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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
ROBERTO CÉSAR PEREIRA LIMA JÚNIOR
ESTUDO MORFOFUNCIONAL E DOS MEDIADORES
INFLAMATÓRIOS ENVOLVIDOS NA PATOGÊNESE DA
MUCOSITE INTESTINAL INDUZIDA POR IRINOTECANO
(CPT-11) EM CAMUNDONGOS: PAPEL DA CASPASE-1,
INTERLEUCINA-18 E ÓXIDO NÍTRICO
FORTALEZA-CE
2008
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2
ROBERTO CÉSAR PEREIRA LIMA JÚNIOR
ESTUDO MORFOFUNCIONAL E DOS MEDIADORES
INFLAMATÓRIOS ENVOLVIDOS NA PATOGÊNESE DA
MUCOSITE INTESTINAL INDUZIDA POR IRINOTECANO (CPT-
11) EM CAMUNDONGOS: PAPEL DA CASPASE-1,
INTERLEUCINA-18 E ÓXIDO NÍTRICO.
Tese apresentada ao programa de Pós-
Graduação em Farmacologia da
Universidade Federal do Ceará como
requisito parcial para obtenção do título de
Doutor em Farmacologia.
Orientador (a):
Prof. Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro
FORTALEZA-CE
2008
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ROBERTO CÉSAR PEREIRA LIMA JÚNIOR
ESTUDO MORFOFUNCIONAL E DOS MEDIADORES
INFLAMATÓRIOS ENVOLVIDOS NA PATOGÊNESE DA
MUCOSITE INTESTINAL INDUZIDA POR IRINOTECANO (CPT-
11) EM CAMUNDONGOS: PAPEL DA CASPASE-1,
INTERLEUCINA-18 E ÓXIDO NÍTRICO
Esta tese foi submetida como parte dos requisitos
necessários à obtenção do grau de Doutor em
Farmacologia, outorgado pela Universidade Federal do
Ceará, e encontra-se à disposição dos interessados na
Biblioteca setorial da referida Universidade.
Data de aprovação: 11/07/2008
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________
Prof. Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro (Orientador)
Universidade Federal do Ceará-UFC
_______________________________________
Prof. Dr. Cláudio de Azevedo Canetti
Universidade Federal do Rio de Janeiro-UFRJ
_______________________________________
Prof. Dr. Giles Alexander Rae
Universidade Federal de Santa Catarina-UFSC
_______________________________________
Prof. Dr. Pedro Jorge Caldas Magalhães
Universidade Federal do Ceará-UFC
_______________________________________
Prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao
Universidade Federal do Ceará-UFC
4
Ao bom Deus, por sempre olhar por
mim e por me fazer tomar as melhores
decisões em todos os momentos de
minha vida.
Aos meus pais Roberto César Pereira
Lima e Maria Aureana Costa Lima, e
aos meus irmãos Denis Roberto e
Marina Lima pelo imprescindível
apoio nos momentos de maior
dificuldade e incentivo constante.
5
AGRADECIMENTOS
Ao grande amigo e orientador Prof. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro pela
enorme e indubitável confiança depositada em mim desde meu ingresso na
família LAFICA, a qual conduz com maestria.
Ao Prof. Marcellus Henrique Loiola Ponte de Souza por interceder por mim no
meu momento de maior dificuldade durante o curso de doutorado, pelo amigo
que nele encontrei, disponibilidade e pelas valiosas sugestões no
desenvolvimento deste trabalho.
Ao Prof. Fernando de Queiróz Cunha pela presteza, disponibilidade e por me
receber com tanta satisfação em seu laboratório na FMRP/USP, permitindo o
desenvolvimento deste trabalho de grande qualidade.
À Profa. Gerly Anne de Castro Brito, pessoa extremamente gentil que sempre
me transmitiu grande paz interior e pelas indispensáveis análises
histopatológicas realizadas nesse trabalho.
A todos os amigos do LAFICA, especialmente Adriana Lima, André Luiz,
Antoniella Gomes, Caroline Addison, Jand-Venes, Profa. Mariana Vale, Mirlane
Cardoso, Pedro Soares, Renata Leitão, Renata Bessa por me fazerem sentir
em casa desde que cheguei ao laboratório.
Ao amigo Helano Carioca pela colaboração e pelas discussões extremamente
construtivas para aperfeiçoamento desse trabalho.
Aos amigos Rosemayre Freire e Caio Azevedo pelos muitos momentos de
descontração na “Padoca” após os dias de árduo trabalho.
Aos alunos de iniciação científica Samuel Miranda, Lorena Rodrigues, Leandro
Linhares, Lorena Nunes, Raphael Marques, Raul Medeiros pela amizade, pelo
constante aprendizado que tive com todos eles e pelo enorme interesse
científico.
Aos inestimáveis e indispensáveis técnicos José Ivan (morfologia) e Vandinha
França Pinheiro (LAFICA) pela grande organização e pelos excelentes
profissionais que são. Uma referência!
Ao técnicos Ana Kátia dos Santos, Diva Amábile Montanha de Souza, Eliana
Beatriz de Barros, Fabíola Leslie Mestriner, Giuliana Bertozi Francisco, Ieda
Regina dos Santos Schivo, Júlio Anselmo, Maria Inês Nemoto, Sérgio Roberto
Rosa, Tadeu Franco Vieira, todos da Faculdade de Medicina da USP de
Ribeirão Preto pelo suporte experimental e pelo companheirismo no tempo que
passei nessa bela cidade.
À minha querida Deysi Viviana por conferir a mim momentos de grande
tranqüilidade durante a fase mais complicada do meu doutorado.
Aos companheiros do LPN pela amizade e permanente incentivo.
6
À secretária Aura Rhanes Yida pela atenção e gentileza com que sempre me
atendeu quaisquer que fossem minhas necessidades em relação à pós-
graduação.
Aos funcionários do Departamento de Fisologia e Farmacologia: Haroldo,
Carlos, Íris, Chiquinho, Fernando, Joana, Alana, pela indispensável ajuda na
manutenção das atividades do departamento.
À CAPES e ao CNPq pelo apoio financeiro.
7
“O rio atinge seus objetivos
porque aprendeu a contornar
obstáculos.” (Lao-Tsé)
8
RESUMO
ESTUDO MORFOFUNCIONAL E DOS MEDIADORES INFLAMATÓRIOS
ENVOLVIDOS NA PATOGÊNESE DA MUCOSITE INTESTINAL INDUZIDA POR
IRINOTECANO (CPT-11) EM CAMUNDONGOS: PAPEL DA CASPASE-1,
INTERLEUCINA-18 E ÓXIDO NÍTRICO. Autor: Roberto César Pereira Lima Júnior.
Doutorado em Farmacologia. Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Faculdade de
Medicina, Universidade Federal do Ceará. Defesa: 11 de julho de 2008. Orientador: Prof. Dr.
Ronaldo de Albuquerque Ribeiro.
Introdução: A Mucosite Intestinal (MI) e a diarréia severas são efeitos colaterais freqüentes
(15-25%) e limitantes da quimioterapia do câncer de cólon com Irinotecano (CPT-11). Até o
presente momento, pouco se conhece sobre a fisiopatologia da MI. Objetivo: Estudar os
mecanismos e mediadores envolvidos na mucosite intestinal induzida por CPT-11, verificando a
participação da protease caspase-1, das citocinas interleucina-1 (IL-1), interleucina-18 (IL-18) e
interleucina-33 (IL-33), do óxido nítrico, de mediadores 5-lipoxigenase e do PAF, assim como a
seqüência de interação entre esses mediadores sob aspectos da resposta inflamatória e
morfofuncionais. Métodos: Camundongos Swiss, C57BL/6 (BL), BALB/c (BC) ou knockout
para Caspase-1 (Casp
-/-
), IL-18 (IL-18
-/-
), óxido nítrico sintase induzida (iNOS
-/-
), 5-
Lipoxigenase (5-LOX
-/-
), receptor para PAF (PAFr
-/-
) machos, 22 g, foram divididos em grupos
(n=4-5) e tratados por 4 dias com salina (5 mL/kg, i.p) ou CPT-11 (60 mg/kg, i.p) ou foram pré-
tratados com IL-18bp (proteína ligante de IL18, 200 µg/animal/4 dias, i.p.), aminoguanidina
(AG, 50 mg/kg, s.c, 2x/dia/4 dias), IL-33 (1 µg/animal/4 dias, i.v, 1h antes do CPT-11) ou
loperamida ([4x3 mg/kg e 4x30 mg/kg]/animal, s.c.) em associação com CPT-11. No 5º dia,
avaliou-se a diarréia por escores, o leucograma e, após sacrifício, coletou-se o duodeno para
dosagem da atividade de mieloperoxidase (MPO, neutrófilos/mg tecido) e de óxido nítrico
sintase induzida (iNOS pM citrulina/h/mg proteína), morfometria (razão vilo/cripta) e
contratilidade in vitro à Acetilcolina (%contração em relação ao KCl60 mM). Para análise
estatística utilizou-se ANOVA/Newman-Keuls ou Kruskal Wallis/Dunn. P<0,05 foi aceito.
Resultados: Camundongos BL apresentaram um padrão de mucosite intestinal similar ao
observado no camundongo Swiss sob aspectos morfofuncionais. O CPT-11 induziu leucopenia
em todos os animais independentemente do tratamento aplicado. Adicionalmente, o CPT-11
induziu em animais BL e BC, não tratados, aumento de MPO intestinal, redução da relação
vilo/cripta, amento da contratilidade in vitro e dos eventos de diarréia comparados com animais
injetados somente com salina (p<0,05). A despeito da administração de CPT-11, animais
Caspase-1
-/-
, IL-18
-/-
ou BC tratados com IL-18bp apresentaram atividade de MPO e de iNOS
reduzidas, bem como aumento na relação vilo/cripta, menor contratilidade duodenal in vitro e
eventos de diarréia atenuados em comparação aos respectivos controles tratados com salina
(p>0,05). Dados idênticos também foram observados em camundongos injetados com IL-33 e
que receberam CPT-11. A redução na atividade de iNOS naqueles animais motivou o estudo do
efeito do CPT-11 em animais iNOS
-/-
ou tratados com aminoguanidina. Observaram-se menores
níveis de citocinas IL-1β e KC, bem como uma atividade de MPO reduzida no duodeno desses
animais. Além disso, verificou-se preservação da relação vilo/cripta e da espessura da camada
muscular, menor contratilidade duodenal in vitro e eventos de diarréia atenuados similar ao
observado nos respectivos controles que receberam apenas salina (p>0,05). Porém, a
administração de CPT-11 a animais PAFr
-/-
foi capaz de induzir alterações morfofuncionais e o
aumento da atividade de MPO intestinal. Em camundongos 5-LOX
-/-
ou tratados com
loperamida (controle positivo), ambos os grupos injetados com CPT-11, observaram-se
aumento da atividade de MPO e alterações morfométricas. Contudo, sobre aspectos funcionais
de contratilidade in vitro, visualizou-se proteção. Conclusões: Esses resultados sugerem que a
via caspase-1-IL-18 óxido nítrico contribui para o desenvolvimento da resposta inflamatória e
alterações morfofuncionais na mucosite intestinal induzida por CPT-11. A IL-33 parece ser um
fator protetor compensatório nessa cascata inflamatória. A 5-LOX e o PAFr parecem ter papel
secundário na patogênese da mucosite intestinal por CPT-11.
Palavras-chave: CPT-11, inflamação, mucosite, citocinas, óxido nítrico.
9
ABSTRACT
MORPHOFUNCTIONAL STUDY AND THE INFLAMMATORY MEDIATORS
INVOLVED ON THE PATHOGENESIS OF IRINOTECAN (CPT-11)-INDUCED
INTESTINAL MUCOSITIS IN MICE: ROLE OF CASPASE-1, INTERLEUKIN-18 AND
NITRIC OXIDE. Author: Roberto César Pereira Lima Júnior. Post-graduation in
Pharmacology. Department of Physiology and Pharmacology, Faculty of Medicine, Federal
University of Ceará. Defense: July 11
th
2008. Advised by Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro.
Introduction: Severe Intestinal Mucositis (IM) and diarrhea are frequent and dose-limiting
side-effects of colon cancer chemotherapy with irinotecan (CPT-11). At present, much of IM
pathophysiology remains unknown. Aims: To study the mechanisms and inflammatory
mediators involved in CPT-11-induced intestinal mucositis, verifying the role of the protease
caspase-1, cytokines interleukin-1 (IL-1), interleukin-18 (IL-18) and interleukin-33 (IL-33),
nitric oxide, 5-lipoxygenase and PAF as well as the sequence of activation of these mediators in
the inflammatory response and morphofunctional contexts. Methods: Swiss, C57BL/6 (BL),
BALB/c (BC) male mice or caspases-1(Casp-1
-/-
), IL-18 (IL-18
-/-
), inducible nitric oxide
synthase (iNOS
-/-
), 5-Lipoxygenase (5-LOX
-/-
), PAF receptor (PAFr
-/-
) knockout mice, 22g, were
divided into groups (n=4-5) and treated for 4 days with saline (5 mL/kg, i.p.) or CPT-11 (60
mg/kg, i.p.) or were given IL-18bp (IL-18 binding protein, 200 µg/animal/4 days, i.p.),
aminoguanidine (AG, 50 mg/kg, s.c, 2x/day/4 days), IL-33 (1 µg/animal/4 days, i.v, 1h
previously CPT-11) or loperamide ([4x3 mg/kg and 4x30 mg/kg]/animal, s.c.) co-administered
with CPT-11. On day 5, diarrhea and leukocyte counts were assessed, and following sacrifice
duodenal portions of the animal were collected to assess myeloperoxidase (MPO,
neutrophils/mg tissue) and nitric oxide synthase (iNOS pM citruline /h/mg protein) activity,
morphometric analysis, and in vitro contractility (%contraction in relation to KCl 60 mM).
ANOVA/Newman Keuls or Kruskal Wallis/Dunn were used as statistical tests. P<0.05 was
accepted. Results: IM was morphofunctionally similar in both BL and Swiss. CPT-11 induced
leukopenia in all animal lineages despite the treatment given. Additionally, CPT-11 induced
MPO, increased in vitro contractility and diarrheic events, and villi/crypt ratio reduction in BL
and BC mice in comparison with saline treated mice (p<0.05). Despite the injection of CPT-11,
Casp-1
-/-
, IL-18
-/-
or IL-18bp treated BC mice presented reduced MPO and iNOS activities and
also increased villi/crypt ratio, reduced duodenal in vitro contractility and mild diarrhea similar
to saline-treated mice (P>0.05), similar to the patterns seen in IL-33 treated mice. The reduced
iNOS activity found in the earlier mice led us to investigate the CPT-11 effect on iNOS
-/-
and
aminoguanidine-treated mice. Lower IL-1β and KC cytokine levels, as well as reduced MPO
activity were found. Also, preserved villi/crypt ratio and muscle layer thickness, normal
duodenal contractility and diarrheic events were seen similarly to saline-treated mice (p>0.05).
However, CPT-11-treated PAFr
-/-
presented morphofunctional alterations and increased
intestinal MPO activity. 5-LOX
-/-
or loperamide treated mice (positive control), both injected
with CPT-11, exhibited increased MPO activity and morphometric alterations, but no
exacerbation on in vitro contractility was observable. Conclusion: Taken together, these results
suggest the role of caspase-1/Interleukin-18/nitric oxide cascade on pathogenesis of CPT-11-
induced morphofunctional alteration and inflammatory response (IM). IL-33 seems to be a
compensatory protective factor on this inflammatory cascade. 5-LOX and PAFr show a likely
secondary role on IM pathophysiology.
Keyworks: CPT-11, inflammation, mucositis, cytokines, nitric oxide.
10
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Regulação das vias de sinalização de citocinas da
família da interleucina-1 (IL-1)
26
Figura 2 Camptotheca acuminata
33
Figura 3 Estrutura da Camptotecina e do Topotecano
34
Figura 4 Estrutura do Irinotecano
34
Figura 5 Metabolismo do CPT-11
36
Figura 6 Detalhes estruturais de produtos do metabolismo do
irinotecano.
37
Figura 7 Representação esquemática de sintomas e alterações
clínicas da mucosite gastrintestinal
39
Figura 8 Esquema de injeção do CPT-11
48
Figura 9 Representação dos graus de diarréia pós-injeção do
CPT-11
52
Figura 10 Esquema de avaliação funcional intestinal in vitro
53
Figura 11 Fotomicrografias do duodeno de camundongos Swiss
injetados com salina 0,9% ou CPT-11
59
Figura 12 Efeito do CPT-11 sobre a razão vilo/cripta em
camundongos Swiss
61
Figura 13 Efeito do CPT-11 sobre a contratilidade duodenal in
vitro em camundongos Swiss
62
Figura 14 Efeito do CPT-11 sobre a contagem de leucócitos
sanguíneos em camundongos Swiss
64
Figura 15 Fotomicrografias do duodeno de camundongos
C57BL/6 injetados com salina 0,9% ou CPT-11
66
Figura 16 Efeito do CPT-11 sobre a razão vilo/cripta em
camundongos C57BL/6
68
Figura 17 Efeito do CPT-11 sobre a contratilidade duodenal in
vitro em camundongos C57BL/6
69
Figura 18 Efeito do CPT-11 sobre a contagem de leucócitos
sanguíneos em camundongos C57BL/6
71
11
Figura 19 Fotomicrografias do duodeno de camundongos
Caspase-1
-/-
injetados com salina 0,9% ou CPT-11
74
Figura 20 Efeito do CPT-11 sobre a razão vilo/cripta em
camundongos Caspase-1
-/-
76
Figura 21 Efeito do CPT-11 sobre a atividade de mieloperoxidase
em duodeno de camundongos Caspase-1
-/-
77
Figura 22 Efeito do CPT-11 sobre a atividade de iNOS duodenal
em camundongos caspase-1
-/-
78
Figura 23 Efeito do CPT-11 sobre a contratilidade duodenal in
vitro em camundongos caspase-1
-/-
79
Figura 24 Efeito do CPT-11 sobre a contagem de leucócitos
sanguíneos em camundongos Caspase-1
-/-
81
Figura 25 Fotomicrografias do duodeno de camundongos
tratados com IL-1Ra e injetados com salina ou CPT-11
83
Figura 26 Efeito do CPT-11 sobre a razão vilo/cripta em
camundongos tratados com IL-1Ra
85
Figura 27 Efeito do CPT-11 sobre a atividade de mieloperoxidase
em duodeno de camundongos tratados com IL-1Ra
86
Figura 28 Efeito do CPT-11 sobre a contratilidade duodenal in
vitro em camundongos tratados com IL-1Ra
87
Figura 29 Efeito do CPT-11 sobre a contagem de leucócitos
sanguíneos em camundongos tratados com IL-1Ra
89
Figura 30 Fotomicrografias do duodeno de camundongos IL-18
-/-
injetados com salina 0,9% ou CPT-11
92
Figura 31 Efeito do CPT-11 sobre a razão vilo/cripta em
camundongos IL-18
-/-
94
Figura 32 Efeito do CPT-11 sobre a atividade de mieloperoxidase
em duodeno de camundongos IL-18
-/-
95
Figura 33 Efeito do CPT-11 sobre a atividade de iNOS duodenal
em camundongos IL-18
-/-
96
Figura 34 Efeito do CPT-11 sobre a contratilidade duodenal in
vitro em camundongos IL-18
-/-
97
Figura 35 Efeito do CPT-11 sobre a contagem de leucócitos
sanguíneos em camundongos IL-18
-/-
99
12
Figura 36 Fotomicrografias do duodeno de camundongos
tratados com IL-18bp e injetados com salina ou CPT-
11
102
Figura 37 Efeito do CPT-11 sobre a razão vilo/cripta em
camundongos tratados com IL-18bp
104
Figura 38 Efeito do CPT-11 sobre a atividade de mieloperoxidase
em duodeno de camundongos tratados com IL-18bp
105
Figura 39 Efeito do CPT-11 sobre a atividade de iNOS duodenal
em camundongos tratados com IL-18bp
106
Figura 40 Efeito do CPT-11 sobre a contratilidade duodenal in
vitro em camundongos tratados com IL-18bp
107
Figura 41 Efeito do CPT-11 sobre a contagem de leucócitos
sanguíneos em camundongos tratados com IL-18bp
109
Figura 42 Fotomicrografias do duodeno de camundongos
tratados com IL-33 e injetados com salina ou CPT-11
112
Figura 43 Efeito do CPT-11 sobre a razão vilo/cripta em
camundongos tratados com IL-33
114
Figura 44 Efeito do CPT-11 sobre a atividade de mieloperoxidase
em duodeno de camundongos tratados com IL-33
115
Figura 45 Efeito do CPT-11 sobre a contratilidade duodenal in
vitro em camundongos tratados com IL-33
116
Figura 46 Efeito do CPT-11 sobre a contagem de leucócitos
sanguíneos em camundongos tratados com IL-33
118
Figura 47 Fotomicrografias do duodeno de camundongos iNOS
-/-
injetados com salina 0,9% ou CPT-11
121
Figura 48 Efeito do CPT-11 sobre a razão vilo/cripta em
camundongos iNOS
-/-
123
Figura 49 Efeito do CPT-11 sobre a atividade de mieloperoxidase
em duodeno de camundongos iNOS
-/-
124
Figura 50 Efeito do CPT-11 sobre a marcação
imunohistoquímica para iNOS duodenal em
camundongos iNOS
-/-
126
Figura 51 Efeito do CPT-11 sobre a contratilidade duodenal in
vitro em camundongos iNOS
-/-
127
13
Figura 52 Efeito do CPT-11 sobre a espessura da camada
muscular duodenal de camundongos iNOS
-/-
129
Figura 53 Efeito do CPT-11 sobre a contagem de leucócitos
sanguíneos em camundongos iNOS
-/-
130
Figura 54 Fotomicrografias do duodeno de camundongos
tratados com aminoguanidina e injetados com salina
ou CPT-11
133
Figura 55 Efeito do CPT-11 sobre a razão vilo/cripta em
camundongos tratados com aminoguanidina
135
Figura 56 Efeito do CPT-11 sobre a atividade de mieloperoxidase
em duodeno de camundongos tratados com
aminoguanidina
136
Figura 57 Efeito do CPT-11 sobre a contratilidade duodenal in
vitro em camundongos tratados com aminoguanidina
137
Figura 58 Efeito do CPT-11 sobre a espessura da camada
muscular duodenal de camundongos tratados com
aminoguanidina
139
Figura 59 Efeito do CPT-11 sobre a contagem de leucócitos
sanguíneos em camundongos tratados com
aminoguanidina
140
Figura 60 Fotomicrografias do duodeno de camundongos 5-
LOX
-/-
injetados com salina 0,9% ou CPT-11
142
Figura 61 Efeito do CPT-11 sobre a razão vilo/cripta em
camundongos 5-Lox
-/-
144
Figura 62 Efeito do CPT-11 sobre a atividade de mieloperoxidase
em duodeno de camundongos 5-Lox
-/-
145
Figura 63 Efeito do CPT-11 sobre a contratilidade duodenal in
vitro em camundongos 5-Lox
-/-
146
Figura 64 Efeito do CPT-11 sobre a contagem de leucócitos
sanguíneos em camundongos 5-Lox
-/-
147
Figura 65 Fotomicrografias do duodeno de camundongos PAFr
-/-
injetados com salina 0,9% ou CPT-11
149
Figura 66 Efeito do CPT-11 sobre a razão vilo/cripta em
camundongos PAFr
-/-
151
Figura 67 Efeito do CPT-11 sobre a atividade de mieloperoxidase 152
14
em duodeno de camundongos PAFr
-/-
Figura 68 Efeito do CPT-11 sobre a contratilidade duodenal in
vitro em camundongos PAFr
-/-
153
Figura 69 Efeito do CPT-11 sobre a contagem de leucócitos
sanguíneos em camundongos PAFr
-/-
154
Figura 70 Fotomicrografias do duodeno de camundongos
tratados com loperamida e injetados com salina ou
CPT-11
156
Figura 71 Efeito do CPT-11 sobre a razão vilo/cripta em
camundongos tratados com Loperamida
158
Figura 72 Efeito do CPT-11 sobre a atividade de mieloperoxidase
em duodeno de camundongos tratados com
loperamida
159
Figura 73 Efeito do CPT-11 sobre a contratilidade duodenal in
vitro em camundongos loperamida
160
Figura 74 Efeito do CPT-11 sobre a contagem de leucócitos
sanguíneos em camundongos tratados com
loperamida
162
Figura 75 Modelo hipotético proposto da patogênese da
mucosite intestinal induzida pelo tratamento com
CPT-11
182
15
LISTA DE QUADROS E TABELAS
Tabela 1 Critérios comuns de terminologia para eventos
adversos (versão 3.0) Diarréia
40
Tabela 2 Efeito do CPT-11 sobre os aspectos microscópicos
duodenais em camundongos Swiss
60
Tabela 3 Avaliação da diarréia em camundongos Swiss 63
Tabela 4 Efeito do CPT-11 sobre os aspectos microscópicos
duodenais em camundongos C57BL/6
67
Tabela 5 Avaliação da diarréia em camundongos C57BL/6
70
Tabela 6 Efeito do CPT-11 sobre os aspectos microscópicos
duodenais em camundongos caspase-1
-/-
75
Tabela 7 Avaliação da diarréia em camundongos caspase-1
-/-
80
Tabela 8 Efeito do CPT-11 sobre os aspectos microscópicos
duodenais em camundongos tratados com IL-1Ra
84
Tabela 9 Avaliação da diarréia em camundongos tratados com
IL-1Ra
88
Tabela 10 Efeito do CPT-11 sobre os aspectos microscópicos
duodenais em camundongos IL-18
-/-
93
Tabela 11 Avaliação da diarréia em camundongos IL-18
-/-
98
Tabela 12 Efeito do CPT-11 sobre os aspectos microscópicos
duodenais em camundongos tratados com IL-18bp
103
Tabela 13 Avaliação da diarréia em camundongos tratados com
IL-18bp
108
Tabela 14 Efeito do CPT-11 sobre os aspectos microscópicos
duodenais em camundongos tratados com IL-33
113
Tabela 15 Avaliação da diarréia em camundongos tratados com
IL-33
117
Tabela 16 Efeito do CPT-11 sobre os aspectos microscópicos
duodenais em camundongos iNOS
-/-
122
Tabela 17 Efeito do CPT-11 sobre os níveis duodenais de
citocinas em camundongos iNOS
-/-
125
16
Tabela 18 Avaliação da diarréia em camundongos iNOS
-/-
128
Tabela 19 Efeito do CPT-11 sobre os aspectos microscópicos
duodenais em camundongos tratados com
aminoguanidina
134
Tabela 20 Avaliação da diarréia em camundongos tratados com
aminoguanidina
138
Tabela 21 Efeito do CPT-11 sobre os aspectos microscópicos
duodenais em camundongos 5-LOX
-/-
143
Tabela 22 Efeito do CPT-11 sobre os aspectos microscópicos
duodenais em camundongos PAFr
-/-
150
Tabela 23 Efeito do CPT-11 sobre os aspectos microscópicos
duodenais em camundongos tratados com loperamida
157
Tabela 24 Avaliação da diarréia em camundongos tratados com
loperamida
161
Quadro 1 Quadro resumitivo dos achados experimentais 180
17
LISTA DE ABREVIATURAS
5-FU 5-Fluorouracil
5-LOX 5-Lipoxigenase
ACh Acetilcolina
AMP Adenosina Monofostato
BALB/c Camundongos da espécie BALB/c
BCh Betanecol
C57BL/6 Camundongos da espécie C57BL/6
CE Colinesterase
c-fos proto-oncogene c-fos
c-jun proto-oncogene c-jun
CO
2
Dióxido de Carbono
CPT-11 Irinotecano
DTT Di-tiotreitol
EGTA ácido etilenoglicol tetracético
ERK Extracellular signal-regulated kinase (família da MAPK)
FAD Flavina Adenina Dinucleotídeo
FLAP proteína ativadora da 5-lipoxigenase
HTAB Brometo de hexadeciltrimetilamonio
H
2
O
2
peróxido de hidrogênio
ICE Enzima conversora de interleucina
IFN-γ Interferon -γ
IgA Imunoglobulina A
IgE Imunoglobulina E
IL-11 Interleucina-11
IL-1α Interleucina-1α
IL-1β Interleucina-1β
IL-1Ra Antagonista do receptor da Interleucina-1
IL-12 Interleucina-12
IL-13 Interleucina-13
IL-15 Interleucina-15
IL-18 Interleucina-18
18
IL-18bp proteína ligante de Interleucina-18
IL-1F11 11
o
membro da família da Interleucina-1
IL-2 Interleucina-2
IL-33 Interleucina-33
IL-4 Interleucina-4
IL-5 Interleucina-5
IL-6 Interleucina-6
iNOS Enzima óxido nítrico sintase induzida
i.p. Intraperitoneal
JNK Quinase do N- terminal de C-Jun (família da MAPK)
KC quimiocina derivada de queratinócito
KCl Cloreto de potássio
Kg Kilograma
L-NAME N
G
-Nitro-L-Arginima Metil Éster
LPS Lipopolissacarídeo
LTC
4
Leutotrieno C
4
LTD
4
Leucotrieno D
4
M Molar
MAPK Proteínas Quinase Ativadas por Mitógenos
mg Miligrama
MgCl
2
Cloreto de magnésio
mL Mililitro
mM Milimolar
MPO Enzima mieloperoxidase
NaCl Cloreto de sódio
NADH Nicotinamida adenina dinucleotídeo
NADPH Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
NaHCO
3
Bicarbonato de sódio
NaH
2
PO
4
Fosfato de sódio monobásico
NF-κB
Fator de transcrição nuclear kappa B
NK Células Natural Killer
NO Óxido nítrico
NOS Enzima óxido nítrico sintase
19
O
2
Oxigênio
P38 membro da família MAPK
PAF Fator de ativação de plaquetas
PAFr Receptor para fator de ativação de plaquetas
PLA
2
Fosfolipase A
2
PMSF Fenil-metil-sulfonil fluoreto
Pró-IL-1 Pró-interleucina-1
Pro-IL-18 Pró-interleucina-18
RNS Espécies Reativas de Nitrogênio
ROS Espécies Reativas de Oxigênio
s.c. Subcutânea
SN-38 7-etil-10-hidroxicamptotencina (metabólito do Irinotecano)
ST2 receptor para IL-33
STAT-6 Transdutor de sinal e ativador de transcrição 6)
Th1 linfócitos T auxiliares 1
Th2 linfócitos T auxiliares 2
TNF-α
Fator de necrose tumoral-alfa
TRAF Fator Associado ao Receptor de TNF
WT Wild type (tipo selvagem)
UGT1A1 uridina 5’-difosfato-glicuronosil-transferase
20
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO............................................................................................. 22
1.1. Trato gastrintestinal: considerações iniciais........................................ 22
1.2. Inflamação................................................................................................ 22
1.3. Mediadores inflamatórios....................................................................... 23
1.3.1. Caspase-1 e citocinas da família IL-1 .................................................... 23
1.3.2. Óxido nítrico ........................................................................................... 29
1.3.3. PAF e 5-LOX.......................................................................................... 30
1.4. Camptotecinas: Descrição e história natural da camptoteca.............. 33
1.5. Irinotecano............................................................................................... 35
1.6. Mucosite: epidemiologia e fases de desenvolvimento........................ 38
1.7. Mucosite intestinal por antineoplásicos ............................................... 43
1.8. JUSTIFICATIVA........................................................................................ 45
2. OBJETIVOS................................................................................................. 47
2.1. Objetivos gerais ...................................................................................... 47
2.2. Objetivos específicos.............................................................................. 47
3. MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................... 48
3.1. Padronização da mucosite intestinal..................................................... 48
3.3. Parâmetros avaliados na mucosite intestinal ............................................ 51
3.3.1. Avaliação de parâmetro hematológico ................................................... 51
3.3.2. Avaliação do grau da diarréia apresentada............................................ 51
3.3.3. Avaliação da contratilidade in vitro de duodeno ..................................... 52
3.3.4. Análise histopatológica e Morfometria da mucosa intestinal .................. 54
3.3.5. Ensaio de mieloperoxidase (MPO)......................................................... 54
3.3.6. Dosagem de citocinas IL-1 e KC............................................................ 55
3.3.7. Determinação da atividade de óxido nítrico sintase induzida (iNOS) ..... 56
3.3.8. Análise estatística .................................................................................. 57
4. RESULTADOS............................................................................................. 58
4.1. Curva de definição de dose em camundongos Swiss......................... 58
4.2. Curva de definição de dose em camundongos C57BL/6..................... 65
21
4.3. Avaliação da participação da caspase-1 na mucosite induzida por
CPT-11............................................................................................................. 72
4.4. Avaliação do efeito do tratamento de camundongos com o
antagonista do receptor de IL-1 (IL-1Ra) sobre a mucosite induzida por
CPT-11............................................................................................................. 82
4.5. Avaliação da participação da IL-18 na mucosite induzida por CPT-11
......................................................................................................................... 90
4.6. Avaliação do efeito do tratamento de camundongos com a proteína
ligante de IL-18 (IL-18bp) sobre a mucosite induzida por CPT-11........... 100
4.7. Avaliação do efeito do tratamento de camundongos com a
interleucina-33 (IL-33) sobre a mucosite induzida por CPT-11 ................ 110
4.8. avaliação da participação da óxido nítrico sintase induzida (iNOS) na
mucosite intestinal induzida por CPT-11 ................................................... 119
4.8.1. Estudo em camundongos knockout para iNOS.................................... 119
4.8.2. Modulação farmacológica da atividade de iNOS com aminoguanidina 131
4.9. Avaliação da participação da 5-lipoxigenase (5-LOX) na mucosite
induzida por CPT-11..................................................................................... 141
4.10. Avaliação da participação do receptor para PAF (PAFr) na mucosite
induzida por CPT-11..................................................................................... 148
4.11. Avaliação do efeito do tratamento de camundongos com cloridrato
de loperamida (LOP) sobre a mucosite induzida por CPT-11 .................. 155
5. DISCUSSÃO.............................................................................................. 163
6. CONCLUSÕES.......................................................................................... 181
7. REFERÊNCIAS.......................................................................................... 183
22
1. INTRODUÇÃO
1.1. Trato gastrintestinal: considerações iniciais
A monocamada epitelial intestinal forma uma barreira a uma complexa
gama de fatores externos incluindo microorganismos, antígenos, alimentos e a
grandes quantidades de enzimas digestivas. Essa superfície do trato
gastrintestinal é composta de tipos celulares variados, como, por exemplo,
epitélio colunar (enterócitos e colonócitos), células caliciformes, células entero-
endócrinas e de Paneth. A camada mucosa de mamíferos em geral apresenta
uma alta capacidade de renovação, ocorrendo uma troca completa dos tipos
celulares de revestimento a cada 24 a 96 horas (Lipkin et al, 1963 apud Göke,
Podolsky, 1996). Desta forma, o perfeito equilíbrio entre a perda celular e a
capacidade proliferativa permite que haja preservação estrutural e integridade
funcional da superfície epitelial celular. Na vigência de um evento lesivo, como
erosões de mucosa, doença inflamatória intestinal, exposição a agentes
infecciosos e/ou toxinas, isquemia, agentes quimioterápicos e radiação, a
eficiente capacidade de renovação tecidual se faz importante.
1.2. Inflamação
No trato gastrintestinal, o processo inflamatório é um componente chave
na defesa da mucosa. Uma resposta inflamatória adequada a agentes externos
e internos evita o agravamento de lesões e permite o desenvolvimento de um
processo de reparo igualmente adequado. Contudo, o comprometimento dessa
resposta, ou seu prolongamento, pode contribuir para complicar o quadro lesivo
instalado e, consequentemente, os sintomas associados. Em geral, a resposta
é coordenada pelos mediadores liberados por células epiteliais e da lâmina
própria como, por exemplo, mastócitos, linfócitos, neurônios e fibroblastos
(Martin, Wallace, 2006).
A inflamação e a ativação do sistema imune no trato gastrintestinal
levam à alteração da função motora que pode algumas vezes persistir após a
resolução da resposta inflamatória na mucosa. Mudanças na função motora
secundárias a diversos estímulos inflamatórios têm sido descritas em modelos
23
experimentais incluindo infecção (Vallance et al., 1998; Bercik et al., 2002),
irritação química (Myers et al., 1997) e ativação da resposta imune (Radojevic
et al., 1999). No contexto da infecção, mudanças na função motora têm sido
associadas à defesa do hospedeiro para, desta forma, tentar expulsar o agente
infeccioso. Em enfoques clínicos, algumas desordens de motilidade têm sido
associadas à ativação imune, variando de casos leves a graves de síndrome
do intestino irritável (Chadwick et al., 2002; Tornblom et al., 2002) a casos de
pseudo-obstrução intestinal (Di Lorenzo, 1999). O conhecimento dos
mecanismos envolvendo mudanças na função motora associadas à ativação
do sistema imune se faz necessário, não somente em termos de fisiopatologia,
mas também como forma de introdução de novas abordagens terapêuticas.
1.3. Mediadores inflamatórios
1.3.1. Caspase-1 e citocinas da família IL-1
As caspases constituem uma família de cisteína proteases que ocupam
uma posição crítica nas cascatas de transdução de sinais associadas com
respostas imunes. Em muitas dessas situações, a ativação de caspases
culmina em apoptose (morte celular programada) das células nas quais essas
proteases são ativadas. Por exemplo, linfócitos T citotóxicos e células natural
killer (NK) eliminam células transformadas ou infectadas por vírus através de
mecanismos pró-apoptóticos. Contudo, as caspases também exercem um
importante papel nas reações imunes, culminando com a produção de
citocinas. É bem conhecido que a caspase-1 (ou enzima conversora de
interleucina-1β (IL-1β), ICE) é essencial para a ativação de IL-1α, IL-1β e IL-18
no contexto da ativação de reações inflamatórias pelo LPS (lipopolissacarídeo)
bacteriano (Creagh et al., 2003). A caspase-1 foi originalmente identificada
após tentativas de se purificar a enzima responsável pelo processamento da
citocina pró-inflamatória IL-1β. A caspase-1 cliva (ativação proteolítica) a pró-
IL-1β e a pró-IL18, formas inativas dessas citocinas, liberando as formas ativas,
IL-1β e IL-18, respectivamente (Thornberry et al., 1992).
24
O papel da caspase-1 tem sido caracterizado em muitos modelos de
inflamação in vivo. Ao nível intestinal, em modelos de doença inflamatória
intestinal, McAllindon e colaboradores (1998) demonstraram que macrófagos,
obtidos de cólon de humanos sem lesão inflamatória e posteriormente
incubados com LPS, somente expressavam o precursor da IL-1β, visto que não
apresentavam caspase-1 ativa. Contudo, tendo em vista a ativação da
caspase-1 em macrófagos coletados de pacientes com doença inflamatória
intestinal, verificou-se a expressão e liberação da forma ativa da IL-1β, de uma
maneira similar a monócitos circulantes. Em outro modelo de lesão intestinal,
colite crônica induzida por DSS (Dextran Sulphate Sodium), animais knockout
para caspase-1 desenvolveram um grau atenuado de colite experimental, com
menor ativação celular verificada em líquido linfonodal mesentérico, além de
significante redução na expressão de citocinas pró-inflamatórias, IL-18,
Interferon-γ (IFN-γ) e IL-1β no cólon (Siegmund et al., 2001).
A interleucina-1 (IL-1) foi uma das primeiras citocinas a serem
descobertas, apresentando participação central na rede de citocinas,
controlando funções importantes no sistema imune durante infecções, no
processo inflamatório, diferenciação celular, remodelação tecidual e morte
celular. A IL-1 existe em duas isoformas, α e β. Ambas reconhecem os
mesmos receptores de superfície e compartilham várias atividades.
Paralelamente aos efeitos biológicos benéficos, a IL-1 participa da
fisiopatologia de muitas doenças intestinais, como na doença inflamatória
intestinal, lesão por isquemia reperfusão, enterites e síndrome do intestino
irritável (Dinarello, 1996; Spiller et al., 2000). A IL-1β (figura 1) está envolvida,
por exemplo, na ativação da via NF-κB e na indução da expressão de
moléculas de adesão nas fases iniciais da resposta inflamatória (Dinarello,
2000). Vias de controle à ação da IL-1β inclui o inibidor natural IL-1Ra
(antagonista do receptor de IL-1), capaz de competir com a IL-1 pelo receptor,
modulando, desta forma, os efeitos pró-inflamatórios dessa citocina (Dinarello,
1996)
Os níveis teciduais de IL-1β e TNF-α se mostraram significativamente
elevados em modelos animais de mucosite oral induzida por radiação (Sonis et
al., 2000) e de mucosite intestinal induzida por irinotecano (Melo et al., 2008).
25
Além disso, a IL-1β e o IFN-γ parecem estar envolvidos na fase de cicatrização
da mucosite oral e intestinal revelando a complexa participação que essas
citocinas possuem no desenvolvimento do processo inflamatório associado à
fisiopatologia dessas doenças (Blijlevens, Sonis, 2007). Contudo, a literatura
ainda carece de informações precisas sobre o verdadeiro papel da IL-1β no
contexto da gênese e/ou resolução da mucosite.
A interleucina-18 (IL-18), um membro da superfamília da citocina IL-1, foi
inicialmente denominada fator de indução de interferon γ (IFN-γ), exercendo um
importante papel na regulação de respostas imunes (Okamura et al., 1995;
Nakanishi et al, 2001). É uma citocina com capacidade de induzir respostas de
padrão Th1 e Th2 dependendo do contexto imunológico. A IL-18 exerce ações
características de outras citocinas pró-inflamatórias (figura 1), como o aumento
da expressão de moléculas de adesão, óxido nítrico sintase e produção de
quimiocinas (Dinarello, 2006)
26
Figura 1 – Regulação das vias de sinalização de citocinas da família da
interleucina-1 (IL-1). As citocinas da família IL-1 ativam alvos celulares através
de receptores estruturalmente relacionados (família IL-1R/ Receptores Toll-like
(TLR)) e vias de sinalização intracelular comuns, culminando com ativação de
NF-κB. Em mamíferos não está claro se o LPS é um ligante direto de TLR-4
(ou CD14 em um complexo com MD2), ou se ele ativa uma cascata de
proteases via PRR que por sua vez levaria à ativação de um ligante para TLR-
4. O processo inflamatório e a ativação do sistema imune aumentam a
expressão de IL-1 e IL-18, que ativam respectivamente os receptores IL-1RI e
IL-18R. Paralelamente, tem-se a ativação de IL-33, que se liga ao receptor
ST2, até pouco tempo descrito como receptor órfão e expresso primariamente
em matócitos e linfócitos Th2, regulando desta forma a função dessas células.
O tratamento de animais com anticorpos anti-ST2 levam ao aumento da
IL-
1
β
Li
g
ante de TL
R
-4 ?
LPS PRR?
Cascata
p
rotease?
MD2
p
38
JNK
MAPKK
TAK1
Degradação
Proteossoma
IL-18R
IL-1R1
ST2
p50
p65
NF-kB
IkB
Proteínas regulatórias:
NEMO/IKK1/IKK2
p50
p65
NF-kB
p50
p65
NF-kB
Jun
Fos
AP
Transcrição
gênica
de citocinas
MyD88
TRAF6
MyD88
TRAF6
MyD88
TRAF6
TRAF6
TLR-4
CD14
MyD88
IRAK1
IRAK4
IRAK4
IRAK1
IRAK4
IRAK1
IRAK4
IRAK1
IL-1
β
IL
-
33
IL
-
18
Meio Extra-celular
Citoplasma
Núcleo
27
resposta tipo Th1, sugerindo que o desequilíbrio de ação entre as vias Th1 e
Th2 favorece o desenvolvimento de patologias específicas para uma via
imunológica. Há grande similaridade de seqüência de ativação desde MyD88,
IRAK4 e TRAF-6. Ligantes de citocinas e desses receptores atuam como
reguladores endógenos sobre a ativação dessas vias (por exemplo, IL-1Ra e
IL-18bp). Outras vias de ativação em mamíferos envolvem a ativação de
quinases de p38. Abreviações: MyD88: proteína de diferenciação mielóide 88;
IRAK1/4: quinase 1/4 ativadora de IL-1R; TRAF6: fator 6 associado ao receptor
de fator de necrose tumoral (TNF); TAK1: quinase 1 associada ao fator de
crescimento transformador (TGF-β); NEMO: modulador essencial do fator
nuclear κB (NF-κB); IkB: inibidor do NF-κB; IKK1/2: quinase 1/2 do IkB;
MAPKK: quinase da proteína quinase ativada por mitógeno; JNK: quinase do n-
terminal do c-jun (adaptado de Harbsky et al., 2007).
Os monócitos, macrófagos e células dendríticas são fontes primárias de
IL-18. Em análise imunohistoquímica, Takeuchi e colaboradores (1997)
mostraram a localização citoplasmática de IL-18 em células epiteliais intestinais
de camundongos adultos em condições fisiológicas, indicando que o precursor
é expresso constitutivamente, possivelmente exercendo papel importante na
indução da resposta imune na mucosa intestinal. Em outro estudo, detectou-se
a liberação de IL-18 por células epiteliais da cavidade oral de humanos após a
exposição ao LPS bacteriano, IFN-γ e proteinase-3. Interessantemente, essas
células não expressam caspase-1 (Sugawara, 2001).
As similaridades estruturais entre pró-IL-1 e pró-IL-18 e a clivagem de
ambas as moléculas pela caspase-1 intracelular sugerem que estas podem ser
ativadas por proteases extracelulares estruturalmente relacionadas à caspase-
1. A existência de uma via alternativa à via da caspase-1, mediando a clivagem
dessas espécies, foi demonstrada em camundongos e em humanos. Por
exemplo, a liberação de IL-1β pode ser observada em um modelo de
inflamação em animais knockout para a enzima caspase-1 (Fantuzzi et al.,
1997). Proteases extracelulares que podem ser relacionadas para esse papel
incluem metaloproteinases (Schönbeck et al., 1998), granzima A (Irmler et al.,
1995) e proteinase-3 (Fantuzzi, Dinarello, 1999).
A IL-18 aumenta a maturação de células T e NK, produção de citocinas
Th1 e citotoxicidade (Nakanishi et al., 2001). Desta forma, apesar de
apresentar, juntamente com a IL-12, efeitos consistentes sobre a indução da
28
via Th1 da inflamação, existem dados que mostram que a IL-18 sozinha, ou em
combinação com IL-4 ou IL-2, induz a expressão de IgE e a diferenciação
celular em Th2 (Nakanishi et al., 2001). Yoshimoto e col. (2000) demonstraram
que essa capacidade da IL-18 induzir ativação da via Th2 da inflamação, na
ausência de IL-12, é dependente de IL-4 e STAT-6 (Signal transducer and
activation of transcription 6).
O receptor para IL-18, IL-18R, é expresso em uma variedade de células,
incluindo macrófagos, neutrófilos, células NK, endotélio e células musculares
lisas (Gracie et al., 2003; Gerdes et al., 2002; Leung et al., 2001). Dados da
literatura mostram que a IL-18 ativa a síntese de intermediários reativos de
oxigênio e a liberação de citocinas, todas secundárias à ativação de neutrófilos
(Leung et al., 2001). Ye e colaboradores (2004) demonstraram que a IL-18
possui papel na cronificação da inflamação em modelo de artrite reumatóide
experimental.
A IL-18 binding protein (IL-18bp, proteína ligante de IL-18), uma proteína
secretada constitutivamente, liga-se à IL-18 com elevada afinidade regulando,
dessa maneira, a atividade dessa citocina. Consequentemente, a IL-18bp inibe
a ativação de IFN-γ, produção de IL-8 e ativação de NF-κB in vitro, bem como
inibe IFN-γ in vivo secundário à injeção de LPS (Novick et al., 1999). Atividades
pró-inflamatória da IL-18 e modulatória da IL-18bp foram discutidas também em
modelos que simulam, por exemplo, doença inflamatória intestinal, sepse,
artrite, lesão hepática (revisto por Dinarelo, Fantuzzi, 2003).
Mais recentemente, um novo membro da família da IL-1 foi descrito, a
IL-33. Similarmente à IL-1β e IL-18, a IL-33 possui marcantes propriedades
imunomodulatórias (Schmitz et al., 2005). Contudo, diferentemente da IL-1β e
IL-18, que promovem respostas predominantemente de padrão Th1 (T-helper
1), a IL-33 conduz primariamente a um padrão de ativação Th2, com
conseqüente produção de citocinas IL-5 e IL-13 e síntese de imunoglobulinas.
Schmitz e colaboradores (2005) sugeriram recentemente que a IL-33 seria o
ligante para o receptor órfão ST2, também conhecido como T1, DER4 e Fit-1
(Tominaga, 1989; Werenskiold et al., 1989; Lanahan et al., 1992; Bergers et al.,
1994) e IL-1F11, seguindo a nomenclatura da família IL-1 (Sims et al., 2001).
29
Ainda de forma idêntica às citocinas IL-1β e IL-18, a IL-33 está presente em
uma forma inativa, pró-IL-33, sendo sugerido sua clivagem via caspase-1.
A interação entre a IL-33 e o receptor ST2 é suficiente para ativar NF-κB
e MAPK (p38; ERK1,2; JNK1,2) em mastócitos (figura 1). Em adição, a
administração de IL-33 em camundongos naive promoveu ativação de citocinas
de padrão Th2, síntese de IgE e eosinofilia (Schmitz et al., 2005).
O gene codificador de ST2 origina duas isoformas do receptor: uma
forma transmembranar, ST2L, e uma forma solúvel, sST2 (Gachter et al.,
1996), esta última servindo como um inibidor da ação da IL-33. A forma ST2L é
primariamente expressa em células Th2 e, através desse receptor, a IL-33
pode suprimir a resposta inata e adaptativa (Liew et al., 2005). É expressa
também em mastócitos, macrófagos e fibroblastos.
Em condições patológicas, a IL-33 pode exercer papel importante como
na asma e doença inflamatória intestinal (Dinarello, 2005). É também
encontrada nos sinoviócitos em indivíduos com artrite reumatóide e no tecido
intestinal de pacientes com doença de Crohn (Carriere et al., 2007).
Apesar das evidências sobre a participação das citocinas da família IL-1
em muitas doenças inflamatórias revelarem um papel indireto, há considerável
número de informações para se sugerir que o conhecimento da imunobiologia
dessas moléculas seja fundamental para o desenvolvimento de novas
abordagens terapêuticas em doenças economicamente importantes, como a
mucosite intestinal por antineoplásicos.
1.3.2. Óxido nítrico
O óxido nítrico (NO) é produto, juntamente com L-citrulina, da conversão
da L-arginina e oxigênio molecular mediante ação da enzima óxido nítrico
sintase (NOS). Existem três isoformas da NOS: NOS-1 (nNOS, neuronal) e
NOS-3 (eNOS, endotelial), expressas constitutivamente, produzindo NO em
baixos níveis (concentrações picomolares) e a NOS-2 (iNOS, induzida), forma
induzida da enzima, expressa geralmente de forma não constitutiva, presente
em resposta à citocinas durante o desenvolvimento de um processo
inflamatório, levando à produção de NO em concentrações micromolares
(Nathan, Xie, 1994).
30
Todas as isoformas estão presentes no trato gastrintestinal. Na vigência
de um estímulo como o LPS, a expressão de iNOS no epitélio intestinal
aumenta em até 15 vezes quatro horas após exposição ao produto bacteriano,
havendo up-regulation dessa isoforma tanto no jejuno como no cólon e íleo
(Tepperman et al., 1993; Chen et al., 1996; Hoffman et al., 1997 apud Potoka et
al., 2002).
Tem-se relacionado que as citocinas estimulam a expressão de iNOS
com a conseqüente produção de óxido nítrico. Um efeito bifásico e dose-
dependente da iNOS na inflamação tem sido relatado (Calabrese, 2001).
Dependendo da condição, o papel da iNOS varia do aumento do padrão
inflamatório à inibição deste (Nathan, 1997). Em baixas concentrações, o NO
exerce um efeito protetor contra lesões de mucosa, em parte devido a um
efeito vasodilatador que resulta em aumento do fluxo sanguíneo mesentérico
(Teperman et al., 1993; Kubes, MacCafferty, 2000; Cockcroft, 2005). Contudo,
em altas concentrações, quando derivado da iNOS, verifica-se um grande
papel do NO na citotoxicidade (Han et al., 2003; Potoka et al., 2003), levando
ao aumento da permeabilidade do epitélio intestinal (Unno et al., 1997).
Cetin e colaboradores (2007) relataram um efeito negativo dose-
dependente do NO sobre as taxas de migração de enterócitos, contribuindo
para o aumento da lesão da barreira intestinal observada em modelo da
doença inflamatória enterocolite necrosante. Muitos estudos relatam que o NO,
oriundo da atividade de iNOS, exibe propriedades deletérias, participando na
fisiopatologia de doenças como, por exemplo, a cistite hemorrágica (Souza-
Filho et al., 1997; Ribeiro et al., 2002), pancreatite (Gómes-Cambronero et al.,
2000) e mucosite oral (Leitão et al., 2007), dentre outros.
1.3.3. PAF e 5-LOX
O dano à superfície epitelial protetora do trato gastrintestinal leva à
ativação da fosfolipase A
2
(PLA
2
), uma enzima chave na produção e
biossíntese de mediadores lipídicos pró-inflamatórios. Os membros da família
da PLA
2
induzem a mobilização de ácidos graxos, a partir da membrana
celular, para a síntese de mediadores lipídicos para o local de inflamação. Os
produtos da ação da PLA
2
incluem fator de ativação de plaquetas (PAF) e
31
ácido araquidônico. Ao ser enzimaticamente clivado pela 5-lipoxigenase (5-
LOX) este último origina leucotrienos e pelas cicloxigenases, origina
prostaglandinas e tromboxanos (Sturm, Dignass, 2002).
Os leucotrienos representam, depois das prostaglandinas, a segunda
maior família de derivados do ácido araquidônico, possuindo uma potente
atividade pró-inflamatória (Sala et al., 1998).
A síntese dos leucotrienos, a partir do substrato ácido araquidônico, é
iniciada pela enzima 5-lipoxigenase (5-LOX) quando há ativação celular
durante o processo inflamatório. Nesse contexto, ao ser translocada para a
membrana, a 5-LOX se associa à FLAP (proteína ativadora da 5-lipoxigenase),
representando um passo necessário à síntese dos leucotrienos (Peters-Golden,
Brock, 2003). Uma vez ligado ao receptor acoplado à proteína G, os
leucotrienos levam ao aumento das concentrações intracelulares de cálcio e
redução de AMP cíclico. Essa ativação conduz a uma cascata de sinalização,
culminando em efeitos como aumento da motilidade intestinal.
Os leucotrienos possuem uma grande variedade de ações biológicas
descritas, como, por exemplo, aumento do recrutamento de neutrófilos,
produção de citocinas, quimiocinas e espécies reativas de oxigênio, aumento
da permeabilidade vascular e expressão de moléculas de adesão, sugerindo-se
possível participação em diversos estados patológicos como asma, artrite,
cistite intersticial, doença inflamatória intestinal e sepse (revisto por Peter-
Golden, Henderson, 2007). Shahbazian e colaboraboradores (2002)
demonstraram que o tomelukast, um antagonista do receptor de leucotrieno D
4
(LTD
4
)
previne as alterações motoras peristálticas causadas pelo LTD
4
.
O PAF (fator de ativação de plaquetas) é um mediador fosfolipídico
sintetizado e secretado, por exemplo, por mastócitos, monócitos e macrófagos
(Finkelman et al., 2005). Níveis circulantes de PAF são, em parte, controlados
pela atividade da PAF acetilhidrolase, uma enzima que degrada PAF (Stafforini
et al., 1987; Karasawa, 2006). Uma variedade de estímulos leva à síntese de
PAF em diferentes células inflamatórias, como em neutrófilos e mastócitos.
Uma das vias que levam à biosíntese de PAF envolve estresse oxidativo.
Espécies reativas de oxigênio (ROS) e de nitrogênio (RNS) são
constantemente produzidas em células aeróbicas como uma conseqüência da
respiração mitocondrial e como produtos de reações enzimáticas, como
32
monooxigenase e NADH/NADPH oxidase (Sakamoto et al., 2002). Uma vez
sintetizado pelas células efetoras, o PAF é então liberado no meio extracelular
ou permanece associado à célula.
A habilidade do PAF, uma vez liberado, de ativar outras células,
depende da sua ação sobre o receptor para PAF (PAFr) na superfície dos alvos
celulares (Raggers et al., 2001).
O papel do PAF tem sido estudado no contexto da apoptose em
modelos de hepatotoxicidade por etanol e LPS. Este modelo é caracterizado
por apoptose dos hepatócitos, necrose e extenso infiltrado inflamatório, além
do aumento da expressão de receptores Fas-ligante. O pré-tratamento da ratos
com antagonista de PAFr (TCV-309) protegeu contra a lesão hepática,
apoptose, necrose, infiltrado neutrofílico e expressão do receptor Fas-ligante
(Murohisa et al., 2002).
O PAF tem uma diversidade de efeitos biológicos, incluindo ativação de
células inflamatórias leucocitárias (Prescott et al., 2000), além de efeitos
vasculares. Está também envolvido em condições patológicas inflamatórias
como angiogênese nos cânceres de mama (Montrucchio et al., 1998), choque,
sepse e lesões traumáticas nos quais o processo inflamatório está exacerbado
(revisto por Esmon, 2001).
A liberação de mediadores pró-inflamatórios e vasoativos, como os
leucotrienos e PAF, está envolvida no mecanismo fisiopatológico da lesão de
mucosas (Öhd et al., 2000; Paterson et al., 2007). Em modelos de inflamação
intestinal em ratos, antagonistas específicos de receptores para leucotrienos e
PAF mostraram-se eficazes em reverter lesões ulcerativas, além de reduzirem
a migração de neutrófilos em monocamadas epiteliais colônicas derivadas de
humanos em estudo in vitro (revisto por Sturm, Dignass, 2000). Dados da
literatura questionam a importância primária desses mediadores na gênese
primária das lesões de mucosa e ulcerações, uma vez que o tratamento com
agentes que seletivamente antagonizam seus receptores nas células alvo, nem
sempre interrompem a cadeia de eventos que leva à lesão de mucosa ([Herbert
et al., 1991; Vane 1994] apud Sturm, Dignass, 2000). Contudo, é relevante
averiguar a importância que esses mediadores assumem em outros modelos
inflamatórios intestinais.
33
1.4. Camptotecinas: Descrição e história natural da camptoteca
Camptotheca acuminata (Figura 2) é uma espécie membro da família
Nyssaceae. É uma planta nativa da China e Tibet, onde é conhecida como xi
shu (árvore feliz). Em 1966, Wall e colaboradores (apud Viegas-Júnior et al.,
2006) relataram, pela primeira vez, o isolamento da camptotecina (figura 3) a
partir da casca do caule dessa árvore. Este composto consiste de um alcalóide
tipo quinolina, que por sua vez tem sido modificado para dar origem a muitos
compostos com atividade antineoplásica, incluindo o topotecano (figura 3),
irinotecano (figura 4) e 9-aminocamptotecina. Na medicina chinesa, a
camptotecina tem sido utilizada para o tratamento da leucemia e carcinomas de
estômago e fígado (Duke, Ayensu, 1985).
Figura 2 – Camptotheca acuminata. Figura representativa da planta
Camptotheca acuminata, espécie da qual se extraem camptotecinas naturais
Quase 20 anos depois de sua descoberta, o único mecanismo de ação
identificado para a camptotecina foi a inibição da topoisomerase I no DNA.
Apesar disso, esta substância não se mostrou adequada para desenvolvimento
farmacêutico, principalmente por sua reduzida solubilidade. Estudos mais
recentes envolvendo a triagem clínica de seu sal sódico não foram bem
sucedidos, pois se evidenciou que a abertura do anel lactônico para
34
preparação do sal sódico inativa a substância. Esta descoberta abriu caminho
para a primeira geração de fármacos análogos da camptotecina, como o
irinotecano (CPT-11, Camptosar
®
) e o topotecano (Hycantina
®
), ambos
solúveis em água, na forma de sais, preparados preservando-se a subunidade
farmacofórica iridoídica, representada pelo anel lactônico hidroxilado
(Montanari, Bolzani, 2001; Oberlies, Krall, 2004). Estas duas substâncias foram
aprovadas pelo Food and Drug Administration (FDA) dos EUA, em 1996, e
atualmente são comercializadas, respectivamente, para tratamento de câncer
de cólon e de ovário.
Camptotecina: R
1
,R
2
=H
Topotecano: R
1
=OH; R
2
= CH
2
N(CH
3
)
2
Figura 3 – Estrutura da Camptotecina e do Topotecano
Irinotecano
Figura 4 – Estrutura do Irinotecano
35
1.5. Irinotecano
O irinotecano é um derivado semi-sintético da camptotecina. Seu nome
químico é cloridrato triidrato (4S)-4,11-dietil-4-hidroxi-9-[(4-dipiperidino)
carboniloxila]-1H pirano [3’,4’,6,7] indolizino [1,2-b] quinolina-
3,14(4H,12H)diona; sua fórmula molecular é C
33
H
38
N
4
O
6
•HCl•3H
2
O, um
composto moderadamente solúvel em água e solventes orgânicos.
A topoisomerase I é uma enzima que atua sobre a dupla fita de DNA
relaxando a supertorção gerada durante a fase de transcrição e replicação do
DNA (Wang, 1996) Devido ao tamanho do cromossomo eucariótico, a remoção
da supertorção se faz necessária e é realizada através da introdução de
quebras transitórias em uma das cadeias da dupla fita de DNA, o que permite
que a cadeia que foi quebrada gire em torno da fita complementar intacta e a
supertorção conseqüentemente seja removida. Após o relaxamento, a ligação
intermediária covalente entre a topoisomerase I e o DNA se desfaz, sendo a
taxa de religação da fita clivada normalmente mais rápida que a taxa de
clivagem (Champoux, 2001). Contudo, uma variedade de drogas tem
capacidade, tanto in vivo como in vitro, de estabilização do intermediário
covalente topoisomerase I-DNA, como, por exemplo, o topotecano e o
irinotecano. A topoisomerase I é, portanto, o alvo molecular da ação desses
agentes, sendo os efeitos citotóxicos, conseqüentemente, fase S específicos.
O irinotecano, um inibidor da topoisomerase I, é uma droga
antineoplásica ativa contra uma variedade de tumores, sendo utilizado
principalmente no tratamento do câncer coloretal (Chester et al., 2003; Langer,
2004; Perez et al., 2004; Rocha-Lima et al., 2004). É um precursor
hidrossolúvel do metabólito lipofílico SN-38 (figura 5). Os estudos bioquímicos
e análises de citotoxicidade realizados in vitro em células tumorais humanas e
de roedores indicam, de forma consistente, que o SN-38 é, pelo menos, 1000
vezes mais potente como um inibidor de topoisomerase I do que o irinotecano
(Takimoto, Arbuck, apud Koizumi et al., 2006), sendo este último, por
conseqüência, comumente descrito como sendo uma pró-droga.
36
FIGURA 5 – Metabolismo do CPT-11
No fígado, a enzima CYP3A4 atua sobre o CPT-11 gerando dois compostos
inativos, APC (7-etil-10-[4-N-(5-ácido aminopentanóico)-1-piperidino]-
carboniloxicamptotecina) e NPC (7-etil-10-[4-amino-1-piperidino]-
carboniloxicamptotecina). O NPC pode ser metabolizado pela CE em SN-38. A
depuração do SN-38 é feita no fígado pelo polipeptídio A1 da família da uridina
difosfato glicosiltransferase 1 (UGT1A1), gerando glicuronídios de SN-38 (SN-
38G), que são desprovidos de atividade biológica. CPT-11, SN-38 e SN-38G
são excretados na bile através das proteínas de transporte MDR1 (multidrug
resistance protein 1) e MRP2 (multidrug resistance-associated protein 2) e
chegam ao intestino delgado. No intestino delgado, o CPT-11 pode ser clivado
pela CE intestinal, formando mais SN-38. Além disso, o SN-38G pode ser
desconjugado pela ação de bactérias intestinais produtoras de β-glicuronidase,
transformando-se novamente em SN-38. Este, por sua vez, é reabsorvido
iniciando um processo de recirculação êntero-hepática (TREINEN-MOSLEN et.
al., 2006; HAAZ et. al., 1998; CHESTER et al., 2003; MATHIJSSEN et al.,
2004; DODDS et al., 1998; KHERER et al., 2000; PIZZOLATO et al., 2003;
GUPTA et. al., 1994; CHU et. al., 1997; IYER et. al., 2002) Extraído de Freitas
HC, 2007.
37
O SN-38 é formado a partir do irinotecano, por clivagem da ligação de
carbamato entre a fração camptotecina e a cadeia lateral dipiperidina (figura 6)
mediada por uma carboxilesterase (Guichard et al., 1999).
Figura 6 – Detalhes estruturais de produtos do metabolismo do
irinotecano.
Glicuronização do composto SN-38 precedida da clivagem do irinotecano pela
carboxil esterase. O esquema descreve as formas lactona e carboxilato de
cada composto. (Tallman et al., 2005).
Os principais efeitos colaterais relacionados ao tratamento com CPT-11
são neutropenia, mucosite e diarréia, que freqüentemente ocorrem
simultaneamente. A diarréia constitui um evento inicial, até 24h após o
tratamento com o antineoplásico Irinotecano, estando relacionada com uma
estimulação colinérgica, o que permite o manejo profilático com atropina, e um
evento tardio
, que aparece entre o segundo e o vigésimo primeiro dia após o
início do tratamento, mas principalmente entre o sexto e o décimo dia após a
administração da droga. O mecanismo preciso de como o irinotecano induz
38
mucosite intestinal e, conseqüentemente, diarréia é ainda desconhecido.
Estudos anteriores investigaram a fase tardia da diarréia induzida por
irinotecano e têm sugerido mecanismos diversos como citotoxidade direta
(Ikuno et al., 1995) ou interferência direta com a microbiota intestinal através do
aumento da atividade da enzima β-glicuronidase (Takasuna et al., 1996). Mais
recentemente, nosso grupo destacou o papel das citocinas TNF-α, IL-1 β e KC
no desenvolvimento da mucosite intestinal induzida por irinotecano (Melo et al.,
2008).
1.6. Mucosite: epidemiologia e fases de desenvolvimento
Mucosite é um termo clínico que descreve uma síndrome caracterizada
por ulceração da mucosa de todo o trato digestivo, resultando em dor, disfagia,
diarréia e disfunção (figura 7), dependendo do tecido afetado (SONIS & FAY,
2002; SONIS et al., 2004; SCULLY & SONIS, 2006). Consiste em um efeito
adverso comum nos pacientes portadores de câncer submetidos a tratamentos
com agentes quimioterápicos diversos, em especial os antimetabólitos e/ou,
radioterapia na região de cabeça e pescoço (CABALLERO et al, 1985; BALIS
et al, 1985; ROTH et al., 1991; BISHOP et al, 1986; SCULLY et al., 2003; 2004;
2006). Deve-se aos efeitos não específicos das drogas antineoplásicas,
lesando as células em processo de divisão celular ativo sejam elas, malignas
ou normais. A mucosite intestinal induzida por antineoplásicos é um efeito
colateral de grande relevância tendo em vista os custos envolvidos no
tratamento, geralmente paliativo, dessa condição.
Clinicamente, a diarréia é o sintoma mais marcante, podendo ser aquosa
e em pequeno volume uma ou duas vezes ao dia ou, nos casos mais severos,
em número superior a dez episódios por dia. Nos quadros mais dramáticos,
pode haver necessidade de nutrição parenteral ou até de intervenções
cirúrgicas em casos de perfuração intestinal ou hemorragia maciça (GIBSON et
al., 2002; BLIJLEVENS et al., 2007). A Figura 7 ilustra uma representação
esquemática dos sintomas e complicações decorrentes da mucosite intestinal.
A Tabela 1 descreve os critérios de graduação da diarréia formulados
pelo Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos (NCI –National Cancer
39
Institute), usados universalmente em estudos clínicos e também na prática
clínica assistencial.
FIGURA 7 – Representação esquemática de sintomas e alterações clínicas
da mucosite gastrintestinal
Os pacientes com mucosite intestinal podem apresentar sintomas leves e auto-
limitados. Entretanto, esse é um efeito adverso potencialmente capaz de gerar
numerosas complicações, incluindo quadros graves e irreversíveis (KEEFE et
al., 2007 adaptado por Freitas, 2007).
Um dos problemas em se entender a mucosite e a diarréia a ela
associada recai no fato de que os mecanismos envolvidos na fisiopatologia
dessa doença não são conhecidos com precisão. Realizar uma terapia efetiva
dessa condição continua sendo um desafio na prática clínica. A diarréia é
observada em aproximadamente 70% dos pacientes em quimioterapia, sendo
maior nos primeiros ciclos de tratamento, quando diarréia de graus 3-4 (tabela
1) pode ser observada em até 25% dos pacientes (Cunningham et al., 1998;
Keefe et al., 2007). Tem sido descrita uma incidência de mucosite em
aproximadamente 40% dos pacientes em uso de vários agentes
quimioterápicos (CABALLERO et al, 1985; BALIS et al, 1985; ROTH et a.,
40
1991; BISHOP et al, 1986; SCULLY et al., 2003; 2004; 2006). A combinação de
diferentes drogas antineoplásicas aumenta essa incidência de 40 para 70%
(CABALLERO et al, 1985; BALIS et al, 1985; ROTH et a., 1991; SCULLY et al.,
2006). Nos tratamentos prévios com quimioterápicos ou radioterapia para
transplante de células hematopoiéticas, a ocorrência de mucosite atinge até 75
a 99%, dos pacientes, particularmente nos casos em que se associa irradiação
e quimioterapia (DONNELLY et al., 1992; BLIJLEVENS et al., 2000).
TABELA 1– Critérios comuns de terminologia para eventos adversos
(versão 3.0) - Diarréia
Grau 1
Aumento da frequência das evacuações, menor que 4
vezes por dia
Grau 2
Aumento da frequência das evacuações de 4 a 6 vezes
por dia
Necessidade de hidratação venosa <24h
Sem interferência nas atividades diárias
Grau 3
Aumento da frequência das evacuações ≥ 7 vezes por
dia
Necessidade de hidratação venosa ≥24h ou
hospitalização
Interferência nas atividades diárias
Grau 4
Risco à vida (ex. colapso hemodinâmico)
Grau 5 Morte
Fonte: National Cancer Institute
A importância clínica se torna evidente se considerarmos que a diarréia
pode, muitas vezes, requerer alterações no esquema de tratamento
antineoplásico adotado ou, até mesmo, comprometer a viabilização do
tratamento. A diarréia é geralmente controlada com loperamida, porém nos
casos mais graves do evento adverso (graus 3 e 4) o tratamento se mostra
ineficaz. Outras estratégias têm sido sugeridas, tal como octreotida, acetorfan,
antibióticos, glutamina, budesonida, IL-15, talidomida, inibidores da enzima
cicloxigenase-2, ciclosporina e alcalinização do lúmen intestinal (Gibson and
Keefe, 2006). Recentemente, novas drogas tem sido incorporadas à prática
clínica, como as pequenas moléculas inibidoras de tirosina quinase, por
41
exemplo, imatinibe, sorafenib e lapatinibe. Apesar de estas fazerem parte do
grupo de drogas alvo direcionadas (targeted therapy), com um mecanismo de
ação bastante pontual, elas não estão livres de apresentar efeitos colaterais.
Mesmo que essas drogas representem uma mudança do paradigma em
oncologia, é evidente que a incidência de diarréia/mucosite intestinal
provavelmente não diminua nos próximos anos.
Postula-se que há mecanismos individuais e fatores tissulares
específicos envolvidos no desenvolvimento da mucosite. Fatores individuais
incluem sexo, raça e doenças sistêmicas concomitantes, enquanto
mecanismos tecido-específicos incluem tipo de epitélio em consideração,
sistema endócrino intrínseco, função tecidual e microbiota local (Keefe, 2007).
Fatores individuais polimórficos têm sido também relacionados. A uridina 5’-
difosfato-glicuronosil-transferase (UGT1A1) é uma enzima responsável pelo
metabolismo do irinotecano, que pode determinar a variação da
susceptibilidade individual à toxicidade do irinotecano (Ando et al., 2007).
Sonis e colaboradores descreveram a mucosite por antineoplásicos
como um processo complexo, no qual ocorre a seguinte seqüência de eventos
biológicos interligados: iniciação, resposta primária ao dano, sinalização (e
amplificação), ulceração e, finalmente, cicatrização (SONIS et al., 2004;
SCULLY et al., 2006). A manifestação de todos os estágios não ocorre
obrigatoriamente em todos os casos. Portanto, em uma mucosite branda com
poucos danos à mucosa, a rápida recuperação e proliferação epitelial evita a
ocorrência da fase ulcerativa, que é a mais sintomática (SONIS, 1998; SONIS
& FAY, 2002).
A fase de iniciação ocorre logo após a radiação ou quimioterapia. A
lesão celular direta das células epiteliais basais ocorre simultaneamente com a
geração de estresse oxidativo e liberação de espécies reativas de oxigênio
(SONIS et al., 2004). A resposta primária ao dano, observada nas células e
tecidos da submucosa, é caracterizada pela expressão de genes de resposta
precoce, c-jun, c-fos e Erg I, e pela ativação de fatores de transcrição, como
fator nuclear-κB (NF-κB) (SCULLY et al., 2006). Em paralelo à ativação do NF-
κB, enzimas como a esfingomielinase e a ceramida sintetase, que catalizam a
síntese de ceramida, são ativadas diretamente pela quimio e/ou radioterapia,
42
ou indiretamente, pelas espécies reativas de oxigênio e TNF-α. A via da
ceramida induz apoptose tanto em células submucosas, como epiteliais
(MADDENS et al, 2002). Adicionalmente, a destruição da fibronectina também
ocorre nessa fase da mucosite, resultando na ativação de macrófagos e
subseqüente injúria tecidual, mediada pelas metaloproteinases e produção
adicional de TNF-α. A participação do TNF- α na patogênese da mucosite oral
foi evidenciada por trabalho do nosso laboratório que mostrou que a
pentoxifilina e a talidomida, ambas inbibidores da síntese de TNF- α, reduzem
significativamente a lesão gastrintestinal induzida por 5-FU em hamster (LIMA
et al., 2005).
Em resumo, a liberação de mediadores inflamatórios, em resposta à
quimio ou radioterapia, resulta em uma série de retroalimentações positivas,
amplificando e prolongando a injúria tecidual, através de seus efeitos nos
fatores de transcrição e nas vias da ceramida e caspases, resultando em
apoptose e liberação de mais mediadores inflamatórios como as citocinas pró-
inflamatórias TNF-α, IL-1β e IL-6.
A fase seguinte, denominada ulcerativa é a mais sintomática e
usualmente ocorre durante o período de grave neutropenia do paciente. A
lesão e morte das células basais epiteliais resultam em mudanças atróficas
que culminam na real deterioração e quebra da mucosa. Nessa fase é comum
a ocorrência de infecção secundária, visto que a úlcera serve de foco para a
colonização de microorganismos. Os produtos da parede celular de bactérias
penetram na submucosa estimulando a liberação de mais citocinas pró-
inflamatórias, o que resulta em inflamação, dor, possíveis infecções
secundárias ou influxo sistêmico de microorganismos e toxinas que, associado
à neutropenia induzida pelas drogas antineoplásicas, aumenta o risco de
bacteremia e septicemia (ELTING et al. 1992, SONIS et al., 2004).
A fase de cicatrização é biologicamente dinâmica, com sinalização da
matriz submucosa extracelular, estimulando a migração, diferenciação e
proliferação do epitélio. Além disso, observam-se o retorno da flora microbiana
normal e a recuperação do número de leucócitos (SONIS et al., 2004). Nosso
grupo demonstrou que a glutamina e seu derivado estável alanil-glutamina
43
aceleram a recuperação da mucosa oral lesada pelo uso de 5-FU (LEITÃO et
al., 2007b).
1.7. Mucosite intestinal por antineoplásicos
Um fator limitante no estudo da mucosite intestinal na prática clínica
reside na dificuldade de se acessar a própria lesão, visto que se utilizam meios
invasivos como endoscopia digestiva com biópsia.
Por serem os agentes citotóxicos mais efetivos em tecidos com alta taxa
proliferativa, o epitélio do trato gastrintestinal, pela sua elevada taxa de
renovação celular, torna-se particularmente susceptível aos efeitos danosos
dos antineoplásicos (PARRILLI et al, 1989; PLEDGER et al, 1988). Esses
danos parecem envolver principalmente as células das criptas intestinais
(SKUBITZ, 1994; SHOU et al, 1991; FOX et al, 1988).
Um aspecto importante da mucosite induzida por antineoplásicos
consiste no fenômeno da translocação bacteriana através de um epitélio
funcionalmente e estruturalmente danificado, evento que parece desempenhar
papel relevante na toxicidade intestinal da quimioterapia e da radioterapia (FOX
et al, 1988; ALVERDY, 1990; SOUBA et al, 1990). A destruição celular
gastrintestinal observada na mucosite por uso de antineoplásicos é resultado
de hipoproliferação celular (TRIER, 1962; ALTMAN, 1974), com atrofia das
vilosidades e aprofundamento das criptas que resulta de disfunção absortiva,
alteração na secreção de eletrólitos, principalmente Na
+
e K
+
, que pode
acarretar diarréia (DONALDSON & LENON, 1979; KEEFE et al., 1997;
CARNEIRO-FILHO et al., 2004a).
Nosso grupo demonstrou (CARNEIRO-FILHO et al, 2004a) que ratos
tratados com o agente antineoplásico metotrexato apresentavam perda de
peso associado a uma diminuição da absorção e da atividade enzimática do
epitélio, além da destruição da mucosa do duodeno, jejuno e íleo, com
presença de infiltrado celular, reforçando a hipótese da fase inflamatória da
mucosite. Ademais, foi demonstrada uma redução da excreção de manitol
quando os ratos foram tratados com metotrexato, mostrando que a
permeabilidade do intestino estava alterada. Essas alterações da
44
permeabilidade intestinal a vários açúcares, sugerem que os efeitos deletérios
sistêmicos, como desnutrição e desidratação, advêm principalmente dos danos
causados à capacidade absortiva da mucosa intestinal (KEEFE et al, 1997).
Outro estudo de nosso laboratório demonstrou que o tratamento de
camundongos com CPT-11 tembém causa uma mucosite intestinal
significativa, apresentando dano na mucosa, com pequenas áreas desnudas.
Além disso, houve achatamento dos vilos, vacuolização do epitélio intestinal,
necrose das criptas e intenso infiltrado inflamatório na lâmina própria (MELO, et
al., 2007). Essa combinação da lesão da mucosa com o infiltrado neutrofílico
reforça a hipótese de ocorrência de uma fase inflamatória no processo
patológico da mucosite induzida por tratamento com CPT-11 (Sonis 2004).
Assim, a mucosite intestinal resulta de eventos inflamatórios, que levam
às alterações de permeabilidade, trânsito intestinal e na motilidade intestinal.
Porém faltam estudos sobre os mediadores inflamatórios envolvidos.
45
1.8. JUSTIFICATIVA
Ao longo das últimas cinco décadas, o número de agentes
antineoplásicos tem crescido exponencialmente e contribuído para o aumento
da qualidade de vida e da sobrevida de pacientes com inúmeros tipos de
câncer (KENNEDY, 1991). Entretanto, os pacientes passaram a sofrer com
efeitos adversos limitantes como náuseas e vômitos, neutropenia, infecções,
mucosite oral e intestinal. Muito tem se descoberto, em parte com nossa
colaboração, com relação aos mecanismos e mediadores envolvidos nos
efeitos colaterais da quimioterapia do câncer. Nesse contexto, observamos que
o tratamento com irinotecano (CPT11) em camundongos causou uma
significativa diarréia nos animais, com diminuição dos vilos intestinais e perda
da arquitetura das criptas. Observamos ainda um aumento na concentração
intestinal de TNF-α, IL-1β e KC. Um fato interessante foi que semelhante à
mucosite oral induzida por 5-FU, o irinotecano (CPT-11) induziu um aumento
da infiltração de neutrófilos para a mucosa intestinal a despeito de ter
promovido leucopenia (MELO, et al., 2007), evidenciando que a mucosite
intestinal induzida por irinotecano e a mucosite oral por 5-FU são processos
inflamatórios que cursam com uma importante infiltração de neutrófilos.
As citocinas e a geração de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio
parecem de fato assumir um papel importante nas vias de desenvolvimento da
mucosite induzida por quimioterápicos. Contudo, o conhecimento aprofundado
acerca das intrincadas vias inflamatórias que culminam nas lesões de mucosa
observadas na mucosite ainda requer maiores estudos, podendo as mesmas
se tornarem alvos terapêuticos importantes.
Atualmente, o tratamento padrão para mucosite induzida por
antineoplásicos é essencialmente paliativo, com suportes analgésico e
nutricional. Alguns agentes têm sido introduzidos na prática clínica para
tratamento da mucosite induzida por quimioterápicos, a exemplo da palifermina
(recombinant keratinocyte growth factor). Contudo, sua utilização é restrita para
prevenção de mucosite em pacientes tratados com quimio e radioterapia
anteriores à realização de transplante de medula óssea. Um outro
inconveniente envolve o alto custo para o tratamento, não se justificando sua
utilização quando o risco de desenvolvimento de mucosite é baixo (revisto por
46
von Bültzingslöwen et al., 2006). A interleucina-11 também foi avaliada em
estudos clínicos envolvendo mucosite oral secundária à quimio e radioterapia
em pacientes transplantados com células-tronco. Porém, nenhum progresso
significativo foi encontrado (Antin et al., 2002).
O interesse especial nos aspectos iniciais da mucosite intestinal implica
numa eventual possibilidade de modulação farmacológica do processo. Como
ainda não se dispõe hoje de meios efetivos para amenizar os efeitos da
mucosite na maioria dos casos (RUBENSTEIN et al., 2002), os pacientes ainda
sofrem com sintomas desconfortáveis, com o maior risco de sepse e com a
possível redução da eficácia do tratamento oncológico devido a atrasos e
reduções de doses (PICO et al., 1998; GIBSON et al., 2002; BLIJLEVENS et
al., 2007; KEEFE et al., 2007 revisto por Freitas HC, 2007).
Desta forma, justifica-se o desenvolvimento de um conhecimento
aprofundado da fisiopatologia dessa alteração inflamatória como forma de se
buscar meios preventivos e terapêuticos que permitam uma melhoria
significativa da qualidade de vida dos pacientes acometidos, evitando a
redução das doses dos quimioterápicos e a interrupção temporária ou definitiva
do tratamento.
47
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivos gerais
- Estabelecer a fisiopatologia das alterações morfológicas, inflamatórias e
funcionais (diarréia e contratilidade) observadas na mucosite intestinal induzida
por irinotecano (CPT-11).
2.2. Objetivos específicos
- Padronizar o modelo de mucosite intestinal induzida por CPT-11 em
camundongos C57BL/6 avaliando-se parâmetros histopatológicos (através de
escores microscópicos) e funcionais (contratilidade in vitro e análise de diarréia);
- Estudar os mecanismos e mediadores envolvidos na mucosite intestinal
induzida por CPT-11 no modelo padronizado, verificando a participação da
protease caspase-1, das citocinas interleucina-1 (IL-1), interleucina-18 (IL-18) e
interleucina-33 (IL-33), do óxido nítrico, e de mediadores lipídicos 5-
lipoxigenase e PAF assim como a seqüência de interação entre esses
mediadores sob aspectos morfofuncionais e inflamatórios.
48
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Padronização da mucosite intestinal
Os animais C57BL/6 ou Swiss receberam quatro injeções, por via
intraperitoneal, de Irinotecano (CPT-11, Camptosar
®
, Pfizer), nas doses de 45,
60 e 75 mg/kg, ou salina (5 mL/kg), uma injeção por dia de acordo com
protocolo desenvolvido por Ikuno et al. (1995). Para a avaliação morfofuncional,
os animais foram sacrificados no dia 5 após a primeira injeção de CPT-11
(Figura 8).
FIGURA 8 – Esquema de injeção do CPT-11
3.2. Avaliação da participação de caspase 1, IL-18, IL-1, IL-33, iNOS,
5-LOX e PAFr na mucosite intestinal induzida por CPT-11 em
camundongos
Animais:
Foram utilizados camundongos C57BL/6, BALB/c, 129Svev e knockout
para caspase-1 (caspase-1
-/-
), citocina IL-18 (IL-18
-/-
), óxido nítrico sintase
induzida (iNOS
-/-
), 5-Lipoxigenase (5-LOX
-/-
), receptor para PAF (PAF
-/-
)
machos, pesando entre 20 e 25 g. Os animais foram colocados em caixas, num
ambiente com temperatura de 22 ± 2
o
C num ciclo de 12h claro/12h escuro,
com livre acesso a água e ração padrão. Os animais foram originalmente
obtidos pelo Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine, USA), criados e
Sacrifício
1 2 3 4 5
Tempo
(Dias)
CPT-11
49
fornecidos pelo biotério da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto -
Universidade de São Paulo. Os protocolos desenvolvidos estavam de acordo
com os padrões de uso de animais experimentais, sendo o projeto previamente
aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da UFC (protocolo 02/04).
Drogas:
Cloridrato de Irinotecano (CPT-11, Camptosar
®
, ampolas 5mL,
100mg/mL, Pharmacia & Upjohn Co. Kalamazoo, EUA).
As soluções utilizadas consistem em soro fisiológico 0,9%, IL-1Ra
recombinante (antagonista do receptor da IL-1, NIBSC 92/644), IL-18bp
(proteína ligante da IL-18), IL-33 (interleucina-33), aminoguanidina e cloridrato
de loperamida (antidiarréico adotado como padrão) diluídas em SF 0,9%,
Protocolos desenvolvidos:
I - Camundongos C57BL/6 (WT, tipo selvagem) e animais Caspase-1 knockout
(Caspase-1
-/-
) foram tratados com salina (SF 0,9%, 5 mL/kg, i.p.) ou CPT-11
(60 mg/kg) por via intraperitoneal, por quatro dias uma vez ao dia.
II - Camundongos BALB/c foram divididos em grupos (n=4-5). Grupo I: controle
normal tratado com salina (SF 0,9%, 5 mL/kg, i.p.); Grupo II: animais tratados
com CPT-11 (60 mg/kg, i.p.); Grupo III: animais tratados com IL-1Ra (50
mg/kg, s.c., um antagonista do receptor de IL-1); Grupo IV: animais tratados
com IL-1Ra administrado diariamente 1h antes do antineoplásico CPT-11.
III - Camundongos BALB/c (WT, tipo selvagem) e animais IL-18 knockout (IL-
18
-/-
) foram tratados com salina (SF 0,9%, 5 mL/kg) ou CPT-11 (60 mg/kg) por
via intraperitoneal, por quatro dias uma vez ao dia.
IV - Camundongos BALB/c foram divididos em grupos (n=4-5). Grupo I:
controle normal tratado com salina (SF 0,9%, 5 mL/kg, i.p.); Grupo II: animais
tratados com CPT-11 (60 mg/kg, i.p.); Grupo III: animais tratados com IL-18bp
50
(200 µg/animal, i.p., uma proteína ligante de IL-18) administrada diariamente 1h
antes do antineoplásico CPT-11.
V - Camundongos BALB/c foram divididos em grupos (n=4-5). Grupo I: controle
normal tratado com salina (SF 0,9%, 5 mL/kg, i.p.); Grupo II: animais tratados
com CPT-11 (60 mg/kg, i.p.); Grupo III: animais tratados com IL-33 (1
µg/animal, e.v.); Grupo IV: animais tratados com IL-33 administrado
diariamente 1h antes do antineoplásico CPT-11.
VI - Os camundongos C57BL/6 e knockout para iNOS (iNOS
-/-
) foram tratados
com salina (SF 0,9%, 5 mL/kg) ou CPT-11 (60 mg/kg) por via intraperitoneal,
por quatro dias uma vez ao dia.
VII - Animais C57BL/6 foram divididos em grupos (n=4-5). Grupo I: controle
normal tratado com salina (SF 0,9%, i.p.); Grupo II: animais tratados com CPT-
11 (60 mg/kg, i.p.); Grupo III: animais tratados com aminoguanidina (AMI, 50
mg/kg, s.c., um inibidor de iNOS); Grupo IV: animais tratados com AMI
administrada no dia 1
o
dia 1h antes, 6 e 12h após o antineoplásico e do
segundo ao quarto dia de injeção do CPT-11, foram feitas administrações de
12/12h.
VIII - Camundongos 129Svev (WT, tipo selvagem) e animais knockout para 5-
lipoxigenase, 5-LOX
-/-
, foram tratados com salina (SF 0,9%, 5 mL/kg) ou CPT-
11, por via intraperitoneal, por quatro dias uma vez ao dia.
IX - Camundongos BALB/c (WT, tipo selvagem) e animais knockout para
receptor PAF, PAFr
-/-
, foram tratados com salina (SF 0,9%, 5 mL/kg) ou CPT-
11, por via intraperitoneal, por quatro dias uma vez ao dia.
X - Camundongos BALB/c foram divididos em grupos (n=4-5). Grupo I: controle
normal tratado com salina (SF 0,9%, 5 mL/kg, i.p.); Grupo II: animais tratados
com CPT-11 (60 mg/kg, i.p.); Grupo III: animais tratados com cloridrato de
loperamida (3 e 30 mg/kg, s.c.); Grupo IV: animais tratados com cloridrato de
51
loperamida (3 mg/kg nos dia 1 e 2 e 30 mg/kg nos dia 3 e 4 de administração
do CPT-11) administrado diariamente 1h antes e 12h após Irinotecano.
Em todos os protocolos, no quinto dia após início do tratamento com CPT-11, a
diarréia foi avaliada segundo escores pré-estabelecidos. Amostras de sangue
foram coletadas e, em seguida, os animais foram sacrificados por
deslocamento cervical. Amostras do duodeno foram retiradas, pesadas e
congeladas a -70ºC para dosagem de atividade da enzima mieloperoxidase.
Outra amostra de tecido foi coletada, imersa em formol a 10% e, após 24
horas, transferida para álcool 70% para analise microscópica. Por fim, realizou-
se o estudo de contratilidade in vitro.
3.3. Parâmetros avaliados na mucosite intestinal
3.3.1. Avaliação de parâmetro hematológico
Os animais foram levemente anestesiados com éter etílico para coleta
de 20µL de sangue. Esta amostra foi diluída imediatamente em 380µL de
solução de Turk. A contagem total de leucócitos na amostra foi realizada
utilizando-se uma câmara de Neubauer para verificação do efeito do CPT-11
no que concerne ao efeito sobre o número de leucócitos circulantes (indução
de leucopenia). Essa observação serviu como controle da atividade do CPT-11
sobre o animal.
3.3.2. Avaliação do grau da diarréia apresentada
Aos eventos de diarréia, apresentados no quinto dia após o início do
tratamento dos animais com CPT-11, foram atribuídos escores (segundo
proposta de Kurita et al., 2000), como discutido a seguir: 0=fezes com aspecto
normal; 1=fezes levemente alteradas, pouco umedecidas; 2=fezes úmidas com
pouca sujidade perianal; 3=fezes úmidas com bastante sujidade perianal
(figura 9). Esse parâmetro representou um indicativo de indução da mucosite,
tendo em vista a associação do sinal diarréia à mucosite, observada na prática
clínica.
52
FIGURA 9 - Representação dos graus de diarréia pós-injeção do CPT-11.
À diarréia são atribuídos escores de acordo com a intensidade. Grau 0=fezes
com aspecto normal; Grau 1=fezes levemente alteradas, pouco umedecidas;
Grau 2=fezes úmidas com pouca sujidade perianal; Grau 3=fezes úmidas com
bastante sujidade perianal
3.3.3. Avaliação da contratilidade de duodeno in vitro
Foram realizados os estudos da contratilidade in vitro de duodeno, conforme
descrito por Araújo e colaboradores (2005), após o 5° dia de início do
tratamento dos animais com CPT-11. Após exposição da cavidade peritoneal
dos animais, segmentos de duodeno (0,5 cm) foram retirados, cortados no
sentido da musculatura circular e colocados em uma placa de Petri, contendo
uma solução nutriente de Tyrode modificada (contendo a seguinte composição
expressa em mM: NaCl 136; KCl 5; MgCl
2
0,98; CaCl
2
2,0; NaH
2
PO
4
0,36;
NaHCO
3
11,9; Glicose 5,5) para limpeza, retirada de tecidos adjacentes e, em
53
seguida, amarrados com linha no sentido da musculatura longitudinal,
suspensos em banho de órgão (20mL de solução de Tyrode, aquecida a 37
o
C,
pH=7,4 e oxigenada continuamente com mistura carbogênica 95% O
2
/5% CO
2
)
e conectados a um transdutor de força (ADInstruments, modelo MLT0201,
EUA), apropriado para registro isométrico de contrações, conectado a um
Amplificador (ADInstruments, ML845 Powerlab 4/25, EUA), para registro das
contrações longitudinais da preparação. Os sinais gerados pelo transdutor
foram registrados em um Sistema de Aquisição de Dados (Chart Pro, EUA).
Após calibração do sistema, foi aplicado ao tecido 1g de tensão de repouso e o
tempo de equilíbrio com as condições artificiais do banho foi de 40 minutos.
Duas contrações padrão (fase fásica) foram inicialmente obtidas mediante a
adição de KCl 60 mM ao banho e, em seguida, feita uma curva concentração-
efeito com o agonista colinérgico acetilcolina (ACh em concentrações
crescentes e cumulativas variando de 10
-10
-10
-4
M adicionadas ao banho pelo
período máximo de 5min para cada concentração). Entre as aplicações de KCl
e entre a de KCl e a primeira de ACh realizou-se a troca de solução (lavagem
do preparo) permitindo-se a estabilização do padrão contrátil basal antes da
adição de novo agente ao banho (FIGURA 10). Os dados obtidos da curva de
ACh foram analisados como percentual de resposta contrátil em relação à
média das contrações padrão observadas inicialmente para o KCl 60 mM.
FIGURA 10 – Esquema de avaliação funcional intestinal in vitro
KCl
60
KCl
60
10(
-
10
-7 -
6
Acetilcolina (ACh)
)M
Lavagem
-
9
-
8
-5
-
4
Lavagem
B
A
%contração =
B
x100
A
54
3.3.4. Análise histopatológica e Morfometria da mucosa intestinal
Após o sacrifício dos animais, foi removido um segmento de 0,5 cm do
duodeno proximal do camundongo. A seguir, essas amostras foram fixadas em
formol tamponado 10% e processadas para coloração pelo método HE
(hematoxilina-eosina) para exame em microscopia óptica 100x (Microscópio
Nikon com objetiva 10x e lente ocular micrométrica Leitz Wetzlar 10x).
A análise histopatológica envolveu a observação do aspecto de vilos e
criptas, bem como presença e intensidade do infiltrado inflamatório. O grau e a
severidade da mucosite foi determinado de acordo com o sistema de escores
proposto por Woo et al. (2000) e descritos a seguir: 0 = ausência de lesão; 1 =
menos de 10% das criptas contêm células necróticas; 2 = mais de 10% das
criptas contêm células necróticas, mas a arquitetura permanece intacta; 3 =
mais de 10% das criptas contêm células necróticas com perda da arquitetura
das criptas (<20%), os vilos encontram-se encurtados e ocorre variável
hipertrofia e hiperbasofilia nas criptas remanescentes; 4 = semelhante à 3,
entretanto, é mais extensa com perda da arquitetura das criptas e
encurtamento dos vilos.
Para análise morfométrica, objetivou-se obter a medida de vilos,
considerada desde o ponto de encontro entre dois vilos até o topo do vilo em
questão (altura do vilo), e criptas intestinais (definida como o ponto de encontro
entre dois vilos medidas até a o início da camada submucosa) para correlação
com a capacidade absortiva (razão altura dos vilos/profundidade das criptas). A
razão entre o comprimento dos vilos intestinais e as criptas de Lieberkühn foi
calculada em µm utilizando-se o software ImageJ versão 1.36b, sendo medidos
entre 5 e 10 vilos e criptas por corte histológico.
3.3.5. Ensaio de mieloperoxidase (MPO)
A atividade de MPO, uma enzima encontrada nos grânulos azurófilos de
neutrófilos, é utilizada como marcador da presença de neutrófilos no tecido
55
inflamado, cuja presença foi determinada por método colorimétrico e a leitura
final realizada em leitor de ELISA. Uma porção do duodeno foi coletada e
incubada em solução de HTAB 0,5% (Brometo de hexadeciltrimetilamonio), na
proporção de 50mg de tecido por mL, e homogeneizada e centrifugada (1500
g/15 min a 4
o
C). O sobrenadante foi transferido para um epperdorf e
novamente centrifugado (10min) para melhor remoção de contaminantes. Após
plaqueamento de 7µL do sobrenadante (placas de 96 wells), 200 µL da solução
de leitura (5 mg O-dianisidine; 15 µL H
2
O
2
1%; 3 mL tampão fosfato; 27 mL
H
2
O) foram adicionados e lidos a 460nm (t
o
=0 min e t
1
=1 min). A mudança na
absorbância foi obtida, plotada em curva padão de neutrófilos e expressa como
neutrófilos/mg de tecido (atividade de MPO).
3.3.6. Dosagem de citocinas IL-1 e KC
Os animais tiveram amostras do duodeno retirados no 5° dia para
análise de citocinas e estocados em freezer -70
o
C até o momento do ensaio. O
tecido coletado foi homogeneizado e processado como descrito por Safieh-
Garabedian et al. (1995). A detecção de IL-1 e KC foi determinada por ELISA,
como descrito previamente (Cunha FQ et al., 1993). Resumidamente, placas
para ELISA de 96 poços foram incubadas por 12h a 4
o
C com anticorpo anti-IL-
1 e anti-KC murino (2µg/mL). Após bloqueio das placas, as amostras e a curva
padrão foram adicionadas em duplicata em várias diluições e incubadas por
24h a 4
o
C. As placas foram então lavadas três vezes com solução tampão e
incubadas com anticorpo monoclonal biotinilado anti-IL-1 e anti-KC diluídos
(1:1000 com o tampão de ensaio com BSA 1%). Após o período de incubação
à temperatura ambiente por 1h, as placas foram lavadas e 50 µL do complexo
HRP-avidina diluído 1:5000 foram adicionados. O reagente de cor 0-
fenilenodiamina (OPD, 50µL) foi adicionado 15min depois e as placas foram
incubadas no escuro a 37
o
C por 15 a 20min. A Reação enzimática foi parada
com H
2
SO
4
e a absorbância medida a 490nm. O resultado foi expresso em
pg/mL/mg proteína.
56
3.3.7. Determinação da atividade de óxido nítrico sintase induzida
(iNOS)
As medidas de atividade da NOS, foram realizadas a partir das amostras
de duodeno, utilizando método previamente descrito (GOMES et al., 2004). No
5º dia, após a primeira administração de CPT-11, os animais foram sacrificados
e porções de duodeno foram coletadas, e mantidas em freezer a -70º C até
realização do ensaio. As amostras homogeneizadas (Polytron- PT 3100) em
0,3 mL de tampão de extração pH=7 (320 mM sucrose; 50 mM Tris; 1 mM
EDTA; 1 mM DTT; 10µg/mL leupeptina; 10µg/mL inibidor de tripsina de soja;
2µg/mL aprotinina; 2 mM PMSF) e centrifugados (9.000 g/10min/4ºC). A seguir,
40 μL de cada sobrenadante foram incubados com 100 μL do tampão de
ensaio pH=7,4 (50 mM KH
2
PO
4
; 1,2 mM MgCl
2
.6H
2
O; 0,25 mM CaCl
2
; 0,12 mM
β-NADPH; 60 mM L-valina; 1 mM L-citrulina; 50µM BH
4
; 4µM FAD; 1 mM DTT)
por 1 hora. As amostras foram preparadas em triplicata. Tubo 1: sem inibidores
de NOS; Tubo 2: L-NAME (inibidor não-seletivo de NOS) e aminoguanidina
(inibidor seletivo de iNOS); Tubo 3: EGTA (quelante de cálcio para as
isoformas constitutivas). L-arginina-
14
C (270 µCi/ mMol) foi adicionada à razão
de 5,4 μL para cada 1mL de tampão de ensaio. Como controles do ensaio,
quatro grupos foram preparados: grupo 1: tubos para avaliar o background
(este tubo não continha amostra); grupo 2: tubos para quantificar o total de
cpm - contagens por minuto (neste tubo não foi adicionado o Dowex nem as
amostras); grupo 3: tubos com 7x 10
6
macrófagos ativados com LPS e IFN-γ
(controle NOS induzida); grupo 4: tubos com homogenato de cerebelo
(controle NOS neuronal). Em seguida, 1mL de resina Dowex AG-50X8 sódica
(1:1 em água, pH 6,0) foi adicionado aos tubos de ensaio, homogeneizados e
centrifugados (9.000 g/10min/4C). Foram colocados 400 μL do sobrenadante
destes tubos em 3 mL de líquido de cintilação e, após agitação, a
radioatividade foi quantificada por contador beta por 1 minuto para cada tubo.
Também foi realizada a quantificação das proteínas totais de cada amostra
pelo método de Comassie Blue (Comassie Blue Reagent; Pierce Chemical,
Rockford, IL). Os resultados foram expressos como pmol de citrulina/hora/mg
de proteína.
57
3.3.8. Análise estatística
A análise estatística, realizada com o software GraphPad Prism
®
, versão
3.0, foi realizada empregando o teste de análise de variância (ANOVA) ou
Kruskal Wallis conforme propriedade respectivamente para dados paramétricos
e não-paramétricos, seguidos do teste de comparações múltiplas de Newman-
Keuls ou teste de Dunn, baseando-se na continuidade das variáveis em
análise. Os resultados foram expressos como média ± E.P.M (variáveis com
distribuição normal) ou pela mediana (mínimo-máximo) (variáveis sem
distribuição normal), sendo as diferenças consideradas estatisticamente
significativas quando p<0,05.
58
4. RESULTADOS
4.1. Curva dose-efeito do CPT-11 em camundongos Swiss
As fotomicrografias (figura 11) e os escores histopatológicos (tabela 2)
indicam que o CPT-11 nas doses de 60 e 75 mg/kg/dia, em comparação com
animais tratados apenas com salina (p<0,05), induziu acentuado encurtamento
dos vilos intestinais, necrose e apoptose de células da cripta com vacuolização
e perda da arquitetura de criptas, vilos e do epitélio de revestimento e
infiltração inflamatória na mucosa. Realizando-se a análise morfométrica no
duodeno de camundongos Swiss (figura 12) tratados com CPT-11, verificou-se
que o antineoplásico, em todas as doses testadas (45, 60 e 75 mg/kg) induziu
redução significativa (p<0,05) na razão vilo/cripta quando comparados com o
controle tratado apenas com salina. Ao ser estudado o padrão de atividade
funcional (contratilidade in vitro de duodeno) do intestino de animais tratados
com CPT-11, verificou-se (figura 13) que o CPT-11, também em todas as
doses testadas (45, 60 e 75 mg/kg), induziu significativo (p<0,05) aumento da
resposta contrátil do duodeno ao estímulo com betanecol, sendo essa
resposta, respectivamente para as doses de 45, 60 e 60 mg/kg, 178%, 209% e
319% maior que a contratilidade do duodeno de animais tratados apenas com
salina. Os dados estão de acordo com a análise do grau de diarréia
apresentada (tabela 3) onde se observou que o CPT-11 induziu significativos
eventos diarréicos (p<0,05) em todas as doses, comparados ao grupo tratado
somente com salina. Como apresentado na figura 14, em todas as doses
testadas (45, 60 e 75 mg/kg), o CPT-11 induziu de forma signigicativa (p<0,05)
leucopenia nos animais.
59
FIGURA 11 - Fotomicrografias do duodeno de camundongos Swiss injetados
com salina 0,9% ou CPT-11.
Os animais receberam salina ou CPT-11 (45, 60 ou 75 mg/kg, i.p.) por quatro
dias consecutivos e foram sacrificados no quinto dia experimental. O duodeno
foi removido e processado para a técnica de coloração pelo método H&E
(100x). Na mucosa dos animais que receberam CPT-11 (60 ou 75 mg/kg) os
vilos estão encurtados (setas horizontais), há achatamento e vacuolização de
enterócitos (seta vertical), necrose de criptas (seta diagonal). Painel A:
Controle salina; Painel B: CPT-11 45 mg/kg; Painel C: CPT-11 60 mg/kg;
Painel D: CPT-11 75 mg/kg.
60
Escores histopatológicos
Grupo Mediana (min-máx)
Salina 0(0-0)
CPT-11 45 mg/kg 2,5(2-3)
CPT-11 60 mg/kg 3(2-4)
*
CPT-11 75 mg/kg 4(4-4)
*
Tabela 2 – Efeito do CPT-11 sobre os aspectos microscópicos duodenais
em camundongos Swiss
CPT-11 induz alterações histopatológicas em duodeno de camundongos Swiss.
O Gráfico revela que o CPT-11, nas doses de 60 e 75 mg/kg, induziu aumento
dos escores histopatológicos comparados com os verificados em camundongos
tratados apenas com salina. *p<0,05 vs grupo tratado com salina. Para análise
estatística utilizou-se o teste Kruskal Wallis seguido do teste de Dunn.
61
Salina 45 60 75
0
1
2
3
4
*
*
*
CPT-11
mg/Kg
Razão vilo/cripta
Figura 12 – Efeito do CPT-11 sobre a razão vilo/cripta em camundongos
Swiss
CPT-11 induz alterações morfométricas em duodeno de camundongos Swiss.
O Gráfico revela que o CPT-11, em todas as doses testadas, induz redução da
razão vilo/cripta comparada com a verificada em camundongos tratados
apenas com salina. *p<0,05 vs grupo tratado com salina. Para análise
estatística utilizou-se o teste ANOVA seguido do teste de Student Newman
Keuls.
62
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
[BeCh]
%Contração em relação
ao KCl60mM
Salina CPT-11 45mg/kg
CPT-11 60mg/kg CPT-11 75mg/kg
FIGURA 13 – Efeito do CPT-11 sobre a contratilidade duodenal in vitro em
camundongos Swiss
Camundongos Swiss apresentam alterações funcionais na contratilidade in
vitro de duodeno ao tratamento com CPT-11. O estudo funcional sobre o
duodeno coletado de animais tratados com CPT-11 revelou um aumento da
responsividade do tecido ao Betanecol (BeCh) na dose de 60 mg/kg quando
comparado aos animais tratados apenas com salina. *p<0,05 vs grupo controle
tratado com salina. Para análise estatística utilizou-se o teste ANOVA seguido
do teste de Student Newman Keuls.
10
-
10
10
-
9
10
-
8
10
-
7
10
-
6
10
-
5
10
-
4
M
*
*
63
Escores para diarréia
Grupo Mediana (min-máx)
Salina 0(0-0)
CPT-11 45 mg/kg 0(0-3)
CPT-11 60 mg/kg 2(0-3)
CPT-11 75 mg/kg 2,5(2-3)*
Tabela 3– Avaliação da diarréia em camundongos Swiss
CPT-11 induz diarréia em camundongos Swiss. O estudo revela que animais
(Swiss) tratados com CPT-11 na dose de 75 mg/kg apresentaram um aumento
na mediana dos escores atribuídos ao parâmetro diarréia quando comparado
aos animais tratados apenas com salina. * p<0,05 vs grupo salina. Para análise
estatística utilizou-se o teste Kruskal Wallis seguido do teste de Dunn.
64
Salina 45 60 75
0
2500
5000
7500
10000
12500
15000
*
*
*
CPT-11
mg/Kg
Leucócitos totais x
10
3
/mL
Figura 14 – Efeito do CPT-11 sobre a contagem de leucócitos sanguíneos
em camundongos Swiss
Tratamento com CPT-11 induz leucopenia em camundongos Swiss. A figura
apresenta o efeito do CPT-11 sobre o número de leucócitos circulantes,
verificando-se leucopenia em todas as doses testadas, indicando a
manutenção do efeito da droga relativo ao parâmetro hematológico. *p<0,05 vs
animal tratado com salina. Para análise estatística utilizou-se o teste ANOVA
seguido do teste de Student Newman Keuls.
65
4.2. Curva dose-efeito do CPT-11 em camundongos C57BL/6
As fotomicrografias (figura 15) e os escores histopatológicos (tabela 4)
indicam que o CPT-11 na dose de 60 mg/kg/dia, em comparação com animais
tratados apenas com salina (p<0,05), induziu acentuado encurtamento dos
vilos intestinais, necrose e apoptose de células da cripta com intensa
vacuolização de cripta e vilo e infiltração inflamatória na mucosa.
Adicionalmente, houve perda significante do epitélio de revestimento. A análise
morfométrica de duodeno de camundongos C57BL/6 (figura 16) demonstrou
que o CPT-11, nas doses testadas (45 e 60 mg/kg), apresentou redução
significativa (p<0,05) na relação vilo/cripta quando comparados com o controle
tratado apenas com salina. Em adição ao observado na análise morfométrica, a
figura 17 refere que apenas a dose de 60 mg/kg do CPT-11 induziu
significativo (p<0,05) aumento da atividade contrátil do duodeno ao estímulo
com betanecol, verificada in vitro, sendo essa resposta 189% maior que a
contratilidade do duodeno de animais tratados apenas com salina. Os dados
estão de acordo com a análise do grau de diarréia apresentada (tabela 5) onde
se observa que somente a dose de 60 mg/kg induziu significativos eventos
diarréicos (p<0,05) comparado ao grupo tratado somente com salina. Como
apresentado na figura 18, em todas as doses testadas (45 e 60 mg/kg), o CPT-
11 induziu de forma signigicativa (p<0,05) leucopenia nos animais, uma
característica de drogas antineoplásicas.
66
FIGURA 15 - Fotomicrografias de camundongos C57BL/6 injetados com
salina 0,9% ou CPT-11.
Os animais receberam salina ou CPT-11 (45 ou 60 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos e foram sacrificados no quinto dia experimental. O duodeno foi
removido e processado para a técnica de coloração pelo método H&E (100x).
Na mucosa dos animais que receberam CPT-11 (60 mg/kg) os vilos estão
encurtados (setas horizontais), há achatamento e vacuolização de enterócitos
(seta vertical), necrose de criptas (seta diagonal). Nos animais que receberam
CPT-11 45 mg/kg, a mucosa apresenta menor encurtamento de vilos e criptas
com maior preservação. Painel A: Controle salina; Painel B: CPT-11 45 mg/kg;
Painel C: CPT-11 60 mg/kg.
67
Escores histopatológicos
Grupo Mediana (min-máx)
Salina 0(0-0)
CPT-11 45 mg/kg 2(2-2)
CPT-11 60 mg/kg 3(2-4)
*
Tabela 4– Efeito do CPT-11 sobre os aspectos microscópicos duodenais
em camundongos C57BL
CPT-11 induz alterações histopatológicas em duodeno de camundongos
C57BL/6. O Gráfico revela que o CPT-11, na dose de 60 mg/kg, induziu
aumento dos escores histopatológicos comparados com os verificados em
camundongos tratados apenas com salina. *p<0,05 vs grupo tratado com
salina. Para análise estatística utilizou-se o teste Kruskal Wallis seguido do
teste de Dunn.
68
Salina 45 60
0
1
2
3
4
5
*
*
CPT-11
mg/Kg
Relação vilo/cripta
Figura 16 – Efeito do CPT-11 sobre a razão vilo/cripta em camundongos
C57BL/6
CPT-11 induz alterações morfométricas em duodeno de camundongos
C57BL/6. O Gráfico revela que o CPT-11, em todas as doses testadas, induz
redução da razão vilo/cripta comparada com a verificada em camundongos
tratados apenas com salina. *p<0,05 vs grupo tratado com salina. Para análise
estatística utilizou-se o teste ANOVA seguido do teste de Student Newman
Keuls.
69
0
50
100
150
200
250
[BeCh]
%Contração em relação ao KCl
60mM
Salina CPT-11 45 mg/kg CPT-11 60mg/kg
FIGURA 17 – Efeito do CPT-11 sobre a contratilidade duodenal in vitro em
camundongos C57BL/6
Camundongos C57BL/6 apresentam alterações funcionais na contratilidade in
vitro de duodeno ao tratamento com CPT-11. O estudo funcional sobre o
duodeno coletado de animais tratados com CPT-11 revelou um aumento da
responsividade do tecido ao Betanecol (BeCh) na dose de 60 mg/kg quando
comparado aos animais tratados apenas com salina. *p<0,05 vs grupo controle
tratado com salina. Para análise estatística utilizou-se o teste ANOVA seguido
do teste de Student Newman Keuls.
10
-
10
10
-
9
10
-
8
10
-
7
10
-
6
10
-
5
10
-
4
*
M
70
Escores para diarréia
Grupo Mediana (min-máx)
Salina 0(0-0)
CPT-11 45 mg/kg 0,5(0-3)
CPT-11 60 mg/kg 2,5(2-3)*
Tabela 5– Avaliação da diarréia em camundongos C57BL/6
CPT-11 induz diarréia em camundongos C57BL/6. Os animais foram tratados
por 4 dias com salina (5 mL/kg, i.p.) ou CPT-11 (45 ou 60 mg/kg, i.p.) e foram
observados no quinto dia após a primeira dose para determinação do grau de
diarréia apresentado. O estudo revela que animais (C57BL/6) tratados com
CPT-11 na dose de 60 mg/kg apresentaram um aumento na mediana dos
escores atribuídos ao parâmetro diarréia quando comparado aos animais
tratados apenas com salina. * p<0,05 vs grupo salina. Para análise estatística
utilizou-se o teste Kruskal Wallis seguido do teste de Dunn.
71
Salina 45 60
0
2500
5000
7500
10000
12500
15000
*
*
CPT-11
mg/Kg
Leucócitos totais x
10
3
/mL
Figura 18 – Efeito do CPT-11 sobre a contagem de leucócitos sanguíneos
em camundongos C57BL/6
Tratamento com CPT-11 induz leucopenia em camundongos C57BL/6. A figura
apresenta o efeito do CPT-11 sobre o número de leucócitos circulantes,
verificando-se leucopenia em todas as doses testadas, indicando a
manutenção do efeito da droga relativo ao parâmetro hematológico. *p<0,05 vs
animal tratado com salina. Para análise estatística utilizou-se o teste ANOVA
seguido do teste de Student Newman Keuls.
72
4.3. Avaliação da participação da caspase-1 na mucosite induzida
por CPT-11
As fotomicrografias (figura 19) e os escores histopatológicos (tabela 6)
indicam que o CPT-11 na dose de 60 mg/kg/dia, em comparação com animais
WT (C57BL/6) tratados apenas com salina, induziu acentuado achatamento
dos vilos intestinais, necrose e apoptose de células da cripta com intensa
vacuolização de cripta e vilo e infiltração inflamatória na mucosa.
Adicionalmente, houve perda significante da continuidade epitélio de
revestimento. Em animais knockout para caspase-1, caspase-1
-/-
, aos quais foi
administrado CPT-11, observaram-se grandes áreas de vacuolização em
criptas e presença de células apoptóticas, bem como acentuado encurtamento
de vilos em algumas regiões e preservação em outras quando comparados aos
correspondentes knockout tratados apenas com salina. Contudo, baseado nos
critérios adotados por Woo et al. (2000) houve marcante perda de arquitetura
tecidual. A análise morfométrica (figura 20) revelou que o tratamento dos
animais selvagens (Caspase-1 WT) com CPT-11 (60 mg/kg, i.p.) induziu uma
significativa redução (p<0,05) na razão vilo/cripta quando comparados com
animais selvagens tratados somente com salina. A figura 20 apresenta
também que animais caspase-1
-/-
que receberam CPT-11, não desenvolveram
alterações nesses parâmetros em comparação com animais knockout tratados
apenas com salina. O efeito pro-inflamatório do CPT-11 (60 mg/kg, i.p.) sobre o
duodeno foi detectado pelo aumento significativo (p<0,05) da atividade de
MPO, como apresentado na figura 21, e da atividade de óxido nítrico sintase
induzida (iNOS), figura 22, em animais selvagens (caspase-1 wt) comparados
com animais selvagens tratados somente com salina (5 mL/kg, i.p). Esses
efeitos não foram verificados nos animais caspase-1
-/-
, a despeito do
tratamento com CPT-11, (p>0,05) comparados com animais knockout que
receberam somente salina. O estudo de contratilidade in vitro (figura 23) e a
análise do grau de diarréia apresentado (tabela 7) demonstraram que o CPT-
11 induziu significativas alterações funcionais, que levam à diarréia, em
animais caspase-1 WT quando comparado com o grupo selvagem tratado
apenas com salina (p<0,05). Porém, a administração do CPT-11 a animais
caspase-1
-/-
não foi capaz de induzir alterações funcionais ou diarréia, quando
73
comparado ao grupo knockout que recebeu apenas salina (p>0,05). Entretanto,
o CPT-11 induziu significativa leucopenia (figura 24) tanto em animais
selvagens (caspase-1 WT) como em animais knockout, comparados com os
respectivos controles tratados apenas com salina (p<0,05).
74
FIGURA 19 - Fotomicrografias do duodeno de camundongos Caspase-1
knockout injetados com salina 0,9% ou CPT-11.
Os animais receberam salina ou CPT-11 (60 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos e foram sacrificados no quinto dia experimental. O duodeno foi
removido e processado para a técnica de coloração pelo método H&E (100x).
Na mucosa dos animais caspase-1 WT que receberam CPT-11 (60 mg/kg) os
vilos estão encurtados (setas horizontais), há achatamento e vacuolização de
enterócitos (seta vertical), necrose de criptas (seta diagonal). Em animais
caspase-1 knockout (caspase-1
-/-
) há perda localizada de vilos e intensa
necrose de criptas (seta diagonal). Painel A: Caspase-1 WT+salina; Painel B:
Caspase-1 WT+CPT-11 60 mg/kg; Painel C: Caspase-1
-/-
+salina; Painel D:
Caspase-1
-/-
+CPT-11 60 mg/kg
75
Escores histopatológicos
Grupo Mediana (min-máx)
Caspase-1 WT 0(0-0)
Caspase-1 WT + CPT-11 60 mg/kg 3(2-4)
a
Caspase-1
-/-
0(0-0)
Caspase-1
-/-
+ CPT-11 60 mg/kg 4(3-4)
b
Tabela 6– Efeito do CPT-11 sobre os aspectos microscópicos duodenais
em camundongos caspase-1
-/-
Camundongos caspase-1
-/-
apresentam alterações histopatológicas no
duodeno secundárias à injeção CPT-11. A análise revelou que o tratamento
dos animais selvagens (C57BL/6-Caspase-1 WT) com CPT-11 induz aumento
dos escores histopatológicos quando comparados com animais selvagens
tratados somente com salina. A figura apresenta também que animais caspase-
1
-/-
, que receberam CPT-11, desenvolvem alterações nesses parâmetros em
comparação com animais knockout tratados apenas com salina.
a
p<0,05 vs
grupo caspase-1 WT tratado com salina;
b
p<0,05 vs grupo caspase-1
-/-
tratado
com salina. Para análise estatística utilizou-se o teste Kruskal Wallis seguido
do teste de Dunn.
76
0
1
2
3
4
Caspase-1 WT
Caspase-1 -/-
*
Relação vilo/cripta
Salina
SalinaCPT-11
60mg/kg
CPT-11
60mg/kg
Figura 20 – Efeito do CPT-11 sobre a razão vilo/cripta em camundongos
Caspase-1
-/-
Camundongos caspase-1
-/-
não desenvolvem alterações morfométricas
histopatológicas no duodeno secundárias à injeção CPT-11. A análise
morfométrica revelou que o tratamento dos animais selvagens (C57BL/6-
Caspase-1 WT) com CPT-11 induz uma redução na razão vilo/cripta quando
comparados com animais selvagens tratados somente com salina. A figura
apresenta também que animais caspase-1
-/-
, que receberam CPT-11, não
desenvolvem alterações nesses parâmetros em comparação com animais
knockout tratados apenas com salina. * p<0,05 vs grupo caspase-1 WT tratado
com salina. Para análise estatística utilizou-se o teste ANOVA seguido do teste
de Student Newman Keuls.
77
0
5000
10000
15000
Caspase-1 WT Caspase-1 -/-
Salina
SalinaCPT-11
60mg/kg
CPT-11
60mg/kg
Atividade de MPO
neutrófilos/mg de tecido
*
FIGURA 21 – Efeito do CPT-11 sobre a atividade de mieloperoxidase em
duodeno de camundongos Caspase-1
-/-
Animais caspase-1
-/-
não apresentam aumento da atividade de MPO no
duodeno por tratamento com CPT-11. O efeito pro-inflamatório do CPT-11 no
duodeno foi detectado pelo aumento da atividade de MPO em animais
selvagens tratados com o antineoplásico comparados com animais selvagens
tratados somente com salina. Esse efeito não foi verificado nos animais
caspase-1
-/-
, a despeito do tratamento com CPT-11. *p<0,05 vs grupo caspase-
1 selvagem (C57BL/6 - caspase-1 WT) tratado com salina. Para análise
estatística utilizou-se o teste ANOVA seguido do teste de Student Newman
Keuls.
78
0.000
0.025
0.050
0.075
Salina
SalinaCPT-11 CPT-11
Caspase-1 WT
Caspase-1 -/-
*
Citrulina
(pM/min/mg proteina)
FIGURA 22 – Efeito do CPT-11 sobre a atividade de iNOS duodenal em
camundongos caspase-1
-/-
Animais caspase-1
-/-
não desenvolvem aumento da atividade de iNOS a
despeito da injeção de CPT-11. O teste revelou que o tratamento dos animais
selvagens (C57BL/6-WT) com CPT-11 induz um aumento na atividade da
enzima quando comparado com animais selvagens tratados somente com
salina. A figura apresenta também que animais caspase-1
-/-
, que receberam
CPT-11, não desenvolvem aumento da atividade de iNOS em comparação com
animais knockout tratados apenas com salina. *p<0,05 vs Caspase-1 WT
tratados com salina. Para análise estatística utilizou-se o teste ANOVA seguido
do teste de Student Newman Keuls.
79
0
30
60
90
120
150
180
[ACh]
% contração em relação ao
KCl 60mM
Caspase-1 WT Caspase-1 WT+ CPT-11 60 mg/kg
Caspase-1 -/- Caspase-1 -/- + CPT-11 60mg/kg
FIGURA 23 – Efeito do CPT-11 sobre a contratilidade duodenal in vitro em
camundongos caspase-1
-/-
Deleção para Caspase-1 é fator protetor contra alterações funcionais de
duodeno induzidas por CPT-11. O estudo funcional do duodeno coletado de
animais selvagens tratados com CPT-11 (caspase-1 WT+CPT-11) revelou um
aumento da responsividade do tecido à Acetilcolina (ACh) quando comparado
aos animais tratados apenas com salina (Caspase-1 WT). Contudo, a
administração do CPT-11 aos animais caspase-1
-/-
não foi capaz de promover
alterações funcionais em comparação com animais knockout para o mesmo
gene tratados somente com salina (caspase-1
-/-
). *p<0,05 vs grupo caspase-1
selvagem (C57BL/6, WT) tratado com salina. Para análise estatística utilizou-se
o teste ANOVA seguido do teste de Student Newman Keuls.
10
-
10
10
-
9
10
-
8
10
-
7
10
-
6
10
-
5
10
-
4
M
*
80
Escores para diarréia
Grupo Mediana (min-máx)
Caspase-1 WT 0(0-0)
Caspase-1 WT + CPT-11 60
mg/kg
3(1-3)
*
Caspase-1
-/-
0(0-0)
Caspase-1
-/-
+ CPT-11 60 mg/kg 1,5(1-3)
Tabela 7– Avaliação da diarréia em camundongos caspase-1
-/-
Animais caspase-1
-/-
não desenvolvem diarréia induzida por CPT-11. O estudo
revela que animais selvagens (C57BL/6, WT) tratados com CPT-11
apresentaram um aumento na mediana dos escores atribuídos ao parâmetro
diarréia quando comparado aos animais selvagens tratados apenas com salina
(caspase-1 WT). Contudo, a administração do CPT-11 aos animais caspase-1
-/-
não foi capaz de promover aumentos significativos na mediana dos escores em
comparação com animais knockout tratados somente com salina.* p<0,05 vs
grupo caspase-1 WT. Para análise estatística utilizou-se o teste Kruskal Wallis
seguido do teste de Dunn.
81
0
5000
10000
15000
Caspase-1 WT Caspase-1 -/-
Salina
SalinaCPT-11
60mg/kg
CPT-11
60mg/kg
a
b
Leucócitosx10
3
/mL
Figura 24 – Efeito do CPT-11 sobre a contagem de leucócitos sanguíneos
em camundongos Caspase-1
-/-
Tratamento com CPT-11 induz leucopenia em camundongos Caspase-1
-/-
. A
figura apresenta o efeito do CPT-11 em induzir leucopenia tanto em animais
selvagens (C57BL/6-WT) como em animais knockout para caspase-1 indicando
a manutenção do efeito da droga sobre a redução do número de leucócitos
circulantes a despeito do tipo de animal.
a
p<0,05 vs grupo Caspase-1 Wild
Type;
b
p<0,05 vs grupo caspase-1
-/-
. Para análise estatística utilizou-se o teste
ANOVA seguido do teste de Student Newman Keuls.
82
4.4. Avaliação do efeito do tratamento de camundongos com o
antagonista do receptor de IL-1 (IL-1Ra) sobre a mucosite induzida por
CPT-11
As fotomicrografias (figura 25) e os escores histopatológicos (tabela 8)
indicam que o CPT-11 na dose de 60 mg/kg/dia, em comparação com animais
BALB/c tratados apenas com salina, induziu em animais tratados ou não com
IL-1Ra acentuado encurtamento dos vilos intestinais, necrose e apoptose de
células da cripta, vacuolização de cripta e vilo e infiltração inflamatória na
mucosa. Adicionalmente, houve perda significante da continuidade do epitélio
de revestimento. A análise morfométrica (figura 26) revelou que o tratamento
dos animais com CPT-11 (60 mg/kg, i.p.), e que receberam o veículo da IL-1Ra
(H
2
0
dest
) ou IL-1Ra (50 mg/kg,s.c., 2x ao dia), induziu uma significativa redução
(p<0,05) na razão vilo/cripta quando comparados com os respectivos animais
controle tratados somente com salina. O efeito pro-inflamatório do CPT-11 (60
mg/kg, i.p.) sobre o duodeno foi detectado pelo aumento significativo (p<0,05)
da atividade de MPO, como apresentado na figura 27, tanto em animais
tratados com o veículo da IL-1Ra com nos que receberam IL-1Ra, comparados
com os respectivos grupos controle tratados somente com salina (5 mL/kg, i.p).
O estudo de contratilidade in vitro (figura 28) e a análise do grau de diarréia
apresentado (tabela 9) demonstraram que o CPT-11 induz significativas
alterações funcionais, que levam à diarréia, em animais tratados com o veículo
da IL-1Ra (H
2
0
dest
) e nos tratados com IL-1Ra, quando comparados com os
respectivos grupos tratados apenas com salina (p<0,05). Adicionalmente, o
CPT-11 induziu significativa leucopenia (figura 29) tanto em animais tratados
com o veículo da IL-1Ra (H
2
0
dest
) como com IL-1Ra, comparados com os
respectivos controles tratados apenas com salina (p<0,05).
83
FIGURA 25 - Fotomicrografias do duodeno de camundongos tratados com
IL-1Ra injetados com salina 0,9% ou CPT-11.
Os animais receberam salina ou CPT-11 (60 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos e foram sacrificados no quinto dia experimental. O duodeno foi
removido e processado para a técnica de coloração pelo método H&E (100x).
Na mucosa dos animais que receberam CPT-11 (60 mg/kg) tratados ou não
com IL-1Ra, os vilos estão encurtados (setas horizontais), há achatamento e
vacuolização de enterócitos (seta vertical), necrose de criptas (seta diagonal).
Painel A: salina; Painel B: CPT-11 60 mg/kg ; Painel C: IL-1Ra
+salina ;
Painel D: IL-1Ra +CPT-11 60 mg/kg
84
Escores histopatológicos
Grupo Mediana (min-máx)
Salina 0(0-0)
CPT-11 60 mg/kg 3(1-4)
a
IL-1Ra 0(0-1)
IL-1Ra + CPT-11 60 mg/kg 4(3-4)
b
Tabela 8– Efeito do CPT-11 sobre os aspectos microscópicos duodenais
em camundongos tratados com IL-1Ra
IL-1ra não previne o desenvolvimento de alterações histopatológicas no
duodeno secundárias à injeção CPT-11. A análise revelou que o a injeção de
CPT-11 a animais tratados ou não com IL-1Ra induz aumento dos escores
histopatológicos quando comparados com animais tratados somente com
salina ou IL-1Ra.
a
p<0,05 vs grupo tratado com salina e veículo de IL-1Ra, que
não recebeu CPT-11;
b
p<0,05 vs grupo salina tratado com IL-1Ra e que
recebeu CPT-11. Para análise estatística utilizou-se o teste Kruskal Wallis
seguido do teste de Dunn.
85
0
1
2
3
Veículo IL1-Ra
a
b
Salina
SalinaCPT-11
60mg/kg
CPT-11
60mg/kg
Razão vilo/cripta
Figura 26 – Efeito do CPT-11 sobre a razão vilo/cripta em camundongos
tratados com IL-1Ra
IL-1ra não previne o desenvolvimento de alterações morfométricas
histopatológicas no duodeno secundárias à injeção CPT-11. A análise
morfométrica revelou que o a injeção de CPT-11 a animais tratados ou não
com IL-1Ra induz uma redução na razão vilo/cripta quando comparados com
animais tratados somente com salina e que receberam veículo ou IL-1Ra.
a
p<0,05 vs grupo tratado com salina e veículo de IL-1Ra, que não recebeu
CPT-11;
b
p<0,05 vs grupo salina tratado com IL-1Ra e que recebeu CPT-11.
Para análise estatística utilizou-se o teste ANOVA seguido do teste de Student
Newman Keuls.
86
0
2500
5000
7500
Veículo IL-1ra
a
b
Salina
SalinaCPT-11
60mg/kg
CPT-11
60mg/kg
Atividade de MPO
neutrófilos/mg de tecido
FIGURA 27 – Efeito do CPT-11 sobre a atividade de mieloperoxidase em
duodeno de camundongos tratados com IL-1Ra
Tratamento com IL-1Ra
não previne aumento da atividade de MPO no duodeno
na mucosite por CPT-11. O efeito pro-inflamatório do CPT-11 no duodeno foi
detectado pelo aumento da atividade de MPO em animais tratados com o
antineoplásico comparados com animais tratados somente com salina, tanto
em animais que receberam ou não o IL-1Ra.
a
p<0,05 vs grupo salina i.p tratado
com veículo (Salina s.c.);
b
p<0,05 vs IL-1Ra que não recebeu CPT-11. Para
análise estatística utilizou-se o teste ANOVA seguido do teste de Student
Newman Keuls.
87
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
[ACh]
%Contração em relação ao KCl
60mM
Salina CPT-11 IL-1ra IL-1ra + CPT-11
FIGURA 28 – Efeito do CPT-11 sobre a contratilidade duodenal in vitro em
camundongos tratados com IL-1Ra
Tratamento de camundongos com IL-1Ra não previne o desenvolvimento de
alterações funcionais de duodeno induzidas por CPT-11. O estudo funcional do
duodeno coletado de animais tratados ou não com IL-1Ra e que receberam
CPT-11 revelou um aumento da responsividade do tecido à Acetilcolina (ACh)
quando comparado aos animais tratados apenas com salina ou com IL-1Ra.
a
p<0,05 vs grupo salina i.p tratado com veículo (Salina s.c.);
b
p<0,05 vs IL-1Ra
que não recebeu CPT-11. Para análise estatística utilizou-se o teste ANOVA
seguido do teste de Student Newman Keuls.
10
-
10
10
-
9
10
-
8
10
-
7
10
-
6
10
-
5
10
-
4
M
a
b
a
b
88
Escores para diarréia
Grupo Mediana (min-máx)
Salina 0(0-0)
CPT-11 60 mg/kg 2(2-3)
a
IL-1Ra 0(0-0)
IL-1Ra + CPT-11 60 mg/kg 2(2-3)
b
Tabela 9– Avaliação da diarréia em camundongos tratados com IL-1Ra
Tratamento de animais com IL-1Ra não previne o desenvolvimento de diarréia
induzida por CPT-11. O estudo revela que animais que receberam salina ou IL-
1Ra e que foram tratados com CPT-11 apresentaram um aumento na mediana
dos escores atribuídos ao parâmetro diarréia quando comparado aos animais
que não receberam o antineoplásico.
a
p<0,05 vs grupo salina i.p tratado com
veículo (Salina s.c.);
b
p<0,05 vs IL-1Ra que não recebeu CPT-11. Para análise
estatística utilizou-se o teste Kruskal Wallis seguido do teste de Dunn.
89
0
3000
6000
9000
12000
Veículo IL-1ra
Leucócitosx10
3
/mL
a
b
Salina
Salina
CPT-11
60mg/kg
CPT-11
60mg/kg
Figura 29 – Efeito do CPT-11 sobre a contagem de leucócitos sanguíneos
em camundongos tratados com IL-1Ra
Tratamento com CPT-11 induz leucopenia em camundongos tratados com IL-
1Ra. A figura apresenta o efeito do CPT-11 em induzir leucopenia tanto em
animais selvagens (BALB/c, WT) como em animais tratados com IL-1Ra
indicando a manutenção do efeito da droga na redução do número de
leucócitos circulantes.
a
p<0,05 vs grupo salina i.p tratado com veículo (Salina
s.c.);
b
p<0,05 vs IL-1Ra que não recebeu CPT-11 (60 mg/kg i.p.). Para análise
estatística utilizou-se o teste ANOVA seguido do teste de Student Newman
Keuls.
90
4.5. Avaliação da participação da IL-18 na mucosite induzida por
CPT-11
As fotomicrografias (figura 30) e os escores histopatológicos (tabela 10)
indicam que o CPT-11 na dose de 60 mg/kg/dia, em comparação com animais
WT (BALB/c) tratados apenas com salina, induziu acentuado achatamento dos
vilos intestinais, necrose e apoptose de células da cripta com intensa
vacuolização de cripta e vilo e infiltração inflamatória na mucosa.
Adicionalmente, houve perda significante da continuidade epitélio de
revestimento. Em animais knockout para interleucina-18, IL-18
-/-
, aos quais foi
administrado CPT-11, observou-se preservação da arquitetura de criptas e
vilos, poucas células apoptóticas, bem como manutenção da continuidade do
epitelio de revestimento quando comparado aos correspondentes knockout
tratados apenas com salina. A análise morfométrica (figura 31) revelou que o
tratamento dos animais selvagens (IL-18 WT) com CPT-11 (60 mg/kg, i.p.)
induziu uma significativa redução (p<0,05) na razão vilo/cripta quando
comparados com animais selvagens tratados somente com salina. A figura 31
apresenta também que animais IL-18
-/-
, que receberam CPT-11, não
desenvolveram alterações nesses parâmetros em comparação com animais
knockout tratados apenas com salina. O efeito pro-inflamatório do CPT-11 (60
mg/kg, i.p.) sobre o duodeno foi detectado pelo aumento significativo (p<0,05)
da atividade de MPO, como apresentado na figura 32, e da atividade de óxido
nítrico sintase induzida (iNOS), figura 33, em animais selvagens (IL-18 WT)
comparados com animais selvagens tratados somente com salina (5 mL/kg,
i.p). Esses efeitos não foram verificados nos animais IL-18
-/-
, a despeito do
tratamento com CPT-11 (p>0,05), comparados com animais knockout que
receberam somente salina. O estudo de contratilidade in vitro (figura 34) e a
análise do grau de diarréia apresentado (tabela 11) demonstraram que o CPT-
11 induz significativas alterações funcionais, que levam à diarréia, em animais
IL-18 WT quando comparado com o grupo selvagem tratado apenas com salina
(p<0,05). Porém, a administração do CPT-11 a animais IL-18
-/-
não foi capaz de
induzir alterações funcionais ou diarréia, quando comparado ao grupo knockout
que recebeu apenas salina (p>0,05). Entretanto, o CPT-11 induziu significativa
91
leucopenia (figura 35) tanto em animais selvagens (IL-18 WT) como em
animais knockout, comparados com os respectivos controles tratados apenas
com salina (p<0,05).
92
FIGURA 30 - Fotomicrografias do duodeno de camundongos IL-18
knockout injetados com salina 0,9% ou CPT-11.
Os animais receberam salina ou CPT-11 (60 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos e foram sacrificados no quinto dia experimental. O duodeno foi
removido e processado para a técnica de coloração pelo método H&E (100x).
Na mucosa dos animais IL-18 WT que receberam CPT-11 (60 mg/kg) os vilos
estão encurtados (setas horizontais), há achatamento e vacuolização de
enterócitos (seta vertical), necrose de criptas (seta diagonal). Em animais IL-18
knockout (IL-18
-/-
) há maior preservação da arquitetura tecidual com necrose
focal de criptas (seta diagonal). Painel A: IL-18 WT+salina; Painel B: IL-18
WT+CPT-11 60 mg/kg; Painel C: IL-18
-/-
+salina; Painel D: IL-18
-/-
+CPT-11 60
mg/kg
93
Escores histopatológicos
Grupo Mediana (min-máx)
IL-18 WT 0(0-0)
IL-18 WT + CPT-11 60 mg/kg 3(1-4)
*
IL-18
-/-
0(0-0)
IL-18
-/-
+ CPT-11 60 mg/kg 1,5(1-4)
Tabela 10 – Efeito do CPT-11 sobre os aspectos microscópicos duodenais
em camundongos IL-18
-/-
Camundongos IL-18
-/-
não desenvolvem alterações histopatológicas no
duodeno secundárias à injeção CPT-11. A análise revelou que o tratamento
dos animais selvagens (BALB/c, WT) com CPT-11 induz aumento nos escores
histopatológicos quando comparados com animais selvagens tratados somente
com salina. A figura apresenta também que animais IL-18
-/-
, que receberam
CPT-11, não desenvolvem alterações nesses parâmetros em comparação com
animais knockout tratados apenas com salina. * p<0,05 vs grupo IL-18 WT
tratado com salina. Para análise estatística utilizou-se o teste Kruskal Wallis
seguido do teste de Dunn.
94
0
1
2
3
4
*
CPT-11
60 mg/kg
CPT-11
60 mg/kg
Salina
Salina
IL-18 WT
IL-18-/-
Razão vilo/cripta
Figura 31 – Efeito do CPT-11 sobre a razão vilo/cripta em camundongos
IL-18
-/-
Camundongos IL-18
-/-
não desenvolvem alterações morfométricas
histopatológicas no duodeno secundárias à injeção CPT-11. A análise
morfométrica revelou que o tratamento dos animais selvagens (BALB/c, WT)
com CPT-11 induz uma redução na razão vilo/cripta quando comparados com
animais selvagens tratados somente com salina. A figura apresenta também
que animais IL-18
-/-
, que receberam CPT-11, não desenvolvem alterações
nesses parâmetros em comparação com animais knockout tratados apenas
com salina. * p<0,05 vs grupo IL-18 WT tratado com salina. Para análise
estatística utilizou-se o teste ANOVA seguido do teste de Student Newman
Keuls.
95
0
4000
8000
12000
16000
20000
wild type
IL-18-/-
Salina
SalinaCPT-11
60mg/kg
CPT-11
60mg/kg
*
Atividade de MPO
Neutrófilos/mg de tecido
FIGURA 32 – Efeito do CPT-11 sobre a atividade de mieloperoxidase em
duodeno de camundongos IL-18
-/-
Animais IL-18
-/-
não apresentam aumento da atividade de MPO no duodeno por
tratamento com CPT-11. O efeito pro-inflamatório do CPT-11 no duodeno foi
detectado pelo aumento da atividade de MPO em animais selvagens tratados
com o antineoplásico (IL-18 WT+CPT-11) comparados com animais selvagens
tratados somente com salina (IL-18 WT). Esse efeito não foi verificado nos
animais IL-18
-/-
, a despeito do tratamento com CPT-11. *p<0,05 vs grupo IL-18
selvagem (BALB/c, WT) tratado com salina. Para análise estatística utilizou-se
o teste ANOVA seguido do teste de Student Newman Keuls.
96
0.000
0.025
0.050
0.075
Salina
SalinaCPT-11
60mg/kg
CPT-11
60mg/kg
IL-18 wt
IL-18-/-
*
Citrulina
(pM/min/mg proteina)
FIGURA 33 – Efeito do CPT-11 sobre a atividade de iNOS duodenal em
camundongos IL-18
-/-
Animais IL-18
-/-
não desenvolvem aumento da atividade de iNOS a despeito da
injeção de CPT-11. O teste revelou que o tratamento dos animais selvagens
(BALB/c, WT) com CPT-11 induz um aumento na atividade da enzima quando
comparado com animais selvagens tratados somente com salina. A figura
apresenta também que animais IL-18
-/-
, que receberam CPT-11, não
desenvolvem aumento da atividade de iNOS em comparação com animais
knockout tratados apenas com salina. *p<0,05 vs IL-18 WT tratados com
salina. Para análise estatística utilizou-se o teste ANOVA seguido do teste de
Student Newman Keuls.
97
0
50
100
150
200
250
300
350
400
[ACh]
% Contração em relação ao
KCl60mM
IL18WT IL18WT+CPT-11 IL18-/- IL18-/- +CPT-11
FIGURA 34 – Efeito do CPT-11 sobre a contratilidade duodenal in vitro em
camundongos IL-18
-/-
Deleção para IL-18 é fator protetor contra alterações funcionais de duodeno
induzidas por CPT-11. O estudo funcional do duodeno coletado de animais
selvagens tratados com CPT-11 (IL-18 WT+CPT-11) revelou um aumento da
responsividade do tecido à Acetilcolina (ACh) quando comparado aos animais
tratados apenas com salina (IL-18 WT). Contudo, a administração do CPT-11
aos animais IL-18
-/-
não foi capaz de promover alterações funcionais em
comparação com animais knockout para o mesmo gene tratados somente com
salina (IL-18
-/-
). *p<0,05 vs grupo IL-18 selvagem (BALB/c, WT) tratado com
salina. Para análise estatística utilizou-se o teste ANOVA seguido do teste de
Student Newman Keuls.
10
-
10
10
-
9
10
-
8
10
-
7
10
-
6
10
-
5
10
-
4
M
*
*
*
*
98
Escores para diarréia
Grupo Mediana (min-máx)
IL-18 WT 0(0-0)
IL-18 WT + CPT-11 60 mg/kg 1(1-2)
*
IL-18
-/-
0(0-0)
IL-18
-/-
+ CPT-11 60 mg/kg 0(0-2)
Tabela 11 – Avaliação da diarréia em camundongos IL-18
-/-
Animais IL-18
-/-
não desenvolvem diarréia induzida por CPT-11. O estudo
revela que animais selvagens (BALB/c, WT) tratados com CPT-11
apresentaram um aumento na mediana dos escores atribuídos ao parâmetro
diarréia quando comparado aos animais selvagens tratados apenas com salina
(IL-18 WT). Contudo, a administração do CPT-11 aos animais IL-18
-/-
não foi
capaz de promover aumentos significativos na mediana dos escores em
comparação com animais knockout tratados somente com salina.* p<0,05 vs
grupo IL-18 WT. Para análise estatística utilizou-se o teste Kruskal Wallis
seguido do teste de Dunn.
99
0
2500
5000
7500
10000
a
CPT-11
60 mg/kg
CPT-11
60 mg/kg
b
IL18 WT
IL18-/-
Salina
Salina
Leucócitos x 10
3
/mL
Figura 35 – Efeito do CPT-11 sobre a contagem de leucócitos sanguíneos
em camundongos IL-18
-/-
Tratamento com CPT-11 induz leucopenia em camundongos IL-18
-/-
. A figura
apresenta o efeito do CPT-11 em induzir leucopenia tanto em animais
selvagens (BALB/c, WT) como em animais knockout para IL-18 indicando a
manutenção do efeito da droga sobre a redução do número de leucócitos
circulantes a despeito do tipo de animal.
a
p<0,05 vs grupo IL-18 Wild Type não
tratado com CPT-11;
b
p<0,05 vs grupo IL-18
-/-
não tratado com CPT-11. Para
análise estatística utilizou-se o teste ANOVA seguido do teste de Student
Newman Keuls.
100
4.6. Avaliação do efeito do tratamento de camundongos com a
proteína ligante de IL-18 (IL-18bp) sobre a mucosite induzida por CPT-11
As fotomicrografias (figura 36) e os escores histopatológicos (tabela 12)
indicam que o CPT-11 na dose de 60 mg/kg/dia, em comparação com animais
BALB/c tratados apenas com salina, induziu acentuado achatamento dos vilos
intestinais, necrose e apoptose de células da cripta com intensa vacuolização
de cripta e vilo e infiltração inflamatória na mucosa. Adicionalmente, houve
perda significante da continuidade epitélio de revestimento. Em animais
tratados com proteína ligante de IL-18, IL-18bp, aos quais foi administrado
CPT-11, observou-se preservação da arquitetura de criptas e vilos, poucas
células apoptóticas, bem como manutenção da continuidade do epitelio de
revestimento quando comparado aos animais tratados apenas com CPT-11. A
análise morfométrica (figura 37) revelou que o tratamento dos animais com
CPT-11 (60 mg/kg, i.p.) induz uma significativa redução (p<0,05) na razão
vilo/cripta quando comparados com animais tratados somente com salina.
Porém, a administração de IL-18bp confere significativa proteção contra as
alterações morfométricas (p<0,05) induzidas por CPT-11, comparada com o
grupo tratado apenas com CPT-11. O efeito pro-inflamatório do CPT-11 (60
mg/kg, i.p.) sobre o duodeno foi detectado pelo aumento significativo (p<0,05)
da atividade de MPO, como apresentado na figura 38, e da atividade de óxido
nítrico sintase induzida (iNOS), figura 39, comparados com animais tratados
somente com salina (5 mL/kg, i.p). Esses efeitos foram atenuados nos animais
que receberam IL-18bp, a despeito do tratamento com CPT-11 (p<0,05),
comparados com animais que receberam somente CPT-11. O estudo de
contratilidade in vitro (figura 40) e a análise do grau de diarréia apresentado
(tabela 13) demonstraram que o CPT-11 induz significativas alterações
funcionais, que levam à diarréia, quando comparado com o grupo tratado
apenas com salina (p<0,05). Porém, verificou-se um grau significantemente
atenuado de alteração ao nível funcional e de diarréia apresentados pelos
animais quando administrada IL-18bp em comparação com o grupo que
recebeu apenas CPT-11 (p<0,05). Entretanto, o CPT-11 induziu significativa
leucopenia (figura 41) tanto em animais tradados com salina como nos que
101
receberam IL-18bp, comparados com o controle tratado apenas com salina
(p<0,05).
102
FIGURA 36 - Fotomicrografias do duodeno de camundongos tratados com
IL-18bp e injetados com salina 0,9% ou CPT-11.
Os animais receberam salina ou CPT-11 (60 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos e foram sacrificados no quinto dia experimental. O duodeno foi
removido e processado para a técnica de coloração pelo método H&E (100x).
Na mucosa dos animais que receberam CPT-11 (60 mg/kg) não tratados com
IL-18bp, os vilos estão encurtados (setas horizontais), há achatamento e
vacuolização de enterócitos (seta vertical), necrose de criptas (seta diagonal).
Em animais tratados com IL-18bp, apesar de receberem CPT-11, há
preservação da arquitetura tecidual. Painel A: salina; Painel B: CPT-11 60
mg/kg; Painel C: IL-18bp+CPT-11 60 mg/kg
103
Escores histopatológicos
Grupo Mediana (min-máx)
Salina 0(0-0)
CPT-11 60 mg/kg 3(1-4)
*
IL-18bp + CPT-11 60 mg/kg 2(1-2)
Tabela 12 – Efeito do CPT-11 sobre os aspectos microscópicos duodenais
em camundongos tratados com IL-18bp
IL-18bp previne o desenvolvimento de alterações histopatológicas no duodeno
secundárias à injeção CPT-11. A análise revelou que a injeção de CPT-11
induz aumento dos escores histopatológicos quando comparados com animais
tratados somente com salina. A figura apresenta também que animais pré-
tratados com IL-18bp e que receberam CPT-11 não desenvolvem alterações
intensas nesses parâmetros em comparação com animais pré-tratados apenas
com salina.
*
p<0,05 vs grupo tratado com salina, que não recebeu CPT-11.
Para análise estatística utilizou-se o teste Kruskal Wallis seguido do teste de
Dunn.
104
0
1
2
3
Salina
Salina IL-18bp
CPT-11
a
b
Razão vilo/cripta
Figura 37 – Efeito do CPT-11 sobre a razão vilo/cripta em camundongos
tratados com IL-18bp
IL-18bp previne o desenvolvimento de alterações morfométricas
histopatológicas no duodeno secundárias à injeção CPT-11. A análise
morfométrica revelou que o a injeção de CPT-11 induz uma redução na razão
vilo/cripta quando comparados com animais tratados somente com salina. A
figura apresenta também que animais pré-tratados com IL-18bp e que
receberam CPT-11 não desenvolvem alterações profundas nesses parâmetros
em comparação com animais pré-tratados apenas com salina e que receberam
CPT-11.
a
p<0,05 vs grupo tratado com salina, que não recebeu CPT-11;
b
p<0,05 vs grupo salina que recebeu CPT-11. Para análise estatística utilizou-
se o teste ANOVA seguido do teste de Student Newman Keuls.
105
0
2500
5000
7500
a
b
Atividade de MPO
neutrófilos/mg de tecido
Salina
CPT-11
IL-18bp
Salina
FIGURA 38 – Efeito do CPT-11 sobre a atividade de mieloperoxidase em
duodeno de camundongos tratados com IL-18bp
Animais tratados com IL-18bp não apresentam aumento da atividade de MPO
no duodeno por tratamento com CPT-11. O efeito pro-inflamatório do CPT-11
no duodeno foi detectado pelo aumento da atividade de MPO em animais
tratados somente com o antineoplásico e pré-tratados com salina (salina+CPT-
11) comparados com animais tratados somente com salina. Esse efeito não foi
verificado nos animais pré-tratados com IL-18bp, a despeito do tratamento com
CPT-11. *p<0,05 vs grupo tratado com salina que não recebeu CPT-11. Para
análise estatística utilizou-se o teste ANOVA seguido do teste de Student
Newman Keuls.
106
0.000
0.025
0.050
0.075
Salina
Salina
CPT-11
IL-18bp
a
b
Citrulina
(pM/min/mg proteina)
FIGURA 39 – Efeito do CPT-11 sobre a atividade de iNOS duodenal em
camundongos tratados com IL-18bp
Animais tratados com IL-18bp não desenvolvem aumento da atividade de iNOS
a despeito da injeção de CPT-11. O teste revelou que o tratamento dos animais
com CPT-11 (salina+CPT-11) induz um aumento na atividade da enzima
quando comparado com animais tratados somente com salina. A figura
apresenta também que animais tratados com IL-18bp, que receberam CPT-11,
não desenvolvem aumento da atividade de iNOS em comparação com animais
pré-tratados apenas com salina e que receberam CPT-11.
a
p<0,05 vs salina;
b
p<0,05 vs CPT-11. Para análise estatística utilizou-se o teste ANOVA seguido
do teste de Student Newman Keuls.
107
0
50
100
150
200
250
[ACh]
% Contração em relação ao
KCl 60mM
Salina CPT-11 IL-18bp + CPT-11
FIGURA 40 – Efeito do CPT-11 sobre a contratilidade duodenal in vitro em
camundongos tratados com IL-18bp
Tratamento com IL-18bp confere proteção contra alterações funcionais de
duodeno induzidas por CPT-11. O estudo funcional do duodeno coletado de
animais tratados com CPT-11 (salina+CPT-11) revelou um aumento da
responsividade do tecido à Acetilcolina (ACh) quando comparado aos animais
tratados apenas com salina. Contudo, a administração do CPT-11 aos animais
pré-tratados com IL-18bp (IL-18bp + CPT-11) não foi capaz de promover
alterações funcionais em comparação com animais tratados somente com
salina e que receberam CPT-11.
a
p<0,05 vs grupo tratado com salina não
tratados com CPT-11;
*
p<0,05 vs grupo tratado com salina e que receberam
CPT-11. Para análise estatística utilizou-se o teste ANOVA seguido do teste de
Student Newman Keuls.
10
-
10
10
-
9
10
-
8
10
-
7
10
-
6
10
-
5
10
-
4
M
a
a
*
*
108
Escores para diarréia
Grupo Mediana (min-máx)
Salina 0(0-0)
CPT-11 60 mg/kg 3(1-3)
a
IL-18bp+CPT-11 60 mg/kg 1(0-2)
b
Tabela 13 – Avaliação da diarréia em camundongos tratados com IL-18bp
Animais tratados com IL-18bp não desenvolvem diarréia induzida por CPT-11.
O estudo revela que animais tratados com CPT-11 apresentaram um aumento
na mediana dos escores atribuídos ao parâmetro diarréia quando comparado
aos animais tratados apenas com salina. Contudo, a administração do CPT-11
aos animais que receberam IL-18bp não foi capaz de promover aumentos
significativos na mediana dos escores em comparação com animais que
receberam injeção de apenas CPT-11.
a
p<0,05 vs salina;
b
p<0,05 vs CPT-11.
Para análise estatística utilizou-se o teste Kruskal Wallis seguido do teste de
Dunn.
109
0
2500
5000
7500
10000
Leucócitosx10
3
/mL
Salina
CPT-11
IL-18bp
Salina
*
*
Figura 41 – Efeito do CPT-11 sobre a contagem de leucócitos sanguíneos
em camundongos tratados com IL-18bp
Tratamento com CPT-11 induz leucopenia em camundongos tratados com IL-
18bp. A figura apresenta o efeito do CPT-11 em induzir leucopenia tanto em
animais tratados com salina como em animais tratados com IL-18bp indicando
a manutenção do efeito da droga sobre a redução do número de leucócitos
circulantes a despeito do pré-tratamento aplicado.
*
p<0,05 vs grupo salina não
tratado com CPT-11. Para análise estatística utilizou-se o teste ANOVA
seguido do teste de Student Newman Keuls.
110
4.7. Avaliação do efeito do tratamento de camundongos com a
interleucina-33 (IL-33) sobre a mucosite induzida por CPT-11
As fotomicrografias (figura 42) e os escores histopatológicos (tabela 14)
indicam que o CPT-11 na dose de 60 mg/kg/dia, em comparação com animais
BALB/c tratados apenas com salina, induziu acentuado achatamento dos vilos
intestinais, necrose e apoptose de células da cripta com intensa vacuolização
de cripta e vilo e infiltração inflamatória na mucosa. Adicionalmente, houve
perda significante da continuidade epitélio de revestimento. Em animais
tratados com interleucina-33, aos quais foi administrada salina, observou-se
encurtamento de vilos sem comprometimento da arquitetura tecidual global ou
perda da continuidade epitelial. Além disso, em animais que receberam IL-33 e
CPT-11 visualizou-se preservação da arquitetura de criptas e vilos, poucas
células apoptóticas e áreas de vacuolização, bem como manutenção da
continuidade do epitélio de revestimento quando comparado aos
correspondentes tratados apenas com salina e IL-33. A análise morfométrica
(figura 43) revelou que o tratamento dos animais com CPT-11 (60 mg/kg, i.p.),
e que receberam o veículo da IL-33 (H
2
0
dest
), induz uma significativa redução
(p<0,05) na razão vilo/cripta quando comparados com animais tratados
somente com salina. A figura 43 apresenta também que animais tratados com
IL-33 que receberam CPT-11 não desenvolveram alterações nesses
parâmetros em comparação com animais tratados com IL-33 e que receberam
salina (p>0,05). Contudo, a IL-33 per si foi capaz de induzir uma significativa
(p<0,05) redução na razão vilo/cripta comparada com o grupo tratado com
salina que não recebeu IL-33. O efeito pro-inflamatório do CPT-11 (60 mg/kg,
i.p.) sobre o duodeno foi detectado pelo aumento significativo (p<0,05) da
atividade de MPO, como apresentado na figura 44, comparado com animais
tratados somente com salina (5 mL/kg, i.p). Esse efeito não foi verificado nos
animais tratados com IL-33, a despeito do tratamento com CPT-11, comparado
com animais que receberam IL-33+salina (p>0,05). O estudo de contratilidade
in vitro (figura 45) e a análise do grau de diarréia apresentado (tabela 15)
demonstraram que o CPT-11 induziu significativas alterações funcionais, que
levam à diarréia, em animais tratados com o veículo da IL-33 (H
2
0
dest
) quando
comparado com o grupo tratado apenas com salina (p<0,05). Porém, a
111
administração do CPT-11 a animais que receberam IL-33 não foi capaz de
induzir alterações funcionais ou diarréia, quando comparado ao grupo que
recebeu apenas IL-33 (p>0,05). Entretanto, o CPT-11 induziu significativa
leucopenia (figura 46) tanto em animais tratados com o veículo da IL-33
(H
2
0
dest
) como com IL-33, comparados com os respectivos controles tratados
apenas com salina (p<0,05).
112
FIGURA 42 - Fotomicrografias do duodeno de camundongos tratados com
IL-33 e injetados com salina 0,9% ou CPT-11.
Os animais receberam salina ou CPT-11 (60 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos e foram sacrificados no quinto dia experimental. O duodeno foi
removido e processado para a técnica de coloração pelo método H&E (100x).
Na mucosa dos animais que receberam CPT-11 (60 mg/kg) tratados ou não
com IL-33, os vilos estão encurtados (setas horizontais), há achatamento e
vacuolização de enterócitos (seta vertical), necrose de criptas (seta diagonal).
Adicionalmente, os animais que receberam somente IL-33 apresentaram
encurtamento de vilo com relativa perda de organização na arquitetura tecidual.
Painel A: salina; Painel B: CPT-11 60 mg/kg; Painel C: IL-33
+salina; Painel
D: IL-33 +CPT-11 60 mg/kg
113
Escores histopatológicos
Grupo Mediana (min-máx)
Salina 0(0-0)
CPT-11 60 mg/kg 3(1-4)
*
IL-33 0(0-1)
IL-33 + CPT-11 60 mg/kg 1,5(1-3)
Tabela 14 – Efeito do CPT-11 sobre os aspectos microscópicos duodenais
em camundongos tratados com IL-33
IL-33 previne o desenvolvimento de alterações histopatológicas no duodeno
secundárias à injeção CPT-11. A análise revelou que o a injeção de CPT-11
induz aumento dos escores histopatológicos quando comparados com animais
tratados somente com salina. A figura apresenta também que animais pré-
tratados com IL-33 e que receberam CPT-11 não desenvolvem alterações
nesses parâmetros em comparação com animais pré-tratados apenas com IL-
33.
*
p<0,05 vs grupo tratado com salina, que não recebeu CPT-11. Para
análise estatística utilizou-se o teste Kruskal Wallis seguido do teste de Dunn.
114
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Veículo (H
2
O
dest
)
IL-33
Salina
SalinaCPT-11
60mg/kg
CPT-11
60mg/kg
Razão vilo/cripta
a
*
a
Figura 43 – Efeito do CPT-11 sobre a razão vilo/cripta em camundongos
tratados com IL-33
IL-33 previne o desenvolvimento de alterações morfométricas histopatológicas
no duodeno secundárias à injeção CPT-11. A análise morfométrica revelou que
o a injeção de CPT-11 induz uma redução na razão vilo/cripta quando
comparados com animais tratados somente com salina. A figura apresenta
também que animais pré-tratados com IL-33 e que receberam CPT-11 não
desenvolvem alterações nesses parâmetros em comparação com animais pré-
tratados apenas com IL-33. Porém, em comparação com o grupo tratado com
veículo e que receberam CPT-11, houve diferença estatística.
a
p<0,05 vs grupo
tratado com salina, que não recebeu CPT-11; *p<0,05 vs grupo salina que
recebeu CPT-11. Para análise estatística utilizou-se o teste ANOVA seguido do
teste de Student Newman Keuls.
115
0
2500
5000
7500
10000
12500
15000
Veículo
IL-33
Salina
SalinaCPT-11
60mg/kg
CPT-11
60mg/kg
*
Atividade de MPO
neutrófilos/mg de tecido
FIGURA 44 – Efeito do CPT-11 sobre a atividade de mieloperoxidase em
duodeno de camundongos tratados com IL-33
Animais tratados com IL-33 não apresentam aumento da atividade de MPO no
duodeno por tratamento com CPT-11. O efeito pro-inflamatório do CPT-11 no
duodeno foi detectado pelo aumento da atividade de MPO em animais tratados
com o antineoplásico e que receberam o veículo da IL-33. Esse efeito não foi
verificado nos animais tratados com IL-33. *p<0,05 vs grupo tratado com salina
que não recebeu CPT-11. Para análise estatística utilizou-se o teste ANOVA
seguido do teste de Student Newman Keuls.
116
0
50
100
150
200
250
[ACh]
%Contração em relação ao KCl
60mM
Controle normal CPT-11 IL-33 IL-33 + CPT-11
FIGURA 45 – Efeito do CPT-11 sobre a contratilidade duodenal in vitro em
camundongos tratados com IL-33
Tratamento com IL-33 confere proteção contra alterações funcionais de
duodeno induzidas por CPT-11. O estudo funcional do duodeno coletado de
animais tratados com CPT-11 e veículo da IL-33 (salina, 100µL/animal, e.v.)
revelou um aumento da responsividade do tecido à Acetilcolina (ACh) quando
comparado aos animais tratados apenas com salina. Contudo, a administração
do CPT-11 aos animais tratados com IL-33 não foi capaz de promover
alterações funcionais em comparação com animais tratados somente com IL-
33. *p<0,05 vs grupo tratado com salina e que receberam veículo da IL-33.
Para análise estatística utilizou-se o teste ANOVA seguido do teste de Student
Newman Keuls.
10
-
10
10
-
9
10
-
8
10
-
7
10
-
6
10
-
5
10
-
4
M
*
*
117
Escores para diarréia
Grupo Mediana (min-máx)
Salina 0(0-0)
CPT-11 60 mg/kg 2,5(2-3)
a
IL-33 0(0-0)
IL-33+CPT-11 60 mg/kg 1(0-2)
Tabela 15 – Avaliação da diarréia em camundongos tratados com IL-33
Animais tratados com IL-33 não desenvolvem diarréia induzida por CPT-11. O
estudo revela que animais tratados com CPT-11 apresentaram um aumento na
mediana dos escores atribuídos ao parâmetro diarréia quando comparado aos
animais tratados apenas com salina. Contudo, a administração do CPT-11 aos
animais tratados com IL-33 não foi capaz de promover aumentos significativos
na mediana dos escores em comparação com animais tratados somente com
IL-33.
a
p<0,05 vs grupo controle salina. Para análise estatística utilizou-se o
teste Kruskal Wallis seguido do teste de Dunn.
118
0
2500
5000
7500
10000
Salina
Salina
CPT-11
60mg/kg
CPT-11
60mg/kg
a
b
Veículo IL-33
Leucócitosx10
3
/mL
Figura 46 – Efeito do CPT-11 sobre a contagem de leucócitos sanguíneos
em camundongos tratados com IL-33
Tratamento com CPT-11 induz leucopenia em camundongos tratados com IL-
33. A figura apresenta o efeito do CPT-11 em induzir leucopenia tanto em
animais tratados com veículo da IL-33 (Salina, 100µL/animal, e.v.) como em
animais tratados com IL-33 indicando a manutenção do efeito da droga na
redução do número de leucócitos circulantes.
a
p<0,05 vs grupo salina tratado
com água destilada;
b
p<0,05 vs grupo salina tratado com IL-33. Para análise
estatística utilizou-se o teste ANOVA seguido do teste de Student Newman
Keuls.
119
4.8. avaliação da participação da óxido nítrico sintase induzida
(iNOS) na mucosite intestinal induzida por CPT-11
4.8.1. Estudo em camundongos knockout para iNOS
As fotomicrografias (figura 47) e os escores histopatológicos (tabela 16)
indicam que o CPT-11 na dose de 60 mg/kg/dia, em comparação com animais
WT (C57BL/6) tratados apenas com salina, induziu acentuada perda dos vilos
intestinais, necrose e apoptose de células da cripta com intensa vacuolização
de cripta e vilo e infiltração inflamatória na mucosa. Adicionalmente, houve
perda significante da continuidade epitélio de revestimento. Em animais
knockout para óxido nítrico sintase induzida, iNOS
-/-
, aos quais foi administrado
CPT-11, observou-se preservação da arquitetura de criptas e vilos, poucas
células apoptóticas e inflamatórias, bem como manutenção da continuidade do
epitélio de revestimento quando comparado aos correspondentes knockout
tratados apenas com salina. A análise morfométrica (figura 48) revelou que o
tratamento dos animais selvagens (iNOS WT) com CPT-11 (60 mg/kg, i.p.)
induziu uma significativa redução (p<0,05) na razão vilo/cripta quando
comparados com animais selvagens tratados somente com salina. A figura 48
apresenta também que animais knockout para iNOS, iNOS
-/-
, que receberam
CPT-11, não desenvolveram alterações nesses parâmetros em comparação
com animais knockout tratados apenas com salina. O efeito pro-inflamatório do
CPT-11 (60 mg/kg, i.p.) sobre o duodeno foi detectado pelo aumento
significativo (p<0,05) da atividade de MPO, como apresentado na figura 49, da
marcação imunohistoquímica para óxido nítrico sintase induzida (iNOS), figura
50, e nos níveis plasmáticos de citocinas IL-1β e KC (tabela 17) em animais
selvagens (iNOS WT) comparados com animais selvagens tratados somente
com salina (5 mL/kg, i.p). Esses efeitos não foram verificados nos animais
iNOS
-/-
, a despeito do tratamento com CPT-11 (p>0,05), comparados com
animais knockout que receberam somente salina. O estudo de contratilidade in
vitro (figura 51) e a análise do grau de diarréia apresentado (tabela 18) e a
análise da espessura da camada muscular (figura 52) demonstraram que o
CPT-11 induz significativas alterações funcionais, que levam à diarréia, e
espessamento da camada muscular em animais iNOS WT quando comparado
com o grupo selvagem tratado apenas com salina (p<0,05). Porém, a
120
administração do CPT-11 a animais iNOS
-/-
não foi capaz de induzir alterações
funcionais, diarréia ou espessamento da muscular, quando comparado ao
grupo knockout que recebeu apenas salina (p>0,05). Entretanto, o CPT-11
induziu significativa leucopenia (figura 53) tanto em animais selvagens (iNOS
WT) como em animais knockout, comparados com os respectivos controles
tratados apenas com salina (p<0,05).
121
FIGURA 47 - Fotomicrografias do duodeno de camundongos iNOS
knockout injetados com salina 0,9% ou CPT-11.
Os animais receberam salina ou CPT-11 (60 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos e foram sacrificados no quinto dia experimental. O duodeno foi
removido e processado para a técnica de coloração pelo método H&E (100x).
Na mucosa dos animais iNOS WT que receberam CPT-11 (60 mg/kg) os vilos
estão encurtados (setas horizontais), há achatamento e vacuolização de
enterócitos (seta vertical), necrose de criptas (seta diagonal). Em animais iNOS
knockout (iNOS
-/-
) há maior preservação da arquitetura tecidual com necrose
focal de criptas (seta diagonal). Painel A: iNOS WT+salina; Painel B: iNOS
WT+CPT-11 60 mg/kg; Painel C: iNOS
-/-
+salina; Painel D: iNOS
-/-
+CPT-11 60
mg/kg
122
Escores histopatológicos
Grupo Mediana (min-máx)
iNOS WT 0(0-0)
iNOS WT + CPT-11 60 mg/kg 3(2-4)
*
iNOS
-/-
0(0-0)
iNOS
-/-
+ CPT-11 60 mg/kg 2(1-3)
Tabela 16 – Efeito do CPT-11 sobre os aspectos microscópicos duodenais
em camundongos iNOS
-/-
Camundongos iNOS
-/-
não desenvolvem alterações histopatológicas no
duodeno secundárias à injeção CPT-11. A análise revelou que o tratamento
dos animais selvagens (C57BL/6, WT) com CPT-11 induz aumento dos
escores histopatológicos quando comparados com animais selvagens tratados
somente com salina. A figura apresenta também que animais iNOS
-/-
, que
receberam CPT-11, não desenvolvem alterações nesses parâmetros em
comparação com animais knockout tratados apenas com salina (p>0,05). *
p<0,05 vs grupo iNOS WT tratado com salina. Para análise estatística utilizou-
se o teste Kruskal Wallis seguido do teste de Dunn.
123
0
1
2
3
4
iNOS wild type
iNOS-/-
*
Salina
Salina
CPT-11
60mg/kg
CPT-11
60mg/kg
razão vilo/cripta
Figura 48 – Efeito do CPT-11 sobre a razão vilo/cripta em camundongos
iNOS
-/-
Camundongos iNOS
-/-
não desenvolvem alterações morfométricas
histopatológicas no duodeno secundárias à injeção CPT-11. A análise
morfométrica revelou que o tratamento dos animais selvagens (C57BL/6, WT)
com CPT-11 induz uma redução na razão vilo/cripta quando comparados com
animais selvagens tratados somente com salina. A figura apresenta também
que animais iNOS
-/-
, que receberam CPT-11, não desenvolvem alterações
nesses parâmetros em comparação com animais knockout tratados apenas
com salina. * p<0,05 vs grupo iNOS WT tratado com salina. Para análise
estatística utilizou-se o teste ANOVA seguido do teste de Student Newman
Keuls.
124
0
2500
5000
7500
iNOS wild type
iNOS-/-
Salina
SalinaCPT-11
60mg/kg
CPT-11
60mg/kg
*
Atividade de MPO
neutrófilos/mg de tecido
FIGURA 49 – Efeito do CPT-11 sobre a atividade de mieloperoxidase em
duodeno de camundongos iNOS
-/-
Animais iNOS
-/-
não apresentam aumento da atividade de MPO no duodeno por
tratamento com CPT-11. O efeito pro-inflamatório do CPT-11 no duodeno foi
detectado pelo aumento da atividade de MPO em animais selvagens tratados
com o antineoplásico (iNOS WT+CPT-11) comparados com animais selvagens
tratados somente com salina (iNOS WT). Esse efeito não foi verificado nos
animais iNOS
-/-
, a despeito do tratamento com CPT-11. *p<0,05 vs grupo iNOS
selvagem (C57BL/6, WT) tratado com salina. Para análise estatística utilizou-se
o teste ANOVA seguido do teste de Student Newman Keuls.
125
Níveis intestinais de citocinas (pg/mg proteína)
Group
IL-1β
KC
iNOS
+/+
+ Salina
8,15 ± 1.82 3,52 ± 0,27
iNOS
WT + CPT-11
537,50 ± 106,30
a
452,30 ± 42,94
a
iNOS
-/-
+ CPT-11
277,50 ± 46,66
*
116,80 ± 68,58
*
TABELA 17 – Efeito do CPT-11 sobre os níveis duodenais de citocinas em
camundongos iNOS
-/-
Animais iNOS
-/-
não apresentam aumento nos níveis de citocinas no duodeno,
a despeito do tratamento com CPT-11. O efeito pro-inflamatório do CPT-11 no
duodeno foi detectado pelo aumento dos níveis de citocinas IL-1β e KC em
animais selvagens tratados com o antineoplásico (iNOS WT+CPT-11)
comparados com animais selvagens tratados somente com salina (iNOS
WT+salina). Esse efeito foi atenuado nos animais iNOS
-/-
tratados com CPT-11.
a
p<0,05 vs grupo iNOS selvagem (C57BL/6, WT) tratado com salina; *p<0,05
vs iNOS WT+CPT-11. Para análise estatística utilizou-se o teste ANOVA
seguido do teste de Student Newman Keuls.
126
Figura 50 – Efeito do CPT-11 sobre a marcação imunohistoquímica para
iNOS duodenal em camundongos iNOS
-/-
Animais tratados com CPT-11 apresentam forte marcação para iNOS. A
análise imunohistoquímica revelou que o tratamento dos animais selvagens
(C57BL/6, WT) com CPT-11 induz forte marcação para iNOS (painel C) quando
comparados com animais selvagens tratados somente com salina (painel B). A
figura apresenta também que animais iNOS
-/-
, que receberam CPT-11, não
apresentam imunomarcação para iNOS (painel D). Painel A-Background
A
B
C
D
127
0
50
100
150
200
250
300
[ACh]
% Contração em relação ao
KCl60mM
iNOSwt iNOSwt + CPT-11 iNOS-/- iNOS-/- + CPT-11
FIGURA 51 – Efeito do CPT-11 sobre a contratilidade duodenal in vitro em
camundongos iNOS
-/-
Deleção para iNOS é fator protetor contra alterações funcionais de duodeno
induzidas por CPT-11. O estudo funcional do duodeno coletado de animais
selvagens tratados com CPT-11 (iNOS WT+CPT-11) revelou um aumento da
responsividade do tecido à Acetilcolina (ACh) quando comparado aos animais
tratados apenas com salina (iNOS WT). Contudo, a administração do CPT-11
aos animais iNOS
-/-
não foi capaz de promover alterações funcionais em
comparação com animais knockout para o mesmo gene tratados somente com
salina (iNOS
-/-
). *p<0,05 vs grupo iNOS selvagem (C57BL/6, WT) tratado com
salina. Para análise estatística utilizou-se o teste ANOVA seguido do teste de
Student Newman Keuls.
10
-
10
10
-
9
10
-
8
10
-
7
10
-
6
10
-
5
10
-
4
M
*
*
*
128
Escores para diarréia
Grupo Mediana (min-máx)
iNOS WT 0(0-0)
iNOS WT + CPT-11 60 mg/kg 3(2-3)
*
iNOS
-/-
0(0-0)
iNOS
-/-
+ CPT-11 60 mg/kg 1(0-2)
Tabela 18 – Avaliação da diarréia em camundongos iNOS
-/-
Animais iNOS
-/-
não desenvolvem diarréia induzida por CPT-11. O estudo
revela que animais selvagens (C57BL/6, WT) tratados com CPT-11
apresentaram um aumento na mediana dos escores atribuídos ao parâmetro
diarréia quando comparado aos animais selvagens tratados apenas com salina
(iNOS WT). Contudo, a administração do CPT-11 aos animais iNOS
-/-
não foi
capaz de promover aumentos significativos na mediana dos escores em
comparação com animais knockout tratados somente com salina.* p<0,05 vs
grupo iNOS WT. Para análise estatística utilizou-se o teste Kruskal Wallis
seguido do teste de Dunn.
129
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
iNOS wild type
iNOS-/-
*
Salina
SalinaCPT-11
60mg/kg
CPT-11
60mg/kg
Espessura da camada
muscular (
μ
m)
FIGURA 52 – Efeito do CPT-11 sobre a espessura da camada muscular
duodenal de camundongos iNOS
-/-
Camundongos iNOS
-/-
não desenvolvem espessamento da camada muscular
do duodeno secundário à injeção CPT-11. A análise revelou que o tratamento
dos animais selvagens (C57BL/6, WT) com CPT-11 induz um espessamento
da camada muscular quando comparados com animais selvagens tratados
somente com salina. A figura apresenta também que animais iNOS
-/-
, que
receberam CPT-11, não desenvolvem alterações nesses parâmetros em
comparação com animais knockout tratados apenas com salina. * p<0,05 vs
grupo iNOS WT tratado com salina. Para análise estatística utilizou-se o teste
ANOVA seguido do teste de Student Newman Keuls.
130
0
5000
10000
15000
iNOS wild type
Salina
SalinaCPT-11
60mg/kg
CPT-11
60mg/kg
iNOS-/-
a
b
Leucócitosx10
3
/mL
Figura 53 – Efeito do CPT-11 sobre a contagem de leucócitos sanguíneos
em camundongos iNOS
-/-
Tratamento com CPT-11 induz leucopenia em camundongos iNOS
-/-
. A figura
apresenta o efeito do CPT-11 em induzir leucopenia tanto em animais
selvagens (C57BL/6, WT) como em animais knockout para iNOS indicando a
manutenção do efeito da droga sobre a redução do número de leucócitos
circulantes a despeito do tipo de animal.
a
p<0,05 vs grupo iNOS WT não
tratado com CPT-11;
b
p<0,05 vs grupo iNOS
-/-
não tratado com CPT-11. Para
análise estatística utilizou-se o teste ANOVA seguido do teste de Student
Newman Keuls.
131
4.8.2. Modulação farmacológica da atividade de iNOS com
aminoguanidina
As fotomicrografias (figura 54) e os escores histopatológicos (tabela 19)
indicam que o CPT-11 na dose de 60 mg/kg/dia, em comparação com animais
C57BL/6 tratados apenas com salina, induziu acentuado achatamento dos vilos
intestinais, necrose e apoptose de células da cripta com intensa vacuolização
de cripta e vilo e infiltração inflamatória na mucosa. Adicionalmente, houve
perda significante da continuidade epitélio de revestimento. Em animais
tratados com aminoguanidina, aos quais foi administrado CPT-11, observou-se
preservação da arquitetura de criptas e vilos, poucas células apoptóticas, bem
como manutenção da continuidade do epitelio de revestimento quando
comparado aos correspondentes controles tratados apenas com salina e
aminoguanidina. A análise morfométrica (figura 55) revelou que o tratamento
dos animais com CPT-11 (60 mg/kg, i.p.), e que receberam o veículo da AMG
(H
2
0
dest
), induz uma significativa redução (p<0,05) na razão vilo/cripta quando
comparados com animais tratados somente com salina. A figura 55 apresenta
também que animais tratados com AMG que receberam CPT-11 não
desenvolvem alterações nesses parâmetros em comparação com animais
tratados com AMG e que receberam salina (p>0,05). O efeito pro-inflamatório
do CPT-11 (60 mg/kg, i.p.) sobre o duodeno foi detectado pelo aumento
significativo (p<0,05) da atividade de MPO, como apresentado na figura 56,
comparado com animais tratados somente com salina (5 mL/kg, i.p). Esse
efeito não foi verificado nos animais tratados com AMG, a despeito do
tratamento com CPT-11, comparado com animais que receberam AMG+salina
(p>0,05). O estudo de contratilidade in vitro (figura 57), a análise do grau de
diarréia apresentado (tabela 20) e a análise da espessura da camada muscular
(figura 58) demonstraram que o CPT-11 induz significativas alterações
funcionais, que levam à diarréia, e espessamento da muscular em animais
tratados com o veículo da AMG (H
2
0
dest
) quando comparado com o grupo
tratado apenas com salina (p<0,05). Porém, a administração do CPT-11 a
animais que receberam AMG não foi capaz de induzir alterações funcionais,
diarréia ou espessamento da camada muscular duodenal, quando comparado
ao grupo que recebeu apenas AMG (p>0,05). Entretanto, o CPT-11 induziu
132
significativa leucopenia (figura 59) tanto em animais tratados com o veículo da
AMG (H
2
0
dest
) como com AMG, comparados com os respectivos controles
tratados apenas com salina (p<0,05).
133
FIGURA 54 - Fotomicrografias do duodeno de camundongos tratados com
Aminoguanidina e injetados com salina 0,9% ou CPT-11.
Os animais receberam salina ou CPT-11 (60 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos e foram sacrificados no quinto dia experimental. O duodeno foi
removido e processado para a técnica de coloração pelo método H&E (100x).
Na mucosa dos animais que receberam CPT-11 (60 mg/kg) não tratados com
aminoguanidina, os vilos estão encurtados (setas horizontais), há achatamento
e vacuolização de enterócitos (seta vertical), necrose de criptas (seta diagonal).
Em animais tratados com aminoguanidina, apesar da injeção de CPT-11, há
preservação da arquitetura tecidual. Painel A: salina; Painel B: CPT-11 60
mg/kg; Painel C: Aminoguanidina; Painel D: Aminoguanidina +CPT-11 60
mg/kg
134
Escores histopatológicos
Grupo Mediana (min-máx)
Salina 0(0-0)
CPT-11 60 mg/kg 3(2-4)
*
Aminoguanidina 0(0-0)
Aminoguanidina+ CPT-11 60
mg/kg
2(2-3)
Tabela 19 – Efeito do CPT-11 sobre os aspectos microscópicos duodenais
em camundongos tratados com aminoguanidina
Aminoguanidina previne o desenvolvimento de alterações histopatológicas no
duodeno secundárias à injeção CPT-11. A figura indica que o tratamento dos
animais com CPT-11 induziu aumento dos escores histopatológicos quando
comparados com animais tratados somente com salina e que receberam o
veículo da aminiguanidina (H
2
0 destilada, 5 mL/kg, s.c). A figura apresenta
também que animais tratados com aminoguanidina e CPT-11 não desenvolvem
alterações nesses parâmetros em comparação com animais tratados apenas
com salina e aminoguanidina (p>0,05).
*
p<0,05 vs grupo tratado com salina que
não recebeu CPT-11. Para análise estatística utilizou-se o teste Kruskal Wallis
seguido do teste de Dunn.
135
0
1
2
3
4
Veículo (H
2
O
DEST
)
Salina
SalinaCPT-11
60mg/kg
CPT-11
60mg/kg
Aminoguanidina
*
Relação vilo/cripta
Figura 55 – Efeito do CPT-11 sobre a razão vilo/cripta em camundongos
tratados com aminoguanidina
Aminoguanidina previne o desenvolvimento de alterações morfométricas
histopatológicas no duodeno secundárias à injeção CPT-11. A figura indica que
o tratamento dos animais com CPT-11 induz uma redução na razão vilo/cripta
quando comparados com animais tratados somente com salina e que
receberam o veículo da aminiguanidina (H
2
0 destilada, 5 mL/kg, s.c). A figura
apresenta também que animais tratados com aminoguanidina e CPT-11 não
desenvolvem alterações nesses parâmetros em comparação com animais
tratados apenas com salina e aminoguanidina.
a
p<0,05 vs grupo tratado com
salina que não recebeu CPT-11; *p<0,05 vs grupo tratado com CPT-11 que
não recebeu aminoguanidina. Para análise estatística utilizou-se o teste
ANOVA seguido do teste de Student Newman Keuls.
136
0
1000
2000
3000
4000
Veículo (H
2
O
DEST
)
Aminoguanidina
Salina
SalinaCPT-11
60mg/kg
CPT-11
60mg/kg
a
Atividade de MPO
neutrófilos/mg de tecido
*
FIGURA 56 – Efeito do CPT-11 sobre a atividade de mieloperoxidase em
duodeno de camundongos tratados com aminoguanidina
Animais tratados com aminoguanidina não apresentam aumento da atividade
de MPO no duodeno por tratamento com CPT-11. O efeito pro-inflamatório do
CPT-11 no duodeno foi detectado pelo aumento da atividade de MPO em
animais tratados com o antineoplásico e que receberam o veículo da
aminoguanidina. Esse efeito não foi verificado nos animais tratados com
aminoguanidina.
a
p<0,05 vs grupo tratado com salina que não recebeu CPT-11;
*p<0,05 vs grupo tratado com CPT-11 que não recebeu aminoguanidina. Para
análise estatística utilizou-se o teste ANOVA seguido do teste de Student
Newman Keuls.
137
0
50
100
150
200
250
[ACh]
% Contração em relação ao
KCl60mM
Salina CPT-11 Aminoguanidina Aminoguanidina+CPT-11
FIGURA 57 – Efeito do CPT-11 sobre a contratilidade duodenal in vitro em
camundongos tratados com aminoguanidina
Tratamento com aminoguanidina confere proteção contra alterações funcionais
de duodeno induzidas por CPT-11. O estudo funcional do duodeno coletado de
animais tratados com CPT-11 e veículo revelou um aumento da responsividade
do tecido à Acetilcolina (ACh) quando comparado aos animais tratados apenas
com salina. Contudo, a administração do CPT-11 aos animais tratados com
aminoguanidina não foi capaz de promover alterações funcionais em
comparação com animais tratados somente com aminoguanidina. *p<0,05 vs
grupo tratado com salina e que receberam veículo da aminoguanidina. Para
análise estatística utilizou-se o teste ANOVA seguido do teste de Student
Newman Keuls.
10
-
10
10
-
9
10
-
8
10
-
7
10
-
6
10
-
5
10
-
4
M
*
138
Escores para diarréia
Grupo Mediana (min-máx)
Salina 0(0-0)
CPT-11 60 mg/kg 3(3-3)
*
Aminoguanidina 0(0-0)
Aminoguanidina+CPT-11 60 mg/kg 1(1-2)
Tabela 20 – Avaliação da diarréia em camundongos tratados com
aminoguanidina
Animais tratados com aminoguanidina não desenvolvem diarréia induzida por
CPT-11. O estudo revela que animais tratados com CPT-11 apresentaram um
aumento na mediana dos escores atribuídos ao parâmetro diarréia quando
comparado aos animais tratados apenas com salina. Contudo, a administração
do CPT-11 aos animais tratados com aminoguanidina não foi capaz de
promover aumentos significativos na mediana dos escores em comparação
com animais tratados somente com aminoguanidina. *p<0,05 vs grupo controle
normal. Para análise estatística utilizou-se o teste Kruskal Wallis seguido do
teste de Dunn.
139
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Veículo (H
2
O
Dest
)
Aminoguanidina
a
Salina
SalinaCPT-11
60mg/kg
CPT-11
60mg/kg
Espessura da camada
muscular (
μ
m)
*
FIGURA 58 – Efeito do CPT-11 sobre a espessura da camada muscular
duodenal de camundongos tratados com aminoguanidina
Aminoguanidina previne o desenvolvimento de espessamento da camada
muscular do duodeno secundário à injeção CPT-11. A figura indica que o
tratamento dos animais com CPT-11 induz espessamento da camada muscular
quando comparados com animais tratados somente com salina e que
receberam o veículo da aminiguanidina (H
2
0 destilada, 5 mL/kg, s.c). A figura
apresenta também que animais tratados com aminoguanidina e CPT-11 não
desenvolvem alterações nesses parâmetros em comparação com animais
tratados apenas com salina e aminoguanidina.
a
p<0,05 vs grupo tratado com
salina que não recebeu CPT-11; *p<0,05 vs grupo tratado com CPT-11 que
não recebeu aminoguanidina. Para análise estatística utilizou-se o teste
ANOVA seguido do teste de Student Newman Keuls.
140
0
5000
10000
15000
Salina
Salina
CPT-11
60mg/kg
CPT-11
60mg/kg
Aminoguanidina
Veículo (H
2
O
Dest
)
a
b
Leucócitosx10
3
/mL
Figura 59 – Efeito do CPT-11 sobre a contagem de leucócitos sanguíneos
em camundongos tratados com aminoguanidina
Tratamento com CPT-11 induz leucopenia em camundongos tratados com
aminoguanidina. A figura apresenta o efeito do CPT-11 em induzir leucopenia
tanto em animais tratados com o veículo da aminoguanidina (H
2
O destilada 5
mL/kg, s.c.) como em animais tratados com aminoguanidina indicando a
manutenção do efeito da droga na redução do número de leucócitos
circulantes.
a
p<0,05 vs grupo tratado com veículo da aminiguanidina que não
recebeu CPT-11;
b
p<0,05 vs grupo tratado com aminoguanidina não tratado
com CPT-11. Para análise estatística utilizou-se o teste ANOVA seguido do
teste de Student Newman Keuls.
141
4.9. Avaliação da participação da 5-lipoxigenase (5-LOX) na
mucosite induzida por CPT-11
As fotomicrografias (figura 60) e os escores histopatológicos (tabela 21)
indicam que o CPT-11 na dose de 60 mg/kg/dia, em comparação com animais
129Svev tratados apenas com salina, induziu acentuado achatamento dos vilos
intestinais, necrose e apoptose de células da cripta e infiltração inflamatória na
mucosa. Adicionalmente, houve perda significante da continuidade epitélio de
revestimento. Em animais knockout para 5-lipoxigenase, 5-LOX
-/-
, aos quais foi
administrado CPT-11, observou-se perda parcial, mas significativa da
arquitetura de criptas e vilos, presença de células apoptóticas, e perda da
continuidade do epitélio de revestimento quando comparado aos
correspondentes knockout tratados apenas com salina. A análise morfométrica
(figura 61) revelou que o tratamento dos animais selvagens (5-LOX WT) e de
5-LOX
-/-
com CPT-11 (60 mg/kg, i.p.) induz uma significativa redução (p<0,05)
na razão vilo/cripta quando comparados com os respectivos animais controle
tratados somente com salina. O efeito pro-inflamatório do CPT-11 (60 mg/kg,
i.p.) sobre o duodeno foi detectado pelo aumento significativo (p<0,05) da
atividade de MPO, como apresentado na figura 62, tanto em animais
selvagens (5-LOX WT) como em animais 5-LOX
-/-
comparados com os
respectivos animais controle tratados somente com salina (5 mL/kg, i.p). O
estudo de contratilidade in vitro (figura 63) demonstrou que o CPT-11 induz
significativas alterações funcionais em animais 5-LOX WT quando comparado
com o grupo selvagem tratado apenas com salina (p<0,05). Porém, a
administração do CPT-11 a animais 5-LOX
-/-
não foi capaz de induzir alterações
funcionais, quando comparado ao grupo knockout que recebeu apenas salina
(p>0,05). Entretanto, o CPT-11 induziu significativa leucopenia (figura 64) tanto
em animais selvagens (5-LOX WT) como em animais knockout, comparados
com os respectivos controles tratados apenas com salina (p<0,05).
142
FIGURA 60 - Fotomicrografias do duodeno de camundongos 5-
lipoxigenase knockout injetados com salina 0,9% ou CPT-11.
Os animais receberam salina ou CPT-11 (60 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos e foram sacrificados no quinto dia experimental. O duodeno foi
removido e processado para a técnica de coloração pelo método H&E (100x).
Na mucosa dos animais 5-LOX WT e 5-LOX knockout (5-LOX
-/-
), ambos
injetados com CPT-11 (60 mg/kg), os vilos estão encurtados (setas
horizontais), há achatamento e vacuolização de enterócitos, necrose de criptas
(seta diagonal). Painel A: 5-Lox WT+salina; Painel B: 5-Lox WT+CPT-11 60
mg/kg; Painel C: 5-Lox
-/-
+salina; Painel D: 5-Lox
-/-
+CPT-11 60 mg/kg.
143
Escores histopatológicos
Grupo Mediana (min-máx)
5-LOX WT 0(0-0)
5-LOX WT + CPT-11 60 mg/kg 4(4-4)
*
5-LOX
-/-
0(0-0)
5-LOX
-/-
+ CPT-11 60 mg/kg 2,5(2-3)
Tabela 21 – Efeito do CPT-11 sobre os aspectos microscópicos duodenais
em camundongos 5-LOX
-/-
Camundongos 5-Lox
-/-
não desenvolvem alterações histopatológicas no
duodeno secundárias à injeção CPT-11. A análise revelou que o tratamento
dos animais selvagens (129Svev, 5-LOX WT) com CPT-11 induz aumento nos
escores histopatológicos quando comparados, respectivamente, com animais
selvagens tratados somente com salina. A figura mostra também que animais
knockout para 5-LOX, que receberam CPT-11, não desenvolvem alterações
histopatológicas significativas em comparação com animais 5-LOX
-/-
que
receberam apenas salina.
*
p<0,05 vs grupo 5-Lox WT tratado com salina. Para
análise estatística utilizou-se o teste Kruskal Wallis seguido do teste de Dunn.
144
0
1
2
3
4
5-Lox WT 5Lox -/-
a
b
Salina
SalinaCPT-11
60mg/kg
CPT-11
60mg/kg
Razão vilo/Cripta
Figura 61 – Efeito do CPT-11 sobre a razão vilo/cripta em camundongos 5-
Lox
-/-
Camundongos 5-Lox
-/-
desenvolvem alterações morfométricas histopatológicas
no duodeno secundárias à injeção CPT-11. A análise morfométrica revelou que
o tratamento dos animais selvagens (129Svev, WT) e knockout para 5-Lox (5-
Lox
-/-
) com CPT-11 induz uma redução na razão vilo/cripta quando
comparados, respectivamente, com animais selvagens e knockout tratados
somente com salina.
a
p<0,05 vs grupo 5-Lox WT tratado com salina;
b
p<0,05 vs
grupo 5-Lox
-/-
tratado com salina. Para análise estatística utilizou-se o teste
ANOVA seguido do teste de Student Newman Keuls.
145
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
a
b
Salina
SalinaCPT-11
60mg/kg
CPT-11
60mg/kg
5-Lox WT
5-Lox-/-
Atividade de MPO
Neutrófilos/mg de tecido
FIGURA 62 – Efeito do CPT-11 sobre a atividade de mieloperoxidase em
duodeno de camundongos 5-Lox
-/-
Animais 5-Lox
-/-
apresentam aumento da atividade de MPO no duodeno por
tratamento com CPT-11. O efeito pro-inflamatório do CPT-11 no duodeno foi
detectado pelo aumento da atividade de MPO em animais selvagens tratados
com o antineoplásico, 5-Lox WT+CPT-11 e 5-Lox
-/-
+CPT-11, comparados com
animais selvagens (129 Svev) e knockout (5-Lox
-/-
), respectivamente, tratados
somente com salina.
a
p<0,05 vs grupo 5-Lox WT tratado com salina;
b
p<0,05 vs
grupo 5-Lox
-/-
tratado com salina. Para análise estatística utilizou-se o teste
ANOVA seguido do teste de Student Newman Keuls.
146
0
50
100
150
200
250
[ACh]
% Contração em relação ao
KCl60m M
5-Lox WT 5-Lox WT+CPT-11 5-Lox-/- 5-Lox-/- + CPT-11
FIGURA 63 – Efeito do CPT-11 sobre a contratilidade duodenal in vitro em
camundongos 5-Lox
-/-
Deleção para 5-Lox previne contra alterações funcionais de duodeno induzidas
por CPT-11. O estudo funcional do duodeno coletado de animais selvagens
tratados com CPT-11 (5-Lox WT+CPT-11) revelou um aumento da
responsividade do tecido à Acetilcolina (ACh) quando comparado aos animais
tratados apenas com salina (5-Lox WT). Contudo, a administração do CPT-11
aos animais 5-Lox
-/-
não foi capaz de promover alterações funcionais em
comparação com animais knockout para o mesmo gene tratados somente com
salina (5-Lox
-/-
). *p<0,05 vs grupo 5-Lox selvagem (129Svev, WT) tratado com
salina. Para análise estatística utilizou-se o teste ANOVA seguido do teste de
Student Newman Keuls.
10
-
10
10
-
9
10
-
8
10
-
7
10
-
6
10
-
5
10
-
4
M
*
*
147
0
5000
10000
15000
a
CPT-11
60 mg/kg
b
Salina
CPT-11
60 mg/kg
Salina
5-Lox WT 5-Lox-/-
Leucócitos x 10
3
/mL
Figura 64 – Efeito do CPT-11 sobre a contagem de leucócitos sanguíneos
em camundongos 5-Lox
-/-
Tratamento com CPT-11 induz leucopenia em camundongos 5-Lox
-/-
. A figura
apresenta o efeito do CPT-11 em induzir leucopenia tanto em animais
selvagens (129 Svev, WT) como em animais knockout para 5-Lox indicando a
manutenção do efeito da droga sobre a redução do número de leucócitos
circulantes a despeito do tipo de animal.
a
p<0,05 vs grupo 5-Lox Wild Type não
tratado com CPT-11;
b
p<0,05 vs grupo 5-Lox
-/-
não tratado com CPT-11. Para
análise estatística utilizou-se o teste ANOVA seguido do teste de Student
Newman Keuls.
148
4.10. Avaliação da participação do receptor para PAF (PAFr) na
mucosite induzida por CPT-11
As fotomicrografias (figura 65) e os escores histopatológicos (tabela 22)
indicam que o CPT-11 na dose de 60 mg/kg/dia, em comparação com animais
WT (BALB/c) tratados apenas com salina, induziu acentuado achatamento dos
vilos intestinais, necrose e apoptose de células da cripta e infiltração
inflamatória na mucosa. Adicionalmente, houve perda significante da
continuidade epitélio de revestimento. Em animais knockout para receptor de
PAF, PAFr
-/-
, aos quais foi administrado CPT-11, observou-se perda
significativa da arquitetura de criptas e vilos, presença de células apoptóticas, e
perda da continuidade do epitélio de revestimento quando comparado aos
correspondentes knockout tratados apenas com salina. A análise morfométrica
(figura 66) revelou que o tratamento dos animais selvagens (PAFr WT) e
knockout para PAFr (PAFr
-/-
) com CPT-11 (60 mg/kg, i.p.) induz uma
significativa redução (p<0,05) na razão vilo/cripta quando comparados com os
respectivos animais controle tratados somente com salina. O efeito pro-
inflamatório do CPT-11 (60 mg/kg, i.p.) sobre o duodeno foi detectado pelo
aumento significativo (p<0,05) da atividade de MPO, como apresentado na
figura 67, tanto em animais selvagens (PAFr WT) como em animais PAFr
-/-
comparados com os respectivos animais controle tratados somente com salina
(5 mL/kg, i.p). O estudo de contratilidade in vitro (figura 68) demonstrou que o
CPT-11 induz significativas alterações funcionais em animais PAFr WT e em
PAFr
-/-
em comparação com os grupos controle tratado apenas com salina
(p<0,05), PAFr WT e PAFr
-/-
, respectivamente. Adicionalmente, o CPT-11
induziu significativa leucopenia (figura 69) tanto em animais selvagens (PAFr
WT) como em animais knockout para esse receptor, comparados com os
respectivos controles tratados apenas com salina (p<0,05).
149
FIGURA 65 - Fotomicrografias do duodeno de camundongos knockout
para receptor de PAF injetados com salina 0,9% ou CPT-11.
Os animais receberam salina ou CPT-11 (60 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos e foram sacrificados no quinto dia experimental. O duodeno foi
removido e processado para a técnica de coloração pelo método H&E (100x).
Na mucosa dos animais PAFr WT e PAFr knockout (PAFr
-/-
), ambos injetados
com CPT-11 (60 mg/kg), os vilos estão encurtados (setas horizontais), há
achatamento e vacuolização de enterócitos (setas diagonais), necrose de
criptas (seta diagonal). Painel A: PAFr WT+salina; Painel B: PAFr WT+CPT-11
60 mg/kg; Painel C: PAFr
-/-
+salina; Painel D: PAFr
-/-
+CPT-11 60 mg/kg.
150
Escores histopatológicos
Grupo Mediana (min-máx)
PAFr WT 0(0-0)
PAFr WT + CPT-11 60 mg/kg 3(1-4)
a
PAFr
-/-
0(0-0)
PAFr
-/-
+ CPT-11 60 mg/kg 3(3-4)
b
Tabela 22 – Efeito do CPT-11 sobre os aspectos microscópicos duodenais
em camundongos PAFr
-/-
Camundongos PAFr
-/-
desenvolvem alterações histopatológicas no duodeno
secundárias à injeção CPT-11. A análise revelou que o tratamento dos animais
selvagens (BALB/c, WT) e knockout para PAFr (PAFr
-/-
) com CPT-11 induz
aumento nos escores histopatológicos quando comparados, respectivamente,
com animais selvagens e knockout tratados somente com salina.
a
p<0,05 vs
grupo PAFr WT tratado com salina;
b
p<0,05 vs grupo PAFr
-/-
tratado com salina.
Para análise estatística utilizou-se o teste Kruskal Wallis seguido do teste de
Dunn.
151
0
1
2
3
4
5
PAFR WT
Salina
CPT-11
60mg/kg
PAFR-/-
Salina
CPT-11
60mg/kg
a
b
Razão vilo/cripta
Figura 66 – Efeito do CPT-11 sobre a razão vilo/cripta em camundongos
PAFr
-/-
Camundongos PAFr
-/-
desenvolvem alterações morfométricas histopatológicas
no duodeno secundárias à injeção CPT-11. A análise morfométrica revelou que
o tratamento dos animais selvagens (BALB/c, WT) e knockout para PAFr
(PAFr
-/-
) com CPT-11 induz uma redução na razão vilo/cripta quando
comparados, respectivamente, com animais selvagens e knockout tratados
somente com salina.
a
p<0,05 vs grupo PAFr WT tratado com salina;
b
p<0,05 vs
grupo PAFr
-/-
tratado com salina. Para análise estatística utilizou-se o teste
ANOVA seguido do teste de Student Newman Keuls.
152
0
2000
4000
6000
8000
10000
PAFr WT PAFr -/-
Salina
SalinaCPT-11
60mg/kg
CPT-11
60mg/kg
a
b
Atividade de MPO
Neutrófilos/mg de tecido
FIGURA 67 – Efeito do CPT-11 sobre a atividade de mieloperoxidase em
duodeno de camundongos PAFr
-/-
Animais PAFr
-/-
apresentam aumento da atividade de MPO no duodeno por
tratamento com CPT-11. O efeito pro-inflamatório do CPT-11 no duodeno foi
detectado pelo aumento da atividade de MPO em animais selvagens tratados
com o antineoplásico, PAFr WT+CPT-11 e PAFr
-/-
+CPT-11, comparados com
animais selvagens (BALB/c) e knockout (PAFr
-/-
), respectivamente, tratados
somente com salina.
a
p<0,05 vs grupo PAFr WT tratado com salina;
b
p<0,05 vs
grupo PAFr
-/-
tratado com salina. Para análise estatística utilizou-se o teste
ANOVA seguido do teste de Student Newman Keuls.
153
0
50
100
150
200
250
300
350
[ACh]
% Contração em relação ao KCl
60mM
PAFr WT PAFr WT + CPT-11 PAFr-/- PAFr-/- + CPT-11
FIGURA 68 – Efeito do CPT-11 sobre a contratilidade duodenal in vitro em
camundongos PAFr
-/-
Deleção para PAFr não previne contra alterações funcionais de duodeno
induzidas por CPT-11. O estudo funcional do duodeno coletado de animais
selvagens e knockout tratados com CPT-11 (PAFr WT+CPT-11 e PAFr-/-+CPT-
11, respectivamente) revelou um aumento da responsividade do tecido à
Acetilcolina (ACh) quando comparados aos animais tratados apenas com
salina (PAFr WT e PAF
-/-
).
a
p<0,05 vs grupo PAFr selvagem (BALB/c, WT)
tratado com salina;
b
p<0,05 vs grupo PAFr
-/-
tratado com salina. Para análise
estatística utilizou-se o teste ANOVA seguido do teste de Student Newman
Keuls.
a
b
a, b
10
-
10
10
-
9
10
-
8
10
-
7
10
-
6
10
-
5
10
-
4
M
154
0
5000
10000
15000
Salina
SalinaCPT-11
60mg/kg
CPT-11
60mg/kg
a
b
PAFr WT
PAFr-/-
Leucócitos x 10
3
/mL
Figura 69 – Efeito do CPT-11 sobre a contagem de leucócitos sanguíneos
em camundongos PAFr
-/-
Tratamento com CPT-11 induz leucopenia em camundongos PAFr
-/-
. A figura
apresenta o efeito do CPT-11 em induzir leucopenia tanto em animais
selvagens (BALB/c, WT) como em animais knockout para PAFr indicando a
manutenção do efeito da droga sobre a redução do número de leucócitos
circulantes a despeito do tipo de animal.
a
p<0,05 vs grupo PAFr WT não tratado
com CPT-11;
b
p<0,05 vs grupo PAFr
-/-
não tratado com CPT-11. Para análise
estatística utilizou-se o teste ANOVA seguido do teste de Student Newman
Keuls.
155
4.11. Avaliação do efeito do tratamento de camundongos com
cloridrato de loperamida (LOP) sobre a mucosite induzida por CPT-11
As fotomicrografias (figura 70) e os escores histopatológicos (tabela 23)
indicam que o CPT-11 na dose de 60 mg/kg/dia administrado a animais
C57BL/6 tratados ou não com loperamida, em comparação com animais
tratados apenas com salina, induziu acentuado achatamento dos vilos
intestinais, necrose e apoptose de células da cripta e infiltração inflamatória na
mucosa. Adicionalmente, houve perda significante da continuidade epitélio de
revestimento. A análise morfométrica (figura 71) revelou que o tratamento dos
animais com CPT-11 (60 mg/kg, i.p.), e que receberam o veículo da Lop
(H
2
0
dest
) ou Lop, induz uma significativa redução (p<0,05) na razão vilo/cripta
quando comparados com os respectivos animais controle tratados somente
com salina. O efeito pro-inflamatório do CPT-11 (60 mg/kg, i.p.) sobre o
duodeno foi detectado pelo aumento significativo (p<0,05) da atividade de
MPO, como apresentado na figura 72, tanto em animais tratados com o
veículo da Lop com nos que receberam Lop, comparados com os respectivos
grupos controle tratados somente com salina (5 mL/kg, i.p). O estudo de
contratilidade in vitro (figura 73) e a análise do grau de diarréia apresentado
(tabela 24) demonstraram que o CPT-11 induz significativas alterações
funcionais, que levam à diarréia, em animais tratados com o veículo da Lop
(H
2
0
dest
) quando comparado com o grupo tratado apenas com salina (p<0,05).
Porém, a administração do CPT-11 a animais que receberam Lop não foi capaz
de induzir alterações funcionais ou diarréia, quando comparado ao grupo que
recebeu apenas Lop (p>0,05). Entretanto, o CPT-11 induziu significativa
leucopenia (figura 74) tanto em animais tratados com o veículo da Lop (H
2
0
dest
)
como com Lop, comparados com os respectivos controles tratados apenas com
salina (p<0,05).
156
FIGURA 70 – Fotomicrografias do duodeno de camundongos tratados
com loperamida e injetados com salina 0,9% ou CPT-11.
Os animais receberam salina ou CPT-11 (60 mg/kg, i.p.) por quatro dias
consecutivos e foram sacrificados no quinto dia experimental. O duodeno foi
removido e processado para a técnica de coloração pelo método H&E (100x).
Na mucosa dos animais injetados com CPT-11 (60 mg/kg), tratados ou não
com loperamida, os vilos estão encurtados (setas horizontais), há achatamento
e vacuolização de enterócitos (setas diagonais), necrose de criptas (seta
diagonal). Painel A: salina; Painel B: CPT-11 60 mg/kg; Painel C: Loperamida
+salina; Painel D: Loperamida +CPT-11 60 mg/kg.
157
Escores histopatológicos
Grupo Mediana (min-máx)
Salina 0(0-0)
CPT-11 60 mg/kg 3(1-4)
a
Loperamida 0(0-0)
Loperamida + CPT-11 60 mg/kg 2,5 (2-4)
b
Tabela 23 – Efeito do CPT-11 sobre os aspectos microscópicos duodenais
em camundongos tratados com loperamida
Tratamento com Loperamida não previne o desenvolvimento de alterações
histopatológicas no duodeno secundárias à injeção CPT-11. A análise revelou
que o tratamento dos animais com CPT-11 (60 mg/kg, i.p.), e que receberam o
veículo da Lop (H
2
0
dest
) ou Lop, induz significativo aumento nos escores
histopatológicos quando comparados com o grupo controle tratado somente
com salina.
a
p<0,05 vs grupo salina tratado com água destilada (5 mL/kg, s.c.);
b
p<0,05 vs grupo salina tratado com loperamida. Para análise estatística
utilizou-se o teste Kruskal Wallis seguido do teste de Dunn.
158
0
1
2
3
Salina Salina
CPT-11
60mg/kg
CPT-11
60mg/kg
a
b
Veículo
Loperamida
Razão vilo/cripta
Figura 71 – Efeito do CPT-11 sobre a razão vilo/cripta em camundongos
tratados com Loperamida
Tratamento com Loperamida não previne o desenvolvimento de alterações
morfométricas histopatológicas no duodeno secundárias à injeção CPT-11. A
análise morfométrica revelou que o tratamento dos animais com CPT-11 (60
mg/kg, i.p.), e que receberam o veículo da Lop (H
2
0
dest
) ou Lop, induz uma
significativa redução na razão vilo/cripta quando comparados com os
respectivos animais controle tratados somente com salina.
a
p<0,05 vs grupo
salina tratado com água destilada (5 mL/kg, s.c.);
b
p<0,05 vs grupo salina
tratado com loperamida. Para análise estatística utilizou-se o teste ANOVA
seguido do teste de Student Newman Keuls.
159
0
1000
2000
3000
4000
5000
Veículo (H
2
0
Dest
)
loperamida
Salina
SalinaCPT-11
60mg/kg
CPT-11
60mg/kg
a
b
Atividade de MPO
neutrófilos/mg de tecido
FIGURA 72 – Efeito do CPT-11 sobre a atividade de mieloperoxidase em
duodeno de camundongos tratados com loperamida
Tratamento com loperamida
não previne aumento da atividade de MPO no
duodeno na mucosite por CPT-11. O efeito pro-inflamatório do CPT-11 no
duodeno foi detectado pelo aumento da atividade de MPO em animais tratados
com o antineoplásico comparados com animais tratados somente com salina,
tanto em animais que receberam veículo ou loperamida.
a
p<0,05 vs grupo
salina tratado com água destilada (5 mL/kg, s.c.);
b
p<0,05 vs grupo salina
tratado com loperamida. Para análise estatística utilizou-se o teste ANOVA
seguido do teste de Student Newman Keuls.
160
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
[ACh]
% Contração em relação ao KCl
60m M
Salina CPT-11 Loperamida Loperamida+CPT-11
FIGURA 73 – Efeito do CPT-11 sobre a contratilidade duodenal in vitro em
camundongos loperamida
Loperamida previne contra alterações funcionais de duodeno induzidas por
CPT-11. O estudo funcional do duodeno coletado de animais tratados com
CPT-11 revelou um aumento da responsividade do tecido à Acetilcolina (ACh)
quando comparado aos animais tratados apenas com salina. Contudo, a
administração do CPT-11 aos animais tratados com loperamida não foi capaz
de promover alterações funcionais em comparação com animais que
receberam somente loperamida. *p<0,05 vs grupo controle tratado com salina.
Para análise estatística utilizou-se o teste ANOVA seguido do teste de Student
Newman Keuls.
10
-
10
10
-
9
10
-
8
10
-
7
10
-
6
10
-
5
10
-
4
M
*
161
Escores para diarréia
Grupo Mediana (min-máx)
Salina 0(0-0)
CPT-11 60 mg/kg 3(2-3)
*
Loperamida 0(0-0)
Loperamida + CPT-11 60 mg/kg 1(0-2)
Tabela 24 – Avaliação da diarréia em camundongos tratados com
loperamida
Animais tratados com loperamida não desenvolvem diarréia induzida por CPT-
11. O estudo revela que animais tratados com CPT-11 apresentaram um
aumento na mediana dos escores atribuídos ao parâmetro diarréia quando
comparado aos animais tratados apenas com salina. Contudo, a administração
do CPT-11 aos animais tratados com loperamida não foi capaz de promover
aumentos significativos na mediana dos escores em comparação com animais
tratados somente com loperamida. *p<0,05 vs grupo controle salina. Para
análise estatística utilizou-se o teste Kruskal Wallis seguido do teste de Dunn.
162
0
2500
5000
7500
Veículo (H
2
O
Dest
)
Loperamida
a
b
Salina
Salina
CPT-11
60mg/kg
CPT-11
60mg/kg
Leucócitosx10
3
/mL
Figura 74 – Efeito do CPT-11 sobre a contagem de leucócitos sanguíneos
em camundongos tratados com loperamida
Tratamento com CPT-11 induz leucopenia em camundongos tratados com
loperamida. A figura apresenta o efeito do CPT-11 em induzir leucopenia tanto
em animais tratados com veículo da loperamida (água destilada, 5 mL/kg, s.c.)
como em animais tratados com loperamida indicando a manutenção do efeito
da droga na redução do número de leucócitos circulantes.
a
p<0,05 vs grupo
salina tratado com água destilada;
b
p<0,05 vs grupo salina tratado com
loperamida. Para análise estatística utilizou-se o teste ANOVA seguido do teste
de Student Newman Keuls.
163
5. DISCUSSÃO
A mucosite do trato alimentar, que engloba todo o tubo digestivo, está
relacionada com a toxicidade associada a muitos regimes quimioterápicos
padrão comumente utilizados no tratamento do câncer, sendo mais
proeminente no intestino delgado. É também observada como reflexo da
radioterapia em muitas partes do trato gastrintestinal (Sonis et al., 2004).
As causas de diarréia diretamente relacionadas com o tratamento do
câncer podem envolver redução da superfície absortiva do intestino, aumento
de motilidade, mecanismos secretores de eletrólitos e fluidos, redução da
atividade enzimática intestinal e aumento da colonização da parede intestinal
por agentes infecciosos (Engelking et al., 1998). Contudo, a ação do sistema
imune sobre esses agentes infecciosos pode ser determinante para o
desenvolvimento de diarréia.
Em um estudo recente do nosso grupo, Melo e colaboradores (2007)
demonstraram que o CPT-11 causa significante dano à mucosa intestinal,
levando ao desenvolvimento de mucosite, caracterizada por áreas desnudas,
achatamento de vilos, vacuolização epitelial, criptas necróticas e intenso
infiltrado inflamatório na lâmina própria, ao lado de grande aumento dos níveis
locias de citocinas pró-inflamatórias, como TNF-α, IL-1β e KC. Essa
observação despertou um interesse em se investigar o mecanismo envolvido
na indução da lesão intestinal pelo antineoplásico CPT-11.
Inicialmente, foram realizados experimentos na tentativa de se
estabelecer a melhor dose de CPT-11 a ser utilizada nos estudos mecanísticos
subseqüentes. O método desenvolvido baseou-se no modelo proposto por
Ikuno e colaboradores (1995), que utilizou 100 mg/kg de CPT-11 durante
quatro dias. Desta forma, optou-se por avaliar morfofuncionalmente a mucosite
intestinal em camundongos Swiss e C57BL/6. A escolha dessas linhagens
baseou-se nos seguintes pontos: a) animais Swiss foram utilizados em
experimentos anteriores (Melo et al., 2008); b) devido à semelhança fisiológica
e imunológica desses camundongos com humanos (Wade, Daly, 2005); e c)
164
considerando as observações encontradas, objetivamos comparar o
desenvolvimento da mucosite intestinal em Swiss com a de camundongos
C57BL/6, uma vez que essa última é a espécie (background) geralmente
utilizada para desenvolvimento de animais knockout.
Um importante método para o estudo dos efeitos funcionais de produtos
de genes específicos in vivo é a criação de camundongos knockout para
determinado gene, nos quais uma ruptura direcionada é utilizada para inibir a
função de um gene em particular. Essa técnica tem sido utilizada para análise
de muitos fenômenos biológicos, incluindo a maturação, ativação e tolerância
de linfócitos. Essa técnica se baseia na fenômeno da recombinação homóloga.
Se um gene exógeno é inserido em uma célula, ele pode se integrar ao acaso
ao genoma celular. Contudo, se o gene contém seqüências que são homólogas
às de um gene endógeno, ele irá se recombinar preferencialmente com as
seqüências endógenas, realizando a substituição (Abbas, Lichtman, 2005a).
Como apresentado nos resultados, foram detectadas alterações
funcionais, que estavam intimamente relacionadas com o grau de lesão
verificado na análise histopatológica, além de estarem associados aos eventos
de diarréia observados. Contudo, no estudo de Melo e colaboradores (2007),
as análises foram realizadas no sétimo dia após a primeira dose de CPT-11.
Em nosso trabalho, os sacrifícios foram feitos no quinto dia devido à
mortalidade elevada verificada do sexto para o sétimo dia experimentais (dados
não apresentados). Essa diferença entre a taxa de mortalidade entre os
estudos possivelmente se estabeleceu, pois foram utilizadas cepas diferentes
de animais, o que implica diferença de sensibilidade ao antineoplásico.
Recentemente, foi publicado por nosso grupo um estudo funcional em
ratos com mucosite intestinal induzida pelo antineoplásico 5-fluorouracil
(Soares et al., 2008). Esta representou a primeira abordagem experimental
das variações funcionais intestinais decorrentes de um tratamento com
quimioterápico, a despeito dos inúmeros estudos in vitro envolvendo o
conhecimento da fisiologia gastrintestinal ou a influência de processos
patológicos outros sobre essa porção do organismo (Nasser et al., 2006;
165
Aerssens et al., 2007; Burns, 2007; Döring et al., 2007; Mulè et al., 2007; Zizzo
et al., 2007; Sartor 2008)
As reações imunes são mais frequentemente denominadas por uma das
duas maiores populações de linfócitos T, Th1 ou Th2. Apesar do vasto
conhecimento relacionado a essa dicotomia da resposta imune em processos
patológicos, um novo tipo de células T, células T regulatórias (Tr), com função
imunosupressiva e com perfil distinto de citocinas daquelas secretadas por
células Th1 e Th2 foi descrito (McGuirk; Mills, 2002). As proporções relativas
dessas subpopulações, induzidas durante uma resposta imune, são os
principais determinantes das funções protetoras e das conseqüências
patológicas da resposta. Uma vez que uma resposta imune se desenvolve ao
longo de uma via, ela se torna cada vez mais polarizada naquela direção
(Abbas, Lichtman, 2005b).
Muitas abordagens foram feitas relacionando a inibição da atividade pró-
inflamatória das respostas Th1, tal como o tratamento de pacientes com
doença de Crohn utilizando anticorpo quimérico contra TNF-α (Sandborn e
Hanauer, 1999; Flamant e Bourreille, 2007) ou a administração de anticorpos
contra IL-12 em modelos experimentais de colite e em humanos (Neurath et al.,
1995; Simpson et al., 1998; Mannon et al., 2004). Outros estudos sugerem que
a inibição da IL-18, fator indutor de Interferon-γ (IFN-γ), que exerce marcante
atividade sinérgica com a IL-12, pode apresentar significância terapêutica.
Freitas (2007) explorou, sob aspectos morfológicos e inflamatórios, a
influência da ausência de IL-18 no desenvolvimento da mucosite intestinal por
CPT-11. Observando o íleo de camundongos, sugeriu que a IL-18 assume
importância na cascata inflamatória que leva à mucosite, tendo em vista a
proteção que animais geneticamente deficientes em IL-18 ou a administração
da proteína ligante para IL-18 (IL-18bp) conferiu a esses animais, observado à
análise microscópica e pela redução de síntese de citocinas pró-inflamatórias
importantes.
166
Há considerável evidência de que a doença inflamatória intestinal e
outras desordens de natureza inflamatória são reflexos de uma excessiva
ativação de respostas imunes de padrão Th1 (Santucci et al., 2005; Schaefer et
al., 2005). Contudo, outros estudos demonstram que a supressão de alguns
membros envolvidos na cascata inflamatória de muitas patologias sugere que
outros mediadores também assumem importância. Chikano e colaboradores
(2000) demonstraram que a IL-18 tem se apresentado como um desses
mediadores, revelando que esta citocina, em conjunto com a IL-12, induz
inflamação intestinal. Demonstraram também que a lesão intestinal que se
desenvolvia era fenômeno dependente de células Th1 e de IFN-γ, porém
independente de TNF-α e NO. Não obstante, a produção de NO se mostrou
dependente de IFN-γ, uma vez que animais knockout para essa última
apresentavam produção diminuída de NO.
Em nosso estudo, verificamos a mucosite em outra porção do trato
gastrintestinal, no duodeno. As observações foram de encontro às feitas por
Freitas (2007), onde animais knockout para IL-18 não desenvolviam lesões tão
significativas a despeito do tratamento com CPT-11. Além disso, detectamos
que esses animais apresentavam menor atividade de iNOS em tecido
duodenal, verificada também em animais deficientes em caspase-1, uma
protease essencial para a clivagem de pró-IL-18 em IL-18 ativa, e em animais
tratados com IL-18bp, sugerindo a ativação seqüencial dessas espécies. Deve-
se salientar que, no modelo descrito por Chikano e col (2000), a administração
das citocinas IL-18 e IL-12 foi realizada em animais sem uma patologia
associada, sugerindo que a interação entre os diversos mediadores possuem
peculiaridades de interação de acordo com as condições patológicas em
questão. De uma forma contraditória, a avaliação da estrutura histopatológica
em camundongos caspase-1
-/-
indicou pouca preservação tecidual. Porém,
justifica-se a intensidade dos escores atribuídos à incidência destacada de
eventos necróticos e apoptóticos de cripta e ao relativo encurtamento de vilo no
animal knockout, mesmo considerando-se os tratados com salina.
Leung e colaboradores (2001) demonstraram que a IL-18 exerce um
papel importante na ativação de neutrófilos, definindo-se uma nova via pela
167
qual a IL-18 pode amplificar a inflamação aguda por promover a adesão e
migração de neutrófilos e a produção de citocinas e quimiocinas. Tais efeitos
assumem grande relevância in vivo tendo em vista que a administração i.p. de
IL-18 induz o recrutamento de neutrófilos para cavidade peritoneal, efeito este
inibido quando se utilizou anticorpo anti-IL-18, suprimindo-se o
desenvolvimento do processo inflamatório agudo induzido por carragenina.
O acúmulo de neutrófilos no ambiente extravascular é uma característica
de alterações inflamatórias, possuindo correlação direta com o processo
patológico em desenvolvimento. Durante as infecções, os neutrófilos podem
fagocitar e matar microrganismos suprimindo dessa forma a progressão da
infecção. Contudo, a permanência dessa entidade inflamatória no sítio lesivo
pode contribuir para a exacerbação do processo patológico (Bradley et al.,
1982; Wagner, Roth, 2000).
Nossos dados corroboram essa observação, uma vez que animais
knockout para IL-18 (IL-18
-/-
) apresentaram menor atividade de
mieloperoxidase, um indicativo de migração de neutrófilos para o sítio
inflamatório, e a administração da proteína ligante para IL-18 foi fidedigna aos
achados para os animais IL-18
-/-
, confirmando o papel pró-inflamatório dessa
citocina.
Paralelamente, o papel da IL-1β no desenvolvimento da inflamação
intestinal depende do aumento na produção dessa citocina e dos níveis do seu
inibidor natural, o IL-1Ra, o antagonista do receptor de IL-1. Há evidências de
que o equilíbrio entre essas espécies pode afetar o resultado final de uma
patologia. Horai e colaboradores (2000) demonstraram que animais
geneticamente deficientes em IL-1Ra desenvolvem espontaneamente artrite
reumatóide. A administração de IL-1Ra reduz a gravidade das lesões em
muitos modelos de inflamação intestinal (Dinarello, 1996), incluindo colite
induzida por complexos imunes em coelhos (Cominelli et al., 1992).
Contudo, no presente estudo não foi verificado qualquer efeito protetor
da IL-1Ra, seja com relação aos parâmetros morfofuncionais ou inflamatórios
168
avaliados. Há razoável possibilidade de que a IL-1 tenha participação no
desenvolvimento da mucosite, uma vez que os níveis dessa citocina se
encontram elevados em modelo de mucosite intestinal, como demonstrado por
Melo e colaboradores (2007) e Freitas (2007). Porém, essa citocina pode não
assumir uma participação central na cascata de mediadores que levam ao
desenvolvimento da mucosite, tendo em vista que o modulador de sua
atividade (IL-1Ra) não protegeu contra alterações funcionais, morfológicas e
inflamatórias como o fez a IL-18bp. Essa observação sugere uma possível
participação secundária da IL-1 na fisiopatologia da mucosite intestinal induzida
por CPT-11 ao contrário do observado por Soares (2008), que verificou que a
IL-1Ra, na mesma dose testada em nosso trabalho, possui importante
participação na mucosite intestinal induzida por 5-Fluorouracil. Essa, portanto,
é uma evidência de que a fisiopatologia da mucosite envolve complexas vias
nem sempre coincidentes, quando comparados estímulos quimioterápicos
diferentes, reforçando a idéia de se estudar os processos inflamatórios
intestinais secundários à quimioterapia antineoplásica nos diversos contextos.
A compreensão dessas diferenças poderá sucitar abordagens terapêuticas
diferenciadas para a mucosite intestinal de pacientes em quimioterapia.
Melo e colaboradores (2007) demonstraram também que a Talidomida e
a Pentoxifilina reduziram significativamente a gravidade da lesão intestinal e o
infiltrado inflamatório secundários ao tratamento de camundongos com CPT-
11. Entretanto, a pentoxifilina foi mais efetiva quanto à proteção. Discutiu-se
que essa diferença de efeito poderia estar relacionada ao espectro de ação
diferenciado dessas drogas sobre a síntese de citocinas pró-inflamatórias. A
pentoxifilina reduzindo a produção de TNF-α, IL-1β e IL-8 e a talidomida
inibindo especificamente a produção de TNF-α.
É bastante conhecida a ativação seqüencial do TNF-α e da IL-1β como
deflagadores da resposta inflamatória, bem como sua ação redundante em
muitos processos patológicos, como estímulo para migração de neutrófilos
(Montecucco et al., 2008; Oliveira et al., 2008) e ação sobre leucócitos,
fibroblastos e células endoteliais para liberação de fatores quimiotáticos
169
(Abbas, Lichtman, 2005c). Apesar das similaridades de efeito, o TNF-α possui
ações pró-apoptóticas que não são verificadas para a IL-1β (Abbas, Lichtman,
2005c).
Desta forma, observa-se que a inibição isolada da ação do TNF-α ou da
IL-1β não permite modular de forma efetiva a deflagração ou a gravidade do
processo patológico em desenvolvimento, tendo em vista o paralelismo de
ação dessas citocinas, o que pode explicar a falta de atividade da IL-1Ra,
quando administrada aos animais tratados com CPT-11 no presente estudo.
O TNF-α é uma citocina que possui muitas funções, incluindo
participação na imunidade, indução de respostas inflamatórias e apoptose.
Algumas das respostas ao TNF-α são mediadas pela caspase-1, que está
envolvida na produção das citocinas IL-1β, IL-18 e IL-33. Jain e colaboradores
(2007) demonstraram que o tratamento de células A549 (células de
adenocarcinoma de pulmão) com TNF-α induzia a expressão aumentada de
RNAm para caspase-1. No presente estudo, animais knockout para caspase-1
apresentaram mucosite intestinal atenuada, tendo em vista a menor atividade
inflamatória, bem como a proteção contra alterações morfofuncionais a
despeito do tratamento com CPT-11. Essas observações, aliadas às de Melo e
colaboradores (2007), sugerem que a caspase-1, ativada via TNF-α assume
participação central nos eventos inflamatórios que desencadeiam a mucosite
intestinal. Contudo, outros fatores podem estar associados à ativação da
caspase-1, uma vez que, como discutido por Melo e col. (2007), o uso de um
inibidor específico para TNF-α, talidomida, não inibe de forma efetiva o curso
da mucosite intestinal, verificada pela diarréia presente nesses animais.
Canetti e colaboradores (2003) sugeriram que a IL-18 ativa a produção
de LTB
4
, sendo esse um dos responsáveis pela quimiotaxia de neutrófilos para
o sítio inflamatório no modelo de artrite induzida por colágeno, onde eles
podem contribuir para a resposta aguda e, até mesmo, à cronificação da
doença inflamatória. Kuwabara e col. (2000), utilizando o mesmo modelo
experimental, indicaram que antagonistas de LTB
4
atenuam o processo
170
inflamatório associado à fisiopatologia da artrite. Essas observações nos
motivaram a verificar a importância dos leucotrienos para o desenvolvimento da
mucosite intestinal, mediante utilização de animais knockout para 5-
lipoxigenase (5-LOX
-/-
), a enzima responsável pela conversão metabólica do
ácido araquidônico em leucotrienos. Curiosamente, a deleção do gene para
essa enzima não conferiu proteção contra a ação do CPT-11 sobre os aspectos
morfológicos e inflamatórios. Porém, considerando-se os aspectos funcionais, o
CPT-11 não promoveu alterações no padrão de contratilidade in vitro de
duodeno em animais 5-LOX
-/-
comparados com os knockout tratados somente
com salina.
Poucas informações podem ser encontradas na literatura relacionando a
ação dos leucotrienos sobre a contratilidade in vitro intestinal (Kawata et al.,
2005; Scott, Maric, 1991). Isso se contrapõe ao amplo conjunto de relatos
acerca da participação que estes mediadores lipídicos possuem em processos
inflamatórios intestinais, atuando como fatores quimiotáticos (Jupp et al., 2007),
mediando o aumento da permeabilidade intestinal ao atuar sobre junções
paracelulares (Mazzon et al., 2006) e aumentando a liberação de acetilcolina
pelo plexo mioentérico (Yoshikawa et al., 1993).
A ação modulatória positiva descrita para a 5-LOX sobre a liberação de
acetilcolina por neurônios entéricos sugerido por Yoshikawa et al. (1993) pode
justificar o fato de animais geneticamente deficientes para essa enzima
apresentarem um padrão contrátil atenuado a despeito da administração do
CPT-11. Contudo, apesar da descrição de ações diretas sobre a funcionalidade
intestinal geral, incluindo-se aqui aspectos secretórios e de permeabilidade
alterada que levam ao desenvolvimento de diarréia, verifica-se um
posicionamento paralelo da 5-LOX no contexto da formação de mediadores
alternativos, porém não menos importantes, que desencadeiam o
desenvolvimento da mucosite intestinal.
Desta forma, decidimos investigar a importância desse eixo de ativação
inflamatória na mucosite intestinal por CPT-11 baseado em duas razões
principais: a) os leucotrienos C
4
e D
4
(LTC
4
e LTD
4
) estimulam culturas
171
primárias de células endoteliais a sintetizar e acumular PAF (McIntyre et al.,
1986); b) o PAF extracelular exerce sua ação ao se ligar ao receptor de
superfície PAFr estimulando a atividade de fosfolipase A2, com conseqüente
formação de fosfatos de inositol, diacilglicerol e formação de araquidonato, este
último dando origem a eicosanóides, como prostaglandinas e leucotrienos
(Peplow, 1999), atuando por exemplo, como fator quimiotático para neutrófilos,
além de também atuar sobre a contratilidade de músculos lisos gastrintestinais,
uterinos e pulmonares (Goodman, Gilman, 2003),.
No modelo desenvolvido nesse trabalho, a avaliação da participação do
receptor para PAF, utilizando-se animais geneticamente deficientes para essa
entidade, não se verificou qualquer proteção desses animais, frente à
administração do CPT-11, seja com respeito às alterações funcionais ou sobre
o desenvolvimento da resposta inflamatória. Justifica-se essa observação pela
provável ação intracelular PAF, podendo-se citar a expressão de moléculas de
adesão em células endoteliais, estimulando, dessa maneira, a migração
neutrofílica para fora da microvasculatura em direção ao foco de infecção
(McIntyre et al., 1986). Desta forma, a não inibição da migração neutrofílica,
como evidenciado pela elevada atividade de MPO, pode envolver essa ação
extra-receptor PAF.
Contudo, o que se observa é uma importância paralela que esses
mediadores lipídicos possuem na cascata que culmina com o desenvolvimento
da mucosite. Provavelmente, o deflagrador central dessa cascata envolva
realmente a via imunológica, como demonstrado em animais caspase-1
-/-
, IL-
18
-/-
e tratados com IL-33. Wallace e colaboradores (1989) demonstraram que a
participação do PAF no desenvolvimento da resposta inflamatória aguda em
modelos de doença inflamatória intestinal é improvável, porém sugerem que
esse mediador possa assumir papel importante na fase de prolongamento da
doença.
Análises realizadas in vivo, nas quais se administrou IL-33 a animais
sem uma patologia de base, mostraram que essa citocina induz marcantes
alterações patológicas em tecidos mucosos, incluindo eosinofilia de pulmão,
172
esôfago e intestino, além de aumentar os níveis séricos de IgA IgE, IL-5 e IL-13
(Schmitz et al., 2005). As observações percebidas no presente trabalho estão
de acordo com as relacionadas com as realizadas por Schmitz e colaboradores
(2005), tendo em vista que a administração de IL-33 a animais que não
receberam CPT-11 induz uma marcante redução na razão vilo/cripta. Essas
mudanças podem estar associadas ao aumento na expressão de IL-13, uma
vez que a administração de IL-33 a animais knockout para IL-13 falhou em
induzir alterações epiteliais intestinais.
Entretanto, a IL-33 parece exercer mais uma atividade imunoregulatória
que participa no controle das respostas imunes Th2, do que uma ação pró-
inflamatória, como os outros membros da família IL-1. Schmitz e colaboradores
(2005) propuseram que a IL-33 inicia uma seqüência de ativação por recrutar o
adaptador MyD88, a quinase associada ao receptor de interleucina-1 (IRAK1,4)
e a ubiquitina ligase, fator associado ao receptor de TNF (TRAF), a partir do
receptor ST2, ativando MAPK (proteínas quinase ativadas por mitógenos) e
NF-κB (fator de necrose kappa B), regulando a transcrição de citocinas
tipicamente associadas à resposta Th2, tal como IL-4, IL-5 e IL-13.
A teoria da regulação das respostas imunes envolve a homeostase entre
atividade Th1 e Th2. Essa hipótese, surgida em 1986, baseou-se nos
diferentes padrões de citocinas liberadas pelo sistema imune de camundongos
e foi adapatada para as respostas imunes observadas em humanos.
Considerando-se o desequilíbrio Th1/Th2 existente em diversas patologias
(Marques et al., 2006; Raghupathy, 2001; Schulze-koops, Kalden, 2001) e a
participação da via de ativação de citocinas importantes na resposta imune Th1
na patogênese da mucosite intestinal, possivelmente a administração de IL-33
poderia modular negativamente a progressão da lesão na mucosite.
Diferentes abordagens, envolvendo citocinas de padrão Th2, inibidores
de citocinas de padrão Th1 ou manipulação por engenharia genética de células
para produzirem IL-4, foram aplicadas e suportam a idéia de interferência de
um padrão Th2 emergente sobre a ação pró-inflamatória de citocinas Th1,
173
prevenindo, por exemplo, a destruição tecidual sinovial na artrite reumatóide
(Schulze-koops, Kalden, 2001).
Carriere e colaboradores (2007) demonstraram que células endoteliais
constituem grande fonte de RNAm e de proteína IL-33 in vivo. Através de
técnicas de hibridização in situ, verificaram que vasos sanguíneos de tecidos
inflamados, coletados de pacientes com artrite reumatóide ou com doença de
Crohn, expressavam RNAm para IL-33, sugerindo que a IL-33 possa ter um
papel importante no endotélio durante o processo inflamatório.
Em comum com a IL-1α, a IL-33 tem um papel dentro da célula, ao se
acumular no núcleo e se associar com a heterocromatina e com a eucromatina.
A região N-terminal parece ser responsável por uma propriedade repressora
transcricional da IL-33 (Carriere et al., 2007). A implicação desse estudo é que
a IL-33 pode atuar como um co-repressor de genes pró-inflamatórios,
promovendo, assim, um fenótipo Th2 antiinflamatório, assumindo uma
importância particular quanto ao conhecimento do papel dessa citocina como
fator nuclear no contexto da inflamação. Desta forma, justifica-se a menor
atividade de mieloperoxidase, menor grau de diarréia e contratilidade duodenal
verificada in vitro em animais tratados com IL-33 e que receberam CPT-11.
No contexto da cascata de ativação Caspase-1Æ IL-18ÆNO, decidimos
investigar o envolvimento do óxido nítrico no desenvolvimento da mucosite
intestinal. O óxido nítrico (NO) está associado a algumas das mais importantes
imunopatologias, incluindo artrite reumatóide, diabetes, lupus eritematoso
sistêmico e choque séptico, além de participar como molécula efetora na
defesa contra patógenos (revisto por Niedbala et al., 2006). Uma característica
comum entre essas doenças é um proeminente papel de células Th1 (Bogdan
et al., 2000; Liew, 2002). Células Th1 produzem IFN-γ que ativam macrófagos a
produzir altas concentrações de NO via iNOS. Em contraste, células Th2
induzem a expressão de IL-4 e IL-5, que podem inibir a indução de iNOS pelo
IFN-γ (Liew et al., 1991; Bogdan et al., 1994).
174
Observações anteriores, feitas por Leitão e colaboradores (2006), no
contexto da mucosite oral por 5-fluorouracil, sugerem a participação do óxido
nítrico na fisiopatologia dessa condição. Levantou-se a hipótese de
participação do óxido nítrico, produzido via iNOS, no desenvolvimento das
lesões intestinais pós administração de CPT-11. Os resultados no presente
estudo corroboraram essa hipótese, tendo em vista o efeito protetor da
aminoguanidina sobre a razão vilo/cripta, influenciada por menor perda na
altura dos vilos e menor comprometimento da arquitetura das criptas a despeito
do tratamento com CPT-11. De forma a confirmar essas observações, animais
knockout para iNOS foram utilizados como ferramenta experimental, obtendo-
se resultado similar.
Durante condições fisiológicas normais, o epitélio intestinal não se
apresenta constantemente inflamado, o que se deve em grande parte às
junções intercelulares que restringem a passagem de bactérias e produtos
bacterianos, como o LPS, do lúmen para o interstício mucoso (Nusrat et al.,
2000). A lesão intestinal que se segue à administração do CPT-11 está
associada ao grande infiltrado inflamatório na parede intestinal (Kurita et al.,
2000; Melo et al., 2008). Neste trabalho, o infiltrado neutrofílico no sítio de
lesão foi avaliado indiretamente pelo ensaio da mieloperoxidase.
Interessantemente, encontrou-se uma marcante redução na atividade de MPO
em segmentos duodenais de camundongos iNOS
-/-
e de animais tratados com
aminoguanidina. Os efeitos do NO sobre a função fisiológica normal, e nos
processos lesivos, varia desde uma participação benéfica até efeitos
prejudiciais, a depender da concentração local. Em altas concentrações, o NO
promove lesão intestinal e perda da função da barreira epitelial. Xu e
colaboradores (2002) demonstraram que o aumento da atividade de iNOS está
diretamente relacionada com os efeitos lesivos de endotoxinas sobre a
integridade intestinal, verificando-se perda na viabilidade celular, associada à
lesão em vilos, culminando com a perda funcional da barreira intestinal,
aumento da permeabilidade e facilitação ao processo de translocação
bacteriana. Em contraste, tem sido demonstrado que o NO reduz a expressão
de moléculas de adesão no endotélio vascular, reduzindo, desta forma, o
infiltrado neutrofílico para o sítio de lesão (Kubes et al., 1991; Dal Secco et al.,
175
2003). A principal razão para essas observações contraditórias, requer maior
investigação. Contudo, essas diferenças parecem estar relacionadas com
peculiaridades, bem como com o curso temporal das condições patológicas em
consideração. O nível de NO produzido localmente, a isoforma de NOS
envolvida, o grau de atividade das células epiteliais relacionado ao estresse
tecidual e outros fatores relacionados ao ambiente celular podem influenciar o
fator resultante da ação do NO sobre a lesão ou proteção da mucosa (Shah et
al., 2004).
Hierholzer e colaboradores (2004) propuseram que um aumento primário
da atividade de iNOS contribui para a resposta inflamatória na parede intestinal
durante o choque hemorrágico e participa na ativação de uma cascata de
mediadores e expressão de citocinas que regulam a lesão intestinal,
recrutamento de neutrófilos e comprometimento da motilidade intestinal.
Avaliando os níveis de citocinas em segmentos de duodeno coletados de
animais tratados com CPT-11, verificamos-se uma elevação nas concentrações
das citocinas pró-inflamatórias IL-1β e do análogo da IL-8 humana em
camundongos, KC. Quando realizada essa pesquisa em animais deficientes
para o gene da iNOS que receberam CPT-11, foi encontrada redução
significativa nas concentrações dessas citocinas, em comparação com animais
selvagens tratados com CPT-11, similarmente ao verificado em inúmeras
condições inflamatórias, provavelmente envolvendo um mecanismo de menor
ativação de células residentes. Além disso, uma menor liberação de KC
localmente por essas células pode adicionalmente levar a um menor
recrutamento de neutrófilos para o sítio de lesão, como sugerido através da
mensuração da atividade de mieloperoxidase nesses animais. Uma menor
expressão de citocinas pode ser também conseqüência da falta de produção
de NO via iNOS bem como de uma possível redução na produção local de
outras espécies reativas (Riaz et al., 2003). Adicionalmente, a atenuação nos
níveis teciduais dessas citocinas sem, completa supressão, é um indicativo de
que a própria IL-1 pode ser um ativador de iNOS. Complementarmente, o
elevado número de células imuno-marcadas para iNOS em animais tratados
com CPT-11, o que não foi observado em animais iNOS
-/-
, reforça o papel
176
fundamental que a iNOS assume com relação ao desenvolvimento da mucosite
intestinal.
Já é bem estabelecido o papel do CPT-11 em promover alterações
morfológicas gastrintestinais, levando ao dano de vilos e redução da área de
absorção e desenvolvimento de diarréia. Mudanças histopatológicas têm sido
descritas em muitos estudos experimentais em animais (Ikuno 1995; Gibson et
al., 2003, Melo et al., 2008). Neste estudo, verificamos que ao modular a
produção de NO, mediante inibição da enzima iNOS, obtém-se redução da
gravidade da diarréia apresentada pelos animais, secundária à mucosite
intestinal. O mecanismo envolvido se mostrou principalmente inflamatório e o
controle dos fatores pró-inflamatórios resultou em eventos diarréicos
atenuados. Tendo em vista que a diarréia é primariamente uma desordem de
motilidade intestinal, seria de importância também primária um estudo no
sentido de se verificar diretamente as alterações funcionais da musculatura lisa
intestinal.
Um dos achados clínicos, de importância singular, no que se refere à
mucosite intestinal induzida por antineoplásicos, é o desenvolvimento de
diarréia severa associada em até 25% dos pacientes (Keefe et al., 2007).
Entende-se que a diarréia, em pacientes oncológicos sob quimioterapia, é um
efeito colateral debilitante e de potencial risco à vida quando não tratada
adequadamente. Uma conseqüência do tratamento envolve a repercussão
funcional sobre o trato gastrintestinal dias ou meses após o término do
tratamento, justificando o desenvolvimento de um conhecimento experimental
sobre aspectos funcionais. Contudo, não há relato na literatura sobre a
repercussão de mediadores inflamatórios como modificadores de aspectos
funcionais intestinais.
Os resultados apresentados neste trabalho revelam que o CPT-11 induz
alterações contráteis no duodeno de camundongos, verificadas em
experimentos de contratilidade in vitro. Essas alterações podem estar
relacionadas aos eventos de diarréia observados em camundongos tratados
com o Irinotecano. Muitos estudos de várias regiões do trato gastrintestinal em
177
diversas espécies animais têm implicado um papel do NO nas contrações
espontâneas (Plujà et al., 1999; Caballero-Alomar et al., 2003; Grasa et al.,
2005). Outros estudos (Eskandari et al., 1997; Kalff et al., 2000) fornecem
evidências do papel da enzima iNOS na regulação da contratilidade da
musculatura lisa intestinal. Segundo esses estudos, o NO regula
negativamente, via iNOS, a função do músculo liso através do mecanismo de
ativação de moléculas de adesão e infiltrado de células polimorfonucleares na
camada muscular do jejuno de roedores. Esses dados enfocaram condições
inflamatórias agudas, utilizando modelos animais de doença de Crohn, ileus
(síndrome de oclusão intestinal), ou na presença de parasitas, onde o NO
apresenta-se como um mediador inibitório e consequentemente tem-se o
impedimento da motilidade normal do intestino.
No protocolo desenvolvido nesse trabalho, onde um agente
quimioterápico é administrado, foi encontrado in vitro um aumento da
motilidade intestinal induzida por acetilcolina ou betanecol, como verificado in
vitro, corroborando os achados para a diarréia. Além disso, altos níveis de NO
sendo produzidos localmente na parede intestinal implicou maior lesão e
aumento da resposta contrátil à acetilcolina. De maneira contrária, animais
deficientes para a enzima iNOS, bem como animais tratados com
aminoguanidina, não desenvolveram aumento de motilidade, mesmo tratados
com CPT-11, de uma maneira até mais efetiva que a loperamida, um agonista
periférico do receptor µ-opióide.
É bem conhecido que a exposição crônica a agentes opióides resulta em
tolerância. Tan-NO e colaboradores (2003) discutem o efeito inibitório de doses
de loperamida administradas repetidamente. Essa é uma droga largamente
utilizada na prática clínica como agente antidiarréico e, segundo esses
pesquisadores, o organismo rapidamente desenvolve tolerância para o efeito
inibitório da loperamida sobre o trânsito gastrintestinal de camundongos após
somente dois dias de dupla administração da droga. Por essa razão e,
considerando o longo período de administração do CPT-11, decidiu-se adotar
um esquema de duas doses distintas para experimentação. Em adição, a
incipiente tolerância descrita anteriormente pode ser a causa de um efeito
178
inibitório sobre a contratilidade in vitro menor da loperamida comparada àqule
observado em animais deficientes para iNOS
-/-
ou tratados com
aminoguanidina.
Adicionalmente ao aumento da atividade funcional motora, foi
mensurada a espessura da camada muscular (circular mais longitudinal). De
acordo com os resultados, o CPT-11 aumentou a espessura dessa camada, o
que pode ser conseqüência do processo inflamatório estabelecido, levando ao
aumento da resposta ao estímulo excitatório, aumento da função motora
intestinal e, finalmente, desencadeamento de eventos de diarréia. Essa
hipótese é ainda mais reforçada pelo fato de o tratamento de animais com
aminoguanidina e animais iNOS
-/-
não apresentarem alteração nesse
parâmetro. Contudo, outras possibilidades envolvem hipertrofia, hiperplasia e
edema tecidual.
Moreels e colaboradores (2001) estudaram funcionalmente o íleo de
ratos pós-injeção de TNBS (ácido trinitro-benzeno sulfônico) e verificaram que
a exacerbação contrátil ileal na fase pós-inflamatória poderia estar relacionada
ao aumento da massa muscular total devido ao processo inflamatório
previamente estabelecido sem, no entanto, haver aumento na capacidade
contrátil de cada célula individualmente. Contudo, deve-se considerar a
possibilidade de up-regulation de receptores de mediadores contráteis, como
acetilcolina, substância P, 5-hidroxitriptamina, prostaglandinas ou até mesmo
mudanças no padrão de atividade de canais iônicos e plexo nervoso
mioentérico. Martinolle e colaboradores (1997) estudaram, em modelo de ileíte
induzida por TNBS em cobaias, as alterações no padrão de contratilidade in
vitro da musculatura longitudinal e circular intestinais, sugerindo que o estímulo
químico induz responsividade diferenciada do tecido a diferentes agonistas
contráteis. Blandizzi e colaboradores (2001) sugeriram que os eventos
adversos colinérgicos do CPT-11 provavelmente não envolvem a inibição da
acetilcolinesterase. Contudo, diversos outros estudos contrapõem essa
informação (Dodds; Rivory, 1999; Morton et al., 1999; Dodds; Rivory, 2001).
Esse portanto, poderia ser outro mecanismo de homeostase tecidual com
reflexo nas fases tardias dos eventos de diarréia, uma vez que no presente
179
estudo a resposta ao mediador colinérgico está aumentada, corroborando
essas hipóteses.
Adicionalmente às possíveis alterações em neurônios do plexo
mioentérico, podem-se encontrar alterações no padrão de esvaziamento e de
contratilidade do fundo gástrico, bem como uma diminuição do trânsito
intestinal. Porém, o papel das células intersticiais de Cajal pode ser descartado
tendo em vista que não se verificou alteração na freqüência das contrações
espontâneas a despeito da administração do CPT-11 (dados não mostrados).
De forma complementar, Martinolle e colaboradores (1995) verificaram que em
intestino de cobaias inflamado pós-injeção de TNBS ocorre alteração da
população de adrenoreceptores, efeito este influenciado por leucotrienos,
porém sem influência de prostanóides. Em nossas condições experimentais,
nenhuma dessas possibilidades foi testada. Porém, não pode ser descartada a
importância desses fatores, baseando-se apenas no espessamento da camada
muscular.
Em todos os experimentos realizados, observou-se uma marcante
leucopenia secundária ao tratamento dos animais com CPT-11. A presença de
leucopenia destaca que o efeito do antineoplásico permanece a despeito das
observações, em muitas situações, de inibição sobre o desenvolvimento da
mucosite. Esse fato permite sugerir que as ações não eram decorrentes da
perda de atividade do CPT-11, mas sim de uma ação realmente moduladora da
atividade inflamatória desses mediadores.
A maior contribuição desse trabalho consistiu em sugerir de forma
inédita a participação de uma cascata seqüencial de mediadores envolvendo
citocinas da família IL-1 e óxido nítrico no desenvolvimento da mucosite
intestinal em camundongos secundária ao tratamento com o antineoplásico
irinotecano (CPT-11). Em síntese, a inibição dessas citocinas culmina com a
redução na síntese de óxido nítrico mediante diminuição da atividade da
enzima óxido nítrico sintase induzida, como ilustrado na figura 75.
180
181
6. CONCLUSÕES
Em conjunto os dados apresentados nesse trabalho permitem concluir que:
- A via de sinalização celular caspase-1/Interleucina-18/óxido nítrico parece
assumir papel fundamental na cascata de mediadores que levam ao
desenvolvimento das alterações morfofuncionais e do processo inflamatório
associados à fisiopatologia da mucosite intestinal induzida por CPT-11;
- A interleucina-33 parece ter papel modulatório negativo sobre o
desenvolvimento da mucosite intestinal induzida por CPT-11;
- Mediadores lipídicos, como os leucotrienos, formados pela via da 5-
lipoxigenase, e o PAF, atuando via receptor PAFr, parecem assumir um papel
secundário na via inflamatória de desenvolvimento da mucosite intestinal
induzida por CPT-11.
182
Figura 75 – Modelo hipotético proposto da patogênese da mucosite
intestinal induzida pelo tratamento com CPT-11.
Baseado nas observações da atual literatura, em conjunto com os dados
obtidos no presente trabalho, sugere-se que a injeção de CPT-11 leva em
células inflamatórias, como neutrófilos e macrófagos, à ativação da protease
caspase-1, direta ou indiretamente, via TNF-α. Uma vez ativada, essa protease
cliva a pró-IL-1β, pró-IL-33 e pró-IL-18 em formas ativas, que são, por
conseguinte, liberados no meio extracelular para interagirem com seus
respectivos receptores. A IL-1β e a IL-18 ativam fatores de transcrição
celulares para síntese de outras citocinas, quimiocinas, iNOS e COX-2, com
posterior liberação de NO e prostanóides. A IL-33, por sua vez, assume papel
modulatório negativo sobre essa cascata de ativação. Paralelamente ao
desenvolvimento de lesão tecidual, sugere-se a participação do PAF e
leucotrienos, porém em caráter secundário, na cascata de ativação de
mediadores inflamatórios principais envolvidos na fisiopatologia da mucosite
intestinal induzida por CPT-11.
?
183
7. REFERÊNCIAS
ABBAS, A.K.; LICHTMAN, A.H. Mecanismos efetores da imunidade mediada
por células, in Imunologia Celular e Molecular, Tradução da 5ª edição, Rio de
Janeiro, Saunders Elsevier, p. 549, 2005a.
ABBAS, A.K.; LICHTMAN, A.H. Mecanismos efetores da imunidade mediada
por células, in Imunologia Celular e Molecular, Tradução da 5ª edição, Rio de
Janeiro, Saunders Elsevier, p. 307-326, 2005b.
ABBAS, A.K.; LICHTMAN, A.H. Citocinas, in Imunologia Celular e Molecular,
Tradução da 5ª edição, Rio de Janeiro, Saunders Elsevier, p. 251-282, 2005c.
AERSSENS, J.; HILLSLEY, K.; PEETERS, P.J.; DE HOOGT, R.; STANISZ, A.;
LIN, J.H.; VAN DEN WYNGAERT, I.; GÖHLMANN, H.W.; GRUNDY, D.;
STEAD, R.H.; COULIE, B. Alterations in the brain-gut axis underlying visceral
chemosensitivity in Nippostrongylus brasiliensis-infected mice.
Gastroenterology, v. 132, n. 4, p. 1375-87, 2007.
ANDO, Y.; FUJITA, K.; SASAKI, Y.; HASEGAWA, Y. UGT1AI*6 and
UGT1A1*27 for individualized irinotecan chemotherapy. Curr Opin Mol Ther, v.
9, p. 258-62, 2007.
ANTIN, J.H.; LEE, S.J.; NEUBERG, D.; ALYEA, E.; SOIFFE; R.J.; SONIS, S.;
FERRARA, J.L.M. A phase I/II double-blind, placebocontrolled study of
recombinant human interleukin-11 for mucositis and acute GVHD prevention in
allogeneic stem cell transplantation. Bone Marrow Transplant, v. 29, p. 373-
377, 2002.
ARAÚJO, P.V.; CLEMENTE, C.M.; DA GRAÇA, J.R.; ROLA, F.H.; DE
OLIVEIRA, R.B.; DOS SANTOS, A.A.; MAGALHÃES, P.J. Inhibitory effect of
sildenafil on rat duodenal contractility in vitro: putative cGMP involvement. Clin
Exp Pharmacol Physiol, v. 32, n. 3, p. 191-5, 2005.
BALIS FM, SAVITCH JL, BLEYER WA, REAMAN GH, POPLACK DG.
Remission induction of meningeal leukemia with high-dose intravenous
methotrexate. J Clin Oncol., v. 3, n. 4, p. 485-489, 1985.
BARKSBY, H.E.; LEA, S.R.; PRESHAW, P. M.; TAYLOR, J.J. The expanding
family of interleukin-1 cytokines and their role in destructive inflammatory
disorders. Clin Exp Immunol, 149: 217–225, 2007.
BERCIK, P.; DE GIORGIO, R.; BLENNERHASSETT, P.; VERDU, E.F.;
BARBARA, G.; COLLINS, S.M. Immune-mediated neural dysfunction in a
murine model of chronic Helicobacter pylori infection. Gastroenterology, v.
123, p. 1205-15, 2002.
BERGERS, G.; REIKERSTORFER, A.; BRASELMANN, S.; GRANINGER, P.;
BUSSLINGER, M. Alternative promoter usage of the Fos-responsive gene Fit-1
184
generates mRNA isoforms coding for either secreted or membrane-bound
proteins related to the IL-1 receptor. EMBO J, v. 13, p. 1176–1188, 1994.
BISHOP JF, JOSHUA DE, LOWENTHAL RM, KRONENBERG H, WHITESIDE
MG, COBCROFT R, DODDS A, WOLF M, MANOHARAN A. A phase I-II study
of cytosine arabinoside, daunorubicin, and VP16-213 in adult patients with
acute non-lymphocytic leukemia. Aust N Z J Med., 6(1):48-51, 1986.
BLANDIZZI, C.; DE PAOLIS, B. ; COLUCCI, R.; LAZZERI, G.; BASCHIERA, F.;
DEL TACCA, M. Characterization of a novel mechanism accounting for the
adverse cholinergic effects of the anticancer drug irinotecan. Br J Pharmacol.,
v. 132, n. 1, p. 73-84, 2001.
BLIJLEVENS NM, DONNELLY JP, PAUW BE. Mucosal barrier injury: biology,
pathology, clinical counterparts and consequences of intensive treatment for
haematological malignancy: an overview. Bone Marrow Transplant, 25:1269–
1278, 2000.
BLIJLEVENS, N.; SONIS, S. Palifermin (recombinant keratinocyte growth
factor-1): a pleiotropic growth factor with multiple biological activities in
preventing chemotherapy- and radiotherapy-induced mucositis, Ann Oncol., v.
18, n. 5, p. 817-26, 2007.
BOGDAN, C.; ROLLINGHOFF, M.; DIEFENBACH, A. Reactive oxygen and
reactive nitrogen intermediates in innate and specific immunity. Curr Opin
Immunol,v. 12, p. 64-76, 2000.
BOGDAN, C.; VODOVOTZ, Y.; PAIK, J.; XIE, Q.W.; NATHAN, C. Mechanism
of suppression of nitric oxide synthase expression by interleukin-4 in primary
mouse macrophages. J Leukoc Biol, v. 55, p. 227-33, 1994.
BRADLEY, P.P.; PRIEBAT, D.A.; CHRISTENSEN, R.D.; ROTHSTEIN, G.
Measurement of cutaneous inflammation: estimation of neutrophil content with
an enzyme marker. J Invest Dermatol, v. 78, n. 3, p. 206-9, 1982.
BURNS, A.J. Disorders of interstitial cells of Cajal. J Pediatr Gastroenterol
Nutr, v. 45, Suppl 2, p. S103-6, 2007.
CABALLERO-ALOMAR, C.; SANTOS, C.; LOPEZ, D.; METAFILE, M.T.; PUIG-
PARELLADA, P. Sources and implications of basal nitric oxide in spontaneous
contractions of guinea pig Taenia caeci. Am J Physiol, v. 285, p. G747-G753,
2003.
CABALLERO GA, AUSMAN RK, QUEBBEMAN EJ. Longterm, ambulatory,
continuous IV infusion of 5-FU for the treatment of advanced adenocarcinomas.
Cancer Treat Rep., 69(1):13–15, 1985.
CALABRESE, E.J. Nitric oxide: biphasic dose responses. Crit Rev Toxicol, v.
31, p. 489-501, 2001.
185
CANETTI, C.A.; LEUNG, B.P.; CULSHAW, S.; MCINNES, I.B.; CUNHA, F.Q.;
LIEW, F.Y. IL-18 enhances collagen-induced arthritis by recruiting neutrophils
via TNF-alpha and leukotriene B4. J Immunol, v. 171, n. 2, p. 1009-15, 2003.
CARRIERE, V. ; ROUSSEL, L.; ORTEGA, N. IL-33, the IL-1-like cytokine ligand
for ST2 receptor, is a chromatin-associated nuclear factor in vivo. Proc Natl
Acad Sci USA, v. 104, p. 282–7, 2007.
CETIN, S.; LEAPHART, C.L.; LI, J.; ISCHENKO, I.; HAYMAN, M.; UPPERMAN,
J.; ZAMORA, R.; WATKINS, S.; FORD, H.R.; WANG, J.; HACKAM, D.J. Nitric
Oxide Inhibits Enterocyte Migration through Activation of RhoA-GTPase in a
SHP-2 Dependent Manner. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, v. 292,
n. 5, p. G1347-58, 2007.
CHADWICK, V.S.; CHEN, W.; SHU, D.; PAULUS, B.; BETHWAITE, P.; TIE, A.;
WILSON, I. Activation of the mucosal immune system in irritable bowel
syndrome.Gastroenterology, v. 122, n. 7, p. 1778-83, 2002.
CHAMPOUX, J.J. DNA topoisomerases: structures, function, and mechanism.
Annu. Rev. Biochem. v. 70, p. 369–413, 2001.
CHESTER, J.D.; JOEL, S.P.; CHEESEMAN, S.L.; HALL, G.D.; BRAUN, M.S.;
PERRY, J.; DAVIS, T.; BUTTON, C.J.; SEYMOUR, M.T. Phase I and
pharmacokinetic study of intravenous irinotecan plus oral ciclosporin in patients
with fluorouracil-refractory metastatic colon cancer. J Clin Oncol, v. 21, n. 6, p.
1125-1132, 2003.
CHIKANO, S.; SAWADA, K.; SHIMOYAMA, T; KASHIWAMURA, S.I.;
SUGIHARA, A.; SEKIKAWA, K.; TERADA, N.; NAKANISHI, K.; OKAMURA, H.
IL-18 and IL-12 induce intestinal inflammation and fatty liver in mice in an IFN-γ
dependent manner. Gut, v. 47, p. 779–86, 2000.
COCKCROFT, J.R. Exploring vascular benefits of endothelium-derived nitric
oxide. AJH, v. 18, p. 177S-183S, 2005.
COMINELLI, F.; NAST, C.C.; DUCHINI, A.; LEE, M. Recombinant interleukin-1
receptor antagonist blocks the proinflammatory activity of endogenous
interleukin-1 in rabbit immune colitis. Gastroenterology, v. 103, p. 65-71, 1992.
CREAGH, E.M.; CONROY, H.; MARTIN, S.J. Caspase-activation pathways in
apoptosis and immunity. Immunol Rev., v. 193, p. 10-21, 2003.
CUNHA, F.Q.; BOUKILI, M.A.; MOTTA, J.I.B.; VARGAFTIG, B.B.; FERREIRA,
S.H. Blockade by fenspiride of endotoxin-induced neutrophil migration in the rat.
Eur J Pharmacol, v. 238, p. 47-52, 1993.
CUNNINGHAM, D.; PYRHONEN, S.; JAMES, R.D. Randomised trial of
irinotecan plus supportive care versus supportive care alone after fluoruracil
186
failure for patients with metastatic colorectal cancer. Lancet, v. 352, p. 1413-8,
1998.
DAL SECCO, D.; PARON, J.A.; OLIVEIRA, S.H.P.; FERREIRA, S.H.; SILVA,
J.S.; CUNHA, F.Q. Neutrophil migration in inflammation: nitric oxide inhibits
rolling, adhesion and induces apoptosis. Nitric Oxide, v. 9, p. 153-164, 2003.
Di LORENZO C. Pseudo-obstruction: current approaches. Gastroenterology,
v. 116, p. 980–7, 1999.
DINARELLO, C.A. Biologic basis for interleukin-1 in disease. Blood, v. 87, p.
2095-2147, 1996.
DINARELLO, C.A. Proinflammatory cytokines, Chest, v. 118, n. 2, p. 503–508,
2000.
DINARELLO, C.A.; FANTUZZI, G. Interleukin-18 and host defense against
infection. J Infect Dis, v. 187, (Suppl. 2), p. S370–84, 2003.
DINARELLO, C.A. An IL-1 family member requires caspase-1 processing and
signals through the ST2 receptor. Immunity. v. 23, p. 461–2, 2005.
DINARELLO, C.A. Interleukin 1 and interleukin 18 as mediators of inflammation
and the aging process. Am J Clin Nutr, v. 83 (suppl), p. 447S–55S, 2006.
DODDS, H.M.; RIVORY, L.P. The mechanism for the inhibition of
acetylcholinesterases by irinotecan (CPT-11). Mol. Pharmacol., v. 56, p. 1346–
1353, 1999.
DODDS, H.M.; RIVORY, L.P. Comments on Blandizzi et al. Characterization of
a novel mechanism accounting for the adverse cholinergic effects of the
anticancer drug irinotecan. (2001) Br J Pharmacol., v. 134, n. 2, p. 448–449,
2001.
DONNELLY JP, MUUS P, SCHATTENBERG A, DE WITTE T, HORREVORTS
A, DEPAUW BE. A scheme for daily monitoring of oral mucositis in allogeneic
BMT recipients. Bone Marrow Transplant., 9:409–413, 1992.
DÖRING, B.; PFITZER, G.; ADAM, B.; LIEBREGTS, T.; ECKARDT, D.;
HOLTMANN, G.; HOFMANN, F.; FEIL, S.; FEIL, R.; WILLECKE, K. Ablation of
connexin43 in smooth muscle cells of the mouse intestine: functional insights
into physiology and morphology. Cell Tissue Res, v. 327, n. 2, p. 333-42, 2007.
DUKE, J.A.; AYENSU, E.S.; ALGONAC, MI, Medicinal Plants of China
Reference Publications, Inc., 1985. Disponível em:
<http://biotech.icmb.utexas.edu/ botany/camphist.html>. Acesso em: 10
fevereiro 2008.
187
ELTING LS, BODEY GP, KEEFE BH. Septicemia e shock syndrome due to
viridans streptococci: a case-control study of predisposing factors. Clin. Infect.
Dis., 14:1201-1207, 1992.
ENGELKING C, RUTLEDGE DN, IPPOLITI C, NEUMANN J, HOGAN CM.
Cancer related diarrhea: a neglected cause of cancer-related symptom distress.
Oncol Nurs Forum, v. 25, p. 859-860, 1998.
ESKANDARI, M.K.; KALFF, J.C.; BILLIAR, T.R.; LEE, K.K.W.; BAUER, A.J.
Lipopolysaccharide activates the muscularis macrophage network and
suppresses circular smooth muscle activity. Am J Physiol Gastrointest Liver
Physiol, v. 36, p. G727-G734, 1997.
ESMON, C.T. Protein C anticoagulant pathway and its role in controlling
microvascular thrombosis and inflammation. Crit Care Méd, v. 29, p. S48–S51,
2001.
FANTUZZI, G.; DINARELLO, C.A. Interleukin-18 and interleukin-1 beta: two
cytokine substrates for ICE (caspase-1). J. Clin. Immunol., v. 19, p. 1-11,
1999.
FANTUZZI, G.; KU, G.; HARDING, M.W.; LIVINGSTON, D.J.; SIPE, J.D.;
KUIDA, K.; FLAVELL, R.A.; DINARELLO, C.A. Response to local inflammation
of interleukin-1-converting enzyme- deficient mice. J. Immunol., v. 158, p.
1818-1824, 1997.
FINKELMAN, F.D.; ROTHENBERG, M.E.; BRANDT, E.B.; MORRIS, S.C.;
STRAIT, R.T. Molecular mechanisms of anaphylaxis: lessons from studies with
murine models. J Allergy Clin Immunol, v. 115, p. 449-57, 2005.
FLAMANT, M., BOURREILLE, A. Biologic therapies in inflammatory bowel
disease: anti-TNF and new therapeutic targets. Rev Med Interne, v. 28, n. 12,
p. 852-61, 2007.
FREITAS, H.C. Envolvimento da interleucina-18 (IL-18) na patogênese da
mucosite gastrintestinal induzida pelo cloridrato de irinotecano (CPT-11). 2007,
104f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) – Faculdade de Medicina,
Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2007.
GACHTER, T.; WERENSKIOLD, A.K.; KLEMENZ, R. Transcription of the
interleukin-1 receptor-related T1 gene is initiated at different promoters in mast
cells and fibroblasts. J Biol Chem, v. 271, p. 124–129, 1996.
GERDES, N.; SUKHOVA, G.K.; LIBBY, P. Expression of interleukin (IL)-18 and
functional IL-18 receptor on human vascular endothelial cells, smooth muscle
cells, and macrophages: implications for atherogenesis. J Exp Med, v. 195, p.
245–257, 2002.
GIBSON, R.J.; BOWEN, J.M.; INGLIS, M.R.; CUMMINS, A.G.; KEEFE, D.M.K.
Irinotecan causes severe small intestinal damage as well as colonic damage in
188
the rat with implanted breast cancer. J Gastroenterol Hepatol, v. 18, p. 1095-
1100, 2003.
GIBSON, R.J.; KEEFE, D.M. Cancer chemotherapy-induced diarrhoea and
constipation: mechanisms of damage and prevention strategies. Support Care
Cancer, v. 14, n. 9, p. 890-900, 2006.
GÖKE, M.; PODOLSKY, D.K. regulation of the mucosal epithelial barrier.
Clinical Gastroenterology, vol. 10, No. 3, p. 393-405, 1996.
GOMES, D.A.; REIS, W.L.; VENTURA, R.R.; GIUSTI-PAIVA, A.; ELIAS, L.L.;
CUNHA, F.Q.; ANTUNES-RODRIGUES, J. The role of carbon monoxide and
nitric oxide in hyperosmolality-induced atrial natriuretic peptide release by
hypothalamus in vitro. Brain Res, v. 1016, n.1, p. 33-9, 2004.
GÓMEZ-CAMBRONERO, L.; CAMPS, B.; DE LA ASUNCIÓN, J.G.; CERDÁ,
M.; PELLÍN, A.; PALLARDÓ, F.V.; CALVETE, J.; SWEIRY, J.H.; MANN, G.E.;
VIÑA, J.; SASTRE, J. Pentoxifylline ameliorates cerulein-induced pancreatitis in
rats: role of glutathione and nitric oxide. J Pharmacol Exp Ther., v. 293, n. 2, p.
670-6, 2000.
GOODMAN AND GILMAN. Autacóides derivados de lipídios in As bases
farmacológicas da terapêutica. Tradução da 10ª edição, Rio de Janeiro, Mc
Graw Hill, 2003.
GRACIE, J.A.; ROBERTSON, S.E.; MCINNES, I.B. Interleukin-18. J Leukoc
Biol, v. 73, p. 213–24, 2003.
GRASA, L.; REBOLLAR. E.; ARRUEBO, M.P.; PLAZA, M.A.; MURILLO, M.D.
The role of NO in the contractility of rabbit small intestine in vitro: effect of K+
channels. Journal of Physiology and Pharmacology, v. 56, n. 3, p. 407-419,
2005.
GUICHARD, S.; TERRET, C.; HENNEBELLE, I.; LOCHON, I.;
CHEVREAU, P.; FRÉTIGNY, E.; SELVES, J.; CHATELUT, E.; BUGAT, R.
CPT-11 converting carboxylesterase and topoisomerase activities in tumour
and normal colon and liver tissues. Br J Cancer,v. 80, p. 364-70, 1999.
HAN, X.; FINK, M.P.; DELUDE, R.L. Proinflammatory cytokines cause NO*-
dependent and -independent changes in expression and localization of tight
junction proteins in intestinal epithelial cells. Shock, v. 19, p. 229-237, 2003.
HIERHOLZER, C.; KALFF, J.C.; BILLIAR, T.R.; BAUER, A.J.; TWEARDY,
D.J.; HARBRECHT, B.G. Induced nitric oxide promotes intestinal inflammation
following hemorrhagic shock. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, v.
286, p. G225-G233, 2004.
HORAI, R.; SAIJO, S.; TANIOKA, H.; NAKAE, S.; SUDO, K.; OKAHARA, A.;
IKUSE, T.; ASANO, M.; IWAKURA, Y. Development of chronic inflammatory
189
arthropathy resembling rheumatoid arthritis in interleukin 1 receptor antagonist-
deficient mice. J. Exp. Med, v. 191, p. 313-320, 2000.
HSU, S.M.; RAINE, L. Protein A, avidin, and biotin in immunohistochemistry. J
Histochem Cytochem, v. 29, n. 11, p. 1349-1353, 1981.
IKUNO, N.; SODA, H.; WATANABE, M.; OKA, M. Irinotecan (CPT-11) and
characteristic mucosal changes in the mouse ileum and caecum. J Natl Cancer
Inst, v. 87, p. 1876-1883, 1995.
IRMLER, M.; HERTIG, S.; MACDONALD, H.R.; SADOUL, R.; BECHERER,
J.D.; PROUDFOOT, A.; SOLARI, R.; TSCHOPP, J. Granzyme A is an
interleukin 1h-converting enzyme. J. Exp. Med., v. 181, p. 1917-1922, 1995.
JAIN, N.; SUDHAKAR, C.H.; SWARUP, G. Tumor necrosis factor-alpha-
induced caspase-1 gene expression. Role of p73. FEBS J, v. 274, n. 17, p.
4396-407, 2007.
JUPP, J.; HILLIER, K.; ELLIOTT, D.H.; FINE, D.R.; BATEMAN, A.C.;
JOHNSON, P.A.; CAZALY, A.M.; PENROSE, J.F.; SAMPSON, A.P. Colonic
expression of leukotriene-pathway enzymes in inflammatory bowel diseases.
Inflamm Bowel Dis, v. 13, n. 5, p. 537-46, 2007.
KALFF, J,C,; SCHRAUT, W.H.; BILLIAR, T.R.; SIMMONS, R.L.; BAUER, A.J.
Role of inducible nitric oxide synthase in postoperative intestinal smooth muscle
dysfunction in rodents. Gastroenterology, v. 118, p. 316-327, 2000.
KARASAWA, K. Clinical aspects of plasma platelet-activating factor–
acetylhydrolase. Biochim Biophys Acta, v. 1761, p. 1359-72, 2006.
KAWATA, H.; HIRANO, K.; NISHIMURA, J.; KUBO, C.; KANAIDE, H. The
mechanism underlying the contractile effect of a chemotactic peptide, formyl-
Met-Leu-Phe on the guinea-pig Taenia coli. Br J Pharmacol, v. 145, n. 3, p.
353-63, 2005.
KEEFE, D.M. Intestinal mucositis: mechanisms and management. Current
Opinion in Oncology, v. 19, p. 323-327, 2007.
KEEFE, D.M.; SCHUBERT, M.M.; ELTING, L.S.; SONIS, S.T.; EPSTEIN, J.B.;
RABER-DURLACHER, J.E.; MIGLIORATI, C.A.; MCGUIRE, D.B.; HUTCHINS,
R.D.; PETERSON, D.E.; Mucositis Study Section of the Multinational
Association of Supportive Care in Cancer and the International Society for Oral
Oncology. Updated clinical practice guidelines for the prevention and treatment
of mucositis. Cancer., v. 109, n. 5, p. 820-31, 2007.
KENEDY, BJ. Evolution of chemotherapy. CA Cancer J Clin, v. 41, p. 261-63,
1991.
KOIZUMI, F.; KITAGAWA, M.; NEGISHI, T.; ONDA, T.; MATSUMOTO, S.;
HAMAGUCHI, T.; MATSUMURA, Y. Novel SN-38–Incorporating Polymeric
190
Micelles, NK012, Eradicate Vascular Endothelial Growth Factor–Secreting
Bulky Tumors. Cancer Res, v. 66, n. 20, p. 10048-10056, 2006.
KUBES, P.; SUZUKI, M.; GRANGER, D.N. Nitric oxide: an endogenous
modulator of leukocyte adhesion. Proc Natl Acad Sci USA, v. 88, n. 11, p.
4651-4655, 1991.
KUBES, P.; MCCAFFERTY, D. Nitric oxide and intestinal inflammation. Am J
Med, v. 109, p. 150-158, 2000.
KURITA, A.; KADO, S.; KANEDA, N.; ONOUE, M.; HASHIMOTO, S.;
YOKOKURA, T. Modified irinotecan hydrochloloride (CPT-11) administration
schedule improves induction of delayed-onset diarrhea in rats. Cancer
Chemother Pharmacol, v. 46, p. 211-220, 2000.
KUWABARA, K.; YASUI, K.; JYOYAMA, H.; MARUYAMA, T.; FLEISCH, J.H.;
HORI, Y. Effects of the second-generation leukotriene B4 receptor antagonist,
LY293111Na, on leukocyte infiltration and collagen-induced arthritis in mice.
Eur. J. Pharmacol, v. 402, n. 3, p. 275-85, 2000.
LANAHAN, A.; WILLIAMS, J.B; SANDERS, L.K.; NATHANS, D. Growth factor-
induced delayed early response genes. Mol Cell Biol, v. 12, p. 3919–3929,
1992.
LANGER, C.J. Irinotecan in advanced lung cancer: focus on North American
trials. Oncology, v. 18, n. 7, p. 17-28, 2004.
LEITÃO, R.F.; RIBEIRO, R.A.; BELLAGUARDA, E.A.; MACEDO, F.D.; SILVA,
L.R.; ORIÁ, R.B.; VALE, M.L.; CUNHA, F.Q.; BRITO, G.A. Role of nitric oxide
on pathogenesis of 5-fluorouracil induced experimental oral mucositis in
hamster. Cancer Chemother Pharmacol., v. 59, n. 5, p. 603-12, 2007.
LEUNG, B.P.; CULSHAW, S.; GRACIE, J.A.; HUNTER, D.; CANETTI, C.A.;
CAMPBELL, C.; CUNHA, F.Q.; LIEW, F.Y.; MCINNES, I.B. A role for IL-18 in
neutrophil activation. J Immunol, v. 167, n. 5, p. 2879-86, 2001.
LIEW, F.Y. T(H)1 and T(H)2 cells: a historical perspective. Nat Rev Immunol,
v. 2, p. 55-60, 2002.
LIEW, F.Y.; LI, Y.; MOSS, D.; PARKINSON, C.; ROGERS, M.V.; MONCADA,
S. Resistance to Leishmania major infection correlates with the induction of
nitric oxide synthase in murine macrophages. Eur J Immunol, v. 21, p. 3009-
14, 1991.
LIEW, F.Y.; XU, D.; BRINT, E.K.; O'NEILL, L.A. Negative regulation of toll-like
receptor-mediated immune responses. Nat Rev Immunol, v. 5, p. 446–458,
2005.
191
LIMA V, BRITO GAC, CUNHA FQ, REBOUÇAS CG, FALCÃO BAA, AUGUSTO
RF, SOUZA MLP, LEITÃO BT, RIBEIRO RA. Efects of the tumor necrosis
factor-alpha inhibitors pentoxifylline and thalidomide in short-term experimental
oral mucositis in hamsters. Eur J Oral Sci., 113(3): 210–217, 2005.
MADDENS S, CHARRUYER A, PLO I, DUBREUIL P, BERGER S, SALLES B,
LAURENT G, JAFFREZOU JP. Kit signaling inhibits the sphingomyelil-ceramide
pathway through PLC gamma 1: implication in stem cell factor radioprotective
effect. Blood, 100:1294-1301, 2002.
MANNON, P.J.; FUSS, I.J.; MAYER, L.; ELSON, C.O.; SANDBORN, W.J.;
PRESENT, D.; DOLIN, B.; GOODMAN, N.; GRODEN, C.; HORNUNG, R.L.;
QUEZADO, M.; YANG, Z.; NEURATH, M.F.; SALFELD, J.; VELDMAN, G.M.;
SCHWERTSCHLAG, U.; STROBER, W. Anti-IL-12 Crohn's Disease Study
Group. Anti-interleukin-12 antibody for active Crohn's disease. N Engl J Med.,
v. 351, n. 20, p. 2069-79, 2004.
MARQUES, V.P.; GONÇALVES, G.M.; FEITOZA, C.Q.; CENEDEZE, M.A.;
FERNANDES BERTOCCHI, A.P.; DAMIÃO, M.J.; PINHEIRO, H.S.; ANTUNES
TEIXEIRA, V.P.; DOS REIS, M.A.; PACHECO-SILVA, A.; SARAIVA CÂMARA,
N.O. Influence of TH1/TH2 switched immune response on renal ischemia-
reperfusion injury. Nephron Exp Nephrol, v. 104, n. 1, p. e48-56, 2006.
MARTIN, G.R.; WALLACE, J.L. Gastrointestinal inflammation: a central
component of mucosal defense and repair. Exp Biol Med, v. 231, n. 2, p. 130-7,
2006.
MARTINOLLE, J.P.; GARCIA-VILLAR, R.; FIORAMONTI, J.; BUENO, L.
Altered contractility of circular and longitudinal muscle in TNBS-inflamed guinea
pig ileum. Am J Physiol., v. 272(5 Pt 1), p. G1258-67, 1997.
MARTINOLLE, J.P.; GARCIA-VILLAR, R.; MORE, J.; BUENO, L. Evidence for
mast cell, leukotriene and nitric oxide involvement in the regulation of the
adrenoceptor number of inflamed small intestine in guinea pigs.
Neurogastroenterol Motil., v. 7,n. 3, p. 187-95, 1995.
MAZZON, E.; SAUTEBIN, L.; CAPUTI, A.P.; CUZZOCREA, S. 5-lipoxygenase
modulates the alteration of paracellular barrier function in mice ileum during
experimental colitis. Shock, v. 25, n. 4, p. 377-83, 2006.
MCALINDON, M.E.; HAWKEY, C.J.; MAHIDA, Y.R. Expression of interleukin 1β
and interleukin 1β converting enzyme by intestinal macrophages in health and
inflammatory bowel disease. Gut, v. 42, p. 214–219, 1998.
MCGUIRK, P.; MILLS, K.H.G. Pathogen-specific regulatory T cells provoke a
shift in the Th1/Th2 paradigm in immunity to infectious diseases. Trends in
Immunology, v. 23, n. 9, 2002.
192
MCINTYRE, T.M.; ZIMMERMAN, G.A.; PRESCOTT, S.M. Leukotrienes C4 and
D4 stimulate human endothelial cells to synthesize platelet-activating factor and
bind neutrophils. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 83, n. 7, p. 2204-8, 1986.
MELO, M.L.; BRITO, G.A.; SOARES, R.C.; CARVALHO, S.B.; SILVA, J.V.;
SOARES, P.M.; VALE, M.L.; SOUZA, M.H.; CUNHA, F.Q.; RIBEIRO, R.A. Role
of cytokines (TNF-alpha, IL-1beta and KC) in the pathogenesis of CPT-11-
induced intestinal mucositis in mice: effect of pentoxifylline and thalidomide.
Cancer Chemother Pharmacol, v. 61, n. 5, p. 775-84, 2008.
MONTANARI, C.A.; BOLZANI, V.S. Drug design based on natural products.
Quím. Nova , São Paulo, v. 24, n. 1, 2001 .
MONTECUCCO, F.; STEFFENS, S.; BURGER, F.; DA COSTA, A.; BIANCHI,
G.; BERTOLOTTO, M.; MACH, F.; DALLEGRI, F.; OTTONELLO, L. Tumor
necrosis factor-alpha (TNF-alpha) induces integrin CD11b/CD18 (Mac-1) up-
regulation and migration to the CC chemokine CCL3 (MIP-1alpha) on human
neutrophils through defined signalling pathways. Cell Signal, v. 20, n. 3, p. 557-
68, 2008.
MONTRUCCHIO, G.; SAPINO, A.; BUSSOLATI, B.; RIZEA-SAVU, S.;
SILVESTRO, L.; LUPIA, E.; CAMUSSI, G. Potential angiogenic role of platelet-
activating factor in human breast cancer. Am. J. Pathol., v. 153, p. 1589-1596,
1998.
MOREELS, T.G.; DE MAN, J.G.; DICK, J.M.; NIEUWENDIJK, R.J.; DE
WINTER, B.Y.; LEFEBVRE, R.A.; HERMAN, A.G.; PELCKMANS, P.A. Effect of
TNBS-induced morphological changes on pharmacological contractility of the
rat ileum. Eur J Pharmacol, v. 423, n. (2-3), p. 211-22, 2001.
MORTON, C.L.; WADKINS, R.M.; DANKS, M.K.; POTTER, P.M. The
anticancer prodrug CPT-11 is a potent inhibitor of acetylcholinesterase but is
rapidly catalyzed to SN-38 by butyrylcholinesterase. Cancer Res., v. 59, p.
1458–1463, 1999.
MULÈ, F.; AMATO, A.; BALDASSANO, S.; SERIO, R. Evidence for a
modulatory role of cannabinoids on the excitatory NANC neurotransmission in
mouse colon. Pharmacol Res., v. 56, n. 2, p. 132-9, 2007.
MUROHISA, G.; KOBAYASHI, Y.; KAWASAKI, T.; NAKAMURA, S.;
NAKAMURA, H. Involvement of platelet activating factor in hepatic apoptosis
and necrosis in chronic ethanol-fed rats given endotoxin. Liver, v. 22, p. 394–
403, 2002.
MYERS, B.S.; DEMPSEY, D.T.; YASAR, S.; MARTIN, J.S.; PARKMAN, H.P.;
RYAN, J.P. Acute experimental distal colitis alters colonic transit in rats. J Surg
Res, v. 69, n. 1, p. 107-12, 1997.
193
NAKANISHI, K.; YOSHIMOTO, T.; TSUTSUI, H.; OKAMURA, H. Interleukin-18
regulates both Th1 and Th2 responses. Annu Rev Immunol, v. 19, p. 423–74,
2001.
NASSER, Y.; FERNANDEZ, E.; KEENAN, C.M.; HO, W.; OLAND, L.D.;
TIBBLES, L.A.; SCHEMANN, M.; MACNAUGHTON, W.K.; RÜHL, A.;
SHARKEY, K.A. Role of enteric glia in intestinal physiology: effects of the
gliotoxin fluorocitrate on motor and secretory function. Am J Physiol
Gastrointest Liver Physiol, v. 291, n. 5, p. G912-27, 2006.
NATHAN, C.; XIE, Q. Nitric oxide synthases: roles, tolls, and controls. Cell, v.
78, p. 915, 1994.
NATHAN, C. Inducible nitric oxide synthase: what diVerence does it make? J
Clin Invest, v. 100, n. 10, p. 2417–2423, 1997.
NEURATH, M.F.; FUSS, I.; KELSALL, B.L.; STUBER E.; STROBER, W.
Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice. J.
Exp. Med., v. 182, p. 1281-1290, 1995.
NIEDBALA, W.; CAI, B.; LIEW, F.Y. Role of nitric oxide in the regulation of T
cell functions. Ann Rheum Dis,v. 65(Suppl III), p. iii37–iii40, 2006.
NOVICK, D.; KIM, S.H.; FANTUZZI, G.; REZNIKOV, L.L.; DINARELLO, C.A.;
RUBINSTEIN, M. Interleukin-18 binding protein: a novel modulator of the Th1
cytokine response. Immunity,v. 10, p. 127–36, 1999.
NUSRAT, A.; TURNER, J.R.; MADARA, J.L. Molecular physiology and
pathophysiology of tight junctions. IV. Regulation of tight junctions by
extracellular stimuli: nutrients, cytokines, and immune cells. Am J Physiol
Gastrointest Liver Physiol, v. 279, p. G851-857, 2000.
OBERLIES, N.H.; KROLL, D.J. Camptothecin and taxol: historic achievements
in natural products research. Journal of Natural Products, v. 67, n.2, p.129-
135, 2004.
ÖHD, J.F.; WIKSTROM, K.; SJOLANDER, A. Leukotrienes induce cell-survival
signaling in intestinal epithelial cells. Gastroenterology, v. 119, p. 1007-1018,
2000.
OKAMURA, H.; TSUTSI, H.; KOMATSU, T. Cloning of a new cytokine that
induces IFN-gamma production by T cells. Nature, v. 378, p. 88–91, 1995.
OLIVEIRA, S.H.; CANETTI, C.; RIBEIRO, R.A.; CUNHA, F.Q. Neutrophil
Migration Induced by IL-1beta Depends upon LTB(4) Released by
Macrophages and upon TNF-alpha and IL-1beta Released by Mast Cells.
Inflammation, v. 31, n. 1, p. 36-46, 2008.
PATERSON, W.G.; KIEFFER, C.A.; FELDMAN, M.J.; MILLER, D.V.; MORRIS,
G.P. Role of platelet-activating factor in acid-induced esophageal mucosal
injury. Dig Dis Sci., v. 52, n. 8, p. 1861-6, 2007.
194
PEPLOW, P.V. Regulation of platelet-activating factor (PAF) activity in human
diseases by phospholipase A2 inhibitors, PAF acetylhydrolases, PAF receptor
antagonists and free radical scavengers. Prostaglandins Leukot Essent Fatty
Acids, v. 61, n. 2, p. 65-82, 1999.
PEREZ, E.A.; HILLMAN, D.W.; MAILLIARD, J.A.; INGLE, J.N.; RYAN, J.M.;
FITCH, T.R.; ROWLAND, K,M,; KARDINAL, C.G.; KROOK, J.E.; KUGLER,
J.W.; DAKHIL, S.R. Randomized phase II study of two irinotecan schedules for
patients with metastatic breast cancer refractory to an anthracycline, a taxane,
or both. J Clin Oncol, v. 22, n. 14, p. 2849-2855, 2004.
PETERS-GOLDEN, M.; BROCK, T.G. 5-Lipoxygenase and FLAP.
Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids, v. 69, p. 99-109, 2003.
PETERS-GOLDEN, M.; HENDERSON, W.R. Leukotrienes. N Engl J Med, v.
357, p. 1841, 2007.
PLUJÀ, L.; FERNÁNDEZ, E.; JIMÉNEZ, M. Neural modulation of the cyclic
electrical and mechanical activity in the rat colonic circular muscle: putative role
of ATP and NO. Br J Pharmacol, v. 12, p. 883-892, 1999.
POTOKA, D.A.; NADLER, E.P.; UPPERMAN, J.S.; FORD, H.R. Role of nitric
oxide and peroxynitrite in gut barrier failure. World J Surg., v. 26, n. 7, p. 806-
11, 2002.
POTOKA, D.A.; UPPERMAN, J.S.; ZHANG, X.R.; KAPLAN, J.R.; COREY, S.J.;
GRISHIN, A.; ZAMORA, R.; FORD, H.R. Peroxynitrite inhibits enterocyte
proliferation and modulates Src kinase activity in vitro. Am J Physiol
Gastrointest Liver Physiol, v. 285, n. 5, p. G861-9, 2003.
PRESCOTT, S.M.; ZIMMERMAN, G.A.; STAFFORINI, D.M.; MCINTYRE, T.M.
Platelet-activating factor and related lipid mediators. Annu Rev Biochem, v. 69,
p. 419–45, 2000.
RADOJEVIC, N.; MCKAY, D.M.; MERGER, M.; VALLANCE, B.A.; COLLINS,
S.M.; CROITORU, K. Characterization of enteric functional changes evoked by
in vivo anti-CD3 T cell activation. Am J Physiol, v. 276, p. R715-23, 1999.
RAGGERS, R.J.; VOGELS, I.; VAN MEER, G. Multidrug-resistance P-
glycoprotein (MDR1) secretes platelet-activating factor. Biochem J, v. 357, p.
859–65, 2001.
RAGHUPATHY, R. Pregnancy: success and failure within the Th1/Th2/Th3
paradigm. Semin Immunol, v. 13, n. 4, p. 219-27, 2001.
RIAZ, A.A.; SCHRAMM, R.; SATO, T.; MENGER, M.D.; JEPPSSON, B.;
THORLACIUS, H. Oxygen radical-dependent expression of CXC chemokines
195
regulate ischemia/reperfusion-induced leukocyte adhesion in the mouse colon.
Free Radic Biol Med., v. 35, n. 7, p. 782-9, 2003.
RIBEIRO, R.A.; FREITAS, H.C.; CAMPOS, M.C.; SANTOS, C.C.;
FIGUEIREDO, F.C.; BRITO, G.A.; CUNHA, F.Q. Tumor necrosis factor-alpha
and interleukin-1beta mediate the production of nitric oxide involved in the
pathogenesis of ifosfamide induced hemorrhagic cystitis in mice. J Urol, v. 167,
n. 5, p. 2229-34, 2002.
ROCHA-LIMA, C.M.; GREEN, M.R.; ROTCHE, R.; MILLER, W.H JR; JEVREY,
G.M.; CISAR, L.A.; MORGANTI, A.; ORLANDO, N.; GRUIA, G.; MILLER, L.L.
Irinotecan plus gemcitabine results in no survival advantage compared with
gemcitabine monotherapy in patients with locally advanced or metastatic
pancreatic cancer despite increased tumor response rate. J Clin Oncolv, 22, p.
18-21, 2004.
ROTH BJ, SLEDGE GWJ, WILLIAMS SD, MEYER SC, ANSARI R, FISHER
WB. Methotrexate, vinblastine, doxorubicin, and cisplatin in metastatic. Cancer,
68(2):248-252, 1991.
SAFIEH-GARABEDIAN, B.; POOLE, S.; ALLCHORNE, A.; WINTER, J.;
WOOLF, C.J. Contribution of interleukin-1 beta to the inflammation-induced
increase in nerve growth factor levels and inflammatory hyperalgesia. Br J
Pharmacol, v. 115, p. 1265-1275, 1995.
SAKAMOTO, H.; TOSAKI, T.; NAKAGAWA, Y. Overexpression of phospholipid
hydroperoxide glutathione peroxidase modulates acetyl-CoA: 1-O-alkyl-2-lyso-
sn-glycero-3-phosphocholine acetyltransferase activity. J Biol Chem, v. 277, p.
50431–8, 2002.
SALA, A.; ZARINI, S.; BOLLA, M. Leukotrienes: Lipid bioeffectors of
inflammatory reactions. Biochemistry, v. 63, p. 84–92, 1998.
SALTZ, L.B.; COX, J.V.; BLANCKE, C. Irinotecan plus fluorouracil and
leucovorin for metastatic colorectal cancer. EnglJMed, v. 343, p. 905-14, 2000.
SANDBORN, W.J.; HANAUER, S.B. Antitumor necrosis factor therapy for
inflammatory bowel disease: a review of agents, pharmacology, clinical results,
and safety. Inflamm. Bowel Dis, v. 5, p. 119-133, 1999.
SANTUCCI, L.; WALLACE, J.; MENCARELLI, A.; FARNETI, S.; MORELLI, A.;
FIORUCCI, S. Different sensitivity of lamina propria T-cell subsets to nitric
oxide-induced apoptosis explains immunomodulatory activity of a nitric oxide-
releasing derivative of mesalamine in rodent colitis. Gastroenterology, v. 128,
n. 5, p. 1243-57, 2005.
SARTOR, R.B. Microbial influences in inflammatory bowel diseases.
Gastroenterology, v. 134, n. 2, p. 577-94, 2008.
196
SCHAEFER, K.L.; DENEVICH, S.; MA, C.; COOLEY, S.R.; NAKAJIMA, A.;
WADA, K.; SCHLEZINGER, J.; SHERR, D.; SAUBERMANN, L.J. Intestinal
antiinflammatory effects of thiazolidenedione peroxisome proliferator-activated
receptor-gamma ligands on T helper type 1 chemokine regulation include
nontranscriptional control mechanisms. Inflamm Bowel Dis, v. 11, n. 3, p. 244-
52, 2005.
SCHMITZ, J. IL-33, an interleukin-1-like cytokine that signals via the IL-1
receptor-related protein ST2 and induces T helper type 2-associated cytokines.
Immunity, v. 23, p. 479–490, 2005.
SCHMITZ, J.; OWYANG, A.; OLDHAM, E.; SONG, Y.; MURPHY, E.;
MCCLANAHAN, T.K.; ZURAWSKI, G.; MOSHREFI, M.; QIN, J.; LI, X.;
GORMAN, D.M.; BAZAN, J.F.; KASTELEIN, R.A. IL-33, an interleukin-1-like
cytokine that signals via the IL-1 receptor-related protein ST2 and induces T
helper type 2-associated cytokines. Immunity, v. 23, p. 479-490, 2005.
SCHÖNBECK, U.; MACH, F.; LIBBY, P. Generation of biologically active
interleukin-1h by matrix metalloproteinases: a novel caspase-1-independent
pathway of interleukin-1h processing. J. Immunol., v. 161, p. 3340– 3346,
1998.
SCHULZE-KOOPS, H.; KALDEN, J.R. The balance of Th1/Th2 cytokines in
rheumatoid arthritis. Best Pract Res Clin Rheumatol, v. 15, n. 5, p. 677-91,
2001.
SCOTT, R.B.; MARIC, M. A limited role for leukotrienes and platelet-activating
factor in food protein induced jejunal smooth muscle contraction in sensitized
rats. Can J Physiol Pharmacol, v. 69, n. 12, p. 1841-6, 1991.
SCULLY C, EPSTEIN J, SONIS S. Oral mucositis: a challenging complication
of radiotherapy, chemotherapy, and radiochemotherapy: part 1, pathogenesis
and prophylaxis of mucositis. Head Neck., 25(12): 1057-1070, 2003.
SCULLY C, EPSTEIN J, SONIS S. Oral mucositis: a challenging complication of
radiotherapy, chemotherapy, and radiochemotherapy. Part 2: diagnosis and
management of mucositis. Head Neck., 26(1):77-84, 2004.
SCULLY C, SONIS S, DIZ PD. Oral mucositis. Oral Dis., 12(3): 229-241, 2006.
SHAH, V.; LYFORD, G.; GORES, G.; FARRUGIA, G. Nitric Oxide in
Gastrointestinal Health and Disease. Gastroenterology, v. 126, p. 903-913,
2004.
SIMPSON, S.J.; SHAH, S.; COMISKEY, M.; DE JONG, Y.P.; WANG, B.;
MIZOGUCHI, E.; BHAN, A.K.; TERHORST, C. T cell-mediated pathology in two
models of experimental colitis depends predominantly on the interleukin
12/signal transducer and activator of transcription (Stat)-4 pathway, but is not
conditional on interferon γ expression by T cells. J. Exp. Med., v. 187, p. 1225-
1234, 1998.
197
SHAHBAZIAN, A.; HEINEMANN, A.; PESKAR, B.A.; HOLZER, P. Differential
peristaltic motor effects of prostanoid (DP, EP, IP, TP) and leukotriene receptor
agonists in the guinea-pig isolated small intestine. Br J Pharmacol, v. 137, n. 7,
p. 1047-54, 2002.
SIEGMUND, B.; LEHR, H.-A.; FANTUZZI, G.; DINARELLO, C.A. IL-1β-
converting enzyme (caspase-1) in intestinal inflammation. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, v. 98, p. 13249–13254, 2001.
SOARES PM, MOTA JM, GOMES AS, OLIVEIRA RB, ASSREUY AM, BRITO
GA, SANTOS AA, RIBEIRO RA, SOUZA MH. Gastrointestinal dysmotility in 5-
fluorouracil-induced intestinal mucositis outlasts inflammatory process
resolution. Cancer Chemother Pharmacol. 2008 Mar 7 [Epub ahead of print]
SONIS ST. Mucositis as a biological process: a new hypothesis for the
development of chemotherapy-induced stomatotoxicity. Oral Oncology 34:39-
43, 1998.
SONIS ST. The pathobiology of mucositis. Nat Rev Cancer. 4(4):277–284,
2004.
SONIS, S.T.; ELTING, L.S.; KEEFE, D.; PETERSON, D.E.; SCHUBERT, M.;
HAUER-JENSEN, M.; BEKELE, B.N.; RABER-DURLACHER, J.; DONNELLY,
J.P.; RUBENSTEIN, E.B. Mucositis Study Perspectives on cancer therapy-
induced mucosal injury: pathogenesis, measurement, epidemiology, and
consequences for patients. Cancer, v. 100 (9 Suppl), p. 1995-2025, 2004.
SONIS ST, FEY EG. Oral complications of cancer therapy. Oncology.,16: 680–
686, 2002.
SONIS, S.T.; PETERSON, R.L.; EDWARDS, L.J. Defining mechanisms of
action of interleukin-11 on the progression of radiation-induced oral mucositis in
hamsters, Oral Oncol, v. 36, n. 4, p. 373–381, 2000.
SOUZA-FILHO, M.V.; LIMA, M.V.; POMPEU, M.M.; BALLEJO, G.; CUNHA,
F.Q.; RIBEIRO, R.A. Involvement of nitric oxide in the pathogenesis of
cyclophosphamide-induced hemorrhagic cystitis. Am J Pathol., v. 150, n. 1, p.
247-56, 1997.
SOUZA, M.H.; TRONCON, L.E.; CUNHA, F.Q.; OLIVEIRA, R.B. Decreased
gastric tone and delayed gastric emptying precede neutrophil infiltration and
mucosal lesion formation in indomethacin- induced gastric damage in rats. Braz
J Med Biol Res, v. 36, n. 10, p. 1383-1390, 2003.
SPILLER, R.C.; JENKINS, D.; THORNLEY, J.P.; HEBDEN, J.M.; WRIGHT, T.;
SKINNER, M.; NEAL, K.R. Increased rectal mucosal enteroendocrine cells, T
lymphocytes, and increased gut permeability following acute Campylobacter
198
enteritis and in post-dysenteric irritable bowel syndrome. Gut, v. 47, p. 804-811,
2000.
STAFFORINI, D.M.; MCINTYRE, T.M.; CARTER, M.E.; PRESCOTT, S.M.
Human plasma plateletactivating factor acetylhydrolase: association with
lipoprotein particles and role in the degradation of platelet-activating factor. J
Biol Chem, v. 262, p. 4215-22, 1987.
STURM, A.; DIGNASS, A.U. Modulation of gastrointestinal wound repair and
inflammation by phospholipids. Biochim Biophys Acta., v. 23, n. 1582(1-3), p.
282-8, 2002.
SUGAWARA, S.; UEHARA, A.; NOCHI, T.; YAMAGUCHI, T.; UEDA, H.;
SUGIYAMA, A.; HANZAWA, K.; KUMAGAI, K.; OKAMURA, H.; TAKADA, H.
Neutrophil proteinase 3-mediated induction of bioactive IL-18 secretion by
human oral epithelial cells. J. Immunol. v. 167, p. 6568– 6575, 2001.
TAKASUNA, K.; HAGIWARA, T.; HIROHASHI, M.; KATO, M.; NOMURA, M.;
NAGAI, E.; YOKOI, T.; KAMATAKI, T. Involvement of β-glucuronidase in
intestinal microflora in the intestinal toxicity of the antitumor camptothecin
derivative Irinotecan hydrochloride (CPT-11) in rats. Cancer Res, v. 56, p.
3752-3757, 1996.
TAKEUCHI, M.; NISHIZAKI, Y.; SANO, O.; OHTA, T.; IKEDA, M.; KURIMOTO,
M. Immunohistochemical and immuno-electron-microscopic detection of
interferon-gamma-inducing factor (“interleukin-18”) in mouse intestinal epithelial
cells. Cell Tissue Res, v. 289, p. 499–503, 1997.
TALLMAN, M.N.; RITTER, J.K.; SMITH, P.C. Differential rates of
glucuronidation for 7-ethyl-10-hydroxy-camptothecin (SN-38) lactone and
carboxylate in human and rat microsomes and recombinant UDP-
glucuronosyltransferase isoforms. Drug Metab Dispos., v. 33, n. 7, p. 977-83,
2005.
TAN-NO, K.; NIIJIMA, F.; NAKAGAWASAI, O.; SATO, T.; SATOH, S.;
TADANO, T. Development of tolerance to the inhibitory effect of loperamide on
gastrointestinal transit in mice. Eur J Pharm Sci., v. 20, n. 3, p. 357-63, 2003.
TEPPERMAN, B.L.; BROWN, J.F.; WHITTLE, B.J. Nitric oxide synthase
induction and intestinal epithelial cell viability in rats. Am J Physiol
Gastrointest Liver Physiol, v. 265, p. G214-218, 1993.
THORNBERRY, N.A.; BULL, H.G.; CALAYCAY, J.R.; CHAPMAN, K.T.;
HOWARD, A.D.; KOSTURA, M.J.; MILLER, D.K.; MOLINEAUX, S.M.;
WEIDNER, J.R.; AUNINS, J. A novel heterodimeric cysteine protease is
required for interleukin-1β processing in monocytes. Nature, v. 356, p. 768-774,
1992.
199
TOMINAGA S. A putative protein of a growth specific cDNA from BALB/c-3T3
cells is highly similar to the extracellular portion of mouse interleukin 1 receptor.
FEBS Lett, v. 258, p. 301–304, 1989.
TORNBLOM, H.; LINDBERG, G.; NYBERG, B.; VERESS, B. Full-thickness
biopsy of the jejunum reveals inflammation and enteric neuropathy in irritable
bowel syndrome. Gastroenterology, v. 123, n. 6, p. 1972-9, 2002.
UNNO, N.; WANG, H.; MENCONI, M.J.; TYTGAT, S.; LARKIN, V.; SMITH, M.;
MORIN, M.J.; CHAVEZ, A.; HODIN, R.; FINK, M.P. Inhibition of inducible nitric
oxide synthase ameliorates endotoxininduced gut mucosal barrier dysfunction
in rats. Gastroenterology, v. 113, p. 1246-11257, 1997.
VALLANCE, B.A.; CROITORU, K. ; COLLINS, S.M. T lymphocyte-dependent
and -independent intestinal smooth muscle dysfunction in the T. spiralis-
infected mouse. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, v. 275, p. G1157-
1165, 1998.
VIEGAS-JÚNIOR, C.; BOLZANI, V.S.; BARREIRO, E.J. Planejamento racional
de fármacos baseado em produtos naturais. Quím. Nova , São Paulo, v. 29,
n. 2, 2006 .
VON BÜLTZINGSLÖWEN, I.; BRENNAN, M.T.; SPIJKERVET, F.K.; LOGAN,
R.; STRINGER, A.; RABER-DURLACHER, J.E.; KEEFE, D. Growth factors and
cytokines in the prevention and treatment of oral and gastrointestinal mucositis.
Support Care Cancer, v. 14, n. 6, p. 519-27, 2006.
WADE, C.M.; DALY, M.J. Genetic variation in laboratory mice. Nat Genet, v.
37, n. 11, p. 1175-80, 2005.
WAGNER, J.G.; ROTH, R.A. Neutrophil migration mechanisms, with an
emphasis on the pulmonary vasculature. Pharmacol Rev, v. 52, n. 3, p. 349-
74, 2000.
WALLACE, J.L;, BRAQUET, P.; IBBOTSON, G.C.; MACNAUGHTON, W.K.;
CIRINO, G. Assessment of the role of platelet-activating factor in an animal
model of inflammatory bowel disease. J Lipid Mediat, v. 1, n. 1, p. 13-23, 1989.
WANG, J.C. DNA topoisomerases. Annu. Rev. Biochem. v. 65, p. 635–692,
1996.
WERENSKIOLD, A.K.; HOFFMANN, S.; KLEMENZ, R. Induction of a mitogen-
responsive gene after expression of the Ha-ras oncogene in NIH 3T3
fibroblasts. Mol Cell Biol, v. 9, p. 5207–5214, 1989.
WOO, P.C.; NG, W.F.; LEUNG, H.C.; TSOI, H.W.; YUEN, K.Y. Clarithromycin
attenuates cyclophosphamide-induced mucositis in mice. Pharmacol Res, v.
41, n. 5, p. 527-32, 2000.
200
XU, D. Selective expression of a stable cell surface molecule on type 2 but not
type 1 helper T cells. J Exp Med, v. 187, p. 787–794, 1998.
XU, D.Z.; LU, Q.; DEITCH, E.A. Nitric oxide directly impairs intestinal barrier
function. Shock, v. 17, p. 139-145, 2002.
YE, X.J.; TANG, B.; MA, Z. The role of interleukin-18 in collagen-induced
arthritis in the BB rat. Clin Exp Immunol, v. 136, p. 440–7, 2004.
YOSHIKAWA, S.; FUKUNAGA, Y.; TAKEUCHI, T.; NISHIO, H.; HATA, F.
Modulation of acetylcholine release from the myenteric plexus of guinea-pig
ileum by 5-lipoxygenase metabolites of arachidonic acid. Eur J Pharmacol, v.
239, n. (1-3), p. 261-4, 1993.
YOSHIMOTO, T.; MIZUTANI, H.; TSUTSUI, H.; NOBEN-TRAUTH, N.;
YAMANAKA, K.; TANAKA, M.; IZUMI, S.; OKAMURA, H.; PAUL, W.E.;
NAKANISHI, K. IL-18 induction of IgE: dependence on CD4+ T cells, IL-4 and
STAT6. Nat Immunol, v. 1, p. 132–137, 2000.
ZIZZO, M.G.; MULÈ, F.; SERIO, R. Functional evidence for GABA as modulator
of the contractility of the longitudinal muscle in mouse duodenum: role of
GABA(A) and GABA(C) receptors. Neuropharmacology, v. 52, n. 8, p. 1685-
90, 2007.
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