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MARIA LUISA PEREIRA DE MELO
PAPEL DE CITOCINAS, ÓXIDO NÍTRICO SINTASE E CICLOOXIGENASE-2
NA MUCOSITE INTESTINAL INDUZIDA PELO AGENTE ANTITUMORAL
CLORIDRATO DE IRINOTECANO (CPT-11) – EFEITO DA PENTOXIFILINA,
TALIDOMIDA E CELECOXIBE
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Farmacologia da Universidade Federal do
Ceará, como requisito parcial para a obtenção do
título de Doutor em Farmacologia.
Orientador: Prof. Dr. Ronaldo de Albuquerque
Ribeiro
FORTALEZA
2007
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MARIA LUISA PEREIRA DE MELO
PAPEL DE CITOCINAS, ÓXIDO NÍTRICO SINTASE E CICLOOXIGENASE-2
NA MUCOSITE INTESTINAL INDUZIDA PELO CLORIDRATO DE
IRINOTECANO (CPT-11) – EFEITO DA PENTOXIFILINA, TALIDOMIDA E
CELECOXIBE
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Farmacologia da Universidade Federal do Ceará, como
requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em
Farmacologia.
Aprovada em: 08 de junho de 2007.
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________________
Prof. Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro (Orientador)
Universidade Federal do Ceará – UFC
_______________________________________________
Prof. Dr. Fernando Queiroz Cunha
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – FMRP/USP
_______________________________________________
Profa. Dra. Helena Alves de Carvalho Sampaio
Universidade Estadual do Ceará – UECE
_______________________________________________
Prof. Dr. Aldo Ângelo Moreira Lima
Universidade Federal do Ceará – UFC
_______________________________________________
Prof. Dr. Marcellus Henrique Loiola Ponte de Souza
Universidade Federal do Ceará – UFC
ads:
Moacir, meu querido irmão, exemplo de trabalho e honestidade.
Heloisa e Beatriz, dádivas de Deus.
Antonele, pela paciência e compreensão.
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, Prof. Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro, pela
confiança e pelo seu compromisso na orientação científica e efetiva
participação em todas as etapas deste trabalho.
À Profa. Dra. Gerly Anne de Castro Brito pelo seu incentivo,
orientação, amizade e confiança.
À Profa. Dra. Mariana Lima Vale, pela sua valiosa participação em
várias etapas deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Marcellus Henrique Loiola Ponte de Souza e Prof. Dr.
Fernando Queiroz Cunha, pelo apoio indispensável em várias etapas desta
pesquisa.
Ao Prof. Dr. Aldo Ângelo Moreira Lima e à Profa. Dra. Helena Alves
de Carvalho Sampaio, pela disponibilidade sempre em ajudar.
Aos estudantes de Iniciação Científica que contribuíram muito para a
realização da presente pesquisa: Rudy Cysne Soares, Breno Augusto
Albuquerque Oliveira, Ismar Vilanova, Sarah Barros Leal Montenegro Carvalho,
Johan Vargas Silva e Regina de Carvalho Kinjo.
Aos amigos do LAFICA, especialmente Renata Leitão, Antoniella
Sousa Gomes, Rosemary Souza Freire, Vilma de Lima, Pedro Marcos Gomes
Soares, Ingrid Chaves Cavalcante, pela agradável convivência e solidariedade.
Aos técnicos, Maria Silvandira França Pinheiro e José Ivan
Rodrigues de Sousa, pela amizade, colaboração e apoio inestimáveis.
À bibliotecária Rosane Maria Costa, da Biblioteca de Ciências da
Saúde da Universidade Federal do Ceará (UFC), pela correção na
normalização deste trabalho.
Ao CNPq, pelo apoio financeiro concedido.
Agradecimento especial à Universidade Estadual do Ceará e aos
colegas do Colegiado de Nutrição, pela liberação de minhas atividades para
realizar este Curso.
Aos colegas do Hospital Geral de Fortaleza, em especial a chefe do
Setor de Nutrição, Maria de Lourdes Mota, pela compreensão e a amizade
sempre presentes.
À minha irmã Maria de Fátima de Melo Barbosa, pelo apoio
incondicional na revisão e correção deste trabalho.
À minha amiga Maria Olganê Dantas Sabry, pela sua participação na
minha formação acadêmica e pelo incentivo e colaboração.
A todos que direta e indiretamente colaboraram em alguma etapa de
minha jornada.
RESUMO
Papel de citocinas, óxido nítrico sintase e ciclooxigenase-2 na mucosite
intestinal induzida pelo cloridrato de irinotecano (CPT-11) – efeito da
pentoxifilina, talidomida e celecoxibe. Autora: MARIA LUISA PEREIRA DE
MELO. Doutorado em Farmacologia, Departamento de Fisiologia e
Farmacologia, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará. Defesa:
08 de junho de 2007. Orientador: Prof. Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro.
Introdução: O cloridrato de irinotecano (CPT-11) é um inibidor da
topoisomerase I, clinicamente efetivo no tratamento de vários tipos de câncer.
Apesar da mucosite intestinal (MI) acompanhada de severa diarréia ser o efeito
colateral mais limitante do uso terapêutico do CPT-11, os exatos mecanismos
que levam a estes efeitos não são estabelecidos. Objetivo: avaliar o
envolvimento de mediadores inflamatórios (citocinas, óxido nítrico – NO e
prostaglandinas – PGs) na patogênese dos eventos que acompanham a MI
induzida pelo CPT-11; e estudar o efeito de inibidores da síntese e liberação de
citocinas, como pentoxifilina (PTX) e talidomida (TLD), e de um inibidor seletivo
da ciclooxigenase-2 (COX-2), o celecoxibe (CLX), na lesão intestinal induzida
pelo CPT-11. Material e Métodos: camundongos Swiss, machos, foram
tratados durante quatro dias consecutivos com CPT-11 (50, 75 e 100 mg/kg,
i.p.) ou veículo (0,5 mL, i.p.), a fim de se obter a melhor dose capaz de induzir
injúrias consistentes com o mínimo de letalidade. Os animais foram tratados
com PTX (1,7, 5 e 15 mg/kg, s.c.), TLD (15, 30, 60 mg/kg, s.c), CLX (3, 10, 30
mg/kg, gavagem) ou veículo (0,5 mL, s.c. ou gavagem), um dia antes da
primeira administração do CPT-11 (75 mg/kg), e diariamente, até o sacrifício,
no quinto ou sétimo dia. Os seguintes parâmetros foram avaliados: diarréia,
variação de massa corpórea, leucograma, sobrevida, análise histopatológica,
atividade de mieloperoxidase (MPO), dosagem de citocinas (TNF-α, IL-1β e
KC) por ELISA e imunohistoquímica para TNF-α, IL-1β, iNOS e COX-2 nas
mucosas duodenais. Resultados: CPT-11 induziu diarréia significante,
acompanhada de perda acentuada de massa corpórea, leucopenia e redução
da sobrevida. As alterações histopatológicas intestinais induzidas pelo CPT-11
caracterizaram-se pela presença de infiltrado inflamatório nas células da lâmina
própria, perda da arquitetura das criptas e achatamento dos vilos. Observou-se
ainda, aumento intestinal na atividade de MPO e dos níveis de TNF-α, IL-1β e
KC, além do aumento significativo na marcação imunohistoquímica para TNF-
α, IL-1β, iNOS e COX-2. O tratamento com PTX inibiu a diarréia tardia, reduziu
as alterações histopatológicas, a atividade de MPO, e os níveis de TNF-α, IL-
1β e KC, assim como a marcação imunohistoquímica para TNF-α, IL-1β e iNOS
na mucosa duodenal, entretanto, não preveniu significativamente a perda de
massa corpórea, a leucopenia e tampouco a mortalidade dos animais. O
tratamento com TLD reduziu as lesões histopatológicas induzidas pelo CPT-11
na mucosa intestinal, os níveis intestinais de MPO e TNF-α, bem como a
marcação imunohistoquímica de TNF-α, mas não foi capaz de prevenir a
diarréia, a perda de massa corpórea, a leucopenia e a sobrevida. O tratamento
com CLX não foi capaz de reduzir os parâmetros inflamatórios e sistêmicos
observados nos animais tratados com CPT-11. Conclusão: Estes resultados
sugerem o envolvimento de TNF-α, IL-1β, KC, NO e PGs na patogênese da MI
induzida pelo CPT-11. PTX e TLD preveniram significativamente as alterações
histológicas e inflamatórias induzidas pelo CPT-11, entretanto, somente PTX foi
capaz de inibir o curso da diarréia.
Palavras-chave: CPT-11, mucosite, citocinas, óxido nítrico sintase,
ciclooxigenase-2, pentoxifilina, talidomida, celecoxibe.
ABSTRACT
Role of cytokines, nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 in the
CPT-11-induced intestinal mucositis – effect of pentoxifylline, thalidomide
and celecoxib. MARIA LUISA PEREIRA DE MELO. Post-graduation in
Pharmacology. Department of Physiology and Pharmacology of the Medicine
Faculty of the Ceará Federal University. Defense: 2007, june 08. Oriented by
Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro.
Introduction: Irinotecan (CPT-11) is an inhibitor of DNA topoisomerase I and
clinically effective against several cancers. A major toxic effect of CPT-11 is
delayed diarrhea; however, the exact mechanism by which the drug induces
diarrhea has not been established. Purpose: The aim of the present study was
to elucidate the involvement of cytokines (TNF-α, IL-1β and KC), nitric oxide
(NO) and prostaglandins (PGs) in the pathogenesis of CPT-11-induced
mucositis and the effects of the cytokine production inhibitors, pentoxifylline
(PTX) and thalidomide (TLD), as well as the effects of the selective
cyclooxygenase (COX-2) inhibitor, celecoxib (CLX), in the CPT-11 induced
intestinal mucositis, in mice. Materials and methods: the animals were treated
with CPT-11 (50, 75 or 100 mg/kg, i.p.) or vehicle (0,5 ml, i.p.) daily for four
days, in order to investigate the best dose able to induce intestinal mucositis
without important mortality. In another set of experiments, the animals received
PTX (1.7, 5, 15 mg/kg, s.c.), TLD (15, 30, 60 mg/kg, s.c.), CLX (3, 10, 30 mg/kg,
oral gavage) or vehicle (0,5 ml, s.c. or oral gavage) one day before the 1
st
administration of CPT-11 (75 mg/kg; i.p.) and daily until the sacrifice, on the 5
th
or 7
th
day. The systemic parameters evaluated were: diarrhea, body mass
variation, survival curve and leucogram. In addition, it was also performed
histological analysis, myeloperoxidase (MPO) activity assay, duodenum levels
of TNF-α, IL-1β and KC by ELISA and immunohistochemistry for TNF-α, IL-1β,
iNOS and COX-2 in the duodenal segments. Results: CPT-11 induced an
important diarrhea, weight loss, leucopenia and mortality increase. It was also
observed histopathological changes, such as shortened villi, loss of the crypt
architecture and inflammatory cells infiltration, observed in the lamina propria,
as well as, an increase in MPO activity, TNF-α, IL-1β and KC tissue levels and
a marked immuno-staining for TNF-α, IL-1β, iNOS and COX-2. The treatment
with PTX inhibited the delayed diarrhea and reduced the following parameters:
histopathological alterations, MPO activity, tissue levels of TNF-α, IL-1β and
KC, and the immuno-staining for TNF-α, IL-1β and iNOS, however, did not
prevent leucopenia, weight loss and mortality. TLD significantly reduced all the
inflammatory parameters evaluated, but was not able to prevent diarrhea,
leucopenia, weight loss and mortality. On the other hand, CLX did not inhibit the
inflammatory nor the systemic alterations induced by CPT-11. Conclusion:
These results suggest an important role of TNF-α, IL-1β, KC, NO and PGs in
the pathogenesis of intestinal mucositis induced by CPT-11. PTX and TLD
showed a protector effect in intestinal structures, however, only PTX reduced
the severity of CPT-11-induced diarrhea.
Key words: irinotecan, mucositis, cytokines, nitric oxide synthase,
cyclooxygenase-2, pentoxifylline, thalidomide, celecoxib.
LISTA DE ABREVIATURAS
α Alfa
β Beta
γ Gama
µL Microlitro
µm Micrômetro
5-FU 5-Fluorouracil
AA Ácido araquidônico
AChE Acetilcolinesterase
AIDS Síndrome de imunodeficiência adquirida
cAMP Monofosfato de adenosina cíclico
ANOVA Análise de variância
APC 7-etil-10-[4-N-(5-ácido aminopentanóico)-1-piperidino]-
carboniloxicamptotecina
ATP Trifosfato de adenosina
bFGF Fator de crescimento fibroblástico básico
BSA Albumina sérica bovina
CE Carboxilesterase
cGMP Monofosfato de guanosina cíclico
CLX Celecoxibe
cMOAT Transportador canalicular multiespecífico de aníons orgânicos
cNOS Óxido nítrico sintase constitutiva
COX Ciclooxigenase
CPT-11 Cloridrato de irinotecano
DAB 3,3’diaminobenzidine-peróxido
DAINEs Drogas antiinflamatórias não-esteróides
DMSO Dimetil sulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucléico
EDRF Fator de relaxamento dependente do endotélio
ELISA Ensaio imunoenzimático
EPM Erro padrão da média
EGF Fator de crescimento epidérmico
g Grama
G-CSF Fator estimulante da colônia de granulócitos
GLP-2 Peptídeo glucagon símile
GM-CSF Fator estimulante das colônias de granulócitos e macrófagos
H&E Hematoxilina e eosina
HGF Fator de crescimento do hepatócito
ICAM Molécula de adesão intercelular
IFN- Interferon-
IGF-1 Fator de crescimento insulina símile-1
IkB Inibidor kappa B
IL- Interleucina
IL-1ra Antagonista do receptor de IL-1
iNOS Óxido nítrico sintase induzida
i.m. Intramuscular
KC Quimiocina derivada de queratinócitos
i.p. Intraperitoneal
i.v. Intravenosa
kg Quilograma
KGF Fator de crescimento de queratinócitos
LPA Ácido lisofosfatídico
LPS Lipopolissacarídeo
M Molar
MAPK Proteína quinase ativada por mitógenos
md Mediana
mg Miligrama
mL Mililitro
mm
3
Milímetro cúbico
MPO Mieloperoxidase
mRNA RNA mensageiro
MRP2 Proteína 2 associada a resistência multidroga
MTX Metotrexato
NADPH Dinucleotídeo fosfato de nicotinamida adenina
NF-κB Fator de transcrição nuclear kappa B
NK Natural Killer
NO Óxido nítrico
NOS Óxido nítrico sintase
NPC 7-etil-10-[4-amino-1-piperidino]-carboniloxicamptotecina
OPD O-fenilenediamine diidrocloreto
PBMCs Células mononucleares do sangue periférico
PBS Solução tamponada de fosfato
pg picograma
PG Prostaglandina
PGI
2
Prostaciclina
P-gp Glicoproteína P
PMN Polimorfonucleares
PTX Pentoxifilina
rhIL-11 IL-11 recombinante humano
RNA Ácido ribonucléico
ROS Espécies reativas de oxigênio
SCFAs Ácidos graxos de cadeia curta
SN-38 7-etil-10-hidroxicamptotecina
SN-38G SN-38 glicuronídio
s.c. Subcutânea
TGF- Fator de crescimento transformador
Th T helper
TLD Talidomida
TNF- Fator de necrose tumoral
TX Tromboxano
UDP-GT Uridina difosfato glicuronosil-transferase
VEGF Fator de crescimento do endotélio vascular
v.o. Via oral
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 – Estrutura química do cloridrato de irinotecano (CPT-11)
lactona .........................................................................................
22
FIGURA 2 – Desenho esquemático do protocolo da mucosite intestinal
experimental ................................................................................ 51
FIGURA 3 – Efeito de diferentes doses do cloridrato de irinotecano (CPT-11)
na variação da massa corpórea de camundongos Swiss ........... 61
FIGURA 4 – Efeito de diferentes doses do cloridrato de irinotecano (CPT-11)
no leucograma de camundongos Swiss ...................................... 62
FIGURA 5 – Efeito de diferentes doses do cloridrato de irinotecano (CPT-11)
na curva de sobrevida de camundongos Swiss .......................... 63
FIGURA 6 – Fotomicrografias da mucosa duodenal de camundongos Swiss
normais e dos submetidos à mucosite intestinal pelo cloridrato
de irinotecano (CPT-11) .............................................................. 66
FIGURA 7 – Efeito de diferentes doses do cloridrato de irinotecano (CPT-11)
na morfometria intestinal de camundongos Swiss ...................... 68
FIGURA 8 – Efeito de diferentes doses do cloridrato de irinotecano (CPT-11)
na atividade de mieloperoxidase (MPO) no duodeno de
camundongos Swiss .................................................................... 71
FIGURA 9 – Efeito do cloridrato de irinotecano (CPT-11) nos níveis de
citocinas (TNF-α, IL-1β e KC) no duodeno de camundongos
Swiss ........................................................................................... 72
FIGURA 10 – Fotomicrografias da marcação de citocinas (TNF-α e IL-1β) na
mucosa duodenal de camundongos Swiss normais e dos
submetidos à mucosite intestinal pelo cloridrato de irinotecano
(CPT-11) ...................................................................................... 74
FIGURA 11 – Fotomicrografias da marcação da enzima óxido nítrico sintase
induzida (iNOS) na mucosa duodenal de camundongos Swiss
normais e dos submetidos à mucosite intestinal pelo cloridrato
de irinotecano (CPT-11) .............................................................. 75
FIGURA 12 –
Fotomicrografias da marcação da enzima ciclooxigenase-2
(COX-2) na mucosa duodenal de camundongos Swiss normais
e dos submetidos à mucosite intestinal pelo cloridrato de
irinotecano (CPT-11) ...................................................................
76
FIGURA 13 – Efeito de diferentes doses da pentoxifilina (PTX) na variação da
massa corpórea em camundongos Swiss com mucosite
intestinal induzida pelo cloridrato de irinotecano (CPT-11) ......... 80
FIGURA 14 – Efeito de diferentes doses da pentoxifilina (PTX) no leucograma
de camundongos Swiss com mucosite intestinal induzida pelo
cloridrato de irinotecano (CPT-11) .............................................. 81
FIGURA 15 – Efeito de diferentes doses da pentoxifilina (PTX) na curva de
sobrevida de camundongos Swiss com mucosite intestinal
induzida pelo cloridrato de irinotecano (CPT-11) ........................ 82
FIGURA 16 – Fotomicrografias da mucosa duodenal de camundongos Swiss
normais, dos submetidos à mucosite intestinal pelo cloridrato
de irinotecano (CPT-11) sem tratamento e com tratamento com
pentoxifilina (PTX) ....................................................................... 84
FIGURA 17 – Efeito de diferentes doses da pentoxifilina (PTX) nas alterações
morfométricas intestinais induzidas pelo cloridrato de
irinotecano (CPT-11) em camundongos Swiss ........................... 86
FIGURA 18 – Efeito de diferentes doses de pentoxifilina (PTX) na atividade
de mieloperoxidase (MPO) no duodeno de camundongos Swiss
com mucosite intestinal induzida pelo cloridrato de irinotecano
(CPT-11) ......................................................................................
88
FIGURA 19 – Efeito da pentoxifilina (PTX) nos níveis de citocinas (TNF-α,
IL-1β e KC) no duodeno de camundongos Swiss com mucosite
intestinal induzida pelo cloridrato de irinotecano (CPT-11) .........
89
FIGURA 20 – Fotomicrografias da marcação de citocinas (TNF-α e IL-1β) na
mucosa duodenal de camundongos Swiss normais, dos
submetidos à mucosite intestinal pelo cloridrato de irinotecano
(CPT-11) sem tratamento e com tratamento com pentoxifilina
(PTX) ...........................................................................................
91
FIGURA 21 – Fotomicrografias da marcação da enzima óxido nítrico sintase
induzida (iNOS) na mucosa duodenal de camundongos Swiss
normais, dos submetidos à mucosite intestinal pelo cloridrato
de irinotecano (CPT-11) sem tratamento e com tratamento com
pentoxifilina (PTX) ....................................................................... 92
FIGURA 22 – Efeito de diferentes doses da talidomida (TLD) na variação da
massa corpórea em camundongos Swiss com mucosite
intestinal induzida pelo cloridrato de irinotecano (CPT-11) ......... 95
FIGURA 23 – Efeito de diferentes doses da talidomida (TLD) no leucograma
de camundongos Swiss com mucosite intestinal induzida pelo
cloridrato de irinotecano (CPT-11) .............................................. 96
FIGURA 24 – Efeito de diferentes doses da talidomida (TLD) na curva de
sobrevida de camundongos Swiss com mucosite intestinal
induzida pelo cloridrato de irinotecano (CPT-11) ........................ 97
FIGURA 25 – Fotomicrografias do duodeno de camundongos Swiss normais,
dos submetidos à mucosite intestinal pelo cloridrato de
irinotecano (CPT-11) sem tratamento e com tratamento com
talidomida (TLD) .......................................................................... 99
FIGURA 26 – Efeito de diferentes doses da talidomida (TLD) nas alterações
morfométricas intestinais induzidas pelo cloridrato de
irinotecano (CPT-11) em camundongos Swiss ...................... 101
FIGURA 27 – Efeito de diferentes doses da talidomida (TLD) na atividade de
mieloperoxidase (MPO) no duodeno de camundongos Swiss
com mucosite intestinal induzida pelo cloridrato de irinotecano
(CPT-11) ...................................................................................... 104
FIGURA 28 – Efeito da talidomida (TLD) nos níveis de citocinas (TNF-α, IL-1β
e KC) no duodeno de camundongos Swiss com mucosite
intestinal induzida pelo cloridrato de irinotecano (CPT-11) ......... 105
FIGURA 29 – Fotomicrografias da marcação de citocinas (TNF-α e IL-1β) na
mucosa duodenal de camundongos Swiss normais, dos
submetidos à mucosite intestinal pelo cloridrato de irinotecano
(CPT-11) sem tratamento e com tratamento com talidomida
(TLD) ........................................................................................... 107
FIGURA 30 – Fotomicrografias da marcação da enzima óxido nítrico sintase
induzida (iNOS) na mucosa duodenal de camundongos Swiss
normais, dos submetidos à mucosite intestinal pelo cloridrato
de irinotecano (CPT-11) sem tratamento e com tratamento com
talidomida (TLD) .......................................................................... 108
FIGURA 31 – Efeito de diferentes doses do celecoxibe (CLX) na variação da
massa corpórea de camundongos Swiss com mucosite
intestinal induzida pelo cloridrato de irinotecano (CPT-11) ......... 111
FIGURA 32 – Efeito de diferentes doses do celecoxibe (CLX) no leucograma
de camundongos Swiss com mucosite intestinal induzida pelo
cloridrato de irinotecano (CPT-11) .............................................. 112
FIGURA 33 – Efeito de diferentes doses do celecoxibe (CLX) na curva de
sobrevida de camundongos Swiss com mucosite intestinal
induzida pelo cloridrato de irinotecano (CPT-11) ........................ 113
FIGURA 34 – Efeito de diferentes doses do celecoxibe (CLX) nas alterações
morfométricas intestinais induzidas pelo cloridrato de
irinotecano (CPT-11) em camundongos Swiss ........................... 116
FIGURA 35 – Efeito de diferentes doses do celecoxibe (CLX) na atividade de
mieloperoxidase (MPO) no duodeno de camundongos Swiss
com mucosite intestinal induzida pelo cloridrato de irinotecano
(CPT-11) ...................................................................................... 118
FIGURA 36 – Fotomicrografias da marcação da enzima ciclooxigenase-2
(COX-2) na mucosa duodenal de camundongos Swiss normais,
dos submetidos à mucosite intestinal pelo cloridratro de
irinotecano (CPT-11) sem tratamento e com tratamento com
celecoxibe (CLX) ......................................................................... 120
FIGURA 37 – Modelo hipotético proposto para a cascata dos mediadores
inflamatórios envolvidos na mucosite intestinal induzida pelo
CPT-11 ........................................................................................ 144
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 – Efeito de diferentes doses do cloridrato de irinotecano (CPT-11)
na indução de diarréia em camundongos Swiss ......................... 60
TABELA 2 – Efeito de diferentes doses do cloridrato de irinotecano (CPT-11)
na indução de mucosite intestinal em camundongos Swiss ....... 67
TABELA 3 – Efeito do cloridrato de irinotecano (CPT-11) no grau de
expressão de citocinas (TNF-α e IL-1β) e de enzimas (iNOS e
COX-2) na mucosa duodenal de camundongos Swiss ............... 73
TABELA 4 – Efeito de diferentes doses da pentoxifilina (PTX) na severidade
da diarréia induzida pelo cloridrato de irnotecano (CPT-11) em
camundongos Swiss .............................................. 79
TABELA 5 – Efeito de diferentes doses da pentoxifilina (PTX) no grau de
mucosite intestinal induzida pelo cloridrato de irinotecano (CPT-
11) em camundongos Swiss ....................................................... 85
TABELA 6 – Efeito da pentoxifilina (PTX) no grau de expressão de citocinas
(TNF-α e IL-1β) e da enzima óxido nítrico sintase induzida
(iNOS) na mucosa duodenal de camundongos Swiss com
mucosite intestinal induzida pelo cloridrato de irinotecano
(CPT-11) ...................................................................................... 90
TABELA 7 – Efeito de diferentes doses da talidomida (TLD) na severidade
da diarréia induzida pelo cloridrato de irnotecano (CPT-11) em
camundongos Swiss ....................................................................
94
TABELA 8 – Efeito de diferentes doses da talidomida (TLD) no grau de
mucosite intestinal induzida pelo cloridrato de irinotecano (CPT-
11) em camundongos Swiss ....................................................... 100
TABELA 9 – Efeito da talidomida (TLD) no grau de expressão de citocinas
(TNF-α e IL-1β) e da enzima óxido nítrico sintase induzida
(iNOS) na mucosa duodenal de camundongos Swiss com
mucosite intestinal induzida pelo cloridrato de irinotecano
(CPT-11) ...................................................................................... 106
TABELA 10 – Efeito de diferentes doses do celecoxibe (CLX) na severidade
da diarréia induzida pelo cloridrato de irnotecano (CPT-11) em
camundongos Swiss .................................................................... 110
TABELA 11 – Efeito de diferentes doses do celecoxibe (CLX) no grau de
mucosite intestinal induzida pelo cloridrato de irinotecano
(CPT-11) em camundongos Swiss .............................................. 115
TABELA 12 – Efeito do celecoxibe (CLX) no grau de expressão da enzima
ciclooxigenase-2 (COX-2) na mucosa duodenal de
camundongos Swiss com mucosite intestinal induzida pelo
cloridrato de irinotecano (CPT-11) .............................................. 119
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 21
1.1 Cloridrato de irinotecano (CPT-11) .............................................................. 22
1.1.1 Estrutura química ......................................................................................... 22
1.1.2 Farmacocinética ........................................................................................... 23
1.1.3 Mecanismo de ação ..................................................................................... 24
1.1.4 Toxicidade .................................................................................................... 25
1.2 Mucosite intestinal ........................................................................................ 25
1.2.1 Fisiopatologia ............................................................................................... 25
1.2.2 Manifestações clínicas ................................................................................. 29
1.2.3 Tratamento ................................................................................................... 30
1.3 Mediadores inflamatórios envolvidos na mucosite intestinal .................. 33
1.3.1 Citocinas ....................................................................................................... 33
1.3.2 Óxido nítrico (NO) ........................................................................................ 35
1.3.3 Prostaglandinas (PGs) ................................................................................. 37
1.4 Moduladores farmacológicos ...................................................................... 38
1.4.1 Pentoxifilina (PTX) ........................................................................................ 38
1.4.2 Talidomida (TLD) .......................................................................................... 40
1.4.3 Celecoxibe (CLX) ......................................................................................... 44
1.5 Justificativa e objetivos ................................................................................ 46
2 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 48
2.1 Animais de experimentação ......................................................................... 48
2.2 Drogas, soluções, corantes e anticorpos ................................................... 48
2.3 Modelo de indução da mucosite intestinal ................................................. 50
2.4 Grupos experimentais .................................................................................. 52
2.4.1 Grupo normal ............................................................................................... 52
2.4.2 Grupo controle .............................................................................................. 52
2.4.3 Grupo tratado com PTX ............................................................................... 52
2.4.4 Grupo tratado com TLD ................................................................................ 53
2.4.5 Grupo tratado com CLX ............................................................................... 53
2.5 Parâmetros avaliados ................................................................................... 53
2.5.1 Avaliação da diarréia .................................................................................... 53
2.5.2 Análise ponderal ........................................................................................... 53
2.5.3 Leucograma ................................................................................................. 54
2.5.4 Avaliação da sobrevida ................................................................................ 54
2.5.5 Análise histopatológica e morfométrica ........................................................ 54
2.5.6 Atividade de mieloperoxidase (MPO) .......................................................... 55
2.5.7 Dosagem de citocinas (TNF-α, IL-1β e KC) no duodeno ............................. 55
2.5.8 Avaliação da expressão de citocinas (TNF-α e IL-1β) e de enzimas (iNOS
e COX-2) por imunohistoquímica .......................................................................... 56
2.6 Análise estatística ......................................................................................... 57
3 RESULTADOS ................................................................................................... 58
3.1 Modelo da mucosite intestinal induzida pelo CPT-11 ................................ 58
3.1.1 Avaliação da diarréia induzida pelo CPT-11 ................................................ 58
3.1.2 Efeito do CPT-11 na variação da massa corpórea ...................................... 59
3.1.3 Efeito do CPT-11 no leucograma ................................................................. 59
3.1.4 Efeito do CPT-11 na sobrevida dos animais ................................................ 59
3.1.5 Efeito do CPT-11 nas estruturas histológicas do intestino ........................... 64
3.1.6 Efeito do CPT-11 na atividade de MPO no duodeno.................................... 69
3.1.7 Efeito do CPT-11 nos níveis de citocinas (TNF-α, IL-1β e KC) no duodeno 69
3.1.8 Efeito do CPT-11 na expressão de citocinas (TNF-α e IL-1β) e de enzimas
(iNOS e COX-2) na mucosa duodenal .................................................................. 69
3.2 Efeito do tratamento com PTX na mucosite intestinal induzida pelo
CPT-11 .................................................................................................................. 77
3.2.1 Efeito da PTX na severidade da diarréia induzida pelo CPT-11 .................. 77
3.2.2 Efeito da PTX na variação da massa corpórea de animais com mucosite
intestinal induzida pelo CPT-11 ............................................................................. 77
3.2.3 Efeito da PTX no leucograma de animais com mucosite intestinal induzida
pelo CPT-11 .......................................................................................................... 77
3.2.4 Efeito da PTX na sobrevida de animais com mucosite intestinal induzida
pelo CPT-11.......................................................................................................... 78
3.2.5 Efeito da PTX nas estruturas histológicas do intestino de animais com
mucosite intestinal induzida pelo CPT-11 ............................................................. 83
3.2.6 Efeito da PTX na atividade de MPO no duodeno de animais com mucosite
intestinal induzida pelo CPT-11 .............................................................................
87
3.2.7 Efeito da PTX nos níveis de citocinas (TNF-α, IL-1β e KC) no duodeno de
animais com mucosite intestinal induzida pelo CPT-11 ........................................ 87
3.2.8 Efeito da PTX na expressão de citocinas (TNF-α e IL-1β) e de enzimas
(iNOS e COX-2) na mucosa duodenal de animais com mucosite intestinal
induzida pelo CPT-11 ............................................................................................ 87
3.3 Efeito do tratamento com TLD na mucosite intestinal induzida pelo
CPT-11 .................................................................................................................. 93
3.3.1 Efeito da TLD na severidade da diarréia induzida pelo CPT-11 .................. 93
3.3.2 Efeito da TLD na variação da massa corpórea de animais com mucosite
intestinal induzida pelo CPT-11 ............................................................................. 93
3.3.3 Efeito da TLD no leucograma de animais com mucosite intestinal induzida
pelo CPT-11 .......................................................................................................... 93
3.3.4 Efeito da TLD na sobrevida de animais com mucosite intestinal induzida
pelo CPT-11 .......................................................................................................... 93
3.3.5 Efeito da TLD nas estruturas histológicas do intestino de animais com
mucosite intestinal induzida pelo CPT-11 ............................................................. 98
3.3.6 Efeito da TLD na atividade de MPO no duodeno de animais com mucosite
intestinal induzida pelo CPT-11 ............................................................................. 102
3.3.7 Efeito da TLD nos níveis de citocinas (TNF-α, IL-1β e KC) no duodeno de
animais com mucosite intestinal induzida pelo CPT-11 ........................................
102
3.3.8 Efeito da TLD na expressão de citocinas (TNF-α e IL-1β) e de enzimas
(iNOS e COX-2) na mucosa duodenal de animais com mucosite intestinal
induzida pelo CPT-11 ............................................................................................ 102
3.4 Efeito do tratamento com CLX na mucosite intestinal induzida pelo
CPT-11 .................................................................................................................. 109
3.4.1 Efeito do CLX na severidade da diarréia induzida pelo CPT-11 .................. 109
3.4.2 Efeito do CLX na variação da massa corpórea de animais com mucosite
intestinal induzida pelo CPT-11 ............................................................................. 109
3.4.3 Efeito do CLX no leucograma de animais com mucosite intestinal induzida
pelo CPT-11 .......................................................................................................... 109
3.4.4 Efeito do CLX na sobrevida de animais com mucosite intestinal induzida
pelo CPT-11 .......................................................................................................... 109
3.4.5 Efeito do CLX nas estruturas histológicas do intestino de animais com
mucosite intestinal induzida pelo CPT-11 ............................................................. 114
3.4.6 Efeito do CLX na atividade de MPO no duodeno de animais com mucosite
intestinal induzida pelo CPT-11 ............................................................................. 117
3.4.7 Efeito do CLX na expressão da enzima ciclooxigenase-2 (COX-2) na
mucosa duodenal de animais com mucosite intestinal induzida pelo CPT-11 ...... 117
4 DISCUSSÃO ...................................................................................................... 121
5 CONCLUSÕES .................................................................................................. 144
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 145
ANEXOS
21
1 INTRODUÇÃO
Apesar do tratamento farmacológico do câncer ter tido um significativo
avanço a partir de 1950, infelizmente, mais de 50% de todos os pacientes com
câncer não respondem à terapia inicial e a doença progride para a doença
metastática (CHU, 2005). Além disso, estes agentes farmacológicos não são
específicos para as células tumorais e, portanto, atingem todas as células de divisão
celular ativa. Deste modo, tanto as células malignas como os tecidos normais que
possuem rápida proliferação estão sujeitos à ação destas drogas.
Conseqüentemente, estas substâncias podem provocar efeitos tóxicos graves
(RANG et al., 2001; CALABRESI; CHABNER, 2003), sendo um dos órgãos afetados
o trato gastrintestinal (BOKEMEYER; HARTMANN, 1999).
Enquanto o manejo de diversas toxicidades relacionadas à quimioterapia,
como a mielossupressão, náuseas e vômitos, tem evoluído, a incidência de mucosite
tem aumentado. Os protocolos de tratamentos com altas doses de quimioterapia e
esquemas terapêuticos que usam radioterapia e quimioterapia concomitante
provavelmente tenham colaborado para este aumento. No entanto, pouco tem sido
descoberto para prevenir e controlar a mucosite (BOKEMEYER; HARTMANN, 1999;
CHU, 2005).
Segundo Rubenstein et al. (2004), a mucosite intestinal é observada entre
5-15% dos pacientes em protocolos padrão, e é descrita com uso de agentes como
metotrexato (MTX) (GIBSON et al., 2002a; GIBSON et al., 2002b; CARNEIRO-FILHO
et al., 2004), 5-fluorouracil (5-FU) (SONIS et al., 2004a), ciclofosfamida (WOO et al.,
2000); gencitabina (APOSTOLIDOU et al., 2003; MURAD et al., 2003), capecitabina
(BOEHMER; JAEGER, 2002; BORNER et al., 2002) e cloridrato de irinotecano (CPT-
11) (GIBSON et al., 2003; SONIS et al., 2004a; ALIMONTI et al., 2004).
No que tange ao CPT-11, a mucosite acompanhada de diarréia tem sido
descrita na literatura como seu principal efeito tóxico (ABIGERGES et al., 1995;
BOKEMEYER; HARTMANN, 1999; ALIMONTI et al., 2004), e esta constitui o objeto
de investigação da presente pesquisa.
1.1 Cloridrato de irinotecano (CPT-11)
22
O CPT-11 é um derivado semi-sintético da camptotecina. Esta substância
foi inicialmente isolada nos Estados Unidos, por Wall et al., em 1966, de uma planta
nativa na China e no Tibet, Camptotheca acuminata. Apesar dos estudos desta
época terem evidenciado seu potencial antineoplásico, sua comercialização só teve
início na década de 1990, quando foi sintetizada uma molécula com menor
toxicidade, o CPT-11 (TAKIMOTO; ARBUCK, 2001; ALIMONTI et al., 2004).
Nos últimos anos, o CPT-11 tem sido utilizado como agente único ou
combinado com outros protocolos para tratamento de primeira e segunda linha para
o câncer colorretal (SALTZ et al., 2001; VAMVAKAS et al. 2002; ROSATI et al., 2002;
CHESTER et al., 2003). Também tem sido utilizado no câncer de ovário (FUJII et al.,
2002), linfoma de Hodgkin’s (RIBRAG et al., 2003), pulmão (ROCHA-LIMA et al.,
2004a; LANGER, 2004), pâncreas (ROCHA-LIMA et al., 2004b), mama (PEREZ et
al., 2004) e de estômago (AJANI, 2005; ENZINGER et al., 2005).
1.1.1 Estrutura química
O CPT-11 é um sal triidratado, 7-etil-10-[4-(1-piperidino)-1-piperidino]
carboniloxi-camptotecina, que possui um anel (α-hydroxi-3-lactona) que sofre
hidrólise reversível no lúmen intestinal produzindo carboxilato e lactona (GUPTA et
al., 1997; DODDS et al., 1998; IKEGAMI et al., 2001; YANG et al., 2006a). A
estrutura química do CPT-11 na forma de lactona pode ser vista na Figura 1.
FIGURA 1 – Estrutura química do cloridrato de irinotecano (CPT-11) lactona.
Fonte: DODDS et al. (1998).
23
1.1.2 Farmacocinética
O CPT-11 é uma pró-droga convertida no seu metabólito ativo, SN-38 (7-
etil-10-hidroxicamptotecina), pela enzima carboxilesterase (CE), particularmente
hCE2. O SN-38 é 100 a 1.000 vezes mais ativo que o CPT-11 (RIVORY et al., 1996;
XIE et al., 2002; CHESTER et al., 2003). A CE encontra-se presente
abundantemente no fígado e em menor quantidade no duodeno, jejuno, íleo, cólon e
reto. Esta enzima libera a cadeia lateral da dipiperidina presente na posição C-10 da
molécula de irinotecano (ALIMONTI et al., 2004).
Após a administração intravenosa em seres humanos, o CPT-11, sob a
forma de lactona, tem meia-vida de aproximadamente 6,8 horas (5 a 9,6 horas),
enquanto que a meia-vida do SN-38 é de aproximadamente 11,05 horas (9,1 a 13
horas). A depuração sistêmica é de aproximadamente 46,9 L/h/m
2
(TAKIMOTO;
ARBUCK, 2001). E, o volume de distribuição para as doses de 125 mg/m
2
e
340 mg/m
2
é de 110±48,5 L/m
2
e 234±69,6 L/m
2
, respectivamente (ALIMONTI et al.,
2004).
O metabolismo da droga é principalmente hepático por uma enzima do
sistema P450, particularmente CYP3A4, que gera componentes inativos como APC
(7-etil-10-[4-N-(5-ácido aminopentanóico)-1-piperidino]-carboniloxicamptotecina) e
NPC (7-etil-10-[4-amino-1-piperidino]-carboniloxicamptotecina) (CHESTER et al.,
2003; MATHIJSSEN et al., 2004). Pequena parte de APC pode ser metabolizada
pela CE em SN-38 (RIVORY et al., 1996; MATHIJSSEN et al., 2004); já o NPC é
metabolizado completamente em SN-38 por esta enzima, contribuindo na atividade e
toxicidade do CPT-11 in vivo (RIVORY et al., 1996; DODDS et al., 1998;
MATHIJSSEN et al., 2004).
Após o CPT-11 ser convertido em SN-38 nos tecidos, a detoxificação
ocorre pela sua conjugação com a enzima uridina difosfato glicuronosil-transferase
(UDP-GT) – UGT1A1, com a formação de SN-38 glicuronídio (SN-38G), composto
inativo (HAAZ et al., 1997; CHESTER et al., 2003; MATHIJSSEN et al., 2004). Gupta
et al. (1997) observaram que a atividade da enzima UDP-GT pode ser modulada pelo
ácido valpróico e fenobarbital. O primeiro provoca aumento da biodisponibilidade do
SN-38, porque inibe glicuronidação, enquanto a administração do fenobarbital
aumenta a reação de conjugação do SN-38, pois induz UDP-GT, podendo ser
benéfico seu uso em pacientes com comprometimento da função hepática.
24
CPT-11 e SN-38 são transportados ligados às seguintes proteínas:
glicoproteína P (P-gp), transportador canalicular multiespecífico de ânions orgânicos
(cMOAT) e proteína 2 associada à resistência multidroga (MRP2) (TAKIMOTO;
ARBUCK, 2001; TAKASUNA et al., 2006).
A eliminação da droga é preferencialmente pelas fezes (60-70%), sendo
também excretada pela bile (25%) e urina (10-20%) (ALIMONTI et al., 2004). Quando
SN-38G é eliminado pela bile no intestino, uma parte é excretada pelas fezes; outra
parte pode ser re-transformada em SN-38 por bactérias intestinais produtoras de
β-glicuronidase (como Escherichia coli e Clostridium perfringens) (TAKASUNA et al.,
1998; XIE et al., 2002). O uso de antibióticos como penicilina associado à
estreptomicina (TAKASUNA et al., 1998; TAKASUNA et al., 2006), neomicina
associado à bacitracina (TAKASUNA et al., 2006) e cefalosporina (CHOWBAY et al.,
2003) reduz o acúmulo de SN-38 no intestino.
1.1.3 Mecanismo de ação
O CPT-11 e seu metabólito ativo (SN-38) são inibidores seletivos da
topoisomerase I, uma enzima envolvida na replicação e transcrição do ácido
desoxirribonucléico (DNA). As topoisomerases mantêm a conformação tridimensional
do DNA através da remoção dos espirais durante a replicação e transcrição,
aliviando a tensão da torção produzida pelo enrolamento da molécula. A
citotoxicidade deve-se ao dano no DNA durante fase S do ciclo celular, quando as
enzimas de replicação do DNA colidem com um complexo ternário da droga, com o
DNA e com a topoisomerase I. Este dano induzido pela droga não é corrigido de
forma eficaz, provocando apoptose (TAKIMOTO; ARBUCK, 2001; ALIMONTI et al.,
2004).
CPT-11 e SN-38 na forma de carboxilato são inibidores menos potente da
topoisomerase I e têm atividade antitumoral mais fraca que a lactona. Entre as duas
formas há um equilíbrio pH-dependente, sendo que o pH ácido promove formação de
lactona e o pH básico resulta na forma aniônica do hidroxiácido (ARIMORI et al.,
2001; IKEGAMI et al., 2002).
1.1.4 Toxicidade
25
As camptotecinas têm em geral menos efeitos adversos que a maioria dos
agentes antineoplásicos (RANG et al., 2001). Os efeitos tóxicos mais severos e que
limitam o seu uso são a mielossupressão (principalmente neutropenia) e a diarréia
tardia (SALIBA et al., 1998; TAKIMOTO; ARBUCK, 2001; CHESTER et al., 2003;
ALIMONTI et al., 2004). Outros efeitos adversos (grau 3 e 4) relatados são: náuseas
e vômitos (9%), astenia (14%), alopecia (53%), elevação das transaminases
hepáticas (8%) e anemia (9%) (ABIGERGES et al.,1995).
A neutropenia, apesar de alta incidência, 23% (ENZINGER et al., 2005) a
43% dos pacientes (ROSATI et al., 2002), pode ser facilmente tratada com a
administração de G-CSF (fator estimulante da colônia de granulócitos) (ALIMONTI et
al., 2004).
Dois tipos de diarréia são associados com o uso do CPT-11: diarréia
aguda ou precoce e diarréia crônica ou tardia (RUBEINSTEIN et al., 2004). O
primeiro tipo, de curso geralmente leve, ocorre durante ou logo após administração
da droga pelo aumento da atividade colinérgica, pois o CPT-11 inibe
acetilcolinesterase (AChE) (GANDIA et al., 1993; DODDS et al., 1999; DODDS;
RIVORY, 1999; DODDS et al., 2001). O segundo, de início tardio, possui alta
incidência, em torno de 82% (SALIBA et al., 1998), e, quando grave, pode limitar a
eficácia do tratamento, já que muitas vezes é necessário reduzir sua dose ou até
mesmo suspender a administração da droga (ABIGERGES et al., 1994; IKEGAMI et
al., 2002; DUNCAN; GRANT, 2003; ALIMONTI et al., 2004).
1.2 Mucosite intestinal
1.2.1 Fisiopatologia
Mucosite alimentar é um termo que descreve a inflamação, erosão e
lesões ulcerativas no trato alimentar secundário à quimioterapia e/ou radioterapia do
câncer (LALLA et al., 2006). A incidência é alta no transplante de medula óssea,
terapia contínua para câncer de mama e cólon e na terapia de tumores de cabeça e
pescoço. Nos protocolos de alto risco, a mucosite severa ocorre em mais de 60% dos
casos (RUBENSTEIN et al., 2004).
26
Os mecanismos fisiopatológicos e o papel dos mediadores inflamatórios
no curso da mucosite oral são bem estabelecidos, entretanto, ainda não é bem
esclarecida a patogênese da mucosite intestinal (DUNCAN; GRANT, 2003; GIBSON;
KEEFE, 2006). Publicações recentes de Keefe (2004) e Bowen et al. (2006) afirmam
que a patobiologia da mucosite intestinal é um processo tão complexo quanto o
proposto para a mucosite oral. Por este motivo, atualmente tem sido proposto o
termo mucosite alimentar que abrange tanto a mucosite oral como a intestinal
(KEEFE, 2004; KEEFE, 2006; BOWEN et al., 2006; PETERSON et al., 2006).
A mucosite induzida por agentes quimioterápicos ou radioterapia é
causada por danos nas células epiteliais com subseqüente indução local da resposta
inflamatória (SONIS et al., 2004a; SONIS, 2004; KEEFE, 2004). Na literatura são
descritos alguns fatores de risco que predispõem os pacientes à mucosite intestinal,
tais como: comprometimento do estado imunológico, altos níveis endógenos de
citocinas pró-inflamatórias, má condição nutricional, composição da flora intestinal
(DUNCAN; GRANT, 2003; AVRITSCHER et al., 2004).
A elevada taxa de proliferação celular no intestino explica o fato destas
células serem afetadas por drogas utilizadas na quimioterapia do câncer. Ocorre
destruição das células de divisão presentes nas criptas, responsáveis pela renovação
epitelial dos vilos (KEEFE et al., 2000; GIBSON et al., 2002a; GIBSON et al., 2002b;
XIAN, 2003; SONIS et al., 2004a; RUBENSTEIN et al., 2004; BOWEN et al., 2006;
GIBSON; KEEFE, 2006). Assim, as células epiteliais continuam a ser descamadas no
topo dos vilos e as drogas inibem a proliferação celular, o que promove atrofia do
epitélio, provocando alterações histológicas que incluem atrofia da mucosa, com
conseqüente inflamação, lesão e ulceração (DUNCAN; GRANT, 2003; SONIS et al.,
2004a; RUBEINSTEIN et al., 2004).
Duncan e Grant (2003), em trabalho de revisão, descrevem os
mecanismos da mucosite intestinal em quatro fases: período inicial, restituição,
inflamação, recuperação.
A fase inicial caracteriza-se pela ação das drogas quimioterápicas que
bloqueiam a síntese do DNA por inibição da topoisomerase e síntese do timidilato.
Pode também ocorrer alterações na molécula do ácido ribonucléico (RNA) e
formação de radicais livres. Desse modo, as células progenitoras de divisão rápida
presentes nas criptas são afetadas. Todas estas alterações inibem o processo
mitótico, provocando ruptura dos processos celulares e de interações célula
27
substrato, que afetam a integridade celular e provocam o estímulo para o influxo de
células inflamatórias e imunes da lâmina própria (DUNCAN; GRANT, 2003).
Durante a segunda fase ocorre paralisação da divisão celular por algumas
horas e apoptose. Isto induz a perda progressiva de células nas criptas e ativa os
processos de restituição. Nesta etapa há um colapso na profundidade e no número
de criptas, encurtamento dos vilos e depleção de células caliciformes (XIAN et al.,
1999; KEEFE et al., 2000). A inflamação ocorre em terapia agressiva e é
caracterizada por perda celular juntamente com um processo de restituição contínuo,
levando a uma completa perda da superfície absortiva e da integridade da barreira.
Esta fase caracteriza-se por perdas de fluidos e colonização bacteriana (DUNCAN;
GRANT, 2003).
E por fim, no processo de recuperação ocorre uma significativa
proliferação celular ao redor de três a quatro dias após o término da terapia, que leva
a restauração funcional das criptas, bem como seu aumento. Conseqüentemente,
ocorre uma recuperação na estrutura e função dos vilos, com retorno da superfície
absortiva do intestino por volta de uma semana (XIAN et al., 1999; DUNCAN;
GRANT, 2003).
Segundo Keefe et al. (2000), a quimioterapia do câncer causa apoptose
que precede a hipoplasia das criptas no intestino delgado de humanos. A primeira
anormalidade notada no primeiro dia após o tratamento quimioterápico é o aumento
de apoptose, seguindo-se da redução das criptas, da área dos vilos e do índice
mitótico a partir do terceiro dia. A hiperplasia das criptas se inicia no quinto dia e
ocorre antes da normalização da mucosa intestinal.
As modificações que as células sofrem quando morrem por apoptose são
decorrentes da ativação de certas proteases citossólicas chamadas caspases
(BOWEN et al., 2006). O controle da apoptose depende da expressão dos genes
apoptóticos e antiapotóticos da família Bcl-2 (THORNBERRY, 1998; KEEFE, 2004;
KEEFE et al., 2004; KEEFE, 2006; BOWEN et al., 2006). Sabe-se, hoje, que a
quimioterapia do câncer aumenta a expressão de fatores apoptóticos da proteína Bcl-
2 (KEEFE, 2004; BOWEN et al., 2006).
O intestino delgado é predominantemente o local de maior destruição
induzida por drogas quimioterápicas (KEEFE, 2006; BOWEN et al., 2006). Apesar do
tratamento com MTX e CPT-11 provocar destruição também no cólon, as alterações
são consideravelmente menores (GIBSON et al., 2003). Postula-se que a mucosite é
28
usualmente mais proeminente no intestino delgado pela diferença na expressão de
fatores pró-apoptóticos e antiapoptóticos da proteína Bcl-2 em diferentes regiões
intestinais (KEEFE et al., 2004). Além disso, as células do intestino delgado
apresentam turnover maior que as do intestino grosso (BOWEN et al., 2006).
Outros estudos apontam que a relação entre apoptose e proliferação
intestinal depende da expressão dos fatores de transcrição p53 e p21 (KEEFE et al.,
2004; GIBSON et al., 2005; BOWEN et al., 2006). Pritchard et al. (1998) mostraram
que p53 é responsável pela destruição de criptas decorrente do tratamento com
5-FU. Observou-se que camundongos geneticamente manipulados – knockout
(p53
-/-
) tratados com 5-FU, tiveram menor resposta apoptótica que camundongos
normais (p53
+/+
). Posteriormente, Gibson et al. (2005) observaram que o uso de MTX
(5 mg/kg) induziu aumento da atividade apoptótica, destruição severa das criptas e
aumento da expressão de p53 sem aumento da expressão de p21.
Os fatores de transcrição, destacando-se o fator de transcrição nuclear
kappa B (NF-κB), possuem um papel-chave no desenvolvimento da mucosite oral,
pois modificam a expressão de citocinas e enzimas (SONIS, 2002; SONIS, 2004;
SONIS et al., 2004a). Na patogênese da mucosite intestinal, Yeoh et al. (2005)
referem seu aumento de expressão acompanhando as alterações no tecido colorretal
após tratamento radioterápico em seres humanos. A radiação ativa e aumenta a
expressão de NF-кB, que ativa as proteínas como a ciclooxigenase-2 (COX-2).
Bowen et al. (2007) identificaram que a proteína quinase ativada por mitógeno
(MAPK) também sinaliza a destruição intestinal induzida por CPT-11 e que o
aumento de expressão das caspases 1 e 3 é responsável pelo processo de
apoptose.
As citocinas, o óxido nítrico (NO) e as prostaglandinas (PGs), por
possuírem um papel de grande relevância na regulação do processo inflamatório,
têm se mostrado como fortes candidatas a serem agentes endógenos liberados em
resposta a agentes quimioterápicos (KASE et al., 1997; WILLIAMS, 2001; TRIFAN et
al., 2002; DE KONING et al., 2006; LEITÃO et al., 2007). Sabe-se que estes
mediadores estão implicados na patogenia da mucosite oral, entretanto, o processo
de ativação dos componentes pró-inflamatórios e os mecanismos desencadeados
pela mucosite intestinal ainda não estão bem esclarecidos.
1.2.2 Manifestações clínicas
29
A mucosite manifesta-se clinicamente pelo aparecimento de sintomas
gastrintestinais como distensão abdominal, dor abdominal e diarréia, as quais podem
levar à desidratação e à má-absorção de nutrientes (DUNCAN; GRANT, 2003;
SONIS et al., 2004a; RUBENSTEIN et al., 2004; AVRITSCHER et al., 2004;
GIBSON; KEEFE, 2006).
A diarréia caracteriza-se pelo aumento da freqüência das evacuações e
redução da consistência das fezes, que pode ou não ser acompanhada de sangue e
cólicas (SALTZ, 2003; GIBSON; KEEFE, 2006). Para medir a severidade da diarréia
induzida por quimioterápicos, o National Cancer Institute (NCI, 2006) recomenda os
seguintes escores: 0 – ausência de diarréia; 1 – aumento menor que quatro
evacuações por dia em relação ao pré-tratamento; 2 – aumento de quatro a seis
evacuações por dia ou diarréia noturna, presença de cólicas moderadas; 3 –
aumento de sete a nove evacuações por dia ou incontinência, presença de cólicas
severas; 4 – aumento de dez evacuações, ou mais por dia ou visualização
macroscópica de sangue nas fezes ou necessidade de suporte parenteral.
A ação da quimioterapia na fisiologia e estrutura do trato gastrintestinal
contribui para anorexia, diminuição do consumo de alimentos e redução da absorção
de nutrientes, que induzem à desnutrição e caquexia (BOKEMEYER; HARTMANN,
1999; DUNCAN; GRANT, 2003; AVRITSCHER et al., 2004; SONIS, 2004; GIBSON;
KEEFE, 2006), manifestada clinicamente por perda tecidual, atrofia da musculatura
esquelética, miopatia, perda rápida de tecido gorduroso, atrofia de órgãos viscerais e
anergia (MATTOX, 2005). Esta condição reduz a qualidade de vida dos pacientes e
aumenta a sua morbidade (BOKEMEYER; HARTMANN, 1999; RUBENSTEIN et al.,
2004). Algumas vezes no tratamento da mucosite é necessário hospitalização, uso
de medicamentos e nutrição parenteral total, com conseqüente aumento de custo
(SONIS et al., 2004a), podendo ainda provocar atraso ou redução da administração
do tratamento quimioterápico (RUBENSTEIN et al., 2004).
Além disso, a mucosite quando associada à neutropenia pela
mielossupressão é um fator de risco para septicemia (SONIS, 2004; AVRITSCHER et
al., 2004). A resposta inflamatória desencadeada pode ser agravada por infecções
secundárias, que poderão levar à translocação bacteriana e à septicemia (WOO et
al., 2000), podendo também aparecer obstrução intestinal, perfuração e formação de
fístulas (RUBEINSTEIN et al., 2004).
30
1.2.3 Tratamento
Apesar dos grandes avanços no conhecimento da mucosite intestinal, não
existe um protocolo definitivo para a prevenção e tratamento destas lesões (GIBSON
et al., 2002a e 2002b; SALTZ, 2003; GIBSON; KEEFE, 2006). Comitês de estudo da
mucosite (Multinational Association of Supportive Care in Cancer – MASCC;
International Society for Oral Oncology – ISOO) elaboraram um guia prático para a
prevenção e tratamento da mucosite oral e gastrintestinal. Neste painel
recomenda-se o tratamento da diarréia com loperamida, um agente que reduz a
peristalse, aumenta o tempo de trânsito intestinal e promove a reabsorção de água
(RUBENSTEIN et al., 2004; KEEFE et al., 2007).
Lenfers et al. (1999) recomendam a budesonida, um corticosteróide,
quando houver falha no tratamento com o uso da loperamida e também para ser
utilizado profilaticamente no controle da diarréia induzida pelo CPT-11 e 5-FU.
Entretanto, a maioria dos estudos indica o uso de octreotida quando não houver
melhora da diarréia com loperamida (ZIDAN et al., 2001; RUBENSTEIN et al., 2004;
PETERSON et al., 2004; GIBSON; KEEFE, 2006; KEEFE et al., 2007). A octreotida é
um análogo da somatostatina, que inibe hormônios gastrintestinais e regula o
transporte de água e eletrólitos na mucosa intestinal (ZIDAN et al., 2001).
Existem outros agentes sendo investigados como substâncias com
potencial de prevenir e tratar a mucosite intestinal como a glutamina, fatores de
crescimento e citocinas antiinflamatórias (PETERSON et al., 2004;
BÜLTZINGSLÖWEN et al., 2006).
Sabe-se que a glutamina é um precursor essencial para a síntese de
purinas e pirimidinas, é a fonte energética preferencial para os enterócitos e ativa a
proliferação celular, ampliando o estímulo de fatores de crescimento como o fator de
crescimento epidérmico (EGF) e fator de crescimento insulina símile-1 (IGF-1)
(PALANCH, 2000). Alguns autores defendem que a glutamina melhora a barreira
intestinal e estimula o crescimento dos vilos após a quimioterapia (KLIMBERG et al.,
1990; PALANCH, 2000; PETERSON et al., 2004; HARSHA et al., 2006). Apesar de
achados positivos do efeito da glutamina na mucosite intestinal experimental
(KLIMBERG et al., 1990; HARSHA et al., 2006), em estudo clínico com 5-FU não se
observou efeito benéfico com o uso deste aminoácido (OKUNO et al., 1999).
31
Entretanto, Savarese et al. (2000) descreveram que a suplementação oral de
glutamina preveniu clinicamente a diarréia tardia decorrente do tratamento com
CPT-11. O último consenso publicado pela seção de mucosite da MASCC e ISOO
não recomenda o uso de glutamina para a prevenção da mucosite intestinal (KEEFE
et al., 2007).
No que se refere aos fatores de crescimento, em modelos
animais, observou-se aumento na expressão do fator de crescimento do
hepatócito (HGF) no período de hiperproliferação das criptas, sugerindo
seu papel positivo no processo de reparo (XIAN et al., 2000). Do mesmo
modo, IGF-1 atenuou a mucosite induzida por MTX (HOWARTH, 2003) e
5-FU (COOL et al., 2005), por promover a proliferação intestinal,
acelerando o reparo epitelial.
Van’t Land et al. (2004) observaram que a suplementação oral
de lactoferrina protegeu ratos da mucosite intestinal induzida por MTX,
por inibição da proliferação de células epiteliais, via bloqueio de peptídeo
glucagon símile (GLP-2). Segundo o autor, uma parada temporal do
turnover das células epiteliais protege da destruição induzida por
quimioterápicos.
A administração do fator de crescimento de queratinócitos (KGF), que
possui ação trófica nas células epiteliais, não protegeu o intestino delgado das
alterações morfométricas (área dos vilos, tamanho das criptas e índice mitótico)
induzidas pelo MTX, apesar de proteger o intestino da redução de peso provocada
por este agente antitumoral (GIBSON et al., 2002a). Huang et al. (2002) também não
encontraram evidências de que o EGF teria um papel preventivo e indutor no reparo
da destruição intestinal provocada por 5-FU. Por outro lado, experimentalmente, uma
dieta rica em glutamina, fator de crescimento transformador-beta (TGF-β) e ácidos
graxos de cadeia curta (SCFAs), ingerida antes e durante o tratamento com MTX,
protegeu ratos da perda de peso, hipoalbuminemia e das lesões gastrintestinais
induzidas pela droga (HARSHA et al., 2006).
Outros estudos observaram a ação protetora da interleucina-11 (IL-11),
uma citocina antiinflamatória. Especula-se que IL-11 pode reduzir a ativação de
citocinas. Na mucosite oral, Sonis et al. (2000) demonstraram que o tratamento com
32
IL-11 recombinante humano (rhIL-11) foi efetivo para atenuar a mucosite oral
induzida por 5-FU em hamsters, pela sua habilidade em reduzir a expressão do fator
de necrose tumoral-alfa (TNF-α) e da interleucina-1beta (IL-1β). A administração de
IL-11 teve também efeito positivo na mucosite intestinal induzida pelo MTX,
reduzindo a perda de peso e melhorando a morfometria intestinal. Entretanto, IL-11
não preveniu apoptose das criptas induzida pela quimioterapia (GIBSON et al.,
2002b).
Outras estratégias têm sido propostas para terapia da diarréia induzida
pelo CPT-11. Alguns estudos apontam o efeito protetor dos antibióticos na toxicidade
intestinal induzida pelo CPT-11, por estes reduzirem a exposição do intestino grosso
ao SN-38 por inibição do desenvolvimento das bactérias produtoras de
β-glicuronidase (GUPTA et al., 1997; TAKASUNA et al., 1998; CHOWBAY et al.,
2003; TAKASUNA et al., 2006). Chowbay et al. (2003) também testaram em ratos a
administração por via oral (v.o.) de carvão mineral na tentativa de reduzir absorção
intestinal do CPT-11, SN-38 e SN-38G, e não observaram efeito no controle da
diarréia. Em modelo experimental (IKEGAMI et al., 2002) e em estudo clínico
(TAMURA et al., 2004), a alcalinização do trato intestinal, através da administração
de bicarbonato de sódio, preveniu a diarréia, provavelmente por reduzir a
concentração de CPT-11 e SN-38 na forma lactona (IKEGAMI et al., 2002).
A administração de IL-15 (11 doses de 100 ou 400 µg/kg), em ratos,
reduziu a destruição da mucosa intestinal induzida pelo CPT-11, a incidência de
diarréia e a letalidade dos animais. As duas doses foram efetivas, apesar de melhor
resposta ser observada com a menor dose. Este efeito positivo parece ser pelo fato
de IL-15 inibir a apoptose celular e/ou estimular o crescimento de células no epitélio
intestinal. Esta citocina também pode melhorar a imunidade, reduzindo a ação das
bactérias intestinais e reduzindo a mielossupressão induzida pelo CPT-11 (CAO et
al., 1998).
Experimentalmente, observou-se que a co-administração de St. John’s
wort ou erva-de-São-João (Hypericum perforatum) melhorou a toxicidade intestinal
induzida pelo pelo CPT-11, pela sua capacidade de inibir citocinas como TNF-α, IL-6,
IL-1β e IFN-γ (HU et al., 2006).
Conclui-se, pois, que os mecanismos celulares e moleculares envolvidos
na patogênese da mucosite intestinal ainda não são totalmente esclarecidos. Além
disso, o seu tratamento consiste apenas em uma abordagem essencialmente
33
paliativa, não existindo um protocolo de atendimento eficaz. Entretanto, torna-se
cada vez mais evidente a participação de mediadores inflamatórios na infiltração
celular, lesão tecidual, ulceração, secreção e cicatrização intestinal (SARTOR, 1994;
SAKAI et al., 1995 e 1997; WILSON; GIBSON, 1997; BARRACHINA et al., 2001; DE
KONING et al., 2006; BÜLTZINGSLÖWEN et al., 2006). Considerando estes
aspectos, o conhecimento dos mecanismos específicos do processo inflamatório que
induz às lesões teciduais abre novas perspectivas na utilização de agentes
moduladores da resposta inflamatória para o tratamento e prevenção da mucosite
intestinal. A seguir, serão abordados os mediadores inflamatórios e os agentes
farmacológicos que serão avaliados na presente pesquisa.
1.3 Mediadores inflamatórios envolvidos na mucosite intestinal
1.3.1 Citocinas
As citocinas compreendem um amplo grupo de glicoproteínas de baixo
peso molecular que possuem a capacidade de modular a atividade celular em
condições fisiológicas e patológicas. Podem ser sintetizadas por todas as células
nucleadas do corpo, mas são liberadas principalmente por macrófagos e linfócitos. A
maioria delas age localmente, de forma autócrina, ou seja, atuam sobre os
receptores das próprias células que as produzem; e de forma parácrina, atuam em
células-alvo vizinhas ou distantes (SARTOR, 1994; NICOLA, 1994).
Em geral, as citocinas são pleiotrópicas, isto é, têm múltiplos efeitos, uma
única citocina pode interagir com mais de um tipo de célula, ter muitas atividades
biológicas, interagir com outras citocinas com atividades sinérgicas ou antagônicas.
Estas ações incluem numerosos efeitos nas células do sistema imune e modulação
da resposta inflamatória. A produção constitutiva das citocinas é normalmente baixa
ou ausente, a sua síntese é regulada por vários estímulos indutores em nível de
transcrição (NICOLA, 1994).
A exposição do intestino a determinadas citocinas reproduz a inflamação
intestinal, induzindo a migração de macrófagos, linfócitos e eosinófilos da lâmina
própria para a superfície do epitélio. Estas células representam uma importante
34
defesa contra microrganismos luminais e facilitam o processo de reparo por aumento
no processo de restituição (SARTOR, 1994; WILSON; GIBSON, 1997; MAHIDA et
al.,1997; WILLIAMS, 2001; DE KONING et al., 2006).
Segundo Williams (2001), citocinas inflamatórias, tais como IL-1, IL-6,
TNF-α, interferon-gama (IFN-γ) e IL-2; e antiinflamatórias, antagonista do receptor de
IL-1 (IL-1ra), TGF-β, IL-4, IL-10, IL-11 estão envolvidas na lesão e reparo da mucosa.
Wilson; Gibson (1997) destacam no processo inflamatório intestinal a importância da
IL-8, IL-2, IFN-γ e IL-1β. No entanto, segundo o mesmo autor, IL-4 e IL-10 podem
perpetuar a injúria epitelial por inibir a migração celular. No presente trabalho, será
especulado o papel de citocinas como TNF-α, IL-1β e quimiocina derivada de
queratinócitos (KC).
O TNF é expresso em duas formas: TNF-α e TNF-β. TNF-α é produzido
por macrófagos, células natural Killer e mastócitos, enquanto TNF-β é primariamente
um produto de linfócitos T ativados. São atividades bem definidas destas citocinas, a
habilidade de ativar neutrófilos, estimular a produção de IL-1, inibir a atividade da
lipoproteína lípase, induzir a caquexia e choque séptico (PALLADINO Jr.; FINKLE,
1986; FONG; LOWRY, 1990). O TNF-α tem sido apontado como um dos mediadores
inflamatórios implicados nas alterações da fisiologia intestinal por induzir expansão
na população de células residentes da lâmina própria e epitélio intestinal, com
conseqüente liberação de citocinas como IL-1, IL-6 e IL-8; e também de derivados
lipídicos, enzimas, oxidantes, capazes de provocar secreção e lesão na mucosa
intestinal (McKAY; PERDUE, 1993; SARTOR, 1994).
Existem duas formas de IL-1, a IL-1α e IL-1β, que possuem atividades
biológicas semelhantes e se ligam com a mesma afinidade aos receptores de
membrana. Existe um terceiro membro na família de genes IL-1, o IL-1ra, que inibe
as ações inflamatórias de IL-1, porque compete biologicamente pela ligação com
receptores de IL-1 (AREND, 1991). IL-1 possui influência marcante no
desenvolvimento de lesões e na secreção intestinal por estimular a síntese de PGs
(THEODOROU et al., 1994) e IL-8 (SARTOR, 1994). In vitro, demonstrou-se que o
efeito secretório intestinal do sobrenadante de macrófagos estimulados pela toxina A
foi dependente da atividade de IL-1β (ROCHA et al., 1998).
A KC é o homólogo de IL-8 em camundongos, que pertence a uma família
de pequenas proteínas estruturalmente semelhantes, as quimiocinas, consideradas
uma sub-família das citocinas. É bem estabelecido que citocinas pró-inflamatórias
35
como TNF-α e IL-1 são indutores da síntese de IL-8, um poderoso ativador de
neutrófilos (LARSEN et al., 1989; MARTICH et al., 1991; THOMAZZI et al., 1997).
Demonstrou-se experimentalmente que IL-8 induz a inflamação intestinal,
caracterizada pela ativação de células imunes, endoteliais e epiteliais, e pelo
recrutamento de células inflamatórias circulantes (SARTOR, 1994).
1.3.2 Óxido nítrico (NO)
Furchogott e Zawadzki, em 1980, demonstraram que o relaxamento
vascular induzido pela acetilcolina foi dependente da presença do endotélio e
evidenciaram que este efeito foi mediado por um fator, posteriormente conhecido
como fator de relaxamento dependente do endotélio (EDRF). Em 1987, demonstrou-
se que o EDRF era o NO (CLANCY et al., 1998). Atualmente, sabe-se que o NO é
produzido por várias células e que, além de regular a vasodilatação, desempenha
outros papéis relevantes como na transmissão de estímulos nervosos, na fisiologia
pulmonar, na coagulação sangüínea e na resposta inflamatória (MONCADA et al.,
1997; CLANCY et al., 1998).
O NO é uma pequena molécula composta de um átomo de nitrogênio e
oxigênio, apresentando um elétron desemparelhado, o que o torna altamente reativo.
Possui meia-vida curta, menor que 15 segundos. E, após transmitir um sinal
transforma-se espontaneamente em nitrito e nitrato (CLANCY et al., 1998; KENDALL
et al., 2001).
A enzima óxido nítrico sintase (NOS) é responsável pela síntese de NO a
partir do substrato L-arginina. Três isoformas de NOS são descritas, sendo uma NOS
induzida (iNOS) expressa em resposta a estímulos patológicos, e duas NOS
constitutivas (cNOS), que estão presentes em condições fisiológicas no endotélio e
neurônios. As enzimas constitutivas são responsáveis pela síntese de pequenas
quantidades de NO, enquanto a atividade da iNOS é, aproximadamente, mil vezes
maior (MONCADA et al., 1997; CLANCY et al., 1998).
A atividade das formas constitutivas é regulada principalmente pela
concentração de cálcio intracelular. O NO produzido por essa enzima atua como
mecanismo de transdução. Os efeitos fisiológicos das baixas concentrações de NO
produzidas em condições normais pela cNOS são mediados pelo monofosfato de
guanosina cíclico (cGMP). O NO é o ativador endógeno da guanilato ciclase solúvel,
36
levando a formação de cGMP, que atua como segundo mensageiro em muitas
células. Entretanto, os efeitos citotóxicos e citoprotetores de altas concentrações de
NO relacionam-se com sua atividade como radical livre (MONCADA et al., 1997).
A expressão de iNOS é resultado de uma resposta inflamatória localizada
ou difusa, resultante de uma lesão ou dano tecidual e é regulada à nível
transcricional (MONCADA et al., 1997; KENDALL et al., 2001). Tem sido
demonstrado na literatura que as citocinas como TNF-α, IL-1β (CLANCY et al., 1998;
RIBEIRO et al., 2002; KENDALL et al., 2001) e interferon gama (IFN-γ)
(BARRACHINA et al., 2001; KENDALL et al., 2001) estimulam a expressão da
enzima com conseqüente produção de NO. Por outro lado, a indução de iNOS pode
ser suprimida por citocinas antiinflamatórias, tais como IL-4 e IL-10, e por
glicocorticóides (CLANCY et al., 1998; KENDALL et al., 2001).
O NO é um potente vasodilatador e seu envolvimento na resposta
inflamatória pode estar relacionado com sua habilidade de aumentar a
permeabilidade vascular e o edema através de alterações no fluxo sanguíneo local e
do aumento na produção de PGs (KENDALL et al., 2001). Além disso, o NO
produzido pela iNOS atua como uma molécula citotóxica contra microrganismos
invasores e células tumorais. A ação citostática e citotóxica do NO se deve a sua
atividade inibidora de enzimas na cadeia respiratória e na síntese de DNA. O NO
interage com ânions superóxidos produzindo substâncias tóxicas como o
peroxinitrito. Embora o NO seja importante para a defesa e na manutenção da
homeostase, a sua produção excessiva pode causar danos teciduais ao hospedeiro e
pode estar envolvido na patogênese de condições como o choque séptico
(MONCADA et al., 1997; KENDALL et al., 2001). É extensivamente mostrado na
literatura que o NO derivado da iNOS é mediador de doenças inflamatórias, incluindo
cistite hemorrágica (SOUZA-FILHO et al., 1997; RIBEIRO et al., 2002), pancreatite
(GÓMEZ-CAMBRONERO et al., 2000) e mucosite oral (LEITÃO et al., 2007).
No trato gastrintestinal estão presentes as isoformas constitutiva e
induzida. O NO tem um papel estimulante da migração epitelial (WILSON; GIBSON,
1997; KUBES; McCAFFERTY, 2000; DIJKSTRA et al., 2004). O NO na forma
constitutiva mantém intacta a barreira da mucosa, pelo seu efeito antioxidante, pela
sua capacidade de reduzir a infiltração de neutrófilos e inibir a enzima dinucleotídeo
fosfato de nicotinamida adenina (NADPH) oxidase. Portanto, a inibição da enzima
NOSc aumenta o estresse oxidativo e a permeabilidade intestinal (KUBES E
37
MCCAFFERTY, 2000; POTOKA et al., 2002). Por outro lado, a presença de iNOS
contribui para inflamação intestinal, induz apoptose e estimula a secreção intestinal
(KUBES; McCAFFERTY, 2000; BARRACHINA et al., 2001; POTOKA et al., 2002;
DIJKSTRA et al., 2004) e parece ser importante na evolução da translocação
bacterina (POTOKA et al., 2002). Assim, o manejo da atividade desta enzima pode
ser uma opção para o tratamento de condições inflamatórias do intestino (DIJKSTRA
et al., 2004).
1.3.3 Prostaglandinas (PGs)
Os eicosanóides estão envolvidos no controle de vários processos
fisiológicos e estão entre os mais importantes mediadores da resposta inflamatória
(VANE et al., 1998; HINZ; BRUNE, 2002; VANE; BOTTING, 2003).
A síntese dos eicosanóides pode ser desencadeada por diversos
estímulos que ativam receptores de membrana acoplados à proteína G, resultando
na ativação da fosfolipase A
2
, a qual hidrolisa fosfolipídeos de membrana liberando
ácido araquidônico (AA). O AA é substrato para duas vias enzimáticas: a via das
COXs, que induz a síntese de PGs e dos tromboxanos (TXs), e a via das
lipoxigenases, responsável pela síntese dos leucotrienos e lipoxinas (VANE et al.,
1990; VANE et al., 1998; HINZ; BRUNE, 2002; VANE; BOTTING, 2003).
A COX, isolada em 1976 e clonada em 1988, é a enzima-chave que
cataliza duas etapas na síntese das PGs. As COXs possuem duas atividades
distintas, uma de endoperóxido redutase que oxida o AA em PGG
2
; e outra que
reduz PGG
2
em PGH
2
. PGH
2
é então transformado por outras enzimas em PGD
2
,
PGE
2
, PGF
2α
, prostaciclina (PGI
2
) e tromboxano A
2
(TXA
2
) (VANE et al., 1990; VANE
et al., 1998; HINZ; BRUNE, 2002; VANE; BOTTING, 2003).
Sabe-se, atualmente, que dois genes expressam duas isoformas distintas
bastante similares da enzima, COX-1 e COX-2, que possuem a estrutura primária
protéica similar e catalisam a mesma reação (VANE et al., 1998; VANE; BOTTING,
2003). A COX-1 é expressa constitutivamente, ou seja, estar presente nas células em
condições fisiológicas, principalmente nos vasos sangüíneos, plaquetas, trato
gastrintestinal e rins. A COX-2, com expressão predominantemente no processo
inflamatório, é induzida na presença de citocinas (IL-1, IL-2, TNF-α), fatores de
crescimento e endotoxinas (VANE et al., 1998; HINZ; BRUNE, 2002). As citocinas
38
antiinflamatórias como IL-4, IL-10 e IL-13 e os corticosteróides reduzem a indução de
COX-2 (ONOE et al., 1996; VANE et al., 1998; HINZ; BRUNE, 2002). Atualmente,
sabe-se que COX-2 também é expressa em pequenas quantidades constitutivamente
(VANE et al., 1998).
Recentemente, foi descrita uma terceira isoenzima de COX, a COX-3; e
duas proteínas derivadas de COX-1, denominadas proteínas COX-1 parcial
(PCOX-1). A COX-3 e uma das proteínas parciais da COX-1, PCOX-1a, são obtidas
a partir do gene de COX-1. COX-3 compartilha todas as características catalíticas e
estruturais tanto de COX-1 como de COX-2 (WILLOUGHBY et al., 2000;
CHANDRASEKHARAN et al., 2002).
Sabe-se que PGs desempenham um papel relevante na fisiopatologia das
diarréias inflamatórias. Os eicosanóides são ativados durante a inflamação intestinal
pela COX-2 (TAN et al., 2000; STURM; DIGNASS, 2002). Trabalhos in vitro relatam o
papel deste mediador no estímulo à secreção de cloro e água no intestino (SAKAI et
al., 1995 e 1997; SUZUKI et al., 2000). Por outro lado, as PGs também são
importantes nos mecanismos de reparo intestinal (TAN et al., 2000).
1.4 Moduladores farmacológicos
1.4.1 Pentoxifilina (PTX)
A pentoxifilina (PTX / 1-[5-oxohexil]-3,7-dimetilxantina), inicialmente
descrita como agente hemorreológico, possui efeito hemodinâmico primário devido a
sua capacidade de reduzir a viscosidade do sangue e aumentar a deformabilidade
dos eritrócitos. A redução da viscosidade do sangue e do plasma ocorre pela
redução da agregação plaquetária e das concentrações plasmáticas de fibrinogênio,
o que diminui o potencial de formação de trombos, melhorando a perfusão na
circulação microvascular. A PTX exerce estes efeitos farmacológicos por inibir a
fosfodiesterase, aumentando desta forma as concentrações intracelulares de
monofosfato de adenosina cíclico (cAMP), bem como por reduzir a síntese do TXA
2
e
aumentar a síntese de PGI
2
. Já o aumento da deformabilidade dos eritrócitos envolve
39
aumento do trifosfato de adenosina (ATP) e nucleotídeos nos eritrócitos (WARD;
CLISSOLD, 1987).
A droga é rapidamente metabolizada por redução, formando o metabólito
ativo 1-(-5-hidroxihexil)-3,7-dimetilxantina (metabólito 1); e por oxidação a outros
metabólitos, especialmente metabólito 4 e 5. O fármaco na forma inicial e o
metabólito ativo ligam-se à membrana dos eritrócitos. A principal via de excreção é a
renal sob a forma de metabólitos polares hidrossolúveis (WARD; CLISSOLD, 1987).
A PTX tem sido utilizada em doenças oclusivas arteriais periféricas e
distúrbios de natureza aterosclerótica ou diabética, como claudicação intermitente e
úlceras nas pernas e gangrena, alterações circulatórias cerebrais, estados
isquêmicos e pós-apopléticos (WARD; CLISSOLD, 1987; BOMBINI et al., 2004).
Novos usos da PTX estão sendo pesquisados e se relacionam ao seu
efeito antiinflamatório, por afetar a aderência de neutrófilos, a produção de citocinas
(GÓMEZ-CAMBRONERO et al., 2000; CARNEIRO FILHO et al., 2001; ABDEL-
SALAM et al., 2003; BOMBINI et al., 2004; LIMA, 2004; LIMA et al. 2005), óxido
nítrico (BESHAY et al., 2001) e a molécula de adesão intercelular (ICAM-1) (FUNK et
al., 1995). Assim, a PTX e seus metabólitos modulam a adesão de leucócitos
polimorfonucleares (PMN), a produção de superóxidos e a desgranulação
(SULLIVAN et al.,1988). Devido ao seu potencial imunomodulador, a PTX tem sido
alvo de pesquisas para o tratamento de doenças inflamatórias (GÓMEZ-
CAMBRONERO et al., 2000; CARNEIRO-FILHO et al., 2001), da perda de peso dos
pacientes com câncer (MATTOX, 2005) e câncer (MISIRLIOGLU et al., 2006).
Vários estudos têm comprovado que a PTX reduz os níveis de TNF-α
(SULLIVAN et al., 1988; STRIETER et al., 1988; NEUNER et al., 1994; FUNK et al.,
1995; HUIZINGA et al., 1996; SCHMIDT-CHOUDHURY et al., 1996; VAN FURTH et
al., 1997; REIMUND et al., 1997; SILVA et al., 2000; MARCINKIEWICZ et al., 2000;
HADDAD et al., 2002; JI et al., 2004), por inibir a transcrição do seu gene (DOHERTY
et al., 1991) pelo aumento da geração intracelular de cAMP (STRIETER et al., 1988;
MARCINKIEWICZ et al., 2000). In vitro, a inibição de TNF-α, em parte suprime a
síntese de IL-2 (JEWETT; BONAVIDA, 1994), apesar da expressão de IL-2 também
ser reduzida em culturas de células tratadas com PTX (FUNK et al., 1995). A
produção de outras citocinas proinflamatórias também é inibida in vitro e in vivo com
40
o tratamento com PTX, tais como IL-1β (NEUNER et al., 1994; VAN FURTH et al.,
1997; REIMUND et al., 1997; SILVA et al., 2000), IFN-γ (FUNK et al., 1995;
MARCINKIEWICZ et al., 2000; SAMARDZIC et al., 2001), de IL-6 (MARCINKIEWICZ
et al., 2000), IL-8 (MARTICH et al., 1991; NEUNER et al., 1994; GUTIERREZ-REYES
et al., 2006) e IL-12 (MARCINKIEWICZ et al., 2000; SAMARDZIC et al., 2001) e IL-18
(SAMARDZIC et al., 2001). A supressão de citocinas inflamatórias pode ser pelo
efeito inibitório na ativação de NF-кB (JI et al., 2004).
Em contraste com a bem documentada ação anti-TNF-α, o papel da
inibição da produção de algumas citocinas é contraditório. A incubação de PTX em
macrófagos peritoneais (MARCINKIEWICZ et al., 2000) e em cultura de epitélio
alveolar (HADDAD et al., 2002) provocou supressão de IL-6. No entanto, outros
trabalhos in vitro não mostraram alteração significativa nos níveis de IL-6 em células
mononucleares do sangue periférico (PBMCs) tratadas com PTX (NEUNER et al.,
1994; FUNK et al., 1995; REIMUND et al., 1997). In vivo, o tratamento com PTX
reduziu a ativação de IL-6 em PBMCs (NEUNER et al. 1994) e em intestino de ratos
tratados com lipopolissacarídeo (LPS) (JI et al., 2004), mas não teve efeito na
expressão de IL-6 em suínos com pleuropneumonia (MYERS et al., 2002). Em
relação a IL-8, a PTX não modificou significativamente sua expressão em alguns
estudos in vitro (REIMUND et al., 1997; MYERS et al., 2002) e in vivo (MYERS et al.,
2002), apesar de Neuner et al. (1994) e Gutierrez-Reyes et al. (2006) terem relatado
down regulation desta citocina após tratamento com PTX.
O efeito regulador da PTX sobre IL-10, uma citocina antiinflamatória,
parece ser dependente da concentração da droga. Assim, concentrações maiores
(10
-3
M) provocaram sua inibição, enquanto o uso em menor concentração (10
-4
M),
induziu produção aumentada (D’HELLENCOURT et al., 1996). In vitro, alta
concentração de PTX também inibiu a produção de IL-10 em macrófagos ativados
com LPS. Esta inibição ocorreu juntamente com a redução da subunidade IL-12p35 e
com o aumento da síntese de IL-12p40 (MARCINKIEWICZ et al., 2000). Ji et al.
(2004), em modelo de sepse induzida por LPS, quando utilizaram a PTX (doses de
6,25; 12,5; 25; 50 e 100 mg/kg) observaram aumento na expressão de IL-10 mRNA,
sendo que o efeito maior ocorreu na dose de 25 mg/kg.
1.4.2 Talidomida (TLD)
41
A talidomida (TLD), uma α-N-fitalimidoglutarimida, foi descoberta por
Wilhelm Kunz, em 1954 (KUNZ et al., 1956). Em 1957, foi comercializada como
droga hipnótico-sedativa, amplamente vendida nos países europeus, asiáticos, no
Canadá e América do Sul, tornando-se o medicamento mais vendido na Alemanha
Ocidental (ERIKSSON et al., 2001). No início da década de 1960, ela foi prescrita
como sedativo e agente antinaúseas indicado para gestantes, sendo responsável
pelo nascimento de milhares de crianças com deformações congênitas como
focomelia (encurtamento de membros), amelia (ausência de membros) e alterações
em orelhas, olhos, coração e sistema gastrintestinal (KLAUSNER et al., 1996;
CALABRESE; FLEISCHER Jr., 2000; MATTHEWS; McCOY, 2003). Após a
confirmação de seus graves efeitos teratogênicos, a TLD teve sua licença de
comercialização cancelada (MATTHEWS; McCOY, 2003).
Outros efeitos colaterais têm sido descritos com uso da TLD, entre eles
destacam-se: o aparecimento de neuropatia periférica, sonolência, astenia,
parestesia (CALABRESE; FLEISCHER Jr., 2000; ERIKSSON et al., 2001), tontura,
alterações do humor, constipação e leucopenia (CALABRESE; FLEISCHER Jr.,
2000).
Apesar da sua proibição, em 1965, o médico israelita Jacob Sheskin
prescreveu TLD como sedativo para pacientes com hanseníase, observando que
estes apresentaram uma acentuada redução da dor e do processo inflamatório
associado ao eritema nodoso da lepra (SHESKIN, 1965). Posteriormente,
pesquisadores demonstraram que estes pacientes apresentaram níveis sangüíneos
aumentados de TNF-α (SARNO et al., 1991) e que a TLD possui a capacidade de
inibição desta citocina, quando expressa em quantidade superior, denotando, pois, o
seu potencial imunomodulador (SAMPAIO et al., 1991; MOREIRA et al., 1993;
TAVARES et al., 1997; KIM et al., 2004). Em 1998, o seu uso para o tratamento da
lepra foi aprovado pela Food and Drug Administration (FDA), marcando
definitivamente o seu renascimento, que é atualmente um dos principais agentes
terapêuticos para o tratamento do leproma (JAKEMAN; SMITH, 1994).
A TLD ressurge como fármaco promissor para o tratamento de outras
desordens sistêmicas, devido às suas propriedades antiinflamatórias,
imunossupressoras, antiangiogênicas, antivirais (KLAUSNER et al., 1996;
MATTHEWS; McCOY, 2003) e anticaquexia (KLAUSNER et al., 1996; MATTOX,
42
2005). Assim, seu uso tem sido pesquisado em patologias como artrite reumatóide
(HUIZINGA et al., 1996; CALABRESE; FLEISCHER Jr., 2000), doença de Crohn
(ERIKSSON et al., 2001; BAUDITZ et al., 2002), câncer (CWILICH et al., 2001;
GOVINDARAJAN, 2000; TEO, 2005; DU et al., 2005; VILLALONA-CALERO et al.,
2007), síndrome de imunodeficiência adquirida (AIDS) (KLAUSNER et al., 1996;
CALABRESE; FLEISCHER Jr., 2000; ERIKSSON et al., 2001), tuberculose
(KLAUSNER et al., 1996; TAVARES et al., 1997), síndrome de Behçet (SHEK; LIM,
2002; CALABRESE; FLEISCHER Jr., 2000; ERIKSSON et al., 2001), lúpus
eritematoso discóide (CALABRESE; FLEISCHER Jr., 2000, ERIKSSON et al., 2001),
mieloma múltiplo (RAJKUMAR et al., 2000; CALABRESE; FLEISCHER Jr., 2000;
ERIKSSON et al., 2001; MATTHEWS; McCOY, 2003). O uso da TLD como agente
imunossupressor tem sido descrito na doença do enxerto-versus-hospedeiro, após o
transplante de medula (VOGELSANG et al., 1989).
No Brasil, existe uma legislação referente ao uso de TLD, que só pode ser
utilizada nas seguintes doenças em programas oficiais: hanseníase (na reação
hansênica tipo eritema nodoso), AIDS (nas úlceras aftóides idiopáticas), lúpus
eritematoso e doença enxerto-versus-hospedeiro. No momento da prescrição, o
paciente deverá receber um termo de esclarecimento e deverá preencher um termo
de responsabilidade (BRASIL, 1998).
Nos últimos anos, há um interesse no desenvolvimento de análogos da
TLD, visando à obtenção de suas características farmacológicas sem o seu efeito
teratogênico. Vários análogos da TLD foram sintetizados como lenalidomide,
revlimid, CC-5013, CC-4047 e ACTIMID, que possuem potente atividade
antiinflamatória e anticâncer (TEO, 2005).
Os mecanismos moleculares do efeito da TLD não são totalmente
esclarecidos, apesar de seus efeitos antiinflamatórios e imunomoduladores serem
bem demonstrados in vitro e in vivo (CALABRESE; FLEISCHER Jr., 2000;
ERIKSSON et al., 2001). É bem documentado pela literatura que a TLD reduz o TNF-
α (SAMPAIO et al., 1991; MOREIRA et al., 1993; MOREIRA et al., 1997; TAVARES
et al., 1997; KIM et al., 2004). In vitro, a TLD inibiu a síntese de TNF-α
em cultura de
monócitos humanos estimulados com LPS e produtos de M. leprae (SAMPAIO et al.,
1991, MOREIRA et al., 1993) e em cultura de macrófagos obtida do lavado bronco-
alveolar de pacientes com tuberculose (TAVARES et al., 1997). In vivo, após
43
administração de TLD observou-se menor síntese de TNF-α após o desafio com LPS
para induzir choque séptico (MOREIRA et al., 1997).
O bloqueio na produção de TNF-α parece não ser completo (MOREIRA et
al., 1993). In vitro, a TLD reduz a síntese de TNF-α através do aumento da
degradação do mRNA (MOREIRA et al., 1993; KIM et al., 2004), reduzindo a meia-
vida da molécula de 30 para 17 minutos (MOREIRA et al., 1993).
Em vários estudos, a inibição induzida por TLD mostrou ser específica
para TNF-α (SAMPAIO et al.,1991; MOREIRA et al., 1993; TAVARES et al., 1997;
KIM et al., 2004). A literatura relata que a TLD não afetou os níveis de IL-1β
(SAMPAIO et al.,1991; MOREIRA et al., 1993; MOREIRA et al., 1997; BAUDITZ et
al., 2002; KIM et al., 2004), IL-6 (SAMPAIO et al.,1991; MOREIRA et al., 1993;
BAUDITZ et al., 2002), IL-8 (KIM et al., 2004), fator estimulante das colônias de
granulócitos e macrófagos (GM-CSF) (SAMPAIO et al., 1991), IFN-γ (MOREIRA et
al., 1997). Entretanto, outros autores demonstraram que a TLD também suprime a
produção de IL-12 em PBMCs (MOLLER et al., 1997) e em indivíduos com doença
de Crohn (BAUDITZ et al., 2002). Corral e Kaplan (1999) descrevem que a droga tem
um duplo efeito nos níveis de IL-12, reduzindo esta citocina quando PBMC são
estimulados por LPS, embora aumente quando estas células são ativadas via
receptor de células T (upregulation na expressão de células T tipo CD40). In vivo, a
TLD inibiu os níveis séricos TNF-α em 93% e IL-6 em 50%, bem como estimulou a
produção de IL-10 (MOREIRA et al., 1997).
A TLD também tem efeito em outros componentes da função celular
(MATTHEWS; McCOY, 2003). A pré-incubação de PMN com TLD inibiu a
quimiotaxia (FAURE et al., 1980; DUNZENDORFER et al., 1997). Outro mecanismo
antiinflamatório apontado por Fujita et al. (2001), é que a TLD e seus análogos
inibem a indução de COX-2 mediada por LPS, reduzindo a produção de PGE
2
.
Parece também que ela tem um papel na regulação dos linfócitos auxiliares,
conhecidos como T-helper (Th). In vitro, em cultura de PBMCs, a TLD induziu
aumento na produção de linfócitos Th2 e de IL-4 e IL-5; e inibiu a produção de
linfócitos Th1 e IFN-γ (McHUGH et al., 1995). Entretanto, Verbon et al. (2000)
demonstraram que em indivíduos saudáveis, a administração de uma dose (v.o.) de
TLD aumentou IFN-γ e reduziu IL-5, sem afetar os níveis de IL-2 e IL-4 em PBMCs.
In vitro e in vivo, dados sugerem que a TLD pode aumentar o número e a função de
células natural Killer (NK), melhorando a imunidade celular (DAVIES et al., 2001).
44
O potencial antineoplásico da TLD provavelmente se deve ao seu efeito
antiangiogênico e imunomodulador, bem como a sua ação indutora de apoptose
(CWILICH et al., 2001; TEO, 2005). A atividade antiangiogênica ocorre por bloqueio
do fator de crescimento fibroblástico básico (bFGF) e do fator de crescimento do
endotélio vascular (VEFG) (TEO, 2005; MATTHEWS; McCOY, 2003). A TLD ainda
inibe o crescimento tumoral por degradação da COX-2 (DU et al., 2005) e por
estimular a proliferação de linfócitos T, aumentando a atividade citotóxica anticâncer
(TEO, 2005).
Alguns estudos têm sugerido que o efeito antiinflamatório e
antiangiogênico da TLD pode ser mediado pelo bloqueio na ativação de NF-кB,
através da inativação do inibidor kappa B (IкB) kinase (KEIFER et al., 2001;
MAJUMDAR et al., 2002). Recentemente, mostrou-se que a administração de TLD
pode melhorar potencial terapêutico do CPT-11, pela sua capacidade de inibir o
NF-кB, responsável em induzir mecanismos de resistência a este agente antitumoral
(VILLALONA-CALERO et al., 2007).
1.4.3 Celecoxibe (CLX)
Desde 1899, quando o químico alemão Felix Hoffman motivou a Bayer a
produzir o ácido acetilsalicílico, patenteado como aspirina, as drogas
antiinflamatórias não-esteróides (DAINEs) passaram a ser os agentes mais
largamente utilizados em todo mundo, apesar do seu mecanismo de ação somente
ter sido esclarecido em 1971, por John Vane (VANE et al., 1990). Vane propôs que
estes agentes suprimem o processo inflamatório pela inibição da COX, impedindo
assim a síntese das PGs (VANE, 1971).
Com a descoberta da COX-2, uma nova perspectiva terapêutica apareceu
com o desenvolvimento de drogas mais seletivas e com menores efeitos adversos,
os inibidores seletivos da COX-2 (VANE; BOTTING, 2003). Os inibidores não
seletivos de COX-2 inibem não somente a resposta inflamatória, mas também a
produção fisiológica de PGs que protege a mucosa do trato gastrintestinal da
destruição do ácido clorídrico e mantém o funcionamento normal dos rins e o
processo de agregação plaquetária quando requerido (VANE et al., 1998; VANE;
BOTTING, 2003). Mais recentemente, novas motivações para o uso clínico foram
45
encontradas com a descrição de uma terceira variante da ciclooxigenase, a COX-3
(WILLOUGHBY et al., 2000; CHANDRASEKHARAN et al., 2002).
A primeira geração dos inibidores específicos da COX-2 é representada
pelo nimesulide, etodalaco e meloxicam. A descoberta da especificidade destes
compostos foi constatada após a comercialização, pela observação clínica e
experimental da reduzida incidência dos efeitos colaterais gastrintestinais.
Posteriormente, a utilização das técnicas de cristalografia de raios X permitiu a
elucidação gradativa da estrutura das COXs. Então, a partir da modificação
molecular dos primeiros inibidores de COX-2, visando o aumento da seletividade
sobre COX-2, foram sintetizadas estruturas com grupamento carboxílico e com
presença de grupos sulfonamida ou sulfona, originando os inibidores seletivos de
segunda geração, como o celecoxibe (CLX) (HINZ; BRUNE, 2002).
Em modelos animais e em seres humanos, o CLX é absorvido
rapidamente e metabolizado através de uma via oxidativa (PAULSON et al., 2001). A
inibição da COX-2 ocorre através da formação de um complexo enzima-inibidor
fortemente ligado, que se dissocia lentamente. Estudos in vitro e in vivo demonstram
que o CLX possui baixa afinidade para COX-1, portanto, ele não interfere nos
processos fisiológicos normais da enzima no estômago, intestinos, plaquetas e rins,
reduzindo os efeitos colaterais (VANE et al., 1998; VANE; BOTTING, 2003).
O CLX foi aprovado em 1998 pela FDA como agente antiinflamatório e
analgésico (HINZ; BRUNE, 2002). Os inibidores seletivos de COX-2 também têm
sido testados no tratamento e prevenção de alguns tipos de câncer (VANE et
al.,1998; HINZ; BRUNE, 2002; GROSCH et al., 2006).
Estudos epidemiológicos e in vitro em modelos animais evidenciaram que
COX-2 tem participação em alguns processos neoplásicos, notadamente câncer de
cólon (VANE et al., 1998; HINZ; BRUNE, 2002; GROSCH et al., 2006). A
superexpressão de COX-2 aumenta a proliferação celular e inibe a apoptose
(GROSCH et al., 2006). Assim, os inibidores específicos da COX-2 podem oferecer
uma alternativa terapêutica profilática na redução de PGs nestes indivíduos (HINZ;
BRUNE, 2002; GROSCH et al., 2006).
Alguns achados sugerem que as PGs derivadas de COX-2 contribuem no
processo patológico da doença de Alzheimer. A proteína amilóide é capaz de ativar a
microglia, induzindo a elevação da expressão neuronal de COX-2, que potencializa o
46
processo oxidativo, induz a síntese de citocinas pró-inflamatórias, acelerando o
processo de neurodegeneração (VANE et al.,1998; HINZ; BRUNE, 2002).
Por outro lado, atualmente a literatura tem relatado o aumento de eventos
tromboembólicos com o uso prolongado dos inibidores de COX-2. O CLASS
(Celecoxib Long-term Arthritis Safety Study), um estudo retrospectivo, verificou que o
CLX apresenta potencial de aumentar o risco dos eventos cardiovasculares, pelo fato
de os inibidores de COX-2 permitirem o aumento de COX-1 (MUKHERJEE et al.,
2001).
1.5 Justificativa e objetivos
A literatura mostra que a mucosite intestinal associada à diarréia é um
grave efeito tóxico do CPT-11 (IKUNO et al., 1995; SALIBA et al., 1998; ZIDAN et al.,
2003; GIBSON et al., 2003; SALTZ et al., 2003; ALIMONTI et al., 2004; BOWEN et
al., 2006), que pode levar à desidratação, à má-absorção dos nutrientes e
conseqüentemente à deterioração do estado geral do paciente (DUNCAN; GRANT,
2003; SONIS, 2004; RUBEINSTEIN et al., 2004; GIBSON; KEEFE, 2006). Além
disso, a mucosite juntamente com a neutropenia, outro efeito colateral do CPT-11, é
um fator de risco para septicemia e translocação bacteriana, podendo este quadro
provocar complicações como obstrução intestinal, perfuração e formação de fístulas
(SONIS, 2004; AVRITSCHER et al., 2004). Na presença de diarréia grave pode-se
necessitar reduzir a dose do fármaco ou até mesmo suspender a sua administração,
interferindo na eficácia do tratamento do câncer (ABIGERGES et al., 1994; IKEGAMI
et al., 2002; DUNCAN; GRANT, 2003; ALIMONTI et al., 2004).
Apesar do impacto das manifestações clínicas, os mecanismos
fisiopatológicos e moleculares responsáveis pelo curso da mucosite intestinal ainda
não são bem estabelecidos (DUNCAN; GRANT, 2003; SONIS et al., 2004a;
RUBEINSTEIN et al., 2004; GIBSON; KEEFE, 2006). Do mesmo modo, ainda não se
tem um protocolo padrão para a prevenção e controle da diarréia (GIBSON et al.,
2002a e 2002b; ALIMONTI et al., 2004; GIBSON; KEEFE, 2006).
Sabe-se que a mucosite intestinal induzida por agentes quimioterápicos
provoca danos nas células epiteliais e conseqüente resposta inflamatória local
47
(DUNCAN; GRANT, 2003; SONIS et al., 2004a, SONIS, 2004). No entanto, são
escassos os dados sobre a participação de mediadores inflamatórios nesta condição.
Desta forma, o estudo dos mecanismos e mediadores envolvidos na mucosite
intestinal induzida pelo CPT-11 torna-se relevante. Além disso, o esclarecimento
destes mecanismos aponta para a possibilidade de uso de moduladores específicos
da resposta imunológica e da inflamação para o tratamento e controle da mucosite
intestinal induzida por esta droga, melhorando a qualidade de vida e reduzindo a
incidência de co-morbidades. Isto permitirá maior liberdade de tratamento,
propiciando maior efetividade no uso deste agente farmacológico.
Assim, o objetivo geral do presente estudo foi estudar os mediadores
inflamatórios responsáveis pelos eventos que acompanham a mucosite intestinal
induzida pelo CPT-11 em camundongos Swiss. Para tanto, foram estabelecidos os
seguintes objetivos específicos:
– Desenvolver o modelo de mucosite intestinal induzido por CPT-11 em
camundongos, reproduzindo as alterações morfo-funcionais e histológicas clássicas.
– Avaliar o papel de citocinas (TNF-α, IL-1β e KC) na fisiopatologia dos
eventos inflamatórios da mucosite intestinal induzida por CPT-11.
– Avaliar a possível participação do óxido nítrico (NO) e das
prostaglandinas (PGs) na lesão intestinal provocada pelo CPT-11, através do estudo
imunohistoquímico para detecção da expressão das enzimas óxido nítrico sintase
induzida (iNOS) e ciclooxigenase-2 (COX-2).
– Estudar o efeito de inibidores farmacológicos da síntese e liberação de
citocinas como pentoxifilina (PTX) e talidomida (TLD) na lesão intestinal induzida pelo
CPT-11.
– Verificar o efeito de um inibidor seletivo da COX-2, celecoxibe (CLX), na
lesão intestinal provocada pelo CPT-11.
48
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Animais de experimentação
Foram utilizados camundongos Swiss, do sexo masculino, com massa
corpórea variando entre 25 a 30 g, provenientes do Biotério Setorial do
Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da
Universidade Federal do Ceará (UFC). Estes animais acomodaram-se dois dias
antes do experimento em gaiolas e permaneceram nas mesmas condições nos dias
da pesquisa.
Todos foram mantidos em ciclos de alternância claro/escuro de 12 horas
em estante ventilada. A dieta oferecida foi ração balanceada utilizada rotineiramente
no biotério, e água à vontade. Os experimentos realizados seguiram o Manual sobre
Cuidados e Usos de Animais de Laboratório, estipulados pelo Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA), que segue as normas da National Research
Council (U.S.A., 1996). O projeto foi previamente aprovado pela Comissão de Ética
em Pesquisa Animal (CEPA) da UFC (protocolo 02/04 – ANEXO 1).
2.2 Drogas, soluções, corantes e anticorpos
– Cloridrato de irinotecano – CPT-11 (Camptosar ®: ampolas 5 mL – 100
mg/mL, Pharmacia & Upjohn Co, Kalamazoo, EUA)
– Pentoxifilina (Trental ®: ampolas de 5 mL – 20 mg/mL, Hoechst, São
Paulo, Brasil)
– Talidomida (comprimidos de 100 mg, CEME, Brasil)
– Celecoxibe (Celebra ®: cápsulas de 100 mg, Searle, São Paulo, Brasil)
– Solução salina: cloreto de NaCl a 0,9% (15M): frasco de 500 mL
(Tayuyna)
– Dimetil sulfóxido (DMSO ®: Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)
49
– Álcool etílico 70% (Reagen)
– Cloral hidratado 10%: (Reagen)
– Formaldeído 40% (Reagen)
– Tampão fosfato de potássio: solução A – 988mL + solução B – 12mL
Solução A:
KH
2
PO
4
(Synth).............................................. 6,8 g
Água destilada 1 L
Solução B:
K
2
HPO
4
(Synth).............................................. 8,7 g
Água destilada ............................................... 1 L
– Tampão de brometo de hexadeciltrimetilamônio (HTAB)
HTAB (Sigma)................................................. 5 g
Tampão fosfato de potássio .......................... 1 L
– Peróxido de hidrogênio (0,1%)
Peróxido de hidrogênio 30% (Vetec) ............. 1 mL
Água destilada ............................................... 29 mL
– Solução de o-dianisidina
O-dianisidina (Sigma) .................................... 16,7 mL
Tampão fosfato de potássio .......................... 10 mL
H
2
O
2 ...............................................................................................
50 µL
Água destilada ............................................... 90 mL
– Líquido de Turk
Ácido acético glacial P. A. (Merck) ................ 20 mL
Violeta de genciana ....................................... 2 mL
Água destilada ............................................... 1 L
– Hematoxilina (Reagen)
– Eosina (Merck)
– Hematoxilina de Mayer (Reagen)
– Vectastatin - kit ABC (Vector)
– Anticorpo primário policlonal de carneiro anti-TNF-α, anti-IL-1β e anti-KC
(National Institute for Biological Standards and Control – NIBSC, UK)
– Anticorpo secundário biotinilado anti-IgG de carneiro (National Institute
for Biological Standards and Control – NIBSC, UK)
50
– Anticorpo primário policlonal de carneiro anti-TNF-α e anti-COX-2 (Santa
Cruz Biotechnology, CA, U.S.A.)
– Anticorpo primário policlonal de coelho anti-1β e anti-iNOS (Santa Cruz
Biotechnology, CA, U.S.A.)
– Anticorpo secundário biotinilado anti-IgG de carneiro (Santa Cruz
Biotechnology, CA, U.S.A.)
– Anticorpo secundário biotinilado anti-IgG de coelho (Santa Cruz
Biotechnology, CA, U.S.A.)
2.3 Modelo de indução da mucosite intestinal
Utilizou-se o modelo de mucosite intestinal experimental baseado no
descrito por Ikuno et al. (1995) adaptado pelo Laboratório de Farmacologia da
Inflamação e do Câncer (LAFICA), do Departamento de Fisiologia e Farmacologia,
da Faculdade de Medicina da UFC.
Inicialmente, realizou-se um estudo piloto com o objetivo de se escolher a
dose que induz injúrias consistentes nas mucosas intestinais com o mínimo de
letalidade. Os animais foram tratados com CPT-11 nas doses de 50, 75 e 100 mg/kg
ou solução salina 0,9% (0,5 mL), administrados por via intraperitoneal (i.p) durante
quatro dias consecutivos.
Verificou-se que a administração do CPT-11 (75 mg/kg) durante quatro
dias consecutivos induziu a mucosite e diarréia com menor índice de mortalidade,
comparado com a dose de 100 mg/kg. Diante destes achados, resolveu-se seguir
este protocolo experimental, utilizando-se, entretanto, CPT-11 em menor dose (75
mg/kg). Os animais foram sacrificados no quinto ou sétimo dias experimentais para o
estudo dos aspectos relacionados à mucosite intestinal e para se testar o efeito de
diferentes classes de drogas no desenvolvimento e nos eventos que acompanham a
mucosite intestinal induzida pelo CPT-11 em camundongos Swiss. A escolha destes
dias baseou-se no fato do aparecimento da diarréia ter início no sexto dia, sendo que
no sétimo dia observou-se maior pico da diarréia, maior perda de peso e maior
mortalidade, demonstrando a presença de um processo patológico severo. O
protocolo do modelo experimental utilizado pode se visto na Figura 2.
51
FIGURA 2 – Desenho esquemático do protocolo da mucosite intestinal experimental.
A mucosite intestinal foi induzida através da administração de CPT-11 (75 mg/kg) por quatro dias
consecutivos. Os animais foram sacrificados no quinto ou sétimo dia experimental, e segmentos do
duodeno, jejuno e íleo foram removidos e processados para análise histopatológica, morfométrica e
avaliação inflamatória (atividade de mieloperoxidase, dosagem de citocinas, avaliação da expressão de
citocinas e das enzimas óxido nítrico sintase induzida – iNOS e ciclooxigenase-2 - COX-2).
CPT-11 ou salina (i.p.)
CPT
(4 dias consecutivos)
Sacrifício
Dia 5 ou 7
C
t.
C
t.
C
t
C
t
Segmentos do
Duodeno, Jejuno e Íleo
•Análise histopatológica e morfométrica
•
A
valiação inflamatória
52
2.4 Grupos experimentais
Os animais foram submetidos aos protocolos de acordo com os grupos
experimentais discriminados a seguir, com o objetivo de avaliar o efeito de agentes
farmacológicos na mucosite intestinal induzida pelo CPT-11, a fim de determinar os
componentes inflamatórios responsáveis pela mesma.
Todos os tratamentos seguiram o esquema proposto por Trifan et al.
(2002). Os animais foram tratados durante sete dias consecutivos, com início um dia
antes da indução da mucosite intestinal pelo CPT-11. Considerou-se como primeiro
dia experimental o início da administração do CPT-11. O número de animais
utilizados em cada grupo foi no mínimo 8 (oito)
2.4.1 Grupo normal
Este grupo foi constituído por animais não submetidos à mucosite intestinal
e que receberam o veículo utilizado na diluição da droga em estudo, administrada
pela mesma via utilizada pelo grupo experimental.
2.4.2 Grupo controle
Este grupo foi constituído por animais submetidos à mucosite intestinal e
que receberam o veículo utilizado na diluição da droga em estudo, administrada pela
mesma via utilizada pelo grupo experimental.
2.4.3 Grupo tratado com PTX
Os animais submetidos à mucosite intestinal induzida por CPT-11 foram
divididos em 3 (três) grupos, os quais receberam PTX nas doses de 1,7, 5 e
15 mg/kg, administrada por via subcutânea (s.c). A PTX foi diluída em solução salina
0,9%.
53
2.4.4 Grupo tratado com TLD
Os animais submetidos à mucosite intestinal induzida por CPT-11 foram
divididos em 3 (três) grupos, os quais receberam TLD nas doses de 15, 30 e 60
mg/kg, administrada por via subcutânea (s.c). A TLD foi diluída em solução a 2% de
dimetil sulfóxido (DMSO) em salina 0,9%.
2.4.5 Grupo tratado com CLX
Os animais submetidos à mucosite intestinal induzida por CPT-11 foram
divididos em 3 (três) grupos, os quais receberam celecoxibe nas doses 3, 10 e 30
mg/kg, administrado por gavagem (v.o.). O CLX foi diluído em água destilada.
2.5 Parâmetros avaliados
2.5.1 Avaliação da diarréia
A severidade da diarréia foi monitorada duas vezes ao dia, durante todo o
período experimental (sete dias), utilizando-se os escores descritos por Kurita et al.
(2000), onde se tem: 0 – normal, ausência de diarréia; 1 – diarréia leve, fezes
levemente umedecidas; 2 – diarréia moderada, fezes sem formas com presença de
quantidade moderada de sujidades na região perianal; e 3 – diarréia grave, fezes
aquosas com grande quantidade de sujidades na região perianal.
A diarréia que apareceu até uma hora após a administração do CPT-11 foi
considerada diarréia precoce; e a que foi observada depois de 6-24 horas após a
administração foi considerada tardia (KASE et al., 1997; ARIMORI et al., 2001).
2.5.2 Análise ponderal
Os animais tiveram a massa corporal avaliada diariamente durante todo o
período experimental, em balança tipo Filizola, com capacidade de 6000g e
sensibilidade de 1g. Este parâmetro era avaliado imediatamente antes da
54
administração do agente quimioterápico, e, após o término da administração do
CPT-11, diariamente, sempre pela manhã até o sétimo dia. Os valores encontrados
foram expressos como variação de massa corpórea (g), obtida através das diferenças
das massas corpóreas determinadas diariamente e a inicial.
2.5.3 Leucograma
Os animais foram anestesiados com éter e, em seguida, colhidas amostras
de sangue periférico por punção na artéria ocular, imediatamente antes do sacrifício.
Utilizou-se 20 µL de sangue diluído em 380 µL do líquido de Turk para contagem do
número total de leucócitos em câmara de Neubauer, conforme metodologia descrita
por Moura et al. (1998). Os valores foram expressos em número total de leucócitos x
10
3
/mm
3
.
2.5.4 Avaliação da sobrevida
Diariamente registrou-se a mortalidade dos animais em cada grupo
experimental para se avaliar a taxa de sobrevida em cada tratamento.
2.5.5 Análise histopatológica e morfométrica
Após o sacrifício dos animais, foram removidos segmentos do duodeno,
jejuno e íleo. A seguir, tais espécimes foram fixados em formalina tamponada 10% e
processados para coloração pelo método hematoxilina-eosina (H&E).
A caracterização histopatológica foi realizada através de um microscópio
Nikon com um aumento de 100 e 400x. Neste estudo foram analisados os aspectos
dos vilos e criptas, bem como presença e intensidade do infiltrado inflamatório. O
grau de severidade da mucosite foi graduado de acordo com os seguintes escores
descritos por Woo et al. (2000): 0 – ausência de lesão; 1 – menos de 10% das criptas
contêm células necróticas; 2 – mais de 10% das criptas contêm células necróticas,
mas a arquitetura permanece intacta; 3 – mais de 10% das criptas contêm células
necróticas com perda da arquitetura das criptas (< 20%), os vilos encontram-se
encurtados e ocorre variável hipertrofia e hiperbasofilia nas criptas remanescentes;
55
4 – semelhante à 3, entretanto, é mais extensa a perda da arquitetura das criptas e o
encurtamento dos vilos.
Na análise morfométrica, utilizou-se microscópio Nikon com objetivas 10x
e lente ocular micrométrica Leitz Wetzlar 10x. As variáveis morfométricas avaliadas
incluíram altura dos vilos, considerada desde o topo até a base, correspondente à
junção cripta/vilo; e profundidade das criptas, definida como a invaginação entre os
vilos adjacentes (CARNEIRO FILHO et al., 2004). Estas medidas realizaram-se com
auxílio do programa de computador NIH image (U.S.A, 2005), considerando-se a
média aritmética destas medidas obtidas entre cinco a dez locais diferentes. Os
valores foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM) em micrômetros
(µm).
2.5.6 Atividade de mieloperoxidase (MPO)
No momento do sacrifício, uma porção do intestino foi processada para
mensuração da atividade de MPO, segundo método adaptado pelo descrito por
Bradley et al. (1982). Esta análise teve a finalidade de avaliar a reação inflamatória
da mucosite intestinal induzida por CPT-11, pois esta enzima é um marcador do
conteúdo de neutrófilos nos tecidos.
As amostras obtidas foram pesadas e mantidas à temperatura de -70
o
C
até a realização do ensaio. Durante a determinação, as amostras foram trituradas por
duas vezes em homogeneizador Politron Ultra-Turrax em solução tampão, sob
condições adequadas de refrigeração. A seguir, estas foram centrifugadas
(centrífuga 5804R) a temperatura de 4
o
C, durante dez minutos, com freqüência de
4.200 rpm. O sobrenadante, então, foi colhido para determinação da atividade de
MPO por ensaio colorimétrico, com uso de um leitor de ELISA, utilizando-se uma
placa com 96 poços e realizando-se duas leituras. Os valores encontrados foram
expressos em unidade de MPO/mg de tecido.
2.5.7 Dosagem de citocinas (TNF-α, IL-1β e KC) no duodeno
A produção de citocinas foi determinada através do conteúdo dessas
citocinas no tecido da mucosa intestinal. Após o sacrifício dos animais (5º e 7º dia
experimental), foram removidos segmentos do duodeno e estocados a -70
o
C para
56
posterior homogeneização e coleta do sobrenadante para dosagem de TNF-α, IL-1β
e KC, segundo descrito por Safieh-Garabedian et al. (1995). A detecção das
concentrações destas citocinas foi realizada por ensaio imunoenzimático (ELISA),
conforme protocolo de Cunha et al. (1993), o qual seguiu as etapas: (1) incubação
com 2 µg/mL de anticorpo anti-TNF, anti-IL-1β e anti-KC diluídos em tampão de
bicarbonato (pH 8.2) – 100 µL/poço (placa de 96 poços) por 16-24h a 4
o
C; (2)
lavagem da placa (3x) com PBS-tween 20, 0,1% v/v; (3) bloqueio com albumina
bovina 1% diluída em tampão de lavagem, 100 µL/poço por duas horas à
temperatura ambiente; (4) lavagem da placa (3x); (5) incubação com a curva padrão
de TNF-α, IL-1β e KC diluída em tampão de lavagem e das amostras a serem
dosadas (100 µL/poço por 16-24h a 4
o
C); (6) lavagem da placa (3x); (7) incubação
com anticorpo biotinilado diluído 1:1.000 em tampão de lavagem contendo 1% de
soro normal de carneiro por uma hora à temperatura ambiente; (8) lavagem da placa
(3x); (9) incubação com avidina-peroxidase (DAKO) diluída 1:5.000 em tampão de
lavagem, 100 µL/poço por 15 minutos à temperatura ambiente; (10) lavagem da
placa (3x); (11) incubação com o-fenilenediamina diidrocloreto (OPD) em tampão
substrato, 100 µL/poço, cobriu-se a placa e deixou-se no escuro por 5-20 minutos à
temperatura ambiente; (12) a reação foi paralisada com 150 µL/poço de H
2
SO
4
1M;
(13) leitura em espectrofotômetro a 490 nm. Os resultados foram expressos em
pg/mL como a curva padrão.
2.5.8 Avaliação da expressão de citocinas (TNF-α e IL-1β) e de enzimas (iNOS,
COX-2) por imunohistoquímica
Imunohistoquímica para TNF-α, IL-1β, iNOS e COX-2 foi realizada
utilizando-se o método de estreptavidina-biotina-peroxidase (HSU et al., 1981). No
sétimo dia, os animais foram sacrificados e tiveram o duodeno removido e fixado em
formol 10% por 24 horas para confecção de lâminas apropriadas para
imunohistoquímica. Os cortes foram desparafinizados, hidratados em xilol e álcool e
imersos em tampão citrato 0,1 M (pH 6,0), sob aquecimento em forno de microondas,
por 15 minutos para a recuperação antigênica. Após o resfriamento, obtido em
temperatura ambiente durante 20 minutos, foram feitas lavagens com solução
tamponada de fosfato (PBS), intercaladas com o bloqueio da peroxidase endógena
57
com solução de H
2
O
2
a 3% (15 minutos). Os cortes foram então incubados overnight
(4
o
C) com os anticorpos primários anti-TNF-α, anti-IL-1β, anti-iNOS e anti-COX-2,
diluídos em PBS com albumina sérica bovina 5% (PBS-BSA) na concentração 1:200,
1:400, 1:200 e 1:200, respectivamente. Após a lavagem no dia seguinte, foi feita a
incubação com o anticorpo secundário biotinilado anti-IgG, diluídos 1:200 ou 1:400
em PBS-BSA, por 30 minutos. Depois de lavado, os cortes foram incubados com o
complexo estrepto-avidina peroxidase conjugada (complexo ABC Vectastain ®) por
30 minutos. Após nova lavagem com PBS, seguiu-se coloração com o cromógeno
3,3`diaminobenzidine-peróxido (DAB), seguida por contracoloração com hematoxilina
de Mayer. Por fim, realizou-se a desidratação das amostras e montagem das
lâminas. Controles negativos foram processados simultaneamente como descrito
acima, sendo que o anticorpo primário foi substituído por PBS-BSA 5%.
O grau de expressão foi avaliado por escores descritos por Yeoh et al.
(2005), onde se tem: 0 – sem marcação; 1 – leve marcação; 2 – moderada
marcação; 3 – moderada a intensa marcação e 4 – intensa marcação.
2.6 Análise estatística
A análise estatística foi realizada com auxílio do software GraphPad
Prisma, version 4.01 (2004). Nos escores de avaliação da diarréia e análise do grau
de mucosite, os dados obtidos foram expressos como mediana (md) acompanhada
pelos respectivos valores extremos do rol de dados e comparados através do teste
de Kruskal-Wallis com comparação de Dunn. As taxas de sobrevida foram calculadas
pelo teste de Kaplan-Meier e os dados analisados pelo teste de Logrank. Nos demais
parâmetros, os resultados foram expressos como média acompanhada pelo erro
padrão da média (média ± EPM) e para comparação utilizou-se a análise de
variância (ANOVA) e teste de Bonferroni. Em todos os parâmetros, considerou-se
estatisticamente significante p < 0,05.
58
3 RESULTADOS
3.1 Modelo da mucosite intestinal induzida pelo CPT-11
Para se estabelecer o modelo de mucosite intestinal induzida pelo
cloridrato de irinotecano (CPT-11) em camundongos Swiss, inicialmente se testou as
doses de 50, 75 e 100 mg/kg de peso, administradas pela via intraperitoneal (i.p.)
durante quatro dias consecutivos. A escolha de tais doses baseiou-se no modelo
descrito por Ikuno et al. (1995), que administraram 100 mg/kg (i.p.) durante quatro
dias consecutivos.
3.1.1 Avaliação da diarréia induzida pelo CPT-11
A Tabela 1 mostra que o CPT-11 administrado por quatro dias
consecutivos, nas doses de 75 e 100 mg/kg, induziu diarréia tardia quando
comparado aos animais que receberam solução salina.
A diarréia precoce referida pela literatura (Jansman et al., 2001;
Rubenstein et al., 2004) foi observada nos grupos administrados com CPT-11 nas
doses de 50, 75 e 100 mg/kg, porém a sua incidência na maioria dos animais foi de
grau leve (escore 1) e não apresentou significado estatístico (p > 0,05). No primeiro
dia, após uma hora da administração da droga, as doses de 75 e 100 mg/kg
induziram diarréia leve em 25% e 37,5% dos animais. No segundo e terceiro dias, a
dose de 75 mg/kg provocou diarréia leve em 35,5% e a de 100 mg/kg em 43,75%,
sendo que no terceiro dia no grupo em que se administrou a maior dose, um animal
(6,25%) apresentou diarréia de grau moderado (escore 2). No quarto dia, a incidência
da diarréia precoce foi maior, 50% para o grupo que recebeu 75 mg/kg e 56,25%
para os animais administrados com CPT-11 em 100 mg/kg, destes apenas um animal
(6,25%) dos que receberam maior dose apresentou diarréia grave (escore 3). O
grupo administrado com CPT-11 (50 mg/kg) apresentou menor incidência de diarréia
precoce, diarréia leve foi observada no segundo e quarto dias em 12,5% e em 25%
dos animais, respectivamente.
59
Entretanto, a diarréia tardia (escore 3; 0-3) teve ocorrência significante
(p < 0,05) nas doses de 75 e 100 mg/kg, com início no sexto e quinto dias
experimentais, respectivamente. No sétimo dia experimental, diarréia grave (escore
3) encontrava-se presente em 83,33% dos animais que receberam a dose de 75
mg/kg, e em 87,35% nos que foram administrados 100 mg/kg.
3.1.2 Efeito do CPT-11 na variação da massa corpórea
A Figura 3 demonstra que o tratamento durante quatro dias com CPT-11,
nas doses de 50, 75 e 100 mg/kg, provocou perda de peso significativa (p < 0,05) em
camundongos Swiss. A redução de peso teve início no quarto dia após o início da
administração da droga e foi dose-dependente, sendo maior no grupo tratado com
maior dose.
3.1.3 Efeito do CPT-11 no leucograma
Observa-se na Figura 4 que os animais tratados com CPT-11, nas doses
de 50, 75 e 100 mg/kg por quatro dias consecutivos, apresentaram leucopenia
(p < 0,05). Redução maior no número total de leucócitos foi observada nos grupos
que receberam maiores doses (75 e 100 mg/kg).
3.1.4 Efeito do CPT-11 na sobrevida dos animais
Analisando-se a Figura 5, verifica-se que o CPT-11 provocou aumento
significativo (p < 0,05) de mortalidade de forma dose-dependente. No sétimo dia
experimental, a dose de 100 mg/kg induziu morte em 50% dos animais, enquanto os
grupos que receberam a quantidade de 75 e 50 mg/kg a mortalidade foi de 25%
(sobrevida de 75%) e 12,5% (sobrevida de 87,5%), respectivamente.
60
TABELA 1 – Efeito de diferentes doses do cloridrato de irinotecano (CPT-11) na
indução de diarréia em camundongos Swiss.
CPT-11
_____________________________________________
_
Dia
Salina
50 mg/kg
75 mg/kg
100 mg/kg
1
o
0 (0-0)
0 (0-0)
0 (0-1)
0 (0-1)
2
o
0 (0-0) 0 (0-1) 0 (0-1) 0 (0-1)
3
o
0 (0-0) 0 (0-0) 0 (0-1) 0 (0-2)
4
o
0 (0-0) 0 (0-1) 0,5 (0-1) 1 (0-3)
5
o
0 (0-0) 0 (0-0) 0 (0-3) 3 (0-3)*
6
o
0 (0-0) 0 (0-2) 3 (0-3)* 3 (0-3)*
7
o
0 (0-0) 0 (0-3) 3 (0-3)* 3 (0-3)*
Os animais receberam CPT-11 (50, 75 e 100 mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro dias
consecutivos (i.p.). A diarréia foi avaliada por escores propostos por Kurita et al. (2000), onde se tem: 0
– normal, ausência de diarréia; 1 – diarréia leve, fezes levemente umedecidas; 2 – diarréia moderada,
fezes sem formas com presença de quantidade moderada de sujidades na região perianal; e 3 –
diarréia grave, fezes aquosas com grande quantidade de sujidades na região perianal. Os valores
representam mediana e variação, e foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis com comparação de
Dunn. * Diferença estatística comparado aos animais tratados com salina (p < 0,05). O número de
animais utilizados em cada grupo foi no mínimo oito.
61
1 2 3 4 5 6 7
-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
Salina
CPT-11 (50 mg/kg)
CPT-11 (75 mg/kg)
CPT-11 (100 mg/kg
)
*
*
*
*
Tempo
(
dias
)
Variação de massa corpórea (g)
FIGURA 3 – Efeito de diferentes doses do cloridrato de irinotecano (CPT-11) na
variação da massa corpórea de camundongos Swiss.
Os animais receberam CPT-11 (50, 75, 100 mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro dias
consecutivos (i.p.). As massas corpóreas foram avaliadas diariamente até o sétimo dia experimental.
Os pontos representam média ± EPM da variação de massa corpórea (g), calculada através das
diferenças das massas corpóreas obtidas diariamente e a inicial. Os dados foram analisados pelo teste
de Bonferroni (ANOVA). * Diferença estatística comparado aos animais tratados com CPT-11
(p < 0,05). O número de animais utilizados em cada grupo foi no mínimo oito.
62
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
CPT-11
(
m
g
/k
g)
Salina 50 75 100
_
______________________
_
*
*
*
Total de leucócitos
x10
3
/mm
3
FIGURA 4 – Efeito de diferentes doses do cloridrato de irinotecano (CPT-11) no
leucograma de camundongos Swiss.
Os animais receberam CPT-11 (50, 75 e 100 mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro dias
consecutivos (i.p.). O sangue foi colhido por punção na artéria ocular imediatamente antes do sacrifício
e a contagem do número total de leucócitos foi realizada em câmara de Neubauer, conforme descrito
por Moura et al. (1998). Os valores representam média ± EPM do número total de leucócitos x 10
3
/mm
3
e foram analisados pelo teste de Bonferroni (ANOVA). * Diferença estatística comparado aos animais
tratados com salina (p < 0,05). O número de animais utilizados em cada grupo foi no mínimo seis.
63
0 1 2 3 4 5 6 7
40
50
60
70
80
90
100
Salina
CPT-11 (50 mg/kg)
CPT-11 (75 mg/kg)
CPT-11 (100 mg/kg
)
*
*
*
Tempo
(
dias
)
% de sobrevida
FIGURA 5 – Efeito de diferentes doses do cloridrato de irinotecano (CPT-11) na
curva de sobrevida de camundongos Swiss.
Os animais receberam CPT-11 (50, 75, 100 mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro dias
consecutivos (i.p.). As taxas de sobrevida foram calculadas pela curva de Kaplan-Meier e a diferença
entre os grupos pelo teste de logrank. * Diferença estatística comparado aos animais tratados com
salina (p < 0,05). O número de animais utilizados em cada grupo foi no mínimo dez.
64
3.1.5 Efeito do CPT-11 nas estruturas histológicas do intestino
A Figura 6 mostram as alterações histológicas observadas com o
tratamento com CPT-11 na dose de 75 mg/kg por quatro dias consecutivos. Os
animais que não receberam tratamento com CPT-11 apresentaram as estruturas
intestinais (duodeno, jejuno e íleo) com vilosidades e criptas íntegras, com epitélio
cilíndrico recobrindo os vilos intestinais e a estrutura intacta das criptas com células
de Paneth. Entretanto, nos animais submetidos ao tratamento durante quatro dias
com CPT-11 nas doses de 75 e 100 mg/kg, observou-se encurtamento acentuado
das vilosidades intestinais, necrose parcial de criptas, achatamento e vacuolização
de enterócitos, presença de infiltrado celular inflamatório na mucosa com predomínio
de células mononucleares e redução de células caliciformes. No íleo dos animais que
foram injetados com CPT-11 (75 e 100 mg/kg) verificou-se infiltração muito
acentuada de leucócitos mononucleares. Por outro lado, nos animais que receberam
50mg de CPT-11/kg também no período de quatro dias, as alterações estruturais do
intestino não foram significativas. Verificou-se vacuolização de enterócitos, sendo as
criptas preservadas no duodeno e jejuno. No íleo observou-se achatamento das
vilosidades e uma destruição parcial das criptas.
Quando se analisou as lesões intestinais de acordo com a classificação do
grau de mucosite intestinal pelos parâmetros descritos por Woo et al. (2000)
observou-se que os animais tratados durante quatro dias consecutivos com CPT-11,
nas doses de 75 e 100 mg/kg, apresentaram incidência significativa (p < 0,05) de
mucosite intestinal classificada como escore 4 nos três segmentos intestinais.
Portanto, o CPT-11 nestas doses induziu lesões extensas nos vilos e criptas no
duodeno, jejuno e íleo. Já o grupo que recebeu 50 mg/kg apresentou lesões
significativas apenas no íleo, escore 4 (2-4). Neste grupo, no duodeno e jejuno
observaram-se criptas com pequena redução de profundidade, mas com arquitetura
intacta classificados com escores 2 (1-3) e 1 (1-3), respectivamente (Tabela 2).
A Figura 7 mostra os dados morfométricos dos vilos e criptas do duodeno,
jejuno e íleo. Os resultados mostram que o CPT-11 nas doses administradas
provocou encurtamento significativo nos vilos nas três porções intestinais de forma
dose-dependente (p < 0,05). No duodeno, verificou-se redução no tamanho dos vilos
em torno de 33,10% no grupo que recebeu a dose de 50 mg/kg, 69,16% para o grupo
de 75 mg/kg e 76,43% para o que recebeu 100 mg/kg. No jejuno, a redução do
65
tamanho dos vilos foi de 40,71%, 57,62% e 65% para as doses de 50, 75 e 100
mg/kg. No íleo, a medida dos vilos reduziu em 30,27%, 51,22% e 49,26% para as
dose de 50, 75 e 100 mg/kg, respectivamente.
No duodeno e jejuno, a profundidade das criptas apresentou-se reduzida
(p < 0,05) nos grupos que receberam doses maiores em 22,08% e 24,60% no
duodeno e 31,70% e 30,78% para o jejuno, nas doses de 75 e 100 mg/kg,
respectivamente. Entretanto, no íleo todas as doses administradas induziram
diminuição significativa (p < 0,05) na profundidade das criptas, que foi de 22,65%,
26,07% e 26,74% para os animais que receberam 50, 75 e 100 mg/kg,
respectivamente.
66
FIGURA 6 – Fotomicrografias da mucosa duodenal de camundongos Swiss normais
e dos submetidos à mucosite intestinal pelo cloridrato de irinotecano (CPT-11).
Os animais receberam CPT-11 (75 mg/kg) ou salina 0,9% por quatro dias consecutivos (i.p.). Foram
sacrificados no sétimo dia experimental, e o duodeno foi removido e processado para a técnica de
coloração pelo método H&E (A e D – aumento de 100x; B, C, E, F – 400x). Mucosa intestinal de
animais normais, não submetidos à mucosite intestinal, mostrando vilos (A, B) e criptas (C)
preservados. Mucosa intestinal de animais que receberam CPT-11, mostrando encurtamento dos vilos
(D,E), achatamento e vacuolização de enterócitos (seta E), necrose de criptas (F) e infiltrado de
células mononucleares (cabeça de seta F).
67
TABELA 2 – Efeito de diferentes doses do cloridrato de irinotecano (CPT-11) na
indução de mucosite intestinal em camundongos Swiss.
CPT-11
_____________________________________________
_
Salina
50 mg/kg
75 mg/kg
100 mg/kg
Duodeno
0 (0-0)
2 (1-3)
4 (3-4)*
4 (4-4) *
Jejuno 0 (0-0) 1 (1-3) 4 (3-4)* 4 (4-4) *
Íleo 0 (0-0) 4 (2-4)* 4 (4-4)* 4 (4-4) *
Os animais receberam CPT-11 (50, 75 e 100 mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro dias
consecutivos (i.p.). Foram sacrificados no sétimo dia experimental, e segmentos do duodeno, jejuno e
íleo foram removidos e processados para a técnica de coloração pelo método H&E. A avaliação
histológica foi realizada por escores propostos por Woo et al. (2000), onde se tem: 0 – ausência de
lesão; 1 – menos de 10% das criptas contêm células necróticas; 2 – mais de 10% das criptas contêm
células necróticas, mas a arquitetura permanece intacta; 3 – mais de 10% das criptas contêm células
necróticas com perda da arquitetura das criptas (< 20%), os vilos encontram-se encurtados, variável
hipertrofia/hiperbasofilia nas criptas remanescentes; 4 – lesões mais extensas que em 3. Os valores
representam mediana e variação, e foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis com comparação de
Dunn. * Diferença estatística comparado aos animais tratados com salina (p < 0,05). O número de
animais utilizados em cada grupo foi no mínimo seis.
68
0
50
100
150
200
250
300
350
*
*
Salina 50 75 100
________________________
*
CPT-11
(
m
g
/k
g)
Duodeno: vilos (
µ
m)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
_______________________
Salina 50 75 100
*
*
CPT-11
(
m
g
/k
g)
Duodeno: criptas (
µ
m)
0
1
2
3
4
5
*
*
Salina 50 75 100
________________________
*
CPT-11
(
m
g
/k
g)
Duodeno: vilos/criptas
0
25
50
75
100
125
150
175
200
Salina 50 75 100
_______________________
_
*
*
*
CPT-11
(
m
g
/k
g)
Jejuno: vilos (
µ
m)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Salina 50 75 100
_______________________
_
*
*
CPT-11
(
m
g
/k
g)
Jejuno: criptas (
µ
m)
0
1
2
3
4
5
Salina 50 75 100
*
*
*
CPT-11
(
m
g
/k
g)
________________________
Jejuno: vilos/criptas
0
25
50
75
100
125
150
*
Salina 50 75
_______________________
_
100
*
*
CPT-11
(
m
g
/k
g)
Íleo: vilos (
µ
m)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Salina 50 75 100
*
________________________
*
*
CPT-11
(
m
g
/k
g)
Íleo: criptas (
µ
m)
0
1
2
3
4
5
Salina 50 75 100
*
*
________________________
CPT-11
(
m
g
/k
g)
Íleo: vilos/criptas
FIGURA 7 – Efeito de diferentes doses do cloridrato de irinotecano (CPT-11) na
morfometria intestinal de camundongos Swiss.
Os animais receberam CPT-11 (50, 75 e 100 mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro dias
consecutivos (i.p.). Foram sacrificados no sétimo dia experimental, e segmentos do duodeno, jejuno e
íleo foram removidos e processados para a técnica de coloração pelo método H&E. Os valores
representam média ± EPM e foram analisados pelo teste de Bonferroni (ANOVA). * Diferença
estatística comparado aos animais tratados com salina (p < 0,05). O número de animais utilizados em
cada grupo foi no mínimo seis.
69
3.1.6 Efeito do CPT-11 na atividade de MPO no duodeno
A Figura 8 mostra que o tratamento com CPT-11 nas doses estudadas
aumentou significativamente (p < 0,05) a atividade de MPO no intestino (duodeno),
no sétimo dia experimental. Este aumento enzimático expressivo demonstra que este
agente quimioterápico provocou infiltração de neutrófilos no intestino.
3.1.7 Efeito do CPT-11 nos níveis de citocinas (TNF-α, IL-1β e KC) no duodeno
Os resultados apresentados na Figura 9 mostram o efeito do tratamento
com CPT-11 (75 mg/kg) nos níveis de TNF-α, IL-1β e KC no duodeno de animais
sacrificados nos dias 5 e 7. O CPT-11 (75 mg/kg) aumentou significativamente
(p < 0,05) os níveis de TNF-α de animais sacrificados no quinto e sétimo dias
experimentais. Entretanto, as citocinas IL-1β e KC somente apresentaram aumento
significativo (p < 0,05) no sétimo dia experimental.
3.1.8 Efeito do CPT-11 na expressão de citocinas (TNF-α e IL-1β) e de enzimas
(iNOS e COX-2) na mucosa duodenal
Na Tabela 3 observam-se as graduações das marcações do TNF-α, IL-1β,
iNOS e COX-2 pelo estudo imunohistoquímico das mucosas do duodeno de
camundongos normais e dos submetidos à mucosite intestinal pelo tratamento com o
CPT-11.
Os animais normais apresentaram leve marcação de TNF-α, IL-1β ao nível
do epitélio dos vilos (escore 1; 1-1). No grupo de animais submetidos à mucosite
observa-se um aumento significativo (p < 0,05) da marcação de TNF-α e IL-1β no
epitélio de revestimento e nas células da lâmina própria (escore 4; 4-4 e 4; 3-4,
respectivamente). A marcação de IL-1β também foi observada nas células
endoteliais (Figura 10).
A mucosite intestinal induzida pelo CPT-11 provocou aumento significativo
(p < 0,05) na expressão de iNOS no segmento do duodeno (escore 4; 3-4). Pode-se
ver na Figura 11 que a marcação de iNOS encontra-se intensa no epitélio de
revestimento e especialmente nas células da lâmina própria, mostrando que houve
70
aumento na atividade desta enzima no curso da mucosite intestinal. Os animais
normais apresentam leve a moderada marcação no epitélio dos vilos (escore 1; 1-2).
Quanto à expressão da COX-2, pode-se verificar na Figura 12, que o
tratamento com CPT-11 aumentou significativamente (p < 0,05) a marcação da COX-
2 no epitélio de revestimento e nas criptas (escore 2,5; 2-3). Nos animais normais
observam-se leve marcação desta enzima (escore 1;1-1).
71
0
1
2
3
4
5
6
Salina 50 75 100
_______________________
*
*
*
CPT-11
(
m
g
/k
g)
U de MPO/mg de tecido
FIGURA 8 – Efeito de diferentes doses do cloridrato de irinotecano (CPT-11) na
atividade de mieloperoxidase (MPO) no duodeno de camundongos Swiss.
Os animais receberam CPT-11 (50, 75 e 100 mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro dias
consecutivos (i.p.). Foram sacrificados no sétimo dia experimental, e uma porção do duodeno foi
congelada no freezer a -70ºC. A atividade de MPO foi determinada por ensaio colorimétrico, segundo
método modificado pelo descrito por Bradley et al. (1982). Os valores representam média ± EPM da
unidade de MPO/mg de tecido e foram analisados pelo teste de Bonferroni (ANOVA). * Diferença
estatística comparado aos animais tratados com salina (p < 0,05). O número de animais utilizados em
cada grupo foi no mínimo seis.
72
0
25
50
75
100
125
150
*
*
Salina Dia 5 Dia 7
_
_____________________
_
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
TNF-
α
(pg/mL)
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Salina Dia 5 Dia 7
_
_____________________
_
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
*
IL-1
β
(pg/mL)
0
250
500
750
1000
1250
*
Salina Dia 5 Dia 7
_______________________
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
KC (pg/mL)
FIGURA 9 – Efeito do cloridrato de irinotecano (CPT-11) nos níveis de citocinas
(TNF-α, IL-1β e KC) no duodeno de camundongos Swiss.
Os animais receberam CPT-11 (75 mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro dias consecutivos (i.p.).
Foram sacrificados no quinto ou sétimo dia experimental, e uma porção do duodeno foi congelada no
freezer a -70ºC. O ensaio foi realizado por ELISA através do método descrito por Cunha et al. (1993).
Os valores representam média ± EPM da quantidade de citocinas (pg/mL) e foram analisados pelo
teste de Bonferroni (ANOVA). * Diferença estatística comparado aos animais tratados com salina
(p < 0,05). O número de animais utilizados em cada grupo foi no mínimo cinco.
73
TABELA 3 – Efeito do cloridrato de irinotecano (CPT-11) no grau de expressão de
citocinas (TNF-α e IL-1β) e de enzimas (iNOS e COX-2) na mucosa duodenal de
camundongos Swiss.
Controle negativo
Salina
CPT-11 (75 mg/kg)
TNF-α
0 (0-0)
1 (1-1)
4 (4-4) *
IL-1β
0 (0-0)
1 (1-1)
4 (3-4) *
iNOS
0 (0-0)
1 (1-2)
4 (3-4)*
COX-2
0 (0-0)
1 (1-1)
2,5 (2-3)*
Os animais receberam CPT-11 (75 mg/kg) ou salina 0,9% por quatro dias consecutivos (i.p.). Foram
sacrificados no sétimo dia experimental, e o duodeno foi removido para técnica de imunohistoquímica
para detecção de TNF-α, IL-1β, iNOS e COX-2. Controle negativo, duodeno de um animal submetido à
mucosite intestinal na ausência de anticorpo primário anti-TNF-α, anti-IL-1β, anti-iNOS e anti-COX-2. O
grau de expressão foi avaliado por escores descritos por Yeoh et al. (2005), onde se tem: 0 – sem
marcação; 1 – leve marcação; 2 – moderada marcação; 3 – moderada a intensa marcação e 4 –
intensa marcação. Os valores representam mediana e variação, e foram analisados pelo teste de
Kruskal-Wallis com comparação de Dunn. * Diferença estatística comparado aos animais tratados com
salina (p < 0,05). O número de animais utilizados em cada grupo foi no mínimo cinco, à exceção do
controle negativo (n=1).
74
FIGURA 10 – Fotomicrografias da marcação de citocinas (TNF-α e IL-1β) na mucosa
duodenal de camundongos Swiss normais e dos submetidos à mucosite intestinal
pelo cloridrato de irinotecano (CPT-11).
Os animais receberam CPT-11 (75 mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro dias consecutivos (i.p.).
Foram sacrificados no sétimo dia experimental, e o duodeno foi removido para técnica de
imunohistoquímica para detecção de TNF-α e IL-1β (aumento de 400x). Controle negativo, duodeno
de um animal submetido à mucosite intestinal na ausência de anticorpo primário anti-TNF-α (A) e anti-
IL-1β (B). Duodeno de um animal normal, mostrando leve marcação de TNF-α (C) e IL-1β (D) no
epitélio dos vilos. Duodeno de um animal submetido à mucosite intestinal, apresentando intensa
marcação de TNF-α (E) e IL-1β (F) no epitélio de revestimento (seta), células da lâmina própria
(cabeça de seta) e do endotélio (seta branca).
75
FIGURA 11 – Fotomicrografias da marcação da enzima óxido nítrico sintase induzida
(iNOS) na mucosa duodenal de camundongos Swiss normais e dos submetidos à
mucosite intestinal pelo cloridrato de irinotecano (CPT-11).
Os animais receberam CPT-11 (75 mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro dias consecutivos (i.p.).
Foram sacrificados no sétimo dia experimental, e o duodeno foi removido para técnica de
imunohistoquímica para detecção de iNOS (aumento de 400x). Controle negativo, duodeno de um
animal submetido à mucosite intestinal na ausência de anticorpo primário anti-iNOS (A). Duodeno de
um animal normal, mostrando leve a moderada marcação de iNOS no epitélio dos vilos (B). Duodeno
de um animal submetido à mucosite intestinal, apresentando intensa marcação de iNOS no epitélio de
revestimento (seta C) e nas células da lâmina própria (cabeça de seta D).
76
FIGURA 12 – Fotomicrografias da marcação da enzima ciclooxigenase-2 (COX-2) na
mucosa duodenal de camundongos Swiss normais e dos submetidos por mucosite
intestinal pelo cloridrato de irinotecano (CPT-11).
Os animais receberam CPT-11 (75 mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro dias consecutivos (i.p.).
Foram sacrificados no sétimo dia experimental, e o duodeno foi removido para técnica de
imunohistoquímica para detecção de COX-2 (aumento de 400x). Controle negativo, duodeno de um
animal submetido à mucosite intestinal na ausência de anticorpo primário anti-COX-2 (A). Duodeno de
um animal normal, mostrando leve marcação de COX-2, principalmente nas criptas (B). Duodeno de
um animal submetido à mucosite intestinal, apresentando moderada a intensa marcação de COX-2 no
epitélio de revestimento (seta C) e nas criptas (cabeça de seta C).
77
3.2 Efeito do tratamento com PTX na mucosite intestinal induzida pelo CPT-11
3.2.1 Efeito da PTX na severidade da diarréia induzida pelo CPT-11
A Tabela 4 mostra o efeito da PTX, nas doses de 1,7, 5 e 15 mg/kg, na
severidade da diarréia induzida pelo CPT-11. A droga foi administrada durante sete
dias consecutivos, iniciando-se o tratamento um dia antes da indução da mucosite
intestinal com o CPT-11. Os resultados demonstram que a PTX nas menores doses
(1,7 e 5 mg/kg) reduziu significativamente a gravidade da diarréia induzida por
CPT-11 no sétimo dia experimental (p < 0,05). No sexto dia, apesar de não ser
verificado diferença estatística, observa-se uma tendência para melhora do quadro
diarréico.
3.2.2 Efeito da PTX na variação da massa corpórea de animais com mucosite
intestinal induzida pelo CPT-11
Os dados apresentados na Figura 13 demonstram que a PTX em nenhuma
dose reverteu a perda de massa corpórea nos animais com mucosite intestinal
induzida pela administração de CPT-11 (p > 0,05), quando administrada no modelo
proposto, ou seja, por sete dias, sendo iniciada a primeira dose um dia antes do
CPT-11.
3.2.3 Efeito da PTX no leucograma de animais com mucosite intestinal induzida pelo
CPT-11
A Figura 14 mostra que o tratamento durante sete dias com a PTX, nas
doses de 1,7, 5 e 15 mg/kg, não alterou (p > 0,05) as contagens do número de
leucócitos totais no sangue periférico dos animais submetidos à mucosite intestinal
induzida pela administração de quatro dias consecutivos de CPT-11.
78
3.2.4 Efeito da PTX na sobrevida de animais com mucosite intestinal induzida pelo
CPT-11
A Figura 15 mostra que a PTX, nas doses de 1,7, 5 e 15 mg/kg, não
alterou significativamente (p > 0,05) a sobrevida dos animais com mucosite intestinal
provocada pelo CPT-11. Sobrevida de 90% foi observada no grupo que recebeu 5
mg/kg, seguida pelo grupo tratado com PTX 1,7mg/kg, que teve sobrevida de 87,5%.
Por outro lado, o grupo em que a PTX foi administrada em maior dose (15mg/kg)
apresentou sobrevida de 80%, enquanto o grupo não tratado com a PTX teve
sobrevida de 75%.
79
TABELA 4 – Efeito de diferentes doses da pentoxifilina (PTX) na severidade da
diarréia induzida pelo cloridrato de irinotecano (CPT-11) em camundongos Swiss.
CPT-11 (75 mg/kg)
____________________________________________________
PTX (mg/kg)
_________________________________
_
____
_
Dia Normal Salina 1,7 5 15
1
o
0 (0-0)
0 (0-1)
0 (0-1)
0 (0-0)
0 (0-1)
2
o
0 (0-0) 0 (0-1) 0 (0-1) 0 (0-1) 0 (0-0)
3
o
0 (0-0) 0 (0-1) 0 (0-1) 0 (0-1) 0 (0-1)
4
o
0 (0-0) 0 (0-2) 0 (0-1) 0 (0-2) 0 (0-2)
5
o
0 (0-0) 0 (0-3) 0 (0-3) 0 (0-3) 0 (0-3)
6
o
0 (0-0) 3 (0-3)# 1 (0-3) 1 (0-2) 2 (0-3)
7
o
0 (0-0) 3 (0-3)# 0 (0-3)* 0 (0-3)* 2 (0-3)
A mucosite intestinal foi induzida através da administração do CPT-11 (75 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos. Os animais receberam PTX (1,7, 5, 15 mg/kg) ou solução salina 0,9% por via
subcutânea (s.c.) durante sete dias, iniciando um dia antes do tratamento com CPT-11. A diarréia foi
avaliada por escores propostos por Kurita et al. (2000), onde se tem: 0 – normal, ausência de diarréia;
1 – diarréia leve, fezes levemente umedecidas; 2 – diarréia moderada, fezes sem formas com
presença de quantidade moderada de sujidades na região perianal; e 3 – diarréia grave, fezes aquosas
com grande quantidade de sujidades na região perianal. Os valores representam mediana e variação,
e foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis com comparação de Dunn. # Diferença estatística
comparado aos animais normais (p < 0,05). * Diferença estatística comparado ao grupo com mucosite
intestinal e tratado com salina (p < 0,05). O número de animais utilizados em cada grupo foi no mínimo
oito.
80
1 2 3 4 5 6 7
-8
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
Normal
Salina
PTX 1,7 mg/k
g
PTX 5 mg/kg
PTX 15 mg/kg
#
#
#
#
Tempo
(
dias
)
Variação de massa corpórea (g)
FIGURA 13 – Efeito de diferentes doses da pentoxifilina (PTX) na variação da massa
corpórea em camundongos Swiss com mucosite intestinal induzida pelo cloridrato de
irinotecano (CPT-11).
A mucosite intestinal foi induzida através da administração do CPT-11 (75 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos. Os animais receberam PTX (1,7, 5, 15 mg/kg) ou solução salina 0,9% por via
subcutânea (s.c.) durante sete dias, iniciando um dia antes do tratamento com CPT-11. As massas
corpóreas foram avaliadas diariamente até o sétimo dia experimental. Os pontos representam média ±
EPM da variação de massa corpórea (g), calculada através das diferenças das massas corpóreas
obtidas diariamente e a inicial. Os dados foram analisados pelo teste de Bonferroni (ANOVA).
# Diferença estatística comparado aos animais com mucosite intestinal tratados com salina e PTX
(p < 0,05). O número de animais utilizados em cada grupo foi no mínimo oito.
81
0
1
2
3
4
5
6
7
8
#
_
_________________
_
PTX (mg/kg)
Normal Salina 1,7 5 15
_
________________________
_
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
#
#
#
Total de leucócitos
x10
3
/mm
3
FIGURA 14 – Efeito de diferentes doses da pentoxifilina (PTX) no leucograma de
camundongos Swiss com mucosite intestinal induzida pelo cloridrato de irinotecano
(CPT-11).
A mucosite intestinal foi induzida através da administração do CPT-11 (75 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos. Os animais receberam PTX (1,7, 5 e 15 mg/kg) ou solução salina 0,9% por via
subcutânea (s.c.) durante sete dias, iniciando um dia antes do tratamento com CPT-11. O sangue foi
colhido por punção na artéria ocular imediatamente antes do sacrifício e a contagem do número total
de leucócitos foi realizada em câmara de Neubauer, conforme descrito por Moura et al. (1998). Os
valores representam média ± EPM do número total de leucócitos x 10
3
/mm
3
e foram analisados pelo
teste de Bonferroni (ANOVA). # Diferença estatística comparado aos animais normais (p < 0,05). O
número de animais utilizados em cada grupo foi no mínimo seis.
82
0 1 2 3 4 5 6 7
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Normal
Salina
PTX (1,7 mg/kg
)
PTX (5 mg/kg)
PTX (15 mg/kg)
#
Tempo
(
dias
)
% de sobrevida
FIGURA 15 – Efeito de diferentes doses da pentoxifilina (PTX) na curva de sobrevida
de camundongos Swiss com mucosite intestinal induzida por cloridrato de irinotecano
(CPT-11).
A mucosite intestinal foi induzida através da administração do CPT-11 (75 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos. Os animais receberam PTX (1,7, 5 e 15 mg/kg) ou solução salina 0,9% por via
subcutânea (s.c.) durante sete dias, iniciando um dia antes do tratamento com CPT-11. As taxas de
sobrevida foram calculadas pela curva de Kaplan-Meier e a diferença entre os grupos pelo teste de
logrank. # Diferença estatística comparado aos animais com mucosite intestinal tratados com salina e
PTX (p < 0,05). O número de animais utilizados em cada grupo foi no mínimo dez.
83
3.2.5 Efeito da PTX nas estruturas histológicas do intestino de animais com mucosite
intestinal induzida pelo CPT-11
O tratamento com a PTX, nas doses de 1,7 e 5 mg/kg durante sete dias
consecutivos, com início um dia da indução da mucosite, melhorou a estrutura
histológica dos animais tratados com o CPT-11, ou seja, reduziu o encurtamento dos
vilos, aumentou a profundidade das criptas e reduziu o infiltrado de células
mononucleares na lâmina própria nos animais submetidos à mucosite intestinal
(Figuras 16).
Quando se utilizou o escore histológico (Woo et al., 2000) para classificar
as lesões intestinais verificou-se que a PTX na dose de 1,7 mg/kg, administrada por
sete dias, reduziu significativamente (p < 0,05) a destruição provocada pelo uso do
CPT-11 no duodeno, jejuno e íleo. Já, a administração de PTX 5 mg/kg melhorou
significativamente (p < 0,05) apenas as estruturas histológicas da porção duodenal e
jejunal. No entanto, a PTX (15 mg/kg) não reverteu significativamente (p > 0,05) as
alterações histológicas induzidas pelo CPT-11 de nenhum segmento intestinal
(Tabela 5).
Os resultados da análise morfométrica do intestino de animais com
mucosite intestinal induzida por CPT-11 tratados e não-tratados com a PTX podem
ser observados na Figura 17, onde se observa que a PTX nas doses utilizadas
aumentou significativamente (p < 0,05) a profundidade das criptas intestinais nos
segmentos duodenal e jejunal em média em 82,82% e 47,88%, respectivamente. Por
outro lado, no íleo apenas a menor dose (1,7 mg/kg) reduziu significativamente
(p < 0,05) a destruição das criptas induzidas pelo CPT-11 em 53,29%, apesar de se
verificar uma tendência de melhora com as outras doses. Em relação à altura dos
vilos, observou-se que no duodeno a PTX nas doses de 1,7 e 5 mg/kg reduziu
significativamente (p < 0,05) o encurtamento em 77,7 e 62,65%, respectivamente.
Assim, a PTX parece ter um papel protetor das lesões induzidas por CPT-11.
84
FIGURA 16 – Fotomicrografias da mucosa duodenal de camundongos Swiss
normais, dos submetidos à mucosite intestinal pelo cloridrato de irinotecano (CPT-11)
sem tratamento e com tratamento com pentoxifilina (PTX).
Os animais receberam CPT-11 (75 mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro dias consecutivos (i.p). A
PTX (1,7 mg/kg) ou solução salina 0,9% foi administrada durante sete dias (s.c.), iniciando um dia
antes do CPT-11. Os animais foram sacrificados no sétimo dia experimental, o duodeno foi removido e
processado para a técnica de coloração pelo método H&E (A, D e G – aumento de 100x; B, C, E, F, H,
I – 400x). Mucosa intestinal de animais normais, não submetidos à mucosite intestinal, mostrando vilos
(A, B) e criptas (C) preservados. Mucosa intestinal de animais que receberam CPT-11, mostrando
encurtamento dos vilos (D, E), achatamento e vacuolização de enterócitos (seta E), necrose de criptas
(F) e infiltrado de células mononucleares na lâmina própria (cabeça de seta F). Mucosa intestinal de
animais que receberam CPT-11 e PTX, mostrando menor encurtamento dos vilos (G, H), aumento da
profundidade das criptas, menor infiltrado de células inflamatórias na lâmina própria (I).
85
TABELA 5 – Efeito de diferentes doses da pentoxifilina (PTX) no grau de mucosite
intestinal induzida pelo cloridrato de irinotecano (CPT-11) em camundongos Swiss.
CPT-11 (75 mg/kg)
____________________________________________
PTX (mg/kg)
_________________________________
Normal Salina 1,7 5 15
Duodeno
0 (0-0)
4 (3-4)#
1 (0-4)*
2 (0-3)*
3 (1-4)
Jejuno 0 (0-0) 4 (4-4)# 2 (0-4)* 2 (0-4)* 4 (0-4)#
Íleo 0 (0-0) 4 (4-4)# 2 (1-4)* 4 (3-4)# 4 (3-4)#
A mucosite intestinal foi induzida através da administração do CPT-11 (75 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos. Os animais receberam PTX (1,7, 5, 15 mg/kg) ou solução salina 0,9%por via subcutânea
(s.c.) durante sete dias, iniciando um dia antes do tratamento com CPT-11. Foram sacrificados no
sétimo dia experimental e segmentos do duodeno, jejuno e íleo foram removidos e processados para a
técnica de coloração pelo método H&E. A avaliação histológica foi realizada por escores propostos por
Woo et al. (2000), onde se tem: 0 – ausência de lesão; 1 – menos de 10% das criptas contêm células
necróticas; 2 – mais de 10% das criptas contêm células necróticas, mas a arquitetura permanece
intacta; 3 – mais de 10% das criptas contêm células necróticas com perda da arquitetura das criptas (<
20%), os vilos encontram-se encurtados, variável hipertrofia/hiperbasofilia nas criptas remanescentes;
4 – lesões mais extensas que em 3. Os valores representam mediana e variação, e foram analisados
pelo teste de Kruskal-Wallis com comparação de Dunn. # Diferença estatística comparado aos animais
normais (p < 0,05). * Diferença estatística comparado ao grupo com mucosite intestinal e tratado com
salina (p < 0,05). O número de animais utilizados em cada grupo foi no mínimo seis.
86
0
50
100
150
200
250
300
350
#
#
Normal Salina 1,7 5 15
___________________
PTX (mg/kg)
__________________________
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
# *
# *
Duodeno: vilos (
µ
m)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Normal Salina 1,7 5 15
___________________
PTX (mg/kg)
__________________________
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
#
*
*
*
Duodenum: criptas (
µ
m)
0
1
2
3
4
5
#
#
# *
Normal Salina 1,7 5 15
___________________
PTX (mg/kg)
__________________________
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
#
Duodeno: vilos/criptas
0
25
50
75
100
125
150
175
200
Normal Salina 1,7 5 15
___________________
PTX (mg/kg)
_________________________
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
#
#
*
#
*
#
Jejuno: vilos (
µ
m)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
#
*
*
*
Normal Salina 1,7 5 15
___________________
PTX (mg/kg)
__________________________
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
Jejuno: criptas (
µ
m)
0
1
2
3
4
5
#
#
Normal Salina 1,7 5 15
___________________
PTX (mg/kg)
__________________________
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
#
#
Jejuno: vilos/criptas
0
25
50
75
100
125
150
Normal Salina 1,7 5 15
___________________
PTX (mg/kg)
_________________________
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
#
*
#
#
Íleo: vilos (
µ
m)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Normal Salina 1,7 5 15
#
*
___________________
PTX (mg/kg)
_________________________
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
*
*
Íleo: criptas (
µ
m)
0
1
2
3
4
5
#
Normal Salina 1,7 5 15
___________________
PTX (mg/kg)
__________________________
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
##
Íleo: vilos/criptas
FIGURA 17 – Efeito de diferentes doses da pentoxifilina (PTX) nas alterações
morfométricas intestinais induzidas pelo cloridrato de irinotecano (CPT-11) em
camundongos Swiss.
A mucosite intestinal foi induzida através da administração do CPT-11 (75 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos. Os animais receberam PTX (1,7, 5 e 15 mg/kg) ou solução salina 0,9% por via
subcutânea (s.c.) durante sete dias, iniciando um dia antes do tratamento com CPT-11. Os animais
foram sacrificados no sétimo dia experimental, e segmentos do duodeno, jejuno e íleo foram removidos
e processados para a técnica de coloração pelo método H&E. Os valores representam média ± EPM e
foram analisados pelo teste de Bonferroni (ANOVA). # Diferença estatística comparado aos animais
normais (p < 0,05). * Diferença estatística comparado ao grupo com mucosite intestinal e tratado com
salina (p < 0,05). O número de animais utilizados em cada grupo foi no mínimo seis.
87
3.2.6 Efeito da PTX na atividade de MPO no duodeno de animais com mucosite
intestinal induzida pelo CPT-11
Através dos dados mostrados na Figura 18, verifica-se que o tratamento
com PTX (1,7, 5 e 15 mg/kg) foi capaz de reduzir de forma significante (p < 0,05) a
atividade da MPO no duodeno. Portanto, a PTX preveniu a migração neutrofílica na
lesão intestinal observada na mucosite intestinal induzida pelo CPT-11.
3.2.7 Efeito da PTX nos níveis de citocinas (TNF-α, IL-1β e KC) no duodeno de
animais com mucosite intestinal induzida pelo CPT-11
O tratamento com PTX (1,7 mg/kg) reverteu significativamente (p < 0,05) o
aumento de TNF-α, IL-1β e KC na mucosa duodenal nos animais submetidos à
mucosite intestinal pela administração de CPT-11 (Figura 19).
3.2.8 Efeito da PTX na expressão de citocinas (TNF-α e IL-1β) e de enzimas (iNOS e
COX-2) na mucosa duodenal de animais com mucosite intestinal induzida pelo
CPT-11
Na Tabela 6 observa-se o efeito da PTX (1,7 mg/kg) no grau de marcação
de TNF-α IL-1β e iNOS na mucosa duodenal de camundongos submetidos à
mucosite intestinal.
As Figuras 20E e 20F mostram o duodeno de um animal submetido à
mucosite intestinal, onde se vê marcações de TNF-α e IL-1β ao nível do epitélio de
revestimento e nas células da lâmina própria, mostrando um aumento (p < 0,05) na
expressão destas citocinas (escore 4; 4-4 e 4; 3-4). Nas fotomicrografias 20G e 20H,
pode-se observar uma redução significativa (p < 0,05) na marcação de TNF-α e IL-1β
tanto ao nível do epitélio de revestimento como na lâmina própria (escores 2; 2-3)
nos animais tratados com PTX.
As Figuras 21C e 21D mostram o duodeno de um animal submetido à
mucosite intestinal induzida pelo CPT-11 apresentando forte marcação de iNOS ao
nível do epitélio de revestimento e nas células da lâmina própria (escore 4; 3-4). A
PTX reduziu (p < 0,05) a marcação de iNOS no epitélio de revestimento, e
especialmente nas células da lâmina própria (escore 1,5; 1-2) (Figura 21E).
88
0
1
2
3
4
5
6
Normal Salina 1,7 5 15
___________________
PTX (mg/kg)
_________________________
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
*
*
#
*
U de MPO/mg de tecido
FIGURA 18 – Efeito de diferentes doses da pentoxifilina (PTX) na atividade de
mieloperoxidase (MPO) no duodeno de camundongos Swiss com mucosite intestinal
induzida pelo cloridrato de irinotecano (CPT-11).
A mucosite intestinal foi induzida através da administração do CPT-11 (75 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos. Os animais receberam PTX (1,7, 5 e 15 mg/kg) ou solução salina 0,9% por via
subcutânea (s.c.) durante sete dias, iniciando um dia antes do tratamento com CPT-11. Foram
sacrificados no sétimo dia experimental, e uma porção do duodeno foi congelada em freezer a -70°C.
A atividade de MPO foi determinada por ensaio colorimétrico, segundo método modificado pelo
descrito por Bradley et al. (1982). Os valores representam média ± EPM da unidade de MPO/mg de
tecido e foram analisados pelo teste de Bonferroni (ANOVA). # Diferença estatística comparado aos
animais normais (p < 0,05). * Diferença estatística comparado ao grupo com mucosite intestinal e
tratado com salina (p < 0,05). O número de animais utilizados em cada grupo foi no mínimo seis.
89
0
25
50
75
100
125
150
# *
#
Normal Salina PTX (1.7 mg/kg)
_______________________
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
TNF-
α
(pg/mL)
0
50
100
150
200
250
300
350
#
*
Normal Salina PTX (1,7 mg/kg)
_______________________
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
IL-1
β
(pg/mL)
0
250
500
750
1000
1250
#
# *
Normal Salina PTX (1.7 mg/kg)
______________________
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
KC (pg/mL)
FIGURA 19 – Efeito da pentoxifilina (PTX) nos níveis de citocinas (TNF-α, IL-1β e
KC) no duodeno de camundongos Swiss com mucosite intestinal induzida pelo
cloridrato de irinotecano (CPT-11).
A mucosite intestinal foi induzida através da administração do CPT-11 (75 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos. Os animais receberam PTX (1,7 mg/kg) ou solução salina 0,9% por via subcutânea (s.c.)
durante sete dias, iniciando um dia antes do tratamento com CPT-11. Foram sacrificados no sétimo dia
experimental, e uma porção do duodeno foi congelada no freezer a -70ºC. O ensaio foi realizado por
ELISA através do método descrito por Cunha et al. (1993). Os valores representam média ± EPM da
quantidade de citocinas (pg/mL) e foram analisados pelo teste de Bonferroni (ANOVA). # Diferença
estatística comparado aos animais normais (p < 0,05). * Diferença estatística comparado ao grupo com
mucosite intestinal tratado com salina (p < 0,05). O número de animais utilizados em cada grupo foi no
mínimo cinco.
90
TABELA 6 – Efeito da pentoxifilina (PTX) no grau de expressão de citocinas (TNF-α e
IL-1β) e da enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) na mucosa duodenal de
camundongos Swiss com mucosite intestinal induzida pelo cloridrato de irinotecano
(CPT-11).
CPT-11 (75 mg/kg)
_____________________________________________
Controle
negativo
Normal Salina PTX (1,7 mg/kg)
TNF-α
0 (0-0)
1 (1-1)
4 (4-4)
#
2 (2-3)*
IL-1β
0 (0-0)
1 (1-1)
4 (3-4)#
2 (2-3)*
iNOS
0 (0-0)
1 (1-2)
4 (3-4)
#
1,5 (1-2)*
A mucosite intestinal foi induzida através da administração do CPT-11 (75 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos. Os animais receberam PTX (1,7 mg/kg) ou solução salina 0,9%por via subcutânea (s.c.)
durante sete dias, iniciando um dia antes do tratamento com CPT-11. Foram sacrificados no sétimo dia
experimental, e o duodeno foi removido para técnica de imunohistoquímica para detecção de TNF-α,
IL-1β e iNOS. Controle negativo, duodeno de um animal submetido à mucosite intestinal na ausência
de anticorpo primário anti-TNF-α, anti-IL-1β e anti-iNOS. O grau de expressão foi avaliado por escores
descritos por Yeoh et al. (2005), onde se tem: 0 – sem marcação; 1 – leve marcação; 2 – moderada
marcação; 3 – moderada a intensa marcação e 4 – intensa marcação. Os valores representam
mediana e variação, e foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis com comparação de Dunn. #
Diferença estatística comparado aos animais normais (p < 0,05). * Diferença estatística comparado ao
grupo com mucosite intestinal e tratado com salina (p < 0,05). O número de animais utilizados em cada
grupo foi no mínimo cinco, à exceção do controle negativo (n=1).
91
FIGURA 20 – Fotomicrografias da marcação de citocinas (TNF-α e IL-1β) na mucosa
duodenal de camundongos Swiss normais, dos submetidos à mucosite intestinal pelo
cloridrato de irinotecano (CPT-11) sem tratamento e com tratamento com
pentoxifilina (PTX).
Os animais receberam CPT-11 (75 mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro dias consecutivos (i.p.).
PTX (1,7 mg/kg) ou solução salina 0,9% foi administrada durante sete dias (s.c.), iniciando um dia
antes do CPT-11. Os animais foram sacrificados no sétimo dia experimental, e o duodeno foi removido
para técnica de imunohistoquímica para detecção de TNF-α e IL-1β (aumento de 400x). Controle
negativo, duodeno de um animal submetido à mucosite intestinal na ausência de anticorpo primário
anti-TNF-α (A) e anti-IL-1β (B). Duodeno de um animal normal, mostrando leve marcação de TNF-α
(C) e IL-1β (D) no epitélio dos vilos. Duodeno de um animal submetido à mucosite intestinal,
apresentando intensa marcação de TNF-α (E) e IL-1β (F) no epitélio de revestimento (seta), células da
lâmina própria (cabeça de seta) e do endotélio (seta branca). Duodeno de um animal submetido à
mucosite intestinal tratado com PTX, mostrando a redução na marcação de TNF-α (G) e IL-1β (H) ao
nível no epitélio de revestimento e nas células da lâmina própria.
92
FIGURA 21 – Fotomicrografias da marcação da enzima óxido nítrico sintase induzida
(iNOS) na mucosa duodenal de camundongos Swiss normais, dos submetidos à
mucosite intestinal pelo cloridrato de irinotecano (CPT-11) sem tratamento e com
tratamento com pentoxifilina (PTX).
Os animais receberam CPT-11 (75 mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro dias consecutivos (i.p.).
A PTX (1,7 mg/kg) ou solução salina 0,9% foi administrada durante sete dias (s.c.), iniciando um dia
antes do CPT-11. Os animais foram sacrificados no sétimo dia experimental, e o duodeno foi removido
para técnica de imunohistoquímica para detecção de iNOS (aumento de 400x). Controle negativo,
duodeno de um animal submetido à mucosite intestinal na ausência de anticorpo primário anti-iNOS
(A). Duodeno de um animal normal, mostrando marcação leve a moderada de iNOS no epitélio dos
vilos (B). Duodeno de um animal submetido à mucosite intestinal, apresentando intensa marcação de
iNOS no epitélio de revestimento (seta C) e nas células da lâmina própria (cabeça de seta D).
Duodeno de um animal submetido à mucosite intestinal tratado com PTX, mostrando a redução na
marcação de iNOS no epitélio de revestimento e nas células da lâmina própria (E).
93
3.3 Efeito do tratamento com TLD na mucosite intestinal induzida pelo CPT-11
3.3.1 Efeito da TLD na severidade da diarréia induzida pelo CPT-11
Pode-se observar na Tabela 7 que o tratamento durante sete dias com
TLD (15, 30 e 60 mg/kg) não reverteu significativamente (p > 0,05) à diarréia induzida
pelo CPT-11.
3.3.2 Efeito da TLD na variação da massa corpórea de animais com mucosite
intestinal induzida pelo CPT-11
A Figura 22 demonstra que a TLD, nas doses de 15, 30 e 60 mg/kg, por
sete dias consecutivos, não reduziu de forma estatisticamente significativa (p > 0,05),
a perda de peso dos animais com mucosite intestinal experimental induzida pelo
CPT-11.
3.3.3 Efeito da TLD no leucograma de animais com mucosite intestinal induzida pelo
CPT-11
Na Figura 23 pode-se observar que o tratamento durante sete dias com
TLD, nas doses de 15, 30 e 60 mg/kg (s.c.) não foi capaz de alterar a contagem total
de leucócitos no sangue de animais submetidos à mucosite intestinal experimental
com CPT-11 (p > 0,05).
3.3.4 Efeito da TLD na sobrevida de animais com mucosite intestinal induzida pelo
CPT-11
O tratamento com TLD durante sete dias consecutivos, não foi capaz de
reduzir a mortalidade de animais submetidos à mucosite intestinal induzida por CPT-
11 (p > 0,05). Os grupos tratados com salina e TLD (15 mg/kg) apresentaram taxa de
sobrevida de 70% e os grupos em que foram administrados TLD 30 e 60mg/kg
tiveram sobrevida de 60% e 66,67%, respectivamente (Figura 24).
94
TABELA 7 – Efeito de diferentes doses da talidomida (TLD) na severidade da diarréia
induzida pelo cloridrato de irinotecano (CPT-11) em camundongos Swiss.
CPT-11 (75 mg/kg)
____________________________________________________
TLD (mg/kg)
_________________________________
_
____
_
Dia Normal Salina 15 30 60
1
o
0 (0-0)
0 (0-2)
0 (0-1)
0 (0-1)
0 (0-2)
2
o
0 (0-0) 0 (0-1) 0 (0-1) 0 (0-1) 0 (0-1)
3
o
0 (0-0) 0 (0-1) 0 (0-1) 0 (0-1) 0 (0-2)
4
o
0 (0-0) 0 (0-2) 0 (0-2) 0 (0-1) 0 (0-3)
5
o
0 (0-0) 0 (0-3) 0 (0-3) 0 (0-3) 0 (0-3)
6
o
0 (0-0) 3 (0-3)# 1 (0-3) 1 (0-3) 1 (0-3)
7
o
0 (0-0) 3 (2-3)# 1 (0-3) 1 (0-3) 1 (0-3)
A mucosite intestinal foi induzida através da administração do CPT-11 (75 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos. Os animais receberam TLD (15, 30 e 60 mg/kg) ou solução salina 0,9% por via
subcutânea (s.c.) durante sete dias, iniciando um dia antes do tratamento com CPT-11. A diarréia foi
avaliada por escores propostos por Kurita et al. (2000), onde se tem: 0 – normal, ausência de diarréia;
1 – diarréia leve, fezes levemente umedecidas; 2 – diarréia moderada, fezes sem formas com
presença de quantidade moderada de sujidades na região perianal; e 3 – diarréia grave, fezes aquosas
com grande quantidade de sujidades na região perianal. Os valores representam mediana e variação,
e foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis com comparação de Dunn. # Diferença estatística
comparado aos animais normais (p < 0,05). O número de animais utilizados em cada grupo foi no
mínimo oito.
95
1 2 3 4 5 6 7
-8
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
Normal
Salina
TLD (15 mg/kg
)
TLD (30 mg/kg)
TLD (60 mg/kg)
Tempo
(
dias
)
#
#
#
#
Variação de massa corpórea (g)
FIGURA 22 – Efeito de diferentes doses da talidomida (TLD) na variação da massa
corpórea em camundongos Swiss com mucosite intestinal induzida por cloridrato de
irinotecano (CPT-11).
A mucosite intestinal foi induzida através da administração do CPT-11 (75 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos. Os animais receberam TLD (15, 30 e 60 mg/kg) ou solução salina 0,9% por via
subcutânea (s.c.) durante sete dias, iniciando um dia antes do tratamento com CPT-11. As massas
corpóreas foram avaliadas diariamente até o sétimo dia experimental. Os pontos representam média ±
EPM da variação de massa corpórea (g), calculada através das diferenças das massas corpóreas
obtidas diariamente e a inicial. Os dados foram analisados pelo teste de Bonferroni (ANOVA).
# Diferença estatística comparado aos animais com mucosite intestinal tratados com salina e TLD
(p < 0,05). O número de animais utilizados em cada grupo foi no mínimo oito.
96
FIGURA 23 – Efeito de diferentes doses da talidomida (TLD) no leucograma de
camundongos Swiss com mucosite intestinal induzida pelo cloridrato de irinotecano
(CPT-11).
A mucosite intestinal foi induzida através da administração do CPT-11 (75 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos. Os animais receberam TLD (15, 30 e 60 mg/kg) ou solução salina 0,9% por via
subcutânea (s.c.) durante sete dias, iniciando um dia antes do tratamento com CPT-11. O sangue foi
colhido por punção na artéria ocular imediatamente antes do sacrifício e a contagem do número total
de leucócitos foi realizada em câmara de Neubauer, conforme descrito por Moura et al. (1998). Os
valores representam média ± EPM do número total de leucócitos x 10
3
/mm
3
e foram analisados pelo
teste de Bonferroni (ANOVA). # Diferença estatística comparado aos animais normais (p < 0,05). O
número de animais utilizados em cada grupo foi no mínimo seis.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Normal Salina 15 30 60
___________________
TLD (mg/kg)
__________________________
CPT-11 (75 mg/kg)
# #
#
#
Total de leucócitos x
10
3
/mm
3
97
0 1 2 3 4 5 6 7
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Normal
Salina
TLD (15 mg/kg)
TLD (30 mg/kg
)
TLD (60 mg/kg
)
#
Tempo
(
dias
)
% de sobrevida
FIGURA 24 – Efeito de diferentes doses da talidomida (TLD) na curva de sobrevida
de camundongos Swiss com mucosite intestinal induzida por cloridrato de irinotecano
(CPT-11).
A mucosite intestinal foi induzida através da administração do CPT-11 (75 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos. Os animais receberam TLD (15, 30 e 60 mg/kg) ou solução salina 0,9% por via
subcutânea (s.c.) durante sete dias, iniciando um dia antes do tratamento com CPT-11. As taxas de
sobrevida foram calculadas pela curva de Kaplan-Meier e a diferença entre os grupos pelo teste de
logrank. # Diferença estatística comparado aos animais com mucosite intestinal tratados com salina e
TLD (p < 0,05). O número de animais utilizados em cada grupo foi no mínimo dez.
98
3.3.5 Efeito da TLD nas estruturas histológicas do intestino de animais com mucosite
intestinal induzida pelo CPT-11
A Figura 25 e a Tabela 8 mostram o grau de mucosite intestinal de
camundongos Swiss submetidos à mucosite intestinal induzido pelo CPT-11 tratados
com TLD nas doses de 15, 30 e 60 mg/kg (s.c.) durante sete dias. Os resultados
demonstram que o tratamento com TLD na maior dose (60 mg/kg) preveniu o
surgimento das lesões intestinais induzidas pelo CPT-11 apenas no segmento
duodenal (p < 0,05) quantificadas pelo critério de Woo et al. (2000).
Quando se fez a análise quantitativa dos vilos e criptas através da
morfometria observou-se que apenas a maior dose mostrou proteger as criptas do
segmento duodenal da destruição induzida pelo CPT-11 (p < 0,05). No jejuno e íleo
nenhuma dose foi capaz de reverter significativamente (p > 0,05) o achatamento dos
vilos e a destruição das criptas induzida pelo tratamento quimioterápico (Figura 26).
99
FIGURA 25
– Fotomicrografias do duodeno de camundongos Swiss normais, dos
submetidos à mucosite intestinal pelo cloridrato de irinotecano (CPT-11) sem
tratamento e com tratamento com talidomida (TLD).
Os animais receberam CPT-11 (75 mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro dias consecutivos (i.p). A
TLD (60 mg/kg) ou solução salina 0,9% foi administrada durante sete dias (s.c.), iniciando um dia
antes do CPT-11. Os animais foram sacrificados no sétimo dia experimental, e o duodeno foi removido
e processado para a técnica de coloração pelo método H&E (A, D e G – 100x; B, C, E, F, H, I – 400x).
Mucosa intestinal de animais normais, não submetidos à mucosite intestinal, mostrando vilos (A, B) e
criptas. (C) preservados. Mucosa intestinal de animais que receberam CPT-11, mostrando
encurtamento dos vilos (D, E), achatamento e vacuolização de enterócitos (seta E), necrose de criptas
(F) e infiltrado de células mononucleares (cabeça de seta F). Mucosa intestinal de animais que
receberam CPT-11 e TLD, mostrando menor encurtamento dos vilos (G, H), aumento da profundidade
das criptas e menor infiltrado de células inflamatórias na lâmina própria (I).
100
TABELA 8 – Efeito de diferentes doses da talidomida (TLD) no grau de mucosite
intestinal induzida pelo cloridrato de irinotecano (CPT-11) em camundongos Swiss
CPT-11 (75 mg/kg)
_______________________________________________
TLD (mg/kg)
___________________________________
Normal Salina 15 30 60
Duodeno
0 (0-0)
4 (4-4)
#
2(1-4)
2 (1-4)
1 (1-4)*
Jejuno 0 (0-0) 4 (3-4)
#
4 (1-4)
#
3 (1-4) 3 (1-4)
Íleo 0 (0-0) 4 (4-4)
#
2 (1-4) 4 (1-4)
#
4 (1-4)
#
A mucosite intestinal foi induzida através da administração do CPT-11 (75 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos. Os animais receberam TLD (15, 30 e 60 mg/kg) ou solução salina 0,9% por via
subcutânea (s.c.) durante sete dias, iniciando um dia antes do tratamento com CPT-11. Foram
sacrificados no sétimo dia experimental e segmentos do duodeno, jejuno e íleo foram removidos e
processados para a técnica de coloração pelo método H&E. A avaliação histológica foi realizada por
escala de escores proposta por Woo et al. (2000), onde se tem: 0 – ausência de lesão; 1 – menos de
10% das criptas contêm células necróticas; 2 – mais de 10% das criptas contêm células necróticas,
mas a arquitetura permanece intacta; 3 – mais de 10% das criptas contêm células necróticas com
perda da arquitetura das criptas (< 20%), os vilos encontram-se encurtados, variável
hipertrofia/hiperbasofilia nas criptas remanescentes; 4 – lesões mais extensas que em 3. Os valores
representam mediana e variação, e foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis com comparação de
Dunn. # Diferença estatística comparado aos animais normais (p < 0,05). * Diferença estatística
comparado ao grupo com mucosite intestinal e tratado com salina (p < 0,05). O número de animais
utilizados em cada grupo foi no mínimo seis.
101
0
50
100
150
200
250
300
350
Normal Salina 15 30 60
n=8
n=7
#
n=6
n=6
n=6
___________________
TLD (mg/kg)
__________________________
_
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
#
#
#
Duodeno: vilos (
µ
m)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Normal Salina 15 30 60
___________________________
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
n=8
___________________
TLD (mg/kg)
n=7
#
n=6
n=6
n=6
*
#
#
Duodeno: criptas (
µ
m)
0
1
2
3
4
5
Normal Salina 15 30 60
___________________________
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
n=8
___________________
TLD (mg/kg)
n=7
#
n=6
#
n=6
#
n=6
#
Duodeno: vilos/criptas
0
25
50
75
100
125
150
175
200
Normal Salina 15 30 60
___________________
TLD (mg/kg)
n=8
n=6
n=6
#
n=6
#
n=6
#
_
_________________________
_
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
#
Jejuno: vilos (
µ
m)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Normal Salina 15 30 60
___________________
TLD (mg/kg)
n=8
___________________________
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
n=6
#
n=6
#
n=6
#
n=6
#
Jejuno: criptas (
µ
m)
0
1
2
3
4
5
Normal Salina 15 30 60
n=8
___________________
TLD (mg/kg)
__________________________
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
n=6
#
n=6
#
n=6
#
n=6
#
Jejuno: vilos/criptas
0
25
50
75
100
125
150
Normal Salina 15 30 60
n=8
n=6
#
n=7
#
n=6
#
n=6
#
___________________
___________________________
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
TLD (mg/kg)
Íleo: vilos (
µ
m)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
n=8
n=6
#
Normal Salina 15 30 60
n=6
#
n=6
#
n=6
#
___________________
TLD (mg/kg)
___________________________
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
Íleo: criptas (
µ
m)
0
1
2
3
4
5
Normal Salina 15 30 60
n=8
n=6
#
n=6
#
n=6
#
n=6
#
____________________
__________________________
_
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
TLD (mg/kg)
Íleo: vilos/criptas
FIGURA 26 – Efeito de diferentes doses da talidomida (TLD) nas alterações
morfométricas intestinais induzidas pelo cloridrato de irinotecano (CPT-11) em
camundongos Swiss.
A mucosite intestinal foi induzida através da administração do CPT-11 (75 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos. Os animais receberam TLD (15, 30 e 60 mg/kg) ou solução salina 0,9% por via
subcutânea (s.c.) durante sete dias, iniciando um dia antes do tratamento com CPT-11. Foram
sacrificados no sétimo dia experimental, e segmentos do duodeno, jejuno e íleo foram removidos e
processados para a técnica de coloração pelo método H&E. Os valores representam média ± EPM e
foram analisados pelo teste de Bonferroni (ANOVA). # Diferença estatística comparado aos animais
normais (p < 0,05). * Diferença estatística comparado ao grupo com mucosite intestinal e tratado com
salina (p < 0,05). O número de animais utilizados em cada grupo foi no mínimo seis.
102
3.3.6 Efeito da TLD na atividade de MPO no duodeno de animais com mucosite
intestinal induzida pelo CPT-11
A Figura 27 mostra o efeito da administração durante sete dias de TLD (15,
30 e 60 mg/kg) na atividade de MPO nos animais com mucosite intestinal induzida
por CPT-11. Observou-se que a TLD foi capaz de inibir significativamente (p < 0,05)
a ativação de MPO no intestino (duodeno), o que demonstra que no grupo tratado
com esta droga houve uma menor infiltração de neutrófilos, o que talvez explique em
parte o efeito positivo da TLD nas lesões intestinais.
3.3.7 Efeito da TLD nos níveis de citocinas (TNF-α, IL-1β e KC) no duodeno de
animais com mucosite intestinal induzida pelo CPT-11
Na Figura 28 observa-se que o tratamento durante sete dias com TLD
(60 mg/kg) reverteu significativamente (p < 0,05) o aumento de TNF-α na mucosa
intestinal nos animais submetidos à mucosite intestinal induzida pelo CPT-11. Por
outro lado, a TLD falhou em reduzir os níveis de IL-1β e KC nos animais com
mucosite intestinal e sacrificados no sétimo dia experimental.
3.3.8 Efeito da TLD na expressão de citocinas (TNF-α e IL-1β) e de enzimas (iNOS e
COX-2) na mucosa duodenal de animais com mucosite intestinal induzida pelo
CPT-11
Na Tabela 11 e na Figura 29 observam-se o resultado do efeito da TLD
(60 mg/kg) na marcação de TNF-α e IL-1β por imunohistoquímica na mucosa
duodenal de camundongos submetidos à mucosite intestinal pelo CPT-11. As
fotomicrografias 29E e 29F mostram o duodeno de um animal submetido à mucosite
intestinal e tratado com salina, onde se vê além das marcações de TNF-α e IL-1β ao
nível do epitélio de revestimento, marcações nas células da lâmina própria,
mostrando assim, um aumento significativo (p < 0,05) na expressão destas citocinas
no processo inflamatório (escore 4; 4-4). Na fotomicrografia 29G pode-se observar
uma redução evidente do TNF-α tanto ao nível do epitélio de revestimento como
também na lâmina própria (escore 2; 1-3), entretanto, confirmou-se por esta técnica
103
que a TLD não alterou a expressão de IL-1β no intestino de animais submetidos à
mucosite intestinal, cujo escore foi 4 (3-4) (Figura 29H).
Na Figura 30 pode-se observar o efeito da TLD (60 mg/kg) na marcação
de iNOS pelo estudo imunohistoquímico do duodeno de camundongos, onde se
constata uma intensa marcação de iNOS ao nível do epitélio de revestimento e nas
células da lâmina própria (escore 4; 3-4) nos animais submetidos à mucosite
intestinal (Figuras 30C e 30D). A fotomicrografia 30E mostra redução na marcação
de iNOS ao nível do epitélio de revestimento, e especialmente nas células da lâmina
própria, no entanto esta diferença não foi significativa (p > 0,05) quando se fez a
graduação nas amostras estudadas segundo o critério de Yeoh et al. (2005), onde
observou-se escore de 2,5 (2-4).
104
0
1
2
3
4
5
6
Normal Salina 15 30 60
___________________
TLD (mg/kg)
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
#
_
________________________
_
*
*
*
U de MPO/mg de tecido
FIGURA 27 – Efeito de diferentes doses da talidomida (TLD) na atividade de
mieloperoxidase (MPO) no duodeno de camundongos Swiss com mucosite intestinal
induzida pelo cloridrato de irinotecano (CPT-11).
A mucosite intestinal foi induzida através da administração do CPT-11 (75 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos. Os animais receberam TLD (15, 30 e 60 mg/kg) ou solução salina 0,9% por via
subcutânea (s.c.) durante sete dias, iniciando um dia antes do tratamento com CPT-11. Foram
sacrificados no sétimo dia experimental e uma porção do duodeno foi congelada em freezer a -70°C. A
atividade de MPO foi determinada por ensaio colorimétrico, segundo método modificado pelo descrito
por Bradley et al. (1982). Os valores representam média ± EPM da unidade de MPO/mg de tecido e
foram analisados pelo teste de Bonferroni (ANOVA). # Diferença estatística comparado aos animais
normais (p < 0,05). * Diferença estatística comparado ao grupo tratado com salina (p < 0,05). O
número de animais utilizados em cada grupo foi no mínimo seis.
105
0
25
50
75
100
125
150
#
*
Normal Salina TLD (60 mg/kg)
_______________________
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
TNF-
α
(pg/mL)
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Normal Salina TLD (60 mg/kg)
______________________
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
#
#
IL-1
β
(pg/mL)
0
250
500
750
1000
1250
#
#
Normal Salina TLD (60 mg/kg)
______________________
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
KC (pg/mL)
FIGURA 28 – Efeito da talidomida (TLD) nos níveis de citocinas (TNF-α, IL-1β e KC)
no duodeno de camundongos Swiss com mucosite intestinal induzida pelo cloridrato
de irinotecano (CPT-11).
A mucosite intestinal foi induzida através da administração do CPT-11 (75 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos. Os animais receberam TLD (60 mg/kg) ou solução salina 0,9% por via subcutânea (s.c.)
durante sete dias, iniciando um dia antes do tratamento com CPT-11. Foram sacrificados no sétimo dia
experimental, e uma porção do duodeno foi congelada no freezer a -70ºC. O ensaio foi realizado por
ELISA através do método descrito por Cunha et al. (1993). Os valores representam média ± EPM da
quantidade citocinas (pg/mL) e foram analisados pelo teste de Bonferroni (ANOVA). # Diferença
estatística comparado aos animais normais (p < 0,05). * Diferença estatística comparado ao grupo com
mucosite intestinal tratado com salina (p < 0,05). O número de animais utilizados em cada grupo foi no
mínimo cinco.
106
TABELA 9 – Efeito da talidomida (TLD) no grau de expressão de citocinas (TNF-α,
IL-1β) e da enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) na mucosa duodenal de
camundongos Swiss com mucosite intestinal induzida pelo cloridrato de irinotecano
(CPT-11)
CPT-11 (75 mg/kg)
_____________________________________________
Controle
negativo
Normal Salina TLD (60 mg/kg)
TNF-α
0 (0-0)
1 (1-1)
4 (4-4)
#
2 (1-3)*
IL-1β
0 (0-0)
1 (1-1)
4 (3-4)#
4 (3-4)
iNOS
0 (0-0)
1 (1-2)
4 (3-4)
#
2,5 (2-4)
A mucosite intestinal foi induzida através da administração do CPT-11 (75 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos. Os animais receberam TLD (60 mg/kg) ou solução salina 0,9% por via subcutânea (s.c.)
durante sete dias, iniciando um dia antes do tratamento com CPT-11. Foram sacrificados no sétimo dia
experimental, e o duodeno foi removido para técnica de imunohistoquímica para detecção de TNF-α,
IL-1β e iNOS. Controle negativo, duodeno de um animal submetido à mucosite intestinal na ausência
de anticorpo primário anti-TNF-α, anti-IL-1β e anti-iNOS. O grau de expressão foi avaliado por escores
descritos por Yeoh et al. (2005), onde se tem: 0 – sem marcação; 1 – leve marcação; 2 – moderada
marcação; 3 – moderada a intensa marcação e 4 – intensa marcação. Os valores representam
mediana e variação, e foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis com comparação de Dunn. #
Diferença estatística comparado aos animais normais (p < 0,05). * Diferença estatística comparado ao
grupo com mucosite intestinal e tratado com salina (p < 0,05). O número de animais utilizados em cada
grupo foi no mínimo cinco, à exceção do controle negativo (n=1).
107
FIGURA 29 – Fotomicrografias da marcação de citocinas (TNF-α e IL-β) na mucosa
duodenal de camundongos Swiss normais, dos submetidos à mucosite intestinal pelo
cloridrato de irinotecano (CPT-11) sem tratamento e com tratamento com talidomida
(TLD).
Os animais receberam CPT-11 (75 mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro dias consecutivos (i.p).
TLD (60 mg/kg) ou solução salina 0,9% foi administrado durante 7 dias (s.c.), iniciando um dia antes
do CPT-11. Os animais foram sacrificados no sétimo dia experimental, e o duodeno foi removido para
técnica de imunohistoquímica para detecção de TNF-α e IL-1β (aumento de 400x). Controle negativo,
duodeno de um animal submetido à mucosite intestinal na ausência de anticorpo primário anti-TNF-α
(A) e anti-IL-1β (B). Duodeno de um animal normal, mostrando leve marcação de TNF-α (C) e IL-1β
(D) no epitélio dos vilos. Duodeno de um animal submetido à mucosite intestinal, apresentando
intensa marcação de TNF-α (E) e IL-1β (F) no epitélio de revestimento (seta), células da lâmina
própria (cabeça de seta) e do endotélio (seta branca). Duodeno de um animal submetido à mucosite
intestinal tratado com TLD, mostrando a redução na marcação de TNF-α (G), mas não de IL-1β (H) no
epitélio de revestimento e nas células da lâmina própria.
108
FIGURA 30 – Fotomicrografias da marcação da enzima óxido nítrico sintase induzida
(iNOS) na mucosa duodenal de camundongos Swiss normais, dos submetidos à
mucosite intestinal pelo cloridrato de irinotecano (CPT-11) sem tratamento e com
tratamento com talidomida (TLD).
Os animais receberam CPT-11 (75 mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro dias consecutivos (i.p). A
TLD (60 mg/kg) ou solução salina 0,9% foi administrada durante sete dias (s.c.), iniciando um dia
antes do CPT-11. Os animais foram sacrificados no sétimo dia experimental, e o duodeno foi removido
para técnica de imunohistoquímica para detecção de iNOS (aumento de 400x). Controle negativo,
duodeno de um animal submetido à mucosite intestinal na ausência de anticorpo primário anti-
iNOS(A). Duodeno de um animal normal, mostrando marcação leve a moderada de iNOS no epitélio
dos vilos (B). Duodeno de um animal submetido à mucosite intestinal, apresentando intensa marcação
de iNOS no epitélio de revestimento (seta C) e nas células da lâmina própria (cabeça de seta D).
Duodeno de um animal submetido à mucosite intestinal tratado com TLD, mostrando pequena redução
na marcação de iNOS ao nível do epitélio de revestimento e, especialmente nas células da lâmina
própria (E).
109
3.4 Efeito do tratamento com CLX na mucosite intestinal induzida pelo CPT-11
3.4.1 Efeito do CLX na severidade da diarréia induzida pelo CPT-11
Os resultados da Tabela 10 demonstram que o CLX, nas doses de 3, 10 e
30 mg/kg, não reduziu a severidade da diarréia induzida pelo CPT-11 (p > 0,05) em
nenhum dos dias estudados. Não houve também alteração na incidência da diarréia
precoce, avaliada imediatamente e após uma hora da administração da droga.
3.4.2 Efeito do CLX na variação da massa corpórea de animais com mucosite
intestinal induzida pelo CPT-11
Os dados observados na Figura 31 demonstram que o CLX (3, 10 e
30 mg/kg) não foi capaz de reduzir a perda de peso dos animais com mucosite
intestinal induzida com CPT-11 na dose de 75 mg/kg (p > 0,05).
3.4.3 Efeito do CLX no leucograma de animais com mucosite intestinal induzida pelo
CPT-11
Os resultados apresentados na Figura 32 mostram que o CLX, nas doses
de 3, 10 e 30 mg/kg, administrado por sete dias consecutivos, não reverteu a
leucopenia induzida pelo tratamento com CPT-11 (p > 0,05).
3.4.4 Efeito do CLX na sobrevida de animais com mucosite intestinal induzida pelo
CPT-11
A Figura 33 demonstra que o CLX reduziu significativamente (p < 0,05) a
sobrevida dos animais submetidos ao tratamento com CPT-11. No sétimo dia
experimental, a sobrevida do grupo tratado com CLX na dose de 3 mg/kg foi de 50%,
enquanto nos grupos tratados com CLX 10 e 30 mg/kg foi de 35,29% e 38,89%,
respectivamente. O grupo com mucosite intestinal, mas não tratado com CLX, teve
sobrevida de 75%.
110
TABELA 10 – Efeito de diferentes doses do celecoxibe (CLX) na severidade da
diarréia induzida pelo cloridrato de irinotecano (CPT-11) em camundongos Swiss.
CPT-11 (75 mg/kg)
____________________________________________________
CLX (mg/kg)
_________________________________
_
____
_
Dia Normal Água 3 10 30
1
o
0 (0-0)
0 (0-1)
0 (0-1)
0 (0-1)
0 (0-1)
2
o
0 (0-0) 0 (0-2) 0 (0-1) 0 (0-1) 0 (0-1)
3
o
0 (0-0) 0 (0-1) 0 (0-1) 0 (0-1) 0 (0-1)
4
o
0 (0-0) 0 (0-3) 0 (0-2) 0 (0-3) 0 (0-3)
5
o
0 (0-0) 0 (0-3) 2 (0-3) 0 (0-3) 3 (0-3)
6
o
0 (0-0) 3 (0-3)# 1,5 (0-3) 3 (0-3) 3 (0-3)
7
o
0 (0-0) 3 (0-3)# 2 (0-3) 3 (2-3)# 3 (0-3)
A mucosite intestinal foi induzida através da administração do CPT-11 (75 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos. Os animais receberam CLX (3, 10 e 30 mg/kg) ou água destilada por gavagem durante
sete dias, iniciando um dia antes do tratamento com CPT-11. A diarréia foi avaliada por escores
propostos por Kurita et al. (2000), onde se tem: 0 – normal, ausência de diarréia; 1 – diarréia leve,
fezes levemente umedecidas; 2 – diarréia moderada, fezes sem formas com presença de quantidade
moderada de sujidades na região perianal; e 3 – diarréia grave, fezes aquosas com grande quantidade
de sujidades na região perianal. Os valores representam mediana e variação, e foram analisados pelo
teste de Kruskal-Wallis com comparação de Dunn. # Diferença estatística comparado aos animais
normais (p < 0,05). O número de animais utilizados em cada grupo foi no mínimo oito.
.
111
1 2 3 4 5 6 7
-8
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
Normal
Água destilada
CLX (3 mg/kg)
CLX (10 mg/kg)
CLX (30 mg/kg
)
#
#
#
#
Tempo
(
dias
)
Variação de massa corpórea (g)
FIGURA 31 – Efeito de diferentes doses de celecoxibe (CLX) na variação da massa
corpórea de camundongos Swiss com mucosite intestinal induzida pelo cloridrato de
irinotecano (CPT-11).
A mucosite intestinal foi induzida através da administração do CPT-11 (75 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos. Os animais receberam CLX (3, 10 ou 30 mg/kg) ou água destilada por gavagem durante
sete dias, iniciando um dia antes do tratamento com CPT-11. As massas corpóreas foram avaliadas
diariamente até o sétimo dia experimental. Os pontos representam média ± EPM da variação de
massa corpórea (g), calculada através das diferenças das massas corpóreas obtidas diariamente e a
inicial. Os dados foram analisados pelo teste de Bonferroni (ANOVA). # Diferença estatística
comparado aos animais com mucosite intestinal tratados com água destilada e com CLX (p < 0,05). O
número de animais utilizados em cada grupo foi no mínimo oito.
112
0
1
2
3
4
5
6
7
8
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
Normal Água 3 10 30
CLX (mg/kg)
#
#
_
__________________
_
#
#
_
_________________________
_
Total de leucócitos
x
10
3
/mm
3
FIGURA 32 – Efeito de diferentes doses do celecoxibe (CLX) no leucograma de
camundongos Swiss com mucosite intestinal induzida por cloridrato de irinotecano
(CPT-11).
A mucosite intestinal foi induzida através da administração do CPT-11 (75 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos. Os animais receberam CLX (3, 10 e 30 mg/kg) ou água destilada por gavagem durante
sete dias, iniciando um dia antes do tratamento com CPT-11. O sangue foi colhido por punção na
artéria ocular imediatamente antes do sacríficio e a contagem do número total de leucócitos foi
realizada em câmara de Neubauer, conforme descrito por Moura et al. (1998). Os valores representam
média ± EPM do número total de leucócitos x 10
3
/mm
3
e foram analisados pelo teste de Bonferroni
(ANOVA). # Diferença estatística comparado aos animais normais (p < 0,05). O número de animais
utilizados em cada grupo foi no mínimo seis.
113
0 1 2 3 4 5 6 7
30
40
50
60
70
80
90
100
Normal
Água destilada
CLX (3 mg/kg)
CLX (10 mg/kg)
CLX (30 mg/kg)
#
*
*
*
Tempo
(
dias
)
% de sobrevida
FIGURA 33 – Efeito de diferentes doses do celecoxibe (CLX) na curva de sobrevida
de camundongos Swiss com mucosite intestinal induzida pelo cloridrato de
irinotecano (CPT-11).
A mucosite intestinal foi induzida através da administração do CPT-11 (75 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos. Os animais receberam CLX (3, 10 e 30 mg/kg) ou água destilada por gavagem durante
sete dias, iniciando um dia antes do tratamento com CPT-11. As taxas de sobrevida foram calculadas
pela curva de Kaplan-Meier e a diferença entre os grupos pelo teste de logrank. # Diferença estatística
comparado aos animais com mucosite intestinal tratados com água destilada e CLX (p < 0,05).
* Diferença estatística comparado aos animais com mucosite intestinal tratados com água destilada
(p < 0,05). O número de animais utilizados em cada grupo foi no mínimo dez.
114
3.4.5 Efeito do CLX nas estruturas histológicas do intestino de animais com mucosite
intestinal induzida pelo CPT-11
O tratamento com CLX nas doses de 3, 10 e 30 mg/kg, durante sete dias
consecutivos, não reverteu significativamente as alterações histológicas no duodeno,
jejuno e íleo induzidas pelo CPT-11. Quando se classificou a mucosite segundo os
escores descritos por Woo et al. (2000), verificou-se que o tratamento com CLX não
reduziu significativamente (p > 0,05) o grau de mucosite intestinal provocada pela
administração do CPT-11 (Tabela 11).
A Figura 34 mostra que nenhuma dose utilizada no tratamento com CLX foi
capaz de reverter significativamente (p > 0,05) as alterações morfométricas
observadas no duodeno, jejuno e íleo de camundongos Swiss com mucosite
intestinal injduzida pelo CPT-11.
115
TABELA 11 – Efeito de diferentes doses do celecoxibe (CLX) no grau de mucosite
intestinal induzida pelo cloridrato de irinotecano (CPT-11) em camundongos Swiss.
CPT-11 (75 mg/kg)
____________________________________
_
_______
_
CLX (mg/kg)
_________________________________
Normal Água 3 10 30
Duodeno
0 (0-0)
4 (4-4)#
3 (0-4)
2 (0-4)
4 (0-4)#
Jejuno 0 (0-0) 4 (3-4)# 4 (0-4)# 3 (2-4) 4 (2-4)#
Íleo 0 (0-0) 4 (3-4)# 3 (0-4) 4 (2-4)# 4 (3-4)#
A mucosite intestinal foi induzida através da administração do CPT-11 (75 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos. Os animais receberam CLX (3, 10 e 30 mg/kg) ou água destilada por gavagem durante
sete dias, iniciando um dia antes do tratamento com CPT-11. Foram sacrificados no sétimo dia
experimental, e segmentos do duodeno, jejuno e íleo foram removidos e processados para a técnica
de coloração pelo método H&E. A avaliação histológica foi realizada por escores propostos por Woo et
al. (2000), onde se tem: 0 – ausência de lesão; 1 – menos de 10% das criptas contêm células
necróticas; 2 – mais de 10% das criptas contêm células necróticas, mas a arquitetura permanece
intacta; 3 – mais de 10% das criptas contêm células necróticas com perda da arquitetura das criptas
(< 20%), os vilos encontram-se encurtados, variável hipertrofia/hiperbasofilia nas criptas
remanescentes; 4 – lesões mais extensas que em 3. Os valores representam mediana e variação, e
foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis com comparação de Dunn. # Diferença estatística
comparado aos animais normais (p < 0,05). O número de animais utilizados em cada grupo foi no
mínimo seis.
116
0
50
100
150
200
250
300
350
Normal Água 3 10 30
#
#
___________________
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
#
#
CLX (mg/kg
)
__________________________
Duodeno: vilos (
µ
m)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Normal Água 3 10 30
#
_________________________
_
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
____________________
CLX (mg/kg)
Duodeno: criptas (
µ
m)
0
1
2
3
4
5
___________________________
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
#
# #
#
Normal Água 3 10 30
___________________
CLX (mg/kg)
Duodeno: vilos/criptas
0
25
50
75
100
125
150
175
200
Normal Água 3 10 30
__________________________
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
#
#
#
#
___________________
CLX (mg/kg)
Jejuno: vilos (
µ
m)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
#
Normal Água 3 10 30
__________________
CLX (mg/kg)
_________________________
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
Jejuno: criptas (
µ
m)
0
1
2
3
4
5
#
#
#
#
Normal Água 3 10 30
___________________
CLX (mg/kg)
__________________________
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
Jejuno: vilos/criptas
0
25
50
75
100
125
150
Normal Água 3 10 30
____________________
CLX (mg/kg)
#
#
#
#
_________________________
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
Íleo: vilos (
µ
m)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
#
Normal Água 3 10 30
__________________
_
CLX (mg/kg)
__________________________
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
Íleo: criptas (
µ
m)
0
1
2
3
4
5
#
#
#
#
Normal Água 3 10 30
___________________
CLX (mg/kg)
__________________________
CPT-11
(
75m
g
/k
g)
Íleo: vilos/criptas
FIGURA 34 – Efeito de diferentes doses do celecoxibe (CLX) nas alterações
morfométricas intestinais induzidas pelo cloridrato de irinotecano (CPT-11) em
camundongos Swiss.
A mucosite intestinal foi induzida através da administração do CPT-11 (75 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos. Os animais receberam CLX (3, 10 e 30 mg/kg) ou água destilada por gavagem durante
sete dias, iniciando um dia antes do tratamento com CPT-11. Foram sacrificados no sétimo dia
experimental, e segmentos do duodeno, jejuno e íleo foram removidos e processados para a técnica
de coloração pelo método H&E. Os valores representam média ± EPM e foram analisados pelo teste
de Bonferroni (ANOVA). # Diferença estatística comparado aos animais normais (p < 0,05). O número
de animais utilizados em cada grupo foi no mínimo seis.
117
3.4.6 Efeito do CLX na atividade de MPO no duodeno de animais com mucosite
intestinal induzida pelo CPT-11
Os resultados apresentados na Figura 35 mostram que nenhuma dose de
CLX foi capaz de reduzir (p > 0,05) a atividade da MPO no intestino de animais com
mucosite intestinal. Portanto, o tratamento com CLX não reduziu a infiltração
neutrofílica induzida pelo CPT-11.
3.4.7 Efeito do CLX na expressão da enzima ciclooxigenase-2 (COX-2) na mucosa
duodenal de animais com mucosite intestinal induzida pelo CPT-11
Na Tabela 12 e na Figura 36 observam-se o resultado do efeito do CLX
(30 mg/kg), na marcação de COX-2 por imunohistoquímica na mucosa duodenal de
camundongos submetidos à mucosite intestinal pelo CPT-11. A fotomicrografia 36C
mostra o duodeno de animais tratados com CPT-11, onde se vê além das marcações
de COX-2 ao nível do epitélio de revestimento, marcações nas criptas, mostrando
assim, um aumento na expressão de COX-2 (p < 0,05) na evolução da mucosite
(escore 2,5; 2-3). Entretanto, o tratamento com CLX não foi capaz de reduzir
(p > 0,05) a expressão desta enzima no intestino (escore 2; 1-3) (Figura 36D).
118
0
1
2
3
4
5
6
Normal Água 3 10 30
_________________________
CPT-11
(
75 m
g
/k
g)
___________________
CLX (mg/kg)
#
#
#
#
U de MPO/mg de tecido
FIGURA 35 – Efeito de diferentes doses do celecoxibe (CLX) na atividade de
mieloperoxidase (MPO) no duodeno de camundongos Swiss com mucosite intestinal
induzida por cloridrato de irinotecano (CPT-11).
A mucosite intestinal foi induzida através da administração do CPT-11 (75 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos. Os animais receberam CLX (3, 10 e 30 mg/kg) ou água destilada por gavagem durante
sete dias, iniciando um dia antes do tratamento com CPT-11. Foram sacrificados no sétimo dia
experimental, e uma porção do duodeno foi congelada em freezer a -70°C. A atividade de MPO foi
determinada por ensaio colorimétrico, segundo método modificado pelo descrito de Bradley et al.
(1982). Os valores representam média ± EPM da unidade de MPO/mg de tecido e foram analisados
pelo teste de Bonferroni (ANOVA). # Diferença estatística comparado aos animais normais (p < 0,05).
O número de animais utilizados em cada grupo foi no mínimo seis.
119
TABELA 12 – Efeito do celecoxibe (CLX) no grau de expressão da enzima
ciclooxigenase-2 (COX-2) na mucosa duodenal de camundongos Swiss com
mucosite intestinal induzida pelo cloridrato de irinotecano (CPT-11)
CPT-11 (75 mg/kg)
_____________________________________________
Controle
negativo
Normal Salina CLX (30 mg/kg)
COX-2
0 (0-0)
1 (1-1)
2,5 (2-3)
#
2 (1-3)
A mucosite intestinal foi induzida através da administração do CPT-11 (75 mg/kg de peso, i.p.) por
quatro dias consecutivos. Os animais receberam CLX (30 mg/kg) ou água destilada por gavagem
durante sete dias, iniciando um dia antes do tratamento com CPT-11. Foram sacrificados no sétimo dia
experimental, e o duodeno foi removido para técnica de imunohistoquímica para detecção de COX-2.
Controle negativo, duodeno de um animal submetido à mucosite intestinal na ausência de anticorpo
primário anti-COX-2. O grau de expressão foi avaliado por escores descritos por Yeoh et al. (2005),
onde se tem: 0 – sem marcação; 1 – leve marcação; 2 – moderada marcação; 3 – moderada a intensa
marcação e 4 – intensa marcação. Os valores representam mediana e variação, e foram analisados
pelo teste de Kruskal-Wallis com comparação de Dunn. # Diferença estatística comparado aos animais
normais (p < 0,05). O número de animais utilizados em cada grupo foi no mínimo cinco, à exceção do
controle negativo (n=1).
120
FIGURA 36 – Fotomicrografias da marcação da enzima ciclooxigenase-2 (COX-2) na
mucosa duodenal de camundongos Swiss normais, dos submetidos à mucosite
intestinal pelo cloridrato de irinotecano (CPT-11) sem tratamento e com tratamento
com celecoxibe (CLX).
Os animais receberam CPT-11 (75 mg/kg) ou solução salina 0,9% por quatro dias consecutivos (i.p).
O CLX (30 mg/kg) ou água destilada foi administrado por gavagem durante sete dias, iniciando um dia
antes do CPT-11. Os animais foram sacrificados no sétimo dia experimental, e o duodeno foi removido
para técnica de imunohistoquímica para detecção de COX-2 (aumento de 400x). Controle negativo,
duodeno de um animal submetido à mucosite intestinal na ausência de anticorpo primário anti-COX-2
(A). Duodeno de um animal normal, mostrando leve marcação de COX-2, principalmente nas criptas
(B). Duodeno de um animal submetido à mucosite intestinal, apresentando moderada a intensa
marcação de COX-2 no epitélio de revestimento (seta C) e nas criptas (cabeça de seta C). Duodeno
de um animal submetido à mucosite intestinal tratado com CLX, mostrando que não houve redução na
marcação de COX-2 (D).
121
4 DISCUSSÃO
Estudos clínicos apontam que o CPT-11 associa-se com a incidência de
mais de 20% de mucosite intestinal severa (RUBENSTEIN et al., 2004), podendo
chegar a acometer até 40% dos pacientes (ALIMONTI et al., 2004). Entretanto, a
patogênese da mucosite intestinal induzida por este agente ainda não está
totalmente esclarecida e não existe um protocolo definitivo para a sua prevenção e
tratamento (GIBSON et al., 2002a e 2002b; ALIMONTI et al., 2004; GIBSON; KEEFE,
2006).
Devido à dificuldade encontrada para se determinar os mecanismos
envolvidos na mucosite intestinal em seres humanos, têm-se desenvolvido modelos
experimentais com o objetivo de investigar os mediadores relacionados e avaliar os
efeitos de diferentes agentes farmacológicos, a fim de reduzir a sua incidência e
severidade.
A mucosite intestinal foi induzida em camundongos Swiss seguindo-se
inicialmente o modelo proposto por Ikuno et al. (1995), que utilizou durante quatro
dias a dose de 100 mg/kg. Escolheu-se o camundongo pela sua semelhança
fisiológica e imunológica com humanos (WADE; DALY, 2005) e pelo fato destes
animais terem um fácil manejo e necessitarem de uma menor quantidade de droga.
Entretanto, observou-se nos animais que receberam a dose de 100 mg/kg uma alta
mortalidade (50%), e então foram testadas as doses de 50 e 75 mg/kg durante quatro
dias consecutivos.
O presente estudo demonstrou que o tratamento com CPT-11 (75 e
100 mg/kg) causou significante mucosite intestinal acompanhada de diarréia,
corroborando outros trabalhos que relatam que a diarréia é uma manifestação clínica
importante observada na mucosite intestinal (DUNCAN; GRANT, 2003; SONIS et al.,
2004a; RUBENSTEIN et al., 2004; AVRITSCHER et al., 2004; GIBSON; KEEFE,
2006). Dois tipos de diarréia são associados com o uso do CPT-11: a diarréia
precoce e a diarréia tardia (JANSMAN et al., 2001; RUBENSTEIN et al., 2004).
Apesar da incidência da diarréia precoce observada em nosso estudo não
ter sido significativa sob o ponto de vista estatístico, não foi desprezível o seu
aparecimento nos animais tratados com CPT-11 nas doses maiores. A dose de
122
75 mg/kg induziu diarréia leve (escore 1) em 35,5% dos animais após a segunda e
terceira administração, e 50% após a quarta. Percentagem maior foi vista na dose de
100 mg/kg, onde se observou 43,75% dos animais com diarréia no segundo e
terceiro dias e 56,25% após a última administração. Incidência superior foi relatada
por Kase et al. (1997), em ratos, após a administração (i.v.) de 60 mg/kg de CPT-11
por quatro dias consecutivos, que observou diarréia precoce de grau leve (escore 1)
no primeiro e segundo dias de administração da droga, aparecendo em 50% e
83,33% dos animais, respectivamente. No terceiro e quarto dias, diarréia aguda foi
observada em todos os ratos de forma severa (escore 2). Esta diferença pode ser
justificada pelo fato de nosso trabalho ser com camundongo Swiss e não ratos Wistar
como o do referido autor. Além disso, a via intravenosa constitui uma via mais rápida
de administração de drogas obtendo-se a concentração desejada com exatidão,
enquanto a via intraperitoneal (i.p.), por nós utilizada, caracteriza-se pela ocorrência
de perdas no metabolismo de primeira passagem no fígado, apesar de oferecer uma
grande área de superfície absortiva, onde a droga entra rapidamente na circulação,
principalmente pela veia porta (BENET et al., 2003). Saliente-se também que o
modelo experimental por nós escolhido, conforme relatado por Ikuno et al. (1995), é
utilizado para o estudo da diarréia tardia.
A diarréia precoce ocorre geralmente com uso do CPT-11 em altas doses,
em conseqüência do aumento da atividade colinérgica, que estimula a contratilidade
intestinal, prejudicando a função absortiva e secretora da mucosa intestinal (GANDIA
et al., 1993; DODDS et al., 1999; DODDS; RIVORY, 1999). Freqüentemente, é
acompanhada de outros sintomas colinérgicos como salivação, dor abdominal,
vômitos, congestão nasal e bradicardia (GANDIA et al., 1993; SALIBA et al., 1998;
TAKIMOTO; ARBUCK, 2001). Kase et al. (1997) caracterizaram a diarréia precoce
induzida pelo CPT-11 como aquela que ocorre até uma hora após a administração da
droga. Esta diarréia geralmente é transitória e dificilmente severa, podendo ser
rapidamente suprimida com uso de atropina (KASE et al., 1997; SALIBA et al., 1998;
DODDS et al., 1999; DODDS; RIVORY, 1999; TAKIMOTO; ARBUCK, 2001; SALTZ
et al., 2003).
Várias teorias tentam justificar a atividade colinérgica do CPT-11. Dodds et
al. (1999) sugerem que este efeito é mediado por estímulo ganglionar provocado pela
liberação da cadeia lateral dipiperidina quando o irinotecano é ativado a SN-38 pelas
esterases. Porém, outros estudos verificaram que o CPT-11 possui atividade
123
anticolinesterásica, sendo um inibidor potente, reversível e seletivo da AChE
(DODDS; RIVORY, 1999; DODDS et al., 2001). Segundo Kase et al. (1997), os
sintomas de diarréia precoce acompanham um aumento de PGE
2
no cólon
descendente, sendo que a administração de atropina inibe seu aparecimento e
normaliza os níveis de PGE
2
. Já o tratamento com indometacina normaliza PGE
2
,
mas falha na prevenção da diarréia precoce. Portanto, a diarréia ocorre devido à
ação anticolinesterásica da droga que provoca hiperperistaltismo mediado pelo
aumento de PGE
2
.
Nós demonstramos que o sintoma da diarréia tardia causado pelo
tratamento durante quatro dias com CPT-11, na dose de 100 mg/kg, teve início no
quinto dia experimental, acometendo 75% dos animais (escore 3; 0-3), enquanto a
dose de 75 mg/kg apareceu no sexto dia em 50% do grupo (escore 3; 0-3). Portanto,
o aparecimento dos sintomas diarréicos é diretamente proporcional à dose
administrada, o que foi também relatado por outros autores. Ikuno et al. (1995)
relataram o aparecimento de diarréia em camundongos após 5,8 dias da primeira
administração da droga na dose de 100 mg/kg por quatro dias seguidos. Doses
inferiores (30 e 60 mg/kg) durante quatro dias consecutivos foram testadas por Kase
et al. (1997), em ratos, que verificaram que a dose de 60 mg/kg induziu diarréia tardia
a partir do terceiro dia de administração da droga. Entretanto, a administração da
dose de 30 mg/kg não foi capaz de induzir diarréia neste modelo experimental.
Clinicamente, a diarréia tardia ocorre em 82% (SALIBA et al., 1998) a 87%
dos pacientes (BOKEMEYER; HARTMANN, 1999; JANSMAN et al., 2001), sendo
que em 30% destes a diarréia ocorre em forma severa (ENZINGER et al., 2005).
Quando ela aparece em período concomitante com a mielossupressão pode
provocar o desenvolvimento de uma complicação infecciosa (BOKEMEYER;
HARTMANN, 1999; JANSMAN et al., 2001). Além disso, quando grave pode limitar a
eficácia terapêutica do tratamento com CPT-11, já que algumas vezes é necessário
reduzir sua dose ou até mesmo suspender seu uso (BOKEMEYER; HARTMANN,
1999; IKEGAMI et al., 2002; ABIGERGES et al. 1994; ALIMONTI et al., 2004), como
já referido.
Existem relatos que a diarréia tardia induzida pelo CPT-11 é secretória,
decorrente da redução intestinal de absorção de fluidos e com a presença de
componentes exsudativos (SAKAI et al., 1995, 1997; SALIBA et al., 1998). A diarréia,
portanto, pode ser causada pelo transporte anormal de água e íons por falha nos
124
mecanismos secretórios, provavelmente provocada pelas alterações das células
epiteliais induzidas pelo agente quimioterápico (IKUNO et al., 1995; SALIBA et al.,
1998).
Nossos achados mostraram que o tratamento com CPT-11 (75 e 100
mg/kg) induziu uma destruição significante da mucosa do duodeno, jejuno e íleo,
caracterizando mucosite grau 4, segundo o critério de classificação descrito por Woo
et al. (2000). Observou-se achatamento acentuado dos vilos, acompanhado de uma
redução significativa do tamanho e número das criptas, vacuolização de enterócitos e
infiltrado de células inflamatórias na lâmina própria.
Esses dados estão de acordo com prévios estudos que demonstram
aspectos similares da mucosite intestinal induzida pelo CPT-11 (IKUNO et al., 1995;
CAO et al., 1998; KURITA et al., 2000; GIBSON et al., 2003; YANG et al., 2006a).
Em camundongos, a administração de 100 mg/kg (durante quatro dias – i.p.) alterou
a mucosa intestinal no sétimo dia experimental por induzir apoptose e diferenciação
de células caliciformes. Observou-se no íleo, vacuolização epitelial, dilatação dos
vasos sangüíneos com infiltrado de células PMN, e redução do tamanho dos vilos.
No ceco, encontrou-se hiperplasia de células caliciformes, com aumento da produção
de muco. Estas alterações estruturais e funcionais são responsáveis pela má-
absorção de água e eletrólitos e hipersecreção de mucina que ocasionam a diarréia
(IKUNO et al., 1995). Já em outro modelo experimental, a administração do CPT-11
na dose de 200 mg/kg, por três dias consecutivos (i.v.), provocou, 24 horas após o
final do tratamento, encurtamento dos vilos, que quando presentes mostraram-se de
forma irregular e atrofiada, redução da profundidade das criptas, e ainda redução de
células caliciformes (CAO et al., 1998). Os achados de Gibson et al. (2003)
mostraram que as alterações histológicas induzidas em ratos pelo CPT-11 em dose
única (100, 150 e 200 mg/kg, i.p.) foram marcantes no cólon, que apresentou
debridação celular e hipersecreção de muco na superfície luminal, entretanto, com
pouco infiltrado inflamatório.
A mucosite intestinal é atribuída à alta taxa de proliferação e turnover das
células do intestino que é afetada pela quimioterapia do câncer. Estas drogas
provocam destruição das células de divisão presentes nas criptas, responsáveis pela
renovação epitelial dos vilos (KEEFE et al., 2000; GIBSON et al., 2002a e 2002b;
XIAN, 2003; SONIS et al., 2004a; RUBEINSTEIN et al., 2004; BOWEN et al., 2006;
GIBSON; KEEFE, 2006). É consenso que os agentes quimioterápicos causam
125
apoptose, que provoca hipoproliferação das criptas (KEEFE et al., 2000; GIBSON et
al., 2002a e 2002b; GIBSON; KEEFE, 2006).
Os eventos histopatológicos que acompanham a mucosite intestinal em
modelo animal são idênticos aos observados em humanos. No intestino delgado
sabe-se que a apoptose nas criptas ocorre desde o primeiro dia após administração
da droga, precedendo a atrofia dos vilos e criptas. Estas alterações são
acompanhadas pelo aparecimento dos sintomas gastrintestinais, prejuízo da
absorção de monossacarídeos e aumento da permeabilidade intestinal que ocorre
entre o terceiro e sétimo dia após quimioterapia (KEEFE et al., 2000).
A magnitude da destruição induzida pelo CPT-11 foi também avaliada por
morfometria, onde se observou redução da altura dos vilos nas três porções
intestinais em todas as doses estudadas (50, 75, 100 mg/kg), bem como menor
profundidade das criptas em todo intestino com as doses de 75 e 100 mg/kg. A dose
de 50 mg/kg reduziu significativamente a profundidade das criptas apenas no íleo.
Comparando nosso estudo com o desenvolvido por Gibson et al. (2003),
encontram-se diferenças. Estes pesquisadores verificaram no jejuno aumento de
apoptose acompanhado de aumento do aprofundamento das criptas quando ratos
receberam CPT-11 na dose única de 100 ou 150 ou 200 mg/kg (i.p.). Este aumento
da profundidade das criptas pode indicar a tentativa de recuperação do epitélio
(LIMA, 2004). Esta diferença de resultados deve-se ao fato dos experimentos
ocorrerem em tempos diferentes. Gibson et al. (2003) observaram hipoplasia de
criptas 24 horas após a administração de dose única de CPT-11 e hiperplasia após
72 horas. No nosso modelo, o CPT-11 foi administrado por quatro dias consecutivos,
assim a tentativa de recuperação das criptas três dias após o término da
administração da droga ainda não havia iniciado, provavelmente pelo fato de o
tratamento ter sido mais prolongado.
Keefe et al (2000), em estudo clínico utilizando regimes de múltiplas
drogas quimioterápicas, observaram redução na área dos vilos e no tamanho das
criptas em 24 e 26%, respectivamente, no terceiro dia após a quimioterapia, sendo
que no 16º dia estas medidas retornaram aos valores iniciais. A contagem mitótica
também reduziu em 72% no terceiro dia após quimioterapia e retornou aos valores
anteriores ao tratamento no 16º.
Outras pesquisas observaram que os produtos do metabolismo do CPT-11
estão implicados na gênese da diarréia (GUPTA et al., 1997; TAKASUNA et al.,
126
1998; XIE et al., 2002; CHOWBAY et al., 2003; TAKASUNA et al., 2006). Nesta
direção, Xie et al. (2002), em estudo farmacocinético com o irinotecano, verificaram
correlação entre a diarréia e a curva de concentração plasmática do SN-38G,
metabólito inativo. A diarréia pode ser conseqüência de uma maior concentração de
SN-38 no intestino formada a partir de SN-38G. As bactérias intestinais formadoras
de glicuronidases seriam responsáveis pela transformação de SN-38G em SN-38 no
lúmen intestinal, e então este composto ativo apresenta efeito tóxico, sendo
responsável pela destruição das células intestinais (GUPTA et al., 1997; TAKASUNA
et al., 1998; XIE et al., 2002; CHOWBAY et al., 2003; TAKASUNA et al., 2006).
Um outro aspecto por nós observado foi a variação da massa corpórea
nos animais com mucosite intestinal. O CPT-11 nas três doses estudadas (50, 75 e
100 mg/kg) provocou perda de peso a partir do quarto dia experimental. A perda de
peso foi dose-dependente, sendo maior no grupo tratado com maior dose de CPT-11.
Resultados semelhantes foram descritos por Kase et al. (1997), em ratos, onde se
observou perda de peso significativa a partir do terceiro dia de tratamento com
CPT-11 na dose de 60 mg/kg administrado durante quatro dias, e a partir do quarto
dia utilizando 30 mg/kg, seguindo o mesmo protocolo. Redução significativa de peso
foi também observada em ratos Sprague-Dawley no sexto dia da primeira injeção do
CPT-11 (60 mg/kg, i.v.), que foi administrado durante quatro dias consecutivos
(YANG et al., 2006a). A redução de peso observada em nosso estudo e de outros
autores pode ser explicada pela redução do consumo alimentar, pela diminuição da
absorção de alimentos devido às alterações das vilosidades intestinais e pela perda
de água e eletrólitos provocada em conseqüência da diarréia, (DUNCAN; GRANT,
2003; SONIS et al., 2004a; RUBEINSTEIN et al., 2004; AVRITSCHER et al., 2004;
GIBSON; KEEFE, 2006).
No decorrer da presente investigação, observou-se, ainda, que o CPT-11
nas doses utilizadas (50, 75 e 100 mg/kg) foi capaz de provocar leucocitose
significativa, corroborando estudos clínicos, que demonstram alta incidência (30 a
36%) de leucopenia, particularmente neutropenia grau 3 e 4 (VAMVAKAS et al.,
2002; PEREZ et al., 2004; ENZINGER et al., 2005). Experimentalmente, o número de
neutrófilos e linfócitos no sangue foram reduzidos significativamente em ratos
tratados com CPT-11 (YANG et al., 2006a). Sabe-se que a mielossupressão
juntamente com a toxicidade gastrintestinal é um dos efeitos colaterais que mais
preocupam no tratamento com CPT-11 pelo risco de septicemia (CAO et al., 1998;
127
ALIMONTI et al., 2004). Além disso, leucopenia grave pode aumentar a incidência de
diarréia tardia por favorecer a infecção bacteriana no trato gastrintestinal (KURITA et
al., 2000).
Em nosso modelo experimental, CPT-11 também induziu aumento
significativo de mortalidade de forma dose-dependente. No sétimo dia experimental,
as doses de 50, 75 e 100 mg/kg induziram mortes em 12,5%, 25% e 50% dos
animais. Mortalidade significativa com uso do CPT-11 também foi observada por
Gibson et al. (2003), que relataram mortalidade proporcional à dose administrada.
Neste trabalho, em até 96 horas, a administração de dose única de 100 mg/kg em
ratos não induziu nenhuma morte. Entretanto, em até 96 horas, quando se injetou
uma dose de 150 mg/kg, 50% dos animais morreram; e no grupo em que foi utilizado
a dose de 200 mg/kg, a mortalidade foi de 100%. Na autópsia, observou-se peritonite
e perfuração duodenal como causa mortis. Alta mortalidade com o tratamento com
CPT-11 também foi observada por Cao et al. (1998), os quais referiram que 86% dos
ratos tratados com 200 mg/kg, durante três dias consecutivos, morreram até o 12º
dia, sendo que apenas 7% destes animais recuperaram-se da diarréia e
sobreviveram.
Com a finalidade de verificar se houve infiltração de células inflamatórias
na lesão intestinal induzida pelo CPT-11, determinou-se no intestino a atividade de
MPO, uma enzima presente nos grânulos azurófilos dos neutrófilos e que é utilizada
como marcador indireto da infiltração neutrofílica local (BRADLEY et al., 1982).
Observou-se que o CPT-11 foi capaz de aumentar a atividade de MPO,
demonstrando a combinação da injúria epitelial com a infiltração de neutrófilos na
mucosa, o que confirma a hipótese da fase inflamatória no processo patológico da
mucosite documentado por Sonis em vários estudos (SONIS, 2004, SONIS et al.,
2004a) e descrito por Duncan e Grant (2003). Assim, a mucosite induzida por
agentes quimioterápicos provoca destruição de células epiteliais e subseqüente
indução de resposta inflamatória local (SONIS et al., 2004a; RUBEINSTEIN et al.,
2004). Os neutrófilos representam um componente central da resposta imune, que é
importante nos mecanismos como fagocitose, produção de espécies reativas de
oxigênio (ROS) e ativação de mediadores inflamatórios (REAVES et al., 2005).
Várias evidências indicam que a resposta inflamatória à radiação e/ou à
quimioterapia tem um papel importante na patogênese da mucosite (KEEFE, 2004;
GIBSON; KEEFE, 2006; LALLA et al., 2006; BÜLTZINGSLÖWEN et al., 2006).
128
Muitos estudos mostram que mediadores inflamatórios participam no
desenvolvimento da lesão e no processo de cicatrização intestinal (SARTOR, 1994;
WILLIAMS, 2001; TRIFAN et al., 2002; DE KONING et al., 2006). Diante de tal fato,
decidiu-se avaliar o envolvimento de algumas citocinas como TNF-α, IL-1β e KC na
fisiopatologia dos eventos inflamatórios da mucosite intestinal induzida pelo CPT-11.
Considerando as fases da mucosite intestinal descritas por Duncan e
Grant (2003), as alterações observadas por nós no sétimo dia experimental
caracterizam a fase inflamatória da mucosite intestinal, portanto este constitui um
período importante para o estudo dos mediadores inflamatórios envolvidos na lesão
intestinal provocada pelo tratamento com o CPT-11. Resolveu-se avaliar também os
níveis intestinais de citocinas no quinto dia experimental, por este ser anterior ao
aparecimento do principal sintoma da mucosite, a diarréia.
O tratamento com CPT-11 aumentou significativamente os níveis
intestinais de TNF-α no quinto e sétimo dia. Entretanto, citocinas como IL-1β e KC
(homóloga à IL-8 dos humanos) apresentaram aumento significativo nos animais
sacrificados no sétimo dia, que corresponde ao período em que as lesões intestinais
estão severas. Observou-se através da imunohistoquímica que a expressão
aumentada de TNFα e IL-1β foi principalmente no epitélio de revestimento e nas
células da lâmina própria.
Provavelmente, na mucosite intestinal citocinas como TNF-α e IL-1β
provocam sinais moleculares que amplificam a lesão. A ativação de TNF-α parece
ocorrer antecipadamente. Esta cascata de citocinas na lesão induzida pelo CPT-11 é
vista em outros estudos. Experimentalmente, é claramente demonstrado que o
TNF-α aparece precocemente na resposta inflamatória (GOWEN et al., 1988; FONG;
LOWRY, 1990). Sabe-se também que IL-1α, IL-1β e TNF-α estimulam secreção de
outras citocinas, dos metabólitos do ácido araquidônico e das proteases por
macrófagos, neutrófilos, células do músculo liso, fibroblastos e células epiteliais
(SARTOR, 1994).
Já foi previamente descrito que a IL-8 é produzida em resposta a
mediadores inflamatórios como IL-1β e TNF-α e esta parece ter uma participação
vital na indução da lesão tecidual induzida pela inflamação (LARSEN et al., 1989).
Confirmando estes achados, demonstrou-se que IL-8 circula em níveis máximos
após a atividade de TNF-α (MARTICH et al., 1991). Estas três citocinas (IL-1, IL-8 e
TNF-α) induzem dor inflamatória pela síntese de PGs (THOMAZZI et al., 1997). Na
129
cascata da inflamação, IL-1β e TNF-α estimulam a transcrição do gene de COX-2
(AKARASEREENONT et al., 1995; DIAZ et al., 1998).
Na mucosite intestinal, alguns autores avaliaram o envolvimento de
citocinas na patogênese do processo. Williams (2001) destaca que as citocinas
inflamatórias como IL-1, IL-6, TNF-α, IFN-α e IL-2 contribuem substancialmente para
a severidade e a manutenção da mucosite intestinal induzida por quimioterápicos.
Gibson et al. (2002b) observaram que a IL-11 atenua as alterações morfométricas
em modelo de mucosite induzida por MTX. De Koning et al. (2006) observaram que
macrófagos de camundongos tratados com MTX produziram IL-10 e TNF-α após
estímulo com LPS. Assim, a produção de TNF-α parece contribuir para a destruição
da mucosa, enquanto IL-10 apresenta efeito protetor, pois nos animais com
deficiência de IL-10 observou-se maior perda de peso e maior destruição intestinal.
Recentemente, demonstrou-se que a mucosite intestinal induzida pelo CPT-11 é
acompanhada pelo aumento nos níveis de TNF-α, IL-1β, IFN-γ e IL-6 (HU et al.,
2006; YANG et al., 2006a).
Na mucosite, as citocinas parecem não só ter um papel na destruição da
mucosa, mas também amplificam a lesão. O TNF-α ativa NF-κB e inicia a cascata da
MAPK (SONIS, 2004), que sinaliza a destruição intestinal induzida pelo CPT-11 por
aumentar a expressão das caspases (BOWEN et al., 2007).
Apesar de nenhum estudo ter avaliado o papel da KC na mucosite
intestinal, nossos resultados demonstram que ela parece ser importante no
desenvolvimento da lesão. Esta quimiocina é considerada como agente indutor do
processo inflamatório intestinal, reconhecido como potente fator quimiotático de
neutrófilos (WILSON; GIBSON, 1997; REAVES et al., 2005).
Portanto, a mucosite intestinal induzida pelo CPT-11 em camundongos
parece ser um processo complexo, que tem a participação de citocinas como TNF-α,
IL-1β e KC (IL-8). NF-kB pode ser o condutor importante, pois modifica a expressão
de citocinas e enzimas. Sua ativação resulta em upregulation de uma variedade de
genes e subseqüente produção de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1β, IL-6 e
IL-8) e de COX-2 (KEIFER et al.
, 2001; SONIS et al., 2004a; SONIS, 2004; YEOH et
al., 2005; LOGAN.et al., 2007). Sabe-se que a inibição de NF-kB melhora a
inflamação (KEIFER et al., 2001).
O aumento da expressão de TNF-α e IL-1β também se associa com o
desenvolvimento de mucosite oral (RUBEINSTEIN et al., 2004; SONIS, 2004; SONIS
130
et al., 2004a). Portanto, estes resultados corroboram a hipótese atualmente
defendida por alguns autores, que afirmam que a patobiologia da mucosite oral
parece ser também aplicada à mucosite intestinal (RUBEINSTEIN et al., 2004;
KEEFE, 2004; KEEFE, 2006; LALLA et al., 2006; BOWEN et al., 2006; PETERSON
et al., 2006). Sabe-se atualmente que a mucosite oral resulta de uma série de fatores
dinâmicos e da interação de eventos celulares e moleculares que envolvem todos os
elementos da mucosa (SONIS, 2004; SONIS et al., 2004a).
Um outro aspecto importante avaliado em nosso estudo foi a expressão de
iNOS por imunohistoquímica. Os resultados mostraram um aumento significante na
marcação de iNOS no intestino de camundongos Swiss tratados com CPT-11, o que
sugere que o NO pode ser um mediador importante na evolução na mucosite
intestinal induzida por esta droga.
O papel de NO na patogênese de condições inflamatórias é bem
documentado pela literatura. Experimentalmente, demonstrou-se a participação de
NO na destruição urotelial e nos eventos inflamatórios que acompanham a cistite
hemorrágica induzida pela ciclofosfamida (SOUZA-FILHO et al., 1997; RIBEIRO et
al., 2002). Recentemente, em pesquisa desenvolvida no LAFICA, Leitão et al. (2007)
demonstraram que o aumento na expressão de iNOS nas bochechas de hamsters
submetidos à mucosite oral por 5-FU associou-se com a destruição tecidual e com os
eventos inflamatórios. Observaram ainda, que o bloqueio da produção de NO teve
um efeito protetor nas lesões que acompanham a mucosite oral, tais como edema,
infiltrado de células inflamatórias, hemorragia, formação de úlceras e abcessos e
redução de infiltração de neutrófilos.
Em nosso estudo, o aumento na expressão de iNOS ocorreu juntamente
com o aumento de citocinas como TNF-α, IL-1β e KC. Estes achados confirmam
estudos anteriores que mostram que citocinas pró-inflamatórias como TNF-α e IL-1β
estimulam a produção de iNOS em modelo de pancreatite e de cistite hemorrágica
(GOMEZ-CAMBRONERO et al., 2000; RIBEIRO et al., 2002).
O NO é mediador da citotoxicidade e eventos inflamatórios (MONCADA et
al., 1997). Sabe-se que no intestino, a enzima iNOS contribui para inflamação
intestinal, induzindo apoptose e estimulando a secreção intestinal (KUBES;
McCAFFERTY, 2000; DIJKSTRA et al., 2004). Entretanto, in vitro, Sakai et al. (2002)
verificaram que o aumento da secreção de cloro induzido pelo CPT-11 no cólon
isolado de ratos não é mediado pela produção de NO.
131
Observou-se ainda uma marcação moderada de iNOS no epitélio intestinal
de animais não submetidos à mucosite intestinal, o que nos leva a acreditar que a
enzima iNOS pode ser constitutivamente expressa no epitélio intestinal normal em
resposta à flora bacteriana local, mas estudos posteriores são necessários para
confirmar esta hipótese. Leitão et al. (2007) também relataram iNOS no epitélio das
bochechas de hamsters não submetidos à mucosite oral.
Diante da confirmação da participação de citocinas e NO na lesão
intestinal induzida pelo CPT-11, buscou-se no presente trabalho avaliar drogas que
possuem o potencial imunomodulador, com o objetivo de se estabelecer o papel
destes mediadores no desenvolvimento da mucosite intestinal induzida pelo CPT-11,
bem como buscar possibilidades terapêuticas para o seu controle.
Na presente investigação, nós demonstramos que a PTX reduziu
significativamente as lesões intestinais, melhorando a recuperação das criptas e
vilos. As menores doses de PTX (1,7 e 5 mg/kg) apresentaram um melhor efeito
protetor das estruturas intestinais e reduziram significativamente a gravidade da
diarréia induzida pelo CPT-11. Entretanto, a maior dose utilizada (15 mg/kg) não teve
efeito redutor da diarréia e nem do grau de mucosite intestinal graduada através do
escore histológico, apesar desta dose ter também melhorado a recuperação das
criptas.
Os efeitos microscópicos foram associados com a redução da infiltração
de neutrófilos detectados através da atividade de MPO. Esta atividade da PTX é
consistente com prévios estudos que mostram que a droga inibiu a migração de
neutrófilos na cavidade peritoneal induzida pela toxina do Clostridium difficile
(CARNEIRO-FILHO et al., 2001) e na cavidade sinovial induzida por ovalbumina
(BOMBINI et al., 2004).
Entretanto, a PTX não foi capaz de reverter a leucopenia e nem a
alteração de peso nos animais submetidos à mucosite experimental, fato já
observado por Lima (2004). Também, não apresentou habilidade de melhorar a
sobrevida dos animais, o que de certa maneira era esperado, visto que ocorreu
melhora nas lesões intestinais.
Um grande número de investigações tem descrito as propriedades
antiinflamatórias da PTX, embora, o seu efeito na diarréia induzida pelo CPT-11 não
tenha sido estudado. O tratamento com dose única com PTX (12 mg/kg) atenuou o
edema e a inflamação na pancreatite experimental (GÓMEZ-CAMBRONERO et al.,
132
2000). Estudos experimentais realizados em nosso laboratório demonstraram que a
PTX (15, 45 e 135 mg/kg) inibiu em ratos o edema de pata induzida pela toxina A do
Clostridium difficile (CARNEIRO-FILHO et al., 2001), protegeu ratos da mucosite
intestinal induzida por MTX (LIMA, 2004) e hamsters da mucosite oral induzida por 5-
FU, diminuindo a intensidade da hiperemia, edema, eritema e infiltrado de células
inflamatórias (LIMA et al., 2005). Clinicamente, demonstrou-se que a administração
de PTX, em pacientes submetidos a transplante de medula, reduziu a severidade da
mucosite e a necessidade de nutrição parenteral total (NPT) (BIANCO et al., 1991).
Entretanto, Ferrà et al. (1997) não observaram efeito benéfico com a administração
de PTX nestes pacientes.
A PTX no modelo por nós utilizado teve melhor efeito antiinflamatório nas
menores doses, o que já foi descrito em outros trabalhos. Abdel-Salam et al. (2003)
verificaram que a administração única de PTX (36 e 72 mg/kg) em ratos 30 minutos
antes da injeção de carragenina reduziu edema de pata. Entretanto, a PTX quando
usada em doses maiores (144, 200 e 300 mg/kg) inicialmente suprimiu a resposta
inflamatória por um período de duas horas, havendo após este período retorno da
inflamação. Esta redução da atividade antiinflamatória pode ser decorrente do seu
efeito vasodilatador que leva ao aumento do volume intraluminal, da pressão
intravascular e da permeabilidade microvascular. E, ainda altas doses desta droga
ativa PGI
2
e NO, contribuindo na continuidade da resposta inflamatória (POHANKA;
SINZINGER, 1986). Além disso, a PTX apresenta efeito regulador de IL-10, uma
citocina antiinflamatória, que parece ser dependente da concentração da droga. In
vitro e in vivo, concentrações maiores de PTX provocam inibição de IL-10, enquanto
a menor concentração induz uma maior síntese desta citocina (D’HELLENCOURT et
al., 1996; MARCINKIEWICZ et al., 2000; JI et al., 2004). A IL-10 tem sido descrita
como uma citocina reguladora na mucosite intestinal induzida por MTX, restringindo a
excessiva exacerbação do processo patológico (DE KONING et al., 2006).
Provavelmente, o efeito terapêutico observado na presente pesquisa em doses
menores que os relatados por outros autores seja pelo fato do nosso modelo utilizar
camundongos, enquanto nos outros trabalhos a PTX foi administrada em ratos e
hamsters.
O efeito protetor da PTX encontrada no presente estudo pode ser
explicado pela sua capacidade de inibir a produção de citocinas inflamatórias. É
demonstrado na literatura que a PTX reduz citocinas como TNF-α (SULLIVAN et al.,
133
1988; STRIETER et al., 1988; NEUNER et al., 1994; FUNK et al., 1995; HUIZINGA et
al., 1996; SCHMIDT-CHOUDHURY et al., 1996; VAN FURTH et al., 1997; REIMUND
et al., 1997; SILVA et al., 2000; MARCINKIEWICZ et al., 2000; HADDAD et al., 2002;
JI et al., 2004), IL-1β (NEUNER et al., 1994; VAN FURTH et al., 1997; REIMUND et
al., 1997; SILVA et al., 2000) e IL-8 (MARTICH et al., 1991; NEUNER et al., 1994;
GUTIERREZ-REYES et al., 2006). No presente estudo, demonstramos que o
tratamento com PTX (1,7 mg/kg) reduziu os níveis intestinais de TNF-α, IL-1β e KC.
Foi também observado que o tratamento com PTX reduziu
significativamente a marcação de iNOS principalmente nas células da lâmina própria.
Estes achados estão de acordo com os descritos por Gómez-Cabronero et al. (2000),
que observaram na pancreatite experimental aumento na produção de NO que foi
prevenida com o tratamento com PTX. Beshay et al. (2001) também observaram
supressão dos níveis de expressão da iNOS in vitro e in vivo com o uso da PTX. A
menor produção de NO nos animais tratados com PTX pode ser em conseqüência da
redução da infiltração de neutrófilos, devido à redução de citocinas inflamatórias
como TNF-α, conforme encontrado por nós e por outros autores (GOMEZ-
CAMBRONERO et al., 2000).
O TNF-α foi a primeira citocina observada em níveis elevados na lesão
intestinal induzida pelo CPT-11. Além disso, através da imunohistoquímica é evidente
a sua forte marcação no epitélio de revestimento intestinal e nas células da lâmina
própria, mostrando sua importante participação na patogênese do processo. Assim,
resolveu-se testar o efeito da TLD na mucosite intestinal induzida pelo CPT-11, a fim
de se verificar o papel de TNF-α nesta lesão intestinal e verificar o potencial
terapêutico desta droga. A ação parcial e especifica da TLD para TNF-α sugere que
esta droga pode ser utilizada no tratamento de condições inflamatórias em que
TNF-α induz efeitos tóxicos, sem que a resposta imune seja totalmente suprimida
(MOREIRA et al., 1993; KLAUSNER et al., 1996).
Os resultados mostraram que a TLD não reverteu significativamente a
intensidade da diarréia induzida pelo CPT-11. Entretanto, a maior dose utilizada
(60 mg/kg) alterou de forma significativa alguns aspectos histológicos da mucosa
duodenal, avaliada pelos escores propostos por Woo et al. (2000) e pela
morfometria. O maior aprofundamento das criptas no segmento duodenal demonstra
uma recuperação na mucosa intestinal, assim provavelmente, a TLD estimulou a
proliferação de células das criptas. Talvez a redução da resposta inflamatória tenha
134
antecipado a fase de cicatrização da mucosite intestinal. Os demais segmentos
intestinais não foram protegidos pelo tratamento com TLD, o que talvez explique a
ineficácia da droga em prevenir a diarréia.
Um possível mecanismo que explicaria tais resultados seria a supressão
do TNF-α, considerado agente importante na mucosite (SONIS, 2004; SONIS et al.,
2004a), o que foi confirmado em nosso trabalho, visto que se observou que a TLD
reduziu significativamente os níveis intestinais de TNF-α determinado por ELISA e a
sua marcação nas células da lâmina própria e no epitélio de revestimento avaliado
por imunohistoquímica. É bem documentado pela literatura que a TLD reduz TNF-α
(SAMPAIO et al., 1991; MOREIRA et al., 1993; MOREIRA et al., 1997; TAVARES et
al., 1997; KIM et al., 2004). In vitro, a TLD inibiu a síntese de TNF-α em cultura de
monócitos humanos estimulados com LPS e produtos de M. leprae (SAMPAIO et al.,
1991, MOREIRA et al., 1993) e em cultura de macrófagos obtida do lavado bronco-
alveolar de pacientes com tuberculose (TAVARES et al., 1997). In vivo, após
administração de TLD observou-se menor síntese de TNF-α após o estímulo com
LPS para induzir choque séptico (MOREIRA et al., 1997).
Em nosso estudo, a TLD não inibiu IL-1β e KC, o que pode explicar o fato
de TLD não ter reduzido a severidade da diarréia em nosso modelo experimental, já
que IL-1β parece ser um estimulador primário da diarréia por inibir a absorção de
água e cloro (SARTOR, 1994; KREYDIYYEH; AL-SADI, 2002).
Em vários estudos, a inibição induzida por TLD mostrou ser específica
para TNF-α (SAMPAIO et al., 1991; MOREIRA et al., 1993; TAVARES et al., 1997;
KIM et al., 2004). A literatura relata que a TLD não afetou os níveis de IL-1β
(SAMPAIO et al.,1991; MOREIRA et al., 1993; MOREIRA et al., 1997; BAUDITZ et
al., 2002; KIM et al., 2004) e IL-8 (KIM et al., 2004). Entretanto, outros estudos
demonstraram que ela também suprime a produção de IL-12 em células
mononucleares de sangue periférico (PBMCs), em monócitos humanos (MOLLER et
al., 1997) e em indivíduos com doença de Crohn (BAUDITZ et al., 2002). Corral e
Kaplan (1999) descrevem que a TLD tem um duplo efeito nos níveis de IL-12,
reduzindo esta citocina quando PBMCs são estimulados por LPS, embora aumente
quando estas células são ativadas via receptor de células T. In vivo, a TLD inibiu os
níveis séricos TNF-α em 93% e IL-6 em 50%, bem como estimulou a produção de
IL-10 (MOREIRA et al., 1997).
Outro aspecto que deve ser destacado, é que a TLD não reduziu
135
significativamente a marcação de iNOS de acordo com os critérios de Yeoh et al.
(2005), mostrando que a ativação de IL-1β pode um fator importante na expressão
desta enzima, conforme já mencionado na literatura (GOMEZ-CAMBRONERO et al.,
2000).
Em nosso estudo, a TLD (15, 30 e 60 mg/kg) causou redução significativa
do número de neutrófilos na mucosa intestinal dos animais sacrificados no sétimo
dia, quantificados pela atividade da MPO. Assim, pode-se concluir que a TLD de
alguma forma reduziu a resposta inflamatória local. Outras pesquisas relatam o efeito
da TLD na quimiotaxia de leucócitos, que é o mecanismo responsável pelo influxo
destas células no local do processo inflamatório (FAURE et al., 1980;
DUNZENDORFER et al., 1997). Faure et al. (1980) verificaram que a pré-incubação
de PMN com TLD inibiu significativamente a quimiotaxia. In vitro, Dunzendorfer et al.
(1997) demonstraram que a TLD afetou citocinas e inibiu a transmigração de
neutrófilos induzida por LPS através da ação direta nas células endoteliais. Em
modelo de colite experimental, a TLD causou substancial redução da atividade de
MPO na mucosa intestinal (MAZZON et al., 2005), e reduziu a severidade dos sinais
histológicos e de permeabilidade intestinal (MAZZON; CUZZOCREA, 2006).
Em modelos animais, várias pesquisas realizadas por nosso grupo
demonstraram que a TLD possui potente ação antiinflamatória e analgésica.
Verificou-se que a TLD reduziu o edema de pata induzida pela toxina da cólera
(VIANA et al., 2002), diminuiu as alterações macroscópias e a neutrofilia na mucosite
oral induzida por 5-FU em hamsters (LIMA, 2004; LIMA et al., 2005), e melhorou os
aspectos histológicos da mucosa intestinal de ratos submetidos à mucosite induzida
por MTX (LIMA, 2004). A TLD também mostrou reduzir a resposta contorciva
induzida por ácido acético e zimosan (RIBEIRO et al., 2000) e a incapacitação
articular induzida por zimosan (VALE et al., 2006).
Os estudos que abordam o efeito de TLD na diarréia induzida por CPT-11
são ainda controversos. Clinicamente tem-se demonstrado uma redução da
toxicidade gastrintestinal do CPT-11 quando este é administrado em combinação
com a TLD em pacientes com diagnóstico de câncer colorretal (GOVINDARAJAN,
2000; GOVINDARAJAN et al., 2000; TCHEKMEDYIAN, 2002). Segundo
Govindarajan et al. (2000), este efeito pode ser explicado pelo fato da TLD inibir a
síntese de TNF-α, aumentar células responsáveis pela imunidade humoral e reduzir
136
a imunidade celular. A TLD pode ainda ter atividade na redução da secreção de
cálcio e potássio pelo efeito direto da redução de TNF-α ou pela inibição da COX.
Em ratos, a TLD melhorou as lesões intestinais e inibiu a produção
intestinal de citocinas (TNF-α, IL-1β, IL-6 e IFN-γ), o processo de apoptose e a
diarréia induzida pelo CPT-11 (YANG et al., 2006a). Outros estudos mostraram que a
associação da TLD com CPT-11 melhora os sintomas da toxicidade gastrintestinal
pela redução da conversão do CPT-11 em SN-38 e aumento da detoxificação do
metabólito ativo (SN-38), via processo de glicuronidação (YANG et al., 2006a; YANG
et al., 2006b). Entretanto Allegrini et al. (2006), em pacientes com diagnóstico de
câncer avançado, observaram redução do metabolismo do CPT-11 e de SN-38
quando o CPT-11 foi administrado em associação com a TLD, mas não se observou
redução significativa na incidência de diarréia.
Em relação ao efeito da TLD na variação ponderal, observou-se que este
fármaco no protocolo aqui utilizado não reduziu, de forma estatisticamente
significante, a perda de massa corpórea dos animais com mucosite intestinal
induzida pelo CPT-11. Era esperado que esta droga realmente não apresentasse
efeito protetor na variação de massa corpórea, visto que ela não suprimiu a diarréia e
nem o achatamento dos vilos nos animais submetidos à mucosite intestinal por CPT-
11, fatores responsáveis pela desidratação e redução de absorção de nutrientes
(DUNCAN; GRANT, 2003; SONIS et al., 2004a; RUBEINSTEIN et al., 2004;
AVRITSCHER et al., 2004; GIBSON; KEEFE, 2006). Além disso, o efeito sedativo da
TLD (CALABRESE; FLEISCHER Jr., 2000; ERIKSSON et al., 2001; MATTHEWS;
MAcCOY, 2003) pode ter contribuído na redução da ingestão de alimentos e líquidos,
sendo mais um fator agravante da perda de peso nestes animais. Contrariando estes
resultados, em estudo clínico em pacientes com câncer colorretal recebendo
quimioterapia com CPT-11, Govindarajan et al. (2000) mostraram que a associação
de CPT-11 com TLD evitou a deterioração do estado nutricional decorrente dos
efeitos tóxicos do CPT-11 no trato gastrintestinal, melhorando a qualidade de vida
nestes pacientes. Experimentalmente, Lima (2004) não observou melhora de peso do
tratamento com TLD em hamsters com mucosite oral e ratos com mucosite intestinal.
Entretanto, Yang et al. (2006a) relatou que a TLD atenuou a perda de peso a partir
do sexto dia experimental em ratos tratados com CPT-11.
Apesar de alguns estudos mostrarem ação positiva da TLD na proteção de
estados caquéticos pelo seu efeito redutor de TNF-α (GOVINDARAJAN et al., 2000;
137
MATTHEWS; MAcCOY, 2003), o papel exato da TLD na caquexia permanece pouco
elucidado. Não existem relatos consistentes do efeito benéfico para a caquexia e
seus sintomas associados quando o medicamento é administrado isoladamente
(ZHOU et al., 2002).
Em relação ao efeito da TLD nos níveis de leucócitos totais, evidenciou-se
que esta não foi capaz de reverter significativamente a leucopenia induzida pelo
tratamento com CPT-11. Esta condição descrita na literatura com uso de CPT-11
(ROSATI et al., 2002; ENZINGER et al., 2005) e observada por nós, possivelmente
não foi prevenida com uso da TLD devido à sua própria capacidade de induzir
leucopenia (CALABRESE; FLEISCHER Jr., 2000; MATTHEWS; McCOY, 2003). Este
fato merece atenção, visto que a leucopenia é um fator de risco para infecções
secundárias que podem provocar translocação bacteriana e septicemia (WOO et al.,
2000; SONIS, 2004; AVRITSCHER et al., 2004).
Um outro aspecto avaliado foi o potencial da TLD em melhorar a sobrevida
de animais submetidos à mucosite intestinal por CPT-11. Nossos resultados
mostraram que esta droga não foi capaz de reverter significativamente a mortalidade
observada no modelo de mucosite, o que era esperado já que a TLD não teve um
efeito protetor consistente nas lesões observadas e ainda, pelo fato desta droga
potencializar o efeito leucopênico do CPT-11, conforme comentado anteriormente.
Pode-se concluir que a TLD apresentou no nosso estudo um efeito
protetor moderado das alterações intestinais induzidas pelo CPT-11. Este fato nos
leva a supor que a mucosite induzida pelo CPT-11 é um processo multifatorial, onde
existe a participação de vários mediadores inflamatórios. Desta forma, TLD não se
mostrou eficaz como tratamento da mucosite intestinal em camundongos Swiss, já
que não reverteu o principal sintoma, a diarréia. O efeito positivo de PTX foi
consistente pelo fato desta droga interferir nos níveis de todas estas citocinas. Assim,
o efeito parcial da TLD foi pelo fato deste fármaco ser inibidor mais específico para
TNF-α e mostra que IL-1β e KC são cruciais no desenvolvimento da lesão. Estes
resultados sugerem que na resposta inflamatória induzida pelo CPT-11, a citocina
inicialmente ativada é o TNF-α que induz a ativação de IL-1β, que juntos ativam KC e
NO.
Sugere-se também que a resposta inflamatória da mucosite intestinal
provocada pelo tratamento com CPT-11 pode ser acompanhada pela liberação de
prostanóides como PGE
2
. A biossíntese de PGs e TX a partir do ácido araquidônico
138
depende da ação da enzima COX (VANE, 1971; VANE et al., 1990; VANE et al.,
1998; HINZ; BRUNE, 2002; VANE; BOTTING, 2003). A COX-1 está presente na
maioria das células como enzima constitutiva, enquanto a COX-2 é uma enzima com
expressão predominantemente no processo inflamatório, apesar de ser expressa em
pequenas quantidades constitutivamente (VANE et al., 1998; HINZ; BRUNE, 2002).
No trato gastrintestinal, PGs são mediadores de vários processos fisiológicos e
patológicos (TAN et al., 2000; WALLACE, DEVCHAND, 2005; SHAO et al., 2006).
No presente estudo verificou-se através de imunohistoquímica uma
expressão aumentada de COX-2 associada à destruição histopatológica resultante
do tratamento com CPT-11, confirmando a presença e o envolvimento das PGs na
patogênese da mucosite intestinal induzida pelo CPT-11. As áreas de maior
marcação de COX-2 correspondem às criptas e ao epitélio de revestimento. A
especificidade da marcação de COX-2 nas criptas encontrada em nosso estudo é
similar ao observado por outros autores (YEOH et al., 2005). As criptas são zonas
proliferativas do intestino (WILSON; GIBSON, 1997; MAHIDA et al., 1997; STURM;
DIGNASS, 2002). Existem evidências que a atividade de COX-2 é um fator
importante nos mecanismos de proliferação intestinal e, portanto, possuem um papel
na recuperação do epitélio intestinal (TAN et al., 2000; WALLACE; DEVCHAND,
2005; SHAO et al., 2006).
Em modelo animal, Sonis et al. (2004b) demonstraram que a radiação
provoca upregulation de COX-2 nos fibroblastos e no endotélio vascular da mucosa
oral e que a geração de COX-2 ocorre paralelamente com a formação de ulcerações.
Observou-se ainda que a COX-2 parece não ser o condutor primário da mucosite
oral, mas é agente amplificador da lesão, possivelmente aumentando a duração e/ou
a severidade das lesões ulcerativas. É possível que isto ocorra via ativação de
NF-κB, que tem papel também nos níveis de citocinas como TNF-α e IL-1β.
Posteriormente, Logan et al. (2007) demonstraram que a expressão de NF-κB e
COX-2 teve aumento significativo na mucosite oral de pacientes em tratamento com
agentes quimioterápicos. Ao nível intestinal, Yeoh et al. (2005), analisando por
imunohistoquímica a expressão de NF-κB e COX-2 no tecido colorretal de 28
pacientes com câncer, concluíram que a destruição histopatológica que ocorreu após
o tratamento radioterápico acompanhou o aumento da expressão de NF-κB e COX-2.
Quanto ao papel das PGs na mucosite intestinal induzida pelo CPT-11,
alguns estudos têm apontado que a administração do CPT-11 associa-se ao
139
aumento da síntese de prostanóides, particularmente PGE
2
e TXA
2
que podem ser
mediadores importantes na diarréia provocada por esta droga (SAKAI et al., 1995 e
1997; KASE et al., 1997, TRIFAN et al., 2002).
Em cólon distal de ratos montado em câmaras de Üssing, Sakai et al.
(1995 e 1997) demonstraram que o CPT-11 e o SN-38 aumentam a secreção de
cloro, via ativação de eicosanóides. Observou-se também que a indometacina, os
inibidores de TXA
2
sintase e os bloqueadores do receptor de TXA
2
foram efetivos no
controle da secreção de cloro, demonstrando que TXA
2
parece ser um mediador
importante no evento.
Deve-se salientar que embora similaridades existam entre os
experimentos in vitro e in vivo, as condições são completamente distintas e as
conclusões obtidas através dos resultados in vitro não podem ser totalmente
aplicadas nos estudos in vivo, nos quais existem complexas interações celulares e
humorais que afetam a expressão da resposta inflamatória. O modelo apresentado
por Sakai et al. (1995, 1997) talvez se aplique mais consistentemente à diarréia
precoce, desta forma, provavelmente o aumento de TXA
2
seja observado na gênese
desta diarréia.
Confirmando esta hipótese, Kase et al. (1997) observaram que a diarréia
precoce induzida pelo CPT-11 foi acompanhada pelo aumento de PGE
2
no cólon
descendente e que a administração de atropina inibiu a sua ocorrência e normalizou
os níveis de PGE
2
, entretanto, o uso de indometacina falhou no seu controle. O
aumento nos níveis de PGE
2
acompanhado de baixa absorção de água e eletrólitos
no cólon também foi observado na diarréia tardia induzida pelo CPT-11. As
alterações patológicas no trato intestinal acompanharam o aumento de PGE
2
, que
parece estar envolvida na cicatrização da mucosa injuriada.
Em vista do envolvimento de PGs na patogênese da mucosite intestinal
induzida pelo CPT-11, testou-se um inibidor seletivo para COX-2, o CLX. Nossos
resultados demonstraram que o CLX nas doses utilizadas não reverteu
significativamente o grau de diarréia, nem tampouco a infiltração neutrofílica
provocada pelo tratamento com CPT-11. Além disso, o CLX não reduziu a
leucopenia, a perda de massa corpórea e não alterou a taxa de sobrevida dos
animais tratados com CPT-11.
Analisando estes resultados em conjunto, pode-se concluir que o CLX não
foi eficiente na prevenção e tratamento da mucosite intestinal no modelo por nós
140
testado. Este fato nos leva a supor que as doses utilizadas podem não terem sido
suficientes para a redução significativa dos níveis de PGs sintetizadas via COX-2; ou
que o papel das PGs na gênese do processo patológico tenham papel secundário e
que outros mediadores inflamatórios sejam integrantes na cascata inflamatória. Por
outro lado, existem evidências que a atividade de COX-2 é um fator importante nos
mecanismos de proliferação intestinal e, consequentemente, esta atividade é
importante nos mecanismos de reparo do epitélio intestinal (TAN et al., 2000;
WALLACE; DEVCHAND, 2005).
Observou-se também que o tratamento com o CLX não reduziu a
marcação de COX-2, resultado compatível com outros estudos que mostram que o
CLX inibe COX-2 através de uma ligação no sítio ativo da enzima e não envolve
mecanismos que interfere em sua expressão (LEVI-ARI et al., 2007).
Alguns estudos referem que PGs participam no curso evolutivo da
mucosite oral (SONIS et al., 2004a e 2004b; SONIS, 2004; LOGAN et al., 2007) e
mucosite intestinal (TRIFAN et al., 2002; SAKAI et al., 1995 e 1997; KASE et al.,
1997; YEOH et al., 2005). No entanto, o bloqueio do processo por DAINES ainda
apresenta resultados controversos.
Um estudo piloto avaliou o efeito do flurbiprofeno na mucosite induzida
pela irradiação na região da cabeça e pescoço. Neste estudo não se observou
diferença significativa na severidade ou na duração da evolução da mucosite nos
grupos tratados e não-tratados com DAINES quando este foi administrado na
semana anterior ao início da radioterapia. No entanto, pacientes que receberam o
antiinflamatório por duas semanas após o início do tratamento apresentaram melhora
significativa no grau de mucosite, demonstrando que a continuidade da terapia pode
ser uma ferramenta importante para o controle da mucosite (STOKMAN et al., 2005).
In vivo, Trifan et al. (2002) mostraram que a co-administração de um
inibidor da COX-2 (CLX) com CPT-11 em ratos melhorou o seu efeito antitumoral,
reduziu a severidade da diarréia provocada pela droga e diminuiu a perda de peso
em ratos. No protocolo, a mucosite intestinal foi induzida através de duas doses de
CPT-11 (150 mg/kg – i.v.), e o CLX foi testado nas doses de 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 50
e 150 mg/kg administrado diariamente durante oito dias consecutivos por gavagem.
A redução da diarréia foi efetiva entre as doses de 10 a 50 mg/kg, sendo que a
melhor resposta foi observada quando se utilizou a dose 30 mg/kg. Por outro lado, a
indometacina, que é um inibidor seletivo de COX-1, não teve efeito antidiarréico em
141
nenhuma das doses testadas (1, 3 e 10 mg/kg). Observou-se também que o aumento
da expressão de COX-2 é associado com o aumento nos níveis de PGE
2
no cólon no
quinto dia após o início do tratamento com CPT-11, confirmando o seu papel como
mediador da diarréia tardia induzida pela droga. Pergunta-se, entretanto, por que
neste modelo o CLX não foi eficaz nas doses maiores?
Duas explicações podem ser sugeridas para explicar a ineficácia do
tratamento com CLX em altas doses. Primeiro, o CLX em altas concentrações
provoca a ativação de NF-κB, que é fator de transcrição de genes pró-inflamatórios
como COX-2 e TNF-α (NIEDERBERGER et al., 2001). A outra explicação é
abordada em alguns trabalhos recentes, que têm sugerido que a COX-2 também tem
papel importante nos mecanismos de defesa e proteção da mucosa do trato
gastrintestinal, modulando a habilidade de resistência e resposta a injúria,
contribuindo significativamente para a resolução da inflamação do trato gastrintestinal
(GRISHIN et al., 2006; WALLLACE; DEVCHAND, 2005).
Além disso, o uso de inibidores específicos de COX-2 associa-se com a
incidência de colite isquêmica (RADAELLI et al., 2005), que pode interferir no curso
evolutivo da mucosite intestinal. TXA
2
, maior produto da COX-1, causa agregação
plaquetária e vasoconstrição. Já a síntese de PGI
2
, largamente mediada por COX-2,
é um potente inibidor plaquetário e agente vasodilator. Portanto, os inibidores
específicos da COX-2 agem preferencialmente na inibição endotelial de PGI
2
sem a
inibição da formação de TXA
2
, provocando um desbalanço entre ambos, que pode
ser responsável pelo aumento de eventos tromboembólicos.
Em nosso laboratório, quando se estudou o efeito do CLX na mucosite
intestinal induzida pelo MTX verificou-se que as doses menores (7,5 e 15 mg/kg) não
promoveram proteção do epitélio intestinal. Por outro lado, a dose de 30 mg/kg
apesar de ter se mostrado útil do ponto de vista morfológico não foi eficiente na
prevenção dos danos (LIMA, 2004).
Analisando, portanto, os nossos resultados à luz dos mostrados por outros
autores, fica evidente que a ineficácia observada com o uso de CLX encontrada em
nosso estudo demonstra que a expressão aumentada de COX-2 induzida pelo CPT
parece não ser o mecanismo principal da diarréia induzida pelo CPT-11, assim,
provavelmente outros mediadores inflamatórios devem ser alvos mais centrais.
Ressalte-se também que os estudos aqui discutidos utilizam ratos e o nosso
142
camundongo, o que pode explicar alguns aspectos discrepantes nos resultados
apresentados.
A Figura 37 ilustra um modelo hipotético proposto, a luz dos resultados
encontrados no presente trabalho, para a cascata dos mediadores inflamatórios
envolvidos na mucosite intestinal induzida pelo CPT-11.
Por fim, sugere-se que as abordagens farmacológicas utilizadas no
presente trabalho possam ser úteis em outros estudos experimentais e em protocolos
clínicos de pacientes em terapia antineoplásica. A PTX por ter apresentado
importante efeito protetor na mucosite induzida pelo CPT-11 torna-se importante alvo
para outros estudos experimentais e clínicos prospectivos e randomizados, no
sentido de se estabelecer a sua eficácia terapêutica em seres humanos.
143
Mucosa
Submucosa
Adventícia
da Muscular
Diarréia
CPT-11
TNF-α
IL-1β
KC, iNOS e COX-2
NO
PGs
Outros
mediadores (?)
FIGURA 37 – Modelo hipotético proposto para a cascata dos mediadores
inflamatórios envolvidos na mucosite intestinal induzida pelo CPT-11.
144
5 CONCLUSÕES
Analisados em conjunto, nossos resultados permitem concluir
especificamente que:
_ No modelo de mucosite intestinal induzida por CPT-11, ora apresentado,
foram observadas alterações morfológicas (achatamento das vilosidades), funcionais
(diarréia com perda de peso) e histopatológicas (necrose parcial das criptas e
infiltrado inflamatório).
_ As citocinas TNF-_, IL-1_ e KC parecem desempenhar um papel
importante na patogênese da mucosite intestinal induzida pelo CPT-11.
_ NO e PGs parecem desempenhar um papel na fisiopatologia das
alterações intestinais induzidas pelo CPT-11.
_ A PTX preveniu significativamente as alterações morfo-funcionais
(achatamento das vilosidades e diarréia) e histopatológicas (necrose das criptas e
infiltrado inflamatório), tais efeitos parecem ser conseqüência de sua capacidade em
inibir TNF-_, IL-1_, KC e iNOS.
_ A TLD inibiu as alterações histológicas induzidas pelo CPT-11, sem, no
entanto, interferir no curso da diarréia, provavelmente, por TNF-_ não ser o único
mediador inflamatório participante da patogênese da lesão.
_ O CLX não apresentou nenhum efeito protetor na evolução da mucosite
intestinal induzida pelo CPT-11.
145
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