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ANA KARINA RODRIGUES ABADIO
ANÁLISE DA DIVERSIDADE GENÉTICA DE ISOLADOS DE
Phaeoisariopsis griseola POR MEIO DE MARCADORES
MOLECULARES
Dissertação apresentada à
Universidade Federal de Viçosa,
como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em
Microbiologia Agrícola, para
obtenção do título de Magister
Scientiae.
VIÇOSA
MINAS GERAIS - BRASIL
2007
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ANA KARINA RODRIGUES ABADIO
ANÁLISE DA DIVERSIDADE GENÉTICA DE ISOLADOS DE
Phaeoisariopsis griseola POR MEIO DE MARCADORES
MOLECULARES
Dissertação apresentada à
Universidade Federal de Viçosa, como
parte das exigências do Programa de
Pós-Graduação em Microbiologia
Agrícola, para obtenção do título de
Magister Scientiae.
APROVADA: 15 de agosto de 2007.
___________________________ _________________________________
Prof
a
. Elza Fernandes de Araújo Prof
a
. Tânia Maria Fernandes Salomão
(Co-orientadora) (Co-orientadora)
___________________________ _____________________________
Prof
a
. Denise Mara Soares Bazzolli Prof. Olinto Liparini Pereira
_____________________________
Prof
a
. Marisa Vieira de Queiroz
(Orientadora)
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AGRADECIMENTOS
A Deus, que me proporcionou vencer mais esta etapa da minha vida.
Aos meus pais, Abel e Luiza, pelo apoio e pela ajuda em todos os
momentos.
Aos meus irmãos, Luciano, Leandro e Gabriela, à minha prima Letícia
e a todos os meus familiares, pelo apoio e incentivo.
À Universidade Federal de Viçosa e ao Departamento de
Microbiologia da UFV, pela oportunidade de realizar este curso de Mestrado.
Ao Instituto de Biotecnologia Aplicada à Agropecuária (BIOAGRO-
Viçosa-UFV), pelo espaço cedido em seus laboratórios para o
desenvolvimento e conclusão deste trabalho.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior,
CAPES, pela bolsa de estudos.
À professora Marisa Vieira de Queiroz, pela competente orientação,
pela confiança e pelo apoio durante toda a realização desse trabalho.
Às professoras conselheiras, Elza Fernandes de Araújo e Tânia Maria
Fernandes Salomão, pelas sugestões e pela disponibilidade durante todo o
desenvolvimento desse trabalho.
Ao pesquisador Aloísio Sartorato e ao Professor Everaldo Gonçalves
de Barros, por terem cedido os isolados de Phaeoisariopsis griseola
utilizados nesse trabalho.
Aos professores do Departamento de Microbiologia, pelos
conhecimentos transmitidos durante o curso.
ii
Aos funcionários da UFV, principalmente do BIOAGRO e da
secretaria do Departamento de Microbiologia, pelo auxílio.
Ao pesquisador Luiz Carlos Bhering Nasser, pela orientação, amizade
e incentivo durante minha Iniciação Científica.
Aos amigos de Brasília, em especial ao Clayton, ao Ricardo e à
Luciana, pela amizade e pelo constante incentivo.
À amiga Adriana, pela amizade incondicional mesmo estando longe.
À amiga Aline, pela grande amizade e por ter participado de todos os
momentos enquanto estive em Viçosa.
Às amigas-irmãs de República, Susan, Lílian, Larissa, Mariane e
Lorena, por tornarem nossa vida em Viçosa muito mais feliz e agradável.
Às amigas Nádia e Ludmila, pelos momentos divertidos que tivemos.
À amiga Patrícia, pelas boas risadas nesses dois anos.
Às amigas Darlene e Irene, pela atenção e pela ajuda na condução
dos trabalhos.
Ao amigo Rafael, pelo auxílio na bioinformática.
Aos amigos do Laboratório de Genética de Microrganismos
Guilherme, Daniel, Maycon, Tatiana, Swiany, Mariana, Leandro, Leonardo e
Natália, pela ajuda e por tornarem o ambiente de trabalho mais agradável.
Aos colegas do Laboratório de Biologia Molecular do Departamento
de Biologia Geral, pela contribuição na realização da técnica de ISSR.
A todos os amigos e colegas do Departamento de Microbiologia, pela
convivência agradável.
A todas as pessoas que, de alguma forma, contribuíram para a
conclusão desse objetivo.
iii
BIOGRAFIA
Ana Karina Rodrigues Abadio, filha de Abel Abadio e Luiza Maria
Rodrigues Abadio, nasceu em Brasília, DF.
Em 2001, iniciou o Curso de Ciências Biológicas na Universidade de
Brasília, e graduou-se em março de 2005.
Foi bolsista de iniciação científica de agosto de 2002 a julho de 2004.
Em agosto de 2005, iniciou o Curso de Mestrado em Microbiologia
Agrícola na Universidade Federal de Viçosa, defendendo dissertação em 15
de agosto de 2007.
iv
SUMÁRIO
RESUMO..................................................................................................... vi
ABSTRACT................................................................................................. viii
1. INTRODUÇÃO.......................................................................................... 1
2. MATERIAL E MÉTODOS......................................................................... 9
2.1. Microrganismos e condições de cultivo......................................... 9
2.2. Extração de DNA total...................................................................... 11
2.3. Análise da região ITS do rDNA....................................................... 12
2.3.1. Condições de amplificação e eletroforese............................... 12
2.3.2. Análise por RFLP........................................................................ 13
2.4. Amplificação de seqüências ERIC, BOX e ISSR........................... 13
2.4.1. Condições de amplificação e eletroforese............................... 13
2.4.2. Análise dos dados...................................................................... 15
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................. 17
4. CONCLUSÕES....................................................................................... 33
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................... 34
v
RESUMO
ABADIO, Ana Karina Rodrigues, M. Sc., Universidade Federal de Viçosa,
agosto de 2007. Análise da diversidade genética de isolados de
Phaeoisariopsis griseola por meio de marcadores moleculares.
Orientadora: Marisa Vieira de Queiroz. Co-orientadoras: Elza Fernandes
de Araújo e Tânia Maria Fernandes Salomão.
A mancha-angular, causada pelo fungo Phaeoisariopsis griseola,
também conhecido como Pseudocercospora griseola (Sacc.) Crous & U.
Braun, é uma das doenças mais importantes que ocorre no feijoeiro,
causando sérios prejuízos na produção. A forma mais econômica de controle
dessa doença é a utilização de cultivares resistentes. Entretanto, estudos
relacionados à diversidade genética de P. griseola têm demonstrado grande
variabilidade genética nesse fungo, o que tem dificultado a obtenção dessas
cultivares. Diante disso, o objetivo desse trabalho foi verificar se as técnicas
ERIC-PCR, BOX-PCR, ISSR-PCR e PCR-RFLP da região ITS do rDNA são
apropriadas para a detecção de polimorfismos genéticos que permitam
estimar a diversidade genética de isolados de P. griseola provenientes dos
estados de Goiás, Minas Gerais, Espírito Santo e Paraná. O DNA total de 29
isolados de P. griseola foi extraído e, posteriormente, utilizado para
amplificação de seqüências ERIC, BOX, ISSR e ITS utilizando
oligonucleotídeos específicos. As clivagens da região ITS com as enzimas
de restrição AluI, HaeIII, HhaI, HpaII, MboI, MspI e RsaI produziram perfis de
restrição idênticos para todos os isolados, e, portanto, a sequência ITS nas
vi
condições empregadas não forneceu marcadores que pudessem diferenciar
os isolados de P. griseola. Por meio da análise de agrupamento dos
resultados obtidos pelas técnicas BOX-PCR, ERIC-PCR e ISSR-PCR, foram
detectados 2, 5 e 28 genótipos, respectivamente, entre os isolados
estudados. Os resultados obtidos mostraram que as técnicas BOX-PCR e
ERIC-PCR foram menos eficientes na detecção de polimorfismo genético
entre os isolados de P. griseola. Os melhores resultados foram obtidos com
o emprego da técnica ISSR-PCR, que mostrou grande capacidade de
detecção de marcadores polimórficos entre os isolados. A diversidade
genética estimada poderá auxiliar no desenvolvimento de estratégias
adequadas para a obtenção de variedades de feijoeiro resistentes a esse
fungo.
vii
ABSTRACT
ABADIO, Ana Karina Rodrigues, M. Sc., Universidade Federal de Viçosa,
August, 2007. Genetic diversity of Phaeoisariopsis griseola isolates
revealed by molecular markers. Adviser: Marisa Vieira de Queiroz. Co-
Advisers: Elza Fernandes de Araújo and Tânia Maria Fernandes
Salomão.
The angular leaf spot, caused by Phaeoisariopsis griseola, also known
as Pseudocercospora griseola (Sacc.) Crous & U. Braun, is one of the most
important diseases in the bean plant, causing serious damages to the
production. The most efficient cost strategy for the management of plant
diseases is the use of resistant cultivars. However, studies related to the
genetic diversity of P. griseola have been demonstrating great genetic
variability in this fungus, what has been hardening the achievement of those
cultivars. Therefore, the aim of this work was to verify if the techniques of
ERIC-PCR, BOX-PCR, ISSR-PCR and PCR-RFLP of the rDNA ITS region
are able to detect the genetic diversity of the P. griseola isolates from Goiás,
Minas Gerais, Espírito Santo and Paraná states. The total DNA of the 29 P.
griseola isolates were extracted and, later, amplified using specific primers
for ERIC, BOX, ISRR and ITS sequences. The cleavages of the ITS region
with the restriction enzymes AluI, HaeIII, HhaI, HpaII, MboI, MspI e RsaI
produced identical restriction profiles for all the isolates, and, therefore, the
ITS sequence under used conditions supply markers that could differ the
isolates of P. griseola. Through the grouping analysis of the results obtained
viii
by the BOX-PCR, ERIC-PCR and ISSR-PCR techniques, 2, 5, and 28
genotypes were revealed, respectively, among the isolates studied. Those
results showed that BOX-PCR and ERIC-PCR techniques were less efficient
to detect the genetic variability of P. griseola isolates. The best results were
obtained using the ISSR-PCR technique, revealing high capacity in the
polymorphism detection among the isolates. The genetic diversity observed
can help in the development of appropriate strategies to obtain resistant bean
plant varieties to this fungus.
ix
1. INTRODUÇÃO
O feijão-comum (Phaseolus vulgaris L.) é um dos mais importantes
constituintes da dieta da população brasileira, por ser reconhecidamente
uma excelente fonte protéica, além de possuir bom conteúdo de carboidratos
e de ser rico em ferro. O Brasil é o maior produtor mundial de feijão-comum,
e Minas Gerais é o segundo maior Estado produtor, respondendo por
aproximadamente 15% da produção nacional (VIEIRA et al., 2006).
Além da sua relevância na dieta do brasileiro, o feijão é um dos
produtos agrícolas de maior importância econômico-social, em razão de ser
cultivado em várias áreas e da mão-de-obra empregada durante o ciclo da
cultura. Estima-se que no cultivo do feijão sejam utilizados cerca de 7
milhões de homens/dia-ciclo de produção, envolvendo aproximadamente
295.000 produtores apenas em Minas Gerais. Esta leguminosa é cultivada
em todas as regiões desse estado, com os mais variados níveis tecnológicos
e sistemas de produção (VIEIRA et al., 2006).
A maioria do feijão consumido ainda é produzida por pequenos
agricultores com poucos recursos tecnológicos e que, frequentemente,
consorciam essa leguminosa com outras culturas, sobretudo o milho. Esses
agricultores geralmente não controlam pragas e doenças (VIEIRA et al.,
2006).
Por ser cultivada durante todo o ano numa grande diversidade de
ambientes, essa leguminosa é afetada por várias doenças. Muitas destas
podem causar, dependendo das condições climáticas, redução significativa
1
na produção ou mesmo inviabilizar determinadas áreas para o cultivo.
Dentre as doenças mais importantes do feijoeiro, a mancha-angular,
causada pelo fungo Phaeoisariopsis griseola (Sacc.) Ferraris, tem sido
apontada como a principal doença da parte aérea da planta e encontra-se
distribuída em todas as regiões do mundo onde essa leguminosa é cultivada,
causando sérios prejuízos (VIEIRA et al., 2006). Até o final da década de
1980, a mancha-angular era reconhecida como doença de pequena
importância econômica (VIEIRA, 1964; OLIVEIRA et al., 1980; GOULART,
1988). Estimativas de perda na produção causada pela mancha-angular
atingem 70% no Brasil, dependendo das condições ambientais e da
suscetibilidade das cultivares (RAVA et al., 1985; SARTORATO & RAVA,
1992). As perdas são maiores quanto mais precoce for o aparecimento da
doença (OLIVEIRA et al., 2004).
Phaeoisariopsis griseola é um fungo mitospórico, pertencente ao
grupo dos cercosporóides (BRAUN, 1995). Com base em dados
morfológicos e de filogenia molecular, Phaeoisariopsis é considerado gênero
anamórfico de Mycosphaerella (CROUS et al., 2001). O fungo foi descoberto
primeiramente por Saccardo na Itália e foi nomeado Isariopsis griseola Sacc.
(SACCARDO, 1878). Posteriormente, FERRARIS (1909) propôs uma nova
combinação incluindo-o no gênero Phaeoisariopsis e recentemente, com
base em estudos de morfologia e de filogenia molecular, CROUS et al.
(2006) propuseram Pseudocercospora griseola (Sacc.) Crous & U. Braun
como o novo nome a ser conferido ao agente etiológico da mancha-angular
do feijoeiro. Entretanto, por esse trabalho ser muito recente e por toda
complexidade envolvida no processo de alteração de nomenclatura, será
usado o nome Phaeoisariopsis griseola.
A mancha-angular pode afetar toda a parte aérea da planta, podendo
causar a queda prematura das folhas com conseqüente redução na
produção. Além disso, o ataque às vagens pode levar à infestação ou
infecção das sementes a serem utilizadas no próximo plantio. Os esporos do
fungo são disseminados pela chuva, por partículas de solo infestadas, pelas
sementes (com baixa taxa de transmissão) e, principalmente, pelas
correntes de ar (SARTORATO, 2005).
2
O processo de infecção ocorre a partir da germinação do conídio na
superfície inferior da folha do feijoeiro, onde um tubo germinativo se estende
e forma uma estrutura semelhante a um apressório nas junções das células
epidérmicas e também sobre os estômatos. Ocorre assim a penetração do
fungo através do estômato. Após a penetração na folha, as hifas crescem
intercelularmente e ocorre a produção e liberação de toxinas pelo patógeno,
causando danos celulares. Os sintomas iniciais da doença nas folhas são
pequenas lesões de cor cinza e com um formato angular. As lesões
coalescem, tornam-se amarronzadas e causam o amarelecimento das
folhas, que caem prematuramente. Lesões podem também aparecer nas
vagens e nos caules (MONDA et al., 2001).
Para o controle da doença, as principais medidas recomendadas são:
boas práticas culturais, incluindo rotação de culturas, época adequada de
semeadura, uso de sementes sadias e remoção de restos culturais; controle
químico; e o uso de variedades resistentes. A utilização de variedades
resistentes é apresentada como a forma mais econômica de controle da
doença (SARTORATO et al., 1996). Entretanto, a alta variabilidade do
patógeno torna difícil encontrar cultivares de feijoeiro com resistência ampla
e duradoura a esta doença (SARTORATO et al., 1991; SARTORATO &
RAVA, 1992; FALEIRO et al., 2001). Devido à variabilidade de P. griseola,
cultivares que se comportam como resistentes em determinadas regiões
apresentam-se como suscetíveis em outras (OLIVEIRA et al., 2004). Assim,
estudos freqüentes da variabilidade genética do patógeno, bem como de sua
distribuição geográfica e a determinação de fontes com adequado nível de
resistência, são pontos-chave em programas de melhoramento visando
resistência a esta doença (OLIVEIRA et al., 2004).
A correta identificação e classificação de microrganismos são de
extrema importância prática não só no aspecto clínico, mas também
fitopatológico, biotecnológico e ambiental. Os métodos utilizados na
discriminação de gêneros, espécies e estirpes de microrganismos podem ser
divididos em métodos fenotípicos e genotípicos. Os métodos fenotípicos
baseiam-se em fenômenos bioquímicos e fisiológicos, enquanto os métodos
genotípicos detectam polimorfismo em nível dos ácidos nucléicos, ou
variação alélica em nível de enzimas. A tipagem de microrganismos, isto é, a
3
capacidade de identificá-los ao nível da espécie e de discriminar entre
indivíduos da mesma espécie, sofreu grandes avanços nos últimos anos,
tendo sido concretizada por uma série de novos métodos que fazem uso da
grande variação encontrada no DNA destes microrganismos. O
entendimento dessa variabilidade é crucial para o desenvolvimento de
estratégias adequadas para a obtenção de variedades resistentes (PYNDJI,
1993).
A diversidade genética de P. griseola foi inicialmente avaliada por
ALVAREZ-AYALA e SCHWARTZ (1979), por meio da inoculação de esporos
dos isolados em cultivares de feijoeiro resistentes e suscetíveis.
BURUCHARA (1983), na Colômbia, utilizou seis variedades diferenciadoras
de feijoeiro e 21 isolados de P. griseola, classificando-os em cinco raças. Em
1987, CORREA-VICTORIA avaliou 55 isolados de P. griseola provenientes
dos EUA, de países da América Latina e da África por meio de análises
isoenzimáticas. Os isolados foram divididos em dois grupos, os africanos e
os dos EUA e da América Latina.
SARTORATO et al. (1991) inocularam esporos de 24 isolados de P.
griseola em 15 cultivares, observando que esses isolados interagiam
diferentemente com os cultivares do hospedeiro. Esses resultados indicaram
uma variabilidade patogênica entre os isolados.
Com o advento das técnicas modernas de biologia molecular,
surgiram diversos métodos de detecção de polimorfismo genético
diretamente em nível de DNA. Inicialmente, a utilização de enzimas de
restrição permitiu a análise de comprimento de fragmentos de restrição de
DNA. O polimorfismo de seqüências é o resultado de pequenas diferenças
na seqüência de DNA, usualmente alterações únicas de pares de bases,
encontradas nos diferentes organismos. Algumas das alterações de
seqüência afetam os sítios de reconhecimento para as enzimas de restrição,
resultando numa variação do tamanho de certos fragmentos do DNA
produzidos pela digestão com uma enzima de restrição particular. Estas
diferenças de tamanho são referidas como polimorfismos do comprimento
dos fragmentos de DNA de restrição (RFLPs). O desenvolvimento do
processo de amplificação em cadeia utilizando uma DNA polimerase (PCR)
levou à descrição de outras técnicas moleculares, como as análises de
4
polimorfismo de DNA amplificado ao acaso (RAPD) (FERREIRA &
GRATTAPAGLIA, 1995).
PASTOR-CORRALES e JARA (1995) estimaram a diversidade
genética de P. griseola e sua co-evolução com o feijoeiro na América Latina
por meio de variedades diferenciadoras e marcadores moleculares RAPD.
Eles confirmaram a diversidade de P. griseola e a separação dos fenótipos
de virulência em dois grupos: Andino, que infecta somente os cultivares de
origem andina e Mesoamericano, que infecta tanto cultivares Andinos quanto
Mesoamericanos.
Estudos relacionados à classificação de isolados em raças por meio
de variedades diferenciadoras e à caracterização por meio da técnica de
RAPD têm demonstrado grande diversidade em P. griseola (NIETSCHE et
al., 2001; MAHUKU et al., 2002; NIETSCHE et al., 2002; SARTORATO
2004; STENGLEIN & BALATTI, 2006).
O desenvolvimento de técnicas moleculares de tipagem de
microrganismos abriu novas possibilidades nos campos da classificação,
identificação e diagnóstico. Qualquer método de tipagem genética deve
permitir a diferenciação clara de estirpes e, principalmente, deve ter uma
elevada reprodutibilidade. Nem todos os métodos moleculares de tipagem
são igualmente eficazes, diferindo na capacidade discriminatória em
diferentes níveis taxonômicos. Dessa forma, a escolha do método a ser
aplicado deve ser feita de acordo com a finalidade pretendida, por exemplo,
identificação, diferenciação, reprodutibilidade, poder discriminatório e custos
envolvidos. Em decorrência de problemas de reprodutibilidade com RAPDs,
outros métodos têm sido desenvolvidos para distinguir entre genótipos. O
método de tipagem denominado rep-PCR é baseado na amplificação, via
PCR, de elementos de DNA repetitivos presentes em genomas bacterianos.
Três famílias de seqüências repetitivas foram identificadas, a sequência REP
(“Repetitive Extragenic Palindromic”) de 35-40 pb (HIGGINS et al., 1982), a
sequência ERIC (“Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus”) de 124-
127 pb (HULTON et al., 1991), e o elemento BOX de 154 pb (MARTIN et al.,
1992).
Estudos baseados em rep-PCR foram descritos inicialmente em
Escherichia coli e Salmonella typhimurium (HIGGINS et al., 1982; HULTON
5
et al., 1991) e posteriormente em Pseudomonas e Xanthomonas (LOWS et
al., 1994; SCORTICHINI et al., 2002). Essas seqüências de DNA repetitivas
têm sido recentemente adaptadas para tipagem de genomas eucarióticos,
com aplicações na discriminação de populações de Leptosphaeria maculans
(Desm.) Ces. & De Not. (JEDRYCZKA et al., 1999), diferenciação de
espécies no gênero Tilletia (McDONALD et al., 2000), análise da diversidade
genética de isolados de Stemphylium solani G. F. Weber (MEHTA et al.,
2002), caracterização da diversidade genética entre isolados de Crinipellis
perniciosa (Stahel) Singer de diferentes plantas hospedeiras (ARRUDA et
al., 2003), discriminação de membros dos gêneros Phaeoacremonium e
Phaeomoniella (ALVES et al., 2004) e na caracterização da diversidade
genética entre isolados de Pandora neoaphidis (Remaud. & Henneleert)
Humber de diferentes hospedeiros e origens geográficas (TYMON & PELL,
2005).
Um outro método empregado para a detecção de variabilidade
genética é a técnica conhecida como ISSR (“Inter Simple Sequence
Repeat”) (ZIETKIEWICZ et al., 1994). Essa técnica permite a amplificação
de segmentos de DNA localizados entre duas seqüências microssatélites
idênticas orientadas em direções opostas. Microssatélites são pequenas
seqüências repetidas de DNA de 2 a 5 pares de bases.
O princípio da técnica de ISSR baseia-se na amplificação do DNA por
PCR, usando como oligonucleotídeos iniciadores seqüências de
nucleotídeos, com cerca de 16 a 25 pb de comprimento, complementares a
sítios de microssatélites aleatórios (ZIETKIEWICZ et al., 1994). Estes
oligonucleotídeos podem ser não ancorados ou ancorados em uma das
extremidades (5’ ou 3’) por uma pequena seqüência de 1 a 4 nucleotídeos. A
ancoragem serve para fixar o pareamento do oligonucleotídeo em uma única
posição no sítio alvo, o que resulta em baixo nível de pareamento
inespecífico. Apesar da técnica de ISSR ter sido originalmente desenvolvida
para a diferenciação genética entre grupos de plantas, recentemente, esta
ferramenta tem sido utilizada com sucesso em estudos de populações de
fungos, insetos e vertebrados (WOLFE, 2005).
Estudos realizados por TYMON & PELL (2005) permitiram estimar a
diversidade genética de 30 isolados, de diferentes origens geográficas, do
6
fungo entomopatogênico P. neoaphidis por meio das técnicas ISSR, ERIC e
RAPD. Um maior número de bandas foi produzido quando utilizou-se
oligonucleotídeos ERIC, entretanto um número maior de bandas polimórficas
foi obtido a partir de ISSR. O número de bandas polimórficas obtidas por
meio de RAPD foi semelhante ao de ISSR. Os resultados obtidos mostraram
altos níveis de variação intraespecífica entre os isolados de P. neoaphidis,
mas não foi detectada uma relação entre essa variação e a origem
geográfica dos isolados.
STENGLEIN e BALATTI (2006) estimaram a diversidade genética de
45 isolados de P. griseola por meio de variedades diferenciadoras e das
técnicas moleculares de RAPD e ISSR. A partir de RAPD e ISSR foram
identificados 9 e 17 genótipos, respectivamente, verificando assim que estas
duas técnicas detectam altos níveis de diversidade entre os isolados.
A detecção de polimorfismo por análises PCR-RFLP da região interna
transcrita (ITS) do DNA ribossomal (rDNA) também tem sido usada com
sucesso na caracterização de fungos, incluindo Rhizoctonia solani J. G.
Külin (MEINHARDT et al., 2002), Beauveria brongniartii (Sacc.) Petch
(WADA et al., 2003) e Aspergillus spp. (MARTÍNEZ-CULEBRAS & RAMÓN,
2007).
Os genes que codificam o rDNA da maioria dos genomas
eucarióticos são altamente repetidos e contêm regiões com graus variados
de divergência de seqüência. Genes que codificam 17S, 5,8S e 25S, ou
seus equivalentes, são separados por seqüências espaçadoras formando
uma única unidade repetida que é arranjada em cópias múltiplas (IBRAHIM
et al., 1994). Enquanto as subunidades do rDNA são altamente
conservadas, o espaçador intergênico (IGS) e o espaçador interno transcrito
(ITS) são polimórficos e constituem ferramentas úteis para estudos
filogenéticos e taxonômicos (HENRION et al., 1994).
Uma das técnicas empregadas na análise da região ITS é a de PCR-
RFLP, que requer pequena quantidade de DNA e dois oligonucleotídeos
específicos que flanqueiam a região ITS (WHITE et al., 1990). Esse
processo de amplificação e digestão com enzimas de restrição propicia a
formação de várias cópias da região ITS e possibilita a análise da seqüência
de DNA e detecção da variabilidade genética (MITCHELL et al., 1995).
7
MEINHARDT el al. (2002) estimaram a diversidade genética de 18
isolados de R. solani de feijoeiro cultivado na região da Mata Atlântica de
São Paulo por meio de PCR-RFLP da região ITS. O padrão obtido permitiu
identificar cinco genótipos entre os isolados, formando três grupos principais
levando-se em consideração 65% de similaridade. Entretanto, nem sempre é
possível identificar variabilidade genética intraespecífica por meio da análise
da região ITS. SILVA (2007) analisou a diversidade genética de 46 isolados
de C. perniciosa derivados de tecido infectado de Theobroma cacao L.,
coletados na Amazônia, por meio PCR-RFLP da região ITS e não verificou
variabilidade genética entre os isolados.
A detecção de elevado grau de polimorfismo, alta reprodutibilidade,
necessidade de pequenas quantidades de DNA e custo relativamente baixo
são algumas das vantagens da utilização das técnicas mencionadas para a
detecção de polimorfismos genéticos. Além do que, os marcadores ERIC,
BOX e ISSR permitem a análise da variabilidade de todo o genoma
analisado.
O objetivo desse trabalho foi verificar se as técnicas ERIC-PCR, BOX-
PCR, ISSR-PCR e PCR-RFLP da região ITS do rDNA são apropriadas para
a detecção de polimorfismos genéticos que permitam estimar a diversidade
genética de isolados de P. griseola provenientes dos estados de Goiás,
Minas Gerais, Espírito Santo e Paraná.
8
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Microrganismos e condições de cultivo
Foram analisados, neste trabalho, 29 isolados do fungo
Phaeoisariopsis griseola (Tabela 1) cedidos gentilmente por Aloísio
Sartorato, pesquisador da EMBRAPA Arroz e Feijão localizada na cidade
Santo Antônio de Goiás, do estado de Goiás e por Everaldo Gonçalves de
Barros, professor do Departamento de Biologia Geral da Universidade
Federal de Viçosa, Viçosa, Minas Gerais.
O fungo foi mantido em placas de Petri contendo meio de cultivo de
polpa de tomate (200 mL de polpa de tomate Pomodoro, 800 mL de água
destilada, 15 g de agar e 3 g de carbonato de cálcio). De cada placa
contendo a cultura do patógeno, foi obtida uma suspensão de conídios e
fragmentos de micélio, a partir da adição de água estéril. Essa suspensão foi
espalhada em placas contendo meio de cultivo de polpa de tomate. Em
seguida, as placas foram incubadas a 24°C por, aproximadamente, 12 dias.
9
Tabela 1. Identificação, patótipo e procedência dos isolados de
Phaeoisariopsis griseola
Isolados Raça Procedência
29-3 63-55 Lambari, MG
97-2 31-15 Coimbra, MG
158-1 63-23 Afonso Cláudio, ES
592-3 _ Anápolis, GO
397 55-23 Sto. Antônio de Goiás, GO
410 63-31 Sto. Antônio de Goiás, GO
419-3 _ Lapa, PR
419-6 _ Lapa, PR
478-2 _ Pato Branco, PR
811 63-23 Damolândia, GO
836 63-7 Damolândia, GO
838 63-23 Damolândia, GO
848 63-47 Damolândia, GO
858 63-15 Damolândia, GO
868 63-63 Damolândia, GO
1018 _ Ponta Grossa, PR
1033 _ Sto. Antônio de Goiás, GO
1038 _ Sto. Antônio de Goiás, GO
1111 _ Sto. Antônio de Goiás, GO
1190 _ Sto. Antônio de Goiás, GO
1191 _ Sto. Antônio de Goiás, GO
1205 _ Goiânia, GO
1206 _ Goiânia, GO
1207 _ Goiânia, GO
1209 _ Goiânia, GO
1213 _ Goiânia, GO
1214 _ Unaí, MG
1218 _ Unaí, MG
1285 _ Sto. Antônio de Goiás, GO
_ Raça ainda não identificada.
10
2.2 Extração do DNA total
A extração do DNA total dos isolados de P. griseola foi realizada
segundo o protocolo estabelecido para fungos do gênero Aspergillus
(PREBBLE & ANDERSON, 1998), com algumas modificações.
Esporos e fragmentos de micélio foram inoculados em meio GPYECH
líquido (ANSARI et al., 2004) e mantidos à 24ºC, por dez dias. Após esse
período de incubação, o micélio foi lavado com água destilada, seco em
papel toalha, congelado em nitrogênio líquido e armazenado à –80°C.
Para iniciar a extração, o micélio foi macerado em gral de porcelana
contendo nitrogênio líquido até transformar-se em um pó fino. O pó obtido foi
transferido para um tubo de polipropileno, onde foram adicionados 15 mL de
tampão de extração (Tris-HCl 200 mM pH 8,0, EDTA 50 mM, NaCl 250 mM,
SDS 2%).
Após a adição do tampão de extração, as amostras foram incubadas
a 70°C, em banho-maria, por aproximadamente 20 minutos. Posteriormente,
foi adicionado um volume de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1) aos tubos,
os quais foram mantidos no gelo por 30 minutos e centrifugados a 14.500 g
por 40 minutos.
Em seguida, adicionou-se ao sobrenadante 1 volume de isopropanol
gelado e a mistura foi incubada a -4°C por 12 horas. Posteriormente, as
amostras foram centrifugadas a 4.300 g por 15 minutos. O sobrenadante foi
descartado e o sedimento foi lavado com etanol 70% (v/v) e seco à
temperatura ambiente, sendo posteriormente ressuspendido em 1 mL de
água ultra pura.
Após homogeneização da solução de ácidos nucléicos, o conteúdo foi
dividido em tubos de 1,5 mL, adicionado de acetato de amônio 7 M para uma
concentração final de 2,6 M, incubado no gelo por 1 hora e centrifugado a
12.000 g por 30 minutos. O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
foi adicionado igual volume de fenol-clorofórmio. Os tubos foram incubados
no gelo por 5 minutos, sendo agitados a cada minuto, e centrifugados a
12.000 g por 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
foi adicionado igual volume de clorofórmio. Os tubos foram incubados no
gelo por 5 minutos, sendo agitados a cada minuto, e centrifugados a 12.000
g por 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para novos tubos.
11
Para a precipitação dos ácidos nucléicos, foi adicionado NaCl a uma
concentração final de 100 mM e um volume de isopropanol gelado
correspondente ao volume do sobrenadante, e os tubos foram incubados a -
4ºC durante 30 minutos. Uma última centrifugação foi feita a 12.000 g por 30
minutos. O DNA precipitado foi lavado com etanol 70% (v/v), seco à
temperatura ambiente e ressuspendido em 50 μL de água ultra pura.
Para digerir o RNA total, foram adicionados 3 μL de RNAse A
(10mg/mL) e a solução foi incubada a 37°C, por 30 minutos.
A quantificação do DNA foi realizada por eletroforese em gel de
agarose 0,8%, usando o DNA do fago λ como marcador de quantidade.
2.3 Análise da região ITS do rDNA
2.3.1 Condições de amplificação e eletroforese
A região ITS foi amplificada via PCR de acordo com WHITE et al.
(1990), utilizando os oligonucleotídeos ITS 1 (5’
TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3’) e ITS 4 (5’ GTAGTCATATGCTTGTCTC
3’) sintetizados pela GIBCO-BRL (Life Technologies). As reações de PCR
possuíam um volume de 25 μL contendo 50 ng do DNA molde; 120 pmoles
de cada oligonucleotídeo (ITS 1 e ITS 4); 10 mM Tris-HCl pH 8,3; 50 mM
MgCl
2
, 0,4 mM de cada dNTP (dGTP, dCTP, dATP e dTTP) e 2U de Taq
DNA polimerase. As amplificações foram realizadas em termociclador PTC-
100 (MJ Research, Inc.), programado para realizar uma desnaturação inicial
a 94°C por 10 minutos, 40 ciclos a 94°C por 1 minuto, 50 °C por 1 minuto, 72
°C por 1 minuto e 30 segundos, e uma extensão final de 72 °C por 7
minutos. Reações controle, sem DNA, foram realizadas com o propósito de
verificar a presença de DNA contaminante.
O produto de amplificação foi analisado por eletroforese em gel de
agarose 1,5% em tampão TBE 1 X (2 mM EDTA; 0,1 M Tris-HC pH 8,0 e 0,1
M ácido bórico), sob uma voltagem constante de 4 Vcm
-1
, visualizado por
exposição à luz UV dos géis contendo brometo de etídeo (0,5 μg/mL), e
digitalizado utilizando o sistema de fotodocumentação Eagle Eye II. Para
12
estimar o tamanho dos fragmentos de DNA amplificados, amostras de 1 Kb
DNA Ladder foram utilizadas como marcador molecular de tamanho.
2.3.2 Análise por RFLP
O produto da amplificação foi clivado separadamente com as enzimas
de restrição: AluI (Promega), HaeIII (Promega), HhaI (Promega), HpaII
(Stratagene), MboI (Stratagene) MspI (Promega), e RsaI (Stratagene). Cada
reação de clivagem continha 10 μL do produto de amplificação, 5 unidades
de enzima, 2 μL de tampão da enzima num volume total de 20 μL, e a
digestão foi realizada a 37°C por 4 horas.
Os fragmentos de DNA obtidos foram analisados em gel de agarose
2,0% em tampão TBE 1 X, sob uma voltagem constante de 4 V.cm
-1
, e estes
foram visualizados por exposição à luz UV dos géis contendo brometo de
etídeo (0,5 μg/mL), e digitalizados usando o sistema de fotodocumentação
Eagle Eye II. Para estimar o tamanho dos fragmentos de DNA de restrição,
foi utilizado como marcador molecular de tamanho o DNA do bacteriófago
Φx174 clivado com a enzima de restrição HaeIII.
A análise dos dados foi feita mediante comparação dos perfis de
restrição de cada isolado.
2.4 Amplificação de seqüências BOX, ERIC e ISSR
2.4.1 Condições de amplificação e de eletroforese
A região BOX foi amplificada via PCR de acordo com RADEMAKER
et al. (1997), utilizando o oligonucleotídeo BOX 1R (5’
CTACGGCAAGGCGACGCTGACG 3’) sintetizado pela Promega. As
reações de PCR possuíam um volume de 25 μL contendo 50 pmoles do
oligonucleotídeo (BOX 1R); 50 ng de DNA genômico molde; 2,5 mM de cada
um dos quatro dNTPs; 2 U de Taq DNA polimerase (Gigco) e 1 mg.mL
-1
de
BSA (soro albumina bovina, Gibco). As amplificações foram feitas em
13
termociclador PTC-100 (MJ Research, Inc.), programado para realizar uma
desnaturação inicial a 95°C por 7 minutos, 35 ciclos a 94°C por 3 segundos,
92°C por 30 segundos, 50°C por 1 minuto, 65°C por 8 minutos, e uma
extensão final a 65°C por 8 minutos.
A região ERIC foi amplificada via PCR de acordo com LOUWS et al.
(1994), utilizando os oligonucleotídeos ERIC 1R (5’
ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC 3’) e ERIC2 (5’
AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG 3’) descritos por VERSALOVIC et al.
(1991) e sintetizados pela Promega. As reações de PCR possuíam um
volume de 25 μL, contendo 50 pmoles de cada um dos dois
oligonucleotídeos (ERIC1R e ERIC2); 50 ng de DNA total molde; 2,5 mM de
cada um dos quatro dNTPs; 2,5 U de Taq DNA polimerase (Gibco) e 1
mg.mL
-1
de BSA (soro albumina bovina, Gibco). As amplificações foram
feitas em termociclador PTC-100 (MJ Research, Inc.), programado para
realizar uma desnaturação inicial a 95°C por 7 minutos, 30 ciclos a 94°C por
1 minuto, 52°C por 1 minuto, 65°C por 8 minutos, e uma extensão final a
65°C por 15 minutos.
A região ISSR foi amplificada via PCR de acordo com STENGLEIN &
BALATTI (2006), com modificações. Anteriormente, 100 oligonucleotídeos
foram testados e 8 desses foram escolhidos (Tabela 2). As reações de PCR
possuíam um volume de 25 µL contendo 50 ng de DNA total; dNTPs a 200
µM; 0,5 U de Taq DNA polimerase; 50 pmoles de oligonucleotídeo e 2,5 µL
de tampão 10 X. As amplificações foram feitas em termociclador PTC-100
(MJ Research Inc.), programado para realizar uma desnaturação inicial de a
94 ºC por 3 minutos, 40 ciclos a 92ºC por 1 minuto, 2 minutos à temperatura
de pareamento do oligonucleotídeo (que varia de acordo com o
oligonucleotídeo utilizado), 72ºC por 2 minutos, e uma extensão final a 72ºC
por 7 minutos.
Para garantir a reprodutibilidade dos fragmentos de DNA
amplificados, todas as reações de PCR foram conduzidas em duplicatas
para cada isolado e reações sem DNA foram realizadas com o propósito de
verificar a presença de DNA contaminante.
Os produtos de amplificação foram analisados por eletroforese em gel
de agarose 1,5% em tampão TBE 1 X, sob uma voltagem constante de 4
14
V.cm
-1
, e estes foram visualizados por exposição à luz UV dos géis contendo
brometo de etídeo (0,5 μg/mL), e digitalizados utilizando o sistema de
fotodocumentação Eagle Eye II. Para estimar o tamanho dos fragmentos de
DNA amplificados, amostras de 1 Kb DNA Ladder foram utilizadas como
marcador molecular de tamanho.
Tabela 2. Oligonucleotídeos usados na amplificação de seqüências ISSR
Oligonucleotídeo Seqüência Temperatura de
pareamento (°C)
UBC 809 AGAGAGAGAGAGAGAGG 53
UBC 836 AGAGAGAGAGAGAGAGYA 50
UBC 842 GAGAGAGAGAGAGAGAYG 48
UBC 880 GGAGAGGAGAGGAGA 53
UBC 888 BDBCACACACACACACA 50
UBC 889 DBDACACACACACACCA 52
UBC 890 VHVGTGTGTGTGTGTGT 57
UBC 891 HVHTGTGTGTGTGTGTG 55
Y = (C,T); B = (C,G,T); D = (A,G,T); H = (A,C,T); V = (A,C,G).
2.4.2 Análise dos dados
Para a análise dos dados, a cada banda com uma mobilidade
eletroforética diferente foi designada um número de posição e uma marca de
1 ou 0 baseado na presença ou ausência da banda. A similaridade genética
foi estimada por meio do coeficiente de Jaccard (1908). O coeficiente de
similaridade de Jaccard foi calculado pela divisão do número de bandas que
ocorreu em ambas as tipagens pelo número total de bandas (comum e
única) em ambas as tipagens. Análises de agrupamento foram realizadas,
permitindo a construção de dendrogramas a partir dos dados do coeficiente
de similaridade de Jaccard pelo método UPGMA (“unweighted pair-group
15
method using arithmetic means”), utilizando o programa GENES (CRUZ,
1997).
A análise de variância molecular (AMOVA), dos dados obtidos a partir
da técnica ISSR-PCR, foi utilizada para revelar a distribuição da variabilidade
genética dentro e entre as populações de isolados coletados nos quatro
Estados. Nesta análise, a diversidade genética total foi particionada em dois
níveis hierárquicos distintos: diferença entre populações e entre isolados
dentro de população. A AMOVA foi realizada de acordo com EXCOFFIER et
al. (1992), com o auxílio do programa Arlequim 3.01 (EXCOFFIER et al.,
2006). A significância da diferenciação foi testada com 1000 permutações.
16
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os isolados de P. griseola foram analisados empregando diferentes
marcadores moleculares. Os oligonucleotídeos ITS1 e ITS4 foram utilizados
para amplificar as regiões espaçadoras transcritas do rDNA ITS1 e ITS2,
incluindo o gene 5,8S. A amplificação com esses iniciadores resultou em um
único fragmento de DNA de aproximadamente 520 pb a partir do DNA total
de 29 isolados (Figura 1). Foram detectados sítios de restrição AluI, HaeIII,
HhaI, HpaII, MboI, MspI e RsaI nos fragmentos de todos os isolados
analisados foram detectados (Tabela 3). A figura 2 ilustra o resultado da
digestão da região ITS com AluI, onde foram detectados dois fragmentos de
DNA de aproximadamente 370 e 150 pb.
As clivagens com todas as enzimas de restrição, das regiões ITS e de
5,8S amplificadas, resultaram em perfis de bandas idênticos para todos os
isolados quando analisados por eletroforese em gel de agarose a 2%.
Portanto, esta análise, nas condições empregadas, não foi apropriada para a
detecção de polimorfismo genético entre os isolados analisados.
17
pb
500
pb
500
pb
500
pb
500
Figura 1. Amplificação da região ITS do rDNA de isolados de P. griseola,
utilizando os oligonucleotídeos ITS1 e ITS4. M - 1 Kb DNA Ladder, utilizado
como marcador de tamanho molecular.
18
p
b
310
194
118
Figura 2. RFLP da região ITS do rDNA de isolados de P. griseola com a
enzima AluI. M - DNA do bacteriófago Φx174 clivado com a enzima de
restrição HaeIII.
Estes resultados estão de acordo com outros autores. Por meio da
análise da região ITS, SILVA (2007) caracterizou a diversidade genética de
46 isolados de C. perniciosa derivados de tecido infectado de T. cacao. O
produto da amplificação foi digerido separadamente com as enzimas de
restrição DraI, EcoRI, HaeIII, HindIII, PstI, HinfI e MspI. Dentre essas
enzimas, HinfI e MspI foram selecionadas por digerirem os fragmentos de
DNA amplificados. Essas clivagens resultaram em perfis de bandas idênticos
para todos os isolados. Diante desses resultados e dos obtidos no presente
trabalho, pode-se observar que a técnica PCR-RFLP da região ITS nas
condições empregadas foi ineficiente na detecção de variabilidade genética
intraespecífica de C. perniciosa e P. griseola. Entretanto, dados mostram
que essa técnica tem sido empregada com sucesso na caracterização de
outros fungos. MEINHARDT el al. (2002), estimaram a diversidade genética
de 18 isolados de R. solani de feijoeiro cultivado na região de Mata Atlântica
de São Paulo por meio da análise da região ITS. O produto da amplificação
da região ITS foi digerido separadamente com as enzimas de restrição AvaI,
HaeIII, HhaI, MboI, MseI, MspI, NciI e TaqI. Sítios HaeIII, HhaI, MseI e TaqI
foram detectados e diferentes perfis de restrição foram identificados, o que
permitiu separar os isolados em cinco genótipos. A análise de PCR-RFLP da
região ITS com essas enzimas mostrou ser efetiva na diferenciação dos
isolados de R. solani, diferenciação essa que não foi evidenciada no
presente trabalho.
19
Tabela 3. Fragmentos de DNA (pb) da região ITS do rDNA dos 29
isolados de Phaeoisariopsis griseola obtidos por clivagem com diferentes
enzimas de restrição
Enzima Tamanho dos fragmentos de DNA (pb)
AluI 370
150
HaeIII 450
70
HhaI 200
180
140
HpaII 280
150
90
MboI 330
190
MspI 280
150
90
RsaI 430
90
A técnica ERIC-PCR do DNA total de 29 isolados de P. griseola
resultou em um total de 15 bandas distintas, com tamanhos de 400 a 1600
pb aproximadamente (Figura 3). Dessas, 53,3% foram polimórficas entre os
isolados testados. Foram consideradas para as análises as bandas mais
definidas e que tiveram repetibilidade nas amplificações.
A análise de agrupamento dos dados de ERIC mostrou cinco
genótipos, organizados em 3 grupos distintos, designados A, B e C (Figura
4) com aproximadamente 18% de dissimilaridade genética, revelando uma
variação entre os três grupos. No grupo A, todos os isolados foram coletados
em Goiás e no grupo B, os isolados foram coletados em Goiás, Minas Gerais
e Espírito Santo. No grupo C, que contém a maioria dos isolados, estes
20
foram coletados em Goiás, Minas Gerais e no Paraná. Os grupos B e C
foram divididos em subgrupos, sendo alguns formados por isolados do
mesmo local de origem e outros com isolados de origem distinta. Esses
resultados mostram que não foi possível identificar uma estruturação dos
isolados de acordo com o local de origem.
Apesar de não ter sido possível a diferenciação dos isolados de P.
griseola de acordo com a origem geográfica, em outros trabalhos foi possível
observar essa diferenciação. ARRUDA et al. (2003), caracterizando a
diversidade genética entre isolados de C. perniciosa de diferentes plantas
hospedeiras por meio de ERIC-PCR, mostraram uma variabilidade
intraespecífica considerável em C. perniciosa de T. cacao, estruturando a
maioria dos isolados com base no local de origem. MEHTA et al. (2002)
também fizeram a análise da diversidade genética de isolados de S. solani
levando-se em consideração a planta hospedeira, algodão e tomate, e o
local de origem dos isolados. Esse trabalho mostrou um baixo nível de
polimorfismo entre os isolados de algodão, mas diferenças claras foram
observadas entre os isolados de algodão e tomate. Além disso, observaram
diferenças entre os isolados de tomate de diferentes locais de origem.
A partir dos resultados desses trabalhos, e levando em consideração
a espécie em estudo, pode-se observar que ERIC-PCR foi uma técnica
capaz de detectar polimorfismo intraespecífico, entretanto, em alguns casos,
não foi possível identificar uma relação dos isolados com o local de origem.
21
p
b
1500
1000
750
500
p
b
1500
1000
750
500
Figura 3. Seqüências ERIC de isolados de P. griseola. M - 1 Kb DNA Ladder,
usado como marcador de tamanho molecular. B - Amostra sem DNA. As setas
pontilhadas indicam bandas polimórficas.
22
Isolados
C
B
A
Distância genética relativa (%)
Figura 4. Dendrograma obtido pelo método UPGMA mostrando as relações
genéticas entre isolados de P. griseola, com base na tipagem ERIC-PCR.
A técnica BOX-PCR do DNA total de 29 isolados de P. griseola
resultou em um total de 10 bandas distintas, com tamanhos de 500 a 2000
pb aproximadamente (Figura 5). Apenas uma dessas 10 bandas (10,0%) foi
polimórfica entre os isolados testados. As bandas identificadas foram, de
modo geral, pouco definidas e com intensidade bastante uniforme,
dificultando a visualização. De qualquer forma, o padrão obtido permitiu
identificar apenas dois genótipos entre os isolados.
A análise de agrupamento dos dados de BOX revelou dois genótipos,
organizados em 2 grupos distintos, designados A e B (Figura 6),
apresentando 10% de dissimilaridade genética. A variabilidade genética foi
menor que àquela encontrada na análise de ERIC-PCR. No grupo A, um
23
isolado foi coletado no Paraná e todos os outros em Goiás. No grupo B, que
contém a maioria dos isolados, estes foram coletados em Goiás, Minas
Gerais, Espírito Santo e no Paraná. Esses resultados também mostram que
não foi possível identificar uma estruturação dos isolados de acordo com o
local de origem.
Embora baixo nível de polimorfismo tenha sido identificado entre os
isolados de P. griseola, existem estudos que demonstram que esta técnica
foi eficiente na diferenciação de isolados de outras espécies fúngicas.
JEDRYCZKA et al. (1999), utilizando ERIC, REP e BOX-PCR para a
caracterização de populações de L. maculans, mostraram que seqüências
ERIC, REP e BOX estão presentes no genoma do fungo e que constituem
ferramentas úteis para a caracterização dos isolados analisados. O
polimorfismo entre os isolados de L. maculans obtido a partir de BOX-PCR
foi bem maior que o observado no presente trabalho. Tal como observado no
presente estudo, as bandas de DNA resultantes da análise por BOX-PCR
realizada por JEDRYCZKA et al. (1999) também apresentaram intensidade
uniforme.
McDONALD et al. (2000) também utilizaram as técnicas ERIC, REP e
BOX-PCR para diferenciar espécies no gênero Tilletia. A análise das três
técnicas combinadas revelou que as espécies foram reunidas em 3 grupos
principais. Os resultados desse estudo demonstram que ERIC-PCR e BOX-
PCR foram eficientes na caracterização das espécies. Entretanto,
diferentemente do nosso trabalho, as bandas geradas por BOX-PCR foram
bem definidas, não apresentando problemas na visualização.
24
p
b
2000
1500
1000
750
p
b
2000
1500
1000
750
Figura 5. Seqüências BOX de isolados de P. griseola. M - 1 Kb DNA Ladder,
utilizado como marcador de tamanho molecular. B - Amostra sem DNA. A
seta pontilhada indica banda polimórfica.
25
Isolados
B
A
Distância genética relativa (%)
Figura 6. Dendrograma obtido pelo método UPGMA mostrando as relações
genéticas entre isolados de P. griseola, com base na tipagem BOX-PCR.
A técnica ISSR-PCR do DNA total de 29 isolados de P. griseola,
utilizando oligonucleotídeos ISSR (Tabela 2), resultou em um total de 61
bandas distintas, com tamanho variando de 300 a 2000 pb
aproximadamente. Dessas, 70,5% foram polimórficas. Bandas com baixo
nível de resolução não foram utilizadas nas análises. Os perfis de bandas
obtidos com os oligonucleotídeos UBC 836 e UBC 888 estão mostrados nas
Figuras 7 e 8, respectivamente.
A análise de variância dos dados moleculares (AMOVA) permitiu uma
divisão da variação genética em dois níveis: dentro de populações e entre
populações. Foi observada maior variação genética dentro das populações,
ou seja, entre os isolados dentro de cada Estado, com 98,69% da variação
26
total. Apenas 1,31% da variação genética foi observada entre populações,
ou seja, entre os isolados dos quatro Estados analisados (Tabela 4). Isso
revela que não há evidência de estruturação populacional entre os Estados.
Tabela 4. Análise de variância molecular (AMOVA) dentro e entre
populações de Phaeoisariopsis griseola
Fonte de variação g.l
Soma dos
quadrados
Componente de
variância
Variação
total (%)
Entre populações
3
15,834
0,06614
1,31
Dentro de
populações
25 124,200 4,96800 98,69
Total
28
140,034
5,03414
g.l= grau de liberdade. As probabilidades foram calculadas por 1000
permutações ao acaso
A análise de agrupamento dos dados de ISSR resultou em um
dendrograma que separou os isolados em 28 genótipos (Figura 9),
detectando variabilidade mais eficientemente do que ERIC-PCR e BOX-
PCR. O alto nível de polimorfismo detectado mostra que a técnica ISSR-
PCR foi apropriada para a discriminação de genótipos em P. griseola.
De acordo com a metodologia utilizada, e baseado na distância
genética relativa de aproximadamente 31%, os isolados foram divididos em
quatro grupos A, B, C e D, contendo cada um deles, 1, 3, 1 e 24 isolados,
respectivamente. O grupo A contém um único isolado coletado no estado de
Goiás. O grupo B inclui isolados procedentes de Goiás e Minas Espírito
Santo. O grupo C também contém um único isolado coletado no estado de
27
Minas Gerais, e o grupo D contém a maioria dos isolados, sendo eles
procedentes dos quatro Estados amostrados.
Curiosamente, o isolado 868, pertencente ao grupo A, divergiu muito
dos demais isolados, ficando separado. Uma importância maior deve ser
dada na caracterização desse isolado, visto que ele pertence à raça 63-63,
significando que todas as cultivares utilizados na identificação desse isolado
dentro de uma raça foram suscetíveis a ele, sendo assim um isolado de
destaque, mais virulento.
Os resultados obtidos por ISSR-PCR, assim como por ERIC-PCR e
BOX-PCR, não mostraram uma relação entre diversidade genética e as
origens geográficas dos isolados. Da mesma forma, estudos realizados por
TYMON & PELL (2005) com 30 isolados, de diferentes origens geográficas,
do fungo entomopatogênico P. neoaphidis por meio das técnicas ISSR,
ERIC e RAPD, mostraram altos níveis de variação intraespecífica entre os
isolados de P. neoaphidis, não identificando uma estruturação dos isolados
de acordo com o local de origem. Estudos realizados por SARTORATO
(2004), onde o objetivo foi estimar a diversidade genética de 96 isolados de
P. griseola coletados em duas cidades do estado de Goiás por RAPD,
mostraram grande diversidade genética entre os isolados, não sendo
possível, também, agrupá-los de acordo com suas origens geográficas.
28
p
b
2036
1636
1018
506
p
b
2036
1636
1018
506
Figura 7. Perfis de isolados de P. griseola utilizando o oligonucleotídeo ISSR
UBC 836. M - 1 Kb DNA Ladder, utilizado como marcador de tamanho
molecular. B - Amostra sem DNA. As setas pontilhadas indicam bandas
polimórficas.
29
p
b
2036
1636
1018
506
p
b
2036
1636
1018
506
Figura 8. Perfis de isolados de P. griseola utilizando o oligonucleotídeo ISSR
UBC 888. M - 1 Kb DNA Ladder, utilizado como marcador de tamanho
molecular. B - Amostra sem DNA. As setas pontilhadas indicam bandas
polimórficas.
30
Isolados
D
C
B
A
Figura 9. Dendrograma obtido pelo método UPGMA mostrando as relações
genéticas entre isolados de P. griseola, com base na tipagem ISSR-PCR.
Distância genética relativa (%)
A grande diversidade genética estimada entre os isolados de P.
griseola foi também reportada em outros estudos com este fungo.
Recentemente, STENGLEIN e BALATTI (2006) estimaram a diversidade
genética de 45 isolados de P. griseola da Argentina utilizando uma série de
cultivares de feijão diferenciadora e marcadores do tipo ISSR e RAPD. A
combinação de RAPD e ISSR definiu 18 genótipos, enquanto que o teste
com a série diferenciadora identificou apenas 13. Além de demonstrar a
grande variabilidade genética entre os isolados, esses resultados também
sugerem que isolados da mesma raça não estão necessariamente
relacionados com os dados obtidos pelas análises do DNA. Esses resultados
estão de acordo com os obtidos no presente trabalho, em que a alta
diversidade genética entre os isolados de P. griseola do Brasil foi verificada
31
e que isolados pertencentes à mesma raça, como por exemplo, os isolados
811 e 838 que pertencem à raça 63-23, apresentaram diferentes perfis
moleculares, sendo agrupados separadamente a partir dos dados obtidos
pelas análises do DNA.
Algumas outras informações podem ser obtidas em relação aos
isolados de P. griseola, mesmo não tendo sido realizada ainda a
identificação da raça da maior parte dos isolados analisados, e o local de
origem de cada isolado. A partir de ERIC-PCR, por exemplo, os isolados 811
e 838, coletados em Damolândia/GO, e o isolado 158-1, coletado em Afonso
Cláudio/ES, pertencem à raça 63-23 e foram agrupados separadamente,
considerando os subgrupos formados. Isso mostra que esses isolados,
mesmo apresentando o mesmo fenótipo de virulência identificado por meio
de plantas diferenciadoras, apresentam uma variabilidade genética adicional.
Por outro lado, os isolados 29-3, coletado em Coimbra/MG, e 158-1
pertencem às raças distintas 63-55 e 63-23, respectivamente, e estão no
mesmo subgrupo. No caso de ISSR-PCR, por exemplo, os isolados 811 e
838 também foram agrupados separadamente. Isso mostra que,
possivelmente, a classificação em raças realizada por plantas
diferenciadoras ainda não é um método perfeito e que marcadores
moleculares poderão representar uma ferramenta que complementará essa
classificação. Assim, não foi possível observar uma relação direta entre
isolado, raça e origem geográfica. De qualquer forma, a identificação de
raças em diferentes localidades e da diversidade genética entre os isolados
pertencentes a essas raças é de grande importância para os programas de
melhoramento do feijoeiro, uma vez que essas informações são essenciais
para a obtenção de cultivares resistentes.
A origem dessa ampla diversidade genética em P. griseola não é
muito clara, uma vez que esse fungo não apresenta ciclo sexual conhecido.
Entretanto, mecanismos como mutação, recombinação, reprodução
parassexual e migração poderiam ser responsáveis por essa grande
diversidade (MAHUKU et al., 2002).
32
4. CONCLUSÕES
Diante dos resultados obtidos nesse trabalho, pôde-se verificar que a
análise das regiões ITS acrescidas do gene 5,8S não foi apropriada para o
estudo de variabilidade genética intraespecífica de P. griseola.
Os resultados obtidos por meio dos métodos de tipagem baseados na
amplificação via PCR de elementos de DNA repetitivos, mostraram que os
elementos repetitivos ERIC e BOX estão presentes também no genoma de
P. griseola.
As análises por BOX-PCR e ERIC-PCR resultaram em dados pouco
informativos, considerando que baixos níveis de polimorfismo foram
detectados. Os melhores resultados, no entanto, foram obtidos com o
emprego da técnica ISSR-PCR, que mostrou elevada capacidade na
detecção de polimorfismo entre os isolados e mostrou ser uma excelente
técnica para caracterização rápida e eficiente de um grande número de
isolados de P. griseola.
Não foi verificado, tanto por meio de ERIC-PCR quanto por ISSR-PCR
uma relação entre diversidade genética e origem geográfica dos isolados.
Constatou-se nesse trabalho, principalmente por meio de ISSR-PCR,
alta diversidade genética entre isolados de P. griseola. A estimada
diversidade observada poderá auxiliar no desenvolvimento de estratégias
adequadas para a obtenção de variedades de feijoeiro resistentes a esse
fungo.
33
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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