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Kátia Valéria Bastos Dias Barbosa
ASPECTOS FENOTÍPICOS CELULARES DE LEUCÓCITOS
CIRCULANTES EM PORTADORES DE HEPATITE C CRÔNICA
COM OU SEM INSUFICIÊNCIA RENAL CRÔNICA
FACULDADE DE MEDICINA
BELO HORIZONTE – MINAS GERAIS
2008
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Milhares de livros grátis para download.
i
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO
KÁTIA VALÉRIA BASTOS DIAS BARBOSA
ASPECTOS FENOTÍPICOS CELULARES DE LEUCÓCITOS
CIRCULANTES EM PORTADORES DE HEPATITE C CRÔNICA
COM OU SEM INSUFICIÊNCIA RENAL CRÔNICA
FACULDADE DE MEDICINA
BELO HORIZONTE – MINAS GERAIS
2008
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Kátia Valéria Bastos Dias Barbosa
ASPECTOS FENOTÍPICOS CELULARES DE LEUCÓCITOS
CIRCULANTES EM PORTADORES DE HEPATITE C CRÔNICA
COM OU SEM INSUFIC
I
ÊNCIA RENAL CRÔNICA
Tese apresentada ao curso de Pós-graduação em Medi-
cina, área de concentração em Gastroenterologia, da
Faculdade de Medicina da Universidade Federal de
Minas Gerais, como requisito parcial para a obtenção
do título de Doutor em Medicina.
Orientadora: Profª Dra. Rosângela Teixeira
1
Co-orientador: Dr. Olindo Assis Martins Filho
2
1
Faculdade de Medicina
Universidade Federal de Minas Gerais
2
Laboratório de Biomarcadores de Diagnóstico
e Monitoração – CPqRR / FIOCRUZ
Universidade Federal de Minas Gerais
Belo Horizonte – MG
2008
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
•
Reitor: Profº Ronaldo Tadêu Pena
• Vice-Reitor: Profª Heloisa Maria Murgel Starling
• Pró-Reitor da Pós-Graduação: Profº Jaime Arturo Ramirez
• Pró-Reitor de Pesquisa: Profº Carlos Alberto Pereira Tavares
FACULDADE DE MEDICINA
• Diretor: Profº Francisco José Penna
• Vice-Diretor: Profº Tarcizo Afonso Nunes
• Coordenador do Centro de Pós-Graduação: Profº Carlos Faria Santos Amaral
• Sub-coordenador do Centro de Pós-graduação: Profº João Lúcio dos Santos Jr.
DEPARTAMENTO DE CLÍNICA MÉDICA
• Chefe: Profº Dirceu Bartolomeu Greco
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM GASTROENTEROLOGIA
Coordenador: Profº Luiz Gonzaga Vaz Coelho
Colegiado:
• Profº Luiz Gonzaga Vaz Coelho (Coordenador)
• Profª Cláudia Alves Couto
• Profª Luciana Dias Moretzsohn
• Profª Teresa Cristina de Abreu Ferrari
• Luiz Fernando Veloso (Representante Discente)
Universidade Federal de Minas Gerais
Belo Horizonte – MG
2008
iv
Kátia Valéria Bastos Dias Barbosa
ASPECTOS FENOTÍPICOS CELULARES DE LEUCÓCITOS
CIRCULANTES EM PORTADORES DE HEPATITE C CRÔNICA
COM OU SEM INSUFIC
I
ÊNCIA RENAL CRÔNICA
PRESIDENTE DA BANCA:
PROF. DR.___________________________________________________________
BANCA EXAMINADORA
PROF. DR.___________________________________________________________
PROF. DR.___________________________________________________________
PROF. DR.___________________________________________________________
PROF. DR.___________________________________________________________
PROF. DR.___________________________________________________________
APROVADA EM: ___/___/___
Universidade Federal de Minas Gerais
Belo Horizonte – MG
2008
v
D
DD
D
edico este trabalho ao João Claudio
pelo apoio e companheirismo
À
minha família, meus pais e minhas
irmãs, pelo amor e carinho
Aos
meus mestres e orientadores, res-
ponsáveis pelo meu crescimento pessoal
e acadêmico
AGRADECIMENTOS
vi
A Deus, por se fazer sempre presente em meu caminho, nas minhas principais escolhas.
A meu pai por todo zêlo e ensinamentos, companhia no silêncio, à minha mãe pelo exemplo
de força e determinação, às minhas irmãs Vívian e Karine pela amizade.
Ao João Claudio pela paciência, amor e incentivo nesta difícil etapa. Sua participação foi
muito importante na manutenção de minha esperança, serenidade e perseverança.
À Dra. Rosângela Teixeira, pela pessoa humana, por todo apoio e dedicação, transformando
os momentos mais difíceis em pequenos problemas. Pelo tempo que, gratuitamente, foi a mim
dedicado, responsável pelo meu crescimento acadêmico, científico e pessoal que continuará, a
partir de agora, sempre comigo, refletido em cada novo projeto. Obrigada por ser minha ori-
entadora, pois esta foi a razão e o princípio de tudo.
Ao Dr. Olindo Assis Martins Filho por ter acreditado no meu trabalho, tendo aberto para mim,
incondicionalmente, as portas do Laboratório de Chagas. E, sobretudo, pelas tardes incansá-
veis, dedicadas aos ensinamentos de imunologia e de técnica laboratorial para uma iniciante.
Agradeço pela sensibilidade, pelo desenvolvimento crítico e científico nesta área complexa do
conhecimento, pois sem dúvidas, na ausência do seu incentivo, este projeto não prosperaria.
Ao Dr. Eric Bassetti pelo apoio e pelo seu importante papel na aproximação inicial com meus
orientadores.
À Bia pela paciência e disponibilidade ao ensinar-me as técnicas laboratorais, sendo a pionei-
ra na minha introdução à prática da metodologia de pesquisa. Obrigada pela força e por ter
estendido a sua mão nas horas mais essenciais.
À enfermeira Raquel pelo cuidado, carinho e disponibilidade para a coleta das amostras.
À Tiza pelo apoio na execução da leitura dos experimentos que, muitas vezes, esgotavam seu
horário.
À Roberta Félix pela disponibilidade espontânea, sempre com muita eficiência.
vii
A todos os estudantes, pós-graduandos, técnicos e pesquisadores do Laboratório de Chagas do
René Rachou - FIOCRUZ, em especial ao Rodrigo, Danielle, Renato, Márcio, Renata, Ana
Paula, Paula, Jordana, Eliandra e Mariléia pela receptividade, transferência de conhecimentos
e amizade.
Aos amigos do ambulatório de Hepatites Virais do Instituto Alfa da UFMG, sempre tolerantes
e auxiliando na inclusão dos pacientes, Mary, Érica, Rodrigo, Osvaldo e Luís Otávio.
À Fundação Hemominas – Hemocentro Regional de Belo Horizonte, pelo sucessivo apoio na
execução do projeto, pela colaboração e parceria, sempre favorecendo o desenvolvimento da
pesquisa.
Ao Núcleo de Nefrologia de Belo Horizonte cuja participação foi distinta na aprovação e na
disponibilidade para a execução do projeto, em especial ao Dr. João Milton, Dr. José Menezes
e a toda equipe de enfermagem.
Ao Centro de Pós-graduação em Medicina da UFMG, área de concentração em Gastroentero-
logia, pela oportunidade.
Meu sincero e humilde agradecimento aos pacientes do ambulatório de hepatites, do centro de
hemodiálise e aos doadores de sangue que se dispuseram a colaborar, voluntariamente, com a
pesquisa, no âmbito dos principais atores do projeto.
viii
“A mente de um indivíduo, uma vez desenvol-
vida por uma idéia nova, nunca recupera suas
dimensões originais.”
Oliver W. Holmes
SUMÁRIO
ix
1.
INTRODUÇÃO .................................................................................................. 20
1.1. Objetivos: .................................................................................................................. 21
1.1.1. Objetivo Principal: ................................................................................................... 21
1.1.2. Objetivos Específicos: ............................................................................................. 21
2.
REVISÃO DA LITERATURA ......................................................................... 22
2.1. Epidemiologia: .......................................................................................................... 22
2.2. História Natural da Infecção pelo Vírus da Hepatite C: ...................................... 23
2.3. Aspectos Básicos da Resposta Imune à Infecção Viral: ........................................ 26
2.4. Resposta Imunológica ao Vírus da Hepatite C: ..................................................... 31
2.5. A Hepatite C no Contexto da Insuficiência Renal Crônica: ................................. 37
2.6. Considerações finais: ................................................................................................ 39
3.
CASUÍSTICA E MÉTODOS............................................................................ 41
3.1. Tipo de estudo:.......................................................................................................... 41
3.2. Casuística: ................................................................................................................. 41
3.2.1. Cálculo do tamanho amostral: ................................................................................. 41
3.2.2. Descrição da casuística: ........................................................................................... 41
3.2.3. Critérios de inclusão e exclusão: ............................................................................. 42
3.2.4. Caracterização da Casuística: .................................................................................. 44
3.2.4.1. Características referentes a todos os grupos: .................................................. 44
3.2.4.2. Características relativas aos grupos com insuficiência renal: ......................... 45
3.2.4.3. Características particulares dos grupos com hepatite C crônica: .................... 46
3.3. Métodos: .................................................................................................................... 50
3.3.1. Entrevista clínica, dados laboratoriais e histológicos: ............................................. 50
3.3.2. Imunofenotipagem dos leucócitos do sangue periférico: ........................................ 51
3.3.3. Aquisição dos Dados e Análise Estatística: ............................................................. 55
3.3.3.1. Análise convencional ...................................................................................... 56
3.3.3.2. Análise de células T reguladoras: ................................................................... 56
3.3.3.3. Análise do marcador CD56 em subpopulações de células CD3
-
CD16
+
: ........ 57
3.3.3.4. Análise de subpopulações de células CD3
-
CD56
+
: ......................................... 58
3.3.3.5. Análise combinada “gated”: ............................................................................ 59
3.3.3.6. Análise de monócitos pró-inflamatórios: ........................................................ 60
3.3.3.7. Análise semiquantitativa da expressão de FcyR em monócitos: .................... 62
3.3.3.8. Análise semiquantitativa da expressão de FcyRIII em neutrófilos: ................ 62
3.3.3.9. Análise da expressão de receptores de quimiocinas: ...................................... 63
x
3.3.4. Análise Estatística: .................................................................................................. 64
3.4. Aspectos Éticos: ........................................................................................................ 65
4.
RESULTADOS .................................................................................................. 66
4.1. Resultados da imunofenotipagem por citometria de fluxo:.................................. 66
4.1.1. Freqüência de populações e subpopulações celulares do sangue periférico em cada
grupo: 66
4.1.1.1. Imunidade inata: .............................................................................................. 66
4.1.1.2. Imunidade adaptativa: ..................................................................................... 75
4.1.2. Estudo da expressão de marcadores de ativação celular nas populações e
subpopulações celulares do sangue periférico em cada grupo: .......................................... 79
4.1.2.1. Imunidade inata: .............................................................................................. 79
4.1.2.2. Imunidade adaptativa: ..................................................................................... 80
4.1.3. Estudo da regulação da resposta imune nos leucócitos do sangue periférico: ........ 82
4.1.3.1. Análise de receptores de imunoglobulina em células da Imunidade inata: .... 82
4.1.3.2. Análise da freqüência de células T reguladoras (CD4
+
CD25
High
): ................ 85
4.1.3.3. Análise da expressão de CD32 (FcγRII) em linfócitos B: .............................. 86
4.1.4. Análise da expressão de receptores de quimiocinas em cada grupo: ...................... 87
4.1.4.1. Imunidade inata: .............................................................................................. 87
4.1.4.2. Imunidade Adaptativa: .................................................................................... 89
4.1.5. Correlações entre as variáveis em estudo (demográficas, laboratoriais,
imunofenotipagem): ............................................................................................................ 92
4.1.5.1. Correlação entre ALT e Grau de Atividade Histológica: ............................... 93
4.1.5.2. Correlação entre variáveis em estudo (demográficas, laboratoriais) e
parâmetros fenotípicos de células da imunidade inata: ................................................... 94
4.1.5.3. Correlação entre variáveis em estudo (demográficas e laboratorais) e
parâmetros fenotípicos de células da imunidade adaptativa: .......................................... 95
4.1.5.4. Correlação entre os parâmetros fenotípicos celulares avaliados no sangue
periférico: ........................................................................................................................ 98
4.1.5.5. Correlação entre células com expressão de quimiocinas e outros fenótipos
celulares estudados: ....................................................................................................... 101
5.
DISCUSSÃO: ................................................................................................... 105
6.
CONCLUSÕES: .............................................................................................. 123
7.
REFERÊNCIAS ............................................................................................... 128
8.
ANEXOS: ......................................................................................................... 140
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Esquema de resposta imune durante uma infecção viral. ....................................... 27
Figura 2 - Subpopulações funcionais de células T. ................................................................. 28
Figura 3 - Aspectos gerais das funções dos linfócitos T auxiliares do tipo 1 ......................... 29
Figura 4 - Aspectos gerais das funções dos linfócitos T auxiliares do tipo 2 ......................... 30
Figura 5 - Variação dos níveis da ALT nos grupos com infecção crônica pelo vírus da
hepatite C .................................................................................................................................. 47
Figura 6 - Perfil da distribuição dos níveis da ALT nos grupos com infecção crônica pelo
vírus da hepatite C. ................................................................................................................... 47
Figura 7 - Quantificação da carga viral do vírus da hepatite C por Reação em Cadeia da
Polimerase. ............................................................................................................................... 49
Figura 8 - Seqüência de procedimentos utilizados para as análises dos percentuais de
populações celulares por citometria de fluxo. .......................................................................... 56
Figura 9 - Seqüência de procedimentos utilizados para as análises dos percentuais de células
T reguladoras (CD4+CD25HIGH) por citometria de fluxo. .................................................... 57
Figura 10 - Seqüência de procedimentos utilizados para as análises dos percentuais das
subpopulações de células NK. .................................................................................................. 58
Figura 11 - Seqüência de procedimentos utilizados para as análises dos percentuais das
subpopulações CD3-CD56DIMCD16-/+ e CD3-CD56BRIGHTCD16-/+ por citometria de
fluxo. ......................................................................................................................................... 59
Figura 12 - Seqüência de passos utilizados para as análises de subpopulações de células T
CD4+ ou CD8+ ativadas (HLA-DR+) por citometria de fluxo. ............................................... 60
Figura 13 - Seqüência de procedimentos utilizados para as análises dos percentuais de
monócitos pro-inflamatórios (CD14+CD16+HLA-DR++) por citometria de fluxo. ............... 61
Figura 14 - Seqüência de procedimentos utilizados para a análise da intensidade média de
fluorescência correspondente à expressão de receptores Fcg na população de monócitos por
citometria de fluxo. ................................................................................................................... 62
Figura 15 - Seqüência de procedimentos utilizados para a análise da intensidade média de
fluorescência correspondente à expressão do receptor Fcg (CD16) na população de neutrófilos
por citometria de fluxo. ............................................................................................................ 63
xii
Figura 16 - Seqüência de procedimentos utilizados para as análises da expressão de
receptores de quimiocinas por citometria de fluxo. .................................................................. 64
Figura 17 - Percentual de monócitos circulantes no sangue periférico em cada grupo: ......... 67
Figura 18 - Análise da razão entre macrófago-like e monócitos totais (A) e da razão entre
monócitos pró-inflamatórios e monócitos totais (B) no sangue periférico: ............................. 68
Figura 19 - Análise do percentual de células Natural Killer totais no sangue periférico em
cada grupo: ............................................................................................................................... 69
Figura 20 - Análise do percentual de células Pré-NK (A), células NK maduras (B) e Células
NK ativadas (C) no sangue periférico em cada grupo: ............................................................. 70
Figura 21 - Análise do percentual de células NKT totais no sangue periférico em cada grupo:
.................................................................................................................................................. 71
Figura 22 - Análise do percentual de células NKT 1 (A), células NKT 2 (B) e células NKT 3
(C) no sangue periférico em cada grupo:.................................................................................. 72
Figura 23 - Análise da razão entre as células NK CD3-CD16-CD56dim (A), células NK
CD3-CD16-CD56bright (B), células NK CD3-CD16+CD56dim (C), células NK CD3-
CD16+CD56bright (D) e células CD56+ totais no sangue periférico em cada grupo: ............ 74
Figura 24 - Análise do percentual de linfócitos T (A) e linfócitos B (B) circulantes em cada
grupo: ........................................................................................................................................ 75
Figura 25 - Análise da razão entre linfócitos T e linfócitos B circulante em cada grupo: ...... 76
Figura 26 - Análise do percentual de linfócitos T auxiliares (A) e de linfócitos T citotóxicos
(B) no sangue periférico em cada grupo:.................................................................................. 77
Figura 27 - Análise da razão entre linfócitos T auxiliares e linfócitos T citotóxicos do sangue
periférico por grupo: ................................................................................................................. 77
Figura 28 - Análise do percentual entre linfócitos B convencionais (A) e linfócitos B1 (B)
circulantes e linfócitos B totais no sangue periférico em cada grupo: ..................................... 78
Figura 29 - Análise do percentual de neutrófilos HLA-DR+ no sangue periférico em cada
grupo: ........................................................................................................................................ 79
Figura 30 - Análise do percentual de células T auxiliares ativadas na população de linfócitos
T auxiliares (A) e do percentual de células T citotóxicas ativadas na população de linfócitos T
citotóxicos (B) circulantes por grupo: ...................................................................................... 80
Figura 31 - Análise da expressão de HLA-DR em linfócitos B do sangue periférico: ........... 81
xiii
Figura 32 - Análise da expressão da molécula CD23 em linfócitos B (linfócitos B ativados)
do sangue periférico em cada grupo: ........................................................................................ 82
Figura 33 - Análise da expressão da molécula CD64 (FcgRI) em eosinófilos circulantes por
grupos: ...................................................................................................................................... 83
Figura 34 - Análise da expressão da molécula CD32 (FcgRII) em monócitos do sangue
periférico em cada grupo: ......................................................................................................... 84
Figura 35 - Análise da expressão da molécula CD16 (FcgRIII) em neutrófilos circulantes em
cada grupo: ............................................................................................................................... 85
Figura 36 - Análise do percentual de células T Reguladoras (Células CD4+CD25High) no
sangue periférico em cada grupo: ............................................................................................. 86
Figura 37 - Análise da expressão de CD32 (FcgRII) em linfócitos B circulantes por grupo: 86
Figura 38 - Análise da expressão de CXCR4 em monócitos do sangue periférico em cada
grupo: ........................................................................................................................................ 87
Figura 39 - Análise da expressão de CCR3 em monócitos do sangue periférico em cada
grupo: ........................................................................................................................................ 88
Figura 40 - Análise da expressão de CXCR4 em linfócitos T auxiliares (A) e em linfócitos T
citotóxicos (B) em cada grupo: ................................................................................................. 89
Figura 41 - Análise da expressão de CXCR3 em linfócitos T auxiliares (A) e em linfócitos T
citotóxicos (B) em cada grupo: ................................................................................................. 90
Figura 42 - Análise da expressão de CCR5 em linfócitos T auxiliares (A) e em linfócitos T
citotóxicos (B) em cada grupo: ................................................................................................. 91
Figura 43 - Análise da expressão de CCR3 em linfócitos T auxiliares (A) e em linfócitos T
citotóxicos (B) em cada grupo: ................................................................................................. 92
Figura 44 - Correlação entre ALT e Atividade Histológica no grupo HepC: ......................... 93
Figura 45 - Correlação entre o percentual de monócitos no sangue periférico e carga viral nos
grupos HepC e HepC+IRC associados (A) e no grupo HepC (B): .......................................... 94
Figura 46 - Correlação entre células o percentual de células NKT totais no sangue periférico
e o tempo provável de infecção (epidemiológico) no grupo HepC+IRC: ................................ 95
Figura 47 - Correlação entre o percentual de linfócitos T auxiliares ativados na população de
linfócitos T auxiliares periféricos e ALT no grupo HepC+IRC: .............................................. 96
xiv
Figura 48 - Correlação entre linfócitos T citotóxicos ativados na população de linfócitos
citotóxicos periféricos e ALT no grupo HepC+IRC: ............................................................... 97
Figura 49 - Correlação entre o percentual de linfócitos T citotóxicos ativados na população
de linfócitos T citotóxicos periféricos e carga viral no grupo HepC: ....................................... 97
Figura 50 - Correlação entre o percentual de monócitos pró-inflamatórios na rpopulação de
monócitos totais e o percentual de linfócitos B do sangue periférico no grupo HepC+IRC: .. 98
Figura 51 - Correlação entre o percentual de linfócitos B e o percentual de linfócitos T
citotóxicos ativados na população de linfócitos T citotóxicos do sangue periferico na
associação entre os grupos HepC e HepC+IRC (A) no grupo HepC (B): ................................ 99
Figura 52 - Correlação entre o percentual de células T reguladoras e o percentual de
linfócitos T auxiliares ativados na população de linfócitos T auxiliares periféricos no grupo
HepC: ...................................................................................................................................... 100
Figura 53 - Correlação entre entre o percentual de células T reguladoras do sangue periférico
e o percentual de linfócitos T citotóxicos ativados na população de linfócitos T citotóxicos
periféricos no grupo HepC+IRC: ........................................................................................... 101
Figura 54 - Análise da correlação entre a expressão de CXCR4 em linfócitos T citotóxicos e
o percentual de linfócitos T citotóxicos ativados na população de linfócitos T citotóxicos
periféricos quando associados os grupos HepC e HepC+IRC (n=36): .................................. 102
Figura 55 - Análise da correlação entre o percentual de células CD8+CXCR3+ na população
de linfócitos T citotóxicos periféricos e o percentual de linfócitos T citotóxicos ativados na
população de linfócitos T citotóxicos periféricos no grupo HepC: ........................................ 103
Figura 56 - Análise da correlação entre a expressão de CCR3 em monócitos e o percentual de
monócitos pró-inflamatórios na população de monócitos do sangue periférico no grupo HepC:
................................................................................................................................................ 104
Figura 57 - Síntese do padrão e interseção do perfil fenotípico celular e molecular entre os
grupos portadores de hepatite C crônica sem (HepC) e com doença renal associada
(HepC+IRC), controle renais crônicos (IRC) e controles sadios (NI): .................................. 117
xv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Dados epidemiológicos referentes aos grupos em estudo ....................................... 45
Tabela 2 - Etiologia da doença de base nos grupos com insuficiência renal crônica ............... 45
Tabela 3 - Dados epidemiológicos dos grupos com insuficiência renal crônica ...................... 46
Tabela 4 - Epidemiologia provável da infecção pelo vírus da hepatite C ................................ 46
Tabela 5 - Dados epidemiológicos, laboratoriais e de biologia molecular dos grupos com
hepatite C crônica ..................................................................................................................... 48
Tabela 6 - Distribuição dos genótipos do vírus da hepatite C por grupo ................................. 48
Tabela 7 - Achados à histologia hepática nos grupos com hepatite C crônica ......................... 50
Tabela 8 - Anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos utilizados para análise de
populações e subpopulações celulares e moléculas de supercície ............................................ 53
xvi
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AASLD – Associação Americana para o Estudo das Doenças do Fígado
ADCC – Citotoxicidade celular dependente de anticorpos
ALT – Alanino aminotransferase
Anti-HCV – Anticorpos contra o vírus da hepatite C
APC – Células apresentadoras de antígenos
EASL – Associação Européia para o estudo do Fígado
EDTA – Ácido etilenodiaminotetracético
ELISA – Enzima imunoensaio para detecção de anticorpos
Fc – Fração cristalizável de imunoglobulinas
FcRs – Receptores para fração cristalizável de imunoglobulinas
FcγRI – Receptor Fc para imunoglobulina G do tipo I (CD64)
FcγRII – Receptor Fc para imunoglobulina G do tipo II (CD32)
FcγRIII – Receptor Fc para imunoglobulina G do tipo III (CD16)
FSC – Distribuição puntual de tamanho
HBV – Vírus da hepatite B
HCV – Vírus da hepatite C
HCV-RNA – Ácido ribonucléico do vírus da hepatite C
HDV – Vírus da hepatite D
HepC – Portadores de hepatite C
HepC+IRC – Portadores de hepatite C e insuficiência renal crônica
HIV – Vírus da imunodeficiência adquirida humana
HLA – Antígeno leucocitário humano
HTLV – Vírus T-linfotrópico humano
IFN – Interferon
Ig – Imunoglobulina
IgG – Imunoglobulina G
IL – Interleucina
IMF – Intensidade média de fluorescência
IRC – Portadores de insuficiência renal crônica
LB – Linfócitos B
xvii
LSN – Limite superior da normalidade
LTa – Linfócitos T auxiliares
LTc- Linfócitos T citotóxicos
MHC – Complexo Maior de Histocompatibilidade
M∅ - Monócitos
NI – Não infectado
NK – Células natural killer
NKT – Linfócitos T natural killer
NUPAD – Núcleo de Pesquisas em Apoio Diagnóstico
OMS – Organização Mundial de Saúde
PBS – Tampão fosfato salínico
PCR – Reação de polimerização em cadeia
SSC – Distribuição puntual de granulosidade
TCR –Receptor de células T
TGF-β - Fator transformador do crescimento Beta
Treg – células T reguladoras
xviii
RESUMO
FUNDAMENTOS e OBJETIVOS: O comportamento da resposta imunológica na infecção
crônica pelo vírus da hepatite C, particularmente em portadores de insuficiência renal crônica,
carece de elucidação. Visa-se o estudo do perfil fenotípico de leucócitos circulantes neste con-
texto. MÉTODOS: Foram estudados quatro grupos: G1- 15 doadores de sangue; G2- 19 por-
tadores de insuficiência renal crônica, não infectados pelo vírus C; G3- 20 portadores de hepa-
tite C crônica, com função renal normal e G4- 16 portadores crônicos do vírus C, com insufi-
ciência renal crônica avançada em hemodiálise. A infecção crônica foi confirmada pela posi-
tividade sérica do HCV-RNA qualitativo. Foram realizados ensaios de imunofenotipagem
“ex-vivo” dos leucócitos periféricos, marcados por anticorpos monoclonais conjugados com
fluorocromos, seguindo-se a análise de imunofluorescência por citometria de fluxo (FACS-
can-BD
), utilizando-se o programa CELLQuest
TM
para aquisição e análise dos dados. RE-
SULTADOS: Maior freqüência de linfócitos T auxiliares e citotóxicos ativados e células NK
e NKT mostraram-se peculiares à infecção crônica pelo vírus da hepatite C. Aumento da ex-
pressão de receptores de quimiocinas do tipo Th1 em células CD4
+
, correlação inversa entre
linfócitos T citotóxicos ativados e carga viral, correlação positiva entre CD8
+
CXCR3
+
e
CD8
+
DR
++
e entre células T reguladoras e células CD4
+
HLA-DR
+
foram características do
grupo com hepatite C crônica e função renal normal. Demonstrou-se significante participação
da imunidade inata, via ativação de monócitos, e retração no compartimento de linfócitos B,
decorrente da redução de linfócitos B1, paralela à diminuição de linfócitos B ativados, parti-
cularidades relacionadas à presença de insuficiência renal crônica e que se preservam na vi-
gência de infecção crônica pelo vírus C. Percentual elevado de células NK com maior poten-
cial citolítico (CD56
DIM
) e menor produção de IFN-γ (CD56
BRIGHT
), redução da expressão de
receptores de quimiocinas em CD4
+
e CD8
+
, correlação inversa entre linfócitos auxiliares e
citotóxicos ativados com níveis de ALT e correlação inversa entre células CD4
+
CD25
HIGH
e
CD8
+
HLA-DR
+
foram inerentes ao grupo de portadores de insuficiência renal crônica com
hepatite C crônica.
CONCLUSÕES: Os resultados demonstraram perfis distintos de resposta
imune entre os portadores de hepatite C crônica com e sem insuficiência renal crônica avan-
çada em hemodiálise.
Palavras-chave: Hepatite C Crônica. Insuficiência Renal Crônica. Imunologia. Imuno-
fenotipagem. Leucócitos periféricos.
xix
ABSTRACT
BACKGROUND AND AIMS: Chronic hepatitis C (CHC) and end-stage renal disease
(ESRD) are common and potentially serious medical problems throughout the world. The
immune system plays a key role in the natural history of hepatitis C virus (HCV) infection.
However, the knowledge of immunological aspects of HCV infection in ESRD patients is still
limited. Hence, we sought to investigate the profile of the immune response focusing on ma-
jor phenotypic features of peripheral blood lymphocytes. Patients and Methods: Four groups
were investigated: G1 - 15 blood donors (BD); G2- 19 patients with ESRD without HCV in-
fection (ESRD); G3- 20 patients with and normal renal function (CHC); G4- 16 patients with
CHC and ESRD in hemodialysis (CHC+ESRD). CHC was confirmed by HCV-RNA-PCR,
high ALT levels and/or liver-biopsy. HIV, HBV, alcoholism, autoimmune liver-diseases, use
of immunosuppressive drugs and transplanted patients were exclusion criteria. EDTA-
peripheral blood white cells were labeled with fluorochrome-conjugated specific monoclonal
antibodies following immunofluorescence analysis by flow cytometry. RESULTS: Although
no changes in the mean frequency of circulating T-cells, higher proportion of activated
CD4+HLA-DR+ as well as CD8+HLA-DR+ T-cells was observed in CHC and CHC+ESRD
as compared with BD. In addition, higher frequency of NKT-cell appeared as the hallmark of
HCV infection, despite the presence of renal disease. On the other hand, the monocyt-
ic/macrophagic and B-cell compartment were the most affected by renal disease. Lower per-
centage of CD19+B-Lymphocytes parallel with significant decrease in the CD19+CD5+B1-
subset and activated CD19+CD23+B-cells besides higher frequency of monocytes, both pro-
inflammatory and macrophage-like, was observed in ESRD and HCH+ESRD as compared to
BD.
CONCLUSIONS: These findings suggest that despite the activation of T-cell subsets is
the most affected by the HCV infection, the presence of ESRD is associated with significant
impairment of the B-cell compartment and activation of innate immunity, via monocyte acti-
vation. It might be implicated in the natural history of CHC in ESRD patients.
20
1. INTRODUÇÃO
O sistema imune parece desempenhar um papel crítico na história natural da hepatite C. No
entanto, os conhecimentos sobre aspectos imunológicos envolvidos na progressão da inflama-
ção tecidual hepática e, conseqüentemente, na evolução da doença, particularmente em porta-
dores de insuficiência renal crônica (IRC), são limitados. Assim, investigações que visam a
maior compreensão da patogenia da infecção pelo vírus da hepatite C (HCV), os determinan-
tes do clareamento viral e os diversos aspectos da resposta imune associados à história natural
da infecção constituem prioridade atual definidas pela conferência da AASLD (Associação
Americana para o Estudo das Doenças do Fígado), em 2005 (VIERLING et. al, 2005). Além
disso, o melhor entendimento da imunologia nessa infecção é essencial para o desenvolvimen-
to de estratégias imunoterapêuticas e, não obstante, de uma vacina eficaz contra o HCV
(FREEMANN et al., 2001; WRIGHT & DARLING, 2004).
Os portadores de insuficiência renal crônica em hemodiálise constituem um subgrupo de alta
prevalência da infecção crônica pelo HCV, cerca de dez vezes maior do que a da população
geral, em razão dos maiores riscos de infecção nosocomial, entre outros fatores de risco que
lhe são peculiares. A hepatite C consiste na principal hepatopatia crônica nesta população
específica e representa importante fator de risco para diminuição da sobrevida de pacientes e
enxertos após o transplante renal. (MEYERS et al, 2003). Subentende-se que maior conheci-
mento sobre a patogenia da infecção pelo HCV nesses indivíduos é essencial.
Pondera-se que, através de uma melhor compreensão dos padrões de resposta imune, explica-
ções possam ser encontradas no sentido de definir a diversidade e esclarecer as incertezas na
evolução natural da infecção crônica pelo HCV, haja vista que, individualmente, as formas de
apresentação da doença são amplamente variadas, desde lesões hepáticas mínimas até a cirro-
se estabelecida. As razões que definem a natureza e a gravidade na progressão da doença ca-
recem de maior elucidação. Sobretudo, refletindo sobre as freqüentes manifestações extra-
hepáticas da infecção pelo HCV, quase na sua totalidade relacionadas a fenômenos de auto-
imunidade (GUMBER et al., 1995; CACOUB et al., 1999), mostra-se notória a participação
do sistema imunológico na patogenia da doença.
21
A imunofenotipagem em sangue periférico tem contribuído, recentemente, para a maior com-
preensão dos aspectos patogênicos e evolutivos de diversas doenças infecciosas, incluindo a
hepatite C crônica. A identificação de perfis imunofenotípicos tem sido correlacionada à in-
flamação e à gravidade da injúria tecidual hepática, assim como à resposta terapêutica (APO-
LINARIO et al.,2002; PERNOLLET et al., 2002; CALVINO et al. 2007). Entender a orques-
tração do sistema imune, delimitando perfis específicos de resposta, supõe-se ser importante
para definir estratégias particularizadas de intervenção, otimizando a abordagem clínica e
terapêutica e, conseqüentemente, reduzindo custos. O presente estudo foi conduzido visando a
investigação dos padrões de resposta imune em portadores de infecção crônica pelo HCV com
e sem insuficiência renal crônica associada, assunto complexo, controverso e que demanda
mais conhecimentos, utilizando a técnica de imunofenotipagem de células do sangue periféri-
co por citometria de fluxo.
1.1. OBJETIVOS:
1.1.1. Objetivo Principal:
Caracterizar de forma descritiva-analítica o perfil fenotípico de leucócitos do sangue periféri-
co em portadores de hepatite C crônica com e sem insuficiência renal crônica.
1.1.2. Objetivos Específicos:
Para alcançar o objetivo principal, foram propostos os seguintes objetivos específicos, anali-
sando-se, de forma comparativa, os grupos portadores de hepatite C crônica com e sem insu-
ficiência renal crônica:
A) Caracterizar a freqüência de populações e subpopulações de leucócitos do sangue periféri-
co envolvidos na resposta imune inata e adaptativa;
B) Analisar a expressão de marcadores de ativação em leucócitos do sangue periférico;
C) Analisar a expressão de marcadores de regulação da resposta imune em leucócitos do san-
gue periférico;
D) Estudar a expressão de receptores de quimiocinas por monócitos e linfócitos T;
E) Estabelecer correlações entre os parâmetros fenotípicos de leucócitos do sangue periférico
com variáveis demográficas, laboratoriais e histológicas de pacientes portadores de hepatite C
crônica com e sem insuficiência renal crônica associada.
22
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. EPIDEMIOLOGIA:
A hepatite C representa, atualmente, um grande problema de saúde pública, com repercussão
mundial. A prevalência global da hepatite C crônica é estimada em aproximadamente 3%
(variando entre 0.1 a 5% em diferentes países): há cerca de 150 milhões de portadores crôni-
cos do HCV dispersados pelo mundo, dos quais acredita-se que quatro milhões estejam nos
Estados Unidos e cinco milhões distribuídos na Europa ocidental. Em países industrializados,
o HCV é responsável por 20% dos casos de hepatite aguda, 70% dos casos de hepatite crôni-
ca, 40% dos quadros de cirrose em estágio terminal, 60% dos casos de carcinoma hepatocelu-
lar e 30% das indicações de transplantes de fígado (EASL INTERNACIONAL CONSENSUS
CONFERENCE ON HEPATITIS C, 1999).
No Brasil, estima-se que a prevalência de portadores deste agente viral possa variar entre 1,5 e
2% (SILVA, 1999), percentual semelhante ao observado na Índia, China, Cuba e Etiópia. Em
inquérito nacional realizado, envolvendo, em maioria absoluta, pré-doadores de sangue e a-
brangendo as cinco regiões do país, a prevalência de doadores com anti-HCV positivo foi de
1,23% (RELATÓRIO DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE HEPATOLOGIA, 2002). Infere-
se que a prevalência da viremia pelo HCV esteja ao redor de 1% na população geral. Vale
ressaltar que a população de pré-doadores de sangue é composta por população supostamente
sadia, não representando, portanto, o perfil dos pacientes portadores de hepatite C. Uma pes-
quisa de base populacional, cuja amostra incluiu indivíduos residentes no município de São
Paulo, com idade entre dois e setenta anos, a prevalência geral do HCV foi de 1,42%, sendo
que, no grupo de indivíduos com mais de trinta anos de idade, este percentual atingiu 3,8%
(FOCACCIA et al., 1998). Existem dados da OMS (Organização Mundial de Saúde) sugerin-
do que a prevalência da hepatite C no Brasil encontre-se entre 2,7% e 4,9% (PYBUS et al.,
2001). Estes números, embora estimados, estariam mais próximos daqueles do último estudo
citado.
A insuficiência hepática terminal relacionada ao HCV é a principal doença de base em paci-
entes referidos para transplante hepático, respondendo por metade ou mais dos transplantes
em muitos centros. As hepatites crônicas, principalmente a hepatite C, têm sido um desafio
23
científico mundial e um sério problema de saúde pública (STRADER et al., 2004). A hepatite
crônica C é, atualmente, a principal causa de morte por hepatopatia avançada nos Estados
Unidos e os portadores crônicos do HCV representam quatro vezes a população acometida
pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) (KIM, 2002). Estima-se que o número anual de
mortes causadas pelo HCV, por cirrose e hepatocarcinoma, poderá superar o número de mor-
tes causadas pelo HIV (EASL INTERNACIONAL CONSENSUS CONFERENCE ON HE-
PATITIS C, 1999).
2.2. HISTÓRIA NATURAL DA INFECÇÃO PELO VÍRUS DA HEPATITE C:
O curso natural da infecção pelo HCV é lento e progressivo na maioria dos casos. Estudos
prospectivos demonstraram que 60 a 85% daqueles infectados pelo HCV evoluem para croni-
ficação da infecção, sendo que, aproximadamente, 15 a 20% dos indivíduos infectados pelo
HCV recuperam-se espontaneamente e 25% apresentam um curso assintomático e com as
aminotransferases persistentemente normais (VILLANO et al., 1999). Uma parte dos pacien-
tes com evidência bioquímica de hepatite crônica evolui com atividade necroinflamatória leve
ou moderada e fibrose hepática mínima, de prognóstico incerto e pouco conhecido. Entretan-
to, 20% dos pacientes com hepatite crônica pelo HCV desenvolvem cirrose e suas complica-
ções após 10 a 20 anos de infecção (ALTER & SEEF, 2000).
A hepatite C crônica progride por meio da deposição de fibrose no parênquima hepático. No
entanto, a doença não apresenta evolução uniforme em todos os portadores crônicos. Enquan-
to alguns indivíduos desenvolvem cirrose e carcinoma hepatocelular em 20 a 30 anos, outros
permanecem com hepatite leve e mínima fibrose por mais de 50 anos. Vários co-fatores estão
envolvidos na progressão da doença para a cirrose estabelecida. Dentre os principais fatores,
possivelmente implicados na evolução da doença hepática associada à agressão pelo HCV,
destacam-se: (a) idade do paciente à época da infecção - em geral, os pacientes que adquirem
a doença em idade mais avançada (maior que 40 anos) apresentam evolução mais rápida para
cirrose; (b) Tempo de doença maior que 20 anos; (c) sexo masculino; (d) alcoolismo; (e) este-
atose hepática; (f) ferro hepático; (g) imunossupressão; (h) hemodiálise; (i) co-infecção com o
vírus HIV ou com o vírus da hepatite B (HBV). (NIH CONSENSUS DEVELOPMENT
CONFERENCE, AASLD, 2002).
24
As incertezas em relação ao curso clínico da hepatite C, a longo prazo, devem-se, em parte, à
impossibilidade de precisar a data de início da doença na maioria dos casos (fase aguda assin-
tomática), à necessidade de biópsia hepática para demonstrar progressão da fibrose e à lenta
evolução da doença desde a hepatite aguda até a cirrose ou carcinoma hepatocelular, dificul-
tando, portanto, os estudos de seguimento. Além disso, há coexistência de muitos fatores de
confusão associados e o tratamento modifica o curso natural da doença. Atualmente, não seria
ético observar a progressão da fibrose em estudos prospectivos em pacientes sem intervenção
terapêutica, visto que há tratamento anti-viral aprovado para a hepatite C (SEEFF, 2000).
O desenho do estudo sobre história natural da doença deve ser considerado na interpretação
da análise. Nos estudos retrospectivos observa-se maior taxa de progressão para cirrose. Estu-
dos com intervalo de exposição ao HCV entre nove e 30 anos demonstraram progressão para
cirrose variável de 6,8% a 55%. (KIYOSAWA et al., 1990; GORDON et al.,1993; TONG et
al., 1995; NIEDERAU et al., 1998). Tal resultado deve-se, provavelmente, a vício de amos-
tragem, normalmente selecionada a partir de casos com doença avançada em centros terciá-
rios. Por sua vez, quando o desenho do estudo é prospectivo, foi encontrado, num período de
acompanhamento de 7,6 a 16 anos, percentual de 7,0 a 15,6% de desenvolvimento de cirrose.
A crítica, neste caso, é o tempo de seguimento, porventura insuficiente (DI BISCEGLIE et. al,
1991; TREMOLADA et al., 1992; KORETZ et al., 1993). Portanto, o desenho retroprospec-
tivo pode ser o modelo, atualmente, mais apropriado para o estudo natural da doença. Neste
tipo de estudo, encontrou-se, com um tempo de seguimento variável entre 17-50 anos, um
percentual de desenvolvimento de cirrose entre 0,3 a 15% (DATZ C et al., 1999; KENNY-
WALSH et al., 2001; SEEFF et al., 2001). Em uma metanálise (FREEMANN et al., 2001)
que abrangeu 57 trabalhos publicados nos últimos anos envolvendo a história natural da hepa-
tite C, os autores encontraram percentual de progressão para cirrose, em 20 anos de observa-
ção, aproximadamente de 22-24% nos grupos com pacientes selecionados em centros hospita-
lares terciários e em casos pós-transfusionais e, distintamente, de 4-7% nos grupos seleciona-
dos a partir de doadores de sangue e na comunidade. Estes dados sugerem a presença de um
vício de seleção e/ou aferição, parcialmente explicado pela presença de pacientes mais graves
em centros terciários, da maior probabilidade de comorbidades e idade avançada nos casos de
transfusão de sangue, assim como menor prevalência de doenças associadas e de indivíduos
mais jovens na comunidade e entre os doadores de sangue.
25
A progressão da fibrose hepática parece ser influenciada por inúmeras variáveis, a saber: a)
definidos: idade no momento do contágio, duração da infecção, sexo masculino, consumo de
álcool > 50g /dia, co-infecção com HIV e CD4 < 200 cel/mm
3
, fibrose na biópsia inicial; b)
prováveis: esteatose, índice de massa corporal, ferro hepático, co-infecção com HBV, imu-
nossupressão (renais crônicos em hemodiálise, transplantados, HIV) e níveis de ALT (alanino
aminotransferase) - necrose e inflamação (POYNARD et al., 1997; MARCELLIN et al.,
2002). A evolução da fibrose no tecido hepático determina, em última análise, o prognóstico.
A fibrogênese é um processo dinâmico complexo, que é mediado por fenômenos necroinfla-
matórios e pela ativação de células estreladas e do qual participam citocinas, enzimas e fatores
de crescimento. (MARCELLIN et al., 2002).
Corroboram, ademais, com o envolvimento direto do sistema imune na expressão da doença,
as variadas manifestações extra-hepáticas da infecção pelo HCV, estando, quase na sua totali-
dade, relacionadas a fenômenos de auto-imunidade. Merecem destaque as tireoidopatias, o
diabete melito, a crioglobulinemia, a glomerulopatia membrano-proliferativa, a síndrome de
Sjögren, dentre outras entidades clínicas, definidas ou provavelmente associadas à infecção
pelo HCV (GUMBER et al., 1995; CACOUB et al., 1999).
Postula-se, em concordância com o exposto anteriormente, que o sistema imune deva influen-
ciar, sobremaneira, a história natural da doença. Por conseguinte, pretende-se estudar o perfil
imunofenotípico dos portadores de hepatite C crônica e, de forma particular, realizar a compa-
ração com um grupo de pacientes com insuficiência renal crônica, com a finalidade de se ob-
ter, possivelmente, um melhor entendimento da participação do sistema imune na intricada
fisiopatogenia da doença. A seguir, menciona-se um relato conciso sobre alguns aspectos
mais relevantes da resposta imunológica, com fim elucidativo, sem o intuito de esgotar o te-
ma.
26
2.3. ASPECTOS BÁSICOS DA RESPOSTA IMUNE À INFECÇÃO VIRAL:
Os vírus, que estruturalmente são aglomerados de proteínas, ácidos nucléicos e lipídeos (vírus
envelopados), são parasitas intracelulares obrigatórios, necessitando de uma célula hospedeira
para a síntese de proteínas, metabolismo energético e fonte de lipídeos. A ligação à célula
hospedeira faz-se por receptores específicos e, após a entrada do vírus na célula hospedeira
permissiva, há a liberação e duplicação dos ácidos nucléicos e produção de proteínas virais.
Após a infecção, diversos mecanismos da resposta imune são desencadeados com o intuito de
controlar a infecção (FIG.1). A infecção de uma célula hospedeira permite a replicação viral
intensa, favorecendo o aparecimento de viremia e subseqüente ativação do sistema imune do
hospedeiro. Um dos mecanismos imunológicos desencadeados consiste na produção de Inter-
feron (IFN) alfa e beta, que atuam na ativação de mecanismos protetores da infecção de célu-
las adjacentes, além de estimulação de substâncias com ação anti-viral direta. Dois dias após a
infecção, mecanismos da imunidade inata já podem ser evidenciados no organismo hospedei-
ro, incluindo a atividade de células fagocíticas e a ativação de linfócitos natural killer (NK),
sendo que a ausência ou redução da atividade desses linfócitos pode levar à maior suscetibili-
dade à infecção viral. Uma das principais contribuições dos linfócitos NK consiste na produ-
ção de IFN-gama, importante tanto para a ativação de outras células NK, macrófagos apresen-
tadores de antígeno, linfócitos B (LB), bem como de elementos da imunidade adaptativa co-
mo os linfócitos T (LT). À medida que a infecção viral progride, respostas imunes específicas
são ativadas, com o aparecimento de linfócitos T auxiliares (LTa-CD4+) e anticorpos secreta-
dos por linfócitos B e a expansão de clones de células T citotóxicas (LTc -CD8+). Os anticor-
pos produzidos contra proteínas virais podem apresentar especificidades variadas, porém a-
queles contra glicoproteínas do envelope ou capsídeo viral ou da membrana da célula infecta-
da são os mais importantes no controle da infecção. A ativação do sistema do complemento
mediada por anticorpos pode levar à destruição da célula infectada, desde que haja grande
concentração de antígenos virais expressos em sua membrana plasmática. Além disso, meca-
nismos de neutralização da partícula viral e citotoxicidade mediada por anticorpos podem
estar presentes durante a infecção.
27
Figura 1 - Esquema de resposta imune durante uma infecção viral.
Linfócitos T auxiliares (LTa) e citotóxicos (LTc); NK = Natural Killer. Retira-
do, com permissão, de MARTINS FILHO et al. (2005).
Os linfócitos T exibem uma grande variedade de funções na resposta imune à infecção viral
(FIG. 2). Essas células podem ser identificadas pela presença de receptores de superfície celu-
lar denominados receptores de células T (TCR) e subdivididas em duas principais populações
em função do tipo de TCR que apresentam: γδ ou αβ. Os linfócitos T αβ representam cerca
de 95% dos linfócitos circulantes e possuem funções distintas, determinadas pelo tipo de mar-
cador de superfície celular que apresentam. Os LT que possuem o marcador CD4 são capazes
de interagir com moléculas de MHC (Complexo Maior de Histocompatibilidade) de classe II,
presentes na superfície de células apresentadoras de antígeno e possuem uma função auxiliar
na montagem da resposta imune, através da síntese de citocinas. Duas subpopulações princi-
pais de LTa podem ser identificadas em função do padrão de citocinas que elas secretam:
LTa1 e LTa2.
LT
a
a
LT
c
c
Curso da Infecção
Valores Relativos
Vi
r
r
e
e
m
m
i
i
a
a
Anticorpos
Células
NK
28
Figura 2 - Subpopulações funcionais de células T.
Subpopulações funcionais de células T expressam o receptor de determinantes anti-
gênicos das células T (TCR) γδ ou αβ. Os Linfócitos T (LT) αβ são subdivididos
em populações CD4+ e CD8+, que reconhecem, respectivamente, MHC de classe II
e classe I. As células T CD4+ denominadas LT auxiliares (LTa) e as células T
CD8+, denominadas LT citotóxicas (LTc) podem ainda ser subdivididas em tipo 1 e
tipo 2 baseado no perfil das citocinas que secretam. Retirado, com permissão, de
MARTINS FILHO et al. (2005)
LTγδ
γδγδ
γδ
Ta2
LTαβ
αβαβ
αβ
Ta1
L
T
Tc1
Tc2
CD4
Ta
CD8
Tc
IFN
-
γ
γγ
γ
, TNF
-
α
αα
α
IL
-
4, IL
-
5 e IL
-
1
0
29
Os LTc CD8
+
, capazes de interagir com moléculas de MHC de classe I, presentes em todas as
células nucleadas do corpo humano, são o principal sistema de vigilância contra os vírus. É
uma resposta eficiente e seletiva na maioria das infecções virais, focalizando o local de repli-
cação viral e destruindo a célula infectada. Esse tipo de linfócito T também pode apresentar
funções distintas durante a resposta imune, sendo subdivididos em duas populações: LTc1 e
LTc2 (FIG 2).
De um modo geral, os linfócitos T do tipo 1 (LTa1) secretam principalmente citocinas, IFN-
gama e TNF-alpha, ativadoras de mecanismos da imunidade celular, como a fagocitose e a
citotoxicidade (FIG 3). Por outro lado, os linfócitos T do tipo 2 (LTa2) estimulados por célu-
las apresentadoras de antígeno, secretam citocinas, IL-4, IL-5 e IL-10 que, em associação com
moléculas co-estimuladoras, favorecem mecanismos da imunidade humoral, antígeno-
específicos (FIG 4).
Figura 3 - Aspectos gerais das funções dos linfócitos T auxiliares do tipo 1
Linfócitos T auxiliares o tipo 1 (Ta1) secretam citocinas ativadoras de mecanismos
efetores da imunidade celular, incluindo a citotoxicidade de Linfócitos T citotóxicos
(LTc) e a internalização e apresentação de antígeno por células fagocíticas (M∅).
Retirado, com permissão, de MARTINS FILHO et al. (2005).
Tc
MØ
Citotoxicidade
IFN-
γ
, TNF-
α
Ta1
Fagocitose e
Apresentação de
Antígeno
30
Figura 4 - Aspectos gerais das funções dos linfócitos T auxiliares do tipo 2.
As células T auxiliares do tipo 2 (Ta2) são estimuladas pelas células apresentadoras
de antígenos, produzem citocinas que favorecem a ativação de linfócitos B (LB) pa-
ra a produção de anticorpos. As células B interagem com os LTa através de molécu-
las co-estimuladoras presentes na superfície celular fornecendo sinais adicionais
fundamentais para a ativação celular. Retirado, com permissão, de MARTINS FI-
LHO et al. (2005).
Cabe salientar que certos vírus podem apresentar estratégias para interferir no seu reconheci-
mento pelo sistema imune. A mutação de proteínas virais imunogenicamente dominantes re-
presenta uma das principais estratégias de evasão que, além de dificultar o desenvolvimento
de vacinas e de proteção duradoura contra novas infecções, favorecem a persistência de infec-
ções crônicas. Não bastassem as mutações virais e a formação de quasi-espécies, os vírus po-
dem interferir na ativação do complemento, na produção de anticorpos, na síntese de IFN-alfa
e beta, inibir o transporte de moléculas MHC classe I para a membrana da célula infectada e,
ainda, codificar proteínas com homologia estrutural com receptores de superfície celular e/ou
citocinas e seus receptores.
Produção de ant
i
cor
pos
Apresentação de
ant
í
genos
IL4, IL5, IL10
LB
Ta2
An
tígenos
31
A revisão da resposta imune a agentes virais, previamente descrita, foi embasada em ABBAS
et al. (2000) e segundo MARTINS FILHO et al. (2005). A seguir, serão abordados alguns
aspectos relevantes da reposta imune desencadeada pela infecção humana pelo HCV, enfati-
zando o papel controverso dos mecanismos de imunidade celular e humoral. Ressalta-se a
importância da investigação científica acerca dos elementos imunológicos ainda não elucida-
dos, inerentes à infecção pelo HCV, na luz do conhecimento da complexidade do sistema i-
mune. Além disso, enfatiza-se a importância da compreensão de suas interações no contexto
do balanço entre padrões da resposta imune inflamatória e moduladora não como mecanismos
polares, isolados e independentes, mas sim como uma resultante do predomínio de um ou
outro tipo de resposta imune num padrão misto.
2.4. RESPOSTA IMUNOLÓGICA AO VÍRUS DA HEPATITE C:
A ausência de uma resposta T-linfocítica eficaz e a elevada capacidade de o vírus HCV reali-
zar mutações parecem promover um elevado índice de cronificação da infecção. A heteroge-
neidade genética do HCV tem importante implicação diagnóstica e clínica, o que, possivel-
mente, explica, ainda, as dificuldades no desenvolvimento da vacina contra o vírus e os per-
centuais de falha terapêutica. O HCV replica preferencialmente nos hepatócitos, porém não é
um vírus, a princípio, diretamente citopático, concorrendo para a persistência da infecção
(NIH CONSENSUS DEVELOPMENT CONFERENCE, AASLD, 2002).
O sistema imune do hospedeiro parece desempenhar importante papel na limitação da replica-
ção do HCV e da lesão tecidual observada na doença hepática relacionada à infecção pelo
vírus (CHENEY et al., 2000). Entretanto, estudos sobre a imunopatologia da infecção crônica
pelo HCV têm mostrado que a resposta imune celular, em particular, o perfil das citocinas
produzidas durante a infecção, parece estar envolvida com a lesão hepatocelular, podendo ser
um fator importante relacionado com a cronificação da doença e a resistência ao tratamento
antiviral (CACCIARELLI et al., 1996; EDWARDS-SMITH et al., 1999). As citocinas atuam
na defesa contra infecções virais tanto diretamente, através da inibição da replicação viral,
quanto indiretamente, através da determinação do padrão predominante da resposta imune do
hospedeiro. Entretanto, considerando a presença de um processo inflamatório contínuo na
infecção crônica pelo HCV, as citocinas também podem contribuir para a lesão hepatocelular
(KOZIEL, 1999). A compreensão dos padrões de resposta imune e de seus determinantes po-
32
de ser útil para explicar porque a maioria dos indivíduos infectados desenvolvem hepatite
crônica, enquanto outros apresentam evidência mínima de inflamação e alguns poucos conse-
guem erradicar a infecção.
Na infecção pelo HCV, há evidências que suportam o conceito de que o padrão de resposta
com predominância de citocinas do tipo 1 se correlaciona com a erradicação da infecção agu-
da. Por outro lado, indivíduos que apresentam resposta predominante do tipo 2 tendem a apre-
sentar persistência da infecção (CHENEY et al., 2000). Mesmo em indivíduos com infecção
crônica, uma forte resposta de linfócitos T auxiliares do tipo 1 parece estar associada com
componente inflamatório menos intenso e curso mais favorável da doença (LECHMANN et
al., 1996; WOITAS et al., 1997). A produção de níveis inadequados de algumas citocinas pa-
rece contribuir para a persistência do vírus e, também, influenciar a resposta à terapia antiviral
na infecção pelo HCV. A quantidade de IL-10 produzida pode, potencialmente, influenciar a
evolução da doença, uma vez que a IL-10 parece ser capaz de interferir na resposta imune
antiviral do indivíduo (WAAL MALEFYT et al., 1998). Foi observado que os níveis séricos
de IL-10 e de outras citocinas do tipo 2, encontravam-se bastante elevados em pacientes com
infecção crônica pelo HCV não tratados quando comparados com indivíduos sadios, sugerin-
do que este desvio para uma resposta do tipo 2, poderia comprometer a resposta imune do
hospedeiro, resultando, pois, na cronificação da infecção pelo HCV (CACCIARELLI et al.,
1996). Níveis séricos elevados de IL-10 também parecem estar associados com persistência
da viremia e resistência à terapia antiviral com INF-α (FUKUDA et al., 1996; OSNA et al.,
1997). Outra citocina que parece ser importante na infecção crônica pelo HCV é o TNF-α.
Pacientes com infecções, aguda e crônica, apresentam níveis plasmáticos de TNF-α elevados
quando comparados com indivíduos não infectados (TILG et al, 1992; NELSON et al., 1997).
Níveis séricos de TNF-α elevados previamente ao tratamento parecem estar associados com
resistência ao IFN-α (LARREA et al., 1996).
Níveis plasmáticos de TGF-β1 encontram-se também elevados em pacientes com hepatite
crônica pelo HCV (SHIRAI et al., 1994). Tem sido demonstrado que a expressão do gene do
TGF-β1, medida pela concentração intra-hepática de RNA mensageiro (mRNA – messenger
RNA) da citocina, apresenta-se significativamente aumentada em pacientes com infecção crô-
nica pelo HCV (ROULOT et al, 1995). TSUSHIMA et al. (1999) observaram que os níveis
33
plasmáticos de TGF-β1 estão elevados em pacientes cronicamente infectados, previamente ao
tratamento, e parecem predizer uma pior resposta ao tratamento com IFN-α. ITO et al. (1991)
demonstraram a presença de níveis elevados de mRNA de TGF-β1 em amostras de tecido
hepático com hepatite crônica. Posteriormente, este mesmo grupo de pesquisadores mostrou
que os níveis plasmáticos de TGF-β1 eram significativamente maiores em pacientes com he-
patite crônica ativa do que em pacientes com hepatite crônica ou cirrose e em indivíduos nor-
mais (SHIRAI et al., 1994).
Os fatores que determinam o desenvolvimento de uma infecção crônica pelo HCV ainda não
estão bem esclarecidos. Recentemente, a evolução das infecções causadas pelos vírus HBV e
HIV foi relacionada com o polimorfismo dos antígenos leucocitários humanos (HLA). Entre-
tanto, permanece incerto o papel do polimorfismo dos HLA nas lesões pela infecção crônica
pelo HCV (KUZUSHITA et al., 1998).
Os linfócitos T auxiliares (CD4
+
) são cruciais na orquestração da imunidade celular contra
patógenos intracelulares. Estas células reconhecem os peptídeos virais antigênicos ligados às
moléculas de histocompatibilidade (HLA) classe II na membrana das células infectadas. Os
LTa também desempenham papel fundamental na ativação dos linfócitos T citotóxicos
(CD8
+
), responsáveis pela eliminação das células infectadas por vírus e, em conjunto, produ-
zem citocinas que podem inibir a replicação viral. A resposta eficiente dos LTa aos diferentes
antígenos virais, incluindo os do core, está associada a uma evolução benigna da infecção
pelo HCV (LASARTE et al., 1998).
A defesa imunológica celular do hospedeiro, incluindo os linfócitos T CD4
+
e CD8
+
, está ati-
vada em pacientes com infecção pelo HCV (NAVEAU, 1999). A patogenia da hepatite pelo
HCV parece estar relacionada a esta resposta imune. A intensidade da resposta dos linfócitos
T na fase inicial da infecção pode ser crítica na evolução da doença. A resposta inicial à in-
fecção pelo HCV é uma defesa imune não-específica, produção de IFN alfa e beta, seguida
por ativação de macrófagos, atividades celulares citotóxicas, tais como das células NK e NKT
(Linfócitos T natural killer), com produção de INF-gama, fase esta que, em conjunto com a
participação de linfócitos Treg CD4
+
CD25
HIGH
, parece ser crucial no desfecho da resposta
imune e, por esta razão, tem sido o objeto de vários estudos. Subseqüentemente, a resposta
imune específica (adaptativa) consiste de uma resposta de LTa, de caráter mais bem definido.
34
Os LTa reconhecem antígenos virais ligados a moléculas de MHC da classe II na superfície
das células apresentadoras de antígeno (APC) e diferenciam-se em dois subtipos, LTa1 e
LTa2. Linfócitos Ta1, por sua vez, são responsáveis pela indução de citotóxicos CD8
+
especí-
ficos, enquanto linfócitos Ta2 induzem a proliferação de linfócitos B específicos e a produção
de anticorpos anti-HCV (PAPATHEODORIDIS, 1999).
O papel da resposta imune humoral na evolução da infecção crônica pelo HCV não está cla-
ramente definido (FREEMANN et al., 2001). De acordo com BASSETT et al. (1999), o cla-
reamento da infecção pelo HCV pode ocorrer na ausência do desenvolvimento de quaisquer
anticorpos contra proteínas do envelope. Em conformidade com este estudo, realizado em
chipanzés, a presença de anticorpos parece não se correlacionar com proteção. No entanto, o
emprego recente de culturas de tecido hepático possibilitou a identificação de anticorpos que
bloqueiam a entrada do HCV nos hepatócitos, através da neutralização da endocitose do vírus
in vitro (LOGVINOFF et al., 2004).
Como observado, o papel da imunidade adquirida no curso da evolução da infecção pelo vírus
C é objeto da abordagem de diversos estudos, sendo, neste aspecto, mais bem elucidado. No
entanto, a natureza da imunidade protetora, incluindo o papel da resposta imune inata após
exposição ao HCV, permanece indefinida. Pouco é conhecido sobre o papel da imunidade
inata na hepatite C. Células NK E NKT podem ter papel significante na resposta imune em
relação a patógenos hepatotrópicos, tais como o HCV (FREEMANN et al., 2001). Em con-
traste com outras infecções por flavivírus e pelo próprio HBV, a maioria dos indivíduos adul-
tos com infecção primária pelo HCV desenvolve infecção persistente. Postula-se que outros
mecanismos de defesa imunológica, ainda não bem esclarecidos, possam estar envolvidos na
resposa imune à infecção pelo HCV. De acordo com ISAGULIANTS et al. (2003), o hospe-
deiro responde precocemente à replicação viral por meio da resposta imune inata através da
produção de citocinas pró-inflamatórias, ativação de células NK e NKT. A potência da res-
posta inata parece ser determinada por constantes genéticas predeterminadas e por variáveis
adquiridas. Numa abordagem atual, a pesquisa de células T reguladoras (BAECHER-ALLAN
et al., 2001; DIECKMANN et al., 2001; JONULEIT et al., 2001), de subpopulações de célu-
las NK com expressão diferencial das moléculas CD56 e CD16/FcyγRIII (ROBERTSON &
RITZ, 1990; GADDY et al., 1997; COOPER et al., 2001), de células NK T (GODFREY et
al., 2000; LOZA et al., 2002) e de monócitos pró-inflamatórios (BELGE et al., 2002) poderia
35
trazer informações importantes que contribuam para o entendimento da infecção crônica pelo
HCV. Para dar suporte a esta pesquisa, populações previamente descritas serão reavaliadas,
como as células T CD3
+
, células B e células NK (subpopulações); subpopulações de células T
(T CD4
+
e T CD8
+
), B (células B convencionais e células B1), bem como a ativação de sub-
populações de células T, através da detecção da molécula HLA-DR.
Associa-se à busca de um entendimento mais abrangente dos mecanismos de clareamento
viral, a recente descoberta de que o HCV apresenta um amplo tropismo celular. O HCV pode
ser encontrado não exclusivamente nos hepatócitos, mas, também, em células do sistema i-
mune (células B, monócitos, macrófagos, células dendríticas), epitélio e em áreas imunologi-
camente privilegiadas, como o sistema nervoso central (ISAGULIANTS, 2003).
Receptores para a fração cristalizável (Fc) das imunoglobulinas (Ig) são responsáveis pela
cooperação entre as fases celular e humoral do sistema imune (REVETCH et al., 1986). A
detecção de diferentes tipos de receptores, dependendo do estado de diferenciação e do tipo
celular em que se expressam, pode ser de grande importância na avaliação da resposta à in-
fecção crônica pelo HCV, uma vez que alterações em seu nível de expressão estão associadas
a enfermidades imunomoduladas. Como exposto anteriormente, a hepatite C pode se apresen-
tar clinicamente através de manifestações extra-hepáticas de natureza auto-imune. (GUMBER
et al., 1995; CACOUB et al., 1999). A distribuição seletiva desses receptores e sua diversida-
de permite mediar diferentes respostas que vão desde funções efetoras como a fagocitose,
secreção de citocinas, citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) e desgranula-
ção de células, até sinais imunomoduladores como a regulação da proliferação e secreção de
anticorpos por linfócitos B (WALLACE et al., 1994). Presume-se que a análise da expressão
destes receptores em tipos celulares diversos possa contribuir para o esclarecimento da sua
implicância na patogenia da doença.
Em macrófagos, muitas funções acessórias e efetoras são mediadas através dos receptores
para fração cristalizável de Ig (FcRs). Constitutivamente expressos em monócitos humanos,
receptores FcγR de baixa e alta afinidade exercem funções efetoras, incluindo ADCC e fago-
citose. A subpopulação de monócitos que expressam FcγRIII (CD16) ganhou atenção consi-
derável uma vez que está aumentada em várias condições patológicas, especialmente infec-
ções. Os monócitos CD14
+
CD16
+
são considerados mais ativados e maduros, sendo denomi-
36
nados macrófagos-like. Estas células produzem constitutivamente citocinas pró-inflamatórias
e in vitro secretam pouco ou níveis indetectáveis de IL-10 após estimulação por LPS. Monóci-
tos CD16
+
, por sua vez, expressam elevados níveis de HLA-DR comparados com monócitos
CD16
-
(ZIEGLER et al., 1996; SKRZECYÑSKA et al., 2002) podendo assim ser distinguidos
em monócitos clássicos (CD14
++
CD16
-
HLA-DR
+
), e monócitos pró-inflamatórios
(CD14
+
CD16
+
HLA-DR
++
). A avaliação de secreção de citocinas demonstrou que a população
minoritária de monócitos pró-inflamatórios é a principal produtora de TNF-α no sangue
(BELGE et al., 2002). Baseado nestas informações, o presente estudo propõe avaliar a expres-
são de receptores para IgG, bem como quantificar a população de monócitos clássicos e proin-
flamatórios presentes no sangue periférico de pacientes cronicamente infectados pelo HCV.
O processo inflamatório na hepatite crônica C envolve inúmeros mecanismos imunológicos,
como a adesão de linfócitos ao endotélio vascular hepático, o extravasamento celular ou dia-
pedese e a adesão celular aos hepatócitos (BANNER et al., 1997). Diversos estudos têm de-
monstrado que o processo de migração celular para um foco inflamatório envolve uma série
de interações celulares mediadas, em sua grande maioria, por moléculas de adesão, conheci-
das como selectinas ou adressinas, e pelos receptores de quimiocinas, substâncias quimiotáti-
cas importantes no recrutamento celular para o foco inflamatório. Estas duas categorias de
moléculas são importantes no direcionamento e no processo seletivo da migração celular para
os tecidos afetados pelo agente infeccioso (ABBAS e cols, 2000). Por conseguinte, busca-se
uma avaliação mais completa da resposta imune celular, abrangendo o estudo da expressão
diferencial de receptores de quimiocinas em populações celulares (células CD4
+
e CD8
+
) do
sangue periférico com potencial de migração para o foco inflamatório no compartimento he-
pático.
Espera-se que esta análise ampla dos componentes do sistema imune, no contexto da infecção
pelo HCV, identifique aspectos relevantes e elucidativos para uma melhor compreensão da
patogenia da doença, visando-se uma abordagem pontual e global desses complexos meca-
nismos imunológicos.
37
2.5. A HEPATITE C NO CONTEXTO DA INSUFICIÊNCIA RENAL CRÔ-
NICA:
Os pacientes com infecção crônica pelo HCV e portadores de doença renal crônica avançada,
em hemodiálise, representam um grupo particular de pacientes cujo interesse em um melhor
entendimento da patogenia da doença é colocado como uma das prioridades no desenvolvi-
mento de protocolos para estudos (NIH CONSENSUS DEVELOPMENT CONFERENCE,
AASLD, 2002).
Os pacientes portadores de IRC apresentam, em geral, perda progressiva e irreversível da fun-
ção renal de filtração glomerular e alterações na produção e excreção de hormônios renais. A
deficiência da filtração glomerular leva à uremia, um quadro complexo de sinais e sintomas
secundário às anormalidades fisiológicas e bioquímicas, como o acúmulo de uréia e creatinina
no organismo. Juntamente com outras toxinas urêmicas, como as proteínas e os hormônios,
esse quadro pode resultar em diminuição dos mecanismos imunes de defesa humoral e celular
(MEYERS et al, 2003).
A produção de eritropoietina, importante hormônio estimulador da produção de hemácias
pelos rins, está diminuída na insuficiência renal. Como conseqüência, surge a anemia, uma
das complicações de maior impacto na qualidade de vida dos pacientes com insuficiência re-
nal, atingindo cerca de 90% dos pacientes. O tratamento, à base de eritropoietina recombinan-
te humana, não é eficaz em todos os casos. Por esta razão, os pacientes com IRC são freqüen-
temente submetidos a transfusões de sangue, aumentando significativamente o risco de aqui-
sição dos vírus hepatotrópicos - HCV, HBV e HDV (vírus da hepatite delta), dentre outros - e
do HIV (HERRINE, 1999). Os pacientes submetidos à hemodiálise apresentam alto risco de
adquirir o vírus C em razão das múltiplas transfusões de sangue, do tempo prolongado a que
são submetidos ao procedimento e ao transplante renal (POORDAD et al., 2004).
A infecção crônica pelo HCV entre os pacientes portadores de IRC pode resultar em significa-
tiva morbidade e mortalidade. A insuficiência hepática secundária à hepatite crônica pelo
HCV é uma das principais causas de morte em transplantados renais. Além disso, tem-se des-
crito que a infecção pelo HCV pode resultar em glomerulonefrite e síndrome nefrótica (CA-
RITHERS, 1999).
38
Embora a história natural da infecção pelo HCV nesta população não seja bem conhecida,
estima-se que 50 a 65% dos pacientes positivos apresentam níveis normais de ALT. Entretan-
to, a disfunção hepática atribuída ao vírus C pode levar à morte 8 a 28% dos pacientes trans-
plantados renais. Por esta razão, os esforços mundiais têm se concentrado no estabelecimento
de protocolos e normas de controle da infecção e abordagem terapêutica da hepatite aguda e
crônica neste grupo de pacientes (NAKAYAMA et al, 2000).
Os estudos recentes têm enfatizado a significativa morbidade e mortalidade atribuídas à infec-
ção pelo HCV em pacientes transplantados renais e em uso de imunossupressores. Por esta
razão, esforços internacionais estão sendo concentrados no estabelecimento de critérios, indi-
cações e contra-indicações ao transplante de órgãos em portadores crônicos do HCV, na alo-
cação de órgãos de doadores positivos ou negativos para o vírus C para recipientes positivos
ou negativos para este vírus, na adequação do uso de imunossupressores para os pacientes
portadores de hepatite C crônica e, por fim, nas conseqüências do transplante renal na evolu-
ção da hepatite C crônica. Estes fatos exemplificam a complexidade da abordagem destes
pacientes (POORDAD et al., 2004).
Conjectura-se que a resposta imune à infecção pelo HCV possa apresentar particularidades
intrínsecas neste subgrupo de portadores renais crônicos, reflexão esta que motiva e justifica a
inclusão deste grupo distinto no presente estudo. A imunopatogenia, com referência ao perfil
da resposta imune, carece de maior elucidação. Enquanto estudos mais recentes demonstram
que a resposta imune celular está relativamente preservada na IRC, parece haver uma defici-
ência da resposta imune humoral na doença renal avançada, visto que já foi demonstrado que
a sorologia pelo ELISA anti-HCV pode não ser confiável em pacientes em diálise. (MEYERS
et al, 2003). Um estudo multicêntrico, realizado na Alemanha, envolvendo 43 unidades de
hemodiálise, demonstrou que 21,6% dos pacientes virêmicos, detectados por PCR (Reação de
Polimerização em Cadeia), apresentaram a pesquisa de anticorpos anti-HCV negativa pelo
ELISA de 3ª geração (HINRICHSEN et al., 2002). Em outro estudo, desenvolvido em Porto
Alegre-RS, esse mesmo achado foi observado em 2,3% dos renais crônicos. (DOTTA et al.,
2003). Postula-se que o estudo da expressão de receptores de Ig na interface da resposta imu-
ne celular e humoral bem como, de subpopulações de linfócitos B, possa identificar alguma
alteração na resposta imune que potencialmente auxilie na explicação dessas evidências.
39
2.6. CONSIDERAÇÕES FINAIS:
Ignorado por muitos anos, o fígado, atualmente, é reconhecido como um órgão de atividade
imune complexa, que tem um papel crucial em algumas das mais importantes patologias ex-
perimentadas pelo ser humano, abrangendo septicemia, doença metastática e, não obstante,
infecções hepatotrópicas. Mesmo em seu estado sadio, o fígado está constantemente envolvi-
do em uma rede de intricados desafios imunológicos para os quais está surpreendentemente
bem equipado, incluindo uma ampla carga de antígenos provenientes da dieta e microorga-
nismos comensais que devem ser imunotolerados, ao lado de patógenos, toxinas, células tu-
morais para as quais tem de desempenhar rápida e efetiva resposta (BOWEN et al., 2005). Os
componentes locais, celulares e moleculares, da imunidade inata e adaptativa combinam com
elementos do sistema imune circulante para prover o fígado com o seu particular e poderoso
sistema imune regional. O órgão é dominado pelos componentes da resposta imune inata que
rapidamente respondem a agentes infecciosos externos e a células infectadas e com mutações
(DOHERTY & FARRELLY, 2000).
De forma peculiar, o fígado possui atuação preponderante na regulação da inflamação sistê-
mica, bem como da resposta imune local, sendo ponte na interação entre patógeno e hospedei-
ro. (VIERLING et al., 2005) O desequilíbrio da resposta imunológica parece ser fator decisi-
vo na evolução da infecção e nas conseqüências estruturais resultantes da injúria experimen-
tada.
Concluindo, conforme as prioridades para futuras pesquisas definidas pela conferência da
AASLD 2005 (VIERLING et al., 2005), há necessidade de implementar estudos cujos objeti-
vos estejam voltados para um maior entendimento da patogenia da infecção pelo HCV, parti-
cularmente para uma melhor caracterização dos aspectos virológicos, imunológicos e outros
fatores ligados ao hospedeiro que determinam o curso e o desfecho da infecção pelo HCV.
Tais estudos poderiam, possivelmente, identificar os aspectos mais críticos em relação aos
determinantes do clareamento viral e os elementos necessários para o desenvolvimento de
imunidade. Um melhor entendimento destas correlações imunológicas poderia também favo-
recer o desenvolvimento de estratégias imunoterapêuticas e, não obstante, de uma vacina efi-
caz contra o HCV (FREEMANN et al., 2001). Por outro lado, a maior compreensão do papel
da resposta imune inata e o estudo de novas sub-populações celulares, como as células T re-
40
guladoras, as subpopulações de células NK e de monócitos circulantes, assim como o estudo
da resposta imune humoral, apresentam-se como uma abordagem recente que poderia esclare-
cer fenômenos intrínsecos da fase crônica da infecção, fornecendo subsídios que poderiam
explicar, em parte, alguns aspectos patogênicos ainda pouco esclarecidos da infecção crônica
pelo HCV.
41
3. CASUÍSTICA E MÉTODOS
3.1. TIPO DE ESTUDO:
Trata–se de um estudo descritivo, analítico, transversal, realizado entre janeiro de 2005 a
março de 2007, envolvendo a Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Belo Hori-
zonte, como instituição principal, e as instituições secundárias: Centro de Pesquisas René-
Rachou – FIOCRUZ, Fundação Hemominas - Hemocentro de Belo Horizonte e a Unidade de
Hemodiálise - Núcleo de Nefrologia de Belo Horizonte.
3.2. CASUÍSTICA:
3.2.1. Cálculo do tamanho amostral:
O cálculo do número (n) de pacientes estimado por grupo foi baseado em estudos previamente
realizados sobre imunofenotipagem e resposta imune em pacientes cronicamente infectados
pelo HCV (Caccicarelli et al,1996, Lechmann et al, 1996). Observa-se que, na literatura, os
estudos conduzidos, envolvendo imunologia e hepatite C crônica, apresentam n semelhante ou
ainda mais reduzido. A seleção de participantes que preenchem os critérios de inclusão e ex-
clusão e os custos provenientes deste tipo de metodologia aplicada são fatores limitantes a
serem considerados.
3.2.2. Descrição da casuística:
O estudo compreendeu quatro grupos de indivíduos, totalizando 70 participantes, incluídos
consecutivamente, de acordo com a seguinte distribuição:
1. Controle: 15 doadores voluntários de sangue, provenientes da Fundação Hemomi-
nas-Hemocentro Regional de Belo Horizonte (grupo = NI);
2. Controle: 19 portadores de IRC, sem infecção crônica pelo HCV, provenientes do
centro de hemodiálise-Núcleo de Nefrologia de Belo Horizonte, MG (grupo = IRC);
42
3. Pacientes: 20 portadores de
infecção crônica pelo HCV, com função renal normal,
provenientes do Ambulatório de Hepatites Virais do Instituto Alfa de Gastroentero-
logia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da UFMG (grupo =
HepC);
4.
Pacientes: 16 portadores de infecção crônica pelo HCV e de insuficiência renal crô-
nica em hemodiálise, provenientes do Ambulatório de Hepatites Virais do Instituto
Alfa de Gastroenterologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da
UFMG (grupo = HepC+IRC).
3.2.3. Critérios de inclusão e exclusão:
São critérios de inclusão comuns a todos os grupos: idade entre 18 e 65 anos (exceção ao gru-
po 1–NI = idade entre 18 e 60 anos), indivíduos de ambos os sexos.
São critérios de exclusão pertencentes a todos os grupos: ingesta etílica maior que 20 g/dia e
não concordância em participar do estudo.
A - Participantes do grupo 1 (NI):
São doadores aptos, sob os seguintes critérios:
Critérios de inclusão:
- sorologia negativa para HCV (ELISA 3ª Geração), HBV, HIV, HTLV I/II, sífilis e chagas;
Critérios de exclusão:
- critérios comuns a todos os grupos, acima descritos.
B - Participantes do grupo 2 (IRC):
São portadores de insuficiência renal crônica terminal em terapia renal substitutiva (hemodiá-
lise), sob os seguintes critérios:
Critérios de inclusão:
- presença de alanino aminotransferase normal (ALT);
- sorologia negativa para o HCV (anti-HCV ELISA 3ª geração);
- HCV-RNA qualitativo por PCR negativo;
43
Critérios de exclusão:
- portadores de hepatite B (HBsAg positivo e/ou anti-HBc IgM e/ou IgG positivos), HIV posi-
tivo, gestação, portadores de doenças auto-imunes, uso de imunossupressores, transplantados;
C - Participantes do grupo 3 (Hep C):
São portadores de hepatite C crônica, virgens de tratamento, atendidos no Ambulatório de
Hepatites do Instituto Alfa de Gastroenterologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de
Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais, seguindo os critérios relacionados:
Critérios de inclusão:
- infecção crônica pelo HCV confirmada por sorologia (ELISA 3ª geração) positiva e detec-
ção do HCV-RNA por PCR qualitativo no sangue periférico.
Critérios de exclusão:
- Cirrose hepática descompensada, doença hepática auto-imune (Anti-músculo liso e/ou anti-
LKM1e/ou anti-mitocôndria e/ou anticorpo anti-núcleo positivos), hepatite B (HBsAg e/ou
anti-HBc IgM e/ou IgG positivos), HIV positivo, insuficiência renal, gestação, doenças auto-
imunes, uso de imunossupressores, transplantados;
D - Participantes do grupo 4 (HepC+IRC):
São portadores de insuficiência renal crônica terminal em hemodiálise e hepatite C crônica
associada, virgens de tratamento, atendidos no Ambulatório de Hepatites do Instituto Alfa do
Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais,
sob os seguintes critérios:
Critérios de inclusão:
- infecção crônica pelo HCV confirmada por sorologia (ELISA 3ª geração) positiva e detec-
ção do HCV-RNA por PCR qualitativo no sangue periférico;
- insuficiência renal crônica avançada, sob terapia substitutiva renal (hemodiálise).
Critérios de exclusão:
- pacientes com cirrose hepática descompensada, portadores de doença hepática auto-imune
(anti-músculo liso e/ou anti-LKM1e/ou anti-mitocôndria e/ou anticorpo anti-núcleo positi-
vos), portadores de hepatite B (HbsAg e/ou anti-HBc IgM e/ou IgG positivos), HIV positivo,
gestação, doenças auto-imunes, uso de imunossupressores; transplantados.
44
3.2.4. Caracterização da Casuística:
Abordou-se o perfil epidemiológico da amostra, registrando-se os dados relevantes para cada
grupo. Com exceção das variáveis idade e sexo (comuns a todos os grupos), de forma especí-
fica, foram considerados os seguintes dados epidemiológicos:
• Nos grupos com IRC (IRC e HepC+IRC): tempo de diagnóstico da IRC, causa da
IRC, tempo de hemodiálise, número de transfusões sangüíneas e data aproximada do
início das transfusões;
• Nos grupos com infecção crônica pelo HCV (HepC e HepC+IRC): fatores de risco pa-
ra hepatite C (epidemiologia provável), tempo provável de infecção (epidemiológico)
e do diagnóstico da doença.
Adicionalmente, nos grupos com infecção crônica pelo HCV (HepC e HepC+IRC), foram
avaliados os dados laboratoriais (bioquímicos, sorológicos, biologia molecular) e histológicos
pertinentes, conforme descrito em métodos.
3.2.4.1. Características referentes a todos os grupos:
A amostra, envolvida no protocolo de pesquisa, compreendeu um total de 70 indivíduos, cujos
dados epidemiológicos, idade e sexo, estão sumarizados na TAB.1. No grupo NI, constituído
por 15 doadores, 8 (56,3%) eram do sexo masculino e 7 (43,7%) eram do sexo feminino. A
idade variou entre 19 e 50 anos, com média de 31,4 anos. Em relação ao grupo IRC, dos 19
controles incluídos, 10 (52,6%) e 9 (47,4%) eram homens e mulheres, respectivamente. A
idade média foi 50,3 anos e a amplitude variou entre 36 e 62 anos. O grupo HepC foi constitu-
ído por 11 (55,0%) pacientes do sexo masculino e 9 (45,0%) do sexo feminino, sendo a idade
média de 52,9 anos, com valor mínimo de 33 anos e máximo de 65 anos e, no grupo
HepC+IRC foram incluídos 16 pacientes, sendo 10 (62,5%) homens e 6 (37,5%) mulheres. A
idade média foi de 41,4 anos, com variação entre 24 e 63 anos. A idade média, apenas do gru-
po NI, foi estatisticamente menor (p>0,05).
45
A variável raça (cor da pele) não foi considerada pela dificuldade de caracterização e pouca
relevância neste estudo. Ressalta-se que a ingesta etílica abusiva, conforme descrito previa-
mente, compreende um dos critérios de exclusão do estudo.
Tabela 1 - Dados epidemiológicos referentes aos grupos em estudo
Grupos
n
Sexo
Idade
#
Mediana Variação
M
n (%)
F
n (%)
NI 15 08 (56,3) 07 (43,7) 31,4 (19-50)*
IRC 19 10 (52,6) 09 (47,4) 50,3 (36-62)
HepC 20 11 (55,0) 09 (45,0) 52,9 (33-65)
HepC+IRC 16 10 (62,5) 06 (37,5) 41,4 (24-63)
NI = controle-doadores de sangue; IRC = controle-insuficiência renal crônica; HepC = hepatite C
crônica; HepC+IRC = hepatite C crônica+insuficiência renal crônica; M=masculino; F=feminino;
#
mediana e variação (em anos); * p< 0,05 – ANOVA.
3.2.4.2. Características relativas aos grupos com insuficiência renal:
Os dois grupos constituídos por portadores de IRC em hemodiálise estão desta forma configu-
rados quanto à etiologia da doença renal crônica (TAB.2):
Tabela 2 - Etiologia da doença de base nos grupos com insuficiência renal crônica
Doença de Base
Grupo IRC
1
Grupo HepC+IRC
2
n %
n %
Hipertensão arterial
14 73,7
8 50,0
Doença renal policística
3 15,7
3 18,7
Pielonefrite crônica
1 5,3
4 25,0
Hipertensão arterial e diabete melito
1 5,3
1 6,3
Total
19 100
16 100
1
Insuficiência renal crônica
;
2
Hepatite C crônica e
Insuficiência renal crônica
A TAB.3 descreve os dados sobre o período de tempo da evolução da IRC, a partir do diag-
nóstico, e do tempo de permanência em hemodiálise até a data da inclusão no estudo. Relata,
46
também, o tempo de início das hemotransfusões, a partir da primeira, e o número prévio, a-
proximado, de transfusões sanguíneas.
Tabela 3 - Dados epidemiológicos dos grupos com insuficiência renal crônica
Grupos
n
Tempo
#
diagnóstico
da IRC
+
Tempo
#
em
hemodiálise
Tempo
#
início
transfusões
Número de
tranfusões
Prévias
§
IRC 19 4,0* 4,0* 3,0* 2
HepC+IRC 16 14,0 11,5 10,0 5
IRC = controle-insuficiência renal crônica; HepC+IRC = hepatite C crônica+insuficiência renal crônica;
#
mediana e variação (em anos);
+
insuficiência renal crônica;
§
média; *p < 0,05 – Mann-Whitney
3.2.4.3. Características particulares dos grupos com hepatite C crônica:
Em relação aos grupos que envolvem portadores da infecção pelo HCV, HepC e HepC+IRC,
estão descritos, a seguir, os principais dados epidemiológicos, laboratoriais e histológicos. A
TAB.4 apresenta a epidemiologia provável, demonstrando os principais fatores de risco para
aquisição da infecção pelo VHC.
Tabela 4 - Epidemiologia provável da infecção pelo vírus da hepatite C
Epidemiologia
Grupo HepC
1
n %
Grupo HepC+IRC
2
n %
Transfusão sanguínea 4 20,0 9 56,3
Uso de drogas 6 30,0 0 0
Acidente biológico 1 5,0 0 0
Sexual 1 5,0 0 0
Cirurgia de grande porte 2 10,0 0 0
Desconhecida 2 10,0 0 0
Cirurgia e transfusão 3 15,0 4 25,0
Nosocomial 1 5,0 3 18,7
Total 20 100,0 16 100,0
1
Insuficiência renal crônica
;
2
Hepatite C crônica e
Insuficiência renal crônica
O grupo HepC apresenta um tempo médio de diagnóstico da hepatite C crônica de 3,9 anos
(variação entre 1 a 12 anos), sendo o tempo médio provável de infecção, com base nos dados
47
epidemiológicos, de 23,7 anos (1 a 40 anos). O grupo HepC+IRC apresenta um tempo médio
de diagnóstico da hepatite C crônica de 5,1 anos (variando entre 1 a 13 anos), com tempo mé-
dio de infecção, a partir da epidemiologia provável, de 13 anos (1 a 40 anos). (TAB.5)
Considerando os dados laboratoriais, o perfil da ALT, em ambos os grupos, foi analisado de
forma quantitativa (contínua) (FIG.5) e de forma categorizada (ordinal) (FIG.6), descrita na
forma de número de vezes o limite superior da normalidade (LSN).
Hep C HepC+IRC
0
50
100
150
Grupos
ALT (mg/dl)
Figura 5 - Variação dos níveis da ALT nos grupos com infecção crônica pelo vírus
da hepatite C
Variação dos níveis da ALT nos grupos com infecção crônica pelo vírus da hepatite
C crônica + insuficiência renal crônica; Teste de
Mann-Whitney - p=0,000.
25
60
15
75
25
0
10
20
30
40
50
60
70
80
% PACIENTES
HepC HepC+IRC
ALT normal
ALT 2-3X LSN
ALT 4-5X LSN
Figura 6 - Perfil da distribuição dos níveis da ALT nos grupos com infecção crônica
pelo vírus da hepatite C.
Hep C = hepatite C crônica; HepC+IRC = hepatite C crônica + insuficiência renal
crônica; ALT= alanino aminotransferase; LSN = Limite Superior da Normalidade.
48
No grupo HepC foi encontrado um valor médio da ALT de 73,5 + 33,4 mg/dL (variação entre
17,0 a 132,0 mg/dl), sendo que em 15 (75%) dos pacientes o nível da ALT se encontrava aci-
ma de 2 vezes o LSN. O grupo HepC+IRC apresentou um nível médio da ALT de 38,3 + 21,1
mg/dL (variação entre 17,0 a 77,0 mg/dl), sendo que em 12 (75%) dos pacientes o nível da
ALT estava normal (p=0,000). (TAB.5) (FIG.6)
Tabela 5 - Dados epidemiológicos, laboratoriais e de biologia molecular dos grupos com hepatite C crônica
Grupos
n
Tempo
#
infecção (anos)
ALT
#
+
Carga
Viral
# §
Genótipo n
(%)
1 2 3
HepC
1
20 26,5 (1-40) 76,0 (17-132) 461,7 (49-880)
13 1 3
HepC+IRC
2
16 10,0 (1-40)* 30,5 (17-77)* 182,5 (23-490)*
6 2 2
#
mediana e variação;
+
ALT= alanino aminotransferase (mg/dl);
§
x 1000;
1
Hepatite C crônica;
2
Insuficiência
renal crônica e Hepatite C crônica. A carga viral e genótipo: no grupo HepC–n=17 e no grupoHepC+IRC–n=10;
*p< 0,05 – Mann-Whitney
Quanto aos dados de biologia molecular, a quantificação da carga viral revelou mediana de
461722 UI/ml (variação de 49300 a 882000 UI/ml) avaliada em um total de15 pacientes do
grupo HepC e mediana de 182514 UI/ml (variação de 23000 a 490722 UI/ml) em um total de
10 pacientes do grupo HepC+IRC (p<0,05 - Mann-Whitney) (TAB. 5) (FIG.7). Na TAB.6
encontra-se a distribuição dos genótipos verificados em cada grupo.
Tabela 6 - Distribuição dos genótipos do vírus da hepatite C por grupo
Genótipo
Grupo HepC
1
n %
Grupo HepC+IRC
2
n %
1
13 76,5 6 70,4
2
1 5,9 2 11,1
3
3 17,6 2 18,5
Total
17 100,0 10 100,0
1
Insuficiência renal crônica
;
2
Hepatite C crônica e
Insuficiência renal crônica
49
HepC+ IRCHepC
1000000
500000
0
Grupos
Figura 7 - Quantificação da carga viral do vírus da hepatite C por Reação em Ca-
deia da Polimerase.
HepC = hepatite C crônica; HepC+IRC = hepatite C crônica+insuficiência re-
nal crônica;
Teste de
Mann-Whitney – p=0,011.
Em relação à histologia hepática, de acordo com o escore METAVIR (BEDOSSA, P., POY-
NARD T, 1996), os dados estão apresentados na TAB.7. Observou-se que não houve diferen-
ça estatisticamente significante entre os grupos com referência ao grau de atividade histológi-
ca e estágio de fibrose (p=0,298 e p=0,127, respectivamente–Qui-quadrado). No entanto, en-
quanto o valor médio do grau de atividade histológica foi de 1 em ambos os grupos, os paci-
entes do grupo HepC apresentaram um valor médio de fibrose de 3, comparado ao valor de 1
no grupo HepC+IRC.
50
Tabela 7 - Achados à histologia hepática nos grupos com hepatite C crônica
Histologia
#
Grupo HepC
1
n %
Grupo HepC+IRC
2
n %
Grau de atividade
0
0 0 1 8,3
1
12 60,0 8 66,7
2
6 30,0 2 16,7
3
2 10, 1 8,3
Total
20 100,0 12 100,0
Estágio de fibrose
0
3 15,0 3 25,0
1
5 25,0 5 41,6
2
3 15,0 2 16,7
3
5 25,0 0 0
4
4 20,0 2 16,7
Total
20 100,0 12 100,0
1
Insuficiência renal crônica
;
2
Hepatite C crônica e
Insuficiência renal crônica;
#
Escore
META
VIR.
3.3. MÉTODOS:
3.3.1. Entrevista clínica, dados laboratoriais e histológicos:
Foi realizada entrevista clínica pelo pesquisador, diretamente, com cada um dos participantes
que concordaram com o estudo, previamente à coleta da amostra de sangue. Foram obtidos, a
partir desta entrevista, além da verificação do preenchimento dos critérios de inclusão e ex-
clusão, os dados demográficos e epidemiológicos, de acordo com o grupo de interesse e con-
forme detalhado anteriormente.
Os participantes que concordaram com o estudo, após esclarecimento e assinatura do termo de
consentimento, foram submetidos à entrevista clínica, seguida de exame físico e coleta de 5
mL de sangue total em veia periférica, em um tubo contendo EDTA como anticoagulante,
amostra a partir da qual o protocolo foi desenvolvido. A coleta de sangue do grupo NI foi
feita por venopunção única, em conjunto com a amostra destinada aos demais exames neces-
sários para o Hemominas. Para o grupo 2 - IRC - a coleta foi realizada imediatamente antes da
conexão do paciente à máquina e antes da heparinização do circuito. Em relação aos grupos 3
51
e 4, a coleta foi realizada após a consulta habitual do paciente no Ambulatório de Hepatites
Virais, por profissional treinado.
Foram obtidos, também, a partir do prontuário, nas instituições/ serviços de origem, os dados
laboratoriais (bioquímicos, sorológicos, biologia molecular) e histológicos pertinentes. Em
relação, especificamente, aos grupos HepC e HepC+IRC, ressalva-se que foram pesquisados
os seguintes dados de Biologia Molecular: PCR-RNA qualitativo (AMPLICOR
®
, Roche Mo-
lecular Systems, limite de detecção 50 UI/ml) e o PCR-RNA quantitativo (AMPLICOR
®
,
Roche Molecular Systems, limites de detecção 600 UI/ml a 850000 UI/ml,). A genotipagem
foi realizada para o HCV e a genotipagem realizada por seqüenciamento direto de um seg-
mento da região 5’ UTR, conforme previamente descrito (SIMMONDS, et al. 1993).
Todos os exames de biologia molecular de detecção, quantificação e genotipagem foram rea-
lizados no Núcleo de Pesquisa em Apoio Diagnóstico (NUPAD) da Faculdade de Medicina da
Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Esses dados foram coletados somente dos
pacientes que realizaram a pesquisa por motivo de protocolo para avaliação da indicação de
tratamento.
A avaliação histológica, quando realizada e por motivos inerentes ao acompanhamento do
paciente no ambulatório, foi baseada na classificação METAVIR (BEDOSSA, P., POY-
NARD T, 1996) e avaliada pelo Serviço de Patologia da Faculdade de Medicina da UFMG.
3.3.2. Imunofenotipagem dos leucócitos do sangue periférico:
Os ensaios de imunofenotipagem dos leucócitos do sangue periférico foram realizados segun-
do o protocolo proposto pelo fabricante, modificado por MARTINS-FILHO (2000), conforme
descrito a seguir:
Em tubos de poliestireno 22x75mm foram adicionados 10µl da diluição constituída pelo anti-
corpo monoclonal específico para o marcador de superfície celular de interesse marcado com
fluorocromo, diluído em PBS (0,015M pH 7,4), nas concentrações descritas (TAB.8). Para
cada análise foram utilizados 50µl de sangue periférico total coletado a vácuo em tubos de
52
5ml contendo EDTA como anticoagulante. Após a etapa de homogeneização em vórtex, as
amostras foram incubadas por 30 minutos, à temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Após o
período de incubação, as amostras foram submetidas à etapa de lise dos eritrócitos, utilizando
2ml de solução de lise comercial (FACS
TM
Lysing Solution - Becton Dickinson) diluída 10
vezes em água destilada. Após homogeneização em vórtex, as amostras foram incubadas, no-
vamente, por 10 minutos à temperatura ambiente e, então, submetidas à centrifugação (7 min-
1300 rpm- 18º C). O sobrenadante foi descartado por inversão e as amostras foram lavadas
com 2ml de PBS (0,015M pH 7,4), empregando-se as mesmas condições de centrifugação
supracitadas. Em seguida, foram adicionados 200µl da solução de PBS (0,015M pH 7,4) em
cada tubo, sendo, imediatamente, realizada a leitura dos parâmetros fenotípicos das células
presentes em cada tubo por imunofluorescência, com o auxílio de um citômetro de fluxo
(FACScan - Becton Dickinson), utilizando-se o programa CELLQuest
TM
para aquisição e
análise dos dados, empregando diferentes estratégias de análises, conforme descrito nos pró-
ximos itens.
O protocolo para a marcação dos receptores de quimiocinas foi desenvolvido de forma seme-
lhante, exceção ao tubo contendo o anticorpo anti-CCR2. Este anticorpo foi incubado por 30
minutos, ao abrigo da luz, com uma amostra de 50µl de sangue periférico. Após, foi acrescen-
tado 2ml de PBS (0,015M pH 7,4), sendo as amostras submetidas à centrifugação nas mesmas
condições anteriormente descritas. A seguir, foi aspirado o sobrenadante, acrescentado ao
tubo AVIDINA, diluída em uma concentração de 1:100 com PBS e, novamente, as amostras
foram reincubadas por 30 minutos. Consecutivamente, o protocolo foi seguido, a partir da
etapa de lise dos eritrócitos.
53
Tabela 8 - Anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos utilizados para análise de populações e
subpopulações celulares e moléculas de supercície
Anticorpos
Diluição em
PBS*
Fluorocromo
Clone
Células Alvo
Anti-IgG
1:2 FITC
1
G1CL -
Anti-CD3 1:2 FITC
2
UCHT1 Linfócitos T
Anti-CD4 1:5, 1:5 FITC
2
, PE
3
RPA-T4,S3.5 Linfócitos T
Anti-CD5 1:2 FITC
3
L17F12 Linfócitos B1
Anti-CD8 1:2, 1:70 FITC
2
, TC
3
RPA-T8, 3B5 Linfócitos T
Anti-CD14
1:9 TC
4
TüK4 Monócitos
Anti-CD16 1:4 TC
3
3G8 Células NK, Monócitos
Anti-CD19 1:2, 1:5 FITC
2
, PE
3
4G7, SJ25-C1 Linfócitos B
Anti-CD23 1:2 PE
2
M-L233 Linfócitos B
Anti-CD25 1:2 PE
3
3G10 Linfócitos T
Anti-CD32 1:2 FITC
2
FLI8.26 Linfócitos B e Monócitos
Anti-CD56 1:2 PE
2
B159 Células NK
Anti-CD64 1:5 FITC
2
10.1 Monócitos
Anti-HLA-DR
1:2 PE
4
Tü36
Linfócitos T e B, Monó-
citos
Anti-CCR2
#
1:5 FITC
5
48607
Linfócitos T, Eosinófilos
e Monócitos
Anti-CCR3
1:5 FITC
5
61828.111
Linfócitos T, Eosinófilos,
Monócitos e Celulas NK
Anti-CCR5
1:5 FITC
5
45531
Linfócitos T, Eosinófilos,
Monócitos e Células NK
Anti-CXCR3
1:5 FITC
5
49801
Linfócito T
Ativado
Anti-CXCR4 1:5 FITC
5
1265 Linfócitos T
*(0,015M pH 7,4); Fabricante:
1
Sigma;
2
BD Pharmigen;
3
Caltag;
4
Serotec;
5
R&D Systems;
# Uso de Avidina (Biotina), FITC, diluição de 1:100, como adjuvavante para CCR2
Para cumprir os objetivos específicos propostos, anteriormente descritos, foram traçados os
seguintes tópicos de investigação, visando a ordenação da metodologia de pesquisa:
A) Caracterização da freqüência de populações e subpopulações de leucócitos do sangue peri-
férico envolvidos na resposta imune inata e adaptativa:
54
A.1. Imunidade inata:
A.1.1. Freqüência da população e subpopulações de monócitos:
- monócitos totais, monócitos macrófago-like e monócitos pró-inflamatórios.
A.1.2. Populações e subpopulações de células Natural Killer (NK):
- NK total, pré-NK, NK madura e NK ativada
- NKT total, NKT1, NKT2 e NKT3
- subpopulações de células CD3
-
CD16
-
e células CD3
-
CD16
+
A.2. Imunidade adaptativa:
A.2.1. Populações de linfócitos:
- linfócitos T, linfócitos B e razão T/B
A.2.2. Subpopulações de linfócitos T:
- CD4
+
, CD8
+
e razão CD4
+
/ CD8
+
A.2.3. Subpopulações de linfócitos B
- linfócitos B convencionais e linfócitos B1
B) Análise da expressão de marcadores de ativação em leucócitos do sangue periférico:
B.1. Imunidade inata:
- Expressão de CD23 em neutrófilos, eosinófilos e monócitos
- Expressão de HLA-DR em neutrófilos e eosinófilos
B.2. Imunidade adaptativa:
- Expressão de HLA-DR em Linfócitos T CD4
+
e CD8
+
- Expressão de HLA-DR em Linfócitos B
- Expressão de CD23 em Linfócitos B
C) Análise da expressão de marcadores de regulação da resposta imune em leucócitos:
C.1. Receptores de Imunoglobulina em células da imunidade inata:
- CD64 (FcγRI) em monócitos, neutrófilos e eosinófilos
- CD32 (FcγRII) em monócitos, neutrófilos e eosinófilos
- CD16 (FcγRIII) em monócitos e neutrófilos
C.2. Freqüência de células T reguladoras (CD4
+
CD25
+
):
- linfócitos CD4
+
CD25
HIGH
C.3.Expressão de CD32 por Linfócitos B:
55
- CD32 (FcγRII) em células CD19
+
D) Estudo da expressão de receptores de quimiocinas por monócitos e linfócitos T:
D. Receptores de quimiocinas em monócitos e linfócitos T:
- Receptores de quimiocinas do Tipo 0 (CCR2, CXCR4)
- Receptores de quimiocinas do Tipo 1 (CXCR3, CCR5)
- Receptores de quimiocinas do Tipo 2 (CCR3)
E) Avaliação das correlações entre os parâmetros fenotípicos de leucócitos do sangue perifé-
rico com variáveis demográficas, laboratoriais e histológicas de pacientes portadores de hepa-
tite C crônica com e sem insuficiência renal crônica associada:
E. Correlações entre as variáveis em estudo e os parâmetros fenotípicos:
- Dados demográficos, bioquímicos, biologia molecular e histológicos.
3.3.3. Aquisição dos Dados e Análise Estatística:
Os dados obtidos através da imunofenotipagem dos leucócitos do sangue periférico foram
analisados através de diversas estratégias, dependendo do fenótipo celular rastreado. Assim,
empregando-se os recursos múltiplos do programa CELLQuest
TM
, foram adotadas diferentes
estratégias para análise fenotípica, baseadas em propostas disponíveis na literatura vigente,
denominadas: análise convencional (SATHLER-AVELAR, 2003); análise de células T regu-
ladoras (BAECHER-ALLAN et al., 2001); análise do marcador CD56 em subpopulações de
células CD3-CD16+ (GADDY et al., 1997), análise de subpopulações de células CD3-CD56+
(COOPER et al., 2001); análise combinada “gated” (SATHLER-AVELAR, 2003); análise de
monócitos pró-inflamatórios (BELGE et al., 2002); análise semiquantitativa da expressão de
FcγR em monócitos (MARTINS-FILHO, 2000); análise semiquantitativa da expressão de
FcγRIII em neutrófilos (SILVA, 1999 modificado por MARTINS-FILHO, 2000) e análise da
expressão de receptores de quimiocinas (MARTINS, 2004).
Ressalta-se que esta análise foi feita em caráter cego, desconhecendo, o pesquisador, as carac-
terísticas do pacientes avaliado. Cada análise foi reavaliada por um segundo pesquisador (ori-
entador) e as discordâncias criticamente reavaliadas. Segue abaixo a descrição:
56
3.3.3.1. Análise convencional
A análise convencional foi realizada segundo proposto por SATHLER-AVELAR (2003). A
FIG.8 ilustra a seqüência de passos para a análise convencional. Este tipo de análise consiste
na seleção da população celular de interesse baseada em aspectos morfométricos, realizada
através de gráficos de distribuição puntual de tamanho (FSC) versus granulosidade (SSC)
(FIG.8A). Após a seleção da região de interesse (R1), o percentual de subpopulações celulares
fluorescentes, dentro da população selecionada, foi obtido em gráficos bidimensionais de dis-
tribuição puntual de fluorescência, incluindo as modalidades FL1 versus FL2, FL2 versus FL3
ou FL1 versus FL3 (FIG. 8B).
FL3/CD19
FL2/CD5
A B
Tamanho
Granulosidade
R1
82.38% 0.37%
2.57%14.69%
Figura 8 - Seqüência de procedimentos utilizados para as análises dos percentuais
de populações celulares por citometria de fluxo.
(A) Gráfico de distribuição puntual FSC versus SSC utilizado para a seleção da po-
pulação de interesse, nesse caso linfócitos pequenos – R1. (B) Gráfico de distribui-
ção puntual FL1 versus FL2 utilizado para quantificar o percentual das populações
ou subpopulações celulares específicas, confinadas em R1.
3.3.3.2. Análise de células T reguladoras:
A análise de células T reguladoras foi realizada segundo método proposto por BAECHER-
ALLAN et al. (2001). A FIG.9 ilustra a seqüência de procedimentos para a análise de células
T reguladoras com fenótipo CD4
+
CD25
HIGH
. Após a seleção da região de interesse (R1), ba-
seada em aspectos morfométricos, realizada através de gráficos de distribuição puntual de
tamanho (FSC)
versus
granulosidade (SSC) (FIG.9A), gráficos de FL1/CD4 versus
FL2/CD25 foram construídos, permitindo identificar a segregação da população CD4
+
em 3
subpopulações: CD4
+
CD25
-
(R2), CD4
+
CD25
LOW
(R3) e CD4
+
CD25
HIGH
(R4). A fração celu-
lar confinada em R4, representa o valor percentual de células T reguladoras na população de
linfócitos totais (FIG. 9B).
57
FL1/CD4
FL2/CD25
A B
Tamanho
Granulosidade
R1
1.98%
25.74%
23.37%
R2
R3
R4
Figura 9 - Seqüência de procedimentos utilizados para as análises dos percentuais
de células T reguladoras (CD4
+
CD25
HIGH
) por citometria de fluxo.
(A) Gráfico de distribuição puntual FSC versus SSC utilizado para a seleção da po-
pulação de interesse, nesse caso linfócitos pequenos – R1. (B) Gráfico de distribui-
ção puntual FL1/CD4 versus FL2/CD25 utilizado para quantificar o percentual de
células T reguladoras (CD4
+
CD25
HIGH
), confinadas em R4.
3.3.3.3. Análise do marcador CD56 em subpopulações de células CD3
-
CD16
+
:
A análise de subpopulações de células CD3
-
CD16
+
foi realizada segundo
proposto por
GADDY et al. (1997). A FIG.10 ilustra a seqüência de procedimentos para a análise das sub-
populações de células pré-NK (CD3
-
CD16
+
CD56
-
) e células NK maduras (CD3
-
CD16
+
CD56
+
). Após a seleção da região de interesse (R1), baseada em aspectos morfométri-
cos, realizada através de gráficos de distribuição puntual de tamanho (FSC) versus granulosi-
dade (SSC) (FIG.10A), foram construídos gráficos de FL1/CD3
versus
FL3/CD16, onde uma
nova região R2 foi delimitada, confinando a população CD3
-
CD16
+
(FIG. 10B). Posterior-
mente, gráficos de FL1/CD3 versus FL2/CD56 foram empregados, onde uma nova região
(R3) foi construída (FIG. 10C), confinando a população CD3
-
CD56
+
. Em seguida, após a
combinação das regiões R1, R2 e R3 através das fórmulas “G2=R2+R3 e G3=R1 and G2”
onde “+” representa o somatório de células confinadas nas regiões R1 e R2 e “and” designa a
intersecção dos eventos presentes simultaneamente em G2 e R1. Em seguida gráficos de
FL3/CD16
versus
FL2/CD56, contendo as células confinadas em G3 (FIG. 10D), foram utili-
zados para quantificar os percentuais das subpopulações CD3
-
CD16
+
CD56
-
e CD3
-
CD16
+
CD56
+
.
58
Figura 10 - Seqüência de procedimentos utilizados para as análises dos percentuais
das subpopulações de células NK.
Células pré-NK (CD3
-
CD16
+
CD56
-
) e NK madura (CD3
-
CD16
+
CD56
+
) por citome-
tria de fluxo. (A) Gráfico de distribuição puntual FSC versus SSC utilizado para a
seleção da população de interesse, nesse caso linfócitos pequenos – R1. (B) Gráfico
de distribuição puntual FL1/CD3 versus FL3/CD16 utilizado para selecionar a popu-
lação celular CD3
-
CD16
+
(R2). (C) Gráfico de distribuição puntual FL1/CD3 versus
FL2/CD56 utilizado para selecionar a população celular CD3
-
CD56
+
(R3). (D) Após
a combinação das regiões R1, R2 e R3 através das fórmulas “G2=R2 + R3 e G3= R1
and G2” um gráfico de FL3/CD16 versus FL2/CD56 contendo as células confinadas
em G3 foi utilizado para quantificar as subpopulações de células NK.
3.3.3.4. Análise de subpopulações de células CD3
-
CD56
+
:
A análise de células CD3
-
CD56
+
foi realizada segundo protocolo proposto por COOPER et al.
(2001). A FIG.11 ilustra a sequência de procedimentos para a análise de células CD3
-
CD56
DIM
CD16
-/+
e CD3
-
CD56
BRIGHT
CD16
-/+
. Após a seleção da região de interesse (R1), ba-
seada em aspectos morfométricos, realizada através de gráficos de distribuição puntual de
tamanho (FSC) versus granulosidade (SSC) (FIG.11A), foram construídos gráficos de
FL1/CD3 versus FL2/CD56, onde uma região (R2) selecionou a população CD3
-
CD56
+
(FIG.11B). O próximo passo consistiu na combinação das regiões R1 e R2 através da fórmula
“G2=R1 and R2”, onde “and” designa a interseção dos eventos presentes simultaneamente em
R1 e R2. Em seguida, gráficos de FL3/CD16
versus
FL2/CD56, contendo as células confina-
Tamanho
Granulosidade
FL1/CD3
FL3/CD16
FL3/CD16
FL2/CD56
A B
D
FL1/CD3
FL2/CD56
C
Tamanho
Granulosidade
Tamanho
Granulosidade
FL1/CD3
FL3/CD16
FL1/CD3
FL3/CD16
FL3/CD16
FL2/CD56
FL3/CD16
FL2/CD56
A B
D
FL1/CD3
FL2/CD56
C
FL1/CD3
FL2/CD56
C
59
das em G2, foram utilizados para quantificar os percentuais das subpopulações CD3
-
CD56
DIM
CD16
-/+
e CD3
-
CD56
BRIGHT
CD16
-/+
(FIG.11C).
FL1/CD3
FL2/CD56
A B
Tamanho
R1
Granulosidade
FL3/CD16
FL2/CD56
C
3.23% 3.88%
85.56%7.33%
CD3
-
CD56
BRIGHT
CD16
+
CD3
-
CD56
DIM
CD16
+
CD3
-
CD56
DIM
CD16
-
CD3
-
CD56
BRIGHT
CD16
-
Figura 11 - Seqüência de procedimentos utilizados para as análises dos percentuais
das subpopulações CD3
-
CD56
DIM
CD16
-/+
e CD3
-
CD56
BRIGHT
CD16
-/+
por citometria
de fluxo.
(A) Gráfico de distribuição puntual FSC versus SSC utilizado para a seleção da po-
pulação de interesse, nesse caso linfócitos pequenos – R1. (B) Gráfico de distribui-
ção puntual FL1/CD3 versus FL2/CD56 (R2) utilizado para selecionar a população
celular CD3
-
CD56
+
- R2. (C) Após a combinação das regiões R1 e R2, através da
fórmula “G2=R1 and R2”, um gráfico de FL3/CD16 versus FL2/CD56, contendo as
células confinadas em G2, foi empregado para quantificar o percentual das subpopu-
lações CD3
-
CD56
DIM
CD16
-/+
e CD3-CD56
BRIGHT
CD16
-/+
.
3.3.3.5. Análise combinada “gated”:
A análise de células CD4
+
e CD8
+
ativadas (HLA-DR
+
) foi realizada segundo proposto por
SATHLER-AVELAR (2003). A FIG.12 ilustra a seqüência de procedimentos para a análise
das subpopulações de células T ativadas. Após a seleção da região de interesse, baseada em
aspectos morfométricos, realizada através de gráficos de distribuição puntual de tamanho
(FSC) versus granulosidade (SSC) (FIG.12A), foram construídos histogramas individuais de
FL1/CD4 ou FL1/CD8, onde uma nova região R2 foi construída, confinando a população
60
CD4
+
ou CD8
+
(FIG.12B). O próximo passo consiste na combinação das regiões R1 e R2 a-
través da fórmula “G2=R1 and R2”, onde “and” designa a interseção dos eventos presentes
simultaneamente em R1 e R2. Em seguida, histogramas unidimensional de FL2/HLA-DR,
contendo as células presentes em G2, foram utilizados para quantificar os percentuais das
subpopulações CD4
+
HLA-DR
+
/CD4
+
ou CD8
+
HLA-DR
+
/CD8
+
(FIG.12C).
A
Tamanho
Granulosidade
R1
B
C
FL1/ CD4
Nº de células
FL2/ HLA-DR
Nº de células
11.78%
Figura 12 - Seqüência de passos utilizados para as análises de subpopulações de cé-
lulas T CD4
+
ou CD8
+
ativadas (HLA-DR
+
) por citometria de fluxo.
(A) Gráfico de distribuição puntual FSC versus SSC utilizado para a seleção da po-
pulação de interesse, nesse caso linfócitos pequenos – R1. (B) Histogramas indivi-
duais de FL1/CD4 ou FL1/CD8, onde uma nova região R2 será construída, confi-
nando a população CD4
+
ou CD8
+
. (C) Após a combinação das regiões R1 e R2 a-
través da fórmula “G2=R1 and R2”, onde “and” designa a interseção dos eventos
presentes simultaneamente em R1 e R2, histogramas unidimensional de FL2/HLA-
DR, contendo as células presentes em G2, foram utilizados para quantificar os per-
centuais das subpopulações CD4
+
HLA-DR
+
/CD4
+
ou CD8
+
HLA-DR
+
/CD8
+
.
3.3.3.6. Análise de monócitos pró-inflamatórios:
A análise de monócitos pró-inflamatórios (CD14
+
CD16
+
HLA-DR
++
) foi realizada segundo
proposto por BELGE et al. (2002). A FIG.13 ilustra a seqüência de procedimentos para a aná-
lise das subpopulações de monócitos pró-inflamatórios. Após a seleção da região de interesse
(R1), baseada em aspectos morfométricos e imunofenotípicos, realizada através de gráficos de
distribuição puntual de FL3/CD14 versus granulosidade (SSC) (FIG.13A), foram construídos
61
gráficos de FL3/CD14 versus FL1/CD16, onde uma região (R2) foi construída selecionando a
população CD14
+
CD16
+
(FIG.13B). O próximo passo consiste na combinação das regiões R1
e R2 através da fórmula “G2=R1 and R2”, onde “and” designa a interseção dos eventos pre-
sentes simultaneamente em R1 e R2. Em seguida, gráficos de FL3/CD14
versus
FL2/HLA-
DR, contendo as células confinadas em G2, foram utilizados para quantificar o percentual de
células CD14
+
CD16
+
HLA-DR
++
(FIG.13C).
FL3/CD14
Granulosidade
A
R1
FL1/CD3
FL2/HLA-DR
B C
FL3/CD14
FL1/CD16
72.0%
28.0%
R2
Figura 13 - Seqüência de procedimentos utilizados para as análises dos percentuais
de monócitos pro-inflamatórios (CD14
+
CD16
+
HLA-DR
++
) por citometria de fluxo.
(A) Gráfico de distribuição puntual FL3/CD14 versus granulosidade (SSC) utiliza-
do para a seleção da população de interesse, nesse caso células CD14
+
de granulosi-
dade intermediária, correspondente aos monócitos – R1. (B) Gráfico de distribuição
puntual FL3/CD14 versus FL1/CD16 (R2) utilizado para selecionar a população
CD14
+
CD16
+
– R2. (C) Após a combinação das regiões R1 e R2, através da fórmula
“G2=R1 and R2”, um gráfico de FL3/CD14 versus FL2/HLA-DR, contendo as cé-
lulas confinadas em G2, foi empregado para quantificar o percentual de monócitos
pró-inflamatórios.
62
3.3.3.7. Análise semiquantitativa da expressão de FcyR em monócitos:
A análise da expressão de Fc
γ
R (CD64, CD32 e CD16) na população de monócitos foi reali-
zada através de análise semiquantitativa por intensidade média de fluorescência, segundo pro-
posto por MARTINS-FILHO (2000). A FIG.14 ilustra a seqüência de procedimentos para a
análise da expressão de FcyR em monócitos. Após a seleção da região de interesse (R1), ba-
seada em aspectos morfométricos e imunofenotípicos, realizada através de gráficos de distri-
buição puntual de FL3/CD14 versus granulosidade (SSC) (FIG.14A), foram construídos his-
togramas de FL1/CD64, FL1/CD32 ou FL1/CD16 para a identificação da intensidade média
de fluorescência para cada FcyR analisado na população de monócitos (FIG.14B ).
A
B
FL3/CD14
FL1/CD16
R1
Nº de células
FL1/ CD32
101.16
Figura 14 - Seqüência de procedimentos utilizados para a análise da intensidade
média de fluorescência correspondente à expressão de receptores Fcγ na população
de monócitos por citometria de fluxo.
(A) Gráfico de distribuição puntual FL3/CD14 versus granulosidade (SSC) utilizado
para a seleção da população de interesse, nesse caso células CD14
+
de granulosidade
intermediária, correspondente aos monócitos – R1. (B) Histograma unidimensional
utilizado para quantificar a expressão dos FcγR em monócitos, através de alterações
na intensidade média de fluorescência da população de distribuição unimodal.
3.3.3.8. Análise semiquantitativa da expressão de Fcγ
γγ
γRIII em neutrófilos:
A análise da expressão de FcyRIII (CD16) na população de neutrófilos foi realizada através
de análise semiquantitativa por intensidade média de fluorescência, segundo proposto por
SILVA (1999) modificado por MARTINS-FILHO (2000). A FIG.15 ilustra a seqüência de
procedimentos para a análise da expressão de FcyRIII em neutrófilos. Após a seleção da regi-
ão de interesse (R1), baseada em aspectos morfométricos, realizada através de gráficos de
63
distribuição puntual de tamanho (FSC)
versus
granulosidade (SSC) (FIG.15A), foram cons-
truídos histogramas de FL1/CD16, contendo as células confinadas em R1, utilizados para a
identificação da intensidade média de fluorescência para o FcyRIII analisado na população de
neutrófilos (FIG.15B).
A B
Tamanho
Granulosidade
R1
Nº de células
FL1/ CD16
276,25
R1
Figura 15 - Seqüência de procedimentos utilizados para a análise da intensidade
média de fluorescência correspondente à expressão do receptor Fcγ (CD16) na popu-
lação de neutrófilos por citometria de fluxo.
(A) Gráfico de distribuição puntual tamanho versus granulosidade (SSC) utilizado
para a seleção da população de interesse, nesse neutrófilos – R1. (B) Histograma u-
nidimensional utilizado para quantificar a expressão do FcγRIII em neutrófilos, atra-
vés de alterações na intensidade média de fluorescência da população de distribuição
unimodal.
3.3.3.9. Análise da expressão de receptores de quimiocinas:
A análise da expressão de receptores de quimiocinas na população de monócitos e linfócitos
do sangue periférico foi realizada através de análise semiquantitativa por intensidade média
de fluorescência, segundo proposto por MARTINS (2004). A FIG.16 ilustra a seqüência de
procedimentos para a análise dos receptores de quimiocinas. Após a seleção da região de inte-
resse, baseada em aspectos morfométricos, obtidos através de gráficos de distribuição puntual
de tamanho (FSC)
versus
granulosidade (SSC) (FIG.16A), foram construídos gráficos de dis-
tribuição puntual de FL1 versus FL2, onde foi construída a região R2, delimitando a popula-
ção em estudo (FIG.16B). O próximo passo consistiu na construção de histogramas unidimen-
sionais de FL1 versus FL2 combinando as regiões R1 e R2 para quantificar a intensidade mé-
dia de fluorescência do receptor na população celular de interesse (FIG.16C).
64
granulosidade
tamanho
R1
A
granulosidade
tamanho
R1
A
FL2/CD4
FL1/CCR3
R2
B
FL2/CD4
FL1/CCR3
R2
B
FL2/CD4
FL1/CCR3
C
FL2/CD4
FL1/CCR3
C
Figura 16 - Seqüência de procedimentos utilizados para as análises da expressão de
receptores de quimiocinas por citometria de fluxo.
(A) Gráfico de distribuição puntual de tamanho (FSC) versus granulosidade (SSC)
utilizado para a seleção da população de interesse, nesse caso linfócitos pequenos –
R1. (B) Gráfico de distribuição puntual FL1/CCR3 versus FL2/CD4 (R2) utilizado
para selecionar a população de linfócitos expressando o receptor – R2. (C) Após a
combinação das regiões R1 e R2, através da fórmula “G2=R1 and R2”, foi constru-
ído um histograma unidimensional para quantificar a expressão do receptor, através
de alterações na intensidade média de fluorescência da população de distribuição u-
nimodal.
3.3.4. Análise Estatística:
Dados demográficos e bioquímicos foram analisados pelo programa
Minitab for Windows
utilizando-se os testes
Qui
-Quadrado,
t
de Student, exato de Fisher, ANOVA e Mann-
Whitney, de acordo com a variável em estudo, preenchimento dos critérios de normalidade e
o número de grupos comparados. As análises estatísticas dos dados provenientes da imunofe-
notipagem de leucócitos periféricos foram realizadas através do programa
GraphPad Softwa-
re – Prism 3.0
. Para comparação ente grupos foi empregado o teste não paramétrico Kruskal-
Wallis, seguido por pós-teste de Dunns. Para a realização de correlações foi empregada a
65
Corrrelação de Spearman. As diferenças foram consideradas estatisticamente significantes
quando o valor p <0.05.
3.4. ASPECTOS ÉTICOS:
O presente estudo foi submetido à aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa, respectiva-
mente, da Universidade Federal de Minas Gerais (COEP) e da Fundação Hemominas (CEP) –
Hemocentro Belo Horizonte. Foi aprovado também pelo Departamento de Ensino e Pesquisa
(DEPE) do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Minas Gerais. Foi obtido con-
sentimento pós-informação de todos os pacientes e doadores voluntários de sangue envolvidos
no estudo.
66
4. RESULTADOS
Subseqüentemente, estão apresentados os resultados obtidos através das diversas estratégias
de análise da imunofenotipagem dos leucócitos do sangue periférico, conforme descrito em
métodos. Optou-se pela ilustração através de gráficos, de acordo com fenótipo celular rastrea-
do, com a finalidade de se tornar objetiva e clara a exposição dos dados. Foi adotada a mesma
ordenação descrita em objetivos específicos e em métodos, buscando-se tornar mais didática a
exposição.
Em cada gráfico está demonstrado o resultado do teste estatístico em questão, destacando-se
as diferenças estatisticamente significantes em cada grupo. Para as análises de todas as com-
parações foi empregado o teste não paramétrico Kruskal-Wallis, seguido por pós-teste de
Dunns, visto que os dados analisados não preencheram as suposições exigidas para distribui-
ção normal.
4.1. RESULTADOS DA IMUNOFENOTIPAGEM POR CITOMETRIA DE
FLUXO:
4.1.1. Freqüência de populações e subpopulações celulares do sangue periférico
em cada grupo:
4.1.1.1. Imunidade inata:
A) Estudo da freqüência da população e subpopulações de monócitos:
O resultado do percentual de monócitos (CD14
+
) no sangue periférico, em cada grupo, está
representado na FIG.17. A análise dos resultados mostrou que o grupo HepC+IRC apresenta
valor percentual de monócitos (CD14
+
) circulantes significativamente maior em relação aos
grupos NI (p<0,001), HepC (p<0,01) e IRC (p<0,05).
67
0
10
20
d
d
d
a,b,c
NI IRC HepC
HepC
+IRC
0
10
20
% de células CD14
+
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
p=0,000*
Figura 17 - Percentual de monócitos circulantes no sangue periférico em cada grupo:
NI = controle-doadores de sangue; IRC = controle-insuficiência renal crônica;
HepC = hepatite C crônica; HepC+IRC = hepatite C crônica+insuficiência renal
crônica; Estatisticamente significante: a– em relação a NI; b– em relação a IRC; c- em
relação a HepC; d– em relação a HepC+IRC; *Kruskal-Wallis, pós-teste de Dunns:
NI x HepC+IRC – p<0,001; HepC x HepC+IRC – p<0,01, IRC x HepC+IRC, HepC x
HepC+IRC – p<0,05.
A FIG.18 mostra, respectivamente, a razão entre monócitos macrófago-like (FIG.18A) e mo-
nócitos pró-inflamatórios (FIG.18B) em relação aos monócitos totais encontrada em cada
grupo. Com referência à razão de monócitos macrófagos-like (CD14
+
CD16
+
), a análise esta-
tística demonstrou diferença estatisticamente significante entre os grupos NI x IRC e NI x
HepC+IRC (p<0,01), assim como entre os grupo HepC x IRC e HepC x HepC+IRC (p<0,05),
revelando maior proporção de macrófagos-like nos grupos IRC e HepC+IRC. Em relação à
razão de monócitos pró-inflamatórios (CD14
+
CD16
+
DR
++
), foi demonstrada análoga diferen-
ça estatística nos grupos IRC e HepC+IRC em relação a NI (p<0,001) e entre HepC+IRC e
HepC (p<0,05).
68
0
10
20
30
40
50
0
10
20
30
40
50
a
d
a,c
0
10
20
30
40
50
0
10
20
30
40
50
b,d
Razão CD14
+
CD16
+
HLA-DR
++
/ CD14
+
(x 100)
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
0
10
20
30
40
50
b,d
a,c
b,d
a,c
0
10
20
30
40
50
A
Razão CD14
+
CD16
+
/ CD14
+
(x 100)
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
p=0,000*
p=0,000*
B
Figura 18 - Análise da razão entre macrófago-like e monócitos totais (A) e da razão
entre monócitos pró-inflamatórios e monócitos totais (B) no sangue periférico:
NI = controle-doadores de sangue; IRC = controle-insuficiência renal crônica;
HepC = hepatite C crônica; HepC+IRC = hepatite C crônica+insuficiência re-
nal crônica; Estatisticamente significante: a– em relação a NI; b– em relação a IRC;
c- em relação a HepC; d– em relação a HepC+IRC;
#
MO=Monócitos *Kruskal-
Wallis, pós-teste de Dunns: NI x IRC, NI x HepC+IRC – p<0,001; HepC x IRC,
HepC x HepC+IRC – p<0,05.
B) Estudo da população e subpopulações de células
Natural Killer
(NK):
Conforme observado na FIG.19, não houve diferença significante em relação à freqüência de
células NK totais (CD3
-
CD16
+/-
CD56
+/-
)
no sangue periférico entre os grupos em estudo
(p=0,103). No entanto, a análise estatística das subpopulações de células NK (FIG.20) evi-
denciou menor freqüência de células pré-NK (células CD3
-
CD16
+
CD56
-
) no grupo HepC
comparado ao grupo NI (p<0,05) (FIG.20A). Em relação às células NK maduras (CD3
-
CD16
+
CD56
+
), os grupos não apresentaram diferença estatística (p=0,109) (FIG.20B). Foi
69
encontrada maior freqüência de células NK ativadas (CD3
-
CD16
-
CD56
+
)
no grupo
HepC+IRC em relação aos grupos NI e IRC (p<0,05) (FIG.20C).
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
0
25
50
75
0
25
50
75
0
25
50
75
0
25
50
75
% de células CD3
-
CD16
+/-
CD56
+/-
p=0,103*
Figura 19 - Análise do percentual de células Natural Killer totais no sangue perifé-
rico em cada grupo:
NI = controle-doadores de sangue; IRC = controle-insuficiência renal crônica;
HepC = hepatite C crônica; HepC+IRC = hepatite C crônica+insuficiência re-
nal crônica; *Kruskal-Wallis.
70
A B
0
25
50
75
c
a
0
25
50
75
0
25
50
75
100
0
25
50
75
100
0
25
50
75
d
a,b
0
25
50
75
d
% de células CD3
-
CD16
+
CD56
-
% de células CD3
-
CD16
-
CD56
+
% de células CD3
-
CD16
+
CD56
+
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
C
p=0,013* p=0,109*
p=0,004*
Figura 20 - Análise do percentual de células Pré-NK (A), células NK maduras (B) e
Células NK ativadas (C) no sangue periférico em cada grupo:
NI = controle-doadores de sangue; IRC = controle-insuficiência renal crônica;
HepC = hepatite C crônica; HepC+IRC = hepatite C crônica+insuficiência re-
nal crônica; Estatisticamente significante: a– em relação a NI; b– em relação a IRC;
c- em relação a HEP C; d– em relação a HepC+IRC; NK = Natural Killer;
*Kruskal-Wallis, pós-teste de Dunns: NI x HEP C – p<0,05; NI x HepC+IRC, IRC x
HepC+IRC – p<0,05.
71
O percentual das células NKT totais (CD3
+
CD16
+/-
CD56
+/-
)
circulantes mostrou-se semelhan-
te (p=0,757) em todos os grupos (FIG.21), assim como a freqüência das células NKT1
(CD3
+
CD56
-
CD16
+
) (p=0,162) e NKT 3 (CD3
+
CD56
+
CD16
+
) (p=0,287) (FIG.22A e
FIG.22C). O resultado da análise estatística de células NKT2 (CD3
+
CD56
+
CD16
-
)
revelou
uma freqüência significativamente maior nos grupos HepC e HepC+IRC em relação a IRC
(p<0,05) (FIG.22B).
p=0,757*
0
25
50
75
0
25
50
75
% de células CD3
+
CD16
+/-
CD56
+/-
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
Figura 21 - Análise do percentual de células NKT totais no sangue periférico em
cada grupo:
NI = controle-doadores de sangue; IRC = controle-insuficiência renal crônica;
HepC = hepatite C crônica; HepC+IRC = hepatite C crônica+insuficiência re-
nal crônica; NKT = Células T Natural Killer; *Kruskal-Wallis.
72
A B
C
0
25
50
75
0
25
50
75
% de células CD3
+
CD16
-
CD56
+
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
p=0,162*
0
10
20
30
c,d
b
b
0
10
20
30
p=0,005*
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
% de células CD3
+
CD16
+
CD56
-
0
1
2
3
4
5
0
1
2
3
4
5
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
% de células CD3
+
CD16
+
CD56
+
p=0,287*
Figura 22 - Análise do percentual de células NKT 1 (A), células NKT 2 (B) e célu-
las NKT 3 (C) no sangue periférico em cada grupo:
NI = controle-doadores de sangue; IRC = controle-insuficiência renal crônica;
HepC = hepatite C crônica; HepC+IRC = hepatite C crônica+insuficiência re-
nal crônica; Estatisticamente significante: b– em relação a IRC; c- em relação a
HepC; d- em relação a HepC+IRC; NKT = Células T Natural Killer; *Kruskal-
Wallis, pós-teste de Dunns: IRC x HepC, IRC x HepC+IRC – p<0,05.
73
Com referência à análise da razão de subpopulações de células NK CD3
-
CD16
-
e células NK
CD3
-
CD16
+
em relação à população de células CD56
+
, observou-se diferença estatisticamente
significante na análise das células NK CD3
-
CD16
-
CD56
DIM
(FIG.23A), com aumento da fre-
qüência no grupo HepC em relação a IRC (p<0,01) e, analogamente, no grupo HepC+IRC em
relação aos grupos NI (p<0,05) e IRC (p<0,001). Não foi encontrada diferença na razão das
células NK CD3
-
CD16
-
CD56
BRIGHT
entre os grupos (p=0,116), como também, das células NK
CD3
-
CD16
+
CD56
DIM
(p=0,196) (FIG.23B e FIG.23C). Foi demonstrada diferença estatisti-
camente significante na análise das células NK CD3
-
CD16
+
CD56
BRIGHT
(FIG.23D), com uma
menor freqüência no grupo HepC comparado ao grupo NI (p<0,001) e, de forma similar, no
grupo HepC+IRC em relação a NI (p<0,001) e a IRC (p<0,05).
74
A B
C
Razão CD3
-
CD16
-
CD56
BRIGHT
/ CD56
+
(x100)
0
10
20
30
40
d
c,d
b
a,b
0
10
20
30
40
Razão CD3
-
CD16
-
CD56
DIM
/ CD56
+
(x100)
p=0,000*
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
0
10
20
30
40
0
10
20
30
40
p=0,116*
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
0
25
50
75
100
0
25
50
75
100
Razão CD3
-
CD16
+
CD56
DIM
/ CD56
+
(x100)
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
p=0,196*
0
10
20
30
c,d
d
a
a,b
0
10
20
30
Razão CD3
-
CD16
+
CD56
BRIGHT
/ CD56
+
(x100)
D
p=0,000*
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
Figura 23 - Análise da razão entre as células NK CD3
-
CD16
-
CD56
DIM
(A), células
NK CD3
-
CD16
-
CD56
BRIGHT
(B), células NK CD3
-
CD16
+
CD56
DIM
(C), células NK
CD3-CD16+CD56
BRIGHT
(D) e células CD56
+
totais no sangue periférico em cada
grupo:
HepC = hepatite C crônica; HepC+IRC = hepatite C crônica+insuficiência re-
nal crônica; NK = Natural Killer; Estatisticamente significante: a– em relação a NI;
b– em relação a IRC; c- em relação a HEP C; d– em relação a HepC+IRC
*Kruskal-Wallis, pós-teste de Dunns: NI x HepC+IRC – p<0,05, IRC x HepC –
p<0,01; IRC x HepC+IRC – p<0,001 (Células NK
#
CD3
-
CD16
+
CD56
DIM
/ CD56
+
);
NI x HepC, NI x HepC+IRC – p<0,001, IRC x HepC+IRC – p<0,05; IRC x
HepC+IRC – p<0,001 (Células NK
#
CD3
-
CD16
+
CD56
BRIGHT
/ CD56
+
).
75
4.1.1.2. Imunidade adaptativa:
A) Estudo da freqüência da população e subpopulações de linfócitos do sangue periférico:
Os resultados relativos à análise estatística da freqüência de linfócitos T circulantes (CD3
+
)
não demonstraram diferença significativa entre os grupos (p=0,942) (FIG.24A). Entretanto,
foi encontrada menor freqüência de linfócitos B (CD19
+
) no grupo IRC em relação a NI
(p<0,01) e HepC (p<0,01) e no grupo HepC+IRC em relação a NI (p<0,01) e HepC (p<0,05)
(FIG.24B). A análise da razão entre linfócitos T (CD3
+
) e linfócitos B (CD19
+
) revelou dife-
rença estatisticamente significante entre o grupo NI e os grupos IRC (p<0,01) e HepC+IRC
(p<0,05), conseqüente ao aumento desta razão nestes grupos (FIG.25).
B
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
0
25
50
75
100
0
25
50
75
100
A
% de células CD3
+
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
p=0,942*
0
10
20
30
b,d
a,c
b,d
a,c
0
10
20
30
p=0,000*
% de células CD19
+
Figura 24 - Análise do percentual de linfócitos T (A) e linfócitos B (B) circulantes
em cada grupo:
NI = controle-doadores de sangue; IRC = controle-insuficiência renal crônica;
HepC = hepatite C crônica; HepC+IRC = hepatite C crônica+insuficiência re-
nal crônica;; *Kruskal-Wallis. Estatiscamente significante: a– em relação a NI; b–
em relação a IRC; c- em relação a HepC; d– em relação a HepC+IRC *Kruskal-
Wallis, pós-teste de Dunns: NI x IRC, NI x HepC+IRC, IRC x HepC – p<0,01;
HepC x HepC+IRC – p<0,05.
76
p=0,002*
0
10
20
30
40
50
b,d
a
a
0
10
20
30
40
50
Raz
ã
o
CD3
+
/
CD19
+
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
Figura 25 - Análise da razão entre linfócitos T e linfócitos B circulantes em cada
grupo:
NI = controle-doadores de sangue; IRC = controle-insuficiência renal crônica;
HepC = hepatite C crônica; HepC+IRC = hepatite C crônica+insuficiência re-
nal crônica; Estatisticamente significante: a– em relação a NI; b– em relação a IRC;
d– em relação a HepC+IRC *Kruskal-Wallis, pós-teste de Dunns: NI x IRC –
p<0,01; NI x HepC+IRC – p< 0,05.
B) Estudo da freqüência das subpopulações de linfócitos T:
Não foi observada diferença estatisticamente significante no percentual de linfócitos T auxili-
ares (CD4
+
) (p=0,496), percentual de linfócitos T citotóxicos (CD8
+
) (p=0,183) (FIG.26A e
FIG.26B), como também na razão entre linfócitos T auxiliares e citotóxicos (razão
CD4
+
/CD8
+
) (p=0,588) do sangue periférico entre os grupos estudados (FIG.27).
77
B
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
00
A
% de células CD4
+
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
% de células CD8
+
25
50
75
25
50
75
p=0,496*
0
25
50
75
0
25
50
75
p=0,183*
Figura 26 - Análise do percentual de linfócitos T auxiliares (A) e de linfócitos T ci-
totóxicos (B) no sangue periférico em cada grupo:
NI = controle-doadores de sangue; IRC = controle-insuficiência renal crônica;
HepC = hepatite C crônica; HepC+IRC = hepatite C crônica+insuficiência re-
nal crônica; *Kruskal-Wallis.
Razão CD4
+
/ CD8
+
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
0.0
2.5
5.0
7.5
0.0
2.5
5.0
7.5
p=0,588*
Figura 27 - Análise da razão entre linfócitos T auxiliares e linfócitos T citotóxicos
do sangue periférico por grupo:
NI = controle-doadores de sangue; IRC = controle-insuficiência renal crônica;
HepC = hepatite C crônica; HepC+IRC = hepatite C crônica+insuficiência re-
nal crônica; *Kruskal-Wallis.
C) Estudo da freqüência das subpopulações de linfócitos B:
78
A análise estatística demonstrou diferença significativa, revelando maior percentual de linfó-
citos B convencionais (CD19
+
CD5
-
) na população de linfócitos B totais do sangue periférico
(CD19
+
) no grupo IRC comparado a NI e a HepC (p<0,01), assim como no grupo HepC+IRC
comparado a NI e a HepC (p<0,05) (FIG.28A). Paralelamente, percentual significativamente
menor de linfócitos B1 (CD19
+
CD5
+
) na população de linfócitos B totais do sangue periférico
foi encontrado no grupo IRC em relação a NI e a HepC (p<0,01) e no grupo HepC+IRC
comparado a NI e a HepC (p<0,05) (FIG.28B).
B
00
A
Razãõ de células CD19
+
CD5
-
/ CD19
+
(x100)
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
50
100
b,d
a,c
b,d
a,c
50
100
p=0,000*
0
50
100
b,d
a,c
b,d
a,c
0
50
100
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
p=0,000*
Razão de células CD19
+
CD5
+
/ CD19
+
(x100)
Figura 28 - Análise do percentual entre linfócitos B convencionais (A) e linfócitos
B1 (B) circulantes e linfócitos B totais no sangue periférico em cada grupo:
NI = controle-doadores de sangue; IRC = controle-insuficiência renal crônica;
HepC = hepatite C crônica; HepC+IRC = hepatite C crônica+insuficiência re-
nal crônica; Estatisticamente significante: a– em relação a NI; b– em relação a IRC;
c- em relação a HepC; d– em relação a HepC+IRC; *Kruskal-Wallis, pós-teste de
Dunns: NI x IRC, HepC x IRC – p<0,01, NI x HepC+IRC, HepC x HepC+IRC –
p<0,05.
79
4.1.2. Estudo da expressão de marcadores de ativação celular nas populações e
subpopulações celulares do sangue periférico em cada grupo:
4.1.2.1. Imunidade inata:
A) Expressão de CD23 em neutrófilos, eosinófilos e monócitos:
Os quatro grupos estudados não apresentaram diferença estatisticamente significante em rela-
ção à análise da expressão da molécula CD23 em neutrófilos (p=0,303), eosinófilos (p=0,938)
e monócitos (p=0,433) do sangue periférico.
B) Expressão de HLA-DR em neutrófilos e eosinófilos:
Observou-se que os grupos HepC e HepC+IRC apresentaram maior percentual de expressão
do marcador HLA-DR em neutrófilos circulantes em relação a NI (p<0,05) (FIG.29). Não foi
encontrada diferença na expressão de HLA-DR em eosinófilos circulantes (p=0,144).
% de neutrófilos HLA-DR
+
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
p=0,009*
0
1
2
3
4
5
0
1
2
3
4
5
a
a
Figura 29 - Análise do percentual de neutrófilos HLA-DR
+
no sangue periférico
em cada grupo:
NI = controle-doadores de sangue; IRC = controle-insuficiência renal crônica;
HepC = hepatite C crônica; HepC+IRC = hepatite C crônica+insuficiência re-
nal crônica; *Kruskal-Wallis, pós-teste de Dunns: NI x HepC e NI x HepC+IRC –
p<0,05.
80
4.1.2.2. Imunidade adaptativa:
A) Expressão de HLA-DR em linfócitos T auxiliares e linfócitos T citotóxicos:
O resultado da análise da expressão da molécula HLA-DR em linfócitos T auxiliares (células
CD4
+
HLA-DR
+
) na população de linfócitos T auxiliares totais (CD4
+
) do sangue periférico
mostrou percentual significativamente maior de células CD4
+
HLA-DR
+
em ambos os grupos
HepC e HepC+IRC em relação a NI (p<0,001) (FIG.30A). Com relação à análise da expres-
são da molécula HLA-DR em linfócitos T citotóxicos (células CD8
+
HLA-DR
+
) na população
de linfócitos T citotóxicos totais (CD8
+
) do sangue periférico, foi encontrado resultado seme-
lhante (p<0,05) (FIG.30B).
BA
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
Razão CD4
+
HLA-DR
+
/CD4
+
(x100)
0
25
50
75
c,d
a
a
0
25
50
75
p=0,000*
0
25
50
75
c,d
a
a
0
25
50
75
Razão CD8
+
HLA-DR
+
/CD8
+
(x100)
p=0,009*
Figura 30 - Análise do percentual de células T auxiliares ativadas na população de
linfócitos T auxiliares (A) e do percentual de células T citotóxicas ativadas na popu-
lação de linfócitos T citotóxicos (B) circulantes por grupo:
NI = controle-doadores de sangue; IRC = controle-insuficiência renal crônica;
HepC = hepatite C crônica; HepC+IRC = hepatite C crônica+insuficiência re-
nal crônica; Estatisticamente significante: a– em relação a NI; b– em relação a IRC;
c- em relação a HepC; d– em relação a HepC+IRC; *Kruskal-Wallis, pós-teste de
Dunns: NI x HepC, NI x HepC+IRC – p<0,001(%CD4
+
HLA-DR
+
/ CD4
+
) e p<0,05
(%CD8
+
HLA-DR
+
/ CD8
+
).
B) Expressão de HLA-DR em linfócitos B:
81
O estudo da expressão da molécula HLA-DR em Linfócitos B (FIG.31) circulantes não reve-
lou diferença significante na análise da intensidade média de fluorescência entre os quatros
grupos (p=0,109).
p=0,109*
Expressão de HLA-DR em CD19
+
(IMF)
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
0
1000
2000
3000
0
1000
2000
3000
Figura 31 - Análise da expressão de HLA-DR em linfócitos B do sangue periférico:
NI = controle-doadores de sangue; IRC = controle-insuficiência renal crônica;
HepC = hepatite C crônica; HepC+IRC = hepatite C crônica+insuficiência re-
nal crônica; IMF = intensidadde média de fluorescência; *Kruskal-Wallis.
C) Expressão de CD23 em linfócitos B:
A análise da expressão da molécula CD23 em linfócitos B (CD19+) demonstrou redução sig-
nificativa no percentual de linfócitos B ativados (Células CD19
+
CD23
+
) do sangue periférico
nos grupos IRC e HepC+IRC em relação a NI (p<0,05) (FIG.32).
82
p=0,011*
Expressão de CD23 em CD19
+
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
0
5
10
15
20
25
b,d
a
a
5
10
15
20
25
Figura 32 - Análise da expressão da molécula CD23 em linfócitos B (linfócitos B
ativados) do sangue periférico em cada grupo:
NI = controle-doadores de sangue; IRC = controle-insuficiência renal crônica;
HepC = hepatite C crônica; HepC+IRC = hepatite C crônica+insuficiência re-
nal crônica; Estatisticamente significante: a– em relação a NI; b– em relação a IRC;
d– em relação a HepC+IRC; *Kruskal-Wallis, pós-teste de Dunns: NI x IRC, NI x
HepC+IRC – p<0,05.
4.1.3. Estudo da regulação da resposta imune nos leucócitos do sangue periféri-
co:
4.1.3.1. Análise de receptores de imunoglobulina em células da Imunidade
inata:
A) Expressão de CD64 (Fc
γ
RI) em monócitos, neutrófilos e eosinófilos:
O resultado da análise estatística da expressão do receptor de imunoglobulina CD64 (Fc
γ
RI)
não mostrou diferença significativa entre os grupos em relação aos monócitos (p=0,110) e
neutrófilos (p=0,144) do sangue periférico. Houve diferença estatisticamente significante na
expressão do receptor Fc
γ
RI em eosinófilos (FIG. 33), demonstrada por menor percentual de
eosinófilos CD64
+
no grupo IRC em relação a HepC+IRC (p<0,05).
83
p=0,018*
Expressão de CD64 em eosinófilos
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
0
10
20
30
d
b
0
10
20
30
Figura 33 - Análise da expressão da molécula CD64 (FcγRI) em eosinófilos circu-
lantes por grupos:
NI = controle-doadores de sangue; IRC = controle-insuficiência renal crônica;
HepC = hepatite C crônica; HepC+IRC = hepatite C crônica+insuficiência re-
nal crônica; Estatitiscamente significante: b– em relação a IRC; d– em relação a
HepC+IRC; *Kruskal-Wallis, pós-teste de Dunns: IRC x HepC+IRC – p<0,05.
B) Expressão de CD32 (Fc
γ
RII) em monócitos, neutrófilos e eosinófilos:
A análise dos dados referentes à expressão do receptor de imunoglobulina CD32 (Fc
γ
RII) não
mostrou diferença significativa entre os grupos em relação aos neutrófilos (p=0,068) e eosinó-
filos (p=0,277) do sangue periférico. Houve diferença estatisticamente significante na expres-
são do receptor Fc
γ
RII em monócitos (FIG.34), demonstrada por redução na intensidade mé-
dia de fluorescência da molécula CD32 no grupo IRC em relação a HepC (p<0,001).
84
p=0,000*
Expressão de CD32 em CD14
+
(IMF)
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
0
100
200
300
b
c
0
100
200
300
Figura 34 - Análise da expressão da molécula CD32 (FcγRII) em monócitos do
sangue periférico em cada grupo:
NI = controle-doadores de sangue; IRC = controle-insuficiência renal crônica;
HepC = hepatite C crônica; HepC+IRC = hepatite C crônica+insuficiência re-
nal crônica; Estatisticamente significante: b– em relação a IRC; c- em relação a
HepC; IMF=intensidade média de fluorescência; *Kruskal-Wallis, pós-teste de
Dunns: IRC x HepC+IRC – p<0,001.
C) Expressão de CD16 (Fc
γ
RIII) em monócitos e neutrófilos;
O resultado relativo à análise da expressão do receptor de imunoglobulina CD16 (Fc
γ
RIII)
mostrou diferença significativa entre os grupos em relação à expressão em neutrófilos do san-
gue periférico (FIG.35). Houve redução estatisticamente significante na expressão do receptor
Fc
γ
RIII, demonstrada por diminuição na intensidade média de fluorescência de CD16 em
neutrófilos nos grupo HepC e HepC+IRC em relação a NI (p<0,01), como também em relação
a IRC (p<0,001). Em relação à expressão da molécula CD16 em monócitos, os resultados
foram anteriormente descritos.
85
p=0,000*
Expressão de CD16 em neutrófilos (IMF)
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
0
1000
2000
3000
c,d
c,d
a,b a,b
0
1000
2000
3000
Figura 35 - Análise da expressão da molécula CD16 (FcγRIII) em neutrófilos circu-
lantes em cada grupo:
NI = controle-doadores de sangue; IRC = controle-insuficiência renal crônica;
HepC = hepatite C crônica; HepC+IRC = hepatite C crônica+insuficiência re-
nal crônica; Estatisticamente significante: a– em relação a NI; b– em relação a IRC;
c- em relação a HepC; d– em relação a HepC+IRC; IMF=intensidade média de fluo-
rescência; *Kruskal-Wallis, pós-teste de Dunns: NI x HepC, NI x HepC+IRC –
p<0,01; IRC x HepC, IRC x HepC+IRC – p<0,001.
4.1.3.2. Análise da freqüência de células T reguladoras (CD4
+
CD25
HIGH
):
Em relação à análise do percentual de células T reguladoras (CD4
+
CD25
HIGH
) no sangue peri-
férico, não foi encontrada diferença estatisticamente significante entre os grupos (p=0,662)
(FIG. 36).
86
p=0,662*
% de células CD4
+
CD25
High
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
0.0
2.5
5.0
7.5
0.0
2.5
5.0
7.5
Figura 36 - Análise do percentual de células T Reguladoras (Células
CD4
+
CD25
HIGH
) no sangue periférico em cada grupo:
NI = controle-doadores de sangue; IRC = controle-insuficiência renal crônica;
HepC = hepatite C crônica; HepC+IRC = hepatite C crônica+insuficiência re-
nal crônica. *Kruskal-Wallis.
4.1.3.3. Análise da expressão de CD32 (Fcγ
γγ
γRII) em linfócitos B:
O resultado da análise da expressão de CD32 (Fc
γ
RII) em linfócitos B (Células CD19
+
) do
sangue periférico não revelou diferença estatisticamente significante entre os quatro grupos
estudados (p=0,754) (FIG.37).
p=0,754*
Expressão de CD32 em CD19
+
(IMF)
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
0
100
200
300
0
100
200
300
Figura 37 - Análise da expressão de CD32 (FcγRII) em linfócitos B circulantes por
grupo:
NI = controle-doadores de sangue; IRC = controle-insuficiência renal crônica;
HepC = hepatite C crônica; HepC+IRC = hepatite C crônica+insuficiência re-
nal crônica. *Kruskal-Wallis.
87
4.1.4. Análise da expressão de receptores de quimiocinas em cada grupo:
4.1.4.1. Imunidade inata:
A) Expressão de receptores de quimiocinas do Tipo 0 (CCR2, CXCR4) em monócitos:
A intensidade média de fluorescência do receptor de quimiocinas CCR2 em monócitos mos-
trou-se semelhante entre os quatro grupos (p=0,812). No entanto, a intensidade média de fluo-
rescência de CXCR4 em monócitos do sangue periférico foi significativamente menor nos
grupos IRC (p<0,01) e HepC+IRC (p<0,05) em relação a NI (FIG.38).
p=0,009*
Expressão de CXCR4 em CD14
+
(IMF)
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
0
25
50
75
100
b,d
a a
0
25
50
75
100
Figura 38 - Análise da expressão de CXCR4 em monócitos do sangue periférico em
cada grupo:
NI = controle-doadores de sangue; IRC = controle-insuficiência renal crônica;
HepC = hepatite C crônica; HepC+IRC = hepatite C crônica+insuficiência re-
nal crônica; Estatisticamente significante: a– em relação a NI; b- em relação a IRC;
d– em relação a HepC+IRC;
IMF=intensidade média de fluorescência; *Kruskal-
Wallis, pós-teste de Dunns: NI x IRC – p<0,01; NI x HepC+IRC – p<0,05.
B) Expressão de receptores de quimiocinas do Tipo 1 (CXCR3, CCR5) em monócitos:
88
O resultado da análise estatística da expressão dos receptores de quimiocinas CXCR3 e CCR5
em monócitos circulantes não evidenciou diferença significativa entre os grupos (p=0,083 e
p=0,259, respectivamente).
C) Expressão de receptores de quimiocinas do Tipo 2 (CCR3) em monócitos:
Com referência à expressão do receptor de quimiocina CCR3 em monócitos, observou-se uma
intensidade média de fluorescência significativamente menor nos grupos IRC (p<0,05) e
HepC (p<0,05) em relação a NI (FIG.39).
p=0,016*
Expressão de CCR3 em CD14
+
(IMF)
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
0
25
50
75
100
0
25
50
75
100
b,c
a
a
Figura 39 - Análise da expressão de CCR3 em monócitos do sangue periférico em
cada grupo:
NI = controle-doadores de sangue; IRC = controle-insuficiência renal crônica;
HepC = hepatite C crônica; HepC+IRC = hepatite C crônica+insuficiência re-
nal crônica; Estatisticamente significante: a– em relação a NI; b– em relação a IRC;
c- em relação a HepC; IMF=intensidade média de fluorescência; *Kruskal-Wallis,
pós-teste de Dunns: NI x IRC e NI x HepC – p<0,05.
89
4.1.4.2. Imunidade Adaptativa:
A) Expressão de receptores de quimiocinas do Tipo 0 (CCR2, CXCR4) em linfócitos T:
A análise estatística não
encontrou diferença significante entre os grupos em relação à expres-
são da molécula CCR2 em linfócitos T auxiliares (CD4
+
) e em linfócitos T citotóxicos
(CD8
+
), respectivamente, p=0,073 e p=0,057. O resultado da análise dos dados referentes à
expressão dos receptores de quimiocinas do tipo CXCR4 em linfócitos T evidenciou diferença
estatisticamente significante entre os grupos, com uma menor intensidade média de fluores-
cência em linfócitos T auxiliares (CD4
+
) no grupo HepC+IRC em relação a NI (p<0,01), co-
mo também diminuição da intensidade média de fluorescência em linfócitos T citotóxicos
(CD8
+
) no grupo HepC+IRC em relação a NI e a IRC (p<0,001) (FIG.40).
BA
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
Expressão de CXCR4 em CD4
+
(IMF)
p=0,002*
00
p=0,000*
0
10
20
30
40
50
d
a
0
10
20
30
40
50
10
20
30
40
50
d
d
a,b
10
20
30
40
50
Expressão de CXCR4 em CD8
+
(IMF)
Figura 40 - Análise da expressão de CXCR4 em linfócitos T auxiliares (A) e em lin-
fócitos T citotóxicos (B) em cada grupo:
NI = controle-doadores de sangue; IRC = controle-insuficiência renal crônica;
HepC = hepatite C crônica; HepC+IRC = hepatite C crônica+insuficiência re-
nal crônica; Estatisticamente significante: a– em relação a NI; b– em relação a IRC;
d- em relação a HepC+IRC; IMF= intensidade média de fluorescência; *Kruskal-
Wallis, pós-teste de Dunns: NI x HepC+IRC em CD4
+
- p<0,05; NI x HepC+IRC e
IRC x HepC+IRC em CD8
+
– p<0,001.
B) Expressão de receptores de quimiocinas do Tipo 1 (CXCR3, CCR5) em linfócitos T:
90
O resultado da análise da expressão de receptores de quimiocinas do tipo CXCR3 em linfóci-
tos T demonstrou diferença significante. Em relação aos linfócitos T auxiliares (CD4
+
), en-
controu-se maior percentual de células CD4
+
CXCR3
+
no grupo HepC comparado a NI
(p<0,01) e a IRC (p<0,05). Em relação aos linfócitos T citotóxicos (CD8
+
), observou-se me-
nor percentual de células CD8
+
CXCR3
+
nos grupos HepC (p<0,01) e HepC+IRC (p<0,05)
comparados a NI (FIG.41). Com referência à expressão de CCR5 em linfócitos T (FIG.42),
foi demonstrado aumento na intensidade média de fluorescência em linfócitos T auxiliares
(CD4
+
) no grupo IRC em relação a HepC+IRC (p<0,05) e, considerando os linfócitos T cito-
tóxicos (CD8
+
), houve, também, aumento na intensidade média de fluorescência no grupo
IRC em relação a NI (p<0,01) e em relação a HepC e HepC+IRC (p<0,001).
BA
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
Razão de células CD4
+
CXCR3
+
/ CD4
+
(x100)
p=0,002*
p=0,000*
Razão de células CD8
+
CXCR3
+
/ CD8
+
(x100)
0
10
20
30
40
50
c
c
0
10
20
30
40
50
a,b
10
20
30
40
50
c,d
a
a
0
10
20
30
40
50
Figura 41 - Análise da expressão de CXCR3 em linfócitos T auxiliares (A) e em lin-
fócitos T citotóxicos (B) em cada grupo:
NI = controle-doadores de sangue; IRC = controle-insuficiência renal crônica;
HepC = hepatite C crônica; HepC+IRC = hepatite C crônica+insuficiência re-
nal crônica; Estatisticamente significante: a– em relação a NI; b– em relação a IRC;
c- em relação a HepC; d- em relação a HepC+IRC; *Kruskal-Wallis, pós-teste de
Dunns: HepC x NI- p<0,01 e HepC x IRC - p<0,05 em CD4
+
; NI x HepC – p<0,01
e NI x HepC+IRC – p<0,05 em CD8
+
.
91
BA
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
Expressão de CCR5 em CD4
+
(IMF)
p=0,015* p=0,000*
Expressão de CCR5 em CD8
+
(IMF)
0
10
20
30
40
d
b
0
10
20
30
40
0
10
20
30
40
b
a,c,d
b b
0
10
20
30
40
Figura 42 - Análise da expressão de CCR5 em linfócitos T auxiliares (A) e em lin-
fócitos T citotóxicos (B) em cada grupo:
NI = controle-doadores de sangue; IRC = controle-insuficiência renal crônica;
HepC = hepatite C crônica; HepC+IRC = hepatite C crônica+insuficiência re-
nal crônica; Estatisticamente significante: a– em relação a NI; b– em relação a IRC;
c- em relação a HepC; d- em relação a HepC+IRC; IMF=intensidade média de fluo-
rescência; *Kruskal-Wallis, pós-teste de Dunns: IRC x IRC+HepC - p<0,05 em
CD4
+
; IRC x NI – p<0,01 e IRC x HepC, IRC x HepC+IRC – p<0,001 em CD8
+
.
C) Expressão de receptores de quimiocinas do Tipo 2 (CCR3) em linfócitos T:
O resultado da análise da expressão de receptores de quimiocinas do tipo CCR3 em linfócitos
T demonstrou diferença significante entre os grupos. Em relação aos linfócitos T auxiliares
(CD4
+
), encontrou-se redução na intensidade média de fluorescência de CCR3
+
no grupo
HepC comparado a NI (p<0,05). Com referência aos linfócitos T citotóxicos (CD8
+
), obser-
vou-se redução na intensidade média de fluorescência de CCR3
+
no grupo HepC+IRC compa-
rados a NI (p<0,05) (FIG.43).
92
BA
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
NI IRC HepC
HepC
+IRC
NI IRC HepC
HepC
+IRC
Grupos
Expressão de CCR3 em CD4
+
(IMF)
p=0,016*
p=0,002*
Expressão de CCR3 em CD8
+
(IMF)
0
10
20
30
40
c
a
0
10
20
30
40
0
10
20
30
40
d
a
0
10
20
30
40
Figura 43 - Análise da expressão de CCR3 em linfócitos T auxiliares (A) e em lin-
fócitos T citotóxicos (B) em cada grupo:
NI = controle-doadores de sangue; IRC = controle-insuficiência renal crônica;
HepC = hepatite C crônica; HepC+IRC = hepatite C crônica+insuficiência re-
nal crônica; Estatisticamente significante: a– em relação a NI;
c- em relação a HepC;
d- em relação a HepC+IRC; IMF=intensidade média de fluorescência; *Kruskal-
Wallis, pós-teste de Dunns: HepC x NI- p<0,05 em CD4
+
; HepC+IRC x NI – p<0,05
em CD8
+
.
4.1.5. Correlações entre as variáveis em estudo (demográficas, laboratoriais,
imunofenotipagem):
Os gráficos, a seguir, descrevem as correlações realizadas entre as principais variáveis em
estudo. Para limitar a extensão da exposição, foram inseridos, de uma forma geral, apenas os
gráficos referentes às correlações estatisticamente significantes. Quando pertinente, no texto
foram descritas as correlações que não atingiram significância estatística. Foi empregada a
correlação de Spearmann (não paramétrica), haja vista que as variáveis não apresentam distri-
buição normal.
93
Em determinadas situações, quando as análises de correlação dos grupos HepC e/ou
HepC+IRC, individualmente, não atingiram significância estatística e ao se refletir sobre os
resultados houve a suposição de um possível erro
β
, foram realizadas as correlações com a
associação entre os grupos, visto que ambos são constituídos de pacientes com Hepatite C
crônica.
4.1.5.1. Correlação entre ALT e Grau de Atividade Histológica:
Foi encontrada correlação positiva estatisticamente significante entre ALT e grau de atividade
histológica (Metavir) no grupo HepC (R=0,819; IC=0,582 a 0,928 – p<0,000) (FIG. 44), não
sendo encontrada correlação significativa em relação ao grupo HepC+IRC (R=0,491; IC= -
0,133 a 0,837 – p>0,05). Não houve correlação significante entre ALT e estágio de fibrose,
em ambos os grupos (p>0,05).
0 50 100 150
0
1
2
3
4
ALT (mg/dl)
histológica
Grau de atividade
0 50 100 150
0
1
2
3
4
p=0,000*
GRUPO HepC
Figura 44 - Correlação entre ALT e Atividade Histológica no grupo HepC:
*Correlação de Spearman - R=0,819; IC=0,582-0,928; ALT=alanino aminotransfe-
rase; Grau de atividade histológica – METAVIR (0-3). HepC = hepatite C crônica.
94
4.1.5.2. Correlação entre variáveis em estudo (demográficas, laboratoriais) e
parâmetros fenotípicos de células da imunidade inata:
Em relação à análise das correlações entre o percentual de monócitos (CD14
+
) do sangue peri-
férico e as variáveis tempo próvavel de infecção (epidemiológico), ALT, grau de atividade
histológica e estágio de fibrose, não foi demonstrada correlação estatisticamente significante
em ambos os grupos HepC e HepC+IRC (p>0,05). A análise individual desses grupos não
encontrou significância estatística em relação à carga viral (p> 0,05), embora houvesse corre-
lação inversa fraca em HepC (R=-0,221) (FIG.45B). Quando associados, foi demonstrada
correlação inversa significante (R= -0,500; IC= -0,753 a -0,119 – p=0,011) entre o percentu-
al de monócitos (CD14
+
) do sangue periférico e carga viral (HCV-RNA quantitativo por P-
CR) (FIG.45A).
p=0,011*
GRUPO HepC e
HepC+IRC
0 10 20 30
10000
100000
1000000
% de células CD14
+
HCV-RNA quantitativo (UI/ ml)
0 10 20 30
10000
100000
1000000
A
p=0,428*
GRUPO HepC
% de células CD14
+
HCV-RNA quantitativo (UI/ ml)
B
0 15 30
0
500000
1000000
0 15 30
0
500000
1000000
Figura 45 - Correlação entre o percentual de monócitos no sangue periférico e carga
viral nos grupos HepC e HepC+IRC associados (A) e no grupo HepC (B):
* Correlação de Spearman – Grupos HepC e HepC+IRC associados: R=-0,500; IC=
-0,753 a -0,119; Grupo HepC R= -0,221; HCV-RNA quantitativo por Reação em
Cadeia da Polimerase; HepC = hepatite c crônica e HepC+IRC = hepatite C crôni-
ca+insuficiência renal crônica.
95
Com referência às células NK totais (CD3
+
CD16
+/-
CD56
+/-
) não se observou correlação esta-
tisticamente significante com as variáveis demográficas, laboratoriais e histológicas em estu-
do (p>0,05).
Foi encontrada correlação inversa estatisticamente significante entre as células NKT totais
(CD3
-
CD16
+/-
CD56
+/-
) e o tempo provável de infecção (epidemiológico) no grupo HepC+IRC
(R= -0,637; IC= -0,865 a -0,192 – p=0,008) (FIG.46). As demais correlações não obtiveram
significância estatística.
p=0,008*
GRUPO HepC+IRC
0 10 20 30
0
10
20
30
40
50
Tempo de Infecção
(anos)
0 10 20 30
0
10
20
30
40
50
% de células CD3
+
CD16
+/-
CD56
+/-
Figura 46 - Correlação entre células o percentual de células NKT totais no sangue
periférico e o tempo provável de infecção (epidemiológico) no grupo HepC+IRC:
* Correlação de Spearman - R= -0,637; IC= -0,865 a -0,192; NKT= Células T Na-
tural Killer; HepC+IRC = hepatite C crônica+insuficiência renal crônica.
4.1.5.3. Correlação entre variáveis em estudo (demográficas e laboratorais) e
parâmetros fenotípicos de células da imunidade adaptativa:
O resultado da análise da correlação entre o percentual de linfócitos T auxiliares ativados (cé-
lulas CD4
+
HLA-DR
+
) na população de linfócitos T auxiliares periféricos e ALT demonstrou
correlação inversa significante no grupo HepC+IRC (R= -0,637; IC= -0,865 a -0,192 –
p=0,008) (FIG. 47). Não foi encontrada correlação estatisticamente significante em relação ao
grupo HepC.
96
Não se encontrou correlação estatisticamente significante entre o percentual de linfócitos T
auxiliares ativados (células CD4
+
HLA-DR
+
) na população de linfócitos T auxiliares periféri-
cos e tempo próvavel de infecção (epidemiológico), grau de atividade histológica, estágio de
fibrose ou carga viral em ambos os grupos HepC e HepC+IRC (p>0,05).
p=0,008*
GRUPO HepC+IRC
0 25 50 75 100
0
10
20
30
40
ALT (mg/dl)
Razão CD4
+
HLA-DR
+
/ CD4
+
(x100)
0 25 50 75 100
0
10
20
30
40
Figura 47 - Correlação entre o percentual de linfócitos T auxiliares ativados na po-
pulação de linfócitos T auxiliares periféricos e ALT no grupo HepC+IRC:
* Correlação de Spearman - R= -0,637; IC= -0,865 a -0,192; ALT = alanino amino-
transferase; HepC+IRC = hepatite C crônica+insuficiência renal crônica.
Com referência ao estudo da correlação entre o
percentual de linfócitos T citotóxicos ativados
(células CD8
+
HLA-DR
+
) na população de linfócitos T citotóxicos periféricos e ALT encon-
trou-se, também, correlação inversa significante no grupo HepC+IRC (R= -0,508; IC= -0,807
a -0,001– p=0,04) (FIG.48). Não foi observada correlação estatisticamente significante em
relação ao grupo HepC.
Foi demonstrada correlação inversa estatisticamente significante entre o
percentual de linfóci-
tos T citotóxicos ativados (células CD8
+
HLA-DR
+
) na população de linfócitos T citotóxicos
periféricos e carga viral (HCV-RNA quantitativo por PCR) no grupo HepC (R= -0,604; IC= -
0,857 a -0,116– p=0,017) (FIG.49). Em relação ao grupo HepC+IRC não foi observada esta
correlação, sendo o valor de R=-0,369 (p>0,05). Não foi encontrada correlação estatistica-
mente significante entre o percentual de linfócitos T citotóxicos ativados (células CD8
+
HLA-
DR
+
) na população de linfócitos T citotóxicos periféricos (CD8
+
) e tempo próvavel de infec-
97
ção (epidemiológico), grau de atividade histológica ou estágio de fibrose em ambos os grupos
HepC e HepC+IRC (p>0,05).
p=0,040*
GRUPO HepC+IRC
ALT (mg/dl)
Razão CD8
+
HLA-DR
+
/ CD8
+
(x100)
0 25 50 75 100
0
10
20
30
40
0 25 50 75 100
0
10
20
30
40
Figura 48 - Correlação entre linfócitos T citotóxicos ativados na população de lin-
fócitos citotóxicos periféricos e ALT no grupo HepC+IRC:
* Correlação de Spearman - R= -0,508; IC= -0,807 a -0,001. ALT=alanino amino-
transferase; HepC+IRC = hepatite C crônica+insuficiência renal crônica.
p=0,017*
GRUPO HepC
HCV-RNA quantitativo (UI/ml)
Razão CD8
+
HLA-DR
+
/ CD8
+
(x100)
0 500000 1000000
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
0 500000 1000000
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
Figura 49 - Correlação entre o percentual de linfócitos T citotóxicos ativados na po-
pulação de linfócitos T citotóxicos periféricos e carga viral no grupo HepC:
* Correlação de Spearman - R= -0,604; IC= -0,857 a -0,116;
#
HCV-RNA quantita-
tivo por Reação em Cadeia da Polimerase; HepC = hepatite C crônica.
98
Em relação à análise das correlações entre células T reguladoras (CD4
+
CD25
HIGH
) e as variá-
veis tempo próvavel de infecção (epidemiológico), ALT, grau de atividade histológica, está-
gio de fibrose e carga viral, não foi demonstrada correlação estatisticamente significante em
ambos os grupos HepC e HepC+IRC (p>0,05). Resultados semelhantes foram demonstrados
em relação ao estudo das correlações com Linfócitos B (células CD19
+
).
4.1.5.4.
Correlação entre os parâmetros fenotípicos celulares avaliados no
sangue periférico:
Foi encontrada correlação positiva estatisticamente significante entre o percentual de monóci-
tos pró-inflamatórios (células CD16
+
CD14
+
DR
++
) na população de monócitos totais (CD14
+
)
do sangue periférico e o percentual de linfócitos B (células CD19
+
) do sangue periférico no
grupo HepC+IRC (R= 0,656; IC= 0,222 a 0,873 – p=0,006) (FIG.50). Esta correlação não foi
significativa no grupo HepC (p>0,05).
p=0,006*
GRUPO HepC+IRC
% de CD14
+
CD16
+
DR
++
/ CD14
+
% de células CD19
+
60 70 80 90 100
0
10
20
30
60 70 80 90 100
0
10
20
30
Figura 50 - Correlação entre o percentual de monócitos pró-inflamatórios na popu-
lação de monócitos totais e o percentual de linfócitos B do sangue periférico no gru-
po HepC+IRC:
* Correlação de Spearman – R = 0,656; IC= 0,222 a 0,873; HepC+IRC = hepatite C
crônica+insuficiência renal crônica.
99
Foi demonstrada correlação inversa estatisticamente significante entre o percentual de linfóci-
tos B (células CD19
+
) do sangue periférico e o percentual de linfócitos T citotóxicos ativados
(células CD8
+
HLA-DR
+
) na população de linfócitos T citotóxicos periféricos (CD8
+
) quando
associados os grupos HepC e HepC+IRC (n=36) (R= -0,368; IC= -0,627 a -0,034– p=0,027)
(FIG.51A). Em relação ao grupo HepC+IRC não foi observada esta correlação, sendo o valor
de R=-0,265 (p>0,05). No entanto, embora com valor p=0,079, foi observada correlação de
Spearman (R= -0,402; IC: -0,717 a 0,050) no grupo HepC (n=20) (FIG.51B).
p=0,027*
GRUPO HepC e
HepC+IRC
p=0,079*
GRUPO HepC
Razão CD8
+
HLA-DR
+
/ CD8
+
(x100)
Razão CD8
+
HLA-DR
+
/ CD8
+
(x100)
A B
% de células CD19
+
0 10 20 30
0
5
10
15
0 10 20 30
0
5
10
15
% de células CD19
+
0 10 20 30
0
5
10
15
0 10 20 30
0
5
10
15
Figura 51 - Correlação entre o percentual de linfócitos B e o percentual de linfócitos
T citotóxicos ativados na população de linfócitos T citotóxicos do sangue periferico
na associação entre os grupos HepC e HepC+IRC (A) no grupo HepC (B):
* Correlação de Spearman – associação dos Grupos HepC e HepC+IRC (n=36): R =
-0,368; IC= -0,627 a 0,034; Grupo HepC (n=20): R= -0,402; IC: -0,717 a 0,050;
HepC = hepatite C crônica; HepC+IRC = hepatite C crônica+insuficiência renal
crônica.
O resultado da análise de correlação entre o
percentual de células T reguladoras
(CD4
+
CD25
HIGH)
do sangue periférico e o percentual de linfócitos T auxiliares ativados (célu-
las CD4
+
HLA-DR
+
) na população de linfócitos T auxiliares periféricos revelou uma correla-
ção positiva estatisticamente significante no grupo HepC (R= 0,569; IC= 0,156 a 0,813 –
p=0,009) (FIG.52). Em relação ao grupo HepC+IRC não foi observada esta correlação
(p>0,05).
100
p=0,009*
GRUPO HepC
% de células CD4
+
CD25
HIGH
Razão CD4
+
HLA-DR
+
/ CD4
+
(x100)
0 5 10 15
0
10
20
30
0 5 10 15
0
10
20
30
0 5 10 15
0
10
20
30
0 5 10 15
0
10
20
30
Figura 52 - Correlação entre o percentual de células T reguladoras e o percentual de
linfócitos T auxiliares ativados na população de linfócitos T auxiliares periféricos no
grupo HepC:
*Correlação de Spearman - R= 0,569; IC= 0,156 a 0,813; HepC = hepatite C crôni-
ca.
Foi demonstrada correlação inversa estatisticamente significante entre o percentual de células
T reguladoras (CD4
+
CD25
HIGH)
do sangue periférico e o percentual de linfócitos T citotóxicos
ativados (células CD8
+
HLA-DR
+
) na população de linfócitos T citotóxicos periféricos (CD8
+
)
no grupo HepC+IRC (R= -0,568; IC= -0,835 a -0,084– p=0,022) (FIG.53). Em relação ao
grupo HepC não foi observada esta correlação (p>0,05).
101
p=0,022*
% de células CD4
+
CD25
HIGH
Razão CD8
+
HLA-DR
+
/ CD8
+
(x100)
GRUPO HepC+IRC
0 10 20
0
10
20
30
40
0 10 20
0
10
20
30
40
Figura 53 - Correlação entre o percentual de células T reguladoras do sangue perifé-
rico e o percentual de linfócitos T citotóxicos ativados na população de linfócitos T
citotóxicos periféricos no grupo HepC+IRC:
*Correlação de Spearman - R= -0,568; IC= -0,835 a -0,084; HepC+IRC = hepatite
C crônica+insuficiência renal crônica.
4.1.5.5. Correlação entre células com expressão de quimiocinas e outros fe-
nótipos celulares estudados:
O resultado das análises de correlações entre células com expressão de receptores de quimio-
cinas e outros parâmetros fenotípicos avaliados demonstrou significância estatística nos se-
guintes casos:
A- Expressão de receptores de quimiocinas do tipo 0:
Foi encontrada correlação inversa estatisticamente significante entre a intensidade média de
fluorescência de CXCR4 em linfócitos T citotóxicos (CD8
+
) e o percentual de linfócitos T
citotóxicos ativados (células CD8
+
HLA-DR
+
) na população de linfócitos T citotóxicos perifé-
ricos (CD8
+
) quando associados os grupos HepC e HepC+IRC (n=36) (R= -0,487; IC = -
0,708 a -0,179– p=0,003) (FIG.54).
102
p=0,003*
GRUPO HepC e
HepC+IRC
Razão CD8
+
HLA-DR
+
/ CD8
+
(x100)
0 10 20 30 40
0
10
20
30
Expressão de CXCR4 em CD8
+
(IMF)
0 10 20 30 40
0
10
20
30
Figura 54 - Análise da correlação entre a expressão de CXCR4 em linfócitos T cito-
tóxicos e o percentual de linfócitos T citotóxicos ativados na população de linfócitos
T citotóxicos periféricos quando associados os grupos HepC e HepC+IRC (n=36):
*Correlação de Spearman – R= -0,487; IC = -0,708 a -0,179; IMF = intensidade mé-
dia de fluorescência; HepC = hepatite C crônica; HepC+IRC = hepatite C crôni-
ca+insuficiência renal crônica.
B- Expressão de receptores de quimiocinas do tipo 1:
O resultado da análise de correlação entre o percentual de células CD8
+
CXCR3
+
nos linfóci-
tos T citotóxicos periféricos (CD8
+
) e o percentual de linfócitos T citotóxicos ativados (célu-
las CD8
+
HLA-DR
+
) na população de linfócitos T citotóxicos periféricos (CD8
+
) demonstrou
correlação positiva estatisticamente significante no grupo HepC (R= 0,584; IC = 0,176 a
0,820 – p=0,006) (FIG.55).
103
p=0,006*
GRUPO HepC
Razão CD8
+
HLA-DR
+
/ CD8
+
(x100)
Razão CXCR3
+
CD8
+
/ CD8
+
(x100)
0 10 20 30 40 50
0
5
10
15
0 10 20 30 40 50
0
5
10
15
0 10 20 30 40 50
0
5
10
15
0 10 20 30 40 50
0
5
10
15
Figura 55 - Análise da correlação entre o percentual de células CD8
+
CXCR3
+
na
população de linfócitos T citotóxicos periféricos e o percentual de linfócitos T cito-
tóxicos ativados na população de linfócitos T citotóxicos periféricos no grupo HepC:
*Correlação de Spearman – R= 0,584; IC = 0,176 a 0,820; HepC = hepatite C crôni-
ca.
C- Expressão de receptores de quimiocinas do tipo 2:
Foi observada correlação inversa estatisticamente significante entre a intensidade média de
fluorescência de CCR3 em monócitos (CD14
+
) e o
percentual de monócitos pró-inflamatórios
(células CD16
+
CD14
+
DR
++
) no sangue periférico no grupo HepC (R= -0,472; IC= -0,763 a -
0,023 – p=0,036) (FIG.56).
104
p=0,036*
GRUPO HepC
% de CD14
+
CD16
+
DR
++
/ CD14
+
50 60 70 80 90 100
0
25
50
75
100
Expressão deCCR3 emCD14
+
(IMF)
50 60 70 80 90 100
0
25
50
75
100
Figura 56 - Análise da correlação entre a expressão de CCR3 em monócitos e o per-
centual de monócitos pró-inflamatórios na população de monócitos do sangue peri-
férico no grupo HepC:
* Correlação de Spearman –
R = -0,472; IC= -0,763 a -0,023; IMF = intensidade média de fluorescência; HepC =
hepatite C crônica.
105
5. DISCUSSÃO:
Diversos estudos, que avaliam os mecanismos imunológicos associados à apresentação de
diferentes formas clínicas e histológicas da hepatite C crônica, têm sugerido a participação de
eventos multifatoriais e a combinação de parâmetros imunológicos diferentes na origem e na
progressão da injúria hepatocelular, conferindo suporte à hipótese de que mecanismos com-
plexos estão envolvidos na indução e/ou regulação da patogenia na infecção crônica pelo
HCV. Embora alguns dos elementos envolvidos no fenômeno de cronificação diferenciada no
curso da infecção pelo HCV já tenham sido descritos, estudos adicionais fazem-se ainda ne-
cessários para a compreensão da dinâmica desse processo (THIMME et al., 2002) e a aborda-
gem da participação de diferentes populações celulares nos eventos protetores e/ou patológi-
cos da doença concorre para o envolvimento e a interligação de ambos componentes da res-
posta imune, inata e adaptativa (DOHERTY & FARRELLY, 2000). Nesse contexto, a cito-
metria de fluxo, através da detecção de moléculas expressas na superfície de células, marca-
dores de ativação, regulação e/ou migração celular, tem contribuído para um grande avanço
na pesquisa científica aplicada ao estudo das doenças infecciosas humanas (FREEMANN et
al., 2001). Empregando-se sistemas de análises mais elaborados e protocolos experimentais
mais atuais, torna-se possível a análise simultânea de um maior número de moléculas por su-
perfície celular, motivando a possibilidade de identificação e/ou caracterização de novas sub-
populações, oferecendo, assim, informações adicionais que podem enriquecer os conhecimen-
tos acerca dos diferentes padrões de resposta imune na hepatite C crônica. Neste trabalho, foi
realizado um estudo detalhado de aspectos fenotípicos celulares e moleculares do sangue peri-
férico de pacientes portadores de infecção crônica pelo HCV, que se presume, possa contribu-
ir para enriquecer o conhecimento sobre esta doença, que continua a ser um desafio científico
após, aproximadamente, 15 anos da descoberta do vírus C. A seguir, serão discutidos os acha-
dos relacionados aos principais parâmetros fenotípicos abordados neste estudo e suas diferen-
ças entre os grupos envolvidos, correlacionando-os com trabalhos relevantes da literatura.
Em relação ao estudo da imunidade inata, observou-se que o grupo HepC+IRC apresenta um
percentual de monócitos (CD14
+
) circulantes significativamente maior em relação aos demais
grupos (NI, HepC e IRC). Paralelamente, a freqüência de monócitos macrófagos-like
(CD14
+
CD16
+
) revelou-se maior em ambos os grupos IRC e HepC+IRC. A razão de monóci-
tos pró-inflamatórios (CD14
+
CD16
+
DR
++
) encontrada foi, analogamente, maior nos grupos
106
IRC e HepC+IRC em relação a NI, devendo-se ressaltar que foi significativamente maior no
grupo HepC+IRC em relação ao grupo HepC. Diante destes achados, pondera-se que o com-
partimento de células fagocíticas é afetado em número e em ativação pela presença da insufi-
ciência renal e sugere, ainda, que a infecção crônica pelo vírus C contribui para uma maior
ativação de monócitos nos pacientes renais crônicos (molécula DR
++
). Os monócitos
CD14
+
CD16
+
, denominados “macrófagos-like”, representam uma população ativada, que
podem ser distinguidos ainda como monócitos pró-inflamatórios (CD14
+
CD16
+
HLA-DR
++
),
contrapondo a população dos chamados monócitos clássicos (CD14
++
CD16
-
HLA-DR
+
) (ZI-
EGLER et al., 1996 SKRZECYÑSKA et al., 2002). A população minoritária de monócitos
pró-inflamatórios é a principal produtora de TNF-
α
no sangue periférico (BELGE et al.,
2002). Estudos sobre resposta imune e liberação de citocinas em pacientes sob hemodiálise
demonstraram que a interação entre sangue e membrana de diálise tem o potencial de ativar
células mononucleares, em particular monócitos, induzindo a síntese de citocinas: TNF-
α
,
IL1-Beta e IL-6, gerando um estado inflamatório crônico (ZAOUI et al., 1994; PERTOSA et
al., 2000), talvez exacerbado nos pacientes com doença renal e hepatite C crônica. Em relação
ao estudo dos receptores de imunoglobulinas, observou-se redução na expressão da molécula
CD32 (Fc
γ
RII) em monócitos periféricos no grupo IRC em relação a HepC, com essa mesma
tendência no grupo HepC+IRC. Este receptor está relacionado à ligação de imunocomplexos,
que podem ter papel modulador da atividade de monócitos. STRAUSS-AYALI et al. (2007)
enfatizaram que a população de monócitos circulantes tem importante participação na respos-
ta imune a infecções e, ao contrário do que se acreditava anteriormente, os monócitos consti-
tuem uma população diversificada morfológica e funcionalmente.
Atribui-se, na atualidade, ao estudo das células
natural killer
(CD3
-
CD16
+/-
CD56
+/-
), a tercei-
ra maior população de linfócitos periféricos, grande destaque na abordagem da resposta imune
em pacientes com infecção crônica pelo HCV. Em contraste, estas células representam a po-
pulação predominante da imunidade inata no compartimento hepático, constituindo entre 50 a
75% do total de linfócitos no fígado saudável (DOHERTY & O’FARRELLY, 2000). É im-
portante ressalvar que os linfócitos intra-hepáticos não sofrem expansão clonal local, mas
migram a partir de sítios extra-hepáticos para o órgão cronicamente infectado, onde exercem
suas funções efetoras e, subseqüentemente, morrem, sugerindo que a manutenção da popula-
ção de linfócitos intra-hepáticos depende de migração contínua (VALIANTE et al., 2000). As
células NK são efetoras essenciais na resposta imune contra agentes virais, produzindo citoci-
107
nas (tais como IFN-
γ
e TNF-
α
), são responsáveis pela atividade citotóxica dependente de an-
ticorpos, como também, interagem com células dentríticas e linfócitos T, sendo um importan-
te elo na ligação entre imunidade inata e adaptativa, atuando na regulação e na manutenção da
resposta imune específica. (BACKSTROM et al., 2004; GOLDEN-MASON & ROSEN,
2006). Ressalta-se, ainda, que uma importante forma de escape imune do HCV é a ligação da
proteína E2 ao receptor CD81 nas células NK, inibindo sua função (CROTTA et al., 2002).
No presente estudo, não foi encontrada diferença significante em relação à freqüência de célu-
las NK totais (CD3
-
CD16
+/-
CD56
+/-
) no sangue periférico entre os grupos em estudo. No en-
tanto, a análise das subpopulações evidenciou uma menor freqüência de células pré-NK (célu-
las CD3
-
CD16
+
CD56
-
) no grupo HepC comparado ao grupo NI. Em relação às células NK
maduras (CD3
-
CD16
+
CD56
+
), os grupos não apresentaram diferença estatística, sendo encon-
trada uma maior freqüência de células NK ativadas (CD3
-
CD16
-
CD56
+
) no grupo HepC+IRC
em relação aos grupos NI e IRC. GADDY & BROXMEYER (1997) ao estudarem a ontoge-
nia das células NK, utilizando sangue de cordão umbilical, demonstraram a existência de uma
nova subpopulação de células NK (CD3
-
CD16
+
CD56
-
) com baixa atividade lítica. Esta popu-
lação, quando cultivada na presença de IL-2, evolui para o fenótipo CD16
-/+
CD56
+
, sendo
considerada por esses autores como linfócitos pré-NK (CD3
-
CD16
+
CD56
-
), um possível pre-
cursor de células NK maduras (CD3
-
CD16
-/+
CD56
+
). O grupo HepC apresentou uma menor
freqüência de células pré-NK, sendo que, no grupo HepC+IRC, foi demonstrada uma maior
freqüência de células NK ativadas, havendo tendência a aumento também no grupo HepC.
Considerando os avanços atuais no estudo fenotípico e/ou funcional detalhado de subpopula-
ções de NK, torna-se importante situar essas informações à luz de nossas observações. Neste
contexto, acredita-se que estes achados estão em concordância com a importância funcional
dessas células e da sua ativação na infecção pelo HCV (BACKSTROM et al., 2004; GOL-
DEN-MASON & ROSEN, 2006).
No âmbito dos estudos fenotípicos e/ou funcionais de células NK, segundo ROBERTSON &
RITZ (1990), existem, ainda, duas subpopulações distintas de células NK identificadas pela
densidade de expressão da molécula CD56 na superfície da célula. Em indivíduos saudáveis,
aproximadamente 90% das células NK são CD56
DIM
e expressam altos níveis de Fc
γ
RIII
(CD16), enquanto a minoria, aproximadamente 10%, são CD56
BRIGHT
e CD16
DIM/-
. Células
NK CD56
DIM
são descritas, por esses autores, como uma população com maior atividade cito-
108
tóxica intrínseca e baixa produção de IFN-
γ
, enquanto as células CD56
BRIGHT
caracterizam-se
pelo inverso. Os resultados demonstram um aumento da população de células NK CD3
-
CD16
-
CD56
DIM
, no grupo HepC em relação a IRC (p<0,01) e, analogamente, no grupo HepC+IRC
em relação aos grupos NI e IRC. Simultaneamente, observa-se uma menor proporção de célu-
las NK CD3
-
CD16
+
CD56
BRIGHT
no grupo HepC comparado ao grupo NI e, de forma similar,
no grupo HepC+IRC em relação a ambos os grupos controles. Pode-se especular que o grupo
HepC+IRC, além de apresentar maior freqüência de células NK ativadas, apresenta ainda um
percentual mais elevado de células NK com maior potencial citolítico e menor produção de
IFN-
γ
. Acredita-se que, na infecção crônica pelo HCV, a atividade citotóxica desempenhe um
papel protetor, enquanto a produção de altos níveis de IFN-
γ
seja responsável, preponderan-
temente, pelo dano tecidual hepático sobrepondo ao controle da infecção viral (GOLDEN-
MASON & ROSEN, 2006). Supõe-se que, possivelmente, as células NK CD3
-
CD16
-
CD56
DIM
, com maior potencial citotóxico, possam contribuir para o controle da resposta imu-
ne na hepatite C crônica. Assim, aliando-se ao papel protetor dos anticorpos líticos, previa-
mente descritos, na interface da resposta imune celular e humoral, as células NK seriam um
elo na ativação dos eventos de ADCC, importantes no controle da morbidade na infecção hu-
mana crônica pelo HCV.
Adicionalmente, na abordagem da população de células NK, realizou-se uma avaliação deta-
lhada das subpopulações de células NKT. Segundo DOHERTY el al. (1999), as células NKT
podem ser identificadas pelo fenótipo CD3
+
CD56
+
. São abundantes no fígado normal, repre-
sentando um terço do montante total de células CD3
+
que expressam, simultaneamente,
CD16, CD56 e/ou CD161 (receptores de superfície de células NK), situando-se, portanto, na
interface entre resposta imune inata e adaptativa. As células NKT parecem ter implicação na
vigilância tumoral e em fenômenos de auto-imunidade, sendo seu papel na infecção crônica
pelo HCV ainda pouco definido (TAKEDA et al., 2000). Com o intuito de classificar as dife-
rentes subpopulações, as células NKT foram subdivididas em: NKT1 (CD3
+
CD16
+
CD56
-
),
NKT2 (CD3
+
CD16
-
CD56
+
) e NKT3 (CD3
+
CD16
+
CD56
+
). No presente estudo, a freqüência
das células NKT totais (CD3
+
CD16
+/-
CD56
+/-
) mostrou-se semelhante em todos os grupos,
assim como a freqüência das células NKT1 (CD3
+
CD56
-
CD16
+
) e NKT 3
(CD3
+
CD56
+
CD16
+
). Observou-se que os grupos HepC e HepC+IRC apresentam um maior
percentual de células NKT2 (CD3
+
CD56
+
CD16
-
) em relação a IRC. O papel dessas subpopu-
lações de células NKT ainda não está estabelecido na literatura através de estudos funcionais.
109
Assim, investigações focalizando aspectos funcionais destas populações de linfócitos, bem
como o seu padrão de síntese de citocinas, consistem em importante objeto de interesse futu-
ro.
Comum a ambos os grupos HepC e HepC+IRC foi a identificação de maior expressão do
marcador HLA-DR em neutrófilos circulantes em relação a NI, caracterizando a presença de
ativação destas células. Os conhecimentos sobre o papel da imunidade inata na determinação
da evolução e progressão da infecção pelo HCV são, não obstante, restritos, haja vista que
apenas recentemente pesquisas científicas, nesta esfera do sistema imune, têm sido desenvol-
vidas. Por conseguinte, este estudo se sobressai pela análise global e abrangente dos seus res-
pectivos componentes. As características que conferem à imunidade adaptativa distintas parti-
cularidades em relação à imunidade inata incluem especificidade, diversidade e memória. A
seguir, serão discutidos os principais resultados encontrados na análise da imunidade adapta-
tiva.
Considerando o compartimento de linfócitos T (CD3
+
) e a freqüência das subpopulações de
linfócitos T, respectivamente, o percentual de linfócitos T auxiliares (CD4
+
) e de linfócitos T
citotóxicos (CD8
+
), não há diferença entre os grupos. Todavia, o estudo da expressão da mo-
lécula HLA-DR (o mais fidedigno marcador de ativação de células T em humanos) em linfó-
citos T CD4
+
e CD8
+
identificou percentual significativamente maior de células CD4
+
HLA-
DR
+
e células CD8
+
HLA-DR
+
em ambos os grupos HepC e HepC+IRC em relação a NI, re-
fletindo a presença da ativação celular no contexto da infecção crônica pelo HCV, indepen-
dentemente da presença de IRC. Estudos imunohistoquímicos, há tempos, indicam que estas
células são importantes mediadores da injúria hepática na patogenia da infecção pelo HCV
(MARROGI et al., 1995).
Recentemente, foi descrita, em humanos, a presença de células T co-expressando o marcador
CD4 e altos níveis de CD25 (IL-2R) que se caracterizam pela anergia em respostas a estímu-
los policlonais, associada à elevada capacidade de suprimir a produção de citocinas e a proli-
feração de células T CD4
+
e CD8
+
, através de um mecanismo complexo de contato célula-
célula, sendo assim denominadas células T CD4
+
reguladoras (BAECHER-ALLAN et al.,
2001; DIECKMANN et al., 2001; JONULEIT, et al., 2001). Embora, em modelos experimen-
tais murinos, as células T CD4
+
reguladoras sejam diferenciadas por apresentarem o fenótipo
110
CD4
+
CD25
+
, sendo, na sua totalidade, possuidoras de potencial papel regulador, caracterizado
por diminuição de produção de citocinas e habilidade de inibir proliferação celular
in
vitro,
em humanos, apenas as CD4
+
CD25
HIGH
apresentam esta habilidade. Em camundongos, os
estudos de células Treg sugeriram que as células CD4
+
CD25
+
parecem ser importantes para a
manutenção da tolerância própria e na prevenção de doenças autoimunes (SAKAGUCHI et
al., 2001). Em humanos, estudos de células T CD4
+
CD25
HIGH
evidenciaram sua importância
crucial na contenção de desordens autoimunes em humanos, pois estão relacionadas com uma
importante função na manutenção da tolerância periférica. Neste contexto, TAAMS et al.
(2002) demonstraram que estas células suprimem a proliferação contra antígenos próprios,
assim como contra aqueles prvenientes da dieta e antígenos estranhos. Segundo BACHER-
ALLAN et al. (2001) as células CD4
+
CD25
HIGH
apresentam um papel regulador, caracteriza-
do por diminuição da produção de citocinas e habilidade de inibir proliferação celular
in vitro
,
em especial a produção da citocina IFN-
γ
. Analisando de forma isolada, não se encontrou
diferença estatisticamente significativa no percentual de células CD4
+
CD25
HIGH
entre os gru-
pos estudados. CABRERA et al. (2004) demonstraram expansão relativa dessas células no
sangue periférico de portadores de infecção crônica pelo HCV em relação a controles, empre-
gando como marcador a presença de IL-10 no citoplasma, estudo sob ênfase mais funcional.
A forma de envolvimento da resposta imune humoral na evolução da infecção crônica pelo
HCV não está claramente definida (FREEMANN et al., 2001). De acordo com BASSETT et
al. (1999), o clareamento da infecção pelo HCV pode ocorrer na ausência do desenvolvimento
de quaisquer anticorpos contra proteínas do envelope, portanto, a presença de anticorpos pa-
rece não se correlacionar com proteção. No entanto, o emprego recente de culturas de tecido
hepático possibilitou a identificação de anticorpos que bloqueiam a entrada do HCV nos hepa-
tócitos, através da neutralização de pseudópodes do vírus
in vitro
(LOGVINOFF et al., 2004).
Conforme discutido previamente, observa-se que os resultados não demonstraram diferença
significante em relação à freqüência de linfócitos T circulantes (CD3
+
), como na razão entre
linfócitos T auxiliares (CD4
+
) e citotóxicos (CD8
+
) entre os grupos. Entretanto, a análise dos
dados revelou um aumento da razão entre linfócitos T (CD3
+
) e linfócitos B (CD19
+
) nos gru-
pos IRC e HepC+IRC em relação ao grupo NI, decorrente de uma redução significativa no
percentual de linfócitos B (CD19
+
) periféricos nesses grupos, inclusive em relação à HepC.
De forma interessante, avaliando as subpopulações de linfócitos B, identifica-se que a diminu-
ição da população de linfócitos B periféricos (CD19
+
) resulta da redução do percentual de
111
linfócitos B1 (CD19
+
CD5
+
) na população de linfócitos B totais, com um aumento relativo do
percentual de linfócitos B convencionais (CD19
+
CD5
-
) nos grupos IRC e HepC+IRC. Linfó-
citos B1 (CD19
+
CD5
+
) representam uma subpopulação de linfócitos B envolvida, principal-
mente, em fenômenos de imunidade e produção de IgM, sendo suprimida por citocinas do
tipo 1 (IFN-
γ
) e estimulada por citocinas do tipo 2 (IL-2, IL-4, IL-5 e IL-10) (VOGEL et al.,
1996).
A expressão da molécula reguladora CD32 (Fc
γ
RII) em linfócitos B (Células CD19
+
) do san-
gue periférico foi semelhante entre os grupos estudados. Estudos realizados por MUTA et al.
(1994) mostraram que a ligação de imunocomplexos ao receptor CD32 em linfócitos B e o
seu entrecruzamento junto ao receptor de células B (BCR) gera um sinal regulador negativo
que inibe a ativação, a proliferação e a secreção de anticorpos pelos linfócitos B. Quando ana-
lisada a expressão de moléculas de ativação celular, a expressão da molécula HLA-DR em
linfócitos B não revelou, igualmente, diferença significante entre os quatros grupos. Entretan-
to, a análise da expressão da molécula ativadora CD23, que consiste em um receptor para IgE,
em linfócitos B (CD19
+
) demonstrou uma diminuição no percentual de linfócitos B ativados
(Células CD19
+
CD23
+
), no sangue periférico, nos grupos IRC e HepC+IRC em relação a NI.
Os resultados da abordagem de linfócitos B, conjuntamente, sugerem um comprometimento
do segmento humoral, tanto dos parâmetros fenotípicos quanto funcionais, determinado pela
doença renal subjacente, em conformidade com os estudos da literatura. Verifica-se que há
retração quantitativa do segmento de linfócitos B em IRC e HepC+IRC, associada à diminui-
ção de linfócitos B1, com redução do número de linfócitos B ativados (CD19
+
CD23
+
), embo-
ra a expressão das moléculas CD32 e HLA-DR tenha sido semelhante. Pesquisas atuais afir-
mam que a resposta imune celular está relativamente preservada na IRC e que, paralelamente,
parece haver deficiência da resposta imune humoral na doença renal avançada, evidência su-
portada pela menor eficácia na produção de anticorpos induzida pelas vacinas do HBV,
pneumocócica, contra o hemófilos, dentre outras. (MEYERS et al, 2003). Não obstante, já foi
demonstrado que a sorologia pelo ELISA anti-HCV pode não ser confiável em pacientes em
diálise (HINRICHSEN et al., 2002; DOTTA et al., 2003). Não foram encontrados estudos, na
literatura, sobre esta análise de caráter abrangente, envolvendo infecção crônica pelo HCV e
IRC.
112
Conforme ressaltado previamente, os linfócitos intra-hepáticos não sofrem expansão clonal no
fígado, mas migram a partir de sítios extra-hepáticos para o órgão cronicamente infectado,
sugerindo que a manutenção da população de linfócitos intra-hepáticos depende de migração
contínua (VALIANTE et al., 2000). As quimiocinas são moléculas que regulam a migração e
o acúmulo de leucócitos específicos para os sítios onde estão ocorrendo processos inflamató-
rios. Estas proteínas, de pequeno peso molecular (aproximadamente 8 a 12 Kda), compreen-
dem quatro famílias classificadas conforme a posição de seus resíduos de cisteína na região
N-terminal: CXC (
α
), CC (
β
), C (
γ
) e CX3C (
δ
) (BAGGIOLINI et al., 1994; KELNER et al.,
1994; CLARK-LEWIS et al., 1995; HOWARD et al., 1996). As quimiocinas parecem estar
envolvidas em vários fenômenos biológicos, incluindo proliferação de células T (TAB et al.,
1996), diferenciação das subpopulações de linfócitos T do tipo 1 e tipo 2 (GAO et al., 1996) e
produção de IL-1 e IL-6 por macrófagos (JIANG et al., 1992). Exercem funções efetoras atra-
vés da ligação a receptores específicos presentes na superfície celular, acoplados à proteína G
(FOXMANAET et al., 1997), com expressão diferenciada em linfócitos e monócitos (ARAI
& CHARO, 1996; SALLUSTO et al., 1998). Estes estudos correlacionaram a expressão dife-
rencial de receptores de quimiocinas com funções celulares específicas, como por exemplo: a
expressão de CCR7 e CXCR4 em células T virgens, CCR5/CXCR3 e CCR3/CCR4 em célu-
las T com o padrão de síntese de citocinas do tipo 1 e do tipo 2, respectivamente. Por outro
lado, o receptor CCR2 é expresso em ambas as subpopulações de linfócitos T (tipo 1 e tipo 2).
A população de monócitos circulantes expressa na superfície celular CCR1, CCR4, CCR5 e
CXCR4 (JIANG et al., 1992) e, em humanos, os monócitos pró-inflamatórios, ativados no
intercurso de infecções, não expressam CCR2 (STRAUSS-AYALI et al., 2007). A análise de
receptores de quimiocinas apresenta-se como uma abordagem complementar que possibilita a
identificação do perfil da resposta imune associada à dinâmica dos eventos imunológicos de-
sencadeados pela infecção crônica pelo HCV. Em síntese, a maior expressão de CXCR3 e
CCR5 tem sido associada ao padrão de resposta imune do tipo 1, enquanto o padrão de res-
posta imune do tipo 2 é caracterizado por maior expressão de CCR3 e CCR4. Na resposta
imune do tipo 0 (mista) é observada maior expressão de CCR2 e CXCR4 (SALLUSTO,
1998).
Haja vista as importantes diferenças encontradas no estudo dos parâmentros fenotípicos em
macrófagos circulantes, decidiu-se avaliar a expressão de quimiocinas nestas células, como
representantes da imunidade inata. A expressão dos receptores de quimiocinas CCR2 (Tipo 0)
113
e CXCR3/ CCR5 (Tipo 1) em monócitos do sangue periférico mostrou-se semelhante entre
os quatro grupos e a expressão do receptor de quimiocina CCR3 (Tipo 2) foi significativa-
mente menor em ambos os grupos HepC e IRC. Por outro lado, a expressão de CXCR4 (Tipo
0), que é uma quimiocina de padrão misto, foi significativamente menor nos grupos IRC e
HepC+IRC em relação a NI, o que poderia sugerir uma tentativa de modulação da resposta
imune ou alteração nos mecanismos de regulação e/ou ativação dessas células, através de in-
ternalização do receptor, nestes grupos.
Em relação à imunidade adaptativa, o resultado do estudo da expressão dos receptores de
quimiocinas do tipo 0 mostrou-se semelhante entre os grupos em relação à expressão da mo-
lécula CCR2 em linfócitos T auxiliares (CD4+) e em linfócitos T citotóxicos (CD8
+
). A análi-
se dos dados referentes à expressão da molécula CXCR4 em linfócitos T identificou redução
da intensidade média de fluorescência em linfócitos T auxiliares (CD4
+
) e em linfócitos T
citotóxicos (CD8
+
) no grupo HepC+IRC. Ressalva-se que o receptor CXCR4 tem atividade
quimiotática para linfócitos T inativos/virgens (VALIANTE et. al., 2000).
Considerando a análise da expressão de receptores de quimiocinas do tipo 1 em linfócitos T
periféricos, encontrou-se maior percentual de células CD4
+
CXCR3
+
no grupo HepC compa-
rado a NI e, em relação aos linfócitos T citotóxicos (CD8
+
), observou-se um menor percentual
de células CD8
+
CXCR3
+
nos grupos HepC e HepC+IRC. APOLINARIO et al. (2002) des-
creveram elevado percentual de células CD3
+
CXCR3
+
no compartimento intra-hepático de
pacientes com infecção crônica pelo HCV, identificando correlação significante entre a ex-
pressão de CXCR3 e atividade inflamatória. Mais recentemente, CALVINO et al. (2007) de-
monstraram que, além de atuar no recrutamento de linfócitos T CD8
+
e na inflamação tecidual
hepática, o aumento do percentual de linfócitos CD8
+
CXCR3 circulantes, no pós-tratamento,
associa-se ao controle da viremia. A hipótese da redução do percentual destes linfócitos na
periferia estar relacionada à migração para o fígado deve ser considerada, fundamentando-se
na ciência de que a molécula CXCR3 é expressa em linfócitos ativados. Com referência à
expressão de CCR5, observou-se aumento da expressão desta molécula em linfócitos T CD4
+
e T CD8
+
do sangue periférico no grupo IRC. A análise da expressão de receptores de quimi-
ocinas do tipo 2 em linfócitos T demonstrou uma diminuição da expressão da molécula C-
CR3
+
em linfócitos T auxiliares (CD4
+
) no grupo HepC e, em relação aos linfócitos T citotó-
xicos (CD8
+
), observou-se redução na expressão de CCR3
+
no grupo HepC+IRC, ambos
114
comparados a NI. No âmbito da análise fenotípica aplicada ao estabelecimento de padrões de
resposta imune distintos, incluindo-se a imunidade do tipo 1 e do tipo 2, diversos estudos têm
demonstrado que as quimiocinas têm uma papel importante mediando suas atividades através
da ligação a seus receptores na superfície dos leucócitos. Para o estabelecimento de um pa-
drão de resposta imune misto (tipo 0) é necessária a existência simultânea de mecanismos
ativadores e moduladores da resposta imune (VALIANTE et. al., 2000).
Analisando de forma global, observa-se que a expressão de receptores de quimiocinas no san-
gue periférico está diminuída no grupo HepC+IRC em relação ao grupo controle e que, na
infecção crônica pelo vírus C, há uma complexidade e não um predomínio de resposta imune
no contexto da análise desses receptores, sugerindo a existência de mecanismos imunomodu-
ladores neste repertório, sobressaindo a maior expressão de receptores do tipo 1 no grupo
HepC. Os estudos de BONECCHI (1998) sugeriram que o padrão de expressão destes recep-
tores pode ser empregado como indicador do estabelecimento de mecanismos distintos da
resposta imune no contexto da imunidade do tipo 1 e do tipo 2. Nesse contexto, as células T
efetoras expressam diferentes tipos de receptores de quimiocinas que contribuem para deter-
minar a orientação da resposta imune, da qual depende a evolução da infecção pelo HCV, ou
seja, o clareamento ou a persistência do vírus (KYONG-MI, 2003).
Em uma segunda fase, foram realizadas correlações entre os diversos parâmetros fenotípicos
estudados, entre si e com dados epidemiológicos, laboratoriais e histológicos. Para uma dis-
cussão mais concisa, serão abordadas as correlações significantes em cada grupo.
Conforme já estabelecido na literatura (KYONG-MI, 2003), observou-se correlação positiva
forte entre ALT e grau de atividade histológica (METAVIR) no grupo HepC (R=0,819), im-
portante no contexto das análises de resposta imune inflamatória. Em contraste, acredita-se
que pelas caracterísicas intrínsecas do grupo HepC+IRC - 75% dos participantes com ALT
normal, em concordância com a literatura (Meyers et al., 2003)
-
embora com R=0,49, esta
correlação não foi significante em pacientes com IRC e infecção crônica pelo HCV (IC= -
0,133 a 0,837 – p>0,05).
De caráter interessante, o grupo HepC apresentou correlação inversa moderada a forte (R= -
0,604) entre o
percentual de linfócitos T citotóxicos ativados (células CD8
+
HLA-DR
+
) na
115
população de linfócitos T e a carga viral (PCR quantitativo). REHERMANN et al. (1996)
evidenciaram que a resposta imune específica por linfócitos T citotóxicos é capaz de contro-
lar, mas, isolodamente, não extinguir a viremia. Observou-se, também, correlação positiva
moderada (R= 0,569) entre o
percentual de células T reguladoras (CD4
+
CD25
HIGH)
do sangue
periférico e o percentual de linfócitos T auxiliares ativados (células CD4
+
HLA-DR
+
) no grupo
HepC. Conforme discutido previamente, as células CD4
+
CD25
HIGH
são responsáveis pelo
controle da resposta imune, pois estão relacionadas com a manutenção da tolerância periférica
(TAAMS et al., 2002) e apresentam papel regulador, caracterizado por diminuição da produ-
ção de citocinas, em especial a produção de IFN-
γ
(BACHER-ALLAN et al., 2001). Neste
sentido, possivelmente, proliferam paralelamente ao aumento do número de células ativadas.
Foi, ainda, identificada, neste grupo, correlação moderada (R= 0,584) entre o percentual de
células CD8
+
CXCR3
+
e o percentual de linfócitos T citotóxicos ativados periféricos (células
CD8
+
HLA-DR
+
), corroborando para a importância do recrutamento de CD8
+
HLA-DR
+
na
infecção crônica pelo VHC no grupo HepC. Evidências prévias demonstraram a íntima rela-
ção entre a expressão deste receptor de quimiocinas e gravidade da atividade inflamatória
tecidual hepática (APOLINARIO et al.,2002; CALVINO et al., 2007).
116
No grupo HepC+IRC houve correlação inversa moderada a forte (R= -0,637) entre as células
NKT totais (CD3
-
CD16
+/-
CD56
+/-
) e o tempo provável de infecção (epidemiológico). Este
achado pode se relacionar à importância destas células na fase mais precoce da infecção
(TAKEDA et al., 2000) ou à sua exaustão pelo tempo prolongado de infecção. Uma interes-
sante correlação inversa moderada a forte (R= -0,637) entre o percentual de linfócitos T auxi-
liares ativados (células CD4
+
HLA-DR
+
) periféricos e ALT, como também, entre o
percentual
de linfócitos T citotóxicos ativados (células CD8
+
HLA-DR
+
) e ALT (R= -0,508) foi demons-
trada somente no grupo HepC+IRC. Aproximadamente 70% dos portadores de hepatite C
crônica com IRC associada, sabidamente, apresentam níveis de ALT normal, sendo esta ami-
notransferase, neste grupo em particular, não confiável para avaliar grau de atividade da do-
ença hepática (MEYERS et al., 2003). Observando as FIG.47 e FIG. 48, identifica-se, de for-
ma clara, que são os únicos quatro pacientes que apresentam ALT acima do limite superior da
normalidade (LSN) aqueles que apresentam menores percentuais de células CD4
+
HLA-DR
+
e
CD8
+
HLA-DR
+
periféricas. Duas ponderações são pertinentes, ou estes pacientes, em particu-
lar, têm maior migração destes linfócitos ativados para o compartimento hepático (causando
maior lise hepatocitária) ou um perfil funcional de resposta imune (polarização ou ativação)
divergente. Destaca-se, também, a presença de correlação positiva moderada a forte (R=
0,656) entre o
percentual de monócitos pró-inflamatórios (células CD16
+
CD14
+
DR
++
) e o
percentual de linfócitos B (células CD19
+
) do sangue periférico no grupo HepC+IRC. Con-
forme discutido anteriormente, observou-se, neste grupo, um comprometimento da resposta
imune humoral decorrente, provavelmente, da doença renal subjacente, em concordância com
estudos prévios (HINRICHSEN et al., 2002). Esta correlação positiva pode significar uma
tentativa da imunidade inata, através da proliferação de monócitos pró-inflamatórios (popula-
ção que é ampliada neste grupo) e produção de citocinas, de estimular a proliferação de linfó-
citos B e, conseqüentemente, restituir a resposta imune humoral deficiente. Finalmente, o
grupo HepC+IRC apresentou correlação inversa forte (R= -0,568) entre o percentual de célu-
las T reguladoras (CD4
+
CD25
HIGH
) e o percentual de linfócitos T citotóxicos ativados (células
CD8
+
HLA-DR
+
) periféricos. Está demonstrado que as células T reguladoras CD4
+
CD25
HIGH
periféricas suprimem a produção de IFN-
γ
por linfócitos T citotóxicos CD8
+
, tornando-os
menos efetivos. No âmbito que a atividade citotóxica destas células é importante mediadora,
outrossim, da injúria hepática, esta correlação é bastante relevante, haja vista que este grupo
apresenta menor intensidade de dano tecidual hepático. Este estudo envolveu uma análise
extensa e minuciosa da resposta imune nestes grupos e, considerando-se a análise ampla de
117
fenótipos celulares, trata-se de um trabalho original. Para o melhor entendimento e maior a-
brangência contextual desses achados, analisados à luz dos conhecimentos prévios sobre cada
grupo distinto, os resultados foram agrupados (FIG.57).
↑
↑↑
↑ CCR5 CD8
+a,c.d
↑
↑↑
↑ CD3
-
CD16
-
CD56
DIM
/CD56
+a
↑
↑↑
↑ CD14
+a,b
↑
↑↑
↑ CD3
-
CD16
-
CD56
+a,b
↓
↓↓
↓ CXCR4 CD4
+a
↓
↓↓
↓ CXCR4 CD8
+a,b
↓
↓↓
↓ CXCR3 CD8
+a,b
↓
↓↓
↓ CD3
-
CD16
+
CD56
-a
↓
↓↓
↓ CCR3 CD4
+a
↑
↑↑
↑ CXCR3
+
CD4
+
/CD4
+a,c
↑
↑↑
↑ CD4
+
HLA-DR
+
/CD4
+a
↑
↑↑
↑ CD8
+
HLA-DR
+
/CD8
+a
↓
↓↓
↓ CD3
-
CD16
+
CD56
BRIGTH
/CD56
+a
↑
↑↑
↑ HLA-DR NEU
a
↓
↓↓
↓ CD16 NEU
a,b
↓
↓↓
↓ CCR3 CD8
+a
↓
↓↓
↓ CXCR3
+
CD8
+
/CD8
+a
↓
↓↓
↓ CCR3 MØ
a
↓
↓↓
↓ CXCR4 MØ
a
↓
↓↓
↓ CD19
+a,c
↑
↑↑
↑CD3
+
/CD19
+a
↓
↓↓
↓ CD19
+
CD23
+a
↓
↓↓
↓ CD19
+
CD5
+
/CD19
+a,c
↑
↑↑
↑ CD19
+
CD5
-
/CD19
+a,c
↑
↑↑
↑ MØ-Like
a,c
↑
↑↑
↑ MØ-Pro
a
↑
↑↑
↑ CD4
+
HLA-DR
+
/CD4
+a
↑
↑↑
↑ CD8
+
HLA-DR
+
/CD8
+a
↓
↓↓
↓ CD3
-
CD16
+
CD56
BRIGTH
/CD56
+a
↑
↑↑
↑ HLA-DR NEU
a
↓
↓↓
↓ CD16 NEU
a,b
↓
↓↓
↓ CCR3 CD8
+a
↓
↓↓
↓ CXCR3
+
CD8
+
/CD8
+a
↓
↓↓
↓ CCR3 MØ
a
↓
↓↓
↓ CXCR4 MØ
a
↓
↓↓
↓ CD19
+a,c
↑
↑↑
↑CD3
+
/CD19
+a
↓
↓↓
↓ CD19
+
CD23
+a
↓
↓↓
↓ CD19
+
CD5
+
/CD19
+a,c
↑
↑↑
↑ CD19
+
CD5
-
/CD19
+a,c
↑
↑↑
↑ MØ-Like
a,c
↑
↑↑
↑ MØ-Pro
a
IRC
IRC
HepC
HepC
+IRC
+IRC
HepC
HepC
↑
↑↑
↑ CCR5 CD8
+a,c.d
↑
↑↑
↑ CD3
-
CD16
-
CD56
DIM
/CD56
+a
↑
↑↑
↑ CD14
+a,b
↑
↑↑
↑ CD3
-
CD16
-
CD56
+a,b
↓
↓↓
↓ CXCR4 CD4
+a
↓
↓↓
↓ CXCR4 CD8
+a,b
↓
↓↓
↓ CXCR3 CD8
+a,b
↓
↓↓
↓ CD3
-
CD16
+
CD56
-a
↓
↓↓
↓ CCR3 CD4
+a
↑
↑↑
↑ CXCR3
+
CD4
+
/CD4
+a,c
↑
↑↑
↑ CD4
+
HLA-DR
+
/CD4
+a
↑
↑↑
↑ CD8
+
HLA-DR
+
/CD8
+a
↓
↓↓
↓ CD3
-
CD16
+
CD56
BRIGTH
/CD56
+a
↑
↑↑
↑ HLA-DR NEU
a
↓
↓↓
↓ CD16 NEU
a,b
↓
↓↓
↓ CCR3 CD8
+a
↓
↓↓
↓ CXCR3
+
CD8
+
/CD8
+a
↓
↓↓
↓ CCR3 MØ
a
↓
↓↓
↓ CXCR4 MØ
a
↓
↓↓
↓ CD19
+a,c
↑
↑↑
↑CD3
+
/CD19
+a
↓
↓↓
↓ CD19
+
CD23
+a
↓
↓↓
↓ CD19
+
CD5
+
/CD19
+a,c
↑
↑↑
↑ CD19
+
CD5
-
/CD19
+a,c
↑
↑↑
↑ MØ-Like
a,c
↑
↑↑
↑ MØ-Pro
a
↑
↑↑
↑ CD4
+
HLA-DR
+
/CD4
+a
↑
↑↑
↑ CD8
+
HLA-DR
+
/CD8
+a
↓
↓↓
↓ CD3
-
CD16
+
CD56
BRIGTH
/CD56
+a
↑
↑↑
↑ HLA-DR NEU
a
↓
↓↓
↓ CD16 NEU
a,b
↓
↓↓
↓ CCR3 CD8
+a
↓
↓↓
↓ CXCR3
+
CD8
+
/CD8
+a
↓
↓↓
↓ CCR3 MØ
a
↓
↓↓
↓ CXCR4 MØ
a
↓
↓↓
↓ CD19
+a,c
↑
↑↑
↑CD3
+
/CD19
+a
↓
↓↓
↓ CD19
+
CD23
+a
↓
↓↓
↓ CD19
+
CD5
+
/CD19
+a,c
↑
↑↑
↑ CD19
+
CD5
-
/CD19
+a,c
↑
↑↑
↑ MØ-Like
a,c
↑
↑↑
↑ MØ-Pro
a
IRC
IRC
HepC
HepC
+IRC
+IRC
HepC
HepC
Figura 57 - Síntese do padrão e interseção do perfil fenotípico celular e molecular
entre os grupos portadores de hepatite C crônica sem (HepC) e com doença renal as-
sociada (HepC+IRC) e controle renais crônicos (IRC):
A orientação das setas representa elevação ou diminuição de um dos parâmetros em
relação aos grupos NI, IRC, HepC e HepC+IRC, indicados pelas letras “a”, “b”, “c”
e “d”, respectivamente. M∅ = macrófagos.
118
SÍNTESE DA DISCUSSÃO:
Grupos HepC e HepC+IRC:
Os resultados demonstraram perfis distintos de resposta imune entre os portadores de hepatite
C crônica com e sem doença renal avançada associada. Comum a ambos os grupos HepC e
HepC+IRC foi a identificação de maior expressão do marcador HLA-DR em neutrófilos cir-
culantes, assim como em células T auxiliares e citotóxicas, demonstrando a presença de ativa-
ção celular, independente da presença de IRC.
Grupo HepC:
O grupo de portadores de hepatite C crônica com função renal preservada apresentou, de for-
ma particular, aumento da expressão de CXCR3 (quimiocina do tipo 1, normalmente expressa
em linfócitos T ativados, relacionada à produção de IFN-
γ
e TNF-
α
) em linfócitos T auxilia-
res e uma redução da expressão de CCR3 (quimiocina do tipo 2), evidência que contribui para
determinar, especificamente neste grupo, o perfil da resposta imune celular, que é essencial-
mente adaptativa, com predomínio da resposta do tipo 1. Foi demonstrado, em estudos expe-
rimentais, que esse ambiente de produção IFN-
γ
e TNF-
α
correlaciona-se com inflamação e
injúria hepatocelular (DOHERTY & FARRELLY, 2000; FREEMANN et al., 2001)
.
Neste
grupo, 75% dos portadores crônicos do HCV têm ALT (marcador de lise hepatocitária) maior
que duas vezes o LSN e observou-se uma forte correlação positiva entre ALT e grau de ativi-
dade histológica (METAVIR) no grupo em estudo HepC. Resultado interessante foi a presen-
ça no grupo HepC de correlação inversa moderada a forte entre o
percentual de linfócitos T
citotóxicos ativados (células CD8
+
HLA-DR
+
) e a carga viral (PCR quantitativo). REHER-
MANN et al. (1996) evidenciaram que a resposta imune específica por linfócitos T citotóxi-
cos é direcionada para o controle viremia, entretanto envolve mecanismos que, por vezes,
resultam na destruição celular. Foi, ainda, identificada, neste grupo, correlação entre as célu-
las CD8
+
que expressam a quimiocina CXCR3
+
(efetora de quimiotaxia para linfócitos ativa-
dos) e o percentual de linfócitos T citotóxicos ativados periféricos (células CD8
+
HLA-DR
+
),
corroborando para a importância do recrutamento de CD8
+
HLA-DR
+
na infecção crônica pelo
HCV no grupo HepC. Evidências recentes apontam para a estreita relação entre a expressão
119
deste receptor de quimiocinas e a gravidade da atividade inflamatória
tecidual hepática (A-
POLINARIO et al., 2002; CALVINO et al., 2007). É possível que o sistema imune, com o
objetivo de controlar a viremia, promova a injúria hepática e, em face da correlação positiva
encontrada entre o
percentual de células T reguladoras (CD4
+
CD25
HIGH
) e o percentual de
linfócitos T auxiliares ativados (células CD4
+
HLA-DR
+
), haja uma tentativa de controlar essa
resposta imune, dado o papel regulador de CD4
+
CD25
HIGH
(TAAMS et al., 2002).
Grupo HepC+IRC:
Em portadores de hepatite C crônica e insuficiência renal crônica observou-se evidente envol-
vimento global da imunidade inata, principalmente via ativação de monócitos, além da parti-
cipação de células NK, paralelamente à participação da imunidade adaptativa.
O grupo controle IRC, estrategicamente incluído, suporta a hipótese de que o aumento na fre-
qüência da população de monócitos circulantes e sua ativação (CD14
+
CD16
+
HLA-DR
++
) seja
uma característica específica de portadores de IRC. Estudos prévios demonstraram que o con-
tato com a membrana de diálise e bactérias presentes no líquido de diálise promove e perpetua
a ativação anormal de monócitos (PERTOSA et al., 2000; CARRACEDO et al., 2002).
O grupo HepC+IRC apresentou maior freqüência de células NK ativadas (CD3
-
CD16
-
CD56
+
), além de percentual mais elevado de células NK com maior potencial citolítico (au-
mento das células NK CD3
-
CD16
-
CD56
DIM
) e menor produção de IFN-
γ
(diminuição das
células NK CD3
-
CD16
+
CD56
BRIGHT
). Acredita-se que, na infecção crônica pelo VHC, as célu-
las NK com atividade citotóxica (ADCC) desempenham papel protetor, enquanto a produção
de altos níveis de IFN-
γ
seja responsável, preponderantemente, pelo dano tecidual hepático
sobrepondo ao controle da infecção viral (GOLDEN-MASON & ROSEN, 2006). Embora
publicações mais recentes ressaltem a importância da imunidade inata na patogenia da hepati-
te C crônica (CROTTA et al., 2002; PERNOLLET et al., 2002), pesquisas envolvendo a par-
ticipação funcional e subpopulações de células NK são ainda restritas na literatura. Pondera-se
um papel protetor da imunidade inata neste subgrupo, suportado, outrossim, neste perfil fun-
cional das células NK.
120
Em relação à imunidade adaptativa, foi notória a retração no compartimento de linfócitos B
(CD19
+
) nos grupos IRC e HepC+IRC, decorrente da redução do percentual de linfócitos B1
(CD19
+
CD5
+
) na população de linfócitos B totais, paralelamente a uma diminuição no per-
centual de linfócitos B ativados (Células CD19
+
CD23
+
). Estes achados, em conjunto, sugerem
um comprometimento do segmento humoral, tanto dos elementos fenotípicos quanto funcio-
nais, determinado pela doença renal subjacente, em conformidade com os estudos da literatu-
ra. Pesquisas atuais afirmam que parece haver uma deficiência da resposta imune humoral na
doença renal avançada (MEYERS et al., 2003). Destaca-se, também, a correlação positiva
moderada a forte, observada neste grupo, entre o percentual de monócitos pró-inflamatórios
(células CD16
+
CD14
+
DR
++
) e o percentual de linfócitos B (células CD19
+
) do sangue perifé-
rico. Esta correlação pode significar uma tentativa da imunidade inata, através da proliferação
de monócitos pró-inflamatórios (população que é ampliada neste grupo) e produção de citoci-
nas, de estimular a proliferação de linfócitos B e, conseqüentemente, restituir a resposta imu-
ne humoral deficiente. Observou-se correlação inversa entre NKT totais (CD3
+
CD16
+/-
CD56
+/-
) e o tempo provável de infecção pelo HCV, sugerindo a importância destas células na
fase mais precoce da infecção (TAKEDA et al., 2000) ou a sua exaustão pelo tempo prolon-
gado de infecção. Contudo, algumas ponderações merecem ser feitas em relação à análise
geral deste grupo. Sabe-se que a hemodiálise em portadores de IRC sustenta um ambiente
inflamatório contínuo, onde se observa uma exacerbação da resposta imune inata buscando a
ativação da resposta imune adaptativa, que não é, em suma, eficaz. De fato, os estudos de
CARRACEDO et al. (2002) identificaram um processo de senilização precoce dos monócitos
submetidos à ativação constante, reduzindo a sua capacidade funcional, contribuindo para a
deficiência na estimulação da resposta imune adaptativa.
Observou-se aumento no percentual de linfócitos T ativados (células CD4
+
HLA-DR
+
e célu-
las CD8
+
HLA-DR
+
) neste grupo, assim como em HepC. Ressalva-se, entretanto, que há redu-
ção, de forma global, da expressão de receptores de quimiocinas nos linfócitos CD4
+
e CD8
+
no grupo Hep+IRC, em especial CXCR3 e CXCR4, moléculas quimiotáticas para linfócitos,
podendo esse achado caracterizar uma menor migração dessas células para o fígado. Relem-
bra-se que os linfócitos intra-hepáticos não sofrem expansão clonal no fígado, mas migram a
partir de sítios extra-hepáticos para o órgão cronicamente infectado, sugerindo que a manu-
tenção da população de linfócitos intra-hepáticos depende de migração contínua (VALIANTE
et al., 2000). Uma interessante correlação inversa moderada a forte entre o percentual de lin-
121
fócitos T auxiliares ativados (células CD4
+
HLA-DR
+
) periféricos, como também, entre o per-
centual de linfócitos T citotóxicos ativados (células CD8
+
HLA-DR
+
) e ALT foi demonstrada
somente no grupo HepC+IRC. Tem-se descrito que cerca de 70% dos portadores de IRC in-
fectados pelo HCV apresentam ALT normal (MEYERS et al., 2003). Interessante foi a identi-
ficação, neste estudo, que somente os pacientes renais crônicos com ALT acima do LSN
(n=4) apresentaram menores percentuais de células CD4
+
HLA-DR
+
e CD8
+
HLA-DR
+
perifé-
ricas. Explicações possíveis para este fato são a provável maior migração dos linfócitos ativa-
dos para o compartimento hepático (causando maior lise hepatocitária) ou um perfil funcional
de resposta imune (polarização ou ativação) divergente. Através do emprego de gráficos de
dispersão e da avaliação direta no banco de dados, observa-se que estes quatro portadores de
HepC+IRC com ALT elevada apresentam comportamento fenotípico bastante próximo do
grupo HepC, em detrimento à IRC. Finalmente, demonstrou-se correlação inversa moderada
entre o percentual de células T reguladoras (CD4
+
CD25
HIGH
) e o percentual de linfócitos T
citotóxicos ativados (células CD8
+
HLA-DR
+
) periféricos, exclusivamente no grupo
HepC+IRC. Está demonstrado que as células T reguladoras CD4
+
CD25
HIGH
periféricas su-
primem a produção de IFN-
γ
por linfócitos T citotóxicos CD8
+
, tornando-os menos efetivos.
No âmbito que a atividade citotóxica destas células é importante mediadora, outrossim, da
injúria hepática, esta correlação é bastante relevante, haja vista que este grupo apresenta lesão
hepatocelular menos intensa. Uma segunda ponderação, com bases nestes achados, é pertinen-
te. Os pacientes portadores de hepatite C crônica e insuficiência renal apresentam, em sua
maioria, ALT normal e lesão hepática histológica menos intensa, conforme descrito na litera-
tura (MEYERS et al., 2003). Numa visão ampliada, os resultados acima apresentados suge-
rem que o grupo HepC+IRC apresenta uma resposta adaptativa deficiente ou são mais imuno-
tolerantes, refletindo no grau de lesão inflamatória hepática. LIBETTA et al. (2001) descreve-
ram que a uremia promove uma configuração do perfil de citocinas que deprime a imunidade
celular, também em concordância, YOON et al. (2006) identificaram que a doença renal a-
vançada resulta no aumento da apoptose e na diminuição das populações de linfócitos T vir-
gens e de memória. Associadamente, estes pacientes, submetidos a consecutivas sessões de
hemodiálise, podem sofrer sucessivas perdas de moléculas de baixo peso molecular, tais como
citocinas e quimiocinas.
Contudo, para melhor esclarecimento dos achados deste estudo, postula-se que a avaliação do
perfil das citocinas produzidas pelos leucócitos no sangue periférico, bem como das citocinas
122
solúveis no plasma, e a análise comparativa dos parâmetros fenotípicos no compartimento
hepático sejam objetos de futuras linhas de pesquisa, visando o aprimoramento e o amadure-
cimento das concepções propostas sobre a resposta imune no contexto da infecção crônica
pelo HCV, todavia restringindo as limitações deste trabalho porventura existentes.
Não foram encontrados estudos, na literatura, contendo esta análise de perfil abrangente, en-
volvendo hepatite C crônica e/ou IRC. Acredita-se que mecanismos múltiplos estejam atuan-
do de forma diferenciada, acoplando eventos protetores ou indutores de danos teciduais, en-
volvendo distintos compartimentos do sistema imune, bem como diferentes tipos celulares, na
orquestração da imunopatogenia na infecção crônica pelo vírus da hepatite C.
À luz do conhecimento da complexidade do sistema imune, enfatiza-se a importância da
compreensão de suas interações no contexto do balanço entre padrões da resposta imune in-
flamatória e moduladora não como mecanismos polares, isolados e independentes, mas sim
como uma resultante do predomínio de um ou outro tipo de resposta imune. Concluindo, este
estudo submete à seguinte reflexão (WRIGHT & DARLING, 2004): “Resposta imune na he-
patite C: o problema é o vírus ou o hospedeiro?”
123
6. CONCLUSÕES:
Os resultados demonstraram perfis distintos de resposta imune entre os portadores de hepatite
C crônica com e sem doença renal avançada. Paralelamente, foram encontrados parâmetros
fenotípicos relacionados, exclusivamente, à presença de infecção crônica pelo vírus da hepati-
te C, comuns a ambos os grupos, além de parâmetros fenotípicos particularmente determina-
dos e que se preservam na presença da insuficiência renal crônica subjacente.
A. Em relação à freqüência de populações e subpopulações de leucócitos do sangue periférico
envolvidos na resposta imune inata e adaptativa:
•
o grupo de portadores de hepatite C crônica e insuficiência renal crônica apre-
sentou evidente envolvimento global da imunidade inata, principalmente via a-
tivação de monócitos (CD14
+
CD16
+
HLA-DR
++
), sendo esta uma característica
da doença renal crônica que se preserva na vigência da infecção pelo HCV. Es-
te grupo, além de apresentar maior freqüência de células NK ativadas (CD3
-
CD16
-
CD56
+
), apresenta ainda percentual mais elevado de células NK com
maior potencial citolítico (NK CD3
-
CD16
-
CD56
DIM
) e menor produção de
IFN-
γ
(NK CD3
-
CD16
+
CD56
BRIGHT
);
•
sobre a imunidade adaptativa, observou-se significante retração no comparti-
mento de linfócitos B (CD19
+
) nos grupos com insuficiência renal crônica, de-
corrente da redução do percentual de linfócitos B1 (CD19
+
CD5
+
), independen-
temente da presença de infecção crônica pelo vírus da hepatite C.
B. Considerando a expressão de marcadores de ativação de leucócitos do sangue periférico:
•
ambos os grupos HepC e HepC+IRC apresentaram maior expressão do marca-
dor HLA-DR em neutrófilos circulantes;
•
não houve diferença na freqüência de populações e subpopulações de linfócitos
T (CD3
+
), entretanto, a ativação de células T auxiliares (CD4
+
HLA-DR
+
) e ci-
totóxicas (CD8
+
HLA-DR
+
) foi comum a ambos os grupos portadores de hepa-
tite C crônica, independentemente da presença de insuficiência renal;
124
•
a expressão da molécula de ativação HLA-DR em linfócitos B foi semelhante
entre os grupos estudados e identificou-se redução do percentual de linfócitos
B ativados (Células CD19
+
CD23
+
) no grupo de portadores de hepatite C crôni-
ca e doença renal associada.
C. Sobre a expressão dos marcadores de regulação da resposta imune em leucócitos circulan-
tes:
•
encontrou-se diferença significativa na expressão de receptores de imunoglo-
bulinas em células da imunidade inata, de forma particular e diversificada em
cada grupo, não estabelecendo um perfil definido;
•
não se observou diferença na freqüência de células T reguladoras
(CD4
+
CD25
HIGH
) e na expressão de CD32 (Fc
γ
RII) em linfócitos B nos grupos
de pacientes portadores de hepatite C crônica, com e sem insuficiência renal
crônica associada.
D. Com referência à expressão dos receptores de quimiocinas:
•
o grupo de portadores de hepatite C crônica com função renal preservada apre-
sentou, de forma exclusiva, aumento da expressão de CXCR3 (quimiocina do
tipo 1) em linfócitos T auxiliares e redução da expressão de CCR3 (quimiocina
do tipo 2);
•
observou-se redução, de forma global, da expressão de receptores de quimioci-
nas nos linfócitos CD4
+
e CD8
+
no grupo de portadores de infecção crônica pe-
lo vírus C e insuficiência renal crônica, em especial CXCR3 e CXCR4 (quimi-
otáticas para linfócitos).
E. Sobre as análises de correlação realizadas entre os parâmetros fenotípicos abordados no
estudo e as variáveis epidemiológicas, laboratoriais e histológicas:
•
o grupo de portadores de hepatite C crônica e função renal preservada apresen-
tou correlação inversa entre o percentual de linfócitos T citotóxicos ativados
(células CD8
+
HLA-DR
+
) e a carga viral (PCR quantitativo). Foi identificada,
125
neste grupo, correlação positiva entre as células CD8
+
que expressam a quimi-
ocina CXCR3
+
(efetora de quimiotaxia para linfócitos ativados) e o percentual
de linfócitos T citotóxicos ativados periféricos (células CD8
+
HLA-DR
+
) e en-
tre o percentual de células T reguladoras (CD4
+
CD25
HIGH)
e o percentual de
linfócitos T auxiliares ativados (células CD4
+
HLA-DR
+
);
•
demonstrou-se correlação positiva, no grupo de portadores de hepatite C crôni-
ca e insuficiência renal, entre o percentual de monócitos pró-inflamatórios (cé-
lulas CD16
+
CD14
+
DR
++
) e o percentual de linfócitos B (células CD19
+
) do
sangue periférico. Correlação inversa entre o percentual de linfócitos T auxilia-
res ativados (células CD4
+
HLA-DR
+
) periféricos, como também, entre o per-
centual de linfócitos T citotóxicos ativados (células CD8
+
HLA-DR
+
) e ALT foi
demonstrada somente nesse grupo. Foi identificada, também, correlação inver-
sa entre o percentual de células T reguladoras (CD4
+
CD25
HIGH
) e o percentual
de linfócitos T citotóxicos ativados (células CD8
+
HLA-DR
+
) periféricos.
126
CONTRIBUIÇÕES DO ESTUDO:
1.
Os distintos padrões específicos da resposta imune observados nesta investigação
contribuem para a maior compreensão das diferenças na apresentação e evolução da
hepatite C crônica em indivíduos com e sem doença renal avançada;
2.
Esta pesquisa apoia o estudo de marcadores séricos não invasivos de inflamação e
de resposta terapêutica em grupos distintos de indivíduos infectados pelo vírus C,
através de imunofenotipagem, haja vista que existe correlação entre fenótipos celu-
lares, inflamação e lesão histológica hepática, corroborando com os estudos dessa
linha;
3.
Estimula futuras pesquisas, abordando aspectos funcionais, tais como o estudo do
perfil de citocinas, contribuindo para um melhor e mais abrangente entendimento da
resposta imune nestes grupos particulares, além da análise comparativa dos parâme-
tros fenotípicos no compartimento hepático;
4.
Demonstra que a hepatite C crônica é uma doença individualizada e complexa, em
relação à resposta imunológica, e que assim também deverá ser o futuro da terapêu-
tica;
5.
Como abordagem ampla da resposta imune, pode contribuir para futura identifica-
ção de pontos críticos da imunopatogenia, relativos à implementação de agentes te-
rapêuticos e de vacinas;
6.
Trata-se de uma análise abrangente e pioneira da resposta imune, que, conseqüen-
temente, abriu caminhos para diversos projetos em nosso grupo, com o propósito de
uma melhor elucidação sobre os resultados obtidos;
7.
Ressalta-se que a revisão literatura, realizada para esta investigação, resultou em
um capítulo sobre resposta imune na hepatite C. Uma análise parcial deste estudo
foi selecionada para apresentação no Congresso da EASL-2007 na Espanha, sendo
o resumo publicado no periódico Journal of Hepatology;
127
8.
Este trabalho foi vencedor do Prêmio “Luiz Carlos da Costa Gayotto” – melhor tra-
balho de pesquisa em área básica, no XIX Congresso Brasileiro de Hepatologia,
sendo, automaticamente, o resumo expandido aceito para publicação na GED – Re-
vista de Gastroenterologia e Endoscopia Digestiva.
128
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140
8. ANEXOS:
FICHA DE AVALIAÇÃO CLÍNICO-EPIDEMIOLÓGICA DOADORES DE SANGUE
1. Identificação do paciente:
Nome: ______________________________________________________ IDsoro: _____________
Sexo: 0=Feminino 1=masculino
Cor: 0= Branca 1=não Branca
Idade:_______ DN: ___/___/____
2. HB:
3. Sorologia para hepatites
HbsAg
0=Negativo 1=Positivo
Anti-HBc total
0=Negativo 1=Positivo
Anti- HCV
0=Negativo 1=Positivo
Anti-HIV
0=Negativo 1=Positivo
4.
Etilismo:
____g/dia etanol
141
FICHA DE AVALIAÇÃO CLÍNICO-EPIDEMIOLÓGICA DE PACIENTES PORTADO-
RES DE IRC
Identificação do paciente:
Nome: ______________________________________________________ IDsoro: _____________
Sexo: 0=Feminino 1=masculino
Cor: 0= Branca 1= não Branca
Idade:_______ DN: ___/___/____
1.
Informações sobre a IRC e hemodiálise
Tempo de diagnóstico IRC(anos): ___________________ Causa da IRC:___________________
Tempo de hemodiálise (anos): _________
2.
Número de transfusões sanguíneas (meses) ______ Tempo: ______________
3.
ALT:
______ g/dl - N___
AST:
________g/dl - N___
4. Etilismo:
____g/dia etanol
5. Sorologia:
HbsAg
0=Negativo 1=Positivo
Anti-HBc total
0=Negativo 1=Positivo
Anti-HBS
0=Negativo 1=Positivo
Anti- HCV
0=Negativo 1=Positivo
Anti-HIV
0=Negativo 1=Positivo
142
FICHA DE AVALIAÇÃO CLÍNICO-EPIDEMIOLÓGICA DE PACIENTES PORTADO-
RES DE HEPATITE C CRÔNICA
Identificação do paciente:
Nome: ______________________________________________________ IDsoro: _____________
Sexo: 0=Feminino 1=masculino
Cor: 0= Branca 1=não Branca
Idade:_______ DN: ___/___/____
1.
Identificação epidemiológica
Fatores de risco para o HCV:
1. Transfusão sanguínea 2. Tatuagens 3. Droga Injetável 4. Acidente biológico
5. Promiscuidade sexual 6. Cirugia 7. Não identificado
8. Outros: __________________________________________________
Tempo diagnóstico (anos): Epidemiológico: _____________ da doença Hepatite C:_______________
Etilismo: ____g/dia etanol
2.
ALT: ________
g/dl - ____ X LSN
3.
AST: ________
g/dl - ____ X LSN
4. Sorologia:
HbsAg
0=Negativo 1=Positivo
Anti-HBc total
0=Negativo 1=Positivo
Anti-HBS
0=Negativo 1=Positivo
Anti- HCV
0=Negativo 1=Positivo
Anti-HIV
0=Negativo 1=Positivo
5. Diagnóstico Molecular do HCV:
Genótipo: ______
Data: _____________________ PCR qualitativo:
0=Negativo
1=Positivo
Data: _____________________ PCR quantitativo: ________________________UI/ml
6. Histologia: A___ F____
143
FICHA DE AVALIAÇÃO CLÍNICO-EPIDEMIOLÓGICA DE PACIENTES PORTADO-
RES DE HEPATITE C CRÔNICA e IRC
Identificação do paciente:
Nome: ______________________________________________________ IDsoro: _____________
Sexo: 0=Feminino 1=masculino
Cor: 0= Branca 1=não Branca
Idade:_______ DN: ___/___/____
1.
Identificação epidemiológica
Fatores de risco para o HCV:
1. Transfusão sanguínea 2. Tatuagens 3. Droga Injetável 4. Acidente biológico
5. Promiscuidade sexual 6. Cirurgia 7. Não identificado
8. Outros: __________________________________________________
Tempo diagnóstico(anos): Epidemiológico: _____________ da doença Hepatite C:_______________
Etilismo: ____g/dia etanol
2. Informações sobre a IRC e hemodiálise
Tempo de diagnóstico IRC (anos): ___________________ Causa da IRC:___________________
Tempo de hemodiálise (anos): _________
3. Número de transfusões sanguíneas: ______ Tempo(anos): _________________
4. ALT: ________ - ____ X LSN
5. AST: ________ - ____ X LSN
6. Sorologia para hepatites
HbsAg
0=Negativo 1=Positivo
Anti-HBc total
0=Negativo 1=Positivo
Anti-HBS
0=Negativo 1=Positivo
Anti- HCV
0=Negativo 1=Positivo
Anti-HIV
0=Negativo 1=Positivo
7. Diagnóstico Molecular do HCV:
Genótipo: ______
Data: _____________________PCR qualitativo: 0=Negativo 1=Positivo
Data: _____________________PCR quantitativo: ___________________________ UI/ml
8. Histologia: A___ F____
144
Consentimento para Participação dos Doadores da Fundação Hemominas
Avaliação De Parâmetros Fenotípicos Celulares de Leucócitos do San-
gue Periférico em Indivíduos Cronicamente Infectados pelo Vírus da He-
patite C
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA PESQUISA
Prezado(a) paciente,
Você foi selecionado(a) para participar de uma pesquisa por ser doador de sangue saudável.
O objetivo deste estudo é analisar a resposta dos portadores desta infecção pelo vírus da hepa-
tite C e as diferentes formas de apresentação desta doença, comparando-os com indivíduos saldáveis.
O conhecimento desses dados nos permitirá conhecer melhor a evolução da doença e orientar aos
portadores desse vírus.
Sua participação nesse estudo é completamente voluntária.
Caso concorde em participar da pesquisa, precisaremos usar uma única amostra de sangue (5
mL) colhida em uma veia do seu braço por um profissional treinado. O sangue colhido será usado
exclusivamente para os exames propostos nesta pesquisa.
Faremos o máximo para minimizar os riscos e desconfortos desconfortos (dor e manchas arro-
xeadas no local da punção). Todos os dados coletados são sigilosos. Você poderá tirar as dúvidas a
respeito desse estudo em qualquer momento no decorrer da pesquisa. Os dados encontrados no estudo
serão informados para você durante o estudo.
Caso você não queira participar do estudo, sinta-se livre para fazê-lo, sem nenhum prejuízo
para você.
Se você necessitar de mais esclarecimentos a respeito desta pesquisa, por favor, entre em con-
tato com o Dra. Kátia Barbosa pelo telefone (031) 3248-9820. Caso tenha dúvidas sobre o aspecto
ético ou o andamento da pesquisa, entre em contato com o Comitê de Ética em pesquisa do HEMO-
MINAS, que a aprovou.
Eu, ____________________________________, concordo em participar do estudo.
_______________________________________________ ( __ __ __ )
Paciente
_______________________________________________
Pesquisador Responsável
Belo Horizonte, _____ de ___________________de 2004
145
Consentimento para Participação dos Pacientes do Hospital das Clínicas
Avaliação De Parâmetros Fenotípicos Celulares de Leucócitos do San-
gue Periférico em Indivíduos Cronicamente Infectados pelo Vírus da He-
patite C
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA PESQUISA
Prezado(a) paciente,
Você foi selecionado(a) para participar de uma pesquisa por ser paciente do ambulatório de
Hepatites do Instituto Alfa de Gastroenterologia do Hospital das Clínicas por ser portador do vírus da
hepatite C.
O objetivo deste estudo é analisar a resposta do seu organismo a infecção por este vírus e as
diferentes formas de apresentação desta doença. O conhecimento desses dados nos permitirá conhecer
melhor a evolução da doença e orientar os portadores desse vírus.
Sua participação nesse estudo é completamente voluntária.
Caso concorde em participar da pesquisa, precisaremos usar uma única amostra de sangue
(5mL) colhida em uma veia do seu braço por um profissional treinado. O sangue colhido será usado
exclusivamente para os exames propostos nesta pesquisa. Iremos também consultar os dados de seu
prontuário e você responderá a um questionário durante a entrevista médica.
Faremos o máximo para minimizar os riscos e desconfortos desconfortos (dor e manchas arro-
xeadas no local da punção). Todos os dados coletados são sigilosos. Você poderá tirar as dúvidas a
respeito desse estudo em qualquer momento no decorrer da pesquisa. Os dados encontrados no estudo
serão informados para você durante o estudo.
Caso você não queira participar do estudo, sinta-se livre para fazê-lo, sem nenhum prejuízo
para você.
Se você necessitar de mais esclarecimentos a respeito desta pesquisa, por favor, entre em con-
tato com o Dr. Kátia Barbosa pelo telefone (031) 3248-9820. Caso tenha dúvidas sobre o aspecto ético
ou o andamento da pesquisa, entre em contato com o Comitê de Ética em pesquisa da UFMG.
Eu, ____________________________________, concordo em participar do estudo.
_______________________________________________ ( __ __ __ )
Paciente
_______________________________________________
Pesquisador Responsável
Belo Horizonte, _____ de ___________________de 2004
146
Termo de consentimento para pacientes portadores de insuficiência renal crônica:
Avaliação De Parâmetros Fenotípicos Celulares de Leucócitos do
Sangue Periférico em Indivíduos Cronicamente Infectados pelo Ví-
rus da Hepatite C
Prezado(a) paciente,
Você foi convidado(a) para participar de uma pesquisa por ser portador de doença renal crôni-
ca e não apresentar hepatite B ou C. O objetivo deste estudo é analisar a resposta dos pacientes com
doença renal crônica e portadores da infecção pelo vírus da hepatite C e as diferentes formas de apre-
sentação desta doença, comparando-os com indivíduos saudáveis. O conhecimento desses dados nos
permitirá conhecer melhor a evolução da doença e orientar aos portadores desse vírus.
Sua participação nesse estudo é completamente voluntária.
Caso concorde em participar da pesquisa, precisaremos usar uma única amostra de sangue (5
mL) colhida em uma veia do seu braço por um profissional treinado. O sangue colhido será usado
exclusivamente para os exames propostos nesta pesquisa. Este exame não lhe traz riscos, o material
utilizado será descartável e a coleta será realizada por um técnico que tem experiência na realização
deste procedimento. Você deve apresentar todas as suas dúvidas à coordenadora deste projeto ou à
equipe médica do ambulatório. Você poderá abandonar o projeto, em qualquer época, sem qualquer
prejuízo pois a sua assistência médica está assegurada mesmo que não participe deste projeto.
Faremos o máximo para minimizar os riscos e desconfortos (dor e manchas arroxeadas no lo-
cal da punção). Todos os dados coletados são sigilosos. Você poderá tirar as dúvidas a respeito desse
estudo em qualquer momento no decorrer da pesquisa. Os dados encontrados no estudo serão infor-
mados para você durante o estudo.
Caso você não queira participar do estudo, sinta-se livre para fazê-lo, sem nenhum prejuízo
para você.
Se você necessitar de mais esclarecimentos a respeito desta pesquisa, por favor, entre em con-
tato com o Dra. Kátia Barbosa pelo telefone (031) 3248-9820. Caso tenha dúvidas sobre o aspecto
ético ou o andamento da pesquisa, entre em contato com o Comitê de Ética em pesquisa da UFMG,
que a aprovou.
Eu, ____________________________________, concordo em participar do estudo.
______________________________________________ ( __ __ __ )
Paciente
_______________________________________________
Pesquisador Responsável
Belo Horizonte, _____ de ___________________de 2004
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