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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
Luzia Kalyne Almeida Moreira Leal
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Luzia Kalyne Almeida Moreira Leal
CONTRIBUIÇÃO PARA A VALIDAÇÃO DO USO MEDICINAL
DE Amburana cearensis (CUMARU): ESTUDOS
FARMACOLÓGICOS COM O ISOCAMPFERÍDIO E O
AMBUROSÍDIO
Tese submetida à Coordenação do Curso de
Pós-Graduação em Farmacologia, da
Universidade Federal do Ceará, como requisito
parcial para obtenção do grau de Doutor em
Farmacologia.
Orientador: Profa. Dra. Glauce Socorro de
Barros Viana
FORTALEZA
2006
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Luzia Kalyne Almeida Moreira Leal
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Tese submetida à Coordenação do Curso de
Pós-Graduação em Farmacologia, da
Universidade Federal do Ceará, como requisito
parcial para obtenção do grau de Doutor em
Farmacologia.
Aprovada em 10/03/2006
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________
Profa. Dra. Glauce Socorro de Barros Viana (Orientador)
Universidade Federal do Ceará - UFC
_______________________________________
Prof. Dr. Isac Almeida de Medeiros
Universidade Federal da Paraíba - UFPB
_______________________________________
Prof. Dr. Antonio José Lapa
Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP
_______________________________________
Prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao
Universidade Federal do Ceará – UFC
_______________________________________
Prof. Dr. Pedro Jorge Caldas Magalhães
Universidade Federal do Ceará – UFC
Dedico,
À DEUS e a MARIA, nossa mãe em CRISTO.
A Eles toda a glória, honra e louvor.
Obrigada por tantas alegrias.
AOS MEUS PAIS
Franscisco Soares e Gizela Almeida
Sempre dedicados a minha formação espiritual e intelectual.
Obrigada pelo sorriso e pelo brilho nos olhos a cada conquista.
AO MEU MARIDO
Giovani Leal
Pela cumplicidade, paciência, presença e
dedicação a mim e as nossas filhas
ÀS MINHAS FILHAS
Luana e Letícia
Presentes concedidos por Deus nessa vida.
À MESTRE
Profa. Dra. Glauce Viana,
Por me contagiar com seu entusiasmo e alegria pela Pesquisa Científica.
........ com muito carinho
AGRADECIMENTOS
À Profa. Dra. Glauce S. B. Viana, pela sua orientação, empenho, confiança, paciência e
amizade na realização desse trabalho;
Aos Professores e funcionários do Departamento de Farmácia - UFC, pela compreensão
durante o meu afastamento;
Ao Prof. Dr. Edilberto Silveira, um amigo trazido pelos estudos de A. cearensis, pelas críticas
e o apoio à minha vida profissional;
Ao Prof. Dr. Francisco José de Abreu Matos, pela confiança depositada desde o início dos
estudos de A. cearensis. Sua amizade e gentilezas são constantes;
Aos Profs. Drs. Pedro Jorge Caldas Magalhães e Vietla Satyanarayana Rao, pela doação de
seus conhecimentos e pelos incentivos constantes;
Ao Kirley M Canuto, parceiro responsável pelos estudos químicos de A. cearensis, por seus
esforços procurando sempre nos atender a cada solicitação;
Aos queridos bolsistas envolvidos nesse ou em outros projetos: Fábio Azevedo, Kassiane
Costa, Noé Fonseca, Kamyla Fonseca, Viviane Moreira, Melina Fechine, Franciane Vilela,
André Barbosa e Cristiane Lucas, pela dedicação e colaboração inestimáveis, além da
agradável relação ensino-aprendizagem;
À Profa. Dra. Márcia Pitombeira pela colaboração nas análises histopatológicos;
Ao Prof. Dr. Osório Viana, pelo seu bom humor e auxílio na preparação dos artigos;
Aos Profs. Drs. Andrelina Noronha e Hélio Vieira que me iniciaram no universo da Pesquisa
Científica;
À Vilani R. Bastos, Juvênia B. Fontenele, Jaqueline Viana e Antonio R. Nava, amigos
sempre presentes, por tudo;
Aos companheiros (as) Silvânia Vasconcelos, Marta Fonteles, Augusta Ferreira, Cléa
Sousa, Vera Lobo, Geanne Cunha, Flávio Maia, Danielle Macedo, Hélio Vitoriano, Cícero
Felipe, Lissiana Magna, Gisley, Lívia e a todos os demais que formam o Laboratório de
Neurofarmacologia, pelo convívio agradável e colaborações em muitos momentos;
Aos Funcionários do Departamento de Farmacologia, Joana, Aura, Silvia, Marta, Rejane,
Ana Eclésia, Patrícia, Vanda, Rose, Íris, “Chiquinho” e Bento, pela convívio agradável e as
gentilezas;
À Profa. Dra. Nylane Alencar, Dra. Artemísia Portela e Dra. Feb Gemima, pelo auxílio na
aquisição de animais;
A todos que formam o Laboratório de Produtos Naturais, em especial a Profa. Dra. Flávia
Almeida Santos, sempre solícita;
Ao Centro de Hematologia e Hemoterapia do Ceará, particularmente ao amigo Marcos
Antônio M. da Silva e a Dra. Acy Teles Quixadá; pela viabilização dos estudos com sangue
humano;
Ao Laboratório de Oncologia Experimental, em particular aos Profs. Drs. Manoel Odorico de
Moraes Filho, Letícia Veras Costa Lotufo e Cláudia do Ó Pessoa, pelo apoio nos estudos em
células hepáticas;
À Fundação Cearense de Amparo á Pesquisa (FUNCAP), pelo apoio financeiro;
Enfim, a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização desse trabalho.
SER FELIZ
Ser feliz não é ter um céu sem tempestades, caminhos sem acidentes, trabalhos sem fadigas,
relacionamentos sem decepções.
Ser feliz é encontrar força no perdão, esperança nas batalhas, segurança no palco do medo,
amor nos desencontros.
Ser feliz não é apenas valorizar o sorriso, mas refletir sobre a tristeza.
Não é apenas comemorar o sucesso, mas aprender lições nos fracassos.
Não é apenas ter júbilo nos aplausos, mas encontrar alegria no anonimato.
Ser feliz é reconhecer que vale a pena viver a vida, apesar de todos os desafios,
incompreensões e períodos de crise.
Ser feliz é deixar de ser vítima dos problemas e se tornar um autor da própria história.
É agradecer a Deus a cada manhã pelo milagre da vida.
Ser feliz é não ter medo dos próprios sentimentos.
É saber falar de si mesmo. É ter coragem para ouvir um “não”.
É ter segurança para ouvir uma crítica mesmo que injusta.
É beijar os filhos, curtir os pais e ter momentos poéticos com os amigos, mesmo que eles nos
magoem.
É ter naturalidade para falar “eu errei”.
É ter ousadia para dizer, “me perdoe” é ter sensibilidade para expressar “eu preciso de
você”.
É ter capacidade de dizer “eu te amo”.
Ser feliz não é ter uma vida perfeita. Mas, usar as lágrimas para irrigar a tolerância;
Usar as perdas para refinar a paciência.
Usar as falhas para esculpir a serenidade.
Usar a dor para lapidar o prazer.
Usar os obstáculos para abrir as janelas da inteligência.
Jamais desista de si mesmo.
Jamais desista das pessoas que você ama.
Jamais desista de ser feliz, pois a vida é um espetáculo imperdível.
E você é um ser humano especial.
(autor desconhecido)
SUMÁRIO
Lista de Abreviações
12
Lista de Figuras
16
Lista de Tabelas
20
Resumo
21
Abstract
23
1. INTRODUÇÃO
1.1. Pesquisa de Plantas Medicinais: inovações tecnológicas e a biodiversidade
brasileira
26
1.2. Amburana cearensis A. C. Smith 27
• Descrição botânica, distribuição geográfica e etnofarmacologia
27
• Composição química de A. cearensis
29
• Toxicologia pré-clínica A. cearensis
30
• Farmacologia pré-clínica A. cearensis
32
1.3. Compostos fenólicos de A. cearensis: isocampferídio e amburosídio A 33
1.4. O Processo Inflamatório 37
• Inflamação e Migração Celular
38
• Leucócitos Polimorfonucleares: neutrófilos
40
• Inflamação e Marcadores Enzimáticos: mieloperoxidase e elastase
41
1.5. Inflamação e Estresse Oxidativo 45
1.6. Músculo Liso das Vias Aéreas 49
1.7. Papel da Inflamação e do Músculo liso das Vias Aéreas na Asma 52
1.8. Farmacoterapia da Asma 55
2. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS
2.1. Justificativa 58
2.2. Objetivos geral e específicos 60
3. MATERIAS E MÉTODOS
3.1. Materiais 62
• Material botânico
62
• Isocampferídio e Amburosídio A isolados de A. cearensis
62
• Animais
62
• Sangue humano
62
• Drogas
63
• Composição das Soluções
63
3.2. Métodos
3.2.1. Estudo Químico - isolamento do isocampferídio e do amburosídio A das
cascas do caule de A. cearensis
66
3.2.2. Avaliação dos efeitos gerais - teste hipocrático. 69
3.2.3. Teste de citotoxicidade 69
• Cultura de hepatócitos de ratos
69
• Isolamento de Hepatócitos.
69
• Condições de cultivo.
70
• Teste do MTT
70
3.2.4. Avaliação da atividade antiinflamatória em modelos experimentais in vivo e
in vitro
71
• Edema de pata induzido por carragenina em ratos
71
• Edema de pata induzido por dextrano, prostaglandina E
2
, histamina,
serotonina ou bradicinina em camundongos
71
• Aumento da permeabilidade vascular induzida por dextrano em pata de
camundongos
72
• Peritonite induzida por carragenina ou N-Formil-metionil-leucil-fenilalanina
72
(fMLP) em camundongos
• Efeito do ICPF e do AMB sobre a desgranulação leucocitária, mensurado
pela atividade das enzimas mieloperoxidase (MPO) e elastase
73
3.2.5. Hepatotoxicidade e estresse oxidativo induzido por CCL
4
em ratos 74
• Avaliação da Função Hepática: Alanina Transaminase (ALT) e Aspartato
transaminase (AST)
74
• Análise Histopatológica
75
• Medida dos níveis de lipoperoxidação no tecido hepático – dosagem de
substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS)
75
• Dosagem de catalase no fígado
75
• Dosagem de Glutationa Reduzida (GSH) – determinação de grupos
sulfidrílicos (-SH) não protéicos.
76
• Determinação do conteúdo de proteína.
76
3.2.6. Avaliação do efeito do ICPF sobre contratilidade da musculatura lisa traqueal
de cobaia
76
3.2.7. Análise estatística 78
4. RESULTADOS
4.1. Avaliação preliminar das toxicidades do isocampferídio (ICPF) e do
amburosídio A (AMB) isolados de Amburana cearensis A.C. Smith
80
• Efeitos gerais do ICPF e do AMB - teste hipocrático em camundongos
80
• Avaliação das citotoxicidades do ICPF e do AMB em hepatócitos de ratos.
80
4.2. Determinação das atividades antiinflamatórias do isocampferídio (ICPF) e do
amburosídio A (AMB) isolados de A. cearensis A.C. Smith
82
• Edema de pata induzido por Carragenina
82
• Edema de pata induzido por dextrano
82
• Edema de pata induzido por prostaglandina E
2,
histamina, serotonina e
bradicinina
89
4.2.3. Peritonite induzida por carragenina ou fMLP em camundongos 92
4.2.4. Efeito do ICPF e do AMB na desgranulação de neutrófilos induzida pelo
fMLP em sangue humano: atividades das enzimas mieloperoxidase (MPO) e
elastase
98
4.3. Avaliação das atividades hepatoprotetora e antioxidante do amburosídio A
(AMB) isolado de A. cearensis A.C. Smith na hepatotoxicidade induzida pelo
CCl
4
em ratos
98
• Determinação do efeito do amburosídio A sobre os níveis séricos das
enzimas transaminases (ALT/TGP e AST/TGO)
102
• Determinação do efeito do amburosídio A sobre a peroxidação lipídica
102
• Determinação do efeito sobre os níveis de glutationa reduzida
102
• Determinação do efeito do amburosídio A sobre a atividade da Catalase
106
• Análise histopatológica do fígado de animais submetidos ao tratamento com
amburosídio A
106
4.4. Avaliação do efeito do ICPF e do AMB sobre a contratilidade da musculatura
lisa traqueal de cobaia
106
5. DISCUSSÃO
123
6. CONCLUSÕES
141
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
144
8. PUBLICAÇÕES
176
LISTA DE ABREVIAÇÕES
ALT/TGP
alanina transaminase/transaminase glutâmica pirúvica
AMB
amburosídio A
AMPc
adenosina 3’,5’-monofosfato cíclico
4-AP
4-aminopiridina
AP-1
proteína ativadora-1
AST/TGO
aspartato transaminase/transaminase glutâmico oxalacética
Boc-Ala-OphNO
2
n-t-butoxicarbonil-l-alanina-p-nitrofeniléster
CCh
carbacol
CCl
4
tetracloreto de carbono
CE
50
concentração efetiva equivalente a 50% da resposta máxima
CEPA
comissão de ética e pesquisa animal
Cg
carragenina
ChTX
charibidotoxina
CLAE/UV
cromatografia líquida de alta eficiência/detector ultra violeta
COBEA
colégio brasileiro de experimentação animal
COX
ciclooxigenase
CYP2A6
isoforma da enzima citocromo p450
DAG
diacilglicerol
DEXA
dexametasona
DL50
dose letal para 50% dos animais
D-MEM
meio eagle Dulbecco’s modificado
DMSO
dimetilsulfóxido
DPOC
doença pulmonar obstrutiva crônica
DSF
desferrioxamina
DTNB
5,5’-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)
Dx
dextrano
ECA
enzima conversora de angiotensina
EDTA
etilenodiaminotetracético
EHA
extrato hidroalcoólico
fMLP
n-formil-metil-leucil-fenilalanina
FPR
receptor peptídio formil
Gc
guanilato ciclase
Glib
glibenclamida
GM-CSF
fator alfa de crescimento de colônia de granulócitos e monócitos
GMPc
guanosina 3’,5’- monofosfato cíclico
GSH
glutationa reduzida
γ-GCS-HS
gama-glutamil cisteína sintetase
GPx
glutationa peroxidase
GSSG-RD
glutationa redutase
GSSG
glutationa oxidada
HBSS
solução salina de Hanks
HE
hematoxilina-eosina
IbTX
iberiotoxina
ICAM-1
molécula de adesão intercelular-1
ICPF
isocampferídio
IgE
imunoglobulina E
IκB
proteína inibidora do NF-κB
IL
interleucina
INDO
indometacina
IP
3
inositol trifosfato
IUCN
união internacional para conservação da natureza
KCl
cloreto de potássio
LDH
lactato desidrogenase
L-NAME
N
G
-nitro-L-argenina metil éster
LPS
lipopolissacarídeo
LTB
4
Leucotrieno B
4
LTC
4
leucotrieno C
4
LTD
4
leucotrieno D
4
LTE
4
leucotrieno E
4
MAP
proteína ativada por mitógeno
MAPK
(proteína ativada por mitógeno) quinase
MCP-1
proteína quimioatraente de monócitos - 1
MDA
malonildialdeído
MDH
malato desidrogenase
MIP-1α
proteína inflamatória do macrófago-1α
MPO
mieloperoxidase
MTT
brometo 3[4,5dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio
NAC
n-acetil-l-cisteína
NADPH
nicotinamida adenina dinuclotídio - p reduzido
NF-κB
fator nuclear kappa b
O
2
-
ânion superóxido
ODQ
1H-[1,2,4]oxadiazolol [4,3-a] quinoxalin-1-one
OmpA
outer membrane protein A
ON
óxido nítrico
ONS
óxido nítrico sintase
PAF
fator ativador de plaquetas
PBS
solução salina tamponada com fosfato (phosphate buffer solution)
PDE
Fosfodiesterase
PGs
Prostaglandinas
PIP
2
fosfatidilinositol-4,5-difosfato
PKC
proteína quinase C
PKG
proteína quinase G
PLC
fosfolipase C
PMNs
Polimorfonucleares
RAI
resposta alérgica inicial
RAT
resposta alérgica tardia
RANTES
regulada por meio de ativação expressa e secretada por células T
normais
RNS
espécies reativas de nitrogênio
ROS
espécies reativas de oxigênio
SARA
síndrome da angústia respiratória aguda
SBF
soro bovino fetal
SOD
superóxido-dismutase
SOD-Mn
superóxido-manganês
SPLI
inibidor de secreção de leucoprotease
TBARS
espécies reativas do ácido tiobarbitúrico
TGF-β
fator de crescimento transformador β
TMB
3, 3’,3, 5’-tetrametilbenzidina
TNF-α
fator de necrose tumoral α
VCAM-1
molécula de adesão da célula vascular - 1
LISTA DE FIGURAS
1
Amburana cearensis A. C. Smith 28
2
Metabólitos secundários obtidos das cascas do caule de A. cearensis. 31
3
Estrutura química de algumas classes de flavonóides 35
4
Migração quimiotática de neutrófilos através de um gradiente de
quimiocinas até o sítio de inflamação ou infecção
39
5
Estimulação de neutrófilos. 41
6
Formação de espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio a partir de
reações com o HOCl, produto da enzima mieloperoxidase.
43
7
Representação esquemática da geração de ROS e suas dismutações. 47
8
Ativação de fatores de transcrição NF-κB e AP-1 por oxidantes, estímulos
ambientais e/ou citocinas alteram os níveis de GSH/GSSG que levam a
indução de genes pró-inflamatórios e antiinflamatórios em células
pulmonares.
48
9
Resposta Alérgica Inicial (EAR), Tardia (LAR) e Remodelamento das Vias
Aéreas na Asma
54
10
Esquema de fracionamento do extrato etanólico de Amburana cearensis
para o isolamento do isocampferídio (ICPF) e do amburosídio A (AMB)
67
11
Avaliação da citotoxicidade do isocampferídio (ICPF) e do amburosídio A
(AMB) em hepatócitos de ratos.
81
12
Atividade antiedematogênica do isocampferídio (ICPF) e do amburosídio A
(AMB) sobre o edema de pata induzido por carragenina em ratos.
83
13a-c
Micrografia ilustrando os efeitos do isocampferídio (ICPF), amburosídio
(AMB) e indometacina (INDO) sobre o edema de pata induzido por
carragenina (Cg) em ratos.
84
14
Avaliação morfométrica do exsudato induzido por carragenina (Cg) na pata
de rato, considerando o efeito do isocampferídio (ICPF) e do amburosídio A
(AMB) e indometacina.
87
15
Efeito do amburosídio A (AMB) sobre o edema de pata (A) e o
extravasamento vascular (B) induzidos por dextrano em camundongos.
88
16
Efeito do isocampferídio (ICPF) sobre o edema (A) e o extravasamento
vascular (B) induzidos por dextrano em camundongos.
90
17
Atividade antiedematogênica do isocampferídio (ICPF) e do amburosídio A
(AMB) sobre o edema de pata induzido por prostaglandina E
2
(PGE
2
) em
camundongos.
91
18
Atividades antiedematogênicas do isocampferídio (ICPF) e do amburosídio
A (AMB) isolados de Amburana cearensis sobre o edema de pata induzido
por histamina em camundongos.
93
19
Atividades antiedematogênicas do isocampferídio (ICPF) e do amburosídio
A (AMB) sobre o edema de pata induzido por serotonina em camundongos
94
20
Avaliação dos efeitos do isocampferídio (ICPF) e do amburosídio A (AMB)
sobre o edema de pata induzido por bradicinina em camundongos.
95
21
Efeitos do isocampferídio (ICPF) e do amburosídio A (AMB) na migração
de leucócitos induzida por carragenina (Cg) na cavidade peritoneal de
camundongos.
96
22
Efeitos do isocampferídio (ICPF) e do amburosídio A (AMB) na migração
de leucócitos induzida por fMLP na cavidade peritoneal de camundongos.
97
23
Efeitos do isocampferídio (ICPF) e do amburosídio A (AMB) na
degranulação de neutrófilos humano estimulados pelo fMLP, determinados
pela atividade da mieloperoxidase (MPO).
99
24
Efeitos do isocampferídio (ICPF) e do amburosídio A (AMB) na
degranulação de neutrófilos humano estimulados pelo fMLP, determinados
pela atividade da elastase.
100
25
Avaliação da citotoxicidade do isocampferídio (ICPF) e do amburosídio A
(AMB) em neutrófilos isolados de sangue humano.
101
26
Efeito do amburosídio A (AMB) sobre a peroxidação lipídica, detreminada
pelos níveis de substâncias reativas com ácido tiobarbitúrico-TBARS em
fígado de ratos tratados com tetracloreto de carbono (CCl
4
).
104
27
Efeito do amburosídio A (AMB) sobre a redução no nível de glutationa 105
reduzida (GSH) induzida pelo tetracloreto de carbono (CCl
4
) em fígado de
ratos
28
Efeito do amburosídio A (AMB) sobre a atividade da catalase em fígado de
ratos tratados com tetracloreto de carbono (CCl
4
)
107
29a,b
Fotomicrografia ilustrando o efeito do amburosídio A (AMB) sobre a
hepatotoxicidade induzida pelo tetracloreto de carbono (CCl
4
) em ratos
108
30
Curva concentração-resposta do efeito relaxante do isocampferídio (ICPF),
teofilina ou veículo (solução aquosa de Tween 80: 0,0024 – 0,24%) em
traquéia isolada de cobaia pré-contraída por carbacol (CCh)
110
31
Fotomicrografia ilustrando a traquéia de cobaia com (A) e sem epitélio (B).
Curva concentração-resposta relaxante do isocampferídio (ICPF) em
traquéia com ou sem epitélio pré-contraída por carbacol (CCh)
113
32
Curva concentração-resposta do efeito relaxante do amburosídio A (AMB)
em traquéia com ou sem epitélio pré-contraída por carbacol (CCh)
114
33
Curva concentração-resposta do efeito relaxante do isocampferídio (ICPF)
em traquéia com epitélio isolada de cobaia e pré-contraída por carbacol
(CCh) na ausência (controle) ou na presença do L-NAME (100 µM)
115
34
Curva concentração-resposta do efeito relaxante do isocampferídio (ICPF)
em traquéia isolada de cobaia sem epitélio e pré-contraída por carbacol
(CCh) na ausência (controle) ou na presença do L-NAME (100 µM)
116
35
Curva concentração-resposta do efeito relaxante do isocampferídio (ICPF)
na traquéia isolada de cobaia pré-contraída por carbacol (CCh) na ausência
(controle) ou na presença do ODQ
117
36
Curva concentração-resposta do efeito relaxante do isocampferídio (ICPF)
em traquéia isolada de cobaia pré-contraída por KCl (40 ou 120 mM) na
ausência ou na presença da glibenclamida (Glib, 33 µM)
119
37
Curva concentração-resposta do efeito relaxante do isocampferídio (ICPF)
na traquéia isolada de cobaia pré-contraída por KCl (40 mM) em ausência
(controle) ou na presença da iberiotoxina (IbTX, 0,1 µM) ou 4-
aminopiridina (4-AP, 100 µM)
120
38
Curva concentração-resposta do efeito relaxante do isocampferídio (ICPF) 121
em traquéia isolada de cobaia pré-contraída por carbacol (CCh) na ausência
(controle) ou na presença do propranolol (1 µM)
39
Curva concentração-resposta do efeito relaxante do isocampferídio (ICPF)
em traquéia isolada de cobaia pré-contraída por carbacol (CCh) na ausência
(controle) ou na presença da capsaicina (3 µM)
122
40
Proposta para o mecanismo de ação relaxante muscular do isocampferídio
(ICPF) em traquéia isolada de cobaia.
139
41
Possíveis sítios de ações do isocampferídio (ICPF) e do amburosídio A
(AMB) isolados de A. cearensis na asma
140
LISTA DE TABELAS
1
Principais canais de potássio presentes nas vias aéreas 52
2
Solução salina tamponada com fosfato (PBS) 63
3
Solução de Turk 63
4
Solução de Albumina 3% 64
5
Tampão HBSS (Solução Salina de Hanks) 64
6
Tampão HBSS modificado 64
7
Tampão HBSS modificado concentrado 65
8
Solução de Krebs-Henseleit concentrada 65
9
Objetivos e métodos empregados nos estudos toxicológico e
farmacológico do isocampferídio (ICPF) e do amburosídio A (AMB)
isolados das cascas do caule de A. cearensis
68
10
Efeito do amburosidio A (AMB) sobre os níveis séricos das enzimas
transaminases, ALT/TGP e AST/TGO, em ratos tratados com
tetracloreto de carbono (CCl
4
)
103
11
CE50 obtida da curva concentração-resposta do efeito relaxante do ICPF
ou AMB em traquéia de cobaia pré-contraída pelo carbacol (CCh) ou
potássio (KCl)
112
RESUMO
CONTRIBUIÇÃO PARA A VALIDAÇÃO DO USO MEDICINAL DE Amburana cearensis
(CUMARU): ESTUDOS FARMACOLÓGICOS COM O ISOCAMPFERÍDIO E O
AMBUROSÍDIO. Aluna: Luzia Kalyne Almeida Moreira Leal. Orientador: Profa. Dra.
Glauce Socorro de Barros Viana. Tese de Doutorado. Programa de Pós-Graduação em
Farmacologia. Departamento de Fisiologia e Farmacologia. Universidade Federal do Ceará,
2006.
Amburana cearensis (Fabaceae) é uma árvore da caatinga nordestina, mais
conhecida popularmente como cumaru. Suas cascas (caule) possuem um cheiro característico
pela presença de cumarina, e são principalmente utilizadas no tratamento da bronquite, tosse e
asma. O presente estudo procurou investigar os efeitos tóxicos e as atividades antiinflamatória,
antioxidante e relaxante muscular do isocampferídio (ICPF, 3-metilflavonol) e/ou do
amburosídio A (AMB, glucosídio fenólico) isolados das cascas do caule de A. cearensis. A
administração intraperitoneal (i.p.) do ICPF ou do AMB em dose única (50 – 200 mg/kg)
mostrou baixa toxicidade em camundongos. Na cultura primária de hepatócitos apenas o ICPF
(100 µg/ml) reduziu significativamente a viabilidade celular, determinada pelo teste do MTT.
O ICPF e o AMB (12,5 – 50 mg/kg, i.p.) apresentaram atividade antiinflamatória, observada
inicialmente pela inibição do edema de pata induzido por carragenina-Cg, prostaglandina E
2
,
dextrano-Dx, histamina ou serotonina e pela redução em 39 e 50% respectivamente do
infiltrado de neutrófilos verificada pela análise histopatológica/morfométrica do edema
induzido por Cg. O aumento da permeabilidade vascular induzido pelo Dx em camundongos,
foi também significativamente inibido pelo ICPF ou AMB. O pré-tratamento (oral ou i.p.) dos
animais com ICPF ou AMB (25 e 50 mg/kg) causaram reduções tanto na migração de
leucócitos quanto neutrófilos induzida por Cg ou fMLP no peritônio de camundongos. O ICPF
e o AMB preveniram parcialmente a degranulação de neutrófilos humano induzida pelo fMLP,
determinada pela redução das atividades das enzimas mieloperoxidase e elastase em até 66 e
52% respectivamente. Os compostos fenólicos em estudo não foram citotóxicos para
neutrófilos (teste do MTT). O AMB mostrou uma ação hepatoprotetora/antioxidante no
modelo de hepatotoxicidade induzida pelo CCl
4
em ratos, determinada pelas enzimas
hepáticas (ALT e AST) e pela catalase, além de TBARS, glutationa reduzida e análise
histopatológica. Na traquéia isolada de cobaia o ICPF (10 – 1000 µM) e o AMB (10 – 3000
µM) relaxaram de maneira concentração-dependente o músculo pré-contraído pelo CCh ou
KCl. A remoção do epitélio traqueal favoreceu o efeito relaxante do ICPF, mas não modificou
o efeito do AMB. O relaxamento induzido pelo ICPF foi inibido em 41% pelo L-NAME; 31 e
50% pelo ODQ (3 e 33 µM); 31 % pelo propranolol e 37 % pela capsaicina. Na traquéia pré-
contraida pelo KCl (40 mM) a glibenclamida (GLB) ou iberiotoxina reduziram o efeito
relaxante do ICPF, enquanto no músculo pré-contraído pelo KCL 120 mM o efeito do ICPF
foi reduzido e não foi afetado pela GLB. Portanto, os resultados apresentados mostram que o
ICPF e o AMB possuem atividades antiinflamatória, relaxante muscular e antioxidante, o que
justifica pelo menos em parte o uso tradicional de A. cearensis no tratamento de doenças
respiratórias onde as características fisiopatológicas incluem inflamação, estresse oxidativo e
broncoconstrição.
Palavras-chave: Amburana cearensis, isocampferídio, amburosídio A, atividades
antiinflamatória, antioxidante e relaxante muscular.
ABSTRACT
CONTRIBUTION TO THE VALIDATION OF THE MEDICINAL USE OF Amburana
cearensis (CUMARU): PHARMACOLOGICAL STUDIES WITH ISOKAEMPFERIDE
AND AMBUROSIDE. Author: Luzia Kalyne Almeida Moreira Leal. Advisor: Prof. Dr.
Glauce Socorro de Barros Viana. Doctoral Thesis. Program of Pos-Graduate in Pharmacology.
Departament de Physiology and Pharmacology. Federal University of Ceará, 2006.
Amburana cearensis is a medicinal plant from Northeast Brazil popularly known as
“cumaru”. Its stem bark has an odor characteristic of the presence of coumarin, being used in
alternative medicine for the treatment of bronchitis and asthma. The present study investigated
the toxicity, as well as the anti-inflammatory, antioxidant and smooth muscle relaxant
activities of isokaempferide (IKPF, 3-metylflavonol) and amburoside A (AMB, phenolic
glucoside), bioactive constituents of the plant. The intraperitoneal administration (ip) of IKPF
or AMB, in single doses (50-200 mg/kg), showed low toxicity in mice. In primary hepatocyte
cultures, only IKPF (100 µg/ml) reduced significantly the cellular viability, as assessed by the
MTT test. ICPF and AMB (12.5- 50 mg/kg, ip) presented anti-inflammatory activities,
observed initially by inhibitions of the carrageenan (Cg), prostraglandin E
2
(PGE
2
), dextran
(Dx), histamine or serotonin-induced paw edemas. Besides, IKPF and AMB (12.5 – 50 mg/kg)
produced 39 and 50% reductions, respectively, of neutrophil migration as assessed by
histopathological/morphometric analyses of the Cg-induced paw edema. The increase of
vascular permeability induced by Dx in mice was also significantly inhibited by IKPF or
AMB. Mice pretreatments (oral or ip) with IKPF or AMB (25 and 50 mg/kg) reduced
peritoneal Cg or fMLP-induced leucocytes and neutrophil migrations. Also, IKPF and AMB
partially prevented fMLP-induced neutrophil degranulation in human blood, as determined by
the decrease in 66 and 52% of activities of the enzymes myeloperoxidase and elastase,
respectively. The two compounds were not cytotoxic for neutrophil, as assessed by the MTT
test. AMB showed hepatoprotective and antioxidant actions in the model of CCl
4
-induced
liver toxicity in rats, as determined by the liver enzymes activity (AST and ALT), catalase,
lipoperoxidation (TBARS assay), reduced glutathione, and histological analysis. In the
isolated guinea pig trachea, IKPF (10-1000 μg/ml) and AMB (10- 3000 μg/ml) produced a
concentration-dependent relaxation of the muscle precontracted by carbacol or KCl. The
epithelium removal improved IKPF-induced relaxation, but did not alter the AMB effect.
IKPF-induced relaxation was inhibited in 41% by L-NAME; 31 and 50% by ODQ (3 and 33
µM); 31% by propranolol and 37% by capsaicin. In the trachea pre-contracted by KCl (40
mM), the pre-incubation with glibenclamide or iberiotoxin, inhibited the IKPF-induced
relaxation by 39% and 38%, respectively. On the other hand, 4-aminopyridine did not
significantly influence the effect of IKPF. However, in the muscle pre-contracted with 120mM
KCl the relaxant effect of IKPF was significantly reduced and not affected by glibenclamide.
In conclusion, results showed that IKPF and AMB present anti-inflammatory, muscular
relaxant and/or antioxidant activities, justifying the traditional use of Amburana cearensis in
the treatment of respiratory tract diseases that present inflammation, oxidative stress, and
bronchoconstriction as pathophysiological characteristics.
Keywords: Amburana cearensis, isokaempferide, amburoside A, antiinflammatory,
antioxidant and muscle relaxant activities.
1. Introdução
25
INTRODUÇÃO
1
1. Introdução
26
1. INTRODUÇÃO
1.1. Pesquisa de Plantas Medicinais: inovações tecnológicas e a biodiversidade brasileira
Dos primórdios das civilizações até o fim do século XIX, as plantas medicinais
constituíram a principal fonte de medicamentos, o que pode ser ilustrado por algumas
farmacopéias, como a Farmacopéia Geral para o Reino e Domínio de Portugal (1794), onde
constam 400 espécies vegetais. Desde então a importância relativa dos produtos naturais tem
oscilado de acordo com as estratégias de grandes companhias farmacêuticas (SCHENKEL et
al., 2000; SEIDL, 2002).
Embora existam muitas substâncias sintéticas bioativas novas e as técnicas
combinatórias tenham expandido consideravelmente o número de substâncias disponíveis para
testes biológicos, existe ainda um grande número de produtos naturais no mercado
farmacêutico (SEIDL, 1999). Nos últimos anos muitas das desvantagens apontadas para a
busca de novos fármacos a partir de produtos naturais estão sendo ultrapassadas através da
aplicação de novas tecnologias úteis, por exemplo, no isolamento e elucidação estrutural de
substâncias e no desenvolvimento de métodos de screening farmacológico. Além disso, o uso
de técnicas cromatográficas combinadas, tais como Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
– Ultra Violeta (CLAE/UV), criaram novas possibilidades analíticas na padronização de
amostras complexas como os extratos vegetais (SCHENKEL et al., 2000).
O Brasil é constituído por vários biomas, possui uma diversidade de solos e climas
que certamente favorecem a riqueza e variedade de tipos de vegetação distribuídos em seus
diversos ecossistemas (CORDELL, 2000). Assim, a biodiversidade brasileira, somada ao
expressivo conhecimento etnofarmacológico oriundo da miscigenação da população
constituem uma vantagem importante no processo de desenvolvimento de programas e
projetos com plantas medicinais que visam o fortalecimento do país na área e o
aproveitamento deste recurso de maneira sustentável (SILVA et al., 2001). Há, entretanto
circunstâncias novas que devem ser levadas em consideração, como a existência de um
conjunto de normas (Medida Provisória N
o
2186-16, 2001; Ministério do Meio Ambiente-
IBAMA) destinadas ao controle do acesso à biodiversidade e às informações tradicionais.
Inclusive, recentemente foi publicado o Decreto 5459 de 07.06.2005; Presidência da
República - Casa Civil, que disciplina as sanções aplicáveis ao não atendimento das normas
legais, que pode ser tratado como caso de “biopirataria”.
No Ceará, há quase 30 anos pesquisadores têm se dedicado ao estudo multidisci
plinar da flora medicinal do Nordeste. Desse esforço já foram gerados inúmeros projetos (ex.:
1. Introdução
27
projeto Farmácias Vivas), solicitações de patentes e trabalhos publicados. Nesse processo
algumas espécies vegetais foram ou continuam sendo objetos de estudos, tais como Amburana
cearensis A. C. Smith, além de outras não menos importantes incluindo Myracrodruon
urundeuva Allemão, Cissus sicyoides L., Justicia pectoralis var stenophylla Leon e Curcuma
longa L.
1.2. Amburana cearensis A. C. Smith
• Descrição botânica, distribuição geográfica e etnofarmacologia
Amburana cearensis (Allemão) A. C. Smith (syn. Torresea cearensis Allemão),
Leguminosae-Papilionoideae (Fabaceae), é conhecida popularmente no Brasil como cumaru,
amburana, amburana de cheiro, cerejeira, cerejeira-rajada, cumuru-do-Ceará, cumaré, cumaru-
das-caatingas, cumaru-de-cheiro, imburana, imburana-de-cheiro e umburana. Na Argentina é
popularmente conhecida como palo trebol e roble (BRAGA 1976, LORENZI, 1992;
LORENZI & MATOS, 2002).
É uma arvore com até 20 m de altura (Figura 1) de tronco revestido por uma casca
espessa (ritidoma esfoliativo) que se desprende em finas lâminas delgadas deixando grandes
manchas vermelho-pardas de mistura com outras esverdeadas. As cascas do caule possuem um
cheiro característico, pela presença de cumarina, o que facilita a identificação da espécie. Suas
folhas são compostas pinadas, de folíolos elípticos, orbiculares até oblongo ou obovais, de 2-3
cm de comprimento. Os frutos tipo vagem tardiamente deiscentes, contém uma única semente
achatada e provida de uma asa membranácea. No Brasil, ocorre do Nordeste até as regiões
mais áridas de São Paulo. Na região amazônica, principalmente no Acre e Rondônia ocorre
outra espécie afim desta planta – Amburana acreana (Ducke) A. C. Smith (BRAGA 1976;
LORENZI & MATOS, 2002). Além da Argentina, Amburana cearensis é encontrada também
na Bolívia (LEITE, 2005).
Amburana cearensis raramente forma populações densas em ambientes florestais,
sendo encontrada normalmente compondo a vegetação de fazendas. Além disso, parece existir
uma variabilidade genética na espécie, embora não tenha sido ainda definido em que pontos
ocorrem tais diferenças (LEITE, 2005).
As cascas do caule bem como as sementes do cumaru são tradicionalmente
utilizadas sob a forma de chá como antiinflamatória, espasmolítica e principalmente no
tratamento da asma, tosse e bronquite. As sementes são usadas, também, como aromatizante
em substituição à fava-tonka, Dipteryx odorata (LORENZI & MATOS, 2002; CORREA,
1. Introdução
28
Figura 1. Amburana cearensis A. C. Smith. (fotos: A. G. LEAL; E. R.
SILVEIRA; LORENZI & MATOS, 2002).
1. Introdução
29
1984). Na Bolívia um grupo étnico, Chacobo, que vive numa região endêmica de malária
utiliza A. cearensis no tratamento da febre (GIMENEZ et al., 1996). As espécies do gênero
Amburana, A. cearensis e A. acreana, têm ainda importância econômica pela qualidade da sua
madeira explorada industrialmente na fabricação de móveis (KILLEEN, 1993).
A. cearensis tem sido identificada como uma
espécie sob risco de extinção pela União Internacional para
Conservação da Natureza – IUCN (American Regional
Workshop, 1996; LEITE, 2005), o que justifica o nosso
interesse em estabelecer uma fonte alternativa, espécie
cultivada, para complementar a fonte silvestre, ou até
mesmo substituí-la. Para tanto, temos realizado estudos
multidisciplinares (agronomia, química e farmacologia) com
espécimes cultivadas por 2 a 9 meses de desenvolvimento (CANUTO et al., 2004; LEAL et
al., 2004).
• Composição química de A. cearensis
Estudo fitoquímico das sementes revelou que possuem aproximadamente 23 % de
óleo fixo constituído principalmente do glicerídeo dos ácidos: palmítico (18,6%), linoléico
(7,1 %), oléico (53,1 %) e esteárico (8,0 %), além de 4 % de cumarina e um pouco de
umbeliferona (SOUSA et al., 1991; MORS & RIZZINI, 2000).
Das cascas do caule da planta coletada no município de Quixeramobin-CE, foram
isoladas várias substâncias, incluindo cumarina (1,2-benzopirona), isocampferídio (5,7-
dihidroxi-2-(4-hidroxifenil)-3-metoxi), fisetina (3,5,3`,4`-tetrahidroxiflanona), alfalona (6-
hidroxi-4´,7-dimetoxiisoflavona) e o glucosídio fenólico, amburosídio A (4-(O-β-D-
glucopiranosil)-hidroxi-7-(3’,4’-dihidroxi-benzoil)-benzilálcool) (CANUTO, 2002). Das
cascas do caule do cumaru coletado na Bolívia, Bravo et al. (1999) isolaram além da cumarina
os amburosídio A e B (4-(O-β-D-glucopiranosil)-hidroxi-7-(3’-metoxi-,4’-hidroxi-benzoil)-
benzil álcool) (Figura 2). Dentre esses compostos serão investigados no presente estudo o
isocampferídio e o amburosídio A.. O isocampferídio foi selecionado por ser o derivado
flavônico majoritário (0,07 %) na planta, além de compor a fração flavonóide bioativa (LEAL
et al., 2003a), enquanto, o amburosídio A (0,3 %) ao lado da cumarina (0,2 %) está entre os
compostos bioativos majoritários presentes nas cascas do caule do cumaru (CANUTO et al.,
2002; 2004).
Foto: cumaru cultivado
1. Introdução
30
• Toxicologia pré-clínica de A. cearensis
O estudo toxicológico agudo do extrato hidroalcoólico (EHA) das cascas do caule
do cumaru administrado por via oral (v.o.) em ratos revelou a baixa toxicidade da planta;
tendo sido observadas mortes apenas pela administração por via intraperitoneal (i.p.), cuja
DL50 foi de 1.79 ± 0.12 g/Kg. Na avaliação toxicológica sub-crônica nenhum efeito tóxico
significativo ou morte foi observado, embora o EHA (500 mg/kg, v.o.) administrado
diariamente durante 4 semanas, tenha causado um aumento nos níveis da alanina transaminase
- ALT. Foi observado também em ratos um aumento no número de neutrófilos, estando
possivelmente relacionado a algum processo inflamatório agudo adquirido pelos animais
durante o período de tratamento (LEAL et al., 2003b). A presença de cumarina na planta
possivelmente contribui para o aumento no nível de ALT observado nos animais tratados com
EHA. Isso, considerando que estudos anteriores (CARLTON et al., 1996; LAKE, 1999;
COHEN, 1979) têm mostrado que altas doses de cumarina produzem lesões hepáticas em
roedores.
A cumarina é um composto orgânico heterocíclico, aromático, encontrada em
várias espécies vegetais e foi isolada pela primeira vez de Dipteryx odorata (fava-tonka),
espécie denominada anteriormente Coumarouna odorata, daí o termo cumarina (FEUER,
1974). De acordo com a espécie animal envolvida a cumarina apresenta diferenças quanto ao
seu metabolismo e ao grau de hepatotoxicidade (COHEN, 1979; LAKE, 1999). No homem a
7-hidroxilação realizada pela CYP2A6, isoforma da enzima citocromo P-450, é a principal via
de biotransformação da cumarina no fígado, enquanto em outras espécies tais como ratos esta
é uma via secundária (GANGOLLI et al., 1974; LAKE, 1999; SHILLING et al., 1969). No
rato a hepatotoxicidade induzida pela cumarina está associada com o seu metabolismo, que
tem como produto intermediário um composto instável, 3,4-epóxido cumarina, que
transforma-se no ácido o-hidroxifenilacético, produto principal do metabolismo hepático
(BORN et al., 2000).
Há registro apenas de um caso de hepatotoxicidade induzida pela cumarina no
homem. Ocorreu com uma paciente de 33 anos com síndrome de Turner, após tratamento
durante 8 semanas com um produto contendo cumarina. A função hepática retornou ao normal
duas semanas após a interrupção do tratamento (FAURSCHOU, 1982).
Em estudo anterior (LEAL et al., 2000) demonstramos que o EHA (500 mg/kg,
v.o.) administrado diariamente durante 50 dias em ratas, não interferiu com a gestação nem
com o desenvolvimento da primeira e segunda geração dos animais Estudos (STRUWE et al.,
1. Introdução
31
OO
CO
2
H
OH
OH
CO
2
H
OH
OCH
3
O
O
OH
H
3
CO
OCH
3
O
OH
O
OH
OH
OH
O
OH
O
OH
OH
OH
OH
O
OH
O
OH
OCH
3
OH
8
R= glicose; 22, 23 di-hidro
9
R= glicose;
Δ
22,23
1
3
4
5 6
7
12
13
RO
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
-
-
-
-
O
O
OH
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
OH
2
O
OH
OH
OH
O
OH
RO
O
O
OH
10
R= H
11
R= CH
3
O
OCH
3
O
OH
OH
OH
Figura 2. Metabólitos secundários obtidos das cascas do caule de A. cearensis. 1. Cumarina , 2.
sacarose, 3. afrormosina, 4. ácido vanílico , 5. ácido protocatecuíco, 6. isocampferídio, 7.
campferol, 8. β-sitosterol glicosilado, 9. estigmasterol glicosilado, 10. amburosídio A, 11.
amburosídio B, 12. quercetina, 13. 4’-metoxifisetina (CANUTO, 2002). Os constituintes em
vermelho foram investigados no presente estudo.
1. Introdução
32
1984; ZIPPRICH et al., 1987; GARTNER et al., 1993) revelaram que a terapia
anticoagulante com derivados cumarínicos (4-hidroxicumarina), warfarin e dicumarol, durante
o inicio da gravidez pode causar malformações. Contudo, é importante registrar que a
cumarina (1,2-benzopirona) presente no cumaru não é um derivado da 4-hidroxicumarina,
classe conhecida por sua atividade anticoagulante (FEUER, 1974).
• Farmacologia pré-clínica de A. cearensis e constituintes químicos
Em estudos anteriores (LEAL, 1995; LEAL et al., 1997) demonstramos que o EHA
e a cumarina administrados por via oral possuem atividade antinociceptiva determinada
através dos modelos de contorções abdominais induzida pelo ácido acético, teste da formalina
e placa quente em camundongos. O efeito antinociceptivo da cumarina ocorreu por
mecanismos independentes da ativação de receptores opiódes, enquanto, o óxido nítrico se
mostrou importante na antinocicepção induzida pela cumarina.
O EHA e a cumarina administrados por via oral, possuem atividades
antiedematogênicas observadas no edema de pata induzido pela carragenina (LEAL et al.,
1997). Além disso, o EHA, a cumarina e a fração flavonóide obtidos das cascas do caule de A.
cearensis, bloquearam a migração de leucócitos induzida por carragenina ou N-formil-metil-
leucil-fenilalanina - fMLP em ratos (LEAL et al., 2003a). A migração celular induzida por
carragenina é dependente da liberação de agentes quimiotáticos pelas células residentes
(SOUZA et al., 1988), enquanto o fMLP é um quimiotático direto (CYBULSKY et al., 1989).
Assim, é possível que o efeito inibitório do EHA, da cumarina e da fração flavonóide ocorra
por uma inibição na liberação de substâncias quimiotáticas, como LTB
4
e IL-8 de macrófagos,
ou por interferir em alguma etapa da migração celular. O EHA, a cumarina e a fração
flavonóide foram capazes também de inibir o aumento da permeabilidade vascular induzida
pela serotonina ou histamina em ratos.
Tanaka et al. (1997) purificaram das sementes de A. cearensis um inibidor de
tripsina tipo Bowman-Birk, que prolonga o tempo de coagulação sanguínea via inibição do
fator XIIa. Mais recentemente, Trevisan & Macedo (2003) mostraram que o extrato etanólico
das cascas do caule de A. cearensis inibiu em 100 % a atividade da enzima colinesterase.
Além de A. cearensis a cumarina é encontrada também em outras espécies, como
Justicia pectoralis Jacq., Eclipta alba Hassk, Pterodon polygaliflorus Bent e Hybanthus
ipecacuanha Benth., encontradas na região nordeste do Brasil onde são utilizadas
tradicionalmente no tratamento de doenças respiratórias (BRAGA, 1976; CORREA, 1984;
antinociceptiva, antiinflamatória e broncodilatadora em roedores (LEAL et al., 2000).
1. Introdução
33
As cumarinas possuem inúmeras propriedades farmacológicas descritas na
literatura, incluindo atividades antiinflamatória, antioxidante, antibacteriana, antiviral,
antitrombótica, antimutagênica e vasodilatadora (HOULT et al., 1996, PAYA et al., 1992). A
cumarina (1,2-benzopirona) tem sido indicada no tratamento de pacientes com linfedema, isso
por sua capacidade de aumentar a ação proteolítica de macrófagos (PILLER,1976; CLODIUS
& PILLER, 1978).
Recentemente Cheng et al (2004) mostraram a bioatividade de uma série de
cumarinas e sua estreita relação estrutura-atividade inibitória sobre a produção de TNF-α.
Além disso, segundo HAN et al. (2005) derivados cumarínicos naturais ou sintéticos com
atividade anti-câncer e antiinflamatória podem possivelmente exercer suas funções biológicas
através da inibição da ativação de quinases, como a MEK1.
Na avaliação do efeito do EHA e constituintes químicos de A. cearensis sobre a
contratilidade muscular lisa, o EHA e a cumarina inibiram de maneira concentração-
dependente, a contração induzida por adrenalina, acetilcolina ou cloreto de bário em ducto
deferente isolado de ratos. Na traquéia isolada de cobaia, o EHA, a cumarina e a fração
flavonóide foram capazes de relaxar o músculo pré-contraído tanto por carbacol, quanto por
histamina ou KCl. A cumarina mostrou-se mais potente, seguida pela fração flavonóide e pelo
EHA (LEAL et al., 2003a).
As atividades antinociceptiva, antiinflamatória e relaxante muscular determinadas
para o extrato das cascas do caule do cumaru, estão possivelmente relacionadas não só com a
presença da cumarina na planta, mas também de outras substâncias como os compostos
fenólicos, incluindo flavonóides e glucosídios fenólicos.
1.3.Compostos fenólicos de A. cearensis: isocampferídio e amburosídio A
Estudos (FRANKEL et al, 1996; PIZZALE et al., 2002; SKERGET et al., 2005)
têm demonstrado que boa parte das ações biológicas determinadas em espécies vegetais estão
relacionadas principalmente à presença de compostos fenólicos na planta.
Os compostos fenólicos apresentam uma grande diversidade estrutural, com
moléculas simples e complexas, que possuem pelo menos um anel aromático ao qual está
ligado pelo menos um grupamento hidroxila, livre ou ligado com outras funções, tais como
éster, éter e glicosídio (BRUNETON, 1999).
A origem dos metabólitos secundários nas plantas pode ser resumida a partir do
metabolismo da glicose, via intermediários principais, o ácido chiquímico e o acetato. O ácido
chiquímico origina os aminoácidos aromáticos, precursores da maioria dos metabólitos
1. Introdução
34
secundários aromáticos. Porém, alguns metabólitos secundários derivam não apenas de um
desses intermediários, mas são resultantes da combinação de uma unidade de ácido chiquímico
e uma ou mais unidades de acetato ou derivados deste, como é o caso das antraquinonas, dos
taninos e dos flavonóides (CARVALHO et al., 2000; SANTOS, 2000; ZUANAZZI, 2000).
Os compostos fenólicos, particularmente os polifenólicos possuem uma variedade
de atividades biológicas incluindo antiviral, antibacteriana, imune-estimulante, antialérgica,
antihipertensiva, antiarrítmica, anti-trombótica, hipocolesterolêmica, antioxidante,
hepatoprotetora, antiinflamatória e anticarcinogênica (FORMICA & REGELSON, 1995;
ROBAK & GRYGLEWSKI, 1996; FAHIM et al., 1999; RICE-EVANS et al., 2000; GAO et
al., 2001).
Os flavonóides representam um dos grupos fenólicos mais importantes,
diversificados e amplamente distribuídos na natureza. Sua presença nos vegetais parece estar
relacionada com funções de defesa (proteção contra raios ultravioleta e ações antifúngicas) e
de atração aos polinizadores (RHODES, 1994). Até a década de oitenta já haviam sido
identificados mais de 4000 flavonóides em vegetais (HARBORNE et al., 1975; HARBORNE,
1986). Inicialmente reconhecidos como os pigmentos amarelos das flores, são também
encontrados nos frutos, sementes, cascas de caule e em algumas bebidas como o vinho tinto
(KEFFORD & CHANDLER, 1970).
A estrutura básica dos flavonóides, dois anéis aromáticos conectados por uma
ponte de três átomos de carbono, resulta de rotas biossíntéticas separadas: a primeira do ácido
chiquímico que origina fenilalanina, o precursor do ácido cinâmico, responsável por um dos
anéis aromáticos (anel B) e a ponte de três carbonos e a segunda do acetato, via ácido
malônico que resulta no outro anel aromático (anel A) do esqueleto básico dos flavonóides. Os
flavonóides são usualmente divididos de acordo com o padrão de substituições na sua estrutura
básica (Figura 3) e podem ocorrer como agliconas, glicosídios e derivados metilados
(BRUNETON, 1999; SANTOS, 2000).
Os flavonóides são conhecidos por possuírem um amplo espectro de atividades, como
antiinflamatória, antioxidante, antialérgica, hepatoprotetora, antitrombótica, antiviral e
antitumoral (DE MEYER et al., 1991; MIDDLETON et al., 2000; SALA et al., 2003;
SKERGET et al., 2005). Heijnen et al. (2002) avaliando o efeito de flavonóides sobre a
peroxidação lipídica, mostraram que existe uma relação estrutura-atividade antioxidante, onde
a presença da função catecol, do orto - 3’,4’- dihidrohidroxila no anel B, da dupla ligação
entre C
2
e C
3
,
da hidroxila no anel C, além da conformação espacial e da lipossolubilidade
da molécula influenciaram na bioatividade desses compostos.
1. Introdução
35
Flavonóis 5 7 3 (R) 3’ 4’
Quercetina OH OH H OH OH
Campferol OH OH H - OH
Isocampferídio OH OH CH
3
- OH
Figura 3. Estrutura química de algumas classes de flavonóides. A parte inferior da figura
mostra a estrutura básica do Flavon-3-ol (flavonol) e respectivos derivados que surgem de
acordo com o padrão de substituições na molécula (modificado de MIDLETON et al., 2000).
Além disso, estudos (MORTON et al., 2000, CAO et al., 1996) revelam que os fla
vonóides são capazes de interferir em várias sistemas enzimáticos, incluindo lipoxigenase,
cicloxigenase, xantina oxidase, fosfolipase A
2
, proteínas quinases, além de fatores de
transcriçãoção gênica como o Fator Nuclear kappa B (NF-κB).
Durante décadas formulações contendo flavonóides como princípios ativos têm
Flavan-3-ol Flavonóide Antocianidina
Flavona Flavonona Chalcona
Flavon-3-ol
1. Introdução
36
sido utilizadas no tratamento de várias doenças no homem (HAVSTEEN, 1983). Flavonóides
tais como quercetina, luteolina e catequinas possuem atividade antioxidante mais potente do
que a vitamina C, vitamina E e β-caroteno (GAO et al.,2001). Portanto, esses compostos
podem prevenir, por exemplo, a produção de radicais livres e a peroxidação lipídica
induzidos pelos raios ultravioleta, que são processos envolvidos em patologias como o
câncer de pele. Entretanto, tem sido observado que alguns compostos fenólicos, incluindo
flavonóides, são mutagênicos e esse efeito parece resultar de uma ação oxidante (MIDLETON
et al., 2000; SVOBODOVA et al., 2003)
O isocampferídio (5,7-dihidroxi-2-(4-hidroxifenil)-3-metoxiflavona), é um
derivado flavônico do campferol (Figura 3), flavonol conhecido por seu largo espectro de
atividades biológicas (Pathak et al., 1991; Midleton Jr et al., 2000). Além de Amburana
cearensis o isocampferídio foi isolado também de outras espécies (Psidia trinervia,
Combretum quadrangulare, Centaurea bracteatea, Genista ephedroides e Cirsium rivulare)
sob a forma livre ou glicosilada (WANG et al., 1989; PISTELLI et al., 1999; BANSKOTA et
al., 2000A; NAZARUK & JAKONIUK, 2005).
Estudos farmacológicos demonstraram que o isocampferídio possui atividade
hepatoprotetora in vitro e antimicrobiana sobre o poliovirus, rinovirus e Bacillus cereus
(WANG et al., 1989; BANSKOTA et al., 2000b). Além disso, esse 3-metilflavonol, foi capaz
de inibir o crescimento de algumas linhagens tumorais e o processo mitótico observado em
ovos de ouriço-do-mar, Lytechinus variegatus (BANSKOTA et al., 2000a; COSTA-LOTUFO
et al., 2003).
Os glicosídios fenólicos possuem descritas várias atividades farmacológicas tais
como antioxidante, antiinflamatória, vasorelaxante e antiproliferativa, e a semelhança do que
foi observado para os flavonóides, em algumas circunstâncias existe também uma estreita
relação estrutura-atividade farmacológica (WU et al., 2005; SVOBODOVA et al., 2003;
RÖSCH et al., 2003; MORTON et al., 2000).
Existem poucos estudos quanto as possíveis propriedades farmacológicas dos
amburosidios A e B, glucosídios fenólicos isolados de A. cearensis. Bravo et al., (1999)
avaliaram as atividades antimalárica, antiprotozoária, antifúngica e antibacteriana desses
glucosídios, onde foi observado que apenas o amburosídio A na dose de 50 mg/kg/dia
apresentou atividade antimalárica, reduzindo em 25% a parasitemia (P. berghei). Estudo
envolvendo a avaliação dos possíveis efeitos antiproliferativos de compostos isolados das
cascas do caule de A. cearensis, mostrou que o amburosídio A não foi citotóxico para os ovos
de ouriço nem inibiu o desenvolvimento de células tumorais (COSTA-LOTUFO et al., 2003).
1. Introdução
37
Em estudos anteriores (LEAL et al., 1995; 1997; 2000; 2003) estabelecemos as
atividades antinociceptiva, antiinflamatória e relaxante muscular do EHA, da cumarina e da
fração flavonóide obtidos de A. cearensis, resultados importantes por justificarem em parte o
uso tradicional da planta indicada principalmente no tratamento de afecções respiratórias,
como tosse, bronquite e asma. Assim, para elucidarmos o papel de outros constituintes
químicos da planta, tais como o isocampferídio e o amburosídio A, foram investigados seus
efeitos sobre a inflamação, estresse oxidativo e o músculo liso das vias aéreas.
1.4. O Processo inflamatório
A inflamação é o mais primitivo mecanismo de defesa e de reparo do organismo
animal em resposta a um patógeno invasor. Há registros de suas características clínicas em
papiros egípcios (~ 3.000 a.C), mas foi Celso - escritor romano, no século I d.C. que
relacionou os quatro sinais cardinais da inflamação: rubor, calor, dor e edema (WEISSMAN,
1992). O processo envolve uma reação complexa à agentes nocivos, como microorganismos e
células danificadas, que envolve respostas vasculares, migração e ativação de leucócitos e
reações sistêmicas. Muitos tecidos e células participam dessa reação, incluindo o fluido,
proteínas plasmáticas, células circulantes, vasos sangüíneos e componentes celulares e
extracelulares do tecido conjuntivo. As células circulantes incluem neutrófilos, monócitos,
eosinófilos, linfócitos, e plaquetas. As células do tecido conjuntivo incluem os mastócitos, que
estão intimamente ligados aos vasos sangüíneos; fibroblastos, macrófagos locais e linfócitos.
Na matriz extracelular, estão envolvidas proteínas fibrosas estruturais (colágeno, elastina),
glicoproteínas de adesão (fibronectina, laminina, colágeno não-fibrilar, tenascina e outras) e
proteoglicanos (MURPHY, 2000; KUMAR et al., 2005).
A inflamação aguda é uma resposta rápida a um agente nocivo, encarregada de
levar mediadores da defesa do hospedeiro ao local da lesão. Na resposta vascular a
vasodilatação é uma das primeiras manifestações da inflamação aguda, que é induzida pela
ação de vários mediadores, como histamina e óxido nítrico. É responsável pelo calor e rubor.
A vasodilatação é seguida pelo aumento na permeabilidade da microcirculação, que leva ao
extravasamento de fluido rico em proteína (exsudato) para o tecido extravascular causando o
edema (MAJNO & PALACE, 1961; SUFFREDINI et al., 1999). Uma função crítica da
inflamação é o encaminhamento de leucócitos à lesão e sua ativação para que desempenhem
suas funções normais de defesa do hospedeiro (MCDONALD et al., 1999).
1. Introdução
38
• Inflamação e Migração Celular
Os leucócitos são células sanguíneas que compreendem os granulócitos,
relacionados à resposta imune inespecífica, e os monócitos e linfócitos, relacionados à
resposta imune específica. Os granulócitos, que constituem aproximadamente 63% dos
leucócitos, são células polimorfonucleares (PMNs) que apresentam núcleo segmentado e
grânulos específicos em seu citoplasma (SILBEMAGL & DESPOPOULOS, 2001).
A migração e a ativação de leucócitos são consideradas um dos principais
mecanismos de defesa da imunidade inata. A migração pode ser dividida nas seguintes etapas:
1. Lúmen: marginação, rolamento e adesão ao endotélio; 2. Transmigração através do
endotélio (diapedese) e 3. Migração nos tecidos intersticiais em direção ao estímulo
quimiotático (MULLER, 2002). Na marginação há o acúmulo de leucócitos na periferia do
fluxo, próximo à superfície vascular. Subseqüentemente, os leucócitos vão rolando pelo
endotélio, aderindo transitoriamente a ele (processo chamado de rolamento) através das E e P-
selectinas, moléculas de adesão apresentadas pelas células endoteliais que se ligam à
moléculas de glicoproteinas (ex.: Ligante-1 da P-selectina - PSGL-1) na superfície dos
leucócitos, que por sua vez também apresentam L-selectina na sua superfície. A firme adesão
dos leucócitos ocorre após sua ativação por mediadores como PAF, IL-8, fator de
complemento C5a, citocinas e produtos bacterianos, fMLP e lipopolissacarídeo - LPS. Os
mediadores ligam-se aos neutrófilos por meio de receptores acoplados a proteína G. A adesão
dos leucócitos à parede do vaso sangüíneo finalmente ocorre por meio de integrinas
(CD11a(b,c)/CD18), que após a ativação dos leucócitos, é capaz de se ligar à molécula de
adesão (molécula de adesão intercelular 1 - ICAM-1 e molécula de adesão da célula vascular -
VCAM-1) da superfície endotelial. Ocorre então aumento da permeabilidade e os leucócitos
migram para o interstício, processo facilitado pela ação de enzimas proteolíticas como elastase
e colagenase (MANTOVANI & SOZZANI, 1997; GONZALEZ-AMARO et al., 1999; MC-
EVER, 2002; HYNES, 2002).
A migração unidirecional de células inflamatórias, como neutrófilos e monócitos,
através dos espaços endoteliais ocorre através de um gradiente de concentração de fatores
quimiotáticos (Figura 4) (WITKO-SARSAT et al., 2000). Alguns desses fatores quimiotáticos
têm sido identificados nos últimos 30 anos, incluindo produtos bacterianos, C5a, leucotrieno
B
4
(LTB
4
), PAF, citocinas, especialmente a superfamília das quimiocinas (proteína de
quimioatração do monócito -1 (MCP-1), eotaxina, proteína inflamatória do macrófago-1α
(MIP-1α) e RANTES (regulada por meio de ativação expressa e secretada por células T
1. Introdução
39
Bacteria ou
cels. mortas
C5a
IL-8 LTB
4
PAF
C5a
IL-8 LTB
4
PAF
C5a
IL-8 LTB
4
PAF
LTB
4
PAF
LTB
4
PAF
Quimiocinas
LTB
4
PAF
LTB
4
PAF
Quimiocinas
LTB
4
PAF
Células
Estromais
FMLP
Endotelio
Neutrofilo
Figura 4. Migração quimiotática de neutrófilos através de um gradiente de quimiocinas até o
sítio de inflamação ou infecção (WITKO-SARSAT et al., 2000)
normais). O tipo de leucócito que migra varia com a duração da resposta inflamatória e com o
de tipo do estímulo. Em geral na inflamação aguda, os neutrófilos predominam no infiltrado
inflamatório durante as primeiras 6 a 24 horas, sendo substituídos pelos monócitos depois 24
a 48 horas (MADGE & PROBER, 2001; ROSSI & ZLOTNIK, 2000; MURPHY, 1994;
JONES, 2000).
Historicamente os PMNs, têm sido considerados como uma população de
leucócito envolvida na resposta inflamatória aguda, atuando como a primeira linha de
defesa contra a
invasão de microorganismos, não sendo citados como uma fonte importante
para a síntese de mediadores inflamatórios. Entretanto, vários estudos (CASSATELLA, 1999;
MCCOLL et al., 1992) têm mostrado que essas células possuem um papel fundamental não
1. Introdução
40
somente na resposta inflamatória aguda, mas também na inflamação crônica e/ou regulação
imune.
• Leucócitos Polimorfonucleares: neutrófilos
Os neutrófilos constituem a primeira linha de defesa do sistema imune inato e são
responsáveis pela fagocitose, morte e digestão de bactérias e fungos (SEGAL, 2005).
Descobertos por Elie Metchnkoff em 1880, é o componente celular mais abundante do sistema
imune e compreendem 90 % dos granulócitos circulantes. Um adulto saudável possui entre
3.000 e 7.500 neutrófilos/μL (METCHNKOFF, 1968; COHEN, 2002).
Ao migrarem para o foco inflamatório os neutrófilos são estimulados e reconhecem
e fagocitam bactérias e outros microorganismos, que são expostos a um arsenal de enzimas
hidrolíticas armazenadas nos grânulos da célula, além de espécies reativas de oxigênio (ROS)
e de nitrogênio (RNS) formadas mediante a estimulação dos neutrófilos (FANTONE &
WARD, 1982; ALLEN & STEVENS, 1992; WITKO-SARSAT et al., 2000) (Figura 5).
A fagocitose estimula um surto de consumo de oxigênio, glicogenólise e a
produção de ROS. A geração de ROS ocorre devido a ativação de uma oxidase
(NADPH oxidase), que oxida o NADPH (nicotinamida adenina dinucleotídio - P
reduzido) e, nesse processo, reduz o oxigênio, formando o ânion superóxido (O
2
-
). O
superóxido é, então, convertido em peróxido
de hidrogênio (H
2
O
2
), que é utilizado como
substrato pela enzima mieloperoxidase contida nos grânulos dos neutrófilos, para a produção
do HOCl, potente agente antimicrobiano (PITHON et al., 1998; SEGAL, 2005).
A produção de ROS é essencial para a destruição de microorganismos, como pode
ser observado pela susceptibilidade à infecções dos indivíduos com doença granuloma tosa
crônica, uma doença genética onde a NADPH oxidase encontra-se inativa (SMITH &
CURNUTTE, 1991). Contudo, a destruição de bactérias pode ser feita também por substâncias
presentes nos grânulos dos leucócitos (RISSO, 2000).
Os neutrófilos possuem três tipos de grânulos, os primários ou azurófilos; os
secundários ou específicos e os terciários ou gelatinase, que diferem quanto as suas funções
primárias (BORREGAARD & COWLAND, 1997). Os grânulos primários ou azurófilos
contêm proteínas e peptídios direcionados para a destruição de microorganismos e digestão,
enquanto os grânulos específicos complementam os componentes da mem brana e auxilia
para limitar as reações de radicais livres. Os grânulos azurófilos contêm mieloperoxidase
(MPO) e três proteinases neutras: a catepsina G, a elastase e a proteinase 3 (WEISS et al.,
1975; KOLSET, 1990). Osgrânulos específicos contêm lactoferrina insaturada, uma proteína
1. Introdução
41
Ânion Superóxido
Radical Hidroxila
Peroxinitrito
Á
cido Hipocloroso
Mieloperoxidase
Matrix Metalo-proteinase
Elastase
Lisozima
Outras enzimas
Fa
g
olisossomo
Núcleo
Grânulo
Receptores
Figura 5. Estimulação de neutrófilos. (modificado de http://www.uni-
leipzig.de/~biophys/arnhold.htm#Seitenanfang – acesso: 23/01/2006)
que se liga e seqüestra o ferro e o cobre presente, transcobalamina II, que se liga a
cianocobalamina (BAGGLIONI et al., 1969), gelatinase e outras proteínas que são
encontradas também na membrana plasmática, incluindo flavocitocromo b
558
e NADPH
oxidase (SEGAL & JONES, 1979). Os grânulos terciários ou gelatinase possuem esse termo
para indicar a presença de gelatinase e não de lactoferrina (HIBBS & BAINTON, 1989). Os
lisossomos contêm hidrolases ácidas e as vesículas secretórias constituem um reservatório
importante de componentes da membrana. Estas enzimas podem ser liberadas para o meio
extracelular, onde mantêm sua atividade proteolítica ao redor do processo inflamatório
(SENGELOV et al., 1994; BORREGAARD & COWLAND, 1997).
• Inflamação e marcadores enzimáticos: mieloperoxidase e elastase
Uma das principais enzimas liberadas pelos grânulos azurófilos dos neutrófilos é
1. Introdução
42
a mieloperoxidase (MPO), uma heme proteína expressa em abundância por PMNs,
constituindo aproximadamente 5% das proteínas totais dos neutrófilos e acima de 25% das
proteínas no grânulo. Assim, os neutrófilos constituem a principal fonte de MPO, que pode ser
encontrada também nos macrófagos e fluidos biológicos (saliva, líquido sinovial, sêmen e
outros), bem como no coração, rins, pele, fígado e placenta (EDWARD et al., 1988;
KLEBANOFF, 1999; PEDRO et al., 2003). Os monócitos contêm apenas 1/3 da MPO
encontrada nos PMNs, enquanto os grânulos dos eosinófilos contém uma enzima relacionada,
a peroxidase eosinofílica, que possui homologia com a MPO em 69,8 % na seqüência de
aminoácidos (CARLSON et al., 1985; SAKAMAKI et al., 1989).
A MPO é uma proteína glicosilada fortemente catiônica e tem um peso molecular
de 144 KD. É constituída por dois dímeros idênticos ligados por uma ponte disulfeto, e possui
um grupo protoporfirina com um íon ferro central. A estrutura tridimencional da MPO foi
recentemente obtida com uma resolução de 1,8 Å (NAUSEEF & MALECH, 1986; FIEDLER
et al., 2000).
A MPO nos estados ativados, principalmente composto I (
+
PorFe
4+
=O), mas
também composto II (PorFe
4+
-OH), é capaz de oxidar diferentes substratos. A enzima nativa
(PorFe
3+
) pode ligar-se ao ânion superóxido ou ao peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
). No
primeiro caso, na ativação da enzima forma-se o composto III, que está aparentemente
envolvido na hidroxilação de substratos aromáticos. O H
2
O
2
é reduzido à água pela MPO
nativa, levando a formação do composto I, que pode ser reduzido a forma nativa pelo íon
cloreto ou mediante duas reduções subseqüentes via formação do composto II (KETTLE &
WINTERBOURN, 1994).
Muitos substratos são conhecidos serem oxidados pelo composto I, e em menor
extensão pelo composto II, tais como tirosina, triptofano, derivados fenólicos e indólicos,
H
2
O
2
, xenobióticos e outros (MÁRQUEZ & DUNFORD, 1995; BURNER et al., 1999; 2000).
Nesse processo, vários radicais, ácidos e outros produtos gerados estão envolvidos em danos
macromoleculares e na degradação tecidual (ARNHOLD, 2004).
O neutrófilo sintetiza H
2
O
2
por ação da enzima superóxido dismutase, daí a MPO
na presença do íon cloreto, converte o H
2
O
2
em ácido hipocloroso (HOCl), agente oxidante
bactericida poderoso que destrói os microorganismos pela halogenação ou pela oxidação de
proteínas e lipídios (peroxidação lipídica). O sistema H
2
O
2
– MPO – hialida é o sistema
bactericida mais eficiente e mais importante presente nos neutrófilos. Outros substratos para
MPO incluem o tiocianto e o nitrito (KLEBANOFF, 1999; KETTLE & WINTERBOURN,
1994; VAN DER VLIET et al., 1997; HAMPTON et al., 1998).
1. Introdução
43
Algumas reações do HOCl levam à formação de espécies reativas de oxigênio e de
nitrogênio com alto potencial de lesão tecidual, tais como o radical hidroxila, gerado da reação
do HOCl com o ânion superóxido ou Fe
2+
(CANDEIAS et al., 1993; WARDMAN &
CANDEIAS, 1996) (Figura 6).
+ H
2
O
2
1
O
2
+ H
2
O + H
+
+ Cl
-
+ O
-
2
.
OH + O
2
+ Cl
-
+ F
3+
.
OH + F
3+
+ Cl
-
HOCl
+ NO
-
2
NO
2
Cl
+
-
OH
Figura 6. Formação de espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio a partir de reações com o
HOCl, produto da enzima mieloperoxidase (ARNHOLD, 2004).
O aumento da atividade da MPO tem sido demonstrado em várias patologias como
processos infecciosos, inflamatórios e isquêmicos. Nessas circunstâncias tem sido observado
que o aumento significativo da atividade da MPO dá-se em proporção direta ao número de
neutrófilos infiltrados no tecido, assim, a atividade dessa enzima tem sido utilizada como
índice de migração leucocitária. A MPO também aumenta a produção de ROS nos PMNs
(BRADLEY et al., 1982; DAUGHERTY et al., 1994; HAMPTON et al., 1998; PEDRO et al.,
2003).
Estudos recentes têm mostrado que oxidantes resultantes da ação da MPO estão
criticamente envolvidos na modulação de vias de transdução. Por exemplo, concentrações
baixas de HOCl produzido por MPO, é capaz de ativar MAP (mitogen-activated protein)
quinase (MIDWINTER et al., 2001), induzir a translocação nuclear do NF-κB (Schoonbroodt
et al., 1997) e de modular a atividade de metaloproteinases (Fu et al., 2004). Além disso, os
radicais livres gerados pela ação da MPO interferem com a via de transdução vascular pela
oxidação do ON endotelial (EISERICH et al., 2002; BALDUS et al., 2001).
Recentemente, Lau et al. (2005) demonstraram que a MPO ao ligar-se às integrinas
CD11b/CD18 nos PMNs, induzem uma cascata de reações intracelulares que levam a um
aumento na degranulação de PMNs, na expressão de CD11b e na atividade da NADPH
oxidase de maneira autócrina. Assim, diante dessas propriedades a MPO caracteriza-se como
um mediador pró-inflamatório, além das suas atividades bactericida e enzimática.
A elastase leucocitária, é a principal proteinase sérica secretada no homem,
presente predominantemente nos grânulos azurófilos dos neutrófilos e nos monócitos. A
1. Introdução
44
enzima elastase secretada pelos neutrófilos é um polipeptídio com 218 aminoácidos, ligados
por pontes disulfeto e possui um sítio catalítico formado pelos aminoácidos histidina, aspartato
e serina. Esta ordem dos aminoácidos é conservada em todas as serinaproteinases, como as
enzimas pancreáticas elastase, tripsina e quimiotripsina (BODE et al., 1986; BELAAOUJ,
2002).
A elastase cujo pH ótimo de ação é neutro, é capaz de solubilizar a fibra elastina,
proteoglicanos, vários colágenos, fibronectina e caderina, o que facilita a migração celular até
o sítio inflamatório (WITKO-SARSAT et al., 2000). Ainda várias proteínas solúveis como
fatores de coagulação sanguínea, imunoglobulinas, fatores do sistema complemento são
substratos da elastase. Por fim, essa enzima também estimula in vitro linfócitos B a
produzirem anticorpos (BAGGIOLINI ET AL., 1978; OWEN et al., 1997; NÉNAN et al.,
2005).
Fisiologicamente a elastase está envolvida na degradação de bactérias gram-
negativas e de materiais estranhos ingeridos durante a fagocitose. O efeito bactericida da
elastase contra bactérias gram-negativas e não gram-positivas deve-se ao fato dessa enzima ser
capaz de degradar a proteína externa de membrana (OmpA – outer membrane protein A),
característica de bactérias gram-negativas (BELAAOUAJ, 2002).
Quando liberada durante a inflamação a elastase é rapidamente ligada aos
inibidores enzimáticos, α-1 e α-2-antitripsina para formar o complexo elastase-inibidor, além
de outros inibidores, como o inibidor de secreção de leucoprotease (SPLI), principal inibidor
da elastase nas vias aéreas (STOCKLEY et al., 2000).
A elastase não é encontrada livre no meio extracelular, porém quando ocorre uma
exocitose anormal ou há um desequilíbrio entre enzima e inibidor, dá-se o acúmulo de elastase
no meio extracelular que é considerado a causa primária da lesão tecidual observada em várias
patologias, como bronquite (LAI et al., 2004), Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica - DPOC
(NÉNAN et al., 2005), enfisema pulmonar (FUJITA et al., 1990; NISHI et al., 2003),
Síndrome da Angústia Respiratória Aguda –SARA, choque séptico (DHAINAUT et al., 2001;
DEVINE, 2003), fibrose cística (MCGARVEY et al., 2002) e artrite reumatóide (MOHR &
WESSINGHAGE, 1983).
Em geral o enfisema pulmonar tem sido relacionado a um acúmulo de proteases
liberadas por células, essas enzimas degradam o tecido conjuntivo dos pulmões e um relativo
desequilíbrio envolvendo proteases e defesa antiproteolítica instala-se. Essa teoria é
freqüentemente referida como “desequilíbrio protease-antiprotease” e envolve principalmente
1. Introdução
45
proteases séricas como a elastase neutrofílica e a metaloelastase macrofágica (NÉNAN et al.,
2005).
Compostos que inibam diretamente a elastase ou a sua liberação pelos neutrófilos
são de interesse crescente para o desenvolvimento de novas drogas antiinflamatórias.
Pesquisas com sementes de leguminosas têm resultado na descoberta de vários inibidores de
proteinases séricas (RICHARDSON, 1991; BATISTA et al., 1996; TRONCOSO et al., 2003).
Dentre as espécies estudadas podemos citar Tamarindus indica, que das sementes foi
purificado um inibidor de elastase e tripsina (FOOK et al., 2005).
Estudos mostram que existe uma estreita relação entre o acúmulo de radicais livres
(espécies reativas de oxigênio (ROS)/ espécies reativas de nitrogênio (RNS) e a evolução da
inflamação (SALVEMINI et al., 2003). Mediadores inflamatórios como citocinas e fatores de
crescimento podem estimular a produção endógena por exemplo de H
2
O
2
um oxidante capaz
de atuar como segundo mensageiro estimulando a cascata de proteínas quinases ligadas à
expressão de genes inflamatórios ou ao controle do ciclo celular
(SUNDARESAN et al., 1995;
PARINANDI et al., 1999; CAI, 2005).
1.5. Inflamação e Estresse Oxidativo
A produção de oxidantes é parte do metabolismo normal de vários tipos celulares e
possui um papel importante para manter a homeostase celular. Os tecidos são constantemente
submetidos à presença de ROS, tais como ânion superóxido (O
2
-
), peróxido de hidrogênio
(H
2
O
2
) e outros gerados durante numerosas reações metabólicas (CASTILLO et al., 1992;
CABRE et al., 2000). Para se proteger contra os efeitos nocivos dos oxidantes o organismo
possui um sistema antioxidante. Porém, quando ocorre um desequilíbrio entre os sistemas pró-
oxidante e antioxidante em favor do primeiro, instala-se o chamado estresse oxidativo (PRIOR
& CAO, 1999; COMHAIR & ERZURUM, 2002).
O estresse oxidativo produz transtornos no metabolismo celular, incluindo aumento
na concentração intracelular de cálcio, alteração no transporte iônico, alteração na
permeabilidade da membrana e destruição celular por peroxidação lipídica (RECKMAGE et
al., 1989). As ROS têm sido implicadas como mediadores de várias patologias tais como,
esclerose múltipla (HALLIWEL & GUTTERIDGE, 1999), câncer hepático (MAJOR &
COLLIER, 1998), artrite reumatóide (DARLINGTON & STONE, 2001), aterosclerose
(SALVEMINI et al., 2002), além das doenças respiratórias incluindo a asma (HENRICKS &
NIJKAMP, 2001; CARAMORI & PAPI, 2004).
1. Introdução
46
Existem cada vez mais evidências que a típica inflamação crônica das vias aéreas
observada na asma, resulta de um estresse oxidativo acentuado. Também muitos dos estímulos
que exacerbam a asma, incluindo infecções virais e poluentes, podem ativar a produção de
oxidantes, induzindo inflamação que produz os sintomas asmáticos (CARAMORI & PAPI,
2004). As ROS causam a asma por oxidação ou nitração de proteínas, lipídios ou DNA
levando a perda da função dessas moléculas (FUJISAWA, 2005).
As células inflamatórias possuem uma capacidade excepcional para a produção de
oxidantes. No foco inflamatório eosinófilos, neutrófilos, monócitos e macrófagos ativados,
além das células epiteliais bronquial podem gerar oxidantes (BARNES et al., 1998;
HENRICKS & NIJKAMP, 2001; BOWLER & CRAPO, 2002). As fontes enzimáticas
potenciais de ROS incluem a cadeia transportadora de elétrons na mitocôndria, sistema xantina
oxidase citosólico, NADPH oxidase associado à membrana, enzimas relacionadas ao
metabolismo do ácido araquidônico (ciclooxigenase e lipoxigenase) e citocromo P450
(CARAMORI & PAPI, 2004; CAI, 2005).
O sistema de defesa antioxidante inclui antioxidantes não enzimáticos (ex.:
glutationa, ácido úrico, bilirubina, β-caroteno (vitamina A), ácido ascórbico (vitamina C) e α-
tocoferol (vitamina E)) e enzimáticos tais como, superóxido-dismutase (SOD), catalase e
glutationa-peroxidase (GSH-Px) (RECKMAGE et al., 1989; CASTILLO et al., 1992; MELIN
et al., 2000). Nos sistemas eucariotos existem duas formas de SOD, a forma SOD-Cu-Zn
encontrada no citosol, enquanto que SOD-Mn está localizada primariamente na mitocôndria.
Esta enzima têm papel antioxidante por catalisar a dismutação do O
2
-
em H
2
O
2
e O
2
, na
presença do próton H
+
(MICHIELS et al., 1994; SIMIBE et al., 2001; ACHARYA et al.,
1991). A catalase está localizada nos peroxissomos e no citosol da célula, e catalisa a redução
do H
2
O
2
a H
2
O e O
2
(SHAN et al., 1990; MICHIELS et al., 1994). Esta enzima é encontrada
no sangue, medula óssea, rim e fígado (MAYES, 1990). Sua atividade é dependente da
NADPH (SCOTT et al., 1991). A GSH-Px remove o H
2
O
2
convertendo a glutationa
reduzida (GSH) em oxidada (GSSG). A recuperação da GSH é feita pela enzima glutationa-
redutase (GSSG-RD) (SING & PATHAK, 1990; COLES et al., 2003) (Figura 7).
Os níveis de GSH/GSSG em resposta à estímulos oxidativos, modulam a expressão
de genes pró-inflamatórios pela ativação de fatores de transcrição tais como Proteína
Ativadora-1 (AP-1) e o NF-κB, e também de genes antioxidantes tais como SOD-Mn, γ- GCS-
HS, GPx. Assim, nas células pulmonares, por exemplo, o equilíbrio na expressão dos genes
pro e antiinflamatórios relacionados ao nível de GSH/GSSG é crítico para definir se o
processo resultará em lesão celular ou proteção contra os efeitos danosos da inflamação
1. Introdução
47
Figura 7. Representação esquemática da geração de ROS e suas dismutações. O ânion
superóxido (O
2
•-
) é
metabolizado via
a reação de dismutação, O
2
•-
+ 2H
+
→ O
2
+ H
2
O
2
, que é
catalisada pela superóxido dismutase (SOD). O H
2
O
2
é convertido em H
2
O e O
2
pelas enzimas
catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx), essa última mediante o consumo de glutationa
reduzida (GSH), levando a formação de glutationa oxidada (GSSG), que é por sua vez
reduzida pela glutationa redutase (GSSG-RD). O H
2
O
2
pode ser ainda convertido no radical
•
OH por uma outra via envolvendo o ferro. Essa reação catalizada pelo ferro, conhecida como
reação de Fenton, é inibida pela desferrioxamina (DSF), um agente quelante que é capaz de
neutralizar a toxicidade do
•
OH. Fonte: HADDAD et al., 2005.
(Figura 8). Dessa forma, o conhecimento do mecanismo molecular que seqüencialmente
regula a expressão desses genes nas células pode abrir um caminho novo na modulação da
resposta inflamatória (RAHMAN & MACNEE, 2000).
Níveis elevados de alguns marcadores diretos ou indiretos do estresse oxidativo,
incluindo malonildialdeído (MDA) e H
2
O
2
, têm sido encontrados na urina, plasma, lavado
broncoalveolar e pulmões de pacientes com asma. Seus níveis estão freqüentemente
relacionados a severidade da asma e são inversamente relacionados ao grau de equilíbrio dos
O
2
-
H
2
O
2
.
OH
Fe
2+
Fe
3+
DSF
GPx
H
2
O + O
2
CAT
E
E
s
s
t
t
r
r
e
e
s
s
s
s
e
e
O
O
x
x
i
i
d
d
a
a
t
t
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i
v
v
o
o
C
C
i
i
t
t
o
o
c
c
i
i
n
n
a
a
s
s
I
I
n
n
f
f
l
l
a
a
m
m
a
a
ç
ç
ã
ã
o
o
GSH GSSG
GSSG-RD
1. Introdução
48
Figura 8. Ativação de fatores de transcrição NF-κB e AP-1 por oxidantes, estímulos
ambientais e/ou citocinas alteram os níveis de GSH/GSSG que levam a indução de genes pró-
inflamatórios e antiinflamatórios em células pulmonares. Produtos dos genes pró-inflamatórios
causam inflamação das via aéreas, que é inibida (X) por genes antiinflamatórios/antioxidantes.
Fonte: RAHMAN & MACNEE, 2000.
sistemas pró- e antioxidante (BARNES et al., 1998; HENRICKS & NIJIKAMP, 2001;
BOWLER & CRAPO, 2002). Outros marcadores incluem proteínas (nitrotirosina e 3-
bromotirosina), lipídios (isoprostanos e etano) e DNA (hidroxideoxiguanosina) (DWEIK et al.,
2001; KHARITONOV & BARNES, 2001; 2002).
As ROS liberadas de eosinófilos, macrófagos alveolares e neutrófilos possuem um
papel importante na asma brônquica. Elas podem induzir a contração do músculo liso das vias
aéreas, a liberação de histamina pelos mastócitos, a secreção de muco e ainda interagem com
inibidor de protease (PRYOR & DOOLEY, 1985; ALVING et al.,1993; HATCH, 1995).
Dessa forma, as ROS estão entre os inúmeros mediadores liberados em processos
inflamatórios das vias aéreas e possuem um papel importante na patogênese de doenças como
Oxidantes
Citocinas
E
st
ím
u
l
o
a
m
b
i
e
n
ta
l
GSH GSSG
NF-ĸB
AP-1
Genes Pró-
inflamatórios
Genes
Antioxidante/
Antiinflamatório
Inflamação
ativação
1. Introdução
49
a asma, a doença pulmonar obstrutiva crônica e a síndrome da angústia respiratória aguda
(RAHMAN & MACNEE, 2000; HENRICKS & NIJKAMP, 2001).
1.6. Músculo Liso das Vias Aéreas
O comportamento anormal do músculo liso, constituinte da maioria dos sistemas
fisiológicos, como vasos sanguíneos, trato gastrointestinal e vias aéreas, está relacionado a
uma série de patologias, incluindo hipertensão, aterosclerose e asma. Dessa forma, tem sido
expressiva a dedicação de pesquisadores em elucidar as características biofísicas e
bioquímicas do músculo liso das vias aéreas visando uma melhor compreensão de como se dá
a sua alteração na asma (STEPHENS, 2002; WEBB, 2003).
Nas vias aéreas os nervos parassimpáticos constituem o principal sistema de
controle motor, onde medeiam a broncoconstrição (BARNES, 1986; PENDRY et al.,
1993). Porém, quanto ao controle exercido pelo sistema nervoso simpático existem
algumas controvérsias, embora não existam dúvidas que os receptores β-adrenérgicos
estão presentes nas vias aéreas e que seus agonistas são broncodilatadores potentes
(STEPHENS, 2002).
O músculo liso pode ser estimulado a contrair-se por múltiplos tipos de sinais:
estimulação nervosa, estimulação hormonal, estiramento da fibra ou alterações no ambiente
químico (KNOT et al., 1996; GUYTON, 2002). Nas vias aéreas os nervos parassimpáticos
constituem o principal sistema de controle motor, onde medeiam a broncoconstrição
(BARNES, 1986; PENDRY et al., 1993). Porém, quanto ao contro le exercido pelo sistema
nervoso simpático existem algumas controvérsias, embora não existam dúvidas que os
receptores β-adrenérgicos estão presentes nas vias aéreas e que seus agonistas são
broncodilatadores potentes (STEPHENS, 2002).
A via neuronal não adrenérgica e não colinérgica citada pela primeira vez por
Coburn & Tomita (1973), está também envolvida nos mecanismos broncoconstritor e
broncodilatador das vias aéreas, com a participação de mediadores incluindo substância P,
neurocinina A, peptídio intestinal vasoativo e óxido nítrico. Além disso, embora as vias aéreas
estejam sob forte controle colinérgico, outros mediadores também exercem seu controle, tais
como leucotrienos, prostaglandinas, histamina e serotonina (SOLWAY & LEEF, 1991;
BELVISE et al., 1993).
O papel importante dos neurônios sensoriais aferentes não mielinizados (fibras C)
na regulação das funções das vias aéreas tem sido extensivamente observado em várias
espécies, incluindo a humana. A ativação desses neurônios por vários tipos de irritantes, como
1. Introdução
50
cigarro, ar frio e solução salina hipertônica, ou mediadores químicos endógenos pode resultar
na broncoconstrição reflexa via mecanismo colinérgico mediado centralmente (COLRIDGE &
COLERIDGE, 1984; ANDERSON & FISCHER, 1993). Além disso, a estimulação das fibras
C por estímulos químicos, como a capsaicina, resulta na liberação de taquicininas, tais como a
substância P, neurocinina A e peptídio relacionado ao gene da calcitonina que possuem
efeitos biológicos potentes em vários tipos celulares incluindo a célula muscular lisa das vias
aéreas (HOLZER, 1988; COLERIDGE & COLERIDGE, 1995; LEE & PISARRI, 2001).
O dano do epitélio das vias aéreas afeta a responsividade das vias aéreas de várias
formas: (1) O epitélio atua como uma barreira fisiológica para difusão, assim ao ocorrer o
dano epitelial, alérgenos, irritantes, gases e agonistas atingem com mais facilidade a célula
muscular lisa. (2) A camada epitelial protege os neurônios da estimulação por produtos
inalados, como os citados anteriormente. Portanto, a camada epitelial ao ser danificada expõe
os neurônios sensoriais à ação de irritantes, por exemplo, e conseqüênte broncoconstrição
reflexa. (3) A camada epitelial tem uma função metabólica. Acetilcolina, histamina e
neuropeptídos podem ser sintetizados e/ou metabolizados pelas células epiteliais. Dessa forma,
uma disfunção da camada epitelial pode resultar no aumento da concentração de vários
agentes contráteis. (4) Finalmente, o epitélio das vias aéreas possui função secretora, ele
sintetiza muco, citocinas e quimiocinas e libera fatores relaxantes, como a prostaglandina E
2
e
o óxido nítrico (BOUSHEY et al., 1980; STERK & BEL, 1989; FOLKERTS & NIJKAMP,
1998).
O cálcio (Ca
2+
) é praticamente um mensageiro universal que controla uma
diversidade de processos celulares, como a transcrição de genes, a proliferação celular e a
contração muscular (BOOTMAN et al., 2001). O processo de contração da célula muscular
lisa é iniciado pelo aumento na concentração intracelular dos íons Ca
2+
, que pode ocorrer
através de vários mensageiros e canais (SOMLYO & SOMLYO, 1968). Dentre os
mensageiros envolvidos, inclui inositol 1,4,5-trifosfato (IP
3
), óxido nítrico, H
2
O
2
/O
2
-
,
diacilglicerol (DAG), ácido araquidônico e o próprio Ca
2+
(BOOTMAN et al., 2002).
Os canais de Ca
2+
são responsáveis pela entrada desse íon na célula em resposta à
sinalização da membrana e podem ser classisficados em: (I) canais de entrada de Ca
2+
e (II)
canais de liberação Ca
2+
. A primeira classe subdivide-se ainda em: (1) canais de Ca
2+
voltagem-dependentes, que são ativados por despolarização da membrana através de estímulos
químicos ou elétricos; (2) canais Ca
2+
operados por receptor que envolve a ativação de
receptores e está associado a uma mínima ou inexistente despolarização da membrana; e (3)
canais de Ca
2+
capacitativo, os quais são operados pela depleção de estoques intracelulares. A
1. Introdução
51
segunda categoria inclui os canais dependentes de receptores para o IP
3
e para a rianodina
(BENOFF, 1998; COBURN, 1977; STEPHENS, 2002).
Os canais de K
+
estão presentes no plasmalema de vários tipos celulares,
contribuindo significativamente para a geração do potencial transmembrana e para a corrente
de repolarização/hiperpolarização (ALEXANDER et al., 2000). A combinação de técnicas de
eletrofisiologia, biologia molecular e a descoberta de ligantes seletivos, tais como a
iberiotoxina tem levado a identificação e caracterização de vários tipos de canais de K
+
(QUAST, 1993). Dentre esses pelo menos três tipos possuem uma função fisiológica e
farmacológica importante na modulação da contratilidade do músculo liso das vias aéreas
(Tabela 1) (PELAIA et al., 2002). Substâncias que aumentam a atividade dos canais de K
Ca++
,
são esperadas reduzirem a excitabilidade celular e direta ou indiretamente diminuírem a
liberação de neurotransmissores e hormônios (GRIBKOFF et al., 1996).
Os nucleotídios cíclicos têm um papel crucial na função celular de mamíferos. A
concentração intracelular de nucleotídios cíclicos é regulada por duas famílias de enzimas,
adenilato e guanilato ciclases que sintetizam adenosina 3’,5’- monofosfato cíclico (AMPc) e
guanosina 3’,5’- monofosfato cíclico (GMPc) respectivamente, dos seus correspondentes
nucleotídios trifosfatos, e as fosfosdiesterases (PDE) que catalisam a hidrólise e inativação do
AMPc e/ou GMPc. A elevação de AMPc nas vias aéreas tem implicações importantes para a
resposta celular nas reações alérgicas.
Agonistas β
2
-adrenérgicos, amplamente utilizados como broncodilatadores no tratamento da
asma, relaxam o músculo liso das vias aéreas através de mecanismo dependente de AMPc.
Está bem documentado que o GMPc a semelhança do AMPc é um segundo mensageiro
importante na regulação do tônus das vias aéreas (KATSUKI & MURAD, 1997; BARNES,
1995; BEAVO, 1995). Inibidores da PDE tipo 5, tais como o sildenafil e o zaprinast podem
elevar o nível de GMPc, o que leva ao relaxamento do músculo liso traqueal de cobaia
(BERNAREGGI et al., 1999).
Embora o presente estudo não tenha empregado modelos experimentais que
mimetizem o processo asmático, o que constitui um objetivo futuro, foi considerado
importante discorrer um pouco acerca do processo asmático. A razão para isso deve-se ao uso
tradicional de A. cearensis no tratamento da asma, cujas características fisiopatológicas
envolvem inflamação e broncoconstrição.
1. Introdução
52
Tabela 1. Principais canais de potássio presentes nas vias aéreas.
Canais de K
+
Abridores Inibidores
Sensíveis ao Ca
2+
- Larga condutância
Dihidrosoiasaponina-1
Charibdotoxina
NS004 NS1619 Iberiotoxina
- Baixa condutância -- Apamina
Retificadores -- 4-aminopiridina
Sensíveis ao ATP Cromacalim Glibenclamida
Levcromacalim Tolbutamida
Pinacidil
Fonte: PALAIA et al., 2002.
1.7. Papel da Inflamação e do Músculo Liso das Vias Aéreas na Asma
A asma é uma doença caracterizada por obstrução, inflamação e
hiperresponsividade das vias aéreas inferiores para uma variedade de estímulos, que resulta
numa limitação variável ao fluxo aéreo, reversível espontaneamente ou com tratamento.
Clinicamente manifesta-se por episódios recorrentes de sibilância, dispnéia, aperto no peito e
tosse, particularmente à noite e pela manhã ao despertar. Resulta de uma interação entre
genética, exposição ambiental e outros fatores específicos que levam ao desenvolvimento e
manutenção dos sintomas (BUSSE & LEMANSKE, 2001; COOKSON, 1999; KUMAR,
2001).
A hiperresponsividade ou hiperreatividade brônquica (HRB) caracteriza-se por
uma resposta exagerada a uma variedade de estímulos que leva à broncoconstrição. Embora a
HRB constitua uma característica essencial da asma, ela é encontrada também em outras
condições incluindo infecção respiratória viral, displasia broncopulmonar, fumo, atopia,
broncoectasia e fibrose cística (PATTEMORE et al., 1990; STERK, 1993). O mecanismo
exato que contribui para HRB não está elucidado completamente, mas, envolve espessamento
da parede muscular, aumentada contratilidade, controle neural autonômico alterado e processo
inflamatório agudo e crônico das vias aéreas que pode causar dano epitelial (LAW et al.,
2000). Na avaliação da HRB, além do teste de broncoprovocação com agentes
broncoconstritores (metacolina, histamina, carbacol, neuropeptídios e outros) tem sido
empregado também testes não farmacológicos (ex.: estímulos físicos (hiperventilação) e
1. Introdução
53
solução hipertônica), que tem sido empregado principalmente na Europa e na América do
Norte (SBPT, 2002 - III Consenso da asma; LAW et al., 2000).
A inflamação brônquica constitui o mais importante fator fisiopatogênico da asma.
É resultante de interações complexas entre os mediadores liberados por células inflamatórias,
como linfócitos T, mastócitos, macrófagos, eosinófilos, basófilos e neutrófilos. Quando o
asmático inala alérgenos, estes são apresentados pela células dendríticas aos linfócitos que
proliferam (KUMAR, 2001; BARNES, 1998; DJUKANOVIC et al., 1990). A resposta
asmática possui duas fases, a inicial e a tardia. A resposta inicial ocorre usualmente dentro de
uma hora após a exposição ao antígeno, devido a ligação do complexo alérgeno - IgE
específica à receptores de alta afinidade nos mastócitos e subseqüente degranulação e
liberação de vários mediadores inflamatórios. A resposta tardia inicia-se 3 – 4 h após a
exposição ao antígeno, tendo seu pico em torno de 9h, enquanto a obstrução das vias aéreas
dá-se entre 12 – 24h após exposição ao alérgeno (Figura 9) (PETERS et al., 1998; VARNER
& LEMANSKE, 2000; BHARADWAJ & AGRAWAL, 2004).
Assim, através desses inúmeros mediadores as células causam lesões e alterações
na integridade epitelial, anormalidades no controle neural autonômico, no tônus da via aérea,
alterações na permeabilidade vascular, hipersecreção de muco, mudanças na função
mucociliar e aumento da reatividade do músculo liso da via aérea (KUMAR, 2001;
HOLGATE, 1997; 2000).
Certos pacientes asmáticos apresentam perda parcial e irreversível da função
respiratória ao longo do tempo. Postula-se que o processo inflamatório crônico nas vias aéreas,
pode através da liberação de diversos mediadores inflamatórios, causar alterações estruturais
irreversíveis nas vias aéreas e conseqüente piora da broncoconstrição, contribuindo assim para
o fenômeno da perda da função pulmonar. A este processo creditou-se o nome de
remodelamento brônquico (MAUAD et al., 2000).
Enfim, na asma existem evidências (HOLGATE et al., 2003; BHARADWAJ &
AGRAWAL, 2004) que a maquinaria contrátil muscular encontra-se rodeada e bombardeada
por mediadores inflamatórios, que parecem ser responsáveis, pelo aumento na velocidade de
contração e pela diminuição na plasticidade muscular. Dessa forma, a disfunção do músculo
liso das vias aéreas pode ser um dos primeiros mecanismos pelo qual a inflamação induz a
hiperresponsividade, que somada ao remodelamento causa um comprometimento ainda maior
na função muscular das vias aéreas no asmático (FERNANDES et al., 2003).
1. Introdução
54
Figura 9. Resposta Alérgica Inicial (RAI), Tardia (RAT) e Remodelamento das Vias Aéreas
na Asma. Cinco a dez minutos após a exposição ao antígeno, ocorre a RAI com a ligação dos
alérgenos aos receptores de IgE nos mastócitos e basófilos, e a conseqüente liberação de
mediadores que causam inflamação, vasodilatação e contração muscular. Citocinas e
quimiocinas liberadas durante EAR recrutam células inflamatórias para o pulmão que leva a
RAT 3 – 4 h após a exposição ao antígeno. A inflamação crônica nos pulmões leva a um
remodelamento das vias aéreas envolvendo espessamento da mucosa, hiperplasia das
glândulas submucosas, fibrose sub-epitelial, deposição de colágeno e aumento da massa
muscular. TGG-β, fator de crescimento transformador - β; RANTES, regulada por meio de
ativação expressa e secretada por células T normais.
Fonte: BHARADWAJ & AGRAWAL, 2004.
5 - 10 min: RAI 3 – 9h: RAT Remodelamento
das vias aéreas
Basófilo
D
D
e
e
s
s
n
n
u
u
d
d
a
a
ç
ç
ã
ã
o
o
Hipersecreção
muco
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s
e
e
IL-6
Colágeno
I
I
L
L
-
-
5
5
T
T
G
G
F
F
-
-
β
β
Vasodilatação
edema
Linf
Neut
.
IL-13
E
E
o
o
s
s
i
i
n
n
.
.
Macrófa
g
o.
Constrição Hipertrofia e Hiperplasia
1. Introdução
55
1.8. Farmacoterapia da Asma
A asma como já descrito se divide em duas fases: aguda e crônica. Na crise aguda,
são utilizados medicamentos com a finalidade de produzirem um relaxamento rápido dos
brônquios, são os chamados broncodilatadores. Porém, a asma crônica é considerada uma
doença inflamatória, e como tal é tratada com antiinflamatórios. Existem pelo menos três
grupos de medicamentos classificados como antiinflamatórios utilizados na asma: 1)
corticóides - grupo de melhor resultado, utilizado principalmente por via inalatória,
apresentam biodisponibilidade baixa, ou seja, sem efeitos sistêmicos importantes ao contrário
do que acontece quando administrados por via oral ou injetável; 2) cromonas - nedocromil e
cromoglicato, empregados principalmente na asma leve; 3) antagonistas dos leucotrienos que
podem ser ministrados em associação com os corticóides inalados, quando estes sozinhos não
controlam a doença (SBPT, 2002 - III Consenso da asma; BHARADWAJ & AGRAWAL,
2004).
Contudo, os tratamentos atuais têm causado efeitos colaterais e/ou não são muito
efetivos em muitos pacientes com asma. Por exemplo, os agonistas adrenérgicos β
2
não são
muito efetivos no tratamento da reação alérgica tardia e o seu uso crônico tem causado
taquicardia, tremores, cãimbras e distúrbios metabólicos. Os efeitos colaterais dos corticóides
são bem conhecidos, incluem intolerância à glicose, ganho de peso, aumento da pressão
sanguínea, catarata, imunossupressão e redução na taxa de crescimento em crianças (LIN &
CASALE, 2002). Assim, tem sido imperativo a busca de uma terapia que elimine ou reduza os
inconvenientes da atual farmacoterapia.
Alguns exemplos dos avanços obtidos na terapia da asma incluem os anticorpos
anti-IgE (BABU et al., 2001) e anti-IL-5 (mepolizumab) (KIPS et al., 2000), além da terapia
com IL-12 (BRYAN et al., 2000). Vários genes pro-inflamatórios expressados no epitélio das
vias aéreas são regulados por fatores de transcrição como o NF-κB (Fator Nuclear kappa B) e
a AP-1 (Proteína Ativadora -1). Os glucocorticóides inibem o NF-κB diretamente por
ligarem-se a ele ou indiretamente por aumentar a expressão do IκB, proteína que inibe NF-
κB. Entretanto, devido aos efeitos colaterais dos glucocorticóides novos fármacos que inibam
NF-κB estão sendo pesquisados (BARNES, 2002).
Estudos recentes mostraram que a suplementação com as vitaminas C e E
reduziram o decréscimo da função pulmonar em asmáticos (ROMIEU et al., 2002; 2004).
Antioxidantes novos como as nitronas e análogos da SOD estão sendo avaliados clinicamente
(FLOYD et al., 2002; SALVEMINI et al., 2003).
1. Introdução
56
Dessa forma, a pesquisa de fármacos que combinem as atividades antiinflamatória,
antioxidante e relaxante muscular e que apresentem menos efeitos indesejáveis em relação à
farmacoterapia atual, é atrativo para o tratamento de doenças inflamatórias das vias aéreas.
2. Justificativa e Objetivos
57
JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS
2
2. Justificativa e Objetivos
58
2.1. JUSTIFICATIVA
Árvore nativa da região Nordeste, Amburana cearensis (Fabaceae) silvestre, mais
conhecida popularmente como cumaru possui um expressivo uso tradicional como
antiinflamatório mas principalmente no tratamento da bronquite, tosse e asma. Estudos
anteriores (LEAL et al., 1995; 1997; 2000, 2003) com Extrato Hidroalcoólico (EHA) das
cascas do caule e constituintes químicos (cumarina e fração flavonóide) isolados do cumaru
demonstraram suas atividades antinflamatória, antinociceptiva e relaxante muscular em
traquéia isolada de cobaia. Na avaliação clínica (Fase I, piloto) do xarope de cumaru que
emprega como produto intermediário o EHA, não foram evidenciados sinais de toxicidade
clínica (SAMPAIO et al., 2000).
A doença pulmonar obstrutiva ou das vias aéreas (ex.: enfisema, bronquite crônica
e asma) é caracterizada por um aumento da resistência ao fluxo de ar devido a uma obstrução
parcial ou completa, em qualquer nível, da traquéia e dos grandes brônquios até bronquíolos
respiratórios terminais (KUMAR et al., 2005).
A brônquite crônica, tão comum entre tabagistas habituais e habitantes de cidades
poluídas, não é uma entidade tão trivial como se pensava no passado. O fator primário ou
desencadeador na gênese dessa doença parece ser uma irritação crônica por substâncias
inaladas, como fumaça do tabaco, poeira de grãos, algodão e sílica. As infecções bacterianas e
virais são importantes no desencadeamento das exarcerbações agudas da doença. A
característica mais inicial da bronquite é a hipersecreção de muco associada à hipertrofia das
glândulas submucosas na traquéia e nos brônquios (DEMELLO & REID, 1995; KUMAR et
al., 2005). As proteases liberadas por leucócitos, como elastase e catepsina, além de
metaloproteinases estimulam a hipersecreção de muco (HAMPTON et al.,1998; LAI et al.,
2004).
A asma é a mais comum das doenças inflamatórias crônicas das vias aéreas.
Anualmente no Brasil ocorrem cerca de 350.000 internações por asma, constituindo-se na
quarta causa de hospitalização pelo SUS (2,3% do total) e sendo a terceira causa entre crianças
e adultos jovens (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2000). É uma doença caracterizada por
obstrução, inflamação e hiperresponsividade das vias aérea inferiores para uma variedade de
estímulos, que resulta numa limitação variável ao fluxo aéreo, reversível espontaneamente ou
com tratamento (SBPT, 2002; III Consenso da asma). Na inflamação brônquica, as células
inflamatórias através da liberação de inúmeros mediadores, tais como histamina, leucotrienos,
ROS, MPO, elastase, proteína básica principal, peroxidase eosinofílica e citocinas que causam
2. Justificativa e Objetivos
59
alterações na permeabilidade vascular, lesões e alterações na integridade epitelial,
anormalidades no controle neural autonômico (substância P, neurocinina A) e no tônus da via
aérea, hipersecreção de muco, mudanças na função mucociliar e aumento da reatividade do
músculo liso da via aérea (KUMAR, 2001; HOLGATE, 2000).
Atualmente, o xarope de cumaru é produzido pela Farmácia Escola-UFC,
Programas Governamentais de Fitoterapia no estado, bem como por indústrias farmacêuticas
nacionais. A padronização do xarope por CLAE-UV, vem sendo realizada pela determinação
apenas do teor de cumarina (SILVA FILHO et al., 2000), embora possivelmente este não seja
o único metabólito bioativo presente na planta.
Dessa forma, dando continuidade aos estudos anteriores decidimos investigar a
possível bioatividade de outras substâncias presentes no cumaru. Para isso, foram avaliadas a
toxicidade do amburosídio A (glucosídio fenólico) e do isocampferídio (3-metilflavonol), bem
como as atividades antiinflamatória, antioxidante e relaxante muscular em traquéia de cobaia.
2. Justificativa e Objetivos
60
2.2. OBJETIVOS
GERAL
Investigar os possíveis efeitos tóxicos do isocampferído (ICPF) ou do amburosídio
A (AMB) isolados de Amburana cearensis e suas atividades antiinflamatória, antioxidante e
relaxante muscular em músculo liso de traquéia isolada de cobaia.
ESPECÍFICOS
• Investigar a ocorrência de possíveis efeitos tóxicos do ICPF e do AMB quando
administrados em dose única em camundongos;
• Avaliar a citotoxicidade do ICPF e do AMB em cultura de células hepáticas;
• Investigar a atividade antiinflamatória do ICPF e do AMB, empregando
modelos de inflamação aguda, tais como edema de pata, peritonite e permeabilidade vascular
em ratos ou camundongos;
• Determinar o efeito do ICPF e do AMB sobre a desgranulação de neutrófilos
isolados de sangue humano, através de determinações enzimáticas (mieloperoxidase e
elastase);
• Pesquisar o possível efeito do AMB sobre a hepatotoxicidade induzida por
tetracloreto de carbono em ratos; investigando a função hepática e o estresse oxidativo, além
de análise histopatológica;
• Determinar os efeitos do ICPF e do AMB sobre o músculo liso traqueal de
cobaia e esclarecer o(s) possível(is) mecanismo(s) de ação sobre a contratilidade muscular.
3. Materiais e Métodos
61
3
MATERIAIS E MÉTODOS
3. Materiais e Métodos
62
3.1. MATERIAIS
Esse projeto foi aprovado pela Comissão de Ética e Pesquisa Animal – CEPA
da Universidade Federal do Ceará, protocolo N
o
21/04, segundo os princípios éticos adotado
pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).
• Material botânico
As cascas do caule de Amburana cearensis foram coletadas na fazenda São
Vicente, na cidade de Quixeramobim - Ceará. Exsicatas (n
o
837 e 847) da espécie estão
registradas no Herbário Prisco Bezerra, Departamento de Biologia, UFC.
• Isocampferídio e Amburosídio A isolados de A. cearensis
O isocampferídio, 3-metilflavonol, e o amburosídio A, glucosídio fenólico, foram
isolados do extrato etanólico das cascas do caule de Amburana cearensis e gentilmente
cedidos pelo grupo de pesquisa em Química Orgânica, Departamento de Química Orgânica e
Inorgânica da UFC, coordenado pelo Prof. Dr. Edilberto Silveira.
• Animais
Os experimentos foram realizados utilizando-se ratos albinos (Rattus norvergicus)
variedade Wistar (120 a 180g) de ambos os sexos, camundongos albinos (Mus musculus)
variedade Swiss-Webster (25 a 30g) de ambos os sexos ou cobaias albinas (Cavia porcelus)
(300 a 450g) de ambos os sexos, provenientes do Biotério Central da Universidade Federal do
Ceará e do Biotério Setorial do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de
Medicina desta mesma Universidade. Os animais foram divididos em grupos e mantidos
aproximadamente durante uma semana no Biotério do Departamento de Fisiologia e
Farmacologia em períodos de claro/escuro de 12 horas para ambientação e aclimatação. Aos
animais foram fornecidas água e ração ad libitum.
• Sangue humano
As amostras de sangue foram colhidas de doadores saudáveis, alunos, funcionários
e professores da universidade. Vale registrar que a colheita foi realizada nas instalações do
Centro de Hematologia e Hemoterapia do Ceará – Hemoce.
3. Materiais e Métodos
63
• Drogas
Carragenina, serotonina, bradicinina, histamina, prostaglandina E
2
, dextrano (PM
17,2), N-formil-metionil-leucil-fenilalanina (fMLP), citocalasina B, mieloperoxidase,
glutationa reduzida, brometo 3[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio (MTT), carbacol,
propranolol, 4-aminopiridina, iberiotoxina, glibenclamida, ester metil N
G
nitro-L-arginina (L-
NAME), 1H-[1,2,4]oxadiazolol [4,3-a] quinoxalin-1-one (ODQ), indomethacina, fentolamina,
etilenodiaminotetracético (EDTA) e Tween 80 foram adqüiridos da Sigma-Aldrich (St Louis,
MO, USA). Os meios de cultura (Ham F-12 e Meio Eagle Dulbecco’s modificado (D-MEM))
e o soro bovino fetal foram adqüiridos da Gibco BRL. Dextrano 500 e percoll foram
adqüiridos da Amersham Biosciences do Brasil Ltda. N-t-butoxicarbonil-L-alanina-p-
nitrofeniléster (Boc-Ala-OphNO
2
) foi adquirido da Fluka, Switzerland. Ácido tricloroacético,
ácido tiobarbitúrico, p-nitrofenol, 3,3’,3,5’-tetrametilbenzidina (TMB) e 5,5’-dithiobis (2-
nitrobenzoic acid) (DTNB) foram adqüiridos da Merck.
• Composição das Soluções
Tabela 2 – Solução salina tamponada com fosfato (PBS)
Composição Quantidade Empresa
Cloreto de sódio 8,0 g Reagen
Cloreto de potássio 0,2 g Reagen
Fosfato de sódio monobásico 0,2 g Reagen
Fosfato de sódio dibásico 1,15g Reagen
Água destilada q.s.p. 1,0 L UFC
pH=7,4
Tabela 3 – Solução de Turk
Composição Quantidade Empresa
Ácido acético glacial 20,0 ml Reagen
Violeta genciana 2,0 ml Reagen
Água destilada q.s.p. 1,0 L UFC
3. Materiais e Métodos
64
Tabela 4 – Solução de Albumina 3%
Composição Quantidade Empresa
Albumina bovina 3,0 g Sigma-Aldrich
Água destilada q.s.p. 0,1 L UFC
Tabela 5 – Tampão HBSS (Solução Salina de Hanks)
Composição Quantidade (mM) Empresa
CaCl
2
1,2 Reagen
MgSO
4
0,4 Reagen
Na
2
HPO
4
0,42 Reagen
KCl 5,4 Reagen
Glicose 5,5 Reagen
NaCl 136 Reagen
Água destilada q.s.p. 1,0 L UFC
pH=7,4
Tabela 6 – Tampão HBSS modificado
Composição Quantidade (mM) Empresa
Na
2
HPO
4
0,42 Reagen
KCl 5,4 Reagen
Glicose 5,5 Reagen
NaCl 136 Reagen
Água destilada q.s.p. 1,0 L UFC
pH=7,4
3. Materiais e Métodos
65
Tabela 7 – Tampão HBSS modificado concentrado
Composição Quantidade Empresa
Na
2
HPO
4
4,2 mM Reagen
KCl 54,0 mM Reagen
Glicose 55,0 mM Reagen
NaCl 1,36 M Reagen
Água destilada q.s.p. 1,0 L UFC
pH=7,0
Tabela 8 – Solução de Krebs-Henseleit concentrada
Composição Quantidade (mM) Empresa
NaCl 119,0 Reagen
NaHCO
3
25,0 Reagen
KCl 4,7 Reagen
CaCl
2
2,5 Reagen
MgSO
4
1,1 Reagen
KH
2
PO
4
1,2 Reagen
glicose 11,0 Reagen
Água destilada q.s.p. 1,0 L UFC
No momento do uso a solução foi diluída 10 vezes, pH=7,4.
3. Materiais e Métodos
66
3.2. MÉTODOS
3.2.1. Estudo Químico - isolamento do isocampferídio (ICPF) e do amburosídio A (AMB)
das cascas do caule de Amburana cearensis
Como representado na Figura 10, as cascas do caule de Amburana cearensis (3,3 kg)
foram trituradas mecanicamente e extraídas exaustivamente com etanol em aparelho de
Soxhlet. O extrato etanólico foi concentrado por destilação do solvente, fornecendo 250 g de
um sólido escuro de odor característico, conferido pela cumarina, denominado de ACCE. O
ACCE (250 g) foi dissolvido em água, extraído com acetato de etila, obtendo-se uma fração
aquosa (ACCEAq – 168,4 g) e outra fração acetato de etila (ACCEA – 74,0 g). A fração
ACCEA, foi dissolvida em metanol e submetida à partição com hexano, obtendo-se assim uma
fase hexânica e outra fase metanólica, que foi evaporada e acrescida de acetato de etila, além
de água até a formação de duas fases. As fases hidrometanólica e acetato de etila foram
concentradas e denominadas ACCEAM (13,8 g) e ACCEAH (47, 2 g) respectivamente. A
fração ACCEAM (55,5 g) foi adsorvida em gel de sílica e acondicionada em coluna
cromatográfica. Utilizou-se como eluentes: hexano/clorofórmio (1:1), clorofórmio,
clorofórmio/acetato de etila (1:1), acetato de etila e metanol. As frações foram coletadas e
denominadas: ACCEAM/HCl, ACCEAM/HC2, ACCEAM/C, ACCEAM/CA, ACCEAM/A,
ACCEAM/M. A fração ACCEAM/CA foi cromatografada em gel de sílica, o que levou a um
pool de frações, denominada ACCEAM/CA. Essa, após ser cromatografada por duas vezes em
Sephadex LH-20
®
, resultou na obtenção de um sólido amorfo amarelo (114, 1 mg),
denominado ACCE-4 e identificado como sendo o ICPF, por meio de análise dos dados
espectrométricos de RMN
1
H e
13
C. A fração ACCEAM/A (8-10) após cromatografia em
Sephadex LH-20
®
foi obtido um sólido denominado ACCE-6 (1,02g) que teve sua estrutura
elucidada através de espectroscópicos, RMN1H e 13C, sendo caracterizado como AMB. As
características físico-químicas do isocampferídio e do amburosídio a foram corroboradas por
estudos anteriores (GANZERA, 1998; BRAVO et al., 1999; CANUTO, 2002). O estudo
químico foi realizado no Departamento de Química Orgânica e Inorgânica, Universidade
Federal do Ceará, sob a coordenação do Prof. Dr. Edilberto Silveira.
3. Materiais e Métodos
67
Figura 10. Esquema de fracionamento do extrato etanólico de Amburana cearensis para o
isolamento do isocampferídio (ICPF) e do amburosídio A (AMB).
cascas do caule
A. cearensis
Extração – EtOH
Extrato EtOH
ACCE
Fração aquosa
ACCEAq
Fração AcOEt
ACCEA
1. Água; 2. AcOEt
Fração MeOH
ACCEAM
F. Hexânica
ACCEAH
ACCEAM/CA
Cromatografia Sílica
ACCEAM/A
Cromatografia Sílica
Sephadex LH-20
MeOH/Hexano
ACCE-4 ACCE-6
ICPF AMB
Sephadex LH-20
CHCl
3
/AcOEt
3. Materiais e Métodos
68
Tabela 9. Objetivos e métodos empregados nos estudos toxicológico e Farmacológico do
isocampferídio (ICPF) e do amburosídio A (AMB) isolados das cascas do caule de Amburana
cearensis.
OBJETIVOS MÉTODOS
Avaliar a toxicidade do ICPF e
do AMB
• Teste hipocrático em camundongos e
citotoxicidade em células hepáticas de ratos
Investigar a atividade
antiinflamatória do ICPF e do
AMB
• Edema de pata, incluindo análise
morfométrica em camundongos ou ratos;
• Permeabilidade vascular em camundongos;
• Migração celular: peritonite induzida por
carragenina ou fMLP em camundongos;
• Degranulação de PMNs-determinações
enzimáticas (MPO e elastase)
Avaliar a atividade
hepatoprotetora e antioxidante
do AMB em ratos
• Hepatotoxicidade inducida por CCL
4
em
ratos : avaliação da função hepática;
peroxidação lipídica (TBARS), dosagem de
catalase e GSH.
Investigar o efeito do ICPF e do
AMB sobre a contratilidade em
traquéia isolada de cobaia
• Efeito sobre o tônus basal e induzido por
carbacol ou KCl;
• Efeito sobre a traquéia sem epitélio;
• Avaliar a participação do: óxido nítrico,
guanilato ciclase e canais de potássio.
3. Materiais e Métodos
69
O isocampferídio e amburosídio A foram dissolvidos numa solução aquosa de
Tween 80, onde a concentração não excedeu a 4%.
3.2.2. Avaliação dos efeitos gerais - teste hipocrático. Camundongos Swiss de ambos os
sexos foram divididos em grupos de 10 animais. Cada grupo foi submetido ao tratamento com
ICPF ou AMB com dose única de 50, 100 e 200 mg/kg, administrada por via intraperitoneal
(i.p.) num volume de 10ml/kg. Os demais grupos foram tratados com o veículo de dissolução
do ICPF e AMB (Tween 80 a 4%) (controle) ou solução salina. Os animais foram observados
15, 30, 60, 120 minutos após o tratamento e a cada 24 horas durante 3 dias. Dentre os sinais
investigados estão incluídos: alteração da motilidade, freqüência respiratória, alteração na cor
da urina, diarréia, analgesia, contorção abdominal, movimentos estereotipados, catatonia,
piloereção, tremor, convulsão, sedação e morte.
3.2.3. Teste de citotoxicidade
Vários ensaios in vitro podem ser empregados na avaliação da potencial
citotoxicidade de substâncias químicas. Esses ensaios necessitam de pequenas quantidades de
substância teste e vários parâmetros podem ser determinados desde a contagem direta de
células às medidas da integridade da membrana (ex.: lactato desidrogenase - LDH) e da
atividade metabólica celular. A medida da função metabólica celular pode ser determinando o
nível de ATP ou a atividade mitocondrial, esta investigada através do teste do MTT (brometo
3[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio). Vários tipos celulares têm sido empregados nos
ensaios de citotoxicidade incluindo, fígado, rim, pulmão, cérebro, testículo e ovário (BARILE
et al., 1994).
• Cultura de hepatócitos de ratos
A cultura primária de hepatócitos constitui um dos sistemas in vitro de escolha para
avaliar a citotoxicidade de xenobióticos. Isso, por manter um nível considerável de
metabolismo e ser o fígado um órgão alvo primário quando na exposição à xenobióticos
(HARBELL et al., 1997).
• Isolamento de Hepatócitos
Foram utilizadas ratas Wistar grávidas (200 – 240 g), que após anestesiadas com
éter e sacrificadas por deslocamento cervical foram submetidas a laporatomia para a retirada
dos embriões. O fígado depois de dissecado foi lavado com solução salina gelada,
3. Materiais e Métodos
70
fragmentado e mantido por 5 minutos em solução de EDTA 2 mM à 37°C no banho-maria sob
agitação. A seguir o sobrenadante foi descartado e os fragmentos de fígado foram
ressuspendidos com solução de HANKS (3ml) contendo colagenase e DNAse a 37°C no
banho-maria. O sobrenadante foi coletado por três vezes a cada 8 minutos. Ao final desses,
aos sobrenadantes (~ 9 ml) foi acrescentado 9 ml de D-MEM com Soro Bovino Fetal (SBF) a
10%, perfazendo um volume total de 18 ml. A solução foi então filtrada e centrifugada a 30g
durante 2 min. O processo foi repetido por 3 vezes descartando o sobrenadante e
acrescentando ao “pellet” o meio Ham F-12 (5ml). Após a última centrifugação, o meio foi
ressuspendido com D-MEM.
• Condições de cultivo.
Após a contagem dos hepatócitos foi realizado o plaqueamento com meio de Ham
F-12/D-MEM (1:1) SBF 10%, empregando placas multi-well de 96 poços e de 6 poços
previamente tratadas com poly-lisina numa concentração de 5x10
4
células/poço. Ao meio de
Ham F12 foi acrescido dexametasona 10
-7
mol/l e insulina 0,6mg/l. A cultura foi mantida a
37°C em estufa a 5% CO
2
. Quatro dias depois do plaqueamento, a cultura foi utilizada para
experimentação (LILJA et al., 1998).
• Teste do MTT
É um método colorimétrico utilizado para determinar a viabilidade celular e se
baseia no fato do MTT, sal de coloração amarela, ser reduzido pelo sistema enzimático
succinato-tetrazol redutase que forma parte da cadeia respiratória da mitocôndria, a um sal,
Formazan, que possui cor púrpura. Assim, a ausência da redução do MTT indica uma
diminuição na atividade metabólica celular, ou seja, na viabilidade celular (MOSMANN,
1983). Decorridos 4 dias de cultura, o ICPF ou AMB foram adicionados à cultura em
concentrações crescentes (0,1; 0,5; 1; 10; 50 e 100 μg/ml). Após 24 h de incubação o meio foi
descartado e incubado um novo meio (200 μL) contendo 10% de MTT, na concentração de 5
mg/ml, e estas células foram incubadas por mais 3h. Por fim, foi descartado o sobrenadante e
adicionado então 150 μL de DMSO puro para a lise das células e solubilização do formazan,
nesse instante as placas foram agitadas durante 15 min com auxílio de um agitador de placas.
A absorbância foi medida em leitor de microplacas a 540 nm. Os experimentos foram
realizados em sextuplicata e repetidos em três dias diferentes.
3. Materiais e Métodos
71
3.2.4. Avaliação da atividade antiinflamatória em modelos in vivo e in vitro
• Edema de pata induzido por carragenina em ratos
Descrito por Winter et al. (1962) o edema inflamatório induzido pela injeção
subcutânea de carragenina na pata é resultante da ação seqüencial e integrada de vários
mediadores inflamatórios que causam um aumento agudo e progressivo do volume da pata.
Assim, esse modelo tem sido considerado útil para avaliação da atividade antiinflamatória de
novos compostos.
Ratos Wistar, machos (120-180 g) divididos em grupos de 8 animais foram tratados
por via i.p. num volume de 10ml/kg, com ICPF (25 e 50 mg/Kg), AMB (25 e 50 mg/kg),
indometacina (5 mg/Kg, i.p.) ou veículo (Tween 80 à 4% em água - controle) 30 min antes da
injeção subcutânea de 100μL da solução de carragenina a 1% na pata traseira, direita do
animal. O volume da pata foi medido antes e 1, 2, 3, 4 e 24 h após a injeção de carragenina,
através de pletismógrafo (Ugo Basile, Itália). O volume do edema foi determinado em ml pela
diferença entre o volume da pata nos referidos intervalos de tempo e o volume antes da injeção
de carragenina.
• Avaliação morfométrica.
O estudo morfométrico foi realizado segundo o método de Aherne (1970), com fins
de identificação e contagem de neutrófilos. Para tanto, foram escolhidos campos aleatórios de
40x, utilizando um retículo de linhas e pontas que permitiu a delimitação dos campos
microscópicos. Quanto ao nível de profundidade, o estudo foi desenvolvido a nível profundo,
este incluindo hipoderme e freqüentemente plano muscular.
• Edema de pata induzido por dextrano, prostaglandina E
2
, histamina,
serotonina ou bradicinina em camundongos
Os ensaios foram realizados segundo estudos anteriores (GAMSÉ et al., 1980;
CUNHA et al., 2001; HERNANDEZ et al., 2001). Camundongos Swiss (25-30 g) receberam
uma injeção subcutânea (50 μL) na pata direita traseira da solução de dextrano 12%,
prostaglandina E
2
(PGE
2
, 30 nmol/animal), histamina (200 μg/animal), serotonina (200
μg/animal) ou bradicinina (3 nmol/animal). O volume da pata foi medido através de
pletismógrafo (Ugo Basile) em diferentes intervalos de tempo após a injeção do estímulo
inflamatório. Nos ensaios com bradicinina os animais foram pré-tratados com captopril (5
mg/kg, i.p.), inibidor da enzima conversora de angiotensina (ECA), para prevenir a ação das
3. Materiais e Métodos
72
cininases. Trinta minutos antes da injeção do estímulo inflamatório os animais foram tratados
com ICPF (12,5; 25 e 50 mg/kg, i.p.), AMB (25 e 50 mg/kg, i.p.) ou veículo (controle). O
volume do edema (μL) foi determinado conforme descrito no ítem anterior.
• Aumento da permeabilidade vascular induzida por dextrano em pata de
camundongos
O edema de pata foi induzido segundo metodologia descrita no item anterior (1.3).
Duas horas após a injeção de dextrano os animais foram sacrificados e realizadas as excisões
das patas para determinação do extravasamento vascular (GAMSÉ et al., 1980). Porém, trinta
minutos antes foi administrado por via intravascular uma solução de azul de Evans (25
mg/kg). As patas dos animais foram mantidas em formamida a 37°C durante 24 h e, após
centrifugação do material a 2.500 r.p.m. durante 20 min a absorbância do sobrenadante foi
determinada em 619 nm. A leitura da absorbância interpolada na curva padrão de azul de
Evans permitiu a quantificação do corante extravasado e foi utilizado como índice do
extravasamento protéico.
• Peritonite induzida por carragenina ou N-Formil-metionil-leucil-
fenilalanina (fMLP) em camundongos
O ensaio foi desenvolvido segundo protocolo experimental proposto por Ferrándis
& Alcaraz (1991). Grupos de 8 animais foram tratados com ICPF (25 e 50 mg/kg, i.p. e v.o.),
AMB (25 e 50 mg/kg, i.p. e v.o.), dexametasona (5 mg/kg, v.o.) ou veículo. Decorridos 30 ou
60 minutos, os animais receberam uma injeção i.p. de 10 ml/kg de carragenina 1% ou fMLP
(10
-4
M). A seguir os animais foram devolvidos às caixas e deixados com livre acesso à ração e
água durante 5 horas. O exsudato peritoneal foi coletado com uma pipeta Pasteur plástica
através de laparoscopia abdominal. Para coleta todos os animais receberam uma injeção de
PBS (Phosphate Buffer Solution) heparinizado (5 UI/ml). Uma amostra do lavado peritoneal
foi diluída 1:20 em líquido de Türk para contagem de leucócitos totais. Enquanto, para
contagem diferencial o exsudato foi centrifugado a 1.000 r.p.m. durante 5 min e ao sedimento
foi adicionado 200 μL de albumina bovina 3% para preparação das lâminas. As células foram
coradas com o corante panótico rápido e os resultados foram expressos em número de
células/ml.
3. Materiais e Métodos
73
• Efeito do ICPF e do AMB sobre a degranulação leucocitária, mensurado
pela atividade das enzimas mieloperoxidase (MPO) e elastase
Obtenção de leucócitos polimorfonucleares (PMNs). O isolamento dos PMNs foi realizado
conforme descrito por Boyum (1968). Para tanto, foi utilizado sangue humano de doadores
sadios coletado com citrato de sódio 3,8% como anticoagulante. Ao sangue humano (400 ml)
foi adicionado igual volume de solução de dextrano 2% em soro fisiológico. Após suave
homogeneização a mistura foi deixada em repouso por 60 min, tempo necessário para a
separação das duas fases. A fase superior, foi centrifugada a 325 g durante 15 min a
temperatura ambiente e ao sedimento ligeiramente contaminado com hemácias foi adicionado
45 ml de água destilada a 4°C seguida de 5 ml de tampão HBSS modificado concentrado.
Após centrifugação (325 g - 10 min a temperatura ambiente), foi adicionado ao sedimento 10
ml de HBSS modificado e em seguida 10 ml de Percoll (1,09 g/ml), para obtenção de um
gradiente a separação das células PMNs. Por fim, o material foi novamente centrifugado,
20.000 g durante 20 min., e a fase intermediária, foi separada, ressuspendida em HBSS e
realizada a contagem de leucócitos, predominantemente neutrófilos (85,0 ± 2,8 %). A
viabilidade celular foi determinada pela técnica de Azul Tripan a 2% (células viáveis: 89,0 ±
2,0 %) e pelo teste do MTT (ítem 3.2.3).
Desgranulação de PMNs. A suspensão de PMNs (2,5 x 10
6
céls/ml) foi pré-incubada durante
15 min a 37°C com AMB (10, 25, 50 e 100 μg/mL), ICPF (25, 50 e 100 μg/mL), veículo
(controle) ou salina (NaCl 0,9%). A seguir foi adicionado a citocalasina B (10 μM) e após 5
min a 37°C os leucócitos foram estimulados com fMLP (10 nM). Decorridos 10 min, o
material foi centrifugado durante 10 min a 4°C e o sobrenadante obtido, rico em enzimas
liberadas pela degranulação leucocitária, foi utilizado nos ensaios enzimáticos realizados
segundo metodologia descrita por Úbeda et al. (2002).
Determinação da atividade da MPO. Aos 50 μL do sobrenadante foi adicionado PBS (100
μL), tampão fosfato (50 μL) e H
2
O
2
(0,012%). Após 5 min a 37 °C foi acrescido 20 μL de
3,3’,3,5’-tetrametilbenzidina (TMB, 1,5 mM) e a reação foi interrompida pela adição de 30 μL
de acetato de sódio (1,5 M; pH 3,0). A absorbância foi determinada em 620 nm. A construção
de uma curva padrão pela adição de quantidades crescentes de MPO (0,125 - 3 U/ml) permitiu
relacionar a absorbância com as unidades enzimáticas/ml. Os resultados foram expressos
como percentual de inibição da atividade enzimática (ANDREWS & KRINSKY, 1981).
3. Materiais e Métodos
74
Determinação da atividade da elastase. Ao sobrenadante (250 μL) foi adicionado 5 μl de
Boc-Ala-OphNO
2
(2 μM). Após 20 min a 37°C foi determinada a absorbância em 348 nm.
Para determinação da atividade enzimática foi construída uma curva padrão pelo emprego de
quantidades crescentes de p-nitrofenol (10 – 200 nmol/mL). Os resultados foram expressos
como percentual de inibição da atividade enzimática (ESCRIG et al., 1997).
3.2.5. Hepatotoxicidade e estresse oxidativo induzido por CCL
4
em ratos (HUONG et al.,
1998).
Ratos Wistar (150-200g), machos, foram pré-tratados por via oral com AMB (25 e
50 mg/kg, i.p.) ou veículo (controle), 30 min antes da administração de CCl
4
50% (i.p.) em
óleo de oliva (0,5 ml/kg). Após 48 h os animais foram anestesiados, coletados o sangue e
sacrificados por decapitação. O fígado foi removido, lavado com solução salina 0,9% resfriada
e homogeneizado.
• Avaliação da Função Hepática. As dosagens enzimáticos (alanina
transaminase, aspartato transaminase e fosfatase alcalina) no sangue foram realizados de
acordo com as orientações do fabricante – Labtest diagnostica (www. labtest.com.br).
Alanina Transaminase (ALT). É uma enzima produzida pelo fígado e liberada no sangue
quando ocorre lesão de células hepáticas. Portanto, a mensuração da alanina transaminase ou
transaminase glutâmica pirúvica (ALT/TGP) no sangue é útil para a detecção de lesão celular
hepática.
A ALT catalisa especificamente a transferência do grupo amina da alanina para o
cetoglutarato, com formação de glutamato e piruvato. O piruvato é reduzido a lactato por ação
da lactato desidrogenase (LDH), enquanto a coenzima NADH é oxidada a NAD (reação 2). A
redução da absorbância em 340 ou 365nm, conseqüente à oxidação da NADH, é monitorizada
espectrofotometricamente, sendo diretamente proporcional à atividade da ALT na amostra.
Procedimento: no ensaio em 1,0 ml do reagente de trabalho foi adicionado 0,1 ml da amostra.
Após homogeneização a mistura foi transferida para uma cubeta termostatizada a 30
o
C e
deixada em repouso durante 1 min. Decorrido esse período foi realizada a leitura inicial (A
1
), a
qual foi repetida após 2 min (A
2
). A média das diferenças de absorbância por minuto
(ΔA/minuto) foi determinada, e utilizada para calcular o resultado. ALT/TGP (U/L) 340nm =
ΔA/minuto x 1746.
3. Materiais e Métodos
75
Aspartato transaminase (AST). É uma enzima liberada no sangue quando ocorre uma lesão
hepática, cardíaca, muscular ou cerebral. Assim, a determinação da aspartato transaminase ou
transaminase glutâmico oxalacética (AST/GOT) em amostras de sangue é útil na avaliação da
função hepática.
A AST catalisa a transferência de grupos amina da alanina para o cetoglutarato,
com formação de glutamato e oxalacetato. Este é reduzido a malato por ação da malato
desidrogenase (MDH), enquanto que a coenzima NADH é oxidada a NAD. A redução da
absorbância em 340 ou 365 nm, determinada por espectrofotometria é diretamente
proporcional à atividade da enzima na amostra.
Procedimento: foi realizado de acordo com processo descrito no item anterior, empregando-se
o reagente de trabalho adequado para a mensuração da AST.
AST/GOT (U/L) 340nm = ΔA/minuto x 1746.
• Análise Histopatológica. O tecido hepático após fixação em formol aquoso
neutro a 10%, foi desidratado com uma seqüência de soluções aquosas contendo etanol 50 –
100% e incluído em parafina. Cortes em seções de 5 µm foram corados com hematoxilina –
eosina e observados com auxílio de microscópio ótico.
• Medida dos níveis de lipoperoxidação no tecido hepático – dosagem de
substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS) (HUONG et al., 1998). Ao
homogenato de fígado (0,5 ml) a 10% em KCl 1,15% foi adicionado 0,9 ml de tampão fosfato
(50 mM) e 0,5 ml do sistema catalisador de formação de radicais livres, contendo FeSO
4
(0,01
mM) e ácido ascórbico (0,1 mM). A mistura foi mantida durante 30 min a 37
o
C e a seguir a
reação foi interrompida pela adição do ácido tricloroacético a 10%. A seguir após nova
centrifugação (3000 rpm – 15 min) o sobrenadante foi separado e acrescido 1 ml de ácido
tiobarbitúrico a 0,8%. A mistura foi mantida em banho de água fervente durante 15 min. Após
resfriamento com auxílio de um banho de gelo, foi medida a absorbância em 532nm. Os dados
foram calculados a partir de uma curva padrão de malonildialdeído (MDA), um dos produtos
tóxicos da peroxidação lipídica, expressos em nmol de MDA/mg de proteína.
• Dosagem de catalase no fígado (AEBI, 1974) O tecido hepático foi homo-
geneizado em um volume 200 vezes o seu peso com solução tampão fosfato de sódio 0,1 M -
pH 7,0. A seguir o homogenato foi centrifugado a 4°C durante 10 min a 5800 rpm; a fase
superior foi desprezada enquanto a fase inferior foi submetida à análise espectrofotométrica
3. Materiais e Métodos
76
(230 nm). Na cubeta foi adicionado 980 μL de meio de reação (H
2
O
2
15%, Tampão Tris-HCl
1 M; EDTA 5 mM pH 8,0; H
2
O Milli-Q), 20μL do amostra diluída (Amostra: tampão (1:200))
e logo a seguir foi determinada a absorbância durante 6 min. Os resultados foram expressos
em mmol/min/mg de proteína.
• Dosagem de Glutationa Reduzida (GSH) – determinação de grupos
sulfidrílicos (-SH) não protéicos. A GSH (L-γ-glutamil-L-cisteinil-glicina) é o tiol (-SH)
mais abundante no meio intracelular e constitui um dos agentes mais importantes do sistema
de defesa antioxidante da célula (Meister & Anderson, 1983).
O nível de GSH foi determinado através do método de Ellman (1959) ligeiramente
modificado. Para tanto, ao homogenato de fígado (400 µl) a 10% em EDTA 0,02 M, foi
acrescido 320 µl de água destilada e 80µl de ácido tricloroacético a 50%. Após centrifugação,
3000 rpm durante 15 min a 4
o
C, foi retirada uma alíquota do sobrenadante (400 µl) e acrescido
Tris-HCl 0,4 M, pH 8,9 (800 µl) e DTNB 0,01 M (20 µl). A leitura espectrofotométrica (420
nm) foi realizada 1 min após a adição do DTNB. Os dados foram calculados a partir de uma
curva padrão de GSH e expressos em µg/mg de proteína.
• Determinação do conteúdo de proteína.
Foi utilizada a metodologia descrita por Lowry et al. (1951). A reação consiste na
hidrólise alcalina das proteínas com posterior reação com o reagente colorimétrico de Folin-
Ciocalteau, em solução contendo Na
2
CO
3
200 mM, NaOH 100 mM, tartarato de sódio e
potássio 1 mM e sulfato de cobre 20 mM. A leitura espectrofotométrica foi realizada a 750 nm
e os valores obtidos foram comparados à curva padrão de albumina.
3.2.6. Avaliação do efeito do ICPF sobre contratilidade da musculatura lisa traqueal de
cobaia
Cobaias (350 – 450g) foram inicialmente anestesiadas pela inalação de éter e a
seguir, colocados na posição de decúbito dorsal para a excisão da traquéia. A região cérvico -
torácica anterior foi aberta cirurgicamente e a traquéia foi então, removida cuidadosamente e
levada a uma placa de Petri contendo solução de Krebs-Henseleit aerada, onde foi feita a
remoção do tecido conectivo. Após a remoção da traquéia os animais foram sacrificados por
exsanguinação, através de secção da artéria aorta abdominal. Segmento da traquéia, com
aproximadamente 3-4 mm de comprimento foi montado em cuba para órgão isolado com
capacidade de 7 ml contendo solução de Krebs-Henseleit aerada com 95% O
2
e
5% CO
2
e
3. Materiais e Métodos
77
mantida a 37 °C (CASTILLO & DE BEER, 1947). A traquéia foi submetida a tensão de 1 gF
e as respostas isométricas foram registradas no polígrafo (Narco Bio Systems Inc., USA) por
intermédio de um transdutor de força (F-60). Durante o período (60 min) de equilíbrio da
preparação, a solução de Krebs-Henseleit foi renovada a cada 15 min. Nos experimentos
realizados com traquéia sem epitélio, o tecido epitelial foi removido delicadamente com
auxílio de uma haste de algodão, e o procedimento foi avaliado por análise histológica e pela
resposta contrátil à bradicinina (1 µM) (Folkerts & Nijkamp, 1998). Todo o estudo foi
realizado na presença de indometacina (3 µM), para prevenir a resposta neural resultante da
produção de prostaglandinas endógena. Em alguns experimentos foram adicionados à solução
Krebs-Henseleit fentolamina (10 µM) e propranolol (1 µM) para inibir a resposta α e β
adrenérgica.
• Procedimento experimental. A traquéia com ou sem epitélio foi pré-contraída
com carbacol (CCh, 30 ou 100 µM, 70 – 90% da contração máxima) ou KCl (40 mM, 49% da
contração máxima, e 120 mM). Logo após a contração sustentada tornar-se estável,
aproximadamente 10 min, foram adicionadas ao banho concentrações crescentes de ICPF (10
– 100 µM) ou AMB (10 – 1000 µM) utilizando o método cumulativo (VAN ROSSUM, 1963).
O relaxamento foi expresso como percentual da contração máxima induzida pelo CCh ou KCl.
A teofilina, bloqueador não seletivo de fosfosdiesterase, foi utilizada como padrão.
Para investigar o possível mecanismo de ação miorelaxante do ICPF, a traquéia com
epitélio foi incubada 20 min antes da adição do agonista com as seguintes drogas: L-NAME
(antagonista competitivo da óxido nítrico sintase, 100 μM), ODQ (inibidor seletivo da
guanilato ciclase, 3 and 33 μM), propranolol (bloqueador β-adrenérgico, 1 μM), capsaicina
(agente dessensibilizante e excitatório dos neurônios sensoriais aferentes, 3 μM), 4-
aminopiridina (4-AP, bloqueador seletivo dos canais de K
+
voltagem dependente, 100 μM),
iberiotoxina (IbTX, bloqueador seletivo do canais de K
+
sensíveis ao Ca
2+
, 0,1 μM) ou
glibenclamida (bloqueador dos canais de K
+
sensíveis ao ATP, 33 μM). Indometacina e
fentolamina foram dissolvidas em etanol, com a concentração final no banho de 0,004%. As
demais drogas foram dissolvidas em água destilada ou Tween 80 (concentração final não
excedeu a 0,05%). O ICPF foi dissolvido numa solução aquosa de Tween 80 4%, e a
concentração final não excedeu a 0,24%.
3. Materiais e Métodos
78
3.2.7. Análise estatística
A análise estatística foi realizada com auxílio do programa Graph Pad Prism 4.0
(USA). Os resultados foram expressos como a média ± erro padrão da média (EPM.) e a
comparação entre as médias foi realizada utilizando-se o teste “t” de Student, comparação
entre duas médias, ou análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de Tukey. As CE
50
(concentração efetiva do ICPF que equivale a 50% da resposta máxima) obtidas foram
comparadas através da média geométrica dos experimentos individuais para um intervalo de
confiança (I.C.) de 95%. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas
quando P<0,05.
4. Resultados
79
4
RESULTADOS
4
4. Resultados
80
4. RESULTADOS
Os resultados do presente estudo foram divididos em quatro partes: 1) Avaliação
preliminar das possíveis toxicidades do isocampferídio (ICPF) e do amburosídio A (AMB)
isolados de Amburana cearensis A.C.Smith em camundongos ou ratos; 2) Determinação das
atividades antiinflamatórias do ICPF e do AMB em ratos ou camundongos; 3) Avaliação da
atividade hepatoprotetora/antioxidante do AMB em ratos e 4) Determinação dos efeitos do
ICPF e do AMB sobre a contratilidade do músculo liso traqueal de cobaias.
4.1. Avaliação preliminar das toxicidades do isocampferídio (ICPF) e do amburosídio A
(AMB) isolados de Amburana cearensis A.C. Smith
• Efeitos gerais do ICPF e do AMB - teste hipocrático em camundongos
Camundongos de ambos os sexos (n= 10) tratados com ICPF (50 e 100 mg/kg, i.p.)
ou AMB (50 e 100 mg/kg, i.p.) em doses únicas, apresentaram comportamento normal durante
todo o período de observação, 3 dias, em relação ao grupo controle (veículo). Porém, a
administração de ICPF na maior dose (200 mg/kg, i.p.) causou mudança na coloração da urina
(amarelo mais intenso) em 20% dos animais tratados, analgesia e diminuição da atividade
motora, sugerindo um possível efeito depressor do sistema nervoso central. A mudança na
coloração da urina está possivelmente relacionada à coloração da solução do ICPF, 3-
metilflavonol, que possui coloração amarelada. Os animais tratados com a maior dose de
AMB (200 mg/kg, i.p.) apresentaram também analgesia, observada pela ausência de reação ao
prensamento da cauda. Nas doses investigadas tanto o ICPF quanto o AMB não causaram a
morte dos animais.
• Avaliação das citotoxicidades do ICPF e do AMB em hepatócitos de ratos.
Na Figura 11 pode ser observado que a adição do ICPF em concentrações
crescentes (0,1; 0,5; 1; 10 e 100 µg/ml) à cultura primária de hepatócitos causou redução (36
%) significativa da viabilidade celular apenas na maior concentração. O AMB (0,1; 0,5; 1; 10
e 100 µg/ml) por sua vez, reduziu apenas de 10 a 23,6 % a viabilidade celular, apresentando
assim uma baixa citotoxicidade para células hepáticas.
4. Resultados
81
con
tro
le
ICPF
0
,1
ICPF 0,5
ICPF
1
I
CPF
1
0
IC
P
F
1
00
0
25
50
75
100
125
células. viáveis (% controle)
*
control
e
AMB 0,1
AMB 0
,
5
AMB
1
AM
B 10
AMB
1
00
0
25
50
75
100
125
células viáveis (% controle)
Figura 11. Avaliação da citotoxicidade do isocampferídio (ICPF) e do amburosídio A (AMB)
em hepatócitos de ratos. As células foram cultivadas durante 4 dias. O ICPF ou AMB nas
concentrações de 0,1; 0,5; 1; 10 e 100 µg/ml (0,237 – 237 µM) foram adicionados ao meio e
24 h depois a viabilidade celular foi determinada pelo teste do MTT. Os valores estão
expressos como média ± E.P.M das análises realizadas em sextuplicata e repetidas em três dias
diferentes. Os resultados obtidos na presença das drogas testes foram comparados em relação
ao controle (* P< 0,05, ANOVA e teste de Tukey, como teste post hoc).
4. Resultados
82
4.2. Determinação das atividades antiinflamatórias do isocampferídio (ICPF) e do
amburosídio A (AMB) isolados de Amburana cearensis A.C. Smith
4.2.1. Modelo do edema de pata induzido por diferentes agentes inflamatórios, incluindo
estudo histopatológico, avaliação morfométrica e avaliação da permeabilidade vascular em
ratos ou camundongos
• Edema de pata induzido por carragenina
O pré-tratamento de ratos Wistar com ICPF (50 mg/kg, i.p.) reduziu
significativamente o volume (ml) do edema de pata na 2
a
, 3
a
e 4
a
hora após a administração de
carragenina (0,71 ± 0,09; 0,81 ± 0,06 e 0,79 ± 0,06 ml respectivamente) em relação ao
controle (1,16 ± 0,05; 1,59 ± 0,06; 1,66 ± 0,04 ml respectivamente) correspondendo a
inibições de 39, 49 e 52 % respectivamente. O AMB na menor dose (25 mg/Kg, i.p.) não
inibiu o edema, porém na dose de 50 mg/kg, causou inibições de até 38 % em relação ao
controle. Resultados semelhantes foram observados nos animais pré-tratados com
indometacina (5 mg/kg, i.p.), utilizada como droga padrão (Figura 12).
No exame histopatológico (Figura 13) da pata dos animais do grupo controle
(veículo) percebe-se uma reação inflamatória aguda, com edema representativo além de uma
intensa infiltração de neutrófilos, presente em maior número na derma profunda. Por outro
lado, nenhuma alteração foi observada no grupo não tratado com carragenina, apenas salina
(NaCl 0,9%). O pré-tratamento dos animais com o ICPF, AMB ou indometacina,
antiinflamatório não esteroidal, causou uma redução no edema e na celularidade, confirmando
os resultados do ensaio anterior.
Pela avaliação morfométrica (número de células/campo) da pata dos animais
verificou-se que o ICPF (50 mg/kg, i.p.), AMB (50 mg/kg, i.p.) e a indometacina (5 mg/kg,
i.p.) reduziram em 39, 50 e 44% respectivamente a celularidade, predominantemente de
neutrófilos, na derma profunda (Figura 14).
• Edema de pata induzido por dextrano
O pré-tratamento dos animais com AMB (25 e 50 mg/kg) interferiu tanto no edema
de pata quanto no extravasamento vascular induzido por dextrano em camundongos (Figura
15). O AMB administrado por via oral na maior dose (50 mg/kg) inibiu em 46 e 51 % o edema
e o extravasamento vascular respectivamente em relação aos controles, pré-tratados com
veículo e dextrano 2h antes das avaliações. Enquanto, no pré-tratamento por
4. Resultados
83
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
123424
Controle
ICPF 50 mg/kg
INDO 5 mg/kg
AMB 25 mg/kg
AMB 50 mg/kg
Figura 12. Atividade antiedematogênica do isocampferídio (ICPF) e do amburosídio A
(AMB) sobre o edema de pata induzido por carragenina em ratos. Ratos Wistar (120-180 g)
foram tratados por via intraperitoneal com ICPF, AMB, indometacina (INDO) ou veículo
(controle) 30 min antes da injeção intraplantar de 0,1 ml da solução de carragenina a 1% na
pata traseira, direita do animal. Os valores representam a média ± E.P.M. de 8 animais por
grupo. *p<0,05 vs. controle (ANOVA e teste de Tukey, como teste post hoc).
Volume do edema
(
ml
)
Tempo (h)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
4. Resultados
84
Figura 13a. Micrografia ilustrando os efeitos do isocampferídio (ICPF), amburosídio (AMB)
e indometacina (INDO) sobre o edema de pata induzido por carragenina (Cg) em ratos.
Coloração hematoxilina e eosina. No grupo salina, animais foram tratados apenas com salina,
observa-se uma aparência normal, com epitélio (E) e diversos planos incluindo derma
superficial (DS), derma intermediária (DI) e plano profundo (PP) (derma profundo, plano
muscular e tecido adiposo). Enquanto no grupo controle(veículo + Cg) se percebe a diferença
nos diversos planos em relação ao grupo NT, com edema (seta preta) e intensa celularidade
predominantemente neutrófilos (seta branca) (aumento 40x).
E
DS
DI
PP
Salina
Controle
10x
10x
40x
4. Resultados
85
Figura 13b. Os tratamentos dos animais com ICPF (50 mg/kg, i.p.) bem como com AMB
(50mg/kg, i.p.) causaram reduções no edema (aumento 10x) e no número de células no plano
profundo melhor observada em maior aumento (40x). Coloração HE.
AMB
ICPF
40x
10x
40x
10x
4. Resultados
86
Figura 13c. Resultado semelhante foi observado para o grupo tratado com indometacina
(INDO, 5 mg/kg, i.p.) com inibição do edema (aumento 10x) e do acúmulo de células no plano
profundo melhor observado em maior aumento (40x). Coloração HE.
INDO
40x 10x
4. Resultados
87
controle ICPF AMB INDO
0 10 20 30 40
Figura 14. Avaliação morfométrica da migração de leucócitos induzida por carragenina (Cg)
na pata de rato, considerando o efeito do isocampferídio (ICPF), amburosídio A (AMB) e
indometacina (INDO). Ratos Wistar (120-180g) foram tratados por via intraperitoneal com
ICPF (50 mg/kg), AMB (50 mg/kg), INDO (5 mg/kg) ou veículo (controle) 30 min antes da
injeção de Cg a 1%.. No grupo não tratado com carragenina, apenas salina, não foram
observados granulócitos. Os valores representam a média ± E.P.M. de 8 animais por grupo.
*p<0,05 vs. controle (teste “t” de Student).
Número de células/campo
Controle ICPF AMB INDO
*
*
*
4. Resultados
88
Sali
n
a
Contr
ole
A
MB
25
i
.
p
.
A
MB
5
0
i
.p.
AMB
25
v.o.
AMB 50 v.o.
0
25
50
75
100
a
a,b
a,b
a,b
a
Sa
l
i
na
Co
n
trol
e
A
MB
2
5
i
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p
.
A
M
B 50 i
.
p.
AMB 25 v.o.
A
M
B
5
0
v
.
o.
0
5
10
15
20
25
a
a,b
a,b
a
a
Figura 15. Efeito do amburosídio A (AMB) sobre o edema de pata (A) e o extravasamento
vascular (B) induzidos por dextrano (Dx) em camundongos. Camundongos Swiss (30 -
35g) foram tratados por via intraperitoneal (i.p.) ou oral (v.o.) com AMB ou veículo
(controle) antes da injeção intraplantar da solução de Dx a 10% na pata do animal. O grupo
salina compreende os animais que não foram administrados dextrano, apenas salina. As
avaliações foram realizadas 2 h após a injeção do Dx. Os valores representam a média ±
E.P.M. de 8 animais por grupo. a vs salina, b vs controle (p<0,05, ANOVA e teste de
Tukey, como teste post hoc).
Volume do edema (µL)
(A)
(B)
Azul de Evans (mg/mL)
4. Resultados
89
via intraperitoneal o AMB causou reduções em torno de 45% no volume do edema, e no
extravasamento vascular inibiu em até 41 % em relação aos controles.
A Figura 16 mostra que o pré-tratamento dos animais com ICPF (25 e 50 mg/kg,
i.p.) reduziu significativamente também o edema induzido pelo dextrano (51,7 ± 5,7 e 42,8 ±
6,8 µl respectivamente) em relação ao controle (85,7 ± 7,4 µl), com inibições de 39 e 50 %
respectivamente. No extravasamento vascular redução significativa foi observada apenas para
a maior dose. A administração oral do ICPF (50 mg/kg) inibiu tanto o edema (43 %) quanto o
extravasamento vascular (41 %) induzidos pelo dextrano.
Com base nos resultados obtidos passamos a investigar o efeito do ICPF e do AMB
sobre o edema de pata induzido por mediadores inflamatórios (prostaglandina E
2
, histamina,
serotonina e bradicinina) envolvidos nos processos inflamatórios investigados.
• Edema de pata induzido por prostaglandina E
2,
histamina, serotonina e
bradicinina
A Figura 17 mostra o efeito do ICPF e do AMB sobre o edema de pata induzido
pela Prostaglandina E
2
– PGE
2
. Observa-se que o ICPF na maior dose (50 mg/kg, i.p.) reduziu
significativamente o edema aos 15, 30, 60, 90 e 120 minutos após a injeção de PGE
2
(18,5 ±
2,4; 27,5 ± 3,3; 15,5 ± 1,6; 17,8 ± 1,8 e 12,6 ± 1,7 µl, respectivamente), quando comparado ao
controle (veículo e PGE
2
) nos mesmos períodos de tempos (42,78 ± 6,8; 56,7 ± 5,1; 50,0 ±
6,0; 35,3 ± 4,6 e 31,0 ± 3,5 µl, respectivamente), causando inibições de 49 a 69%. O AMB (50
mg/kg, i.p.), reduziu também o volume do edema significativamente nos períodos de 30,
60, 90 e 120 minutos após a injeção de PGE
2
, com inibições de 53; 51; 45 e 49 %
respectivamente. Na dose de 25 mg/Kg, i.p. o ICPF e AMB reduziram significativamente o
edema em parte dos períodos estudados, porém em menor grau.
No caso do ICPF (12,5 e 25 mg/kg, i.p.) doses menores já foram suficientes para
reduzir o edema de pata induzido por histamina. Na maior dose o ICPF causou reduções
significativas do edema aos 15, 30 e 60 minutos após a injeção de histamina (12,3 ± 1,8; 18,0
± 2,9 e 15,7 ± 1,8 µl respectivamente) em relação ao controle (48,7 ± 3,4; 54,6 ± 3,4 e 34,3 ±
2,5 µl respectivamente) correspondendo a inibições de 75, 67 e 54 % respectivamente.
Enquanto, na menor dose o ICPF causou também reduções significativas do edema em parte
dos períodos avaliados. Em relação ao pré-tratamento dos animais com o AMB, a dose de 25
mg/kg inibiu o edema apenas aos 15 minutos (31,1 ± 4,0 µl) após a injeção de histamina em
relação ao controle, enquanto na dose de 50 mg/kg ocorreram
4. Resultados
90
Sal
in
a
Co
n
tro
l
e
ICPF 25
i
.p.
IC
PF
50 i.p.
I
C
PF
50
v
.o.
0
25
50
75
100
a
a,b
b
b
S
a
lin
a
C
o
n
tro
le
IC
P
F 2
5
i.
p.
ICPF
5
0
i
.p.
ICPF 50 v.o.
0
5
10
15
20
25
a
a,b
a,b
a
Figura 16. Efeito do isocampferídio (ICPF) sobre o edema (A) e o extravasamento vascular
(B) induzidos por dextrano (Dx) em camundongos. Camundongos Swiss (30 - 35g) foram
tratados por via intraperitoneal (i.p.) ou oral (v.o.) com ICPF ou veículo (controle) antes da
injeção intraplantar da solução de dextrano a 10% na pata traseira, direita do animal. O grupo
salina compreende os animais que não foram administrados dextrano, apenas salina. As
avaliações foram realizadas 2 h após a injeção do Dx. Os valores representam a média ±
E.P.M. de 8 animais por grupo, a vs salina, b vs controle (p<0,05, ANOVA e teste de Tukey,
como teste post hoc).
(B)
(A)
Volume do edema (µL)
Azul de Evans (mg/mL)
4. Resultados
91
0
10
20
30
40
50
60
70
0 15306090120
Controle
AMB 25mg/kg
AMB 50mg/kg
ICPF 25mg/kg
ICPF 50mg/kg
Figura 17. Atividade antiedematogênica do isocampferídio (ICPF) e do amburosídio A
(AMB) sobre o edema de pata induzido por Prostaglandina E
2
(PGE
2
, 30 nmol/animal) em
camundongos. Camundongos Swiss (25-30 g) foram pré-tratados por via intraperitoneal com
ICPF, AMB ou veículo (controle) 30 min antes da injeção intraplantar da solução de PGE
2
(30
nmol/animal, 50 μl) na pata traseira, direita do animal. Os valores representam a média ±
E.P.M. de 8 animais por grupo. *p<0,05 vs controle (ANOVA e teste de Tukey, como teste
post hoc).
Volume do edema (μlL
Tempo (min)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
4. Resultados
92
Na avaliação dos efeitos antiedematogênicos do ICPF e do AMB no edema de pata
induzido por serotonina (Figura 19), o ICPF (25 mg/kg, i.p.) e o AMB (50 mg/kg, i.p.)
inibições de 35 a 58% verificadas em diferentes períodos (15, 30 e 60 minutos) após a injeção
de histamina (Figura 18). apresentaram perfis de inibições semelhantes àqueles observado no
edema induzido por histamina, com inibições em torno de 64 e 45% respectivamente. O ICPF
e o AMB na dose investigada (50 mg/kg, i.p.) não interferiram no edema induzido pela
bradicinina (Figura 20).
4.2.2. Peritonite induzida por carragenina ou fMLP em camundongos
Os efeitos do ICPF e do AMB sobre a migração de leucócitos (x 10
6
céls/ml)
induzida por carragenina estão representados na Figura 21. A administração de carragenina
induziu um aumentou significativo no número de leucócitos totais (5,17 ± 0,41) e neutrófilos
(4,18 ± 0,34) em relação ao grupo não tratado com carragenina, apenas salina (leucócitos
totais: 1,15 ± 0,11; neutrófilos: 0,26 ± 0,04). Porém, o pré-tratamento dos animais com ICPF
(25 e 50 mg/kg, i.p.) reduziu o infiltrado celular tanto com relação ao número de leucócitos
totais (2,14 ± 0,28 e 1,87 ± 0,16 respectivamente) quanto ao número de neutrófilos (1,51 ± 0,2
e 0,95 ± 0,13 respectivamente) correspondendo a inibições de 58,6 e 64 %
respectivamente para leucócitos, e de 64 e 77 % respectivamente para neutrófilos, em relação
ao grupo tratado apenas com carragenina. O pré-tratamento com ICPF por via oral (50 mg/kg)
reduziu em 40 e 52 % o número de leucócitos e de neutrófilos respectivamente no foco
inflamatório.
O AMB (25 e 50 mg/kg) administrado por via oral ou intraperitoneal reduziu
significativamente o infiltrado de leucócitos no foco inflamatório. Na maior dose (v.o. e i.p.)
as reduções nos números de leucócitos (2,56 ± 0,23 e 1,85 ± 0,21 respectivamente) e de
neutrófilos (1,59 ± 0,27 e 1,16 ± 0,19 respectivamente) corresponderam a inibições de 50 e 64
% respectivamente para leucócitos, e 62 e 72 % respectivamente para neutrófilos. A
dexametasona (5 mg/kg, v.o.) reduziu significativa-mente, tanto o número de leucócitos (1,96
± 0,23) quanto o de neutrófilos (0,81 ± 0,02) no foco inflamatório.
Na Figura 22 pode ser observado que o ICPF (50 mg/kg, i.p.) inibiu
significativamente a migração de leucócitos totais (0,62 ± 0,05) e neutrófilos (0,27 ± 0,04)
induzida pelo fMLP, em 58 e 74 % respectivamente quando comparado ao controle
(leucócitos totais: 1,5 ± 0,07; neutrófilos: 1,06 ± 0,11). Na dose menor (25 mg/kg, i.p.) o ICPF
não promoveu redução significativa na migração celular. A administração oral de
4. Resultados
93
0
10
20
30
40
50
60
70
0 15306090
Controle
AMB 25mg/kg
AMB 50mg/kg
ICPF 12,5mg/kg
ICPF 25mg/kg
Figura 18. Atividades antiedematogênicas do isocampferídio (ICPF) e do amburosídio A
(AMB) isolados de Amburana cearensis sobre o edema de pata induzido por histamina em
camundongos. Camundongos Swiss (25 – 30 g) foram tratados por via intraperitoneal com
ICPF, AMB ou veículo (controle) 30 min antes da injeção intraplantar da solução de histamina
(200 μg/animal, 50 μL) na pata traseira, direita do animal. Os valores representam a média ±
E.P.M. de 8 animais por grupo. *p<0,05 vs. controle (ANOVA e teste de Tukey, como teste
post hoc).
Volume do edema (μL)
Tempo (min)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
4. Resultados
94
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 5 15 30 60 90
Controle
AMB 25mg/kg
AMB 50mg/kg
ICPF 12,5mg/kg
ICPF 25mg/kg
Figura 19. Atividades antiedematogênicas do isocampferídio (ICPF) e do amburosídio A
(AMB) sobre o edema de pata induzido por serotonina em camundongos. Camundongos Swiss
(25-30 g) foram tratados por via intraperitoneal com ICPF, AMB ou veículo (controle) 30 min
antes da injeção intraplantar de serotonina (200 μg/animal, 50 μL) na pata traseira, direita do
animal. Os valores representam a média ± E.P.M. de 8 animais por grupo. *p<0,05 vs.
controle (ANOVA e teste de Tukey, como teste post hoc).
Volume do edema (μL)
Tempo (min)
*
*
*
*
*
*
*
*
4. Resultados
95
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 10203060120
Controle
AMB 50mg/kg
ICPF 50mg/kg
Figura 20. Avaliação dos efeitos do isocampferídio (ICPF) e do amburosídio A (AMB) sobre
o edema de pata induzido por bradicinina em camundongos. Camundongos Swiss (25 - 30 g)
foram tratados por via intraperitoneal com ICPF, AMB ou veículo (controle) 30 min antes da
injeção intraplantar da solução de bradicinina (3 nmol/animal, 50 μL) na pata traseira, direita
do animal. Os valores representam a média ± E.P.M. de 8 animais por grupo. Os grupos
tratados foram comparados em relação ao controle (Teste “t” de Student).
Volume do edema (μL)
Tempo (min)
4. Resultados
96
0
1
2
3
4
5
6
Salina
C
o
n
tro
le
ICPF 25 i
.
p.
IC
PF
5
0
i
.p
.
ICPF 50 v.o.
D
EXA 5
v
.o
.
Leucócitos totais
Neutrófilos
0
1
2
3
4
5
6
Salina
Co
n
t
r
o
l
e
AMB 2
5 i
.p.
A
M
B
5
0
i.
p
AMB 2
5 v.o
.
AMB 5
0
v
.
o
.
Leucócitos totais
Neutrófilos
Figura 21. Efeitos do isocampferídio (ICPF) (A) e do amburosídio A (AMB) (B) na migração
de leucócitos induzida por carragenina (Cg) na cavidade peritoneal de camundongos. Os
animais foram tratados por via intraperitoneal (i.p.) ou oral (v.o.) com ICPF, AMB,
dexametasona (Dexa) ou veículo (controle) 30 ou 60 min antes da administração de
carragenina a 1%. Salina, compreende o grupo de animais não tratado com Cg, apenas com
salina (NaCl 0,9 %). Os valores representam a média ± E.P.M. de 8 – 16 animais por grupo, a
vs salina, b vs controle (p<0,05 - ANOVA e teste de Tukey, como teste post hoc).
N
o
de células (x10
6
/mL) N
o
de células (x10
6
/mL)
(A)
(B)
a
a
b
b
b
b a,b
a,b
b
b
a
a
a,b
a,b
b
b
a,b
a,b
b
b
4. Resultados
97
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
Salina Controle ICPF 25 i.p. ICPF 50 i.p.
Leucócitos totais
Neutrófilos
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
Sa
lina
C
ont
rol
e
AMB
2
5 i
.
p
.
AMB
5
0 i.p
.
A
MB
25 v.
o
.
AMB 50 v.o.
Leucócitos totais
Neutrófilos
Figura 22. Efeitos do isocampferídio (ICPF) (A) e do amburosídio A (AMB) (B) na migração
de leucócitos induzida por fMLP na cavidade peritoneal de camundongos. Os animais foram
tratados por via intraperitoneal (i.p.) ou oral (v.o.) com ICPF, AMB ou veículo (controle) 30
ou 60 min antes da administração do fMLP (10
-4
M). Salina, compreende o grupo de animais
não tratado com fMLP, apenas salina (NaCl 0,9%). Os valores representam a média ± E.P.M.
de 8 animais por grupo, a vs salina, b vs controle (p<0,05, ANOVA e teste de Tukey, como
teste post hoc).
a
a
a
b
a
N
o
de células
(
x10
6
/mL
)
(A)
N
o
de células
(
x10
6
/mL
)
a
a
a
,
b
a
,
b
b
b
a
a
a
,
b
a
,
b
(A)
(B)
4. Resultados
98
AMB bloqueou a migração de leucócitos totais (0,96 ± 0,05) e neutrófilos (0,63 ± 0,08) apenas
na maior dose (50 mg/kg). Entretanto, a administração intraperitoneal de AMB (25 e 50
mg/kg) inibiu significativamente a migração de leucócitos (32 e 45 % respectivamente) e de
neutrófilos (42 e 71 % respectivamente) induzida pelo fMLP.
4.2.3. Efeito do ICPF e do AMB na desgranulação de neutrófilos induzida pelo fMLP em
sangue humano: atividades das enzimas mieloperoxidase (MPO) e elastase
A inibição da liberação de enzimas como mieloperoxidase (MPO) e elastase por
neutrófilos é indicativo de um efeito antiinflamatório. Na Figura 23 observa-se que a
incubação de leucócitos polimorfonucleares, predominantemente neutrófilos com o ICPF (25,
50 e 100 µg/mL) inibiu em até 66 % a atividade da MPO liberada por neutrófilos estimulados
pelo fMLP. Enquanto o AMB na concentração de 10; 25; 50 e 100 µg/ml também reduziu em
33, 46, 56 e 65 % respectivamente a atividade da MPO.
A atividade enzimática da elastase foi determinada pela formação de p-nitrofenol,
produto da ação da elastase sobre o Boc-Ala-OphNO
2
(substrato). O
ICPF nas concentrações de 10, 25 e 50 µg/ml inibiu a atividade da elastase, em 27, 50 e 44 %
respectivamente. Resultados semelhantes foram obtidos com o AMB (10, 25 e 50 µg/ml) que
inibiu em 34, 48 e 52 % a atividade da elastase liberada por neutrófilos estimulados pelo fMLP
(Figura 24). Adicionalmente, o ICPF e o AMB nas concentrações de 10; 25; 50 e 100 µg/ml
mostraram ausência de toxicidade em neutrófilos, determinada através do teste do MTT
(Figura 25).
4.3. Avaliação das atividades hepatoprotetora e antioxidante do amburosídio A (AMB)
isolado de Amburana cearensis na hepatotoxicidade induzida pelo CCl
4
em ratos
Nesse modelo experimental a hepatotoxicidade induzida pelo CCl
4
é iniciada pela
ação das enzimas microssomais hepáticas, citocromo P450, que produzem CCl
3
a partir do
CCl
4
. Os produtos da peroxidação lipídica induzida pelo CCl
3
provocam hipofunção da
membrana celular além de alterações enzimáticas (MIYAZAWA et al.,1990).
O efeito do AMB sobre a hepatotoxicidade induzida pelo CCl
4
foi investigado
através da avaliação da função hepática (ALT/TGP e AST/TGO), da peroxidação lipídica, de
sistemas antioxidantes enzimático (catalase) e não enzimático (glutationa reduzida), além de
análise histológica.
4. Resultados
99
IC
P
F
2
5
IC
P
F
5
0
ICPF 1
0
0
AMB 10
AMB 2
5
AM
B
5
0
AMB
10
0
0
10
20
30
40
50
60
70
a
b
b
Figura 23. Efeitos do isocampferídio (ICPF) e do amburosídio A (AMB) na degranulação de
neutrófilos humano estimulados pelo fMLP, determinados pela atividade da mieloperoxidase
(MPO). Os resultados obtidos na presença das drogas testes foram comparados em relação ao
controle (100 % atividade enzimática). Os valores estão expressos como média ± E.P.M. As
análises foram realizadas pelo menos em quadruplicata e repetidas em três dias diferentes. a vs
ICPF 25 µg/ml, b vs AMB 10 µg/ml (p<0,05 – ANOVA e teste de Tukey, como teste post
hoc).
Atividade MPO (% inibição)
4. Resultados
100
IC
PF
1
0
ICP
F
25
ICPF 50
AMB
10
AMB
2
5
A
M
B
50
0
10
20
30
40
50
60
70
a
b
Figura 24. Efeitos do isocampferídio (ICPF) e do amburosídio A (AMB) na degranulação de
neutrófilos humano estimulados pelo fMLP, determinados pela atividade da elastase. Os
resultados obtidos na presença das drogas testes foram comparados em relação ao controle
(100 % de atividade enzimática). Os valores estão expressos como média ± E.P.M. As análises
foram realizadas em quadruplicata e repetidas em três dias diferentes. a vs ICPF 10 µg/ml, b
vs AMB 10 µg/ml (p<0,05 – ANOVA e teste de Tukey, como teste post hoc).
Atividade elastase (% inibição)
4. Resultados
101
con
tr
ole
A
M
B 1
A
MB
10
A
MB
25
A
MB
50
AMB 10
0
0
25
50
75
100
125
controle
ICPF 1
I
CPF
10
ICPF
2
5
I
CPF
5
0
I
CPF 100
0
25
50
75
100
125
Figura 25. Avaliação da citotoxicidade do isocampferídio (ICPF) e do amburosídio A (AMB)
em neutrófilos isolados de sangue humano. O ICPF ou AMB nas concentrações de 1, 10, 25
50 e 100 µg/mL. Após 30 min de incubação a viabilidade celular foi determinado pelo MTT.
Os valores estão expressos como média ± E.P.M das análises foram realizadas em sextuplicata
e repetidas em três dias diferentes. Os resultados obtidos na presença das drogas testes foram
comparados em relação ao veículo (controle) (ANOVA e teste de Tukey, como teste post hoc).
Células viáveis (% controle) Células viáveis (% controle)
4. Resultados
102
• Determinação do efeito do amburosídio A (AMB) sobre os níveis séricos
das enzimas transaminases (ALT/TGP e AST/TGO)
A Tabela 10 mostra o efeito do AMB (25 e 50 mg/kg, i.p.) sobre a elevação dos
níveis séricos das enzimas AST/TGO e ALT/TGP induzido pelo CCL
4
em ratos. A
administração CCl
4
nos animais pré-tratados apenas com veículo (controle), elevou
expressivamente tanto o nível sérico de AST/TGO (145,0 ± 8,11 U/l), quanto ALT/TGP
(93,79 ± 6,64 U/l) em relação ao grupo salina (AST/TGO: 57,63 ± 2,7 U/l; ALT/TGP: 32,59 ±
4,57 U/l), representado pelos animais que não foram tratados com CCl
4
. Entretanto, o
pré-tratamento dos animais com AMB (25 e 50 mg/kg, i.p.) reduziu significativamente as
atividades das enzimas AST/TGO (28,4 e 44,2 % respectivamente) e ALT/TGP (43,2 e 61,3 %
respectivamente) em relação ao grupo controle.
• Determinação do efeito do amburosídio A (AMB) sobre a peroxidação
lipídica
A peroxidação lipídica dos hepatócitos tem sida reconhecida como o fator
importante na hepatotoxicidade induzida pelo CCl
4
. Na Figura 26 pode ser observado o efeito
do AMB sobre a formação de substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico -TBARS, parâmetro
empregado para mensurar a peroxidação lipídica hepática induzida pelo CCl
4
. A concentração
de TBARS (9,96 ± 0,68 nmol MDA/mg proteína) foi elevada em 2,6 vezes pelo CCl
4
nos
animais pré-tratados com veículo (controle), em relação ao grupo salina (3,86 ± 0,26 nmol
MDA/mg proteína), ou seja animais não submetidos ao tratamento com CCl
4
. Porém, o pré-
tratamento dos animais com AMB (25 e 50 mg/kg, i.p.) reduziu significativamente o nível de
TBARS, com inibições de 36 e 52 % respectivamente.
• Determinação do efeito do amburosídio A (AMB) sobre o nível de
glutationa reduzida
A Figura 27 mostra o efeito do AMB sobre a mudança na concentração de
glutationa reduzida induzida pelo CCl
4
no fígado de ratos. O nível de glutationa (GSH, µg/mg
proteína) hepática decresceu significativamente de 9,58 ± 0,76 no grupo salina, para 5,63 ±
0,20 no grupo administrado veículo e CCl
4
, controle. O pré-tratamento dos animais com AMB
(25 e 50 mg/kg, i.p.) aumentou significativamente o nível de glutationa hepática, sendo quase
restabelecida a normalidade (8,21 ± 0,53 e 8,72 ± 0,49 respectivamente).
4. Resultados
103
Tabela 10. Efeito do amburosidio A (AMB) sobre os níveis séricos das enzimas
transaminases, alanina transaminase (ALT) e aspartato transaminase (AST), em ratos tratados
com tetracloreto de carbono (CCl
4
)
GRUPOS AST (U/L) ALT (U/L)
Salina
57,63 ± 2,7 32,59 ± 4,57
Controle
145,0 ± 8,11
a
93,79 ± 6,64
a
AMB 25 mg/kg, i.p.
103,8 ± 7,9
b
53,29 ± 4,96
b
AMB 50 mg/kg, i.p.
80,9 ± 6,73
b
36,28 ± 4,88
b
Os animais do grupo salina receberam apenas salina, i.p. e óleo de oliva, subcutânea (s.c.)
enquanto os demais grupos foram pré-tratados com veículo (controle) ou AMB 30 min antes e
24 h após a administração de CCl
4
a 50% em óleo de oliva, s.c. A atividade enzimática foi
determinada 48 h após a injeção de CCl
4
. Os resultados estão expressos como média ± E.P.M.
de 7 animais por grupo, a vs controle, b vs CCL
4
(p<0,05, ANOVA e teste de Tukey, como
teste post hoc).
4. Resultados
104
Salina Controle AMB 25 AMB 50
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
a
b
b
Figura 26. Efeito do amburosídio A (AMB) sobre a peroxidação lipídica, determinada pelos
níveis de substâncias reativas com ácido tiobarbitúrico-TBARS em fígado de ratos tratados
com tetracloreto de carbono (CCl
4
). Os animais foram tratados com AMB (25 e 50 mg/kg, i.p.)
ou veículo (controle) 30 min antes e 24 h após a administração do CCl
4
a 50% em óleo de
oliva. O grupo salina foi tratado apenas com salina, i.p. e óleo de oliva, s.c. O nível de
TBARS, expresso pela concentração de malonildialdeído (MDA), um dos produtos da
peroxidação lipídica, foi determinado 48 h após a injeção de CCl
4
.
Os valores representam a
média ± E.P.M. de 7 animais por grupo. a vs salina, b vs controle (p<0,05 - ANOVA e teste de
Tukey, como teste post hoc).
TBARS
(nmol MDA/mg proteína)
4. Resultados
105
Salina Controle AMB 25 AMB 50
0
3
6
9
12
a
b
b
Figura 27. Efeito do amburosídio A (AMB) sobre a redução no nível de glutationa reduzida
(GSH) induzida pelo tetracloreto de carbono (CCl
4
) em fígado de ratos. Os animais foram
tratados com veículo (controle.) ou AMB (25 e 50 mg/kg, i.p.) 30 min antes e 24 h após a
administração do CCl
4
a 50% em óleo de oliva. O grupo salina foi tratado apenas com salina,
i.p. e óleo de oliva, s.c. O nível de GSH foi determinado 48 h após a injeção de CCl
4
.
Os
valores representam a média ± E.P.M. de 7 animais por grupo. a vs salina, b vs controle
(ANOVA e teste de Tukey, como teste post hoc).
GSH (µg/mg proteína)
4. Resultados
106
• Determinação do efeito do amburosídio A (AMB) sobre a atividade da
Catalase
A Figura 28 mostra que a atividade da catalase (mmol/min/mg proteína) no fígado
de animais do grupo salina (79,57 ± 9,68) foi significativamente aumentada em relação ao
grupo administrado veículo e CCl
4
, ou seja controle (155,5 ± 15,39). Entretanto, o pré-
tratamento dos animais com AMB inibiu de maneira dose dependente a atividade da catalase.
Na maior dose o AMB (50 mg/kg, i.p.) reduziu significativamente a atividade da catalase
(74,98 ± 10,24), correspondendo a uma inibição de 52 %, enquanto na menor dose (25 mg/kg,
i.p.), a atividade da catalase foi reduzida em apenas 12 %.
• Análise histopatológica do fígado de ratos pré-tratados com amburosídio
A (AMB) e tratados com CCl
4
O tratamento dos animais com o CCl
4
causou mudanças histológicas importantes
no fígado dos ratos, que apresentaram necrose centrolobular intensa além do infiltrado de
células inflamatórias. Entretanto, o pré-tratamento dos animais com AMB nas doses de 25 e
50 mg/kg, i.p., reduziu de maneira dose-dependente as alterações histológicas causadas pela
administração do CCl
4
(Figura 29).
4.4. Avaliação do efeito do ICPF e do AMB sobre a contratilidade da musculatura lisa
traqueal de cobaia
O ICPF (10 – 1000 µM; CE50: 107,3 [80,8 – 142,4] µM) foi capaz de relaxar o
músculo liso traqueal de cobaia pré-contraído pelo carbacol (CCh) de maneira concentração-
dependente, apresentando-se inclusive mais potente em relação à teofilina (3 – 3000 µM;
CE50: 552,8 [385,8 – 792,1] µM), droga padrão (Figura 30, Tabela 11).
Em parte dos experimentos o ICPF alterou o tônus basal (Efeito Máximo (Emax):
6,15 ± 2,92 %), enquanto nenhum efeito foi observado pela adição do veículo em
concentrações crescentes (Tween 80 de 0,0024 – 0,24% em água). Por outro lado, no músculo
pré-contraído pelo CCh ou KCl o veículo causou um relaxamento máximo de 8,38 ± 1,23 ou
7,39 ± 1,07 % respectivamente.
O ICPF apresentou um efeito relaxante mais potente no músculo pré-contraído pelo
KCl em relação a contração induzida pelo CCh, enquanto o AMB (10 – 3000 µM) que
também relaxou de maneira concentração-dependente o músculo liso traqueal pré-contraído
4. Resultados
107
Salina Controle AMB 25 AMB 50
0
50
100
150
200
a
b,c
a
Figura 28. Efeito do amburosídio A (AMB) sobre a atividade da catalase em fígado de ratos
tratados com tetracloreto de carbono (CCl
4
). Os animais foram tratados com veículo (controle)
ou AMB (25 e 50 mg/kg, i.p.) 30 min antes e 24 h após a administração do CCl
4
a 50% em
óleo de oliva (s.c.). O grupo salina foi tratado apenas com salina, i.p. e óleo de oliva. A
atividade da catalase foi determinada 48 h após a injeção de CCl
4
.
Os valores representam a
média ± E.P.M. de 7 animais por grupo. a vs salina, b vs controle , c vs AMB 25 (ANOVA e
teste de Tukey, como teste post hoc).
Catalase
(mmol/min/mg proteína)
4. Resultados
108
Figura 29a. Fotomicrografia ilustrando a hepatotoxicidade induzida pelo tetracloreto
de carbono (CCl
4
) em ratos. No grupo salina (salina, i.p. + óleo de oliva, s.c.) observa-
se o tecido hepático com aparência normal, diferindo do grupo controle
(veículo + CCl
4
50% em óleo de oliva, s.c.) que apresenta esteatose acentuada melhor observada em
maior aumento (seta amarela), necrose e infiltrado inflamatório com agregados de
granulócitos (seta verde), além de células apoptóticas (seta branca).
Salina
Controle
(40x
(10x)
(100x
(40x)
(40x)
4. Resultados
109
Figura 29b. Fotomicrografia ilustrando o efeito do amburosídio A (AMB) sobre a
hepatotoxicidade induzida pelo tetracloreto de carbono (CCl
4
) em ratos. O grupo
tratado com AMB, 25 mg/kg, i.p., apresentou esteatose moderada, infiltrado
inflamatório moderado (granulócitos (seta verde) e algumas células apoptóticas (seta
preta). Enquanto os animais tratados com o AMB, 50 mg/kg, i.p., apresentaram
redução considerada da esteatose e um infiltrado inflamatório discreto.
AMB 25
(40x)
(40x)
AMB 50
(40x
(40x
4. Resultados
110
Figura 30. Curva concentração-resposta do efeito relaxante do isocampferídio (ICPF), da
teofilina ou do veículo (solução aquosa de Tween 80: 0,0024 – 0,24 %) em traquéia isolada de
cobaia pré-contraída por carbacol (CCh). Cada ponto representa a média ± E.P.M. de 6
experimentos. a e b ICPF vs veículo ou teofilina respectivamente por concentração (* p< 0,05;
teste “t” Student). Em alguns pontos da figura o E.P.M. não é visualizado por estar muito
próximo aos símbolos.
% Relaxamento
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
6 5,5 5 4,5 4 3,5 3 3,5
Veículo
Teofilina
ICPF
ICPF (-Log [M])
b
a,
b
a,b
a
,
b
a,b
a
4. Resultados
111
pelo CCh (CE50: 93,9 [46,8 – 188,3] µM) ou KCl (CE50: 342,3 [320,2 – 365,9] µM) se
mostrou mais potente no músculo pré-contraído pelo CCh. À semelhança do ICPF o AMB
também se mostrou mais potente que a teofilina no músculo pré-contraído pelo CCh (Tabela
11).
A remoção do epitélio traqueal favoreceu o efeito relaxante do ICPF (CE50 – com
epitélio: 77,4 [54,8 – 109,2] µM; sem epitélio: 15,0 [11,3 – 20,1] µM) em músculo pré-
contraído pelo CCh, com aumento significativo do efeito (ICPF: 10
-5
a 3x10
-4
M) em relação a
preparação com epitélio (Figura 31). Por outro lado, a ausência do epitélio não modificou o
efeito relaxante do AMB em músculo pré-contraído pelo CCh (Figura 32).
Em geral o ICPF mostrou respostas melhores em relação ao AMB, assim passamos
a investigar o possível mecanismo de ação relaxante do ICPF. Para investigar a possível
participação da via óxido nítrico/GMPc no efeito relaxante do ICPF, foram realizados
experimentos na ausência e na presença de L-NAME (antagonista competitivo da enzima
óxido nítrico sintase) ou ODQ (inibidor seletivo da enzima guanilato ciclase). Em traquéia de
cobaia com epitélio, o L-NAME (100 µM), reduziu significativamente o efeito relaxante do
ICPF com inibições de 41 a 59 % da resposta (Figura 33). Resultados semelhantes foram
observados nas preparações em traquéia sem epitélio, onde o ICPF na presença do L-NAME
apresentou um efeito máximo de 96,05 ± 5,41 %, enquanto na ausência do L-NAME o efeito
máximo foi de 136,5 ± 7,9 (Figura 34). O ODQ (3 e 33 µM) em traquéia com epitélio
preveniu significativamente o efeito relaxante do ICPF, que nas concentrações investigadas
teve seu efeito reduzido em até 47 e 63 % respectivamente (Figura 35).
O papel dos canais de potássio no efeito relaxante do ICPF foi também
investigado com a utilização de vários bloqueadores de canais de potássio. Para tanto,
inicialmente foi verificado que o efeito relaxante do ICPF (3x10
-6
a 3x10
-4
M)
observado no músculo pré-contraído por KCl 40 mM foi significativamente reduzido
em relação às preparações pré-contraídas por KCl 120 mM (concentração capaz de
induzir despolarização máxima da membrana celular), com inibições de 35 a 100 %.
Além
disso, no músculo pré-contraído pelo KCl 120 mM a curva concentração-resposta do
ICPF foi deslocada para a direita. Na traquéia pré-contraída pelo KCl (40 mM) a
glibenclamida (33 µM), bloqueador de canais de potássio sensíveis ao ATP, foi capaz de
reduzir em 35 % o efeito máximo do ICPF, enquanto na traquéia pré-contraída por KCl 120
mM a glibenclamida não modificou a resposta muscular à presença do ICPF (Figura 36).
4. Resultados
112
Tabela 11. CE50 obtida da curva concentração-resposta do efeito relaxante ICPF ou AMB em
traquéia de cobaia pré-contraída pelo carbacol (CCh) ou potássio (KCl).
CE50 (µM) GRUPOS
CCh KCl
AMB 93,9
a,c
(46,8 – 188,3)
342,3
(320,2 – 365,9)
ICPF
107,3
a,b
(80,8 – 142,4)
15,5
(11,3 – 21,0)
Teofilina
552,8
(385,8 – 792,1)
ND
Os valores representam a média geométrica com intervalo de confiança de 95%, das
concentrações de isocampferídio (ICPF) ou amburosídio A (AMB) que produziram 50% da
resposta máxima, em músculo pré-contraído pelo CCh (30 ou 100 µM) ou KCl (40 mM). Os
resultados foram obtidos de 5 – 6 experimentos. a vs teofilina, b vs ICPF-KCl e c vs AMB-
KCl ( P<0,05, teste “t” Student). ND: não determinado.
4. Resultados
113
Figura 31. Fotomicrografia ilustrando a traquéia de cobaia com (A) e sem epitélio (B). Curva
concentração-resposta relaxante do isocampferídio (ICPF) em traquéia com ou sem epitélio
pré-contraída por carbacol (CCh). Cada ponto representa a média ± E.P.M. de 6 - 8
experimentos. As barras verticais representam E.P.M. Com epitélio vs sem epitélio por
concentração (*p< 0,05; teste “t” Student).
A B
% Relaxamento
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
160
5,5 5 4,5 4 3,5 3
com epitélio
sem epitélio
*
*
*
*
*
ICPF (-Log [M])
4. Resultados
114
Figura 32. Curva concentração-resposta do efeito relaxante do amburosídio A (AMB) em
traquéia com ou sem epitélio pré-contraída por carbacol (CCh). Cada ponto representa a média
± E.P.M. de 5 experimentos. As barras verticais representam E.P.M. *p<0,05 (teste “t” de
Student).
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
5,5 5
4,5 4 3,5 3 2,5
com epitélio
sem epitélio
% Relaxamento
AMB (-Log [M])
4. Resultados
115
Figura 33. Curva concentração-resposta do efeito relaxante do isocampferídio (ICPF) em
traquéia com epitélio isolada de cobaia e pré-contraída por carbacol (CCh) na ausência
(controle) ou na presença do L-NAME (100 µM). Cada ponto representa a média ± E.P.M. de
6 - 8 experimentos. As barras verticais representam E.P.M. Controle vs L-NAME por
concentração (*p< 0,05; teste “t” Student). Em alguns pontos da figura o E.P.M. não é
visualizado por estar muito próximo aos símbolos.
% Relaxamento
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
5,5 5 4,5 4 3,5 3
Controle
L-NAME
*
*
*
*
ICPF (-Log [M])
4. Resultados
116
Figura 34. Curva concentração-resposta do efeito relaxante do isocampferídio (ICPF) em
traquéia isolada de cobaia sem epitélio e pré-contraída por carbacol (CCh) na ausência
(controle) ou na presença do L-NAME (100 µM). Cada ponto representa a média ± E.P.M. de
6 - 8 experimentos. As barras verticais representam E.P.M. Controle vs L-NAME por
concentração (*p< 0,05; teste “t” Student). Em alguns pontos da figura o E.P.M. não é
visualizado por estar muito próximo aos símbolos.
% Relaxamento
ICPF (-Log [M])
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
160
5,5 5 4,5 4 3,5 3
Controle
L-NAME
*
*
*
*
4. Resultados
117
Figura 35. Curva concentração-resposta do efeito relaxante do isocampferídio (ICPF) na
traquéia isolada de cobaia pré-contraída por carbacol (CCh) na ausência (controle) ou na
presença do ODQ. Cada ponto representa a média ± E.P.M. de 6 experimentos. As barras
verticais representam E.P.M. Controle vs ODQ (3 e 33 µM) por concentração (*p< 0,05; teste
“t” Student). Em alguns pontos da figura o E.P.M. não é visualizado por estar muito próximo
aos símbolos.
-20
0
20
40
60
80
100
120
5,5 5 4,5 4 3,5
Controle
ODQ 3 µM
ODQ 33 µM
% Relaxamento
ICPF (-Log[M])
*
*
*
*
*
*
4. Resultados
118
Dando continuidade a avaliação da participação dos canais de potássio no efeito
relaxante do ICPF, foi verificado que a iberiotoxina (IbTX; 0,1 µM), bloqueador dos canais de
potássio sensíveis ao cálcio, inibiu de 38 a 100 % o relaxamento induzido pelo ICPF, além
de ter deslocado para a direita a curva concentração-resposta do efeito relaxante do ICPF. Por
outro lado, a 4-AP (100 µM), bloqueador dos canais de potássio voltagem dependente, não
interferiu significativamente no efeito relaxante do ICPF (Figura 37).
A incubação da traquéia com propranolol (1 µM), antagonista competitivo β-
adrenérgico, produziu uma inibição de 31 a 51% do efeito relaxante do ICPF (Figura 38),
enquanto a capsaicina (3 µM), um agente excitatório e desensibilizante dos neurônios
aferentes primários, inibiu em até 61 % o efeito relaxante do ICPF (Figura 39).
4. Resultados
119
Figura 36. Curva concentração-resposta do efeito relaxante do isocampferídio (ICPF) em
traquéia isolada de cobaia pré-contraída por KCl (40 ou 120 mM) na ausência ou na presença
da glibenclamida (Glib, 33 µM). Cada ponto representa a média ± E.P.M. de 5 - 8
experimentos. As barras verticais representam E.P.M. KCl 40 mM vs KCl 120 mM e KCL 40
mM vs KCl 40 mM + Glib por concentração (* p< 0,05; teste “t” Student). Em alguns pontos
da figura o E.P.M. não é visualizado por estar muito próximo aos símbolos.
% Relaxamento
- 20
0
20
40
60
80
100
120
140
160
6 5.5 5 4.5 4 3.5 3
KCl 120
KCl 120 + Glib
KCl 40
KCl 40 + Glib
*
*
*
***
*
*
ICPF (-Log [M])
4. Resultados
120
Figura 37. Curva concentração-resposta do efeito relaxante do isocampferídio (ICPF) na
traquéia isolada de cobaia pré-contraída por KCl (40 mM) em ausência (controle) ou na
presença da iberiotoxina (IbTX, 0,1 µM) ou 4-aminopiridina (4-AP, 100 µM). Cada ponto
representa a média ± E.P.M. de 5 - 8 experimentos. As barras verticais representam E.P.M.
Controle vs IbTX ou 4-AP por concentração (*p< 0,05; teste “t” Student). Em alguns pontos
da figura o E.P.M. não é visualizado por estar muito próximo aos símbolos.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
6 5.5 5
4.
4
3.
Controle
IbTX
4-AP
% Relaxamento
*
*
*
*
*
*
ICPF (-Log [M])
4. Resultados
121
Figura 38. Curva concentração-resposta do efeito relaxante do isocampferídio (ICPF) em
traquéia isolada de cobaia pré-contraída por carbacol (CCh) na ausência (controle) ou na
presença do propranolol (1 µM). Cada ponto representa a média ± E.P.M. de 6 experimentos.
As barras verticais representam E.P.M. Controle vs propranolol por concentração (*p< 0,05;
teste “t” Student). Em alguns pontos da figura o E.P.M. não é visualizado por estar muito
próximo aos símbolos.
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
5,5 5 4,5 4 3,5 3
Controle
Propranolol
% Relaxamento
*
*
*
ICPF (-Log [M])
4. Resultados
122
Figura 39. Curva concentração-resposta do efeito relaxante do isocampferídio (ICPF) em
traquéia isolada de cobaia pré-contraída por carbacol (CCh) na ausência (controle) ou na
presença da capsaicina (3 µM). Cada ponto representa a média ± E.P.M. de 6 experimentos.
As barras verticais representam E.P.M. Controle vs capsaicina por concentração (*p< 0,05;
teste “t” Student). Em alguns pontos da figura o E.P.M. não é visualizado por estar muito
próximo aos símbolos.
ICPF (-log [M])
% Relaxamento
*
*
*
*
*
-20
0
20
40
60
80
100
120
5,5 5 4,5 4 3,5 3
Controle
Ca
p
saicina
5. Discussão
123
5
DISCUSSÃO
5. Discussão
124
5. DISCUSSÃO
Amburana cearensis é uma árvore utilizada tradicionalmente na região nordeste do
Brasil no tratamento da tosse, bronquite e asma. Suas cascas do caule têm sido empregadas na
produção de chás ou de xaropes, estes produzidos por programas governamentais de
fitoterapia ou por indústrias farmacêuticas nacionais. Em estudos anteriores (LEAL et al.,
1997; 2000; 2003) mostramos as atividades antinociceptiva, antiinflamatória e relaxante
muscular do extrato hidroalcoólico, da cumarina e da fração flavonóide obtidos de
A.cearensis. No presente estudo foram investigadas as atividades antiinflamatória,
antioxidante e relaxante muscular de dois compostos fenólicos, isocampferídio (ICPF, 3-
metilflavonol) e amburosídio A (AMB, glucosídio fenólico), isolados da cascas do caule da
planta.
Numa avaliação preliminar, o ICPF e o AMB administrados sistemicamente
apresentaram uma baixa toxicidade aguda. A possível citotoxicidade desses compostos foi
avaliada em cultura primária de células hepáticas através do teste do MTT, onde a viabilidade
celular foi mensurada pela atividade das desidrogenases mitocondriais sobre o sal de
tetrazolium (MTT) (MOSMANN, 1983). O AMB não interferiu na viabilidade das células
hepáticas, enquanto o ICPF reduziu significativamente a viabilidade celular apenas na
concentração de 100 µg/ml. A ausência de citotoxicidade do AMB e a hepatotoxicidade do
ICPF, foi corroborada por estudos anteriores (BANSKOTA et al., 2000a; COSTA-LOTUFO
et al., 2003) que determinaram a citotoxicidade do ICPF para algumas linhagens de células
tumorais, bem como em larvas de ouriços, Lytechinus variegatus. Por outro lado, Banskota et
al. (2000b) mostraram que o ICPF possui ação hepatoprotetora in vitro.
Recentemente (LEAL et al., 2005) demonstramos que o AMB não foi citotóxico
também em células mesencefálicas de ratos, e possui uma ação neuroprotetora observada por
sua ação antioxidante no modelo de neurotoxicidade induzida pela 6-hidroxidopamina.
A atividade antiinflamatória de compostos fenólicos incluindo flavonóides e
glicosídios fenólicos tem sida demonstrada amplamente (MANTHEY, 2000; MIDLETON et
al., 2000), porém esse é o primeiro estudo que caracteriza a bioatividade in vivo do AMB,
além das atividades farmacológicas inéditas do ICPF.
O processo inflamatório é caracterizado pela produção de mediadores
inflamatórios, incluindo prostaglandinas, leucotrienos, histamina e bradicinina, além da
liberação pelos tecidos e células de fatores quimiotáticos (TOMLINSON et al., 1994). O
modelo de inflamação induzido por carragenina (edema de pata e peritonite) é comumente
utilizado para avaliar drogas antiinflamatórias. As características bioquímicas e celulares do
5. Discussão
125
edema de pata induzido por carragenina foram bem descritas no passado e têm sido
constantemente implementadas com novas descobertas (DI ROSA et al., 1971 a, b; 1972;
GARCIA LEME et al., 1973; POSADAS et al., 2004). O processo envolve uma ação
seqüencial de vários mediadores, ocorrendo inicialmente (edema, 0-1 h) a liberação de
histamina, serotonina e bradicinina, seguida (edema, 1-6 h) principalmente pelo aumento nos
níveis de prostaglandinas (PGs). A liberação de PGs coincide com a migração de leucócitos,
principalmente neutrófilos, que amplificam a resposta inflamatória com a produção dentre
outros mediadores, de espécies reativas de oxigênio (ROS) e proteases tais como a
mieloperoxidase (MPO), enzima claramente correlacionada com a severidade do processo
(FANTONE & WARD, 1982; NANTEL et al., 1999; POSADAS et al., 2004). Outro
mediador importante é o óxido nítrico (ON), produzido em condições fisiopatológicas por três
isoformas de ON sintase: endotelial, neuronal e induzível (MONCADA & HIGGS, 1991).
Estudo mais recente (GUAY et al., 2004) caracterizou o edema da carragenina,
numa fase inicial (1-6 h) e tardia (12-24 h). A primeira fase foi associada com o aumento nos
níveis de PGE
2
e tromboxano B
2
e com a expressão acentuada da PGE
2
sintase precedida pela
expressão da enzima ciclooxigenase-2 (COX-2). Porém, COX-2 e PGE
2
sintase permanecem
elevadas na fase tardia.
O ICPF e o AMB à semelhança da indometacina, inibidor inespecífico da enzima
ciclooxigenase, após administração sistêmica, reduziram significativamente o edema de pata
induzido pela carragenina. Esse resultado sugere o potencial antiinflamatório dos referidos
compostos, fato este corroborado pela capacidade do ICPF e do AMB de bloquearem
parcialmente a infiltração de leucócitos para o foco inflamatório, observada pela análise
morfométrica da pata dos animais.
Para investigarmos a possível participação de alguns mediadores inflamatórios, na
atividade antiinflamatória do ICPF e do AMB foi avaliado o efeito da administração sistêmica
desses compostos nos edemas de pata induzidos pela PGE
2
, dextrano, histamina, serotonina ou
bradicinina.
O ICPF e o AMB inibiram significativamente o edema de pata induzido pela PGE
2
.
As prostaglandinas, metabólitos do ácido araquidônico pela ação das isoenzimas
ciclooxigenase (COX-1 e COX-2), têm um papel regulatório chave na imunidade e na
inflamação (GOETZL et al., 1995; PHIPPS et al., 1991). Uma das mais conhecidas e bem
estudadas prostaglandina é a PGE
2
produzida por muitos tipos celulares (ex.: fibroblastos e
macrófagos), que exerce suas ações ligando-se ao seu receptor classificado em EP
1
, EP
2
, EP
3
e
EP
4
, acoplados à proteína G (BREYER et al., 2001). A PGE
2
interage com os linfócitos T,
5. Discussão
126
estimulando via AMPc a produção de interleucinas (IL-4, 5 e 10) pelos linfócitos T helper 2,
ou inibindo a produção de IL-2 e inteferon-γ como ocorre nas linfócitos T helper 1 (HILKENS
et al., 1996). Nos linfócitos B a PGE
2
estimula a produção de imunoglobulinas, como IgG e
IgE. Finalmente, a PGE
2
de uma maneira autócrina regula a sua própria expressão via COX-2
(HARRIS et al., 2002). Assim, os resultados obtidos sugerem que os efeitos
antiedematogênicos do ICPF e do AMB estão possivelmente relacionados a um bloqueio da
síntese ou até mesmo da ação de prostaglandinas, como a PGE
2
.
O dextrano induz o edema por mecanismos distintos em relação à carragenina,
neste caso, o aumento da permeabilidade vascular dá-se devido a desgranulação de mastócitos
e, conseqüente liberação de mediadores inflamatórios como histamina e serotonina. Além
disso, o exsudato produzido apresenta poucas proteínas e neutrófilos (LO et al., 1982). O
tratamento dos animais com ICPF ou AMB inibiu significativamente o edema de pata e o
aumento da permeabilidade vascular induzidos pelo dextrano, bem como os edemas induzidos
pela histamina ou serotonina. Por outro lado, o ICPF e o AMB não interferiram no edema de
pata induzido por bradicinina. Assim, os resultados sugerem que a ação antiinflamatória do
ICPF e do AMB pode estar relacionada a um possível bloqueio da liberação e/ou até mesmo
da ação da histamina e serotonina. Essa hipótese é suportada pelo fato de que muitos
flavonóides, incluindo quercetina e campferol, flavonóis que possuem uma estreita correlação
estrutural com o ICPF (Figura 3), inibem a liberação de histamina por mastócitos de ratos
(GROSSMAN, 1988; MIDDLETON et al., 2000).
A migração de neutrófilos polimorfonucleares (PMNs) tem um papel importante na
resposta inflamatória (ZAK-NEJMARK et al., 1996), constituindo a primeira linha de defesa
contra a invasão de bactérias. Nestas condições, os neutrófilos migram para os tecidos
infectados e inflamados estimulados por um gradiente de concentração de moléculas
quimiotáticas, tais como citocinas, fator de complemento C5a e produtos bacterianos, como o
fMLP e lipopolissacarídeo (WITKO-SARSAT et al., 2000; COHEN, 2002).
Usualmente os PMNs são considerados como uma população de leucócitos
envolvida na resposta inflamatória aguda, sendo citados normalmente por sua atividade
fagocitária e pela produção e liberação de enzimas proteolíticas e de espécies reativas de
oxigênio (ROS) e de nitrogênio (RNS). Entretanto, os neutrófilos são biosinteticamente ativos
e podem produzir também uma variedade de mediadores inflamatórios, incluindo TNF-α, IL-
1β, IL-8, proteína inflamatória macrofágica (MIP)-1α e fator de crescimento endotelial
vascular (VEGF) (DUBRAVCC et al., 1990; WCI et al., 1993; BAZZONI et al., 1991;
CASSATELLA et al., 1997; LAPINCT et al., 2000; TAICHMAN et al., 1997; KASAMA et
5. Discussão
127
al., 2000; 2005). Assim, os PMNs ocupam um posição importante na resposta inflamatória,
onde eles regulam e orquestram não apenas a resposta inflamatória aguda, mas também a
inflamação crônica, além da regulação da resposta imune (KASAMA et al., 2005).
Nossos resultados mostraram que a inflamação aguda induzida pela carragenina ou
pelo fMLP no peritônio de camundongos, levou a um infiltrado celular expressivo,
predominantemente neutrófilos, que foi reduzido significativamente pelo tratamento sistêmico
dos animais com ICPF ou AMB. Esses dados confirmam estudos anteriores (LEAL et al.,
2003) nos quais demonstramos a habilidade do extrato e da fração flavonóide (possui como
componente majoritário o ICPF) de A. cearensis em reduzir o acúmulo de células no peritônio
de ratos.
Tem sido demonstrado que enquanto a carragenina induz a migração de leucócitos,
predominantemente neutrófilos, de maneira indireta dependendo da liberação de fatores
quimiotáticos por células residentes (SOUZA et al., 1988), o fMLP induz a migração de
leucócitos de maneira direta devido a sua natureza quimiotática. Além disso, estudos
(TOMLINSON et al., 1994; HATANAKA et al., 1999) mostram que a injeção de carragenina
no peritônio de ratos induz a expressão da ON sintase (isoforma induzida) e COX-2, levando
assim à liberação de uma grande quantidade de ON e PGs.
O fMLP, produto do metabolismo bacteriano, é um dos mais importantes peptídios
quimiotáticos na resposta imune (MURPHY, 1994). A ligação do fMLP ao seu receptor,
receptor peptídio formil (FPR) e FPR-like 1 (FPRL1) (BOULAY et al., 1990; SU et al., 1999),
causa a ativação da fosfolipase C (PLC) e a produção de dois segundos mensageiros,
trifosfato de inositol e diacilglicerol, que desencadeiam a liberação de cálcio intracelular e
exocitose de enzimas (Nick et al., 1997). O fMLP pode ativar também as vias p38 e p42/44
MAPK (mitogen activated protein kinase). A ativação da primeira via leva à ativação da
fosfolipase A
2
e por conseqüência a produção de eicosanóides, enquanto na segunda via são
desencadeados os processos de adesão, quimiotaxia e desgranulação (NICK et al., 1997;
PARTRICK et al., 2000; BURG & PILLINGER, 2001).
Portanto, o fMLP é um ativador potente de neutrófilos e macrófagos, e uma das
respostas celulares mais importantes como resultado dessa ativação, é a secreção de enzimas
lisossomais, incluindo mieloperoxidase e elastase (SPISANI et al., 1996a, b; SEGAL, 2005).
No presente estudo o ICPF e o AMB inibiram parcialmente a desgranulação de neutrófilos
humanos estimulados pelo fMLP, determinada pelas atividades das enzimas mieloperoxidase
(MPO) e elastase.
5. Discussão
128
A MPO é uma enzima multifuncional envolvida na defesa do hospedeiro e na lesão
tecidual relacionada à inflamação. Essa enzima além de produzir oxidantes, contribui também
na regulação da resposta à invasão de microorganismos (ARNHOLD et al., 2004).
Estudo realizado por Lau et al. (2005) permitiu caracterizar as propriedades da
MPO na inflamação. Primeiramente, a MPO não modula apenas a cascata de sinalização
intercelular, mas também modifica a via de sinalização intracelular nos PMNs. Em segundo
lugar as mudanças proporcionadas pela ativação PMNs independe da ação catalítica da
enzima, mas depende de suas propriedades biofísicas como ligante das integrinas
CD11b/CD18. Conseqüentemente, a ligação da MPO às integrinas leva a um aumento na
fosforilação da tirosina, ativação MAPK (mitogen antigen activate kinase) quinase,
translocação do NFκB e a modificações dos eventos que são sensíveis a reação redox
(HOMMES et al., 2003; GRIENDLING et al., 2000). Como as integrinas CD11b/CD18 estão
presentes também nos monócitos e células natural killer, a MPO de neutrófilos pode modular
também a ativação de outros leucócitos ligados à progressão de doenças inflamatórias crônicas
(HARRIS et al., 2000; LIBBY, 2002). Portanto, a MPO exerce funções que são comuns às
citocinas pró-inflamatórias potentes como TNF-α e IL-8 (LAU et al., 2005).
Enfim, a MPO não serve somente como um índice de recrutamento e ativação de
neutrófilos, mas possui também propriedades tradicionais comuns às citocinas que modulam o
estado de ativação de leucócitos em doenças inflamatórias. Inclusive, estão previstos estudos
para definir se a ativação leucocitária dependente de MPO pode constituir numa estratégia
terapêutica (LAU et al., 2005).
A elastase leucocitária é encontrada predominantemente nos grânulos azurófilos de
neutrófilos e nos monócitos. Essa enzima possui um grande número de substratos da matrix
extracelular, incluindo elastina, proteoglicanos, colágeno e fibronectina (OWEN et al., 1997;
DENTENER et al., 1996; NÉNAN et al., 2005). Quando secretada no foco inflamatório a
elastase pode causar lesões tissulares severas, o que possivelmente determinou a implicação
dessa enzima em várias doenças inflamatórias, como bonquite, enfisema pulmonar, Doença
Pulmonar Obstrutiva Crônica – DPOC, sepsis, asma, artrite e nefrite (MOHR &
WESSINGHAGE, 1983; FUJITA et al., 1990; DHAINAUT et al., 2001; DEVINE, 2003;
NÉNAN et al., 2005). Além disso, a elastase modula as funções de células inflamatórias, como
linfócitos e plaquetas (OWEN et al., 1997).
A elastase neutrofílica produz várias características das doenças pulmonares, como
a hiperplasia das glândulas produtoras de muco, o decréscimo na freqüência de batimentos
ciliares e a lesão epitelial. Essa enzima causa ainda mudanças no sistema de defesa do
5. Discussão
129
hospedeiro que facilita a colonização bacteriana (STOCKLEY et al., 2000). Por fim,
VIGNOLA et al. (1998) mostraram que a inflamação das vias aéreas na asma e na bronquite
crônica está associada com o aumento nos níveis de elastase ativa, que tem um papel
fundamental no remodelamento das vias aéreas, ou melhor, da matrix extracelular onde a
elastina é o componente principal.
Assim, o interesse pela descoberta de drogas que previnam os efeitos deletérios da
elastase tem sido expressivo. Isso, porque os estudos com corticóides, agentes
antiinflamatórios potentes, envolvendo pacientes ou ensaios in vitro têm produzido resultados
considerados conflitantes (ABBINANTE-NISSEN et al., 1995; JANSEN et al., 1991). Além
disso, mais recentemente Kamal et al. (2002) mostraram que a fluticasona inalada por
voluntários saudáveis não teve efeito em nenhum dos componentes da relação
elastase/antielastase a nível do trato respiratório (KAMAL et al., 2002).
Vários substâncias naturais isolados de plantas tais como, antocianidinas,
dihidrochalconas, flavonóis, flavonas, isoflavonas, derivados do ácido caféico, triterpenos e
ácidos graxos tiveram determinadas suas atividades inibidoras da elastase (MELONI et al.,
1995; ROTONDO et al., 1998; SARTOR et al., 2002; DAELS-RAKOTOARISON et al.,
2003). Contudo, a inibição da secreção de elastase parece ser mecanisticamente mais eficaz e
interessante, como já foi observado para alguns compostos fenólicos (BENNET et al., 1981;
SHOWELL et al., 1981; SIEDLE et al., 2003).
Um possível mecanismo pelo qual o ICPF e o AMB inibiram a infiltração de
PMNs no peritônio de camundongos é através da inibição da secreção de enzimas lisossomais
(elastase e MPO) por neutrófilos estimulados. Quanto a participação de moléculas de adesão
no efeito do ICPF e do AMB, de maneira indireta, esses compostos ao reduzirem a secreção de
MPO podem ter prevenido a participação das integrinas CD11b/CD18, que são essenciais para
a adesão de PMNs via ligação às proteínas da matrix extracelular e moléculas de adesão
intercelular-1 (ICAM-1). Contudo, estudos adicionais são necessários para confirmar essa
hipótese.
Um estudo recente (CHEN et al., 2004) avaliou o efeito do campferol, flavonóide
que difere do ICPF apenas pela OH no C3 - anel C, na expressão da molécula de adesão
ICAM-1 induzida pelo TNFα em células epiteliais do sistema respiratório. O campferol inibiu
a expressão da ICAM-1 pela atenuação da atividade da JNK, pela expressão gênica de c-jun e
pela atividade da AP-1 (proteína ativadora-1). Análise da relação estrutura-atividade mostrou a
importância das hidroxilas nos carbonos 5 e 7 do anel A, e no carbono 4 do anel B, comuns ao
campferol e ao ICPF, para ocorrência destes efeitos.
5. Discussão
130
Portanto, a inibição do edema induzido por diferentes mediadores, da migração de
células in vivo, associada a capacidade do ICPF e do AMB de inibirem a secreção de enzimas
(mieloperoxidase e elastase) pelos neutrófilos humano, tornam esses compostos bons
candidatos como drogas antiinflamatórias possivelmente úteis na terapia de doenças
respiratórias caracterizadas pelo acúmulo de células inflamatórias.
Existem várias evidências que a produção excessiva de espécies reativas de
oxigênio (ROS) contribui com a resposta inflamatória, além de estar associada a perda da
função celular (HOLMDAHL et al., 1985; FORMAN & TORRES, 2001). O ânion
superóxido, o peróxido de hidrogênio e o radical hidroxila são ROS produzidas principalmente
na mitocôndria onde 90% do oxigênio celular é consumido (WU, 1998). Estudos mostram que
os processos oxidativos têm um papel fundamental na inflamação através da ativação de
quinases (JNK, MAPK, p38) e de fatores de transcrição sensíveis a reação redox tais como
NFκB e AP-1, que regulam genes de mediadores inflamatórios e de antioxidantes, como a
gamma-glutamilcisteína sintetase (síntese de GSH) e SOD-Mn (RAHMAN & MACNEE,
2000).
Para investigar se a atividade antiinflamatória do AMB está relacionada a uma
possível ação antioxidante, foi avaliado o efeito do tratamento dos animais com AMB sobre a
hepatotoxicidade induzida pelo tetracloreto de carbono (CCl
4
)
em ratos. O estudo envolveu a
avaliação do efeito do AMB sobre as enzimas hepáticas, a peroxidação lipídica (MDA), o
nível de glutationa reduzida (GSH) e a atividade da catalase, além da análise histopatológica
do fígado.
O aumento na produção de radicais livres e o estresse oxidativo pode ser induzido
por uma variedade de estímulos, incluindo radiações ionizantes, exposição à drogas e à
xenobióticos, como CCl
4
, um típico agente hepatotóxico que exerce seus efeitos pela produção
de radicais livres (MELIN et al., 2000; MICHIELS et al., 1994). Devido ao seu caráter
lipossolúvel o CCl
4
atravessa as membranas celulares e deposita-se em orgãos como o fígado,
cérebro, rins e coração (CASTILLO et al., 1992; ZHANG et al., 1989; RINCON et al., 1999).
O tempo para entrada e eliminação do CCl
4
parece ser influenciado pela taxa de perfusão
sanguínea e o conteúdo lipídico dos tecidos. O fígado e o cérebro são rapidamente atingidos
pelo CCl
4
, sendo o fígado o órgão mais investigado quando no processo de intoxicação por
esse produto (SANZGIR et al., 1997).
No presente estudo foi observado que a administração do CCl
4
causou um aumento
na atividade de enzimas, notavelmente àquelas que são indicativas de necrose hepatocelular,
como a AST e ALT. Entretanto, o tratamento dos animais com AMB reduziu
5. Discussão
131
significativamente esse efeito, fato este que foi confirmado pela análise histológica. Na
avaliação do efeito do AMB sobre a peroxidação lipídica induzida pelo CCl
4
, foi observado
que o tratamento dos animais com o AMB reduziu consideravelmente os níveis de
malonidialdeído (MDA) no fígado.
O CCl
4
,
ao ligar-se aos lipídios e proteínas, produz degeneração peroxidativa de
muitos tecidos (CASTILLO et al., 1992; CABRE et al., 2000; SIMIBE et al., 2001; MC LAY
et al., 1976). Ele aumenta significativamente a liberação de enzimas hepáticas, causa
destruição da citocromo P450, necrose hepatocelular e gera produtos da peroxidação lipídica,
como o MDA e o 4-hidroxinonenol (MELIN et al., 2000; MICHIELS et al., 1994). A
toxicidade do CCl
4
provavelmente depende da formação do radical CCl
3
, que na presença do
oxigênio interage com este formando um produto mais tóxico, o CCl
3
O
2
. A peroxidação
lipídica é iniciada pela interação desses radicais reativos do CCl
4
com os ácidos graxos
insaturados e lipídios da membrana celular. A reação do MDA, produto da peroxidação
lipídica, com grupos amino de proteínas pode levar a polimerização e inativação de enzimas,
além da inibição da síntese protéica (BIRD et al., 1980; MELLO FILHO et al., 1983;
HARTLEY et al., 1999; MELIN et al., 2000).
Na hepatotoxicidade causada pelo CCl
4
, as primeiras células danificadas são as da
região centrolobular, onde as atividades enzimáticas são expressivas (EDWARD et al., 1993;
CABRE et al., 2000; SIMIBE et al., 2001). Nesse processo, as células de Kupffer sensíveis às
ações do CCl
4
liberam citocinas citotóxicas tais como IL-1, IL-2 e TNF-α (EDWARD et al.,
1993; SHIGEKI & MASAYUKI, 1999). A expressão dessas citocinas ocorre através da
ativação do NFκB durante as lesões agudas induzidas pelo CCl
4
. Um mediador primário na
lesão hepática é provavelmente as ROS, que causam à ativação do NFκB, fator de transcrição
envolvido na expressão de genes inflamatórios, além da produção de fatores implicados na
necrose hepática, como enzimas proteolíticas e ROS. Assim, a hepatotoxicidade induzida pelo
CCl
4
parece resultar de uma ação direta das ROS e de uma ação indireta, inflamatória
(CZAJA et al., 1995; DECICCO et al., 1998).
Segundo Maurizio et al. (1992) os antioxidantes podem exercer seu efeito protetor
contra as lesões hepáticas induzidas pelo CCl
4
, através da inibição da peroxidação lipídica,
inativação de fatores de transcrição, como o NFκB, ou indução da expressão de enzimas
antioxidantes. Portanto, pelo menos parte do efeito hepatoprotetor do AMB parece estar
relacionado à sua habilidade de reduzir a peroxidação lipídica induzida pelo CCl
4
, que
possivelmente se soma ao seu perfil antiinflamatório.
5. Discussão
132
A dose sub-letal do CCl
4
reduziu significativamente a concentração de GSH no
fígado dos animais, enquanto o tratamento com AMB reverteu quase a normalidade esse
efeito. A GSH, tripeptídio com grupo tiol (sulfidril), é um dos agentes antioxidantes mais
importante do sistema de defesa da célula, envolvida por exemplo, na detoxificação de agentes
químicos e na eliminação de produtos da lipoperoxidação, além de ser requerida na síntese de
DNA, de proteínas e de algumas prostaglandinas (DENEKE et al., 1989; GALLEANO &
PUNTARULO, 1995). A GSH tem sido implicada na modulação da resposta imune e
inflamatória, e seu estado oxidada/reduzida é crítico para vários eventos biológicos, incluindo
a ativação da transcrição gênica de genes específicos, modulação de sinais de transdução
regulados pela reação redox, regulação da proliferação celular, apoptose e inflamação
(BROWN et al., 1994; ARRIGO, 1999; RAHMAN & MACNEE, 2000; HADDAD & HARB,
2005). Estudos (LI et al., 1994; RAHMAN & MACNEE, 1999; MORRISON et al., 1999)
mostram que o nível de GSH é considerado crítico por exemplo, para o sistema de defesa
antioxidante dos pulmões, por estar particularmente envolvida na proteção do epitélio das vias
aéreas. Assim baixas concentrações de GSH nos pulmões contribuem para o desequilíbrio
entre oxidantes e antioxidantes, o que pode amplificar a resposta inflamatória e potencializar
as lesões teciduais (RAHMAN & MACNEE, 1999, CANTIN et al., 1987).
A depleção de glutationa aumenta a sensibilidade das células à várias agressões,
por exemplo a lesão hepática induzida pelo consumo de álcool ou drogas (ex.: acetominofem),
as lesões pulmonares, provocada pelo fumo, e as musculares induzidas pelo excesso de
atividade física (LEEUWENBURGH & JI, 1995). No presente estudo, a diminuição nos níveis
de GSH nos animais tratados com CCl
4
pode ser esclarecida pelo consumo de GSH para a
remoção de ROS e de produtos da lipoperoxidação gerados pela ação tóxica do CCl
4
. Porém,
nos animais pré-tratados com AMB a concentração de GSH foi restabelecida à quase
normalidade, isso ocorreu possivelmente pela habilidade desse glucosídio fenólico em reduzir
os níveis de ROS e de produtos da lipoperoxidação.
A administração aguda do CCl
4
aumentou significativamente a atividade da
catalase, enquanto o tratamento dos animais com AMB reduziu esse efeito a níveis próximos à
normalidade, ou seja, semelhantes aos do grupo de animais que não foram submetidos aos
efeitos tóxicos do CCl
4
.
A catalase é uma enzima chave do sistema de defesa antioxidante da célula, ela
catalisa a redução do H
2
O
2
a H
2
O e O
2
. Estudos (BAE et al., 1997; LEE et al., 1998;
ROBINSON et al., 1999) mostram que o H
2
O
2
pode ser sintetizado endogenamente em certos
tipos celulares em resposta à ativação por citocinas ou fatores de crescimento. Esse agente
5. Discussão
133
oxidante atua então como um segundo mensageiro estimulando a cascata de proteínas quinases
ligadas à expressão de genes inflamatórios ou ao controle do ciclo celular. Hensley et al.
(2000) mostraram que tanto a IL-1 quanto o H
2
O
2
ativam por fosforilação a quinase MAPK
p38, de uma maneira que pode ser antagonizado pelo NAC, N-acetil-L-cisteína, que atua como
precursor de GSH e tem sido utilizado terapeuticamente para elevar os níveis de GSH e
reduzir a inflamação em pacientes com doença pulmonar obstrutiva crônica (Bridgeman et al.,
1994).
Rohrdanz et al. (1998) observaram que a expressão gênica e a atividade da enzima
catalase foram induzidas pela exposição de hepatócitos ao H
2
O
2
durante 24 h. Szymonk-
Lesiuk et al. (2003) obtiveram resultados semelhantes em fígado de ratos, onde foi verificado
um aumento na atividade da catalase 24 e 72h após à administração de CCl
4
. Portanto, o
aumento na atividade da catalase observado no presente estudo está possivelmente relacionado
a um aumento na expressão dessa enzima em função do acúmulo de ROS no fígado,
provocado pelo CCl
4
. Nesse sentido, a redução na atividade da catalase promovida pelo AMB
reflete um efeito antioxidante desse composto.
Galato et al. (2001) avaliaram o potencial antioxidante de alguns fenóis, tais como
os ácidos caféico, para-cumárico e gálico, e observaram que quanto maior o número de
hidroxilas ligadas ao anel aromático, maior a atividade antioxidante desses compostos. Assim,
é possível que os grupos hidroxilas presentes no anel aromático do AMB (Figura 2)
contribuam para sua atividade antioxidante. Esse efeito é um achado importante considerando
que o aumento na produção de radicais livres tem sido implicado na hiperreatividade das vias
aéreas observada na asma (NEIJENS et al., 1984; MELTZER et al., 1988).
A possibilidade que os compostos fenólicos estudados combinem os efeitos
antioxidante e/ou antiinflamatório com a atividade relaxante muscular é particularmente
atrativa para o tratamento de afecções respiratórias tais como a asma, principal uso do cumaru
na medicina tradicional.
No presente estudo o ICPF e o AMB relaxaram de maneira concentração-
dependente a resposta contrátil induzida pelo CCh ou KCl em traquéia isolada de cobaia. Vale
ressaltar que o ICPF mostrou-se mais potente que a teofilina, inibidor não seletivo da enzima
fosfodiesterase. Além disso, foi observado também que o ICPF apresentou-se mais potente na
presença do KCl, sendo capaz de reverter completamente o tonus muscular. Esses resultados
sugerem que o ICPF e o AMB são pelo menos em parte responsáveis pelo efeito relaxante
muscular de A. cearensis, demonstrado anteriormente (LEAL et al., 2003).
5. Discussão
134
O ICPF e o AMB induziram um relaxamento no músculo pré-contraído pelo CCh
ou KCl, que estendeu-se além do tônus basal. Esse resultado nos surpreendeu considerando
que foi observado apenas um leve relaxamento no tonus basal em parte dos experimentos.
Além disso, as avaliações foram realizadas na presença de indometacina para prevenir a
influência de prostanóides (MIURA et al., 1997; VAALI et al., 1998).
A lesão do epitélio brônquico na asma com perda da barreira de proteção expõe as
estruturas mais profundas das vias aéreas à fatores exógenos como alérgenos, vírus e poluentes
atmosféricos, além dos componentes endógenos como as enzimas proteolíticas (ex.: elastase,
MPO, proteína básica principal e peroxidase eosinofílica). Em certos pacientes com asma, a
resposta epitelial à injúria é falha, conduzindo a um longo e anormal processo de reparação,
que resulta em alterações estruturais, coletivamente chamadas de remodelamento brônquico,
que implica em mudanças estruturais no epitélio, (mio)fibroblastos, matriz extracelular
(incluindo membrana basal) e músculo liso (FOLKERTS & NIJKAMP, 1998; MAUAD et al.,
2000; BHARADWAJ & AGRAWAL, 2004).
As células epiteliais das vias aéreas constituem uma barreira física que protegem os
nervos sensoriais e o músculo liso da estimulação por irritantes inalados, além disso, elas
participam na regulação da reatividade brônquica. Tem sido mostrado que as células epiteliais
liberam mediadores inibitórios do tonus muscular tais como prostaglandina E
2
e óxido nítrico
(ON) (FOLKERTS & NIJKAMP, 1998; SPICUZZA et al., 2002).
Na traquéia destituída de epitélio o ICPF e o AMB mantiveram seu efeito
relaxante, além do que o efeito relaxante do ICPF foi significativamente mais potente em
relação à preparação com epitélio. Isso sugere que os efeitos relaxantes do ICPF e do AMB
são epitélio independente. Holroyde (1986) demonstrou que a supersensibilidade à serotonina,
histamina, adenosina, isoprenalina e em menor grau ao KCl, produzida pela remoção do
epitélio traqueal de cobaia não foi devido a ausência de fator relaxante, mas sim a ausência
física de uma barreira. Assim, é possível que o aumento do efeito relaxante do ICPF observado
na traquéia sem epitélio esteja relacionado a uma maior concentração do flavonóide a nível
das células musculares.
As ROS têm um papel fisiológico importante, mas podem causar efeitos inde-
sejáveis aos tecidos quando produzidos em excesso ou durante a ausência de quantidades
suficientes de antioxidantes. Assim, esses mediadores têm sido implicados na patogênese de
várias doenças inflamatórias das vias aéreas, incluindo a asma e a doença pulmonar obstrutiva
crônica - DPOC (HENRICKS & NIJKAMP, 2001). Em trabalho recente, Casoni et al. (2003)
mostraram que a GSH inibe a broncoconstrição induzida por vários estímulos (ex.: carbacol,
5. Discussão
135
histamina e alérgenos) e que durante a resposta contrátil são produzidos radicais livres. Dessa
forma, o efeito relaxante muscular do AMB em traquéia de cobaia pode estar pelo menos em
parte relacionado à sua atividade antioxidante.
O ON em condições fisiológicas ou patológicas como na asma, desempenha uma
função importante na regulação das funções das vias aéreas (SPICUZZA et al., 2002). Tem
sido demonstrado que compostos doadores de ON, relaxam o músculo liso traqueal via
ativação dos canais de K
+
sensíveis ao ATP por mecanismo dependente de GMP cíclico
(KATSUKI & MURAD, 1977; KUBO et al., 1993). Nas vias aéreas o ON pode ser liberado
também por neurônios sensoriais (VAALI et al., 2000). Parte do efeito relaxante do ICPF
parece envolver a liberação de ON por neurônios, considerando que o L-NAME em traquéia
com ou sem epitélio reduziu significativamente o efeito do ICPF. Além disso, o ODQ, inibidor
seletivo da guanilato ciclase (GC), também reduziu significativamente o efeito do ICPF. Dessa
forma, os nossos resultados sugerem que o relaxamento muscular induzido pelo ICPF é
mediado pela ativação da via ON/GC/GMPc. É conhecido que o acúmulo de GMPc pode levar
à expressão de proteína quinase dependente de GMP (PKG), que por sua vez estimula o efluxo
de K
+
e causa
o relaxamento muscular (WU et al., 2005).
Evidências anteriores (LINCOLN & CORNWELL, 1991; BOLOTINA et al., 1994;
ABDERRAHMANE et al., 1998) mostram que o ON é capaz de estimular os canais de K
+
ativados por Ca
2+
em células musculares lisas, incluindo as vias aéreas, causando um
decréscimo no influxo de Ca
2+
e relaxamento muscular.
As células musculares lisas das vias aéreas expressam vários tipos de canais de K
+
que desempenham funções importantes determinando o potencial de membrana de repouso, a
estabilidade elétrica relativa e a responsividade de agentes contráteis e relaxantes. Além disso,
esses canais estão também envolvidos na modulação da liberação de neurotransmissores por
neurônios nas vias aéreas (PELAIA et al., 2002). Um indicativo da possível participação dos
canais de K
+
no efeito relaxante do ICPF em traquéia de cobaia, foi a redução significativa do
seu efeito na presença de alta concentração de KCl (120 mM). Adicionalmente, nessas
circunstâncias a glibenclamida não interferiu no efeito relaxante do ICPF, enquanto que o
contrário foi observado na presença de uma menor concentração de KCl (40 mM).
Vaali et al. (1998) demonstraram que no músculo traqueal pré-contraído por KCl
(40 mM), o efeito relaxante de doadores de ON foi reduzido significativamente pela IbTX.
Nielsen (1996) mostrou que o cromacalim, protótipo dos abridores de canais de K
+
, relaxou as
contrações induzidas por 20 e 30 mM de KCl, mas não teve efeito na contração induzida por
124 mM, enquanto o pinacidil relaxou o músculo em todas as concentrações investigadas.
5. Discussão
136
Além disso, recentemente Gopalakrishnan et al (2004) mostraram que o A-151892,
naftilamida, inibiu completamente a contração induzida pelo KCl (25 mM) em aorta de rato,
mas praticamente não interferiu na despolarização induzida pelo KCl (80 mM). Segundo os
autores o efeito observado constitui num indicativo que o efeito relaxante do A-151892 é
dependente dos canais de potássio.
Assim, considerando as condições experimentais em que foram realizados os
estudos com ICPF, o tônus induzido por 40 mM de KCl (49 % da resposta máxima)
possivelmente ainda permite a ação de abridores de canais de K
+
, ou seja nessas circunstâncias
abridores de canais de K
+
não possuem um papel negligenciável. Dessa forma, os resultados
sugerem que o efeito relaxante do ICPF é mediado por canais de K
+
, contudo, outro
mecanismo de ação independente dos canais de K
+
pode também estar envolvido.
Canais de K
+
sensíveis ao Ca
2+
têm sido identificados no músculo liso das vias
aéreas de cobaias e de outras espécies (HISADA et al., 1990; KOTLIKOFF, 1990). Segundo
Galvez et al. (1990), a iberiotoxina (IbTX) e a charibidotoxina (ChTX) ligam-se em diferentes
sítios nos canais de K
Ca
e modulam a atividade desses canais por mecanismos distintos. Além
disso, a ChTX é conhecida por inibir pelo menos três tipos de canais de K
+
voltagem-
dependente (HERMANN & ERXLEBEN, 1989; VÁZQUEZ et al., 1990), enquanto a IbTX
bloqueia seletivamente os canais de K
Ca
(CANDIA et al., 1992). No presente estudo a IbTX
inibiu significativamente o efeito relaxante do ICPF no músculo pré-contraído por KCl (40
mM), sugerindo portanto a participação dos canais de K
Ca
no efeito do ICPF.
A 4-aminopiridina (4-AP), constitui uma ferramenta farmacológica muito útil para
estudar os canais K
+
voltagem dependente, por não afetar os canais de K
Ca
(BOYLE et al.,
1992). Hisada et al (1990) demonstraram que na traquéia de cobaia existem correntes sensíveis
à 4-AP, entretanto o efeito relaxante do ICPF em traquéia de cobaia não foi afetado
significativamente pela presença da 4-AP.
O envolvimento de receptores adrenérgicos no efeito relaxante do ICPF foi
observado pela inibição de seu efeito pelo propranolol, antagonista competitivo não seletivo de
receptores β-adrenérgicos. Contudo, estudos adicionais são necessários para confirmar a
participação do sistema adrenérgico.
Estudos mostram que a inflamação neurogênica nas vias aéreas tem um papel
importante na patogênese da asma (JOOS & PAUWELS, 2001; BARNES, 1996). Murai et al
(1992) utilizando antagonistas de taquicininas demonstraram que a inflamação nas vias aéreas
é gerada por taquicininas liberadas por neurônios sensoriais aferentes sensíveis à capsaicina
(fibras C), que são estimulados por vários tipos de irritantes como a fumaça de cigarros
5. Discussão
137
(MORIMOTO et al., 1992) e o ar frio (YOSHIHARA et al., 1995). Esses irritantes ativam as
fibras C pela abertura de canais iônicos com alta permeabilidade ao Ca
2+
(CATERINA et al.,
1997).
A estimulação das fibras C leva a liberação de vários neuropeptídios, tais como
substância P, neurocinina A e peptídio relacionado ao gene da calcitonina, que exercem várias
reações respiratórias (HOLZER, 1988). Estudos anteriores (ICHINOSE & BARNES, 1990;
STRETTON et al., 1992) mostraramm que os canais de K
ATP
e K
Ca
possuem modulação
inibitória na ativação das fibras C. No presente estudo, a depleção de neuropeptídios pelo
tratamento com capsaicina reduziu significativamente a ação relaxante do ICPF. Assim,
considerando o perfil ativador de canais de K
ATP
e K
Ca
do ICPF, é possível que parte do efeito
relaxante desse 3-metilflavonol esteja relacionado à inibição do influxo de Ca
2+
e
conseqüentemente da liberação de neuropeptídios pelas fibras C.
Dessa forma, os nossos resultados mostram que o efeito relaxante do ICPF é
epitélio independente e resulta de várias ações intracelulares, mas que possui uma via comum
final às ativações dos canais de K
ATP
e K
Ca
(Figura 40).
As características fisiopatológicas da asma incluem obstrução, inflamação e
hiperresponsividade das vias aéreas (BUSSE & LEMANSKE, 2001; KUMAR, 2001),
resultantes de interações complexas entre células, inflamatórias e estruturais, e mediadores
inflamatórios. Inúmeros estímulos (alérgenos, poluentes ambientais, vírus e outros) podem
induzir o processo asmático, através do acúmulo e da ativação de tipos celulares, destacando-
se mastócitos (fase aguda) e eosinófilos (fase crônica), além de outras células também
importantes como linfócitos, macrófagos e neutrófilos, responsáveis pela síntese e/ou
liberação de vários mediadores inflamatórios, incluindo histamina, citocinas, ROS e enzimas
(MPO, elastase, peroxidase eosinofílica). Assim, as ações conjuntas desses mediadores
propiciam alterações significativas que levam à hiperresponsivade e ao remodelamento das
vias aéreas e conseqüentemente perda do limite de broncoconstrição (MAUAD et al., 2000).
Dessa forma, o bloqueio do aumento da permeabilidade vascular, da migração e
ativação de leucócitos (neutrófilos) e conseqüente prevenção dos danos causados pela ação das
enzimas MPO e da elastase, somados à ação antioxidante e relaxante muscular do ICPF e/ou
do AMB, tornam esses compostos potencialmente úteis no tratamento de doenças
inflamatórias das vias aéreas, como a asma, principalmente na fase inicial da doença (Figura
41). Contudo, estudos adicionais avaliando por exemplo, o efeito desses compostos sobre a
eosinofilia e a síntese e/ou liberação de mediadores inflamatórios como citocinas e
5. Discussão
138
leucotrienos é particularmente interessante, considerando as características fisiopatológicas da
asma.
Por fim, os resultados demonstram que o AMB e o ICPF possuem baixa
citotoxicidade nos tipos celulares investigados (hepatócitos e neutrófilos), e apresentam
atividades antiinflamatória e/ou antioxidante, além do efeito relaxante muscular em traquéia
de cobaia. Assim, as atividades farmacológicas do ICPF e do AMB comprovam que esses
derivados fenólicos podem justificar pelo menos em parte o uso tradicional de Amburana
cearensis, no tratamento de doenças das vias aéreas, como a bronquite e a asma, principais
indicações tradicionais da planta.
É importante registrar que os resultados apresentados nesse estudo constituem num
incentivo para investirmos no desenvolvimento de um medicamento fitoterápico, empregando
como matéria-prima ativa as cascas do caule de A. cearensis. Além disso, a bioatividade do
ICPF e do AMB os tornam, ao lado da cumarina, aptos a serem utilizados como marcadores
no controle de qualidade de produtos derivados da planta. Contudo, para isso estudos
adicionais são ainda necessários.
5. Discussão
139
L - ARGININA
L - CITRULINA
ONS
ICPF
+
ON
+
GCs
GTP
GMPc
PK G
+
+
+
-
ICPF
+
ICPF
+
K
+
Ca²
+
K
+
ICPF
Ca
²
+
K
+
FIBRA C
P
E
P
T
D
I
O
S
Í
Célula do músculo liso
+
-
-
5’ GMP
PDE5
Figura 40. Proposta para o mecanismo de ação relaxante muscular do isocampferídio (ICPF)
em traquéia isolada de cobaia. A ativação da via ON/GCs/GMPc pelo ICPF causa um aumento
nos níveis de GMPc e conseqüentemente ativação da proteína quinase G (PKG). A PKG por
sua vez, estimula o efluxo de K
+
levando a uma redução no influxo de Ca
2+
e ao relaxamento
da célula muscular lisa. Além disso, o ICPF pode ter um efeito direto nos canais K
+
.
Adicionalmente, a abertura dos canais de K
+
nas fibras C pelo ICPF pode causar uma redução
na liberação de neuropeptídios, tais como substância P e neurocininas. + = ativação; - =
inibição. Modificado de WU et al., 2005.
(?)
(?)
5. Discussão
140
Figura 41. Prováveis sítios de ações do isocampferídio (ICPF) e do amburosídio A
(AMB) isolados de A. cearensis na asma. O ICPF e o AMB ao reduzirem a migração e
ativação de leucócitos, particularmente neutrófilos, previnem os efeitos danosos de
enzimas (MPO e elastase) implicadas na produção de ROS, hiperplasia das glândulas
produtoras de muco, lesão epitelial das vias aéreas e ativação de outros tipos celulares que
amplificam a resposta inflamatória. Adicionalmente, a ação seqüestradora de radicais
livres e relaxante muscular podem aliviar a broncoconstrição e a hiperresponsividade das
vias aéreas. (modificado de MAUAD et al., 2000). - = inibição.
ESTÍMULO
(alérgenos, vírus, poluentes)
LIBERAÇÃO DE MEDIADORES INFLAMATÓRIOS
(CITOCINAS, MPO, ELASTASE, ROS)
REMODELAMENTO DAS
VIAS AÉREAS
BRONCOCONSTRIÇÃO
neutrófilo eosinófilo
ICPF E AMB
(
-
)
( - )
macrófa
g
o
RECRUTAMENTO E ATIVAÇÃO
DE CÉLULAS INFLAMATÓRIAS
ICPF E AMB
(
-
)
HIPERRESPONSIVIDADE
ICPF E AMB
6. Conclusões
141
6
6
CONCLUSÕES
6. Conclusões
142
6. CONCLUSÕES
Os resultados obtidos no presente estudo com o isocampferídio (ICPF, 3-
metilflavonol) e o amburosídio A (AMB, glucosídio fenólico) isolados de A. cearensis nos
permitem as seguintes conclusões:
• Apenas o ICPF mostrou citotoxicidade à células hepáticas de ratos, enquanto em
neutrófilos humano o ICPF à semelhança do AMB não interferiram significativamente na
viabilidade celular.
• O ICPF e o AMB possuem atividade antiedematogênica observada pela inibição do edema
de pata induzido por carragenina, PGE
2
, dextrano, histamina ou serotonina em ratos ou
camundongos.
• A atividade antiedematogênica do ICPF e do AMB foi corroborada por suas habilidades
em prevenir o aumento da permeabilidade vascular e o acúmulo de células inflamatórias
nos modelos de edema de pata e peritonite em camundongos.
• Possivelmente a atividade antiedematogênica dos compostos fenólicos investigados está
relacionada a um bloqueio da síntese, liberação e/ou até mesmo da ação de mediadores
como PGE
2
, histamina e serotonina.
• A inibição da migração de células para o foco inflamatório pelo ICPF e pelo AMB parece
está relacionada ao bloqueio da degranulação de neutrófilos, prevenindo assim à ação de
enzimas como mieloperoxidase e elastase.
• O AMB mostrou uma ação hepatoprotetora que está possivelmente relacionada à sua
atividade antioxidante.
• O efeito antioxidante do AMB ocorreu pelo bloqueio de efeitos tóxicos induzidos pelo
estresse oxidativo, como a peroxidação lipídica.
• O AMB possui uma ação seqüestradora de radicais livres, observada pelas medidas de
sistemas de defesas antioxidantes enzimático (catalase) e não enzimático (glutationa
reduzida).
• Tanto o ICPF quanto o AMB possuem ação relaxante muscular epitélio independeente.
• Parte do efeito relaxante do ICPF é mediado pela ativação da via ON/GCs/GMPc e pela
abertura de canais de K
+
, além de interferir na liberação de neuropeptídios, tais como
substância P e neurocinina A pelas fibras C.
6. Conclusões
143
• O efeito relaxante do ICPF resulta de várias ações intracelulares apresentando, porém uma
via comum a abertura dos canais de K
+
sensíveis ao Ca
2+
e ao ATP. Contudo, um
mecanismo independente dos canais de K
+
pode está também envolvido.
• As atividades antiinflamatória, relaxante muscular e/ou antioxidante do ICPF e do AMB
obtidos de A. cearensis são importantes e justificam pelo menos em parte o principal uso
tradicional da planta, que envolve doenças respiratórias caracterizadas pela inflamação,
estresse oxidativo e/ou broncoconstrição.
7. Referências Bibliográficas
144
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
7
7
7. Referências Bibliográficas
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LEAL, L.K.A.M., NECHIO, M., SILVEIRA, E.R., CANUTO, K.M., FONTENELE, J.B.,
RIBEIRO, R.A., VIANA, G.S.B.
Categoria: trabalho publicado - “Anti-inflamatory and smooth muscle relaxant activities of the
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Brasília, 2003.
PRÊMIO JOSÉ PEDRO DE ARAUJO - 2000
Trabalho: Estudo toxicológico e farmacológico pré-clinico de Amburana cearensis A. C.
Smith (cumaru)”
Fundação José Pedro de Araújo, Belo Horizonte, 2000.
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