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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE CLÍNICA MÉDICA
ASSOCIAÇÃO ENTRE APRESENTAÇÃO DE ANTÍGENO,
IMUNORREGULAÇÃO E MORBIDADE NA DOENÇA DE
CHAGAS
ANDRÉIA MARIA MOLICA
BELO HORIZONTE
2007
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
ANDREIA MARIA MOLICA
Associação entre apresentação de antígeno, imunorregulação e morbidade na
doença de Chagas
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-graduação em Ciências da Saúde:
Infectologia e Medicina Tropical da
Faculdade de Medicina da Universidade
Federal de Minas Gerais, como requisito
parcial para obtenção do título de Mestre em
Ciências da Saúde.
ORIENTADOR: Dr. Manoel Otávio da Costa Rocha
CO-ORIENTADORES: Dra. Juliana de Assis G. Estanislau
Dra. Maria José Ferreira Morato
BELO HORIZONTE
2007
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Molica, Andréia Maria
M 721a Associação entre apresentação de antígeno, imunorregulação e
morbidade na doença de Chagas/Andréia Maria
Molica. Belo Horizonte, 2007.
vii,83f.,
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Minas Gerais.
Faculdade de Medicina.
Área de concentração: Medicina Tropical - Infectologia
Orientador: Manoel Otávio da Costa Rocha
Co-orientadores: Juliana de Assis G. Estanislau, Maria José
Ferreira Morato
1.Doença de Chagas/imunologia 2.Linfócitos B/imunologia
3.Macrófagos/imunologia 4.Sistema imune/parasitologia 5.In vitro
6.Trypanosoma cruzi/imunologia I.Título
NLM: WC 705
CDU: 616.937.3
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
Reitor
Ronaldo Tadeu Pena
Pró-Reitor de Pós-Graduação
Jaime Arturo Ramirez
Pró-Reitor de Pesquisa
Carlos Alberto Pereira Tavares
FACULDADE DE MEDICINA
Diretor
Prof. Francisco José Penna
Chefe do Departamento de clínica médica
Prof. Dirceu Bartolomeu Greco
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE: INFECTOLOGIA
E MEDICNA TROPICAL.
Coordenador
Prof. Manoel Otávio da Costa Rocha
Sub-Coordenador
Prof. Antônio Lúcio Teixeira Junior
Colegiado
Prof. Antônio Luiz Pinho Ribeiro
Prof. Carlos Maurício Figueiredo Antunes
Prof. José Roberto Lambertucci
Fátima Lúcia Guedes Silva (Representante Discente)
Este trabalho foi desenvolvido no laboratório
de Imunologia Celular e Molecular do Centro
de Pesquisas René Rachou - FIOCRUZ,
Belo Horizonte.
COLABORADORES
Dr. Rodrigo Correa Oliveira
Ms. Ana Thereza Chaves
Vladimir Martins Pinheiro
Drª Glenda Meira Cardoso
ÓRGÃOS FINANCIADORES: CNPq,
CPqRR e FIOCRUZ
Dedico este trabalho à minha filha, minha mãe,
minha irmã, minha sobrinha e ao Ricardo que sempre
estiveram presentes em todos os momentos.
AGRADECIMENTOS
Á Deus.
À minha filha Sofia, por representar o amor mais sincero e puro da minha
vida.
À minha mãe Manoela, por estar presente em todos os momentos da minha
vida, em especial, neste momento, no qual seu apoio e carinho foram fundamentais
para execução deste trabalho.
Ao Ricardo, pelo carinho, paciência, compreensão, apoio e incentivo, mesmo
distante sempre esteve presente.
À minha irmã Regina, minha sobrinha Bianca meu cunhado Luciano e a
Naiana, pelo carinho, incentivo.
À Tia Linda e meus primos Késsia, Sandra Anderson, Cristiano e Kátia pelo
carinho e incentivo.
Ao Dr. Manoel Otávio, pela preciosa orientação na minha formação
profissional. Pelo carinho e paciência em ensinar ciência. Pelo exemplo profissional
ético, dedicado e competente.
Ao Dr. Rodrigo por ter me recebido em seu laboratório e por ter confiado em
meu trabalho. Obrigada, pela orientação extra oficial neste trabalho, pela
oportunidade de aprendizado tanto profissional quanto pessoal.
À Drª. Maria José agradeço pela disponibilidade, entusiasmo, e pelo exemplo
de profissional e cientista. Obrigada pela paciência, por todos os ensinamentos e
pelos conselhos que me ajudaram a crescer.
À Drª Juliana pela confiança, disponibilidade, compreensão e entusiasmo.
Obrigada pelos ensinamentos que enriqueceram este trabalho.
Aos grandes amigos Ana Thereza e Vladimir, pelos bons momentos e pelas
longas horas de conversa, pela convivência doce, pelos ensinamentos e pelo
carinho. Agradeço também pela ajuda valiosa na execução da parte prática deste
trabalho.
À amiga e irmã Pollyanna pelo apoio e incentivo num momento importante da
minha vida. Obrigada pela amizade sincera, pelo carinho e pela ajuda na parte
escrita deste trabalho.
À Drª Andréa Teixeira, pelos esclarecimentos na parte de citometria de fluxo.
Ao Dr. Ricardo Fujiwara pela ajuda no processamento de parte dos dados
deste trabalho.
À Drª Eveline Gomes, pelo incentivo e ensinamentos na iniciação científica,
pela especial contribuição na minha formação pessoal e profissional.
Aos colegas do laboratório de Imunologia Celular e Molecular do CPqRR:
Solange, Luanda, Denise,Rodolfo, Matheus, Tiza, Iramaya, Isabela, Felipe, Ramon,
Amanda, Alex, Luciana Maria, Haroldo, Wesley, Glenda, Leila, Carol, Simone,
Paulinha, Diana, Flávio, Anne, Guilherme, Vanessa, Stefan, Roberta.
Aos colegas do grupo chagas: Glenda, Jaqueline, Fernanda, Rafaele.
A todos os funcionários do laboratório de imunologia, pela disponibilidade e
competência na realização de procedimentos que facilitam nosso trabalho em
especial, Ana Pacheco, Rita e Sérgio pela disposição e simpatia em ajudar.
A todos os funcionários do Centro de Pesquisas René Rachou.
Aos colegas da Faculdade de Medicina, agradeço pelos bons momentos pela
companhia que tornaram estes momentos mais alegres.
A Elen e Débora, secretárias do curso de pós-graduação em Ciências da
Saude, obrigada pela disponibilidade e ajuda na resolução dos processos
burocráticos.
Aos professores do curso de pós-graduação pelos ensinamentos que
contribuíram intensamente para minha formação.
Aos amigos de Juiz de Fora: Fabrícia, Nobuiki, Maria Imaculada, Diana,
Michela, Priscila, Beatriz, Idálio, Waguinho, Deise, por torcerem por mim.
Aos amigos da UAI, pelo carinho e compreensão.
Aos pacientes pela disposição em doar o sangue voluntariamente para
execução deste trabalho. Obrigada pela preciosa contribuição.
Quem, de três milênios, não é capaz de se dar
conta, vive na ignorância, na sombra, à mercê dos
dias, do tempo.
Goethë
ÍNDICE
Lista de Tabelas ................................................................................................
I
Lista de Figuras ................................................................................................
II
Lista de Abreviaturas e Siglas ...........................................................................
IV
Resumo ............................................................................................................
VI
Abstract .............................................................................................................
VII
1.0 – Introdução .................................................................................................
1
2.0 – Objetivos ..................................................................................................
13
2.1 - Objetivo Geral ..................................................................................
13
2.2 - Objetivos Específicos........................................................................
13
3.0 - População Estudada .................................................................................
14
4.0 - Material e Métodos .............................................................................
16
4.1 - Obtenção do antígeno solúvel do parasito da forma epimastigota
do T.cruzi .................................................................................................
16
4.2 - Obtenção de células mononucleares do sangue periférico .............
16
4.3 – Remoção de células aderentes .......................................................
17
4.4 - Ensaio de proliferação celular ...........................................................
19
4.5 -
Obtenção de sobrenadantes de cultura para detecção dos níveis
de prostaglandina E2 e de citocinas .................................................................
20
4.6 – Análise do fenótipo celular de leucócitos do sangue periférico .......
25
4.7 -
Avaliação do padrão de citocinas nos sobrenadante de cultura de
PBMC e células NA após estimulação in vitro ..................................................
31
4.8 - Quantificação dos níveis de Prostaglandina E2 nos sobrenadantes
de cultura............................................................................................................
27
4.9. Análise estatística ..............................................................................
28
5.0. Resultados..................................................................................................
5.1 Ensaio de proliferação de PBMC e de células NA, estimuladas com
antígeno de T.cruzi ...........................................................................................
30
5.2 Ensaio de proliferação de PBMC, estimuladas com antígeno de
T.cruzi, na presença de indometacina...............................................................
32
5.3 Avaliação da expressão de HLA-DR nas populações de monócitos
em cultura de PBMC e células NA...................................................................
34
5.4 Avaliação da expressão das moléculas CD80 e CD86 na população
de monócitos em cultura de PBMC e NA..........................................................
35
5.5 - Dosagem de PGE2 em sobrenadantes de culturas de PBMC e de
células NA..........................................................................................................
37
5.6 - Avaliação da expressão de HLA-DR na população de linfócitos B
CD19+ em cultura de PBMC e células NA.........................................................
38
5.7 Avaliação da expressão de moléculas CD80 e CD86 na população
de linfócitos CD19+, em culturas de PBMC e de células NA........................
40
5.8 Avaliação do padrão de citocinas produzidas nos sobrenadantes das
culturas de PBMC e de células NA ...................................................................
42
5.9 – Resumo dos resultados ...................................................................
47
6.0. Discussão....................................................................................................
48
7.0. Conclusão...................................................................................................
59
8.0. Referências Bibliográficas..........................................................................
60
I
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: População Estudada...........................................................................
15
Tabela
2: Relação dos anticorpos utilizados para análise do fenótipo de
leucócitos de sangue periférico....................................................................................
24
II
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: An
álise do percentual de monócitos obtidos antes e após remoção
de células aderentes.............................................................................................. 18
FIGURA 2: Análise de linfócitos do sangue periférico após estimulação in vitro
com antígenos do T. cruzi...................................................................................... 23
FIGURA 3 : Análise de monócitos do sangue periférico após estimulação in vitro
com antígenos do T. cruz ..................................................................................... 24
FIGURA 4: Análise quantitativa de citocinas no sobrenadante de cultura
de
PBMC e células não aderentes............................................................................. 27
FIGURA 5. Proliferação celular de PBMC e células não aderentes..................... 31
FIGURA 6. Proliferação celular de PBMC após adição de indometacina..............
33
FIGURA 7. Expressão de HLA-DR
na população de monócitos em cultura de
PBMC e células NA................................................................................................
35
FIGURA 8. Expressão de CD80
na população de monócitos em cultura de
PBMC e células não aderentes..............................................................................
36
FIGURA 9. Expressão de CD86 na população de monócitos em cultura de
PBMC e células não aderentes............................................................................. 36
FIGURA 10. Dosagem de PGE2 em sobrenadante de cultura de PBMC e
células não aderentes............................................................................................ 38
FIGURA 11. Expressão de HLA-
DR na população de linfócitos B em cultura de
PBMC e células não aderentes............................................................................. 39
FIGURA 12. Expressão de CD80
na população de linfócitos B em cultura de
PBMC e células NA............................................................................................... 41
FIGURA 13. Expressão
de CD86 na população de linfócitos B em cultura de
PBMC e células não aderentes..............................................................................
41
FIGURA 14 Dosagem de IL-2 em sobrenadante de cultura de PBMC e
células
não aderentes.........................................................................................................
43
44
III
FIGURA 15. Dosagem de IL-4 em sobrenadante de cultura de PBMC e
células
não aderentes.........................................................................................................
FIGURA 16. Dosagem de IFN-γ em sobrenadante de cultura de PBMC e
células
não aderentes.........................................................................................................
45
FIGURA 17. Dosagem de IL-10 em sobrenadante de cultura de PBMC e
células
não aderentes........................................................................................................ 46
IV
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
APC Célula apresentadora de antígeno
AR Altos respondedores
BR Baixos respondedores
C Cultura controle
CARD Pacientes portadores da forma clínica cardíaca
CD Pacientes portadores da forma clínica cardiodigestiva
CD Grupos de diferenciação (cluster of differentiation)
CPM Contagem por minuto
CTLA-4
Proteína 4 associada ao Linfócito T citotóxico (Cytotoxic T-
lymphocyte-associated protein 4)
DIG Pacientes portadores da forma clínica digestiva
ECG Eletrocardiográfico
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
EP Receptores prostanóides
EPI Antígeno de epimastigota
FACS
Separação de células ativadas por fluorescência – citômetro de fluxo
(Fluorescence activated cell sorter)
FITC Isotiocianato de fluoresceína
FL Fluorescência
FSC Dispersão frontal (forward scatter)
HLA Antígeno leucocitário humano
ICAM Molécula de adesão intercelular
V
IFN Interferon
Ig Imunoglobulina
IL Interleucina
IMC Imunidade mediada por células
IND Pacientes portadores da forma clínica indeterminada
INDO Indometacina
LFA Antígeno funcional de leucócitos
LPS Lipopolissacárides
MHC Complexo de histocompatibilidade principal
NA Células não aderentes
NI Grupo não infectado
NK Célula natural killer
PBMC Células mononucleares do sangue periférico
PBS-W Tampão fosfato salínico de lavagem
PE Ficoeritrina
PGE
2
Prostaglandina E
2
RPMI Meio de cultivo celular
SSC Dispersão lateral (side scatter)
Th1 Células T CD4
+
secretoras de padrão 1 de citocinas
Th2 Células T CD4
+
secretoras de padrão 2 de citocinas
TNF Fator de necrose tumoral
WHO Organização mundial da saúde
VI
RESUMO
Trabalhos anteriores mostraram que células da imunidade inata produzem
prostaglandinas que atuam como moléculas reguladoras da resposta imune a vários
agentes etiológicos, incluindo o Trypanosoma cruzi, causador da doença de Chagas.
O objetivo do presente trabalho foi avaliar o papel de monócitos/macrófagos
como célula reguladora, através da produção de PGE2 e de citocinas, bem como o
de célula apresentadora de antígeno em indivíduos não infectados (NI) e portadores
da doença de Chagas, com as formas clínicas indeterminada ou cardíaca.
Células mononucleares totais (PBMC) e não aderentes (NA) do sangue
periférico foram isoladas. Parte destas células foi submetida ao ensaio de
proliferação celular, durante seis dias, na presença e ausência de antígenos do T.
cruzi, a outra parte foi cultivada durante dezoito horas, após este período coletou-se
o sobrenadante para dosagem de PGE
2
e de IL-2, IL-4, IL-10 e IFN-γ . As células
foram utilizadas para análise fenotípica dos marcadores CD14, CD19, HLADR, CD80
e CD86.
A resposta proliferativa a antígenos do T cruzi mostrou-se aumentada nos
indivíduos dos grupos IND e CARD quando comparados ao grupo NI. Porém após
remoção das células aderentes houve aumento da resposta proliferativa nos
indivíduos NI. A adição de bloqueador (indometacina) de PGE2 as culturas de PBMC
evidencia a formação de dois subgrupos dentro do grupo IND: altos respondedores
(AR) e baixos respondedores (BR), mostrando que o bloqueio de PGE2 pode
influenciar a resposta proliferativa nos indivíduos do grupo IND. A dosagem de PGE2
apresentou níveis semelhantes entre os grupos IND e CARD quando comparados ao
grupo NI sugerindo um papel de molécula reguladora de PGE2 na tentativa de
retorno a homeostasia do sistema imune. Por outro lado a dosagem das citocinas IL-
2, IL-4, IL-10 e IFN-γ, mostraram níveis aumentados em quase todas as culturas
estimuladas quando comparada as culturas sem estímulo.
O estudo do fenótipo de células mononucleares totais e células não aderentes
mostraram que células CD14
+
expressam moléculas HLA-DR, CD80 e CD86 com
intensidade semelhante nas culturas estimuladas ou não com T. cruzi, porém,
apesar de não haver significância, é possível observar no grupo IND uma expressão
menor de moléculas HLA-DR e CD 80. Já as células CD19
+
expressam moléculas
HLA-DR e CD80 com intensidade significativamente maior nas culturas NA
estimuladas quando comparadas às culturas sem estímulo. Demonstrando que
linfócitos B em culturas empobrecidas de macrófagos intensificam sua função de
APC.
Os dados em conjunto sugerem que linfócitos B têm sua função de APC
regulada por macrófagos frente estimulação antigênica pelo T. cruzi independente
da resposta secundária, uma vez que células de indivíduos NI apresentam o mesmo
perfil fenotípico dos pacientes estudados.
Palavras-chave: Trypanosoma cruzi, macrófagos, linfócito B, APC, resposta imune.
VII
Abstract
It has been demonstrated that cells from innate immune response secreted
prostaglandins that act as regulators of the immune response against some
infectious agents as the pathogen of Chagas disease, the Trypanosoma cruzi.
In this work we evaluated the monocytes/macrophages activity as regulatory cells, by
the production of PGE2 and cytokines, and as antigen presenting cells (APC) in non
infected individuals (NI) and patients with the indeterminate(IND) or cardiac (CARD)
clinical forms of Chagas disease.
We isolated peripheral blood mononuclear cells (total and not adherent) and
performed cellular proliferative assays in the presence or not of T. cruzi antigens.
After eighteen hours of culture, the supernatants were assayed for the presence of
PGE2, IL-2, IL-4, IL-10 and IFN-γ. Expression of CD14, CD19, HLA-DR, CD80 and
CD86 markers were performed in the culture cells.
Our data showed a high proliferative response of IND and CARD patients when
compared to the NI group, in the presence of antigen. After removal of the adherent
cells we observed an increase in the proliferative response of cells from the NI group.
In the presence of Indomethacin, a PGE
2
blocker, we observed that the proliferative
response of cells from IND patients could be subdivided into high (AR) and down
(BR) responders. These results demonstrate that the PGE
2
inhibition influences the
cellularproliferate response of IND patients. It interesting to note, that IND and CARD
patients presented similar levels of PGE
2
in comparison to NI group. These data
evidence that PGE
2
has an important role as an immune regulatory molecule. Our
results also showed higher levels of IL-2, IL-4, IL-10 e IFN-γ cytokines in antigen
stimulated cultures when comparied to non the stimulated.
Phenotypical analyses of PBMC and NA populations demonstrated that CD14
+
cells
have similar expression of HLA-DR, CD80 and CD86 in cultures stimulated or not
with T. cruzi antigen. IND patient’s cells presented lower HLA-DR and CD80
expression although not significant. Analyses of CD19
+
cells in NA stimulated
cultures showed higher expression of HLA-DR and CD80 molecules when compared
with non stimulated cultures. These results demonstrated that in the absence of
macrophages, B-lymphocytes may function as antigen presenting cells.
These data suggest that in presence of T. cruzi, APC function of B-lymphocytes is
regulated by macrophages, independent of the secondary response, since NI cells
presented the same phenotypical profile by the patients with Chagas disease.
Key words: Trypanosoma cruzi, macrophages, B-lymphocytes, APC, immune
response.
INTRODUÇÃO
1
1.0 - INTRODUÇÃO
INTRODUÇÃO
2
A doença de Chagas, infecção parasitária causada pelo protozoário
Trypanosoma cruzi, encontra-se desde o norte do México até o sul da Argentina, e
atinge cerca de 16 a 18 milhões de indivíduos (Organização Mundial da Saúde,
2002).
A incidência da doença é a maior em áreas rurais onde condições precárias
de vida facilitam o contato com os insetos triatomíneos (Bogitsh et al.1999). Os
insetos são conhecidos como “barbeiros”, onde o T. cruzi, na forma epimastigota,
vive no interior do intestino, não invadindo outras partes do corpo, e multiplica-se por
fissão binária. No intestino posterior – reto e ampola retal – do barbeiro, essa forma
adere pelo flagelo às células da parede do intestino e se diferencia para a forma
tripomastigota metacíclica, altamente infectante para vertebrados. Os “barbeiros”
adquirem o T. cruzi ao ingerir sangue de animais infectados e os transmite para o
homem e outros vertebrados pelas fezes, geralmente após se alimentar de sangue.
Quando o inseto faz seu repasto, através da pele de um vertebrado, há um grande
aumento de líquido em seu organismo e, em conseqüência, ele rapidamente excreta
parte desse líquido na urina ou nas fezes, liberando junto as formas tripomastigotas
metacíclicas. Incapazes de atravessar a pele íntegra, essas formas morrem assim
que os dejetos do inseto secam, mas, antes disso, podem invadir o organismo e
iniciar a infecção se entrarem em contato com mucosas ou com alguma área lesada
da pele do hospedeiro. As formas tripomastigotas metacíclicas não se multiplicam no
sangue do hospedeiro vertebrado, mas invadem seus tecidos. Após penetrarem nas
células, as formas tripomastigotas escapam do vacúolo fagocítico e se estabelecem
no citoplasma celular, onde se transformam nas formas amastigotas e passam a se
dividir. Após cinco dias, dezenas ou centenas de amastigotas sofrem um processo
de alongamento e se transformam em formas tripomastigotas, as quais, por sua
INTRODUÇÃO
3
grande motilidade, provocam o rompimento da célula e os parasitos livres invadem
outras células próximas ou alcançam a corrente sangüínea disseminando a infecção
para diferentes órgãos e sistemas. Esse ciclo leva a um crescimento exponencial
das populações parasitárias intracelulares e conseqüentemente ao aumento da
parasitemia (Brener, Andrade e Barral-Neto; 2000).
No Brasil, desde a década de 1970, diretrizes de combate a doença foram
direcionadas no sentido de interromper, o mais rapidamente possível, a transmissão
vetorial através do emprego de inseticidas eficientes, bem como melhorias das
habitações rurais, com adequada higiene e limpeza das mesmas na tentativa de se
evitar a presença do vetor nas residências. Concomitantemente, sabendo-se que
transmissão sanguínea é o segundo modo de transmissão de importância
epidemiológica, principalmente nos grandes centros urbanos, foram adotadas
medidas preventivas que permitiram controlar, também, a transmissão por meio das
transfusões de sangue e derivados. Assim sendo, foram estancados os dois
mananciais mais importantes que, anualmente, aumentava em cerca de 100.000
novos casos da doença no Brasil (Consenso Brasileiro em Doença de Chagas,
2005)
Com o êxito inicial representado pela eliminação dos triatomíneos de hábitos
essencialmente domésticos, em especial o Triatoma infestans, os esforços se
concentram atualmente no sentido de manter os resultados obtidos, consolidar o
controle de focos residuais e impedir o estabelecimento de novos focos de
transmissão vetorial (Consenso Brasileiro em Doença de Chagas, 2005).
O T. cruzi pode induzir uma fase aguda de curta duração (8-12 semanas),
caracterizada por elevada parasitemia, facilmente detectada em exames de sangue
à fresco. As principais manifestações clínicas nessa fase são os sinais de porta de
INTRODUÇÃO
4
entrada para o parasito, febre, linfoadenopatia, esplenomegalia e miocardite. Essas
manifestações são normalmente detectadas em crianças, entretanto a maioria dos
indivíduos infectados, a fase aguda muitas vezes passa despercebida (Prata, 2001).
A primeira reação ao T. cruzi durante a fase aguda implica na migração de células
mononucleares para o foco da lesão onde há ruptura das células parasitadas
(Andradre, 1991) liberando, então, citocinas que desencadeiam o processo
inflamatório As lesões tendem a ser difusas e mais graves no coração. A destruição
de células parasitadas ou não, durante a fase aguda, parece ser importante na
patogenicidade da doença, especialmente para indução de disfunções cardíacas e
digestivas que podem ocorrer tardiamente (Andrade, 1983; Andrade, 1994). Na
maioria dos casos agudos, os sintomas clínicos são seguidos por uma aparente
recuperação completa da miocardite. A queda da parasitemia ocorre em decorrência
da resposta imune efetora do hospedeiro, dando início à fase crônica. Nessa fase,
os tripomastigotas sangüíneos são detectados apenas por métodos parasitológicos
indiretos como xenodiagnóstico, hemocultura, ELISA e PCR (Minter-Goedbloed et
al., 1978; Cedilhos et al., 1982, Bronfen et al., 1989; Chiari et al.,1989; Ávila et
al.,1993; Degrave et al., 1994, Zarate-Blates, 2007). Esses métodos são altamente
específicos, porém menos sensíveis e eficazes para o diagnóstico de rotina.
Do ponto de vista clínico, os indivíduos nessa fase podem ser classificados
como pertencentes às formas clínicas: indeterminada (IND), cardíaca (CARD),
digestiva (DIG) ou cardio-digestiva (CD). Os pacientes portadores da forma clínica
indeterminada correspondem cerca de 60-70% dos indivíduos infectados,
apresentam testes sorológicos e/ou parasitológicos positivos para o T. cruzi, e os
exames clínicos, eletrocardiográficos (ECG) e radiológicos (área do tórax, esôfago e
cólon) sem qualquer alteração (Rocha et al., 2003). No entanto, exames adicionais e
INTRODUÇÃO
5
mais sofisticados podem demonstrar nesses pacientes algumas alterações e
anormalidades, geralmente discretas, que podem significar tanto um processo
evolutivo em marcha como apenas resquícios de processo agudo ou crônico inicial
já cicatrizado e sem progressão clínica ou anatômica (Dias, 2000; Rocha et al.,
2003). Acredita-se que cerca de 2 a 5% dos pacientes apresentando a forma clínica
IND irão desenvolver a forma clínica CARD a cada ano, enquanto um menor
percentual irá apresentar a forma clínica DIG (megacólon e/ou megaesôfago) (Dias,
1989). Aproximadamente 30% dos pacientes podem apresentar a forma clínica
CARD que se caracteriza por distúrbios de condução e de contractilidade do
coração, levando ao surgimento de arritmias, insuficiência cardíaca e
tromboembolismo (Rocha et al., 2003). A infecção chagásica pode, ainda, gerar em
5 a 10% dos pacientes, alterações anatômicas e funcionais do trato gastrointestinal,
como denervação da musculatura lisa que reveste a parede do tubo digestório,
dificuldades na deglutição e defecação, além de processos de dilatação de
estruturas esofagianas e intestinais (megas), caracterizando a forma clínica DIG
(Koberle, 1968; Macedo, 1982; De Rezende, 1988). Finalmente, à forma clínica CD,
sendo a menos comum, e nela se associam alterações de órgãos dos sistemas
digestório e cardiovascular.
Os mecanismos envolvidos no desenvolvimento das formas graves da doença
de Chagas e sua morbidade são ainda pouco compreendidos. Acredita-se que estas
manifestações são conseqüências de múltiplos fatores ligados ao T. cruzi (cepa,
virulência, antigenicidade, tropismo, tamanho do inóculo), ao homem (idade, sexo,
raça, perfil da resposta imune) ou ao ambiente (Dias, 2000; Vago, 2000; Macedo,
2004).
INTRODUÇÃO
6
A escassez de parasitos contraposta à intensidade e extensão das lesões,
assim como o prolongado período de latência que precede essas lesões, tem levado
diversos autores a avaliarem o envolvimento de fatores autoimunes na patogênese
da lesão chagásica. Alguns autores apontam para a existência de reação cruzada
entre os componentes autólogos e antígenos do T. cruzi (Kierszenbaum, 1986; Al-
Sabbagh et al., 1998; Cunha-Neto et al., 1995, Cunha-Neto et al, 1996; Levitus et al.,
1991; Van Voorhis & Eisen, 1989; Acosta & Santos-Buch, 1985; Wood et al., 1982;
Bahia-Oliveira et al., 2000, Montran et al., 2000). Além disso, outros autores têm
discutido que a resposta autoimune contra antígenos presentes no tecido cardíaco
pode favorecer o desenvolvimento da forma mais severa da cardiopatia chagásica.
Anticorpos contra receptores adrenérgicos e colinérgicos estão entre os anticorpos
mais bem descritos na doença de Chagas (Borda et al.,1984; Borda e Sterin-
Borda,1996; Sterin-Borda, et al., 1999). Talvani e colaboradores em 2006,
mostraram que indivíduos com cardiopatia chagásica crônica (CCC) tem elevados
níveis de anticorpos anti peptídeos de receptores adrenérgicos e colinérgicos
quando comparados a indivíduos não infectados.
Embora um grande volume de evidências indique que os parasitos
intracelulares per si exerçam papel insignificante na patogênese da doença de
Chagas (Brener, 1987), trabalhos recentes sugerem que o parasitismo intracelular
pode ser mais freqüente do que previamente demonstrado por microscopia óptica,
sugerindo haver, na doença de Chagas, uma participação direta da reatividade
imune contra células parasitadas (Añez et al., 1999, Higuchi et al., 1993, 1997, Vago
et al., 1996; Palomino et al., 2000).
Entretanto, outros fatores além dos parasitos, têm importância na patogênese
da miocardite chagásica, como a própria resposta imune assim como alterações nos
INTRODUÇÃO
7
mecanismos de regulação. A mobilização do sistema imune é importante na redução
da carga parasitária, mas, por outro lado, pode contribuir para o aparecimento das
manifestações crônicas observadas em alguns pacientes.
Baseado nos aspectos imunológicos, a fase crônica da infecção pelo T. cruzi
pode ser caracterizada pelo balanço entre o acúmulo de uma eficiente resposta
imune (inata e adaptativa) e a presença de poucos parasitos no tecido do
hospedeiro. Este balanço pode levar a um longo período assintomático da doença,
mas em uma porção significante dos pacientes, por razões desconhecidas, ocorre
um distúrbio nessa regulação favorecendo o aparecimento das manifestações
clínicas graves da doença na fase crônica (Jones et.al – 1993, Garg e Tarlenton,
2002).
A resposta imune inata não desempenha apenas funções defensivas logo
após a infecção, mas também estimula e direciona as respostas imunes adaptativas
(Akira et al, 2001; Kaisho et. al., 2001). A ativação dos macrófagos representa um
evento relevante da imunidade inata na resistência à infecção pelo T. cruzi. O
processo de fagocitose mediado por macrófagos é capaz de ativar a produção de
uma série de citocinas inflamatórias, tais como IL-12 e TNF-α, que contribuem para
produção de IFN-γ por células NK (Silva et al.,1992). A produção de IFN-γ leva a
redução da parasitemia e a mortalidade de animais infectados, promovendo a
estimulação de macrófagos e a produção de metabólitos
tóxicos para o parasito (Silva et al.,1992; Cardillo et al.,1996; Holscher et al.,1998;
Silva et al.,1995; Vespa et al.,1994). Além disso, a regulação da expressão de
quimiocinas e de INF-γ associados ao decréscimo do parasitismo nos tecidos pode
ser responsável pela controle da inflamação e imunopatogenia observados nos
tecidos cardíacos na infecção experimental pelo T. cruzi (Talvani et al., 2000).
INTRODUÇÃO
8
Por outro lado, a produção de IL-10 pelos macrófagos parece ser um mecanismo
associado à susceptibilidade dos animais à infecção pelo T. cruzi (Silva et al.,1992)
devido, provavelmente, ao seu papel regulador sobre a ativação de macrófagos
induzida pelo IFN-γ, inibindo tanto a liberação de metabólitos tóxicos quanto a
diferenciação de células com perfil de citocinas do tipo 1 (Reed,1988; Cardillo et
al.,1996).
Cabe ressaltar que, embora um perfil de resposta imune inflamatório seja
relevante para o controle da infecção, uma excessiva estimulação da resposta imune
poderia também causar danos ao hospedeiro por estimular respostas inflamatórias
exacerbadas (Hunter et al., 1997). Um estudo recente em humanos demonstrou que
monócitos derivados de pacientes do grupo IND apresentam características
moduladoras como baixa expressão da molécula HLA-DR e alta expressão de IL-10,
enquanto monócitos derivados de pacientes do grupo CARD parecem estar
comprometidos com intensa resposta inflamatória devido à alta expressão de TNF-α
(Souza et al., 2004,). Desta forma, monócitos de pacientes com diferentes formas
clínicas da doença de Chagas apresentam perfis fenotípico-funcionais distintos,
sugerindo uma dicotomia nos mecanismos de controle e desenvolvimento da
patologia cardíaca.
Além disso, a imunidade inata fornece sinais importantes para estimular a
proliferação e a diferenciação dos linfócitos T e B antígeno-específica. Dentro deste
contexto, após internalização de moléculas antigênicas por fagocitose, os
macrófagos podem digerí-las e externá-las no contexto de moléculas do complexo
principal histocompatibilidade (MHC) de classe II, atuando, assim, como células
apresentadoras de antígeno (APC) para os linfócitos T. Desta forma, os linfócitos ao
serem ativados secretariam citocinas e outras moléculas mediadoras para a própria
INTRODUÇÃO
9
população de linfócitos T, B e, ainda para os macrófagos. Por outro lado, está claro
que as APCs estão freqüentemente envolvidas na regulação da resposta de células
T. Uma das estratégias usadas por vários microrganismos patogênicos para escapar
do sistema imune do hospedeiro é a modulação das funções co-estimuladoras e
apresentadoras de antígenos das APCs. Considerando a resposta imune como
resultado destas interações celulares, desencadeadas pelo estímulo antigênico, a
imunidade mediada por células (IMC) em infecções por patógenos intracelulares tem
sido avaliada in vitro tanto em população total de leucócitos, como em células
mononucleares do sangue periférico de indivíduos normais sensibilizadas in vitro
com antígenos do T. cruzi.
Os estudos realizados sobre a resposta imune celular na infecção chagásica
têm sido desenvolvidos através da análise da reatividade in vitro de células
mononucleares do sangue periférico (PBMC), após a estimulação antigênica
específica, bem como por estudos da composição celular de diferentes
compartimentos, produção de citocinas, entre outros. A resposta de proliferação de
PBMC de pacientes portadores de diferentes formas clínicas da doença de Chagas
tem demonstrado que essas células são capazes de proliferar quando estimuladas in
vitro por antígenos do T. cruzi (Mosca et al., 1979, Gusmão et al., 1984; De Titto et
al.,1985, Morato et al., 1986; Gomes, 2002; Michailowsky et al., 2003). Entretanto,
nenhuma relação foi encontrada entre a resposta de proliferação das PBMC e as
formas clínicas CARD e IND. Diferenças na intensidade de resposta de proliferação
de PBMC de pacientes aos antígenos do parasito foram demonstradas por Morato et
al., 1996; onde dois padrões de resposta foram observados: (1) “baixos
respondedores” que correspondiam a 32% dos pacientes, nos quais as PBMCs eram
incapazes de responder aos seis diferentes antígenos derivados de clones ou cepas
INTRODUÇÃO
10
do parasito e (2) “altos respondedores”, correspondendo a 69% dos pacientes, que
apresentavam resposta proliferativa de PBMC a, pelo menos, um antígeno. Esses
pesquisadores demonstraram, ainda, aumento da reatividade celular nesses
pacientes, após remoção de macrófagos, sugerindo, então, estreita correlação entre
o nível da resposta proliferativa de PBMC e a estimulação das células aderentes.
Posteriormente, foi verificado que a atividade reguladora dos macrófagos sobre a
proliferação dos linfócitos estava relacionada à produção de prostaglandinas E
2
(PGE
2
) e IL-10 (Morato, 1994, Pinge-Filho et, al., 1999; Barros-Mazon, et. al.2004). A
proliferação celular decorrente da ativação por mitógenos ou antígenos do parasito é
intensificada em culturas tratadas com indometacina, inibidor de cicloxigenase,
sugerindo que PGE
2
participa da regulação da resposta linfoproliferativa (Castes et
al.,1986). A PGE
2
, sintetizada por macrófagos ativados, é uma molécula moduladora
capaz de inibir a síntese de IL-2 por linfócito T, bem como de seu receptor, reduzir a
produção de IFN-γ, inibir a síntese de IL-1, TNF-α e IL-12 por macrófagos e induzir a
produção de IL-10 (Rappaport et al.,1982; Kunkel et al.,1986; Strassmann et
al.,1994; Van Der Pouw Kraan et al.,1995 Scales,1989; Michelin et al., 2005), além
de alterar a apresentação de antígeno por inibir a expressão de moléculas do MHC
de classe II (Snyder, 1982).
Portanto, as PGE
2
teriam papel importante no balanço das respostas Th1 e
Th2, uma vez que inibem drasticamente a produção de citocinas Th1, como IFN-γ e
IL-2, direcionando a resposta imune para um perfil Th2 (Walker et al.,1983; Cillari et
al., 1986;). A capacidade de PGE
2
em modular a resposta das células T poderia ser
extremamente benéfica no contexto da infecção pelo T. cruzi, sendo um componente
essencial para a proteção do hospedeiro através de sua habilidade de limitar uma
resposta imune exagerada (Th1) induzida pelo parasito (Gomes et al, 2003).
INTRODUÇÃO
11
Entretanto, a presença destas moléculas pode também ser prejudicial para o
hospedeiro uma vez que podem auxiliar na persistência do patógeno suprimindo
uma resposta imune eficiente.
As PGE
2
podem também exercer efeito modulador na ativação e
diferenciação dos linfócitos B, inibindo a expressão de moléculas de MHC de classe
II e de receptores de baixa afinidade para a região Fc da IgE, além de diminuir a
produção de IgM. Em contraste, a PGE
2
aumenta a produção de IgE e
sinergicamente aumenta a produção de IL-4, potencializando o padrão de resposta
imune para o tipo Th2 (Fedyk e Phipps, 1997).
Outra função moduladora das PGE
2
está associada à capacidade de controlar
a atividade das APCs profissionais, tais como células dendríticas, macrófagos e
linfócitos B (Harizi, et al., 2001). Em macrófagos a PGE
2
inibe fortemente a
expressão das moléculas ICAM-1, CD80 e CD86, envolvidas na apresentação de
antígenos, através dos receptores prostanoides (EP) 2 e EP 4, (Morichika et al.,
2003.
Durante o processamento e apresentação de antígenos as APCs profissionais
necessitam de estímulos para a expressão de moléculas co-estimuladoras (CD80,
CD86) e de adesão (LFA-1), importantes para promover ativação e diferenciação
dos linfócitos T, além de favorecer interações entre células B e a produção de
anticorpos (Freeman, et al.,1993a, Freeman, et al., 1993b). Embora os linfócitos B
careçam de atividade fagocítica, eles têm a capacidade de capturar, processar e
apresentar antígenos às células T auxiliares. Eles mostram-se especialmente
eficazes na apresentação de antígenos que se ligam especificamente às suas
imunoglobulinas de superfície. Em geral, os linfócitos B com especificidade
apropriada são muito escassos por ocasião do primeiro contato com o antígeno,
INTRODUÇÃO
12
entretanto, tornam-se cada vez mais importantes como APC, à cada exposição.
Numerosos estudos têm abordado diferentes aspectos da função de apresentação
de antígeno por linfócitos B nas últimas duas décadas, mostrando a importância
dessas células como APC na resposta imune primária e secundária (Rodriguez-
Pinto, 2005). Dentro desse contexto, os linfócitos B podem induzir tolerância ou
gerar resposta imune, dependente do seu estado de ativação (Saoudi, et al., 1995;
Yuschenkoff, et al., 1996; Townsend e Goodnow,1998; Tsitoura, et al., 2002).
Linfócitos B expressando receptor de célula B (BCR) com alta afinidade podem
induzir proliferação de linfócitosT CD4
+
após incubação com antígeno solúvel em
baixa concentração, mostrando que células B possuem mecanismo altamente
eficiente para a concentração de pequenas quantidades de antígeno, o que resulta
em uma intensificação de sua apresentação, podendo modular a resposta imune
contra o antígeno (Batista e Neuberger, 1998; Guermonprez, et al., 1998). Outros
estudos mostram que nas doenças auto-imunes as células B têm um papel central
como células apresentadoras de antígenos (Liang e Mamula, 2000). A auto-
reatividade de células B e T co-existem num repertório normal, mas sua ativação é
dependente de vários fatores genéticos e ambientais. As células B auto-reativas são
importantes APCs na iniciação e desenvolvimento da resposta imune por células T
CD4
+
a antígenos próprios, pois seu BCR não pode determinar a origem do
antígeno (próprio ou estranho). Isto contrasta com as outras APCs, onde a ativação
depende do reconhecimento do padrão molecular do antígeno, ou seja, do antígeno
patogênico. Portanto, em muitos casos, a auto-imunidade pode surgir quando
antígenos que estão seqüestrados tornam-se accessíveis, permitindo que células B
reconheçam esses antígenos, e os apresente as células T CD4
+
, amplificando as
respostas auto-imunes.
INTRODUÇÃO
13
Na doença de Chagas, a ocorrência de auto-imunidade continua sendo um
aspecto fundamental na compreensão da patogênese da doença. Estudos
demonstraram que pacientes com a forma clínica CARD da doença de Chagas
apresentam níveis elevados de células B CD5
+
no sangue periférico e após
estimulação in vitro com anticorpos específicos contra o parasito (Dutra et al.,2000).
Células B CD5
+
têm sido associadas à patologia na doença de Chagas experimental
(Minoprio, 1991) e também tem sido observada a presença dessas células em
doenças auto-imunes (Becker, 1990; Smith e Olson, 1990).
O desenvolvimento da patologia na doença de Chagas é conseqüência de
uma longa e complexa relação entre persistência do parasito e mecanismos
homeostáticos mal adaptados do hospedeiro, levando a alterações patológicas
(Pérez-Fuentes et al., 2003). Desta forma, os estudos propostos neste trabalho
buscam um melhor entendimento dos mecanismos imunológicos envolvidos na
homeostasia do hospedeiro através da caracterização do perfil de macrófagos e
células B como APCs e a avaliação da produção de citocinas e PGE
2
por células
mononucleares do sangue periférico.
OBJETIVOS
14
2.0 - OBJETIVOS
OBJETIVOS
15
2.1. Objetivo Geral
Avaliar o papel de monócitos/macrófagos como células apresentadoras de antígeno
e como células reguladoras da resposta imune em pacientes portadores das formas
clínicas indeterminada e cardíaca da doença de Chagas.
.
2.2. Objetivos Específicos
- Avaliar a resposta de proliferação das células mononucleares do sangue periférico
(PBMC) e de células não aderentes (NA) após estimulação in vitro por antígenos do
T. cruzi;
- Avaliar o efeito da adição de indometacina sobre a resposta de proliferação das
PBMC e de células NA após estimulação in vitro por antígenos do T. cruzi;
- Avaliar os níveis de PGE2 nos sobrenadantes de cultura de PBMC e de células NA
após estimulação in vitro com antígenos do T. cruzi;
- Avaliar a produção das citocinas, IL-2, IL-4, IL-10, IFN-γ, nos sobrenadantes de
culturas de PBMC e de células NA após estimulação in vitro com antígenos do T.
cruzi;
- Avaliar a expressão de moléculas HLA-DR, CD80 e CD86 na superfície de
monócitos e de linfócitos B nas populações de PBMC e de células NA após
estimulação in vitro com antígenos do T. cruzi;
POPULAÇÃO ESTUDADA
16
3.0 – POPULAÇÃO ESTUDADA
POPULAÇÃO ESTUDADA
17
3. POPULAÇÃO ESTUDADA
Neste estudo, avaliamos o papel de monócitos/macrófagos como células
apresentadoras de antígeno e como células reguladoras da resposta imune em
pacientes portadores das formas clínicas indeterminada ou cardíaca da doença de
Chagas, e em indivíduos não infectados pelo T. cruzi, saudáveis, que apresentavam
testes sorológicos negativos (imunofluorescência indireta, ELISA, hemaglutinação ou
Fixação do complemento) bem como ausência de qualquer alteração cardíaca. Os
pacientes avaliados neste trabalho apresentavam idade variando entre 24-66
anos(CONFERIR). Esses pacientes eram provenientes do Centro de Treinamento e
Referência em Doenças Infecciosas e Parasitárias (CTR-DIP) do Hospital das
Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais e
foram acompanhados clinicamente pelo Professor Manoel Otávio da Costa Rocha.
Os pacientes chagásicos foram classificados considerando-se os aspectos clínicos,
radiológicos e eletrocardiográficos, segundo critério sugerido por Rocha et al., 2003.
Para definir a forma clínica indeterminada foram realizados, ainda, esofagograma e
enema opaco.
O critério de exclusão de pacientes neste estudo incluiu presença de
hipertensão arterial, diabetes mellitus ou tolerância reduzida à glicose, disfunção
tireoidiana, insuficiência renal, doenças de obstrução respiratória crônica, desordens
hidroeletrolíticas, história de obstrução coronariana e doença reumática, alcoolismo,
gravidez, anemia e qualquer outra doença sistêmica significativa crônica ou aguda
que pudesse interferir nos resultados dos métodos propostos.
Os detalhes da população estudada estão resumidos na TAB.1. Os pacientes
com doença de Chagas foram classificados da seguinte forma:
POPULAÇÃO ESTUDADA
18
Pacientes com doença de Chagas pertencentes à forma clínica Indeterminada (IND
n=11):
Pacientes com doença de Chagas assintomáticos, sem miocardiopatia aparente,
sem história ou exame físico sugestivo de comprometimento crônico, com apenas
evidências sorológicas da infecção, e os exames de ECG (eletrocardiograma),
Raios-X de Tórax, Raios-X de Esôfago e Enema opaco normais.
Pacientes com doença de Chagas pertencentes à forma clínica Cardíaca (CARD
n=11
Pacientes cardíacos que apresentavam alterações de ECG graves, com
cardiomegalia e/ou sinais de insuficiência cardíaca congestiva.
Todos os indivíduos incluídos nesse estudo foram doadores voluntários. Para
isto foi indispensável o consentimento escrito dos mesmos. O protocolo adotado
nesse trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Federal de Minas
Gerais.
TABELA 1
NÚMERO DE INDIVÍDUOS
GRUPO CLÍNICO SIGLA
Homens Mulheres Total
MEDIANA DA
IDADE/Variação
Não infectados NI 6 5 11 38 (26-59)
Forma clínica
Indeterminada
IND 9 8 17 43 (30-59)
F
orma clínica
Cardíaca
CARD 11 4 15 42 (24-66)
MATERIAL E MÉTODOS
19
4.0 – MATERIAL E MÉTODOS
MATERIAL E MÉTODOS
20
4 - MATERIAL E MÉTODOS
4.1 - Obtenção do antígeno solúvel do parasito da forma epimastigota (EPI) do
T.cruzi
A forma epimastigota do parasito foi cultivada e mantida em meio LIT,
suplementado com 10% de soro fetal bovino. Os parasitos da forma epimastigota
(EPI), pertencentes à cepa CL, foram lavados três vezes em solução salina (PBS
0,15M pH=7,4) por centrifugação, e a massa úmida gelada e degelada três vezes. A
ruptura total dos parasitos se deu por homogeneização em tubos Potter Elvejen a
20000 rpm por 60 segundos. Esse procedimento foi repetido cinco vezes com
intervalos de 30 segundos em banho de gelo. Subsequentemente, as suspensões
foram centrifugadas a 50000 rpm durante 60 minutos a 4
o
C com PBS. O
sobrenadante foi coletado, dialisado por 48 horas a 4
o
C, filtrado em filtro Millipore
0.45µm e mantido em pequenas alíquotas (1mL) a –70
o
C até o uso.
4.2 - Obtenção de células mononucleares do sangue periférico (PBMC)
O sangue dos pacientes que participaram deste estudo foi coletado em tubo
Vacutainer estéril contendo heparina. O sangue total heparinizado foi lentamente
adicionado a uma mistura de Ficoll-Hypaque (LMS, Litton Biogenetics, Savannah,
Georgia, USA), na proporção de 2:1 em tubos de 50 mL e centrifugados a 400g
durante 40 minutos a 20°C em centrífuga refrigerada Beckman, modelo J-
6B(Beckman Instruments Icn., Irvine, USA). Ao final da centrifugação obteve-se um
anel de PBMC entre a mistura de Ficoll-Hypaque e o plasma. O plasma foi retirado,
cuidadosamente, e posteriormente utilizado para os testes de sorologia convencional
MATERIAL E MÉTODOS
21
para a doença de Chagas. As células foram coletadas e transferidas para tubos
cônicos de 50 mL onde foram lavadas 3 vezes por centrifugação 400g por 10
minutos a 4°C em meio de cultura MEM (Minimal Essential Medium). Finalmente, as
células foram ressuspendidas em RPMI, contadas em câmara de Neubauer, e
ajustadas para a concentração desejada de acordo com o ensaio a ser realizado.
Toda a manipulação, com exceção da contagem de células, foi realizada em
condições estéreis em capela de fluxo laminar (BBL-Biological Cabinet, model
60474, Cockeysville, MD ou Veco, modelo VLFS 12 M, Campinas, São Paulo) com
soluções e vidrarias também estéreis previamente siliconizados para evitar
aderência de células à parede dos vidros.
4.3 – Remoção de células aderentes
Partes das células mononucleares obtidas no ensaio acima foram utilizadas
para o ensaio de remoção de macrófagos. Cerca de 1 mL da suspensão de células
(1X10
7
) foi distribuída em 3-4 placas de petri contendo 1mL de meio CMBLAST
(1,6% de L-glutamina, 3% de um coquetel de antibiótico e antimicótico [penicilina,
estreptomicina e anfotericina] e 5% de soro humano normal AB Rh + diluídos em
meio RPMI 1640) e incubadas por 50 minutos em estufas com ar úmido contendo
5% de CO
2
a 37ºC. Após este tempo, as células foram ressuspensas por
movimentos delicados de rotação das placas e transferidos para tubo falcon de
15mL. As placas então eram lavadas três vezes com RPMI a 25°C, juntando os
lavados ao sobrenadante no mesmo tubo falcon de 15mL e centrifugados a 400g por
10 minutos a 4°C. Após a centrifugação, as células foram ressuspensas com RPMI e
MATERIAL E MÉTODOS
22
volume ajustado para concentração de células de 1X10
7
células por mL. O
percentual de remoção dos monócitos foi monitorado por citometria de fluxo. Os
dados do citômetro de fluxo mostraram contaminação entre 15 a 20% de monócitos
na população de células não aderentes (NA),(FIG.1)
FIGURA 1: Análise do percentual de monócitos obtidos antes e após remoção de
células aderentes. A figura representa o perfil de localização de células de acordo
com a emissão de fluorescências FL1 (CD14) em função da granulosidade,
abordagem utilizada para delimitar a população de monócitos (R2) em PBMC (A) e
em células NA, após remoção dos monócitos(B).
R2
B
R2
GRANULOSIDADE
CD14 FITC (FL1)
A
GRANULOSIDADE
CD14 FITC (FL1)
R2
B
R2
GRANULOSIDADE
CD14 FITC (FL1)
A
GRANULOSIDADE
CD14 FITC (FL1)
MATERIAL E MÉTODOS
23
4.4 - Ensaio de proliferação celular
O ensaio de proliferação celular (blastogênese) foi realizado segundo
procedimento descrito por GAZZINELLI et. al.(1983). Em resumo, as PBMC foram
mantidas em meio de cultura CMBLAST. O cultivo foi feito em placas de fundo chato
com 96 poços, onde se acrescentaram a cada poço 150µL de CMBLAST, 25µL de
suspensão de células em RPMI, na concentração de 10
7
células/mL, 25 µL de
preparação antigênica EPI na concentração de 200µg/mL. Paralelamente foi
realizado o ensaio de inibição de prostaglandina (PGE
2
) através da adição de 25 µL
de Indometacina (10
-5
M e 10
-6
M) às culturas de PBMC sem estímulo e com estímulo
antigênico. A Indometacina é um inibidor da via da cicloxigenase, enzima
responsável pela degradação do ácido araquidônico, precursor de vários metabolitos
ecosanóides como as prostaglandinas.
As culturas foram mantidas em incubadora contendo 5% de CO
2
em
atmosfera úmida (Forma Scientific, Marietta, OH, USA) a 37% durante 6 dias. No
sexto dia de cultivo adicionaram-se a cada poço 25 µL de solução de timidina tritiada
(3[H]-timidina) contendo 0,2 µCi, com atividade de 20 Ci/mmol (ICN,
Radiochemicals, Irvine, CA, USA), e as placas de cultura foram, novamente,
incubadas por mais 6 horas. Finalmente, as células foram oletadas em papel de fibra
de vidro (Whatman 934-AH, Whatman INC., Clifton, N.J., USA), com auxílio de um
coletor automático de células (Cell Harvester Brandel, M-24S, USA). O papel de fibra
de vidro contendo as células radioativas foi submetido à secagem em estufa e
colocado em frascos de cintilação líquida, aos quais acrescentaram-se 3,5 mL de
coquetel de cintilação, contendo em cada litro de tolueno: -333mL de Triton X 100
MATERIAL E MÉTODOS
24
(Sigma), - 5g de PPO ( 2,5-difeniloxazole / Fisher Scientific Company, N. J., USA) –
0,1g de POPOP(1,4-bis 2-[5-feniloxazolil]-benzeno] / Fisher).
A radioatividade incorporada foi, inicialmente, determinada em cintilador
Beckman LS6000SC. Cada amostra era contada durante 2 minutos, com os canais
de
3
H e
14
C abertos. Cada experimento era feito em triplicata, acompanhado da
cultura controle, onde se adicionava RPMI em substituição à preparação antigênica.
Os resultados foram expressos em contagens por minuto (cpm) e os dados
analisados após a diminuição do cpm das células não estimuladas (experimental –
controle) E-C = ∆ cpm.
4.5 - Obtenção de sobrenadantes de cultura para detecção dos níveis de
prostaglandina E
2
e de citocinas
Utilizando-se a mesma metodologia para o ensaio de proliferação celular, as
células (10
6
células/poço) foram incubadas em placas de fundo chato de 24 poços,
que continham 800 µL CMBLAST e 100 µL de preparação antigênica EPI. Em
culturas controle acrescentaram-se 100µl de RPMI em substituição ao estímulo
antigênico. As culturas foram mantidas em incubadoras contendo 5% de CO
2
, em
atmosfera úmida a 37
o
C. Os sobrenadantes de cultura foram coletados após 18
horas e estocados imediatamente a -70°C para posterior utilização para dosagem de
prostaglandina E
2
através da técnica de ELISA e para dosagem das citocinas pelo
sistema Cytometric Bead Array (CBA) utilizando o citômetro de fluxo (FACScalibur,
Becton Dickinson, Mountain View, CA).
MATERIAL E MÉTODOS
25
4.6 – Análise do fenótipo celular de leucócitos do sangue periférico
As reações de imunofluorescência para PBMC foram realizadas de acordo
com protocolo sugerido pela Becton Dickinson (San Jose, CA,USA) e adaptado para
placas de 96 poços. Os anticorpos monoclonais utilizados são marcados com
isotiocianato de fluoresceina (FITC) e ficoeritrina (PE) e foram obtidos
comercialmente da Becton Dickinson (Tabela 2). Às placas de 96 poços foram
adicionados 25µL de solução de anticorpo monoclonal específico para o receptor
celular de interesse, marcado com fluorocromo, diluído 1:5 em Tampão FACS (PBS
contendo 1% BSA, pH 7.4). Para cada teste, utilizaram-se 250.000 células por poço
(PBMC ou NA cultura controle e após estimulação antigênica), que foram incubadas
por 20-30 min, ao abrigo da luz, a 4°C. Em seguida, as amostras foram lavadas com
200µL de PBS 0.015 M pH 7.4 por centrifugação (1300rpm, 7min, 4°C) e o
sobrenadante desprezado. As amostras foram então fixadas com 200µlL de solução
fixadora (10g/l de Paraformaldeído, 1% de Cacodilato de Sódio, 6.67g/l de Cloreto
de sódio, pH7.2). Após um período de 30 min a 4°C, transferiu-se as amostras para
tubos de 500µL e os parâmetros fenotípicos das células foram determinados por
citometria de fluxo (FACScan Becton Dickinson).
4.2.6.1 - Aquisição e análise dos dados em Citômetro de Fluxo
O citômetro de fluxo utilizado neste trabalho é equipado com lâmpada de
argônio que permite a avaliação básica de 4 parâmetros: tamanho (FSC) e
granulosidade (SSC), fluorescência do tipo 1 (FL1), fluorescência do tipo 2 (FL2),
fluorescência do tipo 3 (FL3) e fluorescência do tipo 4 (FL4).
MATERIAL E MÉTODOS
26
A identificação de populações celulares de interesse, bem como a
determinação do valor percentual destas populações e sub-populações, foram feitas
através de um sistema de computador e o “software, Cell Quest”, acoplado ao
citômetro. O “Cell Quest” fornece um perfil de células de acordo com o tamanho e
granulosidade. Foram coletados 10.000 eventos para a análise após estimulação in
vitro.
A FIG. 2 representa, de forma esquemática, a determinação do fenótipo celular.
A FIG. 2A mostra a seleção da população de linfócitos baseada em aspectos
morfométricos, através de gráficos de distribuição pontual de tamanho (Dispersão
Frontal - FSC - Forward Scatter) versus granulosidade (Dispersão Lateral - SSC -
Side Scatter). Após seleção da população de interesse, por meio de uma janela
(“gate” R1), a freqüência das subpopulações fluorescentes, dentro da população
selecionada, foi obtida em gráficos bidimensionais de distribuição pontual de
fluorescência 1 (FITC) versus fluorescência 2 (PE). A FIG. 2B ilustra a seleção da
subpopulação de linfócitos B CD19
+
. Os resultados obtidos foram avaliados pelo
Canal Médio de Fluorescênica (CMF).
MATERIAL E MÉTODOS
27
FIGURA 2: Análise de linfócitos do sangue periférico após estimulação in vitro com
antígenos do T. cruzi. (A) representa o perfil celular da população de linfócitos
selecionada no “Gate” R1, em gráfico de tamanho (FSC) versus granulosidade
(SSC). (B) representa o perfil de análise da população de linfócitos B CD19
+
,
expressando CD86 em gráfico de fluorescência 1 (CD19-FITC) versus fluorescência
2 (CD86-PE).
Para garantirmos uma seleção segura para a população de monócitos foi
construído um gráfico de FL1 para o marcador CD14 em função da granulosidade
(FIG.3A). A população analisada apresenta granulosidade intermediária e fortemente
positiva para este fenótipo celular, sendo delimitada por um marcador (R2). Através
desta abordagem pode-se obter uma população homogênea e bem definida das
demais, não só facilitando a seleção da população de interesse, como também
garantindo a sua identificação de forma segura e padronizada. Após a seleção da
janela de interesse (R2) analisou-se a intensidade de fluorescência apresentada
pelas células presentes nesta janela, utilizando-se de gráficos de FL1 versus FL2
(FIG.3B).
R1
TAMANHO
GRANULOSIDADE
A
R1
TAMANHO
GRANULOSIDADE
A
B
CD86 PE
CD19 FITC
B
CD86 PE
CD19 FITC
MATERIAL E MÉTODOS
28
FIGURA 3 : Análise de monócitos do sangue periférico após estimulação in vitro
com antígenos do T. cruz. (A) representa o perfil celular da população de monócitos
selecionada no “gate” R2,. (B) representa o perfil de análise da população de
monócitos CD14
+
expressando CD86, em gráfico de fluorescência 1 (CD14-FITC)
versus fluorescência 2 (CD86).
TABELA 2
Relação dos anticorpos utilizados para análise do fenótipo dos leucócitos do
sangue periférico
Marcador*
Clone
Concentração
Atividade
†
CD19-FITC 4G7
0,5µg
Expresso em linf
ócitos B; transdução de
sinal.
CD14-FITC
M0P9
0,5µg
Identificação de células mielóides como
monócitos e macrófagos; receptor para o
complexo de LPS e LBP.
HLA-DR-PE
G466
0,5µg
Molécula do Complexo de MHC de classe
II expressa na superfície de células
humanas.
CD80-PE
L307.4
0,5µg
Co-estímulo para ativação e proliferação
de células T.
CD86-PE
2331
FUN-1
0,5µg
Co-estímulo para ativação e proliferação
de células T.
*Anticorpos marca Becton Dickinson (BD), E.U.A.
†
8th HLDA International Workshop (2004)
CD14 FITC
CD86 PE
B
CD14 FITC
CD86 PE
B
R2
GRANULOSIDADE
CD14 FITC (FL1)
A
R2
GRANULOSIDADE
CD14 FITC (FL1)
A
MATERIAL E MÉTODOS
29
4.7 - Avaliação do padrão de citocinas nos sobrenadante de cultura de PBMC e
células NA após estimulação in vitro
Os níveis de citocinas dos sobrenadantes de cultura estimuladas foram
quantificados utilizando-se o sistema Cytometric Bead Array (CBA), Becton
Dickinson, seguindo a metodologia sugerida pelo fabricante. Esta técnica emprega
uma mistura de 6 esferas de poliestireno, de intensidades de fluorescência distintas,
recobertas com anticorpos específicos para as citocinas humanas detectadas no
canal de FL3. A utilização de uma mistura de esferas permite a avaliação simultânea
de diversas citocinas de interesse no mesmo ensaio, empregando pequenos
volumes de amostra.
Desta forma, 50µl da mistura de esferas de captura, marcadas com anticorpos
monoclonais anti IFN-γ, IL-2, IL-4 e IL-10 foram transferidas para tubos de 12x75mm
destinados ao controle negativo e às amostras a serem testadas. Em seguida, 50µL
do diluente G e das amostras de sobrenadantes a serem testadas foram adicionados
aos seus respectivos tubos. As misturas foram incubadas por 90 minutos, à
temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Após a incubação, as esferas de captura
foram lavadas com 1mL da solução tampão (PBS) e centrifugadas a 200g, por 5
minutos. Cuidadosamente, o sobrenadante foi aspirado e descartado, restando
aproximadamente 100µl em cada tubo. As esferas de captura foram então
incubadas por 90 minutos, ao abrigo da luz, com um coquetel de anticorpos
monoclonais humanos marcados com PE (Human Inflammation PE Detection
Reagent). Após a incubação, as esferas foram novamente lavadas com 1ml de
tampão e centrifugadas a 200g por 5 minutos. Cuidadosamente, o sobrenadante foi
aspirado e descartado, restando aproximadamente 100µl em cada tubo, onde foram
adicionados 300µl de solução tampão para ressuspender as esferas e posterior
leitura das amostras no citômetro de fluxo.
Para aquisição dos dados das amostras, o aparelho foi ajustado utilizando o
BD FACSComp Software e o BD Calibrate Beads. O objetivo do ajuste do aparelho
consiste em definir os parâmetros de tamanho e granulosidade adequados para o
posicionamento das esferas de captura em gráficos de tamanho versus
granulosidade. Após a seleção das esferas, procedeu-se o ajuste da intensidade da
FL3 para permitir a segregação das esferas policromáticas, apresentando diferentes
MATERIAL E MÉTODOS
30
intensidades de fluorescência, em histogramas unidimensionais. Para cada tubo
processado foram adquiridos 1800 eventos dentro da região selecionada R1 (300
eventos por citocina testada).
A análise do perfil de citocinas do Tipo 1 (IL-2, IFN-γ ) e do Tipo 2 (IL-10 e IL-
4) nos sobrenadantes de cultura foi realizada segundo protocolo proposto pelo
fabricante através da utilização do BD CBA Analyses Software, com auxílio do
Microsoft Excel, modificado como descrito a seguir. O programa BD CBA Analysis
Software faz a seleção automática da região das esferas de captura em gráficos de
tamanho versus granulosidade (FIG.4A). Em seguida, o programa separa as esferas
em função da intensidade da FL3 e analisa o deslocamento das esferas em função
da intensidade da fluorescência 2 (FL2) em gráficos bidimensionais de FL2 versus
FL3).( FIG 4B e C). A ligação da citocina presente na amostra de interesse à esfera
de captura e a revelação da ligação através do uso de um coquetel de anticorpos
monoclonais anti-citocinas humanas marcadas com ficoeritrina (PE) pode ser
evidenciado através do deslocamento do conjunto de esferas para a região de maior
intensidade de fluorescência em relação ao tubo controle negativo, sem amostra
(FIG.4 B e C). Os valores correspondentes à intensidade média de fluorescência FL2
na escala logarítmica foram utilizados como a unidade de análise semi-quantitativa
para cada citocina analisada.
FIGURA 4: Análise quantitativa de citocinas de sobrenadante de cultura utilizado
pelo BD CBA Analyses Software. Inicialmente, o programa promove a seleção
automática da população de esferas de captura em gráficos de tamanho versus
granulosidade (A). Em seguida, separa as esferas e analisa da intensidade de
fluorescência correspondente ao complexo esfera-citocina-anticorpo PE(B e C).
GRANULOSIDADE
IFN-γ
γγ
γ
IL-5
IL-10
IL-2
TNF-α
αα
α
IL-4
FL3
TAMANHO
FL2
Amostra Negativa Amostra Positiva
A CB
GRANULOSIDADE
IFN-γ
γγ
γ
IL-5
IL-10
IL-2
TNF-α
αα
α
IL-4
IFN-γ
γγ
γ
IL-5
IL-10
IL-2
TNF-α
αα
α
IL-4
FL3
TAMANHO
FL2
Amostra Negativa Amostra Positiva
A CB
MATERIAL E MÉTODOS
31
4.8 - Quantificação dos níveis de Prostaglandina E2 nos sobrenadantes de
cultura
A quantificação de prostaglandina E2 (PGE2) secretada por macrófagos, após
estimulação por antígenos do T. cruzi foi realizada empregando-se o KIT de ELISA -
Prostaglandin E
2
Biotrak Enzymeimmunoassay (EIA) Systen –
RPN22210(Amersham Biosciences). Em microplacas de ELISA de fundo chato
(Amersham Biosciences) de 96 poços foram adicionados 50 µL de tampão de ensaio
diluído (Amersham Biosciences), 50 µL das amostras de sobrenadante de cultura e
50µL de anticorpo de cabra anti-mouse (Amersham Biosciences). As placas foram
incubadas por três horas em geladeira (2-8ºC). Em seguida, 50µL de anticorpo anti-
PGE
2
conjugado com peroxidase (Amersham Biosciences) foram adicionados e por
as placas foram incubadas por 1 hora em geladeira (2-8ºC). Após este tempo, os
poços foram aspirados e lavados por 4 vezes com tampão de lavagem (Amersham
Biosciences) Em seguida adicionaram-se 150µL de substrato Tetramethylbenzidine
(TMB) por 30 minutos à temperatura ambiente, sob agitação. A reação enzimática foi
bloqueada pela adição de solução de ácido sulfúrico (1M) e a densidade óptica
medida em leitor de ELISA automático utilizando-se um filtro de 450nm. A
sensibilidade é de 1 – 32pg/poço, ou seja, 20 – 640pg/mL. Os dados obtidos na
leitura foram então processados através do programa Soft Max para o cálculo da
concentração de PGE
2
em pG/mL nos sobrenadantes testados.
MATERIAL E MÉTODOS
32
4.9. Análise estatística
A análise estatística dos dados de perfil celular, freqüência de marcadores
celulares e de produção de citocinas foi realizada através do software GraphPad
PRISM 3.03 (E.U.A.).
Para comparação de dois grupos de amostras foi utilizado o Teste t de “Student”,
para dados paramétricos, e o teste de Mann-Whitney, para dados não
paramétricos.
Na comparação entre três grupos, a avaliação para determinação de dados
paramétricos ou não paramétricos foi realizada utilizando-se o programa
estatístico Making Data Analysis Easier MINITAB 13.20 (E.U.A.). Os testes
estatísticos foram realizados utilizando-se o software GraphPad PRISM 3.0
(E.U.A.). A análise de variância (ANOVA), seguida pela análise de comparações
múltiplas pelo teste de Tukey, foi feita para dados paramétricos. O teste de
Kruskal-Wallis, seguido pela análise de comparações múltiplas pelo teste de
Dunns foi realizado para dados não paramétricos. As diferenças foram
consideradas estatisticamente significativas quando p<0,05 (95% de confiança).
RESULTADOS
33
5.0 - RESULTADOS
RESULTADOS
34
5.1 Ensaio de proliferação de PBMC e de células NA, estimuladas com
antígeno de T.cruzi
Para avaliar a proliferação de PBMC e de células NA de indivíduos não
infectados (NI) pelo T cruzi e de pacientes com as formas IND e CARD da doença
de Chagas, essas células foram cultivadas in vitro na presença e ausência de
homogenato antigênico de formas epimastigotas do T. cruzi (EPI).
Observou-se que as PBMC dos pacientes dos grupos IND e CARD
apresentaram resposta de proliferação celular significativamente maior (p< 0,05), em
comparação aos indivíduos do grupo NI. No entanto, nenhuma diferença significativa
foi encontrada na resposta proliferativa entre as células dos pacientes dos grupos
IND e CARD (FIG.5A). Já no ensaio de proliferação de células NA observou-se nível
mais alto de incorporação de
3
[H]-Timidina pelas células do grupo NI, fazendo com
que não houvesse mais significância dos resultados entre os grupos (FIG.5B).
Considerando-se que a molécula reguladora dessa proliferação celular inespecífica
pudesse ser a PGE2, seguiu-se para o ensaio de inibição da produção deste
mediador lipídico.
RESULTADOS
35
FIGURA 5. Proliferação celular de PBMC e células NA de indivíduos do grupo NI ( )
e de pacientes do grupo IND ( ) e CARD ( ). Os resultados estão representados
por ∆ cpm (contagem de células por minuto (cpm) da cultura de células com
estímulo (E) menos cultura de células sem estímulo (C).Os resultados são expressos
como dispersão dos valores individuais (sinais) e mediana (barras). A letra a
representa as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) relacionadas ao
grupo de pacientes NI.
NA
0
50000
100000
150000
NI IND CARD
B
E - C
(
∆
cpm)
PBMC
0
50000
100000
150000
NI IND CARD
A
a
a
E - C
(
∆
cpm)
RESULTADOS
36
5.2 Ensaio de proliferação de PBMC, estimuladas com antígeno de T.cruzi, na
presença de indometacina
Procedeu-se então ao ensaio de proliferação de células de indivíduos dos
grupos NI, IND e CARD, estimuladas com EPI, na presença e ausência de
indometacina,nas concentrações 10
-5
M e 10
-6
M (INDO 5 e INDO6, respectivamente),
como descrito na metodologia.
Verificou-se não haver diferença estatisticamente significativa entre a
proliferação celular dos indivíduos dos grupos NI, IND e CARD. Entretanto, no grupo
IND, observou-se dois perfis de proliferação: células com baixa capacidade
proliferativa (< 50000 ∆ cpm), oriundas de pacientes denominados baixos
respondedores (BR), tanto na cultura com INDO5, quanto na concentração de
INDO6, e células com maior capacidade de proliferação (> 50000 ∆ cpm), oriundas
de pacientes, denominados altos respondedores (AR) - (FIG. 6A e 3B).
Os pacientes do grupo IND foram, então, separados em dois subgrupos para
uma nova avaliação estatística (Fig 6C e 6D). Neste caso, observou-se diferença
significativa (p<0,05) do subgrupo IND BR, quando comparado com o grupo CARD,
e do subgrupo IND AR, quando comparado com o grupo NI. Os dados foram
reprodutíveis nas culturas adicionadas de INDO5 e de INDO6. Mostrou-se, assim,
que o bloqueio da produção de PGE2 pôde evidenciar capacidades distintas de
proliferação celular de pacientes do grupo IND.
Considerando a resposta de proliferação como conseqüência da ativação
celular, induzida pelo estímulo antigênico, passou-se à análise de moléculas HLA
DR, responsáveis pela apresentação de antígeno.
RESULTADOS
37
FIGURA 6. Proliferação celular de PBMC de indivíduos do grupo NI ( ) e de
pacientes do grupo IND ( ), subgrupo IND BR ( ) e IND AR ( ) e do grupo CARD (
), na presença de Indometacina. Em 2A e 2B antes de separar o grupo IND em dois
perfis e em 2C e 2D após separação do grupo IND em dois perfis. Os resultados
estão representados por ∆ cpm, contagem de células por minuto (cpm) da cultura de
células com estímulo (E) menos cultura de células sem estímulo (C). Os resultados
são expressos como dispersão dos valores individuais (sinais) e medianas (barras).
As letras a e d representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05)
relacionadas ao grupo de pacientes NI e CARD respectivamente.
INDO 6
0
50000
100000
150000
NI IND CARD
B
E - C
(
∆
cpm)
INDO 5
0
50000
100000
150000
NI IND CARD
A
E - C
(
∆
cpm)
INDO 5
0
50000
100000
150000
NI IND BR IND AR CARD
a
d
C
E - C
(
∆
cpm)
INDO 6
0
50000
100000
150000
NI IND BR IND AR CARD
a
d
D
E - C
(
∆
cpm)
RESULTADOS
38
5.3 Avaliação da expressão de HLA-DR nas populações de monócitos em
cultura de PBMC e células NA
Para verificar a ativação de monócitos em PBMC de indivíduos do grupo NI e
pacientes dos grupos IND e CARD, as células foram cultivadas na presença e
ausência de EPI. Avaliou-se a expressão do marcador HLA-DR em células CD14+,
através do canal médio de fluorescência (CMF).
Observou-se que independentemente de os monócitos estarem presentes na
população de PBMC ou remanescentes na população de células NA,
antigenicamente não estimuladas (C), ou estimuladas por EPI, não houve diferença
significante na expressão de HLA-DR na superfície das células CD14
+
. Esse achado
sugere que o estímulo antigênico não foi capaz de aumentar a capacidade de
apresentação de antígeno dos monócitos, para interação com LT, na resposta
secundária dos pacientes com doença de Chagas dos grupos IND ou CARD, em
relação às células dos indivíduos NI (FIG. 7) .
RESULTADOS
39
FIGURA 7. Expressão de HLA-DR, por CMF, na população de monócitos em
culturas controle (C) e estimuladas (E) de PBMC e células NA dos grupos NI cultura
sem estímulo ( ) e cultura com estímulo ( ), IND cultura sem estímulo ( ) e cultura
com estímulo ( ) e CARD cultura sem estímulo ( ) e cultura com estímulo ( ). Os
resultados estão expressos como dispersão dos valores individuais (sinais) e
medianas (barras).
5.4 Avaliação da expressão das moléculas CD80 e CD86 na população de
monócitos em cultura de PBMC e NA
Para confirmar a ausência da ativação de monócitos para a função APC,
avaliou-se a expressão do marcador CD80 em culturas de PBMC e NA controle
(RPMI) e estimuladas com EPI de indivíduos do grupo NI e pacientes do grupo IND e
CARD.
Realizou-se avaliação dos marcadores CD80 e CD86 através de canal
médio de fluorescência (CMF). Verificou-se não existir diferença significativa na
expressão das moléculas CD80 ou CD86 em monócitos das culturas de PBMC e NA
estimuladas ou não com antígenos do T. cruzi, quando compararam-se os grupos
IND e CARD com os indivíduos do grupo NI (Fig 8 e 9).
NA
40
70
100
C E C E C E
NI IND CARD
% Expressão de HLA DR
em monócitos
B
PBMC
40
70
100
C E C E C E
NI IND CARD
% Expressão de HLA DR
em monócitos
A
RESULTADOS
40
FIGURA 8. Expressão de CD80, por CMF, na população de monócitos em culturas
controle (C) e estimuladas (E) de PBMC e células NA dos grupos: NI cultura sem
estímulo ( ) e cultura com estímulo ( ), IND cultura sem estímulo ( ) e cultura com
estímulo ( ) e CARD cultura sem estímulo ( ) e cultura com estímulo ( ). Os
resultados estão expressos como dispersão dos valores individuais (sinais) e
medianas (barras).
FIGURA 9. Expressão de CD86, por CMF, na população de monócitos em culturas
controle (C) e estimuladas (E) de PBMC e NA e células NA dos grupos: NI cultura
sem estímulo ( ) e cultura com estímulo ( ), IND cultura sem estímulo ( ) e cultura
com estímulo ( ) e CARD cultura sem estímulo ( ) e cultura com estímulo ( ). Os
resultados estão expressos como dispersão dos valores individuais (sinais) e
medianas (barras).
PBMC
40
70
100
C E C E C E
NI IND CARD
A
% Expressão de CD 86
em monócitos
NA
40
70
100
C E C E C E
NI IND CARD
B
% Expressão de CD 80
em monócitos
PBMC
40
70
100
C E C E C E
NI IND CARD
% Expressão de CD 80
em monócitos
A
NA
40
70
100
C E C E C E
NI IND CARD
B
% Expressão de CD 80
em monócitos
RESULTADOS
41
Para confirmar, então, que monócitos/macrófagos funcionam como células
reguladoras da resposta proliferativa, e que a PGE2 está presente neste processo,
tornou-se necessária a avaliação deste mediador nas culturas.
5.5 - Dosagem de PGE2 em sobrenadantes de culturas de PBMC e de células
NA
Para verificar a quantidade de PGE2 produzida após estimulação in vitro por
antígenos do T. cruzi, utilizou-se a técnica de ELISA, como descrito na metodologia.
Os sobrenadantes de cultura de PBMC e de células NA dos
indivíduos/pacientes dos grupos NI, IND e CARD foram removidos após 18 horas da
estimulação in vitro por antígenos do T. cruzi.
Embora se percebesse uma diminuição da produção de PGE2 na população
de células NA, não houve diferença estatística entre os níveis de PGE2 nos
sobrenadantes das culturas de PBMC ou de células NA, sem estímulo ou
estimuladas por EPI nos grupos NI, IND e CARD (FIG. 10). Os dados sugerem que a
produção de PGE2 está associada à presença de monócitos na cultura, reforçando o
papel desta célula como imunorreguladora.
RESULTADOS
42
FIGURA 10. Dosagem de PGE2 (pg/mL) em sobrenadante de culturas controle (C) e
estimuladas (E) de PBMC e células NA dos grupos: NI cultura sem estímulo ( ) e
cultura com estímulo ( ), IND cultura sem estímulo ( ) e cultura com estímulo ( ) e
CARD cultura sem estímulo ( ) e cultura com estímulo ( ). Os resultados estão
expressos como dispersão dos valores individuais (sinais) e medianas (barras).
5.6 - Avaliação da expressão de HLA-DR na população de linfócitos B CD19
+
em cultura de PBMC e células NA
Para verificar a capacidade dos linfócitos B atuarem como APC nas
populações de PBMC e de células NA de pacientes dos grupos IND e CARD,
comparadas às do grupo NI, as células foram cultivadas in vitro na presença e
ausência de EPI, avaliando-se a expressão da molécula HLA-DR na superfície dos
linfócitos B CD19+, através do canal médio de fluorescência (CMF).
N I
0
1000
2000
3000
4000
C E C E
PBMC NA
pG/mLPGE2
IND
0
1000
2000
3000
4000
C E C E
PBMC NA
pG/mLPGE2
CARD
0
1000
2000
3000
4000
C E C E
PBMC NA
pG/mLPGE2
RESULTADOS
43
Observou-se que nas culturas de PBMC, estimuladas por EPI, não houve
diferença significante da expressão de HLA-DR nos linfócitos B CD19+, quando
comparada às culturas sem estímulo dos grupos NI, IND e CARD (FIG. 11A e B).
No entanto, a expressão de HLA-DR em linfócitos CD19+ nas culturas de
células NA, estimuladas por EPI, aumentou significantemente quando comparada às
culturas sem estímulo, tanto no grupo NI como nos grupos IND e CARD. (FIG. 11 A
e B), indicando o aumento da capacidade dos linfócitos B atuarem como APC na
ausência de monócitos/macrófagos.
FIGURA 11. Expressão de HLA-DR, por CMF, na população de linfócitos B em
culturas controle (C) e estimuladas (E) de PBMC e células NA dos grupos: NI
cultura sem estímulo ( ) e cultura com estímulo ( ), IND cultura sem estímulo ( ) e
cultura com estímulo ( ) e CARD cultura sem estímulo ( ) e cultura com estímulo
( ). Os resultados estão expressos como dispersão dos valores individuais (sinais) e
medianas (barras). As letras a, c e e representam as diferenças estatisticamente
significativas (p<0,05) da cultura com estímulo em relação a cultura sem estímulo
dos grupos NI, IND e CARD respectivamente.
NA
40
70
100
C E C E C E
NI IND CARD
a
e
c
% Expressão de HLA-DR
em linfócitos B
B
PBMC
40
70
100
C E C E C E
NI IND CARD
% Expressão de HLA-DR
em linfócitos B
A
RESULTADOS
44
5.7 Avaliação da expressão de moléculas CD80 e CD86 na população de
linfócitos CD19+, em culturas de PBMC e de células NA
Considerando, então, que houve ativação do linfócito B através da
verificação do aumento da expressão de HLA-DR na população de células NA,
decidiu-se avaliar a expressão das moléculas de co-estimulação CD80 e CD86 em
células CD19+, tanto na população de PBMC como na de células NA de
indivíduos/pacientes dos grupos NI, IND e CARD, cultivadas in vitro na presença e
na ausência de EPI. Realizou-se avaliação dos marcadores CD80 e CD86 através
de canal médio de fluorescência (CMF).
Não houve diferença significativa na expressão de CD80 nos linfócitos B
CD19+ na cultura de PBMC estimulada com EPI, quando comparada aos linfócitos B
CD19+ na cultura de PBMC sem estímulo dos grupos NI, IND e CARD (FIG. 12A).
No entanto, observou-se aumento significativo na expressão de CD80 nos linfócitos
B CD19+ na cultura de células NA após estímulo in vitro por EPI, quando comparada
à cultura sem estímulo dos grupos NI, IND e CARD (FIG. 12B). A análise da
expressão da molécula CD86
nos linfócitos B CD19
+
mostrou não haver qualquer
alteração tanto na população de PBMC (FIG.13A) como na de células NA (FIG.13B).
RESULTADOS
45
FIGURA 12. Expressão de CD80, por CMF, na população de linfócitos B em culturas
controle (C) e estimuladas (E) de PBMC e células NA dos grupos: NI cultura sem
estímulo ( ) e cultura com estímulo ( ), IND cultura sem estímulo ( ) e cultura com
estímulo ( ) e CARD cultura sem estímulo ( ) e cultura com estímulo ( ). Os
resultados estão expressos como dispersão dos valores individuais (sinais) e
medianas (barras). As letras a, c e e representam as diferenças estatisticamente
significativas (p<0,05) da cultura com estímulo em relação a cultura sem estímulo
dos grupos NI, IND e CARD respectivamente.
FIGURA 13. Expressão de CD86, por CMF, na população de linfócitos B em culturas
controle (C) e estimuladas (E) de PBMC e células NA de indivíduos dos grupos: NI
cultura sem estímulo ( ) e cultura com estímulo ( ) , IND cultura sem estímulo ( ) e
cultura com estímulo ( ) e CARD cultura sem estímulo ( ) e cultura com estímulo
( ). Os resultados estão expressos como dispersão dos valores individuais (sinais) e
medianas (barras).
NA
40
70
100
C E C E C E
NI IND CARD
a
e
c
% Expressão de CD 80
em linfócitos B
B
PBMC
40
70
100
C E C E C E
NI IND CARD
% Expressão de CD 80
em linfócitos B
A
PBMC
40
70
100
C E C E C E
NI IND CARD
% Expressão de CD 86
em linfócitos B
A
NA
40
70
100
C E C E C E
NI IND CARD
% Expressão de CD 86
em linfócitos B
B
RESULTADOS
46
Considerando o importante papel que as citocinas exercem no sistema imune,
atuando como moléculas reguladoras do desenvolvimento e do comportamento das
células efetoras da resposta imune, o passo seguinte foi quantificar e avaliar estas
citocinas nas populações de PBMC e de células NA após 18 horas de estimulação in
vitro por EPI de indivíduos/pacientes dos grupos NI, IND e CARD.
5.8 Avaliação do padrão de citocinas produzidas nos sobrenadantes das
culturas de PBMC e de células NA
IL-2
Observou-se aumento significativo de IL-2 na cultura de PBMC com estímulo
antigênico, em relação à cultura sem estímulo nos grupos IND e CARD (FIG. 14A).
Já no sobrenadante de células NA, houve aumento de IL-2 somente nas células
estimuladas do grupo IND (FIG.14B).
FIGURA 14. Dosagem de IL-2 (pg/mL) em sobrenadante de culturas controle (C) e
estimuladas (E) de PBMC e células NA dos grupos: NI cultura sem estímulo ( ) e
cultura com estímulo ( ), IND cultura sem estímulo ( ) e cultura com estímulo ( ) e
CARD cultura sem estímulo ( ) e cultura com estímulo ( ). Os resultados são
expressos como dispersão dos valores individuais (sinais) e medianas (barras). As
letras c e e representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) da
cultura de PBMC ou NA com estímulo em relação à cultura de PBMC ou NA sem
estímulo dos grupos IND e CARD respectivamente.
NA
0
10
20
30
C E C E C E
NI IND CARD
c
B
IL-2 pG/mL
PBMC
0
10
20
30
C E C E C E
NI IND CARD
c
e
A
IL-2 pG/mL
RESULTADOS
47
IL- 4
Verificou-se aumento na produção de IL-4 nas culturas de PBMC e de células
NA estimuladas com EPI, quando comparada à de culturas sem estímulo dos grupos
NI, IND e CARD (FIG 15 A e B).
FIGURA 15. Dosagem de IL-4(pg/mL) em sobrenadante de culturas controle (C) e
estimuladas (E) de PBMC e células NA dos grupos: NI cultura sem estímulo ( ) e
cultura com estímulo ( ), IND cultura sem estímulo ( ) e cultura com estímulo ( ) e
CARD cultura sem estímulo ( ) e cultura com estímulo ( ). Os resultados são
expressos como dispersão dos valores individuais (sinais) e medianas (barras). As
letras a, c e e representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) da
cultura de PBMC ou NA com estímulo em relação à cultura de PBMC ou NA sem
estímulo dos grupos NI, IND e CARD respectivamente.
PBMC
0
25
50
75
100
C E C E C E
NI IND CARD
c
e
a
A
IL-4 pG/mL
NA
0
25
50
75
100
C E C E C E
NI IND CARD
c
e
a
B
IL-4 pG/mL
RESULTADOS
48
IFN-γ
γγ
γ
Observou-se aumento significativo de IFN-γ no sobrenadante de culturas de
PBMC estimuladas, dos grupos IND e CARD, em relação aos indivíduos do grupo
NI. Houve também aumento na produção dessa citocina nas culturas de PBMC
estimuladas, em relação às não estimuladas (FIG.16 A).
No entanto, nas culturas de células NA, não se observou qualquer diferença
estatisticamente significativa (FIG.16 B).
FIGURA 16. Dosagem de IFN-γ (pg/mL) em sobrenadante de culturas controle (C)
e estimuladas (E) de PBMC e células NA dos grupos: NI cultura sem estímulo ( ) e
cultura com estímulo ( ), IND cultura sem estímulo ( ) e cultura com estímulo ( ) e
CARD cultura sem estímulo ( ) e cultura com estímulo ( ). Os resultados são
expressos como dispersão dos valores individuais (sinais) e medianas (barras). A
letra b representam a diferença estatisticamente significativas (p<0,05) da cultura
com estímulo do grupo IND em relação a cultura com estímulo do grupo NI e as
letras c e e representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) da
cultura com estímulo em relação a cultura sem estímulo dos grupos IND e CARD
respectivamente.
PBMC
0
1000
2000
3000
C E C E C E
NI IND CARD
b,c
e
A
IFN-
γ
pG/mL
NA
0
1000
2000
C E C E C E
NI IND CARD
B
IFN-
γ
pG/mL
RESULTADOS
49
IL-10
Observou-se aumento significativo de IL-10 nas culturas de PBMC e de
células NA com estímulo, em relação às culturas sem estímulo dos grupos NI, IND e
CARD. Observou-se também que, nas culturas estimuladas de pacientes do grupo
IND, a quantidade de IL-10 no sobrenadante de PBMC foi estatisticamente maior,
comparada à cultura de células NA (FIG. 17A e 17B).
FIGURA 17. Dosagem de IL-10 (pg/mL) em sobrenadante de culturas controle (C) e
estimuladas (E) de PBMC e células NA dos grupos: NI cultura sem estímulo ( ) e
cultura com estímulo ( ), IND cultura sem estímulo ( ) e cultura com estímulo ( ) e
CARD cultura sem estímulo ( ) e cultura com estímulo ( ). Os resultados são
expressos como dispersão dos valores individuais (sinais) e medianas (barras). As
letras a, c e e representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) da
cultura de PBMC ou NA com estímulo em relação à cultura de PBMC ou NA sem
estímulo dos grupos NI, IND e CARD respectivamente. O asterisco (*) representa a
diferença estatisticamente significativa da cultura de PBMC com estímulo em a
relação à cultura de NA com estímulo do grupo IND.
NA
0
25
50
75
C E C E C E
NI IND CARD
a
e
c
B
IL-10 pG/mL
PBMC
0
25
50
75
C E C E C E
NI IND CARD
a
e
c
*
A
IL-10 pG/mL
RESULTADOS
50
5.9 - Resumo dos Resultados
- A proliferação de PBMC, estimuladas por EPI, foi significantemente maior nos
grupos IND e CARD em comparação ao grupo NI.
- A indometacina adicionada às culturas de PBMC facilitou a distinção de dois
subgrupos no grupo IND: o primeiro, denominado IND AR, com resposta proliferativa
significativamente maior do que o segundo subgrupo, IND BR.
- O nível de proliferação celular do subgrupo IND AR foi semelhante ao do CARD,
enquanto que a do subgrupo BR foi semelhante ao do subgrupo NI
- Células CD14+ de culturas de PBMC e de células NA, na presença ou na ausência
de EPI, não mostraram alteração da intensidade média de fluorescência para as
moléculas HLADR, CD80 e CD86.
- Linfócitos CD19
+
de culturas de células NA, estimuladas por EPI,
nos grupos NI,
IND e CARD mostraram maior intensidade de expressão das moléculas HLA-DR e
CD80 em relação às culturas não estimuladas.
- Os níveis de citocinas mostraram-se aumentados nos sobrenadantes de culturas
estimuladas com EPI
DISCUSSÃO
51
6.0 - DISCUSSÃO
DISCUSSÃO
52
O estudo dos mecanismos imunológicos envolvidos no curso da doença de
Chagas é de fundamental importância para o entendimento das diferentes e
complexas manifestações clínicas associadas à doença. A interação parasito-
hospedeiro leva à ativação e regulação da resposta imune, na qual a reação do
hospedeiro é dependente de vários fatores, dentre eles, a genética, o estado
nutricional, o meio ambiente, etc. No que diz respeito ao parasito, a variabilidade
molecular das cepas infectantes é crucial para o reconhecimento inicial dos padrões
moleculares pelas células da imunidade inata do hospedeiro (Andrade, 1991;
Andrade et al., 2002).
Esses fatores, em conjunto, podem determinar o sentido do desenvolvimento
das formas clínicas na fase crônica. Acredita-se que o sistema imunológico exerça
papel importante na evolução das lesões teciduais, induzidas pelo parasito, através
da intensa resposta imune observada em modelo experimental, principalmente na
fase aguda da doença (Andrade e Magalhães, 1996; Tarleton, 2001; Soares et al.,
2001, Campos e Gazzinelli, 2004). Desta forma, têm-se demonstrado, em estudos
multidisciplinares, alterações funcionais de componentes do sistema imune do
hospedeiro, relacionando-os à evolução da fase crônica (Brener e Gazzinelli, 1997,
Gomes,et. al., 2003; Dutra et. al., 2005; Talvani et al., 2004;.Higuchi et al., 1997,
Souza et al. 2004; 2007).
A indução de uma eficiente resposta imune é diretamente dependente da
ativação apropriada de APCs, uma vez que o estímulo de células T requer uma
interação entre seus receptores (TCR, CD3 e CD4/CD8) e o complexo MHC-
peptídeo. Neste contexto, o estudo funcional de monócitos/macrófagos tem sido alvo
de investigações tanto na resposta imune inicial, através de captação de antígenos,
via receptores tipo Toll, bem como através da produção de citocinas e
DISCUSSÃO
53
prostaglandinas e da expressão de moléculas reguladoras, envolvidas nos
processos imunopatológicos da doença de Chagas (Borges et. al., 1998; Campos et
al., 2001; Muzio et. al., 2000, Takahashi, et. al., 2005; Kuroda e Yamashita, 2003;
Alegre et al., 2001, Souza et al. 2004, 2007; Campos e Gazzinelli, 2004).
No presente trabalho, monócitos/macrófagos estimulados in vitro com
antígenos derivados do T. cruzi foram avaliados como células indutoras da resposta
imune através de seus marcadores de apresentação de antígenos bem como células
reguladoras de mecanismos imunológicos que envolvem também células e
moléculas da imunidade adaptativa.
A reatividade in vitro aos antígenos do T. cruzi é dependente, por um lado, da
apresentação de antígenos por monócitos/macrófagos ou por linfócitos B e, por
outro lado, da proliferação de linfócitos. As análises da resposta celular a antígenos
de epimastigota do T. cruzi mostraram que a proliferação de PBMC de pacientes
com doença de Chagas foi significativamente maior do que a dos indivíduos NI (FIG.
5A). Entretanto, nenhuma diferença significativa foi observada entre as culturas de
células de pacientes das formas clínicas IND ou CARD (FIG 5B), indicando que
estes pacientes respondem rapidamente ao estímulo antigênico, via linfócitos de
memória, responsáveis pela resposta secundária. Todavia, trabalhos anteriores que
também utilizaram extratos brutos do parasito não estabeleceram correlação
significativa entre o grau de resposta de proliferação celular induzida in vitro por
antígenos do T. cruzi e a forma clínica da doença de Chagas (Mosca et al., 1979;
Gusmão et al., 1984; De Titto et al., 1985; Morato et al., 1986; Dutra et al., 1996;
Pinge-Filho,1999, Gomes et al., 2003). Além desses estudos, outros investigadores
avaliaram a resposta imune a antígenos isolados e/ou recombinantes do T. cruzi.
Neste contexto, proteínas derivadas do T. cruzi como B13, proteína que apresenta
DISCUSSÃO
54
reatividade cruzada à miosina cardíaca (Abel et al., 1997), a trans-sialidase (Ribeirão
et al., 2000) e a cruzipaína (Arnholdt et al., 1993) apesar de induzirem in vitro
reatividade de células de pacientes com doença de Chagas, também não
demonstraram diferenças significativas entre as formas clínicas.
Com o objetivo de avaliar a participação de monócitos/macrófagos como
APC, a reatividade in vitro aos antígenos de EPI foi conduzida em paralelo com
células NA, empobrecidas dessas células mononucleares (FIG.5B). A população de
células NA estimuladas in vitro com EPI mostrou aumento significativo da
proliferação celular nos indivíduos NI, quando comparado com o nível de
proliferação de PBMC (FIG 5A). O aumento de proliferação da população NA em
indivíduos NI sugere a existência de mecanismos reguladores da homeostasia
fisiológica na população de PBMC, uma vez que esses indivíduos não têm células
de memória para antígenos de T.cruzi. De maneira similar, Piuvezam et al. (1993)
demonstraram resposta de proliferação significativa de células de indivíduos NI aos
antígenos do parasito acompanhada por produção de IL-2. Entretanto, os
mecanismos responsáveis por essa estimulação não são ainda bem esclarecidos,
podendo ser devido à mitógenos presentes nas preparações antigênicas do T. cruzi.
Outra possibilidade seria a existência de células capazes de fazer o reconhecimento
parcial de antígenos solúveis de EPI, devido ao mimetismo antigênico, decorrente de
similaridades entre moléculas autólogas e antígenos do parasito (Cunha-Neto et. al.,
1996; Abel et. al., 1997; Tarleton et. al.,1997; Minoprio, 2001).
No entanto, a reatividade in vitro com EPI de células NA não mostrou
qualquer diferença significativa nos pacientes dos grupos IND e CARD, como
previamente mostrado por outros autores (Morato, 1994; Barros-Mazon et al., 2004),
onde a remoção de células aderentes das culturas de PBMC induzia aumento na
DISCUSSÃO
55
proliferação celular (Morato, 1994; Barros-Mazon et al., 2004). Esses autores
sugerem que efeitos supressores seriam exercidos pelos monócitos/macrófagos.
Citocinas e mediadores produzidos por macrófagos como prostaglandinas, IL-10 e
NO seriam moléculas candidatas a mediar supressão na ativação e proliferação de
linfócitos (Walker et. al. 1983; Borges et. al.,1998;; Cheon et al., 2006).
Prostaglandinas são mediadores lipídicos que regulam numerosos processos
biológicos, incluindo a função renal, agregação plaquetária, liberação de
neurotransmissores e modulação de funções imunes (Phipps et al., 1991; Goetzl et
al.,1995). Trabalhos já demonstraram que a PGE
2
influencia ativação Th1/Th2,
sendo produzida por APCs como macrófagos e células dendríticas (Mosmann et. al,
1989; Constant e Bottomly, 1997). Recentemente, observou-se que a produção de
PGE
2
em sobrenadantes de cultura, estimuladas por EPI, de pacientes dos grupos
IND e CARD da doença de Chagas eram semelhantes às concentrações
encontradas em sobrenadantes de cultura de indivíduos NI, (Pinheiro, 2007).
O efeito da produção de PGE
2
sobre a resposta imune in vitro de células de
pacientes com doença de chagas e indivíduos NI foi avaliada nos sobrenadantes
das culturas de PBMC e de células NA. Os níveis de PGE
2
nos sobrenadantes de
cultura estimuladas ou não com antígenos de EPI dos pacientes com doença de
chagas e indivíduos NI foram semelhantes (FIG. 10). Esses resultados sugerem que
a PGE
2
possa ser produzida pelas células em cultura, mesmo na ausência de
estímulo antigênico, talvez em resposta ao estresse das células submetidas à cultura
in vitro. Da mesma forma, a adição de indometacina, inibidor de PGE
2
, em culturas
de PBMC e de células NA não mostrou diferença significativa sobre a proliferação
dessas células após a estimulação in vitro com EPI (FIG.6). Resultado diferente foi
observado por Morato (1994) que observou aumento do nível de proliferação de
DISCUSSÃO
56
células NA de pacientes com doença de Chagas, independentemente da forma
clínica, sugerindo estreita correlação entre o nível da resposta proliferativa de células
NA, com a inibição da produção de PGE
2
em PBMC, por indometacina. Esses
achados sugerem que a PGE
2
, produzida possivelmente por macrófagos, estaria
envolvida na regulação da proliferação celular. Esta controvérsia entre os dois
trabalhos poderia ser atribuída a vários fatores, dentre eles, à avaliação mais
criteriosa dos pacientes, por meio de exames propedêuticos mais acurados e
seguindo classificação direcionada à avaliação dos graus de morbidade e evolução
da cardiopatia chagásica (Rocha et al.,2003), o que não era possível no passado.
Além disso, homogenatos antigênicos do T. cruzi, utilizados nos experimentos
anteriores, eram preparados de um clone do parasito, enquanto que o do presente
trabalho foi originado da cepa CL. A origem distinta dos homogenatos antigênicos
pode implicar em alterações qualitativas e/ou quantitativas nos constituintes
moleculares do parasito e, em conseqüência, interferir na resposta imunológica dos
pacientes (Andrade e Magalhães, 1996; Vago, 2000).
No entanto, ao se avaliar o perfil individual de resposta de proliferação celular,
na presença indometacina, dos pacientes do grupo IND pode-se evidenciar dois
subgrupos distintos (FIG. 6C e D). Os pacientes do grupo IND foram, então,
diferenciados em: “altos respondedores” (AR) que correspondiam a 40% dos
pacientes e que apresentavam resposta proliferativa de PBMC acima de 50000
CPM; e “baixos respondedores” (BR) que correspondiam a 60% dos pacientes e que
apresentavam resposta proliferativa de PBMC abaixo de 50000 CPM. A análise dos
dados mostrou diferença estatisticamente significativa (p<0,05) entre o subgrupo
IND BR e o grupo CARD; e entre o subgrupo IND AR e o grupo NI. Este critério de
classificação permitiu-nos verificar que o grupo IND BR apresenta um perfil de
DISCUSSÃO
57
proliferação celular semelhante ao perfil do grupo NI, enquanto o grupo IND AR
apresenta perfil de proliferação semelhante ao perfil do grupo CARD.
Diante desses resultados seria razoável especular que os pacientes do grupo
IND, considerados como altos respondedores seriam candidatos a desenvolver mais
rapidamente miocardiopatia chagásica após a infecção pelo T. cruzi. Por outro lado,
poder-se-ia admitir que o grupo IND, baixo respondedor, não evoluiria para a doença
cardíaca ou a desenvolveria lentamente. Algumas alterações que podem ser
detectadas em pacientes apresentando a forma clínica IND incluem mudanças
histopatológicas em biópsias cardíacas e distúrbios autonômicos cardíacos
insignificantes e transitórios de condução (Decourt e Barreto, 1988). Estudo
longitudinal realizado em Bambuí-MG mostrou que cerca de 2-5% dos pacientes
com a forma clínica IND evoluíram para forma cardíaca, a cada ano de curso da
doença (DIAS, 1989). O padrão mais comum de evolução é uma miocardiopatia
chagásica incipiente. Infelizmente, ainda, não existe marcador imunológico capaz de
indicar evolução da forma clínica IND para a forma clínica CARD (Dias 1989,
Macedo, 1982), daí a importância dos dados aqui apresentados. Neste sentido,
estudos clínicos longitudinais paralelamente à avaliação da resposta imune in vitro
após estimulação específica poderá ser de grande valor para elucidar esta questão.
Neste contexto, macrófagos teriam papel importante na regulação da
proliferação celular através da produção de PGE
2
. Recentemente, foi demonstrada
associação entre a síntese PGE
2
pelos macrófagos e a resistência do hospedeiro à
infecção experimental pelo T. cruzi (Cardoni e Antunez, 2004). Os autores acreditam
que PGE
2
ative macrófagos, aumentando a produção de NO que, por sua vez, inibe
a replicação intracelular do parasito, impedindo a morte dos camundongos
infectados A PGE
2
produzida pelos macrófagos, atuando de maneira autócrina,
DISCUSSÃO
58
poderia também modular sua função de APC, regulando a expressão de moléculas
de MHC de classe II e de moléculas co-estimulatórias como CD80 e CD86.
Considerando que macrófagos presentes na população de PBMC e remanescentes
na população de células NA seriam capazes de estimular linfócitos, através da
interação MHC/peptídeo – complexo TCR investigou-se a capacidade de
apresentação de antígeno de monócitos/macrófagos CD14
+
através a expressão de
moléculas HLA-DR, CD80 e CD86 (FIGs. 7, 8 e 9).
A avaliação da expressão da molécula HLA-DR
em
células CD14
+
na
população de PBMC e de células NA estimuladas mostrou não existir diferenças
significativas, quando comparou-se culturas controle dos indivíduos dos grupos NI,
IND e CARD. No entanto, foi observado que células CD14
+
de pacientes do grupo
IND expressam menor IMF de moléculas HLA-DR quando comparada às células dos
indivíduos do grupo NI (FIG.7). Os dados sugerem que macrófagos de pacientes do
grupo IND apresentam pouca habilidade para estimular linfócitos T, visto que
moléculas MHC classe II são fundamentais para apresentação de antígenos aos
linfócitos T. Esses achados podem indicar um mecanismo de controle da resposta
imune nos pacientes, levando a uma menor lesão tecidual, o que caracterizaria a
forma indeterminada. Além disso, foi também observado um subgrupo (BR) na
população de indivíduos do grupo IND com resposta proliferativa menor em relação
aos pacientes do grupo CARD, possivelmente em decorrência da baixa expressão
de HLA-DR nos monócitos. Esses dados corroboram outros estudos que também
demonstraram diminuição da expressão de HLA-DR em células CD14
+
de pacientes
do grupo IND em relação ao grupo CARD da doença de Chagas (Souza et al.,
2004). Em animais de experimentação, a infecção pelo T. cruzi pode alterar a
sinalização celular, levando à desativação de células acessórias que pode ser
DISCUSSÃO
59
definida como um processo pelo qual a célula torna-se parcialmente ou
completamente sem resposta para estímulo de ativação, o que normalmente seria
esperado para elevar suas atividades microbicida e tumoricida, produtora de
citocinas, de seu poder oxidativo (Reiner, 1994).
Quanto à expressão de moléculas co-estimuladoras CD80 e CD86 na
população de células CD14
+
verificou-se não haver diferenças significativas entre as
culturas controles e estimuladas de PBMC e de células NA (FIGs. 8 e 9). Contudo,
foi possível observar menor expressão de CD80 e CD86, embora sem significância
estatística, nas culturas de PBMC de pacientes do grupo IND e CARD. Em conjunto,
os achados parecem indicar que monócitos/macrófagos na doença de Chagas não
têm, preferencialmente, função de células apresentadoras de antígenos, o que leva
à hipótese de que esta função seja exercida por linfócito B.
Para compreender melhor o envolvimento dos linfócitos B como células
apresentadoras de antígenos, avaliou-se a expressão das moléculas HLA-DR, CD80
e CD86 em células B CD19+ nas culturas de PBMC e de células NA, após
estimulação in vitro com EPI (FIGs.11, 12 e 13). Diferentemente do padrão de
expressão de muitos outros tipos celulares, a das moléculas classe II do MHC em
linfócitos B é constitutiva (Benjamini, Coico e Sunshine, 2000). É importante
acrescentar que a expressão dessas moléculas pode ser aumentada em linfócitos B,
por meio à exposição a determinadas citocinas como IL-4 (Benjamini, Coico e
Sunshine, 2000). Nesse sentido, foi investigada a expressão de HLA-DR, CD80 e
CD86 em células CD19
+
de culturas de PBMC e de células NA, estimuladas in vitro
com EPI, o que permitiu verificar uma maior expressão das moléculas HLA-DR e
CD80 em LB CD19
+
, na cultura de células NA (FIG 11B e 12 B). Esses dados, em
conjunto com os achados apresentados para macrófagos, sugerem que os linfócitos
DISCUSSÃO
60
B exercem efetivamente a função de APC, e que macrófagos, além de exercerem
suas funções como APC, atuam também como células efetoras, reguladoras e
produtoras de citocinas. Poderia, então, a função reguladora ser exercida sobre a
atividade de APC de linfócitos B? É possível que sim, devido ao aumento verificado
da expressão de moléculas HLADR e CD80 em células B CD19
+
. O fato de
pequenas quantidades de antígenos serem melhor apresentadas por LB poderia
levar monócitos/macrófagos a regularem a função de APC dos LB, impedindo o
reconhecimento de antígenos com alta afinidade, o que desencadearia resposta
auto-imune. Na doença de Chagas, observou-se uma predominância de LB CD5
+
na
circulação, após estimulação in vitro com anticorpos anti- T. cruzi de pacientes com
a forma clínica CARD, sugerindo o envolvimento dos linfócitos B CD5
+
com
desencadeamento de doenças autoimunes autoimunidade (Dutra et. al., 2000;
Minoprio et. al., 2001). Com a finalidade de esclarecer melhor o papel de
monócitos/macrófagos como células reguladoras e de linfócitos B como APC, foram
avaliados os níveis de citocinas nos sobrenadantes das culturas celulares. As
citocinas estão envolvidas em vários processos celulares, incluindo: ativação,
proliferação, diferenciação, maturação e migração celular, além da secreção e
mudança de isotipos. Elas se ligam aos receptores específicos das membranas das
células-alvo, disparando sinais que alteram a expressão gênica na célula-alvo.
A avaliação da produção de IL-2 e IL-4 evidenciou aumento nas culturas
estimuladas de PBMC, quando comparadas às culturas sem estímulo, nos grupos
IND e CARD.
Com relação à produção IFN-γ no sobrenadante das culturas de PBMC dos
grupos IND e CARD, evidenciou-se aumento significativo em relação ao grupo NI,
bem como na cultura estimulada em relação à não estimulada (FIG.16A). Quanto à
DISCUSSÃO
61
produção de IFN-γ nos sobrenadantes de cultura de células NA não foi observado
diferenças significativas (FIG.16B). Esse dado pode indicar que a maior produção de
IFN-γ seja dependente de macrófago, uma vez que ao serem ativados produziriam
citocinas como IL-12 e TNF-α que induziriam a diferenciação para uma resposta Th1
com altos níveis de IFN-γ. De fato, na doença de Chagas foi demonstrado que
macrófagos podem atuar de maneira diferenciada de acordo com a forma clínica,
podendo induzir respostas inflamatórias com alta produção de TNF-α e expressão
de HLA-DR nos pacientes do grupo CARD, e também estarem associados a
características moduladoras como alta expressão de moléculas supressoras como
CTLA-4 e baixa expressão de HLA-DR, bem como a alta produção de IL-10 nos
pacientes do grupo IND (Sathler-Avelar et al., 2003; Souza et al., 2004; 2007).
Portanto, é provável que a diferença entre os indivíduos do grupo IND, sub-grupo AR
e do grupo CARD com os do grupo IND, sub-grupo BR poderia estará associada à
ação reguladora dos macrófagos, e conseqüentemente refletiria no controle e/ou
desenvolvimento da miocardiopatia chagásica. Além disso, a avaliação da produção
de IL-10 foi estatisticamente maior nos sobrenadantes de PBMC de pacientes do
grupo IND, o que corrobora com aqueles encontrados por Gomes et al. (2002), que
mostraram uma maior produção de IL-10 nos pacientes do grupo IND. Os achados
reforçam a interpretação que a IL-10 teria papel importante em proteger o
hospedeiro contra uma resposta do Tipo 1 desregulada impedindo assim um dano
tecidual que poderia ocorrer mais tardiamente. Estudos na literatura mostram que
PGE
2
poderia suprimir a produção de citocinas inflamatórias como IFN-γ e
intensificar a síntese de citocinas anti-inflamatórias como IL-10 (De Witt,
1991;Kambayashi et. al., 1995; Cheon et. al., 2006). Portanto, os resultados obtidos
de produção de IL-10 associados a ação de PGE
2
na proliferação celular e na
DISCUSSÃO
62
expressão de moléculas de MHC e moléculas co-estimulatórias pode sugerir que IL-
10 juntamente com PGE
2
estariam envolvidas na regulação de uma resposta imune
exagerada induzida pelo T. cruzi.
Em síntese, o presente estudo mostrou que modificações importantes no
sistema imune, relacionadas à capacidade de apresentação de antígenos por
macrófagos e linfócitos B e seus produtos (citocinas e PGE
2
), ocorrem no curso da
infecção chagásica crônica. A continuação dos estudos clínicos associados à
investigação imunológica da reatividade celular dos pacientes, principalmente o
envolvimento dos linfócitos B e macrófagos, será de grande importância para
entendimento dos mecanismos responsáveis pelo aparecimento das manifestações
clínicas na fase crônica da doença de chagas. A compreensão da relação parasita-
hospedeiro certamente permitirá avanços no delineamento racional de condutas de
tratamentos quimioterápicos nos indivíduos cronicamente infectados pelo T. cruzi.
CONCLUSÃO
63
7.0 - CONCLUSÃO
CONCLUSÃO
64
CONCLUSÃO
Após realização deste estudo podemos inferir que macrófagos, além de ser uma
célula hospedeira para o parasito T. cruzi, célula efetora e apresentadora de
antígenos, também têm papel importante na regulação da resposta imune no curso
da infecção chagásica crônica. Macrófagos poderiam atuar como modulador da
função de linfócitos B como célula apresentadora de antígeno.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
65
8.0 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
66
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myosin and Trypanosoma cruzi antigen B13: identification of a B13-driven human
T cell clone that recognizes cardiac myosin. Braz. J. Med. Biol. Res. 30:1305-
1308.
Acosta, A. M. e Santos-Buch, C.A. (1985) Autoimmune myocarditis induced by
Trypanosoma cruzi. Circulation, 71:1255-1985.
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ANEXO
82
9.0 - ANEXO
ANEXO
83
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Prezado(a) paciente ____________________________________________
Você está sendo convidado(a) para participar de um projeto de pesquisa sobre a Doença de
Chagas: (ASSOCIAÇÃO ENTRE APRESENTAÇÃO DE ANTÍGENO, IMUNORREGULAÇÃO E
DESENVOLVIMENTO DA MORBIDADE NA DOENÇA DE CHAGAS). Esse projeto se iniciará em
setembro de 2006, com término previsto para março de 2008.
A proposta deste trabalho é buscar esclarecer como o organismo do paciente está reagindo
com relação à doença. A infecção pelo parasito Trypanossoma cruzi, causador da doença, pode se
manifestar de diversas maneiras e gravidade, dependendo, entre outros fatores, do tipo da resposta
imunológica contra a infecção, ou seja, da resposta do organismo do indivíduo. As informações
obtidas por este tipo de investigação podem auxiliar na compreensão dos mecanismos do surgimento
das lesões e evolução da doença e no tratamento clínico dos pacientes.
Se você concordar em ser atendido pela equipe de pesquisadores e colaborar
voluntariamente com este estudo, será colhida amostra de sangue (50mL) em tubos estéreis, para a
realização dessa pesquisa. Os possíveis riscos associados com a coleta de sangue é formação de
um pequeno hematoma no local da punção venosa, através do sistema de coleta a “vácutainer”, este
processo é pouco freqüente e não trará problemas clínicos importantes. A amostra deste material
será conduzida ao Laboratório de Imunologia Celular e Molecular do Centro de Pesquisas René
Rachou - FIOCRUZ para realização do exame de sangue e deverá ser utilizado exclusivamente para
as finalidades acima. Todo o material a ser utilizado será descartável, seguindo as normas de
biossegurança estabelecidas pelo laboratório. O restante da avaliação clínica e laboratorial a ser
realizada faz parte da rotina de atendimento do ambulatório
Sua participação nesse estudo é voluntária e não lhe trará benefício direto ou privilégio. Você
pode abandonar o estudo em qualquer momento sem que isto lhe cause qualquer prejuízo,
inclusive no seu acompanhamento médico. Todos os exames e consultas médicas serão gratuitos.
Para qualquer esclarecimento, por favor, entre em contato com um dos pesquisadores abaixo:
Prof. Manoel Otávio da Costa Rocha Telefone: 3248-9547
Dr. Rodrigo Corrêa Oliveira Telefone: 3349-7775
Dra. Juliana de Assis Silva Gomes Telefone: 3349-7779
Andréia Maria Molica Telefone: 3349-7748
Comitê de Ética em Pesquisa (UFMG) Telefone: 3499-4592
Desde já, agradecemos sua colaboração.
Eu, _______________________________________________________, após ser esclarecido sobre
o projeto de pesquisa, concordo em participar do estudo acima.
Belo Horizonte, ........... de ................... de 200....
___________________________________________________________________
Orientador responsável: Manoel Otávio da Costa Rocha
__________________________________________________
Mestranda: Andréia Maria Molica
FACULDADE DE MEDICINA
CENTRO DE PÓS-GRADUAÇÃO
Av. Prof. Alfredo Balena 190/sala 7003
Belo Horizonte – MG - CEP 30.130-100
Fone: (031) 3248.9641
FAX: (31) 3248.9939
Ministério da Saúde- Fundação Oswaldo Cruz
Centro de Pesquisas René Rachou
Av. Augusto de Lima, 1715 – Bairro Barro Preto
39100-002 Belo Horizonte – MG – BRASIL
Tel.: (31) 3295-3566 – FAX: (31) 3295-3115
Livros Grátis
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