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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
ESTUDO DAS PROPRIEDADES FARMACOLÓGICAS DA
RESINA DE Protium heptaphyllum (Aubl.) March. E DE
SEUS PRINCIPAIS CONSTITUINTES, MISTURA DE
α- E β-AMIRINA
Francisco de Assis Oliveira
Fortaleza – CE
2005
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
ESTUDO DAS PROPRIEDADES FARMACOLÓGICAS DA
RESINA DE Protium heptaphyllum (Aubl.) March. E DE SEUS
PRINCIPAIS CONSTITUINTES, MISTURA DE
α- E β-AMIRINA
Francisco de Assis Oliveira
Tese submetida à coordenação do curso de Pós-
Graduação em Farmacologia, do Departamento de
Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da
Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial
para a obtenção do título de Doutor em Farmacologia.
Orientador: Prof. Vietla Satyanarayana Rao
Fortaleza – CE
2005
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Esta tese foi submetida como parte integrante dos requisitos necessários a
obtenção do Grau de Doutor em Farmacologia, outorgado pela Universidade Federal
do Ceará e encontra-se a disposição dos interessados na biblioteca da Faculdade de
Medicina da referida universidade.
A citação de qualquer trecho desta Tese é permitida, desde que seja feita
de conformidade com as normas da ética.
_____________________________________
Francisco de Assis Oliveira
Tese aprovada em: 24/06/2005
____________________________________
Prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao
(Orientador)
____________________________________
Prof. Dr. João Batista Calixto (UFSC)
____________________________________
Prof. Dr. Reinaldo Nóbrega de Almeida (UFPB)
____________________________________
Profa. Dra.Glauce Socorro Barros Viana (UFC)
____________________________________
Prof. Dr Carlos Maurício de Castro Costa (UFC)
O47e Oliveira, Francisco de Assis
Estudo das propriedades farmacológicas da resina de
Protium heptaphyllum (Aubl.) March. e de seus
principais constituintes, mistura de -e -amirina. /
Francisco de Assis Oliveira / Fortaleza, 2005.
237 f.: il.
Orientador: Prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao.
Tese (Doutorado). Universidade Federal do Ceará. Curso
de Pós-graduação em Farmacologia
1. Bursearaceae. 2. Plantas medicinais. 3.
Farmacologia. 4. Triterpenos. 5. Receptor TRPV1.
CDD 615.32324
A Deus fonte de força e esperança;
Aos meus pais, Alcides (in memorian) e Elisa;
Aos meus irmãos;
A Waleska, minha esposa e companheira.
Dedico
“Outras formas de descobertas dos efeitos terapêuticos das plantas
se encontram em inúmeras práticas, tais como: o uso de amuletos,
a cura por meio de orações que, muitas vezes, utilizam plantas para
o benzimento, em rituais africanos, indí
g
enas e outros. Todas essas
manifestações contribuíram,
g
raças ao seu componente empírico,
com a seleção e a incorporação de espécies ve
g
etais como plantas
medicinais eficazes. Estes exemplos mostram-se suficientes para
caracterizar a importância e a relevância, não apenas dos ma
g
os,
bruxos, feiticeiros e alquimistas, mas também do conhecimento
disseminado por toda a população, os quais contribuem
amplamente para o conhecimento da natureza e servem como
subsídio básico, e de extremo valor, para a seleção de plantas
medicinais para estudos detalhados voltados para a obtenção de
novos medicamentos.” (Di Stasi)
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Vietla Satyanarayana Rao, pela orientação, estímulo e dedicação
durante a realização deste trabalho. Meu muito obrigado.
À Universidade Federal do Piauí pelo afastamento concedido durante o
período da qualificação.
À Profa. Fernanda Regina (UFPI) e à Silvéria Lira pelo incentivo no início
desta jornada.
À Profa. Mariana Helena Chaves (UFPI) pelo fornecimento dos produtos de
Protium heptaphyllum e apoio durante todo o trabalho.
À Profa Gerly Anne de Castro Brito pela colaboração nos trabalhos de análise
histológica.
À Profa Glauce Socorro Barros Viana pela utilização do laboratório.
Ao Prof. Pedro Jorge Caldas Magalhães pelo fornecimento do vermelho de
rutênio.
Aos meus amigos da Pós-graduação Regilane, Roberto, Jeferson, Adriana
Rolim, Luilma, Karina e Juliana.
Gostaria de agradecer, de forma especial, aos amigos Regilane Matos (NC) e
Roberto César (Bob) pela imprescindível e imensurável ajuda na realização deste
trabalho. A vocês dois, meu reconhecimento e o meu muito obrigado.
Meu agradecimento aos bolsistas e ex-bolsistas do Laboratório de Produtos Naturais
Mariana, Kelcyana, Alana, Lívia, Ítalo, Bruno, Cinthia, Fabrício, Deive, Jonny, Hermes, Wilcare,
Rafaela pela ajuda nos experimentos e pelos momentos de alegria.
À Karina Marques e Aline Bastos pela colaboração técnica, apesar do pouco
tempo de convivência no LPN.
Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da UFC, em
especial a Rose, Íris, Chiquinho, Fernando e Edmilson.
À Sílvia Maria e Áura Farias, pela disponibilidade, amizade no decorrer do
curso de Pós-Graduação.
À Profa Flávia Almeida Santos pela ajuda no início dos trabalhos.
À todos os Professores do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da UFC que direta
ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.
À CAPES/PROCAD pelo suporte financeiro.
SUMÁRIO
Lista de Abreviaturas
xiv
Lista de Figuras
xvi
Lista de Tabelas
xix
RESUMO
xxii
ABSTRACT
xxiv
1. INTRODUÇÃO 01
1.1. Os produtos naturais e sua importância como fonte de novos
medicamentos.
01
1.2. Biodiversidade 09
1.3. Resinas naturais 11
1.4. Terpenos 13
1.4.1. Monoterpenos 14
1.4.2. Sesquiterpenos 15
1.4.3. Diterpenos 15
1.4.4. Triterpenos 16
1.4.5. Tetraterpenos e carotenóides 17
1.5. Triterpenos e atividade biológica 17
1.5.1. Atividade antiinflamatória e antinociceptiva 18
1.5.2. Atividade gastroprotetora 25
1.5.3. Atividade hepatoprotetora 31
1.5.4. Neurônios sensoriais aferentes, receptores vanilóides e seus
papéis na gastroproteção e nocicepção visceral 35
1.5.5. Outras atividades 42
1.6. Protium heptaphyllum 44
1.6.1. Considerações botânicas 44
1.6.2. Usos populares 45
1.6.3. Química e farmacologia de Protium spp 47
2. OBJETIVOS 53
3. MATERIAL 55
3.1. Material botânico 55
3.2. Animais experimentais 58
3.3. Drogas e reagentes 58
3.4. Aparelhos 60
4. MÉTODOS
61
4.1. QUÍMICOS
61
4.2. TOXICIDADE AGUDA
61
4.2.1. Toxicidade aguda para camundongos 61
4.2.2. Toxicidade aguda para camarão de salmoura (Artemia sp) 62
4.3. ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA
63
4.3.1. Efeito da resina de P. heptaphyllum no edema de pata
induzido por carragenina 65
4.3.2. Efeito da resina de P. heptaphyllum no granuloma induzido
por “pellet” de algodão 64
4.3.3. Efeito da resina de P. heptaphyllum no aumento de
permeabilidade vascular induzido por ácido acético 63
4.4. ATIVIDADE GASTROPROTERORA
71
4.4.1. Efeito da resina de P. heptaphyllum na úlcera gástrica
induzida por etanol 71
4.4.2. Efeito da resina de P. heptaphyllum na úlcera gástrica
induzida por etanol acidificado 72
4.4.3. Efeito da resina de P. heptaphyllum sobre a secreção gástrica
em modelo de ligação do piloro 73
4.4.4. Efeito da resina de P. heptaphyllum na úlcera gástrica
induzida por indometacina
4.4.5. Efeito da mistura de - e -amirina na úlcera gástrica induzida
por etanol: papel dos neurônios aferentes primários sensíveis à
capsaicina
73
4.5. ATIVIDADE ANTIPRURIGINOSA
68
4.5.1. Efeito da mistura de - e -amirina no prurido induzido por
dextrana T40
68
4.5.2. Efeito da mistura de - e -amirina no prurido induzido pelo
composto 48/80
69
4.5.3. Efeito do antagonista da naloxona sobre a atividade
antirpuriginosa da mistura de - e -amirina ou morfina no prurido
induzido pelo composto 48/80
69
4.5.4. Efeito da mistura de - e -amirina sobre a degranulação de
mastócitos ex vivo
70
4.5.5. Efeito da mistura de - e -amirina no edema de pata induzido
por dextrana
67
4.5.6. Efeito da mistura de - e -amirina no edema de pata induzido
pelo composto 48/80
66
4.5.7. Efeito da mistura de - e -amirina no edema de pata induzido
por histamina
65
4.5.8. Efeito da mistura de - e -amirina no edema de pata induzido
por serotonina
66
4.6. ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA
74
4.6.1. Efeito da mistura de - e -amirina na nocicepção induzida
pela capsaicina
75
4.6.2. Efeito da mistura de - e -amirinas na nocicepção induzida
pela administração intracolônica de capsaicina (nocicepção
visceral)
76
4.6.3. Efeito da mistura de - e -amirina sobre a resposta térmica
induzida por capsaicina
77
4.7. ATIVIDADE HEPATOPROTETORA
77
4.7.1. Efeito da mistura de - e -amirina na hepatoxicidade
induzida pelo acetaminofeno em camundongos
78
4.7.2. Efeito da mistura de - e -amirinas na hepatoxicidade
induzida por D-Galactosamina/Lipopolissacarídeo em
camundongos.
79
4.7.3. Avaliação histopatológica 80
4.8. AVALIAÇÃO DA MISTURA DE α- E β-AMIRINA NOS
TESTES DE ROTA-ROD, CAMPO ABERTO E TEMPO DE
SONO
81
4.8.1. Efeito da mistura de - e -amirina sobre a coordenação
motora de camundongos
81
4.8.2. Efeito da mistura de - e -amirinas sobre a atividade
exploratória
82
4.8.3. Efeito da mistura de - e -amirinas sobre o tempo de sono
induzido por pentobarbital sódico
82
4.9. Efeito da mistura de α- e β-amirina sobre os grupos sulfidrílas
não protéicos (NP-SH)
83
4.10. ANÁLISE ESTATÍSTICA
84
5. RESULTADOS
85
5.1. TOXICIDADE AGUDA
85
5.1.1. Toxicidade aguda para camundongos 85
5.1.2. Toxicidade aguda para Artemia sp 85
5.2. ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA
86
5.2.1. Efeito da resina de P. heptaphyllum no edema de pata
induzido por carragenina 92
5.2.2. Efeito da resina de P. heptaphyllum no granuloma induzido
por “pellet” de algodão 89
5.2.3. Efeito da resina de P. heptaphyllum no aumento de
permeabilidade vascular induzido por ácido acético 86
5.3. ATIVIDADE GASTROPROTERORA
120
5.3.1. Efeito da resina de P. heptaphyllum na úlcera gástrica
induzida por etanol 120
5.3.2. Efeito da resina de P. heptaphyllum na úlcera gástrica
induzida por etanol acidificado 125
5.3.3. Efeito da resina de P. heptaphyllum sobre a secreção gástrica
em modelo de ligação do piloro 128
5.3.4. Efeito da resina de P. heptaphyllum na úlcera gástrica
induzida por indometacina
5.3.5. Efeito da mistura de - e -amirina na úlcera gástrica induzida
por etanol: papel dos neurônios aferentes primários sensíveis à
capsaicina
132
5.4. ATIVIDADE ANTIPRURIGINOSA
107
5.4.1. Efeito da mistura de - e -amirina no prurido induzido por
dextrana T40
107
5.4.2. Efeito da mistura de - e -amirina no prurido induzido pelo
composto 48/80
110
5.4.3. Efeito da naloxona (antagonista de receptor opióide) sobre a
atividade antirpuriginosa da mistura de - e -amirina ou morfina
no prurido induzido pelo composto 48/80
113
5.4.4. Efeito da mistura de - e -amirina sobre a degranulação de
mastócitos ex vivo
116
5.4.5. Efeito da mistura de - e -amirina no edema de pata induzido
por dextrana
104
5.4.6. Efeito da mistura de - e -amirina no edema de pata induzido
pelo composto 48/80
101
5.4.7. Efeito da mistura de - e -amirinas no edema de pata
induzido por histamina
95
5.4.8. Efeito da mistura de - e -amirina no edema de pata induzido
por serotonina
98
5.5. ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA
139
5.5.1. Efeito da mistura de - e -amirina na nocicepção induzida
pela capsaicina
139
5.5.2. Efeito da mistura de - e -amirina na nocicepção induzida pela
administração intracolônica de capsaicina (nocicepção visceral)
144
5.5.3. Efeito da mistura de - e -amirina sobre a resposta térmica
induzida por capsaicina
147
5.6. ATIVIDADE HEPATOPROTETORA
150
5.6.1. Efeito da mistura de - e -amirina na hepatoxicidade
induzida pelo acetaminofeno
150
5.6.2. Efeito da mistura de - e -amirina na hepatoxicidade
induzida por D-Galactosamina/Lipopolissacarídeo em
camundongos
158
5.7. ATIVIDADE DA MISTURA DE α- E β-AMIRINA NOS
TESTES DE ROTA-ROD, CAMPO ABERTO E TEMPO DE
SONO
166
6. DISCUSSÃO
170
7. CONCLUSÕES
202
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
205
9. ANEXO –RELAÇÃO DOS ARTIGOS PUBLICADOS A PARTIR
DOS ESTUDOS REALIZADOS COM A RESINA E A
MISTURA DE TRITERPENOS α- E β-AMIRINA
ISOLADAS DE Protium heptaphyllum (Aubl.) March.
(Bursearaceae).
LISTA DE ABREVIATURAS
% Percentagem
AAS Ácido acetil salicílico
Abs Absorbância
ALT Alanina Aminotransferase
ANOVA Análise de variância
AST Aspartato Aminotransferase
CCD Cromatografia de Camada Delgada
CL
50
Concentração Letal 50%
cm Centímetro
DL
50
Dose letal 50%
DTNB 5,5’- dithil-bis (2-nitrobenzoic acid)
E. P. M. Erro Padrão da Média
EDTA Ácido Etilenodiaminotetraacético sal dissódico
FM Fórmula molecular
g Grama (s)
GalN Galactosamina
GSH Glutationa reduzida
h Hora (s)
HE Hematoxilina-eosina
NaOH
Hidróxido de sódio
i. p. Intraperitoneal
kg Kilograma (s)
L Litro
LPS Lipopolissacarídeo
mg Miligrama
min Minuto (s)
mL Mililitro
NAC N-acetilcisteína
NF-kappa B Fator nuclear kappa B
nm Nanômetro
NP-SH Grupos sulfidrilas não protéicos
PF Ponto de fusão
PG`s Prostaglandinas
PM Peso molecular
rpm Rotações por minuto
s.c. Subcutânea
o
C Grau (s) Centígrado (s)
TCA Ácido tricloroacético
TNB Ácido trinitrobenzeno sulfônico
TNF-
Fator de necrose tumoral alfa
TRPV1
Transient receptor potential vanilloid 1
v.o. Via Oral
g
Microgramas
L
Microlitro
LISTA DE FIGURAS
FIGURA PÁGINA
FIGURA 1 -
Protium heptaphyllum
46
FIGURA 2 -
Estruturas químicas de -amirina (a) e -amirina (b).
52
FIGURA 3 -
Representação esquemática da obtenção da resina purificada e
da mistura de triterpenos - e -amirina a partir da resina bruta
de Protium heptaphyllum (Aubl.) March.
57
FIGURA 4
Efeito da administração oral da resina de P. heptaphillum no
edema de pata induzido por carragenina em ratos.
FIGURA 5 -
Efeito da administração oral da resina de P. heptaphyllum no
granuloma induzido por “pellet” de algodão em ratos.
91
FIGURA 6 -
Efeito da administração oral da resina de P. heptaphyllum sobre
o aumento da permeabilidade vascular induzida por ácido
acético em camundongos.
94
FIGURA 7 -
Efeito da resina de P. heptaphyllum e N-acetilcisteína (NAC)
nas lesões gástricas induzidas por etanol em camundongos.
122
FIGURA 8 -
Efeito da resina de P. heptaphyllum e N-acetilcisteína (NAC)
sobre os níveis de grupos sulfidrilas não protéicos nas lesões
gástricas induzidas por etanol em camundongos.
124
FIGURA 9 -
Efeito da resina de P. heptaphyllum e N-acetilcisteína (NAC)
nas lesões gástricas induzidas por etanol acidificado em
camundongos.
127
FIGURA 10
Efeito da administração intraduodenal da resina de P.
heptaphyllum e cimetidina no volume secretório gástrico em
ratos.
130
FIGURA 11 -
Efeito da administração intraduodenal da resina de P.
heptaphyllum e cimetidina na acidez total gástrica em ratos.
131
FIGURA 12 -
Efeito da resina de P. heptaphyllum e cimetidina nas lesões
gástricas induzidas por indometacina em camundongos.
122
FIGURA 13 -
Efeito da mistura de - e - amirina nas lesões gástricas
induzidas por etanol em camundongos.
134
FIGURA 14 -
Efeito da capsaicina nas lesões gástricas induzidas por etanol
em camundongos.
136
FIGURA 15 -
Efeito da mistura de - e -amirina nas lesões gástricas
induzidas por etanol em camundongos normais e
dessensibilizados pela capsaicina.
138
FIGURA 16 -
Efeito da administração oral da mistura de - e -amirina no
prurido induzido por dextrana T40 em camundongos.
109
FIGURA 17 -
Efeito da administração oral da mistura de - e -amirina no
prurido induzido por composto 48/80 em camundongos.
112
FIGURA 18 -
Efeito do antagonismo de receptor opióide (naloxona) sobre a
atividade antipruriginosa da mistura de - e -amirina ou
morfina no prurido induzido por Composto 48/80 em
camundongos.
115
FIGURA 19 -
Efeito da mistura de - e -amirina sobre a degranulação de
mastócitos mesenteriais induzido pelo composto 48/80 ex vivo.
118
FIGURA 20 -
Microfotografias de mastócitos mesenteriais.
119
FIGURA 21 -
Efeito da administração oral da mistura de - e -amirina no
edema de pata induzido por histamina em camundongos.
97
FIGURA 22 -
Efeito da administração oral da mistura de - e -amirina no
edema de pata induzido por serotonina em camundongos.
100
FIGURA 23 -
Efeito da administração oral da mistura de - e -amirina no
edema de pata induzido pelo composto 48/80 em camundongos.
103
FIGURA 24 -
Efeito da administração oral da mistura de - e -amirina no
edema de pata induzido por dextrana em camundongos.
106
FIGURA 25 -
Efeito da mistura de - e -amirina sobre a nocicepção induzida
pela administração intraplantar de capsaicina.
141
FIGURA 26 -
Efeito da mistura de - e -amirina e vermelho de rutênio sobre
o tempo de lambedura induzido pela injeção subplantar de
capsaicina em camundongos.
143
FIGURA 27 -
Efeito da mistura de - e -amirina sobre a nocicepção induzida
pela administração intracolônica de capsaicina (dor visceral).
146
FIGURA 28 -
Efeito da mistura de - e -amirina e vermelho de rutênio sobre
a resposta térmica induzida por capsaicina em camundongos.
149
FIGURA 29 -
Efeito da Mistura de - e -Amirina e N-acetilcisteína (NAC)
sobre os níveis de grupos sulfidrílas não protéicos (NP-SH) na
hepatotoxicidade induzida por acetaminofeno em camundongos.
153
FIGURA 30 -
Efeito da mistura de - e -amirina e N-acetilcisteína (NAC)
sobre os níveis séricos de ALT e AST na hepatotoxicidade
induzida por acetaminofeno em camundongos.
155
FIGURA 31
Microfotografias de fígados de camundongos.
157
FIGURA 32 -
Efeito da mistura de - e -amirina, N-acetilcisteína (NAC) e
dexametasona (DEX) sobre os níveis de grupos sulfidrílas não
protéicos (NP-SH) na hepatotoxicidade induzida por D-
Galactosamina/LPS em camundongos.
161
FIGURA 33 -
Efeito da mistura de - e -amirina, N-acetilcisteína (NAC) e
dexametasona (DEX) sobre os níveis séricos de ALT e AST na
hepatotoxicidade induzida por D-Galactosamina/LPS em
camundongos.
163
FIGURA 34 -
Microfotografias de fígados de camundongos.
165
LISTA DE TABELAS
TABELA
PÁGINA
TABELA 1 -
Constituintes fixos isolados da espécie do gênero Protium
heptaphyllum com registrados na literatura.
49
TABELA 2 -
Efeito da resina de P. heptaphyllum no edema de pata induzido
por carragenina em ratos.
93
TABELA 3 -
Efeito da resina de P. heptaphyllum no granuloma induzido por
“pellet” de algodão em ratos.
90
TABELA 4 -
Efeito da resina de P. heptaphyllum no aumento de
permeabilidade vascular induzido por ácido acético em
camundongos.
87
TABELA 5 -
Efeito da resina de P. heptaphyllum no modelo de úlcera
gástrica induzida por etanol em camundongos.
121
TABELA 6 -
Efeito da resina de P. heptaphyllum sobre os níveis de grupos
sulfidrilas não protéicos (NP-SH) no modelo de úlcera gástrica
induzida por etanol em camundongos.
123
TABELA 7 -
Efeito da resina de P. heptaphyllum no modelo de úlcera
gástrica induzida por etanol acidificado (0,3M HCl/60% etanol)
em camundongos.
126
TABELA 8 -
Efeito da resina de P. heptaphyllum e cimetidina sobre o
volume secretório gástrico e acidez gástrica total em ratos com
piloro ligado.
129
TABELA 9 -
Efeito da resina de P. heptaphyllum no modelo de úlcera
gástrica induzida por indometacina em camundongos.
121
TABELA 10 -
Efeito da mistura de - e -amirina no modelo de úlcera
gástrica induzida por etanol em camundongos.
133
TABELA 11 -
Efeito da capsaicina no modelo de úlcera gástrica induzida por
etanol em camundongos.
135
TABELA 12 -
Efeito da mistura de - e -amirina na lesão gástrica induzida
por etanol em camundongos normais e dessensibilizados pela
capsaicina
137
TABELA 13 -
Efeito da mistura de - e -amirina no prurido induzido por
dextrana T40 em camundongos
108
TABELA 14 -
Efeito da mistura de - e -amirina no prurido induzido pelo
composto 48/80 em camundongos
111
TABELA 15 -
Efeito da naloxona (antagonista de receptor opióide) sobre a
atividade antirpuriginosa da mistura de - e -amirina ou
morfina no prurido induzido pelo composto 48/80
114
TABELA 16 -
Efeito da mistura de - e -amirina sobre a degranulação de
mastócitos mesenteriais induzido pelo composto 48/80 ex vivo
117
TABELA 17 -
Efeito da mistura de - e -amirina no edema de pata induzido
por dextrana em camundongos.
105
TABELA 18 -
Efeito da mistura de - e -amirina no edema de pata induzido
pelo composto 48/80 em camundongos.
102
TABELA 19 -
Efeito da resina da mistura de - e -amirina no edema de pata
induzido por histamina em camundongos.
96
TABELA 20 -
Efeito da mistura de - e -amirina no edema de pata induzido
por serotonina em camundongos.
99
TABELA 21 -
Efeito da mistura de - e -amirina na nocicepção induzida pela
administração intraplantar de capsaicina
140
TABELA 22 -
Efeito da mistura de - e -amirina e vermelho de rutênio sobre
o tempo de lambedura induzido pela injeção subplantar de
capsaicina em camundongos
142
TABELA 23 -
Efeito da mistura de - e -amirinas no nocicepção induzida
pela administração intracolônica de capsaicina (dor visceral)
145
TABELA 24 -
Efeito da mistura de - e -amirina sobre a hipotermia induzida
pela capsaicina em camundongos
148
TABELA 25 -
Efeito da Mistura de - e -amirina sobre os níveis de
glutationa na hepatotoxicidade induzida por acetaminofeno em
camundongos
152
TABELA 26 -
Efeito da mistura de - e -amirina nos níveis de AST e ALT
na hepatotoxicidade induzida por acetaminofeno em
camundongos
154
TABELA 27 -
Efeito da mistura de - e -amirina nos escores de lesão
hepática na hepatotoxicidade induzida por acetaminofeno em
camundongos
156
TABELA 28 -
Efeito da mistura de - e -amirina sobre os níveis de
glutationa na hepatotoxicidade induzida por D-
Galactosamina/LPS em camundongos.
160
TABELA 29 -
Efeito da mistura de - e -amirina sobre os níveis séricos de
AST e ALT na hepatotoxicidade induzida por D-
Galactosamina/LPS em camundongos.
162
TABELA 30 -
Efeito da mistura de - e -amirina nos escores de lesão
hepática na hepatotoxicidade induzida por D-
Galactosamina/LPS em camundongos.
164
TABELA 31 -
Efeito da mistura de - e -amirinas sobre a coordenação
motora em camundongos.
167
TABELA 32 -
Efeito da mistura de - e -Amirina sobre a atividade
exploratória em camundongos.
168
TABELA 33 -
Efeito da mistura de - e -amirinas sobre o tempo de sono
induzido por pentobarbital sódico em camundongos.
169
RESUMO
ESTUDO DAS PROPRIEDADES FARMACOLÓGICAS DA RESINA DE Protium
heptaphyllum (Aubl.) March. E DE SEUS PRINCIPAIS CONSTITUINTES,
MISTURA DE α- E β-AMIRINA. Francisco de Assis Oliveira. Tese submetida à
coordenação do curso de Pós-Graduação em Farmacologia, do Departamento de Fisiologia
e Farmacologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, como
requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Farmacologia.
A espécie Protium heptaphyllum (Aubl.) March (Burseraceae) popularmente conhecida
como almécega, é encontrada na região Amazônica, em vários Estados do Brasil e países da
América do Sul. Esta espécie exsuda uma resina oleosa e amorfa, usada na medicina popular
como analgésico, antiinflamatória, cicatrizante e expectorante. Estudos fitoquímicos
demonstraram a presença de monoterpenos e triterpenos pentacíclicos, tais como - amirina e -
amirina, maniladilol e breina. O presente trabalho teve como objetivo investigar os efeitos tóxicos
e farmacológicos da resina e de seus constituintes majoritários, a mistura de triterpenos - e -
amirina. Na avaliação dos efeitos tóxicos observamos a toxicidade aguda destes produtos em
camundongos e Artemia sp. Analisando os efeito sistêmicos, avaliamos a atividade
antiinflamatória da resina (edema de pata induzido por carragenina, granuloma induzido por
“pellets” de algodão e permeabilidade vascular induzida por ácido acético) e da mistura de - e -
amirina (edema induzido por histamina, serotonina, dextrana T40 e composto 48/80).
Examinamos ainda as atividades gastroprotetora e antisecretória da resina (lesões gástricas
induzidas pelo etanol absoluto e etanol acidificado e secreção ácida induzida pela ligação pilórica)
e as atividades gastroprotetora (lesões gástricas induzidas pelo etanol absoluto, com animais
dessensibilizados por capsaicina), antipruriginosa (prurido induzido pelo dextrana T40 e composto
448/80 e desgranulação de mastócitos ex vivo), antinociceptiva (nocicepção induzida pela
administração subplantar e intracolônica de capsaicina, resposta hipotérmica induzida por
capsaicina) e hepatoprotetora (lesões hepáticas induzidas por acetaminofeno e GalN/LPS) da
mistura de - e -amirinas. Não foi possível estabelecer as DL
50
da resina (até 5 g/kg, v.o. e 1
g/kg, i.p.) e da mistura de - e -amirina (até 3 g/kg, v.o. e até 2 g/kg, i.p.) em camundongos. A
mistura de - e -amirina, mas não a resina, mostrou toxicidade para Artemia sp, sendo as CL
50
de 42,54 19,96 e 400 27,85 g/mL, respectivamente. Nos modelos de permeabilidade
vascular induzido por ácido acético (camundongos) e granuloma induzido por “pellet” de algodão
(ratos), a resina demonstrou efeito antiinflamatório significativo na dose de 400 mg/kg, reduzindo
a permeabilidade vascular e o peso seco do granuloma. Contudo, a resina não apresentou atividade
sobre edema induzido por carragenina (ratos). Adicionalmente, a resina preveniu as lesões
gástricas induzidas por etanol absoluto e etanol acidificado, além de impedir a depleção dos
grupos sulfidrilas produzida pela etanol absoluto nas doses de 200 e 400 mg/kg. Um efeito
antisecretório da resina (200 e 400 mg/kg) foi observado no modelo de secreção ácida induzida
pela ligação pilórica em ratos. A mistura de - e -amirina também exibiu atividade
gastroprotetora inibindo as lesões gástricas induzidas por etanol absoluto, cujo mecanismo parece
envolver os neurônios sensoriais primários sensíveis à capsaicina. A administração oral dos
triterpenos - e -amirina (100 mg/kg), apresentou atividade antiedematogênica, nos modelos de
edema de pata induzidos por histamina, composto 48/80 e dextrana T40, mas não sobre o edema
induzido por serotonina. A atividade antipruriginosa também foi observada com as - e -amirina
nas doses variando de 50 a 200 mg/kg, em modelos de prurido induzido por dextrana T40 e pelo
composto 48/80 e na redução (100 mg/kg) da degranulação de mastócitos peritoneais ex vivo pelo
composto 48/80. O efeito antinociceptivo da mistura, nas dose de 3 a 100 mg/kg, foi verificado
através da inibição dos comportamentos de nocicepção induzidos pela administração subplantar ou
intracolônica de capsaicina em camundongos. A antinocicepção produzida por estes triterpenos
(10 mg/kg) sobre o tempo de lambedura induzido pela capsaicina (1,6 g/20 L) não foi
potencializada nem revertida pelo vermelho de rutênio (1,5 mg/kg), mas foi significativamente
inibida pela naloxona (2 mg/kg), sugerindo mecanismo opióide. A participação dos receptores
2
-
adrenérgicos neste efeito também foi eliminada, tendo em vista que a ioimbina não reverteu o
efeito antinociceptivo das amirinas no modelo de nocicepção visceral induzida pela capsaicina.
Estes triterpenos bloquearam ainda a hipertermia induzida pela capsaicina (10 mg/kg), mas não
reverteram a resposta hipotérmica induzida por este agente, sugerindo a participação do receptor
vanilóide (TRPV1) no efeito antinociceptivo das amirinas. Nos modelos de hepatoxicidade, a
mistura de - e -amirina (50 e 100 mg/kg) reduziu o aumento nos níveis séricos de ALT e AST e
restabeleceu os níveis de GSH hepáticos, diminuindo as alterações histopatológicas induzidas pelo
acetaminofeno (500 mg/kg), além de potencializar o tempo de sono induzido por pentobarbital
sódico (50 mg/kg), indicando que este efeito hepatoprotetor envolve a inibição do citocromo P-
450. A mistura ofereceu ainda completa proteção contra a mortalidade induzida por GalN/LPS,
reduzindo as lesões hepáticas em camundongos e reduzindo os níveis séricos de ALT, mas não de
AST ou GSH hepáticos, sugerindo um possível feito neuroimunomodulatório neste modelo. Os
triterpenos - e -amirina nas doses variando de 3 a 30 mg/kg, não manifestaram efeitos sedativos
ou incoordenação motora em camundongos. A resina e mistura de - e -amirina possuem baixa
toxicidade e atividades antiinflamatória e gastroprotetora. Os triterpenos - e -amirina exibiram
atividade antipruriginosa, antinociceptiva e hepatoprotetora, cujos efeitos envolvem, pelo menos
em parte, a participação dos neurônios aferentes sensoriais primários.
Palavras Chaves: 1. Burseraceae. 2. Plantas medicinais. 3. Farmacologia. 4. Triterpenos. 5.
Capsaicina
ABSTRACT
STUDIES ON THE PHARMACOLOGICAL PROPERTIES OF RESIN FROM
Protium heptaphyllum (Aubl.) March. AND ITS MAJOR CONSTITUENT, ALPHA-
AND BETA-AMYRIN MIXTURE. Francisco Assis de Oliveira. Thesis submitted in
partial fulfillment to obtain Doctor`s Degree in Biological Sciences (Pharmacology) to the
Post-Graduate Department of Physiology and Pharmacology, Faculty of Medicine, Federal
University of Ceará.
Protium heptaphyllum March (Burseraceae) popularly known as “almécega” is a
popular medicinal plant largely encountered in the Amazon region, various States of Brazil and in
several other South American Countries. The oily amorphous exudate obtained from this plant is
widely used in skin diseases, healing of ulcers, and as an analgesic and anti-inflammatory agent.
Phytochemical studies revealed the presence of several monoterpenes and pentacyclic triterpenes
such as a mixture of - e -amyrin, maniladilol and breine. The present study aimed to investigate
the general toxicity and to establish the pharmacological activity of resin and its major triterpenoid
mixture, the - and -amyrin. In toxicity tests, both the resin and triterpene mixture exhibited low
toxicity to mice. Resin at doses up to 5 g/kg, (p.o.) or 2 g/kg, (i.p.) and triterpene mixture up to 3
g/kg, (p.o.) or 2 g/kg (i.p.) failed to induce any mortality in mice. In Artemia-lethality test, the
calculated (probit analysis) LC
50
values for resin and triterpenes were in the order of 42,54
19,96 and 400 27,85 g/mL, respectively. In pharmacological tests, the resin was analysed for
anti-inflammatory (carrageenan-induced edema, cotton pellet-induced granuloma, and vascular
permeability increase induced by i.p. acetic acid) and gastroprotective (absolute ethanol and
acidified ethanol) effects, whereas the triterpene mixture was examined in assays that demonstrate
gastroprotective (against lesions induced by absolute ethanol), antipruritus (against pruritus
induced by Dextran T40 and compound 48/80), acute and visceral antinociceptive (tests of
subplantar and intracolonic capsaicin) and hepatoprotective (against acetaminophen- and
GalN/LPS-induced models of hepatitis) effects. In anti-inflammatory tests, the resin (200 and 400
mg/kg, p.o.) although failed to modify the carrageenan-induced acute rat paw-edema response, it
caused significant inhibitions at a dose of 400 mg/kg on the formation of cotton pellet-induced
granulomas and on the vascular permeability increase induced by i.p. acetic acid in mice. In
addition, the resin (200 e 400 mg/kg) showed gastroprotective potential against absolute- and
acidified ethanol- induced gastric lesions as evidenced from significant diminution in lesion
scores, restoration of the ethanol-induced depletion of non-protein sulfhydryl content More over,
the resin demonstrated an antisecretory effect on gastric acid secretion induced in 4-h pylorus
ligated rats. The triterpene mixture also produced similar gastroprotection against ethanol-induced
lesions in a manner similar to capsaicin, a pungent principle from hot peppers. This protection
possibly involves capsaicin-sensitive primary afferents since it was abolished in mice pretreated
with a neurotoxic dose of capsaicin. The - e -amyrin mixture (100 mg/kg) manifested
antipruritus effect as evidenced from suppression of scratching behavior in the mouse model of
pruritis induced by s.c. injections of dextran T40 and compound 48/80. Besides, it also produced
an antiedematogenic effect in models of hind paw edema induced by histamine, compound 48/80
and dextran T40 and markedly depressed the compound 48/80-elicited rat mast cell degranulation
(ex vivo). An antinociceptive effect of triterpenoid mixture (3-100 mg/kg) was observed in
capsaicin-evoked somatic (1.6 g/site, subplantar) and visceral (149 g, intracolonic) models of
nociception in mice. Greater suppression of nociceptive behaviors were evidenced at a dose of 10
mg/kg - and -amyrin mixture, which mimicked the effect produced by ruthenium red, a non-
competitive capsaicin antagonist. The antinociceptive effect of triterpenoid mixture was found to
be naloxone (2 mg/kg)-sensitive, suggesting an opioid mechanism. A blockade by triterpene
mixture was also evidenced on the hyperthermic but not the hypothermic response of
subcutaneously administered capsaicin (10 mg/kg) suggesting possible involvement of TRPV1
receptor. In open-field and rota-rod tests, the triterpene mixture did not manifest signs of either
sedation or motor abnormality in mice that could account for the observed antinociception. In the
model of acetaminophen (500 mg/kg)-induced hepatotoxicity, the triterpenoid mixture (50 and
100 mg/kg) effectively reduced the elevated serum AST and ALT levels, restored the depleted
GSH and markedly diminished the histopathological alterations. Potentiation of pentobarbital-
sleeping time was, however, observed at these doses of triterpenoid, indicating a probable
suppression of cytochrome P450 and thus a diminished metabolite formation that may account for
reduced acetaminophen toxicity. The - and -amyrin mixture offered complete protection
against the mortality associated with GalN/LPS, but caused only a moderate diminution of
serum enzymes and histopathological alterations.
Taken together, these findings show that the
resin and - and -amyrin mixture possess low toxicity and have a wide therapeutic potential with
anti-inflammatory, antinociceptive, antipruritus, and gastro- and hepato-protective actions. Most
of the effects of triterpenoid mixture appear to involve in part the participation of primary sensory
afferents in their actions.
Keywords: 1. Burseraceae. 2. Medicinal plants. 3. Pharmacology. 4. Triterpenes. 5. Capsaicin
INTRODUÇÃO
1. INTRODUÇÃO
1.1. Os Produtos Naturais e sua importância como fonte de novos
medicamentos.
Os produtos naturais, compreendendo todos os produtos derivados de origem
natural, plantas, animais, micróbios, minerais e mais recentemente organismos marinhos,
têm sido a mais bem sucedida fonte de novas drogas. Historicamente, a mais importante
fonte natural tem sido as plantas. A pesquisa utilizando plantas medicinais tem avançado
em duas linhas principais: etnofarmacologia e toxicologia. Estas estratégias têm produzido
muitas substâncias valiosas e provavelmente produzirão outras (TULP & BOHLIN, 2004).
Antes da segunda guerra mundial, um grande número de produtos naturais
isolados de plantas superiores tornou-se importantes agentes clínicos e muitos ainda são
utilizados nos dias de hoje. Quinina isolada da casca da Cinchona, morfina e codeína
isoladas do látex do opium, digoxina obtida das folhas da Digitalis, atropina e hioscina
isoladas de espécies da Solanaceae continuam em uso na clínica. Da mesma forma, alguns
antibióticos desenvolvidos a partir dos efeitos antibacterianos de produtos naturais isolados
dos gêneros Penicillium, Cephalosporium e Streptomyces produzidos durante a segunda
guerra também continuam em uso.
Nos anos pós-guerra, houve poucas descobertas de novas drogas a partir de
plantas superiores, com exceção para a reserpina isolada de espécies da Rauwolfia,
introduzindo a era dos tranqüilizantes e a vinblastina obtida da Catharanthus roseus, droga
efetiva no tratamento do câncer, com venda global da ordem de U$ 100 milhões ao ano
(KONG et al., 2003).
O principal objetivo no uso de plantas como fonte de agentes terapêuticos
baseia-se em: i) isolar compostos bioativos para uso direto como droga, por exemplo,
digoxina, digitoxina, morfina, reserpina, taxol, vinblastina, vincristina; ii) produzir
compostos bioativos de estrutura nova ou conhecida como protótipo para semi-síntese na
produção de entidades patenteáveis com alta atividade e/ou baixa toxicidade. Como
exemplo, pode-se citar as drogas: metformina, nabilona, oxycodon, taxotere, teniposídeo,
verapamil, amiodarona, cujas estruturas foram baseadas em galegina,
9
-
tetrahidrocannabinol, morfina, taxol, pofilotoxina, khellina; respectivamente; iii) utilizados
como ferramentas farmacológicas, por exemplo, dietilamina doácido lisérgico, mescalina,
ioimbina e, iv) utilizar toda a planta ou parte desta como fitoterápico, por exemplo,
equinácea, alho, ginkgo biloba, erva de São João (FABRICANT & Farnsworth, 2001).
Os produtos naturais não apenas servem de protótipo ou modelo para
medicamentos sintéticos, eles também exibem características relevantes insuperáveis por
qualquer composto sintético. Uma das características dos produtos de origem natural é sua
grande diversidade estrutural e química. Aproximadamente 40% das substâncias químicas
isoladas de produtos naturais estão ausente na química medicinal atual, complementando
as moléculas produzidas sinteticamente (MULLER-KUHRT et al., 2003).
Existem mais de 120 moléculas derivadas de plantas usadas na medicina
Ocidental, com muitas delas descobertas como resultado do seu uso em vários sistemas da
medicina tradicional por todo o mundo. Muitas dessas drogas derivadas de plantas são bem
estudadas, tais como atropina, codeína, colchicina, pilocarpina e quinina, mais
recentemente, estes exemplos incluem galanthamina (um inibidor da colinesterase usado
em alguns paises da Europa e nos Estados Unidos no tratamento da doença de Alzheimer)
e paclitaxel (um agente anticâncer o qual tem vendagem da ordem de 1 bilhão de dólares)
(KINGHORN, 2002).
Das drogas aprovadas pelo FDA (Food and Drug Administration), nos Estados
Unidos no período de dez anos (1983-1992), 157 das 520 drogas (30%) aprovadas eram
produtos naturais ou seus derivados (SEIDL, 2002). De fato, estima-se que
aproximadamente 40% dos medicamentos disponíveis na terapêutica moderna foram
desenvolvidos direta ou indiretamente a partir de fontes naturais. Alem disso, 10 dentre os
20 medicamentos mais vendido no ano de 1998 foram desenvolvidos a partir de produtos
naturais, e muitas outras moléculas estão, hoje, na fase de estudo clínico (SIANI, 2003).
Nos Estados Unidos, em 1991 para cada 10.000 compostos puros (muitos
originados de síntese) que possuíam atividade biológica (in vitro), 20 foram testados em
modelos animais e 10 destes foram clinicamente avaliados, e apenas um foi aprovado para
comercialização pela FDA. O tempo gasto neste processo foi estimado em 10 anos a um
custo de U$ 231 milhões (Fabricant & farnsworth, 2001), valor maior que o produto
interno bruto de alguns paises, conseqüentemente o desenvolvimento de um novo
medicamento está, infelizmente, restrito às grandes indústrias farmacêuticas localizadas
em países desenvolvidos, sobretudo nos Estados Unidos e Europa (SIANI, 2003).
No Brasil, a industria de medicamentos concentra significativa parcela de
recursos na produção de Fitoterápicos. Os problemas mais freqüentes encontrados nestes
produtos são: identificação botânica equivocada, composição química sem uniformidade,
presença de contaminantes, bula irregular, prazo de validade determinado empiricamente.
Todas estas questões demonstram a deficiência e precariedade, desde a matéria prima até o
produto acabado. A nova legislação submete a indústria ao desenvolvimento de
tecnologias que assegurem e confirmem a eficiência formulação. È neste contexto, que as
monografias oficiais, tornam-se um instrumento que vem atender as necessidades da
indústria de fitoterápicos, fornecendo dados importantes na produção destes medicamentos
(MIGUEL & MIGUEL, 2000).
Já as plantas medicinais da flora nativa são consumidas com pouca ou nenhuma
comprovação de suas propriedades farmacológicas, propagadas por usuários e
comerciantes. As pesquisas realizadas para avaliação do uso seguro de plantas medicinais
e fitoterápicos no Brasil ainda são incipientes, dessa forma, o controle e comercialização
pelo órgãos oficiais em feiras livres, mercados públicos ou lojas de produtos naturais.
Estudos multidisciplinares envolvendo etnobotânicos, químicos, farmacólogos e
agrônomos são necessários para que sejam ampliados os conhecimentos das plantas
medicinais, como agem, quais são os seus efeitos tóxicos e colaterais, como seriam suas
interações com novos medicamentos alopáticos e quais seriam as estratégias mais
adequadas para o controle de qualidade e produção de fitoterápicos (VIEIGA JUNIOR,
2005).
Mesmo com a potencialidade da terapia genética, seria fácil imaginar que essa
forma de cura poderá ser a única forma de tratamento médico das doenças no futuro. Visto
que as plantas forneceram muitas drogas no passado e permanecem como uma rica fonte
de novos compostos baseados na química combinatória natural de milhões de anos de
evolução, estes devem continuar a ser investigado como uma fonte de novos agentes
terapêuticos. A maioria das plantas não foi investigada quimicamente ou biologicamente e
o fracionamento monitorado por ensaios biológicos e os modernos métodos de
determinação estrutural continuarão a auxiliar na pesquisa sobre novas drogas no futuro
(PHILLIPSON, 2003).
1.2. Biodiversidade
As plantas são uma fonte importante de produtos naturais biologicamente ativos.
O número de espécies vegetais superiores (angiospermas e gimnospermas) no planeta é
estimado em 250.000, podendo variar entre 215.000 a 500.000. Destas, apenas 6% tem
sido estudadas sobre atividade biológica e aproximadamente 15% avaliadas
fitoquimicamente (FABRICANT & FARNSWORTH, 2001).
O maior número de espécies encontra-se nas regiões equatoriais da América do
Sul, da África e da Ásia, com o máximo de diversidade global situado na flora da
Colômbia, Equador e Peru (NODARI & GUERRA, 1999). Estas regiões, compostas por
florestas, são uma fonte vital de medicamentos. Atualmente, menos de 1% de todas as
plantas encontradas nas florestas tropicais foram estudadas por suas propriedades
farmacêuticas e, pelo menos, 25% de todas as drogas atuais foram oriundas destas regiões
(KONG et al, 2003).
O Brasil abriga 55 mil espécies de plantas, aproximadamente um quarto de todas
as espécies conhecidas. Destas, 10 mil podem ser medicinais, aromáticas e úteis. Como
conseqüência, pode-se esperar potenciais descobertas de novos produtos naturais
biologicamente ativos nas florestas tropicais. Com este número de espécies, não é surpresa
o descobrimento de plantas ricas em produtos bioativos, que podem ter aplicação direta em
medicina ou para servirem de modelos para síntese de novos medicamentos (IBD, 2005).
A Organização Mundial de Saúde estima que cerca de 65 a 80% (estimada em 6
bilhões de pessoas) da população nos paises em desenvolvimento dependem
primariamente das plantas medicinais na atenção primária à saúde. Dessa forma, as plantas
medicinais por constituírem matéria prima de fácil acesso, de baixo custo e de fácil
manipulação, têm contribuído muito para a saúde da população. São bilhões de pessoas
utilizando essa alternativa, mas somente uma pequena percentagem sob indicação médica.
São muitos os fatores que colaboram no uso de plantas medicinais, sobretudo econômicos
e sociais. Sendo assim, o trabalho de pesquisa com plantas medicinais tende a produzir
medicamentos com custos inferior e mais acessíveis a população, a qual muitas vezes não
conseguem arcar com os custos elevados da aquisição de medicamentos em atendimento
às necessidades básicas de saúde.
A utilização de plantas medicinais, prática difundida pela maioria dos povos em
todo o mundo, vem recebendo incentivo da OMS, a qual recomenda o emprego de plantas
medicinais nos programas de atenção primária à saúde. Um bom exemplo desse emprego
são as Farmácia Vivas, projeto criado pela Universidade Federal do Ceará, utilizando
plantas medicinais validadas e executado com colaboração de médicos, farmacêuticos e
agrônomos (MATOS, 1998).
1.3. Resinas Naturais
Diversas famílias botânicas (Pinaceae, Hamamelidaceae, Leguminosae,
Zigofilaceae, Burseraceae, Anacardiaceae, Umbeliferae, etc.) são produtoras de resinas
que em geral encontram-se dissolvidas em óleos essenciais líquidos e voláteis. Esse líquido
obtido por incisão no próprio vegetal, não tem composição simples (COSTA, 1994).
Os óleos resinas quando expostas ao ar e à luz endurecem por evaporação e
oxidação das essências, resultando em substância de natureza consistente com
características próprias.
As resinas são produtos amorfos de natureza química complexa. Fisicamente são
duras, transparentes ou translúcidas, insolúveis em água, mas podem ser dissolvidas em
álcool ou em outros solventes orgânicos. As resinas queimam com uma chama fumarenta
característica e são provavelmente produtos da oxidação dos terpenos (ROBBERS et al.,
1997).
As resinas podem ocorrer em misturas homogêneas com óleos voláteis. Essas
misturas são conhecidas como óleos-resinas. Dependendo da quantidade relativa do óleo
volátil na mistura, as óleos-resinas poder ser líquidas, semi-sólidas ou sólidas. Em geral,
observa-se uma pequena quantidade de exsudato natural nas árvores que contêm óleo-
resinas, devido à agressão por insetos, à quebra de ramos ou outras lesões, podendo obter
essa substância pela incisão artificial do córtex ou mesmo da madeira (ROBBERS et al.,
1997).
A própolis também é produto resinoso da colméia coletado pelas abelhas a partir
de várias fontes vegetais. As atividades biológicas atribuídas à própolis são as mais
diversas: antibiótica, antifúngica, antiviral, antitumoral, entre outras (BURDOCK,1998). A
composição da própolis depende da época, vegetação e área de coleta (BANSKOTA et al.,
2000).
Muitas propriedades são atribuídas às resinas, dentre estas podemos destacar:
atividade antiinflamatória e antitumoral da resina do gênero Boswellia (BÜCHELE et al.,
2003). Pistacia lentiscus var. Chia produz uma resina com atividade antioxidante in vitro
(ANDRIKOPOULOS et al, 2003). A resina extraída das espécies Commiphora (C. kua e
C. confusa) (Burseraceae), é usada popularmente no tratamento de picada de cobra,
gonorréia, desordens estomacais e nas infecções microbianas (MANGURO et al., 2003a,
MANGURO et al., 2003b). Das partes aéreas de Baccharis grisebachii (Asteraceae),
exsuda uma resina, a qual é usada no tratamento de úlceras, queimaduras e inflamação da
pele (FERESIN et al., 2003). Outras atividades conferidas às resinas incluem: anti-séptica,
expectorante, carminativa, antiespasmódica, emanagoga e anti-helmíntica. Externamente,
os óleos-resinas são utilizados devido as sua propriedade desinfetante, cicatrizante,
rubefaciente, vesicante e como parasiticida no tratamento da sarna (COSTA, 1994).
A óleo-goma-resina de Commiphora molmol (Burseraceae), conhecida como
“mirra” é utilizada na medicina árabe no tratamento de algumas condições inflamatórias,
como antipirética, anti-séptica, estimulante e na cicatrização de diferentes problemas
estomacais, incluindo câncer. A análise química detectou a presença de óleos voláteis,
goma e resina, a qual é formada por esteróides e triterpenos, como por exemplo, 3-epi--
amirina (AL-HARBI et al., 1997).
A atividade antioxidante também é observada nas resinas naturais. Mais
recentemente, Assimopoulou et al. (2004) demonstraram que a resina de Pistacia lentiscus
var. Chia, e o óleo essencial obtido de Commiphora myrrh e Boswellia serrata, apresentam
significativa atividade. Os principais componentes das resinas são álcoois e ácidos
tetracíclicos e pentacíclicos, sendo este último o grupo mais importante, incluindo várias
substâncias resinosas (COSTA, 1994).
1.4. Terpenos
Os terpenóides distribuem-se amplamente na natureza e são encontrados em
abundância nas plantas superiores. Representam a segunda maior classe de metabólitos
secundários com maior número de constituintes ativos (DI STASI, 1996). Encontram-se
subdivididos em classes e são caracterizados por composição molecular do tipo C
10
H
15
,
denominada unidade de isopreno, por isso, esses compostos também são chamados de
isoprenóides.
Durante a formação dos terpenóides, as unidades de isopreno se ligam, e o
número de unidades incorporadas em determinado terpenóide serve de base para a
classificação desses compostos. Desta forma, temos os monoterpenos formados por duas
unidades de isopreno, os sesquiterpenos, contêm três unidades de isopreno. Os diterpenos,
com quatro unidades de isopreno. Os triterpenos são compostos por seis unidades de
isopreno. Os tetraterpenos ou carotenóides têm oito unidades (ROBBERS et al., 1997).
1.4.1. Monoterpenos
São conhecidos mais de mil monoterpenóides naturais, a grande maioria isolada
de plantas superiores. As características marcantes destes compostos são a volatilidade e o
odor pungente, sendo estes compostos os componentes mais comuns de plantas
responsáveis por fragrâncias e aromas. Possuem grande diversidade estrutural sendo
formandos por hidrocarbonetos acíclicos, monocíclicos, bicíclicos ou policíclicos e em
geral acompanhados de derivados oxigenados como os álcoois, aldeídos, cetonas, ésteres,
éteres.
Dentre as drogas vegetais clássicas, ricas em monoterpenos podemos destacar:
Eucalyptus globulus Labill, que fornece o eucaliptol, monoterpeno que possui diversas
atividades biológicas (DUARTE et al., 2005; SANTOS et al., 2004), Mentha x piperita L.,
da qual isola-se o mentol (HALL et al., 2004) e Thymus vulgaris L., da qual se obtém o
timol (AYDIN et al., 2005).
1.4.2. Sesquiterpenos
Apresentam grande distribuição na natureza e constituem a maior classe de
terpenóides. Destacam-se nesta subclasse as lactonas sesquiterpênicas, as quais são
possuidoras de um amplo espectro de atividades biológicas. Como exemplo, temos a
artemisinina, isolada das folhas de Artemisia annua L. e utilizada no tratamento da malária
(VAN DER MEERSCH et al., 2005), partenolido, isolado de Tanacetum parthenium L.
(TIUMAN et al., 2005) com atividade leishmanicidae o ácido valerênico, principal
constituinte do extrato de Valeriana officinalis L. e responsável pelos efeitos ansiolítico e
sedativos desta planta (YUAN et al., 2004).
1.4.3. Diterpenos
Compreendem grupo de compostos do tipo C
20
, na sua maioria são formados por
compostos carbocíclico que contêm até cinco anéis, em diferentes estados de oxidação.
São notoriamente conhecidos por sua vasta atividade biológica. Exemplos clássicos de
drogas ricas em diterpenos: Ginkgo biloba, cujo extrato hidrocetônico é rico em lactonas
diterpênicas, denominadas de ginkgolídeos (A, B e C). Kuribara et al. (2003),
demonstraram que o ginkgolídeo A, é o provável responsável pelos efeitos ansiolítico e
colaterais, presentes no extrato desta planta. Do córtex de Taxus brevifolia Nutt, isola-se o
taxol (paclitaxel), um diterpenóide complexo usado no tratamento do câncer de seios e no
sarcoma de Kaposi (OBERLIES & KROLL, 2004).
1.4.4. Triterpenos
Os triterpenos pertencem à classe dos terpenos e são formandos por seis
unidades de isopreno. Apresentam estrutura do tipo C
30
, policíclica, normalmente tetra ou
pentacíclica, quase sempre hidroxilados na posição C-3. Já foram isolados mais de quatro
mil triterpenóides naturais e identificados mais de quarenta tipos de esqueletos
(ROBBERS et al., 1997).
Os triterpenóides podem ser dividido em três grupos principais: -amirina
(oleanano), -amirina (ursano) e lupeol. As agliconas do tipo -amirina possuem duas
metilas em C-20. Aquelas do tipo -amirina apresentam uma metila no C-20 e outra em C-
19 com a estereoquímica entre os anéis D/E na forma cis. Já os triterpenos do tipo lupeol
difere na estereoquímica entre os anéis D/E, que é trans e no número de carbonos do
quinto anel (E), o qual é formando por cinco átomos de carbono (SHENKEL et al., 1999).
A maioria dos triterpenóides é formada por álcoois que podem combinar-se com
açúcares para formar glicosídeos, denominados heterosídeos saponínicos ou saponinas
triterpênicas. Os triterpenos livres são muitas vezes componentes das resinas, do látex ou
da cutícula das plantas.
Entre as drogas vegetais conhecidas, ricas em triterpenos pentacíclicos, podemos
destacar, o alcaçuz (Glycyrrhiza glabra L.) (Baltina, 2003), quilaia (Quillaja saponaria
Molina) (BOYAKA et al., 2001), castanha da Índia (Aesculus hippocastanum L) (LEACH,
2004), Centella asiatica L. (GNANAPRAGASAM et al., 2004) e Polygala senega L.
(ESTRADA et al., 2000).
1.4.5. Tetraterpenos e Carotenóides
Formam uma classe importante e bastante difundida de tetraterpenóides do tipo
C-40. Conferem as cores amarelas, alaranjadas, vermelhas e púrpuras observadas em
organismos vivos. Foram descritos na literatura em torno de seiscentos carotenóides
naturais.
Nas plantas funcionam como agentes fotoprotetores, pigmentos e na
estabilização das membranas. Nos animais, funcionam como agentes fotoprotetores,
antioxidantes e na prevenção do câncer. Exemplos, são o ácido trans-retinóico (tretinoína)
(LEYDEN et al., 2005), beta-caroteno (WALDMANN et al., 2005) e a vitamina A
(CLARKE et al., 2004), respectivamente.
1.5. Triterpenos e atividade biológica
Há um crescente interesse nos triterpenóides devido ao seu variado espectro de
atividades farmacológicas (PATOCKA, 2003).
1.5.1. Atividades antiinflamatória e antinociceptiva
Testes para detecção das atividades analgésicas e antiinflamatórias são
importantes para o desenvolvimento de drogas a partir de plantas medicinais, uma vez que
dor e inflamação são comumente observadas, ao mesmo tempo, nas doenças inflamatórias.
As drogas antiinflamatórias atualmente disponíveis para o tratamento das várias desordens
inflamatórias, têm um ou mais efeito adverso e indesejáveis efeitos colaterais (GEETHA et
al., 2001).
Nos últimos anos, princípios ativos de estruturas químicas variadas foram
isolados de plantas reputadas por suas atividades antiinflamatórias. A presença de
atividade antiinflamatória nos triterpenos parece ser interessante, uma vez que estes
compostos possuem sistema de anéis mais ou menos similares aos encontrados nos
esteróides, mas destituídos de efeitos colaterais (GEETHA et al., 2001).
Existem muitos trabalhos sobre as ações biológicas dos triterpenos, os quais
podem ser relevantes pelos seus efeitos farmacológicos, incluindo suas propriedades
antiinflamatórias (SAFAYHI & SAILER, 1997), característica comum a compostos desta
classe, principalmente aqueles triterpenos pertencentes às classes oleanano, ursano ou
lupano (MÁÑEZ et al., 1997).
Considerando a similaridade dos triterpenóides com os compostos esteróidais,
freqüentemente lhes são atribuídos, mecanismos destes agentes antiinflamatórios. Como
por exemplo no efeito antiedematogênico do ácido ursólico nos modelos de inflamação
dérmica induzida pelo ácido araquidônico ou do 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato
(TPA) e na inativação do cortisol pelo 11--hydroesteróide desidrogenase em
camungondos pelo ácido glicirretínico (MÁÑEZ et al., 1997).
Trabalhos recentes mostram triterpenos, na forma de aglicona ou heterosídeo,
inibindo a enzima COX-2 (ciclooxigenase) e a produção de NO (óxido nítrico) (SHIN et
al., 2005); modulando a expressão de moléculas de adesão, via inibição de NF-kappaB
(ZHANG et al., 2003), ou ainda inibindo a isoenzima fosfodiesteradse (PDE4), um novo
alvo intracelular para novas drogas antiinflamatórias (WENIGER et al., 2005).
Muitas espécies vegetais são ricas numa gama variada de substâncias
triterpenoídicas presentes em seus órgãos. Muitas destas plantas são utilizadas
tradicionalmente como agentes antiinflamatórios.
As raízes de Rosa rugosa (Rosaceae), são tradicionalmente utilizadas na Coréia
no tratamento da diabetes mellitus e da inflamação crônica. Jung et al. (2005)
demonstraram que quatro triterpenos do tipo 19-hidroxiursano, isolados a partir do
fracionamento do extrato metanólico desta espécie, podem ser os responsáveis pelas
atividades antiinflamatórias e antinociceptiva em modelos clássicos de dor e nocicepção
observados em camundongos e ratos.
Carmona retusa é utilizada nas Filipinas na forma de chá preparado a partir das
folhas secas e disponível em tabletes de 250 mg, sendo indicada no alívio dos sintomas da
diarréia. Villasenõr et al. (2004), demonstraram que o principal constituinte desta planta é
formado por uma mistura de triterpenos, composta de -amirina, -amirina e baurenol, a
qual exibiu um potente efeito analgésico e antidiarréico.
Preparações feitas a partir da goma-resina de Boswellia serrata são utilizadas
tradicionalmente na Índia para o tratamento de doenças antiinflamatórias. A goma é rica
em triterpenos pentacíclicos, sendo o ácido boswellico o principal constituinte.
Experimentos realizados com este triterpeno demonstra que este inibe a biosíntese de
leucotrienos nos granulócitos neutrófilos através de uma inibição não-competitiva da
enzima 5-lipoxigenase (AMMON et al., 2002). Experimentos clínicos mostraram
resultados promissores em pacientes com artrite reumatóide, colite crônica e ulcerativa na
doença de Crohn´s e dentre outra patologias (KIELA et al., 2004). Além desses efeitos,
estudos mostram que o ácido boswellico possui atividade anticancerígena, antitumoral, e
anti-hiperlipidemica (HUANG et al., 2000).
Baricevic et al. (2001), demonstraram que as propriedades antiinflamatórias de
Salvia officinalis, deve-se ao seu principal componente, o ácido ursólico, o qual inibiu
consideravelmente o edema de orelha em camundongos induzido pelo óleo de Cróton.
Neste mesmo trabalho, verificou-se que este triterpeno foi duas vezes mais potente que a
indometacina, droga antiinflamatória não esteroidal utilizada como droga de referência.
Outros triterpenos com atividade antiinflamatória incluem, os ácidos corosolico,
pomolico, tormentico, hyptadienico, augustico e 3-epimaslinico, isolados das folhas de
Perilla frutescens. Todos estes triterpenos mostraram efeito antiinflamatório, com inibição
significativa no modelo de inflamação aguda intraepidermal induzido do TPA (acetado de
12-O-tetradecanoilforbol-13) em camundongos (BANNO et al., 2004).
O ácido 23-hidroxiursólico, um triterpeno isolado de Cussonia bancoensis
mostrou potente atividade analgésica e antiinflamatória nos modelos de contorções
induzidas por ácido acético e no teste da placa quente, respectivamente, além de exibir
significativa ação antiinflamatória no modelo de edema induzido por carragenina em ratos.
Estes resultados sugerem que os efeitos antiinflamatório de C. bancoensis pode dever-se
ao 23-hidroxiursólico (TAPONDJOU et al., 2003). O efeito antiinflamatório do ácido 23-
hidroxiursólico também foi verificado in vitro. Este triterpeno inibiu a expressão das
enzimas iNOS (óxido nítrico sintase indutível) e da COX-2 (cicloxigenase), através do
bloqueio da ativação de NF- kappaB, o que pode, em parte, explicar o efeito
antiinflamatório observado nas cascas de C. bancoensis (SHIN et al., 2004).
A Leptadenia hastata, é planta medicinal utilizado popularmente como
antiinflamatório de uso tópico. Trabalho desenvolvido por Nikiema et al. (2001)
demonstrou que o triterpeno lupeol, isolado desta planta, exibiu significativa atividade
antiinflamatória em modelo clássico de inflamação, além de aumentar a proliferação de
queratinócitos, em modelo in vitro de reparo da epiderme.
Os analgésico atuais, tais como opióides e as drogas antiinflamatórias não
esteroidais, não são adequadas a todos pacientes e em todos os casos. Particularmente é na
dor crônica, onde se observa suas limitações, como por exemplo, nos numerosos efeitos
colaterais, incluindo propensão à tolerância. Dessa forma, a pesquisa visando a descoberta
de outras terapias alternativas é necessária. E as plantas medicinais, conhecidas por serem
importante fonte de novas substâncias químicas com potenciais efeitos terapêuticos, são
fundamentais para este fim. Portanto, a pesquisa com plantas utilizadas tradicionalmente
pela população no alívio de dores, desempenham papel estratégico na busca de novas
drogas analgésicas (VONGTAU et al., 2004).
Diversos modelos animais são empregados no estudo de novas drogas
analgésicas derivadas de produtos naturais. Nestes modelos experimentais a nocicepção
pode ser induzida por agentes químicos, mecânicos, térmicos e inflamatórios.
Capsaicina, o ingrediente pungente da pimenta vermelha (Capsicum spp), é
extensamente utilizada como ferramenta farmacológica no estudo dos mecanismos da dor
tanto em humanos quanto em animais. Como visto anteriormente, a capsaicina possui ação
seletiva sobre as fibras sensoriais que transmitem a sensação de dor. Este efeito resulta da
ativação dos receptores vanilóides pela capsaicina, depletando neuropeptídeos tais como
substância P e CGRP a partir destes neurônios (PELISSIER et al., 2002).
Durante as décadas passadas, pesquisadores têm direcionado seus estudos sobre
o papel da capsaicina na dor e inflamação. Um considerável número de estudos já foram
realizados sobre os efeitos sensoriais da capsaicina quando aplicada sobre a pele ou na
pleura, ou quando injetada intradermicamente em humanos ou em animais experimentais
(SAADÉ et al., 2002).
A injeção de capsaicina da superfície plantar da pata traseira produz padrão de
comportamento de dor característico, tais como lamber e morder a pata afetada (NAH et
al., 2000), produzindo alterações significativas nos limiares de nocicepção térmica e
mecânica (SAADÉ et al., 2002). Uma vez ativado pela capsaicina, os neurônios aferentes
secretam neuropeptídeos (substância P e CGRP) induzindo a inflamação neurogênica.
Cada um desses peptídeos é conhecido por interferir em um ou mais
mecanismos envolvidos na reação inflamatória. Por exemplo, a substância P, pode
contribuir para vasodilatação, liberação de histamina de mastócitos e modular as funções
das células do sistema imune, que expressam receptores para substância P em sua
membrana citoplasmática. CGRP é conhecido por sua vasoativa e por seus efeitos sobre as
células imunológicas (SAADÉ et al., 2002).
A dor visceral é uma das mais comuns forma de dor produzida por doença e
uma das mais freqüentes razões que fazem os pacientes buscar auxilio médico. É um
problema de considerável relevância clínica, e seu mecanismo neurobiológico difere dos
mecanismos envolvidos nas dores nociceptiva ou neuropática. Muito progresso tem sido
feito visando o entendimento das propriedades funcionais dos nociceptores viscerais que
iniciam o estado de dor, seus mecanismos moleculares de ativação e sensibilização e sobre
suas ações ao nível do sistema nervoso central. Alguns alvos moleculares que
desempenham papel fundamental na ativação e sensibilização dos receptores viscerais já
foram identificados, dentre eles está o receptor TRPV1 (CERVERO & LAIRD, 2004).
Muitos modelos de dor crônica são baseados sobre as lesões inflamatórias na
pele, músculo ou articulações ou sobre danos aos nervos periféricos (CERVERO, 2002).
Em modelos animais, substância algogênicas são aplicadas em muitas estruturas viscerais.
Capsaicina, uma substância algogênica, seletiva aos neurônios aferentes (TRPV1), têm
sido extensivamente utilizada em modelos experimentais de dor para induzir hiperalgesia
cutânea. Laird et al. (2001) introduziram um modelo animal especificamente objetivando o
estudo da dor visceral.
Neste modelo, a capsaicina administrada no colón de camundongos induz, de
forma dose dependente, comportamentos de dor visceral e hiperalgesia referida, tais como
lamber o abdômen, contorção abdominal, arrastar o abdômen contra o solo, etc (
LAIRD et
al,.2001; KAWAO et al., 2004), sendo estes efeitos revertidos pela morfina. Este modelo de
dor visceral é útil no estudo farmacológico de drogas antinociceptivas, uma vez que
informações sobre dor visceral, hiperalgesia referida e inflamação do cólon podem ser
obtidos de um mesmo animal em um único modelo.
Tendo em vista a vasta gama de atividades estudadas envolvendo os triterpenos,
a atividade analgésica também faz parte dos efeitos relacionados a estes terpenóides. Por
exemplo, o ácido 23-hidroxitormêntico isolado dos frutos de Rubus coreanus, mostrou
efeito analgésico em testes de nocicepção (contorções abdominais, placa-quente e “tail
flick”) utilizando camundongos e ratos. Este efeito foi mais potente que o seu respectivo
heterosídeo, niga-ichigosídeo (ácido 1,2,3-hidroxitormêntico 28-O-glc) (CHOI et al.,
2003).
Breina, um triterpeno isolada da resina de Protium kleinii e presente no extrato
etéreo desta planta mostrou um pronunciado efeito antinociceptivo em modelos de
nocicepção inflamatória induzidos por ácido acético e formalina em camundongos
(OTUKI et al., 2001).
Ferreira et al. (2000), demonstraram que o extrato metanólico de Epidendrum
Mosenii, exibiu uma acentuada atividade antinociceptiva, frente a modelos de nocicepção
química e térmica e que este efeito deve-se, em parte, a participação do sistema opióide.
Os princípios ativos implicados nesta atividade são triterpenos. Mais recentemente, Otuki
et al., 2005a, demonstraram que a mistura de triterpenos - e -amirinas, isolada da
mesma espécie (P. kleinii), exibiu significativa antinocicepção em ratos. Efeito este que
parece envolver a inibição de fibras sensíveis às proteínas quinases A e C. Otuki et al.,
(2005b) também descreveram o efeito antiinflamatório tópico do triterpeno -amirina no
modelo de edema de orelha induzido por TPA em camundongos.
1.5.2. Atividade gastroprotetora
Tradicionalmente, as plantas medicinais têm sido utilizadas na medicina popular
por todo o mundo para o tratamento de várias doenças, em especial a úlcera gástrica
(TOMA et al., 2002).
O extrato obtido a partir das folhas e frutos de Sapindus saponaria L., rico em
triterpenos pentacíclicos, dentre os quais destacam-se ácido oleanólico, -amirina e -
amirina, apresentou significante atividade antiulcerogênica nos modelo do piloro ligado
em ratos, diminuindo o volume da secreção gástrica, a concentração de ácido clorídrico e o
pH (MEYER et al., 2002). Três espécies nativas da floresta atlântica, Maytenus
aquifolium, Soroceae bomplandii e Zolernia ilicifolia, conhecidas como “espinheiras
santa”, são tradicionalmente utilizadas como analgésicas e antiulcergênica. Dentre os
principais constituintes foram encontrados triterpenos, os quais podem estar relacionados
com a gastroproteção observada nestas plantas, seja por aumento dos fatores de proteção
ou pela atividade antioxidante (GONZALEZ et al., 2001).
A mucosa gástrica é continuamente exposta a agentes potencialmente danosos,
tais como, ácido clorídrico, pepsina, ácidos biliares, condimentos alimentares, produtos
bacterianos e medicamentos. Estes agentes são implicados na patogênese das lesões
gástricas, por promover aumento na secreção do ácido gástrico e pepsina, diminuição no
fluxo sanguíneo gástrico, por suprimir a produção endógena de prostaglandinas, inibir a
proliferação celular e o crescimento da mucosa, além de alterar a mobilidade gástrica
(TOMA et al., 2002).
Dessa forma, um desequilíbrio entre os fatores prejudiciais dentro do lúmen e os
mecanismos de proteção dentro da mucosa gastroduodenal, pode desencadear o
surgimento das úlceras. A ansiedade prolongada, estresse emocional, choque cirúrgico
hemorrágico, queimaduras e trauma também estão envolvidos nas lesões gástricas, cujo
mecanismo ainda é pouco entendido (RAO et al., 2004).
A terapia utilizada para o tratamento das úlceras gástricas inclui o controle da
bactéria Helicobacter pylori bem como o controle da bomba H
+
/K
+
-ATPase, da secreção
ácida e reversão dos danos à mucosa e da inflamação. Muitos medicamentos utilizados no
tratamento desta doença não são completamente efetivos e muitos efeitos adversos
acompanham estas drogas, além do alto custo desses medicamentos para o paciente
(TOMA et al., 2002).
Dessa forma, muitos produtos derivados de plantas apresentam-se como uma
fonte atraente de novas drogas e muitos têm mostrado resultados promissores no
tratamento da úlcera gástrica (ZAYACHKIVSKA et al., 2004), seja como fonte no
desenvolvimento de novas entidades farmacológicas ou como um produto adjuvante no
tratamento desta doença (ARRIETA et al., 2003).
Como visto anteriormente, as ulcerações ocorrem quando há um desequilíbrio
causado tanto por aumento dos fatores agressores ou por diminuição da resistência gástrica
(SAIRAM et al., 2002). Os mecanismos de defesa da mucosa gastrintestinal contra agentes
agressores, tais como ácido clorídrico, bile e drogas antiinflamatórias não esteroidais,
consistem em três fatores principais: i) fatores funcionais, incluindo a secreção de muco
alcalino, microcirculação da mucosa e motilidade; ii) fatores humorais, compreendendo as
prostaglandinas e óxido nítrico e os iii) fatores neurais, formados pelos neurônios
sensoriais sensíveis a capsaicina (CPSN) (ARRIETA et al., 2003).
Os modelos animais desempenham papel importante na busca de novas drogas
com propriedades gastroprotetoras. As lesões na mucosa gástrica pode ser induzido por
diferentes modelos experimentais, e cada um com seu próprio mecanismo (SAMONINA et
al., 2004). Considerando que a etiologia da úlcera é multifatorial, incluindo interação entre
atividade gástrica pepsina, motilidade intestinal e alterções na circulação da mucosa
gástrica (CLEMENTI et al., 2002), comentaremos a seguir os principais modelos
experimentais utilizados para induzir lesões gástricas.
As lesões gástricas por etanol, um modelo extensamente utilizado para avaliação
experimental de drogas antiulcerogênicas (PANDIAN et al., 2002), ocorre
predominantemente na parte glandular do estômago com formação de leucotrienos C4
(LTC4), produtos secretados dos mastócitos e espécies reativas do oxigênio, diminuição do
muco e depleção de grupamento sulfidrílicos, resultando em danos à mucosa gástrica
(RAO et al., 2004). Da mesma maneira que etanol, outros agentes necrotizantes tais como
HCl 0,6 N e NaOH, administrados intragastricamente, produzem graves erosões
hemorrágicas na mucosa do estômago (MATSUDA et al., 1999).
A mucosa gástrica normalmente contém altas concentrações de glutationa
reduzida (GSH) que atuando como antioxidante e desempenhando papel importante na
manutenção da integridade da mucosa no estômago. As lesões induzidas por etanol estão
também associadas com diminuição significativa dos níveis de GSH na mucosa gástrica
(PONGIPIRIYADACHA et al., 2003).
Administração intraperitoneal de indometacina significativamente reduz a
secreção de prostaglandinas (PG´s) e bicarbonato e o fluxo sanguíneo da mucosa gástrica
em animais experimentais. A inibição das PG´s predispõe o estômago e o duodeno à danos
na mucosa, enquanto o estimulo das PG´s pode exercer um papel de proteção. Assim, o
efeito antiulcerogênico citoprotetor de uma droga pode ser mediado pelas PG´s endógenas
(SZABO & SZELENYI, 1987; TAN et al., 2002).
Assim como as lesões induzidas por etanol, o modelo de lesões gástricas
induzido por estresse também é bastante utilizado para avaliação de drogas
gastroprotetoras. Este modelo divide similaridades com o modelo do etanol, mas difere na
etiologia das lesões. As lesões induzidas por estresse de retenção e frio são pequenas e
com sangramento no lúmen, já no modelo de etanol observa-se estrias lineares
relacionadas à necrose da mucosa, hemorragia da submucosa e edema (CHO & OGLE,
1992).
Alterações na secreção e na microcirculação da mucosa gástrica, além da
motilidade anormal desta, são considerados os mecanismos patogênicos responsáveis pelas
lesões gástricas induzidas estresse, que desenvolve-se como um resultado da estimulação
do nervo vago, o qual aumenta a secreção gástrica e depleção do muco gástrico (AL-
HOWIRINY et al., 2005), levando a uma grave hemorragia, juntamente com um aumento
na atividade da mieloperoxidase, sugerindo que neste modelo as lesões envolve a
participação de neutrófilos, uma vez que a mieloperoxidase é um marcador da infiltração
desta célula durante a inflamação no estômago (CHO et al., 2003).
O mecanismo envolvido na formação das lesões gástricas tem sido estudada por
vários pesquisadores utilizando deferentes modelos animais de úlcera induzida. Exposição
de agentes irritantes aumentam a produção de PG´s pela mucosa gástrica com
conseqüência de uma redução do pH do lúmen gástrico, provavelmente através da
estimulação da secreção ácida. A ação protetora das PG´s é mediada pelo aumento na
produção de muco e secreção de bicarbonato, modulação da secreção do ácido gástrico,
inibição da liberação de mediadores inflamatórias por mastócitos e na manutenção do
fluxo sanguíneo durante a exposição a estes agentes (BATISTA et al., 2004).
Desse forma, outro modelo utilizado na avaliação antiulcerogênica de produtos
naturais é o modelo do método do piloro ligado em ratos. A partir da ligação do piloro,
observa-se alteração na circulação da mucosa gástrica e secreção dos produtos dos
mastócitos, além do aumento da secreção ácida (SAMONINA et al., 2004). Os parâmetros
bioquímicos do suco gástrico, bem como produção de muco e síntese de prostaglandinas
podem ser avaliados (BATISTA et al., 2004). Infiltração de leucócitos polimorfonucleares,
os radicais livres derivados do oxigênio e a peroxidação lipídica também estão envolvidos
na patogênese das lesões da mucosa estomacal induzida neste modelo (TANAKA et al.,
2001).
Os danos teciduais produzidos por agentes nocivos, etanol por exemplo, pode
resultar na acumulação de radicais livres tóxicos nas células da mucosa gástricas,
depletando os níveis de glutationa reduzida (GSH) no estômago. Os tióis endógenos tais
com GSH são capazes de ligar-se a radicais livres e prevenir a formação das lesões
produzidos por vários agentes ulcerogênicos. Assim GSH é tem importante participação na
manutenção na integridade da mucosa gástrica (MAITY et al., 2001), funcionando como
agente gastroprotetor, idem as PG´s. Várias enzimas anti-oxidantes, tais como glutationa
peroxidase involvidas na eliminação de peróxido de hidrogênio e na peroxidação lipídica,
são importantes na proteção celular (LA CASA et al., 2000).
Como visto acima, os antioxidantes naturais podem proteger o corpo humano
dos radicais livres e retardar o progresso de muitas doenças crônicas, além de desempenhar
papel importante na patogênese de várias doenças degenerativas (MONTILLA et al.,
2003). Neste sentido, muitos triterpenóides têm se mostrado promissores como agentes
antioxidantes, o que pode ser comprovado pelos diversos estudos envolvendo esta classe
de metabólito secundário (CHEN et al., 2002; YAMASHITA et al., 2002; WANG et al.,
2003; SEKIYA et al., 2003; SHIRWAIKAR et al., 2004; SHIH et al., 2004;
SULTANOVA et al., 2004 ).
1.5.3. Atividade hepatoprotetora
Como dito anteriormente diversas atividades biológicas para aos triterpenos
foram relacionadas nos últimos anos. Os triterpenos possuem uma ampla variedade de
efeitos biológicos, tais como antiinflamatório, anti-hiperlipidêmico, antiulcerogênico e
imunomodulatório. E dentre os efeitos biológicos destes compostos, a hepatoproteção é
dos um mais notáveis (LIU et al., 1994).
O fígado é um dos órgãos mais freqüentemente prejudicados do corpo, tendo em
vista que é exposto a grande variedade de agentes que são potencialmente hepatotóxicos.
Dessa forma, o desenvolvimento de drogas hepatoprotetoras que possam proteger,
satisfatoriamente, o fígado de tais danos são bem vindas (GUPTA et al., 2002).
As opções de tratamentos nas doenças hepáticas tais como, cirrose e hepatite
crônica são problemáticas. Tratamentos efetivos, como interferon, colchicina, penicilamina
e corticosteróides geram profundos efeitos colaterais, piorando, freqüentemente, o quadro
clínico do paciente. Neste sentido, médicos e pacientes necessitam de agentes terapêuticos
efetivos com baixa incidência de efeitos colaterais, e neste contexto, as plantas medicinais
constituem uma alternativa potencial (LUPER, 1999).
O ácido oleanólico é um triterpeno utilizado clinicamente no tratamento da
hepatite na China. Estudo realizado com preparações obtidas a partir deste triterpeno
mostrou diminuição na atividade da alanina aminotransferase (ALT) e no conteúdo do
malonaldeído hepático (malonaldeído-MDA), em modelo de hepatotoxicidade induzida
por tetracloreto de carbono (CCl
4
) (CHEN et al., 2005).
Outro triterpeno, o ácido ursólico presente nas folhas de Eucalyptus hybrid e E.
tereticornis mostrou um significativo efeito protetor, in vitro, no modelo de toxicidade
induzida por etanol em hepatócitos isolados de ratos. Este triterpeno foi capaz de preservar
a viabilidade dos hepatócitos, revertendo as alterações enzimáticas séricas da ALT e AST
(aspartato aminotransferase), induzidas pelo etanol, de forma concentração dependente
(SARASWA et al., 2000).
Os mecanismos de hepatoproteção exercidos por alguns triterpenos, parecem ser
múltiplos. Sabe-se que muitos agentes hepatotóxicos necessitam da ativação de um
metabólito, via sistema citocromo P450 no fígado. Os ácidos olenólico e ursólico, exercem
suas atividades hepatoprotetora por inibir as enzimas CYP1A e CYP2A. O efeito protetor
do primeiro, nos modelos de hepatotoxicidade induzida por acetaminofeno,
bromobenzeno, tioacetamida, CCl
4
e furosamida, em camundongos, pode ser atribuído, em
parte, a inibição do citocromo P450 no fígado (LIU, 1995).
Outra via de proteção envolve a modulação de sistemas enzimáticos de defesa
no fígado. O ácido ursólico exerce sua atividade protetora por modular os níveis de
catalase, glutationa redutase e glutationa peroxidase contribuindo com seus efeitos
hepatoprotetores, além de melhorar a peroxidação lipídica por diminuir os níveis de
malonaldeído no modelo de hepatotoxicidade induzida por agentes hepatotóxicos, como o
CCl
4
, por exemplo. (MARTIN-ARAGON et al., 2001).
O lupeol, triterpeno isolado de Leptadenia hastata, planta medicinal utilizado
popularmente como antiinflamatório Nikiema et al., (2001), mostrou atividade
hepatoprotetora no modelo de hepatotoxicidade induzida por cádmio em ratos. Neste
modelo, Sunitha et al.. (2001), demonstraram que o lupeol, através de sua propriedade
antioxidante, melhorando o sistema “redox” tecidual por intermédio da destruição de
radicais livres, o que foi observado pelas alterações nos níveis de MDA e das enzimas
hepáticas.
Várias espécies de kalanchoe são utilizadas na oriente como tônico, adstringente
analgésico, carminativo, e no tratamento da diarréia e vômito. Várias atividades já foram
comprovadas em laboratório, como antiulcergênica, antiinflamatória e antimicrobiana.
Yadav & Dixit (2003), demonstraram que o suco e o extrato etanólico obtidos da folha
desta planta exibiram significativa atividade hepatoprotetora, in vivo e em in vitro no
experimento de hepatotoxicidade induzida por tetracloreto de carbono (CCl
4
).
Neste modelo a hepatotoxicidade induzida pelo CCl
4
é devido ao metabólito
CCl
3
um radical livre que liga-se às lipoproteínas promovendo a peroxidação de lipídeos
do retículo endoplasmático. A análise fitoquímica desta planta mostra há presença de
triterpenos pentacíclicos dentre outros compostos. Jeong (1999), mostrou que o efeito
hepatoprotetor do ácido oleanólico, no modelo de dano hepático induzido por CCl
4
, em
camundongos, envolve o citocromo P450, mais especificamente o P4502E1.
O tratamento dos animais, por três dias, com este triterpeno resultou em uma
inibição, significativa, do sistema enzimático P4502E1, de maneira dose dependente, além
de prevenir o aumento da ALT, da atividade da lactato desidrogenase e a peroxidação
lídica no fígado. Assim, o efeito hepatoprotetor deste triterpeno, deve-se, em parte, à sua
capacidade de bloquear a bioativação do CCl
4
, sobretudo pela inibição da expressão e
atividade do citocromo P4502E1.
Acetaminofeno é uma das drogas mais utilizadas no mundo devido as suas
propriedades analgésica e antipirética. Contudo, esta droga é conhecida por causar necrose
hepática centrolobular em humanos e em animais experimentais quando altas doses desta
substância são administradas (HAZAI et al., 2002). Assim, como CCl
4
, a toxicidade
exercida pelo acetaminofeno é mediada por um mecanismo que envolve a produção de
radical livre, via citocromo P450, denominado N-acetil-p-benzoquinona imina (NAPQI)
(ROSEN et al., 1983). Liu et al. (1995), demonstraram que o ácido oleanólico exerce efeito
hepatoprotetor frente à hepatotoxicidade induzida pelo acetaminofeno em camundongos,
via diminuição da atividade de várias enzimas do sistema P450, além de aumentar os
níveis de GSH no fígado e diminuir a atividade da enzima catalase em 20%.
1.5.4. Neurônios sensoriais aferentes, receptores vanilóides e seus
papéis na gastroproteção e nocicepção visceral
Os nervos sensoriais aferentes, algumas vezes descritos como nervos aferentes
primários, desempenham papel de proteção, alertando o Sistema Nervoso Central sobre
eventos nocivos nos tecidos periféricos. Estes nervos são encontrados na pele, intestinos e
pulmões e quando estimulados por agentes inflamatórios, secretam os neuropeptídeos
CGRP (calcitonin gene-related peptide) e Substância P (SP), os quais atuam em conjunto
no processo inflamatório. CGRP atua em seu receptor (CGRP
1
) causando vasodilatação
arteriolar e aumento do fluxo sanguíneo nos tecidos inflamados, levando ao edema.
A SP age sobre o receptor de neurocinina (NK
1
), nas vênulas pós-capilares, com
conseqüente extravasamento plasmático, além de estimular a adesão e infiltração de
neutrófilos. A SP induz ainda a secreção de triptase, a partir de grânulos encontrados nos
mastócitos, efeito que estimula a liberação de CGRP
e SP, a partir das terminações
periféricas dos neurônios aferentes, o que contribui para manutenção da inflamação
neurogênica (STEINHOFF et al., 2000 AMADESI et al., 2004).
O envolvimento das fibras sensoriais sensíveis à capsaicina na integridade da
mucosa gástrica é discutida há décadas (ZOLCSANYI & BARTHO, 2001). Os nervos
sensoriais sensíveis à capsaicina também desempenham papel importante na nos
mecanismos de defesa gástrica frente a agentes ulcerogênicos. Recentemente, Horie et al.,
(2004), demonstraram a participação dos receptores vanilóides (VR1) no mecanismo de
defesa da mucosa gástrica de ratos, no modelo de úlcera induzida por HCl. Receptores
vanilóides presentes na mucosa gastrintestinal estão envolvidos na regulação da motilidade
gastroentérica, secreção ácida, aumento no fluxo sanguíneo gástrico através da ação da
CGRP, estimulação da secreção de bicarbonato e muco gástrico ou na manutenção da
integridade da mucosa na presença de substâncias nocivas (PONGPIRIYADACHA et al.,
2003).
A estimulação dos nervos sensoriais sensíveis à capsaicina estimulam a
liberação de neuropeptídeos tais como CGRP e/ou substância P a partir das terminações
destes neurônios e estes medeiam a resposta aferente. CGRP é um potente inibidor da
secreção ácida gástrica em modelos animais e no homem, um efeito que parece ser
mediado através da liberação de somatostina e evidências apontam que CGRP é um forte
candidato aos efeitos antiulcerogênicos mediado pela capsaicina (ABDEL-SALAM et al.,
1999).
O receptor funcional TRPV1 (TRP-vanilloid receptor 1) assemelha-se aos
membros da família de proteínas TRP (transient receptor potential) em termos de
organização topológica. As proteínas TRP são formadas por canais de cálcio
transmembrana, identificado primeiramente em drosophila com TRP mutante e deficiente
para fotorecepção (WOOD, 2005).
A existência de outros tipos de receptores TRPV1 e um grande número de
membros pertencentes à família do receptores TRP sugere que estes receptores podem
estar envolvidos em grande variedade de diferentes estímulos. De fato, estes receptores
estão implicados na transdução de um variedade de sinais extracelulares, incluindo luz,
calor, frio e distensão mecânica; mediadores intracelulares, tais como diacilglicerol e
metabólitos do ácido araquidônico e alguns atuando através de quinases podem também
ativar os receptores TRP (WOOD, 2002).
A recente clonagem e caracterização dos receptores TRPV1 a partir dos tecidos
animais (CATERINA et al., 1997) e humanos (HAYES et al., 2000), foi decisivo na
identificação do alvo molecular dos ligantes para esta classe de receptores de membrana.
Estes ligantes podem ser distribuídos em vários grupos, como os capsaicinóides
(capsaicina, resiniferatoxina, piperina, eugenol, capsazepina e vermelho de rutênio), os
gingeróis, os terpenos dialdeídos insaturados, os triprenilfenóis e os gingenosídeos
(CALIXTO et al., 2005).
Um importante papel têm sido atribuído aos receptores TRPV1 na pesquisa da
dor. Evidencias sugerem que a regulação e ativação destes receptores são determinados por
diversos mecanismos, tendo em vista que o canal iônico é regulado mediadores lipídicos,
pH ácido (prótons), temperatura (acima de cerca de 42ºC), fosfolipídeos e fosforilação,
além de produtos de natureza química ou sintética. (CATERINA & JULIUS, 2001;
CALIXTO et al., 2005). Assim, estes receptores representam um alvo promissor para
novos compostos analgésicos.
A capsaicina é um composto extensamente utilizado em animais e humanos no
estudo dos mecanismos envolvidos na dor para avaliação da eficácia de várias drogas
analgésicas. A ativação pela capsaicina dos nociceptores, tais como fibras-C, promove a
liberação de glutamato e peptídeos neuromodulatórios a partir dos seus neurônios
sensitivos aferentes, bem como peptídeos pró-inflamatórios, tais como substância P e
CGRP de seus terminais periféricos. Estes eventos neuroquímicos são responsáveis pela
hiperalgesia, vasodilatação, inflamação comumente observadas após administração de
capsaicina em humanos e animais de laboratórios (BARRET et al., 2003).
A capsaicina (8-metil-N-vanilil-6-nonenamida) é principal ingrediente da
pimenta vermelha, planta do gênero Capsicum. Capsaicina é estimulante seletivo dos
neurônios aferentes sensoriais da raiz do gânglio dorsal nos mamíferos, formandos por
fibras não mielinizadas C e mielinizadas A, as quais respondem a estimulação nociva
(térmica, mecânica e química) (CATERINA & JULIUS, 2001). Esta propriedade seletiva
da capsaicina tem estimulado a investigação do papel destas fibras aferentes em um
considerável número de processos fisiológicos.
Peskar et al. (1991), verificaram que a estimulação desses receptores pela
administração intragástrica de capsaicina foi efetiva em proteger contra lesões da mucosa
gástrica induzidas por etanol em ratos, efeito que parece não envolve a participação das
PG´s, mas possivelmente a participação do óxido nítrico (NO), o qual pode ser secretado
das terminações nervosas da mucosa gástrica pela própria capsaicina.
As observações de Peskar et al foram confirmadas por ABDEL-SALAM et al.
(1999). Eles observaram que a estimulação do nervo sensorial com capsaicina não
modificou a ação citoprotetora da mucosa pela prostaciclina, tão pouco potenciou a
citoproteção mediada por esta nos modelos de lesão gástrica induzido por administração
tópica de aspirina e HCl, etanol 96% ou HCl 0,6 N. Apesar da controvérsia da capsaicina
sobre a secreção gástrica, este é dos mecanismo pelo qual este agente exerce sua atividade
protetora. Uma vez estimulado, os neurônios sensoriais sensíveis à capsaicina aumenta a
defesa da mucosa gástrica através do aumento da microcirculação além de reduzir os
efeitos agressivos através do efeito inibitório sobre a secreção gástrica (ABDEL-SALAM
et al. (1999).
Porém, altas concentrações desensibilizantes de capsaicina administradas
localmente ou doses neurotóxicas sistêmicas deste agente aumenta, significativamente, a
suscetibilidade da mucosa gástrica de ratos às lesões induzidas por substâncias
ulcerogênicas, como aspirina, etanol 96% ou indometacina (ABDEL-SALAM et al.,
1999), além de retardar o processo de cicatrização das úlceras gástricas (MA et al., 2000).
Estes resultados sugerem que os neurônios aferentes sensíveis à capsaicina
participam nos mecanismos de defesa da mucosa gástrica. Assim, a ativação das
terminações destes neurônios aferentes protegeria a mucosa gástrica da formação das
lesões (HOLZER & LIPPE, 1998). De fato, estudo conduzido por Park et al. (2000),
demonstrou que a capsaicina significativamente inibiu as lesões hemorrágicas induzidas
pelo etanol em ratos. Além de inibir a peroxidação lipídica e a atividade da
mieloperoxidase no mesmo modelo, de forma dose dependente.
Como vimos, os receptores para capsaicina e os neurônios sensíveis à capsaicina
modulam funções fisiológicas tais como manutenção da integridade tecidual. Dessa forma,
a inibição dos receptores TRPV1 ou a desensibilização das fibras sensíveis à capsaicina,
tanto podem ser benéficas como podem produzir perda de algumas funções fisiológicas
(NAGY et al., 2004).
Alguns triterpenos exercem sua atividade envolvendo os neurônios aferentes
sensíveis à capsaicina. Matsuda et al., (1999a; 1999b) demonstraram que o efeito
gastroprotetor e de inibição do esvaziamento gástrico, ambos efeitos exercidos por
Mormodina Ic, um oligoglicosídeo do ácido oleanólico, isolado das frutas de Kochia
scopara (L), devem-se a participação dos neurônios sensíveis à capsaicina participam no
efeito. Os triterpenos são os princípios responsáveis pelo efeito antinociceptivo em
modelos de dor induzido por capsaicina, dentre outros, do extrato metanólico do caule de
Epidendrum Mosenii. Este efeito parece dever-se em parte a interação com o sistema
opióide (FERREIRA et al., 2000).
Estudos mostram que alguns triterpenos pentacíclicos ou seus derivados são
possuidores de ação gastroprotetora ou antiulcerogênica em diferentes modelos de lesões
gástricas em animais (MATSUDA et al., 1998; FARINA et al., 1998; ARRIETA et al.,
2003). Navarrete et al. (2002) propuseram que a presença de um grupamento hidroxila
(OH), livre ou na forma de derivado, na posição C-3 dos triterpenos é necessário para que
estes compostos exerçam sua atividade antiulcerogênica. Dentre os compostos com
propriedades gastroprotetoras, e possuidoras de OH (livre ou derivada) destacam-se -
amirina, -amirina, ácido 3-epi-oleanólico, ácido 18-glicirrético, ácido oleanólico, ácido
ursólico, carbenoxolona, lupeol, sericosídeo e diversas saponinas triterpênicas
(NAVARRETE et al., 2002; FARIANA et al., 1998).
1.5.5. Outras atividades
Uma outra atividade biológica relacionada aos triterpenos é o efeito antitumoral,
o qual é bem descrito para esta classe de compostos. Por exemplo, o ácido ursólico e o
ácido oleanólico, parece exercer suas atividades antitumorais, possivelmente por i) inibir a
inflamação produzida pelo tumor; ii) pela supressão na expressão de certos oncogênes, tais
como c-jun e c-fos e, iii) pela modulação dos sistemas de defesa, tais como potencial
antioxidante e funções immune (LIU, 1995). O ácido ursólico foi capaz de inibir a
angiogênese, in vitro, incluindo a proliferação de células endoteliais, migração e
diferenciação (CARDENAS et al., 2004).
Mais recentemente, Saleem et al. (2004), utilizando modelo de câncer de pele,
verificaram que animais pré-tratados com lupeol mostraram significante redução na
incidência do tumor e retardo no período de latência para o surgimento do tumor. Este
efeito está ligado à inibição da ativação de PI3K induzido por TPA; pela ativação de NF-
kappaB e IKKalfa e degradação e fosforilação de IkappaBalfa.
No período entre 1989 e 1994, cerca de 200 medicamentos aprovados pela FDA
(Food and Drugs Administration) foram obtidos de fontes naturais. Dentre as drogas
anticancerígenas e antimicrobianas, aproximadamente 70% foram desenvolvidos a partir
de produtos naturais (SIANI, 2003). Dessa forma, triagens sistemáticas a partir de produtos
vegetais, representa uma alternativa na descoberta de novos compostos com potencial
atividade antimicrobiana frente às bactérias multiresistentes. Neste contexto, os triterpenos
representam uma fonte potencial de novos fármacos.
Os principais metabólitos de Diopsyros melanoxylon, os triterpenos, amirinas e
ácido ursólico, exibiram potente atividade contra bactérias Gram negativa (Pseudomonas
syringae), com razoável atividade contra bactérias Gram positivas (Bacillus sphaericus) e
Bacillus subtilis (MALLAVADHANI et al., 2004). Encontra-se na literatura trabalhos
relatando atividade antifúngica aos triterpenos. O ácido betulínico, wogonina e oroxindina,
isolados das partes aéreas de Bacopa monnieri e Holmskioldia sanguinea, inibiram
completamente (100% de inibição) o crescimento dos fungos Alternaria alternata e
Fusarium fusiformis (CHAUDHURI et al., 2004).
Frações obtidas do extrato metanólico de Buchholzia coriacea exibiram uma
significativa atividade antifúngica, de forma concentração-dependente, quando comparado
ao tioconazol (droga de referência). Os dois princípios ativos presentes no extrato foram
isolados e identificados como lupeol e beta-sitosterol (AJAIYEOBA et al., 2003).
Outras atividades relacionadas aos triterpenos incluem ainda, atividade
hipoglicêmica (XIE et al., 2004; PEREZ & VARGAS, 2002), antiviral (GONG et al.,
2004; MADUREIRA et al., 2003) e anticariogênica (LIU, 1995).
1.6. Protium heptaphyllum
1.6.1. Considerações Botânicas
A família Burseraceae, pertencente à ordem Rutales, é distribuída em 16 gêneros
encontrados nas regiões tropicais e subtropicais, sendo dividida em três tribos: Protieae,
Boswellieae e Canarieae, sendo a Protieae distribuída em três gêneros: Garuga,
Tetragastris e Protium. Este último gênero é o mais representativo com cerca de 136
espécies (GUIMARÃES, 1997; SUSUNAGA, 1995).
O Protium heptaphyllum (Aubl.) March., da família Burseraceae, popularmente
conhecido como almecegueira, breu-branco verdadeiro (Amazônia), almecegueira-
cheirosa, almecegueira-de-cheiro, almecegueira-vermelha, almecegueiro-bravo, é uma
planta de ocorrência em todo o Brasil em terrenos arenosos, tanto úmidos quanto secos.
Possui altura de 10-20 m, com tronco de 40-60 cm de diâmetro, folhas compostas pinadas
de 2-4 jugas, com folíolos de 7-10 cm de comprimento por 4-5 cm de largura (LORENZI,
1992) (Figura 1).
A planta é perenifólia, heliófita, característica da floresta latiofoliada
semidecídua. É particularmente freqüente em áreas ciliares úmidas. Ocorre tanto em matas
primárias como em formações secundárias. Produz anualmente grande quantidade de
sementes viáveis, amplamente disseminadas por pássaros. Floresce durante os meses de
agosto-setembro. Os frutos amadurecem em novembro-dezembro. A madeira é
moderadamente pesada (densidade 0,77 g/cm
3
), compacta, dura, revessa porém dócil ao
cepilho, bastante elástica, de grande durabilidade quando em lugares secos sendo de
excelente qualidade para a construção civil (LORENZI, 1992) (Figura 1).
As mudas da planta podem ser produzidas a partir da colocação de sementes
para germinação, logo que colhidas, em canteiros ou diretamente em recipientes
individuais contendo substrato peneirado de 0,5 cm de espessura e irrigar diariamente. A
emergência ocorre em 15-25 dias e, a taxa de germinação geralmente é baixa. O
desenvolvimento das plantas no campo é apenas moderado (LORENZI, 1992).
1.6.2. Usos populares
A madeira do P. hepthapyllum é apropriada para construção civil, obras
internas, assoalhos, serviço de torno, carpintaria e marcenaria. A árvore proporciona boa
sombra e apresenta qualidades ornamentais, podendo, por conseguinte, ser utilizada na
arborização urbana e rural. Seus frutos são avidamente procurados por várias espécies de
pássaros que comem o arilo adocicado que envolve as sementes. Por essa razão não pode
faltar na composição de florestas mistas destinadas ao re-povoamento vegetal de áreas
degradadas de preservação permanente, principalmente as localizadas ao longo de rios e
córregos.
FIGURA 1– Protium heptaphyllum (à direita, detalhes das partes aéreas)
(LORENZI, 1992).
A família Burseraceae é uma conhecida fonte de exsudatos e resinas ricas em
substâncias aromáticas que são utilizadas para fins medicinais e industriais (SIANI et al.,
1999). O Protium é o principal gênero desta família e um dos mais distribuídos na
América do Sul (SIANI et al., 1999). Na medicina popular, gomas e óleos-resina de
espécies de Protium são usados para vários fins, como por exemplo, tônico, estimulante,
antiulcerosos e antiinflamatórios (SIANI et al., 1999). A atividade imunoestimulante e
antiinflamatória foi descrito para o extrato aquoso de resinas de espécies de Burseraceae
(DUWIEJUA et al., 1993).
A partir de incisões feitas no tronco de P. heptaphyllum obtém-se um óleo-
resina aromática, amarelo claro, que se solidifica com o ar e se inflama facilmente
(BRAGA, 1976). A resina é utilizada na indústria de verniz, calafetagem de embarcações
em rituais religiosos na forma de incenso (CORRÊA, 1973; MAIA et al., 2000). Na
medicina popular, a resina é utilizada como cicatrizante, antiinflamatória, hemostática,
balsâmica, analgésica e expectorante, no tratamento de doenças da pele e como
antiulcerogênica (CORRÊA, 1973; SUSUNAGA et al., 2001; OTUKI et al., 2001a).
1.6.3. Química e farmacologia de Protium spp
Há poucos relatos na literatura acerca de estudos químico e farmacológico com
espécies do gênero Protium. O levantamento bibliográfico realizado no “Chemical
Abstracts” revelou a presença dos constituintes químicos, os quais encontram-se listados
na Tabela 1. A maioria dos compostos isolados já foram reportados na literatura, sendo os
triterpenos os constituintes predominantes nesta espécie.
A literatura registra ainda dois trabalhos relatando a composição química dos
óleos essenciais da resina e um trabalho sobre óleos essenciais das folhas e caule
(ZOGHBI et al., 1995; SIANI et al., 1999). Trabalho desenvolvido por Bandeira et al.,
(2001), a partir do óleo essencial das folhas, frutos e resina, de um exemplar coletado no
Ceará, elevou à identificação, nas folhas, de mono e sesquiterpenos, tais como, mircerno,
-cariofileno, enquanto os óleos da resina e frutos continham, sobretudo monoterpenos,
como -pineno, limoneno, -felandreno e terpinoleno.
Os mesmo autores deram continuidade aos estudos fitoquímicos sobre a
composição química da resina, estendendo-se a outras partes da planta, tais como caule,
folhas e frutos. Da resina, além do óleo essencial, cujo teor é de 11%, foram isolados o
monoterpeno triidroxilado, triterpenos (-amirina, -amirina e breina); dos frutos verdes,
(-) catequina; dos frutos maduros e folhas, flavonóides quercetina e quercetina-3-O-
ramnosil, respectivamente; e do caule, escopoletina (BANDEIRA et al., 2002).
Dentre as plantas do gênero Protium, algumas vêm sendo estudadas e têm
demonstrado propriedades farmacológicas variadas. Estudo realizado por Otuki et al.
(2001) demonstra que a atividade antinociceptiva de uma fração etérea obtida de P. kleinii,
está relacionada, em parte, com há presença de triterpenos no extrato desta planta.
Tabela 1. Constituintes fixos isolados da espécie do gênero Protium heptaphyllum
com registrados na literatura.
Substâncias
Referências
3-hidroxiursano-12-eno (-amirina)
MAIA et al., 2000; VIEIRA-JUNIOR, et al,
2005
3-hidroxioleano-12-eno (-amirina)
ZOGHBI et al., 1993; MAIA et al., 2000;
VIEIRA-JUNIOR, et al, 2005
ursano-12-eno-3,16-diol (breína)
MAIA et al., 2000; OTUKI et al., 2001;
VIEIRA-JUNIOR, et al, 2005
oleano-12-eno-3,16-diol (maniladiol)
MAIA et al., 2000; VIEIRA-JUNIOR, et
al., 2005
ursano-9(11):12-dieno-3-ol
MAIA et al., 2000
oleano-9(11):12-dieno-3-ol
MAIA et al., 2000
Ácido 3-hidroxi-tirucalla-7,24-dieno-21-óico
MAIA et al., 2000; MORA et al., 2001
Ácido 3-hidroxi-tirucalla-8,24-dieno-21-óico
MAIA et al., 2000
3,24-diidroxiursano-12-eno
SUSUNAGA et al., 2001
3-oxo-20S-hidroxitaraxastano SUSUNAGA et al., 2001
3,20S-diidroxitaraxastano
SUSUNAGA et al., 2001
Éter etílico do ácido p-cumárico ALMEIDA et al., 2001
6-metoxi-7-hidroxicumarina ALMEIDA et al., 2001
7,8-dihidroxi-6-metoxi-2H-1-benzopiran-2-ona ALMEIDA et al., 2001
cleomiscosina A ALMEIDA et al., 2001
-sitosterol
ALMEIDA et al., 2001; Zoghbi et al., 1993
3-O--D-glicopiranosil--sitosterol
ALMEIDA et al., 2001
Lupeol ALMEIDA et al., 2001
Lupenona VIEIRA-JUNIOR, et al, 2005
-amirinona
VIEIRA-JUNIOR, et al, 2005
-amirinona
VIEIRA-JUNIOR, et al, 2005
Estigmasterol ALMEIDA et al., 2001; Zoghbi et al., 1993
Os mesmos autores (OTUKI et al., 2005b), evidenciaram ainda que o extrato
etéreo ou seu principal constituinte ativo, um triterpeno pentacíclico denominado -
amirina isolado do mesmo vegetal, apresentaram pronunciado efeito antiinflamatório em
modelo de inflamação tópica. Dando continuidade ao estudo com P. kleinii, Otuki et al.
(2005a), mostraram ainda que a mistura de dois triterpenos pentacíclicos, -amirina e -
amirina, isolados da resina desta planta produziu, de forma dose dependente, expressiva
antinocicepção em modelos de nocicepção inflamatória induzidos por ácido acético,
formalina e capsaicina em camundongos.
A atividade antinociceptiva também foi observada por Aragão (2004). Neste
estudo, a mistura de triterpenos -amirina e -amirina, isolada de P. heptaphyllum
mostrou efeito antinociceptivo em modelos agudos de nocicepção induzidos por ácido
acético, formalina e placa quente, além das atividades antiinflamatórias
(antiedematogênica), ansiolítica e antiagregante plaquetária.
Muitas espécies de Protium produzem uma resina aromática que exsuda das
cascas e folhas, a qual, dependendo da espécie, é utilizada na confecção de incensos. Da
mesma forma, para algumas espécies, a resina é usada na medicina tradicional por suas
propriedades antiinflamatórias (DEHARO et al., 2001).
Siani et al. (1999), avaliaram a atividade antiinflamatória in vivo e in vitro de
óleos essenciais obtidos da resina e folhas de várias espécies do gênero Protium. Neste
trabalho, os óleos essenciais obtidos da resina P. heptaphyllum (PHP) e das folhas de P.
strumosum (PS) P. grandifolium (PG), P. lewellyni (PL) e P. hebetatum (PHT) foram
avaliados em modelos de inflamação e nocicepção em camundongos.
Os óleos de PHP, PS e PL, inibiram significativamente o extravasamento de
proteínas no modelo de pleurisia induzida por zymosan. Já os óleos de PG, PL e PHT,
inibiram o acúmulo de neutrófilos, enquanto os óleos de PHP e PL inibiram o acúmulo de
eosinófilo na cavidade pleural induzido por LPS. Já in vitro os óleos de PHP e PS,
inibiram a produção de óxido nítrico induzido por LPS. O efeito antinociceptivo não foi
observado com nenhum dos óleos quando os mesmos foram administrados por via oral.
Na busca de novas drogas com potencial atividade contra a malária, a resina
Protium glabrescens, tradicionalmente utilizada devido as suas propriedades
antiinflamatória e analgésica, mostrou significativa atividade antimalárica in vivo contra o
parasita Plasmodium falciparum (DEHARO et al., 2001).
Há um crescente interesse na elucidação das atividades biológicas dos
triterpenóides. Estudos envolvendo alguns destes compostos, como o ácido ursólico, ácido
oleanólico e lupeol, já são bem estabelecidos na literatura. Diferentemente destes últimos,
são escassos os trabalhos abrangendo as atividades relacionadas aos triterpenos -amirina
e -amirina (Figura 2) e a resina de Protium heptaphyllum.
H
O
H
H
H
1
3
5
10
11
14
17
18
21
22
23
24
25
26
27
28
30
29
H
O
H
H
H
29
30
A B
FIGURA 2. Estruturas químicas de -amirina (A) e -amirina (B).
Com base nestes dados, decidimos investigar os efeitos farmacológicos de P
heptaphyllum, uma vez que esta planta é rica em terpenos, particularmente triterpenos
pentacíclicos, incluindo -amirina e -amirina.
OBJETIVOS
2. OBJETIVOS
Tendo em vista os poucos estudos farmacológicos envolvendo a espécie
Protium heptaphyllum e sabendo que a resina desta espécie é rica em substâncias de
natureza terpênica, particularmente os triterpenos pentacíclicos -amirina e -amirina, e
sendo os triterpenos, de uma forma geral, possuidores de variadas atividades
farmacológicas, o presente trabalho tem como objetivo geral estudar os efeitos
farmacológicos da resina e da mistura de triterpenos -amirina e -amirina, um dos seus
principais componentes.
Como objetivos específicos, buscamos:
Obter e purificar a resina a partir do exsudato da casca do caule de Protium
heptaphyllum (Aubl.) March e isolar a mistura de triterpenos pentacíclicos - e -
amirinas, a partir da resina;
Avaliar a toxicidade, em camundongos e Artemia sp, e a CL
50
da resina purificada e
da mistura de triterpenos - e -amirinas;
Examinar farmacologicamente os efeitos da resina nos modelos de inflamação:
edema de pata, granuloma em ratos e permeabilidade vascular em camundongos;
Analisar a atividade gastroprotetora da resina em modelos agudos de úlcera por
etanol absoluto, HCl/etanol sobre a produção dos grupos sulfidrílicos não-protéicos
(NP-SH) em camundongos, além de estudar o efeito da resina sobre a secreção
gástrica, utilizando ligadura do piloro em ratos; Estudar a atividade gastroprotetora
da mistura de triterpenos - e -amirinas, nos modelos de lesões gástricas induzidas
por etanol em camundongos;
Investigar os efeitos da mistura da mistura de triterpenos - e -amirina no prurido
induzido por dextrana T40 e Composto 48/80 em camundongos e na degranulação
de mastócitos mesenteriais de ratos pelo composto 48/80, avaliar ainda a mistura de
triterpenos - e -amirinas em modelos de edema de pata utilizando camundongos,
delineando, quando possível, os mecanismos de ação envolvidos nestes efeitos
farmacológicos;
Verificar a atividade antinociceptiva da mistura de triterpenos - e -amirina, em
modelos de nocicepção utilizando a capsaicina como agente algogênico em
camundongos, projetando os possíveis mecanismos de ação envolvidos nos efeitos
farmacológicos;
Estudar a ação hepatoprotetora da mistura de triterpenos - e -amirinas nos
modelos de lesões hepáticas induzidas por acetaminofeno e
galactosamina/lipopolissacarídeo em camundongos, avaliando a função hepática
através determinando a produção dos grupos sulfidrílicos não-protéicos (NP-SH) e
a atividade das enzimas séricas ALT e AST, além da avaliação microscópica do
fígado;
Averiguar os efeitos da mistura de triterpenos - e -amirinas, nos testes de rota-
rod, campo aberto e no tempo de sono induzido por pentobarbital sódico em
camundongos.
MATERIAL
3. MATERIAL
3.1. Material botânico
O exsudato resinoso (resina bruta) de P. hepthaphyllum foi coletado durante o
mês de Agosto de 2001, no município de Timon, estado do Maranhão, após a identificação
pela botânica Dra. Roseli Farias de Melo Barros. A exsicata da planta foi depositada no
Herbário Graziela Barroso da Universidade Federal do Piauí, sob o número 18247.
3.2. Animais experimentais
Camundongos albinos (Mus musculus), variedade Swiss Webster, adultos, de
ambos os sexos, pesando entre 25-30 g e ratos albinos (Rattus norvegicus), variedade
Wistar, adultos, de ambos os sexos, pesando entre 180-200 g, provenientes do Biotério do
Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal do Ceará. Os animais
foram acondicionados em caixas de polipropileno, à temperatura ambiente de 22-24
o
C,
com ciclos de claro/escuro de 12 em 12 h, recebendo ração padrão (Purina Chow) e água
ad libitum. Os protocolos experimentais utilizados foram aprovados pelo Comitê de Ética
em Pesquisa Animal – CEPA da Universidade Federal do Ceará.
3.3. Drogas e reagentes
Acetaminofeno Sigma, USA
Ácido acético glacial P.A. Synth, Brasil
Ácido Etilenodiaminotetraacético sal dissódico (EDTA) Proanalysi, Brasil
Ácido fosfórico Sigma, USA
Ácido tiobarbitúrico Sigma, USA
Ácido tricloroacético P.A. Sigma, USA
Ácido trinitrobenzeno sulfônico - TNB Sigma, USA
Álcool etílico absoluto P.A. Quimex, Brasil
Azul de Evans Reagen, Brasil
Azul de Toluidina Vetec, Brasil
Bicarbonato de sódio Vetec, Brasil
Capsaicina Calbiochem, USA
Carragenina Sigma, Brasil.
Cetotifeno Farmalab, Brasil.
Cimetidina Smithkline Beecham, Brasil.
Ciproeptadina Prodome, Brasil
Clonidina Sigma, USA
Cloreto de cálcio Vetec, Brasil
Cloreto de magnésio Vetec, Brasil
Cloreto de potássio Vetec, Brasil
Cloreto de sódio Vetec, Brasil
Composto 48/80 Sigma, USA
Dexametasona Prodome, Brasil
Dextrana T40 Sigma, USA
Dextrana Sigma, USA
Dimetilfulfóxido (DMSO) Reagen, Brasil
Éter etílico Labsynth, Brasil
Galactosamina Sigma, ,USA
Glicose Vetec, Brasil
Glutation reduzido Sigma, USA
Histamina Sigma, USA
Ibuprofeno
Schering- Plough, Brasil
.
Indometacina Predome, Brasil.
Ioimbina Sigma, USA
Lipopolissacarídeo Sigma, USA
Malonaldeído Sigma, USA
N-Acetilcisteína
Fluimucil
, Eurofarma, Brasil
Naloxona Dupont, USA
n-butanol Lafan, Brasil
Pentobarbital sódico Abbots Lab, Brasil
Serotonina Sgima, USA
Sulfato de magnésio Vetec, Brasil
Sulfato de sódio Vetec, Brasil
Sulfato de Morfina Cristália, Brasil
Vermelho de rutênio Sigma, USA
Trisma Sigma, USA
Tween 80 Riedel, Alemanha
3.4. Aparelhos
Agitador – aquecedor, modelo 258
Fanen
, Brasil
Agitador de tubos – VORTEX, AP 56 PHOENIX
Analisador bioquímico semi-automático: modelo RA-50
Bayer
, Brasil
Balança analítica
Marte
, Brasil
Balança para animais
Filizola
, Brasil
Banho-maria: Modelo Q-249
QUIMIS
, Brasil
Centrifuga refrigerada, modelo CT 5500 DR
CIENTEC
, Brasil
Freezer –75ºC
Legaci System
Lavadora ultrasônica, modelo USC 700
UNIQUE
Material cirúrgico ---
Microscópio óptico binocular Nikon
pHmetro, modelo PM 608
Alalion
Plestismógrafo Ugo, Basile
Pipetas automáticas
Jencons
Rota-rod, RT-2002 Insight, Brasil
Seringas plásticas B-D-Plastipak
MÉTODOS
4. MÉTODOS
4.1. QUÍMICOS
O estudo fitoquímico, incluindo a obtenção da resina purificada e isolamento da
mistura binária dos triterpenos -amirina e -amirina, foi realizado pela Profa. Dra.
Mariana Helena Chaves do Departamento de Química da UFPI. O material vegetal (resina
bruta) (410 g) foi dissolvida em metanol/diclorometano (4:1). Após filtração, os solventes
foram concentrados em evaporador rotativo sob pressão reduzida, obtendo-se 408 g de
resina purificada, resultando num rendimento de 99,5%. A resina (12,0 g) foi
cromatografada em coluna (5,5 x 38 cm) de gel de sílica (280 g), empacotada com hexano,
utilizando como eluente os solventes hexano e acetato de etila, em ordem crescente de
polaridade.
Foram coletas 104 frações, de aproximadamente 125 mL, as quais depois de
concentradas e analisadas por CCF de sílica, foram reunidas. As frações de M-19 (5,43 g)
foram reunidas e submetidas à caracterização, utilizando as técnicas cromatográficas e
espectroscópicas. A fração M-19 (5,43 g; 45,3%) apresentou-se como um sólido amorfo
branco (FM=C
30
H
50
O; PF=179-181°C; PM=426) cuja identificação foi realizada através
da análise dos seus espectros de RMN
1
H e
13
C e comparação com dados da literatura,
permitindo-nos constatar que os dois triterpenóides tratam-se da -amirina e -amirina
(Figura 2) na razão de 63:37. Considerando que foram obtidos 5,4 g da mistura de - e -
amirina, assim como a proporção entres estes triterpenos, constatou-se que 28,3% -
amirina (3,4 g) e 16,6% (2,0 g) -amirina.
FIGURA 3 – Representação esquemática da obtenção da resina purificada e da mistura
de triterpenos - e -amirina a partir do material vegetal (resina bruta) de
Protium heptaphyllum (Aubl.) March.
Dissolução
Metanol/Diclorometano (4:1)
Filtração
Concentração sob pressão reduzida
Material vegetal (resina bruta) obtido de Protium heptaphyllum (412 g)
Resina purificada Protium heptaphyllum (408 g; 99,5%.)
Fracionamento (12g)
α
- e -
β
-amirina
[α-amirina (28,3%) e β-amirina (16,6%)]
Cromatografia em coluna (sílica)
Eluentes: hexano e acetato de etila
(ordem crescente de polaridade)
104 frações coletadas (125 mL/cada)
Análise por CCD (sílica)
Frações M-19 – 29 (5,43 g; 45,3%)
Reunião (análise por CCD - sílica)
Análise (RMN
1
H e
13
C e dados na literatura)
Identificação
4.2. TOXICIDADE AGUDA
4.2.1. Toxicidade aguda para camundongos
Para a determinação da toxicidade aguda da resina e da mistura de e -
amirina, camundongos Swiss, 25-30 g, foram divididos em grupos de 5 machos e 5
fêmeas, em jejum de sólidos de 18h e tratados, com veículo (3% de Tween 80 em salina
0,9%, 10 mL/kg), resina (1, 2, 3, 4 e5 g/kg, via oral; 1 g/kg, via intraperitoneal) ou mistura
de e -amirina (1,2 e 3 g/kg, via oral; 1e 2 g/kg, via intraperitoneal).
Durante o período de 72 h após a administração das drogas os animais foram
observados quanto aos parâmetros: estado de alerta, sedação, ptose, dispnéia, micção,
diarréia, convulsão, atividade motora espontânea, reflexo postural, piloereção, nocicepção
e morte (MILLER & TAINTER, 1944; LITCHFIELD & WILCOXON, 1949).
4.2.2. Toxicidade aguda para camarão de salmoura (Artemia sp)
A avaliação da toxicidade frente a Artemia sp segue o método descrito por
Meyer et al. (1982). Os ovos de artemia (50 mg) foram colocados para eclodir em um
recipiente contendo água marinha (1000 mL) e aerado durante 48 h (colocado um foco de
luz após as primeiras 24 h). Após este período, as larvas foram coletadas com auxílio de
uma pipeta de Pasteur.
Várias concentrações da resina de P. heptaphyllum (1-3000 g/ml) e da mistura
de - e -amirina (1-1000 g/ml) foram preparadas e colocadas em frascos aos quais
adicionou-se água marinha, sendo 5 mL o volume final em cada frasco. Dez larvas foram
adicionadas a cada frasco e utilizados três frascos para cada dose da resina, sendo o
número de mortes dentre as trinta larvas verificado após 24 h.
A CL
50
(concentração letal para 50% das larvas) com intervalo de confiança de
95% foi determinada para a resina de acordo com o método descrito por Miller Tainter
(1944). Controle não tratado, veículo (3% de Tween 80) ou dicromato de potássio (10-100
g/ml) foram adicionados ao estudo com finalidade de comparação.
4.3. ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA
Muitos exsudatos resinosos possuem valores medicinais como desifetantes e
parasiticidas. A resina de P. heptaphylum, rica em terpenos, é utilizada na medicina
popular como analgésica e antiinflamatória. (CORRÊA, 1973; FINNEY & TARKNOY,
1960). Siani et al. (1999), demonstraram a atividade antiinflamatória e antitumoral do óleo
essencial obtido das folhas e resina de P. heptaphyllum. Assim, como base no exposto,
investigou-se a atividade antiinflamatória da resina e de seus principais constituintes, a
mistura de triterpenos - e - amirina isolados de P. heptaphyllum em modelos
experimentais de inflamação aguda (edema de pata por carragenina 1%, permeabilidade
vascular induzida por ácido acético) e crônica (granuloma por “pellet” de algodão). Estes
modelos envolvem fases distintas da inflamação com participação de variados mediadores
inflamatórios e são amplamente utilizados no estudo de drogas com potencial atividade
antiinflamatória. Tendo em vista a baixa toxicidade da resina e baseados em estudos
preliminares, utilizamos as doses de 200 e 400 mg/kg da resina nos experimentos
subsequentes.
4.3.1. Efeito da resina de P. heptaphyllum no edema de pata induzido por
carragenina
O edema de pata foi induzido em ratos Wistar, machos, 150-180g, divididos em
grupos de 6 animais cada, pela injeção subplantar de 0,1 mL de carragenina 1% dissolvida
em salina 0,9%. A pata contralateral recebeu o mesmo volume de salina 0,9%.
Os animais foram tratados, via oral, com veículo (3% de Tween 80 em salina
0,9%), resina de P. heptaphyllum (200 e 400 mg/kg) ou indometacina (10 mg/kg) e após
1h receberam a carragenina. Após 3h da administração da carragenina o volume das patas
foi registrado em pletismógrafo (Ugo Basile
) e o edema expresso com a diferença, em
mililitros, entre a pata que recebeu carragenina e a pata contralateral que recebeu salina
(WINTER et al., 1962).
4.3.2. Efeito da resina de P. heptaphyllum no granuloma induzido por “pellet”
de algodão
Ratos Wistar, machos, 150-180 g, foram divididos em grupos de 8 animais cada.
O dorso dos animais foi depilado um dia antes do experimento. Os animais foram
anestesiados e feita uma incisão no centro do dorso onde foram implantados
subcutâneamente dois “pellets” de algodão esterilizados (50 mg/cada), um de cada lado do
dorso (SWINGLE & SHIDEMAN, 1972).
Os animais foram tratados, via oral, com veículo (3% de Tween 80 em salina
0,9%, 10 mL/kg), resina de P. heptaphyllum (200 e 400 mg/kg) ou ibuprofeno (300
mg/kg), uma vez ao dia, durante sete dias consecutivos. Ao final do oitavo dia, os animais
foram sacrificados, os “pellets” de algodão retirados e determinado o peso úmido e o peso
seco após secagem em estufa a 60
o
C por 24 horas.
4.3.3. Efeito da resina de P. heptaphyllum no aumento da permeabilidade
vascular induzido por ácido acético
Camundongos Swiss, machos, 25-30 g, divididos em grupos de 8 animais cada,
em jejum de sólidos de 18h, foram tratados, via oral, com veículo (3% de Tween 80 em
salina 0,9%, 10 mL/kg), resina de P. heptaphyllum (200 e 400 mg/kg) ou ácido
acetilsalicílico (AAS - 250 mg/kg). Uma hora após os tratamentos os animais receberam
uma injeção endovenosa de Azul de Evans (25 mg/kg) e 5 min após, uma injeção
intraperitoneal de ácido acético 1% (10 mL/kg).
Após 30 minutos os animais foram sacrificados, as cavidades peritoneais foram
abertas e lavadas com água destilada, o fluido peritoneal coletado e colocado em frascos
com capacidade para 10 mL previamente preparados com 0,1 mL de solução de NaOH
0,1 N. O volume foi completado para 10 mL e a concentração de Azul de Evans
determinada por espectrofotometria em 610 nm (WHITTLE, 1964). A quantidade de
corante extravasada para a cavidade peritoneal foi determinada de acordo com uma curva
padrão de Azul de Evans.
4.4. ATIVIDADE GASTROPROTERORA
Em geral, triterpenos pentacíclicos possuem atividade antiinflamatória,
gastroprotetora, antinociceptiva e antitumoral (FINNEY & TARKNOY, 1960; INOUE et
al., 1990; NAVARRETE et al., 2002; FERNANDES et al., 2003). Os modelos utilizados
neste estudo (lesões gástricas induzidas por etanol, etanol acidificado, secreção ácida
gástrica por piloro ligado e lesões gástricas induzidas por indometacina) são modelos
clássicos de avaliação de drogas com atividade citoprotetoras/antiulcerogênicas. Assim,
investigou-se a atividade gastroprotetora da resina de P. heptaphyllum.e de seus principais
constituintes, a mistura binária de triterpenos - e -amirina.
4.4.1. Efeito da resina de P. heptaphyllum na úlcera gástrica induzida por
etanol
Camundongos Swiss, machos, 25-30 g, divididos em grupos de 8 animais cada,
em jejum de sólidos de 24 h, foram tratados, via oral, com veículo (3% de Tween 80 em
salina 0,9%, 10 mL/kg), resina (200 e 400 mg/kg) ou N-acetilcisteína (NAC - 750 mg/kg,
i.p.).
Uma hora após os tratamentos os animais receberam 0,2 mL de etanol 96% e
após 30 minutos foram sacrificados, os estômagos retirados e a área de lesão gástrica
glandular determinada por planimetria e os dados expressos em termos de percentagem
(ROBERT et al., 1979). Para a determinação dos grupos sulfidrilas não protéicos (NP-SH)
a porção glandular foi processada de acordo com Sedlak & Lindsay (1968).
4.4.2. Efeito da resina de P. heptaphyllum na úlcera gástrica induzida por
etanol acidificado
Camundongos Swiss, machos, 25-30 g, divididos em grupos de 8 animais cada,
em jejum de sólidos de 18h, foram tratados, via oral, com veículo (3% de Tween 80 em
salina 0,9%, 10 mL/kg), resina (200 e 400 mg/kg) ou N-acetilcisteína (NAC - 750 mg/kg,
i.p.).
Uma hora após os tratamentos os animais receberam 0,2 mL de uma solução de
0,3M de HCl em etanol 60% e após 1h foram sacrificados, os estômagos retirados e a área
de lesão gástrica glandular determinada por planimetria e os dados expressos em termos de
percentagem (MIZUI et al., 1987).
4.4.3. Efeito da resina de P. heptaphyllum sobre a secreção gástrica em modelo
de ligação do piloro
Ratos, Wistar, machos, 150-180 g, divididos em grupos de 6 animais cada, em
jejum de sólidos de 24 h, foram anestesiados e realizada a ligação do piloro (SHAY et al.,
1945). Veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg), resina (200 e 400 mg/kg) ou
cimetidina (100 mg/kg) foram administradas por via intraduodenal imediatamente após a
ligação do piloro em um volume de 2,5 mL/kg.
Após 4h da ligação do piloro, os animais foram sacrificados, a cárdia foi
amarrada para evitar uma possível perda do material secretado, e o estômago retirado,
lavados externamente com água destilada e secado em papel de filtro. O conteúdo gástrico
foi coletado em tubos de ensaio e centrifugados a 1500 rpm por 30 minutos. O volume do
sobrenadante foi mensurado em proveta e a acidez total gástrica foi determinada através de
titulação com NaOH 0,1 N, utilizando fenolftaleína 2% como indicador ácido-base
(REITMAN et al., 1970).
4.4.4. Efeito da da resina de P. heptaphyllum sobre as úlcera gástrica induzida
por indometacina
Camundongos Swiss, machos, com peso de 25-30 g, divididos em grupos de 8
animais, em jejum de sólidos de 18 h, foram tratados, via oral, com veículo (3% de Tween
80 em salina 0,9%, 10 mL/kg), resina (100 e 200 mg/kg) ou cimetidina (100 mg/kg, v.o.).
Após uma hora, os animais foram tratados por via subcutânea com indometacina (20
mg/kg), preparada com 0,5 % de carboximetilcelulose e 8 horas depois, os animais foram
sacrificados por deslocamento cervical. De acordo com BHARGAVA (1973), os
estômagos foram retirados, instilados com formalina a 5 % por 15 minutos, abertos ao
longo da grande curvatura, lavados em salina e inspecionados para atribuições de escores
de acordo com SZABO et al. (1985) abaixo descrito, onde n corresponde ao número de
úlceras encontradas.
1. Perda de pregas da mucosa....................................................... 1 ponto
2. Descoloração da mucosa........................................................... 1 ponto
3. Edema....................................................................................... 1 ponto
4. Hemorragias.............................................................................. 1 ponto
5. Número de petéquias
- até 10.....................................................................................
- mais de 10.............................................................................
2 pontos
3 pontos
6. Intensidade da ulceração
- úlceras ou erosão de até 1mm...............................................
- úlceras ou erosão maiores que 1mm.....................................
- úlceras perfuradas..................................................................
n x 2 pontos
n x 3 pontos
n x 4 pontos
4.4.5. Efeito da mistura de α- e β-amirina na úlcera gástrica induzida por
etanol: papel dos neurônios aferentes primários sensíveis à capsaicina
Sabendo-se que os neurônios aferentes sensíveis à capsaicina participam no
mecanismo de defesa da mucosa gástrica (HOLZER & LIPPE, 1988), verificamos um
possível papel destes fibras sensoriais na gastroproteção exercida pelos triterpenos - e -
amirina.
Para tanto, camundongos Swiss, machos, 25-30 g, divididos em grupos de 8
animais cada, em jejum de sólidos de 18 h, foram tratados, via oral, com veículo (3% de
Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg), mistura de - e -amirina (50, 100, 300 e 600
mg/kg) ou capsaicina (2,5, 5, 15 e 20 mg/kg). Uma hora após os tratamentos os animais
receberam 0,2 mL de etanol 96% e após 30 min foram sacrificados, os estômagos retirados
e a área de lesão gástrica glandular determinada por planimetria e os dados expressos
como percentagem (ROBERT et al., 1979).
A participação dos neurônios aferentes sensíveis à capsacina no efeito
gastroprotetor das amirina (100 mg/kg, via oral) no modelo de úlcera gástrica induzida por
etanol foi investigado em camundongos dessensibilizados com capsaicina. Para isso,
Camundongos machos, 25-30 g, foram anestesiados com pentobarbital sódico e tratados
com capsacina, duas injeções de 25 mg/kg por via intraperitoneal, por três dias
consecutivos (MATSUDA & YOSHIKAWA, 1999).
Para prevenir alguma dificuldade respiratória associada ao tratamento com
capsaicina, os animais foram pré-tratados com aminofilina (10 mg/kg, i.m.) antes da
administração de capsacina. Após oito dias, a depleção pela capsacina foi avaliada pela
instilação ocular de uma solução de capsacina 10 g/mL, a ausência de reflexo ocular foi
considerada como dessensibilização dos neurônios sensoriais aferentes.
Animais dessensibilizados e animais normais, divididos em grupos de 8 animais
cada, em jejum de sólidos de 18h, foram tratados, via oral, com veículo (3% de Tween 80
em salina 0,9%, 10 mL/kg) ou mistura de - e -amirina (100 mg/kg). Uma hora após os
tratamentos os animais receberam 0,2 mL de etanol 96% e após 30 min foram sacrificados,
os estômagos retirados e a área de lesão gástrica glandular determinada por planimetria.
4.5. ATIVIDADE ANTIPRURIGINOSA
A literatura mostra que os receptores vanilóides (TRPV1), expressos nas fibras
sensoriais aferentes cutâneas, modulam a nocicepção e inflamação neurogênica
(STANDER et al., 2004). Dessa forma, investigou-se a atividade da mistura de - e -
amirina em modelos de prurido experimentais induzidos por dextrana T40 e pelo
Composto 48/80, avaliando ainda a participação do sistema opióide, assim como, a ação
dos triterpenos sobre a degranulação de mastócitos ex vivo induzido pelo composto 48/80.
4.5.1. Efeito da mistura de α- e β-amirina no prurido induzido por dextrana
T40
Camundongos Swiss, machos, 25-30 g, divididos em grupos de 8 animais cada,
em jejum de sólidos de 18h, foram tratados, via oral, com veículo (3% de Tween 80 em
salina 0,9%, 10 mL/kg), mistura de - e -amirina (50, 100 e 200 mg/kg) ou ciproeptadina
(10 mg/kg).
Duas horas após os tratamentos os animais foram colocados para ambientação
no local de observação por 30 min, após este período receberam uma injeção subcutânea
(50 l), na região dorsal da cabeça, de Dextrana T40 (75 mg/kg). Os animais controle
receberam o mesmo volume de salina 0,9%. O prurido foi observado durante 20 min,
sendo registrado o prurido em todas as parte do corpo (KURAISHI et al., 1995).
4.5.2. Efeito da mistura de α- e β-amirina no prurido induzido por composto
48/80
Camundongos Swiss, machos, 25-30 g, divididos em grupos de 8 animais cada,
em jejum de sólidos de 18 h, foram tratados, via oral, com veículo (3% de Tween 80 em
salina 0,9%, 10 mL/kg), mistura de - e -amirina (50, 100 e 200 mg/kg) ou
ciproheptadina (10 mg/kg).
Duas horas após os tratamentos os animais foram colocados para ambientação
no local de observação por 30 min, após este período receberam uma injeção subcutânea
(50 l), na região dorsal da cabeça, de composto 48/80 (3 mg/kg). Os animais controle
receberam o mesmo volume de salina 0,9%. O prurido foi observado durante 20 min,
sendo registrado o prurido no nariz com as patas dianteiras e traseiras e o prurido no local
de injeção com as patas traseiras (KURAISHI et al., 1995).
4.5.3. Efeito da naloxona (antagonista de receptores opióides) sobre a atividade
antipruriginosa da mistura de α- e β-amirina ou morfina no prurido
induzido por composto 48/80
Para avaliar a participação do sistema opióide na atividade antipruriginosa da
mistura de - e -amirina, camundongos Swiss, machos, 25-30 g, divididos em grupos de
8 animais cada, em jejum de sólidos de 18h, foram tratados com veículo (3% de Tween 80
em salina 0,9%, v.o.) e mistura de - e -amirina (100 mg/kg, v.o.) 2 horas antes e,
naloxona (2 mg/kg, i.p.) ou morfina (7,5 mg/kg, s.c.) 30 minutos antes da administração
subcutânea (50 l), na região dorsal da cabeça, de composto 48/80 (3 mg/kg).
Os animais controle receberam o mesmo volume de salina 0,9%. O prurido foi
observado durante 20 min, sendo registrado o prurido no nariz com as patas dianteiras e
traseiras e o prurido no local de injeção com as patas traseiras (KURAISHI et al., 1995).
4.5.4. Efeito da mistura de α- e β-amirina sobre a degranulação de mastócitos
ex vivo
Ratos Wistar, machos, 150-180 g, em jejum de sólidos de 18 h, divididos em
grupos de 4 animais cada, foram tratados com salina 0,9% (0,1 mL/10 g, v.o.), veículo (3%
de Tween 80 em salina 0,9%, v.o.), mistura de - e -amirina (100 mg/kg, v.o.) ou
cetotifeno (1 mg/kg, v.o.).
Após 2 h, os animais foram sacrificados, os mesentérios retirados e colocados
em tubos de ensaio contendo solução de Ringer (10 mL). A degranulação dos mastócitos
foi induzida pela incubação dos mesentérios, dos respectivos grupos, com Composto 48/80
(concentração final de 0,4 g/mL). O mesmo volume de água destilada foi adicionado aos
tubos de ensaio contendo o mesentério de animais que receberam somente salina.
Após 30 minutos de incubação, os mesentérios foram montados em lâminas de
vidro e corados com azul de toluidina 0,1% para a observação dos mastócitos
degranulados em microscopia ótica. A contagem dos mastócitos íntegros e degranulados
foi realizada em cinco campos de cada lâmina e o resultado expresso como a percentagem
de mastócitos degranulados (NORTON, 1954).
Com o intuito de corroborar com os resultados obtidos na investigação
antipruriginosa das amirinas, avaliou-se os efeitos da mistura dos triterpenos em modelos
de edema de pata induzido por conhecidos agentes degranuladores de mastócitos: dextrana
T40 e Composto 48/80, além de histamina e serotonina
4.5.5. Efeito da mistura de α- e β-amirina no edema de pata induzido por
dextrana T40
Camundongos Swiss, machos, 25-30 g, divididos em grupos de 8 animais cada,
em jejum de sólidos de 18h, foram tratados, via oral, com veículo (3% de Tween 80 em
salina 0,9%, 10 mL/kg), mistura de - e -amirina (50, 100 e 200 mg/kg) ou
ciproheptadina (10 mg/kg). Uma hora após os tratamentos os animais receberam uma
injeção subplantar (50 l) de dextrana 150 mg/kg e o mesmo volume de salina na pata
contralateral.
Após 2h os animais foram sacrificados, as patas cortadas e pesadas e o edema
expresso, em miligramas, pela diferença de peso entre a pata que recebeu dextrana e a pata
contralateral que recebeu salina (WINTER et al., 1962).
4.5.6. Efeito da mistura de α- e β-amirina no edema de pata induzido por
composto 48/80
Camundongos Swiss, machos, 25-30 g, divididos em grupos de 8 animais cada,
em jejum de sólidos de 18 h, foram tratados, via oral, com veículo (3% de Tween 80 em
salina 0,9%, 10 mL/kg), mistura de - e -amirina (50, 100 e 200 mg/kg) ou ciproeptadina
(10 mg/kg). Uma hora após os tratamentos os animais receberam uma injeção subplantar
(50 l) de composto 48/80 (10 mg/kg) e o mesmo volume de salina na pata contralateral.
Após 2h os animais foram sacrificados, as patas cortadas e pesadas e o edema
expresso em miligramas, pela diferença de peso entre a pata que recebeu Composto 48/80
e a pata contralateral que recebeu salina (WINTER et al., 1962).
4.5.7. Efeito da mistura de α- e β-amirina no edema de pata induzido por
histamina
Camundongos Swiss, machos, 25-30 g, divididos em grupos de 8 animais cada,
em jejum de sólidos de 18h, foram tratados, via oral, com veículo (3% de Tween 80 em
salina 0,9%, 10 mL/kg), mistura de - e -amirina (50, 100 e 200 mg/kg) ou ciproeptadina
(10 mg/kg). Uma hora após os tratamentos os animais receberam uma injeção subplantar
(50 l) de histamina 10 mg/kg e o mesmo volume de salina na pata contralateral.
Após 2 h os animais foram sacrificados, as patas cortadas e pesadas, sendo o
edema expresso em miligramas, pela diferença de peso entre a pata que recebeu histamina
e a pata contralateral que recebeu salina (WINTER et al., 1962).
4.5.8. Efeito da mistura de α- e β-amirina no edema de pata induzido por
serotonina
Camundongos Swiss, machos, 25-30 g, divididos em grupos de 8 animais cada,
em jejum de sólidos de 18h, foram tratados, via oral, com veículo (3% de Tween 80 em
salina 0,9%, 10 mL/kg), mistura de - e -amirina (50, 100 e 200 mg/kg) ou
ciproheptadina (10 mg/kg). Uma hora após os tratamentos os animais receberam uma
injeção subplantar (50 l) de serotonina 10 mg/kg e o mesmo volume de salina na pata
contralateral.
Após 2h os animais foram sacrificados, as patas cortadas e pesadas, sendo o
edema expresso em miligramas, pela diferença de peso entre a pata que recebeu serotonina
e a pata contralateral que recebeu salina (WINTER et al., 1962).
4.6. ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA
Sabe-se que a capsaicina quando aplicada topicamente ou injetada na pele
humana ou de animais experimentais, estimula o receptor TRPV1 localizado nas Fibras C
iniciando uma cascata de eventos incluindo excitação neuronal e liberação de mediadores
pró-inflamatórios. A ativação destes neurônios sensoriais pela capsaicina produz dor em
queimação, seguido por estado refretário, analgésico, quando de um subsequente estimulo
nociceptivo (SAADÉ et al., 2002; SZALLASI & BLUMBERG, 1999). Assim, o objetivo
deste estudo foi avaliar uma possivel modulação das amirinas na dor aguda e na
nocicepção visceral induzida por capsaicina.
4.6.1. Efeito da mistura de α- e β-amirina na nocicepção induzida pela
capsaicina
Camundongos Swiss, machos, 25-30 g, divididos em grupos de 8 animais cada,
em jejum de sólidos de 18h, foram colocados para ambientação no local de observação por
30 min. Após este período, os animais foram tratados com veículo da capsaicina (80% de
PBS + 10% de Tween 80 + 10% de Etanol absoluto, v.o.), veículo (3% de Tween 80 em
salina 0,9%, v.o.), mistura de - e -amirina (3, 10, 30 e 100 mg/kg, v.o.) 60 min antes da
administração subplantar (20 l) de capsaicina (1,6 g). O prurido (tempo de lambedura)
na pata injetada com capsaicina foi observado durante 5 min (SANTOS & CALIXTO,
1997).
Para avaliar a participação do sistema opióide no efeito antinociceptivo da
mistura de - e -amirina, naloxona (2 mg/kg, i.p.) foi administrada 15 minutos antes do
tratamento com morfina (5 m/kg) ou - e -amirina (10 mg/kg).
Em um outro grupo de experimento, camundongos Swiss, machos, 25-30 g,
divididos em grupos de 8 animais cada, em jejum de sólidos de 18h, foram tratados
durante três dias consecutivos com veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%, v.o.),
mistura de - e -amirina (10 mg/kg, v.o.), vermelho de rutênio (1,5 mg/kg, s.c.) ou a
combinação de vermelho de rutênio (1,5 mg/kg, s.c.) e a mistura de - e -amirina (10
mg/kg, v.o.). Após 1h do último tratamento, foi administrado por subplantar 20 l de
capsaicina (1,6 g) e o prurido na pata foi observado durante 5 min.
4.6.2. Efeito da mistura de α- e β-amirina na nocicepção induzida pela
administração intracolônica de capsaicina (nocicepção visceral)
Camundongos Swiss, machos, 25-30 g, divididos em grupos de 8 animais cada,
em jejum de sólidos de 18h, foram colocados para ambientação no local de observação por
30 min. Após este período, os animais foram tratados com veículo da capsaicina (80% de
PBS + 10% de Tween 80 + 10% de Etanol absoluto, v.o.), veículo (3% de Tween 80 em salina
0,9%, v.o.), mistura de - e -amirina (3, 10, 30 e 100 mg/kg, v.o.), clonidina (0,1 mg/kg,
v.o.) ou ioimbina (2 mg/kg, s.c.).
Após 60 min, foi administrado por via intracolônica, 50 L de capsacina (149
g) em cada animal, utilizando-se uma cânula (1,6 mm), a uma distância de 4 cm do ânus,
após aplicação de vaselina na região perianal para evitar evitar a estimulação de áreas
somáticas pelo contato com a capsaicina. Um grupo de animais recebeu somente veículo
intracolônico foi incluído no estudo.
Imediatamente após a administração da capsacina foi registrado, por um período
de 30 minutos, o número de comportamento relacionado a nocicepção por capsacina que
são: lambedura abdominal, contorção abdominal, arrastar o abdômen contra o solo e
retração abdominal (KAWAO et al., 2004).
4.6.3. Efeito da mistura de α- e β-amirina sobre a resposta térmica induzida
por capsaicina
A capsaicina quando administrada em animais experimentais por via
subcutânea, nas doses variando de 1-10 mg/kg, induz, de forma dose dependente, queda da
temperatura corporal que persiste por um período de 2 a 5 horas (SZIKSZAY et al., 1982).
Dessa forma, analisamos se a mistura dos triterpenos e o vermelho de rutênio, um
antagonista não competitivo dos receptores TRPV1, poderiam antagonizar a resposta
hipotérmica induzida pela injeção subcutânea da capsaicina em camundongos.
Camundongos Swiss, machos, 25-30 g, divididos em grupos de 8 animais cada,
em jejum de sólidos de 18h, foram tratados com veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%,
v.o.), mistura de - e -amirina (10 e 100 mg/kg, v.o.) ou vermelho de rutênio (1,5 mg/kg,
s.c.) duas vezes ao dia durante três dias, 60 min antes da administração subcutânea de
capsacina (10 mg/kg).
A temperatura retal (ºC) dos animais foi medida antes e 30, 60, 90, 120, 150
min, como também 24 e 48h após a injeção de capsaicina, utilizando-se um termômetro
digital clínico (Becton Dickinson
) inserido a 2 cm do reto (SZIKSZAY et al., 1982).
4.7. ATIVIDADE HEPATOPROTETORA
O paracetamol (acetaminofeno) é um fármaco mundialmente utilizado como
analgésico e antipirético. O seu uso em sobredoses (suicídio ou acidental) ou por
indivíduos com doenças hepáticas (ex. usuários crônicos de álcool) pode levar à hepatite
fulminante (PRESCOTT, 2000; GYAMLANI & PARIKH, 2002). A hepatotoxicidade é
resultado da formação de um metabólito tóxico, n-acetil-p-benzoquinoneimina (NAPQI),
pelo sistema do citocromo P4502E1 hepático, que promove depleção da glutationa e
alteração na homeostase do cálcio (LEE et al., 1996; CHEN et al., 1999; HOLOWNIA &
BRASZKO, 2004).
O Fator de Necrose Tumoral (TNF-), é uma citocina secretada por macrófagos
que apresenta um amplo espectro de efeitos fisiopatológicos. Esta citocina participa não
apenas na imunidade celular e humoral, mas também em muitas patologias tais como
choque séptico, nas doenças inflamatórias intestinais e nas hepatites causadas por virus,
álcool, agentes químicos, doenças autoimunes, e nas lesões hepáticas experimentais
induzidas por GalN/LPS, modelo que frequentemente tem sido utilizado na avaliação de
drogas com atividade hepatoprotetora (KIMIO et al., 2002; SONG et al, 2005.).
Ensaios in vitro, in vivo e ensaios clínicos demonstram a ação hepatoprotetora
de vários triterpenos como ácido oleanólico, ácido ursólico, hederina (LIU et al., 1994).
Nossos estudos demonstraram a atividadade gastroprotetora e antipruriginosa da mistura
de -and β-amirina (OLIVEIRA et al., 2004a; OLIVEIRA et al., 2004b). Estes achados
levaram-nos a investigar o possível efeito da mistura de - e β-amirina na prevenção da
hepatotoxicidade induzida pelo acetaminofeno e no modelo de hepatotoxicidade
inflamatória, induzido por Galactosamina/Lipopolissacarídeo (GalN/LPS).
4.7.1. Efeito da mistura de α- e β-amirina na hepatoxicidade induzida pelo
acetaminofeno em camundongos
Camundongos Swiss, machos, 25-30 g, divididos em 5 grupos de vinte animais
cada, em jejum de sólidos de 18h, foram tratados via intraperitoneal, com veículo (3% de
Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg), mistura de - e -amirina (50 e 100 mg/kg) ou N-
acetilcisteína (NAC - 750 mg/kg) 48, 24 e 2h antes, com exceção da N-acetilcisteína que
foi administrada apenas 2 horas antes, da administração oral de acetaminofeno (500
mg/kg). Animais que receberam apenas salina 0,9% foram incluídos no estudo como
controle normal (JANBAZ & GILANI, 2000).
Após o período de 24 horas depois da administração do acetaminofeno,
amostras de sangue, de todos os animais, foram obtidas através do plexo orbital, sob leve
anestesia com éter, em tubos de coleta de soro com gel separador (Vacuette
) para
determinação dos níveis de Aspartato Aminotransferase (AST) e Alanina
Aminotransferase (ALT) utilizando kits bioquímicos específicos (Labtest
) e um
analisador bioquímico semi-automático (Bayer
, modelo RA-XT). Os animais foram então
sacrificados e o tecido hepático coletado, pesado e processado para a dosagem de grupos
sulfidrilas não protéicos hepáticos - NP-SH (Sedlack & Lindsay, 1968).
4.7.2. Efeito da mistura de α- e β-amirina na hepatoxicidade induzida por D-
Galactosamina/Lipopolissacarídeo em camundongos.
Camundongos Swiss, machos, 25-30 g, divididos em grupos de 8 animais cada,
em jejum de sólidos de 18h, foram tratados com veículo (3% de Tween 80 em água
destilada – 0,1 mL/10g, v.o.), mistura de - e -amirina (50 e 100 mg/kg) ou
Dexametasona (DEX – 2 mg/kg, i.p.) 48, 24 e 2 horas antes, com exceção da
dexametasona que foi administrada apenas 2 horas antes, da administração intraperitoneal
de uma solução de D-galactosamina (GalaN - 800 mg/kg) e Lipopolissacarídeo (LPS - 7,5
g/kg), que foram dissolvidos em solução salina normal e administrados conjuntamente
(GalN/LPS). Os animais que receberam apenas veículo foram incluídos no estudo como
controle normal (MORIKAWA et al., 2002).
Após duas horas da administração de GalN/LPS, amostras de sangue, de todos
os animais, foram obtidas através do plexo orbital, sob leve anestesia com éter, em tubos
de coleta de soro com gel separador (Vacuette
), para determinação dos níveis de
Aspartato Aminotransferase (AST) e Alanina Aminotransferase (ALT) utilizando kits
bioquímicos específicos (Labtest
) e um analisador bioquímico semi-automático (Bayer
,
modelo RA-XT).
Seis horas após a administração de GalN/LPS, os animais foram sacrificados, o
tecido hepático coletado, pesado e processado para a dosagem grupos sulfidrilas não
protéicos hepáticos - NP-SH (SEDLACK & LINDSAY, 1968).
4.7.3. Avaliação histopatológica
Para avaliação das alterações teciduais microscópicas dos fígados, foram
realizados cortes histológicos de todos os grupos. O órgão foi fixado em formalina neutra
10%, incluido em parafina, realizadas secções em micrótomo e corado com hematoxilina-
eosina. As alterações histopátológicas foram examinadas em microscópio óptico e
atribuídos escores numa escala de 0 a 5 para presença e intensidade das lesões de acordo
com Silva et al., 2001, onde:
0 = nenhuma lesão;
1 = mínimo de lesões envolvendo poucas células necróticas;
2 = lesões suaves com 10-25% de células necróticas ou suaves mudanças
degenerativas;
3 = lesões moderadas com 25-40% de células necróticas ou degenerativas;
4 = lesões marcadas com 40-50% de células necróticas ou degenerativas;
5 = lesões severas com mais de 50% de células necróticas ou degenerativas.
4.8. AVALIAÇÃO DA MISTURA DE α- E β-AMIRINA NOS TESTES DE
ROTA-ROD, CAMPO ABERTO E TEMPO DE SONO
Drogas que diminuem atividade motora ou induz sedação podem fornecer
resultados falso-positivo ou falso/negativo em testes de nocicepção. Dessa forma,
avaliamos os efeitos da mistura de - e -amirina, no testes do “rota-rod”, campo aberto e
tempo de sono induzido por pentobarbital sódico. Este último modelo, também foi
utilizado com o objetivo de se verificar uma possível influência das - e -amirinas, sobre
o sistema enzimático do citocromo–P450.
4.8.1. Efeito da mistura de α- e β-amirina sobre a coordenação motora de
camundongos
Camundongos Swiss, machos, 25-30g, em jejum de sólidos de 18h, foram pré-
selecionados pela colocação em um aparelho de “rota-rod“ de 5 cm de diâmetro,
realizando 4 rotações por minuto (rpm). Os animais que permaneceram no aparelho dentro
de 120 segundos foram selecionados, divididos em grupos de 8 animais cada, e tratados,
via oral, com veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg) ou mistura de - e -
amirina (3, 10, 30 e 100 mg/kg).
Após 1h da administração das drogas, os animais foram recolocados no “rota
rod“ e registrado o tempo, em segundos, que o animal permaneceu no aparelho sendo 2
min o tempo máximo de permanência (ROSLAND et al, 1990).
4.8.2. Efeito da mistura de α- e β-amirina sobre a atividade exploratória
A atividade motora dos animais foi verificada por meio de um campo aberto,
quadrangular, com 30 cm de diâmetro, sendo sua base (local onde ocorre à movimentação
dos animais) dividida em 9 quadrados de diâmetros iguais. Camundongos Swiss, machos,
25-30 g, em jejum de sólidos de 18h, divididos em grupos de 8 animais cada, foram
tratados com veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%, v.o.) ou mistura de - e -amirina
(3, 10 e 30 mg/kg, v.o.).
Após 45 min da administração das drogas, os animais foram levados
individualmente ao campo aberto e observados durante um período de 4 minutos, com 1
min de adaptação, quanto a freqüência de locomoção, baseado no modelo descrito por
Archer (1973); Capaz et al. (1981).
4.8.3. Efeito da mistura de α- e β-amirina sobre o tempo de sono induzido por
pentobarbital sódico
A atividade hipno-sedativa dos animais foi verificada no modelo de sono
induzido por pentobarbital (DANDIYA & COLLUMBINE, 1959). Camundongos Swiss,
machos, 25-30 g, em jejum de sólidos de 18h, divididos em grupos de 10 animais cada,
foram tratados via oral com veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%) ou mistura de - e
-amirina nas doses de 3, 10 e 30 mg/kg, 1 h antes, e nas doses de 50 e 100 mg/kg, no
período de 48, 24 e 2 h antes da administração intraperitoneal de pentobarbital sódico (50
mg/kg).
Iniciado o período de sono, em seus respectivos grupos, os animais foram
posicionados em decúbito dorsal em local de adequada observação. Os animais foram
observados quanto ao tempo total de sono. O período total de observação foi de no
máximo 120 min.
4.9. Efeito da mistura de α- e β-amirina sobre os grupos sulfidrílas não
protéicos (NP-SH)
A quantificação dos grupos sulfidrilas não proteícos (NP-SH) foi realizada
segundo o método de Sedlack & Lindsay (1968). A porção glandular do estômago ou
fígado foram removidos, pesados e homogeneizados com EDTA 0,02 M gelado, para
preparar um homogenato a 10%. Uma alíquota de 4 mL de cada amostra foi retirada e
adicionado 3,2 mL de água destilada e 0,8 mL de ácido tricloroacético - TCA 50% em
solução aquosa.
Os tubos de ensaio contendo a mistura foram centrifugados a 3000 rpm por 15
minutos. Um volume de 2 mL foi retirado do sobrenadante e adicionado 4 mL de Tris
0,4M, pH 8,9 e 0,1 mL de DTNB 0,01M. A absorbância foi medida dentro de 5 minutos a
412 nm. A concentração de NP-SH foi calculada através de uma curva de calibração de
glutationa reduzida (GSH) e os resultados expressos em g de NP-SH/g de tecido.
4.10. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os valores experimentais obtidos foram expressos como média erro padrão da
média (E.P.M.). Para comparação entre as médias foi utilizada a análise de variância
(ANOVA), e a significância entre os grupos estabelecida pelos testes de Student Newman
Keul, para dados paramétricos, e teste de Kruskall-Wallis seguido do teste de Dunnett,
para dados não paramétricos (escores das lesões hepáticas induzidas por acetaminofeno e
GalN/LPS e lesões gástricas induzidas por indometacina). Valores de p<0,05 foram
considerados estatisticamente significativos.
RESULTADOS
5. RESULTADOS
5.1. TOXICIDADE AGUDA
5.1.1. Toxicidade aguda para camundongos
A resina na dose de até 5 g/kg, via oral e de 1 g/kg, via intraperitoneal, e a
mistura de - e -amirina na dose de até 3 g/kg, via oral e de até 2 g/kg, via
intraperitoneal, não demonstraram nenhum sinal de toxicidade evidente e não provocaram
morte dos animais.
5.1.2. Toxicidade aguda para Artemia sp
Através da utilização do método dos probitos determinou-se a CL
50
(concentração letal para 50% das larvas) da resina de P. heptaphyllum que foi de 400
27,85 g/mL, vinte vezes menos tóxico do que o dicromato de potásssio, conhecida
substância tóxica para a Artemia sp que possui CL
50
entre 20 e 40 g/mL. Enquanto que a
mistura de - e -amirina exibiu a CL
50
de 42,54 19,96 g/mL, sendo este resultado
similar ao dicromato de potássio.
5.2. ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA
5.2.1. Efeito da resina de P. heptaphyllum no edema de pata induzido por
carragenina
Os animais tratados com a resina de P. heptaphyllum nas doses de 200 e 400
mg/kg não foram capazes de reduzir o volume do edema da pata (0,663 0,062 e 0,510
0,052 mL, respectivamente) induzido pela carragenina 1% quando comparado ao controle
veículo (0,625 0,030). Indometacina (10 mg/kg), conhecida droga antiinflamatória,
reduziu significativamente (p<0,01) o peso da pata induzido pela administração de
carragenina (0,392 0,053 ml) (Tabela 2 e Figura 4).
Tabela 2. Efeito da resina de P. heptaphyllum no edema de pata induzido por
carragenina em ratos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
Edema de Pata
(mL)
Controle (veículo)
---
0,625 0,030
Resina 200
0,663 0,062
400
0,510 0,052
Indometacina 10
0,392 0,053
a
Os resultados são expressos como média erro padrão da média (E.P.M.) do
peso das patas (mg) para 6 animais após 3 horas da administração de carragenina. Veículo
(3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg), resina de P. heptaphillum (200 e 400
mg/kg) e indometacina (10 mg/kg) foram administrados por via oral, 1 hora antes da
injeção subplantar de carragenina 1% (0,1 mL/pata). Após 3 horas o volume do edema
(mL) da pata foi registrado em pletismógrafo.
a
p<0,01 vs controle veículo (ANOVA e
Teste de Student Newman Keul).
FIGURA 4. Efeito da administração oral da resina de P. heptaphillum no
edema de pata induzido por carragenina em ratos.
Veículo (3% de
Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg),resina de P. heptaphillum (200 e 400
mg/kg, v.o.) e indometacina (INDO - 10 mg/kg, v.o.) foram administrados 1
horas antes da injeção subplantar de carragenina 1% (0,1 mL/pata). Após 3
horas o volume do edema (mL) da pata foi registrado em pletismógrafo.
a
p<0,01 vs controle veículo (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
Edema de pata (mL)
Controle
Veículo
200
Resina
10
INDO
mg/kg
400
a
5.2.2. Efeito da resina de P. heptaphyllum no granuloma induzido por “pellet”
de algodão
Após sete dias da implantação dos “pellets” a média de peso dos granulomas
formados foi de 0,714 0,04 mg (peso úmido) e 0,171 0,007 mg (peso seco) para o
grupo controle veículo. A resina nas doses de 200 e 400 mg/kg e ibuprofeno (300 mg/kg)
inibiram de modo significativo (p<0,05 e p<0,01, respectivamente) o desenvolvimento do
granuloma induzido por “pellet” de algodão. Em ambas as doses (200 e 400 mg/kg) a
resina reduziu somente o peso seco (0,148 0,006 e 0,147 0,004 mg, respectivamente)
enquanto o ibuprofeno, fármaco antiinflamatório, reduziu o peso úmido (0,585 0,04 mg)
e o peso seco (0,106 0,008 mg) dos granulomas (Tabela 3 e Figura 5).
Tabela 3. Efeito da resina de P. heptaphyllum no granuloma induzido por
“pellet” de algodão em ratos.
Peso dos Granulomas (mg)
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
Peso Úmido
Peso Seco
Controle (veículo)
---
0,714 0,04
0,171 0,007
Resina 200
0,704 0,03
0,148 0,006
a
400
0,635 0,02 0,147 0,004
a
Ibuprofeno 300
0,585 0,04
a
0,106 0,008
b
Os resultados são expressos como média erro padrão da média (E.P.M.) do
peso (mg) dos “pellets” de algodão para 8 animais. Veículo (3% de Tween 80 em salina
0,9%, 10 mL/kg), resina de P. heptaphyllum (200 e 400 mg/kg) e ibuprofeno (300 mg/kg)
foram administrados por via oral durante todo o período do experimento (7 dias). O peso
dos granulomas foi verificado imediatamente após a remoção e o peso seco após 24 horas
de secagem em estufa a 60 ºC.
a
p<0,05;
b
p<0,01 vs controle veículo (ANOVA e Teste de
Student Newman Keul).
FIGURA 5. Efeito da administração oral da resina de P. heptaphyllum no
granuloma induzido por “pellet” de algodão em ratos.
Veículo (3% de
Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg), resina de P. heptaphyllum (200 e 400
mg/kg, v.o.) e Ibuprofeno (300 mg/kg, v.o.) foram administrados diariamente,
uma vez ao dia, durante 7 dias após a implatação de “pellets” de algodão no
dorso dos animais. O peso úmido dos granulomas foi verificado
imediatamente após a remoção e o peso seco após 24 horas de secagem em
estufa a 60 ºC.
a
p<0,05;
b
p<0,01 vs controle veículo (ANOVA e Teste de
Student Newman Keul).
Peso Úmido
Peso Seco
0
0,2
0,4
0,6
0,8
Peso dos Granulomas (mg)
a
a
a
b
Controle
(veículo)
200
Resina Ibuprofeno
400 300
mg/kg
5.2.3. Efeito da resina de P. heptaphyllum no aumento de permeabilidade
vascular induzido por ácido acético
Os animais tratados com a resina na dose de 400 mg/kg e o ácido acetilsalicílico
(250 mg/kg), fármaco antiinflamatório padrão, apresentaram extravasamento do corante da
ordem de 2,57 0,30 e 1,06 0,52 g de Azul de Evans, respectivamente, quando
comparados ao grupo que recebeu apenas ácido acético (5,34 0,17 g de Azul de Evans).
A resina (400 mg/kg ) apresentou atividade semelhante ao ácido acetil salicílico tendo em
vista que ofereceu inibição de 52 e 80% respectivamente, sobre o aumento da
permeabilidade vascular induzida por ácido acético (Tabela 4 e Figura 6).
Tabela 4. Efeito da resina de P. heptaphyllum no aumento de permeabilidade
vascular induzido por ácido acético em camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
Concentração de
Azul de Evans (µg)
Controle normal
---
0,81 0,07
Controle ácido acético ---
5,34 0,17
a
Resina 200
5,39 0,52
a
400
2,57 0,30
ab
AAS 250
1,06 0,52
ab
Os resultados são expressos como média erro padrão da média (E.P.M.) da
concentração de Azul de Evans (g) no lavado peritoneal 20 min após a administração
intraperitoneal de ácido acético 0,6% (10 mL/kg) para 8 animais. Veículo (3% de Tween
80 em salina 0,9%, 10 mL/kg), resina de P. heptaphyllum e Ácido Acetilsalicílico (AAS -
250 mg/kg) foram administrados por via oral, 1 hora antes da injeção de ácido acético
0,6%.
a
p<0,01 vs controle veículo;
b
p<0,01 vs controle ácido acético (ANOVA e Teste de
Student Newman Keul).
FIGURA 6. Efeito da administração oral da resina de P. heptaphyllum sobre o
aumento da permeabilidade vascular induzida por ácido acético em
camundongos.
Veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg), resina
de P. heptaphyllum (200 e 400 mg/kg, v.o.) e Ácido Acetilsalicílico (AAS -
250 mg/kg, v.o.) foram administrados, 1 hora antes da injeção de ácido acético
0,6%. Os resultados são expressos como média erro padrão da média
(E.P.M.) da concentração de Azul de Evans (g) no lavado peritoneal para 8
animais.
a
p<0,01 vs controle veículo;
b
p<0,01 vs controle ácido acético
(ANOVA e Teste de Student Newman Keul).
0
1
2
3
4
5
6
7
Concentração de Azul de Evans ( g)
Controle
Veículo
200
400
Resina
250
Controle
Ac. Acético
AAS
mg/kg
a
a
ab
ab
5.3. ATIVIDADE GASTROPROTERORA
5.3.1. Efeito da resina de P. heptaphyllum na úlcera gástrica induzida por
etanol
Os efeitos da resina e N-acetilcisteína sobre as lesões gástricas induzidas por
etanol estão demonstrados na Tabela 5 e Figura 7.
Os animais que receberam apenas veículo mostraram extensa área de lesão da
mucosa gástrica (mm
2
) na forma de erosões hemorrágicas. A resina, nas doses de 200 e
400 mg/kg, reduziu significativamente (p<0,001) a lesão gástrica de maneira dose
dependente (7,38 0,61 e 2,50 0,26 mm
2
, respectivamente) quando comparada ao
controle (23,15 1,82 mm
2
) correspondendo a uma inibição de 68 e 89%. A N-
acetilcisteína (NAC - 750 mg/kg), fármaco de referência, diminuiu de forma significativa
(p<0,001) as lesões gástricas (11,78 1,59 mm
2
), quando comparada ao controle em 49%.
Os animais que receberam etanol mostraram significativa redução (p<0,05) nos
níveis de NP-SH (152,0 14,1 g/g de tecido) quando comparado ao controle normal A
resina, nas doses de 200 e 400 mg/kg, não foi capaz de impedir a depleção dos grupos
sulfidrilas produzida pela etanol (176,5 6,6 e 148,9 11,3 g/g de tecido,
respectivamente) A N-acetilcisteína (750 mg/kg) inibiu significativamente (p<0,05) a
depleção dos grupos sulfidrilas (306,2 16,6 g/g de tecido) produzida pelo etanol
(Tabela 6 e Figura 8).
Tabela 5. Efeito da resina de P. heptaphyllum no modelo de úlcera gástrica
induzida por etanol em camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
Área de lesão gástrica
(mm
2
)
Controle (veículo)
---
23,15 1,82
Resina 200
7,38 0,61
a
400
2,50 0,26
a
NAC 750
11,78 1,59
a
Os resultados são expressos como média erro padrão da média (E.P.M.) para
8 animais. Veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg) e resina de P.
heptaphyllum (200 e 400 mg/kg) foram administrados por via oral e N-acetilcisteína (NAC
- 750 mg/kg) por via intraperitoneal, 1 hora antes da administração de etanol absoluto (0,2
mL). Os animais foram sacrificados 30 minutos após a administração do etanol.
a
p<0,001
vs controle normal (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).
FIGURA 7. Efeito da resina de P. heptaphyllum e N-acetilcisteína (NAC) nas
lesões gástricas induzidas por etanol em camundongos.
Os valores
representam a média erro padrão da média (E.P.M.) para 8 animais. Os
animais foram tratados com veículo (3% de Tween 80, v.o.), resina de P.
heptaphyllum (200 e 400 mg/kg, v.o.) e NAC (750 mg/kg, i.p.) 1 hora antes da
administração de etanol absoluto (0,2 mL).
a
p<0,001 vs controle normal
(ANOVA e Teste de Student Newman Keul).
0
5
10
15
20
25
30
Área de lesão gástrica (mm
2
)
Controle
Veículo
200 400 750
Resina
NAC
mg/kg
a
a
a
Tabela 6. Efeito da resina de P. heptaphyllum sobre os níveis de grupos
sulfidrilas não protéicos (NP-SH) no modelo de úlcera gástrica
induzida por etanol em camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
NP-SH
(µg/g tecido)
Controle (veículo)
---
332,8 25,0
Controle (etanol) ---
152,0 14,1
a
Resina 200
176,5 6,6
a
400
148,9 11,3
a
NAC 750
306,2 16,6
b
Os resultados são expressos como média erro padrão da média (E.P.M.) para
os níveis gástricos de glutationa (NP-SH) de 8 animais. Os níveis foram analisados 30
minutos após a administração oral de etanol. Veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10
mL/kg) e resina de P. heptaphyllum (200 e 400 mg/kg) foram administrados por via oral e
N-acetilcisteína (NAC - 750 mg/kg) por via intraperitoneal, 1 hora antes da administração
de etanol absoluto (0,2 mL).
a
p<0,05 vs controle veículo;
b
p<0,05 vs controle etanol
(ANOVA e Teste de Student Newman Keul).
FIGURA 8. Efeito da resina de P. heptaphyllum e N-acetilcisteína (NAC) sobre
os níveis de grupos sulfidrilas não protéicos nas lesões gástricas
induzidas por etanol em camundongos.
Os valores representam a média
erro padrão da média (E.P.M.) para 8 animais. Os níveis de glutationa foram
analisados 30 minutos após a administração oral de etanol. Os animais foram
tratados com veículo (3% de Tween 80, v.o.), resina de P. heptaphyllum (200 e
400 mg/kg, v.o.) e NAC (750 mg/kg, i.p.) 1 hora antes da administração de
etanol absoluto (0,2 mL).
a
p<0,05 vs controle veículo;
b
p<0,05 vs controle
etanol (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).
0
100
200
300
400
NP-SH (
µ
g/g tecido)
Controle
Veículo
200 400 750
Resina
NAC
mg/kg
Controle
Etanol
a
a
a
b
5.3.2. Efeito da resina de P. heptaphyllum na úlcera gástrica induzida por
etanol acidificado
Os efeitos da resina e N-acetilcisteína sobre as lesões gástricas induzidas por
etanol/HCl (0,3 M HCl/60% etanol) estão demonstrados na Tabela 7 e Figura 9.
Os animais que receberam apenas veículo mostraram extensa área de lesão da
mucosa gástrica (mm
2
) na forma de erosões hemorrágicas. A resina, nas doses de 200 e
400 mg/kg, reduziu significativamente (p<0,01) a injúria gástrica de maneira dose
dependente (8,91 0,96 e 6,53 1,15 mm
2
, respectivamente) correspondendo a uma
inibição de 45 e 66%. A N-acetilcisteína (NAC - 750 mg/kg), diminuiu de forma
significativa (p<0,001) as lesões gástricas (4,89 0,05 mm
2
) quando comparada ao
controle em 69%
Tabela 7. Efeito da resina de P. heptaphyllum no modelo de úlcera gástrica
induzida por etanol acidificado (0,3M HCl/60% etanol) em
camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
Área de lesão gástrica
(mm
2
)
Controle normal
---
16,14 1,95
Resina 200
8,91 0,96
a
400
6,53 1,15
a
NAC 750
4,89 0,05
b
Os resultados são expressos como média erro padrão da média (E.P.M.) para
8 animais. Veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg) e resina de P.
heptaphyllum (200 e 400 mg/kg) foram administrados por via oral e N-acetilcisteína (NAC
- 750 mg/kg) por via intraperitoneal, 1 hora antes da administração de uma solução de
0,3M de HCl em etanol 60% (0,2 mL). Os animais foram sacrificados 30 minutos após a
administração do etanol.
a
p<0,01;
b
p<0,001 vs controle normal (ANOVA e Teste de
Student Newman Keul).
FIGURA 9. Efeito da resina de P. heptaphyllum e N-acetilcisteína (NAC) nas
lesões gástricas induzidas por etanol acidificado em camundongos.
Os valores representam a média erro padrão da média (E.P.M.) para 8
animais. Os animais foram tratados com veículo (3% de Tween 80, v.o.),
resina de P. heptaphyllum (200 e 400 mg/kg, v.o.) e NAC (750 mg/kg, i.p.) 1
hora antes da administração de uma solução de 0,3M de HCl em etanol 60%
(0,2 mL).
a
p<0,01;
b
p<0,001 vs controle normal (ANOVA e Teste de Student
Newman Keul).
0
4
8
12
16
20
Área de lesão gástrica (mm
2
)
Controle
Veículo
200 400 750
Resina
NAC
mg/kg
a
a
b
5.3.3. Efeito da resina de P. heptaphyllum sobre a secreção gástrica em modelo
de ligação do piloro
Em ratos com piloro ligado, por 4 h, a administração intraduodenal da resina,
nas doses de 200 e 400 mg/kg ou cimetidina (100 mg/kg), não promoveu alteração
significativa no volume secretório gástrico (2,63 0,23; 2,48 0,38 e 2,82 0,34 mL,
respectivamente), quando comparadas ao controle (3,26 0,32 mL). Contudo, a resina foi
capaz de inibir, significativamente (p<0,001), a acidez total gástrica (2,41 0,50 e 2,07
0,45 Eq/h, respectivamente) de maneira similar a cimetidina (0,95 0,22 Eq/h), um
conhecido antagonista H
2
,quando comparada ao controle (8,35 1,97 Eq/h) (Tabela 8 e
Figuras 10 e 11).
As inibições na acidez total gástrica com resina nas doses de 200 e 400 mg/kg e
cimetidina (100 mg/kg) foram na ordem de 70, 75 e 88% respectivamente.
Tabela 8. Efeito da resina de P. heptaphyllum e cimetidina sobre o volume
secretório gástrico e acidez gástrica total em ratos com piloro ligado.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
Volume Secretório
Gástrico (mL)
Acidez Total Gástrica
(µEq/h)
Controle
---
3,26 0,32
8,35 1,97
Resina 200
2,63 0,23 2,45 0,50
a
400
2,48 0,38 2,07 0,45
a
Cimetidina 100
2,82 0,34 0,95 0,22
a
Os resultados são expressos como média erro padrão da média (E.P.M.) para
6 animais do volume secretório gástrico (mL) e da acidez gástrica total (Eq/h). Veículo
(3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg), resina de P. heptaphyllum (200 e 400
mg/kg) e cimetidina (100 mg/kg) foram administrados por via intraduodenal,
imediatamente após a ligação do piloro. Os animais foram sacrificados 4 horas após a
ligação do piloro.
a
p<0,001 vs controle normal (ANOVA e Teste de Student Newman
Keul).
FIGURA 10. Efeito da administração intraduodenal da resina de P.
heptaphyllum e cimetidina no volume secretório gástrico em ratos.
Os
valores representam a média erro padrão da média (E.P.M.) para 6 animais.
Veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg), resina de P.
heptaphyllum (200 e 400 mg/kg) e cimetidina (100 mg/kg) foram
administrados por via intraduodenal, imediatamente após a ligação do piloro.
Os animais foram sacrificados 4 horas após a ligação do piloro.
0
1
2
3
4
5
Volume secretório gástrico (mL)
Controle
Veículo
200 400 100
Resina
Cimetidina
mg/kg
FIGURA 11. Efeito da administração intraduodenal da resina de P.
heptaphyllum e cimetidina na acidez total gástrica em ratos.
Os
valores representam a média erro padrão da média (E.P.M.) para 6 animais.
Veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg), resina de P.
heptaphyllum (200 e 400 mg/kg) e cimetidina (100 mg/kg) foram
administrados por via intraduodenal, imediatamente após a ligação do piloro.
Os animais foram sacrificados 4 horas após a ligação do piloro.
a
p<0,001 vs
controle normal (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).
0
2
4
6
8
10
12
Acidez total gástrica ( Eq/h)
Controle
Veículo
200 400 100
Resina
Cimetidina
mg/kg
a
a
a
5.3.4. Efeito da da resina de P. heptaphyllum sobre as úlcera gástrica induzida
por indometacina
A Tabela 9 mostram os efeitos da resina de P. heptaphyllum e da cimetidina em
comparação com o grupo controle, pré-tratado com veículo, nas lesões gástrica induzidas
por indometacina.
A administração subcutânea de indometacina (20 mg/kg) produziu lesões gástricas
com uma média de escores de 17,57 1,71. Enquanto que nos animais pré-tratados com
cimetidina (100 mg/kg, v.o.), um antagonista dos receptores H
2
, este efeito foi reduzido
significativamente (p<0,01). O pré-tratamento dos animais com a resina nas doses testadas
não foi capaz de inibir as lesões induzidas pela indometacina.
Tabela 9. Efeito da resina de P. heptaphyllum no modelo de úlcera gástrica
induzida por indometacina em camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
Lesão gástrica
(escores)
Controle (veículo)
---
17,57 1,71
Resina 200
18,87 2,29
400
17,83 2,37
Cimetidina 100
5,50 1,60
a
Os resultados são expressos como média erro padrão da média (E.P.M.) para
8 animais. Veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg) e resina de P.
heptaphyllum (200 e 400 mg/kg) e cimetidina (100 mg/kg) foram administrados por via
oral, 1 hora antes da administração de indometacina (20 mg/kg). Os animais foram
sacrificados 8 horas após a administração da indometacina.
a
p<0,01 vs controle veículo
(ANOVA e Teste de Kruskal Wallis - Dunnett).
5.3.5. Efeito da mistura de α- e β-amirina na úlcera gástrica induzida por
etanol: papel dos neurônios aferentes primários sensíveis à capsaicina
Os animais que receberam apenas veículo mostraram extensa área de lesão da
mucosa gástrica
(mm
2
) na forma de erosões hemorrágicas. A mistura de ,-amirina, nas
doses de 50 e 100 mg/kg e capsaicina nas doses de 2,5 e 5 mg/kg, reduziram
significativamente (p<0,01 e p<0,001, respectivamente) a injúria gástrica de maneira dose
dependente, sendo esta inibição da ordem de 52 e 67% para amirina e 79 e 83% para
capasaicina, respectivamente. Altas doses de amirina (300 e 600 mg/kg) e capsaicina (15 e
20 mg/kg) produziram menor ou não produziram efeito de gastroproteção indicando um
modo semelhante de ação (Tabelas 10 e 11 e Figuras 12 e 13).
A participação dos neurônios aferentes sensíveis à capsacina no efeito
gastroprotetor das amirina (100 mg/kg, via oral) no modelo de úlcera gástrica induzida por
etanol foi investigado em camundongos dessensibilizados com capsaicina. Nos animais
dessensibilizados pela capsacina o dano gástrico produzido pelo etanol (56,70 4,18 mm
2
)
foi mais intenso que aquele observado nos animais normais que receberam apenas veículo
(24,59 1,54 mm
2
). A dessensibilização dos neurônios sensoriais aferentes pela capsacina
aboliu completamente o efeito gastroprotetor da mistura de - e -amirina na dose de 100
mg/kg (58,46 4,44 mm
2
), quando comparado ao grupo tratado apenas as - e -amirina
em animais normais (8,12 1,43 mm
2
) (Tabela 12 e Figura 14).
Tabela 10. Efeito da mistura de α- e β-amirina no modelo de úlcera gástrica
induzida por etanol em camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
Área de lesão gástrica
(mm
2
)
Controle
---
22,63 2,25
,-amirina
50
10,78 2,12
a
100
7,58 2,12
a
300
11,39 1,55
a
600
19,47 3,55
Os resultados são expressos como média erro padrão da média (E.P.M.) para
8 animais. Veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg) e mistura de - e -
amirina (50, 100, 300 e 600 mg/kg) foram administrados por via oral, 1 hora antes da
administração de etanol (0,2 mL). Os animais foram sacrificados 30 minutos após a
administração do etanol.
a
p<0,01 vs controle (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).
FIGURA 12. Efeito da mistura de α- e β- amirina nas lesões gástricas induzidas
por etanol em camundongos.
Os valores representam a média erro
padrão da média (E.P.M.) para 8 animais. Os animais foram tratados com
veículo (3% de Tween 80, v.o.) e mistura de - e -amirina (50, 100, 300 e
600 mg/kg) 1 hora antes da administração de etanol (0,2 mL).
a
p<0,01 vs
controle normal (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).
0
5
10
15
20
25
30
Área de lesão gástrica (mm
2
)
Controle
Veículo
50 100 300
α
,β-amirina
mg/kg
600
a
a
a
Tabela 11. Efeito da capsaicina no modelo de úlcera gástrica induzida por
etanol em camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
Área de lesão gástrica
(mm
2
)
Controle
---
19,82 2,21
Capsaicina 2,5
4,25 1,03
a
5
3,43 0,54
a
15
8,29 1,50
a
20
27,26 3,30
Os resultados são expressos como média erro padrão da média (E.P.M.) para
8 animais. Veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg) e capsaicina (2,5, 5, 15 e
20 mg/kg) foram administrados por via oral, 1 hora antes da administração de etanol (0,2
mL). Os animais foram sacrificados 30 minutos após a administração do etanol.
a
p<0,001
vs controle (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).
FIGURA 13. Efeito da capsaicina nas lesões gástricas induzidas por etanol em
camundongos.
Os valores representam a média erro padrão da média
(E.P.M.) para 8 animais. Os animais foram tratados com veículo (3% de
Tween 80, v.o.) e capsaicina (2,5, 5, 15 e 20 mg/kg) 1 hora antes da
administração de etanol (0,2 mL).
a
p<0,001 vs controle normal (ANOVA e
Teste de Student Newman Keul).
Controle
Veículo
2,5 5,0 15
Capsaicina
mg/kg
20
0
5
10
15
20
25
30
35
Área de lesão gástrica (mm
2
)
a
a
a
Tabela 12. Efeito da mistura de α- e β-amirina na lesão gástrica induzida por
etanol em camundongos normais e dessensibilizados pela capsaicina
Área de Lesão Gástrica (mm
2
)
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
Animais Normais
Animais Dessensibilizados
Controle (veículo)
---
24,59 1,54
56,70 4,18
a
,-amirina
100
8,12 1,43
a
58,46 4,44
ab
Os resultados são expressos como média erro padrão da média (E.P.M.) para
8 animais. Os animais
foram tratados com capsacina (25 mg/kg) por via intraperitoneal, por três
dias consecutivos. Após oito dias, animais dessensibilizados e animais normais foram
tratados via oral com veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg) ou mistura de
- e -amirina (100 mg/kg) 1 hora antes da administração de etanol (0,2 mL). Os animais
foram sacrificados 30 minutos após a administração do etanol.
a
p<0,001 vs controle
veículo animais normais;
b
p<0,01 vs mistura de - e -amirina em animais normais
(ANOVA e Teste de Mann-Whitney).
FIGURA 14. Efeito da mistura de α- e β-amirina nas lesões gástricas induzidas
por etanol em camundongos normais e desensibilizados pela
capsaicina.
Os valores representam a média erro padrão da média (E.P.M.)
para 8 animais. Os animais
foram tratados com capsacina (25 mg/kg) por via
intraperitoneal, por três dias consecutivos. Após oito dias, a
nimais
dessensibilizados e animais normais foram tratados com veículo (3% de
Tween 80, v.o.) ou mistura de - e -amirina (100 mg/kg), 1 hora antes da
administração de etanol (0,2 mL).
a
p<0,001 vs controle veículo em animais
normais;
b
p<0,01 vs mistura de - e -amirina em animais normais (ANOVA
e Teste de Teste de Mann-Whitney).
0
10
20
30
40
50
60
70
área de lesão gástrica (mm
2
)
Controle
Veículo
100
Animais normais
α
,β-amirina
Controle
Veículo
100
α
,β-amirina
mg/kg
a
a
ab
Animais dessensibilizados
5.4. ATIVIDADE ANTIPRURIGINOSA
5.4.1. Efeito da mistura de α- e β-amirina no prurido induzido por dextrana
T40
A administração de salina nos animais controle não demonstrou prurido
enquanto que, os animais que receberam Dextrana T40 manifestaram intenso prurido.
Quando os animais foram pré-tratados com a mistura de - e -amirina nas doses de 50,
100 e 200 mg/kg, esta reduziu de forma significativa (p<0,01) o prurido induzido pela
administração de Dextrana T40 (70,66 22,42; 45,00 6,21 e 54,33 14,85 s/20 min,
respectivamente) quando comparado ao grupo controle veículo (140,71 20,21 s/20 min.).
Ciproeptadina (10 mg/kg), uma conhecida droga antihistamínica, reduziu o prurido de
forma significativa (16,71 9,34 s/20 min) (Tabela 13 e Figura 15).
Tabela 13. Efeito da mistura de α- e β-amirina no prurido induzido por
dextrana T40 em camundongos
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
Prurido
(s/20min)
Controle (salina)
---
4,39 1,46
Controle (veículo) ---
140,71 20,21
a
,-amirina
50
70,66 22,42
ab
100
45,00 6,21
ab
200
54,33 14,85
ab
Ciproeptadina 10
16,71 9,34
ab
Os resultados são expressos como média erro padrão da média (E.P.M.) do
tempo de prurido registrado em segundos (s) durante 20 minutos para 8 animais,
imediatamente após a injeção subcutânea de Dextrana T40. Veículo (3% de Tween 80 em
salina 0,9%, 10 mL/kg), mistura de - e -amirina (50, 100 e 200 mg/kg) e ciproeptadina
(10 mg/kg) foram administrados por via oral, 2 horas antes da injeção subcutânea de
Dextrana T40 (50 L/75 mg/kg).
a
p<0,01 vs controle salina;
b
p<0,01 vs controle veículo
(ANOVA e Teste de Student Newman Keul).
FIGURA 15. Efeito da administração oral da mistura de α- e β-amirina no
prurido induzido por dextrana T40 em camundongos.
Veículo (3% de
Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg), mistura de - e -amirina (50, 100 e
200 mg/kg, v.o.) e ciproheptadina (Cipro - 10 mg/kg, v.o.) foram
administrados 2 horas antes da injeção subcutânea de dextrana T40 (75 mg/kg)
e o tempo de prurido registrado (s) durante 20 minutos.
a
p<0,01 vs controle
salina;
b
p<0,01 vs controle veículo (ANOVA e Teste de Student Newman
Keul).
0
40
80
120
160
200
Prurido (s/20 min
)
Controle
Salina
50
100
α
- e
β
- amirina
10
Cipro
mg/kg
200
Controle
Veículo
Dextrana T40
a
ab
ab
ab
ab
5.4.2. Efeito da mistura de α- e β-amirina no prurido induzido pelo composto
48/80
A administração de salina nos animais controle não demonstrou prurido
enquanto que, os animais que receberam Composto 48/80 manifestaram intenso prurido. O
pré-tratamento com a mistura dos triterpenos - e -amirina nas doses de 100 e 200
mg/kg, reduziu de forma significativa (p<0,01) o prurido induzido pela administração do
Composto 48/80 (45,87 8,07 e 45,37 7,29 s/20 min, respectivamente) quando
comparado ao grupo controle veículo (127,90 11,07 s/20 min.). A administração de
ciproeptadina (10 mg/kg) reduziu de forma significativa (p<0,01) o prurido causado pelo
composto 48/80 (41,28 7,07 s/20 min) (Tabela 14 e Figura 16).
Tabela 14. Efeito da mistura de α- e β-amirina no prurido induzido por
composto 48/80 em camundongos
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
Prurido
(s/20min)
Controle (salina)
---
3,57 1,07
Controle (veículo) ---
127,90 11,07
a
,-amirina
50
122,19 23,98
a
100
45,87 8,07
ab
200
45,37 7,29
ab
Ciproeptadina 10
41,28 7,07
ab
Os resultados são expressos como média erro padrão da média (E.P.M.) do
tempo de prurido registrado em segundos (s) durante 20 minutos para 8 animais,
imediatamente após a injeção subcutânea de Composto 48/80. Veículo (3% de Tween 80
em salina 0,9%, 10 mL/kg), mistura de - e -amirina (50, 100 e 200 mg/kg) e
ciproeptadina (10 mg/kg) foram administrados por via oral, 2 horas antes da injeção
subcutânea do Composto 48/80 (50 L/3 mg/kg).
a
p<0,01 vs controle salina;
b
p<0,01 vs
controle veículo (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).
FIGURA 16. Efeito da administração oral da mistura de α- e β-amirina no
prurido induzido pelo composto 48/80 em camundongos.
Veículo (3%
de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg), mistura de - e -amirina (50, 100 e
200 mg/kg, v.o.) e ciproeptadina (Cipro - 10 mg/kg, v.o.) foram administrados
2 horas antes da injeção subcutânea do composto 48/80 (3 mg/kg) e o tempo
de prurido registrado (s) durante 20 minutos.
a
p<0,01 vs controle salina;
b
p<0,01 vs controle veículo (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).
0
40
80
120
160
200
Prurido (s/20 min
)
Controle
Salina
50
100
α
- e
β
- amirina
1
0
Cipro
mg/kg
200
Controle
Veículo
Composto 48/80
a
ab ab
ab
a
5.4.3. Efeito da naloxona (antagonista de receptor opióide) sobre a atividade
antirpuriginosa da mistura de α- e β-amirina ou morfina no prurido
induzido por composto 48/80
O tratamento dos animais com a mistura de e -amirina (100 mg/kg) ou
morfina (7,5 mg/kg) produziu redução significativa (p<0,01) do prurido causado pelo
Composto 48/80 (20,09 2,84 e 0,42 0,42 s/20 min, respectivamente) quando
comporado ao grupo controle veículo (64,38 4,73 s/20 min). Naloxona (2 mg/kg) quando
administrada sozinha, não alterou o tempo de prurido (67,76 5,75 s/20 min) porém,
quando associada à morfina, inibiu totalmente a ação antipruriginosa desta (61,71 5,45
s/20 min). Naloxona apenas inibiu parcialmente a atividade antipruriginosa da mistura de
e -amirina (41,50 4,14 s/20) (Tabela 15 e Figura 17).
Tabela 15. Efeito da naloxona (antagonista de receptor opióide) sobre a
atividade antirpuriginosa da mistura de α- e β-amirina ou morfina
no prurido induzido por composto 48/80
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
Prurido
(s/20min)
Controle (veículo)
---
64,38 4,73
,-amirina
100
20,09 2,84
a
Morfina 7,5
0,42 0,42
a
Naloxona 2,0
67,76 5,75
Naloxona + ,-amirina
2,0 / 100
41,50 4,14
a,b
Naloxona + Morfina 2,0 / 7,5
61,71 5,45
c
Os resultados são expressos como média erro padrão da média (E.P.M.) do
tempo de prurido registrado em segundos (s) durante 20 minutos para 8 animais,
imediatamente após a injeção subcutânea do Composto 48/80. Os animais foram tratados
com veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg, v.o.) ou mistura de - e -
amirina (100 mg/kg, v.o.) 2 horas antes e, morfina (7,5 mg/kg, s.c.) ou naloxona (2 mg/kg,
i.p.) 30 minutos antes da injeção subcutânea do Composto 48/80 (50 L/3 mg/kg).
a
p<0,01
vs controle veículo;
b
p<0,01 vs -amirina;
c
p<0,01 vs morfina (ANOVA e Teste de
Student Newman Keul).
FIGURA 17. Efeito do antagonismo de receptor opióide (naloxona) sobre a
atividade antipruriginosa da mistura de α- e β-amirina ou morfina
no prurido induzido pelo composto 48/80 em camundongos.
Veículo
(3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg) ou mistura de - e -amirina
(100 mg/kg, v.o.) foram administrados 2 horas e, morfina (Morf - 7,5 mg/kg,
s.c.) ou naloxona (Nal - 2 mg/kg, i.p.) 30 minutos antes antes da injeção
subcutânea do composto 48/80 (3 mg/kg) e o tempo de prurido registrado (s)
durante 20 minutos.
a
p<0,01 vs controle veículo;
b
p<0,01 vs -amirina;
c
p<0,01 vs morfina (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).
0
20
40
60
80
100
Prurido (s/20 min
)
Controle
Salina
Morf
Nal Nal
+
α,β-
amirina
α
,β-
amirina
Morf
+
Nal
a
a
ab
c
5.4.4. Efeito da mistura de α- e β-amirina sobre a degranulação de mastócitos
ex vivo
O percentual de céluas degranuladas no controle veículo foi de 90,60 2,84 %,
enquanto que o grupo tratado apenas com salina exibiu um percentual de 5,50 1,47 %. O
pré-tratamento dos animais com a mistura de - e -amirina na dose de 100 mg/kg reduziu
forma signficativa (p<0,01) a degranulação de mastócitos (12,60 3,18 %) quando
comparado ao grupo controle veículo. Da mesma forma, cetotifeno (1 mg/kg) reduziu
significativamente o percentual de degranulação induzida pelo Composto 48/80 (13,60
2,76 %). As inibições exibidas pelas - e -amirina e cetotifeno foram de 86% e 85%,
respectivamente (Tabela 16 e Figuras 18 e 19).
Tabela 16. Efeito da mistura de α- e β-amirina sobre a degranulação de
mastócitos mesenteriais induzido pelo composto 48/80 ex vivo
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
Mastócitos Degranulados (%)
Controle (salina)
---
2,50 1,47
Controle (veículo) ---
90,60 2,85
a
- e -amirina
100
12,60 3,18
b
Cetotifeno 1,0
13,60 2,76
b
Os resultados são expressos como média erro padrão da média (E.P.M.) do
percentual de mastócitos degranulados para 4 animais. Os animais foram tratados via oral
com salina 0,9% (0,1 mL/10 g), veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg),
mistura de - e -amirina (100 mg/kg) ou cetotifeno (1 mg/kg) e 2 horas após os animais
foram sacrificados e os mesentérios retirados e incubados com Composto 48/80 por 30
minutos. Os mastócitos íntegros e degranulados foram contados em cinco campos de cada
grupo.
a
p<0,01 vs controle salina;
b
p<0,01 vs controle veículo (ANOVA e Teste de
Bonferroni).
FIGURA 18. Efeito da mistura de α- e β-amirina sobre a degranulação de
mastócitos mesenteriais induzido pelo composto 48/80 ex vivo.
Salina
0,9% (0,1 mL/10 g), veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg),
mistura de - e -amirina (100 mg/kg) ou cetotifeno (1 mg/kg) e 2 horas após
os animais foram sacrificados e os mesentérios retirados e incubados com
Composto 48/80 por 30 minutos. Os mastócitos íntegros e degranulados foram
contados em cinco campos de cada grupo.
a
p<0,01 vs controle salina;
b
p<0,01
vs controle veículo (ANOVA e Teste de Bonferroni).
0
20
40
60
80
100
Mastócitos degranulados (%)
a
b
b
Controle
Salina
α
,β-amirina
Cetotifeno
Controle
Veículo
Composto 48/80
A – Controle salina B – Controle Veículo
C – Mistura α,β- amirina D – Cetotifeno
FIGURA 19. Microfotografias de mastócitos mesenteriais. (A) Animais tratados
com salina; (B) Animais tratados com veículo (Tween 80 a 3%) e incubados
com Composto 48/80 (0,4 g/mL), demostrando extensa degranulação de
mastócitos; (C) Animais tratados com - e -amirina (100 mg/kg) e incubados
com Composto 48/80 (0,4 g/mL), demonstrando inibição da degranulação de
mastócitos; (D) Animais tratados com cetotifeno (1 mg/kg) e incubados com
Composto 48/80 (0,4 g/mL), demonstrando inibição da degranulação de
mastócitos.
5.4.5. Efeito da mistura de α- e β-amirina no edema de pata induzido por
dextrana
Os pesos das patas (mg) dos animais tratados com a mistura de - e -amirina,
nas doses de 50, 100 e 200 mg/kg, foram reduzidos significativamente (23,22 4,14;
23,22 4,14 e 21,02 2,00 mg, respectivamente), quando comparado ao grupo controle
veículo (55,45 3,79 mg), sendo as inibições de 38, 58 e 62% respectivamente. A
ciproeptadina reduziu de forma significativa (p<0,01) o peso da pata (20,75 3,55 mg)
sendo esta inibição de 63% (Tabela 20 e Figura 23).
Tabela 20. Efeito da mistura de α- e β-amirina no edema de pata induzido por
dextrana em camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
Edema de Pata
(mg)
Controle (veículo)
---
55,45 3,79
- e -amirina
50
34,31 8,99
a
100
23,22 4,14
c
200
21,02 2,00
c
Ciproeptadina 10
20,75 3,55
b
Os resultados são expressos como média erro padrão da média (E.P.M.) do
peso das patas (mg) para 8 animais após 2 horas da administração do Composto 48/80.
Veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg), mistura de - e -amirina (50, 100
e 200 mg/kg) e ciproeptadina (10 mg/kg) foram administrados por via oral, 1 hora antes da
injeção subplantar de Dextrana (150 mg/kg). Após 2 horas os animais foram sacrificados e
as patas cortadas e pesadas (mg).
a
p<0,05;
b
p<0,01;
c
p<0,001 vs controle veículo (ANOVA
e Teste de Student Newman Keul).
FIGURA 23. Efeito da administração oral da mistura de α- e β-amirina no
edema de pata induzido por dextrana em camundongos.
Veículo (3%
de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg), mistura de - e -amirina (50, 100 e
200 mg/kg, v.o.) e ciproeptadina (cipro - 10 mg/kg, v.o.) foram administrados
1 horas antes da injeção subplantar de serotonina (10 mg/kg). Após 2 horas os
animais foram sacrificados e as patas cortadas e pesadas (mg).
a
p<0,05;
b
p<0,01,
c
p<0,001 vs controle veículo (ANOVA e Teste de Student Newman
Keul).
0
10
20
30
40
50
60
70
Edema de pata (mg)
Controle
Veículo
50
100
α
- e
β
- amirina
10
Cipro
mg/kg
200
b
c
c
a
5.4.6. Efeito da mistura de α- e β-amirina no edema de pata induzido por
composto 48/80
A mistura de - e -amirina na dose de 100 mg/kg, reduziu de forma
significativa (p<0,05) o peso da pata (60,95 4,14 mg) induzido pelo Composto 48/80,
com inibição da ordem de 30%. Ciproeptadina (10 mg/kg), conhecido antihistamínico,
reduziu significativamente (p<0,001) o peso da pata induzido pela administração do
Composto 48/80 (52,88 5,14 mg), sendo o percentual de inibição de 39% (Tabela 19 e
Figura 22).
Tabela 19. Efeito da mistura de α- e β-amirina no edema de pata induzido por
composto 48/80 em camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
Edema de Pata
(mg)
Controle (veículo)
---
86,28 4,08
- e -amirina
50
90,81 6,29
100
60,95 4,14
a
200
85,42 7,05
Ciproeptadina 10
52,88 5,14
b
Os resultados são expressos como média erro padrão da média (E.P.M.) do
peso das patas (mg) para 8 animais após 2 horas da administração do Composto 48/80.
Veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg), mistura de - e -amirina (50, 100
e 200 mg/kg) e ciproeptadina (10 mg/kg) foram administrados por via oral, 1 hora antes da
injeção subplantar do Composto 48/80 (10 mg/kg). Após 2 horas os animais foram
sacrificados e as patas cortadas e pesadas (mg).
a
p<0,05;
b
p<0,001 vs controle veículo
(ANOVA e Teste de Student Newman Keul).
FIGURA 22. Efeito da administração oral da mistura de α- e β-amirina no
edema de pata induzido pelo composto 48/80 em camundongos.
Veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg), mistura de - e -
amirina (50, 100 e 200 mg/kg, v.o.) e ciproeptadina (cipro - 10 mg/kg, v.o.)
foram administrados 1 horas antes da injeção subplantar de serotonina (10
mg/kg). Após 2 horas os animais foram sacrificados e as patas cortadas e
pesadas (mg).
a
p<0,01;
b
p<0,001 vs controle veículo (ANOVA e Teste de
Student Newman Keul).
Controle
Veículo
50
100
α
- e
β
- amirina
10
Cipro
mg/kg
200
0
20
40
60
80
100
120
Edema de pata (mg)
b
a
5.4.7. Efeito da mistura de α- e β-amirina no edema de pata induzido por
histamina
Os animais tratados com a mistura de - e -amirina nas doses de 50 e 100
mg/kg reduziram de forma significativa (p<0,01 e 0,001, respectivamente) o peso da pata
(14,38 1,89 e 18,91 2,69 mg, respectivamente) induzido por histamina, sendo as
inibições de 53 e 38% respectivamente. Ciproeptadina (10 mg/kg), conhecido
antihistamínico, reduziu significativamente (p<0,01) o peso da pata induzido pela
administração de histamina (14,95 1,36 mg), sendo o percentual de inibição da ordem
de 51% (Tabela 17 e Figura 20).
Tabela 17. Efeito da resina da mistura de α- e β-amirina no edema de pata
induzido por histamina em camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
Edema de Pata
(mg)
Controle (veículo)
-
30,33 1,95
,-amirina
50
14,38 1,89
a
100
18,91 2,69
b
200
32,01 2,40
Ciproeptadina 10
14,95 1,36
a
Os resultados são expressos como média erro padrão da média (E.P.M.) do
peso das patas (mg) para 8 animais após 2 horas da administração de histamina. Veículo
(3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg), mistura de - e -amirina (50, 100 e 200
mg/kg) e ciproeptadina (10 mg/kg) foram administrados por via oral, 1 hora antes da
injeção subplantar de histamina (10 mg/kg). Após 2 horas os animais foram sacrificados e
as patas cortadas e pesadas (mg).
a
p<0,01;
b
p<0,001 vs controle veículo (ANOVA e Teste
de Student Newman Keul).
FIGURA 20. Efeito da administração oral da mistura de α- e β-amirina no
edema de pata induzido por histamina em camundongos.
Veículo (3%
de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg), mistura de - e -amirina (50, 100 e
200 mg/kg, v.o.) e ciproeptadina (cipro - 10 mg/kg, v.o.) foram administrados
1 horas antes da injeção subplantar de histamina (10 mg/kg). Após 2 horas os
animais foram sacrificados e as patas cortadas e pesadas (mg).
a
p<0,01;
b
p<0,001 vs controle veículo (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Edema de pata (mg)
Controle
Veículo
50
100
α
- e
β
- amirina
10
Cipro
mg/kg
200
a
a
b
5.4.8. Efeito da mistura de α- e β-amirina no edema de pata induzido por
serotonina
A mistura de - e -amirina nas doses de 50, 100 e 200 mg/kg
não alterou o peso
de pata (28,64 5,92; 27,60 3,41 e 22,97 2,78 mg, respectivamente) induzido por
serotonina (10 mg/kg), porém a ciproheptadina reduziu de forma significativa (p<0,001) o peso da
pata (6,64 0,86 mg) com inibição da ordem de 75% (Tabela 18 e Figura 21).
Tabela 18. Efeito da mistura de α- e β-amirina no edema de pata induzido por
serotonina em camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
Edema de Pata
(mg)
Controle (veículo)
---
26,94 1,58
- e -amirina
50
28,64 5,92
100
27,60 3,41
200
22,97 2,78
Ciproeptadina 10
6,64 0,86
a
Os resultados são expressos como média erro padrão da média (E.P.M.) do
peso das patas (mg) para 8 animais após 2 horas da administração de serotonina. Veículo
(3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg), mistura de - e -amirina (50, 100 e 200
mg/kg) e ciproeptadina (10 mg/kg) foram administrados por via oral, 1 hora antes da
injeção subplantar de serotonina (10 mg/kg). Após 2 horas os animais foram sacrificados e
as patas cortadas e pesadas (mg).
a
p<0,001 vs controle veículo (ANOVA e Teste de
Student Newman Keul).
FIGURA 21. Efeito da administração oral da mistura de α- e β-amirina no
edema de pata induzido por serotonina em camundongos.
Veículo
(3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg), mistura de - e -amirina (50,
100 e 200 mg/kg, v.o.) e ciproeptadina (cipro - 10 mg/kg, v.o.) foram
administrados 1 horas antes da injeção subplantar de serotonina (10 mg/kg).
Após 2 horas os animais foram sacrificados e as patas cortadas e pesadas (mg).
a
p<0,001 vs controle veículo (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Edema de pata (mg)
Controle
Veículo
50
100
α
- e
β
- amirina
10
Cipro
mg/kg
200
a
5.5. ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA
5.5.1. Efeito da mistura de α- e β-amirina na nocicepção induzida pela
capsaicina
A Figura 24 ilustra o efeito da administração oral da mistura de - e -amirina
na nocicepção induzida pela injeção subplantar de capsaicina (1,6 g/20 L). Os
triterpenos - e -amirina, nas doses de 3, 10, 30 e 100 mg/kg, causaram inibições
significativas da ordem de 43, 54, 49 e 27%, respectivamente (p<0,05) do tempo de
reação, tempo em que o animal permaneceu lambendo a pata (41,42 6,0; 33,43 4,87;
37,0 5,54 e 52,84 8,18 s/5 min), quando comparado ao grupo capsaicina (72,44 9,01
s/5 min).
Morfina (5 mg/kg) exibiu uma potente inibição de 97%, enquanto que naloxona
(2 mg/kg) inibiu completamente a ação antinociceptiva da morfina (77,37 8,17 s/5 min)
e da mistura de - e -amirina na dose de 10 mg/kg (80,63 7,65 s/5 min) (Tabela 21).
Os resultados obtidos com o objetivo de verificar uma possível interação entre
vermelho de rutênio (1,5 mg/kg) e - e -amirina (10 mg/kg) sobre a nocicepção induzida
pela capsaicina encontram-se na Tabela 22. Assim como as - e -amirina, o vermelho de
rutênio produziu uma significante inibição da nocicepção (37,77 4,87 e 36,87 5,53 s/5
min) quando comparada ao grupo veículo (60,50 5,97 s/5 min). A associação destas duas
substâncias (vermelho de rutênio + - e -amirina) não mostrou efeitos aditivos ou
antagônicos (35,0 3,12 s/5 min) sobre a nocicepção induzida pela capsaicina (Figura
25).
Tabela 21. Efeito da mistura de α- e β-amirina na nocicepção induzida pela
administração subplantar de capsaicina
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
Tempo de Lambedura da Pata
(s/5 min)
Controle (veículo da capsaicina)
---
1,21 0,84
Controle (veículo) ---
72,44 9,01
a
Morfina 5,0
2,12 1,42
b
- e -amirina
3,0
41,42 6,0
a,b
10
33,43 4,87
a,b
30
37,00 5,54
a,b
100
52,84 8,18
a,b
Naloxona + Morfina 2,0 / 5,0
77,37 8,17
a,c
Naloxona + - e -amirina
2,0 / 10
80,63 7,65
a,d
Os resultados são expressos como média erro padrão da média (E.P.M.) do
tempo de lambedura da pata injetada com capsaicina para 8 animais. Os animais foram
tratados via oral com veículo da capsaicina
(80% de PBS + 10% de Tween 80 + 10% de
Etanol absoluto, v.o.), veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg), mistura de - e
-amirina (3, 10, 30 e 100 mg/kg) 1 hora antes da injeção subplantar de Capsaicina (1,6
g/20 L) e observado durante 5 minutos. A naloxona (2 mg/kg, i.p.) foi administrada 15
minutos antes do tratamento com morfina (5 mg/kg, s.c.) e mistura de - e -amirina (10
mg/kg, v.o.).
a
p<0,05 vs controle veículo da capsaicina;
b
p<0,05 vs morfina;
c
p<0,05 vs
morfina;
d
p<0,05 vs - e -amirina (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).
FIGURA 24. Efeito da mistura de α- e β-amirina sobre a nocicepção induzida
pela administração subplantar de capsaicina.
Veículo da capsaicina
(PBS, Tween 80, Etanol,v.o.), veículo (3% de Tween 80), mistura de - e -
amirina (3, 10, 30 e 100 mg/kg) foram administrados 1h e morfina (Morf - 5
mg/kg, s.c.) 30 minutos antes da injeção subplantar de Capsaicina (1,6 g/20
L). Naloxona (Nal - 2 mg/kg, i.p) foi administrada 15 min antes do
tratamento com morfina (Morf - 5 mg/kg, s.c.) e mistura de - e -amirina (10
mg/kg, v.o.). Os valores representam a média E.P.M. do tempo gasto pelo
animal lambendo a pata durante 5 min.
a
p<0,05 vs controle veículo capsaicina;
b
p<0,05 vs controle veículo;
c
p<0,05 vs morfina;
d
p<0,05 vs -amirina
(ANOVA e Teste de Student Newman Keul).
0
20
40
60
80
100
Tempo lambedura pata (s/5 min)
Controle
Capsaicina
Morf
Nal
+
α,β-
amirina
α
,β-amirina
Nal
+
Morf
Controle
Veículo
3 10 30 100
a
b
ab
ab
ab
ab
ac
ad
5
mg/kg
Capsaicina
Tabela 22. Efeito da mistura de α- e β-amirina e vermelho de rutênio sobre o
tempo de lambedura induzido pela injeção subplantar de capsaicina
em camundongos
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
Tempo de Lambedura da Pata
(s/5 min)
Controle (veículo)
---
60,50 5,97
Vermelho de Rutênio 1,5
36,87 5,53
a
- e -amirina
10
37,77 4,87
a
Vermelho de Rutênio
+
- e -amirina
1,5 / 10
35,00 3,12
a
Os resultados são expressos como média erro padrão da média (E.P.M.) do
tempo de lambedura da pata injetada com capsaicina para 8 animais. Os animais foram
tratados com veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg), Vermelho de Rutênio
(1,5 mg/kg, s.c.), mistura de - e -amirina (10 mg/kg) ou a combinação de Vermelho de
Rutênio (1,5 mg/kg, s.c.) e mistura de - e -amirina (10 mg/kg) durante três dias
consecutivos. Após 1 hora do último tratamento, uma injeção subplantar de Capsaicina
(1,6 g/20 L) foi administrada aos animais e observado durante 5 minutos o prurido na
pata.
a
p<0,01 vs controle veículo (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).
FIGURA 25. Efeito da mistura de α- e β-amirina e vermelho de rutênio sobre o
tempo de lambedura induzido pela injeção subplantar de capsaicina
em camundongos.
Veículo (3% de Tween 80), Vermelho de Rutênio (1,5
mg/kg, s.c.), mistura de - e -amirina (10 mg/kg) ou a combinação de
Vermelho de Rutênio (1,5 mg/kg, s.c.) e mistura de - e -amirina (10 mg/kg)
durante três dias consecutivos. Após 1 hora do último tratamento, uma injeção
subplantar de Capsaicina (1,6 g/20 L) foi administrada aos animais e
observado durante 5 minutos o prurido na pata.
a
p<0,01 vs controle veículo
(ANOVA e Teste de Student Newman Keul)
0
20
40
60
80
Tempo lambedura pata (s/5 min)
Controle
Veículo
Vermelho
Rutênio
α
,β-amirina
10
Vermelho
Rutênio
+
α,β-amirina
1,5
a a
a
mg/kg
Capsaicina
5.5.2. Efeito da mistura de α- e β-amirina na nocicepção induzida pela
administração intracolônica de capsaicina (nocicepção visceral)
A administração intracolônica de capsacina (149 g) nos animais tratados com
veículo promoveu um aumento significativo (p<0,05) no número de comportamentos
nociceptivos (55,0 1,90 /30 min) quando comparado aos animais que receberam apenas o
veículo da capsaicina (9,75 3,72 /30 min).
A administração de - e -amirina, nas doses de 3, 10, 30 e 100 mg/kg e
clonidina (0,1 mg/kg) reduziu de forma significativa (p<0,05) o número de
comportamentos nociceptivos (32,12 3,99; 26,85 3,79; 28,0 6,08; 34,14 3,88 e 6,50
2,46 /30 min, respectivamente), sendo a inibição de 42, 56, 49, 38 e 88%,
respectivamente.
Ioimbina (2 mg/kg) inibiu de forma significativa (p<0,05) a antinocicepção da
clonidina (44,20 6,88 /30 min) porém não alterou a antinocicepção das - e -amirina na
dose de 10 mg/kg (9,87 1,44 /30 min) (Tabela 23 e Figura 26).
Tabela 23. Efeito da mistura de α- e β-amirina no nocicepção induzida pela
administração intracolônica de capsaicina (dor visceral)
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
Número de Comportamentos
Nociceptivos (30 min)
Controle (veículo da capsaicina)
---
9,75 3,72
Controle (veículo) ---
55,00 1,90
a
Clonidina 0,1
6,50 2,46
b
- e -amirina
3,0
32,12 3,99
ab
10
26,85 3,79
ab
30
28,00 6,08
ab
100
34,14 3,88
ab
Ioimbina + Clonidina 2,0 / 0,1
44,20 6,88
ac
Ioimbina + - e -amirina
2,0 / 10
9,87 1,44
ab
Os resultados são expressos como média erro padrão da média (E.P.M.) do
número de comportamentos nociceptivos para 8 animais. Os animais foram tratados com
veículo da capsaicina
(80% de PBS + 10% de Tween 80 + 10% de Etanol absoluto, v.o.),
veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg, v.o.), mistura de - e -amirina (3,
10, 30 e 100 mg/kg, v.o.), clonidina (0,1 mg/kg, v.o.) ou ioimbina (2 mg/kg, s.c.) 1 hora
antes da administração intracolônica de Capsaicina (149 g/50 L) e imediatamente
registrado por 30 min o número de comportamentos relacionados a nocicepção.
a
p<0,05 vs
controle veículo da capsaicina;
b
p<0,05 vs controle veículo;
c
p<0,05 vs clonidina;
d
p<0,05
vs - e -amirina (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).
FIGURA 26. Efeito da mistura de α- e β-amirina sobre a nocicepção induzida
pela administração intracolônica de capsaicina (Dor visceral).
Veículo da capsaicina
(80% de PBS + 10% de Tween 80 + 10% de Etanol absoluto,
v.o.),
veículo (3% de Tween 80), mistura de - e -amirina (3, 10, 30 e 100
mg/kg) , clonidina (Clon - 0,1 mg/kg, v.o.) ou ioimbina (Ioimb - 2 mg/kg, s.c.)
1 hora antes da administração intracolônica de Capsaicina (149 g/50 L). Os
valores representam a média E.P.M. do número de comportamentos
relacionados a nocicepção durante 30 min.
a
p<0,05 vs controle veículo
capsaicina;
b
p<0,05 vs controle veículo;
c
p<0,05 vs clonidina;
d
p<0,05 vs -
amirina (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).
0
10
20
30
40
50
60
Nº comportamentos nociceptivos
Controle
Capsaicina
Clon
Ioim
+
α,β-
amirina
α
,β-amirina
Ioim
+
Clon
Controle
Veículo
10 30 100 3 0,1
mg/kg
a
b
ab
ab
ab
ab
ac
ad
5.5.3. Efeito da mistura de α- e β-amirina sobre a resposta térmica induzida por
capsaicina
A Tabela 24 mostra a mudança na temperatura retal em camundongos induzida
pela capsaicina (10 mg/kg) e o efeito do pré-tratamento da mistura de - e -amirina e
vermelho de rutênio.
A administração subcutânea de capsacina induziu uma hipotermia inicial nos
animais que receberam apenas veículo durante o período de observação de 30 a 150 min,
seguido por uma hipertermia observada no período de 24 e 48 h após a administração da
capsaicina.
As - e -amirina, nas doses de 10 e 100 mg/kg e o vermelho de rutênio (1,5 mg/kg) não
reverteram a resposta hipotérmica da caspsaicina. Contudo, a fase de hipertermia
observada no período de 24 e 48 h, após a administração de capsaicina foi revertida pelo
vermelho de rutênio e - e -amirina apenas na dose de 10 mg/kg (Figura 27).
Tabela 24 Efeito da mistura de - e -amirinas sobre a hipotermia induzida pela capsaicina em camundongos.
Temperatura Corpórea (ºC)
GRUPOS
DOSES
(mg/kg)
T 0
T 30
T 60
T 90
T 120
T 150
24 h
48 h
Normal
---
37,270,04
37,370,11
37,530,08
37,350,19
37,200,18
37,170,13
37,85021
37,350,19
Capsaicina
10
36,850,12
35,560,39
a
36,160,32
a
35,100,44
a
34,830,40
a
35,120,43
a
39,370,09
a
38,670,15
a
,-amirinas
10
38,590,22
35,100,40
a
35,600,45
a
34,960,25
a
35,170,28
a
34,960,26
a
39,530,13
a
37,910,07
a,b
100
36,520,22
34,650,36
a
35,140,41
a
34,940,27
a
34,830,27
a
34,600,30
a
38,870,20
a
38,960,13
a
Vermelho de
Rutênio
1,5
37,000,07
33,280,18
a
33,490,13
a
33,360,10
a
33,220,73
a
34,650,28
a
36,800,15
a
37,270,15
a,b
Cada valor representa a média E. P. M. para 8 animais. Vermelho de Rutênio foi administrado duas vezes ao dia (12/12 h), por um período de
três dias, iniciaramdo-se os experimentos. Todos os grupos (exceto normal) foram tratados com capsaicina (10 mg/kg, s.c.) e medida a
temperatura retal nos tempos T0 a 24 h após a sua administração. A capsaicina foi administrada duas horas após o tratamento com a mistura de
,-amirinas.
a
p<0,001 vs controle normal.
b
p<0,001 vs controle Capsaicina (ANOVA e Teste de Student Newman Keuls).
FIGURA 27. Efeito da mistura de α- e β-amirina e vermelho de rutênio sobre a
resposta térmica induzida por capsaicina em camundongos.
A
Veículo (3% de Tween 80, v.o.), mistura de - e -amirina (10 e 100 mg/kg,
v.o.) e vermelho de rutênio (1,5 mg/kg, s.c.), duas vezes ao dia durante três
dias consecutivos. A temperatura retal foi medida antes e 30, 60, 90, 120 e 150
min. Os valores representam a média E.P.M. da temperatura retal para 8
animais.
a
p<0,05 vs controle veículo;
b
p<0,05 vs capsaicina (ANOVA e Teste
de Student Newman Keul).
Veículo
α,β-amirina 10 mg/kg
Ca
p
saicina
α,β-amirina 100 mg/kg
Vermelho de Rutênio
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
Temperatura Retal (ºC)
0 30 60 90 120 150 24 48
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a,b
a
a
a
a
a
a
a
a,b
Minutos Horas
5.6. ATIVIDADE HEPATOPROTETORA
5.6.1. Efeito da mistura de α- e β-amirina na hepatoxicidade induzida pelo
acetaminofeno
A administração via oral de acetaminofeno (500 mg/kg) mostrou uma
significativa redução (p<0,05) nos níveis de NP-SH (432,17 32,37 g/g de tecido)
quando comparado ao grupo controle normal (655,17 24,10 g/g de tecido).
O pré-tratamento via oral 48, 24 e 2 h antes do acetaminofeno com - e -
amirina nas doses de 50 e 100 mg/kg, foi capaz de impedir a depleção dos grupos
sulfidrilas produzidos pelo acetaminofeno (612,54 32,78 e 642,01 28,59 g/g de
tecido, respectivamente) quando comparado ao grupo acetaminofeno (432,17 32,37 g/g
de tecido).
A administração intraperitoneal de N-acetilcisteína (NAC, 750 mg/kg), inibiu
de forma significativa (p<0,05) a depleção dos grupos sulfidrilas (611,83 32,29 g/g de
tecido) produzidas pelo acetaminofeno (Tabela 25 e Figura 28).
A administração de acetaminofeno (500 mg/kg, v.o.) aumentou de forma
significativa (p<0,01) os níveis AST e ALT séricos (107,28 16,02 e 134,35 19,76 U/L,
respectivamente) quando comparado ao grupo controle normal (43,17 7,34 e 61,98
11,27 U/L, respectivamente).
O tratamento com os triterpenos - e -amirina nas doses de 50 e 100 mg/kg
via oral, promoveu uma redução significativa (p<0,01) dos níveis séricos de AST (32,53
6,98 e 28,57 4,42 U/L, respectivamente) e ALT (61,28 12,49 e 44,15 6,65 U/L,
respectivamente) quando comparado ao grupo acetaminofeno (107,28 16,02 e 134,35
19,76 U/L, respectivamente). Da mesma forma, NAC (750 mg/kg, i.p.) promoveu redução
significativa (p<0,01) em ambos os níveis de enzimas séricas (29,96 6,46 e 41,46 5,34
U/L, respectivamente) (Tabela 26 e Figura 29).
O pré-tratamento com - e -amirina nas doses de 50 e 100 mg/kg via oral,
antes da administração de acetaminofeno, reduziu de forma significativa (p<0,05 e p<0,01,
respectivamente) os escores de lesão hepática (2 [1-3] e 1,5 [1-2], respectivamente)
quando comparado ao grupo acetaminofeno (5 [4-5] ), o que também foi observado nos
animais tratados com NAC (0,5 [0-1] ) (Tabela 27).
A análise histológica dos fígados dos animais tratados com veículo (3% de
Tween 80) demonstrou tecido com arquitetura preservada, apresentando hepatócitos com
disposição normal. Já o grupo tratado com acetaminofeno, mostrou necrose centrolobular,
congestão e intensa área de infiltrado de células inflamatórias. No grupo que recebeu NAC
observou-se presença de hepatócitos com arquitetura parcialmente preservada e pequenas
áreas de necrose e infiltrado de células inflamatórias. Os animais tratados com os
triterpenos - e -amirina, apresentou hepatócitos com arquitetura bem preservada, com
pequenas áreas de necrose e infiltrado de células inflamatórias (Figura 30).
Tabela 25. Efeito da mistura de α- e β-amirina sobre os níveis de glutationa na
hepatotoxicidade induzida por acetaminofeno em camundongos
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
NP-SH
(µg/g tecido)
Controle normal
---
655,17 24,10
Acetaminofeno 500
432,17 32,37
a
,-amirina
50
612,54 32,78
b
100
642,01 28,59
b
NAC 750
611,83 32,29
b
Os resultados são expressos como média erro padrão da média (E.P.M.) para
os níveis hepáticos de glutationa (NP-SH) para 8 animais. As dosagens foram analisadas
24 horas após a administração oral de acetaminofeno (500 mg/kg). A N-acetilcisteína
(NAC, 750 mg/kg, i.p.) foi administrada 2 horas antes e veículo (Tween 80) e a mistura de
- e -amirina (50 e 100 mg/kg, v.o.) 48, 24 e 2 horas antes da administração de
acetaminofeno.
a
p<0,05 vs controle normal;
b
p<0,05 vs controle acetaminofeno (ANOVA
e Teste de Student Newman Keul).
FIGURA 28. Efeito da mistura de α- e β-amirina e N-acetilcisteína (NAC)
sobre os níveis de grupos sulfidrílas não protéicos (NP-SH) na
hepatotoxicidade induzida por acetaminofeno em camundongos.
Os
níveis de glutationa hepática (NP-SH) foram analisados 24 horas após a
administração oral de acetaminofeno (500 mg/kg). A mistura de - e -
amirina (50 e 100 mg/kg, v.o.) e veículo (controle normal) foram
administrados 48, 24 e 2 horas antes e NAC (750 mg/kg, i.p.) 2 horas antes do
tratamento com acetaminofeno. Cada coluna representa a média erro padrão
da média (E.P.M.) de oito animais.
a
p<0,05 vs controle normal;
b
p<0,05 vs
controle acetaminofeno (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).
Controle
Normal
Controle
Veículo
750
50 100
α
,β-amirina
NAC
mg/kg
Acetaminofeno
0
200
400
600
800
NP-SH (
µ
g/g de tecido)
a
b
b
b
Tabela 26. Efeito da mistura de α- e β-amirina nos níveis de AST e ALT na
hepatotoxicidade induzida por acetaminofeno em camundongos
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
AST
(U/L)
ALT
(U/L)
Controle Normal
---
43,17 7,34
61,98 11,27
Acetaminofeno 500
107,28 16,02
a
134,35 19,76
a
- amirina
50
32,53 6,98
b
61,28 12,49
b
100
28,57 4,42
b
44,15 6,65
b
NAC 750
29,96 6,46
b
41,46 5,34
b
Os resultados são expressos como média erro padrão da média (E.P.M.) das
concentrações séricas de ALT e AST (U/L) para 8 animais. As transaminases foram
analisadas 24 horas após a administração oral de acetaminofeno (500 mg/kg). A N-
acetilcisteína (NAC - 750 mg/kg, i.p.) foi administrada 2 horas antes e veículo (Tween 80)
e a mistura de - e -amirina (50 e 100 mg/kg, v.o.) 48, 24 e 2 horas antes da
administração de acetaminofeno.
a
p<0,01 vs controle normal;
b
p<0,01 vs controle
acetaminofeno (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).
FIGURA 29. Efeito da mistura de α- e β-amirina e N-acetilcisteína (NAC)
sobre os níveis séricos de ALT e AST na hepatotoxicidade induzida
por acetaminofeno em camundongos.
Os níveis séricos das transaminases
ALT e AST foram analisados 24 horas após a administração oral de
acetaminofeno (500 mg/kg). A mistura de - e -amirina (50 e 100 mg/kg,
v.o.) e veículo (controle normal) foram administrados 48, 24 e 2 horas antes e
NAC (750 mg/kg, i.p.) 2 horas antes do tratamento com acetaminofeno. Cada
coluna representa a média erro padrão da média (E.P.M.) para oito animais.
a
p<0,01 vs controle normal;
b
p<0,01 vs controle acetaminofeno (ANOVA e
Teste de Student Newman Keul).
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Enzimas (U/L)
Controle
Normal
Controle
Veículo
750
50 100
α
,β-amirina
NAC
mg/kg
Acetaminofeno
a
a
b
b
b
b
b
b
ALT
AST
Tabela 27. Efeito da mistura de α- e β-amirina nos escores de lesão hepática na
hepatotoxicidade induzida por acetaminofeno em camundongos
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
Escores de
Lesão Hepática
Controle Normal
---
0 (0 – 0)
Acetaminofeno - 5 (4 – 5)
a
amirina
50 2 (1 – 3)
b
100 1,5 (1 – 2)
c
NAC 750 0,5 (0 – 1)
c
Os resultados são expressos em termo de mediana mínimos e máximos dos
escores de lesão hepática para 8 animais. Os animais foram sacrificados 24 horas após a
administração oral de acetaminofeno (500 mg/kg). Os fígados foram coletados e
examinados histologicamente e atribuídos escores numa escala de 0 a 5 para presença e
intensidade das lesões. A N-acetilcisteína (NAC, 750 mg/Kg, i.p.) foi administrada 2 horas
antes e veículo (Tween 80) e a mistura de - e -amirina (50 e 100 mg/kg, v.o.) 48, 24 e 2
horas antes da administração de acetaminofeno (500 mg/kg).
a
p<0,001 vs controle normal;
b
p<0,05 vs controle acetaminofeno;
c
p<0,01 vs controle acetaminofeno (ANOVA e Teste
de Kruskal Wallis - Dunnett).
FIGURA 30. Microfotografias de fígados de camundongos. (A) Animais tratados
com salina (v.o.); (B) Animais tratados com acetaminofeno (500 mg/kg, v.o.);
(C) Animais tratados com - e -amirina (100 mg/kg, v.o.) e acetaminofeno;
(D) Animais tratados com NAC (750 mg/kg, i.p.) e acetaminofeno.
A – Controle normal B – Controle Acetaminofeno
C – α,β-amirina 100 mg/kg
D – N-acetilcisteína
5.6.2. Efeito da mistura de α- e β-amirina na hepatoxicidade induzida por D-
Galactosamina/Lipopolissacarídeo em camundongos
Dexametasona (DEX, 2 mg/kg) inibiu de forma significativa (p<0,05) a
depleção dos grupos sulfidrilas produzidos pela GalN/LPS sendo o mesmo efeito
observado com a administração intraperitoneal de N-acetilcisteína (NAC, 750 mg/kg)
(167,82 20,54 e 125,45 16,15 g/g de tecido, respectivamente) quando comparado ao
grupo GalN/LPS (70,07 10,17 g/g de tecido).
A administração de - e -amirina nas doses de 50 e 100 mg/kg não foi capaz
de aumentar os níveis de glutationa hepática (81,11 7,60 e 96,36 5,01 g/g de tecido,
respectivamente) quando comparada ao grupo GalN/LPS (Tabela 28 e Figura 31).
Os níveis séricos das transaminases ALT e AST, aumentaram de forma
significativa (p<0,01) no grupo GalN/LPS (120,64 51,32 e 70,27 19,47 U/L,
respectivamente) quando comparado ao grupo controle normal (16,40 2,58 e 32,12
5,21 U/L, respectivamente).
O tratamento oral com a mistura de - e -amirina nas doses de 50 e 100
mg/kg, reduziu significativamente (p<0,01) os níveis séricos de ALT (17,10 1,62 e 22,17
2,11 U/L, respectivamente) quando comparado ao grupo controle GalN/LPS (120,64
51,32 U/L). Entretanto, não houve diferença significativa nos níveis séricos de AST.
NAC (750 mg/kg, i.p.) e Dexametasona (2 mg/kg, s.c.) promoveram redução
significativa (p<0,001) nos níveis de ALT (22,52 6,61 e 25,31 1,14 U/L,
respectivamente) e AST (32,12 3,41 e 44,34 4,51 U/L, respectivamente) quando
comparado ao grupo controle GalN/LPS (120,64 51,32 e 70,27 19,47 U/L,
respectivamente) (Tabela 29 e Figura 32).
O pré-tratamento oral com - e -amirina nas doses de 50 e 100 mg/kg, antes
da administração de GalN/LPS, reduziu de forma significativa (p<0,001) os escores de
lesão hepática (1 [1-2] e 1 [1-2] ) quando comparado ao grupo GalN/LPS (5 [5-5] ),
observado também no grupo tratado com Dexametasona (1 [0-1] ) (Tabela 30).
A análise histológica dos fígados dos animais tratados com veículo (3% de
Tween 80) demonstrou tecido com arquitetura preservada, apresentando hepatócitos com
disposição normal. Já o grupo tratado com GalN/LPS, mostrou extensas áreas
hemorrágicas com presença de células necróticas e de infiltrado inflamatório com
predomínio de polimorfosnucleares (PMN) e presença de células apoptóticas. O grupo que
recebeu Dexametasona observou-se presença de pequenos focos de necrose com infiltrado
inflamatório (mononucleares), presença de neutrófilos e pontos de infiltração inflamatória
e células apoptóticas.
Nos animais tratados com os triterpenos - e -amirina (50 e 100 mg/kg, v.o.)
observou-se pequenos pontos de infiltrado inflamatório não observando áreas
hemorrágicas e presença de células necróticas (Figura 33).
Tabela 28. Efeito da mistura de α- e β-amirina sobre os níveis de glutationa na
hepatotoxicidade induzida por D-Galactosamina/LPS em
camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
NP-SH
(µg/g tecido)
Controle normal
---
155,91 4,03
GalN/LPS 800/75 x 10
-3
70,07 10,17
a
,-amirina
50
81,11 7,60
100
96,36 5,01
NAC 750
125,45 16,15
b
DEX 2,0
167,82 20,54
c
Os resultados são expressos como média erro padrão da média (E.P.M.) para
os níveis hepáticos de glutationa (NP-SH) para 8 animais. As dosagens foram analisadas
24 horas após a administração de GalN/LPS (800/75x10
-3
mg/kg). A N-acetilcisteína
(NAC - 750 mg/kg, i.p.) e Dexametasona (DEX, 2 mg/Kg, s.c.) foram administradas 2
horas antes e veículo (Tween 80) e a mistura de - e -amirina (50 e 100 mg/kg, v.o.) 48,
24 e 2 horas antes da administração de GalN/LPS.
a
p<0,01 vs controle normal;
b
p<0,05 vs
controle GalN/LPS;
c
p<0,01 vs controle GalN/LPS (ANOVA e Teste de Student Newman
Keul).
FIGURA 31. Efeito da mistura de α- e β-amirina, N-acetilcisteína (NAC) e
dexametasona (DEX) sobre os níveis de grupos sulfidrílas não
protéicos (NP-SH) na hepatotoxicidade induzida por D-
Galactosamina/LPS em camundongos.
Os níveis de glutationa hepática
(NP-SH) foram analisados 6 horas após a administração intraperitoneal de
GalN/LPS (800/75x10
-3
mg/kg). A a mistura de - e -amirina (50 e 100
mg/kg, v.o.) e veículo (controle normal) foram administrados 48, 24 e 2 horas
antes, NAC (750 mg/kg, i.p.) e DEX (2,0 mg/kg, s.c.) 2 horas antes, do
tratamento GalN/LPS. Cada coluna representa a média erro padrão da média
(E.P.M.) para oito animais.
a
p<0,01 vs controle normal;
b
p<0,05 vs controle
GalN/LPS;
c
p<0,01 vs controle GalN/LPS (ANOVA e Teste de Student
Newman Keul).
0
50
100
150
200
NP-SH (
µ
g/g de tecido)
a
b
c
Controle
Normal
Controle
Veículo
750
50 100
α
,β-amirina
NAC
mg/kg
GalN/LPS
2,0
DEX
Tabela 29. Efeito da mistura de α- e β-amirina sobre os Níveis Séricos de AST e
ALT na hepatotoxicidade induzida por D-Galactosamina/LPS em
camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
ALT
(U/L)
AST
(U/L)
Controle normal
---
16,40 2,58
32,12 5,21
GalN /LPS 800/75x10
-3
120,64 51,32
a
70,27 19,47
a
,-amirina
50
17,10 1,62
b
40,59 3,71
100
22,17 2,11
b
43,82 4,37
NAC 750
22,52 6,61
c
32,12 3,41
c
DEX 2,0
25,31 1,14
c
44,34 4,51
Os resultados são expressos como média erro padrão da média (E.P.M.) das
concentrações séricas de ALT e AST (U/L) para oito animais. As transaminases foram
analisadas 2 horas após a administração intraperitoneal de GalN/LPS (800/75x10
-3
mg/kg).
A N-acetilcisteína (NAC - 750 mg/kg, i.p.) foi administrada 2 horas antes e, veículo
(Tween 80) e a mistura de - e -amirina (50 e 100 mg/kg, v.o.) 48, 24 e 2 horas antes da
administração de GalN/LPS.
a
p<0,01 vs controle normal;
b
p<0,01 vs controle GalN/LPS;
c
p<0,001 vs controle GalN/LPS (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).
FIGURA 32. Efeito da mistura de α- e β-amirina, N-acetilcisteína (NAC) e
dexametasona (DEX) sobre os níveis séricos de ALT e AST na
hepatotoxicidade induzida por D-Galactosamina/LPS em
camundongos.
Os níveis séricos das transaminases ALT e AST foram
analisados 2 horas após a administração intraperitoneal de GalN/LPS
(800/75x10
-3
mg/kg). A mistura de - e -amirina (50 e 100 mg/kg, v.o.) e
veículo (controle normal) foram administrados 48, 24 e 2 horas antes, NAC
(750 mg/kg, i.p.) e DEX (2,0 mg/kg, s.c.) 2 horas antes, do tratamento
GalN/LPS. Cada coluna representa a média erro padrão da média (E.P.M.)
para oito animais.
a
p<0,01 vs controle normal;
b
p<0,01 vs controle GalN/LPS;
c
p<0,001 vs controle GalN/LPS (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Enzimas (U/L)
Controle
Normal
Controle
Veículo
750
25 50
α
,β-amirina
NAC
mg/kg
GalN/LPS
2,0
DEX
a
a
b
b
c
c
c
ALT
AST
Tabela 30. Efeito da mistura de α- e β-amirina nos Escores de Lesão Hepática
na hepatotoxicidade induzida por D-Galactosamina/LPS em
camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
Escores de
Lesão Hepática
Controle Normal
---
0 (0 – 0)
GalN/LPS 800/75x10
-3
5 (5 – 5)
a
,-amirina
50 1 (1 – 2)
b
100 1 (1 – 2)
b
DEX 750 1 (0 – 1)
c
Os resultados são expressos em termo de mediana mínimos e máximos dos
escores de lesão hepática para oito animais. Os animais foram sacrificados 6 horas após a
administração intraperitoneal de GalN/LPS (800/75x10
-3
mg/kg). Os fígados foram
coletados e examinados histologicamente e atribuídos escores numa escala de 0 a 5 para
presença e intensidade das lesões. A dexametasona (DEX, 2,0 mg/kg, s.c.) foi
administrada 2 horas antes, veículo (Tween 80) e a mistura de - e -amirina (50 e 100
mg/kg, v.o.) 48, 24 e 2 horas antes, da administração de GalN/LPS.
a
p<0,001 vs controle
normal;
b
p<0,05 vs controle GalN/LPS;
c
p<0,001 vs controle GalN/LPS (ANOVA e Teste
de Kruskal Wallis - Dunnett).
FIGURA 33. Microfotografias de fígados de camundongos. (A) animais tratados
com veículo (3% de Tween 80 - controle normal); (B) animais tratados com
GalN/LPS; (C) animais tratados com mistura de - e - amirina 50 mg/kg; (D)
animais tratados com mistura de - e - amirina 100 mg/kg; (E) animais
tratados com dexametasona (2,0 mg/kg) (HE, 400x).
A - Controle Veículo B - Controle GalN/LPS
C – α,β-amirina 50 mg/kg
D – α,β-amirina 100 mg/kg
E - Dexametasona
5.7. ATIVIDADE DA MISTURA DE α- E β-AMIRINA NOS TESTES DE
ROTA-ROD, CAMPO ABERTO E TEMPO DE SONO
A mistura de triterpenos - e -amirina, nas doses de 3, 10 e 30 mg/kg, por via
oral, não alterou o tempo de permanência dos animais no aparelho de “rota rod”, como
também não influenciou na a atividade locomotora e tão pouco modificou o tempo de sono
dos animais quando comparados aos grupos controles (Tabelas 31 e 32).
O pré-tratamento com a mistura de - e -amirina, nas doses de 50 e 100 mg/kg,
potencializou o tempo de sono induzido por pentobarbital sódico (50 mg/kg, i.p.) em
camundongos. Entretanto, a significância estatística foi observada apenas na dose de 100
mg/kg (Tabela 33).
Tabela 31. Efeito da mistura de α- e β-amirina sobre a coordenação motora em
camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
Tempo de
Permanência
(s/2min)
Controle (veículo)
---
117,37 2,62
,-amirina
3
120,00 0,00
10
114,14 3,82
30
119,28 0,71
Os animais foram tratados com veículo (3% de Tween 80) ou mistura de - e -
amirina (3, 10 e 30 mg/kg, v.o.) 1 hora antes do início de cada experimento. Os resultados
são expressos como média erro padrão da média (E.P.M.) do tempo de permanência no
aparelho de “rota-rod”.
Tabela 32. Efeito da mistura de α- e β-amirina sobre a atividade exploratória
em camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
Freqüência de
Locomoção
(4min)
Controle (veículo)
---
41,11 2,43
,-amirina
3
45,30 3,26
10
41,88 3,71
30
36,62 2,58
100
36,52 2,81
200
37,38 3,45
Os animais foram tratados com veículo (3% de Tween 80) ou mistura de - e -
amirina (3, 10 e 30 mg/kg, v.o.) 1 hora antes do início de cada experimento. Os resultados
são expressos como média erro padrão da média (E.P.M.) da freqüência de locomoção,
que consiste do ato do animal penetrar com as quatro patas em uma das divisões da arena
do campo aberto, durante o período de 4 min.
Tabela 33. Efeito da mistura de α- e β-amirina sobre o tempo de Sono induzido
por pentobarbital sódico em camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
Tempo de
Sono (min)
Controle (veículo)
---
60,55 4,71
,-amirina
3
43,42 3,34
10
44,50 4,63
30
61,75 4,21
50
86,25 7,89
100
105,25 5,29
a
Os animais foram tratados com veículo (3% de Tween 80) ou mistura de - e -
amirina (3, 10, 30, 50 e 100 mg/kg, v.o.) 1 hora antes do início de cada experimento. Os
resultados são expressos como média erro padrão da média (E.P.M.) do tempo gasto pelo
animal dormindo, que foi registrado (min) desde o momento do início do sono até o
retorno à situação de alerta.
a
p<0,001 vs controle (ANOVA e Teste de Student Newman
Keul).
DISCUSSÃO
6. DISCUSSÃO
Do ponto de vista histórico, os produtos naturais sempre desempenharam um
importante papel no processo de obtenção de novos fármacos. A maior parte das drogas
comercializadas é de origem natural ou produtos sintéticos originados a partir de produtos
naturais.
A partir dos produtos naturais, incluindo as toxinas extraídas de animais, de
bactérias, de fungos ou de plantas, foi possível compreender of diversos fenômenos
relacionados à biologia celular e molecular e à eletrofisiologia, permitindo que estruturas
biológicas fossem identificadas, isoladas e clonadas. O que tornou possível à indústria
farmacêutica modelar drogas providas de maior seletividade e também mais eficazes
contra várias patologias de maior complexidade (CALIXTO, 2003).
Resinas são secreções sólidas ou semi-sólidas produzidas por plantas e árvores,
utilizadas para os mais variados fins, na indústria de perfume, fabricação de vernizes e em
rituais religiosos. A partir de incisões obtém-se um exsudato resinoso utilizado na
medicina popular com antiinflamatório, analgésico e na cicatrização de feridas (CORRÊA,
1984; PERNET, 1972; SIANI et al., 1999).
Muitas espécies de Protium exsudam uma resina aromática empregada na
preparação de incensos utilizados em rituais religiosos, e na medicina tradicional por suas
propriedades biológicas (DEHARO et al., 2001).
Análise fitoquímica de P heptaphyllum revelou a presença de monoterpenos e
triterpenos pentacíclicos, incluindo - e -amirina (SUSUNAGA ET AL., 2001; VIEIRA-
JUNIOR, 2005). Aos triterpenos são atribuídas diversas atividades farmacológicas, dentre
estas podemos destacar: atividade antiinflamatória, antiulcerogênica e antinociceptiva
(NIKIEMA et al., 2001; ARRIETA et al., 2003; SPESSOTO et al., 2003).
Apesar de sua utilização pela medicina popular, para os mais variados fins, são
escassos os estudos que comprovem a utilização de resinas como um agente
antiinflamatório ou antiulcerogênico. Dessa forma, sabendo-se a resina de P heptaphyllum
é rica em triterpenos pentacíclicos, avaliamos o seu potencial tóxico, antiinflamatório e
gastroprotetor em modelos experimentais de lesões gástricas e inflamação. E, sendo os
triterpenos - e -amirina os constituintes majoritários da resina de P heptaphyllum,
avaliamos sua toxicidade aguda e suas atividades farmacológicas em modelos animais de
lesões gástricas, nocicepção, prurido e hepatotoxicidade.
TOXICIDADE
A administração oral da resina e da mistura de - e -amirina até as doses de 5
g/kg e 3 g/kg, respectivamente, não foram tóxicas aos camundongos com até 72 horas de
observação. Da mesma forma, os animais que receberam, por via intraperitoneal, a resina e
a mistura de - e -amirina até as doses de até 1 g/kg e 2 g/kg, respectivamente, não
mostraram sinais clínicos de toxicidade e nenhuma morte foi observada no período de até
72 horas.
Os estudos de toxicidade aguda demonstram que, tanto a resina quanto a mistura
de triterpenos, - e -amirina, possuem baixa toxicidade, uma vez que não foi possível
estabelece a DL
50
, para ambos os produtos testados.
Artemia sp (Artemidae), uma larva de camarão de salmoura, é um invertebrado
usado como teste alternativo para se determinar a toxicidade de produtos naturais e
químicos. Nesta metodologia, é possível correlacionar a letalidade das larvas e a
citotoxicidade da substância em estudo (CARBALLO et al., 2002). A literatura relata que
existe uma correlação entre a toxicidade geral frente a Artemia salina e a citotoxicidade
diante de linhagens de células tumorais humanas (CAVALCANTE et al., 2000).
Este teste foi empregado no presente estudo como objetivo de se avaliar
possíveis efeitos tóxicos da resina e da mistura de triterpenos - e -amirina sobre Artemia
sp, determinando seus os valores de CL
50
. Os resultados mostraram que a Concentração
Letal Média (CL
50
) da resina e da mistura de - e -amirina, foram de 400 27,85 e 42,54
19,96 g/mL, respectivamente.
Os resultados obtidos com resina utilizando Artemia sp corroboram com aqueles
em mamíferos, cuja a administração por via oral ou intraperitoneal não causaram sinais de
toxicidade significativos. Por outro lado, a mistura de triterpenos - e -amirina, apesar de
exibir baixa toxicidade in vivo, mostrou toxicidade similar ao dicromato de potássio, no
modelo citotoxicidade com larvas de camarão. Este efeito é esperado, tendo em vista que
efeitos citotóxicos de triterpenos pentacíclicos são observados na literatura e muitos são
considerados potentes agentes anticancerígenos, tais como os ácidos betulínico, pomólico
e oleanólico (FERNANDEZ et al., 2003).
ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA
Aos triterpenos são atribuídas diversas atividades farmacológicas, dentre estas
podemos destacar: atividade antiinflamatória, antiulcerogênica e antinociceptiva
(NIKIEMA et al., 2001; ARRIETA et al., 2003; SPESSOTO et al., 2003).
Apesar de sua utilização pela medicina popular, para os mais variados fins, são
escassos os estudos que comprovem a utilização de resinas como um agente
antiinflamatório ou antiulcerogênico. Dessa forma, sabendo-se a resina de P heptaphyllum
é rica em triterpenos pentacíclicos, sendo os triterpenos - e -amirina os constituintes
majoritários, avaliamos o potencial efeito antiinflamatório da resina nos modelos
experimentais de inflamação.
Avaliando-se uma possível atividade antiinflamatória da resina, utilizamos
modelos de edema de pata induzido por carragenina, aumento da permeabilidade vascular
induzido por ácido acético e granuloma por “pellet” de algodão.
O edema de pata induzido por carragenina tem sido utilizado como um modelo
de inflamação aguda com o fim de se investigar os efeito de drogas antiinflamatórias, uma
vez que não produz efeitos sistêmicos, possui elevado grau de reprodutibilidade e sua ação
inflamatória pode ser inibida por agentes antiinflamatórios esteroidais e não esteroidais
(WINTER et al., 1962). Neste modelo estão envolvidas três fases distintas: a primeira com
liberação de histamina, serotonina, a segunda é mediada pela liberação de cininas, como a
bradicinina e a fase terminal está associada com a liberação de prostaglandinas (DI ROSA
et al., 1971). Os resultados mostraram que a resina (200 e 400 mg/kg) não foi efetiva em
diminuir o edema provocado por carragenina. Indometacina, utilizada como droga padrão,
reduziu significativamente o edema quando comparado ao controle veículo. Os resultados
mostram que a resina parece não interferir com os mediadores inflamatórios presentes no
edema por carragenina.
O granuloma por “pellets” de algodão é um modelo bastante utilizado no estudo
dos componentes presentes na exsudação, transudação e proliferação observados na
inflamação crônica. O fluido absorvido pelos “pellets” influenciam o peso úmido do
granuloma e o peso seco está correlacionado com a quantidade de tecido granulomatoso
formado (RAMPRASATH et al., 2004). A administração oral da resina (200 e 400 mg/kg)
promoveu redução significativa o peso seco dos granulomas, mas não do peso úmido. Este
resultado indica que a resina inibe a proliferação de fibroblastos, atuando sobre o processo
inflamatório crônico.
Na inflamação aguda induzida pelo ácido acético há aumento nos níveis
peritoneais das prostaglandinas PGE2 e PGF2, serotonina e histamina, constituindo um
modelo útil no estudo de drogas com ação antiinflamatória periférica (KOU et al., 2005).
Os resultados demonstram que a resina (400 mg/kg) inibiu, de forma significativa, a
permeabilidade vascular induzida por ácido acético, que corresponde à fase exsudativa
inicial da inflamação, onde há a participação de histamina e serotonina, substâncias que
exibem papel menos importantes no modelo do edema induzido por carragenina (WINTER
et al., 1962; WHITTLE et al., 1964).
Assim, é possível que a resina exerça sua atividade antiinflamatória ao inibir a
degranulação de mastócitos, afetando assim, o aumento da permeabilidade vascular
induzido por ácido acético. Em conclusão, os dados mostram que a resina possui atividade
antiinflamatória na fase inicial (permeabilidade vascular) e tardia (granuloma por “pellets”
de algodão) da inflamação.
ATIVIDADE GASTROPROTETORA
A combinação de atividade antiinflamatória e gastroprotetora em uma mesma
substância é favorável tendo em vista limitações encontradas em agentes antiinflamatórios
que mostram tendência em produzir irritação gástrica, sangramento e danos à mucosa
gástrica (LANZA, 1984; FIORUCCI et al., 2001).
A mucosa gástrica é exposta continuamente a agentes potencialmente
prejudiciais tais como, ácido, pepsina, ácidos biliares, condimentos, produtos bacterianos e
drogas. Estes agentes estão implicados nas patogêneses das úlceras gástricas e muitos
produtos farmacêuticos empregados para o tratamento das úlceras não são completamente
eficazes, além de produzir muitos efeitos adverso (TOMA et al., 2002).
Os produtos derivados de plantas são uma das mais promissoras fontes de novas
drogas e têm mostrado resultados satisfatórios no tratamento das úlceras gástricas
(ALKOFAHI et al., 1999; ZAYACHKIVSKA et al., 2004). Dentre estes compostos,
encontram-se os triterpenos (AL-HOWIRINY et al., 2003; RODRIGUEZ et al., 2004).
Estudos fitoquímicos demonstram que grupamento hidroxila na posição 3 parece
conferir propriedades antiulcerogênicas a triterpenos pentacíclicos (NAVARRETE et al.,
2002). Tendo em vista que a resina de P. heptaphyllum é rica em triterpenos pentacíclicos,
do tipo - e -amirina, resolvemos avaliar se a resina e a mistura destes triterpenos
possuem atividade gastroprotetora em modelos experimentais de lesões gástricas.
Etanol e etanol acidificado são modelos clássicos de avaliação de drogas com
atividade antiulcerogênicas/citoprotetoras (ROBERT et al., 1979; SCHMEDA et al.,
2002). A administração oral da resina de P. heptaphyllum (200 e 400 kg/kg), preveniu as
lesões gástricas induzidas pela administração de etanol e etanol acidificado. Nestes
modelos, os radicais livres parecem contribuir com as lesões gástricas glandulares (TRIER
et al., 1987; MATSUMOTO et al., 1992) e drogas com propriedades antioxidantes tendem
a proteger a mucosa dos danos induzidos por estes agentes (MIZUI, et al., 1987; VALE et
al., 1981).
A incidência das úlceras por etanol localiza-se predominantemente na parte
glandular do estômago, com participação de leucotrienos C
4
(LTC
4
) e produtos da
degranulação de mastócitos (PESKAR et al., 1986; RAO et al., 2004) e estabilizadores de
membrana de mastócitos podem reduzir os danos à mucosa gástrica, contribuindo para
diminuição das lesões (CHO & OGLE, 1992). Além disso, etanol parece depletar os níveis
dos grupos sulfidrílicos não protéicos no estômago e a restauração desses grupamentos
parece ser importante na gastroproteção exercida por algumas drogas (TRIER et al., 1987).
Os resultados mostram que a NAC (750 mg/kg), mas não a resina (200 e 400
mg/kg), foi efetiva em restabelecer os níveis de glutationa reduzida (GSH) no estômago,
no modelo de lesões gástricas induzidas por etanol, sugerindo a possibilidade de outro
mecanismo no efeito gastroprotetor da resina. No estudo em animais com piloro ligado por
4 horas, a resina não foi capaz de modificar o volume secretório gástrico, porém reduziu a
acidez total no estômago de forma significativa, apontando que este efeito poderia estar
envolvido na gastroproteção deste agente.
Sabe-se que a inibição de ambas as isoformas da ciclooxigenase (COX-1 e COX-2)
induz a formação de úlcera gástrica (SULENYMAN et al., 2004). Indometacina, é um
inibidor não seletivo de COX, que age por múltiplos mecanismos, incluindo supressão de
PG´s e produção de leucotrienos, o que resulta no aumento da suscetibilidade à lesões da
mucosa e ulcerações gastroduodenais (BATISTA et al., 2004). As PG´s tem efeito
gastroprotetor, cujo mecanismo envolve a aumento na secreção de muco e bicarbonato,
além do aumento no fluxo sanguíneo da mucosa (KANATANI et al., 2004). Dessa forma,
o modelo de úlcera induzida por indometacina é um teste bastante utilizado para estudo de
drogas antiulcerogênicas.
O pré-tratamento com a resina nas doses de 200 e 400 mg/kg, v.o., não inibiu o
processo de ulceração induzida por indometacina. Por outro lado, a cimetidina; um
antagonista H
2
foi capaz de inibir significativamente a formação das lesões. Estes
resultados sugerem que o efeito gastroprotetor da resina não deve envolver aumento na
produção de PG´s ou inibição de leucotrienos.
Estudos mostrando atividade antioxidante de resinas naturais ricas em
triterpenos pentacíclicos, tais como ácidos oleanólico, ursólico, glicirretínico amirina,
lupeol são encontrados na literatura (ANDRIKOPOULOS et al., 2003; ASSIMOPOULOU
et al., 2005). Assim, assumimos que o efeito gastroprotetor da resina, no modelo de lesões
gástricas induzidas por etanol, deve-se, pelo menos, à sua atividade antioxidante.
Uma das mais interessantes substâncias obtidas da pimenta vermelha (Pipper) é
a capsaicina. Esta substância age sobre os neurônios sensoriais estimulando os receptores
de membrana, predominantemente receptores vanilóides (TRPV1), liberando
neuropeptídeos tais como substância P e CGRP. Em pequenas doses, capsaicina funciona
como um potente agente gastroprotetor, estimulando a microcirculação gástrica, porém em
altas doses, capsaicina destrói seletivamente as terminações neuronais das fibras C, que
resulta na inativação dos nervos sensoriais e perda dos reflexos nos quais estes nervoso
estão envolvidos (ABDEL-SALAM et al., 1999; SZOLCSANYI & BARTHO, 2001).
Evidências mostram que, no estômago, os nervos sensoriais sensíveis à
capsaicina estão envolvidos no mecanismo de defesa local contra a formação de úlceras
gástricas (ABDEL-SALAM et al., 1999) e que a administração oral de capsaicina exerce
proteção contra lesões gástricas induzidas por etanol (PARK et al., 2000).
Sabendo-se que a resina de P. heptaphyllum possui propriedades
gastroprotetoras (OLIVEIRA et al., 2004a) e sendo - e -amirina os triterpenos
majoritários da resina, decidimos por investigar se estes triterpenóides seriam os
responsáveis na gastroproteção observada no modelo de lesões gástricas induzidas por
etanol em camundongos, investigando um possível papel das fibras aferentes sensíveis à
capsaicina neste efeito.
Similar a capsaicina (2,5 a 20 mg/kg), a mistura - e -amirina (50 a 600
mg/kg) demonstrou proteção contra as lesões induzidas por etanol com tendência em
diminuir a eficácia com altas doses, efeito observado em ambas as substâncias. Acredita-se
que o mecanismo pelo qual a capsaicina exerce sua gastroproteção deve-se às
prostaglandinas e ao aumento da microcirculação na mucosa gástrica, aumento na secreção
de muco e bicarbonato, efeitos estes, mediados pela ativação dos neurônios sensoriais
aferentes no estômago (KATO et al., 2003).
Como visto, tratamento com pequenas doses de capsaicina protege a mucosa
gástrica de danos provocados por agentes irritantes, porém a destruição funcional dos
nervos sensoriais pelo pré-tratamento com altas doses de capsaicina aumentam a formação
de lesões gástricas (BRZOZOWSKI et al., 1996).
Em nossos estudos, verificamos que com a dessensibização química dos
neurônios aferentes, o efeito gastroprotetor exercido pela capsaicina é revertido,
comprovando a importância dessa via na atividade gastroprotetora da capsaicina. Os
resultados mostraram que a gastroproteção observada com a mistura - e -amirina, na
dose 100 mg/kg, via oral (67%) foi menor que a resina purificada, nas doses de 200 e 400
mg/kg, via oral (72 e 89%, respectivamente), sugerindo que outros triterpenóides podem
estar presentes na resina e ativando outros mecanismos de proteção, por exemplo,
prostaglandinas, óxido nítrico ou compostos sulfidrílicos (ARRIETA et al., 2002;
PONGPIRIYADACHA et al., 2003).
Estes resultados confirmam que a mistura de triterpenos - e -amirina possui
atividade gastro ou citoprotetora e que este efeito, envolve em parte, a ativação dos
neurônios aferentes sensíveis à capsaicina.
ATIVIDADE ANTIPRURIGINOSA
Tendo em vista a quase inexistência de estudos envolvendo os triterpenos
pentacíclicos do tipo - e -amirina, relacionando a atividade anti-alérgica destes
compostos e, dando continuidade ao estudo farmacológico da mistura de triterpenos - e
-amirina isolada de P. heptaphyllum, avaliamos se a mistura destes triterpenos apresenta
atividades antipruritogênica em modelos de prurido induzido por dextrana T40 e composto
48/80, analisando o papel dos opiódes endógenos e seus efeitos sobre a degranulação,
induzida pelo composto 48/80, de mastócitos peritoneais ex vivo.
Prurido é um importante componente da dermatite atópica, e a utilização de
métodos que quantifiquem a duração do “scratching” ou “coçar” é importante para se
entender os fatores que podem causar o prurido, além da descoberta de novas drogas
antipruriginosas (ORITO et al., 2004; OKU et al., 2003).
É possível encontrar na literatura trabalhos que mostram a eficácia de diversas
classes de compostos naturais, como flavonóis, naftoquinonas, saponinas, frente ao prurido
dependente e independente de histamina (ISHIGURO & OKU, 1994; FU et al., 2003).
Histamina é um dos conhecidos e mediador vasoativo, implicado na fase aguda
da resposta de hipersensibilidade imediata, e uma das substâncias secretadas na
degranulação de mastócitos. O composto 48/80 é um conhecido degranulador de
mastócitos. A estimulação das mastócitos por esta substância parece envolve uma trilha de
sinais de transdução, culminando com a secreção de histamina. O composto 48/80 parece
ativar proteínas G, ativando fosfolipase D de mastócitos, via complexo Proteína G-GTP,
essencial na ativação e secreção dos mediadores presentes nos mastócitos (TASAKA et al.,
1986; CHADI et al., 2000).
O efeito pruritogênico do composto 48/80 deve-se, em parte, a liberação de
histamina e serotonina a partir dos mastócitos (INAGAKI et al., 1999), podendo ainda
induzir prurido, em camundongos, por uma via independente desses autacóides
(SUGIMOTO et al., 1998; INAGAKI et al., 2002). Esta pode ser a razão pela qual a
ciproeptadina, um conhecido antagonista dos receptores histaminérgico e serotoninérgicos,
bem como as amirina, mostraram maior eficácia em inibir o prurido induzido por dextrana
T40 que pelo composto 48/80 (SANTOS et al., 2002). De forma similar ao composto
48/80, dextrana T40 também libera mediadores de mastócitos na pele, produzindo prurido
em camundongos (CHAKRAVARTY et al., 1978).
Os resultados demonstram que a mistura de triterpenos, - e -amirina (50, 100
e 200 mg/kg), foi capaz de suprimir o prurido experimental induzido por dextrana T40 e
pelo composto 48/80 em camundongos de forma significativa. Este é o primeiro estudo
que demonstra atividade antipruritogênica de triterpenos pentacíclicos através da inibição
do prurido induzido por mastócitos.
No modelo de degranulação de mastócitos peritoneais ex vivo, pelo composto
48/80, as amirina, na dose de 100 mg/kg, foram capazes de prevenir a degranulação, efeito
comparável ao cetotifeno, um conhecido estabilizador de mastócitos (KIM et al., 2003).
Corroborando com este achado, a mistura de triterpenos - e -amirina inibiu,
signficativamente, o edema de pata induzido pelo composto 48/80 e dextrana T40 em
camundongos. Assim, os resultados encontrados sugerem que - e -amirina exerce sua
ação modulando a ativação dos mastócitos.
Trabalhos anteriores mostram que antagonistas de receptores -opióides, como
por exemplo, naloxona e naltrexona, inibem o prurido induzido pelo composto 48/80 e
substância P, sugerindo a participação do sistema opióide no prurido (INAGAKI et al.,
1999). Assim, avaliamos o papel dos opióides endógenos no prurido induzido pelo
composto 48/80 e sua inibição pelas - e -amirina. Naloxona, per si não produziu prurido
nem interferiu no prurido induzido pelo composto 48/80 nos camundongos. Por outro lado,
a naloxona foi mais efetiva em antagonizar o efeito inibitório da morfina, porém reverteu
apenas parcialmente o efeito das amirina (100 mg/kg) sobre o prurido induzido pelo
composto 48/80. Estes resultados sugerem que o sistema opióide sensível a naloxona está,
em parte, envolvido no efeito supressor das amirina sobre o prurido induzido pelo
composto 48/80 em camundongos.
Sabe-se que algumas drogas que possuem atividade sedativa podem apresentar
atividade antipruriginosa (KRAUSE & SHUSTER, 1983; WATANABE et al., 1999). Em
nossos estudos, a mistura de - e -amirina (100 e 200 mg/kg), não interferiu na atividade
locomotora dos animais, sugerindo que o mecanismo pelo qual a mistura exerce seu efeito
supressor do prurido não envolve atividade sedativa sobre o sistema nervoso central.
Os dados obtidos sugerem que as - e -amirina possivelmente agem
suprimindo a função secretagoga dos mastócitos, conferindo-lhes efeitos antipruriginoso e
antiinflamatório.
Os modelos experimentais de edema de pata por dextrana, composto 48/80,
histamina e serotonina, são utilizados na avaliação de drogas com atividades
antiedematogênica. Nestes modelos, os mastócitos e seus produtos, incluindo histamina e
serotonina, desempenham papel importante na formação do edema. Os mastócitos podem
secretar seus grânulos por diversos estímulos: por soluções hipotônicas, incubação com
anticorpos anti-IgE e alguns substâncias químicas, como dextrana e o composto 48/80, o
qual é bastante utilizado para degranular mastócitos em modelos in vivo e in vitro (YANG
et al., 2002).
A dextrana induz a degranulação parcial de mastócitos no período de 30
minutos, levando a rápido acúmulo de fluidos, com pequena concentração de proteínas e
neutrófilos (LO et al., 1982), com participação de histamina e serotonina (GUPTA et al.,
2003). Histamina é um dos mais importantes mediadores inflamatórios e um potente
agente vasodilatador, aumentando a permeabilidade vascular (GUPTA et al., 2003).
A presença de serotonina no meio inflamatório induz múltiplas conseqüências.
Uma delas é extravasamento de proteínas a partir das vênulas pós-capilares, contribuindo
para edema periférico, efeito que provavelmente envolve a ativação dos receptores 5-HT
2a
(ZEITZ et al., 2002).
Os resultados mostram que - e -amirina (100 mg/kg) reduzem
significativamente o edema por dextrana, pelo composto 48/80, conhecidos degranuladores
de mastócitos e por histamina, mas não por serotonina. Sugerindo que o efeito
antipruriginoso/antiedematogênico das amirinas, deve-se em parte, à estabilização dos
mastócitos e, provavelmente, à inibição da síntese, liberação ou ação da histamina
(SRINIVASAN et al., 2001).
ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA
Em trabalhos anteriores, demonstramos que a resina e a mistura de triterpenos
- e -amirina isolada de P heptaphyllum, possuem atividade gastroprotetora e que este
efeito envolve a participação dos neurônios aferentes sensíveis à capsaicina (OLIVEIRA et
al., 2004b). Os nervos aferentes sensíveis à capsaicina são descritos como um mecanismo
protetor contra lesões gástricas induzidas por etanol e indometacina e a sua destruição
promove exacerbação dos processo inflamatórios. Todavia, estes nervos exercem ação pró-
inflamatória sobre as lesões gástricas induzidas por estresse em ratos. Desse modo,
dependendo da natureza e duração da inflamação, estes neurônios podem atuar
diferentemente no controle dos processos inflamatórios gástricos (LARAUCHE et al.,
2004).
Muitas substâncias derivadas de plantas são promissores agentes analgésicos, e
vários triterpenos têm produzidos resultados promissores em estudos experimentais e
clínicos (CALIXTO et al., 2000; ALMEIDA et al., 2001; SPESSOTO et al., 2003). Assim,
avançando nos estudo farmacológico com a mistura de triterpenos - e -amirina,
avaliamos a participação dessa mistura em modelos de nocicepção induzida por capsaicina
em camundongos.
A capsaicina, o princípio pungente encontrado na pimenta vermelha, quando
aplicada topicamente em humanos ou em animais experimentais, é conhecida por
estimular o receptor vanilóide (TRPV1) localizado nas fibras C. Os receptores TRPV1
localizam-se nas terminações nervosas dos neurônios sensoriais, tanto ao nível central
quanto periférico, e estudos sugerem que estes receptores estão envolvidos em um amplo
número de processos nociceptivos. Outro receptor envolvido nos efeitos da capsaicina são
os receptores NMDA (N-metil-D-aspartato). Administrada intradermicamente, a
capsaicina promove o aparecimento da hiperalgesia primária (no sítio de aplicação) e
secundária (próximo ao local de aplicação), a qual parece envolver a ativação destes
receptores, cujos antagonistas como a cetamina, são utilizados no alivio da dor e
hipersensibilidade mecânica induzidas por capsaicina em humanos e em animais
experimentais (KINNMAN et al, 1997).
A ativação dos receptores TRPV1 pela capsaicina promove uma complexa
cascata de eventos, incluindo excitação neuronal e liberação de mediadores pró-
inflamatórios, dessensibilização do receptor e toxicidade neuronal (SZOLCSANYI, 1977;
CATERINA et al., 1997). Dessa forma, a capsaicina representa uma importante ferramenta
farmacológica na exploração do papel fisiológico dessas fibras, denominadas de fibras
primárias aferentes sensíveis à capsaicina (SAADÉ et al., 2002).
O papel dos receptores TRPV1 na nocicepção tem sido estabelecido pela
utilização de antagonistas e camundongos “knockout” para esta classe de receptor
(CATERINA et al., 2000; WALKER et al., 2003). Estudos mostraram que os
camundongos “knockout” para este receptor mostraram-se resistentes aos estímulos
nociceptivos produzidos por ativadores dos receptores vanilóides in vivo. Uma outra
características destes animais foi a perda da hipersensibilidade ao estímulo térmico nocivo
observado durante processo inflamatório (DAVIS et al., 2000). Estes achados mostram
claramente o papel que desempenha os receptores TRPV1 durante as condições
inflamatórias, tornando estes receptores um alvo potencial para a ação de vários
mediadores (CALIXTO et al., 2005).
A dessensibilização induzida por agonistas é útil no controle da supressão da
dor neuropática e no controle da dor. Estudo desenvolvido por Karai et al. (2004),
demonstra que o uso de resiniferatoxina, um potente agonista dos receptores TRPV1, é
capaz de destruir seletivamente os neurônios nociceptivos bloqueando a inflamação
hiperalgésica experimental e a inflamação neurogênica Enquanto antagonistas destes
receptores são valiosos agentes no tratamento da hiperalgesia inflamatória (LOPEZ-
RODRIGUEZ et al., 2003).
É bem estabelecido que a capsaicina provoca comportamentos de nocicepção
em roedores, seja decorrente da injeção subplantar (tempo de lambedura) ou administração
intracolônica (lambedura do abdômen, contorções, arrastar a parte inferior do abdômen
contra o piso e retração abdominal) (LAIRD et al., 2001; SAKURADA et al., 2003) e
vários trabalhos demonstram que substâncias naturais como terpenóides, cetônicas
fenólicas e dialdeídos insaturados suprimem estes comportamentos (SZALLASI e
BLUMBERG, 1999; OTUKI et al., 2001; DEDOV et al., 2002; ANDRE et al., 2004).
Os resultados obtidos com os triterpenos - e -amirina (3 a 100 mg/kg),
mostram que a mistura inibiu significativamente o comportamento de dor induzido pela
aplicação subplantar (1,6 g/20 mL) ou intracolônica (149 g/50 L) de capsaicina, de
forma quase equivalente em ambos modelos estudados. Estes resultados são corroborados
por Otuki et al. (2005), que recentemente verificaram efeito antinociceptivo produzido pela
mistura - e -amirina em modelos de nocicepção induzidos por carragenina e capsaicina
em camundongos. Os autores sugerem inibição das vias sensíveis à proteína quinase A e
proteína quinase C como o provável mecanismo de ação destes triterpenos.
As amirinas mostraram maior eficácia em menores doses, com diminuição do
efeito observado em doses mais altas (3 e 100mg/kg, respectivamente), evidenciando uma
curva dose-resposta na forma de “U” e implicando que a mistura pode ter uma dupla ação
sobre a resposta da capsaicina. Em estudo anterior (OLIVEIRA et al., 2004b), observamos
uma tendência similar no seu efeito gastroprotetor contra lesões gástricas induzidas por
etanol em camundongos e sugerimos que o mecanismo pelo qual a mistura dos triterpenos
s - e -amirina exerce seu efeito gastroprotetor, no modelo de lesões gástricas por etanol,
envolve a ativação dos neurônios sensoriais sensíveis à capsaicina, os quais são
reconhecidamente implicados na defesa da mucosa gástrica (WEST & MERCER, 2005).
Por outro lado, o mecanismo da ação antinociceptiva das amirina parece
envolver ainda ativação do sistema opióide. Naloxona (2 mg/kg), conhecido antagonista
dos receptores opióides reverteu parcialmente o efeito antinociceptivo das - e -amirina
(10 mg/kg) no modelo de dor induzido por capsaicina subplantar.
Este resultado vai de encontro ao obtido por Otuki et al. (2005). Neste trabalho,
os autores demonstraram que os efeitos antinociceptivos, periférico, espinhal e
supraespinhal observados com a mistura de triterpenos - e -amirina parece não ser
mediada via sistema opióide.
Contudo, efeito antinociceptivo de triterpenos envolvendo sistema opióide já foi
descrito na literatura. Ferreira et al. (2000) demonstraram que o efeito antinociceptivo do
extrato de Epidendrum Mosenii deve-se, em parte, a participação do sistema opióide e que
os triterpenos são provavelmente os princípios ativos responsáveis por este efeito. Os
triterpenos presentes no extrato obtido das folhas de Bouchea fluminensis, parece exercer
seus efeitos antinociceptivos através dos receptores opióides, uma vez que a naloxona foi
capaz de reverter esta atividade (COSTA et al., 2003).
O receptor TRPV1 desempenha importante papel na regulação funcional dos
nervos sensoriais. Crescentes evidências apontam para o potencial terapêutico dos
moduladores destes receptores, particularmente no controle da dor (DOHERTY et al.,
2005).
TRPV1 é um canal de cátion não seletivo e ativado não apenas por capsaicina
mas também por outras vias como, temperatura, prótons (baixo pH) e fosforilação direta da
proteína quinase C (CORREL et al., 2004). A capsaicina estimula uma fração significativa
de nociceptores, promovendo respostas comportamentais de nocicepção, como tempo de
lambedura e hipotermia, as quais são inibidos por antagonistas da própria capsaicina, como
capsazepina e vermelho de rutênio (PERKINS & CAMPBELL, 1992; SZALLAZI &
BLUMBERG, 1999).
Camundongos “knockout” para o receptor TRVP1 mostram uma acentuada
redução nas comportamentais de nocicepção (CATERINA et al., 2000). Assim, com o
objetivo de ampliar as evidencias que envolvem o mecanismo antinociceptivo pelo qual as
amirina exercem seus efeitos, experimentos foram realizados utilizando o vermelho de
rutênio, uma antagonista não seletivo da capsaicina, no modelo de nocicepção induzido
pela injeção subplantar de capsaicina.
Os resultados obtidos mostram uma inibição similar encontrados com as amirina
(10 mg/kg )e vermelho de rutênio (1,5 mg/kg). Além disso, quando estas duas substâncias
foram co-administradas aos animais, não foi observado efeito aditivo ou antagonismo
sobre a nocicepção induzida pela capsaicina, indicando que possivelmente não houve
interação das amirina com o receptor TRPV1. Estes resultados sugerem que o efeito
antinociceptivo produzido pelo vermelho de rutênio ou amirina pode ser mediado pela
inibição do canal de membrana catiônico ativado pela capsaicina.
O próximo experimento foi avaliar se a mistura de - e -amirina e o vermelho
de rutênio poderiam antagonizar a resposta hipotérmica induzida pela administração
subcutânea de capsaicina em camundongos. Consistente com as observações de Szikszay
et al. (1982), capsaicina na dose de 10 mg/kg, foi capaz de produzir uma nítida hipotermia,
seguida por uma hipertermia que manteve-se por um período de, pelo menos, 48 horas. Os
resultados demonstram que nem o vermelho de rutênio (1,5 mg/kg), nem as amirina (100
mg/kg) conseguiram reverter a resposta hipotérmica da capsaicina.
Porém, o vermelho de rutênio inibiu completamente a resposta hipertérmica
induzida pela capsaicina, enquanto que o efeito inibitório das - e -amirina, nesta
segunda fase, só foi observada apenas com 48 horas. Uma vez que não houve reversão da
fase hipotérmica, induzida pela capsaicina, pela - e -amirina e o vermelho de rutênio
leva-nos a sugerir que estas substâncias não apresentam especificidade em antagonizar o
receptor TRPV1 em camundongos. Apoiando esta observação, Correll et al. (2004),
questionam a seletividade da capsazepina, como um antagonista dos receptores TRPV1,
sugerindo que este agente pode se um antagonista ineficaz destes receptores em modelos
de nocicepção inflamatória em camundongos.
Os mecanismos
2
-adrenérgicos modulam as sensações coloretal e o uso de
agonistas desse receptores parece melhorar as condições fisiológicas e neuropáticas
(ONTTONEN & PERTOVAARA, 2000; SABETKASAIE et al., 2004).
Em nossos estudos, verificamos a possível participações do adrenoreceptores -
2 no efeito antinociceptivo de - e -amirina, empregando a clonidina como substância de
referência (PERTOVAARA & Kalmari, 2003). O pré-tratamento com ioimbina (2,0
mg/kg), antagonista -2, significativamente bloqueou o efeito antinociceptivo da clonidina
(0,1 mg/kg), mas não das amirina (10 mg/kg), sugerindo a não participação do sistema
adrenérgico no efeito antinociceptivo da mistura de triterpenos.
A constante ativação e sensibilização das fibras aferentes primárias tipo C é um
importante componente da dor inflamatória. Estas fibras secretam neuropeptídeos, tais
como substância P e CGRP, os quais contribuem para a inflamação neurogênica na
periferia, podendo causar aumento na excitabilidade medular e a sensibilização central
responsável pela hiperalgesia e alodinia (WOOLF, 1992).
A dor visceral é um importante sintoma em muitas doenças, tais como doença
inflamatória intestinal, onde os neurônios sensoriais aferentes localizados na parede
muscular e mucosa são ativados por distensão durante o peristaltismo e sensibilizados por
uma variedade de mediadores químicos produzidos dentro e fora da parede intestinal,
transmitindo a informação do intestino até o sistema nervoso central (GRUNDY, 2004).
Nos modelos de nocicepção induzidos por capsaicina, a mistura de - e -
amirina, exibiu um efeito supressor sobre os comportamentos nociceptivos. Estes achados
dão base para o uso da mistura de triterpenos como um agente terapêutico potencial no
tratamento da dor neuropática e inflamatória. Porém, estudos dos efeitos das - e -
amirina em modelos de hiperalgesia térmica e nocicepção neuropática são necessários.
Drogas que melhoram a atividade motora ou induz sedação podem fornecer
resultados falso-positivo/negativo em testes de nocicepção. Desta forma, procuramos
determinar a mistura de triterpenos - e -amirina no modelo de tempo de sono induzido
por pentobarbital sódico, que detecta sedação (AHMED et al., 1997); no teste do “rota-
rod”, o qual fornece indícios de déficits neurológicos, incluindo sedação, relaxamento
muscular e comprometimento da atividade motora, e finalmente, o teste de campo aberto,
que detecta incoordenação motora (NOVAS et al., 1988; PU et al., 1995).
A mistura de triterpenos, em doses variando de 3 a 30 mg/kg, por via oral, não
alteraram de forma significativa, o tempo de sono induzido por pentobarbital, a ambulação
no teste do campo aberto, nem a performance dos animais no teste do “rota-rod”. Estes
resultados indicam que a mistura de - e -amirina exerce seu efeito antinociceptivo sem
causar déficits neurológicos ou muscular.
Os dados apresentados mostram que - e -amirina, exerce pronunciado efeito
antinociceptivo em modelos de nocicepção aguda e visceral induzidos pela capsaicina em
camundongos. Embora o exato mecanismo envolvido na ação antinociceptiva destes
triterpenos não seja claro, sugerimos que a mistura de triterpenos desempenhe um papel de
antagonista inespecífico, tal como o vermelho de rutênio, inibindo as fibras sensoriais
aferentes (fibras C), além de interagir com o sistema opióide endógeno.
ATIVIDADE HEPATOPROTETORA
O fígado é um órgão de extrema importância na metabolização de substâncias
estranhas ao organismo, como medicamentos e substâncias nocivas, as quais produzem
uma grande variedade de manifestações tóxicas. A ação contínua do fígado em degradar
estes compostos, entretanto, pode induzir lesões hepáticas causada pelos metabólitos
formados, após a ingestão de altas quantidades de drogas por períodos prolongados.
As drogas convencionais utilizadas no tratamento das doenças hepáticas são
freqüentemente inadequadas (LUPER, 1999; RAJESH & LATHA, 2004). Por isso, torna-
se necessário a busca de novos compostos para o tratamento das destas patologias, visando
substituir as drogas atuais de eficácia e segurança duvidosas. Assim, os produtos naturais
desempenham importante papel como fonte de novos agentes hepatoprotetores.
No passado, a pesquisa experimental e clínica confirmou a eficácia de poucas
plantas, como a Silybum marianum, Picrorhiza kurroa, Curcuma longa, Camellia sinensis,
e Glycyrrhiza glabra (LUPER, 1999). Em muitos casos, a pesquisa nasceu da experiência
tradicional e sabedoria popular e, a partir daí, os mecanismos e vias da ação e a eficácia
terapêutica de certas plantas ou extratos derivados de plantas foram sendo descobertos e
confirmados em estudo clínicos.
Em estudos anteriores, demonstramos que a mistura de triterpenos pentacíclicos,
- e -amirina, possui atividade gastroprotetora e antipruriginosa (OLIVEIRA et al.,
2004b; OLIVEIRA et al., 2004c). É possível encontrar na literatura atividade
hepatoprotetora relacionada a vários triterpenos pentacíclicos (LIU, 1995; LIN et al., 1999;
YIM et al., 2001; TANG et al., 2004). Assim, com base nestas informações, decidimos por
investigar, um possível efeito hepatoprotetor das - e -amirina, nos modelos de
hepatotoxicidade induzida por acetaminofeno e galactosamina/LPS em camundongos.
O paracetamol (acetaminofeno) é um analgésico potente e disponível sem
prescrição médica. A superdosagem de paracetamol é conhecida desde 1966, podendo
levar a falência hepática e sendo a principal razão de transplantes de fígado nos Estados
Unidos e Inglaterra (NARONGCHAI et al., 2004) e responsável por 50-60% de todos os
casos relatados associado a tentativa de suícidio neste último país (BRASIL et al., 2001).
O acetaminofeno é convertido a um intermediário tóxico o N-acetil-p-benzoquinonaimina
(NAPQI), ao ser metabolizado pelas isoenzimas do Citocromo P-450 (CYP2A6 e
CYP2E1) (ROSEN et al., 1983; HAZAI et al., 2002), e os inibidores destas enzimas são
conhecidos por reduzir a toxicidade do acetaminofeno (JANBAZ et al., 2002). Atualmente,
a N-acetil cisteina (NAC) é o tratamento de escolha nas superdosagens de paracetamol,
uma vez que eleva os níveis de glutationa hepática citosólica e mitocondrial destoxificando
o citotóxico e reativo NAPQI (MITCHELL et al., 1973; KOZER et al., 2001).
De acordo com estudo já realizado por Janbaz et al. (2004), a administração de
uma sobre-dose de acetaminofeno por via oral, é efetiva em produzir necrose hepática
centrolobular fulminante, constatada com altos índices de mortalidade nos animais
tratados.
Os resultados mostram que o pré-tratamento com a mistura de - e -amirina
(50 e 100 mg/kg) inibiu completamente a mortalidade induzida por altas doses de
acetominofeno (500 mg/kg). Concentrações, significativamente, elevadas de ALT e AST
são aceitas como um índice de hepatotoxicidade (AHMAD et al., 2002;
SENTHILKUMAR & NALINI, 2004). - e -amirina reduz, de forma significante e de
maneira dose dependente, os níveis de ALT e AST associados com a toxicidade do
acetominofeno.
A NAC é conhecida por elevar a concentração intracelular de glutationa (GSH)
e por eliminar espécies reativas de oxigênio in vivo e in vitro (ARUOMA et al., 1989;
MANOV et al., 2002). A glutationa é um importante antioxidante endógeno encontrada em
altas concentrações no fígado e conhecida por desempenhar importante papel de proteção
seqüestrando radicais livres e participando de diversos processos de detoxificação.
De acordo com os resultados, os triterpenos - e -amirina preveniram a
depleção da GSH hepático induzido por acetaminofeno devido, provavelmente, a produção
do metabólito tóxico (NAPQI) (Tran et al., 2001). Os achados histológicos mostram que a
congestão e a infiltração de células inflamatórias, induzidas pela administração de
acetominofeno, foram consideravelmente diminuídas no grupo tratado com as amirina,
indicando uma possível atividade antiinflamatória destes triterpenos.
Apesar do entendimento sobre as isoformas do citocromo P-450 envolvidas na
ativação do paracetamol e conseqüente produção do seu metabólito tóxico (NAPQI), a
pesquisa na obtenção de inibidores que possam ser utilizados na prevenção e/ou tratamento
da hepatotoxicidade do acetaminofeno ainda prossegue (WALUBO et al., 2004).
Em trabalho recente mostramos que a resina de Protium heptphyllum, rica em -
e -amirina, exibiu atividade antiinflamatória (OLIVEIRA et al., 2004a). Curiosamente, as
estruturas químicas de - e -amirina semelham-se às estruturas de conhecidos triterpenos
pentacíclicos que exibem atividade antiinflamatória, como ácido ursólico, acido
glicirrético e o ácido oleanólico (BARICEVIC et al., 2001; MURAV'EV et al., 2001;
BANNO et al., 2004).
Estudos têm descritos o efeito hepatoprotetor dos triterpenos pentacíclicos como
os ácidos ursólico e oleanólico na inibição das isoformas CYP2E1, CYP1A e CYP2A do
citocromo P-450 (LIU et al., 1995; KIM et al., 2004), sugerindo que a co-administração de
acetaminofeno com inibidores do citocromo P-450, pode útil na prevenção da
hepatotoxicidade associada com o uso de acetaminofeno.
Visto que a hepatotoxicidade causada pelo acetaminofeno envolve reações
mediadas pelo citocromo P-450, verificamos o efeito da mistura de - e -amirina no teste
de tempo de sono induzido por pentobarbital sódico (PBS). O tempo de sono induzido por
barbiturato (pentobarbital sódico – PBS) é uma medida da indução das enzimas do
citocromo P450 (SOUZA et al., 1998). Sabe-se que o metabolismo e a conjugação do PBS
ocorre principalmente ao nível do citocromo P-450, no fígado, mais especificamente,
CYP2B (NEBERT e GONZALEZ, 1987; KUBOTA et al., 2004).
Na maior dose (100 mg/kg) as amirina potencializaram, de forma significativa, o
tempo de sono induzido por PBS, sugerindo interferência com o sistema enzimático
citocromo P-450, e conseqüentemente formação do metabólito tóxico (NAPQI), via
CYPE1, localizado predominantemente no fígado (LEE et al., 1996). Outros estudos são
necessários para se determinar se a mistura de triterpenos - e -amirina inibe
específicamente alguma isoforma do citocromo P-450.
Os resultados indicam que a mistura - e -amirina possui atividade
hepatoprotetora contra a hepatotoxicidade induzida por acetaminofeno e que esta proteção
parece ser, pelo menos em parte, devido à diminuição do estresse oxidativo e à inibição do
citocromo P-450.
A marcante atividade hepatoprotetora da mistura de triterpenos - e -amirina
observada no modelo de hepatotoxicidade induzida por acetaminofeno (OLIVEIRA et al.,
2005d), levou-nos a investigar os efeitos destes triterpenos em um modelo inflamatório, in
vivo, de hepatite tóxica induzido por D-Galactosamina e Lipopolissacarídeo. Embora a
hepatite represente um grupo heterogêneo de doenças com diferentes etiologias e de
patogênese complexa, o sistema imune exibe papel central em muitos destes processos. O
fígado abriga vários tipos de células imunes, sendo a principal célula de defesa
imunológica as células de Kupffer (macrófagos residentes) as quais, sob estímulo,
produzem grande quantidades de citocinas inflamatórias (SCHUMANN et al., 2000).
A D-Galactosamina (GalN) é metabolizada por enzimas que participam na
metabolização da galactose no fígado. Uma vez que essa metabolização consome o
nucleotídeo uridina, a administração de GalN induz uma rápida depleção destes
nucleotídeos, primariamente no fígado, com diminuição da síntese de RNA. Assim,
injeção de grandes doses deste agente em animais experimentais, induz necrose hepática
com efeitos semelhantes à hepatite viral em humanos (ENDO et al., 1999; ANIYA et al.,
2005).
Lipopolissacarídeo (LPS), um componente da membrana externa de bactérias
gram-negativas, é conhecida por estimular a produção de uma variedade de citocinas pró-
inflamatórias, tais como fator de necrose tumoral alfa (TNF-) e a interleucina 1 (IL-1),
além de mediadores secundários, como leucotrienos e prostaglandinas (Kao et al., 2005).
Estes mediadores induzem síndrome inflamatória aguda, evidenciado pelo choque séptico,
o qual é caracterizado por febre, hipotensão, coagulação intravascular e falência múltiplas
dos órgãos (KAO et al., 2005; WEIGAND et al., 2004).
Dentre as citocinas produzidas pelo estimulo com LPS, TNF é considerada a
responsável pela letalidade no modelo experimental de hepatotoxicidade em combinação
com GalN. TNF- é sintetizado e secretado por macrofágos, incluindo células de Kupffer -
macrófagos residentes no fígado - em resposta a estimulação por LPS. A apoptose dos
hepatócitos, induzida por TNF-, é importante no modelo de hepatotoxicidade induzida
por GalN/LPS (MORIKAWA et al., 2002).
Portanto, o TNF- exerce um papel chave na hepatotoxicidade induzida por
GalN/LPS, a qual é caracterizada por apoptose e lise da célula hepática (VAN DIEN et al.,
2001; MORIKAWA et al., 1998). Neste modelo de hepatotoxicidade, o TNF-, através
dos seus receptores (TNFR1, TNFR2), ativa fatores de transcrição, como NF-B e AP-1,
incluindo várias proteínas como FADD, RIP e TRFA2, modulando a indução de muitos
genes que codificam mediadores apoptóticos e caspases, as quais parecem desempenhar
papel importante na morte celular induzida por GalN/LPS (LIU et al., 2002; LIU, 2005).
Assim, a injeção de baixas doses de GalN sensibiliza os animais experimentais
aos efeitos tóxicos de LPS, induzindo a uma hepatite fulminante com congestão hepática
grave, com participação de um intenso estresse oxidativo, resultando em uma morte rápida
dentro de poucas horas (ANIYA et al., 2005; ENDO et al., 1999). Os resultados
demonstram que a mistura - e -amirina (50 e 100 mg/kg), inibiu moderadamente a
necrose hepática, oferecendo proteção contra a mortalidade no modelo de hepatotoxicidade
induzido por GalN/LPS (800/7x10
-3
mg/kg).
A administração de GalN/LPS induziu intensa necrose hepática verificada com a
mortalidade em todos os animais do grupo controle. Entretanto, nos animais tratados com
as amirina (50 e 100 mg/kg), dexametasona (2 mg/kg) e NAC (750 mg/kg) foi observada
completa proteção contra a morte. Além disso, tanto as amirina, quanto a dexametasona,
impediram o aumento do peso hepático bem como as alterações histopatológicas (necrose,
hemorragia) induzidos por GalN/LPS. Níveis elevados das enzimas séricas são indicativos
da perda da integridade funcional das membranas celulares no fígado (AHMAD et al.,
2002). Avaliando-se as enzimas séricas ALT e AST, consideradas um parâmetro de dano
hepático, a mistura de - e -amirina amirina reduziu significativamente os níveis séricos
de ALT, idem à dexametasona, contudo não houve diferença significativa nos níveis
séricos de AST e da glutationa hepática, quando comparado grupo controle GalN/LPS.
Como dito anteriormente, a falência hepática observada no modelo de
hepatotoxicidade induzido GalN/LPS é dependente da produção de TNF-, o qual
contribui para a apoptose e conseqüentemente para a necrose. Entretanto, a apoptose per si
não é a causa direta da injúria hepática, o que é em grande parte devido a infiltração de
neutrófilos (LIEST et al., 1996).
A literatura mostra que muitos triterpenos pentacíclicos, que possuem estrutura
química semelhantes às - e -amirina, tais como ácido boswellico, ácido oleanólico e
ácido ursólico, exercem sua atividade antiinflamatória e hepatoprotetora por inibir a
expressão de citocinas pró-inflamatórias, tais com TNF-, IL-1, IL-6, IL-8 e IL-12,
através da inibição de fatores de transcrição, como o NF-kappa B (BANSKOTA et al.,
2000; SYROVETS et al., 2005; WU et al., 2004; SHISHODIA et al., 2003).
O fator NF-kappa B representa um importante alvo para novas drogas no
tratamento de muitas doenças inflamatórias, incluindo artrite, asma e doenças autoimunes,
e muita atenção tem sido dada na última década na idenficação de compostos que
interfiram seletivamente na trilha deste fator de transcrição e/ou na modulação das
citocinas pró-inflamatórias (CALIXTO et al, 2003; CALIXTO et al, 2004)
Estudos apontam que os neurônios peptidérgicos aferentes primários sensíveis à
capsaicina desempenham um papel na indução e manutenção de hepatite experimental
(BANG et al., 2003). Estes neurônios aferentes primários têm seus corpos celulares no
gânglio da raiz dorsal, de onde emitem suas fibras C não- mielinizadas as quais exercem
efeitos inflamatórios via liberação de substância P e CGRP a partir das suas terminações
induzindo, desta forma, inflamação neurogênica (HARRISON & GEPPETI, 2001).
Portanto, tendo em vista que a mistura de triterpenos influenciam na função dos nervos
sensoriais aferentes, a hepatoproteção exercida por estas substâncias pode ser devida a um
efeito neuroimunomodulatório.
Em resumo, os dados obtidos no presente trabalho demonstram que a resina e a
mistura de triterpenos - e -amirina possuem baixa toxicidade e atividades
antiinflamatória e gastroprotetora. Os resultados mostram ainda que a mistura de - e -
amirina exibiu atividade antipruriginosa, antinociceptiva e hepatoprotetora, cujos efeitos
envolvem, pelo menos um parte, a participação dos neurônios aferentes sensoriais
primários.
Os achados farmacológicos sobre a resina e a mistura de triterpenos - e -
amirina são promissores. Contudo, maiores esclarecimentos se fazem necessários sobre os
mecanismos moleculares que envolvem os efeitos farmacológicos destes agentes,
sobretudo no tocante ao funcionamento dos neurônios sensoriais aferentes, os quais são
implicados em muitas condições inflamatórias. E, a partir destes dados, propor a utilização
de espécies ricas nestes triterpenos como uma alternativa terapêutica, oferecendo a
perspectiva de um adjuvante (Fitoterápico) com propriedades antiinflamatórias,
contribuindo, desta forma, para o desenvolvimento regional, propriedade intelectual local e
para a conservação da biodiversidade brasileira (patrimônio genético).
CONCLUSÕES
7. CONCLUSÕES
A investigação realizada com a resina e a mistura de triterpenos - e -amirina,
isolada de Protium heptaphyllum nos permite concluir que:
A resina e a mistura de triterpenos - e -amirina não exibem potencial
tóxico, tendo em vista que não foi possível estabelecer suas respectivas DL
50
(i.p. ou oral)
em camundongos. A mistura de triterpenos - e -amirina, mas não a resina, apresenta
toxicidade para o Artemia sp.
A resina mostrou atividade antiinflamatória, reduzindo significativamente o
granuloma induzido por “pellets” de algodão e o aumento da permeabilidade vascular
induzida por ácido acético na cavidade peritoneal.
A resina demonstrou atividade gastroprotetora em modelos de lesões gástricas
(etanol e etanol acidificado). A mistura das amirina também inibiu significativamente as
lesões gástricas induzidas por etanol absoluto envolvendo neurônios primários sensíveis à
capsaicina.
O efeito antipruriginoso da mistura de triterpenos - e -amirina foi
evidenciado através da inibição significativa do prurido induzido pelo Composto 48/80 e
dextrana T40 e por intermédio da estabilização das membranas dos mastócitos.
A administração da mistura de - e -amirina mostrou atividade
antiedematogênica ao inibir, de forma significativa, o edema de pata induzido por
histamina, Composto 48/80 e dextrana T40 em modelos experimentais. Porém não foi
efetiva em inibir o edema por serotonina.
A mistura de - e -amirina foi efetiva em inibir a dor somática e/ou visceral
nos modelos de nocicepção em animais induzida pela aplicação subplantar ou
intracolônica de capsaicina.
Os triterpenos - e -amirina impediram, de forma significativa, a
hipertermia induzida pela capsaicina, mas não bloquearam a resposta hipotérmica inicial
destes agentes, sugerindo que as - e -amirina exercem seu efeito antinociceptivo
possivelmente através do receptor vanilóide (TRPV1) com participação opióide neste
mecanismo.
Contudo, o mecanismo de ação antinociceptiva das - e -amirina
provavelmente não envolve a participação dos receptores
2
-adrenérgicos, tendo em vista
que a ioimbina não reverteu o efeito antinociceptivo das amirina no modelo de nocicepção
visceral induzida pela capsaicina. A mistura de triterpenos - e -amirina (3 a 30 mg/kg)
não manifestou efeitos sedativos ou incoordenação motora, indicando que estes efeitos não
contribuíram para sua atividade antinociceptiva.
A mistura de triterpenos - e -amirina ofereceu proteção contra a
hepatotoxicidade induzida pelo acetaminofeno, possivelmente pela inibição enzimática do
citocromo P-450 hepático.
As - e -amirina protegeram contra a hepatite tóxica induzida pela
administração de D-Galactosamina/Lipopolissacarídeo em camundongos. Neste modelo,
as amirina reduziram a mortalidade e preveniram moderadamente as alterações
histopatológicas. É possível que este efeito hepatoprotetor deva-se à sua atividade
antiinflamatória e/ou a neuroimunomodulação, involvendo as fibras aferentes sensíveis à
capsaicina.
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8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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3
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9. ANEXO
RELAÇÃO DOS ARTIGOS PUBLICADOS A PARTIR DOS ESTUDOS REALIZADOS
COM A RESINA E A MISTURA DE TRITERPENOS α- E β-AMIRINA ISOLADA DE
Protium heptaphyllum (Aubl.) March. (Bursearaceae).
1. OLIVEIRA, F. A.; VIEIRA-JUNIOR, G. M.; CHAVES, M. H.; ALMEIDA, F. R.;
FLORENCIO, M. G.; LIMA JR, R. C.; SILVA, R. M.; SANTOS, F. A.; RAO, V. S.
Gastroprotective and anti-inflammatory effects of resin from Protium heptaphyllum in mice
and rats. Pharmacological Research, v. 49, n. 2, p. 105-11, 2004.
2. OLIVEIRA, FA; VIEIRA-JUNIOR, GM; CHAVES, MH; ALMEIDA, FR; SANTOS, KA;
MARTINS, FS; SILVA, RM; SANTOS, FA; RAO, VS. Gastroprotective effect of the mixture
of alpha- and beta-amyrin from Protium heptaphyllum: role of capsaicin-sensitive primary
afferent neurons. Planta Medica, v. 70, n. 8, p. 780-2, 2004.
3. OLIVEIRA, FA; LIMA-JUNIOR, RC; CORDEIRO, WM; VIEIRA-JUNIOR, GM; CHAVES,
MH; ALMEIDA, FR; SILVA, RM; SANTOS, FA; RAO, VS. Pentacyclic triterpenoids,
alpha,beta-amyrins, suppress the scratching behavior in a mouse model of pruritus.
Pharmacology, Biochemistry, and Behavior
, v. 78, n. 4, p. 719-25, 2004c.
4. OLIVEIRA, FA; CHAVES, MH; ALMEIDA, FR; LIMA-JUNIOR, RCP; SILVA, RM;
MAIA, JL; BRITO, GAAC; SANTOS, FA; RAO, VS. Protective effect of - and -amyrin, a
triterpene mixture from Protium heptaphyllum (Aubl.) March. trunk wood resin, against
acetaminophen-induced liver injury in mice. Journal of Ethnopharmacology, v. 98, p. 103-8,
2005.
5. OLIVEIRA, FA; COSTA, CLS; CHAVES, MH; ALMEIDA, FRC; CAVALCANTE, IJM;
LIMA, AF; LIMA JUNIOR, RCP; SILVA, RM; CAMPOS, AR; SANTOS, FA; RAO, VSN.
Attenuation of capsaicin-induced acute and visceral nociceptive pain by α-and ß-amyrin, a
triterpene mixture isolated from Protium heptaphyllum resin in mice. Life Science, 2005. (In
Press)
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