( PDF ) Papel dos núcleos da rafe na quimiossensibilidade ao CO2/pH

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

PAPEL DOS NÚCLEOS DA RAFE NA QUIMIOSSENSIBILIDADE AO

/pH

MIRELA BARROS DIAS

Ribeirão Preto

2008

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MIRELA BARROS DIAS

PAPEL DOS NÚCLEOS DA RAFE NA QUIMIOSSENSIBILIDADE AO

/PH

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Fisiologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,

da Universidade de São Paulo, para obtenção do título

de Doutor em Ciências.

Área de concentração: Fisiologia

Orientador: Prof. Dr. Luiz Guilherme de S. Branco

Ribeirão Preto

2008

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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE

TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA

FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

FICHA CATALOGRÁFICA

Dias, Mirela Barros

Papel dos núcleos da rafe na quimiossensibilidade ao CO

/pH / Mirela Barros

Dias; orientador Luiz Guilherme de Siqueira Branco

-- Ribeirão Preto, 2008.

150 p; 30 cm

Tese (Doutorado – Programa de pós-graduação em Fisiologia da Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo).

MIRELA BARROS DIAS

ROLE OF RAPHE NUCLEI IN CHEMOSSENSITIVITY TO CO

/PH

FOLHA DE APROVAÇÃO

Mirela Barros Dias

Papel dos núcleos da rafe na quimiossensibilidade ao CO

/pH

Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do

título de Doutor em Ciências.

Área de concentração: Fisiologia.

Aprovado (a) em:

Banca examinadora

Prof. Dr. Luiz Guilherme de Siqueira Branco

Instituição: FORP – USP Assinatura: _____________________

Prof. Dr. Benedito Honório Machado

Instituição: FMRP - USP Assinatura: _____________________

Prof. Dr. Luciane Helena Gargaglioni Batalhão

Instituição: UNESP Assinatura: _____________________

Prof. Dr. José Antônio Baddini Martinez

Instituição: FMRP – USP Assinatura: _____________________

Prof. Dr. Vagner Roberto Antunes

Instituição: ICB – USP Assinatura: _____________________

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus que é a minha força, o meu refúgio, meu amigo presente em todos os

momentos, quem me permitiu chegar até aqui. merecedor de toda a honra e louvor.

Ao Beto, que sempre soube me incentivar com carinho e compreensão, me proporcionando

tranqüilidade e segurança. Obrigada pelo amor e pela paciência, especialmente durante os 6

meses que ficamos distantes. O seu apoio foi fundamental para a concretização deste

trabalho.

Agradeço aos meus pais pelo incentivo e amor ilimitado, sem os quais seria impossível

chegar até aqui.

Agradeço ao Prof. Luiz Guilherme de Siqueira Branco que ao longo desses anos de trabalho,

me proporcionou muito mais do que a orientação, mas também sua amizade e confiança,

sempre oferencendo as melhores oportunidades, o que foi essencial para a minha formação.

Ao Prof. Eugene E. Nattie que “abriu as portas do seu laboratório” proporcionando uma

experiência científica internacional que enriqueceu muito minha formação.

À Porf

. Aihua Li pela agradável convivência profissional no laboratório do Prof. Eugene E.

Nattie, e pelo auxílio diário, o que me permitiu aprender a melhor conduta nas técnicas

cirúrgicas e experimentais.

À Luciane não somente pelo imensurável auxílio profissional, mas também pela amizade e

companheirismo ao longo dos anos.

Aos amigos: Camila, Maria Ida, Valéria, Karin, Luciana, Tatiane, Kênia, Giovani, Renato,

Alexandre, Stella, Carol, Caroline Marcantônio, Patrícia de Paula, Renata, Cristiane, Danúbia,

Giuliana, Ana Tereza, Daniela Secco, Kátia, Daniela Massom, Vânia e muitos outros, pelos

momentos inesquecíveis de convivência e pelo apoio sempre presente.

Aos amigos de Dartmouth, que durante os meus 6 meses de estágio foram a minha família:

Eliana, Carlos, Vanessa, Lisa, Joana, Karlene, Thelma, Ward, Chris, Peggy, Mickey, Natalia,

Nick and Alexis.

Ao Gustavo e à Lidiane pelo inestimável auxílio técnico, que foi indispensável para a

realização deste trabalho.

À Lizandra, pelo empenho nos procedimentos de Imuno-histoquímica, sempre conduzidos

com muita qualidade e também pela amizade sincera.

Aos funcionários e professores do Departamento de Fisiologia e da Comissão de Pós-

graduação da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP e do Departamento de

Morfologia, Estomatologia e Fisiologia da Faculdade Odontologia de Ribeirão Preto-USP.

Aos membros da Banca Examinadora: Benedito Honório Machado, Luciane Helena

Gargaglioni Batalhão, José Antônio Baddini Martinez e Vagner Roberto Antunes pelas

discussões e valiosas sugestões apresentadas durante a fase final deste trabalho.

À Fundação de Amparo à Pesquisa no Estado de São Paulo (FAPESP) pelo apoio financeiro e

pela bolsa concedida.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à Coordenação

de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro.

À todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.

RESUMO

Dias, M.B. Papel dos núcleos da rafe na quimiossensibilidade ao CO

/pH. 2008. Tese

(Doutorado) - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão

Preto, 2008.

Estudo No. 1: Participação do núcleo magno da rafe na resposta ventilatória e

termorregulatória à hipercapnia

Sabe-se que a serotonina (5-HT) participa das respostas fisiológicas à hipercapnia e

evidências indicam que os neurônios serotoninérgicos da rafe bulbar são quimiossensíveis.

No núcleo magno da rafe (RMg), 15–20%

dos neurônios são serotoninérgicos. No presente

estudo, foi estudado: 1) o envolvimento do RMg nas respostas ventilatória e termorregulatória

à hipercapnia (7% CO

); 2) o papel dos neurônios serotoninérgicos do RMg nestas respostas;

3) a participação dos receptores serotoninérgicos 5-HT

, 5-HT

e 5-HT

, no RMg, na

modulação da ventilação (

) e da termorregulação em resposta ao CO

. Para tal, ratos

Wistar receberam microinjeções de: 1) ácido ibotênico, para causar lesão não-específica do

RMg, ou seja, lesão de qualquer neurônio que possua receptores para aminoácidos

excitatórios; 2) anti-SERT-SAP para causar lesão específica dos neurônios serotoninérgicos

do RMg; 3) WAY-100635 (antagonista do receptor 5-HT

), Ketanserina (antagonista do

receptor 5-HT

), ou SB269970 (antagonista do receptor 5-HT

) para causar bloqueio dos

receptores serotoninérgicos do RMg. A hipercapnia causou hiperventilação e hipotermia em

todos os grupos. Lesões do RMg (tanto não-específicas quanto específicas) resultaram em

diminuição da resposta ventilatória ao CO

, sendo que as lesões específicas causaram também

uma atenuação da ventilação em condições de normocapnia. A resposta hipotérmica à

hipercapnia não foi modificada por lesão específica ou não-específica dos neurônios

serotoninérgicos. A microinjeção de SB269970 ou ketanserina intra-RMg não alterou a

hiperventilação induzida por hipercapnia, porém o tratamento com WAY-100635 causou

atenuação da resposta ventilatória ao CO

. A resposta térmica ao CO

não foi modificada pela

microinjeção dos antagonistas dos receptores serotoninérgicos 5-HT

, 5-HT

ou 5-HT

Nossos resultados sugerem que o RMg participa da resposta ventilatória à hipercapnia, mas

não possui papel na resposta termorregulatória ao CO

. Ainda, os neurônios serotoninérgicos

do RMg, além de participarem da resposta ventilatória ao CO

, têm papel tônico no controle

da ventilação. Os resultados mostram também que a serotonina, atuando nos receptors 5-HT

do RMg, causa aumento da ventilação durante a exposição ao CO

Estudo No. 2: Interação entre o Núcleo Obscuro da Rafe e Núcleo Retrotrapezóide na

resposta ventilatória à acidificação local

Estudo prévio mostrou que a inibição simultânea do núcleo retrotrapezóide (RTN) e

do núcleo obscuro da rafe (ROb) diminui em 51% a resposta ventilatória à hipercapnia, sendo

este efeito maior do que a inibição do RTN (-24%) ou ROb (0%) separadamente, o que sugere

que o ROb modula a quimiorrecepção por meio da interação com o RTN (Li et al., 2006). A

interação do ROb com o RTN na resposta ventilatória ao CO

foi investigada por meio da

microdiálise de líquido cérebro-espinhal equilibrado com 25% de CO

, simultaneamente em 2

sondas posicionadas em direção ao RTN e ao ROb, ou adjacentes à esses núcleos, em ratos. A

ventilação foi mensurada por meio de pletismografia corporal à temperatura ambiente de

30°C, correspondente à zona termoneutra do animal. Os animais foram divididos em 4 grupos

(N=5): 1) ambos os probes posicionados no RTN e ROb (“RTN-ROb”); 2) um dos probes

posicionado no RTN e o outro probe posicionado perifericamente ao ROb (“RTN – peri-

ROb”); 3) um dos probes posicionado no ROb, o outro adjacente ao RTN (“ROb – peri-

RTN”); 4) ambos os probes posicionados perifericamente às áreas de interesse (“peri-RTN –

peri-ROb”). A acidificação local do “RTN-ROb” aumentou significativamente a

em até

22%, comparado com a

basal, sendo este aumento devido tanto ao aumento da f quanto

do V

. A acidificação do grupo “RTN - peri-ROb” aumentou a

em até 15%, comparado

com a

basal, enquanto que no grupo “ROb – peri-RTN”, a acidificação local não

modificou a

em relação aos seus valores basais. A acidificação de regiões periféricas ao

RTN e ROb reduziu em 11% a resposta ventilatória ao CO

, em comparação com a

basal.

Os resultados deste estudo mostram que a simultânea acidificação do RTN e ROb

potencializou os efeitos da acidificação local do RTN, indicando que o ROb possui um papel

modulador no que diz respeito à quimiorrecepção central exercida pelo RTN.

ABSTRACT

Dias, M.B. Role of raphe nuclei in chemossensitivity to CO

/pH. 2008. Thesis (Doctoral) -

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2008.

PART 1: The role of raphe magnus nucleus in the ventilatory response to hypercapnia

It is known that serotonin [5-hydroxytryptamine (5-HT)]

is involved in the

physiological responses to hypercapnia and there is evidence that the medullary serotonergic

neurons are chemosensitive. Serotonergic

neurons represent the major cell type (comprising

15–20%

of the neurons) in raphe magnus nucleus (RMg). In the present study, we tested the

hypothesis

1) that RMg plays a role in the ventilatory and thermal responses

to hypercapnia

(7% CO

); 2) that RMg serotonergic neurons are involved

in these responses; 3) that 5-HT

5-HT

and 5-HT

receptors within RMg modulate the respiratory and thermal responses to

. To this end, Wistar rats were microinjected with: 1) ibotenic

acid to promote nonspecific

lesioning of neurons in the RMg; 2) anti-SERT-SAP to specifically kill the serotonergic

neurons in the RMg; 3) WAY-100635 (5-HT

antagonist), Ketanserin (5-HT

antagonist), or

SB269970 (5-HT

antagonist) to promote inhibition of 5-HT receptors. Hypercapnia caused

hyperventilation and

hypothermia in all groups. RMg nonspecific lesions elicited

a significant

reduction of the ventilatory response to hypercapnia. Rats

submitted to specific killing of

RMg serotonergic neurons showed

a decreased ventilation during air breathing

and a reduced

ventilatory response to CO

. The hypercapnia-induced hypothermia was not affected by

specific or nonspecific lesions of RMg serotonergic neurons.

The microinjection of SB269970

or ketanserin intra-RMg did not change the hypercapnia-induced hyperventilation, but the

treatment with WAY-100635 attenuated the ventilation during 7% CO

exposure. These data

suggest that RMg plays a role in the ventilatory but not in the thermal response to

hypercapnia, and serotonergic neurons of this nucleus contribute to a non-CO

dependent

chemical drive to breathe and are involved in the ventilatory responses to CO

. Ultimately, 5-

HT acting on the 5-HT

receptors in the RMg increases the ventilation during CO

exposure.

PART 2: Interaction between retrotrapezoid nucleus and raphe obscurus nucleus in the

ventilatory response to focal acidification

Simultaneous inhibition of the RTN and ROb decreased the systemic CO

response by

51%, an effect greater than inhibition of RTN (-24%) or ROb (0%) alone, suggesting that

ROb modulates chemoreception by interaction with the RTN (Li et al., 2006). We investigate

this interaction by simultaneous dialysis of artificial cerebrospinal fluid equilibrated with 25%

in two probes located in, or adjacent to, the RTN and ROb in conscious adult male rats.

Ventilation is measured in a whole body plethysmograph at 30°C, within the thermoneutral

zone of the animals. There are four groups (N=5): 1) probes correctly placed in both RTN and

ROb (“RTN-ROb”); 2) one probe correctly placed in RTN, one adjacent to ROb (“RTN -

peri-ROb”); 3) one probe adjacent to RTN, one correctly placed in ROb (“peri-RTN – ROb”);

4) neither probe correctly placed (“peri-RTN – peri-ROb”). Focal simultaneous acidification

of RTN-ROb significantly increased

up to 22% compared to baseline, with significant

increases in both f and V

. Focal acidification of RTN - peri-ROb increased

significantly

by up to 15% compared to baseline. Focal acidification of ROb and peri-RTN had no

significant effect. The simultaneous acidification of regions just outside the RTN and ROb

actually decreased

by up to 11%. The simultaneous acidification of the RTN and ROb

potentiated the effect of focal acidification of RTN alone. These results indicate a modulatory

role of the ROb with respect to central chemoreception at the RTN.

LISTA DE ABREVIAÇÕES

aCSF: Líquido cérebro-espinhal artificial

AP: Antero-posterior

: Dióxido de carbono

DAB: 3,3’-diaminobenzidina

DMSO: dimetilsulfóxido

DV: Dorso-ventral

EEG: Eletroencefalograma

EMG: Eletromiograma

E.P.M.: Erro padrão da média

f: Freqüência

GABA

: receptor g-aminobutirato do tipo A

L: Lateral

LC: Locus coeruleus

NK1R: Receptor para neurokinina-1

NREM: Movimento não rápido dos olhos

NTS: Núcleo do trato solitário

: Pressão de vapor d’água à temperatura da câmara

PB: Tampão fosfato

PBS: Tampão fosfato/salina

PBC: Complexo pré-Btzinger

: Pressão de vapor de água à temperatura corporal

PCO

: Pressão parcial de dióxido de carbono

pH: potencial hidrogeniônico

: Deflexão de pressão associada ao volume injetado para calibração

: Deflexão de pressão associada com cada volume de ar corrente

RMg: Núcleo magno da rafe

ROb: Núcleo obscuro da rafe

RPa: Núcleo pálido da rafe

RTN: Núcleo retrotrapezóide

SAP: Saporina

SERT: Transportador de recaptação da serotonina

SIDS: Síndrome da morte súbita infantil

SNC: Sistema nervoso central

Ta: Temperatura ambiente

: Temperatura do ar dentro da câmara do animal

Tc: Temperatura corporal

: Ventilação

: Volume de ar injetado na câmara do animal para calibração

VRG: Grupo respiratório ventral

: Volume total

5-CT: 5-carboxamidotriptamina

5-HT: Serotonina

5-HT-ir: imunorreativo à serotonina

5-HTP: 5-hidroxi-L-triptofano

8-OH-DPAT: (R)-(+)-8-hidroxi-2(di-n-propilamino)tetralina

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 20

1.1. Quimiorrecepção dos neurônios serotoninérgicos bulbares .................................. 22

1.2. Interação entre a temperatura corporal e a ventilação na hipercapnia .................... 24

1.3. Receptores serotoninérgicos .................................................................................. 26

1.4. Anormalidades na neurotransmissão serotoninérgica bulbar e suas implicações

clínicas .............................................................................................................................. 28

1.5. O núcleo obscuro da rafe e a sua interação com o núcleo retrotrapezóide ............. 29

2. OBJETIVOS .................................................................................................................... 31

3. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 33

3.1. Estudo No. 1: Participação do núcleo magno da rafe na resposta ventilatória e

termorregulatória à hipercapnia ................................................................................................ 34

3.1.1. Animais ................................................................................................................ 34

3.1.2. Implante de cânulas-guia dirigidas para o núcleo magno da rafe ........................ 34

3.1.3. Microinjeções de drogas no núcleo magno da rafe .............................................. 36

3.1.4. Lesões químicas do núcleo magno da rafe ........................................................... 36

3.1.5. Análise histológica ............................................................................................... 38

3.1.6. Imuno-histoquímica ............................................................................................. 38

3.1.7. Análise quantitativa ............................................................................................. 39

3.1.8. Medida da temperatura corporal .......................................................................... 40

3.1.9. Medida da Ventilação Pulmonar .......................................................................... 40

3.1.10. Protocolos experimentais ..................................................................................... 42

3.1.10.1. Papel do núcleo magno da rafe na resposta ventilatória e

termorregulatória à hipercapnia .......................................................................... 42

3.1.10.2. Papel dos neurônios serotoninérgicos do núcleo magno da rafe na

resposta ventilatória e termorregulatória à hipercapnia ........................................ 43

3.1.10.3. Papel dos receptores serotoninérgicos do núcleo magno da rafe, na

resposta ventilatória e termorregulatória à hipercapnia ........................................ 44

3.1.11. Análise estatística ................................................................................................. 46

3.2. Estudo No. 2: Interação entre o núcleo obscuro da rafe e o núcleo retrotrapezóide na

resposta ventilatória à acidificação local .................................................................................. 47

3.2.1. Animais ................................................................................................................ 47

3.2.2. Procedimentos cirúrgicos ..................................................................................... 47

3.2.3. Microdiálise ......................................................................................................... 49

3.2.4. Medida de ventilação pulmonar ........................................................................... 50

3.2.5. Medida da temperatura corporal .......................................................................... 50

3.2.6. Registro do eletroencefalograma e eletromiograma ............................................ 51

3.2.7. Análise anatômica ................................................................................................ 51

3.2.8. Protocolos experimentais ..................................................................................... 51

3.2.8.1. Efeito da acidificação local simultânea do núcleo retrotrapezóide e do

núcleo obscuro da rafe .......................................................................................... 51

3.2.8.2. Efeito da acidificação local do núcleo retrotrapezóide e região

periférica ao núcleo obscuro da rafe ..................................................................... 52

3.2.8.3. Efeito da acidificação local do núcleo obscuro da rafe e região

periférica ao núcleo retrotrapezóide ...................................................................... 52

3.2.9. Análise estatística ................................................................................................. 52

4. RESULTADOS ................................................................................................................ 54

4.1. Estudo No. 1: Participação do núcleo magno da rafe na resposta ventilatória e

termorregulatória à hipercapnia ................................................................................................ 55

4.1.1. Determinação da localização e efetividade da lesão química inespecífica do

núcleo magno da rafe ........................................................................................................ 55

4.1.2. Determinação da localização e efetividade da lesão química dos neurônios

serotoninérgicos do núcleo magno da rafe ........................................................................ 58

4.1.3. Efeitos da lesão química não específica do núcleo magno da rafe na resposta

ventilatória em resposta à hipercapnia .............................................................................. 61

4.1.4. Efeitos da lesão química dos neurônios serotoninérgicos do núcleo magno da

rafe na resposta ventilatória à hipercapnia ........................................................................ 61

4.1.5. Efeitos da lesão química não específica do núcleo magno da rafe e da lesão

específica dos neurônios serotoninérgicos do núcleo magno da rafe na resposta

termorregulatória à hipercapnia ........................................................................................ 64

4.1.6. Determinação da localização das microinjeções dos antagonistas dos receptores

serotoninérgicos no núcleo magno da rafe ........................................................................ 65

4.1.7. Efeito da microinjeção, no núcleo magno da rafe, do antagonista do receptor 5-

sobre a ventilação e temperatura corporal durante a normocapnia em ratos ........... 65

4.1.8. Efeito da microinjeção, no núcleo magno da rafe, do antagonista do receptor 5-

sobre a ventilação e temperatura corporal durante a hipercapnia em ratos ............. 66

4.1.9. Efeito da microinjeção, no núcleo magno da rafe, do antagonista do receptor 5-

sobre a ventilação e temperatura corporal durante a normocapnia em ratos ............ 68

4.1.10. Efeito da microinjeção, no núcleo magno da rafe, do antagonista do receptor 5-

sobre a ventilação e temperatura corporal durante a hipercapnia a 7% de CO

ratos ................................................................................................................................... 69

4.1.11. Efeito da microinjeção, no núcleo magno da rafe, do antagonista do receptor 5-

sobre a ventilação e temperatura corporal durante a normocapnia em ratos ............ 71

4.1.12. Efeito da microinjeção, no núcleo magno da rafe, do antagonista do receptor 5-

sobre a ventilação e temperatura corporal durante a hipercapnia em ratos ............... 72

4.2. Estudo No. 2: Interação entre o núcleo obscuro da rafe e o núcleo retrotrapezóide na

resposta ventilatória ao CO

..................................................................................................... 73

4.2.1. Localização das sondas de microdiálise .............................................................. 73

4.2.2. Efeito da diálise simultânea do núcleo obscuro da rafe e do núcleo

retrotrapezóide, com 25% de CO

..................................................................................... 77

4.2.3. Efeito da diálise do núcleo retrotrapezóide com 25% de CO

............................. 79

4.2.4. Efeito da diálise do núcleo obscuro da rafe com 25% de CO

............................ 79

4.2.5. Efeito da diálise de regiões periféricas ao núcleo retrotrapezóide e núcleo

obscuro da rafe com 25% de CO

..................................................................................... 82

5. DISCUSSÃO .................................................................................................................... 84

5.1. Estudo No. 1: Participação do núcleo magno da rafe na resposta ventilatória e

termorregulatória à hipercapnia ........................................................................................ 85

5.2. Estudo No. 2: Interação entre o núcleo obscuro da rafe e o núcleo retrotrapezóide na

resposta ventilatória ao CO

.............................................................................................. 90

6. CONCLUSÕES ............................................................................................................... 96

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 98

8. ANEXOS ........................................................................................................................ 112

1. INTRODUÇÃO

A regulação do equilíbrio ácido-básico depende em grande parte da modulação da

ventilação pulmonar exercida pelos quimiorreceptores centrais. Estes são populações de

neurônios no Sistema Nervoso Central (SNC) que respondem às alterações locais nos níveis

de CO

/pH, ajustando a ventilação pulmonar e permitindo que concentrações arteriais

normais de CO

sejam mantidas constantes, apesar das variações do balanço metabólico no

organismo (Nattie, 1999).

De acordo com a visão tradicional, os quimiorreceptores centrais estão presentes na

superfície ventral do bulbo ou próximos a ela (Loeschcke et al., 1982; Mitchell et al., 1963;

Nattie, 1999). Contudo, estudos recentes mostram que estes receptores estão amplamente

distribuídos no SNC, em diferentes áreas do tronco encefálico (Coates et al., 1993; Nattie,

1999; Li et al., 1999; Nattie & Li, 2002a; Nattie & Li, 2002b; Hodges et al., 2004) e até

mesmo no cerebelo (Xu & Frazier, 2000; Xu et al., 2001; Martino et al., 2006). Esses sítios

incluem: núcleo do trato solitário (NTS; Nattie & Li, 2002a), o grupo respiratório ventral

(VRG; Nattie & Li, 1996), o locus coeruleus (LC; Coates et al., 1993; Pineda & Aghajanian,

1997; Biancardi et al., 2008), outros sítios catecolaminérgicos (Li & Nattie, 2006), o

complexo pré-Bötzinger (PBC; Feldman et al., 2003), o núcleo fastigial do cerebelo (Xu et

al., 2001; Martino et al., 2006), o núcleo retrotrapezóide (RTN; Li et al., 1999) e a rafe bulbar

(Bernard et al., 1996; Dreshaj et al., 1998; Wang et al., 2001; Nattie & Li, 2001; Hodges et

al., 2004).

1.1. Quimiorrecepção dos neurônios serotoninérgicos bulbares

Os núcleos da rafe são agrupamentos de neurônios dispostos em uma coluna que se

estende no eixo rostro-caudal, do mesencéfalo ao bulbo. A rafe bulbar inclui o núcleo pálido

da rafe (RPa), o núcleo magno da rafe (RMg) e o núcleo obscuro da rafe (ROb). Os neurônios

presentes nesses núcleos são heterogêneos, no entanto, os neurônios serotoninérgicos

correspondem ao principal tipo celular (Mason et al., 1997), e têm sido identificados como

possíveis neurônios quimiossensíveis da rafe bulbar (Richerson, 2004; Richerson et al.,

2005).

A serotonina (5-hidroxitriptamina - 5-HT) é uma monoamina sintetizada nos

neurônios serotoninérgicos do SNC e nas células enterocromafins do trato gastrointestinal.

Ela é amplamente distribuída no encéfalo e foi identificada há quase 50 anos como molécula

efetora em diversos tipos de músculo liso e, posteriormente, como agente que intensifica a

agregação plaquetária e como neurotransmissor no SNC (c.f. Hoyer et al., 1994). A formação

da 5-HT ocorre pela hidroxilação do aminoácido L-triptofano pela triptofano hidroxilase,

formando a 5-hidroxi-L-triptofano (5-HTP), que por sua vez sofre descarboxilação pela 5-

HTP decarboxilase, resultando na formação da 5-HT.

Sabe-se que neurônios serotoninérgicos projetam-se amplamente para os principais

núcleos respiratórios incluindo o grupo respiratório pontino (Gang et al., 1991), o grupo

respiratório ventral (Connelly et al., 1989) e o grupo respiratório dorsal (Voss et al., 1990).

Além disso, também enviam projeções para os motoneurônios do nervo frênico e do

hipoglosso (Aldes et al., 1988; Zhan et al., 1989). Assim, é razoável propor que os neurônios

serotoninérgicos da rafe bulbar, uma vez estimulados pela acidose, podem aumentar o "drive"

ventilatório em múltiplos sítios e via múltiplos mecanismos.

Estudos in vivo e in vitro fornecem evidências que indicam que a rafe bulbar é

quimiossensível. Wang e colaboradores (1998) demonstraram que muitos neurônios da rafe

bulbar de ratos exibem uma taxa de disparo aumentada em resposta à acidose e ao aumento da

PCO

. Posteriormente, a análise imuno-histoquímica revelou que a maioria desses neurônios

estimulados pelo CO

são serotoninérgicos (Wang et al., 2001). Além disso, a acidificação da

rafe bulbar induz o aumento da ventilação tanto em cabras (Hodges et al, 2004) quanto em

ratos (Nattie & Li, 2001), e foi também demonstrado que a inibição da rafe bulbar, por meio

da microdiálise de um agonista do receptor GABA

, reduz a resposta ao CO

(Messier et al.,

2002). Ainda, Nattie e colaboradores (2004) demonstraram que a lesão de neurônios

serotoninérgicos da rafe bulbar causa diminuição da resposta ventilatória à hipercapnia, sendo

que essa redução foi maior no sono do que em animais acordados. Em outro estudo, Taylor e

colaboradores (2005) induziram inibição dos neurônios serotoninérgicos da rafe bulbar por

meio de 8-OH-DPAT ([(R)-(+)-8-hidroxi-2(di-n-propilamino)tetralina; agonista do receptor

5-HT

] e como resultado, observou-se diminuição da resposta ao CO

. Por outro lado, em

porcos, essa mesma abordagem experimental resulta no aumento da resposta ao CO

animais recém-nascidos, com menos de 10 dias de idade (Messier et al., 2004), indicando que

o papel da rafe bulbar depende de fatores como a idade e espécie. De fato, estudos sugerem

que o papel da rafe bulbar na resposta ventilatória à hipercapnia depende também de outros

fatores como o sexo e a região da rafe bulbar considerada. Nesse sentido, foi demonstrado que

microdiálise de 8-OH-DPAT no ROb, em ratos adultos, não diminui a resposta ao CO

(Li et

al., 2006), enquanto que na região rostral da rafe bulbar (RMg e RPa) ocorre diminuição

dessa resposta (Taylor et al., 2005). Além disso, foi demonstrado que a lesão de 65% dos

neurônios serotoninérgicos em porcos recém-nascidos não alterou a resposta ao CO

exceto

em machos durante o sono de movimento não rápido dos olhos (NREM; Penatti et al., 2006).

Apesar do fato de encontrarmos inúmeros relatos a respeito do papel dos neurônios

serotoninérgicos da rafe nas respostas ao CO

, esses estudos têm como foco a rafe bulbar

como um todo e até então não havia nenhum estudo focando especificamente a participação

do RMg.

Dentre os tipos neuronais presentes no RMg, 15-20% são neurônios serotoninérgicos

(Gao & Mason, 2001) e, além disso, existem evidências anatômicas e fisiológicas para o

papel do RMg no controle da ventilação. O RMg possui uma vasta rede de conexões tanto

com regiões encefálicas superiores quanto com a medula espinhal, e ainda projeta-se ou

recebe projeções de inúmeras áreas envolvidas com o controle da ventilação como o núcleo

motor do nervo frênico (Hosogai et al., 1998), o complexo pré-Bötzinger (Gang et al., 1995),

o grupo respiratório ventral (Holtman & Speck, 1994; Holtman et al., 1990), o grupo

respiratório pontino (Gang et al., 1990; Gang et al., 1991) e o RTN (Cream et al., 2002;

Rosin et al., 2006).

Sabe-se que o RMg exerce uma modulação inibitória da respiração durante a hipóxia,

provavelmente por meio de uma projeção inibitória ao núcleo do trato solitário (Gargaglioni

et al., 2003). Ainda, Teppema e colaboradores (1997) demonstraram que a proteína Fos é

expressa em neurônios do RMg de ratos submetidos à hipercapnia, indicando que o RMg

provavelmente faz parte da via neuronal ativada durante a hipercapnia. Contudo, não existiam

estudos, até então, abordando especificamente a participação do RMg na resposta ventilatória

à hipercapnia.

1.2. Interação entre a temperatura corporal e a ventilação na hipercapnia

Paralelo ao aumento da ventilação, a hipercapnia muitas vezes é acompanhada pela

diminuição da temperatura corporal (Tc). De fato, a hipotermia induzida por hipercapnia é

relatada em diversas espécies, desde anfíbios (Branco & Wood, 1994) a mamíferos

(Lyszczarz et al., 1980; Barros & Branco, 1998), incluindo no homem (Bullard & Crise,

1961; Wagner et al., 1993). Em ratos, observa-se uma redução da Tc de cerca de 1- 1.5°C

(Gautier et al., 1993), um fenômeno que provavelmente é causado pela perda de calor em

conseqüência da hiperpnéia e pela vasolilatação periférica causada pelo CO

(Mortola &

Frappell, 2000). Além disso, foi demonstrado que a termossensibilidade dos neurônios da área

pré-óptica é alterada pela hipercapnia (Boulant, 1998).

A ocorrência de hipotermia induzida por hipercapnia depende de alguns fatores como

a temperatura ambiente (Ta) e idade. Em Ta elevada (acima da zona termoneutra do animal),

tem-se observado a ocorrência de hipertermia em resposta à hipercapnia (Maskrey & Nicol,

1979; Ziemba, 1982). Nos animais recém-nascidos, nos quais a termorregulação depende de

mecanismo comportamental (Alberts, 1978), a hipercapnia não induz diminuição da Tc, uma

vez que não altera a termogênese comportamental (Saiki & Mortola, 1996).

Neurônios serotoninérgicos bulbares têm sido relacionados à regulação da Tc por

meio de efeitos no metabolismo do tecido adiposo marrom e fluxo sanguíneo cutâneo (Cano

et al., 2003). Além disso, Hodges e colaboradores (2008) observaram que camundongos

geneticamente modificados que apresentam ausência quase completa de neurônios

serotoninérgicos, apresentam prejuízo dos mecanismos termorregulatórios de defesa ao frio.

Por outro lado, Nattie e colaboradores (2004) não observaram alteração de Tc em ratos com

lesões em neurônios serotoninérgicos da rafe bulbar, submetidos à hipercapnia. Sabe-se que o

RMg está envolvido no controle termorregulatório em ratos, modulando a relação entre os

sinais dos centros integrativos e as respostas termorregulatórias efetoras (Berner et al., 1999).

No entanto, o envolvimento específico do RMg na resposta termorregulatória induzida por

hipercapnia ainda não foi verificado.

1.3. Receptores serotoninérgicos

A serotonina produz seus efeitos por meio de uma variedade de receptores. Já foi

confirmada a existência de pelo menos 14 subtipos de receptores serotoninérgicos. Por

convenção, os receptores 5-HT tem sido divididos em 7 subfamílas (5-HT

1-7

) de acordo com

suas propriedades farmacológicas, sequências de aminoácidos, organização genética e

segundo mensageiros envolvidos (Hoyer et al., 1994).

Sabe-se que dentre os receptores serotoninérgicos, o 5-HT

, o 5-HT

e o 5-HT

estão

presentes no RMg (Steinbusch, 1981; Chalmers & Watson 1991; Pompeiano et al., 1992;

Hentall et al., 2000; Li & Bayliss, 1998; Muneoka & Takigawa, 2003).

Os receptores 5-HT

estão amplamente distribuídos no SNC. Nos núcleos da rafe

eles são predominantemente somatodentríticos, os quais agem como auto-receptores, inibindo

o disparo celular (Hoyer et al., 2002). A ativação desses receptores causa hiperpolarização

neuronal, um efeito mediado pelos canais de K

acoplados à proteína G (Hoyer et al., 2002).

Existem relatos sobre o envolvimento dos receptores 5-HT

em diversos efeitos fisiológicos

e comportamentais. Vários estudos farmacológicos têm demonstrado a participação deste

receptor no controle da temperatura (cf. Zuideveld et al., 2001). De fato, a administração de

agonistas de receptores 5-HT

causa redução da Tc em diversas espécies, incluindo humanos

(Seleti et al., 1995). Corroborando esses dados, um estudo recente (Lin et al., 2001) mostrou

que a administração de dl-tetrahydropalmatina (ativador de receptores serotoninérgicos 5-

) promove uma queda regulada na temperatura. Quanto ao controle da ventilação, a

presença desses receptores em neurônios respiratórios sugere a sua participação na modulação

do ritmo respiratório. Além disso, foi demonstrado recentemente que os receptores 5-HT

localizados no RMg participam da modulação da resposta ventilatória à hipóxia (Nucci et al.,

2008). Quanto ao receptor 5-HT

, o seu envolvimento no controle da ventilação é

controverso. Foi demonstrado que os receptores 5-HT

2A/2C

possuem papel inibitório na

atividade dos corpúsculos carotídeos (Kirby & McQueen, 1984), enquanto que a

administração de metilsergide (antagonista dos receptores 5-HT

2A/2C

) aumenta a ventilação

induzida por hipóxia (Herman et al., 1999).

Outro receptor serotoninérgico que merece destaque é o receptor 5-HT

que foi

recentemente descoberto (Bard et al., 1993) e posteriormente classificado como

heteroreceptor, ou seja, parecem estar presentes em terminais axônicos glutamatérgicos e uma

vez ativados, parecem inibir a liberação de glutamato e consequentemente reduzem a

influência excitatória, o que inibe a liberação de 5-HT (Harsing et al., 2004). Estudos

anteriores demonstraram a participação do receptor 5-HT

na termorregulação (Hagan et al.,

2000; Gargaglioni et al., 2005). Neste contexto, dois estudos utilizando animais “knockout”

para receptores 5-HT

confirmaram a hipótese de que este receptor é importante na hipotermia

induzida por 5-HT (Guscott et al., 2003; Hedlund et al., 2003). Adicionalmente, os receptores

5-HT

são altamente expressos na área pré-óptica e no hipotálamo anterior, áreas

conhecidamente importantes para a termorregulação (Neumaier et al., 2001). Quanto ao papel

dos receptores 5-HT

na ventilação, evidências sugerem que eles estão envolvidos na resposta

ventilatória à hipóxia (Gargaglioni et al., 2006).

Apesar dos avanços na caracterização dos receptores serotoninérgicos, não existem

relatos a respeito do papel desses na resposta ventilatória e termorregulatória à hipercapnia.

1.4. Anormalidades na neurotransmissão serotoninérgica bulbar e suas implicações

clínicas

Nos últimos anos tem sido crescente o número de estudos envolvendo a

neurotransmissão serotoninérgica nos núcleos da rafe bulbar, especialmente porque

anormalidades dos neurônios serotoninérgicos dessa região parecem representar o substrato

neurobiológico para a instalação de diversas patologias como a Síndrome da Morte Súbita

Infantil (SIDS; Panigrahy et al., 2000; Bradley et al., 2002; Narita et al., 2001; Weese-Mayer

et al., 2003), apnéia obstrutiva do sono (Hudgel et al., 1995) e Síndrome do Pânico (Gorman

et al., 1989; Neumeister et al., 2004). Na SIDS, parecem ocorrer anormalidades em receptores

serotoninérgicos bulbares (Panigrahy et al., 2000) o que pode causar um prejuízo na resposta

ventilatória à hipercapnia (Bradley et al., 2002). Evidências indicam que uma variação no

gene do transportador da 5-HT é um fator de risco para a SIDS (Narita et al., 2001; Weese-

Mayer et al., 2003). Estudos com camundongos geneticamente modificados, que não possuem

o gene para o transportador da 5-HT, demonstraram que esses animais desenvolvem

anormalidades compatíveis com aquelas encontradas em encéfalos de vítimas de SIDS.

Ainda, quando expostos à hipercapnia, esses camundongos apresentam reduzida resposta

ventilatória, comparado com os animais controle, a qual foi muito mais proeminente em

machos (-68%) do que em fêmeas (-22%) (Li & Nattie, 2008). Deve-se ressaltar que a

prevalência da SIDS é maior em crianças do sexo masculino. Esses resultados sugerem que os

neurônios serotoninérgicos bulbares podem estar envolvidos na patogênese da SIDS.

1.5. O núcleo obscuro da rafe e a sua interação com o núcleo retrotrapezóide

O ROb é o mais caudal dentre os núcleos da rafe bulbar e o envolvimento específico

deste núcleo na quimiossensibilidade ao CO

/pH ainda permanece incerto. Recentemente, Li

e colaboradores (2006) observaram que a inibição do ROb, pela microinjeção de 8-OH-DPAT

não diminui a resposta ventilatória ao CO

. No entanto, a inibição simultânea do ROb e do

RTN indicou que o ROb parece ter uma função modulatória na resposta ventilatória à

hipercapnia, por meio de sua interação com o RTN. Nesse estudo, foi realizada inibição do

RTN por meio da microdiálise de muscimol (agonista de receptores GABA

), enquanto que a

inibição dos neurônios serotoninérgicos do ROb foi obtida por meio da microdiálise de 8-OH-

DPAT. Foi observado que a inibição dos neurônios do RTN com muscimol causou

hipoventilação e redução da resposta ventilatória ao CO

. Por outro lado, a inibição dos

neurônios serotoninérgicos do ROb com 8-OH-DPAT não causou efeitos estatisticamente

significativos na resposta ventilatória ao CO

. No entanto, a inibição simultânea do ROb e do

RTN exacerbou as respostas observadas com inibição isolada do RTN, ou seja, tanto a

hipoventilação quanto a diminuição da resposta ventilatória ao CO

foram maiores com a

inibição simultânea, em comparação com a inibição apenas do RTN. Esses dados sugerem

que o ROb não participa diretamente da quimiorrecepção, mas parece modular as respostas

ventilatórias ao CO

por meio de uma interação com o RTN.

Estudos anatômicos indicam que o RTN recebe aferências do ROb. Os traçadores

retrógrados neurobiotina e subunidade B da toxina cólera, quando injetados no RTN, induzem

marcação no ROb (Cream et al., 2002; Solomon et al., 2000; Mulkey et al., 2007). Além

disso, dados recentes mostram que neurônios do RTN positivos ao fator de transcrição

Phox2b, o qual está comumente presente nos neurônios quimiossensíveis do RTN (Stornetta

et al., 2006), apresentam receptores serotoninérgicos e são estimulados pela aplicação local

de 5-HT (Mulkey et al., 2007).

Apesar dos estudos fornecerem evidências da interação entre o ROb e o RTN na

quimiossensibilidade ao CO

/pH, pouco ainda se sabe a respeito desse possível mecanismo.

Deste modo, é de interesse investigar-se os efeitos da acidificação local simultânea do RTN e

do ROb e comparar com os efeitos da acifidicação desses dois sítios separadamente.

2. OBJETIVOS

A presente tese está dividida em dois estudos principais:

O Estudo No. 1, intitulado: “Participação do RMg na resposta ventilatória e

termorregulatória à hipercapnia” teve como objetivos gerais testar a hipótese de que o RMg

participa das respostas ventilatória e termorregulatória à hipercapnia, e que o sistema

serotoninérgico deste núcleo possui um importante papel na modulação destas respostas. Os

objetivos específicos foram:

• Objetivo 1: Averiguar o papel do RMg nas respostas ventilatória e

termorregulatória induzidas por hipercapnia, utilizando lesão química dos

neurônios do RMg.

• Objetivo 2: Verificar o papel dos neurônios serotoninérgicos do RMg nas

respostas ventilatória e termorregulatória induzidas por hipercapnia, utilizando

lesão química específica para neurônios serotoninérgicos.

• Objetivo 3: Testar a participação dos receptores 5-HT

, 5-HT

e 5-HT

nas

alterações de ventilação e temperatura corporal induzidas por hipercapnia.

O Estudo No. 2, intitulado: “Interação entre o ROb e o RTN na resposta ventilatória ao

” teve como objetivo geral testar a hipótese de que o ROb modula a função

quimiossensível do RTN. O objetivo específico foi:

• Objetivo 1: Investigar a interação entre o ROb e o RTN por meio do estudo dos

efeitos da estimulação local simultânea destes dois núcleos, em ratos não

anestesiados.

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Estudo No. 1: Participação do núcleo magno da rafe na resposta ventilatória e

termorregulatória à hipercapnia

3.1.1. Animais

Os experimentos foram realizados em ratos Wistar, adultos com peso corporal de 280-

310g, fornecidos pelo Biotério Central do Campus da USP de Ribeirão Preto. Esses animais

foram alojados em uma sala com umidade e temperatura ambiente controladas (24-26°C),

com ciclo claro-escuro de 12 horas, com as luzes acesas às 6:00 e alimentados com ração e

água “ad libitum”. Todos os protocolos experimentais foram conduzidos de acordo com as

normas e princípios éticos de experimentação em animais de laboratório estabelecidos pelo

Comitê Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e aprovados pela Comissão de Ética

da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (Protocolo No.

214/2005).

3.1.2. Implante de cânulas-guia dirigidas para o núcleo magno da rafe

Utilizando-se um aparelho estereotáxico (David-Kopf, Tujunga, CA, EUA), uma

cânula-guia foi implantada em direção ao RMg. Para os procedimentos cirúrgicos o animal

foi anestesiado com ketamina e xilasina (100 e 10 mg/kg, respectivamente, i.p.), depilado na

região dorsal da cabeça, posicionado no aparelho estereotáxico, sendo a cabeça colocada na

posição plana e fixada por meio de barras auriculares do aparelho estereotáxico. A seguir foi

feita a assepsia da pele com álcool iodado e injetado, subcutaneamente, um anestésico local

com vasoconstritor (cloridrato de lidocaína a 3% com bitartarato de norepinefrina 1:50.000),

na região do escalpo a ser aberta, a fim de se evitar sangramentos após a incisão cirúrgica. Em

seguida foi feita uma incisão longitudinal na pele e tecido subcutâneo, expondo-se a região da

calota craniana, a qual foi posteriormente tratada com solução fisiológica e água oxigenada

para completa assepsia da área. A torre do estereotáxico foi colocada na posição vertical

(angulação zero) e a cabeça do animal ajustada até que os pontos das suturas sagitais

(bregma) e occipital (lâmbda) da calota craniana ficassem no mesmo nível horizontal e então,

foram anotados os parâmetros antero-posterior (AP), dorso-ventral (DV) e lateral (L) a partir

do bregma. Uma vez determinado o ponto de introdução da cânula-guia, foi feito um orifício

na calota craniana com o auxílio de uma broca odontológica esférica acoplada a um motor de

baixa rotação (Foredom Electric CO., Bethel, CT). Por esse orifício foi introduzida a cânula,

cuja extremidade inferior ficava cerca de 3 mm acima da superfície dorsal do RMg. A

localização desta extremidade foi feita a partir de parâmetros previamente estabelecidos em

nosso laboratório juntamente com o auxílio das coordenadas estereotáxicas do Atlas de

Paxinos e Watson (1998) (AP= 10,52 mm; L= 0 mm e DV= 7,5 mm ventral à superfície do

osso). A cânula foi fixada ao crânio com resina acrílica de uso odontológico e ancorada por

pequenos parafusos de aço inoxidável, que foram previamente introduzidos na calota

craniana. Após completa fixação da cânula, a torre do estereotáxico foi removida. Para que

não houvesse obstrução da cânula-guia, foi introduzida, na mesma, um mandril também de

aço inoxidável, que foi mantido até a realização dos experimentos. O animal foi retirado do

estereotáxico e, em seguida, foi submetido a uma laparatomia paramediana para introdução da

cápsula de biotelemetria (modelo: VM-FH; Mini-Mitter Co. Inc., Sunriver, OR) na cavidade

peritoneal para registro da temperatura corporal (Tc). Como medida profilática pós-cirúrgica,

o animal foi tratado com Pentabiótico Veterinário (benzil penicilina 160.000 U/kg) por via

intramuscular. Em seguida o rato foi colocado em uma caixa com água e ração “ad libitum” e

mantido em uma sala com temperatura, umidade e luminosidade controladas, por um período

de 5-7 dias.

3.1.3. Microinjeções de drogas no núcleo magno da rafe

As microinjeções no RMg foram realizadas em animais acordados com o auxílio de

uma bomba de microinjeção (modelo 310; Stoelting, Wood dale, IL, USA) utilizando uma

agulha gengival (28 gauge) conectada por meio de um tubo de polietileno (PE-10) a uma

seringa Hamilton de 5 µL (Hamilton, Reno, NV). O volume microinjetado foi de 100 ηL, com

a duração da microinjeção de aproximadamente de 50 segundos.

3.1.4. Lesões químicas do núcleo magno da rafe

Para realizar os procedimentos cirúrgicos, os ratos foram anestesiados com ketamina-

xilasina (100 e 10 mg/kg, respectivamente, i.p.), posicionados em um estereotáxico e

preparados segundo descrição anterior (3.1.2). A fim de causar lesão não-específica dos

neurônios do RMg, os ratos receberam duas microinjeções de ácido ibotênico (0,2 µg/0,1 µL;

Sigma Chemical CO., St. Louis, MO, EUA), dissolvido em tampão fosfato salina (PBS). O

volume de cada microinjeão de ácido ibotênico no RMg foi de 100 ηL. As coordenadas de

lesão foram: AP= 10,52 mm e 11,3 mm a partir do bregma; L= 0 mm e DV= 7,5 mm ventral à

superfície do osso). Cada injeção foi feita no período de 4 minutos com o auxílio de uma

bomba de infusão (Stoelting, modelo 310, IL, EUA). A agulha permaneceu posicionada

durante 5 min adicionais, antes da remoção para evitar refluxo. Os animais do grupo controle

foram preparados de maneira semelhante, mas receberam duas microinjeções de veículo (PBS

0,01M, pH 7,4) no RMg.

Com o intuito de causar lesão seletiva dos neurônios serotoninérgios do RMg, os ratos

receberam, no RMg, duas microinjeções do composto anti-SERT-SAP [1µM dissolvido em

100 ηL de líquido cérebro-espinhal artificial (aCSF) cada uma; Advanced Targeting Systems,

San Diego, CA]. As coordenadas de lesão foram: AP= 10,52 mm e 11,3 mm a partir do

bregma; L= 0 mm; DV= 7,5 mm ventral à superfície do osso). Cada injeção foi feita no

período de 4 minutos com o auxílio de uma bomba de infusão, sendo que após a injeção, a

agulha foi mantida posicionada durante 5 min adicionais, antes da sua remoção. Os animais

do grupo controle foram preparados de maneira semelhante, mas receberam duas

microinjeções de IgG-SAP [1µM dissolvido em 100 ηL de líquido cérebro-espinhal artificial

(aCSF) cada uma; Advanced Targeting Systems, San Diego, CA], no RMg.

Em todos os grupos de lesão química, após remoção da agulha, a torre do

estereotáxico foi removida, a pele e o tecido subcutâneo da cabeça do animal foram

suturados, e o animal foi retirado do estereotáxico. Em seguida, os animais foram submetidos

a uma laparatomia paramediana para introdução da cápsula de biotelemetria na cavidade

peritoneal. Como medida profilática pós-cirúrgica, os animais foram tratados com

Pentabiótico Veterinário (benzil penicilina 160.000 U/kg) por via intramuscular. Em seguida

os animais foram colocados em caixas com água e ração “ad libitum” e mantidos em salas

com temperatura, umidade e luminosidade controladas, por um período de 6 (lesão

inespecífica; Gargaglioni et al., 2003) ou 9-10 dias (lesão específica; Nattie et al., 2004).

Após esse período, os experimentos foram realizados.

3.1.5. Análise histológica

Ao término dos experimentos com os animais dos grupos que receberam implante de

cânulas-guia em direção ao RMg e do grupo de lesão inespecífica com ácido ibotênico, os

animais foram anestesiados intraperitonealmente com 2,2,2-tribomoetanol, sendo em seguida,

perfundidos intracardicamente com solução salina seguida por uma solução a 10% de

formalina. Os sítios de microinjeção dos animais que receberam cânulas-guia foram marcados

pela microinjeção de azul de Evans a 2%, em um volume de 100 ηL. Os encéfalos foram

então retirados do crânio e transferidos para uma solução de formalina a 10%, onde

permaneceram para fixação por pelo menos 2 dias. Após a fixação, os cérebros foram

seccionados em um micrótomo criostato (Leika, Alemanha). Os cortes obtidos foram, então,

corados pelo método de cresil-violeta (Nissl). As localizações das microinjeções com ácido

ibotênico foram visualizadas pela análise qualitativa dos cortes que revelaram redução da

presença de neurônios no sítio de microinjeção (Schwarcz et al., 1979). Os sítios de

microinjeção dos animais que receberam cânulas-guia foram avaliados de acordo com o atlas

de Paxinos & Watson (1998) sendo considerado, na análise, o centro de cada uma das

microinjeções.

3.1.6. Imuno-histoquímica

Ao término dos experimentos de lesão específica de neurônios serotoninéricos com

anti-SERT-SAP, os animais foram anestesiados intraperitonealmente com 2,2,2-

tribomoetanol, sendo em seguida, perfundidos intracardicamente com tampão fosfato/salina

(PBS) seguido por uma solução a 8% de paraformaldeído. Após, os encéfalos foram extraídos

e colocados em paraformaldeído durante 4 horas. Em seguida foram transferidos para uma

solução de sacarose a 30% em tampão fosfato (PB), sendo mantidos nesta solução por 48

horas, a 4ºC. Após, foram realizados cortes coronais em 30 µm da região contendo o RMg,

sendo colocados em PB 0,01 M. Então os cortes foram incubados com água oxigenada a 10%

em metanol (10%) por 1 hora, em agitação. Imediatamente após, os cortes foram lavados em

PB 0,01 M, incubados em 5% de albumina em PB, para bloqueio das ligações inespecíficas,

durante 1 hora. Em seguida, foi realizada incubação em solução contendo 0.3% de Triton, 2%

de soro normal de carneiro e anticorpo anti-5-HT (Sigma; 1:1000), durante 48 horas. Após

este período de incubação, os cortes foram lavados em PB, por três vezes consecutivas, sendo

imediatamente incubados em anticorpo secundário biotinilado anti-IgG de coelho (Vector;

1:100), durante 1 hora, em agitação. Após três novas lavagens em PB, os cortes foram

incubados no complexo ABC (Vector, CA, EUA) durante 1 hora, em agitação, e em seguida

lavados novamente em PB. Após, o complexo formado foi visualizado através da adição do

substrato da peroxidase, tetracloridrato de 3,3’-diaminobenzidina (DAB) (Sigma Chemical

Co., St. Louis, MO, EUA). Em contato com a peroxidase, o DAB transforma-se em um

produto que apresenta coloração marrom. Assim, células que apresentaram imunorreatividade

para 5-HT desenvolveram coloração marrom.

3.1.7. Análise quantitativa

Secções contendo o RMg foram examinadas em um microscópio óptico (Zeiss,

Germany), associado a uma câmera digital (Leica, DC 200). O número de neurônios

imunorreativos à 5-HT foi quantificado no RMg e RPa em 4 porções: 1) -9,30 a -9,80 mm a

partir do Bregma; 2) -10,04 a -10,30 mm a partir do Bregma; 3) -10.52 mm a partir do

Bregma; 4) -11,30 mm a partir do Bregma. Para a divisão foram analisados pontos

anatômicos de referência, de acordo com o atlas de Paxinos & Watson (1998). O número de

neurônios imunorreativos à 5-HT foi quantificado em todos os cortes de cada uma das 4

regiões. Após a quantificação, foi feita uma média no número de neurônios imunorreativos de

cada área, para cada um dos animais.

3.1.8. Medida da temperatura corporal

Uma sonda de biotelemetria (Mini-Mitter Co. Inc., Sunriver, OR) foi colocada na

cavidade abdominal dos ratos, através de uma incisão na parede abdominal, como descrito

anteriormente. As caixas contendo os animais foram colocadas sobre placas receptoras

(modelo: ER-4000; Mini-Mitter Co. Inc., Sunriver, OR, EUA) que são conectadas a um

computador, onde a Tc é registrada continuamente. A aquisição de dados foi feita por meio da

utilização de um software VitalView (Mini-Mitter Co. Inc., Sunriver, OR, EUA). A Tc foi

registrada por aproximadamente 1 hora antes de qualquer manipulação do animal para a

determinação da Tc inicial.

3.1.9. Medida da Ventilação Pulmonar

As medidas de ventilação foram obtidas por pletismografia de corpo inteiro, em um

sistema fechado (Bartlett & Tenney, 1970). Durante a realização de cada medida de

ventilação, o fluxo de ar foi interrompido e a câmara do animal permaneceu totalmente

vedada por curtos períodos de tempo (~2 min). As oscilações de pressão causadas pela

respiração foram monitoradas por um transdutor de pressão (Validyne), conectado à câmara

do animal e a uma câmara de referência. Os sinais foram coletados por um pré-amplificador

(Gold), passando para um conversor analógico-digital e digitalizados em um computador

equipado com um programa para análise de dados (Acquire 6600 Data Acquisition System,

Gold). Os resultados foram depois analisados pelo programa de análise de dados WINDAQ.

A calibração do volume foi obtida durante cada experimento, injetando-se um volume

conhecido de ar dentro da câmara do animal (1 mL) com o uso de uma seringa graduada.

Duas variáveis respiratórias foram medidas, a freqüência respiratória (f) e o volume corrente

), o último calculado por meio da seguinte fórmula:

= P

x V

x Tc (PB – P

)

Tc (PB - P

) - T

(PB – P

)

: Volume de ar corrente

: Volume de ar injetado na câmara do animal para calibração

: Deflexão de pressão associada com cada volume de ar corrente

: Deflexão de pressão associada ao volume injetado para calibração

Pc: Pressão de vapor de água à temperatura corporal

: Temperatura corporal (em Kelvin)

: Temperatura do ar dentro da câmara do animal

PB: Pressão barométrica

: Pressão de vapor d’água à temperatura da câmara

A ventilação (

) foi medida pelo produto de f pelo V

. A

e o V

estão

apresentados nas condições de pressão barométrica ambiente, à Tc e saturados com vapor

d’água (BTPS).

As medidas de ventilação foram realizadas aos 10, 15, 30, 45, 60, 70, 85, 100, 115 e

130 min após os tratamentos.

3.1.10. Protocolos Experimentais

3.1.10.1. Papel do núcleo magno da rafe na resposta ventilatória e termorregulatória à

hipercapnia

As lesões químicas não-específicas foram realizadas por meio da microinjeção de

ácido ibotênico, que é uma neurotoxina que destrói corpos celulares, mas não as fibras de

passagem (Schwarcz et al., 1979). Esse composto liga-se em receptores para aminoácidos

excitatórios presentes em qualquer tipo neuronal, não apenas nos neurônios serotoninérgicos,

motivo pelo qual o grupo que foi tratado com ácido ibotênico foi denominado grupo de “lesão

não-específica”. Cada rato recebeu duas injeções de 0,2 µg/0,1 µL de ácido ibotênico

dissolvido em PBS, sendo cada injeção aplicada em regiões antero-posteriores diferentes no

RMg. Os animais do grupo controle foram submetidos aos mesmos procedimentos, no entanto

receberam injeções de veículo (PBS 0,01 M, pH 7,4). Os experimentos foram realizados 6

dias após a cirurgia. Dose e métodos de administração foram baseados em estudos prévios

(Caldeira & Franci, 2000; Gargaglioni et al., 2003).

Seis dias após a cirurgia, cada animal foi colocado individualmente na câmara de

pletismografia, sobre uma placa receptora de biotelemetria (Mini Mitter, USA) sendo a Tc

obtida em intervalos de 5 minutos. Durante o período inicial, a câmara foi ventilada com ar

atmosférico umedecido (21% O

). Após a fase exploratória, que variou entre 30-60 minutos

até que o animal ficou calmo e a Tc se estabilizou, a medida de ventilação basal foi efetuada.

Em seguida, os animais foram submetidos à hipercapnia, durante 60 minutos, sendo a câmara

ventilada por uma mistura gasosa umedecida, contendo 7% de CO

, 21% O

e equilibrada

com N

(AGA, Sertãozinho, SP). A ventilação dos animais foi mensurada aos 5, 20, 35, 50, e

70 minutos após o início da hipercapnia. Finalmente, a câmara foi novamente ventilada com

ar atmosférico durante 60 minutos, sendo a

mensurada a cada 15 minutos.

3.1.10.2. Papel dos neurônios serotoninérgicos do núcleo magno da rafe na resposta

ventilatória e termorregulatória à hipercapnia

As lesões químicas específicas de neurônios serotoninérgicos foram feitas por meio da

microinjeção de anti-SERT-SAP. Este composto é formado por um anticorpo ao transportador

de recaptação da serotonina (anti-SERT), ligado à saporina (SAP) que é uma proteína de

inativação ribossomal. Cada rato recebeu duas microinjeções de 1 µM de anti-SERT-SAP

dissolvido em 100 ηL de aCSF (pH= 7,4), no RMg. Os animais do grupo controle foram

preparados de maneira semelhante, mas receberam injeção de IgG-SAP (1 µM dissolvido em

100 ηL de aCSF). Os experimentos foram realizados em 9 a 10 dias após a cirurgia. Dose e

métodos de administração foram baseados em experimentos pilotos e estudo prévio (Nattie et

al., 2004).

Nove a dez dias após a cirurgia, cada animal foi colocado individualmente na câmara

de pletismografia, sobre uma placa receptora de biotelemetria (Mini Mitter, USA), sendo a Tc

obtida em intervalos de 5 minutos. Durante o período inicial, a câmara foi ventilada com ar

atmosférico umedecido (21% O

). Após a fase exploratória, que variou entre 30-60 minutos,

até que o animal apresentou-se aparentemente adaptado e a Tc se estabilizou, a medida de

ventilação basal foi efetuada. Em seguida, os animais foram submetidos à hipercapnia

(mistura gasosa de 7% de CO

, 21% O

e equilibrada com N

), durante 60 minutos. A

ventilação dos animais foi mensurada aos 5, 20, 35, 50, e 70 minutos após o início da

hipercapnia. Finalmente, a câmara foi novamente ventilada com ar atmosférico durante 60

minutos, sendo a

mensurada a cada 15 minutos.

3.1.10.3. Papel dos receptores serotoninérgicos do núcleo magno da rafe, na resposta

ventilatória e termorregulatória à hipercapnia

Experimento 1: Efeito da microinjeção, no núcleo magno da rafe, do antagonista do

receptor 5-HT

sobre a ventilação e temperatura corporal durante a normocapnia em

ratos:

Os animais foram previamente colocados em uma câmara pletismográfica e a Tc foi

continuamente medida por biotelemetria. A câmara foi inicialmente ventilada com ar

atmosférico umedecido (21% O

) por um período de aclimatação de no mínimo 30 min.

Foram então realizadas medidas controle de ventilação e temperatura. A partir daí os ratos

receberam injeção intra-RMg do antagonista 5-HT

(WAY-100635) ou do seu veículo

(salina 0.9%) como já descrito e a ventilação foi mensurada. A concentração de WAY-

100635 no RMg foi de 2.7 ηMol/100 ηL (0,3µg dissolvido em 100 ηL de salina) e foi

escolhida baseado em estudos prévios do nosso laboratório (Gargaglioni et al., 2005;

Gargaglioni et al., 2006; Nucci et al., 2008).

Experimento 2: Efeito da microinjeção, no núcleo magno da rafe, do antagonista do

receptor 5-HT

sobre a ventilação e temperatura corporal durante a hipercapnia em ratos:

Foram realizados neste experimento, os mesmos procedimentos descritos no

experimento 1, no entanto, após a injeção intra-RMg do veículo ou do antagonista 5-HT

(WAY-100635), os animais foram submetidos à hipercapnia (7% de CO

, 21% O

equilibrada com N

), durante 60 minutos. Então a ventilação foi mensurada como descrito

anteriormente.

Experimento 3: Efeito da microinjeção, no núcleo magno da rafe, do antagonista do

receptor 5-HT

sobre a ventilação e temperatura corporal durante a normocapnia em ratos:

Foram realizados neste experimento, os mesmos procedimentos descritos no

experimento 1, contudo os animais receberam injeção intra-RMg do antagonista 5-HT

(Ketanserina) ou do seu veículo [dimetilsulfóxido (DMSO) 15%] e a ventilação foi

mensurada como descrito anteriormente. A concentração de Ketanserina no RMg foi de 3.6

ηMol/100 ηL (2µg dissolvido em 100 ηL de DMSO) e foi escolhida baseado em

experimentos piloto e estudo prévio do nosso laboratório (da Silva et al., 2007; Nucci et al.,

2008).

Experimento 4: Efeito da microinjeção, no núcleo magno da rafe, do antagonista do

receptor 5-HT

sobre a ventilação e temperatura corporal durante a hipercapnia em ratos:

Foram realizados neste experimento, os mesmos procedimentos descritos no

experimento 1, no entanto os animais receberam injeção intra-RMg do veículo ou do

antagonista 5-HT

(Ketanserina) e em seguida, foram submetidos à hipercapnia (7% de CO

21% O

e equilibrada com N

), durante 60 minutos. Então a ventilação foi mensurada como

descrito anteriormente.

Experimento 5: Efeito da microinjeção, no núcleo magno da rafe, do antagonista do

receptor 5-HT

sobre a ventilação e temperatura corporal durante a normocapnia em ratos:

Após os mesmos procedimentos iniciais descritos no experimento 1, os ratos

receberam injeção intra-RMg do antagonista 5-HT

(SB269970) ou do veículo (Propileno-

glicol:água; 2:1)

e a ventilação foi mensurada como descrito anteriormente. A concentração de

SB269970 no RMg foi de 102.8 ηMol/100 ηL (4µg dissolvido em 100 ηL) e foi escolhida

baseado em estudos prévios do nosso laboratório (Gargaglioni et al., 2005; Gargaglioni et al.,

2006; Nucci et al., 2008).

Experimento 6: Efeito da microinjeção, no núcleo magno da rafe, do antagonista do

receptor 5-HT

sobre a ventilação e temperatura corporal durante a hipercapnia em ratos:

Após os mesmos procedimentos iniciais descritos no experimento 1, os ratos

receberam injeção intra-RMg do veículo ou do antagonista 5-HT

(SB269970). Em seguida,

os animais foram submetidos à hipercapnia (7% de CO

, 21% O

e equilibrada com N

durante 60 minutos. Então a ventilação foi mensurada como descrito anteriormente.

3.1.11. Análise estatística

Os valores obtidos foram apresentados como média ± E.P.M. As variações na resposta

ventilatória e na Tc foram avaliadas pelo método ANOVA de duas vias para medidas

repetidas, seguido de pós-teste de Newman Keuls. Valores de P < 0.05 foram considerados

significativos. As análises foram realizadas pelo software SigmaStat 3.1.

3.2. Estudo No. 2: Interação entre o núcleo obscuro da rafe e o núcleo retrotrapezóide

na resposta ventilatória à acidificação local

3.2.1. Animais

Para os experimentos realizados durante o período de estágio no exterior no

laboratório do Dr. Eugene E. Nattie foram utilizados ratos Sprague-Dawley, adultos, com

peso corporal entre 280-350g, provenientes do biotério de Dartmouth Medical School

(Lebanon-NH, USA). Os animais foram mantidos em caixas individuais em um ambiente com

temperatura controlada, com ciclo claro-escuro de 12 horas, alimentados com ração e água

“ad libitum”. Todos os procedimentos experimentais foram previamente aprovados pelo

Comitê Institucional de Uso e Cuidado Animal de Dartmouth College.

3.2.2. Procedimentos cirúrgicos

Os ratos foram submetidos aos procedimentos cirúrgicos de implante de uma sonda de

biotelemetria, duas cânulas-guia de microdiálise, eletrodos de eletroencefalograma (EEG) e

eletrodos de eletromiograma (EMG). Para realização de tais procedimentos, os animais foram

anestesiados com injeção intramuscular de ketamina e xilazina (100 e 20 mg/kg,

respectivamente). Em seguida foi feita a tricotomia do abdômen e da região dorsal da cabeça

e a assepsia da pele com álcool iodado. Uma cápsula de biotelemetria (TA-F20, Data

Sciences, St. Paul, MN) foi então introduzida na cavidade peritoneal dos animais por meio de

laparatomia paramediana e, após sutura da musculatura e da pele abdominal, os ratos foram

posicionados no aparelho estereotáxico (Kopf), sendo a cabeça colocada na posição plana e

fixada por meio de barras auriculares. Após injeção subcutânea de um anestésico local com

vasoconstritor (cloridrato de lidocaína a 3% com bitartarato de norepinefrina 1:50.000) na

região do escalpo a ser aberta, foi feita uma incisão longitudinal na pele e tecido subcutâneo,

expondo-se a região da calota craniana. Uma vez anotados os parâmetros antero-posteriores

(AP), dorso-ventrais (DV) e laterais (L) a partir do bregma, foram feitos pequenos orifícios na

calota craniana com o auxílio de uma broca odontológica, para implante de eletrodos corticais

para registro de eletroencefalograma (EEG). Foram introduzidos três eletrodos de EEG: o

eletrodo frontal localizado a 2 mm anterior ao bregma e 2 mm lateral à linha média, o

eletrodo parietal a 4 mm anterior ao lambda e 2 mm lateral à linha média, e o eletrodo “terra”

que foi inserido entre os eletrodos frontal e parietal. Para o registro do eletromiograma

(EMG), foi inserido um par de eletrodos profundamente na musculatura do pescoço dos ratos.

Em seguida foram introduzidas 2 cânulas-guia de microdiálise (0.38mm de diâmetro) no

bulbo. Uma delas foi posicionada na rafe bulbar caudal (núcleo obscuro da rafe; ROb) e a

outra no núcleo retrotrapezóide (RTN) de acordo com as seguintes coordenadas: ROb= 4,5

mm a partir do lambda; 0 mm da linha média; 10,4-10,5 mm ventral à superfície do osso.

RTN= 2,5 mm a partir do lambda; 1.8-2.0 mm da linha média; 10,6 mm ventral à superfície

do osso. As coordenadas foram baseadas em experimentos pilotos e trabalho anterior (Li et

al., 2006). As cânulas foram fixadas ao crânio com resina acrílica de uso odontológico e

ancoradas pelos eletrodos de EEG. Após esses procedimentos, os animais foram retirados do

estereotáxico, foram colocados em caixas individuais com água e ração “ad libitum” e

mantidos em uma sala com temperatura ambiente, umidade e luminosidade controladas, por

um período de 7 dias.

3.2.3. Microdiálise

Para a microdiálise, foi utilizada uma bomba de infusão a uma taxa de 40 µL/min,

conectada à sonda de microdiálise por meio de um tubo de polietilieno (PE-10). A sonda de

microdiálise é formada por um tubo concêntrico de 11 mm de comprimento, por onde o

líquido de perfusão entra em direção à membrana de diálise (240 µm de diâmetro) onde

ocorre a difusão de moléculas menores que 6000 Da (CMA11, CMA microdialysis, Solna,

Sweden). O fluxo segue então em direção ao tubo de saída, por onde ele é eliminado. A figura

1 demonstra uma representação da cânula de microdiálise. O líquido cerebroespinhal artificial

(aCSF) foi usado como solução de diálise, sendo equilibrado com 5 ou 25% de CO

(composição: Na

= 152 mM; K

= 3,0 mM; Mg

= 2,1 mM; Ca

= 2,2; Cl¯= 131 mM;

HCO

¯= 26 mM). O cálcio foi adicionado somente após o aCSF ter sido equilibrado com

Figura 1: Representação esquemática da sonda de microdiálise. À direita está representada, em maior

aumento, a membrana de troca, por onde ocorre a difusão do CO

do dialisato para o tecido encefálico

(Modificado de Chaurasia et al., 2007).

Fluxo de

entrada

Fluxo de

240

Fluxo de

entrada

Fluxo de

entrada

Fluxo de

240

3.2.4. Medida de ventilação pulmonar

As medidas de ventilação foram obtidas por pletismografia de corpo inteiro, em um

sistema fechado similar ao descrito por Jacky (1978) e Pappenheimer (1977). Durante a

realização de cada medida de ventilação, o fluxo de ar foi interrompido e a câmara do animal

permaneceu totalmente vedada por curtos períodos de tempo (~2 min). As oscilações de

pressão causadas pela respiração foram monitoradas por um transdutor de pressão, conectado

à câmara do animal. Os sinais coletados foram convertidos e digitalizados em um computador

equipado com um programa para análise de dados (DataPac 2000). O fluxo de entrada e saída

de gases na câmara pletismográfica foi equilibrado para prevenir condição hiper ou

hipobárica dentro da câmara. O fluxo de entrada foi umidificado e a taxa de fluxo foi

controlada por um fluxômetro (modelo 7491T, Matheson). O fluxo de saída foi conectado à

um sistema de vácuo conectado a um fluxômetro. A taxa de fluxo através da câmara

pletismográfica foi mantida em torno de 1,4 L/min para prevenir inalação de CO

. A

calibração do volume foi obtida injetando-se um volume conhecido de ar dentro da câmara do

animal (0,3 mL) com o uso de uma seringa graduada.

3.2.5. Medida da temperatura corporal

Durante os experimentos, a Tc foi monitorada continuamente utilizando-se

biotelemetria. A temperatura da câmara foi também mensurada por meio de um termômetro

localizado no interior da mesma.

3.2.6. Registro do eletroencefalograma e eletromiograma

Os sinais dos eletrodos de EEG e de EMG foram coletados em 150 hertz, filtrados em

0.3-50 e 0.1-100 hertz, respectivamente, e gravados diretamente em um computador equipado

com um programa para análise de dados (DataPac 2000).

3.2.7. Análise anatômica

Ao término dos experimentos, os animais foram sacrificados, os encéfalos foram

retirados do crânio, congelados e seccionados em um micrótomo criostato (Reichert-Jung,

Leica, Alemanha), a 50µm. Os cortes obtidos foram, então, corados pelo método de cresil-

violeta (Nissl). Os sítios anatômicos de referência bem como os sítios de diálise foram

identificados com o auxílio do atlas de Paxinos & Watson (1998).

3.2.8. Protocolos experimentais

3.2.8.1.Efeito da acidificação local simultânea do núcleo retrotrapezóide e do núcleo

obscuro da rafe

Antes do início dos experimentos, o peso dos animais foi obtido, e então eles foram

gentilmente manuseados para retirada do mandril e inserção da sonda de microdiálise. Em

seguida, os ratos foram colocados no interior da câmara pletismográfica. Após a fase

exploratória, que variou entre 30-60 minutos até que o animal ficou calmo e a Tc se

estabilizou, a medida de ventilação basal foi efetuada. Em todos os experimentos, a câmara

foi ventilada com ar atmosférico umedecido (21% O

) e a temperatura ambiente (Ta) foi

mantida dentro da zona termoneutra dos animais (~30°C). A manutenção da Ta, foi obtida por

meio do uso de uma lâmpada controlada por um termostato. A diálise de aCSF equilibrado

com 5% CO

(controle) foi iniciada ~15min após os ratos terem sido colocados no interior da

câmara e, após o período de aclimatação, a mensuração da ventilação basal foi iniciada, sendo

feita a cada 5 minutos, durante 30 minutos. A seguir, a solução de diálise foi substituída por

aCSF equilibrada com 25% CO

tanto no RTN quanto no ROb e a ventilação pulmonar foi

mensurada a cada 5 minutos durante 60 minutos.

3.2.8.2.Efeito da acidificação local do núcleo retrotrapezóide e região periférica ao

núcleo obscuro da rafe

O experimento foi realizado segundo descrição anterior. Durante a análise anatômica,

os animais que tiveram as sondas localizadas corretamente no RTN, mas que apresentaram a

outra sonda perifericamente ao ROb (peri-ROb), foram analisados e posteriormente

comparados com o grupo de animais que apresentaram as duas sondas em correta localização.

3.2.8.3. Efeito da acidificação local do núcleo obscuro da rafe e região periférica ao

núcleo retrotrapezóide

O experimento foi realizado segundo descrição anterior. Durante a análise anatômica,

os animais que tiveram as sondas localizadas corretamente no ROb, mas que apresentaram a

outra sonda em região periférica ao RTN (peri-RTN), foram analisados e posteriormente

comparados com o grupo de animais que apresentaram as duas sondas em correta localização.

3.2.9. Análise estatística

As variações nos parâmetros ventilatórios foram avaliadas pelo método ANOVA de

duas vias para medidas repetidas, seguido de pós-teste de Dunnett quando ocorreu interação

entre tempo e tratamento. Valores de P < 0.05 foram considerados significativos. As análises

foram realizadas pelo programa SigmaStat.

4. RESULTADOS

4.1. Estudo No. 1: Participação do núcleo magno da rafe na resposta ventilatória e

termorregulatória à hipercapnia

4.1.1. Determinação da localização e efetividade da lesão química não-específica do

núcleo magno da rafe

As localizações das microinjeções de ácido ibotênico no RMg foram reveladas pela

observação qualitativa da redução do número de neurônios no sítio de microinjeção

(Schwarcz et al., 1979). A figura 2 mostra fotomicrografias representativas de animais

controle (A e B) e com lesão química não-específica do RMg (C e D). Animais cuja injeção

de ácido ibotênico ocorreu em área adjacente ao RMg foram incluídos no grupo controle

“Peri-RMg”.

A figura 3 mostra fotomicrografias seriadas representativas do grupo de animais com

lesão química. Como podemos observar, os sinais causados pela microinjeção de ácido

ibotênico estão presentes apenas nos painéis B e C, o que significa que a lesão é relativamente

restrita a 400 µm do sítio de microinjeção.

Figura 2. Verificação histológica da microinjeção com ácido ibotênico no RMg. Fotomicrografias

de secções coronais encefálicas (30 µm, coloração de Nissl) de um animal respresentativo do grupo

controle (A e B) e com lesão química (ácido ibotênico) do RMg (C e D). Maiores aumentos da

fotomicrografias mostradas em A e C (x20) estão representadas em B e D (x40).

100 µm

200 µm

100 µm

200 µm200 µm

200 µm

Figura 3. Verificação histológica da extensão da lesão. Fotomicrografias (x10) seriadas de secções

coronais encefálicas (30 µm, coloração de Nissl) de um animal representativo do grupo de lesão com

ácido ibotênico. Os números nas porções superiores dos painéis indicam a distância, em mm, em

relação ao Bregma.

4.1.2. Determinação da localização e efetividade da lesão química dos neurônios

serotoninérgicos do núcleo magno da rafe

Lesões químicas foram reveladas pela redução da densidade (número) dos neurônios

imunorreativos para 5-HT. Para tal foi realizada a quantificação dos neurônios imunorreativos

à 5-HT (5-HT-ir) em toda a extensão do RMg, o qual foi dividido em quatro níveis: 1) -9,30 a

-9.80 mm; 2) 10,04 a 10,30 mm; 3) ao redor de -10,52 mm; 4) ao redor de -11,3 mm em

relação ao Bregma. A figura 4 mostra fotomicrografias representativas de animais controle,

injetados com IgG-SAP (A, B e C), e com lesão química dos neurônios serotoninérgicos do

RMg (D, E e F). Como podemos observar na figura 5, ocorreu redução estatisticamente

significante no número de neurônios 5-HT-ir nos níveis -10,52 e -11,30 a partir do bregma, no

grupo de lesão com anti-SERT-SAP comparado com o grupo controle. A diminuição no

número de células marcadas foi observada somente no RMg, não havendo diferença

estatisticamente significante no número de neurônios 5-HT-ir no RPa, entre os animais com

lesão química e com lesão fictícia dos neurônios serotoninérgicos do RMg. Dessa forma

podemos inferir que a lesão com anti-SERT-SAP ficou restrita ao RMg.

Figura 4. Verificação histológica da lesão química dos neurônios serotoninérgicos do RMg.

Fotomicrografias de secções coronais encefálicas (30 µm) de um animal representativo do grupo

controle (IgG-SAP; A-C, G-I) e do grupo com lesão química dos neurônios serotoninérgicos do RMg

(anti-SERT-SAP; D-F, J-L). A-F: -10,52 mm em relação ao Bregma; G-K: -11,30 mm em relação ao

Bregma. Maiores aumentos da fotomicrografias mostradas em A, D, G e J (x10) estão representadas

em B, E, H e K (x20). Maiores aumentos das células indicadas por setas em B, E, H e K estão

representadas em C, F, I e L (x40). Abreviações: RMg: núcleo magno da rafe; RPa: núcleo pálido da

rafe; Py: trato piramidal.

RMg (-9.30 a -9.80mm)

IgG-SAP anti-SERT-SAP

de neurônios 5-HT-ir

RMg (-10.04 a -10.30mm)

IgG-SAP anti-SERT-SAP

de neurônios 5-HT-ir

RMg (-10.52mm)

IgG-SAP anti-SERT-SAP

de neurônios 5-HT-ir

RMg (-11.30mm)

IgG-SAP anti-SERT-SAP

de neurônios 5-HT-ir

RPa (-9.30 a -9.80mm)

igG-SAP anti-SERT-SAP

de neurônios 5-HT-ir

RPa (-10.04 a -10.30mm)

IgG-SAP anti-SERT-SAP

de neurônios 5-HT-ir

RPa (-10.52mm)

IgG-SAP anti-SERT-SAP

de neurônios 5-HT-ir

RPa (-11.30mm)

IgG-SAP anti-SERT-SAP

de neurônios 5-HT-ir

Figura 5. Quantificação dos neurônios imunorreativos à serotonina (5-HT-ir) nos animais

controle (grupo IgG-SAP) e no grupo com lesão dos neurônios serotoninérgicos (grupo anti-

SERT-SAP). A: Comparação da média da quantificação, no RMg, nos níveis -9,30 a -9.80 mm, -

10,04 a -10,30 mm, -10,52 mm e -11,3 mm em relação ao Bregma. B: Comparação da média da

quantificação, no RPa, nos níveis -9,30 a -9.80 mm, -10,04 a -10,30 mm, -10,52 mm e -11,3 mm em

relação ao Bregma.

4.1.3. Efeitos da lesão química não-específica do núcleo magno da rafe na resposta

ventilatória em resposta à hipercapnia

A lesão química do RMg com ácido ibotênico não causou alteração estatisticamente

significante na

em condições de normocapnia (Figura 6). No entanto, a resposta

ventilatória à hipercapnia foi significativamente menor no grupo com lesão, comparado tanto

com o grupo tratado com veículo, quanto com o grupo “Peri-RTN”. Esta resposta foi causada

pela diminuição do V

e da f, nos animais com lesão química do RMg.

4.1.4. Efeitos da lesão química dos neurônios serotoninérgicos do núcleo magno da rafe

na resposta ventilatória à hipercapnia

A figura 7 mostra o efeito da lesão dos neurônios serotoninérgicos do RMg na

respiração basal e na resposta à hipercapnia. Os ratos com lesão apresentaram hipopnéia em

condições de normocapnia, sendo esse efeito causado exclusivamente por uma redução no V

Além disso, quando expostos à hipercapnia, os animais do grupo com lesão exibiram uma

acentuada redução na

, comparado com os grupos controle. Este efeito foi também

causado por diminuição no V

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

Ácido ibotênico intra-RMg (06)

PBS intra-RMg (06)

Ácido ibotênico peri-RMg (05)

(mL kg

-1

)

100

125

150

175

200

f (ciclos/min)

-30 -10 10 30 50 70 90 110 130

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

7% CO

Tempo (min)

(mL kg

-1

min

-1

)

Figura 6. Efeitos da lesão química do RMg com ácido ibotênico ou injeção de veículo, no volume

total (V

), freqüência respiratória (f) e ventilação (V

) de ratos. Durante o período experimental,

os animais foram submetidos à normocapnia e hipercapnia (7% CO

). Os valores são apresentados

com média ± E.P.M. *Diferença estatisticamente significante entre o grupo de animais com lesão e o

grupo controle.

Diferença estatisticamente significante entre o grupo de animais com lesão e o grupo

tratado com veículo. (P < 0.05, ANOVA de duas vias; pós-teste de Student Newman Keuls).

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

anti-SERT-SAP intra-RMg (06)

IgG-SAP intra-RMg (06)

anti-SERT-SAP peri-RMg (04)

(mL kg

-1

)

100

125

150

175

200

f (ciclos/min)

-30 -10 10 30 50 70 90 110 130

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

7% CO

Tempo (min)

(mL kg

-1

min

-1

)

Figura 7. Efeitos da lesão dos neurônios serotoninérgicos do RMg com anti-SERT-SAP no

volume total (V

), freqüência respiratória (f) e ventilação (V

) de ratos. Durante o período

experimental, os animais foram submetidos à normocapnia e hipercapnia (7% CO

). Os valores são

apresentados com média ± E.P.M. *Diferença estatisticamente significante entre o grupo de animais

com lesão e os grupos controle (veículo e peri-RMg);

Diferença estatisticamente significante entre o

grupo de animais com lesão e o grupo tratado com veículo. (P < 0.05, ANOVA de duas vias; pós-teste

de Student Newman Keuls).

4.1.5. Efeitos da lesão química não específica do núcleo magno da rafe e da lesão

específica dos neurônios serotoninérgicos do núcleo magno da rafe na resposta

termorregulatória à hipercapnia

A figura 8 mostra o efeito da lesão do RMg com ácido ibotênico (A) e da lesão dos

neurônios serotoninérgicos do RMg (B) na Tc basal e na resposta termorregulatória ao CO

Como podemos observar, em ambos os grupos ocorreu hipotermia em resposta à hipercapnia,

no entanto não houve diferença estatisticamente significativa entre a resposta

termorregulatória dos grupos com lesão em comparação com seus respectivos grupos

controle.

Ácido ibotênico intra-RMg (06)

PBS intra-RMg (06)

Temperatura Corporal (

-30 -10 10 30 50 70 90 110 130

anti-SERT-SAP intra-RMg (06)

IgG-SAP intra-RMg (06)

7% CO

Tempo (min)

Temperatura Corporal (

Figura 8. Efeitos da lesão química não-específica e lesão específica dos neurônios serotoninérgicos do

RMg na temperatura corporal (Tc) de ratos submetidos à hipercapnia. Os valores são apresentados

com média ± E.P.M. Determinação da localização das microinjeções no RMg

4.1.6. Determinação da localização das microinjeções dos antagonistas dos receptores

serotoninérgicos no núcleo magno da rafe

Na Figura 9 está apresentada uma fotomicrografia de uma secção transversal do tronco

encefálico de um animal representativo dos grupos que foram submetidos à microinjeção de

drogas no RMg, mostrando o sítio de microinjeção corado com azul de Evan’s.

Figura 9. Fotomicrografia de corte transversal de tronco encefálico, a seta indica o sítio de

microinjeção no RMg, de um animal representativo do grupo. 4V: quarto ventrículo.

4.1.7. Efeito da microinjeção, no núcleo magno da rafe, do antagonista do receptor 5-

sobre a ventilação e temperatura corporal durante a normocapnia em ratos

A Figura 10 mostra a resposta ventilatória, expressa por meio de variações de V

, f e

, e a resposta de Tc dos animais tratados com WAY-100635 intra-RMg e dos grupos

controle, tratados com veículo intra-RMg (salina) ou com WAY-100635 peri-RMg durante a

normocapnia. Podemos observar que a microinjeção de antagonista do receptor 5-HT

não

alterou a

(A) e a Tc (B) em condições basais, em comparação com os grupos controle.

WAY 100635 peri-RMg (n=8)

Salina intra-RMg (n=8)

WAY 100635 intra-RMg (n=7)

(mL kg

-1

)

100

125

150

175

200

f (ciclos/min)

-30 -10 10 30 50 70 90 110 130

100

200

300

400

500

600

700

800

Tempo (min)

(mL kg

-1

min

-1

)

4.1.8. Efeito da microinjeção, no núcleo magno da rafe, do antagonista do receptor 5-

sobre a ventilação e temperatura corporal durante a hipercapnia em ratos

Na Figura 11 (A) estão representados os valores de V

, f e

dos animais tratados

com WAY-100635 intra-RMg e dos grupos controle, tratados com veículo intra-RMg ou com

WAY-100635 peri-RMg durante hipercapnia a 7% de CO

. A hipercapnia causou um

aumento na

em todos os grupos experimentais, devido tanto ao aumento na f, quanto no

. Durante a hipercapnia, os animais tratados com WAY-100635 intra-RMg apresentaram

-10 10 30 50 70 90 110 130

WAY100635, intra-RMg (n=6)

Salina, intra- RMg (n=7)

WAY100635, peri-RMg (n=8)

Tempo (min)

(ºC)

Figura 10. (A) Efeito da microinjeção de

WAY-100635 (2.7 ηMol/100 ηL) ou de

veículo (100

ηL salina) no RMg sobre

volume corrente (V

), frequência

respiratória (f) e ventilação (V

) durante a

normocapnia. (B) Efeito da microinjeção

de WAY-100635 ou veículo no RMg sobre

a temperatura corporal (Tc) durante a

normocapnia. A seta indica o tempo da

microinjeção. Os valores são expressos

como média ± E.P.M. *P < 0.05 versus

salina intra-RMg e WAY peri-RMg.

uma significante redução na resposta ventilatória ao CO

, devido a um menor V

, comparado

aos animais controle.

A hipercapnia causou queda da Tc em todos os grupos experimentais, mas não houve

diferença estatística entre o grupo tratado e os grupos controle (B).

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

WAY 100635, intra-RMg (07)

Salina intra-RMg (06)

WAY 100635, peri-RMg (07)

(mL kg

-1

)

100

125

150

175

200

f (ciclos/min)

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

7% CO

Tempo (min)

(mL kg

-1

min

-1

)

Figura 11. (A) Efeito da microinjeção de

WAY-100635 (2.7 ηMol/100 ηL) ou de

veículo (100

ηL salina) no RMg sobre

volume corrente (V

), frequência

respiratória (f) e ventilação (V

) durante a

hipercapnia (7% CO2). (B) Efeito da

microinjeção de WAY-100635 ou veículo

no RMg sobre a temperatura corporal (Tc)

durante a hipercapnia (7% CO

). A seta

indica o tempo da microinjeção. Os valores

são expressos como média ± E.P.M. *P <

0.05 versus salina intra-RMg e WAY peri-

RMg.

A B

-30 0 30 60 90 120

WAY 100635, intra-RMg (07)

Salina intra-RMg (06)

7% CO

WAY 100635, peri-RMg (07)

Tempo (min)

Tc (ºC)

4.1.9. Efeito da microinjeção, no núcleo magno da rafe, do antagonista do receptor 5-

sobre a ventilação e temperatura corporal durante a normocapnia em ratos

A Figura 12 mostra a resposta ventilatória e de Tc dos animais tratados com

Ketanserina intra-RMg e do grupo controle, tratado com veículo (0,1µL DMSO 15%), durante

a normocapnia. Podemos observar que a microinjeção de ketanserina não alterou a ventilação

(A), nem tampouco a Tc (B), em comparação com o grupo controle, em condições de

normocapnia.

15% DMSO, intra-RMg (n=8)

Ketanserina (2µg/0,1µL), intra-RMg (n=6)

(mL kg

-1

)

100

125

150

175

200

f (ciclos/min)

-30 -10 10 30 50 70 90 110 130

100

200

300

400

500

600

700

800

Tempo (min)

(mL kg

-1

min

-1

)

Figura 12. (A) Efeito da microinjeção de

Ketanserina (3.6 ηMol/100 ηL) ou de

veículo (100 ηL DMSO 15%) RMg

sobre volume corrente (V

), frequência

respiratória (f) e ventilação (V

) durante

a normocapnia. (B) Efeito da

microinjeção de Ketanserina ou veículo

no RMg sobre a temperatura corporal

(Tc) durante a normocapnia. A seta

indica o tempo da microinjeção. Os

valores são expressos como média ±

E.P.M.

-10 10 30 50 70 90 110 130

15% DMSO, intra-RMg (n=7)

Ketanserina (2µg/0,1µL), intra-RMg (n=8)

Tempo (min)

Tc (ºC)

4.1.10. Efeito da microinjeção, no núcleo magno da rafe, do antagonista do receptor 5-

sobre a ventilação e temperatura corporal durante a hipercapnia a 7% de

em ratos

Na Figura 13(A) estão representados os valores de V

, f e

dos animais tratados

com Ketanserina intra-RMg e do grupo controle, tratado com veículo, durante hipercapnia a

7% de CO

. A hipercapnia causou um aumento na

em ambos os grupos experimentais,

devido tanto ao aumento na f, quanto no V

, no entanto não houve diferença estatisticamente

significante entre os parâmetros ventilatórios dos animais tratados com Ketanserina

comparados com o grupo controle. A hipercapnia causou queda da Tc nos grupos

experimentais, mas não houve diferença estatística entre o grupo tratado e o grupo controle

(B).

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

Ketanserina intra-RMg (05)

15% DMSO intra-RMg (05)

(mL kg

-1

)

100

125

150

175

200

f (ciclos/min)

-30 -10 10 30 50 70 90 110 130

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

7% CO

Tempo (min)

(mL kg

-1

min

-1

)

Figura 13. (A) Efeito da microinjeção de Ketanserina (3.6 ηMol/100 ηL) ou de veículo (100 ηL

DMSO 15%) RMg sobre volume corrente (V

), frequência respiratória (f) e ventilação (V

) durante a

hipercapnia (7% CO

). (B) Efeito da microinjeção de Ketanserina ou veículo no RMg sobre a

temperatura corporal (Tc) durante a hipercapnia. A seta indica o tempo da microinjeção. Os valores

são expressos como média ± E.P.M.

A B

-30 0 30 60 90 120

Ketanserina intra-RMg (n= 05)

15% DMSO intra NRM (n=05)

7% CO

Tempo (min)

Tc (ºC)

4.1.11. Efeito da microinjeção, no núcleo magno da rafe, do antagonista do receptor 5-

sobre a ventilação e temperatura corporal durante a normocapnia em ratos

A Figura 14 mostra a resposta ventilatória e de Tc dos animais tratados com

SB269970 intra-RMg e dos animais tratados com veículo (Propileno-glicol:água; 2:1), durante a

normocapnia. Podemos observar que a microinjeção de antagonista do receptor 5-HT

não

causou alteração da ventilação (A) e da Tc (B) em condições basais, em comparação com o

grupo controle.

Propileno glicol:água (2:1), intra-RMg (n=5)

SB269970 (4ug/0.1µL), intra-RMg (n=5)

(mL kg

-1

)

100

125

150

175

200

f (ciclos/min)

-30 -10 10 30 50 70 90 110 130

100

200

300

400

500

600

700

800

Tempo (min)

(mL kg

-1

min

-1

)

Figura 14. (A) Efeito da microinjeção de

SB269970 (102.8 ηMol/100 ηL) ou veículo

(100 ηL de Propil-glicol:água 2:1) RMg

sobre volume corrente (V

), frequência

respiratória (f) e ventilação (V

) durante a

normocapnia. (B) Efeito da microinjeção

de SB269970 ou veículo no RMg sobre a

temperatura corporal (Tc) durante a

normocapnia. A seta indica o tempo da

microinjeção. Os valores são expressos

como média ± E.P.M.

-10 10 30 50 70 90 110 130

Propileno glicol:água (2:1); intra RMg (n=5)

SB269970 (4ug/0.1µL); intra-RMg (n=5)

Tempo (min)

Tc (ºC)

4.1.12. Efeito da microinjeção, no núcleo magno da rafe, do antagonista do receptor 5-

sobre a ventilação e temperatura corporal durante a hipercapnia em ratos

Na Figura 15(A) estão representados os valores de V

, f e

dos animais injetados

com SB269970 intra-RMg e dos animais controle (injeção de Propileno-glicol:água, 2:1),

durante hipercapnia a 7% de CO

. A hipercapnia causou um aumento na

em todos os

grupos experimentais, devido ao aumento na f e no V

, no entanto não ocorreu diferença

estatisticamente significante nesta resposta, entre os grupos. Além disso, nenhuma diferença

foi encontrada na resposta termorregulatória à hipercapnia, entre os animais tratados com o

antagonista do receptor 5-HT

e os animais controle (B).

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

SB269970 (4ug/0.1µL), intra-NRM (06)

Propileno glicol:Água (2:1), intra-NRM (05)

(mL kg

-1

)

100

125

150

175

200

f (ciclos/min)

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

7% CO

Tempo (min)

(mL kg

-1

min

-1

)

A B

-30 -10 10 30 50 70 90 110 130

SB269970 (4ug/0.1µL), intra-NRM (n=6)

Propileno glicol:Água (2:1), intra-NRM (n=5)

7% CO

Tempo (min)

Tc (ºC)

Figura 15. (A) Efeito da microinjeção de

SB269970 (102.8 ηMol/100 ηL) ou

veículo (100 ηL Propil-glicol:água 2:1)

RMg sobre volume corrente (V

frequência respiratória (f) e ventilação

) durante a hipercapnia (7% CO

). (B)

Efeito da microinjeção de SB269970 ou

veículo no RMg sobre a temperatura

corporal (Tc) durante a hipercapnia. A

seta indica o tempo da microinjeção. Os

valores são expressos como média ±

E.P.M.

4.2. Estudo No. 1: Interação entre o núcleo obscuro da rafe e o núcleo retrotrapezóide

na resposta ventilatória ao CO

4.2.1. Localização das sondas de microdiálise

A localização das extremidades das sondas de microdiálise dos animais de cada um

dos quatro grupos experimentais está mostrada esquematicamente nas Figuras 16-19. A

figura 16 mostra a localização das extremidades das sondas dos animais do grupo “RTN –

ROb” (n= 5), nos quais ambas sondas foram posicionadas nas regiões de interesse. No lado

esquerdo da figura está representada a localização das sondas posicionadas no RTN. A

distância média dessas sondas em relação ao Bregma foi de -10.90 +/- 0.19 (E.P.M.) mm,

com uma variação de -10.52 a -11.5 mm. Os símbolos do lado direito indicam a localização

das sondas posicionadas no ROb, sendo que a distância média dessas sondas em relação ao

Bregma foi de -12.72 +/- 0.30 (E.P.M.) mm, com uma variação de -12.0 a -13.8 mm.

A Figura 17 mostra a localização das sondas dos animais do grupo “RTN – peri-ROb”

(n= 05), os quais tiveram uma das sondas posicionado no RTN, enquanto a outra sonda foi

posicionada perifericamente ao ROb. No lado esquerdo da figura está representada a

localização das sondas que foram posicionadas no RTN, nos cinco animais do grupo, sendo a

distância média em relação ao Bregma de -10.96 +/- 0.20 (E.P.M.) mm com uma variação de

-10.40 a -11.6 mm. À direita está representada a localização das sondas que foram

caracterizadas como “Peri-ROb”. A distância dessas sondas em relação ao bregma foi de -

12.66 +/- 0.37 (E.P.M.) mm com uma variação de -11.3 a -13.8 mm. Todas as cinco sondas

foram localizadas lateralmente à linha média e dorsal ou ventral ao ROb.

A Figura 18 mostra a localização das sondas do grupo “ROb – peri-RTN” (n= 05), os

quais tiveram uma das sondas posicionada no ROb, mas que apresentaram a outra sonda

localizada em região periférica ao RTN. À esquerda está representada a localização das

extremidades das sondas que foram posicionadas fora da região correspondente ao RTN. A

distância média dessas sondas, em relação ao Bregma foi de -11.07 +/- 0.18 (E.P.M.) mm

com uma variação de -10.58 a -11.46 mm. No lado direito está representada a localização das

sondas posicionadas no ROb. A distância média da extremidade dessas sondas, em relação ao

Bregma, foi de -13.21 +/- 0.17 (E.P.M.) mm com uma variação de -12.68 a -13.6 mm.

A Figura 19 mostra a localização das sondas dos animais do grupo “peri-RTN – peri-

ROb” (n= 05), os quais tiveram as duas sondas posicionadas fora do RTN e do ROb, em

localizações adjacentes às regiões de interesse. No lado esquerdo está representada a

localização das sondas que foram posicionados perifericamente ao RTN. A distância média

dessas sondas, em relação ao Bregma, foi de -11.27 +/- 0.14 (E.P.M.) mm com uma variação

de -10.86 a -11.6 mm. Os esquemas do lado direito mostram a localização anatômica das

sondas que foram posicionadas perifericamente ao ROb. A distância média da extremidade

dessas sondas, em relação ao Bregma, foi de -13.5 +/- 0.1 (E.P.M.) mm com uma variação de

-13.24 a -13.7 mm.

Figura 16. Figura esquemática de secções coronais do tronco encefálico indicando os sítios de

microdiálise no RTN (à esquerda) e no ROb (à direita). As duas áreas sombreadas indicam a

localização aproximada do RTN (abaixo do núcleo facial) e do ROb (na linha média). Nos. indicam a

distância, em mm, em relação ao Bregma. Barra: 1 mm. Abreviações: VII: núcleo facial; Sol: núcleo

do trato solitário; Amb: núcleo ambíguo (Paxinos & Watson, 1998).

Figura 17. Figura esquemática de secções coronais do tronco encefálico indicando os sítios de

microdiálise no RTN (à esquerda) e peri-ROb (à direita). As duas áreas sombreadas indicam a

localização aproximada do RTN (abaixo do núcleo facial) e do ROb (na linha média). Nos. indicam a

distância, em mm, em relação ao Bregma. Barra: 1 mm. Abreviações: VII: núcleo facial; Sol: núcleo

do trato solitário; Amb: núcleo ambíguo (Paxinos & Watson, 1998).

Figura 18. Figura esquemática de secções coronais do tronco encefálico indicando os sítios de

microdiálise no ROb (à direita) e peri-RTN (à esquerda). As duas áreas sombreadas indicam a

localização aproximada do RTN (abaixo do núcleo facial) e do ROb (na linha média). Nos. indicam a

distância, em mm, em relação ao Bregma. Barra: 1 mm. Abreviações: VII: núcleo facial; Sol: núcleo

do trato solitário; Amb: núcleo ambíguo (Paxinos & Watson, 1998).

Figura 19. Figura esquemática de secções coronais do tronco encefálico indicando os sítios de

microdiálise peri-RTN (à esquerda) e peri-ROb (à direita). As duas áreas sombreadas indicam a

localização aproximada do RTN (abaixo do núcleo facial) e do ROb (na linha média). Nos. indicam a

distância, em mm, em relação ao Bregma. Barra: 1 mm. Abreviações: VII: núcleo facial; Sol: núcleo

do trato solitário; Amb: núcleo ambíguo (Paxinos & Watson, 1998).

4.2.2. Efeito da diálise simultânea do núcleo retrotrapezóide e do núcleo obscuro da

rafe, com 25% de CO

A Figura 20 mostra a variação (em porcentagem) de E

V (painel A), V

(painel B) e f

(painel C), dos animais submetidos à microdiálise simultânea de 25% CO

no RTN e ROb

(RTN-ROb), em comparação com os valores basais, obtidos no período controle, durante o

qual os ratos receberam microdiálise de 5% CO

. Foi observado um aumento estatisticamente

significante da

em resposta à acidificação local do RTN e ROb aos 5 minutos (18%), 10

minutos (22%) e 15 minutos (10%), em comparação a

basal. Esta resposta foi decorrente

de aumento no V

e na f. As respostas foram similares entre os períodos de sono e vigília.

Figura 20. Efeito da diálise de 25% CO

simultaneamente no RTN e no ROb (RTN-ROb; n= 5) sobre

o volume corrente (V

), frequência respiratória (f) e ventilação (V

), em comparação com o período

controle. Os valores são expressos como média ± E.P.M. +P < 0.05 versus microdiálise de 5% CO

(ANOVA); *P < 0.01 versus microdiálise de 5% CO

(pós-teste de Dunnett).

Time (min)

010203040

f (% baseline)

100

110

120

130

(% baseline)

100

110

120

130

100

110

120

130

25% CO

RTN - ROb

(% baseline)

f (% basal) V

(% basal)

Tempo (min)

(% basal)

Time (min)

010203040

f (% baseline)

100

110

120

130

(% baseline)

100

110

120

130

100

110

120

130

25% CO

RTN - ROb

(% baseline)

f (% basal) V

(% basal)

Tempo (min)

(% basal)

f (% basal) V

(% basal)

Tempo (min)

(% basal)

4.2.3. Efeito da diálise do núcleo retrotrapezóide com 25% de CO

A Figura 21 mostra a variação (em porcentagem) de E

V (painel A), V

(painel B) e f

(painel C) em resposta à microdiálise de 25% CO

no RTN e em regiões adjacentes ao ROb

(RTN – peri-ROb), em comparação ao período controle (5% CO

). Foi observado que a

aumentou significativamente aos 15 minutos (11%) e 20 minutos (15%) após o início da

microdiálise de 25% CO

. Não houve alteração estatisticamente significante nos valores de

e f.

4.2.4. Efeito da diálise do núcleo obscuro da rafe com 25% de CO

A Figura 22 mostra a variação (em porcentagem) de E

V (painel A), V

(painel B) e f

(painel C) nos animais submetidos à microdiálise de 25% CO

no ROb e em regiões

periféricas ao RTN (ROb – peri-RTN), comparado ao período controle (5% CO

). Não houve

qualquer alteração estatisticamente significante nos parâmetros ventilatórios em resposta à

microdiálise de 25% de CO

, em comparação com os valores basais.

Figura 21. Efeito da diálise de 25% CO

simultaneamente no RTN e regiões periféricas ao ROb (RTN

– peri-ROb; n= 5) sobre o volume corrente (V

), frequência respiratória (f) e ventilação (V

), em

comparação com o período controle. Os valores são expressos como média ± E.P.M. +P < 0.05 versus

microdiálise de 5% CO

(ANOVA); *P < 0.01 versus microdiálise de 5% CO

(pós-teste de Dunnett).

Time (min)

0 10203040

f (% baseline)

100

110

120

130

(% baseline)

100

110

120

130

100

110

120

130

25% CO

RTN

(% baseline)

f (% basal) V

(% basal)

Tempo (min)

(% basal)

RTN – peri-ROb

Time (min)

0 10203040

f (% baseline)

100

110

120

130

(% baseline)

100

110

120

130

100

110

120

130

25% CO

RTN

(% baseline)

f (% basal) V

(% basal)

Tempo (min)

(% basal)

RTN – peri-ROb

Figura 22. Efeito da diálise de 25% CO

simultaneamente no ROb e regiões periféricas ao RTN (ROb

– peri-RTN; n= 5) sobre o volume corrente (V

), frequência respiratória (f) e ventilação (V

), em

comparação com o período controle. Os valores são expressos como média ± E.P.M.

Time (min)

0 10203040

f (% baseline)

100

110

120

130

(% baseline)

100

110

120

130

100

110

120

130

25% CO

ROb

(% baseline)

f (% basal) V

(% basal)

Tempo (min)

(% basal)

ROb – peri-RTN

Time (min)

0 10203040

f (% baseline)

100

110

120

130

(% baseline)

100

110

120

130

100

110

120

130

25% CO

ROb

(% baseline)

f (% basal) V

(% basal)

Tempo (min)

(% basal)

ROb – peri-RTN

4.2.5. Efeito da diálise de regiões periféricas ao núcleo retrotrapezóide e núcleo obscuro

da rafe com 25% de CO

A Figura 23 mostra a variação (em porcentagem) de E

V (painel A), V

(painel B) e f

(painel C), em relação aos valores basais, do grupo de animais submetidos à microdiálise de

25% CO

em sítios adjacentes ao RTN e ao ROb (peri-RTN – peri-ROb). Como pode ser

observado na figura, os animais apresentaram uma redução da

e do V

em resposta à

microdiálise. Por outro lado, não houve alterações estatisticamente significantes na f.

Figura 23. Efeito da diálise de 25% CO

simultaneamente em regiões periféricas ao RTN e ao ROb

(peri-RTN – peri-ROb) sobre o volume corrente (V

), frequência respiratória (f) e ventilação (V

), em

comparação com o período controle. Os valores são expressos como média +P < 0.05 versus

microdiálise de 5% CO

(ANOVA).

Time (min)

0 10203040

f (% baseline)

100

110

120

130

(% baseline)

100

110

120

130

100

110

120

130

25% CO

(% baseline)

f (% basal) V

(% basal)

Tempo (min)

(% basal)

Time (min)

0 10203040

f (% baseline)

100

110

120

130

(% baseline)

100

110

120

130

100

110

120

130

25% CO

(% baseline)

f (% basal) V

(% basal)

Tempo (min)

(% basal)

5. DISCUSSÃO

5.1. Estudo No. 1: Participação do núcleo magno da rafe na resposta ventilatória e

termorregulatória à hipercapnia

O possível envolvimento do RMg e dos neurônios serotoninérgicos deste núcleo, nas

respostas ventilatória e termorregulatória à hipercapnia, foi estudado empregando-se lesões

químicas não-específicas do RMg e lesões químicas específicas para os neurônios

serotoninérgicos do RMg. As lesões químicas não-específicas do presente estudo referem-se

àquelas causadas pelo ácido ibotênico que é uma toxina que se liga à qualquer tipo neuronal

que apresenta receptor para aminoácido excitatório, não havendo preferência para neurônios

serotoninérgicos. Nossos resultados mostraram que lesões do RMg, tanto não-específicas

(com ácido ibotênico) quanto específicas (com anti-SERT-SAP), resultam em diminuição da

resposta ventilatória ao CO

, sendo que as lesões específicas causam também uma atenuação

da ventilação em condições de normocapnia. Esses dados demonstram que os neurônios

serotoninérgicos do RMg estão envolvidos na resposta ventilatória à hipercapnia e ainda

participam da manutenção da ventilação basal. Além disso, os nossos resultados indicam a

participação dos receptores 5-HT

na modulação da ventilação em resposta ao CO

, uma vez

que o bloqueio farmacológico destes receptores, no RMg, causou diminuição da resposta

ventilatória à hipercapnia.

Existem evidências anatômicas e fisiológicas que sugerem que os neurônios

serotoninérgicos da rafe bulbar são quimiossensíveis (Wang et al., 2001; Nattie et al., 2004;

Taylor et al., 2005). Quanto ao RMg, sabe-se que a exposição de ratos à mistura gasosa

hipercápnica resulta na marcação da proteína fos em neurônios deste núcleo (Teppema et al.,

1997) e, ainda, a acidificação local da rafe bulbar rostral (RMg e RPa) resulta em

hiperventilação durante o sono (Nattie & Li, 2001). A fim de testar o envolvimento do RMg

na resposta ventilatória ao CO

, nós verificamos os efeitos da lesão química do RMg na

e f em resposta a hipercapnia (7% de CO

). Para tanto utilizamos ácido ibotênico, o qual é

uma neurotoxina que se liga à receptores glutamatérgicos e causa degeneração dos corpos

celulares neuronais no local onde é injetado, sem causar lesão das fibras de passagem

(Schwarcz et al., 1979). Os ratos com lesão não-específica do RMg não tiveram alteração da

ventilação basal mas responderam com diminuição da resposta ventilatória ao CO

, que

ocorreu devido redução do V

e da f. Este resultado está de acordo com a hipótese que o RMg

está envolvido com a quimiossensibilidade ao CO

/pH.

O RMg apresenta uma população neuronal heterogênea, no entanto, o principal tipo

celular é serotoninérgico, o qual compreende de 15 a 20% dos neurônios do RMg (Gao &

Mason, 2001). No presente estudo, a participação dos neurônios serotoninérgicos do RMg nas

respostas ao CO

foi testada por meio da injeção do composto anti-SERT-SAP no RMg de

ratos, e posterior avaliação da ventilação desses animais em condições basais e em

hipercapnia. O anti-SERT-SAP foi utilizado previamente em um estudo que investigou a

participação dos neurônios serotoninérgicos da rafe bulbar na resposta ventilatória ao CO

(Nattie et al., 2004), e como resultado observou-se uma redução de 16% da resposta

ventilatória ao CO

, que deu-se exclusivamente por diminuição do V

. No presente estudo, a

diminuição da resposta ao CO

dos animais com lesão dos neurônios serotoninérgicos do

RMg foi consideravelmente maior do que a descrita no estudo de Nattie et al (2004), o que

sugere que o RMg exerce um papel predominante, dentre os núcleos da rafe bulbar, na

hiperventilação induzida por hipercapnia. Isso pode indicar também que os outros núcleos

(RPa e/ou ROb) podem não participar ou podem ter papel inibitório na reposta ventilatória ao

, por isso seria interessante investigar o papel de cada núcleo separadamente.

Um dado interessante é que a lesão não-específica do RMg causou redução tanto no

quanto na f, enquanto que a lesão específica dos neurônios serotoninérgicos do RMg

causou redução apenas no V

, enquanto que a f manteve-se similar à dos animais controle.

Este resultado sugere que outros tipos neuronais, no RMg, estão envolvidos na resposta

ventilatória ao CO

atuando na regulação da f, enquanto que os neurônios serotoninérgicos

atuam na regulação do V

Além da diminuição da ventilação em resposta à hipercapnia, a lesão com anti-SERT-

SAP causou hipoventilação, o que sugere que os neurônios serotoninérgicos do RMg estão

envolvidos com o drive respiratório não dependente de CO

. Este resultado está de acordo

com os dados de Taylor e colaboradores (2004) que observaram que a inibição dos neurônios

serotoninérgicos da rafe rostral por meio de 8-OH-DPAT causa hipoventilação. Tal efeito não

foi observado com a lesão com ácido ibotênico, o que pode ser atribuído à perda de outros

neurônios além dos serotoninérgicos, uma vez que o ácido ibotênico causa degeneração de

qualquer neurônio que possui receptor para aminoácidos excitatórios. Sabe-se que o RMg

apresenta uma variedade de tipos neuronais. Além dos neurônios serotoninérgicos, estão

presentes no RMg, os neurônios glutamatérgicos (Haghparast et al., 2007), gabaérgicos (Cao

et al., 2006), opioidérgicos (Mansour et al., 1994), purinérgicos (Cao & Song, 2007),

catecolaminérgicos (Domyancic & Morilak, 1997) e colinérgicos (Satoh et al., 1983).

Sabe-se que o sistema serotoninérgico participa da modulação da termorregulação

(Hodges et al., 2008; Cryan et al. 1999, Ishiwata et al. 2004, Kline et al. 2004, Lin et al.

1983, Lin et al. 1998, Won & Lin 1988). Assim é plausível a hipótese de que a lesão do RMg

ou, mais especificamente, a lesão dos neurônios serotoninérgicos do RMg altere a resposta

hipotérmica ao estímulo hipercápnico. No entanto, animais com lesão não específica com

ácido ibotênico ou com lesão específica com anti-SERT-SAP além de não apresentarem

alterações na Tc basal, desenvolveram hipotermia de duração e magnitude comparáveis aos

animais controle, o que sugere que os neurônios serotoninérgicos do RMg não têm papel

tônico na termorregulação e não participam da modulação da termorregulação em resposta à

hipercapnia. De maneira semelhante, estudo anterior forneceu evidências de que o RMg não

participa da manutenção da Tc em condições basais e não está envolvido na hipotermia

induzida por hipóxia (Gargaglioni et al., 2003).

A serotonina atua em uma série de receptores, os quais estão divididos em 7

subfamílias (Hoyer et al., 1994). Sabe-se que dentre os receptores serotoninérgicos, o 5-HT

o 5-HT

e o 5-HT

estão presentes no RMg (Steinbusch, 1981; Chalmers & Watson 1991;

Pompeiano et al., 1992; Hentall et al., 2000; Pompeiano et al., 1992; Li & Bayliss, 1998;

Muneoka & Takigawa, 2003).

Os resultados do presente estudo indicam que a serotonina, atuando nos receptores 5-

no RMg, aumenta a resposta ventilatória induzida por hipercapnia, uma vez que a

inibição deste receptor por meio da microinjeção do antagonista WAY-100635, diminui a

hiperventilação causada pela exposição à 7% de CO

. Em um estudo prévio de Taylor e

colaboradores (2005), foi observado que a microdiálise de 8-OH-DPAT (agonista do receptor

serotoninérgico 5-HT

) na rafe bulbar resultou na diminuição da resposta ventilatória ao

, mesmo efeito observado no presente estudo com microinjeção do antagonista do mesmo

receptor. Parece contraditório o fato de que a utilização de antagonista ou agonista produza o

mesmo efeito em resposta a um dado estímulo, no entanto o estudo dos efeitos do bloqueio

dos receptores 5-HT

na rafe bulbar é complexo porque os receptores 5-HT

estão

localizados tanto em neurônios serotoninérgicos, quanto em neurônios não-serotoninérgicos

(Helke et al., 1997). Assim é possível que o efeito obtido com a microinjeção de

WAY1000635, na dose utilizada, foi resultante da atuação predominante desta droga em

receptores 5-HT

em neurônios não-serotoninérgicos. Os receptores 5-HT

são

considerados autorreceptores e dessa forma causam inibição neuronal por meio de inibição da

despolarização neuronal espontânea dos neurônios serotoninérgicos (de Montigny et al.,

1984; Mundey et al., 1994) e diminuição da liberação neuronal de 5-HT (Crespi et al., 1990).

No entanto, evidências indicam que os receptores 5-HT

podem estar localizados não apenas

em terminais pré-sinápticos (autorreceptores), mas também em terminais pós-sinápticos (cf.

Mico et al., 2006). Dessa forma, outra hipótese possível é a de que a dose do antagonista

utilizada tem efeito nos receptores 5-HT

pós-sinápticos. Em vista dessas considerações, é

plausível sugerir 3 possíveis explicações para o resultado do presente estudo: 1) a dose do

WAY1000635 utilizada pode ter efeito predominante em receptores 5-HT

localizados em

neurônios não-serotoninérgicos; 2) o antagonista, na dose empregada, pode atuar em

receptores pós-sinápticos; 3) o antagonista 5-HT

, na dose utilizada, pode atuar em outros

subtipos de receptores.

Em relação aos receptores 5-HT

e 5-HT

, os resultados do presente estudo, indicam

que eles não estão envolvidos na modulação da resposta ventilatória à hipercapnia, uma vez

que a microinjeção de antagonistas destes receptores (ketanserina e SB-269970,

respectivamente), nas doses empregadas, não produziu alteração na hiperventilação induzida

por hipercapnia.

Apesar de evidências em estudos anteriores indicarem uma possível participação dos

receptores 5-HT

, 5-HT

e 5-HT

na modulação da termorregulação (Lin et al. 1998, Guscott

et al. 2003; Gargaglioni et al., 2005; Gargaglioni et al., 2006), os nossos dados apontam que

estes receptores presentes no RMg parecem não estar envolvidos com a hipotermia induzida

por hipercapnia.

Em resumo, esses resultados mostram que os neurônios serotoninérgicos do RMg

possuem papel importante na resposta ventilatória à hipercapnia, e que, dentre os receptores

serotoninérgicos presentes no RMg, o receptor 5-HT

está envolvido na modulação desta

resposta.

5.2. Estudo No. 2: Interação entre o Núcleo Obscuro da Rafe e Núcleo

Retrotrapezóide na resposta ventilatória à acidificação local

A acidificação local tem sido empregada em sítios encefálicos como a superfície

ventral do bulbo, o locus coeruleus, a porção rostral do grupo respiratório ventral, o complexo

pré-Bötzinger, o núcleo fastigial do cerebelo, o RTN e a rafe bulbar, no estudo do papel

dessas regiões na quimiorrecepção central (Nattie, 1999, 2000, 2001; Hodges et al., 2004; Li

& Nattie, 2002; Li et al., 1999; Nattie & Li, 2001; Nattie & Li, 2002a). No presente estudo,

foi utilizado a microdiálise de aCSF equilibrado com 25% de CO

que, segundo Li & Nattie

(2002) diminui o pH tecidual em aproximadamente 0.069 unidades de pH. Essa redução é

menos da metade daquela observada durante a ventilação com 7% de CO

. A microdiálise de

aCSF equilibrado com 5% de CO

, por sua vez, não causa alteração no pH tecidual (Li &

Nattie, 2002), motivo pelo qual foi utilizada nos experimentos do grupo controle. A

determinação da importância funcional dos sítios quimiossensíveis por meio da técnica de

acidificação local em animais não-anestesiados é complexa, uma vez que a resposta

fisiológica à este tipo de estimulação produz hipocapnia, que por sua vez resulta na

diminuição das respostas de outros quimiorreceptores incluindo os quimiorreceptores

periféricos, minimizando o grau de aumento da

(Li & Nattie, 2002). Dessa forma, a

evolução temporal do aumento de

produzida pela acidificação local apresenta um padrão

como aquele apresentado na Figura 20, com um aumento inicial seguido por uma diminuição

até um nível ainda acima do nível basal ou controle. Este padrão pode ser devido a uma

excitação inicial dos quimiorreceptores no local da acidificação, seguido por uma lenta

inibição e/ou pela resposta de outros sítios quimiossensíveis à hipocapnia.

Estudos anteriores demonstraram que a acidificação tanto da porção rostral do RTN

quanto da rafe bulbar, in vivo, estimula a ventilação, corroborando com a hipótese de que o

RTN e a rafe bulbar são quimiossensíveis ao CO

/pH. No RTN, a diálise com 25% CO

aumentou a

em 20-24% apenas durante o período de vigília (Li et al., 1999). Na rafe

bulbar, a acidificação local causou um aumento na

em 18-20% apenas durante o sono

(Nattie & Li, 2001). Estes resultados indicam que a função dos sítios quimiossenssíveis

parece variar de acordo com o estado de vigília (Mitchell et al. 2004). No presente estudo,

nós realizamos acidificação local no RTN e o ROb simultaneamente, a fim de se estudar a

interação entre esses dois núcleos. O objetivo inicial foi comparar os efeitos da acidificação

local simultânea do RTN e ROb com a acidificação destes núcleos separadamente. Assim, o

protocolo experimental inicial consistiu na diálise de um dos núcleos com aCSF equilibrado

com 25% de CO

, e do outro sítio com 5% de CO

. No entanto, foi extremamente difícil

posicionar ambas as sondas corretamente, de tal forma que decidimos empregar a diálise com

25% de CO

nas duas sondas, em todos os experimentos e comparar as respostas dos animais

com ambas as sondas corretamente posicionados com as respostas dos ratos que apresentaram

apenas uma das sondas posicionada na área de interesse. Dessa forma foram obtidos 4 grupos:

1) Ambas as sondas corretamente posicionadas (grupo “RTN-ROb”); 2) Uma das sondas

posicionada no RTN e a outra sonda fora do ROb (grupo “RTN – peri-ROb”); 3) Uma das

sondas posicionada no ROb e a outra fora do RTN (grupo “ROb – peri-RTN”); 4) Ambas as

sondas posicionadas fora das areas de interesse (grupo “peri-RTN – peri-ROb”). As

localizações anatômicas das extremidades das sondas no tronco encefálico dos animais estão

representadas nas Figuras 16-19. Como pode ser observado, a localização das sondas

posicionadas no RTN nos grupos 1 e 2 são praticamente idênticas (Figuras 16 e 17). Da

mesma forma, a localização das sondas posicionadas corretamente no ROb nos grupos 1 e 3

são bastante semelhantes (Figuras 16 e 18). As extremidades das sondas do grupo peri-RTN –

peri-ROb foram nitidamente posicionados fora das regiões de interesse, cerca de 1-2 mm em

relação à elas.

Um resultado inesperado foi a diminuição da

de até 10% no grupo peri-RTN –

peri-ROb, comparado com os valores basais iniciais (Figura 23). Os nossos dados não nos

permitem explicar o mecanismo envolvido na inibição da

, mas uma hipótese plausível é

que pode ter ocorrido estimulação de neurônios inibitórios ou que fazem parte de uma via de

inibição da resposta ventilatória à hipercapnia.

Efeito da diálise do núcleo obscuro da rafe e regiões periféricas ao núcleo retrotrapezóide

com 25% de CO

Em um estudo anterior de Nattie & Li (2001), foram analisados os efeitos da

microdiálise de CO

na porção mais rostral da rafe bulbar, e como resultado foi observada o

aumento da

. No presente estudo, a acidificação da região mais caudal da rafe (ROb) não

causou alteração da

em relação aos valores basais.

Esses dados sugerem uma heterogeneidade quanto à função quimiossensível da rafe

bulbar, dependendo da região a ser considerada. Essa hipótese é confirmada com os

resultados de estudos anteriores que investigaram os efeitos da inibição local da rafe bulbar

nas respostas ao CO

. Foi demonstrado que a inibição dos neurônios serotoninérgicos da rafe

bulbar por meio da microdiálise de 8-OH-DPAT na porção rostral causa inibição da resposta

ao CO

(Wang et al., 2001), enquanto que na região caudal esse efeito não foi observado (Li

et al., 2006; Stornetta et al., 2006). Ainda, a estimulação elétrica da rafe bulbar (Cao et al.,

2006), bem como a estimulação local por meio da injeção de glutamato (Bernard et al., 1996)

podem ter tanto efeitos excitatórios quanto inibitórios. Dados de imuno-histoquímica revelam

que a parte dorsal do ROb contém neurônios imunorreativos à GAD (Cao et al., 2006b;

Holmes et al., 1994; Kachidian et al., 1991). Assim, uma possível explicação para a ausência

de hiperventilação em resposta à acidificação do ROb é a de que os neurônios gabaérgicos

que fazem sinapse em outros núcleos respiratórios, ou interneurônios que fazem sinapse no

próprio ROb podem ser estimulados pela acidificação local e seu efeito inibitório se opõe ao

efeito excitatório de outros neurônios.

Efeito da diálise do núcleo retrotrapezóide e regiões periféricas ao núcleo obscuro da rafe

com 25% CO

O RTN está localizado próximo à superfície ventrolateral do bulbo, logo abaixo do

núcleo facial e estende-se caudalmente da parte rostral do núcleo facial até algumas centenas

de micrômetros (Cream et al., 2002; Guyenet et al., 2005; Mulkey et al., 2004; Solomon et

al., 2000). Muitos estudos demonstram a importância do RTN no controle da respiração. Em

animais anestesiados, a inibição local ou lesões do RTN causam apnéia e reduções severas na

quimiossensibilidade (Akilesh et al., 1997; Nattie, 1999; Taylor et al., 2005). Em animais

acordados, lesões do RTN causam hipoventilação e diminuição da resposta ao CO

(Akilesh

et al., 1997; Nattie & Li, 2006), enquanto que a acidificação local estimula a ventilação (Li et

al., 1999). Evidências sugerem que os neurônios quimiossensíveis do RTN expressam o fator

de transcrição Phox2b e são glutamatérgicos (Takakura et al., 2006).

Foi demonstrado, em estudo anterior, que a diálise de 25% de CO

no RTN aumenta a

em 24% em comparação a ventilação basal, durante a vigília (Li et al., 1999). Esta

resposta foi consideravelmente maior do que aquela obtida no presente estudo, onde

observamos um aumento de 15% da

em comparação à

basal (Figura 21). Alguns

fatores podem explicar essa diferença: 1) As sondas de microdiálise do estudo anterior foram

posicionados na região mais rostral do RTN, comparado com a localização das sondas do

presente estudo; 2) Os experimentos do estudo anterior foram conduzidos em temperatura

ambiente abaixo da zona termoneutra dos animais, enquanto que no presente estudo foi

utilizada temperatura ambiente dentro da zona termoneutra. Sabe-se que a temperatura

ambiente influi nas respostas ao CO

(Wang et al., 2001); (3) O efeito excitatório da

acidificação local do RTN pode ter sido atenuada pela acidificação simultânea da região peri-

ROb.

Efeito da diálise simultânea do núcleo retrotrapezóide e do núcleo obscuro da rafe com 25%

de CO

Estudos anatômicos sugerem a interação entre o RTN e o ROb. A injeção do traçador

retrógrado neurobiotina, no RTN, induz marcação positiva no ROb, indicando que o RTN

recebe aferências do ROb (Cream et al., 2002; Solomon et al., 2000). Ainda, um estudo mais

recente (Mulkey et al., 2007) mostrou que os neurônios do RTN positivos à Phox2b

apresentam receptores 5-HT e podem ser excitados pela aplicação local de 5-HT.

Foi demonstrado que a inibição dos neurônios do RTN com muscimol associada à

diálise de aCSF no ROb ou próximo dele, causou hipoventilação e reduziu em até 24% a

resposta ventilatória à hipercapnia. A inibição dos neurônios serotoninérgicos do ROb por

meio de 8-OH-DPAT com simultânea diálise de aCSF no RTN causou hipoventilação mas

não causou efeito estatisticamente significativo na resposta ao CO

. No entanto, a inibição

simultânea do RTN e ROb causou um aumento na hipoventilação e reduziu a resposta

ventilatória à hipercapnia em 51% (Li et al., 2006). Estes dados sugerem um papel

modulatório da rafe bulbar, e os nossos resultados estão de acordo com esta hipótese. A

microdiálise de 25% de CO

no RTN e ROb simultaneamente, aumentou a

em até 22%,

comparado com a

basal (Figura 20). Tal efeito foi maior do que aquele causado pela

diálise do RTN ou ROb, separadamente.

Em resumo, esses resultados mostram que a acidificação local simultânea do RTN

e do ROb potencializa os efeitos da acidificação de um dos sítios separadamente. O

mecanismo pelo qual essa potencialização ocorre não é conhecido. É plausível a hipótese de

que esse efeito ocorra como resultado da ativação dos neurônios quimiossensíveis do RTN

que expressam o gene Phox2b (gene que está envolvido na diferenciação neuronal durante a

embriogênese) pela serotonina liberada de terminais provenientes de neurônios do ROb. A

substância P co-liberada pelos neurônios 5-HT poderia também estimular os

quimiorreceptores do RTN bem como outros neurônios que apresentam receptores para

neuroquinina-1 (NK1Rs). Esta última hipótese é baseada nas observações de Nattie & Li

(2006) de que lesões de células imunorreativas à NK1R do bulbo ventral diminui

significativamente a resposta ao CO

, indicando a importância dessas células na

quimiossensibilidade ao CO

/pH. Além disso, os neurônios serotoninérgicos do ROb podem

ter efeitos diretos no complexo pré-Bötzinger e no grupo respiratório ventral por meio da

neurotransmissão via serotonina e/ou substância P.

6. CONCLUSÕES

• Os neurônios serotoninérgicos do RMg estão envolvidos na resposta ventilatória à

hipercapnia e na manutenção basal da ventilação;

• A resposta termorregulatória à hipercapnia não é modulada pelo RMg;

• Dentre os receptores até então identificados no RMg, o 5-HT

parece estar envolvido

na modulação da hiperventilação mas não da hipotermia em resposta à hipercapnia;

• O ROb parece exercer uma modulação excitatória sobre a resposta quimiossensível

dos neurônios do RTN.

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