra estresse oxidativo por incubação com peróxido de hidrogênio 2 mM.
Extrato / Amostra (300 µg/mL) % Crescimento
Controle* 100,00
Controle* + H
2
O
2
(2 mM) 10,00
Acido ascórbico + H
2
O
2
(2 mM) 92,45
M. guianensis Et + H
2
O
2
(2 mM) 21,06
C. spruceanum Aq + H
2
O
2
(2 mM) 21,39
B. japanurensis Aq + H
2
O
2
(2 mM) 12,24
Passiflora nítida Et + H
2
O
2
(2 mM) 21,39
Derris floribunda Et + H
2
O
2
(2 mM) 17,59
Derris floribunda Aq + H
2
O
2
(2 mM) 21,53
P. olacoides Et + H
2
O
2
(2 mM) 21,00
Obs. (Et) = Extratos Etanólicos, (Aq) = Extrato Aquoso, N.D. = não desenvolvido e S.A. = sem atividade. * =
controle é composto somente por caldo YPD e Levedura, onde o crescimento é igual a 100%.
Nenhum dos extratos mostrou-se suficientemente eficiente para prevenir a morte por
oxidação das células de Saccharomyces como antioxidante padrão utilizado no teste, neste
caso ácido ascórbico. E para os testes de estresse oxidativo com ratos da espécie Wistar foram
feitas dosagens de biomarcadores de estresse oxidativo (MDA e GPx) para amostras de
soro/plasma e tecidos, após incubação com a espécie C. spruceanum. Os resultados estão
expressos nas tabelas abaixo (tabelas 10 e 11).
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82
Tabela 10 – Níveis de antioxidantes séricos (μg/dL) em ratos tratados com CCl
4
e extrato vegetal.
GRUPO MDA (μmol/L) GPx (U/g HGb)
Controle* 5,96 ± 1,8 236,40 ± 29,8
CCl
4
8,75 ± 2,5 252,80 ± 26,8
C. spruceanum 200 mg/kg 6,27 ± 2,7 270,40 ± 33,2
C. spruceanum 400 mg/kg 5,05 ± 0,9 b 264,80 ± 9,6
CCl
4
+ C. spruceanum 400 mg/kg 5,40 ± 1,3 b 255,00 ± 35,8
CCl
4
+ N-acetilcisteina 4,88 ± 2,1 b 284,00 ± 38,4
* - Animais sem exposição ao agente estressor (Acetoaminofeno ou Tetracloreto de Carbono)
Tabela 11 - Níveis antioxidantes teciduais (μg/dL) em ratos tratados com CCl
4
e extrato vegetal.
GRUPO MDA tecidual (μmol/g
proteínas)
GPx tecidual (U/g
prot.)
Controle* 0,25 ± 0,1 23,06 ± 8,9 b e
CCl
4
0,19 ± 0,1 19,69 ± 1,8
C. spruceanum 200 mg/kg 0,12 ± 0,1 b 3,98 ± 2,3 b
C. spruceanum 400 mg/kg 0,36 ± 0,2 8,33 ± 1,0 b
CCl
4
e C. spruceanum 400 mg/kg 0,28 ± 0,1 10,21 ± 1,6 a, b
CCl
4
e N-acetilcisteina 0,26 ± 0,2 9,24 ± 1,1 b, c
* - Animais sem exposição ao agente estressor (Acetoaminofeno ou CCl
4
)
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83
Assim, elaborou-se um protocolo experimental, agora adotado pelo grupo de pesquisa
da Faculdade de Ciências Farmacêuticas para realização de ensaios antioxidantes com
extratos de plantas.
Fluxograma - Protocolo experimental de realização de ensaios para caracterização de atividades
farmacológicas
EXTRATOS DE ESPÉCIEIS A SEREM ESTUDADAS
Espectro UV/Vis (440-750nm)
1ª etapa – DPPH (515nm)
Cl
50
< 20 µg/mL
2ª etapa
–
ABTS
(734nm)
Cl
50
> 20 µg/mL
3ª etapa – AVS (550nm)
4ª etapa
–
RUBRENO
(440nm)
CI
50
> 100 µg/mL
Saccha
romyces
Atividade antifúngica
SIM
NÂO
Ratos Wistar
Tratados com CCl
4
– MDA e GPx
Saccharomyces
Ensaio proteção antioxidante
760nm
RESULTADO SATISFATORIO = POTENCIAL
FITOFÁRMACO A SER EXPLORADO
DESCARTE OU
FRACIONAMENTO
Cl
50
< 20 µg/mL
Cl
50
< 50 µg/mL
Cl
50
< 100 µg/mL
Cl
50
> 20 µg/mL
Cl
50
> 50 µg/mL
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84
6. DISCUSSÃO
O presente trabalho objetivou comparar metodologias para a caracterização de
atividades antioxidantes, analisando extratos obtidos de diferentes espécies de plantas
amazônicas. As plantas estudadas foram: Byrsonima japurensis, Callycophyllum spruceanum,
Derris floribunda, Maytenus guianensis, Passiflora nítida, Petiveria alliacea e Ptychopetalum
olacoides.
Elaborou-se um protocolo experimental de realização de ensaios “in vitro” e “in vivo”
para caracterização de atividades antioxidantes de extratos de plantas. Todos os testes in vitro
utilizados na pesquisa, com exceção para o método que utiliza o rubreno para a varredura do
oxigênio singlete, foram desenvolvidos com pequenas modificações para determinação em
microplacas (MOREIRA et al., 2005). Para os testes in vitro, utilizou-se como primeiro
ensaio o método de varredura do radical DPPH
•
, seguido do ABTS
+
, do método de atividade
varredora de superóxido e o método do Rubreno. Em seguida, realizaram-se os ensaios em
modelos biológicos, iniciando-se o ensaio com leveduras da espécie Saccharomyces
cerevisiae e o teste de estresse com ratos da espécie Wistar (Fluxograma).
A atividade antioxidante de plantas pode estar diretamente ligada a diversos
compostos químicos presentes nas mesmas. Mas, dentre estes compostos, nenhum é tão
representativo quanto os compostos fenólicos. Em 2004, CAI e colaboradores analisaram a
capacidade antioxidante pelo método de ABTS
+
de mais de 112 espécies de plantas
medicinais usadas no tratamento e prevenção do câncer pela população chinesa. E seus
resultados indicaram atividade antioxidante fortemente evidenciada, principalmente nas
plantas que apresentavam predominância de compostos fenólicos.
Com isso, realizou-se um ensaio para a determinação de polifenóis totais dos extratos
estudados. O método utilizado foi com reagente Folin-Ciocalteu (FCR). Esse método é
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85
importante, pois além de ser muito disponível comercialmente, o seu processo já fora bastante
padronizado (LIMA et al., 2006; SILVA et al., 2007; SOUZA et al., 2007; VERZA et al.,
2007). Estes resultados vêm confirmar os resultados dos testes in vitro, onde as espécies que
apresentam maior atividade antioxidante são justamente aquelas que apresentam um valor
maior de compostos fenólicos pelo teste de Folin-Ciocalteu (Byrsonima japurensis,
Callycophyllum spruceanum e o Maytenus guianensis). Quando foi realizado um teste de
correlação do teor de polifenóis com os demais ensaios antioxidantes, este teve um índice de
correlação de 0,829 com o método do DPPH e 0,630 para o teste do ABTS (Tabela 7).
Encontram-se na literatura inúmeros trabalhos que utilizam os testes in vitro com
DPPH
•
e ABTS
+
para avaliar a capacidade varredura de radicais livres para várias categorias
de amostras (GORINSTEIN et al., 2003; KATALINIC et al., 2004; MILIAUSKAS et al.,
2004). Estes dois métodos são os mais utilizados para avaliar o potencial antioxidante de
materiais biológicos por apresentarem excelente estabilidade e baixo custo em determinadas
condições de ensaio (ARNAO, 2000) e também por serem fácies de implementar em
laboratórios fitoquímicos.
Neste trabalho adotou-se como método primário, o teste de DPPH
•
para iniciar a
pesquisa sobre caráter antioxidante das plantas estudadas, devido ao seu baixo custo e a alta
estabilidade do reativo empregado. MENSOR et al. (2001) consideraram o método DPPH
·
rápido e fácil para avaliar a presença de antioxidante na amostra com a grande vantagem deste
método poder ser preparado e realizado em temperatura ambiente, eliminando, assim,
qualquer risco de degradação térmica das moléculas em estudo (BONDET et al., 1997). Os
melhores resultados obtidos foram das espécies Callycophyllum spruceanum, Byrsonima
japurensis e Maytenus guianensis, em ordem decrescente respectivamente. O que confirma os
resultados obtidos com os ensaios para caracterização de compostos fenólicos totais
realizados com as espécies.
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86
Em seguida utilizou-se o método de ABTS
+
, já descrito exaustivamente por muitos
autores e indicado para verificar a atividade antioxidante de substâncias com caráter lipofílico
ou hidrofílico, incluindo os flavonóides, carotenóides e plasma. No entanto, mostram-se
efetivo para avaliar atividade antioxidante de vegetais, alimentos, óleos, bebidas, extratos de
plantas entre outros. Este ensaio possui uma grande variedade metodológica relativa à
formação do cátion radical, ao tempo de reação, ao comprimento de onda e etc., o que facilita
a sua adaptação para diversos tipos de amostras (ARNAO et al., 2001; BENAVENTE-
GARCIA et al., 2000; CAO et al., 1998; CARVALHO, 2006; RE et al., 1998).
Pelo ensaio com ABTS
+
, verificou-se uma maior atividade antioxidante das espécies:
Callycophyllum spruceanum, Ptychopetalum olacoides benth, Maytenus guianensis e
Byrsonima japurensis, em ordem decrescente respectivamente. A alta atividade antioxidante
apresentada pelas espécies C. spruceanum, B. japanurensis e M. guianensis pode ser
indicativo de grande concentração de compostos fenólicos nestas espécies. Mas também se
verificou que algumas espécies (devido outros constituintes) podem apresentar grande
atividade antioxidante, como o ocorrido com a essa espécie Ptychopetalum olacoides benth,
que obteve a menor concentração de compostos fenólicos dentre as espécies aqui abordadas
(Tabela 1), porem foi o segundo mais ativo.
Sabemos que o DPPH
•
possui a maior estabilidade dentre todos os reativos aqui
utilizados, mas quando se trata de extratos vegetais, como os testados neste trabalho, que
podem apresentar forte coloração, o método de ABTS
+
leva vantagem. Enquanto o pico
máximo de absorção do ensaio utilizando DPPH
•
fica em torno de 515 nm, o ensaio com
ABTS
+
utiliza comprimento de onda em torno de 730 nm, o que diminui algumas formas de
interferência no ensaio pertinentes à forte coloração de algumas amostras, talvez devido à
presença de substâncias muito coloridas, tais como antocianidinas e carotenóides (ARNAO,
2000).
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A habilidade de alguns extratos em varrer radicais livres em ensaios simples de
avaliação de capacidade antioxidante tais como os gerados pelo método do ABTS
+
e DPPH
•
não significa que este funcione plenamente em mecanismos complexos tais como substratos
fisiológicos. O radical ânion superóxido (O
2
-•
) é uma espécie radicalar produzida
constantemente nos organismos por diversos processos celulares, tais como a cadeia de
transporte de elétrons na mitocôndria, no microssomo, e por meio de enzimas como xantina
oxidase e NADPH oxidase, e pode estar aumentado em diversas patologias (POLLE et al.,
1989).
Os O
2
-•
são gerados durante o metabolismo como produtos finais de reações
enzimáticas ou acidentalmente como produtos celulares secundários de reações redoxes. Estes
radicais são fontes potenciais de lesões, pois podem agir diretamente sobre alvos biológicos
ou indiretamente iniciando a produção de espécies altamente reativas de oxigênio, como o
oxigênio singlete (1ΔO
2
) ou o radical hidroxila (OH
-
). A primeira linha de defesa contra a
toxicidade do oxigênio é, portanto, a remoção de radical ânion superóxido antes que a
formação de outros produtos nocivos possa ocorrer (POLLE et al., 1989).
Pensando nisso, levou-se em consideração a importância de se caracterizar a atividade
varredora de ânion superóxido (AVS) dos extratos estudados. Muitas pesquisas recentes
utilizaram este método como forma mais específica de ensaio com atividade antioxidante de
espécies vegetais (EWING & JANERO, 1995; HUANG et al., 2005; VASCONCELOS et al.,
2007; OZTURK et al., 2007). Neste ensaio, os extratos que apresentaram maior atividade
foram: C. spruceanum, M. guianensis e B. japanurensis, em ordem decrescente de atividade,
respectivamente. Mas também se obteve um resultado satisfatório das espécies Derris
Floribunda, Petiveria alliacea e Passiflora nítida. Sabe-se que os radicais ânions superóxido
são fontes potenciais de lesões, pois podem agir diretamente sobre alvos biológicos ou
indiretamente iniciando a produção de espécies altamente reativas. Isso vem a corroborar os
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88
conhecimentos étnicos sobre as mais variadas atividades terapêuticas destas espécies, e que
nos levaram a escolha das mesmas para estudo.
A espécie radicalar do oxigênio singlete é o estado eletronicamente excitado do
oxigênio, produzido por reações fotoquímicas ou por outras radiações; reage com um grande
número de moléculas biológicas, incluindo lipídeos da membrana, iniciando processos de
peroxidação. Utilizou-se então um ensaio com rubreno, reativo que oxida na presença de luz
formando oxigênio singlete (
1
Δ
g
O
2
). Este ensaio é utilizado para indicar atividades
fotoprotetora das amostras.
O potencial antioxidante de cada extrato foi determinado em mEq do DABCO por
grama de extrato seco. Foram utilizados valores de CI
50
resultantes das atividades de espécies
estudadas e dos antioxidantes padrões para se ter miliequivalência (mEq – g de antioxidante
padrão por g de extrato vegetal) para cada teste (GREGIANINI et al., 2003). No método de
rubreno não houve atividade para a maioria das espécies testadas, o menor valor de CI
50
obtido foi da espécie Callycophilum spruceanum de
92,43μg/mL (Tabela 6).
Este ensaio
caracteriza a atividade antioxidante por meio do mecanismo de varredura do oxigênio
singlete, gerado a partir da radiação luminosa, o que simula a radiação UV pela exposição à
luz solar. Uma boa atividade de extratos vegetais neste ensaio indicaria uma espécie
promissora à elaboração de uma solução protetora contra radiação solar. Mais devido ao baixo
comprimento de onda utilizado neste ensaio, não descartamos a possibilidade de uma
interferência na reação devido à forte coloração dos extratos vegetais.
No ensaio para a caracterização de compostos fenólicos, utilizando o método de Folin-
Ciocalteu modificado, verificou-se uma maior concentração de compostos fenólicos nas
espécies Callycophyllum spruceanum, Byrsonima japurensis e Maytenus guianensis, em
ordem decrescente respectivamente. Este dado vem a corroborar os bons resultados
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encontrados nestas espécies, e também surgem para comprovar a alta atividade antioxidante
dos compostos fenólicos presentes nos vegetais.
Na espécie Derris floribunda a provável presença dos flavonóides nos extratos desta
espécie (alcoólico e aquoso) pode ter contribuído para resultados obtidos, principalmente, no
método de DPPH
•
. Seu extrato etanólico apresentou atividade nos três métodos (DPPH
•
,
ABTS
+
e AVS) e pouca eficiência antioxidante pelo método do Rubreno (RIBEIRO e
KAPLAN, 2002).
Conforme visto durante a realização desta pesquisa, a atividade antioxidante de
plantas pode estar diretamente relacionada com a presença de compostos fenólicos. Sabe-se
que os antioxidantes quando não são provenientes de via endógena (superóxido dismutase,
catalase, glutationa peroxidase) provêm da via exógena por intermédio da ingestão de
alimentos ricos em antioxidantes (α-tocoferol, β-caroteno, ácido ascórbico, etc.). Estas
substâncias, geralmente oriundas de vegetais, na sua grande maioria são compostos fenólicos,
o que justifica a boa correlação entre os ensaios antioxidantes e teste para determinação de
polifenóis totais, conforme demonstrado na tabela 12.
Quando foi realizado o teste de correlação entre os diferentes ensaios como mostrado
na tabela 11, verificaram-se correlações estatisticamente significativas entres os testes,
principalmente com as concentrações de polifenóis com os testes de varredura de radicais.
Contudo, o único teste que apresentou correlação significativa com todos os demais ensaios
foi o teste de varredura do DPPH, demonstrando o já conhecido amplo espectro de atividade
deste método. Por este achado e por outras razões já explicitadas, isto o torna um excelente
teste para varredura de potencial antioxidante de extratos vegetais. Por outro lado, as baixas
CI
50
encontradas demonstram o excelente potencial antioxidante das espécies estudadas.
Salientando que estes dados aqui apresentados, até o presente momento, não estavam
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90
disponíveis para nenhuma destas espécies, torna claro o grande potencial da flora amazônica
no provimento de novos bioativos com potencial de uso terapêutico.
Em relação à eficiência dos testes in vitro é importante salientar que nem toda esta
atividade antioxidante contida nos extratos das plantas estudadas é sinônimo de eficiência
para ensaios in vivo. Os testes in vitro são mais rápidos e simples de serem executados, mas,
frequentemente, o resultado não é garantia de uma boa atividade antioxidante em modelos
biológicos.
Por isso, ensaios biológicos, utilizando principalmente células eucarióticas da levedura
Saccharomyces cerevisiae, têm se mostrado um complemento para determinação da
capacidade antioxidante de diferentes compostos, fornecendo resultados rápidos,
reprodutíveis e passíveis de serem correlacionados ao observado no homem (SOARES et al.,
2005).
No presente trabalho, utilizaram-se as leveduras da espécie Saccharomyces cerevisiae
modificadas geneticamente onde fora retirado o gene que codifica a enzima catalase,
tornando-as sensíveis ao peróxido de hidrogênio. Sabendo-se que algumas das espécies de
plantas estudadas neste trabalho possuem algum tipo de atividade antimicrobiana, foram
realizados dois testes com as cepas de Saccharomyces cerevisiae (FENNER et al., 2006;
ZULETA et al., 2003).
O primeiro ensaio de incubação das cepas, feito diretamente com os extratos vegetais,
teve caráter qualitativo e serviu para verificar qualquer possível atividade antifúngica
existente nos extratos. Foi realizado de forma simples, apenas incubando os extratos com a
cepa, e após 24h fazendo uma contagem de colônias (tabela 8). As espécies que obtiveram a
maior percentagem de inibição do crescimento das cepas foram a C. spruceanum, M.
guianensis,
Petiveria alliacea, Ptychopetalum olacoides benth.
e B. japanurensis, em ordem
decrescente respectivamente.
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Em seguida realizou-se um novo ensaio para determinação de atividade protetora dos
extratos contra estresse oxidativo causado por incubação peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) a 2
mM. Nenhuma das espécies exibiu atividade protetora, e quando comparadas ao ácido
ascórbico, que obteve percentagem de atividade antioxidante em torno de 92%, os extratos
testados, na mesma concentração, não obtiveram atividade antioxidante maior que 12% em
nenhuma das espécies.
Para a espécie C. spruceanum, que se mostrou mais eficaz na varredura de radicais
livres nos ensaios in vitro, realizou-se um ensaio in vivo por indução de estresse oxidativo em
ratos da espécie Wistar. Estes animais foram tratados com tetracloreto de carbono (CCl
4
)
como indutor do estresse oxidativo. Aqui, pode-se verificar uma boa atividade antioxidante
desta espécie ao compararmos o seu efeito com o fármaco N-acetilcisteína, que é uma droga
antioxidante conhecida na literatura por sua capacidade de inibir radicais livres (PAULA et
al., 2006) e também pelo seu efeito hepatoprotetor (PASTOR et al., 1997; VERCELINO et
al., 2008). Houve uma diminuição significativa nos níveis de MDA no soro e também um
aumento significativo nos níveis séricos de GPx, indicando maior proteção antioxidante no
grupo que ingeriu o extrato de C. spruceanum por via oral.
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7. CONCLUSÃO
• Foi possível conhecer o potencial antioxidante através de cinco diferentes testes in
vitro de extratos de sete espécies de plantas até então pouco exploradas quanto a
este potencial comparando os resultados com padrões de conhecida atividade
antioxidante.
• Das espécies estudadas, aquelas que apresentaram os resultados mais representativos
quanto ao potencial antioxidante foram às plantas Callycophyllum spruceanum,
Maytenus guianensis e a Byrsonima japurensis.
• Foi observada correlação positiva entre os testes antioxidantes in vitro realizados,
sendo o teste do DPPH• o único que se correlacionou com todos os demais testes.
• O teste utilizando cepas de Saccharomyces cerevisiae não se mostrou eficaz para o
estudo do potencial antioxidante das espécies estudadas, pois a maioria dos
extratos apresentou atividade antifúngica o que inviabilizou o teste antioxidante.
• A espécie C. spruceanum que apresentou os melhores resultados nos testes in vitro,
quando analisada no modelo de estresse oxidativo com CCl
4
em ratos wistar, foi
capaz de alterar os níveis séricos e teciduais de marcadores do estresse oxidativo
como malondialdeído e glutationa peroxidase.
• A partir da realização deste trabalho foi possível organizar um protocolo
experimental para estudo do potencial antioxidante de extratos vegetais utilizando
testes in vitro e in vivo.
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