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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS
TURMA FORA DE SEDE/ UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
ESTUDO DO PROCESSO DE VASCULARIZAÇÃO DA
RETINA EM CAMUNDONGOS DEPLETADOS DA
PROTEÍNA PRION CELULAR
Mônica Moreau da Cunha Lima
Dissertação submetida à Universidade Federal do Rio de Janeiro e à
Universidade Federal da Bahia como parte dos requisitos necessários
para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Morfológicas.
Salvador/BA
Dezembro
2007
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ii
ESTUDO DO PROCESSO DE VASCULARIZAÇÃO DA RETINA
EM CAMUNDONGOS DEPLETADOS DA PROTEÍNA PRION
CELULAR
Mônica Moreau da Cunha Lima
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
Dissertação submetida à Universidade Federal do Rio de Janeiro e à
Universidade Federal da Bahia como parte dos requisitos necessários
para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Morfológicas.
Orientadora: Tatiana Coelho-Sampaio (UFRJ)
Co-orientadora: Elisabete Freire (FTC)
Salvador/BA
Dezembro
2007
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iii
Título: Estudo do processo de vascularização da retina em
camundongos depletados da proteína prion celular
Autora: Monica Moreau da Cunha Lima
Dissertação de mestrado submetida à avaliação pelo Programa de
Pós-graduação em Ciências Morfológicas do Instituto de Ciências
Biomédicas, da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ (Turma
Fora de Sede UFRJ/UFBA), como parte dos requisitos necessários à
obtenção do grau de Mestre em Ciências Morfológicas.
Aprovada por:
Prof. ________________________________________________________
Tatiana Coelho-Sampaio – ICB/UFRJ
Orientadora
Prof._________________________________________________________
Elisabete Freire – FTC/JA
Co-orientadora
Prof._________________________________________________________
Radovan Borojevic – ICB/UFRJ
Presidente da Banca
Prof._________________________________________________________
Maria de Fátima Dias Costa - ICS/UFBA
Prof._________________________________________________________
Maria Isabel Dória Rossi – ICB/UFRJ
Prof._________________________________________________________
Manoel Luis Costa – ICB/UFRJ
Revisor
Prof._________________________________________________________
Vitor Antonio Fortuna – ICS/UFBA
Suplente
Salvador/BA
2007
iv
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de
Neuroquímica do Departamento de Biofunção do
Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal
da Bahia e no Laboratório de Biologia da Matriz
Extracelular do Departamento de Histologia do
Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade
Federal do Rio de Janeiro, sob a orientação da
professora Tatiana Coelho-Sampaio e Co-orientação da
professora Elisabete Freire, com auxílios concedidos
pela coordenação de aperfeiçoamento de pessoal e
ensino superior (CAPES), pelo Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e pela
Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa
do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ).
v
FICHA CATALOGRÁFICA
LIMA, Monica Moreau da Cunha
ESTUDO DO PROCESSO DE VASCULARIZAÇÃO DA RETINA DE
CAMUNDONGOS DEPLETADOS DA PROTEÍNA PRION CELULAR, RIO
DE JANEIRO, UFRJ, 2007.
Dissertação de Mestrado
xii, 92 pp.
1. Retina 2. Proteína Prion Celular 3. Vascularização 4. Laminina
5. Membrana basal
I. Universidade Federal do Rio de Janeiro – Instituto de Ciências
Biomédicas - ICB
II. Dissertação
vi
Aos meus pais, Joaquim e Aury, por
terem me dado a energia da vida, o amor.
vii
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por me fazer paciente nas tribulações e pelo auxílio
para concluir este trabalho. Agradeço também por ter colocado tantas
pessoas maravilhosa em meu caminho.
À Elisabete Freire, minha amiga Bete, por tantas coisas que, por
mais que eu agradeça, ainda ficaria devendo. Por ter me resgatado para a
realização de um antigo sonho. Por me incentivar a acreditar neste sonho e
por fornecer meios para a realização deste sonho. Obrigada pelo apoio, não
somente no trabalho, mas em tudo.
À Tatiana Coelho-Sampaio, minha orientadora, pela oportunidade de
ter trabalhado sob sua proteção e inspiração, por ter me aceitado como
aluna e acreditado que mesmo longe o trabalho seria concluído. Por se
preocupar com meus problemas pessoais e me olhar não somente como
aluna, mas acima de tudo, como pessoa. Obrigada pelo grande
crescimento que você me proporcionou.
Ao professor Vivaldo, pela oportunidade de crescimento e por ter
acreditado e possibilitado meios para que eu pudesse desenvolver este
trabalho desde o início. Por se preocupar com o crescimento dos alunos
deste Mestrado.
Ao Professor Radovan Borojevic, por ter primeiro acreditado no
Mestrado aqui em Salvador e por tantos momentos de aprendizado.
viii
Ao meu querido irmão Vitor Hugo, por me apoiar em todos os
momentos, pela ajuda quando precisei de auxílio para estudar, pela
compreensão em vários momentos e pelas horas de descontração e risos.
Ao meu querido irmão Ramon, por também me apoiar em todos os
momentos, por demonstrar tanto carinho e compreensão nos momentos
em que precisei.
À querida Astria, pelo grande apoio desde o início, quando perdeu um
carnaval para estudar comigo para a prova do Mestrado. Obrigada pelo
carinho, amizade e conselhos.
Aos meus amores, meu marido Nando e minhas filhas Fernanda e
Luíza, pelo carinho e paciência.
Aos meus queridos pais, Joquim e Aury, pelo grande apoio e afeto.
À professora Sílvia Costa, por ter me recebido em seu laboratório
(LabNq/UFBA) durante a realização deste trabalho e pela amizade e
carinho que sempre demonstrou.
Ao professor Ramon El-Bachá, por ter me recebido em seu laboratório
(LabNq/UFBA) e por ter sido sempre muito cordial.
Aos colegas do laboratório (LabNq/UFBA), pela amizade, especialmente
Ana Rita, Alexandre, Sandra, Bruno, José Pinheiro e o Senhor Carlos.
À professora Vilma R. Martins pela excelente colaboração, cedendo os
animais para a realização deste trabalho.
Ao professor Rafael Linden pela colaboração cedendo os animais e pelas
frutíferas discussões.
ix
Ao Dr° Marcos Vanier, por ter permitido a utilização de seu laboratório
(Microscopia eletrônica/Fio Cruz-Ba) em vários momentos.
À Professora Graça da Escola de Veterinária da UFBA, por
disponibilizar o biotério para os camundongos.
x
RESUMO
A forma alterada da proteína prion celular, chamada de prion
scrapie (PrPsc), tem sido identificada como a partícula infecciosa
responsável pela transmissão de um conjunto de patologias denominadas
encefalopatias espongiformes. No entanto, ainda não foi descrito um
fenótipo evidente associado à proteína prion celular (PrPc). Como a
proteina prion celular é um receptor para a proteína de matriz
extracelular, laminina,neste trabalho investigamos se os animais nocaute
para PrPc apresentariam alguma anomalidade relacionada à distribuição
de laminina. Para tanto caracterizamos o padrão de deposição da proteína
na membrana limitante interna da retina de camundongos neonatos
selvagens e PrPc
-
. Observamos que os polímeros de laminina depositados
na membrana limitante interna da retina dos animais selvagens
apresentam um padrão de organização poligonal compatível com o
previamente visualizado sobre camadas de astrócitos em cultura, obtidas
de córtex de animais embrionários (Freire e cols., 2004). Esta organização
não é vista em animais nocaute. Realizamos estudos comparativos da
morfologia e integridade funcional dos vasos em camundongos selvagens e
depletados do gene para PrPc em diferentes fases do desenvolvimento. Para
esta análise fizemos imunomarcação de vasos em montagens planas de
retina com anticorpos anti-laminina, anti-colágeno IV, anti-PECAM 1, além
de marcação de núcleos de células da camada interna da retina com DAPI.
Fizemos cortes histológicos de globo ocular de animais adultos para
verificar a integridade das camadas da retina. Caracterizamos que ocorre
um atraso no processo de vascularização da retina de animais depletados
do gene prnp. Identificamos que os vasos da retina de animais nocaute,
apresentam várias alterações como diminuição do calibre, menor
ramificação e perda de pericitos. Acreditamos que estas alterações
comprometam tanto o desenvolvimento quanto a maturação dos vasos,
levando também a alterações nas camadas retinianas e conseqüentemente
ao descolamento de retina descrito neste trabalho. Observamos ainda um
comprometimento da função visual nos animais nocaute. O conjunto dos
resultados obtidos neste trabalho sugere que exista uma correlação entre
as alterações moleculares, celulares e histológicas no desenvolvimento
vascular das retinas de animais nocaute para PrPc e alterações na função
visual desses animais.
xi
ABSTRACT
Prion scrapie (PrPsc), the altered form of cellular prion protein (PrPc),
has been identified as the infectious particle in a class of diseases named
spongeform encephalopathies. Nevertheless, no phenotype has been
associated to PrPc. In this work, we prepared flat retina samples from
newborn PrPc knock-out and wild-type mice and labeled them with DAPI
for nuclei labeling, anti-laminin, anti-type IV collagen and anti-PECAM
antibodies in order to evaluate structural changes associated to PrPc in
mice retina. Histological slices of adult mice retina were also analyzed.
Laminin polymers present in wild-type mice retina displayed polygonal
patterns, comparable to those previously described in embryonic mice
asthrocyte in culture [Freire et al. (2004) J. Cell Sci. 117: 4067-4076]. This
polygonal pattern was not observed in knock-out mice. Several structural
changes, such as decrease of vessel diameter, low vessel ramification, loss
of vessel pericytes and retinal detachment, were observed in knock-out
mice. We believe that these process contribute to the delayed
vascularization of knock-out mice retina compared to wild-type. In
addition, visual loss was observed in knock-out mice but not in wild-type.
These findings suggest that molecular, cellular, histological and functional
particularities in mice retina may be correlated to PrPc function in
vasculogenesis and vessel maturation in mammals
xii
ÍNDICE
RESUMO x
ABSTRACT xi
CAPÍTULO I: INTRODUÇÃO
1
I.I PROTEÍNA PRION CELULAR
2
I.I.I
DESCOBERTA DA PROTEÍNA PRION COMO AGENTE
INFECCIOSO DAS ENCEFALITES ESPONGIFORMES 2
I.I.II
DOENÇAS ASSOCIADAS A ALTERAÇÕES DA PROTEÍNA
PRION 5
I.I.III
ALTERAÇÕES CONFORMACIONAIS DA PROTEÍNA
PRION CELULAR 7
I.I.IV
CAMUNDONGOS DEFICIENTES DE
prnp
12
I.I.V
LIGANTES DE PrPc 13
I.II RETINA
15
I.II.I
ASPECTOS MORFOLÓGICOS DA RETINA 15
I.II.II
VASCULARIZAÇÃO DA RETINA 19
I.II.III
DOENÇAS RELACIONADAS À VASCULARIZAÇÃO
RETINIANA ANORMAL 24
I.II.IV
ASPECTOS MOLECULARES E CELULARES
ENVOLVIDOS NA MODULAÇÃO DA ANGIOGÊNESE
POR BROTAMENTO 26
CAPÍTULO II: OBJETIVOS 31
CAPÍTULO III: MATERIAIS E MÉTODOS 34
III.I MATERIAIS
35
III.II MÉTODOS
36
III.II.I
PREPARAÇÃO DE MONTAGENS PLANAS DA RETINA 36
III.II.II
IMUNOFLUORESCÊNCIA 37
III.II.III
ANÁLISE HISTOLÓGICA 38
III.II.IV
AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO VISUAL 39
III.II.V
ANÁLISE QUANTITATIVA E ESTATÍSTICA 40
CAPÍTULO IV: RESULTADOS 41
CAPÍTULO V: DISCUSSÃO 69
CAPÍTULO VI: CONCLUSÕES 78
CAPÍTULO VII: REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 80
1
I. INTRODUÇÃO
2
I. INTRODUÇÃO
I.I. PROTEÍNA PRION CELULAR
I.I.I. Descoberta da proteína Prion como o agente infeccioso das
encefalites espongiformes
Ao longo de vários anos, pesquisadores tentaram entender as causas
e as bases moleculares de um grupo de patologias denominadas
encefalopatias espongiformes (TSE), que se caracterizam pela deposição de
material de origem protéica, denominado fibrilas amilóides, e por uma
extensa degeneração do tecido cerebral. Essa patologia encontra-se
associada a altos graus de morbidade e mortalidade e inclui formas que
atacam tanto o homem (kuru, doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD), doença
de Gerstmann-Sträussler-Scheinker e insônia familiar fatal) como animais
(scrapie, doença debilitante crônica e encefalopatia espongiforme bovina ou
BSE, popularmente conhecida como doença da vaca louca).
A transmissibilidade de encefalopatias espongiformes foi
demonstrada em várias ocasiões. Na década de 30, o scrapie foi
experimentalmente transmitido entre ovelhas e entre camundongos
através da inoculação de extratos de cérebro de animais afetados em
animais saldáveis (Cuille e cols., 1939; Chandler, 1961). A propagação do
kuru, doença que atingia nativos de algumas tribos da Papua Nova Guiné,
foi atribuída a atos de canibalismo em rituais fúnebres, quando se
ingeriam cérebros e vísceras de pessoas mortas. Essa hipótese foi
3
confirmada com estudos que demonstraram a transmissão experimental
da doença para macacos, através da ingestão de vísceras contaminadas
(Gadjusek e cols., 1966). A redução do kuru só ocorreu quando o
canibalismo foi extinto nessas tribos. Desde então, foram feitas outras
demonstrações sobre a transmissibilidade das encefalopatias
espongiformes (Prusiner, 1993).
Durante anos, vários grupos de pesquisa se dedicaram a estudos
com o objetivo de caracterizar o agente causador das encefalopatias
espongiformes transmissíveis (TSE). Experimentos mostraram que o
agente responsável por essas patologias era extremamente resistente a
tratamentos que destroem ácidos nucléicos, como raios ultravioleta e
radiação ionizante. Assim, a participação de patógenos clássicos como
vírus ou bactérias atuando como agentes causadores das TSEs poderia ser
descartada (Alper e cols.,1967).
A partir de 1974, Stanley Prusiner e seu grupo, iniciaram um
trabalho com o objetivo de isolar e identificar esse novo agente infeccioso.
O grupo, usando cérebro de animais infectados por scrapie, confirmou os
resultados anteriores, ou seja, que o uso de agentes que provocam danos
ao material genético não reduziam a infectividade. Além disso, observaram
que ao testar agentes que desnaturam ou degradam proteínas, a
capacidade infecciosa era drasticamente reduzida. Acreditando que se
tratava de uma nova classe de agentes infecciosos, Prusiner nomeou-os de
“prions” (proteinaceous infectiuos particles) (Prusiner e cols., 1983).
4
A intensa investigação sobre a patogênese das doenças do prion
levou à formulação da hipótese de que estas fossem causadas pela
infecção com a proteína PrPsc (onde sc refere-se à variante scrapie). Esta
corresponderia a uma forma estruturalmente alterada de uma proteína
normal presente na membrana plasmática de diversos tipos celulares,
inclusive neurônios, denominada proteína prion celular (PrPc)( Prusiner,
1998). A proteína infecciosa, de conformação alterada, seria responsável
por desencadear a progressiva conversão conformacional das proteínas
celulares normais (PrPc) em proteínas na forma scrapie (PrPsc), sendo
estas últimas mais propensas a formar os agregados protéicos tidos como
responsáveis pela toxicidade neuronal. Em 1993, o grupo de Charles
Weissmann demonstrou inequivocamente a obrigatoriedade da
participação de PrPc na patogênese das TSE ao relatar que animais
depletados do gene para a proteína celular normal eram totalmente
incapazes de desenvolver a doença, e que a reintrodução do gene para PrPc
restaurava a suscetibilidade à infecção (Bueler e cols., 1993). A geração de
camundongos nocaute para PrPc levou, curiosamente, a uma constatação
adicional, a de que animais deficientes em PrPc não apresentavam
qualquer perturbação do desenvolvimento normal ou alteração morfológica
visível (Bueler e cols., 1992). Posteriormente foram relatadas algumas
flutuações sutis no comportamento dos animais, como por exemplo,
alterações no ritmo circadiano e perturbações no sono (Tobler e cols.,
1996). No entanto, a ausência de um fenótipo evidente associado à
5
depleção do gene para PrPc tem dificultado o estabelecimento das funções
desta proteína em animais normais, o que, por sua vez, tem dificultado as
investigações na direção de uma possível perda de função associada à
patogênese (Martins e cols., 2002).
I.I.II. Doenças associadas a alterações da proteína prion
A primeira patologia associada à proteína prion já é conhecida desde
o inicio do século passado. Trata-se do scrapie, uma doença que acometia
cabras e ovelhas, causando-lhes uma perda de coordenação motora,
irritabilidade extrema e muita coceira, o que determinou o nome da
doença. O scrapie é incurável e após o aparecimento dos sintomas, o curso
da doença até a morte do animal é muito curto (Narang, 1996)
Na década de 1920, foram descritos os primeiros casos de TSE em
humanos. A patologia foi denominada doença de Creutzfeldt-Jakob
porque os primeiros casos foram identificados por Creutzfeldt em 1920 e
por Jacob em 1921. Os sintomas mais comuns são desordens visuais,
perda de memória e deficiência na coordenação motora. Esta doença pode
possuir aspecto esporádico, adquirido ou hereditário (Masters e cols.,
1981). A forma adquirida pode ocorrer através do transplante de córnea,
esterilização imprópria de material cirúrgico, transplante de dura-mater
dentre outras (Lang e cols., 1998). O padrão hereditário dessa doença é
encontrado em aproximadamente 15% dos casos, ocorrendo devido às
mutações no gene que codifica PrPc (Goldfarb e cols., 1994).
6
Na encefalopatia chamada de kuru, como não foi identificada
nenhuma mutação relacionada a essa doença acredita-se que a origem da
epidemia possa estar relacionada com a ingestão de vísceras de algum
portador de CJD, durante a prática canibal (Gajdusek, 1977).
Na década de 80, surgiu uma epidemia que acometeu o gado bovino
na Grã-Bretanha, a encefalopatia espongiforme bovina ou “doença da vaca
louca”. Essa variedade de doença do prion, provavelmente foi originada
pela contaminação por scrapie da ração utilizada para alimentação do
gado, a qual era preparada a partir de vísceras de carneiros, bois, porcos e
galinhas. Dessa forma as partículas do prion eram ingeridas pelo gado
(Wilesmith e cols., 1991). Estudos confirmaram a transmissão da doença
por via oral quando demonstraram a infecção experimental de
camundongos e também do gado através da alimentação (Prusiner, 1991).
Existem ainda outras doenças ligadas à proteína Prion, que afetam
homens ou animais e com características bem semelhantes às já descritas.
As principais são: Doença de Gerstmann-Sträussler-Scheinker, Insônia
Familiar Fatal, Encefalopatia espongiforme felina, dentre outras.
Alguns estudos se dedicam à investigação de estratégias
terapêuticas para doenças relacionadas com alterações da proteína do
prion. Estudos in vitro mostram que diversas substâncias, possuem a
capacidade de inibir a deposição das fibrilas amilóides, incluindo Vermelho
Congo (Caughey e Race, 1992), anfoterecina B, antraciclinas (Tagliavini e
cols., 1997), poliaminas (Supattapone e cols., 2001), curcumina (Caughey
7
e cols., 2003) e RNA de interferência (Daude e cols., 2003). Nenhum destes
trabalhos efetivamente comprovou a eficácia de tais substâncias in vivo.
Mais recentemente, foram produzidos anticorpos contra a proteína scrapie
a partir da inoculação da proteína alterada em camundongos nocaute para
PrPc e camundongos controle, com o objetivo de criar meios de evitar a
associação entre as moléculas protéicas, impedindo a formação das fibrilas
amilóides. Até o momento, não se tem dados sobre a eficácia da utilização
desses anticorpos no tratamento das TSEs (Spinner e cols., 2007).
I.I.III. Alterações conformacionais da proteína prion celular
A proteína do prion celular (PrPc) é normalmente encontrada na
membrana de células de mamíferos e expressa em todos os tecidos, mas se
apresenta de forma abundante no sistema nervoso central (Oesch e cols.,
1985).
Essa proteína é codificada por um gene contido no cromossomo 20,
em humanos (Oesch e cols., 1985). Este gene, denominado prnp em
camundongos e ratos, possui três exons. Em humanos e hamsters existem
apenas dois exons. No entanto, o quadro aberto de leitura se encontra em
um único exon (Collins e cols., 2004). Uma vez codificada, a proteína
murina apresenta 254 aminoácidos com um peptídeo sinalizador na
extremidade amino terminal contendo 22 aminoácidos que é clivado no
retículo endoplasmático durante a sua biossíntese. Uma ancora de GPI
(glicosil-fosfatidil-inositol) é anexada à região C-terminal, que fixa a
8
proteína à porção externa da membrana celular. Além disso, dois sítios de
N-glicosilação estão presentes nos resíduos de asparagina 181 e 197 (em
humanos) e há formação de uma ponte dissulfeto intermolecular entre os
resíduos de cisteína 179 e 214. Após o processamento das porções N- e C-
terminal, a PrPc é gerada na sua seqüência final apresentando 209
aminoácidos ( Prusiner, 1998) (Figura 1).
Figura 1: O diagrama de barras mostra a região da cadeia polipeptídica
que se liga glicosil-fosfatidilinositol (GPI). Após o processamento dos
grupamentos NH2 e COOH terminais, ambas PrPC e PrPSc passam a
apresentar 209 resíduos de aminoácidos. Adaptado de Prusiner, 1998.
PrPc e PrPsc possuem a mesma seqüência de aminoácidos e diferem
apenas em suas propriedades físico-químicas (Turk e cols., 1988).
Enquanto PrPc é solúvel e susceptível à ação de proteases, sua forma
9
anormal, PrPsc apresenta-se muito insolúvel e relativamente resistente à
proteólise (Meyer e cols., 1986). Estas propriedades da PrPsc favorecem a
formação de agregados insolúveis que se depositam lenta e
progressivamente em várias regiões do sistema nervoso, causando a morte
celular. Estudos de espectroscopia de dicroísmo circular revelaram as
estruturas secundárias dessas duas isoformas. Verificou-se que PrPc tem
um perfil característico de proteínas em α-hélice, contendo 40% de regiões
com estrutura do tipo α-hélice e cerca de 3% de regiões com estrutura do
tipo folha-β, ao passo que PrPsc possui muito mais regiões com estruturas
β- pregueadas (Pan e cols., 1993) (Figura 2).
O mecanismo de conversão de PrPc em PrPsc envolve mudanças
conformacionais na estrutura. A proteína PrPc que apresenta
predominantemente regiões com estrutura do tipo alfa-hélice, passa a
apresentar outra conformação com estrutura predominantemente do tipo
folhas beta (Prusiner, 1998). Atualmente existem duas hipóteses para
explicar o mecanismo envolvido na mudança conformacional, a hipótese
do modelo de molde assistido e a do modelo de polimerização por
nucleação.
10
Figura 2. Desenho esquemático mostrando as diferenças nas estruturas
terciárias de PrPc e PrPsc. A, PrPc possui três regiões em α-hélices (verde)
em sua estrutura: α-hélice A (resíduos 144-157), α-hélice B (resíduos 172-
193) e α-hélice C (resíduos 200-227), e duas regiões em folha β-pregueada
(azul) em sua estrutura nos resíduos 129-134 e 159-165. B, PrPsc mostra-
se rica em folha β-pregueada (azul) e pobre em α-hélice (verde). Retirado de
Pan e cols.,1993.
A hipótese de modificação através de molde assistido propõe que a
conversão de PrPc em PrPsc dependa da participação de uma outra
proteína, denominada de proteína X. Esta auxiliaria na formação de um
estado intermediário entre PrPc e PrPsc funcionando como um catalisador.
A conversão espontânea seria impedida por uma alta barreira energética
ocorrendo apenas em presença do catalisador (Aguzzi e Polymenidou,
2004).
A hipótese de polimerização por nucleação, postula que PrPc e
PrPsc possam existir em equilíbrio termodinâmico e que monômeros de
PrPsc por apresentarem a capacidade de polimerizar, formaria um
pequeno núcleo. Este núcleo inicial recrutaria outras moléculas de PrPc
11
que seriam convertidas na forma anormal (Come e cols., 1993). A formação
do núcleo inicial é um processo muito lento, o que explicaria o fato da
demora no aparecimento dos sintomas associados à patologia, mas após o
surgimento a progressão seria acelerada com o recrutamento de mais PrPc
para o agregado em um processo cooperativo (Jarrett e Lansbury, 1993). A
limitação dessa hipótese é que se é possível a existência do equilíbrio entre
as formas PrPc e PrPsc, então a transformação da forma scrapie em
normal deveria ser observado em alguma condição experimental. Além
disso, as duas hipóteses são compatíveis entre si.
Alguns estudos tentam propor a dependência do meio no processo
de conversão de formas estruturais. Diferentes compartimentos celulares
com propriedades físico-químicas distintas poderiam modular o processo
de alteração conformacional. Por exemplo, nos “rafts” da membrana
plasmática, regiões ricas em esfingolipídios e colesterol e onde
normalmente se encontram as moléculas de PrPc (Walmsley e cols., 2003),
talvez haja uma distribuição espacial de cargas e moléculas capazes de
evitar a alteração conformacional indutiva do processo de agregação. Por
outro lado, os lisossomos, organelas que apresentam pH acidificado em
relação ao citoplasma celular, poderiam induzir alterações
conformacionais que facilitariam a agregação protéica durante o processo
de reciclagem de PrPc (Prusiner, 1996).
12
I.I.IV. Camundongos deficientes de prnp
Na tentativa de gerar modelos para o estudo não só da patogênese e
transmissão das doenças priônicas, mas também para estabelecer a
importância biológica de PrPc, foram criados camundongos depletados do
gene prnp.
O grupo de Charles Weissmann, gerou a primeira linhagem de
camundongos nocaute para PrPc, uma vez que estes pesquisadores
conseguiram remover seletivamente o gene prnp que codifica essa proteína
(Büeler e cols., 1992). O grupo verificou que camundongos transgênicos,
(PrPc
-
), são resistentes à infecção por prions e não replicam o agente
infeccioso (Büeler e cols., 1993). Esses resultados levaram à conclusão de
que é necessário que o organismo expresse a proteína do prion nativa para
poder ser infectado e replicar esse agente infeccioso (Büeler e cols., 1993;
Sailer e cols., 1994). A reintrodução de genes de PrPc de diferentes
espécies nestes camundongos restaura sua susceptibilidade em uma
forma espécie específica (Weissmann e cols., 1996; Flechsig e cols., 2000).
Portanto, pode-se afirmar que é absolutamente necessária a expressão da
PrPc para a patogênese da doença (Brandner e cols., 1996a).
A maioria das linhagens nocaute para a proteína PrPc não
apresenta nenhuma anormalidade severa (Büeler e cols., 1992),
entretanto algumas apresentaram problemas como alterações no ritmo
circadiano, defeito na função hipocampal (Collinge e cols., 1994; Tobler e
cols., 1996), dificuldade de aprendizado espacial (Criado e cols., 2005),
13
diminuição dos níveis de cobre cerebral (Brown e cols., 1997), dano
oxidativo tecidual (Shyu e cols., 2005) alterações na resposta inflamatória
(de Almeida e cols., 2005), implicações na diferenciação de células tronco
hematopoiéticas e neurais (Zhang e cols., 2006) (revisado em Caughey e
Baron, 2006). Outros estudos demonstraram que esses animais são mais
sensíveis a drogas convulsivantes (Walz e cols., 2002) e possuem atividade
locomotora alterada (Roesler e cols., 1999). A consolidação das memórias
de curta e longa duração foi descrita nesses camundongos nocautes e
verificou-se que esse processo apresenta-se prejudicado em animais PrPc
-
idosos, quando comparados com animais selvagens da mesma idade
(Coitinho e cols., 2003).
I.I.V. Ligantes de PrPc
Foram descritas inúmeras moléculas como sendo ligante ou
receptores de PrPc. Em 1997, Brown e cols., identificaram a capacidade de
ligação da PrPc ao íons Cu
++
. Mais recentemente foi mostrado que a
capacidade de ligação do cobre radioativamente marcado na membrana
celular era diretamente dependente da concentração de PrPc (Brown e
cols., 1997; Rachidi e cols., 2003). O cobre é um elemento importante para
várias enzimas envolvidas com a proteção contra estresse oxidativo e foi
demonstrado que PrPc possui uma atividade semelhante à da enzima
superóxido dismutase (Brown e Besinger, 1998). Além do cobre, outros
ligantes foram identificados para a PrPc, tais como Aplp1, Nrf2 (Yehiely e
14
cols., 1997), glicosaminoglicanas (Gonzales-Iglesias e cols., 2002; Warner e
cols., 2002), distroglicanas (Keshet e cols., 2000), entre outros.
Outro ligante de PrPc já bem caracterizado, é a laminina, que é o
principal componente não colagenoso da matriz extracelular (Graner e
cols., 2000a e b). A laminina participa do controle de várias funções
biológicas como embriogênese, formação de tecidos, fenômenos
imunológicos entre outros. A laminina também pode estimular a
neuritogênese através da ligação a PrPc (Graner e cols., 2000 a e b ). O
nosso grupo mostrou que astrócitos são capazes de secretar laminina e
que a presença de laminina sobre camadas astrocitárias, diferentemente
estruturadas poderia estimular o crescimento neurítico de forma
diferencial. Como alguns trabalhos mostram que a indução do crescimento
neurítico e a formação de vasos podem ser controlados pelos mesmos
fatores quimiotaticos atrativos e repelentes, sugerindo similaridade entre
os processos (Eichmann e cols., 2005), torna-se interessante avaliar se a
ausência da expressão da PrPc pode influir no processo de vascularização
retiniana.
15
I.II. Retina
I.II.I. Aspectos morfológicos da retina
O olho é um órgão complexo de recepção do sinal luminoso que
atingiu alto grau de especialização, permitindo uma análise minuciosa da
forma dos objetos, sua cor e intensidade de luz refletida. Esse órgão é
formado por várias estruturas adaptadas à função de captação e
interpretação do sinal luminoso. É constituído por três túnicas ou
camadas dispostas concentricamente: 1. A camada externa, formada pela
esclera e pela córnea; 2. A camada média ou túnica vascular, constituída
pela coróide, corpo ciliar e pela íris; e 3. A camada interna ou retina, que
se comunica com o cérebro através do nervo óptico. Além das túnicas
existem outras estruturas presentes no olho. O cristalino ou lente é uma
estrutura transparente, sem vasos e nervos e constituído por organizações
celulares que formam lamelas concêntricas. Situada à frente do cristalino
encontra-se uma expansão fortemente pigmentada denominada íris. Essa
estrutura separa dois compartimentos, a câmara anterior e a câmara
posterior. Atrás do cristalino e circundado pela retina encontra-se o espaço
vítreo, cheio de uma substância viscosa e gelatinosa, denominada corpo
vítreo (Figura 3) (Junqueira e Carneiro, 2004). A retina, constituída por
células neurais e gliais, é a estrutura envolvida na transformação do sinal
luminoso em sinal neural, muito embora todas as outras estruturas que
compõem o olho sejam necessárias para dar-lhe sustentação e forma,
permitindo o seu desempenho como sistema óptico (Heegand, 1997).
16
Figura 3. Estrutura interna do olho humano. Retirado de Junqueira e
Carneiro, 2004.
Classicamente, sob a luz da microscopia óptica, a retina é
composta por várias camadas: 1) A membrana limitante interna,
essencialmente uma membrana basal; 2) A camada de células
17
ganglionares; 3) A camada plexiforme interna; 4) A camada nuclear
interna; 5) A camada plexiforme externa; 6) A camada dos fotorreceptores,
que compreende a região nuclear externa, o segmento interno e o
segmento externo; e 6) O epitélio pigmentado da retina (Heegand, 1997).
A camada dos fotorreceptores é composta de células chamadas
cones e bastonetes. Essas células estão próximas à superfície externa da
retina e para que a luz possa atingi-las, é necessário atravessar a cavidade
vítrea e a retina interna. Após a fotorrecepção, o sinal é conduzido para as
células bipolares, que compõem a camada nuclear interna. Essas células
transmitem os sinais luminosos para a camada de células ganglionares,
cujos axônios se agrupam na superfície interna da retina formando o nervo
óptico. A camada mais externa da retina compreende o epitélio
pigmentado, o qual está em íntimo contato com os segmentos externos dos
fotorreceptores (Figura 4). O suporte metabólico para o funcionamento da
retina interna vem da rede vascular, que repousa sobre a camada
ganglionar, penetra na retina e se estabelece novamente na altura da
camada plexiforme externa. Na realidade a retina pode ser considerada um
tecido relativamente pouco vascularização, dependente da vascularização
dos tecidos adjacentes. O suporte para a retina externa é dado por difusão
através dos vasos da coróide que estão adjacentes ao epitélio pigmentar da
retina. (Schroder e cols., 1990).
A retina também possui colunas de sustentação, compostas pelas
células gliais, ou fibras de Müller, que auxiliam o metabolismo dos
18
neurônios. Juntos, os vasos da retina e o epitélio pigmentar formam a
barreira hemato-retiniana (BHR), uma barreira, que limita o trânsito de
moléculas, propiciando mecanismo para um efetivo controle do fluxo de
fluidos e metabólitos e fazendo da retina neural um tecido
imunologicamente privilegiado (Heegand, 1997).
Figura 4. Desenho esquemático das camadas da retina. Retirado de
Junqueira e Carneiro, 2004.
19
I.II.II. Vascularização da retina
Durante o desenvolvimento embrionário, o sistema circulatório
vascular é o primeiro a se formar, o que vai permitir o fornecimento de
suporte metabólico para a diferenciação celular e desenvolvimento dos
demais tecidos. Os vasos sangüíneos se organizam espacialmente por
todos os tecidos permitindo o fornecimento de nutrientes e as trocas
metabólicas (Risau, 1997).
A formação de vasos sangüíneos pode ocorrer por dois mecanismos
fundamentais: vasculogênese e angiogênese. A vasculogênese é um
processo de formação de vasos a partir de precursores de células
endoteliais, os angioblastos. Estes migram em direção ao local de formação
de novos vasos se diferenciando em células endoteliais. Os primeiros
vasos, como a aorta dorsal e veia cardinal, são formados por esse
mecanismo (Flamme, 1992). Fatores de indução mesodérmica, como os da
família de fatores de crescimento de fibroblastos, são importantes na
indução da diferenciação do mesoderma em hemangioblastos, precursores
não somente de angioblastos, como também de células hematopoiéticas
(Risau, 1995). A angiogênese é o desenvolvimento de novos vasos
sangüíneos a partir de vasos pré-existentes e que tem participação em
diversos processos fisiológicos, como a preparação do endométrio durante
o ciclo menstrual ou a cicatrização de feridas e processos patológicos,
incluindo o crescimento tumoral. Um sistema vascular se forma de
maneira adequada quando há um equilíbrio entre fatores que favorecem a
20
angiogênese e fatores que a inibem, resultando em estabilização vascular
(Bussolino e cols., 1997). A angiogênese excessiva pode causar patologias
como câncer, artrite e cegueira. Por outro lado, o crescimento vascular
insuficiente ou regressão vascular anormal, podem gerar isquemia
cardíaca e cerebral, neurodegenaração, osteoporose e outras doenças
(Carmeliet, 2003).
Durante o desenvolvimento fetal do olho, tanto em humanos
quanto em camundongos, foi observada uma intensa formação de vasos
sangüíneos que partem do pólo posterior para o pólo anterior do olho (Ash
e cols., 2005). A vascularização fetal consiste no processo de formação do
sistema hialóide, o qual atravessa o vítreo em direção à parte posterior do
cristalino. Posteriormente o sistema hialóide regride e é substituído por
vascularização própria da retina (Ash e cols., 2005). Em humanos a
regressão do sistema hialóide é concluída por volta do quarto mês de
gestação enquanto que em camundongos esse processo se completa na
época do nascimento. Com a regressão dos vasos do hialóide, um novo
plexo vascular surge a partir do nervo óptico, dando início à vascularização
da retina propriamente dita. Esta será composta por veias e artérias, que
em seguida se ramificam sobre a superfície interna formando uma espécie
de rede (Figura 5) (Fruttiger, 2007). Em camundongos, já no dia do
nascimento, observa-se o início da formação do plexo vascular primário no
centro da superfície interna da retina. Este cresce e se ramifica até a
periferia do tecido retiniano por volta do sétimo dia após o nascimento. A
21
partir desse momento, os vasos do plexo primário invadem a camada
interna da retina, se ramificando e formando um segundo plexo vascular
paralelo ao primeiro (Connolly e cols., 1988; Stone e cols., 1995).
Figura 5. Desenvolvimento do sistema vascular retiniano em
camundongos. Em (A) a vasculatura hialóide (hv) é suprida pela artéria
hialóide (ha) e drenada pela rede venosa coroidal (ch). A rede venosa
coroidal não se encontra representada em (B) e (C). Em (B) a regressão da
vasculatura hialóide concomitante ao desenvolvimento do plexo primário
(pp) no interior da retina. Em (C) o plexo secundário (dp), mais profundo se
forma a partir de vasos do plexo primário. Retirado de Fruttiger, 2007.
Estudos mostram que tanto a angiogênese quanto a vasculogênese
são processos importantes na vascularização da retina. Alguns trabalhos
sugerem que a formação do plexo vascular primário da retina ocorra pelo
processo de vasculogênese e que a formação do plexo secundário ocorra
por angiogênese (Ashton, 1970 e Hughes e cols., 2000). Essa teoria baseia-
22
se em dados que sugerem a presença de angioblastos, precursores de
células endoteliais, ocupando a superfície da retina durante a formação do
plexo vascular primário. Nesses trabalhos, entretanto, os métodos
utilizados para a marcação de angioblastos, não caracterizam
definitivamente essa população celular, uma vez que a coloração de Nissl,
isolectina de Grinfonia simplicifolia ou identificação de ATPases, não são
universalmente aceitos como marcadores específicos de angioblastos
(McLeod e cols., 1987 e Flower e cols., 1985). Posteriormente, considerou-
se a proteína receptora do tipo 2 para fator de crescimento de endotélio
vascular (VEGFR2) como marcador específico de precursores de células
endoteliais retinianas (Yamashita, 2000 e Yamaguchi, 1993). Entretanto,
em montagem plana de retina de camundongo, a marcação para VEGFR2
foi feita em combinação com colágeno IV, e foi observado que células
positivas para VEGFR2 encontravam-se circundadas pelo colágeno,
evidenciando a presença de células endoteliais maduras, capazes de
secretar a própria membrana basal. Desta forma, não foi possível a
confirmação da presença de angioblastos e a caracterização do processo de
vasculogênese na formação do plexo vascular primário (Fruttger, 2002).
Apesar de até o momento não terem sido encontrados precursores de
células endoteliais na retina de camundongos, alguns trabalhos
desenvolvidos com retinas de embriões humanos sugerem a presença de
angioblastos durante o desenvolvimento retiniano através de marcação
para ADPase/CD39 e CXCR4 (Chan-Ling, 2004 e McLeod, 2006). Contudo,
23
ainda não é possível afirmar que precursores de células endoteliais não
estejam efetivamente envolvidos na formação da vasculatura retiniana,
pois embora dados mostrem a ausência dos mesmos no tecido, é possível
que tais precursores endoteliais possam se agrupar dentro da crescente
rede de vasos sanguíneos propiciando o processo de vasculogênese
(Fruttiger, 2007).
A maior parte das evidências aponta para a hipótese de que o plexo
vascular primário seja formado a partir do processo de angiogênese por
brotamento. Nesse caso, os novos vasos seriam formados a partir de
células endoteliais de vasos já existentes (Risau, 1997). A primeira fase da
angiogênese por brotamento é caracterizada por uma vaso permeabilidade
aumentada decorrente da redução da adesão entre células; pelo início da
invasão, com produção de enzimas proteolíticas que degradam a matriz
extracelular e pela entrada de células no ciclo celular. Esta fase é seguida
pela etapa de diferenciação das células endoteliais em tubos contendo
lúmen. Finalmente chega-se à terceira fase quando ocorre estabilização e a
maturação dos vasos, promovidas por moléculas mediadoras que recrutam
células mesenquimais para as paredes dos capilares (Bussolino e cols.,
1997). O processo é dependente da matriz extracelular no ambiente das
células e a formação de tubos capilares é modulada por componentes da
membrana basal, que as próprias células endoteliais podem secretar
(Risau, 1997).
24
A hipótese de que o plexo primário da retina de camundongos se
forme por angiogênese por brotamento é alicerçada pelas seguintes
evidências. Primeiramente, pela identificação de subtipos de células
endoteliais presentes durante o processo de angiogênese por brotamento
(Gerhardt, 2003). Em segundo lugar, pela existência de perfis de expressão
gênica variados entre os diferentes tipos de células endoteliais ao longo
rede vascular durante o processo de brotamento (Claxton, 2004 e Saint-
Geniez, 2002). Em terceiro lugar, dados sugerem que a via de sinalização
Notch desempenhe um papel relevante na estabilização e manutenção do
fenótipo diferenciado das células endoteliais de regiões do broto. Essas
evidências indicam que as células endoteliais não formam uma população
uniforme e que existem diferenças entre os subtipos celulares dependendo
da sua posição e função na rede vascular (Lu e cols., 2004).
I.II.III. Doenças relacionadas à vascularização retiniana anormal
O crescimento de novos vasos sangüíneos, também chamado de
neovascularização, na retina de indivíduos adultos é uma grande
complicação em doenças como retinopatia diabética. Quase 100% dos
indivíduos com diabetes tipo1 desenvolvem alguma forma de retinopatia
após 15 anos de doença, sendo que, destes, aproximadamente 60% irá
desenvolver a forma mais grave que é a proliferativa. Este estado é
caracterizado pela formação de novos vasos na retina que crescem em
direção à interface vítrea, podendo evoluir para a perda irreversível da
25
acuidade visual, principalmente pelo descolamento tracional da retina
(Fong e cols., 2004). A não proliferativa é caracterizada por alterações
vasculares intra-retinianas associadas a anormalidades microvasculares
como a dissociação de células murais, ou pericitos, dos capilares
retinianos, levando a fragilidade desses vasos e consequentemente a
edemas e hemorragias (Frank, 2004).
A retinopatia da prematuridade também é uma doença
vasoproliferativa que acomete a retina de recém nascidos prematuros. Por
ocasião do nascimento, a vasculogênese da retina está incompleta
favorecendo a formação de tecido neovascular. Na grande maioria dos
casos, este tecido sofre involução espontânea, porém em alguns casos,
evolui para uma proliferação fibrovascular em direção ao vítreo, formando
membranas e trações retinianas. O descolamento da retina pode ser
decorrente dessas trações, acarretando nesses olhos um baixo poder de
resolução visual (Hughes e cols., 2000). Crianças prematuras, muitas
vezes, necessitam ser submetidas a terapias com altos níveis de oxigênio.
Esta terapia cria uma alta tensão de oxigênio na coróide, que se difunde
para a retina e suprime o desenvolvimento normal dos capilares (Penn e
cols., 1995). Em modelos de retinopatias da prematuridade em cobaias,
altos níveis de oxigênio causam regressão dos capilares da retina por
apoptose, a qual é precedida pela diminuição de VEGF. Uma vez o animal
retirado de um ambiente de hiperóxia para o ar atmosférico, a isquemia
subseqüente, promovida pelo fechamento dos capilares em hiperóxia,
26
induz a expressão exagerada VEGF, que induz a angiogênese anormal
(Alan e cols.,1995).
Tanto em humanos quanto em camundongos, a regressão do
sistema vascular hialóide, pode não ocorrer de forma completa.
Vasculatura fetal persistente é um termo utilizado para descrever a
situação onde um ou mais componentes da vasculatura intraocular fetal
não regride totalmente. Essa condição patológica pode causar
complicações incluindo deslocamento de retina, catarata e hemorragias
intra-oculares (Goldberg , 1997).
O entendimento dos princípios biológicos que governam o
crescimento dos vasos sangüíneos na retina poderá resultar em
importantes aplicações clínicas.
I.II.IV. Aspectos moleculares e celulares envolvidos na modulação da
angiogênese por brotamento
O fator de crescimento de endotélio vascular (VEGF) é considerado
o mais importante fator proangiogênico, sendo capaz de regular
angiogênese fisiológica e patológica. O VEGF ou fator de permeabilidade
vascular é produzido em quatro principais isoformas de 121, 165, 189 e
206 aminoácidos (Ferrara e Davis-Smyth, 1997). Tanto VEGF 165 quanto
VEGF 189 e 206 são básicos, com uma alta afinidade por heparina, e
permanecem seqüestrados na matriz extracelular. VEGF 121 é ácido e não
se liga com heparina. As moléculas de VEGF que ficam ligadas com a
27
matriz extracelular podem ser liberados pela ação de proteinases que
desencadeiam a quebra da matriz (Carmeliet e cols., 1999). Existem dois
principais receptores para VEGF, em que se ligam com alta afinidade, que
são VEGFR1 e VEGFR2. Estas são encontrados predominantemente na
superfície de células endoteliais. A expressão de VEGF é sensível à tensão
de oxigênio e é rapidamente regulada por hipóxia, que por sua vez,
também leva à expressão dos genes para VEGFR1 e VEGFR2 nas células
endoteliais (Shweiki e cols., 1992).
Podemos destacar como principais funções de VEGF: potente
mitogênico principalmente para células endoteliais, mediador da secreção
e ativação de enzimas envolvidas na degradação da matriz extracelular
(Pepper e cols., 1991), modulador de sobrevivência para as células
endoteliais através da inibição de apoptose (Alan e cols., 1995) além de
apresentar um papel importante na modulação da migração das células
endoteliais nos sítios de angiogênese (Rousseau e cols., 2000).
O desenvolvimento vascular da retina é precedido pela migração de
astrócitos, formando uma rede que tem início a partir do nervo óptico e se
espalha, por meio da proliferação dessas células, através da superfície
interna retiniana. A rede de astrócitos fornece um molde para o
surgimento dos vasos sangüíneos (Fruttiger, 1996 e Ling, 1988) que vai
envolver a produção de VEGF (Stone e cols., 1995). Estudos sugerem que
exista uma relação estreita entre a rede de astrócitos e vasos da retina. Em
cavalos, os astrócitos estão presentes somente em uma pequena região em
28
volta do nervo óptico, exatamente na região que é vascularizada (Schnitzer,
1987). Na retina de coelhos, vasos e astrócitos estão também intimamente
associados na mesma região (Stone, 1987). Em primatas e camundongos,
astrócitos e vasos sangüíneos cobrem a superfície interna da retina, com
exceção da fóvea, onde nem astrócitos nem vasos sangüíneos são
observados (Schnitzer, 1987).
Durante a vascularização da retina, tipos celulares endoteliais formam
prolongamentos chamados filopódios direcionando o crescimento vascular.
A formação desses prolongamentos depende da sinalização via VEGFR2
estimulada pelo gradiente de concentração de VEGF que é regulada devido
a tensão de oxigênio (Gerhardt, 2005). Normalmente no centro da retina,
onde se observam os primeiros sinais de vascularização, os níveis de VEGF
são baixos devido ao bom suprimento de oxigênio. Por outro lado, observa-
se que na periferia da retina, onde ainda não existem vasos, os níveis de
VEGF são elevados já que ainda não existe um suprimento adequado de
oxigênio (Fruttiger, 2007). Apesar desse gradiente de concentração de
VEGF não ter sido ainda bem demonstrado, existem evidencias que
fortalecem essa hipótese. Por exemplo, distúrbios na distribuição de VEGF
afetam diretamente a velocidade da expansão do plexo vascular através da
retina (Gerhardt, 2003). Isso foi demonstrado com a utilização de
camundongos mutantes com alterações na afinidade a VEGF pela matriz
extracelular.
29
As células endoteliais secretam PDGF-B que possibilita o
recrutamento de células murais também chamadas de pericitos, que se
posicionam ao redor das células endoteliais (Fruttiger, 2002). Os pericitos
são células contrateis que regulam o calibre vascular e o fluxo da
microcirculação retiniana. Normalmente existe uma célula endotelial para
cada pericito no leito capilar da retina humana (Cogan, 1984). Os pericitos
são envoltos por uma lamina basal própria, a qual por sua vez pode
fundir-se com a membrana basal das células endoteliais (Clever e Melton,
2003). A membrana basal é composta por diversas moléculas, destacando-
se dentre elas o colágeno IV e a laminina. O colágeno IV é uma proteína de
alto peso molecular, formado por duas cadeias polipeptídicas, alfa 1 e alfa
2, unidas numa molécula tri-helicoidal que se dispõe em forma de rede. É
uma proteína fibrosa que forma a parte principal da membrana basal
sobre a qual os outros componentes são organizados (Timpl, 1989). A
laminina é uma glicoproteina, também de alto peso molecular, formada por
três cadeias longas de polipeptídeos organizadas em forma de cruz
assimétrica e mantidas unidas através de pontes dissulfeto. Ela atua como
mediador da adesão de grande número de diferentes células ao substrato,
liga-se ao colágeno IV, ao sulfato de heparan, à entactina e a outros
receptores protéicos localizados nas superfícies das células. A laminina
regula uma variedade de fenômenos incluindo adesão, crescimento e
migração celular (Miner e Yurchenco, 2004).
30
A proteína laminina, sabidamente um ligante de PrPc (Graner e cols.,
2000a), se auto-polimeriza de modos distintos na matriz extracelular,
podendo a exposição de domínios específicos da proteína em cada tipo de
polímero formado modular diferentemente a sinalização para o tecido
adjacente (Freire e Coelho-Sampaio, 2000; Freire e cols., 2002; Freire e
cols., 2004). Nesse trabalho investigamos se a ausência de um dos
receptores celulares para laminina nos camundongos nocaute para PrPc
altera o padrão da organização extracelular da proteína e se essa alteração
pode influenciar na vascularização da retina.
Tendo em vista o grande interesse científico e, eventualmente clínico,
em se estabelecer por completo quais seriam as funções normais da PrPc,
esse estudo é de fundamental importância, pois avalia possíveis alterações
morfológicas nos animais nocaute. É interessante chamar a atenção para o
fato de que tal observação poderá orientar a busca por deficiências da
função visual nos animais deficientes em PrPc, que poderiam mesmo
incluir a própria perda da visão. Existe hoje na literatura um caso
correlato observado em camundongos nocaute para colágeno XVIII (Fukai,
2002). Estes animais foram originalmente descritos como desprovidos de
qualquer fenótipo visível. No entanto, investigações mais criteriosas
levaram à descrição de que os camundongos depletados do gene para o
colágeno XVIII eram, na verdade, portadores de extensas deficiências
visuais, suficientes para comprometer totalmente a função visual (Fukai,
2002).
31
II. OBJETIVOS
32
II. OBJETIVOS
O objetivo geral deste trabalho é investigar um possível papel para a
proteína PrPc no desenvolvimento do processo de vascularização da retina.
Realizaremos estudos comparativos da morfologia e integridade funcional
dos vasos em camundongos selvagens e depletados do gene para PrPc em
diferentes fases do desenvolvimento e buscaremos avaliar a função visual
dos animais adultos. Mais especificamente, nossos objetivos serão:
OBJETIVO 1: Estudar o padrão de organização de laminina na membrana
limitante interna da retina de camundongos, para estabelecer se existe
diferença entre os camundongos controle e nocaute no padrão de
deposição da laminina na superfície interna da retina, local no qual a rede
vascular se forma. Para a realização desses ensaios serão utilizadas
preparações do tipo montagens planas, nas quais se tem acesso direto à
superfície da retina.
OBJETIVO 2: Estudar o padrão de organização de laminina nos plexos
vasculares da retina em diferentes etapas do desenvolvimento para
estabelecer se existem diferenças temporais e morfológicas na formação da
rede vascular. Para a realização desses ensaios serão utilizadas
preparações do tipo montagens planas, nas quais se tem acesso direto ao
local de crescimento e expansão da rede vascular ou, alternativamente, em
33
cortes do tecido para se ter acesso à distribuição interna dos capilares e
avaliar a integridade das camadas da retina.
OBJETIVO 3: Investigar a função visual através de avaliação da
capacidade de localização de queijo, ração e objeto inodoro (bola), em
caixas de Skinner. Para avaliar a capacidade de localização, investigamos o
tempo gasto para alcançar os diferentes objetos testados. Adicionalmente,
avaliamos a influência da iluminação ambiente no tempo gasto para a
localização.
34
III. MATERIAIS MÉTODOS
35
III. MATERIAIS E MÉTODOS
III. I. MATERIAIS
Os camundongos utilizados neste estudo foram obtidos através do
cruzamento das linhagens Black C 57 e 129 SV selvagens e nocauteados
para o gene da proteína prion celular. Os camundongos nocaute foram
gentilmente cedidos pelo grupo da professora Vilma Martins do Instituto
Ludwig de Pesquisa contra o Câncer-SP, a partir de uma doação original
do grupo do professor Weissman (Department of Genetics and Howard
Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, New Haven)
responsável pelo desenvolvimento da linhagem de camundongos nocaute
PrPc
-
. Controle e nocaute de ambos os sexos foram usados nos
experimentos. Estes animais permaneceram no biotério da Escola de
Veterinária da Universidade Federal da Bahia (UFBA), em ambiente com
temperatura e umidade controladas e com livre acesso a água e comida.
Foram utilizados um total de 440 animais respeitando as normas e
recomendações nacionais e internacionais.
Os anticorpos primários utilizados foram: anti-laminina desenvolvida
em coelho e adquirida da Sigma Chemical Co. com diluição 1:100 em
salina tamponada por fosfato (PBS); anti-colágeno IV desenvolvido em
camundongo, adquirido da Sigma Chemical Co. com diluição 1:50 em
PBS; anti-PECAM1 (molécula de adesão plaquetária em célula endotelial)
desenvolvido em coelho, adquirido da Sigma Chemical Co. com diluição
36
1:100 em PBS; anti α-actina de músculo liso desenvolvida em
camundongo, adquirida da Sigma Chemical Co. diluído 1:100 em PBS. Os
anticorpos secundários Alexa anti-camundongo diluído 1:500 em PBS e
Cy3 anti coelho 1:100 diluído em PBS foram obtidos respectivamente da
Molecular Probes/Invitrogen e Sigma Chemical Co.
As caixa de Skinner utilizadas foram do modelo 2-EP 100 com luz
de 40W e capacidade de variação da intensidade luminosa.
III. II. MÉTODOS
III.II.I. Preparação de montagens planas da retina
Camundongos de diferentes idades: neonatos (P0), com 1 dia pós-
natal (P1), 2 dias (P2), 5 dias (P5), 10 dias (P10) ou 15 dias (P15), foram
sacrificados (por inalação de CO
2
) para remoção dos globos oculares. Após
a enucleação, os olhos foram imediatamente fixados em 4% de
paraformaldeído (Reagen – Quimibrás Indústrias Químicas S.A.) diluído
em PBS durante 1 hora e dissecados em lupa para retirada da esclera,
lentes e vítreo. As retinas foram então aplainadas realizando-se 4 cortes
radiais a partir das bordas, colocadas em lâminas gelatinizadas e cobertas
com uma lamínula de vidro. Em cima de cada lamínula foi colocado um
peso para facilitar a adesão da retina à lâmina. Este material permaneceu
embebido em paraformaldeído 4% por 24 horas e posteriormente as
lamínulas foram retiradas e as retinas ficaram aderidas às respectivas
37
lâminas. Estas lâminas foram utilizadas para imunohistoquímica,
conforme descrito na próxima seção.
III.II.II. Imunofluorescência
Nos ensaios onde a visualização foi feita por imunofluorescência, as
amostras foram processadas como descrito a seguir. Após aplainadas, as
montagens planas de retina foram submetidas a três lavagens de 5
minutos cada com tampão PBS (Nuclear – Casa da Química Ind. e com.
Ltda) e bloqueadas por 30 minutos com soro albumina bovina 5% (BSA)
(Nuclear – Casa da Química Ind. e com. Ltda) em PBS, em temperatura
ambiente. Em seguida o material foi incubado com os anticorpos primários
em teste por 12 horas a temperatura de 4ºC. Depois deste período mais
três lavagens de 5 minutos com tampão PBS foram feitas e em seguida
incubou-se com o anticorpo secundário por mais duas horas à
temperatura ambiente. As montagens planas de retina marcadas com anti
PECAM 1 e anti-α actina de músculo liso foram permeabilizadas por 10
minutos em tampão PBS/triton X-100 0,2% (Nuclear – Casa da Química
Ind. e com. Ltda) antes da realização do bloqueio com BSA. Algumas
montagens planas de retina foram tratadas com DAPI (4’,6-Diamidino-2-
phenylindole dihydrochloride) (Sigma Chemical Co) por 15 minutos para
visualização dos núcleos celulares. As lâminas foram montadas para
microscopia sobre n-propilgalato (Sigma Chemical Co) e examinadas em
microscópio de epifluorescência Nikon TE 300.
38
III.II.III. Análise Histológica
Para os cortes histológicos foram retirados os globos oculares após o
sacrifício (conforme descrito anteriormente) de camundongos adultos com
60 dias de nascidos. Os globos oculares íntegros após serem removidos,
foram colocados em paraformaldeido 4% por 24 horas. Em seguida o
material foi submetido a banhos em concentrações crescentes de álcool
etílico (70%, 80%, 90% e 100%), imerso em xilol e impregnado com
parafina fundida (Nuclear – Casa da Química Ind. e com. Ltda). Os blocos
foram colocados em temperatura ambiente para a solidificação da parafina
e posteriormente levados ao micrótomo (Hexasystens MRPO 3) e cortados
em cortes de 5 µm de espessura. Entre um corte e outro houve um espaço
de 300 µm. A parafina foi então removida com um banho de xilol e os
cortes de tecido foram imersos em banhos de proporção crescente de
água/álcool etílico para a re-hidratação. O tecido foi então corado com
hematoxilina e eosina (Nuclear – Casa da Química Ind. e com. Ltda), as
lâminas montadas e observadas em microscópio Nikon TE 300.
Foram processados 20 globos oculares de camundongos controle e
20 de animais PrPc
-
. De cada globo ocular foram analisadas cinco lâminas,
chegando a um total de 100 lâminas para controle e 100 para nocaute.
Foram analisados dois campos para cada uma dessas lâminas, 200
campos para PrPc
-
e 200 para controle. Foi considerado a medida de um
campo o diâmetro observado com a objetiva em aumento de 10 X.
39
III.II.IV. Avaliação da função visual
Para avaliar a função visual dos camundongos foi utilizado um
dispositivo conhecido como caixa de Skinner (Figura 6). Este dispositivo é
adequado para estudos de comportamento animal, pois podemos ter
controle de uma variedade de condições de estímulos. Utilizamos este
equipamento porque era necessário o controle da luminosidade do
ambiente em que estavam os camundongos nos testes desenvolvidos para
verificar a função visual. Com 100% de intensidade luminosa na caixa, foi
medido o tempo gasto para que um camundongo alcance determinado
alvo. Os animais foram colocados em uma das extremidades da caixa. Na
outra extremidade foi oferecido primeiro um cubo de queijo. Depois o
animal era trocado de caixa e o mesmo procedimento era feito trocando o
queijo por ração. Novamente mudava-se o animal de caixa e, ao invés de
queijo ou ração, era colocado um objeto (bola) do tamanho do pedaço de
queijo e ração. Em seguida foi medido o tempo gasto, em segundos, para
que cada animal chegasse ao alvo (queijo, ração ou objeto). Este
procedimento foi feito com 20 animais controles e 20 animais PrPc
-
. Cada
animal foi testado 10 vezes para cada alvo. A troca de caixa foi importante
para que o cheiro de um alimento não influenciasse o próximo passo do
experimento.
Foi avaliado também o efeito da intensidade luminosa na função
visual de camundongos controle. Um animal foi colocado na caixa e
mediu-se o tempo que ele levou para chegar ao objeto na outra
40
extremidade. Este tempo foi medido com a caixa contendo 100% de luz,
depois com 70% em seguida com 50% e finalmente com 25% de luz. O
procedimento foi feito com 20 animais controle e repetido 10 vezes para
cada animal.
Figura 6. Caixa de Skinner.
III.II.V Análise Quantitativa e Estatística
As lâminas foram observadas em microscópio de epifluorescência, as
imagens foram capturadas ou fotografadas. As imagens fotografadas foram
escaniadas para posterior montagem no programa Adobe Photoshop CS
versão 8.0.1. As análises estatísticas foram feitas no programa Excel.
Calculamos a média e o desvio padrão em cada caso. As diferenças entre
os grupos de resultados coletados foram analisadas pelo teste t - ANOVA e
considerado significante quando o valor de p foi menor que 0,05. Para
medir o calibre dos vasos foi utilizado o programa Image Pro Plus (Media
Cybernetics).
41
IV. RESULTADOS
42
IV. RESULTADOS
Inicialmente investigamos se em camundongos nocaute para PrPc a
ausência da expressão da proteína prion celular, sabidamente um ligante
para laminina (Graner e cols., 2000a e b), poderia promover alterações no
padrão de deposição da proteína laminina na camada limitante interna da
retina. Observamos, como descrito originalmente por Fruttiger (2002), a
formação das fileiras de células com núcleo fusiformes, marcadas com
DAPI no fronte de crescimento da rede vascular (Figura 7 A). Como a
morfologia nuclear acompanha a celular, essas células foram definidas
como células fusiformes. Análises subseqüentes revelaram que as células
fusiformes eram precursores astrocitários (Fruttiger, 2002). Em associação
às células organizadas em fileiras, a laminina se organiza em tramas
poligonais nas retinas de animais controle (Figura 7 C), mas não nas
retinas de animais nocaute (Figura 7 D). Nos animais nocaute as mesmas
células estão desagrupadas e soltas, sem um padrão definido de
organização, e não há detecção de laminina (Figura 7 B).
43
A
C
D
B
Figura 7. Imunomarcação para laminina na membrana limitante interna
da retina de camundongos neonatos (P0).Marcão para DAPI (A) (B).
Formação das fileiras de células fusiformes (seta), no fronte de crescimento
da rede vascular em animais controle (A) e células sem padrão de
organização em retinas de camundongos PrPc
-
(B). Imunomarcação anti-
laminina (C)(D).Organização em tramas poligonais da laminina em
camundongos controle (C). Não observamos a organização em tramas
poligonais em camundongos nocaute (D). A barra de calibração
corresponde a 10 µm.
44
As redes poligonais de laminina foram observadas sobre os
astrócitos enfileirados encontrados no fronte de crescimento da rede
vascular dos animais controle. Estas redes poligonais de laminina são
semelhantes às que se formam sobre culturas de astrócitos obtidos a
partir do córtex cerebral de animais embrionários ou polimerizadas
artificialmente em pH ácido (Freire e cols. 2002 e 2004). As matrizes com
estruturas poligonais são formadas através da interação entre os braços
curtos da laminina (Barroso e cols., em preparação) e são extremamente
eficientes na promoção do crescimento neurítico.
Para avaliar se a ausência da expressão da proteína prion celular e a
conseqüente ausência da deposição de laminina na matriz da superfície
interna da retina afetariam o desenvolvimento da rede vascular retiniana,
foram dissecadas as retinas de animais nocaute e controle (P1, P2 e P5).
Após serem dissecadas as retinas foram preparadas em montagens planas
e submetidas a análise por imunomarcação da proteína laminina. A
proteína laminina é sabidamente um constituinte de membrana basal que
envolve as células endoteliais e, portanto, neste caso funciona como
marcador da rede vascular. Para acompanhar o crescimento do plexo
vascular primário fizemos marcação para laminina em animais controle
(Figura 8 A, C e E) e nocaute (Figura 8 B, D e F). O plexo vascular
primário, em animais controle, na idade P0 já é bem visível através da
marcação para laminina (Figura 8 A) enquanto que na mesma idade, em
camundongos PrPc
-
, a marcação para laminina se limita a inserção do
45
nervo óptico (Figura 8 B). O crescimento dos vasos em retinas de animais
nocaute com 2 dias (P2) e 5 dias (P5) continua mostrando um atraso em
relação ao observado nas retinas de camundongos controle. Nos controle
em P2 a vascularização da retina já alcança a metade da sua superfície e
nos nocaute este processo apenas se inicia (comparar Figura 8 C e D).
Em P5, os animais controle já apresentam o plexo primário alcançando a
extremidade da retina e nos nocaute o plexo ainda não passa da metade
da retina (Figura 8 E e F).
46
CT
PrPc
-
P0
P2
P2
P5
P5
P0
A
B
C
D
E
F
Figura 8.
Imunomarcação da membrana basal dos vasos, do plexo vascular primário
da retina de camundongos, com anticorpo anti-
laminina. Em camundongos controle
(P0)(A), (P2)(C) e (P5)(E) e em camundongos PrPc
-
(P0)(B),(P2)(D) e (P5)(F).
Observamos
um atraso no processo de vascularização de animais nocaute. O círculo marca a
inserção do nervo óptico. Barra de calibração corresponde a 100 µ
m.
47
A marcação para PECAM 1 da rede vascular das retinas de
camundongos no quinto dia de vida mostra um padrão de ramificação dos
vasos diferente entre retinas de animais controle e nocaute. Ao
observarmos os pontos de ramificação por campo analisado, verificamos
um número muito maior de ramificações nos vasos de animais controle do
que em vasos de animais nocaute. Estes pontos de ramificação dos vasos
chegam a 25 ramificações por campo analisado nos controle (Figura 9 A) e
somente cinco pontos em retinas de camundogos PrPc
-
(Figura 9 B).
Observamos um total de 40 campos para animais controle e 40 para
animais nocaute. O diâmetro dos vasos também foi avaliado através de
marcação para laminina. Quantificamos uma média de 17,5 ± 2,2 µm
para controle (Figura 10 A) e 8,9 ± 1,0 µm para nocaute (Figura 10 B).
48
0
5
10
15
20
25
30
PrPc
-
CT
Número de ramificações
por campo
A
B
C
A
B
Figura 9.
Número de ramificações dos vasos d
o plexo vascular
primário da ret
ina por campo observado, em 30 campos para
controle e 30 para PrPc
-
.Cada campo corresponde ao diâmetro
observado com a objetiva de 10X.
Imunomarcação para PECAM1
nos vasos da retina de camundongos PrPc
-
(B) e controle (A). A
quantificação (C)
mostra um padrão mais ramificado nos vasos de
animais controle (24,6 ±
1,6 ramificações) em relação ao nocaute
(3,8 ±
0,3 ramificações). Barras representam o erro padrão da
medida. Barra de calibração corresponde a 50 µm.
49
0
5
10
15
20
25
Diâmetro médio de vasos
(
µ
m)
CT
PrPc
-
C
A
B
Figura 10.
Imunomarcação dos vasos do plexo vascular primário com
anticorpo anti-laminina em camundongos controle (A) e nocautes (B)
para observação do calibre dos vasos. O calibre foi medido
,
quantificado e obtivemos uma média de 17,5 ± 2,2 µ
m para controle e
8,7 ± 1,0 µm para nocaute (C)
. Barras representam o erro padrão da
medida. Barra de calibração corresponde a 50 µm.
50
Após caracterizarmos as diferenças no crescimento da rede vascular
e identificarmos diferenças no padrão de ramificação e no diâmetro dos
vasos, fomos verificar se haveria diferenças no grau de maturação desses
vasos. Para isso fizemos marcação para α-actina de músculo liso que,
neste caso, identifica pericitos, ou seja, aquelas células murais associadas
ao revestimento endotelial dos capilares. Observamos pericitos descolados
dos vasos em retinas de camundongos PrPc
-
(Figura 11 B). Em animais
controle, os pericitos aparecem bem aderidos aos vasos da retina (Figura
11 A). Quando comparamos com a marcação para laminina dos vasos
confirmamos que em camundongos controle os pericitos aparecem bem
aderidos aos capilares, o que não se observa nos nocaute (comparar
Figura 11 C e D).
51
PrPc
-
CT
A
C
B
D
Figura 11
.
Imunomarcação dos vasos do plexo vascular primário da retina com
anti α actina de músculo liso (A) e (B) e anti- laminina (C) e (D).Notamos
pericitos
descolados dos vasos em retinas de camundongos PrPc
-
(B)
(seta). Em animais
controle, os pericitos aparecem bem aderidos aos vasos da retina (A)
. Quando
comparamos os vasos marcados para laminina confirmamos que
em camundongos
controle os pericitos aparecem com a sua membrana basal aderida a membrana
basal dos vasos (C) o que não se observa nos nocautes (D).
Barra de calibração
corresponde a 10 µm.
52
Para ter certeza de que os nossos resultados, obtidos através de
imunomarcação para laminina se reportam efetivamente à formação da
rede vascular, os vasos nas retinas foram também identificados através de
uma dupla imunomarcação para laminina e colágeno IV (Figura 12A e B).
O colágeno IV, assim como a laminina, identifica a membrana basal que
circunda os vasos sangüineos. Além disso observamos um padrão de
marcação bastante semelhante através da marcação para PECAM-1
(Figura 12 C), que é marcador específico para célula endotelial. Esses
resultados em conjunto demonstram que a marcação para laminina
identifica majoritariamente os vasos da retina.
Uma observação adicional foi a identificação de uma tendência
acentuada à perda de vasos nos nocaute durante o processamento para
imunohistoquímica e preparação das montagens planas. Das 280 retinas
que foram dissecadas durante o desenvolvimento desse trabalho, 140
foram de animais entre o dia do nascimento até o segundo dia de vida (P0-
P2), sendo 70 delas dissecadas de animais controle e 70 de animais
nocaute. Cerca de 100 retinas de animais entre o terceiro e o quinto dia de
vida foram dissecadas, sendo 50 de camundongos controle e 50 de
nocaute. Analisamos ainda 20 retinas de camundongos PrPc
-
e 20 de
controle acima do quinto dia após o nascimento (>P5) (Figura 13 A). Do
total de retinas observadas entre P0 e P2, os vasos foram mantidos em 60
retinas (86%) dissecadas de camundongos controle, enquanto que em
camundongos nocaute somente em 10 retinas (14%) foram observados
53
vasos após os procedimentos de dissecação e montagem plana. Entre as
idades P3 e P5, cerca de 80% das retinas dissecadas dos animais controle
apresentaram vasos, enquanto apenas 10% das retinas do nocaute
mantiveram a rede vascular. Nas retinas dissecadas de animais após o
quinto dia do nascimento foram observados vasos em apenas 25% das de
camundongos controle e nenhuma das retinas dissecada de animais
nocaute mantiveram a rede vascular. (Figura 13 B).
54
C
B
A
Figura 12. Imunomarcação de vasos do plexo vascular primário
da retina de camundongos controle. Anti-laminina (A), anti-
colágeno IV (B) e anti- PECAM1 (C). Barra de calibração
corresponde a 50 µm.
55
0
10
20
30
40
50
60
70
80
CT
PrPc
-
Número total de retinas dissecadas
A
Figura 13.
Quantificação do número total de retinas
dissecadas de animais controle e PrPc
-
(A). Em B
, a
quantificação de retinas dissecadas que
mantiveram os
vasos preservados.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
CT
PrPc
-
P0 – P2
P3 – P5
>
P5
B
Número total de retinas dissecadas
com vasos
P0 – P2
P3 – P5
> P5
56
Para observar a integridade das camadas da retina dos
camundongos fizemos cortes histológicos do globo ocular intacto e
realizamos o procedimento de coloração com hematoxilina e eosina. As
retinas de animais controle são mostradas na figura 14A e C com suas
camadas bem definidas e organizadas, e praticamente inexistem regiões de
descolamento da camada pigmentar da retina. Na figura 14B, D notamos
que nas retinas de camundongos PrPc
-
existem regiões de desorganização
além de regiões de descolamento da retina. As regiões de desorganização
observadas na camada superficial da retina foram quantificadas e
comparadas entre retinas de animais controle (Figura 15 A) e nocaute
(Figura 15 B e C). Observa-se nas retinas de animais nocaute regiões nas
quais as células da superfície retiniana encontram-se aderidas ao
cristalino (Figura 15 B), em outras regiões células da camada superficial
parecem se soltar da retina (Figura 15 C). Do total dos 200 campos
analisados para PrPc
-
e 200 para controle, 85% apresentaram áreas de
desorganização nas retinas dos animais nocaute enquanto apenas cerca de
30% apresentaram áreas de desorganização nas retinas de animais
controle (Figura 15 D).
57
A
B
C
D
C
Figura 14.
Cortes histológicos do globo ocular, corados com
hematoxilina e eosina, de animais controle (A) e (C)
e de camundongos
nocaute (B) e (D). Notamos que nas retinas de camundongos PrPc
-
existem regiões de desorganização das camadas da retina (ponta de
seta) além de regiões de descolamento de retina (seta).
58
A
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
% de campos com
desorganização/ lâmina
CT
PrPc
-
C
B
D
Figura 15.
Cortes histológicos de globo ocular. Em camundongos
controle (A) mostra-se a integridade das camadas da retina. Em B
e
C
observamos regiões de desorganização das camadas da retina de
animais PrPc- (seta). Em D a
quantificação mostra que foi
encontrada uma porcentagem significantemente maior de campos de
desorganização em retinas de camundongos PrPc-.
59
A analise da organização dos vasos evidencia uma maior
estruturação dos vasos nos animais controle, que apresentam paredes
endoteliais íntegras (Figura 16 A). Nos animais nocaute, alguns vasos da
camada superficial encontram-se dilatados, muitas vezes rompidos e não
circundados devidamente por células endoteliais (Figura 16 B). A
quantificação da integridade dos vasos mostra que em apenas cerca de
20% dos campos analisados, as retinas dos animais controle
apresentavam vasos com interrupções da camada endotelial, enquanto que
em 70% dos campos analisados, as retinas dos animais nocaute
apresentavam vasos não íntegros (Figura 16 C).
60
Figura 16. Corte histológico da retina mostrando a organização dos vasos
(seta). Observamos uma maior integridade nas paredes dos vasos de retina
de animais controle (A). Nos animais nocaute, vasos da camada superficial
encontram-se rompidos (B). A quantificação mostra maior desestruturação
nos vasos de retina de camundongos PrPc- (C).
A
C
B
C
CC
C
C
C
C
CCCCC
C
C
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% de campos analisados com
Vasos desestruturados
CT PrPc
-
61
Em paralelo a observação da estruturação dos vasos, comparamos
as retinas dos animais controle (Figura 17 A) e nocaute (Figura 17 B) em
relação à existência de áreas de descolamento de retina. Verificamos que
80% dos campos analisados das retinas dos animais nocaute mostraram
áreas de descolamento enquanto nos animais controle apenas 5% dos
campos apresentaram descolamento (Figura 17 C). Dos 80% dos campos
que apresentaram áreas de descolamento, 45% mostraram apenas uma
região de descolamento no campo observado, cerca de 30% mostraram
duas regiões no campo observado e ainda cerca de 10% mostraram mais
que três regiões de por campo analisado (Figura 17 D).
62
A
B
Regiões de desco
lamento de retina
por campos analisados
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
C
T
PrPc
-
1 região
2 regiões
3 ou +
regiões
% de campos analisados
CT
PrPc
-
C
D
CT
PrPc
-
Figura 17.
Corte histológico de retina mostrando integridade das
camadas em camundongos controle (A)
e regiões de descolamento de
retina em camundongos PrPc- (B) (seta).
Quantificação de áreas de
descolamento de retina por campo analisado em camundongos controle
e nocaute (C)
. Quantificação do número de regiões de descolamento de
retina por campo analisado, em camundongos controle e nocaute (D).
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
% de campos analisados com
áreas de descolamento de retina
D
CT
PrPc
-
CT
PrPc
-
63
Para verificar se as alterações observadas nos vasos da retina,
através das análises por imunohistoquímica e dos cortes histológicos,
poderiam levar a alterações na função visual, fizemos ensaios funcionais
utilizando caixas de Skinner. Com iluminação total os animais PrPc
-
e
controle foram colocados em uma das extremidades da caixa. Na outra
extremidade foram oferecidos diferentes alvos a serem alcançados.
Quantificamos quantas vezes por minuto os animais controle (Figura 18
A) e nocaute (Figura 18 B) chegaram até o alimento (ração ou queijo) e
objeto sem odor, mas como o mesmo tamanho que o pedaço de queijo e de
ração (bola). Tivemos o cuidado de realizar os experimentos trocando de
caixas entre cada teste para evitar que o odor desprendido dos alimentos
interferisse no ensaio seguinte. Observamos que os animais controle
alcançaram o queijo e a ração o mesmo número de vezes no período de um
minuto e poucos se dirigiram apenas uma única vez em direção ao objeto
(Figura 18 A). Os animais nocaute gastaram o período de um minuto
alcançando apenas uma única vez o queijo, alguns sequer alcançaram a
ração e nenhum dos animais testados localizou o objeto inodoro (Figura
18 B).
A’
64
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
ração
objeto
Idas até o alvo
por minuto
*
CT
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
PrPc
-
*
B
queijo objeto
ração
queijo
A
Figura 18.
Quantificação do número de vezes por minuto que os
animais controle (A) e nocaute (B)
levam para chegar até o alimento
(ração ou queijo) e objeto sem forte odor (bola). Barras representam o
erro padrão da medida. De acordo com tratamento estatístico p< 0,05.
65
Adicionalmente analisamos o tempo que cada animal necessita para
encontrar cada alvo oferecido (queijo, ração e objeto). Notamos que não
houve diferença significativa no tempo gasto pelos animais controle para
chegar ao alvo, variando entre 5 segundos para o queijo e o objeto e 3
segundos para a ração (Figura 19 A). Os animais PrPc
-
necessitaram de
um período de tempo significativamente maior tanto para alcançar a ração
quanto para alcançar o queijo. Estes animais levaram em média 66
segundos para encontrar o queijo e 45 segundos a ração (Figura 19 B).
Quando comparamos, na mesma escala, o tempo gasto pelos animais
nocaute e controle notamos que os animais nocaute levam cerca 14 de
vezes mais tempo que os controle para alcançar o alvo (inset C). É
interessante observar que nenhum dos animais PrPc
-
submetidos ao teste
conseguiu chegar ao objeto em num período de 120 segundos (Figura 19
D). Esses resultados mostram claramente que os camundongos controle
tiveram mais facilidade, tanto para encontrar os alimentos quanto o objeto
quando comparados com os animais nocaute.
66
% de animais que não alcançaram
o objeto após (120 seg)
objeto
D
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
D
*
*
Figura 19. Análise do tempo que cada animal necessita para encontrar
cada alvo oferecido (queijo, ração e objeto). Não houve diferença
significativa no tempo gasto pelos animais controle para chegar ao alvo
(A). Os animais PrPc- utilizaram um período de tempo
significativamente maior tanto para alcançar a ração quanto para
alcançar o queijo (B). Nenhum dos animais PrPc- submetidos ao teste
conseguiu chegar ao objeto no período de 120 segundos (D). Barras
representam o erro padrão da medida. De acordo com o tratamento
estatístico p < 0,05.
Tempo gasto para
encontrar o alvo (seg)
0
1
2
3
4
5
6
0
10
20
30
40
50
60
70
80
A
B
0
10
20
30
40
50
60
70
80
C
queijo
ração
objeto
queijo
ração
*
*
67
Para verificar se o ato de encontrar objetos, sob as condições
experimentais encontra-se associado à função visual dos animais, foi
avaliado o efeito da variação da luminosidade no interior das caixas de
Skinner sobre o tempo gasto pelos animais controle, para localizar o
objeto. Observamos que a diminuição da luminosidade no ambiente
diminuiu o tempo gasto pelos animais para alcançar o alvo, indicando que
a diminuição da luminosidade facilita a localização do objeto (Figura 20).
68
0
50
100
150
200
250
Tempo gasto para
encontrar o objeto pela segunda vez (seg)
25
50
75
100
CT
% de luz
*
*
Figura 20. Quantificação dos testes feitos para verificar se o ato de
encontrar objetos, sob as condições experimentais, encontra-se
associado à função visual dos animais. Foi avaliado o efeito da variação
da luminosidade sobre o tempo gasto pelos animais controles, para
localizar o objeto. De acordo com tratamento estatístico p<0,05.
69
V. DISCUSSÃO
70
V. DISCUSSÃO
A laminina é uma glicoproteína de alto peso molecular,
primeiramente identificada e caracterizada como constituinte da
membrana basal (Timple, 1989), teve sua presença também demonstrada
na formação de tecidos como na matriz extracelular do cérebro
embrionário (Luckenbill-Edds, 1997). A Laminina é constituída de três
cadeias, α, β e γ, que se arranjam em forma de cruz, sendo o braço mais
longo formado pela associação entre as três cadeias (Miner e Yurcheco,
2002).
A proteína laminina se auto-polimeriza, dando origem a matrizes de
diferentes formas. A organização da laminina na matriz extracelular do
sistema nervoso central em desenvolvimento é bastante variada, podendo
ser observados agregados puntiformes dispersos de tamanhos variados,
agregados associados a membranas celulares ou ainda agregados em
forma de lâmina. O fato dos padrões de organização apresentarem uma
distribuição temporal sugere que possam ter diferentes funções no
desenvolvimento (Zhou, 1990). Esta hipótese é suportada por observações
feitas in vitro, comparando matrizes de laminina depositadas por diferentes
populações de astrócitos em cultura.
As propriedades do meio extracelular onde são formados os
depósitos de laminina pode modular o processo de organização dos
agregados formados por esta proteína e suas respectivas capacidades de
induzir respostas celulares (Freire e cols., 2002, 2004). Uma possibilidade
71
alternativa seria a de que a morfologia dos depósitos fosse determinada
pela interação com receptores celulares específicos (Tsiper e Yurchenco,
2002). Trabalhos mostram que PrPc se liga tanto a laminina (Graner e
cols., 2000a e b), quanto ao receptor de laminina 67 kDa (Gauczynski e
cols., 2001). Sabendo que durante o desenvolvimento da retina, em
camundongos, há normalmente síntese de laminina pelos astrócitos na
membrana limitante interna, neste trabalho nós inicialmente investigamos
o padrão de organização polimérica da laminina sintetizada pelas células
localizadas nesta região. Células de morfologia fusiformes foram
previamente identificadas na membrana limitante interna e classificadas
como sendo astrócitos por Fruttiger, 2002. Observamos que existe um
padrão de organização de laminina diferenciado na membrana limitante
interna da retina de animais controle quando comparados com os animais
nocaute. No desenvolvimento das retinas de animais controle notamos
deposição de laminina por toda a superfície interna da retina. Observamos
que os polímeros de laminina sintetizados pelos astrócitos retinianos dos
animais controle (Figura 7 C) apresentam um padrão de organização
poligonal compatível com o previamente visualizado sobre camadas de
astrócitos em cultura, obtidas de córtex de animais embrionários (Freire e
cols., 2004). O mesmo padrão poligonal é também observado em matrizes
artificiais sintetizadas por diluição da proteína em pH ácido (Freire e cols.,
2002). A organização poligonal tem sido atribuída às interações que
envolvem exclusivamente os domínios globulares dos braços curtos da
72
laminina (Barroso e cols., em preparação). Em camundongos PrPc-, apesar
de existir laminina na membrana basal dos vasos (Figura 8B, D e F), não
identificamos o padrão de organização polimérica de laminina na
membrana limitante interna da retina (Figura 7 D). Na verdade, nenhuma
marcação para laminina foi observada nos animais depletados da proteína
PrPc. Desta forma, acreditamos que a adesão da proteína laminina sobre a
camada limitante interna da retina possa ser prejudicada pela ausência
da proteína prion celular um dos seus ligantes.
Trabalhos anteriores mostraram que o padrão de polimerização de
laminina é importante para a diferenciação neuronal (Garcia-Abreu e cols.,
1995) e que o complexo PrPc-Ln modula a neuritogênese em células de
cultura primária de hipocampo de ratos e camundongos (Graner e cols.,
2000a e b). Quando neurônios são cultivados em co-cultura com astrócitos
de animais PrPc
-
observa-se crescimento neurítico menor se comparados
com neurônios em contato com astrócitos de animais controle (Lima e
cols., 2007). Neste mesmo trabalho, foi mostrado adicionalmente que a
laminina da matriz extracelular secretada por astrócitos de animais PrPc
-
,
apresenta um padrão de deposição interrompido, ou seja, que os
agregados de laminina não se estruturam em redes poligonais planas,
como as previamente descritas como indutoras de neuritogênese (Freire e
cols., 2002 e 2004). Nossos dados corroboram a hipótese de que PrPc
module a formação da rede poligonal de laminina indutora de
neuritogênese.
73
Além de alterações na organização de laminina na membrana
limitante interna da retina de camundongos nocaute, observamos também
diferenças no padrão de organização das células fusiformes. Foi mostrado
que uma das principais funções dos astrócitos da retina é induzir
crescimento dos vasos (Akiyoshi e cols. 2006). Além disso, segundo
Fruttiger (2002), para que ocorra a formação da rede vascular na
superfície da retina, vários processos celulares e moleculares devem seguir
uma ordem cronológica. Antes de se iniciar a vascularização da retina,
ocorre a formação de uma rede de astrócitos crescendo a partir do nervo
óptico em direção a periferia da retina. A rede de astrócitos forma um
molde para que ocorra efetivamente a formação dos vasos sanguíneos. No
nosso trabalho observamos que as células com núcleos fusiformes
encontradas, em animais controle neonatos (P0), se mostram organizadas
no fronte de crescimento da rede vascular. Estas células se organizam em
forma de fileiras com ramificações definindo a organização estrutural para
que a rede vascular possa ser formada. Quando comparamos com animais
nocaute de mesma idade, não observamos o padrão de organização
compatível com a rede de astrócitos observada nos controles (Figura 7A e
B).
Um dos principais resultados relatados nesta tese foi o atraso na
progressão da vascularização da retina de camundongos nocaute. Segundo
Gariano (2003), o plexo primário da retina de camundongos inicia a sua
formação no dia do nascimento a partir do nervo óptico e cresce em
74
direção às margens da retina. Esta rede vascular ultrapassa a metade da
superfície retiniana em aproximadamente 4 dias após o nascimento e por
volta de uma semana depois de nascidos alcança a periferia da retina. Em
nosso trabalho, ao acompanhar a formação da rede vascular dos
camundongos controle, notamos o início da vascularização em animais
neonatos P0. Aproximadamente no segundo dia de vida a rede vascular
quase alcança metade da superfície retiniana e já no quinto dia a rede
encontra-se próxima a periferia da retina. Observamos, no entanto (Figura
8), que em animais nocaute, este crescimento vascular é bem diferenciado.
Notamos que os vasos da retina destes animais, quando neonatos (P0) são
virtualmente ausentes na inserção do nervo óptico. Em animais nocaute
com idade de dois dias de nascidos (P2), o plexo vascular primário apenas
se inicia na inserção do nervo óptico, o que sugere um atraso no processo
de formação da rede vascular nos animais nocaute. A análise das retinas
dos animais com 5 dias após o nascimento confirma o atraso no processo
de desenvolvimento vascular da retina de camundongos nocaute, pois
nesta fase o plexo vascular primário ainda não alcança a metade da
superfície da retina quando já deveria se aproximar da periferia
Além do atraso no crescimento do plexo vascular primário de
retinas de camundongos nocaute, também observamos diferenças no
padrão de ramificação dos vasos, seu calibre e na sua maturação (Figura
11). Os vasos da retina de animais nocaute são muito menos ramificados e
possuem espessura menor que os de animais controle. Adicionalmente,
75
observamos um número significativo de pericitos descolados da membrana
basal dos vasos. Esses dados sugerem que existam deficiência tanto na
maturação quanto na estabilização dos vasos da retina de camundongos
nocaute. A presença de pericitos nos vasos demonstra a maturação e
integridade dos vasos (Akiyoshi e cols., 2006). O descolamento de pericitos
é um dos primeiros sintomas de comprometimento da integridade dos
vasos sangüíneos. Em doenças relacionadas com vascularização da retina,
como é o caso da retinopatia diabética, a dissociação dos pericitos dos
capilares da retina é o primeiro sintoma da doença e o início de várias
alterações nos vasos que incluem aumento da permeabilidade vascular e
hemorragia (Frank, 2004).
A avaliação histológica comparativa das retinas de animais PrPc
-
e
controle mostrou que as retinas de animais nocaute apresentam
alterações na organização de camadas celulares, assim como alterações na
estrutura vascular associadas a processos de descolamento de retina
(Figura 15). Já em 1997, Bursell e colaboradores mostraram que
processos de descolamento de retina podiam ser causados por patologias
ligadas às alterações microvasculares do tecido retiniano. Estas alterações
circulatórias como as que foram observadas por nós neste trabalho,
podem levar à perda do tônus vascular, alteração do fluxo sangüíneo,
aumento da permeabilidade vascular e conseqüentemente hemorragias e
edema culminando em descolamento de retina que, muitas vezes, pode
levar a diminuição da função visual e até mesmo a perda total da visão.
76
Os ensaios funcionais desenvolvidos nesse trabalho não
permitiram conclusões sobre a acuidade visual dos animais PrPc
-
, apesar
de nossas análises sobre o padrão de comportamento dos camundongos
nocaute sugerirem fortemente que estes animais apresentem alterações na
função visual. Os camundongos nocaute, durante os testes funcionais
realizados, necessitaram de um tempo consideravelmente maior que os
animais controle para alcançar os alimentos oferecidos. Além disso,
nenhum dos camundongos nocaute alcançou o objeto (bola) no tempo
estipulado para o ensaio.
A aquisição de alimentos por camundongos requer o uso de vários
sentidos, dentre eles o olfato e a visão. Para avaliar mais especificamente a
participação da visão nesta atividade, testamos a influência da
luminosidade sobre o tempo necessário para o alcance de objeto
desprovido de odor. O objeto, colocado no lugar do alimento, foi alcançado
pelos animais controle em um tempo similar ao tempo gasto para o
alcance dos alimentos. Os animais nocaute não alcançaram o mesmo
objeto durante o tempo do ensaio funcional. Poderíamos atribuir este fato
aos animais não se sentirem tão atraídos pelo objeto quanto pelo alimento.
Entretanto, percebemos claramente que a visão foi requisitada no ato, pois
quanto menor a intensidade luminosa, menor foi o tempo necessário para
os animais controle encontrarem o objeto. Esse comportamento, no
entanto, não foi verificado nos animais nocaute, ou seja, a diminuição da
intensidade luminosa não promoveu uma diminuição no tempo gasto para
77
o alcance do objeto. Vale ressaltar que era esperado que a diminuição da
intensidade luminosa favorecesse a visão, já que roedores apresentam
visão noturna (Mackintosh, 1974). Os dados obtidos demonstram que o
grande aumento no tempo gasto pelos animais nocaute para alcançarem o
objeto desprovidos de forte odor, não se encontra exclusivamente
associado à falta de interesse pelo objeto, mas principalmente ao
comprometimento visual nesses animais.
78
VI. CONCLUSÕES
79
VI. CONCLUSÕES
-
Nossos resultados mostraram que, apesar de existir laminina expressa
na membrana basal dos vasos, não existe deposição de laminina na
membrana limitante interna da retina dos animais nocaute antes do
crescimento vascular. Acreditamos que a adesão da proteína laminina
sobre a camada limitante interna da retina possa ser prejudicada pela
ausência da expressão da proteína prion celular, um dos seus ligantes.
- Caracterizamos um atraso no processo de vascularização da retina de
animais depletados do gene prnp. Além disso, identificamos que os vasos
da retina de animais nocaute apresentaram várias alterações como
diminuição do calibre, menor ramificação e perda de pericitos.
Acreditamos que estas alterações comprometem tanto o desenvolvimento
quanto a maturação dos vasos levando também a alterações nas camadas
da retina e conseqüentemente ao descolamento de retina observado.
- Os resultados da avaliação funcional sugeriram haver alteração da
função visual nesses animais. Nossos resultados indicam a existência de
uma correlação entre as alterações moleculares, celulares e histológicas no
desenvolvimento vascular das retinas de animais nocaute para PrPc e
alterações na função visual desses animais.
80
VII. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICAS
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