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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
EVELYN CRISTINA SANTANA MARIN
AVALIAÇÃO DA ESTRUTURA E FUNÇÃO RENAL EM RATOS SUBMETIDOS AO
AUMENTO DA INGESTÃO DE SÓDIO NO PERÍODO PRÉ-NATAL E
AMAMENTAÇÃO COM NEFRECTOMIA 5/6
Ribeirão Preto
2007
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EVELYN CRISTINA SANTANA MARIN
AVALIAÇÃO DA ESTRUTURA E FUNÇÃO RENAL EM RATOS SUBMETIDOS AO
AUMENTO DA INGESTÃO DE SÓDIO NO PERÍODO PRÉ-NATAL E
AMAMENTAÇÃO COM NEFRECTOMIA 5/6
Dissertação apresentada à Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo para obtenção
do título de Mestre em Ciências.
Área de Concentração: Fisiologia
Orientadora: Profª. Drª. Terezila Machado
Coimbra
Ribeirão Preto
2007
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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO,
PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Ficha Catalográfica elaborada pela Biblioteca Central Campus USP-
Ribeirão Preto
Marin, Evelyn Cristina Santana
Avaliação da estrutura e função renal em ratos submetidos
ao aumento da ingestão de sódio no período pré-natal e
amamentação com nefrectomia 5/6. Ribeirão Preto, 2007.
115 p. : il. ; 30cm
Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto/USP. Área de concentração:
Fisiologia.
Orientador: Coimbra, Terezila Machado.
1. Desenvolvimento Renal. 2. Sobrecarga de sódio.
3. Nefrectomia 5/6. 4. Angiotensina II.
FOLHA DE APROVAÇÃO
Evelyn Cristina Santana Marin
Avaliação da estrutura e função renal
em ratos submetidos ao aumento da
ingestão da ingestão de sódio no
período pré-natal e amamentação com
nefrectomia 5/6.
Dissertação apresentada à Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo para obtenção
do título de Mestre em Ciências.
Área de Concentração: Fisiologia
Aprovado em: ____/____/____
Banca Examinadora
Prof. Dr.___________________________________________________________
Instituição:_________________________________Assinatura:_______________
Prof. Dr.___________________________________________________________
Instituição:_________________________________Assinatura:_______________
Prof. Dr.___________________________________________________________
Instituição:_________________________________Assinatura:_______________
Aos meus pais e melhores professores de vida
Edson Marin e Cássia Maria M. S. Marin pelo amor
incondicional, incentivo e respeito. Vocês me
ensinaram que a educação é o bem maior que se
pode adquirir.
AGRADECIMENTOS
À Deus por ter me dado perseverança e serenidade durante todo decorrer deste
projeto e por permitir que eu continue sempre aprendendo, me tornando, a cada dia,
alguém melhor.
À Profª. Drª Terezila Machado Coimbra por principalmente ter me aceitado e confiado
em meu trabalho. Agradeço sua atenção, disponibilidade, incentivo e apoio diário.
Manisfesto minha profunda admiração pelo modo como atua na área acadêmica.
À Profª. Drª Cláudia Maria de Barros Helou e Prof. Dr. Márcio Dantas, por aceitarem
participar da avaliação deste trabalho.
Aos Profs. Dr. Hélio César Salgado e Dr. Norberto Garcia Cairasco, por terem
participado da minha qualificação de Mestrado.
Ao Prof. Dr. José Eduardo Dutra de Oliveira que permitiu que durante o
Aprimoramento em Especialização em Nutrição pelo Hospital das Clínicas da
Universidade de São Paulo, Campus de Ribeirão Preto, eu pudesse realizar meu
estágio no Laboratório de Fisiologia Renal.
À Profª. Drª. Maria Sebastiana Silva, orientadora em minha graduação em Nutrição
na Universidade Federal de Goiás pelo incentivo pela carreira acadêmica na cidade
de Ribeirão Preto.
À todos os docentes do departamento de Fisiologia da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto (FMRP) que contribuíram na minha formação como fisiologista. Em
especial, ao Prof. Dr. Wamberto Antônio Varanda, pelas críticas construtivas.
Aos Profs. Drs. Márcio Dantas, Miguel Moysés Neto, Roberto Silva Costa e Osvaldo
Merege Vieira Neto, pela participação tanto nas reuniões científicas de Fisiopatologia
Renal como nas visitas clínicas da Nefrologia no Hospital das Clínicas na FMRP,
além do apoio e amizade.
À técnica do laboratório de Fisiologia Renal da FMRP, Cleonice Giovanini Alves da
Silva, pela paciência em me ensinar e colaboração constante no projeto, além da
nossa amizade.
Aos funcionários do Biotério do Departamento de Fisiologia da FMRP, Leonardo
Fidélis Filho e Eduardo Gomes, pelo apoio e atenção para com os animais e pela
amizade e companheirismo.
Ao técnico do Laboratório de Fisiologia Cardiovascular da FMRP, Carlos Alberto
Aguiar da Silva, pelo auxilio durante as determinações da pressão arterial por
pletismografia.
Às técnicas do Departamento de Patologia da FMRP, Érica Pontin Delloiagono Gual
e Adriana G. C. de Almeida e Rubens Fernando de Melo do Departamento de
Fisiologia da FMRP, pelo auxílio nas inclusões e cortes de tecidos em parafina.
À Maria Luiza Montanha Xavier pelos chás e cafés e colaboração no laboratório
diariamente.
À todos da secretaria do Departamento de Fisiologia: Carlos Alberto Belini, Cláudia
de Barcellos Vanzela, Elisa Maria Aleixo e Fernando César Rastello, pela amizade e
colaboração nos assuntos burocráticos.
Ao meu namorado Stefan Czaplinski Martins Barros, como agradecer por tanta
atenção, paciência e incentivo... Nosso amor foi superior aos obstáculos e fez com
que a distância fortalecesse nossos ideais.
À meus irmãos Ericsson Marin, Tahene Marin e Everton Marin pelo apoio e carinho.
A música de vocês sempre me renova de esperança.
Aos parentes da Família Santana e Marin por estarem sempre me incentivando.
Aos meus queridos companheiros e amigos do Laboratório de Fisiologia Renal: Ana
Paula Coelho Balbi, Andréia Gonçalves Custódio Flávio, Anna Beatriz Aranha,
Cleonice Giovanini Alves da Silva, Heloísa Della Coletta Francescato, Rildo Volpini
e Telma de Jesus Soares, pelo incentivo, apoio, risadas e lágrimas que fizeram do
nosso espaço um ambiente com muito respeito, paz, solidariedade e amizade.
Aos meus amigos fisiologistas Bruno Del Bianco Borges, Ernane Torres Uchoa,
Fabiana Lucio de Oliveira, Fernanda Barbosa Lima, Leandro Marques de Souza,
Lisandra Oliveira Margatho, Lys Angela Favaroni Mendes, Marcelo Bernucci e Nádia
Rubia. Vocês são muito especiais.
Às minhas amigas nutricionistas Gisele Sales Gomes, Cristina Maria Mendes,
Fabíola Rainato e Érika Bronzi que me acompanharam nesta etapa e que
continuamos unidas no desvendar contínuo da Ciência da Nutrição.
Aos amigos que conquistei na cidade de Ribeirão Preto: Cristiane Ruivo, Cleuza
Lacerda, Elaine Madeira, Joilson Nunes do Santos, Juciléia Dalmazzo, Killpy
Ataides, Larissa Nascimento Marques, Maria Lucia Crizol e Thiago Spinelli. Vocês
foram fundamentais para que minha vida nesta cidade fosse simplesmente especial.
Às minhas amigas queridas de Goiânia: Ana Carolina Rezende, Laurenne Oliveira
Santana, Lívia Borges, Janaína Pacheco e Thabita Parisi, por vocês terem
conquistado o espaço de vocês e, apesar da distância, continuamos unidas.
À família Machado Pinheiro por ter me adotado como “filha” em Ribeirão Preto.
Vocês me dedicaram mais do que atenção, mas carinho e respeito.
À Aurora Salino Marin, Ana Salino Morgado, Juarez Machado, Rosires Vieira
Machado Paoli, Paulo Salino e Pedro Marin (todos in memorian) pela ânsia de vida
que me passaram nesta caminhada...
A Basilia de Lima, mulher mais humilde que conheci, porém com uma intensa
capacidade de amar.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), que
durante este projeto me concedeu apoio financeiro.
É preciso ser humilde para aprender...
(Paulo Coelho)
RESUMO
Marin ECS. Avaliação da estrutura e função renal em ratos submetidos ao
aumento da ingestão de sódio no período pré-natal e amamentação com
nefrectomia 5/6. 2007. 115p. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2007.
Filhotes de ratas submetidas ao aumento de ingestão de sódio durante a gravidez
apresentam ausência da resposta do sistema renina angiotensina (SRA) à
sobrecarga de sódio. O SRA contribui para progressão da lesão renal no modelo de
nefrectomia 5/6. Esse estudo visa verificar o efeito da sobrecarga de sódio na
gestação e amamentação na evolução da lesão renal no modelo de nefrectomia 5/6.
Utilizaram-se 48 ratos (Wistar, machos) de mães que receberam salina (NaCl 0,15M)
ou água na gestação e amamentação. Os ratos foram submetidos à nefrectomia 5/6
ou cirurgia fictícia aos 60 dias de idade e divididos nos grupos: S: sham, mães
receberam água; SS: sham-salina, mães receberam salina; NE: nefrectomizados,
mães receberam água; NES: nefrectomizados-salina, mães receberam salina. A
pressão arterial sistólica (PS) e albuminúria foram avaliadas antes e após a cirurgia.
A taxa de filtração glomerular (TFG) foi determinada aos 120 dias da cirurgia e os
rins retirados para histologia. A análise dos dados foi realizada pelo teste de Kruskal-
Wallis e pós-teste de Dunn (albuminúria, histologia) e os demais dados foram
submetidos à análise de variância e pós-teste de Newman-Keuls. Os valores foram
expressos como média±EPM ou mediana e percentis (25-75%). Os filhotes de mães
que receberam salina apresentaram aumento da PS (mmHg) aos 60 dias de idade
em relação ao controle (131±3; 114±3, respectivamente). Não houve diferença na
PS até 90 dias após a cirurgia entre os grupos S e SS (124±4; 133±2,
respectivamente) e entre os grupos NE e NES (182±12; 189±23, respectivamente).
Os ratos dos grupos S e SS não apresentaram diferença na albuminúria (mg/24h,
0,67; 0,82, respectivamente), não houve diferença também na albuminúria dos ratos
dos grupos NE e NES (126; 98, respectivamente) aos 120 dias. A TFG (ml/min/100g)
dos ratos do grupo S foi semelhante a do SS (0,44±0,04; 0,52±0,03,
respectivamente) e a dos ratos do grupo NE foi também semelhante a do NES
(0,15±0,04; 0,15±0,03, respectivamente). O escore para esclerose glomerular dos
ratos do grupo SS (0,06) foi maior em relação ao grupo S (0,00) e entre os grupos
NE (0,29) e NES (0,67) não houve diferença. As lesões tubulointersticias também
foram maiores no grupo SS (1,00) do que no grupo S (0,00), não ocorrendo
diferença entre os grupos NE (2,00) e NES (3,00). A sobrecarga de sódio na
gravidez e lactação pode provocar alterações estruturais nos rins dos filhotes
adultos. Contudo, a evolução da nefrectomia 5/6 foi semelhante nos dois grupos,
sugerindo que a regulação renal local da angiotensina II pode envolver mecanismos
diferentes da sistêmica.
Palavras-chave: desenvolvimento renal, sobrecarga de sódio, nefrectomia 5/6,
angiotensina II.
ABSTRACT
Marin ECS. Renal structure and function evaluation of rats submitted to high
salt intake during the pre-natal period and lactation with 5/6 nephrectomy.
2007. 115p. Master Degree - Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of São
Paulo, Ribeirão Preto, 2007.
Rat pups from dams submitted to high salt intake during the perinatal period
presented renin-angiotensin system (RAS) functional disturbances. The RAS
contributes for progression of renal damage in 5/6 nephrectomy model. The aim of
this study was to evaluate the effect of high salt intake during gestation and lactation
on the evolution of renal damage in rats submitted to 5/6 nephrectomy. A total of 48
sixty-day-old rat pups (Wistar, male) from dams receiving saline (0.15 M NaCl) or
water during gestation and lactation were submitted or not to 5/6 nephrectomy. After
surgery, they were divided into four groups: S: sham, dams received water; SS:
sham-saline, dams received saline; NE: nephrectomized, dams received water; NES:
nephrectomized-saline, dams received saline. Blood pressure (BP) and albuminuria
were determined before and after the surgery. Glomerular filtration rate (GFR) was
determined 120 days after surgery and the kidney removed for histological studies.
Data concerning albuminuria and histological studies were analyzed statistically
using the nonparametric Kruskal-Wallis test followed by the Dunn post-test. Those
data are expressed as median and interquartile range (25-75%). Analysis of variance
with the Newman-Keuls multiple comparisons test was used for the other data. Those
data are expressed as mean ± SEM. Sixty-day-old rat pups from dams receiving
saline presented higher BP (mmHg) compared to controls (131±3; 114±3,
respectively). However, there was no difference on BP between S and SS groups,
(124±4; 133±2, respectively), neither between NE and NES groups (182±12; 189±23,
respectively), until 90 days after surgery. We also did not find any difference on
albuminuria (mg/24h) between S and SS groups (0.67; 0.82, respectively), neither
between NE and NES groups (126; 98, respectively), on day 120 after surgery. The
GFR (mg/min/100g) was similar in S and SS groups (0.44±0.04; 0.52±0.03,
respectively) and in NE and NES groups (0.15±0.04; 0.15±0.03, respectively). The
score for glomerulosclerosis of rats from SS group was higher than S group (0.06
and 0.00, respectively), and there was no difference between NE and NES groups
(0.29 and 0.67, respectively). The tubulointersticial lesions were higher in SS group
than in S group (1.00 and 0.00, respectively), and there was no difference between
NE and NES groups (2.00 and 3.00, respectively). High salt intake during gestation
and lactation in rats provokes structural alterations in the kidney of the adult offspring.
However, the evolution of 5/6 nephrectomy was similar in both groups of
nephrectomized rats, probably because the local renal regulation of angiotensin II
can involve different mechanisms than the systemic regulation.
Key words: renal development, high salt intake, 5/6 nephrectomy, angiotensin II.
LISTA DE ABREVIATURAS
ANG I
Angiotensina I
ANG II
Angiotensina II
AT
1
Receptor do tipo 1 de angiotensina II
AT
2
Receptor do tipo 2 de angiotensina II
cols.
Colaboradores
ECA
Enzima conversora de angiotensina II
ED1
Macrófagos e monócitos
EPM
Erro padrão da média
FE
Na+
e FE
K+
Excreção fracional de sódio e potássio (%)
g
Grama
GL
Glomeruloesclerose
h
Horas
H
+
Hidrogênio
HCO
3-
Bicarbonato
IGF-1
Insulin-like Growth Factor
IgG
Imunoglobulina G
K
+
Potássio
Kg
Quilograma
LDL
Lipoproteínas de baixa densidade
LTI
Lesões tubulointersticiais
M
Molar
MCP-1
Fatores quimiotáticos para macrófagos
MEC
Matriz extracelular
mg
Miligrama
min
Minutos
mL
Mililitro
mm
2
Milímetro quadrado
mmHg
Milímetro de mercúrio
Na
+
Sódio
NaCl
Cloreto de sódio
NE
Grupo de animais nefrectomizados-água
NES
Grupo de animais nefrectomomizados-salina
nL
Nanolitro
PBS
NaCl 0,15M e tampão PO
4
0,01M, pH=7,4
PDFG
Plateled derived growth factor
P
EUF
Pressão efetiva de ultrafiltração
pH
Potencial hidrogeniônico
PO
4-
Fosfato
PS
Pressão arterial sistólica
Q
A
Fluxo plasmático glomerular
RANTES
Regulated Upon Activation Normal T-cell Expressed and
Secreted
RNA
Ácido ribonucléico
S
Grupo de animais sham-água
SRAA
Sistema renina-angiotensina-aldosterona
SS
Grupo de animais sham-salina
TGF-β Transforming Growth Factor-β
TFG
Taxa de Filtração Glomerular
U
in
e P
in
Concentração de inulina na urina e no plasma
U
osm
e P
osm
Osmolalidades Urinária e Plasmática
V
Fluxo urinário
VL
Volume de líquidos ingeridos
VFEC
Volume de fluido extracelular
∆P
Gradiente de pressão hidrostática
∆Pc
Variação de Peso corporal
ºC
Grau Celsius
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1.1
Fases do desenvolvimento glomerular em ratos................... 25
Figura 3.1
Visualização da região isquêmica do rim durante a
realização cirúrgica do modelo da nefrectomia 5/6...............
42
Figura 3.2
Representação esquemática do delineamento experimental... 43
Figura 3.3
Experimento para avaliação da função renal (clearance de
inulina)..................................................................................
45
Figura 3.4
Representação esquemática do experimento da função
renal para determinação da taxa de filtração glomerular
(clearance de inulina)............................................................
46
Figura 4.1
Rim de animal submetido à nefrectomia 5/6 perfundido
com solução de PBS e paraformol 4%..................................
54
Figura 4.2
Variação de peso corporal (g) dos animais desde o
nascimento até 120 dias do processo cirúrgico....................
55
Figura 4.3
Pressão arterial sistólica dos filhotes de mães que
receberam água ou salina 0,15M durante a gestação e
amamentação aos 30 e 60 dias após o nascimento (antes
do processo cirúrgico)...........................................................
57
Figura 4.4
Pressão arterial sistólica de ratos após 30, 60 e 90 dias da
intervenção cirúrgica.............................................................
58
Figura 4.5
Excreção urinária de albumina (mg/24h) dos ratos aos 30 e
60 dias do nascimento cujas mães receberam água ou
salina durante a gestação e amamentação (antes da
cirurgia)..................................................................................
60
Figura 4.6
Albuminúria (mg/24h) de ratos após a intervenção
cirúrgica.................................................................................
62
Figura 4.7
Taxa de filtração glomerular (TFG) de ratos aos 90 e 120
dias após a intervenção cirúrgica.........................................
63
Figura 4.8
Cortes corados em Tricrômio de Masson do córtex renal
dos animais sham e nefrectomizados aos 120 dias da
cirurgia...................................................................................
65
Figura 4.9
Escore para glomeruloesclerose (GL) no córtex renal após
120 dias da cirurgia...............................................................
66
Figura 4.10
Escore para as lesões tubulointersticiais (LTI) no córtex
renal após 120 dias da cirurgia.............................................
67
Figura 4.11
Imunorreação para células ED1-positivas
(macrófagos/monócitos) no córtex renal dos animais sham
e nefrectomizados aos 120 dias da cirurgia..........................
69
Figura 4.12
Número de células ED1-positivas por glomérulo e por área
de 0,245mm
2
do compartimento tubulointersticial do córtex
renal de ratos sacrificados aos 120 dias após o processo
cirúrgico.................................................................................
70
LISTA DE TABELAS
Tabela 4.1
Volume de líquidos ingeridos (VL) e consumo de ração
(g/24h) das ratas submetidas à ingestão normal (controle)
ou aumentada de sódio (experimental) durante a gestação
e amamentação e variação de peso corporal (∆Pc) no
início e final da gestação.......................................................
52
Tabela 4.2
Mortalidade dos ratos após o processo cirúrgico da
nefrectomia 5/6 ou cirurgia fictícia (sham)............................
53
Tabela 4.3
Nefrectomia 5/6 realizada em filhotes cujas mães
receberam água durante a gestação e amamentação ou
salina 0,15M em substituição à água....................................
53
Tabela 4.4
Peso corporal (g) dos animais ao nascimento e aos 60 dias
de idade (período antes da cirurgia).....................................
54
Tabela 4.5
Peso corporal (g) dos animais após a cirurgia e relação do
peso do rim pelo peso corporal após 120 da cirurgia...........
56
Tabela 4.6
Pressão arterial sistólica dos filhotes cujas mães
receberam água ou salina 0,15M durante a gestação e
amamentação, aos 30 e 60 dias após o nascimento (antes
do processo cirúrgico)..........................................................
56
Tabela 4.7
Pressão arterial sistólica dos animais cujas mães
receberam água ou salina 0,15M durante a gestação e
amamentação, após o processo cirúrgico.............................
57
Tabela 4.8
Excreção urinária de albumina (mg/24h) dos filhotes aos 30
e 60 dias após o nascimento cujas mães receberam água
(controle) ou salina (experimental) durante a gestação e
amamentação, antes do processo cirúrgico..........................
59
Tabela 4.9
Excreção urinária de albumina (mg/24h) de ratos 30, 60, 90
e 120 dias após o processo cirúrgico (nefrectomia 5/6 ou
cirurgia fictícia)......................................................................
61
Tabela 4.10
Parâmetros de função renal nos animais após 120 dias da
cirurgia fictícia ou nefrectomia 5/6.........................................
64
Tabela 4.11
Escore para glomeruloesclerose (GL) e lesões
tubulointersticiais (LTI) no córtex de ratos após 120 dias do
processo cirúrgico.................................................................
68
SUMÁRIO
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUÇÃO......................................................................................
.
22
1.1 Desenvolvimento renal ................................................................
.
23
1.2 Sistema renina-angiotensina-aldosterona .................................
.
26
1.3 Sistema renina-angiotensina-aldosterona no
desenvolvimento renal ................................................................
.
29
1.4 Sobrecarga de sódio durante o desenvolvimento renal...........
.
32
1.5 Participação da angiotensina II no modelo da nefrectomia
5/6 ..................................................................................................
.
34
2 OBJETIVOS..........................................................................................
37
3 MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................
.
39
3.1 Animais .........................................................................................
.
40
3.2 Delineamento experimental.........................................................
.
40
3.3 Pressão arterial sistólica .............................................................
.
43
3.4 Carga excretada de albumina......................................................
.
44
3.5 Função renal.................................................................................
.
44
3.6 Volume urinário, determinações das concentrações de Na
+
e
K
+
e osmolalidade .......................................................................
.
47
3.7 Análise histológica.......................................................................
.
48
3.8 Análise imuno-histoquímica........................................................
.
48
3.9 Análise estatística........................................................................
.
49
4 RESULTADOS......................................................................................
.
51
4.1 Grupo controle e experimental ...................................................
.
52
4.2 Mortalidade após o processo cirúrgico .....................................
.
52
4.3 Êxito na nefrectomia 5/6 ..............................................................
.
53
4.4 Peso corporal ...............................................................................
.
54
4.5 Pressão arterial sistólica .............................................................
.
56
4.6 Excreção urinária de albumina ...................................................
.
59
4.7 Função renal.................................................................................
.
63
4.8 Análise histológica.......................................................................
.
64
4.9 Análise imuno-histoquímica........................................................
.
68
5 RESUMO DOS RESULTADOS ............................................................
.
71
6 DISCUSSÃO.........................................................................................
.
74
7 CONCLUSÕES.....................................................................................
.
86
REFERÊNCIAS ....................................................................................
.
88
ANEXOS ...............................................................................................
.
99
APÊNDICES .........................................................................................
.
101
1 INTRODUÇÃO
Marin ECS Introdução
___________________________________________________________________________
23
1.1 Desenvolvimento renal
O desenvolvimento renal humano começa por volta da 5ª semana do período
gestacional e se completa in utero antes da 36ª semana de gestação (NIGAM;
APERIA; BRENNER, 1996; MACDONALD; EMERY, 1959). Em ratos e
camundongos, a nefrogênese começa no 11° e 12° dia embrionário e continua pelo
restante da gestação até a 2ª semana pós-natal, enquanto a maturação estrutural
final e funcional se completa na 3ª semana pós-natal, coincidindo com o período de
desmame (NIGAM; APERIA; BRENNER, 1996).
Em mamíferos, o rim deriva-se de três estruturas fetais de acordo com a
seguinte seqüência de desenvolvimento: pronefros, mesonefros e metanefros. Na
maioria dos mamíferos, incluindo humanos e roedores, os pronefros e mesonefros
aparecem cedo na gestação, porém sofrem regressão, enquanto que os metanefros
se diferenciam no rim adulto (NIGAM; APERIA; BRENNER, 1996). Na nefrogênese,
ocorre a interação entre as células mesenquimais do blastema metanéfrico e as
células epiteliais do broto ureteral, um ramo do ducto mesonéfrico (ducto de
Wolffian). As células mesenquimais indiferenciadas migram, condensando-se ao
redor das extremidades do ureter em ascensão e sofrem conversão mesenquimal-
epitelial. As células epiteliais formadas se proliferam formando vesículas que se
desenvolvem em forma de vírgula e corpos em forma de “S”, estruturas essas
precursoras do nefro (REEVES; CAULFIELD; FARGUHAR, 1978).
O desenvolvimento glomerular é um processo contínuo que pode ser dividido
em 4 estágios (Figura 1.1): 1º - formação em vesícula, 2º - formação em “S”, 3º -
desenvolvimento de alças capilares e 4º - maturação de glomérulos. No primeiro
Marin ECS Introdução
___________________________________________________________________________
24
estágio surge um grupo de células epiteliais colunares formando o revestimento da
luz da vesícula. No estágio posterior, em forma de “S”, o epitélio se transforma em
duas ou mais camadas profundas de células e entre elas, forma-se o espaço de
Bowman. Nesse estágio se inicia a formação de alças capilares e o epitélio sofre
uma reorganização. Os espaços intercelulares são contínuos com o espaço de
Bowman, podendo ser observados entre as células epiteliais viscerais. No final
dessa fase, a membrana basal surge entre o epitélio visceral e o endotélio. No
estágio do desenvolvimento das alças capilares podem ser observadas várias alças
em diversos estágios de maturação e também conspícuos espaços celulares ao
longo da margem lateral entre as células do epitélio visceral. A membrana basal e as
fenestrações endoteliais se diferenciam ao mesmo tempo dos processos podais. A
membrana basal aumenta em espessura e origina uma estrutura madura com uma
camada densa central, a lâmina densa e as lâminas rara interna e externa
adjacentes ao endotélio e epitélio, respectivamente. Os glomérulos podem ser
considerados maduros quando apresentam múltiplas alças capilares, embora o
epitélio visceral ainda não tenha alcançado o seu padrão normal, ou seja, uma
configuração mais achatada e a diferenciação dos processos podais e fendas
completamente estabelecidas. Nesse estágio final, tanto o endotélio bem como o
epitélio visceral, apresentam sua configuração achatada madura (REEVES;
CAULFIELD; FARGUHAR, 1978).
Marin ECS Introdução
___________________________________________________________________________
25
Figura 1.1 Fases do desenvolvimento glomerular em ratos. 1 - formação em
vesículas; 2 - formação em S; 3 - desenvolvimento de alças capilares e 4 -
maturação de glomérulos (REEVES; CAULFIELD; FARGUHAR, 1978).
A formação da matriz extracelular (MEC) representa um dos eventos
principais na diferenciação dos glomérulos. Os principais componentes da MEC são:
colágenos tipo III e IV, fibronectina, lamininas e proteoglicanas. A fibronectina é uma
glicoproteína que pode interagir com outras proteínas da matriz e proteínas
associadas a células, induzindo mudanças na adesão e migração celulares
(YAMADA, 1991; THIERY e cols., 1989). Fatores de crescimento liberados
localmente participam da formação e regulam a produção da MEC, regulando a
remodelação tecidual que ocorre na embriogênese, no desenvolvimento e no reparo
de tecido após lesão (BORDER; NOBLE, 1994).
1 2
3 4
1 2
3 4
Marin ECS Introdução
___________________________________________________________________________
26
1.2 Sistema renina-angiotensina-aldosterona
O sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA) tem importância
fundamental na regulação do volume do fluido extracelular (VFEC) e manutenção da
perfusão tecidual. Esse sistema atua em condições em que ocorrem alterações da
pressão arterial e da homeostase do VFEC, como a perda do volume de sangue
circulante, deficiência intravascular do conteúdo de sódio e água e em situações
clínicas relacionadas com alterações da hemodinâmica (ANTUNES-RODRIGUES e
cols., 2005; BREWSTER; PERAZELLA, 2004; WINAVER e cols., 2000).
O SRAA compreende uma cascata de peptídeos intermediários, sendo o
evento inicial a liberação de renina pelas células justaglomerulares e de outros
tecidos. A síntese da renina é influenciada pela pressão hidrostática nas arteríolas
aferentes glomerulares, níveis de angiotensina II (ANG II), além da quantidade de
sódio que chega à mácula densa. A concentração de potássio plasmático e os níveis
do peptídeo natriurétrico atrial e endotelina também podem afetar a síntese de
renina. Desta forma, a renina atua clivando o angiotensinogênio, sintetizado no
fígado, em angiotensina I (ANG I). A enzima conversora de angiotensina II (ECA)
atua convertendo a ANG I em ANG II. A ECA pode ser encontrada nas células
endoteliais do pulmão, endotélio vascular e nas membranas celulares do rim,
coração e cérebro (BREWSTER; PERAZELLA, 2004).
A presença de componentes locais do SRAA permite a síntese de ANG II
mesmo na ausência de níveis circulantes de ANG I. Isso pode ser observado quando
níveis de ANG II no fluido tubular proximal, fluido intersticial e medula renal estão
aumentados em relação aos níveis sistêmicos, sugerindo que a ANG II possa ser
Marin ECS Introdução
___________________________________________________________________________
27
sintetizada localmente, atuando com efeitos autócrinos e parácrinos com funções
específicas. A ativação da ANG II estimula a síntese de aldosterona na zona
glomerular da glândula adrenal e de outros tecidos (BREWSTER; PERAZELLA,
2004).
Outras vias que não relacionam com a renina e a ECA podem atuar na
produção de ANG II e de aldosterona. Esta síntese é descrita na literatura mesmo na
presença de inibidores da ECA, considerando, desta forma, que aproximadamente
40% da ANG II no rim pode ser produzida por essas vias independentes da ECA
(BREWSTER; PERAZELLA, 2004).
A maior parte das ações biológicas da ANG II no rim é mediada por dois
subtipos de receptores: receptor de ANG II tipo 1, AT
1
, e receptor de ANG II tipo 2,
AT
2
, (BREWSTER; PERAZELLA, 2004). Todavia, a maioria das ações da ANG II é
mediada pelos receptores AT
1
(GOMEZ, 1994; WONG e cols., 1992; CHIU e cols.,
1991). Em tecidos adultos, o AT
1
está distribuído na vasculatura, rim, glândula
adrenal, coração, fígado e cérebro. Em indivíduos adultos normais, o receptor AT
2
está presente somente na medula da adrenal, útero, ovário, endotélio vascular e
distintas áreas cerebrais. No feto, o receptor AT
2
está largamente distribuído
(BREWSTER; PERAZELLA, 2004).
Os subtipos de receptores de ANG II apresentam várias similaridades. Ambos
estão acoplados à proteína G, contendo aproximadamente 360 aminoácidos com
sete domínios transmembrana. Entretanto, seus genes residem em cromossomos
distintos, sendo o gene para AT
1
localizado no 3º cromossomo e o para AT
2
no 10º
cromossomo. Ambos os genes apresentam uma seqüência homológa de 30%. Estes
receptores apresentam um funcionamento distinto com diferentes vias de sinais de
transdução (BREWSTER; PERAZELLA, 2004).
Marin ECS Introdução
___________________________________________________________________________
28
As ações da ANG II na hemodinâmica renal são fundamentais para a
manutenção da pressão arterial. A ativação de receptores AT
1
no rim pode contribuir
para a hipertensão através da retenção de sódio. A constrição da arteríola eferente
pela ANG II reduz o fluxo sangüíneo renal que, por sua vez, aumenta a pressão
intraglomerular, com conseqüente aumento da fração de filtração e da pressão
oncótica nos capilares peritubulares e redução da pressão hidrostática. Essas
alterações nas pressões peritubulares favorecem o movimento de sódio e água no
túbulo proximal do interstício para circulação sistêmica via capilares peritubulares.
Além disso, a ANG II reduz o fluxo sangüíneo medular e a pressão intersticial na
medula renal, diminuindo também a reabsorção de sódio e água em porções mais
distais do nefro (BREWSTER; PERAZELLA, 2004).
O SRAA também aumenta a reabsorção de sódio e água pela ação direta no
transporte tubular renal, estimulando o aumento da atividade do contra-transportador
Na
+
/H
+
na membrana luminal, assim como do co-transportador Na
+
/HCO3
-
na
membrana basolateral. Provoca também aumento da liberação de aldosterona que
irá se ligar a receptores presentes nas células principais dos túbulos distal e coletor,
aumentando a entrada de sódio pelos canais de sódio. Além dos efeitos na
hemodinâmica renal, a ANG II estimula a proliferação celular e remodelamento do
tecido pelo aumento da síntese de citocinas pró-fibróticas e fatores de crescimento.
A maior expressão de quimiocinas, fatores quimiotáticos e moléculas de adesão
contribuem para uma proliferação celular anormal e fibrose renal. A deposição de
colágeno também fica aumentada devido à inibição das proteases que normalmente
degradam proteínas anormais nos tecidos. A associação destes efeitos contribui
para o desenvolvimento da glomeruloesclerose e fibrose tubulointersticial. Portanto,
a manutenção da integridade desse sistema é fundamental para a estabilidade da
Marin ECS Introdução
___________________________________________________________________________
29
função renal. Uma alteração na sua ativação pode desencadear alterações
patológicas no rim. A produção excessiva da ANG II como da aldosterona estão
associadas com lesão renal progressiva. Exemplos clínicos incluem doenças
associadas com a proteinúria, como o diabetes e nefropatias não diabéticas.
Evidências experimentais sugerem que, a combinação da hipertensão do capilar
intraglomerular, efeitos pró-fibróticos e proteinúria contribuem para a injúria renal e
estão diretamente associados com a ativação do SRAA (BREWSTER;
PERAZELLA, 2004).
1.3 Sistema renina-angiotensina-aldosterona no desenvolvimento renal
Várias evidências experimentais têm demonstrado o papel do SRAA no
desenvolvimento renal (HOMMA e cols., 1990; SINGHAL; FRANKI; HAYS, 1990;
BAGBY; HOLDEN, 1988; FERNANDEZ; TWICKLER; MEAD, 1985; CAMPBELL-
BOSWELL; ROBERTSON JR., 1981). Todos os componentes deste sistema estão
presentes desde cedo na vida embrionária. Embora o sistema se encontre up-
regulated durante o desenvolvimento renal, o significado fisiológico dessa alteração
ainda não é totalmente conhecido (GOMEZ e cols., 1993; GOMEZ e cols., 1989;
WALLACE; HOOK; BALIE, 1980).
As atividades da renina e da ECA plasmáticas aumentam durante a gestação
e são maiores ao nascimento quando comparados com animais adultos (WILSON e
cols., 1986; FISELIER e cols. 1983; WALLACE; HOOK; BALIE, 1980; KOTCHEN e
cols., 1972). A expressão do RNAm para renina também se encontra em seus níveis
Marin ECS Introdução
___________________________________________________________________________
30
máximos durante a nefrogênese em ratos recém-nascidos (ROSENBERG e cols.,
1990).
Vários estudos mostram que a ANG II é capaz de induzir o crescimento
celular e a expressão precoce de genes para fatores de crescimento (OMORI e
cols., 2000; GEISTERFER; PEACH; QUEENS, 1998; WOOLF; WINYARD, 1998;
COLES; BURNE; RAFF, 1993; TAUBMAN e cols. 1989). A ANG II pode estimular a
produção da MEC pelas células mesangiais em cultura, através do aumento na
produção do TGF-β, Transforming Growth Factor-
β
(KAGAMI e cols., 1994).
O TGF-β influencia a proliferação e diferenciação de vários tipos de células e
estimula a síntese de diversos componentes da MEC (ROBERTS; McCUNE;
SPORN, 1992; IGNOTZ; ENDO; MASSAGÉ, 1987; LYONS; MOSES, 1990;
RIZZINO, 1988; ROBERTS; SPORN, 1990; SPORN e cols., 1987). O TGF-β
também pode aumentar a produção de colágeno, fibronectina (COIMBRA e cols.,
1991; IGNOTZ; ENDO; MASSAGÉ, 1987) e proteoglicanas (BORDER e cols., 1990)
por fibroblastos, células mesangiais e epiteliais e reduzir a degradação da MEC
(EDWARDS e cols., 1987). Experimentos mostraram que a produção renal de TGF-β
está aumentada em ratos recém-nascidos, quando comparados com animais adultos
(COIMBRA; SILVA; LACHAT, 1994).
A inibição do SRAA pela administração de inibidores da ECA ou de
antagonistas de receptores AT
1
durante o desenvolvimento pós-natal (3 a 21dias)
em ratos, provoca anormalidades na estrutura (redução do volume glomerular,
dilatação tubular, atrofia papilar) e função renal (redução da habilidade de
concentração urinária) (BALBI, 2006; FRIBERG e cols., 1994; MCCAUSLAND;
RYAN; ALCORN, 1994). As anormalidades estruturais parecem resultar de uma
interrupção do desenvolvimento vascular e tubular renal em todas as regiões do rim
Marin ECS Introdução
___________________________________________________________________________
31
(MCCAUSLAND; RYAN; ALCORN, 1994). Em ratos de 4 a 5 semanas de idade
tratados com enalapril durante 6 semanas, apresentaram redução no volume
glomerular, enquanto este efeito não foi verificado em ratos adultos com 3 meses de
idade tratados durante o mesmo período (FOGO e cols., 1990).
Os subtipos de receptores de ANG II são expressos em maior quantidade em
fetos de ratos (MILLAN e cols., 1989). O RNAm para AT
1
pode ser detectado nos
glomérulos renais, vasos e córtex nefrogênicos em ratos recém-nascidos, onde a
proliferação e diferenciação celulares ocorrem simultaneamente (TUFRO-
McREDDIE e cols., 1993). Alguns autores constataram que a expressão dos
receptores AT
1
aumenta com a maturação renal, evidenciando a relação destes
receptores com a regulação da função renal (TUFRO-McREDDIE e cols., 1994). O
bloqueio destes receptores, bem como o uso de inibidores da ECA, resulta também
em dilatação tubular (MCCAUSLAND; RYAN; ALCORN, 1996; FRIBERG e cols.,
1994) além de expansão do compartimento intersticial (BALBI, 2006; KUBO e cols.,
2001; MCCAUSLAND; RYAN; ALCORN, 1996).
Ratos neonatos tratados com losartan, antagonista do SRAA, por 12 dias, a
partir do dia de nascimento, apresentaram alterações tubulares e comprometimento
de glomérulos, que se apresentavam com menor diâmetro, imaturos e em menor
número (TUFRO-McREDDIE e cols., 1995). Em todos os estudos que descrevem as
alterações na estrutura renal de ratos induzidas pelo bloqueio do SRAA, as drogas
eram administradas aos neonatos a partir do 1° (TUFRO-McREDDIE e cols., 1995,
CHARBIT e cols., 1995) ou 3° dia de vida (MCCAUSLAND; RYAN; ALCORN, 1996;
FRIBERG e cols., 1994). Contudo, quando o tratamento com losartan foi realizado
em ratos com mais de 21 dias, nenhuma mudança morfológica grave ocorria
(TUFRO-McREDDIE e cols., 1994). Essas observações sugerem que o
Marin ECS Introdução
___________________________________________________________________________
32
desenvolvimento renal de ratos está suscetível aos efeitos do bloqueio do SRAA,
principalmente durante os últimos 5 dias da gestação e as 2 primeiras semanas de
vida pós-natal (HILGERS; NORWOOD; GOMEZ, 1997).
Os receptores AT
2
intra-renais são abundantes durante a vida fetal e
diminuem logo após o nascimento, sugerindo que esses receptores podem ter uma
breve participação, provavelmente na diferenciação mesenquimal (NORWOOD;
HARRIS; GÓMEZ, 1994; CIUFFO e cols., 1993; GRADY e cols., 1991). Foram
constatados que os receptores AT
2
podem mediar a morte celular programada
(apoptose) e a inibição da proliferação (HORIUCHI; AKISHITA; DZAU, 1999).
Kakuchi e colaboradores (1995) detectaram, em camundongos, a presença do
RNAm para receptores AT
2
no interstício que envolve os ductos coletores e, em
menor quantidade, no mesênquima nefrogênico, sugerindo uma ligação entre
apoptose e esses receptores, resultando na remoção do excesso de mesênquima.
Koseki, Herzlinger e Al-Awqati (1992) postularam que o mesênquima nefrogênico
pode ser automaticamente programado para morte celular e, necessita ser removido
por fatores de crescimento para que o processo de desenvolvimento renal prossiga.
1.4 Sobrecarga de sódio durante o desenvolvimento renal
O VFEC é regulado fundamentalmente pelos mesmos mecanismos que
controlam o balanço de sódio, sendo este mantido dentro de limites estreitos em
indivíduos normais apesar das variações de ingestão de sódio. O aumento do VFEC
e a redução da atividade do sistema simpático que ocorrem em condições de
Marin ECS Introdução
___________________________________________________________________________
33
elevada ingestão de sódio irão inibir a atividade do SRAA, um dos principais
reguladores do VFEC (WINAVER e cols., 2000). Portanto, uma das formas de
reduzir a atividade do SRAA é pelo aumento da ingestão de sódio.
Modificações na atividade do sistema SRAA, que ocorrem durante o período
de desenvolvimento renal pré-natal ou pós-natal, podem provocar alterações
persistentes na função renal e na regulação desse sistema na vida adulta. Estudos
recentes realizados no nosso laboratório mostraram que ratas com 30 dias de idade,
nascidas de mães que receberam sobrecarga de sódio no período gestacional e
amamentação, apresentavam um aumento da pressão arterial sistólica e um declínio
da taxa de filtração glomerular, quando comparados às ratas cujas mães receberam
ingestão normal de sódio no mesmo período. Não foram detectadas alterações da
estrutura e no número de glomérulos por área do córtex renal entre esses animais
(BALBI e cols., 2004).
Silva e colaboradores (2003) verificaram que filhotes adultos de mães
submetidas à sobrecarga de sódio no período da gravidez e lactação apresentavam
redução do peso corporal, aumento da pressão arterial e alterações na regulação do
SRAA. Os autores não detectaram alterações do peso renal e do número de
glomérulos em relação aos animais adultos cujas mães receberam ingestão normal
ou baixa de sódio. Neste estudo, também foi verificado um aumento no conteúdo
renal de ANG II e ausência de atividade moduladora de renina plasmática em
resposta a variações no consumo de sal na dieta.
No nosso laboratório, em estudo anterior, verificou-se que a expressão de
ANG II e de seu receptor AT
1
foram menores no córtex renal em ratas recém-
nascidas (1º dia) cujas mães foram submetidas à sobrecarga de sódio na gestação e
amamentação, quando comparadas às ratas cujas mães receberam ingestão normal
Marin ECS Introdução
___________________________________________________________________________
34
de sódio. Esses dados, observados em animais recém-nascidos, sugerem que
distúrbios que ocorrem durante a fase intrauterina podem provocar alterações
funcionais persistentes na vida adulta (BALBI e cols., 2004).
Barker e colaboradores (1989) mostraram que adaptações fetais a um
ambiente intra-uterino inadequado podem levar a doenças na vida adulta. Segundo
essa teoria, o feto pode sofrer adaptações fisiológicas, neuroendócrinas ou
metabólicas para conseguir sobreviver em um período intra-uterino inadequado. As
adaptações que acontecem durante o desenvolvimento fetal podem levar a uma
reprogramação permanente na proliferação e diferenciação celular durante o
desenvolvimento dos tecidos e órgãos, que resultam em doenças na vida adulta.
1.5 Participação da angiotensina II no modelo da nefrectomia 5/6
O modelo denominado de rim remanescente ou nefrectomia 5/6 ou subtotal é
um dos modelos mais utilizados para induzir a insuficiência renal crônica. O modelo
consiste da redução da massa renal para 1/6 do tamanho original, resultando em
sobrecarga dos nefros remanescentes com lesão renal progressiva (GRETZ;
WALDHERR; STRAUCH, 1993). Esse modelo em questão, é bem caracterizado
funcionalmente pela diminuição da filtração glomerular, proteinúria, hipertensão,
aumento na reninemia e dos níveis renais de ANG II (KLEINKNECHT e cols., 1995).
A hipertrofia do rim remanescente, o aumento da pressão intraglomerular e do
fluxo sangüíneo renal, coagulação intracapilar e proteinúria são fatores que podem
contribuir na evolução para fibrose com perda progressiva das funções renais e
Marin ECS Introdução
___________________________________________________________________________
35
posterior uremia (PURKERSON; HOFFSTEN; KLAHR, 1976; SCHAINUCK e cols.,
1970).
A evolução temporal da nefropatia determinada pela nefrectomia subtotal
pode ser dividida em 3 períodos: primeira fase aguda, após a redução da massa
renal com função renal estável e período de evolução para insuficiência renal
crônica avançada (MEYER e cols., 1987). Nesta fase aguda ocorre insuficiência
renal funcional, sendo histologicamente bem definida após a primeira semana do
procedimento cirúrgico e se segue de recuperação parcial da função renal por volta
da quarta semana. Neste período não ocorrem proteinúria e dislipidemia
importantes, mas a hipertensão arterial já é evidente (YLITALO e cols., 1976).
No segundo período de função renal estável, a preservação da estabilidade
funcional depende da quantidade de proteína ingerida, do metabolismo basal, da
idade e do grau de hipertensão. Nesta fase a proteinúria e hiperlipidemia se
intensificam. O balanço de sódio é levemente positivo nas primeiras 8 semanas e
subseqüentemente tende ao equilíbrio. Em relação à pressão arterial observa-se
elevação com persistência de níveis pressóricos elevados (YLITALO e cols., 1976).
No terceiro período, na fase de evolução para insuficiência renal crônica terminal,
ocorre aumento ainda maior da proteinúria e hiperlipidemia. A pressão arterial
permanece elevada, como na fase anterior, e a função renal se deteriora em uma
grande velocidade que depende do volume de massa renal deixado intacto por
ocasião do procedimento inicial e do nível pressórico (GRETZ; WALDHERR;
STRAUCH, 1993).
As evoluções das lesões histológicas podem ser melhores estudadas após a
fase aguda, uma vez que as alterações iniciais são predominantemente funcionais.
Após esta fase, tem-se a hipertrofia glomerular e tubular, sendo descrita perda focal
Marin ECS Introdução
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36
da borda em escova de túbulos proximais, além da proliferação mesangial e
aumento de matriz, com presença de cilindros hialinos nos túbulos. A expansão
mesangial progressiva evolui para glomeruloesclerose segmentar e focal com
colapso de capilares e obsolescência glomerular. A lesão tubular evolui para fibrose
intersticial e atrofia tubular. Lesões vasculares decorrem do processo hipertensivo,
com depósito subendotelial hialino ou fibrinóide (SCHIMAMURA; MORRISON,
1975). Dentre os fatores que levam à glomeruloesclerose destacam-se o aumento
da pressão intracapilar glomerular, o aumento da taxa de filtração glomerular por
nefro, a deposição de lipídios, a infiltração de macrófagos e plaquetas, o aumento do
conteúdo renal de ANG II e a proteinúria (KLAHR; SCHREINER; ICHIKAWA, 1988;
HAKIM; GOLDSZER; BRANNER,1984; SCHREINER; COTRAN; UNANUE, 1982).
Vários trabalhos têm mostrado que a ANG II tem uma participação importante
na evolução da lesão renal nesses animais. Estudos realizados com antagonistas
desse sistema tem mostrado que essas drogas podem atenuar ou mesmo prevenir a
progressão da lesão renal nos animais com nefrectomia 5/6 (de FREITAS e cols.,
1998; LAFAYETE e cols., 1992; ANDERSON; RENNKE; BRENNER, 1986). Os
benefícios do bloqueio do SRAA resultam da combinação dos efeitos
hemodinâmicos, efeitos antagonistas aos fatores pró-fibróticos e redução da
proteinúria (BREWSTER; PERAZELLA, 2004).
Desta forma, considerando que a ANG II é um dos principais fatores
envolvidos no desenvolvimento da lesão renal nos animais com nefrectomia 5/6 e
que a sua regulação deve estar alterada nos animais submetidos à sobrecarga de
sódio no período pré-natal e amamentação é possível que a evolução dessas lesões
seja diferente dos animais cujas mães receberam ingestão normal de sódio no
mesmo período.
2 OBJETIVOS
Marin ECS Objetivos
38
Considerando que fenômenos que ocorrem durante o desenvolvimento renal
no período pré e pós-natal podem influenciar a vida dos filhotes, esse estudo visa:
• verificar as conseqüências da sobrecarga de salina na gestação e
amamentação na função e estrutura renal dos animais na idade adulta;
• avaliar a evolução da lesão renal pós nefrectomia 5/6 em filhotes de mães
submetidas à sobrecarga de salina durante a gestação e amamentação.
3 MATERIAIS E MÉTODOS
Marin ECS Materiais e Métodos
_______________________________________________________________________________________
40
3.1 Animais
Neste estudo utilizamos 57 ratas Wistar de 180 - 200 g e 23 ratos Wistar de
280 - 300 g para acasalamento e seus respectivos filhotes machos (n=199). Os
animais foram provenientes do Biotério Central da Universidade de São Paulo,
Campus de Ribeirão Preto e mantidos no Biotério do Departamento de Fisiologia da
Faculdade de Medicina da mesma Universidade. Os animais foram mantidos em
número máximo de quatro por gaiola, à temperatura de 22ºC, ciclo claro-escuro de
12 horas e alimentados, após desmame, com dieta ad lib padrão.
Os experimentos realizados estiveram de acordo com os princípios éticos de
experimentação animal, adotado pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal,
e foram aprovados pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, protocolo n.126/2005.
3.2 Delineamento experimental
As ratas foram colocadas para acasalamento na proporção de três fêmeas
para um macho, sendo a gravidez constatada através da presença de
espermatozóides no esfregaço vaginal fresco, sendo este considerado o primeiro dia
da gravidez. Após a constatação da gravidez, foi iniciado o tratamento, sendo as
ratas acompanhadas durante a gestação e amamentação, ambas com duração de
21 dias, sendo as mesmas divididas em dois grupos:
Marin ECS Materiais e Métodos
_______________________________________________________________________________________
41
1. Grupo Controle – ratas submetidas à ingestão normal de NaCl durante a
gestação e amamentação (n=30);
2. Grupo Experimental - ratas submetidas à ingestão aumentada de NaCl
durante a gestação e amamentação pela administração de solução salina
0,15 M em substituição à água (n=27).
A sobrecarga de salina utilizada no grupo experimental teve como intuito
efetuar uma inibição do SRAA, sem os possíveis efeitos tóxicos de drogas,
observados no bloqueio farmacológico.
Durante a gravidez e amamentação, o volume de líquidos ingeridos, assim
como o consumo de ração, foram registrados em média por 7 dias consecutivos. Foi
verificada também a variação de peso corporal durante a gestação em ambos os
grupos de animais controle e experimental.
Os filhotes machos das ratas dos grupos controle e experimentais, aos
sessenta dias de idade, foram submetidos a um processo cirúrgico, sendo, dois
grupos submetidos à cirurgia fictícia (laparotomia com manipulação dos pedículos
renais sem que se provocasse isquemia ou destruição do tecido renal, grupo sham).
Os outros dois grupos de animais foram submetidos à nefrectomia 5/6. Os animais
foram assim distribuídos:
1. Grupo S: Sham/Água: filhotes submetidos à cirurgia fictícia cujas mães
receberam ingestão normal de NaCl durante a gestação e amamentação
(n=24);
2. Grupo SS: Sham/Salina: filhotes submetidos à cirurgia fictícia cujas mães
receberam ingestão aumentada de NaCl durante a gestação e amamentação
pela administração de solução de NaCl 0,15 M em substituição a água (n=36);
Marin ECS Materiais e Métodos
_______________________________________________________________________________________
42
3. Grupo NE: Nefrectomizados/Água: filhotes nefrectomizados cujas mães
receberam ingestão normal de NaCl durante a gestação e amamentação
(n=71);
4. Grupo NES: Nefrectomizados/Salina: filhotes nefrectomizados cujas mães
receberam ingestão aumentada de NaCl durante a gestação e amamentação
pela administração de solução de NaCl 0,15 M em substituição à água (n=68);
Neste estudo optamos pelo modelo da nefrectomia subtotal (5/6) renal por
meio da ligação de dois ramos da artéria renal esquerda (posterior e média),
associada à nefrectomia total direita. A opção por este modelo deu-se devido à
ampla aceitação em estudos recentes envolvendo a insuficiência renal crônica
(GARCIA e cols., 1988; ANDERSON; RENNKE; BRENNER, 1986).
A Figura 3.1 mostra o aspecto do rim logo após a cirurgia da nefrectomia 5/6.
Nesta imagem, o rim foi exposto com o objetivo de melhor visualização da região do
tecido renal que se tornou isquêmica (região escurecida) após a ligação dos dois
ramos da artéria esquerda renal.
Figura 3.1 Visualização da região isquêmica
do rim durante a realização cirúrgica do
modelo da nefrectomia 5/6.
Após a realização do processo cirúrgico, os animais de todos os grupos foram
acompanhados por um período de até 120 dias. O peso corporal, a excreção urinária
Marin ECS Materiais e Métodos
_______________________________________________________________________________________
43
de albumina (abuminúria) e a pressão arterial sistólica foram avaliados mensalmente
antes e após a cirurgia. Após 90 ou 120 dias do processo cirúrgico, avaliou-se a taxa
de filtração glomerular (TFG) pelo clearance de inulina e o rim foi removido para
estudos histológicos e imuno-histoquímicos. O delineamento experimental é
apresentado abaixo (Figura 3.2):
Figura 3.2 Representação esquemática do delineamento experimental.
3.3 Pressão arterial sistólica
A pressão arterial sistólica (PS) foi determinada mensalmente de maneira
indireta por pletismografia (IITC Modelo 31; Life Science Instruments, Victory
Boulevard, Woodland Hills, EUA). Os animais foram previamente aquecidos em uma
câmara durante 15 minutos para elevação da temperatura corporal e dilatação das
artérias da cauda e, em seguida, submetidos à mensuração da pressão arterial
utilizando-se um manguito, colocado diretamente na cauda destes animais.
SALINA 0,15M ou ÁGUA
30d 90d
Gravidez
Nefrectomia 5/6
Albuminúria
Amamentação
60d 30d 60d 120d
Pressão Arterial Sistólica
Função Renal
21d 21d
Amamentação
Marin ECS Materiais e Métodos
_______________________________________________________________________________________
44
3.4 Carga excretada de albumina
A determinação da excreção diária de albumina foi realizada mensalmente em
amostras de urina coletadas por um período de 24 horas, sendo os animais
mantidos em gaiolas metabólicas durante o período da coleta das mesmas. As
amostras foram conservadas em azida sódica à temperatura de –20ºC. O método de
dosagem usado foi o eletroimunoensaio em gel de agarose desenvolvido por Laurell
(1972) e adaptado (COIMBRA; FURTADO; LACHAT, 1983). Foram utilizados neste
processo anticorpo anti-albumina de rato, soluções padrões contendo 0,04, 0,06 e
0,10 mg/mL de albumina, agarose tipo II da Sigma (Sigma Chemical Company, St.
Louis, MO, EUA) e tampão tris-acetato, pH=8,6.
3.5 Função renal
A função renal foi avaliada nos animais controles e experimentais após 90 ou
120 dias da cirurgia, pelo clearance de inulina (FUHR; KACZMARCZYK;
KRUTTGEN, 1955). Os animais foram anestesiados com tionembutal 40 mg/Kg de
peso corporal, intraperitoneal e logo após foi realizada a traqueostomia.
Posteriormente, a artéria e veia femurais foram canuladas para a coleta de amostras
de sangue e administração de líquidos, respectivamente, e os ureteres canulados
para a coleta de urina. Os animais receberam dose inicial (priming) de uma solução
contendo 8 mg/100g de peso corporal de inulina em PBS (NaCl 0,15M e tampão PO
4
Marin ECS Materiais e Métodos
_______________________________________________________________________________________
45
0,01M, pH=7,4). Em seguida foi infundida, através de bomba peristáltica com fluxo
de 2,2 mL/h, uma solução de manutenção contendo inulina numa dose de 0,5
mg/min/100 g de peso corporal para os animais sham e dose de 0,3 mg/min/100 g
de peso corporal para os animais nefrectomizados. Após 30 minutos de
estabilização, foi iniciada a coleta de uma amostra de urina de 60 minutos e foram
coletadas amostras de plasma 30 e 60 minutos após a estabilização. Ao término do
experimento, os rins foram perfundidos com PBS e paraformol 4%, pesados e
fixados em Bouin alcoólico durante quatro horas. Posteriormente, os fragmentos do
tecido renal foram lavados em álcool 70%, e embebidos em parafina para a
realização dos estudos histológicos e imuno-histoquímicos.
A Figura 3.3 apresenta o momento da realização do experimento de
avaliação da função renal. Durante todo o experimento o animal foi mantido sob uma
placa de aquecimento para conservar a temperatura corporal em torno de 37ºC.
Figura 3.3 Experimento para
avaliação da função renal
(clearance de inulina).
Marin ECS Materiais e Métodos
_______________________________________________________________________________________
46
Figura 3.4 Representação esquemática do experimento da função renal
para determinação da taxa de filtração glomerular (clearance de inulina).
As amostras de sangue e urina coletadas nos diferentes períodos (vide
esquema apresentado na Figura 3.4) foram utilizadas para as seguintes
quantificações:
Fluxo urinário (V);
Osmolalidades Urinária e Plasmática (U
osm
e P
osm
);
Clearance de Inulina;
Concentrações de Sódio (Na
+
) e Potássio (K
+
) no plasma e urina.
Essas quantificações foram utilizadas para determinações dos seguintes
parâmetros da função renal:
TFG:
TFG = U
in
x V , onde:
P
in
U
in
= concentração de inulina na urina (mg%);
P
in
= concentração de inulina no plasma (mg%);
V = fluxo urinário (ml/min/100g de peso);
Solução de inulina 2,2 mL/h em PBS
30 min
Perfusão
Plasma 1
Plasma 2/
Urina 1
Priming
(8 mg/100g)
30 min
30 min
Marin ECS Materiais e Métodos
_______________________________________________________________________________________
47
FE
Na+
e FE
K+
:
FE
Na+
= U
Na+
x V x 100 e FE
K+
= U
K+
x V x 100, onde:
P
Na+
x TFG P
K+
x TFG
FE
Na+
e FE
K+
= excreção fracional de sódio e potássio (%);
U
Na+
x V e U
K+
x V = carga excretada de sódio e potássio, respectivamente.
P
Na+
x TFG e P
K+
x TFG = carga filtrada de sódio e potássio, respectivamente.
3.6 Volume urinário, determinações das concentrações de Na
+
e K
+
e
osmolalidade
Volume urinário: determinado gravimetricamente após a coleta de urina de 24
horas em gaiolas metabólicas;
Osmolalidade: determinada nas amostras urinárias e plasmáticas em
osmômetro (The Advanced Osmometer Modelo 3250; Advanced Instruments,
Norwood, MA, EUA), baseando-se no método do abaixamento do ponto de
congelação;
Concentrações de Na
+
e K
+
: determinadas nas amostras urinárias e
plasmáticas por fotometria de chama (Modelo B 262; Micronal, São Paulo,
SP, Brasil).
Marin ECS Materiais e Métodos
_______________________________________________________________________________________
48
3.7 Análise histológica
Os rins dos animais sacrificados 120 dias após o processo cirúrgico foram
retirados e utilizados para análise histológica. As secções de 5 µm de tecido renal
foram coradas com Tricrômio de Masson.
As lesões glomerulares no córtex renal foram avaliadas por escores que
refletiam a extensão da lesão: 0= esclerose segmentar atingindo entre 0 a 10%; 1=
lesão atingindo entre 10 a 25% do glomérulo; 2= lesão entre 25 a 50%; 3= lesão
entre 50 a 75% e 4= lesão superior a 75% da área. Foram avaliados
aproximadamente 163 glomérulos por rato e determinado um escore médio por
glomérulo por animal.
As lesões tubulointersticiais encontradas na região cortical renal foram
avaliadas por escores descritos por Shih, Hines e Neilson (1988): 0,0= normal; 0,5 =
alterações discretas e focais; 1 = alterações acometiam menos que 10% do córtex; 2
= 10 – 25%; 3 = 25 – 75% e 4 = atingiam mais de 75% da área.
3.8 Análise Imuno-histoquímica
As secções de 5 µm de tecido renal dos animais foram desparafinizadas e
submetidas à análise imuno-histoquímica, onde os cortes foram inicialmente
incubados com o anticorpo primário:
Marin ECS Materiais e Métodos
_______________________________________________________________________________________
49
• anti-ED1 (1:1000, IgG monoclonal (SEROTEC, Oxford, Reino Unido), 60
minutos em temperatura ambiente).
Posteriormente, os cortes foram incubados com anticorpo secundário anti-
IgG de camundongo. O produto da reação foi detectado com o sistema avidina-
biotina-peroxidase (Vector Labotatories, Burlingame, CA, EUA) e a cor
desenvolvida pela adição de 3,3 diaminobenzidina (Sigma Chemical Company,
St. Louis, MO, EUA) na presença de água oxigenada. As ligações inespecíficas
foram bloqueadas pelas diluições dos anticorpos primários e secundários com
solução de PBS, contendo albumina bovina 1%. Os controles negativos foram
feitos, substituindo o anticorpo primário por IgG inespecífica de camundongo em
concentrações equivalentes. A contra-coloração foi feita com metilgreen.
A análise da imunorreação para ED1 foi feita pela contagem de células
positivas por glomérulo ou área do córtex renal (medindo 0,245mm
2
) dos animais,
sendo determinado o número médio de células por glomérulo ou campo para cada
rato.
3.9 Análise estatística
Para a análise entre dois grupos utilizou-se o Teste T com correção de Welch,
sendo os resultados expressos em média ± erro padrão da média (EPM). Para
comparações múltiplas, utilizou-se o teste de Kruskal-Wallis, não paramétrico, com
pós-teste de Dunn para análise dos resultados de albuminúria e histologia, sendo os
Marin ECS Materiais e Métodos
_______________________________________________________________________________________
50
dados expressos em mediana e percentis (25-75%). Os demais dados foram
submetidos à Análise de Variância (ANOVA), com comparações múltiplas pelo teste
de Newman-Keuls, sendo os resultados expressos em média ± EPM. O nível de
significância adotado neste estudo foi de p< 0,05.
4 RESULTADOS
Marin ECS Resultados
___________________________________________________________________________
52
4.1 Grupo controle e experimental
O volume de líquidos ingeridos, na gestação e na amamentação, pelas ratas
submetidas à ingestão aumentada de sódio (grupo experimental) foi maior, quando
comparadas às ratas com ingestão normal de sódio (grupo controle) no mesmo
período. A variação de peso corporal, do início ao final da gestação, também foi
maior no grupo experimental, evidenciando assim, um aumento do VFEC. Não
houve diferença significativa entre as ratas de ambos os grupos tanto na gestação
como na amamentação em relação ao consumo de ração (Tabela 4.1).
Tabela 4.1 Volume de líquidos ingeridos (VL) e consumo de ração (g/24h) das ratas
submetidas à ingestão normal (controle) ou aumentada de sódio (experimental)
durante a gestação e amamentação e variação de peso corporal (∆Pc) no início e
final da gestação
VL (mL/24h) Consumo ração (g/24h)
GRUPOS
Gestação Amamentação Gestação Amamentação
∆Pc (Kg)
Controle
52,73 ± 3,24 89,18 ± 7,91 38,88 ± 3,39 61,48 ± 3,83 102,90 ± 18,69
Experimental
73,15 ± 3,16**
*
133,50 ± 14,2* 32,31 ± 0,86 70,09 ± 8,51 175,40 ± 10,29**
Resultados expressos em média±EPM, *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,01 versus controle.
4.2 Mortalidade após o processo cirúrgico
A mortalidade dos animais até 120 dias do processo cirúrgico (Tabela 4.2) foi
superior nos animais submetidos à nefrectomia subtotal do que naqueles submetidos
Marin ECS Resultados
___________________________________________________________________________
53
à cirurgia fictícia (sham). A maior mortalidade ocorreu nos animais nefrectomizados
cujas mães receberam água na gestação e amamentação (52,11%).
Tabela 4.2 Mortalidade dos ratos após o processo cirúrgico da nefrectomia 5/6 ou
cirurgia fictícia (sham)
Mortalidade
Animais Total
n %
Sham/Água 24 3 12,50
Sham/Salina 36 8 22,22
Nefrectomizados/Água 71 37 52,11
Nefrectomizados/Salina 68 27 39,70
4.3 Êxito na nefrectomia 5/6
A Tabela 4.3 apresenta os dados relativos ao êxito na cirurgia de nefrectomia
5/6 nos animais cujas mães receberam água ou salina 0,15M na gestação e
amamentação. A verificação do êxito na cirurgia ocorreu no momento de perfundir o
animal e somente foram analisados os resultados dos animais em que a nefrectomia
foi realizada com sucesso (67,57%).
Tabela 4.3 Nefrectomia 5/6 realizada em filhotes cujas mães receberam água durante
a gestação e amamentação ou salina 0,15M em substituição à água
Nefrectomia
5/6
Água
n %
Salina
n %
Total
n %
Sucesso 22 64,70 28 70,00 50 67,57
Fracasso 12 35,94 12 30,00 24 32,43
Marin ECS Resultados
___________________________________________________________________________
54
A Figura 4.1 mostra a imagem de um rim, após perfusão com solução de
PBS e paraformol 4%, cuja nefrectomia 5/6 ocorreu com êxito. Pode-se verificar na
figura a hipertrofia do órgão, assim como a perda do formato original.
Figura 4.1 Rim de animal submetido à nefrectomia
5/6 perfundido com solução de PBS e paraformol
4%.
4.4 Peso corporal
Não foi observada diferença no peso corporal ao nascimento entre os filhotes de
mães do grupo experimental e controle (Tabela 4.4). No momento da realização
cirúrgica, aos 60 dias de idade, o peso corporal dos filhotes cujas mães receberam água
na gestação e amamentação foi maior em relação aos filhotes do grupo experimental.
Tabela 4.4 Peso corporal (g) dos animais ao nascimento e aos 60 dias de idade
(período antes da cirurgia)
Peso Corporal (g)
Animais
Nascimento 60 dias
Filhotes do grupo controle
7,63 ± 0,12 402,80 ± 8,23
Filhotes do grupo experimental
8,03 ± 0,13 367,70 ± 7,72**
Resultados expressos em média±EPM, **p < 0,01 versus filhotes do grupo controle.
Marin ECS Resultados
___________________________________________________________________________
55
O peso corporal dos animais nefrectomizados após 90 e 120 dias do processo
cirúrgico foi inferior em relação aos animais sham de ambos os grupos (Figura 4.2).
Contudo, somente nos animais cujas mães receberam salina na gestação e
amamentação a diferença de peso corporal entre o grupo sham e nefrectomizados
foi significativa durante todo o período de observação. Quando se comparou a
relação peso do rim pelo peso corporal não observamos diferença entre os grupos
sham, assim como entre os grupos nefrectomizados. Foi observada diferença
somente entre o grupo sham/salina e seu respectivo grupo nefrectomizado (Tabela
4.5).
Figura 4.2 Variação de peso corporal (g) dos animais desde o nascimento até 120
dias do processo cirúrgico.
0
100
200
300
400
500
600
700
Nascimento 60 dias de idade-
realização da
cirurgia
90 dias após a
cirurgia
120 dias após
cirurgia
Peso corporal
(g)
Sham/Água Sham/Salina
Nefrectomizados/Agua Nefrectomizados/Salina
Marin ECS Resultados
___________________________________________________________________________
56
Tabela 4.5 Peso corporal (g) dos animais após a cirurgia e relação do peso do rim
pelo peso corporal após 120 da cirurgia
Peso corporal (g) após a cirurgia
Animais
90 dias 120 dias
Peso: rim/
corporal
Sham/Água
593,90 ± 28,81 611,70 ± 17,90 0,0033 ± 0,0001
Sham/Salina
602,50 ± 14,59 663,10 ± 14,62** 0,0036 ± 0,0002
Nefrectomizados/Água
540,10 ± 20,60 578,70 ± 13,90 0,0046 ± 0,0003
Nefrectomizados/ Salina
528,10 ± 15,49
###
608,50 ± 20,82
##
0,0053 ± 0,0006
#
Resultados expressos em média±EPM, **p < 0,01: versus Sham/Água;
#
p < 0,05: versus
Sham/Salina,
##
p < 0,01: versus Sham/Salina;
###
p < 0,001: versus Sham-Salina
4.5 Pressão arterial sistólica
Os valores referentes à PS dos filhotes do grupo controle e experimental aos
30 e 60 dias após o nascimento (período anterior ao processo cirúrgico) são
mostrados na Tabela 4.6 e na Figura 4.3. Foi verificada uma diferença significativa
na PS entre os grupos, sendo esta diferença mais acentuada aos 60 dias (p< 0,01).
Tabela 4.6 Pressão arterial sistólica dos filhotes cujas mães receberam água ou salina
0,15M durante a gestação e amamentação, aos 30 e 60 dias após o nascimento
(antes do processo cirúrgico)
Pressão Arterial Sistólica
(mmHg)
AGUA SALINA
30 dias
111,4 ± 5,87 130,4 ± 6,69 *
60 dias
114,4 ± 3,21 131,10 ± 3,04
##
Resultados expressos em média±EPM. *p < 0,05: versus água 30 dias;
##
p <
0,01: versus água 60 dias.
Marin ECS Resultados
___________________________________________________________________________
57
0
50
100
150
30 dias
60 dias
Salina
Água
Pressão Arterial
(mmHg)
*##
Figura 4.3 Pressão arterial sistólica dos filhotes de mães que receberam água ou
salina 0,15M durante a gestação e amamentação aos 30 e 60 dias após o
nascimento (antes do processo cirúrgico). *p < 0,05: versus água 30 dias;
##
p < 0,01:
versus água 60 dias.
Os valores da PS no período de 30, 60 e 90 dias após a cirurgia fictícia
(sham) ou nefrectomia 5/6 de ambos os grupos, água e salina, estão apresentados
na Tabela 4.7 e Figura 4.4.
Tabela 4.7 Pressão arterial sistólica dos animais cujas mães receberam água ou
salina 0,15M durante a gestação e amamentação, após o processo cirúrgico
Grupos 30 dias 60 dias 90 dias
Sham/Água
114,80 ± 5,64 120,80 ± 4,63 124,50 ± 4,44
Sham/Salina
128,20 ± 3,44 130,60 ± 4,13 133,50 ± 1,76
Nefrectomia/Água
174,70 ± 6,25*** 176,30 ± 8,67** 182,40 ± 12,17**
Nefrectomia/Salina
157,30 ± 18,29 160,20 ± 5,48 189,10 ± 22,62
###
Resultados apresentados em média±EPM. **p < 0,01 e *** p< 0,001 versus Sham/Água;
###
p < 0,001 versus Sham/Salina.
Marin ECS Resultados
___________________________________________________________________________
58
S SS NE NES
0
100
200
300
30 dias
***
Pressão Arterial
(mmHg)
S SS NE NES
0
100
200
300
60 dias
**
Pressão arterial (mmHg)
S SS NE NES
0
100
200
300
90 dias
**
###
Pressão arterial (mmHg)
Figura 4.4
Pressão arterial sistólica de ratos após 30, 60 e 90 dias da intervenção
cirúrgica. S, Sham/Água; SS, Sham/Salina; NE, Nefrectomizados/Água; NES,
Nefrectomizados/Salina. **p < 0,01 versus S; *** p< 0,001 versus S;
###
p < 0,001
versus SS.
Após a realização da nefrectomia 5/6 ocorreu aumento da PS nos animais
nefrectomizados em relação aos seus respectivos grupos sham, independente do
tratamento realizado na gestação e amamentação. Contudo, não houve diferença
entre os grupos de animais sham, como entre os grupos de animais nefrectomizados
em todos os períodos de 30, 60 e 90 dias. O aumento da PS nos animais
nefrectomizados, cujas mães receberam sobrecarga de NaCl na gestação e
amamentação em relação aos seus respectivos grupos sham, só foi observado aos
A
C
B
Marin ECS Resultados
___________________________________________________________________________
59
90 dias, embora a PS destes animais aos 30 e 60 de idade dias já estivesse elevada
antes da nefrectomia.
4.6 Excreção urinária de albumina
A Tabela 4.8 e a Figura 4.5 mostram os valores para excreção urinária de
albumina nos filhotes cujas mães receberam água ou salina durante a gestação e
amamentação aos 30 e 60 dias do nascimento (antes da intervenção cirúrgica).
Verifica-se que já aos 30 dias ocorreu um aumento da albuminúria nos filhotes do
grupo experimental (salina) em relação controle (água) (p <0,001), sendo que esse
aumento não foi observado aos 60 dias (p <0,05). Nos filhotes do grupo controle
houve diferença entre o período de 30 a 60 dias (p <0,01), o que não foi constatado
nos filhotes do grupo experimental.
Tabela 4.8 Excreção urinária de albumina (mg/24h) dos filhotes aos 30 e 60 dias
após o nascimento cujas mães receberam água (controle) ou salina (experimental)
durante a gestação e amamentação, antes do processo cirúrgico
Filhotes 30 dias 60 dias
Controle 0,15
(0,09; 0,23)
0,30**
(0,20; 0,7)
Experimental 0,29***
(0,14; 0,67)
0,25
#
(0,17; 0,60)
Os resultados estão expressos como mediana e percentis
(25; 75%).** p< 0,01 e *** p< 0,001 versus controle 30
dias,
#
p<0,05 versus controle 60 dias.
Marin ECS Resultados
___________________________________________________________________________
60
0.1
1.0
10.0
Salina
Água
60 dias 30 dias
**
***
Albuminúria (mg/24
horas
Figura 4.5
Excreção urinária de albumina (mg/24h) de ratos aos 30 e 60 dias do
nascimento cujas mães receberam água ou salina durante a gestação e
amamentação (antes da cirurgia). As linhas horizontais representam as medianas.
Dados expressos em escala logarítmica. ** p< 0,01 e *** p< 0,001 versus água 30
dias,
#
p<0,05 versus água 60 dias.
A Tabela 4.9 ilustra os valores relativos à excreção urinária de albumina após
a intervenção cirúrgica nos períodos de 30, 60, 90 e 120 dias nos grupos sham e
nefrectomizados. Observa-se um aumento na excreção urinária de albumina em
ambos os grupos de animais submetidos à nefrectomia 5/6 logo aos 30 dias após a
cirurgia, evidenciando presença de lesão renal e o estabelecimento da nefropatia
nesses animais (GRETZ; WALDHERR; STRAUCH,1993).
Marin ECS Resultados
___________________________________________________________________________
61
Tabela 4.9 Excreção urinária de albumina (mg/24h) de ratos 30, 60, 90 e 120 dias
após o processo cirúrgico (nefrectomia 5/6 ou cirurgia fictícia)
Animais 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias
Sham/Água 0,45
(0,10; 0,60)
0,60
(0,43; 0,90)
0,87
(0,09; 1,25)
0,67
(0,25; 0,72)
Sham/Salina 0,51
(0,24; 1,46)
0,36
(0,14; 0,72)
0,60
(0,33; 1,14)
0,82
(0,44; 1,12)
Nefrectomizados/
Água
20,44***
(5,82;53,95)
65,82***
(31,17;127,40)
124,10***
(37,60; 316,00)
126,00***
(94,50; 163,20)
Nefrectomizados/
Salina
20,28
###
(11,16; 47,53)
44,67
###
(10,22; 86,70)
74,40
###
(33,78; 174,50)
98,18
##
(39,17; 210,80)
Os resultados estão expressos como mediana e percentis (25; 75%).*** p< 0,001 versus
Sham/Água,
##
p<0,01 versus Sham/Salina,
###
p<0,001 versus Sham/Salina,
Na Figura 4.6, verifica-se que não ocorreu diferença na excreção urinária de
albumina entre os grupos sham (água e salina) durante todo o decorrer do
experimento. Os animais nefrectomizados apresentaram aumento significativo na
albuminúria em todos os períodos estudados em relação aos seus respectivos
grupos sham. Contudo, após a nefrectomia não foi constatada diferença significativa
na excreção urinária de albumina entre os grupos nefrectomizados cujas mães
receberam água ou salina na gestação e amamentação.
Marin ECS Resultados
___________________________________________________________________________
62
Figura 4.6
Albuminúria (mg/24h) de ratos após a intervenção cirúrgica, A: 30 dias;
B: 60 dias; C: 90 dias; D: 120 dias. S, Sham/Água; SS, Sham/Salina; NE,
Nefrectomizados/Água; NES, Nefrectomizados/Salina. As linhas horizontais
representam as medianas. Dados expressos em escala logarítmica. *** p< 0,001
versus S,
##
p<0,01 versus SS,
###
p<0,001 versus SS.
30 dias
S SS NE NES
0.01
1.00
100.00
10000.00
***
###
Albuminúria (mg/ 24
horas)
S SS NE NES
0.01
1.00
100.00
10000.00
60 dias
***
###
Albuminúria (mg/24
horas)
S SS NE NES
0.01
1.00
100.00
10000.00
90 dias
***
###
Albuminúria (mg/24
horas)
S SS NE NES
0.01
1.00
100.00
10000.00
120 dias
***
##
Albuminúria (mg/24
horas)
A
DC
B
Marin ECS Resultados
___________________________________________________________________________
63
4.7 Função renal
A avaliação da TFG foi realizada nos animais após 90 e 120 dias do processo
cirúrgico pelo clearance de inulina (Figura 4.7). Nossos resultados não mostraram
diferença significativa entre os grupos sham água e salina tanto no período de 90
como de 120 dias. Contudo, os animais de ambos os grupos submetidos à
nefrectomia subtotal apresentaram uma redução significativa da função renal em
relação aos respectivos grupos sham, sendo mais acentuada a redução no período
de 120 dias, evidenciando declínio da TFG. Esses resultados estão de acordo com
os descritos na literatura para esse modelo de insuficiência renal crônica.
S SS NE NES S SS NE NES
0.00
0.25
0.50
0.75
TFG (ml/min/ 100g)
90 dias
120 dias
***
***
##
###
Figura 4.7
Taxa de filtração glomerular (TFG) de ratos 90 e 120 dias após a
intervenção cirúrgica. S, Sham/Água; SS, Sham/Salina; NE, Nefrectomizados/Água;
NES, Nefrectomizados/Salina.
***
p<0,001 versus S;
##
p<0,01 e
###
p<0,001versus
SS.
Marin ECS Resultados
___________________________________________________________________________
64
Os parâmetros da função renal dos grupos são mostrados na Tabela 4.10.
Houve uma tendência na redução da osmolalidade urinária, aumento da excreção
fracional de sódio e potássio aos 120 dias da intervenção cirúrgica nos animais
submetidos à nefrectomia 5/6 em relação aos respectivos grupos sham.
Tabela 4.10 Parâmetros de função renal nos animais após 120 dias da cirurgia
fictícia ou nefrectomia 5/6
TFG Uosm FE
Na+
FE
K+
S
0,44 ± 0,04
1411,00 ± 168,10 0,08 ± 0,03 13,60 ± 4,66
SS
0,52 ± 0,03
1191,00 ± 146,80 0,24 ± 0,15 27,55 ± 14,78
NE
0,15 ± 0,04***
1021,00 ± 85,12 0,62 ± 0,21* 67,10 ± 21,43*
120
dias
NES
0,15 ± 0,03
###
847,80 ± 111,90 1,70 ± 0,53
#
63,53 ± 11,75
TFG, taxa de filtração glomerular (ml/min/100g); Uosm, osmolalidade urinária
(mOsm/kgH
2
O); FE, fração de excreção (%). S, Sham/Água; SS, Sham/Salina; NE,
Nefrectomizados/Água; NES, Nefrectomizados/Salina Os dados estão expressos
como média±EPM.
*
p<0,05 e
***
p<0,001 versus S;
#
p<0,05,
###
p<0,001versus SS.
4.8 Análise histológica
A análise histológica dos rins dos animais sacrificados após 120 dias da
nefrectomia 5/6 evidenciou a presença de glomeruloesclerose e lesões
tubulointersticiais difusas, caracterizadas por dilatação da luz tubular, atrofia tubular,
infiltrado inflamatório intersticial com alargamento da área intersticial (Figura 4.8).
Ambos os grupos de animais submetidos à nefrectomia subtotal
apresentaram maior percentual de glomeruloesclerose e lesões tubulointersticiais
em relação aos seus respectivos grupos sham (Figura 4.9, Figura 4.10, Tabela
4.11
). Não houve diferença entre os dois grupos de animais nefrectomizados.
Marin ECS Resultados
___________________________________________________________________________
65
Contudo, o grupo sham/salina teve maior escore para glomeruloesclerose e lesões
tubulointersticiais em relação do que o grupo sham/água (p<0,001) após 120 dias da
cirurgia fictícia.
Figura 4.8 Cortes corados em Tricrômio de Masson do córtex renal dos animais sham e
nefrectomizados aos 120 dias da cirurgia. A: Sham/Água; B: Sham/Salina; C:
Nefrectomizado/Água; D: Nefrectomizado/Salina.
C D
B
A
Marin ECS Resultados
___________________________________________________________________________
66
.
Figura 4.9
Escore para glomeruloesclerose (GL) no córtex renal após 120 dias da
cirurgia.
A: S, Sham/Água; SS, Sham/Salina; NE, Nefrectomizados/Água e NES,
Nefrectomizados/Salina.
B: Em destaque, com escala amplificada, os grupos S e
SS. *** p<0,001 versus S;
###
p<0,001 versus SS.
B
S SS NE NES
0
1
2
3
120 dias
***
***
###
escore para GL
S SS
0.0
0.1
0.2
120 dias
***
escore para GL
A
Marin ECS Resultados
___________________________________________________________________________
67
Figura 4.10
Escore para as lesões tubulointersticiais (LTI) no córtex renal após 120
dias da cirurgia. A: S, Sham/Água; SS, Sham/Salina; NE, Nefrectomizados/Água e
NES, Nefrectomizados/Salina. B: Em destaque, com escala amplificada, os grupos S
e SS. *** p<0,001 versus S;
###
p<0,001 versus SS.
S SS NE NES
0
1
2
3
4
120 dias
***
***
###
escore para LTI
S SS
0
1
2
120 dias
***
escore para LTI
B
A
Marin ECS Resultados
___________________________________________________________________________
68
Tabela 4.11 Escore para glomeruloesclerose (GL) e lesões tubulointersticiais (LTI)
no córtex de ratos 120 dias após o processo cirúrgico
Grupos
S
(n = 10)
SS
(n = 13)
NE
(n = 11)
NES
(n = 13)
GL
0,00
(0,00; 0,05)
0,06 ***
(0,04; 0,07)
0,29***
(0,18; 0,75)
0,67
###
(0,34; 0,89)
LTI
0,00
(0,00; 0,00)
1,00 ***
(0,50; 1,00)
2,00 ***
(1,00; 3,00)
3,00
###
(1,00; 3,00)
S- Sham/Água; SS- Sham/Salina; NE- Nefrectomia/Água; NES-
Nefrectomia/Salina. Dados expressos em mediana e percentis (25-
75%).*** p<0,001 versus Sham/Água;
###
p<0,001 versus Sham/Salina.
4.9 Análise imuno-histoquímica
Os resultados do estudo de imuno-histoquímica são mostrados na Figura
4.11
. Os animais nefrectomizados de ambos os grupos apresentaram maior número
de células ED1-positivas (macrófagos/monócitos) por glomérulo e por área de
0,245mm
2
do compartimento tubulointersticial no córtex renal do que seus
respectivos grupos sham (Figura 4.12-A). Não houve diferença significativa entre os
grupos de animais nefrectomizados em relação ao número de
macrófagos/glomérulo. Contudo, foi observada diferença significativa (p<0,05) entre
os grupos de animais nefrectomizados no número de células ED1-positivas por área
do compartimento tubulointersticial do córtex renal (Figura 4.12-B). Os animais do
grupo sham, cujas mães receberam salina na gestação e amamentação,
apresentaram aumento do número de células ED1-positivas por glomérulo e por
Marin ECS Resultados
___________________________________________________________________________
69
área do compartimento tubulointersticial no córtex renal em relação ao grupo sham
cujas mães ingeriram água no mesmo período (p<0,01).
C
B
A
D
Figura 4.11 Imunorreação para células ED1-positivas (macrófagos/monócitos) no córtex
renal dos animais sham e nefrectomizados aos 120 dias da cirurgia. A: Sham/Água; B:
Sham/Salina;
C: Nefrectomizado/Água; D: Nefrectomizado/Salina.
Marin ECS Resultados
___________________________________________________________________________
70
Figura 4.12
Número de células ED1-positivas por glomérulo (A) e por área de
0,245mm
2
do compartimento tubulointersticial (B) do córtex renal de ratos
sacrificados 120 dias após o processo cirúrgico. S, Sham/Água, SS, Sham/Salina,
NE, Nefrectomizados/Água e NES, Nefrectomizados/Salina. *p<0,05 versus S;
**p<0,01 versus S, ***p<0,001 versus S,
#
p<0,05 versus SS,
##
p<0,01 versus SS,
•
p<0,05 versus NE.
A
B
S SS NE NES
0
1
2
3
120 dias- Glomérulos
**
*
#
Número de macrófagos/
glomérulo
S SS NE NES
0
10
20
120 dias- Túbulo-intersticial
***
##
y
**
Número de
macrófagos/área de
0,245 mm
2
5 RESUMO DOS RESULTADOS
Marin ECS Resumo dos Resultados
__________________________________________________________________________________________
72
Os resultados encontrados neste estudo mostraram que:
• O volume de líquidos ingeridos e o peso corporal na gestação foram maiores
nas ratas grávidas com sobrecarga de sódio. Não houve diferença no
consumo de ração na gestação e amamentação entre o grupo experimental e
controle e no peso dos filhotes ao nascimento;
• o peso corporal dos animais após a nefrectomia foi menor em relação aos
seus respectivos grupos sham. O peso corporal dos animais sham/salina foi
significantemente maior que seu respectivo grupo nefrectomizado;
os filhotes das ratas do grupo experimental apresentaram aumento da PS em
relação ao controle, aos 30 e 60 dias de idade. Não houve diferença nos
valores para excreção urinária de albumina, antes da cirurgia nos filhotes;
não houve diferença na PS e na excreção urinária de albumina entre os
grupos sham, nem entre os grupos nefrectomizados, nos períodos avaliados;
ambos os grupos de animais nefrectomizados apresentaram aumento
significativo na albuminúria em todos os períodos estudados em relação aos
seus respectivos grupos sham;
não houve diferença na TFG entre os grupos sham e entre os grupos
nefrectomizados no período de 90 e 120 dias após a intervenção cirúrgica;
ambos os grupos de animais nefrectomizados apresentaram, após 120 dias
da cirurgia, aumento na excreção fracional de sódio e potássio em relação
aos respectivos grupos sham. Não houve diferença na excreção fracional de
sódio e potássio entre os grupos sham, nem entre os grupos nefrectomizados;
Marin ECS Resumo dos Resultados
__________________________________________________________________________________________
73
o grupo sham/salina apresentou maior escore para GL, LTI e número de
células ED1-positivas (glomérulo e compartimento tubulointersticial) em
relação ao grupo sham/água;
animais nefrectomizados apresentaram maior escore para GL, LTI e número
de células ED1-positivas (glomérulo e compartimento tubulointersticial) em
relação aos seus respectivos grupos sham. Não houve diferença entre os
grupos de animais nefrectomizados em relação ao escore para GL e LTI.
Contudo, o número de células ED1-positivas na região tubulointersticial do
córtex renal foi maior nos animais nefrectomizados cujas mães receberam
ingestão normal de sódio no período de gestação e amamentação.
6 DISCUSSÃO
Marin ECS Discussão
__________________________________________________________________________________________
75
A manutenção do volume de fluido extracelular é realizada pelos mecanismos
que controlam o balanço de sódio. O SRAA tem importância fundamental na
regulação do volume do líquido extracelular (ANTUNES-RODRIGUES e cols., 2005;
WINAVER e cols., 2000; ZATZ, 2000). Além disso, várias linhas de evidências
clínicas e experimentais mostram que o SRAA tem participação no desenvolvimento
renal (BALBI, 2006; DAIKHA-DAHMANE e cols., 2006, LACOSTE e cols., 2006;
GOMEZ, 1994; TUFRO-MCREDDIE e cols., 1993; GOMEZ e cols., 1989; MILLAN e
cols., 1989). Todos os componentes deste sistema estão aumentados durante este
período (ZANDI-NEJAD; LUYCKX; BRENNER, 2006). As expressões dos genes
para a renina, como para os receptores da ANG II, estão aumentadas durante o
desenvolvimento, resultando na geração de altos níveis de peptídeos de ANG II
nesta fase. A relação temporal entre desenvolvimento renal e altos níveis de ANG II,
sugere a participação deste hormônio no desenvolvimento e maturação renal (GIL;
BRESOLIN, 2000).
Alterações do desenvolvimento renal podem estar relacionadas com
mutações de genes que codificam os componentes do SRAA (LACOSTE e cols.,
2006). Camundongos com deficiência de ANG II apresentaram na terceira semana
de idade expansão da região mesangial, dilatação dos ductos coletores e hiperplasia
da camada média das artérias interlobulares e arteríolas aferentes (NIIMURA e cols.,
1997). A inibição farmacológica do SRAA, com o tratamento com inibidores da ECA
(como o enalapril), em humanos e animais, causa modificações na hemodinâmica
sistêmica e renal no feto e, além disso, a utilização de antagonistas de receptores
AT
1
, como o losartan, no final da gestação até a lactação, está associada com
alterações irreversíveis na estrutura dos rins dos filhotes (DAIKHA-DAHMANE e
cols., 2006; FRIBERG e cols., 1994; McCAUSLAND; RYAN; ALCORN, 1994).
Marin ECS Discussão
__________________________________________________________________________________________
76
A regulação do volume e da concentração iônica do meio interno no feto é
exercida pela placenta da mãe, e, ao nascimento, quando a função placentária é
terminada, o rim deve assumir a função de homeostasia do organismo. Contudo, no
rato, a nefrogênese persiste mesmo após o nascimento e a maturação estrutural
final e a funcional se completa ao final do desmame (NIGAM; APERIA; BRENNER,
1996). A capacidade de reter sal em condições de depleção de sódio ou de excretar
sal em uma sobrecarga salina pode ser limitada em recém-nascidos (GIL;
BRESOLIN, 2000).
Evidências clínicas e experimentais mostram que os efeitos adversos que
ocorrem no ambiente intra-uterino, podem induzir a alterações estruturais e
funcionais renais nos filhotes na vida adulta (MARCHAND; LANGLEY-EVANS, 2001;
LUCAS e cols.; 2001; LACKLAND e cols., 2001; BRENNER; CHERTOW, 1994). No
presente estudo, constatamos que uma inibição deste sistema, pela sobrecarga de
salina (0,15M), em ratas durante a gestação e lactação provocava alterações na
estrutura e na função renal nos filhotes que persistiram na vida adulta.
Na gravidez, o apetite ao sódio e a ingestão de água estão aumentados,
ocasionando em uma retenção de líquidos corporais de modo gradual ao longo da
gestação. Nossos resultados evidenciaram que o volume de líquido extracelular
deve estar aumentado nas ratas grávidas submetidas à sobrecarga de sódio
comparadas às ratas com ingestão normal. O volume de líquidos ingeridos na
gestação pelas ratas do grupo experimental foi maior, assim como a variação de
peso corporal no mesmo período. Porém, não foram observadas variações no
consumo de ração entre as ratas grávidas do grupo experimental e controle. Esses
dados estão de acordo com os observados em outros estudos (BALBI, 2006; BALBI
e cols., 2004; SILVA e cols., 2003).
Marin ECS Discussão
__________________________________________________________________________________________
77
Em estudo anterior realizado em nosso laboratório, em ratas grávidas
submetidas à ingestão aumentada de sódio, não foram constatadas diferenças nos
valores de PS, osmolalidade plasmática e concentrações plasmáticas de sódio e
potássio em relação às ratas com ingestão normal deste mineral no mesmo período.
Esses dados mostram que as ratas grávidas são capazes de manter o equilíbrio
hidro-eletrolítico durante a gravidez, mesmo quando submetidas à sobrecarga de
sódio. No entanto, nos filhotes das mães com sobrecarga de sódio foi observado
aumento da PS aos 30 dias de idade e redução da TFG (0,67±0,05 ml/min) em
relação aos filhotes do grupo controle (0,80±0,07 ml/min) cujas mães receberam
ingestão normal de sódio na gestação e amamentação (BALBI, 2006; BALBI e cols.,
2004). No presente estudo, foi observada também essa diferença nos valores de PS
nos filhotes de 30 dias de idade, sendo que aos 60 dias a diferença se tornou ainda
mais acentuada. A excreção urinária de albumina também foi maior nos filhotes do
grupo experimental aos 30 dias, não sendo observada aos 60 dias de idade. Esses
dados suportam a hipótese de que distúrbios que ocorrem durante o
desenvolvimento renal podem induzir alterações nos filhotes (ZANDI-NEJAD;
LUYCKX; BRENNER, 2006).
Silva e colaboradores (2003) e Hazon e colaboradores (1988) também
encontraram aumento da PS, do conteúdo renal de ANG II e alterações na
regulação da renina plasmática nos filhotes adultos, cujas mães receberam
sobrecarga de sódio na gestação.
Balbi (2006) verificou que o número de células ANG II-positivas nos
compartimentos glomerular e tubulointersticial, em filhotes de 1 e 7 dias, cujas mães
foram submetidas à sobrecarga de salina na gestação e amamentação (grupo
experimental), estava reduzido em relação aos filhotes de mesma idade cujas mães
Marin ECS Discussão
__________________________________________________________________________________________
78
receberam quantidade normal de sódio no mesmo período. Neste mesmo estudo, foi
verificada também redução da expressão do receptor AT
1
no córtex renal dos
filhotes do grupo experimental no 1º dia pós-natal. Esses achados sugerem que as
reduções nas expressões da ANG II e de seu receptor AT
1
durante o
desenvolvimento renal podem estar relacionadas com a homeostase do sódio e da
água nos animais submetidos à sobrecarga de sódio no período pré-natal. Portanto,
considerando que a regulação da ANG II pode estar alterada nos animais
submetidos à sobrecarga de sódio no período pré-natal e amamentação, avaliamos
nesse estudo a possibilidade da evolução da lesão renal ser diferente nesses
animais após a nefrectomia 5/6. Nesse modelo, a participação do SRAA é bastante
importante e ocorre lesão renal progressiva dos nefros remanescentes com perda da
função renal, de modo semelhante a algumas nefropatias que acometem humanos
(GRETZ; WALDHERR; STRAUCH, 1993).
A evolução temporal da nefropatia, determinada pela nefrectomia 5/6 nos
animais deste estudo, foi caracterizada pelo aumento da excreção urinária de
albumina, elevação da PS e queda da taxa de filtração glomerular. Esses dados
estão de acordo com o esperado para o modelo (GRETZ; WALDHERR; STRAUCH,
1993).
Estudos realizados em ratos submetidos à ablação renal em diferentes
intensidades constataram aumento de 50% da TFG em ratos submetidos à
nefrectomia unilateral e valores três vezes maiores que os observados no rato
normal quando mais de 80% do parênquima renal foi removido cirurgicamente,
mimetizando situação de insuficiência renal crônica avançada (ZATZ, 2000). Em
ratos normais, o gradiente de pressão hidrostática (∆P) nos capilares glomerulares é
cerca de 40 mmHg e fluxo plasmático glomerular (Q
A
) de 140 nL/min. Após ablação
Marin ECS Discussão
__________________________________________________________________________________________
79
de mais de 80% de massa renal, o Q
A
passa a 250 nL/min, enquanto o ∆P vai além
de 50 mmHg e a pressão efetiva de ultrafiltração
atinge valores cerca de três vezes
acima do valor normal. A filtração em cada nefro remanescente pode aumentar
cerca de três vezes em relação ao normal nesses animais.
Nossos resultados de estudos funcionais evidenciaram queda da TFG no
grupo de animais nefrectomizados em relação aos seus respectivos grupos sham. O
declínio da TFG foi mais acentuado aos 120 dias do processo cirúrgico,
evidenciando evolução para insuficiência renal crônica. Contudo, não houve
diferença entre os grupos nefrectomizados, filhotes do grupo controle e
experimental, nos dois tempos avaliados. O declínio da TFG, por sua vez, estava
associado com o aumento da fração de excreção de sódio e de potássio,
evidenciando adaptação dos nefros remanescentes no sentido de manter a
manutenção do balanço desses íons. Não houve diferença nos valores de TFG entre
os grupos sham.
A queda da função renal no modelo de nefrectomia 5/6 é dependente do
volume de massa renal deixada intacta por ocasião do procedimento inicial e do
nível pressórico do animal (GRETZ; WALDHERR; STRAUCH, 1993). Evidências
experimentais relacionam a progressão da doença renal com a hipertensão
sistêmica e dos capilares glomerulares (KLAHR; SCHREINER; ICHIKAWA, 1988;
DWORKIN; FEINER, 1986). No presente estudo, os valores da PS estiveram
aumentados nos animais nefrectomizados desde a primeira determinação, aos 30
dias do processo cirúrgico, permanecendo elevados durante todo o período de
avaliação (60 e 90 dias), não ocorrendo diferenças entre os grupos de animais
nefrectomizados.
Marin ECS Discussão
__________________________________________________________________________________________
80
Vários fatores podem contribuir para o desencadeamento da lesão renal
progressiva nesse modelo, dentre eles, destacam-se os aumentos dos níveis renais
de ANG II, a proteinúria e a infiltração de macrófagos na região intersticial do córtex
renal. A redução da massa renal determinada pela nefrectomia subtotal promove a
elevação dos níveis intra-renais de ANG II (ANDERSON; RENNKE; BRENNER,
1986). Além dos seus efeitos na hemodinâmica renal, aumentando a pressão
hidrostática nos capilares glomerulares, a ANG II possui efeitos pró-inflamatórios e
pró-fibróticos que induzem à fibrose renal. Vários estudos mostram que tratamentos
com inibidores da ANG II atenuam a lesão renal nesse modelo (De FREITAS e cols.,
1998; DWORKIN e cols., 1993; BEUKERS e cols., 1987). Os efeitos da ANG II são
mediados em parte pelo TGF-β, que é considerado pela maioria dos autores como a
principal citocina fibrogênica (COIMBRA; MUGLIA, 2000; De FREITAS e cols.,
1998). A ANG II estimula a produção e ativação do TGF-β em diferentes células. O
TGF-β aumenta a produção e reduz a degradação de vários componentes da MEC
(EDDY, 1996). Além disso, a ANG II pode promover a fibrose também por outras
vias, tais como pela formação de espécies reativas de oxigênio (BREWSTER;
PERAZELLA, 2004).
O aumento de proteínas na urina tem sido relacionado com a progressão da
lesão em diferentes tipos de doenças glomerulares (EARDLEY e cols., 2006;
BARONI e cols., 1999; REMUZZI; RUGGENENTI; BENIGNI, 1997; EDDY, 1989). O
aumento da quantidade de proteínas no filtrado glomerular provoca alterações
tubulointersticiais significativas por vários mecanismos, entre eles: lesão direta das
células tubulares, aumento na produção de amônia, filtração do complemento e
ativação de citocinas, produção de substâncias inflamatórias e vasoativas e
Marin ECS Discussão
__________________________________________________________________________________________
81
precipitação intratubular de proteínas com formação de cilindros (COIMBRA;
MUGLIA, 2000).
Eardley e colaboradores (2006) constataram que a excreção urinária de
albumina estava relacionada com a progressão da lesão renal e com a presença de
macrófagos no compartimento tubulointersticial do córtex renal num estudo realizado
com pacientes portadores de diferentes tipos de doenças glomerulares. Em estudo
realizado em nosso laboratório, foi verificado que a ingestão de bicarbonato de sódio
reduzia a captação de albumina pelas células dos túbulos renais e as lesões
tubulointersticiais observadas nesses animais (BARONI e cols., 1999). Tem sido
observado que a albumina e a IgG podem estimular a produção de substâncias
inflamatórias e vasoativas por essas células (ZOJA e cols., 1998). Esses resultados
sugerem que proteínas filtradas podem induzir lesões nas células tubulares que
evoluem para fibrose renal. Tratamentos que reduzem a filtração e/ou a captação
renal de macromoléculas, como dieta hipoprotéica ou uso de inibidores da ECA,
retardam a progressão da doença renal (COIMBRA; MUGLIA, 2000). Injeções
repetidas de albumina bovina em ratos normais, levaram ao aparecimento da
proteinúria que persistia mesmo após a interrupção do tratamento (EDDY, 1989). A
deposição de macromoléculas na região mesangial dos glomérulos pode também
provocar lesão e proliferação das células mesangiais, aumento da produção da MEC
e glomeruloesclerose. Lipoproteínas de baixa densidade (LDL) interagem com
receptores presentes nas células mesangiais estimulando a produção de oncogenes
(c-fos e c-jun) que levam à morte celular. Além disso, esses polipeptídeos estimulam
também a liberação de fatores quimiotáticos para macrófagos (MCP-1) e PDGF
(plateled derived growth factor) que contribuem para glomeruloesclerose. Contudo, a
maior parte dos estudos mostra que a progressão da lesão renal está mais
Marin ECS Discussão
__________________________________________________________________________________________
82
relacionada com o comprometimento do compartimento tubulointersticial em relação
ao glomerular (COIMBRA; MUGLIA, 2000; EDDY, 1996).
A ativação do SRAA renal local, pelo modelo da nefrectomia, exacerba a
proteinúria. A hipertensão do capilar glomerular leva ao aumento da permeabilidade
glomerular com filtração excessiva de proteínas. O aumento das concentrações
renais de ANG II pode também causar diminuição da expressão de nefrina,
facilitando assim a passagem de proteínas pela barreira de filtração (BREWSTER;
PERAZELLA, 2004). A nefrina é um componente importante do filtro glomerular. A
falta dessa proteína está associada com proteinúria intensa.
Nossos resultados de excreção urinária de albumina mostram valores de
albuminúria significamente maiores em ambos os grupos de animais
nefrectomizados em relação a seus respectivos grupos sham, evidenciando
alterações do filtro glomerular. Contudo, não foi verificada diferença na excreção
urinária de albumina entre os grupos de animais nefrectomizados, assim como entre
os animais sham, em todos os períodos avaliados.
A presença de infiltrado de macrófagos no córtex renal tem sido relacionada
com a progressão da lesão renal na maioria das doenças renais (NATH, 1998;
EDDY, 1996; NIKOLIC-PATTERSON e cols., 1994; KLAHR; SCHREINER;
ICHIKAWA, 1988). A intensidade do acúmulo de macrófagos está relacionada com o
grau de disfunção renal (EARDLEY e cols., 2006; IKEZUMI e cols., 2004). A
infiltração de macrófagos geralmente precede o aparecimento de lesão glomerular
mais severa na maioria das doenças renais que evolui para esclerose (FLOEGE e
cols., 1992; KLAHR; SCHREINER; ICHIKAWA, 1988). Os macrófagos são células
capazes de liberar fatores de crescimento, tais como: TGF-β, Insulin-like Growth
Factor (IGF-I), PDGF entre outros. Esses peptídeos podem induzir à proliferação de
Marin ECS Discussão
__________________________________________________________________________________________
83
células mesangiais, aumento da matriz extracelular e hipertrofia dos compartimentos
glomerular e tubular (EDDY, 1996; SEGA; FINE, 1989).
Os macrófagos podem desempenhar diferentes funções, entre elas: respostas
pró-inflamatórias em decorrência de infecções, remoção de células apoptóticas e
reparação de tecidos. A definição entre indução de lesão ou promoção de reparo
tecidual pelos macrófagos depende da natureza do estímulo presente no rim
(IKEZUMI e cols., 2004).
O número de células ED1-positivas (macrófagos/monócitos) foi maior nos
animais nefrectomizados de ambos os grupos, em comparação aos seus respectivos
grupos sham, tanto nos glomérulos como no compartimento tubulointersticial. Nos
animais nefrectomizados, foi encontrado aumento do número de células ED1-
positivas nos filhotes das mães que ingeriram água na gestação e amamentação em
relação aos filhotes cujas mães foram submetidas à sobrecarga de sódio durante
esses períodos, somente no compartimento tubulointersticial.
Os estudos de imuno-histoquímica revelaram também aumento do número de
células ED1-positivas no grupo sham/salina comparados ao grupo sham/água, tanto
nos glomérulos como no compartimento tubulointersticial, evidenciando que o
tratamento realizado durante o desenvolvimento renal pode levar a alterações
persistentes no córtex renal.
Vários fatores podem estar envolvidos no recrutamento de macrófagos para
os compartimentos glomerulares e intersticiais dos animais com nefrectomia
subtotal, tais como: a presença de grandes quantidades de proteínas no filtrado
glomerular, o estresse oxidativo e o aumento das concentrações renais de ANG II. O
aumento da quantidade de proteínas no filtrado glomerular ocorre devido a
alterações na barreira de filtração, as quais podem contribuir para a presença do
Marin ECS Discussão
__________________________________________________________________________________________
84
infiltrado inflamatório túbulo-intersticial. As proteínas filtradas podem interagir com as
células tubulares após terem sido captadas por essas células, promovendo
modificações em seus fenótipos e funções. As proteínas estimulam a produção e
liberação de substâncias inflamatórias pelas células tubulares como fatores
quimiotáticos para macrófagos e linfócitos, citocinas (TGF-β, endotelina) e ANG II.
Aumentos da expressão de moléculas de adesão intracelular e vascular (ICAM-1 e
VCAM-1), osteopondin e TGF-β foram observados nos compartimentos
tubulointersticiais de ratos com proteinúria provocada pela administração diária de
albumina bovina (EDDY, GIACHELLI, 1995). Em estudos de imuno-histoquímica,
realizado com técnicas de dupla marcação, foram constatados a colocalização de
albumina e IgG tanto nas células dos túbulos renais de ratos com nefretomia 5/6
como no modelo de nefrite de Heymann, estando associados à existência de
macrófagos e monócitos nesses túbulos (ABBATE e cols., 1998).
A liberação de radicais livres pelos tecidos lesados pode levar ao aumento de
MCP-1, Regulated Upon Activation Normal T-cell Expressed and Secreted
(RANTES) e de moléculas de adesão induzindo a maior ativação e migração de
macrófagos (SHIMIZU e cols., 2005; SCHLONDORFF, 1955).
A ANG II também possui efeitos quimiotáticos importantes, estimulando a
migração de linfócitos e monócitos para o compartimento intersticial, contribuindo
para o processo inflamatório que está presente na doença renal progressiva
(NORONHA, FUJIHARA, ZATZ, 2002).
Nos animais de 120 dias do processo cirúrgico, a análise histológica
evidenciou maior escore para glomeruloesclerose e lesões tubulointersticiais no
grupo sham/salina do que em relação ao grupo sham/água (p<0,001). Estes dados
sugerem que o tratamento oferecido na gestação e amamentação pode levar
Marin ECS Discussão
__________________________________________________________________________________________
85
também a alterações estruturais nos rins dos filhotes quando adultos. Contudo, Balbi
e colaboradores (2004) não observaram alterações na área glomerular e no número
de glomérulos por campo do córtex renal nos filhotes de 30 dias cujas mães
receberam sobrecarga de salina, comparados aos filhotes de mães com ingestão
normal de sódio. Os animais submetidos à nefrectomia 5/6 apresentaram maior
escore para glomeruloesclerose e lesões tubulointersticiais em relação aos seus
respectivos grupos sham. Porém, não houve diferença nesses parâmetros entre os
grupos de animais nefrectomizados, independente do tratamento administrado na
gestação e amamentação.
As doenças renais podem evoluir para glomeruloesclerose e fibrose
tubulointesticial, processos nos quais estruturas especializadas são substituídas por
fibroblastos, colágenos e outros elementos da MEC, com perda progressiva da
função renal (COIMBRA; MUGLIA, 2000; EDDY, 1996). Os estudos histológicos
realizados no presente trabalho evidenciaram alterações glomerulares (esclerose
glomerular) e tubulointersticiais crônicas importantes (fibrose e infiltrado inflamatório
do interstício, dilatação e atrofia tubular) nos rins dos animais nefrectomizados, não
ocorrendo diferenças entre esses grupos.
Em resumo, os resultados do presente estudo mostram a presença de
alterações funcionais e estruturais renais nos filhotes, cujas mães receberam
sobrecarga de sódio na gestação e amamentação. Todavia, após a nefrectomia 5/6
esses animais apresentaram uma evolução semelhante aos animais cujas mães
receberam ingestão normal de sódio no mesmo período. Estes dados sugerem que
a regulação renal local da ANG II possa envolver mecanismos diferentes da
sistêmica.
7 CONCLUSÕES
Marin ECS Conclusões
__________________________________________________________________________________________
87
Os ratos adultos nascidos de mães que receberam sobrecarga de sódio na
gestação e amamentação apresentaram alterações na função e estrutura renal
(aumento da PS, GL, LTI, células ED1-positivas). Contudo, a nefrectomia 5/6 não
resultou em modificações na PS, albuminúria, TFG, GL, LTI, ED1-positivas em
comparação com ratos adultos nascidos de mães com ingestão normal de sódio no
mesmo período.
REFERÊNCIAS
*
*
De acordo com: Funaro VMBO et al. Diretrizes para apresentação de dissertações e teses da
USP: documento eletrônico e impresso. São Paulo: SIBi- USP, 2004.110p.
Marin ECS Referências
__________________________________________________________________________________________
89
Abbate M, Zoja C, Corna D, Capitanio M, Bertani T, Remuzzi G. In the progressive
nephropathies, overload of tubular cells with filtered proteins translates glomerular
permeability dysfunction into cellular signals of interstitial inflammation. J Am Soc
Nephol. 1998;9:1213-1224.
Anderson S, Rennke HG, Brenner BM. Therapeutic advantage of converting enzyme
inhibitors in arresting progressive renal disease associated with systemic
hypertension in the rat. J Clin Invest. 1986;77:1993-2000.
Antunes-Rodrigues J, Pincanco-Diniz DLW, Valença MM, Mccann SM. Controle
Neuroendócrino da Homeostase dos Fluidos Corporais. In: Antunes-Rodrigues J.
Neuroendocrinologia Básica e Aplicada. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan;
2005, p. 81-115.
Bagby SP, Holden W. Angiotensin II stimulates proliferation of aortic endothelial cells
(abstract). Clin Res. 1988;36:259.
Balbi AP. Participação da Angiotensina II e MAP-quinases (Mitogenic-Activacted
Protein Kinase) no desenvolvimento renal pós-natal de ratas Wistar.[Tese]. Ribeirão
Preto. Faculdade de Medicina de Ribeirão-Preto. Universidade de São Paulo.
2006.128p.
Balbi AP, Costa RS, Coimbra TM. Postnatal renal development of rats from mothers
that received increased sodiium intake. Pediatr Nephrol. 2004;19:1212-1218.
Barker DJ, Winter PD, Osmond C, Margetts B. Weight in infancy and death from
ischaemic heart disease. Lancet. 1989;2:577-580.
Baroni EA, Costa RC, Volipni RA, Coimbra TM. Sodium bicarbonate treatment
reduces renal injury, renal production of transforming growth factor-β, and urinary of
transforming growth factor-β excretion in rats with doxorubicin-induced nephropathy.
Am J Kidney Dis. 1999;34:328-337.
Beukers JJB, Van der Wal A, Hoedemaeker PJ, Weening JJ. Converting enzyme
inhibition and progressive glomerulosclerosis in the rat. Kidney Int. 1987;32:794-
800.
Border WA, Noble NA. Transforming growth factor beta in tissue fibrosis. N Engl J
Med. 1994;10:1286-1292.
Marin ECS Referências
__________________________________________________________________________________________
90
Border WA, Okuda S, Languino LR, Ruoslahti E. Transforming growth factor-β
regulates production of proteoglycans by mesangial cells. Kidney Int. 1990;37:689-
695.
Brenner BM, Chertow GM. Congenital Oligonephropathy and the Etiology of Adult
Hypertension and Progressive Renal Injury. Am J Kidney Dis. 1994; 23(2):171-175.
Brewster UC, Perazella MA. The Renin-Angiotensin-Aldosterone System and the
Kidney: Effects on Kideny Disease. Am J Med. 2004;116:263-272.
Campbell-Boswell M, Robertson AL Jr. Effects of angiotensin II and vasopressin on
human smooth muscle cells in vitro. Exp Mol Pathol. 1981;35(2):265–276.
Charbit M, Déchaux M, Blazy I, Vargas R, Laouari D, Brocart D, Lacoste M, Gubler
MC, Sachs C. Deleterious effects of inhibition of the renin-angiotensin system in
neonatal rats. Pediatr Nephrol. 1995;9(3):303-308.
Chiu AT, Roscoe WA, McCall DE, Timmermans PB. Angiotensin II-1 receptors
mediate both vasoconstritor and hypertrophic responses in rat aortic smooth muscle
cells. Receptor. 1991;1(1):133-140.
Ciuffo GM, Viswanathan M, Seltzer AM, Tsutsumi K, Saavedra JM. Glomerular
angiotensin II receptor subtypes during development of rat kidney. Am J Physiol.
1993;265:F264-F271.
Coimbra TM, Furtado MR, Lachat JJ. Effects of administration of cationic and native
homologous albumin on the kideny. Nephron. 1983;33:208-215.
Coimbra TM, Muglia VA. Proteinúria e progressão da doença renal. In: Cruz J,
Barros RT, Cruz, HMM. Atualidades em Nefrologia 6. São Paulo: SARVIER; 2000.
p. 50-56.
Coimbra TM, Silva CGA, Lachat JJ. Renal transforming growth factor beta1
production in neonate rats. Cell Prolif. 1994;27:669-675.
Coimbra TM, Wiggins RC, Noh JW, Merritt S, Phan SH. Transforming growth factor-β
production in antiglomerular basement disease in the rabbit. Am J Pathol.
1991;138:223-234.
Marin ECS Referências
__________________________________________________________________________________________
91
Coles HS, Burne JF, Raff MC. Large-scale normal cell death in the developing rat
kidney and its reduction by epidermal growth factor. Development. 1993;118:777-
784.
Daïkha-Dahmane F, Levy-Beff E, Jugie M, Lenclen R. Foetal kidney maldevelopment
in maternal use of angiotensin II type I receptor antagonists. Pediatr Neprol. 2006;
21:729-732.
De Freitas AM, Coimbra TM, Costa RS, Baroni EA. Urinary TGF-beta and renal
production of TGF-beta in rats with subtotal renal ablation: Effect of enalapril and
nifedipine. Nephron. 1998;78:302-309.
Dworkin LD, Bernstein JA, Parker M, Tolbert E, Feiner HD. Calcium antagonists and
converting enzyme inhibitors reduce renal injury by different mechanisms. Kidney
Int. 1993;43:808-814.
Dworkin LD, Feiner HD. Glomerular injury in uninephrectomyzed spontaneously
hypertensive rats: A consequence of glomerular capillary hypertension. J Clin
Invest. 1986;77:797-809.
Eardley KS, Zehnder D, Quinkler M, Lepenies J, Bates RL, Savage CO, Howie AJ,
Adu D, Cockwell. The relationship between albuminuria, MCP-1/CCL2, and interstitial
macrophages in chronic kidney disease. Kidney Int. 2006;69:1189-1197.
Eddy AA. Molecular insights into renal intersticial fibrosis. J Am Soc Neprol.
1996;7:2496-2508.
Eddy AA. Interstitial nephritis induced by protein-over-load proteinuria. Am J Pathol.
1989;135:719-733.
Eddy AA, Giachelli CM. Renal expression of genes that promote interstitial
inflammation and fibrosis in rats with protein-overload proteinuria. Kidney Int.
1995;47:1546-1557.
Edwards DR, Murphy G, Reynolds JJ, Whitham SE, Docherty AJ, Angel P, Heath JK.
Transforming growth factor beta modulates the expression of collagenase and
metalloproteinase inhibitor. EMBO J. 1987;6(7):1899–1904.
Fernandez LA, Twickler J, Mead A, Neovascularization produced by angiotensin II. J
Lab Clin Med. 1985;105:141-145.
Marin ECS Referências
__________________________________________________________________________________________
92
Fiselier TJW, Lijnen P, Monnens L, Van Munster P, Jansen M, Peer Pl. Levels of
renin, angiotensin I and II, angiotesin-converting enzyme and aldosterone in infancy
and childhood. Eur J Pediatr.1983; 141 (1) (abstract 344).
Floege J, Alpers CE, Burns MW, Pritizl P, Gordon K, Coser WG, Johnson RJ.
Glomerular cells, extracellular matrix accumulation and development of
glomerulosclerosis in the remnant kidney model. Lab Invest. 1992;66:485-495.
Fogo A, Yoshida Y, Yared A, Ichikawa I. Importance of angiogenic action of
angiotensin II in the glomerular growth of maturing kidneys. Kidney Int
1990;38:1068–1074.
Friberg P, Sundelin B, Bohman SO, Bobik A, Nilsson H, Wickman A, Gustafsson H,
Petersen J, Adams MA. Renin-angiotensin system in neonatal rats: induction of a
renal abnormality in response to ACE inhibition or angiotensin II antagonism. Kidney
Int. 1994;45(2):485-492.
Fuhr J, Kaczmarczyk Y, Kruttgen CD. Eine einfache colorimetrische Methode zur
Inulinbesimmung fur Nierenclearanceuntersuchugen bei Stoffwechselgesunden und
Diabetikern. Klin Wochenschr. 1955;33:729-730.
Garcia DL, Anderson S, Rennke HG, Brenner BM. Anemia lessens and its prevention
with recombinant human erythropoietin worsens glomerular injury and hypertension
in rats with reduced renal mass. Proc Natl Acad Sci. 1988;85(16):6142–6146
Geisterfer AAT, Peach MJ, Queens GK. Angiotensin II induces hypertrophy, not
hyperplasia, of cultured rat aortic smooth muscle cells. Circ Res. 1998;62:749-756.
Gil FZ, Bresolin NL. Fisiologia Renal no período neonatal. In: Cruz J, Barros RT,
Cruz, HMM. Atualidades em Nefrologia 6. São Paulo: SARVIER; 2000. p.1-8.
Gomez RA. Angiotensin II receptors: relevance in development and disease states.
Exp Nephrol. 1994;2:259-268.
Gomez RA, Lynch KR, Sturgill BC, Elwood JP, Chevalier RL, Carey RM, Peach MJ.
Distribution of renin mRNA and its protein in the developing kidney. Am J Physiol.
1989;257:F850-F858.
Gomez RA, Tufro-McReddie
A, Everett AD. Pentz ES.Ontogeny of renin and AT1
receptor in the rat. Pediatr Nephrol. 1993;7(5):635-638.
Marin ECS Referências
__________________________________________________________________________________________
93
Grady EF, Sechi LA, Griffin CA, Schambelan M, Kalinyak JE. Expression of AT2
receptors in the development rat fetus. J Clin Invest. 1991;88(3):921-933.
Gretz N, Waldherr R, Strauch M. The remnant kidney model. Experimental and
genetic rat models of chronic renal failure. Basel, Karger,1993:1-28.
Hakim RM, Goldszer RC, Branner BM. Hypertension and proteinuria: long-term
sequelae of uninephrectomy in humans. Kidney Int. 1984;25:930-936.
Hazon N, Parker C, Leonard R, Henderson IW. Influence of an enriched dietary
sodium chloride regime during gestation and suckling and post-natally on the
ontogeny of hypertension in the rat. J Hypertens. 1988;6(7):517-524.
Hilgers KF, Norwood VF, Gomez RA. Angiotensin′s role in renal development.
Semin Nephrol. 1997;17(5):492-501.
Homma T, Hoover RL, Ichikawa T, Harris RC. Angiotensin II (Ag II) induces
hypertrophy and stimulates collagen production in cultured rat glomerular mesangial
cell (MC) [abstract]. Clin Res.1990;38:358A.
Horiuchi M, Akishita M, Dzau VJ. Recent progress in angiotensin II type 2 receptor
research in the cardiovascular system. Hypertension. 1999;33:613-621.
Ignotz RA, Endo T, Massagé J. Regulation fibronectin and type I collagen mRNA
levels by transforming growth factor-β. J Biol Chem. 1987; 262:6443-6446.
Ikezumi Y, Hurst L, Atkins RC, Nikolic-Paterson DJ. Macrophage mediated renal
injury is dependent on signaling via the JNK pathway. J Am Soc Nephrol.
2004;15:1775-1784.
Kagami S, Border WA, Miller DE, Noble NA. Angiotensin II stimulates extracellular
matrix protein synthesis through induction of transforming growth factor-beta
expression in rat glomerular mesangial cells. J Clin Invest. 1994;93(6):2431–2437.
Kakuchi J, Ichiki T, Kiyama S, Hogan BLM, Fogo A, Inagami T, Ichikawa I.
Developmental expression of renal angiotensin II receptor genes in mouse. Kidney
Int. 1995; 47:140-147.
Marin ECS Referências
__________________________________________________________________________________________
94
Klahr S, Schreiner G, Ichikawa I. The progression of renal disease. N Engl J Med.
1988;318:1657-1666.
Kleinknecht C, Terzi F, Burtin M, Laouari D, Maniar S. Experimental models of
nephron reduction: some answres, many questions. Kidney Int.1995;47 (suppl
49):51-54.
Koseki C, Herzlinger D, Al-Awqati Q. Apoptosis in metanephric development. J Cell
Biol. 1992;119:1327-1333.
Kotchen TA, Strickland AL, Rice TW, Walters DR. A study of the renin-angiotensin
system in newborn infants. J Pediatr. 1972; 80(6):938–946.
Kubo T, Ibusuki T, Chiba S, Kambe T, Fukumori R. Mitogen protein kinase activity
regulation role of angiotensin and endothelin systems in vascular smooth muscle
cells. Europ J Pharmacol. 2001;411:27-34.
Lackland DT, Egan BM, Fan ZJ, Syddall HE. Low birth weight contributes to the
excess prevalence of end-stage renal disease in African Americans. J Clin
Hypertens. 2001;3(1):29-31.
Lacoste ML, Cai Y, Guicharnaud L, Mounier F, Dumez Y, Bouvier R, et al. Renal
Tubular Dysgenesis, a Not Uncommon Autosomal Recessive Disorder Leading to
Oligohydramnios: Role of the Renin-Angiotensin System. J Am Soc Neprol.
2006;17:2253-2263.
Lafayette RA, Mayer G, Park SK, Meyer TW. Angiotensin II receptor blockade limits
glomerular injury in rats with reduced renal mass. J Clin Invest. 1992;90(3):766–771.
Laurell CB. Eletroimmuno assay. Scand J Clin Lab Invest. 1972;124:21-23.
Lucas SRR, Miraglia SM, Gil FZ, Coimbra TM. Intrauterine Food Restriction as a
Determinant of Nephorosclerosis. Am J Kidney Dis. 2001;37(3):467-476.
Lyons RM, Moses HL. transforming growth factors and the regulation of cell
proliferation. Eur J Biochem. 1990;187(3):467-473.
MacDonald MS, Emery JL. The late intrauterine and postnatal development of human
renal glomeruli. J Anat. 1959;93:331-340.
Marin ECS Referências
__________________________________________________________________________________________
95
Marchand MC, Langley-Evans SC. Intrauterine programming of nephron number: the
fetal flaw revisited. J Neprol. 2001;14:327-331.
McCausland JE, Ryan GB, Alcorn D. The effects of angiotensin converting enzyme
inhibition on postnatal renal development in rats. J Hypertens. 1994;12(Suppl.3):89.
McCausland JE, Ryan GB, Alcorn D. Angiotensin converting enzyme inhibition in the
postnatal rat results in decreased cell proliferation in the renal outer medulla. Clin.
Exp Pharmacol Physiol. 1996;23:552-554.
Meyer TW, Anderson S, Rennke HG, Brenner BM. Reversing glomerular
hypertension established glomerular injury. Kidney Int. 1987;31(3):752-759.
Millan MA, Carvallo P, Izumi S, Zemel S, Catt KJ, Aguilera G. Novel sites of
expression of functional angiotensin II receptors in the late gestation fetus. Science.
1989;244:1340-1342.
Nath KA. The tubulointerstitium in progressive renal disease. Kidney Int.
1998;54:992-994.
Nikolic-Paterson DJ, Lan HY, Hill PA, Atkins RC.Macrophages in renal injury. Kidney
Int. 1994;45(45):S79-S82.
Nigam SK, Aperia AC, Brenner BM. Development and maturation of the kidney. In:
Brenner BM, Rector FC. The Kidney: Physiology and Pathology Philadelphia, WB
Saunders; 1996. p. 72-98.
Niimura F, Labosky PA, Kakuchi J, Okudo S, Yoshida H, Oikawa T, Ichiki T, Naftilan
AJ, Fogo A, Inagami T, Mogan BLM, Ichikawa I. Gene targeting in mice reveals a
requirement for angiotensin in the development and maintenance of kidney
morphology and growth factor regulation. J Clin Invest. 1995; 96(6):2947–2954.
Noronha IL, Fujihara CK, Zatz R. The inflammatory component in progressive renal
disease - are interventions possible? Nephrol Dial Transplant. 2002;17:363-368.
Norwood VF, Harris JM, Gómez RA. Angiotensin II (AII) receptors (AT-1 and AT-2)
are developmentally regulated during early nephrogenesis (Abstract). J Am Soc
Nephrol. 1994;5:632.
Marin ECS Referências
__________________________________________________________________________________________
96
Omori S, Hida M, Ishikura K, Kuramochi S, Awazu M. Expression of mitogen-
activated protein kinase family in rat renal development. Kidney Int. 2000; 58:27-37.
Purkerson ML, Hoffsten PE, Klahr S. Pathogenesis of the glomerulopathy associated
with renal infarction in rats. Kidney Int. 1976; 9:407-417.
Reeves W, Caulfield JP, Farquhar MG. Differentiation of epithelial foot processes and
filtration slits: sequential appearance of occluding junctions, epithelial polyanion and
slit membranes in developing glomeruli. Lab Invest. 1978;39(2):90-100.
Remuzzi G, Ruggenenti P, Benigni A Understanding the nature of renal disease
progression. Kidney Int.1997;51:2-15
Rizzino A. Transforming growth factor-β: Multiple effects on cell differentiation and
extracellular matrices. Dev Biol. 1988;130:411-422.
Roberts AB, Sporn MB. Transforming growth factor betas. In: Sporn MB, Roberts AB.
Handbook of experimental pharmacology: peptide growth factors and their
receptors.vol. 95. Heidelberg, Spring.Verlag; 1990. p. 419-472.
Roberts AB, McCune BK, Sporn MB. TGF-β: Regulation of extracellular matrix.
Kidney Int. 1992;41(3):551-559.
Rosenberg ME et al. Renin gene expression in the growing rat kidney (abstract).
Kidney Int. 1990;37:358.
Schainuck LI, Striker GE, Cutler RE, Benditt EP. Structural- functional correlations in
renal disease. Hum Pathol. 1970;1:631-641.
Schimamura T, Morrison AB. Progressive glomerulosclerosis ocurring in partial five-
sixths nephrectomized rats. Am J Pathol. 1975;79:95-106.
Schlondorff D. The role of chemokines in the initiation and progression of renal
disease. Kidney Int. 1995;47(49):S44-47.
Schreiner GF, Cotran RS, Unanue ER. Macrophages and cellular immunity in
experimental glomerunephritis. Springer Semin Imunopathol. 1982;5:251-267.
Marin ECS Referências
__________________________________________________________________________________________
97
Segal R, Fine FG. Polypeptide growth factors and the kidney. Kidney Int. 1989;36:2-
10.
Shih W, Hines WH, Neilson EG. Effects of cyclosporin A on the development of
immune-mediated interstitial nephritis. Kidney Int. 1988;33:1113–1118.
Shimizu MHM, Coimbra TM, de Araújo M, Menezes LF, Seguro AC. N-
acetylcysteine attenuates the progression of chronic renal failure. Kidney Int.
2005;68:2208-2217.
Silva AA, Noronha IL, Oliveira IB, Malheiros DM, Heimann JC. Renin-angiotensin
system function and blodd pressure in adult rats after perinatal salt overload. Nutr
Metab Cardiovasc Dis. 2003;13(3):133-139.
Singhal PC, Franki N, Hays RM. Angiotensin II induces actin synthesis in cultured
mesangial cells (abstract). Clin Res.1990;38:401A.
Sporn MB, Roberts AB, Wakefield LM, Crombrugghe B. Some recent advances in
the chemistry and biology of transforming growth factor-beta
J Cell Biol. 1987;105:1039-1045.
Taubman MB, Berk BC, Izumo S, Tsuda T, Alexander RW; Nadal-Ginard B.
Angiotensin II induces of c-fos mRNA in aortic smooth muscle. Role of Ca2+
mobilization and protein kinase C activation. J Biol Chem. 1989;264:526-530.
Thiery JP, Duband JL, Dufour S, Savagner P, Imhof BA. Roles of fibronectins in
embryogenesis. In: Mosher DF. Fibronectin. New YorK: Academic Press; 1989. p.
181-212.
Tufro-McReddie A, Harrison JK, Everett AD, Gomez RA. Ontogeny of type 1
angiotensin II receptor gene expression in the rat. J Clin Invest. 1993;91(2):530–
537.
Tufro-McReddie A, Johns DW, Geary KM, Dagli H, Everett AD, Chevalier RL, Carey
RM, Gomez RA. Angiotensin II type 1 receptor: role in renal growth and gene
expression during normal development. Am J Physiol. 1994;266(6):F911-F918.
Tufro-McReddie A, Romano LM, Harris JM, Ferder L, Gomez RA. Angiotensin II
regulates nephrogenesis and renal vascular development. Am J Physiol.
1995;269:F110-F115.
Marin ECS Referências
__________________________________________________________________________________________
98
Wallace KB, Hook JB, Balie MD. Postnatal development of the renin-angiotensin
system in rats. Am J Physiol. 1980;238:R432-R437.
Wilson TA, McCaughran JA, Juno CJ; Kaskel FJ, Partin JS. Ontogeny of plasma
renin activity in the Dahl rat model of essential hypertension. J Hypertens
Suppl.1986;4(5):S23-6.
Winaver J, Abassi Z, Green J, Skorecki KL. Control of extracellular fluid volume and
the pathophysiology of edema formation. Cap 19. In: Brenner BM. The Kidney. 6.ed.
Philadelphia,USA. W.B. Saunders Company; 2000. p. 795-865.
Wong PC et al. Angiotensin II receptor antagonists and receptor subtypes.
Transmission Electron Microsc. 1992;3:211-217.
Woolf AS, Winyard PJ: Advances in the cell biology and genetics of human kidney
malformations. J Am Soc Nephrol. 1998;9:1114-1125.
Zandi-Nejad K, Luyckx VA, Brenner BM. Adult Hypertension and Kidney Disease:The
Role of Fetal Programming. Hypertension. 2006;47(2):502-508.
Zatz R. Fisiopatologia Renal. v.2. São Paulo:Editora Atheneu; 2000. 300p.
Zoja C, Donadelli R, Colleoni S, Figliuzzi M, Bonazzolla S, Morigi M, Remuzzi G.
Protein over-load stimulates RANTES production by proximal tubular cells depending
on NF-kβ activation. Kidney Int. 1998;53:1608-1615.
Yamada KM. Fibronectin and cell surface interactions. In: Hay ED. Cell Biology of
Extracellular Matrix. New York: Plenum Press; 1991. p. 111-146.
Ylitalo P, Hep. R, Möhring J, Gross F. Effects of varying sodium intake on blood
pressure and renin-angiotensin system in subtotally nephrectomized rats. J Lab Clin
Med. 1976;88(5):807–816.
ANEXOS
Marin ECS Anexos
___________________________________________________________________________
100
ANEXO A- Protocolo de ética experimental
APÊNDICES
Marin ECS Apêndices
___________________________________________________________________________
102
APÊNDICE A- Ingestão de líquidos (mL/24h) durante a gestação e amamentação -
valores representam as médias de cada animal
GRUPO CONTROLE GRUPO EXPERIMENTAL
Animal
GESTAÇÃO AMAMENTAÇÃO GESTAÇÃO AMAMENTAÇÃO
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
75,00
80,00
41,56
40,50
42,00
72,33
41,60
56,67
40,00
60,00
55,00
51,72
63,12
45,00
43,33
37,50
51,12
105,00
122,22
80,00
87,00
70,00
97,27
114,44
45,00
81,82
57,78
57,22
66,67
64,17
66,67
78,00
63,00
107,29
79,17
63,57
59,17
72,50
75,00
65,00
74,00
63,33
73,00
95,00
70,83
62,22
61,34
64,66
40,00
62,08
136,50
66,25
53,33
79,20
108,30
83,75
83,33
80,00
81,66
66,67
146,00
90,00
95,00
113,57
120,00
126,67
181,25
123,00
176,50
230,00
Média ± EPM
52,73 ± 3,24 89,18 ± 7,91 73,15 ± 3,16 133,50 ± 14,2
Marin ECS Apêndices
___________________________________________________________________________
103
APÊNDICE B- Consumo de ração (g/24h) durante a gestação e amamentação -
valores representam as médias de cada animal
GRUPO CONTROLE GRUPO EXPERIMENTAL
Animal
GESTAÇÃO AMAMENTAÇÃO GESTAÇÃO AMAMENTAÇÃO
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
34,33
32,83
34,00
33,33
29,63
27,20
53,00
70,00
35,72
25,13
46,75
38,50
45,00
51,06
51,92
43,72
86,20
53,67
70,30
62,08
79,50
74,60
51,70
52,50
60,55
25,00
25,62
32,85
31,48
39,15
35,57
26,67
37,66
30,69
32,29
27,01
32,95
29,40
28,05
36,14
34,66
36,00
32,00
34,22
42,30
27,00
28,00
33,80
33,14
34,36
38,38
27,93
34,13
64,90
51,00
56,50
60,50
59,83
69,58
45,50
58,75
61,50
98,00
98,00
153,00
Média ± EPM
38,88 ± 3,39 61,48 ± 3,83 32,31 ± 0,86 70,09 ± 8,51
Marin ECS Apêndices
___________________________________________________________________________
104
APÊNDICE C- Variação de Peso Corporal (g) do início ao final da gestação -
valores individuais por animal
Animal GRUPO CONTROLE GRUPO EXPERIMENTAL
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
175,00
176,00
82,00
56,00
128,00
107,00
46,00
53,00
208,00
214,00
218,00
145,00
132,00
182,00
205,00
186,00
146,00
186,00
223,00
211,00
263,00
192,00
113,00
166,00
122,00
102,00
118,00
Média ± EPM
102,90 ± 18,69 175,40 ± 10,29
Marin ECS Apêndices
___________________________________________________________________________
105
APÊNDICE D- Peso corporal (g) ao nascimento (N) e aos 60 dias de idade dos
filhotes do grupo controle (água) e experimental (salina 0,15M) e dos animais após
90 ou 120 dias do processo cirúrgico - valores individuais por animal
AGUA SALINA 90 dias 120 diasAnimal
N60
dias
N60
dias
SSSNENESSSSNENES
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
Continua
8,03
6,40
7,50
8,40
6,40
7,60
6,80
8,60
7,60
7,00
7,80
7,30
7,80
7,20
7,20
7,90
5,80
5,97
6,40
8,45
7,27
7,17
8,08
6,47
8,00
8,88
8,35
7,80
6,90
9,96
7,94
7,61
8,27
6,49
7,04
8,45
7,29
7,57
6,94
8,05
5,94
7,29
7,00
6,97
4,59
368,00
416,00
366,00
430,00
413,00
423,00
400,00
338,00
467,00
355,00
405,00
460,00
478,00
420,00
314,00
395,00
345,00
377,00
445,00
450,00
462,00
320,00
402,00
340,00
390,00
390,00
465,00
415,00
415,00
420,00
8,04
8,00
9,30
8,70
8,80
8,60
8,10
8,30
8,90
9,30
8,08
7,10
7,50
6,70
7,10
6,80
7,00
6,00
7,80
6,90
8,50
7,60
7,50
9,58
8,85
9,56
7,75
9,07
9,55
7,32
8,47
6,81
8,59
6,83
8,09
7,93
7,14
8,88
7,57
8,15
7,08
8,79
8,39
8,00
7,90
396,00
311,00
380,00
407,00
375,00
338,00
335,00
382,00
388,00
398,00
397,00
386,00
407,00
380,00
346,00
350,00
379,00
420,00
460,00
430,00
395,00
300,00
370,00
370,00
350,00
260,00
290,00
350,00
360,00
360,00
273,00
380,00
412,00
582,00
646,00
675,00
409,00
596,00
584,00
640,00
619,00
585,00
529,00
540,00
644,00
586,00
576,00
631,00
670,00
578,00
557,00
539,00
693,00
583,00
616,00
710,00
482,00
521,00
503,00
475,00
590,00
640,00
459,00
538,00
630,00
622,00
481,00
440,00
552,00
561,00
552,00
455,00
442,00
571,00
542,00
542,00
469,00
589,00
448,00
617,00
583,00
558,00
560,00
507,00
773,00
535,00
594,00
773,00
556,00
598,00
657,00
631,00
723,00
576,00
567,00
560,00
635,00
550,00
615,00
538,00
674,00
572,00
672,00
659,00
620,00
663,00
717,00
680,00
804,00
652,00
728,00
721,00
770,00
620,00
645,00
602,00
650,00
644,00
548,00
631,00
611,00
475,00
619,00
624,00
686,00
604,00
545,00
586,00
609,00
597,00
521,00
536,00
603,00
496,00
606,00
560,00
694,00
510,00
513,00
585,00
698,00
687,00
674,00
591,00
671,00
542,00
521,00
601,00
655,00
581,00
578,00
482,00
724,00
653,00
693,00
408,00
Marin ECS Apêndices
___________________________________________________________________________
106
Conclusão
AGUA SALINA 90 dias 120 diasAnimal
N60
dias
N60
dias
SSSNENESSSSNENES
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
7,70
7,20
7,80
7,60
9,00
8,38
8,14
9,17
8,21
9,47
9,03
8,00
9,23
8,70
7,37
8,14
7,76
8,75
Média ±
EPM
7,63
±
0,12
402,80
±
8,23
8,03
±
0,13
367,70
±
7,72
593,90
±
28,81
602,50
±
14,59
540,10
±
20,60
528,10
±
15,49
611,70
±
17,90
663,10
±
14,62
578,70
±
13,90
608,50
±
20,82
S, Sham/Água; SS, Sham/Salina; NE, Nefrectomizados/Água; NES,Nefrectomizados/Salina
Marin ECS Apêndices
___________________________________________________________________________
107
APÊNDICE E- Relação do peso do rim pelo peso corporal após 120 da cirurgia -
valores individuais por animal
120 dias
Animal
SSSNENES
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
0,0030
0,0033
0,0036
0,0032
0,0034
0,0044
0,0039
0,0036
0,0041
0,0025
0,0040
0,0029
0,0047
0,0048
0,0045
0,0050
0,0056
0,0030
0,0042
0,0048
0,0039
0,0040
0,0045
0,0039
0,0070
0,0055
0,0043
0,0049
0,0042
0,0110
0,0047
0,0056
Média ± EPM 0,0033 ± 0,0001 0,0036 ± 0,0002 0,0046 ± 0,0003 0,0053 ± 0,0006
S, Sham/Água; SS, Sham/Salina; NE, Nefrectomizados/Água; NES,Nefrectomizados/Salina
Marin ECS Apêndices
___________________________________________________________________________
108
APÊNDICE F- Pressão arterial sistólica (mmHg) dos filhotes cujas mães receberam
água ou salina 0,15M durante a gestação e amamentação, aos 30 e 60 dias após o
nascimento (antes do processo cirúrgico) - valores individuais por animal
30 dias 60 dias
Animal
Água Salina Água Salina
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
127,33
138,50
133,00
124,00
132,50
83,67
105,00
89,00
87,67
87,00
113,50
116,00
134,00
160,00
104,00
116,00
138,00
126,50
134,00
128,33
115,50
106,50
110,67
99,00
109,67
92,50
106,00
130,33
112,33
113,33
122,33
119,33
135,67
135,00
137,00
116,67
126,00
125,00
129,00
128,50
134,00
145,00
144,00
137,33
153,00
136,00
132,00
138,33
100,00
145,00
124,50
105,33
Média ± EPM
111,40 ± 5,8
7
130,40 ± 6,69 114,40 ± 3,21 131,10 ± 3,04
Marin ECS Apêndices
_________________________________________________________________________________________________________________
109
APÊNDICE G- Pressão arterial sistólica (mmHg) dos filhotes cujas mães receberam água ou salina 0,15M durante a gestação e
amamentação, aos 30, 60 e 90 dias do processo cirúrgico - valores individuais por animal
30 dias 60 dias 90 dias
Animal
S SS NENES S SS NENES S SS NENES
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
115,00
126,00
122,50
95,00
129,00
101,50
129,00
105,50
128,00
115,50
143,00
123,50
135,00
133,00
134,00
135,00
172,00
178,67
157,33
190,00
169,50
200,50
155,00
145,00
139,00
119,33
226,33
157,00
120,00
134,00
113,33
115,67
106,50
128,00
125,00
134,00
136,00
130,00
140,00
145,00
169,50
173,00
194,00
181,00
149,00
152,50
195,00
146,50
226,00
191,33
186,50
131,67
163,00
140,50
170,00
196,50
162,00
148,00
164,00
149,67
142,00
136,00
161,00
118,00
133,00
122,50
126,00
131,00
129,00
128,00
130,00
135,00
132,00
142,00
145,00
136,00
135,00
169,00
166,00
185,00
261,00
183,00
167,00
144,67
183,67
246,67
134,33
147,33
227,50
135,50
243,33
Média
±
EPM
114,80
±
5,64
128,20
±
3,44
174,70
±
6,25
157,30
±
18,29
120,80
±
4,63
130,60
±
4,13
176,30
±
8,67
160,20
±
5,48
124,50
±
4,44
133,50
±
1,76
182,40
±
12,17
189,10
±
22,62
S, Sham/Água; SS, Sham/Salina; NE, Nefrectomizados/Água; NES,Nefrectomizados/Salina
Marin ECS Apêndices
___________________________________________________________________________
110
APÊNDICE H- Excreção urinária de albumina (mg/24h) dos filhotes cujas mães
receberam água ou salina 0,15M durante a gestação e amamentação, aos 30 e 60
dias após o nascimento (antes do processo cirúrgico)
- valores individuais por animal
30 dias 60 dias
Animal
ÁGUA SALINA ÁGUA SALINA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
0,362
0,152
0,216
0,176
0,062
0,14
0,655
0,516
0,092
0,094
0,44
0,046
0,046
0,30
0,056
0,12
0,07
0,18
0,23
0,43
0,10
0,04
0,096
0,08
0,014
0,22
0,79
0,26
0,18
1,90
0,37
0,32
0,68
1,14
0,22
0,66
0,01
0,03
1,50
0,32
0,50
0,26
0,37
0,26
0,84
0,12
0,141
0,30
0,182
0,182
0,208
0,676
0,54
0,22
0,21
0,30
0,18
0,27
0,12
0,23
0,85
0,74
0,17
0,55
0,48
0,58
0,17
1,03
0,22
0,85
0,26
0,48
0,72
0,26
0,38
0,26
1,04
0,84
0,79
0,96
0,32
0,07
0,15
0,67
0,97
0,57
0,14
0,29
0,19
0,63
0,19
0,04
0,24
0,21
0,25
1,70
Mediana e
percentis
(25; 75%)
0,15
(0,09; 0,23)
0,29
(0,14; 0,67)
0,30
(0,20; 0,7)
0,25
(0,17; 0,60)
Marin ECS Apêndices
________________________________________________________________________________________________________________
111
APÊNDICE I- Excreção urinária de albumina (mg/24h) dos filhotes cujas mães receberam água ou salina 0,15M durante a
gestação e amamentação, aos 30, 60 e 90 dias do processo cirúrgico- valores individuais por animal
30 dias 60 dias 90 dias 120 diasAnimal
S SS NE NES S SS NE NES S SS NE NES S SS NE NES
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
1,14
0,14
0,60
0,099
2,31
0,046
0,45
0,075
0,80
3,012
0,61
1,17
0,42
0,25
1,86
0,18
0,14
0,885
1,75
0,28
0,23
55,726
146,62
13,718
169,56
24,24
1,41
17,35
36,60
74,76
52,18
68,46
81,60
40,40
1,98
1,76
9,13
23,52
15,58
0,05
9,50
0,88
2,52
6,798
107,05
33,212
12,996
1,155
26,059
61,847
4,33
79,33
72,00
18,34
22,22
11,42
10,89
0,47
0,60
0,92
0,40
3,47
0,46
0,88
5,55
0,06
0,72
0,13
5,86
0,53
1,15
0,65
0,08
0,27
0,37
0,11
0,89
0,80
0,34
1,37
0,36
0,57
0,07
0,07
0,07
0,18
86,83
75,75
55,89
130,50
38,85
23,58
38,75
124,27
300,00
263,94
203,72
40,32
124,20
21,00
1,92
8,80
39,07
98,55
44,34
96,86
9,61
66,65
120,75
115,56
354,03
76,36
227,58
46,65
14,55
0,63
0,88
4,44
36,54
1,84
10,36
81,60
10,08
86,40
87,00
45,00
36,40
1,06
1,80
9,40
0,55
1,25
0,07
0,05
0,04
0,09
0,31
0,87
1,67
2,66
0,30
0,19
0,59
1,06
1,21
0,30
0,16
0,94
0,75
0,22
0,42
0,38
1,08
3,22
0,60
2,52
0,66
0,43
0,36
0,40
0,06
144,72
457,11
131,25
614,65
36,00
835,45
767,88
15,48
28,56
173,60
6,60
48,00
116,90
35,05
78,40
39,20
176,73
30,75
48,11
54,38
119,85
63,67
358,80
366,99
425,04
91,18
26,23
127,00
36,80
6,36
84,80
13,32
37,32
30,49
330,00
172,20
64,00
144,00
15,01
203,55
3,87
1,20
0,065
0,39
0,11
0,25
0,67
0,72
1,03
2,10
0,89
0,95
0,21
0,66
0,75
1,30
0,20
339,30
240,00
514,80
105,60
163,20
94,50
126,00
12,00
44,00
23,52
108,00
53,20
117,30
167,96
88,35
176,70
210,80
149,40
53,04
25,30
19,20
Mediana
e
percentis
(25; 75%)
0,45
(0,10;
0,60)
0,51
(0,24;
1,46)
20,44
(5,82;
53,95)
20,28
(11,16;
47,53)
0,60
(0,43;
0,90)
0,36
(0,14;
0,72)
65,82
(31,17;
127,40)
44,67
(10,22;
86,70)
0,87
(0,09;
1,25)
0,60
(0,33;
1,14)
124,10
(37,60;
316,00)
74,40
(33,78;
174,50)
0,67
(0,25;
0,72)
0,82
(0,44;
1,12)
126,00
(94,50;
163,20)
98,18
(39,17;
210,80)
S, Sham/Água; SS, Sham/Salina; NE, Nefrectomizados/Água; NES,Nefrectomizados/Salina
Marin ECS Apêndices
___________________________________________________________________________
112
APÊNDICE J- Parâmetros de função renal: taxa de filtração glomerular (TFG,
ml/min/100g) nos animais após 90 ou 120 dias da cirurgia fictícia ou nefrectomia 5/6
- valores individuais por animal
90 dias 120 dias
Animal
S SS NENES S SS NENES
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
0,45
0,43
0,67
0,46
0,37
0,59
0,32
0,63
0,78
0,43
0,34
0,36
0,58
0,48
0,15
0,22
0,34
0,14
0,11
0,42
0,40
0,17
0,16
0,18
0,14
0,39
0,45
0,37
0,53
0,36
0,20
0,19
0,27
0,26
0,41
0,37
0,15
0,35
0,05
0,43
0,35
0,51
0,56
0,32
0,49
0,57
0,54
0,46
0,68
0,47
0,43
0,54
0,50
0,16
0,14
0,06
0,03
0,19
0,07
0,06
0,17
0,02
0,22
0,55
0,45
0,25
0,12
0,19
0,19
0,03
0,19
0,04
0,05
0,06
0,08
0,22
Média
±
EPM
0,47
±
0,05
0,51
±
0,06
0,22
±
0,03
0,31
±
0,03
0,44
±
0,03
0,52
±
0,03
0,15
±
0,04
0,15
±
0,03
S, Sham/Água; SS, S0.37ham/Salina; NE, Nefrectomizados/Água; NES,Nefrectomizados/Salina
Marin ECS Apêndices
________________________________________________________________________________________________________________
113
APÊNDICE L- Parâmetros de função renal: fração de excreção (FE, %) de sódio e potássio e osmolalidade urinária (Uosm,
mOsm/kgH
2
O) nos animais após 120 dias da cirurgia fictícia ou nefrectomia 5/6 - valores individuais por animal
FE
Na+
FE
K+
Uosm
Animal
S SS S SS NE NES NE NES S SS NE NES
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
0,09
0,06
0,16
0,02
0,82
0,05
0,18
0,06
0,08
1024,0
1283,0
2203,0
1237,0
1262,0
1459,0
1173,0
1856,0
1010,0
1230,0
793,0
1086,0
988,0
599,0
1285,0
1230,0
1299,0
1304,0
903,0
867,0
1109,0
625,0
1412,0
899,0
864,0
1581,0
470,0
592,0
403,0
583,0
1246,0
616,0
544,0
964,0
0,13
0,69
1,55
0,04
0,10
0,16
1,83
0,34
1,56
0,30
0,10
0,17
2,89
2,70
0,42
0,55
0,31
0,94
0,92
0,41
2,38
3,69
6,63
0,05
1024,0
1283,0
2203,0
1237,0
1262,0
1459,0
1173,0
1856,0
1010,0
1230,0
793,0
1086,0
988,0
599,0
1285,0
1230,0
1299,0
1304,0
903,0
867,0
1109,0
625,0
1412,0
899,0
864,0
1581,0
470,0
592,0
403,0
583,0
1246,0
616,0
544,0
964,0
Média
±
EPM
0,08
±
0,03
0,24
±
0,15
0,08
±
0,03
0,24
±
0,15
0,62
±
0,21
1,70
±
0,53
0,62
±
0,21
1,70
±
0,53
1411,00
±
168,10
1191,00
±
146,80
1021,00
±
85,12
847,80
±
111,90
S, Sham/Água; SS, Sham/Salina; NE, Nefrectomizados/Água; NES,Nefrectomizados/Salina
Marin ECS Apêndices
___________________________________________________________________________
114
APÊNDICE M- Escore para glomeruloesclerose (GL) e lesões tubulointersticiais
(LTI) no córtex de ratos 120 dias após o processo cirúrgico - valores individuais por
animal
GL LTI
Animal
S SSNENESS SSNENES
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
0,02
0,00
0,00
0,01
0,00
0,04
0,00
0,00
0,00
0,00
0,10
0,02
0,06
0,03
0,11
0,20
0,03
0,06
0,05
0,08
0,04
0,06
0,07
1,16
0,89
1,03
0,14
0,32
0,29
0,62
0,03
0,23
0,03
0,25
0,34
0,69
0,16
0,43
0,28
0,67
0,34
1,17
0,90
2,14
0,89
1,20
0,37
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,50
0,00
0,00
0,00
0,00
0,50
0,50
0,50
0,50
2,00
1,00
0,50
1,00
1,00
1,00
1,00
0,50
1,00
3,00
3,00
4,00
2,00
3,00
1,00
3,00
1,00
1,00
1,00
2,00
1,00
3,00
1,00
2,00
2,00
3,00
1,00
3,00
3,00
4,00
3,00
3,00
1,00
Mediana
e
percentis
(25; 75%)
0,00
(0,00;
0,05)
0,06
(0,04;
0,07)
0,29
(0,18;
0,75)
0,67
(0,34;
0,89)
0,00
(0,00;
0,00)
1,00
(0,50;
1,00)
2,00
(1,00;
3,00)
3,00
(1,00;
3,00)
S, Sham/Água; SS, Sham/Salina; NE, Nefrectomizados/Água; NES,Nefrectomizados/Salina
Marin ECS Apêndices
___________________________________________________________________________
115
APÊNDICE N- Número de células ED1-positivas por glomérulo e por área de
0,245mm
2
do compartimento tubulointersticial no córtex renal dos ratos sacrificados
após 120 dias do processo cirúrgico - valores individuais por animal
Glomérulos Tubulointersticial
Animal
S SS NENES S SS NENES
1
2
3
4
5
6
7
0,57
0,44
0,44
0,33
0,43
0,41
0,43
0,92
0,76
0,51
0,83
0,56
1,11
0,48
2,93
1,18
1,19
2,31
0,83
1,17
2,29
1,41
1,08
0,83
1,38
0,77
0,89
1,03
4,08
2,82
2,80
2,87
4,02
3,03
3,43
4,65
5,05
4,46
7,68
6,55
7,86
4,80
21,70
12,86
17,78
19,02
9,90
17,66
18,12
16,34
8,54
9,34
13,00
9,86
8,71
13,50
Média
±
EPM
0,43
±
0,03
0,74
±
0,09
1,70
±
0,30
1,05
±
0,10
3,29
±
0,21
5,86
±
0,56
16,72
±
1,51
11,33
±
1,13
S, Sham/Água; SS, Sham/Salina; NE, Nefrectomizados/Água; NES,Nefrectomizados/Salina
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