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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
CHALCONAS ISOLADAS DE Myracrodruon urundeuva e 2-O-
METILINOSITOL ISOLADO DE Magonia glabrata PROTEGEM
NEURÔNIOS DE DANOS OXIDATIVOS E APOPTOSE INDUZIDA
POR 6-HIDROXIDOPAMINA (6-OHDA): ESTUDO EM CULTURA
PRIMÁRIA DE CÉLULAS MESENCEFÁLICAS DE RATOS.
HÉLIO VITORIANO NOBRE JÚNIOR
Fortaleza-CE
2005
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Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
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ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
CHALCONAS ISOLADAS DE Myracrodruon urundeuva e 2-O-
METILINOSITOL ISOLADO DE Magonia glabrata PROTEGEM
NEURÔNIOS DE DANOS OXIDATIVOS E APOPTOSE INDUZIDA
POR 6-HIDROXIDOPAMINA (6-OHDA): ESTUDO EM CULTURA
PRIMÁRIA DE CÉLULAS MESENCEFÁLICAS DE RATOS.
HÉLIO VITORIANO NOBRE JÚNIOR
Tese submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em
Farmacologia da Universidade Federal do Ceará, como requisito para
obtenção do título de Doutor em Farmacologia
Orientadora: Profa. Dra. Geanne Matos de Andrade Cunha
Fortaleza-CE
2005
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iii
Esta tese foi submetida como parte integrante dos requisitos necessários a
obtenção do Grau de Doutor em Farmacologia, outorgado pela Universidade Federal do
Ceará e encontra-se a disposição dos interessados na biblioteca da Faculdade de
Medicina da referiada universidade.
A citação de qualquer trecho desta tese é permitida, desde que seja feita de
conformidade com as normas da ética.
Hélio Vitoriano Nobre Júnior
Tese aprovada em: 11/08/2005
Prof
a
. Dr
a
. Geanne Matos de Andrade Cunha (orientadora)
Universidade Federal do Ceará
Prof. Dr. Manuel Odorico de Moraes (co-orientador)
Universidade Federal do Ceará
Prof
a
. Dr
a
. Maria da Graça Naffah-Mazzacoratti
Universidade Federal de São Paulo
Prof. Dr. John Fontenele Araujo
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Prof
a
. Dr
a
. Glauce Socorro de Barros Viana
Universidade Federal do Ceará
iv
O BAMBU CHINÊS
(autor desconhecido)
Depois de plantada a semente deste incrível arbusto, não se vê nada
por aproximadamente 5 anos, exceto um lento desabrochar de um diminuto
broto a partir do bulbo.
Durante 5 anos, todo o crescimento é subterrâneo, invisível a olho nu,
mas... uma maciça e fibrosa estrutura de raiz que se estende vertical e
horizontalmente pela terra está sendo construída. Então, no final do 5º ano,
o bambu chinês cresce até atingir a altura de 25 metros.
O escritor Stephen Covey escreveu:
"Muitas coisas na vida pessoal e profissional são iguais ao bambu
chinês. Você trabalha, investe tempo, esforço, faz tudo o que pode para
nutrir seu crescimento, e às vezes não vê nada por semanas, meses ou anos.
Mas se tiver paciência para continuar trabalhando, persistindo e nutrindo, o
seu 5.º ano chegará, e com ele virão um crescimento e mudanças que você
jamais esperava..."
O bambu chinês nos ensina que não devemos facilmente desistir de
nossos projetos e de nossos sonhos... Em nosso trabalho especialmente, que
é um projeto fabuloso que envolve mudanças de comportamento, de
pensamento, de cultura e de sensibilização, devemos sempre lembrar do
bambu chinês para não desistirmos facilmente diante das dificuldades que
surgirão.
Procure cultivar sempre dois bons hábitos em sua vida: a Persistência e
a Paciência, pois você merece alcançar todos os seus sonhos..!!!
"É preciso muita fibra para chegar às alturas e, ao mesmo tempo, muita
flexibilidade para se curvar ao chão."
v
Aos meus amados pais, Hélio e Jandira,
incentivadores e amigos de todas as horas
.
vi
Agradecimentos
A Deus, por se fazer sempre muito presente, dando-me forças para enfrentar todos os
momentos dessa caminhada e iluminado-me nos momentos obscuros da vida .
Aos Meus pais, Hélio Vitoriano Nobre e Josefa Jandira de Queiroz Magalhães
Nobre, por terem me dado a vida, não tão somente ela mas tudo de bom que aprendi foi
por seus ensinamentos, conselhos e amor; e com ela pude chegar até onde estou hoje,
sempre com muito carinho, dedicação e atenção.
Às minhas irmãs queridas, Rafaela de Queiroz Magahães Vitoriano Nobre e Fabricia
de Queiroz Magahães Vitoriano Nobre, por serem além de irmãs grandes amigas.
Ao meu irmão, Paulo de Queiroz Magalhães Vitoriano Nobre, pelo incentivo de amigo e
por tudo que fez durante minha vida.
Á toda minha família, em especial aos meus avós Paulo Solon e Dedece por sempre
estarem participando das minhas conquistas, sempre presentes em tudo que conquistava,
mesmo nos momentos de dificuldades tive o apoio de todos.
Ás minhas tias Fátima de Queiroz, Eliana de Queiroz, Tamires, Isomar e Basinha
que pelo seu apoio permitiram que pudesse chegar até onde estou hoje, minha eterna
gratidão.
À minha namorada Denise, pela paciência nos momentos de ausência, apoio e incentivo
nos momentos mais difíceis.
À minha incontestável, inestimável, amiga, e querida Orientadora Dra. Geanne
Matos de Andrade Cunha, a qual além de apoiar-me na construção do saber científico,
através de seus ensinamentos, mostrou também ser de uma professora dedicada e
atenciosa mostrou-me que ser inteligente, correta e digna faz parte de sua vida.
vii
Ao meu grande amigo e Co-orientador Prof. Dr. Manoel Odorico de Mores Filho,
pelos ensinamentos transmitidos mesmo quando a distância, pela oportunidade que
sempre depositou em mim, quero sempre ser grato por sua existência.
A Professora Claudia do Ó Pessoa, por seus incentivos e principalmente, por sua
vontade em transmitir seus conhecimentos a qual me levou ao LOE, no qual teve início a
tudo hoje conquistado.
À profa. Glauce Socorro Barros Viana, pela recepção em seu laboratório e pelas
importantes discussões que em muito contribuíram para a realização desta tese.
Ao grande amigo sábio Prof Vietla Satyanaraiana Rao, por estar sempre presente
ajudando e incentivando, mostrando que nos caminhos tortuosos sempre existe uma saída
sábia, compartilhando de toda sua sabedoria e inteligência conosco, além de sua grandiosa
humildade que faz com que tenhamos um enorme carinho pelo seu trabalho científico;
Aos Professores do Curso de Pós-Graduação, por terem transmitido com muita
dignidade seus conhecimentos, os quais adquiriram com muito esforço e dedicação;
À Dra. Mary Anne, do Departamento de Farmácia da Faculdade de Farmácia,
Odontologia e Enfermagem, por sua colaboração em não só ceder a fração enriquecida de
chalconas como também pela inestimável ajuda e incentivo para a realização deste
trabalho.
À Dra. Telma, do Departamento de Química Orgânica da UFC por ceder o composto 2-
O-metiloinositol e também pelo seu apoio incondicional e paciência.
Aos Amigos do Laboratório de Oncologia Experimental(LOE), Hemerson Yuri, Patricia
Bonavides, Patrícia Marcal, Alessandra, Bruno, Diego, Fernanda, Ivana, Karla,
Márcio (macaco), Raquel Montenegro, Marne, Rômulo (gavião), Gardênia, Paulinha,
meu agradecimento a todos vocês e tantos outros que por aqui passaram como é o caso do
meu amigo Sérgio (cobra) por terem colaborado na minha pesquisa científica, fazendo do
trabalho diário um ambiente mais ameno e alegre. Em especial a duas grandes amigas do
viii
laboratório de LOE , Silvana e Fátima, por toda sua paciência e amizade , não somente
comigo, mas com todos que ali trabalham, pois além de tudo merece o mérito de minha
tese.
Aos Colegas da Pós-Graduação, por termos juntos vencidos tantas disciplinas,
apresentações de artigos relatórios e provas com um saldo maravilhoso, que um ambiente
solidário de paz e amizade é necessário para que cresçamos juntos em tudo;
Às minhas grandes amigas Kaline e Regilane, dos Laboratórios de Neurofarmacologia e
Farmacologia de Produtos Naturais que sempre me ajudaram em o que precisava, e pelo
apoio amigo, além dos momentos de descontração por qual passamos juntos;
Aos meus amigos Flávio Damaceno Maia e Rivelilson Mendes de Freitas pela essencial
colaboração na realização das análises bioquímicas que nos levaram a alguns trabalhos em
congressos e publicações;
À meu grande amigo Iri Sandro Pampolha Lima e sua esposa Érica por além de uma
amizade que conquistamos, transpomos todos esses anos juntos lutando pelos nossos
sonhos, sonhos estes que hoje me faz acreditar que além de um amigo tenho um irmão.
Ao meu grande amigo Ricardo Araujo de Oliveira por ajudar-me durante toda esta
tese, sempre com sua sabedoria, honestidade e humildade que carrega, e por mostrar que
é no trabalho que encontramos a sabedoria, e que não basta ser amigo, tem que
participar;
A Bolsista do LOE, Marcelle, pela ajuda no desenvolvimento dos experimentos, que em
muito contribuíram nas horas difíceis e pelo apoio amigo;
Aos amigos do HEMOCE, Marcos, Ana Cláudia e Eunice, por incentivo e apoio.
A Unidade de Farmacologia Clínica (UNIFAC) na pessoa da Profa. Dra. Maria Elisabete
Amaral de Moraes, pela disponibilidade da estrutura e apoio incondicional na realização
das análises necessárias.
ix
As Secretárias do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Aura, Marta, Joana
e Rejane que sempre estiveram dispostas a nos ajudar no que fosse preciso. E também a
Rose, que sempre organizada soube guiar-me quando precisava de algo.
A Capes/CNPq e Funcap, por ter colaborado financeiramente durante todo o
desenvolvimento da pesquisa.
SUMÁRIO
Lista de Figuras.......................................................................................................xv
Lista de Abreviaturas..............................................................................................xx
Resumo...................................................................................................................xxii
Abstract...................................................................................................................xxiii
1.
INTRODUÇÃO 25
1.1 Doença de Parkinson – Epidemiologia e Fatores de risco 25
1.2
Patogênese
26
1.3 Dopamina e Doença de Parkinson 28
1.4 Complexos Mitocondriais e Doença de Parkinson 33
1.5 Estresse Oxidativo e Doença de Parkinson 34
1.6 Apoptose 38
1.7 Modelo da Doença de Parkinson 43
1.8 Plantas medicinais 45
1.9 Flavonóides 49
1.10 Aroeira-do-Sertão (Myracrodruon urundeuva Allemão) 61
1.11 Inositois 65
1.12 Tingui de Bola (Magonia glabrata St Hill). 67
1.13
Relevância e Justificativa 69
2. OBJETIVOS 71
2.1 Objetivo geral 71
2.2 Objetivos Específicos 71
x
3.
MATERIAIS E MÉTODOS
73
3.1 Drogas 73
3.2 Isolamento da fração enriquecida de chalconas (FEC) obtido de
Myracrodruon urundeuva
73
3.3 Isolamento do 2-O-Metil-Inositol (MI-TE) obtido de Magonia Glabrata
74
3.4 Animais 75
3.5 Culturas de células mesencefálicas de rato 75
3.6 Neuroprevenção e Neuroresgate
75
3.7 Ensaio de neurotoxicidade - Teste do MTT 77
3.8 Determinação do Nitrito 77
3.9 Determinação da peroxidação lipídica pela medição de substâncias
tiobarbitúricas ácido-reativas (TBARS).
78
3.10 Avaliação do padrão de morte celular por laranja de acridina / brometo
de etídio.
79
3.11 Imuno-histoquímica para tirosina hidroxilase 80
3.12 Análise Estatísca 80
4.
RESULTADOS 82
4.1 Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) Deferoxamina (DEF)
sobre percentual de células dopaminérgicas em cultura de células
mesencefálicas de rato expostas à 6-OHDA. Protocolo de
Neuroprevenção e de Neuroresgate.
82
4.2 Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre percentual de células
dopaminérgicas em cultura de células mesencefálicas de rato quando
expostas à 6-OHDA. Protocolo de Neuroprevenção e de Neuroresgate.
86
4.3 Efeito citotóxico da 6-OHDA sobre a viabilidade de células
mesencefálicas de rato.
91
4.4 Efeito neuropreventivo da fração enriquecida de chalconas (FEC)
isolada de Myracrodruon urundeuva em células mesencefálicas de ratos
exposta à 6-OHDA 40µM.
91
4.5 Efeito neuropreventivo da fração enriquecida de chalconas (FEC)
isolada de Myracrodruon urundeuva em células mesencefálicas de ratos
exposta à 6-OHDA 200 µM.
94
xi
4.6
Efeito de neuroresgate da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada
de Myracrodruon urundeuva em células mesencefálicas de ratos
expostas à 6-OHDA 40
µ
M.
96
4.7
Efeito de neuroresgate da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada
de Myracrodruon urundeuva em células mesencefálicas de ratos
expostas à 6-OHDA 200
µ
M.
96
4.8
Efeito neuropreventivo do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do
fruto de Magonia glabrata em células mesencefálicas de ratos expostas à
6-OHDA 40
µ
M.
99
4.9 Efeito neuropreventivo do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do
fruto de
Magonia glabrata
em células mesencefálicas de ratos expostas
à 6-OHDA 200 µM.
99
4.10 Efeito de neuroresgate do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do
fruto de Magonia glabrata em células mesencefálicas de ratos expostas à
6-OHDA 40 µM.
102
4.11 Efeito de neuroresgate do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do
fruto de Magonia glabrata em células mesencefálicas de ratos expostas
à 6-OHDA 200 µM.
102
4.12 Efeito da 6-OHDA sobre a produção de nitrito em cultura de células
mesencefálicas de rato.
105
4.13 Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de
Myracrodruon urundeuva sobre a formação de nitrito em células
mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40µM (Protocolo de
Neuroprevenção).
105
4.14 Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de
Myracrodruon urundeuva sobre a formação de nitrito em células
mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de
Neuroprevenção).
108
4.15 Efeito da fração enriquecida de chalconas FEC isolada de
Myracrodruon urundeuva sobre a formação de nitrito em células
110
xii
mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40
µ
M (Protocolo de
Neuroresgate).
4.16
Efeito da fração enriquecida de chalconas FEC isolada de
Myracrodruon urundeuva sobre a formação de nitrito em células
mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 200µM (Protocolo de
Neuroresgate).
110
4.17 Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de
M
agonia
glabrata sobre a formação de nitrito em células mesencefálicas de ratos
expostas à 6-OHDA 40
µ
M (Protocolo de Neuroprevenção).
113
4.18 Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de
M
agonia
glabrata sobre a formação de nitrito em células mesencefálicas de ratos
expostas à 6-OHDA 200
µ
M (Protocolo de Neuroprevenção).
113
4.19 Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de
M
agonia
glabrata sobre a formação de nitrito em células mesencefálicas de ratos
expostas à 6-OHDA 40
µ
M (Protocolo de Neuroresgate).
116
4.20 Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de
M
agonia
glabrata sobre a formação de nitrito em células mesencefálicas de ratos
expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate).
116
4.21 Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de
Myracrodruon urundeuva sobre os níveis de TBARS em células
mesencefálicas de ratos expostass à 6-OHDA (Protocolo de
Neuroprevenção).
119
4.22 Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolado de
Myracrodruon urundeuva sobre os níveis de TBARS em células
mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de
Neuroresgate).
121
4.23 Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de
M
agonia
glabrata sobre os níveis de TBARS em células mesencefálicas de ratos
a 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).
123
xiii
4.24 Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de
M
agonia
glabrata sobre os níveis de TBARS em células mesencefálicas de ratos
expostass à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate).
125
4.25 Efeito neuropreventivo da Deferoxamina (DEF) em células
mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA.
127
4.26 Efeito de neuroresgate da Deferoxamina (DEF) em células
mesencefálicas de ratos expostas a 6-OHDA.
127
4.27 Efeito da DEF sobre a formação de nitrito em células mesencefálicas de
ratos exposta à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).
129
4.28 Efeito do DEF sobre a formação de nitrito em células mesencefálicas de
ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate).
129
4.29 Efeito da deferoxamina (DEF) sobre os níveis de TBARS em células
mesencefálicas de ratos exposta à 6-OHDA (Protocolo de
Neuroprevenção).
131
4.30 Efeito da DEF sobre os níveis de TBARS em células mesencefálicas de
ratos exposta à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate).
131
4.31 Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) e Deferoxamina (DEF)
sobre o padrão apoptótico em células mesencefálicas de ratos expostas à
6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).
133
4.32 Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) e Deferoxamina (DEF)
sobre o padrão apoptótico em células mesencefálicas de ratos
expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate).
136
4.33 Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre o padrão apoptótico em células
mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de
Neuroprevenção).
139
4.34 Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre o padrão apoptótico em células
mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de
Neuroresgate).
142
xiv
5. DISCUSSÃO 146
6. CONCLUSÕES 165
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 167
xv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1-
Vias dopaminérgicas no SNC.
28
Figura 2-
Corte transversal de mesencéfalo.
30
Figura 3-
Corpos de Lewy em coloração por HE/Imunoperoxidase.
31
Figura 4-
Formação de radicais livres.
35
Figura 5-
Cascata da apoptose
43
Figura 6-
As neurotoxinas utilizadas em modelos de doença de Parkinson
45
Figura 7-
Núcleo fundamental dos flavonóides
50
Figura 8-
Núcleo fundamental das chalconas
57
Figura 9-
Aroeira do Sertão
62
Figura 10-
Representação estrutural da fração enriquecida de chalcona.
64
Figura 11-
Tingui de Bola
67
Figura 12-
Representação estrutural do 2-O-metilinositol (MIT).
68
Figura 13-
Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) e deferoxamina (DEF)
sobre a morfologia das células mesencefálicas de rato imunoreativas para a
tirosina hidroxilase (TH+) expostas à 6-OHDA (Protocolo de
Neuroprevenção).
83
Figura 14-
Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) e deferoxamina (DEF)
sobre a morfologia das células mesencefálicas de rato imunoreativas para a
tirosina hidroxilase (TH+) expostas a 6-OHDA (Protocolo de
Neuroresgate).
84
Figura 15-
Efeito da FEC sobre o percentual de células dopaminérgicas em em cultura
de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA.
85
xvi
Figura 16-
Efeito do do 2-O-metilinositol (MIT) sobre a morfologia das células
mesencefálicas de rato imunoreativas para a tirosina hidroxilase (TH+)
expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).
87
Figura 17-
Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre a morfologia das células
mesencefálicas de rato imunoreativas para a tirosina hidroxilase (TH+)
expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate).
88
Figura 18-
Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre o percentual de células
dopaminérgicas em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à
6-OHDA.
89
Figura 19-
Efeito da deferoxamina (DEF) sobre o percentual de células
dopaminérgicas em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à
6-OHDA.
90
Figura 20-
Efeito da 6-OHDA sobre a viabilidade de células mesencefálicas de rato.
92
Figura 21-
Efeito de neuroprevenção da fração enriquecida de chalconas (FEC)
isolada de Myracrodruon urundeuva em células mesencefálicas de ratos
expostas à 6-OHDA 40
µ
M.
93
Figura 22-
Efeito neuropreventivo da fração enriquecida de chalcona (FEC) isolada da
Myracrodruon urundeuva em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-
OHDA 200µM.
95
Figura 23-
Efeito de neuroresgate da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada
da Myracrodruon urundeuva em células mesencefálicas de ratos expostas à
6-OHDA 40µM.
97
Figura 24-
Efeito de neuroresgate da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada
de Myracrodruon urundeuva em células mesencefálicas de ratos expostas à
6-OHDA 200
µ
M.
98
Figura 25-
Efeito neuropreventivo do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do
fruto de Magonia glabrata em células mesencefálicas de ratos expostas à
6-OHDA 40
µ
M.
100
Figura 26-
Efeito neuropreventivo do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do
fruto de Magonia glabrata em células mesencefálicas de ratos expostas à
6-OHDA 200µM.
101
xvii
Figura 27-
Efeito de neuroresgate do MIT isolado da casca do fruto de
M
agonia
glabrata
em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40
µ
M.
103
Figura 28-
Efeito de neuroresgate do MIT isolado da casca do fruto de
M
agonia
glabrata em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 200
µ
M.
104
Figura 29-
feito da 6-OHDA sobre os níveis de nitrito em células mesencefálicas de
rato.
106
Figura 30-
Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de
M
yracrodruon
urundeuva sobre a formação de nitrito em cultura de células
mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40µM (Protocolo de
Neuroprevenção).
107
Figura 31-
Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de
M
yracrodruon
urundeuva sobre a formação de nitrito em cultura de células
mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 200µM (Protocolo de
Neuroprevenção).
109
Figura 32-
Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de
M
yracrodruon
urundeuva sobre a formação de nitrito em cultura de células
mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40
µ
M (Protocolo de
Neuroresgate).
111
Figura 33-
Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de
M
yracrodruon
urundeuva sobre a formação de nitrito em cultura de células
mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 200
µ
M (Protocolo de
Neuroresgate).
112
Figura 34-
Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de
M
agonia
glabrata sobre a formação de nitrito em cultura de células mesencefálicas
de ratos expostas à 6-OHDA 40µM (Protocolo de Neuroprevenção).
114
Figura 35-
Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de
M
agonia
glabrata sobre a formação de nitrito em cultura de células mesencefálicas
de ratos expostas à 6-OHDA 200
µM
(Protocolo de Neuroprevenção).
115
Figura 36-
Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de
M
agonia
glabrata sobre a formação de nitrito em cultura de células mesencefálicas
de ratos expostas à 6-OHDA 40
µM (Protocolo de Neuroresgate).
117
xviii
Figura 37-
Efeito do 2-O-metilinositol MIT isolado da casca do fruto de
M
agonia
glabrata sobre a formação de nitrito em cultura de células mesencefálicas
de ratos expostas à 6-OHDA 200
µM
(Protocolo de Neuroresgate).
118
Figura 38-
Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de
M
yracrodruon
urundeuva sobre os níveis de
TBARS em células mesencefálicas de rato
expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).
120
Figura 39-
Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de
Myracrodruon urundeuva sobre os níveis de TBARS em cultura de
células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de
Neuroresgate).
122
Figura 40- Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de
M
agonia
glabrata sobre os níveis de TBARS em células mesencefálicas de rato
expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).
124
Figura 41-
Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de
M
agonia
glabrata sobre os níveis de TBARS em cultura de células mesencefálicas
de ratos exposta à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate).
126
Figura 42-
Efeito neuropreventivo da deferoxamina (DEF) em células
mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA.
128
Figura 43- Efeito de neuroresgate da DEF em células mesencefálicas de ratos
exposta à 6-OHDA.
128
Figura 44-
Efeito da deferoxamina (DEF) sobre a formação de nitrito em cultura de
células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de
Neuroprevenção).
130
Figura 45-
Efeito da DEF sobre a formação de nitrito em cultura de células
mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de
Neuroresgate).
130
Figura 46-
Efeito da deferoxamina (DEF) sobre os níveis de TBARS em células
mesencefálicas de rato expostas a 6-OHDA (Protocolo de
Neuroprevenção).
132
Figura 47-
Efeito da deferoaxamina (DEF) sobre os níveis de TBARS em cultura de
células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de
Neuroresgate).
132
xix
Figura 48-
Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) sobre o padrão
apoptótico em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-
OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).
134
Figura 49-
Efeito da fração enriquecidada de chalconas (FEC) sobre o padrão
apoptótico em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-
OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).
135
Figura 50-
Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) sobre o padrão
apoptótico em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-
OHDA (Protocolo de Neuroresgate).
137
Figura 51-
Efeito da fração enriquecidada de chalconas (FEC) e deferoxamina (DEF)
sobre o padrão apoptótico em cultura de células mesencefálicas de ratos
expostas, à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate).
138
Figura 52-
Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre o padrão apoptótico em cultura de
células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de
Neuroprevenção).
140
Figura 53-
Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre o padrão apoptótico em cultura de
células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de
Neuroprevenção).
141
Figura 54-
Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre o padrão apoptótico em cultura de
células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de
Neuroresgate).
143
Figura 55-
Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre o padrão apoptótico em cultura de
células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de
Neuroresgate).
144
xx
LISTA DE ABREVIATURAS
5-HT- serotonina
6-OHDA- 6-hidroxidopamina
ANOVA- análise de variância
Apaf-1- fator ativador de proteases pró-apoptóticos 1
Apaf-3- fator ativador de proteases pró-apoptóticos 3
BE- brometo de etídio
BHE
- barreira hemato-encefálica
BSA- albumina de soro bovino
CAM- moléculas de adesão celular
CARD- ou domínio de recrutamento de caspases
COMT- catecol-O-metil transferase
DA- dopamina
DED- contendo domínio efetor de morte
DEF- deferoxamina
DOPAC- ácido 3,4 dihidroxifenilacético
DP – doença de Parkinson
EAE- extrato etilacetato
EGCG
- epigalocatequina-3-galato
EPM- erro padrão da média
EROS- espécies reativas de oxigênio
FEC- fração enriquecida de chalconas
fMLP/CB- formil-Met-Leu-Phe/citochalasina B
GSH- glutationa reduzida
HD- doença de Huntington
HPLC
-cromatografia líquida de alta performance
xxi
HVA
- ácido homovanílico
ICAM-1- moléculas de adesão intercelular
LA- laranja de acridina
LDL- lipoproteínas de baixa densidade
LPS- lipopolissacarídeo
MAPK- mitogen-activated protein kinases
MDA- malonil di-aldeído
MEM- Meio Essencial de Eagle
MIT- 2-O-metilinositol
MPTP- 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina
MTT- 3[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolium brometo
NF-Kapa B- fator nuclear Kapa B
NI- nitrito
SNC-sistema nervoso central
SOD- superóxido dismutase
TBARS - substâncias tiobarbituricas ácido-reativas
TH- tirosina hidroxilase
TNF- fator de necrose tumoral
TNF-α- fator de necrose tumoral alfa
TPA- tetradecanoilforbol
xxii
RESUMO
Chalconas isolada de Myracrodruoun urundeuva e 2-O-metilinositol isolado de Magonia glabrata
protegem neurônios de danos oxidativos e apoptose induzida por 6-hidroxidopamina (6-OHDA):
estudo em cultura primária de células mesencefálicas de ratos. HÉLIO VITORIANO NOBRE
JUNIOR. Orientadora: Profa. Dra. Geanne Matos de Andrade Cunha. Tese de Doutorado.
Curso de Pós-Graduação em Farmacologia. Departamento de Fisiologia e Farmacologia, UFC,
2005.
No presente trabalho, estudou-se o efeito citoprotetor da fração enriquecida de chalconas (FEC)
e do 2-O-metilinositol (MIT) em cultura primária de células mesencefálicas de ratos expostas à
neurotoxina 6-hidroxidopamina (6-OHDA). A FEC foi isolada de Myracrodruoun urundeuva, planta
medicinal brasileira comumente utilizada como antiinflamatório do trato genital feminino. Nesta fração
estão presentes as chalconas diméricas urundeuvinas A, B e C. Outro composto estudado foi o MIT,
isolado de Magonia glabrata, uma planta popularmente conhecida como “Tingui de Bola”, cujas
cascas de suas raízes são usadas como “veneno” para facilitar a pesca nos lagos e rios. O MIT é um
monossacarideo com um único anel da estrutura poli-hidroxilada. Apesar de relatos da toxicidade desta
planta, o composto estudado não apresentou toxicidade. As células foram cultivadas durante quatro
dias e após este tempo foram pré-incubadas com FEC ou MIT três horas antes (Protocolo de
neuroprevenção) ou três horas após (Protocolo de neuroresgate) a adição da 6-OHDA. A
imunohistoquímica para tirosina hidroxilase revelou um percentual de células dopaminérgicas em torno
de 2%. A 6-OHDA (40 e 200
µ
M), promoveu uma diminuição na viabilidade celular em torno de
37,65% e 63,44% para células não dopaminérgicas (TH-) e (79,78% e 93,75%) para células
dopaminérgicas (TH+) e aumentou os níveis de nitrito para 551,9% e 721,3% respectivamente em
relação ao controle. Além disso induziu uma grande peroxidação lipídica (aumento de 166,84%) como
observados pelos ensaios MTT, nitrito e TBARS, respectivamente. Na concentração de 200µM a 6-
OHDA induziu uma grande morte celular, com aumento de células em apoptose tardia e necrose. Os
resultados mostraram que a FEC (1; 10 e 100 µg/mL) reduziu significativamente e de maneira dose-
dependente (p<0,05) a morte celular induzida pela 6-OHDA (40 e 200 µM). Além disso preveniu o
aumento de nitrito e a peroxidação lipídica. A FEC demonstrou atividade antiapoptótica e preveniu a
necrose causada pela 6-OHDA (200 µM) (nos dois Protocolos estudados). O MIT (1, 10 e 100 µg/mL)
protegeu tanto as células TH- quanto TH+ do dano induzido pela 6-OHDA (40 e 200µM) (em ambos
os Protocolos), reduzindo os níveis de nitrito e a peroxidação lípidica. Também demonstrou uma
potente atividade antiapoptótica. Estes resultados demonstram que a neuroproteção dos compostos
estudados, FEC e MIT, se deva as ações antioxidante, além de uma proteção a nível mitocondrial
destes polifenois, no caso do MIT também não se podendo descartar uma ação a nível de segundo
mensageiro, via formação de inositol trifosfato e ativação de PKC. Os achados podem ter uma futura
importância clínica em doenças neurodegenerativas tais como na Doença de Parkinson.
Palavras-chaves: culturas de célula mesencefálicas; 6-hidroxidopamina; peroxidação lipídica;
neuroprevenção; neuroresgate; Myracrodruoun urundeuva; Magonia glabrata; chalconas;
urundeuvinas; 2-O-metilinositol.
xxiii
ABSTRACT
Chalcones isolated from Myracrodruon urundeuva and 2-methyl-inositol isolated from Magonia
glabrata protect neurons from 6-hydroxydopamine-induced oxidative injury and apoptose: study
in rat mesencephalic cell cultures. HÉLIO VITORIANO NOBRE JUNIOR. Orientadora: Profa.
Dra. Geanne Matos de Andrade Cunha. Tese de Doutorado. Curso de Pós-Graduação em
Farmacologia. Departamento de Fisiologia e Farmacologia, UFC, 2005
The present work evaluated the cytoprotective effect of chalcone-enriched fraction (CEF) and 2-
methyl-inositol (MIT) in primary rat mesencephalic cell culture exposed to the neurotoxin 6-
hydroxydopamine (6-OHDA). The CEF was obtained from Myracrodruon urundeuva, a Brazilian
medicinal plant used as an antiinflamatory and wound healing agent.in female genital tract. In this
fraction there are the dimerics chalcones urundeuvinas A, B e C The other compound was the MIT
isolated from Magonia glabrata, a plant popularly known as “Tingui de Bola”, which bark from its
root is used as poison to catch the fishes from lakes and rivers. The immunohistochemical assay for
tyrosine hydroxylase revealed that the percentage of dopaminergic cells in our cultures is
approximately 2%. After exposition to 6-OHDA (40 and 200
µ
M) the cellular viability was reduced to
88,81% and 35,45% respectively. The mitochondrial activity was reduced to 88,8 and 35,4%, the
nitrite levels was increased to 551,9% and 721,3% respectively and the lipid peroxidation was
increased to 166,84% in the concentration of 200 µM, as observed in the MTT, nitrite and TBARS
assays respectively. The results show that the exposition to CEF (100 µg/mL) before 6-OHDA
(neuroprevention experiment) or after 6-OHDA (neurorescue experiment) reduced significantly the cell
death caused by 6-OHDA (40 e 200 µM). The CEF prevented significantly the increase in nitrite levels
induced by 6-OHDA (40 and 200
µ
M) (in both experiments), except in the neurorescue experiment in
which the CEF failed to revert the increase in nitrite levels generated by 6-OHDA (200 µM). The CEF
inhibited the lipid peroxidation induced by 6-OHDA (200 µM) in both experiments, and also showed
antiapoptotic activity against 6-OHDA (40 and 200 µM) in both experiments. The MIT protected
significantly TH- and TH+ cells from injury induced by 6-OHDA (40 and 200
µ
M) in both
experiments. It showed a reduction in the nitrite levels generated by 6-OHDA in both experiments. The
MIT also reverted the lipid peroxidation generated by 6-OHDA (200
µ
M) and showed antiapoptotic
activity against 6-OHDA (40 and 200µM) in both experiments. These results suggest that the
neuroprotective action these compounds, CEF and MIT are due to antioxidant, besides a possible
mitochondrial protection of these polyphenols. In related to MIT not must be discarded the idea of a
second messenger action through the production of inositol triphosphate and protein kinase C
activation. The findings may have a clinical importance in neurodegenerative conditions like
Parkinson’s disease.
Key-words: mesencephalic cell culture; 6-hydroxydopamine; lipid peroxidation; neuroprevention;
neurorescue; Myracrodruoun urundeuva, Magonia glabrata; chalcone-enriched fraction; urundeuvine,
2-O-metilinositol.
INTRODUÇÃO
25
1. INTRODUÇÃO
1.1. Doença de Parkinson – Epidemiologia e Fatores de risco
O aumento da expectativa de vida da população mundial trouxe consigo os problemas
que acometem principalmente a velhice. A intensa busca do desenvolvimento de drogas que
modifiquem o curso das doenças neurodegenerativas representa um avanço. Assim este
trabalho explora o conceito de neuroproteção no contexto da Doença de Parkinson (DP) e
resume os avanços recentes nesta área, em particular, o papel dos antioxidantes agindo como
agentes modificadores da doença (TANNER ; GOLDMAN,1996).
A Doença de Parkinson é a desordem do movimento mais comum, afetando 1% da
população na faixa etária de 65 anos e aumentando para 4- 5% na população acima de 85 anos
(ERIKSEN, 2003). Trata-se da segunda principal doença neurológica degenerativa depois do
mal de Alzheimer e ainda será preciso muita pesquisa para que a ciência descubra sua origem e
tratamentos para evitar a degeneração progressiva causada por esta doença. Adolf Hitler,
Saddam Hussein, o ex-presidente norte americano Harry Truman e mais recentemente o Papa
João Paulo II popularizaram a doença, que já faz parte do cotidiano de muitos brasileiros.
A DP é um dos distúrbios neurológicos mais comuns na prática médica. Diversos
estudos encontraram incidências anuais que variam aproximadamente de 16 a 20 casos por
100.000 habitantes, e prevalência média de 120 por 100.000 habitantes. Em todos os estudos
epidemiológicos foram detectados aumentos significativos na prevalência com o avanço da
idade. Outros fatores de risco observados foram o sexo (com maior prevalência da DP nos
homens, sendo a média das taxas homem para mulher aproximadamente igual a 1,5), raça (uma
maior prevalência foi observada na América do Norte e Europa em relação a encontrada no
Japão, China e África), predisposição genética, infecções, trauma e estresse emocional
(TANNER ; GOLDMAN,1996).
26
Existem diferente fatores etiológicos para DP. Estes incluem reconhecidamente fatores
genéticos e ambientais e hipoteticamente interações entre estes. Um destes é a geração de
radicais livres, os quais têm sido implicados na toxicidade de muitos agentes químicos, como o
safrole, o paration, entre outros e na patogênese de muitas doenças inflamatórias, tais como DP,
Doença de Alzheimer, fibrose pulmonar idiopática, nefrose autoimune, na catarata, esclerose
múltipla, porfiria, aterosclerose e câncer (KEHRER, 1993 ; REITER et al., 1999).
Um componente genético de DP foi considerado por Gowers quando observou que a
desordem se manifestava mais comumente nas famílias de doentes. Isto foi confirmado por
inúmeros estudos de casos-controle estimando que parentes de primeiro grau de pacientes com
DP têm 2 ou 5 vezes mais riscos para o desenvolvimento da doença (DUVOISIN et al.,1969;
MARTIN et al.,1973; ALONSO et al.,1986; BUTTERFIELD et al.,1993; MARTTILA;
RINNE,1976; VIEREGGE ; HEVERLIN,1992; SEMCHUK et al.,1993; PAYAMI et al.,1994;
BONIFATI et al.,1995; VIEREGGE ; HEVERLIN,1995; DEMICHELE et al.,1996; MARDER
et al.,1996; LAZZARINI et al.,1994; GASSER,1998).
Estudos em gêmeos têm tradicional significado como estimativa da contribuição
genética para uma desordem. O aumento da freqüência da doença em gêmeos monozigóticos
em oposição aos dizigóticos é um indicativo de contribuição genética significante. Em
associação os estudos de caso-controle, os recentes estudos de gêmeos confirmam que a
contribuição genética para a etiologia da DP a qual é provavelmente mais significativa em
pacientes jovens. Inevitavelmente devido a heterogeneidade da etiologia da DP, um
componente genético será mais importante em alguns pacientes que em outros (YOUNG et al.,
1999).
1.2. Patogênese
A doença de Parkinson - ou parkinsonismo primário - foi descrita pela primeira vez por
James Parkinson em 1817. O Dr. Parkinson (1755-1824) era membro do colégio real de
27
cirurgiões da Inglaterra. Inicialmente a doença foi descrita como "paralisia agitante". A DP é
uma doença neurodegenerativa caracterizada por tremor involuntário (mesmo quando em
repouso), acinesia, rigidez, anormalidades na postura e episódios de interrupção motora
(BARBOSA et al.,1997;YOUNG et al.,1999).
Anormalidades adicionais na substância negra de pacientes com DP incluem evidências
da produção de citocinas inflamatórias, provavelmente microglia reativa (MCGEER et al.,
1988; HIRSCH et al.,1998; BENVENISTE et al.,1992; HOPKINS et al.,1995). Tais mudanças
não são específicas para DP e podem ser vistas em outras doenças neurodegenerativas, tais
como doença de Alzheimer e doença de Huntington (HD), embora em lugares diferentes que a
substancia negra. Portanto, mudanças inflamatórias são provavelmente secundárias embora
possam contribuir para a patogênese.
Existem ramificações glutamatérgicas provenientes do núcleo subtalâmico para a
substância negra. Isto cria a oportunidade para um dano celular mediado por excitotoxinas. Em
suporte a isso existem evidências de resíduos protéicos nitrotirosinas em corpos de Lewy
(GIASSON et al., 2000). Contudo, o dano promovido pela nitrotirosina em proteínas também
pode ser mediado pela liberação de óxido nítrico (NO) dos neurônios da glia produtores de NO.
Além dos sintomas motores, que são os mais importantes, também estão associadas à
DP, em menor freqüências, sintomas como demência, depressão e disfunção autonômica
(BARBOSA et al., 1997). Esses sintomas estão associados principalmente ao déficit de
dopamina nos gânglios da base, mas os mecanismos fisiopatológicos de como isso se processa
ainda não estão bem esclarecidos (BARBOSA et al.,1997; OLEH,1998). A DP compromete
severamente a qualidade de vida do paciente, que pode ter dificuldade para ler, escrever e
dirigir. Num estágio avançado da doença, os pacientes freqüentemente não conseguem sequer
realizar as atividades básicas do cotidiano, resultando em perda do emprego e da autonomia do
paciente (YOUNG et al.,1999)
.
28
1.3. Dopamina e Doença de Parkinson
O neurotransmissor dopamina está presente na maioria das regiões do SNC, originando-
se de longos axônios que partem da substância negra e área tegumentar ventral e inervam os
núcleos da base, partes do sistema límbico e o córtex frontal (figura 1) (CONN, 1994).
Figura 1– Vias dopaminérgicas no SNC.
Neurônios dopaminérgicos produzem dopamina (DA) a partir do aminoácido tirosina,
obtido através da dieta. A tirosina é transportada para dentro do neurônio dopaminérgico onde
posteriormente sofre ação enzimática (COOPER, 1991). As enzimas que catalisam esta síntese
são produzidas e estocadas no corpo celular dos neurônios. A primeira enzima que atua na
síntese de DA é a tirosina hidroxilase (TH). Essa é inibida pelo produto final da via de
biossíntese, a DA, constituindo o mecanismo de regulação contínua da velocidade de síntese
(etapa limitante). É encontrada no citoplasma e cataliza a conversão da tirosina para o
29
aminoácido L-Dopa (1-3,4-diidroxifenilalanina) que sofre a ação rápida de outra enzima a dopa
descarboxilase produzindo a DA
(COOPER, 1991).
Os neurônios, então, estocam DA em vesículas nos terminais de seus axônios. Quando
um neurônio dopaminérgico é ativado, a mudança resultante nas cargas elétricas em ambos os
lados da membrana celular (despolarização) induz a liberação de DA na fenda sináptica através
de um processo denominado exocitose. Para terminar o processo sinalizador, os neurônios
recaptam DA através de um sistema carreador específico localizado na membrana celular
(COOPER, 1991).
Para afetar as células alvo, a DA interage com moléculas receptoras específicas na
superfície de células alvo. Os subtipos de receptores dopaminérgicos se dividem em duas
famílias: a família D
1
-símile, a qual inclui os subtipos D
1
e D
5
e a família D
2
-símile, que inclui
os subtipos D
2
, D
3
e D
4
. Esses receptores realizam suas ações por se acoplarem e ativarem
diferentes complexos de proteínas G. Os receptores D
1
-símile interagem com o complexo de
proteínas Gs, resultando em ativação da adenilil ciclase e aumento nos níveis de AMPc
intracelular. Os receptores D
2
-símile interagem com um complexo de proteínas Gi com
conseqüente inibição da produção de AMPc (COOPER,1991; DE KEYSER,1993; CIVELLI,
1993).
Os neurônios dopaminérgicos têm origem em três grupos celulares localizados no
cérebro. Estes são classificados em A8, A9 e A10 (DAHLSTROM; FUXE,1964; LINDVALL
et al.,1984), correspondendo às regiões cerebrais denominadas campo retrorubral (A8),
substância negra pars compacta (A9) e área tegumentar ventral (A10). Os axônios dos
neurônios dopaminérgicos provenientes destes grupos celulares se estendem para regiões do
mesencéfalo, formando três sistemas neuronais, sistema nigroestriatal, o sistema mesolímbico e
o sistema mesocortical.
30
A degradação metabólica da DA é feita no SNC principalmente por duas enzimas: a
monoamina oxidase (MAO) e a catecol-O-metil transferase (COMT). A MAO existe em duas
formas moleculares semelhantes, codificadas por genes separados (MAO- tipo A e tipo B). A
MAO-A possui preferência de substrato para a serotonina. A MAO-B possui preferência de
substrato para a feniletilamina. Ambas as isoformas atuam sobre a dopamina. Assim, a
degradação da dopamina é feita pela MAO que converte a DA em DOPAC (ácido 3,4
dihidroxifenilacético) a nível neuronal e pela COMT (catecol-O-metil transferase) que converte
DA em HVA (ácido homovanílico) dentro do terminal sináptico (COOPER, 1991). O HVA é o
principal produto do metabolismo da DA nos seres humanos, enquanto DOPAC é o principal
em roedores (COOPER, 1991).
Em 1958, Arvid Carlsson identificou a dopamina como um neurotransmissor
independente. Entre as anormalidades nos neurotransmissores encontradas em cérebros
autopsiados de pacientes com DP, a perda de dopamina (DA) no striatum (núcleo caudado e
putamen) destaca-se como o achado bioquímico mais proeminente, e que está intimamente
relacionado a desordem motora da DP (Figura 2).
FIGURA 2
– Corte transversal de mesencéfalo mostrando: (a) mesencéfalo de individuo com
Parkinson onde podemos observar claramente a redução da população de neurônios
dopaminérgicos da substância negra (b) mesencéfalo de indivíduo normal onde podemos
observar a integridade da substância negra.
Fonte - medlib.med.utah.edu/WebPath/webpath.html
Mesencéfalo/ corte transversal
(a) (b)
31
Em estágios avançados da doença, a perda de DA no striatum excede os 80%, estando os
níveis de DA no putamen consideravelmente mais reduzidos que no núcleo caudado (OLEH et
al., 1998). Essa perda da dopamina está associada a degeneração de neurônios que contêm
melanina e o aparecimento de corpúsculos de Lewy (fig. 3) principalmente na pars compacta
da substância negra, mas também em outras estruturas do tronco encefálico e basais
(BARBOSA et al., 1997). Outros neurotransmissores, como a noradrenalina (NA) e 5-
hidroxitriptamina (5-HT), estão moderadamente reduzidos em áreas específicas do cérebro na
DP. Embora anormalidades da NA e da 5-HT não estejam relacionadas a distúrbios motores,
elas podem estar envolvidas em alguns sintomas cognitivos e psiquiátricos comumente vistos
na DP (BARBOSA,1997; OLEH et al.,1998).
FIGURA 3– Corpos de Lewy são encontrados em neurônios nas áreas de degeneração.
Corpos de Lewy em coloração por HE (a)/Imunoperoxidase (b).
Fonte - medlib.med.utah.edu/WebPath/webpath.html
A
α
-sinucleina foi inicialmente caracterizada como um componente não amilóide das
placas senis presentes na doença de Alzheimer, sendo uma proteína abundante no cérebro
(UEDA et al., 1993). É sintetizada em ribossomos citosólicos e, entre outros eventos,
transportada através dos axônios para os terminais sinápticos onde é armazenada nas vesículas
(UEDA et al.,1993; MAROTEAUX et al.,1988; MAROTEAUX et al.,1991). A função precisa
da α-sinucleina é desconhecida. Camundongos knockout que não produzem α-sinucleina não
têm características fenotípicas óbvias ou patológicas e expressam somente uma pequena
a
b
32
mudança na liberação dos neurotransmissores em resposta a estimulação repetitiva
(ABELIOVICH et al.,2000; CONWAY et al.,1998). A relevância da
α
-sinucleina para a
grande maioria dos pacientes com PD está no fato de ela estar presente nos chamados corpos
Lewy na DP idiopática (SPILLANITINI et al., 1997).
A partir dessa observação tem se sugerido que a agregação e a acumulação de
α
-
sinucleina pode interferir na função proteossomal e resultar em uma disfunção celular
relacionada com o acúmulo dos corpos de Lewy (SHERMAN et al., 2001). Além de esta
hipótese parecer atrativa existem também evidências de que agregados protéicos são uma
resposta protetora ao metabolismo anormal da α-sinucleina. Os radicais livres também parecem
ser um alvo específico para a nitração (GIASSON et al., 2000) o que aumentaria o dano das α-
sinucleinas (KANDA et al.,2000; HASHIMOTO et al.,1999).
Consequentemente estudos recentes sugeriram que mutações na α-sinucleina podem
aumentar a expressão de radicais livres ou prejudicar a atividade mitocondrial (HSU, 2000). A
superexpressão de α-sinucleina humana em células de mesencéfalo de rato resulta em aumento
da morte celular (ZHOU et al.,2000; FORLONI et al.,2000).
A segunda mutação associada com DP foi identificada em grupos de pacientes jovens
autossômicos recessivos no Japão. O locus responsável pela mutação nestas famílias foi
encontrado no cromossomo 6 e foi posteriormente caracterizado por deleções como um gene
que codifica um proteína desconhecida, posteriormente denominada parquina (MATSUMINE
et al., 1997; KITADA et al., 1998; HATTORI et al., 1998). Em contraste com as mutações na
α-sinucleina, as quais muito raramente causam DP, mutações na parquina têm sido descritas
em uma alta proporção de pacientes jovens com DP (<20 anos) e em pequenos grupos
familiares que apresentam padrões autossômicos recessivos de herança (LUCKING et al.,
2000). Assim, mutações na parquina podem responder por uma proporção significante (se bem
que não a maioria) de casos de DP juvenil. A função da parquina não é conhecida, embora
alguns estudos recentes tenham reforçado possíveis ações potenciais no desenvolvimento da
DP (SHIMURA et al., 2000)
33
1.4. Complexos Mitocondriais e Doença de Parkinson
Apesar de a causa de apoptose de células da substância negra não estar completamente
definida, a ocorrência de dano mitocondrial e estresse oxidativo tem sido repetidamente
encontrado em protocolos experimentais e estudos clínicos (FAHN ; COHEN, 1992).
Diminuição da atividade do complexo mitocondrial I tem sido encontrado em tecidos neuronais
e extra-neuronais e em células circulantes. Linhagens de células cultivadas utilizando-se DNA
mitocondrial de pacientes com doença de Parkinson exibiram deficiência do complexo I e
produção aumentada de espécies reativas de oxigênio (SWERDLOW et al., 1996).
Recentemente, o papel do oxido nítrico (NO) na doença de Parkinson tem ganhado
importância pelo achado de 3-nitrotirosina no centro de corpúsculos de Lewy, o marcador
patológico dessa distúrbio neurodegenerativo (GOOD et al., 1998), e da super-expressão de
NO sintase (NOS) no cérebro de pacientes com doença de Parkinson (EVE et al., 1998). Da
mesma forma, foram observados 3-nitrotirosina e super-expressão da enzima em neutrófilos
circulantes de pacientes com DP, sugerindo uma desrregulação generalizada do gene da NOS
(GATTO et al., 2000). A presença de nitrotirosina, um marcador da formação de peroxinitrito
também foi observada em mitocôndrias de ratos em modelos experimentais de DP induzidos
por MPTP, que foi prevenida pela administração prévia de 7-nitroindasole, um inibidor
relativamente inespecífico da NOS. Em células de neuroblastoma SH-SYS5Y, o MPTP e seu
produto ativo MPP+ aumentaram a produção mitocondrial de NO, sugerindo um efeito ativador
na NOS mitocondrial associado ao aumento do Bax (uma proteína apoptótica), liberação de
citocromo c e ativação das caspases (KINDLER et al., 2003). Enquanto a NOS mitocondrial de
144kDa (variante neuronal) é aumentada em estágios iniciais do desenvolvimento, em paralelo
ao curso da plasticidade estrutural do cérebro e cerebelo, a expressão de NOS mitocondrial no
cérebro adulto é consideravelmente menor que em neonatos (RIOBÓ et al., 2002). Aumento
patológico da atividade desta enzima mitocondrial pode contribuir para neurodegeneração.
Evidências indicam que um nível de óxido nítrico aumentado na matriz, secundário à super-
expressão de NO sintase nuclear ou ativação da NOS, leva ao aumento na produção de O
2
-
e
34
alteração do complexo I, e transforma a sinalização celular normal à condição apoptótica. De
fato, o estresse oxidativo induzido pela inibição do complexo I pelo MPP+ ativa a quinase pró-
apoptótica c-Jun N-terminal (JNK) ativada por estresse e a transcrição precoce do NF-Kapa B
em células SH-SY5Yde neuroblastoma (CASSARINO et al., 2000).
Não está claro porque a substância negra é particularmente susceptível aos efeitos
tóxicos do NO, como ocorre na doença de Parkinson, levando à neurodegeneração de células
dopaminérgicas/catecolaminérgicas. A substância negra apresenta concentrações de 6-OHDA
que prontamente reage com NO levando a formação de dopamina semiquinona e aumento da
formação de de O
2
-
e ONOO
-
(RIOBÓ et al., 2001).
1.5. Estresse Oxidativo e Doença de Parkinson.
Radicais livres são moléculas que possuem um ou mais elétrons desemparelhados. Em
geral, são instáveis e têm vida muito curta devido à natureza livre de seus elétrons que os
tornam hábeis a reagir com diversos compostos ou alvos celulares, de modo a obter uma maior
estabilidade química conferida pelo emparelhamento de elétrons (HALLIWELL, 1994). Essas
moléculas causam danos teciduais por interagirem com carboidratos, DNA, lipídios e proteínas
com formaçãode radicais livres. Os seres humanos estão constantemente expostass a radicais
livres e espécies reativas do oxigênio geradas por radiações ionizantes, agentes tóxicos,
poluentes ambientais, etc (fig. 4). Porém, as células também são capazes de produzir espécies
reativas do oxigênio, tais como: o peróxido de hidrogênio e os radicais superóxido, hidroxila e
óxido nítrico.
35
FIGURA 4– Formação de radicais livres. www.webpath.com
O estresse oxidativo tem sido discutido como um importante contribuinte na patologia
das doenças neurodegenerativas (SKOUMALOVA et al., 2003). Uma das idéias relacionadas à
patogênese da DP baseia-se na formação de espécies reativas de oxigênio e conseqüente início
de estresse oxidativo, levando à lesão oxidativa na substância negra pars compacta
(BARBOSA et al., 1997). As evidências que dão suporte ao envolvimento do estresse oxidativo
na patogênese da DP incluem alterações na quantidade de ferro no cérebro, que medeia a
formação de espécies reativas de oxigênio quando está numa forma reativa; deficiência no
funcionamento mitocondrial, particularmente no complexo I da cadeia respiratória; alterações
nos sistemas protetores antioxidantes do cérebro, notadamente na superóxido dismutase (SOD)
e glutationa reduzida (GSH) e evidências de dano oxidativo a lipídeos, proteínas e DNA
(KNEKT et al., 1996).
36
O ferro pode induzir estresse oxidativo e injeções intranigrais podem induzir um modelo
de parkinsonismo progressivo. A perda de GSH, que está associada à doença de corpúsculo de
Lewy, representa um dos sinais iniciais da perda de células da substância negra, podendo
aumentar a suscetibilidade a exposições à tóxicos ou radicais livres. A natureza das espécies de
radicais livres responsáveis pela morte celular na DP não está bem definida, mas acredita-se no
envolvimento de radicais hidroxila (OH-), peroxinitrito e oxido nítrico (HSIEH et al., 2000).
Os radicais livres mais destrutivos gerados no organismo derivam do oxigênio (O
2
).
Portanto, a molécula mais importante para a manutenção da vida pode também provocar danos
celulares, levando à destruição de órgãos e do próprio organismo. Outro radical de grande
relevância é o radical superóxido (O
2-
), produto da adição de um elétron a uma molécula de
oxigênio (HALLIWELL ; GUTTERIDGE, 1986). Muitas outras moléculas biológicas reagem
com o O
2
convertendo-o em O
2-
, como por exemplo a hemoglobina (MISRA ; FRIDOVICH,
1972a), miogobina (GOTOH ; SHIKAMA, 1976), catecolaminas (MISRA ; FRIDOVICH,
1972b) e alguns constituintes dos sistemas de transporte de elétrons mitocondriais (TURRENS
et al.,1985) e microssômicos (JAKOBY ; ZIEGLEr, 1990). Fagócitos ativados (neutrófilos,
monócitos, macrófagos e eosinófilos) podem ainda gerar O
2-
em grande quantidade, com o
objetivo de destruir microorganismos estranhos ao organismo. Tal mecanismo de proteção
natural pode tornar-se nocivo nos processos de inflamação crônica (HALLIWELl et al., 1988).
A espécie de oxigênio mais reativa em sistemas biológicos é o radical hidroxila (OH
•
)
este, age rapidamente no local em que é produzido, sendo capaz de causar alterações nas bases
purínicas e pirimidínicas, levando a inativação ou a mutação do DNA, inibir diversas proteínas
(constituintes das membranas celulares e enzimas) através da oxidação dos seus grupamentos
sulfidrila (-SH) a pontes dissulfeto (-SS) e iniciar a peroxidação de lipídeos, especialmente
ácidos graxos poliinsaturados de membranas e lipoproteínas (HALLIWELL ; GUTTERIDGE,
1986). Este é gerado nos sistemas biológicos principalmente por radiações ionizantes e através
da reação que envolve um metal de transição, o radical superóxido e o peróxido de hidrogênio.
37
Devido ao alto teor de água das células, sua exposição às radiações ionizantes (raios X e
gama), pode resultar na formação do radical hidroxila, através do processo de radiólise da água
(HALLIWELL et al., 1994). Os íons metálicos (de ferro ou cobre) possuem a habilidade de
mover elétrons, o que constitui a base para a iniciação e propagação de muitas das reações de
radicais livres mais nocivas. Assim, o OH
•
é formado pela interação entre um íon metálico
(Fe
3+
), o O
2-
e o H
2
O
2
. O H
2
O
2
, só apresenta toxicidade quando presente em altas concentrações
nas células, outra característica dessa molécula é que ela possui a capacidade de se difundir
rapidamente através das membranas celulares podendo então se distribuir por sítios distantes
dos quais ela foi gerada. Além disso, na presença de metais de transição, mais comumente o
Fe
2+
, mas também o Cu
+
, o peróxido de hidrogênio é reduzido à radical hidroxil (OH
•
) via
reações de Haber-Weiss ou Fenton (REITER et al., 1998).
Fe
3+
+ O
2
-
Fe
2+
+ O
2
H
2
O
2
Fe
3+
+ OH
-
+ OH
•
(reação de Fenton)
Embora a via de produção do OH
•
esteja bem estabelecida e seu papel patológico não
esteja bem determinado, a existência de proteínas de transporte para o ferro e o cobre,
utilizadas pelas células para minimizar a presença de íons metálicos livres indicam que tais
reações podem ser prejudiciais para os sistemas biológicos (LIOCHEV ; FRIDOVICH, 1994).
Um mensageiro intracelular de produção endógena que desempenha um papel em
praticamente todos os sistemas do organismo é o óxido nítrico (NO) (EISERICH et al., 1998),
embora exerça diversas funções fisiológicas úteis, em excesso pode ser nocivo. Em
determinadas condições o NO e o O
2
-
podem interagir, resultando em um produto muito tóxico,
o peroxinitrito (ONOO
-
). O ONOO
-
é capaz de reagir prontamente com diversas moléculas:
proteínas, lipídeos, carboidratos e ácidos nucléicos, danificando-as. Além disso, seus prováveis
produtos de decomposição, OH
•
, dióxido de nitrogênio e outros, possuem semelhante potencial
38
deletério, conseqüentemente, a toxicidade do NO pode ser explicada, pelo menos em parte, por
sua reação com o O
2
-
(DEMIRYUREK, 1998 e EISERICH et al.,1998).
A peroxidação lipídica é um processo envolvendo a oxidação de ácidos graxos
poliinsaturados, os quais são componentes básicos de membranas biológicas. Compostos
reativo eletrofílicos são formados durante a peroxidação lipídica, principalmente aldeídos
α
e
β
-não-saturados. Estes compostos geram ligações com o DNA, e entre elas, propeno e propano
substituído e deoxiguanosina como malondialdeido (MDA), acroleína, crotonaldeido e eteno,
resultantes de reações de bases de DNA com epoxi aldeidos, são um importantíssimo grupo de
complexos. Os epoxi aldeidos são mais reativos para DNA do que aldeídos saturados. Os
compostos resultantes da peroxidação lipídica reagem principalmente com DNA mostrando
ação genotóxica e mutagênica; entre eles, 4-hidroxinonenal é o mais genotóxico, enquanto
MDA é o mais mutagênico (LUCZAJ et al., 2003).
1.6. Apoptose
A apoptose foi identificada em 1972 por Kerr. O nome foi sugerido devido às
mudanças morfológicas que levam à morte celular, por um processo claramente distinto da
necrose, estando sob controle genético, o que a diferencia da necrose celular. A apoptose é um
processo não patológico, sem perda inicial do controle osmótico, em contraposição à necrose,
que é um processo patológico, não fisiológico, com ruptura da membrana celular e liberação do
conteúdo citoplasmático e nuclear, desencadeando, assim, o processo inflamatório (DIVE et al.,
1992).
A apoptose é fundamental para o desenvolvimento normal e sua desregulação pode levar
a um espectro de efeitos. A seqüência de eventos que leva a apoptose não está completamente
entendida, entretanto, as células encolhem-se e perdem o contato intercelular e
subseqüentemente exibem cromatina densa, fragmentação nuclear e corpos apoptóticos dentro
da célula, os quais são rapidamente fagocitados (BOOBIS et al., 1990). O processo de
39
apoptose, além de relevância nos processos biológicos como, diferenciação, desenvolvimento,
maturação celular e função imunológica, é fundamental para o controle da lesão celular
induzida por agentes químicos e fisiológicos (DOSEFF, 2004). O balanço entre proliferação
celular e apoptose é crucial para o desenvolvimento normal e homeostasia tecidual no adulto.
A família Bcl-2 um grupo de proteínas que estão envolvidas no processo apoptótico
pode ser dividida em duas classes: inibidoras da apoptose (anti-apoptóticas), tais como: Bcl-2,
Bcl-xL, Bcl-w, Bfl-1, Mcl-1, A1, E1B19K, LMW5-HL e EBV BHRF1; e promotoras da
apoptose (pró-apoptóticas): Bax, Bak, Bcl-xs, Bad, Bid, Bik, Hrk, Bim e Bok (EVAN, 2001).
Outra proteína que também está envolvida na apoptose é a p53 que nas células normais
tem a função de bloquear a divisão celular quando há injúrias no genoma, fazendo com que o
dano seja reparado; se o dano persistir, este atua como mediador da apoptose. Na apoptose, o
p53 atua diminuindo a transcrição de Bcl-2 e aumentando a de Bax (MONTENARH, 1992).
O mecanismo que desencadeia a apoptose até agora elucidado é através da liberação do
citocromo c. Este normalmente reside nas membranas internas e externas da mitocôndria.
Quando há um estímulo apoptótico, o citocromo c é liberado para citossol onde se apresenta
como um dos principais ativadores da atividade proteolítica da caspase 3 por ativação da
caspase 9. Neste mecanismo, o citocromo c forma um complexo com duas proteínas
citossólicas, Apaf-1 e Apaf-3 (apoptotic protease-activating factor), e o complexo formado
ativa a caspase 3, que ao final, leva à apoptose (EVAN, 2001). O oncogene Bcl-2 e Bcl-xL
encontra-se na membrana externa da mitocôndria para suprimir a apoptose, bloqueando a
liberação do citocromo c e ligando-se a Apaf-1 para prevenir a ativação da caspase 9 (EVAN,
2001).
Outro mecanismo provável no qual o Bcl-2 possa estar suprimindo a apoptose advém da
observação de que sua expressão afeta o balanço de cálcio intracelular (homeostase). A
alteração na concentração de cálcio possui influencia no processo de apoptose. É possível que o
40
Bcl-2 atue diretamente modulando os canais de cálcio ou atue protegendo as membranas
lipídicas da ação danosa de radicais peróxidos os quais são conhecidos como deturpadores da
homeostase do cálcio (EVAN, 2001).
As deficiências nos processos de apoptose são responsáveis pelas proliferações de
células tumorais, sendo responsáveis pelo comprometimento da homeostasia adequada do
indivíduo. Ao contrário disso, a exarcebação destes mecanismos apoptóticos levam a condições
patológicas graves a serem consideradas (doenças autoimunes de forma geral): doenças
neurodegenerativas como Alzheimer, Parkinson, Esclerose Amiotrófica Lateral, Esclerose
Múltipla dentre muitas outras. (FADEEL, 1999).
O mecanismo celular da apoptose é marcado por alterações na permeabilidade celular
(transição da permeabilidade mitocondrial, TPM )– onde há formação de um canal de alta
condutância com perda do potencial para fosforilação oxidativa; há extravasamento de
citocromo c para o meio intracitoplasmático; ativação de uma série de substâncias cisteíno-
aspartato-proteases como caspases (realizam clivagem protéica), transglutaminases
(entrecruzamento de proteínas), endonucleases (clivagem nuclear) e fosfatidilserina /
trombospondina (marcadores da membrana externa dos corpúsculos apoptóticos com indução
da fagocitose). O processo implica na fragmentação da cromatina e das organelas com posterior
clivagem das mesmas. Corpúsculos apoptóticos são fagocitados por macrófagos, que
reconhecem suas sinalizações. O sistema imunológico não desencadeia uma resposta
inflamatória, não havendo lesão de células periféricas (ZUZARTE-LUIS, 2002).
Os mecanismos de iniciação do processo de apoptose são eficientemente regulados por
uma série de inter-relações de múltiplos fatores. Uma seqüência de sinais extracelulares
induzem a morte celular programada como por exemplo, a ligação de fatores em receptores
transmembrânicos, defeito no reparo do DNA celular, drogas citotóxicas ou irradiações.
Muito do nosso atual conhecimento sobre a apoptose advém de estudos em Clostridium
elegans onde uma série de genes foi identificado e atribuído uma função neste complexo
41
mecanismo da apoptose. A apoptose no C. elegans é parcialmente devida a ativação de uma
cisteína-protease ced-3 mediada pela sua oligomerização e ativando (em “cascata”) a proteína
ced-4. A atividade do complexo ced-3/ced-4 é contra-regulado pelo inibidor da apoptose ced-9
e seu indutor egl-1, ambos membros da família Bcl-2. Estudos em mamíferos e pássaros nos
revelaram que o ced-3 é membro da família das cisteínas-proteases, das caspases, e o ced-4
corresponderia ao Apaf-1 (fator ativador de proteases pró-apoptóticos 1), fator determinante na
ativação das caspases (ZUZARTE-LUIS, 2002).
Nas células, as caspases são sintetizadas a partir de zimógenos inativos, denominadas
pró-caspases. As pró-caspases são proteoliticamente processadas entre subunidades pequenas e
grandes resultando em subunidades pequenas e grandes, conseqüentemente. As caspases pró-
apoptóticas são divididas em grupos iniciadores da apoptose incluindo caspases 2, 8, 9 e 10 e
no grupo de executadores da apoptose, incluindo as caspases 3, 6 e 7. De forma geral as
caspases iniciadoras, como a 8 e a 10, possuem domínios longos, contendo domínio efetor de
morte (DED) ou domínio de recrutamento de caspases (CARD) como no caso das caspases 9 e
2. A via de morte da apoptose pode ser induzida por vias extrínsecas de estímulos, como
ligantes de superfície celular, ou por via intrínseca, com sinais originados no interior da célula
(DENAULT, 2002).
Na via extrínseca da ativação da apoptose, a pró-caspase 8 é recrutada pela DED e
induzem o sinal de morte através do complexo (DISC), o ligante pode ser o fator de necrose
tumoral (TNF). A via intrínseca de apoptose envolve a ativação da pró-caspase 9 a qual é
ativada por eventos de transição da permeabilidade mitocondrial (TPM) como já discutido
anteriormente, com liberação de citocromo c para o meio intracitoplasmático (SALVESEN,
2002). Neste caso de ativação da caspase 9, há interação com o fator de ativação das proteases
pró-apoptóticas 1 (Apaf-1). Uma vez ativada, a caspase 9 ativa uma série de outras pró-
caspases como por exemplo a caspase 3, 6 e 7 subseqüentemente, clivando estas pró-caspases
em substratos menores, resultando numa amplificação do sinal de morte. Neste momento
poderíamos observar alterações bioquímicas e morfológicas nas células, agora, em apoptose
(EARNSHAW, 1999).
42
A via extrínseca da apoptose é mediada pelos chamados “receptores de morte” os quais
encontram-se nas superfícies celulares, transmitindo um sinal de morte para o interior da célula.
Receptores de morte incluem o gene da superfamília de receptores para o fator de necrose
tumoral (RTNF), incluindo RTNF-1, Fas (CD95), DR-4 e DR-5 (receptores TRAIL)
(ASHKENAZI, 2002). Todos os membros da família do RTNF possuem domínios
extracelulares ricos em cisteína o que pode dar orige a trimerização e ativação de seus
repectivos receptores de morte. Subseqüentemente o sinal é transduzido para o interior do
citoplasma sendo reconhecido pelo domínio de morte do receptor (DD). Moléculas adaptadores
do tipo FADD ou TRADD possuem DDs os quais recrutam e ativam os complexos indutores
dos domínios de morte, reconhecidos como DISC. Em adição aos DDs, os adaptadores FADD
contém os domínios efetores de morte (DED), os quais interagem formando um complexo
DED-DED seqüestrando pró-caspases 8 para o complexo DISC (SCAFFIDI, 1998).
O papel das mitocôndrias na apoptose tem se tornado um foco para o desenvolvimento
de agentes neuroprotetores e de neuroresgete. De particular interesse é a possível associação
entre anormalidades bioquímicas na substância negra de paciente com DP, incluindo defeitos
no complexo I e geração de radicais. Isto iria, com efeito, diminuir o limiar para a apoptose e
poderia explicar o porque de uma proporção relativamente alta de celulas apoptóticas ser
encontrada em exames de cérebros de pacientes com DP (ANGLADE et al., 1997). As
anormalidades bioquímicas envolvidas na patogênese podem causar um decréscimo no
potencial de ação em uma proporção de células e uma conseqüente diminuição no limiar para
apoptose.
Essas vias de resposta convergem na mitocôndria, freqüentemente através da ativação de
um membro pro-apoptótico da família Bcl-2. Ao contrário do Bcl-2, que parece passar a maior
parte senão toda sua vida acoplado a membranas intracelulares, muitos membros do grupo II e
grupo III, incluindo Bax, Bad, Bim e Bid, podem mover-se entre citosol e organelas. Durante a
apoptose há liberação de citocromo c pela mitocôndria. Uma vez liberado, o citocromo c se
associa com a proteína APAF 1 (apoptotic protease-activating factor 1) e a procaspase-9 para
43
formar o apoptosomo. Na presença de ATP, a caspase 9 é ativada, ativando outros efetores,
incluindo a caspase 3, que finalmente leva a apoptose. Proteínas antiapoptóticas tais com Bcl-2
residem na mitochondria e bloqueiam a liberação do citocromo c, possivelmente pelo sequestro
de Bax (figura 5) (MICHEL, 2000).
FIGURA 5– Cascata da apoptose (MICHEL, 2000)
1.7. Modelo da Doença de Parkinson
Modelos de experimentação em animais são importantes ferramentas que auxiliam o
estudo tanto dos mecanismos patogênicos quanto os princípios terapêuticos na doença de
Parkinson. Os mais importantes são o modelo de depleção de monoaminas pela reserpina,
catalepsia induzida por neurolépticos, lesão com 6-hidroxidopamina (6-OHDA) e 1-metil-4-
fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP). Os modelos in vitro mais usados são intoxicação por
rotenona e paraquat, degeneração nigro-estriatal induzida por 6-OHDA e MPTP (GERLACH
44
et al., 1996; VON BOHLEN ; HALBACH et al., 2004). Hipóteses que explicam os
mecanismos de como agem estas neurotoxinas, principalmente 6-OHDA e MPTP, foram
relacionados com a patogênese da morte de células da substância negra na doença de Parkinson
(GERLACH et al., 1996).
A 6-OHDA foi encontrada como produto endógeno em pacientes com DP. Isso sugere
que ela pode desempenhar um papel na patogênese dessa doença (GLINKA et al.,1997;
JELLINGER et al., 1995). A 6-OHDA forma radicais livres e é um potente inibidor dos
complexos I e IV da cadeia respiratória mitocondrial (GLINKA et al., 1997). Quando injetada
na substância negra de ratos, a 6-OHDA produz uma perda acentuada dos neurônios
dopaminérgicos nigro-estriatais, e uma infusão estriatal contínua pode produzir uma axotomia
terminal de neurônios dopaminérgicos topograficamente limitada e uma prolongada debilidade
comportamental podendo ser evideniciada por mudanças unilaterais que levam a uma
assimetria funcional a qual é quantificada utilizando-se um teste rotacional induzido por
agonistas dopaminérgicos diretos (apomorfina) e indiretos (anfetamina) (PRZEDBORSKI et
al.,1995).
O MPTP é convertido pela monoamina oxidase B (MAO B) a MPP
+
. Como a 6-OHDA,
o MPP
+
é captado por transportadores de dopamina e depois acumula-se na mitocôndria,
levando à inibição do complexo I mitocondrial. Ao contrário da 6-OHDA, o MPP
+
pode ser
captado por vesículas de transporte de monoaminas, o que reduz sua toxicidade. O paraquat e a
rotenona também inibem o complexo I mitocondrial e o maneb inibe o complexo III (VON
BOHLEN UND HALBACH et al., 2004) (Figura 6).
A 6-OHDA atua possivelmente induzindo lesão dopaminérgica nigro-estriatal por
geração de peróxido de hidrogênio e seus radicais hidroxila derivados, (SACHS et al., 1975),
presumivelmente iniciado por um metal de transição tal com o ferro. A prevenção parcial ou
até completa dos efeitos da 6-OHDA e do ferro por uma prévia administração de agentes
quelantes de ferro (BEN-SHACHAR et al., 1991a), vitamina E (CADET et al., 1989) e
45
inibidores da MAO-B como a selegilina (KNOLL et al., 1986), pode explicar o mecanismo de
proteção destes compostos.
Evidências demonstram que a 6-OHDA gera espécies reativas de oxigênio, induzindo
apoptose de células dopaminergicas na substância negra de ratos (COHEN et al., 1974;
WALKINSHAW et al., 1994; HE et al., 2000), embora seu mecanismo molecular não esteja
bem evidenciado, estudos recentes sugerem o envolvimento de mecanismos de estresse
oxidativo que facilitam a conversão da 6-OHDA em uma quinona com a formação de H
2
O
2
,
iniciando assim uma sinalização de morte celular específica por ativação de fatores de
transcrição tais como caspase-3, NFkB, P53 e C-Jun (DEL RIO ; VELEZ-PARDO, 2002).
FIGURA 6– As neurotoxinas utilizadas em modelos de doença de Parkinson (VON BOHLEN
UND HALBACH et al., 2004).
1.8. Plantas Medicinais
Apesar do uso de produtos derivados de plantas e animais ter sido bem documentado por
séculos, suas ações bioquímicas não foram observadas e analisadas cientificamente até os
46
meados dos séculos XVIII e XIX, particularmente no início de 1800 quando um importante
número de substâncias com ações farmacológicas foram identificadas (CLARK et al., 1996).
Segundo estimativa da Organização Mundial de Saúde, 80% da população mundial usa
os recursos das medicinas populares para suprir as necessidades de assistência médica primária
(FARNSWORTH et al., 1985). A medicina tradicional, baseada no uso de produtos obtidos a
partir de plantas, vem sendo responsável por aproximadamente 85% dos medicamentos
utilizados em países desenvolvidos (BUDD et al.,1983). No Brasil, o uso de plantas medicinais
e preparações caseiras assumem fundamental importância no tratamento das doenças que
afetam as populações de baixa renda, tendo em vista a deficiência da assistência médica, a
influência dos hábitos culturais e a disponibilidade da flora (MATOS et al.,1989).
No Brasil, 20% da população é responsável pelo consumo de 63% de medicamentos
industrializados, o restante encontra nos produtos de origem natural, especialmente as plantas
medicinais, a única fonte de recursos terapêuticos (DI STASI, 1996). Esta alternativa é
utilizada tanto dentro de um contexto cultural, na medicina popular, quanto na forma de
fitoterápicos.
As plantas são uma fonte importante de produtos naturais biologicamente ativos, muitos
dos quais se constituem em modelos para a síntese de um grande número de fármacos.
(GUERRA ; NODARI, 2000). A espetacular diversidade molecular de padrões estruturais pode
ser encontrada nas distintas classes de produtos naturais, como flavonóides, isoflavonóides,
lignanas, neolignanas, glicosídeos, cumarinas, cromonas, isocromonas, quinonas, alcalóides,
entre outras, as quais representam uma fonte inesgotável de modelos originais de arquitetura
enantiopura (BARREIRO ; FRAGA, 2001b).
A magnitude da biodiversidade brasileira não é conhecida com precisão tal a sua
complexidade, estimando-se a existência de mais de dois milhões de espécies distintas de
plantas, animais e microorganismos. O Brasil é o país com maior diversidade genética vegetal
47
do mundo, contando com mais de 55000 espécies catalogadas de um total estimado entre
350000 e 550000. Mais da metade dessas espécies encontra-se nas florestas tropicais, cuja área
corresponde a apenas 7% da superfície da terra (SOEJARTO, 1996).
Só a floresta tropical amazônica brasileira abriga 17% da biodiversidade do país. Já a
floresta atlântica contém aproximadamente 35% das Angiospermas do mundo, e mais de 8%
das Pteridófitas (SUFFREDINI et al., 2004). O maior número de espécies encontra-se nas
regiões equatoriais da América do Sul, da África e da Ásia e o máximo de diversidade global
encontra-se na flora da Colômbia, Equador e Peru. Em todo o território dos Estados Unidos e
Canadá, a magnitude da diversidade genética vegetal nativa limita-se a 700 espécies.
Apenas 8% das espécies vegetais da flora brasileira foi estudada em busca de compostos
bioativos e 1100 espécies foram avaliadas em suas propriedades medicinais. Destas, 590
plantas foram registradas no Ministério da Saúde para comercialização (GUERRA ; NODARI,
2000).
Até o ano de 2015, entre 4 e 8% de todas as espécies vivas presentes nas florestas
tropicais podem desaparecer. A América do Sul detém 52% destas
florestas e somente na
década de 80, o Brasil respondeu por 28% das perdas das florestas tropicais e por 14% dos
outros tipos de florestas. As principais causas da perda da diversidade genética têm sido
associadas à destruição e à fragmentação dos ecossistemas e aos estresses ambientais como a
poluição e as mudanças climáticas globais (JUTRO, 1991). Entretanto, a exploração de plantas
de uso medicinal da flora nativa através da extração direta nos ecossistemas tropicais tem
levado a reduções drásticas das populações naturais dessas espécies, seja pelo processo
predatório de exploração, seja pelo desconhecimento dos mecanismos de perpetuação das
mesmas.
Um aspecto menos discutido na questão da devastação das florestas tropicais refere-se à
perda do conhecimento, acumulado por milênios, sobre o uso medicinal tradicional das plantas
48
destas florestas pelas populações a elas associadas. Esta devastação provoca a migração destas
comunidades, normalmente para centros urbanos, provocando o rompimento do fluxo de
conhecimento adquirido e acumulado ao longo do tempo.
Os fitoterápicos têm sido, no caso do Brasil e de muitos países, o suporte da indústria
farmacêutica genuinamente nacional de pequeno e médio porte. Segundo um estudo realizado
pela OMS, o mercado mundial de todos os medicamentos no mundo é de cerca de US$ 480
bilhões. Já o mercado de fitomedicamentos está na ordem de US$ 20 bilhões anuais, com cerca
de US$ 400 milhões no Brasil, e vem apresentando taxas de crescimento internas da ordem de
15%, contra apenas 4% dos medicamentos sintéticos (ALVES, 2004). No Canadá, as vendas
crescem 15% ao ano, enquanto nos Estados Unidos esse número chega a 20 %. No Brasil,
estima-se que 25% dos US$ 8 bilhões de faturamento, em 1996, da indústria farmacêutica
nacional tenham sido originados de medicamentos derivados de plantas (ALVES, 2004).
Dois fatores podem explicar esse crescimento. O primeiro é o desejo de encontrar uma
alternativa aos medicamentos sintéticos, em geral muito caros e carregados de efeitos
colaterais. O segundo e o mais importante é o respaldo cada vez mais sólido que a ciência está
oferecendo às drogas a base de plantas. A partir da constatação de que muitas vezes a sabedoria
popular de fato tem fundamento, diversos pesquisadores deixaram de lado o preconceito e
partiram para a pesquisa sobre o poder medicinal das plantas (DI STASI, 1996).
As potencialidades de uso das plantas medicinais encontram-se longe de estarem
esgotadas. A tarefa de desenvolver, a partir de plantas medicinais, produtos com constância de
composição e propriedades terapêuticas reprodutíveis, como se exige dos demais
medicamentos, ainda é muito complexa. A transformação de uma planta medicinal em um
medicamento é, portanto, uma tarefa que apresenta problemas diferenciados daqueles que
caracterizam a busca de protótipos para novos fármacos. Desta forma, é necessário um esforço
conjunto entre botânicos, químicos, fisiologistas, toxicologistas e farmacologistas, para validar
o uso empírico de produtos vegetais pela população e livrar os países em desenvolvimento da
dependência externa.
49
Além destas prerrogativas, faz-se necessário buscar urgentemente novas parcerias
entre governo, indústrias e universidades, no sentido de encontrar alternativas de investimento
para os programas de saúde pública, tanto na geração de recursos direcionados à produção, bem
como à pesquisa e formação de recursos humanos especializados, para atuarem junto às
comunidades a fim de proporcionar a melhoria da qualidade de vida de nosso povo.
1.9. Flavonóides
Os flavonóides, assim como outros metabólitos secundários, são produzidos pelas
plantas a partir dos metabólitos primários através de rotas biossintéticas diversas e
freqüentemente desconhecidas, às custas de energia. Esses pigmentos representam um dos
grupos fenólicos mais importantes e diversificados entre os produtos de origem natural. Essa
classe de compostos é amplamente distribuída no reino vegetal, principalmente entre os
vegetais superiores, sobretudo em partes aéreas: folhas, flores e frutos. São raros em algas,
briófitas, fungos e pteridófitas. Todavia, estão presentes em abundância em angiospermas,
apresentando neste grupo grande diversidade estrutural (ZUANAZZI, 2000).
O núcleo fundamental dos flavonóides, dois anéis aromáticos conectados por uma cadeia
de três átomos de carbono (C
6
– C
3
– C
6
), resulta de rotas biossintéticas distintas: a do ácido
chiquímico e a do acetato, via ácido malônico. A primeira origina fenilalanina, o precursor do
ácido cinâmico, responsável por um dos anéis aromáticos (anel B) e a ponte de três carbonos. A
segunda, resulta no outro anel aromático (anel A) do núcleo fundamental dos flavonóides (DOS
SANTOS, 2000) (Figura 7). Os flavonóides de origem natural apresentam-se freqüentemente
oxigenados e um grande número ocorre conjugado com açúcares (heterósides) ou sob a forma
dos respectivos compostos aglicônicos livres.
Nas plantas, diversas funções são atribuídas aos flavonóides. Entre elas podemos citar:
a) proteção dos vegetais contra os raios UV e visível, além de proteção contra insetos, fungos,
50
vírus e bactérias; b) atraentes de animais com finalidade de polinização; c) antioxidantes; d)
controle da ação de hormônios vegetais; e e) inibição de enzimas (ZUANAZZI, 2000;
HARBORNE e WILLIAMS, 1999).
O
O
A
B
C
5
6
7
8
3
2
2'
3'
4'
5'
6'
FIGURA 7– Núcleo fundamental dos flavonóides.
São conhecidos mais de 8000 flavonóides, sendo que o número de novas estruturas
identificadas praticamente dobrou nos últimos vinte anos (PIETTA, 2000). Os flavonóides e
derivados constituem uma das mais importantes classes de compostos biologicamente ativos,
sendo por vezes denominados “bioflavonóides”, por apresentarem um largo espectro de
atividade biológica, além da multiplicidade de ações observadas em alguns membros do grupo.
Primariamente reconhecidas como pigmentos responsáveis pela coloração de flores e
frutos (TIMBERLAKE ; HENRY., 1986; BROUILLARD ; CHEMINANT., 1988), os
flavonóides são encontrados em frutos, vegetais, hervas, flores, especiarias, troncos, sementes,
bem como em chás e vinhos tinto. Eles são componentes proeminentes de frutas cítricas
(CHANDLER ; KEFFORD, 1966) e são consumidos regularmente na dieta humana. Dentre os
principais flavonóides, destacamos o flavanol (chá verde, chá preto e vinho tinto), flavanona
(casca de frutas cítricas, frutas cítricas), flavonol (alho-porró, uva, chá preto, cebola, alface,
brócolis, casca de maçã, azeitona, vinho tinto), flavona (casca de frutas, aipo, salsa),
antocianidinas (uva roxa, vinho tinto, framboesa, cereja, morango e casca de frutas coloridas)
51
(WILHELM et al., 2001). Essas substâncias de baixo peso molecular, encontradas em todas as
plantas vasculares, são fenilbenzoil-pironas (fenilcromonas) com um sortimento de estruturas
baseadas em um núcleo comum formado por três anéis. Eles são usualmente subdivididos de
acordo com seus substituintes.
Flavonóides e tocoferol (vitamina E) mostram uma estrutura em comum isto é um anel
cromona. Tem sido realizados grandes esforços para quantificar os diferentes flavonóides em
plantas de consumo alimentar (RICE-EVANS ; PACKER ., 1998) .
Os componentes estruturais da molécula, incluem dois anéis benzênicos de cada lado de
um anel de 3 carbonos. Combinações múltiplas de grupos hidroxilas, açucares, oxigênio, e
grupos metilas ligados a essas estruturas dão origem as várias classes de flavonóides a saber:
flavanóis, flavanonas, flavonas, flavan-3-ois (catequinas), antocianinas e isoflavonas. Vários
estudos mostraram que os flavonóides são potentes antioxidantes, capazes de seqüestrar
radicais hidroxilas, ânions superóxidos e radicais peroxilipídicos. Dois estudos
epidemiológicos recentes (HERTOG et al., 1993; KNEKT et al.,1996) revelaram uma
correlação inversa entre os flavonóides da dieta e a mortalidade por doenças cardíacas. Um
desses estudos realizado na Finlândia com 5133 homens e mulheres encontrou que aqueles
indivíduos com conteúdo alto de flavonóides na dieta apresentaram um risco menor para
doenças coronárias.
Alguns trabalhos têm documentado os benefícios de uma dieta rica em frutas, vegetais,
azeite de oliva, vinho e chás para as doenças cardiovasculares (GIUGLIANO, 2000). Em
muitos países o elevado consumo de gorduras saturadas está fortemente relacionado com a alta
mortalidade por doenças coronarianas. No entanto, este não é o caso de algumas regiões da
França, onde a taxa de mortalidade por doenças coronarianas é aproximadamente 50 % menor
que aquelas de outros países da Europa e dos Estados Unidos (ROSENKRANZ et al., 2002,
HARBORNE e WILLIAMS, 1999). Este fenômeno chamado French paradox pode ser
explicado pelo consumo regular de vinho na dieta, particularmente de vinho tinto, visto que
52
estudos epidemiológicos mostram que este consumo reduz o índice de mortalidade e morbidade
por doenças cardíacas coronarianas (DAS et al., 1990; ROSENKRANZ et al., 2002).
Existem estudos que relatam os benefícios do azeite puro de oliva em patologias como
câncer, especialmente de mama, estômago, cólon, endométrio e ovário, patologias
gastrointestinais como úlceras pépticas, colelitíase e mobilidade gástrica. O óleo de oliva
diminui ainda o risco de artrite reumatóide e melhora a sua evolução. Em indivíduos com
diabetes melitus, o azeite de oliva aumenta a sensibilidade à insulina, diminui a pressão
sangüínea e reduz os níveis das lipoproteínas aterogênicas (ZAMORA-ARDOY et al., 2004).
Estudos recentes demonstraram que o azeite de oliva extravirgem contém em
abundância compostos fenólicos antioxidantes como fenóis simples (hidroxitirosol, tirosol),
flavonóides, secoiridóides aldeídicos e lignanas (acetoxipinoresinol, pinoresinol). Todas estas
substâncias fenólicas são potentes inibidores do ataque de espécies reativas de oxigênio
(EROS). Existem evidências que as ERO estão envolvidas na etiologia de neoplasias ligadas à
gordura como o câncer de mama e colorretal (OWEN et al., 2000). Este estudo, usando uma
metodologia mais acurada de cromatografia líquida de alta performance (HPLC) para
quantificação de EROS, demonstrou que os compostos fenólicos antioxidantes presentes no
azeite de oliva extravirgem são potentes inibidores da geração de radicais livres pela matriz
fecal. Estes achados indicam que o estudo da inter-relação entre EROS e antioxidantes da dieta
é uma área muito promissora para elucidação dos mecanismos envolvidos na carcinogênese
colorretal e para futuras estratégias de prevenção deste tipo de câncer (OWEN et al., 2000).
SEERAM e cols. (2001) demonstraram que a cianidina, um flavonóide presente nas
cerejas, possui uma significante atividade inibitória das enzimas COX-1 e COX-2 com valores
de IC
50
de 90 e 60 µM respectivamente, quando comparadas a IC
50
de 1050 µM para aspirina
em ambos os testes. A inibição preferencial deste flavonóide pela COX-2 pode ser útil para
pacientes em uso crônico de drogas antiinflamatórias não-esteroidais cujos efeitos adversos são
atribuídos em grande parte à inibição da COX-1.
53
A natureza tem sido uma fonte contínua de moléculas farmacologicamente ativas e as
plantas medicinais têm sido usadas por incontáveis gerações. Apesar disso, surpreendentemente
poucas plantas têm demonstrado atividade neuroativa. Existem evidências experimentais de
que a kava e os extratos de Ginkgo biloba possuem atividade neuroprotetora (BASTIANETTO
; QUIRION, 2002; ASSEMI, 2001; OYAMA et al., 1994).
Evidências substanciais sugerem que o acúmulo de peptídeos derivados da proteína
beta-amilóide e em menor extensão radicais livres, podem contribuir para etiologia e
progressão da doença de Alzheimer. BASTIANETTO e cols. (2000) demonstraram que o
extrato de Ginkgo biloba, rico em flavonóides e terpenos, bloqueia completamente os eventos
induzidos pelo peptídio beta-amilóide como, acumulação de EROs e apoptose em cultura de
células de hipocampo.
O perfil antioxidante dos flavonóides provavelmente é a base para a suas atividades
neuroprotetoras cerebrais. Sua biodisponibilidade e particularmente sua presença no cérebro in
vivo parece ter um papel importante na expressão da sua capacidade neuroprotetora. É sabido
que transformações metabólicas como glicuronidação, metilação e outras reações, são a regra e
uma pequena quantidade de flavonóides livres como agliconas estão presentes no sangue
(AZUMA et al., 2002). Entretanto, as barreiras cerebrais parecem ser um obstáculo adicional
para a penetração dos flavonóides no cérebro.
A quercetina é a molécula mais representativa do grupo dos flavonóides e está presente
em vegetais e frutas, com consumo diário de cerca de 25 mg/dia na dieta humana (DAJAS et
al., 2003a). COSTA e cols. (2001) demonstraram que a quercetina atravessa pobremente a
barreira hemato-encefálica (BHE). Em um estudo posterior DAJAS e cols. (2002)
demonstraram que a mistura da quercetina com a lecitina gera uma preparação lipossômica que
aumenta a possibilidade deste flavonóide de atravessar a BHE. Por conseguinte, o complexo
quercetina/lecitina, diminuiu o volume da lesão isquêmica em 56%, mostrando que esta mistura
54
atravessa eficazmente a BHE. Esta diminuição no volume da lesão foi similar àquela obtida
com o uso de bloqueadores de canal de cálcio (O’NEILL et al., 2001).
Dentre as poucas investigações do efeito de flavonóides no cérebro in vivo,
SHUTENKO e cols. (1999) caracterizaram mudanças nos níveis de NO em um modelo de
isquemia global com reperfusão, na presença de quercetina. Estas mudanças foram atribuídas à
ação deste flavonóide como varredor de radicais livres. Também foi descrito o efeito benéfico
da quercetina no choque endotóxico, explicado pela inibição da lipoperoxidação, através do
aumento da atividade da glutationa peroxidase (ABDEL-GAWAD ; CALIFA, 2001).
A capacidade dos flavonóides de inibir a ação de diversas enzimas pode ativar
mecanismos sinalizadores de sobrevivência, exercendo um efeito antioxidante indireto em
adição a um efeito direto de varredor de EROs. É importante mencionar ainda que os
flavonóides também exercem seus efeitos ao nível de glia e vasos cerebrais. Ao nível de
microvasculatura, a atividade antioxidante e antiinflamatória pode ser adicionada à
vasodilatação, melhorando o fluxo sangüíneo e o processo isquêmico (DAJAS et al., 2003b).
Além dos efeitos neuroprotetores há ainda estudos que mostram que os flavonóides
podem ser usados como ansiolíticos e antidepressivos (WOLFMAN et al., 1994; VIOLA et al.,
1995; BUTTERWECK et al., 2000).
Muitas outras atividades farmacológicas são descritas para os flavonóides, dentre estas
estão a anticancerígena. Embora muitos estudos confirmem que concentrações significativas de
flavonóides estejam presentes em vegetais como cebola, couve galega, brócolis e feijões; em
frutas como maçã e tomate; e em bebidas como vinho e chás, não existem estudos conclusivos
que mostrem o potencial anticancerígeno destes constituintes alimentares. Contudo, três
estudos foram feitos com flavonóides presentes na dieta, no tratamento de cânceres humanos.
55
O primeiro estudo mostrou que a genisteína, um flavonóide com atividade estrogênica,
presente nos grãos de soja, é capaz de bloquear a ação do fator transcripcional conhecido como
fator ligante de CCAAT, neutralisando-o antes que o início da leitura seja ativado, dessa forma
a mesma faz com que a célula cancerígena definhe, feneça e morra (COGHLAN, 1998). A
genisteína não produz efeitos danosos sobre células normais. Portanto, este flavonóide,
comumente consumido na dieta, é capaz de estabilizar o crescimento de células cancerígenas,
assim como parar o processo angiogênico.
Os outros dois estudos foram feitos com flavonóides, especialmente as catequinas
(flavan-3-ois), presentes em concentrações elevadas no chá. Cânceres humanos necessitam de
enzimas proteolíticas, como a uroquinase, para invadir células e formar metástases. A inibição
da uroquinase pela epigalocatequina-3-galato (EGCG) em camundongos, diminui o tamanho
do tumor e pode levá-lo até mesmo a remissão completa. A EGCG age ligando-se a uroquinase,
bloqueando a histidina 57 e a serina 195 no seu sítio catalítico (JANKUN et al., 1997).
O segundo estudo feito com a EGCG mostrou que a mesma é capaz de suprimir a
angiogênese, um processo chave requerido para o crescimento de novos vasos sanguíneos
necessários para alimentar o tumor, fazendo com que o mesmo cresça e se metastize (CAO ;
CAO, 1999). Portanto, a EGCG pode ser um importante constituinte da dieta agindo como
preventivo para o crescimento de muitos tipos de câncer no homem.
Os flavonóides são capazes de agir através de vários mecanismos sobre os componentes
sangüíneos, como plaquetas, lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e músculo liso. As
plaquetas são participantes chave na aterogênese e como mediadores pró-inflamatórios, visto
que o TXA
2
e o PAF são produzidos pelas mesmas. Os flavonóides podem inibir a agregação,
a adesão e a secreção plaquetária (HARBORNE ; WILLIAMS, 1999).
Diversos flavonóides têm sido referidos como agentes hepatoprotetores. O extrato
metanólico das folhas de Combretum quadrangulare, rico em flavonas apresentou significante
56
atividade hepatoprotetora na morte celular induzida por D-galactosamina/TNF-α em cultura de
hepatócitos de camundongos (BANSKOTA et al., 2000). Os flavonóides isolados de Apocynum
venetum também mostraram potente atividade hepatoprotetora, inibindo a morte celular
induzida por TNF-α (XIONG et al., 2000).
A propriedade antiviral dos flavonóides tem sido reconhecida por aproximadamente 40
anos, mas somente nos últimos anos com o surgimento de novos vírus, tem-se desenvolvido
algumas modificações estruturais para melhorar a atividade e perfil farmacocinético destes
compostos, além de tentar eliminar ou diminuir sua toxicidade e mutagenicidade quando as
mesmas existem (SELWAY, 1986). Alguns derivados flavônicos como as chalconas e
flavonas, podem apresentar atividade antiviral, inibindo seletivamente diferentes sorotipos de
rinovírus (BAUER et al., 1981).
Recentemente muitos flavonóides tiveram suas atividades avaliadas contra o vírus da
imunodeficiência humana (HIV), o agente causador da síndrome da imunodeficiência adquirida
(AIDS) e alguns destes flavonóides parecem ter atividade inibitória direta sobre este vírus. Este
parece ser o caso da baicalina, uma flavona isolada de Scutellaria baicalensis (LI et al., 1997).
Outros flavonóides são inibidores das enzimas responsáveis pela replicação viral. Por exemplo,
as biflavonas robustaflavona e hinokiflavona são ativos contra transcriptase reversa do HIV-1
(LIN et al., 1997). Já a quercetina, isolada da Acer okamatoanum é inibidora da integrase do
HIV-l (KIM et al., 1998).
Além da atividade antiviral, diversos flavonóides podem apresentar atividade
antimicrobiana. Por exemplo, a quercitrina, isolada de Euphorbia hirta (Euphorbiaceae) e a
cirsimarina, isolada de Microtea debilis (Phytolaccaceae) são usadas para tratar vários tipos de
infecções bacterianas, especialmente diarréias infecciosas (HARBORNE ; WILLIAMS, 1999).
Além destas, o flavonóide 5,7,2’,6’-tetrahidroxi-6-prenil-8-lavandulil-4’-metoxiflavanona inibe
completamente o crescimento de Staphylococcus aureus com concentrações inibitórias entre
1,56 e 6,25 µg mL
−1
(IINUMA et al., 1994). Esta flavona é particularmente ativa contra cepas
57
de S. aureus resistentes a antibióticos, podendo ser útil no tratamento de pacientes
hospitalizados durante longos períodos, onde a infecção por este patógeno é comum.
Flavonóides obtidos de plantas em geral são bem conhecidos antioxidantes e, além
destas propriedades, tem também sido relatadas ações queladores de metal e antiinflamatórias
(BRAVO et al., 1998 e MIDDLETON et al., 2000). Portanto, a natureza multifuncional destes
compostos os torna fortes candidatos para a terapia contra a DP. Recentemente, o chá verde que
contém vários componentes polifenólicos demonstrou atenuar a morte celular
in vitro
induzida
pela 6-OHDA em feocromocitoma e neuroblastoma. (LEVITES et al., 2002).
O termo chalcona é utilizado para caracterizar uma família de compostos que possuem
como núcleo fundamental o 1,3-diarilpropano, modificado pela presença de uma ligação
olefínica, de um grupamento cetona e/ou de um grupamento hidroxila (Figura 8). As chalconas
são compostos precursores da via de biossíntese dos flavonóides. Uma característica importante
neste grupo é a pigmentação amarela apresentada pelos mesmos, que passa a vermelha em
meio alcalino. Essas substâncias têm um papel importante em sistemas ecológicos em função
das cores que produzem nos vegetais e são encontradas em diferentes órgãos, sobretudo nas
flores. As cores estão implicadas especialmente na polinização como atraentes de insetos e/ou
pássaros. Apresentam uma grande variedade de atividades biológicas, sendo as mais comuns
edulcorantes ou protetores contra a luz e calor (BRAVO et al., 1988).
O
A
B
6'
4'
2'
5
3
α
β
β
'
FIGURA 8– Núcleo fundamental das chalconas.
58
Além do papel sobre sistemas ecológicos e das atividades biológicas, as chalconas têm
despertado grande interesse farmacológico. Nos últimos anos, têm sido documentadas as
atividades: antiinflamatória, antinociceptiva (VIANA et al., 2003), antitumoral, antimicrobiana
(RAFI et al., 2000) e antioxidante para várias chalconas e seus derivados sintéticos (LEBEAU
et al., 2000).
Dentre as várias chalconas com atividade antiinflamatória e antinociceptiva podemos
citar as chalconas presentes na fração isolada de Miracrodruon urundeuva (VIANA et al.,
2003b), a 3,4-diclorochalcona, com potente efeito na dor inflamatória (CORREA et al., 2001),
as chalconas derivadas de 2’-hidroxi e 2’,5’-dihidroxichalcona que exibiram efeito
antiinflamatório através da inibição da liberação de beta-glicuronidase e lisozima a partir de
neutrófilos estimulados com formil-Met-Leu-Phe/citochalasina B (fMLP/CB) e uma forte
atividade inibitória sobre a degranulação de mastócitos e formação de NO a partir de células
microgliais murinas estimuladas com lipopolissacarídeo (LPS) (HSIEH et al., 2000) e ainda as
chalconas dimetilamino-chalcona e 3,4,5-trimetoxi-4’-fluorochalcona, que exercem seus efeitos
antiinflamatórios através da inibição da NOS indutível (iNOS) (ROJAS et al., 2002; ROJAS et
al., 2003).
Foi demonstrado que a 4-dimetilamino-3’,4’-dimetoxichalcona, além de apresentar
efeito inibitório sobre o edema de pata induzido por carragenina, também inibiu a migração e a
liberação de fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e eicosanóides em bolsa de ar subcutânea
estimulada com zimosan em camundongos (HERENCIA et al., 2001).
A inibição da expressão de moléculas de adesão celular (CAM), incluindo as intercelular
CAM-1 (ICAM-1), vascular CAM-1 (VCAM-1), e E-selectina é um passo importante no
controle de diversos processos inflamatórios. Estas proteínas de adesão celular são induzidas
por várias citocinas inflamatórias como TNF-
α
, IL-1 e LPS bacteriano. O processo de indução
acontece primariamente ao nível transcripcional, onde o fator nuclear kappa B (NF-kB) tem o
59
papel principal. MADAN e cols. (2000) demonstraram que a 2’-hidroxichalcona inibe a adesão
de neutrófilos periféricos à monocamadas de células endoteliais através da inibição da
expressão da ICAM-1, VCAM-1 e E-selectina. A 2’-hidroxichalcona também inibe a indução
dos níveis basais de transcrição de ICAM-1, VCAM-1 e E-selectina pelo TNF-α, e ainda a
ativação do NF-kB, maior fator transcripcional envolvido na expressão de CAM (HERENCIA
et al., 2001).
Muitos trabalhos têm demonstrado a atividade antimicrobiana das chalconas. Dentre
estas podemos citar a retrochalcona licochalcona C, com atividade antibacteriana contra
Staphylococcus aureus com concentração inibitória mínima de 6,25
µ
g mL
−
1
(HARAGUCHI et
al., 1998). Essa chalcona estrogênica possui ativividade antitumoral e antiapoptótica, através da
modulação da proteína bcl-2 (RAFI et al., 2000).
Existem muitos exemplos de flavonóides com atividade antifúngica, não só contra
patógenos humanos, mas também contra aqueles que parasitam plantas. É o caso de duas
chalconas: 2’-4’-dihidroxi-6’-metoxi-3’-5’-dimetilchalcona e a 2’-4’-dihidroxi-6’-metoxi-5’-
metilchalcona, presentes nas folhas de Myrica cerrata que são inibidoras do crescimento de
Cladosporium cucumerinum (GAFNER et al., 1996).
Existem relatos de que algumas chalconas podem apresentar atividade antiprotozoária.
Os protozoários do gênero Trypanosoma causam um grande espectro de doenças em
hospedeiros humanos. O Trypanosoma brucei brucei, transmitido pela mosca tsetse, causa uma
doença responsável por um importante problema de ordem econômica em algumas partes da
África. Algumas chalconas ativas in vitro e in vivo contra Plasmodium falciparum, também
foram testadas no crescimento de formas sangüíneas do T. b. brucei em cultura de células e em
modelo murino de tripanossomíase, para investigar sua habilidade em inibir a tripanopaina-TB,
a principal cisteína proteinase do T. b. brucei (TROEBERG et al., 2000). Os resultados deste
trabalho demonstraram que muitas chalconas inibiram o crescimento in vitro e in vivo do T. b.
brucei, sugerindo que as mesmas são promissores agentes quimioterápicos antitripanossomíase.
60
Dos frutos de Neoraputia magnifica var. magnifica, foram isoladas duas novas
chalconas, e várias chalconas de estrutura já conhecida. Todas essas substâncias foram testadas
e mostraram-se ativas como inibidores da enzima glicossomal gliceraldeído-3-fosfato
desidrogenase do Trypanosoma cruzi, agente causador da doença de Chagas (TOMAZELA et
al., 2000).
Dentre os flavonóides, as chalconas têm sido relatadas como compostos atraentes com
propriedades quimioprotetoras e antitumorais. As chalconas 4,2’,6’-trihidroxi-4’-
metoxidihidrochalcona, 2’,6’-dihidroxi-4’-metoxidihidrochalcona, e 2’,4’-diacetoxichalcona,
isoladas das partes aéreas de Ononis natrix ssp. ramosissima (Leguminosae), apresentam
moderada atividade citotóxica contra P-388 (leucemia murina), A-549 (carcinoma de pulmão
de não-pequenas células humano) e HT-29 (câncer de colon humano). Entretanto, o composto
mais potente, a 2’,6’-diacetoxi-4,4’-dimetoxidihidrochalcona, mostrou atividade seletiva pela
linhagem de células P-388 (FOREJTNIKOVA et al., 2005; KIMURA, 2005).
A chalcona 3,4,3’,4’,5’-pentametoxichalcona é um potente agente citotóxico, que atua
ligando-se à tubulina, impedindo a montagem dos microtúbulos (LAWRENCE et al., 2000). A
chalcona pedicina (2’,5’-dihidroxi-3’,4’,6’-trimetoxichalcona) isolada das folhas de Fissistigma
languinosum (Annonaceae), também age a nível de tubulina, interrompendo a montagem destas
subunidades em microtúbulos (ALIAS et al., 1995). Nesta mesma planta foram descobertas
duas novas chalconas condensadas, fissistina e isofissistina, citotóxicas contra células KB
(ALIAS et al., 1995).
Com base em sua descoberta de que a licochalcona A isolada de Xin-jiang licorice
possui atividade antiinflamatória e antitumorigênica, SHIBATA (1994) sintetizou e estudou a
atividade antimutoral in vitro e in vivo de 40 chalconas derivadas da licochalcona A. Os
resultados obtidos demonstraram que muitos destes compostos possuem uma grande potência
em inibir a tumorigênese. Dentre estes estão a 3’-metil-3-hidroxichalcona e a 4’-metil-3-
61
hidroxichalcona, que além de inibir a fosforilação de fosfolipídeos promovida pelo acetato de
tetradecanoilforbol (TPA) em células HeLa in vitro, o crescimento de tumores em pele de
camundongos iniciados com dimetilbenz[a]-antraceno e promovido por TPA também
apresentam uma marcante atividade inibitória sobre a proliferação de células HGC-27 (câncer
gástrico humano).
Evidências epidemiológicas sugerem claramente uma relação inversa entre a ingestão de
flavonóides e risco cardiovascular. LEBEAU e cols. (2000) demonstraram que vários
flavonóides possuem forte atividade antioxidante e que dentre estes as chalconas apresentam
melhor atividade, com doses efetivas (ED
50
) menores que as da vitamina E e da quercetina. As
chalconas encontradas no lúpulo também apresentam atividade inibitória sobre a oxidação de
LDL humanas. Este efeito é bem maior que aquele apresentado pela vitamina E e pela
genisteína (MIRANDA et al., 2000).
Há ainda chalconas com atividade antiplaquetária. TAWATA e cols. (1992)
demonstraram a ação antiagregante plaquetária da isoliquiritigenina, uma inibidora da aldose
redutase, purificada de Glycyrrhizae radix (licorice). Este agente inibe a agregação de
plaquetas in vitro, não só pela inibição da atividade da enzima cicloxigenase (COX) como
também da lipoxigenase (LOX) ou peroxidase em plaquetas. A isoliquiritigenina também
apresenta ação antiplaquetária in vivo.
1.10. Aroeira-do-Sertão (Myracrodruon urundeuva Allemão)
A aroeira-do-sertão (Myracrodruon urundeuva Allemão), Anacardiaceae, é uma árvore
encontrada no Brasil, principalmente na vegetação semi-árida do Nordeste, nas matas secas e
subúmidas, mais comumente nas encostas de serras. Ocorre também do México a Argentina,
atingindo a Bolívia e o Paraguai (BANDEIRA et al., 1993) (figura 9). As excicatas da planta
estão disponíveis no herbário Prisco Bezerra da Universidade Federal do Ceará com registro
n°14.999.
62
Myracrodruon urundeuva Allemão
(Aroeira do Sertão)
FIGURA 9– Aroeira do Sertão
63
Estudos de fracionamento químico revelaram que o extrato acetato de etila contém duas
frações principais, as primeiras com predomínio de compostos chalconicos e a segunda com
predominância de taninos catéquicos e pirogalicos (BANDEIRA et al., 1993).
Estudos etnofarmacológicos referem o uso da casca do tronco da Aroeira-do-sertão
desprovida de súber, ou seja, a entrecasca, como um dos remédios vegetais de uso ginecológico
mais freqüente e mais antigos em medicina popular do Nordeste do Brasil. Citam ainda seu
emprego no tratamento por via oral de doenças do aparelho respiratório, do aparelho urinário,
nas hemoptises e diarréias, sob a forma de infuso ou decocto (VIANA et al., 1995). A planta
tem excelente reputação popular no tratamento caseiro das seqüelas pós-partum, e de ferimento
da pele e na boca, usando-se concomitantemente, por via oral e por via tópica (BANDEIRA et
al., 1993).
Outro uso da planta seria no tratamento de úlcera péptica, utilizando as preparações
farmacotécnicas na forma de elixir de aroeira (MATOS et al., 1998 ; BANDEIRA et al.,1993).
Para complementar estes estudos foram realizados também, ensaios de toxicologia clínica e
laboratorial da preparação fitoterápica elixir de aroeira (BANDEIRA et al., 1993 ; VIANA et
al., 1995).
Estudos de farmacologia pré-clínica tem mostrado um potencial antiinflamatório,
cicatrizante e antiúlcera dos extratos hidroalcoólico e aquoso da entrecasca, bem como ausência
de toxicidade com auxílio de vários modelos experimentais (MATOS et al., 1998; VIANA et
al., 1995).
A aroeira-do-sertão, é hoje uma espécie ameaçada de extinção na categoria vulnerável
de tão escassa que é em todas as áreas de ocorrência, por causa da exploração extrativista
estimulada por suas qualidades madeireiras e pelo uso medicinal da sua entrecasca. Por isso foi
64
incluída na lista oficial de plantas da flora brasileira ameaçadas de extinção, conforme
estabelece a portaria do IBAMA de Nº 37–N de 03/04/92 no seu artigo primeiro (VIANA et
al.,1995).
No nosso estudo foi utilizado uma fração enriquecida de chalconas isolada da
entrecasca de Myracrodruon urundeuva Allemão contendo as chalconas diméricas urundeuvina
A, urundeuvina B, urundeuvina C (figura 10) as quais foram conhecidas apenas recentemente e
poucos estudos foram feitos até agora explorando o potencial farmacológico destes compostos,
principalmente no que se refere à suas ações no SNC (BANDEIRA, 2002).
FIGURA 10– Representação estrutural da fração enriquecida de chalcona (BANDEIRA, 2000).
Características fisicoquímicas das urundeuvinas.
Urundeuvina A: Fórmula molecular: C
30
H
22
O
9
; PM:526 Da; Ponto de fusão: 183,7°-
185,8°C; solubilidade: Acetato de etila, Acetona, Éter, Metanol.
Urundeuvina B: Fórmula molecular: C
30
H
20
O
10
; PM:524 Da; Ponto de fusão: 185°-
189°C; solubilidade: Acetato de etila, Acetona, Metanol.
Urundeuvina C: Fórmula molecular: C
30
H
22
O
10
; PM:542 Da; Ponto de fusão: 220
°
-
222
°
C; solubilidade: Acetato de etila, Acetona, Metanol.
65
Com base nos trabalhos mostrando que as chalconas por suas atividade antioxidantes são
neuroprotetoras, resolvemos investigar uma possível ação citoprotetora da fração enriquecida
de chalconas isolada da M. urundeuva, usando um modelo in vitro que simula algumas das
anormalidades bioquímicas, como o aumento da peroxidação lipídica, encontrados na DP.
1.11. Inositois
Embora os inositois tenham sido identificados há mais de 100 anos na urina de
pacientes diabéticos, o papel desta substância na nutrição animal não foi estudado até 1951,
quando se descobriu que eles têm ação lipotrópica (BEST et al., 1951) e hepatoprotetora
(GARGINI, 1951). O papel nutricional foi descoberto mais tarde quando se descobriu que era
essencial para o crescimento celular. O inositol é um poliálcool cíclico contendo um anel de
seis átomos de carbono e seis grupos OH (cicloexanopoliol), sendo um importante constituinte
celular, estando envolvido em diferentes processos bioquímicos. Em mamíferos o inositol
existe principalmente sob a forma de derivados fosforilados, os quais participam da
comunicação celular. Podem ser arranjados em nove estereoisômeros: scilo, mio, neo, epi, D e
L quiro, cis, muco e allo. Dentre estes, o mio-inositol é o mais abundante na natureza, sendo
produzido a partir da glicose (COHEN et al., 1986). A fonte do inositol da dieta vem de frutos
e grãos de cereais, na forma de ácido fítico (mio-inositol hexafosfato). O inositol é absorvido
no trato gastrintestinal e metabolizado em glicose, sendo a concentração no plasma humano em
torno de 28 µM (5mg/L), com altas concentrações no músculo cardíaco, cérebro e músculos
esqueléticos. A urina contém baixas concentrações, mas aumenta em pacientes diabéticos
devido provavelmente à competição entre o inositol e a glicose pela absorção no túbulo renal
(MARCUS; COULSTON, 1996).
O inositol é um intermediário chave no ciclo do fosfatidil-inositol. O controle da
hidrólise do PI(4,5)P
2
é agora reconhecido por ser um dos mecanismos fundamentais na
comunicação intercelular. Um grande número de neurotransmissores e hormônios. utilizam este
66
mecanismo de transdução/amplificação para provocar as respostas celulares. O Ins(1,4,5)P
3
,
hidrossolúvel, liga-se a um receptor intracelular específico e mobiliza o Ca
2+
presente no
retículo endoplasmático de um grande número de sistemas celulares diferentes. Existe um certo
número de substâncias que podem bloquear estes receptores e o mais poderoso já identificado é
a heparina (NISHIZUKA et al., 1988). O Ins(1,4,5)P
3
é responsável pela regulagem de
numerosos processos celulares, como a secreção, o metabolismo, a contração e a proliferação.
O sn-1,2-diacilglicerol fica na membrana plasmática e age ativando a proteína quinase C
(PKC). Esta enzima estimula a fosforilação de numerosas proteínas intracelulares
(NISHIZUKA et al., 1988; WOOTEN et al., 1984).
O mioinositol pode ser usado como marcador das demências corticais, especialmente
nos casos de Alzheimer, quando sua elevação é associada com redução do n-acetil-aspartato
(HUANG et al., 2001), além disso altos níveis de mioinositol tem sido observado em casos de
neoplasias gliais (KIM et al., 2005) e níveis reduzido em casos de encefalopatia hepática
(
SHAWCROSS et al., 2004
).
Além das ações fisiológicas relacionados ao mioinositol, outros compostos derivados do
inositol, encontrados em plantas também demonstram ações farmacológicas. O D-chiroinositol
é estruturalmente relacionado ao fosfatidiinositol fosfato que participa das vias que sinalizam
para liberação de insulina e estimula o transporte de glicose (HOLMAN; KASUGA, 1997). O
D-pinitol (1D-3-O-metil-chiroinositol), um 3-methoxy análogo do D-chiroinositol e princípio
ativo da tradicional planta anti-diabética Bougainvillea spectabilis, tem sido identificado como
um participante ativo, sendo responsável por reduzir a concentração de glicose em ratos
diabéticos (HOLMAN ; KASUGA, 1997) e possui ações antiinflamatórias (BATES et al.,
2000). Além disso, o ácido fítico demonstrou potente atividade antioxidante ( MURAOKA;
MIURA, 2004) e ações contra alguns tipos de câncer como o pancreático (SOMASUNDER et
al., 2005).
67
1.12. Tingui de Bola (Magonia glabrata St Hill).
A família Sapindaceae compreende 140 gêneros e cerca de 2.000 espécies distribuídas
predominantemente nos trópicos e subtrópicos. O gênero Magonia apresenta somente duas
espécies existentes no Brasil e Bolívia, a Magonia glabrata St Hill (Fig.11), conhecida
popularmente como “Tingui de Bola”, é uma pequena árvore muito conhecida pelo homem do
campo por suas características tóxicas. A infusão da casca das raízes é empregada para
“tinguijar” os peixes nas lagoas e rios (BRAGA, 1976).
Magonia glabrata St. Hill
(Tingui de Bola)
FIGURA 11– Tingui de Bola
68
O levantamento bibliográfico sobre a espécie Magonia glabrata relata a presença de
duas substâncias o 2-O-metilinositol conhecido popularmente por quebrachitol e uma
proantocianidina (ARAUJO, 1994).
A espécie Magonia glabrata St Hill, objeto do nosso estudo, foi coletada no Cerradão da
Chapada do Araripe, riacho do Meio, município de Barbalha Estado do Ceará e identificada
pelo Professor Afrânio Gomes Fernandes Departamento de Biologia de Universidade Federal
do Ceará (UFC) sua excicata (n
°
15.198) encontra-se arquivada no herbário Prisco Bezerra de
UFC.
A análise cromatográfica do extrato etanólico dos frutos de Magonia glabrata promoveu
o isolarmento de três constituintes químicos fixos, o 2-O-metilinositol (figura 12), uma mistura
dos esteroides β -sitosterol e estigmasterol e uma cumarina.
O D-chiroinositol é estruturalmente relacionado ao fosfatidiinositol fosfato que participa
das vias que sinalizam para liberação de insulina e estimula o transporte de glicose (HOLMAN
; KASUGA, 1997). O D-pinitol (1D-3-O-metil-chiroinositol), um 3-methoxy análogo do D-
chiroinositol e princípio ativo da tradicional planta anti-diabética
Bougainvillea spectabilis
,
FIGURA 12– Representação estrutural do 2-O-
metilinositol (MIT).PM: 194; PF: 192-194°
69
tem sido identificado como um participante ativo, sendo responsável por reduzir a concentração
de glicose em ratos diabéticos (HOLMAN ; KASUGA, 1997).
1.13. Relevância e Justificativa
O desenvolvimento de drogas neuroprotetoras é dependente do conhecimento dos
fatores etiológicos e patogenéticos que contribuem para a disfunção e morte neuronal na
substância negra. Várias anormalidades bioquímicas foram identificadas na substância negra de
pacientes com DP, existindo claras evidências do aumento na produção de radicais livres, dano
oxidativo em lipídios e proteínas, incluindo o DNA, disfunção mitocondrial e um aumento de
citocinas inflamatórias. Deste modo, a busca de compostos com ação antioxidante nos levou a
investigar um possível efeito neuroprotetor de dois compostos, um isolado de M urundeuva,
uma mistura de chalconas diméricas, e o outro um derivado do inositol, o 2-O-metilinositol,
isolado da casca do fruto de Magonia glabrata, que futuramente poderiam ser usados no
tratamento de doenças neurodegenerativas, como na DP, o que justificaria a importância deste
estudo
70
OBJETIVOS
71
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Estudar a atividade neuroprotetora das chalconas isolada de Myracrodruoun urundeuva
e 2-O-metilinositol isolado de Magonia glabrata em modelo de degeneração celular induzido
pela 6-OHDA em cultura primária de células mesencefálicas de rato.
2.2. Objetivos Específicos
Determinar o percentual de células dopaminérgicas, na cultura primária de células
mesencefálicas de fetos de rato na presença e na ausência de 6-OHDA e os efeitos da
fração enriquecida de chalconas (FEC) e do 2-O-metilinositol (MIT) nestes percentuais
através das técnicas de imunohistoquímica para a tirosina hidroxilase.
Estudar os efeitos de neuroprevenção e de neuroresgate da FEC e do MIT em protocolo
de morte neuronal induzida pela 6-OHDA em cultura primária de células mesencefálicas
de fetos de ratos.
Verificar a ação da FEC e MIT sobre os níveis de nitrito produzidos pela 6-OHDA em
cultura primária de células mesencefálicas de fetos de ratos.
Avaliar a ação da FEC e do MIT sobre os níveis de TBARS produzidos pela 6-OHDA
em cultura primária de células mesencefálicas de fetos de ratos.
Avaliar o padrão apoptótico induzido pela 6-OHDA em cultura primária de células
mesencefálicas através de técnica de fluorescência com brometo de etídio/laranja de
acridina e os efeitos da FEC e do MIT nesse padrão.
72
MATERIAIS E MÉTODOS
73
3. MATERIAS E MÉTODOS
3.1. Drogas
Fração enriquecida de chalconas (FEC), 2-O-metilinositol (MIT), 3[4,5-dimetiltiazol-2-il]-
2,5-difeniltetrazolio (MTT), naftiletilenodiamina e ácido tiobarbiturico, poli-lisina e
sulfanilamida foram adquiridos da marca Sigma, St. Louis, MO, USA. Meio essencial mínimo
de Eagle (MEM) e soro de cavalo foram obtidos da Gibco BRL. Bromidrato de 6-
Hidroxidopamina (Sigma-USA), Deferoxamina mesilato (Sigma-USA), N-(1-naftil)-
etilenodiamina diidrocloreto (Merck-USA), anticorpo primário anti-tirosina hidroxilase
(CHEMICON), anticorpo secundário (reagente amarelo ou LINK – DAKO Cytomation),
Streptavidina peroxidase (reagente vermelho – DAKO Cytomation), DAB (DAKO
Cytomation), laranja de acridina (Sigma-USA), brometo de etídio (Sigma-USA),
Paraformaldeido (Sigma-USA). Os demais reagentes utilizados foram de grau analítico.
3.2. Isolamento da fração enriquecida de chalconas (FEC) obtido da
Myracrodruon
urundeuva.
O isolamento e estudo fitoquímico das chalconas diméricas foi realizado no
Departamento de Química Orgânica e Inorgânica da Universidade Federal do Ceará, sob a
orientação da professora Dra. Mary Anne Bandeira de acordo com método previamente
descrito (BANDEIRA, 2002).
O estudo químico foi realizado à partir do extrato acetato de etila, obtido da entrecasca
após desengurduramento com hexano, em Aparelho de Sohxlet. O extrato acetato de etila foi
purificado em sílica-gel com auxílio de pressão utilizando como eluente uma mistura de
clorofórmio/ acetona em polaridade crescente. Esse procedimento resultou na obtenção de uma
fração codificada como F(8-13) com 8% de rendimento. Nesta fração, após purificação e
isolamento dos seus componentes através de técnicas cromatográficas inéditas, inovadoras e
econômicas utilizando o amido de milho como adsorvente, foram identificadas as chalconas
dimérica urundeuvinas A, B e C. (BANDEIRA, 2002).
74
3.3. Isolamento do 2-O-metilinositol.
O 2-O-metilinositol foi isolado de acordo com método previamente descrito (ARAUJO,
1994) no Departamento de Química Orgânica pela professora Telma Lemos A análise
cromatográfica do extrato etanólico dos frutos de Magonia glabrata promoveu o identificação
de três frações: fração hexanica, fração acetato de etila e fração metanólica. A partir da
purificação, precipitação e recristalização obteve-se o constituinte químico polihidrixilado 2-O-
metilinositol.
As cascas do fruto de Magonia glabrata (2,5 Kg) foram secas, trituradas e extraídas a
temperatura ambiente com álccol etílico. Após concentração parcial (sob vácuo) do extrato
etanólico, separou-se uma alíquota (1/3 do volume obtido) e adicionou-se AcOEt. Verificou-se
a precipitação de um sólido branco que, após filtração e lavagem com acetona forneceu 1,8g de
2-O-metilinositol (rendimenteo de 7,2%).
Extrato Acetato de Etila
ENTRECASCA
F1
F2
F3
F4
F5
F6 F7
(F 8-13) (F 18)
Urundeuvinas A, B, C
CASCA DO FRUTO
F hex F AcOEt
F MeOH
2-O-metilinositol
75
3.4. Animais
Foram utilizadas ratas Wistar grávidas, (200 – 240g) provenientes do biotério do
Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal de Ceará. Os animais
foram mantidos a 23-25 °C com ciclo claro/escuro, e alimentados com uma dieta padrão e água
ad libitum. Vale destacar que o estudo foi submetido ao Comitê de Ética e Pesquisa Animal
(COMEPE), sendo aprovado pelo mesmo.
3.5. Culturas de células mesencefálicas de rato
Os animais foram levemente anestesiados com éter e mortos por deslocamento cervical e
sua área abdominal foi aberta para a retirada dos embriões. As culturas de células
mesencefálicas contendo células neuronais e gliais foram obtidas de mesencéfalo de embriões
de rato Wistar de 17-20 dias de gravidez como descrito por CHOI e cols., (1987). As células
mesencefálicas foram então dissecadas mecanicamente e suspensas em Meio Essencial de
Eagle (MEM) completado com soro de cavalo 10%, estreptomicina (100 mg/ml), penicilina
(1000 UI/ml), actinomicina C (2.5 mg/ml), bicarbonato de sódio (24 mM) e glicose (11 mM).
A suspensão de células foi contada, sendo antes a viabilidaade avaliada por Azul de Tripam
sendo postariormente estas célluas plaqueadas em placas multi-well de 96 poços e 6 poços
preveamente tratadas com poly-lisina com uma concentração de 5 x 10
4
células/poço. As
culturas foram mantidas a 37 °C em estufa a 5% CO
2
. Quatro dias depois do plaqueamento, as
culturas foram utilizadas para experimentação.
3.6. Neuroprevenção e Neuroresgate
"Neuroprevenção" e "neuroresgate" são termos que podem ser interpretados de várias
maneiras. No contexto do nosso trabalho é provavelmente melhor defini-los em termos
bioquímicos e funcionais. Neuroprevenção pode ser definida como proteção das células
neuronais da morte induzida por várias anormalidades bioquímicas associadas com a 6-OHDA.
76
Neuroresgate pode ser definido como o retorno de algumas ou todas as funções bioquímicas e
restauração da função neuronal normal das células danificadas. (SCHAPIRA, 1999).
Em se tratando do mannuseio da 6-OHDA esta foi preperada na hora de ser incubada nas
células sob o risco de se perder a atividade, visto que se trata de uma substância extremamente
fotossensível e termossensível. Daí tanto na pesagem quanto no processo de incubação a luz
esteve apagada e na sala de cultura de células deixando somente luz de fundo. Quanto a
dissolução, esta toxina foi dissolvida em PBS gelado. Logo após a incubação as placas foram
incubadas em estufa com 5% de CO
2
.
Protocolo de neuroprevenção
Troca do meio e adição
da FEC e MIT
4
a
3h
Adição da
6-OHDA 40
µ
M
e
200
µ
M
24h. Determinação dos
níveis de nitrito
TBARS, e ensaio de
viabilidade celular pelo
MTT
1
a
Cultura primária
de células
mesencefálicas
Protocolo de neuroresgate
Troca do meio e adição
da 6-OHDA 40
µ
M
e
200
µ
M
4
a
3h
Adição da FEC e MIT
24h. Determinação dos
níveis de nitrito
TBARS, e ensaio de
viabilidade celular pelo
MTT
1
a
Cultura primária
de células
mesencefálicas
2
a ....
3
a
2
a ....
3
a
5
a
Adição de meio
Adição de meio
5
a
77
3.7. Ensaio de neurotoxicidade - teste do MTT
A neurotoxicidade foi avaliada usando o ensaio MTT (MOSMANN , 1983), que se
baseia no fato do 3[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio (MTT) ser reduzido pelas
enzimas mitocôndriais das células viáveis a um sal (sal de Formazan), sendo a quantidade
deste sal um indicativo da viabilidade celular. Decorridos 4 dias de cultura, foram utilizados 2
protocolos experimentais. No primeiro, as FEC e o MIT foram usados nas concentrações de
0,1, 1, 10 e 100
µ
g/ml e deferoxamina (40
µ
M) (usada como controle positivo) foram
adicionados a cultura, 3 h antes da 6-OHDA (200
µ
M) (protocolo de neuroprevenção). No
segundo ensaio, os compostos foram adcionadas a cultura 3 h depois da 6-OHDA (protocolo de
neuroresgate). Decorridas 24h de incubação 100µL do meio foi retirado para a dosagem dos
níveis de nitrito, os outros 100µL meio foi descartado e incubado um novo meio (200µL)
contendo 10% de 3[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolium brometo (MTT), na
concentração de 5mg/mL em cada poço, onde estas células foram incubadas por mais 3h. Após
este período, descartou-se o sobrenadante e adicionou-se então 150 µL de DMSO puro para a
lise das células e solubilização do formazan as placas foram agitadas em agitador de placas,
decorridos 15 min de agitação, a absorbância foi medida em leitor de microplacas a 540 nm. A
inibição da redução do MTT indica a diminuição da viabilidade celular. Os experimentos foram
realizados em sextuplicata e repetidos em três diferentes dias.
3.8. Determinação de Nitrito
Após o período de incubação, a concentração de nitrito foi determinada segundo o
método de GREEN e cols (1981), que se baseia em revelar a presença de nitrito em uma
amostra (urina, plasma, homogenato tecidual e sobrenadante celular) por uma reação de
diazotização que forma um cromóforo de côr rósea, com pico de absorbância de 560 nm. Para
esta experiência 100
µ
L do reativo de Griess (sulfanilamida a 1%/ cloridrato de N-(1-naftil)-
78
etilenediamina 0.1% / H
3
PO
4
em 1% / água destilada, na proporção de 1:1:1:1) foi adicionado à
100
µ
L do sobrenadante da cultura de célula e incubado a temperatura ambiente por 10 min. A
curva padrão foi elaborada com várias concentrações de NaNO
2
(variando de 0,75 à 100
µ
M)
sob as mesmas condições.Os brancos foram preparados pela adição de 100
µ
L do reativo de
Griess à 100
µ
L do meio de cultura e a absorbância foi medida em leitor de microplacas em
560 nm.
3.9. Determinação da peroxidação lipídica pela medição de substâncias tiobarbitúricas
ácido-reativas (TBARS).
A peroxidação lipídica foi avaliada pela mensuração de substâncias tiobarbitúricas
ácido-reativas (TBARS) (DRAPER et al.,1990). A peroxidação lipídica é uma das mais
importantes expressões orgânicas do estresse oxidativo induzido pela reatividade dos radicais
livres de oxigênio. O método mais empregado para determinação do MDA em amostras
biológicas é baseado na sua reação com ácido tiobarbitúrico (TBA). Nesta reação, duas
moléculas de TBA reagem estequiometricamente com uma molécula de MDA para formar um
pigmento róseo, que tem absorbância máxima em solução ácida em 532 a 535 nm. O
coeficiente de extinção deste pigmento num comprimento de onda de 535 nm, pH 1,0, é 1,53 x
10
-5
M
-1
. Após o período de incubação, o sobrenadante foi descartado e as células foram lisadas
com 1mL de Triton X 100. Então, 250
µ
L do homogenato foi adicionado a tubos de vidro, e
incubados em banho-maria a 37 °C por 1 h, seguido por adição de 400 µL de ácido perclórico
35% para precipitar proteínas. A mistura foi centrifugada a 1400 g por 10 min. e 600 µL do
sobrenadante foi adicionado à 200 µL de uma solução de ácido tiobarbitúrico a 1,2%. A
mistura foi levada a banho-maria e aquecida a 95 °C por 30 min. Após resfriada, a absorbância
foi medida em um leitor de microplacas a 535 nm.
79
3.10. Avaliação do padrão de morte celular por laranja de acridina / brometo de etídio.
Objetivando a determinação do padrão de morte celular (apoptose/necrose), as células
foram incubadas em placas com densidade celular de 5 x 10
4
células/lamínulas, sendo estas
lamínulas pré-tratadas com polilisina e, após o período de incubação, as células foram lavadas
com PBS e incubadas com a solução de laranja de acridina e brometo de etídio (LA/BE) (2
µ
L
de LA; 8
µ
L de PBS; 10
µ
L de BE) durante 01 minuto, sendo em seguida visualizadas em
microscópio de fluorescência OLYMPUS Bx 41. O método (MCGAHON et al., 1995) consiste
em revelar as células (controle e tratadas) com a solução LA/BE , sendo a leitura realizada em
microscópio de fluorescência. A LA que tem por propriedade atravessar a membrana celular,
mesmo esta estando intacta, intercala-se em seguida ao DNA emitindo fluorescência verde ao
mesmo. O BE somente é incorporado por células não viáveis (com instabilidade de membrana),
intercalando-se ao DNA emitindo fluorescência laranja; ligando-se fracamente ao RNA, que
aparecerá em vermelho. As células viáveis, que possuem membrana intacta, apresentam núcleo
uniforme emitindo fluorescência verde pela LA, mas o núcleo não é marcado pelo BE visto
que este não atravessa a membrana quando intacta. As células em apoptose inicial (membrana
ainda intacta) apresentam fluorescência verde brilhante no núcleo (condensação da cromatina)
e não são marcadas por BE; morfologicamente observa-se alterações da membrana em
decorrência da formação de corpúsculos apoptóticos. As células em apoptose tardia
(instabilidade da membrana) apresentam manchas laranjas (condensação da cromatina) e
morfologicamente alterações da membrana (corpos apoptóticos), citoplasma vermelho (RNA).
As células em necrose (lesão de membrana) apresentam cor uniformemente laranja-
avermelhada, não havendo formação de corpos apoptóticos. Acredita-se que as membranas
plasmáticas permanecem intactas durante a apoptose até os últimos estágios quando se tornam
permeáveis aos solutos normalmente retidos (COTRAN et al., 2000). Os experimentos foram
realizados em três dias diferêntes e foram contadas 200 células por lâmina.
80
3.11. Imuno-histoquímica para tirosina hidroxilase.
Com a finalidade de determinarmos o percentual de células dopaminérgicas em nossa
cultura de células mesencefálicas, utilizamos a imuno-histoquímica para tirosina hidroxilase.
As células forma incubadas em placas com lamínulas e, após o período de incubação, as células
foram fixadas em solução de paraformaldeído à 4% por 15 minutos, e posteriormente lavadas
com PBS 3 vezes, sendo adicionado em seguida peróxido de hidrogênio a 3% (em PBS). Logo
após, foi adicionado o anticorpo primário anti-tirosina hidroxilase (CHEMICON) (overnight)
em câmara fria na diluição 1:200 em sol. tampão Tris 0,05M, pH 7,2-7,6, contendo 1% de BSA
(albumina de soro bovino). No dia seguinte, as lâminas foram lavadas com PBS (2 vezes),
sendo logo em seguida adicionado o anticorpo secundário (reagente amarelo ou LINK – DAKO
Cytomation) durante 1 hora. Após esse período as lâminas foram lavadas com PBS, e
adicionada Streptavidina peroxidase (reagente vermelho – DAKO Cytomation) por 40 minutos.
As lâminas foram novamente lavadas e, em seguida, aplicada solução de DAB preparada de
acordo com o fabricante (DAKO Cytomation) durante 30 segundos. Posteriormente as lâminas
foram lavadas c/ água destilada e montadas em meio livre de xilol. Os experimentos foram
realizados em três dias diferentes nos quais as células não dopaminérgicas (TH-) foram
contadas em 4 campos diferentes sendo realizado em seguida a média dessa contagem,
posteriormente ainda utilizando as mesmas lâminas fez-se a contagem das células
dopaminérgicas (TH+) em toda a extensão das lâminas.
3.12 Análise Estatística
A análise estatística foi feita utilizando o programa Graph Pad prism 4.0 Para
comparação entre as médias foi feita uma análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de
Turkey, as diferenças foram consideradas estatisticamente significaticativas quando P<0,05. Os
valores foram expressos como Média ± EPM.
81
RESULTADOS
82
4. RESULTADOS
4.1. Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) e deferoxamina (DEF) sobre
percentual de células dopaminérgicas em cultura de células mesencefálicas de rato
expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção e de Neuroresgate).
A figura 13 mostra a imunoreatividade para tirosina hidroxilase (TH+) na presença ou
na ausência de 6-OHDA (40 e 200µM) no Protocolo de Neuroprevenção. Podemos observar
nos campos de contraste microscópico b e c, que a 6-OHDA (40 e 200
µ
M) produziu uma
progressiva perda de neuritos e imunoreatividade para TH+. A FEC (100
µ
g/mL) (campo e, f) e
DEF (100
µ
g/mL) (campo h, i) reduziram o dano celular induzido por 6-OHDA (40 e 200
µ
M),
o que pode ser observado pela preservação da integridade dos neuritos e do restabelecimento da
imunoreatividade para TH+.
No Protocolo de Neuroresgate (figura 14), podemos observar que A FEC e DEF apesar
de manterem a imunoreatividade para TH nas células dopaminérgicas, a integridade dos
neuritos não foi mais preservada, apesar do soma neuronal ainda estar íntegro.
A figura 15 mostra que a 6-OHDA (40 e 200µM) diminuiu significativamente e de
maneira dose-dependente, a percentagem de células dopaminérgicas (TH+= 18,63 e 4,16%) e
em menor proproção as de células não dopaminérgicas (TH-= 71,01 e 40,71%)
respectivamente, em relação ao controle. A FEC conferiu uma citoproteção aos dois grupos de
células tanto no protocolo de neuroprevenção (TH+= 72,41 % e 59,31 %) (TH-= 92,84% e
89,83%) respectivamente, quanto no de neuroresgate (TH+= 61,90 % e 64,07 %) (TH-=
85,34% e 83,71%) respectivamente.
83
FEC 100
Controle
6-OHDA 40
6-OHDA 200
FEC 100 + 6-OHDA 40
FEC 100 + 6-OHDA 200
DEF 100 DEF 100 + 6-OHDA 40
DEF 100 + 6-OHDA 200
FIGURA 13 – Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) e deferoxamina (DEF)
sobre a morfologia das células mesencefálicas de rato imunoreativas para a tirosin
a
hidroxilase (TH+) expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção). A incubação
com 6-OHDA (40 e 200 µM) revelou alterações na morfologia das células TH+
(campo b-seta larga fechada) e perda total dos neuritos (campo c- seta larga aberta). A
FEC (e, f) e DEF (h, i) reduziram a perda de neuritos induzida pela 6-OHDA. As
células foram cultivadas durante 4 dias. A FEC e DEF
(100µg/ml) foram adicionadas
3h antes da 6-OHDA (40X).
a
h g
b c
i
d
e
f
84
Controle
6-OHDA 200 + DEF 100
6-OHDA 40 + DEF 100
FEC 100
6-OHDA 40 + FEC 100
6-OHDA 200 + FEC 100
FIGURA 14 – Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) e deferoxamina (DEF)
sobre a morfologia das células mesencefálicas de rato imunoreativas para a tirosina
hidroxilase (TH+) expostas a 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate). A incubação co
m
6-OHDA (40 e 200
µ
M) induziu alterações na morfologia das células TH+ (campo b-
seta larga fechada) e perda total dos neuritos (campo c- seta larga aberta). A FEC (e, f)
e DEF (h, i) (seta fina fechada) não conseguiram reduzir a perda de neurônios,
induzidas pela 6-OHDA. As células foram cultivadas durante 4 dias. A FEC e DEF
(100µg/ml) foram adicionadas 3h após à 6-OHDA (40 X).
6-OHDA 40 6-OHDA 50
DEF 100
b
a
c
g
i
h
d
e f
85
FIGURA 15 – Efeito da FEC sobre o percentual de células dopaminérgicas em cultura de
células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA. As células foram cultivadas durante
4 dias. A FEC
(100
µ
g/ml) foi adicionada 3h antes da 6-OHDA (40 e 200
µ
M
) (Modelo de
N
europrevenção) ou 3h após à 6-OHDA (40 e 200
µM
) (Protocolo de Neuroresgate).
Após 24h do tratamento o percentual de células dopaminérgicas foi determinado. Os
valores estão expressos como média
±
EPM, a vs controle (TH-), b vs controle (TH+), c
vs 6-OHDA 40
µ
M
(TH-), d vs 6-OHDA 40
µ
M
(TH +), e vs 6-OHDA 200
µ
M
(TH-), f vs
6-OHDA 200
µ
M
(TH +), (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).
6
-
OHD
A 4
0
6-O
H
DA
20
0
FE
C
10
0
FE
C
+
6
-O
H
DA 4
0
F
E
C
+
6-O
H
DA
20
0
6
-
OHD
A 4
0
+
F
EC
6-OHDA 200
+
F
EC
0
25
50
75
100
neurônios TH
-
neurônios TH
+
a
b
c
d
d
c
b
a
protocolo de
neuroproteção
protocolo de
neuroresgate
Células viáveis (% do controle)
86
4.2. Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre percentual de células dopaminérgicas em
cultura de células mesencefálicas de rato quando expostas à 6-OHDA (Protocolo de
Neuroprevenção e de Neuroresgate).
A figura 16 mostra a imunoreatividade para tirosina hidroxilase (TH+) na presença ou
na ausência de 6-OHDA (40 e 200µM) no protocolo de neuroresgate. Podemos observar nos
campos de contraste microscópico
b
e
c,
que a 6-OHDA (40 e 200µM) produziu uma
progressiva perda de neuritos. O MIT (100 µg/mL)(campos
e
e
f
) reduziu o dano celular
induzido por 6-OHDA (40 e 200
µ
M) o que pode ser observado pela preservação da integridade
dos neuritos e da imunoreatividade para TH+.
No Protocolo de Neuroresgate (figura 17), podemos observar que o MIT reduziu o dano
celular induzido por 6-OHDA (40 e 200
µ
M) o que pode ser observado pela preservação da
integridade dos neuritos e da imunoreatividade para TH+.
A figura 18 mostra que a 6-OHDA (40 e 200µM) diminuiu a percentagem de células
dopaminérgicas (TH+ = 18,63 e 4,16%) e não dopamnnérgicas (TH- = 71,01 e 40,71%)
respectivamente, em relação ao controle, o MIT (100 µgmL) mostrou um efeito citoprotetor a
estas células tendo no protocolo de neuroprevenção (TH+ = 61,10 % e 59,70 %) (TH- =
88,77% e 83,73%), respectivamente, quando no Protocolo de Neuroresgare (TH+ = 44,43 % e
41,67 %) (TH- = 86,40% e 81,79%).
A figura 19 mostra que DEF (100 µgmL) também demonstrou citoproteção conrta a
citotoxicidade da 6-OHDA (40 e 200 µM) no protocolo de neuroprevenção (TH+= 65,27 % e
59,70 %) e (TH-= 99,91% e 88,01%), e no protocolo de neuroresgate (TH+= 56,93 % e 40,27
%) ; (TH- = 86,12% e 85,01%), respectivamente.
87
MIT 100
Controle
6-OHDA 40
6-OHDA 200
MIT 100 + 6-OHDA 40
MIT 100 + 6-OHDA 200
FIGURA 16– Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre a morfologia das células
mesencefálicas de rato imunoreativas para a tirosina hidroxilase (TH+) expostas à 6-
OHDA (Protocolo de Neuroprevenção). A incubação com 6-OHDA (40 e 200
µ
M)
induziu alterações na morfologia das células TH+ (campo b- seta larga fechada) e
p
erda total dos neuritos (campo c- seta larga aberta). O MIT (e e f) reduziu a perda de
neuritos induzida pela 6-OHDA. As células foram cultivadas durante 4 dias. O MIT
(100µg/ml) foi adicionado 3h antes da 6-OHDA (40X).
a
b
d e
f
c
88
6-OHDA 40
MIT 100
6-OHDA 200 + MIT 100
6-OHDA 40 + MIT 100
Controle
6-OHDA 200
FIGURA 17 – Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre a morfologia das células
mesencefálicas de rato imunoreativas para a tirosina hidroxilase (TH+) expostas à 6-OHD
A
(Protocolo de Neuroresgate). A incubação com 6-OHDA (40 e 200 µM) induziu alterações n
a
morfologia das células TH+ (campo b- seta larga fechada) e perda total dos neuritos (campo
c- seta larga aberta). O MIT (e e f) reduziu a perda de neuritos induzida pela 6-OHDA. As
células foram cultivadas durante 4 dias. O MIT
(100µg/ml) foi adicionado 3h após à 6-OHD
A
(40X).
a
f
c
b
e
d
89
FIGURA 18 – Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre o percentual de células
dopaminérgicas em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA. As
células foram cultivadas durante 4 dias. O MIT
(100µg/ml) foi adicionado 3h antes
(Protocolo de Neuroprevenção) e 3h após (Protocolo de Neuroresgate) à 6-OHDA (40 e
200
µM
). Após o tratamento o percentual de células dopaminérgicas foi determinado. Os
valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle (TH-), b vs controle (TH+), c vs
6-OHDA 40
µM
(TH-), d vs 6-OHDA 40
µM
(TH +), e vs 6-OHDA 200
µM
(TH-), f vs 6-
OHDA 200
µM (TH +), (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).
6-OHDA 40
6-OHDA 200
M
I
T 100
M
I
T +
6-OHDA
40
M
I
T
+
6-OHDA
20
0
6
-
O
HD
A
40 + MIT
6-OHDA 200 + MIT
0
25
50
75
100
neurônos TH
-
nerônios TH
+
a
a
c
b
c
d
d
b
protocolo de
neuroprevenção
protocolo de
neuroresgate
f
f
ee
Células viáveis (% do controle)
90
FIGURA 19 – Efeito da deferoxamina (DEF) sobre o percentual de células dopaminérgicas em
cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA. As células foram cultivadas
durante 4 dias. A DEF (100µg/ml) foi adicionada 3h (Protocolo de Neuroprevenção) e 3h após
à 6-OHDA (40 e 200 µM) (Protocolo de Neuroresgate). Após o tratamento o percentual de
células dopaminérgicas foi determinado. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs
controle (TH-), b vs controle (TH+), c vs 6-OHDA 40µM (TH-), d vs 6-OHDA 40µM (TH +),
e vs 6-OHDA 200µM (TH-), f vs 6-OHDA 200µM (TH +), (p< 0,05, ANOVA e teste de
Turkey).
6-OH
D
A
4
0
6
-
OHDA 200
D
EF
1
0
0
D
EF + 6-OHDA
40
DEF
+ 6
-
OH
D
A
2
00
6
-O
HD
A
4
0
+
D
E
F
6-OH
D
A
2
00 + DEF
0
25
50
75
100
neurônios TH
-
neurônios TH
+
a
a
c
c
b
d
d
protocolo de
Neuroprevenção
protocolo de
Neuroresgate
b
Células viáveis (% do controle)
91
4.3. Efeito citotóxico da 6-OHDA sobre a viabilidade de células mesencefálicas de rato.
A figura 20 mostra o efeito da 6-OHDA nas concentrações de 40 e 200
µ
M, equivalente
a 10 e 50
µ
g/mL sobre a viabilidade celular. Os resultados mostram que a 6-OHDA na
concentração de 40
µ
M e 200
µ
M diminui a viabilidade celular para 77,87% e 35,45%
respectivamente, demonstrando um efeito tóxico significativo na concentração (p< 0,05) de
200
µ
M.
4.4. Efeito neuropreventivo da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada da
Myracrodruon urundeuva
em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40
µM
.
A figura 21 mostra que a FEC quando adicionada 3h antes da 6-OHDA 40
µ
M, mostra
um efeito preventivo sobre a neurotoxicidade induzida pela 6-OHDA em células
mesencefálicas de rato. Os resultados mostram que a adição de 40
µ
M da neurotoxina diminuiu
para 76,63% a viabilidade celular (absorbância do MTT: controle = 0,2302 ± 0,009; 6-OHDA
40 µM = 0,1778 ± 0,0131). A FEC nas concentrações de 100µg/ml preveniu significativamente
(p<0,05, ANOVA e teste de Turkey) a toxicidade induzida pela 6-OHDA (absorbância pelo
MTT: FEC 1 + 6-OHDA = 0,1835 ± 0,014 (aumento da viabilidade em relação a 6-OHDA 40
µM) = (3,08%); FEC 10 + 6-OHDA = 0,1983 ± 0,009 (9,51%); FEC 100 + 6-OHDA = 0,226 ±
0,012 (21,84%).
92
FIGURA 20- Efeito da 6-OHDA sobre a viabilidade de células mesencefálicas de rato. As
células foram cultivadas durante 4 dias, após este período foram incubadas com 6-OHDA (40
e 200
µ
M) durante 24 horas. Após o tratamento a viabilidade celular foi determinada pelo
MTT.
Os valores estão expressos como média
±
EPM, a vs controle (p< 0,05, ANOVA e
teste de Turkey).
6-OHDA 40
6
-O
HDA
200
0
50
100
Viabilidade celular (%
em relação ao controle)
93
FIGURA 21– Efeito de neuroprevenção da fração enriquecida de chalconas (FEC)
isolada de Myracrodruon urundeuva em células mesencefálicas de ratos expostas à
6-OHDA. As células foram cultivadas durante 4 dias. A FEC (1; 10 e 100 µg/ml) foi
adicionada 3h antes da 6-OHDA (40µM). Após 24 horas, a viabilidade celular foi
determinada pelo MTT. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs
control, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).
CONTROLE
6
-
O
H
DA 40
FE
C 1+
6-OH
D
A
FEC 10 +
6-OH
D
A
FE
C
10
0
+
6-OH
D
A
0.0
0.1
0.2
0.3
a
b
MTT (Absorbância em
540 nm)
94
4.5. Efeito neuropreventivo da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de
Myracrodruon urundeuva em células mesencefálicas de ratos exposta à 6-OHDA 200 µM.
A figura 22 mostra que a FEC quando adicionada 3h antes da 6-OHDA, mostra um
efeito preventivo sobre a neurotoxicidade induzida pela 6-OHDA em células mesencefálicas de
rato. Os resultados mostram que a adição de 200 µM da neurotoxina diminuiu para 56,32% a
viabilidade celular (absorbância do MTT: controle = 0,087 ± 0,003; 6-OHDA 200 µM = 0,049
± 0,001). A FEC isoladamente, nas concentrações de 0,1; 1; 10 e 100 µg/ml, não alterou a
viabilidade celular (absorbância do MTT: Controle = 0,087 ± 0,003; FEC 0,1 = 0,086 ± 0,001;
FEC 1 = 0,083 ± 0,003; FEC 10 = 0,082 ± 0,002; FEC 100 = 0,085 ± 0,001. A FEC nas
concentrações de 0,1; 1; 10 e 100
µ
g/ml preveniu significativamente (p
<
0,05, ANOVA e teste
de Turkey) a toxicidade induzida pela 6-OHDA (absorbância pelo MTT: 6-OHDA 200
µ
M =
0,049 ± 0,001; FEC 0,1 + 6-OHDA = 0,059 ± 0,001 (aumento da viabilidade em relação a 6-
OHDA 200
µ
M = 11,49 % ; FEC 1 + 6-OHDA = 0,060 ± 0,002 (12,64%); FEC 10 + 6-
OHDA = 0,063 ± 0,003 (16,09%); FEC 100 + 6-OHDA = 0,077 ± 0,002 (32,18%).
95
FIGURA 22 – Efeito neuropreventivo da fração enriquecida de chalcona (FEC)
isolada de Myracrodruon urundeuva em células mesencefálicas de ratos expostas à
6-OHDA. As células foram cultivadas durante 4 dias. A FEC (0,1; 1; 10 e 100
µg/ml) foi adicionada 3h antes da 6-OHDA (200µM). Após 24 horas, a viabilidade
celular foi determinada pelo MTT. Os valores estão expressos como média ± EPM,
a vs controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).
CONTROLE
6-OHDA
200
FEC 0,1
F
E
C 1
FEC 10
FE
C
100
FE
C
0
,1
+
6
-OHD
A
FEC 1+ 6-
O
H
D
A
FEC 10+ 6-OHDA
FE
C
1
0
0
+
6
-OHD
A
0.000
0.025
0.050
0.075
0.100
a
b
b
b
b
MTT (Absorbância em
540 nm).
96
4.6. Efeito de neuroresgate da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de
Myracrodruon urundeuva em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40
µ
M
.
A FEC quando adicionada 3h após a 6-OHDA, mostra um efeito de neuroresgate sobre a
neurotoxicidade induzida pela 6-OHDA em células mesencefálicas de rato (figura 23). A
adição de 40
µ
M da neurotoxina diminuiu para 77,88% a viabilidade celular (absorbância do
MTT: controle = 0,217 ± 0,015; 6-OHDA 200
µ
M = 0,169 ± 0,012). A FEC na concentração
de 100
µ
g/mL preveniu significativamente (p
<
0,05) a toxicidade induzida pela OHDA
(absorbância do MTT: 6-OHDA + FEC 1 = 0,194 ± 0,009 (aumento da viabilidade em relação
a 6-OHDA 40
µ
M = 11,52% ; 6-OHDA + FEC 10 = 0,192 ± 0,011 (10,59%); 6-OHDA + FEC
100 = 0,217 ± 0,012 (22,12%).
4.7. Efeito de neuroresgate da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de
Myracrodruon urundeuva em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 200
µ
M
.
A FEC quando adicionada 3h após a 6-OHDA, mostra um efeito de neuroresgate sobre a
neurotoxicidade induzida pela 6-OHDA em células mesencefálicas de rato (figura 24). A
adição de 200
µ
M da neurotoxina diminuiu para 54,76% a viabilidade celular (absorbância pelo
MTT: controle = 0,084 ± 0,001; 6-OHDA 200
µ
M = 0,046 ± 0,001). A FEC não demonstrou
efeito citotóxico nas concentrações de 0,1; 1; 10 e 100
µ
g/mL, (absorbância pelo MTT:
Controle = 0,084 ± 0,001; FEC 0,1 = 0,086 ± 0,001; FEC 1 = 0,083 ± 0,003; FEC 10 = 0,082 ±
0,002; FEC 100 = 0,085 ± 0,001. A FEC nas concentrações de 10 e 100µg/mL preveniu
significativamente (p<0,05) a toxicidade induzida pela OHDA (absorbância do MTT: 6-OHDA
200
µ
M = 0,046 ± 0,001; 6-OHDA + FEC 0,1 = 0,049± 0,002; (aumento da viabilidade em
relação a 6-OHDA 200
µ
M = 3,57% ; 6-OHDA + FEC 1 = 0,054 ± 0,001 (9,52%); 6-OHDA
+ FEC 10 = 0,058 ± 0,002 (14,28%); 6-OHDA + FEC 100 = 0,079 ± 0,002 (39,28%).
97
FIGURA 23 – Efeito de neuroresgate da fração enriquecida de chalconas (FEC)
isolada de
Myracrodruon urundeuva
em células mesencefálicas de ratos expostas
à 6-OHDA. As células foram cultivadas durante 4 dias. A FEC (1; 10 100
µ
g/mL)
foi adicionada 3h após à 6-OHDA 40
µ
M. Após 24h o tratamento, a viabilidade
celular foi determinada pelo MTT. Os valores estão expressos como média
±
EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).
C
ONTROLE
6-O
H
D
A
40
6
-O
HD
A
+ FE
C
1
6-
OH
D
A
+
F
E
C 1
0
6-
O
HD
A
+ FE
C
10
0
0.0
0.1
0.2
0.3
a
b
MTT (Absorbância em
540 nm).
98
CONTROLE
6-OHDA 20
0
F
E
C 0,
1
F
E
C 1
F
EC
1
0
FE
C
1
00
6-OHDA + FEC 0,1
6-OHDA + FE
C
1
6-
O
H
D
A
+ FEC 1
0
6
-
O
H
D
A
+
F
EC 10
0
0.000
0.025
0.050
0.075
0.100
a
b
b
MTT Abs.
FIGURA 24 – Efeito de neuroresgate da fração enriquecida de chalconas (FEC)
isolada de Myracrodruon urundeuva em células mesencefálicas de ratos expostas
à 6-OHDA. As células foram cultivadas durante 4 dias. A FEC (0,1; 1; 10
100µg/mL) foi adicionada 3h após à 6-OHDA 200µM. Após 24 horas,
a
viabilidade celular foi determinada pelo MTT. Os valores estão expressos como
média
±
EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p<0,05, ANOVA e teste de
Turkey).
99
4.8. Efeito neuropreventivo do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de
Magonia glabrata em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40µM.
A figura 25, mostra um efeito preventivo do MIT sobre a neurotoxicidade induzida pela
6-OHDA 40µM em células mesencefálicas de rato. A adição de 40µM da neurotoxina
diminuiu para 77,88% a viabilidade celular (absorbância do MTT: controle = 0,217 ± 0,015; 6-
OHDA 200
µ
M = 0,169 ± 0,012). O MIT nas concentrações de 10 e 100
µ
g/mL preveniu
significativamente, atingindo os níveis do controle na maior concentração, a toxicidade
induzida pela OHDA (absorbância do MTT: MIT 1 + 6-OHDA = 0,202± 0,009) (aumento da
viabilidade em relação à 6-OHDA=15,20%); MIT 10 + 6-OHDA = 0,212 ± 0,013 (19,81%);
MIT 100 + 6-OHDA = 0,221 ± 0,010 (23,96%).
4.9. Efeito neuropreventivo do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de
Magonia glabrata em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 200 µM.
A figura 26, mostra um efeito preventivo do MIT sobre a neurotoxicidade induzida pela
6-OHDA em células mesencefálicas de rato. A adição de 200 µM da neurotoxina diminuiu para
34,63% a viabilidade celular (absorbância do MTT: controle = 0,205 ± 0,011; 6-OHDA 200
µM = 0,071 ± 0,010). O MIT não apresentou neurotoxicidade, nas concentrações de 0,1; 1; 10
e 100 µg/mL, (absorbância do MTT: Controle = 0,205 ± 0,011; MIT 0,1 = 0,199 ± 0,006; MIT
1 = 0,205 ± 0,008; MIT 10 = 0,201 ± 0,008; MIT 100 = 0,226 ± 0,009. O MIT nas
concentrações de 0,1; 1; 10 e 100µg/mL preveniu significativamente e de maneira dose-
dependente, atingindo os níveis do controle na maior concentração, a toxicidade induzida pela
OHDA (absorbância do MTT: 6-OHDA 200
µ
M = 0,071 ± 0,010; MIT 0,1 + 6-OHDA = 0,169
± 0,004; (aumento da viabilidade em relação à 6-OHDA = 47,80%); MIT 1 + 6-OHDA =
0,185 ± 0,003 (53,66%); MIT 10 + 6-OHDA = 0,169 ± 0,003 (61,46%); MIT 100 + 6-OHDA
= 0,210 ± 0,003 (67,80%).
100
CONTROLE
6-OH
D
A 40
M
IT 1
+ 6
-
OH
D
A
M
IT 1
0+ 6
-
OH
D
A
MI
T
10
0+ 6
-
OHDA
0.0
0.1
0.2
0.3
b
a
b
MTT (Absorbância em
540 nm).
FIGURA 25 – Efeito neuropreventivo do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da
casca do fruto de Magonia glabrata em células mesencefálicas de ratos expostas
à 6-OHDA. As células foram cultivadas durante 4 dias. O MIT (1; 10 e
100µg/mL) foi adicionado 3h antes da 6-OHDA 40µM. Após 24h do tratamento,
a viabilidade celular foi determinada pelo MTT. Os valores estão expressos como
média
±
EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de
Turkey).
101
CO
NTRO
L
E
6-O
HDA 2
00
MIT 0,1
MIT 1
MIT 10
MIT 10
0
MIT 0
,1
+ 6-O
HDA
MIT 1 + 6-OHDA
MI
T
1
0 +
6-
OHD
A
MIT 100 + 6-OHDA
0.0
0.1
0.2
0.3
a
b
b
b
b
MTT (Absorbância em
540 nm).
FIGURA 26 – Efeito neuropreventivo do 2-O-metilinositol (MIT) isolado d
a
casca do fruto de Magonia glabrata em células mesencefálicas de ratos expostas
à 6-OHDA. As células foram cultivadas durante 4 dias. O MIT (0,1; 1; 10
100µg/mL) foi adicionado 3h antes da 6-OHDA 200µM. Após 24h do
tratamento, a viabilidade celular foi determinada pelo MTT. Os valores estão
expressos como média
±
EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOV
A
e teste de Turkey).
102
4.10. Efeito de neuroresgate do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de
Magonia glabrata em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA
40
µ
M.
O MIT quando adicionado 3h após a 6-OHDA, mostra um efeito de neuroresgate sobre a
toxicidade induzida pela 6-OHDA em células mesencefálicas de rato. A adição de 40 µM da
neurotoxina diminuiu para 77,88% a viabilidade celular (absorbância pelo MTT: controle =
0,217 ± 0,015; 6-OHDA = 0,169 ± 0,012). O MIT na concentração de 100
µ
g/ml preveniu
significativamente a toxicidade induzida pela 6-OHDA (absorbância pelo MTT: 6-OHDA +
MIT 1 = 0,199 ± 0,102 (aumento da viabilidade em relação à 6-OHDA 40
µ
M = 13,82%); 6-
OHDA + MIT 10 = 0,197± 0,014 (12,90%); 6-OHDA + MIT 100 = 0,219 ± 0,010 (23,04%)
(figura 27).
4.11. Efeito de neuroresgate do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de
Magonia glabrata em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 200 µM.
O MIT quando adicionado 3h após a 6-OHDA, mostra um efeito de neuroresgate sobre a
toxicidade induzida pela 6-OHDA em células mesencefálicas de rato. A adição de 200 µM da
neurotoxina diminuiu para 34,63% a viabilidade celular (absorbância pelo MTT: controle =
0,205 ± 0,011; 6-OHDA 200
µ
M = 0,071 ± 0,010). O MIT não foi tóxico para as células
(absorbância MTT: Controle = 0,205 ± 0,011; MIT 0,1 = 0,199 ± 0,006; MIT 1 = 0,205 ±
0,008; MIT 10 = 0,201 ± 0,008; MIT 100 = 0,226 ± 0,009. O MIT nas concentrações de 0,1; 1;
10 e 100µg/ml preveniu significativamente a toxicidade induzida pela OHDA (absorbância
pelo MTT: 6-OHDA 200 µM = 0,071 ± 0,010; 6-OHDA + MIT 0,1 = 0,106 ± 0,002 (aumento
da viabilidade em relação à 6-OHDA 200 µM = 17,07%); 6-OHDA + MIT 1 = 0,115 ± 0,003
(21,46%); 6-OHDA + MIT 10 = 0,139 ± 0,009 (33,17%); 6-OHDA + MIT 100 = 0,208 ±
0,002 (66,83%) (figura 28).
103
FIGURA 27 – Efeito de neuroresgate do MIT isolado da casca do fruto de
Magonia glabrata em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA. As
células foram cultivadas durante 4 dias. O MIT (1; 10 e 100µg/mL) foi
adicionado 3h após a 6-OHDA 40µM. Após 24h do tratamento, a viabilidade
celular foi determinada pelo MTT. Os valores estão expressos como média
±
EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).
C
O
N
T
R
O
LE
6-OHDA 40
6-OHD
A
+
MI
T
1
6
-OHD
A
+
MI
T
1
0
6
-O
H
D
A +
MIT 100
0.0
0.1
0.2
0.3
b
a
MTT (Absorbância em
540 nm).
104
CO
NTROL
E
6
-
OHDA 20
0
MIT 0
,
1
M
IT 1
MI
T
1
0
MIT 10
0
6
-OHDA + MIT 0
,1
6-OHDA + MIT 1
6-O
HDA +
M
IT 1
0
6
-
O
H
DA +
M
IT 10
0
0.0
0.1
0.2
0.3
a
b
b
b
b
MTT (Absorbância em
540 nm).
FIGURA 28 – Efeito de neuroresgate do MIT isolado da casca do fruto de
Magonia glabrata em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA. As
células foram cultivadas durante 4 dias. O MIT (0,1; 1; 10 e 100
µ
g/mL) foi
adicionado 3h após a 6-OHDA 200
µ
M. Após 24h do tratamento, a viabilidade
celular foi determinada pelo MTT. Os valores estão expressos como média
±
EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).
105
4.12. Efeito da 6-OHDA sobre a produção de nitrito em cultura de células mesencefálicas
de rato.
A figura 29 mostra que a 6-OHDA promoveu um aumento dose-dependente as
concentrações de nitrito quando comparado com o controle (6-OHDA 40µM = 551,9%; 6-
OHDA 200µM =721,3% (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).
4.13. Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada da Myracrodruon
urundeuva sobre a formação de nitrito em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-
OHDA 40
µ
M (Protocolo de Neuroprevenção).
A figura 30 mostra que a 6-OHDA 40µM elevou as concentrações de nitrito quando
comparado com o controle (controle = 9,18 ± 1,20; 6-OHDA 40µM= 33,61 ± 3,582µM
(aumento do níveis de nitrito em relação ao controle = 266,44%). A FEC na maior
concentração conseguiu reverter os níveis de nitrito produzidos pela adição de 6-OHDA (FEC
1 + 6-OHDA = 31,67 ± 1,820 (redução dos níveis de nitrito em relação a 6-OHDA 40 µM =
5,85%) ; FEC 10 + 6-OHDA = 25,37 ± 2,912 (24,58%); FEC 100 + 6-OHDA = 14,05 ±
3,013
µ
M (58,23%).
106
6-O
H
DA
4
0
6
-O
H
D
A
2
0
0
0
150
300
450
600
750
900
Nitrito (% em relação ao
controle)
FIGURA 29 – Efeito da 6-OHDA sobre os níveis de nitrito em células mesencefálicas de
rato. As células foram cultivadas durante 4 dias, após este período foram incubadas com 6-
OHDA (40 e 200µM) durante 24 horas. Após 24h os níveis de nitrito foram determinados. Os
valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle (p< 0,05, ANOVA e teste de
Turkey).
107
C
O
N
T
RO
L
E
6-OHD
A
4
0
FEC1+ 6-OHDA
FEC1
0
+ 6-OHDA
F
EC
1
0
0
+ 6
-O
H
D
A
0
10
20
30
40
b
a
Nitrito (
µ
M)
FIGURA 30 – Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de
Myracrodruon urundeuva sobre a formação de nitrito em cultura de
células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de
neuroprevenção). As células foram cultivadas durante 4 dias. A FEC
(1; 10
e 100µg/mL)
foi adicionada 3h antes da 6-OHDA 40
µ
M. Após 24h os
níveis de nitrito foram determinados . Os valores estão expressos como
média ± EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de
Turke
y)
.
108
4.14. Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de Myracrodruon
urundeuva sobre a formação de nitrito em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-
OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).
A figura 31 mostra que a FEC (0,1; 1; 10 e 100µg/mL) quando adicionada isoladamente,
não alterou as concentrações de nitrito quando comparado com o controle (controle = 8,393 ±
0,333; FEC 0,1 = 7,306 ± 0,477; FEC 1 = 6,635 ± 0,497; FEC 10 = 7,176 ± 0,352; FEC 100 =
6,986 ± 0,323
µ
M. A FEC nas maiores concentrações conseguiu reverter os níveis de nitrito
produzidos pela adição de 6-OHDA (6-OHDA 200
µ
M = 59,38 ± 2,242; FEC 0,1 + 6-OHDA =
53,21 ± 4,191; (redução dos níveis de nitrito em relação a 6-OHDA) = (10,39%); FEC 1 + 6-
OHDA = 30,95 ± 1,063 (47,87%); FEC 10 + 6-OHDA = 25,30 ± 0,636 (57,39%); FEC 100 +
6-OHDA = 23,76 ± 2,431µM (59,98%).
109
CONTROLE
6-OHD
A 2
00
F
EC
0,1
FEC 1
FEC 10
F
EC
100
F
E
C 0,1
+
6
-
OHDA
F
EC
1+ 6-OHDA
FE
C
10
+
6
-OHDA
FEC 100
+
6-
OHDA
0
10
20
30
40
50
60
70
a
b
b
b
Nitrito (
µ
M)
FIGURA 31– Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de
Myracrodruon urundeuva sobre a formação de nitrito em cultura de
células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (protocolo de
neuroprevenção). As células foram cultivadas durante 4 dias. A FEC
(0,1;
1; 10 e 100µg/mL)
foi adicionada 3h antes da 6-OHDA 200µM. Após 24h
os níveis de nitrito foram determinados . Os valores estão expressos como
média ± EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de
Turke
y)
.
110
4.15. Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de Myracrodruon
urundeuva sobre a formação de nitrito em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-
OHDA 40
µM
(Protocolo de Neuroresgate).
A figura 32 mostra que a 6-OHDA 40
µ
M elevou as concentrações de nitrito quando
comparado com o controle (controle = 9,187 ± 1,202; 6-OHDA 40 µM = 33,61 ± 3,582µM)
(aumento do níveis de nitrito em relação ao controle = 365,84%). A FEC, na concentração de
100
µ
g/ml conseguiu reverter significativamente este aumento nos níveis de nitrito (6-OHDA +
FEC 1 = 30,75 ± 1,969 (redução dos níveis de nitrito em relação a 6-OHDA 40
µ
M = 8,50%);
6-OHDA + FEC 10 = 28,81 ± 1,692(14,28%); 6-OHDA + FEC 100 = 18,34 ± 2,902
µM(45,43%).
4.16. Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de Myracrodruon
urundeuva sobre a formação de nitrito em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-
OHDA (Protocolo de Neuroresgate) 200
µ
M.
A figura 33 mostra que a FEC (0,1; 1; 10 e 100µg/ml), não alterou as concentrações de
nitrito quando comparado com o controle (controle = 1,494 ± 0,130; FEC 0,1 = 1,494 ± 0,132;
FEC 1 = 1,821 ± 0,214; FEC 10 = 2,206 ± 0,309; FEC 100 = 1,760 ± 0,245µM. A FEC em
associação com a 6-OHDA, nas concentrações (0,1; 1; 10 e 100µg/ml) não conseguiu reverter o
aumento nos níveis de nitrito gerados pela 6-OHDA (6-OHDA 200 µM = 27,32 ± 0,708; 6-
OHDA + FEC 0,1 = 26,71 ± 0,6541; 6-OHDA + FEC 1 = 26,87 ± 0,443; 6-OHDA + FEC 10 =
28,73 ± 0,297; 6-OHDA + FEC 100 = 31,83± 0,820µM.
111
FIGURA 32 - Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de
Myracrodruon urundeuva sobre a formação de nitrito em cultura de células
mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40µM (protocolo de neuroresgate).
As células foram cultivadas durante 4 dias. A FEC
(1; 10 e 100µg/ml) foi
adicionada 3h após a 6-OHDA (40µM). Após 24h do tratamento os níveis de
nitrito foram determinados. Os valores estão expressos como média ± EPM,
a
vs
controle; b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).
CON
T
ROL
E
6
-O
HDA
4
0
6-OH
D
A + FEC
1
6
-OH
DA
+ F
E
C
1
0
6-OHDA + FEC 100
0
10
20
30
40
a
b
Nitrito (
µ
M)
112
C
ONT
R
OLE
6-OHD
A
200
F
EC
0,
1
FE
C
1
F
E
C 10
F
EC
100
6-
OH
D
A +
FEC
0,
1
6-O
H
DA + FE
C
1
6-OHD
A
+
F
EC
10
6-OHD
A
+
F
EC
100
0
10
20
30
40
a
Nitrito (
µ
M)
FIGURA 33
- Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de
Myracrodruon urundeuva sobre a formação de nitrito em cultura de células
mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 200µM (protocolo de neuroresgate).
As células foram cultivadas durante 4 dias. A FEC
(0,1; 1; 10 e 100µg/ml) foi
adicionada 3h após a 6-OHDA (200
µ
M). Após 24h do tratamento os níveis de
nitrito foram determinados. Os valores estão expressos como média
±
EPM, a vs
controle (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).
113
4.17. Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de Magonia glabrata
sobre a formação de nitrito em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40
µM
(Protocolo de Neuroprevenção).
A figura 34 mostra que a 6-OHDA 40 µM elevou as concentrações de nitrito quando
comparado com o controle (controle = 9,187 ± 1,202; 6-OHDA 40 µM = 33,61 ± 3,582µM). O
MIT conseguiu prevenir significativamente (p<0,05) o aumento nos níveis de nitrito
produzidos pela adição de 6-OHDA (MIT 1 + 6-OHDA = 29,50 ± 1,978 (redução dos níveis de
nitrito em relação à 6-OHDA = 12,22%; MIT 10 + 6-OHDA = 24,37 ± 2,781 (27,49%); MIT
100 + 6-OHDA = 14,24 ± 1,248µM (57,63%).
4.18. Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de Magonia glabrata
sobre a formação de nitrito em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 200
µ
M
(Protocolo de Neuroprevenção).
A figura 35 mostra que o MIT (0,1; 1; 10 e 100
µ
g/ml), não alterou as concentrações de
nitrito quando comparado com o controle (controle = 8,393 ± 0,333; MIT 0,1 = 9,666 ± 0,841;
MIT 1 = 9,515 ± 0,432; MIT 10 = 10,03 ± 0,634; MIT 100 = 9,743 ± 0,726µM). O MIT
conseguiu reverter significativamente (p<0,05) o aumento nos níveis de nitrito produzidos pela
adição de 6-OHDA (6-OHDA 200
µ
M = 59,38 ± 2,242; MIT 0,1 + 6-OHDA = 49,54 ± 3,453
(redução dos níveis de nitrito em relação a 6-OHDA (200
µ
M) = (16,57%); MIT 1 + 6-OHDA
= 37,93 ± 1,447 (36,12%); MIT 10 + 6-OHDA = 32,27 ± 2,970 (45,65%); MIT 100 + 6-
OHDA = 21,10 ± 0,621µM (64,46%).
114
CONTROLE
6
-OHD
A
40
MIT
1+
6
-OH
DA
MIT 10 + 6-OHDA
MI
T
1
0
0
+
6
-OHD
A
0
10
20
30
40
50
a
b
Nitrito (
µ
M)
FIGURA 34 – Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto
de Magonia glabrata sobre a formação de nitrito em cultura de células
mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40µM (protocolo de
neuroprevenção). As células foram cultivadas durante 4 dias. O MIT (1;
10 e 100µg/mL) foi adicionado 3h antes da 6-OHDA (40µM). Após 24h
do tratamento os níveis de nitrito foram determinados. Os valores estão
expressos como média
±
EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05,
ANOVA e teste de Turkey).
115
CONT
R
O
L
E
6-OHD
A
200
MI
T
0
,
1
MIT
1
MIT
1
0
MI
T
1
00
MIT
0
,
1
+ 6-OHDA
MI
T
1 +
6
-O
H
DA
MI
T
10
+ 6-OHDA
M
IT
1
0
0 +
6
-O
H
DA
0
10
20
30
40
50
60
70
a
b
b
b
b
Nitrito (
µ
M)
FIGURA 35
– Efeito do 2-O-metilinositol
(MIT) isolado da casca do fruto
de Magonia glabrata sobre a formação de nitrito em cultura de células
mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (protocolo de
neuroprevenção). As células foram cultivadas durante 4 dias. O MIT (0,1;
1; 10 e 100µg/mL) foi adicionado 3h antes da 6-OHDA (200µM). Após
24h do tratamento os níveis de nitrito foram determinados. Os valores
estão expressos como média
±
EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p<
0
,
05
,
ANOVA e teste de Turke
y)
.
116
4.19. Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de Magonia glabrata
sobre a formação de nitrito em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40µM
(Protocolo de Neuroresgate)
O MIT na concentração de 100µg/mL diminuiu significativamente o aumento nos níveis
de nitrito gerados pela 6-OHDA 40µM = 33,61 ± 3,582 (6-OHDA + MIT 1 = 32,34 ±
0,761(redução dos níveis de nitrito em relação a 6-OHDA 40
µ
M) = (3,77%); 6-OHDA + MIT
10 = 26,93 ± 0,871
µ
M (19,87%); 6-OHDA + MIT 100 = 17,81± 2,754
µ
M (47%)(figura 36).
4.20. Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de Magonia glabrata
sobre a formação de nitrito em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA
(Protocolo de Neuroresgate)
A figura 37 mostra que a MIT (0,1; 1; 10 e 100µg/ml), não alterou as
concentrações de nitrito quando comparado com controle (controle = 8,393 ± 0,333; MIT 0,1 =
9,666 ± 0,841; MIT 1 = 9,515 ± 0,432; MIT 10 = 10,03 ± 0,634; MIT 100 = 9,743 ± 0,726µM).
A FEC em associação com a 6-OHDA, nas concentrações (10 e 100µg/mL) diminuiu
significativamente o aumento nos níveis de nitrito gerados pela 6-OHDA (6-OHDA 200 µM =
59,38 ± 2,242; 6-OHDA + MIT 0,1 = 55,28 ± 2,147(redução dos níveis de nitrito em relação a
6-OHDA 200 µM) (6,90%); 6-OHDA + MIT 1 = 53,90 ± 0,888 (9,22%); 6-OHDA + MIT 10 =
51,28 ± 0,751µM (13,64%); 6-OHDA + MIT 100 = 20,43± 0,718 µM (65,59%).
117
CON
T
R
O
LE
6-OHDA 40
6
-O
H
D
A
+
MI
T
1
6-OHDA + MIT
10
6
-OHD
A
+
MI
T
1
0
0
0
10
20
30
40
50
a
b
Nitrito (
µ
M)
FIGURA 36 - Efeito do 2-O-metilinositol
MIT
isolado da casca do fruto de
Magonia glabrata sobre a formação de nitrito em cultura de células
mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40
µ
M
(protocolo de neuroresgate).
As células foram cultivadas durante 4 dias. O MIT (1; 10 e 100
µ
g/mL) foi
adicionado 3h após a 6-OHDA 40
µ
M. Após 24h do tratamento os níveis de
nitrito foram determinados. Os valores estão expressos como média
±
EPM, a vs
controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).
118
C
ONTR
OLE
6-OHDA 200
MIT
0,1
MIT 1
MIT
10
MIT 100
6-
O
HD
A
+ MIT 0,1
6-OHDA + MIT 1
6-OHD
A
+ MIT 10
6
-OH
D
A +
MIT
100
0
10
20
30
40
50
60
70
a
b
b
Nitrito (
µ
M)
FIGURA 37 - Efeito do 2-O-metilinositol MIT isolado da casca do fruto de
Magonia glabrata sobre a formação de nitrito em cultura de células
mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (protocolo de neuroresgate). As
células foram cultivadas durante 4 dias. O MIT (0,1; 1; 10 e 100µg/mL) foi
adcionada 3h após a 6-OHDA 200µM. Após 24h do tratamento os níveis de
nitrito foram determinados. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs
controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).
119
4.21. Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de Myracrodruon
urundeuva sobre os níveis de TBARS em células mesencefálicas de ratos expostass à 6-
OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).
A figura 38 mostra que a exposição das células à 6-OHDA aumentou significativamente
(para 166,84%) a peroxidação lipídica demonstrada pelo aumento de TBARS (absorbância do
TBARS, controle = 0,187 ± 0,047; 6-OHDA = 0,499 ± 0,062). A FEC isoladamente nas
concentrações (0,1; 1; 10 e 100
µ
g/mL) não alterou os níveis de TBARS (FEC 0,1 = 0,176 ±
0,020; FEC 1 = 0,164 ± 0,027; FEC 10 = 0,151 ± 0,024; FEC 100 = 0,137 ± 0,014). A FEC nas
concentrações de (10 e 100µg/ml) reverteu significativamente os níveis de TBARS produzidos
pela 6-OHDA (6-OHDA 200 µM = 0,499 ± 0,062; FEC 0,1 + 6-OHDA = 0,487 ± 0,033; FEC
1 + 6-OHDA = 0,451 ± 0,062; FEC 10 + 6-OHDA = 0,293 ± 0,067 (redução dos níveis de
TBARS em relação a 6-OHDA 200 µM) (41,28%); FEC 100 + 6-OHDA = 0,219 ± 0,019
=(56,11%).
120
CONT
RO
L
E
6
-OHDA
2
0
0
F
E
C 0
,
1
FE
C
1
FEC 10
FEC
1
0
0
FE
C 0
,
1
+ 6-OHDA
FE
C 1
+
6
-OHDA
F
EC 10
+
6-OHDA
FEC 100 + 6-OHDA
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
a
b
b
TBARS Abs
FIGURA 38 - Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de
Myracrodruon urundeuva sobre os níveis de
TBARS
em células
mesencefálicas de rato. As células foram cultivadas durante 4 dias. A FEC
(0,1; 1; 10 e 100µg/mL)
foi adicionada 3h antes da 6-OHDA 200
µ
M (protocolo
de neuroprevenção). Após 24h do tratamento, os níveis de
TBARS fora
m
determinados. Os valores estão expressos como média ± EPM,
a
vs controle,
b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).
121
4.22. Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolado de Myracrodruon
urundeuva sobre os níveis de TBARS em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-
OHDA (Protocolo de Neuroresgate).
A figura 39 mostra que a exposição das células à 6-OHDA aumentou
significativamente (170,27%) os níveis de TBARS em relação ao controle (absorbância do
TBARS, controle = 0,185 ± 0,044; 6-OHDA = 0,500 ± 0,058). A FEC isoladamente nas
concentração de (0,1; 1; 10 e 100µg/ml) não alterou os níveis de TBARS (FEC 0,1 = 0,176 ±
0,020; FEC 1 = 0,164 ± 0,027; FEC 10 = 0,151 ± 0,024; FEC 100 = 0,137 ± 0,014). A FEC na
concentração de 100µg/mL reverteu significativamente (p<0,05) os níveis de TBARS
produzidos pela 6-OHDA (6-OHDA 200 µM = 0,500 ± 0,058; 6-OHDA + FEC 0,1 = 0,513 ±
0,058; 6-OHDA + FEC 1 = 0,748 ± 0,040; 6-OHDA + FEC 10 = 0,449 ± 0,043; 6-OHDA +
FEC 100 = 0,276 ± 0,047 (redução dos níveis de TBARS em relação a 6-OHDA 200
µ
M)
(44,8%).
122
C
ON
T
ROLE
6-OHDA 200
FEC 0,1
F
EC
1
F
EC
10
F
EC
100
6-OH
D
A
+ FEC 0,1
6-OHDA + FEC 1
6-OHDA +
F
EC 10
6-OHD
A
+
F
EC
100
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
a
b
TBARS Abs.
FIGURA 39 – Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de
Myracrodruon urundeuva sobre os níveis de TBARS em cultura de células
mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA. As células foram cultivadas
durante 4 dias. A FEC
(0,1; 1; 10 e 100µg/mL)
foi adicionada 3h após à 6-
OHDA (200µM) (protocolo de neuroresgate). Após 24h os níveis de TBARS
foram determinados . Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs
controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).
123
4.23. Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de
Magonia glabrata
sobre os níveis de TBARS em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA
(Protocolo de Neuroprevenção).
A figura 40 mostra que a exposição das células à 6-OHDA aumentou
significativamente (em 166,84%) os níveis de TBARS em relação ao controle (Absorbância do
TBARS, controle = 0,187 ± 0,047; 6-OHDA = 0,499 ± 0,062). A MIT nas concentrações de
(0,1; 1; 10 e 100µg/mL) não alterou os níveis de TBARS em relação ao controle (controle =
0,187 ± 0,047; MIT 0,1 = 0,198 ± 0,029; MIT 1 = 0,208 ± 0,016; MIT 10 = 0,177 ± 0,032; MIT
100 = 0,187 ± 0,029. O MIT nas concentrações de (1; 10 e 100
µ
g/mL) reverteu os níveis de
TBARS produzidos pela 6-OHDA (6-OHDA 200 µM = 0,499 ± 0,062; MIT 0,1 + 6-OHDA =
0,427 ± 0,056; MIT 1 + 6-OHDA = 0,252 ± 0,021 (redução dos níveis de TBARS em relação à
6-OHDA 200
µ
M) = (49,49%); MIT 10 + 6-OHDA = 0,220 ± 0,038 (55,91%); MIT 100 + 6-
OHDA = 0,151 ± 0,024 (69,93%).
124
C
O
N
TR
OLE
6
-
OHDA 200
MIT 0,1
MI
T 1
MI
T 10
MIT 100
MI
T 0,1+ 6-
O
HDA
MI
T 1+
6
-
OH
D
A
MIT 1
0
+
6-OH
D
A
MIT
1
00 + 6-OHDA
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
a
b
b
b
TBARS Abs.
FIGURA 40 - Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de
Magonia glabrata sobre os níveis de TBARS em células mesencefálicas de
rato. As células foram cultivadas durante 4 dias. O MIT
(0,1; 1; 10 e
100
µ
g/mL)
foi adicionado 3h antes da 6-OHDA (200µM) (protocolo de
neuroprevenção). Após 24h do tratamento os níveis de
TBARS
fora
m
determinados. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle,
b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).
125
4.24. Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de Magonia glabrata
sobre os níveis de TBARS em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA
(Protocolo de Neuroresgate).
A figura 41 mostra que a exposição das células à 6-OHDA aumentou
significativamente (em 170,27%) os níveis de TBARS em relação ao controle (absorbância do
TBARS, controle = 0,185 ± 0,044; 6-OHDA = 0,500 ± 0,058). O MIT nas concentrações de
(0,1; 1; 10 e 100
µ
g/mL) não alterou os níveis de TBARS em relação ao controle (controle =
0,185 ± 0,044; MIT 0,1 = 0,198 ± 0,029; MIT 1 = 0,208 ± 0,016; MIT 10 = 0,177 ± 0,032; MIT
100 = 0,187 ± 0,029. O MIT nas concentrações de 10 e 100µg/mL reverteu significativamente
(p
<
0,05) os níveis de TBARS produzidos pela 6-OHDA (6-OHDA 200
µ
M = 0,500 ± 0,058;
MIT 0,1 + 6-OHDA = 0,458 ± 0,038; MIT 1 + 6-OHDA = 0,412 ± 0,044; MIT 10 + 6-OHDA
= 0,311 ± 0,030; (redução dos níveis de TBARS em relação a 6-OHDA = (37,8%); MIT 100 +
6-OHDA = 0,200 ± 0,028 (60,0%).
126
CONT
R
OLE
6
-
OHDA
2
00
MIT
0
,
1
MIT
1
MIT 10
MIT
1
00
6-O
H
D
A
+
MIT
0
,
1
6-OHDA + MIT
1
6-
O
HDA
+
MI
T 1
0
6
-O
H
D
A
+
MI
T
1
0
0
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
a
b
b
TBARS Abs.
FIGURA 41 – Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto
de Magonia glabrata sobre os níveis de TBARS em cultura de células
mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA. As células foram cultivadas
durante 4 dias. O MIT
(0,1; 1; 10 e 100µg/mL)
foi adicionado 3h após à 6-
OHDA (200µM) (protocolo de neuroresgate). Após 24h do tratamento os
níveis de TBARS foram determinados. Os valores estão expressos como
média
±
EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de
Turkey).
127
4.25. Efeito neuropreventivo da Deferoxamina (DEF) em células mesencefálicas de
ratos expostas à 6-OHDA.
A DEF, um quelador de ferro usado como controle do experimento, mostrou um efeito
preventivo sobre a neurotoxicidade induzida pela 6-OHDA. Os resultados mostram que a
adição de 200 µM da neurotoxina diminuiu em 44% a viabilidade celular (absorbância do
MTT: controle = 0,087 ± 0,003; 6-OHDA 200 µM = 0,049 ± 0,001). A DEF, na concentração
de 100 µg/mL, não foi citotóxica para as células (absorbância do MTT: DEF 100 = 0,084 ±
0,001 e preveniu significativamente a toxicidade induzida pela 6-OHDA (absorbância pelo
MTT: DEF 100 + 6-OHDA = 0,077 ± 0,002 (aumento da viabilidade em relação à 6-OHDA =
55,10%) (figura 42).
4.26. Efeito de neuroresgate da Deferoxamina (DEF) em células mesencefálicas de ratos
expostas a 6-OHDA.
A DEF quando adicionada 3h após a 6-OHDA, mostra um efeito de neuroresgate sobre a
neurotoxicidade induzida pela 6-OHDA em células mesencefálicas de rato. Os resultados
mostram que a adição de 200
µ
M da neurotoxina diminuiu em 45,23% a viabilidade celular
(absorbância pelo MTT: controle = 0,084 ± 0,001; 6-OHDA 200 mM = 0,046 ± 0,001). A DEF
na concentração de 100
µ
g/ml preveniu significativamente a toxicidade induzida pela OHDA
(absorbância pelo MTT: 6-OHDA 200
µ
M = 0,046 ± 0,001; 6-OHDA + DEF 100 = 0,076 ±
0,001. (aumento da viabilidade em relação a 6-OHDA 200
µ
M = 65,21%) (figura 43).
128
FIGURA 42 – Efeito neuropreventivo da deferoxamina (DEF) em células
mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA. As células foram cultivadas durante
4 dias. A DEF (100
µ
g/mL) foi adicionada 3h antes da 6-OHDA (200
µ
M). Após
24 horas, a viabilidade celular foi determinada pelo MTT. Os valores estão
expressos como média
±
EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOV
A
e teste de Turkey).
FIGURA 43 – Efeito de neuroresgate da DEF em células mesencefálicas de
ratos exposta à 6-OHDA. As células foram cultivadas durante 4 dias.
A
deferoxamina (DEF) (100µg/ml) foi adicionada 3h após à 6-OHDA (200µM).
Após 24 horas, a viabilidade celular foi determinada pelo MTT. Os valores
estão expressos como média
±
EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05,
ANOVA e teste de Turkey).
C
O
NT
R
OLE
6-OHDA 200
DEF
100
6
-
O
HDA
+
DEF
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
0.09
a
b
MTT Abs.
C
ONT
R
OL
E
6-OHD
A
2
00
D
E
F
100
DEF+ 6-OHDA
0.000
0.025
0.050
0.075
0.100
a
b
MTT Abs.
129
4.27. Efeito da DEF sobre a formação de nitrito em células mesencefálicas de ratos
expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).
A figura 44 mostra que a DEF (100µg/ml) quando adicionada isoladamente, não alterou
as concentrações de nitrito quando comparado com o controle (controle = 1,494 ± 0,130; DEF
100 = 1,492 ± 0,132µM. A DEF não conseguiu reverter o aumento dos níveis de nitrito
produzidos pela adição de 6-OHDA (6-OHDA 200 µM = 27,32 ± 0,708; DEF 100 + 6-OHDA
= 30,56 ± 0,283µM.
4.28. Efeito do DEF sobre a formação de nitrito em células mesencefálicas de ratos
expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate).
A figura 45 mostra que a DEF (100µg/ml), não alterou as concentrações de nitrito. A
DEF não promoveu nenhuma alteração no aumento dos níveis de nitrito gerados pela 6-OHDA
(controle = 1,494 ± 0,130; DEF 100 = 1,492 ± 0,132
µ
M; 6-OHDA 200
µ
M = 27,32 ± 0,708;
DEF 100 + 6-OHDA = 29,16 ± 0,585µM).
130
FIGURA 44 - Efeito da deferoxamina (DEF) sobre a formação de nitrito em cultura de
células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (protocolo de neuroprevenção). As
células foram cultivadas durante 4 dias. A DEF (100µg/mL) foi adicionada 3h antes a 6-
OHDA 200
µ
M. Após 24h do tratamento os níveis de nitrito foram determinados. Os
valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle (p< 0,05, ANOVA e teste de
Turkey).
C
ONTROLE
6-OH
D
A
20
0
DEF 100
6-
O
HDA + DEF
0
10
20
30
a
Nitrito (
µ
M)
FIGURA 45 - Efeito da DEF sobre a formação de nitrito em cultura de células
mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (protocolo de neuroresgate). As células
foram cultivadas durante 4 dias. A DEF (100
µ
g/mL) foi adicionada 3h após a 6-OHDA
200µM. Após 24h do tratamento, os níveis de nitrito foram determinados. Os valores
estão expressos como média ± EPM, a vs controle (p< 0,05, ANOVA e teste de
Turkey).
CONTROLE
6-
O
H
DA
200
DEF 100
D
E
F+
6-OH
DA
0
5
10
15
20
25
30
35
a
Nitrito (
µ
M)
131
4.29. Efeito da deferoxamina (DEF) sobre os níveis de TBARS em células mesencefálicas
de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).
A figura 46 mostra que a exposição das células à 6-OHDA aumentou significativamente
(em 166,84%) os níveis de TBARS (absorbância do TBARS, controle = 0,187 ± 0,047; 6-
OHDA = 0,499 ± 0,062). A DEF na concentração de 100
µ
g/ml não alterou os níveis de
TBARS (DEF 100 = 0,177 ± 0,029). No entanto, a DEF reverteu o aumento dos níveis de
TBARS produzidos pela 6-OHDA (6-OHDA 200 µM = 0,499 ± 0,062; DEF 100 + 6-OHDA =
0,221 ± 0,023) (redução dos níveis de TBARS = 55,55%) .
4.30. Efeito da deferoxamina (DEF) sobre os níveis de TBARS em células mesencefálicas
de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate).
A figura 47 mostra que a exposição das células à 6-OHDA aumentou significativamente
(em 170,27%) os níveis de TBARS em relação ao controle (absorbância do TBARS, controle =
0,185 ± 0,044; 6-OHDA = 0,500 ± 0,058). A DEF reverteu significativo aumento dos níveis de
TBARS produzidos pela 6-OHDA (6-OHDA 200 µM = 0,500 ± 0,058; DEF 100 + 6-OHDA =
0,319 ± 0,059 (redução dos níveis de TBARS = 36,2%).
132
FIGURA 46- Efeito da deferoxamina (DEF) sobre os níveis de TBARS e
m
células mesencefálicas de rato expostas à 6-OHDA (protocolo de
N
europrevenção). As células foram cultivadas durante 4 dias. A DEF
(100
µ
g/mL) foi adicionada 3h antes da 6-OHDA 200
µ
M. Após 24h do
tratamento os níveis de TBARS foram determinados. Os valores estão expressos
como média ± EPM,
a
vs controle,
b
vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de
Turkey).
C
ONT
ROL
E
6-OHDA 200
DEF 10
0
DEF +
6
-
OH
DA
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
a
b
TBARS Abs.
CONTR
O
LE
6
-
O
H
DA 2
0
0
DEF
1
0
0
6-OHDA + DEF
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
a
b
TBARS Abs.
FIGURA 47 – Efeito da deferoaxamina (DEF) sobre os níveis de TBARS e
m
cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (protocolo de
N
euroresgate). As células foram cultivadas durante 4 dias. A DEF (100µg/ml)
foi adicionada 3h após à 6-OHDA 200µM. Após 24h do tratamento os níveis
de TBARS foram determinados. Os valores estão expressos como média
±
EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).
133
4.31. Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) e Deferoxamina (DEF) sobre o
padrão apoptótico em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de
Neuroprevenção).
A figura 48 mostra o padrão de morte celular das culturas mesencefálicas de rato após a
exposição à 6-OHDA. O padrão apoptótico foi evidenciado pela ténica de laranja de
acridina/brometo de etídio, o qual revelou após exposição à 6-OHDA (40 e 200µM)
corpúsculos apoptoticos (campo b seta larga fechada) e necrose (campo c seta larga aberta),
respectivamente. Os campos de contraste microscópico mostraram que a FEC (e, f) e DEF (h,
i) inibiram a apoptose e necrose induzida por 6-OHDA (40 e 200
µ
M), respectivamente. Além
disso, pode ser observado a presença da integridade dos neuritos, após o tratamento com as
drogas neuroprotetoras.
A figura 49 mostra o padrão morfológico da cultura de células mesencefálicas em
condições controle (normais- 91,00%, Apoptose Inicial (AI)- 6,875%, Apoptose Tardia (AT)-
1,250%, necrose- 0,8750%) e após a adiminstração da 6-OHDA (40µM). A neurotoxina
induziu um padrão de AI em 32,50% AT em 3,12%, necrose em 43,00% e células com
morfologia normal em 21,38%. Das células contadas a FEC e a DEF mostraram um efeito
antiapoptótico significativo quando adicionadas antes da 6-OHDA 40
µ
M (FEC = normal -
76,00%, AI- 0,50%, AT- 2,50%, necrose- 17,33%), (DEF = normal - 75,00%, AI- 1,33%, AT-
1,66%, necrose- 20,33%). As células tratadas com FEC isoladamente (100
µ
g/mL)
apresentaram os seguintes padrões celulares (normal - 83,00%, AI- 6,00%, AT- 1,66%,
necrose- 9,33%). Na concentração de 200µM, a 6-OHDA induziu uma grande morte celular,
com aumento de células em apoptose tardia e necrose (normal- 0,25%, AI- 1,75%, AT-
28,38%, necrose- 69,75%), tendo este padrão sido inibido, significativamente à quase
normalidade, pela FEC (normais- 84,00%, AI- 1,00%, AT- 2,33%, necrose- 13,17%), e pela
DEF (normal - 61,83%, AI- 6,83%, AT- 2,33%, necrose- 29,00%). A DEF isoladamente
mostrou um padrão morfológico de células cultivadas em condições controle (normal- 70,50%,
AI- 7,83%, AT- 0,50%, necrose- 11,17%).
134
Controle
6-OHDA 40 6-OHDA 200
FEC 100+ 6-OHDA 40
FEC 100+ 6-OHDA 200
FEC
DEF 100+ 6-OHDA 40 DEF 100+ 6-OHDA 200
FIGURA 48 – Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) sobre o padrão
apoptótico em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA
(Protocolo de Neuroprevenção). As células foram cultivadas durante 4 dias. A 6-
OHDA (40 e 200
µ
M) foi adicionada 3h antes da FEC e deferoxamina (DEF)
(100
µ
g/ml). Após 24h do tratamento, o padrão apoptótico foi avaliado pela ténica de
laranja de acridina/brometo de etídio. Seta larga fechada: corpúsculos apoptóticos,
seta larga aberta: células necróticas (40X).
DEF
a
b
c
d
e
f
g
i
h
135
FIGURA 49- Efeito da fração enriquecidada de chalconas (FEC) sobre o padrão apoptótico em
cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).
As células foram cultivadas durante 4 dias e após este tempo foram pré-incubadas com FEC e
Deferoxamina (DEF) (100µg/mL) por 3 horas e em seguida foi adicionada 6-OHDA (a-40; b-
200
µ
M) permanecendo em incubação por 24h. O padrão apoptótico foi evidenciado pela
técnica de laranja de acridina/brometo de etídio. Os experimentos foram feitos em 3 dias
diferentes e foram contadas 200 células por lâmina. Os valores estão expressos como média
±
EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (dentro de cada padrão morfológico) (p< 0,05, ANOVA e
teste de Turkey).
CONTROLE
6-
OHD
A
40
FEC
100
FEC
+
6-O
H
DA
Defero
x
amin
a
10
0
DEF
+
6-O
H
DA
0
25
50
75
100
normais
apoptose inicial
apoptose tardia
necrose
a
b
b
a
b
a
b
b
b
a
% do total de células
C
O
N
TR
O
L
E
6
-OH
D
A 2
0
0
FEC 1
0
0
FEC + 6-OHDA
D
e
fe
r
oxamina 100
D
E
F + 6
-
O
H
DA
0
25
50
75
100
normais
apoptose inicial
apoptose tardia
necrose
a
b
b
a
b
b
a
b
a
b
b
b
% do total de células
136
4.32. Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) e Deferoxamina (DEF) sobre o
padrão apoptótico em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de
Neuroresgate).
A figura 50 mostra o padrão de morte celular das culturas mesencefálicas de rato após a
exposição à 6-OHDA. O padrão apoptótico foi evidenciado pela técnica de laranja de
acridina/brometo de etídio (fluorescência), o qual revelou após exposição à 6-OHDA (40 e
200µM) corpúsculos apoptoticos (campo b - seta larga fechada) e necrose (campo c - seta larga
aberta),
respectivamente. Os campos de contraste microscópico mostraram que a FEC (
e, f
) e
DEF (h, i) inibiram a apoptose e necrose induzida por 6-OHDA (40 e 200
µ
M)
respectivamente. Nas células tratadas com FEC e DEF, apesar da manutenção da integridade do
corpo celular, é visível a perda de neuritos, com alteração do padrão morfológico de uma célula
cultivada na ausência da neurotoxina (campo f , i seta fina fechada).
A figura 51 mostra o padrão morfológico da cultura de células mesencefálicas em
condições controle (normais- 91,00%, Apoptose Inicial (AI)- 6,875%, Apoptose Tardia (AT)-
1,250%, necrose- 0,8750%) e após a 6-OHDA (40µM). A neurotoxina induziu um padrão de
AI em 32,50%, AT em 3,12%, necrose em 43,00% e células com morfologia normal em
21,38%. Das células a FEC e a DEF mostraram um efeito antiapoptótico significativo quando
adicionadas após à 6-OHDA 40µM (FEC = normais- 75,17%, AI- 2,83%, AT- 4,66%, necrose-
17,33%), (DEF = normais- 60,50%, AI- 5,50%, AT- 3,50%, necrose- 30,63%). As células
tratadas com FEC isoladamente (100
µ
g/mL) apresentaram os seguintes padrões celulares
(normal - 83,00%, AI- 6,00%, AT- 1,66%, necrose- 9,33%). Na concentração de 200
µ
M, a 6-
OHDA induziu uma grande morte celular, com aumento de células em apoptose tardia e
necrose (normal- 0,25%, AI- 1,75%, AT- 28,38%, necrose- 69,75%), tendo este padrão sido
revertido à quase normalidade pela FEC (normais- 78,33%, AI- 4,50%, AT- 3,33%, necrose-
12,17%) e DEF (normais- 52,83%, AI- 1,33%, AT- 3,50%, necrose- 42,33%). A
Deferoxamina (DEF) isoladamente produziu o seguinte padrão morfológico (normal- 70,50%,
AI- 7,83%, AT- 0,50%, necrose- 11,17%).
137
Controle
6-OHDA 40
6-OHDA 200
FEC
6-OHDA 40 + FEC 100
6-OHDA 200 + FEC 100
6-OHDA 40 + DEF 100
6-OHDA 200 + DEF 100
DEF
a b c
d e
f
g
h
i
FIGURA 50 – Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) sobre o padrão
apoptótico em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHD
A
(Protocolo de Neuroresgate). As células foram cultivadas durante 4 dias. A 6-OHD
A
(40 e 200 µM) foi adicionada 3h antes da FEC e DEF (100
µ
g/ml). Após 24h do
tratamento o padrão apoptótico foi avaliado pela técnica de laranja de acridina/brometo
de etídio. Seta larga fechada: corpúsculos apoptóticos, seta larga aberta: células
necróticas, seta fina fechada: células com ausência de neuritos Microscópico
fluorescente (40X).
138
CO
NTROLE
6-OHDA 4
0
FEC
10
0
6-
O
HDA +
FEC
Defe
r
oxami
na
1
0
0
6-OHDA + DEF
0
25
50
75
100
normais
apoptose inicial
apoptose tardia
necrose
a
a
b
a
a
a
b
b
b
b
b
a
% do total de células
CO
N
TROLE
6
-
O
HDA
2
00
FE
C
100
6
-
OHDA + FEC
De
f
e
r
o
x
amina
10
0
6-OHDA + DE
F
0
25
50
75
100
normais
apoptose inicial
apoptose tardia
necrose
a
b
a
a
a
b
b
b
b
b
b
b
% do total de células
FINGURA 51– Efeito da fração enriquecidada de chalconas (FEC) e deferoxamina (DEF)
sobre o padrão apoptótico em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas, à 6-
OHDA (Protocolo de Neuroresgate). As células foram cultivadas durante 4 dias e após este
tempo foram pré-incubadas com 6-OHDA (a-40; b-200
µ
M). Decorridas 3h foi adicionad
a
FEC e DEF (100µg/mL) permanecendo em incubação por 24h. O padrão apoptótico foi
evidenciado pela técnica de laranja de acridina/brometo de etídio. Os experimentos fora
m
feitos em 3 dias diferentes e foram contadas 200 células por lâmina. Os valores estão
expressos como média ± EPM,
a
vs controle,
b
vs 6-OHDA (dentro de cada padrão
morfológico) (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).
139
4.33. Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre o padrão apoptótico em células
mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).
A figura 52 mostra o padrão de morte celular das culturas mesencefálicas de rato após a
exposição à 6-OHDA. O padrão apoptótico foi evidenciado pela técnica de laranja de
acridina/brometo de etídio (fluorescência), o qual revelou após a exposição a 6-OHDA (40 e
200
µ
M) corpúsculos apoptoticos (campo b - seta larga fechada) e necrose (campo c - seta larga
aberta), respectivamente. O campo de contraste microscópico mostrou que o MIT (e, f) inibiu
a apoptose e necrose induzida pela 6-OHDA (40 e 200µM), respectivamente. Além disso pode
ser observado a presença da integridade dos neuritos.
A figura 53 mostra o padrão morfológico da cultura de células mesencefálicas em
condições controle (normais- 91,0%, Apoptose Inicial (AI)- 6,8%, Apoptose Tardia (AT)-
1,2%, necrose- 0,8%) e após a adição da 6-OHDA (40µM), que induziu um padrão de AI em
32,5%, AT em 3,12%, necrose em 43,00% e células com morfologia normal em 21,3%. Das
cdélulas contadas o MIT e o DEF mostraram um efeito antiapoptótico significativo quando
adicionados antes da 6-OHDA 40
µ
M (MIT = normal - 80,83%, AI- 3,00%, AT- 1,66%,
necrose- 14,5%). As células tratadas com MIT isoladamente (100
µ
g/mL) apresentaram os
seguintes padrões celulares (normal - 86,3%, AI- 11,00%, AT- 1,50%, necrose- 1,16%). Na
concentração de 200
µ
M, a 6-OHDA induziu uma grande morte celular, com aumento de
células em apoptose tardia e necrose (normal- 0,25%, AI- 1,75%, AT- 28,38%, necrose-
69,75%), tendo este padrão sido inibido à quase normalidade pelo MIT (normais- 76,83%, AI-
2,00%, AT- 2,50%, necrose- 19,67%).
140
Controle 6-OHDA 40 6-OHDA 200
MIT 100+ 6-OHDA 40 MIT 100+ 6-OHDA 200
MIT 100
FIGURA 52– Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre o padrão apoptótico em cultura de
células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção). As
células foram cultivadas durante 4 dias. A 6-OHDA (40 e 200
µ
M) foi adicionada 3h antes
do MIT. Após 24h do tratamento, o padrão apoptótico foi avaliado pela técnica de laranj
a
de acridina/brometo de etídio. Seta larga fechada: corpúsculos apoptóticos, seta larg
a
aberta: células necróticas Microscópio de fluorescência (40X).
a
g
i
b
h
c
d e f
141
C
ONTRO
L
E
6
-O
HDA 4
0
MIT 1
0
0
MIT + 6-OHDA
0
25
50
75
100
normais
apoptose inicial
apoptose tardia
necrose
a
a
a
b
ab
a
% do total de células
co
nt
r
ol
e
6
-OH
DA
2
00
MIT 100
MIT + 6-
OH
DA
0
25
50
75
100
normais
apoptose inicial
apoptose tardia
necrose
a
a
a
a
b
b
b
b
% do total de células
FIGURA 53– Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre o padrão apoptótico e
m
cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de
N
europrevenção). As células foram cultivadas durante 4 dias e após este tempo
foram pré-incubadas com MIT por 3 horas e em seguida foi adicionada 6-OHDA
(a- 40 ; b- 200
µ
M) permanecendo em incubação por 24h. O padrão apoptótico foi
evidenciado pela técnica de laranja de acridina/brometo de etídio. Os experimentos
foram feitos em 3 dias diferentes e foram contadas 200 células por lâmina. Os
valores estão expressos como média
±
EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (dentro
de cada padrão morfológico) (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).
142
4.34. Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre o padrão apoptótico em células
mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate).
A figura 54 mostra o padrão de morte celular das culturas mesencefálicas de rato após a
exposição à 6-OHDA. O padrão apoptótico foi evidenciado pela técnica de laranja de
acridina/brometo de etídio, o qual revelou após exposição à 6-OHDA (40 e 200µM)
corpúsculos apoptoticos (campo b- seta larga fechada) e necrose (campo c- seta larga aberta),
respectivamente. Os campos de contraste microscópico mostraram que o MIT (e, f) inibiu a
apoptose e necrose induzida por 6-OHDA (40 e 200
µ
M) respectivamente. Nas células tratadas
com MIT apesar da manutenção da integridade do corpo celular é visível a perda de neuritos,
com alteração do padrão morfológico de uma célula cultivada na ausência da neurotoxina
(campo
f -
seta fina fechada).
A figura 55 mostra o padrão morfológico da cultura de células mesencefálicas em
condições controle (normal- 91,0%, Apoptose Inicial (AI)- 6,87%, Apoptose Tardia (AT)-
1,25%, necrose- 0,8750%) e após a adição da 6-OHDA (40
µ
M), que induziu um padrão de AI
em 32,50%, AT em 3,12%, necrose em 43,00% e células com morfologia normal em 21,38%.
Das células contadas o MIT mostrou um efetio antiapoptótico significativo quando adicionados
após a 6-OHDA 40µM (MIT = normais- 79,17%, AI- 3,66%, AT- 0,83%, necrose- 16,33%).
As células tratadas com MIT isoladamente mostraram os seguintes padrões celulares (normal -
83,00%, AI- 6,00%, AT- 1,66%, necrose- 9,33%). Na concentração de 200µM, a 6-OHDA
induziu uma grande morte celular, com aumento de células em apoptose tardia e necrose
(normal- 0,25%, AI- 1,75%, AT- 28,38%, necrose- 69,75%), tendo este padrão sido revertido à
quase normalidade pelo MIT (normais- 76,83%, AI- 3,50%, AT- 2,33%, necrose- 17,67%).
143
MIT 100
6-OHDA 200 + MIT 1006-OHDA 40 + MIT 100
Controle 6-OHDA 40 6-OHDA 200
FIGURA 54 – Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre o padrão apoptótico em cultur
a
de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate). As
células foram cultivadas durante 4 dias. A 6-OHDA (40 e 200 µM) foi adicionada 3
h
antes do MIT. Após 24h do tratamento o padrão apoptótico foi avaliado pela técnica d
a
laranja de acridina/brometo de etídio. Seta larga fechada: corpúsculos apoptóticos, set
a
larga aberta: células necróticas, seta fina fechada: células com ausência de neuritos
Microscópio de fluorescência (40X).
a
d f
e
b
c
144
CO
N
TROLE
6-OHD
A 40
MIT 100
6-OH
DA + M
IT
0
25
50
75
100
normais
apoptose inicial
apoptose tardia
necrose
a
b
a
a
a
b
b
b
a
% do total de células
CO
NT
RO
L
E
6
-OHDA 200
M
I
T
1
00
6-O
H
DA + MIT
0
25
50
75
100
normais
apoptose inicial
apoptose tardia
necrose
a
a
a
a
b
b
b
b
% do total de células
FIGURA 55– Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre o padrão apoptótico em cultura de
células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate). As células
foram cultivadas durante 4 dias e após este tempo foram pré-incubadas com 6-OHDA (a- 40
; b- 200
µ
M). Decorridas 3h foi adicionado MIT permanecendo em incubação por 24h. O
p
adrão apoptótico foi evidenciado pela técnica de laranja de acridina/brometo de etídio. Os
experimentos foram feitos em 3 dias diferentes e foram contadas 200 células por lâmina. Os
valores estão expressos como média
±
EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (dentro de cada
p
adrão morfológico)(p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).
145
DISCUSSÃO
146
5. DISCUSSÃO
A DP é uma doença neurodegenerativa progressiva caracterizada pela perda dos
neurônios dopaminérgicos na substância negra pars compacta e um decréscimo no conteúdo de
dopamina no striatum (HIRSCH et al., 1997; YOUDIM, RIEDERER, 1997). Até o presente,
não existem terapias para a cura da DP, mas somente tratamentos que fornecem substratos para
a síntese de dopamina ou inibem sua metabolização, tais como, L-dopa e inibidores da MAO.
A causa da morte crônica de células na DP e os mecanismos envolvidos neste processo
permanecem obscuros. O esclarecimento parcial do processo de morte celular é comumente
estudado em protocolos que utilizam neurotoxinas tais como 6-OHDA ou MPTP. Hipóteses
que explicam os mecanismos de como agem estas neurotoxinas foram relacionados com a
patogênese da morte de células da substância negra na DP (GERLACH et al.,1996). Os
protocolos in vitro que simulam esta perda dopaminérgica usam cultura primária de células
mesencefálicas de ratos, por serem ricas em neurônios dopaminérgicos. Sendo estes protocolos,
bastante adequados para o estudo de drogas com ação neuroprotetora.
No nosso trabalho utilizamos esse tipo de cultura usando a 6-OHDA como neurotoxina.
A grande dificuldade em se estudar os sinais celulares envolvidos na degeneração
dopaminérgica usando este protocolo é devido ao pequeno rendimento desta cultura em termos
de células dopaminérgicas, em torno de 1 a 5% (ANDREEVA et al., 1996; BRUGG et al.,
1996; AHMADI et al., 2003; NIE et al., 2002 ), além da presença de outros grupos neuronais,
tais como células gabaérgicas (DING et al., 2004) e não neuronais, como células da glia,
particularmente astrócitos (CHEUNG et al., 1997; ALMADI et al., 2003)
A percentagem de células dopaminérgicas na nossa cultura foi em torno de 2%,
suficiente para um estudo adequado de neuroproteção (CHEUNG et al., 1997; MERCER et al.,
2005). Com o objetivo de evitarmos a interferência das células gliais na citotoxicidade induzida
pela 6-OHDA os experimentos passaram a ter um tempo total de 5 dias já que nesse período,
147
não há tempo suficiente para que a proliferação de células gliais interferira no experimento
(MICHEL et al., 1999). Vale também destacar que esse tempo reduzido foi importante para a
quantificação mais significativa das células dopaminérgicas, visto que ocorre uma diminuição
da viabilidade destas células com o aumento do tempo de cultura (HUMPEL et al., 1994,
CHEUNG et al., 1997, NIE et al., 2002)
A 6-OHDA tem sido usada para causar a morte de células dopaminérgicas, entretanto
diferente dos protocolos in vivo, os efeitos in vitro mostram não serem restritos para os
neurônios dopaminérgicos, os trabalhos de Michel e Hefti (1990) mostram que na concentração
de 10 a 100
µ
M a 6-OHDA mata neurônios dopaminérgicos e gabaérgicos, outros autores
também evidenciaram estes achados (KRAMER et al., 1999; LOTHERIUS et al., 1999, DING
et al., 2004), o que vem a corroborar nossos achados onde a 6-OHDA (40 e 200µM) promoveu
uma diminuição na percentagem de células dopaminérgicas (79,78% e 93,75%) e nas não
dopaminérgicas na maior concentração usada (63,44%).
Nos estudos iniciais usando 6-OHDA se pensava que ela era seletiva para neurônios
dopaminérgicos devido à necessidade de usar o transportador de dopamina (DAT) para a
entrada nos neurônios dopaminérgicos (JONSSON; SACHS, 1970; UNGERSTEDT, 1968;
URETSKY; IVERSEN, 1970), posteriormente trabalhos demonstraram que ela pode induzir a
morte celular também em neurônios não catecolaminérgicos que não têm DAT (DODEL et al.,
1999; SEITZ et al., 2000) e até em células não neuronais (ABAD et al., 1995; BLUM et al.,
2000; PUTTONEN et al., 2003).
A descoberta da deficiência no complexo I mitocondrial na substância negra de
pacientes com DP promoveu uma ligação direta entre os protocolos tóxicos de MPTP e
rotenona e DP (SCHAPIRA et al.,1990). O striatum parece ser um sítio particularmente
sensível para a disfunção mitocondrial e o local de maior dano oxidativo. Estes achados
provavelmente decorrem da alta atividade metabólica desta região e da dependência da
fosforilação oxidativa para a obtenção de energia. A 6-OHDA é uma neurotoxina inibidora do
148
complexo I e IV mitocondrial, e pode causar dano celular semelhante ao que ocorre na DP
(JEON et al., 1995). Esta neurotoxina catecolaminergica foi encontrada endogenamente no
cérebro (GLINKA ; YOUDIN, 1997) e urina (ANDREW et al., 1993) de pacientes
provavelmente via auto-oxidação da dopamina (SLIVKA; COHEN, 1985) a qual aumenta com
o envelhecimento e pode levar à toxicidade.
O mecanismo da toxicidade induzida pela 6-OHDA tem sido sumarizado em duas vias,
uma é a via de toxicidade extracelular, onde a 6-OHDA gera H
2
O
2
e outras espécies reativas do
oxigênio através de auto-oxidação, produzindo dano celular (BLOUM et al., 2000; WU et al.,
1996; GASSEN et al., 1998; YAMADA et al., 1997). A outra via está relacionada com a
internalização da 6-OHDA por transportadores dopaminérgicos e a conseqüente geração de
EROS intracelular (GLINKA et al., 1995) tanto por inibição do complexo I e IV da cadeia
transportadora de elétrons mitocondrial quanto por desaminação enzimática da MAO
(GLINKA et al., 1997; SOTO-OTERO et al., 2000 ; WOODGATE et al., 1999; BLOUM et al.,
2000; WU et al., 1996).
Esta neurotoxina provoca total colapso da função de células aeróbias e anaeróbias,
diferente de outras toxinas mitocondriais como a MPP
+
, que causam perda específica do
metabolismo aeróbico. A toxicidade de 6-OHDA leva à perda do consumo de oxigênio
mitocondrial, atividade glicolítica, ATP, gradiente iônico H
+
, potencial de membrana, bem
como acumulação de produtos oxidativos, como o peróxido de hidrogênio. A habilidade da 6-
OHDA em manter o citocromo c em sua forma reduzida parece ter relação com o distúrbio
mitocondrial. A 6-OHDA altera o estado redox dos citocromos resultando em perda de
disponibilidade de substrato e obstrução de eventos de oxidação-redução. As propriedades
redutoras do citocromo c são singulares para os neurotransmissores catecolaminérgicos
(MAZZIO et al., 2004) e pode ter papel significante na vulnerabilidade seletiva de neurônios
dopaminérgicos a agressões mitocondriais. Assim, compostos que possuem atividades
antioxidantes e antiinflamatórias podem ser neuroprotetores em protocolos experimentais de
149
DP e clinicamente podem ser importantes em parar a progressão da DP e assim melhorar a
qualidade de vida destes pacientes.
Neuroproteção e neuroresgate podem ter efeitos muito diferentes na função neuronal daí
o uso em nosso trabalho de dois protocolos onde a fração enriquecida de chalconas (FEC)
obtida da Myracrodruon urundeuva e também o 2-O-metilinositol (MIT) isolado da Magonia
glabrata apresentaram alguns resultados diferentes tanto no protocolo de neuroprevenção
como no protocolo de neuroresgate. O motivo principal de termos testado estas substâncias em
dois protocolos foi o de primeiramente estudá-las como possíveis drogas citoprotetoras, ou
seja, inibindo o estabelecimento do dano celular. No segundo caso avaliaríamos os efeitos
dessas substâncias na tentativa de recuperar algumas atividades bioquímicas perdidas pelo
efeito da neurotoxina e tentar parar este processo.
A determinação da atividade das enzimas mitocondriais pode ser utilizada como
ferramenta para se determinar a viabilidade celular. Dentre elas a medição da clivagem do sal
de tetrazólium (MTT) pelas desidrogenases mitocondriais formando um sal de tetrazólium é
um ótimo protocolo para se procurar drogas com ação neuroprotetora (GUANGJUN et al.,
2002).
Nós mostramos que a FEC protegeu de forma dose-dependente as células
mesencefálicas da neurotoxicidade induzida pela 6-OHDA (40 e 200µM) nos dois protocolos.
Além disso, esta neuroproteção envolveu os neurônios TH+ (dopaminérgicos) e os TH- (não
dopaminérgicos), demosntrando uma ação protetora inespecífica abrangendo as células
neuronais e não neuronais presentes na região mesencefálica. Esta ação pode ser explicada pelo
fato de as chalconas (análogos de flavonóides) atuarem reconhecidamente como agentes
antioxidantes (ZUANAZZI, 2000) e queladores de ferro, diminuindo assim o estresse oxidativo
e a conseqüente morte celular (SIMÕES et al., 2003). Além disso, Pan e cols. (2003)
demonstraram que polifenois extraídos do chá verde podem inibir a recaptação de dopamina
pelo transportador e protegerem células mesencefálicas do dano celular.
150
SHAHIDI e cols. (1991) demonstraram que os O-hidroxiflavonóides são excelentes
quelantes de metais. Estudos com a planta Scutellaria baicalensis analisaram o perfil
antioxidante dos três principais flavonóides contidos no extrato de suas raízes: wogolina (5,7-
dihidroxi-8-metoxiflavona), baicaleína (5,6,7-trihidroxiflavona) e seu 7-glicuronídeo, a
baicalina. Este último mostrou a maior atividade antioxidante dos três, devido à presença do
grupamento glicuronídeo no C
7
de sua estrutura (GABRIELSKA et al., 1997).
A deferoxamina (DEF), um agente quelador de ferro, usado como controle positivo,
também mostrou efeito citoprotetor, quando associada com a 6-OHDA. Alguns trabalhos
relatam que queladores de ferro, como a deferoxamina, são altamente efetivos em induzir
neuroproteção in vivo e in vitro (GUANGJUN et al., 2002). GLINKA e cols. (1996) mostraram
que a deferoxamina ativa a NADH desidrogenase (complexo I) até na ausência de 6-OHDA e
portanto ela provavelmente atuaria diretamente sobre esta enzima, o que também foi
demonstrado por BEM-SHACHAR e cols (1991), o qual mostrou que deferoxamina previne a
inibição da NADH desidrogenase pela 6-OHDA e protege ratos da morte induzida por injeção
intracerebral de 6-OHDA in vivo..
O conceito corrente da patogênese da doença de Parkinson é que o evento central seria a
formação de espécies reativas de oxigênio e o conseqüente estresse levaria ao dano oxidativo
da substancia negra. Estudos post mortem têm provido evidencias que suportam a participação
do estresse oxidativo na geração da doença de Parkinson; em particular estes estudos
demonstram alterações no conteúdo de ferro no cérebro, deficiência na função mitocondrial,
alteração nos sistemas de proteção antioxidantes (especialmente superoxido dismutase e
glutationa reduzida-GSH) e dano oxidativo em lipídios, proteínas e DNA. O Ferro pode induzir
estresse oxidativo e injeções intranigrais têm demonstrado serem capazes de induzir um
protocolo de parkinsonismo progressivo. A perda de GSH é associada com corpos de Lewy
incidentais e pode representar o marcador bioquímico inicial de perda de células nigrais
151
(JENNER et al.,1996). A depleção isolada de GSH pode não resultar em dano nos neurônios
nigrais, mas pode incrementar a susceptibilidade a exposições subseqüentes a radicais livres.
A atividade antioxidante dos flavonóides deriva de sua habilidade em inibir enzimas
envolvidas na produção de radicais livres, em atuar como varredores destes radicais (HUSAIN
et al., 1987; YUTING et al., 1990) e em agir como quelantes de íons (AFANAS’AV et al.,
1989). Outro possível mecanismo para este efeito dos flavonóides seria sua ação estabilizadora
de membranas, através da diminuição da fluidez das mesmas (ARORA et al., 2000).
A capacidade dos flavonóides de agirem como antioxidantes in vitro tem sido assunto de
diversos estudos nos últimos anos e uma importante relação estrutura-atividade foi bem
estabelecida (KUMAMOTO et al., 2001; GUO et al., 1996; CHAO-FANG et al., 2001). DAS e
PEREIRA (1990) demonstraram que uma dupla ligação entre os carbonos C
2
e C
3
, assim como
um grupamento carbonila no C
4
são importantes características para a potência da ação
antioxidante dos flavonóides.
Em relação a fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada da Miracrodruon
unrudeuva esta é composta pelas seguintes chalconas: urundeuvina A, urundeuvina B,
urundeuvina C. A urundeuvina A é possuidora de 7 grupamentos hidroxil assim como a
urundeuvina B, ao passo que a urundeuvina C apresenta 8 grupamentos hidroxil. A presença de
grupamentos hidroxil é importante na estabilização e consequentemente na potência da
molécula devido a um maior número estruturas de ressonância (BANDEIRA, 2000). A
presença desses grupamentos são também presentes em outros tipos de chalconas como a
buteína e outras 3,4-dihidroxichalconas as quais são mais ativas que suas análogas flavonas
devido a sua maior capacidade em deslocar elétrons (DZIEDZIC ; HUDSON, 1983). Da
mesma forma as isoflavonas são bem mais potentes que as flavonas devido aos efeitos
estabilizadores dos grupamentos 4-carbonil e 5-hidroxil presentes nas mesmas. O fato das
urundeuvinas presentes na FEC apresentarem uma dupla entre os carbonos 2 e 3 e o
grupamento carbonila as candidata a ter uma ação antioxidante, o que poderia explicar seu
152
efeito citoprotetor. Deste modo, procuramos investigar o efeito da fração na peroxidação
lipídica e formação de nitrito induzida pela 6-OHDA.
A natureza dos radicais livres responsáveis pela morte celular na doença de Parkinson
permanece desconhecida, mas existem evidências da participação de radicais hidroxila,
peroxinitrito e óxido nítrico (JENNER, 2003, BARREIRO et al., 2003). Na última década,
diferentes cientistas forneceram evidências da existência da óxido nítrico sintase na
mitocôndria (NOSmt) (GHAFOURIFAR ; RICHTER, 1997; GIULIVI et al., 1998), que
catalisa a produção mitocondrial de NO. As variações de expressão e atividade da NOSmt
possuem importantes efeitos nas funções da mitocôndria, como na captação de O
2
e ganho
energético, na produção de O
2
−
e H
2
O
2
e na sinalização celular. O NO produzido em grandes
quantidades pela iNOS e seus derivados, tais como peroxinitrito e dióxido de nitrogênio têm
um importante papel na inflamação e possivelmente em outros processos patológicos
(BARREIRO et al., 2003), daí a importância da busca de produtos fitoquímicos isoladas de
variadas plantas como agentes que suprimem a expressão de iNOS.
Efeitos específicos do óxido nítrico (NO) no complexo I têm sido demonstrados nos
últimos anos, CLEMENTI e cols. (1998) observaram que o NO em concentrações
micromolares e por longos períodos, inibe a respiração e a atividade do complexo I. Assim,
uma longa exposição ao NO induz a produção de O
2
−
e ONOO
−
nas mitocôndrias cardíacas e
hepáticas, resultando em inibição permanente de NADH, enquanto os complexos II e III
permanecem sem alterações. Cooperação entre NO e cálcio durante isquemia foi descrita
(JEKABSONE et al., 2003), NO e cálcio causaram perda do citocromo c mitocondrial e
ativaram a via de apoptose dependente de caspase 3. Considerando que o NO aumenta a
produção mitocondrial de O
2
−
pelos complexos I e III, ainda não se sabe por que o primeiro é
mais seletivamente sensível a ONOO
−
; é possível que o maior acúmulo de ubiquinol no
complexo III proteja as proteínas da nitração (SCHÖPFER et al., 2000).
153
A reação de Griess é um método de espectrometria para análise de nitritos (NO2-) em
soluções aquosas. Nitrito é um produto do metabolismo oxidativo do NO. Assim, é possível
relacionar os níveis de nitrito e nitrato nas amostras com os níveis de NO produzidos. Enquanto
a produção endógena em níveis satisfatórios de NO pode ser benéfica para o organismo, sua
produção excessiva foi implicada na patogenia de muitas doenças envolvendo sistema
cardiovascular, imune e sistema nervoso (BARREIRO et al., 2003).
Nossos resultados mostraram que a 6-OHDA induziu a uma grande formação de nitrito,
estes resultados já tendo sido demonstrado previamente por nosso grupo (NOBRE JÚNIOR et
al., 2003) neste tipo de cultura, por Choi e cols. (2004) em células MN9D, uma linhagem de
células dopaminérgicas, e por Singh e cols. (2005) usando modelos experimentais de DP in
vivo. A FEC mostrou um efeito preventivo sobre a formação de nitrito induzido pela 6-OHDA,
apesar de não ter mostrado efeito quando adicionada após a 6-OHDA, provavelmente o gene da
NOS já tinha sido expresso e a síntese da enzima já tenha sido iniciada.
Um recente trabalho (IVON et al., 2005), estudou muitas chalconas sinteticas por seus
efeitos inibitórios na ativação de mastócios, neutrófilos, macrófagos e células microgliais. Estes
compostos demonstraram atividade inibitória de NO, produto dos macrófagos e células gliais.
Alguns deles mostraram potentes efeitos inibitórios sobre a geração de ânions superoxido em
neutrófilos de ratos em resposta a fMLP/CB. Alguns derivados de chalcona mostraram
atividade inibitória sobre expressão da iNOS e TNF-alfa induzida por LPS, Alcaraz e cols
(2004) demonstraram este efeito em macrófagos RAW 2647 estimulados com LPS ao qual
atribuíram o efeito sobre a expressão da iNOS à inibição da ativação do NF-Kappa B.
Outros flavonóides como a epigalocatequina (LIN et al., 1997), teaflavina-3,3´-digalato
(PAN et al., 2003) e catequina (CUNHA et al., 2003) também demonstraram a capacidade de
diminuir a formação de óxido nítrico em outros modelos estudados.
154
A apigenina também inibe a produção de NO em macrófagos peritoneais de
camundongos em resposta a ativação por lipopolissacarídeos. Algumas características
estruturais influenciam nessa atividade: a) o grupo 3-hidroxila diminui a atividade da NOS; b) a
dupla ligação entre o carbono C2 e C3 aumenta a atividade antioxidante; c) a glicosilação os
torna menos menos ativos que suas agliconas correspondentes; d) a presença do grupo 4’-
hidroxila aumenta a atividade das flavonas e dos flavonóis; e) o grupo 5-OH tende a aumentar a
atividade (MATSUDA et al., 2003).
O estudo dos radicais livres e antioxidantes na biologia está produzindo uma revolução
médica que promete uma nova era para a saúde e o tratamento das doenças. Em relação às
reações oxidativas, as espécies reativas de oxigênio (EROS) tem um papel importante em
doenças degenerativas crônicas, incluindo câncer, doenças autoimunes, inflamatórias,
cardiovasculares e neurodegenerativas (ARUOMA et al., 2003).
Uma superprodução de espécies reativas de oxigênio (EROS) pode aumentar o estresse
oxidativo, o qual pode induzir dano neuronal e em última instância, conduzir para morte
neuronal por apoptose ou necrose. Muitas evidências indicam que o estresse oxidativo está
envolvido na patogenia de várias doenças neurodegenerativas. Vários estudos mostram que
antioxidantes nutricionais (principalmente vitamina E e polifenois) podem bloquear a morte
neuronal in vitro, e podem ter propriedades terapêuticas em modelos animais que simulam as
doenças neurodegenerativas incluindo a DP (MANDEL et al., 2004; YOUDIM et al., 2002;
JIANG et al., 2003). Além disso, dados clínicos sugerem que antioxidantes nutricionais podem
apresentar algum efeito protetor contra a DP (DI MATTEO et al., 2003).
A proteção contra o stress oxidantativo tanto endógeno como exógeno é proporcionado
por vários sistemas enzimáticos, incluindo a catalase, a superóxido dismutase e a glutationa
peroxidase. A glutationa e a glutationa peroxidase inativam os radicais livres e os metabólitos
do oxigênio derivados das reações oxidativas e do metabolismo (MESSANA et al, 1988), além
de afetar a síntese de proteínas e o DNA.
155
A quantificação sensível de substâncias tio-barbitúricas ácido-reativas (TBARS) tem
feito desta técnica uma escolha para a observação de peroxidação lipídica, um maior indicador
de estresse oxidativo (YAGI et al., 1998; ARMSTRONG et al., 1994; LEFERRE et al., 1998).
Este ensaio permite uma importante avaliação da atividade dos radicais livres em condições
patológicas e tem sido usado para quantificar a atividade antioxidante de vários compostos
(VILLA-CABALLERO et al., 2000; HUNNISETT et al., 1995). Embora muitas controversias
tenham aparecido na literatura em relação a especificidade do TBARS direcionados a
compostos diferentes do malonildiaaldeído (MDA).
Nosso resultado demonstrou que a exposição das células à 6-OHDA aumentou os níveis
de TBARS, ação essa que foi revertida pela deferoxamina, o que pode ser explicado pela sua
propriedade queladora de metal e seu efeito antioxidante ocasionadas pela sua captação de
ferro, tornando-o indisponível para a Reação de Fenton (GLINKA et al.,1996).
A FEC tanto no protocolo de neuroprevenção quanto no protocolo de neuroresgate foi
capaz de reverter quase completamente a formação de TBARS induzida por 6-OHDA estando
estes dados de acordo com outros autores (BRAVO, 1998; MIDDLETON et al., 2000) que
afirmam que flavonoides apresentam ação antioxidante e queladora de metal, diminuindo assim
a peroxidação lipídica e a conseqüente formação de TBARS. Como já explicado, a 6-OHDA
causa neurotoxicidade por alterar o ciclo redox, levando a um aumento da produção de espécies
reativas de oxigênio e conseqüente lesão oxidativa. Efeitos semelhantes foram demonstrados
anteriormente em nosso laboratório (NOBRE-JUNIOR et al., 2003) os quais mostraram que a
catequina (derivado flavônico) diminuiu a peroxidação lipídica em cultura de células
mesencefálicas de ratos induzidas pela 6-OHDA.
Uma estrutura polihidroxilada é sabidamente relacionada com propriedades varredoras
de radicais (BORS et al., 1990; RAICE-EVANS et al ., 1996). Portanto estruturas químicas
como as presentes na FEC influenciam sua ação antioxidante. Estudos sugerem que os sítios
156
ativos de polifenóis presentes no chá verde, uma fonte de catequinas, interagem com radicais
livres devido a presença de grupamentos hidroxila no anel C (GUO et al.,1996). Grupamentos
hidroxila em outras posições, como no anel B não tem este efeito. Também, estes grupamentos
hidroxila podem estar relacionados com a atividade inibidora de lipoxigenase, visto que
análogos de flavonóides (chalconas) apresentam ação inibidora da 5-lipoxigenase quando
grupamentos hidroxila estão presentes em posições comparáveis (SOGAWA et al., 1993).
MIYASE e cols. (1999a) identificaram na planta Lespedeza homoloba (Leguminosae),
oito novos compostos fenólicos. Dentre estes, três demonstraram possuir potente atividade
antioxidante in vitro em homogenatos de cérebro de ratos. Em uma análise posterior usando
também o modelo de peroxidação lipídica em homogenato de cérebro de ratos, MIYASE e
cols. (1999b) testaram quinze novos isoflavonóides e concluíram que aqueles compostos que
possuíam um grupamento catecol apresentavam maior atividade antioxidante, do que aqueles
que não possuíam.
O chá verde contém diversos antioxidantes, entretanto são os polifenóis que contribuem
mais profundamente para essa atividade antioxidante e, dos polifenóis, é a epigalatocatequina
galato, que é o mais potente e mais abundante antioxidante presente no chá verde. Contra certos
radicais livres, especialmente os radicais de oxigênio ativo, o EGCG é superior em cerca de 10
vezes do que as vitaminas E e C. As catequinas presentes no chá verde são poderosas
antioxidantes e removedoras de EROS e espécies de nitrogênio em sistemas in vitro (SALAH
et al., 1995; NANJO et al., 1996; MOREL et al., 1999). O chá verde e o preto inibiram a
peroxidação lipídica induzida por ferro-arcorbato em homogenato de membranas mitocondriais
cerebrais (LEVITES et al., 2002).
As ações neuroprotetoras dos polifenois presentes no chá verde podem resultar da
habilidade para induzir as defesas antioxidantes. Vários flavonóides e antioxidantes fenólicos
ativam a expressão de alguns genes de resposta ao estresse (stress-response genes- SRE), tais
como, enzimas metabolizantes de drogas de fase II, glutationa-S-transferase e heme-oxigenase
157
I (CHEN et al., 2000). Além disso, durante o estresse oxidativo, a ativação dos SRE, se
correlacionam com um aumento na ativação do caminho das MAPK (mitogen-activated protein
kinases) (OWUOR ; KONG, 2002; SCROEDER et al., 2002; CHUNG et al., 2003), outros
alvos implicados no efeito neuroprotetor dos flavonóides envolvem o controle da homeostase
do cálcio (ISHIGE et al., 2001), proteína quinase C (LEVITES et al., 2002b, 2003; MARCEL
et al., 2004) e enzimas antioxidantes (CHENG et al.,2000 LEVITES et al., 2001).
A Apoptose é uma forma de morte celular de fundamental importância em vários
sistemas biológicos, desempenhando um papel essencial no desenvolvimento dos tecidos e
órgãos, na regulação da resposta imune e na eliminação de células senecentes. É identificada
por uma série de alterações morfológicas na célula: diminuição do volume celular, perda de
contato, condensação da cromatina, fragmentação do DNA e alteração no potencial
transmembranico da mitocôndria (WANG et al., 2003; BRADY, 2004). A apoptose pode ser
induzida por agentes químicos ou físicos. Quanto à necrose, esta pode ocorrer por uma rápida
ação tóxica da droga na célula e é caracterizada pelo aumento do volume celular inicial e perda
da integridadde da membrana plasmática (DARZYNKIEWICZ et al., 1992). Acredita-se a Bax,
um membro pro-apoptótico da família de proteínas Bcl-2, tenha sua ação primariamente por
facilitação da liberação de citocromo c do espaço intermembrana mitocondrial no citosol,
levando a ativação de caspases e morte celular (RUVOLO et al., 1998). Devido a alterações na
função respiratória, tem sido observado em estudos de pacientes com DP, ativação de caspases
e morte celular com aspectos morfológicos compatíveis com apoptose (HARTMANN et al.,
2001).
Em relação ao padrão de morte celular estudada neste trabalho, a 6-OHDA (40
µ
M)
induziu um aumento no número de células em apoptose inicial e na maior concentração
(200µM) pôde ser observado um aumento no número de células em apoptose tardia e necrose.
Muitos estudo têm sido conduzidos para determinar se a 6-OHDA mata as células por apoptose
ou necrose. Embora a maioria dos estudos concorrem para a apoptose (CADET, 2001; BLUM
et al., 2001), outros autores (PUTONEN et al., 2003; WALKINSHAW; WATERS, 1994;
158
DODEL et al., 1999) descreveram um efeito bifásico após altas concentrações, tal como os
nossos achados. A mudança de apoptose para necrose sendo gradual e dependente do tipo
celular e da concentração usada (MAYO et al., 1999)
A FEC mostrou um efeito antiapoptótico tanto quando adicionada antes como depois da
6-OHDA, além de terem protegido da necrose, apesar de neste caso, o efeito tenha se mostrado
menos potente, já que foi evidenciado que a perda da integridade morfológica, isto é, a perda
dos neuritos não tenha sido inibida.
Liang e colaboradores (2004) mostraram que neurônios dopaminérgicos primarios ou
linhagem de células MN9D quando expostas à 6-OHDA, sofrem degeneração tardia e
apoptose, com uma elevação da atividade celular das caspases 9 e 3, mas não da caspase-8,
indicando que esta via apoptótica predomina na degeneração de neurônios dopaminérgicos e
células MN9D.
Os flavonóides podem proteger o cérebro por sua habilidade de modular a sinalização
intracelular promotora de sobrevivência celular. Quercetina e flavonoides estruturalmente
relacionados (miricetina, fisetina e luteolina) mostram marcante atividade citoprotetora in vitro
em condições experimentais de modelos de morte apoptótica, como as induzidas por peróxido
de hidrogênio em cultura de células PC12 (DAJAS et al., 2003).
Estudos em células de neuroblastoma (NB SH-SY5Y) demonstram um efeito
antiapoptótico da epigalocatequina em baixa concentrações (em torno de 1µM), via down
regulation da expressão de genes pro-apopóticos como, Bax, Bad, mdm2, caspase-1, sem afetar
a expressão dos genes das proteínas antiapoptóticas, bcl-w, bcl-2 e bcl-xL. (LEVITES et al.,
2002; WEINREB et al., 2003b). Dado que a mitocôndria desempenha um grande papel na
apoptose induzida pelo estresse oxidativo, se especula que o efeito antiapoptótico da
epigalocatequina pode ter como alvo a mitocôndria, por bloqueio da abertura dos mitochondrial
permeability transition pore, (mPTP), pois foi demonstrado que os flavonóides se ligam aos
159
sítios de ligação dos receptores GABA-A benzodiazepinicos e receptores da adenosina, que são
associados com a mPTP, modulando a liberação de citocromo c mitocondrial (SCHROETER
et al., 2002). Secundariamente, os flavonoides podem afetar a integridade mitocondrial por
modular a homeostase do cálcio (ISHIGE et al., 2001). Estes dados juntos sugerem que os
flavonoides, particularmente a epigalocatequina, podem funcionar como drogas bioenergéticas,
tais como o a coenzima Q, que está sendo estudada em ensaios clínicos em pacientes com DP
(BEAL, 2003).
Existem evidências de que a família do fator nuclear Kapa B (NF-Kapa B) tem papel
importante no controle da resposta apoptótica (PARK et al., 2004). Analises por
imunocitoquímica e imunoblotting revelaram que o NF-Kapa B-p65 é translocado após
tratamento com 6-OHDA, mas não com MPP+. Uma ativação tempo-dependente do NF-Kapa
B induzida pela 6-OHDA também foi demonstrada por eletroforese. Esses dados podem indicar
uma ativação droga-específica do NF-Kapa B como um fator determinante da sobrevivência
para neurônios dopaminérgicos.
Inúmeras desordens neurodegenerativas tais como esclerose múltipla, doença de
Alzheimer e doença de Parkinson são associadas com processos inflamatórios. O processo
complexo de neuroinflamação envolve vários componentes do sistema imune e o sistema
nervoso central. Particularmente, os astrócitos e células da micróglia geram vários
componentes da cascata do complemento (KULKARNI et al, 2004). O sistema complemento
apresenta um importante papel na etiologia de muitas das desordens neuroinflamatórias. Para
prevenir disfunções relacionadas com o processo inflamatório no sistema nervoso central,
podem ser utilizados agentes tais como antiinflamatórios não-esteroidais, esteróides, nitronas,
catequinas, inibidores de NO sintetase, flavonóides e inibidores de fosfodiesterase
(KULKARNI et al, 2004).
Várias chalconas tem demonstrado atividade antiinflamatória, entre elas a buteína (LEE
et al., 2003), que inibe a produção de NO e a indução da expressão do TNF-alfa e COX e
160
ativação do NK-kappaB, a dimetilamino-chalcona (ROJAS et al., 2002) que inibe a produção
de NO e PGE(2), sofalcone, que inibe a produção de IL-1 e TNF-alfa (FUJIWARA et al.,
2001) e apigenina e kampferol (KOWALSKI et al., 2005), que inibem a expressão do gene da
IL-1 beta e TNF alfa.. Assim é possível que o efeito citoprotetor da FEC seja devido em parte a
sua ação antioxidante e em parte a uma ação antiinflamatória, prevenindo a ativação de células
microglias presentes na cultura e a liberação de citocinas. Além disso, uma ativação tempo-
dependente do NF-Kapa B pela 6-OHDA foi demonstrada (GRUNBLATT et al., 2000), que
possivelmente é bloqueada pela FEC. Finalmente, uma vez que a 6-OHDA produz uma
elevação na atividade das caspases –9 e –3, sem elevar a atividade da caspase-8, nossos
resultados sugerem que essa via de sinalização intrínseca pode estar também bloqueada pela
FEC.
O outro composto estudado neste trabalho foi o 2-O-metilinositol (MIT) isolado da M.
glabrata, pelo grupo da Profa Telma Lemos do Departamento de Química orgânica da UFC.
Apesar de relatos da toxicidade desta planta, o composto isolado não apresenta toxicidade, em
relato pessoal (não publicado), a profa Telma afirmou que o composto não é tóxico para os
peixes, sendo este efeito atribuído a outros compostos presentes na planta. Confirmando estes
achados, o composto estudado não apresentou toxicidade para a cultura primária de células
mesencefálicas de rato, pelo contrário, na maior concentração, ela promoveu um pequeno
aumento na viabilidade celular em relação ao controle.
Quando em associação com a 6-OHDA, o MIT preveniu significativamente a toxicidade
induzida pela 6-OHDA no dois protocolos estudados, inclusive mostrando um efeito protetor
tanto nas células dopaminérgicas, quanto em outros grupos neuronais presentes na cultura. É
também importante destacar que na literatura há poucos trabalhos sobre este composto, nunca
tendo sido relatado um efeito citoprotetor deste, no modelo de cultura de células neuronais
empregado. O MIT é um monossacarídeo com um único anel da estrutura polihidroxilada,
como já citado anteriormente, uma estrutura polihidroxilada está relacionada com propriedades
varredoras de radicais (BORS et al., 1990; RAICE-EVANS et al ., 1996), e um efeito
161
antioxidante moderado foi demonstrado para este composto (MACHADO et al., 2004), é
possível que estas ações possam explicar os efeitos citoprotetores deste composto. Para uma
maior confirmação, resolvemos investigar uma possível ação inibidora do MIT sobre a
formação de nitrito e na peroxidação lipídica induzida pela 6-OHDA no modelo de cultura de
células mesencefálicas. .
O MIT isoladamente não promoveu nenhuma alteração nos níveis de nitrito ao passo
que associado com a 6-OHDA se mostrou até mais potente que a FEC, já que foi efetivo nos
dois protocolos revertendo o aumento nos níveis de nitrito induzido pela neurotoxina. Além
disso, o MIT conseguiu reverter o aumento dos níveis de TBARS produzidos pela 6-OHDA
também nos dois protocolos, comprovando assim um potente efeito antioxidante deste
composto.
Trabalhos demonstram que o mioinositol (inibe o dano ao DNA induzido pela formação
de superóxidos (xantina oxidase dependente), podendo agir como varredor de radicais
hidroxilas (MURAOKA : MIURA, 2004). Com relação a compostos com estruturas
relacionados ao MIT, trabalhos relatam um efeito antioxidante para o ácido fítico (mio-inositol
hexafosfato) uma molécula muito abundante em plantas, que demonstrou um forte efeito
quelador de ferro e inibidor da peroxidação lipídica (MIYAMOTO et al., 2000, 2001; GRAF :
EATON, 1990, MURAOKA ; MIURA, 2004). Também, o pinitol um análogo 3-metoxi do D-
inositol demonstrou um efeito antiinflamatório em modelos in vivo, além de ação
hipoglicemiante, através de um aumento no transporte de glicose, independente de insulina.
Finalmente, o mio-inositol 1,2,6-trifosfato Ins(1,2,6)P3 que é um produto obtido pela
degradação enzimática do ácido fítico (mio-inositol 1,2,3,4,5,6- hexafosfato) mostrou efeitos
farmacológicos importantes em muitas patologias, como por exemplo nas complicações
diabéticas secundárias, nas doenças cardiovasculares e nas inflamações crônicas tais como
artrite (BATES et al., 2000).
162
Com relação ao padrão apoptótico induzido pela 6-OHDA, o MIT inibiu a apoptose das
células neuronais e aumentou a viabilidade celular, nos dois protocolos e nas duas
concentrações da 6-OHDA estudadas, demonstrando uma grande efeito antiapoptótico.
Apesar de numerosos estudos realizados sobre o papel do Ins(1,4,5)P
3
e do sn-1,2-
diacilglicerol como segundo-mensageiros no modo de transdução utilizado na cascata dos
fosfoinositídeos, nenhum mecanismo de ação ou uma relação estrutura-atividade pode ser
proposto sem ambigüidade. Sabe-se que o Ins(1,4,5)P
3
é um mediador na liberação do Ca
2+
intracelular, do retículo endoplasmático (RE) para o citoplasma. Ele ativa um receptor situado
na membrana externa do RE ligado a um canal de cálcio. Esta ativação provoca a abertura
deste último e, assim, a liberação do Ca
2+
no citoplasma com consequente ativação de proteína
quinase dependente de cálcio (PKC) (STREB et al., 1983). Não podemos é claro descartar o
papel da proteína kinase II dependente de calmodulina (CaMKII) a qual é ativada pelo Ca
++
liberado pela ação o IP
3
nos calcissomas. A CaMKII ativa síntese de catecolaminas, ativa
tirosina hidroxilase, fatores de transcrição e é uma das cinases mais envolvidas em fenômenos
plásticos daí a sua importância no contexto da DP.
Outro possível mecanismo de ação para o MIT seria a possibilidade deste atuar nas
células convertendo-se em segundos mensageiros e assim ativar proteina kinase C. Esta
possibilidade decorre do fato dos inositois apresentarem a capacidade de seqüestrar fósforo
(ALMEIDA et al., 2003) e que através deste mecanismo teríamos a formação do trifosfato de
inositol (um segundo mensageiro). Além disso, Qiao e cols (2000) demonstraram que o MIT
(também chamado de quebrachitol) pode ser usado na síntese de fosfatidilinositol polifosfatos.
O papel da PKC nas doenças neurodegenerativas, principalmente DP está adquirindo uma
maior relevância (MANDEL et al., 2005), o mecanismo pelo qual a ativação da PKC alfa leva à
neuroproteção precisa ainda ser definido. Estudos suportam um papel dela como uma BCl-2
quinase que pode suprimir a apoptose , provavelmente através da fosforilação direta ou indireta
da Bcl-2 (RUVOLO et al., 1998)
163
Estudos têm demonstrado que o mio-inositol, o isômero mais abundante no cérebro, e os
inositóis fosfatos podem representar uma via para o tratamento das doenças Maníaco-
Depressivas, de Alzheimer e Síndrome de Down (MCLAURIN et al., 2000; SHIMOHAMA et
al., 1998; HUANG et al., 1999). Daí a relevância de um estudo mais profundo sobre as ações
do MIT isolado de compostos naturais como droga neuroprotetora.
A neurodegeneração na doença de Parkinson, Alzheimer e outras doenças
neurodegenerativas tem se apresentado multifatorial, englobando um complexo de reações
tóxicas incluindo inflamação, neurotoxicidade glutamatérgica, aumento de ferro e óxido nítrico,
depleção de antioxidantes endógenos, redução da expressão de fatores tróficos e expressão de
proteínas pró-apoptóticas que levariam ao dano neuronal (MANDEL et al., 2004). Se a
neuroproteção pela FEC e MIT for confirmada em animais e posteriormente em seres humanos
com DP, a FEC obtida de M. urundeuva e o MIT isolado de Magonia glabrata poderão ter um
importante significado clínico como drogas complementares não somente para terapia da
doença de Parkinson mas como fortes candidatos como agentes neuroprotetores na doença.
164
CONCLUSÃO
165
6. CONCLUSÕES
A cultura de células mesencefálicas de rato revelou um percentual de células dopaminérgicas
em torno de 2% após 5 dias de cultura
A 6-OHDA (40 e 200 µM), promoveu uma diminuição na viabilidade celular em torno de
37,65% e 63,44% para células não dopaminérgicas (TH-) e (79,78% e 93,75%) para células
dopaminérgicas (TH+).
A 6-OHDA (40 e 200
µ
M), induziu a um aumento nos níveis de nitrito e na peroxidação
lipídica .
Na concentração de 200 µM a 6-OHDA induziu uma grande morte celular, com aumento no
número de células apoptóticas e necróticas.
A fração enriquecida de chalconas (FEC) nas concentrações de 1; 10 e 100µg/Ml reduziu
significativamente e de maneira dose-dependente a morte celular induzida pela 6-OHDA (40 e 200
µ
M), tanto quando adicionada 3 horas antes (protocolo de neuroprevenção) quanto adicionada 3
horas após a neurotoxina (protocolo de neuroresgate).
Além disso a FEC inibiu o aumento de nitrito (somente no protocolo de neuroprevenção) e a
peroxidação lipídica (nos dois protocolos) induzida pela 6-OHDA.
A FEC demonstrou atividade antiapoptótica e preveniu a necrose causada pela 6-OHDA (200
µM) (nos dois protocolos estudados).
O 2-O-metilinositol (MIT) nas concentrações de 1, 10 e 100 µg/Ml protegeu tanto as células
TH- quanto TH+ do dano induzido pela 6-OHDA (em ambos os protocolos),
O MIT reduziu os níveis de nitrito e a peroxidação lípidica induzida pela 6-OHDA nos dois
protocolos estudados.
Também demonstrou uma potente atividade antiapoptótica, além de diminuir o número de
células necróticas .
Apesar de estruturas quimicamente diferentes o mecanismo antiapoptótico e neuroprotetor da
FEC e do MIT parece estar relacionado com uma proteção mitocondrial e atividade antioxidante,
via interferência no sistema NO; não se podendo estacar uma ação a nível de segundos
mensageiros, tais como inositó trifosfatos e PKC.
166
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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