( PDF ) Estudo do papel do óxido nítrico nas mucosites oral e intestinal induzidas por 5-fluorouracil e metotrexato e efeito da glutamina e alanil-glutamina na mucosite oral induzida por 5-fluorouracil

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

RENATA FERREIRA DE CARVALHO LEITÃO

ESTUDO DO PAPEL DO ÓXIDO NÍTRICO NAS MUCOSITES ORAL E

INTESTINAL INDUZIDAS POR 5-FLUOROURACIL E METOTREXATO E EFEITO

DA GLUTAMINA E ALANIL-GLUTAMINA NA MUCOSITE ORAL INDUZIDA POR

5-FLUOROURACIL.

RENATA FERREIRA DE CARVALHO LEITÃO

FORTALEZA

2007

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Tese apresentada ao programa de Pós-Graduação em

Farmacologia da Universidade Federal do Ceará como

requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em

Farmacologia

Orientador: Prof

. Dr

Gerly Anne de Castro Brito

Universidade Federal do Ceará – UFC

FORTALEZA

2007

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ESTUDO DO PAPEL DO ÓXIDO NÍTRICO NAS MUCOSITES ORAL E

INTESTINAL INDUZIDAS POR 5-FLUOROURACIL E METOTREXATO E EFEITO

DA GLUTAMINA E ALANIL-GLUTAMINA NA MUCOSITE ORAL INDUZIDA POR

5-FLUOROURACIL.

Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da

Universidade Federal do Ceará como requisito parcial para a obtenção do título de

Doutor em Farmacologia.

Aprovada em: 20 de abril de 2007.

BANCA EXAMINADORA

_________________________________

Prof

. Dr

. Gerly Anne de Castro Brito (orientadora)

Universidade Federal do Ceará – UFC

_________________________________

Prof. Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro

Universidade Federal do Ceará – UFC

________________________________

Prof

. Dr

. Adriana Abalen Martins Dias

Fundação Antônio Prudente – SP

_________________________________

Prof. Dr. Mauro Martins Teixeira

Universidade Federal de Minas Gerais – UFMG

____________________________________

Prof Dr. Eduardo Costa Studart Soares

Universidade Federal do Ceará - UFC

iii

Aos meus pais, Wilson e Lúcia, e meus irmãos, Raquel, Gilberto e Felipe,

pelo imenso incentivo e apoio.

Ao meu marido, Rômulo e meus filhos, Rômulo Filho e Clara, por tudo.

AGRADECIMENTOS

À professora Gerly Anne de Castro Brito, a quem, além da firme orientação do

presente trabalho, agradeço pela sua inestimável amizade e competência.

Ao professor Ronaldo de Albuquerque Ribeiro, pelas muitas oportunidades e

pelo privilégio de tê-lo compondo a minha banca examinadora.

A todos os professores da pós-graduação em farmacologia que contribuíram

em minha formação nesse curso, especialmente aos professores Marcellus e Vietla

Rao, pela disponibilidade e atenção.

Ao professor Reinaldo Oriá, pela valiosa contribuição no estudo da mucosite

intestinal.

Às mais novas professoras e antigas amigas, Vilma e Mariana, sempre

disponíveis e presentes.

Aos estudantes de iniciação científica, Alana, Lorena, Delanie, Emanuelle,

Johann, e Júlio Werner, cujas participações foram decisivas e indispensáveis.

Aos amigos do LAFICA, Rosinha, Maria Luisa, Pedro, Antoniella, Carolina,

Rosane, Yuri, Maurício e tantos outros, pela convivência agradável e pela amizade.

À Vandinha, por sua presteza em ajudar, sempre.

Ao Ivan, pela boa vontade e dedicação na confecção das lâminas.

Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Rose,

Haroldo, Bento, Chiquinho e, muito especialmente, à Áura, pela disposição em

ajudar.

Ao CNPq, pelo apoio financeiro.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 Estrutura química da molécula de 5-fluorouracil 13

Figura 2 Estrutura química da molécula de metotrexato 15

Figura 3 Diagrama simplificado da ação do metotrexato na

síntese da t

Figura 4 Desenho esquemático do protocolo experimental de

mucosite oral

Figura 5 Desenho esquemático do protocolo experimental da

mucosite intestinal ratos ou camundongos

Figura 6 Aspectos macroscópicos e microscópicos de

mucosas jugais de hamsters normais (A e B) ou

submetidos a mucosite oral induzida por 5-

Fluorouracil e trauma mecânico e que foram tratados

com salina (C e D), aminoguanidina (E e F) ou N-(3-

(Aminomethyl)benzyl)acetamidina (1400W; G e H):

Figura 7 Efeito dos inibidores da NOS, Nφ-Nitro-L-arginina

methyl ester (L-NM), aminoguanidina (AG) e N-(3-

(Aminomethyl)benzyl)acetamidina (1400W) sobre as

medidas de atividade de mieloperoxidase observadas

na mucosite oral em hamsters

Figura 8 Efeito do 5-fluorouracil (5-FU) sobre a atividade da

nítrico óxido sintase (NOS) nas mucosas jugais dos

hamsters

Figura 9 Efeito do N-(3-(Aminomethyl)benzyl)acetamidina

(1400W) sobre a dosagem de nitrito nas mucosas

jugais de hamsters submetidos a mucosite oral por 5-

fluorouracil (5-FU).

Figura 10 Fotomicrografias de imunohistoquímica para NOSi de

uma mucosa jugal normal (B) ou com mucosite oral

experimental recebendo solução salina (C),

aminoguanidina (AG; D), ou N-(3-

(Aminomethyl)benzyl)acetamidina (1400W; E).

Figura 11 Fotomicrografias de lâminas de mucosas jugais

processadas pelo método de TUNEL, de um animal

normal (B) ou com mucosite oral experimental tratado

com solução salina (C), aminoguanidina (AG; D), ou

N-(3-(Aminomethyl)benzyl)acetamidina (1400W; E).

Figura 12 Efeito do N-(3-(Aminomethyl)benzyl)acetamidina

(1400W) na produção salivar não estimulada, no 4º

(A) e 10º dias (B), de animais submetidos à mucosite

oral por 5-fluorouracil (5-FU) e trauma mecânico.

Figura 13 Efeito da aminoguanidina (AG) e Nφ-Nitro-L-arginine

methyl (L-NAME) sobre a altura de vilos no duodeno

(A), jejuno (B) e íleo (C) dos animais submetidos a

mucosite intestinal.

Figura 14 Fotomicrografias de jejuno de ratos Wistar normais e

de animais submetidos à mucosite intestinal pelo

metotrexato (MTX) que receberam salina,

aminoguanidina (AG) ou Nφ-Nitro-L-arginine methyl

(L-NAME).

Figura 15 Efeito da aminoguanidina (AG) e Nφ-Nitro-L-arginine

methyl (L-NAME) na atividade de mieloperoxidase

(MPO) em segmentos de jejuno de animais

submetidos à mucosite intestinal por MTX.

Figura 16 Exemplos representativos da marcação

imunohistoquímica para enzima nítrico óxido sintase

(NOSi; lado direito) e para células TUNEL positivas

(lado esquerdo) em segmentos de jejuno de rato.

Figura 17 Ensaio de Western Blot para a expressão da enzima

óxido nítrico sintase induzida (NOSi; MW ~130kDa)

em homogenato de segmentos de jejuno.

Figura 18 Aspectos macroscópicos e microscópicos de

mucosas jugais de hamsters normais (A e B) ou

submetidos a mucosite oral induzida por 5-

Fluorouracil (5-FU) e trauma mecânico e que foram

tratados com salina, observados no 10º (C e D) e 14º

(E e F) dias, com glutamina (G e H) ou alanil-

glutamina (I e J), observados no 14º dia de

experimento.

Figura 19 Efeito da glutamina e alanil-glutamina sobre o nível

de glutamina no soro de hamsters submetidos a

mucosite oral por 5-fluorouracil (5-FU).

Figura 20 Efeito glutamina e alanil-glutamina sobre a atividade

de mieloperoxidase observada nas mucosas jugais

de hamsters submetidos à mucosite oral

experimental

Figura 21 Efeito da glutamina e alanil-glutamina sobre as

medidas de atividade de mieloperoxidase observadas

na mucosite oral em hamsters.

Figura 22 Fotomicrografias de lâminas de mucosas jugais

processadas para detecção de apoptose pelo

método de TUNEL, de um animal normal (B) ou com

mucosite oral experimental tratado com solução

salina (C), glutamina (D), ou alanil-glutamina (E).

vii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Escores das análises macroscópicas e microscópicas da

mucosa jugal dos hamsters submetidos a mucosite oral

experimental e tratados com aminoguanidina (AG) e N-(3-

(Aminomethyl)benzyl)acetamidina (1400W)

Tabela 2 Escores das análises macroscópicas e microscópicas da

mucosa jugal dos hamsters submetidos a mucosite oral

experimental e tratados com Nφ-Nitro-L-arginina methyl

ester (L-NAME)

Tabela 3 Escores das análises macroscópicas e microscópicas da

mucosa jugal dos hamsters submetidos a mucosite oral

experimental e tratados com glutamina e alanil-glutamina

durante 10 dias.

Tabela 4 Escores das análises macroscópicas e microscópicas da

mucosa jugal dos hamsters submetidos a mucosite oral

experimental e tratados com glutamina e alanil-glutamina

durante 14 dias.

viii

LISTA DE ABREVIATURAS

Alfa

Beta

µl

microlitro

µm

micrômetro

1400W N-(3-(Aminomethyl)benzyl)acetaminide

5-FU Fluorouracil

AG Aminoguanidina

AL-GLU Alanil-glutamina

Anova Análise de variança

DAB 3,3`diaminobenzidine-peróxido

DHFR Enzima diidrofolato redutase

DNA Ácido desoxirribonucléico

ELAM Moléculas de adesão endotélio-leucócito

epm Erro padrão da média

FDUMP 5-fluoro-2’-desoxiurudina

FUTP trifosfato de 5-fluorouridina

G Grama

G-CSF Fator estimulador de crescimento de granulócitos

GLU Glutamina

GM-CSF Fator estimulador de colônia de granulócitos/

monócitos

GMPc Guanilato monofosfato cíclico

H&E Hematoxifilina e eosina

HPLC Cromatografia líquida de alta performance

ICAM Molécula de adesão intercelular

IL- Interleucina

INCA Instituto Nacional do Câncer

INF- Interferon

Ip Via intra-peritoneal

Kg Kilograma

KGF Fator de crescimento de queratinócitos

L-NAME Nφ-Nitro-L-Arginina Metil Ester

LPS Lipopolissacarídeo

M Molar

Mg Miligrama

Ml Mililitro

Mm Milímetro

MPO Mieloperoxidase

MTX Metotrexato

NF-κB

Fator de transcrição nuclear kappa B

Nm nanômetro

NO Óxido nítrico

NOS Óxido nítrico sintase

NOSc Óxido nítrico sintase constitutiva

NOSe Óxido nítrico sintase endotelial

NOSi Óxido nítrico sintase induzida

NOSn Óxido nítrico sintase neuronal

PAF Fator ativador de plaquetas

PG Prostaglandina

RNA Ácido ribonucléico

Sc Via subcutânea

TCA ácido tricloracético

TGF Fator transformador de crescimento

TM Trauma mecânico

TNF Fator de necrose tumoral

TUNEL TdT-mediated dUTP nick end-labeling

VCAM moléculas de adesão celular vascular

RESUMO

A mucosite induzida por quimioterápicos é um efeito colateral importante e limitante

da terapia do câncer, cuja fisiopatologia não é completamente compreendida. O

presente estudo visa investigar o papel do óxido nítrico (NO) na patogênese das

mucosites oral e intestinal induzidas por 5-fluorouracil (5-FU) e metotrexato (MTX) e

os efeitos da glutamina (GLU) e alanil-glutamina (AL-GLU) na mucosite oral induzida

por 5-FU. A mucosite oral foi induzida por duas administrações intraperitoneais (i.p.)

de 5-FU nos 1

e 2

dias (60 e 40 mg/kg respectivamente), em hamsters. Os animais

foram tratados subcutaneamente (s.c.) com os inibidores da óxido nítrico sintase

(NOS), N-(3-(Aminomethyl)benzyl)acetamidina (1400W; 1 mg/kg), aminoguanidina

(AG; 5 or 10 mg/kg), Nϕ-Nitro-L-Arginina Methyl Ester (L-NAME; 5, 10 or 20 mg/kg)

ou salina (0,4 ml), uma hora antes do 5-FU e, diariamente, até o sacrifício, no 10º

dia. Em outro ciclo de experimentos, os animais receberam salina, suspensão de

GLU ou de AL-GLU (100 mM) uma hora antes do 5-FU e, diariamente, até o

sacrifício, nos 10

e 14

dias. A mucosite intestinal foi induzida pela administração de

MTX (2,5 mg/kg; s.c.) nos primeiros três dias de experimentos, em ratos Wistar. Os

animais foram tratados com AG (10 mg/Kg; i.p.), ou L-NAME (20 mg/Kg; i.p.), uma

hora antes do MTX e, diariamente, até o sacrifício, no 5º dia. Na investigação do

papel do NO na mucosite oral induzida por 5-FU, os seguintes parâmetros foram

avaliados: análises micro e macroscópica, atividade de mieloperoxidade (MPO) e da

NOS, níveis teciduais de nitrito, imunohistoquímica para NOSi e detecção de morte

celular. O efeito do 5-FU na produção salivar também foi avaliado. No estudo dos

efeitos da GLU e AL-GLU, análises micro e macroscópicas, atividade de MPO,

detecção de morte celular, estoques teciduais de glutationa e concentração sérica

de glutamina foram os parâmetros avaliados. No estudo do papel do NO na mucosite

intestinal, foram realizados análise histopatológica, medida da altura de vilos nos três

segmentos do intestino delgado, atividade de MPO, detecção de apoptose, assim

como, western blot e imunohistoquímica para NOSi. 1400W e AG, contrariamente ao

L-NAME, reduziram os parâmetros macro e microscópicos da mucosite oral e a

infiltração de células inflamatórias, detectada na histopatologia e na atividade de

MPO. Foram observados ainda, no 10º dia, maior atividade da NOS e marcação

imunohistoquímica para NOSi. 1400W reverteu a diminuição da secreção salivar

induzida por 5-FU. A mucosite oral induzida por 5-FU resultou na diminuição dos

níveis séricos de glutamina, bem como dos estoques teciduais de glutationa, no 10º

dia, efeitos que foram revertidos pela administração de GLU e AL-GLU. Apesar de

não ter prevenido a mucosite oral no 10º dia, o tratamento com GLU ou AL-GLU

reduziu os parâmetros macro e microscópicos da mucosite oral, e a atividade de

MPO, no 14º dia. Na mucosite intestinal, AG e L-NAME preveniram o encurtamento

de vilos e reduziram a necrose de criptas, assim como o infiltrado inflamatório,

efeitos induzidos pelo MTX, sendo esse último constatado pela análise

histopatológica e atividade de MPO. Foi detectado maior marcação

imunohistoquímica para NOSi no jejuno de ratos submetidos à mucosite intestinal.

Esses resultados sugerem o papel relevante do NO na fisiopatologia das mucosites

oral e intestinal. O presente estudo demonstrou ainda que a GLU e AL-GLU

aceleraram a recuperação da mucosa dos animais submetidos a mucosite oral por 5-

FU, aumentando os níveis teciduais de glutationa, reduzindo a inflamação e

promovendo reepitelização.

Palavras-chaves: óxido nítrico, mucosite, óxido nítrico sintase, glutamina, 5-

fluorouracil, metotrexato.

xii

ABSTRACT

Mucositis induced by antineoplastic drugs is an important, dose-limiting and costly

side effect of cancer therapy, which pathophysiology is not completely understood.

The aim of the present study was to investigate the role of nitric oxide (NO) on the

pathogenesis of oral and intestinal mucositis induced by 5-fluorouracil (5-FU) and

methotrexate (MTX) and the effect of glutamine (GLU) and alanyl-glutamine (AL-

GLU) on 5-FU-induced experimental mucositis. Oral mucosistis was induced by two

intraperitoneal (i.p) administrations of 5-FU on the 1

and 2

days (60 and 40 mg/kg,

respectively) in hamsters. Animals were treated subcutaneously (s.c.) with the nitric

oxide synthase (NOS) inhibitors N-(3-(Aminomethyl)benzyl)acetamidine (1400W; 1

mg/kg), aminoguanidine (AG; 5 or 10 mg/kg), Nϕ-Nitro-L-Arginine Methyl Ester (L-

NAME; 5, 10 or 20 mg/kg) or saline (0.4 ml), one hour before the injections of 5-FU

and daily until sacrifice, on the 10

day. In another set of experiments, animals

received saline, GLU or AL-GLU suspension (100 mM) one hour before the injections

of 5-FU and daily until sacrifice, on the 10

or 14

day. Intestinal mucositis was

induced by three administrations of MTX (2.5 mg/kg; s.c.) on the first three days of

the experiment, in Wistar rats. Animals were treated i.p. with AG (10 mg/Kg), or L-

NAME (20 mg/Kg), one hour before the injections of MTX and daily until sacrifice, on

the 5

day. In the investigation of the role of NO on 5-FU induced oral mucositis, the

following parameters were evaluated: microscopic and macroscopic analysis,

myeloperoxidade (MPO) and NOS activities, nitrite level, immunohistochemistry for

NOSi, salivary secretion, and cell death. In order to study the effect of GLU and AL-

GLU, microscopic and macroscopic analysis, MPO activity, cell death, glutathione

stores and the serum concentration of glutamine, were evaluated. In the MTX-

induced intestinal mucositis, histopathological analysis was evaluated and the villus

height in all three small intestine segments was measured. MPO activity, cell death,

as well as, western blot and immunohistochemistry to evaluated the expression of the

NOSi, were also conducted. 1400W or AG, but not L-NAME, reduced macroscopic

and histological parameters of oral mucositis, and reduced the inflammatory cell

infiltration as detected on histopathology and by MPO activity. Increased NOS activity

and immunostaining for NOSi were detected. 5-FU induced a decrease in salivary

secrection, observed on 4

day, and this effect was prevented by 1400W. The 5-FU-

induced oral mucositis significantly decreased the serum GLU level as well as the

cheek pouch glutathione stores, observed on day 10. GLU or AL-GLU reversed the

5-FU effects, restoring serum GLU levels and cheek pouch glutathione stores,

observed on day 10, but did not prevent oral mucositis at this time. However, GLU

and AL-GLU reduced macroscopic and histological parameters of oral mucositis, and

reduced the MPO activity on day 14. In the MTX-induced mucositis, AG and L-NAME

significantly prevented villous blunting, lamina propria cell death, and reduced crypt

necrosis induced by MTX, decreasing neutrophil infiltration as detected by

histopathology and by MPO activity. These data were associated with the detection

of iNOS expression by Western blot and by immunohistochemistry in the jejunum

tissue. These results suggest an important role of NO in the pathogenesis of oral and

intestinal mucositis induced by 5-FU and MTX. The present study also demonstrated

that GLU or AL-GLU hastens mucosal recovery increasing mucosal tissue

glutathione stores, reducing inflammatory parameters and speeding reepithelization.

Key-words: nitric oxide, mucositis, nitric oxide synthase, glutamine, 5-fluorouracil,

methotrexate.

xiii

SUMÁRIO

LISTA DE ILUSTRAÇÕES.....................................................................................v

LISTA DE TABELAS............................................................................................vii

LISTA DE ABREVIATURAS................................................................................viii

RESUMO................................................................................................................x

ABSTRACT...........................................................................................................xii

1 INTRODUÇÃO 1

1.1 Mucosite oral 1

1.2 Mucosite intestinal 9

1.3 Antimetabólitos 12

1.3.1 5-Fluorouracil 13

1.3.2 Metotrexato 14

1.4 Abordagem farmacológica 17

1.4.1 Óxido Nítrico (NO) 17

1.4.2 Glutamina e alanil-glutamina 21

1.5 Justificativa e objetivos 26

2 MATERIAIS E MÉTODOS 27

2.1 Animais 27

2.1.1 Mucosite oral 27

2.1.2 Mucosite intestinal 28

2.2 Drogas, Anticorpos, Soluções, Líquidos e Corantes

utilizados

2-3 Protocolos experimentais 29

2.3.1 Mucosite oral induzida por 5-Fluorouracil (5-FU) em

hamsters

2.3.1.1 Modelo experimental 29

2.3.1.2 Grupos experimentais 31

2.3.1.2.1 Grupos controles 31

2.3.1.2.2 Grupo tratado com L-NAME 32

2.3.1.2.3 Grupo tratado com aminoguanidina 32

2.3.1.2.4 Grupo tratado com 1400W 32

xiv

2.3.1.2.5 Grupo tratado com Glutamina 33

2.3.1.2.6 Grupo tratado com Alanil-glutamina 33

2.3.1.3 Parâmetros avaliados tanto para o estudo do papel do óxido

nítrico, quanto para o estudo do efeito da alanil-glutamina e

glutamina na mucosite oral induzida por 5-FU

2.3.1.3.1 Análise macroscópica das mucosas jugais 33

2.3.1.3.2 Análise histopatológica das mucosas jugais 34

2.3.1.3.3 Dosagem de mieloperoxidase 35

2.3.1.3.4 Imunohistoquímica pelo método de TUNEL (TdT- mediated

dUTP Nick end-labeling)

2.3.1.4 Parâmetros avaliados no estudo do papel do óxido nítrico na

mucosite oral experimental

2.3.1.4.1 Determinação da atividade da nítrico óxido sintase (NOS) 36

2.3.1.4.2 Dosagem de nitrito 37

2.3.1.4.3 Imunohistoquímica para detecção da enzima óxido nítrico

sintase induzida (NOSi)

2.3.1.4.4 Avaliação da taxa de salivação não estimulada 39

2.3.1.5 Parâmetros avaliados no estudo do efeito da glutamina e

alanil-glutamina na mucosite oral experimental

2.3.1.5.1 Deteminação da concentração sérica de glutamina 39

2.3.1.5.2 Determinação de grupos sulfidrílicos não protéicos 39

2.3.2 Mucosite intestinal induzida por metotrexato em ratos. 40

2.3.2.1 Modelo de mucosite intestinal 40

2.3.2.2 Grupos experimentais 41

2.3.2.2.1 Grupos controles 42

2.3.2.2.2 Grupo tratado com L-NAME 42

2.3.2.2.3 Grupo tratado com L-NAME e L-arginina 42

2.3.2.2.4 Grupo tratado com aminoguanidina 42

2.3.2.3 Parâmetros avaliados 43

2.3.2.3.1 Análise morfométrica 43

2.3.2.3.2 Estudo imunohistoquímico para detecção de NOSi e

imunohistoquímica pelo método de TUNEL (TdT-mediated

dUTP Nick end-labeling)

2.3.2.3.3 Análise por Western Blot 43

2.4 Análise estatística

3 RESULTADOS

3.1 Efeito do óxido nítrico na mucosite oral induzida por 5-

fluorouracil

3.1.1 Efeito dos inibidores de NOS, L-NAME, AG e 1400W sobre

as mucosas jugais de hamsters submetidos à mucosite oral

induzida por

3.1.1.1 Análise Macroscópica

3.1.1.2 Análise Microscópica 45

3.1.2 Efeito do L-NAME, aminoguanidina e 1400W sobre a

atividade de mieloperoxidase nas mucosas jugais de

hamsters submetidos à mucosite oral experimental

3.1.3 Efeito 5-fluorouracil sobre a atividade da NOS na mucosas

jugal de hamsters submetidos à mucosite oral experimental

3.1.4 Efeito do 1400W sobre a dosagem de nitrito das mucosas

jugais de hamsters submetidos a mucosite oral por 5-FU

3.1.5 Efeito da aminoguanidina e 1400W na marcação

imunohistoquímica para nitrico óxido sintase induzida

(NOSi)

3.1.6 Efeito da aminoguanidina e 1400W na marcação de células

TUNEL positivas, como indicativo de apoptose

3.1.7 Efeito do 1400W na produção salivar não estimulada de

animais submetidos à mucosite experimental

3.2 Efeito do óxido nítrico na mucosite intestinal induzida

por metotrexato (MTX)

3.2.1 Efeito dos inibidores da NOS, AG e L-NAME, sobre as

alterações morfométricas e histopatológicas observadas em

animais submetidos à mucosite intestinal induzida por

metotrexato

3.2.2 Efeito da AG e L-NAME sobre a atividade de

mieloperoxidase em jejuno de animais submetidos à

mucosite intestinal por MTX

3.2.3 Efeito do MTX na marcação imunohistoquímica para NOSi e

de células TUNEL positivas

3.2.4 Western Blot 67

3.3 Efeito da glutamina e alanil-glutamina na evolução da

mucosite oral induzida por 5-FU

3.3.1 Efeito da glutamina e alanil-glutamina sobre as mucosas

jugais de hamsters submetidos à mucosite oral induzida por

5-FU

3.3.1.1 Análise Macroscópica 68

3.3.1.2 Análise Microscópica 69

3.3.2 Efeito 5-FU sobre os níveis de glutamina no soro de

hamsters..

3.3.3 Efeito da glutamina e alanil-glutamina sobre os estoques de

glutationa nas mucosas jugais dos hamsters submetidos à

mucosite oral experimental

3.3.4 Efeito glutamina e alanil-glutamina sobre a atividade de

mieloperoxidase observada nas mucosas jugais de

hamsters submetidos à mucosite oral experimental

3.3.5 Efeito da glutamina e alanil-glutamina na marcação de

células TUNEL positivas, como indicativo de apoptose

xvi

4 DISCUSSÃO

5 CONCLUSÕES

6 REFERÊNCIA

7 ANEXOS

124

xvii

1 INTRODUÇÃO

1.1 Mucosite oral

Mucosite é um termo clínico que descreve uma síndrome caracterizada por

ulceração da mucosa do trato digestivo, resultando em dor, disfagia, diarréia e

disfunção, dependendo do tecido afetado (SONIS; FAY, 2002; SONIS, 2004;

SCULLY et al., 2006). Consiste em um efeito adverso comum nos pacientes

portadores de câncer submetidos à tratamentos com agentes quimioterápicos

diversos, em especial os antimetabólitos e/ou, radioterapia na região de cabeça e

pescoço (ALTMANN, 1974; CABALLERO et al., 1985; BALIS et al, 1985; ROTH et

al., 1991; MAGRATH et al, 1984; BISHOP et al, 1986; SCULLY et al; SCULLY et al,

2003; SCULLY et al, 2004; SCULLY et al, 2006). Deve-se aos efeitos não

específicos das drogas antineoplásicas, lesando tanto as células malignas quanto as

normais, em processo de divisão celular ativo.

A forma oral caracteriza-se principalmente pela presença de lesões

ulcerativas (estomatites) dolorosas e responsáveis por grave desconforto local. Os

pacientes queixam-se principalmente de dor intensa, muitas vezes impedindo-os de

se alimentar normalmente, o que agrava seu estado nutricional e, como

conseqüência, o estado geral, podendo haver a necessidade de sondas

nasogástricas, hospitalização e, nos casos mais graves, interrupção temporária ou

definitiva do tratamento, o que resulta no aumento dos custos e comprometimento

do prognóstico do caso (SCULLY et al., 2006).

O diagnóstico é clínico e baseia-se no uso de agentes notadamente

estomatotóxicos e na localização das lesões orais. A mucosite induzida pela

quimioterapia acomete mais comumente áreas não queratinizadas, incluindo as

mucosas bucal e labial, assoalho da boca, porção ventral da língua e palato mole,

raramente afetando o dorso da língua, o palato duro e a gengiva (McCARTHY et al.,

1998), enquanto que a mucosite decorrente de radiação, além da mucosa móvel,

acomete também o palato duro (SCULLY et al., 2006). O diagnóstico diferencial

deve ser feito para infecções virais e doenças do tipo enxerto contra hospedeiro. As

infecções virais diferem clinicamente da mucosite oral por serem localizadas na

mucosa queratinizada do palato duro, gengiva e dorso da língua e o seu

aparecimento geralmente coincide com febre. A síndrome enxerto contra hospedeiro

é limitada à pacientes submetidos à transplante de células hematopoiéticas e

desenvolve-se após a recuperação hematológica (cerca de 21 dias após o

transplante), consistindo de lesões orais normalmente liquenóides e, muito

freqüentemente, associado à xerostomia (WOO et al., 1997).

Embora seja difícil prever se determinado paciente irá desenvolver mucosite

apenas em decorrência das drogas administradas, alguns fatores predispõem o

desenvolvimento de mucosite oral. Fatores relacionados ao tratamento, tais como o

quimioterápico utilizado, a dose, o esquema posológico e a via de administração

(SCULLY et al., 2006), e fatores predisponentes do paciente, como saúde bucal

deficiente, pouca produção salivar, traumas por restaurações ou próteses mal-

adapatadas, focos de infecção, idade e até mesmo debilidades sistêmicas podem

propiciar o aparecimento e definir a severidade da mucosite. Quanto mais jovem o

paciente, maior a probabilidade de desenvolver mucosite oral (PLEOVA, 1999;

KOSTLER et al., 2001; DENHAM; HAUER-JENSEN, 2002; SONIS; FAY, 2002;

BARASCH; PETERSON, 2003; DUNCAN; GRANT, 2003). Os efeitos colaterais

bucais em crianças abaixo dos 12 anos de idade aumentam em mais que o dobro

que nos pacientes adultos. Parece provável que o índice mitótico elevado das

células da mucosa bucal, neste grupo etário, seja um fator adjuvante (MCCARTHY

et al., 1998).

A diminuição da produção salivar (xerostomia) tem sido relatada em pacientes

com câncer no trato gastrointestinal tratados com 5-fluorouracil (5-FU) (McCARTHY

et al., 1998), assim como em pacientes irradiados por tumores de cabeça e pescoço

(ROSARIO et al., 2005). Estudos demonstram que uma produção salivar adequada

é imprescindível para a manutenção da saúde oral. A saliva contém imunoglobulinas

secretórias (anticorpos) contra os microorganismos na boca, e a lizosima, que

hidroliza um componente importante das membranas externas de bactérias. Na

ausência de anticorpos e lisozima, os organismos que causam a infecção bucal e

cáries dentárias proliferam (MANDEL, 1987; LEVINE, 1989; WOLFF et al., 1990). A

combinação dos efeitos citotóxicos do quimioterápico no epitélio oral, e os efeitos da

xerostomia, que predispõe a mucosa à injúria, justifica a presença aumentada de

mucosite oral em pacientes com pouca produção salivar (McCARTHY et al., 1998).

Além disso, devido ao seu efeito lubrificante, a saliva é importante na mastigação e

deglutição dos alimentos. Sua liberação reduzida pode comprometer a nutrição do

indivíduo acometido e, como conseqüência, seu quadro geral, deixando-o mais

susceptível à infecções secundárias.

Tem sido descrito uma incidência de mucosite em aproximadamente 40% dos

pacientes em uso de vários agentes quimioterápicos (ALTMANN, 1974;

CABALLERO et al, 1985; BALIS et al, 1985; ROTH et a., 1991; MAGRATH et al,

1984; BISHOP et al, 1986; SCULLY et al., SCULLY et al., 2003; SCULLY et al.,

2004; SCULLY et al., 2006). A combinação de diferentes drogas antineoplásicas

aumenta essa incidência de 40 para 70% (CABALLERO et al, 1985; BALIS et al,

1985; ROTH et a., 1991; SCULLY et al., 2006). Nos tratamentos prévios com quimio

ou radioterapia para transplante de células hematopoiéticas, a ocorrência de

mucosite chega a atingir 75 a 99%, dos pacientes, particularmente nos casos em

que se associa irradiação e quimioterapia (DONNELLY et al., 1992; BLIJLEVENS et

al., 2000).

Essa complicação oral da quimioterapia ocorre através de dois mecanismos

principais: efeito direto do quimioterápico na mucosa oral (estomatotoxicidade direta)

ou efeito indireto resultante da mielossupressão (estomatotoxicidade indireta)

(SONIS, 2004; DUNCAN; GRANT, 2003). No início, as lesões são geralmente

discretas, sendo comum a progressão para áreas confluentes de ulceração.

Apesar do efeito direto dos quimioterápicos na renovação do epitélio e,

conseqüente perda de sua capacidade regenerativa, ser um fator chave no

desenvolvimento das ulcerações características da mucosite oral, tem-se valorizado,

mais recentemente, a participação da submucosa no desencadeamento e

severidade dessa desordem (SONIS, 1998; SONIS; FAY, 2002; DUNCAN; GRANT,

2003; SONIS et al., 2004, SCULLY et al., 2006).

Sonis e colaboradores descreveram a mucosite oral como um processo

complexo, no qual ocorre a seguinte seqüência de eventos biológicos interligados:

iniciação, resposta primária ao dano, sinalização (e amplificação), ulceração e,

finalmente, cicatrização (SONIS et al., 2004; SCULLY et al., 2006). A manifestação

de todos os estágios não ocorre obrigatoriamente em todos os casos. Portanto, uma

mucosite branda, com poucos danos à mucosa, rápida recuperação e proliferação

epitelial, evita a ocorrência da fase ulcerativa, a mais sintomática (SONIS, 1998;

SONIS; FAY, 2002).

A fase de iniciação ocorre logo após a radiação ou quimioterapia. A injúria

celular direta das células epiteliais basais ocorre simultaneamente com a geração de

estresse oxidativo e liberação de espécies reativas de oxigênio (SONIS et al., 2004,

2006). De fato, estudos demonstram claramente a presença dessas espécies

reativas após exposição a agentes estomatotóxicos (GATE et al, 1999), assim como

atenuação da mucosite oral por agentes que bloqueiam, ou são varredores desses

radicais livres (CULY; SPENCER, 2001). A geração dos radicais tóxicos de oxigênio

e sua capacidade de estimular uma série de fatores de transcrição caracterizam a

resposta aguda do tecido ao agente quimioterápico e consiste no marco da fase

inicial da mucosite, que, segundo Sonis, precede os outros eventos biológicos

(SONIS et al., 2004).

A resposta primária ao dano, observada nas células e tecidos da submucosa,

é caracterizada pela expressão de genes de resposta precose, c-jun, c-fos e Erg I, e

pela ativação de fatores de transcrição, como fator nuclear-κB (NF-κB) (SCULLY et

al., 2006).

Normalmente o NF-κB encontra-se no citoplasma na sua forma inativa, ligado

à proteína inibitória, IκB. Vários estímulos inflamatórios, incluindo agentes

quimioterápicos, radioterapia e citocinas inflamatórias, são capazes de ativá-lo,

dissociando-o da IκB, através da fosforilação dessa proteína por kinases específicas

(BARNES, 1997). A dissociação da IκB resulta na translocação do NF-κB para o

núcleo, onde liga-se a sítios específicos de genes inflamatórios e imunes, regulando

a produção de várias proteínas e moléculas como, citocinas pró-inflamatórias,

[interleucina-1 (IL-1), interleucina-6 (IL-6) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α)],

óxido nítrico, enzimas e moléculas de adesão. Os resultados são injúria tecidual e

apoptose. Estudos sugerem que a ativação do NF-κB, tanto pelos agentes

quimioterápicos como pela radioterapia, é um elemento chave na gênesis da

mucosite. A regulação positiva de outros genes resulta na expressão de moléculas

de adesão, ativação da via da ciclooxigenese-2 e, conseqüente angiogênese

(SONIS et al., 2004, 2006).

A participação do óxido nítrico (NO) na mucosite oral induzida por radiação foi

sugerida por Sonis, através da detecção da expressão da enzima óxido nítrico

sintase induzida (NOSi), envolvida na síntese de óxido nítrico (NO), através de RT-

PCR (reverse transcriptase-polymerase chain reaction), em tecido de mucosa jugal

de hamsters (SONIS et al., 2002). A participação do NO na mucosite oral induzida

por quimioterápicos, no entanto, não tinha sido demonstrada até a publicação dos

resultados que serão apresentados no presente estudo.

Pararelo à ativação do NF-κB, enzimas, como a esfingomielinase e a

ceramida sintetase, que catalizam a síntese de ceramida, são ativadas diretamente

pela quimio e/ou radioterapia, ou indiretamente, pelas espécies reativas de oxigênio

e TNF-α. A via da ceramida induz apoptose tanto em células submucosas, como

epiteliais (MADDENS et al, 2002). Adicionalmente, a destruição da fibronectina

também ocorre nessa fase da mucosite oral, resultando na ativação de macrófagos e

subseqüente injúria tecidual, mediada pelas metaloproteinases e produção adicional

de TNF-α (SONIS et al., 2004).

Em resumo, a liberação de mediadores inflamatórios, em resposta à quimio

ou radioterapia, resulta em uma série de feedbacks positivos, amplificando e

prolongando a injúria tecidual, através de seus efeitos nos fatores de transcrição e

nas vias da ceramida e caspases, resultando em apoptose e liberação de mais

mediadores inflamatórios como as citocinas pró-inflamatórias TNF-α, IL-1β e IL-6.

Corroborando com esses dados, um estudo recente de nosso laboratório

demonstrou efeito protetor da pentoxifilina e talidomida, inibidores da síntese de

citocinas, na mucosite oral induzida por 5-FU, em hamsters (LIMA et al, 2005).

A fase seguinte, denominada ulcerativa é a mais sintomática e usualmente

ocorre durante o período de grave neutropenia do paciente. A injúria e morte das

células basais epiteliais, resultante das fases anteriores, resultam em mudanças

atróficas que culminam na real deteriorização e quebra da mucosa. Nessa fase é

comum a infecção secundária, visto que a úlcera serve de foco para a colonização

de microorganismos. Os agentes etiológicos mais associados a essa infecção são

principalmente bactérias da própria flora oral, assim como bactérias oportunistas

gram negativas (Escherichia coli, Klebsiella pneumoiae, Enterobacter cloacae,

Pseudomonas aeruginosa), micoorganismos gram-positivos (Streptococcus mitis, S.

oralis, S. sanguis e staphylococci), além de fungos como a Candida albicans e

outras espécies de Candida, como kruseitropicalis, parapsilosis, glabrat, aspergillus

e vírus (WINGARD et al, 1991; MCCARTHY; SKILLINGS, 1992; EPSTEIN; WONG,

1994; FELD, 1997). Os produtos da parede celular de bactérias penetram na

submucosa estimulando a liberação de mais citocinas pró-inflamatórias, o que

resulta em inflamação, dor, possíveis infecções secundárias ou influxo sistêmico de

microorganismos e toxinas que, associado à neutropenia induzida pelas drogas

antineoplásicas, aumenta o risco de bacteremia e septicemia (ETING et al. 1992).

De fato, estudos sugerem que o uso profilático de agentes antifúngicos, absorvidos,

ou parcialmente absorvidos pelo trato gastrointestinal, como por exemplo, o

fluconazol, reduz as manifestações clínicas de candidíase oral e infecção sistêmica

(WORTHINGTON; CLARKSON, 2002).

A fase seguinte, de cicatrização, é biologicamente dinâmica, com sinalização

da matriz submucosa extracelular, estimulando a migração, diferenciação e

proliferação do epitélio. Além disso, observam-se o retorno da flora microbiana

normal e a recuperação do número de leucócitos (SONIS et al., 2004; 2006).

Em geral, as alterações iniciais da mucosite oral tornam-se evidentes dentro

de quatro a cinco dias após o início da quimioterapia. A lesão atinge seu auge, com

o aparecimento de úlceras, dentro de sete a dez dias após a última dose, e, a seguir,

observa-se a cicatrização da mucosa nas próximas três semanas (SCULLY et al.,

2006). O desenvolvimento da mucosite oral, em hamsters, apresenta-se semelhante

ao observado em humanos. Estudos prévios de nosso laboratório (LIMA et al.,

2005) demonstraram que as mucosas orais de hamsters submetidos à mucosite oral

por 5-FU e trauma mecânico, no 4º dia de experimento, apresentaram aspectos

gerais semelhantes aos da normalidade. As lesões mostraram-se significantes

somente a partir do 5º dia após o início da quimioterapia ou um dia após o trauma

mecânico, verificando-se eritema e hiperemia acentuados, presença de hemorragia,

de úlceras extensas, mas ausência de abscessos. É importante ressaltar que o

trauma mecânico, preconizado por Sonis e colaboradores, consiste em ranhuras na

mucosa oral, realizadas com uma agulha de ponta romba, a fim de mimetizar os

efeitos clínicos de uma irritação crônica, comumente observada em humanos, tais

como o trauma causado por restaurações ou próteses mal adaptadas (SONIS et al.,

1990). A seguir, a lesão atingiu o auge no 10º dia, tendo sido constatado hiperemia e

eritema acentuados, hemorragia, úlceras extensas e abscessos. A partir do 12º dia,

as alterações inflamatórias tornaram-se significantemente reduzidas, observando-se

no 14º dia, hiperemia e eritema moderados, ausência de hemorragia, de úlceras e

abscessos, além de áreas de tecido em cicatrização. Finalmente, no 16° dia

experimental, os aspectos avaliados encontraram-se praticamente resolvidos,

condizentes com as características da normalidade (LIMA et al., 2005).

Portanto, o modelo proposto por Sonis e colaboradores (SONIS et al, 1990) e

modificado em nosso laboratório para o estudo da mucosite oral experimental,

mostrou-se capaz de reproduzir experimentalmente os principais achados na

mucosite oral em humanos (LIMA et al., 2005; LEITÃO et al., 2007), permitindo uma

investigação mais profunda do desenvolvimento dessa alteração inflamatória. No

entanto, é importante levar em consideração o fato da mucosite oral humana ser,

sobretudo, uma lesão multifatorial, contribuindo para o seu surgimento e a sua

evolução, não apenas os efeitos estomatotóxicos diretos da quimioterapia

antineoplásica, mas também, fatores locais como bactérias e suas toxinas,

patógenos virais ou fúngicos, além de vários aspectos facilitadores da solução de

continuidade da mucosa oral, como por exemplo, a irritação decorrente de

restaurações ou próteses mal-adaptadas (McCARTHY et al., 1998; WILKES 1998).

O tratamento padrão para mucosite oral induzida por quimioterapia é

essencialmente paliativo, com suportes analgésico e nutricional. O conhecimento

adequado da fisiopatologia dessa alteração inflamatória é fundamental para a busca

de meios preventivos e terapêuticos que permitam melhoria significativa da

qualidade de vida dos pacientes acometidos, evitando a redução das doses dos

quimioterápicos, ou até mesmo a interrupção temporária ou definitiva do tratamento.

Atualmente tem-se utilizado algumas estratégias objetivando reduzir a

exposição dos tecidos orais aos agentes quimioterápicos. O uso de gelo

(crioterapia), levando ao resfriamento da mucosa e, conseqüente vasoconstricção,

tem sido de grande valia para tratamentos com drogas de meia-vida curta. Estudos

demonstram que o uso de gelo, cinco minutos antes da aplicação de 5-FU em bolus,

e mantido na boca por 30 minutos, reduziu a mucosite oral em torno de 50%

(MAHOOD et al., 1991; ROCKE et al., 1993; CASCINU et al., 1994). O efeito

benéfico da crioterapia tem sido descrito também em pacientes tratados com

metotrexato e melfalan (DUMONTET et al., 1994; MELONI et al., 1996).

Agentes que reduzem momentaneamente a excreção salivar, como os

antagonistas muscarínicos propantelina e pilocarpina, têm sido utilizados, em

algumas situações, na tentativa de reduzir a exposição tópica da mucosa oral às

drogas quimioterápicas excretadas na saliva. Os resultados, no entanto, são

conflitantes. Estudos demonstraram que a propantelina foi capaz de reduzir a

mucosite oral associada ao uso de etoposida (AHMED et al., 1993), e à combinação

de etoposida, ifosfamida e carboplatina (OBLON et al., 1997). Da mesma forma, o

uso de pilocarpina na prevenção da mucosite oral tem-se mostrado benéfico em

alguns estudos (AWIDI et al., 2001; JONHSON et al., 1993), enquanto que, em

outros trabalhos, não foi constatado nenhum efeito (WARDE et al., 2002;

LOCKHART et al., 2005; SCARANTINO et al., 2006).

Produtos naturais como a camomila (Matricaria reculita), devido à seus

componentes antiiflamatórios, também têm sido testados na prevenção da mucosite

oral, apresentando, no entanto, poucos resultados positivos (SCULLY et al., 2006)

Estudos recentes de nosso laboratório obtiveram resultados benéficos com

aplicações tópicas, em forma de gel, de babosa (Aloe barbadensis) e aroeira

(Myracrodruon urundeuva) na prevenção da mucosite oral experimental induzida por

5-FU (SANTANA et al., 2006).

O fator estimulador de colônia granulócito-macrófago (GM-CSF), tanto na

forma de bochechos bucais (IBRAHIM; MULHIM, 1997), como por via subcutânea,

tem apresentado resultados benéficos em vários estudos clínicos, reduzindo a

severidade e duração da mucosite oral relacionada ao uso de vários agentes

quimioterápicois (GABRILOVE et al., 1988; CRAWFORD; O´ROURKE, 1994; CHI et

al., 1995; ROSSO et al., 1997; KARTHAUS et al., 1998), constituindo um importante

agente terapêutico, juntamente com o fator transformador de crescimento beta (TGF-

β3) (SPIJKERVET; SONIS, 1998).

Outras abordagens preventivas e terapêuticas têm sido investigadas com

sucesso, como por exemplo, o uso do antiinflamatório benzidamina e do fator de

crescimento queratinócito (KGF) (SCULLY et al., 2006), enquanto várias outras não

apresentaram resultados conclusivos, como o uso tópico de prostaglandina E2, de

vitamina E (devido seus efeitos antioxidantes), de pentoxifilina, da interleucina

antiinflamatória-11 (IL-11), assim como bochechos de clorexidina, clindamicina, ou

fluconazol (DONNELLY et al., 2003).

Em suma, os vários estudos sobre prevenção e tratamento da mucosite oral

como efeito colateral da quimio e radioterapia, demonstram que nenhuma

intervenção isolada é capaz de prevenir completamente a mucosite oral. Futuras

pesquisas deverão ser delineadas a fim de avaliar a combinação adequada das

diversas intervenções disponíveis para esse fim. Somente o esclarecimento da

fisiopatologia dessa condição inflamatória, no entanto, permitirá o desenvolvimento

de novas terapias eficazes na prevenção e tratamento da mucosite oral, utilizando

apenas um único agente terapêutico.

1.2 Mucosite intestinal

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Apesar do efeito imunossupressor do MTX, o sistema imune da mucosa ainda

é capaz de responder ao estímulo bacteriano (KONING et al., 2006), com

conseqüente ativação de fatores de transcrição e regulação positiva de vários

genes, resultando na ativação de processos pró- e anti-inflamatórios. Tem sido

relatado, de fato, tanto a participação da citocina pró-inflamatória TNF-α, quanto o

papel anti-inflamatório da IL-10 na fisiopatologia da mucosite intestinal por MTX

(KONING et al., 2006). Estudos realizados em nosso laboratório confirmaram a

participação TNF-α na fisiopatologia da mucosite intestinal induzida por MTX, em

ratos (LIMA et al., 2004).

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1.3 Antimetabólitos

Os antimetabólitos apresentam forte semelhança estrutural com o ácido fólico

e as bases purina e pirimidina envolvidas na síntese de DNA, RNA e determinadas

enzimas. Atuam como substratos falsos em reações bioquímicas, inibindo etapas de

síntese ou incorporando-se a moléculas e interferindo na função ou replicação

celular (KAUFMA; CHABNER, 2001).

Os agentes antimetabólicos exercem seus efeitos principalmente por

bloquearem bioquimicamente a síntese de DNA e, portanto, são restritos á fase S do

ciclo celular (KAUFMA; CHABNER, 2001). Dentre esses diferentes fármacos,

destacam-se o 5-fluorouracil (5-FU), análogo da pirimidina, e o metotrexato (MTX),

antagonista do ácido fólico, largamente utilizados no tratamento de vários tipos de

câncer e selecionados para o presente estudo, sobretudo por seus efeitos colaterais

nas células do trato-gastrointestinal, resultando em mucosites, particularmente nas

mucosas oral e intestinal.

A mucosite no trato gastrointestinal, de fato, é um efeito colateral que

acomete aproximadamente 40% dos pacientes tratados com vários agentes

quimioterápicos, dentre os quais, o 5-FU e o MTX (BALLIS et al., 1985; ROTH et al.,

1991; CABALLERO et al., 1985).

1.3.1 5-Fluorouracil

A síntese das pirimidinas fluoradas deveu-se à observação de que células de

hepatoma de rato utilizavam uracil radiomarcado mais avidamente do que as células

normais. Esse estudo sugeriu o envolvimento de diferentes caminhos enzimáticos

para o uso do uracil e, possivelmente, de seus análogos, entre as células malignas e

normais, o que poderia ser útil na diminuição dos efeitos adversos de agentes

quimioterápicos que interferissem com a utilização da uracila (RUTMAN et al., 1954).

De fato, embora não se tenha ainda descoberto qualquer propriedade bioquímica

peculiar compartilhada com todas as células cancerosas, as células neoplásicas

possuem diferenças metabólicas em comparação com as células normais, tornando-

as mais susceptíveis aos diversos antimetabólitos.

O 5-fluorouracil foi introduzido em 1958 e está incluído entre os fármacos de

maior utilidade para o tratamento de tumores sólidos e leucemias, devido à seus

múltiplos efeitos sobre o crescimento celular anormal (GREM, 2001). O 5-FU é uma

pirimidina fluorada, preparado a partir da substituição de um átomo de hidrogênio

por outro mais estável de flúor na posição 5 da molécula de uracil (Figura 1).

Figura 1 - Estrutura química da molécula de 5-fluorouracil

Fonte:

Pelo menos dois mecanismos primários de ação estão associados à injúria

celular por 5-FU. O primeiro e o principal, está relacionado a sua conversão

intracelular no nucleotídio “fraudulento”, monofosfato de 5-fluoro-2’-desoxiurudina

(FDUMP), no fígado. O FDUMP interage com a timidilato sintetase e co-fatores

fólicos, mas não pode ser convertido em timidilato porque, no FDUMP, o flúor

substitui o hidrogênio em C5, em que ocorreria a metilação, e esta ligação carbono-

flúor não é tão susceptível à clivagem enzimática quanto a ligação carbono-

hidrogênio. A conseqüência é a inibição da síntese de DNA, e, conseqüentemente,

do crescimento celular (McCARTHY et al. 1998). O segundo mecanismo resulta da

incorporação de um outro intermediário do metabolismo do 5-FU, o trifosfato de 5-

fluorouridina (FUTP), ao RNA, interferindo na sua função (WILKINSON et al., 1975;

PINEDO; PETERS 1988).

O 5-FU, como outros antimetabólitos, exerce suas ações sobre as células que

se encontram na fase S do ciclo celular, o que contribui para reduzir seus efeitos

colaterais, uma vez que a população de células que não se encontram nessa fase

são poupadas de suas ações (GREM, 2001). Seus efeitos adversos variam

consideravelmente de acordo com o protocolo de tratamento, dose utilizada, e via de

administração, e são mais evidentes em células com grande índice de mitoses,

como tecidos de rápida proliferação da medula óssea (resultando em

granulocitopenia e trombocitopenia), e do trato gastrointestinal, com conseqüente

manifestação de mucosite, faringite, esofagite, gastrite, colite, dentre outros (KOENI;

PATEL, 1970; PIRZADA et al., 2000). Vários estudos demonstram incidência de

mucosite como efeito colateral do 5-FU em aproximadamente 8 a 89% dos casos de

câncer coloretal (MINSKY et al., 1993; LEVI et al, 1994; ROSSO et al., 1994), 15 a

40% dos indivíduos com câncer gástricos (LACAVE et al., 1991; OHTSU et al., 1991;

PYRHONEN, et al., 1995), 4 a 74% dos casos de cabeça e pescoço (OSAKI et al.,

1992; SHIRINIAN et al., 1994) e 4 a 82% em pacientes portadores de câncer de

mama (MOHAPATRO et al., 1992; LAMAR et al., 1994).

Alopecia, dermatite, cardiotoxicidade e, mais raramente, neurotoxicidade, são

outros efeitos tóxicos relatados do 5-FU (PIRZADA et al., 2000).

1.3.2 Metotrexato

Em 1948, foi demonstrado por Farber e colaboradores que o análogo do

ácido fólico, aminopterina, foi capaz de inibir a proliferação de células leucêmicas e

produzir remissões em casos de leucemias agudas (MESSMANN; ALLEGRA, 2001).

Esse trabalho gerou grande interesse nos agentes antifolatos, também conhecidos

como antagonistas do ácido fólico. Desde então, o uso desses compostos tem-se

mostrado eficaz nos tratamentos de leucemias, câncer de cabeça e pescoço, câncer

de mama e bexiga, linfomas e corioncarcinoma (MESSMANN; ALLEGRA, 2001).

Essas drogas constituem, de fato, uma estratégia importante no tratamento do

câncer, uma vez que os folatos são essenciais para a síntese dos nucleotídios

purínicos e do timidilato, que, por sua vez, são essenciais à síntese de DNA e à

divisão celular. Além das indicações para tratamento das neoplasias malignas, os

antifolatos também têm sido utilizados como abordagem terapêutica de doenças não

malignas como psoríase, artrite reumatóide, doença enxerto-contra-hospedeiro,

infecções bacterianas e parasitárias associadas com a síndrome da imunodeficiência

adquirida (MESSMANN; ALLEGRA, 2001).

O metotrexato é o principal antagonista do ácido fólico e um dos

antimetabólitos mais largamente utilizados na quimioterapia do câncer

(MESSMANN; ALLEGRA, 2001). Sua estrutura química encontra-se representada

na figura 2.

Figura 2 - Estrutura química da molécula de metotrexato

Fonte:

Para o melhor entendimento do mecanismo de ação do metotrexato, é

necessário esclarecer que, normalmente, os folatos no sangue apresentam um único

resíduo glutâmico, mas muitos folatos intracelulares são convertidos à

poliglutamatos e são, preferencialmente, conservados no interior das células. O

metotrexato, de forma semelhante, é captado pelas células por transportadores de

ácido fólico e, como este, convertido à forma glutâmica. Os folatos têm que ser

reduzidos à tetrahidrofolato (FH

) para agir como coenzimas. Essa reação é

catalizada pela enzima diidrofolato-redutase e ocorre em duas etapas: primeiro o

folato é reduzido à diidrofolato (FH

) e, depois, a FH

. O FH

, por sua vez, funciona

como co-fator na transferência de unidades de um carbono, um processo essencial

tanto para formar timidilato e, portanto, para a síntese de DNA, como também para a

nova síntese de purinas. Durante a formação de timidilato, o FH

é novamente

convertido em FH

(Figura 3).

Figura 3 - Diagrama simplificado da ação do metotrexato na síntese da timidilato.

Legenda: A poliglutamato tetraidrofolato (FH

) age como carreador de um unidade

de carbono (FH

+ C), fornecendo um grupo metil necessário para a conversão da

2’-desoxiuridilato para 2’-desoxitimidilato pela timidilato sintetase. Esta transferência

de carbono leva à oxidação do FH

a FH

Fonte: Rang et al. (1997).

Portanto, a enzima diidrofolato-redutase tem um papel crucial na manutenção

do nível de FH

intracelular: pela redução do FH

produzido a partir da redução do

ácido fólico e aquele gerado durante a síntese de timidilato. O metotrexato inibe a

diidrofolato-redutase (apresentando maior afinidade pela enzima que o FH

) e

depleta o FH

intracelular. A reação mais sensível à depleção de FH

é a síntese de

timidilato, que resulta no bloqueio da síntese do DNA e RNA. A síntese das

proteínas também é inibida, visto que os folatos reduzidos atuam como co-fatores na

conversão da glicina em serina e da homocisteína em metionina (BLEYER 1978).

METOTREXATO

Diidrofolato-

redutase

Diidrofolato-

redutase

(-) (-)

Folatos FH

+ C

2´desoxitimidilato 2´desoxiuridilato

(-)

Os tecidos ativamente proliferativos, tais como os tumores malignos, células

do epitélio dérmico, da mucosa gastrintestinal e da bexiga, são os mais sensíveis

aos efeitos desse agente, resultando no aparecimento dos efeitos tóxicos, tais como

mielossupressão, manifestada na forma de leucopenia e trombocitopenia, que

podem resultar em infecção secundária e hemorragia, além de estomatite, faringite,

esofagite e de mucosite gastrintestinal (MESSMANN; ALLEGRA, 2001). A

ocorrência desses efeitos adversos depende da dose, do esquema terapêutico e da

via de administração da droga. A mucosite, em particular, é um importante efeito

colateral e usualmente surge por volta de 3 a 7 dias após a terapia com metotrexato.

Esta alteração, quando ocorre, é um sinal precoce de toxicidade, podendo causar

severo desconforto ao indivíduo acometido, e resultar no comprometimento do

tratamento quimioterápico (MESSMANN; ALLEGRA, 2001).

1.4 Abordagem farmacológica

1.4.1 Óxido Nítrico (NO)

Óxido nítrico é um radical livre, altamente reativo, que apresenta importantes

funções nos sistemas cardiovascular, neurológico e imune. É sintetizado a partir da

L-arginina e do oxigênio molecular pelas enzimas óxido nítrico sintases (NOS),

liberando L-citrulina como co-produto (MONCADA et al., 1991). Três isoformas de

NOS foram identificadas: uma isoforma neuronal (NOSn), inicialmente encontrada no

cérebro (BREDT; SNYDER, 1994; SESSA et al., 1992), uma endotelial (NOSe),

isolada em endotélio (LAMAS et al., 1992) e uma isoforma induzida (NOSi), isolada

inicialmente em macrófagos (XIE et al., 1992). Ambas NOSn e NOSe são

constitutivamente expressas em seus leitos de origem, e por essa razão são

referidas como enzimas NOS constitutivas (NOSc). A atividade das NOSc é

dependente da concentração citossólica de cálcio [Ca

], que aumenta em

decorrência de vários estímulos fisiológicos, liberando NO em pequenas quantidades

(concentrações picomolares).

A NOSi, por sua vez, é regulada à nível transcripcional, em resposta à

estímulos pró-inflamatórios, como citocinas pró-inflamatórias, endotoxinas, hipóxia e

estresse oxidativo, ao passo que glicocorticóides, citocinas anti-inflamatórias, como

interleucina-4 (IL-4) e interleucina-10 (IL-10) e o fator de transformação de

crescimento (TGF-ß) suprimem a produção de NO (MONCADA et al., 1991;

BOGDAN et al., 1994). A ativação da NOSi, independe da concentração do cálcio

intra-celular e resulta na liberação de grandes quantidades de NO (concentrações

nanomolares) por períodos mais longos (NATHAN; XIE, 1994). O NO produzido em

altas concentrações atua como uma molécula citotóxica contra fungos, bactérias,

protozoários e células tumorais (MONCADA, 1991; WONG; BILLIAR, 1995). Por

outro lado, essa liberação de NO têm outras conseqüências biológicas, incluindo

vasodilatação, danos teciduais aos tecidos do hospedeiro, dor, lesão tecidual e

apoptose (MONCADA et al., 1991; SZABÓ, 1996).

Efeitos paradoxais do NO têm sido apontados nas diversas pesquisas que

envolvem essa molécula, em vários tecidos e em diferentes circunstâncias,

participando tanto das funções fisiológicas normais, como da injúria tecidual. No trato

gastrointestinal, o NO regula a integridade da barreira mucosa sob condições

fisiológicas, através da modulação do fluxo sanguíneo e da inibição da agregação

plaquetária e adesão leucocitária (HUTCHESON et al., 1990; ALICAN; KUBES,

1996). De fato, estudos em cobaia demonstraram que a inibição da NOSc resultou

em ileíte, sugerindo a importância de concentrações basais de NO na proteção da

mucosa gastrointestinal (MILLER et al., 1994).

No metabolismo ósseo, níveis basais de NO parecem ser necessários para a

homeostase, uma vez ter sido demonstrado que a produção constitutiva de NO por

osteoblastos, desempenha um importante papel na regulação do crescimento

dessas células (RALSTON et al., 1995). Esses estudos sugerem ainda que a

produção de NO por osteoclastos, via NOSc, exerce uma ação supressiva autócrina

em sua atividade reabsortiva (KASTEM et al., 1994), e que a inibição desses níveis

basais pode ter um impacto dramático na reabsorção óssea localizada e na

integridade de todo o osso (SUNYER et al., 1996).

Níveis basais de NO também desempenham papeis homeostáticos no

sistema cardiovascular, via regulação da pressão sanguínea e do tônus vascular,

modulação do crescimento de células locais e proteção dos vasos contra injúrias,

eventualmente causadas pelas plaquetas e células circulantes (NASEEM, 2005). A

diminuição da liberação constitutiva de NO pode resultar em constricção das artérias

coronárias durante exercícios ou em situações de estresse e contribuir para a

isquemia de miocárdio em pacientes portadores de doença coronariana, além de

facilitar a inflamação vascular, com conseqüente formação da placa aterosclerótica

(CANON, 1998). De fato, o passo inicial para a aterosclerose é o recrutamento e

deposição local de leucócitos nas paredes arteriais (LI et al., 1993), processos

facilitados pelas moléculas de adesão, VCAM-1 (moléculas de adesão celular

vascular 1), ICAM-1 (moléculas de adesão intra celular 1), ELAM-1 (moléculas de

adesão endotélio-leucócito 1) ou E-selectinas (BEVILACQUA et al., 1987;

SPRINGER, 1990, 1994; CYBULSKY; GIMBRONE, 1991). A regulação negativa de

moléculas de adesão tais como VCAM-1, E-selectinas e, em menor proporção,

ICAM-1, por NO, tem sido descrito na literatura (DE CATERINA et al., 1995; PENG

et al., 1998) e, provavelmente deve-se à inibição do NF-κB (DE CATERINA et al.,

1995; SPIEKER et al., 1997). Juntos, esses resultados explicam, pelo menos em

parte, os efeitos antiinflamatórios de níveis basais de NO, assim como seus efeitos

na prevenção da aterosclerose.

Por outro lado, grandes quantidades de NO, produzidas pela NOSi, estão

associadas à várias patologias inflamatórias, dentre as quais, septicemia

(HUTCHESON et al., 1990; PETROS et al., 1991, 1994; FANG, 1997), psoríase

(KOLB-BACHOFEN et al., 1994), artrite (MCCARTNEY-FRANCIS et al., 1993;

STEFANOVIC-RACIC et al., 1993), esclerose múltipla (PARKINSON et al., 1997),

dentre outras. No trato gastrointestinal, a liberação de grandes quantidades de NO,

via NOSi, resulta em injúria celular e comprometimento da integridade da mucosa

intestinal, tanto em modelos experimentais quanto em humanos (POTOKA et al.,

2002; BOUGHTON-SMITH et al, 1993; MIDDLETON et al., 1993; SINGER et al.,

1996). De acordo com esse dado, o aumento da expressão e atividade da NOSi no

trato gastrointestinal foi previamente constatado em modelo de colite em rato (SEO

et al., 1995) e em modelo de ileíte em cobaia (MILLER et al., 1993), assim como no

intestino de ratos expostos à endotoxinas (TEPPERMAN et al., 1993; CHEN et al.,

1996; HOFFMAN et al., 1997). No metabolismo ósseo, foi demonstrado que altas

concentrações de NO, liberadas pela NOSi, via ativação de citocinas, estão

associadas à redução da formação óssea, observada em algumas patologias, como

na osteopenia inflamatória (PFEILSHIFTER et al., 1987), além de atuar como

estimulador da reabsorção óssea, uma vez que inibidores da NOS suprimiram a

atividade de osteoclastos isolados e inibiram a reabsorção óssea estimulada por IL-1

e TNF (RALSTON et al., 1995).

Corroborando com os vários trabalhos citados, estudos realizados em nosso

laboratório demonstraram efeitos pró-inflamatórios do NO na doença periodontal

(LEITÃO et al, 2004, 2005), artrite reumatóide (ROCHA et al., 2002) e cistite

hemorrágica (SOUZA-FILHO et al., 1997). A ferramenta farmacológica bastante

utilizada nessas pesquisas e em vários outros trabalhos descritos na literatura,

consta do bloqueio da síntese de NO, por meio de análogos estruturais da L-

arginina, que atuam como falsos substratos enzimáticos e ocupam sítios de ligação

entre a L-arginina e a NOS (KNOWLES; MONCADA, 1994). Existem disponíveis

para esse fim, vários inibidores enzimáticos, com seletividades diferentes para as

diversas isoformas da NOS, dentre os quais, foram utilizados no presente trabalho, o

inibidor não-seletivo, Nφ-Nitro-L-arginina methyl ester (L-NAME), a aminoguanidina,

mais seletiva para a NOSi (GRIFFITHS et al., 1993; MUSCARA; WALLACE, 1999) e

o N-(3-(Aminomethyl)benzyl)acetamidina (1400W), um dos inibidores disponíveis

mais seletivos para NOSi, cuja potência e seletividade foi demonstrada tanto em

estudos in vitro quanto in vivo (GARVEY et al., 1997).

A administração exógena de NO também tem sido utilizada na investigação

de seus efeitos em determinados sistemas, revelando, algumas vezes, resultados

inesperados. Em estudo realizado em nosso laboratório, a inibição da síntese de

NO, pela administração sistêmica de L-NAME ou AG, foi capaz de prevenir a perda

óssea, característica da doença periodontal. De forma contraditória, nesse mesmo

estudo, a administração exógena de NO, através da aplicação local de seu doador,

isossorbida, também reduziu significativamente a reabsorção óssea (LEITÃO et al.,

2004). Esses resultados são contraditórios, visto que tanto a inibição da liberação de

NO durante o processo inflamatório, quanto sua administração exógena, preveniram

a perda óssea. Estudos da literatura, de fato, revelam diferentes ações do óxido

nítrico no metabolismo ósseo, associadas à diferentes concentrações: níveis basais

endógenos, produzidos pela NOSc, são necessários para a homeostase, níveis

endógenos elevados, produzidos pela NOSi, ativada no processo inflamatório,

parecem estar envolvidos na reabsorção óssea, provavelmente através do

recrutamento e ativação de osteoclastos, enquanto que a administração exógena de

NO, previne a perda óssea, possivelmente pela indução de apoptose em

osteoclastos (WEI et al., 1995; RALSTON et al., 1995).

Muitos dos processos fisiológicos mediados por NO, como relaxamento do

músculo liso, neurotransmissão, inibição da agregação plaquetária e adesão

leucocitária, são mediados pelo sistema da guanilato sintase, com aumento da

produção de guanilato monofosfato cíclico (GMPc) (FRIEBE; KOESLING, 2003).

Existem evidências, porém, de que outros mecanismos não-dependentes de GMPc

possam estar envolvidos em algumas situações ( MacINTYRE et al., 1991;

RALSTON et al., 1995). Os efeitos deletérios de NO, por outro lado, estão

associados à formação de seus metabólitos ativos, como nitrito, nitrato, nitrosaminas

e, principalmente peroxinitrito, ânion citotóxico formado pela combinação do NO com

o superóxido, ambos largamente produzidos durante processos inflamatórios. Esse

composto, altamente tóxico, é responsável pela peroxidação lipídica (RUBBO et al.,

1994), oxidação dos grupamentos sulfidril de proteínas (RADI et al., 1991a,1991b),

nitração de vários tipos de proteínas contendo resíduos de tirosina e nitrosilação de

ácidos nucléicos e proteínas, resultando em alterações genéticas, perda da função

protéica, inativação de várias enzimas, incluindo enzimas mitocondriais, com

conseqüente inibição da respiração mitocondrial e apoptose (BECKMAN, 1996,

BECKMAN; KOPPENOL, 1996; ISCHIROPOULOS et al., 1992; KONG et al., 1996;

SZABO et al., 1996; MURPHY, 1999; LALA; CHAKRABORTY, 2001; WINK et al.,

1998).

1.4.2. Glutamina e alanil-glutamina

A glutamina é o aminoácido livre mais abundante no plasma e tecidos de

seres humanos (MURPHY; WSHOLME, 1999). Seu peso molecular é de 146,15

kDa. É importante ressaltar que a glutamina é instável em solução, particularmente

em ácido, ou quando estocada por períodos prolongados, podendo resultar na

geração de produtos tóxicos, como o glutamato, o que tem limitado o seu uso

(KHAN; ELIA, 1991). Esse problema, no entanto, tem sido superado pela adição de

dipeptídeos à molécula de glutamina, formando compostos estáveis e altamente

solúveis, como a alanil-glutamina. O uso da alanil-glutamina tem-se mostrado bem

tolerado, seguro (FURST et al., 1989) e eficaz, tanto em estudos clínicos (TREMEL

et al., 1994; MORLION et al., 1998), quanto experimentais (CARNEIRO et al., 2003,

2004a; BRITO et al., 2005).

A glutamina do organismo advém da produção endógena, somada à

aquisição pela dieta, apresentando uma boa absorção pelos enterócitos

(WINDMUELLER; SPAETH, 1974). A sua síntese envolve a adição de um

grupamento amino à molécula de glutamato, catalizada endogenamente pela

glutamina sintetase.

Em condições normais, a produção endógena sozinha responde pelas

necessidades de glutamina, por isso, tradicionalmente, a glutamina era considerada

um aminoácido não-essencial. No entanto, seus estoques podem ser depletados na

vigência de estados catabólicos, como trauma cirúrgico, infecção, jejum prolongado,

exercício extenuante, queimaduras extensas e infecção. Nesses casos, a

concentração de glutamina plasmática declina, podendo ficar abaixo da metade dos

valores normais, o que reflete sua maior utilização por leucócitos, enterócitos,

fibroblastos e outras células, cuja atividade é estimulada nessas situações

(DECOMBAZ et al., 1979; ASKANAZI et al., 1980; VENTE et al., 1989; LACEY;

WILMORE, 1990; PARRY-BILLINGS et al., 1990, 1992; PETERSEN et al., 1996;

FURUKAWA et al., 2000). Nesses casos, faz-se necessário um suplemento de

glutamina através da dieta, para a manutenção de seus níveis plasmáticos

fisiológicos. Por isso, a glutamina tem sido caracterizada como um aminoácido

condicionalmente essencial (LACEY; WILMORE, 1990; SMITH; WILMORE, 1990).

A molécula de glutamina compreende cinco carbonos e tem muitas funções

metabólicas importantes. Devido à sua larga distribuição em todo o corpo e por ser

constituída por dois grupos amina (NH

), a glutamina participa da transferência de

nitrogênio e carbono entre tecidos. Esse efeito é particularmente importante no

sistema nervoso central, onde a metabolização de aminoácidos resulta na produção

de grupamentos de amônia, os quais são tóxicos em grandes quantidades. A

amônia pode ser incorporada à moléculas de glutamina e, posteriormente, liberada

no fígado para a síntese mitocondrial de uréia, produto final do metabolismo dos

aminoácidos, e excretada pelos rins. O papel principal da glutamina no sistema

nervoso central, no entanto, é a sua participação, como precursora da síntese dos

neurotransmissores glutamato e ácido gamaaminobutírico (GABA) (CURTIS;

JOHNSTON, 1974). A glutamina também participa na manutenção do equilíbrio

ácido-básico através do transporte de íons amônio para os rins, possibilitando sua

posterior eliminação na urina (SMITH, 1990).

A glutamina é também muito importante para os processos mitóticos por

exercer um papel essencial na síntese de precursores de macromoléculas celulares

e na geração de energia, sendo substrato para a gliconeogênese. Por isso, é

utilizada rapidamente, como combustível oxidativo por células de intensa atividade

mitótica, incluindo linfócitos, fibroblastos, enterócitos e células tumorais

(WINDMUELLER; SPAETH, 1985). Os grupamentos NH

da glutamina ainda podem

ser utilizados para a produção de novos aminoácidos ou incorporados à purinas e

pirimidinas, na síntese de ácidos nucléicos. Ademais, tem sido demonstrado que a

glutamina, através da conversão à glutamato, é um importante precursor na síntese

de glutationa, o principal antioxidante intracelular (HONG et al., 1992; DENNO et al.

1996; YU et al., 1996, 1999), essencial para o funcionamento celular normal

(DENNO et al., 1996).

Pelas propriedades da glutamina, é razoável supor que a disponibilidade

reduzida desse aminoácido pode levar ao comprometimento da função imune por

alterações na capacidade de proliferação das células envolvidas. De fato, foi

demonstrado que a proliferação linfocitária induzida pelo bacilo Calmette-Guerin

(BCG) e vírus do sarampo in vitro é dependente da presença de glutamina no meio

(CHANG et al., 1999). Curi e colaboradores evidenciaram que glutamina age em

neutrófilos normais in vitro, aumentando sua atividade bactericida (CURI et al, 2000).

Adicionalmente, tem sido apontado a importância do metabolismo da glutamina na

função de macrófagos, durante reações inflamatórias e imunológicas, provavelmente

via liberação de citocinas. (COSTA ROSA et al., 1994). Esses dados sugerem que

níveis apropriados de glutamina influenciam as respostas imunológicas a diferentes

antígenos e que pacientes depletados de glutamina apresentam-se mais

susceptíveis à infecções. Ensaios controlados randomizados evidenciaram que,

nesse grupo de pacientes, a reposição de glutamina associava-se à uma redução da

incidência de pneumonia, bacteremia e sepse (HOUDIJIK et al., 1998), do tempo e

custo de internação hospitalar (JONES et al., 1999; MORLION et al., 1998) e de

parâmetros inflamatórios, como a concentração de receptores solúveis de TNF-α

(HOUDJIK et al., 1998), ou de proteína C–reativa no plasma (WISCHMEYER et al.,

2001). Um estudo recente demonstrou efeitos positivos da glutamina, diminuindo as

taxas de mortalidade em pacientes em estados graves, provavelmente devido a seus

efeitos benéficos na proteção e função metabólica tecidual, além da atenuação da

inflamação e do estresse oxidativo (WISCHMEYER, 2006).

Reforçando o papel da glutamina na inflamação, nosso grupo, demonstrou

recentemente que a deficiência de glutamina in vivo resulta no aumento da produção

de citocinas e na migração neutrofílica, e que esses efeitos são revertidos pela

administração de glutamina em doses capazes de restabelecer sua concentração

sérica fisiológica (NASCIMENTO et al., 2005).

Os efeitos proliferativos da glutamina levaram ao delineamento de muitas

pesquisas, a fim de investigar o seu possível papel na prevenção de efeitos tóxicos

da quimio ou radioterapia em tecidos normais com alta taxa de renovação celular,

como o epitélio da cavidade oral e do intestino, resultando em mucosites oral e

intestinal, respectivamente. Os resultados, no entanto, são conflitantes. Estudos

avaliando o papel da glutamina na prevenção da mucosite oral em indivíduos

submetidos a transplante de medula óssea, demonstraram redução da severidade e

duração dessa condição inflamatória apenas nos pacientes submetidos à

transplantes autólogo, mas não nos casos de transplante alogênico, onde foi

utilizado um agente imunossupressor a fim evitar doenças do tipo enxerto-contra-

hospedeiro (ANDERSON et al., 1998). A administração endovenosa de alanil-

glutamina, assim como a administração oral de glutamina mostraram-se eficazes na

redução de mucosite oral em pacientes portadores de câncer de cabeça e pescoço

submetidos à quimio e/ou radioterapia (HUANG et al., 2000; CERCHIETTI et al.,

2006). Da mesma forma, glutamina, por via oral, em crianças e adultos submetidos a

diferentes tratamentos quimioterápicos, diminuiu significativamente a incidência de

mucosite oral (SKUBITZ; ANDERSON, 1996; ANDERSON et al., 1998). Além dos

estudos clínicos, vários estudos experimentais, relataram efeitos positivos da

glutamina na redução da morbidade e da mortalidade de animais tratados com

agentes citotóxicos, como o metotrexato (FOX et al., 1988), e o 5-FU (O´DWYER et

al., 1987).

Vários trabalhos, no entanto, não demonstraram efeitos benéficos da

glutamina na prevenção da mucosite oral e/ou intestinal, decorrentes da terapia

antineoplásica. Não foram observados efeitos protetores desse aminoácido em

pacientes oncológicos tratados com 5-FU (JEBB et al., 1994; OKUNO et al., 1999),

tampouco da alanil-glutamina em indivíduos submetidos a diversos tratamentos

quimioterápicos (VAN ZAANEN et al., 1994). Da mesma forma,

(

(PYTLÍK et al., 2002). De acordo com esses dados,

estudos experimentais de nosso grupo demonstraram que glutamina e alanil-

glutamina, não preveniram as lesões intestinais causadas pelo 5-FU (CARNEIRO-

FILHO, 2004b).

A participação da glutamina na prevenção dos efeitos colaterais da terapia

do câncer levantou o questionamento se a administração desse aminoácido a

pacientes oncológicos estimularia o crescimento do tumor, visto ter sido

demonstrado que a glutamina, como fonte energética fundamental, é utilizada pelos

tumores de crescimento rápido (KLIMBERG; MCCLELLAN, 1996; MEDINA, 2001).

De fato, pacientes portadores de neoplasias malignas avançadas apresentam

depleção da glutamina (JOHNSON et al., 2003). Pesquisas demonstram, no entanto,

que dietas enriquecidas com glutamina podem repletar os estoques e manter o

metabolismo muscular da glutamina sem estimular o crescimento tumoral

(KLIMBERG et al., 1990). Ademais, além de atenuar a perda protéica muscular em

pacientes oncológicos, estudos sugerem ainda que a suplementação de glutamina

apresenta outros efeitos positivos nesses pacientes. De fato, a progressão tumoral,

além do ávido consumo dos estoques de glutamina do indivíduo acometido, está

associada à depressão da atividade das células natural killer devido à diminuição

das concentrações de glutationa nessas células. Portanto, a suplementação dietética

de glutamina, pode apresentar efeitos positivos, restaurando os níveis de glutationa

das células de defesa, com conseqüente aumento da imunidade (AUSTGEN et al.,

1992; MEDINA; NUNEZ DE CASTRO, 1990), assim como protegendo diversas

outras células teciduais do estresse oxidativo induzido pelos quimioterápicos ou pela

radioterapia. Adicionalmente, estudos sugerem que a suplementação oral de

glutamina pode aumentar a seletividade das drogas anti-tumorais por proteger os

tecidos normais (CAO Y, 1999; DECKER-BAUMANN et al., 1999) e, possivelmente,

por sensibilizar as células tumorais para o dano relacionado ao tratamento

quimioterápico (ROUSE et al., 1995).

1.5 Justificativa e objetivos

A mucosite oral, assim como a mucosite intestinal constituem uma síndrome

inflamatória debilitante e dolorosa e que acomete pacientes em uso de agentes

quimioterápicos e/ou raditerapia. As lesões das mucosas oral e intestinal são uma

porta de entrada para microorganismos, fato que associado a neutropenia causada

também pelos quimioterápicos, aumenta o risco de septicemia (ETING et al. 1992).

Estes fatores limitam o uso dos agentes antineoplásicos, particularmente os agentes

citotóxicos e antimetabólitos, tais como 5-fluorouracil e o metotrexato (LOPRINZI et

al. 1995), levando algumas vezes ao comprometimento do tratamento do câncer.

Atualmente, o tratamento das mucosites oral e intestinal consiste apenas em

uma abordagem essencialmente paliativa, não existindo um protocolo de

atendimento preventivo e eficaz, provavelmente, devido à deficiência da

compreensão precisa dos mecanismos e mediadores envolvidos. Entretanto, sabe-

se que determinados mediadores inflamatórios, como as citocinas TNF-α e IL-1, são

importantes na sua patogenia (LIMA et al., 2005; LEITÃO et al., 2006; SCULLY et

al., 1990), assim como está bem definido a ocorrência de estresse oxidativo no

desenvolvimento dessas condições inflamatórias (SONIS et al, 2004, 2006).

Portanto, o objetivo geral do presente trabalho foi avaliar o papel do óxido

nítrico na mucosite oral, em hamsters, e na mucosite intestinal, em ratos, induzidas

por 5-FU e metotrexaro, respectivamente, visto não ter sido previamente descrito na

literatura, até a publicação dos resultados do presente trabalho, um estudo definitivo

do papel do óxido nítrico no desenvolvimento das mucosites oral e intestinal.

Ademais, o presente trabalho objetivou ainda investigar o efeito da glutamina

e de seu análogo estável, alanil-glutamina, na mucosite oral induzida por 5-FU, em

hamsters, uma vez que estudos in vivo e in vitro de nosso grupo demonstram efeitos

positivos desse aminoácido, assim como de seu derivado estável, alanil-glutamina,

no reparo do epitélio intestinal (CARNEIRO-FILHO et al., 2004b; BRITO et al, 2005),

o que vislumbra perspectivas para a prevenção da mucosite oral.

Como objetivos específicos, o presente estudo buscou:

• Avaliar o efeito dos inibidores da NOS, aminoguanidina, L-NAME e 1400W,

nas mucosites oral e intestinal induzidas por 5-fluorouracil e metotrexato,

respectivamente.

• Avaliar a expressão e a atividade da NOS na mucosite oral e intestinal

induzida por 5-fluorouracil e metotrexato.

• Avaliar se na mucosite oral induzida por 5-FU há depleção da glutamina

sérica e dos estoques teciduais de glutationa e investigar se a reposição de

glutamina é capaz de prevenir ou diminuir a severidade das lesões.

Animais

Os protocolos experimentais foram executados de acordo com as diretrizes

aprovadas pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do Departamento de Fisiologia

e Farmacologia - UFC para uso de animais experimentais (processo nº 38/06), os

quais foram mantidos sob condições de temperatura ambiente e ciclos claro-escuros

controlados durante os experimentos. Todos os esforços foram realizados no sentido

de reduzir o número de animais utilizados, a dor, o sofrimento e o estresse dos

mesmos.

2.1.1 Mucosite oral

Foram utilizados hamsters Golden (Mesocricetus auratus) machos, com

massa corpórea entre 140 e 160 gramas, provenientes do Biotério setorial do

Departamento de Fisiologia e Farmacologia (UFC), onde foram alojados em caixas

de plástico, em número de quatro animais em cada uma delas, com alimentação

balanceada à base de sementes e cereais, como aveia, milho, semente de girassol e

abóbora (sem sal). A água foi disponibilizada à vontade.

A seleção de hamster foi baseada na facilidade de observação de suas

mucosas jugais e por sua habilidade em tolerar doses do quimioterápico capazes de

induzir mucosite sem mortalidade significativa (SONIS et al., 1990)

.2.1.2 Mucosite Intestinal Experimental

Foram utilizados ratos Wistar (Rattus novergicus) machos, com massa

corpórea entre 180 e 240 gramas, provenientes do Biotério setorial do Departamento

de Fisiologia e Farmacologia (UFC). Esses animais foram alojados em caixas de

plástico, em número de seis animais em cada uma delas, com livre acesso à água e

comida.

2.2 Drogas, Anticorpos, Soluções, Líquidos e Corantes utilizados

• Fluorouracil: ampola de 10 ml (25 mg/ml) – Fluoro-Uracil

(Roche, Rio de

Janeiro, Brasil);

• Metotrexato: frasco-ampola de 2ml (25 mg/ml) – Metotrexato

(Pharmacia, Rio

de Janeiro, Brasil);

• Nφ-Nitro-L-Arginina Metil Ester (L-NAME) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO);

• Aminoguanidina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO);

• N-(3-(Aminomethyl)benzyl)acetaminide (1400W) (Sigma Chemical Co., St. Louis,

MO);

• Glutamina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO);

• Alanil-glutamina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO);

• Anticorpo primário de coelho anti-NOSi (Santa Cruz Biothechnology);

• Anticorpo secundário (de detecção) biotinilado anti-IgG de coelho (Santa Cruz

Biothechnology);

• Kit ApopTag Peroxidase para detecção de apoptose (Chemicon International,

S7100);

• Álcool etílico 70% (Reagen);

• Cloral hidratado 10% (Reagen);

• Formaldeído 40% (Reagen);

• Hematoxilina (Reagen);

• Eosina (Merck);

Fluorouracil (5-FU), Metotrexato (MTX), L-NAME, aminoguanidina (AG), 1400W,

glutamina e alanil-glutamina foram diluídas em solução salina 0,9%.

2.3 Protocolos experimentais

2.3.1 Mucosite oral induzida por 5-Fluorouracil (5-FU) em hamsters

3.1.1.1 Modelo experimental

Utilizou-se o modelo de mucosite oral experimental, desenvolvido por Sonis e

colaboradores (SONIS et al. 1990) e adaptado no Laboratório de Farmacologia da

Inflamação e do Câncer (LAFICA) do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, da

Faculdade de Medicina – UFC (LEITÃO et al., 2007; LIMA et al., 2005).

Os hamsters receberam doses de 60 e 40 mg/kg de 5-FU nos dias 1 e 2, por

via intraperitoneal (ip), respectivamente. No 4º dia foram feitas escoriações nas

mucosas jugais direitas dos animais, previamente anestesiadas com hidrato de cloral

(300 mg/kg), com o auxílio de uma agulha com ponta romba, como fator potenciador

para a mucosite, ou seja, conferindo um trauma mecânico (TM). As ranhuras foram

distribuídas em número de três no sentido horizontal e cruzadas por mais três, em

ambas as faces das mucosas (Figura 4).

Em função de estudos previamente realizados no LAFICA (LIMA et al., 2005),

o 10º dia foi escolhido como sendo ideal para o sacrifício, por ser o dia no qual foi

observado maior intensidade do processo inflamatório. Para a avaliação do efeito da

glutamina e alanil-glutamina na evolução da mucosite oral, o experimento foi

prolongado até o 14º dia para avaliar o efeito dessas substâncias no período de

recuperação.

Figura 4: Desenho esquemático do protocolo experimental de mucosite oral

Legenda: Os hamsters receberam doses de 60 e 40 mg/kg de 5-fluorouracil nos dias 1 e 2.

No 4º dia foram feitas escoriações nas mucosas jugais direitas dos animais, com o auxílio de

uma agulha com ponta romba, como fator potenciador para a mucosite, distribuídas em

número de três no sentido horizontal e cruzadas por mais três, em ambas as faces das

mucosas. No 10º ou 14º dias, as mucosas jugais foram fotografadas, removidas, divididas

em partes iguais para serem congeladas ou fixadas em formol e subseqüentes

processamentos para coloração pelo método H&E.

5-FU:

1º dia: 60 mg/kg (i.p.)

2º dia: 40 mg/kg (i.p.)

1 h

Salina 0,9% (oral)

Glutamina (100mM, oral)

l-Glutamina

(

10mM

oral

)

Salina 0,9% (s.c)

1400W (1mg/kg; s.c.),

AG (5 ou 10 mg/kg; s.c.)

ou L-NAME

(5, 10 ou 20 mg/kg; s.c.)

4º dia:

escoriações

com agulha de

ponta romba

Formol 10% Freezer –70º C

10º dia: sacrifício

Análise histopatológica

Estudo imunohistoquímico

Mieloperoxidase

Atividade da NOSi

Dosagem de nitrito

Grupos GSH

Dosagem de

glutamina sérica

2.3.1.2 Grupos experimentais

Foram utilizados cento e trinta e dois hamsters durante o decorrer desse

estudo, sendo setenta e dois nos experimentos para avaliação do papel do óxido

nítrico na mucosite oral e sessenta para avaliação da glutamina e alanil-glutamina na

prevenção e cicatrização da mucosite oral experimental.

2.3.1.2.1 Grupos controles

Os grupos controles foram constituídos, cada um deles, por, no mínimo, seis

hamsters. Esses grupos consistem de:

• animais que não foram submetidos à mucosite oral experimental

(Normal).

Esse grupo recebeu injeções de solução salina a 0,9% (0,5 ml),

administradas por via subcutânea (sc), nos experimentos para

avaliação do papel do óxido nítrico ou, por via oral, nos

experimentos para avaliação do efeito da glutamina e alanil-

glutamina, 1 hora antes de cada injeção intraperitoneal (i.p.) de

solução salina (no lugar de 5-FU) e, diariamente, até o

sacrifício, no 10º ou 14º dias.

• animais submetidos à mucosite experimental por 5-FU e

escoriações nas mucosas jugais no 4º dia (Salina).

Esse grupo recebeu 5-FU (60 e 40 mg/kg; i.p.), nos 1º e 2º dias

e foi submetido ao trauma mecânico na mucosa jugal, no 4º

dia. Recebeu ainda, administração de solução salina 0,9%, por

via subcutânea, nos experimentos para avaliação do papel do

óxido nítrico, ou por via oral, nos experimentos para avaliação

do efeito da glutamina e alanil-glutamina, 1 hora antes de cada

injeção de 5-FU e do trauma mecânico e, diariamente, até o

sacrifício, no 10º ou 14º dias.

• animais submetidos apenas as escoriações nas mucosas jugais

(trauma mecânico) no 4º dia de experimento (TM) .

Esse grupo foi submetido apenas ao trauma mecânico (TM) na

mucosa jugal, no 4° dia. Não recebeu administração de 5-FU,

mas de solução salina 0,9%, por via subcutânea, nos

experimentos para avaliação do papel do óxido nítrico, ou por

via oral, nos experimentos para avaliação do efeito da

glutamina e alanil-glutamina, diariamente, até o sacrifício, no

10º ou 14º dias.

2.3.1.2.2 Grupo tratado com L-NAME

Os animais, submetidos à mucosite oral por 5-fluorouracil, foram subdivididos

em 3 grupos de seis hamsters cada, os quais receberam L-NAME, nas doses de 5,

10 e 20 mg/kg, respectivamente, administradas por via subcutânea, 1 hora antes de

cada injeção de 5-FU ou das escoriações (TM) e diariamente durante dez dias.

2.3.1.2.3 Grupo tratado com aminoguanidina

Os animais, submetidos à mucosite oral por 5-fluorouracil, foram subdivididos

em 2 grupos de seis hamsters cada, os quais receberam aminoguanidina, nas doses

de 5 e 10 mg/kg, administradas por via subcutânea, 1 hora antes de cada injeção de

5-FU ou das escoriações (TM) e, diariamente, durante dez dias.

2.3.1.2.4 Grupo tratado com 1400W

(

)

2.3.1.2.5 Grupo tratado com alanil-glutamina

O grupo de seis animais, submetidos à mucosite oral por 5-fluorouracil,

recebeu solução oral de alanil-glutamina 100mM, 1 hora antes de cada injeção de

5-FU ou das escoriações (TM) e, diariamente, durante dez ou quatorze dias.

2.3.1.2.6 Grupo tratado com glutamina

O grupo de seis animais, submetidos à mucosite oral por 5-fluorouracil,

recebeu solução oral de glutamina 100mM, 1 hora antes de cada injeção de 5-FU

ou das escoriações (TM) e, diariamente, durante dez ou quatorze dias.

2.3.1.3 Parâmetros avaliados tanto para o estudo do papel do óxido nítrico,

quanto para o estudo do efeito da alanil-glutamina e glutamina na mucosite oral

induzida por 5-FU

2.3.1.3.1 Análise macroscópica das mucosas jugais

No 10º ou 14º dia, os animais foram sacrificados e suas mucosas jugais foram

fotografadas antes de serem removidas. Para a análise macroscópica foram

avaliados a presença e intensidade de eritema, hiperemia, hemorragia, úlceras e

abscessos, classificados de acordo como os escores citados a seguir:

• Escore 0: hiperemia e eritema ausentes ou discretos; hemorragia ausente;

ausência de úlceras e de abscessos.

• Escore 1: hiperemia e eritema moderados; hemorragia ausente; ausência de

úlceras; ausência de abscessos; presença de tecido cicatricial.

• Escore 2: hiperemia e eritema acentuados; presença de hemorragia, presença de

úlceras pequenas, de até 1 cm de diâmetro, presença de maior área cicatricial e

ausência de abscessos.

• Escore 3: hiperemia e eritema acentuados; presença de hemorragia, de úlceras

extensas e abscessos.

2.3.1.3.2 Análise histopatológica das mucosas jugais

Os estudos histológicos das mucosas jugais foram realizados em cortes

seriados de 4 µm de espessura, ao microscópio óptico (x 40). No 10º ou 14º dia, os

animais foram sacrificados e suas mucosas, após serem fotografadas, foram

removidas e divididas, onde uma parte foi fixada em solução tamponada de

formaldeído a 10% por 24 horas, e a outra, congelada. Para análise microscópica

foram avaliados aspectos inflamatórios como presença e intensidade do infiltrado

celular, dilatação e ingurgitamento vasculares, hemorragia, edema, úlceras e

abscessos, classificados de acordo com os escores padronizados em nosso

laboratório, citados a seguir:

• Escore 0: epitélio e tecido conjuntivo sem vasodilatação; infiltrado celular ausente

ou discreto; ausência de hemorragia, de edema, de úlceras e abscessos.

• Escore 1: ingurgitamento vascular discreto; áreas de reepitelização; infiltrado

celular discreto, com maior número de leucócitos mononucleares, ausência de

hemorragia, de edema, de úlceras e abscessos.

• Escore 2: ingurgitamento vascular moderado; degeneração hidrópica epitelial

(vacuolização); infiltrado celular moderado, com predomínio de leucócitos

polimorfonucleares; presença de áreas hemorrágicas, de edema e de eventuais

úlceras pequenas; ausência de abscessos.

• Escore 3: ingurgitamento vascular acentuado; vasodilatação acentuada; infiltrado

celular acentuado, com maior número de leucócitos polimorfonucleares; presença

de áreas hemorrágicas, de edema, de abscessos e úlceras extensas.

2.3.1.3.3 Dosagem da mieloperoxidase

Mieloperoxidase (MPO) é uma enzima presente nos grânulos azurófilos dos

neutrófilos e tem sido utilizada como um marcador quantitativo da infiltração de

neutrófilos nos processos inflamatórios em vários tecidos, cuja presença foi

determinada pelo método colorimétrico ELISA. As medidas de atividade da

mieloperoxidase foram realizadas a partir das mucosas jugais dos hamsters, usando

uma versão modificada do método descrito por Bradley e colaboradores (BRADLEY

et al., 1982). No 10º ou 14º dia, os animais foram sacrificados e suas mucosas, após

serem fotografadas, foram removidas, pesadas e congeladas em freezer a 70ºC

negativos até a realização do ensaio. Durante a determinação, as amostras foram

incubadas em solução de HTAB 0.5% (Brometo de hexadeciltrimetilamonio) na

proporção de 50 mg de tecido por mL. Em seguida, foram homogeneizadas e

centrifugadas (1500g/15min./4ºC), sob condições adequadas de refrigeração. Os

sobrenadantes foram transferidos para eppendorfs e novamente centrifugados (10

min.) para a melhor remoção de contaminantes. Após plaquetamento de 7µL do

sobrenadante, em duplicata, (placas de 96 wells), 200µL da solução de leitura (5 mg

de O-dianisidine; 15µL H

1%, 3 mL de NaPO

buffer; 27 mL de H

destilada)

foram adicionados aos poços e foi realizada a leitura a 460nm (t

=0 min. e t

= 1

min.). A mudança na absorbância foi obtida, plotada em curva padrão de neutrófilos

e os valores obtidos foram expressos como neutrófilos/mg de tecido (atividade de

MPO)

2.3.1.3.4 Imunohistoquímica pelo método de TUNEL (TdT- mediated dUTP Nick

end-labeling)

No 10º ou 14º dia, os animais foram sacrificados e suas mucosas, após

serem fotografadas, foram removidas e divididas, onde uma parte foi fixada em

solução tamponada de formaldeído a 10%, a fim de serem devidamente

processadas para inclusão, microtomia (4µm) e montagem em lâminas cobertas de

L-polilisina, apropriadas para a realização de imunohistoquímica. Utilizou-se para a

detecção de células TUNEL positivas, como indicativo de apoptose, o kit ApopTag

S 7100. Os cortes histológicos foram desparafinizados com xilol e reidratados com

concentrações decrescentes de álcool (absoluto, 95% e 70%). Em seguida, lavados

com solução tampão fosfato (PBS) e incubados em temperatura ambiente com

proteinase K por 15 minutos, a fim de promover a recuperação antigênica. Depois de

lavado com água destilada, o material foi tratado com peróxido de hidrogênio 3%

(v/v) em PBS durante 15 minutos, para bloquear a peroxidase endógena. Seguiu-se

nova lavagem com PBS e incubação com o Equlibration Buffer por 10s e,

imediatamente depois, com a enzima TDT (desoxinucleotidil transferase) associada

aos nucleotídios marcados com digoxigenina (reaction buffer), os quais se ligam às

hidroxilas livres do DNA fragmentado das células apoptóticas. O controle negativo

não recebeu a enzima. Após incubação em estufa a 37º por 1 h, a reação foi

bloqueada pela solução stop e as lâminas lavadas em PBS. Seguiu-se a adição do

conjugado antidigoxigenina e nova incubação à temperatura ambiente por 30

minutos. Após nova lavagem com PBS, seguiu-se a coloração com o cromógeno 3,3

diaminobenzidina (DAB), seguida por contra-coloração com methyl green. Por fim,

foi feita nova lavagem com água destilada, imersão em N-butanol 100% e xilol e, em

seguida, montagem das lâminas.

2. 3.1.4 Parâmetros avaliados no estudo do papel do óxido nítrico na mucosite

oral experimental.

2.3.1.4.1 Determinação da atividade da nítrico óxido sintase (NOS)

As medidas de atividade da NOS, foram realizadas a partir das mucosas

jugais dos hamsters, utilizando método previamente descrito (GOMES et al., 2004).

No 10º dia, os animais foram sacrificados e suas mucosas, após serem fotografadas,

foram removidas e mantidas em freezer a -70º C até serem enviadas para Ribeirão

Preto para a realização do ensaio, devidamente refrigeradas em gelo seco. As

amostras homogeneizadas (Politron- PT 3100) em 0,2 mL de tampão de extração

pH=7 (320mM sucrose; 50 mM Tris; 1 mM EDTA; 1mM DTT; 10µg/mL leupeptina;

10µg/mL soybean tripsin inhibitor; 2µg/mL aprotinina; 2mM PMSF) e centrifugados

(10.000 rpm/20min/4ºC). A seguir, 40 µL de cada sobrenadante foram incubados

com 100 µL do tampão de ensaio pH 7,4 (50mM KH

; 1,2mM MgCl

.6H

0,25mM CaCl

; 0,12mM β-NADPH; 60 mM L-valina; 1 mM L-citrulina; 50µM BH

;

4µM FAD; 1mM DTT) por 1 hora. As amostras foram preparadas em triplicata. Tubo

1: sem inibidores de NOS; Tubo 2: L-NAME (inibidor não específico de NOS) e

aminoguanidina (inibidor específico de NOSi); Tubo 3: EGTA (quelante de cálcio

para as isoformas constitutivas). L-arginina-

C (270µCi/mmol) foi adicionada à

razão de 100 µL para cada 1,0 mL de tampão de ensaio. Como controles do ensaio,

quatro grupos foram preparados: 1) tubo para avaliar o background (este tubo não

continha amostra); 2) tubo para quantificar o total de com – contas por minuto (neste

tubo não foi adicionado o Dowex e tampouco as amostras); 3) tubo com 2x 10

macrófagos ativados com LPS e IFN-γ controle NOS induzida) e 4) tubo com

homogenato de cerebelo (controle NOS neuronal). Em seguida, 1 mL de resina

Dowex AG-50X8 sódica

(1:1 em água, pH 6,0) foi adicionado aos tubos de ensaio,

homogeneizados e centrifugados (10.000 rpm/10min/4ºC). Foram colocados 400 µL

do sobrenadante destes tubos em 3 mL de líquido de cintilação e após agitação, a

radioatividade foi quantificada por contador beta por 1 minuto para cada tubo.

Também foi realizada a quantificação das proteínas totais de cada amostra pelo

método de Comassie Blue (Comassie Blue Reagent; Pierce Chemical, Rockford, IL).

Os resultados foram expressos como pmol de citrulina/hora/mg de proteína. A

atividade da sintase de NO (NOS total) foi determinada pela diferença entre o valor

obtido da cpm dos tubos com os inibidores aminoguanidina + L-NAME da cpm dos

tubos sem inibidores.

B. Dosageme nitrito

2.3.1.4.2 Dosagem de nitrito

No 10º dia, os animais foram sacrificados e suas mucosas, após serem

fotografadas, foram removidas e congeladas em freezer a 70ºC negativos até a

realização do ensaio. A dosagem de nitrito foi obtida como um indicador da

produção de óxido nítrico, através da determinação do conteúdo total de

nitrito/nitrato (

/ NO

) na mucosa jugal através da concentração total nas

amostras, determinada espectrofotometricamente pela reação de Griess (CHEN et

al., 2000). Inicialmente, 200 mg de tecido da mucosa jugal foram homogeneizados

em 2 mL de uma solução gelada de cloreto de potássio (KCL) a 1,15% (homogenato

a 10%). O homogenato foi centrifugado por 15 minutos a 14.000 rpm. O nível total

de NO

/ NO

foi determinado com NO

das amostras (0,04 mL) convertido em NO

pela incubação em um solução de 0,04 mL de nitrato redutase, NADPH, KH

água destilada “overnight”. Após plaquetamento de 80 µL de cada amostra, em

duplicata (placas de 96 poços), uma série de diluições da curva-padrão de referência

de NO

–

(640 µM, 320 µM, 160 µM, 80 µM, 40 µM, 20 µM, 10 µM, 5 µM, 2,5 µM, 1,25

µM e 0,625 µM) foi preparada. A seguir, foram adicionados 80 µL da solução de

Griess (2% de sufanilamida, ácido fosfórico 5%, NEED e água destilada) em cada

poço. A coloração púrpura/magenta aparece imediatamente e é medida em leitor de

placas com filtro de 540 nm. Os valores obtidos para as amostras experimentais

foram comparados com os obtidos para curva padrão.

2.3.1.4.3 Imunohistoquímica para detecção da enzima (NOSi)

Imunohistoquímica para NOSi foi realizada utilizando método de

estreptavidina-biotina-peroxidase (HSU; RAINE, 1981). No 10° dia, os animais

foram sacrificados e tiveram suas mucosas jugais removidas e fixadas em formol

10% por 24 h para confecção de lâminas apropriadas para imunohistoquímica. Os

cortes foram desparafinizados, hidratados em xilol e álcool e imersos em tampão

citrato 0,1 M (pH 6,0), sob aquecimento em forno de microondas, por 15 minutos

para a recuperação antigênica. Após o resfriamento, obtido em temperatura

ambiente durante 20 minutos, foram feitas lavagens com solução tamponada de

fosfato (PBS), intercaladas com o bloqueio da peroxidase endógena com solução de

a 3% (15 minutos). Os cortes foram incubados “overnight” (4

C) com anticorpo

primário de coelho anti-NOSi diluído 1:200 em PBS com albumina sérica bovina 5%

(PBS-BSA). Após a lavagem do dia seguinte, foi feita a incubação com o anticorpo

secundário (de detecção) biotinilado anti-IgG de coelho, diluído 1:200 em PBS-BSA,

por 30 minutos. Depois de lavado, os cortes foram incubados com o complexo

estrepto-avidina peroxidase conjugada (complexo ABC Vectastain®) por 30 minutos.

Após nova lavagem com PBS, seguiu-se coloração com o cromógeno

3,3`diaminobenzidine-peróxido (DAB), seguida por contra-coloração com

hematoxilina de Mayer. Por fim, realizou-se a desidratação das amostras e

montagem das lâminas. Controles negativos foram processados simultaneamente

como descrito acima, sendo que o anticorpo primário foi substituído por PBS-BSA

5%.

2.3.1.4.4 Avaliação da taxa de salivação não estimulada

Os animais submetidos à mucosite oral induzida por 5-FU que receberam

administração diária de salina 0,9% (Salina) ou 1400W (1 mg/kg), assim como o

grupo controle normal, foram anestesiados com hidrato de cloral no 4º e 10º dias de

experimento para avaliação da taxa de salivação. Para tal, a saliva pré-existente nas

cavidades bucais foi retirada por bolinhas de algodão, posicionadas no assoalho

bucal. Em seguida, cones de papel de filtro para uso em endodontia (TANARI

Industrial LTDA, Brasil) foram pesados e posicionados bilateralmente no assoalho

bucal para absorção da saliva secretada durante 5 minutos. Após esse período, os

cones foram retirados e novamente pesados. A produção salivar durante 5 min.

resulta da diferença entre as duas pesagens.

2.3.1.5 Parâmetros avaliados no estudo do efeito da glutamina e alanil-glutamina

na mucosite oral experimental

2.3.1.5.1 Deteminação da concentração plasmática de glutamina

Imediatamente antes do sacrifício, no 10° dia, coletou-se sangue através de

punção cardíaca em hamsters anestesiados com hidrato de cloral. As amostras

foram centrifugadas a 3.000 rpm, por 15 minutos a 4º C. O plasma obtido de cada

amostra foi congelado em freezer a 70ºC negativos até serem encaminhadas, em

gelo seco, ao laboratório Clementino Fraga para a realização do ensaio com

cromatografia líquida (HPLC) com detecção ultravioleta, seguindo método

previamente descrito (BIDLIGMEYER et al., 1984).

2.3.1.5.2 Determinação de grupos sulfidrílicos não protéicos nas mucosas jugais

No 5º ou 10º dia, os animais foram sacrificados e suas mucosas, após serem

fotografadas, foram removidas, pesadas e mantidas em freezer a 70º C negativos

até a realização do ensaio, seguindo protocolo previamente descrito (SEDLAK;

LINDSAY, 1968) para a dosagem de grupos sulfidrílicos não protéicos,

representados principalmente pela glutationa. Durante a determinação, as amostras

foram trituradas em homogeneizador Politron Ultra-Turrax em 1 mL de EDTA 0.02M

para cada 100 mg de tecido, sob condições adequadas de refrigeração. Alíquotas de

400 µL do homogenato foram adicionadas a 320 µL de água destilada e 80 µL de

ácido tricloracético 50% (TCA) para a precipitação de proteínas. Os tubos foram

centrifugados (3000rpm/15minutos/4ºC) e alíquotas de 400 µL do sobrenadante

foram adicionadas a 800 µL de tampão Tris 0,4 M, pH 8,9 e 20 µL de DTNB e

agitados por 3 minutos no agitador de tubos, imediatamente antes da leitura em

aparelho de ELISA , com absorbância de 412 nm. A quantidade de grupos

sulfidrílicos não protéicos nas mucosas jugais foi descrita como µg/mg de tecido.

2.3.2 Mucosite intestinal induzida por metotrexato em ratos

2.3.2.1 Modelo de mucosite intestinal

Utilizou-se o modelo de mucosite intestinal experimental descrito por

Vanderhoof (VANDERHOOF et al., 1990), e adaptado no Laboratório de

Farmacologia da Inflamação e do Câncer (LAFICA) do Departamento de Fisiologia e

Farmacologia, da Faculdade de Medicina – UFC (CARNEIRO-FILHO et al., 2004).

Os ratos receberam três doses de 2,5 mg/kg de metotrexato nos dias 1, 2 e 3,

via subcutânea (s.c.). Em função de dados prévios obtidos no LAFICA (CARNEIRO-

FILHO et al., 2004) foi escolhido o 5º dia para o sacrifício, no qual foi observado

maior intensidade do processo inflamatório e, portanto, ideal para se proceder às

modulações farmacológicas com L-NAME e aminoguanidina (Figura 5).

Figura 5 - Desenho esquemático do protocolo experimental da mucosite intestinal

ratos ou camundongos

Legenda:

Os animais receberam três injeções 2,5 mg/kg de metotrexato nos dias 1, 2 e 3,

respectivamente. No 5º dia, os mesmos foram mortos e tiveram segmentos de duodeno,

jejuno e íleo removidos, divididos em partes iguais para serem congeladas ou fixados em

formol e subseqüentes processamentos para coloração H&E.

2.3.2.2 Grupos experimentais

Foram utilizados cento e oito ratos durante todo o decorrer desse estudo,

distribuídos nos diversos grupos experimentais descriminados a seguir:

MUCOSITE INTESTINAL EXPERIMENTAL

Injeções de MTX (sc)

Dias 1, 2 e 3: 2,5 mg/kg

Segmentos de

Duodeno, Jejuno e Íleo

Sacrifício

Dia 5

Formol 10%

24 hs

Análise

Morfométrica

(Baseado em

Vanderhoof et al., 1990)

2.3.2.2.1 Grupos controles

Os grupos controles foram constituídos, cada um deles, por, no mínimo, seis

ratos. Esses grupos consistem de:

2.4 animais que não foram submetidos à mucosite intestinal por MTX .

Esse grupo recebeu injeções de salina 0,9%, via subcutânea (s.c)

e intraperitoneal (i.p), diariamente, durante 5 dias (Normal).

2.5 animais que receberam MTX nos 3 primeiros dias. Esse grupo

recebeu injeções de salina a 0.9% (i.p.) 1 hora antes de cada

injeção de metotrexato e diariamente até o sacrifício, no 5° dia

(Salina).

2.3.2.2.2 Grupo tratado com L-NAME

Os animais submetidos à mucosite intestinal por metotrexato receberam L-

NAME na dose de 20 mg/kg, a cada vinte e quatro horas por via intra-peritoneal, até

o 5º dia.

2.3.2.2.3 Grupo tratado com L-NAME e L-arginina

Os animais, submetidos à mucosite intestinal por metotrexato receberam L-

NAME na dose de 20 mg/kg, seguida pela administração imediata de L-arginina, na

dose de 300 mg/kg, a cada 24 horas, ambas administradas por via intra-peritoneal,

até o 5º dia.

2.3.2.2.4 Grupo tratado com aminoguanidina

Os animais, submetidos à mucosite intestinal por metotrexato receberam

aminoguanidina, na dose de 10 mg/kg, a cada vinte e quatro horas, administrada por

via intra-peritoneal, até o 5º dia.

2.3.2.3 Parâmetros avaliados

2.3.2.3.1 Análise morfométrica

;

(

)

(

;

)

(

)

(

)

No 5º dia, os animais foram sacrificados e segmentos de jejuno foram

removidos. As amostras foram, então, fixadas em solução tamponada de

formaldeído a 10%, durante 24 horas e, subseqüentemente, processadas em

parafina. Cortes (4 µm) seriados foram feitos em lâminas adequadas, cobertas com

L-polilisina.

As técnicas já foram descritas anteriormente, como parte dos parâmetros

avaliados no estudo do papel do óxido nítrico na mucosite ora experimental.

2.3.2.3.3 Avaliação da expressão de NOSi por Western Blot

Os animais foram sacrificados no 5º dia por deslocamento cervical e

segmentos de jejuno foram removidos e mantidos em freezer a -70º C até o ensaio.

As amostras foram submetidas à sonicação com solução de lise celular (Trinton X-

100 1% e Nonidet P-40 0.2%) e EDTA (2mM), sendo transferidas posteriormente

para tubos testes contendo inibidor de protease e centrifugadas a 14000 rpm a 4ºC.

A concentração protéica do sobrenadante foi determinada pelo ensaio de BCA –

bicinchoninic acid (Pierce), em tubos eppendorf, com leitura em espectrofotômetro

(absorbância de 562nm). Padronizou-se a quantidade de proteina para 50µg, de

acordo com uma curva padrão para proteína. Os lisados foram congelados a –70º C

até a análise. Em seguida, foi feito a separação eletroforética (Bio Rad mini-gel) das

amostras após desnaturação (por meio de ebolição) em gel de poliacrilamida 12,5%

(SDS- Page), com o marcador de proteina (Invitrogen). O gel foi, então, transferido

para uma membrana de nitrocelulose overnight em aparelho de transferência 36v

(Bio Rad mini-transfercell) a 4º C. No dia seguinte, a membrana de celulose foi

bloqueada com leite desnatado por 1 hora, a fim de bloquear outras proteases,

seguida de incubação com anticorpo primário durante 1 hora e meia, diluição 1:500

em BSA 5%. Após lavagens com tampão contendo TRIS, glicina, Tween 20 e água

destilada, foi feito incubação com anticorpo secundário, diluído 1:500 em leite

desnatado, durante 1 hora e meia, em plataforma oscilante. Depois de lavar com o

tampão de lavagem, foi feita a revelação da membrana de nitrocelulose pela técnica

de ECL, em filme de raio-X (Kodak X-Omat), em sala escura. Em seguida, foi feito a

leitura e o diagnóstico das bandas.

2.4 Análise estatística

Os dados foram expressos como Média ± erro padrão (Média ± epm) ou

mediana, acompanhada de valores extremos, de acordo com o parâmetro avaliado.

Para comparações entre os grupos foram utilizados Análise de Variância (ANONA) e

teste de Bonferroni, para comparar médias, e teste de Kruskal-Wallis e Dunn´s, para

medianas. Em todas as situações, foi adotado o nível de significância p<0,05.

3 RESULTADOS

3.1 Efeito do óxido nítrico na mucosite oral induzida por 5-fluorouracil

3.1.1. Efeito dos inibidores de NOS, L-NAME, AG e 1400W sobre as mucosas

jugais de hamsters submetidos à mucosite oral induzida por 5-FU.

3.1.1.1 Análise Macroscópica

A análise macroscópica das mucosas jugais do grupo de animais submetidos

a mucosite oral por 5-FU que receberam apenas solução salina (Salina), no 10

dia,

constatou presença de hiperemia e eritema acentuados, hemorragia, úlceras

extensas e abscessos, recebendo escore e variação 3(2-3) (Figura

6C; Tabelas 1 e

2), significativamente diferente do grupo controle normal (Normal), cujo escore e

variação foram 0(0-0) (Figura. 6A; Tabelas 1 e 2) ou dos animais submetidos apenas

ao trauma mecânico (TM), com escore e variação 0.5(0-1) (Tabelas 1 e 2).

O tratamento dos animais submetidos à mucosite oral com os inibidores da

NOS, AG (10 mg/kg) ou 1400W (1 mg/kg) preveniu, de forma significativa, os danos

à mucosa oral causados pela administração de 5-FU. A análise macroscópica das

mucosas jugais desses animais constatou redução de eritema e ausência de

ulcerações e abscessos, observados no 10º dia de experimento (Figura 6E e 6G;

Tabela 1). AG, na dose de 5 mg/kg (Tabela 1), assim como o inibidor não seletivo da

NOS, L-NAME, em todas as doses utilizadas (Tabela 2), não foram capazes de

prevenir, de forma significativa, as lesões induzidas pela mucosite oral experimental.

3.1.1.2 Análise Microscópica

A análise histopatológica das mucosas jugais do grupo não tratado (Salina)

revelou acentuada vasodilatação, infiltrado celular intenso, com predominância de

neutrólifos, hemorragia, edema e úlceras extensas (Figura 6D), recebendo escore e

variação 3(1-3) (Tabela 1), significativamente diferentes aos atribuídos ao grupo

Para uma melhor compreensão desta seção, a Figura 6 foi dividida em 8 partes, e cada uma delas foi

identificada seqüencialmente com as letras A a H, sendo citadas no texto da seguinte forma: Figura 6A; Figura

6B................;Figura 6H.

submetido apenas ao trauma mecânico (TM; Tabela 1 e 2) e também ao grupo

controle normal (Normal; Figura 6B; Tabelas 1 e 2).

O tratamento com AG (Figura 6F; Tabela 1) ou 1400W (Figura6H; Tabela 1)

reduziu, de forma significativa (p<0.05), a infiltração de células inflamatórias,

presença de edema e hemorragia e preveniu a formação de úlceras e abscessos

(Tabela 1). Observou-se ainda, nas mucosas jugais de animais tratados com esses

inibidores, áreas de reepitelização (Figura 6).

Figura 6 - Aspectos macroscópicos e microscópicos de mucosas jugais de hamsters

normais (A e B) ou submetidos a mucosite oral induzida por 5-Fluorouracil e trauma

mecânico e que foram tratados com salina (C e D), aminoguanidina (E e F) ou N-(3-

(Aminomethyl)benzyl)acetamidina (1400W; G e H):

F E

Legenda: A mucosite oral foi induzida em hamsters através de injeções de 5-FU e

de trauma mecânico com o auxílio de agulha de ponta romba nas mucosas jugais.

Os animais receberam aminoguanidina (10 mg/kg; s.c), 1400W (1mg/kg; s.c) ou 0,5

ml de solução salina 0,9% uma hora antes de cada injeção de 5-FU ou do trauma

mecânico e, diariamente, durante 10 dias, quando então, foram sacrificados e

devidamente fotografados. Amostras foram removidas, fixadas em formol a 10% e

processadas para coloração H&E (x40).

Tabela 1 - Escores das análises macroscópicas e microscópicas da mucosa jugal

dos hamsters submetidos a mucosite oral experimental e tratados com

aminoguanidina (AG) e N-(3-(Aminomethyl)benzyl)acetamidina (1400W)

5-FU

AG 1400W

Grupos Experimentais NORMAL TM SALINA 5mg/kg 10mg/kg 1mg/kg

Análise macroscópica 0 (0-0) 0.5 (0-1) 3 (2-3)* 3 (1-3)* 2 (1-3)*

** 1 (1-3)*

Análise microscópica 0 (0-0) 0.5 (0-1) 3 (1-3)* 3(1-3)* 1.5 (1-3)*

** 1 (1-3)*

___________________________________________________________________

Legenda: A mucosite oral foi induzida em hamsters através de injeções de 5-fluorouracil (5-

FU) e de trauma mecânico (TM) com o auxílio de agulha de ponta romba nas mucosas

jugais. Os animais receberam aminoguanidina (AG; 5 e 10 mg/kg; sc), 1400W (1 mg/kg; sc)

ou 0,5 ml de solução salina 0,9% (Salina) uma hora antes de cada injeção de 5-FU ou do

trauma mecânico e, diariamente, durante 10 dias. Os dados representam mediana e

variação de pelo menos 6 hamsters, dos seguintes parâmetros analisados: dilatação e

ingurgitamento vasculares; intensidade de infiltrado celular; presença de áreas

hemorrágicas; de edema, de abscessos e de úlceras, para análise histopatológica e

presença e intensidade de eritema, de hiperemia, de hemorragia, de úlceras e de

abscessos, para análise macroscópica. *p<0,05 representa diferenças estatísticas em

relação ao grupo controle normal (Normal); **p<0,05 representa diferenças estatísticas em

relação aos animais com mucosite oral não tratados, que constituem o grupo Salina

(Kruskal-Wallis e Dunn´s).

Tabela 2 - Escores das análises macroscópicas e microscópicas da mucosa jugal

dos hamsters submetidos a mucosite oral experimental e tratados com Nφ-Nitro-L-

arginina methyl ester (L-NAME)

5-FU

L-NAME (mg/Kg)

Grupos Experimentais

NORMAL

SALINA

5 10 20

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

___________________________________________________________________

Legenda: A mucosite oral foi induzida em hamsters através de injeções de 5-fluorouracil e

de trauma mecânico (TM) com o auxílio de agulha de ponta romba nas mucosas jugais. Os

animais receberam L-NAME (5, 10 ou 20 mg/kg-s.c) ou 0,5 ml de solução salina 0,9%

(Salina) uma hora antes de cada injeção de 5-fluorouracil ou do trauma mecânico e,

diariamente, durante 10 dias. Os dados representam mediana e variação de pelo menos 6

hamsters, dos seguintes parâmetros analisados: dilatação e ingurgitamento vasculares;

intensidade de infiltrado celular; presença de áreas hemorrágicas; de edema, de abscessos

e de úlceras, para análise histopatológica e presença e intensidade de eritema, de

hiperemia, de hemorragia, de úlceras e de abscessos, para análise macroscópica. *p<0,05

representa diferenças estatísticas em relação ao grupo controle normal (Normal) (Kruskal-

Wallis e Dunn´s).

3.1.2 Efeito do L-NAME, aminoguanidina e 1400W sobre a atividade de

mieloperoxidase nas mucosas jugais de hamsters submetidos à mucosite oral

experimental

A atividade da enzima mieloperoxidase nas mucosas jugais do grupo de

hamsters submetidos à mucosite oral induzida por 5-FU (Salina), encontra-se

significativamente aumentada (p<0,05), no 10° dia de experimento, em comparação

ao grupo controle normal (Normal) ou ao grupo submetido apenas ao trauma

mecânico (TM). O tratamento com aminoguanidina (10 mg/kg) ou 1400W (1 mg/kg),

reduziu, de forma significativa, a atividade dessa enzima, quando comparados ao

grupo salina, restaurando esse parâmetro aos níveis encontrados nos grupos normal

e TM. Foi observado ainda, aumento significativo da atividade de mieloperoxidase

nas mucosas jugais de animais submetidos à mucosite oral experimental e tratados

com L-NAME (20 mg/Kg) (Figura 7).

3.1.3. Efeito 5-fluorouracil sobre a atividade da NOS na mucosas jugal de hamsters

submetidos à mucosite oral experimental

A administração de 5-FU, seguida por trauma mecânico resultou no aumento

significativo (p<0,05) da atividade da NOS, no 10º dia de experimento, nas mucosas

jugais dos animais que receberam solução fisiológica a 0,9% (Salina), quando

comparado ao grupo controle normal (Figura 8).

3.1.4. Efeito do 1400W sobre a dosagem de nitrito das mucosas jugais de hamsters

submetidos a mucosite oral por 5-FU

Os níveis de nitrito encontrados nas mucosas jugais de animais submetidos a 10

dias de mucosite oral induzida por 5-FU (Salina), encontram-se significativamente

aumentados (p<0,05), em comparação ao grupo controle normal (Normal) ou ao

grupo submetido apenas ao trauma mecânico (TM). A administração diária de

1400W (1 mg/kg) preveniu, de forma significativa (p<0,05), o aumento dos níveis de

nitrito nas mucosas jugais de animais submetidos à mucosite oral experimental,

restaurando esse parâmetro aos níveis encontrados nos grupos controle normal e

TM (Figura 9)

Figura 7 - Efeito dos inibidores da NOS, Nφ-Nitro-L-arginina methyl ester (L-NM),

aminoguanidina (AG) e N-(3-(Aminomethyl)benzyl)acetamidina (1400W) sobre as

medidas de atividade de mieloperoxidase observadas na mucosite oral em hamsters.

Legenda: A mucosite oral foi induzida em hamsters através de injeções de 5-fluorouracil e

de trauma mecânico (TM) com o auxílio de agulha de ponta romba nas mucosas jugais. Os

animais receberam injeções subcutâneas de 0,5 ml de salina, L-NAME (20 mg/kg), AG (10

mg/kg) ou 1400W (1 mg/kg), uma hora antes de cada injeção de 5-fluorouracil ou do trauma

mecânico (TM) e, diariamente, até o sacrifício, no 10° dia. Amostras de mucosa foram

coletadas e congeladas em freezer -70

C. As barras representam Média ± EPM da

quantidade de MPO x 10

/grama de mucosa jugal. *p<0,05 representa diferenças

estatísticas em relação aos animais normais (Normal). **p<0,05 representa diferença

estatísticas em relação aos animais submetidos a mucosite experimental que receberam

salina (Salina). O número de animais utilizados foi, no mínimo, seis (Anova; Bonferroni).

Normal TM Salina L-NM AG 1400W

5-FU

MPOx10

/g de mucosa

jugal

Figura 8 - Efeito do 5-fluorouracil (5-FU) sobre a atividade da nítrico óxido sintase

(NOS) nas mucosas jugais dos hamsters.

Legenda: A mucosite oral foi induzida em hamsters através de injeções de 5-

fluorouracil e de trauma mecânico com o auxílio de agulha de ponta romba nas

mucosas jugais. Os animais receberam injeções subcutâneas de 0,5 ml de salina

uma hora antes de cada injeção de 5-fluorouracil ou do trauma mecânico e,

diariamente, até o sacrifício, no 10º dia. Amostras de mucosa foram coletadas e

congeladas em freezer -70

C. As barras representam Média ± EPM da produção de

citrulina (pmol/15 min/mg de proteína) *p<0,05 representa diferenças estatísticas em

relação aos animais normais (Normal). O número de animais utilizados foi, no

mínimo, seis (Anova; Bonferroni).

Figura 9 - Efeito do N-(3-(Aminomethyl)benzyl)acetamidina (1400W) sobre a

dosagem de nitrito nas mucosas jugais de hamsters submetidos a mucosite oral por

5-fluorouracil (5-FU).

Legenda: A mucosite oral foi induzida em hamsters através de injeções de 5-FU e

de trauma mecânico (TM) com o auxílio de agulha de ponta romba nas mucosas

jugais. Os animais receberam injeções subcutâneas de 0,5 ml de salina, ou 1400W

(1 mg/kg), uma hora antes de cada injeção de 5-FU ou do trauma mecânico (TM) e,

diariamente, até o sacrifício, no 10º dia. Amostras de mucosa foram coletadas e

congeladas em freezer -20

C. As barras representam Média ± EPM da quantidade

de NO

/NO

(µM) da mucosa jugal. *p<0,05 representa diferenças estatísticas em

relação aos animais normais (Normal). **p<0,05 representa diferença estatísticas em

relação aos animais submetidos a mucosite experimental que receberam salina

(Salina). O número de animais utilizados foi, no mínimo, seis (Anova; Bonferroni).

Normal TM Salina 1400W

120

5-FU

/NO

(

3.1.5 Efeito da aminoguanidina e 1400W na marcação imunohistoquímica para

nitrico óxido sintase induzida (NOSi)

Observou-se marcação imunohistoquímica acentuada para enzima NOSi nas

células do tecido conjuntivo da mucosa jugal de hamster submetido à mucosite oral

experimental (Figura10C), em relação à marcação observada na mucosa de um

animal normal, não submetido à mucosite oral (Figura10B). O tratamento com AG

(10 mg/kg; Figura10D) ou 1400W (1 mg/kg; Figura10E), reduziu, consideravelmente,

a marcação imunohistoquímica para NOSi, quando comparado ao grupo submetido

à mucosite oral experimental que recebeu solução salina 0,9% (Salina). O controle

negativo (10A) representa uma amostra de mucosa jugal onde o anticorpo primário

foi substituido pelo PBS-BSA 5% e não mostra nenhuma marcação de NOSi.

3.1.6 Efeito da aminoguanidina e 1400W na marcação de células TUNEL positivas,

como indicativo de apoptose

Observou-se aumento claro de células TUNEL positivas nas células do tecido

conjuntivo e do epitélio da mucosa jugal de hamster submetido à mucosite oral

induzida por 5-FU e trauma mecânico (Figura

11C) quando comparada à mucosa

de um animal normal, não submetido à mucosite oral (Fig.ura11B). O tratamento

com AG (10 mg/kg; Figura 11D) ou 1400W (1 mg/kg; Figura 11E), reduziu a

marcação de células TUNEL positivas, sugerindo a diminuição de células em

apoptose, em relação ao grupo submetido à mucosite oral experimental que recebeu

solução salina (Salina; Figura 11). O controle negativo (Figura 11A) representa uma

amostra de mucosa jugal que não recebeu a enzima TdT que cataliza a adição dos

nucleotídeos do kit à terminação OH do DNA fragmentado, passo fundamental para

a marcação celular.

Para melhor compreensão desta seção, as Figuras de números 10 e 11 foram dividas em partes, cada uma delas

recebeu as numerações originais, acrescidas de uma letra do alfabeto romano, obedecendo a ordem seqüencial.

Figura 10 - Fotomicrografias de imunohistoquímica para NOSi de uma mucosa jugal

normal (B) ou com mucosite oral experimental recebendo solução salina (C),

aminoguanidina (AG; D), ou N-(3-(Aminomethyl)benzyl)acetamidina (1400W; E).

Legenda: A mucosite oral foi induzida em hamsters através de injeções de 5-

fluorouracil e de trauma mecânico com o auxílio de agulha de ponta romba nas

mucosas jugais. Os animais receberam injeções subcutâneas de 0,5 ml de salina,

aminoguanidina (10 mg/kg) ou 1400W (1 mg/kg), uma hora antes de cada injeção de

5-fluorouracil ou do trauma mecânico (TM) e, diariamente, até o sacrifício, no 10°

dia. Amostras de mucosa jugal coletadas, colocadas em formal a 10% e

processadas para a confecção de lâminas apropriadas para a técnica de

imunohistoquímica para detecção de NOSi (aumento de 400x). O controle negativo

(A) representa uma amostra de mucosa jugal onde o anticorpo primário foi

substituido pelo PBS-BSA 5% e não mostra nenhuma marcação de NOSi.

Figura 11 - Fotomicrografias de lâminas de mucosas jugais processadas pelo

método de TUNEL, de um animal normal (B) ou com mucosite oral experimental

tratado com solução salina (C), aminoguanidina (AG; D), ou N-(3-

(Aminomethyl)benzyl)acetamidina (1400W; E).

Legenda: A mucosite oral foi induzida em hamsters através de injeções de 5-

fluorouracil (5-FU) e de trauma mecânico com o auxílio de agulha de ponta romba

nas mucosas jugais. Os animais receberam injeções subcutâneas de 0,5 ml de

salina, AG (10 mg/kg) ou 1400W (1 mg/kg), uma hora antes de cada injeção de 5-FU

ou do trauma mecânico e, diariamente, até o sacrifício, no 10º dia. Amostras da

mucosa jugal foram retiradas por ocasião dos sacrifícios realizados no 10º dia,

colocadas em formal a 10% e processadas para a confecção de lâminas apropriadas

para marcação de células TUNEL positivas (aumento de 400x). O controle negativo

(A) representa uma amostra de mucosa jugal que não recebeu a enzima TdT que

cataliza a adição dos nucleotídeos do kit à terminação OH do DNA fragmentado,

passo fundamental para a marcação celular.

3.1.7 Efeito do 1400W na produção salivar não estimulada de animais submetidos

à mucosite experimental

Observou-se redução significativa (p<0,05) da produção de saliva, no 4° dia

de experimento, no grupo de animais submetidos à mucosite oral experimental e que

recebeu solução fisiológica 0,9% (Salina), quando comparada ao grupo controle

normal (Normal). O tratamento dos animais submetidos à mucosite oral por 5-FU e

trauma mecânico com 1400W (1 mg/kg) preveniu, significativamente (p<0,05), a

diminuição da produção salivar, mantendo os mesmos níveis observados no grupo

controle normal (Normal; Figura

12A). No 10º dia de experimento, entretanto, não

foram observadas diferenças significativas entre os grupos: controle normal

(Normal), grupo submetido à mucosite oral experimental que recebeu salina 0,9%

(Salina) e grupo tratado com 1400W (Figura 12B).

Para melhor compreensão desta seção, a Figura 12 foi dividida em duas partes, cada uma delas foi identificada

sequencialmente com a letra A e B, sendo citadas no texto da seguinte forma: Figura 12A; Figura 12B

Figura 12 - Efeito do N-(3-(Aminomethyl)benzyl)acetamidina (1400W) na produção

salivar não estimulada, no 4º (A) e 10º dias (B), de animais submetidos à mucosite

oral por 5-fluorouracil (5-FU) e trauma mecânico.

Legenda: A mucosite oral foi induzida em hamsters através de injeções de 5-FU e de

trauma mecânico com o auxílio de agulha de ponta romba nas mucosas jugais. Os animais

receberam injeções subcutâneas de 0,5 ml de salina ou 1400W (1 mg/kg), uma hora antes

de cada injeção de 5-FU ou do trauma mecânico e, diariamente, até 10º dia. No 4° e 10º

dias, após anestesia com hidrato de cloral e previa secagem da saliva pré-existente nas

cavidades bucais, cones de papel de filtro pesados previamente foram posicionados

bilateralmente no assoalho bucal para absorção da saliva secretada durante 5 minutos.

Após esse período, os cones foram novamente pesados. A produção de saliva durante 5

min resulta da diferença entre as duas pesagens. As barras representam Média ± EPM do

peso dos cones (g). *p<0,05 representa diferenças estatísticas em relação aos animais

normais (Normal). **p<0,05 representa diferença estatísticas em relação aos animais

Normal Salina 1400W

5-FU

peso dos cones (g)

Normal Salina 1400W

5-F

peso dos cones (g)

submetidos a mucosite experimental que receberam salina (Salina). O número de animais

utilizados foi, no mínimo, seis (Anova; Bonferroni).

3.2 Efeito do óxido nítrico na mucosite intestinal induzida por metotrexato

(MTX)

3.2.1 Efeito dos inibidores da NOS, AG e L-NAME, sobre as alterações

morfométricas e histopatológicas observadas em animais submetidos à mucosite

intestinal induzida por metotrexato

Observa-se, no 5º dia de experimento, encurtamento significativo (p<0,05)

dos vilos em todos os segmentos intestinais (duodeno, jejuno e íleo) dos animais

submetidos à mucosite intestinal por metotrexato e que receberam salina 0,9%

(Salina), quando comparados às mucosas de ratos normais, não submetidos à

mucosite intestinal (Normal; Figura

13). Observou-se ainda, no jejuno dos animais

do grupo salina, vilos encurtados e recobertos por células vacuoladas e planas,

intenso infiltrado de células inflamatórias, células de músculo liso verticalmente

orientadas na lâmina própria (Figura

14C) e criptas necróticas com infiltrado

neutrofílico (Figura 14D). Esses achados inflamatórios não estão presentes no jejuno

do grupo controle normal (Figura 14A e 14B).

O tratamento com AG (10 mg/kg) e L-NAME (20 mg/kg) foram capazes de

prevenir, de forma significativa (p<0,05), mas parcial, o encurtamento dos vilos

causado pelo metotrexato nos segmentos de duodeno e jejuno. Apenas o tratamento

com AG, no entanto, preveniu significativamente (p<0,05) o encurtamento dos vilos

no íleo (Figura 13). Ambos, AG (Figura 14E e 14F) e L-NAME (Figura 14G e 14H)

reduziram as alterações observadas nos vilos dos três segmentos do intestino

delgado, assim como a necrose das criptas ocasionadas pela administração de

MTX, conforme pode-se observar nos segmentos representativos de jejuno (Figura

14).

Para melhor compreensão desta seção, a Figura 13 foi dividida em três partes, cada uma delas foram

identificadas seqüencialmente com as letras A; B e C, sendo citadas no texto da seguinte forma: Figura 13A;

Figura 13B e Figura 13C

A Figura 14 foi dividida em 8 partes, cada uma delas foram identificadas seqüencialmente com as letras A; B;

C; D; E; F; G e H, sendo citadas no texto da seguinte forma: Figura 13A........Figura13H.

A administração do substrato verdadeiro da NOS, L-arginina (300 mg/Kg; i.p.),

simultaneamente à injeção de L-NAME, não foi capaz de reverter os efeitos do L-

NAME em nenhum dos três segmentos do intestino delgado (Figura 13).

Normal Salina AG - L-arg

100

150

L-NAME

Vilos (

Normal Salina AG - L-arg

100

150

200

L-NAME

Vilos (

Normal Salina AG - L-arg

100

150

L-NAME

MTX

Vilos (

Figura 13 - Efeito da aminoguanidina (AG) e Nφ-Nitro-L-arginine methyl (L-NAME)

sobre a altura de vilos no duodeno (A), jejuno (B) e íleo (C) dos animais submetidos

a mucosite intestinal.

Legenda: A mucosite intestinal foi induzida por três injeções consecutivas de 2,5

mg/kg (s.c) de metotrexato, em ratos. Os animais receberam antes da administração

do quimioterápico, solução salina 0.9% (i.p.), AG (10 mg/kg; i.p.) ou L-NAME (20

mg/kg; i.p.) diariamente, até o sacrifício, no 5o dia. Segmentos de duodeno, jejuno e

íleo foram removidos e processados para a coloração pelo método H&E para análise

morfométrica. *p<0,05 representa diferenças estatísticas em relação ao grupo

controle normal (Normal). **p<0,05 representa diferenças estatísticas em relação ao

grupo salina. O número de ratos utilizados foi, no mínimo, seis. (Anova; Bonferroni).

F E

Figura 14 - Fotomicrografias de jejuno de ratos Wistar normais e de animais

submetidos à mucosite intestinal pelo metotrexato (MTX) que receberam salina,

aminoguanidina (AG) ou Nφ-Nitro-L-arginine methyl (L-NAME).

Legenda: A mucosite intestinal foi induzida por três injeções consecutivas de MTX

(2,5 mg/kg; s.c.). Os animais receberam solução salina 0.9% (i.p.), AG (10 mg/kg;

i.p.) ou L-NAME (20 mg/kg; i.p.) , 1 hora antes da administração do quimioterápico e

diariamente, até o sacrifício, no 5

dia. O jejuno de cada animal foi removido e

processado para a técnica de coloração pelo método H&E (aumento de 400x).

Fotomicrografias representativas de jejuno normal, mostrando a região de vilos (A) e

criptas (B); jejuno de um animal submetido à mucosite intestinal por MTX, mostrando

vilos encurtados e recobertos por células vacuoladas e achatadas, intenso infiltrado

de células inflamatórias, células de músculo liso verticalmente orientadas na lâmina

própria (C) e criptas necróticas com infiltrado neutrofílico (seta amarela; D). A

administração sistêmica de aminoguanidina (E e F) e Nφ-Nitro-L-arginine methyl (L-

NAME; G e H) preveniu o encurtamento dos vilos, assim como a destruição das

criptas nos segmentos de jejuno de animais tratados com MTX. A barra mede 10µm.

3.2.2 Efeito da AG e L-NAME sobre a atividade de mieloperoxidase em jejuno de

animais submetidos à mucosite intestinal por MTX

Observou-se aumento significativo (p<0,05) da atividade da enzima mieloperoxidase

nos segmentos de jejuno do grupo de hamsters submetidos à mucosite intestinal por

MTX (Salina), no 5° dia de experimento, em comparação ao grupo controle normal.

O tratamento com aminoguanidina (10 mg/kg) ou L-NAME (20 mg/kg), reduziu, de

forma significativa (p<0,05), a atividade dessa enzima, restaurando esse parâmetro

aos níveis normais. (Figura 15).

3.2.3 Efeito do MTX na marcação imunohistoquímica para NOSi e de células

TUNEL positivas.

Observou-se, em segmentos de jejuno de animais submetidos à mucosite intestinal

por MTX, marcação imunohistoquímica acentuada para enzima NOSi, nas células

epiteliais que recobrem os vilos, em células da lâmina própria (Figura

16G) e nas

células inflamatórias presentes nos arredores e no interior das criptas necróticas

(Figura16I), quando comparada à tênue marcação observada na região de vilos

(Figura16C) e criptas (Figura16E) de um animal do grupo controle normal. O controle

negativo representa uma amostra de jejuno aonde o anticorpo primário foi

substituído pelo PBS-BSA 5% e não mostra nenhuma marcação de NOSi (A).

Observou-se, ainda, em segmentos de jejuno de animais submetidos à mucosite

intestinal por MTX (Salina), aumento acentuado de células TUNEL positivas na

lâmina própria (Figura16F), quando comparado ao jejuno de um animal do grupo

controle normal (Figura16D). O tratamento com AG (Figura16H) e L-NAME (Figura

16I) reduziu consideravelmente o número de células TUNEL positivas marcadas na

lâmina própria. O controle negativo representa uma amostra de jejuno aonde a

enzima TdT foi substituída pelo reaction buffer e não mostra marcação para células

TUNEL positivas (Figura16B).

Para melhor compreensão desta seção, a Figura 16 foi dividida em 10 partes, cada uma delas foram

identificadas seqüencialmente com as letras A; B; C; D; E; F; G ; H; I e J, sendo citadas no texto da seguinte

forma: Figura 13A........Figura 13I.

Figura15. - Efeito da aminoguanidina (AG) e Nφ-Nitro-L-arginine methyl (L-NAME)

na atividade de mieloperoxidase (MPO) em segmentos de jejuno de animais

submetidos à mucosite intestinal por MTX.

Legenda: A mucosite intestinal foi induzida por três injeções consecutivas de 2,5

mg/kg (s.c) de metotrexato em ratos. Os animais receberam antes de cada

administração do quimioterápico, solução salina, AG (10 mg/kg) ou L-NAME (20

mg/kg) diariamente, até o sacrifício, no 5

dia. Segmentos de jejuno foram coletados

e congelados em freezer –70º. As barras representam Média ± EPM da quantidade

de MPO x 10

/grama de tecido. *p<0,05 representa diferenças estatísticas em

relação ao grupo controle normal (Normal). **p<0,05 representa diferenças

estatísticas em relação ao grupo salina. O número de ratos utilizados foi, no mínimo,

seis. (Anova; Bonferroni).

C D

Figura 16 - Exemplos representativos da marcação imunohistoquímica para enzima

nítrico óxido sintase (NOSi; lado direito) e para células TUNEL positivas (lado

esquerdo) em segmentos de jejuno de rato.

Legenda: Os animais receberam MTX ou salina (s.c.) por três dias consecutivos.

Foram sacrificados no quinto dia experimental e tiveram os jejunos removidos para a

confecção de lâminas aproapriadas para a técnica de detecção de células TUNEL

positivas e de imunohistoquímica para NOSi (aumento de 400X). Jejuno de um

animal submetido à mucosite intestinal por metotrexato apresenta marcação

imunohistoquímica intensa para NOSi, tanto nas células epiteliais que recobrem os

vilos e nas células da lâmina própria (G), quanto nas células inflamatórias situadas

nos arredores e no interior das criptas necrosadas (I; seta preta), quando comparado

à marcação discreta nas regiões de vilos (C) e criptas (E) de um animal não

submetido à mucosite intestinal por MTX. O controle negativo representa uma

amostra de jejuno aonde o anticorpo primário foi substituído pelo PBS-BSA 5% e

não mostra nenhuma marcação de NOSi (A). Essa figura mostra ainda, em

segmentos de jejuno de animais submetidos à mucosite intestinal por MTX, aumento

acentuado de células TUNEL positivas na lâmina própria (F), quando comparado ao

jejuno de um animal do grupo controle normal (D). O tratamento com

aminoguanidina (H) e Nφ-Nitro-L-arginine methyl (L-NAME; I) reduziu

consideravelmente o número de células TUNEL positivas marcadas na lâmina

própria. O controle negativo (B) representa uma amostra de jejuno que não recebeu

a enzima TdT que cataliza a adição dos nucleotídeos marcados à terminação OH do

DNA fragmentado, passo fundamental para a marcação celular. As setas amarelas

indicam células TUNEL positivas. A barra mede 10 µm.

3.2.4 Western Blot

A expressão da NOSi foi claramente detectada no segmento de jejuno de um

animal submetido à mucosite intestinal por MTX, pelo método de Western Blot. Não

foi detectado a expressão da enzima nos segmentos de jejuno de animais

submetidos à mucosite intestinal e tratados com aminoguanidina (10 mg/kg) ou L-

NAME (20 mg/kg), nem tampouco em amostras de jejuno de animais do grupo

controle normal (Figura17).

Figura 17 - Ensaio de Western Blot para a expressão da enzima óxido nítrico

sintase induzida (NOSi; MW ~130kDa) em homogenato de segmentos de jejuno.

Legenda:A expressão da enzima NOSi foi detectada no jejuno de um animal submetido à

mucosite intestinal por MTX. A enzima não foi detectada nas amostras de jejuno de animais

submetidos à mucosite intestinal com MTX e tratados com aminoguanidina (AG; 10 mg/kg)

ou Nφ-Nitro-L-arginine methyl (L-NAME; 20 mg/kg), tampouco no jejuno de um animal

normal, não submetido à mucosite intestinal. A figura representa

blot de 2 experimentos.

3.3 Efeito da glutamina e alanil-glutamina na evolução da mucosite oral

induzida por 5-FU

3.3.1 Efeito da glutamina e alanil-glutamina sobre as mucosas jugais de hamsters

submetidos à mucosite oral induzida por 5-FU.

3.3.1.1 Análise Macroscópica

A análise macroscópica das mucosas jugais do grupo de animais submetidos

a mucosite oral por 5-FU que receberam apenas solução salina (Salina), no 10

dia,

constatou presença de hiperemia e eritema acentuados, hemorragia, úlceras

Normal

130kDa

AG L-NAME

MTX

extensas e abscessos, recebendo escore e variação 3(2-3) (Figura

18C; Tabela 3),

sendo significativamente diferente do grupo controle normal (Normal), cujo escore e

variação foram 0(0-0) (Figura18A; Tabelas 3) ou dos animais submetidos apenas ao

trauma mecânico (TM), com escore e variação 0,5(0-1) (Tabela 3).

O tratamento dos animais submetidos à mucosite oral com glutamina (100

mM) ou alanil-glutamina (100 mM) não foi capaz de prevenir, de forma significativa,

os danos à mucosa oral causados pela administração de 5-FU, observados no 10°

dia de experimento (Tabela 3). Por outro lado, no 14° dia, observou-se que o

tratamento, tanto com alanil-glutamina (Figura18G; Tabela 4) quanto com glutamina

(Figura18I; Tabela 4), reduziu significativamente as alterações inflamatórias, quando

comparados ao grupo submetido à mucosite oral experimental que recebeu salina

0,9% (Salina), aonde ainda observava-se eritema, edema e ulceração, apesar do

visível processo de cicatrização (Figura18E, Tabela 4).

3.3.1.2 Análise Microscópica

A análise histopatológica das mucosas jugais do grupo não tratado (Salina),

no 10º dia de experimento, revelou acentuada vasodilatação, infiltrado celular

intenso, com predominância de neutrólifos, hemorragia, edema e úlceras extensas

(Figura18D), recebendo escore e variação 3(1-3) (Tabela 3), apresentando diferença

estatística em relação ao grupo submetido apenas ao trauma mecânico (TM; Tabela

3 e 4) e também ao grupo controle normal (Normal; Figura18B; Tabelas 3 e 4).

O tratamento com alanil-glutamina (Figura18F; Tabela 3) ou glutamina

(Figura18H; Tabela 3) não foi capaz de reduzir a infiltração de células inflamatórias,

presença de edema e hemorragia, tampouco de prevenir a formação de úlceras e

abscessos, observados no 10º dia. Por outro lado, observou-se, no 14° dia de

experimento, maiores áreas de reepitelização nos grupos tratados com alanil-

glutamina (Figura18H; Tabela 4) ou glutamina (Figura18J; Tabela 4), quando

Para melhor compreensão desta seção, a Figura 18 foi dividida em 10 partes, cada uma delas foram

identificadas seqüencialmente com as letras A; B; C; D; E; F; G; H; I e J, sendo citadas no texto da seguinte

forma: Figura 18A........Figura 18I.

comparados ao grupo de animais submetidos à mucosite oral experimental por 5-FU

que receberam salina 0,9% (Salina; Figura18F; Tabela 4).

A B

Figura 18 - Aspectos macroscópicos e microscópicos de mucosas jugais de

hamsters normais (A e B) ou submetidos a mucosite oral induzida por 5-Fluorouracil

(5-FU) e trauma mecânico e que foram tratados com salina, observados no 10º (C e

D) e 14º (E e F) dias, com glutamina (G e H) ou alanil-glutamina (I e J), observados

no 14º dia de experimento

Legenda: A mucosite oral foi induzida em hamsters através de injeções de 5-

fluorouracil e de trauma mecânico (TM) com o auxílio de agulha de ponta romba nas

mucosas jugais. Os animais receberam solução oral de glutamina (100mM), alanil-

glutamina (100mM) ou 0,5 ml de solução salina 0,9% uma hora antes de cada

injeção de 5-FU ou do trauma mecânico e, diariamente, durante 10 ou 14 dias,

quando então, foram sacrificados e devidamente fotografados. Amostras foram

removidas, fixadas em formol a 10% e processadas para coloração H&E (x40).

TABELA 3 - Escores das análises macroscópicas e microscópicas da mucosa jugal

dos hamsters submetidos a mucosite oral experimental e tratados com glutamina e

alanil-glutamina durante 10 dias.

5-FU

Grupos experimentais NORMAL TM SALINA GLU AL-GLU

Análise macroscópica

0 (0-0) 0.5 (0-1) 3 (2-3)* 3 (1-3)* 3 (1-3)*

Análise microscópica 0 (0-0) 0.5 (0-1) 3 (1-3)* 2 (1-3)* 2 (1-3)*

___________________________________________________________________

Legenda: A mucosite oral foi induzida em hamsters através de injeções de 5-fluorouracil e

de trauma mecânico (TM) com o auxílio de agulha de ponta romba nas mucosas jugais. Os

animais receberam AG (5 e 10 mg/kg; sc), 1400W (1 mg/kg; sc) ou 0,5 ml de solução salina

0,9% (Salina) uma hora antes de cada injeção de 5-fluorouracil ou do trauma mecânico,

diariamente, durante 10 dias. Os dados representam mediana e variação de pelo menos 6

hamsters, dos seguintes parâmetros analisados: dilatação e ingurgitamento vasculares;

intensidade de infiltrado celular; presença de áreas hemorrágicas; de edema, de abscessos

e de úlceras para análise histopatológica e presença e intensidade de eritema, de hiperemia,

de hemorragia, de úlceras e de abscessos para análise macroscópica.

*p<0,05 representa

diferenças estatísticas em relação ao grupo controle normal (Normal); **p<0,05 representa

diferenças estatísticas em relação aos animais com mucosite oral não tratados, que

constituem o grupo salina (Kruskal-Wallis e Dunn´s).

TABELA 4 - Escores das análises macroscópicas e microscópicas da mucosa jugal

dos hamsters submetidos a mucosite oral experimental e tratados com glutamina e

alanil-glutamina durante 14 dias.

5-FU

Grupos experimentais NORMAL TM SALINA GLU AL-GLU

Análise macroscópica 0 (0-0) 0.5 (0-1) 2 (2-3)* 2 (1-2)*

** 2 (1-2)*

Análise microscópica 0 (0-0) 0.5 (0-1) 2 (1-3)* 2 (1-3)*

** 1 (1-2)*

___________________________________________________________________

Legenda: A mucosite oral foi induzida em hamsters através de injeções de 5-

fluorouracil e de trauma mecânico (TM) com o auxílio de agulha de ponta romba nas

mucosas jugais. Os animais receberam AG (5 e 10 mg/kg; sc), 1400W (1 mg/kg; sc)

ou 0,5 ml de solução salina 0,9% (Salina) uma hora antes de cada injeção de 5-

fluorouracil ou do trauma mecânico e, diariamente, durante 14 dias. Os dados

representam mediana e variação de pelo menos 6 hamsters, dos seguintes

parâmetros analisados: dilatação e ingurgitamento vasculares; intensidade de

infiltrado celular; presença de áreas hemorrágicas; de edema, de abscessos e de

úlceras para análise histopatológica e presença e intensidade de eritema, de

hiperemia, de hemorragia, de úlceras e de abscessos para análise macroscópica.

*p<0,05 representa diferenças estatísticas em relação ao grupo controle normal

(Normal); **p<0,05 representa diferenças estatísticas em relação aos animais com

mucosite oral não tratados, que constituem o grupo salina (Kruskal-Wallis e Dunn´s).

3.3.2 Efeito 5-FU sobre os níveis de glutamina no soro de hamsters.

A administração de 5-FU, seguida por trauma mecânico, causou diminuição

significativa (p<0,05) dos níveis de glutamina no soro dos animais que receberam

solução fisiológica a 0,9% (Salina), no 10º dia de experimento, quando comparado

ao grupo controle normal. A administração de glutamina e alanil-glutamina, nas

doses utiizadas, restaurou os níveis séricos de glutamina para a dosagem dos

animais normais (Figura 19).

3.3.3 Efeito da glutamina e alanil-glutamina sobre os estoques de glutationa nas

mucosas jugais dos hamsters submetidos à mucosite oral experimetal.

Os estoques de glutationa nas mucosas jugais dos animais submetidos à

mucosite oral induzida por 5-fluorouracil e trauma mecânico (Salina) encontram-se

significativamente diminuídos (p<0,05), no 10º dia, quando comparados ao grupo

controle normal e ao grupo submetido apenas ao trauma mecânico (TM). A

administração oral de alanil-glutamina (100mM) ou glutamina (100mM) foi capaz de

reverter, de forma significativa (p<0,05), os efeitos da mucosite oral experimental nos

estoques de glutationa na mucosa jugal, no 10° dia, visto que, nesses 2 grupos, não

se observou diminuição dos estoques de glutationa nas bochechas dos animais.

(Figura 20).

Figura 19 - Efeito da glutamina e alanil-glutamina sobre o nível de glutamina no soro

de hamsters submetidos a mucosite oral por 5-fluorouracil (5-FU).

Legenda: A mucosite oral foi induzida em hamsters através de injeções de 5-FU e

de trauma mecânico (TM) com o auxílio de agulha de ponta romba nas mucosas

jugais. Os animais receberam administrações orais de 0,5 ml de salina, glutamina

(100mM), ou alanil-glutamina (100mM), uma hora antes de cada injeção de 5-FU ou

do trauma mecânico (TM). Imediatamente antes do sacrifício, no 10º dia, sangue foi

coletado a partir de punção cardíaca, sob anestesia, centrifugados e congelados em

freezer 70º negativos para dosagem de glutamina. As barras representam Média ±

EPM da quantidade de glutamina (mMol/ml) do soro. *p<0,05 representa diferenças

estatísticas em relação aos animais normais (Normal). **p<0.05 representa diferença

estatísticas em relação aos animais submetidos a mucosite experimental que

receberam salina (Salina). O número de animais utilizados foi, no mínimo, seis

(Anova; Bonferroni).

Normal TM Salina Al- G lu Glu

0.0

0.3

0.6

5-FU

glutamina

Mol/ml

Figura 20 - Efeito da glutamina e alanil-glutamina sobre os estoques de glutationa

nas mucosas jugais de hamsters submetidoa à mucosite oral por 5-fluorouracil (5-

FU), no 5° (A) e 10° (B) dias.

Legenda:A mucosite oral foi induzida em hamsters através de injeções de 5-FU e de

trauma mecânico com o auxílio de agulha de ponta romba nas mucosas jugais. Os

animais receberam administrações orais de 0,5 ml de salina, glutamina (100mM), ou

alanil-glutamina (100mM), uma hora antes de cada injeção de 5-FU ou do trauma

mecânico. Amostras de mucosa foram retiradas por ocasião dos sacrifícios

realizados no 5º e 10º dias e congeladas em freezer 70o negativos. As barras

representam Média ± EPM dos estoques de glutationa (µg/100mg de mucosa jugal).

*p<0,05 representa diferenças estatísticas em relação aos animais normais

(Normal). **p<0.05 representa diferença estatísticas em relação aos animais

submetidos a mucosite experimental que receberam salina (Salina). O número de

animais utilizados foi, no mínimo, seis (Anova; Bonferroni).

Normal Salina Glu Al-G lu

400

800

1200

5-FU

g de NPSH/100mg

Normal Salina Glu Al- Glu

100

200

300

5-FU

g de NPSH/100mg

3.3.4 Efeito glutamina e alanil-glutamina sobre a atividade de mieloperoxidase

observada nas mucosas jugais de hamsters submetidos à mucosite oral

experimental

A atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) nas mucosas jugais do grupo

de hamsters submetidos à mucosite oral induzida por 5-FU (Salina), encontra-se

significativamente aumentada (p<0,05), no 10° dia de experimento, em comparação

ao grupo controle normal ou ao grupo submetido apenas ao trauma mecânico (TM).

O tratamento com alanil-glutamina, tampouco com glutamina não foi capaz de

reduzir, de forma significativa, a atividade dessa enzima, quando comparados ao

grupo salina, no 10º dia de experimento. No 14º dia, no entanto, tanto alanil-

glutamina quanto glutamina reduziram significativamente (p<0,05), o aumento da

atividade de mieloperoxidase induzido pela mucosite oral experimental, comparada

com a atividade de MPO no 10º dia (Figura 21).

3.3.5 Efeito da glutamina e alanil-glutamina na marcação de células TUNEL

positivas, como indicativo de apoptose

Observou-se um aumento claro de células TUNEL positivas no tecido

conjuntivo da mucosa jugal de hamster submetido à mucosite oral induzida por 5-FU

e trauma mecânico (Figura

22C) quando comparada à mucosa de um animal

normal, não submetido à mucosite oral (Figura 22B). O tratamento com alanil-

glutamina (Figura 22D) ou glutamina (Figura 22E), reduziu a quantidade de células

TUNEL positivas, sugerindo a diminuição de células em apoptose, em relação ao

grupo submetido à mucosite oral experimental que recebeu solução salina 0,9%

(Figura 22C). O controle negativo representa uma amostra mucosa aonde a enzima

TdT foi substituída pelo reaction buffer e não mostra marcação para células TUNEL

positivas (Figura22A).

Para melhor compreensão desta seção, a Figura 22 foi dividida em 5 partes, cada uma delas foram identificadas

seqüencialmente com as letras A; B; C; D e E, sendo citadas no texto da seguinte forma: Figura 22A........Figura

22E.

Figure 21 - Efeito da glutamina e alanil-glutamina sobre as medidas de atividade de

mieloperoxidase observadas na mucosite oral em hamsters.

Legenda: A mucosite oral foi induzida em hamsters através de injeções de 5-

fluorouracil (5-FU) e de trauma mecânico (TM) com o auxílio de agulha de ponta

romba nas mucosas jugais. Os animais receberam administrações orais de 0,5 ml de

salina, glutamina (100mM) ou alanil-glutamina (100mM), uma hora antes de cada

injeção de 5-fluorouracil ou do trauma mecânico (TM) e, diariamente, até o sacrifício,

no 10° ou 14° dias. Amostras de mucosa foram coletadas e congeladas em freezer -

20o C. As barras representam Média ± EPM da quantidade de MPO x 106/grama de

mucosa jugal. *p<0,05 representa diferenças estatísticas em relação aos animais

normais (N) e ao grupo submetido apenas ao trauma mecânico (TM). **p < 0,05

representa diferença estatísticas em relação aos animais submetidos a mucosite

experimental que receberam salina durante 14 dias (5-FU 14d). O número de

animais utilizados foi, no mínimo, seis (Anova; Bonferroni).

N TM 10d 14d 10d 14d 10d 14d

5-FU

AL-GLU

GLU

MPOx10

/g de tecido

Figura 22 - Fotomicrografias de lâminas de mucosas jugais processadas para

detecção de apoptose pelo método de TUNEL, de um animal normal (B) ou com

mucosite oral experimental tratado com solução salina (C), glutamina (D), ou alanil-

glutamina (E).

Legenda: A mucosite oral foi induzida em hamsters através de injeções de 5-

fluorouracil (5-FU) e de trauma mecânico (TM) com o auxílio de agulha de ponta

romba nas mucosas jugais. Os animais receberam administrações orais de 0,5 ml de

salina, glutamina (100 mM) ou alanil-glutamina (100 mM), uma hora antes de cada

injeção de 5-FU ou do trauma mecânico (TM). Amostras da mucosa jugal foram

retiradas por ocasião dos sacrifícios realizados no 10º dia, colocadas em formal a

10% e processadas para a confecção de lâminas apropriadas para a detecção de

E D

células TUNEL positivas (aumento de 400x). O controle negativo (A) representa uma

amostra de mucosa jugal que não recebeu a enzima TdT que cataliza a adição dos

nucleotídeos marcados à terminação OH do DNA fragmentado, passo fundamental

para a marcação celular.

4 DISCUSSÃO

O presente estudo demonstra claramente que o tratamento de hamsters com

aminoguanidina (AG) e N-(3-(Aminomethyl)benzyl)acetamidina (1400W), inibidores

da isoforma induzível da óxido nítrico sintase (NOSi) (GRIFFITHS et al., 1993;

MUSCARA; WALLACE, 1999; GARVEY et al., 1997), reduziu, de forma significativa,

os danos à mucosa oral causados pela mucosite induzida por 5-fluorouracil (5-FU) e

trauma mecânico. O tratamento com esses inibidores preveniu a infiltração de

células inflamatórias, assim como o edema, a hemorragia e a formação de úlceras e

abscessos. A administração de Nφ-Nitro-L-arginina methyl ester (L-NAME), um

inibidor não específico da NOS (MONCADA et al., 1991), entretanto, não foi capaz

de prevenir as alterações inflamatórias da mucosite oral. Estes dados, em conjunto,

sugerem a participação do óxido nítrico (NO), derivado da NOSi, na patogênese da

mucosite oral induzida por 5- FU.

O óxido nítrico é uma molécula composta por um átomo de nitrogênio e

oxigênio, apresentando um elétron desemparelhado, o que o torna altamente

reativo, com uma meia vida de 2 a 30 segundos. Dessa forma, após transmitir um

sinal, transforma-se espontaneamente em nitrito e nitrato (CRISTOPHERSON et al.,

1997). NO é formado pela enzima óxido nítrico sintase (NOS), numa reação que

combina oxigênio molecular com o nitrogênio terminal do aminoácido L-arginina,

liberando citrulina como co-produto. Três isoformas de NOS foram identificadas: uma

isoforma neuronal (NOSn), inicialmente encontrada no cérebro (BREDT et al., 1994;

SESSA et al., 1992), uma endotelial (NOSe), isolada em endotélio ( LAMAS et al.,

1992) e uma isoforma induzida (NOSi), isolada inicialmente em macrófagos (XIE et

al., 1992). Ambas NOSn e NOSe são constitutivamente expressas em seus leitos de

origem, e por essa razão são referidas como enzimas NOS constitutivas (NOSc).

Suas atividades são reguladas, principalmente, pela concentração do cálcio

intracelular [Ca

]. Dessa forma, o aumento do [Ca

] rapidamente ativa a NOSc,

pela ligação do complexo cálcio-calmodulina ao sítio para calmodulina na enzima.

Este caminho de síntese de NO é caracterizado por sua liberação em pequenas

quantidades (concentração picomolar) que pode ser rapidamente modulada por

qualquer estímulo externo que altere a [Ca

]. O NO produzido por essa enzima

regula várias respostas fisiológicas (EVANS; RALSTON, 1996). A nítrico óxido

sintase induzida (NOSi), por sua vez, é principalmente regulada à nível

transcripcional. Citocinas pró-inflamatórias e endotoxinas são potentes indutoras da

expressão dessa enzima em vários tipos de células, ao passo que, glicocorticóides e

citocinas antiinflamatórias como IL-4 e IL-10 e o fator de transformação de

crescimento (TGF-ß) suprimem a produção de NO por essa enzima (MONCADA et

al., 1991; BOGDAN et al., 1994). A ativação da NOSi, independe da concentração

do cálcio intra-celular e resulta na liberação de grandes quantidades de NO

(concentrações nanomolares) por períodos mais longos (NATHAN; XIE, 1994).

Mucosite oral é um processo complexo iniciado pela injúria às células basais

do epitélio e tecido subjacente pelas drogas quimioterápicas ou pela radiação. Além

do efeito direto desses agentes na atividade proliferativa das células epiteliais

(DUNCAN; GRANT, 2003), a geração de estresse oxidativo e liberação de espécies

reativas de oxigênio constituem uma das etapas iniciais para o desenvolvimento da

mucosite. As espécies reativas de oxigênio causam danos diretos às células,

tecidos, vasos sanguíneos, além de estimular fatores de transcrição, como o fator

nuclear κB ( NF-κB), que regula a expressão de múltiplos genes imunes e

inflamatórios. Dessa forma, a ativação do NF-κB resulta na liberação de múltiplos

mediadores inflamatórios, incluindo citocinas pró-inflamatórias como, interleucina 1β

(IL-1 β), interleucina-6 (IL-6) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) (HALL et al,

1995; KRENGER; FERRARA, 1999a, 1999b; SONIS et al, 2000). Estudo realizado

no nosso laboratório demonstra efeitos protetores significativos dos inibidores da

síntese de citocinas, pentoxifilina e talidomida, induzida por 5-FU em hamsters na

mucosite oral (LIMA et al., 2005). Esses dados são corroborados por diversos

estudos clínicos que sugerem a participação de TNF-α e IL-1 na fisiopatologia da

mucosite oral induzida por radioterapia (EPSTEIN et al., 1986; EPSTEIN et al., 1989;

EPSTEIN et al., 2001).

A investigação da participação do óxido nítrico na mucosite oral induzida por

5-FU, portanto, teve como base vários trabalhos na literatura que demonstram que

citocinas pró-inflamatórias estimulam a produção de NO e que o NO é um dos

mediadores dos efeitos citotóxicos dessas citocinas na inflamação (ESTRADA et al.,

1992, LIU et al., 2005; RALSTON et al., 1994). Reforçando o papel do óxido nítrico

em eventos inflamatórios, nosso grupo tem demonstrado a participação dessa

molécula na patogênese de várias doenças inflamatórias, como a periodontite

(LEITÃO et al., 2004, 2005), artrite reumatóide (ROCHA et al., 2002) e cistite

hemorrágica (SOUZA-FILHO et al., 1997). Estes resultados são reforçados por

dados da literatura que também relatam a participação do NO em várias outras

patologias inflamatórias (HUTCHESON et al., 1990; KOLB-BACHOFEN et al., 1994;

PETROS et al., 1991, PETROS et al., 1994; BOUGHTON-SMITH et al., 1993; CHEN

et al., 1996; MIDDLETON et al., 1993; STEFANOVIC-RACIC et al., 1993;

TEPPERMAN et al., 1993; FANG, 1997; PARKINSON et al., 1997; LAPPIN et al.,

2000; LOHINAI et al., 2001; SINGER et al., 1996; SORRELLS et al., 1996; FORD et

al., 1997; UNNO et al., 1997; DICKSON et al., 1999).

O efeito protetor do 1400W e da aminoguanidina, observado no presente

estudo, está associado à redução na infiltração de neutrófilos na mucosa oral,

detectada pela análise histopatológica e pela atividade de mieloperoxidase. A

mieloperoxidase é uma enzima microbicida presente em grânulos azurófilos de

neutrófilos e utilizada amplamente como marcador da presença destas células no

tecido inflamado (BRADLEY et al., 1982). Nosso trabalho demonstrou, de fato, uma

relação entre a atividade detectável de mieloperoxidase e a intensidade das lesões.

O menor infiltrado neutrofílico observado nas mucosas jugais de hamsters tratados

com 1400W ou AG é corroborado com estudos que demonstram que camundongos

nocauteados para NOSi, ou animais tratados com inibidores da NOS, apresentaram

redução significativa na migração neutrofílica induzida por enterotoxina B, produtos

da parede bacteriana, carragenina ou zymosan (AJUEBOR et al., 1998;

CUZZOCREA et al., 2000; FRANCO-PENTEADO

et al, 2001a, FRANCO-

PENTEADO et al 2001b). Outros estudos sugerem, contudo, que o NO regula

negativamente a expressão de moléculas de adesão no endotélio vascular,

resultando na diminuição do influxo de neutrófilos ao sítio inflamado (PENG et al.,

1998; KUBES et al., 1991; DAL SECCO et al., 2003). Uma explicação razoável para

essa controvérsia pode estar relacionada ao efeito bifásico de NO, relatado em

vários estudos, em diferentes modelos experimentais (WEI et al., 1995; LEITÃO et

al, 2004; RALSTON et al., 1995). No que diz respeito à migração de células

inflamatórias, tem sido demonstrado que, enquanto baixos níveis de NO, produzidos

pela NOSc, levariam à supressão da adesão de neutrófilos às células endoteliais

(HICKEY et al., 1994a, HICKEY et al., 1994b), níveis mais elevados de NO,

produzidos em processos inflamatórios, via NOSi, em resposta às citocinas, estaria

levando ao aumento da migração e ao dano tecidual, por mecanismos ainda não

completamente esclarecidos (AJUEBOR et al., 1998). Uma possível explicação pode

ser atribuída à formação de peroxinitrito, durante os eventos inflamatórios, a partir da

reação entre o NO e produtos reativos de oxigênio (CROW; BECKMAN, 1996;

SZABO, 1996; SZABO et al., 1997), ambos produzidos concomitantemente em

resposta às citocinas pró-inflamatórias (CUZZOCREA et al., 1998). O peroxinitrito

promove peroxidação lipídica (RADDI et al., 1991b; RUBBO et al., 1994), oxidação

de proteínas (RADDI et al., 1991a), além da nitrosilação de resísuos de tirosina de

uma grande variedade de proteínas, resultando na inativação de enzimas e/ou de

receptores (BECKMAN, 1996; BRENNER et al., 1997; ISCHIROPOULOS et al.,

1992; KONG et al., 1996; SZABO, 1996), com conseqüente injúria tecidual, maior

infiltração de células inflamatórias e amplificação da inflamação. Ademais, tem sido

demonstrado, que o NO produzido em grandes quantidades pela NOSi, promove a

liberação de vários mediadores inflamatórios, como TNF-α, IL-6 e quimiocinas, que

por sua vez, induzem a liberação de quantidades adicionais de NO (HIERHOLZER

et al., 1998; AJUEBOR et al., 1998; BRENNER et al., 1997) e que a inibição da NOS

acarreta no aumento da produção da interleucina-10 (IL-10), uma citocina anti-

inflamatória (MUHL; DINARELLO, 1997). Portanto, o menor influxo de neutrófilos

observado nas mucosas jugais de hamsters tratados com AG ou 1400W,

provavelmente, deve-se à supressão da produção de NO pela NOSi e suas

consequências.

Por outro lado, observou-se que o inibidor não seletivo da NOS, L-NAME,

(MONCADA et al., 1991) não preveniu, de forma significativa, as lesões induzidas

pela mucosite oral experimental, tampouco, a infiltração de neutrófilos, observada na

análise histopatológica e no ensaio de atividade da enzima mieloperoxidase. De

forma contrária, o tratamento com L-NAME promoveu um aumento significativo da

atividade de mieloperoxidase nas mucosas jugais de hamsters submetidos à

mucosite oral experimental. Em concordância com esse dado, foi demonstrado que

na disfunção endotelial, que resulta na supressão dos níveis basais de NO,

observou-se supra-regulação das moléculas de adesão, particularmente de P-

selectina, acarretando no aumento da migração de células inflamatórias e no maior

dano tecidual (LEFER; LEFER, 1996). Adicionalmente, foi demonstrado que

inibidores da NOS, incluindo L-NAME, aumentam a adesão leucocitária em endotélio

mesentérico de gato, possivelmente devido a regulação positiva da expressão das

moléculas de adesão CD11/CD18 (SZABO, 1996), uma vez que esse efeito foi

revertido por anticorpos monoclonais contra CD18 (KUBES et al., 1991). Portanto, a

inibição da isoforma constitutiva da NOS pelo L-NAME pode explicar sua falta de

efeito na prevenção da mucosite oral induzida por 5-FU, e a maior infiltração de

neutrófilos nas mucosas jugais de animais submetidos à mucosite oral e tratados

com L-NAME. Em suma, esses resultados sugerem que níveis basais de NO são

essenciais para a manutenção da homeostase, enquanto níveis elevados de NO,

produzidos pela NOSi durante as reações inflamatórias, contribuem para o dano

tecidual local (BRENNER et al. 1997; AJUEBOR et al., 1998; HIERHOLZER et al.,

1998; LOHINAI et al, 1998).

O aumento significativo da atividade da NOS, dos níveis de nitrito e, mais

especificamente, da marcação imunohistoquímica para NOSi, detectados no 10º dia

de experimento, nas mucosas jugais de hamsters submetidos a mucosite oral por 5-

FU e trauma mecânico, confirmam o envolvimento do óxido nítrico na fisiopatologia

dessa condição inflamatória. Esses achados são corroborados por um estudo,

realizado por Sonis e colaboradores, no qual demonstra-se a expressão do gene

para NOSi em mucosas jugais de hamsters submetidos à mucosite oral por radiação

(SONIS et al., 2002). A participação do NO na patogênese da mucosite oral induzida

por quimioterápicos, no entanto, não havia sido descrito na literatura, até a

publicação dos resultados apresentados nesse estudo (LEITÃO et al., 2007).

Vale ressaltar que no presente trabalho, observou-se marcação

imunohistoquímica para NOSi mesmo no epitélio da mucosa de hamster normal,

não submetido à mucosite oral. Provavelmente, esse resultado deve-se à expressão

da NOSi no epitélio da mucosa oral, em resposta ao ambiente bucal, normalmente

contaminado. Estudos adicionais, no entanto, são necessários para confirmar essa

hipótese. Observou-se também uma diminuição considerável da marcação

imunohistoquímica para NOSi nas células da lâmina própria da mucosa oral dos

animais submetidos à mucosite oral por 5-FU e trauma mecânico e tratados com AG

ou 1400W, quando comparados à marcação encontrada na mucosa oral de animais

submetidos à mucosite que receberam solução salina. Esse achado, provavelmente

é uma conseqüência da menor lesão inflamatória, em função da menor produção de

NO no tecido conjuntivo das mucosas jugais dos animais tratados com AG ou

1400W. É importante ressaltar que AG e 1400W bloqueiam a produção de NO por

competirem com a L-arginina pelo sítio ativo da enzima, não sendo relatado

consensualmente, a inibição da expressão da enzima por esses agentes.

O efeito protetor da aminoguanidina e do 1400W na mucosite oral

experimental também pode estar relacionado à diminuição da morte celular, visto

que o tratamento com esses inibidores da NOS reduziu claramente a marcação de

células TUNEL positivas, sugerindo diminuição de células apoptóticas, em relação

ao grupo submetido à mucosite oral experimental que recebeu solução salina. De

fato, a apoptose participa da fisiopatologia da mucosite oral induzida por

quimioterápicos (SONIS et al., 2004) e vários estudos demonstram que altas

concentrações de NO induzem apoptose em vários tipos de células (BECKMAN et

al., 1996; BRUNE et al., 1998; UEHARA et al., 1999; KANAOKA et al., 2000), por

diferentes mecanismos, dentro os quais, inibição reversível da respiração

mitocondrial, inativação irreversível das enzimas mitocondriais e/ou indução da

permeabilidade mitocondrial transitória (MURPHY, 1999). Corroborando com esse

dado, tem sido demonstrado que a produção excessiva de NO contribui para o

desenvolvimento de desordens neurodegenerativas, (HANTRAYE et al., 1996;

PRZEDBORSKI et al., 1996), e inflamatórias (YAGMUR et al., 2007), via indução de

apoptose.

No presente estudo, observou-se ainda, no 4º dia de experimento, diminuição

da produção salivar não estimulada, no grupo submetido à mucosite oral

experimental por 5-FU que recebeu solução salina, em comparação ao grupo de

animais normais. A diminuição da produção salivar foi previamente relatada em

pacientes com câncer no trato gastrointestinal tratados com 5-FU (McCARTHY et al.,

1998), assim como em pacientes irradiados por tumores de cabeça e pescoço

(ROSÁRIO et al., 2005), ambos por mecanismos não esclarecidos. De fato, é

aceitável que alterações na composição e quantidade salivar, influencie a

susceptibilidade da mucosa oral aos agentes citotóxicos, assim como sua

capacidade de reparo (SONIS et al., 2004), devido às suas ações protetoras. A

saliva, além de lubrificar e higienizar os tecidos da cavidade oral, contém

imunoglubulina A e substâncias antimicrobianas, como lactoferrina e lisozima,

limitando o acesso de agentes potencialmente nocivos ao trato gastrointestinal.

Contém ainda componentes bioativos, como fator de crescimento epidérmico que

provavelmente apresentam efeitos proliferativos sobre o epitélio da mucosa oral

(CHRISTENSEN et al, 1996; EGEA et al., 2002). Ademais, a xerostomia, condição

causada pela falta ou diminuição de saliva, causa dificuldades na deglutição,

afetando a ingestão de alimentos e comprometendo ainda mais o estado geral do

paciente (ORD; BLANCHAERT, 2001). O tratamento com 1400W preveniu

significativamente a diminuição da produção salivar, mensurada no 4º dia, no grupo

de hamsters submetidos à mucosite oral por 5-FU, mantendo esse parâmetro

semelhante ao encontrado no grupo controle normal e sugerindo uma possível

participação do NO, via NOSi, na toxicidade do 5-FU nas glândulas salivares. Na

avaliação da taxa salivar não estimulada, no 10º dia, não se observou diferenças

significativas entre o grupo controle normal e os grupos submetidos à mucosite oral

que receberam salina ou 1400W, provavelmente devido ao declínio das ações,

diretas ou indiretas, do 5-FU nas glândulas salivares. Apesar do efeito do 1400W na

produção salivar, demonstrado nesse trabalho, estudos adicionais são necessários a

fim de avaliar mais profundamente o papel do NO no efeito do 5-FU nas glândulas

salivares e na produção salivar.

Continuando nosso estudo sobre o papel do NO na mucosite induzida por

agentes antineoplásicos, o presente trabalho demonstrou ainda que o tratamento de

ratos submetidos à mucosite intestinal por MTX, com L-NAME ou AG, preveniu as

alterações morfológicas intestinais induzidas por MTX, como encurtamento de vilos e

necrose de criptas.

Mucosite intestinal é um efeito colateral da quimioterapia do câncer que leva à

importantes alterações, como diminuição da absorção de nutrientes, aumento da

permeabilidade intestinal, diarréia recorrente e perda de peso, comprometendo o

estado geral do paciente (DUCAM ; GRANT, 2003).

Metotrexato é uma droga citotóxica causadora de danos às células de rápida

divisão, como as células epiteliais das criptas intestinais, diminuindo, dessa forma, a

renovação celular. Nosso grupo demonstrou anteriormente que a administração de

MTX em ratos causa atrofia de vilos, diminuição da função de barreira e redução da

área de superfície absortiva (CARNEIRO-FILHO et al., 2004). Como conseqüência

da perda da função de barreira, o sistema imune da mucosa é exposto a vários

estímulos microbianos, como lipopolissacarídeos, respondendo com a liberação de

citocinas inflamatórias e anti-inflamatórias (TSUJI et al., 2003).

De fato, estudos demonstram a participação de citocinas pró-inflamatórias no

desenvolvimento da mucosite intestinal (HALL et al., 1995; KONING et al., 2006).

Conforme já citado, citocinas especialmente TNF-α e IL-1β induzem a expressão da

NOSi, com conseqüente produção de NO (ESTRADA et al., 1992; RALSTON et al.,

1994). Portanto, de acordo com os dados apresentados, NO, via NOSi, estaria

contribuindo para os danos à mucosa intestinal, de forma semelhante à sua

participação na mucosite oral induzida por 5-FU, conforme demonstrada no nosso

estudo (LEITÃO et al., 2007). Dados da literatura sugerem, entretanto, que

pequenas quantidades de NO, produzidos pela isoforma constitutiva da NOS

desempenha papel homeostático no trato gastrointestinal (POTOKA et al., 2002).

A participação da NOSi no desenvolvimento da mucosite intestinal por MTX,

descrita neste trabalho, é reforçada pelo claro aumento da expressão dessa enzima,

detectado por imunohistoquímica e por western blot em segmentos de jejuno de

animais submetidos à mucosite intestinal por MTX que receberam solução salina.

Corroborando com nossos dados, o aumento da expressão e atividade da NOSi foi

previamente constatado em modelo de colite em rato (SEO et al., 1995) e em

modelo de ileíte em cobaia, sendo nesse último, também prevenido pela

administração de L-NAME (MILLER et al., 1993). Da mesma forma, no nosso

trabalho, o L-NAME reduziu as alterações morfológicas e inflamatórias induzidas

pelo MTX na mucosite intestinal. Esse dado difere dos aqui apresentados

anteriormente para mucosite oral, onde o L-NAME não foi capaz de prevenir as

alterações inflamatórias induzidas por 5-FU, e sugere a participação do NO, via

NOSc, no desenvolvimento da mucosite intestinal, visto ser o L-NAME um inibidor

não específico da NOS (MONCADA et al., 1991). Uma possível explicação para os

diferentes resultados encontrados na mucosite oral e intestinal, em relação à

participação da NOSc e NOSi, pode ser atribuída à respostas distintas das mucosas

oral e intestinal frente à agressão. É importante enfatizar as diferenças embrionárias

dos epitélios da mucosa oral (ectoderma) e intestinal (endoderma). Além disso, o

fato dos estudos terem sido realizados em espécies animais diferentes pode ter

contribuído para esses resultados.

No presente estudo, foi observado diminuição da expressão da NOSi,

detectada por western blot, no jejuno de animais submetidos à mucosite intestinal

com MTX e tratados com AG ou L-NAME. Provavelmente esse resultado, conforme

discutido para mucosite oral, seja uma conseqüência da redução da inflamação no

tecido conjuntivo, por esses inibidores da NOS.

A marcação imunohistoquímica para NOSi foi mais evidente nos neutrófilos

situados dentro e nos arredores das criptas necróticas dos animais submetidos à

mucosite intestinal por MTX e que receberam salina, sugerindo a forte participação

do NO liberado por essas células na destruição das criptas intestinais, resultando em

retardo da recuperação das células de revestimento dos vilos. A importância dos

neutrófilos nessa condição inflamatória foi mais uma vez confirmada pelo aumento

da atividade de mieloperoxidase no jejuno dos animais do grupo MTX (submetidos à

mucosite intestinal que receberam salina). Foi observado ainda que o efeito protetor

do L-NAME e AG está associado à redução da infiltração neutrofílica, constatado

tanto pela histopatologia, quanto pela atividade de mieloperoxidase.

Embora estudos clássicos demonstrem a regulação negativa de moléculas de

adesão pelo NO (KUBES et al., 1991; PENG et al., 1998), o resultado apresentado

no presente estudo é corroborado por um outro trabalho, o qual demonstra que o L-

NAME inibiu a formação de edema induzido por carragenina, um agente inflamatório

conhecido por promover aumento da permeabilidade vascular às custas da

infiltração de leucócitos (MARTIN et al., 1994). Acredita-se que o menor infiltrado

inflamatório observado nos segmentos de jejuno dos animais tratados com L-NAME

e AG seja resultado da liberação diminuída de NO, com diminuição na formação de

peroxinitrito, um potente oxidante, o qual pode causar danos teciduais (RADI et al,

1991a, RADI et al, 1991b; BECKMAN; KOPPENOL, 1996; KONG et al., 1996; GOW

et al., 1996), levando à amplificação da resposta inflamatória e conseqüentemente,

maior infiltração de células inflamatórias, conforme já discutido neste trabalho para a

mucosite oral. Reforçando essa hipótese, estudos demonstram a participação de

NO, via formação de peroxinitrito, no desencadeamento da injúria à mucosa

intestinal, em condições clínicas associadas à expressão acentuada de NOSi no

intestino, provavelmente via apoptose de enterócitos dos vilos intestinais, resultando

numa área descoberta, sem células, susceptível à bactérias e seus produtos (

BECKMAN; KOPPENOL, 1996; POTOKA et al, 2002). A indução de apoptose por

peroxinitrito tem sido descrito em vários tipos de células (LIN et al., 1998;

BATINELLI; LOSCALZO, 2000; CASSINA et al, 2002; ESTEVEZ; JORDAN, 2002;

JOVANOVIC et al., 2002; LI et al., 2004; ITO et al., 2004; OIAO et al., 2005),

incluindo as células epiteliais intestinais (SANDOVAL et al, 1997a, SANDOVAL et al

1997b; POTOKA et al., 2003).

A apoptose de células epiteliais da mucosa intestinal e de criptas fazem

parte dos mecanismos desencadeadores da mucosite intestinal (PARIS et al. 2001,).

Um estudo clínico demonstrou que a mucosite intestinal induzida por quimioterápicos

está associada à apoptose de criptas, detectada pelo método de TUNEL (KEEFE et

al., 2000). Demostrou-se também apoptose induzida por MTX em linhagem celular

epitelial de ratos (PAPACONSTANTINOU et al., 2001). Corroborando com esses

trabalhos, observou-se, no presente estudo, aumento acentuado de células TUNEL

positivas no jejuno de animais submetidos à mucosite intestinal, quando comparado

à marcação observada no jejuno de um animal do grupo controle normal, sugerindo

o envolvimento da apoptose no mecanismo de citotoxicidade do MTX. Demonstrou-

se ainda no nosso trabalho, que o tratamento com L-NAME ou AG foi capaz de

prevenir a morte celular, detectada pela diminuição da marcação de células TUNEL

positivas sugerindo que o NO deve ser um mediador envolvido na indução de morte

celular na mucosite intestinal induzida por MTX.

O presente estudo demonstrou que a administração do substrato verdadeiro

da NOS, L-arginina, simultaneamente à administração do L-NAME, não foi capaz de

reverter os efeitos do L-NAME em nenhum dos três segmentos do intestino delgado.

O L-NAME é um análogo estrutural da L-arginina, atuando como falso substrato

enzimático, ocupando os sítios de ligação entra a L-arginina e a NOS (KNOWLES;

MONCADA, 1994). A inibição da enzima por esse substrato análogo pode ser

revertida pela aplicação simultânea de concentrações molares equivalentes de L-

arginina, o que é consistente com o seu bloqueio competitivo do sítio ativo da

enzima (BREDT; SNYDER, 1994). No presente estudo, objetivando investigar se o

efeito benéfico do L-NAME na mucosite intestinal deve-se à sua ação específica

sobre o bloqueio da NOS, administrou-se injeções simultâneas de L-NAME e L-

arginina em um grupo de ratos submetidos à mucosite intestinal por MTX. De forma

surpreendente, observou-se, entretanto, que os animais desse grupo específico,

apresentaram vilos menos achatados, assim como criptas mais íntegras, quando

comparado ao grupo tratado apenas com L-NAME. Essa diferença é

estatisticamente significativa nos segmentos de jejuno e íleo e, possivelmente, deve-

se a um outro papel da L-arginina, independente de seu efeito na síntese de NO.

L-arginina é um aminoácido não essencial, que possui múltiplas

propriedades biológicas e desempenha vários papéis no organismo, incluindo a

liberação de hormônios, síntese de colágeno durante processos de cicatrização,

além de participar de respostas imunes e inflamatórias (KIRK; BARBUL, 1990;

SUCHNER et al 2002). Por esses motivos, a L-arginina é especialmente importante

durante a recuperação após estados catabólicos (GRABON, 2006). Foi relatado que

a suplementação dietética com arginina, em modelo experimental de ileite, resultou

na diminuição do tempo de cicatrização das úlceras (SUKUMAR et al., 1997) e

estimulou a recuperação da mucosa do intestino delgado após injúria por radiação

(GURBUZ et al., 1998). Um trabalho recente mostra ainda que a administração oral

de arginina diminuiu o dano intestinal causado por endotoxemia induzida por

lipopolissacarídeos em ratos (SUKHOTNIK et al., 2005). Os mecanismos

responsáveis por esses efeitos positivos, todavia, não estão esclarecidos. Foi

sugerido que a liberação de hormônio de crescimento ou produção de poliaminas, a

partir de arginina e ornitina, seriam responsáveis pelos efeitos benéficos da arginina

exógena na recuperação da mucosa após isquemia/reperfusão (CYNOBER, 1994).

Ademais, foi demonstrado previamente o papel das poliaminas na manutenção da

integridade do epitélio intestinal (WANG, 1995) sugerindo que a biossíntese desse

aminoácido, influencia o crescimento normal da mucosa e a proliferação celular

(WANG et al., 1991).

Não se pode excluir, todavia, a possibilidade do efeito protetor da L-arginina,

observado no presente trabalho, ser conseqüência da produção de grandes

quantidades de NO, lembrando que a L-arginina é o substrato verdadeiro para sua

síntese. Resultado semelhante foi encontrado em estudo realizado em nosso

laboratório, no qual foi constatado o efeito bifásico do NO na reabsorção óssea, em

modelo de periodontite experimental. Neste estudo, a inibição da síntese de NO,

pela administração sistêmica de L-NAME ou AG, foi capaz de prevenir a perda

óssea, característica da doença periodontal. De forma contraditória, a aplicação local

do doador de NO, isossorbida, também reduziu significativamente a reabsorção

óssea (LEITÃO et al., 2004). De fato, o efeito dual do NO tem sido extensivamente

relatado (WEI et al., 1995; RALSTON et al., 1995). Em concordância com esse dado,

um estudo demonstrou efeito protetor da L-arginina, via aumento na produção de

NO, na injúria por reperfusão após transplante pancreaticoduodenal em ratos (YUAN

et al., 2004).

Em suma, os resultados apresentados aqui demonstram que a inibição da

NOS protege significativamente a mucosa intestinal contra os danos induzidos por

MTX. Nossos dados, mostrando um aumento da expressão da NOSi reforçam a

participação do NO no dano da mucosa intestinal durante o tratamento com MTX.

Considerando os dados demonstrados no presente trabalho, mostrando o

papel relevante do NO na mucosite oral e intestinal e a prevenção das lesões

associadas a esta condição por inibidores de sua síntese, torna-se razoável

especular que a sua modulação possa vir a ser no futuro uma opção na prevenção

e/ou tratamento destas condições. Obviamente esta opção está condicionada ao

surgimento de novos moduladores seguros para uso em humanos. Nesse contexto,

é importante uma breve discussão sobre o papel do óxido nítrico e de suas

isoenzimas no crescimento do tumor, após revisão da literatura. A expressão de

NOS e a produção de NO tem sido detectada em vários tumores humanos. As

células tumorais normalmente expressam NOSi e, em alguns casos, NOSe e NOSn,

dependendo do tipo do tumor e de seu estágio. No entanto, no que diz respeito ao

papel do NO na progressão do câncer, têm sido relatados dados conflitantes;

estudos demonstram que o NO pode promover ou inibir o crescimento tumoral e a

metástase. Esses efeitos opostos parecem depender de alguns fatores, tais como, a

concentração e o tempo de exposição ao NO, além da sensibilidade da célula

tumoral à essa molécula. Ainda não foram desenvolvidos até o momento, estudos

pré-clínicos esclarecendo a relação entre produção de NO, função linfática e

metástase no desenvolvimento do câncer (FUKUMURA et al., 2006). Estudos

adicionais aos atualmente divulgados na literatura, portanto, são necessários no

sentido de definir o papel do NO e de suas enzimas associadas, na evolução do

tumor, considerando sempre as diferenças entre os vários tipos de câncer e o

estágio no qual se encontram. Mesmo após a definição do papel do NO no câncer e,

caso seja confirmado a vantagem de sua modulação, o uso localizado no tumor seria

vantajoso em relação ao sistêmico, considerando o papel crítico da NOSe na

homeostasia de vários sistemas fisiológicos, como por exemplo, o cardiovascular.

Por fim, o presente trabalho buscou avaliar os efeitos da suplementação de

glutamina e de seu derivado estável, alanil-glutamina, na prevenção da mucosite

oral induzida por 5-FU em hamsters, assim como na fase de cicatrização das lesões

características dessa condição inflamatória. Inicialmente detectamos que o 5-FU

induziu uma diminuição significativa nos níveis plasmáticos de glutamina no grupo

de hamsters submetidos à mucosite oral por esse quimioterápico, em relação ao

grupo controle normal, no 10° dia de experimento. De acordo com esse resultado,

tem sido amplamente demonstrado declínio da concentração de glutamina

plasmática na vigência de estados catabólicos, como injúria e infecção (DECOMBAZ

et al., 1979; ASKANAZI et al., 1980; VENTE et al., 1989; LACEY; WILMORE, 1990;

PARRY-BILLINGS et al., 1990, 1992; PETERSEN et al., 1996; FURUKAWA et al.,

2000). Esse fato é relevante, especialmente em indivíduos susceptíveis, como

pacientes em recuperação pós-operatória, recém-nascidos de baixo peso, ou ainda

indivíduos com câncer (NEU; DEMARCO, 2002). Ademais, demonstrou-se que o

crescimento tumoral depleta os estoques de glutamina do indivíduo acometido,

resultando em caquexia (MEDINA, 2001; JOHNSON et al., 2003). Tem sido relatado

que pacientes com câncer de cabeça e pescoço são naturalmente depletados de

glutamina (KUBOTA et al., 1992), condição que pode ser exacerbada pelos efeitos

do tratamento do câncer, como sugerido pelos dados apresentados no nosso

estudo.

A glutamina é o aminoácido livre mais abundante nos músculos e sangue de

seres vivos (MURPHY; NEWSHOLME, 1999). Sua molécula compreende cinco

carbonos e tem muitas funções metabólicas importantes, tais como: combustível

oxidativo, transferência de nitrogênio e carbono entre tecidos, regulação na

homeostasia ácido-base, como precursora da amônia excretada pelo rim, além de

ser uma molécula precursora da gliconeogênese, da biossíntese de purinas, de

pirimidinas (e, conseqüentemente, ácidos nucléicos) e de outros aminoácidos. Dessa

forma, a glutamina é muito importante para os processos mitóticos por exercer um

papel essencial na geração de energia e na síntese de precursores de

macromoléculas celulares. Além disso, sabe-se que o crescimento tumoral está

associado ao ávido consumo de glutamina pelas células do tumor e à menor

atividade de células natural killer devido à diminuição das concentrações de

glutationa nessas células (MEDINA 2001). A glutationa é o principal antioxidante

intracelular, envolvida em várias funções biológicas, sintetizada a partir da glutamina.

Esses dados nos levam a supor, por conseguinte, que a suplementação de

glutamina em pacientes com câncer poderia apresentar efeitos benéficos,

restaurando os níveis de glutationa nas células de defesa do tipo natural killer, o que

resultaria no fortalecimento do processo de defesa do organismo. De fato, estudos

experimentais, em ratos, indicam que o suplemento dietético de glutamina foi capaz

de diminuir o crescimento tumoral por restaurar a função dessas células (FAHR et

al., 1994; YOSHIDA et al., 1995). Um estudo clínico recente, em pacientes com

câncer de mama demonstrou que a administração oral de glutamina não interferiu

com o efeito do tratamento quimioterápico no crescimento do tumor (LI et al., 2006).

Nosso grupo de pesquisa demonstrou anteriormente que a glutamina, e

especialmente a alanil-glutamina, têm efeitos expressivos na proteção da mucosa

intestinal contra a agressão por 5-FU e toxinas bacterianas (CARNEIRO-FILHO et

al., 2004b; BRITO et al., 2005). Estes dados, em conjunto, nos estimularam a

estudar o efeito da glutamina e alanil-glutamina na evolução das lesões encontradas

na mucosite oral induzida por 5-FU.

Apesar da administração de glutamina ou alanil-glutamina, na dose utilizada

nesse estudo, ter sido suficiente para reverter o efeito do 5-FU na diminuição dos

níveis séricos de glutamina, e também para aumentar significativamente os estoques

de glutationa nas mucosas jugais de animais submetidos à mucosite oral

experimental, não foi capaz de prevenir as lesões induzidas pela mucosite oral por 5-

FU, observadas no 10° dia. Esses resultados, apesar de inesperado, provavelmente

estão associados ao efeito direto do agente quimioterápico utilizado, que não pode

ser revertido pela glutamina. O 5-FU atua como potente antimetabólito ligando-se à

enzima timidilato sintetase, inibindo-a. Tal atividade resulta em inibição da síntese do

ácido timidílico e comprometimento da síntese de DNA e, conseqüentemente, do

crescimento celular (PINEDO; PETERS, 1988). O efeito direto do 5-FU sobre as

mitoses de células de rápida divisão celular, presentes nas camadas basais do

epitélio oral, desempenha papel importante no desenvolvimento da mucosite oral,

visto que diminui a taxa de renovação epitelial, resultando em alterações atróficas da

mucosa e, eventualmente, ulceração (GUGGENHEIMER et al., 1977; LOCKHART;

SONIS, 1991). Diante do exposto, apesar da glutamina ser essencial para a

proliferação celular, e um substrato metabólico importante para as células de rápida

divisão celular (NEWSHOLME et al., 1988), a suplementação de glutamina,

tampouco de alanil-glutamina, não foi capaz de antagonizar os efeitos do 5-FU na

inibição da proliferação celular, 10 dias após sua primeira administração. Estudos

clínicos demonstraram resultados semelhantes, aonde a suplementação de

glutamina ou de alanil-glutamina, não apresentaram nenhum efeito na mucosite oral

em pacientes transplantados (PYTLÍK et al., 2002), tampouco em pacientes com

câncer gastrointestinal (OKUNO et al., 1999), fazendo uso de 5-FU.

Os aspectos macroscópicos observados no 10º dia foram confirmados pela

análise histopatológica, a qual constatou vasodilatação, acentuada infiltração de

células inflamatórias, áreas hemorrágicas, edema, ulcerações e abscessos nas

mucosas jugais de hamsters submetidos à mucosite experimental que receberam

salina, assim como nos grupos tratados com glutamina ou alanil-glutamina.

O 14º dia de experimento foi selecionado para a avaliação do efeito da

glutamina e alanil-glutamina na fase de cicatrização das lesões induzidas por 5-FU e

trauma mecânico, baseado em estudos prévios de nosso grupo (LIMA et al., 2005).

Os resultados do presente estudo demonstram que a administração diária de

glutamina ou alanil-glutamina reduziu o tempo de cicatrização das lesões

características da mucosite oral, com diminuição dos parâmetros inflamatórios,

avaliados 14 dias após a primeira administração de 5-FU, quando comparados ao

grupo submetido à mucosite oral experimental que recebeu solução salina. Uma

explicação razoável para esse fato pode estar relacionada ao declínio da ação

antimetabólica do 5-FU, o que permitiu que a glutamina e alanil-glutamina

exercessem suas ações proliferativas. Nosso grupo obteve resultado semelhante em

modelo de mucosite intestinal induzida por 5-FU em ratos, o qual demonstrou que,

apesar de glutamina, tampouco alanil-glutamina, não terem sido capazes de prevenir

as lesões intestinais causadas pelo 5-FU, a alanil-glutamina foi capaz de acelerar a

recuperação da mucosa intestinal, de forma significativa (CARNEIRO-FILHO,

2004b). Esse efeito positivo da glutamina e alanil-glutamina é associado à

diminuição da infiltração neutrofílica, detectada pela histopatologia e pela redução

significativa da atividade de mieloperoxidase, observada no grupo submetido à

mucosite oral e tratados com glutamina ou alanil-glutamina. Esses resultados

corroboram com estudos prévios realizados no nosso laboratório, os quais

demonstraram aumento significativo da atividade de mieloperoxidase em ratos

depletados de glutamina e submetidos à edema de pata por carragenina ou pela

toxina A do Clostridium difficile. Esse estudo demonstrou ainda que a reposição de

glutamina foi capaz de reverter esse efeito inflamatório (NASCIMENTO et al., 2005).

Alguns aspectos devem ser considerados para justificar os benefícios da

suplementação de glutamina na redução do tempo de cicatrização, observado nesse

estudo. Em primeiro lugar, a glutamina é capaz de ativar a ornitina descarboxilase, a

primeira enzima da síntese de poliamina, de forma dose-dependente, com

conseqüente aumento da síntese de DNA. Ademais, glutamina ativa também a

sinalização mitótica, incluindo proteínas quinases ativadoras de mitose e de fatores

de transcrição, resultando em respostas proliferativas (KANDIL et al., 1995;

RHOADS et al, 1997). Em segundo lugar, tem sido demonstrado o papel positivo da

glutamina no sistema imune e na síntese de glutationa, reduzindo o estresse

oxidativo (HONG et al., 1992; DENNO et al., 1996; YU et al., 1996, 1999, AMORES-

SANCHEZ; MEDINA, 1999), importante desencadeador da mucosite oral (SONIS et

al., 2004). De fato, demonstrou-se nesse estudo, aumento dos estoques de

glutationa, no 10º dia, nas mucosas jugais de hamsters com mucosite oral induzida

por 5-FU e tratados com glutamina ou alanil-glutamina.

Apesar da cisteína e outros compostos tióis serem considerados limitantes

na biossíntese de glutationa, foi demonstrado que na vigência de estresses

metabólicos, a glutamina é essencial para a restauração dos níveis depletados de

glutationa (WELBOURNE , 1979; HONG et al., 1982; WELBOURNE; DASS et al.,

1982).

Glutationa, o principal antioxidante intracelular, está envolvida em várias

funções biológicas, incluindo a varredura de radicais livres, defesa contra

xenobióticos e carcinogênicos, reações redox e biossíntese de DNA e proteínas

(JOHNSON et al., 2003), sendo essencial para o funcionamento celular normal

(DENNO et al., 1996). Ademais, glutationa apresenta efeito inibitório da síntese de

várias citocinas (KARMALI, 1984; BUCKLEY et al., 1991). Os resultados desse

estudo sugerem que o aumento da biodisponibilidade de glutamina, como

conseqüência da administração exógena, foi capaz de restaurar gradativamente os

níveis de glutationa, o que pode ter diminuído a geração de radicais livres e estresse

oxidativo e resultando em maior proteção e proliferação celulares. No 5º dia após a

primeira administração de 5-FU, glutamina e tampouco alanil-glutamina não foram

capazes de reverter o efeito do 5-FU sobre os estoques de glutationa (dado não

mostrado). Esse resultado, em parte, pode explicar o efeito tardio dessas

substâncias na mucosite oral induzida por 5-FU.

Em suma, demonstrou-se que o 5-FU reduziu significativamente os níveis de

glutamina no soro de hamsters, assim como os estoques de glutationa nas mucosas

jugais desses animais. A administração de glutamina ou alanil-glutamina, não foi

capaz de prevenir as alterações inflamatórias, observados no 10º dia de mucosite

oral induzida por 5-FU. No entanto, os animais submetidos à mucosite oral por 5-FU

tratados com essas substâncias apresentaram reduções dos parâmetros

inflamatórios e aumento considerável das áreas de re-epitelialização, observados no

14º dia de experimento, quando comparados aos animais submetidos à mucosite

oral que receberam salina. Em outras palavras, a glutamina, assim como a alanil-

glutamina, não foram capazes de prevenir a mucosite oral por 5-FU, mas foram

eficazes em acelerar a cicatrização ou recuperação das lesões, reduzindo, de foram

significante, as alterações inflamatórias avaliadas.

• Os inibidores da NOS preveniram as mucosites oral e intestinal, induzidas por

5-fluorouracil e metotrexato, sugeringo o papel do óxido nítrico na

fisiopatologia dessas alterações inflamatórias. De acordo com os resultados

apresentados, pode-se sugerir a participação do NO produzido pela NOSi na

mucosite oral e pelas isoformas NOSc e NOSi na mucosite intestinal.

• A participação do óxido nítrico nas mucosites oral e intestinal induzidas por 5-

fluorouracil e metotrexato é reforçada pela maior atividade de NOS na

mucosite oral e pela maior expressão da enzima NOSi, detectadas tanto na

mucosite oral e intestinal.

• A glutamina e seu derivado alanil-glutamina em doses capazes de restaurar

os níveis séricos de glutamina e os níveis teciduais de glutationa, não

preveniram a mucosite oral induzida por 5-fluorouracil, no entanto, aceleraram

a recuperação da mucosa reduzindo a inflamação e promovendo

reepitelização.

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