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UNIVERSIDADE LUTERANA DO BRASIL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E TOXICOLOGIA
APLICADA
MESTRADO PROFISSIONALIZANTE
AVALIAÇÃO DA GENOTOXICIDADE INDUZIDA PELO EXTRATO
AQUOSO DE ALCACHOFRA (Cynara scolymus) EM CAMUNDONGOS
Dissertação para obtenção do Título
de Mestre em Genética e
Toxicologia Aplicada.
Meriele Ana Zan
Orientadora: Dra. Juliana da Silva
CANOAS
2008
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2
O presente trabalho foi desenvolvido nas dependências do Laboratório de
Genética Toxicológica situado na Universidade Luterana do Brasil (ULBRA) e
parte das análises seguiu no Laboratório de Microscopia da Universidade de
Caxias do Sul, campus (UCS-CARVI) de Bento Gonçalves.
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3
Dedico esta dissertação de Mestrado as
duas pessoas mais importantes da minha vida:
Aos meus pais
Vocês deixaram seus sonhos para que eu
sonhasse.
Derramaram lágrimas para que eu fosse
feliz.
Vocês perderam noites de sono para que
eu dormisse feliz.
Acreditaram em mim, apesar dos meus
erros.
Vocês me educaram com muito amor.
Jamais se esqueçam que eu levarei
sempre um pedaço de vocês dentro de mim...
4
AGRADECIMENTOS
Foram muitos, os que me ajudaram a concluir este trabalho.
Meus sinceros agradecimentos aos meus pais pelo apoio moral e
financeiro dedicados a este curso, obrigada por terem apostado em mim.
Aos professores do PPGTA que passaram informações valiosas para a
realização deste trabalho.
A professora Dra. Juliana da Silva por aceitar a orientação deste estudo e
conduzir seu desenvolvimento, com muita sabedoria e paciência.
Ao professor Dr. Alexandre Ferraz pela assessoria no processo de
extração do material, por ceder seu laboratório para tal procedimento.
Ao professor Dr. Alexandre Specht, entomólogo que cedeu o Laboratório
de Microscopia da UCS-CARVI para visualização das lâminas.
Ao longo do experimento realizado no laboratório de Genética Toxicológica
da ULBRA contei com o apoio e ajuda de todos no qual aqui deixo meu registro
de agradecimento.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS --------------------------------------------------------------------------------7
LISTA DE TABELAS--------------------------------------------------------------------------------8
LISTA DE ABREVIATURAS----------------------------------------------------------------------9
LISTA DE UNIDADES ---------------------------------------------------------------------------- 11
RESUMO --------------------------------------------------------------------------------------------- 12
ABSTRACT ------------------------------------------------------------------------------------------ 14
I. INTRODUÇÃO----------------------------------------------------------------------------------- 16
I.1. A Alcachofra ------------------------------------------------------------------------------------------17
I.2. Atividades biológicas dos compostos químicos de Cynara scolymus ------------------------19
I.3. Uso de C. scolymus como planta medicinal ------------------------------------------------------23
I.4. Atividade antioxidante de C. scolymus -----------------------------------------------------------24
I.5. Genotoxicidade de plantas medicinais -----------------------------------------------------------25
I.6. Metodologias utilizadas neste estudo-------------------------------------------------------------27
I.6.1. Ensaio Cometa ---------------------------------------------------------------------------------------------------27
I.6.2. Teste de Micronúcleos ------------------------------------------------------------------------------------------31
I.6.3. Testes de avaliação do estresse oxidativo TBARS e Catalase -------------------------------------------33
I.6.4. Testes de avaliação do potencial antioxidante DPPH e hipoxantina/xantina oxidase ----------------34
II. OBJETIVOS ------------------------------------------------------------------------------------- 36
III. METODOLOGIA------------------------------------------------------------------------------ 37
III. 1. Preparação do Material Vegetal ---------------------------------------------------------------37
III. 2. Screening fitoquímico-----------------------------------------------------------------------------37
III. 2.1. Detecção de substâncias fenólicas -------------------------------------------------------------------------37
III. 2.2. Detecção de taninos-------------------------------------------------------------------------------------------38
III. 2.3. Detecção de flavonóides -------------------------------------------------------------------------------------38
III. 2.4. Detecção de antraquinonas ----------------------------------------------------------------------------------40
III. 2.5. Detecção de cumarinas---------------------------------------------------------------------------------------40
III. 2.6. Detecção de saponinas ---------------------------------------------------------------------------------------40
III. 2.7. Detecção de hetorosídeos cardiotônicos ------------------------------------------------------------------41
III. 2.8. Detecção de alcalóides ---------------------------------------------------------------------------------------41
III. 3. Estresse Oxidativo --------------------------------------------------------------------------------42
III. 3.1. Métodos para medir o estresse oxidativo.-----------------------------------------------------------------42
III. 3.2. Substâncias que reagem ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) ------------------------------------------42
III. 3.3. Teste da Atividade da Catalase (CAT) --------------------------------------------------------------------43
III. 4. Atividade Antioxidante --------------------------------------------------------------------------43
III. 4. 1. Métodos para avaliar a atividade antioxidante ----------------------------------------------------------43
III. 4. 2. Teste Hipoxantina/xantina oxidase------------------------------------------------------------------------43
III. 4. 3. Teste DPPH ---------------------------------------------------------------------------------------------------44
III. 5. Ensaio Cometa-------------------------------------------------------------------------------------45
III. 5. 1. Tratamento in vivo -------------------------------------------------------------------------------------------45
6
III. 5. 2. Tratamento in vitro-------------------------------------------------------------------------------------------46
III. 5. 3. Ensaio Cometa------------------------------------------------------------------------------------------------46
III. 6. Teste de Micronúcleos----------------------------------------------------------------------------47
III. 7. Análise estatística ---------------------------------------------------------------------------------48
IV. RESULTADOS E DISCUSSÃO ------------------------------------------------------------ 49
V. CONCLUSÕES ---------------------------------------------------------------------------------- 68
VI. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS----------------------------------------------------- 70
VII. ANEXOS---------------------------------------------------------------------------------------- 80
VII. 1. Anexo 1---------------------------------------------------------------------------------------------80
VII. 2. Anexo 2---------------------------------------------------------------------------------------------84
VII. 3. Anexo 3---------------------------------------------------------------------------------------------85
7
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Cynara scolymus. Folha (A); Flor (B).....................................................18
Figura 2. Estrutura química de produtos presentes em C. scolymus....................22
Figura 3. Classificação dos cometas.....................................................................30
Figura 4. Micronúcleos em medula óssea.............................................................32
Figura 5. Peso dos animais verificado no primeiro e último dia de tratamento com
extrato foliar (EF) e extrato do receptáculo (ER)...................................................53
Figura 6. Média e desvio padrão da peroxidação lipídica (TBARS) dos animais
tratados com as diferentes doses..........................................................................55
Figura 7. Média e desvio padrão da catalase (CAT) dos animais tratados com as
diferentes doses.....................................................................................................56
Figura 8. Inibição da geração de ROS pelos extratos aquosos de folha e
receptáculo de alcachofra .....................................................................................58
Figura 9. Gráfico de classes de cometas..............................................................65
Figura 10. Índice de danos (ID) do ensaio cometa in vitro da atividade
antigenotóxica do extrato foliar de alcachofra pela indução de danos pelo peróxido
de hidrogênio em (A) medula óssea, (B) sangue periférico, (C) cérebro e (D)
fígado.....................................................................................................................67
8
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Análise fitoquímica do receptáculo e folha de alcachofra ....................49
Tabela 2. Tabela de compostos químicos de relatos na literatura para C.
scolymus.....................................................................................................51
Tabela 3. Inibição de DPPH (2,2-Difenil-1-picrilhidrazil).......................................57
Tabela 4. Média e desvio padrão de eritrócitos policromáticos micronucleados do
tecido sanguíneo de camundongos tratados com extrato foliar e do
receptáculo de alcachofra...........................................................................59
Tabela 5. Média e desvio padrão de eritrócitos policromáticos micronucleados do
tecido medular de camundongos tratados com os extratos das folhas e
receptáculo de alcachofra..........................................................................60
Tabela 6. Índice de danos em sangue, medula, fígado e cérebro, de
camundongos tratados com extrato aquoso (folhas e receptáculo) de
alcachofra. ..................................................................................................62
Tabela 7. Freqüência de danos em sangue, medula, fígado e cérebro, em
camundongos tratados com extrato foliar e do receptáculo de
alcachofra..................................................................................................63
9
LISTA DE ABREVIATURAS
AEAC “Capacidade antioxidante do ácido ascórbico”
AKPC “Peroxidase C”
ALS “Sítios alcali-lábeis”
ANOVA “Análise da variância”
ANVISA “Agência Nacional de Vigilância Sanitária”
AOA “Atividade antioxidante”
APX “Ascorbato peroxidase”
CA “Ácido cafeico”
CAT “Catalase”
CcP “Citocromo c peroxidase”
CD29, CD98, CD147, CD43 “Proteínas integrinas”
CGA “Ácido clorogênico”
CP “Ciclofosfamida”
DHBA “Diidroxifenois”
DHCA “Ácido diidrocafeico”
DHFA “Ácido diidroferulico”
DMSO “Dimetilsulfoxido”
DNA “Ácido desoxirribonucléico”
DPPH “ 2,2-Difenil-1-picrilhidrazil”
EDTA “Ácido etilenodiamino tetra-acético”
EF “Extrato foliar”
ER “Extrato do receptáculo”
FD “Freqüência de danos”
FeCl
3
“Cloreto férrico”
FISH “Hibridação fluorescente”
H
2
O
2
“Peróxido de Hidrogênio”
HDL “Proteína de alta densidade”
HPLC “ Cromatografia líquida”
10
ID “Índice de danos”
KOH “Hidróxido de potássio”
LDL “Proteína de baixa densidade”
LiP “Lignina peroxidase”
MBA “ Malondialdeído”
MN “Micronúcleos”
NaCl “Cloreto de sódio”
NaOH “Hidróxido de sódio”
NCE ou ECN “Eritrócitos normocromáticos”
NDCN “Núcleo não detectável”
NFκB “Fator nuclear”
NO “Óxido nítrico”
OECD “Organização econômica de cooperação e desenvolvimento”
OMS “Organização Mundial de Saúde”
PCE ou ECP “Eritrócitos policromáticos”
POD “Oxidoredutase de peróxido de hidrogênio”
PPO “Monofenol, diidroxi-L-fenilalanina”
RP – HPLC “Cromatografia liquida em coluna de fase reversa”
RPMI “Meio Rosewell”
SCGE “Eletroforese em gel simples”
SOD “Superóxido Dismutase”
TBARS “Ácido Tiobarbitúrico”
t-BHP “Tert-butilidroperóxido”
TCA “Ácido tricloroacético”
TNFa “Citocina pro-inflamatória”
11
LISTA DE UNIDADES
µg: micrograma
mg: miligrama
kg: quilograma
µl: microlitro
ml: mililitros
l: litro
h: horas
M: molar
mA: miliampere
ppb: partes por bilhão
12
RESUMO
A alcachofra (Cynara scolymus) é amplamente consumida tanto sob a
forma de chá bem como alimento. Estudos apontam importantes atividades
biológicas desta planta, como hepatoprotetora, ser diurética, redutora de
colesterol, além de possuir atividade antioxidante e antiinflamatória devido à
presença de compostos como polifenóis, lactonas sesquiterpênicas e flavonóides.
O objetivo deste estudo foi verificar o efeito genotóxico e/ou mutagênico dos
extratos de alcachofra, folha e receptáculo, através do ensaio cometa e teste de
micronúcleos em camundongos (Mus musculus) in vivo, bem como avaliar as
atividades antioxidantes pelos testes DPPH e hipoxantina/xantina oxidase. Os
animais foram tratados via gavage por três dias consecutivos e divididos em seis
grupos: (1) controle negativo que recebeu água; (2) controle positivo com
Ciclofosfamida; (3) extrato foliar (EF)=2000 mg/kg; (4) EF=1000 mg/kg; (5)
EF=500 mg/kg; (6) extrato do receptáculo (ER)=2000 mg/kg. Os resultados
demonstraram que o extrato foliar e do receptáculo em todas as concentrações
não foram mutagênicos, pelo teste de micronúcleos em sangue periférico e
medula óssea, nem apresentaram indução à genotoxicidade, avaliado pelo ensaio
cometa, exceto o extrato foliar na maior dose. Este último apresentou indução a
danos no DNA de forma significativa quando comparado ao controle negativo.
Diferentes tecidos foram avaliados, sendo que no grupo que recebeu a maior
dose de extrato foliar observaram-se danos e que os tecidos-alvo foram o fígado e
o cérebro. Estresse oxidativo avaliado pelo teste TBARS e CAT não
demonstraram resultados positivos. A atividade antioxidante dos extratos de
alcachofra foi avaliada pelos testes DPPH e hipoxantina/xantina oxidase e ambos
foram positivos, principalmente o extrato foliar. No teste in vitro de pré-tratamento
com o extrato foliar nos camundongos, observou-se atividade antioxidante do
extrato em células de medula óssea. Na avaliação fitoquímica observou-se a
presença de flavonóides e compostos fenólicos em ambos os extratos, sendo que
saponinas foram encontradas apenas nas folhas. Assim, observa-se que o extrato
13
das folhas da alcachofra, na maior dose administrada neste estudo em
camundongos, devido a sua mistura complexa, mas com provável influência dos
flavonóides e saponinas, demonstraram maior atividade genotóxica e
antioxidante, sendo os tecidos-alvo fígado e cérebro. Nossos resultados
demonstraram que o uso popular do chá das folhas apresenta-se coerente quanto
aos efeitos antioxidantes, mas que doses elevadas devem ser observadas com
atenção, por poder levar a efeito genotóxico.
Palavras-chave: Cynara scolymus, genotoxicidade, mutagenicidade, ensaio
cometa, teste de micronúcleos, estresse oxidativo.
14
ABSTRACT
The artichoke (Cynara scolymus) is wide consumed by tea and food form.
Studies point important biological activities about this plant like hepatoprotetive
action, diuretic, cholesterol reducer, antioxidant property and anti inflammatory
because present poliphenois, lactones and flavonoids. The test purpose verifying
the genotoxicity and mutagenicity potential of artichoke’s extracts (leaves and
flower) using comet assay and micronucleus test (in vivo) in mice (Mus musculus)
and too evaluate the antioxidant activity. The animals were receiving treatments by
artichoke’s flower and leaves lyophilized extract gavage during three days. They
were divide in six groups: (1) negative control receive water; (2) positive control
receive cyclophosphamide; (3) leaves extract (LE) = 2000 mg/kg; (4) LE= 1000
mg/kg; (5) LE= 500 mg/kg; (6) flower extract (FE) = 2000 mg/kg. The results point
the leaves and flower extracts don’t presented mutagenicity for micronucleus test
in peripheral blood and bone narrow, nether present genotoxicity induction by
Comet assay, except the leaves extract on mayor dose. The last presented
damage DNA induction significant when compared with negative control. Different
tissues were employed and just two present DNA damage, liver and brain for the
group receive the treatment of high level foliar extract dose observed the point-
tissues were liver and brain. The oxidative stress was evaluated by TBARS and
CAT tests, both don’t demonstrate positive results. The antioxidant activity by both
extracts of artichoke was evaluated by DPPH and hipoxantine/xantine oxidase
tests and both were significant values, note the leaves extract. In vitro test with
pre-treatment with leaves extract in mice we can observe the antioxidant activity of
extract in bone narrow cells. Chemistry screening detect the flavonoids and
phenolics compounds presence in both extracts, the saponins just appear in
leaves extract. Then, we can observed the leaves extract of artichoke, in the high
dose, in this mice studies, by your complexicity mix compounds, but with influence
positive by flavonoids and saponins, presented high genotoxicity and antioxidant
15
activity, on the tissues point liver and brain. Our results demonstrate that the
popular use of the tea leaves (folk medicine) appears to be consistent about the
effects antioxidants, but that high doses should be observed carefully, as it may
lead to genotoxic effect.
Keywords: Cynara scolymus, genotoxicity, mutagenicity, comet assay,
micronucleus test , oxidative stress.
16
I. INTRODUÇÃO
Há milhares de anos, o homem vem utilizando os recursos da flora no
tratamento de diversas patologias. Há relatos, por exemplo, do uso de plantas
com finalidades terapêuticas por volta de 3.000 a.C. (Ko, 1999). No ano 78 d.C. o
botânico grego Pedanios Dioscorides descreveu cerca de 600 plantas medicinais,
além de produtos minerais e animais no tratado De Materia Medica. Este tratado
permaneceu como fonte de referência por mais de catorze séculos (Tyler, 1996).
Foi através da observação e da experimentação pelos povos primitivos que as
propriedades terapêuticas de determinadas plantas foram sendo descobertas e
propagadas de geração em geração, fazendo parte da cultura popular. No século
XVI, o médico suíço Philippus Aureolus Theophrastus Bombastus von
Hohenheim, conhecido como Paracelsus (1493-1541), formulou a “Teoria das
Assinaturas”, baseada no provérbio latim similia similibus curantur, “semelhante
cura semelhante”. Com esta teoria acreditava-se que a forma, a cor, o sabor e o
odor das plantas estavam relacionados com as suas propriedades terapêuticas,
podendo dar indícios de seu uso clínico. Algumas destas plantas passaram a
fazer parte das farmacopéias alopáticas e homeopáticas a partir do século XIX,
quando se começou a investigar suas bases terapêuticas (Elvin-Lewis, 2001).
Atualmente, os fitoterápicos são amplamente utilizados em diversos países.
Na África, por exemplo, 80% da população dependem do uso destes
medicamentos, os quais representam alternativos frente ao alto custo dos
fármacos sintéticos. O mercado mundial de medicamentos fitoterápicos é de US$
43 bilhões por ano. Somente nos Estados Unidos da América, este mercado
representa US$ 5 bilhões por ano, sendo o setor que mais cresce no mercado
farmacêutico norte-americano (Aschwanden, 2001). Estima-se que cerca de 60%
dos fármacos com atividades antitumorais e antimicrobianas, já comercializados
ou em fase de pesquisa clínica, sejam de origem natural (Shu, 1998).
No Brasil, há cerca de 100.000 espécies vegetais catalogadas, mas
somente 8% foram estudadas quanto a sua química, e estima-se que apenas
17
1.100 espécies tenham sido avaliadas quanto às suas propriedades terapêuticas
(Garcia et al., 1996). O Brasil gasta cerca de dois a três bilhões de dólares por
ano na importação de matérias – primas utilizadas no preparo de medicamentos.
O panorama, nessa área, mostra que 84% dos fármacos consumidos no Brasil
são importados e que 78 a 80% da produção é realizada por empresas
multinacionais (Miguel & Miguel, 1999), índice que justifica a busca de alternativas
para superar a dependência externa por parte da indústria químico-farmacêutica
brasileira.
As plantas dispõem de compostos químicos resultantes do metabolismo
primário e secundário. O primeiro grupo de compostos comporta as substâncias
indispensáveis à planta e que se formam graças ao processo fotossintético. O
segundo grupo, oriundo do metabolismo secundário, aparentemente sem
atividade na planta, possui efeitos terapêuticos notáveis. Tais substâncias,
denominadas princípios ativos ou metabólitos secundários são alcalóides,
flavonóides, óleos essenciais, resinas, taninos entre outros (Di Stasi, 1996).
Estas substâncias se encontram nas plantas sob a forma de complexos,
cujos componentes se completam e reforçam a sua ação sobre o organismo.
Mesmo quando a planta medicinal possui somente um principio ativo, este
apresenta um efeito benéfico superior ao produzido pela mesma substância
obtida por síntese química (Di Stasi, 1996).
I.1. A Alcachofra
A alcachofra, Cynara scolymus (Figura 1), pertence ao gênero Cynara da
família Asteraceae. É uma planta vivaz, com folhas compostas pinatífidas e
espinhosas, sendo as superiores bem menores que as da base. Flores púrpuras
reunidas em um grande capítulo envolvido por grandes brácteas que são a parte
comestível da inflorescência. Provavelmente originária do Mediterrâneo é uma
hortaliça herbácea e considerada perene, pois soltam rebentos que substituem a
planta velha. Caule estriado ou sulcado. Folhas alternas, de cor prateada,
carnosas, com 5 a 9 cm de comprimento, elíptica, de base estreita, com espinhos
18
curtos. Flores com grandes brácteas carnosas na base, verde ou vermelha,
formando capítulos grandes; são hermafroditas ou de sexos separados, podendo
ou não estar na mesma inflorescência. Formam um tufo e ao centro brotam
hastes retas que sustentam um tipo de botão floral comestível. Podem atingir em
média 1,2m de altura (Joly, 1985). É uma planta cultivada como alimento em
regiões onde o clima é temperado. Foi introduzida no Brasil na segunda década
do século passado pelos italianos se adaptando a climas amenos, não tolera o frio
intenso nem solos muito úmidos. Comumente cultivada em regiões serranas com
altitude acima de 700 m e temperaturas entre 14 e 25 graus (Isechik et al., 1998).
Figura 1. Cynara scolymus. Folha (A); Flor (B).
C. scolymus é rica em vitaminas A e do complexo B e em sais minerais
como ferro, cálcio, magnésio, fósforo. A alcachofra é usada como planta medicinal
no tratamento de distúrbios hepáticos, controle de diarréia e diurético. A cabeça
ou receptáculo da alcachofra pode ser consumido quando conservada no vinagre
ou azeite, cozida ou mesmo crua. Depois de cozida, a alcachofra altera-se muito
e produz toxinas devendo ser consumida logo após o cozimento (Low et al.,
1999).
Esta planta é muito utilizada na culinária mediterrânea. Suas folhas têm
sido usadas em forma de chá desde tempos remotos, pelo seu efeito terapêutico
incluindo o melhor fluxo sanguíneo, mobilização de reservas energéticas, indução
da quebra do colesterol, inibição da biossíntese do colesterol e oxidação do LDL
A
B
19
(lipoproteína de baixa densidade), além de possuir ação antibacteriana,
antifúngica e antioxidante tendo efeitos hepatoprotetores (Llorach et al., 2002).
Muitos estudos focam nas propriedades antioxidantes da alcachofra devido
à composição de polifenóis compreendendo os ácidos mono e dicafeoiliquinicos e
os flavonóides. Estas propriedades consistem nestes compostos fenólicos agirem
como antioxidantes ou substratos oxidativos de reações com muito ferro
(Lattanzio et al., 1994).
I.2. Atividades biológicas dos compostos químicos de Cynara
scolymus
Uma análise cromatográfica realizada por HPLC em coluna de fase reversa
dos compostos fenólicos de alcachofra revelou a presença de ácidos
hidroxicinâmicos como o ácido clorogênico, ácido p-cumárico e ácido ferúlico,
assim como também a presença de cinarina (ácido 1,3-dicafeoilquinico),
flavonóides apigenina e luteolina. Os ácidos hidroxicinâmicos se mostraram mais
concentrados no receptáculo e nas brácteas interiores (Fratianni et al., 2007).
O ácido clorogênico foi encontrado nas brácteas interiores. Este produto
tem demonstrado em estudos in vivo, propriedades antioxidantes e
anticarcinogênicas (Gonthier et al., 2003). Apesar de ser pouco absorvido pelo
intestino delgado, é capaz de prevenir alta produção de metabólitos microbianos,
sendo considerado responsável pelas propriedades biológicas atribuídas aos
polifenóis dietéticos (Gonthier et al., 2003). O ácido cumárico está presente no
receptáculo e brácteas internas da alcachofra, este por sua vez, conforme cita a
literatura, apresenta propriedades antiinflamatórias (Luceri et al., 2004). Ácido
ferúlico, mais presente nas brácteas exteriores. A cinarina, composto polifenólico
típico do gênero Cynara é importante por sua atividade colerética (Gebhardt,
1997). Flavonóides como luteolina e apigenina possuem diversas atividades
farmacológicas dentre elas antioxidantes (Perez-Garcia et al., 2000). A luteolina é
importante na inibição da biossíntese de colesterol (Gebhardt, 1998).
20
Um experimento foi realizado para avaliar quais compostos e em que
quantidades estão presentes em 13 produtos contendo alcachofra, dentre eles 6
fármacos e 7 suplementos alimentares. O ácido 1-O-cafeoilquínico somente não
foi detectado no suplemento alimentar em formato de pastilha efervescente assim
como apigenina 7-O-glucosídeo, naringenina 7-O-glucosídeo, apigenina 7-O-
rutinosideo e narirutina. No suco foram encontrados dois compostos ausentes em
todas as outras amostras avaliadas, a naringenina 7-O-glucosídeo e narirutina,
além de conter todos os demais compostos (Schutz et al., 2006).
Aubert et al. (1998) em estudo mais detalhado sobre as antocianinas de C.
scolymus identificou: cianidina 3, 5 - diglucosídeo, cianidina 3 - glicosídeo,
cianidina 3, 5 - malonildiglicosídeo, cianidina 3 – cafeilsoforosídeo – 5 - glicosídeo,
cianidina 3 - soforosídeo, cianidina 3 - cafeilsoforosídeo e cianidina 3 -
cafeilglicosídeo .
As enzimas cinarases têm sido isoladas de C. scolymus, mas suas
propriedades ainda são pouco conhecidas. Um estudo avaliou as propriedades
físicas e catalíticas da principal isoenzima presente nas flores de C.scolymus, a
cinarase A (Sidrach, et al., 2005). A atividade das cinarases pode estar envolvida
na polinização da planta ou no mecanismo de defesa contra patógenos e insetos
(Ramalho-Santos et al., 1997). A pepstatina, um tipo de inibidor de proteinases
aspárticas (Rich e Sun, 1980) inibiu a cinarase A confirmando que o sítio catalítico
de cinarase A contém dois resíduos de ácido aspártico e pertence ao grupo das
proteinases aspárticas (Veríssimo et al., 1998).
Os compostos químicos da alcachofra cultivada no Brasil diferem em
quantidade dos compostos da planta cultivada na Europa devido a influências
sazonal e ambiental (Noldin et al., 2003). Através da análise fitoquímica com o
extrato bruto de C. scolymus verificou-se a presença dos seguintes compostos
(Figura 2):
I) Como ácidos fenólicos há a cinarina que reduz a taxa de colesterol de
maneira significativa através de uma estimulação metabólico
enzimática, sendo utilizada para casos de hiperlipidemia e ateromatose
no interior dos tecidos adipóides; também é utilizada como anti-
hepatotóxica (Sidrach et al., 2005) e em uremia, melhorando a excreção
21
da amônia (Azzini et al., 2007). Há também o ácido clorogênico que
tem dois grupos hidroxila no mesmo anel fenólico revelando maior
atividade antioxidante que o cinarosídio. O ácido clorogênico é
antioxidante, pertence à família dos ésteres formado por ácidos
cinâmicos, ácidos quínicos e pode ser isolado de folhas e frutos
(Clifford, 2003). E há também a presença de outros ácidos fenólicos
que se encontram em baixa concentração como o ácido cafeico e o
ácido ferúlico.
II) Como flavonóides presentes nas folhas de alcachofra se encontram o
cinarosídio que tem dois grupos hidroxil em um único anel e um grupo
hidroxila no segundo anel mostrando menor atividade antioxidante que
o outro flavonóide denominado escolimosídio (Cechinel et al., 2003)
bem como é encontrada a luteolina, um tipo de flavona que atua como
antioxidante, previne a inflamação, promove o metabolismo de
carboidratos e modula o sistema imunológico, além de prevenir contra o
câncer (Mann, 1992). Já no receptáculo encontram-se os flavonóides
apigenina, narirutina e cianidina, todos com propriedades
antioxidantes (Schutz et al., 2006).
III) Encontra-se também a lactona sesquiterpênica cinaropicrina, que
pode ser responsável por eventuais ações tóxicas, antitumoral,
antimicrobiana, antifúngica (Hay et al., 1994) e neurotóxica (Noldin et
al., 2003).
IV) Há a presença do composto lupeol, um triterpeno cujas atividades
farmacológicas são anti-tumorais, antioxidantes e antiinflamatórias
(Cechinel et al., 2003).
V) E por fim detectou-se a presença das saponinas denominadas
cinarasaponinas. São metabólitos secundários atuantes na defesa das
plantas contra microrganismos. Possuem características como gosto
amargo e algumas apresentaram a propriedade de hemolisar as células
sanguíneas. As saponinas colaboram para o tratamento do colesterol;
inibem o progresso de alguns tipos de câncer (Krizkova et al., 2004).
22
Figura 2. Compostos químicos presentes em C.scolymus (Cechinel et al., 2003).
23
I.3. Uso de C. scolymus como planta medicinal
A alcachofra é indicada para tratar afecções hepatobiliares, eliminar uréia e
colesterol e também aliviar os distúrbios gástricos e renais. É utilizada como
coadjuvante nos regimes de emagrecimento, sendo empregada também em
casos de hipertensão. Ensaios farmacológicos realizados em ratos, usando os
extratos da alcachofra por via oral, confirmando a ação hepatoprotetora desta
planta, isto é, os extratos foram capazes de diminuir fortemente os danos
causados no fígado por agentes tóxicos. Ensaios clínicos efetuados em humanos
com o suco de suas folhas e os botões florais, ambos contendo cinarina,
provocaram redução acentuada dos níveis de colesterol total, colesterol LDL e
triglicerídeos (Pittler et al., 1998). O uso da alcachofra é recomendado em
diferentes tratamentos como anemia, nefrite, diabetes, bronquite asmática,
hemorróidas, prostatite, uretrite, quadros de debilidade cardíaca, hepatite,
colecistite, arteriosclerose, além do seu efeito diurético (Schneider, 1984).
Recomenda-se evitar o consumo de alcachofra durante a amamentação, em
casos de fermentação intestinal e para alérgicos à alcachofra (Macchia et al.,
2004).
C. scolymus tem alta concentração do componente não digerível, a fibra
inulina (Goñi et al., 2005). A alcachofra melhora a síntese e excreção dos ácidos
biliares, estes ácidos podem modificar a atividade microbiana in vitro (Fujisawa et
al., 1996), ainda podem aumentar a permeabilidade e a entrada de substratos na
célula, induzidos pela atividade da β-glucosidase e β-glucuronidase (Simon et al.,
1984). A mucosa gastrintestinal é exposta a espécies reativas de oxigênio (Harris
et al., 1992), todavia a ingesta de antioxidantes indigeríveis naturais podem
prevenir doenças do cólon. Células do cólon contêm um sistema bioquímico
ligado a sistemas seqüestradores de radicais livres incluindo catalases,
superóxido dismutase, e micronutrientes antioxidantes. Apenas uma pequena
parte do ácido clorogênico (presente na composição de C. scolymus) é absorvida
pelo intestino delgado, todavia a microbiota do cólon é capaz de quebrar o ácido
24
clorogênico em ácido cafeico e ácido quínico (Buchanan et al., 1996), que por sua
vez, estão associados a atividades anticarcinogênicas (Tanaka et al., 1993).
I.4. Atividade antioxidante de C. scolymus
Devido aos componentes fenólicos presentes nas folhas de C. scolymus
como cinarina, ácido cafeico, ácido clorogênico e luteolina, a alcachofra é capaz
de inibir o estresse oxidativo gerado por espécies reativas de oxigênio em
leucócitos humanos (Perez-Garcia et al., 2000).
Outro estudo envolvendo extratos de C. scolymus verificou seu efeito
hepatoprotetivo levando a regeneração do fígado depois de uma parcial
hepatectomia (Adzet, 1987). Este estudo sugeriu que o efeito protetivo ocorreu
devido à propriedade antioxidante da planta. No referido estudo os hepatócitos de
ratos foram submetidos a um estresse oxidativo pela exposição ao peróxido de
hidrogênio avaliando a propriedade antioxidante do extrato de alcachofra, assim
como sua interferência nos níveis de glutationa hepática.
A peroxidase C (AKPC) foi isolada do receptáculo de alcachofra, tem
atividade neutralizadora de ácidos como o ácido clorogênico e ácido cafeico,
abundantes nas flores de alcachofra. Peroxidases catalisam a oxidação de
substratos por peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) (López-Molina et al., 2003).
Um estudo avaliou o comportamento enzimático da peroxidase AKPC em
presença de íons cálcio. Este metal ligou-se com a enzima formando um
complexo cinético que pode ser inativado por H
2
O
2
(peróxido de hidrogênio)
e
apresenta alta afinidade com substratos reduzidos (Hiner et al., 2004). Descobriu-
se que a peroxidase AKPC da C.scolymus se liga ao óxido nítrico, o qual tem um
importante papel como transmissor de sinais não só no tecido endotelial vascular
(Palmer et al., 1987), mas também nos neurônios periféricos (Radomski et al.,
1987). A AKPC, podendo se ligar ao NO, serve como determinante quantitativo do
nível de NO presente no meio aquoso (López-Molina et al., 2003).
25
I.5. Genotoxicidade de plantas medicinais
A utilização de plantas como recurso terapêutico é uma prática
generalizada na medicina popular e tem aumentado acentuadamente nas últimas
décadas. Apesar da ampla utilização das plantas medicinais, pouca informação se
encontra disponível sobre seus constituintes, bem como sobre os riscos em
potencial oferecidos à saúde humana (Fonseca et al., 2004). Segundo a
Organização Mundial de Saúde (OMS), aproximadamente 80% da população
utilizam medicamentos à base de produtos naturais no alívio de alguma
sintomatologia desagradável. Há uma riqueza muito grande na flora brasileira,
estimada em 120 mil espécies, das quais apenas 1% tem sido estudada, do ponto
de vista fitoquímico ou farmacológico.
No Brasil, a legislação para medicamentos fitoterápicos (Anexo 1) vem
sofrendo modificações nos últimos anos. A Agência Nacional de Vigilância
Sanitária (ANVISA) vem elaborando normas para a regulamentação destes
medicamentos, desde a Portaria № 6 de 1995, que estabeleceu prazos para que
as indústrias farmacêuticas apresentassem dados de eficácia e segurança dos
medicamentos fitoterápicos, passando pela RDC № 17 de 2000, e a Resolução
RDC № 48 de 16 de março de 2004, atualmente em vigor, que dispõe sobre o
registro de medicamentos fitoterápicos. Esta preocupação das autoridades
regulatórias com a normatização dos medicamentos fitoterápicos propicia a
avaliação de aspectos importantes, como a eficácia e segurança do uso destes
medicamentos. O uso tradicional de diversas plantas medicinais baseado em
conhecimentos populares, aliado à crença de que, por ser natural não causa
reações adversas, fez com que poucas plantas medicinais fossem avaliadas
através de estudos pré-clínicos e clínicos, a fim de comprovar sua eficácia e
segurança. Além disto, sabe-se que muitos fitoterápicos apresentam substâncias
que podem desencadear reações adversas. Estes podem ser constituintes
naturais da planta. Por isso, é necessário um rigoroso controle de qualidade
desde o cultivo, coleta da planta, extração de seus constituintes, até a elaboração
do medicamento final (Turolla et al., 2006).
26
A grande maioria da população desconhece que as plantas produzem
pesticidas naturais para se defender contra fungos, insetos e outros predadores.
Supõe-se que existam dez mil pesticidas naturais na dieta humana. Destes, foram
analisados somente 63 pesticidas pelos testes de mutagenicidade e/ou
carcinogenicidade. Destes 35 foram considerados carcinógenos em roedores, ou
seja, mais da metade. Sabe-se também que para cada alimento vegetal
analisado, há aproximadamente 50 pesticidas naturais não avaliados (Franke et
al., 2003).
Muitas plantas de uso popular apresentam efeitos genotóxicos e o uso
destas deveria ser feito com mais critério. Por outro lado, avanços biotecnológicos
vêm permitindo a síntese e modificações destas estruturas ativas, objetivando a
obtenção de produtos com maior atividade terapêutica e menor toxicidade.
Existem medicamentos que são lançados no mercado e que, por serem
designados como “naturais”, são usados pela população sem que se tenha
realizado um estudo mais detalhado sobre a sua composição química e
toxicidade. Isso resulta no escasso conhecimento sobre seus efeitos colaterais,
especialmente sobre o material genético. Portanto, é imprescindível que os
estudos com plantas medicinais sejam estimulados, não só pelo esclarecimento à
população que as utiliza, mas também porque se tem no Brasil uma riqueza de
espécies ainda não estudadas, a qual constitui uma promissora fonte de novas
drogas (Varanda, 2006). Muitos alimentos que contém toxinas naturais causam
câncer em ratos ou camundongos e estão presentes naturalmente em níveis
variantes entre poucas partes por bilhão (ppb) a 4.000.000 ppb pode-se citar:
anis, erva-doce, maçãs, bananas, erva de cheiro doce, brócolis, couve de
Bruxelas, repolho, cenouras, couve-flor, aipo, canela, cravo-da-índia, cacau, chá
de confrei, noz-moscada, suco de laranja entre outros (Maron e Ames, 1983).
Diversas espécies vegetais são usadas, na medicina popular, sob a forma
de chá. Através do teste Salmonella/Microssoma investigou-se o efeito
mutagênico e genotóxico de marcela (A. satureoides), carqueja (B. anomala) e
açoita-cavalo (L. divaricata), todas apresentaram resultados positivos quanto à
genotoxicidade. Isso se deve à presença intrínseca, nesses vegetais, de taninos e
flavonóides, tais como quercitina e campferol (Da Silva et al., 2003).
27
Ensaios de toxicidade do extrato de C. scolymus em Artemia salina a partir
do extrato metanólico bruto das folhas e a fração hexânica, causaram mortalidade
significativa na população destes microcrustáceos (Noldin et al., 2003). O
triterpeno lupeol, isolado da fração hexânica, foi confirmado como sendo o
responsável pelos efeitos citotóxicos no estudo realizado. Por outro lado a lactona
sesquiterpênica cinaropicrina está presente em grande quantidade na alcachofra
cultivada no Brasil e mesmo não tendo apresentado ação citotóxica no modelo A.
salina, é considerada neurotóxica (Noldin et al., 2003).
I.6. Metodologias utilizadas neste estudo
Além disso, o uso aleatório de fitoterápicos e plantas in natura justifica o
aumento no número de estudos de genotoxicidade de produtos naturais no meio
científico. As plantas, apesar de suas inúmeras propriedades farmacológicas,
também podem causar danos no DNA (Varanda, 2006).
O ser humano está constantemente exposto a agentes mutagênicos, sejam
eles de natureza endógena ou do próprio ambiente. Para avaliar o efeito destes
mutágenos na vida do ser humano a genética toxicológica com seus bioensaios é
capaz de elucidar os efeitos genotóxicos em potencial, que são tidos como pré-
requisitos para o desenvolvimento do câncer. O termo genotóxico se refere às
alterações letais e/ou hereditárias, que são transmitidas, tanto pelas células
somáticas, como pelas germinativas (Fonseca et al., 2004).
Inúmeras técnicas para detecção de danos no DNA vêm sendo
empregadas na genética toxicológica para identificar substâncias com atividade
genotóxica. No estudo que segue foi utilizado o ensaio cometa em combinação
com o teste de micronúcleos.
I.6.1. Ensaio Cometa
O ensaio cometa, também conhecido como SCGE (single cell gel
electroforesis) é um método simples para medir quebras no ácido
desoxirribonucléico (DNA) em células eucarióticas. As células são embebidas em
28
agarose e sobre uma lâmina de microscópio são lisadas com detergente e sais
para formar nucleóides contendo alças de DNA ligadas a matrix nuclear
desprovida de histonas. A eletroforese em pH alcalino resulta em estruturas que
lembram cometas, que observadas ao microscópio revelam a intensidade da
cauda que reflete o número de quebras contidas no DNA. O ensaio pode ser
empregado na avaliação da genotoxicidade de novas drogas, no monitoramento
da contaminação ambiental com genotoxinas, no biomonitoramento humano e
epidemiologia molecular. A sensibilidade e especificidade do ensaio são melhores
se os nucleóides são incubados com enzimas de reparo que reconhecem
específicos tipos de danos no DNA e as convertem em quebras, aumentando a
quantidade de DNA na cauda do cometa. Assim o ensaio, além de ser capaz de
detectar vários tipos de lesões (quebras), é possível detectar a cinética dos
mecanismos de reparo (Collins, 2004). As quebras podem representar o efeito
direto de alguns agentes prejudiciais, ou podem ser intermediárias no mecanismo
de reparo celular. Quebras no DNA podem também advir da ação de radicais
livres gerados por processos de estresse oxidativo (Frenzilli et al., 2006).
O ensaio cometa é o método mais comum, rápido e barato que envolve a
lise (tratamento que remove membranas celulares e nucleares além de proteínas
restando os nucleóides) das células com detergente e sal. Depois de embebidas
em agarose o DNA é imobilizado via eletroforese (o DNA migra para o ânodo,
devido sua carga negativa, dependendo do número de lesões contidas nos
nucleóides). A cauda do cometa parece simplesmente um halo de alças relaxadas
que migraram para um lado através do processo de eletroforese lembrando um
cometa, dividido em duas partes, ‘cabeça’ e ‘cauda’. Sendo assim, células com
pouco ou nenhum dano não apresentariam cauda, permanecendo como
nucleóides, enquanto as células com mais danos apresentariam caudas maiores.
No início Ostling and Johanson empregaram o pH menor que 10 e somente
observaram quebras duplas. Atualmente, na eletroforese, se emprega o pH >13,
que desnatura o DNA, a separação das duas fitas de DNA ao redor da quebra por
essa alcalinização é essencial para revelar a quebra, e assim é possível detectar,
além das quebras simples, as duplas, crosslinks e sítios álcali-labeis (ALS)
contribuindo enormemente para a interpretação dos resultados (Collins et al.,
29
2008). O ensaio cometa é mais comumente empregado em células animais,
culturas ou células isoladas (linfócitos separados do sangue ou células de tecidos
desagregados). Há inúmeros softwares utilizados na contagem e classificação
dos cometas, para tanto a coloração deve ser com brometo de etídeo, e com a
ajuda de um microscópio de fluorescência é possível analisar os parâmetros de
momento da cauda (tail moment), comprimento da cauda (tail lenght) e
intensidade da fluorescência na cabeça e na cauda (Collins, 2004).
Os cometas foram analisados manualmente diferenciando as cinco classes
de danos desde 0 (zero) sem cauda até 4 (todo DNA está presente na cauda)
conforme Figura 3.
30
Figura 3. Segundo o critério visual do pesquisador, foram contados os cometas
pelas respectivas classes de danos: Dano 0 (sem cauda); 1 (pequena
migração do DNA); 2 (média migração do DNA); 3 (extensa migração do
DNA); 4 (cabeça separada da cauda).
Na análise a coloração dos cometas é feita com nitrato de prata e são
observados em microscópio 50 células por lâmina em duplicata para cada animal.
O ensaio cometa apresenta inúmeras vantagens, como sua aplicação em
vários tecidos e células, a sensibilidade para detectar baixos níveis de danos no
DNA, a necessidade de poucas células por amostra e a utilização de pouco tempo
e baixo custo (Schwaab et al., 2005). Outra vantagem do ensaio é que pode
analisar danos em tecidos e este é monitorado em nível de células individuais.
Células necróticas ou apoptóticas podem resultar em cometas com cabeça
pequena ou inexistente e cauda larga e difusa, comumente descritos como
‘hedgehogs’, células fantasmas ou núcleo não detectável (NDCN) (Schwaab et
al., 2005). Outra vantagem apresentada pelo ensaio é que para ver o cometa não
0
1
2
3
4
31
é necessário haver divisão celular como ocorre no teste de micronúcleos que só
pode ser detectado após ocorrer mitose (Cotelle et al., 1999).
Há algumas limitações para o ensaio cometa, referentes à aplicação e
interpretação, onde lesões primárias no DNA como quebras simples, podem
sofrer rápido reparo, e não ser detectadas se o tempo da realização do ensaio
exceder o tempo do reparo (2-6h) que assegura que estas lesões sejam
capturadas pelo teste.
O ensaio cometa faz parte de um grupo de testes indicador (oposto a
testes mutagênicos), pois detecta danos no DNA recentes que podem, caso não
sejam reparados, resultar em mutações (Schwaab et al., 2005). Como um teste
de genotoxicidade ele permite identificar possíveis mutágenos e carcinógenos
humanos (Tice et al., 2000).
I.6.2. Teste de Micronúcleos
O teste de micronúcleos é o mais utilizado para avaliar aberrações
cromossômicas e estruturais, podendo ser feito em outros tipos de células, além
da medula óssea, como fígado, pele, células do cólon.
Desde o século XIX, os micronúcleos eram conhecidos como corpúsculos
de Howel-Jolly
no sangue periférico de mamíferos. Em 1970 o teste de
micronúcleos foi estabelecido como um método alternativo para monitorar
aberrações cromossômicas por análise metafásica. Nos dias atuais, o teste é tido
como essencial dentro do grupo de testes de genotoxicidade. Tudo começou com
a correlação da presença destes corpúsculos de Howel-Jolly (Schmid, 1975) em
eritrócitos de gatos e ratos.
O mecanismo de formação do micronúcleo e a correlação entre
freqüências de eritrócitos micronucleados e células com aberrações
cromossômicas vem sido estudada desde 1984. Os fragmentos acêntricos das
cromátides e/ou cromossomos resultantes de aberrações cromossômicas formam
micronúcleos (Obe et al., 2007).
32
As células da medula extraídas do fêmur do animal são suspendidas em
soro bovino fetal e com uma gota da suspensão é feito um esfregaço em lâminas
histológicas, posteriormente são fixadas, coradas e prontas para análise em
microscópio. Onde a freqüência de eritrócitos policromáticos micronucleados é
avaliada, bem como, a freqüência de eritrócitos normocromáticos (NCE) (Figura
4). Eritrócitos do sangue também podem ser avaliados, contudo os tecidos da
medula contêm células mais uniformes, em maior quantidade e em constante
divisão facilitando a identificação da clastogênese e aneugênese (Obe et al.,
2007).
Figura 4. Micronúcleos em medula óssea. Observação em esfregaço de medula
óssea de camundongo de eritrócito policromático (EPC) com micronúcleo
(MN) e eritrócito normocromático (ENC) (Da Silva et al., 2003).
O teste de micronúcleos pode classificar se o micronúcleo é formado
apenas por fragmentos cromossômicos, caracterizando o fenômeno de
clastogênese (quebra de cromossomos), ou então, pode identificar a aneugênese
(perda ou ganho de cromossomos) que é o micronúcleo formado por um
cromossomo inteiro com centrômero. Isso só é possível combinando o teste com
a técnica de FISH (hibridação fluorescente in situ) (Ribeiro et al., 2003).
33
Ensaios genotóxicos são de extrema importância na avaliação de novas
drogas. O teste de micronúcleos in vivo em células do tecido hematopoiético de
roedores é muito empregado para detectar a indução de aberrações
cromossômicas (Obe et al., 2007).
I.6.3. Testes de avaliação do estresse oxidativo TBARS e Catalase
O estresse oxidativo ocorre quando há um desequilíbrio intracelular entre a
geração e os níveis enzimáticos normais que formam os mecanismos de defesa
aos agentes oxidantes numa dada espécie (Sies,1997). O aumento na
concentração das ROS pode levar a um aumento ou a inibição na atividade dos
sistemas enzimáticos de proteção. As ROS podem alterar a estrutura de
proteínas, danificar processos enzimáticos, membranas lipídicas além de
provocar lesões no DNA (Da Silva et al., 2003).
As ROS podem atingir todos os componentes celulares, em especial a
membrana devido à peroxidação lipídica que altera a sua permeabilidade e
estrutura. Conseqüentemente há perda de seletividade pelas trocas iônicas e
formação de substâncias citotóxicas como o malondialdeído (MDA) levando a
morte celular. A lipoperoxidação esta associada ao envelhecimento e a processos
carcinogênicos (Ferreira et al., 1997). Para determinar a lipoperoxidação se utiliza
a técnica de TBARS (Buege & Aust, 1978) que mede as substâncias reativas ao
ácido tiobarbitúrico.
Para proteger o organismo do ataque destas ROS existe uma série de
sistemas de defesa antioxidante, como enzimas específicas que inativam algumas
delas; enzimas que controlam a disponibilidade de metais na célula; captadores
não proteicos de radicais; e em paralelo, desenvolveram-se sistemas de
regeneração e reparação de macromoléculas danificadas, especialmente o DNA,
a fim de corrigir possíveis falhas ou sobrecargas nos mecanismos de defesa
(Halliwell & Gutteridge, 2000). Entre os principais sistemas antioxidantes
enzimáticos destacam-se a superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT) e a
glutationa peroxidase (GSH-Px), as quais catalisam a redução dos oxidantes
primariamente no meio intracelular (Maxwell,1995).
34
A enzima catalase (Cat) é uma ferrihemoenzima cuja função principal é
dismutar peróxido de hidrogênio formando água e oxigênio molecular. A atividade
da catalase em animais e plantas encontra-se nos peroxissomos. A atividade da
catalase em homogeinizados de tecidos é originária da ruptura dos peroxissomos
durante a homogeinização. Em animais, a catalase está presente em quase todos
os órgãos, principalmente no fígado. Por não possuírem peroxissomos, alguns
órgãos estão mais expostos aos danos provocados pela produção de ERO, como
coração, pulmões e cérebro (Borella e Varela, 2004).
I.6.4. Testes de avaliação do potencial antioxidante DPPH e
hipoxantina/xantina oxidase
O teste hipoxantina/xantina oxidase fundamenta-se no processo de
hidroxilação da hipoxantina, que é transformada em xantina e depois em ácido
úrico (devido à presença da enzima xantina oxidase). A hipoxantina/xantina
oxidase produz também o íon superóxido a partir do oxigênio e peróxido de
hidrogênio a partir da água. Na presença de Fe
+3
e EDTA, o íon superóxido reduz
o Fe
+3
para formar Fe
+2
, que forma numa segunda etapa o peróxido de hidrogênio
e o radical hidroxila, que são muito reativos. A metodologia para determinar a
concentração deste radical hidroxila no teste é baseada na reação dos radicais
hidroxilas com o ácido salicílico. Desta forma são formados dois compostos
estáveis: 2,3 e 2,5 dihidroxi-ácido-benzóico (2,3-DHBA e 2,5-DHBA), que podem
ser medidos por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) (Owen et al.,
1996; 2000). A presença de antioxidantes pode influenciar na produção de dois
compostos estáveis: 2,3-DHBA e 2,5 DHBA, pois pode ocorrer competição entre o
antioxidante e o ácido salicílico na reação com radicais livres (radicais hidroxila).
Sendo assim formará menos radicais hidroxila que podem reagir com ácido
salicílico, portanto terá menos compostos formados (2,3 DHBA e 2,5 DHBA). E
quanto menos compostos DHBA’s formados maior a atividade antioxidante do
composto testado (Moura et al., 2007).
O modelo para avaliação da atividade antioxidante utilizando DPPH• é
baseado na capacidade do radical livre estável 2,2-difenil-1-picrilhidrazil em reagir
35
com substâncias doadoras de H, incluindo compostos fenólicos (Roginsky & Lissi,
2005), sendo um método amplamente utilizado e relativamente rápido quando
comparado a outras técnicas (Sanchez-Moreno et al., 1998; Mensor et al., 2001).
Os antioxidantes reagem com DPPH, que é um radical livre estável, convertendo-
o a 1,1-difenil-2-(2,4,6 trinitrofenil) hidrazine e o grau de descoloração, medido via
espectrofotômetro, indica o potencial antioxidante dos compostos testados (Liu et
al., 2004).
36
II. OBJETIVOS
Devido aos poucos trabalhos que são encontrados sobre a toxicidade da
planta C. scolymus e ao seu uso aleatório pela população, o presente trabalho
objetivou avaliar os efeitos genotóxicos e mutagênicos provenientes de extratos
liofilizados de folhas e do receptáculo da alcachofra. Para tanto, os objetivos
específicos foram os seguintes:
1 - Analisar a constituição fitoquímica das folhas e receptáculo de C.
scolymus;
2 - Avaliar o estresse oxidativo dos extratos aquosos da folha e do
receptáculo por meio dos testes TBARS e CAT;
3 – Avaliar o potencial antioxidante de ambos os extratos por meio dos
testes hipoxantina/xantina oxidase e DPPH (2,2-Difenil-1-picrilhidrazil);
4 - Avaliar a genotoxicidade e mutagenicidade dos extratos (folha e
receptáculo) de alcachofra em camundongos por meio da realização de ensaio
cometa e teste de micronúcleos;
5 – Avaliar o efeito antigenotóxico através de ensaio cometa in vitro em
células sanguíneas de camundongos.
37
III. METODOLOGIA
III. 1. Preparação do Material Vegetal
As folhas jovens de alcachofra foram coletadas na cidade de Bento
Gonçalves, RS no mês de julho de 2007, antes da floração, pois segundo
Cechinel et al., 2003, nesta época a concentração dos compostos é maior. A
parte comestível, o receptáculo de Cynara scolymus foi adquirido no mercado
local. As folhas foram secas à temperatura ambiente e o receptáculo foi utilizado
fresco e ambos triturados. Após a trituração em moinho de facas, 100g do
material vegetal foi submetido a uma extração aquosa em 1L (1:10) a 80
o
C
(infuso), durante 20 minutos. Esta infusão foi congelada e depois foi submetida ao
processo de liofilização por cinco dias. A partir deste obteve-se o extrato aquoso
liofilizado utilizado para tratar os camundongos e realizar ensaios in vitro.
III. 2. Screening fitoquímico
III. 2.1. Detecção de substâncias fenólicas
Para a detecção de substancias fenólicas fez-se uma extração aquosa de:
2 g da amostra foi extraída em 20 ml de água destilada a 80ºC por 10 min.
Esfriou-se, filtrou-se e dividiu-se em 3 tubos de ensaio (reação a, b e branco).
Tubo 1: 5 ml de extrato das folhas mais cloreto férrico (1%); Tubo 2: 5 ml de
extrato das folhas mais hidróxido de potássio (3%); Tubo 3: somente 5 mL de
extrato das folhas. Foram adicionadas gotas de reagente de detecção nos tubos
teste. Coloração verde ou azul no tubo com cloreto férrico (FeCl
3
)
e amarelo ou
laranja no tubo com hidróxido de potássio (KOH) indicaram a presença de
substâncias fenólicas (Simões et al., 2002).
38
III. 2.2. Detecção de taninos
A fim de avaliar a presença de taninos pegou-se, 2 g da amostra da folha
em pó foi extraída em 20 ml de água destilada a 80ºC por 10 min. Esfriou-se,
filtrou-se e dividiu-se em 3 tubos de ensaio (reação a,b e branco). Tubo 1: 5 ml de
extrato das folhas mais 1 ml solução de gelatina (1%), formação de precipitado ou
turvação indica a presença de taninos. Tubo 2: 5 ml de extrato das folhas mais 3
gotas de cloreto férrico (3%), coloração azulada, indicativo de taninos
hidrolisáveis, coloração verde indicativo de taninos condensados. Tubo 3:
somente 5 ml de extrato das folhas (Simões et al., 2002)..
III. 2.3. Detecção de flavonóides
Para a extração aquosa de flavonóides pegou-se 2 g da amostra da folha
e receptáculo em pó foi extraída em 50 ml de água destilada a 80ºC por 10 min.
Esfriou-se, filtrou-se e dividiu-se em 2 tubos de ensaio (reação a e branco). Tubo
1: 5 ml de extrato das folhas mais 0,1g de óxido de magnésio (catalisador) mais
0,5 ml de ácido clorídrico; Tubo 2: somente 5 ml de extrato das folhas. Coloração
vermelha indicativo de flavonóides, coloração laranja indicativo de flavonas e
coloração violeta indicativo de flavononas (Simões et al., 2002).
A determinação dos flavonóides totais (F. BRAS. IV 2002)
1
da alcachofra
(Cynara scolymus) seguiu um protocolo específico para tal procedimento
envolvendo pesagens e cálculos das análises espectrofotométricas das soluções.
Para ambas as análises o procedimento ocorreu da mesma forma.
Primeiramente, para preparação da solução-mãe pesou-se 1,25 g de planta
moída e transferida para um balão de fundo redondo de 100 ml, adicionou-se 15
ml de metanol. Aqueceu-se em banho-maria, sob refluxo, por 30 minutos em
temperatura 45-50
0
C. Logo a mistura foi filtrada em algodão para um balão
volumétrico de 25 ml. O resíduo insolúvel retornou ao mesmo balão e foi
1
Fonte: Farmacopéia Brasileira: Parte II. Fascículo 4. São Paulo. Atheneu, 2002.
39
adicionado 10 ml de metanol. Aqueceu-se novamente sob refluxo por 10 minutos.
Filtrou-se e retornou-se para o mesmo balão de 25 ml. Após resfriamento a
temperatura ambiente, completou-se o volume para 25 ml com metanol. A partir
do preparado (solução-mãe) preparou-se 2 outras soluções; a solução-amostra
contendo 1 ml da solução-mãe adicionada de 0,5 ml de solução de cloreto de
alumínio a 2% em balão volumétrico com metanol. E a solução-branca foi
preparada com 1 ml de solução-mãe acrescida de metanol em balão de 25 ml.
Feitas as soluções, procedeu-se com a leitura em espectrofotômetro, onde se
obteve a absorbância da solução-amostra em comprimento 425 nm utilizando-se
da solução-branca para ajuste do zero. A partir do valor obtido foi calculado o teor
de flavonóides totais, conforme a equação:
Q = A x 62500
500 x m x (100 – Pd)
Onde A é absorbância média, m é a massa do vegetal (g) e Pd é o valor
determinado da porcentagem de perda de água por dessecação obtida pelo
método gravimétrico.
O método gravimétrico determina a perda de água por dessecação. Para o
procedimento, aplicado em ambos os extratos de alcachofra, foram pesados
pesa-filtros tampados e vazios antes de receberem a planta, e este valor anotado.
Após pesou-se 2 g da planta moída e transferiu-se para o pesa-filtro, previamente
dessecado na estufa durante 30 minutos, pesou-se novamente e o valor anotado.
Colocou-se o pesa-filtro com a amostra, dentro da estufa, previamente aquecida a
100
0
C por 5 horas. Após este período retirou-se o pesa filtro com a amostra e
deixou-se esfriar a temperatura ambiente. Depois de fria pesou-se novamente e
anotou-se o valor.
Com os valores obtidos procedeu-se com o cálculo da porcentagem de
água em relação ao vegetal seco ao ar livre, conforme a fórmula:
Pd = Pu – Ps x 100
Pa
Onde Pu é o peso do pesa-filtro contendo a amostra antes da dessecação
e Ps é o peso do pesa-filtro contendo a amostra após a dessecação.
40
III. 2.4. Detecção de antraquinonas
Extração aquosa: 2 g da amostra da folha em pó foi extraída com 10 ml de
hidróxido de potássio. Esfriou-se, filtrou-se. Em funil de separação adicionou-se
0,5 ml de ácido acético e extraiu-se com tolueno. A fase orgânica foi separada em
um tubo teste adicionando 2 ml de hidróxido de potássio (3%). Coloração rosa a
vermelho indicativo de presença de antraquinonas (Simões et al., 2002).
III. 2.5. Detecção de cumarinas
Para a análise de cumarinas utilizou-se 5 g da amostra da folha em pó
extraída em 20 ml de etanol (70%) a 80ºC por 10 min. Durante a extração o frasco
foi coberto com papel Whatman № 3, umedecido com KOH ou NaOH. Após
aquecimento durante 10-15 minutos o papel foi retirado e visto em luz UV 365 nm.
As cumarinas aparecem com fluorescência intensiva (Simões et al., 2002).
III. 2.6. Detecção de saponinas
Para a extração aquosa utilizou-se 0,5 g da amostra moída em 20 ml de
água destilada a 80ºC por 10 min. Depois de esfriada e filtrada a solução foi
separada em um tubo, diluída em água destilada (10 ml) e sofreu agitação em
cilindro graduado para observar o anel de espuma formado. O anel de espuma foi
medido por três vezes, logo após a agitação, após dez minutos e após a adição
de 3 ou 4 gotas de ácido clorídrico. O desenvolvimento de espuma superior a 10
mm e persistência em repouso é indicativo de presença de saponinas (Simões et
al., 2002).
41
III. 2.7. Detecção de hetorosídeos cardiotônicos
Utilizou-se 1g da amostra em 20 ml de água destilada e acetato de chumbo
(10%) a 80ºC por 10 min. Esfriou-se, filtrou-se e extraiu-se três vezes com
clorofórmio. A fase orgânica foi separada em três cadinhos de cerâmica para os
testes de identificação.
1. Reação de Baljet: evaporou-se no cadinho 5 ml da solução
clorofórmica, adicionaram-se algumas gotas do reagente de Baljet
ao resíduo. A caracterização de núcleos lactônicos se dá pelo
desenvolvimento de cor alaranjado ao vermelho-escuro.
2. Reação de Keller-Kiliani: utilizada para detecção de açúcares.
Evaporou-se no cadinho 5 ml da solução clorofórmica, ao resíduo foi
adicionado 3 ml de ácido acético e 1 gota de cloreto férrico (5%).
Verteu-se a solução para um tubo com 2 ml de ácido clorídrico. O
desenvolvimento de um anel marrom avermelhado e a coloração
azul na camada acética indica presença de açúcares.
3. Reação de Salkowsky: utilizada para detectar esteróides. No
cadinho com 5 ml da solução clorofórmica adicionou-se 5 gotas de
acido sulfúrico. O desenvolvimento de coloração vermelha é
indicativo da presença de esteróides (Simões et al., 2002).
III. 2.8. Detecção de alcalóides
Uma extração aquosa foi feita com 5 g da amostra em pó em 10 ml de
ácido clorídrico (1%) a 80ºC por 10 min. Esfriou-se, filtrou-se e separou-se em três
placas de Petri de vidro 1 ml. Na primeira adicionou-se 4 gotas de reagente de
Bertrand, na segunda adicionou-se 4 gotas de reagente de Mayer e na terceira
adicionou-se 4 gotas de reagente de Dragendorff.
42
III. 3. Estresse Oxidativo
III. 3.1. Métodos para medir o estresse oxidativo.
Para avaliação do estresse oxidativo foram coletadas amostras de sangue,
medula, cérebro e fígado. O sangue foi centrifugado por 5 min em 1000 rpm e o
pellet foi ressuspendido em 1,5 ml de cloreto de sódio 0,9%. Para a catalase o
pellet ressuspendido foi diluído 100 vezes em cloreto de sódio 0,9%. O fígado
500mg foi macerado com 2 ml de cloreto de sódio 0,9% e centrifugado para
baixar debris por 3 minutos a 1000 rpm depois foi utilizado o sobrenadante. Para
o teste TBARS o sangue foi diluído com cloreto de sódio 0,9% na concentração
(1:3) e o fígado (1:10).
III. 3.2. Substâncias que reagem ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS)
A peroxidação lipídica é um processo complexo e ocorre em múltiplos
estágios. Por isso, muitas técnicas são utilizadas para medir a peroxidação de
lipídios de membrana, lipoproteínas ou ácidos graxos. No teste TBARS o MDA
(malondialdeído), formado durante a peroxidação lipídica, reage com o TBA para
gerar um composto colorido que é detectado espectrofotometricamente em
530nm (Garcez et al., 2004).
A amostra de sangue e fígado diluídos na quantidade de 300 µl foi
centrifugada com 600 µl de TCA 15% (ácido tricloroacético) por 10 minutos a
10.000 rpm. A 500 µl de sobrenadante foi adicionado em tubo de ensaio 500 µl de
TBA 0,67% (ácido tiobarbitúrico) e incubado por 20 minutos em banho fervente
(100ºC). Após os tubos de ensaio foram resfriados por 10 minutos para posterior
leitura em espectrofotômetro em 532 nm.
43
III. 3.3. Teste da Atividade da Catalase (CAT)
A CAT catalisa a decomposição de peróxido de hidrogênio em água e
oxigênio. O ensaio constitui em medir a diminuição da absorção do peróxido de
hidrogênio em 240 nm. A medida espectrofotométrica consiste em colocar nas
cubetas o meio de reação (solução reguladora de fosfato 50 mM) com distintas
alíquotas da amostra em seguida adiciona-se o peróxido de hidrogênio e a
concentração é expressa em unidade de catalase por miligrama de proteína
(Unid. CAT/mg proteína) (Boveris e Chance, 1973).
Para a técnica da catalase a leitura foi feita em espectrofotômetro em 240
nm em cubeta de quartzo e devendo acertar em 100% de transmitância com o
tubo branco (tampão fosfato + 100 µl da amostra). Para o teste adicionar a
amostra (100 µl) a 1 ml de peróxido de hidrogênio 14 mM e ler o decréscimo de
absorbância em 30 e 60 segundos. A concentração é expressa em Unid CAT/mg
de proteína.
III. 4. Atividade Antioxidante
III. 4. 1. Métodos para avaliar a atividade antioxidante
Para avaliar o potencial antioxidante dos extratos de alcachofra foram
utilizados reagentes químicos como DPPH (2,2-difenil-1-picriidrazil), hipoxantina,
xantina oxidase, ácido ascórbico, rutina e ácido salicílico adquiridos pela Sigma
(St. Louis).
III. 4. 2. Teste Hipoxantina/xantina oxidase
O método empregado para avaliar a habilidade dos extratos de seqüestrar
os radicais hidroxilas foi baseado no descrito por Owen et al. (1996).
44
Primeiramente os extratos foram dissolvidos em solução tamponante
(hipoxantina, Fe (III), EDTA e ácido salicílico) numa concentração de 2,0 mg/ml e
diluído (em triplicata) em tampão até atingir o volume final de 1,0 ml. Uma alíquota
de 5 µl de xantina oxidase dissolvida em 3,2 M (NH
4
)
2
SO
4
foi adicionada para
iniciar a reação. As amostras foram incubadas for 3 h a 37 °C. Uma alíquota de 30
µl de reação foi analisada por HPLC seguindo as condições cromatográficas
descritas por Owen et al. (2000,2003). A análise cromatográfica foi realizada com
gradiente baseado em água/metanol e ácido acético com coluna de fase reversa
BondaPack C18 (Waters) e detecção a 325nm. O equipamento de HPLC tem um
módulo de separação 2695 (Waters) e um detector UV 2487 (Waters). A
hidroxilação de ácido salicílico e hipoxantina foi monitorada a A= 325 e A=278nm,
respectivamente. A quantidade de dihidroxifenois (2,3 e 2,5 dihidroxi-ácido-
benzóico (2,3-DHBA e 2,5-DHBA) produzidos pelo radical hidroxila (OH
.
) foi
determinada pela curva padrão preparada com os respectivos dihidroxifenóis.
III. 4. 3. Teste DPPH
O seqüestro de radicais livres do DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil) foi
medido conforme método descrito por Yamaguchi et al. (1998) modificado em
ambos os extratos da alcachofra onde foram adicionados Tris-HCl (100 mM), pH
7.0 com 250 mM de DPPH dissolvido em metanol. Foram feitas 6 diluições para
cada extrato e submetidos por 20min sem contato com luminosidade. Mediu-se
absorbância a 517 nm com espectrofotômetro Shimadzu modelo UV-1602PC
(Kyoto, Japan). O experimento foi conduzido em triplicata. Os resultados foram
expressos como AEAC (capacidade oxidante equivalente do ácido ascórbico) em
gramas e calculado por:
AEAC (µg AA/g) = IC
50(AA)
/ IC
50(sample)
x 1 g
45
III. 5. Ensaio Cometa
III. 5. 1. Tratamento in vivo
Foram utilizados camundongos (Mus musculus) adultos com peso médio
de 20-40g, criados no biotério da Central de Laboratórios da ULBRA, em
ambiente com temperatura controlada (25
o
C) e ciclos de 12h de luz e 12h escuro
em umidade relativa oscilando entre 30-70% em gaiolas de polietileno
suplementadas com água e comida ad libitum.
Os animais foram identificados com cores diferentes e receberam via
gavage as doses respectivas a cada grupo durante 3 dias. Os animais foram
pesados antes da dosagem oral, e o volume que foi administrado foi calculado de
acordo com o peso do animal (0,1 ml da substância teste por 10 g do animal).
Os camundongos foram divididos em diferentes grupos que receberam os
seguintes tratamentos:
1. Grupo Controle Negativo (C-): 5 machos e 5 fêmeas tratados com o solvente
água (10 ml/kg).
2. Grupo Controle Positivo (C+): 5 machos e 5 fêmeas tratados com doses em
dois tempos de CP (ciclofosfamida) (2 dosagens de 25 mg/kg; 24h e 48h).
3. Grupo Teste 1 (G1): 5 machos e 5 fêmeas tratados com doses em três tempos
(24, 48 e 72h) onde apresenta a concentração máxima do extrato foliar (2000
mg/kg).
4. Grupo Teste 2 (G2): 5 machos e 5 fêmeas tratados com doses em três tempos
(24, 48 e 72h) onde apresenta a concentração média do extrato foliar (1000
mg/kg).
5. Grupo Teste 3 (G3): 5 machos e 5 fêmeas tratados com doses em três tempos
(24, 48 e 72h) onde apresenta a concentração mínima do extrato foliar (500
mg/kg).
6. Grupo Teste 4 (G4): 5 machos e 5 fêmeas tratados com doses em três tempos
(24, 48 e 72h) onde apresenta a concentração máxima do extrato do receptáculo
(2000 mg/kg).
A dose de 2000 mg/kg é considerada como dose máxima para o
tratamento conforme recomendação interna (OECD, 1997).
46
III. 5. 2. Tratamento in vitro
Para verificar a antigenotoxicidade da alcachofra utilizaram-se as lâminas
do Controle Negativo e do grupo G1 (extrato foliar 2000 mg/kg) e submeteu-se a
um tratamento com exposição das amostras ao peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) na
concentração de 0,25 mM durante 5 minutos. Logo as lâminas foram lavadas com
solução salina (NaCl 9%) por 3 vezes. A metodologia seguiu as recomendações
de Lovell & Omori (2008).
III. 5. 3. Ensaio Cometa
As amostras de sangue foram homogenizadas com 12 µl de heparina, já as
células provenientes da medula óssea, fígado e cérebro tiveram que sofrer uma
homogenização com o meio RPMI (Rosewell Park Memorial Institute 1640
medium) (Hartmann et al., 2003).
As amostras foram misturadas com uma fina camada de agarose “low
melting” 0,75% e colocadas sobre lâminas pré-cobertas com agarose normal à
1,5%. As lâminas foram mergulhadas em uma solução de lise (2,5 M NaCl, 100
mM EDTA e 10 mM Tris, pH 10 com adição de 1% Triton X-100 e 10% DMSO na
hora do uso), por 48 horas a 4
o
C, para o rompimento das membranas celulares. O
EDTA serve para quelar o cálcio e o magnésio prevenindo a ativação da
endonuclease, o DMSO age como seqüestrador de radicais limitando o dano
oxidativo no DNA (Smith et al., 2008). Procedeu-se com a eletroforese incubando-
as em tampão alcalino (300 mM NaOH e 1 mM EDTA, pH > 13) por 20 minutos e
subseqüente aplicação de corrente elétrica de 300 mA e 25 V (0,90 V/cm) por 15
minutos. As lâminas foram neutralizadas logo após a eletroforese com tampão
Tris 0,4 M, pH 7,5 e coradas com prata (Nadin et al., 2001).
Foram analisadas 100 células por indivíduo (50 de cada lâmina duplicada),
em microscópio Leica CME. As células foram classificadas visualmente em cinco
classes, de acordo com o tamanho da cauda, sem danos (classe 0) até danos
47
máximos (classe 4). Assim, o índice de danos de cada grupo estudado pode ir de
zero (100x0; 100 células observadas completamente sem danos) a 400 (100x4;
100 células observadas com dano máximo).
III. 6. Teste de Micronúcleos
Os testes com sangue e medula de camundongos foram realizados de
acordo com protocolos e recomendações internacionais já estabelecidas
(Mavournin et al., 1990), seguindo as etapas seguintes: Primeiramente foi
coletado sangue total dos animais e feito esfregaço direto em lâminas limpas para
microscópio (duas lâminas por indivíduo); deixou-se secar em temperatura
ambiente; fez-se a coloração com Giemsa e tampão fosfato pH 5,8 por cinco
minutos; codificaram-se as lâminas coradas. Os animais foram sacrificados, para
o teste com medula, por deslocamento cervical seguindo recomendações da
OECD (1997). Logo a seguir o preparo seguiu a seqüência: os fêmures dos
camundongos foram removidos, limpos e as duas extremidades foram cortadas; a
medula óssea foi extraída com uma agulha histológica e colocada sobre a lâmina
com uma gota de soro bovino fetal; depois de homogeneizada, foi feito esfregaço
com cada fêmur; após a preparação do esfregaço, as lâminas foram secas e
coradas com uma mistura de 60 ml de Giemsa, 30 ml de May-Grünwald Giemsa e
10 ml de tampão fosfato (pH 5,8) por 5 minutos; em seguida foram enxaguadas
em água destilada deixando-se secar em temperatura ambiente. Inicialmente foi
determinada uma relação entre os linfócitos jovens (policromatófilos - EPC) e os
maduros (normocromatófilos - ENC), em 1000 células eritróides de cada roedor.
Esta relação evitou falso - negativos devido à falta de EPC. Juntamente foram
contados 1000 EPCs por lâmina, sendo duas lâminas por animal. Esta
metodologia foi empregada da mesma maneira para todos os tecidos analisados.
48
III. 7. Análise estatística
A análise estatística foi conduzida utilizando ANOVA, com pós teste
Dunnett, onde valores de P< 0,05 foram considerados estatisticamente
significativos. Quando houve diferenças em relação às variâncias utilizou-se o
teste não paramétrico Kruskal – Wallis onde valores de P<0,05 foram
considerados significativos (Dunn). Foram considerados genotóxicos os
tratamentos que aumentaram significativamente o ID (Índice de dano) e/ou a FD
(Freqüência de dano %) em relação ao controle negativo. Foram considerados
antigenotóxicos os tratamentos que diminuíram significativamente os danos
induzidos pelo peróxido de hidrogênio. Para análise dos resultados das
avaliações de estresse oxidativo e potencial antioxidante foram aplicados os
mesmos testes estatísticos.
49
IV. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Durante o processo de preparo da infusão a flor foi despedaçada e triturada
e mostrou escurecimento (browning) acentuado dos tecidos. Este fato pode ser
explicado pela alta concentração de polifenóis. O escurecimento é causado pela
oxidação de certos compostos polifenólicos catalisados por enzimas, como as
polifenol oxidases (PPO) e o escurecimento é atribuído a reações entre os
polifenóis e íons metálicos como o ferro, por exemplo. No caso da alcachofra o
fenol envolvido é o ácido clorogênico (Lattanzio et al., 1993).
Na tabela 1 podemos observar o resultado do screening fitoquímico de C.
scolymus. As folhas de alcachofra apresentaram substâncias fenólicas,
flavonóides e saponinas e o receptáculo apresentou substâncias fenólicas e
flavonóides.
Tabela 1. Análise fitoquímica das folhas e do receptáculo de alcachofra (C.
scolymus).
Compostos Folhas Flor
Substâncias Fenólicas Positivo Positivo
Taninos
Negativo Negativo
Flavonóides Positivo Positivo
Cumarinas
Negativo Negativo
Antraquinonas
Negativo Negativo
Cardiotônicos
Negativo* Negativo
Saponinas Positivo
Negativo
Alcalóides
Negativo** Negativo***
(*) a reação de Baljet e Keller foram positivas. (**) precipitou o reagente Mayer e Bertrand. (***)
precipitou somente o reagente Bertrand.
Conforme a bibliografia os flavonóides presentes no receptáculo da
alcachofra são a narirutina (Wang et al., 2003), apigenina (Zhu et al., 2003) e
cianidina (Schutz et al., 2006) e como constituintes das folhas o escolimosídico
(Cechinel et al., 2003), cinarosídico (Wang et al., 2003) e luteolina (Fratianni et al.,
50
2007). Embora os compostos variem entre os extratos a quantidade de
flavonóides totais foi muito similar entre ambas as partes da alcachofra (folha =
0,5644 e receptáculo = 0,6544).
Além dos flavonóides podemos citar como substâncias fenólicas
detectadas na análise fitoquímica da alcachofra, o ácido cafeico (Azzini et al.,
2007), ácido ferúlico (Azzini et al., 2007) presentes nas folhas e cinarina (Speroni
et al., 2003) e ácido clorogênico (Wabg et al., 2003) encontrados nas folhas e no
receptáculo. Quanto à presença de saponinas, somente as folhas apresentaram
resultado positivo. No estudo de Krizkova et al.( 2004) a folha da espécie de
alcachofra C. cardunculus apresentou três saponinas, denominadas
cinarasaponinas 1s, 2s e 3s.
O teste que caracterizou a ausência de cardiotônicos para a alcachofra
apresentou resultado positivo no ensaio de Baljet, o qual indica a presença de
lactonas e o ensaio de Keller- Kiliani sugeriu a presença de açúcares. A literatura
aponta a presença da lactona sesquiterpênica cinaropicrina (Emendorfer et al.,
2005) e a presença de açúcares como o polissacarídeo inulina na alcachofra
(López-Molina et al., 2005).
Os dados aqui obtidos vão de encontro com os da literatura referente à
composição química (Tabela 2) e cujas estruturas químicas observadas no Anexo
2.
51
Tabela 2. Tabela dos compostos químicos relatados na literatura para C. scolymus.
Compostos
Fórmula
Molecular
Classificação Citações
FOLHAS
Cinaropicrina C
19
H
22
O
6
Lactona
sesquiterpênica
Emendorfer et al., 2005 ; Cho et al., 2000,2004 ; Shimoda et
al., 2003 ; Cheng et al., 1992 ; Macchia et al., 2004
Lupeol C
30
H
50
O
Triterpeno
Cechinel et al., 2003
Cinarosídio (luteolina-7-O-glicosídio) C
21
H
20
O
11
Flavonóide
Wang et al., 2003 ; Zhu et al., 2004
Ácido Cafeico C
9
H
8
O
4
Acido fenólico
Azzini et al., 2007
Inulina C
6n
H
10n+2
O
5n+1
Polissacarídeo
López-Molina et al., 2005
Ácido Ferúlico C
10
H
10
O
4
Acido fenólico
Azzini et al., 2007
Escolimosídio
(luteolina-7-O-rutinosideo)
C
27
H
32
O
15
Flavonóide
Cechinel et al., 2003
Luteolina
Luteolina-7-rutinosideo
C
15
H
10
O
6
Flavonóide
Wang et al., 2003 ; Zhu et al., 2004 ; Fratianni et al., 2007;
Michels et al., 2005
RECEPTÁCULO
Apigeninas
Apigenina-7-rutinosideo
Apigenina-7-glicopiranosideo
C
27
H
30
O
14
C
21
H
20
O
10
Flavonóide
Wang et al., 2003 ; Zhu et al., 2004
Narirutina
Naringenina-7-O-glicosideo
C
27
H
32
O
14
Flavonóide
Wang et al., 2003
Cianidina C
15
H
11
O
6
Antocianina
(flavonóide)
Schutz et al., 2006
FOLHAS E RECEPTÁCULO
Cinarina 1,3-Di-O-ácido cafeoilquinico C
25
H
24
O
11
Ácido fenólico
Wang et al., 2003 ; Zhu et al., 2004 ; Speroni et al., 2003
Ácido clorogênico
5-O-acido cafeoilquinico
C
16
H
18
O
9
Ácido fenólico
Wang et al., 2003 ; Azzini et al., 2007 ; Zhu et al., 2004
52
No decorrer do tratamento durante três dias consecutivos alguns efeitos
tóxicos puderam ser observados nos camundongos. Os sintomas observados nos
camundongos foram letargia e perda de peso (Figura 5). Nos grupos que
receberam o extrato foliar, nas três doses, tanto os machos quanto as fêmeas
apresentaram quadro de letargia, sendo mais acentuada no grupo que recebeu a
dose máxima de extrato (2000 mg/kg). Neste mesmo grupo após 24h da primeira
dose, três machos morreram (Anexo 3).
O grupo que recebeu o extrato do receptáculo não apresentou efeito
letárgico, porém apresentou redução de peso corpóreo dos animais. Esta
redução, no entanto, não foi significativa. A letargia observada nos grupos que
foram tratados com extrato foliar, nas três doses provavelmente se deve a
propriedade analgésica das folhas de alcachofra. De acordo com o estudo de
Ruppelt et al. (1991) esta atividade ocorre nos camundongos de ambos os sexos
em virtude do extrato aquoso das folhas de alcachofra induzir uma inibição de
contrações musculares (90,72%). A letargia pode ser explicada devido a atividade
da PPO que tem seu metabolismo elevado devido ao ácido clorogênico (Dogan e
Salman, 2007). C. scolymus apresenta alta concentração de compostos não
digeríveis como a fibra inulina, por exemplo, e esta alta concentração sustenta a
perda de peso apresentado pelos animais no experimento, ou seja, a presença de
compostos não digeríveis contribui para a diminuição da ingesta de alimentos em
ratos tratados com alcachofra dando a sensação de saciedade (Delargy et al.,
1997).
53
G1Peso D1 G1Peso D3 G2Peso D1 G2Peso D3 G3Peso D1 G3Peso D3 G4Peso D1 G4Peso D3 C-Peso D1 C-Peso D3 C+Peso D2 C+Peso D3
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
***
*
Grupos
Peso (g)
Figura 5. Peso dos animais verificado no primeiro (D1) e último dia (D3) de tratamento com (EF) extrato foliar (G1=
2000mg/kg/ G2=1000mg/kg/ G3= 500mg/kg) e (ER) extrato do receptáculo (G4 = 2000mg/kg). (C-) controle negativo
– água / (C+) controle positivo = Ciclofosfamida. Teste t-Student significativo para P<0,05(*) e (***) P<0,0001.
EF 2000 mg/Kg EF 1000 mg/Kg EF 500 mg/Kg ER 2000 mg/Kg
C- C+
54
Ao final do tratamento, observou-se em 100% dos animais uma hipertrofia
do cólon, no grupo que recebeu a maior dose de extrato foliar (dados não
apresentados). A explicação para o ocorrido pode ser devido à presença do
composto chamado inulina, que anteriormente fora citada para justificar a perda
de peso observada nos animais, no extrato foliar, que é um polissacarídeo
indigerível presente na alcachofra que estimula o crescimento bacteriano do
intestino. Ela é metabolizada, somente no intestino, pelas bactérias que liberam
metano, gás carbônico e hidrogênio. A hipertrofia do cólon está relacionada com
processos fermentativos que ocorrem com estes compostos não digeríveis
acomodando os polissacarídeos fermentados (Wyatt et al., 1986).
Na avaliação do estresse oxidativo do tecido hepático dos camundongos
tratados com extrato foliar e do receptáculo da alcachofra não se verificou a
diferença significativa em relação ao grupo controle quanto à peroxidação lipídica
pelo teste TBARS conforme figura 6. Apenas uma diferença foi observada entre o
grupo que recebeu a menor dose (G3) e o grupo com a dose intermediária de
extrato foliar (G2). A peroxidação lipídica é um marcador para a formação de
espécies reativas de oxigênio (ROS), capazes de causar danos oxidativos em
macromoléculas como DNA e lipídios. Neste caso não foi possível verificar o
estresse oxidativo induzido pela alcachofra.
55
C- EF2000mg/kg EF1000mg/kg EF500mg/kg ER2000mg/kg
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
*
GRUPOS
TBARS (nMol equiv MDA/mg proteína)
Figura 6. Média e desvio padrão da peroxidação lipídica (TBARS) dos animais
tratados com as diferentes doses. EF (extrato foliar), ER (extrato do
receptáculo). Valores significativos para P<0,05 – teste Tukey.
O teste da catalase foi realizado com amostras de fígado dos grupos teste
que receberam extrato foliar e extrato do receptáculo de alcachofra. A figura 7
mostra que não houve variação significativa entre os grupos quanto ao nível de
catalase produzida.
56
C- EF2000mg/kg EF1000mg/kg EF500mg/kg ER2000mg/kg
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Grupos
Unid.CAT/mg proteína
Figura 7. Média e desvio padrão da catalase (CAT) dos animais tratados com as
diferentes doses. EF (extrato foliar), ER (extrato do receptáculo).
A atividade antioxidante dos extratos de alcachofra foi avaliada pelos testes
DPPH e hipoxantina/xantina oxidase. Além de não induzir a formação de ROS,
nos testes de avaliação da atividade antioxidante (Tabela 3) verificamos a
capacidade de seqüestrar os radicais livres (Figura 8).
Para análise desta atividade ambos os extratos, bem como ácido ascórbico
e rutina (controles positivos), foram testados usando o teste DPPH (Yamaguchi et
al., 1998). Os resultados deste efeito (Tabela 3) mostram uma atividade dose –
dependente. A capacidade dos extratos de alcachofra (EF e ER) em seqüestrar
os radicais livres foi 70,6% e 43%, respectivamente, na concentração de 1000
µg/ml. O valor de IC
50
para os extratos foram 399,48 µg/mL (extrato foliar) e
1124,39 µg/mL (extrato do receptáculo). Comparando com os resultados obtidos
nos controles positivos o efeito do ácido ascórbico (IC
50
= 4,03 µg/mL) e rutina
(IC
50
= 19,59 µg/mL) foi 99,6% e 98,3%, respectivamente para a concentração de
1000 µg/ml e 99,4% e 83,4% respectivamente para a concentração de 100 µg/ml.
57
Tabela 3. Inibição de DPPH* pelo teste DPPH dos extratos aquosos de
folhas e das flores, da rutina e do ácido ascórbico e AEAC (= capacidade
antioxidante equivalente ao ácido ascórbico).
Amostra Inibição (%) IC
50
(µg/mL)
AEAC
(µg/g)
Concentração
1
µg/ml
10
µg/ml
100
µg/ml
1000
µg/ml
Ácido
ascórbico
9,70 98,11 99,40 99,62 4,03 ± 0,16 1,0000
Rutina
3,62 34,41 83,40 98,37
19,59 ± 0,76
0,2058
EF
2,07 4,52 15,12 70,62
399,48 ± 16,48
0,0101
ER
0,79 1,56 4,55 42,92
1124,39 ± 44,65
0,0036
*DPPH = 2,2-Difenil-1-picrilhidazil; ácido ascórbico e rutina como controles
positivos.
A atividade antioxidante in vitro de ambos os extratos também foi
determinada pelo monitoramento da produção de ácidos hidroxil benzóicos
(DHBA) como produto da ação entre o radical hidroxila e o ácido salicílico pelo
teste hipoxantina/xantina oxidase (Owen et al., 1996). A redução da oxidação total
dos produtos em função da concentração dos extratos (folhas e receptáculo) pode
ser verificada na figura 8. Ambos os extratos mostram uma capacidade
antioxidante in vitro dose-dependente. O extrato aquoso foliar de alcachofra (EF)
tem atividade antioxidante maior, reduzindo a formação de ambas as espécies de
DHBA para 38,2% na dose mais concentrada (2 mg/ml) enquanto o extrato
aquoso do receptáculo (ER) mostrou menor redução (23,7%).
Observa-se ainda que em ambos os testes o extrato foliar demonstrou
maior atividade antioxidante. Diferentes autores vêm demonstrando esta atividade
relacionada com diferentes compostos presentes nas folhas de alcachofra como
lupeol e escolimosídio (Cechinel et al., 2003), cinarosídio, apigenina, naritutina
(Wang et al., 2003), ácido cafeico, clorogênico e ferúlico (Azzini et al., 2007),
cinarasaponinas (Krizkova et al., 2004).
58
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
0
25
50
75
100
Extratos de alcachofra (mg/ml)
% DHBA
Figura 8. Inibição da geração de ROS (espécies reativas de oxigênio) pelo extrato
aquoso de folhas (■) e pelo extrato aquoso de receptáculo (▲) usando o
teste de hipoxantina/xantina oxidase. Os dados foram apresentados com
média de desvio padrão n=3.
Para o teste de micronúcleos não se verificou um efeito mutagênico para
os grupos tratados com ambos os extratos (Tabela 4 e 5), não induzindo aumento
significativo de micronúcleos em sangue periférico de camundongos (Tabela 4). O
único grupo que apresentou diferença significativa foi o controle positivo. Quando
comparados por sexo encontrou-se uma diferença significativa, somente entre os
gêneros do grupo que recebeu a maior dose do extrato foliar, resultado
considerado esporádico visto que nenhuma tendência fora observada.
59
Tabela 4. Média e desvio padrão de eritrócitos policromáticos micronucleados do
tecido sanguíneo de camundongos tratados com extrato foliar e do
receptáculo de alcachofra.
Eritrócitos Micronucleados em Sangue
Grupos
Dose
(mg/kg)
Gênero
Valor
individual
(mEPC/2000EPC)
Total
de
MNs
Por
gênero
M ± D.P.
Por grupo
M ± D.P.
M 5,4,5,6,8 28 5,60 ± 1,51
Controle
Positivo
a
25
F 6,10,5,5,6 27 6,40 ± 2,07
6,00 ± 1,76***
M 0,1,0,1,0 2 0,40 ± 0,54
Controle
Negativo
b
-
F 0,1,1,1 3 0,75 ± 0,55
0,56 ± 0,50
M 2,3,5 10 3,33 ± 1,52
G1(EF) 2000
F 3,0,1 4 1,33 ± 1,52
2,33 ± 1,75
M 2,2,1,0,1 6 1,20 ± 0,83
G2(EF) 1000
F 2,0,2,0,1 5 1,00 ± 1,00
1,10 ± 0,88
M 1,0,1,0 2 0,50 ± 0,57
G3(EF) 500
F 0,1,2,2,1 6 1,20 ± 0,83
0,89 ± 0,78
M 1,3,0,0,1 3 1,00 ± 1,22
G4(ER) 2000
F 2,0,0,1,0 3 0,60 ± 0,89
0,80 ± 1,03
a
(Ciclofosfamida),
b
(água). MN (Micronúcleos), EPC (Eritrócitos Policromáticos), ENC
(eritrócitos normocromáticos), EF = extrato foliar, ER = extrato do receptáculo, G1 (EF
2000mg/kg), G2 (EF 1000mg/kg), G3 (EF 500mg/kg), G4 (ER 2000mg/kg). (***) Valor
significativo P<0,001, ANOVA – Dunnet.
Este teste também foi realizado com medula óssea (Tabela 5), tecido mais
importante na avaliação de substâncias químicas no processo de mutagênese e
carcinogênese, já que é um tecido proliferativo (hematopoiético). Na medula
óssea também não se observou diferença significativa dos grupos tratados com
os extratos e o controle negativo. Neste tecido não se pode verificar efeito tóxico
induzido pelas doses utilizadas (EPC/ENC). De forma similar Miadokova et al.
(2008) em estudo utilizando o teste Ames, não encontrou efeito mutagênico, isto
é, o extrato não induziu aumento na freqüência de colônias revertentes de
60
Salmonella typhimurium (linhagens TA97, TA98, TA100, TA102) com ou sem
ativação metabólica.
Tabela 5. Média e desvio padrão de eritrócitos policromáticos micronucleados do
tecido medular de camundongos tratados com os extratos das folhas e do
receptáculo de alcachofra.
Eritrócitos Micronucleados em Medula Óssea
Grupos
Dose
(mg/kg)
Gênero
Valor
individual
(mEPC/2000
EPC)
Total
de
MNs
Por
gênero
M ± D.P.
Por grupo
M ± D.P.
EPC/ENC
M
5,5,7,11,4 32 6,40 ± 2,79
Controle
Positivo
a
25
F
6,11,5,8,8 38 7,60 ± 2,30
7,00 ± 2,49***
1,08 ± 0,36
M
0,0,1,1,0 2 0,40 ± 0,54
Controle
Negativo
b
-
F
1,0,1,1 3 0,75 ± 0,50
0,57 ± 0,53
1,18 ± 0,14
M
3,0,3 6 2,00 ± 1,73
G1(EF) 2000
F
2,0,1 3 1,00 ± 1,00
1,50 ± 1,38
1,16 ± 0,17
M
2,1,0,0,1 4 0,80 ± 0,83
G2(EF) 1000
F
1,1,0,2,1 5 1,00 ± 0,70
0,90 ± 0,74
1,24 ± 0,29
M
2,1,2,0 5 1,25 ± 0,95
G3(EF) 500
F
0,3,1,1,1 6 1,20 ± 1,09
1,22 ± 0,97
1,10 ± 0,13
M
1,0,1,1,1 4 0,80 ± 0,44
G4(ER) 2000
F 0,0,0,1,2 3 0,60 ± 0,89
0,70 ± 0,67
1,30 ± 0,22
a
(Ciclofosfamida),
b
(água). MN (Micronúcleos), EPC (eritrócitos policromáticos), ENC (eritrócitos
normocromáticos), EF = extrato foliar, ER = extrato do receptáculo, G1 (EF 2000mg/kg), G2 (EF
1000mg/kg), G3 (EF 500mg/kg), G4 (ER 2000mg/kg). (***) Valor significativo P<0,001, ANOVA –
Dunnet.
O ensaio cometa foi aplicado, no presente estudo, nos seis grupos teste
incluindo o controle positivo nas amostras de sangue, medula, cérebro e fígado
(Tabela 6 e 7). Na tabela 6 podemos observar os resultados referentes ao índice
de danos (ID) e na tabela 7 a freqüência de danos (%FD).
61
O índice de danos no tecido sanguíneo dos animais do grupo tratado com a
maior dose de extrato foliar apresentou aumento significativo, bem como para
fígado, medula e cérebro. Também foi observado, no fígado e cérebro aumento
significativo na freqüência de danos. Ainda pode-se observar que na medula
óssea houve aumento no índice de danos significativo para o grupo tratado com a
menor dose do extrato foliar, sendo que os machos apresentaram maior
sensibilidade para os tecidos: fígado e cérebro. Por não se observar uma
tendência nas outras doses estes dados foram considerados ao acaso.
De um modo geral o grupo que recebeu extrato do receptáculo (ER) da
alcachofra não apresentou genotoxicidade para nenhum dos tecidos avaliados.
Este resultado pode ser explicado devido à presença de antocianinas, flavonóides
não-catecólicos responsáveis pela cor roxa da alcachofra, e também relacionada
na prevenção de algumas patologias como doenças cardiovasculares, câncer,
além de apresentar atividade antioxidante pelo poder de quelar íons metálicos,
inibir a peroxidação lipídica, reduzir radicais livres e formar complexos com o DNA
(Schutz et al., 2006).
O resultado positivo no ensaio cometa nos camundongos, principalmente
para o grupo G1 (EF 3X2000 mg/kg) pode ser explicado pela presença de
lactonas sesquiterpênicas que tem inúmeras propriedades biológicas. Dentre suas
propriedades estão atividade anti-tumoral, anti-úlcera, antiinflamatória,
neurocitotóxica e cardiotônica (Cho et al., 2000). O estudo realizado por Cho, et
al. (2004) demonstrou que a cinaropicrina apresenta efeito citotóxico e pró-
apoptótico contra vários tipos de células como macrófagos, eosinófilos,
fibroblastos e linfócitos. A ação apoptótica da cinaropicrina pode ser devido à
geração de ROS. Os flavonóides nas folhas de alcachofra, como luteolina (Wang
et al., 2003), cinarosídio e escolimosídio (Cechinel et al., 2003), apresentam o
radical catecol em sua estrutura química. Sabe-se que a oxidação do catecol para
quinonas gera eletrófilos que podem induzir danos ao DNA (Oikawa et al., 2001;
Miadokova et al., 2008).
62
Tabela 6. Índice de dano em sangue, medula, fígado e cérebro de camundongos tratados com extrato foliar e do receptáculo
de alcachofra.
Índice de Dano (ID)
Sangue Fígado Medula Cérebro
Grupos/
Dose(mg/kg)
Gênero
Por sexo Por grupo Por sexo
Por grupo
Por sexo
Por grupo
Por sexo
Por grupo
M
72,40 ± 31,13
- - -
Controle
Positivo
F
31,20 ± 12,05
51,80 ± 13,49
-
-
-
-
-
-
M
27,00 ± 13,34 86,80 ± 65,60 61,60 ± 7,44 72,80 ± 33,48
Controle
Negativo
F
20,75 ± 4,27
23,88 ± 6,41
124,75 ± 81,71
103,67 ± 7,10
127,75 ± 76,24
91,00 ± 49,29
174,75 ± 31,33
118,11 ± 61,77
M
28,00 ± 11,31 177,00 ± 86,27 111,50 ± 54,45 258,50 ± 54,45
G1 (3x2000)
F
42,3 ± 21,90
47,13± 21,94*
270,00 ± 13,86
223,50 ± 50,20*
226,63 ± 7,51
168,92 ± 33,19*
261,67 ± 77,84
260,08 ± 16,54**
M
16,00 ± 7,35 94,40 ± 63,30 61,40 ± 44,65 137,20 ± 89,95
G2 (3x1000)
F
17,60 ± 11,15
16,80 ± 8,94
132,60 ± 69,19
113,50 ± 65,68
124,80 ± 51,86
93,10 ± 56,55
75,80 ± 21,03
106,50 ± 71,87
M
20,50 ± 6,24 224,00 ± 31,75** 213,00 ± 48,03 222,33 ± 49,65*
G3 (3x500)
F
18,80 ± 7,82
19,56 ± 6,78
153,60 ± 53,41
180,00 ± 56,97
158,50 ± 77,84
181,86 ± 68,17**
130,60 ± 78,36
165,00 ± 70,35
M
9,60 ± 11,44 111,40 ± 39,39 60,60 ± 11,13 127,20 ± 78,44
G4 (3x2000)
F
14,20 ± 4,32
11,90 ± 8,50
106,80 ± 74,28
109,10 ± 56,10
81,40 ± 15,22
71,00 ± 16,18
133,40 ± 70,41
130,30 ± 70,35
(*) Valor significativo (P<0.05) (**) Valor significativo (P<0.01) Teste t-Student..
(C+) – controle positivo – Ciclofosfamida, (C-) – controle
negativo- água/ G1 (EF 2000mg/kg)/ G2 (EF 1000mg/kg)/ G3 (EF 500mg/kg)/ G4 (ER 2000 mg/kg).
63
Tabela 7. Freqüência de danos em sangue, medula, fígado e cérebro de camundongos tratados com extrato foliar e do
receptáculo de alcachofra.
Freqüência de Dano (FD)
Sangue Fígado Medula Cérebro
Grupos/
Dose(mg/kg)
Gênero
Por sexo Por grupo Por sexo Por grupo Por sexo Por grupo Por sexo Por grupo
M
41,20 ± 16,59
- - -
Controle
Positivo
F
21,60 ± 6,50
31,40 ± 7,13
-
-
-
-
-
-
M
13,60 ± 7,16 35,20 ± 20,99 32,80 ± 8,87 37,20 ± 13,08
Controle
Negativo
F
8,75 ± 2,22
11,44 ± 5,83
47,50 ± 22,17
40,67 ± 21,14
54,50 ± 25,58
42,40 ± 20,58
75,75 ± 8,10
54,33 ± 22,87
M
13,00 ± 4,24 94,00 ± 2,83 45,00 ± 21,21 97,50 ± 0,71
G1 (3x2000)
F
17,33 ± 2,52
17,33 ± 9,71
95,67 ± 3,21
94,83 ± 0,27**
88,33 ± 2,89
66,67 ± 12,95
87,00 ± 11,79
92,25 ± 7,83*
M
6,40 ± 4,10 40,20 ± 28,20 21,60 ± 23,24 61,60 ± 38,81
G2 (3x1000)
F
7,40 ± 3,58
6,90 ± 3,67
51,00 ± 19,42
45,60 ± 23,52
45,20 ± 17,47
33,40 ± 23,03
29,80 ± 9,50
45,70 ± 32,28
M
9,50 ± 1,29 77,33 ± 31,75* 70,00 ± 20,00 89,33 ± 16,77
G3 (3x500)
F
8,80 ± 1,79
9,11 ± 1,54
52,40 ± 13,67
61,75 ± 16,88
55,00 ± 23,80
61,43 ± 21,93
71,40 ± 26,45
78,13 ± 23,80
M
4,20 ± 5,31 43,00 ± 17,23 23,40 ± 4,10 51,60 ± 31,67
G4 (3x2000)
F
8,20 ± 1,79
6,20 ± 4,29
36,00 ± 22,41
39,50 ± 19,20
30,60 ± 6,23
27,00 ± 6,25
55,00 ± 31,02
53,30 ± 29,60
(*) Valor significativo (P<0.05) (**) Valor significativo (P<0.01).
(C+) – controle positivo – Ciclofosfamida, (C-) – controle negativo - água/ G1
(EF 2000mg/kg)/ G2 (EF 1000mg/kg)/ G3 (EF 500mg/kg)/ G4 (ER 2000 mg/kg). Os resultados do controle positivo não estão aqui expressos pois os
grupos foram comparados com o grupo controle negativo no teste cometa.
64
No presente estudo verificou-se o aparecimento de cometas, ou seja,
danos no material genético das células em todos os tecidos analisados. Em
nosso estudo foi verificado uma maior indução de danos nas células de fígado
e cérebro tanto para o extrato foliar quanto para o extrato do receptáculo.
No entanto, como observado anteriormente (Tabelas 4 e 5) não foi
verificado mutagenicidade, assim o efeito antioxidante (Tabela 3) também
demonstrado anteriormente deve ter uma grande inferência aliado a um
provável efeito de reparação. Os dados referentes às classes de danos (Figura
9) corroboram para esta conclusão, visto que, observarmos preferencialmente
classes 1 e 3, relacionadas com simples quebras e que são fácil e rapidamente
reparadas (Da Silva et al., 2000). Na figura 9 pode-se ainda verificar que existe
uma incidência significativa de cometas da classe 4 nos tecidos, fígado,
cérebro e medula acima de 10%, principalmente na dose mais concentrada de
extrato foliar indicando que o processo citotóxico leva as quebras duplas no
DNA (Da Silva et al., 2000). Cometas de nível 4 detectados pelo ensaio,
quando em alta freqüência, sugerem processo necrótico ou apoptótico pela
intensa migração de DNA (Collins et al., 2008). Esta intensa migração
demonstra citotoxicidade e caracteriza quebra duplas no material genético.
Estas lesões no DNA correspondem a danos mais graves que quebras simples,
indicam aberrações cromossômicas e moleculares (regulação gênica) como
sérias conseqüências para a célula levando a morte, ao dano ou até mesmo a
uma transformação neoplásica (Dixon et al., 2002). Este índice significativo de
cometas Classe 4 pode ser devido às folhas de alcachofra apresentarem a
lactona sesquiterpênica chamada cinaropicrina que pode causar morte celular
por induzir apoptose pela ativação de caspases, resultando no bloqueio do
ciclo celular e fragmentação do DNA (Cho, et al., 2004).
O fato dos valores tanto para o ID quanto para o FD observados nas
tabelas 6 e 7, anteriormente citadas, terem sido altos para o controle negativo
pode ter ocorrido devido ao procedimento do teste, pelos animais terem sofrido
estresse.
65
Figura 9. Gráfico de classes de cometas. (A) sangue periférico; (B) fígado; (C) cérebro; (D) medula. (C- controle negativo/ G1 (EF
2000mg/kg)/ G2 (EF 1000mg/kg)/ G3 (EF 500mg/kg)/ G4 (ER 2000 mg/kg). Classe 0 (sem cauda); Classe 1 (pequena
migração do DNA); Classe 2 (média migração do DNA); Classe 3 (extensa migração do DNA); Classe 4 (cabeça separada da
cauda).
C-
G1
G2
G3
G4
C
l
a
s
s
0
C
l
a
s
s
1
C
l
a
s
s
2
C
l
a
s
s
3
C
l
a
s
s
4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
C-
G1
G2
G3
G4
C
l
a
s
s
0
C
l
a
s
s
1
C
l
a
s
s
2
C
l
a
s
s
3
C
l
a
s
s
4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
C-
G1
G2
G3
G4
C
l
a
s
s
0
C
l
a
s
s
1
C
l
a
s
s
2
C
l
a
s
s
3
C
l
a
s
s
4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
C-
G1
G2
G3
G4
C
l
a
s
s
0
C
l
a
s
s
1
C
l
a
s
s
2
C
l
a
s
s
3
C
l
a
s
s
4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
C
A
B
D
66
Ainda pelo ensaio cometa, realizou-se exposição in vitro (ex vivo) ao
peróxido de hidrogênio, objetivando verificar o efeito antigenotóxico do extrato
foliar de alcachofra (EF 3X2000 mg/kg) nas células do sangue, medula, cérebro
e fígado. A proteção contra a ação oxidante do peróxido foi verificada de forma
significativa somente nas células de medula óssea (Figura 10).
A antigenotoxicidade medular desencadeada pelo extrato foliar de
alcachofra pode ter ocorrido devido à presença de flavonóides como a luteolina
que contribui para o mecanismo protetor, já que é um composto capaz de
penetrar através da membrana celular para seu interior e lá oferecer a proteção
necessária ao DNA através de mecanismos biológicos; como prevenir a
geração de radicais hidroxil nos lugares onde os íons ferro estão presentes.
Estes íons promovem a proteção contra os danos induzidos pelo peróxido pela
habilidade de passar através da membrana e remover ligações com ferro em
locais intracelulares, estes íons de ferro normalmente formam ligações com
substâncias de alto peso molecular como DNA, RNA, proteínas e carboidratos
(Melidou et al., 2005).
Ainda na Figura 10, pode-se observar que no tecido cerebral o extrato
foliar de alcachofra apresentou efeito pró-oxidante junto ao peróxido de
hidrogênio, embora não de forma significativa. O que provavelmente ocorreu
devido à presença da lactona sesquiterpênica cinaropicrina com propriedade
neurotóxica com potencial ativo concentrado no anel butirolactona (Shimoda et
al., 2003).
67
Figura 10. Índice de danos (ID) do ensaio cometa in vitro da atividade antigenotóxica do extrato foliar de alcachofra pela indução de
danos pelo peróxido de hidrogênio em (A) medula óssea, (b) sangue periférico, (C) cérebro, e (D) fígado. (*) P<0,05 – Teste t
Student .
A B
C D
68
V. CONCLUSÕES
O presente estudo visou avaliar o efeito genotóxico dos extratos aquosos
liofilizados (foliar e receptáculo) de alcachofra (Cynara scolymus) visto que seu
uso comum é muito amplo e bem difundido na população mundial e dados
bibliográficos apontavam alguns componentes citotóxicos presentes na planta. As
análises, através do ensaio cometa e teste de micronúcleos, da genotoxicidade e
mutagenicidade induzida pela alcachofra em camundongos nos permitiram
concluir que:
1- As análises fitoquímica das folhas e do receptáculo de alcachofra
indicaram a presença das classes químicas descritas na literatura como
substâncias fenólicas, flavonóides e saponinas, este último somente foi
encontrado nas folhas;
2- Os extratos liofilizados das folhas e do receptáculo de alcachofra
apresentaram valores semelhantes de flavonóides totais;
3- O efeito antioxidante foi observado principalmente para o extrato foliar
pelos testes DPPH e hipoxantina/xantina oxidase;
4- As folhas e o receptáculo de alcachofra não apresentaram indução ao
estresse oxidativo (TBARS e CAT);
5- O extrato foliar apresentou-se genotóxico (ensaio cometa), porém não
mutagênico (teste de micronúcleos);
6- Os principais tipos de classes de danos observados foram Classe 1,2 e
3, relacionadas principalmente com quebras simples de DNA;
7- Os tecidos que apresentaram maior indução de danos foram: fígado e
cérebro, demonstrando serem os tecidos-alvos da mistura complexa da folha da
alcachofra;
8- O efeito antigenotóxico somente foi observado em medula óssea de
camundongos pré-tratados com o extrato foliar.
9- O extrato do receptáculo não demonstrou nenhum sinal de toxicidade,
mutagenicidade e genotoxicidade.
69
Como descrito anteriormente, as folhas da alcachofra têm sido usadas em
forma de chá desde tempos remotos, pelo seu efeito terapêutico incluindo o
melhor fluxo sanguíneo, mobilização de reservas energéticas, indução da quebra
do colesterol, e por ter efeitos hepatoprotetores, além de possuir propriedades
antioxidantes. Nossos resultados demonstraram que o uso popular do chá das
folhas apresenta-se coerente quanto aos efeitos antioxidantes, mas que doses
elevadas devem ser observadas com atenção, por poder levar a efeito genotóxico
principalmente no cérebro.
70
VI. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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80
VII. ANEXOS
VII. 1. Anexo 1
O Adjunto da Diretoria Colegiada da Agência Nacional de Vigilância
Sanitária, no uso da atribuição, que lhe confere a Portaria nº. 13 de 16 de janeiro
de 2004, considerando o disposto no art.111, inciso II, alínea "a" § 3º do
Regimento Interno, aprovado pela Portaria nº. 593, de 25 de agosto de 2000,
republicada no DOU de 22 de dezembro de 2000, considerando que a matéria foi
submetida à apreciação da Diretoria Colegiada, que a aprovou em reunião
realizada em 8 de março de 2004, resolve:
Art. 1º Determinar a publicação da "GUIA PARA A REALIZAÇÃO DE
ESTUDOS DE TOXICIDADE PRÉ-CLÍNICA DE FITOTERÁPICOS”, anexo.
I.Considerações gerais:
1. Este guia tem por objetivo indicar métodos padronizados para os estudos de
toxicologia pré-clínica de acordo com a Resolução vigente para registro e
renovação de registro de fitoterápicos.
2. Os estudos de toxicidade devem ser conduzidos com amostras padronizadas
do medicamento fitoterápico ou do derivado vegetal a partir do qual é produzido.
II. Toxicidade aguda
Avalia a toxicidade após exposição a uma dose única ou dose fracionada
administrada no período de 24 horas
1. Espécie animal - deve ser usada uma espécie de mamífero evitando-se
animais com características genéticas especiais.
2. Sexo - devem ser utilizados machos e fêmeas;
3. Grupos e número de animais por teste (controle e tratado): No mínimo 6
machos e 6 fêmeas, por dose do produto;
81
4. Idade - os animais devem estar em idade adulta;
5. Via de administração - deve ser utilizada a mesma via proposta para o uso do
produto.
6. Doses - suficientes para observação de possíveis efeitos adversos e estimativa
da DL50 (dose letal 50% - dose que mata 50% dos animais). Se não forem
observados efeitos adversos, utilizar a dose máxima possível.
7. Sinais de toxicidade incluindo tempo de aparecimento, progressão e
reversibilidade destes sintomas devem ser anotados. Deve ser observado o
maior número possível de parâmetros, tais como alteração da locomoção,
frequência respiratória, piloereção, diarréia, sialorréia, alteração do tônus
muscular, hipnose, convulsões, hiperexcitabilidade do sistema nervoso central,
contorções abdominais, número de animais mortos com possível causa de morte
e respectivos exames histopatológicos.
8. Período de observação - Durante as primeiras 24 horas, nos períodos de 0, 15,
30 e 60 minutos e a cada 4 horas e diariamente durante 14 dias após
administração, prazo que pode ser ampliado dependendo do aparecimento de
sinais de toxicidade, visando observar reversão ou não destes sinais. Desde a 24ª
hora e até 14 dias após administração da dose, devem ser observados a variação
de peso e o consumo de alimentos. Ao fim do período de observação todos os
animais sobreviventes devem ser sacrificados e autopsiados. Caso sejam
observadas alterações nas autópsias, estudos histopatológicos dos órgãos
acometidos devem ser realizados.
III. Toxicidade de doses repetidas (longa duração)
Avalia a toxicidade após a exposição a doses repetidas.
1. Espécie animal - devem ser usadas pelo menos duas espécie de mamíferos,
sendo uma roedora e uma não-roedora. As linhagens devem ser definidas
evitando-se animais com características genéticas especiais.
82
2. Sexo - devem ser utilizados machos e fêmeas;
3. Grupos e número de animais por teste:
Roedores: No mínimo 10 machos e 10 fêmeas, por dose do produto
Não-roedores: no mínimo 3 machos e 3 fêmeas, por dose do produto.
Para cada estudo incluir um grupo controle com o veículo da formulação.
4. Idade - os animais devem estar em idade adulta jovem
5. Via de administração - deve ser utilizada a mesma via proposta para o uso do
produto.
6. O período de administração do produto nos animais segue relação com o
período proposto para utilização terapêutica, conforme tabela abaixo :
Período de uso
Duração mínima do estudo das doses
repetidas
Até 30 dias de uso por ano 4 semanas
Acima de 30 dias de uso por ano 12 semanas
7. Doses - no mínimo três, a saber, a dose que produza o efeito terapêutico
(menor dose), a maior dose que produza um efeito adverso detectável, limitada
pelo volume da dose, e uma dose intermediária, por exemplo a média geométrica
entre a dose maior e menor dose.
8. Parâmetros a serem observados nos grupos experimentais e no grupo controle
tratado com o veículo, tais como: alterações comportamentais, variação do peso
corpóreo (semanal), o hemograma completo e análises bioquímicas de sangue
(sódio, potássio, gama-glutamiltranspeptidase, aminotransferases, fosfatase
alcalina, uréia, creatinina, ácido úrico, colesterol, triglicerídeos, glicose, proteínas
totais e bilirrubina);
9. Exames anatomopatológicos
83
Exames macroscópicos devem ser realizados em todos os animais para todas as
doses. Os exames histopatológicos devem ser realizados obrigatoriamente nos
animais tratados com a maior dose. O material retirado dos animais deve ser
mantido em estado de conservação por até cinco anos. Na ausência de
alterações histopatológicas nos animais tratados com a maior dose e de
alterações macroscópicas com as doses menores, torna-se desnecessária
a realização de exames histopatológicos para as demais doses baixa e
intermediária. Recomenda-se que sejam analisados macro e microscopicamente
os órgãos abaixo relacionados: fígado, rins, pulmão, coração, esôfago e
estômago, intestinos, órgãos sexuais, pâncreas, adrenal, tireóide.
IV. Estudo especial - Genotoxicidade
Estudo que deve ser efetuado quando houver indicação de uso contínuo ou
prolongado do medicamento em humanos.
1. Avaliação in vitro da reversão de mutação em bactérias incluindo ativação
metabólica ou de dano a cromossomos de células de mamíferos ou de linfoma de
camundongo;
2. Avaliação in vivo do dano em cromossomo em células hematopoiéticas de
roedores (teste de micronúcleo)
V. Avaliação toxicológica de medicamentos fitoterápicos de uso tópico:
Cumprir o disposto nos itens II, III, e quando indicado IV, além de realizar os
seguintes testes adicionais:
1. Sensibilização dérmica 2. Irritação cutânea 3. Irritação ocular
84
VII. 2. Anexo 2
Cinaropicrina Cinarina Narirutina
Lupeol Ácido clorogênico Inulina
Cinarosideo Escolimosídeo Cianidina
Ácido cafeico Luteolina Cinarasaponina
Ácido ferúlico Apigenina
CH
2
O
CH
2
OH
CH
2
HO
H
2
C
O
CH
2
O
O
1
5
5
3
4
10
9
8
7
6
11
13
15
14
1' 2'
4'
3'
HO
O
OHO
GliO
OH
OH
HO
HO
CH
CH COOH
HO
HO
CH CH C O
O
O
COOH
HO
HO
C
O
CH CH
OH
OH
Cinarina
HO
H
O
CH CH C
O
O
OH
OH
O
C
HO
HO
O
O
H
O
R
u
t
O
O
H
O
H
85
VII. 3. Anexo 3
Tabela de pesos dos camundongos observados durante o período de
tratamento com extratos de alcachofra.
Grupo/Dose Dias
Sexo
Resultados Individuais(g) Por Sexo(g)
Por Grupo(g)
M **
1
F **
M (27,40; 29,50; 25,00; 27,90; 28,00)
27,50 (M)
2
F (26,10; 29,00; 29,00; 28,00; 31,00)
M (27,40; 29,40; 25,20; 28,00; 28,10)
Controle
Positivo
(Ciclofosfamida
25mg/kg)
3
F (26,10; 29,20; 29,00; 28,10; 31,10)
28,60 (F)
28,00
M (38,00; 39,00; 41,00; 37,00; 40,00)
1
F (27,00; 27,50; 30,00; 25,00)
M (38,50; 39,10; 41,00; 37,20; 40,20)
39,10 (M)
2
F (27,00; 27,50; 30,20; 25,00)
M (38,50; 39,00; 41,20; 37,20; 40,20)
Controle
Negativo
(Solvente água)
3
F (27,10; 27,50; 30,20; 25,20)
21,90 (F)
30,50
M (35,00; 35,50; 32,50; 35,20; 36,40)
1
F (30,40; 31,00; 31,50; 31,70)
M (†; 33,00; 30,00; †;†)
33,80 (M)
2
F (28,30; 29,00; 28,50; 29,20)
M (†; 29,50; 28,10; †;†)
Grupo 1
(EF 2000mg/kg)
3
F (25,00; †; 26,10; 24,20)
22,90 (F)
28,35
M (40,20; 36,50; 36,90; 38,70; 37,40)
1
F (30,80; 29,10; 29,70; 30,20; 30,80)
M (38,10; 35,00; 35,00; 36,50; 36,00)
36,10 (M)
2
F (29,10; 27,50; 27,00; 29,00; 29,10)
M (36,50; 33,00; 33,00; 34,00; 35,50)
Grupo 2
(EF 1000mg/kg)
3
F (28,00; 26,00; 25,50; 27,00; 28,00)
28,40 (F)
32,20
M (36,70; 37,50; 34,20; 36,60)
1
F (30,00; 30,50; 31,90; 30,30; 29,50)
M (34,00; 35,50; 32,10; 34,50)
27,10 (M)
2
F (29,10; 29,20; 30,00; 29,70; 28,00)
Grupo 3
(EF 500mg/kg)
3 M (32,10; 33,30; 31,30; 33,10)
29,20 (F)
28,1
86
F (28,00; 28,50; 29,50; 28,40; 27,30)
M (30,10; 29,00; 27,00; 31,20; 38,00)
1
F (32,00; 29,00; 35,40; 34,30; 37,00)
M (30,00; 28,00; 26,60; 30,10; 37,80)
30,40 (M)
2
F (31,00; 28,00; 34,00; 32,10; 36,00)
M (29,00; 27,90; 26,10; 29,60; 36,50)
Grupo 4
(ER2000mg/kg)
3
F (30,20; 27,20; 33,50; 31,70; 35,80)
32,40 (F)
31,40
(*) extrato foliar e do receptáculo de Cynara scolymus; (**) a Ciclofosfamida não foi
aplicada no primeiro dia. EF (extrato foliar), ER (extrato do receptáculo).
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