( PDF ) Estudo do potencial antineoplásico da biflorina, ? - naftoquinona isolada das raízes de Capraria biflora L.

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

ESTUDO DO POTENCIAL ANTINEOPLÁSICO DA

BIFLORINA,

- NAFTOQUINONA ISOLADA DAS

RAÍZES DE Capraria biflora L.

MARNE CARVALHO DE VASCONCELLOS

FORTALEZA

2007

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MARNE CARVALHO DE VASCONCELLOS

ESTUDO DO POTENCIAL ANTINEOPLÁSICO DA

BIFLORINA,

- NAFTOQUINONA ISOLADA DAS

RAÍZES DE Capraria biflora L.

Tese submetida à coordenação do Programa de Pós-

Graduação em Farmacologia, do Departamento de

Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da

Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial

para obtenção do título de Doutor em Farmacologia.

Orientador: Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho

Co-orientadora: Profa. Dra. Letícia Veras Costa Lotufo

FORTALEZA

2007

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V448e Vasconcellos, Marne Carvalho de

Estudo do potencial antineoplásico da biflorina, о-naftoqui-

nona isolada das raízes de Capraria biflora L. / Marne

Carvalho de Vasconcellos – Fortaleza, 2007

181 f. : il.

Orientador: Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho

Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Ceará. Curso

de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza – CE, 2007

1. Farmacologia 2.Teste de mutagenicidade 3. Toxicidade.

I. Moraes Filho, Manoel Odorico de (orient.) II.Título

CDD 615.1

MARNE CARVALHO DE VASCONCELLOS

ESTUDO DO POTENCIAL ANTINEOPLÁSICO DA

BIFLORINA,

- NAFTOQUINONA ISOLADA DAS

RAÍZES DE Capraria biflora L.

Tese aprovada em 14 de dezembro de 2007

BANCA EXAMINADORA

__________________________________________________

Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho

Orientador

Universidade Federal do Ceará

__________________________________________________

Profa. Dra. Letícia Veras Costa Lotufo

Co-Orientadora

Universidade Federal do Ceará

__________________________________________________

Profa. Dra. Maria Elisabete Amaral de Moraes

Universidade Federal do Ceará

__________________________________________________

Profa. Dra. Ana Paula Negreiros Nunes Alves

Universidade Federal do Ceará

__________________________________________________

Profa. Dra. Marília Oliveira Fonseca Goulart

Universidade Federal de Alagoas

DEDICATÓRIA

“Dedico esta tese a meus pais

Lena e Mário Vasconcellos

com todo meu amor.”

AGRADECIMENTOS

A Deus, por estar presente em todos os segundos de minha vida, me dando força

principalmente nos momentos de desânimo.

Ao Dr. Manoel Odorico de Moraes, meu orientador, que ainda quando aluna de

Farmácia, em Manaus, me deu a oportunidade de vir pra cá e durante todos esses anos

aqui em Fortaleza, sempre me incentivou e me orientou a continuar.

A Dra. Letícia Veras Costa Lotufo que sempre foi muito mais que uma co-orientadora,

em todos os momentos fosse fácil ou difícil me recebeu e apoiou, pela amizade e

compreensão constantes pela troca científica ao longo desses anos e por todas as

broncas também.

A Dra. Maria Elisabete Amaral de Moraes pela constante participação na minha

formação acadêmica no Laboratório de Oncologia Experimental ou na Unidade de

Farmacologia Clínica, pelo voto de confiança além de seu apoio e compreensão em

todas as horas.

Ao Dr. João Antônio Pegas Henriques pela oportunidade de conviver em seu laboratório

na Universidade Federal do Rio Grande do Sul, por toda sua orientação, carinho e apoio

sem os quais parte desse trabalho não se realizaria.

A Dra. Marília Oliveira Fonseca Goulart por aceitar participar da minha banca, pela

simpatia constante e oportunidade de colaboração nesse trabalho.

Ao Dr. Fernando Antonio Frota Bezerra pela orientação, pelo convívio, com seu

maravilhoso senso de humor e a paz de espírito que transmitia nas horas difíceis e claro

pela malacagem compartilhada.

A Dra. Claudia do Ó Pessoa, pelo apoio e incentivo constantes, ainda que em momentos

difíceis o meu muito obrigada, por todos esses anos de convívio.

A Dra. Ana Paula Negreiros Nunes Alves pela incansável disponibilidade, pela amizade

e carinho em todas as horas.

A Dra. Maria Rosa Lozano Borrás, pela constante torcida, carinho e amizade dispensada

desde a graduação até hoje.

Ao Dr. Rommel Burbano pela oportunidade de conviver e aprender em seu laboratório

na Universidade Federal do Pará.

A Dra. Telma Leda Gomes de Lemos pela oportunidade de poder trabalhar com a

biflorina.

A Dra. Jenifer Saffi pelo agradável convívio em Porto Alegre.

Aos amigos do LOE, Diego, Helton, Hemerson, Gardênia, Hélio, Patrícia Bonavides,

Patrícia Marçal, Paulo Michel, Danilo, Ivana, Carla, Bruno, Zé Roberto, Delano, Jérsia,

Arinice, Washington e Felipe por compartilharem suas experiências e amizade.

Aos amigos da Unidade de Farmacologia, André, Demétrius, Ismael, Ismênia, Ana,

Vagnaldo, Aline e Pacífica.

Aos companheiros, Cynthia, Kristiana, Cecília, Dayse, Silvéria e até o Carlinhos, por

nossas caranguejadas.

À Silvana pela imensurável ajuda neste trabalho.

Aos técnicos, Luciana, Adriano, Fátima, Evanir, Raimundo e Paulo sempre prontos a

ajudar.

Às secretárias Fábia, Maria Tereza, Flávia, Malu, Aura, Joana, Sheila e Adelânia que

sempre davam “um jeito” em tudo.

Aos professores da Pós-Graduação em Farmacologia pelos ensinamentos.

À Íris, Fernando, Chiquinho, Mônica, Vilanir, Alana, Carlos, Sílvio, Dona Bia, Sr.

Francisco, Sr. Aroldo, Sr. Dantas e demais funcionários da UNIFAC e do Departamento

de Fisiologia e Farmacologia da UFC, por fornecerem sempre boas condições de estudo

e trabalho.

Ao Aluísio Marques Fonseca pela paciência e disponibilidade incansáveis sempre que

lhe pedia mais biflorina.

Aos amigos Márcia e Antônio Barroso, pelo agradável convívio, amizade e carinho

constantes.

Aos amigos Tércio, Emília e Cecília pela salutar convivência durante o doutorado, pelo

carinho e amizade.

Aos amigos que fiz na UFRGS, Renato, Dinara, Giovanni, Albanin, Miriana, Izabel, as

Anas, Nicolas, Santos, Fernanda, Mirian, Márcia, Knulp, Jack, Cassiana, Bacana,

Renata e Fabrício.

Aos amigos que fiz na UFPA, Patrícia, Dani Baiana, Dani, Drica, Aline, Taís e André.

Na UFAL a Aline pela grande colaboração e paciência que teve comigo durante nosso

recente convívio.

Ao povo do Labomar, Janise, Janaína, Jeamylle, Lucas, Josi e Marcionília.

Ao amigo Daniel Pereira Bezerra o qual sem seu dinamismo e desprendimento com os

animais com certeza esse trabalho não se realizaria, valeu!!!

Ao amigo Marcio Pinho Pereira, por estar sempre presente e disposto a me ajudar em

todas as horas, por sua amizade, carinho, compreensão e por todos os seriados que

assistimos juntos.

À amiga Paula Christine Jimenez, por sempre estar por perto, pelo carinho, amizade e

acolhida em todas as horas difíceis, mas também nas horas lúdicas compartilhando de

agradáveis momentos como em nossas incansáveis partidas de buraco ao lado da tia

Susana e da tia Simone tomando caldo verde, com a Nágela peruando.

A amiga Isabelle Arthaud, outra companheira de carteado, dos seriados e de tantas

outras coisas, pelo carinho e amizade.

A amiga Raquel Carvalho Montenegro, por sua amizade, carinho e compreensão, ao

longo desses anos.

A meus tios e padrinhos Carlos (in memoriam) e Maria Sidney, por todo apoio durante

esses anos.

Aos meus irmãos Marla e Marcel, e ao meu cunhado Marcos que durante a minha

ausência, partilharam comigo o incentivo carinhoso neles contido.

Agradeço também ao apoio financeiro da CAPES e do Instituto Claude Bernard, sem os

quais não poderia realizar este trabalho.

RESUMO

ESTUDO DO POTENCIAL ANTINEOPLÁSICO DA BIFLORINA,

NAFTOQUINONA ISOLADA DAS RAÍZES DE Capraria biflora L.

Marne Carvalho de

Vasconcellos. Orientador: Manoel Odorico de Moraes Filho. Co-orientadora: Letícia Veras Costa Lotufo.

Tese de Doutorado. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. Departamento de Fisiologia e

Farmacologia, UFC, 2007.

A biflorina é uma 1,4 – orto-naftoquinona isolada de raízes de Capraria biflora, que

possui uma ampla distribuição nas américas do Sul e do Norte. O objetivo desse trabalho foi

avaliar se a biflorina apresentava um potencial citotóxico e antitumoral utilizando modelos in

vitro e in vivo. O presente estudo também avaliou a genotoxicidade dessa molécula em

linfócitos periféricos humanos e em outros modelos como células V79, bactérias, leveduras bem

como em medula óssea de camundongos. Frente a dezesseis linhagens tumorais, dentre elas 15

humanas e 1 murina, a biflorina mostrou-se bastante citotóxica, uma vez que teve sua CI

variando de 0,43 e 14,61 µg/mL. Para avaliar sua seletividade, ela foi testada também em

linfócitos humanos estimulados com fitohemaglutinina, onde se pode concluir que ela não é

seletiva. A biflorina não foi capaz de inibir o desenvolvimento de ovos de ouriço-do-mar e nem

causar ruptura na membrana de hemácias de camundongos. Para avaliar seu mecanismo de ação

e seu potencial antitumoral in vivo a linhagem B16 (Melanoma) foi escolhida para que os testes

in vitro e in vitro pudessem ser realizados com a mesma célula. Os estudos in vitro realizados

por coloração diferencial e por citrometria de fluxo sugerem que a biflorina induz morte celular

por apoptose, uma vez que as células tratadas apresentaram redução do volume nuclear,

condensação de cromatina e formação de corpos apoptóticos. A citometria de fluxo confirmou a

fragmentação de DNA induzida na maior concentração de biflorina e demonstrou que as células

tratadas apresentaram despolarização da mitocôndria significante. Além disso, por citometria a

integridade de membrana não foi alterada e não exibiu aumento da percentagem de células não

viáveis, sendo o mesmo observado com as células avaliadas por exclusão por azul de tripan. A

atividade in vivo da biflorina foi avaliada em três modelos, sarcoma 180, carcinoma de Erlich e

melanoma B16. A biflorina inibiu o crescimento dos tumores dos animais transplantados com

sarcoma 180 e carcinoma de Erlich, bem como foi capaz de aumentar a resposta antitumoral e

diminuir a toxicidade sistêmica do 5-FU quando associada com ele. Nos animais transplantados

com B16 a sobrevida dos animais tratados com biflorina aumentou significativamente. Foi

demonstrado também que a biflorina possui ação imunoadjuvante aumentando a produção de

anticorpos contra ovalbumina, o que pode estar relacionada com suas propriedades antitumorais.

Também foi estudada a interação da biflorina com o DNA de fita dupla e de fita simples,

mostrando que ela inibe diretamente o DNA, mas não inibe Topoisomerase I, sugerindo que

outro mecanismo deve estar associado a essa interação, podendo estar relacionado à indução de

dano ao DNA. Contudo a biflorina mostrou-se genotóxica apenas no teste do cometa, onde a

freqüência e o índice de danos em linfócitos humanos aumentaram significativamente, sem, no

entanto induzir efeito clastogênico pelo teste de aberrações cromossômicas. Por outro lado, por

sua comprovada atividade antioxidante, possivelmente associada à remoção de grupos hidroxil,

a biflorina demonstrou ter uma atividade antimutagênica, contra células V79 e linhagens de

Saccharomyces cereviseae tratadas com H

, quando usada em baixas concentrações, além de

não causar peroxidação lipídica bem como diminuir a peroxidação lipídica medida pelos níveis

de TBARS em células V79. Ainda para descartar quaisquer dúvidas em relação a não indução

de mutagenicidade pela biflorina, outros dois testes sugeridos pelos protocolos internacionais

como testes padrão para comprovação de segurança de muitos químicos incluindo biocidas e

fármacos, foram realizados os testes de Ames em Salmonella thyphimurium e o teste de

micronúcleos em medula óssea de camundongos, ambos com resultados negativos. Todos esses

dados compilados sugerem que a biflorina é uma droga com uma potente atividade citotóxica

em células neoplásicas, antitumoral, atividade imunoadjuvante, potencial antioxidante que

interage diretamente com DNA de fita simples e de fita dupla, mas não inibe topoisomerase,

porém mostra-se genotóxica, mas não mutagênica quando testada em vários modelos

biológicos.

Palavras chave: Biflorina, citotoxicidade, atividade antitumoral e antimutagenicidade.

ABSTRACT

ANTINEOPLASTIC POTENTIAL OF BIFLORIN,

- NAFTOQUINONE ISOLATED

FROM THE ROOTS OF Capraria biflora L. Marne

Carvalho de Vasconcellos. Advisor: Manoel

Odorico de Moraes Filho. Co-advisor: Letícia Veras Costa Lotufo. Doctorate Thesis. Graduate Program

on Phamacology. Departament of Phisyology and Pharmacology. Federal University of Ceara, 2007.

Biflorin is a 1,4 - o-naftoquinone isolated from the roots of Capraria biflora, which has

an ample distribution among North and South América. The goal of this study was to evaluate

the antitneoplastic potential of biflorine in vitro and in vivo models. Genotoxic effects in human

peripheral lymphocytes and other cell models, such as V79, bacteria and yeasts, as well as in

mice bone marrow. Was also accessed biflorin was highly cytotoxic against 15 human tumor

cell lines and 1 murine cell line, with IC50 ranging from 0.43 to 14.61 µg/mL. Cell selectivity

was was not observed, since in was equally toxic to normal human lymphocytes stimulated with

phytoheamaglutinin. No inhibitory effect on see-urchin egg development or lysis of mouse

erythrocyte was observed following biflorin treatment. Mode of action studies and antitumor

potential was evaluated on the B16 melanoma cell line, which enables in vitro and in vivo

studies. The in vitro data suggests that biflorin induces cell death by apoptosis, as treated cells

showed a decrease in nucleus size, chromatin condensation and formation of apoptotic bodies.

Flow cytometry confirmed DNA fragmentation and a significant mitochondrial depolarization

on the highest concentration tested. Membrane integrity disruption was not observed when

analyzed by flow cytometry and no increase in non viable cells was registered. The later result

was also seen on the trypan blue exclusion cell count. In vivo antitumor activity was evaluated

in three tumor models: Sarcoma 180, Erlich´s Carcinoma and Melanoma B16. Biflorin inhibited

tumor growth in S-180 and Erlich transplanted animals and increased the antitumor effect of 5-

FU where decreasing its toxicity. On B16 transplanted animals, survival span of biflorin-treated

animals increased significantly. It was demonstrated that biflorin possess immune-adjuvant

proprieties, increasing the production of anti-albumin antibodies, which can be related to its

antitumor activity. Interaction of biflorin with single and double stranded DNA was confirmed,

but was shown that it does not inhibit topoisomerase I, suggesting that a different mechanism is

associated with this interaction, probably DNA damage induction. Biflorin showed genotocicity

only on the comet assay, in which frequency and damage index towards human lymphocytes

were significantly increased, without, however, inducing clastogenic effect on chromosome

aberration assessment. On the other hand, due to its antioxidant effect, possibly associated to

removal of hydroxi groups, biflorin, in lower concentrations, showed antimutagenic activity

towards V79 cells and Saccharomyces cereviseae treated with H

. Moreover, it does not

induce lipidic peroxidation, thus reducing this effect in V79 cells, as seen by assessment of

TBARS levels. To discard any doubts on biflorin´s non-mutagenic proprieties; the Ames test in

Salmonella thyphimurium and the micronucleus assay on mouse bone marrow was carried out,

both presenting a negative result. Taken together, these results suggest that biflorin is a strong

cytotoxic compound against neoplastic cells as possess antitumor, immune-adjuvant and

antioxidant potential, interacts directly with single and double stranded DNA, but not

topoisomerase I, has a genotoxic but not mutagenic effect and increases survival rate in treated

mice.

Keywords: Biflorin, cytotoxicicity, antitumor activity and antimutagenicicity.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Porcentagem

Maior que

Menor que

AcOH

Ácido acético

Ag/AgCl/Cl

Eletrodo de referência – Fio de prata imerso em solução de

cloreto de prata

ANOVA

Analisys of Variance (Análise de Variância)

AOLW

Absorbância de comprimento de onda baixo

AOWH

Absorbância de comprimento de onda alto

BrdU

Bromodeoxiuridina

Concentração efetiva

Concentração inibitória média

CLAE

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

Dióxido de carbono

DAB

Diaminobenzidina

DMSO

Dimetilsulfóxido

DNA

Ácido Desoxirribonucléico (ADN)

Dox

Doxorrubicina

dsDNA

Ácido Desoxirribonucléico em fita dupla (ou dupla hélice)

SEM

Etil Metano Sulfonato

EMEA

The European Medicines Agency

EPM

Erro Padrão da Média

EtOH

Etanol

FDA

Food and Drug Administration

Grama

Hora

H/E

Hematoxilina/Eosina

Água destilada

Peróxido de hidrogênio

HST

High –throughput screening

Intervalo de confiança

INCA

Instituto Nacional do Câncer

LA/BE

Laranja de acridina/ Brometo de etídio

Litro

Miligramas

Min

Minuto

Mililitro

MMS

Metil Metano Sulfonato

MTT

3-(4,5-dimetiltiazol-2-tiazolil)2,5-difenil-2H tetrazolina

bromido

NaOAc

Acetato de sódio

Nanômetro

OVA

Ovalbumina

PBS

Phosphate buffer solution (Tampão fosfato)

Potencial hidrogeniônico

q.s.p.

Quantidade suficiente para

RNM

Ressonância magnética nuclear

Rpm

Rotações por minuto

ssDNA

Ácido Desoxirribonucléico em fita simples (ou simples hélice)

TBS

Tris buffer solution (Tampão de tris)

TBARS

Espécies reativas de tiobarbitúricos

US-NCI

United States National Cancer Institute (Instituto Nacional do

Câncer dos Estados Unidos)

VPD

Voltametria de pulso diferencial

Vezes

µL

Microlitro

LISTA DE TABELAS

Tabela 1

Agentes anticâncer utilizados na clínica derivados de plantas.

Tabela 2

Linhagens celulares tumorais utilizadas nos ensaios de citotoxicidade.

Tabela 3

Efeito inibitório da biflorina e doxorrubicina sobre células neoplásicas

humanas pelo método MTT.

Tabela 4

Atividade antimitótica da biflorina e doxorrubicina sobre o

desenvolvimento de ovos de ouriçi-do-mar.

Tabela 5

Taxa de inibição tumoral dos animais tratados com biflorina e 5-

fluorouracil transplantados com Sarcoma 180.

Tabela 6

Taxa de inibição tumoral dos animais tratados com biflorina e 5-

fluorouracil transplantados com Carcinoma de Erlich.

Tabela 7

Valores de velocidade de varredura (ν), potenciais de pico catódico

(Epc), potenciais de pico anódico (Epa) e variação entre potencial

anódico e catódico (Epa – Epc) da Biflorina.

Tabela 8

Protocolos de tratamento da biflorina aplicados a linfócitos humanos em

curtos tempos de cultura.

Tabela 9

Aberrações cromossômicas (ACs) e índice mitótico em cultura de

linfócitos tratados com biflorina durante as fases G1 e G1/S do ciclo

celular.

Tabela 10

Aberrações cromossômicas (ACs) e índice mitótico em cultura de

linfócitos tratados com biflorina durante a fase S do ciclo celular.

Tabela 11

Aberrações cromossômicas (ACs) e índice mitótico em cultura de

linfócitos tratados com biflorina durante a fase G2 do ciclo celular.

Tabela 12

Atividade retiradora de radicais livres da biflorina no sistema DPPH.

Tabela 13

Dano no DNA pelo teste cometa em células V79 expostas a biflorina

mais H

por 1h a 37ºC com subseqüente tratamento com tampão,

endonuclease III e formamidopirimidina DNA – glicosilase.

Tabela 14

Indução de mutação na linhagem XV-18514C de S. cerevisiae após 3h

de tratamento com biflorina.

Tabela 15

Indução de mutação na linhagem XV-18514C de S. cerevisiae após o

tratamento com peróxido de hidrogênio em células na fase estacionária

pré-incubadas com biflorina por 3h em condições de não crescimento.

Tabela 16

Indução de crossing-over (/cyh2) e conversão gênica (leu1-1/leu1-12) na

linhagem diplóide XS2316 de S. cerevisiae após tratamento com

biflorina durante a fase de crescimento exponencial e o efeito desse pré-

tratamento sobre a indução de recombinogênese pelo peróxido de

hidrogênio.

Tabela 17

Indução de revertentes de his+ em linhagens de Salmonella typhimurium

pela biflorina com e sem atividade metabólica.

Tabela 18

Indução de revertentes de his+ em linhagens de Salmonella typhimurium

pela biflorina com e sem atividade metabólica.

Tabela 19

Indução de revertentes de his+ em linhagens de Salmonella typhimurium

pela biflorina com e sem atividade metabólica.

Tabela 20

Freqüência de eritrócitos policromáticos micronucelados dos animais

tratados com biflorina em 24 e 48h.

Tabela 21

Resumo dos resultados obtidos com a biflorina.

Lista de Figuras

Figura 1

Esquema das bases moleculares da formação do câncer.

Figura 2a

Representação espacial das taxas brutas de incidência em homens.

Figura 2b

Representação espacial das taxas brutas de incidência em mulheres.

Figura 3

Classificação de antineoplásicos segundo Calabresi e Chabner.

Figura 4

Atividade dos agentes quimioterápicos antineoplásicos,

dependendo da fase do ciclo celular.

Figura 5

Representação do DNA, em fita dupla e em fita simples.

Figura 6

Estrutura química do DNA de fita dupla.

Figura 7

Representação do modo de operação do biossensor de DNA.

Figura 8

Distribuição da origem dos medicamentos anticâncer que estão no

mercado nos últimos 25 anos.

Figura 9

Estrutura química das quinonas usando-se como critério o anel

quinoidínico.

Figura 10

Estrutura química de diferentes naftoquinonas.

Figura 11a

Foto da Capraria biflora.

Figura 11b

Foto das raízes de Capraria biflora.

Figura 12

Estrutura química da biflorina.

Figura 13

Fluxograma da obtenção dos extratos das raízes de Capraria

biflora.

Figura 14

Esquema representativo do método MTT.

Figura 15

Esquema representativo do método antitimitótico em ovos de

ouriço-do-mar.

Figura 16

Esquema representativo do método de hemólise em eritrócitos de

camundongos.

Figura 17

Esquema representativo do método de exclusão por azul de tripan.

Figura 18

Esquema representativo do método de coloração

hemtaoxilina/eosina.

Figura 19

Esquema representativo do método de coloração laranja de

acridina/brometo de etídio.

Figura 20

Esquema representativo do método do BrDU.

Figura 21

Esquema representativo do citômetro de fluxo.

Figura 22

Esquema representativo dos protocolos antitumorais em

camundongos.

Figura 23

Esquema representativo do protocolo de sobrevida dos animais

transplantados com melanoma B16.

Figura 24

Esquema representativo do método imunoadjuvante em animais.

Figura 25

Voltamograma de Pulso Diferencial (Carbono Vítreo) para a

mistura das bases guanina e adenina.

Figura 26

Esquema representativo do método Alamar Blue.

Figura 27

Esquema representativo do método do cometa.

Figura 28

Representação esquemática dos danos do cometa observados ao

microscópio.

Figura 29

Esquema representativo do método de aberrações cromossômicas

em linfócitos.

Figura 30

Esquema representativo dos testes em bactérias e leveduras.

Figura 31

Esquema representativo da formação de micronúcleos.

Figura 32

Esquema representativo do método de micronúcleos in vivo.

Figura 33

Determinação da viabilidade celular por azul de tripan das células

B16 tratadas com biflorina após 24 h de incubação.

Figura 34

Fotomicrografia das células B16 tratadas com biflorina após 24 h

de incubação, coradas por H/E.

Figura 35

Determinação da viabilidade celular por LA/BE das células B16

tratadas por 24 h com biflorina utilizando coloração por

microscopia de fluorescência.

Figura 36

Inibição do 5-bromo-2´-deoxyuridina (BrdU) incorporado pelas

células B16 tratadas por 24 h com biflorina.

Figura 37

Histogramas de ciclo celular das células B16 tratadas por 24 h com

biflorina.

Figura 38

Determinação da fragmentação internucleossomal do DNA de

células B16 por citometria de fluxo.

Figura 39

Determinação do efeito da biflorina sobre o potencial

transmembrana em células B16 por citometria de fluxo usando

rodamina 123.

Figura 40a

Fotomicrografia dos órgãos dos animais tratados com biflorina e 5-

FU.

Figura 40b

Fotomicrografia dos órgãos dos animais tratados com biflorina e 5-

FU.

Figura 41

Efeito imunoadjuvante sobre camundongos saudéveis imunizados

biflorina e ovalbumina.

Figura 42

Curva de sobrevida dos animais transplantados com células de

melanoma B16 tratados com biflorina e dacarbazina.

Figura 43

Efeito sobre o volume tumoral dos grupos controle e tratados com

biflorina transplantados com células B16 no experimento de

sobrevida.

Figura 44

Efeito imunoadjuvante sobre camundongos B57CL/6

transplantados com células B16 imunizados com biflorina e

ovalbumina.

Figura 45

Voltametria cíclica da biflorina.

Figura 46a

Voltametria quadrada da biflorina.

Figura 46b

Voltametria de pulso diferencial da biflorina.

Figura 47

Voltametria de pulso diferencial da biflorina.

Figura 48

Voltametria de pulso diferencial do biossensor de dsDNA em

presença da biflorina.

Figura 49

Voltametria de pulso diferencial do biossensor de ssDNA em

presença da biflorina.

Figura 50a

Freqüência de dano do efeito da biflorina ou doxorrubicina no teste

do cometa em linfócitos humanos.

Figura 50b

Índice de dano do efeito da biflorina ou doxorrubicina no teste do

cometa em linfócitos humanos.

Figura 51

Efeito da biflorina na autoxidação do ácido oléico. A oxidação do

ácido oléico.

Figura 52

Inibição da geração de espécies reativas de oxigênio pela biflorina

no sistema hipoxantina-xantina oxidase

Figura 53

Sobrevivência clonogênica de células V79 após o tratamento com

biflorina em diferentes concentrações por 3 horas.

Figura 54

Sobrevivência clonogênica de células V79 pre-tratadas com doses

não tóxicas de biflorina por 3 h em meio sem SBF e exposto a

por 1h.

Figura 55

TBARS em células V79 pré-tratadas com biflorina e expostas a

Figura 56a

Freqüência de dano do efeito da biflorina ou doxorrubicina no teste

do cometa em células V79.

Figura 56b

Índice de dano do efeito da biflorina ou doxorrubicina no teste do

cometa em células V79.

Figura 57a

Freqüência de micronúcleos dos animais tratados com biflorina ou

EMS por 24 horas.

Figura 57b

Freqüência de micronúcleos dos animais tratados com biflorina ou

EMS por 48 horas.

SUMÁRIO

Dedicatória

Agradecimentos

Lista de Abreviaturas e Siglas

Lista de Tabelas

Lista de Figuras

Resumo

Abstract

1. Introdução

1.1. Câncer 22

Modelos antitumorais não clínicos utilizados no desenvolvimento de novos

fármacos antineoplásicos 33

1.2. Produtos Naturais 35

1.3. Naftoquinonas 40

2. Objetivos

2.1. Geral

2.2. Específicos

3. Material e Métodos

3.1. Material Utilizado 49

Equipamentos 49

Soluções 51

Reagentes 53

Fármacos 53

3.2. Metodologia Experimental 54

3.2.1.Obtenção da Biflorina 54

Coleta e informações sobre a planta

Obtenção dos extratos das raízes de Capraria biflora

Obtenção de CBR-2 a partir de EEP

Obtenção de CBR-2 a partir de EEE

Coleta e informações sobre a planta

3.2.2. Estudo da citotoxicidade in vitro 55

3.2.2.1. Linhagens Celulares Utilizadas 55

3.2.2.2. Manutenção das Células 56

3.2.2.3. Teste de citotoxicidade in vitro – Ensaio do MTT 56

3.2.3. Avaliação da atividade antimitótica nos ovos do ouriço-do-mar 57

3.2.4. Avaliação da atividade hemolítica em eritrócitos de camundongos

Mus musculus Swiss 59

3.3. Estudo de mecanismo de ação no modelo de melanoma murino in vitro 60

3.3.1. Viabilidade celular – Exclusão por azul de tripan 60

3.3.2. Análise morfológica – Coloração diferencial por hematoxilina/eosina 62

3.3.3. Análise morfológica – Coloração diferencial por Laranja de Acridina

/ Brometo de Etidio

3.3.4. Inibição da síntese de DNA por incorporação de BrDU 64

3.3.5. Análises por citometria de fluxo 66

3.3.5.1. Integridade da membrana plasmática 66

3.3.5.2. Ciclo celular e fragmentação de DNA 67

3.3.5.3. Determinação do potencial transmembrânico da mitocôndria 68

3.4. Estudo da atividade antitumoral in vivo 70

3.4.1. Avaliação do efeito da biflorina em camundongos transplantados com

os tumores Sarcoma 180 e Carcinoma de Erlich 70

3.4.2. Efeito na biflorina na sobrevida de animais transplantados com o

tumor Melanoma B16 72

3.4.3. Avaliação da Atividade Imunoadjuvante 73

3.5. Avaliação da interação da biflorina com o DNA 75

3.5.1. Interação com DNA por eletroquímica 75

3.5.2. Inibição da enzima Topoisomerase I 77

3.6. Avaliação do potencial citotóxico, genotóxico e clastogênico in vitro em

linfócitos humanos 77

3.6.1. Teste de citotoxicidade in vitro – Ensaio do Alamar Blue 77

3.6.2. Teste Cometa 79

3.6.3. Avaliação de Aberrações cromossômicas em linfócitos de sangue

periférico 82

3.7. Avaliação do potencial antioxidante

3.7.1. Autoxidação do ácido oléico

3.7.2. Atividade antioxidante para determinação da remoção de radicais

livres por DPPH

3.7.3. Hipoxantina/Xantina Oxidase

3.8. Atividade biológica e genotóxica em células V79

3.8.1. Cultura de células V79 85

3.8.2. Avaliação da citotoxicidade a partir da sobrevivência clonal 85

3.8.3. Avaliação da peroxidação lipídica 85

3.8.4. Teste cometa 86

3.9. Potencial genotóxico em diferentes sistemas biológicos 86

3.9.1. Detecção da atividade citotóxica, mutagênica e antimutagênica em

Saccharomyces cerevisiae

3.9.2. Teste em Salmonella thiphymurium – teste de Ames 88

3.9.3. Micronúcleos de medula óssea de camundongos

Preparo dos animais para o teste do micronúcleo

4. Resultados

4.1. Atividade citotóxica in vitro 95

4.1.1. Teste de citotoxicidade em células de linhagens tumorais – Teste do

MTT 95

4.1.2. Teste da atividade antimitótica em ovos de ouriço-do-mar 97

4.1.3. Atividade hemolítica 97

4.2. Estudo do mecanismo de ação no modelo de melanoma murino in vitro 98

4.2.1. Análise da Viabilidade celular – Exclusão por azul de tripan 98

4.2.2. Análise morfológica – Coloração por hematoxilina/eosina 99

4.2.3. Análise morfológica – Coloração diferencial por Laranja de Acridina/

Brometo de Etidio 101

4.2.4. Síntese de DNA por incorporação de BrDU 102

4.2.5. Análise do ciclo celular e fragmentação de DNA 103

4.2.6. Potencial transmembrana

105

4.3. Atividade antitumoral em modelos animais in vivo 106

4.3.1. Modelo murino em animais transplantados com Sarcoma 180 e

Carcinoma de Erlich 106

4.3.1.1. Toxicidade Sistêmica em camundongos Swiss 106

4.3.2. Atividade imunoadjuvante em animais Swiss saudáveis 112

4.3.3. Modelo murino em animais transplantados com Melanoma B16 112

4.3.3.1 Sobrevida dos animais e inibição tumoral 112

4.3.3.2 Atividade Imunoadjuvante 114

4.4. Avaliação da interação da biflorina com o DNA 115

4.4.1. Fita Dupla dsDNA 118

4.4.2. Fita Simples ssDNA 119

4.4.3. Inibição de Topoisomerse I 119

4.5. Avaliação do potencial citotóxico, genotóxico e clastogênico in vitro em

linfócitos humanos 120

4.5.1. Avaliação da citotoxicidade pelo método do Alamar Blue 120

4.5.2. Avaliação da genotoxicidade – Teste Cometa 120

4.5.3. Avaliação da clastogenicidade – Teste de Aberrações Cromossômicas 122

4.6. Avaliação do potencial antioxidante 125

4.6.1. Autoxidação do ácido oléico 125

4.6.2. Xantina Oxidase 126

4.6.3. Efeito retirador de radicais livres pelo método DPPH 126

4.7. Atividade biológica e genotóxica em células v79 128

4.7.1. Sobrevivência Clonogênica e Peroxidação Lipídica em células V79 128

4.7.2. Potencial genotóxico em células V79 131

4.8. Potencial genotóxico em diferentes sistemas biológicos 134

4.8.1. Leveduras 134

4.8.2. Teste de Ames em Salmonella thyphimurium 138

4.8.3. Avaliação do potencial clastogênico da biflorina em medula óssea de

camundongo 142

5. Discussão

145

6. Considerações Finais

165

7. Conclusão

166

8. Referências

167

9. Anexos

Anexo 1 - Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa com Animais

Anexo 2 – Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos

Anexo 3 – Trabalhos Publicados

1. INTRODUÇÃO

1.1. CÂNCER

Nos organismos vivos, a informação genética encontra-se na molécula de DNA.

O DNA, ou ácido desoxirribonucléico codifica os genes responsáveis pela estrutura e

função dos organismos e permite a transmissão das características das espécies para a

progênie na forma de genes (FERREIRA & ROCHA, 2004). Os genes servem como

moldes para a síntese das moléculas de RNA, que por final são utilizadas para sintetizar

polipeptídeos, os componentes básicos para todas as proteínas (READ, 2002).

A molécula de DNA não é estável e está sujeita à formação de lesões, as quais se

caracterizam como alterações químicas da molécula original. Tais alterações são

denominadas mutações que podem ser causadas por erros durante a duplicação do

DNA. Essas alterações químicas são diversas e resultantes de três causas principais:

lesões espontâneas devido à instabilidade inerente das ligações químicas específicas dos

nucleotídeos em condições fisiológicas de temperatura e pH; o ataque de espécies

reativas de oxigênio e nitrogênio; e, por fim, lesões ambientais resultantes de interações

da molécula de DNA com diferentes agentes físicos e compostos químicos presentes no

meio ambiente (HOEIJMAKERS, 2001).

A freqüência com que alterações espontâneas ocorrem no DNA é relativamente

alta: 25 mil bases por dia em uma célula humana contendo o seu genoma total (3 x

pb) (FRIEDBERG, 2001). Lesões persistentes no DNA acarretam o funcionamento

celular incorreto e em aumento da mutagênese devido a uma maior probabilidade de

ocorrere erros quando da replicação de um molde alterado do DNA. Muitas das

mutações não implicam em mudanças detectáveis na atividade metabólica da célula ou

do organismo e, portanto, passam despercebidas. Outras mutações podem determinar a

morte celular e, por conseqüência, também não são detectáveis. Apenas um pequeno

número de mutações como as que ocorrem em genes específicos e alteram o código

genético inicial podem resultar em processos de tumorigênese levando ao aparecimento

do câncer (TORNATELLI & HANAWALT, 1999).

A palavra câncer é de origem latina (Cancer) que significa “caranguejo”, a qual

deve ter sido empregada em analogia entre a morfologia do crustáceo e ao modo de

crescimento infiltrante do tumor (DE ALMEIDA, 2005).

Durante a vida do indivíduo, as células normais dividem-se rapidamente até

atingir a fase adulta do mesmo. Já as células cancerosas diferem das células normais,

pelo fato de continuarem a crescer e se dividir, não obedecendo ao controle biológico

natural do organismo (HANAHAN & WEINBERG, 2000). Dividindo-se rapidamente,

estas células adquirem novas características genéticas que as tornam mais agressivas,

determinando a formação de tumores primários ou neoplasias malignas ou câncer, com

propriedades de invasão e destruição do tecido adjacente, bem como de metastização

(HANAHAN & WEINBERG, 2000, INCA - Instituto Nacional do Câncer, 2007).

As evidências mais antigas referentes ao câncer foram encontradas em tumores

ósseos fossilizados de múmias humanas do antigo Egito. Os restos ósseos revelaram um

sugestivo crescimento tumoral ósseo ou destruição craniana óssea vista nos cânceres de

cabeça e pescoço. Já a descrição mais antiga para o câncer foi encontrada no Egito por

volta de 1600 a.C. O papiro de Edwin Smith descrevia oito casos de tumores ou

ulcerações da mama as quais eram tratadas com cauterização e relatadas como não

tendo tratamento.

As causas de câncer são variadas, podendo ser externas ou internas ao

organismo, estando ambas inter-relacionadas. As causas externas relacionam-se ao meio

ambiente e aos hábitos ou costumes próprios de um ambiente social e cultural. As

causas internas, na maioria das vezes geneticamente pré-determinadas, estão ligadas à

capacidade do organismo de se defender das agressões externas (INCA, 2007). Os

fatores ambientais podem ser atribuídos a: hidrocarbonetos policíclicos, poluentes (no

ar, na água, no trabalho), dieta alimentar, agentes infecciosos, radiações ionizantes,

entre outros. Já os fatores genéticos tais como: mutações espontâneas, diferenças

herdadas de genes envolvidos com a proliferação celular, apoptose e/ou sistema de

reparo do material genético, ou ainda alterações somáticas na expressão destes genes,

entre outros, agem em conjunto com os fatores ambientais e com a susceptibilidade para

o desenvolvimento do câncer (PERERA, 1997)

Nesse âmbito, o câncer é uma doença genética complexa cuja iniciação e

progressão envolvem passos em que o DNA acumula uma série de lesões. Essas

alterações simultâneas geralmente ocorrem em genes relacionados à proliferação,

diferenciação e morte celular. Dentre as evidências experimentais que corroboram esta

teoria está o fato de que a célula cancerosa é capaz de transmitir as suas características

fenotípicas às células “filhas” (BALMIAN et al., 2003). O processo de oncogênese

resultante destas alterações culmina com o crescimento de sucessivas populações ou

clones celulares nos quais as mutações se acumularam em um processo denominado

expansão clonal (SILVA, 2004). A figura 1 mostra esquematicamente como esse

processo ocorre.

Na tentativa de evitar que o câncer se espalhe, existem três tipos principais de

tratamento; cirurgia, radioterapia e quimioterapia. Com o objetivo de erradicar o câncer,

normalmente se utiliza mais de um tipo de tratamento. A massa tumoral originada a

partir de um único clone celular é constituída por uma população de células

heterogêneas. As subpopulações de células diferem em relação a vários atributos

fenotípicos, como cariótipo, responsividade hormonal e suscetibilidade a agentes

antineoplásicos. Por exemplo, tumores com baixa fração de crescimento como o câncer

de mama e de colo do útero possuem uma menor suscetibilidade à quimioterapia, bem

como a ausência de antigenicidade das células proporciona uma maior resistência ao

ataque imunológico (KUMMAR et al., 2004). Assim, no âmbito da quimioterapia, cujo

objetivo primário é destruir as células neoplásicas preservando as células normais,

apesar do considerável arsenal de drogas já existentes para o tratamento do câncer, em

muitos casos, o sucesso terapêutico não é alcançado por causa de falhas nos esquemas

terapêuticos, altos índices de recidivas e redução da sobrevida. Como os agentes

quimioterápicos em sua maioria possuem um mecanismo de ação não específico,

lesando células neoplásicas e normais, o aparecimento de efeitos colaterais como

náuseas, perda de cabelo e susceptibilidade maior às infecções, torna-se comum. E

ainda que o organismo se recupere após o tratamento, faz-se necessário que os

benefícios sejam confrontados com a toxicidade, na procura de um índice terapêutico

favorável uma vez que esse reflete a segurança relativa de um medicamento

estimulando, assim, a procura por novos fármacos (SALMONM, 1998).

Figura 1: Esquema das bases moleculares da formação do câncer. Kummar, 2004 adaptado.

Célula

Agentes que

causam lesão

no DNA

Ativação de

oncogenes

Alterações de genes que

alteram a apoptose

Inativação dos genes

supressores tumorais

Expressão de produtos gênicos alterados e perda de

produtos gênicos reguladores

Mutações herdadas em:

-Genes que afetam o

reparo do DNA;

-Genes que afetam o

crescimento ou apoptose

celular

Lesão no DNA

Muta

ão em células somáticas

Reparo bem sucedido do DNA

Incapacidade de Reparo do DNA

Mesmo considerando a diversidade de tratamentos e de quimioterápicos

antineoplásicos em uso clínico, a mortalidade decorrente do câncer continua

inaceitavelmente alta. No Brasil, segundo o Departamento de Informática do Sistema

Único de Saúde (DATASUS), a morbidade hospitalar de neoplasias malignas (CID 10-

032-052) no período de agosto de 2006 a julho de 2007 foi 547.790 casos (DATASUS,

2007), o que reflete uma alta incidência de câncer na população brasileira, uma vez que

este se apresenta como a terceira causa de morte, precedido apenas pelas mortes

ocasionadas por acidentes e pelas doenças cardiovasculares. Os dados o Instituto do

Câncer mostram como se comporta a distribuição dos casos de câncer no Brasil (Figuras

2a e 2b).

Homens

197,59 a 389,67

119,25 a 197,58

87,89 a 119,24

50,04 a 87,88

Figura 2a: Representação espacial das taxas brutas de incidência por 100.000 homens, estimadas para o

ano 2006, segundo a Unidade da Federação (todas as neoplasias, exceto pele não melanoma).

Figura 2b: Representação espacial das taxas brutas de incidência por 100.000 mulheres, estimadas para o

ano 2006, segundo a Unidade da Federação (todas as neoplasias, exceto pele não melanoma)

As primeiras observações de regressão tumoral induzida por fármacos datam do

início da década de 1940 e foram feitas com as mostardas nitrogenadas. Com o passar

do tempo, novos fármacos quimioterápicos foram adicionadas ao arsenal da terapia

antineoplásica. Apesar de maior atividade antitumoral e menor toxicidade, o

fundamento racional da ação dessas novas moléculas estava baseado em conceitos

relativamente antigos do ciclo celular. A ação se caracterizava por interromper ou

perturbar etapas importantes de proliferação celular, levando as células em fase de

duplicação à morte. Atualmente uma nova geração de fármacos tem-se desenvolvido

rapidamente. Esses agentes, atuando na membrana celular ou no ambiente intracelular,

induzem a morte da célula neoplásica com pouco ou nenhum efeito deletério sobre

outras células. Fazem parte dessa nova classe, fármacos como anticorpos monoclonais,

inibidores da enzima tirosino-quinase, entre muitos outros (SAMPAIO FILHO et al.,

2006).

A investigação pelo mecanismo de ação de fármacos com atividade anticâncer

tem sido objeto de muita atenção. A literatura revela muitas vias que são estudadas para

atacar a célula neoplásica (KOVACIC, 2007). Contudo, a variedade dos tipos de

Mulheres

180,46 a 341,88

116,75 a 180,45

86 a 116,74

56,29 a 85,99

Fonte: www.inca.

ov.br

acessado em 11.11.07

compostos quimioterápicos é tão grande que Chabner e Calabresi (1995) fizeram uma

classificação no mecanismo de ação dos quimioterápicos nas diferentes etapas da

síntese do DNA, transcrição e tradução (Figura 3). Entretanto, muitos autores discordam

desta classificação, pois, outros fármacos, como por exemplo, agentes hormonais e

produtos naturais ciclo-celular específicos, não são classificados dessa forma.

Figura 3: Classificação de antineoplásicos segundo Chabner e Calabresi (1995) adaptado.

Enzimas

(inibe síntese protéica)

Alcalóides vegetais e taxóis

(inibe polimerização

de microtúbulos)

Antimetabólitos

(inibe síntese de

TMP

)

Hidroxiuréia, PALA

(inibe ribonucleosídeo redutase

e inibe biosíntese de pirimidina)

Agentes alquilantes

(formam derivados com

DNA

)

Dactinomicina e derivados

(intercalação no DNA e

inibição da RNA

polimerase)

Antagonistas purínicos

(inibem síntese purínica)

Pela diversidade de mecanismos existentes na transformação da célula normal

em célula maligna, a compreensão do ciclo celular se torna indispensável, haja vista que

há correlação aproximada dos ciclos metabólicos com os agentes antineoplásicos mais

comuns como demonstrado na figura 4.

Figura 4: Atividade dos agentes quimioterápicos antineoplásicos, dependendo da fase do ciclo celular.

Fonte: De almeida, 2005.

O ciclo celular é regulado por sinais extracelulares como fatores de crescimento

e disponibilidade de nutrientes. A célula que não está se replicando, apresenta-se na fase

ou está em quiescência. Em G

o DNA apresenta-se super-enovelado, com atividade

nuclear baixa. Quando as células passam para a fase G

, ocorre à preparação da célula

para a multiplicação, com a produção de fatores de crescimento celulares que são

essenciais para a formação da nova célula, além de preparação para a síntese de DNA,

que ocorrerá na fase subseqüente, fase S. Na fase G

há a síntese de componentes para a

mitose (divisão celular com manutenção do número de cromossomos específico da

espécie) como a produção do fuso mitótico que é feita na fase M. Após a divisão do

material nuclear há a citocinese (que é a separação da célula mãe, formando as duas

células filhas com suas organelas e demais constituintes celulares), finalizando o ciclo

de replicação celular (retorna à fase G

). A célula tumoral ou transformada não finaliza

o ciclo de replicação celular (não retorna à fase G

), assim passa da fase M para nova

fase G

Nas fases do ciclo celular, diversos fármacos irão atuar afetando a multiplicação

celular, esses fármacos que exercem sua ação sobre as células que se encontram no ciclo

celular, são denominados ciclo-celular específicos. Outro grupo de agentes

denominados de ciclo-celular não específico tem a capacidade de agir sobre as células

tumorais independentes de estarem atravessando o ciclo ou de estarem em repouso (fase

Considerando as características químicas e os mecanismos farmacológicos dos

agentes antineoplásicos, podemos considerá-los fármacos tão heterogêneos quanto os

tumores envolvidos. Os agentes antineoplásicos mais antigos e mais usados são

conhecidos como agentes alquilantes que interagem com o DNA e não são ativos

somente no processo de divisão celular. Ainda que outros alvos sejam estudados como

fármacos antitumorais, o DNA ainda é um dos alvos mais estudados (de ALMEIDA et

al., 2005).

O estudo da interação de fármacos com o DNA é considerado um dos mais

importantes aspectos em descoberta de fármacos e em processos de desenvolvimento

farmacêutico. A primeira possibilidade de interação ocorre pelo controle dos fatores de

transcrição e de polimerases, nos quais os fármacos interagem com proteínas que se

ligam ao DNA. A segunda possibilidade faz-se através da ligação com RNA tanto com

a dupla hélice do DNA, formando tripla hélice, ou com a fita simples, com a formação

de híbridos, que podem interferir na atividade de transcrição. Na terceira e última

possibilidade, há interação de pequenas moléculas diretamente com a estrutura do DNA.

A interação promovida por uma modificação covalente do DNA por agentes citotóxicos

representa uma lesão bioquímica grave. Nesse caso, as interações podem ser

eletrostáticas, geralmente inespecíficas, com o envolvimento do arcabouço negativo

(açúcar-fosfato), via intercalação entre os pares de bases e/ou interação covalente

(RAUF et al., 2005). A habilidade em medir níveis de modificação covalente de DNA

in vivo pode ser vista como uma forma eficiente de monitorar a eficiência terapêutica de

fármacos. (RAUF et al., 2005) (Figuras 5 e 6).

Figura 5: Representação do DNA, em fita dupla e em fita simples, evidenciando suas bases constituintes,

guanina (G), adenina (A), citosina (C) e timina (T).

Figura 6: Estrutura química do dsDNA à direita. Bases púricas (guanina – G ; adenina – A) e pirimídicas

( timina – T e citosina – C); açúcares – S e grupamentos fosfatos – P.

Estudos em biossensores de DNA (de ABREU, BRETT & GOULART, 2002;

RAUF et al., 2005) são um dos modelos úteis para clarificar o mecanismo biológico de

ação de fármacos que atuam interagindo com o DNA, uma vez que nos últimos anos, os

eletrodos modificados com DNA foram aplicados com sucesso tanto como superfícies

modificadas para determinação eletroanalítica de fármacos (RAUF et al., 2005), quanto

para o estudo da interação dos mesmos com o ácido desoxirribonucléico (DE-LOS-

SANTOS-ÁLVAREZ et al., 2004; RAUF et al., 2005). Eles permitem avaliar e predizer

interações com prejuízos celulares, através de experimentos eletroquímicos (voltametria

de pulso diferencial e de onda quadrada, em eletrodos de carbono vítreo modificados

com DNA em fita dupla e simples) baseados na observação da ligação das moléculas-

teste com ácidos nucléicos, tornando-se uma ferramenta para pesquisa de novas

moléculas, como os antineoplásicos que interagem com o DNA (Figura 7).

Figura 7: Representação do modo de operação do biossensor de DNA. O analito entra entre as fitas do

DNA, modifica sua conformação, o que leva à exposição de suas bases, passíveis de oxidação anódica.

Modelos experimentais utilizados no desenvolvimento de novos fármacos

antineoplásicos

Para se obter informações a cerca da farmacodinâmica, farmacocinética e da

toxicologia dos fármacos em desenvolvimento, é necessário que vários testes não

clínicos sejam realizados para que se possa estimar uma dose inicial a ser administrada

em seres humanos e identificar parâmetros que devam ser monitorados para identificar

prováveis efeitos adversos (DORATO & BUCKLEY, 1998).

Grande número de moléculas candidata a fármacos não são aprovados nessa

triagem, uma vez que os riscos detectáveis nesses ensaios não clínicos são muitas vezes

inaceitáveis para serem testados em seres humanos. Esses parâmetros, no entanto, para

serem mensurados devem ser aplicados em modelos animais adequados, levando–se em

consideração as similaridades e diferenças entre o perfil farmacocinético no animal e no

homem.

A quimioterapia do câncer no século XX foi dominada pelo desenvolvimento de

drogas genotóxicas, iniciadas pelo descobrimento de propriedades anticâncer da

mostarda nitrogenada nos anos de 1940 e da aminopterina, derivada do ácido fólico

(BAGULEY, 2002).

Nos anos de 1930-1960, foi reconhecido que modelos tumorais eram mais

produtivos se fossem induzidos em linhagens de camundongos puros, e o

desenvolvimento de linhagens puras de camundongos levou ao uso de tumores

transplantados para o screening de um amplo número de compostos, naturais e

sintéticos (CORBETT et al., 1997).

Tumores transplantáveis de hamsters, porco da índia, camundongos, coelhos e

ratos foram durante muitos anos fornecidos pelo National Cancer Research Center no

National Cancer Institute (NCI) na divisão de tratamento de câncer, Frederick Research

Center em Frederick, MD. Porém, ao longo dos anos, o camundongo se tornou

claramente o animal favorito na descoberta de drogas, o custo e a necessidade de

grandes quantidades de agentes caros, eliminaram os roedores maiores da maioria dos

programas de pesquisa nos anos de 1970 inclusive no programa do NCI (CORBETT et

al., 1997).

As técnicas de cultura de células, por sua vez, exercem um papel chave no

desenvolvimento de drogas anticâncer pela imposição adicional de limitações pela

captação e efluxo das drogas, interação com outros receptores celulares e metabolismo

celular. Ensaios clonogênicos, integrando múltiplas vias de morte celular, são

particularmente usados na mensuração da sobrevivência celular seguida pela exposição

a drogas citotóxicas. Por outro lado, microculturas, combinadas com outros métodos

colorimétricos na avaliação de efeitos antiproliferativos, têm sido à base do screening

em grande escala de drogas citotóxicas e citostáticas. O programa do NCI tornou

possível utilizar 60 ou mais linhagens celulares para comparar os perfis de inibição de

crescimento celular de novas drogas potenciais com os das dezenas de milhares de

compostos previamente testados, fornecendo informações sobre mecanismo de ação e

atividade antiproliferativa. No entanto, tais ensaios refletem tanto mudanças

citocinéticas como efeitos citotóxicos, e esforço adicional é necessário para desenvolver

métodos de cultura adequados para modelar as características de sobrevivência dos

tumores sólidos submetidos à ação de fármacos antitumorais in vivo. Algumas das

novas abordagens mais promissoras incluem a utilização de culturas celulares

tridimensionais para permitir a medida das taxas de difusão de drogas, bem como a

avaliação da sensibilidade dos efeitos das drogas sobre as células e o microambiente

tumoral (BAGULEY et al, 2002).

Com o passar dos anos, as pesquisas in vitro e in vivo, passaram por constantes

adequações às exigências do mercado farmacêutico, que constantemente traz novas

drogas que se inserem melhor no cotidiano das pessoas, com drogas que melhoram a

sobrevida dos pacientes, aumentando a expectativa de vida da população (LUCCHESE,

2001). Porém, juntamente a esse processo, há necessidade de avaliação dos riscos que

estão inseridos nesse avanço tecnológico e dessa forma, as agências regulatórias norte-

americana (FDA – Food and Drug Admnistration) e européia (EMEA – European

Medicines Agency), exigem a avaliação toxicológica de estudos não clínicos de

fármacos antineoplásicos, pois com o auxílio das regulamentações observa-se um

evidente progresso na pesquisa e desenvolvimento de novos medicamentos. No Brasil,

no entanto, não existe um processo acelerado de regulamentação como no FDA ou

EMEA, o que faz com que seja necessário seguir guias específicos oriundos de agências

regulatórias internacionais ou outras entidades como a Organização Mundial de Saúde.

1. 2. PRODUTOS NATURAIS

As primeiras descrições de plantas medicinais remontam das primeiras escrituras

e o papiro de Ebers, o qual enumera mais ou menos 100 doenças e descreve um grande

número de drogas de natureza animal e vegetal. Antes da era cristã, a “história natural”

foi relatada por vários filósofos. Sobressaíram-se Hipócrates, o pai da medicina, que se

consagrou por tomar a natureza como guia na escolha dos remédios (Natura

medicatrix), e Treosfato, discípulo de Aristóteles, que escreveu vários livros sobre a

história e utilização das plantas, como o uso da Papaver sonniferum, cujo princípio

ativo é a morfina (VALLE, 1978).

No século I da era cristã, Diascórides, médico grego, lança sua obra sobre

medicina e farmácia intitulada De Materia Medica, usada há mais de 15 séculos, em

cinco volumes, com mais de 500 produtos de origem vegetal, descrevendo o emprego

terapêutico de muitas delas que serviu como ensinamento até a época do Renascimento

(MAHRAN, 1977).

Claudius Galenus, Galeno, nascido em Pérgamo, Ásia Menor, em meados de

161-180 d.C iniciou sua carreira como médico dos gladiadores em Alexandria, e mais

tarde foi o médico particular do Imperador Marco Aurélio, em Roma. Considerado o

“pai das ciências farmacêuticas”, desenvolveu a ciência de preparação de

medicamentos. Até os nossos dias, preparações de origem natural são classificadas

como “galênicas” (GUILLÉM, 1987; MARGOTTA, 1998).

Os árabes, que foram os primeiros a distinguir a medicina da farmácia,

contribuíram muito para a difusão de diversas plantas medicinais nas costa do

Mediterrâneo (França, Itália e Espanha). Dentre os principais médicos árabes que se

ocuparam das plantas medicinais estão, Avicena (978-1036), que se tornou tão famoso

quanto Hipócrates e Galeno, e Ibn Baithar, que em sua obra Kitabal-Dschamial Kabu

(grande compilação de medicamentos e alimentos simples) trata de 1.400 drogas, das

quais 200 citadas ineditamente. Deve-se aos árabes os primeiros cultivos de açafrão,

cana-de-açúcar, arroz, algodão e algarroba (GUILLÉM, 1987).

Desde a colonização do Brasil, os europeus, principalmente médicos portugueses

que aqui estiveram, foram obrigados a perceber a importância dos remédios indígenas,

os quais foram chamados de “as árvores e ervas da virtude”, por Gabriel Soares de

Souza, em “Tratado Descritivo no Brasil” de 1857 (PINTO, 1995).

Em 1808, a “Abertura dos portos às nações amigas” e a vinda da Corte Real para

o Brasil estão entre os primeiros marcos históricos na ciência brasileira. Foi a partir do

decreto de D. João VI que começaram a chegar ao Brasil às primeiras expedições

científicas, cujo principal objetivo era dar conhecimento da exuberância da fauna e flora

brasileiras (FREEDBERG, 1986).

De fato, por ser o detentor da maior floresta equatorial e tropical úmida do

mundo, o Brasil, não pode abrir mão de estudar os produtos naturais que fazem parte de

seu vasto território (PINTO et al., 2002).

O primeiro alcalóide natural isolado, na história da química, sob a forma pura foi

a cinchonina. O médico que a isolou a partir das cascas da quina foi Bernardino Antônio

Gomes, que prestou serviço durante vários anos no Brasil na armada Portuguesa. Na

mesma expedição em que se encontrara Bernardino Antônio Gomes, o médico Carl

Friedericj von Martius e o zoólogo Johann Baptist Spix, iniciaram o estudo sistemático

da flora e fauna do Brasil. Através de von Martius, o jovem farmacêutico alemão

Theodoro Peckolt, em 1847, veio ao Brasil estudar sua flora, ganhando, então, o título

de pai da fitoquímica, através de um estudo fantástico executado na época. Dentre seus

muitos trabalhos, destaca-se o isolamento da substância da Plumeia lancifolia,

denominada agoniadina, primeiro iridóide a ser isolado na natureza em forma pura.

Ainda, Ezequiel Correia dos Santos obteve o primeiro alcalóide puro a ser isolado no

Brasil, a pereirina (COSTA 1986; MYERS et al., 2000).

Ao final do século XIX o desenvolvimento da química de produtos naturais

abriu caminho para a pesquisa dos princípios farmacológicos ativos obtidos de fontes

naturais (PINTO et al., 2002).

Já no século XX, após a criação da Academia Brasileira de Ciências (1916),

começaram a ser fundadas as Sociedades Científicas, como por exemplo, a primeira

Sociedade Brasileira de Química (homônima da atual) 1922, tendo sido, os anos 20,

considerada a década da “criação” e das mudanças (RHEINBOLDT, 1955).

O desenvolvimento de novos fármacos e as indústrias química e agroquímica

exigem uma completa investigação da eficácia e segurança das substâncias por elas

estudadas. O potencial de risco e benefício dessas substâncias é cuidadosamente

considerado, de modo que os benefícios do uso da nova molécula superem os efeitos

colaterais existentes (KRISHNA et al., 1998). O entusiasmo em relação ao estudo de

plantas medicinais e seus extratos vêm crescendo na assistência à saúde em função de

sua fácil aceitabilidade, disponibilidade e baixo custo. Grande parte da população

mundial utiliza a medicina popular para seus cuidados primários em relação à saúde, e

se presume que a maior parte dessa terapia tradicional envolve o uso de extratos de

plantas ou seus princípios ativos (FARNSWORTH et al., 1985; KAUR et al., 2005).

As plantas constituem uma importante fonte de compostos para a terapia do

câncer e cerca de 60% dos agentes anticâncer utilizados na clínica, sejam as moléculas

puras ou derivados sintéticos ou semi-sintéticos, são obtidos de fontes naturais,

incluindo as plantas, organismos marinhos e microorganismos (CRAGG et al., 2005;

NEWMAN et al., 2003). A pesquisa com plantas como fonte de agentes anticâncer

iniciou-se na década de 50 com o descobrimento e o desenvolvimento de alcalóides da

vinca, vimblastina e vincristina e o isolamento das podofilotoxinas. Como resultado, o

Instituto de Câncer dos Estados Unidos (NCI) iniciou uma extensa coleção de plantas

em 1960, focada principalmente nas regiões temperadas, estendendo-se mais tarde,

1986, a uma nova coleção de plantas e outros organismos, desta vez oriundos de regiões

tropicais e subtropicais (CASSADY e DOUROS, 1980; CRAGG e NEWMANN, 2005).

Isso levou ao descobrimento de vários quimiotipos com atividades citotóxicas como os

taxanos e camptotencinas. A Tabela 1 mostra os agentes anticâncer derivados de

plantas. É interessante, no entanto, ressaltar que após o encerramento dessas coletâneas,

nenhum novo agente derivado de planta, encontra-se em uso clínico, porém apenas em

desenvolvimento pré-clínico (CRAGG e NEWMAN, 2005).

De acordo com Cragg & Newman (2007), nos últimos 25 anos, os

medicamentos anticâncer utilizados na clínica médica podem ser divididos a partir de

sua origem de acordo com a figura abaixo:

Figura 8: Distribuição da origem dos medicamentos anticâncer que estão no mercado nos últimos 25

anos. Fonte: dados obtidos de Newmann & Cragg, 2007.

Categorias usadas para definir a origem dos medicamentos anticâncer

B – Uso biológico, como peptídeos ou proteínas isolados de algum organismo ou linhagem

celular.

N – Produto Natural

ND – Derivado de produto natural por modificação semi-sintética

S – Totalmente sintético

S/NM – São derivados sintéticos que imitam os produtos naturais

S* - Totalmente sintético, mas na farmacopéia diz ser de origem natural

S*/NM – São derivados sintéticos que imitam os produtos naturais

V – Vacina

17%

25%

18%

S/NM

12%

11%

S*/NM

Tabela 1 - Agentes anticâncer utilizados na clínica derivados de plantas.

Origem Princípio Ativo Estrutura química Mecanismo de ação

Campthoteca acuminata Camptotencina

Inibição da enzima

Topoisomerase I

(DA SILVA, et al, 2003)

Derivado da

camptotencina

Topotecano

Inibição da enzima

Topoisomerase I

(DA SILVA, et al, 2003)

Derivado da

camptotencina

Irinotenaco

Inibição da enzima

Topoisomerase I

(

LI et al, 2006)

Catharantus roseus

Vimblastina

Vincristina

Inibição do fuso mitótico,

interrompendo a divisão

celular na metáfase

(DE ALMEIDA et al, 2005)

Taxus breviflora

Taxus canadensis

Taxus baccata

Paclitaxel

Impede a despolimerização

da tubulina

(SOUZA, 2004)

Conversão semi-sintética

do taxol

Docetaxel

Impede a despolimerização

da tubulina

(SOUZA, 2004)

Podophyllum pelatum

Podophyllum emodii

Podofilotoxina

Bloqueio das fases S e G

do ciclo celular e inibição

da enzima topoisomerase II

(DE ALMEIDA et al, 2005)

Derivado semi-sintético

da epipodofilotoxina

(isômero da

podoxfilotoxina)

Etoposídeo

Inibição da enzima

Topoisomerase II

(MCCLENDON & OSHEROFF,

2007)

Derivado semi-sintético

da epipodofilotoxina

(isômero da

podoxfilotoxina)

Tenoposídeo

Inibição da enzima

Topoisomerase II

(MCCLENDON & OSHEROFF,

2007)

Bleekeria vitensis Elliptinum

Intercalação com o DNA

(DUGUE, et al 1986)

Cephalotaxus

harringtonia

Homoharringtone

Inibição da síntese de

proteínas e indução de

diferenciação

(

KANTARJIAN et al, 2001)

1.3. NAFTOQUINONAS

As quinonas representam uma ampla e variada família de metabólitos de

distribuição natural (THOMPSON, 1997). Destaca-se sua importância em processos

bioquímicos vitais e em estudos farmacológicos, nos quais elas têm apresentado

variadas atividades, sobressaindo-se as propriedades antitumorais, microbicidas,

tripanomicidas, viruscidas e inibidoras de sistemas celulares reparadores atuando de

diferentes formas como, por exemplo, ao induzirem a formação deletéria endógena de

espécies bioativas derivadas do oxigênio, levando ao estresse oxidativo celular. Outra

atividade marcante dessas moléculas tem sido a inibição do complexo das

topoisomerases (DA SILVA et al., 2003). As topoisomerases são enzimas que modulam

o estado topológico do DNA através da quebra transitória de uma ou ambas as fitas da

dupla hélice do DNA, e vem sendo estudada como um alvo para várias drogas usadas

no tratamento do câncer (POMMYER et al., 2003).

Quimicamente as quinonas podem ser divididas em vários grupos por suas

diferenças moleculares, usando–se como critério o tipo de anel quinonoídico:

benzoquinonas – um anel benzênico; naftoquinonas – um anel naftalênico;

antraquinonas – uma anel antracênico linear ou angular (Figura 9). Em decorrência de

diferentes arranjos isoméricos, pode-se ter com um mesmo anel e com carbonilas em

diferentes posições, diferentes quinonas. Estas formas isoméricas diferem muito em

suas propriedades físicas, químicas e quanto à sua atuação biológica. Numa observação

mais apurada sobre a importância das quinonas, pode-se citar o grande número de

drogas neste grupo que possuem aplicações práticas reconhecidas (DA SILVA et al.,

2003). Algumas, inclusive, chegaram à produção industrial, como por exemplo, a

vitamina K, as mitomicinas e as antraciclinas (RUTTIMANN, 1986).

Figura 9: A) 1,4 p- benzoquinona; B) 1,4-naftoquinona; C) 9,10-antroquinona.

A citotoxicidade das quinonas leva à especulação de que existe uma propriedade

química intrínseca na unidade quinonoídica, associada a outros fatores estruturais, que

são responsáveis pela intensidade das atividades antitumorais (BRAND AND FISHER,

1990). Foi observado que muitas quinonas possuem um grupo de saída que pode ser

ativado por redução das carbonilas quinonoídicas, gerando intermediários alquilantes

(LIN, 1984) (agentes antineoplásicos biorredutores). De acordo com vários autores, o

estresse oxidativo levando a danos no DNA e alquilação de nucleófilos celulares

nucleares são os dois principais mecanismos da citotoxicidade das quinonas (BOLTON

et al., 2000).

As naftoquinonas, representadas, principalmente, pela β-lapachona e pelo

lapachol, que é conhecido desde 1858 e pode ser considerado um dos principais

representantes do grupo de quinonas das tabebuias, têm sido encontradas como

constituintes de várias plantas das famílias Bignoniaceae, Verbenaceae e Proteaceae e

constituem um grupo promissor devido as suas propriedades citotóxicas e antitumorais.

Lima e colaboradores (1972) estudaram e demonstraram a existência da atividade

antitumoral de várias outras naftoquinonas, como a juglona, lawsona e plumblagina

(Figura 10).

B C

Figura 10: Estrutura química das naftoquinonas: A) Lapachol, B) Beta-lapachona, C)Alfa-Lapachona, D)

Juglona, E)Plumbagina e F) Lawsona

OOH

OH O

A Capraria biflora L. (figura 11 A) é uma planta variável, herbácea ou

arbustiva, cujo caule é ramoso, até 150 cm de altura, ereto; possui ramos alternos,

cilíndricos, pubescentes ou hirsutos. Suas folhas são alternas, oblongo-lanceolado-

agudas, irregularmente serradas, inteiras na base, cuneadas e estreitando para o pecíolo,

até 8 cm de comprimento, peninervadas, sendo a nervura média saliente na página

inferior, a planta possui flores pediceladas, auxiliares, germinadas, raramente solitárias

ou fasciculadas, pequenas, brancas campanuladas; seu fruto possui cápsula ovado-

oblonga, glabra, contendo sementes escuras oblongo-cuneadas, rugosas (CORRÊIA

1984).

Fig

A Capraria bifloria é uma espécie pertencente à família Schrophulariaceae,

originária das Antilhas e América do Sul, que habita zonas temperadas e áreas de clima

tropical. A espécie é amplamente distribuída no continente americano. Na América do

Sul é encontrada em países como Venezuela, Peru, Guiana Francesa e Brasil (encontra-

se nos estados de Goiás, Minas Gerais e na faixa litorânea entre o Piauí, até o Espírito

Santo). Na América Central pode ser encontrada em El Salvador, Trinidad-Tobago,

Bahamas, Panamá, Curaçao, Guatemala e Porto Rico; na América do Norte: Estados

Figura 11: A) Capraria biflora L.; B) raízes da C. biflora.

Unidos e México; na Ásia: Índia e China. No continente europeu é muito usada como

ornamento. (CORREA, 1931; MATOS, 1988).

Esta planta é conhecida no Brasil como: balsaminha, chá-da-balsaminha, chá-do-

méxico, chá-da-martinica, chá-de-goteira, chá-do-rio, chá-das-antilhas, chá-de-lima,

chá-do-maranhão, chá preto, chá-de-boi, chá-bravo, chá-de-calçada, chá-da-terra, chá-

da-américa, chá-de-marajó (CORRÊIA, 1984; LORENZI & MATOS, 2002).

As folhas secas e raízes da Capraria biflora são usadas na medicina popular para

substituir o chá-da-índia em problemas estomacais ou no tratamento de desordens

dermatológicas em geral, afecções do aparelho urinário, febrífuga e estimulante,

vômitos, recuperação de parto, diarréia e inflamações, bem como analgésico,

especificamente em dores menstruais e pós-parto, contra otite, desordens reumáticas e

hemorróidas. Evita-se fazer infusão em doses elevadas podendo provocar debilidade.

Além disso, suas raízes possuem propriedades anti-sépticas e antimicrobianas

(AYENSU, 1981; HONYCHURCH, 1986; MATOS, 2002; MORAIS et. al., 1995,

SCOFIELD 2002).

O infuso das folhas e extremidades florais é utilizado, principalmente no Brasil,

no combate a dores estomacais, como sudorífero, febrífugo e para afecções do trato

urinário (LORENZI & MATOS, 2002). Em países da América do Sul, como Trinidad,

Peru e Guiana Francesa, o infuso das folhas de C. biflora é empregado para combater a

febre, gripe, dismenorréia, urticária, vômitos, sarampo e para lavagens oftálmicas

(LUU, 1975). O seu decocto, por via oral, é utilizado como estimulante, colagogo,

adstringente, estupefaciente e na cura de feridas e paralisia muscular (LUU,1975;

RAMIREZ et al.,1988).

Além desses usos, a decocção das folhas, em países das Américas Central e do

Norte, como Guatemala, Bahamas, Curaçao e México, são indicados para o tratamento

de edemas e câimbras nas pernas. A infusão das folhas é indicada em casos de

indigestão, diarréia e afecções ovarianas. O extrato aquoso quente das folhas é utilizado

para diabetes, diarréia, gonorréia, debilidade geral e para perda de memória (MORTON,

1968). Na Índia, usa-se o extrato quente para casos de febre, diarréia e dismenorréia

(AYENSUN, 1981). A infusão e decocção das folhas são usadas para diabetes e no

intuito de apressar o parto, diminuindo a dor (MORTON, 1968).

O extrato aquoso das folhas de C. biflora, usado em camudongos no teste da

chapa quente nas concentrações de 50, 100 e 200 mg/kg, revelou a existência de uma

relativa propriedade analgésica da planta quando comparada com a morfina na dose de

3 mg/kg (ACOSTA et al., 2003a).

Acosta e colaboradores (2003b) demonstraram também, que o extrato aquoso

das folhas possui uma forte atividade antiinflamatória na concentração de 200 mg/kg em

relação à indometacina no teste do edema de pata induzido por carragenina. O edema

foi significativamente reduzido nas concentrações de 50, 100 e 200 mg/kg, para 38,75,

35,96 e 27,94% respectivamente. A peritonite induzida por carragenina também

confirmou a atividade antiinflamatória. Na concentração de 200 mg/kg a inibição da

inflamação foi de 58,76%.

Além da utilização de partes da planta, há relatos do emprego de C. biflora em

associação a outras plantas, como diurético, calmante, bem como para o tratamento de

afecções no aparelho urinário (CORDEIRO et al., 1996).

Como referido anteriormente, a propriedade antimicrobina da C. biflora é

oriunda de suas raízes, de onde, Gonçalves de Lima e colaboradores (1953) isolaram um

princípio ativo que denominaram de biflorina.

A biflorina, objeto de nosso estudo, (Figura 12) é uma

-naftoquinona (6,9-

dimetil-3-(4-metil-3-pentenil)nafta[1,8-bc]-piran-7,8-diona) prenilada de origem natural

que pode ser facilmente obtida das raízes da Capraria biflora L. (Figura 11 B), foi

isolada pela primeira vez em 1953 por Gonçalves de Lima e colaboradores e seus dados

de RMN

C foram registrados pela primeira vez por Fonseca e colaboradores (2002).

Figura 12: Estrutura química da biflorina (6,9-dimetil-3-(4-metil-3-pentenil)nafta[1,8-bc]-piran-7,8-

diona).

A biflorina mostrou como primeira atividade relatada, um potencial

antimicrobiano frente a bactérias Gram-positivas, álcool-ácido-resistentes e alguns

fungos (GONÇALVES DE LIMA et al., 1958, 1962, SERPA 1958).

A atividade da biflorina contra microorganismos foi testada por Gonçalves de

Lima e colaboradores (1958), que verificaram que a pureza da substância, estava

diretamente relacionada com sua atividade. Em 1958, os dois ensaios realizados com

diferentes graus de pureza da substância, mostraram que com a biflorina mais pura o

valor da Concentração Mínima Inibitória (CMI) era menor. Em 1962, Gonçalves de

Lima e colaboradores, com um novo método de extração da biflorina, demonstraram

que ocorreu um aumento da CMI para vários microorganismos testados. Este fato pode,

no entanto, estar associado à fotossensibilidade da biflorina, cujos dois produtos de sua

degradação (um solúvel e o outro insolúvel em éter de petróleo), também possuem

atividade antimicrobiana menor, em relação à própria biflorina. Outros ensaios frente a

fungos dermatófitos e leveduras, utilizando principalmente cepas de Candida albicans,

revelaram uma atividade dose-dependente frente aos microorganismos sobre os quais

ela possui alguma atividade (LYRA JÚNIOR, 1999).

Ainda em 1958, há registro de um relato de caso, onde foi preparada uma pasta

com 1% de biflorina cristalizada, que foi utilizada num paciente de 14 anos, do sexo

masculino, que apresentava uma “lesão eritematosa peribucal, abrangendo a parte

externa dos lábios, a qual se estendia para cima até a altura do nariz, para baixo em toda

a região mentoniana e lateralmente, sobre a face, até uns 5 cm além da comissura labial.

A pele da área atingida apresentava-se edematosa com uma coloração vermelho forte e

deixava exudar constantemente líquido claro e de cheiro pútrido em face do que o

paciente mantinha constantemente um lenço sobre a lesão. No caso, o paciente

queixava-se de forte sensação de ardência e prurido na zona afetada” (SERPA, 1958).

A pasta de biflorina a 1% foi usada duas vezes ao dia. Após dois dias de

tratamento, a pele que se apresentava edematosa de coloração vermelha forte, com

exudato constante de coloração clara e odor fétido, já se encontrava com coloração

rósea, sem exudação de líquido e sem odor. No sexto dia de aplicação da pasta a pele já

possuía um aspecto quase normal. Coletas em pontos diferentes da área edematosa

possibilitaram isolar o fungo Trichosporon margaritipherum. Inicialmente, o paciente

usou a pasta veiculada em vaselina e lanolina, posteriormente por possuir uma melhor

penetração, o veículo foi trocado por polietilenoglicol, onde se constatou que em uma

semana não havia sequer vestígio de eritema (SERPA, 1958). Não existem relatos

posteriores a esse.

Levando-se em consideração o fato dessa planta ser estudada, nos seus aspectos,

fitoquímicos e ter conhecida atividade antimicrobiana, desde a década de 50. Faz-se

necessário que os estudos farmacológicos sejam continuados. Em particular no caso de

uma naftoquinona propõe-se avaliar suas propriedades, citotóxicas, antitumorais e

genotóxicas, tomando por base as demais quinonas amplamente estudas e conhecidas na

literatura como é o caso principalmente do Lapachol e Beta-lapachona, como descrito

anteriormente. É de suma importância caracterizar a biflorina em relação a outras

bioatividades.

2. OBJETIVOS

2.1 GERAL

Avaliar o potencial antineoplásico da biflorina em modelos tumorais e não

tumoaris in vitro e in vivo.

2.2 ESPECÍFICOS

2.2.1 Avaliar a citotoxicidade da biflorina em linhagens tumorais humanas e murina in

vitro;

2.2.2 Avaliar o potencial antimitótico da biflorina em ovos de ouriço-de-mar;

2.2.3 Avaliar a atividade hemolítica da biflorina em eritrócitos de camundongos;

2.2.4 Avaliar o mecanismo de ação da biflorina em células de melanoma murino in

vitro;

2.2.5 Avaliar o potencial antitumoral da biflorina nos modelos animais murinos,

sarcoma 180, carcinoma de erlich e melanoma;

2.2.6 Avaliar a sobrevida dos animais transplantados com melanoma B16;

2.2.7 Avaliar o potencial imunoadjuvante da biflorina;

2.2.8 Avaliar a atividade antioxidante da biflorina em modelos in vitro;

2.2.9 Estudar o potencial genotóxico e mutagênico da biflorina em células V79 e

linfócitos in vitro e em Salmonella thiphymurium, Saccharomices cereviseae e medula

óssea de camundongos;

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. MATERIAIS UTILIZADOS

EQUIPAMENTOS

Agitador de placa MLW modelo Thys 2

Agitador Vortex – AD8850

Aquário Marinho

Balança Analítica GEHAKA AG200

Balança pra pesar animais – Filizola

Banho-Maria – MOD. 105 DI DELLTA

Centrífuga Centimicro FANEM Modelo 212

Centrífuga de lâminas Shandon Shoutern Cytospin

Centrífuga de placas Eppendorf Modelo Centrifuge 5403

Centrífuga Excelsa Baby I FANEM Modelo 206

Citômetro de fluxo Guava EasyCyte Mini

Contador Manual – Blood Cell Counter Export – DB – Division of Bexton, Dickinson

and Company

Cuba de Eletroforese – Bio Rad (DNA sub cell gel)

Deonizador de água Mili-Q

Espectrofotômetro de placas – DTX 880 multimode detector, Beckman Coulter

Fluxo Laminar VECO

Fonte Modelo 250 – Life technologies

Forno de Microondas – Panasonic

Freezer – Prosdócimo

Geladeira – Prosdócimo

High-throuput screeing - biomek 3000 - Beckman Coulter

Incubadora de células (CO

Water-Jacket Incubator) NUAIRES TS Autoflow

Microscópio de Fluorescência Olympus BX41

Microscópio óptico de inversão Nikon Diaphot

Microscópio óptico Metripex Hungray PZO-Labimex Modelo Studar lab

Micrótomo – SLEE - MANZ BR1

Milli Q – Millipore

Potenciostato/Galvanostato mod. AutoLab PGSTAT20

Shaker PSU-2T Plus

Termomixer eppendorf

SOLUÇÕES

NOMES CONCENTRAÇÕES MARCA

Acridina laranja

100 µg/mL Fluka

Água do mar filtrada

Anticorpo anti-BrdU

1 µL de anticorpo anti-BrdU

Anticorpo Anti - BrdU

BSA 5% q.s.p. 500 µL de solução

Sigma

Dako

Azul de tripan

10% Sigma

BrdU

10mM Sigma

Brometo de etídio

100 µg/mL Sigma

Diaminobenzidina (DAB)

5µL DAB

1 mL de Tris-Hcl (Tris 0,05M)

pH=7,6

2 µL de H2O2

Imunotech

Proquímios

DMSO

10% Vetec

Eosina

0,5% Vetec

Estreptavidina -peroxidase

1 µL em BSA 5% q.s.p.100 µL de

solução

Dako

Etanol

70%

Formalina neutra

10% Vetec

Gentamicina

5mg/mL

Hematoxilina

0,1% Doles

Iodeto de propídeo (PI)

50 µg/mL Sigma

Iodeto de propídeo (PI)

50 µg/mL + triton X-100 0,2% e

citrato de sódio 0,1%

Sigma

KCl

0,5M Labsynth

Meio de cultura de células

RPMI 1640

Diluído em água deionizada, filtrado

e complementado com 10% SBF,

1% glutamina, 1% de antibióticos,

1% de bicarbonato de sódio (0,75%)

e 25mM de HEPES

Cultilab

MTT

5 mg/mL Sigma

Penicilina – estreptomicina

Penicilina 10.000 U.I/mL

Streptomicina 10mg/mL

Cultilab

NOMES CONCENTRAÇÕES MARCA

Rodamina 123

1 mg/mL Sigma

Solução desnaturante (para

análise de incorporação de

BrdU)

Formamida 70%

2x SSC (pH=6,5-7,5 a 70ºC)

Vetec

Solução salina

0,85% + CaCl

10mM Vetec

Solução salina

0,9% Vetec

Soro fetal bovino

Cultilab

SSC 10X

Cloreto de sódio 1,5M

Citrato de sódio 0,15M

Labsynth

Grupo Química

Tampão fosfato (PBS)

8,766 g de Cloreto de sódio

2,14 g de NaHPO4.7H2O

0,276 g de NaHPO4.H20

H2O q.s.p. 1 L de solução (pH = 7,2)

Labsynth

Tampão Tris (TBS) 10X

Cloreto de sódio 1,5 M

Tris 0,5 M (pH= 7,6)

Tripsina

0,25% Cultilab

Triton X -100

1% Isofar

REAGENTES

Ácido Acético – Merck

Ácido Oléico – Merck

Ácido Clorídrico – Merck

Ácido 2,5 – dihidroxibenzóico – Acros Organics

Ácido 2,3 – dihidroxibenzóico – Acros Organics

Agarose baixo ponto de fusão – Gibco

Agarose ponto de fusão normal – Gibco

Alamar Blue – Sigma

Bicarbonato de Sódio – Dinâmica

Butilhidroxitolueno – Acros Organics

Brometo de Etídio – Sigma

Cloreto de sódio – Vetec

DMSO – Vetec

Etanol – Vetec

Etilmetanosulfonato – Sigma

Ficoll – Sigma

Formaldeído – Dinâmica

Hipoxantina – Merck

Formamida – Vetec

Laranja de Acridina – Sigma

Metilmetanosulfonato – Sigma

Parafina – Synth

Peróxido de Hidrogênio – Merck

Vitamina C – Acros Organics

Xantina Oxidase – Merck

Xileno P.A. – Vetec

1,1 – difenil – 2- picrilhidrozil – Acros Organics

FÁRMACOS

5 – Fluorouracil – Sigma

Dacarbazina – Eurofarma Laboratórios Farmacêuticos

Doxirrubicina – Sigma

3.2. METODOLOGIA EXPERIMENTAL

3.2.1. Obtenção da Biflorina

Coleta e informações sobre a planta

A planta foi coletada em 2001, em uma plantação no município de Fortaleza, foi

identificada pelo professor Edson de Paula Nunes (Universidade Federal do Ceará). A

exsicata (nº 30.849) foi depositada no Herbário Prisco Bezerra, Departamento de

Biologia, Universidade Federal do Ceará, Ceará, Brasil.

Obtenção dos extratos das raízes de Capraria biflora O (CH

)

(EEE), éter de

petróleo (EEP), CHCl

(ECR) e EtOH (EER).

As 450g de raízes secas e moídas foram divididas em duas partes de 225g, onde

foi extraída com éter etílico em aparelho soxhlet à 50°C(EEE), obtendo 200 mg e a

outra com éter de petróleo (EEP) à frio, obtendo 90 mg, ambos na ausência de luz.

Os 90 mg obtidos a partir do extrato éter de petróleo foram aquecidos à 60°C e

posteriormente recristalizados e filtrados à vácuo, obtendo-se cristais agulha de cor

vermelho-escuro, solúveis em CHCl

, com ponto de fusão variando de 154-158°C

(FONSECA et al., 2003). Esse procedimento foi realizado várias vezes para a obtenção

da biflorina.

Figura 13: Fluxograma da obtenção da biflorina das raízes de Capraria biflora.

RAÍZES SECAS

(450g)

(1)

EEP (90mg)

(2)

EEE (150mg)

1. Éter de Petróleo a frio

2. Soxlhet à 50ºC em éter etílico

3.2.2. ESTUDO DA CITOTOXICIDADE IN VITRO

3.2.2.1. Linhagens celulares utilizadas

As linhagens celulares utilizadas estão listadas quanto ao tipo histológico,

origem e fonte na tabela 2.

Tabela 2: Linhagens celulares tumorais utilizadas nos ensaios de citotoxicidade in

vitro.

Linhagem Tipo Histológico Origem Fonte

HL-60

Leucemia humano

Children’s Mercy Hospital

de Kansas City – USA

CEM Leucemia humano

Children’s Mercy Hospital

de Kansas City – USA

K 562 Leucemia humano NCI

MCF-7 Mama humano

Children’s Mercy Hospital

de Kansas City – USA

MDA MB 231 Mama humano NCI

MX 1 Mama humano NCI

NCI H266

Pulmão humano NCI

NCI H23 Pulmão humano NCI

M14 Pele humano NCI

UACC – 257 Pele humano NCI

UACC – 62 Pele humano NCI

MDA MB 435 Pele humano NCI

B16 Pele murino NCI

HCT-8 Cólon humano

Children’s Mercy Hospital

de Kansas City – USA

PC3 Próstata humano NCI

SF295 Sistema Nervoso humano NCI

3.2.2.2. Manutenção das Células

As linhagens celulares foram cultivadas em garrafas para cultura de células (75

, volume de 250 mL), os meios utilizados foram RPMI 1640 e/ou DMEM,

suplementados com 10% de soro bovino fetal e 1% de antibióticos

(penicilina/estreptomicina). As células foram mantidas em incubadoras com atmosfera

de 5 % de CO

a 37º C. Diariamente acompanhava-se o crescimento celular com a

utilização de microscópio de inversão. O meio era trocado sempre que o crescimento

celular atingia confluência necessária para renovação de nutrientes. Para a manutenção

de células aderidas utilizou-se tripsina (0,25%) para que as células despregassem-se das

paredes das garrafas.

3.2.2.3. Teste de citotoxicidade in vitro – Ensaio do MTT

As células em suspensão ou monocamadas foram distribuídas em multiplcas de

96 cavidades numa densidade de 0,3 x 10

células/mL, para células suspensas e 0,6 x

células/mL para células aderidas. A substância teste foi incubada durante 72 horas

juntamente com a suspensão de células. A doxorrubicina foi utilizada como controle

positivo. Após o período de incubação, as placas foram centrifugadas (1500

rpm/15min), e o sobrenadante foi descartado. Cada cavidade recebeu 200 µL da solução

de MTT (10% de meio RPMI 1640) e foi reincubada por 3 horas, em estufa a 37ºC e a

5% de CO

. Após esse período, as placas foram novamente centrifugadas (3000 rpm/10

min), o sobrenadante foi desprezado, e o precipitado foi ressuspendido em 150 µL de

DMSO. Para a quantificação do sal reduzido nas células vivas, as substâncias foram

lidas com o auxílio de um espectrofotômetro de placa, no comprimento de onda de 550

nm (figura 14). Essa técnica tem a capacidade de analisar a viabilidade e o estado

metabólico da célula, sendo, bastante útil para avaliar a citotoxicidade (MOSMANN,

1983).

Análise dos dados

As drogas foram testadas em diluição seriada, em triplicata. Foi registrado o

gráfico absorbância X concentração e determinados suas CI

(concentração inibitória

média capaz de provocar 50% do efeito máximo) e seus respectivos intervalos de

confiança (IC 95%) realizado a partir da regressão não-linear utilizando o programa

Prism versão 4.0 (GraphPad Software).

Contagem

Incubação com as

amostras

69 h

3 h

MTT

Contagem

Incubação com as

amostras

69 h

3 h

MTT

Figura 14: Esquema representativo do método MTT.

3.2.3. Avaliação da atividade antimitótica nos ovos do ouriço-do-mar

Foram utilizados exemplares da espécie Lytechinus variegatus coletados na praia

da Lagoinha, litoral cearense. Esses animais são facilmente coletados e mantidos em

aquários no laboratório. Além disso, apresenta ovos não muito pigmentados, facilitando

a visualização dos estágios de desenvolvimento. Esse teste pode dar uma visão geral

sobre o mecanismo de ação da droga, dependendo do estágio em que a droga inibe o

desenvolvimento dos ovos (como descrito em JIMENEZ et al., 2003).

Procedimento Experimental

A eliminação dos gametas foi induzida pela injeção de até 3 mL de KCl 0,5M na

cavidade celômica (perivisceral) dos ouriços. Após o término da eliminação dos

gametas, os óvulos foram lavados em uma proveta com água do mar filtrada. Esse

processo foi repetido por mais duas vezes, para remoção da camada gelatinosa que

envolve o óvulo. Após a última lavagem, os óvulos foram ressuspendidos em 50 mL de

água do mar filtrada. Os espermatozóides concentrados foram coletados e mantidos em

baixa temperatura, 4º C, até o momento do uso. A fecundação foi realizada pela adição

de 1 mL da suspensão de espermatozóides (0,05 mL de suspensão concentrada dos

espermatozóides/2,45 mL de água do mar) à suspensão de óvulos (50mL). Após cerca

de dois minutos, a fecundação foi confirmada pela presença da membrana da

fecundação através da observação de uma amostra das células em microscópio óptico.

Os ovos (1 mL) foram distribuídos numa placa de 24 cavidades, contendo a biflorina em

diferentes concentrações (1, 3, 10, 30 e 100 µg/mL). A doxorrubicina foi utilizada como

controle positivo do experimento nas concentrações de 0,1, 0,3, 1, 3, e 10 µg/mL. Os

ovos forma incubados num volume final de 2 mL, mantidos à temperatura ambiente (26

± 2ºC) sob agitação constante. Nos intervalos correspondentes a primeira e terceira

divisões foram fixadas alíquotas de 0,2 mL em formalina 10%. Já na blástula, 0,1 mL de

formaldeído foi adicionado ao volume restante na placa . Cem embriões foram contados

em cada amostra para obtenção da porcentagem de células divididas (figura 15) (como

descrito por JIMENEZ et al., 2003).

Análise dos dados

Os dados foram analisados a partir da média e do erro padrão da média dos

experimentos. Os cálculos da CI

(concentração inibitória média capaz de provocar

50% do efeito máximo) e seu respectivo intervalo de confiança (IC) 95% foi realizado a

partir de regressão não-linear utilizando o programa Prism 4.0 (GraphPad Software).

Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os

dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida de Student

Newman Keuls (p<0,05).

Extração dos

gametas (KCl 0,5M)

Liberação dos

gametas

fêmea

macho

Fecundação

Visualização

Plaqueamento

Fixação

(formalina 10%)

Contagem

Extração dos

gametas (KCl 0,5M)

Liberação dos

gametas

fêmea

macho

Fecundação

Visualização

Plaqueamento

Fixação

(formalina 10%)

Contagem

Figura 15: Esquema representativo do método antitimitótico em ovos de ouriço-do-mar.

3.2.4. Avaliação da atividade hemolítica em eritrócitos de camundongos Swiss

A avaliação da atividade hemolítica permitiu avaliar o potencial da biflorina em

causar lesões na membrana plasmática da célula, seja pela formação de poros ou pela

ruptura total da membrana (DRESCH et al., 2005).

Procedimento Experimental

Foi coletado o sangue de três camundongos (Mus musculus Swiss) por via

orbital (animais previamente anestesiados com éter etílico) sendo diluído em 1:30 de

solução salina (NaCl 0,85 + CaCl

10mM). Os eritrócitos foram lavados 2 vezes em

solução salina por centrifugação (5000 rpm/3 min.) para redução da contaminação

plasmática e ressuspendidos em solução salina para obtenção de uma suspensão de

eritrócitos (SE) a 2%. Os ensaios foram realizados em placas de 96 cavidades. Cada

poço da 1ª fileira recebeu 100 µL da solução salina. Na 2ª, os poços receberam 50 µL da

solução salina e 50 µL do veículo de diluição da substância teste, neste caso, DMSO.

Aos poços da 3ª fileira, foram adicionados 100 µL de solução salina e 100 µL de

biflorina em suspensão com DMSO. Da 4ª fileira em diante os poços receberam 100 µL

da solução salina, excetuando-se os da última fileira, que receberam 80 µL de solução

salina e 20 µL de Triton X – 100 a 1% (controle positivo). As diluições foram feitas da

3ª à 11ª cavidade, retirando-se 100 µL da solução da cavidade anterior e transferindo

para a seguinte de modo que as concentrações foram sempre diluídas pela metade,

variando de 1,56 a 200 µg/mL. Em seguida, 100 µL da suspensão de eritrócitos foram

plaqueados em todos os poços. Após incubação por 1 hora. Sob agitação constante à

temperatura ambiente (26 ± 2ºC), as amostras foram centrifugadas (5000 rpm/3min.) e o

sobrenadante transferido para uma outra placa para a leitura da absorbância da

hemoglobina no espectrofotômetro de placas a 540 nm (figura 16). A atividade da

biflorina foi determinada de maneira relativa ao valor dos controles positivo e negativo.

Sangria

Centrifugação

Ressuspensão

em salina

SE 4%

Centrifugação

Plaqueamento das

substâncias

Plaqueamento do

sangue

c- b c+

1 h

Transferência do

sobrenadante

Sangria

Centrifugação

Ressuspensão

em salina

SE 4%

Centrifugação

Plaqueamento das

substâncias

Plaqueamento do

sangue

c- b c+

1 h

Transferência do

sobrenadante

Figura 16: Esquema representativo do método de hemólise em eritrócitos de camundongos.

3.3. ESTUDO DO MECANISMO DE AÇÃO NO MODELO DE MELANOMA

MURINO IN VITRO

Para os estudos in vitro na linhagem B16, as células, na concentração de

(0,5x10

) foram incubadas por 24 horas com biflorina e examinadas ao microscópio de

inversão. A concentração utilizada foi estimada a partir da CI

encontrada no método

do MTT nesta linhagem celular.

3.3.1. Viabilidade celular – Exclusão por azul de tripan

O teste de exclusão por azul de tripan permitiu quantificar separadamente as

células viáveis das células mortas pela substância testada. O corante penetra em todas as

células, porém somente as células viáveis conseguem bombear o tripan para fora, sendo

possível dessa maneira, observar uma coloração azulada nas células metabolicamente

inativas.

Procedimento experimental

A alíquota de 90 µL da suspensão de células adicionam-se 10 µL do azul de

tripan. As células viáveis e as não viáveis foram diferenciadas e contadas em câmara de

Newbauer, contando-se as células de dois quadrantes diagonalmente opostos (figura

17). A Doxorrubicina (0,3 µg/mL) foi usada como controle positivo (Renzi et al., 1993).

Análise dos dados

Os dados foram analisados a partir da média e do erro padrão da média de 3

experimentos. Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os

diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA)

seguida de Student Newman Keuls, com nível de significância de 5% (p<0,05).

Azul de Tripan

Inviável

Viável

90µL de célula

10µL de Tripan

Azul de Tripan

Inviável

Viável

90µL de célula

10µL de Tripan

Figura 17: Esquema representativo do método de exclusão por azul de tripan.

3.3.2. Análise morfológica – Coloração diferencial por hematoxilina/eosina

A coloração por hematoxilina/eosina permite a análise da integridade nuclear,

bem como alterações existentes no citoplasma. A hematoxilina é um corante alcalino

que tem afinidade por ácidos e pelas proteínas nucleares, conferindo ao núcleo uma

coloração azul e a eosina por sua vez, é um corante basofílico e liga-se ao citoplasma

conferindo-lhe uma coloração rósea.

Procedimento experimental

Para observar a morfologia celular, foi utilizada uma alíquota de 50 µL da

suspensão celular, a qual foi adicionada a uma centrífuga de lâminas (cytospin). Após a

adesão das células nas lâminas elas foram fixadas em etanol absoluto por 1 min., sendo

seu excesso retirado em água corrente antes de efetuar a coloração com hematoxilina,

seguido de eosina (figura 18).

Análise dos dados

As lâminas foram analisadas em microscópio óptico, para avaliação de suas

características morfológicas e comparadas ao controle (não-tratadas). O registro das

alterações celulares foi feito por fotografia.

Fixação

HEMATOXILINA

EOSINA

Coloração

Basofílica

Coloração

Acidofílica

Metanol 100%

Célula não corada Célula corada com

hematoxilina

Célula corada com

hematoxilina e

contracorada com eosina

Fixação

HEMATOXILINA

EOSINA

Coloração

Basofílica

Coloração

Acidofílica

Metanol 100%

Célula não corada Célula corada com

hematoxilina

Célula corada com

hematoxilina e

contracorada com eosina

Figura 18: Esquema representativo do método de coloração hemtaoxilina/eosina.

3.3.3. Análise morfológica – Coloração diferencial por Laranja de Acridina /

Brometo de Etidio

O método de contagem diferencial laranja de acridina /brometo de etídio

(MCGAHON et al., 1995) permite diferenciar células viáveis daquelas em processo de

morte por apoptose ou necrose através da contagem diferencial por fluorescência. Este

método baseia-se na revelação das células (controle e tratadas) com a coloração por

brometo de etídio (BE) e laranja de acridina (LA) no núcleo. A laranja de acridina

intercala-se ao DNA, conferindo aparência verde ao núcleo celular, sendo capaz de

atravessar membranas intactas. O brometo de etídio é incorporado majoritariamente por

células não viáveis (com instabilidade de membrana), intercalando-se ao DNA corando-

o de laranja; ligando-se fracamente ao RNA, que se mostrará com uma coloração

vermelha. As células viáveis com membrana intacta apresentam núcleo uniformemente

corado de verde pela LA. O BE marca muito fracamente e às vezes não marca, pois não

atravessa a membrana íntegra. As células em apoptose inicial (membrana ainda intacta)

apresentam manchas verdes brilhantes no núcleo (condensação da cromatina) e não são

marcadas por BE. Foram observadas as alterações da membrana em decorrência da

formação de corpúsculos apoptóticos. As células em necrose (lesão na membrana)

apresentaram um padrão de coloração uniforme, laranja-avermelhada e não há formação

de corpos apoptóticos. Possivelmente as membranas plasmáticas permaneçam intactas

durante o fenômeno apoptótico até os últimos estágios quando são permeáveis aos

solutos normalmente retidos (KUMMAR et al., 2004).

Procedimento experimental

A suspensão de células controle ou tratadas com biflorina foi transferida para um

tubo eppendorf e centrifugada por 3 min em baixa rotação. O sobrenadante foi

descartado e as células foram ressuspendidas em 20 µL de solução de PBS. Em seguida,

1 µL da solução de BE:LA foi adicionado a cada tubo e uma alíquota dessas células foi

transferida para uma lâmina e montado com lamínula para, em seguida, ser contada

considerando cada evento celular de interesse (figura 19) (como descrito em GENG et

al., 2003).

Análise dos dados

Foram contadas 300 (trezentas) células, em duplicata, cada amostra para

quantificação percentual de cada evento celular (viáveis, necróticas e apoptóticas). As

lâminas foram montadas e fotografadas para registro visual dos efeitos. Para verificação

de ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os dados foram

comparados por análise de variância (ANOVA) seguida de Student Newman Keuls

(p<0,05).

Plaqueamento

(B16)

24h

Incubação

Contagem

Células viáveis

Células apoptóticas

Células necróticas

Plaqueamento

(B16)

24h

Incubação

Contagem

Células viáveis

Células apoptóticas

Células necróticas

Figura 19: Esquema representativo do método de coloração laranja de acridina/brometo de etídio.

3.3.4. Inibição da síntese de DNA por incorporação de BrDU

A bromodeoxiuridina (BrDU) é uma base nitrogenada análoga da Timina.

Quando as células estão sintetizando DNA o BrDU é incorporado no lugar da timina. A

detecção de BrDU incorporado nas células é feita por técnicas de imunohistoquímica.

Procedimento experimental

O BrDU é adicionado 3h antes do término do período de incubação com a droga

(21h), para que seja incorporado ao DNA das células em mitose. Após o período de três

horas, lâminas foram preparadas e colocadas para secar ao ar livre por 2h. Após o

período de secagem foram fixadas em metanol:ácido acético (7:1,5) por 5 minutos. As

células foram lavadas com tampão Tris (TBS) e incubadas em solução desnaturante

(formamida) por 90 minutos a 60ºC e pH 7,4. Após uma segunda lavagem com TBS, as

células foram circuladas com caneta hidrofóbica e incubadas com anticorpo primário e

deixadas na geladeira durante a noite em câmara úmida. As células foram incubadas

com anticorpo biotinado por 20 minutos e, em seguida, com a solução de estreptavidina-

fluoresceína por mais 20 minutos. Foi adicionado o cromógeno diaminobenzidina

(DAB) por 1-5 minutos e em seguida, removido com água destilada (figura 20). A

contracoloração foi realizada com hematoxilina de Harrys a 0,1% (Pera et al., 1977).

Análise dos resultados

Foram contadas as 200 (duzentas) primeiras células observadas em microscópio

óptico. Consideraram-se positivas para proliferação as células de núcleo corado com

DAB (coloração marrom) as que incorporaram o BrDU e, negativas as células de núcleo

corado com hematoxilina (coloração azul). A proporção de células marcadas em

marrom e não-marcadas entre os diferentes grupos foi comparada pelo teste do Qui-

quadrado com nível de significância de 5% (p<0,05).

BrdU

Montar placa

Anticorpos Primário e

Secundário

Estreptavidina-

Peroxidase

DAB

DNA

Síntese de

DNA

Desnaturação

BrdU

Montar placa

Anticorpos Primário e

Secundário

Estreptavidina-

Peroxidase

DAB

DNA

Síntese de

DNA

Desnaturação

Figura 20: Esquema representativo do método do BrDU.

3.3.5. Análises por citometria de fluxo

Os estudos utilizando citometria de fluxo (figura 21) foram realizados em

células B16 não tratadas ou tratadas por 24h com biflorina (1,5, 3 ou 6 µg/mL) ou

doxorrubicina (0,3 µg/mL).

3.3.5.1. Integridade da membrana plasmática

As células em apoptose mantêm suas membranas íntegras durante quase todo o

processo até a sua morte, diferentemente daquelas necróticas. Este ensaio se baseia na

capacidade de o iodeto de propídeo (PI), hidrofílico, penetrar apenas nas células cujas

membranas estejam rompidas e emitir alta fluorescência vermelha somente quando

excitado pelo laser de argônio (488 nm) e estiver ligado ao DNA. As células cujas

membranas permanecem íntegras emitem menor fluorescência. Deste modo, este

método permite avaliar a viabilidade celular através da verificação da integridade da

membrana plasmática.

Procedimento Experimental

Alíquotas de 100 µL de suspensão de células tratadas e não tratadas foram

incubadas com 100 µL de uma solução de PI a 50 µg/mL (diluído em PBS). Após 5

minutos, as amostras foram analisadas por citometria de fluxo. Foram obtidas

informações acerca da integridade da membrana celular utilizando-se o filtro para o

espectro do vermelho.

Análise dos dados

Os dados foram analisados a partir da média e do erro padrão da média de n

experimentos. Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os

diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA)

seguida por Teste de Dunnet, com nível de significância de 5% (p < 0,05) no programa

GraphPad Prism versão 5.0.

3.3.5.2. Ciclo celular e fragmentação de DNA

Esse ensaio igualmente se baseia na capacidade de o iodeto de propídio (PI) se

ligar ao DNA. Inicialmente a membrana plasmática foi lisada para que o PI pudesse se

ligar a todo o DNA das células. A intensidade de fluorescência emitida é diretamente

proporcional a quantidade de DNA existente na célula, permitindo assim diferenciar

DNA celular (e suas diferentes nas fases do ciclo - G1, S e G2) de DNA fragmentado.

Procedimento experimental

Alíquotas de 100 µL de suspensão de células tratadas e não tratadas foram

adicionadas 100 µL de uma solução de PI a 50 µg/mL (diluído em PBS) contento triton

X-100 a 0,2% e citrato de sódio a 0,1%. Após 30 minutos de incubação na ausência de

luz, as amostras foram analisadas por citometria de fluxo utilizando o filtro vermelho.

Análise dos dados

Os histogramas de ciclo celular plotados como intensidade de fluorescência

vermelha (eixo x) versus número de células (eixo y) foram analisados no programa

ModFit LT 3.1 com a ferramenta syncronization wizard.

3.3.5.3. Determinação do potencial transmembrânico da mitocôndria

A mitocôndria é responsável pela iniciação da via intrínseca da apoptose. A

rodamina 123, um corante fluorescente nucleofílico, é seqüestrado pra dentro da

mitocôndria quando esta apresenta seu potencial transmembrânico inalterado. Assim, as

células viáveis emitirão alta fluorescência verde devido à maior quantidade de rodamina

123 ligada às cargas positivas internas, enquanto que as mitocôndrias despolarizadas

terão menor afinidade pelo corante, gerando eventos que emitirão menor fluorescência.

Deste modo, este ensaio foi utilizado para a investigação da ativação da via apoptótica

intrínseca por parte da substância em estudo através da observação da alteração do

potencial transmembrânico mitocondrial.

Procedimento experimental

A uma alíquota de 100µL de suspensão de células tratadas e não tratadas foi

adicionado 200µL de uma solução de rodamina 123 diluída na concentração de 1

µg/mL (diluído em PBS). Após 15 minutos de incubação na ausência de luz a 37ºC, as

amostras foram lavadas com PBS, reincubadas por 30 minutos e então analisadas por

citometria de fluxo utilizando o filtro verde.

Análise dos dados

Os dados foram analisados a partir da média e do erro padrão da média de n

experimentos. Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os

diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA)

seguida por Teste de Dunnet, com nível de significância de 5% (p < 0,05) no programa

GraphPad Prism versão 5.0.

Laser de íon argônio

(488 nm)

lulas

Filtros:

FSC

SSC

Detectores:

Vermelho

Verde

Amarelo

525 nm

680 nm

583 nm

100

Laser de íon argônio

(488 nm)

lulas

Filtros:

FSC

SSC

Detectores:

Vermelho

Verde

Amarelo

525 nm

680 nm

583 nm

100

Figura 21: Esquema representativo do citômetro de fluxo.

3.4. ATIVIDADE ANTITUMORAL EM MODELOS ANIMAIS IN VIVO

3.4.1. Avaliação do efeito da biflorina em camundongos transplantados com os

tumores Sarcoma 180 e Carcinoma de Erlich

A avaliação da atividade antitumoral está relacionada à regressão total de

tumores nos animais, à redução no crescimento dos tumores sensíveis ao composto ou

ao aumento da expectativa de vida durante o tratamento, comparando-se aos não

tratados. Ficou demonstrado que o melhor resultado desses fatores depende do

procedimento do tratamento, que deverá ser começado até 48 h após o transplante.

Neste período, as células tumorais já teriam iniciado a formação do nódulo tumoral

(SCHABEL et al., 1977). Um dos tumores utilizados, o Sarcoma 180, foi descoberto em

1914 no Crocker Laboratory (Columbia Univrsity, New York). Originalmente, este é um

tumor sólido, surgido espontaneamente na região axilar de camundongos e foi

primeiramente classificado como carcinoma mamário. Após vários transplantes

subcutâneos, assumiu a forma sarcomatosa, por volta de 1919. O carcinoma de Erlich na

forma sólida foi detectado em 1907, em Frankfurt, por Paul Erlich, que relatou a

existência de diversos tumores transplantáveis. O tumor traplantável de Erlich atual não

provém de neoplasma primário único como fonte, embora a maioria dos tumores seja

derivada de glândula mamária.

Procedimento Experimental

A avaliação da atividade antitumoral foi realizada utilizados os tumores sólidos

Sarcoma 180 e Carcinoma de Erlich, com 10 dias de implantação na região axilar

direita. O animal doador, ou da manutenção, foi sacrificado por deslocamento cervical,

sendo realizada uma assepsia com álcool iodado. Em seguida, foi retirado o líquido

ascítico da cavidade abdominal, tendo sido preparado uma suspensão de células com

5,0mL de solução de Ringer-lactato, 0,2mL de gentamicina (5mg/mL) e 0,5mL do

líquido ascítico, para posterior contagem de células. Nos animais receptores, foram

injetadas 2 x 10

céls/0,5mL na região axilar esquerda dos camundongos (Mus

musculus Swiss). Nestes experimentos, foram utilizados 10 animais por grupo, num

total de 6 grupos para cada tumor, sendo todas fêmeas, apresentando massa corpórea

variando entre 25-30 g. Vinte e quatro horas após a inoculação do tumor foi iniciado o

tratamento por 7 dias consecutivos utilizando as doses de 25 ou 50 mg/kg de biflorina,

10 ou 25 mg/kg do quimioterápico 5 - Fluorouracil, a associação de 25 mg/kg de

biflorina com 10 mg/kg de 5 – Fluorouracil e o veiculo de diluição das substâncias

(DMSO 10%). Vinte e quatro horas após o termino do tratamento os animais foram

sacrificados e retirados os tumores, rins, fígado e baço para pesagem e análise

histológica (figura 22).

O percentual de inibição do crescimento tumoral (IT) foi calculado pela fórmula:

IT (%) = [(A-B)/A] x 100

Onde:

A = média dos pesos dos tumores no grupo controle.

B = média dos pesos dos tumores nos animais tratados.

Análise dos resultados

Os dados foram analisados a partir da média e do erro padrão da média de n

experimentos. Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os

diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA)

seguida de Student Newman Keuls, com nível de significância de 5% (p<0,05).

Esquema de tratamento com a biflorina:

dia 0 dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5 dia 6 dia 7 dia 8

Inoculação

do tumor

sacrifíciotto 1 tto 2 tto 3 tto 4 tto 5 tto 6 tto 7

diluição

cels/mL

Implante

intramuscular

das células

Solução

de ringer

lactato

Contagem

de células

Tumor

Liver

Kidneys

Spleen

Esquema de tratamento com a biflorina:

dia 0 dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5 dia 6 dia 7 dia 8

Inoculação

do tumor

sacrifíciotto 1 tto 2 tto 3 tto 4 tto 5 tto 6 tto 7

dia 0 dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5 dia 6 dia 7 dia 8

Inoculação

do tumor

sacrifíciotto 1 tto 2 tto 3 tto 4 tto 5 tto 6 tto 7

diluição

cels/mL

Implante

intramuscular

das células

Solução

de ringer

lactato

Contagem

de células

Tumor

Liver

Kidneys

Spleen

Tumor

Liver

Kidneys

Spleen

Figura 22: Esquema representativo dos protocolos antitumorais em camundongos.

3.4.2. Efeito na biflorina na sobrevida de animais transplantados com o tumor

Melanoma B16

O Melanoma B16 no início dos anos de 1970 foi estabelecido como modelo

tumoral em pesquisa de mestátase em animais e foi quando começou a ser cultivado in

vitro. O desenvolvimento e uso do melanoma B16 foi incorporado a um amplo escopo

da pesquisa oncológica (TEICHER, 1997).

Procedimento Experimental

As células de Melanoma B16 foram mantidas e crescidas em incubadoras com

atmosfera de 5 % de CO

e temperatura de 37º C em garrafas para cultura Corning 75

em meio de cultura RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1%

de antibióticos (penicilina/estreptomicina). O crescimento celular foi acompanhado

iariamente com a utilização de microscópio de inversão. O meio de cultura foi trocado

sempre que o crescimento celular atingia confluência necessária para a renovação de

nutrientes. Para expansão da cultura e remoção das células da garrafa, foi utilizado

solução de tripsina 0,25% para soltá-las das paredes. O transplante do tumor foi

realizado pela inoculação de 10

células/0,5mL subcutaneamente na região axilar de

camundongos Mus musculus B57CL/6.

Para este experimento, foram utilizados 10 animais por grupo, num total de 4

grupos, sendo todas fêmeas, apresentando massa corpórea variando entre 25-30 g. Vinte

e quatro horas após a inoculação do tumor foi iniciado o tratamento por 10 dias

consecutivos utilizando as doses de 25 mg/kg de biflorina, 25 mg/kg do quimioterápico

Dacarbazina, a associação de 25 mg/kg de biflorina com 25 mg/kg de Dacarbazina e o

veiculo de diluição das substâncias (DMSO 10%). Ao término do tratamento, os

animais foram deixados com água e alimento ad libidum e observados diariamente para

monitoramento dos animais e registro dos óbitos, até o último, vindo a morrer ao 66º dia

após a inoculação do tumor (figura 23). Outros parâmetros avaliados, além da

sobrevida, foram o volume do tumor e a variação de peso do animal durante o período

de tratamento.

Análise dos dados

Os dados foram analisados a partir da média e do erro padrão da média de n

experimentos. Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os

diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA)

seguida de Student Newman Keuls, com nível de significância de 5% (p<0,05). Para

análise de sobrevida foi realizada a análise de Kaplan-Meyer, e a ocorrência de

diferenças significativas foi verificada através do teste do χ

(qui-quadrado).

Esquema de tratamento com a biflorina:

dia 0 dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5 dia 6 dia 7 dia 8

dia

Inoculação

do tumor

Morte

natural

tto 1 tto 2 tto 3 tto 4 tto 5 tto 6 tto 7

tto

8 tto 9 tto 10

Esquema de tratamento com a biflorina:

dia 0 dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5 dia 6 dia 7 dia 8

dia

Inoculação

do tumor

Morte

natural

tto 1 tto 2 tto 3 tto 4 tto 5 tto 6 tto 7

tto

8 tto 9 tto 10

Figura 23: Esquema representativo do protocolo de sobrevida dos animais transplantados com melanoma

B16.

3.4.3. Atividade Imunoadjuvante

Para avaliar se a biflorina tem alguma atividade imunoadjuvante, foi realizado o

experimento de imunização subcutânea em animais para se obter o soro dos

camundongos imunizados e submetê-los a quantificação de anticorpos totais (Ig Total).

Procedimento experimental

Esse ensaio foi realizado duas vezes, a primeira vez em camundongos saudáveis

Swiss e a segunda em camundongos B57CL/6 transplantados com melanoma B16.

Ambos os ensaios tiveram dois grupos experimentais, um grupo tratado com biflorina e

outro com biflorina e ovalbumina. No primeiro caso se utilizou 1mg de biflorina por

animal e 50µg de ovalbumina, no segundo caso, os animais receberam 25mg/Kg de

biflorina e 50µg de ovalbumina. Os animais saudáveis foram sangrados com 7, 14 e 21

dias após imunização única. Os animais com tumor foram imunizados por 10 dias e

foram sangrados apenas no 21

dia. O sangue foi obtido pelo plexo orbital dos animais

para se obter o soro dos animais. Os anticorpos Ig total (IgM, IgA e IgG) foram

detectados por reação enzimática através do ensaio de imunoabssorbância (ELISA).

Cinqüenta microgramas (50 µg) de ovalbumina purificada foram diluídos em solução

salina e um volume de 100 µL foi usado e colocado em placas de 96 poços. As placas

foram incubadas a 37

C por 1 h, lavadas três vezes com 0,05% de tween-PBS. As

placas foram bloqueadas com 5% de leite desnaturado em 10 mM de PBS, pH7,2, com

0,9% de NaCl por 2h a 37

C, foram lavados novamente e o soro diluído em PBS (1:10-

1:1280) foi adicionado (100 µL) e a placa foi reincubada por 2 h a 37

C. As placas

foram então, novamente lavadas com Tween-PBS e tratadas com imunoglobulinas

conjugadas anti-mouse rabbit (100 µL/poço, diluição final 1:1000) por 2 h a

temperatura ambiente. As placas foram subsequentemente lavadas com Tween-PBS. A

reação foi desenvolvida pela adição de orto-fenilenediamina seguido de incubação por

20 min a 37

C. O resultado da intensidade de coloração foi lida a 450 nm (figura 24).

Análise dos dados

As leituras foram analisadas pelo programa Prisma 4.0. Os dados de n animais

foram analisados pelo teste ANOVA-Newman Keuls (p<0,05).

Dia 1

SANGRIA

7º, 14ºe 21º dias após o 1º dia de

tratamento

Extra

ão do Soro

Soro

ELISA

INDIRETO

Etapa

Dia 1

SANGRIA

7º, 14ºe 21º dias após o 1º dia de

tratamento

Extra

ão do Soro

Dia 1

SANGRIA

7º, 14ºe 21º dias após o 1º dia de

tratamento

Extra

ão do Soro

Soro

ELISA

INDIRETO

Etapa

Soro

ELISA

INDIRETO

Soro

ELISA

INDIRETO

Etapa

Figura 24 – Esquema representativo do método imunoadjuvante em animais.

3.5. AVALIAÇÃO DA INTERAÇÃO DA BIFLORINA COM O DNA

3.5.1. Interação com DNA por eletroquímica

Foram realizados estudos eletroquímicos da Biflorina através de voltametria

cíclica, voltametria de pulso diferencial e voltametria de onda quadrada. A avaliação

eletroquímica foi realizada previamente aos estudos em biossensor de DNA para

determinação do perfil eletroquímico da o-naftoquinona.

Os estudos voltamétricos da biflorina foram realizados utilizando-se um sistema

de três eletrodos – eletrodo de trabalho, auxiliar e de referência: carbono vítreo (BAS,

área 7.065 mm

), platina e Ag/AgCl/Cl

0,1 molL

-1

(em um tubo com capilar, Luggin,

com Vycor

na extremidade), respectivamente. Foi utilizado N

em todas as análises

(borbulhado na solução nos intervalos entre cada medida voltamétrica) para garantir a

retirada do O

dissolvido no meio. Os experimentos foram carreados em meio prótico

(solução aquoso-etanólica (7:3, v/v) tamponada, pH aparente de 4,5). Utilizando-se uma

concentração de 3 mmol L

-1

de biflorina. A análise dos dados foi realizada a partir de

gráficos obtidos nos experimentos, utilizando o programa Origin 6.0.

A técnica empregada para análise do comportamento eletroquímico do dsDNA e

ssDNA é a Voltametria de Pulso Diferencial (VPD). As medidas eletroquímicas foram

realizadas com o uso do equipamento AUTOLAB PGSTAT20 interligado a um

microcomputador.

Biossensores são definidos como dispositivos analíticos incorporados a um

material biológico (tecidos, microrganismos, organelas, enzimas, ácidos nucléicos, etc.),

a um material derivado biologicamente ou material similar, intimamente associado ou

integrado com um transdutor, que pode ser óptico, eletroquímico, termométrico,

piezoelétrico ou magnético.

O dsDNA (DNA nativo, “double-strand” ou fita dupla) sempre apresenta

menores correntes de eletrooxidação quando comparado ao ssDNA (DNA

desnaturado,“single-strand” ou fita única), desnaturado termicamente (Figura 25), não

só pelo fato de os sítios de oxidação estarem protegidos, porque envolvidos em ligações

hidrogênio, como também por sua menor flexibilidade e maior dificuldade de adsorção.

Figura 25: Voltamograma de Pulso Diferencial (Carbono Vítreo) para a mistura das bases guanina e

adenina (2.10

-5

molL

-1

); timina e citosina (2.10

-4

mol L

-1

). Tampão fosfato pH 7,4.

= 5 mV s

-1

amplitude 50 mV

Procedimento experimental

O DNA utilizado foi do tipo I, altamente polimerizado de calf thymus (timo de

bezerro), contendo 6,2% de Na e 13% de H

O, dessecado e armazenado à 8ºC. Usou-se

pinça para sua fragmentação e pesagem. Para preparação do gel de dsDNA, 25 mg de

dsDNA foram colocados em um microtubo juntamente com 2,0 mL de tampão acetato

(pH 4,5). O gel foi armazenado sob refrigeração por 24 horas, para completa dissolução

do DNA e formação do gel (o dsDNA não pode ser submetido ao ultra-som para não

comprometer a integridade da dupla hélice). 20 µL do gel foram colocados sobre a

superfície limpa e condicionada do eletrodo de carbono vítreo (BAS 3 mm) e então seco

com auxílio de um fluxo contínuo de nitrogênio. O eletrodo de carbono vítreo, após

polimento com pasta de diamante (1 micra) e alumina (3 micra), foi condicionado em

técnica de VPD (E

aplic.

= 0 a 1,4 V) a uma velocidade de 5 mV s

-1

em vários ciclos até a

completa estabilização da superfície do eletrodo (organização da dupla camada).

Imediatamente após secagem do gel de DNA, sobre a superfície do eletrodo modificado,

0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6

citosina

Timina

Adenina

Guanina

5 µ A

E / V vs Ag/AgCl

foram adicionados 20 µL da solução (10

-4

mol L

-1

) da substância-teste dissolvida em

etanol, prosseguiu-se o mesmo procedimento de secagem e então se analisou o

biossensor na região de E= 0 a 1,4 V usando a técnica de voltametria de pulso

diferencial. Foi realizado um branco (controle), em triplicata, adicionando apenas etanol

(20 µL) ao gel, para verificar se o etanol poderia interagir com o DNA. A medida

eletroquímica foi realizada utilizando um eletrodo apropriado para acondicionar a pasta

de carbono (Metrohm) modificada.

3.5.1. Inibição da enzima Topoisomerase I

Os efeitos inibitórios da biflorina (5, 10 e 30 µg/mL) em Topoisomerase I foram

mensurados usando o kit para screening de drogas (TopoGEN, Inc.). Duzentos e

cinquenta nanogramas (250 ng) de DNA foram incubados com 4 unidades de Topo I a

37 ºC por 30 min em tampão de relaxamento e na ausência e presença de biflorina (5, 10

e 30 µg/mL). Camptotencina (0,1mM) foi usada como controle positivo. A reação foi

terminada pela adição de 10% de SDS (2 µL) e proteinase K (50 µg/mL) e incubada a

37ºC por 30 min. As amostras foram submetidas a eletroforese em gel de agarose por 90

min, a temperatura ambiente, e visualizadas com brometo de etídio.

3.6. AVALIAÇÃO DO POTENCIAL CITOTÓXICO, GENOTÓXICO E

CLASTOGÊNICO IN VITRO EM LINFÓCITOS HUMANOS

3.6.1. Teste de citotoxicidade in vitro – Ensaio do Alamar Blue

O alamar blue, recentemente identificado como resazurina (O'BRIEN et al.,

2000), é um indicador fluorescente/colorimétrico com propriedades redox. Como com

os sais de tetrazólio, o alamar Blue reduz-se em células em proliferação. A forma

oxidada é azul (não fluorescente/célula não viável) e a forma reduzida é rósea

(fluorescente/célula viável). Este foi inicialmente utilizado para indicar crescimento

e/ou viabilidade celular no monitoramento de proliferação de linfócitos (AHMED et al.,

1994) e atualmente apresentas várias aplicações.

Procedimento Experimental

Com o intuito de se investigar a seletividade da biflorina em célula normal, foi

realizado o teste do Alamar Blue com linfócitos isolados de sangue periféricos de

doadores saudáveis. Os linfócitos obtidos foram isolados a partir de uma amostra de

cerca de 5 mL de sangue, acrescida de 5 mL de PBS. As etapas até o isolamento

incluíram a adição de 3 mL de Ficoll, seguida por 30 minutos de centrifugação a

1500rpm, e feita aspiração dos linfócitos, presentes na região intermediária entre as

hemácias e o soro (“nuvem de linfócitos”). A suspensão de linfócitos foi transferida

para um outro tubo ao qual foi acrescido PBS até o volume de 11 mL, sendo

centrifugado por 20 min a 1000 rpm. O sobrenadante foi descartado e o pellet de

linfócitos foi ressuspendido em 2 mL de PBS. Os linfócitos foram contados em câmara

de neubauer e expostos a droga por 72 h. Os linfócitos foram plaqueados em placas de

96 cavidades (2x10

células/poço em 100µL de meio). Após 24 h, (0,009-25 µg/mL) de

biflorina foi dissolvida em DMSO e adicionada em cada poço (usando o HTS-high-

throughput screening) e incubado por 72 h. A Dox foi usada como controle positivo

(0,009-5 µg/mL). Os grupos controle receberam a mesma quantidade de DMSO. Vinte e

quatro horas antes do final do tempo de incubação, 10 µL da solução estoque de Alamar

blue foi adicionado a cada poço da placa (figura 26).

Análise dos dados

A absorbância foi medida usando um leitor de placas. O efeito da droga foi

quantificado como a porcentagem da absorbância de controle em 570 nm e em 595 nm.

A absorbância do Alamar blue no meio de cultura e a absorbância do meio de cultura

sozinho é medido em um comprimento de onda mais alto e em um comprimento de

onda mais baixo. A absorbância do meio sozinho é subtraída da absorbância do meio

mais alamar blue lido no comprimento de onda mais elevado. Esse valor é chamado

AOHW. A absorbância do meio sozinho é subtraída da absorbância do meio mais

alamar blue, lido no comprimento de onda mais baixo. Esse valor é chamado AOLW. O

fator de correção R0 pode ser calculado pelo AOWH e AOLW, onde R0 =

AOLW/AOHW. A porcentagem da redução do alamar blue é expressa por: % reduzida

= AOLW – (AOHW x R0) x 100.

Linfócitos [ 2x10

cél/poço/100µL]

Meio RPMI 1640

SBF 209% e ANTB

Fito 4%

Plaqueamento 72 h

Leitura no

espectofotômetro

Absorbância em 570nm

e 595nm

Linfócitos [ 2x10

cél/poço/100µL]

Meio RPMI 1640

SBF 209% e ANTB

Fito 4%

Plaqueamento 72 h

Leitura no

espectofotômetro

Absorbância em 570nm

e 595nm

Absorbância em 570nm

e 595nm

Figura 26– Esquema representativo do método Alamar Blue.

3.6.2. Teste Cometa

A análise do cometa alcalino (SINGH et al., 1988), avalia a extensão da quebra

ao DNA após exposição de linfócitos a drogas suspeitas de potencial genotóxico. O

desenho experimental do estudo do cometa é determinado pela proposta da análise

levando em consideração a investigação do dano.

Procedimento Experimental

Os linfócitos foram obtidos de 4 voluntários saudáveis e isolados a partir de uma

amostra de cerca de 3mL de sangue, acrescida de 5mL de PBS. As etapas até o

isolamento incluíram a adição de 3 mL de Ficoll, seguida por 30 minutos de

centrifugação a 1500 rpm, e feita aspiração dos linfócitos, presentes na região

intermediária entre as hemácias e o soro (“nuvem de linfócitos”). A suspensão de

linfócitos foi transferida para um outro tubo ao qual foi acrescido com PBS até o

volume de 11 mL, sendo centrifugado por 20 min a 1000rpm . O sobrenadante foi

descartado e o pellet de linfócitos foi ressuspendido em 2 mL de PBS.

Foram usadas as concentrações de 15 e 30 µg/mL de biflorina. Como controle

positivo foi utilizado doxorrubicina (0,3 µg/mL), incubada com linfócitos por quarenta

minutos. Como controle negativo foram utilizados linfócitos sem a exposição de

qualquer droga.

Das amostras dos linfócitos tratados com biflorina e as dos controles positivo e

negativo, foi retirada uma alíquota de 10 µL de linfócitos, a qual foi adicionada a 110

µL de agarose 1,5%.

As lâminas foram previamente cobertas com 110 µL de agarose (NMP) a 60° C,

sendo mantida a temperatura ambiente por 24h até a solidificação da agarose.

As amostras estudadas foram colocadas sobre a lâmina, sendo, em seguida,

cobertas com lamínulas para uniformizar a distribuição do material e mantidas a 4°C

para solidificação da agarose.

As lâminas foram removidas da solução de lise, e neutralizadas por 15min na

solução de neutralização. Em seguida foram dispostas horizontalmente na cuba de

eletroforese e preenchida com tampão de corrida por 40min para permitir o

desempacotamento do DNA. A eletroforese foi conduzida em baixa luminosidade por

20 min, usando 20 V (volts) e a corrente de 300 mA. Após eletroforese as lâminas,

foram retiradas e mergulhadas na solução de neutralização durante 5 min, para

neutralizar a alcalinidade.

As lâminas foram fixadas em etanol 100%. Posteriormente, aplicou-se 30µL da

solução de Brometo de Etídio (20µg/mL) e foram cobertas com lamínula, sendo

analisadas em microscópio de fluorescência (figura 27).

Análise dos dados

A análise foi realizada de acordo com o padrão de escores previamente

determinados pelo tamanho e intensidade da cauda do cometa (figura 28). Foram,

contados 50 cometas/lâmina e classificados, de acordo com a percentagem de DNA na

cauda do cometa, indicando o grau de quebra do DNA, de acordo com a figura 28.

Os dados foram analisados a partir da média e do erro padrão da média de n

experimentos. Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os

diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA)

seguida por Teste de Turkey, com nível de significância de 5% (p < 0,05) no programa

GraphPad Prism versão 4.0.

Figura 27– Esquema representativo do método do cometa.

0 = sem danos (<5%)

¾ 1 = baixo nível de danos (5 – 20%)

¾ 2 = médio nível de danos (20 – 40%)

¾ 3 = alto nível de danos (40 – 95%)

¾ 4 = dano total (95%)

O índice de dano (ID) foi obtido em pela seguinte fórmula: ID = 400 -∑ Scores

(

)

(

)

(

)

Figura 28: Tipos de cometas: Representação dos cometas corados com brometo de etídeo e visualizados

mo microscópio de fluorescência, sendo indicado o escore atribuído para cada cometa de acordo com o

dano.

0 1 2

3 4

Análise da Cauda

3.6.3. Avaliação de Aberrações cromossômicas em linfócitos de sangue periférico

Existem três níveis de mutações, as mutações gênicas, as aberrações

cromossômicas estruturais como as deleções, duplicações, inversões e translocações e as

aberrações cromossômicas em número (KIRSCH-VOLDERS

et al., 2002). As

aberrações cromossômicas estão intimamente relacionadas a doenças como neoplasia,

na qual se verifica uma correlação positiva entre a freqüência de aberrações

cromossômicas nos linfócitos e o desenvolvimento do câncer e, com cerca de 50% dos

abortos espontâneos, os quais apresentam algum tipo de aberração cromossômica

(NATARAJAN, 2002).

Procedimento Experimental

Os linfócitos foram obtidos de 4 voluntários adultos saudáveis, dos quais foram

coletados 10mL de sangue periférico, em tubos heparinizados. Desse sangue foram

feitas culturas em meio apropriado, suplementado com 20% de soro bovino fetal e 4%

de fitoemaglutinina, o mitógeno que estimula o crescimento e divisão dos linfócitos,

que foram colocados em garrafas de cultura mantidas a 37

C em estufa de CO

. A ação

da biflorina foi avaliada nas fases G

, G1/S, S e G

do ciclo celular. As células em

cultura foram tratadas após 48 horas de estimulação com fitoemaglutinina.

Aproximadamente 90 minutos antes do término das incubações foi adicionada uma

solução de colchicina (0,016%) para interromper a divisão celular em metáfase. Após o

término do tempo de incubação, as culturas foram centrifugadas e fixadas (3 metanol: 1

ácido acético) para a confecção das lâminas. As lâminas foram coradas com Giemsa

diluído em tampão fosfato 0,06 M, pH 6,8, foram analisadas, sempre, em teste cego

(figura 29).

Análise dos dados

A análise foi realizada em metáfases bem espalhadas, sem sobreposição e em

células com 21±1 cromossomos. Foram analisadas pelo menos 100 metáfases por

cultura em microscópio de luz e em objetiva de imersão. Foram feitas duplicatas de

cada concentração, além dos controles negativo (veículo da preparação) e positivo

(Doxorrubicina 0,01µg/mL). Os dados foram analisados a partir da média e do erro

padrão da média de n experimentos. Para verificação da ocorrência de diferenças

significativas entre os diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de

variância (ANOVA) seguida por Teste de Turkey, com nível de significância de 5% (p

< 0,05) no programa GraphPad Prism versão 4.0.

Colchicina - 70h Cultura das células

Visualização

Colchicina - 70h Cultura das células

Visualização

Figura 29: Esquema representativo do método de aberrações cromossômicas em linfócitos.

3.7. AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIOXIDANTE

3.7.1. Autoxidação do Ácido oléico

A oxidação do ácido oléico [ácido 9(Z)-octadecenóico], um ácido de gordura

monoinsaturado, o maior constituinte dos triglicerídeos, foi monitorado por seis dias,

como descrito por Masuda e colaboradores (1992).

Procedimento experimental

Dois miligramas de biflorina foram diluídos em 4,0 mL de EtOH, 4,1 mL de

ácido oléico(2,53%) diluido em RtOH, 8,0mL de tampão fosfato e 3,9mL de água

destilada foi colocada em um frasco de 50mL com tampa e colocado em um forno a 40º

C no escuro. A oxidação do ácido oléico foi monitorada da seguinte forma: para 0,1mL

da amostra foi adicionada 9,7mL de EtOH (75%), 0,1mL de tiocianato de amônio

(30%) e 0,1mL de cloreto ferroso (0,2nM) diluido em HCl (3,5%) para misturar a

reação e após exatamente 3 min, foi lida a absoirbância em 500nm, por dia durante seis

dias.

3.7.2. Atividade antioxidante para determinação da remoção de radicais livres por

DPPH (Método do radical livre DPPH)

O ensaio do DPPH é uma das metodologias antioxidantes mais conhecidas e

frequentemente utilizada. O DPPH (1,1-difenill - 2-picrilhidrazyil) é um radical livre

estável devido sua deslocalização de elétrons ao longo da molécula. Essa deslocalização

promove uma coloração violeta em torno de 520nm. Quando uma solução de DPPH é

misturada a um substrato agindo como um doador de hidrogênio o DPPH é obtido pela

mudança simultânea da cor violeta para amarelo pálido (MOLYNEUX &

SONGKLANAKARIN,2004).

Procedimento experimental

O efeito antioxidante da biflorina, assim como do Trolox® (vitamina E

hidrosolúvel), Butl hidroxitolueno (BHT) e Vitamina C (ácido ascórbico) foi avaliado

pela intensidade de emissão de fluorescência de DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil).

DPPH a 60

µM foi misturado a três concentrações de Biflorina (250, 125 and 62.5

µg/mL) e incubado por 30 minutos a temperatura ambiente. A absorbância foi então

medida a 520nm. A biflorina e o DPPH foram, então, dissolvidos em etanol e a

porcentagem do efeito redutor foi obtida por comparação da absorbância da solução

teste à solução controle. Trolox

, BHT

e Vitamina C foram usados como controles

positivos.

3.7.3. Hipoxantina/xantina oxidase

Procedimento experimental

Este ensaio foi utilizado para também avaliar o potencial antioxidante in vitro da

biflorina e se baseou no método descrito por Owen

et al., 1996. Biflorina doi dissolvida

no tampão experimental (1,0 mL - hypoxanthine, Fe (III), EDTA and salicylic acid)

adicionado a hexano 2% e testads nas concentrações de 0,1 a 2 mg/mL. O hexano foi o

diluente de escolha por o DMSO tem uma pronunciada ação antioxidativa. Um alíquota

de 5µL de xantina oxidade (18mU) dissolvida em 3,2 M NH

foi utilizada para

iniciar a reação. Após incubação por 3h a 37 °C, 30µL da mistura reacional foi

analisada por CLAE usando uma coluna cromatográfica C18 de fase reversa eluída com

gradiente de metanol/água/ácido acético. A produção de dihidroxifenol (ácido 2,5-

dihidroxibenzóico e ácido 2,3-dihidroxibenzóico) pela reação de ácido salicílico aos

radicais hidroxi (OH

•

) liberados foi detrminado por curvas padrão dos respectivos

dihidroxifenóis.

3.8. ATIVIDADE BIOLÓGICA E GENOTÓXICA EM CÉLULAS V79

3.8.1. Cultura de células V79

Fibroblastos de hamster chinês (células V79) foram cultivadas sob condições

padrão em meio MEM com sais de Earle, suplementado com 10% de soro fetal bovino,

2 mM de L-glutamina e 1% de antibióticos (100 IU/mL penicillina e 100 lg/mL

estreptomicina). As células foram mantidas em frascos de cultura (Nunc, 25 cm

) a

temperatura de 37 ºC e atmosfera umidificada a 5% CO

e resgatadas com tripsina

0,15% e EDTA 0,08% diluídos em PBS. 3 x 10

células foram plaqueadas com 5% de

meio completo e crescidas por 2 dias antes do início do tratamento. A biflorina foi

testada em 2,5, 5,0, 10,0 e 30,0 µg/mL na ausência ou presença de peróxido de

hidrogênio (100 mM). A concentração final de DMSO no meio foi mantida constante e

inferior a 0,5% (v/v).

3.8.2. Avaliação da citotoxicidade a partir da sobrevivência clonal

Uma cultura logarítimica de células V79 foi crescida de acordo com o protocolo.

Em seguida, as células foram tripsinizadas e 500 células foram plaqueadas em placas de

60 mm para determinar a habilidade de formação de colônia. Biflorina foi adicionada ao

meio após a adesão das células. Após 5 dias de incubação, as células foram fixadas em

etanol e as colônias com 50 ou mais células foram coradas com Giemsa, contadas e a

porcentagem de sobrevivência foi calculada relativa ao controle.

3.8.3. Avaliação da peroxidação lipídica

A indução de peroxidação lipídica por biflorina foi avaliada a partir da reação de

TBA com malondialdeído (MDA), um produto de peroxidação lipídica. Células V79

(3x10

cells) foram incubadas com biflorina em diferentes concentrações por 3h em

meio livre de FBS, após lise com Tris-HCl (15mM por 1h). Dois mililitros (2 mL) de

TBA (0,4 mg/mL) e HCl 0,25M foram adicionados ao lisado. Após incubação com

TBA 6,7 mg/mL por 15 minutos a 100 ºC, a mistura foi centrifugada por 10 minutos a

750G. TBA reage com produtos de peroxidação lipídica, distintos de MDA. Os

resultados foram expressos nos termos de espécies reativas de tiobarbitúricos (TBARS)

como determinadas pela absorbância a 523 nm. TMP hidrolizado foi usado como

padrão. Os resultados foram normalizados pelo conteúdo de proteínas.

Análise dos dados

Os resultados foram analisados estatisticamente utilizando o teste ANOVA-

Tukey, comparando-se os tratamentos com o controle negativo. Foi considerado

estatisticamente significativo P < 0,05.

3.8.4. Teste Cometa

Células V79 foram incubadas por 3h com diferentes concentrações de biflorina

(2,5, 5,0, 10,0 and 30,0 µg/mL) com ou sem peróxido de hidrogênio (incubado por 1h)

ou com uma pequena modificação, foram tratadas com ou sem as enzimas EndoIII e

Fpg. As células foram lavadas com PBS gelado, removidas com 100 µL de tripsina

0,15% e ressuspensas em meio completo. Em seguida, 20 µL da suspensão de células (2

x10

cells/mL) foi dissolvido em 0,5% em agarose com baixo ponto de fusão e

imediatamente espalhada sobre uma lâmina pré-tratada com 1% de agarose com baixo

ponto de fusão. O ensaio do cometa foi realizado como descrito anteriormente. A

análise foi realizada por coloração com nitrato de prata e as células foram contadas em

microscópio óptico.

3.9. POTENCIAL GENOTÓXICO EM DIFERENTES SISTEMAS

BIOLÓGICOS

3.9.1 Detecção da atividade citotóxica, mutagênica e antimutagênica em

Saccharomyces cerevisiae

A levedura S. cerevisiae é um fungo unicelular do tipo ascomicete, com ciclo

eucariótico típico e completo, e notavelmente semelhante às células de mamíferos no

que se refere às macromoléculas, organelas e proteínas com homologia a proteínas

humanas, tornando-a uma ferramenta importante nas pesquisas sobre mutagênese,

reparo do DNA e mecanismos que respondem ao estresse oxidativo (COSTA E

FERREIRA, 2001), podendo ser cultivado facilmente em condições adequadas, tanto na

fase haplóide como na diplóide. Em geral, o tempo de duplicação das leveduras a 28-30

C, tendo glicose como fonte de carbono, é de aproximadamente 90 minutos.

Procedimento Experimental

Para os ensaios de mutagênese e antimutagênese em leveduras foi utilizada a

linhagem XV185-14c e para o ensaio de recombinogênese foi utilizada a linhagem

XS2316 de

S. cerevisiae. O crescimento das células de Saccharomyces cerevisiae foi

feito em meio líquido completo (YEL) contendo 1% de extrato de levedura, 2% de

bactopeptona e 2% de glicose. Para determinação do número de células viáveis, ou seja,

unidades formadoras de colônias foram feitas semeaduras em meio YEPD solidificado

com 2% de bacto-agar.

Em frasco de Erlenmeyer contendo 30 mL de YEL foi inoculada uma colônia

isolada dessa linhagem e colocada para crescer em ‘shaker’, a 180 rpm e 30

C, durante

48 horas, para atingir a fase estacionária. As culturas assim mantidas atingiram uma

concentração de 2 a 4 x10

céls/mL. Posteriormente, esta suspensão foi passada para um

tubo Falcon de 50 mL e centrifugada por 5 minutos a 5000 rpm. Após esta primeira

centrifugação, o sobrenadante foi desprezado e foram adicionados 20 mL de solução

salina, seguida de centrifugação para lavagem das células. As células foram contadas

em câmera de Neubauer no microscópio óptico e foram feitas as diluições necessárias

para se obter a concentração celular desejada para o tratamento. Uma suspensão celular

de 2x10

células/mL em fase estacionária foi incubada durante 20 horas a 30

C, sob

agitação a 180 rpm, com doses crescentes (50-500 µL/mL de suspensão celular) da

amostra

. Foi determinada a sobrevivência através de semeadura em meio rico YEPD,

após 3-5 dias de crescimento em estufa a 30

C. Para a detecção de mutação induzida

(revertentes LIS, HIS ou HOM) as células foram incubadas em meio mínimo seletivo,

durante 3-5 dias a 30

C. As células foram tratadas na presença e ausência de peróxido

de hidrogênio para avaliar a capacidade antimutagênica da biflorina, quando as células

após pré-tratamento com biflorina, fossem expostas aos danos induzidos pelo peróxido

de hidrogênio. A mutação

his1-7 é um alelo de sentido incorreto ou missense, do tipo

não supressivo, e, portanto, as reversões são a conseqüência de mutações no próprio

lócus. Entretanto, o alelo

lys1-1 corresponde a uma mutação do tipo ocre sem sentido

(

nonsense), a qual pode ser revertida de forma lócus específico ou através de mutação

para frente (mutação forward) em um gene supressor. A diferença entre as reversões

verdadeiras e mutações supressoras (

forward) no lócus lys1-1 está bem descrita por

Schüller e Von Borstel (1974), onde o conteúdo de adenina reduzido no meio SC-lys

mostra reversão no lócus quando as colônias são vermelhas e mutações supressoras

quando as colônias ficam brancas. Acredita-se que

hom3-10 contenha mutação do tipo

deslocamento do quadro de leitura ou

frameshift, devido a sua resposta a uma série de

agentes sabidamente mutagênicos.

Para avaliar a recombinogênese, a suspensão de (2 x10

células / mL) de células

diplóides na fase exponencial, foi incubada durante 18 horas a 30 ° C em PBS com

diferentes concentrações de biflorina. Após o tratamento, as células foram diluídas em

PBS, plaqueadas, em três diferentes meios de cultura (SC, SC - leu e SC + cyh) e

incubadas durante 5-7 dias a 30º C. Quando o efeito protetor foi investigado, as células

foram incubadas com biflorina, lavadas e expostas a 4 mM peróxido de hidrogênio a

30°C em PBS no escuro sob agitação. Após a exposição, as células foram contadas,

diluídas e plaqueadas em meio específico. As colônias cultivadas em meio SC indicam

a sobrevivência e as colônias de células cultivadas em SC - leu e SC + cyh indicam

recombinação mitótica intragênica (transformação genética) e recombinação intergênica

(crossing-over), respectivamente. A fim de medir a exata frequência de crossing-over

para eliminar a possibilidade de que alguma colônia reistente a cicloheximida resultar

em reversão no lócus CYH2 legitimidade, bem como de monossomia do cromossomo

VII. Portanto, as colônias resistentes a cycloheximida foram plaquedas sobre uma série

placas com meio SC - lys, SC - se reuniu e SC -, com posterior triagem desses

marcadores para cyh2. Ensaios foram realizados em quatro placas em triplicata para

cada dose.

Análise dos dados

Os ensaios com S. cerevisiae, os resultados foram analisados estatisticamente

utilizando o teste ANOVA-Dunett, comparando-se os tratamentos com o controle

negativo. Foi considerado estatisticamente significativo P < 0,05.

3.9.2. Teste em

Salmonella thiphymurium – teste de Ames

O teste

Salmonella/microssoma, desenvolvido pelo Dr. Bruce Ames e

colaboradores na década de 70 (AMES 1975; 1979), é um ensaio bacteriano de curta

duração que busca identificar substâncias causadoras de danos genéticos que possam

levar a mutações (MARON e AMES, 1983 e MORTELMANS E ZEIGER, 2000).

O teste usa linhagens de

Salmonella typhimurium com mutações pré-existentes

onde a bactéria fica impossibilitada de sintetizar o aminoácido histidina e não forma

colônias na sua ausência no meio de cultura. Observa-se, porém que novas mutações

nos sítios das mutações pré-existentes podem restaurar a função do gene para a síntese

de histidina e formar colônias, conseqüentemente as células mutadas passam a crescer

na ausência de histidina. Por esta razão este teste é referido como de mutação reversa

(MARON e AMES, 1983; MORTELMANS e ZEIGER, 2000).

Procedimento Experimental

Foram utilizadas as linhagens TA97a, TA98, TA100, TA102 e TA1535 de

Salmonella typhimurium. Para cada experimento, as culturas das linhagens-teste

cresceram pelo período de uma noite em caldo nutriente Oxoid N

2, até a densidade de

1-2x10

unidades formadoras de colônias (UFC)/mL. As culturas foram colocadas em

agitador (100rpm) a 37

C, ao abrigo de luz, por 11-14 horas. As doses foram

selecionadas por um ranging find na cepa TA100. Onde foram escolhidas 5 doses para o

teste, as amostras foram de 66,00 a 333,30 µg/placa. Foi utilizada a fração microssomal

- S9 que é composta por um homogenato de fígado de células de rato. A fração S9 é

acrescida de co-fatores adequados e necessita de condições de pH específicas para que

as reações de metabolização possam ocorrer. Para avaliar a atividade mutagênica foi

utilizado o teste de incorporação em placas, que consiste na exposição da (s) linhagem

(s) testadora (s) e a amostra a testar em placa de Agar glicose mínimo na presença e

ausência de sistema de avaliação metabólica S9 (0,5 mL). Os diferentes componentes

foram, primeiramente, adicionados aos tubos de teste esterilizados contendo 2 mL de

Agar de superfície líquido suplementado com histidina e biotina, mantendo-os a

temperatura de 45

C. Os conteúdos dos tubos foram misturados, homogeneizados e

vertidos sobre a superfície de uma placa contendo Agar mínimo. Após solidificação do

Agar de superfície, as placas foram incubadas invertidas e ao abrigo da luz, por 48h, a

C. O ensaio foi realizado em triplicata (GATEHOUSE et al., 1994). Procedeu-se,

então, a contagem do número de revertentes em todas as placas.

Análise dos dados

Na análise do teste Salmonella/microssoma, os resultados são expressos em

revertentes/placas ou pela razão de mutagenicidade (RM), também denominada de

índice de mutagenicidade (IM) e o número de revertentes na placa-controle

(espontâneos), permitindo comparação de resultados entre diferentes linhagens. Para o

estudo da diferença entre doses e entre repetições, foi utilizada ANOVA, seguida de

análise de regressão linear da curva dose-resposta.

30ºC / 37ºC

Cepas Inóculo

Diluição

Plaqueamento

Contagem das colônias

30ºC / 37ºC

Cepas Inóculo

Diluição

Plaqueamento

Contagem das colônias

30ºC / 37ºC

Cepas Inóculo

Diluição

Plaqueamento

Contagem das colônias

30ºC / 37ºC

Cepas Inóculo

Diluição

Plaqueamento

Contagem das colônias

Figura 30: Esquema representativo dos testes em bactérias e leveduras.

3.9.3. Micronúcleos de medula óssea de camundongos

O teste do Micronúcleo em medula óssea de roedores in vivo é amplamente

aceito pelas agências internacionais e instituições governamentais.

O teste do Micronúcleo é o ensaio

in vivo mais amplamente utilizado para

detecção de agentes clastogênicos (que quebram cromossomos), e de agentes

aneugênicos (que induzem aneuploidia ou segregação cromossômica anormal)

(MACGREGOR

et al., 1987; HAYASHI et al., 1994). Esse teste foi inicialmente

desenvolvido em eritrócitos de medula de camundongos, mas pode ser feito em medula

de ratos.

As características gerais do teste são (1) o efeito do agente químico é observado

em eritrócitos policromáticos anucleados (PCEs); (2) o eritrócito policromático tem um

tempo de vida relativamente curto, de modo que qualquer micronúcleo que ele contenha

deve ter sido gerado como resultado de danos induzidos recentemente; (3) os

micronúcleos são facilmente identificáveis e a sua distribuição é bem definida; e (4) a

freqüência de micronúcleo induzida em eritrócito policromático é dependente do tempo

de amostragem (figura 31).

Preparo dos animais para o teste do micronúcleo

Os animais foram expostos à substância teste por via intraperitoneal e

sacrificados nos tempos de 24 e 48 horas após o tratamento para a retirada da medula

óssea dos camundongos. Foram utilizados animais saudáveis, adultos jovens (entre 6 e 8

semanas de idade), distribuídos ao acaso, tanto para o grupo controle como para os

grupos tratados. Os animais, identificados individualmente, foram aclimatados às

condições do biotério por pelo menos 3 dias antes do início do estudo. A variação de

peso dos animais foi mínima, não excedendo a 20% do peso médio de cada sexo. Em

cada grupo controle e tratados com a substância teste, foram incluídos 5 animais de cada

sexo, a temperatura da sala de manutenção dos animais foi de 22

C (± 3

C) e um ciclo

de luz 12h claro/12h escuro. Os animais foram mantidos em caixa de polipropileno em

pequenos grupos (máximo 5), do mesmo sexo e em estantes ventiladas. Para a

alimentação, foi utilizada água filtrada e ração para camundongos oferecidos sem

restrição de quantidade. As substâncias foram dissolvidas em DMSO no momento do

tratamento dos animais. Grupos de animais controles negativo e positivo foram

incluídos em cada estudo e foram testados ao mesmo tempo em que os grupos tratados.

Os animais do grupo controle negativo foram tratados somente com o solvente/veículo.

Foi utilizado um grupo controle para cada tempo de amostragem.

Procedimento Experimental

Os animais foram tratados com a substância teste uma única vez, as amostras de

medula óssea foram coletadas em dois momentos após a administração da substância

teste: 24 e 48h. Como controle positivo foi utilizado etilmetanosulfonato (EMS, CAS

62-50-0), 200mg/kg. Após o sacrifício do animal, uma amostra do material de medula

óssea foi coletada dos fêmures, em uma pequena quantidade (3 mL) de soro bovino

fetal. As preparações celulares foram coradas adequadamente com Leishman e

analisadas para a presença de micronúcleos. Foram preparadas duas lâminas de cada

animal (figura 32).

Todas as lâminas, incluindo aquelas do controle positivo e negativo, foram

codificadas antes da análise. A proporção de eritrócitos imaturos (PCE) dentre o total de

eritrócitos (PCE + NCE) foi determinada contando-se pelo menos 200 eritrócitos (PCE

+ NCE) por animal. Para avaliação de células micronucleadas, foram analisados pelo

menos 2000 PCE por animal.

Análise dos dados

Os dados foram analisados a partir da média e do erro padrão da média de n

animais. Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes

grupos, os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida por

Teste de Turkey, com nível de significância de 5% (p < 0,05) no programa GraphPad

Prism versão 4.0.

ERITROBLASTO

ERITR

CITO

POLICROM

TICO

ERITR

CITO

NORMOCROM

TICO

HEM

CIA

24h (1 dia)

PROCESSO DE MATURA

ÃO ERITROCIT

RIO

MEDULA ÓSSEA

SANGUE

12 horas

24 horas

PCEs

MACRÓFAGO

vasos

ERITROBLASTO

EXPULSÃO DO NUCLEO

ERITROBLASTO

ERITR

CITO

POLICROM

TICO

ERITR

CITO

NORMOCROM

TICO

HEM

CIA

24h (1 dia)

PROCESSO DE MATURA

ÃO ERITROCIT

RIO

MEDULA ÓSSEA

SANGUE

12 horas

24 horas

PCEs

MACRÓFAGO

vasos

ERITROBLASTO

EXPULSÃO DO NUCLEO

Figura 31: Esquema representativo da formação de micronúcleos.

Após tratamento

24 e 48 h

RETIRADA

DO FÊMUR

soro

Centrifugação

Visualização

Após tratamento

24 e 48 h

RETIRADA

DO FÊMUR

soro

Centrifugação

Visualização

Figura 32: Esquema representativo do método de micronúcleos in vivo.

4.1. ATIVIDADE CITOTÓXICA IN VITRO

4. 1. 1. Teste de citotoxicidade em células de linhagens tumorais – Teste do MTT

A atividade citotóxica da biflorina foi avaliada pelo método do MTT e os

resultados estão representados na tabela 3. A biflorina mostrou-se inespecífica e com

uma atividade citotóxica variada, porém com CI

variando de 0,43 a 14,61 µg/mL.

Tabela 3 - Efeito inibitório da biflorina e da doxorrubicina (controle positivo) de

células em cultura em 16 diferentes linhagens tumorais. Os valores apresentados

referem-se a CI

(µg/ml) e o intervalo de confiança de 95% obtido por regressão

não linear.

LINHAGEM CELULAR

Biflorina

µg/mL (µM)

Doxorrubicina

µg/mL (µM)

Linhagens Leucêmicas

HL-60

1,95 (6,30)

1,26 – 2,69

0,02 (0,03)

0,01 – 0,02

CEM

1,02 (3,30)

1,24 – 1,96

0,02 (0,03)

0,01 – 0,02

K 562

2,43 (7,86)

1,41 –2,372

0,14 (0,24)

0,09-0,22

Linhagens de Mama

MCF-7

0,43 (1,30)

1,28 – 1,768

0,20 (0,34)

0,17 – 0,24

MDA MB 231

14,61 (47,26)

11,54-18,50

0,22 (0,37)

0,18-0,26

MX 1

1,11 (3,61)

0,98 –1,29

0,076 (0,13)

0,054-0,10

Linhagens de Pulmão

NCI H266

0,86 (2,80)

0,67 – 1,12

0,15 (0,26)

0,13-0,18

NCI H23

0,58 (1,88)

0,51 - 0,6584

0,065 (0,11)

0,058 – 0,074

Linhagens de Melanoma

M14

2,34 (7,02)

1,85-2,95

0,30 (0,15)

0,16-0,55

UACC – 257

1,48 (4,44)

n.d.

0,27 (0,45)

0,23-0,32

UACC – 62

1,67 (5,01)

1,55-1,8

0,09 (0,5)

0,08-0,99

MDA MB 435

0,65 (2,10)

1,726 – 3,451

0,47 (0,81)

0,34-0,65

B16 (murino)

10.12 (16.86)

6,98 -14,67

0,03 (0,05)

0,02 – 0,04

Outras Linhagens

PC3 (Próstata)

6,09 (19,7)

4,17-8,89

0,45 (0,77)

0,38-0,68

SF295 (SNC)

0,63 (2,02)

0,567 – 0,69

0,16 (0,27)

0,13-0,23

HCT-8 (Cólon)

0,88 (2,80)

4,73 – 12,5

0,04 (0,07)

0,03 – 0,05

n.d. – não determinado

4.1.2. Teste da atividade antimitótica em ovos de ouriço-do-mar

A biflorina não foi capaz de causar inibição do desenvolvimento de ovos de

ouriço-do-mar, diferente do que ocorreu com o controle positivo (doxorrubicina), que

inibiu o desenvolvimento embrionário em baixas concentrações (Tabela 4).

Tabela 4 - Atividade antimitótica da biflorina e da doxorrubicina (controle

positivo) em desenvolvimento de ovos de ouriço do mar (Lytechinus variegatus). Os

dados mostram os valores da IC

(µg/mL) e o intervalo de confiança (IC 95%) na

primeira e terceira clivagem e na blástula obtido por regressão não linear.

Substância

clivagem

µg/mL (µM)

clivagem

µg/mL (µM)

Blástula

µg/mL (µM)

Biflorina

> 100,0 (194,5)

Doxorrubicina

6,28 (10,83)

4,34 – 9,09

0,34 (0,59)

0,16 – 0,73

0,54 (0,93)

0,27 – 1,07

4.1.3. Atividade hemolítica

O efeito hemolítico da biflorina foi avaliado em eritrócitos de camundongos Mus

musculus

. Neste ensaio, observou-se ausência de atividade hemolítica nas concentrações

testadas (1,5 a 200 µg/mL). São consideradas ativas aquelas substancias que

apresentaram CE

< 200 µg/mL.

4.2. ESTUDO DO MECANISMO DE AÇÃO NO MODELO DE MELANOMA

MURINO IN VITRO

A linhagem de melanoma murino (B16), foi utilizada como modelo para

avaliação de atividade do mecanismo de ação e inibição tumoral

in vitro e in vivo,

respectivamente, pela possibilidade de poder usar a mesma célula em ambos os

modelos.

4.2.1. Análise da Viabilidade celular – Exclusão por azul de tripan

Os experimentos foram realizados em células B16, 24 horas após a incubação de

biflorina, em concentrações correspondentes a 1,5, 3,0 e 6,0 µg/mL com base no seu

valor CI

após 24 horas incubação (2,95 µg/mL). A exclusão pelo teste de azul de

tripan foi realizada para avaliar a viabilidade celular (figura 33). Em todas as

concentrações, a biflorina reduziu a viabilidade celular (p <0,01). No entanto, a

biflorina não provocou aumento significativo no número de células não viáveis em

nenhuma concentração testada (Figura 16) A doxorrubicina foi usada como controle

positivo na concentração de 0,3 µg/mL causando redução de 65,5% das células viáveis

(figura 33).

Biflorina

(µg/mL)

1.5

3.0 6.0

Células Não Viáveis

Células Viáveis

Número de células

(X 10

/mL)

Figura 33: Determinação da viabilidade celular analisada por azul de tripan das células B16 tratadas com

biflorina após 24 h de incubação. Controle Negativo (C) foi tratado com o veículo usado para diluir a

substância. Doxorrubicina (0,3 µg/mL) foi usada como controle positivo (D). Os dados são apresentados

como valor das médias ± D.P. em dois experimentos independentes em duplicata (n=4). *, p < 0,01 **

p<0,001 comparado ao controle pelo teste de ANOVA seguido pelo teste Student Newman-Keuls.

4.2.2. Análise morfológica – Coloração por hematoxilina/eosina

A análise morfológica das células B16, tratadas em relação às células não

tratadas, revelou alterações mediadas pela biflorina (Figura 34). As células tratadas com

biflorina, em todas as concentrações testadas (1,5, 3,0 e 6,0 µg/mL), apresentaram

morfologia compatível com apoptose, incluindo uma redução de tamanho das células,

vacúolos intracelulares e formação de “bleebings”. Além disso, a biflorina causou um

aumento do número de figuras mitóticas em diferentes fases do ciclo celular, sugerindo

um mecanismo de ação de droga, não-seletivo para as diferentes fases do ciclo celular.

A doxorrubicina também induziu redução das células, condensação de cromatina

nuclear e fragmentação, morfologia compatível com apoptose.

100

Metáfase atípica

Alinhamento

em fileira

Anáfase

Metáfase

Prófase

Metáfase

Anáfase

Metáfase tardia

Prófase

Figura 34: A – Controle: Células viáveis exibindo irregularidades na membrana plasmática, núcleos vesiculosos,

cromatina uniformemente distribuída. Células em metáfase. B - Dox: Rarefação celular / redução do tamanho das

células / vacúolos na periferia do citoplasma / irregularidades da membrana plasmática. Rarefação celular /

Vacúolos na periferia das células / Restos celulares. C, D: Biflorina 1,5µg/mL - Células com tamanho reduzido /

Células aglomeradas e em fileira / Aumento de “bleebings” / Vacúolos na periferia / Figuras mitóticas. E: Biflorina

3,0 µg/mL - Células paradas em fases diferentes do ciclo celular (predomina em metáfase tardia e anáfase) /

Diminuição do número de células / Aumento de células com “bleebings”/ Células com vacúolos periféricos. F:

vacúolos no citoplasma B 6,0 µg/mL – HE Diminuição do número de células / células com tamanho pequeno /

células em apoptose / vacúolos, bleebings/ células em metáfase tardia. G,H: células apoptóticas/ rarefação celular

101

4.2.3. Análise morfológica – Coloração diferencial por Laranja de Acridina/

Brometo de Etidio

A morfologia de células tratadas foi investigada utilizando LA / BE coloração

para microscopia fluorescente. Foi calculada a percentagem de células viáveis, células

apoptóticas e necróticas. Células uniformemente verdes com morfologia normal foram

observadas no grupo controle atingindo mais de 90% das células contadas. As células

tratadas com biflorina apresentaram um número crescente de células em apoptose nas

concentrações de 3,0 e 6,0 µg/mL (p <0,05, figura 35); apenas na maior concentração,

foram encontradas células necróticas. Além disso, as células tratadas com doxorrubicina

também mostraram características apoptóticas.

1,5 3,0 6,0

(µg/mL)

Biflorina

Viáveis

Apoptóticas

Necróticas

Número de células (%)

Figura 35: Determinação da viabilidade celular por laranja de acridina e bromteo de etídio (LA/BE) das

células B16 tratadas com biflorina utilizando coloração por microscopia de fluorescência. Controle

Negativo (C) foi tratado com o veículo usado para diluir a substância. Doxorrubicina (0,3 µg/mL) foi

usada como controle positivo (D). Os dados são apresentados como valor das médias ± D.P. em dois

experimentos independentes em duplicata (n=4). *, p < 0,05 comparado ao controle pelo teste de

ANOVA seguido pelo teste Student Newman-Keuls.

102

4.2.4. Síntese de DNA por incorporação de BrDU

Neste ensaio, foi avaliada a capacidade proliferativa das células tratadas em

comparação as não-tratadas pela incorporação de BrdU no DNA (figura 36). Em todas

as concentrações testadas, a inibição da síntese do DNA fo

i significativamente

diminuída (p <0,05) em relação ao controle negativo. A biflorina inibiu a incorporação

do BrdU em 33,02%, 29,95% e 43,16%,nas concentrações de 1,5, 3,0 e 6,0 µg/mL,

respectivamente. A doxorrubicina, que foi utilizado como controle positivo, e causou

inibição de síntese de DNA em 88,92% das células.

C D 1,5 3,0 6,0

(µg/mL)

Biflorina

BrdU-células

positivas (%)

Figura 36: Inibição do 5-bromo-2´-deoxyuridina (BrdU) incorporado pelas células B16 tratadas com

biflorina. Controle Negativo (C) foi tratado com o veículo usado para diluir a substância. Doxorrubicina

(0,3 µg/mL) foi usada como controle positivo (D). Os dados são apresentados como valor das médias ±

D.P. em dois experimentos independentes em duplicata (n=4), a porcentagem da positividade do BrdU

em 200 células. *, p < 0,05 comparado ao controle pelo teste de ANOVA seguido pelo teste Student

Newman-Keuls.

103

4.2.5. Análise do ciclo celular e fragmentação de DNA

A análise do ciclo celular das células tratadas com biflorina não evidenciou

interferência em nenhuma fase específica em relação às células não tratadas

(Figura 20). Contudo, foi observado um aumento na fragmentação de DNA de até

33,5 % na concentração de 6,0 µg/mL, enquanto havia 13% de DNA fragmentado

no controle negativo (figuras 37 e 38).

Figura 37: Histogramas de ciclo celular analisados no ModFit LT 3.1 pelo modelo Sync Wizard. Eixo x:

intensidade de fluorescência e eixo y: números de células 0,3 x 10

após 24 h de incubação. A, sem

tratamento; B, doxorrubicina a 0,3 µg/mL; C, D e E Biflorina nas concentrações de 1,5; 3,0 e 6,0 µg/mL

respectivamente. Valores representados pela média ± E.P.M.

Channels

(

RED-HLin-Red Fluorescence

(

RED-HLin

))

0 40 80 120 160 20

Number

0 50 100 150 200

Channels

(

RED-HLin-Red Fluorescence

(

RED-HLin

))

0 40 80 120 160 20

Number

0 30 60 90 120

Channels

(

RED-HLin-Red Fluorescence

(

RED-HLin

))

0 40 80 120 160 20

Number

0 80 160 240 320

Channels

(

RED-HLin-Red Fluorescence

(

RED-HLin

))

0 40 80 120 160 20

Number

0 60 120 180 240

Channels

(

RED-HLin-Red Fluorescence

(

RED-HLin

))

0 40 80 120 160 20

Number

0 40 80 120 160

Debris

G0G1

G2M

S-Phase

5,16% 30,41%

6,12%

10,68%

23,00%

104

C D 1,5 3,0 6,0

Biflorina

(µg/mL)

Fragmentação de DNA

Internucleossomal (%)

Figura 38: Determinação da fragmentação internucleossomal do DNA de células B16 por citometria de

fluxo usando iodeto de propídio, Triton X-100 e citrato após 24h de incubação com biflorina. Controle

Negativo (C) foi tratado com o veículo usado para diluir a substância. Doxorrubicina (0,3 µg/mL) foi

usada como controle positivo (D). Os dados são apresentados como valor das médias ± E.P.M. em três

experimentos independentes em triplicata (n=9). *, p < 0,05 comparado ao controle pelo teste de ANOVA

seguido pelo teste Student Newman-Keuls.

4.2.6. Potencial transmembrana da mitocôndria

A análise do potencial transmembrana da mitocôndria das células tratadas com

biflorina foi realizada por citometria de fluxo com coloração por rodamina 123.

Foi observada despolarização da mitocôndria em todos os tratamentos 1,5, 3,0 e

6,0µg/mL (figura 39).

105

Figura 39: Determinação do efeito da biflorina sobre o potencial transmembrana em células B16 por

citometria de fluxo usando rodamina 123 após 24 h de incubação. Controle Negativo (A) foi tratado com

o veículo usado para diluir a substância. Doxorrubicina (0,3 µg/mL) foi usada como controle positivo (B).

(D) Dados das células tratadas com biflorina 1,5 µg/mL e (E) e (F) foram tratados com biflorina 3,0 e 6,0

µg/mL respectivamente. Cinco mil eventos foram analisados em cada experimento. Os dados são

apresentados como valor das médias ± E.P.M. em três experimentos independentes em triplicata (n=9). *,

p < 0,05 comparado ao controle pelo teste de ANOVA seguido pelo teste Student Newman-Keuls.

4.3. ATIVIDADE ANTITUMORAL EM MODELOS ANIMAIS IN VIVO

4.3.1. Modelo murino em animais transplantados com Sarcoma 180 e Carcinoma

de Erlich

Os efeitos nos animais, tratados com biflorina e com biflorina + 5FU por 7 dias

consecutivos, transplantados com Sarcoma180 e Carcinoma de Erlich, estão nas Tabelas

5 e 6. Foi observada uma significante redução do peso do tumor em animais tratados

com a biflorina em ambas as doses e em ambos os modelos tumorais (p<0,05). Pode-se

24%

55%

52%

84%

43%

09%

34,50%

67,65%

C D 1.5 3.0 6.0

Biflori n a

(µg/ mL)

Despolarização

M itocondrial (% )

80,15%

11,48%

106

observar que quando a biflorina foi administrada com uma dose baixa de 5-FU

(10mg/Kg), ocorreu um sinergismo entre os compostos, aumentando a inibição tumoral

quando da associação feita.

4.3.2. Toxicidade Sistêmica em camundongos Swiss

O valor referente ao peso corpóreo dos animais antes e após a administração da

substância não sofreu alteração. Apenas o valor do peso do baço na dose de 25 mg/Kg

nos animais transplantados com Sarcoma 180 e na dose de 50mg/Kg nos animais

transplantados com Carcinoma de Erlich, mostrou-se significativamente aumentado

quando comparado com o controle negativo, sugerindo a existência de alguma alteração

microscópica. O tumor e os órgãos (fígado, baço e rim) retirados dos animais

transplantados com os tumores foram retirados para análise histológica. Em ambos os

tumores, o grupo controle negativo apresentou células pleomórficas poligonais e

redondas com núcleos hipercromáticos e binucleados. Foram observados vários graus

de pleomorfismos nuclear e celular, além de mitoses, invasão muscular e necrose de

coagulação. Nos grupos tratados com biflorina 50mg/Kg, 5-FU 25mg/kg ou na

associação de biflorina 25mg/Kg + 5-FU 10mg/Kg, foram observadas extensas áreas de

necrose coagulativa enquanto que nos grupos tratados com biflorina 25mg/Kg e 5-FU

10mg/Kg isoladamente, houve apenas um discreto aumento das áreas de necrose

coagulativa.

A análise histopatológica dos rins dos animais tratados com 5-FU (10 e

25mg/Kg), biflorina (25 e 50mg/Kg) ou a associação da biflorina com 5-FU, revelou

degeneração hidrópica tubular proximal, mas a estrutura do glomérulo estava

essencialmente preservada. Por outro lado, a análise histopatológica dos fígados, de

todos os animais tratados inclusive o grupo controle negativo, apresentaram alterações

como hiperplasia das células de Kuppfer, intensa degeneração hidrópica dos hepatócitos

e congestão venosa centriolobular e portal. Além dessas alterações, os animais tratados

com 5-FU (10 e 25mg/Kg), biflorina (25 e 50mg/Kg) ou a associação da biflorina com

5-FU apresentaram também, esteatose microvesicular, hemorragia sinusoidal e um

infiltrado de células inflamatórias em foco crônico (Figura 40a).

No baço, a biflorina, mostrou um discreto aumento da polpa branca e ninhos de

megacariócitos, sugerindo uma possível atividade imunomodulatória (Figura 40b).

107

108

Tabela 5 – Taxa de inibição tumoral dos animais tratados com biflorina e 5-fluorouracil transplantados com Sarcoma 180

Os dados apresentados são representados pela média ± SD de n experimentos. As diferenças significativas foram analisadas pelo teste ANOVA seguido por Newman Keuls:

a) p<0,05 comparado com o grupo controle. b)p<0,05 comparado com o grupo da biflorina 25/Kg/dia. c)p<0,05 comparado com o grupo biflorina 25mg/Kg/dia e 5-FU

10mg/Kg/dia administrados independentemente.

Droga

Dose

(mg/kg/dia)

Fígado

(g/100g peso

corpóreo)

Baço

(g/100g peso

corpóreo)

Rins

(g/100g peso

corpóreo)

Tumor

(g)

Inibição

(%)

Controle -

5,21

± 0,16 0,65 ± 0,02 1,16 ± 0,04 1,78 ± 0,09

- 20

5,47

± 0,19 0,78 ± 0,03

1,25 ± 0,05 1,51 ± 0,07

14,89 14

Biflorina

5,17

0,10 0,71

0,05 1,00 ± 0,04 0,88

0,14

50,53 10

Biflorina +5-FU 25 + 10

4,57

± 0,28

0,54 ± 0,04

a,b)

1,11 ± 0,13 0,61 ± 0,11

a,c)

65,83 10

5,73

± 0,30 0,50 ± 0,03ª

)

1,25 ± 0,06 1,07 ± 0,10

39,84 10

5- FU

5,12

± 0,31

0,30 ± 0,03

a,b,c)

1,68 ± 0,08 0,46 ± 0,08

74,19 13

109

Tabela 6 - Taxa de inibição tumoral dos animais tratados com biflorina e 5-fluorouracil transplantados com Carcinoma de Erlich

Os dados apresentados são representados pela média ± SD de n experimentos. As diferenças significativas foram analisadas pelo teste ANOVA seguido por Newman Keuls:

a) p<0,05 comparado com o grupo controle. b)p<0,05 comparado com o grupo da biflorina 25/Kg/dia. c)p<0,05 comparado com o grupo biflorina 25mg/Kg/dia e 5-FU

10mg/Kg/dia administrados independentemente. d) p<0,05 comparado com o grupo da biflorina 25mg/Kg/dia+5-FU 10mg/Kg/dia.

Droga

Dose

(mg/kg/dia)

Fígado

(g/100g peso

corpóreo)

Baço

(g/100g peso

corpóreo)

Rins

(g/100g peso

corpóreo)

Tumor

(g)

Inibição

(%)

Controle -

5,04

± 0, 18 0,78 ± 0,06 1,14 ± 0,03 1,89 ± 0,68

- 22

4,99

± 0,20 0,69 ± 0,05

0,99 ± 0,05 1,99 ± 0,38

12,29 7

Biflorina

5,92

0,15

a,c,d)

0,96

0,07

c,d)

1,32 ± 0,03 1,24

0,33

45,39 9

Biflorina +5-FU 25 + 10

4,69

± 0,18 0,57 ± 0,05 1,13 ± 0,08 0,47 ± 0,19

a,c)

79,36 9

4,92

± 0,25 0,65 ± 0,07

1,26 ± 0,080 1,34 ± 0,51

41,15 7

5- FU

4,09

± 0,35 0,23 ± 0,03

a,b,c,d)

1,12 ± 0,03 0,58 ± 0,26

74,57 9

110

Figura 40a: Fígado dos animais tratados com A - DMSO 10% H/E 400X, B - 5 - FU H/E 400X,

C - Biflorina 25 mg/Kg/dia H/E 400X, D - Biflorina 25 mg/Kg/dia + 5 FU 10 mg/Kg/dia HE

400X.

DMSO 10%

Trato

ortal

5 FU 10mg

Hiperplasia das células

de kuppfer

Esteatose

microvesicular

Biflorina + 5FU

Trato portal

Hiperplasia das

células de ku

fer

Hiperplasia das células de

kuppfer

Degeneração

hidrópica

Biflorina

111

Figura 40b: Baço dos animais tratados com A - DMSO 10% H/E 100X, B - 5-FU 10 mg/Kg/dia H/E

200X, C - Biflorina 25mg/Kg/dia H/E 100X, D - Biflorina 25 mg/Kg/dia H/E 400X, E - Biflorina

25mg/Kg/dia H/E 400X, F - Biflorina 25 mg/Kg/dia + 5-FU 10mg/Kg/dia H/E 200X.

Biflorina+ 5 FU

Arteríola Central

Polpa branca

Biflorina + 5 FU

Megacariócitos

DMSO 10%

Folículos linfóides

5 FU 10

Folículos linfóides

Polpa branca

Biflorina

Megacariócito

Biflorina 25

112

4.3.3. Atividade imunoadjuvante em animais Swiss saudáveis

Para investigar a indução da resposta imune humoral da biflorina, os animais que

foram imunizados com ovalbumina (OVA) 50µg e com biflorina + OVA (1mg + 50µg),

tiveram os níveis de anticorpos (Ig Total) medidos no soro obtido no tempo 0, 7, 14 e 21

dias após a administração das substâncias. A quantidade de Ig Total no soro dos animais

tratados com biflorina aumentou significativamente (p<0,05) em relação ao controle

(OVA) (figura 41).

Preimmune 7 14 21

0.0

0.5

1.0

1.5

Ova

Ova + BIF

Dias após a imunização

Absorbância

Figura 41: Efeito da biflorina e OVA + biflorina. Os camundongos foram imunizados subcutaneamente

com OVA (50 µg) ou OVA (50 µg) + biflorina (1mg). O soro dos animais foi coletado antes da

imunização, 7, 14 e 21 dias após imunização. Os anticorpos foram detectados por ELISA e a diluição

usada foi de 1:40. Os dados são apresentados pela média ± E.P.M de 10 animais. *P< 0,05, ANOVA

seguido por teste de Newman Keuls.

3.3.4 Modelo murino em animais transplantados com Melanoma B16

3.3.4.1. Sobrevida dos animais e inibição tumoral

Os animais tratados com biflorina (25mg/Kg) tiveram uma sobrevida de até 66

dias, entretanto, os animais do grupo controle (DMSO 10%) sobreviveram apenas até o

Pré-Imune

113

38º dia e os grupos tratados com dacarbazina (25 mg/Kg) e dacarbazina mais biflorina

sobreviveram até 41 e 47 dias respectivamente (figura 42). A biflorina diminuiu

significativamente o tamanho do tumor dos animais tratados, em relação ao grupo

controle (figura 43).

0 10 20 30 40 50 60 70

100

125

Controle

Dacarbazina

Biflorina

Associado

Dias

Sobrevida (%)

Figura 42: Curva de sobrevida dos animais transplantados com células de melanoma B16 e tratados com:

Controle (DMSO 10%), Dacarbazina 25mg/Kg/dia; Biflorina 25 mg/Kg/dia e Associado: Biflorina

25mg/Kg/dia + Dacarbazina 25 mg/Kg/dia com p<0,05.

0 5 10 15 20 25 30

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Controle

Biflorina

Dias após o implante do tumor

Volume Tumoral (cc

)

Figura 43: Efeito sobre o volume tumoral dos grupos controle e tratados com biflorina transplantados

com células B16 no experimento de sobrevida.

114

4.3.3.2 Atividade Imunoadjuvante

Nos animais transplantados com melanoma, também se pode investigar a

indução da resposta imune humoral da biflorina, os animais que foram imunizados com

ovalbumina (OVA) 50µg e com biflorina + OVA (25mg/Kg + 50µg), tiveram os níveis

de anticorpos (Ig Total) medidos no soro após 21 da administração das substâncias. A

quantidade de Ig Total no soro dos animais tratados com biflorina aumentou

significativamente (p<0,05) em relação ao controle (OVA) (Figura 44). Não se pode

concluir que essa resposta seja contra o tumor, mas sistemicamente o animal não

apresentou imunidade reduzida, o que pode ter colaborado a manter os animais vivos

por um período grande.

Figura 44: Efeito da biflorina e OVA + biflorina. Os camundongos foram imunizados subcutaneamente

com OVA (50 µg círculo fechado) ou OVA (50 µg) + biflorina (25mg). O soro dos animais foi coletado

antes da imunização e 21 dias após imunização. Os anticorpos foram detectados por ELISA e a diluição

usada foi de 1:320. Os dados são apresentados pela média ± E.P.M de 10 animais. *P< 0,05, ANOVA

seguido por teste de Newman Keuls.

Pré-imune OVA OVA + Biflorina

0.0

0.5

1.0

1.5

Absorbância 450nm

115

4.4. AVALIAÇÃO DA INTERAÇÃO DA BIFLORINA COM O DNA

A voltametria cíclica da biflorina em meio prótico (figura 45), na velocidade de

varredura (

ν) de 35 mVs

-1

, apresentou uma onda de redução em potencial Epc = - 0,302

V com sua correspondente anódica em

Epa = - 0,220 V, demonstrando que a redução

eletroquímica da biflorina, neste meio, tem características de reversibilidade, onde a

espécie reduzida na varredura catódica é oxidada em seguida.O mesmo comportamento

foi observado com a variação da velocidade de varredura, havendo apenas um discreto

deslocamento do potencial de redução, para valores mais negativos, assim como uma

maior variação entre potencial de pico anódico e potencial de pico catódico (

Epa – Epc)

(Tabela 7), o que poderia indicar diagnóstico de processo quase-reversível, entretanto

devem ser considerados fenômenos de queda ôhmica que possibilitam essas variações.

-1,5-1,2-0,9-0,6-0,30,0

-12

-10

-8

-6

-4

-2

-0,220 V

-0,302 V

Corrente µA

E (V) vs Ag/AgCl/Cl

(0,1 mol L

-1

)

35 mVs

-1

Figura 45: Voltametria cíclica da Biflorina (3mmol L

-1

) em meio prótico, solução aquoso-etanólica (7:3),

tampão acetato pH aparente de 4,5. ν = 35 mVs

-1

O comportamento voltamétrico da biflorina, avaliado pelas técnicas de onda

quadrada e pulso diferencial (figuras 46a e b e 47), manteve-se reprodutível.

116

Tabela 7: Valores de velocidade de varredura (ν), potenciais de pico catódico (Epc),

potenciais de pico anódico (

Epa) e variação entre potencial anódico e catódico (Epa –

Epc) da Biflorina.

Velocidade varredura

(ν)/Vs

-1

Epc I (V) Epa I (V) Epa – Epc

(mV)

0,035 -0,302 -0,221 81

0,050 -0,312 -0,214 98

0,075 -0,316 -0,208 108

0,100 -0,317 -0,213 104

0,200 -0,318 -0,204 114

0,300 -0,319 -0,200 119

0,400 -0,324 -0,197 127

0,500 -0,336 -0,174 162

0,750 -0,349 -0,162 187

1 -0,361 -0,141 220

-1.5-1.2-0.9-0.6-0.30.0

-90

-60

-30

Corrente µA

E (V) vs Ag/AgCl/Cl

(0,1 mol L

-1

)

Figura 46a: Voltametria de onda quadrada da biflorina (3mmol L

-1

), na frequência de 20 Hz.

117

-1.5-1.2-0.9-0.6-0.30.0

-50

-40

-30

-20

-10

Corrente µA

E (V) vs Ag/AgCl/Cl

(0,1 mol L

-1

)

Figura 46b: Voltametria de pulso diferencial da biflorina (3mmol L

-1

A varredura anódica da biflorina, no mesmo meio e sistema de eletrodos que foi

realizada a redução, utilizando-se técnica de pulso diferencial, apresentou uma onda de

oxidação em potencial muito positivo (

Epa = +1,1 V).

0.00.30.60.91.21.5

Corrente µA

E (V) vs Ag/AgCl/Cl

(0,1 mol L

-1

)

Figura 47: Voltametria de pulso diferencial da biflorina (3mmol L

-1

Conhecidos os parâmetros eletródicos da biflorina, caracterizou-se seu

comportamento frente ao DNA através do biossensor eletroquímico, uma vez que a

118

possibilidade de interação de quinonas com o DNA e largamente citada e comprovadas

(referências).

4.1. Fita Dupla dsDNA

A voltametria de pulso diferencial do biossensor de dsDNA (figura 48) em

presença de biflorina (20 µL de uma solução 3 mmol L

-1

) apresentou dois picos de

oxidação referentes às bases nitrogenadas guanina e adenina, respectivamente.

Demonstrando que houve interação da biflorina com o biossensor de

dsDNA, pois não é

possível observar sinais de oxidação relacionados às bases em

dsDNA (DNA de fita

dupla), pelo fato das mesmas estarem com seus sítios oxidáveis ocupados, mantendo

assim a integridade do ácido desoxirribonucléico. Quando uma substância interage com

dsDNA, pode haver uma mudaça na conformação do mesmo, e dessa forma, há uma

exposição das bases à superfície eletródica, permitindo suas oxidações, o que foi

observado com a biflorina.

0,20,40,60,81,01,21,4

dsDNA (branco)

dsDNA + 20 mL Biflorina 3 mmol L

-1

-0,984 V

-0,693 V

Corrente µA

E (V) vs Ag/AgCl/Cl

(0,1 mol L

-1

)

Figura 48: Voltametria de pulso diferencial do biossensor de dsDNA em presença da biflorina (3mmol L

119

4.4.2. Fita Simples ssDNA

O estudo eletroquímica da biflorina em solução de ssDNA (DNA de fita

simples) demonstrou que a biflorina também interage com o

ssDNA diretamente, uma

vez que houve uma diminuição da intensidade de corrente anódica quando da adição de

biflorina na solução de

ssDNA (figura 49).

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

Corrente µA

E (V) vs Ag/AgCl/Cl

(0,1 mol L

-1

)

ssDNA

ssDNA + Biflorina (3 mmolL

-1

)

Figura 49: Voltametria de pulso diferencial do biossensor de ssDNA em presença da biflorina (3mmol L

4.4.3. Inibição de Topoisomerse I

O teste de inibição de topoisomerase I realizado em DNA purificado, foi

realizado em decorrência do fato de ter se verificado a interação da biflorina com as

fitas simples e duplas do DNA, entretanto, não é por inibição de topoisomerase I que

este fenômeno ocorre, uma vez que nas doses de 5, 10 e 30µg/mL o resultado foi

negativo.

120

4.5. AVALIAÇÃO DO POTENCIAL CITOTÓXICO, GENOTÓXICO E

CLASTOGÊNICO IN VITRO EM LINFÓCITOS HUMANOS

4.5.1. Avaliação da citotoxicidade pelo método do Alamar Blue

Os valores da CI

da biflorina obtidos pelo método do Alamar Blue em

linfócitos humanos isolados de doadores saudáveis após 72 h de incubação foram 5,12

µg/mL (4,28-6,12) e para doxorrubicina (controle positivo) foi de 0,96 µg/mL (0,52-

1,80). Os valores apontam uma atividade moderada da biflorina em linfócitos humanos

após 72 horas de exposição.

4.5.2. Avaliação da genotoxicidade – Teste Cometa

A atividade genotóxica foi avaliada através do teste cometa. Os linfócitos foram

isolados e incubados com 15 e 30 µg/mL de biflorina e 0,3 µg/mL de dox (controle

positivo). Em todos os tratamentos, a indução de dano ao DNA foi significativa em

relação ao controle negativo. A biflorina apresentou um aumento no índice de dano (ID)

de 4 a 6 vezes maior em relação ao controle negativo (ID

biflorina

= 69 ± 8,8 e 110 ± 7,3)

nas doses de 15 e 30 µg/mL respectivamente (figura 50a), além de nas mesmas

concentrações aumentar 4.1 e 13 vezes, respectivamente, a freqüência de dano em

relação ao controle negativo (figura 50b). Com base nos resultados obtidos, a biflorina

se revelou genotóxica em linfócitos humanos nas doses e tempo testados.

121

Controle Dox 15 30

100

125

150

175

Biflorina

(µg/mL)

Índice de Dano (%)

Controle Dox 15 30

100

125

150

175

(µg/mL)

Biflorina

Frequência de Dano (%)

Figura 50: Painel A – Índice de dano e Painel B – Freqüência de dando efeito da biflorina (15 e 30

µg/mL) ou doxorrubicina 0,3 µg/mL (DOX) no teste do cometa em linfócitos humanos. As barras

representam a media ± E.P.M. de três experimentos independentes. *p < 0,01 vs. controle (ANOVA,

Tukey test).

122

4.5.3. Avaliação da clastogenicidade - Teste de Aberrações Cromossômicas

Foi realizado, em linfócitos humanos obtidos a partir de sangue periférico de

voluntários saudáveis em, o teste de aberrações cromossômicas nas diferentes fases do

ciclo celular (G1, G1/S, S, G2 tabelas 8, 9,10 e 11) nas concentrações de 15 e 30 µg/mL

de biflorina e 0,1µg/mL de dox, com o objetivo de avaliar o seu potencial clastogênico.

No entanto, observou-se que a biflorina, não induz quebras crossomômicas ou

alterações numéricas nas concentrações testadas, porém diminui o índice mitótico da

fase S (Tabela 10), nos pulsos de 1 e 6 horas (p<0,05), o que sugere um potencial

citotóxico nesses tempos de tratamentos, uma vez que a diminuição foi significativa em

relação ao controle negativo. Todavia deve-se ressaltar que as doses testadas são três e

seis vezes maiores que a IC

da biflorina em linfócitos em uma exposição de 72 horas,

sugerindo que a substância em questão poderá ser considerada segura.

Tabela 8: Protocolos de tratamento da biflorina aplicados a linfócitos humanos em

curtos tempos de cultura.

Tratamento FITO Biflorina Lavagem COL RET. C

G1 0 h 0 h

- 50 h 52 h

G1/S 0 h 24 h

- 50 h 52 h

(1 h pulso) 0 h 24 h

25 h 50 h 52 h

(6 h pulso) 0 h 24 h

30 h 50 h 52 h

G2 0 h 69 h

- 70 h 72 h

FITO: fitohemaglutinina; COL: colchicina; RET. C: retirada da cultura

123

Tabela 9: Aberrações cromossômicas (ACs) e índice mitótico em cultura de linfócitos

tratados com biflorina durante as fases G1 e G1/S do ciclo celular.

ACs

Tratamento

(%)

Gaps Quebras Total

Polip

End

- Controle 2,8 4 0 4 0 0

15,0

µg/mL

2,6 0 0 0 0

30,0 µg/mL

4,2 1 0 1 3

Dox 3,1** 5 4 9 2 4

- Controle 2,8 0 0 0 0 0

G1/S

15,0

µg/mL

3,6 0 0 0 0 0

30,0

µg/mL

3,4 1 0 1 0 0

DOX 3,2** 17 6 23 5 0

Polip: Células poliplóides; End: endoreduplicação; DOX: Doxorrubicina (controle

positivo). **p<0.01

Tabela 10: Aberrações cromossômicas (ACs) e índice mitótico em cultura de linfócitos

tratados com biflorina durante a fase S do ciclo celular.

ACs

Tratamento

(%)

Gaps Quebras Total

Polip

End

- Controle 2,8 0 0 0 0 0

1 h

15,0

µg/mL

0,94* 0 1 1 0 0

30,0 µg/mL

0,95* 2 2 4 0 0

Dox 2,4 10 7 17 1 1

- Controle 2,8 0 0 0 0 0

6 h

15,0

µg/mL

1,0* 3 0 3 0 0

30,0

µg/mL

0,8* 1 2 3 0 0

DOX 1,9 14 10 24 3 0

Polip: Células poliplóides; End: endoreduplicação; DOX: Doxorrubicina (controle

positivo). *p<0,05

124

Tabela 11: Aberrações cromossômicas (ACs) e índice mitótico em cultura de linfócitos

tratados com biflorina durante a fase G2 do ciclo celular.

ACs

Tratamento

(%)

Gaps Quebras Total

Polip

End

- Controle 2,8 0 0 0 0 0

15,0

µg/mL

2,9 0 0 0

30,0 µg/mL

2,6 1 0 0

Dox 5,2** 24 8 32

Polip: Células poliplóides; End: endoreduplicação; DOX: Doxorrubicina (controle

positivo). **p<0,01

125

4.6. AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIOXIDANTE

4.6.1. Autoxidação do ácido oléico

Para determinar as propriedades oxidativas da biflorina, a oxidação de ácido

oléico foi doseada pelo método do tiocianato. A biflorina mostrou atividade

antioxidante contra a autoxidação do ácido oléico no sistema água - álcool até quatro

dias de incubação, entretanto no quinto e sexto dia, não se mostrou mais eficiente

(figura 51). Estes dados sugerem fortemente que a citotoxicidade da biflorina não estava

relacionada com a geração de espécies reativas de oxigênio.

Figura 51: Efeito da biflorina na autoxidação do ácido oléico. A oxidação do ácido oléico foi realizada

pelo método do tiocianato, descrito na metodologia experimental.

126

4.6.2. Xantina Oxidase

A capacidade antioxidante de biflorina foi determinada pelo acompanhamento

da produção de ácido benzóico hidroxilado (DHBA) devido ao ataque de espécies

reativas de oxigênio (ROS) no ensaio da xantina oxidase/ácido salicílico na hipoxantina.

A redução do total dos produtos de oxidação assim como a quantidade de extrato

acrescentado no ensaio é apresentada na Figura 35. Desta forma, a biflorina revelou

uma significativa capacidade antioxidante de forma dose - dependente em

concentrações elevadas, devido à sua capacidade capturadora de radicais hidroxila.

Biflorina Solvente

100

% DHBA

Figura 52: Inibição da geração de espécies reativas de oxigênio pela biflorina no sistema hipoxantina-

xantina oxidase. Solvente (hexano) (círculo fechado) e biflorina (círculo aberto).

4.6.3. Efeito retirador de radicais livres pelo método DPPH

Os resultados do efeito capturador de radicais livres da biflorina no sistema

DPPH estão na tabela 12. Esses resultados demonstram uma atividade concentração-

dependente da atividade antioxidante. O efeito capturador da biflorina foi de 79,30% na

maior concentração (250µg/mL) e de 55,60 e 53,50% nas concentrações de125 e 62,5

µg/mL respectivamente.

127

Table 12: Atividade retiradora de radicais livres da biflorina no sistema DPPH. O efeito

foi medido pela absorbância do radical DPPH a 520 nm contendo uma amostra teste de

µM de DPPH.

Concentração (µg.mL

-1

)

Tratamento 0,25 0,125 0,0625

Atividade % Atividade % Atividade %

Controle

0,2938±0,00005 00,00 0,2938±0,00005 00,00 0,2938±0,00005 00,00

Trolox

0,0090±0,00004 96,94 0,0170±0,00005 94,21 0,0170±0,00005 94,21

BHT

0,0408±0,00005 86,12 0,0855±0,00005 70,91 0,1169±0,00005 60,22

Vitamin C

0,0080±0,00005 97,28 0,0160±0,00003 94,55 0,0180±0,00005 93,87

Biflorina

0,0649±0,00005 79,30 0,1306±0,00003 55,60 0,1364±0,00005 53,50

4.7. ATIVIDADE BIOLÓGICA E GENOTÓXICA EM CÉLULAS V79

128

4.7.1. Sobrevivência Clonogênica e Peroxidação Lipídica em células V79

As células V79 foram selecionadas em nosso estudo, porque é uma linhagem

normal, elas têm um cariótipo estável, duplicação em curto tempo e são fáceis de manter

em cultura, além de serem utilizadas com freqüência em estudos de citotoxicidade e

genotoxicidade (ROSA

et al.,2007). A sobrevivência clonogênica foi realizada a fim de

determinar o intervalo de concentrações citotóxicas da biflorina (figura 53). Abaixo de

10µg/mL a biflorina não se mostrou citotóxica, portanto se utilizaram as concentrações

de 1 a 10µg/mL para os experimentos subseqüentes. A análise da sobrevivência clonal

nas concentrações não tóxicas de biflorina foi feita para avaliar a capacidade da

biflorina em reduzir a toxicidade do peróxido de hidrogênio H

A figura 54, mostra

que citotoxicidade induzida pelo H

foi significativamente suprimida pelo pré-

tratamento com biflorina nas concentrações de 5 e 10 µg/mL. Avaliou-se também os

danos oxidativos acionados pelo H

através da lipoperoxidação. Os resultados

mostraram que as células tratadas com H

tiveram um aumento dose-dependente na

produção de TBARS, contudo as células pré-tratadas com biflorina apresentaram uma

extensão menor de lipoperoxidação, sugerindo que sua capacidade antioxidante seja

responsável por esse efeito, além da biflorina isoladamente não ser capaz de gerar

aumento nos níveis de TBARS (figura 55).

129

0 5 10 15 20 25 30

100

Biflorina (mg/mL)

Habilidade de formação de colônia (%)

Figura 53: Sobrevivência clonogênica de células V79 após o tratamento com biflorina em diferentes

concentrações por 3 horas de incubação em meio sem SBF. Os resultados são expressos pela media±

E.P.M., n=9.

150

mg/

10 mg

100

Pré-tratamento biflorina

Sobrevivência (%)

Figura 54: Sobrevivência clonogênica de células V79 pré-tratadas com doses não tóxicas de biflorina por

3 h em meio sem SBF e exposto a H

(150µM) por 1 h a 37ºC no escuro. Os dados são apresentados

pela média ± E.P.M., n=9. * p<0,05, analisados pelo teste ANOVA seguido de Tukey’s multiple

comparison teste. As células pré-tratadas com biflorina foram comparadas com as células expostas a H

(150µM).

130

ontr

Negat

µ 15

5 mg/mL

0 mg/mL

1 mg/

Tratamento biflorina

Pré-tratamento com biflorina

mais exposição a H

Equivalentes (nmol MDA/mg proteína)

Figura 55: Determinação de substâncias reativas a ácido tiobarbitúrico (TBARS) em células V79 pré-

tratadas com biflorina nas concentrações indicadas, por 3 h e subsequentemente submetidas à exposição a

(150µM). Os dados são apresentados pela média ± E.P.M., n=9. * p<0,05 analisados pelo teste

ANOVA seguido de Tukey’s multiple comparison teste. As células pré-tratadas com biflorina foram

comparadas com as células expostas a H

(150µM).

131

4.7.2. Potencial genotóxico em células V79

Para quantificar a indução e inibição de dano oxidativo, foi realizado o teste

cometa

in vitro versão alcalina (pH>13) em células V79, com enzimas que reconhecem

os sítios específicos de lesões oxidativas em bases púricas e pirimidínicas. A biflorina

quando avaliada isoladamente não induziu dano significativo nas doses mais baixas

(2,5; 5,0 e 10 µg/mL), apenas a concentração citotóxica de 30 µg/mL induziu danos

significativos em relação ao controle negativo (figura 56). Como esperado, as células

tratadas com 150 µM de H

tiveram um significativo aumento nos índices de dano

(Figura 38). Quando as células foram pré-tratadas com biflorina e depois expostas a

, a extensão do dano oxidativo induzido pelo H

e reconhecidos pelas enzimas

EndoIII e Fpg, diminuiu significativamente, como indicado na tabela 13, tornando

evidente a atividade antioxidante da biflorina.

132

Controle

MMS

10.0

30.0

100

150

200

250

Biflorina

(µg/m L)

***

Índice de dano

Controle

10.

30.

100

150

200

250

300

350

Biflorina + H

150 µM

(µg/mL)

Índice de dano

Figura 56: Painel A: avaliação da genotoxicidade da biflorina usando teste cometa em células V79.

Todos os tratamentos foram comparados com o controle negativo. Painel B: Efeito do pré-tratamento com

biflorina por 3 h e exposição por peróxido (150µM) induzindo dano no DNA em células V79 pelo ensaio

cometa. As barras representam os valores das médias± E.P.M. de três experimentos independentes.

Células pré-tratadas com biflorina foram expostas a (150µM de H

). O símbolo * p<0,05, **P<0,01 e

***P<0,001, pelo teste de ANOVA seguido por Tukey teste.

133

Tabela 13: Dano ao DNA pelo teste cometa em células V79 expostas a biflorina

mais H

por 1h a 37ºC com subseqüente tratamento com tampão, endonuclease

III e formamidopirimidina DNA – glicosilase.

Agente Dose Índice de dano (ID)

Tampão EndoIII FPG

Controle Negativo

Biflorina 2,5 µg/mL

29,5

± 3,5 36,3 ± 6,5 37,5 ± 3,5

5,0 µg/mL

39,5

± 7,4 48,5 ± 1,7 48,5 ± 7,0

150 µM 187,5 ± 9,5 238,5 ± 2,5 269,5 ± 4,5

Biflorina +H

2,5 µg/mL 118,5 ± 4,5* 133,0 ± 8,3* 143,0 ± 1,0*

5,0 µg/mL 131,6 ± 1,52* 159,0 ± 3,4* 187,5 ± 3,5*

Controle negativo.

Os valores das médias e dos desvios padrão foram obtidos da contagem de 100 células por

experimento – um total de três experimentos por concentração testada.

Controle positivo.

* Dados significantes em relação ao controle positive (peróxido de hidrogênio). P<0,001 pelo teste

ANOVA seguido por Tukey.

134

4.8. POTENCIAL GENOTÓXICO EM DIFERENTES SISTEMAS

BIOLÓGICOS

4.8.1. Leveduras

Nos testes realizados em leveduras, a biflorina não induziu citotoxicidade nas

fases estacionária e exponencial de culturas haplóides em levedura do tipo selvagem

quando tratados em condições de não - crescimento até a concentração 0,25 mg/mL

(Tabela 14). No que diz respeito à avaliação do potencial mutagênico, a mutação de

ponto (HIS1 +, LYS1 +) e mutação frameshift (HOM3 +) durante o tratamento na fase

estacionária e crescimento exponencial em condições de crescimento e não -

crescimento não foi significativa (Tabela 14) o que indica ausência de mutagenicidade.

Neste sentido, foi escolhido trabalhar com células em fase estacionária nos

experimentos subseqüentes. Foi observado que no tratamento com biflorina em

concentrações não - citotóxicas 0,125 mg/mL e 0,25 mg/mL, houve diminuição da

freqüência de mutação induzida pelo peróxido de hidrogênio nos lócus his1, lys1 e

hom3, indicando um potencial antimutagênico devido à propriedade antioxidante

(Tabela 15). Os efeitos recombinogênicos da biflorina foram investigados em leveduras

diplóides realizada sob as condições de crescimento e não - crescimento (tabela 16). Os

resultados mostraram que a biflorina não induziu significativa a recombinogênese de

crossing over e conversão gênica nas concentrações empregadas. Como esperado, o pré

- tratamento com biflorina impediu a indução de eventos recombinogênicos pelo

peróxido de hidrogênio, quando as células foram tratadas nas concentrações de 0,125 -

0,5 mg/mL.

135

Tabela 14: Reversão para o ponto de mutação (his1-7), para o alelo (lys1-1) em mutação

frameshift (

hom3-10) na linhagem haplóide XV185-14c de S. cerevisiae após o

tratamento com biflorina por 3h a 30ºC.

Concentração

Sobrevivência

(%)

HIS1revertentes/

sobreviventes

LYS1revertentes/

sobreviventes

HOM revertentes/

sobreviventes

Tratamento em Condições de NÃO Crescimento em Fase Estacionária

0 µg/mL 100 12,1 ± 2,0 1,3 ± 0,7

2,2 ± 0,7

0,5 µg/mL 52,0 163,0 ± 11,6*** 15,1 ± 2,1*** 24,7 ± 0,6***

Biflorina 0 100 10,0 ± 0,0 3,0 ± 0,9 2,5 ± 0,1

0,125 mg/mL 88,5 14,1 ± 1,9 2,5 ± 0,1 1,2 ± 0,0

0,25 mg/mL 71,0 18,7 ± 0,9 1,8 ± 0,6 1,6 ± 1,0

0,5 mg/mL 50,2 9,7 ± 3,2 2,4 ± 0,9 2,7 ± 1,0

1 mg/mL 28,2 11,0 ± 1,4 3,3 ± 2,6 3,6 ± 1,3

2 mg/mL 15,3 16,0 ± 4,6 1,8 ± 0,4 3,6 ± 0,4

Tratamento em Condições de NÃO Crescimento em Fase Exponencial

0 µg/mL 100 18,7 ± 0,9

8,1 ± 1,3

6,7 ± 0,3

0,5 µg/mL 41,4 182,5 ± 8,0*** 34,2 ± 11,1*** 48,1 ± 0,7***

Biflorina 0 100 10,0 ± 1,0 7,8 ± 2,2 7,6 ± 0,4

0,125 mg/mL 87,4 11,2 ± 1,2 6,3 ± 0,9 7,4± 15

0,25 mg/mL 83,1 11,3 ± 1,0 6,8 ± 0,1 7,2± 0,4

0,5 mg/mL 55,7 10,0 ± 0,4 5,1 ± 0,1 6,0 ± 2,0

1 mg/mL 15,0 15,6 ± 1,5 4,5 ± 2,3 5,8 ± 0,1

2 mg/mL 3,1 10,6 ± 1,3 6,9 ± 0,3 6,8 ± 2,1

Tratamento em Condições de Crescimento

0 µg/mL 100 10,3 ± 0,9

3,0 ± 0,5

4,8 ± 0,9

0,5 µg/mL 51,4 160,5 ± 21,3*** 24,9 ± 0,9*** 26,3 ± 2,3***

Biflorina 0 100 11,0 ± 0,6 3,1 ± 0,9 3,8± 0,1

0,125 mg/mL 88,0 12,4 ± 1,6 4,9 ± 2,2 4,9± 1,7

0,25 mg/mL 60,9 10,1 ± 1,0 3,4 ± 0,6 4,8 ± 0,1

0,5 mg/mL 55,4 14,4 ± 0,6 5,1 ± 1,4 3,9 ± 0,0

1 mg/mL 38,6 13,2 ± 1,5 6,5 ± 2,3 5,1 ± 0,1

2 mg/mL 2,9 14,4 ± 2,9 3,5 ± 0,7 4,6 ± 1,8

Revertentes Lócus - especifico.

Revertentes Lócus não- especifico.

CN: controle negativo, dimetil sulfoxido usado como veículo.

CP: controle positivo, 4-nitroquinoleina-N-oxido 0,5 µg/mL,

Os dados estão apresentados pela média e D.P. de três experimentos independentes; *** Dado significante em relação ao controle

negativo, onde P<0,001, analisado pelo teste ANOVA seguido por

Tukey teste.

136

Tabela 15: Reversão para o ponto de mutação (his1-7), para o alelo (lys1-1) mutação frameshift (hom3-10) na linhagem haplóide XV185-14c de

S. cerevisiae após o tratamento com peróxido de hidrogênio em células na fase estacionária pré-incubadas com biflorina por 3h em condições de

não crescimento.

Concentração

Sobrevivência

(%)

HIS1 revertentes/

sobreviventes

LYS1 revertentes/

sobreviventes

HOM3 revertentes/

sobreviventes

0 100 10,3 ± 0,9

3,0 ± 0,5

4,8 ± 0,9

4 mM 41,0 41,4 ± 1,3*** 37,7 ± 1,8*** 36,0 ± 0,9***

Biflorina (pré-tratamento mais

exposição a H

4 mM)

0,125 mg/mL 41,9 9,2 ± 0,5*** 4,1 ± 0,4 *** 5,1 ± 1,1**

0,25 mg/mL 40,8 14,1 ± 1,6** 5,5 ± 3,6*** 7,9 ± 1,0 ***

0,5 mg/mL 65,4 34,4 ± 7,9 43,4 ± 2,7 35,6± 3,7

1 mg/mL 78,6 42,4 ± 2,6 40,9 ± 0,2 31,8 ± 3,9

2 mg/mL 22,0 40,3 ± 6,9 37,9 ± 1,6 34,6 ± 1,8

Revertentes Lócus - especifico.

Revertentes Lócus não- especifico.

CN: controle negativo, dimetill sulfoxido usado como veículo.

Os dados estão apresentados pela média e D.P. de três experimentos independentes; Dado significante em relação ao controle negativo, onde *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, analisado pelo

teste ANOVA seguido por

Tukey teste.

137

Tabela 16: Indução de crossing-over (/cyh2) e conversão gênica (leu1-1/leu1-12) na

linhagem diplóide XS2316 de

S. cerevisiae após pré-tratamento com biflorina durante a

fase de crescimento exponencial e o efeito do pré-tratamento sobre a indução de

recombinogênese pelo peróxido de hidrogênio.

Concentração Sobervivência (%)

Crossing over/ 10

sobreviventes

Conversão gênica/

sobreviventes

0 µg/mL 100 9,1 ± 0,8 1,5 ± 0,2

0,5 µg/mL 67,0 185,0 ± 26,6*** 49,0 ± 3,0***

Biflorina 0 100 12,1 ± 2,0 1,0 ± 0,4

0,125 mg/mL 94,0 10,8 ± 1,0 1,5 ± 0,6

0,25 mg/mL 91,0 9,7 ± 3,1 1,7 ± 0,3

0,5 mg/mL 89,2 8,5 ± 3,8 1,9 ± 0,8

1,0 mg/mL 86,5 12,4 ± 0,4 1,3 ± 0,6

2,0 mg/mL 73,3 13,0 ± 1,3 1,9 ± 0,5

4 mM 51,7 106,5± 18,4*** 43,4± 9,0 ***

Biflorina (pré-tratamento mais exposição a H

4 mM)

0,125 mg/mL 49,3 33,1 ± 9,3*** 9,9 ± 1,3***

0,25 mg/mL 63,0 55,0 ± 6,5*** 12,0 ± 3,3***

0,5 mg/mL 71,9 72,0 ± 8,4*** 25,1 ± 4,1** *

1,0 mg/mL 85,3 95,1 ± 9,0 38,1 ± 5,2

2,0 mg/mL 89,1 110,4 ± 22,1 46,5 ± 4,9

CN: controle negativo, dimetill sulfóxido usado como veículo.

CP: controle positivo, 4-nitroquinoleina-N-oxido 0,5 µg/mL,

Os dados estão apresentados pela média e D.P. de três experimentos independentes; *** Dado significante em relação ao

controle negativo, onde P<0,001, analisado pelo teste ANOVA seguido por

Tukey teste.

138

4. 8.2. Teste de Ames em Salmonella thyphimurium

As doses estabelecidas, na linhagem TA100, para a avaliação do potencial

mutagênico da biflorina em linhagens de

Salmonella thyphimurium, foram de 66,00;

133,50, 200,10; 266,70 e 333,30 µg/mL. Não foi observada mutagenicidade em

nenhuma das cinco linhagens (TA98, TA97a, TA100, TA102 e TA1535) testadas na

ausência ou presença de ativação metabólica, ou seja ela não induz mutação de

deslocamento do quadro de leitura ou substituição de pares de base nas condições

testadas, mostrando-se negativa para o teste de Ames.

139

Tabela 17: Indução de revertentes de his+ em linhagens de Salmonella typhimurium pela biflorina com e sem atividade metabólica (S9 mix)

Substância TA98 TA97a

-S9 +S9 -S9 +S9

rev/placa

rev/placa IM

rev/placa

383,66±93,32

724,00±142,00

875,66±471,46

1630,50±265,16

22,00±2,65 - 32,33±3,06 - 44,33±11,24 - 66,00±10,58 -

Dose (µg per placa)

66,60 21,33±4,16 0,96 46,67±2,31 1,44 50,00±5,66 1,13 102,33±10,79 1,55

133,50 21,67±7,37 0,98 34,33±6,03 1,06 39,00±1,41 0,88 82,33±8,62 1,25

200,10 25,00±6,08 1,13 32,67±5,03 1,01 21,00±14,80 0,47 79,33±17,90 1,20

266,70 21,00±2,00 0,95 27,67±1,53 0,85 28,00±1,00 0,63 71,50±2,12 1,08

333,30 23,00±6,08 1,04 41,67±12,50 1,28 48,00±8,49 1,08 87,00±33,05 1,32

Número de revertentes/placa: média de três experimentos independents ± DP;

IM: Índice Mutagênico (nº. de his+ induzida por amostra/nº. de espontâneas his+ no controle

negativo).

CP: controle positivo (-S9) 4-NQO (5,0 µg/placa); (+S9) aflatoxina B1 (0,5 µg/placa).

CN: controle negativo DMSO (25 µl) usado como solvente para biflorina.

140

Tabela 18: Indução de revertentes de his+ em linhagens de Salmonella typhimurium pela biflorina com e sem atividade metabólica (S9 mix)

Substância TA100 TA102

-S9 +S9 -S9 +S9

rev/placa

rev/placa IM

rev/placa

1922,00±402,07 16,5

1530,33±113,50 11,19 2115,60±502,14 5,73 1934,33±279,01 4,20

116,33±19,09 - 136,67±5,03 - 368,67±72,92 - 460,00±52,92 -

Dose (µg per placa)

66,60 123,33±8,50 1,06 144,00±17,09 1,05 331,33±38,70 0,90 493,33±77,18 1,07

133,50 98,00±20,00 0,84 138,00±22,54 1,01 329,33±63,79 0,89 565,33±74,22 1,23

200,10 104,67±8,08 0,90 127,33±20,82 0,93 425,33±16,17 1,15 516,67±122,84 1,12

266,70 106,00±10,82 0,91 166,33±12,66 1,22 384,00±24,98 1,04 484,00±52,46 1,05

333,30 131,33±29,14 1,13 130,67±37,17 0,96 378,67±59,37 1,02 429,33±84,13 0,93

Número de revertentes/placa: média de três experimentos independents ± DP;

IM: Índice Mutagênico (nº. de his+ induzida por amostra/nº. de espontâneas his+ no controle

negativo).

CP: controle positivo (-S9) 4-NQO (5,0 µg/placa) para TA102 e azida de sódio (5,0 µg/placa) para TA100 (+S9) aflatoxina B1 (0,5 µg/placa).

CN: controle negativo DMSO (25 µl) usado como solvente para biflorina.

Tabela 19: Indução de revertentes de his+ em linhagens de Salmonella typhimurium pela biflorina com e sem atividade metabólica (S9 mix)

141

Substância TA1535

-S9 +S9

rev/placa

1595,00±220,53

105,60±1,15

10,00±1,00 - 13,00±1,73 -

Dose (µg per placa)

66,60 11,33±2,89 1,13 11,33±5,13 0,87

133,50 11,67±4,04 1,16 15,00±3,61 1,15

200,10 11,67±0,58 1,16 12,67±2,52 0,97

266,70 6,67±3,06 0,66 16,33±4,04 1,25

333,30 12,33±5,51 1,23 10,33±5,51 0,79

Número de revertentes/placa: média de três experimentos independents ± DP;

IM: Índice Mutagênico (nº. de his+ induzida por amostra/nº. de espontâneas his+ no controle

negativo).

CP: controle positivo (-S9) azida de sódio (5,0 µg/placa); (+S9) aflatoxina B1 (0,5 µg/placa).

CN: controle negativo DMSO (25 µl) usado como solvente para biflorina.

142

4.8.3. Avaliação do potencial clastogênico da biflorina em medula óssea de

camundongo

Para completar a bateria de testes de mutagenicidade, a biflorina foi testada em

camundongos nos tempos de 24 e 48 horas de exposição. Após esse período, os fêmures

dos animais foram retirados para a análise dos eritrócitos normocromáticos (NCEs),

policromáticos (PCEs) e eritrócitos policromáticos micronucleados (PCEMNs). O Teste

do Micronúcleo foi considerado negativo para biflorina, uma vez não houve diferença

estatisticamente significante entres os grupos tratados e o grupo controle negativo em

relação à freqüência de PCEMNs em nenhum tempo de tratamento (Tabela 20). Os

resultados obtidos então sugerem que a biflorina não induz dano cromossômico

estrutural e/ou numérico nos eritrócitos dos camundongos Swiss, diferente do que

ocorreu com os animais do grupo controle positivo tratados com EMS (p< 0,01) (Figura

39).

Tabela 20 – Freqüência de eritrócitos policromáticos micronucelados (PCEMNs)

em medula óssea de camundongos Swiss de ambos os sexos tratados com duas

diferentes concentrações de biflorina.

Tratamentos

Número de

PCEs Analisados

PCEMNs

Relação

PCE/NCE

24 Horas

Nº %

DMSO 10%

20.000 57 0,28 4,01

EMS

20.000 402* 2,01 2,83*

Biflorina 25mg/kg 20.000 45 0,22 3,90

Biflorina 50mg/kg 20.000 51 0,25 3,94

Tratamentos

Número de

PCEs Analisados

PCEMNs

Relação

PCE/NCE

48 Horas

Nº %

DMSO 10%

20.000 41 0,20 3,92

EMS

20.000 360* 1,80 2,87*

Biflorina 25mg/kg 20.000 37 0,18 3,79

Biflorina 50mg/kg 20.000 41 0,20 3,84

Controle negativo,

Controle positivo.

* p < 0,01(ANOVA, Tukey test).

143

Controle EMS 25 50

Biflorina

(mg/Kg)

Nº de células micronucleadas

Controle EMS 25 50

Biflorina

(mg/Kg)

Nº de células micronucleadas

Figura 57 - Painel A – Freqüência de micronúcleos dos animais tratados com biflorina ou EMS por 24

horas. Painel B – Freqüência de micronúcleos dos animais tratados com biflorina ou EMS por 48 horas.

As barras representam a media ± E.P.M. de 10 animais por grupo, numa contagem de 2000 células

policromáticas. *p < 0,01 vs. controle (ANOVA, Tukey test).

144

Tabela 21 – Resumo dos resultados obtidos com a biflorina versus controles positivos.

ESTUDO BIF.

C +

Atividade citotóxica in vitro

Em células tumorais +++

+++

Em linfócitos humanos ++

+++

Inibição do desenvolvimento de ovos de ouriço-do-mar -

+++

Atividade Hemolítica -

n.d

Estudo do mecanismo de ação em células B16 in vitro

Viabilidade celular por exclusão de azul de tripan ++

+++

Morfologia diferencial por Hematoxilina/Eosina C.R. C.R.

Morfologia diferencial por Laranja de acridina/Brometo de etídeo C.R. C.R.

Inibição da síntese de DNA ++

+++

Análise do ciclo celular -

Indução de fragmentação de DNA ++

+++

Potencial transmembrana da mitocôndria ++

+++

Atividade in vivo

Efeito da biflorina sobre camundongos transplantados com Sarcoma 180 ++

+++

Efeito da biflorina sobre camundongos transplantados com Carcinoma de

Erlich

+++

Efeito da biflorina sobre camundongos transplantados com Melanoma

B16

Sobrevida avaliada em camundongos transplantados com Melanoma B16 +++

Atividade Imunoadjuvante em camundongos saudáveis +++

n.d

Atividade Imunoadjuvante em camundongos black (C57/BL) +++

n.d

Toxicidade sistêmica nos camundongos transplantados com células

tumorais

L S

Interação com o DNA

Por eletroquímica +++

n.d

Inibição de Topoisomerase I -

Genotoxicidade/Clastogenicidade em linfócitos humanos

Teste Cometa G

Teste de Aberrações Cromossômicas nas diferentes fases do ciclo celular N.C.

Potencial Antioxidante

Autoxidação de ácido oléico ++

n.d

Xantina oxidase ++

n.d

Atividade frente ao DPPH ++

n.d

Atividade Biológica e Genotóxica em Células V79

Sobrevivência clonogênica +

Peroxidação lipídica -

+++

Teste Cometa ++

+++

Genotoxicidade/Mutagenicidade em outros sistemas

Em Leveduras N.G.

Em Bactérias N.M.

Em Medula óssea de camundongos N.C.

(+) Fracamente ativa; (++) Ativa; (+++) Fortemente ativa; (-) Não ativa; (C.R.) – Corrobora os demais

resultados; (L) – Leve; (S) – Severa; (G) - Genotóxico; (C) Clastogênico; (M) Mutagênico; (N.G) – Não

genotóxico; (N.C.) – Não clastogênico; (N.M.) – Não mutagênico; (n.d) – Não Determinado

145

5. DISCUSSÃO

As quinonas são metabólitos amplamente distribuídos na natureza, apresentando

participação crucial em vários processos bioquímicos vitais como a cadeia respiratória e

a fotossíntese (DA SILVA

et al., 2003). Do ponto de vista farmacológico e terapêutico,

estas moléculas são utilizadas como medicamentos antitumorais, antibacterianos e

antimaláricos, e incluem drogas como antraciclinas, daunorrubicina, doxorrubicina,

mitomicina e mitoxantronas, amplamente utilizadas na terapia de tumores sólidos

(VERMA, 2006). Particularmente em relação às naftoquinonas, destacam-se moléculas

como a β – lapachona e o lapachol, que constituem um grupo promissor de compostos

com propriedades citotóxicas e antitumorias (ASCHE, 2005).

Nesse trabalho, nos propusemos a estudar a atividade antitumoral da biflorina,

uma

orto-naftoquinona, isolada das raízes de Capraria biflora, conhecida na literatura

por suas propriedades antimicrobianas (LIMA

et al., 1958). Vale ressaltar ainda que a

extração e o isolamento da biflorina envolvem procedimentos relativamente simples

(D’ALBUQUERQUE

et al., 1962), possibilitando sua obtenção em larga escala,

ressaltando seu potencial uso terapêutico.

Assim como o lapachol (2-hidroxi-3(3-metil-2-butenil)-1,4 naftoquinona e

outros agentes quimioterápicos, a biflorina mostrou uma forte atividade citotóxica

vitro

quando testada em linhagens tumorais humanas (HL60, CEM, K562, MCF-7, MX-

1, MDA MB 231, MDA MB 435, M14, UACC257, UACC62, NCI H266, NCI H23,

PC3, SF295 e HCT-8). A CI

variou de 0,43 µg/mL em células MCF-7 a 14,61 µg/mL

em células MDA-MB-431, ambas linhagens de mama. De acordo com a literatura,

compostos puros podem ser considerados promissores para justificar novos estudos,

quando apresentarem CI

menor que 1µg/mL (PESSOA et al., 2000). Considerando

este valor, a biflorina mostrou-se bastante citotóxica contra 8 linhagens e

146

moderadamente ou pouco citotóxica frente a outras 8 linhagens, não sendo possível

estabelecer nenhuma seletividade com relação a origem das células.

Em estudos anteriores com o extrato de

C. biflora, Nascimento e colaboradores

(1984) mostraram que esse extrato foi extremamente citotóxico contra células KB, com

uma CI

de 3µg/mL. Os autores sugeriram que a biflorina seria a molécula responsável

por esta atividade observada no extrato das raízes da planta. Nossos resultados

corroboram com essa hipótese.

De acordo com vários autores, na avaliação do potencial antitumoral de uma

droga, é de extrema importância a utilização de células normais a fim de se avaliar a

seletividade para célula normal ou tumoral (ZUCO

et al., 2002; ANAZETTI et al.,

2003). A biflorina foi testada em linfócitos periféricos humanos estimulados com

fitoemaglutinina, apresentando CI

de 5,12 (4,28 – 6,12) µg/mL. Este valor sugere uma

baixa seletividade da biflorina. A doxorrubicina, por sua vez, apresentou CI

neste

modelo de 0,96 (0,52 – 1,80) µg/mL.

Ainda para avaliar sua citotoxicidade, foram realizados experimentos

subseqüentes para investigar a atividade em ovos de ouriço-do-mar e a capacidade de

induzir hemólise em hemácias de camundongos. No ensaio do ouriço-do-mar, a

biflorina não foi capaz de inibir o desenvolvimento de embriões mesmo na concentração

mais alta testada (100µg/mL), diferentemente do que foi observado com o

quimioterápico doxorrubicina (controle positivo). Geralmente, substâncias citotóxicas

testadas em ovos de ouriço-do-mar e células tumorais têm se mostrado ativas em ambos

os ensaios, embora alguns compostos possam apresentar valores de CI

em ovos de

ouriço-do-mar maiores que em células tumorais, como observado para doxorrubicina e

etoposídeo (COSTA-LOTUFO

et al., 2003; MONTENEGRO et al., 2004).

147

O estudo de alterações no desenvolvimento embrionário de ouriço-do-mar é um

modelo adequado para avaliar atividade citotóxica, teratogênica e antineoplásica de

novos compostos (JACOBS & WILSON, 1986; COSTA-LOTUFO

et al., 2002). Esse

método pode detectar agentes seletivos como inibidores de síntese de DNA e RNA,

inibidores de síntese de proteínas e avaliação de inibidores de microtúbulos (JACOBS

et al., 1981; BRANDHORST, 1985; JACOBS & WILSON, 1986, FUSETANI, 1987,

GHISALBERTI, 1993).

No ensaio de hemólise, os resultados mostraram que a biflorina não causou dano

à membrana das hemácias, sugerindo que a citotoxicidade da biflorina não está

relacionada à ruptura inespecífica da membrana plasmática.

Uma vez avaliado o potencial citotóxico

in vitro da biflorina, iniciou-se uma

investigação mais detalhada para avaliar o mecanismo de ação citotóxica dessa

substância. Para esse fim, foi utilizada a linhagem de melanoma murino B16, cedida

pelo Instituto Norte Americano do Câncer (NCI-USA), uma vez que seria possível

avaliar os efeitos da biflorina tanto

in vitro quanto in vivo.

O melanoma é uma neoplasia com um crescente aumento de incidência na

população. Quando diagnosticado na fase inicial da doença, ele é curável. Porém

quando avançado, os melanomas metastáticos são quase sempre fatais, e os pacientes

com essa doença avançada têm sobrevida reduzida. Atualmente, a terapia

quimioterápica sistêmica ainda não é satisfatória, pois apenas a pequena minoria dos

pacientes responde de forma aceitável (GOGAS

et al., 2007). A literatura tem relatado a

dificuldade em se obter drogas com mecanismos contra o tumor que não tragam tantos

prejuízos aos pacientes. Em recente revisão, Gogas e colaboradores (2007) fizeram um

apanhado de informações à cerca do papel da quimioterapia citotóxica no tratamento do

melanoma metastático, discutindo os aspectos da quimioterapia de um único agente, da

148

quimioterapia combinada, das combinações da quimioterapia com agentes

imunomoduladores e a combinação da quimioterapia com alvos direcionados e

mostraram que os agentes em terapia única promovem <20% de respostas em pacientes

com melanoma metastático. A dacarbazina (DCTI) que é o único quimioterápico

citotóxico aprovado pela agência regulatória de medicamentos norte-americana (FDA)

para tratamento de melanoma metastático (GOGAS

et al., 2007), produz taxas de

resposta em 15-25% dos pacientes, com uma resposta média de 5 – 6 meses, mas apenas

<5% das respostas são completas. E o tratamento em longo prazo com DCTI tem

mostrado que <2% dos pacientes conseguem uma sobrevida de 6 anos. A temozolamida

(TMZ) via oral, um congênere da DCTI, foi eficaz contra vários tumores sólidos,

principalmente os tumores de sistema nervoso central (SNC) e tornou-se uma

alternativa a DCTI, uma vez que esta é ineficaz para mestástases no SNC. Em um

estudo randomizado com 305 pacientes com melanoma avançado, a TMZ mostrou-se

equivalente a DCTI em termos de taxa de resposta objetiva, tempo de progressão e

tempo livre de doença. Nesse estudo, pacientes com metástase no SNC foram excluídos.

O estudo foi desenhado para mostrar a superioridade da TMZ sobre a DCTI e de fato a

TMZ foi muito bem tolerada e mostrou vantagens em relação à qualidade de vida dos

pacientes, no entanto, o FDA não aceitou os resultados do ensaio para indicação de

aprovação para o tratamento de melanoma, eles acharam que a administração de TMZ

em múltiplas doses ao dia ou a sua administração prolongada pode como em algumas

quimioterapias levar a mecanismos de resistência.

Outros agentes como cisplatina e carboplatina mostraram modesta atividade em

pacientes com melanoma metastático, com sobrevida de 3 meses. Quando associados à

aminofostina a sobrevida foi só de 4 meses. As nitrosuréias (carmustina, lomustina e

semustina demonstraram grave mielosupressão (ATIKINS, 1997; KIRKWOOD &

149

ARGAWALA, 1993). Os alcalóides da vinca, particularmente vindesina e vimblastina

tem mostrado aproximadamente resposta em 14% (QUAGLIANA,

et al., 1984) dos

pacientes e os taxanos de 16 a 17% (AAMDAL

et al., 1994; BEDIKIAN et al., 1995).

Com base na DCTI nenhuma dessas drogas tem chegado a estudo de fase III, porque já

em fase II, as respostas são inferiores a DCTI. Essas drogas raramente são usadas em

tratamento como agentes únicos na terapia de melanoma metastático, mas são

frequentemente incorporadas em combinação de quimioterapia ou bioquimioterapia.

Com isso, têm sido feitas investigações com agentes citotóxicos em combinação com

agentes com mínima eficácia imunomoduladora, e resultados similares entre a

associação da DCTI com tamoxifen e DCTI com interferon

α tem sido observada. Uma

taxa de 28% de sobrevida com média de 41 semanas de DCTI e tamoxifen foi alcançado

em relação a 12% de sobrevida de DCTI sozinha e quando associada à interferon

foram encontradas12 repostas completas e 4 parciais em 30 pacientes e a DCTI sozinha

mostrou 2 respostas completas e 4 parciais. Isso ressalta a necessidade de uma maior

eficácia de agentes únicos, que, isoladamente ou em combinação com outros agentes

poderá anular a resistência e também a necessidade de novos agentes que possuam vias

que possam diminuir os efeitos colaterais com um impacto significativo nessa doença

(GOGAS

et al., 2007).

Baseado nisso, foi dado seguimento as investigações no modelo melanoma B16,

onde os resultados obtidos a partir da determinação da CI

(3,0 µg/mL) da biflorina

após 24 horas de exposição mostraram que a maioria das células B16 tratadas com

biflorina sofreu morte celular por apoptose, sendo esta avaliada por coloração

diferencial por Laranja de Acridina /Brometo de Etídio. A indução de apoptose de

células tumorais é um benefício para a quimioterapia antineoplásica (LOS

et al., 2003).

A apotose é a morte celular programada da célula que envolve o controle genético de

150

eventos bioquímicos e morfológicos das células, incluindo a externalização da

fosfatidilserina, liberação de citocromo c da mitocôndria, ativação de caspase, redução

de volume nuclear das células, condensação de cromatina e fragmentação de DNA

intranucleossomal (SCHULTZ & HARRINGTON, 2003). Alguns desses eventos

puderam ser observados nos experimentos realizados pela coloração diferencial por

hematoxilina/eosina. Ficou claro que a morfologia das células tratadas com diferentes

concentrações de biflorina (1,5; 3,0 e 6,0 µg/mL) é sugestiva de apoptose, uma vez que

podemos observar a redução do volume nuclear, condensação de cromatina, corpos

apoptóticos e várias invaginações. Essas alterações morfológicas também foram

observadas nas células tratadas com doxorrubicina (0,3 µg/mL).

As informações de fragmentação de DNA e redução de volume celular tanto por

observação direta por coloração diferencial H/E, quanto por citometria de fluxo,

sugeriram indução de morte celular por apoptose. Inicialmente, para caracterização do

tipo de morte celular causado pela biflorina, a avaliação da integridade de membrana

por citometria não exibiu aumento da percentagem de células não viáveis, ou seja,

daquelas coradas com iodeto de propídeo. As células não viáveis estão sujeitas ao

mesmo princípio de coloração pelo brometo de etídeo quando utilizado para avaliar as

células necróticas contadas na coloração com AL/BE. Essa diferença, embora não

esperada, pode ser explicada em parte pelas diferentes sensibilidades dos ensaios em

questão. Na citometria foram contadas 5.000 células para cada replicata, enquanto que

na coloração com AL/BE são contadas 300 células para cada amostra.

Em seguida, o efeito da biflorina foi avaliado nas células B16 através de

citometria de fluxo. Esta técnica foi utilizada por permitir uma quantificação mais

precisa e confiável de indução de apoptose e de outros parâmetros, como avaliar se

ocorre alguma interferência específica nas fases do ciclo celular das células (LECOEUR

151

et al., 1997). A análise do ciclo celular permitiu observar que a biflorina não promove

acúmulo de células em nenhuma das fases do ciclo celular.

A citometria de fluxo também confirmou as observações morfológicas a cerca da

fragmentação de DNA. Enquanto as células não tratadas apresentaram 5% de DNA

fragmentado, o tratamento com biflorina causou fragmentação de 23% na maior

concentração (6,0 µg/mL). Foi avaliada também a viabilidade celular por citometria

testando a integridade da membrana plasmática e contagem de células com morfologia

normal. O percentual de células viáveis não mudou significativamente até a maior

concentração testada (6,0 µg/mL).

Os estudos relacionados ao tipo de morte celular foram prosseguidos com

objetivo de melhor caracterizar a via apoptótica envolvida. A mitocôndria desempenha

papel chave na deflagração da apoptose em certas condições celulares. A via intrínsica

da apoptose é também conhecida como via mitocondrial, tendo como o principal

modulador dessa via, a proteína Bcl-2 da super família Bcl-2, que consiste de membros

pró-apoptóticos e anti-apoptóticos, e a interação do equilíbrio global entre o balanço

dessas proteínas pode determinar o destino da célula (ORRENIUS, 2004). A alteração

no potencial transmembrânico mitocondrial pode ser medida para verificação indireta da

ativação da via intrínseca. A biflorina alterou significativamente o potencial

mitocôndrial desde a concentração 1,5 µg/mL, sugerindo o envolvimento da ativação da

via apoptótica intrínseca. Modelos atuais sugerem que o Bax/Bak, que é um subgrupo

de moléculas (Bax, Bak, Bok e Bcl-x

), com função pró-apoptótica central, são

mantidas e verificadas pela proteína antiapoptótica Bcl-2. Essas moléculas são, por sua

vez, inativadas pela “BH3-only”, uma família de proteínas como a Bim, Bid, Bik, Noxa

e Puma. O “BH3-only” faz uma ligação hidrofóbica com as proteínas da família Bcl-2 e

atua como sensor celular que regula a ativação da morte celular por apoptose na via

152

intrínseca (STRASSER, 2005). Esta via é ativada por uma multiplicidade de estímulos,

incluindo drogas citotóxicas, estresse genotóxico, retirada de fatores de crescimento,

dano no DNA, perda de ancoragem e pelos chamados modificadores de resposta imune

como as imidazoquiloninas (LEVERKUS, 2004). Portanto, o controle das proteínas

Bcl-2 é um ponto crítico que precisa ser superado para o tratamento eficiente do câncer.

É importante que muitas proteínas sejam inativadas para expressão do Bax/Bak, para

que estas, por sua vez, conduzam o processo da apoptose através da mitocôndria

(CORY

et al, 2003). Os resultados obtidos sugerem que a indução de apoptose pela

biflorina, de fato, envolve as vias dependentes da despolarização da mitocôndria. Outros

estudos são necessários para averiguar de que forma a biflorina pode estar inativando as

proteínas anti-apoptóticas ou ativando as proteínas pró-apoptóticas e conduzindo essas

células à morte celular programada.

Os resultados da atividade citotóxica da biflorina nos levaram a investigar sua

atividade antitumoral para uma melhor análise a cerca do seu efeito em animais. A

literatura mostra vários trabalhos com o estudo de naftoquinonas contra tumores

sólidos. Lima e colaboradores em 1972 estudaram a atividade antitumoral de

naftoquinonas como a juglona, o lapachol, a lawsona e a plumbagina nos modelos

Sarcoma 180, mostrando que esses compostos, com exceção do lapachol, inibiram o

crescimento do tumor. Por outro lado, todas essas substâncias, inclusive o lapachol,

foram ativas contra o carcinoma de Erlich. A beta-lapachona foi ativa contra sarcoma

180

in vitro e em sarcoma de Yoshida e carcinossarcoma de Walker 256 in vivo

(SANTANA et al., 1968; DO CAMPO et al., 1979).

Os resultados obtidos no presente trabalho mostram que a biflorina apresentou

atividade contra os tumores Sarcoma 180 e Carcinoma de Erlich com perfil bastante

similar às outras naftoquinonas. Em adição a atividade antitumoral observada pela

153

biflorina administrada isoladamente, esse composto foi capaz de aumentar a resposta

suscitada pelo 5-FU (P<0,05) em camundongos transplantados com sarcoma 180 e

carcinoma de Erlich. Esse resultado mostra-se interessante, pois possibilita uma opção

de melhora na eficácia da terapêutica antineoplásica cujo objetivo é desenvolver uma

combinação de drogas que possa reduzir os efeitos colaterais durante o tratamento.

A análise histopatológica do baço, rim e fígado retirados dos animais tratados

com biflorina revela apenas uma leve toxicidade, uma vez que os animais tratados

apenas com DMSO 10% (grupo controle) apresentaram um perfil morfológico

semelhante nesses órgãos. Algumas alterações como esteatose microvesicular

acompanhadas de degeneração hidrópica de hepatócitos foram observados nos animais

tratados com biflorina e com 5-FU. Esses efeitos, de acordo com a literatura, também

podem estar relacionados com uma leve hepatotoxicidade (KUMMAR, 2004; TORTI

al.,2001).

O fígado é um órgão com grande capacidade de regeneração por fenômeno

adaptativo como o aumento no retículo endoplasmático produzido por longo tempo de

tratamento com drogas anticonvulsivantes (KUMMAR, 2004).

A regeneração dos tecidos hepáticos ocorre em muitas doenças, com exceção

das mais deletérias. Mesmo quando a necrose hepatocelular está presente, mas o tecido

conjuntivo é preservado, a regeneração pode ser completa (KUMMAR, 2004). Além

disso, as alterações observadas nos rins dos animais tratados com biflorina também

podem ser consideradas discretas (SHULER & BENNET, 1995; TORTI

et al.,2001).

Pode-se dizer que a biflorina exibiu efeitos antitumorais sobre os tumores sem uma

expressiva toxicidade. Além disso, apesar da baixa potência observada para a utilização

de biflorina isoladamente, ela aumentou a eficácia do 5-FU e diminui a toxicidade

sistêmica induzida por 5-FU, quando a ele associada.

154

Os efeitos da biflorina no baço dos animais tratados incluíram aumento de peso

do órgão, aumento da polpa branca e de ninhos de megacariócitos, suscitando a hipótese

de que a atividade antitumoral desse composto possa estar relacionada a uma atividade

imunoestimulante, juntamente com a já descrita toxicidade direta frente a células

tumorais.

Para o estudo da atividade imunoadjuvante da biflorina, os animais foram

tratados com ovalbumina (controle) ou biflorina associada à ovalbumina para

investigação da síntese de anticorpos anti-OVA. Os resultados revelam um aumento da

produção de anticorpos totais (IgG, IgA e IgM) anti-OVA em camundongos imunizados

com ovalbumina em associação com a biflorina quando comparados ao grupo tratado

apenas com ovalbumina, o que indica uma atividade imunoadjuvante humoral desse

composto.

O sistema imunológico desempenha uma função de proteção do indivíduo contra

microorganismos patogênicos, mas também é responsável pela manutenção da baixas

taxas de crescimento de células neoplásicas ou lesões pré-cancerosas no organismo

(BRANDLEIN

et al., 2003a; 2003b; 2004; VOLLMERS & BRANDLEIN,

2005a,2005b). Chamamos esse evento contínuo que impede a formação de tumores pelo

sistema imunológico de vigilância imunológica. Com relação à imunidade humoral, a

IgM parece ser o anticorpo mais envolvido na vigilância imunológica, pois consegue

ligar-se em antígenos glicosilados que estão na superfície de células neoplásicas e ativar

uma série de ações como: ativação do sistema complemento e lise de células

cancerígenas, opsonização da célula alvo e quimiotaxia de células fagocíticas para o

tumor (VOLLMERS AND BRÄNDLEIN, 2007). O aumento da síntese de anticorpos

anti-OVA induzido pela biflorina, como demonstrado nos resultados desse trabalho,

pode sugerir também que esse composto é capaz de aumentar a síntese de anticorpos

155

contra o tumor. É possível que esse aumento de anticorpos induza as ações descritas

acima levando a diminuição da massa tumoral.

Um terceiro modelo tumoral foi utilizado com o intuito de avaliar se a biflorina

promoveria alguma ação benéfica em relação à sobrevida dos animais inoculados com o

tumor. Como vários cânceres, incluindo Melanoma, são conhecidos por serem sensíveis

à modulação imunitária (TUTHILL

et al., 2007), era de interesse avaliar os efeitos deste

composto no melanoma murino B16, uma vez que os resultados obtidos apontaram uma

atividade imunoadjuvante em animais suiços saudáveis.

Tuthill e colaboradores (2007), em estudo semelhante a esse realizado com a

biflorina, testaram o SCV - 07 (D - gama - glutamil - L - triptofano), um peptídeo

sintético com efeito imunoestimulante comprovado, e eficácia contra várias infecções

virais e bacterianas, em camundongos B57CL/6 transplantados com células B16. Os

resultados foram semelhantes aos obtidos com a biflorina, onde se observou redução do

volume tumoral em relação ao controle negativo e ausência de toxicidade sistêmica.

Além disso, também foi observada a sobrevida e a atividade imunoadjuvante nos

animais (B57CL/6) que receberam as células tumorais tratados com biflorina.

Novamente foi obtido mais um resultado interessante, pois a sobrevida dos animais

tratados com a

orto-naftoquinona foi maior quando comparado aos demais grupos,

inclusive em relação ao grupo controle positivo tratado com dacarbazina.

Nesse âmbito, buscando estudar qual seria o mecanismo de ação da

orto-

naftoquinona em estudo resolveu-se investigar as propriedades eletroquímicas da

biflorina, e se ocorre interação direta com o DNA através da análise por biossensor de

DNA. Sabe-se que quinonas podem exercer danos no DNA através de suas ações

eletrofílicas, resultando em aductos covalentes no centro nucleofílico do DNA

(PARDEE

et al., 2002; BENTLE et al.,2006).

156

As propriedades eletroquímicas de algumas biomoléculas fornecem informações

que podem, eventualmente, ser relacionadas às ações biológicas. A eletroquímica possui

um papel relevante quando ocorre transferência de elétrons seguida de estresse

oxidativo, gerando espécies oxigenadas reativas ou tóxicas, que podem gerar danos às

células. O estudo dos potenciais de redução pode ser útil no entendimento do modo de

ação de fármacos, enzimas e toxinas. O estudo em biossensores de DNA nos permite

avaliar e prever interações com o DNA com base na sua ligação a ácidos nucléicos

(KOVACIC

et al., 2000; ABREU et al, 2002).

De fato, o perfil eletroquímico mostrou que a biflorina sofre redução e interage

com o DNA de fita dupla e com o DNA de fita simples, sem a necessidade de nenhum

intermediário reativo, ou espécie oxigenada.

Esses resultados estimularam a pesquisa sobre uma possível inibição de

topoisomerase, bem como do potencial genotóxico da biflorina através da avaliação da

indução de dano ao DNA detectada pelo teste do cometa e pela avaliação de aberrações

cromossômicas em linfócitos de sangue periférico de voluntários saudáveis. Um

balanço entre os efeitos terapêuticos e toxicológicos de um composto é um importante

parâmetro quando avaliado seu potencial como droga farmacológica. A cultura celular

pode ser usada para avaliar a citotoxicidade basal e o alvo de toxicidade orgânica

(EKWALL & EKWALL, 1988; SEIBERT

et al., 1996).

A Topoisomerase I (Top I) está envolvida em múltiplos eventos envolvidos com

o DNA, como replicação do DNA, transcrição, condensação e descondensação

cromossômica e provavelmente na recombinação através da clivagem e religação do

DNA, que são normalmente acoplados para o relaxamento do DNA superespiralado

durante a transcrição e replicação da cromatina (POMMIER

et al., 2003). A biflorina,

no entanto, não causou inibição de topoisomerase, sugerindo que a interação que ocorre

157

com o DNA não é por esse mecanismo. Por outro lado, a beta-lapachona foi identificada

como uma potente candidata a inibidora por sua ação direta com a enzima (DEGRASSI

et al., 1993; LI et al., 1993). Lapachol e seus derivados apresentaram além da inibição

dose-dependente de inibição de crescimento do carcinoma de Erlich e células

leucêmicas K562 em cultura, inibição de topoisomerase I e II (ESTEVES-SOUZA,

2007). Esses resultados sugerem um mecanismo de ação para a biflorina diferente

daquele descrito para outras naftoquinonas.

Além disso, a biflorina não induziu aberrações cromossômicas em linfócitos,

porém em ambas as doses testadas, foi capaz de reduzir o índice mitótico na fase S do

ciclo celular, ressaltando sua citotoxicidade. Essas concentrações correspondem a

aproximadamente 3 a 5 vezes o valor da CI

em linfócitos, calculada pelo teste do

Alamar Blue, e ainda assim, não houve indução de efeito clastogênico pela biflorina.

Por outro lado, no teste cometa, nas mesmas concentrações houve um aumento

dos níveis em dano ao DNA. Os danos mensurados correspondentes a escores de 0 a 4

são passiveis de reparo (TICE

et al., 2000), mas o desenho do estudo não permitiu

predizer se esse processo de reparo ocorre. De fato, algumas outras naftoquinonas são

conhecidas por induzirem genotoxicidade. Vanni e colaboradoes (1998) demonstraram

que a β-lapachona é genotóxica em células CHO quando em eluição alcalina, causando

quebras nas fitas de DNA, sendo seletiva mediante citotoxicidade na fase S do ciclo

celular indicada pela análise em citometria de fluxo. Também foi encontrado que 2-

metil-1,4-naftoquinona pode causar quebras nas fitas de DNA nas fases tardias dos

estágios de desenvolvimento do camarão erva (KIM

et al., 2004).

O distúrbio do equilíbrio redox e a indução de dano ao DNA, principalmente

quebras de fita simples e dupla, podem resultar em potencial citotoxicidade em células

normais e células tumorais (ROSA

et al., 2007). De acordo com vários autores, o

158

estresse oxidativo levando ao dano do DNA e alquilação do nucleófilo celular são os

dois prováveis mecanismos de citotoxicidade das quinonas (BOLTON

et al., 2000).

Controversamente, a biflorina apresentou atividade antioxidante em baixas

concentrações, isso foi verificado em três metodologias diferentes. Na autoxidação do

ácido oléico, bem como o método utilizando o ensaio de hipoxantina/xantina oxidase e

o método do DPPH para avaliar a habilidade da biflorina em remover radicais livres

demonstraram que ao invés da biflorina apresentar atividade pró-oxidante como

lapachol e β-lapachona, ela provavelmente protege as células dos danos causados por

agentes oxidantes. Todos esses resultados somados fizeram com que outras perguntas

fossem suscitadas e então as investigações a cerca da existência de atividade

antioxidante, nos levaram a escolher outros modelos para explorar esse potencial.

As células V79 são bem caracterizadas e comumente utilizadas nos estudos de

citotoxicidade e genotoxicidade (BRADLEY

et al., 1981). A biflorina não induziu

citotoxicidade quando testada em doses baixas e teve efeito protetor contra o peróxido

de hidrogênio.

O peróxido de hidrogênio é uma substância com atividade genotóxica, capaz de

induzir danos oxidativos no DNA, incluindo quebra de fitas e modificação básica no

DNA. Os efeitos mutagênicos de ROS, em especial de H

, que induz lesões

semelhantes aos causados por radiação ionizante, estão bem documentados em células

V79 (LI

et al., 2000).

Células V79 quando foram expostas à biflorina na presença e ausência de

peróxido de hidrogênio mostraram a redução dos danos induzidos pela peroxidação

lipídica, mensurada pelos níveis de TBARS. A biflorina também foi capaz de diminuir

danos ao DNA e mutação, desencadeada pelo peróxido de hidrogênio em levedura.

Qualquer lesão detectável por uma enzima de reparo específica (que cliva o DNA

159

especificamente no seu sítio de lesão) pode ser avaliada pelo teste cometa (COLLINS

al, 1993). Ao empregar as enzimas endonuclease III (endoIII) e Formamidopirimidina

DNA-glicosilase (Fpg) para detectar danos oxidativos, através do ensaio cometa com

modificações, verificou-se que a biflorina não induz dano oxidativo. Ao contrário,

promoveu uma importante diminuição dos danos induzidos pelo peróxido de

hidrogênio. No entanto, relativamente pouco se sabe dos efeitos da biflorina sobre dano

oxidativo induzido por espécies reativas de oxigênio no DNA das células dos

mamíferos.

A razão para esta proteção por biflorina em doses baixas não é óbvia, mas

provavelmente reside na remoção de radicais livres. O H

gera radicais hidroxilas

pela reação de Fenton, que atacam DNA, conduzindo assim a quebra de fitas (VALKO

et al., 2007).

Para os ensaios de mutagênese, a biflorina não induziu atividade mutagênica na

linhagem XV185-14c de

S. cerevisiae nas doses testadas. Para os testes de

antimutagenicidade, a substância protegeu significantemente de lesões induzidas por

quando pré-tratadas, na dose de 0,25 mg/mL. Este efeito poderia ser atribuído a

uma atividade desmutagênica, onde os agentes protetores atuariam diretamente sobre a

ação do H

, inibindo a formação dos compostos que induzem mutações no DNA ou

seqüestrando as moléculas reativas, como o radical hidroxil. Por sua vez, Jamieson e

colaboradores (1994) testaram a naftoquinona plumbagina em células de

S. cerevisiae,

sugerindo que sua ação tóxica seria devido à produção de ânions superóxido, o que

ficou comprovado uma vez que na linhagen mutante no gene superóxido dismutase

Cu/ZnSOD (

SOD1) a plumbagina se mostrou extremamente sensível, inclusive 100

vezes mais sensível que na linhagem mutante em MnSOD (

SOD2) sendo indistinta

entre a

sod2 e o tipo selvagem.

160

Da mesma forma, na recombinogênese na linhagem XS2316, nas concentrações

de 0,125 a 0,5 mg/mL de biflorina, os efeitos do H

foram revertidos.

O padrão seguido internacionalmente para genotoxicidade,

Standard Battery for

Genotoxicity Testing of Pharmaceuticals – (ICH, 1997), recomenda uma bateria padrão

de testes a ser realizada para

a avaliação da genotoxicidade de drogas de um modo geral

e de drogas antineoplásicas. Essa bateria de testes é composta por um teste em mutação

genética de bactéria, um teste

in vitro com avaliação citogenética de dano cromossomal

com células de mamíferos e um teste

in vivo para danos cromossomais usando células

hematopoiéticas de roedores.

O teste de Ames é usado em primeira instância como

triagem para determinar o

potencial mutagênico de novos produtos químicos e drogas, os dados oriundos deste

teste são submetido às agências regulatórias para o registro de muitos químicos,

incluindo fármacos e biocidas (AULETTA

et al., 1993; FDA, 1993; KIRKLAND,

1993; SOFUNI, 1993). Os protocolos internacionais têm sido desenvolvidos para que as

empresas e laboratórios possam assegurar a uniformidade dos estudos (ICH, 1995;

OECD, 1997).

Com o intuito de contemplar as normas internacionais e descartar quaisquer

dúvidas em relação à genotoxicidade da biflorina foram ainda utilizados o teste de

micronúcleos em medula óssea de camundongo e o teste de mutação genética, com as

linhagens de

Salmonella typhimurium, ambos com o resultado negativo.

Estudos com a naftoquinona lawsona relatam que ela quando testada em medula

óssea de camundongo, não mostrou efeito clastogênico após 24 e 48h de tratamento,

porém após 72h observou-se um aumento da incidência de micronúcleos, os autores

ressaltam que existe essa hematotoxicidade no tempo de 72h que pode estar associada à

exposição ao veículo (DMSO), uma vez que a eritropoiese induzida por agentes

161

genotóxicos, leva a pequenos aumentos na freqüência de micronúcelos, os dados

sugerem que a resposta positiva produzida em 72h pela lawsona é consistente com a

estimulação de hematopoiese subseqüente a uma toxicidade hematológica da lawsona e

não ao mecanismo de reatividade com o DNA (KIRKLAND & MARZIN, 2003). Com

a biflorina, também não se observou clastogenicidade após 24 e 48h do tratamento. Não

foram realizadas análises após 72h do tratamento.

No teste com

Salmonella typhimurium os resultados obtidos com biflorina

mostraram-se negativos com e sem ativação metabólica em todas as linhagens testadas.

A literatura, no entanto, indica que quinonas não-substituídas normalmente não

apresentam mutagenicidade, ao contrário das quinonas derivadas com um ou mais

grupos hidroxila ou metila, as quais tem mostrado mutagenicidade nos testes com

bactéria na presença de ativação metabólica (MATSUSHIMA

et al., 1986). Vários

estudos foram feitos a cerca da mutagenicidade de quinonas pelo teste de Ames, e estas,

de um modo geral, mostraram-se não mutagênicas para algumas linhagens e

mutagênicas para outras, mas praticamente todas se mostraram negativas para as

mesmas linhagens testadas contra biflorina. Num estudo com cinco naftoquinonas

(chimafilina, 5,8-hidroxi-1,4-naftoquinona, juglona, plumbagina e menadiona) testadas

em relação ao potencial antimutagênico contra mutagenicidade induzida por 2-

nitrofurano, 3-nitrofluruaneto e 1-nitropireno, em

S. thyphimurium TA98, todas elas

foram potentes agentes antimutagênicos em relação à presença de função metil e

hidroxila, entretanto, a plumbagina, mostrou-se excepcionalmente antimutagênica

(EDENHARDER & TANG, 1997), o que vem a corroborar com Farr e colaboradores

(1985), que concluíram que a toxicidade da plumbagina é, em parte, função do dano

causado ao DNA, porém, esse dano é diferente do tipo causado pelo H

, sendo as

respostas celulares do H

e da plumbagina distintas.

162

Vários estudos de validação têm sido feitos para determinar a reprodutibilidade

dos resultados dos testes de Ames intra e inter-laboratoriais (DUNKEL

et al.,

1984,1985; MARGOLIN

et al., 1984; PURCHASE et al., 1978). A preocupação tem

sido a determinação da sensibilidade e a correlação do teste de Ames com estudos de

carcinogenicidade. Eles, de fato, têm sido estabelecidos para que se possa predizer a

correlação entre uma resposta mutagênica positiva e a carcinogenicidade em roedores

McCANN

et al., 1975; AMES & McCAN, 1976; SUGIMURA et al., 1976; TENNANT

et al., 1987 ZEIGER et al., 1988), que variam de 90 (McCANN et al., 1975) a 77%

(ZEIGER

et al., 1988), sendo as diferenças primárias, a composição química das

substâncias avaliadas.

A biflorina, não apresentou mutagenicidade, porém existe a possibilidade de

uma substância não genotóxica ser carcinogência, como é o caso, por exemplo, o

tetracloroetileno, 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina, fenobarbital, pentaclorofenol e o

tetradecanoil forbol acetato (VAN DELFT

et al., 2004). No entanto, substâncias

carcinogênicas não genotóxicas, embora não causem mutações, podem estimular a

proliferação celular e desta forma estimulam a fixação de mutações espontâneas e

conseqüente expansão clonal, pela acelerada proliferação celular, resultando em um

segundo clone e assim por diante (GOMES-CARNEIRO

et al., 1997). Porém uma vez

que a biflorina mostrou-se genotóxica em linfócitos, mas essa genotoxicidade não

progrediu para uma mutação e o índice mitótico, indicativo de citotoxicidade diminuiu,

duas coisas podem estar acontecendo; a célula está sendo levada a morte,

provavelmente por apoptose ou o sistema de reparo da célula não está alterado, estando

em perfeito funcionamento. A lesão ao DNA pode ter sido reparada e o ciclo celular ter

continuado sem prejuízos, o que pode não ocorrer em linhagens tumorais, uma vez que

algumas linhagens possuem deficiência no seu sistema de reparo. Niaga e

163

colaboradores (2007) mostraram que as linhagens tumorais de mama humana MCF-7 e

HCC1937 são deficientes no sistema de reparo por excisão de quatro lesões induzidas

por danos oxidativos, isso, o que pode ser visto como algo benéfico para o tratamento

do câncer, na radioterapia, por exemplo, se as células tiverem os danos induzidos por

radioterapia, reparados, isso pode resultar em falência do tratamento e recorrência da

doença (JONES

et al., 2005).

Estudos realizados por Boorstein e Pardee (1983 e 1984) sugeriram que o co-

tratamento de beta-lapachona com 3-aminobenzamida, uma droga conhecida por inibir

PLD (“repair of potentially lethal damage”) (BURGMAN & KONINGS, 1989) inibem

o reparo de dano ao DNA, bloqueando a replicação do DNA e atividade da timidilato

sintase. Eles propuseram que a beta-lapachona inibe um passo de ligação do reparo do

DNA. Em estudos mais recentes, foi proposto que a beta-lapachona inibe a reparação

do DNA através da hiperativação do PARP-1. O PARP-1 é uma das mais abundantes

enzimas das células eucarióticas e serve como um apelido das moléculas de sinalização

que respondem a quebras das fitas do DNA, as duas porções terminais de zinco do

PARP – 1 reconhecem e se ligam com alta afinidade, às quebras de fitas simples e

duplas, contribuindo para facilitar a reparação das fitas pela via de reparo por excisão

de bases (BER), bem como pela via de reparo por recombinação homóloga (HR). (DE

MURCIA & MENISSIER DE MURCIA, 1994). A beta-lapachona, hiperativa o

PARP-1, que depleta NAD

e os níveis de ATP inativando a energia dependente do

processo de reparo. Esse resultado acumula dano no DNA causado por NQO1

dependente da formação de espécies reativas de oxigênio, levando a inibição do reparo

e morte celular.

164

Esses dados vêm descrevendo como as quebras de DNA de fita dupla e de fita

simples podem ser um alvo para a prevenção e tratamento do câncer e abrem uma nova

perspectiva de pesquisa em relação à investigação mecanismo de ação da biflorina.

Assim, pode-se estabelecer também que a biflorina interage diretamente com o

DNA de fita dupla e de fita simples, mas não é uma molécula inibidora de

Topoisomerase I. Dessa maneira, deixa-se em aberto boas perspectivas para futuros

estudos onde se possa averiguar se o modo de ação da biflorina seria pela alquilação

com o DNA, o que levaria a célula à morte, possivelmente por apoptose, sem, no

entanto, permitir que um processo de mutagênese se estabeleça, impedindo assim o

desenvolvimento da carcinogênese e tornando, esta molécula, um sério candidato à

terapia do câncer.

A biflorina é uma molécula com grande potencial farmacológico, como foi

demonstrado, e ainda é de fácil obtenção, com ênfase em ser esta uma molécula

essencialmente brasileira. Tal qual a maioria das quinonas conhecidas e estudadas

quanto à sua bioatividade, a biflorina é citotóxica

in vitro e possui relevante atividade

antitumoral

in vivo. No entanto, diferentemente delas, a biflorina demonstrou um

potencial imunoadjuvante e um significativo efeito antioxidante e protetor contra a

citotoxicidade, genotoxicidade, mutagenicidade e lipoperoxidação celular induzida por

. Entretanto, o achado que deve ter maior destaque, o que torna esta molécula

promissora, é o seu notável efeito no aumento significativo da sobrevida de animais

portadores de melanoma B16, sendo ainda mais eficaz que o próprio controle positivo.

165

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS

A ο-naftoquinona apresentou potencial citotóxico que não parece estar

relacionado à ruptura de membrana ou a dano oxidativo. Quando avaliado seu

mecanismo de ação verificou-se que a biflorina se comporta como uma substância

citotóxica, não causa alterações no ciclo celular, mas inibe a síntese de DNA e interage

diretamente com DNA de fita simples e DNA de fita dupla e induz morte celular por

apoptose.

Em modelos tumorais

in vivo a biflorina inibiu o crescimento tumoral do

sarcoma 180 e do carcinoma de Erlich, bem como aumentou a sobrevida dos animais

transplantados com B16, o que parece estar relacionado ao potencial imunoadjuvante da

molécula.

Quando avaliada quanto ao potencial genotóxico, mostrou-se citotóxica e

genotóxica em linfócitos humanos, contudo sem causar mutação. Em células V79 e

cereviseae apresentou potencial antimutagênico relacionado à remoção de radicais

hidroxil. Nos testes em

Salmonella thyphimurium e medula óssea de camundongos

igualmente não foi mutagênica, mostrando que quando metabolizada a biflorina também

não é mutagênica.

166

7. CONCLUSÃO

Considerando as atividades citotóxica, antitumoral e imunoadjuvante da

biflorina, e o seu potencial antineoplásico, coroado com o aumento da sobrevida dos

animais, tornam esta uma promissora molécula para a terapia do câncer.

167

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AAMDAL, S.; WOLFF, I.; KAPLAN, S.; PARIDAENS, J.; KERGER, J.;

SCHACHTER, J.;WANDERS, J.; FRANKLIN, W.R.; VERWEIJ, J. Docetaxel

(Taxotere) in advanced malignant melanoma: a phase II study of the EORTC early

clinical trials group.

European Journal Cancer, 30A, 1061-1064, 1994.

ACOSTA, S.L., MURO, L.V.; SACERIO, A.L.; MONTEAGUDO, G.L.; Pena, A.R. &

Okwei, S.N. Anti-inflammatory Effects of an Aqueous Extract of

Capraria biflora L.

Acta Farmaceutica Bonaerense, 22: 53-5, 2003a.

ACOSTA, S.L., MURO, L.V.; SACERIO, A.L.; MONTEAGUDO, G.L.; Pena, A.R. &

Okwei, S.N.. Analgesic properties of

Capraria biflora leaves aqueous extract.

Fitoterapia, v.74: p.686-8, 2003b.

AHMED, S. A.; GOGAL, R. M.; WALSH, J. E. A new rapid and simple non-

radioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes an

alternative to [3H]thymidine incorporation assay.

Journal of immunological methods,

v. 170, n. 2, p. 211-224, 1994.

AMES, B.N.; MCCANN, J. Detection of carcinogens as mutagens in the

Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals. Proceedings of the National

Academy of Sciences of the United States of America

, n. 73, p. 950–954, 1976.

ANAZETTI, M.C.; MELO, P.S.; DURAN, N.; HAUN, M. Comparative cytotoxicity of

dimethylamide-crotonin in the promyelocytic leukemia cell line (HL-60) and human

peripheral blood mononuclear cells.

Toxicology, v.188, p.261–274, 2003.

ATKINS, M.B. The treatment of metastatic melanoma with chemotherapy and

biologics.

Current opinion in oncology, v 9, p.205-213, 1997.

ASCHE, C. Antitumor Quinones.

Medicinal chemistry, v.5, p. 449-467, 2005.

AULETTA, A.E.; DEARFIELD, K.L; CIMINO, M.C. Mutagenicity test schemes and

guidelines: U.S. EPA Office of Pollution Prevention and Toxics and Office of Pesticide

Programs.

Environmental and molecular mutagenesis, n. 21, p. 38–45, 1993.

AYENSU, E. S.

Medicinal Plants of the West Indies, Reference Publications,

Algonac, Mich., p. 170, 1981.

BALMAIN, A.; GRAY, J.; PONDER, B. The genetics and genomics of cancer.

Nature

genetics, (supplement) v.33, p.238-244, 2003.

BAGULEY, B.C. A brief history of cancer chemotherapy.

Anticancer drug

development, San Diego, California, p.1, 2002.

BEDIKIAN, A.Y.; WEISS, G.R.; LEGHA, S.S.; BURRIS, H.A.; ECKARDT, J.R.;

JENKINS, J.; ETON, O.; BUZAID, A.C.; SMETZER, L.; VON HOFF, D.D. Phase II

trial of docetaxel in patients with advanced cutaneous malignant melanoma previously

untreated with chemotherapy.

Journal of Clinical Oncology, v.1 p. 2895-2899, 1995.

168

BENTLE, M.S.; BEY, E.A.; DONG, Y.; REINICKE, K.E.; BOOTHMAN, D.A. New

tricks for old drugs: the anticarcinogenic potential of DNA repair inhibitors.

Journal of

molecular histology, v.37, p.203–218, 2006.

BERVELY, A.T.

Anticancer drug development guide pre clinical screening, clinical

trials and approval Totowa, New Jersey, p.397, 1997.

BERVELY, A.T.

Tumor models in cancer research Totowa, New Jersey, p.397,

2002.

BOLTON, J.L.; TRUSH, M.A.; PENNING, G.;

DRYHURST, G.; MONKS, T.J. Role

of quinones in Toxicology.

Chemical research in toxicology, v.13, p.135-160, 2000.

BOORSTEIN, R.J., PARDEE, A.B. (1983) Coordinate inhibition of DNA synthesis and

thymidylate synthase activity following DNA damage and repair.

Biochemical and

biophysical research communications 117:30–36.

BOORSTEIN, R.J., PARDEE, A.B. (1984) Beta-lapachone greatly enhances MMS

lethality to human fibroblasts.

Biochemical and biophysical research

communications 118:828–834.

BRADLEY, M.; BHUYAN, B.; FRANCIS, M.C.; LANGENBACH, R.;

PETERSON, A.; HUBERMAN, E. Mutagenesis by chemical agents in V79 Chinese

hamster cells: a review and analysis of literature,

Mutation Research v.87, p.81–142,

1981.

BRAND, D.J. AND FISHER, J.F. Reductive transformations of 10-

deoxydaunomycinone.

Journal of Organic Chemistry v. 55, p. 2518-2530.

BRANDLEIN, S.; LORENZ, J.; RUOFF, N.; HENSEL, F.; BEYER, I.; MU¨LLER, J.;

NEUKAM, K.; ECK, M.; ILLERT, B.; MULLER-HERMELINK, H. K.; AND

VOLLMERS, H. P. Human monoclonal IgM antibodies with apoptotic activity isolated

from cancer patients.

Human Antibodies, v.11, p.107-119, 2002.

BRANDSHORT, B. Informational content of the echinoderm egg. In: Browder LW, ed.

Developmental Biology, a Comprehensive Synthesis. Oogenesis. New York: Plenum

Press 525-576, 1985.

BURGMAN, P.; KONINGS, A. W. T.

Effect of Inhibitors of Poly(ADP-Ribose)

Polymerase on the Radiation Response of HeLa S3 Cells

, Radiation Research, v. 119,

n. 2, p. 380-386, 1989.

CASSADY, J.M., DOUROS, J.D. (Eds.).

Anticancer Agents Based on Natural

Product Models. Academic Press, New York. 1980.

CHABNER, B.A.; CALABRESI, P. Antineoplásicos Em

As Bases Farmacológicas da

Terapêutica

; Goodman, L. S.; Gilman, A., eds.; Mc Graw Hill: Rio de Janeiro, p.903-

949, 1995.

169

COLLINS, A.R. Comet Assay for DNA damage and repair: principles, applications and

limitations.

Molecular Biotechnology, v.26, p. 249-61, 2004.

CORBETT T.H.; POLIN, L.; ROBERTS, B.J.; LAWSON, A.J.; LEOPOLD III, W.R.;

WHITE, K.; KUSHNER, J.; PALUCH, J.; HAZELDINE, S.; MOORE, R.; RAKE, J.;

HORWITZ, J.P. Transplantable Synergic Rodent Tumours.

Solid Tumors in Mice.

Teicher, B.A. In: Tumor Models in Cancer Research, p. 41-70, 1997.

CORY, S.; HUANG, D.C.; ADAMS, J.M. The Bcl-2 family: roles in cell survival and

oncogenesis.

Oncogene, v.22, p.8590–8607, 2003.

COSTA, V.; FERREIRA, P.M. Oxidative stress and signal transduction in

Saccharomyces cerevisiae: insights into ageing, apoptosis and diseases. Molecular

Aspects of Medicine., v. 22, p. 217-246, 2001.

COSTA-LOTUFO, L.V.; CUNHA, G.M.A.; FARIAS, P.A.M.; VIANA, G.S.B.;

CUNHA, K.M.A.; PESSOA, C.; MORAES, M.O.; SILVEIRA, E.R.; GRAMOSA,

N.V.; RAO, V.S.N. The cytotoxic and embryotoxic effects of kaurenoic acid, a

diterpene isolated from

Copaifera langsdorffii oleo-resin. Toxicon, v. 40, p.1231-1234,

2002.

COSTA-LOTUFO, L.V; JIMENEZ, P.C.; WILKE, D.V.; LEAL, L.K.A.M.; CUNHA.

G.M.A.; SILVEIRA, E.R.; CANUTO, K.M.; VIANA, G.S.B.; MORAES, M.E.A.;

MORAES, M.O.; PESSOA, C. Antiproliferative effects of several compounds isolated

from Amburana cearensis A.C.Smith. Z Naturforsch, v.58c, p. 675-680, 2003.

CORRÊA, M.P. Dicionário das Plantas Úteis do Brasil e das Exóticas Cultivadas.

Ed. Imprensa Nacional, Rio de Janeiro, Brasil, v.2, pág. 205, 1984.

CRAGG, M.G. & NEWMAN, D.J. Plants as a source of anti-cancer agents.

Journal of

Ethnopharmacology

, v.100, p.72-79, 2005.

DA SILVA, M.N.; FERREIRA, V.F.; SOUZA, M.C.B. Um panorama atual da química

e da farmacologia de naftoquinonas, com ênfase na β-lapachona e derivados.

Química

Nova, v.26, n.3, p.407-416, 2003.

DATASUS, Incidência de cancer no Brasil <http://w3.datasus.gov.br/datasus/>.

Acessado em 15.10.2007.

DAVIDOVIC, L.; VODENICHAROV, M.; AFFAR, E.B.; POIRIER, G.G. Importance

of poly(ADP-ribose) glycohydrolase in the control of poly(ADP-ribose) metabolism.

Experimental Cell. Research, v.268, p.7–13. 2001.

DE ABREU, F.C.; BRETT, A.M.O.; GOULART, M.O.F. Detection of the damage

caused to DNA by niclosamide using an electrochemical DNA-Biosensor.

Biosensors

& Bioelectronics, v.17, p.913-919, 2002.

170

DE ALMEIDA, V.L.; LEITÃO, A.; REINA, L.C.B.; MONTANARI, C.A.; DONNICI,

C.L.; LOPES, M.T.P.

Câncer e agentes antineoplásicos ciclo-celular específicos e ciclo-

celular não específicos que interagem com o dna: uma introdução.

Química Nova, v.28,

p. 118-129, 2005.

DE-LOS-SANTOS-ÁLVAREZ, P.; LOBO-CASTAÑÓN, M.J.; MIRANDA-

ORDIERES, A.J.; MUÑÓN-BLANCO, P. Electrochemistry of Nucleic Acids at Solid

Electrodes and Its Applications.

Electroanalitycal, v.16, p.1193-1204, 2004.

DEGRASSI, F

.; DE SALVIA, R.; BERGHELLA, L. The production of chromosomal

alterations by beta-lapachone, an activator of topoisomerase I.

Mutation Research,

v.288, p.263-267, 1993.

DOCAMPO, R.; CRUZ, F. S.; BOVERIS, A.; MUNIZ, R. P.; ESQUIVEL, D. M. β-

Lapachone enhancement of lipid peroxidation and superoxide anion and hydrogen

peroxide formation bysarcoma 180 ascites tumor cells.

Biochemical Pharmacology v.

28, p. 723-728, 1979

DRESCH, R.R.; HAESER, A.S.; LERNER, C.; MOTHES, B.; VOZÁRIHAMPE,

M.M.; HENRIQUES, A.T. Detecção de atividade lectínica e atividade hemolítica em

extratos de esponjas (Porífera) nativas da costa atlântica do Brasil.

Revista Brasileira

Farmacognosia, v.15, p.16 - 22, 2005.

DUGUE, B.; AUCLAIR, C.; MEUNIER, B. Covalent Binding of Elliptinium Acetate

(NSC 264137) to Nucleic Acids of L1210 Cells in Culture.

Cancer Research, v.46, p.

3828-3833, 1986.

DUNKEL, V.C. ZEIGER, E.; BRUSICK, D.; MCCOY, E.; MCGREGOR, D.;

MORTELMANS, K.; ROSENKRANZ, H.S.; SIMMON, V.F. Reproducibility of

microbial mutagenicity assay: 1. Test with

Salmonella typhimurium and Escherichia

coli

using a standardized protocol. Environmental Mutagenesis, v. 6, n. 2, p. 1–254,

1984.

DUNKEL, V.C

; ZEIGER, E.; BRUSICK, D.; MCCOY, E.; MCGREGOR, D.;

MORTELMANS, K.; ROSENKRANZ, H.S.; SIMMON, V.F. Reproducibility of

microbial mutagenicity assays: II. Testing of carcinogens and noncarcinogens in

Salmonella typhimurium and Escherichia coli. Environmental. Mutagenesis v.7, n. 5,

p. 1–248, 1985.

EDENHARDER, R.; TANG, X. Inhibition of the mutagenicity of 2-nitrofluorene, 3-

nitrofluoranthene and 1-nitropyrene by flavonoids, coumarins, quinones and other

phenolic compounds.

Food and Chemical Toxicology, v.35, p. 357-372, 1997.

ESTEVES-SOUZA, A.; FIGUEIREDO, D.V.; ESTEVES, A.; CÂMARA, C.A.;

VARGAS, M.D.; PINTO, A.C.; ECHEVARRIA, A. Cytotoxic and DNA-

topoisomerase effects of lapachol amine derivatives and interactions with DNA.

Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 40, p.1399-1402, 2007.

171

EKWALL, B.; EKWALL, H. Comments on the use of diverse cell systems in toxicity

testing,

Alternatives to laboratory animals, v.15, p.193–200, 1988.

FARNSWORTH, N. R.; AKERELE, O.; BINGEL A.S.; SOEJARTO D.D.; GUO Z.

Medicinal plants in therapy

. Bulletin World Health Organisation, v.63, 965-981,

1985.

FONSECA, A. M.; SILVEIRA, E. R.; PESSOA, O. D. L.; LEMOS, T. L. G. Total

assignments of

H and

C spectra of biflorin and bis-biflorin from Capraria biflora.,

Magnetic resonance in chemistry., v. 41:p. 1038-40, 2002.

FONSECA, A. M., PESSOA, O. D. L., SILVEIRA, E. R., MONTE, F. J., BRAZ-

FILHO, R. AND LEMOS, T. L. G. Total assignments of 1H and 13C spectra of biflorin

and bis-biflorin from

Capraria biflora. Magnetic Resonance in Chemistry, v.41,

p.1038-1040, 2003.

FOOD AND DRUG ADMINISTRATION (FDA).

Toxicological Principles for the

Safety Assessment of Direct Food Additives and Color Additives Used in Food

“Redbook II” [Draft]. FDA, Center for Food Safety and Applied Nutrition,

Washington D.C., 1993.

FREEDBERG, D.

Ciência, Comércio e Arte em o Brasil dos Holandeses 1630-1654,

Herkenhoff, P., org.; GMT Editores Ltda.: Rio de Janeiro, 1999.

FRIEDBERG, E.C. How nucleotide excision repair protects against cancer.

Nature

Reviews., v.1, p.22-33, 2001.

FUSETANI, N.

Marine metabolites which inhibit development of echinoderm

embryos. In: Scheur PJ, ed. Biorganic Marine Chemistry. Berlin: Springer-Verlag,

p.61-92, 1987.

GATEHOUSE, D.; HAWORTH, T.; CEBULA, T.; GOCKE, E.; KIER, L.;

MATSUSHIMA, T.; MELCION, C.; NOHMI, T.; OHTA, T.; VENITT, S.; ZEIGER, E.

Recommendations for the performance of bacterial mutation assays.

Mutation

Research

, n.312, p.217-233, 1994.

GHISALBERTI, E.L. Detection and isolation of bioactive natural products. In:

Coletage, S.M. and Molyneaux, R.J. (eds),

Bioactive natural products: production,

detection, isolation and structural determination. Boca Raton, CRC Press, p.9-57,

1993.

GOGAS, H.J., KIRKWOOD, J.M., SONDAK, V.K. Chemoterapy for metastatic

melanoma. Time for a change?

Cancer, v. 109, p 445-464, 2007.

GOMES-CARNEIRO, M.R.; RIBEIRO-PINTO, L.F.; PAUMGARTTEN, F.J.R.

Fatores de risco ambientais para o câncer gástrico: a visão do toxicologista.

Caderno de

Saúde Pública

, v.13, p.27-38, 1997.

172

GONÇALVES DE LIMA, O.; I. L. D’ALBUQUERQUE; P. LOUREIRO; C. L

CARMONA; M. Z. BERNARD. Biflorina, novo antibiótico isolado da

Capraria biflora

(Scrophulariaceae),

Revista de Química Industrial, v. 22 (249), p.1-3, 1953a.

GONÇALVES DE LIMA, O.; I. L. D’ALBUQUERQUE; P. LOUREIRO. Novas

observações sobre a biflorina-antibiótico isolado da

Capraria biflora

(Scrophulariaceae),

Anais da Sociedade Biologia Experimental., XI (1), 3-9., 1953b.

GONÇALVES DE LIMA, O.; I. L. D’ALBUQUERQUE. Método simples de extração e

purificação da biflorina,

Revista do Instituto de Antibióticos de Recife, v.1 (1), p.7-9,

1958.

GONÇALVES DE LIMA, O.; I. L. D’ALBUQUERQUE; NAVARRO, M.C.P. Novo

Método de Extração Purificação da Biflorina com Possibilidade Industrial,

Revista do

Instituto de Antibióticos de Recife, v.4 (1/2), p.79-81, 1962.

GONÇALVES DE LIMA, O.; MACIEL, G. M.; OLIVEIRA, L. L.; LACERDA, A. L.;

MOREIRA, L. C.; MARTINS, D. G.

Revista do Instituto de Antibióticos de Recife,

v. 12, p. 3—12, 1972.

GUILLÉM, D.G. ALBARRACIN, A., ARQUIOLA, E., ERILL,S., MONTIEL L.,

PESET, J.L., ENTRALGO, P.L.

Historia del medicamentos. 4.ed. Doyma. 1987.

HANAHAN, D.; WEINBERG, R.A. The hallmarks of cancer.

Cell, v. 100, p. 57-70,

2000.

HOEIJMARKERS, H.J.J. Genome maintenance mechanism for preventing cancer.

Nature, v.411, p.366-374, 2001.

HONYCHURCH, P.N.

Caribean Wild Plants and Their Uses, Macmillan Publishers

Ltd.: London, p. 84, 1986.

INTERNATIONAL COMMISSION ON HARMONIZATION (ICH).

Guidance on

Specific Aspects of Regulatory Genotoxicity Tests for Pharmaceuticals

International Commission on Harmonisation of Technical Requirements for

Registration of Pharmaceuticals for Human Use, 1995.

INCA. Incidência de Câncer no Brasil <

www.inca.gov.br/estimativa/2006>. Acessado

em 11 de novembro de 2007.

JACOBS, R.S.; WHITE, S.; WILSON, L. Selective compounds derived from marine

organisms: effects on cell division in fertilized sea urchin eggs. Fed Proc

40, 26-9,

1981.

173

JACOBS, R.S., WILSON, L. Fertilized sea urchin egg as a model for detecting cell

division inhibitors. In: Aszalor A, ed.

Modern Analysis of Antibiotics. New York:

Marcel Dekker, Inc. p. 481-493, 1986.

JAMIESON, D.J.; RIVERS, S.L.; STEPHEN, D.W.S. Analysis of

Saccharomyces

cerevisiae proteins induced by peroxide and superoxide stress. Microbiology, v.140, p.

3277-3283, 1994.

JIMENEZ, P. C.; FORTIER, S. C.; LOTUFO, T. M. C.; PESSOA, C.; MORAES, M. E.

A.; MORAES, M. O.; COSTA-LOTUFO, L. V. Biological activity in extracts of

ascidians (Tunicata, Ascidiacea) from the northeastern Brazilian coast.

Journal of

experimental marine biology and ecology., 287, 93 . 101, 2003.

JONES, R.K.; GEWIRTZ, D.A.; YANNONE, S.M.; ZHOU, S.; SCHATZ, D.G.;

VALERIE, K.; POVIR, L. F. Radiosensitization of MDA-MB-231 breast tumor cells by

adenovirus-mediated overexpression of a fragment of the XRCC4 protein.

Molecular

Cancer Therapy,v.4, p.1541-1547, 2005.

KAUR, S.; MICHAEL, H.; ARORA, S.; HÄRKÖNEN, P.L.; KUMAR, S. The in vitro

cytotoxic and apoptotic activity of Triphala-an Indian herbal drug.

Journal of

Ethnopharmacology.,v.97 p.15-20, 2005.

KIRSCH-VOLDERS, M.; VANHAUWAERT, A.; DE BOECK, M.; DECORDIER, I.

Importance of detecting numerical versus structural chromosome aberrations.

Mutation

Research v. 504, p. 137-148, 2002.

KIRKLAND, D.J. Genetic toxicology testing requirements: official and unofficial

views from Europe.

Environmental Molecular and Mutagenesis, n. 21, p. 8–14,

1993.

KIRKLAND, D.; MARZIN, D. An assessment of the genotoxicity of 2- hydroxy-1,4-

naphthoquinone, the natural dye ingredient of henna.

Mutation Research, v.573,

p.183–199, 2003..

KOVACIC, P

. Unifying mechanism for anticancer agents involving electron transfer

and oxidative stress: clinical implications.

Medical Hypotheses, v.69, n.3, p.510-516,

2007.

KRISHNA, G.; URDA, G.; THEISS, J. Principles and practices of integrating

genotoxicity evaluation into routine toxicology studies: a pharmaceutical industry

perspective.

Environmental Molecular and Mutagenesis, v.32, p.115-120, 1998.

KUMMAR, V.; ABBAS, A.; FAUSTO, N.; ROBBINS; COTRAN.

Pathology Basis of

Disease, 7th ed. China: WB Saunders, 1552, 2004.

LECOEUR, H.; LEDRU, E.; PRÉVOST, M.C.; GOUGEON, M.L. Strategies for

phenotyping apoptotic peripheral human lymphocytes comparing ISNT, annexin-V and

7-AAD cytofluorometric staining methods.

Journal of Immunological Methods,

v.209, p. 111–123, 1997.

174

LEVERKUS, M. Imiquimod: unexpected killer.

The Journal of investigative

dermatology, v.122, p. 15-16, 2004.

LI, C.J

.; AVERBOUKH, L.; PARDEE, A.B. Beta-Lapachone, a novel DNA

topoisomerase I inhibitor with a mode of action different from camptothecin.

The

Journal of Biological Chemistry, v.268, p. 22463-22468, 1993.

LI, J.; CHEN, J.J.; ZHANG, F.; ZHANG, C. Ebselen protection against hydrogen

peroxide-induced cytotoxicity and DNAdamage in HL- 60 cells,

Acta pharmacologica

Sinica, v.21, p. 455–459, 2000.

LI, QY.; ZU, Y.G.; SHI, R. Z.; LI, P.Y. Review Camptothecin: Current Perspectives.

Current Medicinal Chemistry, v. 13, p. 2021-2039, 2006.

LIN, T.S.; ANTONINI, I.; COSBY, L.A.; SARTORELLI, A.C. 2,3-Dimethyl-1,4-

naphthoquinone derivatives as bioreductive alkylating agents with cross-linking

potential.

Journal of Medicinal Chemistry, v.27, p.813–815, 1984.

LINDAHL, T.; WOOD, R. D.; Quality control by DNA repair.

Science, v.286, p.1897,

1999.

LOS, M.; BUREK, C.J.; STROH, C.; BENEDYK, K.; HUG, H.; MACKIEWICZ, A.

Anticancer drugs of tomorrow: apoptotic pathways as target for drug design.

Drug

Discovery Today, v. 8, p.67–77, 2003.

LORENZI, H.; F. J. A. MATOS.

Plantas Medicinais no Brasil: Nativas e Exóticas,

Instituto Plantarum, Nova Odessa-São Paulo, p. 434-435, 2002.

LYRA JÚNIOR, D.P. “Isolamento, Atividade Antifúngica e Validação do Método de

Doseamento da 3-prenil-6,9-dimetil-7,8-dioxoquinona - Biflorina”,

Dissertação de

Mestrado

, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, 1999.

LU, H.R.; ZHU, H.; HUANG, M.; CHEN, Y.; CAI, Y.J; MIAO, Z.H; ZHANG, J.S.;

DING, J. Reactive oxygen species elicit apoptosis by concurrently disrupting

topoisomerase II and DNA-dependent protein kinase.

Molecular Pharmacology, v.68,

p.983–994, 2005.

LUU, C. Notes on the traditional pharmacopeia of Fench Guyana. Plantas Medicinales

Phytoterapie, v.9, p.125-135, 1975.

MACGREGOR, J. T., HEDDLE, J. A., HITE, M., MARGOLIN, B. H., RAMEL, C.,

SALAMONE, M. F., TICE, R.R. AND WILD, D. Guidelines for the conduct of

micronucleus assays in mammalian bone marrow erytrocytes.

Mutation Research,

v.189 p.103-112, 1987.

MARGOTTA, R.

História ilustrada da medicina. São Paulo, Manole, 1998.

175

MARZIN, D.; KIRKLAND, D. 2-Hydroxy-1,4-naphthoquinone, the natural dye of

Henna, is non-genotoxic in the mouse bone marrow micronucleus test and does not

produce oxidative DNA damage in Chinese hamster ovary cells.

Mutation Research,

v.560, p.41-47, 2004.

MAHRAN, G.;

Medicina Tradicional, v.1, n.23, 1977.

MARGOLIN, B.H.; RISKO, K.J.; SHELBY M.D.; ZEIGER, E. Sources of variability

in Ames'

Salmonella typhimurium tester strains: analysis of the International

Collaborative Study on “Genetic Drift”.

Mutation Research, n.130, p. 11-25, 1984.

MARON, D. M.; AMES, B. M. Revised Methods for the

Salmonella mutagenicity test.

Mutation Research, n.113, p.173-215, 1983.

MATOS, F.J.A.

Farmácias Vivas-Sistema de Utilização de Plantas Medicinais

Projetado Para Pequenas Comunidades, 4

edição, Editora UFC, Edições Sebrae,

Fortaleza;CE, p.111-113, 2002.

MATSUSHIMA, T.; MURAMATSU, M.; YAGAME, O.; ARAKI, A.; TIKKANEN,

L.; NATORI, S.

Mutagenicity and chemical structure relations of naturally

occurring mutagens from plants. In: Ramel, C.; Lambert, B.; Magnusson, J., eds.,

Progress in Clinical and Biological Research. Genetic Toxicology of Environmental

Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis; 4th International

Conference on Environmental Mutagens, Stockholm, Sweden, June 24-28

, 1985. New

York, Alan R. Liss, Inc., p. 133-140, 1986.

MCCANN, J.; CHOI, E.; YAMASAKI, E.; AMES, B.N. Detection of carcinogens in

the

Salmonella/microsome test. Assay of 300 chemicals. Proceedings of the National

Academy of Sciences of the United States of America., n.72, p. 5135–5139, 1975.

MCGAHON, A. J.; MARTIN, S. M.; BISSONNETTE, R. P.; MAHBOUBI, A.; SHI,

Y., MOGIL, R. J.; NISHIOKA, W. K. & GREEN, D.R. The end of the (cell) line:

methods for the study of apoptosis in vitro.

Methods in Cell Biology, v. 46, p. 153-185,

1995.

MCCLENDON, A.K. & OSHEROFF, N. DNA topoisomerase II, genotoxicity, and

cancer.

Mutation Research, v. 623, p.83-87, 2007.

MIAO, Z.H.; TONG, L,J.; ZHANG, J.S.; HAN, J.X.; DING, J. Characterization of

salvicine-resistant lung adenocarcinoma A549/SAL cell line.

International Journal of

Cancer, v.110, p.627-632, 2004.

MIAO, Z.H.; TANG, T.; ZHANG, Y.X.; ZHANG, J.S.; DING, J.; Cytotoxicity,

apoptosis induction and downregulation of MDR-1 expression by the anti-

topoisomerase II agent, salvicine, in multidrug-resistant tumor cells.

International

Journal of Cancer, v.106, p.108–115, 2003.

MOLYNEUX, P.; Songklanakarin, J. The use of the stable free radical

diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity.

Science

Technology, v. 26, p. 211-219, 2004.

176

MONTENEGRO, R.C.; JIMENEZ, P.C.; FARIAS, R.A.F.; ANDRADE-NETO, M.;

BEZERRA, F.S.; MORAES, M.E.A.; MORAES, M.O.; PESSOA, C.; COSTA-

LOTUFO, L.V. Cytotoxic activity of pisosterol, a triterpene isolated from

Pisolithus

tinctorius (Mich.: Pers.) Coker & Couch, 1928”. Z Naturforsch, v. 59c, p.519-22,

2004.

MORAIS, N. M. T; NOGUEIRA, C. M. D; LOPES, M. F. G.; VASCONCELOS, N. M.

S; SÁ, M. J. H. C.(1995) Estudo Inorgânico Analítico de Plantas Medicinais,

Anais

Associação. Brasileira de. Química, v. 44 (4), p. 14-19, 1995.

MORTON, J.F. A Survey of Medicinal Plants of Curacao, Economic botany., v. 22,

p. 87-102, 1968.

MOSMANN, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application

to proliferation and cytotoxicity assays.

Journal of immunological methods, 16, 55.63,

1983.

MORTELMANS, K.; ZEIGER, E. The Ames Salmonella/microssome mutagenicity

assay.

Mutation Research, n. 455, p.29-60, 2000.

MURCIA, G.; MURCIA, M. J. Poly (ADP-ribose) polymerase: a molecular nick-

sensor.

Trends in Biochemical Science, v.19, p.172–176, 1994.

MYERS, N.; MITTERMEIER, R. A.; MITTERMEIER, C. G.; DA FONSECA, G. A.

B.; KENT, J. Biodiversity hotspots for conservation priorities.

Nature, v.403, p.853,

2000.

NASCIMENTO, S.C., J.F. MÉLLO & A.A. CHIAPPETA. Agentes citotóxicos

experimentos com células KB.

Revista Instituto de Antibióticos de Recife, v, 22:

p.19-26, 1984.

NATARAJAN, A.T. Chromosome aberrations: past present and future.

Mutation

Research

v.504, p.3–16, 2002.

NEWMAN, D.J. & CRAGG, M.G. Natural products as sources of new drugs over the

last 25 years.

Journal of Natural products, v.70, p.461- 477, 2007.

NYAGA, S.G.; JARUGA, P.; LOHANI, A.; DIZDAROGLU, M.; EVANS, M.K.

Accumulation of Oxidatively Induced DNA Damage in Human Breast Cancer Cell

Lines Following Treatment with Hydrogen Peroxide.

Cell Cycle, v. 6, p. 1472-1478,

2007.

O'BRIEN, J.; WILSON, I.; ORTON, T.; POGNAN, F. Investigation of the Alamar Blue

(resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity.

European Journal of Biochemistry, v. 267, p. 5421-5426, 2000.

OECD (ORGANISATION FOR ECONOMIC CO-OPERATION AND

DEVELOPMENT).

Guideline for Testing of Chemicals, Test Guideline 471: Bacterial

Reverse Mutation Test, OECD, Paris, France, 1997.

177

ORRENIUS, S. Mitochondrial regulation of apoptotic cell death.

Toxicology Letters,

v. 149, p.19, 2004.

PARDEE, A.B., LI, Y.Z.; LI. C.J. Cancer therapy with beta-lapachone.

Currents

Cancer Drugs Targets, v.2, p.227-242, 2002.

PESSOA, C.; SILVEIRA, E.R.; LEMOS, T.L.G.; WETMORE, L.A.; MORAES, M.O.;

LEYVA, A. Antiproliferative effects of compounds derived from plants of northeast

Brazil.

Phytotherapia Research, v. 14, p.187-191, 2000.

PERA, F., MATTIAS, P., DETZER. Methods for determining the proliferation kinetics

of cells by means of 5-bromodeoxyuridine.

Cell Tissue Kinetics 10, 255-264, 1977.

PERERA, F.P. Enviroment and Cancer: Who are susceptible?

Science. v.278, 1997.

PINTO, A. C. O Brasil dos viajantes e dos exploradores e a química de produtos

naturais brasileira.

Química Nova, v.18, p. 608-615, 1995.

PINTO, A.C.; SILVA, D.H.S.; BOLZANI, V.S.; LOPES, N.P.; EPIFÂNIO, R.A.

Produtos Naturais: Atualidade, Desafios e Perspectivas.

Química Nova, v. 25, p.45-61,

2002.

POOL-ZOBEL B.L.; LOTZMANN, N; KNOLL, M; KUCHENMEISTER, F;

LAMBERTZ, R; LEUCHT, U; SCHRODER, H.G.; SCHMEZER, P.

Detection of

genotoxic effects in human gastric and nasal mucosa cells isolated from biopsy samples.

Environmental Molecular and Mutagenesis, v.24, n.1, p.23-45. 1994.

POMMIER, Y.; REDON, C.; RAO, V.A.; SEILER, J.A; SORDET, O.; TAKEMURA,

H.; ANTONY, S.; MENG, L.; LIAO, Z.; KOHLHAGEN, G.; ZHANG, H.; KOHN,

K.W. Repair of and checkpoint response to topoisomerase I-mediated DNA damage.

Mutation Research, v.27, Review, p.173-203, 2003.

PURCHASE, I.F.H.; LONGSTAFF, E.; ASHBY, J.; STYLES, J.A.; ANDERSON, D.;

LEFEVRE, P.A.; WESTWOOD, F.R.; An evaluation of 6 short-term tests for detecting

organic chemical carcinogens.

British Journal of Cancer, v. 37, p. 873–959, 1978.

QUAGLIANA, J.M.; STEPHENS, R.L.; BAKER, L.H.; COSTANI, J.J. Vindesine in

patients with metastic malignant melanoma:

Journal of Clinical Oncology, v 2, 316-

319,1984

RABINOVIC, A.D.; LEWIS, D.A.; HASTINGS, T. Role of oxidative changes in the

degeneration of dopamine terminals after injection of neurotoxic levels of dopamine.

Neuroscience, v.101, p.67-76, 2000.

RAMIREZ, V.R.; MOSTACERO, L. J.; GARCIA, A. E.; MEJIA, C.F. Vegetales

emplegados em medicina tradicional norperuana.

Banco Agrio del Peru & Nacional

Universidade Trujillo,

p. 54, 1988.

178

RAUF, S., GOODING, J.J., AKHTAR, K., GHAURI, M.A., RAHMAN, M., ANWAR,

M.A., KHALID, A. M.: Electrochemical approach of anticancer drugs-DNA interaction.

Journal Pharmaceutical Biomedical Analitycal., v.37, p.205, 2005.

RENZI, D., VOLTOLINA M., FOSTER, R. The evaluation of a multi-endpoint

cytotoxicity assay system.

ATLA., v. 21, p.89-96, 1993.

RHEINBOLDT, H. Em

As Ciências no Brasil; Azevedo, F. de, ed.; Melhoramentos:

São Paulo, v.2, cap. VIII, 1955.

ROSA, R.M.; MOURA, D.J.; SILVA, A.C.R.; SAFFI, J.; HENRIQUES, J.A.P.

Antioxidant activity of diphenyl diselenide prevents the genotoxicity of several

mutagens in Chinese hamster V79 cells.

Mutation Research, v. 631, p. 44–54, 2007.

RUTTIMANN, A. Recent advances in the synthesis of K-vitamins[J].

Chimia, v.40

p.290-306.

1986.

FERREIRA, C.G. & ROCHA, J.C. Em

Oncologia Molecular, Atheneu, 2004

SALMONM, S.E. Em

Farmacologia Básica & Clínica, Katzung, B.G., ed.; Guanabara

Koogan S.A.: Rio de Janeiro, p. 629-655, 1998.

SCOFIELD,D.

<http://www.cassiakeyensis.com/sofl_plants/med_Caprariabiflora.ht

ml>, 2002.

SCHABEL, F. Quantitative evaluation of anticancer agent activity in experimental

animals.

Pharmacology & Therapeutics, v.1, p. 411 - 435, 1977.

SERPA, J. Cadidíase cutâneas na criança,

Anais da Faculdade de Medicina

Universidade de Recife,

18 (2), 275-88, 1958.

SCHULLER, R. C. AND VON BORSTEL, R. C. Spontaneous mutability in yeast. I.

Stability of lysine reversion rates to variation of adenine concentration.

Mutation

Research

, v.24, p.17-23, 1974

SEIBERT, H.; BALL, M.; FENTEM, J.; BIANCHI,V.; CLOTHIER, R.; DIERICKX,

P.; EKWALL, B., GARLE, M.; G´OMEZ-LECH´ON, M.; GRIBALDO, L.; GULDEN,

M.; LIEBSCH, M.; RASMUSSEN, V.; ROGUET, R.; SHRIVASTAVA, R.; WALUM,

E. Acute toxicity testing in vitro and the classification and labeling of chemicals,

Alternatives to laboratory animals, v.24, p.499-510, 1996.

SILVA, R.L.A. Oncogenes e Genes Supressores de Tumor. Em:

Oncologia Molecular,

p.29, 2004.

SINGH, N.P.; McCOY, M.T.; TICE, R.R.; SCHNEIDER, E.L. A simple technique for

quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.

Experimental Cell

Research p.184-191, 1998.

179

SOFUNI, T. Japanese guidelines for mutagenicity testing.

Environmental and

Molecular Mutagenesis, v. 21, p. 2-7, 1993.

SOUZA, M.V.N.; Novos produtos naturais capazes de atuar na estabilização de

microtúbulos, um importante alvo no combate ao câncer.

Química Nova, v.27, p.308-

312, 2004.

STRASSER, A. The role of BH3-only proteins in the immune system.

Nature Reviews

Immunology, v.5, p.189-200, 2005.

SPEIT, G.; HARTMANN, A. The contribution of excision repair to the DNA effects

seen in the alkaline single cell gel test (comet assay).

Mutagenesis., v.10, n.6, p.555-

559, 1995.

SUGIMURA, T.; SATO, S.; NAGAO, M.; YAHAGI, T.; MATSUSHIMA, T.; SEINO,

Y.; TAKEUCHI, M.; KAWACHI, T. Overlapping Of Carcinogens And Mutagens, In:

P.N. Magee, S. Takayama, T. Sugimura, T. Matsushima (Eds.),

Fundamental of

Cancer Prevention, University Park Press, Baltimore, p.191-215, 1976.

TEICHER, B.A. In:

Cancer: Principles and Practice of Oncology, DeVita VT,

Hellman S and Rosenberg SA (eds). Lippincott-Raven Publishers: Philadelphia, p. 405–

418, 1997.

TENNANT, R.W.; MARGOLIN, B.H.; SHELBY, M.D.; ZEIGER, E.; HASEMAN,

J.K.; SPALDING, J.; RESNICK, W.; STASIEWICZ, M.; ANDERSON, B.; MINOR,

R. Prediction of chemical carcinogenicity in rodents from in vitro genetic toxicity

assays.

Science. n.236, p.933–941, 1987.

THOMPSON, R. H. In:

Naturally Occuring Quinones IV: Recents Advances;

Champman & Hall: London, 1997.

TICE, R.R

, AGURELL E, ANDERSON D, BURLINSON B, HARTMANN A,

KOBAYASHI H, MIYAMAE Y, ROJAS E, RYU J.C., SASAKI Y.F. Single cell

gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing.

Environmental Molecular Mutagen., v.35, p.206-221, 2000.

TORNATELLI, S.; HANAWALT, P.C. Effect of DNA lesions on transcription

elongation.

Biochemie., v.81, p.133-146, 1999.

TORTI, V. R.; COBB, A.J.; EVERITT, I.J.; MARSHALL, M.W.; BOORMAN, G.A.;

BUTTERWORTH, B. E. Nephrotoxicity and Hepatotoxicity Induced by Inhaled

Bromodichloromethane in Wild-Type and p53-Heterozygous Mice.

Toxicological

Science, v.64, p 269-280, 2001.

TUTHILL, C. W.; LIU, Y.; CAI, Q.; WANG, H.; KUNG, A. Effect of the immune

modulating peptide, SCV-07, in the murine B16 melanoma model.

Journal of Clinical

Oncology, ASCO Annual Meeting Proceedings Part I. v.25, n.18, p. 13514, 2007.

180

VALKO, M.; LEIBFRITZ, D.; MONCOL, J.; CRONIN, M. T.; MAZUR, M.;

TELSER, J. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human

disease.

The international journal of biochemistry & cell biology, v.39, p.44-84,

2007.

VALLE, J. R.;

A Farmacologia no Brasil, Antecedentes e Perspectivas, Academia de

Ciências do Estado de São Paulo: São Paulo, 1978.

VANNI, A.; FIORE, M.; SALVIA, R.; CUNDARI, E.; RICORDY, R.; CECCARELLI,

R.; DEGRASSI, F. DNA damage and cytotoxicity induced by b-lapachone: relation to

poly (ADP-ribose) polymerase inhibition.

Mutation Research, v. 401, p. 55-63, 1998.

VAN DELFT, J.H.M.; VAN AGEN, E.; VAN BREDA, S.G.J.; HERWIJNEN, M.H.;

STAAL, Y.C.M.; KLEINJANS, J.C.S.

Discrimination of genotoxic from non-genotoxic

carcinogens by gene expression profiling.

Carcinogenesis, v. 25, p.1265-1276, 2004.

VOLLMERS, H.P.; BRANDLEINS, S. Death by stress: antibody induces apoptosis.

Methods and Findings Experimental Clinical pharmacology, v.27, p.185, 2005.

VOLLMERS, H.P.; BRANDLEINS, S. Natural antibodies and cancer.

Journal of

Autoimmunity, v.29, p.295-302, 2007.

ZEIGER, E.; ANDERSON, B.; HAWORTH, S.; LAWLOR, T.; MORTELMANS, K.;

SPECK, W.

Salmonella mutagenicity tests: III. Results from the testing of 255

chemicals.

Environmental Mutagenenesis, v.9, p.100–110, 1987.

ZEIGER, E. Identification of rodent carcinogens and noncarcinogens using genetic

toxicity tests: premises, promises, and performance.

Regulatory toxicology and

pharmacology, n.28, p. 85–95, 1998

ZHANG, J.S.; DING, J.; TANG, Q.M.; LI, M.; ZHAO, M.; LU, L.J.; CHEN, L.J.;

YUAN S.T.; Synthesis and antitumour activity of novel diterpenequinone salvicine and

the analogs.

Bioorganic & medicinal chemistry letters, v.9, p.2731–2736, 1999.

ZUCO, V.; SUPINO, R.; RIGHETTI, S.C.; CLERIS, L.; MARCHESI, E.;

GAMBACORTI-PASSERINI, C.; FORMELLI, F. Selective cytotoxicity of betulinic

acid on tumor cell lines, but not on normal cells.

Cancer Letters, v.175, p.17–25, 2002.

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