ads:
ROSANA ELISA GONÇALVES GONÇALVES
CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS DA MAQUINARIA DE DIVISÃO DO
ENDOSIMBIONTE DO PROTOZOÁRIO TRIPANOSOMATÍDEO Crithidia deanei
Dissertação apresentada como requisito
parcial à obtenção do grau de Mestre, pelo
Programa de Pós-graduação em Biologia
Celular e Molecular, do Setor de Ciências
Biológicas da Universidade Federal do
Paraná
Orientador: Stenio Perdigão Fragoso
CURITIBA
2008
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
ROSANA ELISA GONÇALVES GONÇALVES
CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS DA MAQUINARIA DE DIVISÃO DO
ENDOSIMBIONTE DO PROTOZOÁRIO TRIPANOSOMATÍDEO Crithidia deanei
Dissertação apresentada como requisito
parcial à obtenção do grau de Mestre, pelo
Programa de Pós-graduação em Biologia
Celular e Molecular, do Setor de Ciências
Biológicas da Universidade Federal do
Paraná
Orientador: Stenio Perdigão Fragoso
CURITIBA
2008
ads:
ii
Dedico este trabalho a meus pais,
Pela dedicação infinita…
Pelas viagens não feitas…
Por carros não comprados…
Por confortos e vontades deixados de lado…
Tenham a certeza de apesar dos esforços pra que eu tivesse uma boa educação,
A melhor educação que tive foi ter vocês como meus educadores!!! Pais heróis!!!
Dedico também ao meu amado irmão,
É um grande orgulho tê-lo como exemplo… Irmão mais velho!!!
Serei eternamente grata por vocês terem feito a minha vida mais doce...
Mais fácil…
Mais divertida…
Mais interessante…
Mais humana…
E assim nasceu minha consciência!!!
iii
AGRADECIMENTOS
Ao Dr. Stênio Perdigão Fragoso pela orientação, paciência e confiança. Pelo
exemplo de pesquisador, mas mais que isso pelo exemplo de simplicidade, bom
caráter, amizade e respeito. Pelo incentivo de trilhar novos caminhos em terras
distantes. Fica aqui minha eterna admiração e meu mais sincero agradecimento.
À Dra. Lucia Yim pelos preciosos ensinamentos em biologia molecular e pela
co-orientação deste trabalho. Exemplo de seriedade e vivacidade em tudo que faz.
Ao Dr. Maurílio Soares pela grande ajuda nas microscopias e formatação das
figuras deste trabalho. Pelo jeitinho mineirinho de cativar as pessoas, pelas
conversas e pelas jujubas.
Ao Dr. Samuel Goldenberg, Dr. Marco A. Kriger e Dr. Cláudia N. D. dos
Santos pelo exemplo de profissionalismo.
À CAPES pelo suporte financeiro.
Ao Dr. Christian Probst pelas contribuições nesse trabalho.
Aos amigos de laboratório Adriana Umaki, Alda Ferreira, Daniela Fiori, Flávia
Oliveira, Janaína, Leonardo Foti, Márcia Shimada e Patrícia Mörking pela amizade,
pelos risos, por aquela mãozinha, pelas conversas sérias ou não. Tudo isso fez
parte da minha mais nova formação. Vocês são muito especiais!
Aos ex-companheiros de laboratório, mas ainda amigos Gisele Picchi e Édio
Lourenço pela amizade, exemplo e motivação.
À Edilaine e ao Luiz pelo apoio administrativo, competência e muita
paciência.
Aos amigos Nilson José Fidêncio, Paulo Arauco, Janaína e Vanessa pela
amizade e apoio técnico.
iv
A todos os amigos do Instituto de Biologia Molecular do Paraná pelo apoio e
amizade.
Às minhas eternas amigas Francielle Kimura, Juliana Driessen, Lila
Montalvão, Octaviana Fialho e Roana Yumi Arai por tudo que vivemos juntas, pela
amizade e pelo respeito mútuo. Que o G6 sempre exista!
À minha irmã de coração Fabiana Ribeiro pela agradável companhia nesses
últimos anos. Obrigada por fazer parte da minha vida!
Aos sambas de terças e quintas, às salsas de sexta e aos forrós de quartas e
sábados pelos momentos de descontração e por recarregarem minha energia, por
mais incrível que isso possa parecer.
Aos meus pais por me passarem a certeza de que sempre poderei contar com
eles.
v
Tem horas que a gente se pergunta “Por que é que não se junta tudo em uma coisa
só?”...
O Teatro Mágico
vi
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS...................................................................................... ix
LISTA DE TABELAS..................................................................................... xii
RESUMO........................................................................................................ xiii
ABSTRACT.................................................................................................... xiv
1 INTRODUÇÃO............................................................................................ 1
1.1 JUSTIFICATIVA....................................................................................... 4
1.2 DIVISÃO CELULAR EM BACTÉRIAS......................................................
6
1.2.1 Sistema Min........................................................................................... 11
1.3 DIVISÃO CELULAR EM ORGANELAS DE ORIGEM
ENDOSIMBIÓTICA........................................................................................
14
2 OBJETIVOS................................................................................................ 16
2.1 OBJETIVOS GERAIS............................................................................... 16
2.2 METAS..................................................................................................... 16
3 MATERIAIS E MÉTODOS.......................................................................... 17
3.1 CULTIVO DOS MICRORGANISMOS.......................................................
17
3.1.1 Cultivo dos tripanosomatídeos.............................................................. 17
3.1.2 Cultivo de bactérias............................................................................... 17
3.2 ISOLAMENTO DO DNA GENÔMICO DO ENDOSSIMBIONTE DE
Crithidia deanei..............................................................................................
18
3.2.1 Fracionamento celular: Isolamento do Endosimbionte.........................
18
3.2.2 Purificação do DNA endosimbionte……………………………………….
19
3.3 EXTRAÇAO DNA GENÔMICO DE Escherichia coli................................
19
3.4 CONSTRUÇÃO DE PLASMÍDEOS E MANIPULAÇÃO DO DNA............ 19
3.4.1 Amplificação por PCR (Reação em cadeia da polimerase) de genes
para clonagem……………………………………………………………………..
22
3.4.2 Clonagens............................................................................................. 23
3.4.2.1 Clonagem do gene minC do endosimbionte no vetor de expressão
pJF119EH.......................................................................................................
23
3.4.2.2 Clonagem dos genes minCD do endosimbionte no vetor de
expressão pJF119EH.....................................................................................
24
3.4.2.3 Clonagem do gene minE do endosimbionte no vetor de expressão
pJF119EH.......................................................................................................
25
3.4.2.4 Clonagem dos genes minCDE do endosimbionte no vetor de
expressão pJF119EH.....................................................................................
25
3.4.2.5 Clonagem dos genes minCDE de Escherichia coli no vetor de
expressão pJF119EH.....................................................................................
25
3.4.2.6 Clonagem dos genes minCDE do endosimbionte no vetor de
expressão pBAD22........................................................................................
25
3.4.2.7 Clonagem dos genes minCDE de Escherichia coli no vetor de
expressão pBAD22........................................................................................
26
3.4.2.8 Clonagem do gene zipA do endosimbionte no vetor de expressão
pJF119EH.......................................................................................................
26
3.4.2.9 Clonagem do gene zipA do endosimbionte no vetor de expressão
pGFPXa..........................................................................................................
26
3.4.2.10 Clonagem do gene minC do endosimbionte no vetor de expressão
pGEX-4T.........................................................................................................
27
3.4.2.11 Clonagem do gene minD do endosimbionte no vetor de expressão
vii
pGEX-4T.........................................................................................................
28
3.4.2.12 Clonagem do gene minE do endosimbionte no vetor de expressão
pGEX-4T.........................................................................................................
28
3.4.2.13 Clonagem do gene ftsK do endosimbionte no vetor de expressão
pGEX-4T.........................................................................................................
28
3.4.2.14 Clonagem do gene minC do endosimbionte no vetor de expressão
pQE30.............................................................................................................
28
3.4.2.15 Clonagem do gene minD do endosimbionte no vetor de expressão
pQE30.............................................................................................................
29
3.4.2.16 Clonagem do gene minE do endosimbionte no vetor de expressão
pQE30.............................................................................................................
29
3.4.2.17 Clonagem do gene zipA do endosimbionte no vetor de expressão
pQE30.............................................................................................................
30
3.4.2.18 Clonagem do gene ftsZ do endosimbionte no vetor de expressão
pET47b...........................................................................................................
30
3.4.2.19 Clonagem do gene da dinamina de Trypanosoma cruzi (Tcdnm)
no vetor de expressão de tripanosomatídeos pTEXGFP2.............................
31
3.4.3 Ligação dos genes nos vetores de expressão...................................... 31
3.4.4 Preparação de células cálcio-competentes...........................................
32
3.4.5 Transformação e seleção dos clones recombinantes........................... 32
3.4.6 Seleção dos clones recombinantes através da técnica da palitagem
(toothpick).......................................................................................................
32
3.4.7 Preparação dos plasmídeos contendo os produtos de PCR
(miniprep)........................................................................................................
33
3.5 EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES............................. 33
3.6 TESTE DE SOLUBILIDADE DAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES...... 34
3.7 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE A PARTIR DE
CORPÚSCULOS DE INCLUSÃO...................................................................
34
3.8 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA FtsZe UTILIZANDO RESINA DE
NÍQUEL-NTA..................................................................................................
35
3.9 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE (FUSÃO COM GST)
UTILIZANDO RESINA GLUTATIONA-SEPHAROSE....................................
35
3.9.1 Purificação da proteína recombinante GST-FtsKe................................
35
3.9.2 Purificação das proteínas recombinantes GST-MinC,GST-MinD,
GST-MinDK11A e GST-MinDK16A................................................................
36
3.10 PURIFICAÇÃO DE FtsZ DE Escherichia coli.........................................
37
3.11 OBTENÇÃO DE ANTISSORO POLICLONAL CONTRA AS
PROTEÍNAS RECOMBINANTES...................................................................
37
3.12 ENSAIO DE POLIMERIZAÇÃO DE FtsZe............................................. 38
3.12.1 Método 1..............................................................................................
38
3.12.2 Método 2..............................................................................................
38
3.13 IDENTIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS MinC E MinD EM EXTRATOS
PROTÉICOS DE ENDOSIMBIONTE USANDO WESTERN BLOT................
38
3.14 PROCEDIMENTO DE TRANSFECÇAO............................................... 39
3.15 ENSAIO DE COMPLEMENTAÇÃO....................................................... 40
3.16 ENSAIO DE ATIVIDADE ATPase DE MinD e FtsK DO
ENDOSIMBIONTE..........................................................................................
41
3.17 IMUNOLOCALIZAÇÃO POR MICROSCOPIA ÓPTICA.........................
41
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................. 43
4.1 CARACTERIZAÇÃO E CLONAGEM DO GENE zipAe............................
43
viii
4.1.1 Análise de superexpressão de zipAe em Escherichia coli....................
47
4.2 CARACTERIZAÇÃO E CLONAGEM DO GENE ftsKe.............................
50
4.2.1 Ensaio atividade ATPase de FtsKe....................................................... 55
4.3 CARACTERIZAÇÃO E CLONAGEM DO GENE ftsKe.............................
56
4.3.1 Ensaio de Polimerização de FtsZe........................................................ 60
4.3.2 Purificação de FtsZ de Escherichia coli.................................................
63
4.4 CARACTERIZAÇÃO E CLONAGEM DOS GENES minCDE...................
64
4.4.1 Fenótipo da super-expressão dos genes do sistema Min do
endosimbionte em E. coli...............................................................................
74
4.4.2 Purificação de MinDe solúvel pra teste de atividade ATPásica............ 80
4.4.2.1 Ensaio de atividade ATPase de MinDe, MinDeK11A e MinDeK16A..
82
4.4.3 Ensaios de complementação de minCDEe em E. coli..........................
84
4.4.4 Ensaios de interação............................................................................. 87
4.4.5 Purificação de MinCe, MinDe, MinEe para produção de anti-soro
específico........................................................................................................
92
4.5 LOCALIZAÇÃO DA DINAMINA COM FUSÃO À GFP NO
TRIPANOSOMATÍDEO Blastocrithidia culicis................................................
99
5 CONCLUSÕES........................................................................................... 102
REFERÊNCIAS.............................................................................................. 103
ix
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - TRIPANOSOMATÍDEO Crithidia desouzai CONTENDO UM
ENDOSIMBIONTE OBSERVADO POR MICROSCOPIA
ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO...........................................
2
FIGURA 2 -
ANEL SEPTAL EM Escherichia coli..........................................
8
FIGURA 3 -
DIVISÃO DOS CROMOSSOMOS EM Escherichia coli............
9
FIGURA 4 - INTERDEPENDÊNCIA DA LOCALIZAÇÃO DOS
COMPONENTES DO DIVISOMA EM Escherichia coli………..
10
FIGURA 5 - AGRUPAMENTO GÊNICO EM DISTINTAS ESPÉCIES
BACTERIANAS.........................................................................
11
FIGURA 6 - MODELO DE OSCILAÇÃO DAS PROTEÍNAS Min…………... 13
FIGURA 7 - DIVISÃO CELULAR EM PLASTÍDEO – DINAMINA COMO
UM EFETOR DA DIVISÃO........................................................
14
FIGURA 8 - ESQUEMA DO PLASMÍDEO pJF119EH.................................. 23
FIGURA 9 -
ESQUEMA DO AGRUPAMENTO GÊNICO minCDE DO
ENDOSIMBIONTE MOSTRANDO A POSIÇÃO OS
OLIGONUCLEOTÍDEOS INICIADORES UTILIZADOS............
24
FIGURA 10 - ESQUEMA DO PLASMÍDEO pGFPXA..................................... 27
FIGURA 11 - ESQUEMA DO PLASMÍDEO pGEX-4T.................................... 27
FIGURA 12 - ESQUEMA DO PLASMÍDEO pQE30........................................ 29
FIGURA 13 - ESQUEMA DO PLASMÍDEO pET-47b..................................... 31
FIGURA 14 - ALINHAMENTO DA PROTEÍNA ZIPA DO ENDOSIMBIONTE
COM A DO CORRESPONDENTE HOMÓLOGO DE
Bordetella papapertussis...........................................................
44
FIGURA 15 -
SEQUÊNCIA NUCLEOTÍDICA DO GENE zipA DO
ENDOSIMBIONTE DE Crithidia deanei E A
CORRESPONDENTE SEQUÊNCIA AMINOACÍDICA DA
PROTEÍNA................................................................................
45
FIGURA 16 -
ORGANIZAÇÃO CROMOSSÔMICA DO GENE zipA
NO
ENDOSIMBIONTE.....................................................................
46
FIGURA 17 -
AMPLIFICAÇÃO DO GENE zipA DO ENDOSIMBIONTE.........
46
FIGURA 18 - ANÁLISE DA EXPRESSÃO DA PROTEÍNA
RECOMBINANTE GFP-ZipAe EM E. COLI POR SDS-
PAGE.........................................................................................
48
FIGURA 19 -
PADRÃO MIGRATÓRIO DE ZipA DE Escherichia coli EM
GEL SDS-PAGE........................................................................
49
FIGURA 20 -
SUPEREXPRESSÃO DE GFP-ZipAe EM E. coli (CEPA
TOP10F´) – ANÁLISE FENOTÍPICA.........................................
49
FIGURA 21 -
SUPEREXPRESSÃO DE GFP-ZipAe EM E. coli (CEPA
TOP10F´) – ANÁLISE FENOTÍPICA USANDO
MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE E DE
FLUORESCÊNCIA....................................................................
50
FIGURA 22 -
SEQUÊNCIA NUCLEOTÍDICA DO GENE ftsK DO
ENDOSIMBIONTE DE Crithidia deanei E A
CORRESPONDENTE SEQUÊNCIA AMINOACÍDICA DA
PROTEÍNA................................................................................
52
FIGURA 23 - ALINHAMENTO DA SEQÜÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DA
PROTEÍNA FtsK DO ENDOSIMBIONTE COM A DO
x
CORRESPONDENTE HOMÓLOGO DE Bordetella
sp...............................................................................................
53
FIGURA 24 -
ORGANIZAÇÃO CROMOSSÔMICA DO GENE ftsk NO
ENDOSIMBIONTE.....................................................................
54
FIGURA 25 -
AMPLIFICAÇÃO DO GENE ftsK DO ENDOSIMBIONTE........
54
FIGURA 26 - PURIFICAÇÃO DE GST-FtsKe MEDIANTE
CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE POR GLUTATIONA........
55
FIGURA 27 - ATIVIDADE ATPÁSICA DE FtsKe........................................... 56
FIGURA 28 -
SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DO GENE ftsZ DO
ENDOSIMBIONTE DE C. deanei..............................................
57
FIGURA 29 -
ALINHAMENTO DAS PROTEÍNAS FtsZ DE B.
bronchiseptica, DO ENDOSIMBIONTE DE C. deanei E DE E.
coli.............................................................................................
58
FIGURA 30 -
AMPLIFICAÇÃO DO GENE ftsZ DO ENDOSIMBIONTE..........
59
FIGURA 31 -
SOBREEXPRESSÃO DE FtsZe EM E. coli (CEPA BL21) –
ANÁLISE FENOTÍPICA.............................................................
60
FIGURA 32 - ANÁLISE DE POLIMERIZAÇÃO DE FtsZe POR WESTERN
BLOT.........................................................................................
61
FIGURA 33 - PURIFICAÇÃO DE FtsZe POR CROMATOGRAFIA DE
AFINIDADE UTILIZANDO RESINA DE NÍQUEL-
NTA...................................
62
FIGURA 34 -
PURIFICAÇÃO DE FtsZ DE Escherichia coli POR
CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE UTILIZANDO RESINA
DE NÍQUEL-NTA.......................................................................
63
FIGURA 35 - WESTERN BLOT UTILIZANDO SORO ANTI-FtsZ DE
Escherichia coli..........................................................................
64
FIGURA 36 -
ORGANIZAÇÃO CROMOSSÔMICA DOS GENES minCDE
NO ENDOSIMBIONTE..............................................................
65
FIGURA 37 -
SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DOS GENES minCDE
DO ENDOSIMBIONTE DE C. deanei E A
CORRESPONDENTE SEQÜÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DA
PROTEÍNA................................................................................
66
FIGURA 38 -
AMPLIFICAÇÃO DO GENE minC DO ENDOSIMBIONTE.......
67
FIGURA 39 -
AMPLIFICAÇÃO DO GENE minD DO ENDOSIMBIONTE.......
68
FIGURA 40 -
AMPLIFICAÇÃO DO GENE minE DO ENDOSIMBIONTE.......
69
FIGURA 41 - ALINHAMENTO DA PROTEÍNA MinC DO ENDOSIMBIONTE
DEDUZIDO A PARTIR DAS SEQÜÊNCIAS
NUCLEOTÍDICAS, COM OS CORRESPONDENTES
HOMÓLOGOS DE Bordetella spp E Escherichia coli...............
70
FIGURA 42 - REPRESENTAÇÃO DO DOMÍNIO C-TERMINAL DA
PROTEÍNA MinC RICO EM RESÍDUOS DE GLICINA.............
71
FIGURA 43 - ALINHAMENTO DA PROTEÍNA MinD DO ENDOSIMBIONTE
DEDUZIDO A PARTIR DAS SEQÜÊNCIAS
NUCLEOTÍDICAS, COM OS CORRESPONDENTES
ORTÓLOGOS DE Bordetella spp E Escherichia coli................
72
FIGURA 44 - ALINHAMENTO DA PROTEÍNA MinE DO ENDOSIMBIONTE
DEDUZIDO A PARTIR DAS SEQÜÊNCIAS
NUCLEOTÍDICAS, COM OS CORRESPONDENTES
ORTÓLOGOS DE Bordetella spp E Escherichia coli................
74
FIGURA 45 - EFEITO DA SUPEREXPRESSÃO DE MinCe E MinCDe EM
xi
Escherichia coli..........................................................................
76
FIGURA 46 -
EFEITO DA SUPEREXPRESSÃO DE MinCe EM Escherichia
coli.............................................................................................
77
FIGURA 47 -
EFEITO DA SUPEREXPRESSÃO DE MinDe EM Escherichia
coli.............................................................................................
77
FIGURA 48 -
EFEITO DA SUPEREXPRESSÃO DE MinEe EM Escherichia
coli UTILIZANDO O PLASMÍDEO pJFminEe............................
79
FIGURA 49 -
EFEITO DA SUPEREXPRESSÃO DE MinEe EM Escherichia
coli UTILIZANDO O PLASMÍDEO pQEminEe..........................
80
FIGURA 50 - PURIFICAÇÃO DE GST-MinDe, GST-MinDeK11A E GST-
MinDeK16A MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE
AFINIDADE................................................................................
81
FIGURA 51 - WESTERN BLOT USANDO O SORO ANTI-MinDe OBTIDO
EM CAMUNDONGOS E REAGIDO CONTRA A PROTEÍNA
RECOMBINANTE PURIFICADA GST-MinDe E AS
PROTEÍNAS MUTANTES GST-MinDeK11A e GST-
MinDeK16A................................................................................
82
FIGURA 52 - ENSAIO DE ATIVIDADE ATPase DE MinD DO
ENDOSIMBIONTE.....................................................................
83
FIGURA 53 - EFEITO DA SUPEREXPRESSÃO DE GST-MinDe, GST-
MinDeK11A e GST-MinDeK16A EM Escherichia coli...............
84
FIGURA 54 - ENSAIO DE COMPLEMENTAÇÃO DE PB114 COM O
OPERON minCDE DO ENDOSIMBIONTE CLONADO NO
VETOR pJF119EH....................................................................
85
FIGURA 55 - ENSAIO DE COMPLEMENTAÇÃO DE PB114 COM O
OPERON minCDE DO ENDOSIMBIONTE CLONADO NO
VETOR pJF119EH....................................................................
86
FIGURA 56 -
ENSAIO DE PULL-DOWN REAGIDO COM ANTI-MinCe.........
88
FIGURA 57 -
ENSAIO DE PULL-DOWN REAGIDO COM ANTI-MinDe.........
88
FIGURA 58 - PURIFICAÇÃO DE MinCe UTILIZANDO RESINA DE
NÍQUEL-NTA.............................................................................
90
FIGURA 59 - PURIFICAÇÃO DE MinDe UTILIZANDO RESINA DE
NÍQUEL-NTA.............................................................................
90
FIGURA 60 - ENSAIO DE INTERAÇÃO DE MinCe COM A MAQUINARIA
DE DIVISÃO DE Escherichia coli..............................................
91
FIGURA 61 - ENSAIO DE INTERAÇÃO DE MinDe COM A MAQUINARIA
DE DIVISÃO DE Escherichia coli..............................................
92
FIGURA 62 - PURIFICAÇÃO DE GST-MinCe………………………………..... 93
FIGURA 63 - PURIFICAÇÃO DE GST-MinDe…………………………………. 94
FIGURA 64 - PURIFICAÇÃO DE GST-MinDe…………………………………. 94
FIGURA 65 - WESTERN BLOT UTILIZANDO SOROS ANTI-MinCe E
ANTI-MinDe...............................................................................
95
FIGURA 66 -
IMUNOLOCALIZAÇÃO DE MinCe EM B. culicis.......................
96
FIGURA 67 -
IMUNOLOCALIZAÇÃO DE MinCe EM C. deanei.....................
97
FIGURA 68 -
IMUNOLOCALIZAÇÃO DE MinDe EM B. culicis.......................
98
FIGURA 69 -
AMPLIFICAÇÃO DO GENE DINAMINA DO T. cruzi.................
100
FIGURA 70 - CO-LOCALIZAÇÃO DE GFP-DINAMINA NO
ENDOSIBIONTE DE B. culicis..................................................
100
xii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 -
LISTA DE CEPAS DE Escherichia coli......................................
17
TABELA 2 - LISTA DE PLASMÍDEOS E OLIGONUCLEOTÍDEOS.............. 20
TABELA 3 - NÚMERO DE COLÔNIAS OBTIDAS QUANDO SE
TRANSFORMAVA PB114 OU PB114 pRARE COM
DIFERENTES PLASMÍDEOS....................................................
78
xiii
RESUMO
Alguns protozoários monoxênicos da família Trypanosomatidae, tais como
Blastocrithidia culicis, Crithidia deanei Crithidia oncopelti, Crithidia desouzai e
Herpetomonas roitmani apresentam bactérias simbióticas em seu citoplasma. A
estreita relação desenvolvida entre a bactéria simbiótica e o tripanosomatídeo
hospedeiro faz deste modelo uma excelente fonte para a melhor compreensão da
origem simbiótica de organelas como a mitocôndria e o cloroplasto. É interessante
destacar que no caso de tripanosomatídeos existe apenas uma bactéria simbiótica
por célula, fato que implica a existência de um perfeito controle temporal da divisão
celular destes microrganismos. Os fatores que realizam e controlam este processo, e
a maneira como eles agem, são até agora desconhecidos. Caracterizamos, portanto,
algumas proteínas-chave no processo de formação e de regulação do anel de
divisão Z, o qual é importante para a formação do septo na região central da célula
em divisão. Entre estas proteínas estão a FtsZ, a FtsK, a ZipA e o complexo proteíco
MinCDE. Os genes que codificam essas proteínas foram identificados a partir do
sequenciamento do genoma do endosimbionte de C. deanei, que está sendo
realizado no Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP). Todos os genes
estudados foram amplificados por PCR a partir do DNA do endosimbionte purificado
de C. deanei. A análise das sequências de aminoácidos derivadas dos genes em
questão mostra que elas compartilham maior similaridade com os ortólogos de
bactérias do gênero Bordetella (subdivisão
β das proteobactérias). A expressão dos
genes ftsZe, zipAe e minDe em E. coli induz a formação de filamentação, indicando
que as proteínas recombinantes produzidas são funcionais e conseguem
desestabilizar a maquinaria de divisão da E. coli. A expressão de todo o locus
minCDE do endosimbionte não foi capaz de complementar cepa de E. coli PB114,
que possui a deleção de todo o locus minCDE (∆minCDE). A funcionalidade das
proteínas FtsKe e MinDe foi também demonstrada pela sua capacidade de hidrolisar
ATP. Quanto à proteína FtsZe, esta foi capaz de se polimerizar, característica
importante para a formação do anel Z. Esses dados sugerem que proteínas do
divisoma do endosimbionte se mantiveram funcionais durante a evolução dessa
relação simbiótica.
A análise, por microscopia de fluorescência, da expressão do gene da dinamina de
Trypanosoma cruzi, fusionado ao gene GFP, em C. deanei, mostra que a proteína
recombinante dinamina-GFP está associada com o endosimbionte. Esse resultado
sugere o envolvimento da dinamina no processo de divisão do endosimbionte, como
acontece na divisão de cloroplastos e mitocôndrias, e que este possa ser um dos
mecanismos que o tripanosomatídeo hospedeiro utiliza para controlar a divisão do
endosimbionte.
xiv
ABSTRACT
Some monoxenous protozoa of the Trypanosomatidae family such as Blastocrithidia
culicis, Crithidia deanei, Crithidia oncopelti, Crithidia desouzai and Herpetomonas
roitmani harbor endosymbiotic bacteria in their cytoplasm. The relationship between
the endosymbiont and the trypanosomatid provides an intersting model to
understanding the emergence of eukaryotic organelles mitochondria and choroplasts.
It is noteworthy to note that in the case of trypanosomatids there is only one
symbiotic bacterium per cell, which implies the existence of a perfect control of the
endosymbiont division. The factors that perform and control this process as well as
their mechanisms remain unknown. In this regard, we characterized some key
proteins involved in the processes of assembling and regulation of the Z ring, which
are important steps in the division site formation in the mid-cell. Among these
proteins, there are FtsZ, FtsK, ZipA and the complex MinCDE. The genes encoding
these proteins were identified in the genome of the endosymbiont of C. deanei that
has been sequenced in the Institute of Molecular Biology of Paraná (IBMP). All the
studied genes were amplified by PCR from the genomic DNA of the endosymbiont
purified from C. deanei. The analysis of the deduced amino acid sequences from
these genes show that they share greater similarity with the orthologues from the
Bordetella genus (subdivision of
β Proteobacteria). We showed that the expression of
the genes ftsZe, zipAe and minDe in E. coli induce filamentation, indicating that these
recombinant proteins were functional and could destabilize the division machinery in
E. coli. The functionality of the proteins FtsKe and MinDe was also showed by their
hability to hydrolise ATP. Regarding the FtsZe, we show that it was able to self-
polimerize, an important feature for the Z ring assembly. Taken together, these data
suggest that proteins of the endosymbiont divisome have maintained their
functionality during the evolution of the symbiotic relationship.
Immunofluorescence microscopy analysis showed that the fusion protein GFP-
dynamin from T. cruzi expressed in C. deanei was associated with the endosymbiont.
This result suggests the involvement of the dynamin in the endosymbiont division
process as observed for the division of mitochondria and chloroplasts. Furthermore,
dynamin may be one of the mechanisms used by the trypanosomatid to control the
endosimbiont division.
1
1 INTRODUÇÃO
Os protozoários tripanosomatídeos (família Trypanosomatidae, ordem
Kinetoplastida) vêm sendo alvo de constantes estudos em diferentes áreas da
biologia celular, biologia molecular, genética e imunologia. Tamanho interesse está
relacionado ao fato de diversos protozoários patogênicos participarem desta família.
Dentre estes parasitas, os mais conhecidos pertencem aos gêneros Trypanosoma e
Leishmania. Existem ainda nesta família protozoários não-patogênicos
monoxênicos, ou seja, que apresentam durante todo o ciclo de vida um único
hospedeiro invertebrado. Neste último caso estão presentes alguns gêneros como
Crithidia, Herpetomonas e Leptomonas.
Os protozoários da família Trypanosomatidae caracterizam-se pela presença
de um flagelo único associado a uma bolsa flagelar e contendo estrutura
paraflagelar, uma mitocôndria única e ramificada, além de acidocalcisomos e
glicosomos em número e forma variados. Aproximadamente 30% do DNA dos
tripanosomatídeos se encontra em uma região específica da mitocôndria, o
cinetoplasto (revisto por SHLOMAI, 1994).
Alguns protozoários monoxênicos da família Trypanosomatidae apresentam
bactérias simbióticas em seu citoplasma (figura 1). Dentre estes podemos citar as
espécies Blastocrithidia culicis (BRUESKE, 1967), Crithidia deanei (MUNDIM et al.,
1974), Crithidia oncopelti (GILL & VOGEL, 1963), Crithidia desouzai e
Herpetomonas roitmani (FIORINI et al., 1989). Quando observados por microscopia
eletrônica de transmissão, os simbiontes apresentam-se envoltos por duas unidades
de membrana; uma mais externa, que fica em contato com o citoplasma da célula
hospedeira e outra que delimita a matriz do endosimbionte. A matriz do
endosimbionte por sua vez apresenta duas regiões distintas: uma mais clara que
contém fibrilas de DNA e outra mais escura que é rica em ribossomos (CHANG,
1974; MOTTA et al., 2003; SOARES & DE SOUZA, 1988).
2
FIGURA 1 - TRIPANOSOMATÍDEO Crithidia desouzai CONTENDO UM
ENDOSIMBIONTE OBSERVADO POR MICROSCOPIA ELETRÔNICA
DE TRANSMISSÃO.
Corte ultra-fino mostrando o aspecto geral do protozoário. (N) núcleo, (E) Endosimbionte, (K) Cinetoplasto, (M)
Mitocôndria, (V) partículas semelhantes a vírus, (G) Complexo de Golgi, (F) Flagelo e (FP) Bolsa flagelar.
FONTE: SOARES et al., 1989
O processo simbiótico, envolvendo o endosimbionte e sua célula hospedeira,
implica uma relação muito estreita, com o surgimento de alterações ultra-estruturais
em ambos os seres e o estabelecimento de uma troca recíproca de produtos
metabólicos. Como sugerido por Margulis (1976), nos casos mais íntimos de
associação simbiótica podem ocorrer alterações morfológicas, assim como a
formação de novas estruturas ou a perda parcial ou completa de outras. No caso
específico da endosimbiose nos tripanosomatídeos, observa-se a perda parcial da
estrutura paraflagelar (GADELHA et al., 2005), modificações morfológicas no
citoesqueleto de microtúbulos e na rede de DNA mitocondrial do protozoário, assim
como a redução da parede celular da bactéria simbiótica. Apesar de não apresentar
uma parede celular típica, os endosimbiontes de tripanosomatídeos são sensíveis à
ação de antibióticos β-lactâmicos cujo alvo são as Penicillin Binding Proteins (PBPs),
enzimas encarregadas de sintetizar o peptidoglicano da parede celular bacteriana
(FREYMULLER & CAMARGO, 1981; MOTTA et al., 1997a). Estes dados sugerem a
existência de uma parede reminescente ou degenerada nestes simbiontes,
desempenhando importantes papéis na divisão celular e na manutenção da forma. A
3
presença do endosimbionte promove ainda modificações físico-químicas no
protozoário hospedeiro, alterando a composição de açúcares e a carga de superfície
(DWYER & CHANG, 1976; ESTEVES et al., 1982; ODA et al., 1984). Tal como
ocorre em outras associações simbióticas, existe uma intensa troca de nutrientes e
outros metabólitos entre os seres envolvidos: o endosimbionte fornece aminoácidos,
hemina e vitaminas ao protozoário, mas por outro lado é capaz de beneficiar-se da
produção de ATP da célula hospedeira (revisto por DE SOUZA & MOTTA, 1999;
PALMIÉ-PEIXOTO et al, 2006; FROSSARD et al., 2006). Cumpre ressaltar que
todas as tentativas de manter o endosimbionte de tripanosomatídeos em cultivo fora
da célula hospedeira foram infrutíferas, o que sugere que durante o processo de
evolução conjunta o simbionte deve ter perdido funções essenciais que atualmente
são fornecidas pelo hospedeiro. Cepas de protozoários livres de endosimbionte
(aposimbióticas) podem ser obtidas por tratamento com cloranfenicol (CHANG,
1975), mas seu cultivo requer a adição de nutrientes, tais como hemina, e seu
crescimento é muito mais lento quando comparado com cepas simbióticas.
Além de alterações morfológicas e ultra-estruturais, a endosimbiose pode
também acarretar a perda de genes do endosimbionte não mais necessários no
ambiente intracelular, ou a transferência de genes de um ser para o outro, sendo
que em alguns casos estes se tornam uma unidade co-evolutiva bipartite
(ANDERSSON & KURLAND, 1998; revisto por HOFFMEISTER & MARTIN, 2003).
Os exemplos mais extremos da evolução redutiva de genomas residentes
intracelularmente são aqueles das organelas celulares, como as mitocôndrias e
cloroplastos das células eucarióticas. O estudo da relação simbiótica de bactérias ou
algas com protozoários hospedeiros tem ajudado na compreensão da origem
simbiótica destas organelas. Hoje em dia a teoria simbiótica é aceita pela maioria
dos pesquisadores para explicar o aparecimento destas organelas. Parece que ao
longo do processo evolutivo genes sofreram transferência da bactéria ou alga
simbiótica para o núcleo da célula hospedeira, até um ponto em que a
“protomitocôndria” ou o “protocloroplasto” perdeu autonomia replicativa. Em
mitocôndrias, o tamanho do genoma é bastante variado nas diferentes células
eucarióticas. De um modo geral estes genes estão relacionados à produção de
ribosomos mitocondriais e de subunidades de proteínas que compõem a membrana
interna, mais especificamente as que participam da cadeia respiratória. O fato dos
genes que codificam tais proteínas não terem sido transferidos pode significar que
4
uma transferência errada destes genes acarretaria o não-funcionamento de
proteínas essenciais à manutenção do metabolismo de fosforilação oxidativa que
caracteriza a mitocôndria (GRAY et al., 1999; MARGULIS, 1976).
Em relação à origem dos endosimbiontes de Crithidia deanei e Blastocrithidia
culicis, a análise do gene que codifica o RNA ribosomal 16S mostrou que esse gene
é idêntico nos dois tipos de endosimbiontes e muito similar ao da bactéria Bordetella
bronchiseptica, da subdivisão
β das Proteobactérias (DU et al., 1994a), sendo então
os endosimbiontes classificados nesta subdivisão. Os endosimbiontes destas
espécies de tripanosomatídeos passaram a ser denominados respectivamente
Kinetoplastibacterium crithidii e Kinetoplastibacterium blastocrithidii. Cabe ainda
mencionar que estes dois tripanosomatídeos encontraram-se relacionados
filogeneticamente entre si quando foram feitas análises de sequências gênicas do
SSU rRNA (DU et al., 1994b) e também quando características isoenzimáticas foram
analisadas (MOTTA et al., 1991).
Outros fatores comprovam a natureza bacteriana dos simbiontes de
tripanosomatídeos, tais como a organização e densidade do DNA (SPENCER &
CROSS, 1975) e a presença de enzimas típicas de procariontes, como as da via
biossintética da lisina (GILL & VOGEL, 1962, 1963). Alguns estudos (MOTTA et al.,
1991; FARIA E SILVA et al., 1991; DU et al., 1994-b) sugerem que o processo
simbiótico bactéria/protozoário hospedeiro hoje conhecido em tripanosomatídeos
originou-se a partir de um único evento evolutivo, envolvendo a aquisição de uma
proteobactéria da divisão β por um protozoário ancestral dos tripanosomatídeos.
Conclui-se a partir desta introdução que tripanosomatídeos que apresentam
em seu citoplasma bactérias simbióticas constituem um excelente modelo
experimental, já que: são facilmente cultiváveis, não apresentam perigo de
manipulação por serem não-patogênicos, podem ser utilizados em estudos
comparativos a fim de esclarecer novos aspectos sobre o carácter evolutivo desta
família e possibilitam um melhor entendimento da origem das organelas
citoplasmáticas a partir da relação entre o simbionte e a célula hospedeira.
1.1 JUSTIFICATIVA
Embora muito se conheça sobre a organização ultra-estrutural dos
endosimbiontes dos tripanosomatídeos e dos aspectos bioquímicos da relação
simbiótica, muito pouco se conhece sobre seus genomas e sobre possíveis
5
transferências gênicas envolvendo a bactéria simbiótica e seu protozoário
hospedeiro. Estas são questões que uma vez respondidas nos ajudam a
compreender a origem do microrganismo endosimbionte e em que momento do
processo evolutivo a endosimbiose ocorreu nesta importante família de protozoários.
Além disso, a estreita relação desenvolvida entre a bactéria simbiótica e o
tripanosomatídeo hospedeiro faz deste modelo uma excelente fonte para a melhor
compreensão da origem simbiótica de organelas como a mitocôndria e o cloroplasto.
Os endosimbiontes de tripanosomatídeos, além de fornecer um material
importante para a compreensão do aparecimento de organelas, são por si próprios
um sistema extremamente interessante do ponto de vista da biologia molecular. Ao
longo do processo evolutivo a bactéria endosimbiótica teve que ajustar seu
metabolismo e certamente seu repertório gênico em função do novo habitat em que
se encontrava, ou seja, o citoplasma do tripanosomatídeo hospedeiro. Não apenas o
genoma bacteriano pode ter se modificado, como também os mecanismos de
regulação gênica, incluindo aí a transferência de funções importantes, como controle
da divisão celular para a célula hospedeira, já que nesse caso específico o número
dessas bactérias simbióticas é limitado a uma por protozoário. Essa característica é
identificada em outros sistemas, onde a aquisição de um estilo de vida com
associação obrigatória ao hospedeiro geralmente leva à diminuição do tamanho da
população, devido ao habitat restrito (revisto por ANDERSON & KURLAND, 1998).
Essa derivação genética pode levar à fixação de mutações que inativam genes que
não são mais necessários naquele novo nicho ou mesmo de genes benéficos.
É interessante notar que os dados de genômica estrutural para várias
espécies de bactérias intracelulares obrigatórias sugerem uma correlação entre a
patogenicidade e a redução do genoma, incluindo rápida evolução das seqüências
polipeptídicas e um baixo conteúdo G+C. Um dado típico é aquele que mostra que
enquanto Escherichia coli e espécies de Samonella ou Bacillus codificam de 1500 a
6000 proteínas, bactérias patogênicas intracelulares obrigatórias geralmente
codificam apenas 500 a 1000 proteínas. Outro dado interessante mostra que cada
linhagem bacteriana segue diferentes rotas evolutivas para compor o minimalismo
do genoma. Portanto, não há um repertório mínimo de genes conservados para os
processos celulares universais, tais como crescimento e replicação (MORAN, 2002).
É plausível supor que devido à sua associação estreita com o protozoário, o
endosimbionte possa ter perdido, substituido ou transferido genes para o núcleo da
6
célula hospedeira, provavelmente para tornar o seu metabolismo mais eficiente
(CAVALIER-SMITH, 1987). Isso provavelmente aconteceu com os endosimbiontes
que originaram as mitocôndrias e cloroplastos (MARTIN, 2003). Contudo, como
Moran (2002) salienta, a perda de função gênica não leva necessariamente ao
minimalismo do genoma com a eliminação de DNA, como revelam estudos recentes
com alguns tipos de bactérias endosimbióticas. Um exemplo é a espécie Buchnera
aphidicola, da subdivisão de γ-proteobactérias, onde estudos mostram que tais
procariotos retêm DNA não-funcional na forma de pseudogenes. Essas bactérias
possuem ainda uma grande estabilidade no genoma, estando esta associada com
uma quase completa ausência de rearranjos cromossomais e de eventos de
transferência gênica horizontal durante os últimos 150 milhões de anos,
possivelmente devido à perda de genes envolvidos com a recombinação de DNA
nos estágios iniciais da endosimbiogênese (SILVA et al., 2003).
É interessante destacar que no caso de tripanosomatídeos existe apenas uma
bactéria simbiótica por célula, fato que implica a existência de um perfeito controle
temporal da divisão celular destes organismos. Os fatores que realizam e controlam
este processo, e a maneira como eles agem, são até agora desconhecidos, e o seu
estudo forma parte dos objetivos deste trabalho.
1.2 DIVISÃO CELULAR EM BACTÉRIAS
A maioria das bactérias cresce e se divide por um processo chamado de
fissão binária, dando origem a duas células filhas – cada uma com um material
genético. Para que isso ocorra, esse processo deve se acompanhado por uma
correta replicação e segregação do cromossomo único durante a divisão da célula-
mãe (LUTKENHAUS, 2007). Uma análise mais fina da divisão bacteriana, utilizando-
se microscopia eletrônica, revelou a formação de um septo no meio da célula.
Em bactérias, para que a divisão celular aconteça é preciso que o aparelho de
divisão (dito septo ou divisoma) se forme no sítio da futura constrição do citoplasma
e posteriormente dirija a invaginação orquestrada da membrana e da parede celular.
Mensuração da posição do septo em bacilos revelou que este se posiciona
precisamente na região central da bactéria (revisado por LUTKENHAUS, 2007).
Então vem a grande pergunta: como essa especificidade topológica é conseguida?
Quais são os fatores que a regulam?
7
O estudo da divisão celular em Escherichia coli utilizando-se técnicas de
biologia molecular levou à identificação de genes essenciais neste processo. A
maioria desses genes têm a designação de fts (filamentation temperature-sensitive),
devido à filamentação causada em mutantes sensíveis à temperatura ao gene
correspondente (LUTKENHAUS, 2007).
A proteína FtsZ, um homólogo estrutural da tubulina eucariótica (NOGALES et
al., 1998), tem um papel chave na divisão, dado que é a primeira proteína que
polimeriza associada à face interna da membrana citoplasmática, formando uma
estrutura anular no centro da célula (anel Z). O interessante é que esta proteína está
presente em virtualmente todas as eubactérias, assim como também em Archaeas e
algumas organelas eucarióticas, tais como cloroplastos das plantas e algas verdes,
e mitocôndrias de eucariotos primitivos (OSTERYOUNG & NUNNARI, 2003). O anel
Z, por sua vez, atua como arcabouço para outros componentes do divisoma, que
vão se ligando de forma seqüencial e dirigem a constrição do citoplasma, até gerar
duas células filhas equivalentes (revisto por ERRINGTON et al., 2003;
LUTKENHAUS, 2007). Assim, além de FtsZ, foram identificadas pelo menos treze
proteínas que formam o divisoma em E. coli: FtsA, ZipA, ZapA, FtsE, FtsX, FtsK,
FtsQ, FtsL, FtsB, FtsW, PBP3 (FtsI), FtsN e AmiC, todas as quais foram visualizadas
mediante microscopia de fluorescência formando um anel na posição central da
célula (figura 2).
8
FIGURA 2 – ANEL SEPTAL EM Escherichia coli
A) GFP-FtsL visualizada por microscopía de deconvolução. B)
Modelo para a montagem seqüencial das proteínas no anel
septal em E. coli. FONTE: Weiss (2004).
FtsA e ZipA (de Z-interacting protein A) interagem diretamente com FtsZ
somente após a deposição desta última na região central da célula onde se formará
o divisoma. FtsA e ZipA são majoritariamente citosólicas, embora ZipA apresente um
domínio transmembrana N-terminal e FtsA se associe de forma periférica à
membrana. Ambas estão envolvidas na estabilização e na ancoragem do anel Z à
membrana. O restante das proteínas do divisoma se liga mais tarde no anel (figura
4), possui localização na membrana e/ou no periplasma e, com exceção de FtsE (de
função desconhecida) e FtsK (envolvida na segregação do cromossomo, ver mais
abaixo), todas participam na síntese do peptidoglicano septal.
FtsK está envolvida na partição do cromossomo durante as últimas etapas da
segregação do DNA, e é altamente conservada entre as eubacterias. Trata-se de
uma proteína com massa molecular elevada, com um domínio transmembrana N-
terminal essencial para a formação do septo e um domínio citosólico C-terminal que
possui atividade DNA translocase dependente de ATP (BIGOT et al., 2004). Outras
proteínas tais como XerC, XerD, Topo IV participam do processo de segregação
cromossomal (Figura 3).
A)
B)
9
FIGURA 3 – DIVISÃO DOS CROMOSSOMOS EM Escherichia coli
FONTE: Bigot et al (2007)
Da mesma forma que a tubulina, a proteína FtsZ liga e hidrolisa GTP
(MUKHERJEE et al., 1993; DE BOER et al., 1992a; RAYCHAUDHURI & PARK,
1992). A ligação do GTP induz uma polimerização reversível da proteína que resulta
na formação de protofilamentos (MUKHERJEE & LUTKENHAUS, 1994). Por sua
vez, a auto-associação de FtsZ é essencial para a hidrólise do GTP, dado que o sítio
catalítico é formado pela interação de dois monômeros. Recentemente foi descrito
que o anel Z é extremamente dinâmico in vivo. Embora o mecanismo molecular
através do qual FtsZ dirige a citocinese seja ainda desconhecido, existem evidências
que sugerem que o passo limitante na dinâmica do anel Z é a hidrólise do GTP
(STRICKER et al., 2002; ANDERSON et al., 2004).
10
FIGURA 4 – INTERDEPENDÊNCIA DA LOCALIZAÇÃO DOS COMPONENTES DO
DIVISOMA EM Escherichia coli
A flecha indica o momento de seleção do sítio de divisão e os números a ordem temporal na qual as distintas
proteínas vão se adicionando ao divisoma. FONTE: Carballido-López & Errington (2003)
A maioria dos genes implicados no processo de divisão celular e síntese da
parede encontra-se localizada no mesmo cluster cromossômico, chamado do dcw
cluster (division and cell wall) (figura 5). Esse agrupamento gênico encontra-se
conservado mesmo em bactérias filogeneticamente distantes, tanto ao nível da
identidade como da ordem dos genes, o que poderia facilitar a formação dos
complexos protéicos específicos (MINGORANCE et al., 2004). Existem, porém,
algumas espécies bacterianas nas quais estão ausentes alguns dos genes deste
agrupamento, sendo casos extremos aquelas bactérias de vida intracelular
obrigatória, tais como aquelas patogênicas do gênero Mycoplasma, que só possuem
os genes do início (mraZ-mraW) e do final (ftsZ) do agrupamento (HIMMELREICH et
al., 1996). O mesmo é encontrado no endosimbionte de afídeos, Buchnera
aphidícola, que possui a seqüência ftsL-ftsI-murE-murF-mraY-murD-ftsW-murG-
murC-ddlB-ftsA-ftsZ (BAUMANN & BAUMANN, 1998). Os genes desinados por mur
codificam proteínas que participam da síntese de peptideoglicanos.
11
FIGURA 5 – AGRUPAMENTO GÊNICO EM DISTINTAS ESPÉCIES BACTERIANAS
FONTE: Tamames et al. (2001)
1.2.1 Sistema Min
Uma vez que a divisão celular é um processo espacial e temporalmente
regulado, há a necessidade da presença de proteínas cuja atividade se contraponha
à daquela das proteínas de divisão, a fim de evitar a formação do septo em posições
incorretas na célula. Essas proteínas são conhecidas como proteínas
desestabilizadoras, como as que compõem o complexo MinCD (revisto por
HOWARD, 2004). O prefixo Min é devido ao fato de mutações nesses genes
levarem a célula a se dividir nos pólos, gerando mini-células sem material genético.
MinC e MinD formam um complexo que interage com FtsZ e com a membrana
celular e inibe a polimerização de FtsZ. Esse complexo é um inibidor não específico
do septo, sendo capaz de bloquear todos os sítios potenciais de divisão bacteriana.
A proteína responsável pela especificidade topológica do complexo MinCD é a
proteína MinE, cuja localização oscilatória em torno à região central da célula
suprime a atividade inibitória de MinCD exclusivamente nessa região, permitindo
assim a polimerização da FtsZ na posição correta (HU & LUTKENHAUS, 1999).
Mediante análises de microscopia de fluorescência com células vivas da bactéria
Escherichia coli foi evidenciada a localização oscilatória do complexo MinCD entre
12
os pólos celulares, enquanto que a localização de MinE, sendo também oscilatória,
se limita exclusivamente à região central da célula. Homólogos de MinD e MinE
foram encontrados em cloroplastos das plantas e algas verdes, indicando que o
mecanismo de determinação topológica da divisão se conservou ao longo da
evolução (OSTERYOUNG & NUNNARI, 2003)
A figura 6 mostra um modelo de como esse sistema funciona.
13
FIGURA 6 – MODELO DE OSCILAÇÃO DAS PROTEÍNAS Min
MinD-ATP se liga à membrana e recruta MinC. MinE desloca MinC e estimula a atividade ATPásica de MinD, ocorrendo, então,
a liberação dessas proteínas da membrana. Quando acontece a liberação de MinE, esta pode imediatamente se ligar à MinD
que está na membrana. MinD liberada sofre então troca de nucleotídeo gerando MinD-ATP. A concentração de MinD-ATP nas
imediações do antigo pólo é diminuída pelo fato de se ligar cooperativamente à membrana já contendo MinD. Em
contrapartida, a concentração de MinD-ATP aumenta no outro pólo, que carece de MinD ligado à membrana. À medida que a
concentração aumenta, MinD acaba se ligando, formando uma nova zona polar. Como MinE é liberada do antigo pólo, a
proteína se liga na extremidade da zona polar de MinD.
FONTE: LUTKENHAUS, 2007
MInD-ATP se liga à membrana e recruta MinC. MinE desloca MinC e estimula
MinD ATPase, causando sua liberação da membrana. MinD rapidamente torna-se
MinD-ATP formando o complexo MinCD ligado à membrana no pólo oposto. A
oscilação de um pólo a outro leva em torno de 40-50 segundos. Inúmeros trabalhos
14
têm mostrado que MinD ocupa o papel central do sistema, interagindo com MinC e
MinE.
1.3 DIVISÃO CELULAR EM ORGANELAS DE ORIGEM ENDOSIMBIÓTICA
O papel das proteínas de divisão tem também merecido destaque em relação
às organelas de origem endosimbiótica, como os cloroplastos e mitocôndrias
(OSTERYOUNG & NUNNARI, 2003). Os cloroplastos presentes em eucariotos
fotosintéticos superiores ainda se dividem usando componentes derivados daqueles
usados para divisão celular dos ancestrais procariotos, onde a proteína FtsZ tem um
papel chave. Dado o envolvimento quase universal da FtsZ na divisão de
procariotos, é surpreendente a ausência de genes ftsZ nos genomas nuclear e
mitocondrial de S. cerevisiae e C. elegans. Esse fato indica que um mecanismo
diferente para a divisão mitocondrial evoluiu em fungos e animais, não sendo este
mais baseado na FtsZ (OSTERYOUNG, 2000) levando à descoberta de um segundo
grupo de GTPases, conhecidas como proteínas relacionadas à dinamina (DRPs,
dynamin-related proteins). Dinaminas atuam em vários processos celulares
envolvendo tráfego de vesículas (HINSHAW, 2000). DRPs denominadas de Dnm1
em levedura e Drp1 em animais estão diretamente associadas com os sítios de
constrição e fissão mitocondrial (BLEAZARD et al., 1999, LABROUSSE et al.,
1999). A figura 7 mostra um modelo de divisão mitocon
FIGURA 7 – MODELO DE DIVISÃO MITOCONDRIAL EM EUCARIOTOS
PRIMITIVOS
A membrana externa (OM) e a membrana interna (IM) da mitocôndria estão representadas por verde escuro e
verde claro, respectivamente. A localização mitocondrial de FtsZ e da dinamina estão indicados em azul e
vermelho, respectivamente. Primeiramente ocorre a formação do anel Z no lado da matriz mitocondrial,
determinando, então, o sítio de divisão. Em seguida, ocorre a formação do anel MD. Esses dois anéis (anel Z e
MD) começam a fazer a constrição da mitocôndria. Quando tiver ocorrido suficiente constrição tornando tubular o
sítio de contrição, dinamina é recrutada, se localizando no lado citoplasmático da membrana externa, formando
um anel ou espiral, terminando a constrição e formando duas organelas filhas. FONTE: Nishida, 2004
15
A existência de um sistema de divisão mitocondrial independente de FtsZ,
leva à possibilidade de haver, mesmo apesar da presença da proteína FtsZ, um
processo de divisão no endosimbionte que possa ser executado por uma maquinaria
diferente daquela de origem procariótica baseado em proteínas da célula
hospedeira, como dinaminas.
16
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
O objetivo geral deste trabalho é o estudo e identificação dos genes que
codificam as proteínas envolvidas na divisão celular do endosimbionte do
tripanosomatídeo Crithidia deanei. Este trabalho faz parte de um projeto mais
ambicioso, que trata do seqüenciamento total do genoma do endosimbionte,
produzindo informação detalhada sobre sua origem evolutiva e inferências sobre os
fatores que levam a uma associação mutualística dessa bactéria com os
tripanosomatídeos hospedeiros.
2.2 METAS
1) Caracterizar os genes ftsK, ftsZ, zipA, minC, minD e minE do
endosimbionte, bem como estudar o envolvimento desses genes no
processo de divisão da bactéria simbiótica presente em
tripanosomatídeos.
2) Realizar estudos de complementação de um mutante
∆minCDE de
E. coli (PB114).
3) Produzir antisoros policlonais específicos contra as proteínas do
sistema Min (MinCDE) e realizar estudos de imuno-localização
usando microscopia de fluorescência.
4) Avaliar a atividade bioquímica e as interações entre essas proteínas.
5) Estudar o envolvimento de proteínas relacionadas às dinaminas no
processo de divisão do endosimbionte.
17
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.2 CULTIVO DOS MICRORGANISMOS
3.1.1 Cultivo dos tripanosomatídeos
Crithidia deanei e Blastocrithidia culicis contendo endosimbionte foram
cultivadas em meio Warren (WARREN, 1960) contendo 10% de soro fetal bovino, a
28
o
C com passagens a cada 24 h. No caso das cepas curadas (aposimbióticas), o
meio de cultivo foi o mesmo, mas a concentração de soro fetal bovino foi aumentada
para 20%. Após cultivo nestas condições, as culturas se encontravam em fase
exponencial de crescimento.
3.1.2 Cultivo de bactérias
As cepas de Escherichia coli utilizadas neste trabalho estão listadas na
Tabela 1. .As cepas XL1-blue e Top10F’ foram usadas como hospedeiras para as
clonagens moleculares. A cepa BL21 contendo o plasmídeo pLysS foi utilizada pra
indução de genes clonados no vetor pET47b. A cepa Rosetta (DE3) contendo
pRARE foi usada para aumentar a expressão de proteínas para posterior
purificação. A cepa PB114 foi usada para o estudo de complementação com os
genes minCDE do simbionte.Os meios de cultura LB (Luria-Bertani broth) e LB ágar,
suplementados com antibióticos quando requeridos (100 µg/ml ampicilina, 80 µg/ml
kanamicina, 34 µg/ml cloranfenicol, 12,5 µg/ml tetraciclina), foram usados para
manter E. coli a 37 ºC.
TABELA 1- LISTA DE CEPAS DE Escherichia coli
Nome da cepa Genótipo Referencia
BL21
PB114
dadR1, trpE61, trpA62, tna-5,
∆minCDE::kan
de Boer et al,
1989
Rosetta (DE3)
F
-
, ompT, hsdS
B
, (r
B
-
, m
B
-
), gal, dcm,
lacY1, (DE3), pRARE (Cm
R
)
Novagen
Top10Fי
F´{lacIq Tn10 (TetR)} mcrA ∆(mrr-hsdRMS-
mcrBC) Φ80lacZ∆M15 ∆lacX74 recA1 araD139
∆(ara-leu)7697 galU galK rpsL endA1 nupG
Invitrogen
XL1blue
endA1, gyrA96, hsdR17, lac.sup.-, recA1
Stratagene
18
3.2 ISOLAMENTO DO DNA GENÔMICO DO ENDOSIMBIONTE DE Crithidia deanei
3.2.1 Fracionamento celular: Isolamento do endosimbionte
C. deanei foi cultivada em 800 ml de meio Warren por 24 h a 28 ºC até a
concentração de aproximadamente 5x10
7
células/ml. Em seguida, as células foram
coletadas por centrifugação a 4.000 x g por 10 min e lavadas duas vezes com PBS.
O sedimento celular foi então resuspenso em água bidestilada gelada e mantido por
45 min no gelo. A suspensão celular foi então submetida a centrifugação nas
mesmas condições descritas acima. As células foram resuspensas em 12 ml de
sacarose a 0,25 M em Tris-HCl 20 mM, pH 7,6 e foram lisadas por ultra-som com
três pulsos de 15 s na potência 2 do aparelho Ultrasonic Homogenizer, modelo 4710
(Cole-Parmer Instrument Co.). O volume do lisado foi então ajustado para 20 ml com
tampão contendo sacarose 0,25 M, Tris-HCl 20 mM (pH 7,6), CaCl
2
2 mM, MgCl
2
10
mM e DNase tipo I (Sigma) 25 µg/ml. O homogenato foi então incubado a 25 ºC por
30 min. Decorrido esse tempo, o volume foi aumentado para 30 ml com sacarose
0,25 M, Tris-HCl 20 mM (pH 7,6) e centrifugado a 5.000 x g por 20 min. O
sobrenadante foi descartado e o sedimento foi resuspenso em sacarose 0,25 M em
Tris-HCl 20 mM (pH 7,6) e EDTA 2 mM. Pronase (protease tipo XIV de Streptomyces
griseus) foi adicionada para a concentração final de 0,5 mg/ml. O homogenato foi
imediatamente centrifugado a 4.000 x g por 20 min. O sedimento foi resuspenso em
10 ml de Tris-HCl 20 mM (pH 7,6) contendo sacarose 0,25 M. Alíquotas de 2,5 ml
dessa solução foram colocadas sobre 2,5 ml de sacarose a 0,5 M contidos em tubos
de centrífuga de vidro com capacidade para 15 ml (tubos Corex
®
). O material foi
centrifugado a 550 x g por 10 min, a camada acima do colchão de sacarose 0,5 M foi
coletada e o sedimento, consistindo principalmente de células não lisadas pelo ultra-
som, foi descartado. A camada superior foi centrifugada a 4.000 x g por 10 min e o
sedimento foi resuspenso em 6 ml de sacarose 0,25 M em Tris-HCl 20 mM, pH 7,6.
O material (1 ml por tubo) foi cuidadosamente colocado sobre 3 ml de gradiente
descontínuo de sacarose (2 ml de sacarose 0,44 M e 1 ml de sacarose 0,88 M).
Após a centrifugação a 1.740 x g por 30 min, o sedimento enriquecido em
endosimbiontes foi coletado.
19
3.2.2 Purificação do DNA endosimbionte
O DNA da fração de endosimbiontes obtida por fracionamento celular de C.
deanei foi isolado como descrito por Ausubel et al. (1988). O protocolo consiste
basicamente na suspensão da fração de endosimbiontes em TE (10 mM Tris-HCl, 10
mM EDTA, pH 8,0), seguida da adição de tampão de lise contendo EDTA 5 mM,
NaCl 10 mM, SDS 0,5% e proteinase K 2 mg/ml diluídos em Tris-HCl 10 mM, pH 8.
O material foi incubado por 1 h a 55
o
C e o DNA foi purificado por extração com
fenol/clorofórmio e precipitado com etanol na presença de acetato de sódio 0,3 M,
pH 6,0 por 30 min em gelo seco. O DNA foi coletado por centrifugação a 13.000 x g
e lavado com etanol 70 %. Após secar a temperatura ambiente, o DNA foi diluído em
TE e quantificado por espectrofotometria UV a 260 nm.
3.3 EXTRAÇÃO DO DNA GENÔMICO DE Escherichia coli
O protocolo utilizado foi tomado de Syn & Swarup (2002). Cerca de 3 ml de
uma cultura de Escherichia coli com densidade óptica de 1,2 (A600) foram
centrifugados por 5 minutos a 4000g e o sedimento celular foi lavado com 0,75 ml de
NaCl a 1% e resuspenso em 0,75 ml de TES (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA pH 8,
2% SDS). A ressuspensão foi incubada por 5 min a 75 ºC. O DNA foi extraído pela
adição de fenol:clorofórmio (3:1, v/v), seguida por extração com clorofórmio. O DNA
foi precipitado com acetato de sódio e isopropanol a temperatura ambiente e
centrifugado imediatamente em uma microcentrífuga. O pellet foi lavado com etanol
70% e ressuspenso em 150 µl de TE contendo RNAse (50 µg/ml). O DNA foi
quantificado no espectrofotômetro e 100 ng foram usados para cada amplificação
por PCR.
3.4 CONSTRUÇÃO DE PLASMÍDEOS E MANIPULAÇÃO DO DNA
Os plasmídeos e oligonucleotídeos (primers) utilizados neste trabalho estão
listados na tabela 2. Vale ressaltar que todas as amplificações foram realizadas
utilizando a Triple Master DNA Polimerase (Eppendorf), a fim de garantir a fidelidade
da seqüência de nucleotídeos dos fragmentos de interesse.
Todas as construções foram verificadas por análise de restrição e posterior
seqüenciamento do DNA.
20
TABELA 2- LISTA DE PLASMÍDEOS E OLIGONUCLEOTÍDEOS
Plasmídeos
Nome Características Referencia
pBAD22
Vetor de expressão de genes sob controle de P
BAD
e araC
Guzman et
al., 1995
pBADminCDEe
Derivado de pBAD22, contendo minCDEe sob controle de P
BAD
e araC
Este
trabalho
pBADminCDEEc
Derivado de pBAD22, contendo minCDE de Escherichia coli sob
controle de P
BAD
e araC
Este
trabalho
pETftsZEc
Derivado de pET28a, contendo ftsZ de Escherichia coli sob controle de
P
T7
(Ap
R
)
Lucia Yim
pETftsZe
Derivado de pET47b, contendo ftsZe sob controle de P
T7
(Kan
R
)
Este
trabalho
pGEX-4T Vetor de clonagem para fusões a GST, com sítio de corte por Trombina
(Ap
R
)
Pharmacia
Biosciences
pGEXminCe Derivado de pGEX-4T contendo a fusão GST-MinCe sob controle de
P
Tac
e lacI
q
(Ap
R
)
Este
trabalho
pGEXminDe Derivado de pGEX-4T contendo a fusão GST-MinDe sob controle de
P
Tac
e lacI
q
(Ap
R
)
Este
trabalho
pGEXminDeK11A Derivado de pGEX-4T contendo a fusão GST-MinDe sob controle de
P
Tac
e lacI
q
(Ap
R
), no entanto o resíduo de lisina na posição 11 foi
substituído pelo resíduo de alanina
Este
trabalho
pGEXminDeK16A Derivado de pGEX-4T contendo a fusão GST-MinDe sob controle de
P
Tac
e lacI
q
(Ap
R
), no entanto o resíduo de lisina na posição 16 foi
substituído pelo resíduo de alanina
Este
trabalho
pGEXminEe Derivado de pGEX-4T contendo a fusão GST-FtsZe sob controle de P
Tac
e lacI
q
(Ap
R
)
Este
trabalho
pGEXftsKe Derivado de pGEX-4T contendo a fusão GST-FtsKe sob controle de P
Tac
e lacI
q
(Ap
R
)
Este
trabalho
pGFPXa Vetor de clonagem para fusões a GFP, expressada sob controle de P
T5
,
com cauda de 6xHis no extremo Nt e sítio de corte por Fator á no
extremo Ct da GFP (Ap
R
)
Morking et
al., 2004,
BBRC
pGFPzipAe Derivado de pGFPXa contendo a fusão GFP-ZipAe sob controle do
promotor P
T5
(Ap
R
)
Este
trabalho
pGroESL
Genes groES e groEL de E. coli clonados sob controle do P
Tac
num
vetor com origem de replicação p15A (compatível com colE1) (Cm
R
)
Goloubinoff
et al., 1989
pJF119EH
Vetor de expressão de genes sob controle de P
Tac
e lacI
q
(Ap
R
)
Furste et
al., 1986
pJFminCe
Derivado de pJF119EH, portando minCe sob controle de P
Tac
e lacI
q
(Ap
R
)
Este
trabalho
pJFminCRBS
Derivado de pJF119EH, portando minCe sob controle de P
Tac
e lacI
q
(Ap
R
)
Este
trabalho
pJFminCDRBS
Derivado de pJF119EH, portando minCDe sob controle de P
Tac
e lacI
q
(Ap
R
)
Este
trabalho
pJFminCDEe
Derivado de pJF119EH, portando minCDEe sob controle de P
Tac
e lacI
q
(Ap
R
)
Este
trabalho
pJFminCDEEc
Derivado de pJF119EH, portando minCDEEc sob controle de P
Tac
e lacI
q
(Ap
R
)
Este
trabalho
pJFminEe
Derivado de pJF119EH, portando minEe sob controle de P
Tac
e lacI
q
(Ap
R
)
Este
trabalho
21
pJFzipAe
Derivado de pJF119EH, portando zipAe sob controle de P
Tac
e lacI
q
(Ap
R
)
Este
trabalho
pNUSMYC Derivado de pNUSHcN (vetor de expressão de tripanosomatídeos),
portando três seqüências MYC
Este
trabalho
pNUSMYCDnmTc
Derivado de pNUSMYC, portando o gene Dnm de Trypanosoma cruzi
Este
trabalho
pQEminCe
Derivado de pQE30, portando minCe sob controle do promotor P
T5
(Ap
R
)
Este
trabalho
pQEminDe
Derivado de pQE30, portando minDe sob controle do promotor P
T5
(Ap
R
)
Este
trabalho
pQEminEe
Derivado de pQE30, portando minEe sob controle do promotor P
T5
(Ap
R
)
Este
trabalho
pQEzipAe
Derivado de pQE30, portando zipAe sob controle do promotor P
T5
(Ap
R
)
Este
trabalho
pRARE Plasmídeo portador dos genes para os tRNAs dos codons AGG, AGA,
AUA, CUA, CCC, GGA, com origem de replicação compatível com Col-
E1 (Cm
R
)
Novagen
pREP4
Plasmídeo portador do gene lacI, com origen de replicação p15A
(compatível com colE1) (Km
R
)
Qiagen
pTEXGFP2 Vetor de expressão de tripanosomatídeos Gisele
Picchi
pTEXGFPDnmTc
Derivado do pTEXGFP2 portando o gene Dnm de Trypanosoma cruzi
Este
trabalho
OLIGONUCLEOTÍDEOS
Nome Seqüência Sítio de
restrição
minC1
5’-ATGAATTCATGATGAATAAATCCTTAATTGAATTTA-3’
EcoRI
minC2
5’-CTTCTAGAGAGTTATATGGCAATTATTGTTAGTT-3’
XbaI
minC3
5´-ATGGTACCAGGAGGTTAAAATGATGAATAAATCCTTAATTG-3´
KpnI
QECF 5'CATGGATCCATGATGAATAAATCCTTAATTGAATTTA3'
BamHI
QECR 5'ACTAAGCTTGAGTTATATGGCAATTATTGTTAGTT3'
HindIII
minD2
5’-GATCTAGATTATCTACCTCCAAAAAGTCG-3’
XbaI
minD3
5´-CAGGTCGACTCGTGGCGCGAGTTGTTGTAGTAACT -3´
SalI
minD4
5´-GAGCGGCCGCTTATCTACCTCCAAAAAGTCGTTTGATA-3´
NotI
K11A 5´CAGGTCGACTCGTGGCGCGAGTTGTTGTAGTAACTTCTGGTGCA
GGAGGCGTGG 3´
SalI
K16A 5´CAGGTCGACTCGTGGCGCGAGTTGTTGTAGTAACTTCTGGTAAAG
GAGGCGTGGGTGCAACCACTAGCA3´
SalI
QEDF 5´CAGGGATCCGTGGCGCGAGTTGTTGTAGTAACT3´
BamHI
QEDR 5´AGAAAGCTTTTATCTACCTCCAAAAAGTCGTTTGATA3´
HindIII
minE1
5’- TGAATTCAACATGTCATTTCTGTCGTTT-3’
EcoRI
minE2
5’-GATCTAGATTAAGTTTTTTGTTGCATCTCTAT-3’
XbaI
22
minEgfpR
5´ CGAGCTAGCTTAAGTTTTTTGTTGCATCTCTAT 3
NheI
minEgstR
5 ´GATAAGTTTTGCGGCCGCTTAAGTTTTTTGTTGCATCTCTAT 3´
NotI
QEEF 5'CTTGGATCCATGTCATTTCTGTCGTTT3'
BamHI
QEER 5'CGAAAGCTTTTAAGTTTTTTGTTGCATCTCTAT3'
HindIII
minCEc1
5´-GTGAATTCGGGATGTCAAACACGCCAATCG-3
EcoRI
minEEc1
5´- CAGGATCCTTATTTCAGCTCTTCTGCTTCCGG-3´
BamHI
zipA3
5´ TTAGGTACCAGGAGGACTAATGACTAATGTAAATAATTC 3´
KpnI
zipA4
5´ TATCTAGATTAGCTAGCTTTAAAAACTCTTCTTGCACG-3´
XbaI e NheI
zipA2
5´-TAAAGCTTTTAAGATCTTTTAAAAACTCTTCTTGCACG-3´
HindIII e
BglII
zipA5 5´ TTAAAGCTTATGACTAATGTAAATAATTCAAAAG 3´
HindIII
QEAF 5´ TTAGGATCCATGACTAATGTAAATAATTCAA3´
BamHI
QEAR 5´ CTAAAGCTTTTAAAAACTCTTCTTGCACGATAGC3´
HindIII
ftsK1 5´ATGAATTCCCAGATCTTAGTTTATTAGATATGCCA 3´
EcoRI
ftsK2
5´ATCATGATGCGGCCGCTTATCACTCATCCTTACCATCTGTAG 3´
NotI
dinGFP1
5´ CTAGATCTCATGAATCAGCTTATCGCTGT 3´
BglII
dinGFP2
5´ TAATCGATTTATAATGTAAATTCACGCACAC 3´
ClaI
pETZeF 5´AAGAATTCGATGAGGTTTGAGATTC3´
EcoRI
pETZeR 5´AATGTCGACATAATCAACTCTCTTTC3´
SalI
Os sítios de reconhecimento para as enzimas de restrição adicionados aos primers estão sublinhados e os
códons de início ou final da tradução estão em negrito. Destaque em vermelho: mutação inserida na sequência.
3.4.1 Amplificação por PCR (Reação em cadeia da polimerase) de genes para
clonagem
Os oligonucleotídeos foram construídos com base nas seqüências dos genes
do endosimbionte de C. deanei, cujo genoma está sendo seqüenciado no IBMP.
Para amplificar minCDE de E. coli utilizamos a seqüência dos genes disponível no
Genbank (www.genbank.org). Para amplificar a dinamina utilizamos a sequência do
gene do Trypanosoma cruzi, já que o gene de C. deanei não foi caracterizado.
As amplificações por PCR foram realizadas com uma mistura de Taq DNA
polimerase e uma outra polimerase de alta fidelidade (Triplemaster PCR system -
Eppendorf), para minimizar a possibilidade de incorporação de mutações na
seqüência a clonar. As reações continham, em um volume de 50 µl, 100 ng de DNA
23
isolado do endosimbionte, 175 µM de cada dNTP, 10 pmoles de cada primer e 2
unidades de DNA polimerase com tampão apropriado fornecido pelo fabricante. A
mistura foi previamente incubada a 94
o
C por 2 minutos e logo após foi submetida a
35 ciclos de amplificação, cada um consistindo de incubações a 94
o
C por 30
segundos, 55
o
C por 30 segundos e 72
o
C por 1,5 minutos (a temperatura de
anelamento e o tempo de extensão dependeram de cada oligonucleotídeo e do
tamanho do fragmento a amplificar). Em seguida a amostra permaneceu por mais 5
minutos a 72
o
C. As reações foram realizadas em termociclador Perkin-Elmer 9700
ou MWG de Biotech.
3.4.2 Clonagens
3.4.2.1 Clonagem do gene minC do endosimbionte no vetor de expressão pJF119EH
Para a clonagem do gene minC do endosimbionte de C. deanei (minCe) no
pJF119EH (figura 6, FURSTE et al., 1986), este foi amplificado por PCR a partir de
DNA genômico purificado do simbionte usando os primers minC1/minC2 (tabela 2 e
figura 9).
FIGURA 8 – ESQUEMA DO PLASMÍDEO pJF119EH
MCS - sítio múltiplo de clonagem
P
Tac
MCS
rrn
Ap
R
ori
LacI
pJF119EH
5,3 kb
24
FIGURA 9 – ESQUEMA DO AGRUPAMENTO GÊNICO minCDE DO
ENDOSIMBIONTE MOSTRANDO A POSIÇÃO OS OLIGONUCLEOTÍDEOS
INICIADORES UTILIZADOS
O fragmento obtido, de 720 pb, foi digerido com EcoRI e XbaI e inserido no
vetor pJF119EH previamente digerido com as mesmas enzimas. O plasmídeo
resultante, pJFminCe, expressa o minCe em sua forma nativa a partir do promotor
P
Tac
, mediante indução com IPTG (isopropil-tio-galactopiranosideo). A presença no
plasmídeo do gene lacI
q
, que codifica para o repressor do P
Tac
, ajuda a diminuir o
escape basal da transcrição.
O clone bacteriano contendo o plasmídeo pJFminCe quando incubado na
presença de IPTG produziu uma proteína de massa molecular esperada (24,7 kDa),
mas a indução foi muito reduzida, e não apresentava alteração do fenótipo de E.
coli. Acreditamos que, nessas condições, a indução não foi suficiente para aumentar
os níveis de MinCe significativamente. Assim, foi desenhado outro primer (minC3)
introduzindo a seqüência AGGAGG, consenso para o sítio para ligação do
ribossomo (Ribosome Binding Site, RBS), 5 pb a montante do ATG do gene para
aumentar a sua expressão. Este primer introduzia no fragmento o sítio para KpnI. O
gene minCe foi então amplificado com os primers minC3/minC2, digerido com KpnI e
XbaI e ligado ao pJF119EH previamente digerido com as mesmas enzimas. Assim,
foi possível aumentar os níveis de expressão de minCe em E. coli.
3.4.2.2 Clonagem dos genes minCD do endosimbionte no vetor de expressão
pJF119EH
A estratégia utilizada para superexpressar minCe e minDe simultaneamente
em E. coli foi a mesma já descrita para o gene minCe, ou seja clonagem no vetor
pJF119EH. Os genes minCDe foram amplificados usando os primers minC3/minD2
(tabela 2 e figura 7). O fragmento obtido, de 1670 pb, foi digerido com KpnI e XbaI e
clonado no pJF119EH/KpnI/XbaI. O plasmídeo resultante chamou-se
pJFminCDRBS.
m
m
i
i
n
n
C
C
m
m
i
i
n
n
D
D
m
m
i
i
n
n
E
E
minC1, minC3
minC2 minD2, minD4 minE2
minD1, minD3
minE1
25
3.4.2.3 Clonagem do gene minE do endosimbionte no vetor de expressão pJF119EH
Para a clonagem do gene minE do endosimbionte de C. deanei (minEe) no
pJF119EH, este foi amplificado por PCR a partir de DNA genômico purificado do
simbionte usando os primers minE1/minE2 (ver tabela 2 e figura 7). O fragmento
obtido, de 255 pb, foi digerido com EcoRI e XbaI e inserido no vetor pJF119EH
previamente digerido com as mesmas enzimas. O plasmídeo resultante se
denominou pJFminEe.
3.4.2.4 Clonagem dos genes minCDE do endosimbionte no vetor de expressão
pJF119EH
O agrupamento gênico minCDE do endosimbionte (minCDEe) foi amplificado
com os primers minC3/minE2 (tabela 2 e figura 7), o fragmento resultante, de 1930
pb, foi digerido com KpnI e XbaI e inserido no pJF119EH/KpnI/XbaI. O plasmídeo
resultante chamou-se pJFminCDEe.
3.4.2.5 Clonagem dos genes minCDE de Escherichia coli no vetor de expressão
pJF119EH
Para obter um vetor que expressasse os genes minCDE de E. coli
(minCDEEc) para ser usado como controle positivo nos ensaios de
complementação, amplificamos os genes a partir do DNA genômico purificado da
cepa XL1blue utilizando os oligos minCEc1 e minEEc1 (que contém os sítios de
corte para as enzimas EcoRI e BamHI, respectivamente). O fragmento resultante, de
1900 pb, foi digerido com EcoRI e BamHI e clonado no vetor pJF119EH previamente
digerido com EcoRI e BamHI. O plasmídeo assim obtido se denominou
pJFminCDEEc.
3.4.2.6 Clonagem dos genes minCDE do endosimbionte no vetor de expressão
pBAD22
O agrupamento gênico minCDE do endosimbionte (minCDEe) foi amplificado
com os primers minC1/minE2 (ver tabela 2 e figura 7), o fragmento resultante, de
1930 pb, foi tratado com o fragmento Klenow da DNA pol I e digerido com XbaI, e
depois inserido no pBAD22/SmaI/XbaI. O plasmídeo resultante chamou-se
pBADminCDEe.
26
3.4.2.7 Clonagem dos genes minCDE de Escherichia coli no vetor de expressão
pBAD22
Para obter um vetor que expressasse os genes minCDE de E. coli
(minCDEEc) para ser usado como controle positivo nos ensaios de
complementação, amplificamos os genes a partir do DNA genômico purificado da
cepa XL1blue utilizando os oligos minCEc1 e minEEc1. O fragmento resultante, de
1900 pb, foi tratado com Klenow e digerido com EcoRI. Em seguida foi clonado no
vetor pBAD22 previamente digerido com EcoRI e SmaI. O plasmídeo assim obtido
se denominou pBADminCDEEc.
3.4.2.8 Clonagem do gene zipA do endosimbionte no vetor de expressão pJF119EH
Para a clonagem do gene zipA do endosimbionte de C. deanei (zipAe) no
pJF119EH, este foi amplificado por PCR a partir de DNA genômico purificado do
endosimbionte usando os primers zipA3/zipA4 (ver tabela 2). O fragmento obtido, de
944 pb, foi digerido com KpnI e XbaI e inserido no vetor pJF119EH previamente
digerido com as mesmas enzimas. O plasmídeo resultante denominou-se pJFzipAe.
3.4.2.9 Clonagem do gene zipA do endosimbionte no vetor de expressão pGFPXa
O gene zipAe foi amplificado com os oligos zipA2 e zipA5, o fragmento de 944
pb foi digerido com HindIII e BglII e então clonado no vetor pGFPXa (figura 10),
previamente cortado com HindIII e Bglii. Como resultado, obteve-se um plasmídeo,
pGFPzipAe, que expressava a proteína quimérica GFP-ZipAe contendo uma cauda
de 6xHis na porção amino-terminal, sob controle do P
T5
. Para limitar o escape basal
da transcrição, o plasmídeo pGFPminCe foi co-transformado na mesma cepa com o
pREP4, portador do gene lacI
q
.
27
FIGURA 10 - ESQUEMA DO PLASMÍDEO pGFPXA
3.4.2.10 Clonagem do gene minC do endosimbionte no vetor de expressão pGEX-4T
O gene minCe foi amplificado com os primers minC1/minC2, tratado com
Klenow e digerido com EcoRI. O fragmento então foi ligado ao pGEX-4T (figura 11),
previamente digerido com EcoRI e SmaI. O plasmídeo resultante, pGEXminCe,
codifica uma proteína de fusão composta pela GST (Glutationa-S-Transferase) e a
MinC do endosimbionte (GST-MinCe) sob controle do P
Tac
e lacI
q
. Na união entre
ambas existe um sítio de reconhecimento para a trombina.
FIGURA 11 - ESQUEMA DO PLASMÍDEO pGEX-4T
O pGEX4T possui os sítios de restrição para BamHI, EcoRI, SmaI, SalI
XhoI e NotI. Entre a seqüência codificadora da GST e o MCS existe um
sítio de corte para a trombina.
http://www1.gelifesciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/Products?Op
enDocument&parentid=27458001&moduleid=38859
M
C
S
4900bp
pGEX-4T
M
C
S
M
C
S
4900bp
pGEX-4T
P
T5
pGFPXa
M
C
S
P
T5
pGFPXa
P
T5
pGFPXa
M
C
S
28
3.4.2.11
Clonagem do gene minD do endosimbionte no vetor de expressão pGEX-4T
O gene minDe foi amplificado com os primers minD3/minD4 (ver tabela 2 e
figura 7), digerido com SalI e NotI e ligado ao pGEX-4T (figura 9), previamente
digerido com as mesmas enzimas. O plasmídeo resultante, pGEXminDe, expressava
uma proteína de fusão composta pela GST (Glutationa-S-Transferase) e a MinD do
endosimbionte (GST-MinDe) sob controle do P
Tac
e lacI
q
.
3.4.2.12 Clonagem do gene minE do endosimbionte no vetor de expressão pGEX-4T
O gene minEe foi amplificado com os primers minE1/minEgstR (ver tabela 2 e
figura 7), digerido com EcoRI e NotI e ligado ao pGEX-4T, previamente digerido com
as mesmas enzimas. O plasmídeo resultante, pGEXminEe, codifica uma proteína de
fusão composta pela GST (Glutationa-S-Transferase) e a MinD do endosimbionte
(GST-MinEe) sob controle do P
Tac
e lacI
q
.
3.4.2.13 Clonagem do gene ftsK do endosimbionte no vetor de expressão pGEX-4T
O fragmento de 1480 pb do gene ftsKe (codifica a porção C-terminal da FtsK)
foi amplificado com os primers ftsK1/ftsK2, digerido com EcoRI e NotI e ligado ao
pGEX-4T, previamente digerido com as mesmas enzimas. O plasmídeo resultante,
pGEXftsKe, expressa uma proteína de fusão composta pela GST (Glutationa-S-
Transferase) e a região C-terminal da proteína FtsK do endosimbionte (GST-
CtFtsKe) sob controle do P
Tac
e lacI
q
.
3.4.2.14 Clonagem do gene minC do endosimbionte no vetor de expressão pQE30
O gene minCe foi amplificado com os oligonucleotídeos iniciadores QECF e
QECR, o fragmento de 720 pb digerido com BamHI e HindIII, e clonado no vetor
pQE30 (figura 12), previamente digerido com BamHI e HindIII. Como resultado,
obteve-se o plasmídeo, pQEminCe, que expressava a proteína MinCe contendo uma
cauda de 6xHis na região amino-terminal, sob controle do P
T5
. Para limitar o escape
basal da transcrição, o plasmídeo pQEminCe foi co-transformado na mesma cepa
com o pREP4, portador do gene lacI
q
.
29
FIGURA 12 - ESQUEMA DO PLASMÍDEO pQE30
http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/Protocols/pQE-30_UA.pdf
3.4.2.15 Clonagem do gene minD do endosimbionte no vetor de expressão pQE30
O gene minDe foi amplificado com os oligonucleotídeos iniciadores QEDF e
QEDR, o fragmento de 880 pb foi digerido com BamHI e HindIII, e clonado no vetor
pQE30, previamente digerido com BamHI e HindIII. Como resultado, obteve-se o
plasmídeo, pQEminDe, que codifica a proteína MinDe contendo uma cauda de 6xHis
na região amino-terminal, sob controle do P
T5
. Para limitar o escape basal da
transcrição, o plasmídeo pQEminDe foi co-transformado na mesma cepa com o
pREP4, portador do gene lacI
q
.
3.4.2.16 Clonagem do gene minE do endosimbionte no vetor de expressão pQE30
O gene minEe foi amplificado com os oligonucleotídeos iniciadores QEEF e
QEER, o fragmento de 255 pb foi digerido com BamHI e HindIII, e clonado no vetor
pQE30, previamente digerido com BamHI e HindIII. Como resultado, obteve-se o
plasmídeo, pQEminEe, que codifica a proteína MinEe contendo uma cauda de 6xHis
na região amino-terminal, sob controle do P
T5
. Para limitar o escape basal da
transcrição, o plasmídeo pQEminEe foi co-transformado na mesma cepa com o
pREP4, portador do gene lacI
q
.
30
3.4.2.17 Clonagem do gene zipA do endosimbionte no vetor de expressão pQE30
O gene zipAe foi amplificado com os oligonucleotídeos iniciadores QEEF e
QEER, o fragmento de 944 pb foi digerido com BamHI e HindIII, e clonado no vetor
pQE30, previamente digerido com BamHI e HindIII. Como resultado, obteve-se o
plasmídeo, pQEminEe, que codifica a proteína MinEe contendo uma cauda de 6xHis
na região amino-terminal, sob controle do P
T5
. Para limitar o escape basal da
transcrição, o plasmídeo pQEminEe foi co-transformado na mesma cepa com o
pREP4, portador do gene lacI
q
.
3.4.2.18 Clonagem do gene ftsZ do endosimbionte no vetor de expressão pET47b
O gene ftsZ do endosimbionte de C. deanei (ftsZe) foi amplificado por PCR a partir
do DNA genômico obtido de frações purificadas de simbionte, usando os primers
pETZeF e pETZeR. Esses oligonucleotídeos inciadores contém sítios de
reconhecimento para as enzimas de restrição EcoRI e SalI, respectivamente. O
fragmento resultante, de 1.160 pb, foi digerido com EcoRI e SalI e clonado no vetor
pET47b (figura 13), previamente digerido com EcoRI e SalI. O plasmídeo resultante,
pETftsZe, expressava o ftsZe com uma cauda de 6xHis a partir do promotor P
T7
,
mediante indução com IPTG (isopropil-tio-galactopiranósido).
31
FIGURA 13 - ESQUEMA DO PLASMÍDEO pET-47b
http://www.emdbiosciences.com/docs/docs/PROT/TB415.pdf
3.4.2.19 Clonagem do gene da dinamina de Trypanosoma cruzi (Tcdnm) no vetor de
expressão pTEXGFP2.
O gene que codifica a dinamina de T. cruzi foi amplificado com os primers
dinGFP1/dinGFP2. O fragmento obtido de 1700 pb foi digerido com as enzimas de
restrição BglII e ClaI e clonado no vetor pTEXGFP2 digerido com as mesmas
enzimas. O plasmídeo pTEXGFP2 foi construído no IBMP a partir do plasmídeo
pTEX (KELLY et al., 1992)
O plasmídeo resultante, pTEXGFPTcDnm, codifica uma proteína de fusão composta
pela GFP e a dinamina do T. cruzi.
3.4.3 Ligação dos genes nos vetores de expressão
Os genes foram ligados aos vetores, ambos previamente digeridos com as
enzimas de restrição adequadas na relação molar de 3:1 (inserto:plasmídeo) em
volume de reação de 10 µl, contendo tampão da enzima T4 DNA ligase e uma
unidade da enzima T4 DNA ligase (USB). A reação foi incubada a 16 ºC por 18 h. As
ligações entre os genes e o vetor foram usadas para transformar a cepa XL-1Blue
ou TOP10F’ de E. coli
32
3.4.4 Preparação de células cálcio-competentes
Foi utilizado o método do cloreto de cálcio descrito em Sambrook et al.
(1989). Assim, uma colônia da cepa XL1blue ou TOP10F’ de E. coli foi inoculada em
5 ml de meio LB contendo 12,5 µg/ml de tetraciclina. A cultura foi incubada por 16
horas a 37
o
C sob agitação constante. Um ml desta cultura foi transferido para 100
ml de meio LB (inóculo de 1:100) pré-aquecido a 37 ºC. As células foram incubadas
a 37
o
C sob agitação constante até a fase de crescimento exponencial (densidade
óptica
600
= 0,5). A cultura foi então centrifugada a 5000 x g por 10 minutos a 4
o
C e o
pellet obtido foi resuspenso em 50 ml (metade do volume original) de CaCl
2
100 mM
frio e mantido no gelo por 10 minutos. A suspensão foi submetida a uma nova
centrifugação de 5.000 x g e as células foram resuspensas em 2,0 ml (1/50 do
volume da cultura original) de CaCl
2
50 mM frio e mantidas no gelo até a
transformação, ou congeladas a -80 ºC após adicionar glicerol 20%.
3.4.5 Transformação e seleção dos clones recombinantes
As reações de ligação foram incubadas no gelo por 30 min com 200 µl de
bactérias competentes. Após este tempo, a mistura foi incubada a 42
o
C durante 2
min (choque térmico) e colocada de novo no gelo. Em seguida, 1 ml de meio LB foi
adicionado ao tubo e as células foram cultivadas a 37
o
C por 1 hora antes do
plaqueamento. Volumes de 100 e 200 µl da cultura de bactérias transformadas
foram espalhados em placas de Petri contendo meio de cultura seletivo (LB, agar
15%, e antibiótico dependendo do plasmídeo). As placas foram incubadas por 18
horas a 37
o
C. Clones contendo plasmídeos recombinantes foram selecionados
mediante a técnica de palitagem ou por PCR de colônia.
3.4.6 Seleção dos clones recombinantes através da técnica da palitagem
(toothpick)
As colônias foram coletadas com o auxílio de palitos de dente (toothpick)
estéreis e transferidas para o fundo de tubos de microcentrifuga e para a superfície
do meio LB solidificado para a obtenção de uma réplica das colônias que foram
analisadas (placa-mãe). A cada um dos tubos foram acrescentados 10
µl do tampão
de lise. Os tubos foram incubados em banho-maria a 65 ºC por 10 min. As amostras
33
foram analisadas por eletroforese em gel de agarose a 1%, usando o plasmídeo
original como controle. Ao fim da eletroforese o gel foi corado com brometo de
etídeo (0,5
µg/ml) por aproximadamente 20 min e lavado com água ultrapura e
analisado em luz ultravioleta. O gel foi fotografado no sistema de foto-documentação
UVP (Biorad).
3.4.7 Preparação dos plasmídeos contendo os produtos de PCR (miniprep)
As colônias selecionadas foram inoculadas em 5 ml de meio LB contendo o
antibiótico de resistência e cultivadas por 18 h a 37
o
C sob constante agitação. As
células obtidas foram centrifugadas a 12.000 x g por 1 minuto e o sedimento obtido
foi utilizado para a extração dos plasmídeos através do sistema “QIAprep spin
miniprep kit” (QIAGEN). Nestas condições, cerca de 5 a 10 µg de DNA dos
diferentes plasmídeos foram recuperados para serem utilizados em testes de
expressão e complementação.
3.5 EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES
Colônias recombinantes foram inoculadas em 2 ml de meio LB com o
antibiótico de resistência do plasmídeo e cultivadas durante 16 h a 37 °C (pré-
inóculo). Uma alíquota de 200 µl de cada pré-inóculo foi inoculada em 2 tubos
contendo 2 ml de meio LB e antibiótico. As culturas foram incubadas por uma hora a
37 ºC. Após esse período foi adicionado IPTG na concentração final de 2 mM a uma
das culturas (cultura induzida). A cultura sem adição de IPTG (não induzida) serviu
de controle negativo da expressão. Ambas as culturas foram incubadas a 37 °C por
mais três horas. As bactérias foram coletadas por centrifugação a 12.000 x g por 2
min e resuspensas em 500 µl de PBS. A suspensão bacteriana foi lisada por
ultrasom (Ultrasonic Homogenizer 4710 Series, Cole-Parmer Instrument Co.) por 2
pulsos de 5 segundos em potência 3. Vinte microlitros desses extratos das culturas
bacterianas (induzida e não induzida) foram adicionados a 5 µl de Tampão de
amostra 4x, sendo em seguida incubados por 5 min a 100 ºC. Cada amostra foi
submetida à eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida, com SDS (SDS-
PAGE), a 28 mA, como descrito por Laemmlli (1970). Após a eletroforese as
proteínas foram coradas com solução de Coomassie Blue R-250 a 65 °C por 30 min
34
e descoradas com trocas sucessivas de solução de descoloração para géis de
proteína, na mesma temperatura.
3.6 TESTE DE SOLUBILIDADE DAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES
Para testar a solubilidade das proteínas recombinantes, as culturas
bacterianas foram induzidas como descrito no item 3.4. Após a indução, as bactérias
foram coletadas por centrifugação a 7.000 x g por 10 min a 4 °C. Os sedimentos
bacterianos foram resuspensos em 3 ml de solução de sonicação contendo 100
µg/µl de lisozima e incubados por 30 min a 4 ºC. Foi adicionado PMSF (fluoreto de
fenil metil sulfonil) à solução para uma concentração final de 1 mM. A suspensão
bacteriana foi lisada por ultrasom, com 3 pulsos de 15 seg (potência 7). Após a lise,
o sobrenadante e o sedimento de cada clone testado foram analisados em SDS-
PAGE para analisar a solubilidade das proteínas recombinantes.
3.7 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE A PARTIR DE
CORPÚSCULOS DE INCLUSÃO
Esta técnica é utilizada pra proteínas recombinantes insolúveis. Para a
purificação de corpúsculos de inclusão, uma colônia recombinante foi inoculada em
3 ml de meio LB + antibiótico de resistência do plasmídeo e cultivada durante 16 h a
37 °C (pré-inóculo). Foram inoculados 2 ml do pré-inóculo em 200 ml de meio
LB/antibiótico e as culturas foram incubadas por três horas a 37 ºC. Após esse
período foi adicionado IPTG na concentração final de 1 mM à cultura. Após a
indução, a cultura foi centrifugada a 7.000 x g por 10 min a 4 °C. Os sedimentos
bacterianos foram resuspensos em 10 ml de PBS e a lise foi realizada como descrito
no item anterior, mas antes se adicionou à suspensão bacteriana lisozima para uma
concentração final de 0,5 mg/ml, por 20 min a temperatura ambiente. O lisado foi
centrifugado a 12.000 x g por 20 min a 4 ºC. O sobrenadante foi descartado e o
sedimento (pellet), contendo as proteínas recombinantes insolúveis na forma de
corpúsculos de inclusão, foi resuspenso em 5 ml de uma solução de suspensão de
corpúsculo (Tris-HCl 20 mM pH 8,0, NaCl 0,5 M e Triton X-100 2%) para cada 100
ml da cultura original. A solução foi centrifugada por 10 min a 12.000 x g a 4 ºC e o
sobrenadante foi descartado. Repetiu-se essa lavagem por mais 2 vezes. O material
então foi lavado com 10 ml de solução de PBS (retirar o Triton X-100) e centrifugado
por 10 min a 12.000 x g a 4 ºC. O sedimento formado foi resuspenso em 2 ml de
35
PBS e adicionou-se PMSF para uma concentração final de 1 mM. A esse material
foi adicionado 1 ml de tampão de amostra 4X e purificou-se por eletroforese em gel
preparativo de poliacrilamida a 8%, com 15 cm de largura por 10 cm de altura. O gel
foi submetido à eletroforese por 16 h a 20 mA. O gel foi corado com solução de KCl
100mM, a banda correspondente foi cortada e eletroeluída por 2 horas a 60V em
tampão de SDS-PAGE.
3.8 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA FtsZe UTILIZANDO RESINA DE NÍQUEL-NTA
A cepa BL21 pLysS foi transformada com o plasmídeo pETftsZe e a produção
da proteína recombinante 6xHisFtsZ foi induzida mediante crescimento em LB com
Amp, Kana e IPTG 0,5 mM a 30 ºC. A proteína recombinante se mostrou solúvel
nestas condições, obtendo-se uma quantidade suficiente para a sua purificação por
cromatografia de afinidade em resina de níquel-NTA, conforme descrição do
fabricante (Qiagen). Brevemente, o extrato induzido foi resuspenso em tampão de
ligação (Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,5 M, Imidazol 5 mM), sonicado e as células não
lisadas foram descartadas por centrifugação. O sobrenadante foi incubado com a
resina Ni-NTA durante 2h a 4 ºC com agitação suave. A fração não retida foi
separada da resina por gravidade em coluna. Em seguida a resina foi lavada uma
vez com o tampão de ligação e uma vez com o tampão de lavagem (tampão de
ligação, contendo imidazol 20 mM). A proteína recombinante foi eluída com tampão
de eluição (tampão de ligação, contendo imidazol 100 mM). As alíquotas das frações
obtidas foram aplicadas em um gel de poliacrilamida a 13%.
3.9 PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNA RECOMBINANTE (FUSÃO COM GST)
UTILIZANDO RESINA GLUTATIONA-SEPHAROSE
3.9.1 Purificação da proteína recombinante GST-FtsKe
A cepa Top10F’ pRARE foi transformada com o plasmídeo pGEXFtsKe e a
produção da proteína GST-FtsKe foi induzida com IPTG. Um clone recombinante foi
cultivado durante 16 h a 37 ºC (pré-inóculo). O pré-inóculo foi diluido 1:100 em 200
ml de LB contendo ampicilina e cloranfenicol e incubado a 37 ºC com agitação. Ao
atingir a absorbância A
600
∼0,5, IPTG foi adicionado para uma concentração final de
0,5 mM. Após 3 h de indução as células foram recolhidas por centrifugação e
resuspensas em 5 ml de PBS 1x contendo PMSF 0,15 mM (inibidor de protease) e
lisozima 0,1 mg/ml. A ressupensão celular foi sonicada mediante 6 pulsos de 5
36
segundos cada um, com intervalos de 1 minuto, durante o qual as células foram
mantidas em gelo. A ruptura das células bacterianas foi verificada por observação
em microscópio de contraste de fase. Para eliminar restos celulares e células não
lisadas, a suspensão foi centrifugada a 4 ºC durante 30 min a 10.000 rpm em
microcentrifuga Eppendorf. Ao sobrenadante, contendo a proteína GSTFtsKe a
purificar, foi acrescentado Triton X-100 a uma concentração final de 0,2% e 400
µl
de resina Glutathione-Sepharose 4B fast flow (Pharmacia), previamente equilibrada
em PBS 1x. A mistura foi incubada a 4ºC durante 16 h com agitação suave, e a
fração não retida foi separada da resina por gravidade em coluna. A resina foi lavada
3 vezes com 10 ml de PBS contendo Triton X-100 a 0,2%, e 3 vezes com 10 ml de
PBS. A proteína GST-FtsKe foi eluída em vários passos com um tampão contendo
Tris-HCl 50 mM pH 8,0 e glutationa reduzida 10 mM (tampão Glutationa).
3.9.2 Purificação das proteínas recombinantes GST-MinC,GST-MinD, GST-
MinDK11A e GST-MinDK16A
O plasmídeos pGECminCe, pGEXminDe, pGEXminDeK11A e
pGEXminDeK16A foram usados para transformar a cepa Top10F’. As colônias
recombinantes foram inoculadas em 3 ml de meio LB com o antibiótico ampicilina e
cultivadas durante 16 h a 37 °C (pré-inóculo). No d ia seguinte os pré-inóculos foram
diluídos 1:100 em 300 ml de meio LB contendo ampicilina e as culturas foram
cultivadas a 30 ºC com agitação. Ao atingir a absorbância A
600
∼0,4 foi adicionado
IPTG a uma concentração final de 0,5 mM. Em seguida a temperatura do agitador foi
diminuída para 25 °C. Após indução por 16 h, as cél ulas foram recolhidas por
centrifugação e resuspensas em 5 ml de PBS 1x contendo PMSF 0,15 mM e
lisozima 0,1 mg/ml. A resupensão de células foi sonicada mediante 6 pulsos de 5
segundos cada um, com intervalos de 1 minuto, durante o qual as células foram
mantidas em gelo. A ruptura das células bacterianas foi verificada por observação
em microscópio de contraste de fase. Para eliminar restos celulares e células não
lisadas, a suspensão foi centrifugada a 4 ºC durante 30 min a 10.000 rpm em
microcentrifuga Eppendorf. Ao sobrenadante (contendo a proteína GSTFtsKe a
purificar) foi acrescentado Triton X-100 a uma concentração final de 0,2% e 400 µl
de resina Glutathione-Sepharose 4B fast flow (Pharmacia), previamente equilibrada
em PBS 1x. A mistura foi incubada a 4 ºC durante 16 h com agitação suave, e a
fração não retida foi separada da resina por gravidade em coluna. A resina foi lavada
37
3 vezes com 10 ml de PBS contendo Triton X-100 0,2%, e 3 vezes com 10 ml de
PBS. A proteína GST-FtsKe foi eluída em várias alíquotas com um tampão contendo
Tris-HCl 50 mM pH 8 e glutationa reduzida a 10 mM (tampão Glutationa).
3.10 PURIFICAÇÃO DE FtsZ DE Escherichia coli
Uma cultura da cepa BL21 pLysS pETftsZEc foi incubada em 3 ml de
LB+Cm+Ap a 30 ºC por 16 horas. Em seguida fez-se uma diluição 1/100 em 250 ml
de LB +Cm+Ap a 30 ºC. Quando a cultura atingiu DO600 ∼ 0,4-0,5, acrescentou-se
IPTG para uma concentração final de 0,5 mM e fez-se uma indução por 3 horas a 30
ºC. Em seguida centrifugou-se a cultura e o sedimento obtido foi resuspenso em 4
ml de PEM (50 mM Pipes pH 6,5, 2 mM MgCl
2
, 1 mM EDTA) + PMSF 0,15 mM.
Esse material foi sonicado com 4 pulsos de 10 segundos na potência 7 e
centrifugou-se o material sonicado por 30 minutos a 13000 rpm a 4 ºC. Ao
sobrenadante adicionou-se CaCl
2
(concentração final 20 mM) e GTP (concentração
final 1 mM), incubou-se por 15 min a 30 ºC e centrifugou-se por 15 min a 20.800 x g
a 4 ºC (FtsZ polimeriza e precipita). Resuspendeu-se o sedimento em 4 ml de
tampão de ligação (20 mM TrisHCl pH 8, 300 mM NaCl, 5 mM imidazol). Esse
material foi centrifugado por 5 min a 20.800 x g a 4 ºC e descartou-se o sedimento
(material insolúvel). O sobrenadante foi incubado por 16 horas a 4 ºC com a resina
de Níquel-NTA (500 µl, previamente lavada com tampão de ligação). Após
incubação, o material foi passado por uma coluna e recolheu-se o material não
ligado. A resina retida foi lavada com 10 ml de tampão de ligação (5 mM de imidazol)
e em seguida com 10 ml de tampão de lavagem (20 mM de imidazol). Eluiu-se então
o material com 1 ml de tampão de eluição (imidazol 100 mM), sendo este passo
repetido mais 3 vezes, obtendo-se ao final 4 eluatos.
3.11 OBTENÇÃO DE ANTISORO POLICLONAL CONTRA AS PROTEÍNAS
RECOMBINANTES
As proteínas recombinantes (solúveis ou insolúveis) purificadas foram
inoculadas em camundongos da linhagem BALBc, por via sub-cutânea, com 5
aplicações de aproximadamente 50 µg de antígeno em intervalos de 15 dias,
seguindo-se obtenção do soro 1 semana após a última inoculação. O antígeno foi
emulsificado em adjuvante completo de Freund na primeira inoculação, e em
adjuvante incompleto nas inoculações subseqüentes.
38
3.12 ENSAIO DE POLIMERIZAÇÃO DE FtsZe
3.12.1 Método 1
Uma cultura da cepa BL21 pLysS pETftsZe foi incubada em 3 ml de
LB+Cm+Ap a 30 ºC por 16 horas. Em seguida fez-se uma diluição 1/100 em 250 ml
de LB+Cm+Ap a 30 ºC. Quando a cultura atingiu DO
600
∼ 0,4-0,5, acrescentou-se
IPTG para uma concentração final de 0,5 mM e fez-se uma indução por 3 horas a 30
ºC. Em seguida, a cultura foi centrifugada a 6.000 x g e o sedimento obtido foi
resuspenso em 4 ml de PEM (50 mM Pipes pH 6,5, 2 mM MgCl
2
, 1 mM EDTA) +
PMSF 0,15mM. Esse material foi sonicado com 4 pulsos de 10 segundos na
potência 7. O material sonicado foi centrifugado por 30 minutos a 12000 x g a 4 ºC.
Ao sobrenadante adicionou-se CaCl
2
(concentração final 20 mM) e GTP (final 1
mM), incubou-se por 15 min a 30 ºC e centrifugou-se por 15 min a 20.800 x g a 4 ºC
(FtsZ polimeriza e precipita). Ao sobrenadante obtido deu-se o nome de material
“não polimerizado”. Ressuspendeu-se o pellet em 4 ml de tampão de ligação (20 mm
TrisCl pH 8, 300 mM NaCl, 5 mM imidazol). Esse material foi centrifugado por 5 min
a 20.800 x g a 4 ºC. Ao sedimento obtido deu-se o nome de “polimerizado insolúvel”
e ao sobrenadante “polimerizado solúvel”. Essas três frações foram aplicadas em gel
SDS-PAGE e analisadas na presença de FtsZe por Western blot utilizando-se anti-
histidina.
3.12.2 Método 2
Diluiu-se a FtsZe, purificada por cromotografia de afinidade (resina de níquel),
em tampão PEM (50 mM Pipes pH 6,5, 2 mM MgCl
2
, 1 mM EDTA) a uma
concentração de 1 mg/ml. Adicionou-se Mg
+2
a uma concentração final de 10 mM e
imediatamente adicionou GTP (concentração final de 1 mM). Com auxílio de um
espectrofotômetro mediu-se a absorbância a 360nm. Em aproximadamente um
minuto a absorbância alcança um valor máximo e se mantém estável por 10-15
minutos. O controle foi feito sem a adição de GTP.
3.13 IDENTIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS MinC e MinD EM EXTRATOS
PROTÉICOS DE ENDOSIMBIONTE USANDO WESTERN BLOT
A técnica de Western blot consiste na transferência de proteínas, previamente
separadas por SDS-PAGE para um suporte sólido (membrana de nitrocelulose).
39
Foram repetidos os mesmos passos do teste de solubilidade da proteína, desde a
indução até a eletroforese em gel de poliacrilamida. O procedimento a seguir foi
executado segundo o método de Towbin et al. (1979). Após a eletroforese, as
proteínas foram eletrotransferidas para uma membrana de nitrocelulose. A
transferência foi realizada a 28 mA a 4 °C por 16 h . Após a transferência, a
membrana de nitrocelulose foi corada com solução de Ponceau S (Ponceau S 0,5%
em acido acético 1%) para verificar a qualidade da transferência e posteriormente foi
descorada com TBS/Tween (Tris-HCl 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, Triton X-100
0,05%) e incubada em solução de bloqueio (leite desnatado a 5% em TBS/Tween)
por 16 h. No dia seguinte a membrana foi transferida para 3 ml de solução de
bloqueio contendo o anticorpo primário (os antisoros utilizados foram aqueles
produzidos em camundongos contra as proteínas GST-MinCe, GST-MinDe e GST-
ZipAe, na diluição 1:250). A membrana foi incubada nessa condição por 1 hora e em
seguida lavada 3 vezes (5 min) com aproximadamente 50 ml de TBS/Tween. Cerca
de 3 ml da solução contendo o anticorpo secundário (policlonal) anti-IgG de
camundongo conjugado com fosfatase alcalina (Promega), diluído 1:7.500, foram
adicionados à membrana e incubou-se por 45 min. A membrana foi lavada
novamente por 3 vezes (5 min) com aproximadamente 50 ml de solução
TBS/Tween. Para revelar a reação, foram utilizados 66
µl de NBT (cromógeno) e 33
µl de BCIP (substrato), diluídos em 10 ml de tampão para a fosfatase alcalina.
3.14 PROCEDIMENTO DE TRANSFECÇAO
Cepas normais de B. culicis e C. deanei na fase logaritmica foram lavadas
uma vez com PBS (Dulbecco´s phosphate buffered saline, Gibco, Invitrogen
Corporation) e resuspensas a 5x10
8
células/ml em tampão de eletroporação (NaCl
140 mM, HEPES 25 mM e Na
2
HPO
4
0,74 mM, pH 7,5). Em um volume de 400 µl
das células resuspensas foram adicionados 50 µg do plasmídeo pTEXGFPTcDnm e
manteve-se por 10 min em gelo. As células foram eletroporadas utilizando-se o
aparelho Gene Pulser
II Apparatus (Bio-Rad) a nas condições estabelecidas de 450
V e 500 µF. Dois pulsos foram utilizados para transfecção e após a eletroporação as
células foram mantidas a temperatura ambiente por 5 min. Em seguida essas células
foram inoculadas em 10 ml de meio de crescimento (meio Warren acrescido de 10%
de soro fetal bovino, 10.000 U penicilina e 100 µg/ml estreptomicina). Após 24 h o
40
antibiótico G418 (Geneticin - Sigma
), a uma concentração final de 350 µg/ml, foi
adicionado para selecionar a população transfectada. As células foram cultivadas
por 3 dias e após esse tempo foram diluídas (1:10) em meio de cultura contendo
G418. Esse procedimento foi realizado até a seleção da população resistente. Essa
população selecionada foi utilizada para posterior análise por microscopia de
fluorescência.
3.15 ENSAIO DE COMPLEMENTAÇÃO
Para verificar se os genes minCDEe são capazes de substituir os genes
próprios de E. coli na função de regulação da localização do septo, usou-se a cepa
PB114 (∆minCDE::kan), portadora de uma deleção total do operon minCDE e
gentilmente cedida pelo Dr. Piet de Boer (Ohio, USA). Como conseqüência da
deleção, essa cepa não é capaz de regular corretamente a posição do septo,
mostrando células de longitude normal e filamentos curtos e também mini-células
(células carentes de DNA, produto da formação errônea do septo em um pólo).
PB114 foi transformada com o plasmídeo pJFminCDEe, portador dos genes
minCDEe sob controle do P
Tac
e lacI
q
e plaqueada a 37 ºC em LB-agar contendo
ampicilina, kanamicina e glicose 0,2%. Como controle positivo ou negativo, a mesma
cepa foi transformada em paralelo com o plasmídeo pJFminCDEEc (portador dos
genes minCDE da E. coli sob controle do P
Tac
e lacI
q
) ou com o vetor vazio
pJF119EH, respectivamente. As colônias assim obtidas foram cultivadas em meio
líquido contendo ampicilina em presença ou ausência do indutor IPTG, e
visualizadas no microscópio de contraste de fase. Cumpre ressaltar que só foi
possível transformar a cepa PB114 com os plasmídeos pJFminCDEe ou
pJFminCDEEc, mas não com os plasmídeos pJFminC ou pJFminCD, o que sugere
que, a expressão mesmo basal dos genes minC e minD do endosimbionte é letal em
uma cepa de E. coli que carece do operon minCDE.
Utilizando o pJF119EH para esse estudo não obtivemos um resultado
satisfatório. Para se ter um resultado mais acurado, clonamos os genes minCDEe e
minCDEEc no vetor pBAD22. Esse vetor é mais bem regulado pela utilização do
promotor induzido por arabinose, resultando em um menor escape, já que a
estequiometria é de extrema importância no sistema Min. O protocolo segue o
descrito anteriormente, porém induziu-se as células transformadas com 0,0002% de
arabinose.
41
3.16 ENSAIO DE ATIVIDADE ATPase DE MinD e FtsK DO ENDOSIMBIONTE
A hidrólise de ATP foi medida usando a técnica do verde de Malaquita, um
ensaio colorimétrico que detecta a produção de fosfato inorgânico (LANZETTA et al.,
1979; HOENIG et al., 1989). As proteínas recombinantes GST-MinDe e GST-FtsKe
expressas a partir do pGEXminDe e pGEXftsKe, respectivamente, foram incubadas
em 50 µl de tampão ATPase (50 mM TrisHCl pH 7,5, 50 mM KCl, 2 mM MgCl
2
, 5%
glicerol) durante uma hora a 28 ºC com concentrações crescentes de ATP. A reação
foi interrompida mediante adição de 200 µl de reativo de verde de Malaquita (2
volumes de verde de Malaquita 0.0812%, 2 volumes de agua MilliQ, 1 volume de
molibdato de amônia 5,72% preparado em HCl 6 M e 1 volume de Polivinil Alcohol
2.32%). Após dois minutos foram adicionados 25 µl de citrato de sódio 34% para
parar a produção de cor. A absorbância das amostras foi medida a 630 nm usando
um espectrofotômetro STAT FAX 2100. Os valores obtidos de amostras controle,
contendo apenas GTP nas mesmas condições, foram subtraídos dos valores obtidos
para as amostras teste. Os valores obtidos de amostras controle contendo apenas a
proteína sem ATP também foram subtraídos. Para a quantificação do fosfato
inorgânico (Pi) liberado enzimaticamente, as amostras foram comparadas com uma
curva padrão preparada com diluções de KH
2
PO
4
500 µM em tampão ATPase. Para
determinar as constantes Vmax e Km, os dados foram ajustados à equação de
Michaelis-Menten, usando regressão não-linear (GraphPad Prism version 4.00 para
Windows, GraphPad software, Inc).
3.17 IMUNOLOCALIZAÇÃO POR MICROSCOPIA ÓPTICA
Para os ensaios de imunofluorescência, C. deanei e B. culicis foram
cultivadas em meio Warren acrescido de 10% de soro fetal bovino até a
concentração de 1x10
7
células/ml. As células foram coletados por centrifugação a
3.000 x g por 10 min, lavadas em PBS pH 7,2 e novamente coletados por
centrifugação nas mesmas condições descritas acima. As células foram então
resuspensas em uma concentração final de 5x10
6
células/ml e depositadas em
lamínulas tratadas com poli-L-lisina 0,01% diluída em PBS. O material foi fixado em
paraformaldeído a 2% diluído em PBS durante 5 min. A fixação foi interrompida por
duas lavagens com glicina 0,1 M por 3 min. As lamínulas foram então lavadas duas
42
vezes com PBS durante 5 min e incubadas com Triton X-100 0,08% diluído em PBS
por 2 min a temperatura ambiente. As lamínulas foram novamente lavadas por duas
vezes com PBS durante 5 min, incubadas em tampão de bloqueio por 16 horas e em
seguida incubadas por 1 hora com o antisoro policlonal correspondente diluído 1:50
em tampão de bloqueio. Posteriormente as lamínulas foram lavadas 3 vezes por 5
min com PBS e incubadas por 30 min com anti-IgG de camundongo conjugado a
Alexa Fluor 488 (Sigma), diluído 1:400 em tampão de bloqueio. Após este tempo, as
lamínulas foram incubadas com iodeto de propídio 0,1
µg/ml em PBS por 5 min,
lavadas três vezes em PBS por 5 min e montadas com n-propil-galato sobre uma
lâmina de microscopia ótica. As lâminas foram observadas no microscópio de
fluorescência Nikon Eclipse E600. Imagens digitais foram capturadas usando-se a
câmara CoolSnap (Media Cybernetics).
43
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O GENE zipA ESTÁ PRESENTE NO GENOMA DO ENDOSIMBIONTE
4.1 CARACTERIZAÇÃO E CLONAGEM DO GENE zipAe
A análise do sequenciamento do genoma do endosimbionte de C. deanei
realizado no IBMP mostrou que a proteína FtsA não está codificada no genoma do
endosimbionte. Essa proteína é importante para formação do anel Z, pois interage
com FtsZ e ancora o complexo na membrana da bactéria, para o posterior
recrutamento das demais proteínas do complexo. Assim, trabalhamos com a
possibilidade de que ZipA, outra proteína de membrana que se liga ao anel Z nas
etapas iniciais da divisão, fornecendo estabilidade ao anel Z, pudesse ser capaz de
realizar a função correspondente à da FtsA no endosimbionte. Segundo Pichoff &
Lutkenhaus (2002), tanto FtsA como ZipA podem estabilizar o anel Z, levando
adiante a divisão. De fato, o anel Z pode se formar em mutantes de E. coli que
carecem de ftsA ou zipA, mas não em mutantes que carecem de ambos os genes.
ZipA também é importante para a localização de FtsK no septo (PICHOFF &
LUTKENHAUS, 2002). Para obter informação nesse sentido, identificamos o gene
zipA no genoma do endosimbionte de C. Deanei, que possui uma região codificante
de 944 pb e codifica uma proteína de com massa molecular de 36,2 kDa. Esta
proteína apresenta grande similaridade com uma proteína de membrana de
Bordetella parapertussis (E value= 4e
-19
, 26% de identidade), que por sua vez
mostra consistente homologia com várias proteínas ZipA de outras bactérias. O
alinhamento da seqüência de aminoácidos entre as proteínas ZipA do
endosimbionte (ZipAe) e da Bordetella sp. é mostrado na figura 14. A maior
similaridade é evidenciada no domínio carboxi-terminal, responsável pela interação
com FtsZ (MOSYAK et al., 2000). Todavia, o fragmento transmembrânico,
normalmente presente ao amino-terminal, não foi identificado nessa região na
seqüência da ZipAe. Usando o programa PHDhtm (ROST et al., 1996), foi possível
identificar um possível fragmento transmembrânico na ZipAe, que compreende os
resíduos 172 até 195. O programa Tm Pred por sua vez, prediz um possível
fragmento transmembrânico entre os resíduos 189 e 206 (Figura 15). Esses dados,
no entanto, resultaram com baixa confiabilidade, e precisam ser confirmados
experimentalmente.
44
FIGURA 14 - ALINHAMENTO DA PROTEÍNA ZIPA DO ENDOSIMBIONTE COM A
DO CORRESPONDENTE HOMÓLOGO DE Bordetella papapertussis
45
FIGURA 15 - SEQUÊNCIA NUCLEOTÍDICA DO GENE zipA DO ENDOSIMBIONTE
DE Crithidia deanei E A CORRESPONDENTE SEQUÊNCIA AMINOACÍDICA DA
PROTEÍNA
A)
ATGAATTATAACTTTTTACAATCTATAAAAGATATTATTAATAATATAAAATTAATGACTAATGTAAATAATTCAAAAGATA
TTAGTCATATTTCTGATCGTATTGAACCAGTTATTTCGGCATCTGCTTCTATTTTGAGTGAAGATTATAACAATTATTATTC
TAATATTGATAATGAAATTGAATTTTCAATAGATATTATTTTCGATTTGCCAGTTTTGGGTATTGATATTAAGAAAATATTA
ACTGTTAATCATGAAGAAGAGATAAGATATTTGGTAGAGTCAACAGATAAAATAAAGCAGATAGATATTTCTGATAATAATT
CTTACAGTTTGTTAAAAATGCTAGTTTTACTAGCAAATAGAGCAGGACCTATAAGTGAGTCAAGATTTTTCAATTCATATCA
ATTAGCTAAAGATATAACATCACATATTAATGCTACTATCATATGTCCTGATTATAATTTTATTATTGACAAAGCTATTTGT
TTAGATAGGCTATGTATGTCTTTAGATTCTTGTATTAGTTTGCATTTAATTATGAACAAGAAATTAGATAATGGGATGTTAT
TAAGTATTGCTAATATATTCGGATTCATATATTCATATAAAGATGCTTTATTATTGGATAATAGTGAATATTACATTATCTT
ATCTCGAAGTAATAATTATTCATTACAAGATTTTGTAAAAATAGGAGATGTAATTAGTTTTACATTAGATATTCCTCGTTCT
AATTCTGATAAAAATTTGTTTTATATTTTTTTTAGTTTTATAAAGGAAATCTCAGAATATATAGATGCTAAAATAGTTGATA
AAAATGGTATTGAGTTATCTTTTGATAATATAAATGCAATAGAATTACAAGTGCAAAAAATTTTGAATTCTTTAGAAAATAA
TGGTTTTAAAGCTGGTAGCTATCGTGCAAGAAGAGTTTTTAA
B)
M N Y N F L Q S I K D I I N N I K L M T N V N N S K D I S H I S D R I E P
V I S A S A S I L S E D Y N N Y Y S N I D N E I E F S I D I I F D L P V L
G I D I K K I L T V N H E E E I R Y L V E S T D K I K Q I D I S D N N S Y
S L L K M L V L L A N R A G P I S E S R F F N S Y Q L A K D I T S H I N A
T I I C P D Y N F I I D K A I C L D R L C M S L D S C I S L H L I M N K K
L D N G M L L S I A N I F G F I Y S Y K D A L L L D N S E Y Y I I L S R S
N N Y S L Q D F V K I G D V I S F T L D I P R S N S D K N L F Y I F F S F
I K E I S E Y I D A K I V D K N G I E L S F D N I N A I E L Q V Q K I L N
S L E N N G F K A G S Y R A R R V F K
Seqüência de nucleotídeos do gene zipA do endosimbionte de C. deanei (A) e a correspondente seqüência de
aminoácidos da proteína (B). Os prováveis fragmentos transmembrana segundo os programas PHDhtm ou Tm
Pred estão ressaltados em amarelo ou fucsia, respectivamente.
Vale ressaltar que a região genômica flanqueando o gene zipA acha-se
conservada no endosimbionte em relação às outras bactérias, tais como Bordetella
sp. e E. coli, onde zipA se localiza a jusante do gene ligA (que codifica para uma
DNA ligase) (figura 16). Portanto, certa sintenia ainda é mantida.
46
FIGURA 16 – ORGANIZAÇÃO CROMOSSÔMICA DO GENE zipA NO
ENDOSIMBIONTE
Para verificar se o gene zipAe pertence efetivamente ao genoma da bactéria,
não ocorrendo transferência para o genoma da C. deanei, realizamos amplificação
por PCR com os oligonucleotídeos iniciadores específicos do gene zipAe do
endosimbionte de C. deanei, usando como molde DNA genômico de cepas de C.
deanei normal e aposimbiótica, do endosimbionte e de cepa de B. culicis normal.
FIGURA 17 – AMPLIFICAÇÃO DO GENE zipA DO ENDOSIMBIONTE
C. Deanei normal
C. Deanei curada
Endosimbionte
B. Culicis normal
Kb
2,0
1,6
1,0
0,85
C. Deanei normal
C. Deanei curada
Endosimbionte
B. Culicis normal
Kb
2,0
1,6
1,0
0,85
Amplificação por PCR do gene zipA a partir de DNA total de cepas de C.
deanei normal, aposimbiótica, DNA genômico de frações purificadas de
simbionte e cepa de B. culicis normal.
O resultado obtido (figura 17), indica que o gene zipAe encontra-se
codificado no genoma do simbionte, dado que a partir da cepa aposimbiótica de C.
47
deanei não se amplificou fragmento algum
.
Também houve amplificação utilizando-
se o DNA de B. culicis normal.
A PROTEÍNA ZipA DO ENDOSIMBIONTE É CAPAZ DE FILAMENTAR
Escherichia coli
4.1.1 Análise de superexpressão de zipAe em Escherichia coli
O efeito da sobre-expressão do gene zipAe no fenótipo de E. coli foi analisado
em clones bacterianos contendo o plasmídeo recombinante pJFzipAe, onde o gene
zipAe foi inserido no vetor pJF119EH. Nesse sistema de expressão bacteriano a
proteína recombinante ZipAe é produzida na sua forma nativa, sem qualquer
etiqueta (tag). No entanto, nenhuma alteração fenotípica foi verificada. Os dados da
literatura mostram, contudo, que a sobre-expressão do gene zipA leva a célula ao
processo de filamentação (HALE & DE BOER, 1997).
A segunda estratégia foi inserir o gene zipAe no no vetor pGFPXa, com o
objetivo de se ter uma maior expressão e aumentar a solubilidade da proteína ZipAe,
já que a fusão com a proteína GFP aumenta a solubilidade da proteína a ela
fusionada. Nesse sistema ZipAe foi fusionada à extremidade C-terminal da GFP.
A expressão da proteína recombinante está representada na figura 18.
48
FIGURA 18 – ANÁLISE DA EXPRESSÃO DA
PROTEÍNA RECOMBINANTE GFP-ZipAe
EM E. coli POR SDS-PAGE
Gel desnaturante de poliacrilamida 12% corado com azul
de coomassie, mostrando o perfil eletroforético dos
extratos do clones recombinantes 1 e 9. A indução foi feita
com IPTG 2mM.
Nos dois clones obtidos pode-se perceber a produção de uma proteína
recombinante de aproximadamente 80 kDa, diferente da massa molecular esperada
de 63 kDa para o polipeptídeo resultante da fusão da GFP (28 kDa) com a ZipAe (35
kDa). No entanto, Hale & de Boer (1997) relataram uma migração aberrante da
proteína ZipA de E. coli em gel SDS-PAGE. Os autores esperavam encontrar uma
proteína de 36,4 kDa, mas caracterizaram a ZipA como uma proteína de 50 kDa,
como se pode notar pela figura 19.
49
FIGURA 19 – PADRÃO MIGRATÓRIO DE ZipA DE
Escherichia coli EM GEL SDS-PAGE
Fonte: Hale & de Boer (1997)
Então, considerando-se a hipótese que a ZipAe tenha o mesmo
comportamento aberrante em SDS-PAGE que a ZipA de E. coli, é plausível que esta
proteína recombinante de aproximadamente 80 kDa, que encontramos em extratos
bacterianos induzidos possa ser a proteína de fusão GFP-ZipA (28 kDa + 50 kDa).
Além disso, como conseqüência da expressão dessa proteína recombinante de 80
kDa, as bactérias apresentavam o esperado fenótipo de filamentação (Figura 20).
FIGURA 20 - SUPEREXPRESSÃO DE GFP-ZipAe EM E. coli (CEPA TOP10F´) –
ANÁLISE FENOTÍPICA
A BA B
Fenótipo causado pela superexpressão de zipAe em E. coli Top10F’ transformada com pGFPzipAe. A) Top10F’
pGFPzipAe não induzido. B) Top10F’ pGFPzipAe induzido com IPTG 2mM. As células foram fixadas e fotografadas
usando um microscópio Nikon E600.
O fenótipo de filamentação foi ainda mais evidente quando a expressão da
proteína GFP-ZipAe se deu na cepa XL1-Blue de E. coli (figura 21).
50
FIGURA 21 – SUPEREXPRESSÃO DE GFP-ZipAe EM E. coli (CEPA TOP10F´) –
ANÁLISE FENOTÍPICA USANDO MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE E DE
FLUORESCÊNCIA
Fenótipo causado pela superexpressão de zipAe em E. coli XL1Blue transformada com pGFPzipAe. A) XL1Blue
pGFPzipAe não induzido. B) XL1Blue pGFPzipAe induzido com IPTG 2mM. As células foram fixadas e fotografadas usando
um microscópio Nikon E600.
O GENE ftsK ESTÁ PRESENTE NO GENOMA DO ENDOSIMBIONTE
4.2 CARACTERIZAÇÃO E CLONAGEM DO GENE ftsKe
FtsK é uma proteína essencial para a viabilidade em E. coli, integrante do
divisoma e responsável pela coordenação entre a constrição do anel septal e a
segregação dos cromossomos (BEGG et al., 1995). Neste trabalho os autores
analisaram a divisão celular de uma cepa mutante TOE44 termosensível. O cultivo
dessa cepa mutante a 42 ºC levou à inibição da divisão da bactéria. Contudo, essa
inbição ocorreu em um estágio mais tardio do processo. A mutação que gerou esse
fenótipo estava presente no gene denominado de ftsK. A proteína FtsK possui
similaridade com à proteína SpoIIIE de Bacillus subtilis, a qual é requerida no
processo final da constrição do septo durante esporulação e é responsável pela
transferência do cromossomo da célula-mãe ao pré-esporo (WU & ERRINGTON,
1994; WU et al., 1995). FtsK é uma proteína bifuncional, com um domínio N-terminal
contendo quatro fragmentos transmembrânicos e um domínio C-terminal citosólico
com atividade ATPase. O domínio N-terminal é essencial para a localização da
proteína no anel septal, enquanto que o domínio C-terminal participa na segregação
A
B
51
dos cromossomos mediante sua atividade DNA-translocase e a ativação da
Topoisomerase IV e do complexo XerCD (que levam a cabo a decatenação dos
cromossomos) (DRAPER et al., 1998; YU et al., 1998; LIU et al., 1998; AUSSEL et
al., 2002; ESPELI et al., 2003).
A análise de busca de homologia nas seqüências de aminoácidos dos clones
da biblioteca genômica do simbionte nos permitiu identificar o gene ftsK. A maior
homologia encontrada foi com a FtsK de Bordetella (E value=0.0, 60% de
identidade). As seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos são mostradas na
figura 22A. Foi anotado um códon GTT (valina) como início da tradução, porque não
há presença de um ATG na posição apropriada.
52
FIGURA 22 - SEQUÊNCIA NUCLEOTÍDICA DO GENE ftsK DO ENDOSIMBIONTE
DE Crithidia deanei E A CORRESPONDENTE SEQUÊNCIA AMINOACÍDICA DA
PROTEÍNA
A)
GTTGGTTTTGCTTTCATTTTAGTAGGTTCTTTAGGTATAGAGTCATTATATGTCACTTTCTTTTGTTCATATATGCCTATAAC
ATTTGTTGATATTTGTATTTCTGGTTGTTTATTAGGTAACTTAATAACAAATTATGTTTATTTTTCATTCGGATTACTATCTA
CAAAGTTATATTTTTTTGCTTTGTTATCAATAGGATTTAGCTTATTTTTTTCTTTTTCTTGGTTTGTTTTTTTTAGATCATTA
GTAACTAATTTTTTTTGTCTGACTTGTAATATTAAATATAGATTTATTTGTCTCGCTTGCTGGTTATTAAAATTAATAAAAGG
CATAAGGATCAAAAGATCTAATAATAAAAAAGATGTTTTTTTAAGTAGTGAGTCAAATTCAATTAAAGTTATAAAAGATAAAA
ATATTAGAGAAATAGAAAGTAATTCAAATGATGGTAGTAATTCAAGTGAGGATAGCAATTTAAGTTCATATGTTGAAGAGGAT
TTTGTAGAAAAGGCAAGTGATAATAATGTTTCAGATTCCAAAAGCAACACAAATATCATAGAATCTTATAAAGATAAAACCTC
TTATGACAAAAAATCTCCAGATCTTAGTTTATTAGATATGCCAGATAATAGTCCATGTTATGTCACAGATGAGATCATAGAGT
CTACTTCTGAATTAATAGAAAAAAAACTTTCTGATTTCGGAGTCTCTGTAAAGGTAGTTCTTGCAAAGGCTGGTCCGGTTGTA
ACAAGATACGAGATTGAGCCTAATATAGGTGTAAAAGGCAGTCAGATTGTCAATTTGTCTCGTGATTTGGCTCGTGCCCTTAG
TGTTGCAAGTATCAGAGTTGTAGAAACAATACCAGGAAAAAATTTGATGGGGTTAGAATTACCCAACCCTAAACGTCAATCTG
TTAGCCTACATGAAATTTTAGAATCTTCTTTATATCAAAATAGTAATTCTGTATTAACTATGGCTCTTGGTAAAGATATTGCT
GGAAATCCGGTTATAGCTGATTTGTCAAAAATGCCCCATTTGTTAGTTGCAGGAACGACAGGATCAGGAAAGTCAGTTGGTAT
AAATGCTATGATCATATCTTTGTTATATAAATCTGATGCATCTCAAATTAGATTGATTTTAATAGATCCTAAAATGTTAGAGA
TGAGTGTATATGAAGGAATACCTCATTTATTGACTAACGTTGTTACAGATATGAAAAAAGCAGCTAATGCTCTGAGATGGTGT
GTTGGAGAAATGGAAAGAAGATATCGATTGATGAGCAAATTAGGCGTTCGTAATTTGTCTGGCTATAATGAGAAAATTATAGC
TTCTTTTAACAATGGCAATGGCATAAAAAATCCATTTTCTATTAGCACTGATAATCCAGAATTTCTACAGGTTATGCCATCGA
TAGTTGTTGTTATTGATGAGTTAGCTGACTTAATGATGGTAGTAGGAAAGAAAATAGAAGAATTAATAGCTCGTTTGGCACAG
AAAGCTAGAGCTGCAGGTATACACTTAATTCTTGCTACACAAAGACCTAGTGTTGACGTTATTACAGGATTGATTAAGGCAAA
TATCCCTACACGTATAGCTTTTCAGGTTTCTTCAAAAATAGATTCACGTACTATTTTAGATCAATCTGGAGCAGAAAACTTAT
TGGGCCAGGGAGATATGTTATATCTACCTCCTGGGGTAGGTTTTCCTGTCAGAGTACATGGTGCTTTTGTTAGTGATAATGAA
GTCCATAGGGTAGTTGAATATTTTAAATCACAAGGAGAAGCTAATTATGTTGAAGGAATCCTTGATGCTGAGCCTTATGATAA
CAATTCTGATTCTGCAAATAGTATCACTGGCATAGAAGACAATGAGTCAGATCCAATGTATGATAGTGCTTGCGACATTATTA
TAAAACATAAAAGAGCCTCTATATCTCTAGTTCAGCGTCATTTAAGAATTGGGTACAATCGTGCAGCAAGATTATTAGAACAA
ATGGAAAAGGCAGGTATGGTTTCTAAAATGCATTCAAATGGAAATAGGGACATACTAATTTCTACAGATGGTAAGGATGAGTG
A
B)
VGFAFILVGSLGIESLYVTFFCSYMPITFVDICISGCLLGNLITNYVYFSFGLLSTKLYFFALLSIGFSLFFSFSWFVFFRSL
VTNFFCLTCNIKYRFICLACWLLKLIKGIRIKRSNNKKDVFLSSESNSIKVIKDKNIREIESNSNDGSNSSEDSNLSSYVEED
FVEKASDNNVSDSKSNTNIIESYKDKTSYDKKSPDLSLLDMPDNSPCYVTDEIIESTSELIEKKLSDFGVSVKVVLAKAGPVV
TRYEIEPNIGVKGSQIVNLSRDLARALSVASIRVVETIPGKNLMGLELPNPKRQSVSLHEILESSLYQNSNSVLTMALGKDIA
GNPVIADLSKMPHLLVAGTTGSGKSVGINAMIISLLYKSDASQIRLILIDPKMLEMSVYEGIPHLLTNVVTDMKKAANALRWC
VGEMERRYRLMSKLGVRNLSGYNEKIIASFNNGNGIKNPFSISTDNPEFLQVMPSIVVVIDELADLMMVVGKKIEELIARLAQ
KARAAGIHLILATQRPSVDVITGLIKANIPTRIAFQVSSKIDSRTILDQSGAENLLGQGDMLYLPPGVGFPVRVHGAFVSDNE
VHRVVEYFKSQGEANYVEGILDAEPYDNNSDSANSITGIEDNESDPMYDSACDIIIKHKRASISLVQRHLRIGYNRAARLLEQ
MEKAGMVSKMHSNGNRDILISTDGKDE
LEGENDA: Sequencia de nucleotídeos do gene ftsK do endosimbionte de C. deanei (A) e a correspondente seqüência de
aminoácidos da proteína (B). Em fucsia se assinalam os prováveis fragmentos Tm segundo o programa Tm Pred. Em vermelho
o domínio P-Loop, responsável pela atividade ATPásica.
Utilizando diversos programas de análise, foram identificados 3 ou 4 possíveis
fragmentos transmembranários, localizados na região amino-terminal da proteína.
Em vermelho está representado o domínio responsável pela atividade de ATPase
([AG]-x(4)-G-K-[ST]), estando, então, totalmente conservado (figura 22B).
A proteína resultante é um pouco menor que a homóloga de B. pertussis (tem
691 aa em comparação com os 789 aa de Bordetella), mas a seqüência está
bastante conservada, sobretudo no domínio C-terminal (Figura 23).
53
FIGURA 23 - ALINHAMENTO DA SEQÜÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DA PROTEÍNA
FtsK DO ENDOSIMBIONTE COM A DO CORRESPONDENTE HOMÓLOGO DE
Bordetella sp.
54
Vale a pena notar que a posição do locus do gene ftsK no genoma do
simbionte está conservado em relação ao locus do gene ftsK das bactérias do
gênero Bordetella, onde ftsK encontra-se adjacente ao gene trxB (figura 24).
FIGURA 24 – ORGANIZAÇÃO CROMOSSÔMICA DO GENE ftsk NO
ENDOSIMBIONTE
A figura 25 mostra que o gene ftsKe está presente no genoma do
endosimbionte e que os oligonucleotídeos iniciadores desenhados para o
endosimbionte de C. deanei não foram capazes de amplificar o gene do
endosimbionte de B. culicis.
FIGURA 25 – AMPLIFICAÇÃO DO GENE ftsK DO ENDOSIMBIONTE
C. Deanei normal
C. Deanei curada
Endosimbionte
B. Culicis normal
Kb
2,0
1,6
1,0
0,85
C. Deanei normal
C. Deanei curada
Endosimbionte
B. Culicis normal
Kb
2,0
1,6
1,0
0,85
Legenda: Amplificação por PCR do gene ftsK a partir de DNA
total de cepas de C. deanei normal e aposimbiótica, DNA
genômico de frações purificadas de simbionte e cepa de B.
culicis normal.
55
A PROTEÍNA FtsKe RECOMBINANTE POSSUI ATIVIDADE ATPásica
4.2.1 Ensaio atividade ATPase de FtsKe
Pelo fato da região N-terminal do gene ftsK do endosimbionte ser um
fragmento transmembranar, foi amplificado somente um fragmento de 1480 pb
correspondente à região C-terminal e clonado no vetor pGEX-4T. O plasmídeo
resultante foi chamado pGEXftsKe.
Essa clonagem teve como objetivo produzir uma proteína recombinante para
avaliar a atividade ATPásica. Aproveitando a indução realizada em E. coli para a
produção dessa quimera, uma alíquota foi retirada e visualizada por microscopia
óptica para análise fenotípica. No entanto, nenhuma alteração foi observada.
Após indução em cepa de E. coli Top10F’ obteve-se uma proteína
recombinante solúvel de aproximadamente 84 kDa (54 kDa correspondente ao
fragmento de FtsK e 28 kDa correspondente à GST) que foi purificado por resina de
glutationa-sepharose (figura 26).
FIGURA 26 - PURIFICAÇÃO DE GST-FtsKe MEDIANTE CROMATOGRAFIA DE
AFINIDADE POR GLUTATIONA
50
60
70
80
90
kDa
FT
Res
El1
El2
El3
El4
50
60
70
80
90
kDa
FT
Res
El1
El2
El3
El4
LEGENDA: Alíquotas dos diferentes passos da purificação foram aplicadas num gel
desnaturante de poliacrilamida 10%, corado com Azul de Coomassie. FT: material
não retido após passagem pela resina de Glutationa-sepharose. Res: material retido
na resina. El1-El4: eluições do material retido usando um buffer com excesso de
glutatione livre.
O material das eluições 1 e 2 foi utilizado no ensaio de atividade ATPásica
(figura 27):
56
FIGURA 27 – ATIVIDADE ATPÁSICA DE FtsKe
GST-FtsKe foi incubada durante uma hora a 28ºC com concentrações
crescentes de GTP, e a produção de Pi foi medida a 630nm.
Observa-se que FtsK ainda mantém a atividade ATPase, que é característica
das translocases. Vale ressaltar que o ensaio controle somente com a proteína GST
foi não apresentou atividade.
A PROTEÍNA FtsZe É CAPAZ DE SE POLIMERIZAR
4.3 CARACTERIZAÇÃO E CLONAGEM DO GENE ftsZe
A proteína FtsZ desempenha um papel chave na divisão celular das bactérias,
fornecendo o arcabouço molecular sobre o qual se monta o aparelho de divisão.
Além disso, a regulação da localização do divisoma na célula acontece através da
polimerização de FtsZ. FtsZ é a proteína de divisão mais conservada
evolutivamente, estando presente em virtualmente todas as eubactérias (com
algumas exceções, dentre as quais aquelas do gênero Chlamydia), assim como
também em arquéias e algumas organelas eucarióticas, tais como cloroplastos das
plantas e algas verdes, e mitocôndrias de eucariotos primitivos (OSTERYOUNG &
NUNNARI, 2003). A proteína FtsZe já foi caracterizada em trabalhos anteriores de
57
nosso laboratório. A seqüência completa do gene (figura 28), de 1161 pb, foi obtida
a partir dos dados do seqüenciamento dos clones da biblioteca genômica do
endosimbionte, e a maior homologia, a partir da seqüência de aminoácidos, se dá
com a FtsZ de bactérias do gênero Bordetella. A análise da região adjacente ao
gene ftsZ confirma os nossos dados: a homologia de todos os genes do
agrupamento dcw é maior com os ortólogos de Bordetella sp. O conteúdo em GC é
de 34,97%, um valor baixo quando comparado com o que se observa nos genomas
procarióticos em geral, mas que está em concordância com o valor calculado a partir
da totalidade de seqüencias genômicas do endosimbionte conhecidas até o
momento (33,6%).
FIGURA 28 - SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DO GENE ftsZ DO
ENDOSIMBIONTE DE C. deanei
ATGAGGTTTGAGATTCTAGATAATAGTTCTAAAGGAACAATTATAAAAGTTATAGGGGTCGGAGGTGCAGGAGGTAATGCTGT
AGCACATATGATTAATAGTGGAATTAAAGGTGTTGATTTTATATGTGCAAATACAGATTCTCAAGCTTTAGCTGCTACTAATG
CTCCTGTGCAAATACGTCTTGGAGAGACTGGTTTAGGTGCAGGAGCAAAACCAGAGCAAGGAAGGGCACATGCGGAAACGGCG
AGAGAAGAGATACGTTCTGTGTTAGATGGATCCCATATGGTATTTATTACTGCAGGAATGGGAGGAGGTACAGGTACAGGTGC
TAGTCCTATTGTTGCAGAAATAGCAAAAAATTTAGGTATATTGACGGTGGGGATTGTAACAAAACCATTTTTATTTGAAGGCA
ATAAGCGCTTACGTTTAGCAGAAGAAGGTATAGCAGAGTTATCAAAATATGTAGATTCTCTGATTGTTATTTTGAATGAGAAT
CTTTATGAGTTTATGGATGATGATTCTACACAAGAAGATTGTTTTAAAGCTGCAGATAGTGTTTTACATAATGCCTGTGCTGG
TATTGCAGAAATAATTAATGTTGATGGTAATGTTAATGTTGATTTTGAAGACGTGCGTACAATTATGGGCGAGCATGGACAAG
CTATGATGGGTACTGCAGTAGCATCTGGTATAGAACGTGCAAAAATTGCAGCAAAACAGGCTATTTCTTGCCCTTTATTAGAA
GGAGTGAATTTAGAAGGGGCAAAAGGATTGCTAGTTAATATTACTTCTAATAGATCACTAAAAATGAAGGAAACTCGTGAAAT
TATGGAAATAATACGTGCTTATGCATCAGAAGATGCTACTGTGATTTTTGGTAATGCTTATGATGATTCTATGGGCGATGAAC
TTAGAGTTACTGTTGTGGCAACTGGTTTGAATAAGTTTACAGATGATATAAATAATAATAAATTGCAGAGTATTTCTATTGAT
AAAAAGAGATCAGCTTTTGATTCTAATAAATATCAAAATAGAGTTTCTACTCCATCTGTCATTACGAATCCTAGATTAAAAGA
TTCTAATATTGAAAATGATAAATCTGTTCAAAGTAATAATGATTTCGATATTCCTAGCTTTCTAAGAAAGAGAGTTGATTAG
A proteína resultante possui 386 aa, um peso molecular calculado de 41.3
kDa e apresenta 69% de identidade com o ortólogo de Bordetella bronchiseptica. A
identidade com o ortólogo de E. coli é ainda alta (48,9%). É interessante ressaltar
que todos os motivos envolvidos na união e hidrólise do GTP acham-se presentes
na proteína do simbionte, assim como também o domínio C-terminal altamente
conservado envolvido na interação com FtsA e ZipA (figura 29) (MA & MARGOLIN,
1999; MOSYAK et al., 2000; HANEY et al., 2001).
58
FIGURA 29 - ALINHAMENTO DAS PROTEÍNAS FtsZ DE B. bronchiseptica, DO
ENDOSIMBIONTE DE C. deanei E DE E. coli
Os aminoácidos conservados em todas as seqüências estão sombreados em preto, e aqueles conservados na
maioria das seqüências em cinza. As regiões envolvidas na união de GTP e o peptídeo Ct responsável pela
interação com FtsA e ZipA em E. coli se indicam com quadros vermelhos e amarelo, respectivamente
.
No caso dos cloroplastos ou mitocôndrias, o gene ftsZ foi transferido para o
genoma nuclear. No nosso modelo de estudo não ocorreu essa transferência, visto
que em cepas aposimbióticas não foi possível amplificar o gene ftsZ por PCR (figura
30).
59
FIGURA 30 – AMPLIFICAÇÃO DO GENE ftsZ DO ENDOSIMBIONTE
C. Deanei normal
C. Deanei curada
Endosimbionte
B. Culicis normal
Kb
2,0
1,6
1,0
0,85
C. Deanei normal
C. Deanei curada
Endosimbionte
B. Culicis normal
Kb
2,0
1,6
1,0
0,85
Amplificação por PCR do gene ftsZ a partir de DNA total de
cepas de C. deanei normal e aposimbiótica, DNA genômico de
frações purificadas de simbionte e DNA total da cepa de B.
culicis normal.
Já se sabe que FtsZe possui atividade GTPásica, mas no entanto não é
capaz de complementar a cepa de E. coli PAT84 (ftsZ84
Ts
).
Essa cepa é portadora
de uma mutação em ftsZ que produz uma proteína FtsZ termo-sensível. Como
conseqüência, essa cepa cresce e se divide normalmente a 30ºC, mas na
temperatura restritiva de 42 ºC a FtsZ é inativada e a bactéria, incapaz de se dividir e
portanto, filamenta e morre.
A primeira questão que levantamos em relação a FtsZ do endosimbionte é se
ela seria capaz de se polimerizar. Para analisarmos essa característica,
expressamos o gene ftsZe na cepa BL21 LysS E. coli, a partir do plasmídeo
pETftsZe, no qual o gene ftsZe foi ligado ao vetor pET47b. O sistema de expressão
pET fornece a proteína FtsZe com uma cauda de 6xHis.
Ao visualizarmos por microscopia óptica o fenótipo dessa cepa induzida com
IPTG verificou-se uma filamentação, indicando que
um excesso de FtsZe interfere
com o processo de divisão de E. coli, como pode ser observado na figura 31.
60
FIGURA 31 – SOBREEXPRESSÃO DE FtsZe EM E. coli (CEPA BL21) – ANÁLISE
FENOTÍPICA
Fenótipo causado pela superexpressão de ftsZe em E. coli BL21 pLysS transformada com pETftsZe. A) BL21 pLysS
pETftsZe não induzido. B) BL21 pLysS pETftsZe induzido com IPTG 2mM. As células foram fixadas e fotografadas usando
um microscópio Nikon E600.
4.3.1 Ensaio de Polimerização de FtsZe
Para verificar se FtsZe seria capaz de se polimerizar, utilizamos duas
técnicas, ambas partindo do mesmo princípio: quando FtsZ está em solução
tamponante PEM e adiciona-se um íon divalente (Ca+ ou Mg+) e GTP, a proteína é
capaz de se polimerizar. A primeira técnica seguiu o princípio da purificação de FtsZ
de E. coli (materiais e métodos item 3.10). Alíquotas de diferentes frações obtidas
durante o ensaio foram aplicadas em gel de proteína para realização de Western
blot reagindo a membrana com anticorpo monoclonal anti-histidina, com a finalidade
de identificar em qual dessas frações se acha presente a proteína FtsZe (figura 32).
61
FIGURA 32 – ANÁLISE DE POLIMERIZAÇÃO DE FtsZe POR WESTERN BLOT
A
B
A) Esquema do ensaio de polimerização de FtsZe. Alíquotas das frações representados pelos números 1
(material não polimerizado), 2 (polimerizado insolúvel) e 3 (polimerizado solúvel) foram aplicados em gel
desnaturante de poliacrilamida 12% para realizar análise por western blot utilizando anticorpo monoclonal anti-
histidina (B). 1) FtsZe não polimerizada em tampão PEM + GTP 1mM. 2) FtsZe polimerizada em tampão PEM +
GTP 1mM e insolúvel em tampão de ligação (Tris-HCl, NaCl, imidazol 5mM). 3) ) FtsZe polimerizada em tampão
PEM + GTP 1mM e solúvel em tampão de ligação (Tris-HCl, NaCl, imidazol 5mM). O Western blot foi revelado
por fosfatase alcalina.
62
Percebe-se que FtsZe aparece em todas as frações, inclusive na fração
polimerizada, sugerindo-se que FtsZe é capaz de polimerizar. No entanto,
diferentemente do que ocorre com FtsZ de E. coli, a FtsZe polimerizada - em sua
grande maioria - não se solubiliza quando se adiciona o tampão de ligação.
Portanto, este não é o melhor método para purificar FtsZe utilizando resina de
níquel-NTA. Para se ter a proteína purificada, e assim fazer análise de polimerização
por espectrofotometria, utilizou-se o método usual para purificação de proteínas com
cauda de histidina (sem prévia polimerização).
A figura 33 representa a purificação de FtsZe com resina de níquel-NTA.
FIGURA 33 – PURIFICAÇÃO DE FtsZe POR CROMATOGRAFIA DE
AFINIDADE UTILIZANDO RESINA DE NÍQUEL-NTA
50kDa
40kDa
30kDa
Não induzido
Induzido
Não ligado
Lavado com 5 mM imidazol
Lavado com 20 mM imidazol
Eluição
Resina
50kDa
40kDa
30kDa
Não induzido
Induzido
Não ligado
Lavado com 5 mM imidazol
Lavado com 20 mM imidazol
Eluição
Resina
Purificação de FtsZe mediante cromatografía de afinidade (Níquel-NTA). Alíquotas
dos diferentes passos da purificação foram aplicadas num gel desnaturante de
poliacrilamida 10% e coradas com Azul de Coomassie.
Com a proteína purificada, seguiu-se o protocolo descrito no item 3.11.2 da
seção Materiais & Métodos. Dados preliminares sugerem que com a presença de
63
Mg+ e GTP ocorre polimerização de FtsZe, havendo aumento da absorbância
medida pelo espectrofotômetro em comparação com a amostra que não continha
GTP (tabela 5). Após 10 minutos a absorbância diminuiu, mostrando que com o
consumo de GTP o polímero é desfeito. Esse experimento precisa ser repetido mais
algumas vezes para se fazer um tratamento estatístico dos valores obtidos.
4.3.2 Purificação de FtsZ de Escherichia coli
Utilizando-se o plasmídeo pETftsZEc, a proteína FtsZ de E. coli produzida na
cepa BL21 pLysS. O fenótipo de BL21 pLysS pETftsZEc induzida também é de
filamentação (dado não mostrado). A purificação de FtsZ está representada na figura
34. A primeira etapa da purificação parte de sua capacidade de polimerizar, mas não
está mostrada na figura abaixo.
FIGURA 34 – PURIFICAÇÃO DE FtsZ DE ESCHERICHaI COLI POR
CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE UTILIZANDO RESINA DE NÍQUEL-
NTA
Purificação de FtsZe mediante cromatografía de afinidade (Níquel-NTA). Alíquotas
dos diferentes passos da purificação foram aplicadas num gel desnaturante de
poliacrilamida 10% e coradas com Azul de Coomassie. Ins: material insolúvel após
sonicação. FT: material não retido após passagem pela resina de níquel. W5:
lavagem com tampão contendo 5 mM de imidazol. W20: lavagem com 20 mM de
imidazol E1-E4: eluições do material retido usando um tampão com 100 mM de
imidazol. Res: material que ficou retido na resina após as eluições.
A proteína FtsZEc purificada foi então inoculada em camundongos Balb-C
para produção de antisoro policlonal, que foi testado por ensaio de western blot
(figura 35).
64
FIGURA 35 – WESTERN BLOT UTILIZANDO SORO
ANTI-FtsZ DE Escherichia coli
Western blot usando o soro anti FtsZEc obtido em camundongos
reagido com extrato de E. coli (1). O Western blot foi revelado por
fosfatase alcalina. A banda corresponde está assinalda com a
ponta de seta.
Os soros dos camundongos 1 e 2 houve a reconhecimento de apenas um
banda de aproximadamente 41kDa, referente à proteína FtsZ de E. coli. Esses soros
foram utilizados para ensaios de interação que serão apresentados mais adiante.
O SISTEMA minCDE PARTICIPA DA DIVISÃO DO SIMBIONTE
4.4 CARACTERIZAÇÃO E CLONAGEM DOS GENES minCDE
Como já mencionado na introdução deste trabalho, a divisão celular bacteriana
é um processo finamente regulado, tanto temporal como espacialmente. As
proteínas responsáveis pelo controle espacial da divisão, MinC, MinD e MinE, são
codificadas por três genes que se encontram formando um operon nos
cromossomos bacterianos. Como resultado do seqüenciamento sistemático dos
clones da biblioteca do endosimbionte e da procura por homologia, fomos capazes
de identificar os genes minC-minD-minE, localizados na mesma região
cromossômica e na mesma fita de DNA, o que indica que provavelmente sejam
transcritos de forma coordenada (figura 36).
65
FIGURA 36 – ORGANIZAÇÃO CROMOSSÔMICA DOS GENES minCDE NO
ENDOSIMBIONTE
As seqüências de aminoácidos deduzidas a partir desses genes (figura 37)
mostraram maior identidade com os ortólogos de Bordetella sp., em concordância
com o observado na imensa maioria dos genes do endosimbionte. O conteúdo em
G+C do operon (31,88%) é consistente com o valor determinado para a totalidade
das seqüencias genômicas do endosimbionte conhecidas (33,6%). As seqüências
de aminoácidos deduzidas a partir desses genes mostraram maior identidade com
os ortólogos de Bordetella sp., sendo as porcentagens de identidade significativas:
38,5% e 64,5% para MinC (domínios N-terminal e C-terminal respectivamente),
78,6% para MinD e 72,6% para MinE.
66
FIGURA 37 - SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DOS GENES minCDE DO
ENDOSIMBIONTE DE C. deanei E A CORRESPONDENTE SEQÜÊNCIA DE
AMINOÁCIDOS DA PROTEÍNA
MinC
ATGATGAATAAATCCTTAATTGAATTTAAAAGTGCCAGTTTTAATGTATATGCTCCTAAAATTATAATTCATACTTCTAATAT
AAATGACTTAAGCACCTCAATAACAAAACATATATATAATTCTGGAAACTTTTTTAAAAATGAACATGTAGTTATAGATGCTA
CTCAGATAGACCAAATTATAGACTGGGATATGCTGATCACAATTCTTAAAGAACACGAGATTAATATATTAGGAATAGTAGCT
AATAACATTAATATTCAGAATGCAATCAAAGCTGGATTGTCTCCATTAGATATTATCACTAATAAAAATATTAAAATTGAAAC
AAACGCTACACAATTACCAACGATGCTAATTGATAAACCGTTACGCTCTGGGCAAAAAATATATGCTAGCAAATCTGACCTTA
TTGTAATCGGCATGGTCAGCCAAGGAGCTGAAATTATAGCAGATGGAAATATACATGTGTATGGCCCGCTAAGAGGTAAAGCA
ATGGCTGGAGCACAGGGTAATAAAGAGGCTAGAATATTTACAACACAACTAAATGCAGAATTATTATCTATATCAGGTGTATA
TCAAGTTATAGAAAATGATTTAAAAGATACTGTGATGAATAAACCAGCCATAGTACAACTAATGGATGAAAAACTAACAATAA
TTGCCATATAA
M M N K S L I E F K S A S F N V Y A P K I I I H T S N I N D L S T S I T K H I Y N S
G N F F K N E H V V I D A T Q I D Q I I D W D M L I T I L K E H E I N I L G I V A N
N I N I Q N A I K A G L S P L D I I T N K N I K I E T N A T Q L P T M L I D K P L R
S G Q K I Y A S K S D L I V I G M V S Q G A E I I A D G N I H V Y G P L R G K A M A
G A Q G N K E A R I F T T Q L N A E L L S I S G V Y Q V I E N D L K D T V M N K P A
I V Q L M D E K L T I I A I
MinD
GTGGCGCGAGTTGTTGTAGTAACTTCTGGTAAAGGAGGCGTGGGTAAAACCACTAGCAGTGCTAGCTTTTCTGCTGGATTAGC
TTTACGCGGCTATAAAACTATCGTAATAGACTTTGATGTCGGATTACGTAATCTTGATCTTATTATGGGTTGTGAAAGAAGAG
TAGTATATGATTTCATAAACGTAGTACAAGGAGACGCCAATCTAAAACAAGCTCTAATAAAAGATAAAAATACTGAAAATCTA
TTTATACTTCCTGCTTCGCAAACAAGAGATAAAGATGCATTAACACAATCTGGAGTAGAAAAGGTTTTAGAAGATCTAAAAAA
AATGGGTTTCGAATACATAGTATGCGACTCTCCAGCTGGAATAGAGTCTGGTGCGTTAATGGCCGCATATTTTGCAGATGATG
CTATTATYGTCACAAATCCTGAAATATCTTCTGTAAGAGACTCCGATAGGATTTTAGGGATACTGTCCTCAAAGTCAAAACGT
GCTAYAGAGGGCCTCGARCCTATAAAAGAATTCTTGTTGATAACCAGATATAACCCAAAAAGAGTTATTAATGGTGAAATGCT
TTCTATATCAGATATAGAAGATATYWTGCGTATCGACCTAGCTGGAGTTATTCCAGAATCTGAATCAGTATTGCACGCATCTA
ACCAGGGTCTACCTGCTATTCATCTTAATGAAACACCAGTATCAATAGCATACAATGATCTTGTTTCTCGTTACTTAGGCGAA
TCCATTCCAATGAAATTTACAGAATATGAAAAACCTAGCTTTATCAAACGACTTTTTGGAGGTAGATAA
V A R V V V V T S G K G G V G K T T S S A S F S A G L A L R G Y K T I V I D F D V G
L R N L D L I M G C E R R V V Y D F I N V V Q G D A N L K Q A L I K D K N T E N L F
I L P A S Q T R D K D A L T Q S G V E K V L E D L K K M G F E Y I V C D S P A G I E
S G A L M A A Y F A D D A I I V T N P E I S S V R D S D R I L G I L S S K S K R A X
E G L E P I K E F L L I T R Y N P K R V I N G E M L S I S D I E D I X R I D L A G V
I P E S E S V L H A S N Q G L P A I H L N E T P V S I A Y N D L V S R Y L G E S I P
M K F T E Y E K P S F I K R L F G G R
MinE
ATGTCATTTCTGTCGTTTTTATTAGGAGAAAAGAAAAAAACTGCCTCTGTTGCTAAGGAAAGATTACAAATCATACTTGCACA
CGAGCGTTCAAACAAAAATTCACCAGACTATCTAAATAAACTACAACAAGAACTTATATCAGTTCTATCTAAGTATGTTGTAA
TAAACCCTGATGATATTAAAGTTAaTATTGAAAGTCAGGGTTCTTTGGATGTTCTTGAAGTAAAAATAGAGATGCAACAAAAA
ACTTAA
M S F L S F L L G E K K K T A S V A K E R L Q I I L A H E R S N K N S P D Y L N K L
Q Q E L I S V L S K Y V V I N P D D I K V N I E S Q G S L D V T S K N R D A T K H
Após a descoberta de genes ftsZ no genoma de Arabidopsis, uma procura em
banco de dados levou à descoberta de ortólogos dos genes minD e minE em
algumas plantas superiores e em algas. Contudo, nenhum ortólogo de minC foi
identificado. Os ortólogos de minD e minE foram primeiramente identificados no
genoma de cloroplastos de Chlorella vulgaris. Em seguida, esses genes foram
identificados no genoma nuclear de Arabidopsis, e posteriormente no genoma de
67
outras espécies, tais como tabaco e arroz. Análises mostram que esses genes
codificam proteínas funcionais que participam ativamente da maquinaria de divisão
dos cloroplastos. (revisto por MAPLE & MOPLER, 2007). Verificamos então se os
genes minCDE estavam presentes em cepas normais e aposimbióticas. Foram
realizadas PCRs utilizando-se oligonucleotídeos iniciadores específicos baseados
nas seqüências nucleotídicas do genoma do endosimbionte de C. deanei (figura 38).
FIGURA 38 – AMPLIFICAÇÃO DO GENE minC DO ENDOSIMBIONTE
C. Deanei normal
C. Deanei curada
Endosimbionte
B. Culicis normal
Kb
0,65
1,6
1,0
0,85
C. Deanei normal
C. Deanei curada
Endosimbionte
B. Culicis normal
Kb
0,65
1,6
1,0
0,85
LEGENDA - Amplificação por PCR do gene minC a partir de DNA
total de cepas de C. deanei normal e aposimbiótica, DNA
genômico de frações purificadas de simbionte e DNA total da
cepa de B. culicis normal.
Houve amplificação de minCe apenas quando utilizamos DNA total de C.
deanei normal e DNA do endosimbionte (figura 38), levando a conclusão que o gene
so está presente no genoma da bactéria endosimbiótica, não tendo ocorrido sua
transferência para o genoma do protozoário hospedeiro. Os iniciadores utilizados
não foram capazes de amplificar o gene do endosmbionte de B. culicis. Os mesmos
resultados foram obtidos para o gene minDe (figura 39).
68
FIGURA 39 – AMPLIFICAÇÃO DO GENE minD DO ENDOSIMBIONTE
C. Deanei normal
C. Deanei curada
Endosimbionte
B. Culicis normal
Kb
2,0
1,6
1,0
0,85
C. Deanei normal
C. Deanei curada
Endosimbionte
B. Culicis normal
Kb
2,0
1,6
1,0
0,85
LEGENDA: Amplificação por PCR do gene minD a partir de DNA
total de cepas de C. deanei normal e aposimbiótica, DNA
genômico de frações purificadas de simbionte e DNA total de
cepa de B. culicis normal.
A figura 40 mostra os resultados obtidos para minEe. Como para os outros
genes do sistema min, minEe está presente no genoma do endosimbionte. No
entanto, conseguiu-se uma amplificação de minE quando se utilizou DNA da cepa
normal de B. culicis.
69
FIGURA 40 – AMPLIFICAÇÃO DO GENE minE DO ENDOSIMBIONTE
C. Deanei normal
C. Deanei curada
Endosimbionte
B. Culicis normal
pb
100
400
300
200
C. Deanei normal
C. Deanei curada
Endosimbionte
B. Culicis normal
pb
100
400
300
200
LEGENDA: Amplificação por PCR do gene ftsK a partir de DNA total de
cepas de C. deanei normal e aposimbiótica, DNA genômico de frações
purificadas de simbionte e DNA total de cepa de B. culicis normal.
Foi realizada uma análise detalhada de domínios e aminoácidos importantes
para a função característica de cada proteína do sistema Min a partir de pesquisas
feitas com bactérias de vida livre (figuras 41, 43 e 44).
70
FIGURA 41 - ALINHAMENTO DA PROTEÍNA MinC DO ENDOSIMBIONTE
DEDUZIDO A PARTIR DAS SEQÜÊNCIAS NUCLEOTÍDICAS, COM OS
CORRESPONDENTES HOMÓLOGOS DE Bordetella spp E Escherichia coli
MinC
Bordetella spp -MNTESLALDFKSATLYAIRVVLHDADTTRLRAALDKRMADAGSFFENEPVVIDATRVDA 59
Simbi MMNKSLIEFKSASFNVYAPKIIIHTSNINDLSTSITKHIYNSGNFFKNEHVVIDATQIDQ 60
E.coli -MSNTPIELKGSSFTLS--VVHLHEAEPKVIHQALEDKIAQAPAFLKHAPVVLNVSALED 57
*.. : :. * .: : :* :: . : :: .:: :: *::: **::.: ::
Bordetella spp PVDWPALLQALADHNLPPIGVV-AEGANLQGARDAGLVPVELSTPVARAPQVIDTAPPND 118
Simbi IIDWDMLITILKEHEINILGIV-ANNINIQNAIKAGLSPLDIITNKN---IKIETN---- 112
E.coli PVNWSAMHKAVSATGLRVIGVSGCKDAQLKAEIEKMGLPILTEGKEKAPRPAPTPQAPAQ 117
::* : : : :*: .:. ::: . *: .
Bordetella spp VATPVPSVPEATAEAAAKAGPQDDEAYGEQADEAPAHNPESVPTRAARETTEANRPTATP 178
Simbi -ATQLP------------------------------------------------------ 117
E.coli NTTPVT------------------------------------------------------ 123
:* :.
Bordetella spp PQSSSALVITKPLRSGQRVYARHTDLIVIGMVSQGAEVIADGNVHVYGPLRGKAMAGARG 238
Simbi -----TMLIDKPLRSGQKIYASKSDLIVIGMVSQGAEIIADGNIHVYGPLRGKAMAGAQG 172
E.coli ----KTRLIDTPVRSGQRIYAPQCDLIVTSHVSAGAELIADGNIHVYGMMRGRALAGASG 179
: :* .*:****::** : **** . ** ***:*****:**** :**:*:*** *
Bordetella spp DTSARIFTTQLDAELLAVAGVYRVVEDKLDRALHNQPALVRLDGDTLRIEALKG 292
Simbi NKEARIFTTQLNAELLSISGVYQVIENDLKDTVMNKPAIVQLMDEKLTIIAI-- 224
E.coli DRETQIFCTNLMAELVSIAGEY-WLSDQIPAEFYGKAARLQLVENALTVQPLN- 231
: .::** *:* ***::::* * :.:.: . .:.* ::* : * : .:
LEGENDA: Alinhamento da proteína MinC do endosimbionte deduzido a partir das seqüências
nucleotídicas, com os correspondentes homólogos de Bordetella spp e Escherichia coli utilizando o
programa ClustalW. Em vermelho mostra-se os aminoácidos consenso entre as proteínas dos três
organismos. Em amarelo e verde, resíduos de glicinas conservadas.
MinC é constituída por dois distintos domínios ligados por uma região flexível.
Em E. coli o domínio N-terminal compreende os resíduos de aminoácidos de 1 a 99.
O domínio C-terminal inclui os resíduos 125 a 231. A região C-terminal da proteína
MinC é mais conservada e interage com ela mesma e com MinD (HU &
LUTKENHAUS, 2000). A região N-terminal interage com FtsZ (HU et al., 1999). Foi
proposto que a interação de MinC com MinD é responsável por fazer com que a
região N-terminal de MinC interaja com seu alvo, FtsZ (JOHNSON et al., 2002).,
Quatro resíduos de glicina completamente conservados no domínio C-terminal de
MinC têm um papel chave na função dessa proteína na inibição da divisão celular. O
resíduo de glicina que ocupa a posição 161 (G161) está envolvido com a
homodimerização, a qual é essencial para a função de MinC, enquanto os resíduos
G135, G154 e G171 são críticos na interação MinC-MinD (RAMIREZ-ARCOS et al.,
2004).
Analisando a figura 42, percebemos que o domínio C-terminal é o mais
conservado, em concordância com trabalhos anteriores, e também que todos os
resíduos de glicina citados como importantes para a função de MinC de E. coli
71
estão presentes na proteína MinCe (realçados em amarelo), indicando que essa
proteína seja funcional no processo de divisão do endosimbionte. Outros resíduos
de glicina também estão conservados na região C-terminal (em verde). A figura 43
nos mostra de uma maneira mais visual esse domínio da proteína MinC rico em
resíduos de glicina.
FIGURA 42 – REPRESENTAÇÃO DO DOMÍNIO C-TERMINAL DA PROTEÍNA MinC
RICO EM RESÍDUOS DE GLICINA
As letras G em amarelo representam os resíduos de glicina.
MinD é uma proteína conservada membro da família das ATPases. Pode-se
perceber claramente que MinD do endosimbionte permaneceu bastante conservada
(Figura 43).
72
FIGURA 43 - ALINHAMENTO DA PROTEÍNA MinD DO ENDOSIMBIONTE
DEDUZIDO A PARTIR DAS SEQÜÊNCIAS NUCLEOTÍDICAS, COM OS
CORRESPONDENTES ORTÓLOGOS DE Bordetella spp E Escherichia coli
MinD
Bordetella spp. MTRIVVVTSGKGGVGKTTTSASFSAGLAMRGHKTAVIDFDVGLRNLDLIM 50
Simbi VARVVVVTSGKGGVGKTTSSASFSAGLALRGYKTIVIDFDVGLRNLDLIM 50
E. coli MARIIVVTSGKGGVGKTTSSAAIATGLAQKGKKTVVIDFDIGLRNLDLIM 50
::*::*************:**::::*** :* ** *****:*********
Bordetella spp. GCERRVVYDFVNVIQGEASLKQALIKDKQLENLFILPASQTRDKDALTQE 100
Simbi GCERRVVYDFINVVQGDANLKQALIKDKNTENLFILPASQTRDKDALTQS 100
E. coli GCERRVVYDFVNVIQGDATLNQALIKDKRTENLYILPASQTRDKDALTRE 100
**********:**:**:*.*:*******. ***:**************:.
Bordetella spp. GVEKVIDELKEMGFDYIVCDSPAGIEAGALMAAYFADDALVVTNPEVSSV 150
Simbi GVEKVLEDLKKMGFEYIVCDSPAGIESGALMAAYFADDAIIVTNPEISSV 150
E. coli GVAKVLDDLKAMDFEFIVCDSPAGIETGALMALYFADEAIITTNPEVSSV 150
** **:::** *.*::**********:***** ****:*::.****:***
Bordetella spp. RDSDRILGILAAKSRRAVQGDEPVKEYLLLTRYNPKRVNDGEMLSLSDIE 200
Simbi RDSDRILGILSSKSKRAXEGLEPIKEFLLITRYNPKRVINGEMLSISDIE 200
E. coli RDSDRILGILASKSRRAENGEEPIKEHLLLTRYNPGRVSRGDMLSMEDVL 200
**********::**:** :* **:**.**:***** ** *:***:.*:
Bordetella spp. DILRIKLIGVIPESEAVLQASNQGLPAIHLKDTDVSEAYKDVVARFLGEE 250
Simbi DIXRIDLAGVIPESESVLHASNQGLPAIHLNETPVSIAYNDLVSRYLGES 250
E. coli EILRIKLVGVIPEDQSVLRASNQGEPVILDINADAGKAYADTVERLLGEE 250
:* **.* *****.::**:***** *.* :: .. ** * * * ***.
Bordetella spp. RSLRFTDYEKPGLLKRLFGGK 271
Simbi IPMKFTEYEKPSFIKRLFGGR 271
E. coli RPFRFIEEEKKGFLKRLFGG- 270
.::* : ** .::******
Alinhamento da proteína MinD do endosimbionte deduzido a partir das seqüências nucleotídicas,
com os correspondentes ortólogos de Bordetella spp e Escherichia coli utilizando o programa
ClustalW. Em vermelho mostra-se os aminoácidos idênticos entre a proteína dos três organismos.
Em amarelo e verde, resíduos de aminoácidos idênticos e essenciais para a função da proteína.
Em azul, seqüência MTS de endereçamento para membrana (membrane-targeting sequence)
A proteína MinD possui conservados os domínios e resíduos de aminoácidos
importantes para sua função. Por exemplo, o resíduo de lisina que ocupa a posição
11 (K11) – destaque em verde – é essencial para a ativação de MinC de E. coli, bem
como é responsável pela interação de MinD com a membrana, MinE e com si próprio
(Hayashi et al., 2001; Zhou et al., 2005). Tanto o resíduo de lisina na posição
11(K11) , quanto na posição 16 (K16) são importantes para a atividade ATPase de
MinD. Outros resíduos importantes são E146, S148 e D152 (destaque em amarelo).
Na proteína MinD de E. coli, esses três resíduos estão presentes na hélice 7 da
Walker A m
otif
A
’ m
otif
Walker B motif
73
proteína e interagem eletroestaticamente com a lisina 11. Esses três resíduos da
hélice 7 não são necessários para a ligação de MinD à membrana ou para a
ativação de MinC e também não são requeridos para a ligação com MinE. No
entanto, são importantes pela estimulação da atividade ATPase de MinD pela MinE
(ZHOU et al., 2005).
A proteína MinD do endosimbionte compartilha outro sinal importante com a
MinD de E. coli, o sinal MTS (membrane-targeting sequence – MTS), uma região de
8 a 12 resíduos de aminoácidos altamente conservados na porção C-terminal e que
é essencial para o direcionamento da proteína para a membrana. MinD se associa
com a membrana interna e essa interação é pré-requisito para o subseqüente
recrutamento de MinC à membrana. Este passo é crítico para a regulação topológica
da divisão bacteriana. O consenso de MTS é KG[FLI][LFI]X3-4KR[LFI][FL], onde X3-
4 representa três ou quatro inserções de resíduos achados em algumas proteínas
MinD (SZETO et al., 2002). Esse consenso está representado pela cor azul na figura
43. Percebe-se que ainda está bastante conservado, mais um indício de que o
sistema Min continua funcional na divisão endosimbiótica.
A região N-terminal de MinE (resíduos de 1 a 31) é responsável pela supressão
da atividade de inibição da divisão do complexo MinCD (Figura 44). Essa função
está correlacionada com a habilidade de MinE de se ligar a MinD e, assim, estimular
sua atividade ATPase, tornando-a inativa. No entanto, não há uma especificidade
topológica. Essa especificidade topológica de MinE é dada pelo domínio C-terminal
(resíduos de 32 a 88), que é o responsável pela dimerização de MinE (revisto por
LUTKENHAUS, 2007). Um estudo recente (RAMOS et al., 2006) mostrou que o
domínio N-terminal interage com o domínio C-terminal, indicando que esses
domínios não são completamente independentes. Nesse trabalho mostrou-se que o
mutante não funcional L22D possuia alterações estruturais nos dois domínios com
uma significante desestabilização de toda a estrutura de MinE. Isto sugeriu que há
uma íntima associação entre os domínios anti-MinCD e de especificidade topológica.
Vale ressaltar que o resíduo de lisina 22 importante pra estruturação da proteína
está conservada em MinEe.
74
FIGURA 44 - ALINHAMENTO DA PROTEÍNA MinE DO ENDOSIMBIONTE
DEDUZIDO A PARTIR DAS SEQÜÊNCIAS NUCLEOTÍDICAS, COM OS
CORRESPONDENTES ORTÓLOGOS DE Bordetella spp E Escherichia coli
MinE
Bordetella spp. MSFLSFLLGQKKSSASVAKERLQIILAHERGRGDSPDYLPQLQQELVAVISKYVKIDPED 60
Simbi MSFLSFLLGEKKKTASVAKERLQIILAHERSNKNSPDYLNKLQQELISVLSKYVVINPDD 60
E.coli MALLDFFLSRKKNTANIAKERLQIIVAERRRSDAEPHYLPQLRKDILEVICKYVQIDPEM 60
*::*.*:*..**.:*.:********:*..* .*.** :*::::: *:.*** *:*:
Bordetella spp IKVHLERQ-DTLEVLEVKIEMPQN---- 83
Simbi IKVNIESQ-GSLDVTSKNRDATKH---- 83
E.coli VTVQLEQKDGDISILELNVTLPEAEELK 88
:.*::* : . :.: . : .:
Alinhamento da proteína MinE do endosimbionte deduzido a partir das seqüências nucleotídicas, com os
correspondentes ortólogos de Bordetella spp e Escherichia coli utilizando o programa ClustalW. Em
vermelho mostra-se os aminoácidos idênticos entre a proteína dos três organismos. Em amarelo e verde,
resíduos de aminoácidos idênticos e essenciais para a função da proteína.
Segundo Shih (2002), mutantes MinE
D45A/V49A
em E. coli são incapazes de
formar o anel E. Ao realizar uma análise desses resíduos de aminoácios
percebemos que o resíduo de valina 49 está conservada no endosimbionte.
Entretanto, tanto em Bordetella spp quanto no endosimbionte o resíduo de
aminoácido na posição 45 é o glutamato e não o aspartato. No entanto, esse dois
aminoácidos possuem a mesma característica, pois os dois são aminoácidos ácidos.
D45 e V49 estão destacados em amarelo na figura 45.
Todas essas análises mostram que apesar da relação endosimbiótica, essas
proteínas mantiveram-se conservadas, principalmente em regiões chaves pra suas
funções, como vimos anteriomente. As análises também sugerem que as proteínas
do sistema Min continuam tendo papel no controle da divisão do endosimbionte.
Para tirarmos maiores conclusões, outros testes que poderiam nos fornecer maiores
informações sobre essa questão foram realizados.
O SISTEMA Min CONTINUA FUNCIONAL NO ENDOSIMBIONTE
4.4.1 Fenótipo da sobreexpressão dos genes do sistema Min do endosimbionte em
E. coli
MinC é um inibidor da formação do septo, já que interage especificamente com
FtsZ, impedindo sua polimerização e, portanto, a formação do anel Z. MinD é uma
proteína de membrana com atividade ATPásica que se liga a MinC, ativando-a, e
permitindo a sua localização na membrana. A localização do complexo MinCD é
75
oscilatória, achando-se na maior parte do tempo próximo aos pólos celulares. MinE
é a responsável por dar especificidade ao complexo MinCD, já que mediante a sua
união a MinD e sua localização central na célula, desloca o complexo inibidor da
membrana, permitindo assim a formação do anel Z no lugar correto. Em E. coli,
quando o gene minC é superexpresso observa-se uma inibição da divisão celular,
evidenciada pelo aumento no comprimento das células. Esse efeito é mais
dramático se minC e minD são superexpressos conjuntamente, formando longos
filamentos de células. Para verificar se essas alterações de fenótipos também
ocorrem quando se sobrexpressa minCDE do endosimbionte, esses genes foram
clonados no vetor pJF119EH.
As clonagens foram feitas como especificado na seção Materiais & Métodos.
O clone bacteriano contendo o plasmídeo resultante, pJFminCe, quando incubado
na presença de IPTG produzia uma proteína do peso molecular esperado (24,7
kDa), mas a indução era muito pobre, e não apresentava alteração do fenótipo de E.
coli. Acreditamos que nessas condições a indução não era suficiente para aumentar
os níveis de MinCe significativamente. Para isso, foi desenhado outro primer (minC3)
introduzindo a seqüência AGGAGG, consenso para o Ribosome Binding Site (RBS),
5 pb a montante do ATG do gene, para aumentar a sua expressão. Assim, foi
possível aumentar os níveis de expressão de minCe em E. coli. No entanto, quando
se transformava E. coli cepa XL1Blue com esse plasmídeo e depois se induzia com
IPTG também não se verificava uma mudança do fenótipo (filamentação).
Então decidimos usar uma outra estratégia, que consistiu em clonar no
mesmo vetor os genes minC e minD. O plasmídeo resultante chamou-se
pJFminCDRBS. Como já explicado anteriormente, a sobreexpressão do minCe não
gerou alteração visível na morfologia celular, mas quando se superexpressou
conjuntamente minCe e minDe observou-se filamentação celular (figura 45).
76
FIGURA 45 - EFEITO DA SUPEREXPRESSÃO DE MinCe E MinCDe EM
Escherichia coli
A cepa XL1blue (contendo o plasmídeo pRARE) foi transformada com o pJFminCRBS, pJFminCDRBS
(construções portadoras do RBS upstream de minC) ou, como controle, com o vetor vazio, e as bactérias
cultivadas na presença de 0,5 mM de IPTG durante 2 hs.
Esse resultado pode ser explicado pelo fato de que MinCe não ter suficiente
afinidade pela FtsZ da E. coli para inibir sua polimerização. Então, a presença de
MinDe ativaria MinCe, possibilitando sua localização na membrana, com a
conseqüente inibição da divisão. Esses dados apontam uma possível funcionalidade
do complexo MinCD do simbionte na localização de FtsZ.
Utilizando-se do vetor de expressão pQE30 fez-se a clonagem de minCe e
minDe separadamente, resultando nos plasmídeos pQEminCe e pQEminDe,
respectivamente. O resultado da indução desses dois genes para o fenótipo da E.
coli transformada pode ser visualizado nas figuras 46 e 47.
77
FIGURA 46 - EFEITO DA SUPEREXPRESSÃO DE MinCe EM Escherichia coli
Efeito da superexpressão de MinCe em E. coli (cepa Top10F´) contendo o plasmídeo
pREP4 e pQEminCe induzida com IPTG 2mM. Em (A) Cultura de Top10F’ pREP4
pQEminCe não induzida, (B) ) Cultura de Top10F’ pREP4 pQEminCe induzida.
FIGURA 47 - EFEITO DA SUPEREXPRESSÃO DE MinDe EM Escherichia coli
Efeito da superexpressão de MinDe em E. coli (cepa Top10F´) contendo o plasmídeo
pREP4 e pQEminCe induzida com IPTG 2mM. Em (A) Cultura de Top10F’ pREP4
pQEminDe não induzida, (B) ) Cultura de Top10F’ pREP4 pQEminDe induzida.
Como se percebe, a expressão MinCe não causou filamentação, que foi
posteriormente observada quando se expressou MinDe. Esse resultado mostra que
MinDe é suficiente para inibir a divisão e enfraquece a hipótese levantada acima, de
que sua superexpressão poderia aumentar a afinidade de MinCe por FtsZ, causando
então a filamentação.
Este resultado sugere que MinCe não é mais funcional. No entanto, outro
resultado abaixo nos mostra a funcionalidade de todo o sistema Min (tabela 3).
78
TABELA 3 – NÚMERO DE COLÔNIAS OBTIDAS QUANDO SE TRANSFORMAVA
PB114 OU PB114 pRARE COM DIFERENTES PLASMÍDEOS
Transformação pJF119EH pJFminC pJFminCRBS pJFminCDRBS pJFminCDE pJFminCDEEc
PB114 >1000 < 5 < 5 < 5 >1000 >1000
PB114 pRARE >1000 0 0 0 >1000 >1000
A cepa PB114 é um mutante que tem os genes minCDE deletados. O fenótipo
dessa cepa é bem característico, já que não existe o controle espacial da formação
do septo, função esta realizada pelo sistema min. Portanto, o sítio de divisão é
formado em qualquer parte da célula. Portanto essa cepa apresenta tanto o fenótipo
de mini-células (septo formado nos pólos), quanto de células filamentadas e células
normais. Quando tentamos transformar essa cepa com o plasmídeo contendo só o
gene minC ou os genes minCD do endosimbionte, as bactérias não foram capazes
de proliferar, e portanto não obtivemos muitas colônias transformantes. Quando a
mesma cepa foi transformada com os dois plasmídeos, mais o plasmídeo pRARE, o
resultado negativo foi acentuado, e não foram obtidos transformantes. A conclusão é
que MinCe e MinCDe podem estar interagindo com as outras proteínas do divisoma,
inibindo então a formação do septo, levando as células a morte. No entanto, quando
a cepa PB114 foi transformada com um plasmídeo contendo conjuntamente os
genes minCDE do endosimbionte ou da própria E. coli, o número de colônias obtidas
foi superior a 1000, o mesmo resultado foi obtido quando a cepa foi transformada
com o vetor nativo. Neste caso, acreditamos que a proteína MinEe está suportando
a divisão celular pela inibição do complexo MinCDe, permitindo a correta formação
do septo. Isso sugere que de alguma maneira MinCe é funcional na divisão de E.
coli. Contudo, não temos dados para afirmar que participe na divisão do
endosimbionte.
A proteína MinE atua deslocando o complexo inibitório MinCD do centro da
célula para os pólos, permitindo assim a formação de anel Z no centro e evitando a
sua formação nos pólos (que são, pela sua vez, sítios potenciais de divisão). Um
aumento dos níveis da MinE gera deslocamento do MinCD inclusive dos pólos, e
assim a divisão pode também acontecer nessas regiões com a conseqüente
ocorrência de mini-células (células pequenas, carentes de DNA) (DE BOER et al.,
1989). Para obter informação sobre a possível funcionalidade da MinE do simbionte,
79
o gene minEe foi clonado em pJF119EH para a sua superexpressão em E. coli.
Obtivemos então o plasmídeo pJFminEe.
Na figura 48 se observa o fenótipo resultante:
FIGURA 48 - EFEITO DA SUPEREXPRESSÃO DE MinEe EM Escherichia coli
UTILIZANDO O PLASMÍDEO pJFminEe
Efeito da superexpressão de MinEe em E. coli. A cepa Rosetta (contendo pRARE) foi
transformada com o plasmídeo pJFminEe ou com o vetor vazio e as culturas
crescidas durante 2 horas em 0,5 mM de IPTG. Algumas minicélulas estão
assinaladas com setas vermelhas.
Fica claro que a presença de MinEe induz a formação de mini-células em E.
coli, apontando à funcionalidade do sistema Min do simbionte na determinação da
posição do aparelho de divisão na célula.
Com o plasmídeo pQEminEe, que expressa minEe com uma cauda de 6xHis,
também se verifica o mesmo fenótipo (Figura 49).
pJFminEe
pJF119EH
80
FIGURA 49 - EFEITO DA SUPEREXPRESSÃO DE MinEe EM Escherichia coli
UTILIZANDO O PLASMÍDEO pQEminEe
Efeito da superexpressão de MinDe em E. coli (cepa Top10F´) contendo o plasmídeo
pREP4 e pQEminCe induzida com IPTG 2mM. Em (A) Cultura de Top10F’ pREP4
pQEminEe não induzida, (B) ) Cultura de Top10F’ pREP4 pQEminEe induzida.
4.4.2 Purificação de MinDe solúvel pra teste de atividade ATPásica
Como visto anteriormente, MinD é uma proteína bastante conservada e
possui atividade ATPase. Portanto, avaliamos se MinDe ainda mantém essa
atividade. A proteína MinDe foi purificada a partir da superexpressão do gene minDe
na cepa Top10F’ de E. coli contendo o plasmídeo pGEXminDe. Essa indução foi
feita a baixa temperatura. Além disso, como mostrado anteriormente, os resíduos de
lisina das posições 11 e 16 da proteína MinD tem fundamental importância na sua
atividade ATPásica. Para avaliar se esses resíduos ainda continuam tendo um
importante papel na proteína MinD do endosimbionte, mutações foram feitas,
substituindo-se os resíduos de lisina por resíduos de alanina das posições citadas.
Os plasmídeos contendo essas mutações foram denominados de pGEXminDK11A e
pGEXminDK16A. A utilização desses mutantes também serviu de controle nesse
ensaio, já que se poderíamos estar medindo a atividade de uma proteína
inespecífica presente na purificação. As proteínas purificadas podem ser
visualizadas na figura 50.
81
FIGURA 50 – PURIFICAÇÃO DE GST-MinDe, GST-MinDeK11A E GST-MinDeK16A
MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE AFINIDADE
Purificação de GST-MinDe, GST-MinDeK11A e GST-MinDeK16A mediante cromatografía de
afinidade. Alíquotas das três eluições realizadas para cada proteína foram aplicadas em um
gel desnaturante de poliacrilamida 12% e coradas com Azul de Coomassie. As eluições foram
feitas utilizando um tampão com excesso de glutationa livre.
A banda de 57 kDa corresponde à fusão de GST com MinDe e MinDe
mutantes. Como não se obteve somente uma banda específica, fez-se Western blot,
reagindo as frações eluídas com um soro anti-MinDe (Figura 51).
82
FIGURA 51 - WESTERN BLOT USANDO O SORO ANTI-MinDe OBTIDO EM
CAMUNDONGOS E REAGIDO CONTRA A PROTEÍNA RECOMBINANTE
PURIFICADA GST-MinDe E AS PROTEÍNAS MUTANTES GST-MinDeK11A e GST-
MinDeK16A
LEGENDA: A reação foi contra a terceira eluição da purificação
mostrada na figura 51 e utilizando anticorpo policlonal anti-
MinDe. O Western blot foi revelado por fosfatase alcalina.
Apesar de purificação não apresentar bandas únicas, percebe-se que
majoritariamente têm-se na purificação a proteína MinDe e degradações inerentes
ao processo.
4.4.2.1 Ensaio de atividade ATPase de MinDe, MinDeK11A e MinDeK16A
Os ensaios de atividade ATPase foram realizados simultaneamente com as
três proteínas submetidas a duas diferentes temperaturas: 28 ºC e 37 ºC. A
temperatura de 28 ºC é a temperatura de incubação das culturas de
83
tripanosomatídeos com endosimbionte e a temperatura de 37 ºC é a temperatura
ótima para crescimento de muitas bactérias, inclusive E. coli, que é nosso organismo
modelo. Os resultados obtidos estão representados na figura 52.
FIGURA 52 – ENSAIO DE ATIVIDADE ATPase DE MinD DO ENDOSIMBIONTE
LEGENDA: GST-MinDe (WT), GST-MinDeK11A (K11A) e GST-MinDeK16A (K16A) foram incubadas durante
uma hora a 28ºC (A) e 37 ºC (B) com concentrações crescentes de GTP, e a produção de Pi foi medida a
630nm.
Podemos observar que a proteína MinDe apresentou uma fraca atividade
ATPásica. Em MinD de E. coli essa atividade é estimulada pela presença de MinE.
No entanto, percebe-se claramente que as proteínas mutantes MinDeK11A e
MinDeK16A possuem uma atividade ainda menor quando comparado com a
proteína nativa. Isso mostra que os resíduos de lisina nas posições 11 e 16 são, de
fato, importantes na atividade ATPase de MinDe. Todos esses resultados estão de
acordo com os resultados obtidos na literatura para a proteína MinD de E. coli
(HAYASHI et al, 2001). Esse resultado também nos faz inferir de que a atividade
detectada não se trata de uma proteína inespecífica, já que houve uma redução da
atividade nas proteínas mutantes.
Para verificar se os mutantes MinDeK11A e MinDeK16A continuavam com
capacidade de inibir a divisão, fez-se uma análise fenotípica de cepa de E. coli
quando da sobreexpressão dessas proteínas mutantes. O resultado está mostrado
na figura 53.
A
B
84
FIGURA 53 - EFEITO DA SUPEREXPRESSÃO DE GST-MinDe,
GST-MinDeK11A e GST-MinDeK16A EM Escherichia coli
Efeito da superexpressão de GST-MinDe e das proteínas mutantes GST-MinDeK11A
e GST-MinDeK16A em E. coli (cepa Top10F´). A) Cultura de Top10F’ contendo o
plasmídeo pGEX-4T, (b) Cultura de Top10F’ contendo o plasmídeo pGEXminDe, (C)
Cultura de Top10F’ contendo o plasmídeo pGEXminDeK11A, (D) Cultura de Top10F’
contendo o plasmídeo pGEXminDeK16A. As culturas foram induzidas com IPTG
0,5mM..
Podemos observar que as proteínas mutantes de MinDe continuam
apresentando capacidade de inibir a divisão celular de E. coli, já que a filamentação
continua ocorrendo. É interessante notar a grande presença de mini-células quando
da expressão de MinDeK16A.
4.4.3 Ensaios de complementação de minCDEe em E. coli
Mutantes de E. coli sem o operon minCDE (
∆
minCDE) mostraram um fenótipo
de mini-células, juntamente com células inusitadamente alongadas com conteúdo de
DNA maior do que o normal (BI & LUTKENHAUS, 1993; DE BOER et al., 1989).
Quando essas cepas mutantes são transformadas com plasmídeos contendo os
85
genes minCDE, elas recuperam o fenótipo normal. Para verificar a funcionalidade do
sistema Min do simbionte, o operon minCDEe completo foi clonado no plasmídeo
pJF119EH e o efeito da sua expressão no mutante de E. coli PB114 (
∆
minCDE,
gentilmente fornecido pelo Dr. Piet de Boer, da Universidade de Ohio. EUA) foi
analisado. Como controle negativo ou positivo utilizamos o plasmídeo vazio ou o
pJFminCDEEc (portador do operon minCDE de E. coli), respectivamente (figura 54).
FIGURA 54 – ENSAIO DE COMPLEMENTAÇÃO DE PB114 COM O OPERON
minCDE DO ENDOSIMBIONTE CLONADO NO VETOR pJF119EH
LEGENDA: Ensaio de complementação de PB114 (minCDE::kan) com o operon minCDE do
simbionte. PB114 foi transformada com o vetor vazio (A), com o pJFminCDEEc (B) ou com
o pJFminCDEe (C), e as células crescidas em LB contendo 0,5 mM de IPTG durante 2
horas.
O resultado obtido mostra que minCDEe clonado no vetor pJF119 não foi
capaz de complementar a cepa mutante PB114. Segundo de Boer (1988), o operon
min é capaz de complementar a cepa mutante min quando se utiliza um plasmídeo
que se replica com baixo número de cópias (low-copy), mas a complementação não
é conseguida com um plasmídeo com grande número de cpópias (high-copy),
indicando que os níveis de proteínas Min deve obedecer certa estequiometria (de
aproximadamente 1-10 vezes os níveis fisiológicos) para ser funcional.
A fim de se obter um resultado mais conclusivo, adotamos a mesma
estratégia de clonagem, mas agora utilizando o pBAD22 como vetor. Este vetor
permite um fino controle nos níveis de expressão, já que é possível reduzir
fortemente a expressão do gene de interesse na ausência do indutor e conseguir
uma maior modulação nos níveis de expressão de acordo com a concentração do
indutor (arabinose). No teste de complementação foram usadas várias
concentrações de arabinose. Conseguimos complementar a cepa PB114 com o
plasmídeo pBADminCDEEc com 0,0002% do indutor. Em concentrações maiores
houve filamentação da cepa, no entanto não havia presença de mini-células,
comprovando assim que a estequiometria de expressão do sistema Min é importante
A B C
86
para a divisão normal da célula bacteriana. O estudo de complementação utilizando
o vetor pBAD22 pode ser visto na figura 55.
FIGURA 55 – ENSAIO DE COMPLEMENTAÇÃO DE PB114 COM O OPERON
minCDE DO ENDOSIMBIONTE CLONADO NO VETOR pJF119EH
87
LEGENDA: Ensaio de complementação de PB114 (minCDE::kan) com o operon minCDE do
simbionte. PB114 foi transformada com o vetor vazio (A), com o pBADminCDEEc (B ) ou
com o pBADminCDEe (C), e as células crescidas em LB contendo 0,0002% de arabinose
durante 2 horas.
Observa-se que as células de PB114 portadoras do operon minCDE de E.
coli se dividem normalmente, enquanto que as que possuem o minCDE do
simbionte mostram fenótipo de mini-células e filamentos, similar ao observado nas
células portadoras do vetor vazio. Podemos concluir que os genes minCDE do
simbionte não são capazes de complementar a cepa PB114 quando se fez a
utilização dos vetores pJF119 e pBAD22.
4.4.4 Ensaios de interação
Como se pode perceber pelos dados já apresentados, toda a maquinaria de
divisão atua como um grande complexo. Para verificar se as proteínas do divisoma
do endosimbionte interagem entre si e com as proteínas de E. coli, realizamos um
ensaio de pull-down utilizando GST-FtsZ ligado à resina de sepharose e FtsZEc
ligado à resina de níquel-NTA (figura 56 e 57). Os testes foram feitos com extrato
bacteriano da cepa PB114 pJFminCDEe induzida, pelo fato dessa cepa não possuir
MinCDE endógenas, que poderiam interferir nos estudos de interação propostos e
em virtude da impossibilidade de obtermos extrato de endosimbionte recém
purificado.
88
FIGURA 56 – ENSAIO DE PULL-DOWN REAGIDO COM ANTI-MinCe
Nas primeira 3 tiras mostra a interação de FtsZEc com o extrato protéico de PB114
pJFminCDEe reagido com anticorpo monoclonal anti-MinCe. Nas outras três tiras mostra a
interação de FtsZe com o extrato protéico de PB114 pJFminCDEe reagido com anticorpo
monoclonal anti-MinCe. A seta mostra a banda corresponde a MinCe.
FIGURA 57 – ENSAIO DE PULL-DOWN REAGIDO COM ANTI-MinDe
Nas primeira 3 tiras mostra a interação de FtsZEc com o extrato protéico de PB114
pJFminCDEe reagido com anticorpo monoclonal anti-MinDe. Nas outras três tiras mostra a
interação de FtsZe com o extrato protéico de PB114 pJFminCDEe reagido com anticorpo
monoclonal anti-MinDe. A seta mostra a banda corresponde a MinDe.
89
Podemos observar mais claramente a interação de MinDe com FtsZ de E. coli
e com FtsZe. A interação de MinCe com a FtsZ não pode ser visualizada, pois reage
fracamente com o antisoro policlonal. Esse ensaio será repetido, mas dessa vez
utilizando o anticorpo monoclonal anti-MinCe. Não está descrito que MinD interaja
diretamente com FtsZ. Essa interação que observamos através da técnica de pull-
down pode ser conseqüência de proteínas intermediárias (formação de complexos)
como, por exemplo, MinCe fazendo o papel de ponte entre MinDe e FtsZ. Nenhuma
reação específica foi observada quando apenas GST foi utilizada como controle
negativo.
Outro fato que sugere que ocorra interação entre as proteínas Min do
endosimbionte e proteínas da maquinaria de divisão de E. coli, é a presença de FtsZ
de E. coli quando da purificação de MinCe e MinDe recombinantes por cromatografia
em resina de níquel-NTA. Durante o procedimento de purificação dessas proteínas,
observamos que as frações eluidas quando submetidas a eletroforese em SDS-
PAGE apresentavam uma proteína contaminante,de mesma massa em ambas as
purificações, nos levando a acreditar de que poderia se tratar de uma proteína do
complexo da maquinaria de divisão de E. coli. Uma vez que a presença dessa
proteína poderia ser meramente devido a interações inespecíficas, resolvemos fazer
outra purificação em condições mais estringentes, como a utilização de Triton X-100
1% na incubação com a resina e nas lavagens. As purificações podem ser
visualizadas nas figuras 58 e 59.
90
FIGURA 58 – PURIFICAÇÃO DE MinCe UTILIZANDO RESINA DE NÍQUEL-NTA
Não induzido
Induzido
Não ligado
Lavagem 5mM imidazol
Lavagem 20mM imidazol
Eluído
Resina
20kDa
25kDa
30kDa
Não induzido
Induzido
Não ligado
Lavagem 5mM imidazol
Lavagem 20mM imidazol
Eluído
Resina
20kDa
25kDa
30kDa
Purificação de MinCe mediante cromatografía de afinidade (Níquel-NTA). Alíquotas
dos diferentes passos da purificação foram aplicadas num gel desnaturante de
poliacrilamida 15% e coradas com Azul de Coomassie. A eluição foi realizada com
100mM de imidazol.
FIGURA 59 – PURIFICAÇÃO DE MinDe UTILIZANDO RESINA DE NÍQUEL-NTA
20kDa
25kDa
30kDa
40kDa
Não induzido
Induzido
Não ligado
Lavagem 5mM imidazol
Lavagem 20mM imidazol
Eluído
Resina
20kDa
25kDa
30kDa
40kDa
Não induzido
Induzido
Não ligado
Lavagem 5mM imidazol
Lavagem 20mM imidazol
Eluído
Resina
Purificação de MinDe mediante cromatografía de afinidade (Níquel-NTA). Alíquotas
dos diferentes passos da purificação foram aplicadas num gel desnaturante de
poliacrilamida 15% e coradas com Azul de Coomassie. A eluição foi realizada com
100mM de imidazol.
91
Uma alíquota da fração eluída da purificação de MinCe foi analisada por
western blot usando antisoros contra as proteínas FtsZ, MinDe e GyrBe (figura 60).
Da mesma forma, uma alíquota da fração eluída da purificação de MinDe foi
analisada por western blot usando antisoros contra as proteínas FtsZ, MinCe e
GyrBe (figura 61). O anticorpo anti-FtsZ foi produzido a partir da proteína de E. coli.
Para MinC, MinD e GyrB, os antisoros foram produzidos a partir das respecitvas
proteínas do endosimbionte.
FIGURA 60 – ENSAIO DE INTERAÇÃO DE MinCe COM A
MAQUINARIA DE DIVISÃO DE Escherichia coli
Western blot do material eluido mostrado na figura 58. Em (1) reação com o
anticorpo policlonal anti-FtsZEc, em (2) reação com o anticorpo policlonal anti-
MinDe e em (3) reação com o anticorpo policlonal anti-GyrBe. , banda FtsZEc
está indicada pela seta preta, enquanto MinDEc é indicada pela seta
vermelha.
92
FIGURA 61 – ENSAIO DE INTERAÇÃO DE MinDe COM A
MAQUINARIA DE DIVISÃO DE Escherichia coli
Western blot do material eluido, mostrado na figura 59. Em (1) reação com o
soro anti-FtsZEc, em (2) reação com soro anti-MinCe e em (3) reação com o
soro anti-GyrBe. A proteína FtsZEc está indicada pela seta preta, enquanto
que a seta vermelha indica a banda correspondente a MinCEc.
Pelo resultado do western blot, podemos observar que MinCe e MinDe
interagem com FtsZ de E. coli. MinCe interage com MinD de E. coli. MinDe interage
com MinC de E. coli. O anticorpo anti-GyrB foi utilizado como controle negativo. É
possível que na purificação de MinCe e MinDe possa estar ocorrendo a co-
purificação de outras proteínas do divisoma de E. coli (ZipA, FtsK, ...). Para
comprovar isso estamos produzindo antisoros contra essas outras proteínas.
Esse resultado corrobora nossa hipótese de que o sistema Min continua
funcional no endosimbionte.
LOCALIZAÇÃO DAS PROTEÍNAS DO SISTEMA Min NO ENDOSIMBIONTE
4.4.5 Purificação de MinCe, MinDe, MinEe para produção de anti-soro específico
Com o objetivo de localizar as proteínas do sistema Min no endosimbionte,
construímos plasmídeos contendo os genes Min individuais fusionados com o gene
da GST (Glutationa S-Transferase). Bactérias expressando esses genes quimeras
produzem proteínas recombinantes fusionadas a GST que podem ser purificadas
por cromatografia de afinidade, utilizando resina de glutationa-sepharose. As
93
proteínas recombinantes purificadas dessa maneira podem então ser utilizadas para
a produção de anti-soro específico para as proteínas MinC, MinD e MinE do
endosimbionte. Os plasmídeos pGEXMinCe, pGEXminDe e pGEXminEe foram
introduzidos na cepa Top10F’ e a produção das respectivas proteínas induzida com
IPTG. Nestas condições foram observadas bandas com o peso molecular esperado
para as fusões (GST-MinC com 50 kDa, GST-MinD com 55 kDa , GST-MinE com 35
kDa). Como os níveis de indução foram muito pobres, usamos a cepa Rosetta (DE3)
pRARE. Essa cepa possui o plasmídeo pRARE que contém genes para certos
tRNAs que são pouco abundantes em E. coli (que reconhecem os códons: AGG,
AGA, AUA, CUA, CCC, GGA). Assim, é possível aumentar a expressão de genes
heterólogos que em condições normais seriam expressos muito pobremente. Nestas
condições, a produção das proteínas recombinantes aumentou consideravelmente, o
que permitiu obter suficiente quantidade de proteína purificada para imunizar
camundongos. As figuras 62, 63 e 64 a seguir mostram a purificação dessas
proteínas recombinantes.
FIGURA 62 - PURIFICAÇÃO DE GST-MinCe
50kDa
Ins
FT
Res
El1
El2
El3
El4
50kDa
Ins
FT
Res
El1
El2
El3
El4
Purificação de GST-MinCe mediante cromatografía de afinidade. Alíquotas dos
diferentes passos da purificação foram aplicadas num gel de SDS-PAGE contendo
10% de poliacrilamida, corado com Azul de Coomassie. Ins: insolúvel após da
sonicação. FT: material não retido após passagem pela resina de Glutationa-
sepharose. Res: material retido na resina. El1-El4: eluições do material retido usando
um tampão com excesso de glutationa livre.
94
FIGURA 63 - PURIFICAÇÃO DE GST-MinDe
50
60
1µl
5µl
10µl
kDa
50
60
1µl
5µl
10µl
kDa
Análise da purificação do corpúsculo de inclusão da
fusão GST-MinDe por SDS-PAGE
FIGURA 64 - PURIFICAÇÃO DE GST-MinEe
1µl
5µl
50
40
30
kDa
10µl
1µl
5µl
50
40
30
kDa
10µl
50
40
30
kDa
10µl
Análise da purificação do corpúsculo de inclusão da
fusão GST-MinE por SDS-PAGE
A análise por Western blot dos soros obtidos está representada na figura 65.
Somente se conseguiu soros anti-MinCe e MinDe.
95
FIGURA 65 – WESTERN BLOT UTILIZANDO SOROS ANTI-MinCe E ANTI-MinDe
Figura 54 - Western blot usando anti-soro anti-MinCe (A) e anti-MinDe (B) obtidos em
camundongos. Extrato E.coli induzido: E. coli transformada com o pJFMinCDEe e
induzida com IPTG. O Western blot foi revelado por fosfatase alcalina
Observa-se pela análise de western blot que as proteínas MinCe e MinDe
sintetizadas pela E. coli, a partir da expressão dos genes minCe e minDe inseridos
no vetor pJFminCe e pJFminDe respectivamente, são claramente reconhecidas
pelos soros, mas as proteínas MinC e MinD presentes no extrato protéico do
simbionte são fracamente identificadas. Este resultado pode ser explicado pelo fato
de que, em condições fisiológicas, os níveis de MinC e MinD em E. coli são baixos
(400 ± 80 moléculas/célula para MinC). Se os níveis de MinC no endosimbionte
forem similares aos de E. coli, é possível a quantidade dessa proteína presente no
extratos utilizados esteja no limite de detecção da técnica imunológica utilizada..
Outro problema recorrente na produção dos anticorpos policlonais foi conseguir
camundongos em que o soro pré-imune não reagisse com proteínas dos
tripanosomatídeos e também do endosimbionte.
As figuras 66, 67 e 68 a seguir mostram a imunolocalização das proteínas
MinCe e MinDe no endosimbionte dos tripanosomatídeos utizando-se os soros anti-
MinCe e anti-MinDe, respectivamente.
96
FIGURA 66 - IMUNOLOCALIZAÇÃO DE MinCe EM B. culicis
A) Marcação com iodeto
de propídeo. B) Anticorpo
secundário conjugado ao
Alexa Flúor 488. C)
Sobreposição das
imagens A e B.
Em setas azuis está
representado o
cinetoplasto, em roxo, o
núcleo e em branco o
endosimbionte. A barra
representa 10 µm.
97
FIGURA 67 - IMUNOLOCALIZAÇÃO DE MinCe EM C. deanei
A) Marcação com iodeto de propídeo. B) Anticorpo secundário conjugado ao Alexa Fluor 488. C) Campo claro.
D) Sobreposição ampliada. Em setas azuis está representado o cinetoplasto, em roxo, o núcleo e em branco o
endosimbionte. A barra representa 10 µm.
98
FIGURA 68 - IMUNOLOCALIZAÇÃO DE MinDe EM B. culicis
A) Marcação com
iodeto de
propídeo. B)
Anticorpo
secundário
conjugado ao
Alexa Fluor 488.
C) Sobreposição
das imagens A e
B.
Em setas azuis
está representado
o cinetoplasto, em
roxo, o núcleo e
em branco o
endosimbionte. A
barra representa
10 µm.
99
Portanto, os soros anti-MinCe e anti-MinDe reconhecem seus antígenos no
endosimbionte. Espera-se que essas proteínas tenham uma localização nos pólos.
No entanto, com este tipo de microscopia nào é possível ter essa percepção mais
afinada.
A PROTEÍNA Dinamina SE CO-LOCALIZA COM O ENDOSIMBIONTE
4.5 LOCALIZAÇÃO DA DINAMINA COM FUSÃO À GFP NO TRIPANOSOMATÍDEO
Blastocrithidia culicis
Uma importante característica dos tripanosomatídeos contendo simbiontes
até agora estudados é que há apenas uma bactéria por célula hospedeira. Outra
característica é que a divisão do endosimbionte é coordenada com a divisão do
tripanosomatídeo hospedeiro. Essas duas características sugerem que a célula
hospedeira dispõe de mecanismos para regular a divisão da bactéria simbiótica.
Como discutido na Introdução, a dinamina e proteínas do tipo dinamina (dinamina-
like) que estão codificadas no núcleo de eucariontes primitivos são responsáveis
pelo processo final na fissão de plastídeos. Partindo desse conhecimento, iniciamos
a investigação sobre a possível participação da dinamina na divisão do
endosimbionte. Para testar essa hipótese, o gene da dinamina foi clonado em fusão
com o gene da GFP em um plasmídeo, o qual foi posteriormente usado para
transfectar cepas normais de C. deanei e B. culicis, seguida da observação dos
protozoários transfectados por microscopia de fluorescência.
Uma vez que o gene da dinamina de C. deanei não está caracterizado,
resolvemos utilizar a informação sobre o gene da dinamina de T. cruzi, (disponível
no portal www. genedb.org) para desenhar oligonucleotídeos. Embora esses genes
sejam bem conservados em T. cruzi, Leishmania e T. brucei, não conseguimos obter
amplificação usando o DNA genômico de C. deanei. Então, fizemos a clonagem
utilizando o gene da dinamina amplificado do DNA genômico de T. cruzi (Figura 69).
O plasmídeo resultante foi denominado de pTEXGFPDnm. A transfecção foi feita em
C. deanei e B. culicis. No entanto, conseguimos clones transfectantes apenas com
B. culicis.
100
FIGURA 69 – AMPLIFICAÇÃO DO GENE DINAMINA DO T. cruzi
3,0
2,0
1,6
3,0
2,0
1,6
Eletroforese em gel de agarose 0,8% do produto de amplificação do
gene dnmTc. O marcador utilizado foi o DNA 1Kb ladder plus, as
bandas estão indicadas em kb.
A proteína GFP-Dinamina nos protozoários transfectados foi
identificada por microscopia de fluorescência indireta usando anticorpo monoclonal
anti-GFP, seguida da incubação com anticorpo anti-IgG de camundongo conjugado
a Alexa Flúor 488 (Figura 70).
FIGURA 70 – CO-LOCALIZAÇÃO DE GFP-DINAMINA NO ENDOSIBIONTE DE B.
culicis
Em setas azuis está representado o cinetoplasto, em roxo, o núcleo e em branco o endosimbionte.
101
Nessas imagens todo o endosimbionte está marcado. No entanto,
acreditamos que esse padrão de marcação seja devido ao estágio de divisão do
endosimbionte. Nossa hipóptese é que no começo da divisão nenhuma dinamina se
encontra associada ao endosimbionte, e apenas as proteínas de divisão do
endosimbionte estão atuando. À medida que a divisão vai chegando ao seu termo, a
dinamina se concentra no lado exterior do sítio de constrição, finalizando o processo
de divisão, em um processo conjunto com o divisoma bacteriano. Como visto na
figura 70, a dinamina ainda está associada o endosimbionte que já se dividiu. Nossa
hipóstes é que essa proteína tenha papel importante, juntamente com outras
proteínas da célula hospedeira ainda não caracterizadas, na segregação do
endosimbionte, garantindo que cada protozoário, depois da divisão, contenha um
único endosimbionte. Esse resultado é bastante promissor. No entanto, análises
mais minuciosas devem ser realizadas.
102
5 CONCLUSÕES
1) O gene zipA encontra-se presente no genoma do endosimbionte de C.
deanei.
2) ZipAe tem maior homologia com a proteína ortóloga de bactérias do gênero
Bordetella sp.
3) Superexpressão de ZipAe é capaz de filamentar cepa de Escherichia coli,
estando de acordo com o descrito na literatura
4) O gene ftsK encontra-se presente no genoma do endosimbionte de C. deanei.
5) FtsKe tem maior homologia com bactérias do gênero Bordetella.
6) FtsKe possui atividade ATPásica, característico de proteínas translocase.
7) FtsZe é capaz de polimerizar, característica essencial pra formação do anel Z.
8) Os genes minCDE encontram-se presente no genoma do endosimbionte de
C. deanei. As seqüências de aminoácidos deduzidas a partir desses genes
mostraram maior homologia com os ortólogos de Bordetella sp.
9) Superexpressão de MinCe não é capaz de filamentar cepa de Escherichia
coli.
10) Superexpressão de MinDe é capaz de filamentar cepa de Escherichia coli.
11) Superexpressão de MinEe é capaz de produzir o fenótipo ca cepa mutante
PB114, estando de acordo com o descrito na literatura.
12) MinDe possui atividade ATPase e essa atividade é diminuída nos mutantes
MinDeK11A e MinDeK16A, mostrando que os resíduos de lisina na posição
11 e 16 são importante para esse atividade, como descrito na literatura.
13) Análise por microscopia de fluorescência mostra que antisoros anti-MinCe e
MinDe reconhecem esses antígenos no endosimbionte.
14) MinCe interage com FtsZ e MinD de Escherichia coli.
15) MinDe interage com FtsZe, FtsZ e MinC Escherichia coli.
16) Dinamina pode estar atuando no processo de divisão do endosimbionte e
pode ser um mecanismo usado pela célula hospedeira para controlar a
divisão da bactéria endosimbiótica..
103
REFERÊNCIAS
AARSMAN, M.; PIETTE, A.; FRAIPONT, C.; INKENVLEUGEL, T.; NGUYEN-
DISTÈCHE.; DEN BLAAWEN, T. Maturation of the Escherichia coli divisome
occurs in two steps. Mol. Microbiol. 55: 1631-1645, 2005.
ANDERSSON, S. G. E.;KURLAND, C. G. Reductive evolution of resident
genomes. Trends Microbiol. 6: 263-268, 1998.
ANDERSON, D. E.; GUEIROS-FILHO, F. J.; ERICKSON, H. P. Assembly
dynamics of FtsZ rings in Bacillus subtilis and Escherichia coli, the effects of
FtsZ-regulating proteins. J Bacteriol 186: 5775–5781, 2004.
AUSSEL, L.; BARRE, F. X.; AROYO, M.; STASIAK, A.; STASIAK, A. Z.; SHERRATT,
D. FtsK is a DNA motor protein that activates chromosome dimer resolution by
switching the catalytic state of the XerC and XerD recombinases.Cell 108: 195–
205, 2002.
AUSUBEL, F. M., BRENT, R., KINGSTON, R. E., MOORE, D. D., SEIDMAN, J. G.,
SMITH, J. A. & STRUHL, K. Current Protocols in Molecular Biology. Green
Publishing Associates and Wiley, New York, NY, 1988.
BAUMANN, L.; BAUMANN, P. Characterization of ftsZ, the cell division gene of
Buchnera aphidicola (endosimbiont of aphids) and detection of the product.
Current Microbiology 36: 85-89, 1998.
BEGG, K. J., DEWAR, S. J., DONACHIE, W. D. A new Escherichia coli cell
division gene, ftsK. Journal of Bacteriology 177: 6211-6122, 1995.
BI E.; LUTKENHAUS, J. Cell division inhibitors SulA and MinCD prevent
formation of the FtsZ ring. J Bacteriol. 175:1118-25, 1993.
BIGOT, S.; CORRE, J.; LOUARN, J. M.; CORNET, F.; BARRE, F. X. FtsK activities
in Xer recombination, DNA mobilization and cell division involve overlapping
and separate domains of the protein. Mol Microbiol. 54: 876-86, 2004.
BIGOT, S.; SIVANATHAN, V.; POSSOZ, C.; FRANÇOIS-XAVIER, B.; CORNET, F.
FtsK, a literature chromossome segragation machine. Molecular Microbiology 64:
1431-1441, 2007.
BLEAZARD, W.; McCAFFERY, J. M.; KING, E. J.; BALE, S.; MOZDY, A.; TIEU, Q.;
NUNNARI, J.; SHAW, J. M. The dynamin-related GTPase Dnm1 regulates
mitochondrial fission in yeast. Nature Cell Biol. 1: 298-304, 1999.
BRUESKE, W.A. The diplosome of Blastocrithidia culicis (Novey, Mc Neal and
Torrey, 1907) (Mastigophora: Trypanosomatidae). 1967. Tese – Universidade de
Minnesota, Minneapolis, Minn. pp. 77-401.
CARBALLIDO-LOPEZ, R.; ERRINGTON, J. The bacterial cytoskeleton: in vivo
104
dynamics of the actin-like protein Mbl of Bacillus subtilis. Dev Cell 4: 19–28, 2003.
CAVALIER-SMITH, T. The simultaneous symbiotic origin of mitochondria,
chloroplasts and microbodies. Ann. New York Acad. Sci. 503: 55-71, 1987.
CHANG, H.P. Ultrastructure of symbiotic bacteria in normal and antibiotic-
treated Blastocrithidia culicis and Crithidia oncopelti. J. Protozool. 21: 699-707,
1974.
CHANG, K. P. Reduced growth in Blastocrithidia culicis and Crithidia oncopelti
freed of intracellular symbionts by chloramphenicol. J. Protozool. 22: 271-276,
1975.
DE BOER, P. A.; CROSSLEY, R. E.; ROTHFIELD, L. I. Isolation and properties of
minB, a comples genetic locus involved in correct placement of the division
site in Escherichia coli. J Bacteriol 170:2106-12, 1988.
DE BOER, P. A.; CROSSLEY, R. E.; ROTHFIELD, L. I. A division inhibitor and a
topological specificity factor coded for by the minicell locus determines- the
proper placement of the division septum in E. coli. Cell 56:641-649, 1989.
DE BOER, P. A.; CROSSLEY, R.; ROTHFIELD, L. The essential bacterial cell-
division protein FtsZ is a GTPase. Nature 359: 254–256, 1992a.
DE BOER, P. A, ROBIN, E.; CROSSLEY, R. E.; LAWRENCE I.; ROTHFIELD, L. I.
Roles of MinC and MinD in the site-specific septation block mediated by the
MinCDE system of Escherichia coli. J. Bacteriol. 174:63-70, 1992b.
DE SOUZA, W. ; MOTTA, M. C. M. Endosymbiosis in protozoa of
Trypanosomatidae family. FEMS Microbiol. lett. 173: 1-8, 1999.
DRAPER, G. C.; McLENNAN, N.; BEGG, K.; MASTERS, M.; DONACHIE, W. D.
Only the N-terminal domain of FtsK functions in cell division. J. Bacteriol. 180:
4621–4627, 1998.
DU, Y.; DMITRI, A. M.; CHANG, K. P. Monophyletic origin of (ß-division
proteobacteral endosymbionts and their coevolution with insect
trypanosomatid protozoa Blastocrithidia culicis and Crithidia spp. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 91: 8437-8441, 1994a.
DU, Y.; McLAUGHLIN, G.; CHANG, K.P. 16S ribosomal DNA sequence identities
of ß-proteobacterial endosymbionts in three Crithidia species. J. Bacteriol. 176:
3081-3084, 1994b.
DWYER, D. M.; CHANG, H. P. Surface membrane carbohydrate alterations of a
flagellated protozoan mediated by bacterial endosymbiontes. Proc. Nat. Acad.
Sci. USA. 73: 852-856, 1976.
105
ERRINGTON, J.; DANIEL R. A.; SCHEFFERS, D. J. Cytokinesis in bacteria.
Microbiol. Mol.Biol. Rev. 67: 52-65, 2003.
ESPELI, O.; LEVINE, C.; HASSING, H.; MARIANS, K. J. Temporal regulation of
topoisomerase IV activity in E. coli. Mol. Cell 11, 189–201, 2003.
ESTEVES, M. J. G.; ANDRADE, A. F. B.; ANGLUSTER, J. Cell surface
carbohydrates in Crithidia deanei: influence of the endosymbiote. Eur. J. Cell
Biol. 26: 244-248, 1982.
FARIA E SILVA, P. M.; SOLE-CAVA, A. M.; SOARES, M. J.; MOTTA, M. C. M.;
FIORINI, J. E.; DE SOUZA, W. Herpetomonas roitmani: a trypanosomatid with a
bacterium-like endosimbiont in the cytoplasm. J. Protozool. 38: 489-494, 1991.
FIORINI, J. E.; FARIA-E-SILVA, P. M.; BRAZIL, R. P. Três novas espécies de
tripanosomatídeos de insetos isolados em Alfenas, Minas gerais, Brasil. Mem.
Inst. Oswaldo Cruz 84: 69-74, 1989.
FREYMULLER, E.; CAMARGO, E. P. Ultrastructural differences between species
of trypanosomatids with and without endosymbionts. J. Protozool. 28: 175-182,
1981.
FROSSARD, M. L., SEABRA, S. H.; DAMATTA, R. A., DE SOUZA, W.; DE MELLO,
F. G.; MOTTA, M. C. M. Na endosymbiont positively modulates ornithine
descarboxylase in host trypanosomatids. Biochemical and Biophysical Research
Communications 343: 443-449, 2006.
FURSTE, J. P.; PANSEGRAU, W.; FRANK, R.; BLOCKER, H.; SCHOLZ, P.;
BAGDASARIAN, M.; LANKA, E. Molecular cloning of the plasmid RP4 primase
region in a multi-host-range tacP expression vector. Gene 48: 119-131, 1986.
GADELHA, C.; WICKSTEAD, B.; DE SOUZA, W.; GULL, K.; CUNHA-E-SILVA, N.
Cryptic paraflagellar rod in endosymbiont-containing kinetoplastid protozoa.
Eukaryotic Cell 4: 516-525, 2005.
GEISSLER, B., ELRAHEB, D., AND MARGOLIN, W. A gain-of function mutation
in ftsA bypasses the requirement for the essential cell division gene zipA in
Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 100: 4197–4202, 2003.
GILL, J. W.; VOGEL, H. J. Lysine synthesis and phylogeny: biochemical evidence
for a bacterial type endosymbiont in the protozoan Herpetomonas (Strigomonas)
oncopelti. Biochim. Biophys. Acta. 56: 200-201, 1962.
GILL, J. W.; VOGEL, M. J. A bacterial endosymbiont in Crithidia (Strigomonas)
oncopelti: biochemical and morphological aspects. J. Protozool. 10: 148-152, 1963.
GRAY, M. W.; BURGER, G.; LANG, B. F. Mitochondrial evolution. Science 283,
1476-1481, 1999.
106
GUZMAN, L.-M.; BELIN, D.; CARSON, M.; BECKWITH, J. Tight regulation,
modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose
pBAD promoter. J. Bacteriol. 177: 4121-4130, 1995.
HALE, C. A.; DE BOER, P. A. Direct binding of FtsZ to ZipA, an essential
component of the septal ring structure that mediates cell division in E. coli.
Cell. 88:175-85, 1997.
HANEY, S. A.; GLASFELD, E.; HALE, C.; KEENEY, D.; HE, Z.; DE BOER, P.
Genetic analysis of the Escherichia coli FtsZ-ZipA interaction in the yeast two-
hybrid system. Characterization of FtsZ residues essential for the interactions with
ZipA and with FtsA. J Biol Chem 276: 11980-11987, 2001.
HAYASHI, I.; OYAMA, T.; MORIKAWA, K. Structural and functional studies of
MinD ATPase: implications for the molecular recognition of the bacterial cell
division apparatus. EMBO J. 20;1819-1828, 2001.
HIMMELREICH, R.; HILBERT, H.; PLAGENS, H.; PIRKL, E.; LI, B. C.; HERRMANN
R. Complete sequence analysis of the genome of the bacterium Mycoplasma
pneumoniae. Nucleic Acids Res. 24: 4420-4449, 1996.
HINSHAW. J. E. Dynamin and its role in membrane fission. Annu. Rev. Cell Dev.
Biol. 16: 483-519, 2000.
HOENIG, M.; LEE, R. J.; FERGUSON, D. C. A microtiter plate assay for inorganic
phophate. J. Biochem. Biophys. Meth. 19: 249-252, 1989.
HOFFMEISTER, M.; MARTIN, W. Interspecific evolution: microbial symbiosis,
endosymbiosis and gene transfer. Environ Microbiol. 5: 641-649, 2003.
HOWARD M. A mechanism for polar protein localization in bacteria. J Mol Biol.
335: 655-63, 2004.
HU, Z.; LUTKENHAUS, J. Topological regulation of cell division in Escherichia
coli involves rapid pole to pole oscillation of the division inhibitor MinC under
the control of MinD and MinE. Mol Microbiol. 34: 82-90, 1999.
HU, Z.; LUTKENHAUS, J. Analysis of MinC reveals two independent domains
involved in interaction with MinD and FtsZ. J. Bacteriol. 182:3965-3971, 2000.
HU, Z.; MUKHERJEE, A.; PICHOFF, S.; LUTKENHAUS, J. The MinC component
of the division site selection system in Escherichia coli interacts with FtsZ to
prevent polymerization. Proc. Natl. Acad. Sci. 96:14819-14824, 1999.
JOHNSON, J. E.; LACKNER, L. L.; DE BOER, P. A. Targeting of DMinC/MinD and
DMinC/DicB complexes to septal rings in Escherichia coli suggests a multistep
mechanism for MinC-mediated destruction of nascent FtsZ rings. J. Bacteriol.
184:2951-2962, 2002.
KELLY, J. M.; WARD, H. M.; MILES, M. A.; KENDALL, G. A shuttle vector which
facilitates the expression of transfected genes in Trypanosoma cruzi and
Leishmania. Nucleic Acids Res. 20: 3963-3969, 1992.
107
LABROUSSE, A. M.; ZAPPATERRA, M. D.; RUBE, D. A.; VAN DER BLIEK, A. M. C.
elegans dynamin-related protein DRP-1 controls severing of the mitochondrial
outer membrane. Mol. Cell. 4: 815-26, 1999.
LANZETTA, P. A.; ALVAREZ, J. L.; REINACH, P. S.; CANDIA, O. A. An improved
assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Anal. Biochem. 100: 95-97,
1979.
LIU, G.; DRAPER, G. C.; DONACHIE, W. D. FtsK is a bifunctional protein
involved in cell division and chromosome localization in Escherichia coli.Mol.
Microbiol. 29: 893–903, 1998.
LUTKENHAUS, J. Assembly Dynamics of the Bacterial MinCDE System and
Spatial Regulation of the Z Ring. Annu. Rev. Biochem. 76: 539-62, 2007.
MA, X.; MARGOLIN, W. Genetic and functional analyses of the conserved C-
terminal core domain of Escherichia coli FtsZ. J Bacteriol. 181: 7531-7544, 1999.
MAPLER J. & MØLLER, S. G. Plastid Division: Evolution, Mechanism and
Complexity. Annals of Botany 99: 565–579, 2007.
MARGULIS, L. Genetic and evolutionary consequences of symbiosis. Exp.
Parasitol. 39: 277-349, 1976.
MARTIN, W. Gene transfer from organelles to the nucleus: frequent and in big
chunks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 8612-8614, 2003.
MINGORANCE, J.; TAMAMES, J.; VICENTE, M. Genomic channeling in bacterial
cell division. J Mol Recognit. 17: 481-487, 2004.
MORAN, N. A. Microbial minimalism: Genome reduction in bacterial pathogens.
Cell 108: 583-586, 2002.
MOSYAK, L., ZHANG, Y., GLASFELD, E., HANEY, S., STAHL, M., SEEHRA, J., and
SOMERS, W. S. The bacterial cell-division protein ZipA and its interaction with
an FtsZ fragment revealed by X-ray crystallography. EMBO J. 19: 3179–3191,
2000.
MOTTA, M. C. M.; SOLÉ-CAVA, A. M.; FARIA-E-SILVA, P. M.; SOARES, M. J.; DE
SOUZA, W. Morphological and biochemical characterization of the
trypanosomatids Crithidia desouzai and Herpetomonas anglusteri. Can. J. Zool.
69: 571-577, 1991.
MOTTA, M. C. M.; MONTEIRO-LEAL, L. H.; DE SOUZA, W.; FONTOURA, D. F.;
FERREIRA, L. C. S. Detection of penicillin-binding proteins in the
endosymbiont of the trypanosomatid Crithidia deanei. J. Euk. Microbiol. 44: 492-
496, 1997a.
MOTTA, M. C. M.; SOARES, M. J.; ATTIAS, M.; MORGADO, J.; SAAD-NEHME, J.;
MEYER-FERNANDES, J. R.; DE SOUZA, W. Ultrastructural and biochemical
108
analysis of the relationship of Crithidia deanei with its endosymbiont. Eur. J.
Cell Biol. 72: 370-377, 1997b.
MOTTA, M.C.M.; DE SOUZA, W.; THIRY, M. Ultrastructural detection of DNA and
RNA in Trypanosomatids: cytochemical and immunocytological study. FEMS
Microbiol. Letters 221: 17-23, 2003.
MUKHERJEE, A.; DAI, K.; LUTKENHAUS, J. Escherichia coli cell division protein
FtsZ is a guanine nucleotide binding protein. Proc. Natl Acad. Sci. USA 90: 1053–
1057, 1993.
MUKHERJEE, A.; LUTKENHAUS, J. Guanine nucleotide dependent assembly of
FtsZ into filaments. J. Bacteriol. 176: 2754–2758, 1994.
MUNDIM, M.H., ROITMAN, J.; HERMANS, M.A.; KITAJIMA, E.W. Simple nutrition
of Crithidia deanei a reduviid trypanosomatid with an endosymbiont. J.
Protozool. 21: 518-521, 1974.
NISHIDA, K.; TAKAHARA, M.; MIYAGISHIMA, S.; KUROIWA, H.; MATSUZAKI, M.;
KUROIWA, T. Dynamic recruitment of dynamin for final mitochondrial
severence in a primitive red alga. Proc. Natl. Acad. Sci. 100:2146-2156, 2003.
NOGALES, E.; DOWNING, K. H.; AMOS, L. A.; LOWE, J. Tubulin and FtsZ form a
distinct family of GTPases. Nat. Struct. Biol. 5: 451-458, 1998.
ODA, L. M.; ALVIANO, C. S.; SILVA-FILHO, F. C.; ANGLUSTER, J.; ROITMAN, I;
DE SOUZA, W. 1984. Surface anionic groups in symbionte-bearing and
symbiont-free strains of Crithidia deanei. J. Protozool. 31: 131-134, 1984.
OSTERYOUNG, K. W. Organelle fission. Crossing the evolutionary divide. Plant
Physiol. 123: 1213-1216, 2000.
OSTERYOUNG, K. W.; NUNNARI, J. The division of endosymbiotic organelles.
Science 302: 1698-1704, 2003.
PALMIÉ-PEIXOTO, I. V.; ROCHA, M. R; URBINAZ, J. A.; DE SOUZA, W.;
EINICKER-LAMAS, M.; MOTTA, M. C. M. Efects of sterol biosynthesis inhibitor
on endosymbiont-bearing trypanosomatids. FEMS Microbiol Lett: 255: 33-42,
2006.
PICHOFF, S.; LUTKENHAUS, J. Unique and overlapping roles for ZipA and FtsA
in septal ring assembly in Escherichia coli. EMBO J 21: 685–693, 2002.
RAMIREZ-ARCOS, S.; GRECO, V.; DOUGLAS, H.; TESSIER, D.; FRAN, D.;
SZETO, J.; WANG, J.; DILLON, J. R. Conserved glycines in the C terminus of
MinC proteins are implicated in their functionality as cell division inhibitors. J.
Bacteriol. 186: 2841-2855, 2004.
109
RAMOS, D.; DUCAT, T.; CHENG, J.; ENG, N. F.; DILLON, J. A.; GOTO, N. K.
Conformation of the cell division regulator MinE: evidence for interactions
between the topological specificity and anti-MinCD domains. Biochemistry 45:
4593-601, 2006.
RAYCHAUDHURI, D.; PARK, J. T. Escherichia coli cell-division gene ftsZ
encodes a novel GTP-binding protein. Nature 359: 251–254, 1992.
ROST, B.; FARISELLI, P.; CASADIO, R. Topology prediction for helical
transmembrane proteins at 86% accuracy. Protein Science, 7:1704-1718, 1996.
SAMBROOK, J.; FRITSHC, E.F.; MANIATIS, T. Molecular Cloning: A laboratory
manual. Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989.
SYN C. K. C.; SWARUP, S.. A scalable protocol for the isolation of large-sized
genomic DNA within an hour from several bacteria. Analytical Biochemistry 278:
86-90, 2002.
SHIH, L. Y.; FU, X.; KING, G. F.; LE, T.; ROTHFIELD, L. Division site placement
em E. coli: mutations that prevent formation of the MinE ring lead to loss the
normal midcell arrest of growth of polar MinD membrane domains. EMBO J. 21:
3347-3357, 2002.
SHLOMAI, J. The assembly of kinetoplast DNA. Parasitol. Today 10:341-346,
1994.
SILVA, F. J.; LATORRE, A.; MOYA, A. Why are the genomes of endosymbiotic
bacteria so stable? Trends Genet. 19: 176-180, 2003.
SOARES, M. J.; DE SOUZA, W. Freeze-fracture study of the endosymbiont of
Blastocrithidia culicis. J. Protozool. 35: 370-374, 1988.
SOARES, M. J.; MOTTA, M. C. M.; DE SOUZA, W. Bacterium-like endsymbiont
and vírus-like particles in the trypanosomatid Crithidia desouzai. Microbios
Letters 41:137-141, 1989.
SPENCER, R.; CROSS, G. A. M. Purification and properties of nucleic acids
from unusual cytoplasmic organelles on the flagellate protozoan Crithidia
oncopelti. Biochim. Biophy. Acta. 390: 141-154, 1975.
STRICKER, J.; MADDOX, P.; SALMON, E. D.; ERICKSON, H. P. Rapid assembly
dynamics of the Escherichia coli FtsZ-ring demonstrated by fluorescence
recovery after photobleaching. Proc Natl Acad Sci USA 99: 3171–3175, 2002.
SZETO, T. H.; ROWLAND, S. L.; ROTHFIELD, L. I.; KING, G. F. Membrane
localization of MinD is mediated by a C-terminal motif that is conserved acroos
eubacteria, archaea, and chloroplasts. Prc. Natj. Acad. Sci. USA. 99: 15693-
15698, 2002.
110
TAMAMES, J. Evolution of gene order conservation in prokaryotes. Genome
Biology 2: 0020.1–0020.11, 2001.
TOWBIN, H.; STAEHELIN, T.; GORDON, J. Electrophoretic transfer of proteins
from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some
applications. Proc Natl Acad Sci USA. 76: 4350-4354, 1979.
WANG, X.; LUTKENHAUS, J. Characterization of the ftsZ gene from
Mycoplasma pulmonis, an organism lacking a cell wall. J Bacteriol 178: 2314-
2319, 1996.
WARREN, L.G. Metabolism of Schizotrypanum cruzi, Chagas. I. Effect of culture
age and substrate concentration on respiratory rate. J. Parasitol. 46: 529-539, 1960.
WU , L. J.; ERRINGTON, J. Bacillus subtilis SpoIIIE protein required for DNA
segregation during asymmetric cell division. Science 264:572-575, 1994.
WU, L. J.; LEWIS, P. J.; ALLMANSBERGER, R.; HAUSER, P. M.; ERRINGTON, J.
A conjugation-like mecjanism for prespore chromosome partioning during
sporulation in Bacillus subtilis. Genes Dev. 9:1316-1326, 1995.
WEISS D. S. Bacterial cell division and the septal ring. Mol Microbiol 54(3): 588-
97, 2004.
YU, X-C.; WEIHE, E. K.; MARGOLIN, W. Role of the C-terminus of FtsK in
Escherichia coli chromosome segregation. J Bacteriol 180: 6424–6428, 1998.
ZHOU, H.; SCHULZE, R.; COX, S.; SAEZ, C.; HU, Z.; LUTKENHAUS, J. Analysis of
MinD mutations reveals residues required for MinE stimulation of the MinD
ATPase and residue required for MinC interaction. Journal of Bacteriology. 187:
629-638, 2005.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
