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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

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THE UNIVERSITY OF CHICAGO

DEPARTMENT OF MEDICINE

HEMATO-ONCOLOGY SECTION

ESTUDO DE POLIMORFISMOS (GERMLINE) NO GENE EGFR (RECEPTOR

DO FATOR DE CRESCIMENTO EPIDERMAL) E POSSÍVEIS ASSOCIAÇÕES

COM A RESPOSTA CITOTÓXICA EM FIBROBLASTOS TRATADOS COM

INIBIDORES DE TIROSINA QUINASE

RAQUEL CARVALHO MONTENEGRO

Fortaleza – Ceará

2006

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RAQUEL CARVALHO MONTENEGRO

ESTUDO DE POLIMORFISMOS (GERMLINE) NO GENE EGFR (RECEPTOR

DO FATOR DE CRESCIMENTO EPIDERMAL) E POSSÍVEIS ASSOCIAÇÕES

COM A RESPOSTA CITOTÓXICA EM FIBROBLASTOS TRATADOS COM

INIBIDORES DE TIROSINA QUINASE

Tese submetida à Coordenação do Programa de Pós Graduação em

Farmacologia do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade

Federal do Ceará, como requesito para obtenção do titulo de Doutor em

Farmacologia.

Data da aprovação: 11/05/2006

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes (Orientador)

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

Prof

. Dra. Emygdia Rosa do Rêgo Barros Pires Leal- Mesquita

UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHÃO

Prof

. Dra. Letícia Veras Costa Lotufo

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

Prof. Dr. Demetrius Antônio Machado de Araújo

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

Prof. Dr. Ronaldo Albuquerque Ribeiro

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

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M784e Montenegro, Raquel Carvalho

Estudo de polimorfismos (Germline) no gene EGFR

(Receptor do Fator de Crescimento Epidermal) e possíveis

associações com a resposta citotóxica em fibroblastos tratados

com inibidores de tirosina quinase/ Raquel Carvalho Montenegro.

2006.

105 f. : il.

Orientador: Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho

Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Ceará. Faculdade

de Medicina, Fortaleza, 2006.

1. Farmacogenética . 2. Inibidores de Proteínas Quinases . 3. Genes erbB-1

4. Polimorfismo Genético. I. Moraes Filho, Manoel Odorico (orient.). II. Título.

CDD 615.58

RAQUEL CARVALHO MONTENEGRO

ESTUDO DE POLIMORFISMOS (GERMLINE) NO GENE EGFR (RECEPTOR

DO FATOR DE CRESCIMENTO EPIDERMAL) E POSSÍVEIS ASSOCIAÇÕES

COM A RESPOSTA CITOTÓXICA EM FIBROBLASTOS TRATADOS COM

INIBIDORES DE TIROSINA QUINASE

Tese submetida à Coordenação do

Programa de Pós Graduação em

Farmacologia do Departamento de Fisiologia

e Farmacologia da Universidade Federal do

Ceará, como requesito para obtenção do

titulo de Doutor em Farmacologia

Orientador: Manoel Odorico de Moraes Filho

Fortaleza-CE

2006

Dedico esta Tese a Deus por me ajudar

a enfrentar e a superar todos os

obstáculos para realização deste

trabalho.

“Mesmo nas noites totalmente sem

estrelas podem anunciar a aurora de

uma grande realização.”

Martin Luther King

AGRADECIMENTOS

Minha Família, pelo apoio na minha ída para Chicago e por toda a

compreensão e carinho em todos os momentos da minha vida.

À CAPES, por ter financiado a minha bolsa de doutorado em Chicago.

Ao Dr. Manoel Odorico de Moraes, por me aceitar durante todos esse

anos no seu laboratório e por incentivar a busca por novos caminhos na

atividade científica.

Ao Dr. Mark Ratain, pela oportumidade de estar em seu grupo na

Universidade de Chicago por 1 ano e por todo o apoio científico e introdutório no

campo da farmacogenética.

À Dra. Maria Elisabete Amaral de Moraes, coordenadora do Programa

de Pós-Graduação em Farmacologia, pelo apoio e incentivo na minha ida para

Chicago na busca de um novo ramo da Farmacologia.

Ao Dr. Wanqing Liu, meu supervisor no laboratório em Chicago, por me

sempre me ajudar, incentivar e ensinar todo o conteúdo necessário para o

desenvolvimento desta Tese. Alem da sua fiel amizade e companheirismo nas

horas mais difíceis.

À Jackeline Ramirez, Jackie, por ter me recebido muito bem no

laboratório em Chicago, sempre fornecer os materiai necessários para o

desenvolvimento desta tese e por sua amizade nas horas difíceis.

Ao Dr. Federico Innocenti, pelo carinho, apoio, incentivo e opiniões no

trabalho desenvolvido.

À Dra. Letícia Veras Costa Lotufo, pela amizade, pelos conselhos

sábios e por sempre me incentivar na busca de novos conhecimentos.

À Dra. Cláudia Pessoa, pela amizade e por acreditar sempre no meu

potencial.

Aos Professores do Programa de Pós-Graduação, por terem

colaborado com a minha formação.

Aos amigos do Laboratório de Farmacologia Clínica da Universidade de

Chicago pelo apoio no laboratório, pela amizade e simpatia que tornaram mais

fáceis os dias de trabalho em Chicago.

Aos amigos do Laboratório da Dra. Eileen Dolan pelo apoio, amizade e

solidariedade nos infindáveis dias na sala de cultura (“The Cave”).

Aos meus amigos da International House em Chicago pela oportunidade

de conhecer diferentes culturas e de participar de diferentes eventos.

Aos meus colegas do Laboratório de Oncologia Experimental por

acreditar em mim e sempre ajudar e apóiar nas etapas difíceis que devem ser

cumpridas por nós estudantes de pós-graduação.

Agradeço as minhas amigas que tiveram paciência comigo e que nunca

deixaram de estar presentes na minha vida, nem mesmo afastada por 1 ano.

Por fim, agradeço a Deus por tudo que Ele me proporcionou até agora e

que sem a Sua presença nada disso teria sido possível.

SUMÁRIO

Lista de Gráficos ix

Lista de Tabelas X

Lista de Figuras xi

Lista de Abreviaturas xii

Resumo xv

Abstract xvii

1. INTRODUÇÃO 1

1.1 FARMACOGENÉTICA 2

1.2 FARMACOGENÉTICA DE DROGAS ANTICÂNCER 6

1.3 RECEPTORES TIROSINA QUINASE 10

1.4 FAMíLIA DO RECEPTOR DO FATOR DE

CRESCIMENTO EPIDERMAL 11

1.5 INIBIDORES DE TIROSINA QUINASE 18

1.5.1 AG1478 19

1.5.2 Gefitinib (Iressa

) e Erlotinib (Tarceva

)

1.6 MUTAÇÃO E POLIMORFISMOS FUNCIONAIS DO EGFR1 21

2. OBJETIVOS 28

3. MATERIAIS E MÉTODOS 30

3.1 Materiais 31

3.2 Métodos 32

3.2.1 CULTURA DE CÉLULAS 32

3.2.2 EXPANSÃO DAS CÉLULAS 32

3.3.3 CONTAGEM E PLAQUEMENTO DAS CÉLULAS 32

3.4.4 INIBIDORES DE TIROSINA QUINASE 33

3.5.5 ATIVIDADE CITOTÓXICA PELO MÉTODO DO ALAMAR BLUE

3.6.6 EXTRAÇÃO DE DNA 33

3.7.7 EXTRAÇÃO DE RNA 34

3.8.8 RFLP – Restriction Fragment Lenth Polymorphism 34

3.9.9 ELETROFORESE CAPILAR 35

3.9.9.1 DETECÇÃO DE MICROSSATÉLITES 35

3.9.9.2 SNaPshot 36

3.9.9.3 Long Range PCR 37

3.10 PCR EM TEMPO REAL 37

3.11 ANÁLISE ESTATÍSTICA 38

4. RESULTADOS 39

4.1 CARACTERIZAÇÃO DA POPULAÇÃO ESTUDADA 40

4.2 AVALIAÇÃO FENOTÍPICA DOS FIBROBLASTOS 41

4.2.1 ATIVIDADE CITOTÓXICA DA DROGA AG1478 41

4.2.2 ATIVIDADE CITOTÓXICA DO GEFITINIB

4.2.3 ATIVIDADE CITOTÓXICA DO ERLOTINIB 56

4.3 AVALIAÇÃO DO GENÓTIPO DOS FIBROBLASTOS

PARA O GENE DO EGFR 56

4.3.1 POLIMORFISMO R497K 57

4.3.2 POLIMORFISMO -216 G/T 58

4.3.4 POLIMORFISMO 787 C/T 59

4.3.5 ANÁLISE DE MICROSSATÉLITE NO INTRON 1 60

4.4 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA 61

4.5 IDENTIFICAÇÃO DOS HAPLÓTIPOS 61

4.6 ESTUDO FUNCIONAL: ASSOCIAÇÕES ENTRE

FENÓTIPO E GENÓTIPO 64

5. DISCUSSÃO 65

6. CONCLUSÃO 73

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 75

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1

Distribuição da raça dos voluntários doadores das amostras de

fibroblastos utilizados para a avaliação dos polimorfismos no

gene do EGFR.

Gráfico 2

Distribuição da raça dos voluntários doadores das amostras de

fibroblastos utilizados para a avaliação dos polimorfismos no

gene do EGFR

Gráfico 3

Curva Dose-Resposta de fibroblastos tratados por 72 horas

com inibidor de tirosina quinase do EGFR AG1478 nas

concentrações de 5, 10, 15 e 20µM.

Gráfico 4

Curva Dose-Resposta de fibroblastos com CI50 maior que

20µM tratados com inibidor de tirosina quinase do EGFR

AG1478 nas doses de 20, 40, 60 e 80µM por 72 horas.

Gráfico 5

Comparação das curvas dose-resposta dos grupos resistente

(CI50 > 80µM) e sensível (CI50 < 20µM) ao AG1478.

Gráfico 6

Curva Dose-Resposta de fibroblastos tratados por 72 horas

com inibidor de tirosina quinase do EGFR gefitinib

nas

concentrações de 10, 20, 40 e 60µM.

Gráfico 7

Curva Dose-Resposta de fibroblastos sensíveis ao tratamento

com gefitinib por 72 horas.

Gráfico 8

Comparação das curvas dose-resposta dos grupos resistente

(CI50 > 30µM) e sensível (CI50 < 20µM) ao gefitinib.

Gráfico 9

Determinação do numero de repetições CA no intron 1 em

cada alelo (G e T) da região promotora do gene do EGFR.

LISTA DE TABELAS

Tabela 1

Porcentagem de efeito inibitório do AG1478 nas doses de

5µM e 20µM no grupo de fibroblasto sensíveis (CI50 <

10µM).

Tabela 2

Porcentagem de efeito inibitório do AG1478 nas doses de

5µM e 20µM no grupo de fibroblastos com CI50 entre

10µM e 70µM.

Tabela 2

(continuação)

Porcentagem de efeito inibitório do AG1478 nas doses de

5µM e 20µM no grupo de fibroblastos com CI50 entre

10µM e 70µM.

Tabela 3

Porcentagem de efeito inibitório do AG1478 nas doses de

5µM e 20µM no grupo de fibroblastos resistentes (CI50 >

80µ )

Tabela 4

Porcentagem de efeito inibitório do gefitinib nas doses de

20µM e 40µM no grupo de fibroblastos sensíveis (CI50 <

20µM).

Tabela 5

Porcentagem de efeito inibitório do gefitinib nas doses de

10µM e 40µM no grupo de fibroblastos sensíveis com

CI50 maior que 20µM e menor que 30µM.

Tabela 5

(continuação)

Porcentagem de efeito inibitório do gefitinib nas doses de

10µM e 40µM no grupo de fibroblastos sensíveis com

CI50 maior que 20µM e menor que 30µM.

Tabela 6

Porcentagem de efeito inibitório do gefitinib nas doses de

10µM e 40µM no grupo de fibroblastos (CI50 > 30µM).

LISTA DE FIGURAS

Figura 1

Inter-relação entre os genes e como estes podem afetar

a resposta aos fármacos

Figura 2 Mecanismo de ativação do receptor EGFR. 12

Figura 3

Localização cromossômica do gene do EGFR, seus

éxons e respectivos domínios.

Figura 4 Transdução do sinal via EGFR. 17

Figura 5 Estrutura química do inibidor de tirosina quinase AG1478. 19

Figura 6

Estrutura química dos inibidores de tirosina quinase

gefitinib (a) e erlotinib (b).

Figura 7

Localização dos polimorfismos na região promotora,

intron 1 e éxon 13 no gene EGFR.

Figura 8

Genotipagem do SNP R497K no éxon 13 do gene EGFR

Figura 9

Genotipagem do SNP -216G/T na região promotora do

gene EGFR1.

Figura 10 Genotipagem do SNP 787C/T no gene do EGFR. 59

Figura 11 Análise de Microssatélites CA no Intron 1 do gene EGFR. 60

Figura 12

Análise do número de repetições CA no Intron 1 e os

alelos G e T na região promotora do gene EGFR.

LISTA DE ABREVIATURAS

A Adenina

ATP Adenosina Trifosfato

AUC Área Sobre a Curva

C Citosina

CYP Citocromo P450

°C Graus Celcius

ddNTP Dideoxi-ribonucleotídeo

dNTPs Desoxi-ribonucleotídeo

DPD Dihidropirimidina Dehidrogenase

EGFR Receptor do Fator de Crescimento Epidermal

FDA Food and Drug Administration

G6PD Glicose-6-fosfato-dehidrogenase

GSTM Glutationa S-transferase

Guanina

INCA Instituto do Câncer do Ceará

K Lisina

mL Mililitros

MMP Metaloproteinases

NAT N-acetiltransferase

ng Nanogramas

nm Nanômetro

NSCLC Câncer de pulmão de células não-pequenas

pb Pares de base

PCR Polimerase Chain Reaction

PharmGkB The Pharmacogenetic and Pharmacogenomic

Knowledge Base

PI3K Quinase fosfatidilinositol-3

R Arginina

RFLP Restriction Fragment Lenth Polymorphism

SNP Single Nucleotide Polymorphism

T Timina

TPMT Tiopurina S-metiltransferase

UGT UDP-glucoronosil transferase

VEGF Fator de Crescimento do Endotélio Vascular

5-FU 5-Fluoracil

µM Micromolar

µL Microlitro

% Porcentagem

‘ Minutos

‘’ Segundos

RESUMO

Estudo de polimorfismos (germline) no gene EGFR e possíveis

associações com a resposta citotóxica em fibroblastos tratados com

inibidores de tirosina quinase. Raquel Carvalho Montenegro. Orientador:

Manoel Odorico de Morais Filho. Co-Orientador: Mark J Ratain. Tese de

Doutorado Sanduíche em Chicago. Programa de Pós-Graduação em

Farmacologia. Departamento de Fisiologia e Farmacologia, UFC; e

Departamento de Medicina, UC. 2006.

Apenas um pequeno número de pacientes beneficiam-se da terapia com

inibidores de EGFR. Em razão disso, torna-se importante o entendimento dos

mecanismos envolvidos na resposta a estas drogas a fim de encontrar

marcadores preditores de eficácia terapêutica, auxiliando, então, na seleção de

pacientes que podem se beneficiar com essas drogas. Apesar de mutações

somáticas e amplificações gênicas terem sido correlacionadas à eficácia

terapêutica dos inibidores de EGFR, foi demonstrado que células neoplásicas

e/ou pacientes que possuem expressão de EGFR normal também são sensíveis

à estas drogas. Assim, o objetivo deste trabalho foi entender os mecanismos

envolvidos na predisposição à sensibilidade aos inibidores de tirosina quinases

em células normais por meio de análise de polimorfismos (germline) no gene

EGFR. Para isso, foi escolhido um modelo in vitro, utilizando-se 70 amostras de

fibroblastos normais. Os estudos citotóxicos foram realizados com dois

inibidores de EGFR Gefitinib (Ge) e AG1478 (AG). As células foram incubadas

por 72 horas com diferentes concentrações (10, 20, 40 e 60 µM para Ge e 5, 10,

15 e 20 µM para AG) sendo dissolvidas em DMSO. Para a análise genotípica,

foram avaliados quatro polimorfismos: -216G/T, R497K, 787C/T e intron 1 (CA)

A expressão de EGFR foi analisada por PCR em tempo real. Já para as outras

duas drogas, observou-se que estas se comportaram de forma diferente. Os

fibroblastos tiveram uma maior variabilidade na resposta para Ge (coeficiente de

variabilidade entre as quatro doses de 61%) quando comparado a resposta para

AG (26%). A inibição do crescimento não foi correlacionada com o nível de

expressão de EGFR. Observou-se, ainda, correlação significante entre o

polimorfismo R497K e a sobrevida das células tratadas com AG na dose de 5µM

(p<0.01) e 10µM (p<0.05) com uma maior inibição do crescimento celular nos

alelos K. Nenhuma correlação foi observada entre os polimorfismos e a

citotoxicidade de Ge. Essas observações sugerem que os efeitos citotóxicos de

G e AG possuem mecanismos diferentes, e que outros genes tais como

trasportadores podem contribuir para a resposta a essas drogas. O polimorfismo

R497K pode ser útil como marcador de predição de resposta a AG e/ou agentes

semelhantes. Mais estudos envolvendo vias de sinalização devem ser realizados

para esclarecer a relação entre resposta e rash cutâneo em pacientes tratados

com inibidores de tirosina quinase.

Palavras-Chave: 1. Farmacogenética. 2. Inibidores de Proteínas Quinases. 3.

Genes erbB-1. 4. Polimorfismo Genético

ABSTRACT

Response to EGFR inhibitors in fibroblast cell lines and its association with

germline polymorphisms. Raquel Carvalho Montenegro. Orientador:

Manoel Odorico de Morais Filho. Co-Orientador: Mark J Ratain. Tese de

Doutorado Sandwich. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia.

Departamento de Fisiologia e Farmacologia, UFC; e Departamento de

Medicina, UC. 2006

Only a small number of cancer patients benefit from therapy with EGFR

inhibitors. It is therefore important to understand the mechanism of action of

these drugs and to find predictive markers for drug response to guide the

selection of patients who can benefits from these drugs. Although somatic

mutations and gene amplification have been correlated with the efficacy of

EGFR-targeting therapy, cancer cells and/or patients with normal EGFR

expression are also sensitive to these drugs. We then aim to further understand

the mechanism underlying the predisposition to sensitivity to EGFR inhibitors in

germline cells. We chose 70 human normal fibroblasts cell lines as an in vitro

model. Cytotoxicity studies were performed on these cells using two EGFR

inhibitors, tarceva (T), gefitinib (G) and AG1478 (AG). Cells were incubated with

serial concentrations of the drugs (10, 20, 40 and 60 µM for T and G and 5, 10,

15 and 20 µM for AG) dissolved in DMSO. Growth inhibition was measured by

Alamar Blue. Four polymorphisms, -216G/T, R497K, 787C/T and intron 1 (CA)

were genotyped in these cells. EGFR expression was measured with real-time

PCR. There was considerable variability in drug response in a dose-dependent

manner among these cells. No working concentration were found to be toxic for

T. The other two drugs behaved quite differently. The fibroblasts had a much

more variable response to G (mean of coefficient of variance of survival rates

under all 4 concentrations, 61%) when compared to the response to AG (26%).

Drug response was not correlated with EGFR expression. A significant

correlation was observed between the R497K polymorphism and the survival rate

of cells treated with AG at 5 µM (p<0.01) and 10 µM (p<0.05) with higher growth

inhibition in K allele-carriers. No correlation was observed between any of the

four EGFR polymorphisms and G cytotoxicity. These observations suggest that

the cytotoxic effects of G and AG are due to different mechanisms, and that other

genes such as transporters may also contribute to drug response. The R497K

polymorphism may be useful as a predictive marker for response to AG and/or

similar agents. Also, pathway studies should be done to clarifyed the relationship

between response and cutaneous rash in patients treated with tirosine kinase

inhibitors.

Keywords: 1. Pharmacogenetics. 2. Tirosine kinase inhibitors. 3. erbB-1 gene. 4.

Genetic polymorphism

INTRODUÇÃO

1. INTRODUÇÃO

1.1 FARMACOGENÉTICA

O estudo das bases genéticas envolvidas na variabilidade individual

encontrada nas respostas terapêuticas a fármacos é conhecido como

farmacogenética (Shi et al., 2001). No nosso organismo os genes e mais

recentemente RNAi (RNA de interferência) determinam as proteínas, pequenas

modificações nestes genes podem alterar a função destas proteínas. Ao entrar

no organismo, os fármacos distribui-se por todo o corpo interagindo com estas

proteínas. Com isso, pequenas modificações podem afetar ou até mesmo abolir

a resposta do indivíduo às drogas (Figura 1).

Figura 1: Inter-relação entre os genes e como estes podem afetar a resposta

aos fármacos. Diferentes variações em genes envolvidos nos processos

FÁRMACO

Absorção

Distribuição

Metabolismo

Excreção

GENE (S)

Concentração

FÁRMACO

Alvos

Moleculares

GENE (S)

REAÇÕES

ADVERSAS

EFEITOS

BENÉFICOS

farmacocinéticos podem alterar a concentração do fármaco no organismo, que

ao interagir com alvos moleculares tais como receptores, transportadores, entre

outros, podem levar a um efeito tóxico (reação adversa) ou a um efeito benéfico.

Estes dois caminhos podem ser determinados por variações nos genes

responsáveis por estes alvos moleculares.

As primeiras observações da variação individual em respostas às drogas

foram relatadas por Pitágoras (510 a.C.), onde a ingestão de favas provocava

intoxicação em alguns indivíduos e em outros, não. Passaram-se séculos para

que houvesse novas observações que levassem ao que hoje chamamos de

farmacogenética.

Entre 1902 e 1909, Archibald Garrod ressaltou a concepção de

individualidade química no homem (Garrod, 1902). Em um trecho publicado no

livro “Inborn errors of metabolism” (1908), Garrod sumariza a sua visão da

farmacogenética: “... even against chemical poisons taken by mouth, or by other

channels, there are some means of defence. Every active drug is a poison, when

taken in large enough doses; and in some subjects a dose which is innocuous to

the majority of people has toxic effects, whereas others show exceptional

tolerance of the same drug...” (... até mesmo um veneno tomado pela boca ou

por qualquer outra via leva o organismo a desenvolver algum tipo de defesa.

Toda droga ativa é um veneno quando tomada em altas doses; e em alguns

indivíduos a dose que é inócua para a maioria das pessoas pode apresentar

efeitos tóxicos, enquanto que em outros indivíduos a mesma droga e dose pode

ser tolerada...) (Meyer, 2004).

Apesar das observações de Garrod, o primeiro estudo de relevância na

farmacogenética não foi relativo à variabilidade individual em resposta a drogas

e sim a habilidade de distinguir o sabor, no caso, inabilidade de sentir o gosto da

feniltiocarbamida. Até os dias atuais, não se sabe a causa desta variabilidade,

mas este estudo serviu de protótipo para inúmeros ensaios no campo da

farmacogenética (Meyer, 2004).

Em meados de 1950, o desenvolvimento de novas técnicas permitiu uma

maior segurança na mensuração da atividade de enzimas metabólicas,

metabólitos intermediários e resposta a drogas. Estudos com a isoniazida

demonstraram que havia diferença interindividual na excreção desta droga e que

esta diferença estava relacionada a habilidade de cada indivíduo converter

isoniazida a acetilisoniazida (Meyer, 2004). Foi apenas em 1960 que Evans

identificou dois grupos denominando-os de acetiladores rápidos e acetiladores

lentos (Evans, 1960). As bases genéticas deste polimorfismo só foram

elucidadas 40 anos depois que Blum, Grant e Meyer (1991) purificaram a

enzima N-acetiltransferase 1/2 (NAT1/2) e clonaram seus respectivos genes

levando a descoberta de duas variáveis mutantes, hoje conhecida como NAT2*5

e NAT2*6 associados a alelos acetiladores lentos (Blum et al., 1991). Estudos

com gêmeos demonstraram ser uma herança autossômico-recessiva e que

indivíduos com fenótipo de acetiladores lentos eram mais suceptíveis a efeitos

tóxicos tais como neuropatia periférica (Meyer, 2004).

Foi na segunda Guerra mundial que Alf Alving e seus colaboradores

observaram que aproximadamente 10% dos soldados negros apresentavam

crises hemolíticas agudas com a administração de primaquina ou qualquer outra

droga anti-malárica quando comparado ao pequeno número de casos

observados em soldados caucasianos (Clayman et al., 1952). Depois foi

observado que a causa destas crises estava relacionada com a deficiência da

enzima glicose-6-fosfato-dehidrogenase (G6PD) alterando o metabolismo dos

eritrócitos (Alving et al., 1956). Atualmente, sabe-se que o locus desta enzima

G6PD no cromossomo X é um dos mais polimórficos na espécie humana e que

os alelos responsáveis pela atividade reduzida desta enzima estão altamente

correlacionados com a prevalência de malaria (Meyer, 2004).

Em 1957, Kalow & Staron caracterizaram a deficiência sérica da enzima

colinesterase em indivíduos com apnéia relacionada a administração da

succinilcolina. Estes autores, estudando grupos familiares, demonstraram que o

efeito prolongado da paralisia muscular devido a succinilcolina estava associado

a alteração cinética de uma pseudocolinesterase, a butirilcolinesterase e que

esta deficiência era autossômica-recessiva.

A propagação dos estudos relacionando variabilidade interindividual em

relação às drogas levou Vogel em 1959 a sugerir o nome Farmacogenética

(Meyer, 2004). Em 1962, Kalow publicou a primeira monografia chamada:

“Pharmacogenetics - Heredity and the response to drugs” (Farmacogenética –

Hereditariedade e resposta às drogas) com exemplos de fatores genéticos que

influenciavam a resposta a drogas. Nos anos subseqüentes houve uma

explosão de pesquisas e encontros para se discutir os estudos em

farmacogenética em diferentes áreas.

Os estudos com gêmeos (Alexanderson et al., 1969) foram importantes

para comprovar as evidências de que, os fatores genéticos são responsáveis por

essa variação interindividual no metabolismo da maioria das drogas. Foi com

estes estudos que se estabeleceu que o mecanismo dos antidepressivos

tricíclicos estivesse sob controle gênico.

Nos anos 70, dois grupos marcaram os estudos na farmacogenética.

Robert L Smith, em Londres, realizou um experimento com seus colegas onde

todos tomaram 32mg de debrisoquina (antihipertensivo). Após algumas horas,

Smith apresentou hipotensão ortostática severa enquanto que seus colegas não

apresentaram sintomas (Meyer, 2004). A análise da urina dos voluntários

revelou que a alta sensibilidade a este medicamento era devida a inabilidade de

formar o metabólito 4-hidroxidebrisoquina. Um estudo com 94 voluntários e 3

famílias levou a descrição do polimorfismo na enzima responsável pela oxidação

da droga, sendo descrito dois fenótipos: metabolizadores rápidos e

metabolizadores lentos, sendo então caracterizada como uma herança

autossômica-recessiva (Mahgoub et al., 1977).

No mesmo período, na Alemanha, Michel Eichelbaum e Hans Dengler

observaram que em seus estudos de farmacocinética da espartaína

(antiarrítmico) dois voluntários apresentaram efeitos indesejáveis, como

náuseas, visão turva entre outros. Estes efeitos foram correlacionados a altos

níveis de espartaína no plasma dos voluntários. Mais uma vez, estudos de

população e com famílias demonstraram que o metabolismo desta droga gerava

diferentes fenótipos, sendo, portanto um polimorfismo genético (Meyer, 2004).

O mecanismo molecular foi descoberto alguns anos depois, sendo

inicialmente identificado que a enzima responsável pelos diferentes fenótipos era

da família do citocromo P450 (Meier et al., 1983). Subseqüentemente, esta

enzima, atualmente conhecida como CYP2D6, foi purificada (Gut et al., 1984) e

clonada (Gonzalez et al., 1988). Com esta descoberta e com o surgimento da

técnica de reação em cadeia da polimerase - PCR (Polimerase Chain Reaction)

em 1985, foi possível desenvolver o primeiro teste de PCR alelo específico para

identificar os genótipos mais comuns associados aos metabolizadores lentos

(Heim & Meyer, 1990). Johansson e colaboradores, em 1993, demonstraram

que os indivíduos com fenótipo associado a metabolizadores ultra-rápidos

apresentaram amplificação do gene correspondente a enzima CYP2D6. Esta foi

a primeira observação de amplificação gênica com ganho de função em

indivíduos sadios.

Nas décadas seguintes à descoberta da CYP2D6, vários estudos foram

realizados a fim de encontrar polimorfismos em outros membros da família do

citocromo P450. Um deles foi o polimorfismo da mefenitoína (anticonvulsivante)

associada a uma deficiência da enzima CYP2C19 levando a um aumento no

efeito do omeprazol (anti-ulcerativos) (Morais et al., 1994), ou ainda, o

polimorfismo associado a fenitoína/warfarina, tobultamida, entre outras drogas,

causado por uma mutação na enzima CYP2C9 (Scordo et al., 2000).

Atualmente, o estudo da farmacogenética pode ser observado em todas

as áreas da medicina; drogas antiinflamatórias não-esteroidais, anti-retrovirais,

anti-hipertensivas, anti-neoplásicas, entre outras.

1.2 FARMACOGENÉTICA DE DROGAS ANTICÂNCER

O câncer é a segunda causa de morte por doença no Brasil e no mundo.

Um dos tratamentos utilizados no combate ao câncer é a quimioterapia que

pode ser feita com a aplicação de um ou mais quimioterápicos. A toxicidade é

variável para os diversos tecidos e depende da droga utilizada. Os efeitos

terapêuticos e tóxicos dos quimioterápicos dependem do tempo de exposição e

da concentração plasmática da droga. Com o surgimento da farmacogenética,

observamos que essa concentracão plasmática pode mudar de acordo com a

variabilidade genética de cada indivíduo levando à efeitos mais severos ou até

mesmo ausência de efeito terapêutico.

Uma das primeiras observações de um polimorfismo associado a drogas

anticâncer foi em 1995 onde Krynetzki e colaboradores identificaram uma

mutação pontual (G

238

> C) no gene da enzima tiopurina S-metiltransferase

(TPMT), gene com herança autossômico-recessiva, responsável pelo

metabolismo das drogas 6-mercaptopurina e azatioprina. Essa mutação leva a

um decréscimo na atividade catalítica da enzima resultando em severos efeitos

colaterais em pacientes portadores desta alteração. Para caracterizar que esta

mutação estava presente no DNA genômico de pacientes que apresentavam

toxicidade hematopoiética severa e que esta era inerente a pacientes com

deficiência na enzima TPMT, os autores genotiparam o pai, a mãe e o irmão

para essa mutação e constataram que a mãe possuía um alelo mutado e um

normal, o pai, alelos sem a mutação em questão, e a filha com um alelo mutado

e o outro normal para a mutação. Isso leva a conclusão de que existe um outro

fator, provavelmente, ligado ao alelo paterno que colabora para a toxicidade

observada neste pacientes.

A partir destas descobertas, outros trabalhos estão sendo desenvolvidos

na tentativa de se formar um grupo de genes alvos que possam levar a uma

melhora no prognóstico e até mesmo no tratamento de pacientes com Leucemia

Linfoblástica Aguda (LLA). Tais alvos estariam envolvidos com a

farmacodinâmica de drogas antileucêmicas tais como a enzima glutationa S-

transferase (GSTM 1) e a enzima timidilato sintase (Rocha et al., 2005).

A deficiência da enzima Dihidropirimidina Dehidrogenase (DPD) é um

outro alvo do estudo farmacogenético, visto que esta enzima participa da via

metabólica do 5-Fluorouracil (5-FU), quimioterápico bastante utilizado na prática

clínica. Acreditava-se que a toxicidade causada pelo 5-FU estava associada a

uma deficiência na DPD (Diasio et al., 1988). Esta descoberta até então

promissora levou à inúmeros estudos, mas com resultados pouco satisfatórios.

Pó volta de 2000, dois grupos demonstraram que 33% e 66% dos seus

pacientes com efeitos adversos severos após administração de 5-FU não

apresentavam deficiência completa na DPD (Milano et al., 1999; van Kuilenburg

et al., 2000) mostrando um possível envolvimento de outros fatores que

justifiquem a discrepância entre os achados. Estudos com a variante DPD*2A

(mutação G > A em um sítio de splicing), uma das mais freqüentes em pacientes

com toxicidade aguda ao 5-FU, mostraram associação com a toxicidade severa

(van Kuilenburg et al., 2001; Raida et al., 2001). Já outro estudo (Collie-Duguid

et al., 2000) não conseguiu confirmar esta associação.

Atualmente, sabe-se que o gene da DPD apresenta uma série de

mutações funcionais o que dificulta o seu uso em testes de screening de

pacientes com toxicidade ao 5-FU, pois a análise de apenas uma mutação neste

gene não seria conclusiva para pacientes com alto risco de toxicidade

(Nagasubramanian et al., 2004).

Um outro exemplo no estudo da farmacogenética de drogas anti-

neoplásicas é o polimorfismo da enzima UDP-glucoronosil transferase (UGT),

envolvida na excreção do irinotecan (Camptosar

). Derivado da campotencina, o

irinotecan é uma pró-droga que no fígado é metabolizada por carboxilases em

SN-38, seu metabólito ativo. O SN-38 é glucoronizado pela enzima UGT (SN-

38G), principalmente UGT1A1(Iyer et al., 1998), sendo em seguida excretado

pela bile e urina. No intestino, o SN-38G pode sofrer a ação da enzima

bacteriana β-glucoronidase e voltar a sua forma ativa SN-38. Um dos efeitos

colaterais do irinotecan é a diarréia severa que está diretamente associada ao

seu metabólito ativo, SN-38. Assim, é sabido que quando existem baixos índices

de glucoronização do SN-38, maior é o risco de toxicidade (Gupta et al., 1994).

O polimorfismo do gene da enzima UGT1A1 foi inicialmente observado

em paciente com Sindrome de Gilbert. A região promotora do gene UGT1A1 ao

invés de conter 6 repetições TA continham 7 repetições (Bosman et al., 1995),

sendo posteriormente denominada de variante UGT1A1*28 do gene UGT1A1

(Mackenzie et al., 1997). Em 2002, Iyer e colaboradores observaram a

correlação entre o número de repetições TA, a farmacocinética e a toxicidade do

irinotecan. Pacientes com genótipo homozigoto ou heterozigoto para o alelo

(TA)

apresentaram uma aumento na AUC

SN-38

e um efeito adverso maior, como

por exemplo diarréia severa.

Atualmente, esta associação já está bastante caracterizada e aceita no

meio científico (Marcuello et al., 2004; Ando et al., 2005) e em agosto de 2005, a

agência americana de regulamentação de medicamentos e alimentos, FDA

(Food and Drugs Administration), aprovou um kit para detectar o polimorfismo do

gene UGT1A1, tecnologia desenvolvida pelo grupo do Dr. Mark Ratain na

Universidade de Chicago, que será disponibilizada comercialmente para todo o

mundo pela clínica Mayo (Rochester-EUA) (Aase, 2005).

Um outro marcador importante na farmacogenética de drogas anti-

neoplásicas é o HER-2 ou erbB2. A amplificação gênica do HER-2 é encontrada

em aproximadamente 30% dos cânceres de mama e ovário, resultando na

superexpressão do seu produto gênico e consequentemente em um prognóstico

ruim (Pegram et al., 1997).

Em 1992, Carter e colaboradores revolucionaram a terapêutica do câncer

com a modelagem de um anticorpo monoclonal humanizado, conhecido

atualmente como Herceptin

ou Trastuzumab. Esta droga se liga a proteínas

HER-2 presentes na superfície celular e que são responsáveis por uma cascata

de sinalização que controlam a proliferação celular. Com isso, o FDA aprovou

um teste farmacogenético indireto (1998) e um direto (2001) para detecção

desta alteração molecular, sendo recomendado para pacientes com grau +2 ou

+3 na escala de imunorreatividade do HER-2 (Eppenberger-Castori et al., 2001).

Atualmente, o trastuzumab é utilizado em milhões de pacientes vítimas do

câncer de mama, positivos para HER-2.

A descoberta do cromossomo Filadélfia em pacientes com Leucemia

Mielóide Crônica (LCM) em 1960 foi um marco na citogenética do câncer

(Nowell & Hungeford, 1960). Em 1973, Rowley demonstrou que o cromossomo

Filadélfia resulta de uma translocação recíproca de material genético entre o

cromossomo 9 e o cromossomo 22, definido citogeneticamente como t(9:22)

(q34;q11). Esta translocação resulta em uma proteína quimérica conhecida

como bcr/abl, com atividade tirosina quinase. Por causa dessa alta atividade

específica e nova localização na célula agora no citoplasma, bcr/abl tem acesso

a diferentes substratos que a proteína c-abl não tinha, e as fosforila de uma

maneira desordenada (Senechal & Sawyer, 1996). Em 2001, o FDA aprova o

Glivec

(Mesilato de Imatinib), uma droga inibidora da atividade tirosina quinase

da proteína quimérica bcr/abl (FDA, 2001). Atualmente, é possivel determinar se

através da detecção desta proteína aberrante, quais os pacientes que tem o

cromossomo Filadélfia e que podem ser beneficiados com o uso do Mesilato de

Imatinib.

Atualmente, um dos alvos da farmacogenética de drogas anti-neoplásicas

é o receptor de fator de crescimento epidermal tipo 1 (EGFR). Isso porque foi

observado que o gene EGFR apresenta-se amplificado ou superexpresso em

inúmeros tipos de câncer, sendo detectado em até 50% dos tumores de pulmão

de células não-pequenas (NSCLC) (Amann et al., 2005).

Em maio de 2003, o FDA aprovou o gefitinib (Iressa

) (Cohen et al.,

2004) e em 2004, o erlotinib (Tarceva

), drogas inibidoras da tirosina quinase do

EGFR1, utilizada para pacientes com NSCLC avançado ou metastático (FDA,

2004).

Atualmente, sabe-se que a resposta terapêutica associada a estes

inibidores está relacionada a mutações encontradas no domínio tirosina quinase

do receptor (Lynch et al., 2004). A partir desta descoberta, muitos estudos estão

sendo realizados com o intúito da caracterização da importância deste receptor

e o seu envolvimento na resposta terapêutica.

1.3 RECEPTORES TIROSINA QUINASE

A família de receptores acoplados à tirosina quinase é uma das mais

importantes no controle e regulação da sinalização celular tanto nas células

sadias quanto nas células tumorais. Proteínas tipo tirosina quinase existem em

duas formas: acopladas a receptores ou citosólicas. Algumas, ainda, podem ser

nucleares como a Abl. Todas possuem um domínio para o substrato, o ATP e a

catálise. Este último domínio é responsável pela transferência de um grupo

fosforil terminal do ATP para um grupo amino da tirosina do substrato aceptor,

desencadeando uma cascata de fosforilação de resíduos de tirosina de

inúmeras moléculas alvo, controlando, assim, processos celulares fundamentais

como o ciclo celular, migração, metabolismo, proliferação e diferenciação

(Schlessinger, 2000).

As tirosinas quinases acopladas a receptores representam mais da

metade de todas as tirosinas quinases já descritas (Blume-Jensen & Hunter,

2001). Estes receptores possuem um domínio extracelular onde reside o sitio de

ligação, uma alfa-hélice hidrofóbica na porção transmembrânica e um domínio

citosólico que possui o resíduo protéico com atividade tirosina quinase. Quando

o efetor se liga ao receptor ocorre à dimerização do receptor, com conseqüente

transdução do sinal via fosforilação de um radical de tirosina em uma proteína

intracelular, desencadeando, assim, uma seqüência de eventos que leva a uma

resposta celular (Tibes et al., 2005). Atualmente, um dos grupos de receptores

mais estudados com atividade tirosina quinase é a família dos receptores de

fator de crescimento epidermal ou EGFR.

1.4 FAMÍLIA DO RECEPTOR DO FATOR DE CRESCIMENTO EPIDERMAL

A família do receptor do fator de crescimento epidermal (EGFR) localiza-

se na superfície celular, possuindo um domínio extracelular, um

transmembrânico e um intracelular. Esta família consiste de quatro

representantes: (a) EGFR ou ErbB1 ou HER1; (b) ErbB2 ou HER2/neu; (c)

ErbB3 ou HER3; e, (d) ErbB4 ou HER4. Estes receptores são homólogos no

domínio tirosina quinase, mas diferem no domínio extracelular e na porção

carboxi-terminal (Schlessinger, 2000). Quando o ligante acopla a um dos

membros desta família, ocorre dimerização do receptor. Esta pode ocorrer entre

receptores iguais (homodímeros) como, por exemplo, ErbB1/ErbB1 ou entre

receptores diferentes mas da mesma família (heterodímero) como por exemplo

ErbB1/ErbB2, com conseqüente internalização do receptor (Figura 2) (Tsao &

Herbst, 2003). Após a dimerização e a internalização do receptor, ocorre a

autofosforilação dos resíduos citoplasmáticos de tirosina quinase, o que permite

a fosforilação de outras proteínas que levam, assim, a transdução do sinal e

conseqüentes eventos celulares (Herbst, 2004).

-P

-P P-

P-

-P -P P-

P-

ErbB1

ErbB2

-P

Substrato

Substrato-P

Substrato

-P

Substrato-P

SINALIZAÇÃO

CELULAR

MEIO EXTRACELULAR

MEIO INTRACELULAR

NÚCLEO

Figura 2: Mecanismo de ativação do receptor EGFR. Quando o ligante acopla

ao receptor, ocorre dimerização deste receptor. Esta pode ser entre receptores

iguais (homodímeros) ou diferentes (heterodímeros), levando a transdução do

sinal via fosforilação de substratos intracelulares. (John Mendelsohn and Jose

Baselga .J Clin Oncol. 2003. 21:2787-2799).

A degradação destes receptores é um passo muito importante na

regulação deste receptor. Depois de ligado, este sofre internalização, com

término da sinalização em alguns segundos, sendo então degradado por

endocitose e posteriormente, reciclado na superfície celular para que possa

repetir todo o processo de sinalização (Yarden, 2001).

Quando a atividade tirosina quinase apresenta-se alterada podem ocorrer

transformações oncogênicas nas células ou tecido. Atualmente, sabe-se que

existem quatro mecanismos mais prováveis: (a) transdução retroviral de um

proto-oncogene correspondente a tirosina quinase e concomitante mudanças

estruturais (Miller & Raab-Traub, 1999); (b) rearranjo genético, tais como

translocações, o que resulta em fusão de proteínas, onde a nova proteína

gerada possui a porção tirosina quinase da proteína A e a porção externa da

proteína B, como por exemplo, a proteína aberrante Bcr-Abl conhecido como

cromossomo Filadélfia, encontrado em leucemias (Kloetzer et al., 1985); (c)

mutações com ganho de função ou pequenas deleções no resíduo tirosina

quinase, como por exemplo no KIT em tumores estromais do sistema digestivo

(Majunder et al., 1988); e (d) amplificação gênica, resultando em uma

superexpressão de tirosina quinase (Blume-Jensen & Hunter, 2001). Todas

estas alterações tornam os representantes desta família alvos importantes na

terapêutica do câncer.

Atualmente, um dos membros mais importantes desta família na pesquisa

do câncer é o EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) ou ErbB1 ou ainda

HER1. A molécula do EGFR foi descoberta em 1975 por Cohen e

colaboradores, sendo identificada como uma glicoproteína de 170kDa

constituída de uma única cadeia protéica com 1186 aminoácidos, cujo gene esta

localizado no braço curto do cromossomo 7 (Davies et al., 1980). O gene do

EGFR possui 28 éxons, sendo mostrado na figura abaixo cada éxon e suas

respectivas áreas codificadoras (Figura 3).

Este receptor apresenta um segmento transmembrânico hidrofóbico

(éxons 1 a 16) de 23 aminoácidos ligados ao domínio intracelular que apresenta

uma atividade tirosina quinase (éxon 18 a 24) e um domínio regulatório do

receptor (Schlessinger, 1988).

Domínio

Extracelular

Domínio

Tirosina Quinase

Domínio

Regulatório

Cromossomo 7

7p11.2

O uso de modelos animais levou a descoberta de diferentes ligantes para

o EGFR. Em 1995, estudos com animais “nock out” para o gene do EGFR

mostraram que esta ausência era letal ao embrião ou estava envolvida na falha

do desenvolvimento de diversos órgãos, como por exemplo, pele, pulmão e trato

gastrointestinal (Gscwind et al., 2004). Atualmente, já foram descritos vários

ligantes endógenos sendo o EGF e TGF-α os principais (Yarden & Sliwkowski,

2001).

Em células normais existem cerca de 40.000 a 100.000 receptores/célula.

Já em células tumorais, principalmente de tumores sólidos como mama, pulmão,

cabeça e pescoço, cólon, entre outros, podem apresentar 2 x 10

moléculas de

HER por célula (Herbst, 2004), sendo observada uma superexpressão do

EGFR1 em cerca de 80-100% de tumores de cabeça e pescoço, 14-91% nos

tumores de mama, 50-90% dos tumores renais, 40-80% dos tumores

pulmonares entre outros (Grandis & Sok, 2004), o que o torna o EGFR1 um

excelente alvo na terapêutica do câncer.

A imortalização celular ou proliferação celular observada no câncer,

dentre outras doenças, está relacionada a um descontrole no ciclo celular. A via

de transdução do sinal do EGFR/HER1 leva a ativação da ciclina D1 que está

envolvida no controle do ciclo celular. Normalmente, quando as células normais

atingem certa densidade, elas param de crescer e entram em quiescência (G0).

Contudo, o estímulo de fatores de crescimento tais como o EGF pode fazer com

Figura 3: Localização cromossômica do gene do EGFR, seus éxons e respectivos

domínios. O gene do EGFR se localiza no cromossomo 7, na região 7p11.2. Os

éxons estão em azul e os íntrons em cinza. O íntron 1, que tem aproximadamente

123Kb, foi truncado neste esquema. FONTE: www.egfr-info.com

que estas células saiam do seu estado quiescente e entrem novamente na fase

G1 do ciclo celular. Na fase G1 existe um ponto de checagem que as células

tem que passar para progredir no ciclo celular. A ciclina D1 faz com que estas

células passem da fase G1 para fase de síntese (S) do ciclo celular, resultando

em uma rápida divisão celular (Harari & Yarden, 2000).

O crescimento tumoral parece estar associado a um aumento do tecido

vascular, necessário para o crescimento e nutrição celular (Hanahan & Folkman,

1996). Desta forma, a via de transdução do sinal do EGFR/HER1 envolvida na

promoção da angiogênese segue dois mecanismos principais: primeiro, ocorre

estimulação da produção de fatores angiogênicos, via ativação do EGFR/HER1,

tais como VEGF (Fator de Crescimento do Endotélio Vascular), o que leva a

produção de novos tecidos vasculares; e segundo, há um aumento na produção

de enzimas especializadas denominadas metaloproteinases (MMP) que facilita a

remodelagem da matriz tecidual (O-charoenrat et al., 1999).

A ativação do EGFR1/HER1 também pode apresentar um efeito anti-

apoptótico que promove reparo e aumento da sobrevida celular após exposição

à agentes tóxicos, tais como quimioterapia e radioterapia. Em células normais, o

dano ao DNA induzido por agentes tóxicos induz a expressão da proteína Bax

que entra na mitocôndria e inicia o processo de apoptose. O mecanismo

proposto para o envolvimento do EGFR1/HER1 na sobrevida celular baseia-se

na ativação do receptor com conseqüente indução da expressão da Bcl-2, uma

proteína anti-apoptótica que bloqueia a atividade da proteína Bax, levando à

célula a sobreviver e consequentemente, proliferar, podendo promover o

desenvolvimento e o crescimento tumoral (Jost et al., 1999).

A complexidade da cascata de transdução do sinal via ativação do

EGFR1 não se resume a um só evento celular específico. Contudo, algumas

vias já foram identificadas, sendo as principais (Figura 4): via ras/raf/MAPK, via

quinase fosfatidilinositol-3 (PI3K) e via STAT (Tibes et al., 2005; Knight et al.,

2004).

Quando o EGFR1 é fosforilado, este recruta a proteína adaptadora Shc e

Grb2, que agem via Sos que por fim ativa a proteína Ras. Subseqüentemente,

ocorre uma cascata de ativação via Raf e MAP quinase/Erk or MEK, levando a

fosforilação das MAP quinase ERK1/2, que por fim, induz a expressão de fatores

de crescimento (Figura 4). A ativação das vias MAP quinases esta associada

com a divisão celular e sua atividade aberrante podem estar correlacionadas ao

descontrole da proliferação celular observada no câncer (Pal & Pegram, 2005).

O envolvimento do EGFR1 na promoção do ciclo celular parece estar

relacionado com a via PI3K. Acredita-se que proteína adaptadora Gab1 ativa

PI3K o que, por fim, leva a ativação do fator de transcrição NF-κβ (Figura 4).

Esta via parece estar envolvida na progressão do ciclo celular em alguns tipos

de câncer (Pal & Pegram, 2005).

Uma outra via iniciada pela ativação do EGFR1 é mediada por uma

tirosina quinase citoplasmática, c-Src. A proteína c-Src ativa a transcrição de

fatores de transcrição da família STAT (Figura 4), o que parece ser importante

na proliferação e sobrevida celular observada no câncer. A ativação da via da

proteína STAT3 parece estar envolvida na resistência de células tumorais a

agentes citotóxicos (Pal & Pegram, 2005).

-P

P-

TGF-

EGF

Shc

Grb2

Sos

RAS

RAF

MEK 1/2

GAB

PIP3K

PKB

PKC

NF-κB

Ral

c-Src

STAT3

Figura 4: Transdução do sinal via EGFR. Quando o ligante EGF ou TGF-α se

liga ao receptor, há uma dimerização do receptor com o conseqüente

desencadeamento da transdução do sinal que pode ser via ras, PIP3 e STAT

levando aos diferentes tipos de atividade biológica.

É sabido que o EGFR1 apresenta-se desregulado no câncer e que esta

desregulação pode se apresentar de diferentes formas. Dentre elas podemos

citar: defeitos na internalização dos receptores, amplificação gênica levando a

uma superexpressão do receptor e de ligantes, sendo esta última importante nos

casos de tumores de mama e próstata dependentes de hormônio.

1.5 INIBIDORES DE TIROSINA QUINASE

É sabido que o EGFR1 apresenta-se superexpresso em inúmeros tipos

de tumores, tornando-o um alvo atrativo na terapêutica do câncer. Diferentes

estratégias vêm sendo propostas tais como ligantes e/ou anticorpos conjugados

a toxinas e anticorpos que tem alta afinidade por ligantes do EGFR, anticorpos

monoclonais e pequenas moléculas inibidoras dos resíduos tirosina quinase do

receptor do EGFR1. Atualmente, os dois últimos mecanismos vêm sendo

bastante explorados na clínica médica.

Anticorpos monoclonais ligam-se na porção externa do receptor, fazendo

com que não haja interação entre ligante e o receptor, bloqueando, assim a

sinalização intracelular. Um dos mais novos representantes desta classe é o

Erk 1/2

PROLIFERAÇÃO

CELULAR

IMORTALIZAÇÃO

CELULAR

PROGRESSÃO

CICLO CELULAR

cetuximab (Mendelsen, 1997; Giaccone, 2005; Jimeno & Hidalgo, 2005),

aprovado para o tratamento de câncer colorretal metastático.

Já as pequenas moléculas inibidoras de tirosina quinase bloqueiam o

receptor na porção intracelular, no resíduo tirosina quinase, podendo se

reversíveis ou irreversíveis. Inúmeras moléculas vêm sendo testadas e usadas

em ensaios experimentais como o AG1478, PD153035 entre outras. Até o

presente momento, as únicas moléculas disponíveis comercialmente são

Gefitinib e o Erlotinib.

1.5.1 AG1478

A molécula do inibidor de tirosina quinase AG1478 faz parte da família

das quinazolinas, denominada 4-(3-cloroanilino)-6,7-dimetoxiquinazolina (Figura

5). Estudos anteriores demonstraram que esta droga é capaz de parar o ciclo

celular e inibir a proliferação celular em diferentes tipos de câncer (Zhu et al.,

2001; Shushan et al., 2004).

Figura 5 - Estrutura química do inibidor de tirosina quinase AG1478.

1.5.2 Gefitinib (Iressa

) e Erlotinib (Tarceva

)

Gefitinib e o Erlotinib são inibidores de tirosina quinase do receptor de

crescimento epidermal tipo 1, também conhecido com HER1, erbB1 ou EGFR. O

gefitinib e o erlotinib são medicamentos orais e fazem parte da família das

quinazolinamina com nome N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metoxi-6-[3-4-morfolin

propoxi] e N-(3-ethynylfenil)-6,7bis(2-metoxietoxi)-4-quinazolinamina,

respectivamente (Figura 6). O gefitinib apresenta-se em comprimidos de 250mg

(AstraZeneca) e o erlotinib em comprimidos de 25 mg, 100 mg e 150 mg (OSI-

Pharmaceutical/Genetech).

Figura 6: Estrutura química dos inibidores de tirosina quinase gefitinib (a) e

erlotinib (b).

O mecanismo de ação destes medicamentos ainda não foi

completamente elucidados. O genfitinib inibe a porção intracelular do receptor do

fator de crescimento epidermal (EGFR), bloqueando a fosforilação de proteínas

no citoplasma. Este compete com o ATP no seu sitio de ligação (Cohen et al.,

2004).

Os estudos de fase I englobaram pacientes com diferentes tipos de

tumores sólidos que apresentavam superexpressão do EGFR1. Dentre todos os

tipos de tumores avaliados, os pacientes com câncer de pulmão de células não

pequenas foram os que apresentaram melhor resultado, onde alguns deste

pacientes apresentaram estabilização da doença (Baselga et al. 2002; Ranson

et al., 2002) e redução de 50 a 90% da massa tumoral. Com isso, o FDA

aprovou, em maio de 2003, o uso de gefitinib em pacientes com câncer de

pulmão de células não pequenas que falharam a dois ou mais tratamentos

prévios, apesar de estudos clínicos realizados pela companhia AstraZeneca

(a)

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(b)

mostrarem que apenas 10% dos pacientes foram bastante beneficiados com

esta droga (Cohen

et al., 2004).

A observação de um subgrupo de paciente responsivo ao gefitinib, levou

a comunidade científica a tentar entender as causas desta seleção. Em 2004,

Lynch e colaboradores demonstraram que deleções e mutações pontuais no

éxon 19 e 21 do gene EGFR poderiam estar relacionadas à resposta

terapêutica, visto serem estas regiões codificadoras do resíduo tirosina quinase.

Biópsias de 9 pacientes que responderam a terapia com gefitinib, revelaram que

em 8 delas, as mutações estavam presentes. É importante ressaltar que o tecido

normal destes pacientes não apresentou estas mutações, levando a conclusão

de que estas são adquiridas no surgimento do câncer ou após exposição radio-

ou quimioterápica. Além disso, os pacientes que não responderam a terapia com

gefitinib, também não possuíam mutações ou deleções nos éxons 19 e 21

(Lynch

et al., 2004). Na mesma época, em 2004, Paez e colaboradores também

encontraram uma correlação entre mutações pontuais e deleções e a resposta

ao gefitinib. Um outro fator importante na resposta terapêutica é a amplificação

do gene EGFR1 (Cappuzzo

et al., 2005; Moroni et al., 2005; Takano et al.,

2005). A mesma correlação entre mutação e resposta para inibidores de tirosina

quinase não pode ser afirmada para outros tipos de tumores, mesmo que estes

tenham respondido a esta terapia (Su et al., 2005; Nagahara et al., 2005).

A vantagem do uso da terapia guiada em relação a terapia convencional

esta na atenuação dos efeitos colaterais. O

rash cutâneo e a diarréia são os

efeitos adversos mais severos observados em pacientes que usam qualquer

inibidor de tirosina quinase do EGFR1.

Estudos preliminares demonstraram que existe uma forte associação

entre a ocorrência de

rash cutâneo e a resposta terapêutica com conseqüente

prolongamento da sobrevida destes pacientes. Esta correlação foi observada em

pacientes com diferentes tipos de câncer que estavam sob terapia anti-tirosina

quinase do EGFR1 (Pérez-Soler

et al., 2003; Pérez-Soler & Saltz, 2005;

Mohamed et al., 2005; Dudek

et al., 2006).

Complilando todos os estudos anteriores podemos observar que como os

inibidores de tirosina quinase são específicos para o EGFR1 e como há uma

evidente correlação entre

rash cutâneo e resposta terapêutica, existe alguma

alteração presente na célula normal que também está na célula tumoral, que não

aquelas mencionadas anteriormente (deleções e mutações pontuais), visto que

estas não estão presentes em células normais. Com isso, se faz importante o

estudo de polimorfismos que possam vir a ajudar na seleção de pacientes que

irão se beneficiar da terapêutica com inibidores de tirosina quinase.

1.6 MUTAÇÃO E POLIMORFISMOS FUNCIONAIS DO EGFR1

O projeto genoma permitiu o seqüênciamento de todo DNA genômico

humano, o que culminou no surgimento de novas áreas da ciência. Não basta

apenas saber a seqüência, um código, mas o que ele significa, quais as suas

implicações moleculares e celulares e como podemos utilizá-lo no entendimento

de processos fisiológicos e patológicos no organismo. A descoberta de

mutações, polimorfismos, microssatélites, entre outros só tem importância clínica

se forem associados a estudos funcionais.

O gene do EGFR apresenta inúmeras alterações, mas se estas possuem

significado clínico ainda não se sabe por completo. Esse é um processo de

busca incessante: ter ou não um significado esperado. Um fenômeno bastante

importante no estudo do EGFR1 são as mutações e os polimorfismos

encontrados no gene responsável por este receptor. As definições de mutação

se confundem com as de polimorfismo. Uma mutação pode ser definida como

uma alteração permanente no material genético. Existem diferentes tipos de

mutação, dentre elas: mutação pontual (troca, perda ou inserção de 1 pb),

mutação

missense (substituição errada de um aminoácido) e mutação nonsense

(produz um códon de terminação levando a formação de um produto gênico

completamente errado) (Passarge, 2001).

Uma das mutações mais comuns no câncer é a forma mutante EGFRvIII.

Esta variante forma uma proteína truncada, onde a porção externa do receptor é

ausente, logo ocorre ativação constitutiva do domínio tirosina quinase

desencadeando uma cascata de eventos independente do ligante (Pedersen

., 2001). Esta mutação é comum em tumores do sistema nervoso central,

principalmente glioblastomas e não é encontrada em células normais (Wilstrand

et al., 1995). Como esta forma mutante não necessita de ligante ou dimerização

para que o receptor seja ativado, também não existe uma baixa regulação por

endocitose o que significa que está sempre ativo (Huang

et al., 1997).

Atualmente, o estudo de polimorfismos funcionais vem ganhando uma

enorme atenção por parte da comunidade científica. O polimorfismo é a

existência de um ou mais alelos “normais” em um lócus gênico onde a

freqüência do alelo mais raro deve ser maior que 1% na população. Um

polimorfismo pode existir em diferentes níveis, tais como variante na seqüência

de DNA, na seqüência de aminoácidos, na estrutura cromossômica ou até

mesmo a níveis fenotípicos, quando há a observação de dois ou mais fenótipos

(Passarge, 2001).

Diferentes polimorfismos foram identificados no EGFR1. Um dos

primeiros polimorfismos funcionais observados no EGFR apresenta-se como

uma mudança de apenas 1 nucleotídeo (SNP) de guanina (G) para adenina (A),

levando a substituição do aminoácido arginina pela lisina no códon 497 (HER-1

R497K), no domínio extracelular do EGFR1 (Zhang

et al., 2005) (Figura 7).

Acredita-se que o domínio extracelular do EGFR de alguma forma modula a

eficiência no recrutamento de substratos intracelulares e/ou permite a ativação

de uma via de sinalização alternativa que não leva a indução nuclear eficiente de

proto-oncogenes e subseqüente estimulação do crescimento (Moriai

et al.,

1994).

Um estudo

in vitro comparou a forma selvagem do receptor, HER-1 497R,

com a variante HER-1 497K e demonstrou que, em células normais, não há

diferença em relação a interação receptor-ligante, contudo a variante HER-1

497K parece reduzir a resposta mitogênica em relação a forma selvagem, via

diminuição da expressão do RNAm das proteínas

myc, fos e jun, conhecidas

como estimuladoras da proliferação celular (Moriai

et al., 1994).

Em 2005, Zhang e colaboradores observaram que paciente com câncer

retal com genótipo homozigoto GG (arginina-arginina) e heterozigotos GA

(arginina-lisina) apresentaram uma maior probabilidade de recorrência da

doença local pélvica em 5 anos. Já nos pacientes homozigotos AA (lisina-lisina)

não foi observada nenhum tipo de recorrência.

O nível de expressão do EGFR1 é primariamente regulado pela

abundancia no RNAm. A transcrição do gene EGFR1 é iniciada em múltiplos

sítios do promotor rico em GC fora das regiões conhecidas como iniciadoras

TATA e CAAT box, que são ausentes neste receptor (Ishii

et al., 1985). Chi e

colaboradores (1992) demonstraram que o primeiro intron do EGFR (Figura 7)

apresentava uma região altamente polimórfica constituída de repetições

dinucleotídicas (citosina e adenina) e que esta estava envolvida na transcrição

gênica . Posteriormente, estudos

in vitro e in vivo demonstraram que o número

de vezes que estas repetições ou microssatélites ocorriam era importante na

regulação e nos níveis de transcrição deste gene; quanto mais repetições

menores o nível de transcrição gênica. Esta redução na transcrição poderia

chegar a 80% nos casos de alelos com 21 repetições em comparação com o

alelo com 16 repetições (Gebhardt

et al., 1999). Estudos clínicos preliminares

demonstraram uma associação entre polimorfismo e resposta clínica ao

tratamento com 5-fluorouracil/oxaliplatina em pacientes com câncer de colon

metastático; pacientes com genótipo16/16 apresentavam menor resposta e

menor sobrevida global do que os pacientes com genótipo 16/18 e 16/20

(Zhang, 2002).

Em relação a etinicidade, Liu e colaboradores (2003) demonstraram que

japoneses apresentam alelos com maior número de repetições quando

comparados a caucasianos e negros americanos. Em 2004, Brandt e

colaboradores não conseguiram demonstrar a associação entre o tamanho do

alelo e o risco de câncer de mama, mas demonstraram que mulheres com

histórico familiar de câncer de mama e com os dois alelos maiores que 19

repetições apresentavam um alto risco para este câncer. Em 2005, Zhang e

colaboradores demonstraram uma tendência a recorrência local de câncer retal

em pacientes com alelos menores que 20 repetições. Outros estudos estão

sendo desenvolvidos para confirmação da influência deste polimorfismo no

estudo do câncer, não só em relação a susceptibilidade ao câncer mas também

à resposta terapêutica.

Como dito anteriormente, existem inúmeras modificações no gene do

EGFR1, o importante é saber o que elas significam. Uma alteração na região

promotora pode ser de grande importância visto que esta pode alterar a

transcrição deste gene. Recentemente, um outro polimorfismo funtional foi

descrito na região promotora do gene EGFR1 (Liu

et al., 2005). Em 2005, Liu e

colaboradores demonstraram que uma substituição de guanina (G) por timina (T)

na posição -216 do promotor (Figura 7) alterava a atividade do promotor

in vitro

e in vivo, sendo observada tanto em células tumorais como em células normais.

A presença do alelo T foi associada a um aumento em 40% na expressão de

EGFR1 em relação ao alelo G. Os autores demonstraram que existe variação

interindividual nesta posição e que nela se encontra o sítio de ligação de um

fator de transcrição, a proteína Sp1 (Liu

et al., 2005).

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Éxon 1

Éxon 13 R497K

-216G/T

Éxon 2

Éxon 28

Intron 1

Figura 7: Localização dos polimorfismos na região promotora, intron 1 e éxon 13

no gene EGFR. O polimorfismo R497K refere-se a uma substituição do

aminoácido arginina pela lisina no códon 497 do éxon 13, o polimorfismo -

216G/T refere-se a uma substituição de guanina por timina na região promotora

do gene EGFR e o microssatélite no íntron 1 refere-se a repetição CA (citosina-

adenina).

Atualmente, estão sendo desenvolvidos estudos associando fenótipo com

estes polimorfismos para uma melhor compreensão de seus mecanismos. No

estudo de Zhang e colaboradores (2005) citado anteriormente, os autores

demonstraram que pacientes com a variante lisina-lisina no éxon 13 tinham

baixo risco de recorrência local de câncer, independente do numero de

repetições CA. Já pacientes com pelo menos um alelo arginina e com algum

alelo com 20 repetições apresentaram menor risco de recorrência local de

câncer retal do que aqueles com pelo menos um alelo arginina, mas com os dois

alelos com menos de 20 repetições CA. Ainda em 2005, Liu e colaboradores

demonstraram que o polimorfismo -216G/T e o microssatélite no intron1 (CA)n

não estão em

linkage desequilibrium (LD), indicando que a ocorrência de um

não depende da ocorrência do outro. Apesar de não ter sido observado LD,

existe uma correlação significante entre microssatélites longos e redução da

expressão de EGFR1 em portadores da variante -216G e esta variação também

está correlacionada com a etnicidade do indivíduo, sendo esta observação mais

proeminente em caucasianos (43%) quando comparados a asiáticos (0%). Os

autores sugerem que estudo com sistemas celulares oriundos de diferentes

Promotor

xon 1

(CA)n

... tgtcttaCACACACACACACACACACACACACACACACAccggattgctg...

indivíduos possa levar a uma maior compreensão da importância deste

polimorfismo na resposta terapêutica via EGFR1.

Como dito anteriormente, a toxicidade cutânea é um dos eventos

adversos mais comuns dos inibidores de tirosina quinase. Existem evidências da

relação entre resposta anti-tumoral e

rash cutâneo onde estas não estão

relacionadas com a dose administrada (Cohen

et al., 2002), levando à hipótese

de que há um componente genético associado a resposta anti-tumoral e

inibidores de tirosina quinase. Considerando-se o aumento da expressão de

EGFR no tecido epidermal e o proposto efeito dos microssatélites no Intron1

(CA)n na expressão do EGFR, é razoável acreditar que exista uma correlação

entre o número de repetições (CA)n e sensibilidade à inibidores do EGFR1 tanto

no tecido epidermal como no tecido tumoral. Em 2004, Amador e colaboradores

demonstraram que indivíduos com alelos com repetições intrônica curtas

apresentaram maior incidência de toxicidade cutânea à inibidores de EGFR1. O

número de repetições encontrado foi igual no tecido tumoral e no tecido normal

do mesmo paciente, levando aos autores a concluírem que nesta região não

ocorrem mutações somáticas no curso de desenvolvimento tumoral. Este

achado é bastante importante, pois este polimorfismo pode vir a funcionar como

um marcador de resposta biológica.

Visto que apenas 10% dos pacientes respondem a terapia com inibidores

de tirosina quinase (Cohen

et al., 2004) faz-se necessário a descoberta de um

marcador biológico que possa selecionar estes pacientes. Como são drogas

com alvo específico para a tirosina quinase do EGFR e como há uma nítida

correlação entre resposta terapêutica e

rash cutâneo, alterações no EGFR

encontradas nas células normais podem ser utilizadas para a seleção de

pacientes que poderiam se beneficiar com essa terapia.

OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar a presença de polimorfismos no gene do EGFR em fibroblastos de

indivíduos sadios e correlacionar estes polimorfismos a resposta citotóxica

vitro

para dois inibidores de tirosina quinase, AG1478, Erlotinib

e Gefitinib.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Avaliar a atividade citotóxica do AG1478, Erlotinib e do Gefitinib

em fibroblastos

humanos;

- Avaliar a presença do polimorfismo R497K no gene do EGRF em fibroblastos

humanos;

- Avaliar a presença do polimorfismo -216G/T no gene do EGFR em fibroblastos

humanos;

- Avaliar o numero de repetições CA no intron 1 do gene EGFR

- Avaliar o nível de expressão do EGFR em fibroblastos;

- Estudar a correlação entre indivíduos heterozigotos para o polimorfismo -

216G/T e para o número de repetições CA;

- Avaliar a existência ou não de correlação entre fenótipo e genótipo.

MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Materiais

MEM (Minimum Essential Media) – GIBCO

RPMI – GIBCO

SBF – GIBCO

L-GLUTAMINA – GIBCO

FRASCOS DE CULTURA E PLACAS- COSTAR

DMSO – SIGMA

AG1478 - Calbiochem

Iressa

- Biaffin GmbH & Co KG.: PKI-GFTB

Tarceva

- Biaffin GmbH & Co KG.: PKI-ELTB

AlamarBlue

– Biosource

DNeasy – Qiagen

RNA latter

- Qiagen

RNeasy – Qiagen

Agarose PA Ultra Pura – Gibco

Tampão TBE 10X- Ambion (Applied Biosystems)

Água Livre de DNAse e RNAse – Ambion (Applied Biosystems)

BstN I – BioLabs

BseR I – BioLabs

Acrilamida - Sigma

Bis-Acrilamida – Sigma

Brometo de Etídeo - Sigma

Marcador de Peso Molecular 100pB - Invitrogen

Hotstar Taq Polimerase – Qiagen

Taq PCR Core Kit - Qiagen

ABI PRISM® SNaPshot® Multiplex Kit – Applied Biosystem

SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase)

- Promega

Exo I (Exonuclease I) - USB

Primers: IDT (Integrated DNA Technologies, Inc)

kit High Capacity cDNA Archive – Applied Biosystems

Kit iQ

SYBR

Green Supermix - BioRad

3.2 Métodos

3.2.1 CULTURA DE CÉLULAS

Foram selecionados 70 biópsias de pele de vfoluntários sadios adquiridos

no banco de células Coriell e cultivados em meio MEM (Minimum Essential

Media), suplementado com 5% de L-glutamina e 15% de soro fetal bovino (SFB)

ativado. Para controle de atividade dos inibidores de tirosina quinase, foiram

utilizadas células tumorais de pulmão, H-1993 e H-2170, cultivadas em meio

RPMI 1640 com 10% de SFB inativado. Ambas as células foram mantidas em

estufa de CO

a 37°C. O projeto foi aprovado pelo comitê de Ética da

Universidade de Chicago, Chicago, IL – EUA.

3.2.2 EXPANSÃO DAS CÉLULAS

As células foram cultivadas e quando confluentes foram tratadas com

1mL de tripsina por 5 minutos a 37

°C. Em seguida, foi adicionado 8mL de meio

nos frascos de cultura, sendo em seguida transferido 3mL desta mistura (células

mais meio) para 3 frascos de cultura: um para plaqueamento e congelamento,

outro para extração de DNA e mais um para extração de RNA. As células foram

então mantidas em estufa de CO

a 37°C.

3.2.3 CONTAGEM E PLAQUEAMENTO DAS CÉLULAS

As células foram cultivadas e quando confluentes foram tratadas com

tripsina por 5 minutos a 37

°C. Em seguida, foi adicionado meio de cultura

correspondente a cada tipo celular e retirada uma amostra para contagem

celular pelo método da exclusão por azul de tripan. As células foram contadas

em câmara de Newbauer e plaqueadas em placa de 96 poços na concentração

de 5000 células/poço.

3.2.4 INIBIDORES DE TIROSINA QUINASE

Para o estudo foram utilizados três inibidores de tirosina quinase: AG1478

(Calbiochem; Cat.: 658552), Gefitinib (Biaffin GmbH & Co KG.: PKI-GFTB) e

Erlotinib (Biaffin GmbH & Co KG.: PKI-ELTB). Todos foram dissolvidos em

DMSO, sendo a concentração final do solvente na placa mantida menor que

0.03%. As concentrações utilizadas para AG1478 foram: 5, 10, 15 e 20µM e 20,

40, 60 e 80µM; para Gefitinib: 10, 20, 40, 60µM e 10, 20, 30 e 40µM; e para

Erlotinib: 5, 10, 20, 30, 60µM.

3.2.5 ATIVIDADE CITOTÓXICA PELO MÉTODO DO ALAMAR BLUE

As células foram plaqueadas em placas de 96 poços na concentreção de

5000 células/poço e incubadas por 24 horas, em estufa de CO

a 37°C, para

permitir a sua aderência à placa. No dia seguinte, as drogas foram diluídas e

adicionadas à placa, sendo incubadas por 72 horas em estufa CO

a 37°C. Vite

quatro horas antes do término da incubação, foi adicionado 20µL de

AlamarBlue

, sendo lida em espectrofotômetro de placa no comprimento de

onda de 570 e 600nm. Os resultados foram analisados de acordo com o

fabricante, sendo calculado a concentração que inibe 50% do crescimento

celular (CI50).

O princípio do método se baseia na redução deste corante pelas células

em proliferação. O AlamarBlue

interage com metabólitos produzidos pela

respiração celular. Essa interação resulta na substituição de oxigênio por

hidrogênio. Essa substituição é contínua em células em crescimento e

acompanhada da abilidade de mudança de coloração do meio, que passa de

azul para róseo.

3.2.6 EXTRAÇÃO DE DNA

As células foram cultivadas e quando confluentes foram tratadas com

tripsina por 5 minutos a 37

°C. Em seguida, as células foram coletadas,

centrifugadas a 10000 rpm por 1 minuto, retirado o sobrenadante, sendo

armazenadas em freezer -70

°C. A extração de DNA foi realizada de acordo com

o protocolo do Kit DNeasy de extração de DNA total de células animais da

Qiagen®. O método de extração é baseado na ruptura da membrana celular

através de tampão de lise, precipitação de proteínas seguida de centrifugação e

precipitação do DNA através de lavagens com álcool e centrifugações. Ao

término das lavagens, o DNA precipitado foi hidratado e congelado. Quando

todas as amostras foram extraídas, foi realizada a leitura de DNA por

espectrofotômetro em 280 e 260nm e corrida em gel de agarose 2% para

dosagem e comprovação de qualidade do material. O DNA foi então diluído na

concentração de 20ng/µL.

3.2.7 EXTRAÇÃO DE RNA

As células foram cultivadas e quando confluentes foram tratadas com

tripsina por 5 minutos a 37

°C. Em seguida, estas foram centrifugadas (1200 rpm

por 5 minutos), descartado o sobrenadante e ressuspendidas em tampão RNA

latter

e armazenadas em freezer -70°C. A extração de RNA foi realizada de

acordo com o protocolo do Kit RNeasy de extração de RNA total de células

animais da Qiagen

. O método de extração é baseado na ruptura da membrana

celular por força mecânica seguida de captura do RNA em uma mini coluna

acoplada a um tubo de microcentrífuga seguido de limpeza e eluição do RNA

por meio de tampões. Quando todas as amostras foram extraídas, foi realizada a

leitura de RNA por espectrofotômetro em 280 e 260nm para dosagem e

comprovação de qualidade do material. As leituras foram realizadas no mesmo

dia com todas as amostras para um maior controle em caso que variação do

aparelho. O RNA foi diluído para 120ng/µL.

3.2.8 RFLP – Restriction Fragment Length Polymorphism

Essa técnica baseia-se na amplificação do segmento de interesse por

reação em cadeia da polimerase (PCR), seguido de corte da fita dupla de DNA

através do uso de enzimas de restrição. Ao ser submetido a clivagem com uma

enzima de restrição, o DNA de indivíduos geneticamente distintos é cortado ou

não nos sítios de restrição, gerando fragmentos de diferentes tamanhos. Essa

técnica foi utilizada para genotipagem dos polimorfismos 497G/A (ou R497K) e -

216G/T. As enzimas utilizadas foram

BstN I e BseR I, respectivamente. Os

primers utilizados foram: 5’-CTTGTCCACTTCCCTGC-3’; 5’-

GTCTGCCATGCCTTGTGCTC-3’; 5’-TCTGCTCCTCCCGATCCCTCCT-3’; e 5’-

CAGGTGGCCTGTCGTCCGGTCT-3’. As condições da reação de PCR para

R497K foram: 1 ciclo de 95°C (12’); 35 ciclo de 95°C (10’’), 56°C (10’’), 72°C

(20’’); e a extensão final a 72°C (7’). Produto de PCR de 102pb. Digestão com

BstN I por 3 horas a 60°C. Para -216 as condições foram as seguintes: 1 ciclo de

98°C (12’); 98°C (10’’); 8 ciclo tochdown 68 - 60°C (15’’); 72°C (20’’); 30 ciclo de

98°C (10’’), 59°C (15’’), 72°C (20’’); e a extensão final a 72°C (7’). Produto de

PCR de 224pb. Digestão com

BseR I por 3 horas a 37°C. A visualização dos

fragmentos foi realizado através de eletroforese em gel de poliacrilamida 10% e

revelado com brometo de etídeo.

3.2.9 ELETROFORESE CAPILAR – SEQUÊNCIAMENTO

3.2.9.1 DETECÇÃO DE MICROSSATÉLITES

Microssatélite pode ser definido como DNA repetitivo presente no genoma

dos eucariontes. As seqüências de DNA que se repetem variam de 2 a 6 pb.

Cada repetição encarrilhada se constitui em um loco de microssatélite cujos

alelos se diferenciam por variações no tamanho total do microssatélite. São co-

dominantes, multialélicos e de distribuição ampla no genoma; por isso são

usados como marcadores em estudos de genética de populações e

mapeamento (CIB – Conselho de Informação sobre Biotecnologia, 2006). A

detecção de mcrossatélites no intron 1 do gene EGFR foi realizada por análise

de microssatélite fluorescente a partir de PCR. Os primers utilizados foram: 5’-

Fam-GTTTGAAGAATTTGAGCCAACC-3’ (primer marcado); e 5’-

TTCTTCTGCCACACTTGGCAC-3’. As condições da reação de PCR foram:

95°C (10’); 35 ciclos de 95°C (10’’), 55°C (10’’) e 72°C (20’’); e uma extensão

final a 72°C (7’). Em seguida, os produtos de PCR foram levados ao Applied

Biosystems ABI377 genetic analyzer para determinação dos alelos. A análise

dos cromatogramas foi realizada no programa Gene Mapper v3.7.

3.2.9.2 SNaPshot

Essa técnica tem como objetivo identificar um polimorfismo de um único

nucleotídeo (SNP). O SNP é um tipo de marcador molecular capaz de

diferenciar indivíduos por meio de variações em apenas um nucleotídeo de

seqüências de DNA que codificam (ou não) genes. Essa variação alélica pode

ser detectada por seqüenciamento direto na região de interesse ou pela técnica

denominada SNaPshot. Esse método utiliza probes que se ligam imediatamente

uma base antes do SNP de interesse. Com o auxílio de desoxirribonucleotídeos

(dNTP) marcados, podemos identificar qual a base que será inserida na região

de interesse. Os dNTPs utilizados nesta reação são dideoxi-nucleotídeos

(ddNTP) que ao serem inseridos no DNA páram a reação. Por eletroforese

capilar, ou sequenciamento, pode-se determinar qual base foi inserida. O

cromatograma obtido possue cores diferentes, onde cada cor pertence a um

nucleotídeo específico: adenina (A) – verde; citosina (C) – preto; guanina (G) –

azul; e timina (T) – vermelho.

Essa ténica foi utilizada para genotipagem do polimorfismo 787C/T.

Inicialmente foi realizado PCR da região de interesse, onde os primers utilizados

foram: 5’-AAGCCTACGTGATGGCCAGC-3’; e reverso 5’-

GCGATCTGCACACACCAGTTGA-3’. Em seguida, a reação de PCR é

purificada com o auxílio de duas enzimas SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase) e

EXO I (exonuclease). A primeira remove os dNTPs não utilizados e a segunda

remove o excesso de primers. Estas são incubadas a 37°C por 1 hora seguido

de 15 minutos a 95°C. Depois de limpa, a reação de PCR é submetida a reação

snapshot, onde os probes irão se ligar imediatamente antes do SNP de interesse

e o nucleotídeo incorporado será o ddNTP. As seqüências dos probes utilizados

foram: 5’-ATCTGCCTCACCTCCACCGTGCA-3’ e 5’-

AGCCGAAGGGCATGAGCTGCGTGATGAG-3. As condições utilizadas foram:

30 ciclos de 96°C (10’’), 54°C (5’’) e 60°C (30’’). Em seguida, a reação de

snapshot é purificada com a enzima SAP e então as amostras são

encaminhadas para o seqüenciador ABI-3100/3700. Os cromatogramas foram

gerados no softwear GeneScan e analisados de acordo com a coloração do pico

no caso de indivíduos homozigotos ou dois picos para heterozigotos.

3.2.9.3 Long Range PCR

Esta metodologia baseia-se na amplificação de amplicon longo e pode ser

utilizada, dentre outras utilidades, para determinacão de haplótipos. A técnica foi

utilizada para estudar haplótipos G ou T na região -216 e o número de

repetições CA no intron 1 do gene do EGFR. Para isso, foram realizados duas

reações de PCR por amostra; uma para o alelo T outra para o alelo G. Em cada

uma destas reações foi adicionado primers para região de repetição CA,

obtendo-se ao final um amplicon com as duas regiões. Os primers utilizados

foram: EGFR-G 5'-CGCGGCCGCAGCAGCCTCCG-3' e EGFR-T 5'-

CGCGGCCGCAGCAGCCTCCT-3'. As condições utilizadas foram: 98°C (15’);

35 ciclos de 98°C (30’’), 70°C (2’); e extensão final de 70°C por 7 minutos. Em

seguida, os produtos de PCR foram levados ao Applied Biosystems ABI377

genetic analyzer para determinação dos alelos. A análise dos cromatogramas foi

realizada no programa Gene Mapper v3.7.

3.3 PCR EM TEMPO REAL

A técnica de PCR em tempo real permite o acompanhamento de todo o

processo de amplificação do molde de RNA (cDNA) onde esta amplificação é

monitorada continuamente durante os ciclos que compõem uma reação habitual

de PCR. A síntese de cDNA foi realizada com o kit

High Capacity cDNA Archive

e as condições usadas foram as sugeridas pelo fabricante. A detecção direta do

produto de PCR é monitorada pela mensuração do aumento de fluorescencia

causada pela ligação de um corante que se liga a fita dupla de DNA. Quando

essa ligação ocorre há um aumento da fluorescencia deste composto sendo

então detectado no momento em que os ciclos estão acontecendo. Essa reação

foi realizada de acordo com o Kit iQ

SYBR

Green Supermix. Como controle foi

utlizado o gene da subunidade ribossomal 18S. Os primers utilizados foram:

18S-RNA-5’-CGATGCCTTAGCTGAGATAT-3’; 18S-RNA-5’-

GGTCCAAGAATTTCACCTCT-3’; EGFR-5’-CCTACGTGATGGCCAGCGTG-3’;

e EGFR-5’-GCTGGCCATGTAGGCTT-3’. Para a reação e detecção dos

produtos de PCR foi utilizado o aparelho Mx3000P.

3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA

A análise estatística foi realizada com o programa GraphPad Prism

versão 3.02 pelo Dr. Wei Zang, bioestatístico responsável do grupo de

Farmacogenética da Universidade de Chicago. Foram utilizados os testes de

Mann-Whitney U-Test ou não paramétrico Kruskal-Wallis test e Sperman, sendo

considerado significativo p<0,05.

RESULTADOS

4. RESULTADOS

4.1 CARACTERIZAÇÃO DA POPULAÇÃO ESTUDADA

O estudo foi realizado fibroblastos adquiridos no banco de células Coriell

(EUA). Dos indivíduos estudados, 33,8% eram do sexo feminino e 66,2% do

sexo masculino (gráfico 1), com idade variando entre 1 ano e 96 anos (gráfico

1). De acordo com a raça (Nebert & Menon, 2001), 69% eram caucasoídes,

15,5% negroídes, 1,4% mongolóides e 14,1% outras raças ou ausência de

informação (gráfico 2).

Distribui¨‹o da Idade dos indiv’duos de acordo com o sexo

F M

100

Sexo

Gráfico 1: Distribuição dos voluntários doadores das amostras de fibroblastos

utilizados para a avaliação dos polimorfismos no gene do EGFR de acordo com

a sexo e a idade. F- Feminino; M – Masculino.

Porcentagem das Raças Presentes no Estudo

Caucasóide Negróide Mongolóide Outros

Raças

Gráfico 2: Distribuição da raça dos voluntários doadores das amostras de

fibroblastos utilizados para a avaliação dos polimorfismos no gene do EGFR.

4.2 AVALIAÇÃO FENOTÍPICA DOS FIBROBLASTOS

4.2.1 ATIVIDADE CITOTÓXICA DA DROGA AG1478

A atividade citotóxica foi avaliada pelo método colorimétrico do

AlamarBlue. As células cultivadas e plaqueadas na concentração de 5000

células/poço foram incubadas com o AG1478 nas concentrações de 5, 10, 15 e

20µM por 72 horas sendo lidas em seguida no espectrofotômetro 570 e 600 nm

(gráfico 3). As células resistentes, foram tratadas com as doses de 20, 40 , 60 e

80µM até que se obtivesse a CI50 (concentração que inibe 50% do crescimento

celular) (gráfico 4). Os dados foram então analisados por um programa de

cálculo de CI50 (tabela 1, 2 e 3) que é utilizado e foi aprovado pelo grupo de

Farmacogenética (PharmGkB) americano, disponibilizado pelo Hospital Saint

Judes Children Hospital no Tenesse. A atividade da droga foi confirmada nas

células tumorais H-1993 e H-2170 com CI50 de 2,369 e 1,406µM,

respectivamente.

Curva Dose-Resposta de Fibroblastos Tratados com AG1478

100

120

140

160

180

0 5 10 15 20

Doses (mM)

GM03348D GM00023A

GM03652F F2

GM05294A GM00500B

GM05400 GM00726B

GM05758A GM01650B

GM03349C GM00038C

GM01864D GM00043B

GM01680A GM05658

GM01653A GM0037H

GM00323A GM01652B

GM05399 GM09503

GM03377C GM05381

GM02185B GM09918

GM01582A GM02673

GM04260B GM08400

GM08402 F1

GM00321A GM04390A

GM05659D GM00409B

GM01706A GM01681A

GM01651B GM00498B

GM05879C GM03440C

GM2674B GM08399A

GM2036A GM00288B

GM05565A GM08398

GM00731B GM02037C

GM03234 GM01717A

GM00495A GM05757B

GM03529A GM02938D

GM00967D GM00499B

GM00024B GM00316C

GM00408D GM00497D

GM01891A GM02623D

GM02937A GM03523A

GM03524A GM03525A

GM03651E GM03658A

GM08401

Gráfico 3: Curva Dose-Resposta de fibroblastos tratados por 72 horas com

inibidor de tirosina quinase do EGFR AG1478 nas concentrações de 5, 10, 15 e

20µM.

Curva Dose-Resposta de Fibroblastos Tratados com AG1478

100

120

0 20406080

Dose

GM00495A

GM01891A

GM03523A

GM03658A

GM00316C

GM03524A

GM00499B

GM08399A

GM03440C

GM00408D

GM05757B

GM02937A

GM03525A

GM08401

GM01717A

GM00497D

GM00498B

GM01582A

GM02938D

GM00967D

GM02673

GM03651E

GM03234

GM00731B

GM08398

GM02037C

GM03529A

GM00288B

GM00024B

GM02623D

Gráfico 4: Curva Dose-Resposta de fibroblastos com CI50 maior que 20µM

tratados com inibidor de tirosina quinase do EGFR AG1478 nas doses de 20, 40,

60 e 80µM por 72 horas. A linha tracejada em preto, indica o limite entre as

células com resistentes a AG1478 na dose de 80µM .

De acordo com o gráfico 4, observamos que mesmo na dose máxima

testada (80µM) existem células que não atingiram 50% de inibição de

crescimento.

Tabela 1: Porcentagem de efeito inibitório do AG1478 nas doses de 5µM e

20µM no grupo de fibroblasto sensíveis (CI50 < 10µM).

Fibroblastos

AG1478

5µM (%)

AG1478

20µM (%)

CI50 (µM)

GM03348D 58,46 17,14 5,54

GM00023A 62,13 25,42 6,98

GM03652F 100,95 15,30 7,16

F2 77,32 31,44 7,50

GM05294A 96,37 30,10 8,36

GM00500B 74,93 17,71 8,47

GM05400 94,21 30,21 8,60

GM00726B 88,42 27,85 8,60

GM05758A 83,30 17,11 8,74

GM01650B 94,80 32,58 8,84

GM03349C 96,68 37,00 8,98

GM00038C 100,46 44,39 9,87

Tabela 2: Porcentagem de efeito inibitório do AG1478 nas doses de 5µM e

20µM no grupo de fibroblastos com CI50 entre 10µM e 70µM.

Fibroblastos

AG1478

5µM (%)

AG1478

20µM (%)

CI50 (µM)

GM01864D 91,61 33,82 10,1

GM00043B 96,32 23,21 10,1

GM01680A 94,93 40,26 10,2

GM05658 112,69 30,85 10,7

GM01653A 100,02 36,28 11,1

GM0037H 92,51 38,66 11,1

GM00323A 96,31 35,00 11,3

GM01652B 100,27 38,72 11,4

GM05399 100,16 29,83 11,4

GM09503 97,82 34,03 11,4

GM03377C 100,97 28,01 11,5

GM05381 98,86 37,09 11,5

GM02185B 84,25 36,03 11,7

GM09918 100,23 37,58 11,9

GM01582A 101,74 44,46 12,8

GM02673 90,55 47,17 13,5

GM04260B 94,80 38,27 13,6

GM08400 99,25 44,68 13,6

GM08402 99,26 39,74 13,7

F1 99,17 43,24 13,8

GM00321A 96,52 38,14 13,8

Tabela 2 (continuação): Porcentagem de efeito inibitório do AG1478 nas doses

de 5µM e 20µM no grupo de fibroblastos com CI50 entre 10µM e 70µM .

Fibroblastos AG1478

5µM (%)

AG1478

20µM (%)

CI50 (µM)

GM04390A 101,62 40,45 13,9

GM05659D 98,37 41,65 14,1

GM00409B 99,41 41,70 14,7

GM01706A 114,10 46,99 15,2

GM01681A 98,99 47,32 15,8

GM01651B 101,16 46,62 15,9

GM00498B 93,43 44,34 16,0

GM05879C 127,88 46,79 16,4

GM03440C 154,26 49,58 16,4

GM2674B 100,81 40,65 16,5

GM08399A 98,94 52,54 18,5

GM2036A 107,70 47,25 19,0

GM00288B 110,85 49,00 19,1

GM05565A 99,80 45,83 19,5

GM08398 99,68 50,073 19,6

GM00731B 98,57 49,96 19,8

GM02037C 100,10 54,43 20,3

GM03234 96,46 51,68 20,4

GM01717A 96,47 41,03 21,5

GM00495A 99,76 52,77 22,0

GM05757B 99,18 56,72 22,4

GM03529A 101,09 79,94 25,8

GM02938D 98,77 59,22 26,2

GM00967D 99,68 73,81 42,5

GM00499B 94,51 53,95 70,4

Tabela 3: Porcentagem de efeito inibitório do AG1478 nas doses de 5µM e

20µM no grupo de fibroblastos resistentes (CI50 > 80µM).

Fibroblastos

AG1478

5µM (%)

AG1478

20µM (%)

CI50 (µM)

GM00024B 100,38 58,50 >80

GM00316C 99,38 59,19 >80

GM00408D 100,43 65,46 >80

GM00497D 110,91 57,25 >80

GM01891A 95,99 55,06 >80

GM02623D 106,34 65,39 >80

GM02937A 117,04 73,77 >80

GM03523A 96,93 55,07 >80

GM03524A 99,60 54,56 >80

GM03525A 118,95 65,35 >80

GM03651E 83,53 49,11 >80

GM03658A 98,53 73,94 >80

GM08401 102,01 48,57 >80

De acordo com as CI50, existe variabilidade entre as células analisadas:

17,14% foram sensíveis ao AG1478 (tabela 1), apresentando CI50 menores que

10µM, 65,72% apresentaram CI50 variando entre 10 e 70µM (tabela 2) e

17,14% foram resistentes ao tratamento com AG1478, não sendo possível

calcular a CI50 destas células, mesmo na concentração de 80µM (tabela 3).

Entretanto, podemos observar que há diferenças individuais na porcentagem de

efeito na dose de 20µM no grupo resistente, onde alguns indivíduos possuem

mais de 73% de sobrevida nesta dose enquanto outros possuem apenas 48%

de sobrevida (tabela 3). A média do coeficiente de variabilidade dos índices de

sobrevida das células nas concentrações testadas foi de 26%.

Curva Dose-Resposta de Fibroblastos Sens’veis versus

Fibroblastos Resistntes ao Tratamento com AG1478

100

120

140

0 5 10 15 20

Doses (mM)

GM03348D

GM00023A

GM03652F

GM05294A

GM00500B

GM05400

GM00726B

GM05758A

GM01650B

GM03349C

GM00038C

GM00024B

GM00316C

GM00408D

GM00497D

GM01891A

GM02623D

GM02937A

GM03523A

GM03524A

GM03525A

GM03651E

GM03658A

GM08401

Gráfico 5: Comparação das curvas dose-resposta dos grupos resistente (CI50 >

80µM) e sensível (CI50 < 20µM) ao AG1478. A linha tracejada em preto, indica o

limite entre as células com CI50 abaixo de 10µM e acima de 80µM .

Quando são comparados os grupos de fibroblastos sensíveis à AG1478

(CI50 < 10µM) e os resistentes a AG1478 (CI50 > 80µM) observamos mais

claramente que há diferença inter-individual entre eles (gráfico 5).

4.2.2 ATIVIDADE CITOTÓXICA DO GEFITINIB

A avaliação da atividade citotóxica do Gefitinib foi realizado pelo método

colorimétrico do AlamarBlue e obedecendo as mesma condições da droga

AG1478, descrita anteriormente. As células foram cultivadas e plaqueadas na

concentração de 5000 células/poço, sendo incubadas com o Gefitinib nas

concentrações de 10, 20, 40 e 60µM por 72 horas e lidas em seguida no

espectrofotômetro (gráfico 6). A atividade da droga foi confirmada nas células

tumorais H-1993 e H-2170 sendo a CI50 de >5 e 0,73µM, respectivamente.

Curva Dose-Resposta de Fibroblastos Tratados com Iressa

100

120

140

160

180

010204060

Dose

GM00023A GM03523A

GM01717A GM05381

GM02673 GM01891A

GM08398 GM05399

GM09503 GM03652F

GM00323A GM03348D

GM03651E GM04260B

GM02937A GM03234

GM0037H GM05400

GM02938D GM00731B

F1 GM2036A

GM05658 GM00321A

GM00409B GM03524A

GM08402 GM00499B

GM01653A GM00038C

GM00967D GM05565A

GM05659D GM09918

GM03529A GM01652B

GM03349C GM03525A

GM00024B GM02037C

GM02623D GM04390A

GM01651B GM01706A

GM05758A GM05294A

GM01681A GM05879C

GM08401 GM00043B

GM00288B GM01680A

GM01650B

Gráfico 6: Curva Dose-Resposta de fibroblastos tratados por 72 horas com

inibidor de tirosina quinase do EGFR gefitinib

nas concentrações de 10, 20, 40 e

60µM.

As células que não foram possíveis determinar a CI50, foram submetidas

a um novo tratamento com as doses de 10, 20, 30 e 40µM (gráfico 7). Os dados

foram então analisados por um programa de cálculo de CI50 utilizado e

aprovado pelo grupo de Farmacogenética (PharmGkB) americano,

disponibilizado pelo Hospital Saint Judes Children Hospital no Tenesse.

Curva Dose-Resposta de Fibroblastos Tratados com Iressa

100

120

140

010203040

Doses (mM)

GM08400

GM00498B

GM01864D

GM03377C

GM05757B

GM2674B

GM02185B

GM00500B

GM08399A

GM00408D

GM01582A

GM03440C

GM00316C

GM00497D

GM00726B

GM00495A

GM03658A

Gráfico 7: Curva Dose-Resposta de fibroblastos sensíveis ao tratamento com

gefitinib por 72 horas. As células foram re-incubadas com gefitinib nas

concentrações de 10, 20, 30 e 40µM.

De acordo com as CI50, observamos que 12,68% foram sensíveis ao

Gefitinib (tabela 4), apresentando CI50 menores que 20µM, 61,97%

apresentaram CI50 maior que 20µM e menor que 30µM (tabela 5) e 25,35%

maior que 30µM (tabela 6). A variação entre os grupos não parece evidente para

o modelo com o gefitinib como agente inibidor de tirosina quinase. A média do

coeficiente de variabilidade dos índices de sobrevida das células nas

concentrações testadas foi de 69%.

Tabela 4: Porcentagem de efeito inibitório do gefitinib nas doses de 20µM e

40µM no grupo de fibroblastos sensíveis (CI50 < 20µM).

Fibroblastos

Gefitinib

20µM (%)

Gefitinib

40µM (%)

CI50 (µM )

GM00023A 22,49 4,87 12,29

GM03523A 36,20 0,69 14,77

GM01717A 30,16 11,00 14,88

GM05381 37,98 14,75 17,09

GM02673 40,30 12,19 17,6

GM01891A 43,14 7,60 18,35

GM08398 45,93 10,43 18,93

GM05399 48,65 0,54 19,65

GM08400 46,91 3,10 19,71

Tabela 5:

Porcentagem de efeito inibitório do gefitinib nas doses de 10µM e

40µM no grupo de fibroblastos sensíveis com CI50 maior que 20µM e menor

que 30µM.

Fibroblastos

Gefitinib

20µM (%)

Gefitinib

40µM (%)

CI50 (µM )

GM09503 50,73 6,11 20,04

GM03652F 26,17 5,83 20,1

F2 55,62 3,27 20,3

GM00323A 53,09 8,05 20,31

GM03348D 65,07 5,719 20,72

GM03651E 53,04 8,48 20,94

GM04260B 55,16 8,51 20,99

GM00498B 60,31 4,11 21,31

GM02937A 65,17 7,62 21,34

GM03234 73,53 10,65 22,1

GM0037H 69,86 13,14 22,13

GM05400 65,95 7,98 22,22

GM02938D 73,72 9,37 22,3

GM01864D 70,55 3,59 22,46

GM00731B 62,77 4,56 22,91

F1 62,47 11,86 22,95

GM2036A 68,75 14,87 23,1

GM03377C 84,68 2,43 23,39

GM05658 79,85 5,08 23,5

GM00321A 65,70 2,39 23,57

GM00409B 69,23 10,29 23,61

GM05757B 66,60 9,93 23,66

GM2674B 88,65 3,97 23,68

GM02185B 73,98 6,32 24,34

GM03524A 76,37 7,75 24,35

Tabela 5 (continuação): Porcentagem de efeito inibitório do gefitinib nas doses

de 10µM e 40µM no grupo de fibroblastos sensíveis com CI50 maior que 20µM

e menor que 30µM.

Fibroblastos

Gefitinib

20µM (%)

Gefitinib

40µM (%)

CI50 (µM )

GM08402 77,37 8,14 24,4

GM00500B 92,02 0,85 24,43

GM00499B 86,24 9,51 24,45

GM01653A 75,69 11,01 24,67

GM08399A 88,92 7,84 24,97

GM00408D 94,10 11,58 25,51

GM00038C 87,56 11,98 25,63

GM00967D 65,15 18,81 25,68

GM05565A 84,56 12,89 25,79

GM05659D 73,52 10,69 25,85

GM09918 96,08 8,78 25,98

GM01582A 96,86 2,86 26,24

GM03440C 83,08 11,25 26,81

GM00316C 94,22 20,84 27,73

GM03529A 94,84 9,019 28,79

GM00497D 87,05 29,27 28,84

GM01652B 89,93 12,91 28,86

GM03349C 96,01 18,20 29,31

GM03525A 83,85 25,18 29,98

Tabela 6: Porcentagem de efeito inibitório do gefitinib nas doses de 10µM e

40µM no grupo de fibroblastos (CI50 > 30µM).

Fibroblastos Gefitinib Gefitinib CI50 (µM )

20µM (%) 40µM (%)

GM00024B 88,78 17,32 30,27

GM00726B 111,27 16,85 30,46

GM00495A 99,35 3,17 31,33

GM02037C 91,17 22,21 31,64

GM02623D 90,14 19,89 31,66

GM04390A 92,63 19,77 31,82

GM01651B 93,84 39,43 32,16

GM03658A 99,21 35,55 32,75

GM01706A 87,65 37,33 33,11

GM05758A 88,00 31,01 33,79

GM05294A 93,06 38,80 34,29

GM01681A 89,45 36,17 34,91

GM05879C 89,678 47,46 38,39

GM08401 148,23 46,08 38,75

GM00043B 90,81 48,92 39,41

GM00288B 101,31 56,34 42,31

GM01680A 97,12 58,82 43,63

GM01650B 129,02 75,38 51,54

Curva Dose-Resposta de Fibroblastos Sensíveis versus

Fibroblastos Resistentes ao Tratamento com Iressa

100

120

140

160

180

010204060

Doses (mM)

GM00023A

GM03523A

GM01717A

GM05381

GM02673

GM01891A

GM08398

GM05399

GM02037C

GM02623D

GM04390A

GM01651B

GM01706A

GM05758A

GM05294A

GM01681A

GM05879C

GM08401

GM00043B

GM00288B

GM01680A

GM01650B

Gráfico 8: Comparação das curvas dose-resposta dos grupos resistente (CI50 >

30µM) e sensível (CI50 < 20µM) ao gefitinib. A linha tracejada em preto, indica

que na dose de 20µM podemos observar que há uma diferença na resposta

celular.

De acordo com o gráfico 8, podemos observar que existe variabilidade

entre as células, mas essa parece ser tênue quando comparamos com os

valores das CI50 (tabelas 4, 5 e 6) . Entretanto, quando observamos o gráfico 8

e a porcentagem do efeito celular na dose de 20µM (tabelas 4, 5 e 6) em todos

os indivíduos analisados, observamos que há uma diferença entre eles, onde

uns apresentam sobrevida de apenas 23% enquanto outras apresentam

sobrevida de 100% na dose de 20µM .

4.2.3 ATIVIDADE CITOTÓXICA DO ERLOTINIB

De acordo com as doses testadas, não foi possível utilizar o Erlotinib para

os ensaios de citotoxicidade, pois a concentração máxima tolerada pelo meio

não foi suficiente para inibir 50% do crescimento celular. A atividade da droga foi

confirmada nas células tumorais, H-1993 e H-2170, com CI50 correspondentes a

>5 e 1,3µM, respectivamente.

4.3 AVALIAÇÃO DO GENÓTIPO DOS FIBROBLASTOS PARA O GENE DO

EGFR

O gene do EGFR possui 28 éxons. O polimorfismo na região promotora

do gene (-216 G/T) e no éxon 13 (R497K) foi realizada através da técnica de

RFLP (Restriction Fragment Lenth Polymorphism). Para genotipagem do

polimorfismo 787C/T no éxon 20 foi utilizado snapshot (ou single base

extension). Para detecção de microssatélite no Intron 1 foi utilizado GENESCAN

e para análise o softwear GENE MAPPER v3.7. Para confirmação dos produtos

de PCR foi utilizado gel de agarose a 2% e para a genotipagem gel de

poliacrilamida a 10%. Duas células tumorais de pulmão (H-1993 e H-2170)

foram utilizadas como controle dos genótipos.

4.3.1 POLIMORFISMO R497K

As células foram cultivadas em meio completo MEM (15% SFB e 2µM de

L-glutamina) até atingir a confluência, para posteriormente ser extraído o DNA.

As amostras foram digeridas pela enzima Bst1 que tem especificidade para alelo

G e analisadas em gel de poliacrilamida 10 % (Figura 8). Das células analisadas,

56,34% apresentaram genótipo GG, 33,80% genótipo GA e 9,86% genótipo AA.

Em relação a freqüência, o alelo G esta presente em 73,24% dos fibroblastos e

o alelo A em 26,76%.

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Figura 8:

Genotipagem do SNP R497K no éxon 13 do gene EGFR 1. Os

produtos de PCR foram submetidos a tratamento com a enzima de restrição

BstN I, sendo observado dois padrões homozigotos (GG e AA) e um padrão

heterozigoto (GA).

1651B 316C 5294A 3658A 1653A 43B 5399 8399A 500B 2673 F2 3440C 2037C 3349C

4.3.2 POLIMORFISMO -216 G/T

As células foram cultivadas em meio completo MEM (15% SFB e 2µM de

L-glutamina) até atingir a confluência, para que posteriormente ser extraído o

DNA. As amostras foram digeridas pela enzima Bse RI que tem especificidade

para alelo T e analisadas em gel de poliacrilamida 10% (Figura 9). Das células

analisadas, 8,45% apresentaram genótipo TT, 47,89% genótipo GT e 43,66%

genótipo GG. Em relação à freqüência, o alelo G esta presente em 67,60% dos

fibroblastos e o alelo T em 32,40%.

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Figura 9: Genotipagem do SNP -216G/T na região promotora do gene EGFR 1.

Os produtos de PCR foram submetidos a tratamento com a enzima de restrição

BseR I, sendo observado dois padrões homozigotos (GG e TT) e um padrão

heterozigoto (GT).

2036A 3529A 23A 1582A 8401 1864D 5381 5659D 1651B 316C 5294A 3658A 1653A

4.3.3 POLIMORFISMO 787 C/T

O DNA das células cultivadas foi submetido a reação de PCR para o

polimorfismo 787C/T no gene do EGFR. Depois de confirmada a amplificação da

seqüência de interesse e a reação de

“snapshot”, as amostras foram submetidas

ao GENESCAN e analisadas no gene mapper v3.7, onde vermelho indica o alelo

T e preto o alelo C (Figura 10). Das células analisadas, 35,60% apresentaram

genótipo TT, 49,15% genótipo CT e 15,25% genótipo CC. Em relação à

freqüência, o alelo C esta presente em 39,83% da amostra e o alelo T em

60,17%.

GM288B

GM2673

GM731B

Figura 10: Genotipagem do SNP 787C/T no gene do EGFR. O pico vermelho

representa o alelo C e o pico preto representa o alelo T. Um pico indica os

indivíduos homozigotos e dois picos indica indivíduos heterozigotos.

4.3.4 ANÁLISE DE MICROSSATÉLITE NO INTRON 1

Para análise de microssatélite foi utilizado reação de PCR com primer

marcado com fluorescência. Depois de confirmada a amplificação da seqüência

de interesse, as amostras foram submetidas ao GENESCAN e analisadas no

gene mapper v3.7 (Figura 11). Como controle foi usado uma amostra de

fibroblasto (GM 4260B) com genótipo conhecido (heterozigoto) previamente. Os

resultados mostram que existem diversas combinações de alelos CA entre os

indivíduos: 14/17 (1), 15/16 (1), 15/21 (1), 16/16 (10), 16/17 (6), 16/18 (11),

16/19 (2), 16/20 (11), 16/21 (6), 17/17 (1), 17/20 (3), 17/21 (3), 18/18 (2), 18/20

(5), 19/20 (2), 19/21 (1), 20/20 (3) e 20/21 (2). Entretanto, podemos observar que

mais da metade dos indivíduos (67%) possuem pelo menos 1 alelo com 16

repetições.

Figura 11:

Análise de Microssatélites CA no Intron 1 do gene EGFR. Para

determinação do numero de repetições CA, deve-se usar um controle

previamente seqüenciado e então comparar os maiores picos com os maiores

picos dos fibroblastos usados no trabalho. Gráficos com pico único refere-se a

homozigoto para o numero de repetições. Na figura acima, o controle possui um

alelo com 16 repetições e o outro alelo com 20 repetições.

4.4 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA

A avaliação da expressão de EGFR nas células foi realizada com a

técnica de PCR em tempo real (RT-PCR). Para isso, o RNA das células foi

isolado, sendo realizado RT-PCR para obtenção de cDNA e em seguida PCR

em tempo real. Como controle interno foi utilizado a subunidade ribossomal18S.

De acordo com os resultados, a variabilidade entre as amostras foi de 60% para

o EGFR e de 40% para a subunidade 18S. Como a análise deve ser realizada

GM 9503

Controle

GM 23A

com a razão entre estes dois genes, não foi observada variabilidade na

expressão do EGFR nas amostras.

4.5 IDENTIFICAÇÃO DOS HAPLÓTIPOS

Para identificação de haplótipos com o polimorfismo -216 encontrado na

região promotora e o número de repetições CA no intron 1, foram selecionada as

amostras duplo heterozigoto ou heterozigoto composto para os dois

polimorfismos ao mesmo tempo. Para cada indivíduo, foi realizada uma reação

de PCR alelo específico G ou T do polimorfismo -216G/T e o intron 1 (Figura

12). Em seguida, as amostras foram levadas ao sequenciador GENESCAN v3.7

para determinação do numero de repetições CA em cada alelo independente

(adendo 5).

Figura 12: Análise do número de repetições CA no Intron 1 e os alelos G e T na

região promotora do gene EGFR. Cada alelo foi discriminado por PCR e em

seguida submetiso a análise de microssatélite. Como controle foi utilizado uma

amostra conhecida com 16 e 20 repetições CA. Para genotipagem, cada alelo foi

analisado observando-se o último pico detectado pelo seqüenciador, sendo

então comparado com o controle.

De acordo com os dados gerados, observamos que dentro do grupo

heterozigoto há uma correlação (p < 0,02) entre um menor número de repetições

GM 4260B

Alelo T

Alelo G

CA e o alelo T (gráfico 9). Entretanto, se forem considerado todos os alelos,

homozigotos e heterozigotos, tanto para -216G/T como intron1, não observamos

essa correlação, provavelmente pela maior freqüência de alelo (67%)

encontrado na população estudada.

Distribui¨‹o dos Alelos T e G em rela¨‹o ao Nmero

de Repeti¨›es CA no Intron I

16 17 18 19 20 21

Repeti¨›es CA

Gráfico 9: Determinação do numero de repetições CA no intron 1 em cada alelo

(G e T) da região promotora do gene do EGFR. Observa-se que no alelo T há

menos repetições CA no íntron 1.

4.6 ESTUDO FUNCIONAL: ASSOCIAÇÕES ENTRE FENÓTIPO E GENÓTIPO

As indicações de variabilidade fenotípica nos dois modelos experimentais

(AG1478 e Gefitinib) e as diferentes influências dos polimorfismos na biologia

celular desencadearam o interesse de determinar se há ou não influência

desses polimorfismos tanto na resposta citotóxica quanto na expressão de

EGFR.

De acordo com as análise, há correlação entre a dose de 5µM e 10µM de

AG1478 e o polimorfismo R497K (p<0,01 e p<0,05, respectivamente), com uma

maior inibição do crescimento celular em alelos com a variação K (lisina) em

comparação com a variação R (arginina). Para os demais polimorfismos não foi

observada nenhuma correlação entre atividade citotóxica do AG1478 e -216G/T,

787C/T e intron 1. Entretanto, há uma tendência dos indivíduos sensíveis a

AG1478 apresentarem o genótipo CC para o polimorfismo 787C/T. Esse achado

se torna importante visto o desconhecimento da função deste polimorfismo.

Em relação a expressão de RNAm, observou-se que há um aumento de

27% na expressão de EGFR nos indivíduos homozigotos -216T em relação aos

homozigotos -216G. Não foi observado correlação entre a expressão de RNAm

e a atividade citotóxica de AG1478 e gefitinib, bem como com os polimorfismos

787C/T, intron 1 e R497K.

5. DISCUSSÃO

Entende-se por câncer, um conjunto de doenças que se caracteriza por um

crescimento desordenado das células levando a formação de tumores. As

células tumorais costumam ser agressivas e de difícil controle podendo

espalhar-se para outras partes do corpo (metástase) através da corrente

sanguínea, dando origem a novos tumores. Um dos tratamentos mais

conhecidos no combate ao câncer é a quimioterapia. Diferente da cirurgia e da

radioterapia, a quimioterapia é uma forma de tratamento sistêmico, ou seja, que

atua em todo o corpo, no entanto, quando há formação de metástases muitas

vezes, a quimioterapia passa a ser a melhor forma de tratamento.

Os quimioterápicos, no entanto, não atuam exclusivamente sobre as

células tumorais, as estruturas normais que se renovam constantemente, como

a medula óssea, os pêlos e a mucosa do tubo digestivo, são também atingidas

pela ação dos quimioterápicos. Há uma margem muito tênue entre os efeitos

terapêuticos e tóxicos dos quimioterápicos, onde a ocorrência desses efeitos

depende, do tempo de exposição, da concentração plasmática da droga

(Instituto Nacional do Câncer-INCA, 2006) e mais recentemente do padrão

genético de cada paciente. O ajuste da dose pela área de superfície corpórea

não corrige essas diferenças interindividuais (Innocenti & Ratain, 2002).

A observação de que um paciente apresentou uma resposta exagerada

ou desenvolveu uma reação inesperada à droga, tem sido ponto inicial para

muitos estudos farmacogenéticos. Tal variação se dá desde uma falha na

resposta a um medicamento, ocorrência de reações adversas e interações

droga-droga, quando várias delas são administradas concomitantemente. As

conseqüências clínicas variam desde um desconforto do paciente até uma

fatalidade ocasional. Com isso, a potência intrínseca dos agentes anti-

neoplásicos e a sua administração na dose máxima tolerada pelo paciente torna

o tratamento quimioterápico um grande risco para pacientes que estão fora dos

padrões populacionais de “normalidade” (Innocenti & Ratain, 2002). Esses

“padrões de normalidade” podem estar relacionados com a idade, a etnicidade,

o uso de medicamentos ou suplementos alimentares concomitantes ao

tratamento, costumes, estilo de vida.

Embora se tenha reconhecido durante anos que a toxicidade a agentes

quimioterápicos fosse um problema clínico substancial, apenas na última década

foram desenvolvidos medicamentos denominados alvo-específico, como o

gefitinib, erlotinib, cetuximab que são inibidores de tirosina quinase do EGFR.

Estes medicamentos se ligam a moléculas específicas inibindo o crescimento

tumoral, tendo como principal atrativo à baixa toxicidade nas células normais, e

com isso aumentando a tolerabilidade ao tratamento (de Bono

et al., 2003;

Jimeno & Hidalgo, 2005). Entretanto, nem sempre há uma ausência total de

toxicidade nas células normais. Este fato se torna bastante interessante na

busca de marcadores biológicos de predição terapêutica ou toxicológica. Sendo

um medicamento de alvo conhecido, teoricamente torna-se “mais fácil” a

identificação deste marcador.

O estudo com inibidores de tirosina quinase do EGFR teve como suporte

as observações clínicas de correlação entre resposta terapêutica e

rash cutâneo

(Pérez-Soler, 2003; Pérez-Soler & Saltz, 2005). Este trabalho, no entanto, é o

primeiro que avaliam as possíveis correlações entre polimorfismo no gene EGFR

de células normais (germline polymorphism) e a resposta terapêutica.

Um dos fatores importantes no estudo da farmacogenética é o sexo e a

raça. Dos indivíduos incluídos no estudo, 33,8% eram do sexo feminino e 66,2%

do sexo masculino, com idade variando entre 1 e 96 anos. Já em relação a raça,

69% eram caucasoídes, 15,5% negroídes e 1,4% mongolóides. Não houve

correlação entre sexo, raça e resposta anti-proliferativa. A análise fenotípica foi

realizada com dois inibidores da tirosina quinase do EGFR, o gefitinib e o

AG1478, onde se pode observar que há diferença de comportamento ou

mecanismo entre estas duas drogas, apesar de ambas agirem no mesmo alvo.

Essa variação de mecanismo também foi observada por Amann e colaboradores

(2005) em células tumorais (NSCLC)

in vitro tratadas com diferentes inibidores

de EGFR.

Estudos prévios com inibidores de tirosina quinase, demonstraram que

apenas 10% dos pacientes com câncer se beneficiam desta terapia (Cohen

., 2004). Os resultados fenotípicos mostram que 17,14% dos indivíduos foram

sensíveis ao AG1478 e 12,68% foram sensíveis ao gefitinib. As células tratadas

com AG1478 apresentam evidências de inter-variabilidade entre os doadores em

relação à resposta a esse agente, onde 17,14% foram sensíveis ao AG1478

(CI50 < 10µM), 65,72% tiveram uma sensibilidade intermediária (CI50 variando

entre 10 e 70µM) e 17,14% foram resistentes (CI > 80µM). Analisando cada

indivíduo em relação ao percentual de crescimento das células na dose de 20µM

observou-se que houve diferença expressiva entre a inibição destas células: no

grupo sensível há indivíduos com 82% de inibição e outros com 66%; no

intermediário, os com CI50 entre 10µM e 20µM possuem uma variação de 77%

de inibição em alguns indivíduos e 50% em outros, já os com CI50 maior que

20µM e menor que 80µM, essa variação chega a ser de 48% em alguns

indivíduos e 26% em outros; e, no grupo resistente à inibição varia de 51% a

26% . Os dados mostraram que mesmo aumentando a dose de AG1478 o

percentual de inibição, em algumas células, não muda, essa observação é mais

evidente nos indivíduos considerados resistentes ao tratamento com AG1478,

onde não houve variação da percentagem de inibição mesmo com o aumento da

dose de 20µM para 80µM, por isso, provavelmente, não foi possível calcular a

CI50 destes indivíduos.

No modelo com gefitinib a faixa de variabilidade não foi tão ampla como

no modelo com AG1478, 12,68% foram sensíveis ao gefitinib (CI50 < 20µM),

61,97% teve uma sensibilidade intermediária (CI50 maior que 20 e menor que

30µM) e 25,35% (CI50 > 30µM). A relação do percentual de crescimento das

células na dose de 40µM em cada indivíduo mostrou uma diferença expressiva

entre eles. No grupo sensível há indivíduos com 99,5% de inibição e outros com

85%; no intermediário, os com CI50 entre 20µM e 30µM possuem uma variação

de 99,1% a 71%; e, no grupo com CI50 > 30µM encontrou-se indivíduos com

97% de inibição enquanto outros apresentam apenas 25%.

De acordo com Herbst (2004), nas células normais existem cerca de

40.000 a 100.000 receptores/célula. De acordo com estudos farmacogenéticos

existentes na literatura, existem variações inter-individuais que tornam cada

indivíduo único, podendo assim, cada célula apresentar quantidades de

receptores diferentes. Quando ocorre saturação destes receptores nas células

pelos inibidores de tirosina quinase, o aumento da dose não influência mais na

resposta terapêutica. Este processo de saturação total pode levar ao processo

de apoptose e assim diminuir a massa tumoral de pacientes com câncer. Em

células onde não houve saturação total dos receptores, elas podem desenvolver

um mecanismo de resistência, sobreviver e voltar a se dividir (Pao

et al., 2005)

ou necessitar de um maior tempo de exposição para desencadear a resposta

inibitória esperada. Estudos em células tumorais

in vitro demonstraram que

algumas células melhoraram sua resposta terapêutica aos inibidores de tirosina

quinase quando já haviam sido expostas a algum tipo de terapia, seja radio ou

quimioterapia (Knight

et al., 2004). O mecanismo de resistência estabelecido por

essas células pode ser um outro mecanismo pela qual se observa variação na

resposta das células tratadas com AG1478 e gefitinib, já que não existi nenhuma

informação sobre os tratamento e drogas utilizadas previamente pelos doadores

das células estudadas.

Em 2004, Lynch e colaboradores e Paez e colaboradores demonstraram

o envolvimento de deleções e mutações pontuais no éxon 19 e 21 do gene

EGFR, regiões codificadoras do resíduo tirosina quinase, com a resposta ao

gefitinib e que o tecido normal destes pacientes não apresentam estas

mutações. Pacientes que não responderam a terapia com gefitinib, também não

possuíam mutações ou deleções nos éxons 19 e 21. Estudos preliminares

também demonstraram que existe uma forte associação dose-dependente entre

a ocorrência de

rash cutâneo e a resposta terapêutica (Pérez-Soler et al., 2003;

Pérez-Soler & Saltz, 2005), entretanto, essa associação é menos consistente

com o uso do gefitinib (Pérez-Soler & Saltz, 2005), o que pode explicar a

pequena intervariabilidade observada na CI50 no modelo com este

medicamento.

Estudos com células tumorais demonstraram a existência de diferentes

polimorfismos que podem interferir na funcionabilidade do EGFR, ou alterando a

trandução do sinal (Moriai

et al., 1994), ou aumentando a sua transcrição (Liu et

., 2003; Liu et al., 2005). Como há uma correlação entre resposta e

manifestações cutâneas, deve-se tentar encontrar o que existe em comum entre

a célula tumoral e a célula normal. De acordo com os polimorfismos estudados,

R497K, -216G/T, 787C/T e repetição CA no intron 1, não houve associação

entre estes e as CI50 das drogas testadas. No entanto, quando analisado o

percentual de efeito em cada dose individualmente, observou-se que há

correlação entre resposta ao tratamento com AG1478 nas doses de 5µM

(p<0,01) e 10µM (p<0,05) e os indivíduos portadores do alelo K observado no

polimorfismo R497K. Esse polimorfismo é caracterizado por uma mudança de

apenas um nucleotídeo no éxon13, região codificadora do domínio extracelular

do EGFR, levando a uma substituição de arginina (EGFR-497R) para lisina

(EGFR-497K) no códon 497 (Moriai

et al., 1993). Células que expressam a

variante EGFR-497K demonstraram ativar uma via menos mitogênica que as

que carregam a variante EGFR-497R (Moriai

et al., 1994). Logo, proliferando

menos, torna-se mais fácil o bloqueio do EGFR nestas células, saturando os

seus receptores mais rápido e com isso melhorando a reposta nos indivíduos

que possuem este polimorfismo. Além disso, é possível que, de alguma forma, o

domínio extracelular do EGFR que possui a substituição arginina-lisina module a

eficiência no recrutamento de substratos intracelulares para o receptor ativado

e/ou permita a ativação de vias de sinalização alternativas que não levam a

indução eficiente de proto-oncogenes nucleares e subseqüente estímulo do

crescimento celular.

A hipótese de que a porção extracelular do receptor EGFR pode

representar uma importante região reguladora é suportada pela observação de

que 7 resíduos

upstream do códon 497 e 5 resíduos downstream são

conservados nos receptores de ratos, camundongos e humanos (Moriai

et al.,

1994). Nossos resultados corroboram com estes achados. O fato de haver

significância nas duas doses menores (5 e 10µM) e não nas duas maiores dose

(15 e 20µM) indica que, provavelmente, estes indivíduos doadores destas

células necessitam de uma menor dose para desencadear a resposta

terapêutica desejada. Nos indivíduos resistentes (>80mM) outros mecanismos

podem estar envolvidos como mutações no gene

ras que demonstrou estar

presente em células tumorais resistentes ao tratamento com inibidores de EGFR

(Eberhard

et al., 2005; Pao et al., 2005).

A variabilidade individual na resposta a inibidores de tirosina quinase tem

levado a busca incessante de um marcador biológico que possa selecionar os

pacientes que se beneficiaram com esta terapia. Em 2005, Liu e colaboradores

demonstraram a presença do polimorfismo -216G/T na região promotora do

gene EGFR. O polimorfismo -216G/T se localiza no sitio de reconhecimento do

fator de transcrição Sp1, sendo este fator importante na atividade promotora do

gene EGFR. Não houve correlação entre este polimorfismo e a CI50, entretanto,

de acordo com a genotipagem dos fibroblastos, foi observado um aumento de

27% na expressão de EGFR nos indivíduos homozigotos T em comparação com

os heterozigotos G. Esse resultado mostra uma correlação positiva com os

achados de Liu e colaboradores (2005) que demonstraram que a afinidade para

proteínas nucleares foi maior no alelo T do que no alelo G e que o nível de

expressão de EGFR foi 40% maior nos alelos T.

Os estudos funcionais de alterações encontradas no gene do EGFR

podem levar a uma maior elucidação do seu envolvimento na resposta

terapêutica e no desenvolvimento do

rash cutâneo nos pacientes tratados com

inibidores de tirosina quinase. O estudo funcional do polimorfismo 787C/T no

domínio tirosina quinase do EGFR parece não exercer influência nos níveis de

expressão do EGFR e na atividade citotóxica dos dois agentes testados.

Entretanto, foi observado uma tendência no genótipo CC para os indivíduos

sensíveis ao AG1478. Provavelmente, um estudo multicêntrico, com um maior

número de indivíduos e com etnicidades diferentes, torne essa correlação mais

evidente.

Em 1992, Chi e colaboradores demonstraram que repetições

dinucleotídicas (citosina e adenina) no intron 1 do EGFR possui uma relação

intrínseca com a transcrição gênica. De acordo com diferentes autores

(Gebhardt

et al., 1999; Amador et al., 2004), há uma relação inversa entre o

número de repetições CA e a transcrição gênica. De acordo com os resultados

observados no presente estudo, não houve correlação entre o numero de

repetição CA no intron 1 e a CI50 das células tratadas com AG1478 e gefitinib

os níveis de RNAm nos fibroblastos. Os estudos encontrados na literatura até o

presente momento referem-se ao tratamento de células tumorais. Os

mecanismos envolvendo as alterações genéticas são diferentes na célula normal

e na células tumoral, o que pode influenciar na resposta terapêutica (Amador

., 2004). Outros estudos e variações no protocolo devem ser realizados para

elucidação do provável envolvimento deste polimorfismo na resposta aos

inibidores de tirosina quinase e o

rash cutâneo apresentado pelos pacientes,

visto que há evidência que este polimorfismo é detectado nas células normais e

se mantém nas células tumorais do mesmo indivíduo (Amador

et al., 2004).

A influência de polimorfismos na resposta biológica pode ser individual ou

em grupo. A ocorrência de um polimorfismo pode ou não vir acompanhada de

um outro polimorfismo, desencadeando o efeito biológico. Em 2005, Liu e

colaboradores demonstraram que o polimorfismo -216G/T e o microssatélite no

intron1 (CA)n não estão em

linkage desequilibrium (LD), indicando que a

ocorrência de um não depende da ocorrência do outro. No estudo proposto

também não foi observado LD entre o polimorfismo -216G/T e o intron1.

Entretanto, quando analisado apenas os indivíduos heterozigotos foi observado

que indivíduos portadores do alelo T apresentam também uma seqüência mais

curta de repetições CA. O aumento do número de casos poderia levar a um

aumento na correlação entre esse dois polimorfismos.

Apesar, da vasta literatura sobre o EGFR e seus inibidores, muita dúvidas

ainda precisam ser elucidadas. Observações clínicas indicam que há uma

estreita ligação entre resposta terapêutica e polimorfismo e resposta terapêutica

rash cutâneo. Resta descobrir a interseção entre eles e assim apresentar um

preditor de resposta terapêutica para os pacientes que se beneficiariam com o

so de inibidores de tirosina quinase do EGFR.

6. CONCLUSÃO

Os resultados observados sugerem que há diferença entre os

mecanismos de ação dos inibidores de tirosina quinase do EGFR1 e que há

diferença de resposta nos diferentes indivíduos tratados com AG1478, sendo

este o melhor modelo para se estudar a citotoxicidade

in vitro destes agentes.

Apenas o polimorfismo R497K está associado a resposta terapêutica nas células

tratadas com AG1478. Este polimorfismo deve ser investigado em um maior

número de indivíduos podendo ser utilizado no futuro como um marcador de

resposta terapêutica. Outros alvos como oncogenes, transportadores e

mediadores podem estar contribuindo para a ausência ou presença de resposta

nos indivíduos tratados com esses inibidores.

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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