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Fundação Oswaldo Cruz
Instituto René Rachou
Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde
“AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA DA DENSIDADE PARASITÁRIA
TECIDUAL NO PERFIL DE PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS E
FENOTÍPICOS DE CÉLULAS DE CÃES NATURALMENTE
INFECTADOS POR Leishmania (Leishmania) chagasi”
Luanda Liboreiro Guerra
Belo Horizonte
Março / 2008
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
Ministério da Saúde
Fundação Oswaldo Cruz
Instituto René Rachou
Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde
“Avaliação da influência da densidade parasitária tecidual no perfil de parâmetros
hematológicos e fenotípicos de células de cães naturalmente infectados por Leishmania
(Leishmania) chagasi”
Luanda Liboreiro Guerra
Dissertação apresentada com vistas
à obtenção do Título de Mestre em
Ciências na área de concentração
de Biologia Celular e Molecular
Orientador: Dr. Rodrigo Corrêa Oliveira - Laboratório de Imunologia Celular e Molecular,
Instituto René Rachou, Fundação Oswaldo Cruz
Co-Orientador: Dr. Alexandre Barbosa Reis – Laboratório de Imunopatologia / NUPEB,
Universidade Federal de Ouro Preto
Belo Horizonte
Março / 2008
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O trabalho experimental desta dissertação foi realizado no Laboratório de Imunologia
Celular e Molecular do Centro de Pesquisas René Rachou / FIOCRUZ, Belo Horizonte, MG.
COLABORADORES
Dra. Andréa Teixeira Carvalho
1
Dr. Olindo Assis Martins Filho
1
Dr. Rodolfo Cordeiro Giunchetti
1, 2
1- Laboratório de Biomarcadores de Diagnóstico e Monitoração, Instituto René
Rachou, Fundação Oswaldo Cruz
2- Laboratório de Imunopatologia, Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas,
Universidade Federal de Ouro Preto
Suporte Financeiro
Instituto René Rachou – Fundação Oswaldo Cruz (IRR/FIOCRUZ)
Prazo: (24 meses) - Período: 2006-2008
Apoio
PAPES IVb – Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG)
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP)
“Cada um sabe a dor e a delícia de ser o que é”
Caetano Veloso
DEDICATÓRIAS
Aos meus pais, Elizabeth e Rogério;
Ao Ralph.
AGRADECIMENTOS
Ao Dr. Alexandre Barbosa Reis, por ter confiado a mim este trabalho e por ter sempre me
valorizado e acreditado em mim. Sua orientação e apoio desde a iniciação científica foram
essenciais para que eu trilhasse o meu caminho e cumprisse esta etapa. Obrigada por sua
enorme motivação e estímulo nos momentos de desânimo e por todas as oportunidades que
você me proporcionou. Serei eternamente grata por tudo isto.
Ao Dr. Rodrigo Corrêa Oliveira, pela acolhida no laboratório, por todas as oportunidades que
me foram dadas e por sua disponibilidade e atenção. Seu exemplo profissional foi e será
sempre muito importante para mim. Muito obrigada!
À Dra. Andréa Teixeira Carvalho, que certamente foi muito mais do que uma colaboradora
deste trabalho. Sua enorme ajuda, paciência, opiniões e conselhos fizeram com que tudo se
tornasse menos árduo. Obrigada por seu apoio e exemplo que sem dúvida sempre levarei
comigo.
À Dra. Marilene Susan Marques Michalick e Dra. Célia Maria Ferreira Gontijo pela
participação e contribuições durante a qualificação.
À Anna Carolina Lustosa Lima, pela assessoria em Bioestatística, essencial ao
desenvolvimento deste trabalho.
À Ana Thereza, Carol, Denise, Fê, Jack e Roberta pelo apoio, conversas, viagens a congressos
e por todos os momentos de descontração durante estes anos, tornando os dias muito mais
felizes!
À Dra. Juliana Assis Estanislau pelo apoio e incentivo durante o ingresso no mestrado.
Ao Dr. Rodolfo Giunchetti pelo apoio e pelas importantes oportunidades de aprendizagem.
Aos colegas Vladimir, Andréia Molica, Solange, Lu Maria, Pedro, Rafa, Paulinha, Matheus e
Daniel pelo apoio e agradável convivência.
Ao Apoio Técnico: Lu Lisboa, Lorena e Tiza, pela disponibilidade e por tornarem mais fácil e
organizado o ambiente de trabalho.
À Clari, pela alegria e disponibilidade em sempre ajudar no que fosse preciso.
À Eliane e Wallison, pela ajuda, disponibilidade e atenção dispensados a mim.
À Rita e Ana, por deixarem o ambiente sempre mais agradável e fácil de trabalhar.
Ao Instituto René Rachou, pelo apoio financeiro e infra-estrutura técnica.
À Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, na pessoa da Dra.
Cristiana Alves Brito.
Às secretárias Cris e Andréa pela paciência e disponibilidade em ajudar.
À Maíra, Carol, Júlia e Lutiana pela convivência durante as disciplinas do mestrado.
A todos os amigos da graduação pelos momentos de festa e alegria, em especial à Marina,
pelo companheirismo e amizade.
Aos meus pais, pelo infinito amor, paciência, carinho e incentivo incondicionais, acreditando
sempre em mim e estando ao meu lado em todos os momentos.
Ao Ralph, pelo amor, apoio, confiança, paciência, companheirismo e carinho diários que me
dão força e me fazem muito feliz!
À Deus, por me guiar em todos os meus caminhos e me proporcionar todas as oportunidades.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
01
2 JUSTIFICATIVA
09
3 HIPÓTESE
10
4 OBJETIVOS
11
4.1 Objetivo Geral 11
4.2 Objetivos Específicos
11
5 MATERIAIS E MÉTODOS
12
5.1 Seleção e manejo dos cães 12
5.2 Procedimentos técnicos realizados para a necropsia dos cães 13
5.3 Obtenção de amostra de sangue de cães 13
5.4 Avaliação dos parâmetros parasitológicos 13
5.4.1 Pesquisa do parasito em esfregaços por aposição de tecido 13
5.4.2 Avaliação da densidade parasitária em esfregaços por aposição de tecidos
através do índice de parasitismo tecidual 14
5.5 Metodologia relacionada à avaliação dos parâmetros hematológicos 14
5.6 Avaliação da resposta celular no contexto ex vivo através da imunofenotipagem de
células do sangue e baço 15
5.6.1 Citometria de fluxo para leucócitos de cães 15
5.6.2 Obtenção e preparação da suspensão de leucócitos totais e esplenócitos de
cães para imunofenotipagem 16
5.6.3 Ensaio de imunofluorescência para avaliação da expressão fenotípica de
leucócitos e esplenócitos de cães 18
5.6.4 Ensaio de imunofluorescência para fenotipagem de monócitos do sangue
periférico de cães 19
5.7 Obtenção e análise de dados por citometria de fluxo 20
5.8 Categorização de dados 25
5.9 Análise Estatística 27
6 RESULTADOS
28
6.1 Avaliação de parâmetros hematológicos em cães naturalmente infectados por L. (L.)
chagasi com diferentes densidades parasitárias esplênicas e cutâneas e animais não
infectados 28
6.2 Análise de fenótipos celulares de granulócitos do sangue periférico de cães
naturalmente infectados por L. (L.) chagasi com diferentes densidades parasitárias
esplênicas e de animais não infectados 30
6.3 Análise de fenótipos celulares de granulócitos do sangue periférico de cães
naturalmente infectados por L. (L.) chagasi com diferentes densidades parasitárias
cutâneas e de animais não infectados 32
6.4 Análise de fenótipos celulares de monócitos do sangue periférico de cães
naturalmente infectados por L. (L.) chagasi com diferentes densidades parasitárias
esplênicas e de animais não infectados 34
6.5 Análise de fenótipos celulares de monócitos do sangue periférico de cães
naturalmente infectados por L. (L.) chagasi com diferentes densidades parasitárias
cutâneas e de animais não infectados 36
6.6 Análise de fenótipos celulares de linfócitos do sangue periférico e do baço em cães
naturalmente infectados por L. (L.) chagasi com diferentes densidades parasitárias
esplênicas e animais não infectados 38
6.7 Análise de fenótipos celulares de linfócitos do sangue periférico e do baço em cães
naturalmente infectados por L. (L.) chagasi com diferentes densidades parasitárias
cutâneas e animais não infectados
45
7 RESUMO DOS RESULTADOS
51
8 DISCUSSÃO
53
9 PRINCIPAIS EVIDÊNCIAS
64
10 CONCLUSÃO
65
11 PERSPECTIVAS
66
12 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
67
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Esfregaços por aposição do baço e pele (ponta de orelha) 14
Figura 2- Representação esquemática da seqüência de eventos da análise de dados obtidos
por citometria de fluxo 22
Figura
3
- Controles das reações de imunofenotipagem 23
Figura 4
-
Reações de imunofenotipagem 24
Figura 5- Classificações individuais de cães com baixa, média e alta densidade parasitária
esplênica e cutânea 26
Figura 6- Densidades parasitárias determinadas pelos índices de parasitismo esplênico e
cutâneo de cães com diferentes formas clínicas naturalmente infectados por Leishmania
(Leishmania) chagasi 26
Figura 7- Análise da expressão de MHC-II, CD45RA e CD45RB em granulócitos do
sangue de cães naturalmente infectados por L. (L.) chagasi com diferentes densidades
parasitárias esplênicas e de animais não infectados 31
Figura
8
- Análise da expressão de MHC-II, CD45RA e CD45RB em granulócitos do
sangue de cães naturalmente infectados por L. (L.) chagasi com diferentes densidades
parasitárias cutâneas e de animais não infectados 33
Figura
9
- Análise da expressão de MHC-II, CD45RA e CD45RB em monócitos do sangue
de cães naturalmente infectados por L. (L.) chagasi com diferentes densidades parasitárias
esplênicas e de animais não infectados 35
Figura
10
- Análise da expressão de MHC-II, CD45RA e CD45RB em monócitos do sangue
de cães naturalmente infectados por L. (L.) chagasi com diferentes densidades parasitárias
cutâneas e de animais não infectados 37
Figura
11
- Análise de Linfócitos T (Thy-1+ e CD5+) no sangue e baço de cães
naturalmente infectados por L. (L.) chagasi com diferentes densidades parasitárias
esplênicas e de animais não infectados 39
Figura
12
- Análise de subpopulações de Linfócitos T (CD4+ e CD8+) no sangue e baço de
cães naturalmente infectados por L. (L.) chagasi com diferentes densidades parasitárias
esplênicas e de animais não infectados 41
Figura
13
- Análise de Linfócitos B (CD21+) e monócitos (CD14+) no sangue e baço de
cães naturalmente infectados por L. (L.) chagasi com diferentes densidades parasitárias
esplênicas e de animais não infectados 42
Figura
14
- Análise da expressão de MHC-II, CD45RA e CD45RB em linfócitos totais no
sangue e baço de cães naturalmente infectados por L. (L.) chagasi com diferentes densidades
parasitárias esplênicas e de animais não infectados 43
Figura
15
- Análise de Linfócitos T (Thy-1+ e CD5+) no sangue e baço de cães
naturalmente infectados por L. (L.) chagasi com diferentes densidades parasitárias cutâneas
e animais não infectados
46
Figura
16
- Análise de subpopulações de Linfócitos T (CD4+ e CD8+) no sangue e baço de
cães naturalmente infectados por L. (L.) chagasi com diferentes densidades parasitárias
cutâneas e de animais não infectados
47
Figura
17
- Análise de Linfócitos B (CD21+) e monócitos (CD14+) no sangue e baço de
cães naturalmente infectados por L. (L.) chagasi com diferentes densidades parasitárias
cutâneas e de animais não infectados
48
Figura
18
- Análise da expressão de MHC-II, CD45RA e CD45RB em linfócitos totais no
sangue e baço de cães naturalmente infectados por L. (L.) chagasi com diferentes densidades
parasitárias cutâneas e de animais não infectados
49
Figura
19
- Diagrama das principais alterações fenotípicas observadas em cães naturalmente
infectados por L. (L.) chagasi com diferentes densidades parasitárias de baço e pele
52
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
- Painel de Anticorpos monoclonais empregados na imunofenotipagem das células
caninas
16
Tabela 2
- Distribuição do painel de anticorpos anti-marcadores de superfície celular em
microplaca de 96 orifícios
20
Tabela 3
- Grupos de cães não infectados e naturalmente infectados por L. (L.) chagasi
apresentando diferentes graus de parasitismo esplênico e cutâneo
27
Tabela 4
- Avaliação de parâmetros hematológicos em cães com parasitismo esplênico e
animais não infectados
29
Tabela 5
- Avaliação de parâmetros hematológicos em cães com parasitismo cutâneo e
animais não infectados
29
Tabela 6
- Análise das correlações entre as densidades parasitárias esplênicas e a expressão
dos marcadores de superfície em granulócitos
32
Tabela 7
- Análise das correlações entre as densidades parasitárias cutâneas e a expressão
dos marcadores de superfície em granulócitos
34
Tabela 8
- Análise das correlações entre as densidades parasitárias esplênicas e a expressão
dos marcadores de superfície em monócitos
36
Tabela 9
- Análise das correlações entre as densidades parasitárias cutâneas e a expressão
dos marcadores de superfície em monócitos
38
Tabela 10
- Análise das correlações entre as densidades parasitárias esplênicas e a expressão
dos marcadores de superfície de células do sangue periférico e do baço
44
Tabela 11
- Análise das correlações entre as densidades parasitárias cutâneas e a expressão
dos marcadores de superfície de células do sangue periférico e do baço
50
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
Ac: Anticorpo
AP: Alto Parasitismo
BP: Baixo Parasitismo
CD: Cluster of Differentiation
CLAW: Canine Leukocyte Antigen
Workshop
CMF: Canal Médio de Fluorescência
CNI: Cães Não Infectados
COBEA: Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal
DDT: Dichloro-Diphenyl-Trichloroethane
EDTA: Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
FACS: Fluorescence Activated Cell Sorter
FACSdil: Solução diluente de anticorpos
FITC: Fluorescein Isothiocyanate
FSC: Forward Scatter
H
2
O
2
: Peróxido de Hidrogênio
ICB: Instituto de Ciências Biológicas
IFN-γ: Interferon-gamma
LTA: Leishmaniose Tegumentar
Americana
LV: Leishmaniose Visceral
LIT: Liver Infusion Tryptose
IPE: Índice de Parasitismo Esplênico
LDU: Leishman Donovan Units
LVA: Leishmaniose Visceral Americana
LVC: Leishmaniose Visceral Canina
iNOS: Inducible Nitric Oxide Synthase
IPC: Índice de Parasitismo Cutâneo
MHC: Major Histocompatibility Complex
MP: Médio Parasitismo
Ig: Imunoglobulina
IL: Interleucina
O
2
-
: Ânion Superóxido
PBS: Phosphate buffer saline
PMN: células polimorfonucleares
RIFI: Reação de Imunofluorescência
Indireta
RNAm: RNA mensageiro
RPMI 1640: Meio de cultivo celular
SCN: Soro de carneiro normal
SFB: Soro Fetal Bovino
SFM: Sistema Fagocítico Mononuclear
SLA: Soluble Leishmania Antigen
SRD: Sem Raça Definida
SRN: Soro de rato normal
SSC: Side Scatter
TGF-β: Transforming Growth Factor Beta
Th1: Células T CD4+ secretoras de
citocinas do tipo 1 (IL-2 e IFN-γ)
Th2: Células T CD4+ secretoras de
citocinas do tipo 2 (IL-4, IL-5, IL-6, IL-10)
TNF-α: Tumour Necrosis Factor Alpha
UFMG: Universidade Federal de Minas
Gerais
RESUMO
Durante a infecção por Leishmania, o parasitismo tecidual difere dependendo do local
avaliado e pode implicar em perfis imunopatológicos distintos durante a Leishmaniose
Visceral Canina (LVC). Neste estudo, foi avaliada a relação entre a densidade parasitária
cutânea e esplênica e o perfil fenotípico de linfócitos, monócitos e granulócitos em 40 cães
naturalmente infectados por L. (L.) chagasi categorizados de acordo com três diferentes níveis
de densidades parasitárias (baixo, médio e alto parasitismo). Vinte cães não infectados,
utilizados como grupo controle, foram sorologica e parasitologicamente negativos para L. (L.)
chagasi. Os principais achados descrevem a densidade parasitária esplênica como sendo mais
estreitamente relacionada às alterações fenotípicas em linfócitos do sangue periférico do que o
parasitismo cutâneo durante a LVC. Os dados obtidos mostraram diminuição na expressão de
linfócitos T CD5+ em cães com alto parasitismo esplênico em comparação com cães de baixo
e médio parasitismo. Foi observada ainda, maior razão de linfócitos T/B (CD5+/CD21+) em
cães com menores densidades parasitárias no baço. Estes dados são semelhantes aos
observados para linfócitos T Thy-1+, sugerindo que as células T CD5+ e Thy-1+ são as
responsáveis pela manutenção e estabelecimento da interação parasito/hospedeiro. A
correlação entre parasitismo esplênico e células T CD8+ re-enfatiza o papel da resposta imune
mediada por células T nos mecanismos de resistência durante a LVC. Além disso, diminuição
na expressão de monócitos CD14+ e em valores absolutos de monócitos circulantes na
avaliação hematológica foram observados como característica marcante do alto parasitismo,
sugerindo que ocorre recrutamento de monócitos para os tecidos linfóides, durante a LVC
ativa, onde eles podem desempenhar papel importante em reações imunes locais durante a
apresentação antigênica. Na avaliação das populações de granulócitos, os eosinófilos
apresentaram aumento na expressão de MHC-II, no grupo com alto parasitismo, quando
comparado a cães não infectados, sugerindo a participação destas células como
apresentadoras de antígeno. Além disto, estes dados sugerem que a eliminação do parasito
pode ocorrer via mecanismos fagocíticos no sangue de cães com alto parasitismo esplênico e
cutâneo. Desta forma, acredita-se que os resultados obtidos acrescentam informações
importantes para melhor compreensão da patogênese da leishmaniose visceral canina e
poderão auxiliar em futuros estudos que busquem o desenvolvimento e a avaliação de
medicamentos e vacinas.
ABSTRACT
During Leishmania infection, tissue parasitism at different sites may differ and imply
in distinct immunopathological patterns during canine visceral leishmaniasis (CVL). For this
reason we have assessed the influence of skin and spleen parasite density, the major sites of
parasitism, on the phenotypic profile of circulating lymphocytes, splenocytes, granulocytes
and monocytes. Forty Brazilian dogs naturally infected by L. (L.) chagasi were categorized
according to three different levels of parasite densities (low, medium and high parasitism)
with 20 non-infected dogs, used as control group. These animals were serologically and
parasitologically negative for L. (L.) chagasi. The major findings show that spleen parasite
density is closely related to major phenotypic changes in peripheral blood lymphocytes than
skin parasitism during CVL. Our data showed a decrease on the expression of CD5+ T
lymphocytes in dogs with high splenic parasitism when compared to low and medium
parasitism. We observed higher CD5+/CD21+ ratio in lymphocytes of dogs with lower
parasite densities in the spleen. These data are similar to the observed for Thy-1+ T
lymphocytes, suggesting that CD5+ and Thy-1+ T cells are responsible for maintenance and
establishment of parasite/host interaction. The correlation between spleen parasitism and
CD8+ T cells re-emphasizes the role of T cell-mediated immune response in resistance during
CVL. Moreover, a decrease in the expression of CD14+ monocytes and in absolute values of
circulating monocytes in the haematological evaluation were observed as a hallmark of high
parasitism, indicating the recruitment of monocytes to lymphoid tissue, during active CVL,
where they may play an important role in immune reactivity as antigen presenting cells. In the
evaluation of granulocyte populations, eosinophils demonstrated an increase on the expression
of MHC-II, in the high parasitism group when compared to non-infected dogs, suggesting
their participation as antigen presenting cells. Moreover, these data suggest that elimination of
the parasite may be via phagocytic mechanisms in the blood of dogs with high spleen and skin
parasitism. Thus, the results obtained in this study add new information that may be important
for a better understanding of the pathogenesis of canine visceral leishmaniasis and help on
development of future strategies on drugs and vaccine approaches.
1 INTRODUÇÃO
As leishmanioses são infecções parasitárias que acometem animais domésticos e
silvestres e o homem. São causadas por protozoários digenéticos da ordem Kinetoplastida,
incluídos na família Trypanosomatidae e no gênero Leishmania (Lainson & Shaw, 1987).
Vivendo alternadamente em hospedeiros vertebrados e invertebrados, são parasitos
intracelulares obrigatórios que se reproduzem por divisão binária dentro do Sistema
Fagocítico Mononuclear (SFM) de mamíferos susceptíveis, como forma flagelada ou
promastigota encontrada no tubo digestivo do inseto vetor e outra aflagelada ou amastigota
nos tecidos dos vertebrados.
A transmissão do parasito ocorre durante o repasto sanguíneo de fêmeas de dípteros da
família Phlebotomidae, gênero Lutzomyia (Novo Mundo) ou Phlebotomus (Velho Mundo),
em hospedeiro vertebrado e/ou reservatório infectado. Após a ingestão dos parasitos, as
formas amastigotas no interior do intestino do inseto vetor transformam-se em formas
promastigotas, que sofrem sucessivas divisões binárias. As formas promastigotas metacíclicas
infectantes são introduzidas na derme do hospedeiro vertebrado, onde infectam células do
SFM, principalmente macrófagos, e se diferenciam em formas amastigotas que proliferam até
que ocorra a lise da célula infectada, levando à infecção de outras células. O ciclo biológico se
fecha quando células infectadas por formas amastigotas são ingeridas por fêmeas de
flebotomíneos não infectadas.
As leishmanioses ocorrem em 88 países, com mais de 12 milhões de pessoas
infectadas ou em risco de infecção, com incidência anual estimada em cerca de 1-1,5 milhões
de casos para a Leishmaniose Tegumentar (LT) e 500.000 casos para a Leishmaniose Visceral
(LV) (WHO, 2007).
No Novo Mundo, dependendo da espécie de Leishmania e da imunidade do
hospedeiro, a doença pode se manifestar em duas formas principais: Leishmaniose
Tegumentar Americana (LTA), que pode se apresentar como forma clínica cutânea, cutâneo-
mucosa e cutâneo-difusa, tendo inúmeras espécies como agentes etiológicos destas
manifestações clínicas da LTA ou da Leishmaniose Visceral Americana (LVA), causada por
Leishmania chagasi (Alvar et al., 2004).
A leishmaniose visceral pode apresentar-se em diferentes formas clínicas, podendo ser
fatal quando não tratada. A leishmaniose tegumentar, sob a forma cutâneo-mucosa, apresenta
lesões extremamente mutilantes: na forma cutâneo-difusa é caracterizada por deficiência na
resposta imune mediada por células e na forma cutânea pode apresentar lesões múltiplas
(Desjeux, 2004).
O controle das leishmanioses ainda enfrenta grandes barreiras, não só relacionadas à
disponibilidade de drogas curativas, mas, também relativas ao controle de reservatórios,
movimentação de populações, urbanização desordenada, mudanças climáticas dentre outros
fatores. As medidas estabelecidas por Deane (1956), para o controle da LV foram baseadas
em um tripé de ações, que envolvem o tratamento dos indivíduos infectados, aspersões de
inseticidas, com efeito residual em domicílio e peri-domicílio e eliminação de cães infectados
(Palatnick-de-Souza et al., 2001), uma vez que a terapêutica na Leishmaniose Visceral Canina
(LVC) apresenta-se ineficaz. Para que o controle da LV seja efetivo, as medidas devem ser
mantidas durante longo período e, mesmo assim, é freqüente a reativação dos focos, uma vez
que as medidas anti-vetoriais não têm obtido sucesso. Na Índia foi observada a resistência do
vetor P. argentipes a altas concentrações de DDT. Esta observação vem agravar a situação no
local, uma vez que concomitantemente, tem sido observado grande número de pacientes que
não respondem à quimioterapia convencional com antimoniais, demonstrando a resistência
das cepas locais a estas drogas (WHO, 1991). Tal problema se estende a outros países onde a
LV é endêmica, dentre eles o Brasil, agravando ainda mais os sérios problemas enfrentados
nos programas de controle da doença.
O sacrifício dos cães soropositivos acarreta profunda tristeza e mesmo indignação aos
proprietários em face ao valor afetivo a esses animais. Nestas situações, a imunoprofilaxia
aparece então como uma das únicas alternativas para o controle da infecção. Marzochi et al.
(1985) e Genaro (1993), sugerem a aplicação de uma vacina anti-LVC como importante
medida de controle, tanto para a infecção canina quanto humana. No entanto, ainda não se
dispõe desta ferramenta para o controle da LV. No Brasil, nosso grupo de pesquisa tem
realizado estudos no sentido de desenvolver uma vacina contra a LVC. Recentemente,
Giunchetti et al. (2007a,b) demonstraram a antigenicidade e imunogenicidade em cães de uma
vacina de L. braziliensis morta com extrato de saliva de flebotomíneos e o adjuvante
saponina. Entretanto, estudos nesta linha são ainda muito controversos e necessitam ser
ampliados e testados mais rigorosamente antes de sua aplicação no campo.
No Brasil, a LV inicialmente possuía caráter eminentemente rural e, mais
recentemente, vem se expandindo para áreas urbanas de médio e grande porte (OMS, 2003).
Esta distribuição e principalmente a ampliação das áreas nas quais a doença vem causando
epidemias deve-se a fatores sócio-econômicos ainda pouco estudados. Dentre os fatores
importantes está a presença de cães nos domicílios e peri-domicilios, que são reservatórios
domésticos importantes e as raposas como reservatórios silvestres (Corredor et al., 1989).
Estes dados mostram claramente que a LVC necessita ser avaliada mais detalhadamente do
ponto de vista epidemiológico, considerando-se sua alta incidência na última década, além da
intensa densidade parasitária cutânea em cães infectados, o que contribui para a dispersão da
doença (Molina et al., 1994; Tesh, 1995). A enzootia canina tem precedido a ocorrência de
casos humanos e a infecção em cães tem sido mais prevalente do que no homem (OMS,
2003). A leishmaniose canina existe em cerca de 50 países dentre os 88 onde a leishmaniose
humana está presente, afetando principalmente três grandes áreas: China, Bacia do
Mediterrâneo e Brasil (Alvar et al., 2004).
Segundo Mancianti et al. (1988), a LVC pode ser dividida conforme os sinais clínicos
apresentados pelos cães, em três formas: assintomática, com ausência de sinais clínicos
sugestivos de infecção por Leishmania; oligossintomática podendo apresentar linfadenopatia,
pequena perda de peso e/ou pêlo opaco; e sintomática, podendo apresentar todos ou alguns
dos sinais graves da doença, como alterações cutâneas (alopecia, dermatite furfurácea,
úlceras), ceratoconjuntivite, onicogrifose, paralisia dos membros posteriores, dentre outros.
Fatores como estado nutricional, genética, raça e idade podem determinar a progressão da
doença após a infecção (Acedo-Sánchez et al., 1996; Fisa et al., 1999; Solano-Gallego et al.,
2000; Reis et al., 2005). A importância relativa de cada fator no cão ainda não foi bem
estabelecida.
Estudos longitudinais em cães em área endêmica vêm demonstrando que a história
natural da doença pode se desenvolver de diferentes formas. Alguns cães infectados podem
controlar a expansão do parasito e curar a infecção, enquanto em outros a infecção permanece
assintomática por tempo indefinido, durante o qual o animal não apresenta sinais. Nos cães
em que não há controle da expansão do parasito, a doença progride e somente após dois a
quatro meses de incubação os sinais da LVC se manifestam (Fisa et al., 1999; Quinnell et al.,
2001a; Moreno & Alvar, 2002).
Os cães constituem um excelente modelo de estudo para a leishmaniose.
Considerando-se as similaridades das sintomatologias desenvolvidas pelos cães e humanos
em diversas doenças causadas por agentes infecciosos, estudos têm utilizado estes animais
como modelo para a avaliação da interação parasito-hospedeiro e de resposta imune, bem
como para o desenvolvimento de novos métodos de diagnóstico e prognóstico e na avaliação
de protocolos terapêuticos e vacinais para uso de rotina na clínica veterinária (Cobbold &
Metcalfe, 1994; Williams, 1997). No entanto, pouco se conhece sobre os mecanismos imunes
importantes na resposta efetiva contra a infecção ou desenvolvimento de patologia por esses
animais. O nosso grupo vem desenvolvendo estudos pioneiros nesta área o que nos tem
permitido identificar alguns biomarcadores importantes no desenvolvimento das formas
clinicas da LVC. Estes estudos têm sido limitados, em parte, devido a dificuldades na
obtenção de reagentes para utilização em estudos de resposta imune canina.
Diversos estudos têm avaliado a relação entre formas clínicas distintas da LVC e
progressão da doença, com o objetivo de identificar marcadores laboratoriais para serem
usados em estudos de infecção por L. (L.) chagasi. Nosso grupo demonstrou alterações no
status bioquímico/hematológico associado a formas clínicas graves da LVC, sugerindo que a
resposta a estes parâmetros pode ser uma abordagem interessante durante o desenvolvimento
terapêutico e vacinal (Reis et al., 2006a). Além disso, nosso grupo demonstrou, recentemente,
a importância dos isotipos de imunoglobulinas como marcadores de evolução clínica e
densidade parasitária tecidual em cães naturalmente infectados por L. (L.) chagasi (Reis et al.,
2006b). IgG1 e IgG2 têm sido utilizados como indicadores mais adequados do status clínico
na LVC do que IgG total (Deplazes et al., 1995). Correlação direta entre altos níveis de
anticorpos IgG1 anti-Leishmania e o aparecimento de sinais clínicos foi demonstrado em cães
infectados por L. (L.) infantum, enquanto IgG2 foi associado com a infecção assintomática
(Nieto et al., 1999). Estes resultados não foram corroborados por outros estudos, nos quais
altos níveis de IgG2 foram encontrados em cães sintomáticos (Leandro et al., 2001) além de
IgA e IgE (Reis et al., 2006b). Entretanto, Day (2007) sugere ainda que as subclasses de
imunoglobulinas não possuem relação com perfis sorológicos específicos.
É bem aceito na infecção experimental em cães, que a presença de
hipergamaglobulinemia, principalmente IgG, não confere proteção (Genaro, 1993; Pinelli et
al., 1994). Já foi descrito que a imunidade efetiva parece ser mais dependente da imunidade
celular específica.
A análise fenotípica de células da resposta imune, por citometria de fluxo, permite
avaliar de maneira mais precisa diferentes marcadores de superfície celular (Bacal &
Faulhaber, 2003). A citometria de fluxo se tornou ferramenta ainda mais promissora para a
identificação e caracterização de populações e subpopulações celulares em uma grande
variedade de fluidos biológicos. Desta forma, originaram-se diversos estudos relacionados à
avaliação de perfis fenotípicos distintos, sendo a imunofenotipagem de linfócitos a aplicação
mais comum desta metodologia (Jaroszeski & Radcliff, 1999).
Entretanto, a eficácia de ensaios por citometria de fluxo ainda requer padronização,
especialmente na área clínica veterinária laboratorial (Reis et al., 2005). Ao longo dos últimos
anos, um grande problema no estudo da LVC tem sido a escassez de marcadores
imunológicos e reagentes específicos para a investigação da biologia celular canina (Moreno
& Alvar, 2002; Reis et al., 2005). O “Canine Leukocyte Antigen Workshop” (CLAW) foi um
evento chave que estimulou a comunidade científica a buscar novas aplicações da citometria
de fluxo para a identificação de subpopulações celulares caninas.
O desenvolvimento de anticorpos monoclonais específicos anti-marcadores de
superfície de células de cães viabilizou o estudo detalhado de uma série de moléculas
conectadas a diversas funções imunológicas. Neste sentido, Moore et al. (1992), utilizaram os
anticorpos monoclonais específicos anti-CD4 ou CD8 que são expressos nas subpopulações
de linfócitos T e verificaram que neutrófilos apresentavam alta expressão de CD4. O papel
funcional desta expressão em neutrófilos caninos ainda não é conhecido. Tafuri (1995) e
Tafuri et al. (1996) realizaram um estudo histopatológico, por imunohistoquímica dos
receptores tipo 3 e 4 do complemento no fígado e baço de cães naturalmente e
experimentalmente infectados com L. (L.) chagasi. Esses autores verificaram que a expressão
de CD11 e CD18
pelos macrófagos deve representar papel central na resposta celular dos cães
em ambas formas de infecção. Pinelli et al. (1995) realizaram estudos em cães infectados com
L. (L.) infantum, utilizando anticorpos monoclonais dirigidos contra células caninas e
verificaram a depleção de linfócitos T CD4+ e CD8+ no sangue periférico de cães com LV.
Cães apresentando a forma sintomática da doença revelaram supressão da imunidade
mediada por células (Pinelli et al., 1994). A análise imunofenotípica de células do sangue
periférico de cães demonstrou que a infecção por L. (L.) infantum é acompanhada por baixos
níveis, tanto de células T CD4+ quanto de células B CD21+, demonstrando a
imunossupressão em cães sintomáticos (Bourdoiseau et al., 1997). Em um estudo relacionado
ao status clínico e a densidade parasitária na medula óssea de cães naturalmente infectados
por L. chagasi, Reis et al. (2006c) descreveram a baixa freqüência de células B e de
monócitos (CD14+) como marcadores importantes da LVC grave. Além disso, observou-se
valor percentual aumentado de linfócitos T CD8+ em cães assintomáticos e com baixa
densidade parasitária.
Estudos in vitro também confirmaram a alteração da resposta imune celular durante a
LVC. Brandonisio et al. (1986) destacaram a reduzida habilidade fagocítica de monócitos em
cães infectados. Além disso, Panaro et al. (1998) demonstraram que monócitos do sangue
periférico de cães infectados por L. (L.) infantum não possuem efeito leishmanicida mediado
por óxido nítrico (NO). Poucos estudos têm demonstrado o envolvimento de linfócitos T
CD8+ na resistência à LV canina (Barbiéri, 2006). Estes linfócitos foram detectados em cães
assintomáticos experimentalmente infectados por L. (L.) infantum, mas não em animais
sintomáticos, sugerindo que a lise direta por linfócitos T citotóxicos de macrófagos infectados
representa mecanismo efetor adicional na resistência à LVC (Pinelli et al., 1995).
Estes estudos pioneiros mostram a grande importância da análise detalhada da resposta
imune nestes animais. No entanto, a análise apenas de marcadores celulares não é suficiente
para entendermos os mecanismos envolvidos na resposta imune efetiva contra a LVC.
Estudos utilizando células mononucleares do sangue periférico derivadas de cães
experimentalmente infectados sugerem associação entre resposta imune do tipo 1 e resistência
à LVC, com produção de citocinas como IFN-γ, IL-2 e TNF-α (Pinelli et al., 1994; Santos-
Gomes et al., 2002). O principal mecanismo efetor envolvido na resposta imune protetora na
LVC é a ativação de macrófagos por IFN-γ e TNF-α para a eliminação de amastigotas
intracelulares através da via do óxido nítrico L-arginina (Vouldoukis et al., 1996). O papel de
IL-12 na indução e manutenção da resposta imune do tipo 1 tem sido pouco estudado na LVC
(Barbiéri, 2006). A expressão simultânea de transcritos de RNAm de IL-12p40, além de IL-2
e IFN-γ foi observada em cães experimentalmente infectados por L. (L.) infantum, indicando
que estas citocinas estão envolvidas no retardo do estabelecimento da doença neste animais
(Santos-Gomes et al., 2002).
Ao contrário do que se observa no modelo murino da infecção cutânea por L. major,
uma clara associação entre resposta imune do tipo 2 e progressão da doença ainda não pôde
ser demonstrada em cães portadores da LV. Evidências de resposta imune mista Tipo1/Tipo2
foram apresentadas em estudos com células mononucleares do sangue periférico de cães
assintomáticos estimuladas in vitro por antígenos do parasito. Estas células apresentaram
transcritos de RNAm de IL-2, IFN-γ e IL-10. Entretanto, IL-2 e IFN-γ predominaram em cães
assintomáticos e o desenvolvimento da sintomatologia não pôde ser relacionado à expressão
de IL-10 (Santos-Gomes et al., 2002; Chamizo et al., 2005). Apesar da produção de IL-10 na
infecção humana por L. (L.) chagasi estar correlacionada a patologia (Ghalib et al., 1993;
Peruhype-Magalhães et al., 2005), dados relacionados ao envolvimento desta citocina com a
doença ativa na LVC são controversos. IL-10 secretada por células T reguladoras
(CD4+CD25+) tem sido demonstrada na leishmaniose murina e humana (Belkaid et al., 2002;
Campanelli et al., 2006). No entanto, pouco se sabe sobre o possível papel destas células na
LVC. A expressão de RNAm de IL-4 não foi observada em células mononucleares do sangue
periférico isoladas de cães assintomáticos, apesar desta citocina ter sido detectada em células
de cães assintomáticos estimuladas pelo antígeno solúvel de L. infantum (Soluble Leishmania
Antigen - SLA) (Chamizo et al., 2005). Quinnell et al. (2001b), observaram que na medula
de cães naturalmente infectados com L. (L.) chagasi, não houve aumento de IL-10, e em
apenas alguns animais observou-se discreto aumento de IL-4. É possível que, em cães, a
resposta do Tipo 2 seja produzida durante o período de incubação da doença, o que pode
determinar a progressão da infecção e o aparecimento de sinais clínicos. Estudo realizado por
Santos-Gomes et al. (2002) com cães experimentalmente infectados por L. infantum,
demonstrou que durante o período de incubação, não se observa resposta imune definida, e
apenas pouco antes do aparecimento de sinais observa-se resposta do Tipo 1 que, no entanto,
não evitou o desenvolvimento da doença e que foi regulada, uma vez que a doença foi
estabelecida. Neste ponto, a expressão de citocinas foi consideravelmente reduzida.
Estes estudos, em conjunto, apresentam descrição parcial da imunidade mediada por
células no contexto ex vivo ou in vitro, que não necessariamente refletem no que se observa
em órgãos diretamente afetados pelo parasito. Considerando-se que a LVC é uma doença
sistêmica, é de grande importância a realização de estudos que busquem um entendimento da
resposta imune mediada por células em compartimentos linfóides de cães naturalmente
infectados.
Nosso grupo mostrou recentemente, que cães sintomáticos naturalmente infectados
com L. chagasi apresentam alta expressão de IL-10 em esplenócitos. O aumento de IL-10
observado em cães com alto parasitismo esplênico foi marcante, uma vez que 100% destes
animais expressaram esta citocina (Lage et al., 2007). Esta alta expressão de IL-10, mesmo na
presença de IFN-γ e TNF-α, parece direcionar a resposta imune para uma resposta
imunossupressora, impedindo que macrófagos ativados controlem a proliferação do parasito e
sua disseminação por órgãos linfóides. Em estudo da imunidade órgão-específica na LVC,
Sanchez et al. (2004) demonstraram que independentemente da forma clínica, o fígado se
apresenta com índice de “Leishman Donovan Units” (LDU) significativamente maior em
comparação ao baço. Por outro lado, Reis et al. (2006b) observaram que em cães
sintomáticos, a pele e o baço foram os órgãos mais intensamente parasitados.
Reis (2001) ao avaliar a resposta imune no contexto ex vivo, através da
imunofenotipagem de leucócitos do sangue periférico, demonstrou que cães dos grupos
assintomático e oligossintomático apresentaram aumento de linfócitos T circulantes (Thy-1+ e
CD5+). Esse evento foi acompanhado por elevação preferencial nas subpopulações de
linfócitos T CD8+ e linfócitos T CD4+, respectivamente. Por outro lado, o grupo sintomático
apresentou os menores níveis de linfócitos T (CD4+ e CD8+), linfócitos B (CD21+) e
monócitos (CD14+) circulantes. A análise da resposta imune no baço mostrou a ocorrência de
aumento no percentual de linfócitos T CD8+ nos grupos assintomático e sintomático. Foi
observada também diminuição de linfócitos B (CD21+) em cães do grupo sintomático além
de queda na expressão do marcador CD45RA em todos os grupos de animais infectados.
Neste trabalho, os parâmetros hematológicos foram avaliados em cães naturalmente
infectados por L. (L.) chagasi através da realização de hemograma. Além disso, a
imunofenotipagem por citometria de fluxo foi utilizada para avaliar a expressão dos principais
marcadores de superfície celular em granulócitos e monócitos do sangue periférico, além de
linfócitos e esplenócitos nesses cães. O critério de avaliação utilizado foi o parasitismo de
baço e pele, quantificado através do índice de parasitismo tecidual, que corresponde ao
número de formas amastigotas presentes em cada 1000 células nucleadas. Considerando-se a
escassez de dados relacionados à densidade parasitária tecidual, este trabalho pretende
acrescentar informações sobre a resposta imune celular em cães sob a ótica do parasitismo de
baço e pele, que estão entre os órgãos mais acometidos pelo parasito durante o curso da
doença (Reis et al., 2006b).
A pele é o órgão que se expõe inicialmente à entrada do parasito e sua densidade
parasitária tem sido associada à presença de perfil inflamatório granulomatoso em cães com
LV (Dos Santos et al., 2004), além de ser de grande importância na transmissão da doença,
especialmente em cães assintomáticos (Marzochi et al., 1985; Solano-Gallego et al., 2004). Já
o baço se caracteriza por ser importante órgão linfóide, interposto à circulação sistêmica e
portal (Abbas & Lichtman, 2005). Estudos histopatológicos do compartimento esplênico
mostram, nos casos mais graves alterações importantes como, por exemplo, decréscimo no
número de linfócitos na bainha periarteriolar, elevada proliferação de macrófagos, hiperplasia
folicular e aumento da polpa vermelha com predomínio de macrófagos e plasmócitos
(Alencar, 1959). Além disso, tais lesões podem ser, por vezes, acompanhadas de intenso
parasitismo.
2 JUSTIFICATIVA
Considerando-se que o cão é um importante reservatório do parasito, altamente
relevante na cadeia epidemiológica de transmissão da LV, torna-se fundamental maior
compreensão da resposta imune relacionada à evolução clínica e parasitológica na LVC, não
somente para o entendimento da resposta imune canina, mas, também, para o
desenvolvimento de vacinas mais eficazes. Existem inúmeros trabalhos na literatura que
buscam avaliar as alterações na resposta imune de cães em função das manifestações clínicas
(Deplazes et al., 1995; Reis, 2001; Santos-Gomes et al., 2002). Entretanto, trabalhos que
abordam a influência do parasitismo tecidual na resposta imune sistêmica e/ou
compartimentalizada na LVC são escassos (Sanchez et al., 2004; Reis et al., 2006c;
Giunchetti et al., 2008a,b). Além dos testes que permitem o diagnóstico da infecção, a
determinação da densidade parasitária é fundamental para o entendimento da biologia da
infecção em animais susceptíveis como o cão. Assim, a associação entre a densidade
parasitária real e a análise da resposta imune podem contribuir de maneira significativa para o
estudo do desenvolvimento dos processos imunopatológicos associados à infecção (Reis et
al., 2006a).
Esta dissertação visa, portanto, utilizar esses dois fatores como base para avaliação
inicial acerca da participação das principais populações e subpopulações de células
mononucleares e sua correlação com a densidade parasitária nos principais órgãos acometidos
pelo parasito. Assim, acreditamos que este trabalho acrescentará novas informações
relevantes que irão facilitar o entendimento da imunopatogênese da LVC e da relação
parasito-hospedeiro, contribuindo para estudos futuros de testes de drogas e vacinas.
3 HIPÓTESE
O presente trabalho possui a hipótese de que diferentes graus de parasitismo medidos
pela contagem do índice de parasitismo tecidual influenciam a resposta imune celular de cães
naturalmente infectados por L. (L.) chagasi.
4 OBJETIVOS
4.1 Objetivo Geral
Avaliar os parâmetros hematológicos e o perfil fenotipico de células presentes no
sangue e baço de cães naturalmente infectados com L. (L.) chagasi, apresentando diferentes
graus de parasitismo de baço e pele.
4.2 Objetivos Específicos
- Avaliar o quadro hematológico de cães naturalmente infectados com L. (L.) chagasi,
apresentando diferentes graus de parasitismo de baço e pele;
- Avaliar a resposta imune inata de cães naturalmente infectados com L. (L.) chagasi,
através da expressão fenotípica de granulócitos (neutrófilos e eosinófilos) e monócitos do
sangue periférico e suas correlações com o parasitismo de baço e pele;
- Avaliar a resposta imune adaptativa de cães naturalmente infectados com L. (L.)
chagasi através da expressão fenotípica de linfócitos do sangue periférico e de esplenócitos e
suas correlações com o parasitismo de baço e pele.
5 MATERIAIS E MÉTODOS
5.1 Seleção e manejo dos cães
Todos os cães foram temporalizados, ou seja, decorrentes do estudo desenvolvido por
Reis (2001), em que foram selecionados 60 cães, sendo 20 não infectados e 40 naturalmente
infectados por L. (L.) chagasi, portadores das diferentes formas clínicas da infecção, de ambos
os sexos, com idade variando entre 2 a 6 anos, sem raça definida (SRD), criados e mantidos
no canil de experimentação do Laboratório de Leishmanioses do Departamento de
Parasitologia ICB-UFMG ou cedidos pelo Centro de Zoonoses da Prefeitura Municipal de
Belo Horizonte – MG. Antes da chegada dos animais, as celas foram submetidas ao “vazio
sanitário”, que consistiu na desinfecção das mesmas através de lavagens com solução de
hipoclorito a 1%. As celas foram mantidas sob inspeções periódicas do ambiente externo e
desinsetização trimestral com piretróide (k-otrine®) para evitar a presença de flebotomíneos.
Os animais foram submetidos à coleta de fezes para o diagnóstico de infecções por
protozoários ou helmintos intestinais e coleta de sangue para triagem sorológica através da
Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI). Em seguida, receberam tratamento anti-
helmíntico de largo espectro (Endal Plus®) composto de febantel, palmoato de pirantel e
praziquantel, além de banho com inseticida de ação ectoparasitária (Butox, Quimio).
Posteriormente, foram identificados em fichas, conforme suas características físicas (sexo,
tamanho, cor, pelagem, etc), numerados e mantidos em quarentena. Durante este período os
cães foram vistoriados diariamente e examinados semanalmente. Quinze dias após a
quarentena foi realizado novo exame coproparasitológico, para certificação da eficácia do
tratamento anti-helmíntico, bem como análise ectoscópica, para avaliar a eficiência da ação
do inseticida. Os cães foram mantidos no canil do ICB/UFMG, com água potável e ração
balanceada (Kinus® - BRASWEY-SA), fornecida “ad libitum”.
O diagnóstico sorológico foi realizado no soro dos cães pela reação de
imunofluorescência indireta (RIFI), segundo Camargo (1964), empregando conjugado
específico anti-IgG de cão (molécula total, Biomanguinhos, Fiocruz, RJ). Foram utilizadas
formas promastigotas de L. amazonensis (MHOM/BR/1960/BH6) mantidas em crescimento
logarítmico em meio LIT. Animais com títulos de IgG superiores à 1:40 foram considerados
positivos. Os resultados foram expressos em títulos de anticorpos, obtidos por diluição seriada
do soro por fator 2 até o encontro de resultado negativo ou ponto de titulação (Genaro, 1993).
Todas as amostras negativas foram repetidas para confirmação dos resultados. As reações
foram realizadas imediatamente após a entrada dos cães no canil e antes de ser realizada a
necropsia. Na análise dos resultados, foram consideradas as reações realizadas após a
quarentena, no material colhido nos dias dos procedimentos de citometria de fluxo do sangue
periférico e na véspera da realização de uma rigorosa inspeção clínica dos cães.
5.2 Procedimentos técnicos realizados para a necropsia dos cães
A eutanásia dos cães foi procedida conforme as recomendações do Colégio Brasileiro
de Animais de Experimentação (COBEA), e em concordância com a Lei n°. 6.638, de 8 de
maio de 1979, que estabelece normas práticas Didático-Científicas da vivissecção de animais.
Somente após constatação da morte, iniciavam-se os trabalhos de necropsia do animal. Para
otimização metodológica dos procedimentos realizados durante a necropsia, foi enfocado um
dos principais órgãos envolvidos no processo patológico da LVC, o baço, onde foi colhido o
fragmento para confecção de esfregaços por aposição em lâminas e avaliação dos ensaios de
fenotipagem por citometria de fluxo.
5.3 Obtenção de amostras de sangue de cães
As amostras de sangue de cães foram coletadas em seringas descartáveis e estéreis de
20 cc, através de venopunção, preferencialmente da veia jugular ou da radial.
Em seguida,
eram transferidos 5 mL de sangue para tubo contendo EDTA (na proporção de 1mg/mL)
destinados à realização do hemograma e imunofenotipagem celular, enquanto 10 mL eram
transferidos para dois tubos sem anticoagulante. Os dois últimos tubos foram imediatamente
centrifugados, por duas vezes, à 1500 rpm por 10 minutos para obtenção rápida das amostras
de soro, as quais foram aliquotadas e congeladas à – 20ºC até o momento de uso nos testes.
5.4 Avaliação dos parâmetros parasitológicos
5.4.1 Pesquisa do parasito em esfregaços por aposição de tecido
A pesquisa do parasito foi realizada no baço e pele (fragmento de ponta de orelha).
Estes materiais foram mantidos a temperatura ambiente e usados na confecção de esfregaços
por aposição em lâminas de microscopia. Após secagem ao ar por cerca de 1 hora, os
esfregaços foram corados por coloração panótica (Giemsa) e examinados ao microscópio
óptico, no intuito de se identificar formas amastigotas de Leishmania e, posteriormente,
avaliar as densidades parasitárias.
Figura 1- Esfregaços por aposição do baço e pele (ponta de orelha). A - Macrófago do baço com citoplasma
densamente parasitado por amastigotas (aumento 1500X). B – Fotomicroscopia ótica da pele apresentando
macrófagos com citoplasma densamente parasitado por amastigotas. Observe o núcleo com cromatina
condensada que encontra-se em posição periférica (aumento 1500X).
5.4.2 Avaliação da densidade parasitária em esfregaços por aposição de tecidos através
do índice de parasitismo tecidual
Para avaliar a densidade parasitária no baço e pele, as formas amastigotas foram
contadas ao microscópio óptico, segundo Reis (2001) adaptado de Stauber (1955). Os
resultados dos índices de parasitismo tecidual correspondem ao número de formas
amastigotas de Leishmania por 1.000 células nucleadas.
5.5 Metodologia relacionada à avaliação dos parâmetros hematológicos
Para a avaliação do quadro hematológico dos animais, foi realizado hemograma
completo, através da técnica convencional de contagem de hemácias e leucócitos (Dace &
Lewis, 1984) em contador eletrônico semi-automático de células - CELM CC 510, por
ocasião da coleta de sangue. Na série branca, o leucograma foi determinado pelo número de
A
B
leucócitos/mm
3
a partir da contagem diferencial destes em esfregaços corados por coloração
panótica, segundo May-Grünwald-Giemsa.
5.6 Avaliação da resposta celular no contexto ex vivo através da imunofenotipagem de
células do sangue e baço
5.6.1 Citometria de fluxo para leucócitos de cães
A citometria de fluxo é uma técnica que inclui a análise básica de três parâmetros
celulares: tamanho (determinado pela difração do raio laser – “Forward scatter” - FSC),
granulosidade ou complexidade interna (determinada pela reflexão do raio laser – “Side
Scatter” - SSC) e intensidade relativa de fluorescência e permite o estudo de diferentes
componentes ou elementos celulares simultaneamente, empregando fluorocromos diferentes.
Para a realização dos ensaios de imunofenotipagem das células obtidas a partir do
sangue periférico e do baço, foram utilizados anticorpos monoclonais específicos anti-
receptor de células caninas, geralmente produzidos em ratos, com exceção dos anticorpos
monoclonais anti-CD14 Cy-5 (Fluorescência tipo 3) e anti-CD21 FITC (isotiocianato de
fluoresceína - Fluorescência Tipo 1), que são específicos para células humanas mas possuem
reatividade cruzada com células caninas. Os demais anticorpos não estavam marcados com
fluorocromos, sendo empregado, portanto, anticorpo secundário anti-IgG de rato marcado
com FITC (Tabela 1). Foi analisado apenas um tipo de fenótipo por tubo, portanto, não houve
utilização de marcações simultâneas. Para aquisição, armazenamento e análise dos dados
referentes à resposta celular foi empregado um citômetro de fluxo (FACScan – Becton
Dickinson), equipado com um sistema de computador contendo o "Software - Cell Quest". O
número de eventos armazenados para cada tubo analisado foi de 10.000.
Como controles foram utilizados apenas os anticorpos secundários para cada ensaio.
Na Tabela 1, podem ser observadas as características do painel de anticorpos monoclonais,
utilizados na imunofenotipagem das diferentes células caninas investigadas.
Tabela 1 - Painel de Ac(s) monoclonais empregados na imunofenotipagem das células
caninas
Anticorpos
Monoclonais
Hospedeiro
Clone
Isotipo
Células alvo
Anti CD 5
Rato
YKIX322.3
IgG2a
Células T
Anti Thy-1
Rato
YKIX337.217
IgG2b
Células T, monócitos e
granulócitos
Anti CD 4
Rato
YKIX302.9
IgG2a
Céls. T helper
Anti CD 8
Rato
YCATE55.9
IgG1
Céls. T supressoras
Anti CD 45RB
Rato
YKIX716.13
IgG2b
Leucócitos
Anti CD 45RA
Rato
YKIX753.22.2
IgG2b
Leucócitos
Anti CD 14
Camundongo
TÜK4
IgG2a
Monócitos
Anti MHC II
Rato
YKIX334.2
IgG2b
Células T e B
Anti CD 21
FITC
Camundongo
IOB1a
IgG1
Célula B
Anti Rat IgG
FITC
Coelho
Policlonal Rat
IgG
-
Controle isotípico
Todos os anticorpos foram produzidos pela SEROTEC Ltd (Oxford - England). 8th HLDA International
Workshop, San Diego, Ca.
5.6.2 Obtenção e preparação da suspensão de leucócitos totais e esplenócitos de cães
para imunofenotipagem
Da amostra de sangue colhida em EDTA, foi retirado 1mL e transferido para um tubo
de 15mL de poliestireno, fundo em V (FALCON®, BD, New Jersey, USA). Em seguida,
foram adicionados lentamente 5mL de solução de lise (Facs lysing solution – BECTON
DICKINSON) e, imediatamente, o material foi submetido a agitação no vórtex em velocidade
média. Então, foram adicionados mais 5mL da mesma solução sob agitação e, por fim, o
volume completado para 13mL com essa solução e homogeneizando lentamente. O material
foi mantido em repouso por 10 minutos a temperatura ambiente e, em seguida, centrifugado a
1500 rpm, por 10 minutos na mesma temperatura. O sobrenadante foi desprezado de uma só
vez, vertendo o tubo, e o conteúdo ressuspendido em 13mL de PBS 1X pH 7,2,
homogeneizado, com o intuito de lavar as células que foram submetidas à lise. Novamente o
material foi submetido à centrifugação a 1500 rpm, por 10 minutos à temperatura ambiente. O
sobrenadante foi desprezado e o sedimento homogeneizado e ressuspendido em PBS pH
7,2/10% SFB (Soro Fetal Bovino - GIBCO, Grand Island, New York, USA). Após
centrifugação, o sobrenadante foi aspirado com o auxílio de pipeta Pasteur acoplada a bomba
de vácuo, e o sedimento resuspendido em 500µL de tampão PBS 1X pH 7,2 10% SFB. Antes
de iniciar o protocolo de imunofenotipagem, era realizado um teste de controle de qualidade
da suspensão celular onde tomava-se 60µL da suspensão em 340µL de solução fixadora para
citometria - MaxFacsFix (10,0g/L de paraformaldeído, 10,2g/L de cacodilato de sódio e
6,65g/L de Cloreto de sódio, pH 7,2), em um tubo de poliestireno (FALCON
2054, BD,
New Jersey, USA), específico para leitura no citômetro de fluxo (FACScan - BECTON
DICKINSON, San Jose, CA, EUA). O teste permitia ajustar o número de eventos celulares
para 1.500 eventos/segundo por tubo, além de avaliar antecipadamente a qualidade do perfil
celular da amostra com relação ao tamanho e a granulosidade das células, após a lise.
Para a obtenção de linfócitos do baço, fragmentos de aproximadamente 4cm de
comprimento por 1cm de largura foram recolhidos deste órgão com o auxílio de pinça e
tesoura previamente flambados e imediatamente transferidos para tubos estéreis, abertos
próximos da chama de fogo, contento RPMI 1640 heparinizado.
Em capela de fluxo laminar, o fragmento do baço era transferido para uma placa de
Petri contendo solução de RPMI 1640 heparinizado, e com o auxílio de um bisturi estéril
cortado em pequenos fragmentos de aproximadamente 0,5 X 0,5 cm. Três destes fragmentos
foram transferidos para um macerador de vidro, contendo em torno de 2mL de solução de
RPMI 1640 heparinizado, e macerados. A suspensão celular obtida foi transferida para tubo
FALCON
de 50mL de poliestireno (BD, New Jersey, USA), ao qual foi adicionado RPMI
1640 heparinizado até completar volume final de 40mL. Esta operação foi repetida por mais
duas vezes, obtendo então volume total de 120mL de suspensão celular. A suspensão foi
filtrada, por meio de montagem de filtros plásticos rosqueados contendo tela de metal com
poros de pequeno diâmetro e, através de outros filtros, com tela de maior diâmetro e estéreis.
Para remoção de pequenos fragmentos de tecido conjuntivo e/ou de coágulos existentes junto
com as células, a suspensão final foi passada através de filtro com tela de metal de diâmetros
decrescentes, em ambiente estéril. O filtrado foi homogeneizado manualmente e aplicado
vagarosamente, na razão de 20mL da suspensão sobre 10mL de gradiente de Ficoll-Hypaque
(Histopaque
®
1.077 - SIGMA Co., USA) gelado, em tubos de vidro com tampa de metal, e
submetidos à centrifugação à 1.800 rpm por 40 minutos a temperatura ambiente. Logo em
seguida, foi removido na interface dos líquidos, o anel de esplenócitos e lavado 3 vezes, por
centrifugação, à 1.500 rpm, por 10 minutos à 4º C em RPMI 1640 heparinizado. Ao final, as
células foram ressuspensas em 1 ou 2mL de RPMI 1640, conforme a quantidade de sedimento
obtido. Uma alíquota de 100µL foi transferida para um tubo, sendo realizada a contagem das
células em contador eletrônico semi-automático de células - CELM CC 510. O valor obtido
foi multiplicado pelo volume ressuspendido, e o volume final ajustado para conter 1x10
7
cels/mL.
5.6.3 Ensaio de imunofluorescência para avaliação da expressão fenotípica de leucócitos
e esplenócitos de cães
Os anticorpos monoclonais foram preparados na diluição previamente estabelecida
pela titulação dos mesmos, durante os ensaios de padronização desta metodologia segundo
Reis et al. (2005), em solução de PBS 10% SFB/10% soro de carneiro normal, inativado à
56ºC em banho-maria por 30 minutos (SCN FACS dil) e distribuído em microplacas de 96
orifícios com fundo em "U" (LIMBRO, INC Biomedicals, Inc. Aurora, Ohio). As placas
foram preparadas 1 semana antes dos experimentos de fenotipagem e armazenadas em
“freezer” à -20ºC. A cada orifício foram transferidos 30µL de cada anticorpo diluído
previamente, conforme mostrado na Tabela 2. Em cada fileira horizontal de uma placa (12
orifícios) foi feita a marcação fenotípica das células de um único cão. Os orifícios 01, 02 e 03
representavam os controles de qualidade da reação de imunofenotipagem e das reações
negativo e positivo, os quais permitiam avaliar as possíveis reações inespecíficas que
poderiam ocorrer, caso não fosse realizado o bloqueio destas ligações. Foi empregado, no
orifício 02, uma mistura de soros de rato normal (SRN), diluído 1:6000 em solução de
FACSdil, servindo de controle isotípico das reações. Já o orifício 03, foi utilizado para
verificar a ocorrência de ligação inespecífica do anticorpo secundário em algum possível
epitopo das células de cão. Reações apresentando resultados com percentual de fluorescência
dos orifícios 01, 02 e 03 superiores a 2% eram desconsideradas e repetidas. A cada orifício
foram adicionados 30µL da suspensão celular e, após o plaqueamento das células, a placa foi
submetida à agitação, cuidadosa e lenta em vórtex, e deixada sob incubação por 30 minutos,
ao abrigo da luz e à temperatura ambiente. Em seguida, foram adicionados 140µL de PBS 1X,
para remoção do excesso de anticorpos livres, que não ligaram às células durante o processo
de incubação. Após a centrifugação à 2.500 rpm por 10 minutos a temperatura ambiente, o
sobrenadante foi desprezado de uma só vez, e a placa vertida sobre papel toalha absorvente
para eliminação do sobrenadante. O sedimento celular foi ressuspenso agitando-se a placa em
vórtex e adicionado aos orifícios contendo a suspensão celular, 60µL do anticorpo secundário,
exceto no primeiro que recebeu 60µL da solução FACSdil. A placa foi submetida à agitação
lenta no vórtex, para homogeneizar o material, sendo incubada por 30 minutos no escuro à
temperatura ambiente. Em seguida, as células foram lavadas por 2 vezes, a primeira com
140µL de PBS 1X pH 7,2, submetida à centrifugação a 2.500 rpm por 10 minutos a
temperatura ambiente. O sobrenadante foi desprezado de uma só vez e as células
ressuspensas, utilizando-se vórtex. Na segunda lavagem realizada em 200µL de PBS 1X pH
7,2, novamente as células foram centrifugadas conforme descrito e, finalmente,
ressuspendidas em 170µL de solução fixadora (MaxFacsFix). Com o auxílio de pipeta
multicanal, as células foram transferidas para tubos de poliestireno com capacidade para
500µL (Thomas Scientific, United Kingdom). Após 30 minutos foi realizada a leitura do
material no citômetro de fluxo (FACScan - BECTON DICKINSON, San Jose, CA, EUA).
Para os ensaios de imunofluorescência para avaliar a expressão fenotípica ex vivo das
células obtidas do baço, 2-3mL da suspensão celular de cada órgão foram submetidas a lise,
usando-se a mesma solução descrita na seção 5.6.2. Este processo resultava em uma
suspensão final livre de eritrócitos, tendo sido fixada previamente à marcação. As etapas
subseqüentes de marcação seguem a metodologia já descrita anteriormente, entretanto, a
quantidade de anticorpo monoclonal anti-CD21 foi o dobro (10µL) da utilizada no protocolo
de marcação das células do sangue periférico. A marcação com anti-CD21 foi realizada
durante a etapa de revelação com o anticorpo secundário.
5.6.4 Ensaio de imunofluorescência para fenotipagem de monócitos do sangue periférico
de cães
A presença de monócitos no sangue periférico de cães saudáveis e infectados, foi
avaliada através de um processo simples de marcação primária, empregando-se anticorpo
monoclonal anti-CD14 humano conjugado com Cy-5. A marcação foi realizada em tubos de
poliestireno (FALCON
2054, BD, New Jersey, USA), contendo 50µL de anti-CD14 diluído
1:200 em FACSdil. Em seguida, foram adicionados 50µL de sangue total colhido em EDTA.
As células foram, então, misturadas com o anticorpo com auxílio de vórtex e incubadas por 30
minutos ao abrigo da luz, a temperatura ambiente. A lise dos eritrócitos foi realizada
adicionando-se 2mL de solução de lise, sob agitação no vórtex, incubando-se por 10 minutos,
a temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Logo após esta etapa, foi adicionado 1mL de PBS
pH 7,2, sendo o material homogeneizado no agitador e centrifugado a 1.500 rpm por 10
minutos, à temperatura ambiente. O sobrenadante foi desprezado de uma só vez, vertendo o
tubo, e o sedimento ressuspenso manualmente, sendo adicionados ao mesmo 2mL de PBS 1X
pH 7,2, seguindo-se homogeneização no agitador e centrifugação a 1.500 rpm
por 10 minutos
a temperatura ambiente. O sobrenadante foi desprezado como anteriormente e o sedimento
ressuspendido em 200µL de solução fixadora.
Tabela 2 – Distribuição do painel de anticorpos anti-marcadores de superfície celular
em microplaca de 96 orifícios
Orifícios
Anticorpo
1
ário
/diluição
Anticorpo
2
ário
/diluição
1
30
µ
L FACS dil 60
µ
L FACS dil
2
30
µ
L FACS dil 60
µ
L FACS dil
3
30
µ
L SRN (1:6.000) 60
µ
L ANTI-RATO- FITC 1:100
4
30
µ
L THY-1 (1:800) 60
µ
L ANTI-RATO- FITC 1:100
5
30
µ
L CD5 (1:800) 60
µ
L ANTI-RATO- FITC 1:100
6
30
µ
L CD4 (1:12.500) 60
µ
L ANTI-RATO- FITC 1:100
7
30
µ
L CD8 (1:800) 60
µ
L ANTI-RATO- FITC 1:100
8
30
µ
L MHC-II (1:200) 60
µ
L ANTI-RATO- FITC 1:100
9
30
µ
L CD45 RA (1:200)
60
µ
L ANTI-RATO- FITC 1:100
10
30
µ
L CD45 RB (1:800) 60
µ
L ANTI-RATO- FITC 1:100
11
30
µ
L FACS dil 5
µ
L CD21-FITC
*
*Para o anticorpo anti CD21-FITC, foram adicionados 5µL do anticorpo e, sobre este, adicionados 30µL da
suspensão celular durante a etapa do conjugado, permanecendo 30 minutos em incubação no escuro.
5.7 Obtenção e análise de dados por citometria de fluxo
O primeiro passo para a análise dos dados obtidos de células de sangue periférico e
baço, ex vivo, consistiu na identificação das populações celulares de interesse (R1, R2, R3 e
R4). Neste caso, os linfócitos, neutrófilos, eosinófilos e monócitos, respectivamente, passaram
a ocupar uma região característica, após ajustes de ganhos de tamanho (determinado pela
difração do raio laser – “Forward Scatter” – FSC) versus granulosidade ou complexidade
interna (determinada pela reflexão do raio laser – “Side Scatter” – SSC) (Figura 2). Após a
seleção da região de interesse, a mesma foi analisada utilizando-se a intensidade de
fluorescência apresentada pelas células presentes na região selecionada, e disposta em
gráficos do tipo histograma, onde se tem Fluorescência tipo 1 (FL1) versus número de células.
Inicialmente, foram analisados para cada amostra os controles das reações (Figura 3). O
controle de células (Figura 3A) foi importante para avaliação da qualidade do perfil celular, o
controle isotípico (Figura 3B) foi importante para detectar reações cruzadas e o controle do
conjugado (Figura 3C) foi fundamental para posicionar o marcador (M1), que servirá de
referência para todas as análises subseqüentes.
Assim, tomando-se como referência o marcador do conjugado, foram construídos
gráficos do tipo histograma onde se tem FL1 versus número de células, obtendo-se o valor
percentual equivalente à população positiva para cada marcador de superfície avaliado
durante as reações de imunofenotipagem (Figura 4). Para a análise da população de monócitos
foi construído um histograma de intensidade de fluorescência onde se tem Fluorescência tipo
3 versus número de células totais. O marcador foi posicionado considerando-se a população
celular positiva para o marcador (CD14), obtendo-se o percentual equivalente à população de
monócitos dentro da população de leucócitos totais (Figura 4).
A estratégia utilizada para para expressar os valores absolutos (n
o
de células/mm
3
)
baseou-se na seguinte equação: [% Linfócitos positivos para o marcador celular x n
o
absoluto
de linfócitos obtidos no hemograma]/100.
Figura 2- Representação esquemática da seqüência de eventos da análise de dados obtidos por citometria de
fluxo. Gráficos de distribuição pontual FSC X SSC são utilizados para seleção da população de interesse. Em
(A) está representado o perfil celular obtido de amostras de sangue periférico; em (B) está representado o perfil
celular obtido de amostras de baço. Em (A) e (B) também estão representadas as seleções das populações de
linfócitos e esplenócitos, respectivamente (R1 e R2); em (C) está representada a seleção da população de
neutrófilos de amostras do sangue periférico (R3); em (D) está representada a seleção da população de
eosinófilos de amostras do sangue periférico (R4) e em (E) está representada a seleção da população de
monócitos de amostras do sangue periférico (R5).
Tamanho
B
Granulosidade
Tamanho
A
Granulosidade
R1
R1
Granulosidade
R2
C
R3
Tamanho
D
R4
Granulosidade
E
Tamanho
B
Granulosidade
Tamanho
A
Granulosidade
R1
Tamanho
A
Granulosidade
R1
R2
Granulosidade
R3
C
R3
Tamanho
D
R3R4
Tamanho
D
R5
Granulosidade
E
Linfócitos
Esplenócitos
Neutrófilos
Eosinófilos
Monócitos
Fluorescência
Tamanho
Tamanho
Figura 3- Controles das reações de imunofenotipagem. Histogramas de fluorescência individual (FL1 X Nº de
células) foram utilizados para analisar a intensidade de fluorescência das células presentes na região selecionada.
Em (A) está representado o controle de células, o controle isotípico em (B) e o controle do conjugado onde é
posicionado o marcador M1, utilizado para as reações de imunofenotipagem em (C).
Figura 4- Reações de imunofenotipagem. Histogramas de fluorescência individual (FL1 X Nº de células) foram
utilizados para analisar a intensidade de fluorescência das células presentes na região selecionada. Após
posicionar o marcador M1 do controle do conjugado foi obtido o percentual de população positiva para cada
marcador de superfície celular (THY-1+, CD5+, CD4+, CD8+ e CD21+). Para análise de células (CD14+)
obteve-se um histograma individual (FL3 X Nº de células) que após posicionamento do marcador obteve-se o
valor percentual de células (CD14+) na população de leucócitos totais (fora de R1). A análise de CMF por
gráficos de histogramas (FL1 X Nº de células) foi realizada em toda a população de linfócitos do sangue
periférico e nos esplenócitos (sem M1).
FL1
(CD45RA+)
CMF=515,26
Nº de Células
46,0 %
FL1
(CD4+)
Nº de Células
FL1 (THY-1+)
70,0 %
Nº de Células
FL1 (CD5+)
68,0 %
Nº de Células
25,0 %
(CD8+)
FL1
Nº de Células
FL3 (CD14+)
8,0 %
Nº de Células
CMF=569,46
FL1
Nº de Células
16,0 %
FL1 (CD21+)
Nº de Células
CMF=443,30
FL1 (MHCII+)
Nº de Células
M1
M1
M1
M1
M1
M1
(CD45RB+)
5.8 Categorização de dados
A categorização de dados foi realizada de acordo com a densidade parasitária nos
diferentes órgãos, utilizando-se a análise por tercis. A metodolologia estatística de tercis
consiste na divisão por três do número total de cães incluídos nos grupos de animais
infectados. Desta forma, o primeiro grupo infectado possui um terço dos cães com os menores
índices de parasitismo, o segundo grupo é alocado com o segundo terço de cães com os
índices medianos e no último terço permanecem os cães com os índices mais altos de
parasitismo no baço e na pele.
Os mesmos cães foram diferentemente categorizados para cada tecido, sendo que 27
animais (67,5%) apresentaram a mesma classificação no baço e na pele (Figura 5).
Através do
teste de McNemar concluiu-se que não há diferença estatisticamente significativa (p= 1,000)
na classificação atribuída ao baço em relação à pele. Além disto, o teste de correlação de
Spearman mostrou uma correlação positiva (r= 0,699 / p= 0,000 para valores atribuídos e r=
0,818 / p= 0,000 para o índice de parasitismo tecidual) entre as classificações realizadas para
o baço e a pele.
Desta forma, três grupos foram assim classificados: Baixo Parasitismo (BP; n=13),
Médio Parasitismo (MP; n=13) e Alto Parasitismo (AP; n=14). Vinte Cães Não Infectados
(CNI), parasitologicamente e sorologicamente negativos para Leishmania, constituíram o
grupo controle. O critério utilizado para as categorizações foi o índice de parasitismo tecidual
já descrito anteriormente (item 5.4.2), sendo os valores em cada grupo e nos respectivos
tecidos apresentados na Tabela 3.
Na análise da relação entre as densidades parasitárias determinadas pelo índice de
parasitismo tecidual e as diferentes formas clínicas, foi possível observar correlação positiva
da densidade parasitária no baço (r= 0,5048 / p= 0,001) e na pele (r= 0,4416 / p= 0,004) com a
severidade da doença. Além disto, a densidade parasitária foi significativamente maior no
baço (p<0,01) e na pele (p<0,001) de cães sintomáticos (CS) em comparação aos cães
assintomáticos (CA) (Figura 6).
Figura 5- Classificações individuais de cães com baixa, média e alta densidade parasitária esplênica e cutânea.
Foram atribuídos diferentes valores para cada categoria, sendo os valores 1-2 para cães com baixo parasitismo
(BP, triângulos alaranjados), 2-3 para cães com médio parasitismo (MP, triângulos vermelhos) e 3-4 para cães
com alto parasitismo (AP, triângulos roxos) no baço e na pele.
Figura 6- Densidades parasitárias determinadas pelos índices de parasitismo esplênico e cutâneo de cães com
diferentes formas clínicas naturalmente infectados por Leishmania (Leishmania) chagasi. As barras representam
as medianas, e os símbolos, os valores individuais dos grupos. CA = Cães Assintomáticos ( , n= 6), CO = Cães
Oligossintomáticos ( , n=9), CS = Cães Sintomáticos ( , n=15). As diferenças estatisticamente significativas
estão representadas pela letra a, correspondente aos cães assintomáticos (CA) em comparação aos cães
sintomáticos (CS).
Baço Pele
1
2
3
4
Baço Pele
1
2
3
4
Densidade Parasitária
(Valores Atribuídos)
Baço Pele
1
2
3
4
Baço Pele
1
2
3
4
Densidade Parasitária
(Valores Atribuídos)
CA CO CS
1
10
100
1000
10000
a
IP (Baço)-log
CA CO CS
1
10
100
1000
10000
a
IP (Pele)-log
Tabela 3 - Grupos de cães não infectados e naturalmente infectados por L. (L.) chagasi
apresentando diferentes graus de parasitismo esplênico e cutâneo
Legenda: IPE (Índice de Parasitismo Esplênico); IPC (Índice de Parasitismo Cutâneo). Os pontos de corte para
os índices de parasitismo em cada um dos grupos foram determinados através da análise por tercis.
5.9 Análise Estatística
Para a realização das análises estatísticas, o banco de dados foi transferido para
planilhas do software de análises estatísticas GraphPad Prism-4.0® (San Diego, CA, USA)
para a realização de testes comparativos paramétricos e não-paramétricos. Os testes ANOVA
(pós-teste Tukey) para dados paramétricos e Kruskal-Wallis (pós-teste Dunns) para dados
não-paramétricos, foram utilizados na comparação entre todos os grupos (CNI, BP, MP e AP)
e apenas entre os grupos de cães infectados (BP, MP e AP) dentro de cada fenótipo celular.
Os testes de correlação de Spearman e Pearson foram utilizados com o objetivo de investigar
associações entre os fenótipos avaliados e as densidades parasitárias esplênicas e cutâneas. As
diferenças estatisticamente significativas foram consideradas quando o valor de p≤ 0,05.
Grupo Sigla
Cães Não Infectados
Baixo Parasitismo
Médio Parasitismo
Alto Parasitismo
CNI
BP
MP
AP
0
0 a 11
12 a 170
184 a 2564
CorCor
Sexo
9 / 11 M
5 F / 8 M
7 F / 6 M
6 F / 8 M
Grupo Sigla
Cães Não Infectados
Baixo Parasitismo
Médio Parasitismo
Alto Parasitismo
CNI
BP
MP
AP
n
20
13
13
14
n
20
1
1
1
n
20
1
1
n
20
1
1
CorCorCorCor
Sexo
9 F
IPC
0
0 a 9
10 a 130
133 a 7246
IPE
6 RESULTADOS
6.1 Avaliação de parâmetros hematológicos em cães naturalmente infectados por L. (L.)
chagasi com diferentes densidades parasitárias esplênicas e cutâneas e animais não
infectados
Para a determinação de parâmetros hematológicos de cães naturalmente infectados por
L. (L.) chagasi e cães não infectados, foram avaliados os valores de eritrócitos (milhão/mm
3
),
hemoglobina (g/dL), hematócrito (% de células), além da global de leucócitos/mm
3
. A partir
da contagem diferencial das populações celulares em lâminas coradas pelo Giemsa, foram
calculados os valores absolutos de linfócitos, neutrófilos, eosinófilos e monócitos.
Dentre as alterações observadas no hemograma, foi detectada anemia grave em cães
com AP esplênico, com diminuição significativa na contagem de eritrócitos de cães AP (p<
0,001) e MP (p< 0,05) quando comparado ao grupo controle e na concentração de
hemoglobina e hematócrito de cães AP comparado ao grupo BP (p< 0,05) (Tabela 4). Cães
com alta densidade parasitária cutânea apresentaram apenas diminuição nos valores de
hemoglobina em comparação aos cães do grupo BP (p< 0,05) (Tabela 5). Além disso,
observamos queda significativa (p<0,05) no valor absoluto de linfócitos no grupo de cães com
AP esplênico quando comparados aos cães do grupo MP (Tabela 4).
O quadro hematológico avaliado, levando-se como parâmetro de análise o parasitismo
de pele ou baço, apresenta-se com: eosinopenia no grupo de cães com AP e MP (p<0,05) e
monocitopenia no grupo de cães com AP (p<0,05) em comparação ao grupo CNI (Tabelas 4 e
5).
Tabela 4 – Avaliação de parâmetros hematológicos em cães com parasitismo esplênico e
animais não infectados
CNI
(n=20)
BP
(n=13)
MP
(n=13)
AP
(n=14)
PARÂMETROS
HEMATOL ÓGICOS
GRAU DE PARASITISMO DE BAÇO
Leucócitos – 10
3
/µl
Linfócitos – 10
3
/µl
Neutrófilos– 10
3
/µl
Eosinófilos– 10
3
/µl
Monócitos – 10
3
/µl
12,8±2,7
2,7±1,5
7,3±3,1
1,8±0,8
1,0±0,4
13,7±4,9
2,6±2,6
7,3±3,5
0,6±1,2
0,9±0,5
12,0±4,8
3,2±1,2
6,7±3,3
0,7±0,7
0,7±0,4
11,6±3,3
1,2±1,4
8,1±2,2
0,7±0,4
0,6±0,4
CNI
(n=20)
BP
(n=13)
MP
(n=13)
AP
(n=14)
PARÂMETROS
HEMATOL ÓGICOS
GRAU DE PARASITISMO DE BAÇO
Leucócitos – 10
3
/µl
Linfócitos – 10
3
/µl
Neutrófilos– 10
3
/µl
Eosinófilos– 10
3
/µl
Monócitos – 10
3
/µl
12,8±2,7
2,7±1,5
7,3±3,1
1,8±0,8
1,0±0,4
13,7±4,9
2,6±2,6
7,3±3,5
0,6±1,2
0,9±0,5
12,0±4,8
3,2±1,2
6,7±3,3
0,7±0,7
a
0,7±0,4
1,2±1,4
**
0,7±0,4
a
0,6±0,4
a
46,4±5,4 40,3±4,3 36,3±6,4 29,6±11,8
b
± ± ±
15,7±1,9 14,0±2,1 12,7±2,5 10,1±4,0
b
± ± ±
6,8±0,8 5,6±0,6 5,3±0,9
a
4,2±1,6
a
± ± ±
Eritrócitos – milhão/mm
3
Hemoglobina – g/dL
Hematócrito – %
Os resultados estão expressos como média ou mediana (linfócitos e eosinófilos) dos valores absolutos +/- desvio
padrão. CNI= Cães Não Infectados, BP= Baixo Parasitismo, MP= Médio Parasitismo e AP= Alto Parasitismo.
As diferenças estatisticamente significativas encontram-se representadas em vermelho pelas letras a, b e c
(correspondentes aos grupos CNI, BP e MP, respectivamente) e pelos asteriscos *, **,***, (correspondentes aos
grupos de cães infectados BP, MP e AP, respectivamente); n= número de animais avaliados em cada grupo.
Tabela 5 – Avaliação de parâmetros hematológicos em cães com parasitismo cutâneo e
animais não infectados
CNI
(n=20)
BP
(n=13)
MP
(n=13)
AP
(n=14)
PARÂMETROS
HEMATOL ÓGICOS
GRAU DE PARASITISMO DE PELE
Leucócitos – 10
3
/µl
Linfócitos – 10
3
/µl
Neutrófilos– 10
3
/µl
Eosinófilos– 10
3
/µl
Monócitos – 10
3
/µl
12,8±2,7
2,7±1,5
7,3±3,1
1,8±0,8
1,0±0,4
14,3±4,3
2,5±2,6
8,0±3,3
0,6±1,1
0,7±0,4
11,6±4,3
2,7±1,4
6,4±3,0
0,7±0,8
a
0,6±0,4
11,4±4,2
1,9±1,3
7,7±2,7
0,2±0,5
0,4±0,4
CNI
(n=20)
BP
(n=13)
MP
(n=13)
AP
(n=14)
PARÂMETROS
HEMATOL ÓGICOS
GRAU DE PARASITISMO DE PELE
Leucócitos – 10
3
/µl
Linfócitos – 10
3
/µl
Neutrófilos– 10
3
/µl
Eosinófilos– 10
3
/µl
Monócitos – 10
3
/µl
12,8±2,7
2,7±1,5
7,3±3,1
1,8±0,8
1,0±0,4
14,3±4,3
2,5±2,6
8,0±3,3
0,6±1,1
0,7±0,4
11,6±4,3
2,7±1,4
6,4±3,0
0,6±0,4
11,4±4,2
1,9±1,3
7,7±2,7
0,2±0,5
a
0,4±0,4
a
46,4±5,4 39,0±5,6 36,4±10,2 30,4±9,7± ± ±
15,7±1,9 13,6±2,1 12,8±3,9 10,2±3,1
b
± ± ±
6,8±0,8 5,4±0,7 5,2±1,5 4,4±1,2± ± ±
Eritrócitos – milhão/mm
3
Hemoglobina – g/dL
Hematócrito – %
Os resultados estão expressos como média ou mediana (linfócitos, eosinófilos e monócitos) dos valores
absolutos +/- desvio padrão. CNI= Cães Não Infectados, BP= Baixo Parasitismo, MP= Médio Parasitismo e AP=
Alto Parasitismo. As diferenças estatisticamente significativas encontram-se representadas em vermelho pelas
letras a, b e c
(correspondentes aos grupos CNI, BP e MP, respectivamente); n= número de animais avaliados em
cada grupo.
6.2 Análise de fenótipos celulares de granulócitos do sangue periférico de cães
naturalmente infectados por
L. (L.) chagasi
com diferentes densidades parasitárias
esplênicas e de animais não infectados
Para avaliar a possível relação entre o parasitismo e a resposta imune inata de cães
naturalmente infectados por L. (L.) chagasi e cães não infectados de acordo com os diferentes
graus de parasitismo esplênico, a expressão de MHC-II, CD45RA e CD45RB foi analisada
por Canal Médio de Fluorescência (CMF) nas populações de granulócitos (neutrófilos e
eosinófilos) do sangue periférico. Os resultados obtidos foram avaliados, ainda, através de
análises de correlação entre a expressão dos marcadores e as densidades parasitárias no baço.
A expressão de MHC-II por eosinófilos apresentou-se significativamente (p<0,01)
aumentada em cães com AP esplênico em comparação com o grupo controle (Figura 7B). Na
avaliação da expressão dos demais marcadores de superfície celular através da categorização
por diferentes densidades parasitárias esplênicas não foram observadas diferenças
estatisticamente significativas.
Figura 7- Análise da expressão de MHC-II, CD45RA e CD45RB em granulócitos do sangue de cães
naturalmente infectados por L. (L.) chagasi com diferentes densidades parasitárias esplênicas e de animais não
infectados. A) CMF de MHC-II em neutrófilos, B) CMF de MHC-II em eosinófilos, C) CMF de CD45RA em
neutrófilos, D) CMF de CD45RA em eosinófilos, E) CMF de CD45RB em neutrófilos, F) CMF de CD45RB em
eosinófilos, G) CMF da razão CD45RB/CD45RA em neutrófilos e H) CMF da razão CD45RB/CD45RA em
eosinófilos. As barras representam as médias e medianas, e os símbolos, os valores individuais dos grupos. CNI
= Cães Não Infectados ( , n= 20), BP = Baixo Parasitismo ( , n= 13), MP = Médio Parasitismo ( , n= 13) e
AP = Alto Parasitismo ( , n= 14). As diferenças estatisticamente significativas encontram-se representadas
pelas letras a,b,c e d, (correspondentes aos grupos CNI, BP, MP e AP, respectivamente).
FE
HG
DC
B
A
Eosinófilos
Neutrófilos
FE
HG
DC
B
A
Eosinófilos
Neutrófilos
CMF MHC-II
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF MHC-II
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF MHC-II
a
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF MHC-II
a
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RA
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RA
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RA
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RA
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RB
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RB
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RB
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RB
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RB/CD45RA
CNI BP MP AP
0
1
2
CMF CD45RB/CD45RA
CNI BP MP AP
0
1
2
CMF CD45RB/CD45RA
CNI BP MP AP
0
1
2
CMF CD45RB/CD45RA
CNI BP MP AP
0
1
2
Entre as densidades parasitárias esplênicas e a expressão dos marcadores constitutivos
de células caninas em granulócitos, não foi observado nenhum valor de correlação
significativo, seja na avaliação de neutrófilos ou de eosinófilos (Tabela 6).
Tabela 6 – Análise das correlações entre as densidades parasitárias esplênicas e a
expressão dos marcadores de superfície em granulócitos
A letra r representa o coeficiente de correlação de Spearman ou Pearson e p o valor de significância.
6.3 Análise de fenótipos celulares de granulócitos do sangue periférico de cães
naturalmente infectados por
L. (L.) chagasi
com diferentes densidades parasitárias
cutâneas e de animais não infectados
Assim como no item 6.2, as populações de neutrófilos e eosinófilos do sangue
periférico foram avaliadas através da expressão de MHC-II, CD45RA e CD45RB por CMF
em cães com diferentes densidades parasitárias cutâneas. Os resultados obtidos foram
avaliados, ainda, através de análises de correlação entre a expressão dos marcadores e as
densidades parasitárias na pele.
A expressão de MHC-II por eosinófilos apresentou-se aumentada (p<0,05) em cães
com AP cutâneo em relação aos cães do grupo CNI, da mesma forma como observado para os
cães parasitados no baço (Figuras 7B e 8B).
Na avaliação da expressão de CD45RA por eosinófilos, observou-se um aumento
significativo (p<0,05) em cães AP em comparação aos cães do grupo BP (Figura 8D). As
demais avaliações realizadas através da categorização por diferentes densidades parasitárias
cutâneas não mostraram diferenças estatisticamente significativas.
Neutrófilos
Correlações com o parasitismo esplênico
Eosinófilos
MHC-II
CD45RA
CD45RB
CD45RB/CD45RA
r = - 0,0414
p = 0,8049
r = - 0,0506
p = 0,7625
r = - 0,1144
p = 0,4939
r = 0,2244
p = 0,1756
r = 0,2271
p = 0,1703
r = - 0,3143
p = 0,0546
r = - 0,1084
p = 0,5171
r = - 0,2625
p = 0,1113
Figura 8- Análise da expressão de MHC-II, CD45RA e CD45RB em granulócitos do sangue de cães
naturalmente infectados por L. (L.) chagasi com diferentes densidades parasitárias cutâneas e de animais não
infectados. A) CMF de MHC-II em neutrófilos, B) CMF de MHC-II em eosinófilos, C) CMF de CD45RA em
neutrófilos, D) CMF de CD45RA em eosinófilos, E) CMF de CD45RB em neutrófilos, F) CMF de CD45RB em
eosinófilos, G) CMF da razão CD45RB/CD45RA em neutrófilos e H) CMF da razão CD45RB/CD45RA em
eosinófilos. As barras representam as médias e medianas, e os símbolos, os valores individuais dos grupos. CNI
= Cães Não Infectados ( , n= 20), BP = Baixo Parasitismo ( , n= 13), MP = Médio Parasitismo ( , n= 13) e
AP = Alto Parasitismo ( , n= 14). As diferenças estatisticamente significativas encontram-se representadas
pelas letras a,b,c e d, (correspondentes aos grupos CNI, BP, MP e AP, respectivamente) e pelos asteriscos *,
**,***, (correspondentes aos grupos de cães infectados BP, MP e AP, respectivamente).
FE
HG
DC
B
A
Eosinófilos
Neutrófilos
FE
HG
DC
B
A
Eosinófilos
Neutrófilos
CMF MHC-II
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF MHC-II
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF MHC-II
a
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF MHC-II
a
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RA
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RA
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RA
*
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RA
*
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RB
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RB
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RB
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RB
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RB/CD45RA
CNI BP MP AP
0
1
2
CMF CD45RB/CD45RA
CNI BP MP AP
0
1
2
CMF CD45RB/CD45RA
CNI BP MP AP
0
1
2
CMF CD45RB/CD45RA
CNI BP MP AP
0
1
2
Na avaliação da correlação entre as densidades parasitárias cutâneas e a expressão dos
marcadores constitutivos de células caninas em granulócitos, foi detectada correlação
positiva, porém fraca, para CD45RA (r = 0,4305, p = 0,0070) em eosinófilos (Tabela 7). A
análise de correlação entre o parasitismo cutâneo e a expressão dos marcadores constitutivos
em neutrófilos não apresentou correlações significativas.
Tabela 7 – Análise das correlações entre as densidades parasitárias cutâneas e a
expressão dos marcadores de superfície em granulócitos
A letra r representa o coeficiente de correlação de Spearman ou Pearson e p o valor de significância. As
correlações significativas estão representadas pelos valores em vermelho.
6.4 Análise de fenótipos celulares de monócitos do sangue periférico de cães
naturalmente infectados por
L. (L.) chagasi
com diferentes densidades parasitárias
esplênicas e de animais não infectados
A resposta imune inata também foi avaliada através da análise da população de
monócitos do sangue periférico utilizando-se a expressão de MHC-II, CD45RA e CD45RB
por CMF e as análises de correlação para estes marcadores considerando-se o parasitismo
esplênico.
A expressão de CD45RB em monócitos apresentou diferença significativa (p<0,05) na
comparação entre os grupos, onde foi detectada diminuição em cães com AP esplênico em
relação ao grupo BP (Figura 9C). Na avaliação da expressão de MHC-II e CD45RA, assim
como da razão CD45RB/CD45RA não foram observadas diferenças estatisticamente
significativas.
Neutrófilos
Correlações com o parasitismo cutâneo
Eosinófilos
MHC-II
CD45RA
CD45RB
CD45RB/CD45RA
r = 0,1760
p = 0,2904
r = 0,1325
p = 0,4277
r = - 0,0783
p = 0,6402
r = 0,4305
p = 0,0070
r = 0,2826
p = 0,0856
r = - 0,3175
p = 0,0521
r = - 0,0085
p = 0,9592
r = - 0,1083
p = 0,5175
Figura 9- Análise da expressão de MHC-II, CD45RA e CD45RB em monócitos do sangue de cães naturalmente
infectados por L. (L.) chagasi com diferentes densidades parasitárias esplênicas e de animais não infectados. A)
CMF de MHC-II, B) CMF de CD45RA, C) CMF de CD45RB e D) CMF da razão CD45RB/CD45RA. As barras
representam as médias e medianas, e os símbolos, os valores individuais dos grupos. CNI = Cães Não Infectados
( , n= 20), BP = Baixo Parasitismo ( , n= 13), MP = Médio Parasitismo ( , n= 13) e AP = Alto Parasitismo
( , n= 14). As diferenças estatisticamente significativas encontram-se representadas pelos asteriscos *, **,***,
(correspondentes aos grupos de cães infectados BP, MP e AP, respectivamente).
Nas análises de correlação entre as densidades parasitárias esplênicas e a expressão
dos marcadores celulares avaliados em monócitos foi observada correlação negativa fraca
para CD45RB (r = - 0,4335, p = 0,0066) (Tabela 8). Para a expressão dos demais marcadores
constitutivos de células caninas em monócitos não foram observadas correlações com o
parasitismo esplênico.
DC
B
A
DC
B
A
CMF MHC-II
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF MHC-II
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RA
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RA
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RB
*
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RB
*
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RB/CD45RA
CNI BP MP AP
0
1
2
CMF CD45RB/CD45RA
CNI BP MP AP
0
1
2
Tabela 8 – Análise das correlações entre as densidades parasitárias esplênicas e a
expressão dos marcadores de superfície em monócitos
A letra r representa o coeficiente de correlação de Spearman ou Pearson e p o valor de significância. As
correlações significativas estão representadas pelos valores em vermelho.
6.5 Análise de fenótipos celulares de monócitos do sangue periférico de cães
naturalmente infectados por
L. (L.) chagasi
com diferentes densidades parasitárias
cutâneas e de animais não infectados
A avaliação da fenotipagem de monócitos do sangue periférico de cães com diferentes
densidades parasitárias cutâneas não apresentou nenhuma diferença estatisticamente
significativa entre os grupos, para os marcadores avaliados (Figura 10).
Monócitos
Correlações com o parasitismo esplênico
MHC-II
CD45RA
CD45RB
CD45RB/CD45RA
r = - 0,2613
p = 0,1130
r = - 0,2015
p = 0,2251
r = - 0,2886
p = 0,0789
r = - 0,4335
p = 0,0066
Figura 10- Análise da expressão de MHC-II, CD45RA e CD45RB em monócitos do sangue de cães naturalmente
infectados por L. (L.) chagasi com diferentes densidades parasitárias cutâneas e de animais não infectados. A)
CMF de MHC-II, B) CMF de CD45RA, C) CMF de CD45RB e D) CMF da razão CD45RB/CD45RA. As barras
representam as médias e medianas, e os símbolos, os valores individuais dos grupos. CNI = Cães Não Infectados
( , n= 20), BP = Baixo Parasitismo ( , n= 13), MP = Médio Parasitismo ( , n= 13) e AP = Alto Parasitismo
( , n= 14).
Nas análises de correlação entre as densidades parasitárias cutâneas e a expressão dos
marcadores celulares avaliados em monócitos foi observada correlação negativa fraca para
CD45RB (r = - 0,3674, p = 0,0214) (Tabela 9). Para a expressão dos demais marcadores
constitutivos de células caninas em monócitos não foram observadas correlações com o
parasitismo cutâneo.
DC
B
A
DC
B
A
CMF MHC-II
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF MHC-II
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RA
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RA
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RB
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RB
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RB/CD45RA
CNI BP MP AP
0
1
2
CMF CD45RB/CD45RA
CNI BP MP AP
0
1
2
Tabela 9 – Análise das correlações entre as densidades parasitárias cutâneas e a
expressão dos marcadores de superfície em monócitos
A letra r representa o coeficiente de correlação de Spearman ou Pearson e p o valor de significância. As
correlações significativas estão representadas pelos valores em vermelho.
6.6 Análise de fenótipos celulares de linfócitos do sangue periférico e do baço em cães
naturalmente infectados por
L. (L.) chagasi
com diferentes densidades parasitárias
esplênicas e animais não infectados
Os fenótipos celulares de linfócitos do sangue periférico e baço foram avaliados em
cães naturalmente infectados por L. (L.) chagasi e cães não infectados de acordo com os
diferentes graus de parasitismo esplênico. Os marcadores de superfície celular: Thy-1, CD5,
CD4, CD8, CD21 e CD14 foram avaliados em valores absolutos (imunofenotipagem de
células do sangue periférico) e percentuais (imunofenotipagem de esplenócitos). Para a
análise da expressão de MHC-II, CD45RA e CD45RB foi utilizado o canal médio de
fluorescência (CMF), uma vez que estes marcadores são expressos de forma constitutiva por
células caninas. Os resultados obtidos foram avaliados, ainda, através de análises de
correlação entre a expressão dos marcadores e as densidades parasitárias no baço.
Na avaliação de células Thy-1+ do sangue e baço, foi observada diminuição
significativa (p<0,05) no grupo de cães AP em comparação com o grupo MP. De forma
similar, houve queda significativa (p<0,05) nos valores absolutos de linfócitos T CD5+, no
grupo de cães AP em comparação com os cães dos grupos BP e MP (Figuras 11A, 11B e
11C).
Na avaliação da razão entre Thy-1+/CD21+ e CD5+/CD21+ foi observado aumento
significativo (p<0,05) em cães dos grupos BP e MP em comparação com o grupo CNI,
indicando o predomínio dos linfócitos T no sangue de cães com menores densidades
Monócitos
Correlações com o parasitismo cutâneo
MHC-II
CD45RA
CD45RB
CD45RB/CD45RA
r = - 0,2023
p = 0,2169
r = - 0,0779
p = 0,6373
r = - 0,2612
p = 0,1082
r = - 0,3674
p = 0,0214
parasitárias no baço. A razão de linfócitos T/B também apresentou-se aumentada (p<0,05) nos
cães BP e MP em comparação aos cães AP (Figuras 11E e 11G).
Figura 11- Análise de Linfócitos T (Thy-1+ e CD5+) no sangue e baço de cães naturalmente infectados por L.
(L.) chagasi com diferentes densidades parasitárias esplênicas e de animais não infectados. A) Valor absoluto de
Linfócitos T (Thy-1+), B) Valor percentual de Esplenócitos T (Thy-1+), C) Valor absoluto de Linfócitos T
(CD5+), D) Valor percentual de Esplenócitos T (CD5+), E) Valor percentual da razão entre Linfócitos T e B
(Thy-1+/CD21+), F) Valor percentual da razão entre Esplenócitos T e B (Thy-1+/CD21+), G) Valor percentual
da razão entre Linfócitos T e B (CD5+/CD21+) e H) Valor percentual da razão entre Esplenócitos T e B
(CD5+/CD21+). As barras representam as médias e medianas, e os símbolos, os valores individuais dos grupos.
CNI = Cães Não Infectados ( , n= 20), BP = Baixo Parasitismo ( , n= 13), MP = Médio Parasitismo ( , n=
13) e AP = Alto Parasitismo ( , n= 14). As diferenças estatisticamente significativas encontram-se
representadas pelas letras a,b,c e d, (correspondentes aos grupos CNI, BP, MP e AP, respectivamente) e pelos
asteriscos *, **,***, (correspondentes aos grupos de cães infectados BP, MP e AP, respectivamente).
H
G
F
E
D
C
B
A
BaçoSangue
H
G
F
E
D
C
B
A
BaçoSangue
Linfócitos T (THY-1+) / mm
3
**
CNI BP MP AP
0
6000
12000
Linfócitos T (THY-1+) / mm
3
**
CNI BP MP AP
0
6000
12000
% Esplenócitos T (THY-1+)
**
CNI BP MP AP
0
50
100
% Esplenócitos T (THY-1+)
**
CNI BP MP AP
0
50
100
d
***
***
Linfócitos T (CD5+) / mm
3
CNI BP MP AP
0
6000
12000
d
***
***
Linfócitos T (CD5+) / mm
3
CNI BP MP AP
0
6000
12000
% Esplenócitos T (CD5+)
CNI BP MP AP
0
50
100
% Esplenócitos T (CD5+)
CNI BP MP AP
0
50
100
% LT/LB(THY-1+/CD21+)
a
a
**
CNI BP MP AP
0
40
80
% LT/LB(THY-1+/CD21+)
a
a
**
CNI BP MP AP
0
40
80
% ET/EB(THY-1+/CD21+)
CNI BP MP AP
0
10
20
% ET/EB(THY-1+/CD21+)
CNI BP MP AP
0
10
20
***
a
a
***
% LT/LB(CD5+/CD21+)
CNI BP MP AP
0
40
80
a
a
***
% LT/LB(CD5+/CD21+)
CNI BP MP AP
0
40
80
% ET/EB(CD5+/CD21+)
CNI BP MP AP
0
15
30
% ET/EB(CD5+/CD21+)
CNI BP MP AP
0
15
30
**
a
Para os valores absolutos e percentuais de linfócitos T CD4+ não foram observadas
diferenças significativas entre os grupos estudados. Para a subpopulação de linfócitos T CD8+
foi detectado aumento significativo (p<0,05) em cães com BP e MP em relação ao grupo CNI.
Já o grupo de cães AP apresentou queda (p<0,05) nesta subpopulação no sangue periférico,
em comparação aos cães do grupo MP (Figura 12C). Os esplenócitos T CD8+ apresentaram
aumento em cães MP (p<0,05) em comparação ao grupo CNI (Figura 12D).
O predomínio da subpopulação de linfócitos T CD8+ pode ser claramente
demonstrado através do gráfico de percentual da razão entre linfócitos T CD4+/CD8+ no
sangue, em que há uma diminuição significativa (p<0,05) em todos os grupos de cães
infectados em comparação aos do grupo CNI (Figura 12E).
Figura 12- Análise de subpopulações de Linfócitos T (CD4+ e CD8+) no sangue e baço de cães naturalmente
infectados por L. (L.) chagasi com diferentes densidades parasitárias esplênicas e de animais não infectados. A)
Valor absoluto de Linfócitos T (CD4+), B) Valor percentual de Esplenócitos T (CD4+), C) Valor absoluto de
Linfócitos T (CD8+), D) Valor percentual de Esplenócitos T (CD8+), E) Valor percentual da razão entre
Linfócitos T (CD4+/CD8+), F) Valor percentual da razão entre Esplenócitos T (CD4+/CD8+). As barras
representam as médias e medianas, e os símbolos, os valores individuais dos grupos. CNI = Cães Não Infectados
( , n= 20), BP = Baixo Parasitismo ( , n= 13), MP = Médio Parasitismo ( , n= 13) e AP = Alto Parasitismo
( , n= 14). As diferenças estatisticamente significativas encontram-se representadas pelas letras a,b,c e d,
(correspondentes aos grupos CNI, BP, MP e AP, respectivamente) e pelos asteriscos *, **,***, (correspondentes
aos grupos de cães infectados BP, MP e AP, respectivamente).
Na avaliação de linfócitos B (CD21+) do sangue periférico e baço de cães
categorizados por diferentes densidades parasitárias esplênicas, não foram observadas
diferenças estatisticamente significativas (Figura 13). Já na avaliação de monócitos (CD14+)
do sangue periférico foi observada queda significativa (p<0,05) no grupo de cães AP em
comparação com o grupo MP (Figura 13).
F
E
D
C
B
A
BaçoSangue
F
E
D
C
B
A
BaçoSangue
Linfócitos T CD4+ / mm
3
CNI BP MP AP
0
1500
3000
Linfócitos T CD4+ / mm
3
CNI BP MP AP
0
1500
3000
%Esplenócitos T CD4+
CNI BP MP AP
0
30
60
%Esplenócitos T CD4+
CNI BP MP AP
0
30
60
a
a
**
Linfócitos T CD8+ / mm
3
CNI BP MP AP
0
2500
5000
a
a
**
Linfócitos T CD8+ / mm
3
CNI BP MP AP
0
2500
5000
a
%Esplenócitos T CD8+
CNI BP MP AP
0
40
80
a
%Esplenócitos T CD8+
CNI BP MP AP
0
40
80
% Linfócitos T CD4+/CD8+
a a a
*
CNI BP MP AP
0.0
2.5
5.0
% Linfócitos T CD4+/CD8+
a a a
*
CNI BP MP AP
0.0
2.5
5.0
% Esplenócitos T CD4+/CD8+
CNI BP MP AP
0.0
1.5
3.0
% Esplenócitos T CD4+/CD8+
CNI BP MP AP
0.0
1.5
3.0
Figura 13- Análise de Linfócitos B (CD21+) e monócitos (CD14+) no sangue e baço de cães naturalmente
infectados por L. (L.) chagasi com diferentes densidades parasitárias esplênicas e de animais não infectados. A)
Valor absoluto de Linfócitos B (CD21+), B) Valor percentual de Esplenócitos B (CD21+) e C) Valor absoluto
de monócitos (CD14+). As barras representam as médias e medianas, e os símbolos, os valores individuais dos
grupos. CNI = Cães Não Infectados ( , n= 20), BP = Baixo Parasitismo ( , n= 13), MP = Médio Parasitismo
( , n= 13) e AP = Alto Parasitismo ( , n= 14). ND= Não Determinado.
Na avaliação da expressão de CD45RA por CMF em esplenócitos de cães com
diferentes densidades parasitárias de baço, foi observada queda significativa (p<0,05) deste
marcador no grupo de cães MP em comparação com os grupos CNI e AP (Figura 14D). Não
houve diferença estatisticamente significativa na expressão de MHC-II e CD45RB entre os
grupos avaliados.
C
B
A
BaçoSangue
C
B
A
BaçoSangue
Linfócitos B (CD21+) / mm
3
CNI BP MP AP
0
500
1000
Linfócitos B (CD21+) / mm
3
CNI BP MP AP
0
500
1000
%Esplenócitos B (CD21+)
CNI BP MP AP
0
30
60
%Esplenócitos B (CD21+)
CNI BP MP AP
0
30
60
Monócitos (CD14+) / mm
3
CNI BP MP AP
0
1000
2000
Monócitos (CD14+) / mm
3
CNI BP MP AP
0
1000
2000
ND
c
Figura 14- Análise da expressão de MHC-II, CD45RA e CD45RB em linfócitos totais no sangue e baço de cães
naturalmente infectados por L. (L.) chagasi com diferentes densidades parasitárias esplênicas e de animais não
infectados. A) CMF de MHC-II no sangue, B) CMF de MHC-II no baço, C) CMF de CD45RA no sangue, D)
CMF de CD45RA no baço, E) CMF de CD45RB no sangue, F) CMF de CD45RB no baço, G) CMF da razão
CD45RB/CD45RA no sangue e H) CMF da razão CD45RB/CD45RA no baço. As barras representam as médias
e medianas, e os símbolos, os valores individuais dos grupos. CNI = Cães Não Infectados ( , n= 20), BP =
Baixo Parasitismo ( , n= 13), MP = Médio Parasitismo ( , n= 13) e AP = Alto Parasitismo ( , n= 14). As
diferenças estatisticamente significativas encontram-se representadas pelas letras a,b,c e d, (correspondentes aos
grupos CNI, BP, MP e AP, respectivamente) e pelos asteriscos *, **,***, (correspondentes aos grupos de cães
infectados BP, MP e AP, respectivamente).
FE
DC
HG
B
A
BaçoSangue
FE
DC
HG
B
A
BaçoSangue
CMF MHC-II
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF MHC-II
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF MHC-II
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF MHC-II
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RA
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RA
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RA
a
**
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RA
a
**
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RB
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RB
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RB
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RB
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RB/CD45RA
CNI BP MP AP
0
1
2
CMF CD45RB/CD45RA
CNI BP MP AP
0
1
2
CMF CD45RB/CD45RA
CNI BP MP AP
0
1
2
CMF CD45RB/CD45RA
CNI BP MP AP
0
1
2
***
Nas análises de correlação entre as densidades parasitárias esplênicas e a expressão
dos marcadores de superfície celular avaliados, foram observadas correlações negativas para
os linfócitos T Thy-1+ (r = - 0,4452, p = 0,0051) e CD5+ (r = - 0,4344, p = 0,0057), para as
razões de linfócitos T/B Thy-1+/CD21+ (r = - 0,3633, p = 0,0250) e CD5+/CD21+ (r = -
0,3457, p = 0,0311) e para as subpopulações de linfócitos T CD4+ (r = - 0,3223, p = 0,0454) e
CD8+ (r = - 0,5012, p = 0,0012). Além disto, correlação positiva foi observada para a razão
CD4+/CD8+ (r = 0,5455, p = 0,0003). As correlações observadas para os linfócitos T CD8+ e
razão CD4+/CD8+ apresentaram-se mais fortes em relação às demais, uma vez que o valor
de r foi superior a 0,5. Todas estas correlações foram observadas apenas na avaliação destas
células no sangue periférico, não sendo observadas, portanto, correlações entre o parasitismo
esplênico e os marcadores presentes em células do baço (Tabela 10).
Tabela 10 – Análise das correlações entre as densidades parasitárias esplênicas e a
expressão dos marcadores de superfície de células do sangue periférico e do baço
A letra r representa o coeficiente de correlação de Spearman ou Pearson e p o valor de significância. As
correlações significativas estão representadas pelos valores em vermelho. ND= Não Determinado.
r = - 0,4452
p = 0,0051
r = - 0,3633
p = 0,0250
Células do Sangue
Correlações com o parasitismo esplênico
Células do Baço
CD5
CD4
Thy-1
CD8
r = - 0,4344
p = 0,0057
r = - 0,3457
p = 0,0311
r = - 0,1497
p = 0,3630
r = - 0,0130
p = 0,9372
r = 0,0018
p = 0,9912
r = 0,0568
p = 0,7311
CD21
CD14
Thy-1/CD21
CD5/CD21
CD4/CD8
MHC-II
CD45RA
CD45RB
CD45RB/CD45RA
r = - 0,3223
p = 0,0454
r = 0,5455
p = 0,0003
r = - 0,5012
p = 0,0012
r = - 0,1243
p = 0,4507
r = 0,2106
p = 0,1981
r = 0,1564
p = 0,3416
r = - 0,0471
p = 0,7756
r = - 0,0172
p = 0,9172
r = - 0,2269
p = 0,1648
r = 0,0803
p = 0,6268
r = - 0,1382
p = 0,4015
r = - 0,1264
p = 0,4433
ND
r = 0,3108
p = 0,0541
r = 0,0764
p = 0,6435
r = - 0,0487
p = 0,7683
r = - 0,2902
p = 0,0731
r = 0,1503
p = 0,3610
6.7 Análise de fenótipos celulares de linfócitos do sangue periférico e do baço em cães
naturalmente infectados por
L. (L.) chagasi
com diferentes densidades parasitárias
cutâneas e animais não infectados
Assim como no item 6.6, os fenótipos celulares de linfócitos do sangue periférico e
baço foram avaliados em valores absolutos (imunofenotipagem de células do sangue
periférico) e percentuais (imunofenotipagem de esplenócitos) de acordo com a densidade
parasitária na pele, para os mesmos marcadores de superfície celular. O canal médio de
fluorescência (CMF) foi utilizado para a análise da expressão de MHC-II, CD45RA e
CD45RB. As análises de correlação foram realizadas entre a expressão dos mesmos
marcadores e as densidades parasitárias cutâneas.
As populações de linfócitos T Thy-1+ e CD5+ analisadas individualmente através da
categorização por diferentes densidades parasitárias cutâneas não apresentaram diferenças
estatisticamente significativas, entretanto, na avaliação da razão entre os percentuais de Thy-
1+/CD21+ e CD5+/CD21+, foi observado aumento significativo (p<0,05) nos cães BP em
comparação com os cães AP (Figuras 15E e 15G).
Figura 15- Análise de Linfócitos T (Thy-1+ e CD5+) no sangue e baço de cães naturalmente infectados por L.
(L.) chagasi com diferentes densidades parasitárias cutâneas e de animais não infectados. A) Valor absoluto de
Linfócitos T (Thy-1+), B) Valor percentual de Esplenócitos T (Thy-1+), C) Valor absoluto de Linfócitos T
(CD5+), D) Valor percentual de Esplenócitos T (CD5+), E) Valor percentual da razão entre Linfócitos T e B
(Thy-1+/CD21+), F) Valor percentual da razão entre Esplenócitos T e B (Thy-1+/CD21+), G) Valor percentual
da razão entre Linfócitos T e B (CD5+/CD21+) e H) Valor percentual da razão entre Esplenócitos T e B
(CD5+/CD21+). As barras representam as médias e medianas, e os símbolos, os valores individuais dos grupos.
CNI = Cães Não Infectados ( , n= 20), BP = Baixo Parasitismo ( , n= 13), MP = Médio Parasitismo ( , n=
13) e AP = Alto Parasitismo ( , n= 14). As diferenças estatisticamente significativas encontram-se
representadas pelos asteriscos *, **,***, (correspondentes aos grupos de cães infectados BP, MP e AP,
respectivamente).
FE
DC
HG
B
A
BaçoSangue
FE
DC
HG
B
A
BaçoSangue
Linfócitos T (THY-1+) / mm
3
CNI BP MP AP
0
3000
6000
Linfócitos T (THY-1+) / mm
3
CNI BP MP AP
0
3000
6000
% Esplenócitos T (THY-1+)
CNI BP MP AP
0
50
100
% Esplenócitos T (THY-1+)
CNI BP MP AP
0
50
100
Linfócitos T (CD5+) / mm
3
CNI BP MP AP
0
3000
6000
Linfócitos T (CD5+) / mm
3
CNI BP MP AP
0
3000
6000
% Esplenócitos T (CD5+)
CNI BP MP AP
0
50
100
% Esplenócitos T (CD5+)
CNI BP MP AP
0
50
100
*
% LT/LB(THY-1+/CD21+)
CNI BP MP AP
0
30
60
*
% LT/LB(THY-1+/CD21+)
CNI BP MP AP
0
30
60
% ET/EB(THY-1+/CD21+)
CNI BP MP AP
0
10
20
% ET/EB(THY-1+/CD21+)
CNI BP MP AP
0
10
20
*
% LT/LB(CD5+/CD21+)
CNI BP MP AP
0
30
60
*
% LT/LB(CD5+/CD21+)
CNI BP MP AP
0
30
60
% ET/EB(CD5+/CD21+)
CNI BP MP AP
0
15
30
% ET/EB(CD5+/CD21+)
CNI BP MP AP
0
15
30
***
***
As subpopulações de linfócitos T (CD4+ e CD8+) do sangue periférico avaliadas sob a
ótica do parasitismo cutâneo não apresentaram diferenças estatisticamente significativas entre
os grupos estudados. Entretanto, a avaliação do percentual de esplenócitos T CD8+, mostrou
aumento significativo (p<0,05) em cães do grupo AP em comparação com o grupo CNI
(Figura 16D).
Figura 16- Análise de subpopulações de Linfócitos T (CD4+ e CD8+) no sangue e baço de cães naturalmente
infectados por L. (L.) chagasi com diferentes densidades parasitárias cutâneas e de animais não infectados. A)
Valor absoluto de Linfócitos T (CD4+), B) Valor percentual de Esplenócitos T (CD4+), C) Valor absoluto de
Linfócitos T (CD8+), D) Valor percentual de Esplenócitos T (CD8+), E) Valor percentual da razão entre
Linfócitos T (CD4+/CD8+) e F) Valor percentual da razão entre Esplenócitos T (CD4+/CD8+). As barras
representam as médias e medianas, e os símbolos, os valores individuais dos grupos. CNI = Cães Não Infectados
( , n= 20), BP = Baixo Parasitismo ( , n= 13), MP = Médio Parasitismo ( , n= 13) e AP = Alto Parasitismo
( , n= 14). As diferenças estatisticamente significativas encontram-se representadas pelas letras a,b,c e d,
(correspondentes aos grupos CNI, BP, MP e AP, respectivamente).
Na avaliação de linfócitos B (CD21+) do sangue periférico e baço e monócitos
(CD14+) do sangue periférico, não foram observadas diferenças estatisticamente
FE
DC
B
A
BaçoSangue
FE
DC
B
A
BaçoSangue
%Esplenócitos T CD4+
CNI BP MP AP
0
30
60
%Esplenócitos T CD4+
CNI BP MP AP
0
30
60
Linfócitos T CD8+ / mm
3
CNI BP MP AP
0
3000
6000
Linfócitos T CD8+ / mm
3
CNI BP MP AP
0
3000
6000
a
%Esplenócitos T CD8+
CNI BP MP AP
0
40
80
a
%Esplenócitos T CD8+
CNI BP MP AP
0
40
80
% Linfócitos T CD4+/CD8+
CNI BP MP AP
0
2
4
% Linfócitos T CD4+/CD8+
CNI BP MP AP
0
2
4
% Esplenócitos T CD4+/CD8+
CNI BP MP AP
0
2
4
% Esplenócitos T CD4+/CD8+
CNI BP MP AP
0
2
4
Linfócitos T CD4+ / mm
3
CNI BP MP AP
0
1500
3000
Linfócitos T CD4+ / mm
3
CNI BP MP AP
0
1500
3000
CNI BP MP AP
0
1500
3000
significativas entre os grupos estudados de acordo com as diferentes densidades parasitárias
cutâneas (Figura 17).
Figura 17- Análise de Linfócitos B (CD21+) e monócitos (CD14+) no sangue e baço de cães naturalmente
infectados por L. (L.) chagasi com diferentes densidades parasitárias cutâneas e de animais não infectados. A)
Valor absoluto de Linfócitos B (CD21+), B) Valor percentual de Esplenócitos B (CD21+) e C) Valor absoluto
de monócitos (CD14+). As barras representam as médias e medianas, e os símbolos, os valores individuais dos
grupos. CNI = Cães Não Infectados ( , n= 20), BP = Baixo Parasitismo ( , n= 13), MP = Médio Parasitismo
( , n= 13) e AP = Alto Parasitismo ( , n= 14). ND= Não Determinado.
A avaliação da expressão de CD45RB por CMF em esplenócitos de cães categorizados
por diferentes densidades parasitárias cutâneas mostrou aumento significativo (p<0,05) no
grupo de cães AP em comparação com o grupo MP (Figura 18F). Os demais marcadores de
superfície celular avaliados não apresentaram diferenças estatisticamente significativas entre
os grupos em linfócitos totais do sangue periférico e esplenócitos.
C
B
A
BaçoSangue
C
B
A
BaçoSangue
Linfócitos B (CD21+) / mm
3
CNI BP MP AP
0
300
600
Linfócitos B (CD21+) / mm
3
CNI BP MP AP
0
300
600
%Esplenócitos B (CD21+)
CNI BP MP AP
0
30
60
%Esplenócitos B (CD21+)
CNI BP MP AP
0
30
60
Monócitos (CD14+) / mm
3
CNI BP MP AP
0
1500
3000
Monócitos (CD14+) / mm
3
CNI BP MP AP
0
1500
3000
ND
Figura 18- Análise da expressão de MHC-II, CD45RA e CD45RB em linfócitos totais no sangue e baço de cães
naturalmente infectados por L. (L.) chagasi com diferentes densidades parasitárias cutâneas e de animais não
infectados. A) CMF de MHC-II no sangue, B) CMF de MHC-II no baço, C) CMF de CD45RA no sangue, D)
CMF de CD45RA no baço, E) CMF de CD45RB no sangue, F) CMF de CD45RB no baço, G) CMF da razão
CD45RB/CD45RA no sangue e H) CMF da razão CD45RB/CD45RA no baço. As barras representam as médias
e medianas, e os símbolos, os valores individuais dos grupos. CNI = Cães Não Infectados ( , n= 20), BP =
Baixo Parasitismo ( , n= 13), MP = Médio Parasitismo ( , n= 13) e AP = Alto Parasitismo ( , n= 14). As
diferenças estatisticamente significativas encontram-se representadas pelos asteriscos *, **,***,
(correspondentes aos grupos de cães infectados BP, MP e AP, respectivamente).
FE
HG
DC
B
A
BaçoSangue
FE
HG
DC
B
A
BaçoSangue
CMF MHC-II
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF MHC-II
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF MHC-II
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF MHC-II
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RA
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RA
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RA
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RA
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
**
CMF CD45RB
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
**
CMF CD45RB
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RB
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RB
CNI BP MP AP
0
200
250
550
850
CMF CD45RB/CD45RA
CNI BP MP AP
0
1
2
CMF CD45RB/CD45RA
CNI BP MP AP
0
1
2
CMF CD45RB/CD45RA
CNI BP MP AP
0
1
2
CMF CD45RB/CD45RA
CNI BP MP AP
0
1
2
Nas análises de correlação entre as densidades parasitárias cutâneas e a expressão dos
marcadores de superfície celular avaliados, foram detectadas correlações negativas para os
linfócitos T Thy-1+ (r = - 0,3190, p = 0,0478) e CD5+ (r = - 0,3218, p = 0,0429) e para a
subpopulação de linfócitos T CD8+ (r = - 0,3411, p = 0,0312). Além disto, correlação positiva
foi observada para a razão CD4+/CD8+ (r = 0,3709, p = 0,0185). Todas estas correlações
foram observadas apenas na avaliação destas células no sangue periférico, não sendo
observadas, portanto, correlações entre o parasitismo cutâneo e os marcadores presentes em
células do baço (Tabela 11). É importante ressaltar que todas as correlações aqui observadas,
embora estatisticamente significativas, são correlações fracas.
Tabela 11 – Análise das correlações entre as densidades parasitárias cutâneas e a
expressão dos marcadores de superfície de células do sangue periférico e do baço
A letra r representa o coeficiente de correlação de Spearman ou Pearson e p o valor de significância. As
correlações significativas estão representadas pelos valores em vermelho. ND= Não Determinado.
r = - 0,3190
p = 0,0478
r = - 0,2965
p = 0,0668
Células do Sangue
Correlações com o parasitismo cutâneo
Células do Baço
CD5
CD4
Thy-1
CD8
r = - 0,3218
p = 0,0429
r = - 0,2831
p = 0,0767
r = - 0,0833
p = 0,6093
r = - 0,0228
p = 0,8885
r = 0,0241
p = 0,8826
r = 0,0084
p = 0,9589
CD21
CD14
Thy-1/CD21
CD5/CD21
CD4/CD8
MHC-II
CD45RA
CD45RB
CD45RB/CD45RA
r = - 0,2441
p = 0,1290
r = 0,3709
p = 0,0185
r = - 0,3411
p = 0,0312
r = - 0,0898
p = 0,5815
r = 0,1345
p = 0,4078
r = - 0,0301
p = 0,8534
r = 0,1208
p = 0,4576
r = 0,0141
p = 0,9308
r = - 0,1970
p = 0,2232
r = 0,1331
p = 0,4128
r = 0,0040
p = 0,9801
r = - 0,1878
p = 0,2459
ND
r = 0,2947
p = 0,0649
r = 0,1544
p = 0,3415
r = 0,0901
p = 0,5803
r = - 0,2284
p = 0,1563
r = 0,2100
p = 0,1934
7 RESUMO DOS RESULTADOS
Após a apresentação dos resultados obtidos neste estudo da avaliação de parâmetros
hematológicos e imunofenotípicos de células de cães naturalmente infectados por L. (L.)
chagasi, associada à densidade parasitária de baço e pele, foi possível relacionar as seguintes
evidências:
Parâmetros Hematológicos:
• A anemia foi mais pronunciada em cães com alto parasitismo esplênico em função da
queda no número de hemácias, da concentração de hemoglobina e do hematócrito;
• Cães com alto e médio parasitismo esplênico e cutâneo apresentaram eosinopenia e
monocitopenia.
Parâmetros Imunofenotípicos:
• Cães com alto parasitismo esplênico apresentaram diminuição de linfócitos T
circulantes (Thy-1+ e CD5+) e esplenócitos T (Thy-1+), acompanhado de diminuição
na subpopulação de linfócitos T (CD8+). Além disso, cães com baixo e médio
parasitismo esplênico tiveram aumento da razão T/B, enquanto a razão CD4+/CD8+
apresentou-se diminuída em todos os grupos de cães infectados;
• Fortes correlações foram observadas entre as células T CD8+ (correlação negativa),
razão CD4+/CD8+ (correlação positiva) e o parasitismo esplênico;
• Cães com alto parasitismo esplênico apresentaram diminuição de monócitos (CD14+)
circulantes;
• Cães com médio parasitismo esplênico apresentaram diminuição de esplenócitos T
CD45RA+;
• Cães com baixo parasitismo esplênico apresentaram aumento de monócitos
CD45RB+;
• Cães com alto parasitismo cutâneo apresentaram aumento de esplenócitos T
CD45RB+ e eosinófilos CD45RA+;
• Maior expressão de esplenócitos T CD8+ e de MHC-II por eosinófilos foi observada
em cães com alto parasitismo esplênico e cutâneo.
Figura 19- Diagrama das principais alterações fenotípicas observadas em cães naturalmente infectados por L.
(L.) chagasi com diferentes densidades parasitárias de baço e pele. Legenda: LT (Linfócitos T), ET
(Esplenócitos T), Mon. (Monócitos), Eos. (Eosinófilos). CNI= Cães Não Infectados, BP= Baixo Parasitismo,
MP= Médio Parasitismo e AP= Alto Parasitismo. As alterações associadas ao parasitismo esplênico estão
representadas no círculo azul, enquanto aquelas associadas ao parasitismo cutâneo encontram-se no círculo
amarelo e as alterações relacionadas a ambos os parasitismos encontram-se na intersecção em verde.
LT (THY-1+): AP
LT (CD5+): AP
ET (CD45RA+): MP
ET (CD8+): MP
Eos. (MHC-II+): AP
Mon. (CD45RB+): AP
ET (CD45RB+): AP
Eos. (CD45RA+): AP
LT (CD8+): BP/MP
ET (THY-1+): MP
Parasitismo de Baço Parasitismo de Pele
ET (CD8+): AP
LT (CD14+): AP
8 DISCUSSÃO
Apesar das alterações fenotípicas observadas em células do sangue periférico de cães
portadores das diferentes formas clínicas da LVC já terem sido investigadas por alguns
estudos (Reis, 2001; Reis et al., 2006c; Giunchetti et al., 2006), existem poucos trabalhos que
correlacionam estas alterações em cães com a densidade parasitária tecidual (Sanchez et al.,
2004; Reis et al., 2006c; Giunchetti et al., 2008b). O estudo da influência do parasitismo na
LVC é essencial para o entendimento dos aspectos imunopatológicos da infecção. Desta
forma, estudos de resposta imune em cães naturalmente infectados por L. (L.) chagasi
contribuem para o entendimento da interação parasito/hospedeiro e suas correlações com as
alterações imunopatológicas na história natural da LVC.
No presente trabalho buscou-se avaliar os parâmetros hematológicos em cães
naturalmente infectados por L. (L.) chagasi através da realização de hemograma. Além disso,
a imunofenotipagem por citometria de fluxo foi utilizada para avaliar a expressão dos
principais marcadores de superfície celular em granulócitos e monócitos do sangue periférico,
além de linfócitos e esplenócitos de cães naturalmente infectados por L. (L.) chagasi
categorizados de acordo com três diferentes níveis de densidades parasitárias (baixo, médio e
alto parasitismo). O critério de avaliação utilizado foi o parasitismo do baço e da pele,
quantificado através do índice de parasitismo tecidual, que corresponde ao número de formas
amastigotas presentes em cada 1000 células nucleadas. Este trabalho pretende acrescentar
informações sobre a resposta imune celular em cães sob a ótica do parasitismo do baço e pele,
uma vez que esses órgãos estão entre os mais acometidos pelo parasito durante o curso da
doença (Reis et al., 2006b).
Já foi demonstrado previamente que análises parasitológicas realizadas em esfregaços
de tecidos (pele, baço, fígado e linfonodo) assim como em culturas de medula óssea, são
eficientes para a detecção de Leishmania inclusive em cães assintomáticos. No caso do exame
parasitológico da pele, foi possível detectar formas amastigotas em 42% dos cães
assintomáticos e em 94% dos animais sintomáticos (Reis et al., 2006a). Esses achados
reforçam que a intensidade do parasitismo tecidual na maioria das vezes reflete a evolução
das manifestações clínicas e destacam a importância do parasitismo cutâneo como ferramenta
útil de diagnóstico, em se tratando de animais assintomáticos. Reis et al. (2006b) observaram
que as formas clínicas da LVC apresentaram forte associação com as densidades parasitárias
em todos os órgãos avaliados (pele, medula óssea, baço, fígado e linfonodo), sendo que cães
com baixo parasitismo apresentaram-se, em sua maioria, assintomáticos, enquanto cães com
alto parasitismo apresentaram maior associação com o desenvolvimento de sintomatologia.
Além disso, estes autores observaram que apesar da densidade parasitária nos órgãos
avaliados ter sido positivamente correlacionada às formas clínicas da LVC, as densidades
parasitárias de medula óssea e baço apresentaram a correlação mais forte com o status clínico,
se comportando como biomarcadores parasitológicos confiáveis associados às formas clínicas
da LVC. Sanchez et al. (2004) em análise da imunidade específica no baço e fígado de cães
assintomáticos e sintomáticos naturalmente infectados com L. (L.) chagasi, demonstraram
correlação positiva entre maiores valores de LDU no baço e cães sintomáticos, assim como
valores de LDU duas vezes menores em cães assintomáticos.
Nosso grupo de estudo demonstrou, recentemente, alterações significativas em
parâmetros hematológicos associados ao status clínico na LVC (Reis et al., 2006a). No
presente estudo, este tema foi associado à densidade parasitária esplênica e cutânea.
Observamos que cães com alta densidade parasitária esplênica possuem alterações tanto na
série vermelha quanto na série branca do hemograma, com diminuição significativa na
contagem de eritrócitos, valores de hemoglobina e hematócrito, indicando a presença de
anemia grave em cães com AP esplênico (Tabela 4). Parece que a anemia na LVC é
influenciada pelos baixos níveis de íons circulantes em função do seqüestro destes devido a
mecanismos inflamatórios (Burillo et al., 1994). Além disso, acredita-se que são diversas as
etiologias do processo anêmico na LVC, sendo a hemorragia, hemólise, processo inflamatório
e eritropoiese diminuída, os mecanismos mais citados na literatura (Burillo et al., 1994). No
presente estudo, também foram observadas quedas significativas no número de subpopulações
de leucócitos circulantes (eosinófilos e monócitos). Cães com alta densidade parasitária
cutânea apresentaram alterações similares de parâmetros hematológicos, incluindo diminuição
dos valores de hemoglobina e número de eosinófilos e monócitos circulantes (Tabela 5). De
acordo com Reis (2001) a redução no valor absoluto de monócitos (CD14+) circulantes no
grupo de cães sintomáticos, sugere que a LVC ativa o recrutamento destas células para órgãos
linfóides secundários, onde podem desempenhar papel importante em conexões imunológicas
durante a apresentação antigênica. O aumento de macrófagos no baço de cães com LV já foi
documentado (Barrouin-Melo et al., 2006). Além disso, com o intenso parasitismo tecidual
em diversos sítios linfóides (como fígado e linfonodos) (Giunchetti et al., 2008a,b), bem
como a presença de hiperplasia e hipertrofia de células do SFM compondo um infiltrado
inflamatório geralmente caracterizado por ser do tipo plasmolinfohistiocitário (Tafuri et al.,
2001), podemos supor que parte dos monócitos encontra-se participando da formação destes
infiltrados.
A fim de se avaliar elementos que possam estar envolvidos com a resposta imune inata
de cães naturalmente infectados e não infectados, a expressão de MHC-II, CD45RA e
CD45RB foi analisada por canal médio de fluorescência nas populações de granulócitos
(neutrófilos e eosinófilos) e monócitos do sangue periférico.
Estudos in vitro mostraram que tanto neutrófilos como eosinófilos são capazes de
fagocitar e matar Leishmania. Esta atividade microbicida e de fagocitose é similar àquela
apresentada por monócitos (Chang, 1981; Pearson et al., 1987). A atividade parasiticida de
polimorfonucleares e monócitos em cães saudáveis e naturalmente infectados por L. infantum
foi avaliada por Brandonisio et al. (1996). Esses autores demonstraram que os mecanismos
microbicidas de polimorfonucleares e monócitos são relacionados à produção de superóxidos:
O
2
-
, H
2
O
2
, sendo esta atividade maior em cães tratados. Além disso, esses autores observaram
que a produção de O
2
-
e H
2
O
2
por estas células foi menor em cães sintomáticos, diminuindo
diretamente sua atividade leishmanicida.
No presente estudo, a análise da expressão dos marcadores constitutivos de células
caninas em neutrófilos do sangue periférico, seja sob a ótica do parasitismo esplênico ou
cutâneo, não apresentou correlações ou diferenças estatisticamente significativas entre os
grupos estudados. Sabe-se que as células polimorfonucleares são encontradas
predominantemente nas fases iniciais da infecção (Hill, 1986; Pompeu et al., 1991). Portanto,
a presença de intenso infiltrado de leucócitos polimorfonucleares logo após a infecção cutânea
com L. major sugere a importância destas células no controle inicial da densidade parasitária e
na distribuição do parasito na leishmaniose cutânea (Lima et al., 1998). O envolvimento de
neutrófilos na fase inicial da infecção também já foi demonstrado por Rousseau et al. (2001)
em camundongos BALB/c infectados por L. infantum. Estes autores observaram que a
fagocitose e morte de promastigotas ocorreu no baço logo após a infecção, e a depleção de
neutrófilos antes e após a inoculação do parasito levou ao aumento de 10 vezes na carga
parasitária. Já foi demonstrado que a depleção de neutrófilos do baço de camundongos está
associada com níveis aumentados de IL-4 e IL-10 e produção reduzida de IFN-γ por células T
CD4+ e CD8+, o que sugere o papel crítico dos neutrófilos no desenvolvimento de respostas
imunes protetoras do Tipo 1 (McFarlane et al., 2008). Entretanto, o papel de
polimorfonucleares na regulação de respostas imunes durante a infecção por Leishmania
ainda é controverso. Tacchini-Cottier et al. (2000) demonstraram que os neutrófilos são
capazes de induzir resposta imune do Tipo 2 em camundongos BALB/c infectados por L.
major, uma vez que se apresentaram como fontes iniciais importantes de IL-4. Peruhype-
Magalhães et al. (2005) demonstraram correlação clara entre o perfil de citocinas de
neutrófilos, eosinófilos, células NK e monócitos e o status clínico na LV humana, em que
estas células se apresentaram importantes não apenas no controle inicial do crescimento do
parasito e disseminação sistêmica de Leishmania, mas também como fontes relevantes de
citocinas imunoreguladoras.
Estudos relacionados ao papel dos eosinófilos durante a infecção por Leishmania são
escassos e têm sido restritos principalmente aos modelos murinos de infecção experimental. A
presença de eosinofilia significativa já foi demonstrada em cães experimentalmente infectados
com promastigotas de L. (L.) chagasi e saliva de L. longipalpis em comparação aos cães
inoculados apenas com Leishmania ou saliva (Paranhos et al., 1993). A eosinofilia tecidual já
foi demonstrada por Grimaldi et al. (1984) na leishmaniose cutânea murina, em que os
eosinófilos estariam contribuindo, juntamente com macrófagos, para a eliminação dos
parasitos no local da lesão. De acordo com Oliveira et al. (1998), os eosinófilos ativados
produzem óxido nítrico, o que está envolvido com a atividade microbicida destas células
contra L. major. Estes autores verificaram que os eosinófilos foram capazes de produzir nitrito
e matar o parasito após ativação na presença de LPS e IFN-γ. A análise de eosinófilos no
presente estudo revelou aumento significativo na expressão de MHC-II em cães com alto
parasitismo esplênico (Figura 7B) e cutâneo (Figura 8B), quando comparados ao grupo de
cães não infectados, sugerindo que as populações de eosinófilos podem estar atuando
ativamente como células apresentadoras de antígeno, secretoras de citocinas e de mediadores
dos grânulos específicos. Além disso, estes dados sugerem que a eliminação do parasito pode
se dar via mecanismos fagocíticos no sangue de cães com alto parasitismo esplênico e
cutâneo. Os eosinófilos apresentaram ainda aumento na expressão de CD45RA em cães
altamente parasitados na pele, em comparação ao grupo com baixo parasitismo (Figura 8D),
além de correlação positiva com a densidade parasitária cutânea (Tabela 7), sugerindo
novamente a ocorrência de ativação celular significativa em cães com baixo parasitismo.
Já foi descrito que a infecção por L. (L.) chagasi pode alterar de forma significativa a
expressão de marcadores celulares de adesão e moléculas co-estimuladoras em monócitos
humanos (De Almeida et al., 2003). Esses autores observaram diminuição na expressão de
MHC-I e MHC-II, ausência de citocinas pró-inflamatórias e expressão prejudicada de
moléculas co-estimuladoras induzidas por L. (L.) chagasi. A presença de fator solúvel
produzido pela inoculação de monócitos humanos com L. donovani já foi descrita por
suprimir a ativação de monócitos dependente de IFN-γ, não sendo observado o aumento na
expressão de MHC-II nestas células (Engelhorn et al., 1990). No presente trabalho, a análise
de fenótipos celulares de monócitos do sangue periférico não apresentou diferenças
estatisticamente significativas na expressão de MHC-II entre os grupos estudados. Os
macrófagos MHC-II+, apesar de serem o alvo primário da infecção e cruciais para o controle
do crescimento do parasito, ainda permanecem controversos quanto à sua função como
células apresentadoras de antígeno (Lemos et al., 2004). Segundo Lemos et al. (2004) os
macrófagos produzem iNOS, acumulam em locais infectados e são capazes de controlar o
número de parasitos, mesmo na ausência da expressão de MHC-II.
No presente estudo, foi observada ainda diminuição na expressão de CD45RB em
monócitos de cães com alto parasitismo esplênico, comparado aos cães com baixo parasitismo
(Figura 9C), além de correlação negativa com as densidades parasitárias do baço (Tabela 8) e
pele (Tabela 9). Estes achados corroboram com os de Reis et al. (2006c), que observaram
aumento na expressão de CD45RB em linfócitos de cães assintomáticos e reforçam a relação
entre o aumento na expressão de CD45RB e a presença de perfil de ativação celular em cães
com menores densidades parasitárias. Entretanto, o significado funcional desta expressão
aumentada, especialmente em monócitos, ainda necessita de maiores investigações.
A caracterização fenotípica de polimorfonucleares, através da expressão de
marcadores de superfície celular ainda é tema de estudo bastante escasso, principalmente
devido ao fato de ser desconhecida a relação entre a maioria dos marcadores e a função dessas
células, especialmente em cães. Neste estudo, objetivou-se realizar uma avaliação fenotípica
inicial de neutrófilos, eosinófilos e monócitos através de marcadores constitutivos de células
caninas e a sua possível correlação com a densidade parasitária. Este estudo mostra a
necessidade de ampliarmos a avaliação do número de marcadores celulares, assim como a
determinação da correlação com a resposta imune efetora, lacunas ainda importantes no
estudo da resposta imune na LVC.
As características fenotípicas de leucócitos circulantes, expressas em valores
absolutos, parecem ser marcadores imunológicos importantes associados à densidade
parasitária tecidual em cães naturalmente infectados por L. (L.) chagasi (Guerra, 2005; Reis et
al., 2006c). Os principais achados deste estudo descrevem a densidade parasitária esplênica
como sendo mais estreitamente relacionada às alterações fenotípicas em linfócitos do sangue
periférico do que o parasitismo cutâneo durante a LV canina. Este fato pode ser explicado
pelo papel do baço, que além de ser importante órgão linfóide, atua como o maior sítio de
resposta imune frente a antígenos carreados por via hematogênica.
Os dados obtidos na análise de linfócitos do sangue periférico de cães categorizados
por diferentes densidades parasitárias esplênicas demonstraram diminuição no valor absoluto
de linfócitos T CD5+ em cães com AP esplênico, em comparação aos cães com BP e MP. Foi
observada ainda, maior razão de linfócitos T/B (CD5+/CD21+), indicando o predomínio de
linfócitos T no sangue periférico de cães com BP e MP. Esses dados são semelhantes aos
observados para linfócitos T Thy-1+ (Figura 11). Além disso, foram observadas correlações
negativas para as células T (CD5+ e Thy-1+) e suas razões com células B, reforçando os
dados já obtidos anteriormente (Tabela 10). As populações de linfócitos T Thy-1+ e CD5+
têm grande importância na manutenção e estabelecimento da relação parasito/hospedeiro,
levando a um melhor prognóstico na LVC. Em cães portadores da forma assintomática ou
oligossintomática da doença, há aumento no número de células T (CD5+) e suas
subpopulações (CD4+ e CD8+) circulantes, criando um microambiente eficiente para a
remoção dos parasitos (Reis et al., 2006c). A alta atividade da resposta imune do hospedeiro
parece ser eficiente na remoção do parasito durante a fase assintomática, mas não é capaz de
promover a eliminação do mesmo nos estágios finais da doença ou no início da fase
sintomática. Considerando-se a correlação positiva existente entre a densidade parasitária
tecidual e as formas clínicas na LVC (Reis et al., 2006b), nossos dados corroboram com estas
afirmações, demonstrando que o aumento no número de linfócitos T no sangue periférico
parece criar um microambiente favorável à remoção dos parasitos em cães com menores
densidades parasitárias.
Reis (2001) demonstrou que a fase assintomática da infecção por L. (L.) chagasi está
associada ao aumento de células T (Thy-1+ e CD5+). Este aumento está intimamente
relacionado às subpopulações de células T CD4+ e, principalmente, de células T CD8+. Por
outro lado, no grupo de cães sintomáticos observou-se alteração no fenótipo celular com
queda nas populações de linfócitos T (Thy-1+ e CD5+) e suas subpopulações CD4+ e CD8+.
No presente estudo, os dados obtidos para os linfócitos T Thy-1+ e CD5+ refletem o
aumento observado na expressão da subpopulação de linfócitos T CD8+ em cães com baixo e
médio parasitismo esplênico (Figura 12C). Desta forma, sugere-se que os linfócitos T CD8+
possam estar participando dos mecanismos efetores, devido a sua atividade citotóxica contra
macrófagos infectados em cães com menores densidades parasitárias. De fato, diversos
estudos têm correlacionado o nível de células T CD8+ com proteção durante a infecção
canina por Leishmania (Pinelli, 1997; Reis et al., 2006c) ou durante a resposta imunogênica
após a administração de vacina contra a LVC (Giunchetti et al., 2007a; Giunchetti et al.,
2008c). Pinelli et al. (1997) observaram que estes animais não foram apenas capazes de
montar resposta imune do tipo 1, através da produção de IFN-γ, mas a infecção também foi
capaz de promover a lise de macrófagos infectados por L. infantum. O presente estudo
demonstrou ainda, forte correlação negativa entre células T CD8+ e a densidade parasitária
esplênica (Tabela 10), com os maiores níveis de células T CD8+ sendo observados em cães
com as menores densidades parasitárias no baço. Foi observada ainda, diminuição na razão
CD4+/CD8+ em todos os cães infectados por Leishmania em comparação ao grupo controle
(Figura 12E). Entretanto, foi observado o aumento desta razão em cães com alto parasitismo
comparado ao grupo baixo parasitismo, além de forte correlação positiva com o parasitismo
esplênico (Tabela 10), o que reforça o papel imunoprotetor de células T CD8+ nos cães com
baixa densidade parasitária no baço. Tipicamente, elevado número de células T CD8+ tem
sido observado no sangue periférico de cães assintomáticos e são associados a baixas
densidades parasitárias na medula óssea (Reis et al., 2006c). Apesar de não ter sido observada
diferença significativa na expressão de células T CD4+ (Figura 12A), observou-se correlação
negativa com a densidade parasitária esplênica (Tabela 10), o que sugere a participação desta
subpopulação em eventos protetores, porém de forma menos expressiva do que as células T
CD8+.
A queda de linfócitos B CD21+ tem sido descrita no sangue periférico durante a LVC,
especialmente em cães sintomáticos (Bourdoiseau et al., 1997; Reis et al., 2006c). Giunchetti
et al. (2008b) em estudo histopatológico do linfonodo poplíteo de cães portadores de LV
observaram intenso infiltrado de plasmócitos neste local, consistente com a hipótese de que as
células B migram do sangue periférico para os linfonodos, onde se diferenciam em
plasmócitos. Além disso, esses autores encontraram correlação negativa entre a freqüência de
células B CD21+ no linfonodo e a densidade parasitária cutânea, uma vez que baixas
contagens de células B e altas densidades parasitárias são normalmente observadas em cães
sintomáticos e/ou animais com níveis de anticorpos anti-Leishmania mais altos (Reis et al.,
2006a,b,c). Contrastando com estes dados, em nosso estudo não foram encontradas
correlações ou diferenças estatisticamente significativas quando estas células foram avaliadas
no sangue periférico, levando-se em consideração a relação com as diferentes densidades
parasitárias esplênicas (Figura 13A, Tabela 10) ou cutâneas (Figura 17A, Tabela 11).
Como já citado anteriormente, Reis (2001) observou redução no valor absoluto de
monócitos (CD14+) circulantes no grupo de cães sintomáticos, sugerindo que ocorre
recrutamento preferencial de monócitos para tecidos linfóides secundários, onde eles podem
atuar como células apresentadoras de antígeno. No presente estudo, também foi observada
diminuição estatisticamente significativa de células CD14+ avaliadas através da
imunofenotipagem de leucócitos do sangue periférico em cães com alto parasitismo esplênico
(Figura 13C). Corroborando com estes resultados, Giunchetti et al. (2006) observaram
redução no número de monócitos CD14+ no sangue de cães sintomáticos e correlação
positiva entre a inflamação crônica na derme e monócitos CD14+ do sangue periférico,
demonstrando ativação potencial desta população celular e a migração para a derme, porém
com escassa contribuição na resistência à infecção por L. (L.) chagasi.
Cobbold & Metcalfe (1994) avaliaram pela primeira vez a expressão de moléculas de
MHC-II em cães. Estes autores observaram que, ao contrário de outras espécies, em cães a
molécula de MHC-II é expressa em todos os linfócitos circulantes. Reis et al. (2006c)
observaram que a expressão aumentada de MHC-II na população de linfócitos do sangue
periférico de cães assintomáticos está associada ao aumento da capacidade de resistência do
hospedeiro à infecção e poderia refletir aumento da capacidade de apresentação antigênica,
levando a atividade efetiva do sistema imune. Por outro lado, cães sintomáticos apresentando
menor expressão de MHC-II estariam mais vulneráveis à gravidade da doença, devido a uma
resposta imune supressora, permitindo a disseminação do parasito. Em estudo de
camundongos MHC-II-deficientes infectados por L. major, Erb et al. (1995) demonstraram
que estes animais são incapazes de restringir a disseminação do parasito apesar de possuírem
proporções aumentadas de células T CD8+. Esses autores sugerem que a resposta imune
restrita ao MHC-II, mediada por células T CD4+ funcionais, é essencial para o controle de
infecções primárias com L. major. No presente estudo, entretanto, não foram observadas
diferenças estatisticamente significativas ou correlações para a expressão da molécula de
MHC-II por linfócitos totais quando avaliada através do parasitismo esplênico (Figura 14A,
Tabela 10) ou cutâneo (Figura 18A, Tabela 11).
Em cães, a molécula CD45, também chamada de antígeno comum de leucócitos,
possui três "exons" que podem diferenciar conforme o tamanho da cadeia em diferentes
isoformas: CD45RA, RB, RC, RO. Entretanto, o significado funcional das isoformas de
CD45 ainda tem sido muito discutido, principalmente quando se trata do modelo canino
(Williams et al., 1997). Anticorpos monoclonais têm sido empregados para distinguir
subpopulações de células T associadas com diferentes vias de secreção de citocinas, em
função da expressão de determinadas isoformas. Já foi descrito que células T virgens de cão,
linfócitos T auxiliares secretores de IFN-γ (células do Tipo 1) e uma grande variedade de
linfócitos B expressam o antígeno CD45RA de alto peso molecular (220-240 kDa), enquanto
células produtoras de IL-4 (células do Tipo 2) ou linfócitos T e de memória expressam
CD45RO (Cobbold & Metcalfe, 1994). Já o antígeno CD45RB tem sido associado aos
linfócitos T CD4+ ativados pela infecção por protozoários (Gomes-Pereira et al., 2004).
No presente estudo, não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas
para estes marcadores celulares nas populações de linfócitos do sangue periférico, mesmo
quando avaliados através da razão CD45RB/CD45RA (Figura 14). Investigações recentes
foram conduzidas em cães infectados por L. (L.) chagasi demonstrando proporções
aumentadas de células CD45RB+ e menores proporções de células CD45RA+ no baço e
sangue periférico comparado aos cães não infectados (Barrouin-Melo et al., 2006). Reis et al.
(2006c) observaram o aumento na expressão da razão CD45RB/CD45RA em cães
assintomáticos, sugerindo aumento da proporção de linfócitos CD45RB em detrimento à de
linfócitos T CD45RA+, em comparação aos dados dos cães sintomáticos e do grupo controle.
Esse resultado poderia refletir ativação efetiva de linfócitos T (Tipold et al., 1998) durante a
infecção assintomática.
A análise dos diferentes fenótipos de linfócitos do sangue periférico de cães
categorizados de acordo com a densidade parasitária cutânea não apresentou diferenças
significativas entre os grupos estudados. Entretanto, os resultados de correlação
demonstraram que células T (Thy-1+ e CD5+) e as subpopulações de células T CD8+
possuem correlação negativa com densidade parasitária cutânea (Tabela 11), resultado similar
àquele encontrado para o parasitismo esplênico. A razão das subpopulações de linfócitos T
(CD4+/CD8+) apresentou correlação positiva com o parasitismo cutâneo (Tabela 11),
demonstrando proporções aumentadas de linfócitos T CD4+ e diminuídas de linfócitos T
CD8+ em cães com maiores densidades parasitárias na pele, o que sugere o papel das células
T CD8+ em eventos protetores em cães com baixo parasitismo cutâneo. Além disso,
observou-se aumento nas razões de células T/B (Thy-1+/CD21+ e CD5+/CD21+) em cães
com baixo parasitismo, comparado aos cães altamente parasitados na pele (Figuras 15E,G), o
que demonstra o predomínio dos linfócitos T circulantes em cães com baixa densidade
parasitária na pele.
Com o objetivo de melhor compreender os eventos relacionados à resposta imune
compartimentalizada na LVC em cães naturalmente infectados por L. (L.) chagasi e cães não
infectados, foi realizada uma caracterização do perfil fenotípico das principais populações de
linfócitos do baço. O baço é o local inicial para a geração de resposta imune mediada por
células, mas acaba se tornando local de persistência do parasito, com alterações
imunopatológicas importantes. Estas alterações incluem a esplenomegalia e desarranjo na
arquitetura tecidual que parece contribuir para o status imunocomprometido do hospedeiro. O
desenvolvimento progressivo da patologia esplênica é amplamente associado a altos níveis de
TNF e IL-10 (Stanley & Engwerda, 2007). Além disso, o baço é um órgão linfóide importante
que está interposto à circulação sanguínea, sendo o principal local de respostas imunológicas
a antígenos provenientes do sangue (Abbas & Lichtman, 2005). Durante a infecção por L. (L.)
chagasi há grande quantidade de antígenos derivados do parasito que circulam e chegam ao
baço. Acrescenta-se a isso, a alta densidade parasitária local, que mantém contato freqüente
com os esplenócitos induzindo a ativação celular e resposta imune contra o parasito (Reis et
al., 2006b).
Os resultados obtidos no presente estudo através da fenotipagem de células do baço
demonstraram aumento na expressão de esplenócitos CD8+ em cães com médio parasitismo
esplênico (Figura 12D) e em cães com alto parasitismo cutâneo (Figura 16D), quando
comparado aos cães não infectados. Estes resultados sugerem que os esplenócitos CD8+
podem apresentar status de ativação distinto durante a LVC, possivelmente associado a
atividade celular supressora ou imunomoduladora. Em concordância com esta hipótese,
Peruhype-Magalhães et al. (2006) demonstraram na LV humana ativa que linfócitos T CD8+
circulantes apresentaram perfil misto de citocinas caracterizado por níveis elevados de IFN-γ
e IL-10 intracelulares. Resultados também corroborados por Lage et al. (2007) que mostraram
perfil misto de RNAm de citocinas em fragmentos de tecido esplênico obtidos de cães
naturalmente infectados por L. (L.) chagasi. Além disso, maiores níveis de TGF-β no baço de
cães assintomáticos e de IFN-γ no baço de animais sintomáticos, além de altas concentrações
de IL-10 no baço de ambos os grupos de cães já foram previamente observados (Corrêa et al.,
2007). Santana (2007) não observou diferença na expressão de IFN-γ e IL-4 em tecido
esplênico de cães não infectados ou naturalmente infectados por L. (L.) chagasi, com perfis de
resistência ou susceptibilidade. Strauss-Ayali et al. (2007) observaram que tanto resposta
imune do Tipo 1 quanto do Tipo 2 ocorrem no baço durante a infecção canina experimental
por L. infantum.
É possível que uma migração seletiva de células T CD8+ do Tipo 2 para o baço,
simultaneamente com a síntese de IL-10, represente uma característica imunológica relevante
na supressão da resposta imune mediada por células observada em cães com maiores
densidades parasitárias. Desta forma, sugere-se que uma ativação funcional elevada,
direcionada ao perfil imunológico do Tipo 2, pode justificar o papel de esplenócitos T CD8+
em cães infectados. Além disso, as células CD8+ podem mediar proteção não apenas através
do aumento quantitativo no número de células, mas também através da alteração qualitativa
na capacidade funcional para resposta imune do Tipo 1 que aumenta a migração de células T
circulantes para os distintos tecidos do hospedeiro. Uma análise funcional, utilizando-se um
conjunto de marcadores (citocinas e quimiocinas) dirigidos contra populações e
subpopulações de linfócitos T (CD4+ e CD8+) necessita ser realizada e constitui uma das
perspectivas futuras de nosso grupo.
A análise da expressão de CD45RA por canal médio de fluorescência em esplenócitos
de cães parasitados no baço é fundamental para entendermos o perfil de ativação celular. Os
nossos dados mostraram diminuição significativa de células expressando esse marcador em
cães com médio parasitismo esplênico, quando comparado aos cães não infectados e com alto
parasitismo (Figura 14D). De acordo com Tipold et al. (1998), a perda de CD45RA ocorre em
outras espécies, após ativação de linfócitos T, implicando que esse marcador está presente em
células virgens ou células T em repouso. Entretanto, se as alterações na expressão das
isoformas de CD45 ocorrem simultaneamente ou sequencialmente em diferentes tecidos, e
como elas afetam o desenvolvimento da LVC ainda necessita de maiores investigações (Reis
et al., 2006c). Dessa forma, esses dados sugerem que existe perfil de ativação celular durante
a infecção, mas que não pode ser diferenciado com a avaliação apenas desse marcador.
Investigações futuras, utilizando painel ampliado de marcadores de ativação ajudarão a
compreender melhor a importância desse fenômeno no estabelecimento/manutenção da
infecção.
9 PRINCIPAIS EVIDÊNCIAS
Os resultados obtidos no presente estudo evidenciaram que o aumento da densidade
parasitária esplênica provoca mais alterações fenotípicas de linfócitos do sangue periférico do
que o parasitismo cutâneo na LVC. Além disso, os animais infectados com diferentes graus de
parasitismo apresentaram alterações significativas nas populações celulares do sangue
periférico que nem sempre são refletidas nas células do baço. Destaca-se a ocorrência de um
quadro hematológico marcante em cães altamente parasitados no baço, com anemia grave
devido à queda no número de hemácias e na concentração de hematócrito e hemoglobina,
além da queda nas populações de eosinófilos e monócitos. Os resultados obtidos destacam
ainda a importância dos linfócitos T totais na manutenção e estabelecimento da relação
parasito-hospedeiro. Além disso, a associação entre parasitismo esplênico e células T CD8+
reforça o papel da resposta imune mediada por células T em mecanismos de resistência
durante o curso da LVC. A avaliação de granulócitos mostrou pela primeira vez a participação
dos eosinófilos MHC-II+ em eventos de apresentação antigênica em cães altamente
parasitados. Entretanto, estudos posteriores serão necessários para uma investigação mais
ampla da influência do parasitismo em parâmetros fenotípicos de neutrófilos, eosinófilos e
monócitos.
Os resultados deste trabalho ressaltam a importância da realização de estudos que
quantificam o número de formas amastigotas em diferentes tecidos na LVC. Embora muitos
autores comentem sobre intensidade de parasitismo tecidual, são poucos os relatos da
avaliação quantitativa da densidade parasitária em cães naturalmente infectados por L.
chagasi. O presente estudo aponta a contagem do índice de parasitismo tecidual em cães
como método de diagnóstico e prognóstico em avaliações imunopatológicas e traz novas
perspectivas para as avaliações terapêuticas e imunoprofiláticas, podendo ser uma medida da
ação leishmanicida de drogas nos diversos tecidos afetados e na proteção de vacinas. Desta
forma, acredita-se que os resultados obtidos irão fornecer informações para melhor
compreensão da patogênese da LVC e auxiliar em futuros estudos de testes de drogas e
ensaios vacinais.
10 CONCLUSÃO
A partir do conjunto de resultados obtidos no presente estudo foi possível concluir que
diferentes graus de parasitismo medidos pela contagem do índice de parasitismo tecidual
influenciam a resposta imune celular de cães naturalmente infectados por L. (L.) chagasi.
11 PERSPECTIVAS
• Avaliar o perfil fenotípico de neutrófilos (MHC-II+, CD45RA+, CD45RB+) do baço;
• Ampliar a análise da expressão de marcadores de superfície celular para outras
populações celulares além dos já avaliados em neutrófilos, eosinófilos e monócitos;
• Avaliar o perfil fenotípico in vitro e ex vivo de pequenos e grandes linfócitos (Thy-1,
CD5, CD4, CD8 e CD21) do baço de cães naturalmente infectados com L. (L.)
chagasi, apresentando diferentes graus de parasitismo de baço e pele;
• Estudar os aspectos imunopatológicos envolvidos na ativação, adesão e migração
celular de leucócitos do sangue periférico de cães naturalmente infectados por L. (L.)
chagasi para diferentes órgãos linfóides (pele e linfonodo).
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