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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
MARCUS DAVIS MACHADO BRAGA
Avaliação dos efeitos renais e vasculares do veneno da
Bothrops insularis e de frações isoladas
Fortaleza
2006
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
MARCUS DAVIS MACHADO BRAGA
Avaliação dos efeitos renais e vasculares do veneno da Bothrops
insularis e de frações isoladas.
Tese de Doutorado submetida à
Coordenação do Curso de Pós-
Graduação em Farmacologia do
Departamento de Fisiologia e
Farmacologia da Universidade Federal do
Ceará, como requisito parcial para
obtenção do título de Doutor em
Farmacologia.
Orientadora: Prof
a
. Dra. Helena Serra Azul Monteiro
Co-orientadora: Prof
a
. Dra. Maria Alice Costa Martins
FORTALEZA
2006
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B794a Braga, Marcus Davis Machado
Avaliação dos efeitos vasculares e renais do veneno
da Bothrops insularis e de frações isoladas
Braga._ Fortaleza, 2006
238 f.: il.
Orientador: Profa. Dra. Helena Serra Azul Monteiro
Tese (Doutorado). Universidade Federal do Ceará.
Faculdade de Medicina.
1. Venenos de cobra 2. Bothrops 3. Rim - efeito de drogas
4. Lectina 5. Trombina 6. Fosfolipases A 7. L-aminoácido oxidases
I. Monteiro, Helena Serra Azul (Orient.) II. Título
CDD 615.942
MARCUS DAVIS MACHADO BRAGA
Avaliação dos efeitos sistêmicos, renais e vasculares do veneno da
Bothrops insularis e de frações isoladas.
Tese de Doutorado submetida à Coordenação
do Curso de Pós-Graduação em
Farmacologia do Departamento de Fisiologia
e Farmacologia da Universidade Federal do
Ceará, como requisito parcial para obtenção
do título de Doutor em Farmacologia.
Aprovada em: 07 de março de 2006
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________
Prof
a
. Dra. Helena Serra Azul Monteiro (Orientadora)
_______________________________________________
Prof.: Dr. Marcos Hikari Toyama
_______________________________________________
Prof.: Dr. Talapala Govindaswamy Naidu
_______________________________________________
Prof
a
.: Dra. Nylane Maria Nunes Alencar
_______________________________________________
Prof
a
.: Dra. Arlandia Cristina Lima Nobre de Morais
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
¾ Professora Helena Serra Azul Monteiro, pela orientação e exemplo que me
tem dispensado ao longo da vida profissional, que transcende a atividade
didática.
¾ Professor Ronaldo de Albuquerque Ribeiro pelo estímulo ao aprimoramento
profissional.
¾ Professor Livino Virgínio Pinheiro Junior, pelo exemplo de mestre, apoio
e colaboração, indispensáveis para a elaboração deste trabalho.
¾ Professor Paulo Roberto de Carvalho Almeida pelo estímulo, apoio,
colaboração e exemplo de humildade.
¾ Professor Dalgimar Bezerra de Meneses pelo apoio nos exames
histopatológicos.
AGRADECIMENTOS
¾ A todos os professores do curso de doutorado do Departamento de Fisiologia
e Farmacologia da Universidade Federal do Ceará, pelos ensinamentos a
mim transmitidos.
¾
Ao Instituto de Biomedicina da Universidade Federal do Ceará.
¾
Ao Prof. Dr. Marcos Hikari Toyama, ao Prof. Dr. Talapala Govindaswamy
Naidu, à Prof
a
. Dra. Nylane Maria Nunes Alencar e à Prof
a
. Dra. Arlandia
Cristina Lima Nobre de Morais, que prontamente aceitaram o convite para
participarem da Banca Examinadora.
¾
Ao doutorando do Departamento de Fisiologia e Farmacologia Paulo Sérgio
Barbosa, pelo companheirismo na realização das análises laboratoriais e
execução dos experimentos.
¾
À doutoranda do Departamento de Fisiologia e Farmacologia Renata de
Sousa Alves pelo prestimoso apoio na realização dos experimentos.
¾
Ao doutorando do Departamento de Fisiologia e Farmacologia René Duarte
pelo prestimoso apoio nas análises estatísticas dos dados.
¾
Ao professor Josias Martins Vale pela orientação no ordenamento estatístico.
¾
Aos demais mestrandos, doutorandos, e estudantes de graduação do
laboratório de fisiologia cardiorenal, pelo companheirismo na realização dos
experimentos laboratoriais.
¾
À bibliotecária Norma de Carvalho Linhares pela competência na orientação
das normas de citação das referências bibliográficas.
¾
A todos os técnicos do Instituto de Biomedicina da Universidade Federal do
Ceará, pelo profissionalismo no apoio à execução dos experimentos, em
especial à funcionária Maria Silvia Helena Freire de França, que sempre
atenta e cuidadosamente me acompanhou em todas as etapas dos
experimentos.
¾ Ao Major BM Anderson Alves Viana pelo apoio e orientação no âmbito da
informática.
¾ A toda minha família e amigos, que estiveram presentes e solidários na
realização deste trabalho.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.............................................................................................. 30
1.1 Aspectos Gerais e Epidemiológicos....................................................... 30
1.2 Classificação das Serpentes.................................................................. 32
1.3 Características Gerais dos Venenos das Serpentes.............................. 33
1.4 Características dos Venenos Bothrops.................................................. 39
1.4.1 Atividades citotóxicas dos venenos Bothrops............................... 39
1.4.2 Atividade lectina dos venenos Bothrops....................................... 40
1.4.3 Atividade L-aminoácido oxidase dos venenos Bothrops............... 43
1.4.4 Atividade trombina símile dos venenos Bothrops.......................... 46
1.4.5 Atividade fosfolipásica A
2
dos venenos Bothrops.......................... 49
1.4.6 O papel das metaloproteinases dos venenos Bothrops................ 53
1.5 O Veneno da Bothrops insularis............................................................. 54
1.6 Complicações dos Acidentes Ofídicos................................................... 60
1.7 Justificativa............................................................................................. 66
2 OBJETIVOS.................................................................................................. 69
2.1 Objetivos Gerais..................................................................................... 69
2.2 Objetivos Específicos............................................................................. 69
3 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................. 71
3.1 Animais experimentais ........................................................................... 71
3.2 Procedimentos com Veneno e Frações de Bothrops insularis............... 71
3.2.1 Purificação da lectina do veneno da Bothrops insularis................ 72
3.2.2 Purificação da L-aminoácido oxidase do veneno da serpente
Bothrops insularis......................................................................... 73
3.2.3 Purificação da trombina símile do veneno da serpente Bothrops
insularis........................................................................................ 74
3.2.4 Purificação da fosfolipase A2 do veneno da serpente Bothrops
insularis........................................................................................ 76
3.3 Primeiro Modelo - Procedimentos de Perfusão Renal............................ 77
3.3.1 Divisão dos grupos de animais...................................................... 77
3.3.2 O Veneno e suas frações.............................................................. 78
3.3.3 Solução perfusora e seu preparo.................................................. 78
3.3.4 O Sistema de perfusão renal......................................................... 78
3.3.5 Preparo do sistema....................................................................... 81
3.3.6 Calibração do sistema................................................................... 81
3.3.7 Técnica cirúrgica............................................................................ 83
3.3.8 Protocolo experimental................................................................ 84
3.3.9 Avaliação bioquímica................................................................... 85
3.3.10 Análise histológica................................................................ 85
3.3.11 Cálculo dos parâmetros renais.................................................... 86
3.4 Segundo Modelo - Procedimentos de Avaliação Pressórica Sistêmica
na Artéria Aorta......................................................................................
87
3.4.1 O sistema de avaliação sistêmica na artéria aorta 87
3.4.2 Procedimento cirúrgico e protocolo do experimento..................... 88
3.4.3 Análise histológica......................................................................... 89
3.5 Terceiro Modelo - Procedimentos de Perfusão no Leito Vascular
Mesentérico............................................................................................
90
3.5.1 O sistema de perfusão no leito vascular mesentérico isolado....... 90
3.5.1 Protocolo da avaliação no leito vascular mesentérico................... 91
3.5.1 Técnica cirúrgica da perfusão do leito vascular mesentérico
isolado.................................................................................................... 92
3.5.2 Análise histológica......................................................................... 93
4 AVALIAÇÃO ESTATÍSTICA......................................................................... 93
5 RESULTADOS............................................................................................. 95
5.1 Resultados dos Experimentos com Perfusão Renal.............................. 95
5.1.1 Avaliação dos grupos controle....................................................... 95
5.1.1.1 Avaliação das alterações fisiológicas renais dos grupos
controle.............................................................................. 95
5.1.1.2 Avaliação dos achados histopatológicos no grupo
controle.............................................................................. 95
5.1.2 Alterações induzidas pelo veneno da Bothrops insularis e de
suas frações, em rim isolado perfundido de rato......................... 97
5.1.2.1 Alterações induzidas pelo veneno da Bothrops
insularis, no rim isolado de rato...................................... 99
5.1.2.1.1 Alterações fisiológicas renais induzidas pelo
veneno da B. insularis, em rim de rato.............. 99
5.1.2.1.2 Alterações histopatológicas renais induzidas
pelo veneno da Bothrops insularis, em rim de
rato....................................................................
106
5.1.2.2 Alterações induzidas pela lectina do veneno da
Bothrops insularis, no rim de rato................................... 107
5.1.2.2.1 Alterações fisiológicas induzidas pela lectina
do veneno da serpente Bothrops insularis no
rim de rato........................................................
108
5.1.2.2.2 Alterações histopatológicas induzidas pela
lectina do veneno da Bothrops insularis, no
rim de rato........................................................
114
5.1.2.3 Alterações induzidas pela L-aminoácido-oxidase
(LAAO) do veneno da Bothrops insularis, no rim de
rato..................................................................................
117
5.1.2.3.1 Alterações fisiológicas induzidas pela L-
aminoácido-oxidase (LAAO)do veneno da B.
insularis, no rim de rato...................................
117
5.1.2.3.2 Alterações histopatológicas renais induzidas
pela L-aminoácido-oxidase do veneno da B.
insularis, em rim de rato..................................
124
5.1.2.4 Alterações induzidas pela trombina símile do veneno da
B. insularis, no rim de rato................................................ 126
5.1.2.4.1 Alterações fisiológicas induzidas pela
trombina símile do veneno da B. insularis,
no rim de rato...............................................
126
5.1.2.4.2 Alterações histopatológicas renais induzidas
pela trombina símile do veneno da B.
insularis, em rim de rato...............................
133
5.1.2.5 Alterações induzidas pela fosfolipase A
2
(PLA
2
) do
veneno da Bothrops insularis, no rim de rato.................... 135
5.1.2.5.1 Alterações fisiológicas induzidas pela
fosfolipase A
2
(PLA
2
) do veneno da Bothrops
insularis, no rim de rato..................................
135
5.1.2.5.2 Alterações histopatológicas renais induzidas
pela fosfolipase A
2
(PLA
2
) do veneno da
Bothrops insularis, em rim de rato..................
142
5.2 Efeitos do Veneno da B. insularis no Leito Vascular Sistêmico............. 144
5.2.1 Alterações fisiológicas sistêmicas do veneno .............................. 144
5.2.2 Alterações hIstopatológicas sistêmicas do veneno ...................... 146
5.3 Efeitos do Veneno da B. insularis no Leito Vascular Mesentérico......... 151
5.3.1 Alterações fisiológicas do veneno no leito vascular mesentérico.. 151
5.3.2 Alterações histopatológicas........................................................... 153
6 DISCUSSÃO DOS RESULTADOS.............................................................. 157
6.1 Efeitos no Rim Isolado de Rato...................... 157
6.2 Efeitos do Veneno da Bothrops insularis no Leito Arterial Sistêmico..... 181
6.3 Efeitos do Veneno da B. insularis no Leito Arterial Mesentérico
Isolado................................................................................................... 186
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS.......................................................................... 193
8 CONCLUSÕES............................................................................................ 197
9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................. 199
10 ANEXOS..................................................................................................... 228
LISTA DE ABREVIATURAS
ADAMS – metaloproteinases envolvidas com a ativação e comunicação celular
BIT - fração trombina símile extraída do veneno bruto da Bothrops insularis
BILE - fração Lectina símile extraída do veneno bruto da Bothrops insularis
BiP - fração fosfolipase A
2
símile extraída do veneno bruto da B. insularis
BiLa - fração L-aminoácido oxidase extraída do veneno bruto da B. insularis
cAMP – adenosina monofosfato cíclica
cGMP – guanidina monofosfato cíclica
C osm. - clearance osmótico
COX - cicloxigenase
FU - fluxo urinário
HPLC - cromatografia líquida de alta eficiência
LAAO – L-aminoácido oxidase
MMPs – proteinases da matriz extracelular
NO – óxido nítrico
PAF – fator de ativação plaquetária
PLA
2
– fosfolipase A
2
PP - pressão de perfusão
PPBs – peptídios potenciadores da bradicinina
%TCl - percentual de cloro tubular total transportado
%pTCl - percentual de cloro tubular proximal transportado
%pTK - percentual de potássio tubular total transportado
%pTK - percentual de potássio tubular proximal transportado
%TNa – percentual de sódio tubular total transportado
%pTNa - percentual de sódio tubular proximal transportado
RAPs - Receptores ativados por proteinases
RFG - ritmo de filtração glomerular
RVR - resistência vascular renal
SVMPs – metaloproteinases dos venenos das serpentes
TNFα – fator de necrose tumoral α
VEGF – fator de crescimento vascular e endotelial
VWF – fator de von Willebrand
WEB 2086 - triazolobenzodiazepina
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Principais características de diferenciação entre as
serpentes peçonhentas e não peçonhentas.......................... 33
Figura 2: Extração do veneno das serpentes........................................ 36
Figura 3: A serpente Bothrops insularis................................................ 55
Figura 4: Hábitos diurnos da serpente Bothrops insularis.................. 46
Figura 5: Ilha da Queimada Grande...................................................... 58
Figura 6: Sistema de perfusão de rim isolado com recirculação........... 79
Figura 7: Representação gráfica do sistema de perfusão de rim
isolado com recirculação........................................................ 80
Figura 8: Valores registrados de pressão de perfusão (PP) durante a
calibração do sistema (n = 6)................................................. 82
Figura 9: Valores registrados pelo fluxômetro (L/h) durante a
calibração do sistema (n=6)................................................... 82
Figura 10: Valores registrados de volume de salina (mL/min) durante a
calibração do sistema (n = 6)................................................. 83
Figura 11: Técnica cirúrgica do isolamento do rim (A= veia femoral,
B=ureter canulado e C= cânula arterial)................................ 84
Figura 12: O sistema montado e registro pressórico.............. 87
Figura 13: Técnica Cirúrgica da avaliação pressórica sistêmica
(canulação da aorta e jugular)............................................... 88
Figura 14: Desenho esquemático do sistema de perfusão de leito
vascular mesentérico............................................................. 91
Figura 15: Técnica cirúrgica no leito vascular mesentérico.................... 92
Figura 16: Fotografia de rim de rato, controle, perfundido com a
solução de Krebs-Henseleit modificada. Células de
revestimento tubular com a borda em escova preservada....
96
Figura 17: Fotografia de rim de rato, controle, perfundido com a
solução de Krebs-Henseleit modificada. Focos esparsos de
degeneração hidrópico-vacuolar das células tubulares e
discreta deposição proteinácea na luz...................................
96
Figura 18: Percentual de glomérulos afetados pelo aumento da
permeabilidade e extravasamento proteináceo com cada
fração perfundida...................................................................
98
Figura 19: Pressão de perfusão (PP), (mmHg) em rim isolado de ratos
Wistar (n=6) na presença do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL)...............................................................................
100
Figura 20: Resistência vascular renal (RVR), (mmHg/mL.g
-1
.min
-1
) em
rim isolado de ratos Wistar (n=6) na presença do veneno da
B. insularis (10μg/mL)...........................................................
100
Figura 21: Fluxo urinário (FU), (mL.g
-1
.min
-1
) em rim isolado de ratos
Wistar (n=6) na presença do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL)...............................................................................
101
Figura 22: Ritmo de filtração glomerular (mL.g
-1
.min
-1
) em rim isolado
de ratos Wistar (n=6) na presença do veneno da Bothrops
insularis (10μg/mL).................................................................
101
Figura 23: Percentual de transporte total de sódio (%TNa
+
) em rim
isolado de ratos Wistar (n=6) na presença do veneno da
Bothrops insularis (10μg/mL).................................................
102
Figura 24: Percentual de transporte proximal de sódio (%pTNa
+
) em
rim isolado de ratos Wistar (n=6) na presença do veneno da
Bothrops insularis (10μg/mL).................................................
102
Figura 25: Percentual de transporte total de potássio (%TK
+
) em rim
isolado de ratos Wistar (n=6) na presença do veneno da
Bothrops insularis (10μg/mL).................................................
103
Figura 26: Percentual de transporte proximal de potássio (%pTK
+
) em
rim isolado de ratos Wistar (n=6) na presença do veneno da
B. insularis (10μg/mL)............................................................
103
Figura 27: Percentual de transporte total de cloro (%TCl
-
) em rim
isolado de ratos Wistar (n=6) na presença do veneno da
Bothrops insularis (10μg/mL).................................................
104
Figura 28: Percentual de transporte proximal de cloro (%TCl
-
) em rim
isolado de ratos Wistar (n=6) na presença do veneno da B.
insularis (10μg/mL)................................................................
104
Figura 29: Parâmetros do clearance osmótico (C. osm.) em rim isolado
de ratos Wistar (n=6) na presença do veneno da Bothrops
insularis (10μg/mL)................................................
105
Figura 30: Fotografia de rim de rato perfundido, na presença do
veneno da Bothrops insularis (10μg/mL). Balonização de
células tubulares proximais....................................................
106
Figura 31: Fotografia de rim de rato perfundido, na presença do
veneno da Bothrops insularis (10μg/mL). Necrose tubular
aguda, de aspecto morfológico semelhante à apoptose, e
depósito proteináceo intratubular ..........................................
107
Figura 32: Pressão de perfusão (PP), (mmHg) em rim isolado de ratos
Wistar (n=6) na presença da lectina do veneno da B.
insularis (10μg/mL)................................................................
109
Figura 33: Resistência vascular renal (RVR), (mmHg/mL.g
-1
.min
-1
) em
rim isolado de ratos Wistar (n=6) na presença da lectina do
veneno da B.othrops insularis (10μg/mL)..............................
109
Figura 34: Fluxo urinário (FU), (mL.g
-1
.min
-1
) em rim isolado de ratos
Wistar (n=6) na presença da fração lectina do veneno da
B.nsularis (10μg/mL)..............................................................
110
Figura 35: Ritmo de filtração glomerular (RFG), (mL.g
-1
.min
-1
) em rim
isolado de ratos Wistar (n=6) na presença da fração lectina
do veneno da B. insularis (10μg/mL).....................................
110
Figura 36: Percentual de transporte total de sódio (%TNa
+
) em rim
isolado de ratos Wistar (n=6) na presença da lectina do
veneno da Bothrops insularis (10μg/mL)...............................
111
Figura 37: Percentual de transporte proximal de sódio (%pTNa
+
) em
rim isolado de ratos Wistar (n=6) na presença da lectina do
veneno da Bothrops insularis (10μg/mL)...............................
111
Figura 38: Percentual de transporte total de potássio (%TK
+
) em rim
isolado de ratos Wistar (n=6) na presença da lectina do
veneno da Bothrops insularis (10μg/mL)...............................
112
Figura 39: Percentual de transporte proximal de potássio (%pTK
+
) em
rim isolado de ratos Wistar (n=6) na presença da lectina do
veneno da Bothrops insularis (10μg/mL)...............................
112
Figura 40: Percentual de transporte total de cloro (%TCl
-
) em rim
isolado de ratos Wistar (n=6) na presença da lectina do
veneno da Bothrops insularis (10μg/mL)...............................
113
Figura 41: Percentual de transporte proximal de cloro (%TCl
-
) em rim
isolado de ratos Wistar (n=6) na presença da lectina do
veneno da Bothrops insularis (10μg/mL)...............................
113
Figura 42: Parâmetros do clearance osmótico (C. osm.) em rim isolado
de ratos Wistar (n=6) na presença da lectina do veneno da
Bothrops insularis (10μg/mL)...............................
114
Figura 43: Rim de rato perfundido, na presença da lectina do veneno
da Bothrops insularis (10μg/mL). Material proteináceo no
espaço de Bowman, balonização das células tubulares e
deposição proteinácea na luz................................................
115
Figura 44: Fotografia de rim de rato perfundido, na presença da lectina
do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL). Depósito
proteináceo nos túbulos distais. ...........................................
116
Figura 45: Fotografia de rim de rato perfundido, na presença da lectina
do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL). Necrose
tubular aguda.. ......................................................................
116
Figura 46: Pressão de perfusão (PP), (mmHg) em rim isolado de ratos
Wistar (n=6) na presença da LAAO do veneno da Bothrops
insularis (10μg/mL).................................................................
118
Figura 47: Resistência vascular renal (RVR), (mmHg/mL.g
-1
.min
-1
) em
rim isolado de ratos Wistar (n=6) na presença da LAAO do
veneno da Bothrops insularis (10μg/mL)...............................
118
Figura 48: Fluxo urinário (FU), (mL.g
-1
.min
-1
) em rim isolado de ratos
Wistar (n=6) na presença da LAAO do veneno da Bothrops
insularis (10μg/mL)................................................................
119
Figura 49: Ritmo de filtração glomerular(RFG), (mL.g
-1
.min
-1
) em rim
isolado de ratos Wistar (n=6) na presença da LAAO do
veneno da Bothrops insularis (10μg/mL)...............................
119
Figura 50: Percentual de transporte total de sódio (%TNa
+
) em rim
isolado de ratos Wistar (n=6) na presença da LAAO do
veneno da Bothrops insularis (10μg/mL)...............................
120
Figura 51: Percentual de transporte proximal de sódio (%pTNa
+
) em
rim isolado de ratos Wistar (n=6) na presença da LAAO do
veneno da Bothrops insularis (10μg/mL)...............................
120
Figura 52: Percentual de transporte total de potássio (%TK
+
) em rim
isolado de ratos Wistar (n=6) na presença da LAAO do
veneno da Bothrops insularis (10μg/mL)...............................
121
Figura 53: Percentual de transporte proximal de potássio (%pTK
+
) em
rim isolado de ratos Wistar (n=6) na presença da LAAO do
veneno da Bothrops insularis (10μg/mL)...............................
121
Figura 54: Percentual de transporte total de cloro (%TCl
-
) em rim
isolado de ratos Wistar (n=6) na presença da LAAO do
veneno da B. insularis (10μg/mL).........................................
122
Figura 55: Percentual de transporte proximal de cloro (%TCl
-
) em rim
isolado de ratos Wistar (n=6) na presença da LAAO do
veneno da Bothrops insularis (10μg/mL)...............................
122
Figura 56: Parâmetros do clearance osmótico (C. osm.) em rim isolado
de ratos Wistar (n=6) na presença da LAAO do veneno da
B. insularis (10μg/mL)..........................................
123
Figura 57 Fotografia de rim de rato perfundido, na presença da LAAO
do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL). Focos de
necrose tubular aguda e apoptose.........................................
124
Figura 58: Fotografia de rim de rato perfundido, na presença da LAAO
do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL). Balonização de
células tubulares e deposição proteinácea na luz.................
125
Figura 59: Fotografia de rim de rato perfundido, na presença da LAAO
do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL). Deposição
proteinácea no espaço de Bowman e balonização de
células tubulares....................................................................
125
Figura 60: Pressão de perfusão (PP) (mmHg), em rim isolado de ratos
Wistar (n=6) na presença trombina símile do veneno da
Bothrops insularis (10μg/mL).................................................
128
Figura 61: Resistência vascular renal (RVR), (mmHg/mL.g
-1
.min
-1
) em
rim isolado de ratos Wistar (n=6) na presença da trombina
símile do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL)................
128
Figura 62: Fluxo urinário (FU), (mL.g
-1
.min
-1
) em rim isolado de ratos
Wistar (n=6) na presença da trombina símile do veneno da
Bothrops insularis (10μg/mL).................................................
129
Figura 63: Ritmo de filtração glomerular (mL.g
-1
.min
-1
) em rim isolado
de ratos Wistar (n=6) na presença da trombina símile do
veneno da Bothrops insularis (10μg/mL)...............................
129
Figura 64: Percentual de transporte total de sódio (%TNa
+
) em rim
isolado de ratos Wistar (n=6) na presença da trombina
símile do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL)................
130
Figura 65: Percentual de transporte proximal de sódio (%pTNa
+
) em
rim isolado de ratos Wistar (n=6) na presença da trombina
símile do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL)................
130
Figura 66: Percentual de transporte total de potássio (%TK
+
) em rim
isolado de ratos Wistar (n=6) na presença da trombina
símile do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL)................
131
Figura 67: Percentual de transporte proximal de potássio (%pTK
+
) em
rim isolado de ratos Wistar (n=6) na presença da trombina
símile do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL)................
131
Figura 68: Percentual de transporte total de cloro (%TCl
-
) em rim
isolado de ratos Wistar (n=6) na presença da trombina
símile do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL)................
132
Figura 69: Percentual de transporte proximal de cloro (%pTCl
-
) em rim
isolado de ratos Wistar (n=6) na presença da trombina
símile do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL)................
132
Figura 70: Parâmetros do clearance osmótico (C. osm.) em rim isolado
de ratos Wistar (n=6) na presença da trombina símile do
veneno da Bothrops insularis (10μg/mL)................
133
Figura 71: Fotografia de rim de rato perfundido, na presença da
trombina símile do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Material proteináceo no espaço de Bowman, túbulos com o
mesmo material na luz e balonização do epitélio..................
134
Figura 72: Fotografia de rim de rato perfundido, na presença da
trombina símile do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Depósitos proteináceos na luz de túbulos proximais e
distais, e balonização de células tubulares............................
134
Figura 73: Pressão de perfusão (PP), (mmHg) em rim isolado de ratos
Wistar (n=6) na presença da fosfolipase A
2
do veneno da
Bothrops insularis (10μg/mL).................................................
137
Figura 74: Resistência vascular renal (RVR), (mmHg/mL.g
-1
.min
-1
) em
rim isolado de ratos Wistar (n=6) na presença da
fosfolipase A
2
do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL)...
137
Figura 75: Fluxo urinário (FU), (mL.g
-1
.min
-1
) em rim isolado de ratos
Wistar (n=6) na presença da fosfolipase A
2
do veneno da
Bothrops insularis (10μg/mL).................................................
138
Figura 76: Ritmo de filtração glomerular (mL.g
-1
.min
-1
) em rim isolado
de ratos Wistar (n=6) na presença da fosfolipase A
2
do
veneno da Bothrops insularis (10μg/mL)...............................
138
Figura 77: Percentual de transporte total de sódio (%TNa
+
) em rim
isolado de ratos Wistar (n=6) na presença fosfolipase A
2
do
veneno da Bothrops insularis (10μg/mL)...............................
139
Figura 78: Percentual de transporte proximal de sódio (%pTNa
+
) em
rim isolado de ratos Wistar (n=6) na presença da
fosfolipase A
2
extraída do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL)...............................................................................
139
Figura 79: Percentual de transporte total de potássio (%TK
+
) em rim
isolado de ratos Wistar (n=6) na presença da fosfolipase A
2
do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL)..........................
140
Figura 80: Percentual de transporte proximal de potássio (%pTK
+
) em
rim isolado de ratos Wistar (n=6) na presença da
fosfolipase A
2
do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL)...
140
Figura 81: Percentual de transporte total de cloro (%TCl
-
) em rim
isolado de ratos Wistar (n=6) na presença da fosfolipase A
2
do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL)..........................
141
Figura 82: Percentual de transporte proximal de cloro (%pTCl
-
) em rim
isolado de ratos Wistar (n=6) na presença da fosfolipase A
2
do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL)..........................
141
Figura 83: Parâmetros do clearance osmótico (C. osm.) em rim isolado
de ratos Wistar (n=6) na presença da fosfolipase A
2
do
veneno da Bothrops insularis (10μg/mL)..........................
142
Figura 84: Fotografia de rim de rato perfundido, na presença da
fosfolipase A
2
do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Focos de necrose tubular aguda............................................
143
Figura 85: Fotografia de rim de rato perfundido, na presença da
fosfolipase A
2
do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Espaço de Bowman e túbulos com material proteináceo,
balonização de células tubulares...........................................
144
Figura 86: Comportamento da pressão arterial sistêmica média dos
ratos (n=6) com variação das doses do veneno da Bothrops
insularis..................................................................................
145
Figura 87: Queda da pressão arterial sistêmica média dos ratos (n=6)
com variação das doses do veneno da Bothrops insularis.... 145
Figura 88: Fotografia do coração de rato na presença de veneno da
Bothrops insularis em circulação sistêmica (1, 3, 10, 30,
100 e 300µg). Congestão vascular........................................
146
Figura 89: Fotografia do fígado de rato na presença de veneno da
Bothrops insularis em circulação sistêmica (1, 3, 10, 30,
100 e 300µg). Congestão portal. ...........................................
147
Figura 90: Fotografia do fígado de rato na presença de veneno da B.
insularis em circulação sistêmica (1, 3, 10, 30, 100 e
300µg). Veia centrolobular congesta e esteatose em
microgotas.............................................................................
147
Figura 91: Fotografia do intestino de rato na presença de veneno da
Bothrops insularis em circulação sistêmica (1, 3, 10, 30,
100 e 300µg). Congestão vascular........................................
148
Figura 92: Fotografia do rim de rato na presença de veneno da
Bothrops insularis em circulação sistêmica (1, 3, 10, 30,
100 e 300µg). Congestão vascular e hemorragia
intersticial...............................................................................
148
Figura 93: Fotografia do pulmão de rato na presença de veneno da
Bothrops insularis em circulação sistêmica (1, 3, 10, 30,
100 e 300µg). Congestão de grandes vasos e capilares
intersticiais……………………...............................................
149
Figura 94: Fotografia do pulmão de rato na presença de veneno da
Bothrops insularis em circulação sistêmica (1, 3, 10, 30,
100 e 300µg). Congestão de pequenos vasos, hemorragia
e infiltrado linfopolimorfonuclear……….……………...........
149
Figura 95 Fotografia do pulmão de rato na presença de veneno da
Bothrops insularis em circulação sistêmica (1, 3, 10, 30,
100 e 300µg). Intensa hemorragia difusa
bronquioloalveolar……...........................................................
150
Figura 96: Fotografia do pulmão de rato na presença de veneno da
Bothrops insularis em circulação sistêmica (1, 3, 10, 30,
100 e 300µg). Hemorragia macroscópica..............................
150
Figura 97: Ação do veneno da B. insularis no leito mesentérico, com
redução significativa da pressão de perfusão basal.............. 152
Figura 98: Traçado da perfusão de leito vascular mesentérico obtido
após infusão de Fenilefrina (5 μM/mL/min ); de Fenilefrina
(5 μM/mL/min ) com o veneno da B. Insularis (BiV)
(10μg/mL/min ); e somente com o BiV (10μg/mL/min )........
153
Figura 99: Mesentério de rato na presença de veneno da Bothrops
insularis (10μg/mL/min). Macroscopia...................................
154
Figura 100: Mesentério de rato na presença de veneno da Bothrops
insularis (10μg/mL/min). Adipócitos e artéria mesentérica
preservados............................................................................
154
Figura 101: Mesentério de rato na presença de veneno da Bothrops
insularis (10μg/mL/min). Tecido adiposo preservado............
155
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Alterações vasculares, urinárias e eletrolíticas provocadas
pelo veneno e suas frações em rim isolado de rato............... 97
Tabela 2: Principais alterações histopatológicas observadas no rim
perfundido com o veneno e suas frações.............................. 98
Tabela 3: Percentual de glomérulos apresentando algum grau de
extravasamento proteináceo para o espaço de Bowman,
em rins perfundidos com o veneno e frações........................
98
Tabela 4: Parâmetros vasculares do rim isolado de ratos Wistar (n=6)
na presença do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL)......
100
Tabela 5: Parâmetros fisiológicos do rim isolado de ratos Wistar (n=6)
na presença do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL)......
101
Tabela 6: Parâmetros eletrolíticos relativos ao transporte de sódio no
rim isolado de ratos Wistar (n=6) na presença do veneno da
Bothrops insularis (10μg/mL).................................................
102
Tabela 7: Parâmetros eletrolíticos relativos ao transporte de potássio
no rim isolado de ratos Wistar (n=6) na presença do veneno
da Bothrops insularis (10μg/mL)............................................
103
Tabela 8: Parâmetros eletrolíticos relativos ao transporte de cloro no
rim isolado de ratos Wistar (n=6) na presença do veneno da
Bothrops insularis (10μg/mL).................................................
104
Tabela 9: Parâmetros do clearance osmótico no rim isolado de ratos
Wistar (n=6) na presença do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL). ............................................................................
105
Tabela 10: Parâmetros vasculares do rim isolado de ratos Wistar (n=6)
na presença da lectina do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL)...............................................................................
109
Tabela 11: Parâmetros fisiológicos do rim isolado de ratos Wistar (n=6)
na presença da lectina do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL). .............................................................................
110
Tabela 12: Parâmetros eletrolíticos do rim isolado de ratos Wistar
(n=6) na presença da lectina do veneno da Bothrops
insularis (10μg/mL).................................................................
111
Tabela 13: Parâmetros eletrolíticos do rim isolado de ratos Wistar
(n=6) na presença da lectina do veneno da Bothrops
insularis (10μg/mL).................................................................
112
Tabela 14: Parâmetros eletrolíticos do rim isolado de ratos Wistar
(n=6) na presença da lectina do veneno da Bothrops
insularis (10μg/mL).................................................................
113
Tabela 15: Parâmetros do clearance osmótico do rim isolado de ratos
Wistar (n=6) na presença da lectina do veneno da Bothrops
insularis (10μg/mL).................................................................
114
Tabela 16: Parâmetros vasculares do rim isolado de ratos Wistar (n=6)
na presença da L-aminoácido-oxidase (LAAO) do veneno
da Bothrops insularis (10μg/mL)............................................
118
Tabela 17 Parâmetros fisiológicos do rim isolado de ratos Wistar (n=6)
na presença da L-aminoácido-oxidase do veneno da
Bothrops insularis (10μg/mL).................................................
118
Tabela 18: Parâmetros eletrolíticos do rim isolado de ratos Wistar
(n=6) na presença da L-aminoácido-oxidase do veneno da
Bothrops insularis (10μg/mL)................................................
120
Tabela 19: Parâmetros eletrolíticos do rim isolado de ratos Wistar
(n=6) na presença da L-aminoácido-oxidase do veneno da
Bothrops insularis (10μg/mL)................................................
121
Tabela 20: Parâmetros eletrolíticos do rim isolado de ratos Wistar
(n=6) na presença da L-aminoácido-oxidase do veneno da
Bothrops insularis (10μg/mL)................................................
122
Tabela 21: Parâmetros do clearance osmótico do rim isolado de ratos
Wistar (n=6) na presença da L-aminoácido-oxidase do
veneno da Bothrops insularis (10μg/mL)...............................
123
Tabela 22: Parâmetros vasculares do rim isolado de ratos Wistar (n=6)
na presença da trombina símile do veneno da Bothrops
insularis (10μg/mL)................................................................
128
Tabela 23: Parâmetros fisiológicos do rim isolado de ratos Wistar (n=6)
na presença da trombina símile do veneno da Bothrops
insularis (10μg/mL).................................................................
129
Tabela 24: Parâmetros eletrolíticos do rim isolado de ratos Wistar
(n=6) na presença da trombina símile do veneno da
Bothrops insularis (10μg/mL).................................................
130
Tabela 25: Parâmetros eletrolíticos do rim isolado de ratos Wistar
(n=6) na presença da trombina símile do veneno da
Bothrops insularis (10μg/mL).................................................
131
Tabela 26: Parâmetros eletrolíticos do rim isolado de ratos Wistar
(n=6) na presença da trombina símile do veneno da
Bothrops insularis (10μg/mL).................................................
132
Tabela 27: Parâmetros do clearance osmótico do rim isolado de ratos
Wistar (n=6) na presença da trombina símile do veneno da
Bothrops insularis (10μg/mL).................................................
133
Tabela 28: Parâmetros vasculares do rim isolado de ratos Wistar (n=6)
na presença da fosfolipase A
2
do veneno da Bothrops
insularis (10μg/mL).................................................................
137
Tabela 29: Parâmetros fisiológicos do rim isolado de ratos Wistar (n=6)
na presença da fosfolipase A
2
do veneno da Bothrops
insularis (10μg/mL)................................................................
138
Tabela 30: Parâmetros eletrolíticos do rim isolado de ratos Wistar
(n=6) na presença da fosfolipase A
2
do veneno da Bothrops
insularis (10μg/mL)................................................................
139
Tabela 31: Parâmetros eletrolíticos do rim isolado de ratos Wistar
(n=6) na presença da fosfolipase A
2
do veneno da Bothrops
insularis (10μg/mL)...............................................................
140
Tabela 32: Parâmetros eletrolíticos do rim isolado de ratos Wistar
(n=6) na presença da fosfolipase A
2
do veneno da Bothrops
insularis (10μg/mL).................................................................
141
Tabela 33: Parâmetros do clearance osmótico do rim isolado de ratos
Wistar (n=6) na presença da fosfolipase A
2
do veneno da
Bothrops insularis (10μg/mL).................................................
142
Tabela 34: Comportamento da pressão arterial sistêmica média com
variação das doses de veneno da Bothrops insularis
aplicadas sistemicamente em ratos Wistar (n=6)..................
145
Tabela 35: Pressão de leito mesentérico em ratos tratados (n=6)
exclusivamente com Fenilefrina (5μM); com o veneno de
Bothrops insularis (BiV) (10μg/mL) e fenilefrina (5μM); e
somente com BiV (10μg/mL).................................................
152
Tabela 36: Alterações da pressão arterial mesentérica em ratos
tratados (n = 6), exclusivamente com Fenilefrina (5 μM);
com o veneno de Bothrops insularis (BiV, 10μg/mL/min) e
com Fenilefrina (5 μM); e somente com o veneno
(10μg/mL/min)........................................................................
152
Tabela 37: Prováveis mediadores liberados pelas células renais na
presença das frações estudadas, no início e no final de
cada experimento...................................................................
157
Tabela 38: Prováveis mediadores liberados e frações atuantes nos
experimentos com o veneno, no leito arterial sistêmico........ 185
Tabela 39: Prováveis mediadores liberados e frações atuantes nos
experimentos com o veneno no leito arterial mesentérico
isolado....................................................................................
190
ANEXO A - Equipamento utilizado.
ANEXO B - Substâncias utilizadas na perfusão renal e Solução de Krebs Henseleit
ANEXO C - Comportamento da Pressão Arterial do Leito Mesentérico de Ratos
Perfundido com o Veneno Da Bothrops insularis, Pré-contraído com Fenilefrina,
Combinado com fenilefrina e Isoladamente, na dose de 10μg/mL/min.
ANEXO D - Tabelas dos parâmetros renais do grupo controle com o rim isolado de
rato.
ANEXO E - Alterações Renais Induzidas Pelo Veneno Da Bothrops
insularis.Trabalho Apresentado no XXIII Encontro Universitário De Iniciação À
Pesquisa da UFC Realizado em Fortaleza, Ceará, entre 01 a 02 de julho de 2004.
ANEXO F - Renal histopathological alterations inserted by the venom of the Bothrops
insularis serpent. Trabalho Apresentado no VIII Congresso a Sociedade Brasileira de
Toxinologia e Symposium of the Pan American Section of the International Society
on Toxinology, realizado em Angra dos Reis, Rio de Janeiro, Brasil de 19 a 23 de
Setembro de 2004.
ANEXO G - Alterações Renais Induzidas Pelo Veneno Da Bothrops insularis.
Trabalho Apresentado no XXXVI Congresso da Sociedade Brasileira de
Farmacologia e Terapêutica Experimental (SBFTE), realizado em Águas de Lindóia,
São Paulo, Brasil de 17 a 20 de outubro de 2004.
ANEXO H - Efeito Renal da Fração Trombina-Like do Veneno de Bothrops
insularis.Trabalho Apresentado no XXIV Encontro Universitário De Iniciação à
Pesquisa da UFC, realizado em Fortaleza, Ceará, entre 09 a 10 de junho de 2005.
ANEXO I - Alterações Renais Induzidas pela L-aminoáido-oxidase (LAAO) do
veneno Bothrops insularis. Trabalho Apresentado na XX Reunião Anual da
Federação de Sociedades de Biologia Experimental (FeSBE 2005) XX Reunião
Anual da Federação de Sociedades de Biologia Experimental XXX Congresso
Brasileiro de Biofísica XL Congresso Brasileiro de Fisiologia XXXVII Congresso
Brasileira de Farmacologia e Terapêutica Experimental XXI Congresso Brasileiro de
Investigação Clínica XXIX Congresso Brasileiro de Neurociências e Comportamento,
realizado em Águas de Lindóia, SP Brasil entre 24 e 27 de agosto de 2005.
ANEXO J - Alterações Renais Induzidas Pela Trombina Like do Veneno da Bothrops
Insularis.Trabalho Apresentado na XX Reunião Anual da Federação de
Sociedades de Biologia Experimental (FeSBE 2005) XX Reunião Anual da
Federação de Sociedades de Biologia Experimental XXX Congresso Brasileiro de
Biofísica XL Congresso Brasileiro de Fisiologia XXXVII Congresso Brasileira de
Farmacologia e Terapêutica Experimental XXI Congresso Brasileiro de Investigação
Clínica XXIX Congresso Brasileiro de Neurociências e Comportamento, realizado em
Águas de Lindóia, SP Brasil entre 24 e 27 de agosto de 2005.
ANEXO K - Alterações Renais Induzidas pela Lectina do Veneno da Bothrops
insularis. Trabalho Apresentado na XX Reunião Anual da Federação de Sociedades
de Biologia Experimental (FeSBE 2005) XX Reunião Anual da Federação de
Sociedades de Biologia Experimental XXX Congresso Brasileiro de Biofísica XL
Congresso Brasileiro de Fisiologia XXXVII Congresso Brasileira de Farmacologia e
Terapêutica Experimental XXI Congresso Brasileiro de Investigação Clínica XXIX
Congresso Brasileiro de Neurociências e Comportamento, realizado em Águas de
Lindóia, SP Brasil entre 24 e 27 de agosto de 2005.
ANEXO L - Trabalho aceito para publicação na revista Toxicon em 10 de fevereiro
de 2006. “Purification and biological effects of C-type lectin isolated from Bothrops
insularis venom”.
RESUMO
Foram investigados os efeitos do veneno da serpente Bothrops insularis e de suas
frações, lectina, L-aminoácido oxidase, trombina símile e fosfolipase A
2
, no rim
isolado e sistema vascular de rato. As frações foram purificadas a partir de uma
combinação de procedimentos cromatográficos, usando colunas de HPLC de
exclusão molecular, troca iônica, fase reversa e colunas de baixa pressão de
afinidade. Foi utilizada a perfusão de rim isolado de rato e a solução de Krebs-
Henseleit modificada (Bowman, 1970; Fonteles et al. 1998). Parâmetros
selecionados da função renal foram avaliados durante as condições experimentais,
com a infusão do veneno e suas frações, aos 60, 90, e 120 minutos. Os primeiros 30
minutos serviram de controle interno. No leito arterial sistêmico de rato (Ferreira,
1965) a pressão arterial foi avaliada por manômetro conectado por cânula à artéria
carótida comum, e o veneno injetado na veia jugular. Os registros foram realizados a
cada 10 minutos após a administração de doses crescentes do veneno, até a
infusão da dose de 300μg, aos 60 minutos. Na Perfusão do leito arterial mesentérico
isolado de rato (McGregor, 1965), utilizou-se a solução de Krebs-Henseleit em fluxo
constante de 4mL/minuto. A pressão de perfusão foi registrada manometricamente.
A avaliação estatística foi determinada por análise de variância (ANOVA) e teste de
Bonferroni, com nível de significância menor de 5%. No rim, o grupo tratado com o
veneno apresentou redução em todos os parâmetros avaliados, com exceção da
absorção de potássio. Com a lectina a pressão de perfusão aumentou inicialmente e
caiu em seguida, juntamente com o fluxo urinário e o ritmo de filtração glomerular.
Houve aumento na reabsorção de sódio e potássio, com redução no clearance
osmótico. Com a trombina-símile, ocorreu aumento inicial seguido de queda no final
em quase todos os parâmetros, com exceção da resistência vascular renal. A
reabsorção tubular do sódio e do cloro caiu; houve elevação inicial do transporte de
potássio; com aumento seguido de queda do clearance osmótico. Com a L-
aminoacido oxidase houve queda em todos os parâmetros avaliados. Com a
fosfolipase A
2
houve elevação nos parâmetros fisiológicos e vasculares; no
transporte tubular de potássio e no clearance osmótico; com queda na reabsorção
de sódio e cloro. Todos os rins mostraram, no final, sinais de necrose tubular aguda,
com exceção dos perfundidos com a trombina-símile. Excetuando os tratados com
veneno, todos os rins apresentaram, ao final, extravasamento protéico para o
espaço de Bowman. No leito arterial sistêmico o veneno produziu redução na
pressão arterial sistêmica diretamente proporcional à quantidade de veneno
administrada, excetuando a dose de 10μg, além de intensa hemorragia pulmonar
com proliferação de neutrófilos e linfócitos nos alvéolos, hemorragia no rim e
congestão generalizada. No leito arterial mesentérico se observou uma redução na
presão quando o veneno foi administrado em leito arterial pré-contraído com
fenilefrina, como também isoladamente, na ausência de fenilefrina. O veneno da
Bothrops insularis mostrou potencial hemorrágico e vasodilatador semelhante aos
outros venenos de serpentes do gênero, com atividade necrotizante superior nos
rins, onde provocou necrose tubular aguda, ao contrario do observado com outros
venenos do mesmo gênero, em experimentos no rim isolado de rato.
Palavras chave: Veneno de cobra, Bothrops insularis, Rim-efeito de drogas,
Lectinas, L-aminoácido oxidases, Trombina, Fosfolipases A.
ABSTRACT
We investigated the biochemical and biological effects of the whole venom from
Bothrops insularis (popularly known as “golden lancet”), and four of its fractions, a
thrombin-like enzyme, a lectin-like substance, an L-amino acid oxidase and a
phospholipase A
2
, in perfused rat kidneys and vascular sistem. The fractions were
purified by a combination of Sephadex gel filtration in HPLC columns, and ion-
exchange chromatography on DEAE-Sephadex in reverse phase, low-pressure
affinity columns. We used a modified isolated perfused rat kidney assay, with Krebs-
Henseleit solution as the perfusion fluid (Bowman, 1970; Fonteles et al., 1998).
Selected parameters of renal function during stable experimental conditions were
evaluated before and at 60, 90, and 120 minutes after infusion of venom and its
fractions, with the first 30 minutes interval constituting the paired control. In the
systemic vascular bed (Ferreira, 1965), the arterial pressure was evaluated by a
manometer connected through a canule to carotid common artery and the venom
was injected into the jugular vein, with registers made at every 10 minutes after
administration in increasing doses, until an infusion of 300μg was reached at 60
minutes. In the isolated rat mesenteric blood vessels method (McGregor, 1965), the
perfusions were done with Krebs-Henseleit solution, at a constant flow rate of
4mL/minute. The perfusion pressure was measured manometrically. Statistical
evaluations were performed by analysis of variance (ANOVA) and Bonferroni test, at
the 5% significance level. In perfused kidney studies, the group treated with the
whole venom showed a fall in all physiological parameters, except in potassium
transport. With the lectin-like fraction, the perfusion pressure rose initially, followed by
a fall, along with urinary flow and glomerular filtration rate. Sodium and potassium
tubular reabsorption increased, with a fall in the osmotic clearance. The thrombin-like
fraction promoted an initial rise followed by a fall in the end, in almost all parameters
except in the renal vascular resistance. The sodium and chloride tubular reabsorption
fell. There was an initial rise in the potassium transport, and an initial rise followed by
a fall in the osmotic clearance. With the L-amino acid oxidase fraction, there was a
fall in all the parameters studied. The Phospholipase A
2
fraction induced a rise in the
physiological and vascular parameters, as also in the potassium transport and
osmotic clearance; accompanied by a fall in sodium and chloride reabsorption. With
the exception of the thrombin-like fraction, all the substances tested induced acute
tubular necrosis in perfused kidneys in the end. Protein extravasation into the
Bowman space was evidenced in all perfused kidneys except in those treated with
the whole venom; but was more intense with the thrombin-like fraction. In the
systemic arterial bed, the whole venom raised arterial pressure in a dose-dependant
manner, except at the concentration of 10μg; in addition to causing intense
pulmonary hemorrhage with neutrophils and alveolar lymphocyte proliferation, renal
hemorrhage, and generalized vascular dilatation and congestion. In the isolated
mesenteric artery, there was a marked fall in perfusion pressure when the whole
venom was infused into the vessel pre-contracted with phenillephrine, as also in the
isolated vessel without phenillephrine. We conclude that Bothrops insularis venom
shows vasodilatation and hemorrhagic potential, like other venoms of the genus; but,
different from other Bothrops venoms, it also reveals a significant necrotic activity
when perfused into isolated rat kidney, causing acute tubular necrosis,
Key words: Snake venoms, Bothrops insularis, Kidney-drugs effects, Lectins, L-
amino acid oxidase, Thrombin, Phospholipases A.
29
INTRODUÇÃO
30
1 INTRODUÇÃO
1.1 Aspectos Gerais e Epidemiológicos
O valor global da incidência dos acidentes por picadas de serpentes e de sua
severidade permanece desconhecido, seja por falta de registro ou por metodologia
deficiente na captação dos dados (LIZANO; DOMONT; PERALES, 2003). A despeito
das estatísticas incompletas, estima-se que ocorrem anualmente cinco milhões de
casos, provocando 50.000 mortes, especialmente em áreas rurais dos trópicos,
atingindo a África, a Ásia e a América do Sul (WARRELL, 1996; CHIPPAUX, 1998;
CHIPPAUX; GOYFFON, 1998; LIZANO; DOMONT; PERALES, 2003). Além da
mortalidade eles geram um importante problema de saúde pública nos países em
desenvolvimento, na medida em que resultam em morbidades crônicas associadas
com amputações, deformidades e falência renal, e suas conseqüências sócio-
econômicas. (WHO, 1981; LIZANO; DOMONT; PERALES, 2003).
Em nosso país, os primeiros cuidados historicamente dispensados a pessoas
picadas por serpentes foram promovidos por Vital Brazil, registrando óbitos
decorrentes de acidentes ofídicos na região de Botucatu, no estado de São Paulo,
onde posteriormente se desenvolveram os maiores centros de criação de serpentes
e produção de soro antiofídico, como o Instituto Butantan, em 1901 (BENCHIMOL;
TEIXEIRA, 1993).
A notificação tornou-se obrigatória em 1986, e condicionada a
distribuição de soro aos estados (BOCHNER; STRUCHINER, 2002). Foram
registrados, no Brasil de junho a dezembro de 1986, 8574 casos. No três anos
seguintes, 1987, 1988 e 1989, respectivamente 21463, 19815 e 20947 casos
(BARRAVIERA, 1997). Entretanto, apesar da obrigatoriedade da notificação, os
dados são irregulares, em parte devido à existência de sistemas paralelos de
captação de dados (BOCHNER; STRUCHINER, 2002). Apresentam maior precisão
apenas em determinadas regiões, onde o assunto é mais estudado (CAIAFFA et al.,
1997; RIBEIRO et al., 1993; RIBEIRO; JORGE; IVERSSON, 1995).
No Brasil, apesar das falhas nas notificações, o Ministério da Saúde calcula
que ocorreram entre 1990 e 1993, 20.000 acidentes por ano, com 359 óbitos,
31
principalmente por serpentes do gênero Bothrops spp. (BRASIL, 1998; 2001;
CHIPPAUX; 1998). A extensa maioria era relacionada às espécies do gênero
Bothrops, 90,5%, vindo em segundo lugar o Crotalus com 7,7%, depois o Lachesis
com 1,4% e finalmente o Micrurus com 0,4% (BRASIL, 1998; 2001). Em 314 desses
óbitos o tempo decorrido entre a picada e o atendimento foi informado. Em 39,49%
dos óbitos o tratamento ocorreu nas primeira 6 horas, enquanto na maioria, 60,51%
o atendimento deu-se após esse tempo (BRASIL, 1998; 2001). Os acidentes eram
mais comuns em indivíduos do sexo masculino, trabalhadores rurais, na faixa etária
dos 15 aos 49 anos, atingindo principalmente os membros inferiores. (BOCHNER;
STRUCHINER, 2003).
Bochner e Struchiner (2003) realizaram um extenso levantamento na
literatura, de casos registrados no Brasil entre 1901 e 2000, concluindo que as
análises epidemiológicas realizadas nos últimos 100 anos são baseadas nas
variáveis utilizadas por Vital Brazil no início do século passado, com todas as
mesmas deficiências de subnotificação. Neste século, os registros mais recentes
limitam-se a informes regionais (DA SILVA; JORGE; RIBEIRO, 2003; PINHO;
OLIVEIRA; FALEIROS, 2004).
O Nordeste do Brasil aparece nos dados mais recentes do Ministério da
Saúde, nos anos de 1990 a 1993, últimos dados disponíveis, com o menor
coeficiente de incidência anual de acidentes ofídicos. Sendo uma das regiões mais
pobres, tradicionalmente agrícola, e de localização geográfica equatorial,
provavelmente tem sua situação subestimada em virtude de subnotificações, como
se observa nos registros sanitários brasileiros relativos ao assunto (BOCHNER;
STRUCHINER, 2003). No Ceará, os acidentes ofídicos compreendem uma boa parte
das ações dispensadas aos cuidados de saúde pública, seja na disponibilização do
soro, ou nos cuidados especializados necessários. O registro de casos é irregular e
poucos trabalhos foram publicados relativos à epidemiologia. Guimarães e et al.
(1989) verificaram, em dados da Divisão de Epidemiologia da Secretaria Estadual de
Saúde do Estado, entre 1986 e 1988, a ocorrência de 1079 casos de acidentes por
serpentes peçonhentas e não peçonhentas, com 7 óbitos e portanto uma letalidade
de 1,6%.
A Secretaria Estadual de Saúde do Estado do Ceará registrou, entre 1987 e
1990, 1256 casos, com 18 óbitos e letalidade de 1,4% (CEARÁ, 1991). Feitosa et al.
32
(1997), observaram a notificação de 688 casos no período de 1992 a 1995,
acometendo pessoas do sexo masculino em 75% dos casos, na faixa etária entre 10
e 49 anos em 72% das ocorrências, sendo atingidos principalmente os membros de
trabalhadores agrícolas. Houve uma sazonalidade, com os acidentes ocorrendo nos
meses de abril a setembro. A maioria dos acidentes foi provocada por serpentes do
gênero Bothrops, 88,3%, seguida pelas do gênero Crotalus, 10,7%, Micrurus, 0,9% e
Lachesis, 0,2%. A mortalidade foi de 0,7%, embora os casos sem informação
tenham chegado a 33,6% do total (FEITOSA; MELO; MONTEIRO, 1997). A maioria
dos óbitos ocorreu entre pacientes que foram tratados nas primeiras 6 horas após a
picada, fato que provavelmente deveu-se ao uso inadequado da dose ou do soro.
Apesar da baixa incidência dos acidentes crotálicos (FEITOSA; MELO; MONTEIRO,
1997), e da pobreza de dados disponíveis, o soro anticrotálico foi o mais utilizado no
Estado do Ceará no período analisado (FEITOSA, 1996).
1.2 Classificação das Serpentes
Troiano (1991) classificou os ofídicos na classe Reptilia, subclasse
Lepidosauria, ordem Squamata, subordem Serpentes. Calcula-se que existam cerca
de 3000 espécies de serpentes no mundo, das quais 410 são venenosas e
peçonhentas (BARRAVIERA, 1993), com a mortalidade dos acidentes variando
segundo a região (WARREL, 1989), a incidência de animais peçonhentos e a
capacidade de resposta do serviço de saúde (FEITOSA; MELO; MONTEIRO, 1997;
BRASIL, 1998; 2001).
As três principais famílias de serpentes existentes no Brasil, a Colubridae,
Elapidae e Viperidae, são classificadas segundo dois aspectos principais. A
localização das presas e a presença ou não de sulcos ou canais nestas, que
permitam a drenagem do veneno a partir das glândulas produtoras supralabiais.
Além disso, são estudadas suas características biológicas e a presença da fosseta
loreal entre o olho e a narina [(Figura 1) (BARRAVIERA, 1997; INSTITUTO
BUTANTAN, 1996)].
Adquirem verdadeira importância epidemiológica apenas as duas últimas
famílias, Elapidae e Viperidae (BRASIL, 1998; 2001).
33
A família Elapidae é composta de 18 espécies, todas incluídas no gênero
Micrurus. Seu veneno é fortemente neurotóxico, com ação pré e pós sináptica. A
ação pre-sináptica, predominante na M. corallinus, mas também observada em
algumas espécies de cascavel, consiste de atuação na junção neuromuscular pelo
bloqueio da liberação de acetilcolina e impedimento da deflagração do potencial de
ação, efeito que não responde aos anticolinesterásicos. A atividade pós-sináptica,
mais intensa na M. frontalis, é produzida por uma neurotoxina de baixo peso
molecular, que é rapidamente absorvida pela circulação sangüínea desencadeando
sinais precoces. Ela resulta da competição com a acetilcolina pelos receptores
colinérgicos de modo semelhante ao curare. A neostigmina e o edrofônio,
anticolinesterásicos, impedem a degradação da acetilcolina pela acetilcolinesterase,
prolongando a sua meia vida e melhorando os sintomas (BRASIL, 1998; 2001).
FIGURA 1: Principais características de diferenciação entre as serpentes
peçonhentas e não peçonhentas.
Fonte: BRASIL. Ministério da Saúde. Fundação Nacional de Saúde. Manual de diagnóstico e
tratamento de acidentes por animais peçonhentos. Brasília, 2001.
À família Viperidae, pertencem os gêneros, Bothriopsis, Porthidium, Bothrops,
Crotalus e Lachesis, dos quais apenas os três últimos adquirem importância
34
epidemiológica. Os gêneros Bothriopsis e Porthidium são resultados de nova
classificação com revisão do gênero Bothrops (BRASIL, 2001).
1.3 Características Gerais dos Venenos das Serpentes
Os venenos das serpentes são produzidos como um complexo enzimático de
finalidades principalmente digestivas com atividades tóxicas que neutralizam e
matam a presa durante a captura, acrescido de um efeito defensivo contra
predadores (INSTITUTO BUTANTAN, 1996). Produzem três tipos de resultados
integrados, a imobilização através de hipotensão, decorrente de vasodilatação
generalizada e hemorragia, a imobilização por paralisia, bloqueando a placa
neuromuscular, e a digestão dos tecidos da persa, através de seu efeito necrotizante
(AIRD, 2002). Contêm uma infinidade de substâncias com estruturas simples e
complexas, cuja proporção e características individuais variam com a espécie
(VARANDA; GIANNINI, 1994).
Dentre seus componentes orgânicos, entre 90 e 95% do seu peso seco é
composto de proteínas (BON, 1997), incluindo ainda carboidratos, lipídios,
especialmente fosfolipídios, e aminas biogênicas (VARANDA, GIANNINI, 1994).
Alguns dos elementos protéicos atuam enzimaticamente, enquanto outros agem
como toxinas diretas, principalmente na desestabilização de membranas celulares,
pelos mecanismos mais variados.
Desta forma, são encontrados entre aqueles com atividade enzimática, as
fosfolipases A
2
(PLA
2
) presentes nas espécies botrópicas, que estão relacionadas à
produção de derivados do ácido aracdônico (SIX; DENNIS, 2000), as
metaloproteinases responsáveis pela proteólise das membranas basais dos vasos,
as trombina símiles que ativam fatores da coagulação, transformam o fibrinogênio
em fibrina e induzem a agregação plaquetária (SANTOS et al., 2000), e as
flavoenzimas L-aminoácido oxidases que provocam ou inibem a agregação
plaquetária além de induzirem apoptose (DU; CLEMETSON, 2002).
Sem atividade enzimática são observadas toxinas que afetam processos
vitais como a função neuromuscular, as neurotoxinas de atividade pré e pós
sináptica (HAWGOOD; SANTANA DE SÁ, 1979), as que atuam na membrana
celular do músculo cardíaco, como as cardiotoxinas que despolarizam de modo
35
persistente a membrana das células excitáveis acarretando hemólise (REID, 1964),
e as lectinas, como a botrocetina, que se ligam a glicoproteínas e interferem com a
formação do coágulo e na agregação plaquetária (MONTEIRO et al., 2003).
Os componentes inorgânicos mais encontrados são elementos como o cálcio,
cobre, ferro, potássio, magnésio, manganês sódio, fósforo, cobalto e zinco
(FRIDERICH; TU, 1991). Alguns atuam como estabilizadores de proteínas, outros,
participam dos mecanismos catalíticos de componentes enzimáticos (BJARNASON;
FOX, 1994).
Reconhecidos por sua complexidade bioquímica, os venenos de serpentes
contêm milhares de proteínas cujo conhecimento dos mecanismos de ação e de
seus alvos podem favorecer o desenvolvimento de drogas terapêuticas ou de
ferramentas biológicas (FOX et al. apud TANJONI et al., 2003). Têm motivado uma
série de pesquisas, as quais, na medida em que revelam detalhes funcionais
permitem a formulação de medicamentos de uso disseminado. Desde que Rocha e
Silva, em 1949, descobriu um dos elementos chave do processo inflamatório, a
bradicinina, utilizando veneno da Bothrops jararaca, ficou claro a importância destas
pesquisas. Importância econômica, inclusive, gerando questionamentos sobre o
relacionamento da indústria farmacêutica e o meio acadêmico, deixado de fora no
momento de obtenção do lucro (FERREIRA, 1994).
Medicamentos de uso generalizado foram produzidos nesta linha, como os
inibidores da ECA (enzima conversora da angiotensina). Inicialmente identificado
como um fator potenciador da bradicinina (BPF) presente no veneno da Bothrops
jararaca (FERREIRA; ROCHA E SILVA, 1965; FERREIRA, 1965; AMORIM et al.,
1967), teve em seguida constatadas suas características de ação como inibidor das
enzimas inativadoras da bradicinina (FERREIRA, 1965, FERREIRA, 1966;
FERREIRA, VANE, 1967), posteriormente da conversão da angiotensina I em
angiotensina II (BAHKLE, 1968; BAHKLE; REYNARD; VANE, 1969), sendo
finalmente sintetizado artificialmente por pesquisadores da industria de
medicamentos (CUSHMAN et al., 1977), atualmente um dos antihipertensivos mais
utilizados em todo o mundo (FERREIRA, 1998). Outras pesquisas vêm sendo
desenvolvidas, na busca de medicamentos com propriedades semelhantes às
características de frações do veneno de serpentes, como ativadores da protrombina
que estimulam a coagulação (MASCI; WHITAKER; DE-JERSEY, 1988),
36
antimicrobianos (STABELI et al., 2004), peptídios natriuréticos (LISY et al, 1999), e
no campo da oncologia (BODE et al., 1994).
Seus venenos, extraídos para estudo (Figura 2), demonstraram possuir em
comuns características gerais como atividade proteolítica causando necrose;
atividade coagulante e, portanto provocando hemorragia por consumo do
fibrinogênio; ação neurotóxica (GUTIÉRREZ et al., 1981; BARRAVIERA, 1997).
Gêneros específicos guardam predomínio de algumas destas atividades.
FIGURA 2: Extração do veneno das serpentes.
Fonte: INSTITUTO BUTANTAN. O Butantan e as serpentes do Brasil. São Paulo, 1996.
As serpentes do gênero Bothrops têm atividades proteolíticas e coagulantes
acentuadas, sendo a ação neurotóxica mais evidente somente em algumas espécies
(RODRIGUES-SIMIONI et al., 2004).
As serpentes do gênero Crotalus possuem atividade mista com forte
predominância da ação neurotóxica (BARRAVIERA, 1997).
Nas serpentes do gênero Lachesis as ações predominantes são proteolíticas
e coagulantes, com discreta ação neurotóxica (HAAD, 1981).
As serpentes do gênero Crotalus conhecidas como cascavéis, compreendem
26 espécies distribuídas por todo o continente americano. São encontradas nas
regiões secas e pedregosas e pouco freqüentes nas florestas e matas úmidas. Na
Amazônia, são vistas apenas nos lugares secos e elevados da região de Santarém,
serra do Cachimbo e alguns serrados. Alimenta-se de pequenos roedores e sua
agressividade é menor que as do gênero Bothrops, e maior que as do Lachesis e
Micrurus. No Brasil encontramos uma única espécie, a Crotalus durissus, subdividida
em 6 subespécies, Crotalus durissus cascavella, Crotalus durissus collilineatus,
Crotalus durissus marajoensis, Crotalus durissus ruruima, Crotalus durissus terrificus
37
e Crotalus durissus trigonicus (BARRAVIERA et al., 1989). Sua coloração é variável.
Podemos encontrar as cores oliva-cinzenta, oliva, marrom-cinzenta até marrom, com
manchas romboédricas pela linha dorsal, manchas com margens brancas e centro
mais claro; lado ventral branco-amarelado até cinzento-amarelado (GRANTSAU,
1990).
Seu veneno produz uma emergência médica, determinando, em alguns
serviços, uma mortalidade de até 11% nos casos tratados com soro específico, e de
72% nos casos não tratados (ROSENFELDE, 1991). A Crotalus dirissus terrificus,
presente na América do Sul, contém inúmeras toxinas, incluindo crotoxina (VITAL
BRAZIL; EXCELL, 1971), crotamina (LI et al., 1993; MANCIN et al., 1998),
convulxina (PRADO-FRANCISHETTI, VITAL BRAZIL, 1980) e giroxina
(ALEXANDER; GROTHUSEN; ZEPEDA; SCHW, 1988). Suas atividades biológicas
compreendem miotoxicidade, neurotoxicidade, alterações hematológicas,
hepatotoxicidade e nefrotoxicidade (BARRAVIERA, 1997).
A crotoxina é a fração com fisiopatologia mais conhecida, composta pela
interação não covalente de duas subunidades, a fosfolipase A
2
, uma proteína básica
de 16.000 Dalton, e uma proteína ácida de 9.000 Dalton, a crotapotina (HENDON;
FRAENKEL-CONRAT, 1971; BARRAVIERA, 1997). A crotapotina potencializa a
atividade miotóxica da fosfolipase A
2
, promovendo lesões subsarcolêmicas, com
edema intramitocondrial das células musculares esqueléticas, que se iniciam em 4 a
6 horas (GOPALAKRISHNAKONE; DEMPSTER; HAEGOOD, 1984). É responsável
ainda pelos efeitos neurotóxicos, centrais, e periféricos, bloqueando a liberação pre-
sináptica da acetilcolina. Na junção neuromuscular produz paralisia semelhante ao
curare. Provoca ainda vômitos, salivação intensa, diarréia e convulsões
(BARRAVIERA, 1997). A rabdomiólise produzida na necrose muscular é
responsabilizada indiretamente pela lesão renal, através da formação de cilindros de
mioglobina que obstruem os túbulos, como também por toxicidade direta do
miopigmento nas células de revestimento tubular (AZEVEDO-MARQUES et al.,
1998). Este mecanismo de ação da rabdomiólise ainda não é bem estabelecido, já
que substâncias vasoativas liberadas pelo endotélio renal parecem contribuir para a
agressão tecidual (MARTINS et al., 1998). Além disso foi demonstrada a
nefrotoxicidade direta da crotoxina (MONTEIRO et al., 2001), proposta como o
principal agente do acometimento dos rins (MARTINS et al., 2002).
38
O Gênero Lachesis apresenta baixa incidência de acidentes, geralmente em
regiões de baixa densidade populacional e com sistema de notificação muito
deficiente, portanto também com poucos trabalhos publicados na literatura a seu
respeito (BRASIL, 1998; 2001; HAAD, 1981). Estão distribuídas pelas grandes
florestas tropicais brasileiras, como a Zona da Mata Atlântica e a floresta Amazônica,
embora haja registro de acidentes e captura desta espécie em regiões serranas
úmidas do Ceará (BRASIL, 1998; 2001; FEITOSA; MELO; MONTEIRO, 1997). No
Brasil é encontrada uma única espécie, Lachesis muta, subdivididas em duas
subespécies Lachesis muta muta e Lachesis muta noctivaga (BARRAVIERA, 1997).
Tem um padrão de cor marrom amarelado, com grandes manchas triangulares
pretas, as quais apresenta uma mancha clara no centro e o lado ventral de cor
creme-esbranquiçado (GRANTSAU, 1990). São conhecidas como surucucu,
surucucu-pico-de-jaca, surucutinga, surucucu-de-fogo. É a serpente venenosa de
maior tamanho em toda América Latina, chegando a um comprimento de quatro
metros e a secretar 4,5mL de veneno (BARRAVIERA, 1997). Seu veneno causa
lesão tecidual importante, provocada por proteases semelhantes às encontradas no
veneno botrópico. Foi obtida uma fração com atividade semelhante à da trombina
(BRASIL, 1998; 2001), que determina quadros hemorrágicos que podem ser
sistêmicos, transformando, em excesso, o fibrinogênio em fibrina e levando a uma
coagulopatia de consumo (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005). Possui ação
neurotóxica, representada por sinais de excitação vagal com bradicardia, diarréia,
hipotensão arterial e choque (BARRAVIERA, 1997), embora a fração específica não
tenha ainda sido determinada (BRASIL, 1998; 2001).
As serpentes do gênero Bothrops são as responsáveis pelo maior número de
acidentes no Brasil. Habitam preferencialmente ambientes úmidos, tais como as
áreas cultivadas e circunjacências, onde abundam pequenos roedores que são a
fonte de sua alimentação. Têm hábitos noturnos e são as mais agressivas do país,
atacando em silêncio quando ameaçadas. Constitui o gênero, uma população de
cerca de 32 espécies, com coloração enriquecida por desenhos variados, sobre um
fundo que tende acompanhar a cor predominante do terreno, variando do verde, na
B. bilineatus, ao cinza na B. insularis. Também muito variável são o tamanho e as
denominações das várias espécies, bem como sua distribuição por toda a América
Central, América do Sul, incluindo o território brasileiro (BARRAVIEIRA, 1997). Tal
39
diversidade de aspectos anatômicos possibilita que novas subespécies sejam
constantemente descritas (LIMA, 2001).
1.4 Características dos Venenos Bothrops
Os venenos das Bothrops apresentam inúmeras frações protéicas, cujo
mecanismo de ação não está bem definido. Cerca de 90% do seu peso seco é
constituído de uma grande variedade de enzimas, toxinas não enzimáticas e
proteínas não tóxicas, e o restante 10% compreende carboidratos, lipídios, metais,
aminoácidos livres e aminas biogênicas.
Estão definidas algumas das atividades primárias de frações citotóxicas,
vasculotóxicas, necrotizantes e coagulantes, que parecem responsáveis por outras
ações secundárias, como o choque e a insuficiência renal aguda (GUTIÉRREZ et al.,
1981; BARRAVIERA, 1997), as quais ainda necessitam de maiores esclarecimentos
sobre a patogenia.
Localmente provocam dor intensa, edema, hemorragia e necrose tissular,
levando às vezes, a amputação do membro (ROSENFELDE, 1971; GUTIÉRREZ et
al., 1981). Estes efeitos resultam da atividade de proteases (VITAL BRAZIL, 1982),
fosfolipases (MEBS; SAMEJIMA, 1986), fatores hemorrágicos (HOUSSAY, 1930),
com a liberação de agentes vasoativos levando ao edema (VILLARROEL et al.,
1978) que é agravado pela isquemia (CHAPMAN, 1968). Várias proteínas
hemorrágicas e miotóxicas foram isoladas de diferentes venenos originários de
serpentes de vários gêneros (BJARNASON; TU, 1978; BJARNASON; FOX, 1994;
MANDELBAUM; REICHL; ASSAKURA, 1982; MEBS; SAMEJIMA, 1986; SELISTRE;
GIGLIO, 1987; AIRD, 2002; TANJONI et al., 2003; CASTRO et al., 2004); embora
seus mecanismos de ação sejam ainda pouco compreendidos.
1.4.1 Atividades citotóxicas dos venenos Bothrops
A ação citotóxica é resultado da capacidade proteolítica dos venenos
(GUTIÉRREZ; CERDAS, 1984), podendo provocar necrose adiposa, mionecrose e
necrose do endotélio vascular, guardando relação direta com a quantidade do
veneno inoculado. A patogênese é complexa, decorrendo da atividade de proteases,
40
hialuronidases e fosfolipases A
2
metaloproteases, presentes no veneno, provocando
a liberação de mediadores inflamatórios do endotélio lesado pelas hemorraginas e
pela ação coagulante do veneno. As lesões locais, rubor, edema, bolhas e necrose,
acompanhados por dor intensa, podem ser agravadas por infecção bacteriana
secundária, principalmente Morganella morgagnii, Escherichia coli, Providentia sp e
Streptococco do grupo D (BRASIL, 2001). Podem surgir abscessos contendo
germes provenientes da boca do animal, da pele do acidentado ou do uso de
contaminantes, bacilos Gram-negativos, anaeróbios e cocos Gram-positivos D
(BRASIL, 2001), provocando algumas vezes a amputação do membro afetado
(MILANI et al., 1997). Quando a ação é generalizada, algumas toxinas podem
provocar rabdomiólise que leva a mioglobinúria e agravando o quadro com
insuficiência renal aguda (AZEVEDO-MARQUES et al., 1985). A atividade
necrotizante é mais intensa em alguns gêneros (BARRAVIERA, 1997). A Bothrops
moojeni possui atividade necrosante local em cobaias mais intensa que outras do
gênero (VILLARROEL et al. 1979), e a Bothrops insularis tem o veneno 14 vezes
mais potente que a Bothrops jararaca (INSTITUTO BUTANTAN, 1996).
Harris e Cullen (1990), classificaram a atividade citotóxica dos venenos de
serpentes pela sua capacidade de lesar irreversivelmente células musculares
estriadas, e separaram suas toxinas em três grupos; a) as pequenas miotoxinas,
mais estudadas nos venenos crotálicos; b) as cardiotoxinas; c) as miotoxinas
fosfolipases A
2
(PLA
2
) que formam o grupo mais extenso.
1.4.2 Atividade lectina dos venenos Bothrops
Ao mesmo tempo em que ativam a coagulação por um mecanismo trombina
símile, o veneno possui certas frações capazes de se ligar à trombina, inibindo a
atividade, em decorrência de sua capacidade de se ligarem a açucares, sendo por
isso classificadas entres as lectinas animais dependentes de cálcio (OGAWA et al.,
2005).
Lectinas são definidas como proteínas não imunes com afinidade específica
para moléculas de carboidrato, primeiramente reconhecidas por sua capacidade de
aglutinas células (SHARON; LIS, 1972; PEUMANS; VAN DAMME, 1995). As lectinas
de origem animal foram inicialmente classificadas de acordo com sua necessidade
41
de cálcio para atuar, chamadas, portanto, cálcio dependentes as do tipo-C, sendo
reconhecidas hoje também as dependentes do radical sulfidril, denominadas tipo-S,
sendo na sua maioria específicas para β-galactosídios (DRICKAMER, 1993). Um
aspecto importante que diferencia as lectinas em geral das lectinas símiles do tipo C
dos venenos das serpentes é que, enquanto as primeiras são exclusivamente
homodímeros ou homooligômeros, as últimas são comumente heterodímeros
constituídos de subunidades homólogas α e β (MONTEIRO et al., 2003).
Lectinas do tipo-C são proteínas não enzimáticas encontradas em muitos
animais vertebrados, moluscos, vegetais, bactérias e cogumelos (KILPATRICK,
2002), que se ligam não covalentemente a mono ou oligossacarídeos de modo
dependente de cálcio. São estruturalmente metaloproteinas com múltiplos domínios
que contêm uma ou mais cópias de uma região altamente conservada que consiste
de 115-130 resíduos de aminoácidos, denominados domínio de reconhecimento de
carboidrato (DRC) (OGAWA et al., 2005).
Lectinas do tipo-C que perderam a capacidade de se ligar a carboidratos são
encontradas somente em venenos de serpentes (OGAWA et al., 2005), como por
exemplo, o fator X, ativador da coagulação sanguínea, do veneno da Vipera russeli.
São denominadas lectinas símiles e tratam-se de metaloproteinases heterodímeras
que contém um domínio de lectina tipo-C com sua cadeia leve altamente homóloga a
lectinas específicas para galactose, mas que ela mesma não se liga à galactose
(TAKEYA et al., 1992). Elas mostram atividades contra fatores de coagulação,
inibição da agregação plaquetária e da trombina, afetando a homeostase e trombose
(OGAWA et al., 2005).
Aquelas lectinas encontradas nos venenos das serpentes apresentam
características estruturais que se assemelham tanto com as do tipo-C como do tipo-
S (HIRABAYASHI et al., 1991). De fato, a maioria das lectinas do tipo C isoladas dos
venenos de serpentes não consegue se ligar a carboidrato e não podem ser
consideradas verdadeiras lectinas (DRICKAMER, 1999; MORITA, 2004; MONTEIRO
et al., 2003), sendo, portanto, denominadas lectinas símiles. Pertencem a uma vasta
família de proteínas estruturalmente homólogas e funcionalmente distintas. Possuem
pelo menos um domínio de reconhecimento de carboidrato por subunidade (DRC) ou
apresentam um domínio do tipo de lectina cálcio dependente, que não se liga a
carboidrato ou cálcio (SHARON et al., 2003).
42
Foram isoladas de venenos de diversas serpentes, como a Crotalus atrox
(HIRABAYASHI et al., 1991), a Lachesis muta stenophyrs (ARAGÓN-ORTIZ;
BRENES-BRENES; GUBENSEK, 1990), a Bothrops jararaca (OZEKI et al., 1994),
Bothrops jararacussu (DE CARVALHO et al., 2002), a Bothrops godmani
(LOMONTE et al., 1990), Dendroaspis jamesonii (OGILVIE et al., 1986), a
Agkistrodon p. piscivorus (KOMORI et al., 1999), e a Bitis arietans (NIKAI et al.,
1995). Da Bothrops insularis Guimarães-Gomes et al. (2004) isolaram uma fração
lectina, ainda sem caracterização de seus efeitos biológicos.
As estruturas primárias de mais de 80 tipos de lectinas e lectina do tipo C
símile, isoladas de venenos de serpentes já foram determinadas. Elas são
normalmente compostas por duas unidades idênticas ligadas covalentemente,
consistindo de 135-141 aminoácidos ligados por ponte dissulfídrica (OGAWA et al.,
2004; MONTEIRO et al., 2003). Foram isoladas lectinas de vários venenos do
gênero Bothrops, Incluindo serpentes das espécies B. jararaca (FUJIMURA et al.,
1995), Bothrops godmani (LOMONTE et al., 1990), B. pirajai (HAVT et al., 2005), B.
asper (RUCAVADO et al., 2005), B. jararacussu (KASSAB et al., 2004).
Basicamente existem dois tipos de lectinas nos venenos das serpentes. O
primeiro tipo tem pontes dissulfídricas ligando homodímeros α e β formados por dois
peptídios homólogos de massa molecular por subunidade de aproximadamente
14kDa, com capacidade de aglutinar eritrócitos e de se ligar a carboidratos
produzindo uma gama de efeitos patológicos necrotizantes, similares aos
encontrados nos venenos das serpentes do gênero Bothrops
(HAVT et al., 2005). O
segundo tipo tem um alto peso molecular, entre 50 e 100 kDa, correspondendo a
multímetros ligados por pontes dissulfídricas, que estão associados a de dois a
quatro heterodímeros α β, tal qual visto na convulxina, do veneno crotálico, que
mostra outras importantes atividades como a agregação plaquetária, sem entretanto
ação significativa na aglutinação de eritrócitos (TOYAMA et al., 2001).
Nos mamíferos as lectinas então envolvidas na aderência celular a outras
células e à matriz extracelular (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005). As dos venenos
das serpentes, quando injetadas em outros animais, podem aglutinar hemácias in
vitro, estimular mitose em linfócitos, determinar agregação plaquetária, induzir
edema, liberar cálcio dos estoques intracelulares, e inibir a proliferação de algumas
linhagens de células (MARCINKIEWICZ et al., 2000). Podem se ligar ao fator de von
43
Willebrand e induzir sua interação com a glicoproteína plaquetária Ib. Outras, ao
contrário, ligam-se à glicoproteína plaquetária Ib impedindo o fator de von Willebrand
de mediar a agregação plaquetária, ou inibem a coagulação por formar complexos
não covalentes com os fatores IX e IXa, X e Xa, bloqueando sua participação na
cascata da coagulação, e algumas interagem diretamente com a trombina inibindo
suas funções de agregação de plaquetas, quebra do fibrinogênio e ativação da
coagulação (MONTEIRO et al., 2003).
1.4.3 Atividade L-aminoácido oxidase dos venenos Bothrops
Recentemente, Stabeli et al. (2004) isolaram uma L-aminoácido oxidase
(LAAO) do veneno da B. alternatus, demonstrado sua atividade na agregação
plaquetária e efeito bactericida. Tempone et al. (2001) fracionaram outra LAAO do
veneno da Bothrops moojeni que revelou atividade parasiticida contra a Leishmania,
através de um mecanismo envolvendo a geração de peróxido de hidrogênio.
As L-aminoácido oxidases (LAAOs) são flavoenzimas que catalisam a
desaminação estereoespecífica de um substrato L-aminoácido, a um α-cetoácido
correspondente, com a produção de peróxido de hidrogênio e amônia (DU,
CLEMETSON, 2002). São enzimas largamente distribuídas em diferentes
microorganismos tais como bactérias, fungos, algas verdes e venenos de serpentes.
Nos microorganismos estão envolvidas na utilização de fontes de nitrogênio
(STABELI et al., 2004). A Neurospora crassa que utiliza rotineiramente fontes de
nitrogênio rapidamente metabolizáveis, como amônia, glutamina e glutamato,
quando em condições ambientais desfavoráveis aumentam a produção de LAAO
para passar a utilizar aminoácidos, purinas, nitrato, proteínas e peptídios (XIAO;
MARZLUF, 1993; CALDERON et al., 1997).
Elas estão presentes nos venenos de serpentes e se supõe que sejam
toxinas, ainda que seu modo de ação não esteja esclarecido (STABELI et al., 2004).
A serpente C. rhodostoma apresenta 30% de seu veneno constituído de LAAO
(PONNUDURAI et al., 1994). Se sua toxicidade está relacionada à atividade
enzimática também não está claro, embora, muitos trabalhos recentes tenham
descrito seus efeitos biológicos e as suas características farmacológicas. Neste
sentido é citada sua ação sobre plaquetas, indução de apoptose, hemólise,
44
citotoxicidade e capacidade de provocar hemorragia através da lesão endotelial
(SUHR, KIM, 1996; TORII et al., 1997; DU, CLEMETSON, 2002), formação de
edema e efeito bactericida (STILES et al., 1991; LI et al., 1994; MASUDA et al.,
1997; STABELI et al., 2004).
Estruturalmente são glicoproteínas formadas por homodímeros, que se ligam
à Flavina Adenina Dinucleotídio (FAD). Alguns tipos de venenos possuem mais de
um tipo de LAAO. (DU, CLEMETSON, 2002). Nos venenos crotálicos elas se
associam especificamente às células endoteliais de mamíferos, induzindo apoptose
(SUHR; KIM, 1996).
Seus sítios ativos estão bem caracterizados estruturalmente, mostrando em
geral distintas massas moleculares variando entre 110-150 kDa, se medida por
filtração em gel, e entre 50-70kDa quando medida por SDS/PAGE, o que indica que
são homodímeros associados não covalentemente. Seus substratos preferenciais
incluem L-aminoácidos hidrofóbicos, como L-leucina, L-fenilalanina, L-triptofano, L-
metionina, L-isoleucina e L-norleucina, sendo as variações de afinidade explicadas
pelos diferentes sítios de ligação, não abrangendo aminoácidos hidrofílicos ou D-
aminoácidos (DU, CLEMETSON, 2002).
A maioria dos seus efeitos parece decorrer da produção do peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
) (SKARNES, 1970; TAKATSUKA et al., 2001; ALI et al., 2000;
TEMPONE et al., 2001; DU; CLEMETSON, 2002). Com relação à função plaquetária
seu efeito tem sido descrito como dúbio. Para Nathan et al. (1982), a LAAO da Echis
colorata inibe a agregação das plaquetas induzida por ADP e Takatsuka et al., 2001,
sugerem que esta atividade seria realizada através da produção de peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
), já que ele é inibido pela catalase, enzima que reduz este efeito.
Propõem que a atuação do peróxido de hidrogênio se deva à inibição da interação
de uma integrina (GPIIb/IIIa), expressa na superfície da plaqueta ativada, com o
fibrinogênio.
Outros autores observaram a ativação da agregação plaquetária humana (ALI
et al., 2000), ação que é inibida pela indometacina e aspirina (LI et al., 1994), mas
não pelo bloqueio da estimulação do ADP, decorrendo, portanto da produção de
Tromboxane A
2
pela cicloxigenase. Também bloqueadores da adenilato ciclase e da
guanilato ciclase, como a prostaglandina E
2
, inibem esta ação, juntamente com a
catalase, agindo na eliminação de H
2
O
2
. Sugere, então, que a LAAO induz a
45
agregação plaquetária pela produção de peróxido de hidrogênio, que por sua vez
aumenta a produção de Tromboxane A
2
dependente de cálcio, mas independente de
ADP (DU, CLEMETSON, 2002). A ativação das plaquetas pela trombina e pelo ADP
não envolve o peróxido de hidrogênio, que está relacionado à ativação plaquetária
pelo colágeno, a qual é também inibida pela catalase. O peróxido de hidrogênio é
produzido pelas plaquetas estimuladas pelo colágeno, atuando como segundo
mensageiro que ativa o metabolismo do ácido aracdônico e a fosfolipase C, embora
ainda não esteja bem claro como se dá esta ação (PIGNATELLI et al., 1998).
Entretanto, é possível que as LAAOs também ativem as plaquetas através de um
receptor específico, já que Suhr e Kim (1996) demonstraram que a LAAO da A. halys
promove efeitos citotóxicos diferentes em diferentes linhagens celulares (DU,
CLEMETSON, 2002).
A citotoxicidade se apresenta como a indução da apoptose, relacionada pela
primeira vez às LAAOs em células do endotélio vascular (SUHR, KIM, 1996; TORII
et al., 1997), e posteriormente a outras células em cultura. Parece envolver também
a produção de peróxido de hidrogênio, sendo inibida pela catalase. Muitas
evidências sugerem que é desencadeada pelo mecanismo celular oxidativo, já que
os agentes que a promovem são oxidantes ou estimulantes deste mecanismo (DU,
CLEMETSON, 2002). O peróxido de hidrogênio e outros radicais livres de oxigênio
promovem a peroxidação de ácidos graxos insaturados das membranas celulares,
numa reação autocatalítica em cadeia, desestruturando estas membranas, ou
provocam oxidação de resíduos de aminoácidos das pontes dissulfídricas que unem
cadeias protéicas, fragmentando as proteínas celulares (KUMAR; ABBAS; FAUSTO,
2005), ambos levando à morte celular.
O peróxido de hidrogênio induz a expressão de Fas em células endoteliais,
através de uma proteína tirosina quinase. Fas é uma proteína de membrana da
família dos receptores do fator de necrose tumoral e do fator de crescimento neural,
mediadores da morte celular, e intermedia a apoptose induzida pelo peróxido de
hidrogênio (SUHARA et al., 1998). O H
2
O
2
aumenta ainda a atividade da caspase 3,
uma cisteína protease, bem reconhecida na indução da morte celular
(DIPIETRANTONIO et al., 1999), fato que embora não esteja diretamente
relacionado com a atividade das LAAOs, reforça o envolvimento do H
2
O
2
no
mecanismo da apoptose.
46
Dentre outros efeitos biológicos, Ali et al., 2000, estudando as LAAOs com o
modelo da pata de rato, observou a formação de edema pronunciado após uma hora
da injeção de LAAO do veneno da E. macmahoni. A hemorragia é um resultado final
de uma série de eventos cujo principal elemento parece ser a apoptose das células
endoteliais (DU, CLEMETSON, 2002). O edema pode ser decorrente da atividade
do peróxido de hidrogênio na estimulação da óxido nítrico sintetase e liberação do
óxido nítrico pelo endotélio (MITTAL, 1993).
O efeito bactericida foi primeiro determinado com a LAAO da Crotalus
adamanteus (SKARNES, 1970), com posterior demonstração de eficácia sobre
bactérias Gram positivas e Gram negativas a partir do veneno da Pseudechis
australis (STILES et al., 1991). Tempone et al. (2001) observaram a LAAO do
veneno da B. moojeni matava a forma promastigota de Leishmania spp. in vitro, e
possuía efeito terapêutico em pacientes infectados, bem como eliminava outros
parasitas intracelulares, e novamente o peróxido de hidrogênio parece ter um papel
chave, visto que esta ação também foi inibida pela catalase (SKARNES, 1970;
STILES et al., 1991; TEMPONE et al., 2001).
Algumas LAAOs apresentam similaridade com uma proteína induzida pela
interleucina 4 (CHU; PAUL, 1997), com adesinas como a proteína de adesão
vascular (VAP-1) induzida pela inflamação, com aminooxidases séricas bovinas
(SALMI; JALKANEN, 2001), e com proteínas indutoras de apoptose em peixes
infectados por nematóides (PIA), que impedem a infecção (JUNG et al., 2000).
Todas têm sítio de ligação com flavina adenina dinucleotídio (FAD) similares e são
capazes de produzir H
2
O
2
. Como as LAAOs humanas estão envolvidas na
inflamação, é possível que as LAAOs dos venenos das serpentes estejam
relacionadas com a inflamação que se desenvolve após a agressão e inoculação do
veneno (DU; CLEMETSON, 2002).
1.4.4 Atividade trombina símile dos venenos Bothrops
Uma das estratégias para a captura da presa das serpentes do gênero
Bothrops é causar imobilização através de hipotensão e hemorragia (AIRD, 2002). A
cascata da coagulação sanguínea é ativada por uma variedade de enzimas
proteolíticas, glicoproteínas, dos venenos das serpentes, com mecanismo de ação
47
semelhante ao da trombina. São serinoproteases capazes de atuar, em mamíferos,
de modo semelhante à trombina, sobre o fibrinogênio, gerando monômeros de
fibrina (MEIER; STOCKER 1991; ZHANG et al., 1998; CASTRO et al 2004;
MITCHELL, 2005; KAMIGUTI; CARDOSO, 1989; KAMIGUTI et al., 1986). Várias
enzimas com estas características foram descritas numa mesma espécie ou em
espécies e mesmo gêneros diferentes. Seus genes pertencem à família das
tripsinas/cininas, guardando similaridade com os genes das tripsinas,
quimiotripsinas, e cininas de mamíferos.
Seu efeito na coagulação inclui trombose macrovascular e microvascular,
aumento do tempo de protrombina e do tempo parcial de tromboplastina e redução
do nível de fibrinogênio. A fração responsável, porém, atua com algumas diferenças
em relação à trombina endógena. Não é inativada pela heparina, e não ativando o
fator XIII (fator estabilizador da fibrina), tem como conseqüência a formação de um
coágulo mais instável e facilmente removido da circulação, levando rapidamente ao
esgotamento da capacidade coagulativa do indivíduo (MITCHELL, 2005). Raras são
capazes de ativar esse fator XIII, (Cerastes cerastes), como também os fatores V
(Agkistrondon contortrix contortrix) (KISIEL ,1979; TOKUNAGA et al., 1988), o fator
VIII (Bothrops jararaca e B. atrox) e o fator X (Cerastes cerastes) (CASTRO et al,
2004).
Atuam de modo variável sobre o fibrinogênio. Algumas clivam ambas as
cadeias Aα e Bβ do fibrinogênio, liberando fibrinopeptídio A e B, mas a maioria cliva
apenas uma delas, A ou B formando um complexo de fibrina facilmente degradável
pela plasmina (SEEGERS; OUYANG, 1979; RUSSEL, 1983). A trombina age
sempre nos dois tipos, Aα e Bβ. A PA-Bj, da Bothrops jararaca não hidrolisa o
fibrinogênio, mas sim outros substratos peptídicos contendo arginina ou lisina
(SERRANO et al. 1995). As plaquetas são também ativadas, pelos fragmentos da
fibrina degradada ou pela própria trombina símile (MITCHELL, 2005), e produzem
tromboxane A
2
, que promove agregação e ativação de mais plaquetas. Com a falta
de ativação do fator XIII, o coágulo instável é rapidamente digerido pelo sistema
fibrinolítico, retroalimentado por produtos de degradação da fibrina, levando à
persistente formação de microtrombos e sua destruição. O resultado final é um
quadro de coagulação intravascular disseminada, levando a coagulopatia por
consumo do fibrinogênio (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005; NIEWIAROWSKI et al.,
48
1979; WHITE, 2003). Os microtrombos se formam nos capilares renais, juntamente
com a redução do fluxo renal, decorrente de vasoplegia e hipovolemia por
hemorragia local, provocadas pelo veneno botrópico, contribuem para a insuficiência
renal aguda e o choque hipovolêmico (MITCHELL, 2005).
Até o presente, mais de 30 enzimas com atividade semelhante à trombina
tiveram sua estrutura primária conhecida, com sítio ativo mantendo uma seqüência
altamente conservada (histidina 57, ácido aspártico 102, serina 195). O carboidrato
da molécula pode variar em quantidade (0 a 30%) e em qualidade, sendo
encontrados fucose, monose, hexose, galactose, dentre outros, e parece mais
importante para estabilizar a proteína do que para seu efeito catalítico. Baseados na
sua estrutura secundária e susceptibilidade aos inibidores clássicos de
serinoproteases, estudos reconheceram sua relação evolutiva com a tripsina,
quimiotripsina e calicreína de mamíferos, estando incluída na mesma família
(CASTRO et al., 2004). Elas podem afetar muitos pontos da coagulação, desde a
ativação dos fatores plasmáticos como a proteína C (KISIEL et al., 1987), a ativação
da via alternativa do complemento (TAMBOURGI et al., 1994; YAMAMOTO et al.,
2002) e da indução da agregação plaquetária (SANTOS, et al, 2000; TENG; KO,
1998). Os inibidores comuns da formação de trombina, como a heparina, não são
capazes de inibir a maioria destas serinoproteases das serpentes, embora uma
pequena parcela sofra a inibição da heparina e da antitrombina III. Como a trombina,
também são insensíveis aos inibidores clássicos da tripsina, como a α1-antitripsina
(CASTRO et al., 2004).
Este componente de atividade trombina símile tem sido bem estudado com
vistas ao entendimento de seu mecanismo de ação, para possível aplicação nas
alterações de coagulação (RIZZA; CHAN; HENDERSON, 1965; HOWIE;
PRENTICE; McNICOL, 1973; CHAN, 1969; CASTRO et al., 2004).
Estudos sobre os efeitos de outros componentes da família trombina símile,
revelaram atividade na liberação de cininas, levando a um efeito hipotensor
(MATSUI et al., 2000; KOMORI; NIKAI, 1997; MARKLAND, et al., 1982). Geralmente
a cinina liberada a partir do cininogênio plasmático, pelas frações de veneno com
atividade semelhante à trombina, é a bradicinina (PETRETSKI et al., 2000; KOMORI
et al., 2001; SERRANO et al., 1998). A elegaxobina II do veneno da Trimeresurus
elegans é única no sentido de ser capaz de liberar Lisil-bradicinina, como as
49
calicreínas teciduais. É bem conhecida a presença de calicreína em tecidos tais
como o pâncreas, as glândulas salivares, a pele e o cólon, capaz de provocar a
proteólise do cininogênio gerando lisil-bradicinina (RANG et al., 2004).
1.4.5 Atividade fosfolipásica A
2
dos venenos Bothrops
As fosfolipases A
2
compõem uma superfamília de enzimas definidas por sua
habilidade de catalisar a hidrólise do éster ligado à posição central (sn-2) de
glicerofosfolipidios de membrana celulares, liberando precursores de mediadores
químicos relacionadas ao processo inflamatório. Foram descritas cerca de 19
enzimas com atividade fosfolipase em mamíferos, encontradas sob duas formas;
intracelular, ou citosólica, e extracelular ou secretória (RANG et al., 2004).
A forma secretória compreende 10 isoenzimas de baixo peso molecular,
dependentes de cálcio para atuação e implicadas em processos biológicos como a
geração de eicosanóides, na inflamação e defesa do hospedeiro (KUDO;
MURAKAMI, 2002). No processo fisiopatológico natural, a forma citosólica, é a
principal implicada na liberação do ácido aracdônico (eicosatetraenóico) e, portanto,
dos ecosanóides (prostaglandinas, tromboxano A
2
s, leucotrienos e lipoxinas), como
também da lisogliceril-fosforilcolina, o precursor de outro mediador inflamatório, o
fator de ativação plaquetária (PAF) (RANG et al., 2004). Uma cicloxigenase de
ácidos graxos (COX) agindo em seguida à liberação do ácido araquidônico vai
metaboliza-lo a prostanóides (prostaglandinas e Tromboxane A
2
) e uma lipoxigenase
dará origem aos leucotrienos e lipoxinas. O fator de ativação plaquetária (PAF) é
originado de um fosfolipídio, lisogliceril-fosforilcolina, que após sofrer a ação da
fosfolipase A
2
é acetilado pela acetiltransferase (RANG et al., 2004; KUMAR;
ABBAS; FAUSTO, 2005). Compreende três enzimas, das quais a cPLA
2
α é a mais
implicada no mecanismo do ácido araquidônico, e com ativação finamente regulada
pelo cálcio e fosforilação. A fosfolipase independente de cálcio iPLA2 compreende
uma família de duas enzimas que participam do remodelamento dos fosfolipídios. A
família da acetilhidrolase do fator de ativação plaquetária, PAR-AH, consiste de
quatro enzimas cujo substrato específico são o PAF e fosfolipídios oxidados, os
quais degrada para inibir o processo inflamatório (KUDO; MURAKAMI, 2002).
50
Foram classificadas segundo quatro critérios; a) a capacidade de catalisar a
hidrólise do éster do substrato fosfolipídico; b) a seqüência completa de
aminoácidos; c) a homologia de seqüências; d) a variação no segmento
cataliticamente ativo (SIX; DENNIS, 2000).
Na classificação geral das enzimas fosfolipases, as miotoxinas dos venenos
das serpentes foram as primeiras identificadas e estão incluídas principalmente no
grupo IIA de Six e Dennis (KUDO; MURAKAMI, 2002). Em um mesmo veneno são
encontradas uma variedade de PLA
2
que podem possuir atividade neurotóxica,
citotóxica, cardiotóxica, miotóxica hipotensiva, proinflamatória, coagulantes ou
agregantes de plaquetas, com características moleculares de estrutura quaternária
monomérica ou multiméricas, homo ou heterodiméricas, ligadas por pontes
dissulfídricas, tóxicos e não tóxicos, cataliticamente ativos ou não. Todas são
dependentes de cálcio para atuar e os resíduos da alça de ligação ao cálcio são
particularmente conservados.
As miotoxinas fosfolipases A
2
, foram separadas conforme presença de
atividade neurotóxica ou não (MEBS; OWNBY, 1990). Elas mantêm uma homologia
estrutural que se mantém constante dentro de cada grupo. Dentre estas últimas
existe uma clara distinção entre as que contêm um ácido aspártico na posição 49,
“Asp49”, e as com um resíduo de lisina nesta posição “Lys49” (LOMONTE;
ÂNGULO; CALDERÓN, 2003). Um quarto grupo foi constituído pelas toxinas que
indiretamente lesam os músculos, como as causadoras de hemorragia, que pela
estase provocariam isquemia e necrose secundária (GUTIÉRREZ; CERDAS, 1984).
Aquelas fosfolipases neurotóxicas são comumente encontradas nos venenos
elapídicos, sendo as responsáveis pelo seu efeito letal, agindo em doses muito
baixas (baixa DL50) na junção neuromuscular, com atividade pre-sináptica
(ROSEMBERG, 1990), podendo causar lesão muscular esquelética em doses mais
baixas ainda, de 1-2μg (HARRIS; JOHNSON; KARLSSON, 1975). São também
encontradas em venenos crotálicos, como a crotoxina, de serpentes sul americanas,
(HENDON; FRAENKEL-CONRAT, 1971; SALVINI et al., 2001), e em venenos de
algumas serpentes botrópicas sendo encontrada no veneno da B. insularis. (COGO
et al., 1998).
As miotoxinas fosfolipases A
2
não neurotóxicas são muito mais comuns em
venenos crotálicos e botrópicos, onde também são mais abundantes, agindo em
51
doses maiores (alta DL50), (GUTIÉRREZ et al., 1986b; ROSEMBERG, 1990;
SOARES, et al., 2000a; SOARES et al., 2001), e tendo menor participação na
mortalidade direta destes venenos (LOMONTE; GUTIÉRREZ; MATA, 1985). Seu
potencial mionecrótico também é mais fraco que aquelas PLA
2
com ação
neurotóxica, embora, por serem encontradas em maiores quantidades nestes
venenos tenham uma participação central na lesão e destruição tissular, causando
mionecrose em doses de 25-100μg (LOMONTE et al., 1987, LOMONTE; ÂNGULO;
CALDERÓN, 2003; MOURA-DA-SILVA et al., 1991; MELO; OWNBY, 1999;
TRENTO et al., 2001).
Estruturalmente são constituídas por 125 resíduos de aminoácidos, unidos
por seis pontes dissulfídricas e contêm uma extensão C-terminal com cinco a sete
resíduos. Dentre estas fosfolipases são reconhecidos três tipos diferentes; a) as
clássicas com ácido aspártico no carbono 49, que catalisa a hidrólise do éster ligado
à posição sn-2 do glicerofosfolipidio (Asp49); b) as variantes, também denominadas
proteínas semelhantes a PLA
2
(PLA
2
símile) por serem estruturalmente semelhantes,
mas destituídas de atividade enzimática, contendo lisina em substituição ao ácido
aspártico, (Lys49), (LOMONTE; ÂNGULO; CALDERÓN, 2003); c) variantes com
serina ocupando a posição 49, (Ser49), (KRIZAJ et al., 1991; POLGÁR et al., 1996),
as duas últimas enzimaticamente inativas (LOMONTE; ÂNGULO; CALDERÓN,
2003). Lee et al. (2001) propõem que as características estruturais destas impedem
a liberação do ácido graxo produzido após a hidrólise inicial do fosfolipídio,
interrompendo o ciclo catalítico. Seu efeito mionecrótico transcorre por uma via
catalítica independente da atividade enzimática, sendo acompanhado, in vivo, por
edema, hiperalgesia, liberação de citocínas proinflamatórias como interleucina 6 (IL
6), além de atividade letal quando injetada por via endovenosa ou intraperitonial em
camundongos (LOMONTE; ÂNGULO; CALDERÓN, 2003).
In vitro as fosfolipases A
2
apresentam efeitos na placa neuromuscular
principalmente aquelas Lys49 de vários venenos, mas também a Asp49 no veneno
da Bothrops insularis (COGO et al., 1998), atividade citolítica que se expressa pela
ruptura de lipossomos compostos de fosfolipídios carregados negativamente
(SOARES et al., 2000b), promoção da degranulação de mastócitos com
conseqüente aumento da permeabilidade vascular e formação de edema
52
(LANDUCCI, et al., 1998), além de provocarem lesão renal em sistema de rim
isolado de rato (BARBOSA et al., 2002).
Recentemente Barbosa et al. (2005) comprovaram atividade bactericida em
miotoxinas fosfolipase A
2
, Asp49 e Lys49, do veneno da Bothrops jararacussu. A
Asp49 demonstrou atividade enzimática e destruiu a membrana e a parede celular
do microorganismo Xanthomonas axonopodis, induzindo desorganização e perda de
elementos citoplasmáticos, quando examinados por microscopia eletrônica.
A despeito de inúmeras pesquisas, as bases moleculares para a seletividade
e especificidade farmacológica das PLA
2
, não estão ainda claras. Basicamente o seu
alvo primário está localizado no exterior da célula, e seu mecanismo de ação parece
envolver três mecanismos. Em primeiro lugar sua atividade catalítica intrínseca que
pode liberar ácidos graxos e lisofosfolipídios ativos com potente ação biológica. Em
segundo lugar a ligação interfacial com as camadas lipídicas das membranas
celulares, com ou sem hidrólise de fosfolipídios, podendo afetar as funções celulares
ou integridade das membranas destas células. Finalmente a ligação a proteínas
específicas nas superfícies celulares, que atuam como receptores ligados à
membrana, já havendo sido identificados receptores específicos para fosfolipases A
2
de cadeia única. Nas células neurais de ratos os do tipo N, e tipo N símile, em
células pulmonares, hepáticas, cardíacas e renais. Estes receptores se ligam com
elevada afinidade a PLA2 neurotóxicas. Em células musculares esqueléticas de
coelhos foram observados receptores do tipo M, e do tipo M símile também em
células pulmonares, hepáticas, cardíacas e renais. Estes últimos ligando-se
principalmente a PLA2 não tóxicas (VALENTIN; LAMBEAU, 2000).
São receptores pertencentes à superfamília das lectinas do tipo C, que
guardam pouca identidade nos resíduos de aminoácidos mas mantém uma região
extracelular N-terminal rica em cisteína que se assemelha ao domínio de
reconhecimento de carboidratos (CRD) da fibronectina. Esta região, CRD, é zona de
ligação da fosfolipase A
2
ao receptor, que se liga também à região de ligação ao
cálcio, e com isto tem inibida sua atividade catalítica mas tem atividade endocitária e
internaliza a fosfolipase (VALENTIN; LAMBEAU, 2000). A fosfolipase A
2
fracionada
do veneno da Bothrops insularis, tem sua atividade tóxica essencialmente
dependente de sua ação enzimática. Inicialmente produz contração muscular que se
segue a uma inibição da transmissão neuromuscular. Este último efeito parece
53
resultar de alterações na cinética dos canais de potássio pré e pós sinápticos
(COGO et al., 1998).
Independentemente de possuírem ou não atividade enzimática, as
fosfolipases A
2
desestabilizam os fosfolipídios das membranas celulares e induzem
lesão da membrana celular e induzem lesão da membrana celular, permitindo um
influxo descontrolado de íons cálcio e sódio que promovem alterações intracelulares
irreversíveis culminantes com a morte celular (LOMONTE; ÂNGULO; CALDERÓN,
2003).
1.4.6 O papel das metaloproteinases dos venenos Bothrops
No homem, as metaloproteinases participam do remodelamento do tecido
conectivo no processo de cicatrização das feridas (MITCHELL, 2005). Nos venenos
das serpentes além de lesarem as células endoteliais, contribuindo para a
hemorragia local ou sistêmica (RUIZ DE TORRENT et al., 1999), facilitam a
disseminação do veneno a partir do local da injeção (ANAI et al., 2002), onde
contribuem com a mionecrose, a dermonecrose, a formação de bolhas e a
inflamação (GUTIÉRREZ; RUCAVADO, 2000). Ao destruir a membrana basal,
expõem a matriz extracelular ao plasma, ativando secundariamente a cascata da
coagulação e liberando mediadores químicos da inflamação (KUMAR; ABBAS;
FAUSTO, 2005). São decorrentes desta atividade muitas hemorragias sistêmicas, as
vezes no sistema nervoso central (BARRAVIEIRA, 1997), coagulação,
defibrinogenação, e inibição da agregação plaquetária (KAMIGUTI; HAY; ZUZEL,
1996a) que provocam a morte de pacientes.
Estruturalmente, as metaloproteinases dos venenos das serpentes (SVMPs)
estão intimamente relacionadas às proteínas de mamíferos, desintegrinas e
metaloproteinases envolvidas na ativação e comunicação celular (ADAMs), e com as
metaloproteinases da matriz (MMPs) (RUCAVADO; ESCALANTE; GUTIÉRREZ,
2004). Pertencem à superfamília de metzincinas, encontradas também em
crustáceos e bactérias, assim classificadas por conterem sítios idênticos de ligação
com o zinco e uma conformação que determina uma base hidrofóbica para o íon
zinco (BODE; GOMIS-RUTH; STOCKLER, 1993). São formadas a partir de
precursores multidomínios que possuem um domínio catalítico e um domínio rico em
54
cisteína semelhante à desintegrina, guardando o domínio catalítico similaridade
estrutural e funcional com o domínio das metaloproteinases da matriz (MMPs). Este
mantém todos os resíduos de ligação com o zinco e constantes estruturais
envolvidas em catálise. Ao contrário, o domínio rico em cisteína semelhante a
desintegrina é encontrado nas ADAMs e substitui um domínio hemopexina C, muito
encontrado nas MMPs secretadas (TANJONI et al., 2003).
A especificidade de substrato das metaloproteinases dos venenos das
serpentes (SVMPs) é muito semelhante ao das metaloproteinases da matriz
(MMPs), envolvendo componentes da membrana basal da microvasculatura
(TANJONI et al., 2003), a qual, quando rompida deixa extravasar sangue,
constituindo o mecanismo fisiopatológico da hemorragia provocada pelas SVMPs
(GUTIERREZ; RUICAVADO, 2000). A atividade catalítica das metaloproteinases
envolvidas na ativação e comunicação celular (ADAMs) e das SVMPs está
relacionada ao revestimento celular e, portanto, à comunicação entre as células e
sua ativação (MOURA-DA –SILVA et al., 1996).
Uma das SVMPs bem estudada, a jararhagina, isolada do veneno da B.
jararaca, é um dos principais componentes responsáveis pela hemorragia. Além de
degradar a matriz extracelular também atua em proteínas plasmáticas da
coagulação, importantes para a hemostasia (KAMIGUTI et al., 1996b). Seu domínio
semelhante a desintegrina rico em cisteína, é capaz de antagonizar a ativação
plaquetária induzida pelo colágeno (USAMI et al., 1994). Aparentemente os dois
domínios agem sinergicamente inibindo a agregação plaquetária e destruindo a
matriz extracelular, agravando a hemorragia (KAMIGUTI; HAY; ZUZEL, 1996a).
1.5 O Veneno da Bothrops insularis
A serpente Bothrops insularis (Figura 3) é endêmica exclusivamente da Ilha
da Queimada Grande situada a 30 km da costa sul do Estado de São Paulo, vizinha
de Itanhaém e Peruíbe, recoberta em quase a totalidade de seus 430 mil metros
quadrados por mata atlântica. Foi descrita em 1921 pelo herpetólogo Afrânio do
Amaral (1894-1982), do Instituto Butantan. Diferenciou-se da Bothrops jararaca pelo
processo conhecido como especiação alopática, que decorre da existência de uma
barreira geográfica. Estima-se que o nível do mar variou no período Quaternário,
55
criando passagens para a ilha a partir do continente, há cerca de 11 mil anos, com o
isolamento e a falta de predadores produzindo uma das maiores densidades
populacionais de serpentes no mundo, com cerca de 2 a 4 mil indivíduos
(MARQUES; MARTINS; SAZINA, 2002).
FIGURA 3: Bothrops insularis com sua cor amarelada.
Fonte: http://www.bioterium.com.br
O veneno da Bothrops insularis (Jararaca-Ilhoa), apresenta características
semelhantes aos das outras serpentes do seu gênero com uma potência quatorze
vezes maior (MEBS, 1970; INSTITUTO BUTANTAN, 1996). Atua com uma dose letal
menor em aves que em mamíferos, com DL50 de 0,50 mg/kg em pintos e DL50 de
3,73 mg/kg em camundongos (COGO et al., 1993). As Jararaca-Ilhoas estão
restritas à Ilha Queimada Grande e não entram na água salgada. Os indivíduos
adultos têm hábitos diurnos, que não é comum nas jararacas em geral, e são
arborícolas (Figura 4). Alimentam-se principalmente de aves migratórias como o
sabiá-uma (Platycichla favipes), o tuque (Elaenia mesoleuca) e a coleirinha
(Sporophila caerulescens), já que as aves residentes parecem ter aprendido a evitar
seu ataque. Quando ocorre o bote ela costuma manter a ave capturada retida na
boca, até a morte desta, para impedir sua fuga. Eventualmente come anfíbios,
lagartos e a outra serpente endêmica da ilha conhecida como dormideira (Dipsas
albifrons). Não há mamíferos terrestres na ilha e os únicos presentes são duas
espécies de morcegos (Nyctinomops laticaudatus e N. macrotis).
56
FIGURA 4: Bothrops insularis, arborícola e diurna.
Fonte: http://eco.ib.usp.br
Seu veneno possui atividade coagulante, fibrinolítica (MEBS, 1970), atividade
caseinolítica baixa, fosfolipase e esterase semelhante à trombina (LÔBO-ARAÚJO et
al. apud COGO et al., 1993; SELISTRE; GIGLIO, 1987; SELISTRE et al., 1990), e
potenciadora da bradicinina (CINTRA; VIEIRA; GIGLIO, 1990). Provoca em
músculos de aves e mamíferos acentuada necrose, alterações vasculares e
hemorragias, além de agir na placa neuromuscular (COGO et al., 1998), provocando
perda do equilíbrio, paralisia e convulsões (COGO; RODRIGUES–SIMIONE;
PRADO-FRANCISCHETTI, 1990).
Selistre e Giglio, (1987), isolaram deste veneno uma enzima com atividade
semelhante à trombina (I-SII-R), com peso molecular de 45.000, composta de açúcar
em 22% e o restante de aminoácidos, de ph 7,4. É relativamente estável frente à
trombina a 45ºC e 60ºC, em pH 7,4. Ambas hidrolisam as cadeias α e β do
fibrinogênio. É inibida pela heparina em títulos maiores que a trombina e, ao
contrário desta, não ativa o fator XIII da coagulação.
Foram isoladas cinco toxinas com características mionecróticas,
hemorrágicas e indutoras de edema (SELISTRE et al., 1990). Duas frações ativas
foram purificadas por homogeneidade; a) SIII-SpI de peso molecular de cerca
32.000 Da, com resíduo de Valina na porção N-terminal, mostrava atividade
esterase, indutora de edema e contrátil em músculo liso; b) SIII-SpVI, uma
fosfolipase mionecrótica e indutora de edema, de peso molecular de cerca 29.000
Da, com resíduo de aminoácido pyro-Glu (pyroglutamato) na porção N-terminal,
57
consistindo de duas cadeias de peso molecular de aproximadamente 15.000 Da
ligadas por pontes dissulfídricas, com capacidade indutora de edema inibida pela
dexametasona, mas não por indometacina. Outra três frações altamente purificadas
eram heterodímeros hemorrágicos, SIII-SpIII-3, SIII-SpIII-4 e SIII-SpIII-5, de peso
molecular de 26.000, 29.000 e 26.000 Da e contendo na porção N-terminal resíduos
de Asx (Glutamina/Ácido Glutâmico), Asx e Glicina, respectivamente, todas elas
aumentando o tempo de recalcificação do plasma citratado de rato. Nenhuma das
cinco demonstrou ação proteolítica na caseína ou cininogênica. A hemorragia,
quando sistêmica, decorre do consumo de fibrinogênio.
A ação neurotóxica é acentuada na espécie Bothrops insularis (ZAMUNER;
PRADO-FRANCISCHETTI; RODRIGUES–SIMIONE, 1996), sendo mais potente em
aves que em camundongos (COGO, et al., 1993). Uma fosfolipase A
2
(PLA
2
), de
atividade caracteristicamente pre-sináptica, pois não afeta a resposta a acetilcolina
ou ao potássio em experimentos “in vitro” com junções neuromusculares, é a maior
responsável pela atividade paralisante do veneno (COGO, et al., 1998;
RODRIGUES-SIMIONI et al., 2004). Desenvolveu-se, provavelmente, a partir de sua
necessidade adaptativa. De existência limitada à ilha da Queimada Grande (Figura
5) que é povoada exclusivamente por aves, havia a necessidade de imobilizar a
presa imediatamente para evitar sua fuga, não sendo este afeito paralisante uma
atividade marcante nos venenos de outras espécies de Bothrops (COGO, et al.,
1998; INSTITUTO BUTANTAN, 1966).
Cintra et al. (1990) descreveram peptídios potenciadores da bradicinina (PPB)
que reforçavam sua atividade contrátil no íleo isolado de preá, e a atividade
hipotensiva em ratos anestesiados, oito dos quais continham resíduos de
aminoácidos na posição 3-13 com seqüência e estrutura primária demonstrando
marcante homologia com PPBs de outros venenos.
Outras frações tipicamente encontradas em venenos do gênero Bothrops já
foram isoladas do veneno da espécie Bothrops insularis. Guimarães-Gomes et al.
(2004) isolaram uma lectina do tipo C deste veneno, sem contudo, caracterizar sua
atividade biológica.
58
FIGURA 5: Ilha da queimada grande.
Fonte: http://www.markoshea.tv
Não se tem registro ainda, na literatura, do isolamento de frações com
atividade L-aminoácido oxidase no veneno da Bothrops insularis, embora estejam
presentes em venenos de outras espécies do seu gênero, como a Bothrops moojeni
(TEMPONE et al., 2001), Bothrops alternatus (STABELI et al., 2004) e Bothrops
asper (UMANA, 1982).
Mais recentemente Junqueira-de-Azevêdo et al. (2001) observaram a
expressão de um gen em Bothrops insularis semelhante ao existente em
vertebrados, responsável pela produção do fator de crescimento endotelial e
vascular (VEGF) presente no seu veneno (sVEGF), responsável pelo aumento da
permeabilidade vascular, que acomete os primeiros estágios da lesão.
O veneno e suas frações atuam de forma mais agressiva em rins de aves que
em mamíferos, em conformidade com as características alimentares da espécie,
com dieta praticamente exclusiva de aves, fato que o torna mais específico para este
tipo de presa. Ainda que estes efeitos não estejam bem esclarecidos em sua
fisiopatologia, é provável que decorram de um mecanismo citotóxico direto
potencializado por distúrbios relacionados à isquemia na hemodinâmica regional (DA
CRUZ HOFLING et al., 2001).
Sua atividade nefrotóxica foi testada em pintos vivos com idade entre 5 e 12
dias, utilizando-se o veneno (20-80µg/mL) completo e a fração PLA
2
(10-40µg/mL),
que eram injetados no músculo peitoral na quantidade de 0,1 mL. Observou-se,
após 3 e 24 horas, que embora a ação do primeiro seja mais extensa, a fração PLA
2
determinava necrose tubular aguda mais acentuada, principalmente nos túbulos
contornados proximais, onde se encontrava dilatação do espaço intercelular com
59
eventual descamação celular, vacuolização e contorno irregular da borda em
escova. Havia acentuação da atividade endocitária, com vacúolos de conteúdo
variado. Os glomérulos estavam freqüentemente congestos e os podócitos com
cisternas alargadas no retículo endotelial rugoso. Nos casos examinados em 24
horas em que se observava degeneração aguda, a barreira de filtração estava
completamente destruída. O parênquima cortical estava mais afetado que o medular,
se observando graus variáveis de alterações degenerativas ao longo de diferentes
segmentos do néfron de um mesmo animal (D’ABREU, 1996; DA CRUZ HOFLING
et al., 2001).
Vários trabalhos têm avaliado a capacidade mionecrotizante dos venenos de
serpentes e suas frações. Alguns realizados in vivo incluem parâmetros bioquímicos
voltados para os efeitos gerais, avaliando lesão celular através da creatinoquinase
plasmática (CPK) (GUTIÉRREZ; LOMONTE; CERDAS, 1986a; LOMONTE;
GUTIÉRREZ, 1989; SOARES et al., 2002). Outros são voltados para os efeitos
locais secundários à mionecrose como o edema, avaliado pela técnica da pata do
rato (LOMONTE; GUTIÉRREZ, 1989; SOARES et al., 2002), a hiperalgesia
(CHACUR et al., 2003), a liberação de citocínas proinflamatórias como a interleucina
6 (IL6) (LOMONTE; TARKOWSKI; HANSON, 1993).
Também tem sido estudada a capacidade letal pela administração, in vivo,
intraperitonial ou intravenosa do veneno, já que a potência agressiva das miotoxinas
PLA
2
não neurotóxica é muito baixa (GUTIÉRREZ et al., 1986b; ANDRIÃO-
ESCARSO et al., 2000). O aspecto anatomopatológico foi observado inicialmente na
tentativa de se estabelecer parâmetros comparativos do potencial mecrotizante dos
venenos completos (VILLARROEL et al., 1978/79 a,b,c, d; HARRIS; JOHNSON;
KARLSSON, 1975).
Outros trabalhos procuram observar as respostas à ação do veneno e suas
frações, seja através de técnicas histopatológicas e ultraestruturais (GUTIÉRREZ;
LOMONTE; CERDAS, 1986a; HOMSI-BRANDEBURGO et al., 1988; LOMONTE;
GUTIÉRREZ, 1989; HARRIS; CULLEN, 1990; TOYAMA et al., 1998; MELO;
OWNBY, 1999), seja com microscopia intravital (LOMONTE et al., 1994).
Em relação à Bothrops insularis, alguns trabalhos foram realizados no sentido
de se avaliar a mionecrose com o edema associado e letalidade de seu veneno e
frações (SELISTRE; GIGLIO, 1987; SELISTRE et al., 1990; BARBOSA et al., 2003).
60
Outras observações referem-se principalmente a órgãos específicos como o rim, e o
fígado de aves, que compões sua alimentação básica (PARONETTO, 1996; DA
CRUZ HOFLING et al., 2001), e muita atenção tem sido dada à atividade pre-
sináptica de frações PLA
2
em estudos in vitro, fato que reflete a maior toxicidade
deste veneno possuindo uma PLA
2
com atividade neurotóxica (COGO et al., 1998).
Como a insuficiência renal é uma das principais causa de morte nos acidentes
ofídicos, são de fundamental importância as ações do veneno, sejam elas
localizadas primariamente no rim ou generalizadas no organismo levando
secundariamente ao sofrimento renal, tais como a rabdomiólise ou a
desidratação e a isquemia renal conseqüente.
1.6 Complicações dos Acidentes Ofídicos
Localmente os venenos botrópicos provocam edema hemorragia e
inflamação, podendo levar ao quadro de síndrome compartimental no membro
afetado (BRASIL, 2001).
Dentre as complicações sistêmicas, que surgem em 24 a 48 horas, o choque
pode decorrer de hipovolemia devida à hemorragia e retenção de líquidos no
membro afetado, da ativação de mediadores químicos da inflamação de atividade
hipotensora, tais como prostaglandina, serotonina, histamina (WEN apud MENDES,
1995), bradicinina e os inibidores de sua inativação (FERREIRA; ROCHA-E-SILVA,
1965), de insuficiência respiratória devida a edema pulmonar e da coagulação
intravascular disseminada pela alteração de parâmetros de homeostase sanguínea
(BARRAVIEIRA, 1997). Os mediadores inflamatórios podem determinar sintomas
gerais da fase aguda da inflamação, que são inespecíficos, tais como cefaléia, febre,
vômitos ou diarréia (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
A insuficiência renal aguda, complicação mais comum nos acidentes ofídicos
que vão a óbito em alguns serviços (RIBEIRO et al., 1998; SITPRIJA;
CHAIYABUTR, 1999), pode ocorrer secundariamente ao choque (MITCHELL, 2005),
ou por ação nefrotóxica direta do veneno (BOER-LIMA; GONTIJO, CRUZ-HÖFLING,
1999). Sua etiopatogenia, entretanto, não está bem definida, parecendo ser
multifatorial (NANCY et al., 1991). Em relação ao acidente botrópico, os sintomas
parecem decorrer, além da ação direta do veneno, de efeitos aditivos ou sinérgicos
61
das diferentes toxinas e enzimas presentes nos venenos com a liberação de
substâncias vasoativas no rim (FERREIRA et al., 1992), de coagulação intravascular
disseminada e da formação de microtrombos determinando isquemia renal
(AMARAL et al., 1986). São agravados por alterações sistêmicas conseqüentes ao
sangramento e hemólise, como a hipotensão e o colapso circulatório provocando
isquemia (SOE-SOE; THAN-THAN; KHIN-EI-HAN, 1990). Foi identificado um
peptídio natriurético tipo C no veneno da B. jararaca que poderia agravar a
desidratação (MURAYAMA et al., 1997).
Do ponto de vista anatomopatológico a lesão mais freqüente é a necrose
tubular aguda (AMARAL et al., 1985), como a observada em acidentes crotálicos
(AMORIM; MELO, 1954), mais acentuada no córtex renal (D’ABREU, 1996; DA-
CRUZ-HOFLING et al., 2001; DATE; SHASTRY, 1981) sendo referida por alguns
autores a ocorrência também de alterações glomerulares (RESENDE, 1989).
Aung-khin (1978) estudou a injeção letal do veneno da Vipera russelli em
animais e em pacientes acidentados. Seu veneno tem potentes efeitos coagulantes
e hematológicos, semelhantes ao da Bothrops. Observou alterações nos rins que
eram mais marcantes naqueles que sobreviviam pelo menos 16 horas. Consistiam
principalmente em hemorragia, deposição intraglomerular de fibrina e seus produtos
de degradação coagulados, que, obstruindo os capilares levava à redução do fluxo
sanguíneo nos glomérulos renais. A isquemia resultava em necrose tubular e
subseqüente falência renal. A luz capilar glomerular estava congesta contendo
polimorfonucleares e células que lembravam mastócitos. O tufo glomerular parecia
sólido e preenchia o espaço de Bowman, onde era visível hemorragia, contendo
células mesangiais edemaciadas com aumento da matriz. Nos mortos com em
menos tempo as alterações surgiam apenas nos túbulos com vacuolização das
células de revestimento, degeneração hialina e dilatação dos túbulos contornados
proximais.
Após 24 horas aparecia típica necrose tubular, com túbulos dilatados
revestidos por células achatadas e descamadas na luz, expondo a membrana basal
em alguns pontos. Em alguns túbulos distais e canais coletores eram vistos restos
celulares granulares hialinos, hemácias degeneradas e células de revestimento
descamadas. No interstício renal havia hemorragia focal na cortical e difusa na
medular, comprimindo e obstruindo os túbulos, com infiltrado mononuclear contendo
62
eosinófilos e mastócitos em meio a edema. Na microscopia eletrônica observou que
muitas alças capilares glomerulares estavam ocluídas por trombos e fibrina, e a luz
continha hemácias, leucócitos e abundante material granular, plaquetas
degranuladas ou desintegradas com perda das organelas internas como
mitocôndrias, vacúolos ligados à membrana e grânulos, que eram visíveis envoltas
em fibrina amorfa e fibrilar. O espaço de Bowman era às vezes preenchido por
fibrina, mas a membrana basal das alças capilares estava intacta. Nos que
sobreviveram até quatro dias ainda se observava debris plaquetários envoltos em
fibrina, e fusão de processos podais das células epiteliais nas regiões adjacentes
aos trombos. Havia edema citoplasmático no endotélio com aumento da densidade
eletrônica e perda dos detalhes estruturais, com descamação em muitos pontos,
expondo a membrana basal interna. No mesangio as células estavam vacuoladas e
degeneradas em matriz rarefeita contendo massas de fibrina (AUNG-KHIN, 1978).
Observações histopatológicas renais mais recentes, relativas à Bothrops
moojeni, constataram picnose com condensação da cromatina, nos núcleos de
células de vários túbulos proximais, descontinuidade da borda em escova,
vacuolização citoplasmática e, em alguns túbulos, degeneração e descamação de
células necróticas, sendo sugerido que essas alterações teriam sido provocadas
pela atividade proteolítica de fosfolipases A
2
(PLA
2
) do veneno (BOER-LIMA;
GONTIJO; CRUZ-HÖFLING, 1999). Foi identificado um peptídio natriurético tipo C
no veneno da B. jararaca (MURAYAMA et al., 1997), e recentemente outros
peptídios natriuréticos têm sido descritos na literatura (LISY et al., 1999) que
poderiam agravar o quadro renal provocando desidratação.
O veneno da Bothrops jararacussu tem uma atividade miotóxica muito
intensa, sendo a rabdomiólise capaz de determinar mioglobinúria com efeitos
deletérios adicionais para o rim (MILANI et al., 1997). A mioglobinúria é uma
condição clínica freqüente no envenenamento ofídico e pode ser uma das causas da
Insuficiência Renal Aguda (IRA), (ZAGER, 1996). Parece ser proeminente nas
primeiras 24 horas após o envenenamento, sendo freqüente no acidente causado
por diversas serpentes.
Ponraj e Gopalakrishnakone (1997), estudando a serpente Pseudechis
australis, observaram que a extensão dos danos musculares causados pela
miotoxina determinava a quantidade de mioglobina que penetrava na circulação
63
renal, preenchendo dos túbulos proximais até os distais, com a estase na luz do
túbulo aumentando o contato e a citotoxicidade. A insuficiência renal aguda (IRA)
era agravada pelo pH ácido da urina enquanto o alcalino conferia significativa
proteção morfológica e funcional, e a desidratação potencializava vasoconstrição e
diminuía o ritmo de filtração glomerular. Foi sugerido que a miotoxina da B. moojeni
penetra na bicamada lipídica da membrana por interação hidrofóbica, causando sua
desestabilização com prejuízo na permeabilidade de íons e macromoléculas,
ocorrendo influxo de cálcio com alteração do citoesqueleto, danos mitocondriais e
ativação de proteases e fosfolipases dependentes de cálcio (BOER-LIMA;
GONTIJO; CRUZ-HÖFLING, 1999).
Outros autores observaram que as células renais, sob o estímulo do veneno
de algumas serpentes, poderiam liberar, além de PAF, prostaglandinas, citocínas,
frações do complemento, e bradicinina (BARRAVIERA; LOMONTE; TARKOWSKI,
1995), esta última estimulando a liberação de oxido nítrico pelo endotélio o qual
provocaria aumento da Taxa de Filtração Glomerular (TFG) (KOEPPEN; STANTON,
1997).
O PAF promove uma vasoconstrição renal com diminuição do fluxo
sangüíneo, reduz a taxa de filtração glomerular, determina a excreção reduzida de
sódio pela urina, produz oligúria e retenção hidroeletrolítica apresenta um efeito
compensador que é a liberação de prostaglandinas vasodilatadoras no rim
(DOUGLAS, 2000).
As prostaglandinas vasodilatadoras renais, PGE
1
, PGE
2
, PGA
1,
PGA
2
, PGH
2
,
PGI
2
e PGG
2
, principalmente PGI
2
e PGE
2
, são responsáveis pelo aumento do fluxo
sanguíneo e conseqüente diurese, natriurese e caliurese. A prostaglandina F
2α
(PGF
2α,
) e o Tromboxane A
2
(TXA
2
) têm ação vasoconstritora, promovendo redução
do fluxo sanguíneo renal e da taxa de filtração glomerular (BYDLOWSKI, 2000).
O óxido nítrico (NO) é um gás de radical livre, formado numa reação,
catalisara por enzimas, entre o oxigênio molecular e a L-arginina, de forma
fisiológica ou em resposta a estímulos patológicos. Neste caso, a enzima óxido
nítrico sintetase induzida (iNOS), atua mesmo com níveis muito baixos de cálcio,
estimulada por fatores agressivos tóxicos, por vasodilatadores como a acetilcolina e
a bradicinina, e por citocínas como o interferon γ em sinergia com o fator de necrose
tumoral (TNFα) e a interleucina 1 (IL-1). O ON é produzido pelas células endoteliais,
64
agindo como ativador endógeno da guanilato ciclase, resultando na formação do
GMP cíclico, um segundo mensageiro que relaxa o músculo liso dos vasos
dilatando-os (RANG et al., 2004). Juntamente com a endotelina é um dos principais
responsáveis pela lesão glomerular nos processos patológicos renais (MITCHELL,
2005).
A endotelina (ET) é um peptídios de 21 aminoácidos encontrado em três
isoformas, das quais a ET1 e ET2 estão presentes no rim, onde também é envolvida
nas alterações hemodinâmicas reativas a fatores agressivos (MITCHELL, 2005).
Apresenta uma ação vasoconstritora renal, sendo secretada no compartimento
basolateral do endotélio por células mesangiais e tubulares renais. Numerosos
estímulos podem modular a transcrição dos genes da endotelina, incluindo
substâncias vasoativas, fatores de crescimento citocínas, agonistas de receptores
acoplados a proteína G e radicais livres de oxigênio. São estimulantes a própria
endotelina, a angiotensina, a trombina, o fator de crescimento derivado das
plaquetas, o fator de necrose tumoral, a interleucina 1 e o tromboxano A2, dentre
outros. Inibem a transcrição o peptídios atrial natriurético, a heparina, o inibidor da
enzima conversora da angiotensina, a guanidina monofosfato cíclica (cGMP) e a
adenosina monofosfato cíclica (cAMP). Atua principalmente como um mediador
autócrino e parácrino, estimulando, entretanto, a liberação de outros hormônios,
incluindo a aldosterona, a adrenalina, o peptídios atrial natriurético, hormônios
hipotalâmicos e hipofisários (RANG et al., 2004; SOROKIN; KOHAN, 2003). Tem
meia vida curta devido ao limitado estoque celular.
Os receptores da endotelina são membros da família de receptores acoplados
à proteína G, cujos tipos A (RET-A) e B (RET-B) e são encontrados nas células
endoteliais. Ao serem estimulados são capazes de modular uma variedade de
cascatas intracelulares, regulando a produção de cicloxigenases, tirosinoquinases, e
óxido nítrico sintetase. Seu mecanismo de ação envolve a ativação de fosfolipase C,
e proteinoquinase C. A endotelina pode induzir a formação de fibrina (DOUGLAS,
2001) que, no rim, é uma das conseqüências comuns dos acidentes ofídicos
(PONRAJ; GOPALAKRISHNAKONE, 1997; AUNG-KHIN, 1978; BOER-LIMA;
GONTIJO; CRUZ-HÖFLING, 1999).
Usando o modelo de rim isolado perfundido de rato, Monteiro e Fonteles,
1999, demonstraram que o veneno da Bothrops jararaca provocava nefrotoxicidade
65
direta. Eles registraram que ele promovia a redução da pressão de perfusão, do
fluxo urinário, da taxa de filtração glomerular, e do transporte tubular de sódio e
potássio. Propôs o envolvimento do fator de ativação plaquetária (PAF), baseado em
observações anteriores de que o rim, no mesmo modelo, era capaz de produzir PAF,
além de histamina e serotonina (PIROTZKY et al, 1984).
Havt et al. (2001) utilizando o mesmo modelo observou que este veneno, da
Bothrops jararaca, também reduzia a pressão de perfusão, a resistência vascular
renal e o transporte tubular de sódio e potássio, mas aumentava o fluxo urinário e a
taxa de filtração glomerular. Alguns autores afirmaram que praticamente todas as
serpentes possuem fosfolipase A
2
(PLA
2
) em seu veneno (BON, 1997).
Homsi-Brandeburgo et al. em 1988, quando fracionaram o veneno da B.
jararacussu registraram a existência de uma fração com atividade PLA
2
da qual
isolaram 5 subfrações. Uma delas sem atividade PLA
2
apresentava intensa atividade
miotóxica. Nas demais, onde foi detectada atividade enzimática PLA
2
, não foi
observada atividade miotóxica. Pelo bloqueio com dexametasona, Havt et al. (2001)
constataram que os efeitos renais do mesmo veneno, da B. jararacussu, não foram
alterados pela mesma quantidade desta droga, que bloqueava a atividade PLA
2
do
veneno da Crotalus durissus cascavella (MARTINS et al., 1998). Concluíram que, ou
a atividade PLA
2
foi mais intensa que a capacidade inibitória da dexametasona sobre
a PLA
2
(BARNES, 1995), ou os efeitos renais seriam promovidos por uma miotoxina,
que não tinha atividade PLA
2
. Utilizando triazolobenzodiazepina (WEB 2086), um
antagonista do fator de ativação plaquetária (PAF), Havt, et al., (2001) sugeriram
que, com o veneno da Bothrops jararacussu, o envolvimento do PAF no aumento da
Taxa de Filtração Glomerular e no fluxo urinário, independe dos parâmetros
vasculares, pressão de perfusão e resistência vascular renal.
O veneno da Bothrops moojeni altera mais intensamente os parâmetros da
função renal que o da Bothrops jararaca, produzindo uma diurese intensa, que não é
observada na perfusão em rim isolado de rato com o veneno desta última. Barbosa e
et al., 2002, fracionaram o veneno da Bothrops moojeni, estudando a atividade de
fosfolipases A
2
(PLA
2
) de duas frações miotóxicas, nos rins, constatando que
possuíam atividade enzimática menos intensa que a do veneno completo. Uma
delas, principalmente, possuía atividade quase nula nos rins isolados de ratos. Arni e
Ward (1996) e Gutiérrez e Lomonte (1997) demonstraram que uma fosfolipases A
2
66
(PLA
2
) com uma região C-terminal rica em Lisina era responsável pela atividade
citotóxica de miotoxinas de serpentes Bothrops, característica ausente nesta última
miotoxina. Entretanto Kini e Iwanaga (1986), comparando seqüências de miotoxinas
e fosfolipases de venenos de serpentes, sugeriram que um sítio catiônico associado
a uma região hidrofóbica seria responsável pela atividade miotóxica, independente
da atividade fosfolipases A
2
(PLA
2
), podendo determinar lesão celular pela
desorganização da barreira lipídica, afetando em conseqüência, o influxo de cálcio e
causando necrose.
1.7 Justificativa
A Bothrops insularis é uma espécie de serpente de vida isolada, encontrada
somente na ilha da Queimada Grande, localizada a cerca de 30 quilômetros da
costa do Estado de São Paulo, no Brasil. Esta restrição geográfica a sujeita a
possíveis desastres naturais ou mesmo artificiais, como queimadas e capturas
ilegais para o mercado negro de animais. Embora sua densidade populacional seja
grande, há sempre o risco de eliminação completa destes animais, fazendo com que
seja considerada uma espécie ameaçada de extinção (MARQUES; MARTINS;
SAZINA, 2002). Em virtude disso a União Mundial para a Conservação da Natureza
(IUCN) a incluiu na categoria “criticamente ameaçada” na edição de 2000 da Lista
Vermelha de Espécies Ameaçadas (www.redlist.org).
Diferentemente de outras espécies do gênero Bothrops, ela se alimenta
principalmente de aves e poucos invertebrados, os limitados alimentos disponíveis
no local (DUARTE; PUORTO; FRANCO, 1995). Sua toxinologia é pouco esclarecida
se comparada com a de outras Bothrops. Seu veneno é cinco vezes mais potente
em aves que a jararaca comum (MARQUES; MARTINS; SAZINA, 2002). Dentre os
componentes isolados de seu veneno se incluem esterases (SELISTRE et al., 1990),
a fosfolipase A
2
(PLA
2
) (SELISTRE et al., 1990), proteínas que estimulam o
crescimento endotelial vascular (JUNQUEIRA-DE-AZEVEDO et al., 2001), lectinas
(GIUMARÃES-GOMES et al., 2004), e peptídios potenciadores da bradicinina
(CINTRA; VIEIRA; GIGLIO, 1990). Mais recentemente foi descrita uma variedade de
atividade peptidase em venenos deste gênero, incluindo o da Bothrops insularis
(GASPARELLO-CLEMENTE et al., 2002). Ele inibe irreversivelmente a transmissão
67
neuromuscular em camundongos e em pintos, onde a ação é mais eficaz, sendo a
atividade enzimática essencial para o efeito neurotóxico (COGO et al., 1998). Fração
com atividade L-aminoácido oxidase ainda não foi isolada deste veneno, embora
seja bem estabelecida sua presença em outros venenos de serpentes do gênero
Bothrops (TEMPONE et al., 2001; STABELI et al., 2004).
A despeito da importância biológica e toxinológica deste veneno, existem
poucos estudos sobre o efeito do veneno e suas frações, se comparados aos
venenos de outras espécies do gênero Bothrops ou mesmo de outros gêneros da
família Viperidae, como o Crotalus. Mais raros ainda são estudos relativos à
atividade biológica de suas frações, especialmente no sistema de rim isolado com
responsividade limitada ao leito vascular renal, ou mesmo da atividade vascular do
veneno, seja sistêmica, com interferência de todos os fatores comumente liberados
em reações generalizadas, ou limitada ao leito mesentérico isolado onde as
respostas são imediatas e diretas.
68
OBJETIVOS
69
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
• Avaliar a toxicidade vascular e renal direta aguda, do veneno da Bothrops
insularis e suas frações estudadas.
2.2 Objetivos Específicos
• Avaliar o efeito do veneno sobre parâmetros funcionais renais em rato, do
veneno e de suas frações, fosfolipase A
2
, lectina, trombina símile e L-
aminoácido oxidase, liofilizados.
• Avaliar as alterações renais histopatológicas provocadas pelo veneno e
suas frações, fosfolipase A
2
, lectina, trombina símile e L-aminoácido-
oxidase, liofilizados, in vitro, em ratos.
• Avaliar as alterações provocadas na pressão arterial de ratos pelo veneno
liofilizado.
• Avaliar as alterações histopatológicas provocadas pelo veneno em ratos,
no coração, pulmões, rins, fígado, e intestino.
• Avaliar as alterações vasculares diretas provocadas na pressão arterial do
leito mesentérico de ratos, pelo veneno.
• Avaliar as alterações histopatológicas provocadas pelo veneno, in vitro, no
leito vascular mesentério de ratos.
70
MATERIAL E MÉTODOS
71
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Animais experimentais
Foram utilizados ratos Wistar machos, adultos, com peso entre 270 e 300g,
oriundos do biotério da Unidade de Pesquisas Clínicas da Universidade Federal do
Ceará. Os animais foram mantidos em jejum alimentar de 24 horas antes do
experimento com o fornecimento de água "ad libitum". Os animais foram
anestesiados pelo pentobarbital sódico na dose de 50 mg/kg intraperitonial. Foram
seguidos todos os protocolos éticos de pesquisa em animais.
3.2 Procedimentos com Veneno e Frações de Bothrops insularis
O veneno da Bothrops insularis foi uma cortesia do Instituto Butantan.
Inicialmente o veneno foi liofilizado. As purificações das frações do veneno da B.
insularis foram realizadas utilizando uma combinação de filtração em gel Sephadex e
cromatografia de fase reversa (HPLC) com produtos químicos analíticos da Sigma
and Aldrich Chemical, Waters, Applied Biosystems, Pierce and Bio Rad, conforme
descrito por Toyama et al., (1995). O fracionamento foi realizado com as técnicas
completas descritas a seguir, no laboratório do Departamento de Bioquímica da
UNICAMP-SP (Universidade de Campinas) pelo Doutor Marcos Hikari Toyama, que
gentilmente cedeu o veneno total liofilizado e as frações estudadas.
Com a finalidade de se avaliar a possível atividade citotóxica direta, o veneno
total, uma fração fosfolipase (PLA
2
), uma lectina, uma fração com atividade trombina
símile, e uma com atividade L-aminoácido-oxidase, dele extraídas, se propõe o
estudo destas frações em um sistema com perfusão de rim isolado de rato,
excluindo atividades sistêmicas “in vivo”. Foi utilizado o modelo inicialmente descrito
por Bowman em 1970, modificado em nosso laboratório pela adição de um pulmão
artificial para melhor oxigenação (FONTELES et al., 1998). Neste modelo a
substância perfusora recircula, permitindo a atuação de mediadores liberados pela
células renais.
72
Paralelamente a atividade sistêmica do veneno foi analisada através da
administração endovenosa em ratos, com a pressão arterial controlada em modelo
adaptado do descrito por Ferreira (1965). Neste sistema ocorre a interferência de
mediadores liberados por células de todo o organismo. O exame histológico do
coração, pulmões, rins, fígado, baço, e intestino, foi realizado após o sacrifício dos
animais, no final do experimento.
Complementando a avaliação vascular, o veneno foi estudado no modelo de
circulação em leito mesentérico isolado perfundido, segundo o modelo descrito por
Mcgregor (1965). Neste sistema é avaliada a resposta vascular, visto que não há
circulação do líquido perfusôr.
3.2.1 Purificação da lectina do veneno da serpente Bothrops insularis
A lectina do tipo C do veneno da Bothrops insularis foi purificada depois da
cromatografia em dois passos, primeiramente com o veneno submetido a
cromatografia de exclusão molecular (cromatografia líquida de alta eficiência, HPLC)
seguida por uma segunda purificação em cromatografia de alta afinidade. No
primeiro momento o veneno (30 mg) foi dissolvido em 400μl de bicarbonato de
amônia tamponado (0,3M; pH 7,8) e após a dissolução completa foi homogeneizado
e clarificado por ultracentrifugação mantida a 4.300xg por 5 minutos para obtenção
do extrato. Previamente a exclusão molecular por HPLC carreada por Superdex 75
(Pharmacia; 1 x 60 cm) foi equilibrada com o mesmo tampão utilizado para a
homogeneização durante 2 horas, antes da injeção do extrato do veneno. A
purificação da fração de protéica do veneno foi realizada com manutenção em fluxo
constante na taxa de 0,3mL/minuto, com o desenvolvimento da cromatografia
monitorado a 280nm, e o perfil da hemaglutinação foi obtido com o uso de
suspensão de hemácias a 2%. Após esta primeira purificação, a fração lectina símile
foi submetida a novo procedimento cromatográfico, realizado em cromatografia de
alta afinidade. Inicialmente aproximadamente 10mg da fração lectina símile completa
foi dissolvida em 1mL de salina Tris-base de cálcio (CTBS; Tris, 20mM, NaCl,
150mM, CaCl
2
5mM, pH 7.5). Após a dissolução completa da fração, a solução foi
então clarificada por ultracentrifugação a 4500xg por 5 minutos. A cromatografia de
afinidade absorvida com lactose (0,8 x 5cm) foi previamente equilibrada com CTBS
73
por 40 minutos, seguida pela injeção da solução do veneno. A lectina foi eluida
usando um gradiente de 0.1-0.3M de lactose em CTBS. A fração lectina símile foi
extensivamente dializada em bicarbonato de amônia tamponado (0.1M, pH 8.0) e
liofilizada. A homogeneidade molecular da proteína do eluato na cromatografia de
afinidade foi avaliada por HPLC de fase reversa (coluna de 0,1x 30cm de μ-
Bondapack C18, Waters) utilizando um gradiente linear e descontínuo 0-100% de
acetonitrila em 0.1% de ácido trifluoroacetico (v/v). Rapidamente, três miligramas da
fração lectina obtida da cromatografia de afinidade foi dissolvida em 250μl de
tampão A e centrifugado a 4500xg por 2 minutos e o sobrenadante foi então
aplicado em HPLC de fase reversa analítica, previamente equilibrada com tampão A
[0.1% ácido acético trifluoroacetico (TFA)] por 15 minutos. A eluição da proteína foi
então conduzida usando um gradiente linear de tampão B (66.6% Acetonitrila em
tampão A) e a corrida cromatográfica monitorada a 214nm de absorvância. Depois
da eluição a fração foi liofilizada e estocada a -40
o
C. SDS-PAGE usando gel Tricina
acrylamida a 12% confirmou a homogeneidade molecular da fração.
3.2.2 Purificação da L-aminoácido oxidase do veneno da serpente
Bothrops insularis
Uma amostra de 30mg do veneno foi dissolvida em 0,3M de bicarbonato de
amônia, com ph 7,9 e clarificado por ultracentrifugação a 4500 x g por 2 minutos. O
sobrenadante foi aplicado e fracionado em uma coluna (1 x 60cm) de Superdex 75
(Pharmacia) que foi pré-incubada com o mesmo tampão utilizado na diluição do
veneno. A taxa do fluxo foi de 0,2mL/min e o perfil da eluição foi monitorado a
280nm de absorvância. A atividade L-aminoácido oxidase (LAAO) foi mensurada por
ensaio em microplacas. A principal fração LAAO (10mg) foi dissolvida em 400μl de
bicarbonato de amônia a 0,3 M, ph 7,9 e clarificada por ultracentrifugação a 4500 x g
por 2 minutos. O sobrenadante foi aplicado e fracionado em coluna (1x30cm) de
Superdex 200 (Pharmacia). A principal fração LAAO foi estocada e dessalinizada
usando unidade de ultrafiltração em miliporo, com ponto de corte do peso molecular
de 30kDa. A fração concentrada foi então recuperada e estocada a -20
o
C. Após esta
primeira cromatografia de exclusão molecular a fração LAAO foi submetida a novo
procedimento cromatográfico. A principal fração LAAO (10mg) foi então dissolvida
74
em 400μl de tampão bicarbonato de amônia 0.05M, pH 7.8 até a dissolução
completa. A amostra foi clarificada em centrifugação de alta velocidade e o
sobrenadante aplicado em Protein Pack DEAE 5PW previamente equilibrado com o
mesmo tampão usado na diluição do veneno. As proteínas foram eluídas em fluxo
constante na taxa de 1,0mL/min, utilizando um gradiente linear (0.05-1.0 M) de
bicarbonato de amônia e o perfil da eluição foi monitorado a 280nm. Frações
contendo proteína LAAO símile foram separadas e estocadas a -20
o
C. A
homogeneidade molecular foi avaliada por cromatografia de fase reversa HPLC
(0.1x 30cm column of μ-Bondapack C18, Waters) usando um gradiente linear e
descontínuo 0-100% de acetonitrila em 0.1% de ácido trifluoracético (v/v).
Rapidamente três miligramas de proteína LAAO resultante da troca iônica foi
dissolvida em 250μl de tampão A e centrifugada a 4500 x g por 2 minutos e o
sobrenadante foi então aplicado em cromatografia analítica de fase reversa HPLC,
previamente equilibrada com tampão A [0.1% de ácido acético trifluoracético (TFA)]
por 15 minutos. A eluição da proteína foi então conduzida usando um gradiente
linear de tampão B (66.6% Acetonitrila em tampão A) e a corrida cronomatográfica
monitorada a 280nm de absorvância. Depois da eluição a fração foi liofilizada e
estocada a -40
o
C. O grau de purificação da LAAO símile também foi avaliado,
utilizando eletroforese PAGE-SDS.
3.2.3 Purificação da trombina símile do veneno da serpente Bothrops
insularis
A trombina símile da Bothrops insularis foi purificada depois de três passos
em cromatografia, primeiramente o veneno foi submetido a cromatografia de
exclusão molecular HPLC (Superdex 75) seguido de uma segunda purificação em
DEAE 5PW e Hi Trap Benzamidina FF (Pharmacia). Num primeiro tempo o veneno
(30mg) foi dissolvido em 400μL de bicarbonato de amônia tamponado (0.3M; pH 7,8)
e após a dissolução completa o veneno foi homogeneizado e clarificado por
ultracentrifugação realizada a 4.300xg por 5 minutos para se obter o extrato do
veneno. Previamente a exclusão molecular por HPLC carreada por Superdex 75
(Pharmacia; 1 x 60cm) foi equilibrada com o mesmo tampão utilizado para a
homogeneização durante 2 horas, antes da injeção do extrato do veneno. A
75
purificação da fração protéica do veneno foi realizada com manutenção em fluxo
constante na taxa de 0,3mL/minuto, com o desenvolvimento da cromatografia
monitorado a 280nm, e a serinoprotease e coagulação do fibrinogênio monitorados
no transcorrer da cromatografia. Após esta primeira purificação, a fração trombina
símile foi submetida a novo procedimento cromatográfico, realizado em
cromatografia (0.78 x 8cm, Waters) DEAE 5PW. Inicialmente aproximadamente 5mg
da fração trombina símile do veneno foi dissolvida em 400μl de bicarbonato de
amônia tamponado (50mM, pH 7.8), após completa homogeneização a solução do
veneno foi então clarificada por centrifugação em alta velocidade durante um minuto
(4500 x g). Antes da aplicação do extrato da fração, a coluna cromatográfica foi
equilibrada durante 20 minutos com tampão A (bicarbonato de amônia tamponado,
50mM, pH 7.8). A cromatografia foi realizada usando uma concentração linear do
tampão B (bicarbonato de amônia, 1M, pH 7.9). A cromatografia foi conduzida em
fluxo constante na taxa de 1mL/min, a purificação da fração foi monitorada a 280nm
e as atividades enzimáticas foram simultaneamente monitoradas. Finalmente a
proteína trombina símile do veneno da Bothrops insularis foi purificada em coluna Hi
Trap Benzamidine FF. Neste último procedimento, previamente a coluna foi
equilibrada em solução de bicarbonato de amônia a 0.2M, que foi usado para
homogeneização da amostra e a eluição da trombina símile foi realizada usando um
gradiente de eluição de curto passo de tampão B (tampão bicarbonato de amônia,
2M, pH 8.0). A cromatografia transcorreu monitorada a 280nm a fração foi coletada e
a apropriada caracterização foi realizada. A fração trombina símile foi coletada e
extensivamente dializada em bicarbonato de amônia tamponado (0.1M, pH 8.0) e em
seguida liofilizada. A homogeneidade molecular da proteína eluida em cromatografia
de afinidade foi avaliada por HPLC de fase reversa (coluna de 0.1x 30cm de μ-
Bondapack C18, Waters) usando um gradiente linear e descontínuo 0-100% de
acetonitrila em 0.1% de ácido trifluoroacetico (v/v). Rapidamente, três miligramas do
pico de trombina símile obtido com a purificação foi dissolvido em 250μl de tampão A
e centrifugado a 4500xg por 2 minutos e o sobrenadante foi então aplicado em
HPLC de fase reversa analítico, previamente equilibrado com tampão A [0.1% de
ácido acético trifluoroacetico (TFA)] por 15 minutos. A eluição da proteína foi então
conduzida usando um gradiente linear de tampão B (66.6% acetonitrila no tampão A)
e a corrida cromatográfica foi monitorada a 214nm de absorvância. Depois da
76
eluição a fração foi liofilizada e estocada a -40
o
C. SDS-PAGE usando gel Tricina
acrylamida a 12% confirmou a homogeneidade molecular da fração.
3.2.4 Purificação da fosfolipase A
2
do veneno da serpente Bothrops
insularis
O veneno da Bothrops insularis (25mg) foi dissolvido em 0,3M de bicarbonato
de amônia, pH 7,9, e clarificado por ultracentrifugação a 4500 x g por 2 minutos. O
sobrenadante foi empregado e fracionado em uma coluna (1 x 60cm) de Superdex
75 (Pharmacia) que foi pré-incubada com o mesmo tampão utilizado na diluição do
veneno. A taxa de fluxo foi de 0,2mL/minuto e o perfil da eluição foi monitorado a
280nm de absorvância. A atividade enzimática foi monitorada usando 4N3OBA e a
mionecrose foi avaliada pela detecção do nível de CK no soro durante a exclusão
molecular por HPLC. A principal fração PLA
2
mionecrótica (7.5mg) foi dissolvida em
400μl de bicarbonato de amônia tamponado 0.05M, pH 7.8 ate a dissolução
completa. As amostras foram clarificadas em centrifugação de alta velocidade e o
sobrenadante foi aplicado a Protein Pack SP 5PW previamente equilibrado com o
mesmo tampão utilizado na diluição do veneno. As proteínas foram eluídas em fluxo
constante na taxa de 1,0 mL/ minuto, usando um gradiente linear (0.05-1.0 M) de
bicarbonato de amônio e o perfil da eluição foi monitorado 280 nm. As frações
contendo miotoxinas PLA
2
símile foram coletadas, liofilizadas e estocadas a -40
o
C.
A massa molecular e a homogeneidade do homogenato do eluato de proteínas
foram avaliados por HPLC de fase reversa (0.1x 30cm coluna de μ-Bondapack C18,
Waters) usando um gradiente linear e descontínuo 0-100% de acetonitrila em 0.1%
de ácido trifluoroacetico (v/v). Imediatamente, três miligramas de proteína PLA
2
miotóxica da troca iônica foram dissolvidas em 250μl de tampão A e centrifugados a
4500xg por 2 minutos e o sobrenadante foi então aplicado em HPLC de fase reversa
analítica, previamente equilibrado com tampão A [0,1% de ácido acético
trifluoroacetico (TFA)] por 15 minutos. A eluição da proteína foi então realizada
usando um gradiente linear do tampão B (66.6% de acetonitrila em tampão A) e a
corrida cromatográfica monitorada a 280nm de absorvância. Após eluição a fração
foi liofilizada e estocada a -40
o
C. O grau de pureza da PLA
2
avaliado usando duas
eletroforeses dimensionais (2D) e espectrometria de massa MALDI TOF. A
77
eletroforese 2D foi conduzida como descrito por Anderson e Anderson (1991). A
espectrometria utilizou proteínas purificadas por HPLC, no qual a proteína foi
colocada em uma placa de amostra e introduzida espectrofotômetro de massa
MALDI TOF.
3.3 Primeiro Modelo
Procedimentos de Perfusão Renal
Este ensaio foi utilizado para teste das ações do veneno puro e suas frações
isoladas em perfusão renal, permitindo acompanhar a atividade também de
mediadores liberados pelas células renais estimuladas pelo veneno e frações, pois a
substância perfusora recircula no sistema, permitindo demonstrar a atividade destes
mediadores. Todos os modelos utilizaram os mesmos equipamentos para
observação histológica (Anexo A).
3.3.1 Divisão dos grupos de animais
Com a finalidade de avaliar os efeitos do veneno da Bothrops insularis, como
também de quatro de suas frações, uma lectina, uma L-aminoácido oxidase, uma
com atividade trombina símile
e uma fosfolipase (PLA
2
), os animais foram dividido
em seis grupos com 6 animais cada. No grupo controle, os rins foram perfundidos
com a solução de Krebs-Henseleit modificada com 6g% de albumina bovina. Nos
demais grupos foram utilizados os mesmos procedimentos do grupo controle até os
30 minutos de perfusão. Os dados obtidos aos 30 minutos foram utilizados como
controle interno do experimento. Após este período foi adicionado 1mg de veneno
total liofilizado e a mesma dose de cada uma das suas frações, também liofilizadas,
diluídas em 1 ml de solução salina (0,9%), e a seguir em 99 mL da solução perfusora
(10 μg/mL.)
78
3.3.2 O Veneno e suas frações
O veneno foi dividido em quatro frações, com atividades distintas. Uma
lectina, uma L-aminoácido oxidase, uma trombina símile e uma fosfolipase (PLA
2
). O
veneno e as frações foram todos liofilizados, e gentilmente cedidos pelo Doutor
Marcos Toyama da Universidade de Campinas.
3.3.3 Solução perfusora e seu preparo
A solução empregada nas experiências foi a de Krebs-Henseleit (Anexo B),
modificada, contendo albumina bovina a 6 g%
A solução de Krebs-Henseleit modificada (Fonteles, 1998), concentrada a
20%, continha NaCl = 138g, KCl = 7g, NaH
2
PO
4
.H
2
O = 3,2g, MgSO
4
. 7 H
2
O = 5,8g e
Uréia = 10g. Quarenta e oito horas antes dos experimentos, 100mL desta solução
foram separados e acrescidos de NaHCO
3
= 4,2g , CaCl
2
. 2 H
2
O = 0,74g, glicose =
2g, e penicilina G potássica cristalina = 0,05g. Em seguida, o volume foi completado
para 2000 mL com água bidestilada. Foram retirados 300 mL desta solução, aos
qual se adicionou albumina bovina (6g%). Em seguida, solução foi dializada com
albumina, auxiliada por um homogeneizador. A diálise tem como objetivo retirar
substâncias contaminantes como piruvatos, citratos e lactatos (HANSON; BALLARD,
1968; COHEN; KOOK; LITTLE,1977; ROSS, 1978).
A solução de Krebs-Henseleit para a diálise foi trocada com 24 horas. No
final, após 48 horas de diálise, a solução perfusora foi acrescida com 0,15g de
inulina. O pH da solução perfusora foi ainda ajustado entre os valores de 7,3 e 7,4.
3.3.4 O sistema de perfusão renal
Nos nossos experimentos foi utilizado o sistema de perfusão de rim isolado
com recirculação (Figura 6, 7), também conhecido como sistema de perfusão de rim
isolado fechado. No Ensaio de Perfusão do rim isolado de rato foi usado o método
inicialmente descrito por Bowman (1970), e depois modificado por Pegg (1971), e
em 1983 por Fonteles et al., que adicionaram um pulmão artificial do tipo silástico,
baseado no modelo de Hamilton et al. (1974).
79
Neste sistema o perfusato recircula no rim com uma quantidade de 100 mL de
solução Krebs-Henseleit modificada por Fonteles et al., (1998) e a oxigenação é
adaptada ao sistema (MONTEIRO, 1990).
FIGURA 6: Sistema de perfusão de rim isolado com recirculação.
O sistema de perfusão de rim isolado com recirculação (Figuras 10; 11) é
composto por um conjunto de equipamentos cada um deles desempenha uma
determinada função.
1) Condensador: Mantém aquecido o cilindro reto que comporta a solução do
experimento;
2) Coletor de urina: Frasco que recebe a urina do rim montado no sistema,
trocados em intervalos de 10 minutos;
3) Seringa coletora de perfusão: Coletor da solução de perfusão no sistema
feita em intervalos de 10 minutos;
80
4) Bomba de perfusão (Watson): Bombeia a solução de perfusão no sistema,
apresenta cinco velocidades;
5) Filtro de millipore (8μm): Filtra a solução perfusora;
FIGURA 7: Representação gráfica do sistema de perfusão de rim isolado com
recirculação.
6) Banho Maria: aquece o oxigenador ou o pulmão artificial mantendo a
temperatura constante entre 37ºC;
7) Fluxômetro: Mede o fluxo da solução;
8) Manômetro de mercúrio: Mede a pressão do perfusato;
Fluxômetro
Seringa
Oxigenador
Cata bolhas
Manômetro
Canula
Arterial
Coletor de
Urina
Condensador
O
2
/CO
2
Filtro Bomba
Banho Maria
81
9) Catabolhas: Retira as bolhas formadas evitando assim embolia no rim;
10) Oxigenador ou pulmão artificial: Promove as trocas gasosas (95% de O
2
e
5% de CO
2
);
11) Bomba aquecedora com termostato: mantém o perfusato na temperatura
de 37ºC.
3.3.5 Preparo do sistema
Antes de cada experimento o sistema foi lavado com detergente e depois
calibrado.
A calibração foi sempre feita com o sistema em funcionamento na presença
de solução fisiológica a 0,9%, aquecida na temperatura de 37ºC. A cada unidade da
bomba de perfusão (1,2,3,4 e 5), foi coletada a solução salina por 1 minuto em
proveta milimetrada (fluxo na ponta da cânula arterial), e anotada a medida do
fluxômetro e a pressão de perfusão, através do manômetro de mercúrio ligado ao
sistema. Para melhor adaptação do sistema às unidades de bomba, foram
estabelecidos 3 minutos de intervalos entre cada coleta.
A calibração foi feita com o objetivo de se conhecer o fluxo de perfusão em
face da resistência da própria cânula arterial. Para tanto, os resultados de calibração
obtidos nos quatro grupos tratados foram compilados em curvas, onde foi plotada a
velocidade da bomba no eixo das abscissas contra a pressão de perfusão, volume
de salina coletado (fluxo) e o valor obtido no fluxômetro no eixo das ordenadas.
3.3.6 Calibração do sistema
O sistema foi calibrado sempre antes do início dos experimentos. Foi avaliada
em cada uma das unidades da bomba (1, 2, 3, 4, e 5) a pressão de perfusão (PP)
em mmHg, o fluxo urinário (L/h) e o volume de salina coletado em um minuto
(mL/min) (Figura 8, 9, 10).
82
0
20
40
60
80
100
12345
Velocidade da Bomba (rpm x 10)
PP (mmHg)
FIGURA 8: Valores registrados de pressão de perfusão (PP) durante a calibração
do sistema (n = 6)
0
0,02
0,04
0,06
12345
Velocidade da Bomba (rpm x 10)
Fluxômetro (L/h)
FIGURA 9: Valores registrados pelo Fluxômetro (L/h) durante a calibração do
sistema (n=6).
83
0
25
50
75
12345
Velocidade da Bomba (rpm x 10)
Fluxo (mL/min)
FIGURA 10: Valores registrados de volume de salina (mL/min) durante a calibração
do sistema (n = 6)
3.3.7 Técnica cirúrgica
Após a anestesia do animal com Pentobarbital Sódico na dose de 50 mg/Kg
intraperitonial (IP), foram injetados na veia femoral devidamente identificada, 3 mL
de manitol a 20 %, com intuito de melhorar o acesso cirúrgico ao ureter.
Após assepsia do abdômen, foi realizada uma incisão da parede abdominal
com base na linha alba e duas incisões perpendiculares à primeira, no meio da
parede, para aumentar o campo cirúrgico (Figura 11). Rebatidas às vísceras para o
lado esquerdo para visualização do rim direito e conseqüente limpeza dos tecidos
presentes na área. Em seguida, o ureter foi isolado e canulado com tubo de
polietileno (PE
50
). Com o intuito de evitar interferência fisiológica da glândula adrenal
direita no experimento, esta foi identificada, isolada e seccionada, para com isso
providenciar a descapsulação do rim. Cumpridos estes procedimentos, a artéria
renal foi canulada a partir da artéria mesentérica superior. Após sua identificação, a
artéria mesentérica superior foi ocluida em seu lado direito e pinçado no seu lado
esquerdo. Com pequeno corte em seu tecido introduzimos a cânula por 3 a 5 mm e
fixamos cânula e artéria. Logo a seguir, o órgão foi isolado com pinças e seccionado,
promovendo a retirada do rim e ureter. Devidamente liberado, o rim já acoplado ao
84
sistema, passa por um período de adaptação in vitro de aproximadamente 30
minutos (Figura 6).
FIGURA 11: Técnica cirúrgica do isolamento do rim (A= veia femoral, B= ureter
canulado e C= cânula arterial).
3.3.8 Protocolo experimental
Os experimentos foram iniciados após a adaptação do órgão ao sistema num
tempo de aproximadamente 30 minutos. O tempo total de perfusão do órgão foi de
120 minutos. Durante esse período, foram coletados a cada 5 minutos as medidas
do fluxômetro e a pressão do perfusato. Em intervalos de 10 minutos, de maneira
intercalada, foram coletados a urina e o perfusato. Estes frascos com urina foram
pesados e, juntamente com os frascos de perfusato, mantidos em temperatura de -
20
º
C para permitir posteriores dosagens de potássio, sódio, cloreto, inulina e
A
B
C
85
osmolaridade. Sempre aos 30 minutos do início do experimento, administramos
veneno da Bothrops insularis ou suas frações.
Com o rim direito montado no sistema, o rim esquerdo foi coletado para
controle interno, o qual foi pesado e retirado um fragmento para posterior exame
histopatológico. Após o fim do experimento, foi realizado o mesmo procedimento
com o rim direito.
3.3.9 Avaliação bioquímica
Perfusatos e urinas foram coletados em intervalos de 10 minutos, de forma
intercalada, conforme o protocolo experimental acima descrito. Com este material
foram realizados testes bioquímicos. O clearance foi mensurado de acordo com Pitts
(1971), e Martinez-Maldonado e Opava-Stitzer (1978). A dosagem de sódio e
potássio, foi realizada pelo método de fotometria de chama (Flame photometer -
modelo 443IL). As dosagens de cloreto foram realizadas seguindo o método descrito
pelo kit do fabricante Labtest. A inulina foi dosada a partir do mesmo material,
através de hidrólise direta, como descrito por Walser et al. (1955), e modificada por
Fonteles e Leibach (1982). Finalmente foi medida a osmolaridade das amostras com
um osmômetro (vapor Pressur osmometer - modelo 5100c ESCOR). Todas as
análises bioquímicas foram realizadas na Unidade de Pesquisas Clínicas da
Universidade Federal do Ceará.
3.3.10 Análise histológica
Após cada experimento, fragmentos dos dois rins e dos rins do grupo controle
foram retirados e acondicionados em frasco de formol 10% para proceder à análise
histológica. Fragmentos de mesentério foram coletados para controle nos
experimentos do segundo modelo. Estes fragmentos foram desidratados,
diafanizados e em seguida cortados, numa espessura de 5μm. Procedeu-se à
coloração do material por hematoxilina-eosina e as lâminas foram analisadas em
microscópio óptico. Todas as lâminas dos rins submetidos à perfusão foram
confeccionadas no Laboratório de Anatomia Patológica - Biopse, e avaliadas no
Departamento de Patologia e Medicina Legal da Universidade Federal do Ceará.
86
3.3.11 Cálculo dos parâmetros renais
Foram utilizadas as fórmulas abaixo para determinação dos parâmetros
funcionais renais (PITTS, 1971; MARTINEZ-MALDONADO; OPAVA-STITZER, 1978;
FONTELES et al., 1993).
1. PP (mmHg) = Pressão de perfusão. Leitura em manômetro
2. RVR (mmHg/mL.g-¹.min
-1
) = Resistência vascular renal = PP (mmHg) / FPR
3. FPR (mL.g
-1
.min
-1
) = Fluxo de perfusão renal (registrado a cada 10 min/ intervalo de tempo x peso
do rim x)
4. FU (mL.g
-1
. min
-1
) = Fluxo urinário = Peso do volume urinário / Peso do rim esquerdo x 10 (admitiu-
se que a urina possui a mesma densidade da água)
5.RFG = Ritmo de filtração glomerular = (DOU in / DOP in x FU = sendo DOU in = densidade ótica da
inulina na urina e DOP in = densidade ótica da inulina no perfusato)
6. %TNa
+
= Percentual de sódio transportado= TNa
+
x 100 / FNa
+
7. TNa
+
= (μEq.g
-1
. min
-1
) = Sódio transportado = FNa
+
- ENa
+
8. FNa
+
= (μEq.g
-1
. min
-1
) = Sódio filtrado
= RFG x PNa
+
(PNa
+
= Concentração de sódio no perfusato)
9. ENa
+
= (μEq.g
-1
. min
-1
) = Sódio excretado= FU x UNa
+
(UNa
+
= Concentração de sódio na urina)
10. %pTNa
+
- Percentual de transporte proximal de sódio= pTNa
+
x100/FNa
11. pTNa
+
(μEq.g
-1
.min
-1
) = Transporte proximal de sódio= FNa
+
x AdNa
+
12. AdNa
+
- Aporte distal de sódio (μEq.g
-1
.min
-1
) = dTNa
+
+ ENa
+
13. dTNa
+
- Transporte distal de sódio (ml.g
-1
. min
-1
) = CH
2
O x PNa
+
14. C. H2O - clearance de água livre (ml.g
-1
.min
-1
) = FU -C. osm
15.Cosm (mL.g
-1
.min
-1
) = Clearance osmótico = [Uosm / Posm] x FU (onde Uosm = Osmolaridade
urinária e Posm = Osmolaridade do perfusato)
16. %TK
+
(μEq.g
-1
. min
-1
) = Percentual de potássio transportado = TK
+
x 100 / FK
17. %pTK
+
= percentual de transporte proximal de potássio= pTK
+
x100/FK
18. % TCl
–
(μEq.g
-1
. min
-1
) = Percentual de cloreto transportado = TCl
–
x 100 / F TCl
–
19. %pTCl
–
= percentual de transporte proximal de cloreto = p TCl
–
x100/F TCl
–
Todos os cálculos realizados para a determinação dos parâmetros do sódio,
acima citados, foram repetidos para o potássio e cloreto.
87
3.4 Segundo Modelo
Procedimentos de Avaliação Sistêmica na Artéria Aorta
Este ensaio foi utilizado para teste das ações do veneno puro no leito vascular
sistêmico, abrangendo grandes e pequenos vasos (FURCHGOTT, ZAWADSKI,
1980), expressando também a reatividade de todas as células do animal, capazes
de liberar mediadores, já que este permanece vivo enquanto dura o experimento,
com o veneno em sua circulação sanguínea.
3.4.1 O sistema de avaliação sistêmica na artéria aorta
A atividade sistêmica do veneno foi analisada através da administração
endovenosa em ratos, com a pressão arterial controlada em modelo descrito por
Ferreira (1965), no qual a cânula da carótida media a pressão e o veneno era
injetado na jugular, utilizando fisiógrafo, sendo a variação de pressão medida a partir
da queda da linha determinada no início do experimento, dez minutos após a
administração de doses crescentes do veneno (Figura 12).
O sistema montado O registro da variação pressórica arterial
FIGURA 12: O sistema montado e exemplo de registro pressórico.
88
3.4.2 Procedimento cirúrgico e protocolo do experimento
Após rebatimento das glândulas parótidas, direita e esquerda, foi aprofundada
a incisão até a traquéia, onde foi realizada traqueostomia, com a finalidade de
garantir o fluxo respiratório. Após divulsão marginal deste órgão, foi identificado o
feixe vasculonervoso de onde se isolou a artéria carótida esquerda, com muito
cuidado para não lesar o nervo vago. Foi procedida, então, a canulação desta artéria
para registro da pressão arterial média. Igual manobra foi realizada com vistas à
canulação da veia jugular externa com o propósito de injetar as substâncias testes e
os padrões (Figura 13).
FIGURA 13: Técnica Cirúrgica da avaliação pressórica sistêmica (canulação da
artéria aorta e veia jugular).
89
Os registros das experiências foram realizados com transdutores acoplados a
um fisiógrafo (Anexo A). Antes do início das experiências o instrumento era
calibrado, se utilizado como padrão um manômetro de mercúrio numa escala de 20
a 250 mmHg.
As doses do veneno se iniciaram com 0,1μg, seguidos de 0,3μg, 10μg, 30μg,
100μg e finalizando com 300μg, conforme a sobrevivência do animal, diluídos em
0,1mL de solução salina. O controle foi obtido com a administração de solução
salina, anterior ao início da injeção do veneno. O exame histológico do coração,
pulmões, rins, fígado, e intestino, foi realizado após o sacrifício dos animais, no final
do experimento.
3.4.3 Análise histológica
Após cada experimento, fragmentos do coração, pulmões, rins, fígado e
intestino foram retirados e acondicionados em frasco de formol 10% para proceder à
análise histológica.
O controle foi coletado do grupo utilizado para o experimento do segundo
modelo, do leito mesentérico isolado perfundido, no qual se utiliza apenas o
mesentério. Deste grupo foram retirados os outros órgãos, coração, pulmões, fígado,
rins e intestino, buscando-se evitar desperdício de animais.
Estes fragmentos foram desidratados, diafanizados e em seguida cortados,
numa espessura de 5μm. Procedeu-se à coloração do material por hematoxilina-
eosina e as lâminas foram analisadas em microscópio óptico.
Todas as lâminas foram confeccionadas no Laboratório de Anatomia
Patológica - Biopse, e avaliadas no Departamento de Patologia e Medicina Legal da
Universidade Federal do Ceará.
90
3.5 Terceiro Modelo
Procedimentos de Perfusão no Leito Vascular Mesentérico
O objetivo deste sistema foi avaliar a resposta pressórica vascular ao veneno
da Bothrops insularis. Para tanto ele foi inicialmente injetado na artéria mesentérica
pré-contraída, visando-se observar uma possível atividade inibitória da
vasocontração, sendo, em seguida injetados em no leito arterial com pressão basal
fisiológica, visando observar uma possível atividade vasodilatadora. Como não há
recirculação do perfusato neste sistema, qualquer atividade detectada se deveria ao
efeito direto do veneno nas paredes dos vasos, ou exclusivamente da atuação de
mediadores autócrinos e parácrinos.
3.5.1 O sistema de perfusão no leito vascular mesentérico isolado.
A perfusão foi realizada segundo o modelo descrito por Mcgregor (1965). O
leito mesentérico isolado tinha a artéria mesentérica canulada e era perfundido com
a solução de Krebs-Henseleit (Anexo B). A solução de perfusão oxigenada com fluxo
contínuo de oxigênio a 95% e CO
2
a 5%, e mantida em temperatura constante de
37ºC com o fluxo mantido constante (4 mL/min) (Figura 14). As alterações de
pressão foram registradas em um manômetro de
mercúrio, numa escala de 10 a 250
mmHg, conectado ao sistema perfusôr. Foram examinados os efeitos vasculares
diretos do veneno da B. insularis na concentração de 100 μg/mL (n = 6), após
contração dos vasos produzida por fenilefrina (5 μM; n=6) e isoladamente sem a
atuação da fenilefrina. Os experimentos foram iniciados com uma pressão basal
entre 30 e 50 mmHg. O tempo de infusão das substâncias testadas foi sempre de 20
minutos em um fluxo constante de 0,1 mL/min.
91
FIGURA 14: Desenho esquemático do sistema de perfusão de leito vascular
mesentérico.
3.5.2 Protocolo da avaliação no leito vascular mesentérico
Dois protocolos foram estabelecidos. No primeiro passo o veneno foi
infundido em leitos mesentéricos isolados pré-contraídos submaximamente (≅ 80 –
90 %) com fenilefrina, para simular as condições de pressão do leito in vivo, sendo
possível verificar efeitos vasodilatadores e vasoconstritores. No segundo, depois de
estabilizada uma pressão de perfusão basal (30 – 50 mmHg) o veneno da serpente
Bothrops insularis foi infundido para se avaliar a variação da pressão de perfusão,
independentemente da vasoconstrição determinada pela fenilefrina.
O controle foi obtido dos níveis pressóricos basais, com o mesentério
perfundido exclusivamente com a solução de Krebs-Henseleit, no início dos
experimentos.
Todos os reagentes utilizados neste trabalho eram de padrão analítico,
obtidas das companhias Sigma (St. Louis, MO, E.U.A.), Merck (Darmstadt,
Germany), Reagen (Rio de Janeiro, RJ, Brasil) e Synth (Diadema, São Paulo,
Brasil).
92
3.5.3 Técnica cirúrgica da perfusão do leito vascular mesentérico isolado
Inicialmente, foi feita uma incisão da cavidade abdominal, paralelamente a
linha Alba, e dois cortes perpendiculares ao primeiro, para ampliar o campo
cirúrgico.
Após a abertura do abdome, a artéria mesentérica superior era identificada
para que seus ramos, pancreático-duodenal, ileocecal e cecal fossem ligados. Em
seguida, a artéria mesentérica superior era isolada, cuidadosamente dissecada do
conjuntivo adjacente e canulada na sua porção distal, próxima à aorta, com tubo de
polietileno (PE20). O animal era sacrificado pela abertura do tórax. O intestino era
então separado por dissecção junto ao bordo intestinal do mesentério e este
imediatamente levado ao sistema de perfusão (Figura 15).
FIGURA 15: Técnica cirúrgica da avaliação no leito vascular mesentérico. A)
intestino delgado e mesentério; B) Artéria mesentérica superior
canulada com tubo de polietileno (PE20); C – Leito mesentérico
conectado ao sistema de perfusão.
93
3.5.4 Análise histológica
Após cada experimento, fragmentos do mesentério, incluindo a artéria, foram
retirados e acondicionados em frasco de formol 10% para proceder à análise
histológica. O controle foi obtido com mesentério dos animais do segundo modelo.
Fragmentos dos demais órgãos, coração, pulmões, rins, fígado e intestino,
foram utilizados como controle no segundo modelo, de avaliação sistêmica da ação
do veneno.
Estes fragmentos foram desidratados, diafanizados e em seguida cortados,
numa espessura de 5μm. Procedeu-se à coloração do material por hematoxilina-
eosina e as lâminas foram analisadas em microscópio óptico.
Todas as lâminas foram confeccionadas no Laboratório de Anatomia
Patológica - Biopse, e avaliadas no Departamento de Patologia e Medicina Legal da
Universidade Federal do Ceará.
4 AVALIAÇÃO ESTATÍSTICA
Utilizou-se um computador PC Pentium (333 Hz) e programas Prisma 3.0 e
Microsoft Excel para análise estatística dos dados, e elaboração de gráficos e
tabelas. Os dados foram expressos por média ± EPM e comparados com o grupo
controle.
A diferença entre os grupos foi avaliada pela analise de variância (ANOVA),
seguida pelo teste t-Bonferroni, e o teste t-Student’s foi utilizado para comparar
amostras não pareadas, sempre com significância de * p< 0,05.
Todas as tabelas e gráficos dos parâmetros renais foram avaliados e
estudados de acordo com a variável de tempo, e os dados compilados em intervalos
de 30 minutos, utilizando-se o programa Prism 3.0 e Microsoft Excel.
94
RESULTADOS
95
5 RESULTADOS
5.1 Resultados dos Experimentos com Perfusão Renal
5.1.1 Avaliação dos grupos controle
Foram realizadas avaliações das alterações fisiológicas, na pressão arterial, e
histopatológicas renais, nos grupos controle.
5.1.1.1 Avaliação das alterações fisiológicas renais dos grupos
controle
Foram realizados seis experimentos controle para avaliação dos parâmetros
funcionais e histopatológicos renais, sob a influência apenas da solução perfusora
de Krebs-Henseleit modificada, para posterior comparação com os grupos tratados
com o veneno da serpente Bothrops insularis e suas frações. Todos os parâmetros
mantiveram-se estáveis durante os 120 minutos de experimento (Anexo D).
5.1.1.2 Avaliação histológica do grupo controle
No grupo controle, os rins apresentavam a maioria das células de
revestimento tubular proximal preservadas com a borda em escova bem visualizada
(Figura 16); focos esparsos de degeneração hidrópico-vacuolar destas células no
córtex renal, discreta deposição intratubular de material proteináceo (Figura 17);
glomérulos, interstício e vasos sem anormalidades.
96
FIGURA 16: Fotografia do rim de rato, controle, perfundido com a solução de Krebs-
Henseleit modificada. Células de revestimento tubular com a borda em
escova preservada. (HE), (40x).
FIGURA 17: Fotografia do rim de rato, controle, perfundido com a solução de Krebs-
Henseleit modificada. Focos esparsos de degeneração hidrópico-
vacuolar de células tubulares e discreta deposição proteinácea na luz.
(HE), (20x).
A
A
97
5.1.2 Alterações induzidas pelo veneno da serpente Bothrops insularis e
de suas frações, em sistema de rim isolado perfundido de rato
Foram examinadas as alterações fisiológicas e histopatológicas. As
alterações fisiológicas mostraram características particulares do veneno e de cada
uma de suas frações, em parâmetros renais vasculares, funcionais e eletrolíticos que
variaram muito (Tabela 4).
TABELA 1: Alterações vasculares, urinárias e eletrolíticas apresentadas pelo
veneno e suas frações no sistema de perfusão em rim isolado de rato.
Veneno Lectina LAAO Trombina PLA2 Ação/
Tempo
60 90 120 60 90 120 60 90 120 60 90 120 60 90 120
PP ↓ ↓ ↓ ↑ ↓ ↓ ↓ ↑ ↑ ↓ ↑ ↑ ↑
RVR ↓ ↓ ↓ ↓ ↑ ↑ ↑ ↑
FU ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↑ ↓ ↑ ↑ ↑
RGF ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↑ ↓ ↑ ↑
%TNa ↓ ↓ ↓ ↑ ↓ ↓ ↓ ↓
%pTNa ↓ ↓ ↓ ↑ ↑ ↓ ↓ ↓
%TK ↑ ↓ ↓ ↑
%pTK ↑ ↓ ↓ ↑ ↑
%TCl ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓
%pTCl ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓
C. osm ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↑ ↓ ↓ ↑ ↑ ↑
PP= pressão de perfusão; RVR= resistência vascular renal; FU= fluxo urinário; RFG= ritmo de
filtração glomerular; %TNa
+
= percentual de transporte de sódio; %pTNa
+
= percentual de transporte
proximal de sódio; %TK
+
= percentual de transporte de potássio; %pTK
+
= percentual de transporte
proximal de potássio; %TCl-= percentual de transporte de cloro; %pTCl-= percentual de transporte
proximal de cloro; C osm= clearance osmótico. ↓ Redução do parâmetro. ↑ Elevação do parâmetro.
As alterações histopatológicas se repetiram em quase todos os exames, que
se diferenciaram do controle em duas evidências principais, necrose tubular aguda e
extravasamento de proteínas para o espaço de Bowman. A necrose tubular aguda
foi mais intensa com a aplicação da fração lectina e com o veneno, e não foi vista
com o uso da fração trombina símile (Tabela 5). O extravasamento proteináceo para
espaço de Bowman foi mais marcante com a aplicação da fração trombina símile e
não foi visto quando foi utilizado o veneno (Tabela 5; 6; Figura 18).
98
TABELA 2: Principais alterações histopatológicas observadas com a aplicação do
veneno e de suas frações.
Veneno/Fração Extravasamento Proteináceo glomerular Necrose Tubular Aguda
Controle - -
Veneno
−
+++
Lectina 36% +++
LAAO 40% ++
Trombina símile 73%
−
Fosfolipase A
2
47% ++
Extravasamento proteináceo: % de glomérulos com algum grau de extravasamento.
+ = Pouca intensidade; ++ = Moderada intensidade; +++ = Grande intensidade.
TABELA 3: Percentual de glomérulos apresentando algum grau de extravasamento
proteináceo para o espaço de Bowman.Erro! Vínculo não válido.Número de Glomérulos =
Contados em 10 campos de maior aumento (40x).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Veneno
Bruto
Lectina LAAO Trombina-
simile
PLA2
% de Glomérulos Afetados
FIGURA 18: Percentual de glomérulos apresentando algum grau de extravasamento
proteináceo para o espaço de Bowman.
5.1.2.1 Alterações induzidas pelo veneno da serpente Bothrops insularis,
no rim isolado de rato
Foram estudados dois aspectos das alterações renais provocadas pelo
veneno da serpente Bothrops insularis, no rim isolado de rato, as alterações
fisiológicas e as alterações histopatológicas.
99
5.1.2.1.1 Alterações fisiológicas renais induzidas pelo veneno da
serpente Bothrops insularis, em rim isolado de rato
O grupo em que o rim foi tratado com o veneno da Bothrops insularis (BiV)
apresentou intensas alterações da função renal após sua aplicação. Houve queda
nos parâmetros vasculares, pressão de perfusão e resistência vascular renal (Tabela
7); nos parâmetros funcionais renais, fluxo urinário e ritmo de filtração glomerular
(Tabela 8); nos parâmetros eletrolíticos relativos ao sódio (Tabela 9) e ao cloreto
(Tabela 10), sem alteração significativa nos de potássio (Tabela 11); e queda no
clearance osmótico (Tabela 12).
Uma vez comparados o grupo controle e o tratado, observou-se queda da
pressão de perfusão do início ao final do experimento, aos 120 minutos
(C
120
=110,28±3,69; BiVb
120
=71,8±7,6 mmHg) (Tabela 7; Figura 19); a resistência
vascular renal também caiu a partir dos 60 minutos, até o final do experimento
(C
120
=5,48±0,53; BiVb
120
=3,65±0,53 mmHg/ml.g
-1
.min
-1
) (Tabela 7; Figura 20); o
fluxo urinário caiu progressivamente a partir dos 60 minutos, nos 90 minutos e ao
final (C
120
=0,160±0,020; BiVb
120
=0,104±0,023 mL.g
-1
.min
-1
) (Tabela 8; Figura 21); o
ritmo de filtração glomerular também caiu a partir dos 60 minutos, até o final
(C
120
=0,697±0,084; BiVb
120
= 0,478±0,135 mL.g
-1
.min
-1
) (Tabela 8; Figura 22); o
percentual de transporte tubular total de sódio caiu a partir dos 60 minutos até o final
(C
120
=79,76±0,56; BiVb
120
=69,57±4,05%) (Tabela 9; Figura 23); como também o
percentual de transporte proximal de sódio no mesmo período, (C
120
=74,94±3,41;
BiVb
120
=62,34±4,52%) (Tabela 9; Figura 24); a absorção de potássio não sofreu
alterações significativas (Tabela 10; Figura 25; 26).
100
TABELA 4: Parâmetros vasculares do rim isolado de ratos Wistar (n=6) na presença
do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Controle Veneno Controle Veneno
Tempo
PP (mmHg)
PP (mmHg)
RVR(mmHg/.mL.
g
-1
.min
-1
)
RVR(mmHg/.mL.
g
-1
.min
-1
)
min. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m.
30 110,11 3,68 108,40 5,70 5,39 0,48 5,50 0,59
60 108,27 4,88 86,70* 7,50 5,57 0,49 4,30* 0,50
90 108,69 5,09 51,10 * 5,50 5,32 0,57 2,61 * 0,40
120 110,28 3,69 71,80* 7,60 5,48 0,53 3,65 * 0,53
Dados apresentados por média±EPM (p<0,05).*=Diferença estatisticamente significativa para p<0,05.
PP= pressão de perfusão; RVR= resistência vascular renal.
30 60 90 120
0
50
100
150
Controle
Veneno
*
*
*
Tempo (minutos)
Pressão de Perfusão
(mmHg)
FIGURA 19: Pressão de perfusão, em rim isolado de ratos Wistar (n=6), na
presença do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
30 60 90 120
0.0
2.5
5.0
7.5
Controle
Veneno
*
*
Tempo (minutos)
Resistência Vascular Renal
(mmHg/mL.g
-1
.min
-1
)
*
FIGURA 20: Resistência vascular renal, em rim isolado de ratos Wistar (n=6), na
presença do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). *= diferença estatisticamente significativa do controle.
101
TABELA 5: Parâmetros fisiológicos do rim isolado de ratos Wistar (n=6) na presença
do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Controle Veneno Controle Veneno
Tempo
F.U.(mL.g
-1
.min
-1
) F.U.(mL.g
-1
.min
-1
) R.F.G.(mL.g
-1
.min
-1
) R.F.G.(mL.g
-1
.min
-1
)
min. Média e.p.m. Média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m.
30 0,139 0,009 0,148 0,004 0,701 0,073 0,654 0,043
60 0,158 0,015 0,064 * 0,015 0,707 0,051 0,287 * 0,077
90 0,164 0,024 0,042 * 0,008 0,633 0,051 0,147 * 0,031
120 0,160 0,020 0,104 * 0,023 0,697 0,084 0,478 * 0,135
Dados apresentados por média±EPM (p<0,05).*=Diferença estatisticamente significativa para p<0,05.
FU= fluxo urinário; RFG= ritmo de filtração glomerular.
30.0 60.0 90.0 120.0
0.0
0.1
0.2
Controle
Veneno
*
*
*
Tempo (minutos)
Fluxo Urinário
(mL.g
-1
.min
-1
)
FIGURA 21: Fluxo urinário, em rim isolado de ratos Wistar (n=6), na presença do
veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
30 60 90 120
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
Controle
Veneno
*
*
*
Tempo (minutos)
Ritmo de Filtração
Glomerular (mL.g-1.min-1)
FIGURA 22: Ritmo de filtração glomerular, em rim isolado de ratos Wistar (n=6), na
presença do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). *= diferença estatisticamente significativa do controle.
102
TABELA 6: Parâmetros eletrolíticos relativos ao transporte de sódio no rim isolado
de ratos Wistar (n=6), na presença do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Controle Veneno Controle Veneno
Tempo
% T Na
+
% T Na
+
% pT Na
+
% pT Na
+
min. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m.
30 81,94 1,24 82,27 0,99 75,65 1,42 77,57 0,96
60 81,11 1,52 76,28* 3,19 74,69 0,99 69,09* 3,73
90 79,26 0,90 72,52 * 2,91 73,84 2,64 64,66 * 3,22
120 79,76 0,56 69,57 * 4,05 74,94 3,41 62,34 * 4,52
Dados apresentados por média±EPM (p<0,05).*=Diferença estatisticamente significativa para p<0,05.
%TNa
+
=percentual de transporte total de sódio; %pTNa
+
=percentual de transporte proximal de sódio.
30 60 90 120
0
25
50
75
100
Controle
Veneno
*
*
*
Tempo (minutos)
%TNa+
FIGURA 23: Percentual de transporte total de sódio em rim isolado de ratos Wistar
(n=6), na presença do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
30 60 90 120
0
25
50
75
100
Controle
Veneno
**
*
Tempo (minutos)
% pTNa+
FIGURA 24: Percentual de transporte proximal de sódio (%pTNa
+
) em rim isolado de
ratos Wistar (n=6), na presença do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). *= diferença estatisticamente significativa do controle.
103
TABELA 7: Parâmetros eletrolíticos relativos ao transporte de potássio no rim
isolado de ratos Wistar (n=6), na presença do veneno da B. insularis
(10μg/mL).
Controle Veneno Controle Veneno
Tempo
% TK
+
% TK
+
%pTK
+
%pTK
+
min. Média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m.
30 69,13 4,14 69,64 1,42 64,50 4,74 67,94 2,01
60 69,04 5,68 64,88 3,99 62,71 4,08 61,69 4,60
90 71,84 4,21 67,67 2,34 64,27 6,12 63,81 2,75
120 69,94 6,86 67,76 3,93 61,83 5,62 64,53 4,43
Dados apresentados por média±EPM(p<0,05). *=Diferença estatisticamente significativa para p<0,05.
%TK
+
=percentual de transporte total, potássio; %pTK
+
=percentual de transporte proximal de potássio.
30 60 90 120
0
25
50
75
100
Controle
Veneno
Tempo (minutos)
%TK+
FIGURA 25: Percentual de transporte total de potássio em rim isolado de ratos
Wistar (n=6) na presença do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05).
30 60 90 120
0
25
50
75
Controle
Veneno
Tempo (minutos)
% pTK+
FIGURA 26: Percentual de transporte proximal de potássio em rim isolado de ratos
Wistar (n=6) na presença do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05).
104
TABELA 8: Parâmetros eletrolíticos relativos ao transporte de cloreto no rim isolado
de ratos Wistar (n=6), na presença do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Controle Veneno Controle Veneno
Tempo
% T Cl
-
% T Cl
-
% pT Cl
-
% pT Cl
-
min. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m.
30 79,90 1,03 78,87 1,36 76,81 1,25 76,17 1,13
60 81,25 2,44 73,71* 3,41 78,49 2,90 68,52* 4,05
90 77,32 2,22 64,49 * 4,87 76,58 1,20 58,63 * 5,21
120 78,53 2,33 68,98 * 4,14 76,36 2,47 63,75 * 4,61
Dados apresentados por média±EPM (p<0,05).*=Diferença estatisticamente significativa para p<0,05.
%TCl-= percentual de transporte total de cloro; %pTCl-= percentual de transporte proximal de cloro.
30 60 90 120
0
25
50
75
100
Controle
Veneno
*
*
*
Tempo (minutos)
%TCl-
FIGURA 27: Percentual de transporte total de cloreto em rim isolado de ratos Wistar
(n=6), na presença do veneno da Bothrops insularis, na concentração
de 10μg/mL.
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
30 60 90 120
0
25
50
75
100
Controle
Veneno
*
*
*
Tempo (minutos)
% pT Cl-
FIGURA 28: Percentual de transporte proximal de cloreto em rim isolado de ratos
Wistar (n=6), na presença do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
105
TABELA 9: Parâmetros do clearance osmótico no rim isolado de ratos Wistar (n=6),
na presença do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Controle Veneno
Tempo
C osm (mL.g
-1
.min
-1
) C osm (mL.g
-1
.min
-1
)
min. média Epm média e.p.m.
30 0,120 0,02 0,136 0,01
60 0,121 0,02 0,056* 0,02
90 0,142 0,01 0,036* 0,01
120 0,125 0,01 0,090* 0,02
Dados apresentados por média±EPM (p<0,05).*=Diferença estatisticamente significativa para p<0,05.
C. osm= Clearance osmótico.
30 60 90 120
0.00
0.05
0.10
0.15
Controle
Veneno
*
*
*
Tempo (minuto)
Clearance osmótico
(mL.g-1.min-1)
FIGURA 29: Parâmetros do clearance osmótico em rim isolado de ratos Wistar (n=6)
na presença do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
O percentual de cloreto total transportado foi reduzido a partir dos 60 minutos, até o
final aos 120 minutos (C
120
=78,53±2,33; BiVb
120
=68,98±4,14%) (Tabela 11; Figura
27); o percentual de cloreto proximal transportado também foi reduzido
progressivamente a partir dos 60 até os 120 minutos (C
120
=76,36±2,47;
BiVb
120
=63,75±4,61%) (Tabela 11; Figura 28); e o clearance osmótico foi reduzido
aos 60 e 90 minutos (C
90
=0,14±0,01; BiVb
90
=0,04±0,01mL.g
-1
.min
-1
) (Tabela 12;
Figura 29).
106
5.1.2.1.2 Alterações histopatológicas renais induzidas pelo veneno da
serpente Bothrops insularis, em rim isolado de rato
No grupo controle, os rins apresentavam focos esparsos de degeneração
hidrópico-vacuolar das células de revestimento tubular no córtex renal, discreta
deposição intratubular de material proteináceo; glomérulos, interstício e vasos sem
anormalidades (Figura 17).
FIGURA 30: Fotografia do rim de rato perfundido, ao final do experimento, ao final
do experimento, na presença do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL). (A) Balonização de células tubulares proximais. (HE), (20x).
No grupo tratado com o veneno da serpente Bothrops insularis foram
observados extensos fenômenos degenerativos representados por balonização
hidrópica com vacuolização citoplasmática das células de revestimento tubular
proximal e descontinuidade de sua borda em escova (Figura 30); áreas focais
corticais apresentando células de núcleos picnóticos com condensação da cromatina
e fragmentados característicos de necrose tubular aguda, que apresenta o mesmo
aspecto morfológico de apoptose (Figura 31); deposição proteinácea acentuada nos
túbulos. Glomérulos, interstício e vasos normais.
A
107
FIGURA 31: Fotografia do rim de rato perfundido, ao final do experimento, na
presença do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL). Necrose tubular
aguda, com aspecto morfológico igual ao da apoptose (A), e depósito
proteináceo intratubular (B). (HE). (40x).
5.1.2.2 Alterações induzidas pela fração lectina extraída do veneno da
serpente Bothrops insularis, no rim isolado de rato
Foram estudados dois aspectos das alterações renais provocadas pela fração
lectina extraída do veneno da serpente Bothrops insularis, no rim isolado de rato, as
alterações fisiológicas e as alterações histopatológicas.
B
A
108
5.1.2.2.1 Alterações fisiológicas induzidas pela fração lectina extraída
do veneno da serpente Bothrops insularis, no rim isolado
de Rato
Os rins tratados com a fração lectina do veneno da Bothrops insularis (BiL),
apresentaram uma resposta marcante, porém variada. A pressão de perfusão sofreu
uma elevação inicial com queda posterior (Tabela 13); os parâmetros funcionais
renais, fluxo urinário e ritmo de filtração glomerular, caíram progressivamente
(Tabela 14). Aumentou a reabsorção eletrólitos como o sódio (Tabela 15) e o
potássio (Tabela 16), mas a do cloreto não se alterou significativamente (Tabela 17),
e diminuiu o clearance osmótico (Tabela 18).
O grupo em que o rim foi tratado com a lectina apresentou um aumento inicial
da pressão de perfusão (C
60
=108,27±4,9; BiLc
60
=112,9±5,4 mmHg) com queda aos
120 minutos (C
120
=110,28 ±3,69; BiLc
120
=100,03±5,19mmHg), (Tabela 13; Figura
32); a resistência vascular renal aumentou aos 60 minutos mas sem significância
estatística (Tabela 13; Figura 33); o fluxo urinário caiu progressivamente a partir dos
90 minutos (C
120
=0,160±0,020; BiLc
120
=0,082±0,008 mL.g
-1
.min
-1
) (Tabela 14; Figura
34); o ritmo de filtração glomerular caiu no final (C
120
=0,697±0,084; BiLc
120
=
0,394±0,063 mL.g
-1
.min
-1
) (Tabela 14; Figura 35); o percentual de transporte tubular
total de sódio aumentou aos 90 minutos(C
90
=79,26±0,90; BiLc
90
=83,08±2,04%)
(Tabela 15; Figura 36); o percentual de transporte proximal de sódio aumentou aos
60 e 90minutos (C
90
=73,84±2,64; BiLc
90
=79,75±2,42%) (Tabela 15; Figura 37); o
transporte total de potássio (C
120
=69,94±3,16; BiLc
120
=74,91*±1,74 %) (Tabela 16;
Figura 38) e o percentual de potássio proximal reabsorvido (C
120
=61,83±5,62;
BiLc
120
=70,99±3,06%) aumentaram ao final do experimento (Tabela 16; Figura 39);
e houve diminuição do clearance osmótico aos 120 min (C
120
=0,13±0,01;
BiLc
120
=0,07 *±0,01 mL.g
-1
.min
-1
) (Tabela 18; Figura 42). O transporte de cloreto não
sofreu alterações (Tabela 17; Figura 40, 41).
109
TABELA 10: Parâmetros vasculares do rim isolado de ratos Wistar (n=6), na
presença da fração lectina do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Controle Lectina Controle Lectina
Tempo
PP (mmHg)
PP (mmHg)
RVR(mmHg/.mL.
g
-1
.min
-1
)
RVR(mmHg/.mL.
g
-1
.min
-1
)
min. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m.
30 110,11 3,68 110,53 3,82 5,15 0,49 5,29 0,47
60 108,27 4,88 122,03* 5,24 5,38 0,51 6,01 0,57
90 108,69 5,09 112,87 5,41 5,36 0,59 5,57 0,54
120 110,28 3,69 100,03* 5,19 5,20 0,47 5,08 0,63
Dados apresentados por média±EPM (p<0,05).*=Diferença estatisticamente significativa para p<0,05.
PP= pressão de perfusão; RVR= resistência vascular renal.
30 60 90 120
0
50
100
150
Controle
Lectina
*
*
Tempo (minutos)
Pressão de
Perfusão(mmHg)
FIGURA 32: Pressão de perfusão em rim isolado de ratos Wistar (n=6) na presença
da fração lectina do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
30 60 90 120
0.0
2.5
5.0
7.5
Controle
Lectina
Tempo (minutos)
Resistência Vascular Renal
(mmHg/mL.g
-1
.min
-1
)
FIGURA 33: Resistência vascular renal em rim isolado de ratos Wistar (n=6), na
presença da fração lectina do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05).
110
TABELA 11: Parâmetros fisiológicos do rim isolado de ratos Wistar (n=6), na
presença da fração lectina do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Controle Lectina Controle Lectina
Tempo
F.U
(mL.g
-1
.min
-1
)
F.U
(mL.g
-1
.min
-1
)
R.F.G
(mL.g
-1
.min
-1
)
R.F.G.
(mL.g
-1
.min
-1
)
min. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m.
30 0,139 0,009 0,145 0,006 0,701 0,073 0,662 0,061
60 0,158 0,015 0,154 0,011 0,707 0,051 0,694 0,057
90 0,164 0,024 0,129 * 0,007 0,633 0,051 0,594 0,038
120 0,160 0,020 0,082 * 0,008 0,697 0,084 0,394 * 0,063
Dados apresentados por média±EPM (p<0,05).*=Diferença estatisticamente significativa para p<0,05.
FU= fluxo urinário; RFG= ritmo de filtração glomerular.
30 60 90 120
0.0
0.1
0.2
Controle
Lectina
*
*
Tempo (minutos)
Fluxo Urinário(mL.g
-1
.min
-1
)
FIGURA 34: Fluxo urinário em rim isolado de ratos Wistar (n=6), na presença da
fração lectina extraída do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
30 60 90 120
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
Controle
Lectina
*
Tempo (minutos)
Ritmo de Filtração
Glonerular (mL.g
-1
.min
-1
)
FIGURA 35: Ritmo de filtração glomerular em rim isolado de ratos Wistar (n=6), na
presença da fração lectina do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
111
TABELA 12: Parâmetros eletrolíticos do rim isolado de ratos Wistar (n=6), na
presença da fração lectina do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Controle Lectina Controle Lectina
Tempo
% TNa % T Na+ %pTNa % pT Na+
min. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m.
30 81,94 1,24 81,84 1,91 75,65 1,42 78,04 2,45
60 81,11 1,52 82,84 2,01 74,69 0,99 79,41 * 2,47
90 79,26 0,90 83,08 * 2,04 73,84 2,64 79,75 * 2,42
120 79,76 0,56 81,16 2,26 74,94 3,41 77,24 2,50
Dados apresentados por média±EPM (p<0,05).*=Diferença estatisticamente significativa para p<0,05.
%TNa
+
= percentual de transporte total de sódio; %pTNa
+
=percentual de transporte proximal de sódio.
30 60 90 120
0
25
50
75
100
Controle
Lectina
*
Tempo (minutos)
% T Na+
FIGURA 36: Percentual de transporte total de sódio em rim isolado de ratos Wistar
(n=6), na presença da lectina do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
30 60 90 120
0
25
50
75
100
Controle
Lectina
*
*
Tempo (minutos)
% pT Na+
FIGURA 37: Percentual de transporte proximal de sódio em rim isolado de ratos
Wistar (n=6) na presença da lectina do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
112
TABELA 13: Parâmetros eletrolíticos do rim isolado de ratos Wistar (n=6), na
presença da fração lectina extraída do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Controle Lectina Controle Lectina
Tempo
%TK % T K+ %pTK % pT K+
min. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m.
30 69,13 4,14 67,34 3,03 64,50 4,74 63,54 3,51
60 69,04 5,68 70,52 2,24 62,71 4,08 67,09 2,74
90 71,84 4,21 72,37 2,14 64,27 6,12 69,04 2,49
120 69,94 3,16 74,91* 1,74 61,83 5,62 70,99 * 3,06
Dados apresentados por média±EPM (p<0,05).*=Diferença estatisticamente significativa para p<0,05.
%TK
+
=percentual de transporte total potássio; %pTK
+
=percentual de transporte proximal de potássio.
30 60 90 120
0
25
50
75
100
Controle
Lectina
*
Tempo (minutos)
%TK+
FIGURA 38: Percentual de transporte total de potássio em rim isolado de ratos
Wistar (n=6), na presença da lectina do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
30 60 90 120
0
25
50
75
Controle
Lectina
*
Tempo (minutos)
%pTK+
FIGURA 39: Percentual de transporte proximal de potássio em rim isolado de ratos
Wistar (n=6) na presença da lectina do veneno da Bothrops insularis,
na concentração de 10μg/mL.
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
113
TABELA 14: Parâmetros eletrolíticos do rim isolado de ratos Wistar (n=6), na
presença da fração lectina do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Controle Lectina Controle Lectina
Tempo
%TCl % T Cl- %pTCl % pT Cl-
min. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m.
30 79,90 1,03 78,61 2,20 76,81 1,25 74,82 2,76
60 81,25 2,44 79,84 2,18 78,49 2,90 76,41 2,66
90 77,32 2,22 80,09 2,16 76,58 1,20 76,76 2,54
120 78,53 2,33 78,72 2,35 76,36 2,47 74,80 2,80
Dados apresentados por média±EPM (p<0,05).*=Diferença estatisticamente significativa para p<0,05.
%TCl-= percentual de transporte total de cloro; %pTCl-= percentual de transporte proximal de cloro.
30 60 90 120
0
25
50
75
100
Controle
Lectina
Tempo (minutos)
% T Cl-
FIGURA 40: Percentual de transporte total de cloreto em rim isolado de ratos Wistar
(n=6), na presença da fração lectina do veneno da B. insularis.
(10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05).
30 60 90 120
0
25
50
75
100
Controle
Lectina
Tempo (minutos)
% pT Cl-
FIGURA 41: Percentual de transporte proximal de cloreto em rim isolado de ratos
Wistar (n=6), na presença da fração lectina do veneno da B. insularis
(10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05).
114
TABELA 15: Parâmetros do clearance osmótico do rim isolado de ratos Wistar (n=6)
sob efeito da fração lectina extraída do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL), aos 30, 60, 90 e 120 minutos.
Controle Lectina
Tempo
C osm (mL.g
-1
.min
-1
) C osm (mL.g
-1
.min
-1
)
min. média e.p.m. Média e.p.m.
30 0,12 0,02 0,12 0,01
60 0,12 0,01 0,13 0,01
90 0,14 0,01 0,10 0,01
120 0,13 0,01 0,07 * 0,01
Dados apresentados por média±EPM (p<0,05).
* = Diferença estatisticamente significativa para p<0,05.
C. osm.= Clearance osmótico.
30 60 90 120
0.00
0.05
0.10
0.15
Controle
Lectina
*
*
Tempo (minutos)
Clearance osmótico
(mL.g-1.min-1)
FIGURA 42: Parâmetros do clearance osmótico (C. osm.) em rim isolado de ratos
Wistar (n=6) na presença da lectina do veneno da Bothrops insularis,
na concentração de 10μg/mL.
Dados apresentados por média ± EPM (p<0,05). *=diferença estatisticamente significativa do controle.
5.1.2.2.2 Alterações histopatológicas renais induzidas pela fração
lectina extraída do veneno da serpente Bothrops insularis,
em rim isolado de rato
No grupo controle, os rins apresentavam focos esparsos de degeneração
hidrópico-vacuolar das células de revestimento tubular, discreta deposição
intratubular proximal de material proteináceo; glomérulos, interstício e vasos sem
anormalidades (Figura 17).
115
No grupo tratado com a fração lectina extraída do veneno da serpente
Bothrops insularis foram observados fenômenos degenerativos representados por
balonização hidrópica com vacuolização citoplasmática extensa e descontinuidade
da borda em escova das células de revestimento tubular proximal (Figura 43);
descamação necróticas de células de revestimento tubular proximal para a luz;
deposição proteinácea acentuada nos túbulos proximais e distais (Figura 44); áreas
focais corticais apresentando células de núcleos fragmentados sugestivos de
necrose tubular aguda (Figura 45); extravasamento de perfusato dos capilares
glomerulares com deposição proteinácea no espaço de Bowman dos glomérulos de
aspecto crescêntico (Figura 43). Algum grau de extravasamento foi observado em
36% dos 129 glomérulos contados em 10 campos de grande aumento (40x) por
lâmina. Interstício e vasos normais.
FIGURA 43: Fotografia do rim de rato perfundido, ao final do experimento, na
presença da lectina do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Material proteináceo no espaço de Bowman (A), balonização das
células tubulares e deposição proteinácea na luz (B). (HE), (20x).
A B
116
FIGURA 44: Fotografia do rim de rato perfundido, ao final do experimento, na
presença da lectina do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Depósito proteináceo nos túbulos distais (A). (HE), (40x).
FIGURA 45: Fotografia do rim de rato perfundido, ao final do experimento, na
presença da lectina do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Necrose tubular aguda (A). (HE), (40x).
A
A
117
5.1.2.3 Alterações induzidas pela fração L-aminoácido-oxidase
(LAAO) extraída do veneno da serpente Bothrops insularis,
no rim isolado de rato
Foram estudados dois aspectos das alterações renais provocadas pela fração
com atividade L-aminoácido-oxidase extraída do veneno da serpente Bothrops
insularis, no rim isolado de rato; as alterações fisiológicas e as alterações
histopatológicas.
5.1.2.3.1 Alterações fisiológicas induzidas pela fração L-aminoácido-
oxidase (LAAO) extraída do veneno da serpente Bothrops
insularis, no rim isolado de rato
Os rins foram tratados com a L-aminoácido-oxidase extraída do veneno de
Bothrops insularis (BiLA) apresentaram queda em todos os parâmetros avaliados.
Na pressão de perfusão e resistência vascular renal (Tabela 19); no fluxo urinário e
ritmo de filtração glomerular (Tabela 20). No transporte sódio (Tabela 21); de
potássio, (Tabela 22); de cloreto (Tabela 23); e no clearance osmótico (Tabela 24).
O grupo em que o rim foi tratado com a BiLA apresentou um diminuição da
pressão de perfusão aos 90 e aos 120 minutos (C
120
=110,28±3,69; BiLA
120
=82,2±5,6
mmHg) (Tabela 19; Figura 46); da resistência vascular renal no final
(C
120
=5,48±0,53; BiLA
120
=4,12±0,42 mmHg/ml.g
-1
.min
-1
), (Tabela 19; Figura 47); o
fluxo urinário caiu progressivamente a partir dos 60 minutos até o final
(C
120
=0,160±0,020; BiLA
120
=0,064±0,012 mL.g
-1
.min
-1
) (Tabela 20; Figura 48); o
ritmo de filtração glomerular caiu a partir dos 90 minutos até o final
(C
120
=0,697±0,084; BiLA
120
=0,176±0,017 mL.g
-1
.min
-1
) (Tabela 20; Figura 49); o
percentual de transporte tubular total de sódio caiu aos 120 minutos (C
120
=
79,76±0,56; BiLA
120
=65,39±6,19%) (Tabela 21; Figura 50).
118
TABELA 16: Parâmetros vasculares do rim isolado de ratos Wistar (n=6), na
presença da L-aminoácido-oxidase (LAAO) do veneno da B. insularis
(10μg/mL).
Controle LAAO Controle LAAO
Tempo
PP (mmHg) PP (mmHg)
RVR-
mmHg/.mL.g
-
1
.min
-1
RVR-
mmHg/.mL.g
-
1
.min
-1
min. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m.
30 110,11 3,68 108,02 1,56 5,15 0,49 5,27 0,35
60 108,27 4,88 107,19 3,08 5,38 0,51 5,20 0,29
90 108,69 5,09 97,10* 1,70 5,36 0,59 4,72 0,29
120 110,28 3,69 82,19* 5,58 5,20 0,47 4,02* 0,42
Dados apresentados por média±EPM (p<0,05).*=Diferença estatisticamente significativa para p<0,05.
PP= pressão de perfusão; RVR= resistência vascular renal.
30 60 90 120
0
50
100
150
Controle
LAAO
*
*
Tempo (minutos)
Pressão de Perfusão
(mmHg)
FIGURA 46: Pressão de perfusão em rim isolado de ratos Wistar (n=6), na presença
da LAAO do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
30 60 90 120
0.0
2.5
5.0
7.5
Controle
LAAO
*
Tempo (minutos)
Resistência Vascular Renal
(mmHg/mL.g
-1
.min
-1
)
FIGURA 47: Resistência vascular renal em rim isolado de ratos Wistar (n=6), na
presença da LAAO do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
119
TABELA 17: Parâmetros fisiológicos do rim isolado de ratos Wistar (n=6), na
presença da L-aminoácido-oxidase do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Controle LAAO Controle LAAO
Tempo
F.U.(mL.g
-1
.min
-1
) F.U.(mL.g
-1
.min
-1
) R.F.G.(mL.g
-1
.min
-1
) R.F.G.(mL.g
-1
.min
-1
)
min. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m.
30 0,139 0,009 0,146 0,007 0,701 0,073 0,658 0,070
60 0,158 0,015 0,129* 0,005 0,707 0,051 0,678 0,083
90 0,164 0,024 0,087* 0,012 0,633 0,051 0,337* 0,057
120 0,160 0,020 0,064* 0,012 0,697 0,084 0,176* 0,017
Dados apresentados por média±EPM (p<0,05).*=Diferença estatisticamente significativa para p<0,05.
FU= fluxo urinário; RFG= ritmo de filtração glomerular.
30.0 60.0 90.0 120.0
0.0
0.1
0.2
Controle
LAAO
*
*
*
Tempo (minutos)
Fluxo Urinário(mL.g
-1
.min
-1
)
FIGURA 48: Fluxo urinário em rim isolado de ratos Wistar (n=6), na presença da
LAAO do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
30 60 90 120
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
Controle
LAAO
*
*
Tempo (minutos)
Ritmo de Filtração
Glonerular (mL.g
-1
.min
-1
)
FIGURA 49: Ritmo de filtração glomerular em rim isolado de ratos Wistar (n=6), na
presença da LAAO do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
120
TABELA 18: Parâmetros eletrolíticos do rim isolado de ratos Wistar (n=6), na
presença da L-aminoácido-oxidase do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Controle LAAO Controle LAAO
Tempo
% T Na
+
% T Na
+
% pT Na
+
% pT Na
+
min. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m.
30 81,94 1,24 83,71 1,97 75,65 1,42 77,90 2,47
60 81,11 1,52 86,15 3,54 74,69 2,99 81,32 4,19
90 79,26 0,90 74,99 5,55 73,84 2,64 68,35 6,52
120 79,76 0,56 65,39* 6,19 74,94 3,41 58,62* 6,86
Dados apresentados por média±EPM (p<0,05).*=Diferença estatisticamente significativa para p<0,05.
%TNa
+
= percentual de transporte total de sódio; %pTNa
+
=percentual de transporte proximal de sódio.
30 60 90 120
0
25
50
75
100
Controle
LAAO
*
Tempo (minutos)
%TNa+
FIGURA 50: Percentual de transporte total de sódio em rim isolado de ratos Wistar
(n=6), na presença da LAAO do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
30 60 90 120
0
25
50
75
100
Controle
LAAO
*
Tempo (minutos)
%pTNa+
FIGURA 51: Percentual de transporte proximal de sódio em rim isolado de ratos
Wistar (n=6), na presença da LAAO do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
121
TABELA 19 - Parâmetros eletrolíticos do rim isolado de ratos Wistar (n=6), na
presença da L-aminoácido-oxidase do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Controle LAAO Controle LAAO
Tempo
% TK
+
% TK
+
%pTK
+
% pT K
+
min. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m.
30 69,13 4,14 72,96 2,26 64,50 4,74 69,14 2,76
60 69,04 5,68 70,78 2,50 62,71 4,08 67,95 2,66
90 71,84 4,21 57,17* 5,79 64,27 6,12 49,39* 4,75
120 69,94 6,86 60,26* 2,24 61,83 5,62 51,59* 2,97
Dados apresentados por média±EPM (p<0,05).*=Diferença estatisticamente significativa para p<0,05.
%TK
+
=percentual de transporte total, potássio; %pTK
+
=percentual de transporte proximal de potássio.
30 60 90 120
0
25
50
75
100
Controle
LAAO
*
*
Tempo (minutos)
%TK+
FIGURA 52: Percentual de transporte total de potássio em rim isolado de ratos
Wistar (n=6), na presença da LAAO do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
30 60 90 120
0
25
50
75
Controle
LAAO
**
Tempo (minutos)
%pTK+
FIGURA 53: Percentual de transporte proximal de potássio em rim isolado de ratos
Wistar (n=6), na presença da LAAO do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
122
TABELA 20: Parâmetros eletrolíticos do rim isolado de ratos Wistar (n=6), na
presença da L-aminoácido-oxidase do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Controle LAAO Controle LAAO
Tempo
%TCl
-
% T Cl
-
%pTCl
-
% pT Cl
-
min. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m.
30 79,90 1,03 81,60 2,17 76,81 1,25 77,79 2,67
60 81,25 2,44 84,24 1,12 78,49 2,90 81,40 1,34
90 77,32 2,22 72,98 6,04 76,58 1,20 68,34 7,00
120 78,53 2,33 64,58* 6,68 76,36 2,47 59,81* 7,36
Dados apresentados por média±EPM (p<0,05).*=Diferença estatisticamente significativa para p<0,05.
%TCl-= percentual de transporte total de cloro; %pTCl-= percentual de transporte proximal de cloro.
30 60 90 120
0
25
50
75
100
Controle
LAAO
*
Tempo (minutos)
%TCl-
FIGURA 54: Percentual de transporte total de cloreto em rim isolado de ratos Wistar
(n=6), na presença da LAAO do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
30 60 90 120
0
25
50
75
100
Controle
LAAO
*
Tempo (minutos)
% pT Cl-
FIGURA 55: Percentual de transporte proximal de cloreto em rim isolado de ratos
Wistar (n=6), na presença da LAAO do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
123
TABELA 21: Parâmetros do clearance osmótico do rim isolado de ratos Wistar
(n=6), na presença da L-aminoácido-oxidase do veneno da B.
insularis (10μg/mL).
Controle LAAO
Tempo
C osm (mL.g
-1
.min
-1
) C osm (mL.g
-1
.min
-1
)
min. média e.p.m. Média e.p.m.
30 0,120 0,02 0,124 0,01
60 0,121 0,02 0,111 0,01
90 0,142 0,01 0,074* 0,02
120 0,125 0,02 0,056* 0,02
Dados apresentados por média±EPM (p<0,05).*=Diferença estatisticamente significativa para p<0,05.
C. osm.= Clearance osmótico
30 60 90 120
0.0
0.1
0.2
Controle
LAAO
*
*
Tempo (minutos)
Clearance osmótico
(mL.g
-1
.min
-1
)
FIGURA 56: Parâmetros do clearance osmótico em rim isolado de ratos Wistar
(n=6), na presença da LAAO do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
O percentual de transporte proximal de sódio também caiu aos 120 minutos
(C
120
=74,94±3,41; BiLA
120
=58,62±6,86%) (Tabela 21; Figura 51); ocorreu diminuição
do transporte total de potássio a partir dos 90 minutos até o final (C
120
= 69,94± 6,86;
BiLA
120
=60,26±2,24%) (Tabela 22; Figura 54), como também do percentual do
transporte proximal de potássio (C
120
= 61,83±5,62; BiLA
120
=51,59±2,97%), (Tabela
22; Figura 55); diminuiu o percentual de cloreto total transportado ao final do
experimento (C
120
=78,53±2,33; BiLA
120
=64,58±6,68%) (Tabela 23; Figura 52), e o
percentual de cloreto proximal transportado, também aos 120 minutos
(C
120
=76,36±2,47; BiLA
120
=59,81±7,36%) (Tabela 23; Figura 53); e o clearance
osmótico caiu a partir dos 90 minutos até o final (C
120
=0,13±0,02; BiLA
120
=0,06±0,02
mL.g
-1
.min
-1
) (Tabela 24; Figura 56).
124
5.1.2.3.2 Alterações histopatológicas renais induzidas pela fração
com atividade L-aminoácido-oxidase extraída do veneno da
serpente Bothrops insularis, em rim isolado de rato
No grupo controle, os rins apresentavam focos esparsos de degeneração
hidrópico-vacuolar das células de revestimento tubular; discreta deposição
intratubular proximal de material proteináceo; glomérulos, interstício e vasos sem
anormalidades (Tabela 21).
No grupo tratado com a fração LAAO do veneno da serpente Bothrops
insularis foram observados focos de necrose tubular aguda, que tem o mesmo
aspecto morfológico de apoptose, mais evidentes na cortical, com núcleos picnóticos
de cromatina condensada e fragmentada (Figura 57); fenômenos degenerativos
reversíveis representados por balonização hidrópica com vacuolização
citoplasmática extensa e descontinuidade da borda em escova das células do
revestimento tubular proximal com descamação necrótica destas células para a luz
tubular; deposição proteinácea acentuada nos túbulos proximais e distais (Figura
58).
FIGURA 57: Fotografia do rim de rato perfundido, ao final do experimento, na
presença da LAAO do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL). Focos
de necrose tubular aguda e apoptose (A). (HE), (20x).
A
125
FIGURA 58: Fotografia do rim de rato perfundido, ao final do experimento, na
presença da LAAO do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL). (A)
Balonização de células tubulares e deposição proteinácea na luz (B).
(HE), (40x).
FIGURA 59: Fotografia do rim de rato perfundido, ao final do experimento, na
presença da LAAO do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Deposição proteinácea no espaço de Bowman (A) e balonização de
células tubulares (B). (HE), (20x).
A
A
B
B
126
Houve extravasamento de perfusato dos capilares glomerulares com deposição
proteinácea no espaço de Bowman dos glomérulos de aspecto crescêntico (Figura
59). Algum grau de extravasamento foi observado em 40% dos 108 glomérulos
contados em 10 campos de grande aumento (40x) por lâmina. Interstício e vasos
normais.
5.1.2.4 Alterações induzidas pela fração trombina símile extraída do
veneno da serpente Bothrops insularis, no rim isolado de rato
Foram estudados dois aspectos das alterações renais provocadas pela fração
trombina símile extraída do veneno da serpente Bothrops insularis, no rim isolado
perfundido de rato; as alterações fisiológicas e as alterações histopatológicas.
5.1.2.4.1 Alterações fisiológicas induzidas pela fração trombina símile
extraída do veneno da serpente Bothrops insularis, no rim
isolado de rato
Os rins tratados com a fração trombina símile extraída do veneno da serpente
Bothrops insularis, (BiT) apresentaram intensas e variadas alterações da função
renal no transcorrer do experimento. Observou-se elevação inicial dos parâmetros
vasculares, pressão de perfusão e resistência vascular renal (Tabela 25), dos
padrões funcionais renais, fluxo urinário e ritmo de filtração glomerular, (Tabela 26),
com queda de todos eles ao final. Houve também redução do transporte de
eletrólitos, como o sódio (Tabela 27) e o cloreto (Tabela 28), com aumento inicial do
transporte de potássio (Tabela 29), e aumento inicial do clearance osmótico com
diminuição final (Tabela 30).
127
O grupo em que o rim foi tratado com a trombina símile apresentou um
aumento da pressão de perfusão aos 60 (C
60
=108, 27±4,88; BiT
60
=193,2±7,1
mmHg) que se seguiu de queda ao final do experimento, aos 120 minutos
(C
120
=110,28±3,69; BiT
120
=99,5±4,52 mmHg) (Tabela 25; Figura 60); a resistência
vascular renal aumentou aos 60 minutos (C
60
=5,38±0,51; BiT
60
=9,63±1,28
mmHg/mL.g
-1
.min
-1
), voltando em seguida ao nível basal (Tabela 25; Figura 61); o
fluxo urinário aumentou aos 60 minutos (C
60
=0,158±0,015;BiT
60
=0,307±0,034 mL.g
-1
.
min
-1
) e caiu aos 120 minutos (C
120
=0,160±0,020;BiT
120
=0,039±0,005 mL.g
-1
.min
-1
),
(Tabela 26; Figura 62); o ritmo de filtração glomerular subiu aos 60 minutos
(C
60
=0,707±0,051; BiT
60
=1,839±0,396 mL.g
-1
.min
-1
) e caiu aos 120 minutos
(C
120
=0,697±0,084; BiT
120
=0,151±0,022 mL.g
-1
.min
-1
), (Tabela 26; Figura 63); o
percentual de transporte tubular total de sódio caiu aos 120 minutos (C
120
=79,76
±0,56; BiT
120
=72,63±1,76%) (Tabela 27; Figura 64); o percentual de transporte
proximal de sódio também caiu aos 120 minutos (C
120
=74,94±3,41;
BiT
120
=67,89±3,08%) (Tabela 27; Figura 65); aumentou o transporte total de potássio
no início do experimento (C
60
=69,04±3,68;BiT
60
=75,84±3,02%), (Tabela 28; Figura
66) como também o percentual de potássio proximal transportado, aos 60 minutos
(C
60
=62,71±4,08; BiT
60
=73,80±3,87%), (Tabela 28; Figura 67); diminuiu o percentual
de cloreto tubular total transportado ao final do experimento (C
120
=78,53±2,33;
BiT
120
=74,48±1,08%) (Tabela 29; Figura 68); como também percentual de cloreto
proximal transportado a partir dos 90 minutos até o final, aos 120 minutos
(C
120
=76,36±2,47; BiT
120
=68,74±3,39%) (Tabela 29; Figura 69); o clearance
osmótico aumentou aos 60 min (C
60
=0,12±0,02; BiT
60
=0,26±0,051%) e diminuiu dos
90 aos 120 min (C
120
=0,12±0,02; BiT
120
=0,03±0,01%) (Tabela 30; Figura 70).
128
TABELA 22: Parâmetros vasculares do rim isolado de ratos Wistar (n=6), na
presença da fração trombina símile do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Controle Trombina símile Controle Trombina símile
Tempo
PP (mmHg)
PP (mmHg)
RVR-mmHg/.mL.
g
-1
.min
-1
RVR-mmHg/.mL.
g
-1
.min
-1
min. média e.p.m. média e.p.m. Média e.p.m. média e.p.m.
30 110,11 3,68 108,71 4,14 5,15 0,49 5,56 0,85
60 108,27 4,88 193,21* 7,07 5,38 0,51 9,63* 1,28
90 108,69 5,09 134,87* 8,37 5,36 0,59 6,83 ? 1,06
120 110,28 3,69 99,54* 4,52 5,20 0,47 5,05 0,77
Dados apresentados por média±EPM (p<0,05).*=Diferença estatisticamente significativa para p<0,05.
PP=pressão de perfusão; RVR= resistência vascular renal.
30 60 90 120
0
100
200
300
Controle
Trombina símile
*
*
*
Tempo (minutos)
Pressão de Perfusão
(mmHg)
FIGURA 60: Pressão de perfusão em rim isolado de ratos Wistar (n=6), na presença
da trombina símile do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
30 60 90 120
0
5
10
15
Controle
Trombina símile
*
Tempo (minutos)
Resistência Vascular Renal
(mmHg/mL.g
-1
.min
-1
)
FIGURA 61: Resistência vascular renal em rim isolado de ratos Wistar (n=6), na
presença da trombina símile do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
129
TABELA 23: Parâmetros fisiológicos do rim isolado de ratos Wistar (n=6), na
presença da trombina símile do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Controle Trombina símile Controle Trombina símile
Tempo
F.U.(mL.g
-1
.min
-1
) F.U.(mL.g
-1
.min
-1
) R.F.G.(mL.g
-
.min
-1
) R.F.G.(mL.g
-1
.min
-1
)
min. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m.
30 0,14 0,009 0,13 0,014 0,70 0,07 0,79 0,15
60 0,158 0,015 0,31* 0,034 0,71 0,05 1,84* 0,40
90 0,16 0,024 0,11 0,026 0,63 0,05 0,75 0,24
120 0,16 0,020 0,04* 0,005 0,70 0,08 0,15* 0,02
Dados apresentados por média±EPM (p<0,05).*=Diferença estatisticamente significativa para p<0,05.
FU= fluxo urinário; RFG= ritmo de filtração glomerular.
30.0 60.0 90.0 120.0
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
Controle
Trombina símile
*
*
Tempo (minutos)
Fluxo Urinário
(mL.g
-1
.min
-1
)
FIGURA 62: Fluxo urinário em rim isolado de ratos Wistar (n=6), na presença da
trombina símile do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
30 60 90 120
0
1
2
3
Controle
Trombina símile
*
*
Tempo (minutos)
Ritmo de Filtração
Glonerular (mL.g
-1
.min
-1
)
FIGURA 63: Ritmo de filtração glomerular em rim isolado de ratos Wistar (n=6), na
presença da trombina símile do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
130
TABELA 24: Parâmetros eletrolíticos do rim isolado de ratos Wistar (n=6), na
presença da fração trombina símile do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Controle Trombina símile Controle Trombina símile
Tempo
% T Na
+
% T Na
+
% pT Na
+
% pT Na
+
min. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m.
30 81,94 1,24 82,61 2,75 75,65 1,42 77,68 4,68
60 81,11 1,52 80,17 2,32 74,69 0,99 77,13 3,38
90 79,26 0,90 76,56 4,41 73,84 2,64 71,07 6,78
120 79,76 0,56 72,63* 1,76 74,94 3,41 67,89* 3,08
Dados apresentados por média±EPM (p<0,05).*=Diferença estatisticamente significativa para p<0,05.
%TNa
+
= percentual de transporte total de sódio; %pTNa
+
=percentual de transporte proximal de sódio.
30 60 90 120
0
25
50
75
100
Controle
Trombina símile
*
Tempo (minutos)
%TNa+
FIGURA 64: Percentual de transporte total de sódio em rim isolado de ratos Wistar
(n=6), na presença da trombina símile do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
30 60 90 120
0
25
50
75
100
Controle
Trombina símile
*
Tempo (minutos)
%pTNa+
FIGURA 65: Percentual de transporte proximal de sódio em rim isolado de ratos
Wistar (n=6), na presença da trombina símile do veneno da B. insularis
(10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
131
TABELA 25: Parâmetros eletrolíticos do rim isolado de ratos Wistar (n=6), na
presença da fração trombina símile do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Controle Trombina símile Controle Trombina símile
Tempo
% TK
+
% TK
+
%pTK
+
%pTK
+
min. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m.
30 69,13 4,14 67,37 4,36 64,50 4,74 63,44 5,67
60 69,04 3,68 75,84* 3,02 62,71 4,08 73,80* 3,87
90 71,84 4,21 69,47 5,27 64,27 6,12 64,98 7,36
120 69,94 6,86 71,80 1,49 61,83 5,62 68,06 2,61
Dados apresentados por média±EPM (p<0,05).*=Diferença estatisticamente significativa para p<0,05.
%TK
+
=percentual de transporte total, potássio; %pTK
+
=percentual de transporte proximal de potássio.
30 60 90 120
0
25
50
75
100
Controle
Trombina símile
*
Tempo (minutos)
%TK+
FIGURA 66: Percentual de transporte total de potássio em rim isolado de ratos
Wistar (n=6), na presença da trombina símile do veneno da B. insularis
(10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
30 60 90 120
0
25
50
75
100
Controle
Trombina símile
*
Tempo (minutos)
%pTK+
FIGURA 67: Percentual de transporte proximal de potássio em rim isolado de ratos
Wistar (n=6), na presença da trombina símile do veneno da B. insularis
(10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
132
TABELA 26: Parâmetros eletrolíticos do rim isolado de ratos Wistar (n=6), na
presença da fração trombina símile do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Controle Trombina símile Controle Trombina símile
Tempo
%TCl
-
%TCl
-
%pTCl
-
%pTCl
-
min. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m.
30 79,90 1,03 81,17 2,46 76,81 1,25 75,24 2,33
60 81,25 2,44 76,60 2,59 78,49 2,90 72,56 3,57
90 77,32 2,22 75,54 4,74 76,58 1,20 69,05* 3,11
120 78,53 2,33 74,48* 1,08 76,36 2,47 68,74* 3,39
Dados apresentados por média±EPM (p<0,05).*=Diferença estatisticamente significativa para p<0,05.
%TCl
-
= percentual de transporte total de cloro; %pTCl
-
= percentual de transporte proximal de cloro.
30 60 90 120
0
25
50
75
100
Controle
Trombina símile
*
Tempo (minutos)
%TCl-
FIGURA 68: Percentual de transporte total de cloreto em rim isolado de ratos Wistar
(n=6), na presença da trombina símile do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
30 60 90 120
0
25
50
75
100
Controle
Trombina símile
*
*
Tempo (minutos)
% pT Cl-
FIGURA 69: Percentual de transporte proximal de cloreto em rim isolado de ratos
Wistar (n=6), na presença da trombina símile do veneno da B. insularis
(10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
133
TABELA 27: Parâmetros do clearance osmótico do rim isolado de ratos Wistar
(n=6), na presença da fração trombina símile do veneno da B.
insularis (10μg/mL).
Controle Trombina símile
Tempo
C osm (mL.g
-1
.min
-1
) C osm (mL.g
-1
.min
-1
)
min. média e.p.m. Média e.p.m.
30 0,120 0,02 0,103 0,02
60 0,121 0,02 0,257* 0,05
90 0,142 0,01 0,084* 0,02
120 0,125 0,02 0,032* 0,01
Dados apresentados por média±EPM (p<0,05).*=Diferença estatisticamente significativa para p<0,05.
Cosm= clearance osmótico.
30 60 90 120
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
Controle
Trombina símile
*
*
*
Tempo (minutos)
Clearance osmótico
(mL.g
-1
.min
-1
)
FIGURA 70: Parâmetros do clearance osmótico em rim isolado de ratos Wistar
(n=6), na presença da trombina símile do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
5.1.2.4.2 Alterações histopatológicas renais induzidas pela fração
trombina símile extraída do veneno da serpente Bothrops
insularis, em rim isolado de rato
No grupo controle, os rins apresentavam focos esparsos de degeneração
hidrópico-vacuolar das células de revestimento tubular, discreta deposição
intratubular proximal de material proteináceo; glomérulos, interstício e vasos sem
anormalidades (Tabela 21).
134
FIGURA 71: Fotografia do rim de rato perfundido, ao final do experimento, na
presença da trombina símile do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL). Material proteináceo no espaço de Bowman (A), túbulos
com o mesmo material na luz e balonização do epitélio (B). (HE), (40x).
FIGURA 72: Fotografia do rim de rato perfundido, ao final do experimento, na
presença da trombina símile do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL). Depósitos proteináceos na luz de túbulos proximais (A) e
distais (B), e balonização de células tubulares (C). (HE), (40x).
B
A
C
B
A
135
No grupo tratado com a trombina símile foram observados fenômenos
degenerativos reversíveis representados por balonização hidrópica com
vacuolização citoplasmática extensa e descontinuidade da borda em escova das
células de revestimento tubular proximal (Figura 71); descamação destas células
para a luz tubular; deposição proteinácea acentuada nos túbulos proximais e distais
(Figura 72); acentuado extravasamento de perfusato dos capilares glomerulares com
deposição proteinácea no espaço de Bowman, de aspecto crescêntico (Figura 71).
Algum grau de extravasamento foi observado em 73% dos 97 glomérulos
examinados em 10 campos de grande aumento (40x) por lâmina. Interstício e vasos
normais.
5.1.2.5 Alterações induzidas pela fração fosfolipase A
2
(PLA
2
) extraída do
veneno da serpente Bothrops insularis, no rim isolado de rato
Foram estudados dois aspectos das alterações renais provocadas pela fração
com atividade fosfolipase A
2
extraída do veneno da serpente Bothrops insularis, no
rim isolado perfundido de rato; as alterações fisiológicas e as alterações
histopatológicas.
5.1.2.5.1 Alterações fisiológicas induzidas pela fração com atividade
fosfolipase A
2
(PLA
2
) extraída do veneno da serpente
Bothrops insularis, no rim isolado perfundido de rato
Os efeitos causados nos rins perfundidos pela Fosfolipase A2 extraída do
veneno de Bothrops insularis (BiF) incluem elevação dos parâmetros vasculares
(Tabela 31) e funcionais renais (Tabela 32), do início ao final do experimento. Houve
também queda no transporte de sódio (Tabela 33) e cloreto (Tabela 35), e aumento
na reabsorção de potássio proximal no final do experimento (Tabela 34), com
aumento do clearance osmolar (C osm.) do início ao final do ensaio (Tabela 36).
136
O grupo em que o rim foi tratado com a BiF apresentou um aumento da
pressão de perfusão aos 60 (C
60
=108, 27±4,88; BiF
60
=141,57±3,96mmHg) que se
manteve em menor escala dos 90 até o final do experimento (Tabela 31; Figura 73);
a resistência vascular renal aumentou a partir dos 60 minutos (C
60
=5,00±0,39;
BiF
60
=7,35±0,25 mmHg/mL.g
-1
.min
-1
), mantendo o nível até o final (Tabela 31; Figura
74); o fluxo urinário aumentou de modo crescente a partir dos 60 até os 120 minutos
(C
120
=0,160±0,020; BiF
120
=0,202±0,028mL.g
-1
.min
-1
) (Tabela 32; Figura 75); o ritmo
de filtração glomerular subiu aos 90 minutos (C
90
=0,63±0,05; BiT
90
=1,07±0,24mL.g
-
1
.min
-1
) e manteve-se elevado em menores níveis (Tabela 32; Figura 76); o
percentual de transporte tubular total de sódio caiu aos 60 minutos (C
60
=81,11±1,52;
BiF
60
=75,94±2,59%) e manteve-se baixo (Tabela 33; Figura 77); o transporte
proximal de sódio foi reduzido aos 60 min (C
60
=74,69±0,99; BiF
60
=72,59±1,06%)
(Tabela 33; Figura 78); não variou o transporte total de potássio (Tabela 34; Figura
79), mas aumentou o percentual de potássio proximal transportado aos 120 minutos
(C
120
=61,83±5,62; BiF
120
=70,84±2,67%) (Tabela 34; Figura 80); diminuiu o
percentual de cloreto total transportado do início ao final do experimento
(C
120
=78,53±2,33; BiF
120
=70,97±2,86%) (Tabela 35; Figura 81); como também
diminuiu o percentual de cloreto proximal transportado a partir dos 60 minutos
(C
60
=78,49±2,90; BiF
60
=68,23±2,03%) (Tabela 35; Figura 82); o clearance osmótico
aumentou a partir dos 60 min até o final (C
120
=0,125±0,020; BiF
120
=0,195±0,052
mL.g
-1
.min
-1
) (Tabela 36; Figura 83).
137
TABELA 28: Parâmetros vasculares do rim isolado de ratos Wistar (n=6), na
presença da fração fosfolipase A
2
do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Controle PLA
2
Controle PLA
2
Tempo
PP (mmHg)
PP (mmHg)
RVR(mmHg/.mL.
g
-1
.min
-1
)
RVR(mmHg/.mL.
g
-1
.min
-1
)
min. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m.
30 110,11 3,68 107,82 1,18 5,15 0,49 5,64 0,24
60 108,27 4,88 141,57* 3,96 5,38 0,51 7,35* 0,25
90 108,69 5,09 141,07* 1,42 5,36 0,59 7,36* 0,27
120 110,28 3,69 134,23* 5,49 5,20 0,47 7,09* 0,53
Dados apresentados por média±EPM (p<0,05).*=Diferença estatisticamente significativa para p<0,05.
PP= pressão de perfusão; RVR= resistência vascular renal.
30 60 90 120
0
50
100
150
Controle
Fosfolipase A2
*
*
*
Tempo (minutos)
Pressão de Perfusão
(mmHg)
FIGURA 73: Pressão de perfusão em rim isolado de ratos Wistar (n=6), na presença
da fosfolipase A
2
do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
30 60 90 120
0.0
2.5
5.0
7.5
Controle
Fosfolipase A2
*
*
*
Tempo (minutos)
Resistencia Vascular Renal
(mmHg/mL.g
-1
.min
-1
)
FIGURA 74: Resistência vascular renal em rim isolado de ratos Wistar (n=6), na
presença da fosfolipase A
2
do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
138
TABELA 29: Parâmetros fisiológicos do rim isolado de ratos Wistar (n=6), na
presença da fração fosfolipase A
2
, do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Controle PLA
2
Controle PLA
2
Tempo
F.U.(mL.g
-1
.min
-1
)
F.U.(mL.g
-1
.min
-1
) R.F.G.(mL.g
-1
.min
-1
) R.F.G.(mL.g
-1
.min
-1
)
min. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m.
30 0,139 0,009 0,148 0,008 0,70 0,07 0,77 0,05
60 0,158 0,015 0,188* 0,010 0,71 0,05 0,73 0,07
90 0,164 0,024 0,203* 0,019 0,63 0,05 1,07* 0,24
120 0,160 0,020 0,202* 0,028 0,70 0,08 0,90* 0,05
Dados apresentados por média±EPM (p<0,05).*=Diferença estatisticamente significativa para p<0,05.
FU= fluxo urinário; RFG= ritmo de filtração glomerular.
30 60 90 120
0.0
0.1
0.2
0.3
Controle
Fosfolipase A2
*
*
*
Tempo (minutos)
Fluxo Urinário
(mL.g
-1
.min
-1
)
FIGURA 75: Fluxo urinário em rim isolado de ratos Wistar (n=6), na presença da
fosfolipase A
2
do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
30 60 90 120
0.0
0.5
1.0
1.5
Controle
Fosfolipase A2
*
*
Tempo (minutos)
Ritmo de Filtração
Glomerular (mL.g
-1
.min
-1
)
FIGURA 76: Ritmo de filtração glomerular em rim isolado de ratos Wistar (n=6), na
presença da fosfolipase A
2
do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
139
TABELA 30: Parâmetros eletrolíticos do rim isolado de ratos Wistar (n=6), na
presença da fração fosfolipase A
2
do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Controle PLA
2
Controle PLA
2
Tempo
% T Na
+
% T Na+
% pT Na
+
% pT Na
+
Min. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m.
30 81,94 1,24 81,84 2,13 75,65 1,42 76,47 1,98
60 81,11 1,52 75,94* 2,59 74,69 0,99 72,59* 1,06
90 79,26 0,90 78,21 2,46 73,84 2,64 74,98 2,51
120 79,76 0,56 76,68* 2,18 74,94 3,41 73,59 2,26
Dados apresentados por média±EPM (p<0,05).*=Diferença estatisticamente significativa para p<0,05.
%TNa
+
= percentual de transporte total de sódio; %pTNa
+
=percentual de transporte proximal de sódio.
30 60 90 120
0
25
50
75
100
Controle
Fosfolipase A2
*
*
Tempo (minutos)
%TNa+
FIGURA 77: Percentual de transporte total de sódio em rim isolado de ratos Wistar
(n=6), na presença da fosfolipase A
2
do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
30 60 90 120
0
25
50
75
100
Controle
Fosfolipase A2
*
Tempo (minutos)
%pTNa+
FIGURA 78: Percentual de transporte proximal de sódio em rim isolado de ratos
Wistar (n=6), na presença da fosfolipase A
2
do veneno da B. insularis
10μg/mL.
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
140
TABELA 31: Parâmetros eletrolíticos do rim isolado de ratos Wistar (n=6), na
presença da fração fosfolipase A
2
do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Controle PLA
2
Controle PLA
2
Tempo
% TK
+
% T K
+
%pTK
+
%pTK
+
min. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m.
30 69,13 4,14 66,43 3,60 64,50 4,74 65,05 3,28
60 69,04 5,68 64,29 3,19 62,71 4,08 62,94 3,08
90 71,84 4,21 72,83 2,80 64,27 6,12 71,60 2,94
120 69,94 6,86 71,93 2,59 61,83 5,62 70,84* 2,67
Dados apresentados por média±EPM (p<0,05).*=Diferença estatisticamente significativa para p<0,05.
%TK
+
=percentual de transporte total, potássio; %pTK
+
=percentual de transporte proximal de potássio.
30 60 90 120
0
25
50
75
100
Controle
Fosfolipase A2
Tempo (minutos)
%TK+
FIGURA 79: Percentual de transporte total de potássio em rim isolado de ratos
Wistar (n=6), na presença da fosfolipase A
2
do veneno da B. insularis
10μg/mL.
Dados em média ± EPM (p<0,05).
30 60 90 120
0
25
50
75
Controle
Fosfolipase A2
*
Tempo (minutos)
%pTK+
FIGURA 80: Percentual de transporte proximal de potássio em rim isolado de ratos
Wistar (n=6), na presença da fosfolipase A
2
do veneno da B. insularis
(10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
141
TABELA 32: Parâmetros eletrolíticos do rim isolado de ratos Wistar (n=6), na
presença da fração fosfolipase A
2
do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Controle PLA
2
Controle PLA
2
Tempo
%TCl
-
%TCl
-
%pTCl
-
%pTCl
-
min. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m.
30 79,90 1,03 78,42 2,41 76,81 1,25 74,29 1,88
60 81,25 2,44 72,00* 2,79 78,49 2,90 68,23* 2,03
90 77,32 2,22 74,71 2,93 76,58 1,20 71,40 1,26
120 78,53 2,33 70,97* 2,86 76,36 2,47 69,88* 1,94
Dados apresentados por média±EPM (p<0,05).*=Diferença estatisticamente significativa para p<0,05.
%TCl-= percentual de transporte total de cloro; %pTCl-= percentual de transporte proximal de cloro.
30 60 90 120
0
25
50
75
100
Controle
Fosfolipase A2
*
*
Tempo (minutos)
%TCl-
FIGURA 81: Percentual de transporte total de cloreto em rim isolado de ratos Wistar
(n=6), na presença da fosfolipase A
2
do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
30 60 90 120
0
25
50
75
100
Controle
Fosfolipase A2
*
*
Tempo (minutos)
% pT Cl-
FIGURA 82: Percentual de transporte proximal de cloreto em rim isolado de ratos
Wistar (n=6), na presença da fosfolipase A
2
do veneno da B. insularis
(10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
142
TABELA 33: Parâmetros do clearance osmótico do rim isolado de ratos Wistar
(n=6), na presença da fosfolipase A
2
do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Controle PLA
2
Tempo
C osm (mL.g
-1
.min
-1
) C osm (mL.g
-1
.min
-1
)
min. Média e.p.m. média e.p.m.
30 0,120 0,02 0,136 0,02
60 0,121 0,02 0,179* 0,02
90 0,142 0,01 0,192* 0,03
120 0,125 0,02 0,195* 0,05
Dados apresentados por média±EPM (p<0,05).*=Diferença estatisticamente significativa para p<0,05.
Cosm= clearance osmótico.
30 60 90 120
0.0
0.1
0.2
0.3
Controle
Fosfolipase A2
*
*
*
Tempo (minutos)
Clearance osmótico
(mL.g
-1
.min
-1
)
FIGURA 83: Parâmetros do clearance osmótico em rim isolado de ratos Wistar
(n=6), na presença da fosfolipase A
2
do veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL).
Dados em média ± EPM (p<0,05). * = diferença estatisticamente significativa do controle.
5.1.2.5.2 Alterações histopatológicas renais induzidas pela fração
com atividade fosfolipase A
2
(PLA
2
) extraída do veneno da
serpente Bothrops insularis, em rim isolado de rato
No grupo controle, os rins apresentavam focos esparsos de degeneração
hidrópico-vacuolar das células de revestimento tubular, discreta deposição
intratubular proximal de material proteináceo; glomérulos, interstício e vasos sem
anormalidades (Figura 17).
143
No grupo tratado com a fração fosfolipase A
2
extraída do veneno da Bothrops
insularis foram observados áreas focais de necrose tubular aguda na cortical (Figura
84); fenômenos degenerativos reversíveis representados por balonização hidrópica
com vacuolização citoplasmática extensa das células de revestimento tubular e
descontinuidade da borda em escova; descamação necrótica destas células para a
luz tubular (Figura 85); deposição proteinácea acentuada nos túbulos proximais e
distais; acentuado extravasamento de perfusato dos capilares glomerulares com
deposição proteinácea no espaço de Bowman dos glomérulos de aspecto
crescêntico (Figura 85). Algum grau de extravasamento foi observado em 46,61%
dos 118 glomérulos contados em 10 campos de grande aumento (40x) por lâmina.
Interstício e vasos normais.
FIGURA 84: Fotografia do rim de rato perfundido, ao final do experimento, na
presença da fosfolipase A
2
do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
(A) Focos de necrose tubular aguda. (HE), (40x).
A
144
FIGURA 85: Fotografia do rim de rato perfundido, ao final do experimento, na
presença da fosfolipase A
2
do veneno da Bothrops insularis (10μg/mL).
(A) Espaço de Bowman e túbulos com material proteináceo (B); (C)
balonização de células tubulares. (HE), (40x).
5.2 Efeitos do Veneno da Bothrops insularis no Leito Vascular Sistêmico
Foram observados os efeitos fisiológicos relacionados à pressão arterial e
histopatológicos no coração, pulmões, rins, fígado e intestino, do veneno da
Bothrops insularis injetado no leito vascular cítrico, in vivo.
5.2.1 Alterações fisiológicas sistêmicas do veneno
Foi observada uma forte reação hipotensiva que cresceu com o aumento da
dose aplicada, sendo parcialmente recuperada, após cada queda, por efeito
compensatório do animal (Tabela 37; Figura 86, 87). A exceção foi a dose de 10μg
que não aumentou significativamente a pressão arterial.
O controle foi obtido com a injeção de solução salina e aferição da pressão
arterial no início dos experimentos (Figura 87). Dois dos seis animais foram a óbito
antes da aplicação da última dose, de 300μg do veneno.
C
A
B
145
TABELA 34: Comportamento da pressão arterial sistêmica média com variação das
doses de veneno bruto da Bothrops insularis aplicadas sistemicamente
em ratos Wistar (n=6).
Animal Salina 1µg Rec 3µg Rec 10µg Rec 30µg Rec 100µg Rec 300µg Rec
Rato 01 128 120 124 40 106 66 110 26 52 0
Rato 02 128 108 124 92 130 104 126 92 116 78 94 62 80
Rato 03 87 67 85 73 94 70 97 73 100 70 103 55 103
Rato 04 102 92 100 90 102 92 104 82 102 82 100 78
Rato 05 118 100 112 100 108 101 106 100 109 94 106 80
Rato 06 111 56 106 46 87 15 96 44 87 74 85
Média 112 90 108 74 105 75 106 70 94 66 98 69 92
B. Rec = Base de recuperação do nível pressórico após o efeito do veneno.
Salina = Pressão arterial após o uso de solução salina
0
20
40
60
80
100
120
Salina
1mcg
B. Rec
3mcg
B. Rec
10
m
c
g
B. Rec
3
0m
c
g
B.
R
ec
10
0
mcg
B.
R
ec
30
0
mcg
B
.
R
ec
Doses (
μ
g) e Recuperação
Pressão Arterial (mmHg)
FIGURA 86: Pressão arterial média dos ratos com doses do veneno da B. insularis.
Rec = recuperação do nível pressórico. Salina = Pressão arterial após o uso de solução salina.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Basal Salina 1mcg 3mcg 10mcg 30mcg 100mcg 300mcg
Pressão Arterial (mmHg)
*
*
*
*
FIGURA 87: Queda da pressão arterial média com doses do veneno da B. insularis.
Dados em média ± EPM (p<0,05). *= diferença estatisticamente significativa entre os grupos.
146
5.2.2 Alterações histopatológicas sistêmicas do veneno
Observou-se acentuada congestão generalizada, de grandes e pequenos
vasos, afetando principalmente o coração, fígado, intestino, rins e pulmões (Figura
88, 89, 90, 91, 92, 93). No fígado se observava esteatose em microgotas (Figura 90).
Havia focos de hemorragia intersticial nos rins (Figura 92). Nos pulmões houve
hemorragia intra-alveolar difusa, com acúmulo de células inflamatórias
polimorfonucleares e linfocitárias principalmente ao redor de bronquíolos (Figura 94).
Alguns dos alvéolos e bronquíolos estavam rotos e preenchidos de hemorragia
(Figura 95). A hemorragia pulmonar era observada macroscopicamente (Figura 96).
Os órgãos do grupo controle não apresentavam alterações.
FIGURA 88: Fotografia do coração de rato na presença de veneno da Bothrops
insularis em circulação sistêmica (1, 3, 10, 30, 100 e 300µg/mL), ao
final do experimento. (A) Congestão vascular. (HE), (40x).
A
147
FIGURA 89: Fotografia do fígado de rato na presença de veneno da B. insularis em
circulação sistêmica (1, 3, 10, 30, 100 e 300µg/mL), ao final do
experimento. Congestão de vênula (A) e arteríola porta (B). (HE), (40x).
FIGURA 90: Fotografia do fígado de rato na presença de veneno da B. insularis em
circulação sistêmica (1, 3, 10, 30, 100 e 300µg/mL), ao final do
experimento. (A) Veia centrolobular congesta, (B) esteatose em
microgotas. (HE), (40x).
A
B
A
B
148
FIGURA 91: Fotografia do intestino de rato na presença de veneno da Bothrops
insularis em circulação sistêmica (1, 3, 10, 30, 100 e 300µg/mL), ao
final do experimento. (A) Congestão vascular. (HE), (40x).
FIGURA 92: Fotografia do rim de rato na presença de veneno da Bothrops insularis
em circulação sistêmica (1, 3, 10, 30, 100 e 300µg/mL), ao final do
experimento. (A) Congestão vascular e hemorragia intersticial focal (B).
(HE), (20x).
A
A
B
149
FIGURA 93: Fotografia do pulmão de rato na presença de veneno da Bothrops
insularis em circulação sistêmica (1, 3, 10, 30, 100 e 300µg/mL), ao
final do experimento. (A) Congestão de grandes vasos e capilares
intersticiais (B). (HE), (40x).
FIGURA 94: Fotografia do pulmão de rato na presença de veneno da Bothrops
insularis em circulação sistêmica (1, 3, 10, 30, 100 e 300µg/mL), ao
final do experimento. (A) Congestão de pequenos vasos, (B)
hemorragia e (C) infiltrado linfopolimorfonuclear. (HE), (40x).
A
B
B
C
A
150
FIGURA 95: Fotografia do pulmão de rato na presença de veneno da Bothrops
insularis em circulação sistêmica (1, 3, 10, 30, 100 e 300µg/mL), ao
final do experimento. (A) Intensa hemorragia difusa
bronquioloalveolar. (HE), (40x).
FIGURA 96: Fotografia do pulmão de rato na presença de veneno da Bothrops
insularis em circulação sistêmica (1, 3, 10, 30, 100 e 300µg/mL), ao
final do experimento. Hemorragia macroscópica.
A
151
5.3 Efeitos do Veneno da Bothrops insularis no Leito Vascular Mesentérico
5.3.1 Alterações fisiológicas do veneno no leito vascular mesentérico
O veneno da Bothrops insularis (BiV, 100μg/mL/min) induziu uma redução
significativa [109,10 ± 5,104 mmHg* (*p<0,05)] na pressão de perfusão do leito
vascular mesentérico pré-contraído com fenilefrina [139,60 ± 7,153 mmHg (*p<0,05)]
do sistema obtida com a infusão de fenilefrina (5 μM/mL/min). Isoladamente o
veneno [30,63 ± 2,248 mmHg* (*p<0,05)] produziu uma redução significativa em
ralação ao controle [38,00 ± 0,2783 mmHg (*p<0,05)], [(pressão basal de
estabilização do leito), (Tabela 38, 39; Figura 97, 98)].
A pressão de perfusão basal do leito mesentérico foi elevada de uma média
38,00 mmHg para 139,60 mmHg, após a administração de fenilefrina,
correspondendo a uma elevação de 367,37% (Tabela 38; Figura 97).
A pressão de perfusão máxima obtida com a fenilefrina foi de 163,5 mmHg,
que estabilizou em 137,5 mmHg, a pressão submáxima obtida com a aplicação da
fenilefrina na qual foi administrado conjuntamente o veneno, correspondendo a
84,09% da pressão arterial máxima (Anexo C).
A pressão de perfusão sofreu elevação média provocada pela fenilefrina para
139,60 mmHg e foi diminuída quando a fenilefrina foi associada ao veneno para
109,10 mmHg, correspondendo a uma redução de 21,84% (Tabela 38; Figura 97).
Os valores da pressão de perfusão variaram da média de 139,6 mmHg, após
a infusão da fenilefrina, para 30,63 mmHg com a infusão do veneno isoladamente.
Esta diminuição corresponde a aproximadamente 78,05 % da contração média
produzida pela fenilefrina (Tabela 38; Figura 97).
O controle apresentou uma pressão de perfusão média de 38,00 mmHg, que
diminuiu para 30,63 mmHg com a injeção do veneno isoladamente, correspondendo
a uma redução de 19,39 % (Tabela 38; Figura 97).
Aleatoriamente, em um dos experimentos foi readministrada fenilefrina após o
final da avaliação, constatando-se a integridade do leito vascular cuja resposta á
fenilefrina mostrou nova elevação da pressão de perfusão.
152
TABELA 35: Pressão de leito mesentérico em ratos tratados (n=6), exclusivamente
com Fenilefrina (5 μM); com o veneno de Bothrops insularis (BiV,
10μg/mL/min) e fenilefrina (5 μM); e somente com o veneno
(10μg/mL/min).
Drogas Resultados
Pressão basal (controle)
38,00 ± 0,2789
Fenilefrina (5 μM) 139,60 ± 7,153
a
Fenilefrina (5 μM)+BiV (10μg/mL/min) 109,10 ± 5,104
b
BiV (10μg/Ml/min) 30,63 ± 2,248
a,b,c
Resultados expressos em Média ± EPM.
a = p<0,05 em relação à pressão basal; b = p<0,05 em relação a fenilefrina; a,b,c = p<0,05 em
relação ao controle, à fenilefrina, à fenilefrina com o veneno.
Controle Fenilefrina Fenilefrina+BiV Veneno (BiV)
0
50
100
150
*c
*a
*b
Pressão de Perfusão
(mmHg)
FIGURA 97: Ação do veneno da B. insularis no leito mesentérico de ratos (n=6),
(BiV, 10μg/mL/min), com redução significativa da pressão de perfusão
basal.
Resultados expressos em Média ± EPM.
*a = p<0,05 em relação à pressão basal; *b = p<0,05 em relação a fenilefrina; *c = p<0,05 em relação
ao controle e à fenilefrina com o veneno.
TABELA 36: Alterações da pressão arterial mesentérica em ratos tratados (n = 6),
exclusivamente com Fenilefrina (5 μM); com o veneno de Bothrops
insularis (BiV, 10μg/mL/min) e com Fenilefrina (5 μM); e somente com
o veneno (10g/mL/min).
Drogas Pressão Arterial
Fenilefrina (5μM)
↑
Fenilefrina (5μM)+BiV (10μg/mL/min)
↓
BiV (10μg/mL/min)
↓↓
153
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
36
38
40
42
44
46
48
50
52
54
56
58
60
62
64
66
68
70
72
74
76
78
80
Basal Fenilefrina Fenilefrina + Veneno
insularis (BiV)
Veneno insularis (BiV)
Pressão de Perfusão (mmHg)
FIGURA 98: Traçado da perfusão de leito vascular mesentérico isolado de rato,
obtido após infusão de Fenilefrina (5μM/mL/min); de Fenilefrina
(5μM/mL/min) e o veneno da Bothrops insularis (BiV, 10μg/mL/min);
e somente com o veneno da Bothrops insularis (BiV, 10μg/mL/min).
5.3.2 Alterações histopatológicas do veneno no leito mesentérico
Não foram observadas alterações macroscópicas no tecido periférico ao leito
mesentérico perfundido (Figura 99).
Microscopicamente os vasos apresentavam as células adiposas, células de
revestimento endotelial e musculatura lisa vascular, também sem alterações
evidentes ao microscópio óptico (Figura 100, 101).
O grupo controle não apresentava alterações.
154
FIGURA 99: Mesentério de rato na presença de veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL/min), ao final do experimento. Macroscopia..
FIGURA 100: Mesentério de rato na presença de veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL/min), ao fim do experimento. Adipócitos e artéria
mesentérica preservados. (20x).
A
155
FIGURA 101: Mesentério de rato na presença de veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL/min), ao final do experimento. Tecido adiposo preservado
(A). (40x).
A
156
DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
157
6 DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
6.1 Efeitos no Rim Isolado de Rato
O veneno e as diversas frações estudadas apresentaram respostas
características próprias que estão referidas separadamente. A fração trombina símile
participou com o maior aumento da permeabilidade, deixando extravasar material
proteináceo em um número maior de glomérulos (73% dos glomérulos), (Tabela 5, 6;
Figura 18). A fração lectina provocou necrose tubular aguda em maior extensão
(Tabela 5; Figura 45). É provável que parte expressiva destas ações tenha decorrido
da liberação de mediadores pelas células renais, estimuladas pelo veneno ou
frações que foram perfundidas (Tabela 40).
TABELA 37: Prováveis mediadores liberados pelas células renais na presença das
frações estudadas, no início e no final de cada experimento.
Fração do Veneno
Mediadores Iniciais Mediadores Finais
Lectina
• Tromboxano A2.
• Fator de Ativação Plaquetário
(PAF)
– Alta dose
• Óxido Nítrico
• Purinas
– Guanosina
L-Aminoácido Oxidase
(LAAO)
• Peróxido de hidrogênio
– Óxido Nítrico
• Óxido Nítrico
• Purinas
– Guanosina
Trombina símile
• Receptores ativados por
proteinases
– RAP 1
• Proteinoquinase C
• Bradicinina
• Óxido nítrico
Fosfolipase A2
• Tromboxano A2
• Fator de Ativação Plaquetária –
(PAF)
– Alta dose
• Endotelina
• Fator de Ativação Plaquetária –
(PAF)
– Baixa dose
• Efeitos do veneno no rim isolado de rato
Os efeitos causados pelo veneno de Bothrops insularis sugerem a sua
nefrotoxicidade direta em rim isolado de rato, com redução de todos os parâmetros
funcionais renais analisados. Houve queda nos parâmetros vasculares, pressão de
perfusão e resistência vascular renal (Tabela 7; Figura 19, 20); nos parâmetros
158
funcionais renais, fluxo urinário e ritmo de filtração glomerular (Tabela 8; Figura 21,
22); nos parâmetros eletrolíticos relativos ao transporte de sódio e do cloreto (Tabela
9,11; Figura 23, 24, 27), sem alteração significativa no de potássio (Tabela 10;
Figura 25, 26) , além de queda no clearance osmótico (Tabela 12; Figura 29).
Segundo Sitprija e Chaiyabutr (1999), os efeitos renais no envenenamento
ofídico decorreriam de coagulação intravascular disseminada, de ação nefrotóxica
direta pela ação proteolítica do veneno, ou de espasmos dos vasos renais
decorrente da liberação de substâncias vasoativas. Monteiro e Fonteles, 1999,
testaram o veneno da Bothrops jararaca em sistema de rim isolado de rato,
observando diminuição da pressão de perfusão, do fluxo urinário, do ritmo de
filtração glomerular e do percentual de transporte tubular de sódio, potássio e do
clearance osmótico, sugerindo a participação do PAF nestes efeitos, já que sua
inibição específica por triazolobenzodiazepina (WEB 2086) bloqueava estas
alterações. Havt et al., 2001, trabalhando com o veneno da Bothrops jararacussu no
mesmo sistema, também constataram a diminuição da pressão de perfusão e da
resistência vascular renal, do fluxo urinário e do ritmo de filtração glomerular, com
reversão dos efeitos no fluxo urinário e do ritmo de filtração glomerular ao final do
experimento.
Barbosa e et al., 2002, compararam os efeitos do veneno da Bothrops
moojeni com algumas de suas frações e observaram resultados muito diferentes. O
veneno completo apresentou-se com as mesmas características dos venenos
Bothrops em geral, mas as frações fosfolipase A2 demonstraram alguns efeitos
opostos, sugerindo que o conjunto das frações resulta num somatório das atividades
com efeitos mais complexos.
Havt et al., 2005, demonstraram que o veneno da Bothrops pirajai
apresentava as mesmas respostas que uma lectina, dele extraída, com redução de
todos os parâmetros renais, vasculares funcionais renais e na reabsorção de
eletrólitos como o sódio, o cloreto e o potássio, estudados no sistema de rim isolado
de rato. As respostas eram semelhantes as de outros venenos botrópicos
previamente analisados pelo mesmo sistema de rim isolado de rato (BARBOSA et
al., 2002; HAVT et al., 2001; MONTEIRO; FONTELES, 1999). Eles propuseram que
provavelmente os resultados decorriam da liberação de mediadores inflamatórios
159
liberados por células endoteliais e mesangiais, estimuladas pelo veneno e seus
componentes.
Em nosso trabalho o veneno da B. insularis, produziu uma queda em todos os
parâmetros renais avaliados, compatível com os estudos anteriormente citados,
sem, entretanto, qualquer reversão dos parâmetros ao final do experimento (Tabela
4). Os potenciadores da bradicinina presentes nos venenos Bothrops, já bem
estudados por Ferreira (1992), que influenciam na produção renal de bradicinina
seguida da de óxido nítrico, explicariam esta queda. O veneno, em nosso estudo,
também apresentou respostas diferentes daquelas observadas quando testamos
suas frações com atividade fosfolipase e trombina símile. O resultado de sua
atividade se assemelhou mais aos efeitos produzidos pela fração com atividade L-
aminoácido oxidase e lectina (Tabela 4). È provável que sua atividade decorra de
efeito tóxico direto sobre as células renais (SITPRIJA; CHAIYABUTR, 1999), levando
a um quadro de insuficiência renal aguda (KUMAR; ABBAS; FAUSTO et al., 2004),
com parada do funcionamento da reabsorção de eletrólitos pelas células tubulares e
relaxamento das células musculares lisas dos vasos, compatível com o achado
histopatológico de necrose tubular aguda [(Tabela 5; Figura 31), (D’ABREU, 1996;
DA CRUZ HOFLING et al., 2001)].
• Achados histopatológicos com o veneno
O veneno da Bothrops insularis, neste trabalho, alterou a arquitetura renal
provocando focos de necrose tubular aguda, provavelmente por toxicidade direta
dele ou de suas frações (Figura 31). As alterações renais do tipo necrose tubular,
afetando principalmente os túbulos contornados proximais, já foram descritas como
resultantes da atividade do veneno da Bothrops insularis, como também
vacuolização e irregularidades na borda em escova das células de revestimento
destes túbulos (D’ABREU, 1996; DA CRUZ HOFLING et al., 2001). A necrose
tubular aguda é uma lesão irreversível do epitélio tubular renal (ALPERS, 2005) com
duas etiologias potenciais. A isquemia, nos casos de insuficiência circulatória renal
como a que ocorre no choque hipovolêmico pela diminuição do fluxo sanguíneo
renal; e a lesão tóxica direta do epitélio de revestimento tubular, no caso de
intoxicações químicas, como nos envenenamentos (KUMAR; ABBAS; FAUSTO,
160
2005). No presente caso a lesão direta pela toxicidade do veneno teria determinado
a morte do epitélio.
Os fenômenos degenerativos representados por balonização hidrópico-
vacuolar extensa das células de revestimento tubular são lesões reversíveis que
refletem as fases iniciais da agressão tóxica do veneno, que culminou com a
necrose tubular aguda (Figura 30). Podem decorrer de desequilíbrio eletrolítico e
hemodinâmico, observado nas fases iniciais do choque hipovolêmico (ORDÓNES;
ROSAI, 2004). A discreta deposição intratubular de material proteináceo decorreu da
lesão epitelial tubular que provocou o acúmulo de proteína liberada do citoplasma
das células lesadas, juntamente com resíduos citoplasmáticos (Figura 31). Não
foram encontrados os achados referidos por Resende (1989) a respeito de
hemorragia e infiltrado leucocitário glomerular com deposição de fibrina, os quais,
provavelmente, decorreram do maior tempo de exposição ao veneno nos casos de
acidentes ofídicos, ou resultaram da deposição de hemácias, células inflamatórias e
fibrina no espaço urinário (AUNG-KHIN, 1978), células e material que não estão
presentes no sistema de perfusão de rim isolado. O veneno não provocou
extravasamento proteináceo para o espaço de Bowman, não influenciando a
permeabilidade capilar glomerular (Tabela 6; Figura 18).
• Efeito da fração lectina no rim isolado de rato
Os rins tratados com a fração lectina apresentaram uma resposta marcante,
porém variada. Os parâmetros vasculares, pressão de perfusão e resistência
vascular renal sofreram uma elevação inicial, embora está última não tenha
apresentado significância estatística, com queda posterior (Tabela 13; Figura 32,
37); os parâmetros funcionais renais, fluxo urinário e ritmo de filtração glomerular
caíram progressivamente (Tabela 14; Figura 34, 35). Houve aumento da reabsorção
eletrólitos como o sódio, e o potássio (Tabela 15, 16; Figura 36, 37, 38, 39). A
reabsorção do cloreto não se alterou significativamente (Tabela 17; Figura 40, 41), e
diminuiu o clearance osmótico (Tabela 18; Figura 42).
Lectinas do tipo-C mostram atividades contra fatores de coagulação (IX, X,
VWF), inibição da agregação plaquetária e da trombina, afetando a homeostase e
161
trombose (OGAWA et al., 2005). São heterodímeros constituídos de subunidades
idênticas α e β. A família das lectinas do tipo C, dos venenos das serpentes, possui
características biológicas muito variáveis, apesar de manterem uma estrutura
primária bem conservada, com domínios de reconhecimento de carboidrato
homólogos ás verdadeiras lectinas do tipo C (DRICKAMER, 1999).
Havt et al., 2005, demonstraram que a lectina extraída do veneno da serpente
B. pirajai induzia redução significativa na pressão de perfusão, da resistência
vascular renal, no fluxo urinário, e no ritmo de filtração glomerular, no rim isolado de
rato. Eles propuseram que estes resultados provavelmente se deviam à liberação de
mediadores produzidos pelas células endoteliais e mesangiais estimuladas pela
lectina. Por outro lado, como estes resultados eram semelhantes aos produzidos
pelo veneno da B. pirajai, eles acreditaram que a lectina era a fração mais influente
nos efeitos renais, embora sugiram que a lectina possa alterar parâmetros
dependentes do aumento da permeabilidade, como o fluxo urinário e a taxa de
filtração glomerular, através de mecanismos diferentes. Entretanto, ao tentar
potencializar a atividade da bradicinina na contração do íleo de cobaia com a lectina
não obtiveram resultado, o que acontecia no controle em que testava captopril.
Também a lectina não afetava a pressão de perfusão basal ou pré-contraída de
artéria mesentérica isolada.
Trabalhos recentes demonstraram que lectinas de plantas e animais podem
promover a liberação de mediadores inflamatórios (ALENCAR et al., 1999;
ASSREUY et al., 2002). Havt et al., 2003, trabalhando com lectinas vegetais no
mesmo sistema, observaram a elevação da pressão de perfusão, da resistência
vascular renal, que sugeriu serem conseqüentes à liberação de eicosanóides de
atividade vasoconstritora como o tromboxane A
2,
ou outros fatores endoteliais
vasoativos, pois foram bloqueados pela indometacina. Em estudo mais detalhado,
Barraviera, et al., 1995, observou que pacientes picados por serpentes podem
liberar prostaglandinas, citocínas, bradicinina, frações de complemento, e fator de
ativação plaquetária (PAF). Todas estas substâncias podem ser também liberadas
pelas células renais (HAVT et al., 2001; KOEPPEN; STANTON, 1997). Neste
sentido, prostaglandinas renais poderiam interferir também no transporte tubular de
sódio, potássio e cloreto, promovido pela lectina (HAVT et al., 2005). Os
162
eicosanóides renais representam um papel importante autoregulador na função renal
modificando a hemodinâmica e fisiologia glomerular e tubular (FOEGH, et al., 1998).
Em nosso trabalho a perfusão do rim com a solução de Krebs-Henseleit, sem
plasma, exclui a atividade descrita das lectinas relacionadas à hemaglutinação,
inibição da trombina ou de fatores da coagulação. Como os parâmetros vasculares
sofreram uma rápida elevação inicial com queda posterior e os parâmetros
funcionais renais caíram progressivamente, é provável que as a lectina testada
apresente outras características ainda não esclarecidas, como a agressão tóxica
direta [(Tabela 4), (DE CARVALHO et al., 2001; KASSAB et al., 2004)].
Diferentemente do trabalho de Havt et al., 2005 com a lectina da Bothrops pirajai, os
resultados observados com a lectina da Bothrops insularis não foram os mesmos
daqueles com o veneno, exceto no final. Entretanto, o aumento inicial nos
parâmetros vasculares poderia ser decorrente da estimulação das células
mesangiais e endoteliais pela lectina, com liberação de eicosanóides
vasoconstritores como o Tromboxane A
2
, seguido da liberação de vasodilatadores
como a bradicinina ou outros derivados eicosanóides como prostaglandinas, ou do
fator de ativação plaquetário (PAF) que em baixas doses tem efeito vasodilatador,
todos capazes de diminuir a pressão vascular e de perfusão renal. O aumento da
reabsorção de eletrólitos, com conseqüente diminuição do clearance osmótico
(Tabela 4), poderia decorrer da ativação da bomba de Na
+
/K
+
/Cl
-
, em um efeito
inverso ao descrito por Teixeira et al. (2001) para proteínas vegetais. A maior
reabsorção de eletrólitos carrearia água e levaria à redução do filtrado. O potássio,
excretado em troca do NaCl, retornaria passivamente devido à grande
permeabilidade das células tubulares a este íon (GUYTON, 2002).
Até o momento, entretanto, não existem provas determinantes de quais
mediadores estão envolvidos nestas alterações.
• Achados histopatológicos com a lectina
Os achados histopatológicos provocados pela ação da lectina revelaram
alteração da arquitetura renal, com diversos focos de necrose tubular aguda e
deposição proteinácea no espaço de Bowman, devido a extravasamento de
perfusato dos capilares glomerulares (Tabela 5, 6; Figura 43, 45). A atividade lectina,
163
ou seja, de proteína que se liga a açucares, é característica de algumas proteínas de
adesão celular a outras células e à matriz extracelular (KUMAR; ABBAS; FAUSTO,
2005). É o caso das selectinas, importantes na adesão e migração leucocitária nos
de mamíferos, as quais se ligam pelo seu domínio lectina a oligossacarídeos
sializados, como o sializado de Lewis X, que por sua vez estão ligados
covalentemente a outras glicoproteínas de receptores de membrana. Dentre as
selectinas a E-selectina (CD62E, previamente denominada ELAM-1) é tipicamente
expressa no endotélio. Juntamente com as integrinas, outras glicoproteínas, como a
laminina e fibronectina, expressas na superfície celular possibilitam a ligação entre
células endoteliais e a glicoproteínas da membrana basal. Sua expressão é
estimulada por certas citocínas proinflamatórias, e sendo as integrinas capazes de
alterar a conformação do citoesqueleto com contração celular, ampliando os poros
juncionais intercelulares do endotélio, uma das alterações do endotélio relacionadas
ao aumento da permeabilidade vascular na inflamação aguda (RANG et al., 2004).
Marcinkiewicz et al. (2000) isolaram uma lectina do veneno de Echis
multisquamatus, um potente e seletivo inibidor da integrina alpha2beta1 (α2β1). A
lectina ainda poderia substituir as ligações de oligossacarídeos ou polissacarídeos
como proteoglicanos, às glicoproteínas de adesão da superfície celular, deixando as
células livres de suas ligações intercelulares, ampliando novamente os poros
intercelulares, o que permitiria o extravasamento do perfusato para a cápsula de
Bowman. Outro mecanismo de aumento da permeabilidade é a injúria direta ao
endotélio, já bem caracterizada pela lectina do veneno da Bothrops jararacussu (DE
CARVALHO et al., 2001; KASSAB et al., 2004), permitindo também o
extravasamento de albumina do perfusato para o espaço de Bowman. Monteiro e
Fonteles (1999) sugeriram a ação do Fator de Ativação Plaquetária (PAF) no
aumento da filtração glomerular e no fluxo urinário em sistema idêntico de rim
isolado, o qual poderia ser liberado pelas células endoteliais lesadas. Kassab et al.
(2004) demonstraram que as lectinas dos venenos das serpentes são citotóxicas
para algumas linhagens de células endoteliais e estas sob estresse podem produzir
PAF (BALESTRIERI et al., 2004), que por sua vez aumenta a permeabilidade às
moléculas plasmáticas, incluindo albumina (HANDLEY et al., 1984), provavelmente
por ativação direta das células endoteliais da microvasculatura (VICTORINO;
NEWTON; CURRAN, 2004). Uma lectina do veneno da Bothrops jararaca, a
164
bothrojaracin (BJC), inibe a trombina por se ligar ionicamente aos seus sítios I e II,
através dos quais ela exerce sua função de agregação plaquetária e quebra do
fibrinogênio (AROCAS et al., 1996; ZINGALI et al., 1993). Possivelmente estes
mesmos sítios são aqueles capazes de ativar a produção de PAF pelo endotélio,
agindo a lectina como substituto da trombina nesta sua ação específica (RANG et
al., 2004). As lectinas também podem agir como anticoagulantes com atividade
antitrombina, atividade esta inexistente no sistema perfundido sem sangue como
este.
Os fenômenos celulares degenerativos, representados em nosso estudo por
núcleos de cromatina condensada característicos da moderada necrose tubular
aguda, foram bem visíveis, e refletem a citotoxicidade direta da lectina, já descrita
por alguns autores para certas linhagens celulares tumorais [(Figura 45), (DE
CARVALHO et al., 2001)]. Ela participou com maior intensidade no potencial
citotóxico do veneno, provocando necrose tubular aguda em maior extensão (+++),
embora apenas tardiamente tenha provocado alterações fisiológicas sugestiva de
redução da função renal (Tabela 4, 5; Figura 45). Esta citotoxicidade pode ter
contribuído para o extravasamento proteináceo glomerular, como resultado de
agressão endotelial e aumento da permeabilidade dos capilares glomerulares
(Tabela 6; Figura 18, 43). A balonização hidrópica por vacuolização extensa com
descontinuidade da borda em escova das células de revestimento tubular e a
descamação destas células para a luz tubular sinais reversíveis de sofrimento
celular, foram observados em maior intensidade do que quando ocorreram nas
outras frações estudadas, demonstrando o potencial lesivo inicial da lectina (Figura
44). Também foram vistas nos controles, porém em menor intensidade e limitadas à
camada cortical do rim.
• Efeito da fração L-aminoácido oxidase no rim isolado de rato
Os rins tratados com a fração L-aminoácido-oxidase extraída do veneno da
serpente Bothrops insularis, apresentaram intensas alterações da função renal
(Tabela 4). Os parâmetros vasculares e funcionais renais sofreram uma redução
importante e precoce, sendo o fluxo urinário reduzido desde a primeira avaliação,
aos 60 minutos (Tabela 19, 20; Figura 46, 47, 48, 49). Todos os eletrólitos
165
apresentaram redução na reabsorção. O sódio total e proximal no final, juntamente
com o cloreto e o potássio que sofreu redução significativa a partir dos 90 minutos
(Tabela 21,22,23; Figura 50, 51, 52, 53, 54, 55). O clearance osmótico foi reduzido
desde o início do experimento, embora de modo significativo apenas depois dos 90
minutos (Tabela 24; Figura 56).
As L-aminoácido oxidases (LAAOs) são flavoenzimas que catalisam a
desaminação estereoespecífica de um substrato L-aminoácido, capazes de atuar na
ativação de plaquetas, na citotoxicidade por indução de apoptose e de provocar
hemorragia (DU, CLEMETSON, 2002). Nos venenos crotálicos elas se associam
especificamente às células endoteliais de mamíferos, induzindo apoptose (SUHR;
KIM, 1996). Com relação à função plaquetária seu efeito tem sido descrito como
dúbio, porém este efeito seria através da produção de peróxido de hidrogênio
(H
2
O
2
), inibindo a interação de uma integrina (GPIIb/IIIa), expressa na superfície da
plaqueta ativada, com o fibrinogênio. Outros autores observaram a ativação da
agregação plaquetária humana (ALI et al., 2000) ação também relacionada ao H
2
O
2
.
A LAAO induz a agregação plaquetária pela produção de peróxido de hidrogênio,
que por sua vez aumenta a produção de Tromboxane A
2
dependente de cálcio (DU;
CLEMETSON, 2002), fato pouco expressivo neste sistema desprovido de plaquetas.
As LAAOs são também capazes de promover a hipotensão pela ativação da
guanilato ciclase solúvel e ativação da cGMP na presença de peróxido de hidrogênio
e superóxido dismutase (AIRD, 2002), atuando cGMP no relaxamento da
musculatura lisa (RANG et al., 2004), em vasos com ou sem endotélio (MARCZIN;
RYAN; CATRAVAS, 1992; SCHMIDT et al., 1992). O peróxido de hidrogênio pode
ativar a óxido nítrico sintetase gerando óxido nítrico através da L-arginina, o qual se
difunde através da membrana celular e ativa a guanilato ciclase solúvel (AIRD, 2002)
ou atuar diretamente na produção de óxido nítrico (MITTAL, 1993; KIM et al., 1998).
A indução da apoptose pelas LAAOs está relacionada a células do endotélio
vascular (SUHR, KIM, 1996; TORII et al., 1997), envolvendo também a produção de
peróxido de hidrogênio. Muitas evidências sugerem que é desencadeada pelo
mecanismo celular oxidativo, já que os agentes que a promovem são oxidantes ou
estimulantes deste mecanismo (DU, CLEMETSON, 2002). O peróxido de hidrogênio
induz a expressão de Fas em células endoteliais, através de uma proteína
tirosinoquinase. Fas é uma proteína de membrana da família dos receptores do fator
166
de necrose tumoral e do fator de crescimento neural, mediadores da morte celular, e
media a apoptose induzida pelo peróxido de hidrogênio (SUHARA et al., 1998). O
H
2
O
2
aumenta ainda a atividade da caspase 3, uma cisteína protease, bem
reconhecida na indução da morte celular (DIPIETRANTONIO et al., 1999), fato que
embora não esteja diretamente relacionado com a atividade das LAAOs, reforça o
envolvimento do H
2
O
2
no mecanismo da apoptose. As condições patológicas
resultando em lesão celular com liberação de altos níveis de purinas podem
provocar apoptose (RALEVIC; BURNSTOCK, 1998). A guanosina provavelmente
contribui com a hipotensão que ocorre nos envenenamento ofídicos pelo aumento
do cGMP no endotélio vascular (AIRD, 2002). As L-aminoácido oxidases podem
liberar leucina que acelera a atividade de proteases quimiotripsinas-símiles
endógenas, colaborando com as metaloproteases dos venenos em sua ação
proteolítica (AIRD, 2002). A função primária das LAAOs é provavelmente promover
hipotensão pela ativação de guanilato ciclase solúvel, na presença de superóxido
dismutase, e seu potencial apoptótico, nos venenos das serpentes, tem mais função
digestiva do que de captura (AIRD, 2002).
Exclusivamente as células endoteliais, mesangiais, e tubulares no rim isolado
de rato, sofrem a ação do peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
), ou de purinas, já que não
há circulação de plaquetas neste sistema. Elas são aptas também, a partir de lesão
celular com conseqüente liberação de radicais livres do oxigênio, a liberar derivados
do ácido aracdônico, neste caso prostaciclina (PGI
2
), pois são ricas em prostaciclina
sintetase. A prostaciclina é um potente vasodilatador, agindo ainda sinergicamente
com outros vasodilatadores inflamatórios, como a bradicinina e a histamina, e
promove a natriurese inibindo a reabsorção tubular de sódio (RANG et al., 2004).
Causa aumento da permeabilidade capilar, embora esta ação seja descrita como
indireta, resultante da potencialização dos efeitos de mediadores como a bradicinina
e a histamina. Dentre outros efeitos biológicos, Ali et al., 2000, estudando as LAAOs
com o modelo da pata de rato, observou a formação de edema pronunciado após
uma hora da injeção de LAAO do veneno da E. macmahoni. É possível, portanto,
que a vasodilatação e o extravasamento proteináceo decorram da liberação de
prostaciclina, histamina e bradicinina, nas células renais (PIROTZKY et al., 1984),
em contacto com peróxido de hidrogênio ou com purinas (AIRD, 2002).
167
Desta maneira, ainda que em nosso estudo não se possa precisar o mais
influente, a produção de prostaciclina, histamina, bradicinina, ou óxido nítrico,
estimulada pela liberação de peróxido de hidrogênio provocada pela LAAO, ou a
atividade de purinas como a guanosina, a leucina, ou da guanilato ciclase solúvel na
presença da superóxido dismutase, liberadas pelas células apoptóticas, podem ser
responsabilizadas pela vasodilatação arteriolar. Esta provocou queda nos
parâmetros circulatórios avaliados, a pressão de perfusão e a resistência vascular
renal, com conseqüente redução do fluxo urinário e do ritmo de filtração glomerular
devido à passagem direta do perfusato nos vasos dilatados, sem produzir o filtrado
urinário (Tabela 4)..
A apoptose de células tubulares provavelmente produziu a acentuada
redução na reabsorção de eletrólitos. Com a manutenção da queda da filtração
glomerular, foi observada a queda subseqüente do clearance osmótico. Dentre as
frações estudadas a LAAO foi a que apresentou um efeito mais próximo daquele
produzido pelo veneno, sugerindo que seja a sua atividade promotora da apoptose a
maior responsável pela atividade tóxica do veneno da B. insularis (Tabela 4).
• Achados histopatológicos com a L-aminoácido oxidase
Na histopatologia foram observados fenômenos degenerativos representados
por núcleos de cromatina condensada em apoptose; balonização hidrópica por
vacuolização extensa das células de revestimento tubular; descamação destas
células para a luz tubular; deposição proteinácea moderada nos túbulos proximais
(Figura 58); extravasamento de perfusato dos capilares glomerulares com deposição
proteinácea no espaço de Bowman dos glomérulos, apresentando formato de
aspecto em crescente (Figura 59). Algum grau de extravasamento foi observado em
40% dos 108 glomérulos contados em 10 campos de grande aumento (40x) por
lâmina (Tabela 6; Figura 18, 59). O interstício e os vasos estavam normais.
A avaliação histopatologia reflete o aumento da permeabilidade, com o
extravasamento de proteínas, observado no espaço de Bowman, e daí para os
túbulos, que provavelmente resultou da lesão endotelial pelo estímulo à apoptose ou
da atividade de mediadores liberados, como prostaciclina, histamina, bradicinina, ou
o óxido nítrico.
168
A apoptose com núcleos picnóticos foi bem evidenciada, como descrita na
literatura, podendo se confundir morfologicamente com o aspecto da necrose tubular
aguda [(Figura 57), (SUHR, KIM, 1996; TORII et al., 1997)]. As áreas observadas
com necrose tubular aguda de moderada intensidade com núcleos de cromatina
condensada refletem o estímulo à apoptose desencadeado pelas LAAOs (Figura
61a), bem como os sinais reversíveis de sofrimento celular, um passo inicial da
morte celular apoptose, como a balonização pela vacuolização citoplasmática e
descontinuidade da borda em escova com descamação de células de revestimento
tubular proximais e distais para a luz, que também foram vistas nos controles, porém
em menor intensidade e limitadas à cortical (Figura 17, 58). Todos estes sinais foram
descritos por Aird (2002) como característicos da função digestiva das LAAOs, que
resulta da sua ligação direta com a superfície celular (SUHR, KIM, 1996) e liberação
de peróxido de hidrogênio (TORII et al., 1997).
• Efeito da fração trombina símile no rim isolado de rato
Os rins tratados com a fração trombina símile extraída do veneno da serpente
Bothrops insularis, apresentaram alterações variadas na função renal ao final do
experimento. Observou-se elevação inicial dos valores pressóricos, pressão de
perfusão e resistência vascular renal, dos funcionais renais, fluxo urinário e ritmo de
filtração glomerular, com queda no final (Tabela 25, 26; Figura 60, 61, 62, 63). Houve
também queda final no transporte de eletrólitos, como o sódio e o cloreto (Tabela 27,
29; Figura 64, 65, 68, 69), com aumento inicial do transporte de potássio (Tabela 28;
Figura 66, 67), e aumento inicial do clearance osmótico com diminuição final (Tabela
30; Figura 70).
CASTRO e et al., em revisão de 2004 sobre as frações com atividade
semelhantes à trombina (trombina símile), mostram que elas apresentam outras
atividades biológicas totalmente diferentes daquelas características da família. Cita o
exemplo da LM-TL do veneno da Laquesis muta, composta de um polipeptídio de
cadeia única, produz em camundongos opstótomo e rolamentos convulsivos em
torno do eixo longitudinal dos animais. Curiosamente uma serinoprotease homóloga,
expressa no sistema nervoso de mamíferos, denominada neuropsina, está envolvida
em epileptogênese leve e na plasticidade hipocampal. Ela tem relações estruturais
169
com tripsina e com o fator de crescimento de nervo gama, um membro da família
calicreína. De forma semelhante à LM-TL, a neuropsina forma pontes dissulfídricas
correspondendo àquelas formadas pela tripsina, e seus sítios ativos são também
restritos a pequenos resíduos de prolina no substrato. Há uma superposição da sua
estrutura cristalizada com a da LM-TL. Alguns neuropeptídios podem contribuir para
a chamada inflamação neurogênica, produzindo, às vezes, contração muscular lisa,
como as taquicininas (substância P e neurocinina) (HOLZER, 1988), outras vezes
vasodilatação, como na ação do peptídeo relacionado à calcitonina (RANG et al.,
2004), promovendo a liberação de oxido nítrico e histamina (KOSTIZA et al., 1995;
KOSTIZA; MÉIER, 1996).
Os componentes da família trombina símile promovem a liberação de cininas
a partir do cininogênio plasmático, geralmente a bradicinina, produzindo hipotensão
(MATSUI et al., 2000; KOMORI; NIKAI, 1997; MARKLAND, et al., 1982; PETRETSKI
et al., 2000; KOMORI et al., 2001; SERRANO et al., 1998). É bem conhecida a
presença de calicreína em tecidos tais como o pâncreas, as glândulas salivares, a
pele e o cólon, capaz de provocar a proteólise do cininogênio gerando bradicinina
(GRIESBACHER et al., 2003; PETRAKI; KARAVANA; DIAMANDIS, 2003;
KOMATSU, et al., 2005; BARTNIK, 2003).
Katori e Majima, 2003, demonstraram que os túbulos renais distais são
capazes de produzir todos os componentes do sistema cinina-calicreína,
independentemente do sistema cinina-calicreína plasmático, e que este sistema
tecidual ativado induz natriurese e diurese. Além disso o rim é um rico produtor de
endotelina, cujos níveis circulantes podem ser aumentados por estímulo da trombina
(SOROKIN; KOHAN, 2003).
A ação da bradicinina se processa através da geração de óxido nítrico,
prostaglandina (PGI
2
), provocando vasodilatação, agindo a calicreína tecidual como
importante controle do fluxo sanguíneo para certas glândulas. Provoca aumento da
permeabilidade vascular e estimula o transporte de íons e a secreção de líquidos em
vários epitélios, incluindo o do intestino, vias aéreas e da vesícula biliar (RANG et al.,
2004).
Bagate e et al. (2001), demonstraram a atividade vasodilatadora em rim
isolado de rato, produzida por mecanismos envolvendo o receptor B(2), das cininas,
ligada a atividade de canais de potássio ativados no endotélio que Quilley e Qiu
170
(2005), revelaram ser independente da ação do oxido nítrico e prostaglandinas. São
receptores de uma categoria abrangente e pertencentes à família dos receptores
acoplados à proteína G.
Em alguns tecidos a bradicinina é espasmogênica para o músculo liso,
incluindo aquele do intestino e o do útero (CALIXTO, 1995).
Existe uma variedade de forças atuando na monocamada endotelial, cujo
somatório determina o dinâmico equilíbrio entre a manutenção de sua integridade e
sua responsividade. De um lado as forças que mantêm as células unidas entre se,
como as caderinas e moléculas de adesão à membrana basal, e as forças que
atuam na tensão centrípeta, contraindo a musculatura vascular lisa, primariamente
via fosforilação das miosinas de cadeia leve. O efeito da trombina na indução da
ativação da quinase da miosina de cadeia leve é dependente da proteólise do
receptor, da mobilização do cálcio, e da ativação da proteinoquinase C. A formação
de poros entre na monocamada, evento central na permeabilidade vascular,
depende por sua vez da ativação das quinases que fosforilizam a miosina de cadeia
leve, um evento obrigatório na contração da musculatura lisa vascular (GARCIA;
VERIN; SCHAPHORST, 1996). A contração muscular lisa também pode ser
provocada pelas as taquicininas (substância P e neurocinina), pertencentes à família
das cininas (DE SCHEPPER et al., 2005; QUINN; COLLINS; BAIRD, 2004).
Glusa et al, 1996, já mostraram que em vasos com endotélio desnudo a
trombina e peptídios ativadores dos receptores da trombina produzem respostas
contráteis dependentes da concentração, associadas com o aumento da produção
de trifosfato de inositol e da ativação da proteína quinase C (KUTZ; PAINTZ;
GLUSA, 1998). No endotélio intacto ambos induzem relaxamento mediado por óxido
nítrico. São efeitos vasculares opostos determinados pela trombina, em receptores
diferentes (KU; ZALESKI, 1973).
Receptores ativados por proteinases (RAPs), uma classe de receptores
acoplados a proteína G, são ativados pela proteólise e exposição da seqüência NH
2
terminal de proteínas, que age como ligante e ativador deste receptor (DERY et al.,
1998; HOLLENBERG; COMPTON, 2002; MACFARLANE et al., 2001). Foram
clonados quatro membros desta família de receptores, mas apenas RAPs 1, 3, e 4
são ativados pela trombina. Embora PARs 1, e 4 sejam capazes de gerar sinais
171
intracelulares após a ativação proteolítica, RAP3 apesar de não sinalizar age como
cofator da ativação do RAP4 (HOLLENBERG; COMPTON, 2002).
Os rins expressam em abundância o RAP1 em camundongos e em humanos,
com localização detectada nas células vasculares e tubulares (GUI;
LOUTZENHISER; HOLLENBERG, 2003). O papel funcional do RAP1 na fisiologia
renal foi sugerido, em trabalhos recentes, como tendo um papel importante na
inflamação renal (CUNNINGHAM et al., 2000), demonstrando o impacto da sua
ativação na função vascular periférica (HOLLENBERG et al., 1993, TESFAMARIAM,
1994a; TESFAMARIAM, 1994b).
Gui et al., 2003, utilizando o método do rim isolado de rato, demonstraram
que RAP1 causava vasoconstrição renal e diminuição do ritmo de filtração
glomerular RFG, mediando a resposta da trombina. Nós observamos resultados
similares com a trombina símile da Bothrops insularis, fato que sugere a participação
de RAP1 neste efeito.
Outros trabalhos relacionam a produção de endotelina à ação da trombina
(SOROKIN; KOHAN, 2003). A endotelina é um vasoconstritor potente, produzido
por células mesangiais e tubulares renais. Age produzindo efeito autócrino e
parácrino e tem meia vida curta devido ao estoque celular limitado. Os receptores da
endotelina são membros da família de receptores acoplados à proteína G, e os do
tipo 1 (ET1) são os mais encontrados nas células mesangiais. Ao serem estimulados
são capazes de modular uma variedade de cascatas intracelulares, regulando a
produção de cicloxigenases, tirosinoquinases, e óxido nítrico sintetase. Seu
mecanismo de ação envolve a ativação de fosfolipase C, e proteinoquinase C, com
resultante aumento da troca de sódio por hidrogênio. Em baixas concentrações a
endotelina causa aumento lento da concentração intracelular de cálcio a partir de
influxo pelos canais de cálcio voltagem dependente. Em altas concentrações há um
aumento rápido e transitório a partir dos estoques intracelulares. O resultado é a
contração rápida das células mesangiais (SOROKIN; KOHAN, 2003).
Desta forma, a ativação de receptores RAP1, ou a liberação de endotelina
estimulados pela trombina símile, pode ter sido responsável pela rápida elevação
inicial da pressão de perfusão e da resistência vascular renal (Tabela 25; Figura 60,
61).
172
Paralelamente a liberação de bradicinina, sobreposta em seu efeito
vasodilatador pela endotelina ou receptores RAP1, aumentou a permeabilidade
vascular com o aumento do fluxo urinário e do ritmo de filtração glomerular,
observados em nosso estudo (Tabela 26; Figura 62, 63). Posteriormente, após o
consumo do estoque de endotelina, seria liberada em toda a sua extensão a
atividade da bradicinina, com a produção de óxido nítrico relaxamento destas células
e queda dos níveis pressóricos, com o perfusato passando livremente pelos vasos
glomerulares, determinando queda no ritmo de filtração glomerular e fluxo urinário
(Tabela 4). A reabsorção de sódio e de cloreto foi reduzida no final do experimento,
possivelmente devido à atividade da bradicinina, cujos receptores relacionados, B2,
possuem atividade natriurética (KATORI; MAJIMA, 2003), como também pela
redução do filtrado urinário (Tabela 27; Figura 64, 65). A reabsorção tubular, total e
proximal, de potássio aumentou, possivelmente por reabsorção dependente da Na+-
K+ ATPase, que reabsorveu potássio em troca da excreção de sódio (Tabela 28;
Figura 66, 67). A diminuição do fluxo urinário e do ritmo de filtração glomerular
trouxe como conseqüência a diminuição do clearance osmótico, que havia
aumentado inicialmente, acompanhando este parâmetro (Tabela 30; Figura 70).
Desta forma podemos sugerir que, partir de nossos experimentos, houve uma
vasoconstrição inicial, decorrente da atividade vasoconstritora produzida pela
trombina símile do veneno da B. insularis. Embora não possamos afirmar quais
mediadores operam este mecanismo, é provável que seja conseqüência da ação
direta da trombina símile nos receptores ativados por proteinases (RAP1), ou por
mediadores produzidos e liberados pelas células endoteliais e mesangiais
estimuladas pela trombina símile. Compreendem substâncias da mesma família da
trombina símile, como as taquicininas, ou mesmo de endotelina, que tem
fisiologicamente sua produção estimulada pela trombina, levando à elevação dos
parâmetros vasculares, como a pressão de perfusão e a resistência vascular renal.
O aumento do fluxo urinário e do ritmo de filtração glomerular seria decorrente do
maior extravasamento do filtrado pelos poros das células endoteliais devido ao efeito
inicial de mediadores inflamatórios que aumentam a permeabilidade, como a
bradicinina. Em seguida, com o esgotamento do pequeno estoque intracelular de
endotelina (SOROKIN; KOHAN, 2003), prevaleceu a ação estimulatória ao endotélio
para a produção de bradicinina, com efeito parácrino sobre as paredes vasculares,
173
liberação da produção de óxido nítrico, e conseqüente vasodilatação (BAGATE et
al., 2001), resultando na inversão de todos os valores, com queda dos níveis
pressóricos e da formação de urina (Tabela 4).
O aumento inicial da formação de urina produziu o aumento da reabsorção de
potássio por difusão passiva devido à grande permeabilidade das faces basolaterais
das células epiteliais tubulares, independente da bomba de sódio-potássio ATPase
(GUYTON, 2002). No final, com a diminuição do filtrado urinário e o efeito
natriurético da bradicinina (KATORI; MAJIMA, 2003), ocorreu diminuição da
reabsorção de sódio e de cloreto, que foi carreado junto com o sódio, voltando o
potássio aos níveis normais de exceção (Tabela 4).
O aumento inicial da reabsorção de potássio, por sua vez, leva à elevação
dos níveis de potássio intersticial, que pode ter contribuído com a vasodilatação
observada ao final do experimento, como demonstraram Quilley e Qiu (2005). Os
níveis de potássio elevados promovem vasodilatação de maneira independente da
intermediação de vasodilatadores como o óxido nítrico ou prostaglandinas, mas por
hiperpolarização das células endoteliais devido à ativação de canais de cálcio.
• Achados histopatológicos com a trombina símile
Na histopatologia observou-se intensa deposição proteinácea nos túbulos
proximais, distais e canais coletores; degeneração hidrópica por vacuolização
citoplasmática e descontinuidade da borda em escova das células tubulares
proximais (Figura 72); acentuado extravasamento de perfusato dos capilares
glomerulares com deposição proteinácea no espaço de Bowman dos glomérulos,
com aspecto em crescente (Figura 71). Praticamente não se observou necrose
tubular aguda com a fração trombina símile (Tabela 5);.
O achado histopatológico de deposição proteinácea na cápsula de Bowman
reflete bem a elevação da permeabilidade vascular nos capilares glomerulares,
decorrente da liberação de bradicinina pelas células endoteliais, permitindo o
extravasamento de proteínas (BAGATE et al., 2001), com conseqüente acúmulo nos
túbulos distais e canais coletores. Foi a fração onde se observou maior
extravasamento proteináceo para o espaço urinário (73,19%) e túbulos distais,
174
provavelmente em decorrência de liberação de mediadores que provocam aumento
da permeabilidade capilar glomerular (Tabela 6; Figura 18).
Os sinais de sofrimento celular reversível como degeneração hidrópica por
vacuolização citoplasmática e descontinuidade da borda em escova, das células
tubulares proximais, também foram vistos nos controles e eram discretos e limitados
à cortical (Figura 72).
• Efeito da fração fosfolipase A
2
(PLA
2
) no rim isolado de rato
Os efeitos causados nos rins perfundidos pela Fosfolipase A2 extraída do
veneno de Bothrops insularis foram marcantes e incluem elevação dos valores
pressóricos e funcionais renais, do início ao final do experimento (Tabela 4; 31, 32;
Figura 73, 74, 75, 76). Houve também queda no transporte sódio e de cloreto
(Tabela 33, 35; Figura 77, 78, 81, 82), desde o início, e aumento na reabsorção de
potássio proximal no final (Tabela 34; Figura 79, 80) com aumento do clearance
osmolar do início ao final do experimento (Tabela 36; Figura 73).
Cogo e et al. (1998) isolaram uma fração fosfolipase A
2
do veneno da
Bothrops insularis que apresentava atividade na placa neural. Esta atividade se
caracterizava por uma contração muscular inicial seguida de inibição completa da
condução neuromuscular, com completa e rápida despolarização dose dependente,
que sugeriram estar relacionada com alterações cinéticas dos canais de potássio.
Havt et al., 2001, estudaram a atividade do veneno da serpente Bothrops
jararacussu e a inibição de sua atividade fosfolipase A
2
no rim isolado de rato e
constataram uma diminuição na pressão de perfusão e na resistência vascular renal,
queda no transporte tubular total de sódio e de potássio, e no final do experimento
um aumento na taxa de filtração glomerular e no fluxo urinário. Eles relacionaram a
alteração nos parâmetros funcionais renais (fluxo urinário e ritmo de filtração
glomerular) e no transporte de potássio, à produção do fator de ativação plaquetária
(PAF). A diminuição na pressão de perfusão e na resistência vascular renal
relacionaram à produção de bradicinina e conseqüente liberação de NO pelo
endotélio, potencializada por fatores potenciadores de bradicinina anteriormente
descritos por Ferreira et al. (1970). O óxido nítrico também estimularia o aumento na
taxa de filtração glomerular e no fluxo urinário, (KOEPPEN, STANTON, 1997).
175
Propuseram ainda que o veneno da B. jararacussu teria fatores natriuréticos para
justificar um aumento da diurese, observado no intenso aumento no ritmo de filtração
glomerular, no fluxo urinário e na eliminação de sódio, independentes dos
parâmetros vasculares, já que ocorria uma queda na pressão de perfusão e
resistência vascular renal. Observaram ainda que a PLA
2
deste veneno não possuía
atividade enzimática, pois sua ação não era inibida por corticosteróides, propondo
que teria atividade exclusivamente miotóxica (citotóxica).
Utilizando exclusivamente a fração PLA2, Barbosa et al. (2002) obtiveram
resultados semelhantes aos nossos. Observaram que PLA2, com Lys-49, do veneno
da B. moojeni, ocorreu um aumento na pressão de perfusão, resistência vascular
renal, fluxo urinário, ritmo de filtração glomerular, e percentual de potássio
transportado, com decréscimo do transporte de sódio e cloreto, ao contrário do
veneno completo que provocava queda nos parâmetros vasculares renais, com
aumento no fluxo urinário e ritmo de filtração glomerular. Propôs que a região C
terminal rica em lisina desta PLA2, seria a indutora da atividade tóxica por agressão
direta à membrana celular, podendo estimular a liberação de vasoconstritores,
liberados por estímulos agressores diretos independentemente de atividade
enzimática como ocorre com muitas PLA2 com Lys-49 de veneno de serpentes
(LOMONTE; ÂNGULO; CALDERÓN, 2003). A atividade enzimática das PLA2 Asp-
49, como a utilizada em nosso estudo, produzindo derivados do ácido aracdônico,
como a prostaglandina F
2α
(PGF
2α,
), o Tromboxane A
2
(TXA
2
) e o fator de ativação
plaquetária (PAF) que têm ação vasoconstritora, e fisiologicamente promovem
redução do fluxo sanguíneo renal e da taxa de filtração glomerular e do fluxo urinário
(BYDLOWSKI, 2000). No sistema de rim isolado de rato utilizado, porém, o fluxo do
perfusato é mantido constante devido o permanente bombeamento, transitando sob
maior pressão nos capilares glomerulares e produzindo maior filtrado em
decorrência da pressão vascular aumentada e da atividade de prostaglandinas
aumentando a permeabilidade; o resultado é um aumento no ritmo de filtração
glomerular e no fluxo urinário.
Estudando uma fosfolipase A
2
extraída da Bothrops jararacussu, também uma
Asp49, Barbosa et al. (2005), observaram efeitos muito parecidos. Houve redução
dos parâmetros vasculares, pressão de perfusão, resistência vascular renal, e
funcionais renais, ritmo de filtração glomerular e fluxo urinário, com diminuição do
176
transporte tubular de sódio e potássio. Estes efeitos foram bloqueados apenas
parcialmente pela indometacina, sugerindo uma atividade parcial enzimática, através
da liberação de mediadores inflamatórios derivados da cicloxigenase. Eles sugeriram
que os outros efeitos não bloqueados poderiam decorrer da atividade da porção C-
terminal da fosfolipase. Foi observada ainda a atividade antibacteriana desta Asp49,
com destruição de membrana e parede celular do microrganismo estudado,
Xanthomonas axonopodis, que sob seu efeito apresentava perda e desorganização
de elementos citoplasmáticos, à microscopia eletrônica.
Rigden et al. (2003) registraram atividade mionecrótica em uma fosfolipase A2
do tipo Asp49 extraída da Bothrops pirajai, PrTx-III, que apresenta atividade
catalítica na porção N-terminal. Desta forma, a agressão sobre as membranas das
células endoteliais ou mesangiais desencadearia a produção de vasoconstritores
como a endotelina. Entretanto, a atividade enzimática não bloqueada pela
indometacina poderia decorrer da atuação de outros derivados do ácido aracdônico
como os liberados pela lipoxigenase, o tromboxano A
2
ou o fator de ativação
plaquetária (PAF).
Monteiro e Fonteles (1999) descreveram o envolvimento do fator de ativação
plaquetária (PAF) na mediação dos efeitos do veneno da Bothrops jararaca no
sistema de rim isolado de ratos. Eles mostraram que antagonistas de receptores do
PAF, como a triazolobenzodiazepina (WEB 2086) e um componente natural da
Ginko biloba, BN 52021, bloqueavam os efeitos do veneno nos parâmetros do fluxo
urinário e no ritmo de filtração glomerular.
O PAF deriva de seu precursor lisogliceril-fosforilcolina (liso-PAF) liberado
pela fosfolipase A
2
dos fosfolipídios da membrana celular, podendo ele mesmo ativar
a fosfolipase A
2
com conseqüente produção de eicosanóides (RANG et al., 2004).
Em doses baixas produz vasodilatação e aumento da permeabilidade vascular,
enquanto que em doses mais elevadas produz hiperalgesia liberação de tromboxane
A2 e leocotrienos, com atividade espasmogênica na musculatura lisa (RANG et al.,
2004). Pirotzky et al. (1984) demonstraram que o rim isolado de rato produz
substâncias como histamina, serotonina e o fator de ativação plaquetária (PAF).
O veneno da B. jararaca reduzia o fluxo urinário, a pressão de perfusão, o
ritmo de filtração glomerular e o transporte de sódio e potássio, com redução
também no clearance osmolar (MONTEIRO; FONTELES, 1999). Os bloqueadores
177
de PAF e a indometacina, um inibidor da cicloxigenase (HIGGS; VANE, 1983),
anulavam os efeitos do veneno no fluxo urinário e no ritmo de filtração glomerular
sem afetar a atividade do veneno na pressão de perfusão e transporte de íons,
mostrando a participação do PAF e de outros fatores dependentes da cicloxigenase,
como as prostaglandinas e o tromboxano A
2
, nas alterações provocadas pelo
veneno (MONTEIRO; FONTELES, 1999).
Em nosso estudo a fosfolipase A
2
do veneno da Bothrops insularis apresentou
com elevação dos parâmetros renais vasculares e fisiológicos funcionais renais,
além de aumento da reabsorção de potássio, com a redução no transporte de sódio
(Tabela 4). Estes efeitos variados na atividade dos venenos botrópicos revelam a
atuação de um conjunto de substâncias influindo na sua resposta, sendo possível
que a fosfolipase A2 do veneno da Bothrops insularis contribua com atividade
enzimática na produção do PAF e tromboxano A
2
em maior quantidade que resultou
em constrição da musculatura lisa vascular e elevação dos valores pressóricos e da
resistência vascular renal, paralelamente à produção de outros fatores que
aumentaram o transporte de potássio.
Outro candidato a promotor desta atividade vasoconstritora é a endotelina, um
fator vasoconstritor produzido por células endoteliais descrito por Hickey et al. em
1985, com três isoformas, cujo subtipo endotelina 1 (ET1) é encontrada
particularmente nos rins, em células endoteliais (MASAKI, 1993). É liberada a partir
de estímulos como trombina, plaquetas ativadas, angiotensina II, arginina-
vasopressina, adrenalina, tromboxane A
2
, hipóxia, estresse de cisalhamento e
endotoxinas (ASAKURA et al., 2005). Age como mediador parácrino, embora possa
também estimular a produção de hormônios como a adrenalina aldosterona e o
peptídeo atrial natriurético (RANG et al., 2004). A endotelina ativa receptores de
membrana acoplados à proteína G, cujo RNA mensageiro é expressos nos rins,
especialmente nas células mesangiais (SOROKIN; KOHAN, 2003). Os receptores do
tipo ET
A
estão presentes, principalmente, no músculo liso vascular e mediam
funções como vasoconstrição, mutagênese, secreção de aldosterona e a troca de
sódio por potássio, estando acoplados à fosfolipase C. Os receptores ET
B
tem o
RNA mensageiro expresso nos rins e é altamente expresso nas células endoteliais,
sendo também encontrado nas células musculares lisas vasculares. Agonistas de
receptores ET
B
foram encontrados em venenos de áspedes e foram subdivididos em
178
duas categorias; ET
B1
presente no endotélio e ET
B2
presente no músculo liso
vascular. Os do tipo, ET
B1
provocam vasodilatação ao aumentar o cálcio intracelular
das células endoteliais o qual, juntamente com a calmodulina, ativa a oxido nítrico
sintetase e a fosfolipase A
2
, com conseqüente aumento de ON e prostaglandinas
(PGI
2
), (RANG et al., 2004).
Os receptores ET
B2
mediam respostas vasoconstritoras de modo semelhante
aos referidos para o ET
A
, acoplados à fosfolipase C e ativando a proteína quinase C
(RANG et al., 2004). Fisiologicamente a endotelina mantém uma vasoconstrição
tônica através de sua ação na musculatura lisa vascular. Suas concentrações
plasmáticas se elevam em condições patológicas com componente de
vasoespasmo, como o infarto agudo do miocárdio, vasoespasmo renal e cerebral
(MASAKI, 1993; RANG et al., 2004). A fosfolipase A
2
(PLA2) ligando-se a membrana
celular e desestabilizando sua dupla camada lipídica (BARBOSA et al., 2005),
esterificando fosfolipídios desta membrana e produzindo derivados do ácido
aracdônico como o tromboxane A
2
, ou ligando-se a receptores de superfície e
desencadeando a liberação de variados produtos celulares (VALENTIN; LAMBEAU,
2000), estimularia a liberação de endotelina pelo endotélio vascular glomerular e
células endoteliais. Desta forma, através da endotelina a fosfolipase produziria a
resposta vasoconstritora observada neste trabalho, expressa na elevação da
pressão de perfusão e na resistência vascular renal. Com a agressão ao endotélio
poderia ocorrer extravasamento de líquido, agravado pela manutenção da perfusão
no sistema, produzindo aumento do filtrado urinário e do ritmo de filtração
glomerular.
A atividade das PLA2 também pode ser expressa a partir de liberação de
purinas de origem endógena. Após a desestabilização dos fosfolipídios das
membranas celulares e indução de lesões nas membranas celulares, o influxo de
íons promove alterações intracelulares irreversíveis e morte celular (LOMONTE;
ÂNGULO; CALDERÓN, 2003; BARBOSA et al., 2005), com liberação de bases
nucleotídicas dos núcleos. Recentemente Aird, 2002, estudou o papel das purinas
na ação do veneno das serpentes. As frações fosfolipases, as citotoxinas,
miotoxinas e as de atividade trombina símile, podem participar de sua liberação. No
rim a adenosina ativando receptores A
2
, de baixa afinidade promove vasodilatação
(INSCHO et al., 1991), entretanto os receptores de alta afinidade A
1
, mediam
179
vasoconstrição que predomina sobre a vasodilatação, e no vivo causa redução do
fluxo renal (INSCHO et al., 1991, 1994), principalmente pela atividade da arteríola
aferente, contração das células mesangiais e inibição de renina e outros
neurotransmissores (AGMON; DINOUR; BREZIS, 1993; MUNGER; JACKSON,
1994). A adenosina exógena, experimentalmente, diminui a excreção de água e
sódio pela ativação de receptores A1 (MIZUMOTO et al, 1993; VAN BUREN et al.,
1993).
Seja através da produção de derivados do ácido aracdônico, (PAF ou
tromboxano A
2
) de endotelina ou de purinas com atividade vasoconstritora, a PLA2
provocou um aumento na pressão de perfusão e na resistência vascular renal. Em
conseqüência do aumento da pressão aumentou o fluxo urinário e o ritmo de
filtração glomerular. Houve diminuição da reabsorção de sódio e cloreto,
provavelmente por agressão direta às células tubulares, concomitantemente. O
aumento da reabsorção do potássio nos túbulos proximais pode ser conseqüência à
sua difusão passiva devido à grande permeabilidade das faces basolaterais das
células epiteliais tubulares, independente da bomba de sódio-potássio ATPase
(GUYTON, 2002), mesmo porque que sua reabsorção total não foi afetada. O
balanço final, com redução da reabsorção de sódio e cloreto levou ao aumento do
clearance osmótico devido à eliminação urinária elevada destes íons (Tabela 4).
A fração fosfolipase A2 foi a que demonstrou efeitos mais antagônicos aos
provocados pelo veneno. Como as fosfolipases compõem grande parte dos venenos
botrópicos (VALENTIN; LAMBEAU, 2000), é possível que sua atividade enzimática,
liberando mediadores, ou direta, na agressão celular, seja antagonizada pelas
demais frações testadas, já que todas foram aplicadas com a mesma dose 10μg/mL.
• Achados histopatológicos com a fosfolipase A
2
O achado histopatológico de moderada deposição proteinácea na cápsula de
Bowman reflete bem a elevação da permeabilidade vascular nos capilares
glomerulares, permitindo o extravasamento de proteínas (Tabela 6; Figura 85).
Chacur et al., 2003, demonstraram a capacidade de induzir hiperalgesia de PLA2,
principalmente do tipo Asp-49, através da produção de edema em pata de rato, e
atribuiu este efeito à sua atividade enzimática com mediação local de bradicinina. É
180
provável, portanto, que a PLA
2
utilizada em nosso estudo, do tipo Asp-49, tenha
produzido o extravasamento de perfusato para o espaço urinário através deste
mediador, além da pressão de perfusão elevada. Este extravasamento levou
conseqüentemente ao aumento da deposição de proteínas nos túbulos renais.
As áreas focais corticais, ainda que discretas, de necrose tubular aguda
refletem lesão irreversível do epitélio de revestimento tubular, possivelmente em
resposta à atividade citotóxica da PLA
2
, sobre os fosfolipídios das membranas
celulares, que provocou também a descamação do epitélio tubular, reforçando a
suposição de agressão direta nas células (Tabela 5; Figura 84).
Da Cruz Hofling e et al. (2001) registraram alterações semelhantes
provocadas por fosfolipase A
2
extraída do veneno da Bothrops insularis, in vivo, que
atribuíram à toxicidade direta desta fração, potencializada por distúrbios isquêmicos
regionais. D'Abreu et al. (1996) descreveram, além de necrose tubular aguda,
vacuolização e irregularidades da borda em escova das células do revestimento
tubular proximal e congestão dos corpúsculos renais com ruptura da barreira de
filtração glomerular, estudando pintos vivos. Eles observaram ainda que a necrose
tubular era menos marcante que aquela determinada pelo veneno, fato que foi
compatível com nossas conclusões. Observações histopatológicas renais, relativas à
Bothrops moojeni (Barbosa et al., 2002), constataram picnose com condensação da
cromatina, nos núcleos de células de vários túbulos proximais, descontinuidade da
borda em escova, vacuolização citoplasmática e, em alguns túbulos, degeneração e
descamação de células necróticas, sendo sugerido que essas alterações teriam sido
provocadas pela atividade proteolítica de fosfolipases A
2
(PLA
2
) do veneno (BOER-
LIMA; GONTIJO; CRUZ-HÖFLING, 1999). Estas áreas, entretanto, em nosso estudo
eram discretas e o achado de sofrimento reversível de células tubulares proximais foi
preponderante, com balonização por vacuolização citoplasmática e perda da borda
em escova (Figura 85). Estes últimos também foram vistos nos controles, porém em
menos intensidade e limitados à cortical (Figura 17).
181
6.2 Efeitos do veneno da Bothrops insularis no leito arterial sistêmico
Neste sistema podem ser estudadas as ações conjuntas de todas as
substâncias componentes do veneno, bem como dos mediadores que estas possam
ativar a liberação, incluindo sobre as células sanguíneas e componentes do plasma.
Houve redução da pressão arterial diretamente proporcional à dose do
veneno aplicada por via intrajugular de 1μg, 3μg, 10μg, 30μg, 100μg e 300μg, com
exceção da dose de 10μg, em todos os animais estudados (n=6) (Tabela 37; Figura
86, 87).
Cintra e et al., 1990, já haviam estudado os efeitos sistêmicos do veneno da
serpente Bothrops insularis em ratos anestesiados, observando também sua
atividade hipotensora, a qual atribuiu a potenciadores da bradicinina.
A vasodilatação acentuada e generalizada em todos os órgãos estudados,
fígado, baço, rins intestino e principalmente os pulmões, ocorreu em conseqüência
da hipotensão que o veneno determinou.
Desde as pesquisas iniciais de Rocha e Silva, 1949 são conhecidos os
peptídios potenciadores da bradicinina do veneno botrópico, que já inspiraram a
produção dos antihipertensivos sintéticos mais bem aceitos no mercado
farmacêutico. Usualmente demonstram dois tipos diferentes de atividade. A
potenciação da bradicinina pela inibição de sua enzima inativadora, e inibição da
enzima conversora da angiotensina, aparentemente os dois eventos ocorrendo
independentemente, segundo a conformação molecular do peptídeo (FERREIRA et
al., 1999). A bradicinina é inativada por cininases, uma delas idêntica à enzima
conversora da angiotensina, a cininase II. Esta última é uma peptidil dipeptidase que
remove os dois aminoácidos C-terminais da cinina inativando-a, e liga-se à
superfície luminal das células endoteliais ocorrendo principalmente no pulmão. Cliva
também os dois aminoácidos C-terminais do peptídeo inativo, a angiotensina I,
convertendo-o no peptídeo vasoconstritor ativo, a angiotensina II. Deste modo a sua
inativação perpetua a ação de um vasodilatador, a bradicinina, ao mesmo tempo em
que impede a geração de um vasoconstritor, dando como resultado a vasodilatação
(RANG et al., 2004). A outra enzima, a cininase I menos específica, é uma
carboxipeptidase que remove a arginina C-terminal da bradicinina, produzindo des-
Arg-bradicinina, agonista específico de uma das classes principais de receptores de
182
bradicinina. A bradicinina tem ação vasodilatadora por induzir a produção de
prostaciclina (PGI
2
), que também inibe a agregação plaquetária, e de oxido nítrico
(NO) através do aumento da produção endotelial da enzima óxido nítrico sintetase
induzida (iNOS) (RANG et al., 2004). Os peptídios potenciadores da bradicinina são
os responsáveis pela hipotensão provocada pelo veneno Bothrops (ROCHA-E-
SILVA; BERALDO; ANDRADE, 1949; FERREIRA; ROCHA-E-SILVA, 1965), já
havendo sido isolados e bem caracterizados alguns deles. Ferreira (1998) descreve
a história do isolamento de nove peptídios de pequeno peso molecular extraídos do
veneno da Bothrops jararaca, dos quais o nonapeptídio BPP
9a
era o mais ativo, tanto
na inibição da conversão da angiotensina como na potenciação da bradicinina
(inibição da cininase), bem como da determinação da estrutura do menor peptídeo,
BPP
5a
. Estão presentes no veneno de várias espécies do gênero Bothrops (CINTRA;
VIEIRA; GIGLIO, 1990; FERREIRA; ROCHA-E-SILVA, 1965; FERREIRA et al.,
1998), já havendo sido reconhecidos peptídios potenciadores da bradicinina em
venenos de várias espécies de serpentes e até mesmo em venenos de escorpiões
(FERREIRA; ALVES; HENRIQUES, 1993; FERREIRA et al., 1998; FERREIRA et al.,
1999; FERREIRA, 2000).
A atividade do veneno compreende um somatório das atividades individuais
de todas as suas frações, cada uma delas participando na proporção da quantidade
presente no veneno e da intensidade de seu efeito.
A fração LAAO do veneno pode também contribuir com a hipotensão
promovendo a produção de peróxido de hidrogênio pelo endotélio vascular (SUHR,
KIM, 1996; TORII et al., 1997). O peróxido de hidrogênio age como segundo
mensageiro, ativando o metabolismo do ácido aracdônico e a fosfolipase C
(PIGNATELLI et al., 1998), com a produção de derivados araquidônicos
vasodilatadores como a prostaciclina (PGI). Com a apoptose provocada pelas L-
aminoácido oxidases, em algumas células, são liberados altos níveis de purinas,
dentre as quais a guanosina que provavelmente contribui com a hipotensão pelo
aumento do cGMP no endotélio vascular (AIRD, 2002). As LAAOs ativam a guanilato
ciclase, através da liberação de purinas, solúvel produzindo cGMP na presença de
superóxido dismutase (AIRD, 2002). O cGMP produz relaxamento da musculatura
lisa afetando canais iônicos, fosfodiesterases e a proteína quinase G, resultando em
diminuição da entrada de cálcio e seqüestro do cálcio no retículo sarcoplasmático,
183
impedindo a despolarização celular (RANG et al., 2004). A adenosina é outra purina
liberada a partir da apoptose e fragmentação celular, sendo capaz de ativar
receptores de adenosina A
2
na vasculatura produzindo hipotensão (AIRD, 2002). A
ação decorre do aumento da adenilato ciclase e do AMP cíclico, que pela ativação
da proteinoquinase A, fosforiliza e inibe a quinase de cadeia leve de miosina,
responsável pela fosforilação da miosina e possibilitando a sua interação com a
actina e contração muscular (RANG et al, 2004). A adenosina também é capaz de
ativar receptores A
3
em mastócitos que liberam substâncias vasoativas hipotensoras
como a histamina, leucotrienos e serotonina (AIRD, 2002).
Outras frações do veneno poderiam atuar pela estimulação de receptores α
2
de atividade relaxante vascular que liberam prostanóides vasorelaxantes
(VANHOUTTE; MILLER, 1989), ou mesmo de receptores α
1
vasorelaxantes
localizados nas células endoteliais (ZSCHAUER et al., 1997), dos quais o subtipo
α
1D
, quando estimulado é capaz de gerar óxido nítrico através da ativação da
fosfolipase C, liberação de trifosfato de inositol que libera os estoques de cálcio
intracelulares, do retículo sarcoplasmático, gerando óxido nítrico sintetase (FILIPPI
et al., 2001) uma vez que a ativação desta enzima é cálcio dependente (LUCKHOFF
et al., 1988; BERDEAUX, 1993). Outros tipos de receptores vasorelaxantes que
devem ser considerados são os receptores ativados por proteinases do subtipo 2
(PARS2), que são ativados por tripsina ou triptases que podem ser liberadas por
mastócitos (GUI; LOUTZENHISER; HOLLENBERG, 2003). Eles pertencem à família
dos receptores ativados por proteinases cujos demais subtipos conhecidos PARs1, 3
e 4 são ativados também pela trombina, dentre outras proteinases, podendo sofrer a
estimulação direta da trombina endógena liberada no plasma do animal pela
presença do veneno, ou pela fração trombina símile constituinte do veneno. Todos
são mais bem discutidos na análise da atividade direta do veneno no leito arterial
mesentérico isolado de ratos.
Outro efeito bem evidente foi a hemorragia, principalmente intraalveolar, nos
pulmões, que não foi bem caracterizada nos demais órgãos estudados. Os animais
sobreviveram pouco tempo após a última dose, e alguns morreram antes do final do
experimento, provavelmente não dando tempo para a atuação de frações
estimulantes de hemorragia nos órgãos não afetados. Antes disso a hipotensão
levou à formação do quadro do pulmão de choque, que ocorre em conseqüência de
184
hipertensão e se expressa pela vasodilatação pulmonar com extravasamento de
hemácias, células inflamatórias como polimorfonucleares neutrófilos, linfócitos e
deposição de fibrina para o interior dos alvéolos. É um quadro que decorre do
sofrimento do epitélio pulmonar pela hipóxia que se estabelece nos quadros de
choque vasoplégico, que ocorre em respostas a toxinas como as dos venenos das
serpentes (MITCHELL, 2005).
Entretanto as frações anticoagulantes como as lectinas acentuaram a
hemorragia alveolar, que se mostrou tão evidente (MONTEIRO et al., 2003). O efeito
procoagulantes da fração trombina símile, que também causa hemorragia pelo
consumo de fibrinogênio, provavelmente colaborou com as lectinas no
desenvolvimento de hemorragia pulmonar (CASTRO et al., 2004), embora não
tenham sido encontrados sinais de coagulação intravascular disseminada como
trombos nos pequenos vasos (MITCHELL, 2005). As LAAOs podem também
contribuir para a hemorragia pela indução da apoptose nas células endoteliais (LI et
al., 1994; MASUDA et al., 1997). A fosfolipase contribui para a hemorragia devido ao
seu efeito tóxico sobre as membranas celulares (BARBOSA et al., 2005).
As metaloproteinases zinco dependentes, são componentes dos venenos
botrópicos capazes de destruir as ligações de proteínas de sustentação, como as
integrinas, com o colágeno, de clivar proteínas da membrana basal, da própria
matriz extracelular e de componentes plasmáticos importantes para a homeostase,
agravando a hemorragia (RUCAVADO et al. , 2005; TANJONI et al., 2003).
No fígado a congestão centrolobular era bem marcante, juntamente com
esteatose em microgotas. Não foram encontradas as lesões dos sinusóides
hepáticos e espaços porta descritas por Paronetto (1996). Este autor estudou
comparativamente a atividade sistêmica do veneno e de uma sua fração de
atividade miotóxica, fosfolipase A2. Ele observou que o veneno da Bothrops insularis
e uma fração PLA
2
apresentaram capacidade de provocar lesões hepáticas, em
pintos com uma reação dose e tempo dependente para ambas as drogas, com o
veneno completo agindo mais intensamente na alteração da arquitetura hepática,
tornando irreconhecíveis os sinusóides, espaços-porta e centrolobular. Em altas
doses houve vacuolização dos hepatócitos com ruptura das cristas mitocondriais e o
aparecimento de muitas sombras hepatocitárias. Houve marcante diminuição dos
depósitos de glicogênio, evidência de ativação de grande número de células de Pitt
185
e de Kuppfer, com a fração PLA
2
provocando hemorragia hepática mais intensa
(PARONETTO, 1996). Provavelmente o tempo de sobrevida curto em nosso estudo,
não permitiu o estabelecimento destes sinais de sofrimento hepático, além da
esteatose em microgotas, já que os animais morriam logo após o experimento com a
dose crescente até a dose letal, de forma rápida pela insuficiência respiratória. É
provável, entretanto, que outras frações como as L-aminoácido oxidases,
promovendo apoptose também contribuam com a lesão celular hepática (DU,
CLEMETSON, 2002). Outras observações registradas por Barraviera et al. (1989),
constituindo-se de desaparecimento das cristas mitocondriais por edema, com
rarefação da matriz e perda do conteúdo mitocondrial de hepatócitos, foram vistas
na microscopia eletrônica, que não foi o caso de nosso estudo.
Nos rins não se observaram as alterações clássicas descritas por Amaral e et
al. (1985), como necrose tubular aguda ou a ocorrência de alterações glomerulares
(RESENDE, 1989), mas Aung-khin, 1978, refere que as alterações renais são mais
evidentes em animais que sobrevivem pelo menos 16 horas. Nos mortos em menos
tempo as alterações surgiam apenas nos túbulos com vacuolização das células de
revestimento, degeneração hialina e dilatação dos túbulos contornados proximais.
São sinais descritos também por D'Abreu et al. (1996) e Da Cruz Hofling et al.
(2001), em pintos vivos, como resposta ao veneno da Bothrops insularis. Mas
somente após 24 horas de sobrevida aparecia típica necrose tubular, hemorragia
intersticial, com infiltrado mononuclear contendo eosinófilos e mastócitos em meio a
edema. Somente a congestão acentuada em grandes e pequenos vasos, com focos
de hemorragia intersticial era marcante em nosso estudo.
TABELA 38: Prováveis mediadores liberados e frações atuantes nos experimentos
com o veneno, no leito arterial sistêmico.
Local de Ação Mediadores Frações Hemorrágicas Frações Hipotensoras
Veneno – no
leito arterial
sistêmico
• TNFα
• Histamina
• RAP2 - NO
• Bradicinina
• Prostaglandinas
– PGI
• Lectina
• Metaloproteinases
• Trombina símile
• LAAO
• Potenciadores da
Bradicinina
186
6.3 Efeitos do veneno da Bothrops insularis no leito arterial mesentérico
isolado
O leito mesentérico isolado foi perfundido com o objetivo de se investigar a
atividade direta do veneno nos vasos, isto é, vasodilatação ou vasoconstrição, já que
neste sistema a solução é desprezada após a passagem no leito vascular, não
permitindo a recirculação de possíveis substâncias produzidas pelo endotélio, além
de não permitir a interferência das contrações intestinais (MCGREGOR, 1965).
Entretanto, aquelas substâncias com atividade autócrina ou parácrina podem
produzir reatividade característica. Hill e et al., 1996, demonstraram que neste
sistema a função arterial era controlada pelos nervos simpáticos perivasculares e
pela atividade parácrina do óxido nítrico liberado pelo endotélio. O endotélio é fonte
ainda de numerosos mediadores químicos potentes que por uma atividade parácrina
controlam a contração ou o relaxamento do músculo liso subjacente (RANG et al.,
2004). O músculo liso difere do estriado e do cardíaco por não conter troponina. O
Cálcio+calmodulina regulam a quinase de miosina cadeia leve, que por sua vez
fosforiliza as cadeias leves de miosina, permitindo a sua interação com a actina,
início do processo de contração (RANG et al., 2004).
A hipertensão provocada pela fenilefrina sofria uma queda nos momentos
finais de sua atividade pela dessensibilização de receptores específicos de atividade
vasoconstritora os simpaticomiméticos α
1
. A partir da injeção do veneno esta queda
se agravou com uma hipotensão estatisticamente significante, revelando sua potente
atividade hipotensora. Esta atividade foi ainda mais marcante com a administração
do veneno isoladamente (Tabela 38, 39; Figura 97), comprovando que sua atividade
independe da fenilefrina, e portanto, de algum efeito agonista fraco, mas que decorre
de ação direta. As várias frações constituintes do veneno produziram um efeito
global vasodilatador e, portanto, hipotensor, compatível com o efeito descrito na
literatura para a atividade dos venenos botrópicos (Tabela 38, 39; Figura 97).
A enzima óxido nítrico sintetase, em sua forma constitutiva e indutível, está
presente no músculo liso vascular e esta última pode ser expressa a partir de
estímulos patológicos que agridam às células. Elas desencadeiam a formação de
óxido nítrico que age como mediador autócrino e parácrino, ativando a guanilato
ciclase com conseqüente formação de cGMP, seqüestrando o cálcio e impedindo a
187
contração muscular lisa. O óxido nítrico pede também atuar pela hiperpolarização do
músculo liso vascular através da ativação dos canais de potássio (RANG et al.,
2004).
A atividade relaxante de receptores α
2
foi bem estudada por Vanhoutte e
Miller (1989), bem como a atividade vasoconstritora de receptores α
1
pós-juncionais,
os principais responsáveis pela atividade simpaticominética na resistência vascular.
Entretanto Zschauer et al. (1997) demonstraram a presença de receptores α
1
vasorelaxantes em artérias braquiais e pulmonares de coelhos e ratos. Eles sugerem
que a estimulação destes receptores α
1
localizados nas células endoteliais é capaz
de gerar óxido nítrico, enquanto os receptores α
2
liberam prostanóides
vasorelaxantes. A atividade vasorelaxante dos receptores α
1
seria um mecanismo
modulador local da resposta simpaticomimética, além da dessensibilização do
receptor (HU; MILLER; HOFFMAN, 1994). E conhecido o aumento da resposta
vasoconstritora simpática em vasos com o endotélio removido ou quando
concomitante com inibidores do óxido nítrico (GREENBERG et al., 1989; BOER-
LIMA; GONTIJO; CRUZ-HÖFLING, 1999). Muitos tecidos expressam receptores α
1
e
três de seus subtipos são encontrados no músculo liso, α
1A
, α
1B
e α
1D
(ZHONG;
MINNEMAN, 1999). Filippi et al. (2001) estudaram a atividade destes receptores em
leito mesentérico isolado de ratos, utilizando fenilefrina, um agonista específico α
1
,
concluindo que o subtipo α
1D
está envolvido no relaxamento endotélio dependente, e
que agonistas α
1
tem maior afinidade por este subtipo, visto que o efeito ocorre em
concentrações menores do que as suficientes para produzir vasoconstrição. Eles
concluíram que a ativação do receptor α
1D
ativaria a fosfolipase C liberando trifosfato
de inositol que liberaria os estoque de cálcio intracelulares, do retículo
sarcoplasmático, gerando óxido nítrico sintetase, uma vez que a ativação desta
enzima é cálcio dependente (Luckhoff et al., 1988; Berdeaux, 1993). Isto poderia
explicar não somente a queda da pressão de perfusão ao final da administração da
fenilefrina, potencializando a dessensibilização dos receptores, como também a
possível atuação do veneno da B. insularis nestes receptores, provocando
vasodilatação por efeito direto. A possibilidade do veneno atuar somente como
agonista competitivo fraco da fenilefrina nos receptores α
1A
e α
1B
, apenas com
188
bloqueio parcial da fenilefrina pode ser descartada, tendo em vista que sozinho o
veneno também promoveu vasodilatação (Tabela 38, 39; Figura 97).
Outra possível atuação do veneno no desencadear da vasodilatação
promovida no leito arterial mesentérico seria pela ativação dos receptores ativados
por proteinases (PARs). Eles compreendem uma família de receptores
transmembrana acoplados a proteína G que são ativados por proteólise, envolvidos
na resposta endotelial a agressões (BUCCI; ROVIEZZO; CIRINO, 2005). Eles são
naturalmente ativados pela trombina e outras proteases inflamatórias ou coagulantes
(STEINBERG, 2005). A fração trombina símile do veneno da Bothrops insularis
poderia atuar através da sua ativação. Estão presentes em vários vasos sanguíneos,
onde modulam o tônus vascular. Experimentos recentes sugerem a participação em
especial dos receptores do tipo PARs 2 na fisiopatologia do sistema cardiovascular
(BUCCI ROVIEZZO; CIRINO, 2005). Eles não são diretamente ativados pela
trombina, mas podem ser estimulados por peptídios liberados pela clivagem de
proteínas (GUI; LOUTZENHISER; HOLLENBERG, 2003). Na artéria mesentérica
pré-contraída de ratos, Kawabata et al. (2004) demonstraram que os PARs 2
ativados causam relaxamento via liberação de óxido nítrico e pela hiperpolarização
provocada por fatores hiperpolarizantes derivados do endotélio. Sua ativação produz
relaxamento dos músculos lisos vasculares e causa hipotensão por mecanismos
dependentes de óxido nítrico e prostanóides (KAWABATA et al., 2004), mas também
por mecanismos hiperpolarizantes, independentes de óxido nítrico, cicloxigenases
ou guanilato ciclase, que são dependentes de canais de potássio e poderiam
constituir o mecanismo primário da produção de hipotensão “in vivo” (MCGUIRE et
al., 2004). A trombina tem atividade na produção de bradicinina e potenciadores de
seu efeito, que ativam a produção do óxido nítrico pelas células endoteliais (KU;
ZALESKI, 1973). No endotélio intacto induz relaxamento mediado por óxido nítrico
(KU; ZALESKI, 1973).
A fosfolipase A
2
do veneno da Bothrops insularis apresenta atividade na placa
neuromuscular e este efeito parece relacionado com alteração na cinética de canais
de potássio. Inicialmente causa contração, logo seguida de bloqueio, que poderia
contribuir para a vasodilatação. Este efeito parece ser dependente de sua atividade
enzimática (COGO et al., 1998). Outras fosfolipases A
2
neurotoxinas correntemente
apresentam atividade bloqueadora dos canais de potássio nas junções
189
neuromusculares, provavelmente ocorre pela facilitação da liberação da liberação do
neurotransmissor, antes do bloqueio irreversível (ROWAN; HARVEY, 1996). Esta
atividade enzimática poderia, também, desencadear também a liberação de
endotelina, mediada pelo tromboxane A
2
(ASAKURA et al., 2005), ou diretamente
pelo estresse (RANG et al., 2004) provocado pela fosfolipase A
2
nos lipídios da
membrana celular (VALENTIN; LAMBEAU, 2000). Os receptores da endotelina do
tipo ET
A
estão presentes, principalmente, no músculo liso vascular e mediam
funções como vasoconstrição, que em geral são preponderantes. Entretanto, os
receptores da endotelina do tipo ET
B
têm o RNA mensageiro altamente expresso
nas células endoteliais. Ativadores de receptores ET
B
foram encontrados em
venenos de áspedes e foram subdivididos em duas categorias; ET
B1
presente no
endotélio e ET
B2
presente no músculo liso vascular. Os do tipo, ET
B1
provocam
vasodilatação ao aumentar o cálcio intracelular das células endoteliais que,
juntamente com a calmodulina, ativa a oxido nítrico sintetase e a fosfolipase A
2
, com
conseqüente aumento de ON e retroalimentação na esterificação do ácido
aracdônico e produção de prostaglandinas (PGI
2
) (RANG et al., 2004).
A participação da fração lectina neste sistema é questionável. Com lectina
extraída do veneno da serpente B. pirajai, Havt et al., 2005, demonstraram que ela
induzia redução significativa na pressão de perfusão e da resistência vascular renal
no rim isolado de rato. Eles propuseram que estes resultados provavelmente se
deviam à liberação de mediadores produzidos pelas células endoteliais e mesangiais
estimuladas pela lectina. Entretanto, ao tentar potenciar a atividade da bradicinina na
contração do íleo de cobaia com a lectina não obtiveram resultado. Também a
lectina não afetava a pressão de perfusão basal ou pré-contraída de artéria
mesentérica isolada de rato, ou mesmo da pressão do leito pré-contraído com
fenilefrina.
A indução da apoptose pelas LAAOs, está relacionada a células do endotélio
vascular (SUHR, KIM, 1996; TORII et al., 1997), envolvendo a produção de peróxido
de hidrogênio. Lucchesi et al. (2005), demonstraram que o peróxido de hidrogênio
tem ação vasodilatadora em artéria mesentérica de camundongos pré-contraídos
com fenilefrina, independente da óxido nítrico sintetase, cicloxigenase, e canais de K
do endotélio. Em condições em que a hiperpolarização está comprometida, como
com o uso de cloreto de potássio, o peróxido de hidrogênio produz vasoconstrição.
190
Eles propõem que o peróxido de hidrogênio controla o tônus arterial como um fator
hiperpolarizante dependente do endotélio. O peróxido de hidrogênio age como
segundo mensageiro, ativando o metabolismo do ácido aracdônico e a fosfolipase C
(PIGNATELLI et al., 1998). Na apoptose provocada pelas LAAOs, são liberados
altos níveis de purinas, dentre as quais a guanosina que provavelmente contribui
com a hipotensão pelo aumento do cGMP no endotélio vascular (AIRD, 2002). As L-
aminoácido oxidases podem contribuir, ainda, para a queda da pressão de perfusão
ativando a guanilato ciclase solúvel que produz cGMP na presença de superóxido
dismutase (AIRD, 2002), atuando esta cGMP no relaxamento da musculatura lisa
pela diminuição das respostas ao íon cálcio no músculo liso vascular (RANG et al.,
2004). A produção de prostaciclina, estimulada pela liberação de peróxido de
hidrogênio provocada pela LAAO, ou a atividade de purinas como a guanosina, a
leucina, ou da guanilato ciclase solúvel na presença da superóxido dismutase,
liberadas pelas células apoptóticas, provavelmente contribuem com a vasodilatação
arteriolar. Entretanto, neste experimento, a apoptose foi discreta pois o leito arterial
voltou a responder à fenilefrina readministrada após o final do ensaio, não sendo
também observada no exame histológico, o que não exclui sua ocorrência.
Não se pode descartar, porém, a atividade de outros constituintes do veneno
que provavelmente contribuem para a vasodilatação observada no leito mesentérico.
Enzimas como as dispeptidil dispeptidases, por exemplo, podem destruir
neuropeptídios vasoconstritores como a substância P, neuropeptídio Y e peptídio YY
(AIRD et al., 2002), liberados nos neurônios sensoriais presentes na vasculatura
mesentérica (RANG et al., 2004).
TABELA 39: Prováveis mediadores liberados e frações atuantes nos experimentos
com o veneno no leito arterial mesentérico isolado.
Local de Ação Mediadores Frações Hemorrágicas Frações Hipotensoras
Veneno – no
leito arterial
mesentério
• RAP2 – NO
• Bradicinina
• Prostaglandinas
– PGI
Atividade não observada
• PLA
2
- Ação enzimática
• LAAO
• Potenciadores de
bradicinina
191
Não foram observados efeitos histopatológicos na perfusão do leito arterial
mesentérico, provavelmente devido ao fato de as alterações necróticas dependerem,
em grande parte da intervenção de células inflamatórias e do plasma, praticamente
ausentes neste sistema pela sua raridade no tecido gorduroso, pela ausência de
circulação linfática, abolida com o isolamento do leito arterial, e ao pouco tempo de
exposição do mesentério ao veneno (Figura 99, 100, 101).
192
CONSIDERAÇÕES FINAIS
193
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS
• Alterações renais provocadas pelo veneno e frações da Bothrops
insularis
O veneno bruto mostrou uma toxicidade acentuada provocando um quadro de
insuficiência renal aguda. Somente não foi reduzido o transporte de potássio, que
em grande parte ocorre por difusão, independente da atividade celular.
A fração lectina participou com maior intensidade, dentre todas as frações
estudadas, no potencial citotóxico do veneno, provocando necrose tubular aguda em
maior extensão. Estes resultados, com efeitos finais revertendo a elevação inicial de
alguns parâmetros, sugerem a liberação inicial de mediadores que intermediaram o
aumento da pressão de perfusão e a reabsorção de eletrólitos, seguida da agressão
direta final da lectina que alterou a integridade das células renais.
A fração LAAO foi a que apresentou um efeito mais próximo daquele
produzido pelo veneno bruto, com redução dos parâmetros vasculares, funcionais
renais, da reabsorção de eletrólitos e do clearance osmótico, além da moderada
produção de necrose tubular aguda. É provável que sua atividade promotora da
liberação de H
2
O
2
e seus mediadores, se juntou à sua capacidade promotora da
apoptose, que tem a mesma representação morfológica de necrose tubular aguda,
caracterizando seu papel importante na atividade tóxica do veneno da B. insularis.
A fração trombina símile apresentou efeitos contraditórios. Inicialmente
promoveu elevação dos parâmetros vasculares e fisiológicos, com redução final.
Também os eletrólitos, em geral, sofreram aumento inicial do transporte com queda
ao final do experimento. Foi a fração onde se observou maior extravasamento
proteináceo para o espaço urinário e túbulos distais. É provável que tenha atuado
através de mediadores sem potencial citotóxico já que não se observou necrose
tubular. Possivelmente vasoconstritores foram produzidos inicialmente, em seguida
substituídos por vasodilatadores que aumentaram também a permeabilidade
vascular, provocando o extravasamento protéico dos capilares glomerulares.
A fração fosfolipase A
2
foi a que demonstrou efeitos mais antagônicos aos
provocados pelo veneno, com elevação dos parâmetros vasculares e na produção
194
de urina. Houve queda também no transporte de eletrolíticos, como o sódio e cloreto,
mas o potássio mostrou aumento da reabsorção. O clearance osmótico aumentou,
demonstrando a redução global do transporte de eletrólitos. É provável que sua
atividade enzimática, liberando mediadores, tenha se combinado com a agressão
direta que produziu necrose tubular no final.
Na histopatologia observou-se o aumento da permeabilidade dos capilares
glomerulares com deposição proteinácea no espaço de Bowman. Não foi vista na
atividade do veneno completo, porém foi observada em na presença de todas as
frações, com maior intensidade na fração trombina símile onde 73,19% dos
glomérulos apresentaram algum grau de extravasamento.
A necrose tubular aguda, um achado quase inexistente com a trombina símile,
moderado na ação do veneno bruto, de forma leve na da fosfolipase A
2
, moderada
na LAAO (confundindo-se com apoptose), e mais intenso com a lectina, demonstrou
o potencial tóxico direto das frações.
Finalmente a apoptose foi vista como resultado da fração LAAO, como
descrito na literatura, contribuindo para a necrose tubular observada na sua
atividade.
• Alterações vasculares sistêmicas provocadas pelo veneno da
Bothrops insularis
Observou-se uma importante atividade hipotensora do veneno bruto. A
recuperação após queda inicial nos níveis pressóricos provavelmente decorria de
resposta reflexa do animal à queda da pressão arterial, à custa de atividade
adrenérgica ou liberação de outros vasoconstritores.
Na histopatologia foi observada a vasodilatação acentuada e generalizada em
todos os órgãos estudados (coração, rins, intestino, fígado e pulmões), refletindo a
hipotensão que o veneno provoca.
Nos pulmões a hemorragia foi bem evidente, ocorrendo em menor
intensidade nos rins. Em outros órgãos a hemorragia foi menos expressiva,
possivelmente devido ao tempo de morte dos animais que foi quase imediato. O
efeito procoagulante da fração trombina símile, que causa hemorragia pelo consumo
195
de fibrinogênio, provavelmente potencializou o da lectina em sua atividade
anticoagulante, no desenvolvimento de hemorragia.
Os animais chegavam ao óbito, com as doses maiores, devido à hipotensão e
por insuficiência respiratória decorrente da hemorragia pulmonar maciça.
• Alterações vasculares mesentéricas do veneno da Bothrops insularis
O veneno bruto produziu relaxamento em vasos pré-contraídos com
fenilefrína, demonstrando a importância de sua atividade hipotensora, capaz de inibir
qualquer resposta do hospedeiro. Sem vasoconstritores também foi marcante a
vasodilatação resultante da ação isolada do veneno, excluindo sua atividade limitada
a agonismo competitivo fraco da fenilefrina.
O relaxamento provavelmente resultou da atividade global das frações
hipotensoras do veneno, como a lectina a LAAO e a trombina símile, bem como de
outras não determinadas, que promoveram a liberação de fatores como
prostaglandinas, purinas, peróxido de hidrogênio e o óxido nítrico, com sua atividade
hiperpolarizante nos canais de potássio..
Não ocorrendo recirculação neste sistema, estes fatores foram liberados
diretamente pelo endotélio, com atividade autócrina e parácrina alcançando os
músculos lisos vasculares.
196
CONCLUSÕES
197
8 CONCLUSÕES
- O veneno bruto da Bothrops insularis mostrou atividade hipotensora, hemorrágica e
necrotizante, provocando hemorragia mais acentuada nos pulmões e necrose
tubular aguda.
- A fração Lectina mostrou o maior potencial necrotizante renal.
- A fração Trombina símile provocou o maior extravasamento proteináceo
glomerular.
- A fração Fosfolipase provocou efeitos opostos ao do veneno bruto nos rins.
- A fração LAAO mostrou os resultados mais semelhantes ao do veneno bruto nos
rins.
198
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228
ANEXO A
Equipamento utilizado nos experimentos.
Microscópio óptico (Nikon) - Exame histológico
Máquina fotográfica Canon PowerShot A95 5MP Digital Camera with 3x Optical
Zoom -As fotografias microscópicas e macroscópicas.
Transdutores P23 Stath - transndução da pressão arterial sistêmica ao fisiógrafo
Fisiógrafo “Gemini” 7070, 2 channel recorders - Monitoramento da pressão arterial
sistêmica
229
ANEXO B
Substâncias utilizadas na perfusão renal
Nos experimentos com perfusão renal utilizamos as substâncias abaixo.
NaHCO
3
(Synth)
NaH
2
PO
4
.H
2
O (Synth)
NaCl (Synth)
MgSO
4
. 7H
2
O (Reagen)
CaCl
2
. 2H
2
O (Reagen)
Manitol (Reagen)
Uréia (Reagen)
KCl (Merck)
Glicose (Squibb)
Penicilina G Potássica Cristalina (Squibb)
Heparina (CEME)
Inulina (Sigma)
Pentobarbital Sódico (Cristália)
Albumina Bovina
Solução de Krebs-Henseleit
114.0mM de NaCl; 4.96mM de KCl; 1.24mM de KH
2
PO
4
; 0.5mM de MgSO
4
.7H
2
O;
24.99mM de NaHCO
3
; 2.10mM de CaCl
2
.2H
2
O; e 3.60mM de glicose
230
ANEXO C
Comportamento da pressão arterial do leito mesentérico de ratos perfundido
com o veneno da Bothrops insularis, pré-contraído com fenilefrina, combinado com
fenilefrina e Isoladamente, na dose de 10μg/mL/min.
Média
Basal 0 38
238
438
638
838
10 38
12 38
14 38
16 38
18 38
Fenilefrina 20 38
22 127
24 134,5
26 136,5
28 140,5
30 162
32 163,5
34 152
36 146,5
38 140,5
Fenilefrina + Veneno
insularis
40 137,5
42 137,5
44 125,5
46 122
48 116,5
50 111
52 104
54 98
56 95
58 92
Veneno insularis 60 89
62 49
64 36,5
66 30,25
68 27,75
70 27,25
72 27,25
74 27,75
76 27
78 26,5
80 27
231
ANEXO D
Tabelas dos parâmetros renais do grupo controle com o rim isolado de rato.
Parâmetros vasculares e fisiológicos urinários do rim isolado perfundido com solução
de Krebs-Henseleit modificada (controle).
Tempo
PP (mmHg)
RVR
(mmHg/
mL.g
-1
.min
-1
)
FU
(mL.g
-1
.min
-1
)
RFG
(mL.g
-1
.min
-1
)
Min. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m.
30 110,11 3,68 5,15 0,49 0,14 0,01 0,70 0,07
60 108,27 4,88 5,38 0,51 0,16 0,01 0,71 0,05
90 108,69 5,09 5,36 0,59 0,16 0,02 0,63 0,05
120 110,28 3,69 5,20 0,47 0,16 0,02 0,70 0,08
Dados apresentados por média±EPM (p<0,05).
PP= pressão de perfusão; RVR= resistência vascular renal; FU= fluxo urinário; RFG= ritmo de
filtração glomerular.
Parâmetros eletrolíticos do rim isolado perfundido com solução de Krebs-Henseleit
modificada (controle).
Tempo % TNa %pTNa %TK %pTK
Min. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m. média e.p.m.
30 81,94 1,24 75,65 1,42 69,13 4,14 64,50 4,74
60 81,11 1,52 74,69 0,99 69,04 5,68 62,71 4,08
90 79,26 0,90 73,84 2,64 71,84 4,21 64,27 6,12
120 79,76 0,56 74,94 3,41 69,94 6,86 61,83 5,62
Dados apresentados por média±EPM (p<0,05).
%TNa
+
= percentual de transporte de sódio; %pTNa
+
= percentual de transporte proximal de sódio;
%TK
+
= percentual de transporte de potássio; %pTK
+
= percentual de transporte proximal de potássio.
Parâmetros eletrolíticos do rim isolado perfundido com solução de Krebs-Henseleit
modificada (controle).
Tempo C osm (mL.g
-1
.min
-1
) %TCl %pTCl
min. média epm Média e.p.m. média e.p.m.
30 0,120 0,02 79,90 1,03 76,81 1,25
60 0,121 0,02 81,25 2,44 78,49 2,90
90 0,142 0,01 77,32 2,22 76,58 1,20
120 0,125 0,02 78,53 2,33 76,36 2,47
Dados apresentados por média±EPM (p<0,05).
%TCl-= percentual de transporte de cloro; %pTCl-= percentual de transporte proximal de cloro; C
osm= clearance osmótico.
232
ANEXO E
Trabalho Apresentado no: XXIII Encontro Universitário De Iniciação À Pesquisa da
UFC, realizado em Fortaleza, Ceará, entre 01 a 02 de julho de 2004.
Título: Alterações Renais Induzidas Pelo Veneno Da Bothrops insularis.
RESUMO
Monique Aguiar Porto (Farmácia-UFC),Daniel Freire de Sousa- (PIBIC/CNPq-
Farmácia-UFC), João Paulo Saraiva- Abreu(Medicina-UFC), Marcus Davis Machado
Braga(Co-orientador),Helena Serra Azul Monteiro(Orientadora). Departamento de
Fisiologia e Farmacologia – Faculdade de- Medicina – UFC.
Palavras-Chave: Bothrops insularis; rim; perfusão; nefrotoxicidade.
Introdução: Dentre as complicações secundárias mais comuns nos-
envenenamentos ofídicos podemos citar a insuficiência renal- aguda.
Objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos causados pelo- veneno da
Bothrops insularisem rim isolado de rato. Métodos: Utilizamos rins de
ratos Wistar (260-300g; n=6) perfundido- segundo técnica descrita por
Fonteles, M.C. et al, Am. J. Physiol., 244, p.235, 1983. Os resultados do
grupo controle (C), onde os-rins foram perfundidos apenas com a solução
de Krebs-Hanseleit- modificada com 6 g% de albumina bovina, foram
comparados ao-grupo tratado com o veneno da Bothrops insularis
(10μg/mL). Os-experimentos tiveram a duração de 120 minutos e o
veneno foi-adicionado aos 30 minutos de perfusão. Os resultados foram-
analisados por Teste t de Student com *p<0,05. Resultados: O- veneno
da Bothrops insularis (BiV) reduziu a pressão de perfusão-
(C
90
=108,70±5,1mmHg; BiV
90
=51,9±5,7mmHg*), a resistência- vascular
renal (C
90
=5,76± 0,65 mmHg/ml
-1
.g
-1
.min
-1
;BiV
90
=2,85±0,52 mmHg/ml
-1
.g
-
1
.min
-1*
), o fluxo urinário- (C
90
=0,138±0,008 ml
-1
.g
-1
.min
-1
;
BiV
90
=0,044±0,008 ml
-1
.g
-1
.min
-1*
), o ritmo de filtração
glomerular(C
90
=0,699±0,089 ml
-1
.g
-1
.min
-1
; BiV
90
0,194±0,050 ml
-1
.g
-1
.min
-
1*
) e o percentual de transporte- tubular de sódio(C
120
= 79,76±0,56;
BiV
120
=73,78±3,45*). Conclusão:Os efeitos causados pelo veneno da
Bothrops insularis-sugerem nefrotoxicidade direta em rim isolado de rato.
Apoio financeiro: CNPq
233
ANEXO F
Trabalho Apresentado no: VIII Congresso da Sociedade Brasileira de Toxinologia.
Symposium of the Pan American Section of the International Society on Toxinology,
ealizado em Angra dos Reis, Rio de Janeiro, Brasil de 19 a 23 de Setembro de
2004.
Título: Renal histopathological alterations inserted by the venom of the Bothrops
insularis serpent.
1
Braga, M.D.B.,
2
Barbosa, P.S.F.,
4
Toyama, M.H.,
4
Toyama, D.O.,
Aprígio, C.C.,
2
Evangelista, I.L.,
3
Martins, A.M.C.,
2
Martins, R.D.,
2
Alves, R.S.,
2
Capelo, P.A.O.,
1
Menezes, D.B.,
2
Fonteles, M.C.,
2
Monteiro, H.S.A.
1
Depto. de Patologia,
2
Depto. de Fisiologia e Farmacologia, e
3
Dpto. de Análises Clínicas e Toxicológicas –UFC,
4
Depto. de
Bioquímica –UNESP.
Acute Renal Failure (ARF) is one of the major complications of
botropic accidents. The aim this study was evaluates the
histopathological alterations caused by the Bothrops insularis (Bi)
venom. Isolated kidneys from Wistar rats weighing 260 to 300g,
were perfunded with Krebs-Hansleit solution containing 6% of
bovine serum albumin. After the experiments the kidneys were
immersed in 10% formaldehyde for 24 hours, inserted in wax for 3
micra thickness slices and stained by hematoxilin-eosin. In the
control group (c), the kidneys showed sparse areas of vacuolar-
hydropic degeneration of the tubular coating cells, discreet
intratubular deposition of proteic material; glomerules, interstitio
and vessesl with no abnormalities. In the treated group with
Bithrops insularis (Bi), venom were observed a degeneration
represented by vast vacuolar-hydropic balooning of the tubular
coating cells; cortical focal areas showing cells of picnotic nucleus
similar to acute tubular necrosis; increased proteic depot within
the tubules but normal vessels, gomerules and interstitio. In
conclusion the kidney architecture is disrupted in presence of
Bothrops insularis venom, with dead of tubular coating cells.
234
ANEXO G
Trabalho Apresentado no: XXXVI Congresso Da Sociedade Brasileira de
Farmacologia e Terapêutica Experimental (SBFTE), realizado em Águas de Lindóia,
São Paulo, Brasil de 17 a 20 de outubro de 2004.
Título: Alterações Renais Induzidas Pelo Veneno Da Bothrops insularis.
Braga, M.D.M., Barbosa P.S.F., Toyama, M.H., Toyama, D.O., Martins, R.D.,
Alves, R.S., Evangelista, J.S.A.M., Aprígio C.C., Oliveira, A.L., Martins A.M.C.,
Marongoni, S., Fonteles, M.C., Monteiro, H.S.A.
Deptos Bioquímica, Fisiologia e Farmacologia da UFC, UNESP e UNIFOR.
Introdução: Dentre as complicações secundárias mais comuns nos
envenenamentos ofídicos podemos citar a insuficiência renal aguda. Objetivo deste
Trabalho foi avaliar os efeitos causados pelo o veneno da serpente Bothrops
insularis em rim isolado de rato. Métodos e Resultados: Utilizamos rins de ratos
Wistar (260- 300gr; n=6) perfundidos segundo técnica descrita por Fonteles, M.C. et
al, Am. J. Physiol., 244, p. 235, 1983. Os resultados do grupo controle (C), onde os
rins foram perfundidos apenas com a solução de Krebs-Hanseleit modificada com 6
g% de albumina bovina, foram comparado ao grupo tratado com o veneno da
Bothrops insularis (10µg/ml) adicionado 30 minutos após o início do experimento,
sendo que estes experimentos tiveram a duração de 120 minutos. Os resultados
foram analisados por Teste T de Student com *p<0,05. Nos grupos em que os rins
foram tratado com o veneno da serpente Bothrops insularis apresentou uma redução
em todos os parâmetros estudados: pressão de perfusão (PP) (C
90
=108,70±5,085;
BiV
90
=51,9±5,7); resistência vascular renal (RVR) (C
90
=5,76± 0,65; BiV
90
=2,85±0,52);
fluxo urinário (FU) (C
90
=0,138±0,008; BiV
90
=0,044±0,008); ritmo de filtração
glomerular (RFG) (C
90
=0,699±0,089; BiV
90
=0,194±0,050); percentual de transporte
tubular de sódio (TNa
+
) (C
120
=79,76±0,56; BiV
120
=73,78±3,45).
Conclusão: Os efeitos causados pelo veneno de Bothrops insularis sugerem a sua
nefrotoxidade direta em rim isolado de rato.
235
ANEXO H
Trabalho Apresentado no: XXIV Encontro Universitário De Iniciação à Pesquisa da
UFC, realizado em Fortaleza, Ceará, entre 09 a 10 de junho de 2005.
Título: Efeito Renal da Fração Trombina-Like do Veneno de Bothrops insularis.
João Paulo Saraiva Abreu (PIBIC/CNPq Medicina-UFC), Monique Aguiar Porto
(CNPq Farmácia-UFC), Marcus Davis Braga (Co-orientador). Depto. de Patologia e
Medicina Legal – Faculdade de Medicina - UFC. Paulo Sérgio F. Barbosa (co-
orientador). Depto. de Fisiologia e Farmacologia. Helena Serra Azul Monteiro
(Orientadora). Depto. de Fisiologia e Farmacologia – Faculdade de Medicina - UFC.
Palavras-Chave: Bothrops insularis, veneno, nefrotoxicidade, trombina-like.
Agradecimentos: apoio financeiro do CNPq e CAPES.
O trabalho objetiva avaliar os efeitos nos padrões fisiológicos e
histopatológicos renais causados pela fração trombina-like do veneno de Bothrops
insularis (BiT), em rim isolado de rato. Os rins de ratos Wistar (260-300gr; n=6)
foram perfundidos em sistema de rim isolado, segundo metodologia descrita por
Fonteles, M.C. et al., Am. J. Physiol., 244, p.235, 1983. Os resultados do grupo
controle (C) foram comparados aos do grupo tratado com BiT (10µg/mL). Os dados
foram analisados por teste t de Student com *p<0,05. Para o estudo histopatológico,
os rins perfundidos foram seccionados em cortes de 5μm e corados com HE. O
grupo tratado com BiT apresentou um aumento da pressão de perfusão aos 60min,
seguido de redução aos 120min (C
120
=110,28±3,69; BiT
120
=99,5 ± 5,5 mmHg*);
aumento da resistência vascular renal (C
90
= 5,32 ± 0,57; BiT
90
= 6,83 ± 1,06
mmHg/mL.g
-1
.min
-1
*); redução do fluxo urinário (C
120
= 0,160±0,020; BiT
120
= 0,039
±0,005 mL.g
-1
.min
-1
*) e redução do ritmo de filtração glomerular (C
120
= 0,697 ±
0,084; BiT
120
= 0,151 ± 0,022 mL.g
-1
.min
-1
*); os percentuais de transporte tubular de
sódio e cloreto diminuiram. A histopatologia evidenciou achados sugestivos de
necrose tubular aguda e a presença de deposição proteinácia no espaço de
Bowman e nos túbulos proximais e distais. Como conclusão, verificou-se que a
fração trombina-like purificada do veneno da serpente de Bothrops insularis (BiT)
alterou os parâmetros renais, possivelmente por modificação do controle vascular
renal e danos celulares diretos, como necrose tubular aguda.
236
ANEXO I
Trabalho Apresentado no: XX Reunião Anual da Federação de Sociedades
de Biologia Experimental (FeSBE 2005)
XX Reunião Anual da Federação de Sociedades de Biologia Experimental, XXX
Congresso Brasileiro de Biofísica, XL Congresso Brasileiro de Fisiologia, XXXVII
Congresso Brasileira de Farmacologia e Terapêutica Experimental, XXI Congresso
Brasileiro de Investigação Clínica e XXIX Congresso Brasileiro de Neurociências e
Comportamento, realizado em Águas de Lindóia, SP Brasil entre 24 e 27 de agosto
de 2005.
Título: Alteraçes Renais Induzidas pela L-aminoáido-oxidase (LAAO) do veneno
Bothrops insularis.
- Toxicologia
43.001
ALTERAÇÕES RENAIS INDUZIDAS PELA L-AMINOÁIDO-OXIDASE (LAAO) DO
VENENO BOTHROPS INSULARIS. 1 Maia, D.G. ; 2 Braga, M D M ; 1 Barbosa, P. S.
F. **; 1 Evangelista, I.L. **; 3 Toyama, M. H. ; 3 Toyama, D. O. **; 1 Martins, RD **; 1
Alves, RS **; 4 Porto, M.A. *; 1 Capelo, P.A.O. *; 5 Fonteles, M. C. ; 1 Martins, A. M.
C. ; 1 Monteiro, H. S. A. ; 1 Fisiologia e Farmacologia, UFC; 2 Patologia e Medicina
Legal, UFC; 3 Bioquímica, UNICAMP; 4 Farmácia e Farmacologia, UFC; 5 Instituto
de Ciências Biólogas, UEC
Objetivo: Avaliar os efeitos causados pela LAAO do veneno da Bothrops insularis
(BiLA), em rim
isolado de rato.
Métodos e Resultados: Utilizamos rins de ratos Wistar (260-300gr; n=6) perfundidos
segundo técnica descrita por Fonteles, M.C. et al, Am. J. Physiol., 244, p.235, 1983.
Para o estudo histopatológico os rins perfundidos foram seccionados em cortes de
5μm e corados com HE. Os resultados do grupo controle (C), onde os rins foram
perfundidos com a solução de Krebs-Hanseleit modificada com 6g% de albumina,
foram comparados aos do grupo tratado (com BiLA 10Lg/ml) adicionada 30 minutos
após o iníio do experimento. Os experimentos tiveram duração de 120 minutos. Os
resultados foram analisados por teste t de Student com *p<0,05. O grupo em que o
rim foi tratado com a BiLA apresentou uma diminuição da pressão de perfusão
(C120=110,28?,69;BiLA120=82,2?,6 mmHg*), da resistência vascular renal
(C120=5,48?,53;BiLA120=4,12?,42 mmHg/mL.g-1.min-1*); do fluxo urinário
(C120=0,160?,020; BiLA120=0,064?,012 mL.g-1.min-1*), do ritmo de filtra誽o
glomerular (C120=0,697?,084; BiLA120=0,176?,017 mL.g-1.min-1*); e no transporte
tubular de sódio e cloreto. Na histopatologia observou-se deposição proteinácea
acentuada nos túbulos proximais, distais e no espaço de Bowman. Extravasamento
foi observado em 40% dos 108 glomérulos contados em 10 campos de grande
aumento (40X) por lâmina.
Conclusões:
A L-aminoáido-oxidase da Bothrops insularis reduziu todos os parâmetros renais,
além de alterar a permeabilidade capilar glomerular.
237
ANEXO J
Trabalho Apresentado no: XX Reunião Anual da Federação de Sociedades de
Biologia Experimental (FeSBE 2005)
XX Reunião Anual da Federação de Sociedades de Biologia Experimental, XXX
Congresso Brasileiro de Biofísica, XL Congresso Brasileiro de Fisiologia, XXXVII
Congresso Brasileira de Farmacologia e Terapêutica Experimental, XXI Congresso
Brasileiro de Investigação Clínica, XXIX Congresso Brasileiro de Neurociências e
Comportamento. realizado em Águas de Lindóia, SP Brasil entre 24 e 27 de agosto
de 2005.
Título: Alterações Renais Induzidas Pela Trombina Like do Veneno da Bothrops
Insularis.
43.027
ALTERAÇÕES RENAIS INDUZIDAS PELA TROMBINA LIKE DO VENENO DA
BOTHROPS INSULARIS. 1 Porto, M.A. ; 2 Braga, M D M ; 3 Barbosa, P. S. F. **; 3
Evangelista , J. S. A. M. **; 4 Toyama, M. H. ; 4 Toyama, D. O. **; 3 Abreu, J. P. S. *;
3 Martins, R. D. **; 3 Alves, R. S. **; 2 Menezes, D. B. ; 5 Fonteles, M. C. ; 1 Martins,
A. M. C. ; 3 Monteiro, H. S. A. ; 1 Departamento de Fisiologia e Farmacologia, UFC;
2 Patologia e Medicina Legal, UFC; 3 Fisiologia e Farmacologia, UFC; 4 Bioquímica,
UNICAMP; 5 Instituto de Ciências Biológicas, UEC
Objetivo: Avaliar os efeitos fisiológicos e histopatológicos causados pela trombina
like (BiT), isolada do veneno da Bothrops insularis, em rim isolado de rato. Métodos
e Resultados: Utilizamos rins de ratos Wistar (260-300g; n=6) perfundidos segundo
técnica descrita por Fonteles, M.C. et al, Am. J. Physiol., 244, p.235, 1983. Para o
estudo histopatológico os rins perfundidos foram conservados, seccionados em
cortes de 5μm e corados com HE. Os resultados do grupo controle (C), onde os rins
foram perfundidos com a solução de Krebs-Hanseleit modificada com 6g% de
albumina, foram comparados ao grupo tratado com BiT (10Lg/mL) adicionada 30 min
após o início do experimento com dura誽o de 120 min. Os resultados foram
analisados por teste t de Student com *p<0,05. O grupo em que os rins foram
tratados com a BiT apresentou um aumento da pressão de perfusão aos 60min
seguido de redução aos 120min (C120=110,28?,69; BiT120=99,5?,5 mmHg*);
aumento da resistência vascular renal (C90=5,32?,57; BiT90=6,83?,06 mmHg/mL.g-
1.min-1*); enquanto que o fluxo urinário (C120=0,160?,020; BiT120=0,039?,005
mL.g-1.min-1*) e o ritmo de filtrado glomerular reduziram (C120=0,697?,084;
BiT120=0,151?,022 mL.g-1.min-1*); os percentuais de transporte tubular de sódio e
cloreto diminuiram. A histopatologia mostrou áreas focais corticais com células de
núcleos picnóticos característicos de necrose tubular aguda; deposição proteinácea
no espaço de Bowman e nos túbulos proximais e distais. Extravasamento foi
observado em 73% dos 97 glomérulos contados em 10 campos de grande aumento
(40X) por lâmina.
Conclusões: Trombina like purificada do veneno da serpente de Bothrops insularis
(BiT) alterou todos os
parâmetros renais, possivelmente por danos celulares diretos como necrose tubular
aguda.
238
ANEXO K
Trabalho Apresentado no: XX Reunião Anual da Federação de Sociedades de
Biologia Experimental (FeSBE 2005)
XX Reunião Anual da Federação de Sociedades de Biologia Experimental, XXX
Congresso Brasileiro de Biofísica, XL Congresso Brasileiro de Fisiologia, XXXVII
Congresso Brasileira de Farmacologia e Terapêutica Experimental, XXI Congresso
Brasileiro de Investigação Clínica, XXIX Congresso Brasileiro de Neurociências e
Comportamento, realizado em Águas de Lindóia, SP Brasil entre 24 e 27 de agosto
de 2005.
Título: Alterações Renais Induzidas pela Lectina do Veneno da Bothrops insularis.
43.033
ALTERAÇÕES RENAIS INDUZIDAS PELA LECTINA DO VENENO DA BOTHROPS
INSULARIS. 1 Martins, A. M. C. ; 2 Braga, M D M ; 3 Barbosa, P. S. F. **; 3 Sousa,
T. M. **; 4 Toyama, M. H. ; 4 Toyama, D. O.; 3 Martins, RD **; 3 Alves, RS **; 3
Germano, D. *; 2 Menezes, D. B. ; 3 Moura Filho, F.J.R. *; 5 Fonteles, M. C. ; 3
Monteiro, H. S. A. ; 1 Análises Clínicas e Toxicológicas, UFC; 2 Patologia e Medicina
Legal, UFC; 3 Fisiologia e Farmacologia, UFC; 4 Bioquímica, UNICAMP; 5 Ciências
Biológicas, UEC
Objetivo: Avaliar os efeitos causados pela lectina (BiLc) purificada, do veneno da
Bothrops insularis, em rim isolado de rato. Métodos e Resultados: Utilizamos rins de
ratos Wistar (260-300gr; n=6) perfundidos segundo técnica descrita por Fonteles,
M.C. et al, Am. J. Physiol., 244, p.235, 1983. Para o estudo histopatológico os rins
perfundidos foram seccionados em cortes de 5μm e corados com HE. Os resultados
do grupo controle (C), onde os rins foram perfundidos com a solução de Krebs-
Hanseleit modificada com 6 g% de albumina, foram comparados ao grupo tratado
(com BiLc,10Lg/ml) adicionada 30 minutos após o início do experimento com
duração de 120 min. Os resultados foram analisados por teste t de Student com
*p<0,05. A lectina apresentou uma diminuição da pressão de perfusão (C120=110,28
?,7;BiLc120=100,0?,2 mmHg*); do fluxo urinário (C120=0,160?,020;
BiLc120=0,082?,008 mL.g-1.min-1*); e do ritmo de filtração glomerular
(C120=0,697?,084; BiLc120= 0,394?,063 mL.g-1.min-1*); aumentou os percentuais
de transporte tubular de sódio e potássio. O histopatológico mostrou áreas focais
corticais de necrose tubular aguda; deposição proteinácea nos túbulos proximais,
distais e no espaço de Bowman. Extravasamento foi observado em 36% dos 129
glomérulos contados em 10 campos de grande aumento (40X) por lãmina.
Conclusões: A lectina da B. insularis promoveu alterações em todos os parâmetros
renais estudados; induziu aumento na permeabilidade capilar glomerular por
nefrotoxicidade direta.
239
ANEXO L
Trabalho aceito para publicação na revista Toxicon em 10/02/2006.
Purification and biological effects of C-type lectin isolated from Bothrops
insularis venom
---------- Forwarded message ----------
From: [email protected] <[email protected] >
Date: 10/02/2006 06:37
Subject: Your Submission
Ms. Ref. No.: TOXCON-D-06-00037
Title: Purification and biological effects of C-type lectin isolated from Bothrops
insularis venom
Toxicon
Dear Alice,
I am pleased to confirm that your paper "Purification and biological effects of C-
type lectin isolated from Bothrops insularis venom" has been accepted for
publication in Toxicon.
Comments from the Editor and Reviewers can be found below.
Thank you for submitting your work to this journal.
With kind regards,
Alan Harvey
Receiving Editor
Toxicon
Comments from the Editors and Reviewers:
Dear Prof Monteiro
MS 06-44
I am pleased to tell you that your paper has been accepted for publication in
Toxicon. It has been sent to the publishers and you will receive proofs in due
course.
Yours sincerely
Alan Harvey
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