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ARYÁDINA MARA RIBEIRO DE SOUZA
ATIVIDADE DAS BACTERIOCINAS BOVICINA HC5 E NISINA SOBRE O
CRESCIMENTO E A RESISTÊNCIA TÉRMICA DE Alicyclobacillus
acidoterrestris EM SUCOS DE FRUTAS
VIÇOSA
MINAS GERAIS - BRASIL
2008
Dissertação apresentada à
Universidade Federal de Viçosa,
como parte das exigências do
programa de Pós-Graduação em
Microbiologia Agrícola, para
obtenção do título de Magister
Scientiae.
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Ficha catalográfica preparada pela Seção de Catalogação e
Classificação da Biblioteca Central da UFV
T
Souza, Aryádina Mara Ribeiro de, 1972-
S729a Atividade das bacteriocinas bovicina HC5 e nisina sobre
2008 o crescimento e a resistência térmica de
Alicyclobacillus acidoterrestris em sucos de frutas /
Aryádina Mara Ribeiro de Souza – Viçosa, MG, 2008.
xiv, 64f.: il. (algumas col.) ; 29cm.
Orientador: Hilário Cuquetto Mantovani.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Viçosa.
Referências bibliográficas: f. 53-64.
1. Alicyclobacillus acidoterrestris - Efeito de bovicina
HC5. 2. Alicyclobacillus acidoterrestris - Efeito de nisina.
3. Suco de frutas - Deterioração. 4. Bacteriocinas.
5. Bactérias. 6. Microbiologia agrícola. I. Universidade
Federal de Viçosa. II.Título.
CDD 22.ed. 579.36
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ARYÁDINA MARA RIBEIRO DE SOUZA
ATIVIDADE DAS BACTERIOCINAS BOVICINA HC5 E NISINA SOBRE O
CRESCIMENTO E A RESISTÊNCIA TÉRMICA DE Alicyclobacillus
acidoterrestris EM SUCOS DE FRUTAS
APROVADA: 19 de Junho de 2008
Dissertação apresentada à
Universidade Federal de Viçosa,
como parte das exigências do
programa de Pós-Graduação em
Microbiologia Agrícola, para
obtenção do título de Magister
Scientiae.
______________________________
Profª. Flávia Maria Lopes Passos
______________________________
Profª. Maria Cristina Dantas Vanetti
(co-orientadora)
______________________________
Profº. Sukarno Olavo Ferreira
______________________________
Profª. Denise Mara Soares Bazzolli
______________________________
Profº. Hilário Cuquetto Mantovani
(orientador)
ii
A Deus
Ao meu marido, Jorge
Aos meus pais, A
g
enor e Olinda
Dedico esta vitória.
iii
AGRADECIMENTOS
A Deus por estar presente em todos os momentos de minha vida e por mais
uma vitória alcançada.
Ao meu marido, Jorge, pelo amor, carinho, compreensão e incentivo em todos
os momentos.
Aos meus pais, Agenor e Olinda, pelo apoio, compreensão e orações.
Aos meus irmãos, Soraia, Patrícia, Bethânia, Agenor, Kelem e sobrinhos,
Vinícius, Thaís, Priscila, Frederico, Déborah e Gustavo, pelo incentivo e carinho.
À Universidade Federal de Viçosa e ao Departamento de Microbiologia pela
oportunidade de realizar o mestrado e pela excelente formação.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
pela concessão da bolsa.
Ao professor Hilário Cuquetto Mantovani pela orientação, confiança
depositada em mim, disponibilidade e por toda dedicação, sempre zelando pelo
melhor desenvolvimento dos trabalhos e contribuindo para o crescimento
profissional de seus orientados.
À professora Maria Cristina Dantas Vanetti pelo exemplo profissional,
conselhos, carinho e pela grande contribuição durante o mestrado.
À professora Célia Alencar de Moraes pela co-orientação e sugestões.
Ao professor Sukarno Olavo Ferreira por contribuir de forma tão significativa
na execução dos trabalhos de microscopia, pela paciência e disponibilidade. Por
participar da banca de defesa e sugestões.
iv
Às professoras Denise Mara Soares Bazzolli e Flávia Maria Lopes Passos
pela participação na banca de defesa e pelas sugestões.
A todos os professores do Departamento de Microbiologia que contribuíram
para minha formação. Em especial ao professor Arnaldo Chaer pela atenção,
ensinamentos e sugestões durante a conduta das aulas de Microbiologia Geral.
A Alexandra pela amizade, companheirismo e pela ajuda indispensável para a
realização deste trabalho.
A Carol pela amizade e por compartilhar os momentos bons e ruins durante
todo o curso.
Aos colegas do Laboratório de Microbiologia de Anaeróbios: Isabela, Juliana,
Henrique, Marcelão, Aline, Marcelo, Claudinha, Ana Andréa e Janaína. Em especial
a Fernanda pela amizade e ajuda nas extrações de bovicina.
Aos colegas do Laboratório de Microbiologia de Alimentos e Patógenos:
Adriana Ponce, Gardênia, Evandro, Renata, Simone e Wanessa pela ajuda e boa
vontade.
A todos os Funcionários do Departamento de Microbiologia, em especial,
Adriana, Pablo e José Carlos pela ajuda na realização desse trabalho. A Nilcéa, Laura
e Rejane pelo auxílio.
Aos amigos do BIOAGRO, em especial a Talitinha, Mariana, Néia, Fabi,
Maike, Péricles, Eliana, Thiago, Guilherme e Juline pela ajuda e momentos de
descontração.
A todos que torceram por essa conquista, muito obrigada!
v
Luiz Fernando Veríssimo
“Não deixe que a saudade sufoque,
que a rotina acomode,
que o medo impeça de tentar.
Desconfie do destino e acredite em você.
Gaste mais horas realizando
que sonhando,
fazendo que planejando,
vivendo que esperando
porque, embora
quem quase morre esteja vivo,
quem quase vive já morreu.”
vi
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS.........................................................................................................viii
LISTA DE TABELAS ...........................................................................................................x
RESUMO...............................................................................................................................xi
ABSTRACT.........................................................................................................................xiii
INTRODUÇÃO......................................................................................................................1
2. REVISÃO DE LITERATURA......................................................................................... 3
2.1. BACTÉRIAS ASSOCIADAS À DETERIORAÇÃO DE SUCOS DE FRUTAS .............................. 3
2.2. ALICYCLOBACILLUS E A DETERIORAÇÃO DE SUCOS DE FRUTAS..................................... 5
2.3. BACTERIOCINAS E MECANISMO DE AÇÃO .................................................................. 13
2.4. NISINA......................................................................................................................... 15
2.5. BOVICINA HC5............................................................................................................ 16
2.6. MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA (AFM) UTILIZADA EM ANÁLISES DE AMOSTRAS
BIOLÓGICAS
............................................................................................................... 18
3. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 20
3.1. MICRORGANISMO E CONDIÇÕES DE CULTIVO ............................................................. 20
3.2. EXTRAÇÃO E DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE BOVICINA HC5.............................. 21
vii
3.3. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA NISINA ................................................................ 22
3.4. EFEITO DE BOVICINA HC5 E NISINA SOBRE O CRESCIMENTO DE A. ACIDOTERRESTRIS22
3.5. EFEITO DE BOVICINA HC5 E NISINA SOBRE A VIABILIDADE CELULAR DE A.
ACIDOTERRESTRIS EM TAMPÃO FOSFATO
................................................................... 22
3.6. EFEITO DE BOVICINA HC5 E NISINA SOBRE A VIABILIDADE CELULAR DE A.
ACIDOTERRESTRIS EM DIFERENTES SUCOS DE FRUTAS
............................................... 23
3.7. PREPARO DA SUSPENSÃO DE ENDOSPOROS DE A. ACIDOTERRESTRIS........................... 25
3.8. DETERMINAÇÃO DO VALOR D DE ESPOROS DE A. ACIDOTERRESTRIS EM DIFERENTES
SUCOS DE FRUTAS
..................................................................................................... 25
3.9. ANÁLISE DA MORFOLOGIA E DO ENVELOPE CELULAR DE A. ACIDOTERRESTRIS
TRATADO COM BOVICINA
HC5 E NISINA................................................................... 26
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO..................................................................................... 27
4.1. EFEITO DE BOVICINA HC5 E NISINA SOBRE O CRESCIMENTO DE A.
ACIDOTERRESTRIS
...................................................................................................... 27
4.2. EFEITO DE BOVICINA HC5 E NISINA SOBRE A VIABILIDADE CELULAR DE A.
ACIDOTERRESTRIS EM TAMPÃO FOSFATO
................................................................... 30
4.3. EFEITO DE BOVICINA HC5 SOBRE A VIABILIDADE CELULAR DE A. ACIDOTERRESTRIS
EM DIFERENTES SUCOS DE FRUTAS
........................................................................... 32
4.3.1. VIABILIDADE CELULAR DE A. ACIDOTERRESTRIS EM DIFERENTES SUCOS DE FRUTAS,
CONTENDO DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE BOVICINA
HC5 E NISINA .................. 37
4.4. DETERMINAÇÃO DO VALOR D DE ESPOROS DE A. ACIDOTERRESTRIS EM DIFERENTES
SUCOS DE FRUTAS NA PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE BACTERIOCINA
......................... 42
4.5. CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS E DO ENVELOPE CELULAR DE A. ACIDOTERRESTRIS
TRATADO COM BOVICINA
HC5 E NISINA................................................................... 45
5. CONCLUSÕES................................................................................................................ 53
5. REFERÊCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................. 54
viii
LISTA DE FIGURAS
F
IGURA 1. EFEITO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE BOVICINA HC5 E DE NISINA NO
CRESCIMENTO DE
A. ACIDOTERRESTRIS DSMZ 2498 EM CALDO BAM............28
F
IGURA 2. NÚMERO DE CÉLULAS VIÁVEIS DE A. ACIDOTERRESTRIS DSMZ 2498
INCUBADOS EM TAMPÃO FOSFATO COM BOVICINA HC5 E NISINA...................31
F
IGURA 3. EFEITO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE BOVICINA HC5 SOBRE A.
ACIDOTERRESTRIS
DSMZ 2498 INOCULADO EM SUCO DE ABACAXI.................32
F
IGURA 4. EFEITO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE BOVICINA HC5 SOBRE A.
ACIDOTERRESTRIS DSMZ 2498 INOCULADO EM SUCO DE UVA.........................33
F
IGURA 5. EFEITO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE BOVICINA HC5 SOBRE A.
ACIDOTERRESTRIS
DSMZ 2498 INOCULADO EM SUCO DE MANGA...................33
F
IGURA 6. EFEITO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE BOVICINA HC5 SOBRE A.
ACIDOTERRESTRIS
DSMZ 2498 INOCULADO EM SUCO DE MAMÃO...................35
F
IGURA 7. EFEITO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE BOVICINA HC5 SOBRE A.
ACIDOTERRESTRIS
DSMZ 2498 INOCULADO EM SUCO DE LARANJA.................35
F
IGURA 8. EFEITO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE BOVICINA HC5 SOBRE A.
ACIDOTERRESTRIS
DSMZ 2498 INOCULADO EM SUCO DE MAÇÃ......................36
ix
FIGURA 9. EFEITO DE BOVICINA HC5 E NISINA SOBRE A. ACIDOTERRESTRIS DSMZ 2498
INOCULADO EM SUCO DE ABACAXI
..................................................................38
F
IGURA 10. EFEITO DE BOVICINA HC5 E NISINA SOBRE A. ACIDOTERRESTRIS DSMZ 2498
INOCULADO EM SUCO DE LARANJA..................................................................39
F
IGURA 11. EFEITO DE BOVICINA HC5 E NISINA SOBRE A. ACIDOTERRESTRIS DSMZ 2498
INOCULADO EM SUCO DE UVA
................................................. ........................39
F
IGURA 12. EFEITO DE BOVICINA HC5 E NISINA SOBRE A. ACIDOTERRESTRIS DSMZ 2498
INOCULADO EM SUCO DE MAMÃO....................................................................41
F
IGURA 13. EFEITO DE BOVICINA HC5 E NISINA SOBRE A. ACIDOTERRESTRIS DSMZ 2498
INOCULADO EM SUCO DE MANGA
.....................................................................41
F
IGURA 14. EFEITO DE BOVICINA HC5 SOBRE A. ACIDOTERRESTRIS DSMZ 2498
INOCULADO EM SUCO DE MAÇÃ.......................................................................42
F
IGURA 15. IMAGENS TRIDIMENCIONAIS TOPOGRÁFICAS COM O MODO INTERMITENTE DE
MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA
(NT-MDT), DA SUPERFÍCIE CELULAR DE A.
ACIDOTERRESTRIS DMSZ 2498 TRATADAS COM BOVICINA HC5......................47
F
IGURA 16. IMAGENS TRIDIMENCIONAIS TOPOGRÁFICAS COM O MODO INTERMITENTE DE
MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA
(NT-MDT), DA MORFOLOGIA CELULAR DE
A. ACIDOTERRESTRIS DMSZ 2498 TRATADAS COM BOVICINA HC5.................48
F
IGURA 17. IMAGENS TRIDIMENCIONAIS TOPOGRÁFICAS COM O MODO INTERMITENTE DE
MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA
(NT-MDT), DA REDUÇÃO DO NÚMERO DE
CÉLULAS VEGETATIVAS E ESPORULAÇÃO DE A. ACIDOTERRESTRIS DMSZ 2498
TRATADAS COM BOVICINA
HC5.......................................................................49
F
IGURA 18. IMAGENS TRIDIMENCIONAIS TOPOGRÁFICAS COM O MODO INTERMITENTE DE
MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA (NT-MDT), DA SUPERFÍCIE CELULAR DE A.
ACIDOTERRESTRIS
DMSZ 2498 TRATADAS COM NISINA...................................50
F
IGURA 19. IMAGENS TRIDIMENCIONAIS TOPOGRÁFICAS COM O MODO INTERMITENTE DE
MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA
(NT-MDT), DA MORFOLOGIA CELULAR DE
A. ACIDOTERRESTRIS DMSZ 2498 TRATADAS COM NISINA...............................51
F
IGURA 20. IMAGENS TRIDIMENCIONAIS TOPOGRÁFICAS COM O MODO INTERMITENTE DE
MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA (NT-MDT), DA REDUÇÃO DO NÚMERO DE
CÉLULAS VEGETATIVAS DE
A. ACIDOTERRESTRIS DMSZ 2498 TRATADAS COM
NISINA...............................................................................................................52
x
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. CARACTERÍSTICAS DOS SUCOS UTILIZADOS NESTE ESTUDO.......................24
TABELA 2. EFEITO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE BOVICINA HC5 E NISINA
SOBRE O CRESCIMENTO DE
A. ACIDOTERRESTRIS EM CALDO BAM...........29
T
ABELA 3. DOSE BACTERICIDA MÍNIMA (DBM) DE BOVICINA HC5 E NISINA CONTRA
A. ACIDOTERRETRIS INOCULADO EM DIFERENTES SUCOS DE FRUTAS..........38
T
ABELA 4. TEMPO DE REDUÇÃO DECIMAL (D
90 ºC
) DE ESPOROS DE A. ACIDOTERRESTRIS
EM DIFERENTES SUCOS DE FRUTAS CONTENDO
80 UA/ML DE BOVICINA
HC5 OU NISINA.........................................................................................44
xi
RESUMO
SOUZA, Aryádina Mara Ribeiro, M. Sc., Universidade Federal de Viçosa, junho de
2008. Atividade das bacteriocinas bovicina HC5 e nisina sobre o
crescimento e a resistência térmica de Alicyclobacillus acidoterrestris em
sucos de frutas Orientador: Hilário Cuquetto Mantovani. Co-orientadores
Maria Cristina Dantas Vanetti e Célia Alencar de Morais.
Alicyclobacillus acidoterrestris é uma bactéria termoacidófila, esporogênica,
que tem sido relacionada com a deterioração de sucos de frutas pasteurizados. A
prevenção da deterioração dos sucos ácidos por A. acidoterrestris é considerado um
desafio para a indústria de sucos de frutas e novas alternativas são necessárias para o
controle deste microrganismo. O uso de bacteriocinas de bactérias do ácido láctico
tais como a nisina, pode ser uma alternativa interessante para o controle de bactérias
deterioradoras termoacidófilas. Entretanto, outros peptídeos apresentam estrutura e
função que conferem potencial para aplicação na preservação de alimentos. Neste
estudo, foi avaliado o efeito de bovicina HC5 e nisina sobre o crescimento e a
resistência térmica de A. acidoterrestris DSMZ 2498 inoculado em diferentes sucos
de frutas. A adição de bacteriocinas ao meio de cultura reduziu a velocidade
específica de crescimento e a densidade óptica (DO) máxima mensurada. Quando
bovicina HC5 foi utilizada nas concentrações de 10 e 20 UA/mL o crescimento de A.
acidoterrestris foi completamente inibido. Resultados semelhantes foram obtidos
quando as culturas foram tratadas com nisina. Ambas bacteriocinas apresentaram
efeito bactericida contra células vegetativas de A. acidoterrestris inoculadas em
tampão fosfato pH 4,0. Doses de 10 e 25 UA/mL de bovicina HC5 e nisina
xii
adicionadas aos sucos de abacaxi, uva e manga reduziram a viabilidade celular de A.
acidoterrestris. Entretanto, esse efeito não foi observado quando as bacteriocinas
foram adicionadas aos sucos de mamão, laranja e maçã. Esses resultados sugerem
que a composição do suco de fruta afeta a atividade ou a estabilidade da bacteriocina.
A dose bactericida mínima (DBM) de bovicina HC5 e de nisina contra A.
acidoterrestris inoculado em diferentes sucos de frutas foi de 66,6 e 60,0 UA/mL,
respectivamente. Também avaliou-se o efeito de bovicina HC5 e nisina na redução
térmica de A. acidoterrestris. A adição de bovicina HC5 ou nisina na concentração
de 80 UA/mL nos sucos de frutas reduziu a resistência térmica dos esporos de A.
acidoterrestris a 90
o
C (D
90°C
) em quase 30 vezes. A observação de células
vegetativas de A. acidoterrestris DSMZ 2498 tratadas com bovicina HC5 ou nisina
por meio de microscopia de força atômica revelou mudanças severas no envelope
celular e na morfologia de células vegetativas de A. acidoterrestris. Considerando os
resultados obtidos neste trabalho, bovicina HC5 e nisina demonstraram serem
efetivas contra A. acidoterrestris e apresentam potencial para reduzir a deterioração
de sucos de frutas por bactérias termoacidófilas.
xiii
ABSTRACT
SOUZA, Aryádina Mara Ribeiro, M. Sc., Federal University of Viçosa, June, 2008.
Activity of the bacteriocins bovicin HC5 and nisin on the growth and the
thermal resistance of Alicyclobacillus acidoterrestris in fruit juices. Advisor:
Hilário Cuquetto Mantovani. Co-advisors: Maria Cristina Dantas Vanetti and
Célia Alencar de Morais.
Alicyclobacillus acidoterrestris is a thermoacidophilic sporogenic bacterium
which has been related to the deterioration of pasteurized fruit juices. The prevention
of acid juice deterioration by A. acidoterrestris is considered a challenge by the fruit
juice industry, and new alternatives are needed to control this microorganism. The
use of bacteriocins from lactic acid bacteria such as nisin, can be an interesting
alternative for the control of thermoacidophilic deteriorative bacteria. However, other
peptides present structure and function that confer potential for their application in
food preservation. In this study, the effect of bovicin HC5 and nisin was evaluated on
the growth and thermal resistance of A. acidoterrestris DSMZ 2498 inoculated in
different fruit juices. The addition of bacteriocins to the culture media reduced the
specific growth rate and the maximum optical density (OD). When bovicin HC5 was
used in concentrations of 10 and 20 UA/mL, the growth of A. acidoterrestris was
completely inhibited. Similar results were obtained when the cultures were treated
with nisin. Both bacteriocins presented bactericidal effects against vegetative cells of
A. acidoterrestris inoculated in phosphate buffer at pH 4.0. Doses of 10 and 25
UA/mL of bovicin HC5 and nisin respectively, added to pineapple juices, grape
xiv
juices, and mango juices reduced the cellular viability of A. acidoterrestris.
However, this effect was not observed when the bacteriocins were added to papaya
juice, orange juice and apple juice. These results suggest that the composition of fruit
juice affects bacteriocin activity or stability. The minimum bactericidal dose (MBD)
of bovicin HC5 and nisin against A. acidoterrestris inoculated in different fruit juices
was 66.6 and 60.0 UA/mL, respectively. The effect of bovicin HC5 and nisin in the
thermal reduction of A. acidoterrestris was also evaluated. The addition of bovicin
HC5 or nisin at the concentration of 80 UA/mL in fruit juices reduced the thermal
resistance of A. acidoterrestris spores at 90
o
C (D
90°C
) almost 30 times. The
observation of A. acidoterrestris DSMZ 2498 vegetative cells treated with bovicin
HC5 or nisin through atomic force microscopy revealed severe changes in the
cellular envelope and in the A. acidoterrestris vegetative cells morphology.
Considering the results obtained in this study, bovicin HC5 and nisin demonstrated
effectiveness against A. acidoterrestris, and present potential to reduce the
deterioration of fruit juices by thermoacidophilic bacteria.
1
INTRODUÇÃO
O Brasil é um dos grandes exportadores de sucos de frutas e essa atividade
econômica contribui, significativamente, para a balança comercial do país. Além
disso, as atividades de cultivo e processamento de frutas geram grande número de
empregos e renda nas regiões produtoras. A qualidade da matéria-prima e do produto
processado é fundamental para o crescimento contínuo do setor e da competitividade
do Brasil no cenário internacional. Entretanto, a deterioração de sucos de frutas
causada por microrganismos acarreta prejuízos para a indústria assim como para o
país.
Os sucos concentrados possuem características que contribuem para a
qualidade microbiológica do produto e dificultam ou impedem o crescimento de
microrganismos. Apesar disso, é considerado um alimento passível de deterioração
após serem reconstituídos. Quando o suco reconstituído é pasteurizado, esporos de
bactérias resistentes a esse processo, encontram ambiente favorável para a
germinação e crescimento, podendo deteriorar o produto. Um importante grupo de
bactérias associadas à deterioração de sucos de frutas são as termoacidófilas que,
freqüentemente, produzem esporos com elevada resistência térmica.
Atualmente, um dos microrganismos termoacidófilos de interesse na industria
de sucos é Alicyclobacillus acidoterrestris. A importância dessa bactéria reside no
elevado potencial deteriorador pela produção de “off-flavor” e pela resistência
térmica de seus esporos, o que dificulta sua eventual inativação durante o
processamento dos sucos. Os esporos de A. acidoterrestris estão presentes no solo e
2
podem contaminar frutos, materiais e equipamentos utilizados durante o
processamento da matéria-prima.
A prevenção da deterioração dos sucos ácidos por A. acidoterrestris, bem como
a estabilidade dos sucos de frutas durante a estocagem são considerados desafios
para a indústria de sucos, já que o processo térmico requerido para inativar esporos
desta bactéria também produz mudanças sensoriais indesejáveis nesses produtos para
o consumo. Assim, tem ocorrido aumento no interesse pelo estudo de alternativas
mais eficientes na prevenção do crescimento desse microrganismo. Dentro deste
contexto, o uso de bacteriocinas de bactérias do ácido láctico pode ser uma
alternativa interessante para o controle de bactérias deterioradoras termoacidófilas.
Esses peptídeos possuem efeito bactericida ou bacteriostático e tem ação
principalmente contra bactérias gram-positivas. Várias bacteriocinas de bactérias
lácticas já foram purificadas e caracterizadas, sendo que a nisina é a única
bacteriocina aprovada para ser utilizada na conservação de alimentos.
Entretanto, outros peptídeos apresentam estrutura e função que conferem
potencial para aplicação na preservação de alimentos. Neste trabalho, avaliou-se a
efetividade da bacteriocina bovicina HC5 contra A. acidoterrestris, devido ao amplo
espectro antimicrobiano e estabilidade térmica e ao pH do peptídeo produzido por
Streptococcus bovis HC5. Considerando que as bacteriocinas agem como
coadjuvantes no tratamento térmico para reduzir a resistência ao calor dos esporos e
atuam como componente de um sistema de múltiplas barreiras (pH, temperatura,
concentração de sólidos solúveis, etc) para evitar o desenvolvimento de A.
acidoterrestris, neste contexto, este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de
bovicina HC5 e nisina sobre o crescimento e a resistência térmica de A.
acidoterrestris inoculado em diferentes sucos de frutas. Visto que, observações
prévias resultaram na hipótese de que bovicina HC5 possui efeito bactericida sobre
células vegetativas de A. acidoterrestris e de que sua atividade poderia ser afetada
pelas características intrínsecas dos alimentos.
3
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Bactérias associadas à deterioração de sucos de frutas
A qualidade dos sucos de frutas é influenciada basicamente por fatores
microbiológicos, enzimáticos, químicos e físicos, que comprometem suas
características sensoriais e nutricionais (CORRÊA NETO e FARIA, 1999).
As características físico-químicas dos sucos concentrados, tais como: pH
entre 3,5 e 4,0; atividade de água menor que 0,9, alta concentração de matéria sólida
dissolvida (65 ºBrix), redução da capacidade de aeração e oxigênio dissolvido, em
adição ao tratamento térmico durante o processo de concentração e armazenamento
sob refrigeração, inibem o crescimento de microrganismos deterioradores e, ou
patogênicos (EGUCHI et al., 1999).
Entretanto, os sucos de frutas são substratos apropriados para o
desenvolvimento de alguns microrganismos deterioradores, tais como bactérias
esporulantes e fungos, capazes de sobreviver ao tratamento térmico aplicado,
podendo crescer a baixos valores de pH. Estes microrganismos podem deteriorar o
produto ao promoverem a alteração de alguns de seus componentes como
carboidratos, proteínas e vitaminas, produzindo odores e sabores indesejáveis e
mudanças na cor, pH e textura do produto final (EGUCHI et al., 2001).
Porém, depois de reconstituídos com água, que reduz o Brix para cerca de 11º,
o produto fica mais susceptível à ação de microrganismos deterioradores. Quando o
4
suco reconstituído é pasteurizado, a maioria das formas vegetativas de
microrganismos é eliminada. Porém, os esporos de algumas bactérias são resistentes
ao processo de pasteurização. No suco, essas bactérias encontram ambiente favorável
para a germinação e crescimento, podendo deteriorar o produto (EGUCHI et al.,
1999).
No final da década de 80 o crescimento de microrganismos em sucos ácidos já
havia sido bem documentado, sendo frequentemente associado com a produção de
“off-flavor” e outros produtos do metabolismo microbiano (PARISH, 1991). A
microbiota de sucos de frutas é constituída por bactérias acidotolerantes, leveduras e
bolores, sendo que a maioria das bactérias acidotolerantes encontradas são
Lactobacillus e Leuconostoc (PARISH e HIGGINS, 1988). Deste modo, os sucos de
frutas foram considerados durante muito tempo, como produtos passíveis de
deterioração causada por leveduras, bolores e bactérias lácticas. No entanto, hoje
sabe-se que os sucos de frutas são substratos adequados para o desenvolvimento de
bactérias termoacidófilas formadoras de esporos, capazes de sobreviver a tratamentos
térmicos de pasteurização e de crescer em baixo pH (EIROA, 1999).
As espécies de bactérias deterioradoras freqüentemente associadas a sucos de
frutas processados (pH < 4.5) inclui microrganismos do gênero Bacillus,
Clostridium, Lactobacillus, Leuconostoc, e bactérias acetogênicas. Também tem sido
encontrados Streptococcus e espécies de Pediococcus com menor freqüência em
suco de frutas processado (KUSANO et al., 1997).
Formas esporuladas têm papel importante na deterioração de alimentos ácidos.
Sendo este envolvimento associado à alta resistência térmica dos esporos, que em
algumas espécies, ainda são viáveis mesmo depois de tratamentos térmicos como a
pasteurização. Porém, devido ao baixo pH dos sucos ácidos, as espécies que podem
crescer em tais substratos são, principalmente, dos gêneros Clostridium, Bacillus e
Alicyclobacillus (EGUCHI et al., 1999).
Bactérias do gênero Clostridium que apresentam metabolismo fermentativo e
formam esporos resistentes ao calor representam um grupo de organismos
potencialmente deterioradores e também algumas espécies são de risco para a saúde
pública (EIROA, 1999). Espécies associadas a alimentos ácidos incluem Clostridium
pasteurianum que cresce a pH 3,8 a 5,0 e Clostridium butyricum que cresce a pH 3,8
a 4,0 (PIRES, 2006).
5
Espécies anaeróbias facultativas pertinentes a alimentos ácidos incluem:
Bacillus coagulans, B. licheniformes, B. mascerans, B. polymyxa (EGUCHI et al.,
1999). No gênero Bacillus, as espécies de maior importância são B.
stearothermophilus (termófilas e deterioradoras de alimentos de baixa acidez) e B.
coagulans (termófilas e cresce em alimentos com valores mínimos de pH entre 4,0 e
5,0) que freqüentemente acidificam produtos a base de tomate (suco, pasta) e frutas
enlatadas por meio de fermentação chamada “flat sour” (PIRES, 2006).
Outro importante microrganismo termoacidófilo formador de esporos é o
Alicyclobacillus que está associado com a deterioração de sucos de frutas ácidas,
conservas, refrigerantes e bebidas isotônicas (YAMAZAKI et al., 1996).
Atualmente, este gênero envolve várias espécies: A. acidoterrestris, A.
acidocaldarius, A. cyclohepetanicus, A. hesperidium, A. sendaiensis, A. acidiphilus,
A. mali, A.vulcanalis, A. pomorum, A. herbarius. A. acidoterrestris tem sido
considerado indicador microbiológico da qualidade de sucos de frutas. (PEÑA,
2005).
2.2. Alicyclobacillus e a deterioração de sucos de frutas
A deterioração de sucos de frutas devido a produção de “off-flavor” e
mudanças na coloração por A. acidoterrestris e A. acidocaldarius foi descrita por
Chen et al. (2006). A primeira ocorrência de deterioração de suco de fruta causada
por um microrganismo acidófilo formador de esporo foi relatada em suco de maçã
(pH 3,15), envasado assepticamente na Alemanha em 1982 (CERNY et al., 1984). O
microrganismo deteriorador foi inicialmente classificado como Bacillus
acidoterrestris, mas, posteriormente, a bactéria foi reclassificada no gênero
Alicyclobacillus (WISOTZKEY et al., 1992).
Em 1994, Splittstoesser e colaboradores isolaram estirpes de Bacillus acidófilos
em suco de maçã industrializado e envasado a quente. Os sucos apresentaram “off-
flavor”, leve turbidez e ausência de formação de gás. Mcintyre et al. (1995) isolaram
Bacillus acidófilos esporulados de suco reconstituído e envasado a quente, sendo
estas bactérias isoladas da água utilizada no preparo dos sucos. Previdi et al. (1995)
caracterizaram, na Itália, estirpes de bactéria esporulada acidófila isolada de suco de
laranja não deteriorado, que mostraram características similares com as de A.
6
acidoterrestris. No Brasil, Pinhatti et al. (1997) enumeraram até 1,8 x 10
2
UFC/mL
de Alicyclobacillus em amostras de concentrado de laranja. Eiroa et al. (1999)
detectaram ocorrência de 14,7% de Alicyclobacillus em suco concentrado de laranja
em um total de 75 amostras analisadas. Recentemente, Mcknight (2003) indicou a
presença de esporos de A. acidoterrestris em 28% das 57 amostras de suco de
maracujá comercial analisadas, sendo que a contaminação variou de 1,1 a maior do
que 23 NMP/100 mL. Esse mesmo autor não verificou a presença desta bactéria em
suco de abacaxi.
Segundo Chang e Kang (2004), o conteúdo de sólidos solúveis em sucos de
frutas é um importante fator para o crescimento de Alicyclobacillus. O crescimento é
inibido quando o conteúdo de açúcar nas amostras excede 18 °Brix. Além disso,
Splittstoesser et al. (1998) observaram que compostos fenólicos inibem o
crescimento desse microrganismo, uma vez que sucos de uva vermelha
apresentaram-se mais inibitórios que os sucos de uva branca. O crescimento de
Alicyclobacillus é inibido quando a concentração de etanol excede 6%. Esse fato
evita que os vinhos de mesa sejam deteriorados, embora determinadas cidras possam
ser susceptíveis à formação de “off-flavor” (SPLITTSTOESSER et al., 1998).
A deterioração de sucos a base de frutas por Alicyclobacillus tem sido
caracterizada pelo desenvolvimento de odor descrito como anticéptico, desinfetante
ou medicinal, embora muitas vezes o odor produzido pela deterioração seja pouco
perceptível (EGUCHI et al., 2001; MURRAY et al., 2007). As características típicas
de deterioração por esta bactéria geralmente são relatadas como sabor desagradável,
eventual aumento na turbidez do suco e presença ou não de sedimentos no interior da
embalagem (YAMAZAKI et al., 1996; JENSEN et al., 2001).
A principal substância responsável pelo odor característico de deterioração por
Alicyclobacillus foi identificada como guaiacol (2-metoxifenol) (SPLITTSTOESSER
et al., 1998), podendo ser produzida a partir do aminoácido vanilina (YAMAZAKI et
al,, 1996) ou do aminoácido tirosina (JENSEN et al., 2001). Segundo Niwa e
Kuriyama (2003), o guaiacol se forma a partir de ácido ferúlico em sucos de frutas,
via vanilina e ácido vanílico.
Segundo Pettipher et al. (1997) e Orr et al. (2000), concentrações de 2 ng/mL
de guaiacol podem ser detectadas por medições sensoriais em suco de frutas. Em
suco de maçã e laranja a presença de guaiacol foi detectada quando
7
aproximadamente 10
5
UFC/mL de A. acidoterrestris estavam presentes no suco.
EGUCHI et al. (2001) demonstraram, por meio de análise sensorial, pequena
diferença em relação ao odor para concentrações de 10
2
esporos/mL quando
comparado com suco não inoculado, sendo o odor mais intenso para concentrações
de 10
3
esporos/mL de Alicyclobacillus.
Outra substância a qual também é atribuída à formação de odor desagradável
nos sucos deteriorados por Alicyclobacillus é o 2,6 dibromofenol. Jensen (1999)
detectou a presença desta substância em sucos de frutas contaminados por
Alicyclobacillus. No entanto, até então, a detecção de halofenóis em sucos tinha sido
atribuída à contaminação por agentes sanificantes e não havia sido relacionada com
uma contaminação microbiana.
Sucos de frutas não são os únicos alimentos deteriorados que apresentam
concentrações detectáveis de guaiacol e a presença deste composto também é
determinada em vinhos (ÀLVAREZ-RODRÍGUEZ et al, 2003), em leites
achocolatados, iogurtes e sorvetes deteriorados (JENSEN et al., 2001).
Álvarez-Rodriguez et al. (2003), em estudo com microrganismos isolados de
cortiça utilizada para o engarrafamento de vinho, observou a produção de guaiacol
por quatro diferentes espécies bacterianas, sendo um isolado de Bacillus subtilis e
três isolados de Streptomyces. Essa pesquisa demonstrou que outros microrganismos,
além de A. acidoterrestris, produzem guaiacol. Recentemente, foi comprovada a
produção de guaiacol por outra espécie de Alicyclobacillus, A. acidiphilus, indicando
que os estudos sobre a deterioração de produtos ácidos devem ser direcionados a
outras espécies de Alicyclobacillus (CHANG e KANG, 2004).
Segundo Matsubara (2002), o gênero Alicyclobacillus spp. abrange
microrganismos heterotróficos isolados de diferentes ambientes, incluindo locais
geotérmicos, solo e alimentos processados termicamente. Até 1994, as espécies de
Alicyclobacillus foram classificadas no gênero Bacillus e foram denominadas
Bacillus acidocaldarius (DARLAND e BROCK, 1971), Bacillus acidoterrestris
(DEINHARD et al., 1987a) e Bacillus cycloheptanicus (DEINHARD et al., 1987b).
No entanto, análises comparativas do rDNA 16S e do perfil de ácidos graxos de
membrana demonstraram que estas espécies eram suficientemente diferentes de
outras espécies de Bacillus, justificando a reclassificação em um novo gênero
(WISOTZKEY et al., 1992).
8
As espécies mais estudadas desse gênero são: A. acidocaldarius que se
caracteriza por bastonetes aeróbios, gram-positivos, formadores de endosporos, com
2 a 3 µm de comprimento e 0,7 a 0,8 µm de largura. Os endosporos são terminais ou
subterminais, possuindo elevada resistência ao calor. As colônias são planas com
bordas irregulares não pigmentadas. O ácido graxo predominante na membrana é o
ω-cyclohexil, sendo que o ω-cyclohexil-undecanoico (C:17) e o ω-cyclohexil-
tridecanoico (C:19) contribuem com o 50% do total de ácidos graxos da membrana.
A faixa de temperatura para o crescimento varia de 45 a 70 ºC, e o pH ótimo de
crescimento varia de 2,0 a 7,0 (DARLAND e BROCK, 1971).
A espécie A. cycloheptanicus é caracterizada por apresentar bastonetes
aeróbios gram-positivos e formar endosporos subterminais. O tamanho da célula é de
2,5 a 4,5 µm de comprimento e 0,35 a 0,55 µm de largura. Os esporos são ovais e as
colônias são circulares e pequenas. As células requerem fatores para o crescimento
tais como metionina, isoleucina e vitamina B12. O principal ácido graxo da
membrana celular é o ácido graxo ω-cycloheptil-undecanoico, ω- cycloheptil-
tridecanoico e o ácido ω-cycloheptil-a-hidroxi-undecanoico. A faixa de temperatura
para o crescimento varia de 40 a 53 ºC, e o pH ótimo de crescimento varia de 3,0 a
5,5 (DEINHARD et al., 1987b).
A. acidoterrestris são bastonetes aeróbios gram-positivos, formadores de
endosporos terminais ou subterminais, cujo tamanho varia de 2,9 a 4,3 µm de
comprimento e 0,6 a 0,8 µm de largura. Os esporos são ovais e as colônias são
circulares, de coloração creme-clara, opacas a translúcidas. Não requerem nenhum
fator de crescimento (DARLAND e BROCK, 1971; DEINHARD et al., 1987;
YAMAZAKI et al., 1996). A temperatura ótima de crescimento está em torno de 42
a 53 ºC, porém, algumas estirpes podem crescer em temperaturas ótimas de
aproximadamente 37ºC.
A. acidoterrestris é uma bactéria termoacidófila, formadora de esporos, não
patogênica, isolada de diferentes ambientes. Estirpes de A. acidoterrestris tem sido
isoladas geralmente de solos de fazendas, florestas, jardins e sucos de frutas
deteriorados (MATSUBARA et al., 2002). A espécie A. acidoterrestris possui como
componente principal da membrana celular ácidos graxos ω-ciclohexano
(DARLAND e BROCK, 1971; DEINHARD et al., 1987; YAMAZAKI et al., 1996;
TERRANO et al., 2005). A presença destes ácidos graxos parece estar relacionada
9
com a resistência às condições ácidas e às altas temperaturas, o que contribui para a
sobrevivência das células sob condições extremas (CHANG e CANG, 2004;
TERRANO et al., 2005). Outra característica importante desse microrganismo é que
a MK-7 é a principal menaquinona envolvida na cadeia transportadora de elétrons,
porém, a presença de MK-6 também já foi descrita (DEINHARD et al., 1987a). A
parede celular contém o ácido meso-diaminopimélico como principal diaminoácido.
Os resultados da análise de similaridade do rDNA 16S na estirpe DSM 3922
(=ATCC 4380) indicaram relação filogenética próxima com A. acidocaldarius e o
conteúdo G + C entre 51,6 e 53,3 mol% (determinado pelo método da desnaturação
térmica) (DARLAND e BROCK, 1971; YAMAZAKI,et al., 1996). Em relação às
características bioquímicas, destaca-se a não produção de indol e dihidroxiacetona e
a reação de Voges-Proskauer negativa ou variável. Também foi observado que A.
acidoterrestris não cresce na presença de 5% de NaCl (CHANG e KANG, 2004).
Os esporos do A. acidoterrestris apresentam alta resistência a meios ácidos e
temperaturas de pasteurização comumente aplicados durante o processamento de
sucos de frutas e vegetais, sucos concentrados e purês, chá, xarope de açúcar e
produtos com baixo pH (MURRAY, 2007). Trabalhos anteriores indicaram que A.
acidoterrestris é capaz de crescer em valores de pH que variam de 2,2 a 6,0 (CERNY
et al., 1984, DEINHARD et al., 1987a, YAMAZAKI, 1996, TERRANO et al., 2005)
com faixa ótima entre 3,5 a 5,0 (PINHATTI et al., 1997).
A extrema resistência aos tratamentos térmicos por endosporos bacterianos é de
grande interesse para a conservação de alimentos. Os esporos são metabolicamente
dormentes e resistentes a condições ambientais extremas de calor, frio, dessecação,
escassez de nutrientes, radiação e exposição a agentes químicos tóxicos (SETLOW,
2003). A resistência térmica de esporos bacterianos depende da espécie, do meio e da
temperatura na qual o esporo foi produzido. Esta resistência ao calor tem sido
associada com a desidratação do núcleo do esporo, a mineralização das camadas que
formam a parede do esporo e a adaptação térmica (SPINELLI, 2006).
O ácido dipicolínico (DPA), que não é encontrado na célula vegetativa, foi
associado com a elevada resistência térmica dos esporos bacterianos, especialmente
na forma do complexo cálcio-dipicolinato. Por outro lado, a liberação de DPA e de
cálcio durante a germinação dos esporos coincide com a perda da resistência térmica
(SPINELLI, 2006). Além disso, pequenas proteínas ácidos solúveis (SASP) do tipo
10
a/b são encontradas nos esporos associadas com o DNA. Essas proteínas previnem a
desnaturação dos ácidos nucléicos e contribuem para a resistência ao calor
(NAKASHIO e GERHARDT, 1985).
As SASP estão localizadas no citoplasma do núcleo do esporo, o qual apresenta
conteúdo de água reduzido em relação à célula vegetativa. A desidratação do núcleo
do esporo é o principal fator que contribui para a elevada resistência térmica dos
endosporos (NAKASHIO e GERHARDT, 1985). Além disso, a mineralização do
núcleo do endosporo com cátions divalentes, como magnésio (Mg
+2
), manganês
(Mn
+2
) ou cálcio (Ca
+2
), aumenta a resistência dos esporos ao calor, enquanto a
desmineralização dos mesmos causa redução da resistência térmica (CHANG e
KANG, 2004). Entretanto, quando Yamazaki et al. (1997) estudaram a influência do
meio de esporulação e íons divalentes na resistência térmica de esporos de A.
acidoterrestris, não houve diferença na resistência térmica de esporos submetidos a
desmineralização seguida da remineralização com cálcio. Além disso, o conteúdo de
Ca
2+
e Mn
2+
dos esporos foi pouco alterado, o que indicou que a presença dos íons
divalentes contribui para resistência térmica elevada.
Estudos de condutividade mostraram que os cátions divalentes encontram-se
imobilizados no esporo dormente (CARSTENSEN, MARQUES, GERHARDT,
1971). Assim, a manipulação da carga de cátions pode alterar a resistência do esporo.
Depois de uma prolongada incubação a baixo pH os cátions são progressivamente
eliminados do esporo, resultando em redução da resistência térmica; porém este
fenômeno pode ser reversível com a restauração parcial ou completa da resistência
dos esporos por meio de uma incubação prolongada com elevada concentração de
sais e em pH alcalino (GOMBAS, 1987).
O valor D (tempo necessário para reduzir a população de esporos viáveis em
90% a uma dada temperatura) dos esporos é geralmente baixo quando estes são
aquecidos sob condições ácidas, possivelmente por danos causados no DNA (SAKO
et al., 1981). A resistência térmica dos esporos pode ser afetada por tratamentos
como a sonicação (GOMBAS, 1983) ou radiação ionizante e acidificação, quando
aplicados antes ou simultaneamente com o processo térmico. Doses moderadas de
radiação ionizante podem causar diminuição no valor D, enquanto o tratamento
combinado com radiação e calor pode resultar na inativação sinergística dos esporos
(GOMBAS; 1983).
11
A resistência térmica de A. acidoterrestris pode está relacionada à presença do
ácido graxo com radical ω-ciclohexil na membrana celular desta bactéria, o que
contribui para sua sobrevivência a baixos valores de pH e altas temperaturas
(MCKNIGHT, 2003). Silva et al. (1999) avaliaram a influência do pH (2,5 a 6,0),
dos elementos sólidos solúveis (5 a 60 ºBrix) e da temperatura (85 ºC a 97 ºC) na
resistência térmica de esporos de A. acidoterrestris e notaram aumento do valor D
quando concentração de sólidos solúveis (°Brix) aumentou. A resistência ao calor de
A. acidoterrestris foi afetada principalmente pela temperatura, seguida pelo Brix e
pelo pH. Os valores D decresceram com o aumento da temperatura e a diminuição do
Brix e do pH. Tais resultados indicaram que a inativação dos esporos em suco
concentrado (alto Brix) é mais difícil do que em suco pronto para beber (baixo Brix).
Eiroa et al. (1999) determinaram a resistência térmica de esporos de A.
acidoterrestris em suco de laranja. Os autores demonstraram que a melhor
combinação tempo e temperatura usada para ativar os esporos foi de 70 ºC por 20
minutos. Os esporos demonstraram alta resistência ao calor com valores D variando
de 60,8 a 94,5 min a 85 ºC, 10 a 20,6 min a 90 ºC e 2,5 a 8,7 min a 95 ºC. A elevada
resistência ao calor dos esporos indica que estes representam risco para a
deterioração de sucos pasteurizados, envasados a quente e UHT (Ultra High
Temperature).
A pasteurização aplicada aos sucos de frutas, geralmente na faixa de 85 a 95 °C
é um processo que previne o crescimento de microrganismos deterioradores e
elimina grande parte dos patogênicos (PONTIUS et al., 1998). Contudo, os sucos de
frutas são susceptíveis a bactérias esporuladas acidofilicas como o A. acidoterrestris
(EIROA et al., 1999). Assim, seriam necessárias temperaturas de 102,1 ºC por 36
segundos reduzir três ciclos logarítmicos de A. acidoterrestris (MCKNIGHT, 2003).
No entanto, os fatores de qualidade como: cor, sabor, textura e nutrientes são mais
termossensíveis do que os próprios microrganismos, o que dificulta a utilização de
métodos de processamento térmico mais drásticos. Neste caso, torna-se necessário
aliar ao tratamento térmico mais brando, outros processos de controle da deterioração
causada por esse microrganismo (SILVA et al., 2003).
Examinando o efeito de alguns ácidos orgânicos no crescimento de A.
acidoterrestris, Yamazaki et al. (1997) constataram que o ácido láctico e o ácido
succínico foram inicialmente inibitórios. Porém, após 36 horas, cessou a inibição e a
12
população bacteriana voltou a crescer, tornando-se semelhante à população
alcançada no cultivo controle, ou seja, na ausência de ácido láctico e ácido succínico.
A maior inibição do crescimento de A. acidoterrestris foi observada com 0,1% de
ácido acético. Os resultados indicaram que os produtos contendo ácido acético, a
exemplo de molhos de saladas, não são facilmente deterioradas por esta bactéria. No
entanto, produtos à base de outros ácidos podem ser ineficazes na prevenção do
crescimento de A. acidoterrestris.
Cerny et al. (2000) estudaram a influência da temperatura do potencial de
oxido redução e do conteúdo de oxigênio no crescimento de A. acidoterrestris em
suco de frutas. A 46 ºC o crescimento foi mais rápido do que a 35 ºC. A 30 ºC
observou-se uma longa fase lag, prolongando-se quando estocados sob refrigeração
por várias semanas. O efeito do potencial redox foi avaliado pela adição de ácido
ascórbico, testado a 35 ºC. Com a adição de 10 mg de ácido ascórbico o crescimento
foi estimulado, entretanto, quando se utilizou concentrações de 15 mg o crescimento
foi inibido. Em suco de laranja, 0,1% de oxigênio residual na embalagem foi
suficiente para permitir o crescimento da bactéria, sendo que o mesmo não ocorreu
em condições anaeróbias; já em suco de maçã, concentrações de oxigênio residual de
3 a 7% permitiram crescimento rápido, similar ao observado na presença de 21% de
oxigênio.
Doyle (1999) reportou o efeito de vários desinfetantes sobre esporos de A.
acidoterrestris expostos a 23 ºC durante 10 minutos, observando-se reduções
logarítmicas de 2,4 a 0,4 quando utilizou-se 1% de H
2
O
2
, 200 ppm Cl
2
, e 500 ppm de
cloreto de sódio acidificado, sendo menos efetiva a exposição da bactéria em 8% de
fosfato trisódico e 80 ppm de H
2
O
2
em ácido peracético. Quando foram utilizados
500 ppm de Cl
2
e 1200 ppm de cloreto de sódio acidificado em superfícies de maçãs
contendo esporos de A. acidoterrestris, observou-se redução de menos de um ciclo
logarítmico na viabilidade celular. O tratamento com 2% H
2
O
2
foi ineficiente para
inativar esporos remanescentes da superfície das maçãs. A inativação de células
vegetativas de A. acidoterrestris por tratamento com alta pressão foi realizada por
Alpas, Alma e Bozoglu (2003), obtendo-se redução superior a quatro ciclos log em
suco de maçã, laranja e tomate, quando aplicado 350 MPa a 50 ºC por 20 minutos.
Outro importante método de controle que é utilizado para prevenir a
deterioração de alimentos por A. acidoterrestris são as bacteriocinas. Bactérias do
13
ácido láctico produzem bacteriocinas que compreendem um amplo e diverso grupo
de peptídeos antimicrobianos sintetizados ribossomicamente. Estas possuem efeito
bactericida ou bacteriostático, agindo principalmente sobre bactérias gram-positivas
(LÜCKE, 2000; CLEVELAND et al., 2001). Segundo Yamazaki et al. (2000), a
capacidade da nisina em inibir o crescimento de células vegetativas e, os esporos de
A. acidoterrestris, aumentou com a diminuição do pH. O uso de nisina na prevenção
da germinação dos esporos e na redução da resistência térmica de A. acidoterrestris
em bebidas ácidas indica o potencial de aplicação das bacteriocinas no controle desta
bactéria.
2.3. Bacteriocinas e Mecanismo de ação
Segundo Bruno e Montville (1994) e Eijsink et al. (1996), as bacteriocinas são
peptídeos biologicamente ativos e exibem propriedades antimicrobianas contra
espécies intimamente relacionadas com o organismo produtor. Podem apresentar
efeito bactericida ou bacteriostático, dependendo da concentração e apresentam
pequeno ou amplo espectro de ação. Têm sua produção mediada por genes
localizados em plasmídeos ou no cromossomo e o peptídeo ativo pode interagir com
sítios de ligação específicos ou inespecíficos localizados na membrana da bactéria
sensível. Em geral, atuam sobre a membrana plasmática, causando dissipação do
gradiente eletroquímico em células sensíveis.
Bactérias lácticas caracterizam-se como cocos ou bastonetes gram-positivos,
não esporulantes que produzem ácido láctico como produto principal da fermentação
de carboidratos (ABEE, 1995). Muitas espécies de bactérias lácticas (Lactobacillus,
Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc), utilizadas na produção de
alimentos fermentados, têm apresentado antagonismo contra outras bactérias
filogeneticamente relacionadas e contra patógenos (MCMULLEN & STILES, 1996).
Segundo Klaenhammer (1993), as bacteriocinas de bactérias lácticas podem ser
divididas em quatro classes, de acordo com as propriedades estruturais e físico-
químicas. As bacteriocinas da classe I e II, as mais conhecidas, apresentam massa
molecular inferior a 10 kDa e termoestabilidade. As das classes III e IV não são bem
conhecidas, mas apresentam massa molecular superior a 30 kDa; são termolábeis e
14
podem ser proteínas hidrofílicas ou complexos formados por proteínas, fosfolipídios
e/ou carboidratos.
Atualmente, uma nova classificação proposta por Cotter et al. (2005) divide as
bacteriocinas em duas categorias distintas. A classe I inclui os peptídeos que contêm
anéis de lantionina em sua estrutura (lantibióticos), enquanto a classe II abrange as
bacteriocinas que não passam por modificação pós-traducional. As bacteriolisinas
(agrupadas na classe III) formam um grupo à parte devido ao mecanismo de ação
distinto das demais classes, o qual envolve a hidrólise da parede celular bacteriana.
Os estudos sobre o mecanismo de alguns lantibióticos e pequenos peptídeos
termoestáveis revelam que a ação das bacteriocinas ocorre na membrana
citoplasmática (MONTVILLE & CHEN, 1998, DELVES-BROUGHTON, 2005).
Dependendo de sua concentração, as bacteriocinas são bactericidas ou
bacteriostáticas e atuam permeabilizando as membranas de células sensíveis por
meio da formação de poros, o que resulta no efluxo de íons, dissipação da força
próton-motiva (PMF), hidrólise de ATP e eventual perda de viabilidade e lise celular
(BRUNO & MONTVILLE, 1994; ENNAHAR et al., 2000).
A primeira fase na formação de poros pela bacteriocina envolve interações
eletrostáticas entre as cargas positivas e os grupos polares dos resíduos de
aminoácidos da bacteriocina com os fosfolipídios aniônicos presentes na membrana
citoplasmática da célula alvo. Nesta fase, a bacteriocina é sensível à ação de enzimas
proteolíticas. A segunda fase é irreversível e envolve mudanças letais na membrana
das estirpes sensíveis à bacteriocina (CHIKINDAS et al., 1993; ABEE et al., 1995,
ENNAHAR et al., 2000).
De acordo com Lücke (2000), as bactérias gram-negativas são menos
suscetíveis à ação de bacteriocinas das bactérias do ácido láctico devido à presença
da membrana externa que limita o acesso dos peptídeos ao sítio alvo. O tratamento
de culturas gram-negativas com agentes quelantes que permeabilizam a membrana
externa, o aquecimento ou congelamento em níveis subletais ou o uso de alta pressão
pode sensibilizar bactérias gram-negativas, como Salmonella, à ação de
bacteriocinas. Além disso, as bactérias gram-negativas são mais sensíveis aos ácidos
orgânicos produzidos pelas bactérias lácticas em comparação com as bactérias gram-
positivas (ENNAHAR et al., 2000).
15
Segundo Cotter et al. (2005), apenas a nisina e a pediocina PA-1 são
comercialmente produzidas, apesar de existirem várias outras bacteriocinas com
potencial para serem utilizadas na preservação de alimentos. A nisina era a única
bacteriocina testada na preservação de sucos de frutas e bebidas contendo esporos de
Alicyclobacillus. Estudos recentes demonstraram que outras bacteriocinas, além da
nisina, podem ser utilizadas na preservação de alimentos ácidos. Por exemplo,
enterocina AS-48, produzida por Enterococcus faecalis, mostrou-se capaz de inativar
endosporos de A. acidoterrestris em diferentes sucos de frutas (GRANDE et al.,
2005).
Outra bacteriocina considerada para este propósito é a bovicina HC5, uma
bacteriocina produzida por Streptococcus bovis, mostrou ser efetiva em inibir
bactérias deterioradoras de polpa de fruta e que apresentou atividade esporicida
contra endosporo de A. acidoterrestris inoculados em polpa de manga (De Carvalho
et al., 2008). Além disso, a atividade inibitória de bovicina HC5 já foi demonstrada
contra diversos microrganismos, tais como Clostridium aminophilum
(MANTOVANI e RUSSELL, 2002) Clostridium sporogenes (FLYTHE e
RUSSELL, 2004) e Listeria monocytogenes (MANTOVANI e RUSSELL, 2003).
2.4. Nisina
A bacteriocina mais estudada e empregada na preservação de alimentos é a
nisina, produzida por certas estirpes de Lactococcus lactis ssp lactis, e reconhecida
pelo FDA (Food and Drug Administration) desde 1989 como substância GRAS
(Generally Recognized as Safe) para utilização em alimentos. Estudos toxicológicos
realizados com nisina demonstraram que a ingestão da bacteriocina não apresentou
efeitos tóxicos para o organismo humano (CARR et al., 2002; DELVES-
BROUGHTON, 2005).
O uso da nisina é permitido em queijos pasteurizados para prevenir o
crescimento indesejável de Clostridium botulinum, sendo também utilizada em leites
não fermentados, frutas enlatadas, vegetais, carnes, pescado e cerveja, na proporção
de 500 a 10.000 IU por grama de alimento. Nisina tem sido indicada para preservar o
aroma dos alimentos e prevenir a fermentação maloláctica precoce em vinhos quando
a fermentação alcoólica ainda não está encerrada, inibindo o crescimento de bactérias
16
lácticas contaminantes que interferem no equilíbrio de sabor, aroma e características
estéticas do vinho. A aplicação mais difundida da nisina é para o controle de esporos,
porém os mecanismos bioquímicos desta atividade ainda não foram claramente
elucidados. Seu efeito é normalmente esporostático, sendo que a atividade é maior
sob condições ácidas ou se os esporos forem previamente tratados pelo calor (CARR
et al., 2002).
Komitoupolou et al. (1999) reportaram que a nisina inibe a germinação dos
esporos. Os autores observaram que a 44
°
C, o crescimento de A. acidoterrestris
ocorreu de forma lenta e poucos esporos germinaram. Quando a concentração de
nisina utilizada foi de 100 IU/mL, a germinação dos esporos foi totalmente inibida.
De acordo com Davis et al. (1998) a estabilidade da nisina não é afetada pelas
temperaturas de pasteurização, aplicadas aos sucos de frutas com pH na faixa de 3 a
4. Yamazaki et al. (2000) monitoraram a sensibilidade de A. acidoterrestris frente a
diferentes concentrações de nisina e observaram redução de, aproximadamente, 75%
no valor de D
90ºC
dos esporos.
Peña (2005) estudou o efeito da nisina na resistência térmica de esporos de A.
acidoterrestris CRA7152 em suco concentrado de laranja (64 º Brix). Avaliou-se a
adição de 0, 50, 75 e 100 IU de nisina/mL de suco sob temperaturas de 95 e
observou-se que os valores D sem adição de nisina foram de 12,9 min. Quando
nisina foi adicionada nas concentrações de 30, 50, 75 e 100 IU/mL ao suco de fruta
processado a 95ºC houve diminuição da termoresistência dos esporos e os valores D
foram de 12,3, 11,3, 10,4, e 9,4 minutos, respectivamente. Esses resultados indicam
que a nisina pode ser considerada uma opção como coadjuvante do tratamento
térmico na redução da resistência térmica dos endosporos bacterianos.
2.5. Bovicina HC5
S. bovis HC5 é uma bactéria ruminal gram-positiva, que produz uma
bacteriocina (bovicina HC5) com amplo espectro de ação. Bovicina HC5 possui
massa molecular de aproximadamente 2440 Da, e seqüência amino terminal e
mecanismo de ação que a agrupam com os lantibióticos (MANTOVANI et al, 2002).
Bovicina HC5 possui estabilidade térmica (121
0
C por 20 min) e mostrou-se
17
resistente a tratamentos com alfa-quimiotripsina e proteinase K, além de ser estável
na presença de oxigênio.
A maior parte da bacteriocina produzida por S. bovis HC5 fica associada às
células, podendo ser liberada por tratamento com solução ácida de cloreto de sódio
(HOULIHAN et al, 2004). Bovicina HC5 age sobre a membrana plasmática das
bactérias sensíveis formando poros que causam a perda de potássio intracelular de
células energizadas com glicose (MANTOVANI et al., 2002; HOULIHAN et al.,
2004). Estas características, aliadas à similaridade com a nisina em relação ao
espectro e mecanismo de ação fazem desta bacteriocina um candidato potencial para
o controle de patógenos e bactérias deterioradoras de alimentos.
Mantovani e Russell (2003) demonstraram efeito bactericida de bovicina HC5
contra L. monocytogenes, com diminuição de 5 a 7 ciclos log no número de células
viáveis após 2 h de exposição à bacteriocina. Bovicina HC5 causou efluxo de
potássio intracelular de L. monocytogenes em apenas 15 min, quando o pH do meio
foi menor do que 6,0. Esse mesmo efeito não foi observado quando o pH do meio era
maior do que 6,0. Células de L. monocytogenes adaptadas ao ácido (pH final 4,6)
apresentaram sensibilidade à bovicina HC5 similar àquelas que não eram ácido-
adaptadas (pH final 6,3). Estes resultados sustentam a idéia de que bovicina HC5 é
efetiva no controle de L. monocytogenes .
De Carvalho et al. (2008) demonstraram atividade bactericida de bovicina HC5
contra células vegetativas de A. acidoterrestris em diferentes valores de pH e
atividade esporicida contra esporos desta bactéria inoculados em polpa de manga ou
tampão fosfato. Quando esporos de A. acidoterrestris foram tratados termicamente
na presença de bovicina HC5, os valores de D diminuíram de 77 a 95% quando
comparados aos controles em temperaturas variando de 80
0
C a 95
0
C. Esses
resultados indicam que essa bacteriocina possui potencial para reduzir a resistência
térmica dos esporos de A. acidoterrestris. Também foi reportado o efeito bactericida
desta bacteriocina contra células de B. cereus, B. thuringiensis e C. tyrobutyricum
(DE CARVALHO et al., 2007a; DE CARVALHO et al., 2007b). Esses resultados
indicam que bovicina HC5 tem potencial para prevenir a germinação de esporos de
bactérias termoacidófilas formadoras de endosporos em sucos de frutas.
18
2.6. Microscopia de Força Atômica (AFM) utilizada em análises de amostras
biológicas
A microscopia de força atômica (AFM) é uma técnica que foi desenvolvida
por Binning, Quate e Gerber em 1986, como resultado de uma colaboração entre a
IBM e a Universidade de Stanford. Essa técnica permite obter imagens reais, em três
dimensões, da topografia das superfícies, com uma resolução espacial, tanto lateral
como vertical, e visualização de superfícies em nível atômico de diferentes naturezas
tais como: metais, películas orgânicas, polímeros, amostras biológicas em sistemas
condutores e isolantes e em diversos meios, incluindo vácuo, pressão atmosférica e
meios líquidos (OHNESORGE e BINNING, 1993). O microscópio de força atômica
possibilita a observação direta da arquitetura da superfície de células e tem sido
utilizado para avaliar características da superfície de diversas moléculas biológicas
(STRAUSSER e HEATEON, 1994).
O princípio de funcionamento do AFM baseia-se na varredura da superfície
da amostra por uma ponta piramidal (ponteira) de alguns micrômetros de
comprimento (100 a 200 µm) e geralmente com menos de 20 nanômetros de
diâmetro, integrada em um cantilever (braço) flexível. À medida que a sonda (ponta
+ cantilever) se aproxima da superfície, os átomos da ponta interagem com os
átomos das moléculas da superfície do material, causando a deflexão do cantilever e
essa deflexão é proporcional à força de interação. Esta deflexão do braço do AFM é
medida por meio da mudança de direção (angular) de um feixe laser emitido por um
diodo de estado sólido e refletido pelo braço de AFM, sendo o feixe laser refletido
captado por um fotodetector. A sonda do AFM segue os contornos da superfície.
Durante o deslocamento da ponta pela superfície o computador analisa, em cada
posição na superfície, a força de interação entre a ponta de AFM e a amostra e traça
o diagrama das alturas, construindo a topografia do material analisado. A força mais
comumente associada com AFM na deflexão do cantilever é a força de van der
Waals (STRAUSSER e HEATEON, 1994).
A técnica de AFM pode ser operada em três modos diferentes: contato, não-
contato e contato intermitente ("tapping"). O modo contato intermitente é o mais
utilizado em amostras biológicas devido ao fato de que as superfícies são menos
modificadas. No modo intermitente o cantilever é mantido bem próximo da
superfície da amostra e a força interatômica entre a ponta e a amostra é atrativa.
19
Neste caso a ponta oscila em alta frequência (100 kHz a 1 MHz), a poucos
nanômetros acima da superfície e a força total entre a ponta e a amostra é muito
baixa, geralmente em torno de 10
-12
N. Esta oscilação aumenta consideravelmente a
sensibilidade do microscópio, o que faz com que forças de van der Waals e forças
eletrostáticas possam ser detectadas (BEECH et al., 2002; STRAUSSER e
HEATEON, 1994)
Os estudos com microscopia de força atômica têm trazido notáveis contribuições
à ciência, em especial à biologia, física, ciência dos materiais e microeletrônica. Em
sistemas biológicos incluindo células, bactérias, vírus e biomoléculas, isso possibilita
a compreensão dos fenômenos biofísicos e químicos, constituindo-se em mais uma
ferramenta auxiliar de análise.
Beech et al. (2002) através de imagens topográficas, utilizando o modo
intermitente, investigou a formação de biofilmes bacterianos de superfícies metálicas
em sistemas industriais. Ferreira (2002), empregou a AFM, no modo intermitente,
para obter imagens topográficas de imunoglobulinas de coelho (Ag) e o respectivo
complexo com o anticorpo (anti-IgG de coelho) imobilizado em superfície de mica
atomicamente plana. Paquim e Brett (2003), utilizaram AFM no estudo dos
processos de adsorção de moléculas de DNA na superfície de eletrodos de grafite
pirolítica altamente orientada (HOPG). Neste trabalho, a técnica de AFM foi
utilizada para avaliar a morfologia e o envelope celular de células de A.
acidoterrestris expostas a bovicina HC5 e nisina.
20
3. MATERIAL E MÉTODOS
O presente trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Microbiologia de
Anaeróbios do Departamento de Microbiologia, da Universidade Federal de Viçosa.
3.1. Microrganismo e condições de cultivo
Alicyclobacillus acidoterrestres DSMZ 2498 foi cultivado em condições
aeróbias, a 43
0
C, em meio BAM - modificado por Silva et al. (1999) - composto por
três soluções: (A) CaCl
2
.7H
2
O, 0,25 g; MgSO
4
.7H
2
O, 0,5 g; (NH
4
)
2
SO
4
, 0,2 g;
extrato de levedura, 2,0 g; glicose, 5,0 g; KH
2
PO
4
, 3,0 g; 1 L de água destilada, o pH
do meio foi ajustado para 4,0 com HCl 1N ou NaOH 1N; (B) Solução de elementos
traço SL-6 (1 mL) (ZnSO
4
.7H
2
O, 0,1 g; MnCl
2
.4H
2
O, 0,03 g; H
3
BO
3
, 0,3 g; CoCl
2
.6
H
2
O, 0,2 g; CuCl
2
.2 H
2
O, 0,01 g; NiCl
2
.6H
2
O, 0.02 g; NaMoO
4
.2H
2
O, 0,03 g; 1 L
de água destilada. (C) solução de agar 1,5%.
A solução B foi esterilizada por filtração, em membrana de poro 0,22 µm
(Milipore 67120 Molsheim, GV, França) e armazenada sob refrigeração, à 4
o
C, em
garrafas de vidro de 1000 mL. Todas as soluções foram preparadas separadamente.
As soluções A e C foram esterilizadas a 121
o
C por 15 min. Posteriormente, 1 mL/L
da solução B foi misturada a solução A. Para o preparo do meio acrescido de agar, a
solução A foi preparada em concentração dupla, adicionada com a solução B e,
quando necessário, da solução C.
21
Para constatar a pureza da cultura estoque de A. acidoterrestris DSMZ 2498
uma alçada do estoque da cultura foi retirada e estriada em placas de petri contendo
meio BAM. As placas foram incubadas por 48 horas a 43
o
C. Posteriormente,
colônias isoladas foram transferidas com alça de repicagem para caldo BAM e
incubado em agitador (New Brunswick Scientific, C24, Edison, NJ,U.S.A.) por 24
horas a 43
o
C, sob agitação de 120 rpm. Foram realizadas observações culturais das
colônias (forma, cor, tamanho), coloração diferencial de Gram e testes de catalase e
indol. As culturas puras foram mantidas congeladas a -20
o
C no meio de crescimento
com 20% de glicerol. Desses estoques foram retiradas alíquotas utilizadas em todo o
experimento. Antes de cada experimento, foi feita coloração de Gram para confirmar
a pureza da cultura.
3.2. Extração e determinação da atividade de bovicina HC5
O procedimento para extração de bovicina HC5 foi realizado conforme
Mantovani et al. (2002). Culturas de S. bovis foram cultivadas em meio basal até
atingir a fase estacionária e o pH foi ajustado para 7,0 com NaOH (1 N). Em seguida,
a cultura foi aquecida a 70 ºC por 30 min e as células foram centrifugadas à 1742 g,
15 min, 5 ºC (Sorvall
®
RT 6000 D, GMI, Minnesota, EUA). Após o descarte do
sobrenadante, o material centrifugado foi lavado com 50 mL de tampão fosfato de
sódio (5 mM, pH 6,7). As células foram ressuspendidas no mesmo volume de cloreto
de sódio (100 mM) com pH ajustado para 2,0 utilizando-se HCl (1 N). Em seguida, a
suspensão de células foi incubada por 2 h a temperatura ambiente em agitador
magnético.A suspensão de células foi então centrifugada (1742 g, 15 min, 5 ºC) e o
sobrenadante liofilizado e ressuspenso em 10 mL de tampão fosfato (5 mM, pH 2,0)
foi estocado em geladeira até se utilizado.
A atividade antimicrobiana do extrato foi analisada pelo método de difusão
em meio sólido descrito por HOOVER e HARLANDER (1993). A. acidoterrestris
DSMZ 2498 foi utilizado como microrganismo indicador. Diluições seriadas do
extrato foram realizadas em tampão fosfato de sódio pH 2,0 e alíquotas de 25 µL de
cada diluição foram aplicadas em orifícios de 5 mm de diâmetro feitos em meio
BAM contendo aproximadamente, 10
7
UFC/mL de A. acidoterrestris. As placas
foram incubadas por 24 horas a 43
o
C. A atividade de bovicina HC5 foi calculada a
22
partir do recíproco da maior diluição onde foi possível a visualização dos halos de
inibição com diâmetro maior ou igual a 5 mm (a partir da borda do orifício), sendo
expressa em unidades arbitrárias por mL (UA/mL).
3.3. Determinação da atividade da nisina
A solução de nisina (Chrisin C; CHL Hansen; 1000 UI/mg) foi preparada
diluindo-se 1 g de nisina em 10 mL de solução de 0,02 M e 0,75% de NaCl pH 2,0,
conforme descrito por Mazzotta (1997). A solução foi centrifugada a 1742 g por 10
min e o centrifugado descartado. A atividade da bacteriocina foi determinada pelo
método de diluição em meio sólido conforme descrito para a bovicina HC5 no item
3.2.
3.4. Efeito de bovicina HC5 e nisina sobre o crescimento de A. acidoterrestris
A cultura de A. acidoterrestris DSMZ 2498 foi ativada em caldo BAM,
incubado a 43
o
C por 24 horas a 120 rpm. Após incubação, foram transferidos 1,25
mL do inóculo para 50 mL de caldo BAM em frascos erlenmeyer tipo side-arms (250
mL) acrescido de 0,01; 0,1; 1; 10 e 20 UA/mL do extrato de bovicina HC5, obtido
como descrito no item 3.2, além do controle, sem adição da bacteriocina. O
crescimento foi monitorado pela leitura da densidade óptica (DO) a 600 nm
(Spectronic 20D
+
, Thermo, U.S.A.) durante 12 horas. Foi determinada a velocidade
específica de crescimento (µ,h
-1
), a duração da fase lag (h) e a densidade óptica final
(DO
600nm
) das culturas na presença das diferentes concentrações de bovicina HC5 e
nisina. Os experimentos foram realizados em triplicata e o mesmo procedimento foi
utilizado com a nisina. Os resultados apresentados representaram a média das
repetições.
3.5. Efeito de bovicina HC5 e nisina sobre a viabilidade celular de A.
acidoterrestris em tampão fosfato
A cultura de A. acidoterrestris DSMZ 2498 foi ativada em caldo BAM e
incubada a 43
o
C por 24 horas sob agitação de 120 rpm. Foram transferidos 10
7
UFC/mL para erlenmeyer (125 mL) contendo 50 mL de tampão fosfato 5 mM e pH
23
4,0 acrescido de 0,1; 1 e 10 UA/mL do extrato de bovicina HC5 ou nisina. Os frascos
foram incubados a 43 ºC por 24 horas a 120 rpm e nos tempos 0, 0,25, 0,50, 1, 2, 4,
8, 12 e 24 horas de incubação, alíquotas de 100 µL foram colhidas, diluídas
sucessivamente de 10
-1
a 10
-7
. O plaqueamento das diluições foi realizado em
triplicata, utilizando a técnica de microgotas (MORTON, 2001) onde 20 µL foram
depositados em meio BAM e incubadas a 43
0
C por 24 horas. O tratamento controle
consistiu na ausência da bacteriocina no tampão fosfato. O experimento foi realizado
duas vezes em triplicata e os resultados obtidos representam as médias das
repetições.
3.6. Efeito de bovicina HC5 e nisina sobre a viabilidade celular de A.
acidoterrestris em diferentes sucos de frutas
Os sucos utilizados neste estudo foram adquiridos em estabelecimento
comercial do Município de Viçosa e suas características descritas na Tabela 1. Para
avaliar a microbiota presente nos sucos foram inoculadas alíquotas 1% (v/v) em
tubos de ensaio contendo 5 mL de caldo BHI e em tubos contendo 5 mL de caldo
BAM e incubados por 48 horas a 43 ºC e 120 rpm. O experimento foi realizado em
triplicata para cada tipo de suco, sendo o mesmo lote comercial para cada tipo de
suco. Foram determinados os seguintes parâmetros para cada suco antes da
inoculação e a cada tempo de colheita de amostra, atividade de água (Aw) (“Aqua
Lab”, modelo Cx2- Decagon), potencial de hidrogênio (pH) (Tecnal, phmetro digital
TEC-2mp) e sólidos solúveis ( Brix) (“Hand-Held Refractometer”, modelo
137531L0/ Leica).
Inicialmente, foi avaliado o efeito do tempo de incubação com bovicina HC5
sobre a viabilidade celular de A. acidoterrestris DSMZ 2498, a cultura foi ativada em
caldo BAM e incubada a 43
o
C por 24 horas sob agitação de 120 rpm. Foram
transferidos 10
7
UFC/mL para cada erlenmeyer (125 mL) contendo 50 mL de suco
(Tabela 1) acrescido de 10; 25 e 100 UA/mL do extrato de bovicina HC5 e incubados
a 43 ºC e 120 rpm. Amostras de 100 µl foram coletadas após 0, 1, 2, 4, 8, 12 e 24
horas de incubação e submetidas a diluições seriadas sucessivas de10
-1
a 10
-7
. O
experimento foi realizado duas vezes em duplicata utilizando a técnica de microgotas
descrita no item 3.5. Tratamento controle sem a adição da bacteriocina também foi
realizado. Os resultados apresentados representam as médias das repetições.
24
A cultura de A. acidoterrestris DSMZ 2498 foi ativada em caldo BAM e
incubada a 43
o
C por 24 horas sob agitação de 120 rpm. Foram transferidas 10
7
UFC/mL para cada erlenmeyer (125 mL) contendo 50 mL de suco acrescido de 10;
20, 40, 60, 80 e 100 UA/mL do extrato de bovicina HC5 ou nisina e incubados a 43
ºC por 12 horas a 120 rpm. Alíquotas de 100 µL foram retiradas e submetidas a
diluições seriadas sucessivas de 10
-1
a 10
-7
. O plaqueamento das diluições foi
realizado duas vezes com duas repetições, utilizando a técnica de microgotas
(MORTON, 2001). Tratamentos controle sem adição de bacteriocina também foram
realizados.
Tabela 1. Características dos sucos de frutas utilizados neste estudo.
Sucos Composição* (Aw) (pH)
(Brix)
Suco de Abacaxi
Polpa de abacaxi (mínimo 50%),
água e açúcar (máximo 10%)
0,930 3,55 13,25
Suco de Laranja
Suco concentrado de Laranja,
água, açúcar e aroma natural de
laranja
0,922 3,14 13,50
Suco de Mamão
Polpa de mamão (mínimo 50%),
água e açúcar (máximo 10%)
0,937 3,44 13,00
Suco de Uva
Água, suco concentrado de uva,
açúcar e aroma natural de uva
0,935 2,78 14,00
Suco de Manga
Polpa de manga (mínimo 50%),
água e açúcar
0,926 3,72 14,00
Suco de Maçã
Suco de maçã concentrado,
água e aroma natural de maçã
0,930 3,46 12,00
* Composição segundo a descrição do rótulo do fabricante
25
3.7. Preparo da suspensão de endosporos de A. acidoterrestris
Os esporos foram obtidos segundo o método descrito por Silva et al. (1999),
com modificações. A cultura foi incubada a 45 ºC por cinco dias sob agitação 120
rpm e posteriormente foi refrigerada a 4
o
C por dois dias. Lâminas foram então
preparadas para a observação microscópica após coloração dos esporos utilizando
corante verde malaquita (BRASIL, 2003). Quando constatou-se que 80 a 90% da
cultura estava esporulada , realizou-se a centrifugação da cultura a 9000 g por 10
min, a 5 ºC (Sigma CE, 4K15, D-37520, Germany). O sobrenadante foi descartado e
o material centrifugado foi ressuspenso em 20 mL de tampão fosfato (pH 4,0). A
suspensão obtida foi então incubada em banho-maria (Thermomix BMS, D-34209,
Melsugen, Germany) a 80 ºC, por 10 minutos, para inativação das células vegetativas
e ativação dos esporos. Após o tratamento térmico a suspensão de esporos foi
centrifugada por três vezes consecutivas (9000 g, 10 min, 5 ºC) e o sobrenadante
descartado. O centrifugado foi ressuspendido em 10 ml de tampão fosfato pH 4,0 e
estocado a 4
o
C. A enumeração dos esporos foi realizada por meio da contagem do
número de colônias viáveis em meio BAM.
3.8. Determinação do valor D de esporos de A. acidoterrestris em diferentes
sucos de frutas
Para determinação do valor D dos endosporos de A. acidoterrestris foi utilizada
a temperatura de 90 ºC, que representa um valor médio de temperatura utilizada no
processamento térmico de diferentes sucos de frutas. Foram inoculados 10
9
esporos/mL em tubos de aço inoxidável AISI 304 de 7,4 mm x 127 mm com paredes
de 0,25 mm de espessura contendo em 5 mL de cada suco (Tabela 1). Cada tubo foi
adicionado com 80 UA/mL (concentração final) de bovicina HC5 ou nisina, que
corresponde a uma concentração de bacteriocina capaz de inibir completamente o
crescimento de A. acidoterrestris em meio de cultura. Os tubos foram incubados em
banho-maria a 90 ºC e determinou-se o lag térmico para que o centro do tubo
atingisse a temperatura desejada. Foram plaqueadas para os controles as diluições 10
-
1
a 10
-6
de todos os tempos amostrados, enquanto para os tratamentos com
bacteriocina foram plaqueadas as diluições 10
-1
a 10
-6
nos tempos de 30 e 60
26
segundos e 10
0
a 10
-5
nos tempos de 90, 120 e 180 segundos. O plaqueamento foi
feito pela técnica de microgotas conforme descrito previamente no item 3.5. As
placas foram incubadas em duplicatas a 43 ºC por 48 horas.
As curvas de sobrevivência foram traçadas utilizando o número de esporos
sobreviventes na presença ou ausência de bovicina HC5 ou nisina. Os dados foram
ajustados por regressão linear segundo a equação logN = logN
0
– bt, em que N
corresponde ao número de sobreviventes; N
0
, número inicial de esporos; t, tempo de
exposição à temperatura de tratamento e b, coeficiente angular para curva de
sobreviventes reduzirem um ciclo logarítmico. O valor de D foi calculado plotando-
se o log do número de sobreviventes versus o tempo, sendo D = 1/b, o inverso do
coeficiente angular da curva de sobrevivência.
3.9. Análise da morfologia e do envelope celular de A. acidoterrestris tratado
com bovicina HC5 e nisina
O efeito de bovicina HC5 e nisina sobre a morfologia e o envelope celular de
A. acidoterrestris foi determinado por microscopia de força atômica (AFM) (NT-
MDT, Ntegra Prima, Rússia) utilizando-se microscópio de Força atômica do
Laboratório de Nanoscopia do Departamento de Física da UFV.
Para o preparo das amostras, as culturas de A. acidoterrestris DSMZ 2498
foram previamente ativadas em 50 mL de caldo BAM, centrifugadas a 1742 g por 10
min e lavadas com tampão fosfato pH 4,0 por três vezes consecutivas.
Posteriormente, o centrifugado foi ressuspendido em 10 mL de tampão fosfato (pH
4,0) na ausência ou presença de bovicina HC5 ou nisina (10 UA/mL) e incubados por
até 24 horas a 43 ºC e 120 rpm. Alíquotas de 500 µL foram retiradas após 2, 4, 8 e 24
horas de incubação. As amostras foram centrifugadas, o sobrenadante foi descartado
e as células foram espalhadas em lâminas de vidro (1 cm x 1cm) utilizando alça de
repicagem. Todo o procedimento foi realizado assépticamente. As medidas de
topografia das amostras de A. acidoterrestris DSMZ 2498 foram realizadas
utilizando-se o modo intermitente, no qual a ponta do microscópio apresenta contato
intermitente com a superfície da amostra, o que minimiza o risco de deformação da
amostra e permite uma maior resolução lateral.
27
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Efeito de bovicina HC5 e nisina sobre o crescimento de A. acidoterrestris
A. acidoterrestris cresceu em caldo BAM, com velocidade específica de
crescimento de 0,62 h
-1
atingindo DO
600nm
de 1,00 após 12 h de incubação (Tabela
2). A adição de bovicina HC5 ao meio de cultura reduziu a velocidade específica de
crescimento e a DO máxima mensurada, sendo que na presença de 1 UA/mL houve
redução de 27% na velocidade específica de crescimento e aumento de quatro horas
na fase lag (Tabela 2, Figura 1). Quando bovicina HC5 foi utilizada nas
concentrações de 10 e 20 UA/mL o crescimento de A. acidoterrestris foi
completamente inibido, mesmo quando as culturas foram incubadas por um período
de 10 dias.
Resultados semelhantes foram obtidos quando as culturas foram tratadas com
nisina. Na concentração de 0,1 UA/mL houve redução de 16% na velocidade
específica de crescimento e de aproximadamente 6% na DO
600nm
após 12 h de
incubação, com aumento da fase lag em 2 horas (Tabela 2). Entretanto, quando foi
adicionado 1 UA/mL de nisina o crescimento foi inibido por um período de
incubação maior que 12 horas. Nas concentrações de 10 e 20 UA/mL houve inibição
do crescimento por um período maior do que 96 e 240 horas de incubação,
respectivamente (Tabela 2).
28
0
0,4
0,8
1,2
024681012
Densidade óptica
(DO 600nm)
Tempo (h)
b
0
0,4
0,8
1,2
024681012
Densidade óptica
(DO600nm)
Tempo (h)
a
Figura 1. Efeito de diferentes concentrações de bovicina HC5 (a) e de nisina (b) no
crescimento de A. acidoterrestris em caldo BAM. Células em fase estacionária
(aproximadamente 10
7
UFC/mL) de A. acidoterrestris foram inoculadas em
caldo BAM na ausência e presença de bovicina HC5 nas concentrações de 0,01
UA/mL (quadrado fechado), 0,1 UA/mL (triângulo fechado), 1 UA/mL (losango
fechado), 10 UA/mL (retângulo fechado) e 20 UA/mL (círculos fechados). Os
controles sem bacteriocina também são mostrados (círculos abertos). O
crescimento foi monitorado pela leitura da DO a 600 nm por 12 horas de
incubação.
29
Tabela 2. Efeito de diferentes concentrações de bovicina HC5 e nisina sobre o
crescimento de A. acidoterrestris em caldo BAM a 43
o
C e 120 rpm
(-) Não houve crescimento
Nd – não determinado
Esses resultados indicam que A. acidoterrestris é sensível a bovicina HC5 e
nisina e que as bacteriocinas apresentam efeito similar sobre o crescimento de A.
acidoterrestris. Bovicina HC5 possui mecanismo de ação similar a nisina e a
atividade inibitória dos lantibióticos tem sido relacionada com efeitos sobre a
permeabilidade da membrana plasmática. A possível perda de metabólitos
intracelulares (p.ex. potássio) por A. acidoterrestris diminui a eficiência metabólica
da bactéria e, conseqüentemente, a velocidade específica de crescimento e o
rendimento de biomassa (MANTOVANI e RUSSELL, 2003). Em altas
concentrações, a célula provavelmente encontra-se depletada de ATP e perde
viabilidade.
Entretanto, observou-se crescimento de A. acidoterrestris após 96 horas de
incubação quando se utilizou a nisina na concentração de 10 UA/mL, sendo que o
mesmo não foi observado com concentrações equivalentes de bovicina HC5. Estes
resultados sugerem que A. acidoterrestris pode se adaptar à nisina ou que uma
subpopulação de células resistentes foi selecionada durante a incubação com nisina.
Mecanismos de adaptação ou resistência a nisina foram anteriormente reportados
para bactérias sensíveis, tais como L. monocytogenes, C. botulinum, (MAZZOTTA e
µ (h
-1
) Fase Lag (h) DO
600nm
Concentração da
bacteriocina
(UA/mL)
Bovicina
HC5
Nisina
Bovicina
HC5
Nisina
Bovicina
HC5
Nisina
0 0,62 0,62 1 1 1,00 1,00
0,01 0,61 0,60 1 1 1,00 0,88
0,1 0,58 0,58 2 2 0,82 0,84
1 0,45 nd 4 >12 0,51 0,80
10 - nd 240 >96 - 0,90
20 - - - - - -
30
MONTIVILLE, 1997; GRANDALL e MONTVILLE, 1998; MANTOVANI e
RUSSELL, 2002, MARTINEZ e RODRIGUES, 2005; BONNET et al., 2005),
Streptococcus thermophilus (GARDE et al. 2003) e Streptococcus bovis
(MANTOVANI e RUSSELL, 2001). Diferentes mecanismos de adaptação ou
resistência foram reportados para explicar o fenótipo observado, destacando-se a
produção de enzimas que inativam a bacteriocina, mudança na composição lipídica
da membrana e mudança da composição da parede celular (MAZZOTTA e
MONTVILLE, 1997). Entretanto, nenhum relato de resistência à nisina foi reportado
para A. acidoterrestris. A adaptação de microrganismos sensíveis à bovicina HC5
ainda não foi relatada.
4.2. Efeito de bovicina HC5 e nisina sobre a viabilidade celular de A.
acidoterrestris em tampão fosfato
As culturas de A. acidoterrestris (10
8
UFC/mL) incubadas em tampão fosfato
pH 4,0, reduziram um ciclo log no número de células viáveis após 24 horas de
incubação. Porém, quando a cultura foi adicionada de 0,1 ou 1 UA/mL de bovicina
HC5 observou-se a diminuição de dois e três ciclos log no número de células viáveis
(Figura 2a). Quando foi adicionado 10 UA/mL de bovicina HC5 houve redução de
quatro ciclos log com 12 horas de incubação e observou-se perda da viabilidade
celular com 24 horas de incubação. Resultado semelhante foi verificado quando
células de A. acidoterrestris foram incubadas com doses equivalentes de nisina
(Figura 2b).
A atividade de bovicina HC5 contra células vegetativas de A. acidoterrestris
inoculadas em tampão fosfato pH 4,0 foi bactericida, sendo o mesmo observado
quando a nisina foi utilizada. Mantovani e Russell (2003) demonstraram o efeito
bactericida de bovicina HC5, por efluxo de potássio intracelular, sobre L.
monocytogenes. tendo sido verificado acentuado declínio na viabilidade celular da
cultura do patógeno quando exposta à bacteriocina por apenas 2 horas. Resultados
similares foram obtidos quando células de L. monocytogenes foram expostas à nisina
(MONTVILLE e CHEN, 1998). A semelhança no efeito bactericida de ambas as
bacteriocinas neste trabalho pode ser devida a estrutura e o mecanismo de ação dos
peptídeos avaliados. Dessa forma, a incapacidade da célula restabelecer o gradiente
de íons na membrana resulta na paralisação das atividades de transporte de solutos,
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de células viáveis
(Log
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UFC/mL)
Tempo (h)
a
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N
o
de células viáveis
(Log
10
UFC/mL)
Tempo (h)
b
perda da homeostasia e eventual morte celular. Trabalhos adicionais deverão ser
realizados para caracterizar completamente a estrutura e as características
bioquímicas da bovicina HC5.
Figura 2. Número de células viáveis (Log
10
UFC/mL) de A. acidoterrestris DSMZ 2498
incubados em tampão fosfato (pH 4,0) com bovicina HC5 (a) e nisina (b). As
culturas foram inoculadas com 10
8
UFC/mL da bactéria. As bacteriocinas foram
adicionadas nas concentrações de 0,1 UA/mL (losango fechado), 1 UA/mL
(quadrado fechado), 10 UA/mL (triângulo fechado). Os controles sem
bacteriocina também são mostrados (círculos abertos). As culturas foram
incubadas por 24 horas a 43
o
C a 120 rpm.
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N
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de células viáveis
(Log
10
UFC/mL)
Tempo (h)
4.3. Efeito de bovicina HC5 sobre a viabilidade celular de A. acidoterrestris em
diferentes sucos de frutas
Quando os sucos de abacaxi e uva foram inoculados com aproximadamente 10
6
UFC/mL de A. acidoterrestris DSMZ 2498, sem a presença de bovicina HC5, o
número de células viáveis aumentou cerca de um ciclo log após 24 horas de
incubação (Figura 3 e Figura 4). Porém, quando A. acidoterrestris foi inoculado em
suco de manga, o número de células viáveis diminuiu cerca de 10 vezes (Figura 5).
A. acidoterrestris é uma bactéria que geralmente não cresce em meios complexos.
Entretanto, o crescimento observado em alguns sucos de frutas sugere que os
requerimentos nutricionais desta bactéria ainda não foram completamente
explorados.
A adição de 10 e 25 UA/mL de bovicina HC5 aos sucos de abacaxi, uva e
manga reduziu a viabilidade celular de A. acidoterrestris. As doses de bacteriocina
utilizadas diminuíram o número de células viáveis de 10 vezes (suco de manga) a
100.000 vezes (suco de abacaxi) (Figuras 3,4 e 5). A adição de 100 UA/mL de
bovicina HC5 reduziu a população de células viáveis de A. acidoterrestris a níveis
abaixo do limite de detecção, sendo reportados os valores estimados.
Figura 3. Efeito de diferentes concentrações de bovicina HC5 sobre A. acidoterrestris
DSMZ 2498 inoculado em suco de abacaxi. O suco foi inoculado com cerca de
10
6
UFC/mL e adicionado com 10 (triângulo fechado), 25 ( losango fechado) ou
100 UA/mL (quadrado fechado) de bovicina HC5. Nos tempos 0, 1, 2, 3, 4, 8, 12
e 24 horas de incubação, alíquotas foram retiradas e o número de células viáveis
foi determinado. Os controles sem bacteriocina também são mostrados (círculos
abertos). As culturas foram incubadas por 24 horas a 43
o
C a 120 rpm.
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de células viáveis
(Log
10
UFC/mL)
Tempo (h)
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de células viáveis
(Log
10
UFC/mL)
Tempo (h)
Figura 4. Efeito de diferentes concentrações de bovicina HC5 sobre A. acidoterrestris
DSMZ 2498 inoculado em suco de uva. O suco foi inoculado com cerca de 10
6
UFC/mL e adicionado com 10 (triângulo fechado), 25( losango fechado) ou 100
UA/mL (quadrado fechado) de bovicina HC5. Nos tempos 0, 1, 2, 3, 4, 8, 12 e
24 horas de incubação, alíquotas foram retiradas e o número de células viáveis
foi determinado. Os controles sem bacteriocina também são mostrados (círculos
abertos). As culturas foram incubadas por 24 horas a 43
o
C a 120 rpm.
Figura 5. Efeito de diferentes concentrações de bovicina HC5 sobre A. acidoterrestris
DSMZ 2498 inoculado em suco de manga. O suco foi inoculado com cerca de
10
6
UFC/mL e adicionado com 10 (triângulo fechado), 25( losango fechado) ou
100 UA/mL (quadrado fechado) de bovicina HC5. Nos tempos 0, 1, 2, 3, 4, 8, 12
e 24 horas de incubação, alíquotas foram retiradas e o número de células viáveis
foi determinado. Os controles sem bacteriocina também são mostrados (círculos
abertos). As culturas foram incubadas por 24 horas a 43
o
C a 120 rpm.
34
Quando o suco de mamão, laranja e maçã foram inoculados com,
aproximadamente, 10
6
UFC/mL de A. acidoterrestris DSMZ 2498, respectivamente,
sem a presença de bovicina HC5, observou-se aumento de um a três ciclos log no
número de células viáveis com 24 horas de incubação (Figuras 6, 7 e 8). A adição de
bovicina HC5 nas doses de 10 e 25 UA/mL aos sucos de mamão, laranja e maçã não
afetou o crescimento de A. acidoterrestris no suco de fruta, sendo que o número de
células viáveis nas culturas tratadas com a bacteriocina foram semelhantes ao
controle. Doses de 100 UA/mL inibiram completamente o crescimento de A.
acidoterrestris nos sucos de maçã e laranja por até 24 horas (Figuras 6, 7 e 8). Em
suco de mamão, observou-se crescimento estimado de aproximadamente 10
2
UFC/mL de A. acidoterrestris após 24 horas de incubação na presença de 100
UA/mL de bovicina HC5 (Figura 6).
Esses resultados sugerem que a matriz do alimento pode interferir na atividade
das bacteriocinas. Segundo Schillinger et al. (1996), as características intrínsecas do
alimento podem interferir na solubilidade da bacteriocina e na sua distribuição e
ligação nos componentes do alimento (por exemplo, partículas de gordura ou
proteínas), embora nenhum componente específico dos sucos de frutas tenha sido
relacionado com estes efeitos. Além disso, a presença de proteases termotolerantes
ou ocorrência de reações de oxidação também poderiam afetar a atividade de
peptídeos antimicrobianos (JUNG et al., 1992). A. acidoterrestris demonstrou que
possui capacidade de crescer e possivelmente de deteriorar suco de mamão, fato
ainda não reportado na literatura.
A atividade de bovicina HC5 contra A. acidoterrestris incubado em tampão
fosfato não condiz com os resultados obtidos quando utilizou-se concentrações
equivalentes de bovicina HC5 nos diferentes sucos de frutas. Esses resultados
sugerem que a composição dos sucos de frutas afeta a atividade ou a estabilidade da
bacteriocina. É possível que a energia cinética das moléculas e as forças de interação
(forças de van der Waals e interações eletrostáticas) entre o peptídeo e as células alvo
sejam distintas no tampão e no suco de fruta. Portanto, a determinação da efetividade
de agentes antimicrobianos comumente realizada a nível laboratorial utilizando
soluções tampão ou meios sintéticos deve ser vista com cuidado.
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2
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de células viáveis
(Log
10
UFC/mL)
Tempo (h)
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N
o
de células viáveis
(Log
10
UFC/mL)
Tempo (h)
Figura 6. Efeito de diferentes concentrações de bovicina HC5 sobre A. acidoterrestris
DSMZ 2498 inoculado em suco de mamão. O suco foi inoculado com cerca de
10
6
UFC/mL e adicionado com 10 (triângulo fechado), 25( losango fechado) ou
100 UA/mL (quadrado fechado) de bovicina HC5. Nos tempos 0, 1, 2, 3, 4, 8, 12
e 24 horas de incubação, alíquotas foram retiradas e o número de células viáveis
foi determinado. Os controles sem bacteriocina também são mostrados (círculos
abertos). As culturas foram incubadas por 24 horas a 43
o
C a 120 rpm.
Figura 7. Efeito de diferentes concentrações de bovicina HC5 sobre A. acidoterrestris
DSMZ 2498 inoculado em suco de laranja. O suco foi inoculado com cerca de
10
6
UFC/mL e adicionado com 10 (triângulo fechado), 25( losango fechado) ou
100 UA/mL (quadrado fechado) de bovicina HC5. Nos tempos 0, 1, 2, 3, 4, 8, 12
e 24 horas de incubação, alíquotas foram retiradas e o número de células viáveis
foi determinado. Os controles sem bacteriocina também são mostrados (círculos
abertos). As culturas foram incubadas por 24 horas a 43
o
C a 120 rpm.
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N
o
de células viáveis
(Log
10
UFC/mL
Tempo (h)
Figura 8. Efeito de diferentes concentrações de bovicina HC5 sobre A. acidoterrestris
DSMZ 2498 inoculado em suco de maçã. O suco foi inoculado com cerca de 10
6
UFC/mL e adicionado com 10 (triângulo fechado), 25( losango fechado) ou 100
UA/mL (quadrado fechado) de bovicina HC5. Nos tempos 0, 1, 2, 3, 4, 8, 12 e
24 horas de incubação, alíquotas foram retiradas e o número de células viáveis
foi determinado. Os controles sem bacteriocina também são mostrados (círculos
abertos). As culturas foram incubadas por 24 horas a 43
o
C a 120 rpm.
37
4.3.1. Viabilidade celular de A. acidoterrestris em diferentes sucos de frutas,
contendo diferentes concentrações de bovicina HC5 e nisina
Quando A. acidoterrestris foi inoculadoem população equivalente a 10
6
UFC/mL em suco de abacaxi adicionado com 40 UA/mL de bovicina HC5 ou nisina
houve redução de dois ciclos log da viabilidade celular (Figura 9). Em suco de
laranja quando adicionado de bovicina HC5 na mesma concentração (40 UA/mL)
diminuiu em quatro ciclos log a viabilidade celular de A. acidoterrestris (Figura 10).
Entretanto, ao ser adicionada nisina em concentrações equivalentes houve inibição
completa do crescimento de A. acidoterrestris em suco de laranja. O crescimento de
A. acidoterrestris foi completamente inibido em suco de abacaxi adicionado das
concentrações de 60, 80 e 100 UA/mL de bovicina HC5 ou nisina. Observou-se a
redução de quatro ciclos log da viabilidade celular de A. acidoterrestris quando 40
UA/mL de bovicina HC5 ou nisina foi adicionado em suco de uva. Sendo que, a
inibição completa do crescimento de A. acidoterrestris quando foi adicionado ao
suco de uva nisina na concentração de 60 UA/mL. Houve redução de quatro ciclos
log no número de células viáveis de A. acidoterrestris ao ser adicionada bovicina
HC5 em concentração equivalente. Entretanto, inibiram completamente o
crescimento de A. acidoterrestris quando foi adicionado ao suco 80 e 100 UA/mL de
bovicina HC5 ou nisina (Figura 11).
Os valores de DBM tanto para bovicina HC5 como para nisina encontrados nos
sucos de laranja foram os mesmos verificados para o suco de abacaxi, ou seja, 60
UA/mL (Tabela 3). A DBM foi diferente para as bacteriocinas adicionadas em suco
de uva sendo de 60 UA/mL de nisina e 80 UA/mL de bovicina HC5.
Estes resultados demonstram que a atividade bactericida de bovicina HC5 e
nisina foram similares nos sucos de abacaxi e laranja, porém quando adicionadas em
suco de uva a nisina foi efetiva em uma concentração menor do que quando
adicionada bovicina HC5. Estes resultados sugerem que o substrato e a concentração
podem estar influenciando na atividade da bacteriocina.
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2
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N
o
de células viáveis
(Log
10
UFC/mL)
Concentrações (UA/mL)
Tabela 3. Dose bactericida mínima (DBM) de bovicina HC5 e nisina contra A.
acidoterretris inoculado em diferentes sucos de frutas
Figura 9. Efeito de bovicina HC5 sobre A. acidoterrestris DSMZ 2498 inoculado em suco
de suco de abacaxi. Foram inoculados cerca de 10
6
UFC/mL na ausência de
bovicina (controle) e na presença de 10, 20, 40, 60, 80 e 100 UA/mL de bovicina
HC5 (círculo fechado) ou nisina (quadrado fechado). Com 12 horas de
incubação a 43 ºC a 120 rpm,alíquotas foram retiradas e o número de células
viáveis foi determinado.
DBM (UA/mL)
Sucos
Bovicina HC5 (UA/mL) Nisina (UA/mL)
Abacaxi 60 60
Laranja 60 60
Mamão 80 60
Uva 80 60
Manga 60 40
Maçã 60 80
DBM média 66,6 60,0
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0
2
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N
o
de células viáveis
(Log
10
UFC/mL)
Concentrações (UA/mL)
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N
o
de élulas viáveis
(Log
10
UFC/mL)
Concentrações (UA/mL)
Figura 10. Efeito de bovicina HC5 sobre A. acidoterrestris DSMZ 2498 inoculado em suco
de suco de laranja. Foram inoculados cerca de 10
6
UFC/mL na ausência de
bovicina (controle) e na presença de 10, 20, 40, 60, 80 e 100 UA/mL de bovicina
HC5 (círculo fechado) ou nisina (quadrado fechado). Com 12 horas de
incubação a 43 ºC a 120 rpm,alíquotas foram retiradas e o número de células
viáveis foi determinado.
Figura 11. Efeito de bovicina HC5 sobre A. acidoterrestris DSMZ 2498 inoculado em suco
de suco de uva. Foram inoculados cerca de 10
6
UFC/mL na ausência de bovicina
(controle) e na presença de 10, 20, 40, 60, 80 e 100 UA/mL de bovicina HC5
(círculo fechado) ou nisina (quadrado fechado). Com 12 horas de incubação a 43
ºC a 120 rpm, alíquotas foram retiradas e o número de células viáveis foi
determinado
.
40
A viabilidade celular de A. acidoterrestris (10
6
UFC/mL) diminuiu em dois
ciclos log quando foi adicionado 40 UA/mL de bovicina HC5 em suco de mamão.
Entretanto, ao ser adicionada concentrações equivalentes de nisina, houve redução de
três ciclos log (Figura 12). Porém, quando a mesma concentração foi adicionada ao
suco de manga e maçã houve redução de três e dois ciclos log na viabilidade celular
de A. acidoterrestris respectivamente. Doses de 60, 80 e 100 UA/mL de bovicina ou
nisina inibiram completamente o crescimento de células viáveis em suco de manga e
maçã (Figura 13 e Figura 14). O crecimento de A. acidoterrestris em suco de mamão
adicionado de 60 UA/mL de nisina foi completamente inibido por 12 horas de
incubação, porém, quando foi adicionada bovicina HC5 na mesma concentração
houve redução de quatro ciclos log na viabilidade celular, foi necessário uma dose de
80 UA/mL de bovicina HC5 para inibir completamente o crescimento de A.
acidoterrestris. Foram registrados como DBM da nisina em suco de mamão e manga
valores de 60 UA/mL e 40 UA/mL, respectivamente, e para bovicina HC5 nestes
mesmos sucos 80 UA/mL e 60 UA/mL. No suco de maçã os valores de DBM foram
menores para bovicina HC5 (60 UA/mL) enquanto para nisina este valor foi
estabelecido em 80 UA/mL.
Os valores médios de DBM encontrados para bovicina HC5 e nisina foram
semelhantes (60,00 e 66,0). Estes resultados demonstram a similaridade entre essa
bacteriocinas, o modo de ação pode ser semelhante e que as doses podem interferir
na atividade das bacteriocinas. Estes resultados demonstram que bovicina HC5
apresenta características que lhe confere potencial para ser utilizada como
conservante natural de sucos de frutas.
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de cálulas viáveis
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UFC/mL)
Concentrações (UA/mL)
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de células viáveis
(Log
10
UFC/mL)
Concentrações (UA/mL)
Figura 12. Efeito de bovicina HC5 sobre A. acidoterrestris DSMZ 2498 inoculado em suco
de suco de mamão. Foram inoculados cerca de 10
6
UFC/mL na ausência de
bovicina (controle) e na presença de 10, 20, 40, 60, 80 e 100 UA/mL de bovicina
HC5 (círculo fechado) ou nisina (quadrado fechado). Com 12 horas de
incubação a 43 ºC a 120 rpm, alíquotas foram retiradas e o número de células
viáveis foi determinado.
.
Figura 13. Efeito de bovicina HC5 sobre A. acidoterrestris DSMZ 2498 inoculado em suco
de suco de manga. Foram inoculados cerca de 10
6
UFC/mL na ausência de
bovicina (controle) e na presença de 10, 20, 40, 60, 80 e 100 UA/mL de bovicina
HC5 (círculo fechado) ou nisina (quadrado fechado). Com 12 horas de
incubação a 43 ºC a 120 rpm, alíquotas foram retiradas e o número de células
viáveis foi determinado.
42
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0 20406080100
N
o
de células viáveis
(Log
10
UFC/mL)
Concentrações (UA/mL)
Figura 14. Efeito de bovicina HC5 sobre A. acidoterrestris DSMZ 2498 inoculado em suco
de suco de maçã. Foram inoculados cerca de 10
6
UFC/mL na ausência de
bovicina (controle) e na presença de 10, 20, 40, 60, 80 e 100 UA/mL de bovicina
HC5 (círculo fechado) ou nisina (quadrado fechado). Com 12 horas de
incubação a 43 ºC a 120 rpm, alíquotas foram retiradas e o número de células
viáveis foi determinado.
4.4. Determinação do valor D de esporos de A. acidoterrestris em diferentes
sucos de frutas na presença ou ausência de bacteriocina
Os valores de D
90ºC
obtidos quando os esporos de A. acidoterrestris foram
aquecidos nos diferentes tipos de sucos variaram de 9,0 a 15,8 min e foram maiores
do que os valores de redução decimal obtidos quando os sucos foram adicionados
com bovicina HC5 ou nisina (Tabela 4). Estes resultados confirmam a resistência
térmica desta bactéria e demonstram o efeito das bacteriocinas em tornar os esporos
mais sensíveis ao tratamento térmico. O suco, inoculado com esporos de A.
acidoterrestris, sem adição de bacteriocina que teve menor valor D
90°C
foi o de
abacaxi (9,0 min).
A adição de bovicina HC5 ou nisina na concentração de 80 UA/mL dos sucos
avaliados resultou em redução dos valores de D
90°C
em quase 30 vezes. A adição de
bovicina HC5 ou nisina ao suco de abacaxi diminuiu o tempo de redução decimal em
94% (0,48 min). Obteve-se redução de 96% e 97% no valor D de A. acidoterrestris
inoculado em suco de laranja acrescido de bovicina HC5 ou nisina. Quando os sucos
43
de mamão, uva, manga e maçã foram adicionados com bovicina HC5 ou nisina
(Tabela 4), o valor D
90°C
dos esporos de A. acidoterrestris reduziu aproximadamente
96%.
Determinar a resistência térmica do A. acidoterrestris é muito importante para
implementar estratégias efetivas para o processamento térmico de sucos de frutas. Os
índices de redução decimal (valor D) de esporos de A. acidoterrestris são
extremamente variáveis, sendo afetados pelas condições e meio de crescimento e
pela temperatura na qual o esporo foi produzido (TAMEGA, 2005).
No presente trabalho, a resistência térmica de A. acidoterrestris inoculado em
diferentes sucos de frutas, apresentou valor D
95ºC
médio de 13,8 min. Vários autores
têm investigado os parâmetros de resistência térmica de A. acidoterrestris em
diferentes sucos de frutas. Os valores de D
90°C
obtidos neste trabalho (Tabela 4)
coincidem com os valores reportados na literatura. Eiroa et. al. (1999) estudando a
resistência térmica desta bactéria em suco de laranja, inoculou uma suspensão de
esporos da estirpe tipo A. acidoterrestris DSMZ 2498 em suco de laranja obteve D
90
ºC
de 16,9 min. De Carvalho et. al. (2008) obteve valores de D
90 ºC
de 11,66 min para
esporos de A. acidoterrestris DSMZ 2498 inoculados em polpa de manga com pH
4,0. Estes resultados evidenciaram a capacidade dos esporos de A. acidoterrestris em
sobreviver a tratamentos térmicos usualmente utilizados pelas indústrias de sucos de
frutas.
44
Tabela 4. Tempo de redução decimal (D
90 ºC
) de esporos de A. acidoterrestris em
diferentes sucos de frutas contendo 80 UA/mL de bovicina HC5 ou
nisina.
*O desvio padrão das médias foi inferior a 10%
Uma das características importantes das bacteriocinas bovicina HC5 e nisina é
o fato de se manterem estáveis em temperaturas de pasteurização. Assim, mesmo que
o esporo consiga germinar, as bacteriocinas presentes no meio poderiam ter efeito
bactericida sobre o crescimento das células vegetativas. A nisina inibe a germinação
de esporos e possui ação esporostática, porém o mecanismo de inibição ainda não é
bem esclarecido. A inibição depende da presença do resíduo Dha (dihidroxiadenina)
na posição 5 e presume-se que a nisina interage com grupos sulfidrílicos presentes na
superfície do esporo que são essenciais para a germinação (LIU e HANSEN, 1983;
MORRIS et al., 1984, DELVES-BROUGHTON, 2005).
Neste trabalho, a bovicina HC5 demonstrou ser tão efetiva quanto a nisina
na redução térmica de esporos de A. acidoterrestris em diferentes sucos de frutas
(Tabela 1). Os resultados obtidos juntamente com as caraterísticas de estabilidade ao
calor e a baixo pH de bovicina HC5 fazem desta bacteriocina um candidato potencial
como conservante natural de suco de frutas.
Valor de D
90 ºC
(min)
Sucos
Controle Bovicina HC5 Nisina
Abacaxi 9,0 0,483 0,478
Laranja 15,8 0,534 0,472
Mamão 14,7 0,507 0,490
Uva 15,2 0,564 0,533
Manga 13,4 0,508 0,507
Maçã 14,8 0,492 0,488
Média
13,8 0,514 0,494
45
4.5. Características morfológicas e do envelope celular de A. acidoterrestris
tratado com bovicina HC5 e nisina
A observação de células vegetativas de A. acidoterrestris DSMZ 2498 tratado
com bovicina HC5 ou nisina por microscopia de força atômica revelou severas
mudança estruturais comparadas com as células que não foram expostas a ação da
bacteriocina. A adição de 10 UA/mL de bovicina HC5 causou danos na superfície
celular (Figura 15). Com a adição dessa bacteriocina, também foi possível observar
mudanças na morfologia celular (Figura 16), a redução no número de células
vegetativas viáveis e esporulação da cultura foi observado nos tempos de 0, 2, 4, 8 e
24 horas (Figura 17), foram feitos controles sem adição de bacteriocina com 24 horas
de incubação.
A observação das células tratadas com nisina foi apenas nos tempos de 2 e 8
horas de incubação. Nesta situação também foi possível observar danos no envelope
celular (Figura 18) e na morfologia das células vegetativas viáveis de A.
acidoterrestris (Figura 19). Os resultados foram semelhantes quando adicionado
bovicina HC5, porém a nisina demonstrou agir rapidamente sobre a células, apenas
com 2 horas foi possível observar uma diminuição considerável no número de
células, com 8 horas de incubação foram observadas poucas células vegetativas
viáveis, porém não foi observado a esporulação da cultura (Figura 20). Os resultados
obtidos com a nisina sugerem a necessidade de se fazer observações em tempos
menores de incubação.
A ação de bovicina HC5 e nisina sobre o envelope celular de A.
acidoterrestris foi similar. Esses resultados sugerem que essas bacteriocinas podem
se ligar a receptores semelhantes na célula alvo. O modo de ação da nisina em
bactérias sensíveis é duplo, pois, o peptídeo se liga ao lipídeo II, que transporta as
subunidades de N-acetilglicosamina e ácido N-acetilmurâmico do citoplasma para a
parede celular, interrompendo a síntese de peptideoglicano (WIEDEMANN, 2001).
Além disso, a nisina pode usar o lipídeo II como molécula “âncora” para iniciar o
processo de inserção na membrana e conseqüente formação do poro, que ocasiona
uma rápida morte celular devido à perda dos gradientes iônicos vitais e a
concomitante dissipação da força próton motora na bactéria (MONTVILLE e CHEN,
1998; WIEDEMANN, 2001; COTTER, 2005).
46
A observação topográfica da superfície celular de A.acidoterrestris tratada
com bovicina HC5 (Figura 15) ou nisina (Figura 18) indica possíveis pontos de
extrusão do citoplasma possivelmente causados pela ação das bacteriocinas sobre o
envelope celular. Esse efeito pode ser devido à ação direta ou indireta das
bacteriocinas sobre a síntese de peptideoglicano. Entretanto, estudos posteriores
serão necessários para determinar se a bovicina HC5 também interage com o lipídeo
II das bactérias sensíveis. Estudos têm demonstrado que outras bacteriocinas de
bactérias lácticas, a exemplo da enterocina AS-48, também podem causar mudanças
estruturais nas células de A. acidoterrestris (GRANDE et. al., 2005).
47
Figura 15. Imagens tridimencionais topográficas com o modo intermitente de microscopia
de força atômica (NT-MDT), de células vegetativas de A. acidoterrestris DMSZ
2498 tratadas com bovicina HC5. A suspensão de células (10
8
UFC/mL) foi
incubada por 24 horas em tampão fosfato com pH 4,0 a 43 ºC e 120 rpm. Foram
feitas observações da cultura controle sem adição de bovicina HC5, com 24
horas de incubação (a) e após 2 horas (b), 4 horas (c), 8 horas (d) e 24 horas (e)
de incubação com 10 UA/mL de bovicina HC5. A superfície celular de células
representativas foi analisada com varredura de 1 µm.
48
Figura 16. Imagens tridimencionais topográficas com o modo intermitente de microscopia
de força atômica (NT-MDT), de células vegetativas de A. acidoterrestris DMSZ
2498 tratadas com bovicina HC5. A suspensão de células (10
8
UFC/mL) foi
incubada por 24 horas em tampão fosfato com pH 4,0 a 43 ºC e 120 rpm. Foram
feitas observações da cultura com 24 horas de incubação sem adição de bovicina
HC5, após com 2 horas (b), 4 horas (c), 8 horas (d) e 24 horas (e) de incubação
com 10 UA/mL de bovicina HC5. A morfologia celular de células
representativas foi analisada com varredura de 3 µm.
49
Figura 17. Imagens tridimencionais topográficas com o modo intermitente de microscopia
de força atômica (NT-MDT), de células vegetativas de A. acidoterrestris DMSZ
2498 tratadas com bovicina HC5. A suspensão de células (10
8
UFC/mL) foi
incubada por 24 horas em tampão fosfato com pH 4,0 a 43 ºC e 120 rpm. Foram
feitas observações da cultura com 24 horas de incubação sem adição de bovicina
HC5, após com 2 horas (b), 4 horas (c), 8 horas (d) e 24 horas (e) de incubação
com 10 UA/mL de bovicina HC5. A redução do número de células vegetativas e
esporulação foi analizada com varredura de 40 µm.
50
Figura 18. Imagens tridimencionais topográficas com o modo intermitente de microscopia
de força atômica (NT-MDT), de células vegetativas de A. acidoterrestris DMSZ
2498 tratadas com nisina. A suspensão de células (10
8
UFC/mL) foi incubada
por 24 horas em tampão fosfato com pH 4,0 a 43 ºC e 120 rpm. Foram feitas
observações da cultura controle sem adição de nisina, com 24 horas de
incubação (a), 2 horas (b) e 8 horas (c), de incubação com 10 UA/mL de
bovicina HC5. A superfície celular de células representativas foi analisada com
varredura de 1 µm.
51
Figura 19. Imagens tridimencionais topográficas com o modo intermitente de microscopia
de força atômica (NT-MDT), de células vegetativas de A. acidoterrestris DMSZ
2498 tratadas com nisina. A suspensão de células (10
8
UFC/mL) foi incubada
por 24 horas em tampão fosfato com pH 4,0 a 43 ºC e 120 rpm. Foram feitas
observações da cultura controle sem adição de nisina, com 24 horas de
incubação (a), 2 horas (b) e 8 horas (c), de incubação com 10 UA/mL de
bovicina HC5. A superfície celular de células representativas foi analisada com
varredura de 3 µm.
52
Figura 20. Imagens tridimencionais topográficas com o modo intermitente de microscopia
de força atômica (NT-MDT), de células vegetativas de A. acidoterrestris DMSZ
2498 tratadas com nisina. A suspensão de células (10
8
UFC/mL) foi incubada
por 24 horas em tampão fosfato com pH 4,0 a 43 ºC e 120 rpm. Foram feitas
observações da cultura controle sem adição de nisina, com 24 horas de
incubação (a), 2 horas (b) e 8 horas (c) de incubação com 10 UA/mL de nisina.
A redução no número de células vegetativas foi analizada com varredura de 40
µm.
53
5. CONCLUSÕES
Bovicina HC5 e nisina inibiram o crescimento e reduziram a viabilidade
celular de A. acidoterrestris em diferentes sucos de frutas.
Bovicina HC5 e nisina reduziram a resistência térmica de esporos de A.
acidoterrestris inoculados em diferentes sucos de frutas.
Bovicina e nisina afetaram a morfologia e o invelope celular de A.
acidoterrestris.
Bovicina HC5 e nisina apresentaram doses bactericidas mínimas contra A.
acidoterrestris.
A bovicina HC5 foi tão efetiva quanto a nisina contra A. acidoterrestris
inoculado em diferentes sucos de frutas.
As bacteriocinas permaneceram estáveis nas condições de incubação e
tratamento térmico avaliados neste trabalho.
54
5. REFERÊCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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