ads:
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
ESTUDO DAS PROPRIEDADES ANTICÂNCER DA PIPLARTINA
DANIEL PEREIRA BEZERRA
Fortaleza – CE
2008
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
DANIEL PEREIRA BEZERRA
ESTUDO DAS PROPRIEDADES ANTICÂNCER DA PIPLARTINA
Tese submetida à Coordenação do programa de Pós-
Graduação em Farmacologia do Departamento de
Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal do
Ceará como requisito parcial para a obtenção do grau de
Doutor em Farmacologia.
Orientadora: Prof
a
Dr
a
Letícia Veras Costa Lotufo
Fortaleza - CE
2008
ads:
B469e Bezerra, Daniel Pereira
Estudo das propriedades anticâncer da piplartina/Daniel
Pereira Bezerra; Orientadora: Letícia Veras Costa-Lotufo.
– Fortaleza, 2008.
273 f. : il.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Ceará.
Faculdade de Medicina, 2008.
1. Ensaios de Seleção de Medicamentos Antitumorais.
2. Alcalóides. 3. Amidas. 4. Testes de Mutagenicidade.
5. Antineoplásicos I. Costa-Lotufo, Letícia Veras (Orient.).
II Título.
CDD 615.323925
DANIEL PEREIRA BEZERRA
ESTUDO DAS PROPRIEDADES ANTICÂNCER DA PIPLARTINA
Tese submetida à coordenação do programa
de Pós-graduação em Farmacologia como
parte dos requisitos necessários para a
obtenção do grau de Doutor em
Farmacologia outorgado pela Universidade
Federal do Ceará.
Aprovada em: 27/06/2008
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________________
Profª. Drª. Letícia Veras Costa-Lotufo (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará-UFC
__________________________________________________
Profª. Drª. Raquel Carvalho Montenegro
Universidade Federal do Ceará-UFC
__________________________________________________
Prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao
Universidade Federal do Ceará-UFC
__________________________________________________
Prof. Dr. Rommel Mário Rodríguez Burbano
Universidade Federal do Pará-UFPA
__________________________________________________
Profª. Drª. Vanderlan da Silva Bolzani
Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho-UNESP
A Deus
Agradecimentos
À Profª Drª Letícia Veras Costa-Lotufo, pela orientação deste trabalho, pela ajuda,
incentivo e paciência demonstrada em todos os momentos de trabalho em comum;
À Profª Drª Claudia do Ó Pessoa, por todas as dúvidas esclarecidas no desenvolver
da pesquisa e pela amizade;
Ao Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes, pela contribuição à pesquisa no Laboratório
de Oncologia Experimental;
À Profª Drª Raquel Carvalho Montenegro, pelo auxílio prestado e dicas essenciais;
À Profª Drª Ana Paula Negreiros Nunes Alves, pelos esclarecimentos sobre
patologia e as análises histopatológicas;
À Profª Drª Otília Deusdênia Loiola Pessoa, Profª Drª Jane Eire Silva Alencar de
Menezes, Profª Drª Mary Anne Sousa Lima e ao Prof. Dr. Edilberto Rocha Silveira,
pela colaboração neste trabalho;
À Profª Drª Nylane Maria Nunes Alencar, pela colaboração neste trabalho;
Ao Prof. Dr. João Antônio Pegas Henriques e a Profª Drª Jenifer Saffi da
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, pela colaboração neste trabalho;
Ao Prof. Dr. Norberto Peporine Lopes e a Profª Drª Pierina Sueli Bonato pela
oportunidade de conviver e aprender em seus laboratórios na Universidade de São
Paulo – Ribeirão Preto;
À Drª Valquíria Aparecida Polisel Jabor da Universidade de São Paulo – Ribeirão
Preto, pelo auxílio imensurável no estudo farmacocinético;
Ao Prof. Dr. Rommel Mário Rodríguez Burbano da Universidade Federal do Pará,
por ter aceitado participar desta banca de doutorado;
Ao Prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao, por ter aceitado participar desta banca de
doutorado;
Aos pós-graduandos do Laboratório de Oncologia Experimental: Cecília, Márcio,
Kristiana, José Roberto, Diego, Michel, Ivana, Danilo, Patrícia Marçal, Patrícia
Bonavides, Bruno, Hemerson, Paula, Emília, Washington, Carla e Gardênia pela
ajuda de todos os dias e pela amizade;
Aos alunos da graduação que participam das atividades do Laboratório de Oncologia
Experimental: Fernanda, Eveline, Elthon, Felipe, Arinice, Delano e Jersia;
À Silvana pela imensurável ajuda neste trabalho;
Aos técnicos Adriano Santos, Luciana França e Maria de Fátima Teixeira cuja
dedicação é essencial para o laboratório;
Á amiga Marne Carvalho Vasconcellos, pela imensurável colaboração com os
estudos de mutagênese;
Aos amigos que fiz na USP-RP: Estela, Denise, Ana Ligia, Fernando, Cris e Tomaz.
Aos professores da Pós-graduação em Farmacologia por todas as lições;
Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia: Áurea, Chiquinho,
Aroldo, Sr. Bento, Fernando, Mônica e Íris que tentam resolver ou indicar o melhor
caminho para os problemas do dia a dia;
Aos meus pais, que se dedicaram para me darem à oportunidade de realizar este
trabalho;
A todos que, diretamente ou indiretamente, contribuíram para a minha formação
pessoal e acadêmica ou para a execução deste trabalho;
Aos órgãos financiadores dos projetos de pesquisa do Laboratório de Oncologia
Experimental, CNPq, FINEP, FUNCAP e BNB;
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo
apoio financeiro, sem o qual seria impossível a realização desse trabalho.
Índice
Lista de Figuras
Lista de Tabelas
Lista de Símbolos e Abreviaturas
Resumo
Abstract
1. Introdução............................................................................................................. 29
1.1. Câncer............................................................................................................ 29
1.2. Produtos naturais com atividade anticâncer.................................................. 33
1.3. Componentes da dieta como agentes anticâncer.......................................... 42
1.4. Piplartina........................................................................................................ 50
2. Objetivos............................................................................................................... 55
2.1. Geral.............................................................................................................. 55
2.2. Específicos .................................................................................................... 55
3. Materiais e Métodos............................................................................................. 57
3.1. Materiais utilizados......................................................................................... 57
3.1.1. Equipamentos........................................................................................ 57
3.1.2. Reagentes.............................................................................................. 58
3.1.3. Fármacos............................................................................................... 60
3.2. Soluções........................................................................................................ 60
3.3. Células........................................................................................................... 61
3.3.1. Manutenção das células em cultura....................................................... 63
3.3.2. Obtenção de células PBMC................................................................... 63
3.3.3. Manutenção do tumor sarcoma 180 em camundongos......................... 64
3.4. Microorganismos............................................................................................ 64
3.4.1. Manutenção dos microorganismos........................................................ 66
3.4.1.1. Preparo das culturas de Salmonella typhimurium............................. 66
3.4.1.2. Preparo das culturas de Saccharomyces cerevisiae........................ 66
3.5. Animais.......................................................................................................... 67
3.6. Procedimento experimental........................................................................ 67
3.6.1. Obtenção da piplartina........................................................................... 67
3.6.2. Obtenção do N-3,4,5-trimetoxidihidrocinamoil-dihidropiridin-2-ona....... 68
3.6.3. Obtenção do N-3,4,5-trimetoxicinamoil-1,2-aminoetano........................ 68
3.6.4. Obtenção do O-3,4,5-trimetoxicinamoil-1,2-etanodiol............................ 69
3.6.5. Obtenção do ácido 3,4,5-trimetoxicinâmico........................................... 69
3.6.6. Obtenção do S-3,4,5-trimetoxicinamoil-benzeno................................... 70
3.6.7. Estudo da atividade citotóxica........................................................... 72
3.6.7.1. Ensaio de citotoxicidade em células tumorais............................ 72
3.6.7.1.1. Principio do teste......................................................................... 72
3.6.7.1.2. Procedimento experimental........................................................ 72
3.6.7.1.3. Análise dos dados....................................................................... 73
3.6.7.2. Ensaio de citotoxicidade em células normais.............................. 73
3.6.7.2.1. Principio do teste......................................................................... 73
3.6.7.2.2. Procedimento experimental........................................................ 74
3.6.7.2.3. Análise dos dados....................................................................... 74
3.6.8. Estudo do mecanismo de ação citotóxico em células HL-60.......... 75
3.6.8.1. Determinação da viabilidade celular............................................. 75
3.6.8.1.1. Principio do teste......................................................................... 75
3.6.8.1.2. Procedimento experimental........................................................ 75
3.6.8.1.3. Análise dos dados....................................................................... 76
3.6.8.2. Determinação do potencial transmembrânico da mitocôndria.. 76
3.6.8.2.1. Princípio do teste........................................................................ 76
3.6.8.2.2. Procedimento experimental........................................................ 77
3.6.8.2.3. Análise dos dados....................................................................... 77
3.6.8.3. Determinação da ativação da caspase-3...................................... 78
3.6.8.3.1. Princípio do teste........................................................................ 78
3.6.8.3.2. Procedimento experimental........................................................ 78
3.6.8.3.3. Análise dos dados....................................................................... 79
3.6.8.4. Determinação do conteúdo de DNA nuclear da célula................ 79
3.6.8.4.1. Princípio do teste........................................................................ 79
3.6.8.4.2. Procedimento experimental........................................................ 80
3.6.8.4.3. Análise dos dados....................................................................... 80
3.6.8.5. Determinação do índice mitótico................................................... 80
3.6.8.5.1. Princípio do teste........................................................................ 80
3.6.8.5.2. Procedimento experimental........................................................ 81
3.6.8.5.3. Análise dos dados....................................................................... 81
3.6.9. Estudo da atividade genotóxica e mutagênica................................. 82
3.6.9.1. Ensaio de genotoxicidade in vitro – Danos ao DNA - Ensaio
do cometa................................................................................................................. 82
3.6.9.1.1. Princípio do teste........................................................................ 82
3.6.9.1.2. Procedimento experimental........................................................ 83
3.6.9.1.3. Análise dos dados....................................................................... 84
3.6.9.2. Estudo do mecanismo de ação genotóxico em células V79...... 86
3.6.9.2.1. Determinação da viabilidade celular....................................... 86
3.6.9.2.1.1. Principio do teste................................................................... 86
3.6.9.2.1.2. Procedimento experimental.................................................. 86
3.6.9.2.1.3. Análise dos dados................................................................. 86
3.6.9.2.2. Determinação do potencial transmembrânico da
mitocôndria............................................................................................................... 87
3.6.9.2.2.1. Princípio do teste.................................................................. 87
3.6.9.2.2.2. Procedimento experimental.................................................. 87
3.6.9.2.2.3. Análise dos dados................................................................. 87
3.6.9.2.3. Determinação do conteúdo de DNA nuclear da célula.......... 88
3.6.9.2.3.1. Princípio do teste.................................................................. 88
3.6.9.2.3.2. Procedimento experimental.................................................. 88
3.6.9.2.2.3. Análise dos dados................................................................. 88
3.6.9.3. Teste de Ames – Ensaio de mutação gênica reversa em
Salmonella typhimurium......................................................................................... 89
3.6.9.3.1. Princípio do teste........................................................................ 89
3.6.9.3.2. Procedimento experimental........................................................ 89
3.6.9.3.3. Análise dos dados....................................................................... 91
3.6.9.4. Ensaio de mutagênese e recombinogênese em
Saccharomyces cerevisiae..................................................................................... 91
3.6.9.4.1. Princípio do teste........................................................................ 91
3.6.9.4.2. Procedimento experimental........................................................ 92
3.6.9.4.3. Análise dos dados....................................................................... 94
3.6.9.5. Avaliação da genotoxicidade/mutagenicidade em medula
óssea de camundongos – Teste do micronúcleo in vivo..................................... 94
3.6.9.5.1. Princípio do teste........................................................................ 94
3.6.9.5.2. Procedimento experimental........................................................ 95
3.6.9.5.3. Análise dos dados....................................................................... 96
3.6.10. Estudo farmacocinético.................................................................... 96
3.6.10.1. Desenvolvimento e validação da metodologia bioanalítica...... 96
3.6.10.1.1. Condições cromatográficas e detecção no espectrômetro de
massas no modo MS/MS........................................................................................... 97
3.6.10.1.2. Preparações das soluções-padrão da curva de calibração e do
controle de qualidade.................................................................................................
101
3.6.10.1.3. Procedimento de extração do analito do plasma de ratos........... 104
3.6.10.1.4. Validação do método................................................................. 106
3.6.10.1.4.1. Especificidade...................................................................... 106
3.6.10.1.4.1.1. Princípio do teste............................................................. 106
3.6.10.1.4.1.2. Procedimento experimental............................................. 106
3.6.10.1.4.1.3. Análise dos dados............................................................ 106
3.6.10.1.4.2. Recuperação......................................................................... 107
3.6.10.1.4.2.1. Princípio do teste............................................................. 107
3.6.10.1.4.2.2. Procedimento experimental............................................. 107
3.6.10.1.4.2.3. Análise dos dados............................................................ 107
3.6.10.1.4.3. Determinação do limite de quantificação.......................... 107
3.6.10.1.4.3.1. Princípio do teste............................................................. 107
3.6.10.1.4.3.2. Procedimento experimental............................................. 108
3.6.10.1.4.3.3. Análise dos dados............................................................ 108
3.6.10.1.4.4. Linearidade........................................................................... 108
3.6.10.1.4.4.1. Princípio do teste............................................................. 108
3.6.10.1.4.4.2. Procedimento experimental............................................. 109
3.6.10.1.4.4.3. Análise dos dados............................................................ 109
3.6.10.1.4.5. Precisão................................................................................ 110
3.6.10.1.4.5.1. Princípio do teste............................................................. 110
3.6.10.1.4.5.2. Procedimento experimental............................................. 110
3.6.10.1.4.5.3. Análise dos dados............................................................ 111
3.6.10.1.4.6. Exatidão................................................................................ 111
3.6.10.1.4.6.1. Princípio do teste............................................................. 111
3.6.10.1.4.6.2. Procedimento experimental............................................. 111
3.6.10.1.4.6.3. Análise dos dados............................................................ 112
3.6.10.1.4.7. Estabilidade.......................................................................... 112
3.6.10.1.4.7.1. Princípio do teste............................................................. 112
3.6.10.1.4.7.2. Procedimento experimental............................................. 112
3.6.10.1.4.7.3. Análise dos dados............................................................ 113
3.6.10.2. Estudo de disposição cinética da piplartina.............................. 113
3.6.10.2.1. Princípio do teste...................................................................... 113
3.6.10.2.2. Procedimento experimental...................................................... 113
3.6.10.2.3. Análise dos dados..................................................................... 115
3.6.11. Avaliação da associação do 5-Fluourouracil com a piplartina...... 117
3.6.11.1. Avaliação da associação do 5-fluorouracil (5-FU) com a
piplartina sobre a proliferação de células tumorais humanas in vitro...............
117
3.6.11.1.1. Principio do teste....................................................................... 117
3.6.11.1.2. Procedimento experimental...................................................... 117
3.6.11.1.3. Análise dos dados..................................................................... 117
3.6.11.2. Avaliação da associação do 5-Fluourouracil com a piplartina
em camundongos transplantados com tumor Sarcoma 180...............................
118
3.6.11.2.1. Princípio do teste...................................................................... 118
3.6.11.2.2. Procedimento experimental...................................................... 119
3.6.11.2.3. Análise dos dados..................................................................... 120
3.6.11.3. Parâmetros toxicológicos avaliados........................................... 120
3.6.11.3.1. Avaliação dos parâmetros bioquímicos............................... 120
3.6.11.3.1.1. Princípio do teste................................................................ 120
3.6.11.3.1.2. Procedimento experimental................................................ 121
3.6.11.3.1.3. Análise dos dados............................................................... 122
3.6.11.3.2. Avaliação dos parâmetros hematológicos........................... 122
3.6.11.3.2.1. Princípio do teste................................................................ 122
3.6.11.3.2.2. Procedimento experimental................................................ 122
3.6.11.3.2.3. Análise dos dados............................................................... 122
3.6.11.3.3. Análise histopatológica.......................................................... 123
3.6.11.3.3.1. Princípio do teste................................................................ 123
3.6.11.3.3.2. Procedimento experimental................................................ 123
3.6.11.3.3.3. Análise dos dados............................................................... 123
4. Resultados............................................................................................................ 126
4.1. Estudo da atividade citotóxica................................................................... 126
4.1.1. Avaliação da atividade citotóxica da piplartina e seus análogos em
células tumorais humana...........................................................................................
126
4.1.2. Avaliação da atividade citotóxica da piplartina em células normais
humana......................................................................................................................
128
4.2. Estudo do mecanismo de ação citotóxico em células HL-60.................. 130
4.2.1. Determinação da viabilidade celular...................................................... 130
4.2.2. Determinação do potencial transmembrânico da mitocôndria............... 138
4.2.3. Determinação da ativação da caspase-3............................................... 138
4.2.4. Determinação do conteúdo de DNA nuclear da célula.......................... 141
4.2.5. Determinação do índice mitótico............................................................ 143
4.3. Estudo da atividade genotóxica e mutagênica......................................... 146
4.3.1. Avaliação da genotoxicidade in vitro – Danos ao DNA - Ensaio do
cometa.......................................................................................................................
146
4.3.2. Estudo do mecanismo de ação genotóxico em células V79.................. 148
4.3.2.1. Determinação da viabilidade celular................................................ 148
4.3.2.2. Determinação do potencial transmembrânico da mitocôndria......... 152
4.3.2.3. Determinação do conteúdo de DNA nuclear da célula.................... 152
4.3.3. Avaliação da mutagenicidade no ensaio de mutação gênica reversa
em Salmonella typhimurium – Teste de Ames...........................................................
155
4.3.4. Avaliação da mutagenicidade e recombinogênese em
Saccharomyces cerevisiae........................................................................................
158
4.3.5. Avaliação da genotoxicidade/mutagenicidade em medula óssea de
camundongos – Teste do micronúcleo in vivo...........................................................
162
4.4. Estudo farmacocinético.............................................................................. 165
4.4.1. Desenvolvimento e validação da metodologia bioanalítica.................... 165
4.4.1.1. Especificidade.................................................................................. 165
4.4.1.2. Recuperação.................................................................................... 166
4.4.1.3. Determinação do limite de quantificação......................................... 166
4.4.1.4. Curva de calibração/linearidade....................................................... 169
4.4.1.5. Precisão e exatidão.......................................................................... 169
4.4.1.6. Estabilidade...................................................................................... 172
4.4.2. Estudo de disposição cinética da piplartina........................................... 174
4.5. Avaliação da associação do 5-Fluourouracil com a piplartina................ 178
4.5.1. Avaliação da associação do 5-fluorouracil (5-FU) com a piplartina
sobre a proliferação de células tumorais humanas in vitro.......................................
178
4.5.2. Avaliação do efeito da associação do 5-fluorouracil com a piplartina
sobre a massa tumoral de camundongos transplantados com o tumor Sarcoma
180.............................................................................................................................
180
4.5.3. Avaliação dos aspectos toxicológicos.................................................... 183
4.5.3.1. Efeito da associação do 5-fluorouracil com a piplartina sobre a
massa corpórea e a massa úmida dos órgãos de camundongos saudáveis ou
transplantados com o tumor Sarcoma 180................................................................
183
4.5.3.2. Efeito da associação do 5-fluorouracil com a piplartina sobre os
parâmetros bioquímicos de sangue periférico de camundongos saudáveis ou
transplantados com o tumor Sarcoma 180................................................................
185
4.5.3.3. Efeito da associação do 5-fluorouracil com a piplartina sobre os
parâmetros hematológicos de sangue periférico de camundongos saudáveis ou
transplantados com o tumor Sarcoma.......................................................................
187
4.5.3.4. Análise histopatológica dos órgãos de camundongos, saudáveis ou
transplantados com o tumor Sarcoma 180, tratados com o 5-fluorouracil
associado com a piplartina.........................................................................................
189
4.6. Resumo dos resultados obtidos com a piplartina.................................... 193
5. Discussão............................................................................................................. 196
6. Conclusão............................................................................................................. 224
7. Referencias Bibliográficas.................................................................................. 226
8. Anexos.................................................................................................................. 255
Lista de Figuras
Figura 1
Estrutura química da vimblastina (1), vincristina (2), vindesina (3) e
vinorelbina (4)........................................................................................ 36
Figura 2
Estrutura química do paclitaxel (5) e docetaxel (6)............................... 37
Figura 3
Estrutura química da podofilotoxina (7), etoposídeo (8) e tenoposídeo
(9).......................................................................................................... 39
Figura 4
Estrutura química da camptotecina (10), topotecano (11) e
irinotecano (12)...................................................................................... 40
Figura 5
Alguns componentes da dieta com propriedades anticâncer................ 44
Figura 6
Estrutura química de alguns componentes da dieta com propriedades
anticâncer.............................................................................................. 45
Figura 7
Estrutura química de alguns componentes da dieta com propriedades
anticâncer (continuação)....................................................................... 46
Figura 8
Estrutura química da piplartina……………………………………………. 51
Figura 9
Estrutura química dos análogos da piplartina....................................... 71
Figura 10
Representação dos tipos de cometas corados com prata e
visualizados em microscópio óptico...................................................... 85
Figura 11
Espectrometria de massas da piplartina no modo MS/MS operando
em íon positivo....................................................................................... 99
Figura 12
Espectrometria de massas da carbamazepina no modo MS/MS
operando em íon positivo...................................................................... 100
Figura 13
Procedimento de preparação das amostras de plasma de ratos
empregando a extração líquido-líquido................................................. 105
Figura 14
Efeito da piplartina sobre a proliferação de células leucêmicas HL-60
determinado por citometria de fluxo usando iodeto de propídeo após
3, 6, 12 e 24 horas de incubação..........................................................
132
Figura 15
Efeito da piplartina sobre a integridade da membrana citoplasmática
de células leucêmicas HL-60 determinado por citometria de fluxo
usando iodeto de propídeo após 3, 6, 12 e 24 horas de incubação...... 133
Figura 16
Efeito da piplartina sobre a morfologia de células leucêmicas HL-60
determinado por citometria de fluxo usando o FSC e SSC como
parâmetros de tamanho relativo da célula e granulosidade ou
complexidade interna da célula, respectivamente, após 3 horas de
incubação.............................................................................................. 134
Figura 17
Efeito da piplartina sobre a morfologia de células leucêmicas HL-60
determinado por citometria de fluxo usando o FSC e SSC como
parâmetros de tamanho relativo da célula e granulosidade ou
complexidade interna da célula, respectivamente, após 6 horas de
incubação..............................................................................................
135
Figura 18
Efeito da piplartina sobre a morfologia de células leucêmicas HL-60
determinado por citometria de fluxo usando o FSC e SSC como
parâmetros de tamanho relativo da célula e granulosidade ou
complexidade interna da célula, respectivamente, após 12 horas de
incubação.............................................................................................. 136
Figura 19
Efeito da piplartina sobre a morfologia de células leucêmicas HL-60
determinado por citometria de fluxo usando o FSC e SSC como
parâmetros de tamanho relativo da célula e granulosidade ou
complexidade interna da célula, respectivamente, após 24 horas de
incubação.............................................................................................. 137
Figura 20
Efeito da piplartina sobre o potencial transmembrânico de células
leucêmicas HL-60 determinado por citometria de fluxo usando
rodamina 123 após 3, 6, 12 e 24 horas de incubação.......................... 139
Figura 21
Efeito da piplartina sobre a ativação da caspase-3 em células
leucêmicas HL-60 após 24 horas de incubação.................................... 140
Figura 22
Avaliação do efeito da piplartina sobre o índice mitótico de células
leucêmicas HL-60 determinado por coloração diferencial com
hematoxilina/eosina em células leucêmicas HL-60 após 3 horas de
incubação.............................................................................................. 144
Figura 23
Análise do índice mitótico demonstrando uma parada do ciclo celular
em G
2
associada com o tratamento com a piplartina............................ 145
Figura 24
Efeito da piplartina sobre a proliferação de células V79 determinado
por citometria de fluxo usando iodeto de propídeo após 3 horas de
incubação.............................................................................................. 149
Figura 25
Efeito da piplartina sobre a integridade da membrana citoplasmática
de células V79 determinado por citometria de fluxo usando iodeto de
propídeo após 3 horas de incubação.................................................... 150
Figura 26
Efeito da piplartina sobre a morfologia de células V79 determinado
por citometria de fluxo usando o FSC e SSC como parâmetros de
tamanho relativo da célula e granulosidade ou complexidade interna
da célula, respectivamente, após 3 horas de incubação....................... 151
Figura 27
Efeito da piplartina sobre o potencial transmembrânico de células
V79 determinado por citometria de fluxo usando rodamina 123 após
3 horas de incubação............................................................................
153
Figura 28
Perfil cromatográfico mostrando a especificidade referente ao
método analítico para quantificação da piplartina em plasma de ratos
por HPLC com detecção por espectrometria de massas...................... 167
Figura 29
Curva analítica mostrando a linearidade referente ao método
analítico para quantificação da piplartina em plasma de ratos por
HPLC com detecção por espectrometria de massas............................ 170
Figura 30
Curva de decaimento plasmático da piplartina após a administração
de uma única dose de 50 mg/kg em ratos............................................ 176
Figura 31
Efeito da associação do 5-fluorouracil (5-FU) com a piplartina sobre a
massa tumoral de animais transplantados com o tumor Sarcoma 180. 181
Figura 32
Histopatologia dos tumores de camundongos transplantados com o
tumor Sarcoma 180............................................................................... 182
Figura 33
Histopatologia dos fígados de camundongos transplantados com o
tumor Sarcoma 180............................................................................... 190
Figura 34
Histopatologia dos rins de camundongos transplantados com o tumor
Sarcoma 180......................................................................................... 191
Figura 35
Histopatologia dos baços de camundongos transplantados com o
tumor Sarcoma 180............................................................................... 192
Figura 36
Mecanismo de ação proposto para a atividade citotóxica/genotóxica
da piplartina........................................................................................... 214
Lista de Tabelas
Tabela 1
Alvo molecular de componentes da dieta com propriedades
anticâncer.............................................................................................. 48
Tabela 2
Alvo molecular de componentes da dieta com propriedades
anticâncer (continuação)....................................................................... 49
Tabela 3
Células utilizadas nos ensaios de citotoxicidade, genotoxicidade e
antitumoral............................................................................................. 62
Tabela 4
Linhagens de microorganismos utilizadas nos ensaios de
mutagenicidade e recombinogênese..................................................... 65
Tabela 5
Preparo das amostras para a curva de calibração da piplartina........... 102
Tabela 6
Preparo das amostras para controle de qualidade da piplartina........... 103
Tabela 7
Parâmetros farmacocinéticos avaliados................................................ 116
Tabela 8
Atividade citotóxica da piplartina e seus análogos em linhagens de
células tumorais humanas..................................................................... 127
Tabela 9
Atividade citotóxica da piplartina em células humanas normais........... 129
Tabela 10
Efeito da piplartina sobre distribuição do ciclo celular de células
leucêmicas HL-60 determinado por citometria de fluxo usando iodeto
de propídeo após 3, 6, 12 e 24 horas de incubação............................. 142
Tabela 11
Atividade genotóxica da piplartina em células V79 avaliada pelo teste
do cometa após 3 horas de incubação.................................................. 147
Tabela 12
Efeito da piplartina sobre distribuição do ciclo celular em células V79
determinado por citometria de fluxo usando iodeto de propídeo após
3 horas de incubação............................................................................ 154
Tabela 13
Avaliação da atividade mutagênica por deslocamento do quadro de
leitura ou frameshift (his+) nas linhagens TA98 e TA97a de
Salmonella typhimurium após tratamento com piplartina sem ou com
ativação metabólica............................................................................... 156
Tabela 14
Avaliação da atividade mutagênica por substituição de pares de
bases (his+) nas linhagens TA100 e TA102 de Salmonella
typhimurium após tratamento com piplartina sem ou com ativação
metabólica.............................................................................................
157
Tabela 15
Indução de mutação reversa e para frente ou forward (can1) na
linhagem haplóide N123 de Saccharomyces cerevisiae após
tratamento com piplartina em fase exponencial de crescimento........... 159
Tabela 16
Indução de mutação pontual (his-7 e lys1-1) e mutação por
deslocamento do quadro de leitura ou frameshift (hom3-10) na
linhagem haplóide XV185-14c de Saccharomyces cerevisiae após
tratamento com piplartina em fase exponencial de crescimento...........
160
Tabela 17
Indução de recombinações mitóticas intergênica ou crossing-over
(+/cyh2) e intragênica ou conversão gênica (leu1-1/leu1-12) na
linhagem diplóide XS2316 de Saccharomyces cerevisiae após
tratamento com piplartina em fase exponencial de crescimento........... 161
Tabela 18
Freqüência de eritrócitos policromáticos micronúcleados em medula
óssea em camundongos após tratamento com piplartina..................... 163
Tabela 19
Proporção de eritrócitos policromáticos e eritrócitos normocromáticos
de medula óssea em camundongos após tratamento com piplartina... 164
Tabela 20
Recuperação média do procedimento de purificação das amostras de
plasma de ratos para a piplartina e o padrão interno
(carbamazepina), empregando extração liquido-liquido........................ 168
Tabela 21
Precisão e exatidão intra-ensaio e inter-ensaio referentes ao método
analítico para quantificação da piplartina em plasma de ratos por
HPLC com detecção por espectrometria de massas............................ 171
Tabela 22
Estabilidade da piplartina em amostra de plasma, analisadas
imediatamente após o preparo, mantidas a temperatura de – 20 ºC e
submetidas a três ciclos de congelamentos e descongelamentos ou
após permanência á temperatura ambiente por 4 horas....................... 173
Tabela 23
Concentrações plasmáticas da piplartina após a administração de
uma única dose de 50 mg/kg em ratos................................................. 175
Tabela 24
Parâmetros farmacocinéticos calculados a partir da curva de
disposição cinética da piplartina, após a administração de uma única
dose de 50 mg/kg em ratos...................................................................
177
Tabela 25
Efeito da associação do 5-fluorouracil com a piplartina sobre a
proliferação de células tumorais humanas............................................ 179
Tabela 26
Efeito da associação do 5-fluorouracil com a piplartina sobre a massa
corpórea e a massa úmida dos órgãos de camundongos saudáveis
ou transplantados com o tumor Sarcoma 180....................................... 184
Tabela 27
Efeito da associação do 5-fluorouracil com a piplartina sobre os
parâmetros bioquímicos de sangue periférico de camundongos
saudáveis ou transplantados com o tumor Sarcoma 180..................... 186
Tabela 28
Efeito da associação do 5-fluorouracil com a piplartina sobre os
parâmetros hematológicos de sangue periférico de camundongos
saudáveis ou transplantados com o tumor Sarcoma 180.....................
188
Tabela 29
Resumo dos resultados encontrados para o estudo da atividade
citotóxica da piplartina........................................................................... 194
Tabela 30
Estrutura química de compostos relacionados à piplartina................... 199
Tabela 31
Estrutura química de compostos relacionados à piplartina
(continuação)......................................................................................... 200
Lista de símbolos e abreviaturas
µL
Microlitro
µM
Micromolar
[ ] Concentração
< Menor que
> Maior que
5-FU 5-Fluorouracil
ALT Alanina aminotransferase
AST Aspartato aminotransferase
ANOVA Analisys of Variance (Análise de variância)
AUC
0-24h
Área sob a curva de concentração de 0 a 24(h)
AUC
0-∞
Área sob a curva de concentração de 0 ao infinito
CCD Cromatografia em camada delgada
Cl Clearance total
CI
50
Concentração inibitória média
C
max
Pico de concentração máxima
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucléico
E.P.M. Erro padrão da média
EPC Eritrócitos policromáticos
EPCM Eritrócitos policromáticos micronúcleados
ENC Eritrócitos normocromáticos
G Força da gravidade
g Grama
HIS Histidina
his- Auxotrofilia para o aminoácido histidina
his+ Prototrofia para o aminoácido histidina
HOM Homosserina
h Hora
HPLC
High performance liquid chromatography
(Cromatografia Líquida de Alta Eficiência)
HTS High –throughput screening
IC Intervalo de confiança
IM Índice de mutagenicidade
L Litro
LIS Lisina
K
el
Constante de eliminação
M Molar
mg Miligrama
ng Nanograma
mL Mililitro
mM Milimolar
MRM Monitorar múltiplas reações
MTT Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio
m/z
Relação massa/carga
PBS Phosphate buffer solution (Tampão fosfato)
pH Potencial hidrogeniônico
-S9 Sem Ativação Metabólica
+S9 Com Ativação Metabólica
SC Meio sintético completo
SC-his Meio sintético sem histidina
SC-lys Meio sintético sem lisina
SC-hom Meio sintético sem homosserina
TBS Tris buffer solution (Tampão tris)
T
1/2
Tempo de meia vida de eliminação do fármaco
T
max
Tempo do pico de concentração máxima
US-NCI United States National Cancer Institute (Instituto
Nacional do Câncer dos Estados Unidos)
UI Unidades internacionais
Vd Volume de distribuição
YEPD Meio completo para leveduras
Resumo
ESTUDO DAS PROPRIEDADES ANTICÂNCER DA PIPLARTINA. Daniel Pereira
Bezerra. Orientadora: Letícia Veras Costa-Lotufo. Tese de Doutorado. Programa de
Pós-Graduação em Farmacologia. Departamento de Fisiologia e Farmacologia,
UFC, 2008.
A piplartina é um alcalóide/amida conhecido encontrado em espécies do gênero
Piper com propriedade citotóxica interessante. Para avaliar o seu potencial
antineoplásico, um estudo farmacológico de suas propriedades anticâncer foi
realizado em vários modelos biológicos. A piplartina apresentou potente atividade
citotóxica em todas as linhagens tumorais testadas. Por comparação da
citotoxicidade de moléculas com estruturas relacionadas com a piplartina, foi
identificado que a presença da carbonila α,β-insaturada do anel amídico é essencial
para a sua atividade citotóxica. Em células mononucleares de sangue periférico de
doadores saudáveis expostas a piplartina, foi observada apenas fraca atividade
citotóxica. Adicionalmente, a piplartina induziu apoptose em células leucêmicas HL-
60, com participação da via intrínseca, de maneira dependente da concentração,
como observado pelo padrão de morfologia celular, integridade da membrana
citoplasmática, alteração no potencial transmembrânico da mitocôndria e aumento
da fragmentação do DNA. Na análise do ciclo celular, foi observado bloqueio na fase
G
2
.
A piplartina foi capaz de induzir dano ao DNA em células V79, como observado
pelo ensaio do cometa alcalino e neutro. Seu mecanismo de ação genotóxico parece
ser semelhante ao da sua atividade citotóxica. Não foi observada atividade
mutagênica, com ou sem ativação metabólica (S9), nas linhagens de Salmonella
(modelo procariótico) testadas. Por outro lado, a piplartina foi mutagênica e
recombinogênica em linhagens de Saccharomyces cerevisiae (modelo eucariótico).
Isto pode ser explicado pela diferença fisiológica entre a enzima topoisomerase II de
eucarióticos e procarióticos, refletindo uma possível interferência da piplartina sobre
a atividade desta enzima. No ensaio do micronúcleo in vivo, a piplartina induziu
aumento da freqüência de micronúcleo na maior dose testada (100 mg/kg).
Entretanto, não alterou a proporção de eritrócitos policromáticos/normocromáticos.
Em estudo farmacocinético, um método bioanalítico por LC-MS/MS foi desenvolvido
e validado para a quantificação da piplartina em plasma de ratos. O método
apresentou-se linear, sensível, preciso e exato. No estudo de disposição cinética, a
piplartina apresentou um perfil de absorção típico de um modelo
monocompartimentado. Adicionalmente, os níveis plasmáticos são compativeis com
o valor obtido na citotoxicidade in vitro o que nos leva a propor que a atividade
anticâncer da piplartina deve-se as suas propriedades citotóxica direto. No ensaio de
atividade antitumoral, a combinação da piplartina com o 5-fluourouracil levou a um
aumento da inibição do crescimento in vitro e in vivo. Além disso, análises
hematológicas mostraram leucopenia após tratamento dos animais com o 5-
fluourouracil, o qual foi revertido pela combinação com a piplartina. Esses dados
sugerem que a piplartina apresenta um potencial anticâncer promissor.
Palavras chave: Ensaios de Seleção de Medicamentos Antitumorais, Alcalóides,
Amidas, Testes de Mutagenicidade, Antineoplásicos.
Abstract
STUDY OF ANTICANCER PROPERTIES OF PIPLARTINE. Daniel Pereira Bezerra.
Advisor: Letícia Veras Costa-Lotufo. Doctorate Thesis. Postgraduate Program on
Pharmacology. Department of Physiology and Pharmacology, Federal University of
Ceara, UFC, 2008.
Piplartine is a known alkaloid/amide from Piper species with interesting cytotoxic
properties. In order to understand the antineoplasic potential of piplartine, a
pharmacological study was performed in several biological models. Piplartine
displayed potent cytotoxicity against all cancer cell lines. By comparing the
cytotoxicity of selected molecules that differ in structural elements, it was identified
that the presence of the α,β-unsaturated carbonyl moiety of the amide ring is an
important structural requirement for cytotoxic activity. In healthy peripheral blood
mononuclear cells exposed to piplartine, it was observed only weak cytotoxic activity.
Moreover, piplartine treatment induced apoptosis in HL-60 cells, by the intrinsic
pathway, in a dose-dependent manner, as observed by morphology and
cytoplasmatic membrane integrate changes, alteration in mitochondrial membrane
potential and an increase in internucleosomal DNA fragmentation. In the cell cycle
analysis, piplartine induced G
2
cell cycle arrest. Piplartine treatment induced DNA
strand breaks in V79 cells, as detected by neutral and alkaline comet assay. Its
genotoxic mechanism of action seems to be similar to its cytotoxic activity. No
mutagenic effect, with or without metabolic activation (S9 mix), in Salmonella strains
(prokaryotic model) was observed under experimental conditions. On the other hand,
piplartine was mutagenic and recombinogenic in Saccharomyces cerevisiae assays
(eukaryotic model). This can be explained due to the differences in physiological
between eukaryote and prokaryote DNA topoisomerase II, reflecting a possible
interference of piplartine upon this enzyme activity. In vivo micronucleus test,
piplartine increased in the levels of micronuclei in the highest dose tested (100
mg/kg). Nevertheless, no bone marrow cytotoxicity was found after piplartine-treated
animals as observed by the polychromatic/normochromatic erythrocyte ratio. In
pharmacokinetic study, a LC–MS/MS bioanalytical method for the determination of
piplartine in rat plasma was established. The method developed shows great linearity
and low quantification limit; precision and accuracy were within the acceptable
ranges for bioanalytical purposes. In the concentration–time profiles, piplartine
showed absorption kinetic of a monocompartimental model. Additionally, the plasma
levels are compatible with the in vitro cytotoxicity which leads us to propose that the
anticancer activity of piplartine is due to its direct cytotoxic properties. In antitumor
assay, the combination of piplartine with 5-fluourouracil led to an in vitro and in vivo
increasing of the tumor growth inhibition. In addition, hematological analysis showed
leukopenia after 5-fluourouracil treatment, which was reversed by the combined use
of piplartine. These data suggest that piplartine has promising anticancer potential.
Key words: Antitumor Drug Screening Assays, Alkaloids, Amides, Mutagenicity
tests, Antineoplasics.
Introdução
Introdução
- 29 -
1. Introdução
1.1. Câncer
O câncer é uma das doenças que mais causam temor na sociedade, por ter
se tornado um estigma de mortalidade e dor. Na verdade, a palavra câncer é o
termo comum para todos os tumores malignos. Apesar da origem desta palavra ser
relativamente incerta, provavelmente deriva do termo câncer, que em latim, significa
caranguejo. Presumivelmente, a origem da palavra câncer para a doença deve a
ramificação, que se assemelha a morfologia do carangueijo (KUMMAR et al., 2004).
As células do câncer possuem defeitos nos mecanismos que governam a
proliferação normal. Entre as características do tumor maligno estão à auto
sufuciência da sinalização de fatores de crescimento, insensibilidade a inibidores do
crescimento, inibição da morte celular programada (apoptose), potencial replicativo
ilimitado, angiogênese, poder de invasão e capacidade de metastastizar-se
(HANAHAN & WEINGER, 2000). O câncer é caracterizado por um desvio nos
mecanismos de controle que dirigem a proliferação e a diferenciação das células.
Essas células proliferam excessivamente e formam tumores locais que podem
comprimir ou invadir estruturas adjacentes normais (KATZUNG, 2003). As células
que sofrem transformação neoplásicas geralmente expressam antígenos de
superfície celular que parecem ser do tipo fetal normal (WERNERT et al., 1991;
APTSIAURI et al., 2007). Além disso, apresentam outros sinais de indiferenciação
aparente e podem exibir anormalidades cromossômicas estruturais e numéricas,
incluindo diversas translocações e o aparecimento de seqüências gênicas
amplificadas (RABBITTS et al.,, 2001; RABBITTS, 2001).
Existe uma pequena subpopulação de células no interior do tumor, que
podem ser descritas como células-tronco tumorais. Essas células retêm a
capacidade de sofrer ciclos repetidos de proliferação, podendo migrar para locais
distantes no corpo, a fim de colonizar vários órgãos através do processo
denominado metástase. Essa progressão neoplásica é acompanhada de
anormalidades quantitativas em diversas vias metabólicas e componentes celulares
(CROKER & ALLAN, 2008).
Introdução
- 30 -
O processo de carcinogênese, ou seja, de formação do câncer, em geral dá-
se lentamente, podendo levar vários anos para que uma célula cancerosa origine um
tumor detectável. Esse processo passa por vários estágios antes de chegar ao
tumor: estágio de iniciação, estágio de promoção e estágio de progressão
(SPANDIDOS, 1985; CHABNER & LONGO, 1996; SPENCE & JONHSTON, 2001;
KUMMAR et al., 2004; SPANDIDOS, 2007).
O estágio de iniciação é o primeiro estágio da carcinogênese. Nele as células
sofrem o efeito de um agente carcinogênico (agente oncoiniciador) que provoca
modificações em alguns de seus genes. Nesta fase as células encontram-se
geneticamente alteradas, porém ainda não é possível se detectar um tumor
clinicamente. Exemplos de substâncias químicas carcinógenas: sulfato de dimetila,
metilnitrossuréia, cloreto de vinila, aflatoxinas, dimetilnitrosamina e benzopireno
(CHABNER & LONGO, 1996; SPENCE & JONHSTON, 2001; KUMMAR et al., 2004;
JUNG et al., 2006).
No estágio de promoção, as células geneticamente alteradas sofrem o efeito
dos agentes cancerígenos classificados como oncopromotores. A célula iniciada é
transformada em célula maligna, de forma lenta e gradual. Para que ocorra essa
transformação, é necessário um longo e continuado contato com o agente
cancerígeno promotor. A suspensão do contato muitas vezes interrompe o processo
nesse estágio (SPENCE & JONHSTON, 2001; KUMMAR et al., 2004).
O estágio de progressão é o terceiro e último estágio e caracteriza-se pela
multiplicação descontrolada, sendo um processo irreversível. O câncer já está
instalado, evoluindo até o surgimento das primeiras manifestações clínicas da
doença. Os fatores que promovem a iniciação ou progressão da carcinogênese são
chamados de carcinógenos. O fumo, por exemplo, é um agente carcinógeno
completo, pois possui componentes que atuam nos três estágios da carcinogênese
(SPENCE & JONHSTON, 2001; KUMMAR et al., 2004; JUNG et al., 2006;
SPANDIDOS, 2007).
O câncer é classificado de acordo com o tipo de célula normal que o originou,
e não de acordo com os tecidos para os quais se espalhou. Isso é o que pode se
chamar de classificação primária (KATZUNG, 2003; KUMMAR et al., 2004).
Introdução
- 31 -
Os processos invasivos e metastáticos, bem como a série de anormalidades
metabólicas decorrentes do câncer, provocam doença e morte eventual do paciente,
a não ser que a neoplasia possa ser erradicada com o tratamento (KATZUNG, 2003;
INCA, 2007).
Existem três tipos principais de tratamento para o câncer: cirurgia,
radioterapia e quimioterapia (KATZUNG, 2003). Mais recentemente tem-se usado a
terapia de fotorradiação (KUSUZAKI et al., 2007) e a imunoterapia (HERR &
MORALES, 2008), sendo que o objetivo de cada um destes tratamentos é erradicar
o câncer, normalmente por meio da terapia combinada, onde é associado mais que
um tipo de tratamento.
A técnica cirúrgica leva à remoção de tumores com eficácia, se não houver
metástase; no caso da leucemia, por exemplo, costuma ser necessário o uso de
outros tipos de terapia, como o transplante de medula. A radioterapia é usada
comumente em conjunto com a cirurgia, com incremento da eficiência do tratamento.
Mesmo isoladamente, a radioterapia pode diminuir tumores grandes, diminuir a
recorrência e a chance de metástase, sendo uma abordagem antineoplásica muito
usada; entretanto, mesmo que sejam usados os sensitizadores (que diminuem os
efeitos colaterais) o tratamento por radiação é sujeito a severas limitações
(KATZUNG, 2003; KUMMAR et al., 2004; RUSTHOVEN et al., 2008; SOREIDE et
al., 2008).
O objetivo primário da quimioterapia é destruir as células neoplásicas,
preservando as normais. Entretanto, a maioria dos agentes quimioterápicos atua de
forma não-específica, lesando tanto células malignas quanto normais,
particularmente as células de rápido crescimento, como as gastrointestinais,
capilares e as do sistema imunológico. Isto explica a maior parte dos efeitos
colaterais da quimioterapia: náuseas, perda de cabelo e susceptibilidade maior às
infecções. Porém, o corpo recupera-se destes inconvenientes após o tratamento, e o
uso clínico desses fármacos exige que os benefícios sejam confrontados com a
toxicidade, na procura de um índice terapêutico favorável. Um fator importante para
o êxito da quimioterapia é a precocidade no diagnóstico do tumor (KATZUNG, 2003;
KUMMAR et al., 2004).
Introdução
- 32 -
Há mais de três décadas, estão sendo envidados esforços no sentido de
desenvolver fármacos para tratamento do câncer por triagem empírica e
planejamento racional de novos compostos. Recentemente, foram desenvolvidas
várias classes de fármacos que incluem agentes indutores da diferenciação
(DRUMEA et al., 2008). Estes agentes destinam-se a forçar as células neoplásicas,
depois de um bloqueio de maturação, a formar células de estágios finais, com pouca
ou nenhuma potencialidade proliferativa. Agentes antimetastáticos (PÉREZ &
DANISHEFSKY, 2007), destinados a comprometer as propriedades de superfície
das células malignas alterando, assim, seu potencial invasivo e metastático. Agentes
antiangiogênicos (KHOSRAVI-SHAHI & FERNÁNDEZ-PINEDA, 2008) destinados a
inibir a formação da vasculatura do tumor, agentes hipóxidos específicos
(KATZUNG, 2003) para células-troco tumorais, destinados a explorar a maior
capacidade das reações redutoras nessas células terapeuticamente resistentes,
devido á deficiência de oxigênio no interior dos tumores sólidos, fármacos
radiossensibilizantes tumorais e radioprotetores (BRIZEL, 2007) dos tecidos
normais, cujo objetivo é aumentar a eficácia terapêutica da radioterapia e
modificadores da resposta biológica (FRAZER et al., 2007), que alteram as reações
metabólicas e imunológicas entre o tumor e o hospedeiro.
Apesar de todo o avanço no tratamento do câncer, a resistência a fármacos
constitui um dos maiores problemas na quimioterapia do câncer. Verifica-se o
desenvolvimento de resistência adquirida em vários tipos de tumores sensíveis a
fármacos. Experimentalmente, a resistência a fármacos pode ser altamente
especifica para um único fármaco e, em geral, baseia-se numa alteração do
aparelho genético das células tumorais, com amplificação ou aumento da expressão
de um ou mais genes específicos (DEVITA et al., 1996; KATZUNG, 2003; KUMMAR
et al., 2004).
Em pesquisa realizada pela Organização Mundial de Saúde em 2005, de um
total de 58 milhões de mortes ocorridas no mundo, o câncer foi responsável por 7,6
milhões, o que representou 13% de todas as mortes. Os principais tipos de câncer
com maior mortalidade são: de pulmão (1,3 milhão); de estômago (cerca de 1
milhão); de fígado (662 mil); de cólon (655 mil); e de mama (502 mil). Do total de
óbitos por câncer ocorridos em 2005, mais de 70% ocorreram em países de média
ou baixa renda (WORLD HEALTH ORGANIZATION - WHO, 2006).
Introdução
- 33 -
Estima-se que, em 2020, o número de casos anuais novos seja da ordem de
15 milhões, sendo que cerca de 60% desses novos casos ocorrerão nos países em
desenvolvimento. É também conhecido que pelo menos um terço dos casos novos
de câncer que ocorrem anualmente no mundo poderiam ser prevenidos (INCA,
2007).
No Brasil, as estimativas para o ano de 2008, válidas também para o ano de
2009, apontam que ocorrerão 466.730 casos novos de câncer. Deste total, são
esperados 231.860 casos novos, para o sexo masculino, e 234.870 para o sexo
feminino. Estima-se que o câncer de pele do tipo não melanoma será o maior
incidência na população brasileira, seguido pelos tumores de próstata, de mama
feminina, de pulmão, de cólon e reto, de estômago e de colo do útero. Os tumores
mais incidentes para o sexo masculino serão devidos ao câncer de pele não
melanoma (56 mil casos novos), de próstata (49 mil), de pulmão (18 mil), de
estômago (14 mil) e de cólon e reto (12 mil). Para o sexo feminino, destacam-se os
tumores de pele não melanoma (59 mil casos novos), de mama (49 mil), de colo do
útero (19 mil), de cólon e reto (14 mil) e de pulmão (9 mil). A distribuição dos casos
novos de câncer segundo sua localização primária é bem heterogênea entre
Estados e Capitais do País. As regiões Sul e Sudeste, de maneira geral, apresentam
as maiores taxas, enquanto as regiões Norte e Nordeste mostram as menores taxas.
As taxas da região Centro-Oeste apresentam um padrão intermediário (INCA, 2007).
Diante de tal cenário, fica claro a necessidade de pesquisar novos grupos de
fármacos para o controle e o tratamento do câncer. A prevenção de novos casos, o
aumento da sobrevida e melhora na qualidade de vida das pessoas com câncer são
uns dos novos desafios da pesquisa atualmente.
1.2. Produtos naturais com atividade anticâncer
Há centenas de anos a medicina e os produtos naturais já estavam
intimamente ligados pelo uso de medicamentos tradicionais e venenos naturais. Os
primeiros registros, escritos em cuneiforme sob placas de argila, eram da
Mesopotâmia e datavam cerca de 2.600 a.C.. Dentre as substâncias listadas
encontravam-se óleos de plantas de cedro (Cedrus sp., Pináceas), cipreste
Introdução
- 34 -
(Cupressus sempervirens L., Cupressaceae), alcaçuz (Glycyrrhiza glabra L.,
Fabaceae) e papoula (Papaver somniferum L., Papaveraceae), todos eles ainda
utilizados hoje para o tratamento de indisposições como tosses e resfriados e
doenças como infecções parasitárias e inflamações (SCHWARTSMANN et al., 2002;
NEWMAN et al., 2003; NEWMAN & CRAGG, 2007).
Os estudos químicos, farmacológicos e clínicos desses medicamentos
tradicionais, os quais derivam predominantemente de plantas, foram à base de
alguns medicamentos de uso atual, tais como a aspirina e a morfina (NEWMAN et
al., 2000; SCHWARTSMANN et al., 2002; NEWMAN et al., 2003; BUTLER, 2004;
CRAGG et al., 2006; NEWMAN & CRAGG, 2007).
Dentre os produtos naturais encontramos os chamados metabólitos
secundários. Estes são produtos de vias condicionais que são ativadas em
contextos ou situações particulares. Eles podem ser divididos em diversas classes
estruturais: terpenos, lignanas, taninos, esteróides, chalconas, flavonas, flavanonas,
alcalóides e quinonas, dentre outros (CLARDY & WALSH, 2004).
Muitas dessas substâncias constituem-se, sobretudo, em modelos para o
desenvolvimento de medicamentos sintéticos modernos, tais como os fármacos
anticâncer utilizados atualmente: a vimblastina (Velban
®
) e a vincristina (Oncovin
®
) e
os análogos vindesina (Eldisine
®
) e vinorelbina (Navelbine
®
); o paclitaxel (Taxol
®
) e o
análogo docetaxel (Taxotere
®
); a podofilotoxina e os análogos, etoposídeo
(Etopophos
®
) e tenoposídeo (Vumon
®
); e a camptotecina e os análogos, topotecano
(Hycamtin
®
) e irinotecano (Camptosar
®
). Esses medicamentos movimentam cerca
de 50 bilhões de dólares anualmente (CRAGG & NEWMAN, 2000; CRAGG &
NEWMAN, 2005; PINTO et al., 2002).
A vimblastina (1) e a vincristina (2) são alcalóides naturais encontrados nas
partes aéreas da planta Catharanthus roseus var. albus G. Don. ou Vinca rósea L.,
(Apocynaceae) daí serem chamados de alcalóides da vinca (figura 1). Já a vindesina
(3) e vinorelbina (4) são derivados semi-sintético (GUERITTE-FAHY, 2005; CRAGG
& NEWMAN, 2005; NEWMAN & CRAGG, 2007).
O alvo dos alcalóides da vinca é o aparelho mitótico, em particular, os
microtúbulos. O mecanismo de ação envolve o bloqueio da polimerização dos
microtúbulos, que constituem uma parte importante do citoesqueleto e do fuso
Introdução
- 35 -
mitótico. O farmaco liga-se especificamente à proteina microtubular, a tubulina, na
forma dimérica. O complexo fármaco-tubulina liga-se a extremidade em formação
dos microtubulos, interrompendo a sua organização, com consequente
despolimerização destes microtubulos. O processo determina a parada da mitose na
fase da metáfase, com dissolução do fuso mitótico e interferência na segregação
dos cromossomos (KATZUNG, 2003).
Esses fármacos são usados geralmente em associação com outros agentes
quimioterápicos para o tratamento de vários tipos de câncer, incluindo leucemias,
linfomas, câncer testicular, carcinoma de mama, câncer de pulmão e sarcoma de
Kaposi. Entre os efeitos tóxicos estão náuseas, vômito, depressão da medula óssea,
bem como alopécia (PLASSCHAERT et al., 2004; CONNORS, 2005; CRAGG &
NEWMAN, 2005).
O paclitaxel (5) (figura 2) é um diterpeno encontrado nas cascas da planta
Taxus brevifolia Nutt (Taxaceae). O seu análogo, docetaxel (6) (figura 2), foi obtido
através do estudo da relação estrutura-atividade (KINGSTON, 2005; CRAGG &
NEWMAN, 2005).
Um dos fatores que desde sedo despertou a atenção no estudo dos taxanos
foi o seu mecanismo de ação ser diferente do que, até então, era conhecido. As
estruturas intracelulares afetadas pelos taxanos também são os microtúbulos.
Entretanto, contrariamente a outros fármacos antimitóticos conhecidos, como, os
alcalóides da vinca ou a colchicina que induzem a disjunção dos microtúbulos, os
taxanos promove a polimerização da tubulina em microtúbulos das células
(KINGSTON, 1991; KATZUNG, 2003). Os microtúbulos formados por indução dos
taxanos são extremamente estáveis e disfuncionais. Havendo assim um
deslocamento no equilíbrio dinâmico entre a formação dos microtúbulos e a sua
dissociação em tubulina, o que compromete a mitose, bloqueando a divisão celular e
comprometendo funções celulares vitais, o que provoca a morte da célula.
Os taxanos possuem atividade significativa no câncer ovariano e no câncer de
mama avançado. Os efeitos colaterais que limitam a dose do paclitaxel (5) incluem
neutropenia, trombocitopenia e neuropatia periférica. O principal efeito tóxico do
docetaxel (6) é a depressão da medula óssea (HAJEK et al., 1996; KATZUNG,
2003).
Introdução
- 36 -
N
H
N
R
4
CH
3
O
O
CH
3
N
N
R
1
R
2
OH
R
3
CH
3
O
CH
3
R
1
R
2
R
3
R
4
Vimblastina (1) CH
3
CO
2
CH
3
OCH
2
CH
3
OH
Vincristina (2) COH CO
2
CH
3
OCH
2
CH
3
OH
Vindesina (3) CH
3
CONH
2
OH OH
Vinorelbina (4) CH
3
CO
2
CH
3
OCH
2
CH
3
H
Figura 1 – Estrutura química da vimblastina (1), vincristina (2), vindesina (3) e
vinorelbina (4).
Introdução
- 37 -
R
1
R
2
Paclitaxel (5)
OCOCH
3
Docetaxel (6)
OC(CH
3
)
OH
Figura 2 – Estrutura química do paclitaxel (5) e docetaxel (6).
CH
3
Introdução
- 38 -
A podofilotoxina (7) é conhecida há muitos anos como o agente citotóxico
encontrado na raiz da planta Podophyllum peltatum L. (Berberidaceae). Os análogos
semi-sintéticos da podofilotoxina (7) (figura 3), etoposídeo (8) e tenoposídeo (9),
também foram obtidos através do estudo da relação estrutura-atividade (LEE &
XIAO, 2005; CRAGG & NEWMAN, 2005). O etoposídeo (8) e tenoposídeo (9) são
muitos semelhantes na sua estrutura química, na sua ação clínica e no bloqueio das
células nas fases finais do ciclo celular, S e G
2
. O mecanismo de ação envolve a
inibição da enzima nuclear topoisomerase II, que resulta em lesão do DNA através
da quebra dos filamentos induzidas pela formação de um complexo terceário do
fármaco, do DNA e da enzima (KATZUNG, 2003; LEE & XIAO, 2005).
O etoposídeo (8) tem sido usado clinicamente para o tratamento de leucemias
monocíticas, câncer testicular e no carcinoma de células pequenas do pulmão,
enquanto o tenoposídeo (9) possui atividade contra vários linfomas. Além de causar
náusea, vômito e alopecia, ocorre toxicidade significante do sistema hematopoético
e do sistema linfóide (KATZUNG, 2003; CRAGG & NEWMAN, 2005).
A camptotecina (10) é um alcalóide natural encontrado na planta chinesa
Camptotheca acuminata Decne (Nyssaceae). Este serviu como protótipo para a
síntese do topotecano (11) e irinotecano (12) (figura 4). Estes atuam interferindo na
atividade da enzima topoisomerase I, sendo responsável pela quebra e ligação de
filamentos simples de DNA, resultando em lesão do DNA e morte celular por
apoptose (KATZUNG, 2003; RAHIER et al., 2005).
O topotecano (11) é usado para o tratamento de câncer de ovário e de câncer
de pequenas células de pulmão. Já o irinotecano (12), um pró-fármaco, é usado
para o tratamento de câncer coloretal. A ocorrência de mielossupressão constitui
frequentemente o efeito adverso que limita a dose desses fármacos (RAHIER et al.,
2005; KATZUNG, 2003; CRAGG & NEWMAN, 2005).
Um problema desta quimioterapia e, de um modo geral, de todas até hoje
conhecidas, é a possibilidade das células cancerosas se tornarem resistentes, via
um mecanismo conhecido como resistência a múltiplas substâncias (multi-drug
resistance ou MDR), aspecto bioquímico complexo e ainda em estudo (SILVA et al.,
2003b).
Introdução
- 39 -
Podofilotoxina (7)
R
Etoposídeo (8) CH
3
Tenoposídeo (9)
S
-
Figura 3 – Estrutura química da podofilotoxina (7), etoposídeo (8) e tenoposídeo (9).
Introdução
- 40 -
R
1
R
2
R
3
Camptotecina (10) H H H
Topotecano (11) OH
H
Irinotecano (12)
H
CH
2
CH
3
Figura 4 - Estrutura química da camptotecina (10), topotecano (11) e irinotecano
(12).
CH
3
NCH
3
CH
3
O
O
N
N
Introdução
- 41 -
Diante do sucesso destes medicamentos de origem vegetal, é possível
entender a corrida entre algumas indústrias multinacionais pela busca de novas
substâncias bioativas. Esta busca foi intensificada nos anos 90, especialmente nas
florestas tropicais onde se concentra grande parte da biodiversidade. Além disso,
inúmeros análogos foram sintetizados em laboratórios por diferentes grupos de
pesquisa, com o objetivo de se identificar os grupos farmacofóricos, estabelecendo,
assim, a relação estrutura-atividade na tentativa de se obter fármacos mais potentes
(KINGSTON, 2000). A partir deste momento, grandes mudanças ocorreram nos
centros de pesquisas, incluindo a identificação de novos alvos moleculares
exploráveis, estabelecimento de programas de triagem de produtos naturais em
larga escala (HTS – High Throughput Screening), avanços no projeto racional de
fármacos e química combinatória (YUNES et al., 2001; MANN, 2002;
ROTHENBERG et al., 2003; BUTLER, 2004; GANESAN, 2004; WESTWELL &
STEVENS, 2004; CRAGG & NEWMAN, 2005; CRAGG et al., 2006; NEWMAN &
CRAGG, 2007).
Não foram somente as plantas que serviram de fontes para o
desenvolvimento de novos fármacos anticâncer. Os microrganismos, que sempre
foram a principal fonte de agentes antibacterianos, também proporcionam alguns
fármacos-chaves para a quimioterapia do câncer. Alguns exemplos notáveis são a
bleomicina (Blenoxane
®
), dactinomicina (Cosmegen
®
), plicamicina (Mithracin
®
),
mitomicina C (Mutamycin
®
) e as antraciclinonas, daunorrubicina (Daunoblastina
®
) e
doxorrubicina (Adriamycin
®
). Em geral, o mecanismo de ação desses antibióticos dá-
se pela ligação destes ao DNA através de sua intercalação entre bases especificas,
bloqueando a síntese de RNA ou DNA (ou ambos), provocando ruptura dos
filamentos de DNA e interferindo na replicação celular (KATZUNG, 2003).
A medicina moderna também tem encontrado no oceano uma vasta fonte de
compostos com importante potencial terapêutico. Alguns exemplos de produtos
naturais marinhos são: discodermolida, eleuterobina, sarcodictina e laulimalida, que
também apresentam potente atividade anticâncer e mecanismo de ação similar ao
do paclitaxel (5) (COLWELL, 2002; MANN, 2002; SOUSA, 2004; GANESAN, 2004).
Contudo, apesar de a natureza abrigar uma encantada e fascinante
biodiversidade de vida microbiana, vegetal e animal, o reino vegetal é o que tem
Introdução
- 42 -
contribuído de forma mais significativa para o fornecimento de metabólicos
secundários, muitos destes de grande valor agregado devido às suas aplicações
como medicamento, cosméticos, alimentos e agroquímicos (PHILLIPSON &
ANDERSON, 1998; CRAGG & NEWMAN, 2005; CRAGG et al., 2006; AGGARWAL
& SHISHODIA, 2006; NEWMAN & CRAGG, 2007). Entretanto, o conhecimento
fitoquímico e farmacológico de grande parte das plantas do planeta permanecem
desconhecidos. A elucidação dos componentes ativos presentes nas plantas, bem
como de seus mecanismos de ação, são um dos maiores desafios para a química e
a farmacologia atualmente (GEBHARDT, 2000; CRAGG & NEWMAN, 2005; CRAGG
et al., 2006; SUBRAMANIAN et al., 2006; NEWMAN & CRAGG, 2007).
1.3. Componentes da dieta como agentes anticâncer
O princípio "Deixe o alimento ser teu remédio e o remédio ser teu alimento",
exposto por Hipócrates aproximadamente 2.500 anos atrás, está recebendo um
interesse renovado. Nos últimos anos, o interesse de pesquisadores por alimentos
específicos ou componentes alimentares biologicamente ativos, os supostos
alimentos funcionais ou os nutracêuticos, do inglês "Foods for Specified Health Use"
(FOSHU) (HASLER, 1998).
Nos estudos epidemiológicos, in vitro, in vivo e ensaios clínicos que envolvem
câncer e dieta em diversas populações, um dos temas mais discutidos é a existência
de uma diferença na incidência das várias formas de câncer, que pode estar
relacionada às variações na ingestão de determinados componentes da dieta
(RIVLIN, 2001; MEYSKENS & SZABO, 2005; TRIPATHI et al., 2005).
As frutas, vegetais e temperos são excelentes fontes de fibra, vitaminas e sais
minerais, mas também contêm componentes como polifenóis, terpenos, alcalóides e
flavonóides, dentre outros (AGGARWAL & SHISHODIA, 2006). Estes podem trazer
muitos benéficos para a saúde além da nutrição básica. Dentre esses podemos citar
o açafrão, pimenta do reino, pimenta vermelha, romã, soja, manjericão cravo-da-
índia, gengibre, uva, chá verde, frutas cítricas, tomate, alho, alcachofra, cenoura e
vegetais crucíferos, dentre outros (figuras 5, 6 e 7).
Introdução
- 43 -
Diversas classes de anticarcinogênicos têm sido identificadas nos grãos de
soja, por exemplo, incluindo inibidores de protease, fitoesteróis, saponinas, ácidos
fenólicos, ácidos fíticos e isoflavonas (MESSINA & BARNES, 1991; RAFFOUL et al.,
2007; WU et al., 2008). Destes, as isoflavonas (genisteina (16) e daidzeina) são
particularmente notáveis porque a soja é a única fonte dietética significativa destes
componentes. Devido ao fato delas serem estrogênios fracos, as isoflavonas podem
agir como antiestrogênios por competir com os estrogênios endógenos de
ocorrência natural e que são mais potentes ao ligarem-se ao receptor de estrogênio.
Isso pode explicar porque populações que consumem quantidades significativas de
soja têm um risco reduzido de câncer dependente de estrogênio (MESSINA et al.,
1997; CHEUNG et al., 2008).
Num estudo de coorte prospectivo com mais de 47.000 homens, aqueles que
consumiram produtos a base de tomate 10 vezes ou mais por semana tiveram
menos da metade do risco de desenvolver câncer de próstata avançado
(GIOVANNUCCI et al., 1995; CLINTON et al., 1996; SYED et al., 2007; SERENE et
al., 2008; SCHWARZ et al., 2008). Outros cânceres cujo risco tem sido inversamente
associado com os níveis sangüíneos ou teciduais de licopeno (21) incluem o de
mama, trato digestivo, colo uterino, bexiga e pele e pulmão (LI et al., 1997;
CLINTON, 1998).
O chá perde apenas para água como a bebida mais consumida no mundo.
Uma grande atenção tem sido dirigida aos constituintes polifenólicos do chá,
particularmente do chá verde (HARBOWY & BALENTINE, 1997; WESTERTERP-
PLANTENGA et al., 2006). Os polifenóis abrangem mais de 30% do peso bruto total
das folhas do chá fresco. As catequinas (27) são os polifenóis predominantes e mais
importantes do chá verde (GRAHAM, 1992; WESTERTERP-PLANTENGA et al.,
2006).
Introdução
- 44 -
Figura 5 – Alguns componentes da dieta com propriedades anticâncer. Fonte:
AGGARWAL & SHISHODIA, 2006.
Introdução
- 45 -
OCH
3
OH
OO
OH
H
3
CO
CH
2
OCH
3
OH
CH
2
CCH
2
H
OH
OH
OH
O
OH
O
OH
OH
O
OH
NH
CH
3
CH
3
O
CH
3
CH
3
CH
2
CH
3
O
O
O
CH
2
OH
OH
OH O
H
H
OH
H
H
OC
3
H
OH
O
O
OH
OH
O
OH
OH
O
Figura 6 – Estrutura química de alguns componentes da dieta com propriedades
anticâncer.
Curcumina (13)
Eugenol (14)
Resveratrol (15)
Genisteína (16)
Capsaicina (17)
Limoneno (18)
Ácido elágico (20) Silimarina (19)
Introdução
- 46 -
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
OH
CH
3
O
CH
3
OOH
S
CH
3
N
O
CS
CH
2
SCH
2
O
O
OH
OH
OH
OH
OH
OH
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
H
CH
3
CH
3
COOH
CH
3
H
H
Figura 7 – Estrutura química de alguns componentes da dieta com propriedades
anticâncer (continuação).
O
O
N
O
Licopeno (21)
β-Caroteno (22)
Gingerol (23)
Sulforafano (24)
Alicina (26) Piperina (25)
Catequina (27)
Ácido ursólico (28)
Introdução
- 47 -
Diversos estudos mostram que o alho pode ser eficáz em reduzir o risco de
câncer em humanos (ERNST, 1997; PITTLER & ERNST, 2007; SHUKLA & KALRA,
2007; GAPTER et al., 2008). Em um estudo com mais de 40.000 mulheres pós-
menopausa, o consumo de alho foi associado com uma redução de
aproximadamente 50% no risco de câncer de cólon (STEINMETZ et al., 1994).
As frutas cítricas também possuem um efeito protetor contra uma variedade
de cânceres humanos. Ainda que laranjas, limões e limas sejam uma das principais
fontes de importantes nutrientes como vitamina C, outros componentes podem ser
os responsáveis pela atividade anticâncer (ELEGBEDE et al., 1993; WOLFE & LIU,
2003). As frutas cítricas são particularmente ricas em uma classe de fitoquímicos
conhecida como limonóides (18) (HASEGAWA & MIYAKE, 1996).
O alcalóide/amida piperina (25) é o principal constituinte da pimenta do reino
(Piper nigrum L., Piperaceae). Vários estudos mostram seu potencial tanto para a
prevenção quanto para o tratamento do câncer. A piperina previne citotoxicidade,
genotoxicidade e carcinogênese induzida por carcinógenos químicos e protege da
induzida por aflatoxina B
1
(SELVENDIRAN et al., 2004; SELVENDIRAN et al., 2006).
Pradeep & Kuttan (2002) demonstraram que a piperina inibe metástase de pulmão
induzida por células de melanoma B16F-10 em camundongos. A piperina também
apresenta atividades imunomodulatória e antitumoral em vários modelos in vivo
(SUNILA & KUTTAN, 2004, BEZERRA et al., 2005; BEZERRA el at., 2006). Além
disso, o gênero Piper, de um modo geral, tem mostrado ser uma importante fonte de
compostos bioativos, incluindo a piperlonguminina e a piplartina (PARMAR et al.,
1997; BEZERRA et al., 2008).
Os resultados das pesquisas que envolvem esses microelementos
representam um grande avanço na elucidação do papel preventivo e/ou curativo do
alimento, no combate ao câncer. Os inúmeros microelementos isolados apresentam
atividade na espressão de vários alvos farmacológicos tais como fator nuclear kappa
B (NFkB), ativador da proteína-1 (AP-1), ciclo celular, apoptose, proteína quinase B
(PKB), gene P53, sinalizadores de fator de crescimento, citocinas e metástase, fator
de necrose tumoral, sinalizador e ativador da transcrição (STAT), ciclooxigenase 2
(COX-2), lipooxigenase (LOX), oxido nitro sintase indutiva (NOSi), proteína
mitogênica ativada (MAP), metilação do DNA e angiogênese (tabelas 1 e 2).
Introdução
- 48 -
Tabela 1 – Alvo molecular de componentes da dieta com propriedades anticâncer.
Nome da planta Composto ativo
Alvo molecular
Açafrão
(Curcuma longa L.)
Curcumina (13),
curcuminóides
↓NF-κB, ↓AP-1, ↓STAT1, ↓STAT3,
↓STAT5, ↓β-catenina, ↑Nrf2, ↓VEGF,
↓HER2, ↓PKA, ↓PKC, ↓VCAM-1, ↓Bcl-2,
↓Bcl-XL, ↓ICAM-1, ↓TF, ↓AR, ↓p53, ↑MDR,
↓FTPase, ↑GST, ↑GSH-px, ↑HO, ↓XOD,
↓ciclina D1, ↓5-LOX, ↓COX-2, ↓INOS,
↓MMP-9, ↓TNF, ↓IL-6, ↓L-8, ↓IL-12
Pimenta do reino
(Piper nigrum L.)
Piperina (25) ↓NF-κB, ↓ATF-2, ↓c-Fos, ↓cAMP, ↓IL-1β,
↓IL-6, ↓TNF, ↓GM-CSF
Pimenta vermelha
(Capsicum annum L.)
Capsaicina (17)
↓NF-κB, ↓ciclina D1, ↓Bcl-2, ↓Bcl-xL,
↓Cdk1, ↓Bcl-2, ↓Bcl-xL
Romã
(Punica granatum L.)
Ácido elágico (20)
↓NF-κB, ↓COX-2, ↓cíclica D1, ↓MMP-9,
↓PDGF, ↓VEGF, ↑p21/WAF1, ↑p53
Soja
(Glycine max L. Merr.)
Genisteína (16) ↓NF-κB, ↑caspase-12, ↑p21/WAF1, ↑ GST-
px
Manjericão (Ocimum
sanctum L.)
Ácido ursólico (28)
↓NF-κB, ↓COX-2, ↓ciclina D1, ↓MMP-9
Cravo-da-índia
(Eugenia caryophyllus
Sprengel)
Eugenol (14)
↓NF-κB
Gengibre
(Zingiber officinale
Roscoe)
Gingerol (23)
↓TNF, ↓NF-κB, ↓AP-1, ↓COX-2, ↓NOS,
↓VEGF, ↑caspase-3, ↓Bcl2
Abreviações: NF-κB, fator nuclear kappa B; AP-1, ativador da proteína-1; iNOS,
óxido nítrico sintase induzida; COX-2, ciclooxigenase-2; IL, interleucina; TNF, fator
de necrose tumoral; HO, heme-oxigenase; Nrf, fator relacionado ao NF-E2; PKA,
proteína quinase A; PKC, proteína quinase C; LOX, lipoxigenase; VEGF, fator
endotelial de crescimento vascular; AR, receptor androgênio; VCAM, moléculas de
adesão vascular; ICAM, moléculas de adesão intercelular; TF, fator tecidual; MDR,
resistência a muitifármacos; Ftase, proteína farnesil transferase; GST, glutationa S-
transferase; GST-px, glutationa peroxidase; XOD, xantina oxidase; MMP,
metaloprotease de matriz; STAT, sinalizador e ativador da transcrição; Cdk, ciclica
dependente de quinase; PDGF, fator de crescimento derivado de plaqueta; caspase,
P53, P21 são proteínas pró-apoptóticas; BcL2 e BcLxL são proteínas
antiapoptóticos; β-catenina, proteína estrutural; HER, proto-oncogene; ciclicas,
reguladoras do ciclo celular. Fonte: AGGARWAL & SHISHODIA, 2006; PRADEEP &
KUTTAN, 2004.
Introdução
- 49 -
Tabela 2 – Alvo molecular de componentes da dieta com propriedades anticâncer
(continuação).
Nome da planta Composto ativo
Alvo molecular
Uva (Vitis vinifera L.)
Resveratrol (15) ↓COX-2, ↓iNOS, ↓AP-1, ↓NF-κB,
↑P21 Cip1/WAF1, ↑p53, ↑Bax,
↑caspases, ↓ciclina D1, ↓ciclina E,
↓Bcl-2, ↓Bcl-xL, ↓PKC, ↓PKD, ↓5-
LOX, ↓VEGF, ↓IL-1, ↓IL-6, ↓IL-8, ↓AR,
↓PSA, ↓CYP1A1, ↑HO-1, ↑Nrf2, ↓
STAT
Chá verde (Camellia
sinensis L.)
Catequinas (27)
↓NF-κB, ↓AP-1, ↓COX-2, ↓ciclina D1,
↓MMP-9, ↑HO-1, ↓IL-6, ↓VEGF, ↑p53,
↓Bcl-2, ↑p21/WAF1
Frutas cítricas (Citrus
sp.)
Limoneno (18)
↓COX-2, ↓iNOS
Tomate (Lycopersicon
esculentum Mill.)
Licopeno (21) ↓NF-κB
Alho
(Allium sativum L.)
Alicina (26)
↓NF-κB
Alcachofra
(Cynara scolymus L.)
Silimarina (19)
↓NF-κB, ↓AP-1, ↓COX-2, ↓ciclina D1,
↓MMP-9
Cenoura
(Daucus carota
sativus L.)
β-caroteno (22)
↓NF-κB
Vegetais crucíferos
(Brassica sp.)
Sulforafano (24)
↓NF-κB, ↓ciclina D1, ↓Cdk1, ↓Bcl-2,
↓Bcl-xL
Abreviações: NF-κB, fator nuclear kappa B; AP-1, ativador da proteína-1; iNOS,
óxido nítrico sintase induzida; COX-2, ciclooxigenase-2; IL, interleucina; HO, heme-
oxigenase; Nrf, fator relacionado ao NF-E2; PKD, proteína quinase D; PKC, proteína
quinase C; LOX, lipoxigenase; PSA, antígeno prostático especifico; CYP, citocromo
p450; CYP7A1, colesterol 7α-hidroxilase; VEGF, fator endotelial de crescimento
vascular; AR, receptor androgênio; MMP, metaloprotease de matriz; STAT,
sinalizador e ativador da transcrição; Cdk, ciclica dependente de quinase; caspase,
P53, P21, Bax são proteínas pró-apoptótica; BcL2 e BcLxL são proteínas
antiapoptóticos; ciclicas, reguladoras do ciclo celular. Fonte: AGGARWAL &
SHISHODIA, 2006.
Introdução
- 50 -
A partir destes exemplos, fica evidente que várias substâncias presentes em
frutas, legumes e temperos podem apresentar potente atividade farmacológica.
Portanto, é necessário mais investigações envolvendo os componentes alimentares
para elucidar o papel desses fitoquímicos na prevenção e no tratamento do câncer.
1.4. Piplartina
A piplartina (29) (figura 8), também chamada de piperlongumina, é um
alcalóide/amida encontrado nas plantas do gênero Piper, tais como Piper longum L.
(pimenta longa), Piper tuberculatum L. (pimenta-d’arda), Piper arborescens Roxb.
(Pimenta do fruto ganchoso), Piper callosum Ruiz & Pav. (João Brandim), Piper
retrofractum Vahl. e Piper sylvaticum Roxb (PARMAR et al., 1997).
A piplartina apresenta diferentes atividades biológicas. Essa amida
apresentou potente atividade repelente e inseticida para formiga Atta cephalotes
(CAPRON & WIEMER, 1996). A atividade antifúngica da piplartina também foi
estudada com resultados positivos para as linhagens Cladosporium sphaerospermun
e Cladosporium cladosporioides (NAVICKIENE et al., 2000; SILVA et al., 2002).
A piplartina também apresentou um efeito leishmanicida potente quando
testada no modelo in vitro contra promastigotos de Leishmania donovani na
concentração de 100 µM. Esta atividade foi confirmada in vivo usando o modelo, em
hamster, de leishmaniose visceral na dose de 30 mg/kg (BODIWALA et al., 2007).
Em relação às ações da piplartina sobre o sistema nervoso central, foram
observadas atividades ansiolítica e antidepressiva (FELIPE et al., 2007). A piplartina
apresentou um perfil similar ao observado com a buspirona e venlafaxina, não
apresentando nenhuma sedação. O efeito ansiolítico é completamente revertido pelo
flumazenil, sugerindo a participação de receptores do tipo benzodiazepínicos. A
piplartina mostrou efeito antidepressivo no teste do nado fossado, possivelmente
agindo no sistema de neutransmissão monoaminérgica, similarmente a imipramina.
Introdução
- 51 -
10
11
15
12
14
13
9
8
7
N
1
5
4
6
3
2
OO
H
3
CO
H
3
CO
OCH
3
Figura 8 – Estrutura química da piplartina (29) {5,6-dihidro-1-[1-oxo-3-(3,4,5-
trimetoxifenil)-2-propenil]-2(1H)piridinona}.
Introdução
- 52 -
Em ensaio de atividade antiagregante plaquetária, a piplartina mostrou ser um
potente inibidor da agregação plaquetária induzida por colágeno, ácido aracdônico,
fator ativador de plaquetas e por agonista de receptor de tromboxano A2, mas não
por trombina, sugerindo uma ação antagonista nos receptores de tromboxano A2
(TSAI et al., 2005; PARK et al., 2007; IWASHITA et al., 2007).
A piplartina também apresenta uma ação espasmolítica em aorta de rato. A
piplartina relaxou de maneira concentração-dependente a aorta pré-contraída com
fenilefrina. Este efeito foi independente do endotélio funcional e da participação das
prostaciclinas. Piplartina administrada cumulativamente sobre a fase tônica da
contração, inibe de maneira concentração-dependente as contrações induzidas por
KCl, sugerindo um efeito sobre os canais de cálcio dependentes de voltagem.
Piplartina também inibe as contrações fásicas induzidas por fenilefrina em meio livre
de cálcio, porém não apresenta nenhum efeito sobre as contrações fásicas
induzidas por cafeína nas mesmas condições experimentais. O autor sugere que a
piplartina induz relaxamento em aorta de rato por bloquear o influxo de Ca
2+
através
dos canais de cálcio dependentes de voltagem e por interferir na mobilização de
Ca
2+
dos estoques intracelulares sensíveis ao 1,4,5-trifosfato de inositol (mobilização
de Ca
2+
mediada por receptor) (OLIVEIRA, 2000).
A atividade citotóxica da piplartina foi descrita inicialmente em 1990, por
pesquisadores taiwanêses, em células tumorais KB (carcinoma nasofaríngeo
humano), P-388 (leucemia linfocítica murina), A-549 (carcinoma de pulmão humano)
e HT-29 (adenocarcinoma de cólon humano) (DUH et al., 1990a; DUH et al., 1990b;
TSAI et al., 2005). O potencial citotóxico da piplartina foi avaliado em estudos
posteriores, agora pelo nosso grupo de pesquisadores, em células HL-60 (leucemia
promielocítica humana), B16 (melanoma murina), HCT-8 (carcinoma de cólon
humano) e CEM (leucemia linfocítica humana), K-562 (leucemia mielocítica crônica
humana), JUKART (leucemia de células T humana) e MOLT-4 (leucemia de células
T humana) (BEZERRA et al., 2005; BEZERRA et al., 2007).
Além disso, o efeito da piplartina sobre o desenvolvimento de ovos de ouriço
do mar Lytechinus variegatus foi também avaliado (BEZERRA et al., 2005). A
piplartina causou inibição do desenvolvimento dos ovos de ouriço do mar de maneira
dependente da concentração durantes todas as fases examinadas, primeira e
Introdução
- 53 -
terceira divisões e blástula. A atividade antimitótica da piplartina foi relacionada com
a inibição da síntese de proteína e/ou DNA.
O efeito citotóxico da piplartina parece está relacionada com a inibição da
síntese de DNA e indução de morte celular por ambas as vias, apoptose e necrose,
dependendo da concentração usada (BEZERRA et al., 2007). Entretanto, seu
mecanismo de ação ainda não é conhecido.
Adicionalmente, o potencial anticâncer da piplartina foi confirmado em modelo
pré-clínico in vivo (BEZERRA et al., 2006). A administração de piplartina ou piperina
(50 ou 100 mg/kg/dia) inibiu o desenvolvimento de tumor sólido em camundongos
transplantados com Sarcoma 180. A atividade antitumoral da piplartina parece estar
relacionada diretamente a sua ação citotóxica, como observada pela redução da
marcação com Ki67 em tumores de animais tratados. A análise histopatológica do
fígado e rins demostrou que ambos os órgãos foram reversivelmente afetados pelo
tratamento com a piplartina, entretanto, de maneira mais intensa nos rins.
Assim, a piplartina, um produto natural encontrado em pimentas, pode ser um
agente anticâncer promissor. Por isso, estudos farmacológicos que avaliem seu
potencial citotóxico, em níveis celular e molecular, são requeridos. Para tanto, esta
tese focou estudar a farmacologia das propriedades anticâncer da piplartina.
- 54 -
Objetivos
Objetivos
- 55 -
2. Objetivos
2.1. Geral
Estudar as propriedades anticâncer da piplartina em vários modelos
biológicos.
2.2. Específicos
• Avaliar a relação estrutura-atividade citotóxica da piplartina;
• Avaliar a seletividade deste composto em relação a células normais;
• Avaliar o mecanismo de ação citotóxico da piplartina em células HL-60:
o Avaliar o efeito da piplartina sobre a indução de morte celular;
o Avaliar o efeito da piplartina sobre o ciclo celular;
• Avaliar o potencial genotóxico da piplartina em células V79;
• Avaliar o potencial mutagênico e recombinogênico da piplartina;
• Avaliar o efeito da piplartina sobre as células da medula óssea de animais;
• Avaliar a cinética de absorção da piplartina;
• Avaliar o efeito da associação do 5-FU com a piplartina.
- 56 -
Materiais e Métodos
Materiais e Métodos
- 57 -
3. Materiais e métodos
3.1. Materiais utilizados
3.1.1. Equipamentos
• Agitador de placa, MLW modelo Thys 2
• Agitador vortex, AD8850
• Balança analítica, GEHAKA AG200
• Balança para pesar animais, Filizola
• Banho-Maria, MOD. 105 DI DELLTA
• Centrífuga centimicro, FANEM Modelo 212
• Centrífuga de lâminas, Shandon Shoutern Cytospin
• Centrífuga de placas Eppendorf, Modelo Centrifuge 5403
• Centrífuga excelsa Baby I, FANEM Modelo 206
• Citômetro de fluxo, Guava EasyCyte Mini
• Coluna cromatográfica C18 (250 mm x 4,6 mm, 5µm), Nanoseparation
Technologies
• Contador manual, Division of Bexton, Dickinson and Company
• Deatilador de água
• Deonizador de água Mili-Q, Millipore
• Espectrofotômetro de placas, DTX 880 multimode detector, Beckman Coulter
• Espectrômetro de massas, Micromass, Quattro MicroTM
• Fluxo laminar, VECO
• Gerador de nitrogênio, Dominick Hunter, UHPLCMS 18
• HTS (High throuput screeing biomek 3000), Beckman Coulter
Materiais e Métodos
- 58 -
• Incubadora de células (CO2 Water-Jacket Incubator), NUAIRES TS Autoflow
• Microscópio de fluorescência, Olympus BX41
• Microscópio óptico, Metripex Hungray PZO-Labimex Modelo Studar lab
• Microscópio óptico de inversão, Nikon Diaphot
• Micrótomo – SLEE - MANZ BR1
• Pipetas automáticas, Gilson
• Potenciostato/galvanostato mod. AutoLab PGSTAT20
• Pré-coluna (4 mm x 4 mm), Merck
• Sistema HPLC (cromatografia líquida de alta eficiência ou CLAE), Shimadzu
3.1.2. Reagentes
• Acetato de sódio, VETEC
• Acetonitrila grau analítico, Tedia
• Ácido Acético, Vetec
• Ácido clorídrico (HCl), Vetec
• Ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA), Proquímios
• Aflotoxina B
1
, Sigma
• Agarose baixo ponto de fusão, Gibco
• Agarose ponto de fusão normal, Gibco
• Alamar blue, Sigma
• Azida sódica, Sigma
• Bicarbonato de Sódio, Dinâmica
• Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT), Sigma
• Brometo de Etídio, Sigma
• Cloreto de sódio (NaCl), Vetec
Materiais e Métodos
- 59 -
• Dimetilsulfóxido (DMSO), Vetec
• Eosina, Vetec
• Etanol, Vetec
• Ficoll, Sigma
• Fitohemaglutinina, Sigma
• Formaldeído, Dinâmica
• Fosfato de sódio, Labsynth
• Hematoxilina, Doles
• Hidróxido de sódio (NaOH), VETEC
• Iodeto de propídeo, Sigma
• Meio de cultura para bactérias Nutrient Broth nº 2 líquido, Oxoid
• Meio de cultura para células RPMI ou DMEM, Cultilab
• Meio de cultura para leveduras YEPD e YEL, Difco
• Metanol, Vetec
• Metanol grau analítico, Burdick & Jackson
• Metano sulfonato de etila, Sigma
• Metano sulfonato de metila, Sigma
• Rodamina 123, Sigma
• Soro fetal bovino (SFB), Cultilab
• Tolueno grau analítico, Mallinckrodt Baker
• Tripsina, Cultilab
• Tris – Base, Proquímios
• Triton X – 100, Isofar
• Xileno, Vetec
Materiais e Métodos
- 60 -
3.1.3. Fármacos
• 5 – Fluorouracil, Sigma
• Carbamazepina, Sigma
• Doxorrubicina, Sigma
• Estreptomicina, Cultilab
• Gentamicina, Novafarma
• Penicilina, Cultilab
• Piplartina (29) (ver item 3.6.1)
• N-3,4,5-trimetoxidihidrocinamoil-dihidropiridin-2-ona (30) (ver item 3.6.2)
• N-3,4,5-trimetoxicinamoil-1,2-aminoetano (31) (ver item 3.6.3)
• O-3,4,5-trimetoxicinamoil-1,2-etanodiol (32) (ver item 3.6.4)
• Ácido 3,4,5-trimetoxicinâmico (33) (ver item 3.6.5)
• S-3,4,5-trimetoxicinamoil-benzeno (34) (ver item 3.6.6)
3.2. Soluções
• Tampão fosfato pH = 7,4 (PBS)
8,77 g de NaCl, 3,18 g de NaH
2
PO
4
(monobásico), 10,94 g de Na
2
HPO
4
(dibásico) e água destilada em quantidade suficiente para 1 L de solução.
• Tampão tris pH = 7,6 (TBS)
8,77 g de NaCl, 6,08 g de tris-base e água destilada em quantidade suficiente
para 1 L de solução. Ajustar o pH para 7,6 com HCl.
• Tampão para corrida eletroforética pH ~ 13 – para ensaio do cometa alcalino
Materiais e Métodos
- 61 -
0,292 g de EDTA, 12 g de NaOH e água destilada em quantidade suficiente para
1 L de solução.
• Tampão para corrida eletroforética pH ~ 8,0 – para ensaio do cometa neutro
12,11 g de tris-base, 25,2 g de acetato de sódio e água destilada em quantidade
suficiente para 1 L de solução.
• Tampão de lise pH = 10 – para ensaio do cometa
145 g de NaCl, 29,23 g de EDTA, 1,21 g de tris-base, 10 mL de triton X-100, 100
mL de DMSO e água destilada em quantidade suficiente para 1 L de solução.
• Solução de neutralização pH = 7,5 – para ensaio do cometa
78,46 g de tris-base e água destilada em quantidade suficiente para 1 L de
solução. Ajustar o pH para 7,5 com HCl.
3.3. Células
As células utilizadas nos ensaios de citotoxicidade, genotoxicidade e
antitumoral estão listadas quanto ao tipo histológico, origem e fonte na tabela 3.
Materiais e Métodos
- 62 -
Tabela 3 - Células utilizadas nos ensaios de citotoxicidade, genotoxicidade e
antitumoral.
Linhagem* Tipo Histológico Origem Fonte
HL-60
Leucemia
promielocítica
Humana
Children’s Mercy Hospital –
EUA
HCT-8 Carcinoma de cólon Humana
Children’s Mercy Hospital –
EUA
SF-295 Glioblastoma Humana
Instituto Nacional do Câncer
- EUA
MDA-MB-435 Melanoma Humana
Instituto Nacional do Câncer
- EUA
PBMC Linfócitos e monócitos Humana Cultura primária
V79 Fibroblastos (pulmão) Murina - hamster
Centro de Biotecnologia -
UFRGS
Sarcoma 180 Sarcoma
Murina –
camundongos
Laboratório de Oncologia
experimental - UFC
*Linhagens pertencentes ao Laboratório de Oncologia Experimental da Universidade
Federal do Ceará.
Materiais e Métodos
- 63 -
3.3.1. Manutenção das células em cultura
As linhagens celulares foram cultivadas em garrafas para cultura de células
(75 cm
3
, volume de 250 mL), os meios utilizados foram RPMI 1640 ou DMEM,
suplementados com 10% de soro bovino fetal e 1% de antibióticos
(penicilina/estreptomicina). As células foram mantidas em incubadoras com
atmosfera de 5 % de CO
2
a 37 ºC. Diariamente acompanhava-se o crescimento
celular com a utilização de microscópio de inversão. O meio foi trocado sempre que
o crescimento celular atingia confluência necessária para renovação de nutrientes.
Para a manutenção de células aderidas utilizou-se tripsina (0,25%) para que as
células despregassem-se das paredes das garrafas (PESSOA, 2000).
3.3.2. Obtenção de células PBMC
As células de PBMC (peripheral blood mononuclear cells – linfócitos e
monócitos) foram obtidas a partir de sangue periférico de voluntários saudáveis. A
coleta do sangue foi realizada em frasco heparinizados por profissionais
capacitados, nas dependências da UNIFAC-UFC (Unidade de Farmacologia Clínica
da Universidade Federal do Ceará), utilizando seringas esterilizadas e descartáveis
com volume de 5 mL. O material assim obtido foi imediatamente transportado para o
Laboratório de Oncologia experimental (LOE) do Departamento de Fisiologia e
Farmacologia, também da Universidade Federal do Ceará.
As células PBMC foram isoladas a partir de uma amostra de cerca de 3 mL de
sangue, acrescida de 5 mL de PBS. As etapas até o isolamento incluíram a adição
de 3 mL de Ficoll, seguida por 30 minutos de centrifugação a 1.000 G, e feita a
aspiração dos PBMC, presentes na região intermediária entre as hemácias e o
plasma. A suspensão de células PBMC foi transferida para um outro tubo o qual foi
acrescido com PBS até o volume de 11 mL, sendo centrifugado por 20 minutos a
1.000 G. O sobrenadante foi descartado e o precipitado de células PBMC foi
ressuspendido em meio completo (RPMI 1640 acrescido de 20% de soro fetal
Materiais e Métodos
- 64 -
bovino, 1 % de antibiótico (penicilina-estreptominica) e 4% de fitohemaglutinina) e
contado em câmera de Newbauer para posterior diluição e plaqueamento.
3.3.3. Manutenção do tumor sarcoma 180 em camundongos
O animal de manutenção ou doador foi anestesiado com éter etílico e
sacrificado por meio de deslocamento cervical. Fez-se o procedimento asséptico
com álcool iodado e, em seguida, coletou-se o líquido ascítico da cavidade
abdominal, tendo sido preparada uma suspensão de células com 5,0 mL de Ringer
lactato, 0,2 mL de gentamicina (5 mg/mL) e 0,5 mL do líquido ascítico, para posterior
contagem das células. Os animais receptores foram inoculados com 2 x 10
6
células/0,5 mL na região intraperitoneal. O procedimento é realizado a cada 10 dias,
conforme aprovado pelo comitê de ética de pesquisas em animais da UFC (CEPA).
3.4. Microorganismos
As linhagens de microorganismos utilizadas nos ensaios de mutagenicidade e
recombinogênese estão listadas quanto ao genótipo e fonte na tabela 4.
Materiais e Métodos
- 65 -
Tabela 4 - Linhagens de microorganismos utilizadas nos ensaios de mutagenicidade
e recombinogênese.
Linhagem* Genótipo Fonte
Saccharomyces cerevisiae
XV185-14c
Matα ade2-2 arg 4-17 his1-7 lys1-1
trp5-48 hom3-10
R.C. Von Borstel
N123
MATa his1-7
J.A.P. Henriques
XS2316
MATa/α ADE6/ade6 leu1-1/leu1-12
trp5-48/TRP5 CYH2/cyh2
MET13/met13 LYS5/lys5-1 his1-
1/his1-1
I. Machida e S. Nakaia
Salmonella typhymurium
TA97a Deslocamento do quadro de leitura
do DNA para -C-C-C-C-C-C-; + 1 Cyt
B. M. Ames
TA98 Deslocamento do quadro de leitura
do DNA para -C-G-C-G-C-G-C-G
B. M. Ames
TA100 Substituição de leucina (GAG) por
prolina (GGG)
B. M. Ames
TA102 Mutação ochre TAA no gene hisG B. M. Ames
*Linhagens pertencentes ao Centro de Biotecnologia da Universidade Federal do Rio
Grande do Sul.
Materiais e Métodos
- 66 -
3.4.1. Manutenção dos microorganismos
3.4.1.1. Preparo das culturas de Salmonella typhimurium
Para a preparação das culturas bacterianas utilizadas nos ensaios de
mutagenicidade, cada cepa mantida em nitrogênio líquido foi descongelada em
banho de gelo. A cultura descongelada (200 µL) foi então transferida para um
erlenmeyer contendo 20 mL de meio Oxoid Nutrient Broth nº 2 líquido. A cultura foi
colocada para crescer em banho-maria a 37 ºC, com agitação (90 rpm) e protegida
da luz, durante 14-15 horas, tempo de crescimento necessário para a obtenção de
uma concentração bacteriana de 1-2 x 10
9
células/mL (MARON & AMES 1983).
3.4.1.2. Preparo das culturas de Saccharomyces cerevisiae
O crescimento das células foi feito em meio líquido completo (YEL) contendo
1% de extrato de levedura, 2% de bactopeptona e 2% de glicose. Para determinação
do número de células viáveis, ou seja, unidades formadoras de colônias foram feitas
semeaduras em meio YEPD solidificado com 2% de bacto-ágar (AUSUBEL et al.,
1989; BURKE et al., 2000). Para todos os tratamentos, as células foram
ressuspendidas e diluídas em solução salina (NaCl 0,9%). Nos testes de
mutagênese foi empregado o Meio Sintético (SC) suplementado (SC-histidina, SC-
lisina e SC-homoserina), nos quais os aminoácidos foram omitidos, conforme
descrito por Ausubel et al. (1989).
Células em fase estacionária de crescimento foram obtidas a partir de uma
colônia isolada, retirada da placa e colocada para crescer em meio líquido YEL, por
48 horas, a 30 ºC, até atingir a concentração de 2-4 x 10
8
células/mL. Culturas em
fase exponencial foram obtidas por incubação de 2 x 10
6
células/mL de uma pré-
cultura em fase estacionária, também em meio YEL. Após cerca de 4 horas de
incubação, nas mesmas condições acima descritas, a cultura alcançava a fase
exponencial de crescimento (1-2 x 10
7
células/mL), com uma percentagem de 50-
70% brotos.
Materiais e Métodos
- 67 -
3.5. Animais
Foram utilizados ratos Wistar albino (Rattus norvegicus) ou camundongos
Swiss albino (Mus musculus) oriundos do Biotério Central da Universidade Federal
do Ceará. Estes foram alojados dentro de gaiolas de polipropileno e grades
metálicas apropriadas em pequenos grupos do mesmo sexo (não excedendo 5
animais por gaiola para ratos ou 10 animais por gaiola para camundongos). A
temperatura do local foi de 22 °C ± 5 °C. A iluminação foi artificial, com uma
alternância de 12 horas de luz e 12 horas de escuro. Os animais tiveram livre acesso
a alimentação (ração especifica) e água.
Foram utilizados animais (fêmeas ou machos) adultos, jovens, saudáveis e que
não tenham sido anteriormente submetidos a processos experimentais. O número
de animais utilizados foi reduzido ao mínimo cientificamente aceitável. No início do
estudo, a variação de massa dos animais foi à mínima possível, não excedendo ± 20
% da massa média de cada grupo.
Os animais foram identificados de forma inequívoca, e foram aclimatados
às condições do biotério durante pelo menos cinco dias. A dor e o sofrimento dos
animais no decurso dos ensaios foram minimizados de acordo com os princípios
éticos de experimentação animal da COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação
Animal). Todos os experimentos foram realizados de acordo com os princípios éticos
de experimentação animal preconizados pela Comissão de Ética no Uso de Animais
da Universidade Federal do Ceará.
3.6. Procedimento experimental
3.6.1. Obtenção da piplartina (29)
Para obtenção da piplartina, raízes de Piper tuberculatum foram coletadas em
setembro de 2004 no Campus do Pici da Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-
Materiais e Métodos
- 68 -
Ceará, Brasil. A exsicata (nº 34736) foi depositada no Herbário Prisco Bezerra, do
Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará.
Raízes de P. tuberculatum (420,0 g) foram macerados com uma mistura de
éter de petróleo e acetato de etila 1:1 (1,5 L) por 24 h (3x). A mistura de solventes foi
removida por rotoevaporação produzindo um sólido amarelado (13,24 g), o qual foi
cristalizado com metanol quente para obter piplartina (4,35 g, e ponto de fusão de
122,2 e 122,6 ºC). Rendimento 32,46 %. A estrutura da piplartina foi determinada por
análise espectroscópica e comparação dos dados da literatura (ATAL et al., 1975;
BRAZ-FILHO et al., 1981).
3.6.2. Obtenção do N-3,4,5-trimetoxidihidrocinamoil-dihidropiridin-2-ona (30)
Para a obtenção do (30) a partir da piplartina, uma reação de hidrogenação
foi realizada utilizando um sistema de hidrogenação sob pressão. A esse sistema
foram adicionados 100 mg de piplartina solubilizados em 20 mL de diclorometano e
ródio como catalisador da reação. O sistema foi mantido sob agitação magnética por
aproximadamente 24 horas, atmosfera de hidrogênio e uma pressão de 3,5 atm.
Após este período, o catalisador foi removido por filtração. Análise por CCD revelou,
que o produto não estava puro, sendo submetido a fracionamento cromatográfico
em coluna flash de gel de sílica pré-empacotada com diclorometano. Após eluição
com o mesmo solvente, obteve-se 27 mg de líquido viscoso amarelado. Rendimento
27 %. Sua estrutura foi determinada por análise espectroscópica (figura 9).
3.6.3. Obtenção do N-3,4,5-trimetoxicinamoil-1,2-aminoetano (31)
Para a obtenção do (31) 100 mg da piplartina foram dissolvidos em 5 mL de
clorofórmio e acondicionados em balão de 50 mL. À solução foram adicionados 1 mL
de 1,2-diaminoetano. O sistema foi mantido sob agitação magnética à temperatura
ambiente por aproximadamente 2 horas. Análise comparativa por CCD sugeriu o
final da reação, através do desaparecimento da mancha relativa ao material de
partida. A elaboração da reação foi realizada adicionando-se 30 mL de água
destilada à mistura reacional, seguida de extração com clorofórmio (3 x 10 mL). As
Materiais e Métodos
- 69 -
fases orgânicas foram reunidas e secas com sulfato de sódio anidro e evaporadas
sob pressão reduzida. O produto da reação foi 97 mg, de um material gelatinoso
amarelado, que se mostrou homogêneo em CCD, o qual foi identificado com sendo
o (31). Rendimento 97%. Sua estrutura foi determinada por análise espectroscópica
(figura 9).
3.6.4. Obtenção do O-3,4,5-trimetoxicinamoil-1,2-etanodiol (32)
Para a obtenção do (32) 1,5 mL de etilenoglicol foram adicionados a 100 mg
da piplartina, dissolvidos em 15 mL de diclorometano e acondicionados em balão de
50 mL. À mistura reacional foram adicionados 1 mL da solução aquosa de hidróxido
de sódio 10% (p/v). A reação se processou sob agitação magnética e refluxo por um
período de 24 horas. Análise comparativa por CCD sugeriu o final da reação, através
do desaparecimento da mancha relativa ao material de partida. A elaboração da
reação foi realizada adicionando-se 20 mL de água destilada à mistura reacional,
seguida de extração com diclorometano (3 x 10 mL) como fase orgânica. Ao termino
da extração, a fase aquosa foi desprezada e as fases orgânicas foram reunidas e
secas com sulfato de sódio anidro e evaporadas sob pressão reduzida. O produto
reacional apresentou-se como um sólido amarelo pesando 55 mg, que se mostrou
homogêneo em CCD, o qual foi identificado como sendo o (32). Rendimento 55%.
Sua estrutura foi determinada por análise espectroscópica (figura 9).
3.6.5. Obtenção do ácido 3,4,5-trimetoxicinâmico (33)
Para a obtenção do (33) 100 mg da piplartina foram dissolvidos em 30 mL
de acetona e acondicionados em balão de 50 mL. À solução foram adicionados 10
mL de ácido clorídrico 2N. O sistema foi mantido sob refluxo por um período de 2
horas. O desenvolvimento da reação foi acompanhada por CCD até o
desaparecimento da mancha relativa ao material de partida. A elaboração da reação
foi realizada adicionando-se 30 mL de água destilada à mistura reacional, seguida
de extração com clorofórmio (3 x 15 mL). Ao termino da extração, a fase aquosa foi
desprezada e as fases orgânicas foram reunidas e secas com sulfato de sódio
Materiais e Métodos
- 70 -
anidro e evaporadas sob pressão reduzida. O produto reacional apresentou-se como
um sólido incolor pesando 44 mg, o qual foi identificado como sendo o (33).
Rendimento 44 %. Sua estrutura foi determinada por análise espectroscópica (figura
9).
3.6.6. Obtenção do S-3,4,5-trimetoxicinamoil-benzeno (34)
Para a obtenção do (34) 100 mg da piplartina foram dissolvidos em 15 mL
clorofórmio e acondicionados em balão de 50 mL. À solução foram adicionados 1 mL
de tiofenol e uma quantidade equimolecular de KOH, para tornar o tiofenol mais
nucleofílico. A mistura reacional foi mantida sob refluxo por 2 horas. O término da
reação foi acompanhado por CCD, quando foi observado o desaparecimento da
mancha relativa ao material de partida. A elaboração da reação foi realizada
adicionando-se 30 mL de água destilada à mistura reacional, seguida de extração
com clorofórmio (3 x 15 mL). As fases orgânicas foram reunidas e secas com sulfato
de sódio anidro e evaporadas sob pressão reduzida. O produto reacional
apresentou-se como um sólido branco pesando 80 mg, o qual foi identificado como
sendo o (34). Rendimento 80 %. Sua estrutura foi determinada por análise
espectroscópica (figura 9).
O estudo químico foi realizado no Departamento de Química Orgânica e
Inorgânica da Universidade Federal do Ceará, sob a orientação do professor Dr.
Edilberto Rocha Silveira, da professora Drª Mary Anne Sousa Lima, da professora
Drª Otília Deusdênia Loiola Pessoa e da professora Drª Jane Eire Silva Alencar de
Menezes.
Materiais e Métodos
- 71 -
N
OO
OCH
3
CH
3
O
CH
3
O
H
N
O
OCH
3
CH
3
O
CH
3
ONH
2
(30)
(31)
O
O
OCH
3
CH
3
O
CH
3
OOH
OH
O
OCH
3
CH
3
O
CH
3
O
(32) (33)
S
O
OCH
3
CH
3
O
CH
3
O
(34)
Figura 9 – Estrutura química dos análogos da piplartina.
Materiais e Métodos
- 72 -
3.6.7. Estudo da atividade citotóxica
O estudo da atividade citotóxica da piplartina e seus análogos foi realizado em
células humana tumorais. Adicionalmente, a atividade citotóxica da piplartina foi
avaliada em células humana normais.
3.6.7.1. Ensaio de citotoxicidade em células tumorais
3.6.7.1.1. Principio do teste
A avaliação do potencial citotóxico das substâncias testes foram realizada em
células tumorais humanas (HL-60 - leucemia promielocítica, HCT-8 – carcinoma de
cólon, SF-295 – glioblastoma e MDA-MB-435 – melanoma) através do método do
MTT após 72 horas de incubação. Este é um ensaio quantitativo in vitro que foi
desenvolvido por Mossman em 1983 para estimação de proliferação e sobrevivência
celular. É definido na literatura como apropriado para estimativa de citotoxicidade
(PESSOA et al., 2000; COSTA-LOTUFO et al., 2004; BEZERRA et al., 2005;
BEZERRA et al., 2008) e baseia-se na capacidade da succinato desidrogenase, uma
enzima do Ciclo de Krebs ativa em mitocôndrias de células viáveis, em converter o
sal de tetrazolium (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio, ou MTT),
que é hidrossolúvel e de cor amarelada, em cristais de formazan, que são de cor
azul escura. Essa técnica tem a capacidade de analisar a viabilidade e o estado
metabólico da célula, sendo assim, bastante útil para avaliar a citotoxicidade.
3.6.7.1.2. Procedimento experimental
As células em suspensão ou monocamadas foram distribuídas em multiplacas
de 96 cavidades numa densidade de 0,3 x 10
6
células/mL, para células em
suspensão (HL-60) e 0,7 x 10
5
células/mL para as células aderidas (MDA-MB-435,
SF-295 e HCT-8). Após 24 horas de incubação, as substâncias testes (0,09 a 25
Materiais e Métodos
- 73 -
µg/mL) dissolvidos em DMSO foram adicionados em cada poço, utilizando o HTS
(high-throughput screening), e encubadas por 72 horas. A doxorrubicina foi utilizada
como controle positivo com concentrações variando de 0,003 a 0,25 µg/mL. O
controle negativo recebeu a mesma quantidade de DMSO. Após o período de
incubação, as placas foram centrifugadas (15 G/15 min), e o sobrenadante foi
descartado. Cada cavidade recebeu 200 µL da solução de MTT (0,5 mg/mL em meio
RPMI 1640) e foi reincubada durante 3 horas, em estufa a 37 ºC e a 5% CO
2
. Após
esse período, as placas foram novamente centrifugadas (30 G/10 min), o
sobrenadante foi desprezado, e o precipitado foi ressuspendido em 150 µL de
DMSO. Para a quantificação do sal reduzido nas células vivas, as absorbâncias
foram lidas com o auxílio do espectrofotômetro de placa, no comprimento de onda
de 595 nm (MOSSMAN et al., 1983).
3.6.7.1.3. Análise dos dados
As substâncias foram testadas em diluições seriadas, em duplicata ou
triplicata. Foi registrada a percentagem de inibição x log da concentração e
determinado suas CI
50
(concentração inibitória média capaz de provocar 50% do
efeito máximo) e seus respectivos intervalos de confiança (IC 95%) realizado a partir
de regressão não-linear utilizando o programa Prisma versão 5.0 (GraphPad
Software).
3.6.7.2. Ensaio de citotoxicidade em células normais
3.6.7.2.1. Principio do teste
Para avaliar a citotoxicidade do composto teste sobre a proliferação de
células normais, o ensaio do alamar blue foi realizado utilizando células PBMC
(Peripheral blood mononuclear cells - células mononucleadas de sangue periférico
humano, que inclui linfócitos e monócitos) após 72 horas de exposição com o
composto teste. O alamar blue, recentemente identificado como resazurina
Materiais e Métodos
- 74 -
(O'BRIEN et al., 2000), é um indicador fluorescente/colorimétrico com propriedades
redox. Como com os sais de tetrazólio, o alamar blue reduz-se em células em
proliferação. A forma oxidada é azul (não fluorecente/célula não viável) e a forma
reduzida é rósea (fluorescente/célula viável). A redução do alamar blue reflete a
proliferação celular. Este foi inicialmente utilizado para indicar crescimento e/ou
viabilidade celular no monitoramento de proliferação de linfócitos (AHMED et al.,
1994) e atualmente apresenta várias aplicações.
3.6.7.2.2. Procedimento experimental
Inicialmente, as células PBMC foram plaqueadas em placas de 96 cavidades
(3 x 10
4
células/poço em 100 µL de meio). Após 24 horas de incubação, as
substâncias testes (0,09 a 25 µg/mL) dissolvidos em DMSO foram adicionados em
cada poço, utilizando o HTS, e incubadas por 72 horas. A doxorrubicina (0,09 a 25
µg/mL) foi utilizada como controle positivo. O controle negativo recebeu a mesma
quantidade de DMSO. Vinte e quatro horas antes do final do período de incubação,
10 µL da solução estoque (0,312 mg/mL) de alamar blue (resazurina) foram
adicionados a cada poço. As absorbâncias foram mensuradas nos comprimentos de
onda de 570 nm (reduzido) e 595 nm (oxidado) utilizando uma leitora de placa
(AHMED et al., 1994).
3.6.7.2.3. Análise dos dados
A proliferação celular foi calculada utilizando a seguinte fórmula: %
proliferação = A
LW
– (A
HW
x R
0
) x 100. Onde, A
LW
e A
HW
são as absorbâncias no
menor e maior comprimento de onda, respectivamente. O R
0
foi calculado utilizando
a seguinte fórmula: R
0
=AO
LW
/AO
HW
. Onde, AO
LW
e AO
HW
são as absorbâncias do
meio adicionado ao alamar blue subtraído das absorbâncias do meio isolado nos
comprimentos de onda menor e maior, respectivamente. A substância foi testada em
diluição seriada, em duplicata ou triplicata. Foi registrada a percentagem de inibição
x log da concentração e determinado suas CI
50
e seus respectivos intervalos de
Materiais e Métodos
- 75 -
confiança (IC 95%) realizado a partir de regressão não-linear utilizando o programa
Prisma versão 5.0 (GraphPad Software).
3.6.8. Estudo do mecanismo de ação citotóxico em células HL-60
O estudo do mecanismo de ação citotóxico da piplartina foi realizado
utilizando a linhagem leucêmica HL-60 como modelo. Foram avaliados a viabilidade
celular, o potencial transmembrânico da mitocôndria e o conteúdo de DNA nuclear
da célula, que reflete as fases do ciclo celular, por citometria de fluxo. O efeito da
piplartina sobre a ativação da caspase-3 também foi avaliado. Adicionalmente, o
índice mitótico foi determinado por coloração diferencial por hematoxilina/eosina.
3.6.8.1. Determinação da viabilidade celular
3.6.8.1.1. Principio do teste
A análise da integridade da membrana plasmática é uma importante
ferramenta para estudar o tipo de morte celular, visto que apenas na necrose ela
apresenta-se precocemente alterada. O teste se baseia na capacidade do iodeto de
propídeo (PI), hidrofílico, penetrar na célula cuja membrana esteja rompida e após a
ligação ao DNA emitir alta fluorescência quando é excitado pelo laser de argônio
(488 nm). A célula com membrana íntegra emite baixa fluorescência. Deste modo,
este método permite avaliar a viabilidade celular através da avaliação da integridade
da membrana plasmática (MACKLIS & MADISON, 1990).
3.6.8.1.2. Procedimento experimental
A determinação da integridade da membrana celular foi avaliada por
citometria de fluxo utilizando o PI como agente fluorogênico. A doxorrubicina (0,3
µg/mL) foi usada como controle positivo em todos os experimentos. O controle
Materiais e Métodos
- 76 -
negativo foi tratado com o veículo (DMSO) usado para diluir a substância. As
concentrações utilizadas da piplartina neste estudo foram previamente determinadas
(BEZERRA et al., 2007).
As células HL-60 foram plaqueadas na densidade de 3 x 10
5
células/mL com
diferentes concentrações da piplartina (2,5 µg/mL, 5 µg/mL e 10 µg/mL). Uma
alíquota de 50 µL foi recolhida 3 h, 6 h, 12 h e 24 h após a incubação com a
substância. As células foram diluídas com a solução de PI (2 µg/mL em PBS), na
ausência de luz e a 37 ºC, e, após 5 minutos, analisadas por citometria de fluxo
(MILITÃO et al., 2006). Os ensaios foram realizados em três experimentos
independentes realizados em triplicatas. Cinco mil eventos foram analisados em
cada amostra.
3.6.8.1.3. Análise dos dados
Os dados foram analisados a partir da média ± E.P.M. de n experimentos.
Para avaliação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos,
os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de
Student Newman-Keuls com a utilização do programa GraphPad Prisma versão 5.0.
3.6.8.2. Determinação do potencial transmembrânico da mitocôndria
3.6.8.2.1. Princípio do teste
A mitocôndria é responsável pela iniciação da via intrínseca da apoptose.
Quando bcl-2/xl é liberado da membrana externa da mitocôndria, forma-se um poro
permitindo a saída de H+, causando despolarização mitocondrial, e também seguida
de fatores como citocromo c, Smac/Diablo, dentre outros. A rodamina 123, um
corante fluorescente nucleofílico, é seqüestrado pra dentro da mitocôndria quando
esta apresenta seu potencial transmembrânico inalterado. Assim, as células viáveis
emitirão alta fluorescência verde devido à maior quantidade de rodamina 123 ligada
às cargas positivas internas, enquanto que as mitocôndrias despolarizadas terão
Materiais e Métodos
- 77 -
menor afinidade pelo corante, gerando eventos que emitirão menor fluorescência.
Deste modo, este ensaio foi utilizado para a investigação da ativação da via
apoptótica intrínseca por parte da substância em estudo através da observação da
alteração do potencial transmembrânico mitocondrial (MARCHETTI et al., 1996).
3.6.8.2.2. Procedimento experimental
A determinação do potencial transmembrânico da mitocôndria da célula foi
avaliada por citometria de fluxo utilizando a rodamina 123 como agente fluorogênico.
A doxorrubicina (0,3 µg/mL) foi usada como controle positivo em todos os
experimentos. O controle negativo foi tratado com o veículo (DMSO) usado para
diluir a substância. As concentrações utilizadas da piplartina neste estudo foram
previamente determinadas (BEZERRA et al., 2007).
As células HL-60 foram plaqueadas na densidade de 3 x 10
5
células/mL com
diferentes concentrações da piplartina (2,5 µg/mL, 5 µg/mL e 10 µg/mL). Uma
alíquota de 50 µL foi recolhida 3 h, 6 h, 12 h e 24 h após a incubação com a
substância. As células foram diluídas com a solução de rodamina 123 (1 µg/mL em
PBS), na ausência de luz e a 37 ºC, e, após 15 minutos. Após o período de
incubação as células foram centrifugadas e o precipitado foi ressuspendido em PBS
e reincubado por 30 minutos e, então, analisadas por citometria de fluxo (MILITÃO et
al., 2006). Os ensaios foram realizados em três experimentos independentes
realizados em triplicatas. Cinco mil eventos foram analisados em cada amostra.
3.6.8.2.3. Análise dos dados
Os dados foram analisados a partir da média ± E.P.M. de n experimentos.
Para avaliação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos,
os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de
Student Newman-Keuls com a utilização do programa GraphPad Prisma versão 5.0.
Materiais e Métodos
- 78 -
3.6.8.3. Determinação da ativação da caspase-3
3.6.8.3.1. Princípio do teste
As caspases pertencem a família de proteases cisteínas, podendo ser divididas
em caspases inflamatórias e caspases apoptóticas, os quais podem ser incluídas
nos grupos de caspases iniciadoras (como no caso da apoptose as caspases-8 e -9)
e efetoras (como no caso da apoptose as caspases-3 e -7). A ativação da caspase-3
possui papel central no mecanismo de apoptose. A caspase-3 é responsável pela
clivagem de vários componentes celulares relacionados ao reparo e controle do
DNA. Assim, a dosagem da caspase-3 permite o estudo de mecanismos apoptóticos
(MEHMET, 2002).
3.6.8.3.2. Procedimento Experimental
A atividade de caspase-3 foi avaliada utilizando-se kit colorimétrico de protease,
de acordo com as recomendações do fabricante. O método é baseado na detecção
espectrofotométrica do cromóforo p-nitroanilida (pNA) após clivagem dos substratos
X-pNA, onde X representa a seqüência de aminoácidos reconhecidos por caspases
especificas: Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)-pNA para a caspase-3. Inicialmente, células
HL-60 (2 x 10
6
células/mL) foram incubadas por 24 horas com diferentes
concentrações de piplartina (2,5 µg/mL, 5,0 µg/mL e 10, µg/mL) em estufa úmida a
37 ºC e atmosfera contendo 5% de CO
2
. Após o período de incubação as células
foram centrifugadas e lisadas em gelo. A quantidade de proteína no lisado foi
determinada utilizando-se o ensaio para dosagem de proteína pelo método de
Bradford (BRADFORD, 1976). Em seguida, 100-200 µg de proteínas foram
incubadas com o substrato em placa de 96 cavidades. A densidade óptica das
amostras foi medida em comprimento de onda de 405 nm (MILITÃO et al., 2006). A
atividade de caspase nas amostras foi determinada em relação ao controle não
tratado e expresso como atividade de caspase-3 especifica (UI/mg de proteína).
Materiais e Métodos
- 79 -
3.6.8.3.3. Análise dos dados
Os dados foram analisados a partir da média ± E.P.M. de n experimentos. Para
avaliação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os
dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de
Student Newman-Keuls com a utilização do programa GraphPad Prism versão 5.0.
3.6.8.4. Determinação do conteúdo de DNA nuclear da célula
3.6.8.4.1. Princípio do teste
O ciclo celular é constituído pelas seguintes fases: G
1
, S, G
2
e M. Durante o
período de crescimento celular (fase G
1
) uma célula diplóide apresenta um conteúdo
2n (n – conteúdo de um conjunto haplóide de cromossomos) de DNA nuclear, possui
duas cópias de cada gene. Durante a fase S ocorre a duplicação do genoma nuclear
(2-4n) e na fase seguinte (fase G
2
) ocorre o segundo período de crescimento celular,
durante o qual o conteúdo em DNA nuclear é mantido no nível 4n. Em seguida
ocorre a mitose (fase M, 4n) durante a qual a célula se divide, formando duas células
filhas, cada uma com um conteúdo 2n em DNA. As células que não se encontram
em divisão celular (G
0
) apresentam um conteúdo 2n de DNA. Assim, as diferentes
fases do ciclo celular podem ser determinadas a partir do conteúdo de DNA que elas
apresentam. Deste modo, o resultado da distribuição do conteúdo de DNA nuclear
de uma população de células pode dar-se em G
0
/G
1
, S e G
2
/M (SHAPIRO, 1985;
CIBAS, 1995).
Para determinação do conteúdo de DNA nuclear da célula foi utilizado o PI
como agente fluorogênico. Esse teste baseia-se na capacidade do PI se ligar ao
DNA. Inicialmente a membrana plasmática das células é lisada por um detergente
para que o PI possa se ligar ao núcleo. Assim, as fases do ciclo celular foram
determinadas através do conteúdo do DNA que elas apresentavam (MELAMED et
al., 1979; SHAPIRO, 1985; CIBAS, 1995).
Materiais e Métodos
- 80 -
3.6.8.4.2. Procedimento experimental
A determinação do conteúdo de DNA nuclear da célula, que reflete as fases
do ciclo celular, foi avaliada por citometria de fluxo utilizando o PI como agente
fluorogênico. A doxorrubicina (0,3 µg/mL) foi usada como controle positivo em todos
os experimentos. O controle negativo foi tratado com o veículo (DMSO) usado para
diluir a substância. As concentrações utilizadas da piplartina neste estudo foram
previamente determinadas (BEZERRA et al., 2007).
As células HL-60 foram plaqueadas na densidade de 3 x 10
5
células/mL com
diferentes concentrações da piplartina (2,5 µg/mL, 5 µg/mL e 10 µg/mL). Uma
alíquota de 50 µL foi recolhida 3 h, 6 h, 12 h e 24 h após a incubação com a
substância. As células foram diluídas com a solução de lise contendo o PI (0,1% de
citrato de sódio, 0,1 % de triton X-100 e 2 µg/mL iodeto de propídeo em PBS), na
ausência de luz e a 37 ºC, e, após 30 minutos, analisadas por citometria de fluxo
(MILITÃO et al., 2006). Os ensaios foram realizados em três experimentos
independentes realizados em triplicatas. Cinco mil eventos foram analisados em
cada amostra.
3.6.8.4.3. Análise dos dados
Os dados foram analisados a partir da média ± E.P.M. de n experimentos.
Para avaliação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos,
os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de
Student Newman-Keuls com a utilização do programa GraphPad Prisma versão 5.0.
3.6.8.5. Determinação do índice mitótico
3.6.8.5.1. Princípio do teste
Materiais e Métodos
- 81 -
O índice mitótico representa a razão entre o número de células em mitose e o
número total de células. Este representa a proliferação celular de uma dada
população de células. O índice mitótico é uma importante ferramenta em estudos
células e genéticos (HUANG et al., 2003). Neste estudo, o cálculo do índice mitótico
foi utilizado para determinar a porcentagem de células em mitose e compará-la com
a percentagem de células em G
2
/M determinada por citometria de fluxo.
3.6.8.5.2. Procedimento experimental
O índice mitótico foi determinado por coloração diferencial por
hematoxilina/eosina. A doxorrubicina (0,3 µg/mL) foi usada como controle positivo
em todos os experimentos. O controle negativo foi tratado com o veículo (DMSO)
usado para diluir a substância. As concentrações utilizadas da piplartina neste
estudo foram previamente determinadas (BEZERRA et al., 2007).
As células HL-60 foram plaqueadas na densidade de 3 x 10
5
células/mL com
diferentes concentrações da piplartina (2,5 µg/mL, 5 µg/mL e 10 µg/mL). Uma
alíquota foi recolhida 3 horas após a incubação com a substância. Para observar a
morfologia, 50µL da suspensão de células foram adicionadas à centrífuga de lâmina.
Após a adesão das células na lâmina, a fixação foi feita com metanol 100% por 1
minuto e a coloração, primeiramente, realizada foi a hematoxilina, seguida pela
eosina. O material foi observado em microscópio ótico, com aumento de 400X,
contando-se o número de células em fase da mitose (prófase, metáfase, anáfase e
telófase) e em interfase. Um total de 1000 células foi contado em cada lâmina
(HUANG et al., 2003). Os ensaios foram realizados em três experimentos
independentes realizados em triplicatas.
3.6.8.5.3. Análise dos dados
O índice mitótico foi obtido dividindo-se o número de células em mitose
(prófase + metáfase + anáfase + telófase) pelo número total de células (intérfase +
mitose) multiplicando-se por 100. Os dados foram analisados a partir da média ±
Materiais e Métodos
- 82 -
E.P.M. de n experimentos. Para avaliação da ocorrência de diferenças significativas
entre os diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de variância
(ANOVA) seguida pelo teste de Student Newman-Keuls com a utilização do
programa GraphPad Prisma versão 5.0.
3.6.9. Estudo da atividade genotóxica e mutagênica
No estudo da atividade genotóxica in vitro, o ensaio do cometa, em células
V79 (fibroblastos de pulmão de Hamster Chinês), foi realizado para avaliar danos à
fita simples e à fita dupla do DNA induzidos pela piplartina. Adicionalmente, o estudo
do mecanismo de ação genotóxica foi avaliado por citometria de fluxo. A atividade
mutagênica da piplartina foi investigada em dois modelos clássicos: ensaio de
mutação gênica reversa em Salmonella typhimurium (modelo procariótico) e ensaio
de mutagenicidade e recombinogênese em Saccharomyces cerevisiae (modelo
eucariótico). Para avaliar o potencial genotóxico/mutagênico in vivo da piplartina, o
ensaio do micronúcleo em medula óssea foi realizado em camundongos.
3.6.9.1. Ensaio de genotoxicidade in vitro - Dano ao DNA - Ensaio do cometa
3.6.9.1.1. Princípio do teste
O ensaio cometa ou SCGE (Single Cell Gel Electrophoresis Assay) foi
desenvolvido por Singh e colaboradores (1988) para detectar quebra de fitas simples
e duplas na molécula de DNA induzidas por substâncias com potencial genotóxico,
tais como agentes alquilantes, intercalantes e oxidantes. Sendo muito utilizado em
estudo de genética toxicológica, a fim de um biomonitoramento ambiental ou no
monitoramento populacional em humanos. Entretanto, este teste é utilizado como
um indicativo e não como um teste mutagênico. Este pode ser utilizado tanto em
células de animais quanto vegetais in vitro e in vivo (FAIRBAIRN et al., 1995;
ANDERSON et al., 1994; SILVA et al., 2003a).
Materiais e Métodos
- 83 -
3.6.9.1.2. Procedimento experimental
A avaliação do potencial genotóxico da piplartina, avaliado através do ensaio
do cometa, foi realizado na linhagem celular V79. O ensaio do cometa foi realizado
em condições alcalinas e em condições neutras (HARTMANN & SPEIT, 1997;
SINGH & SINGH, 2002; WOJEWODZKA et al. 2002). O metano sulfonato de metila
foi usado como controle positivo em todos os experimentos. O controle negativo foi
tratado com o veículo (DMSO) usado para diluir a substância.
Inicialmente foi avaliada a atividade citotóxica da piplartina na linhagem V79
para a determinação das concentrações a serem usadas no teste. Foram semeadas
500 células em placas de 60 mm para determinar a capacidade de formação de
colônia. A piplartina foi adicionada ao meio após a adesão das células. Após 5 dias
de incubação, as células foram fixadas em etanol e as colônias com 50 ou mais
células foram coradas com Giemsa, contadas e a porcentagem de sobrevivência,
relativa ao controle, foi calculada. A piplartina foi citotóxica em concentrações acima
de 10 µg/mL. As concentrações 1 µg/mL, 2,5 µg/mL, 5 µg/mL e 10 µg/mL foram
escolhidas para os estudos de genotoxicidade.
Para o estudo da atividade genotóxica, células V79 (3 X 10
6
células em 5 mL)
foram incubadas por 3 horas com diferentes concentrações da piplartina. Após o
período de incubação, as células foram lavadas com PBS gelado, removidas com
100 µL de tripsina 0,15% e ressuspensas em meio completo. Em seguida, 20 µL da
suspensão de células (~10
6
células/mL) foi dissolvido em 0,5% em agarose com
baixo ponto de fusão e imediatamente espalhada sobre uma lâmina pré-tratada com
1% de agarose com baixo ponto de fusão. As células foram, então, colocadas em
solução de lise por pelo menos 1 hora a 4 ºC. Em seguida foram dispostas
horizontalmente na cuba de eletroforese e preenchida com tampão de corrida, em
pH ~ 13, para o ensaio do cometa em condições alcalinas (HARTMANN & SPEIT,
1997; SINGH & SINGH, 2002) ou em pH ~ 8,0 para o ensaio do cometa em
condições neutras (WOJEWODZKA et al., 2002), por 60 min para permitir o
equilíbrio com o tampão de corrida. A eletroforese foi conduzida em baixa
luminosidade por 20 min, usando 14 V e uma corrente de 12 mA (0,5 V/cm). Após a
Materiais e Métodos
- 84 -
corrida eletroforética, as lâminas foram retiradas e mergulhadas na solução de
neutralização durante 5 minutos. A análise foi realizada por coloração com nitrato de
prata (NADIN et al. 2001) e as células foram contadas em microscópio óptico. Os
ensaios foram realizados em três experimentos independentes realizados em
triplicatas.
Este estudo de genotoxicidade em V79 foi realizado no Centro de
Biotecnologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, sob a orientação do
professor Dr. João Antonio Pegas Henriques e da professora Drª Jenifer Saffi.
3.6.9.1.3. Análise dos dados
A análise foi realizada de acordo com o padrão de escores previamente
determinados pelo tamanho e intensidade da cauda do cometa (BURLINSON et al.,
2007; HARTMANN & SPEIT, 1997; TICE et al., 2000). Foram, contados 50
cometas/lâmina e classificados, de acordo com a percentagem de DNA na cauda do
cometa, indicando o grau de quebra do DNA, de acordo com a figura 10. Onde 0 =
sem danos (<5%), 1 = baixo nível de danos (5-20%), 2 = médio nível de danos (20-
40%), 3 = alto nível de danos (40-95%) e 4 = dano total (95%). Foram calculados o
índice (ID) e a freqüência (FD) de danos. O ID foi obtido pela seguinte fórmula: ID =
400 - ∑ Escores. A FD representa a porcentagem de células que sofrem danos no
DNA. Os dados foram analisados a partir da média ± E.P.M. de n experimentos.
Para avaliação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos,
os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de
comparações múltiplas de Tukey com a utilização do programa GraphPad Prisma
versão 5.0.
Materiais e Métodos
- 85 -
Figura 10 - Representação dos tipos de cometas corados com prata e visualizados
em microscópio óptico, sendo indicado o escore atribuído para cada cometa de
acordo com o dano. a) tipos 0 (verde) e 1 (amarelo); b) tipos 2 (vermelho) e 3 (azul);
c) tipo 4. Fonte: NADIN et al. 2001.
Materiais e Métodos
- 86 -
3.6.9.2. Estudo do mecanismo de ação genotóxico em células V79
O estudo do mecanismo de ação genotóxico da piplartina foi realizado na
linhagem celular V79 (fibroblastos de pulmão de Hamster Chinês). Foram avaliados
a viabilidade celular, o potencial transmembrânico da mitocôndria e o conteúdo de
DNA nuclear da célula, que reflete as fases do ciclo celular, por citometria de fluxo.
3.6.9.2.1. Determinação da viabilidade celular
3.6.9.2.1.1. Principio do teste
Ver item 3.6.8.1.1.
3.6.9.2.1.2. Procedimento experimental
A determinação da integridade da membrana celular foi avaliada por
citometria de fluxo utilizando o PI como agente fluorogênico. A doxorrubicina (1
µg/mL) foi usada como controle positivo em todos os experimentos. O controle
negativo foi tratado com o veículo (DMSO) usado para diluir a substância. As
concentrações utilizadas da piplartina neste estudo foram previamente
determinadas.
As células V79 foram plaqueadas na densidade de 2 x 10
5
células/mL com
diferentes concentrações da piplartina (5 µg/mL e 10 µg/mL). Uma alíquota de 50 µL
foi recolhida 3 horas após a incubação com a substância. A análise foi realizada de
acordo com o item 3.6.8.1.2.
3.6.9.2.1.3. Análise dos dados
Materiais e Métodos
- 87 -
Os dados foram analisados a partir da média ± E.P.M. de n experimentos.
Para avaliação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos,
os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de
Student Newman-Keuls com a utilização do programa GraphPad Prisma versão 5.0.
3.6.9.2.2. Determinação do potencial transmembrânico da mitocôndria
3.6.9.2.2.1. Princípio do teste
Ver item 3.6.8.2.1.
3.6.9.2.2.2. Procedimento experimental
A determinação do potencial transmembrânico da mitocôndria da célula foi
avaliada por citometria de fluxo utilizando a rodamina 123 como agente fluorogênico.
A doxorrubicina (1 µg/mL) foi usada como controle positivo em todos os
experimentos. O controle negativo foi tratado com o veículo (DMSO) usado para
diluir a substância. As concentrações utilizadas da piplartina neste estudo foram
previamente determinadas.
As células V79 foram plaqueadas na densidade de 2 x 10
5
células/mL com
diferentes concentrações da piplartina (5 µg/mL e 10 µg/mL). Uma alíquota de 50 µL
foi recolhida 3 horas após a incubação com a substância. A análise foi realizada de
acordo com o item 3.6.8.2.2.
3.6.9.2.2.3. Análise dos dados
Os dados foram analisados a partir da média ± E.P.M. de n experimentos.
Para avaliação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos,
Materiais e Métodos
- 88 -
os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de
Student Newman-Keuls com a utilização do programa GraphPad Prisma versão 5.0.
3.6.9.2.3. Determinação do conteúdo de DNA nuclear da célula
3.6.9.2.3.1. Princípio do teste
Ver item 3.6.8.4.1.
3.6.9.2.3.2. Procedimento experimental
A determinação do conteúdo de DNA nuclear da célula, que reflete as fases
do ciclo celular, foi avaliada por citometria de fluxo utilizando o PI como agente
fluorogênico. A doxorrubicina (1 µg/mL) foi usada como controle positivo em todos
os experimentos. O controle negativo foi tratado com o veículo (DMSO) usado para
diluir a substância. As concentrações utilizadas da piplartina neste estudo foram
previamente determinadas.
As células V79 foram plaqueadas na densidade de 2 x 10
5
células/mL com
diferentes concentrações da piplartina (5 µg/mL e 10 µg/mL). Uma alíquota de 50 µL
foi recolhida 3 horas após a incubação com a substância. A análise foi realizada de
acordo com o item 3.6.8.4.2.
3.6.9.2.2.3. Análise dos dados
Os dados foram analisados a partir da média ± E.P.M. de n experimentos.
Para avaliação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos,
os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de
Student Newman-Keuls com a utilização do programa GraphPad Prisma versão 5.0.
Materiais e Métodos
- 89 -
3.6.9.3. Teste de Ames – ensaio de mutação gênica reversa em Salmonella
typhimurium – teste Salmonella – microssoma
3.6.9.3.1. Princípio do teste
O teste de Ames foi desenvolvido por Bruce Ames e colaboradores na década
de 70. Tem sido utilizado, mundialmente, nas últimas décadas para avaliar a
mutagenicidade de substâncias químicas puras e misturas complexas (HENRIQUES
et al., 1987; ROLLA, 1995; MORTELMANS & ZEIGER, 2000). O teste emprega
linhagens de Salmonella typhimurium (células procarióticas) derivadas da parental
LT2, auxotróficas para histidina (his-), apresentando diferentes mutações no operon
deste aminoácido. A maioria das linhagens bacterianas utilizadas no teste apresenta
características que as tornam mais sensíveis para detecção de mutações, incluindo
seqüências sítio específicas no DNA que respondem positivamente para reversão,
aumento da permeabilidade celular a grandes moléculas, ausência do sistema de
reparo de DNA livre de erro e plasmídeos contendo genes que causam aumento do
processo de reparo sujeito a erro (GRIFFITHS et al., 2002).
Essas linhagens não são capazes de crescer em meio de cultura mínimo,
sem histidina, a menos que ocorram mutações que restaurem sua capacidade de
síntese. Suspensões de células bacterianas são expostas à amostra-teste, na
presença e na ausência de um sistema de ativação metabólica exógeno, e
plaqueadas em meio de cultura mínimo. O número de revertentes é facilmente
medido pela contagem de colônias que crescem nesse meio de cultura após a
exposição de uma população de bactérias à amostra a ser testada (HENRIQUES et
al., 1987). Os testes são acrescidos de uma fonte exógena de metabolização
visando mimetizar parcialmente as condições de metabolização de mamíferos
(RABELO-GAY et al, 1991).
3.6.9.3.2. Procedimento experimental
Materiais e Métodos
- 90 -
Na avaliação do potencial mutagênico da piplartina, realizado através do teste
de Ames (modelo procariótico), foram usadas linhagens de S. typhimurium que
detectam mutações do tipo deslocamento do quadro de leitura (TA98 e TA97a) e
mutações por substituição de pares de bases (TA100 e TA102). Foram usados
controles positivos específicos para cada linhagem. O controle negativo foi tratado
com o veículo (DMSO) usado para diluir a substância.
Inicialmente foi avaliada a atividade citotóxica da piplartina na linhagem TA
100 de S. typhimurium para a determinação das concentrações a serem usadas no
teste. As culturas foram colocadas em agitador (100 rpm) a 37 ºC, ao abrigo de luz,
por 11-14 horas. A piplartina foi citotóxica em concentrações acima de 40 µg/mL. As
concentrações 8 µg/mL, 16 µg/mL, 32 µg/mL e 40 µg/mL foram escolhidas para os
estudos de mutagenicidade.
Para cada experimento, as culturas das linhagens-teste cresceram por 12
horas em caldo nutriente Oxoid Nº2, até a densidade de 1-2 x 10
9
unidades
formadoras de colônias (UFC)/mL. Foi utilizada a fração microssomal - S9 que é
composta por um homogenato de fígado de células de rato. A fração S9 é acrescida
de co-fatores adequados e necessita de condições de pH específicas para que as
reações de metabolização possam ocorrer. Para avaliar a atividade mutagênica foi
utilizado o teste de incorporação em placas, que consiste na exposição das
linhagens testadas e a amostra a testar em placa de Agar glicose mínimo na
presença e ausência de sistema de avaliação metabólica S9 (0,5 mL). Os diferentes
componentes foram, primeiramente, adicionados aos tubos de teste esterilizados
contendo 2 mL de Agar de superfície líquido suplementado com histidina e biotina,
mantendo-os a temperatura de 45 ºC. Os conteúdos dos tubos foram misturados,
homogeneizados e vertidos sobre a superfície de uma placa contendo Agar mínimo.
Após solidificação do Agar de superfície, as placas foram incubadas invertidas e ao
abrigo da luz, por 48 horas, a 37 ºC. O ensaio foi realizado em triplicata. Procedeu-
se, então, a contagem do número de revertentes em todas as placas (MARON &
AMES, 1983; GATEHOUSE et al., 1994; MORTELMANS & ZEIGER, 2000). Os
ensaios foram realizados em três experimentos independentes realizados em
triplicatas.
Materiais e Métodos
- 91 -
Este estudo de metagênese S. typhimurium foi realizado no Centro de
Biotecnologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, sob a orientação do
professor Dr. João Antonio Pegas Henriques e da professora Drª Jenifer Saffi.
3.6.9.3.3. Análise dos dados
Na análise do teste Salmonella/microssoma, foi utilizado o programa
Salmonel (MYERS et al., 1991; PICADA et al., 2003). Para o estudo da diferença
entre doses e entre repetições, foi utilizada a análise da variância (ANOVA), seguida
de análise de regressão linear da curva dose-resposta. Os resultados foram
expressos em revertentes/placas ou pela razão de mutagenicidade (RM), também
denominada de índice de mutagenicidade (IM). As amostras foram consideradas
com resultado positivo quando IM foi ≥ 2 em pelo menos uma das doses testadas e
quando houve uma relação dose resposta entre as concentrações testadas e o
número de revertentes induzidos. A substância foi considerada citotóxica quando o
IM foi ≤ 0,6.
3.6.9.4. Ensaio de mutagênese e recombinogênese em Saccharomyces
cerevisiae
3.6.9.4.1. Princípio do teste
Esse teste tem por objetivo avaliar agentes químicos e sua atividade
mutagênica, utilizando como modelo Saccharomyces cerevisiae, que é um fungo
unicelular, que apresenta um ciclo eucariótico típico e completo. Os efeitos
mutagênicos podem ser avaliados em culturas haplóides e diplóides e em todos os
estágios do ciclo celular como G
1
, síntese de DNA, mitose e meiose, assim como os
elementos genéticos extranucleares, como as mitocôndrias. A recombinação
mitótica em células diplóides pode ser reflexo da expressão das atividades de
reparação celular em resposta aos danos introduzidos no genoma pelos agentes
químicos. Substâncias que produzem mutações freqüentemente podem introduzir
Materiais e Métodos
- 92 -
efeitos recombinantes (SILVA et al., 2003a). A levedura possui também um sistema
endógeno de ativação metabólica, constituído pelo complexo enzimático citocromo
p-450, o qual a torna capaz de ativar vários pré-mutagênicos sem necessidade de
ativação de um sistema exógeno (SILVA et al., 2003a).
Este teste se baseia na restauração ou compensação de um defeito gênico
responsável por um requerimento nutricional (ZIMMERMANN, 1975). A restauração
se deve a uma reversão exata do defeito original, enquanto que a compensação
pode ser devida a uma mutação secundária dentro do gene (mutação supressora
interna) ou por uma mutação externa, como no caso dos alelos sem sentido
(nonsense – mutação que resulta na alteração de um códon que determina um
aminoácido para um códon de terminação da síntese protéica) (HAWTHORNE &
LEOPOLD, 1974; ATKIN et al., 1993). As células revertentes (mutantes ou
recombinogênicas) podem ser detectadas pela semeadura em placas contendo meio
seletivo no qual o fator de crescimento inicialmente requerido não está presente, ou
está em quantidades muito pequenas, permitindo um background de crescimento.
3.6.9.4.2. Procedimento experimental
A avaliação do potencial mutagênico foi realizada nas linhagens haplóides
N123 e XV185-14c de S. cerevisiae e o potencial recombinogênico foi realizado na
linhagem diplóide XS2316 de S. cerevisiae. O 4-nitroquinolina-N-óxido foi usado
como controle positivo em todos os experimentos. O controle negativo foi tratado
com o veículo (DMSO) usado para diluir a substância.
Inicialmente foi avaliada a atividade citotóxica da piplartina em fase
estacionaria ou exponencial de crescimento na linhagem XV185-14c de S.
cerevisiae. A piplartina apresentou atividade citotóxica apenas nas células na fase
exponencial de crescimento em concentrações acima de 100 µg/mL. As
concentrações 10 µg/mL, 25 µg/mL, 50 µg/mL e 100 µg/mL foram escolhidas para os
estudos de mutagenicidade e recombinogênese em fase exponencial de
crescimento.
Em frasco de Erlenmeyer contendo 30 mL de YEL foi inoculada uma colônia
isolada da linhagem e colocada para crescer em incubadora com agitação orbital, a
Materiais e Métodos
- 93 -
180 rpm e 30 ºC, durante 48 horas, para atingir a fase estacionária. As culturas
assim mantidas atingiam uma concentração de 2 a 4 x 10
8
céls/mL. Posteriormente,
esta suspensão foi passada para um tubo Falcon de 50 mL e centrifugada por 5
minutos a 5000 rpm. Após esta primeira centrifugação, desprezou-se o
sobrenadante e adicionou-se 20 mL de solução salina, seguido de centrifugação
para lavagem das células. Este procedimento foi repetido duas vezes. As células
foram então contadas em câmera de Neubauer no microscópio óptico e foram feitas
as diluições necessárias para se obter à concentração celular desejada para o
tratamento. Uma suspensão celular de 2 x 10
8
células/mL em fase estacionária foi
incubada durante 20 horas a 30 ºC, sob agitação a 180 rpm, com doses crescentes
(10-100 µg/mL de suspensão celular) da piplartina. Determinou-se a sobrevivência
através de semeadura em meio rico YEPD, após 3-5 dias de crescimento em estufa
a 30 ºC. Para a detecção de mutação induzida (revertentes das marcas LIS, HIS ou
HOM) as células foram incubadas em meio mínimo seletivo, durante 3-5 dias a 30
ºC. As placas foram incubadas no escuro a 30 ºC, em estufa, durante 3-5 dias e
após fez-se a contagem do número de colônias revertentes (AUSUBEL et al., 1989;
BURKE et al., 2000). Todos estes experimentos foram feitos em triplicata para cada
dose testada.
Na avaliação do potencial recombinogênico na linhagem diplóide XS2316 de
S. cerevisiae, uma suspensão de levedura (2 x 10
8
microorganismos/mL) em fase
exponencial em 1 mL de PBS (sem condições de crescimento) ou meio YPD (com
condições de crescimento) foram incubadas por 3 horas a 30 ºC contendo diferentes
concentrações da piplartina. Após o tratamento, as células foram diluídas em PBS,
plaqueadas, em três diferentes meios de cultura (SC, SC - leu e SC + cyh) e
incubadas durante 3-10 dias a 30 ºC. As colônias cultivadas em meio SC indicam a
sobrevivência e as colônias de células cultivadas em SC - leu e SC + cyh indicam
recombinação mitótica intragênica ou conversão gênica e recombinações mitóticas
intergênica ou crossing-over, respectivamente. A fim de medir a exata freqüência de
crossing-over para eliminar a possibilidade de que alguma colônia resistente a
cicloheximida resultar em reversão no lócus CYH2 legitimidade, bem como de
monossomia do cromossomo VII, as colônias resistentes a cicloheximida foram
plaquedas sobre uma série placas com meio SC - lys, SC - se reuniu e SC -, com
posterior triagem desses marcadores para cyh2 (AUSUBEL et al., 1989; BURKE et
Materiais e Métodos
- 94 -
al., 2000). Os ensaios foram realizados em três experimentos independentes
realizados em triplicatas.
Este estudo de metagênese e recombinogênese em S. cerevisiae foram
realizados no Centro de Biotecnologia da Universidade Federal do Rio Grande do
Sul, sob a orientação do professor Dr. João Antonio Pegas Henriques e da
professora Drª Jenifer Saffi.
3.6.9.4.3. Análise dos dados
Os dados foram analisados a partir da média ± E.P.M. de n experimentos.
Para avaliação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos,
os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de
comparações múltiplas de Tukey com a utilização do programa GraphPad Prisma
versão 5.0.
3.6.9.5. Avaliação da genotoxicidade/mutagenicidade em medula óssea de
camundongos – Teste do micronúcleo in vivo
3.6.9.5.1. Princípio do teste
Micronúcleos (MN) são pequenos corpúsculos compostos de material
cromossômico. Após a separação das cromátides no processo mitótico, dois núcleos
são reconstituídos, um em cada pólo. A membrana nuclear é refeita ao redor destes
dois conjuntos cromossômicos. Mas se um cromossomo inteiro ou um fragmento
cromossômico acêntrico não se integra ao novo núcleo (por não ser unido ao fuso),
este também pode ser considerado um micronúcleo. Os micronúcleos, então, são,
estruturalmente, pequenos núcleos representados por material genético que foi
perdido pelo núcleo principal como conseqüência de um dano genético. Este dano
pode ser causado por agentes químicos, físicos ou biológicos, capazes de interferir
Materiais e Métodos
- 95 -
no processo de ligação do cromossomo às fibras do fuso, ou que possam introduzir
a perda de material genético (cromossomos inteiros ou fragmentos). O teste de
micronúcleo, portanto, detecta genotoxicidade cromossômica em eucariotos do tipo
clastogênese e danos ao fuso mitótico (SILVA et al., 2003a).
O teste de MN em organismo sob exposição aguda, menos de quatro
semanas, é realizado em eritrócitos jovens, denominados policromatófitos (EPC) que
por conterem RNA ribossomal se cora de forma diferenciada. A análise por ser muito
simples apresenta vantagem em relação à análise dos cromossomos. Os
micronúcleos podem ser identificados em qualquer tipo de célula. Pode-se avaliar
micronúcleos para diagnóstico de doenças hematológicas em células epiteliais da
mucosa bucal, do trato urinário, e também monitorar ambientes através de teste em
roedores, plantas e peixes (SILVA et al., 2003a).
3.6.9.5.2. Procedimento experimental
O efeito genotóxico in vivo da piplartina foi avaliado em medula óssea de
camundongos. Os animais foram expostos à substância teste por via intraperitoneal,
em uma única administração, e sacrificados nos tempos de 24 e 48 horas após o
tratamento para a retirada da medula óssea dos camundongos. O etileno metano
sulfonato (EMS) foi utilizado com controle positivo na dose de 200 mg/kg. O controle
negativo foi tratado com o veiculo (DMSO 10%) utilizado para diluir a substância. O
experimento foi realizado de acordo com os princípios éticos de experimentação
animal preconizados pela comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade
Federal do Ceará.
Os animais foram tratados com piplartina nas doses (50 mg/kg e 100 mg/kg)
previamente determinadas (BEZERRA et al., 2006). Após 24 ou 48 horas, os
animais foram sacrificados por deslocamento serviçal. Uma amostra do material de
medula óssea foi coletada dos fêmures, em uma pequena quantidade (3 mL) de soro
bovino fetal. As preparações celulares foram coradas (duas lâminas de cada
animal), adequadamente com Leishman, e analisadas para a presença de
micronúcleos. Foi utilizado um grupo controle para cada tempo de amostragem
(SCHMID, 1975; OECD, 1997).
Materiais e Métodos
- 96 -
3.6.9.5.3. Análise dos dados
Todas as lâminas, incluindo aqueles do controle positivo e negativo, foram
codificadas antes da análise. A proporção de eritrócitos policromáticos (PCE) dentre
o total de eritrócitos normocromáticos (PCE + NCE) foi determinada pela contagem
de 1000 eritrócitos (PCE + NCE) por animal. Para avaliação de células
micronucleadas, foram analisados de 2000 PCE por animal.
Os dados foram analisados a partir da média ± E.P.M. de n animais. Para
avaliação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os
dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de
comparações múltiplas de Tukey com a utilização do programa GraphPad Prisma
versão 5.0. A substância foi considerada genotóxica neste ensaio quando
apresentou um aumento, estatisticamente significante, de eritrócitos policromáticos
micronúcleados (EPCM) de maneira dose resposta em pelo menos um dos tempos
analisados, quando comparado ao grupo controle negativo (LI et al., 2007).
3.6.10. Estudo farmacocinético
Dentre o estudo farmacocinético, foi estuda à cinética de absorção da
piplartina após uma única dose de 50 mg/kg em ratos. Inicialmente a metodologia
bioanalítica de detecção da piplartina em plasma de ratos foi desenvolvida e
validada.
3.6.10.1. Desenvolvimento e validação da metodologia bioanalítica
A metodologia bioanalítica de detecção da piplartina em plasma de ratos foi
desenvolvida e validada para demonstrar que o método analítico descrito é
adequado e confiável para as análises propostas. Na validação da metodologia
Materiais e Métodos
- 97 -
foram analisados os seguintes critérios: especificidade, recuperação, limite de
quantificação, linearidade, precisão, exatidão e estabilidade.
3.6.10.1.1. Condições cromatográficas e detecção no espectrômetro de massas
no modo MS/MS
As análises por HPLC foram conduzidas em um cromatógrafo (Shimadzu)
composto de duas bombas modelo LC10AD, um controle de sistema SLC 10A, uma
coluna CTO-10AS, um injetor Rheodyne modelo 7125 com um loop de 20 µL, uma
coluna analítica (coluna NST 18, 5 µm, 250 mm x 4,6 mm) e uma pré-coluna (coluna
CN Lichrospoher 100, 5µm, 4 mm x 4 mm). A fase móvel foi constituída por
acetonitrila: água (70:30, v/v) adicionada de 0,2% de ácido acético (preparada
diariamente e desgaseificada com gás hélio) a temperatura ambiente (22º C). A
corrida cromatográfica foi programada para operar com fluxo de 1 mL/min com um
tempo total de corrida de 5 min.
A espectrometria de massas (mass spectrometry - MS) foi executada
utilizando-se um aparelho do tipo triplo quadrupolo modelo Quattro LC equipado com
uma interface de ionização de pressão atmosférica com Z-electrospray operando em
íon positivo e calibrado com iodeto de sódio/iodeto de césio. A temperatura da fonte
foi de 100 ºC e dessolvatação de 250 ºC. O nitrogênio foi usado para secagem e
nebulização e o argônio foi utilizado como gás de colisão.
As condições para a otimização do MS/MS foi determinada pela injeção direta
da solução padrão (10 µg/mL) do analito (piplartina) e do padrão interno
(carbamazepina - A escolha do padrão interno deu-se através da análise de sua
estrutura química, bem como da estabilidade deste em fluidos biológicos) dissolvidos
na fase móvel e introduzidos com uma bomba de infusão com um fluxo de 20
µL/min. Os valores de voltagem do cone e energia de colisão foram,
respectivamente: 15 V e 10 eV para a piplartina e 20 V e 20 eV para a
carbamazepina. A detecção ocorreu com interface de electrospray operado no modo
positivo (ES+) e programado para monitorar múltiplas reações (MRM). Íons
protonados e seus respectivos produtos foram monitorados pelas seguintes massas:
Materiais e Métodos
- 98 -
317,42 > 220,90 m/z para monitoramento da piplartina e 236,40 > 193,83 m/z para o
monitoramento da carbamazepina (figuras 11 e 12).
A quantificação foi realizada por MRM dos íons protonados e seus respectivos
produtos, utilizado uma metodologia com padronização interna, onde se utilizam as
razões entre as áreas dos picos referentes ao analito (piplartina) e as áreas do
padrão interno (carbamazepina).
Materiais e Métodos
- 99 -
Figura 11 - Espectrometria de massas da piplartina no modo MS/MS operando em
íon positivo.
Materiais e Métodos
- 100 -
Figura 12 - Espectrometria de massas da carbamazepina no modo MS/MS
operando em íon positivo.
Materiais e Métodos
- 101 -
3.6.10.1.2. Preparações das soluções-padrão da curva de calibração e do
controle de qualidade
Todas as soluções-padrão foram preparadas em metanol, utilizando balões e
pipetas volumétricas calibradas, e armazenadas em frascos de vidro âmbar,
rotulados, hermeticamente fechados e acondicionados em refrigerador a -20 ºC.
As soluções-padrão de piplartina utilizadas na curva de calibração e no
controle de qualidade, nas concentrações de 16 ng/mL, 80 ng/mL, 160 ng/mL, 400
ng/mL, 800 ng/mL, 2.000 ng/mL, 5.000 ng/mL, 10.000 ng/mL e 20.000 ng/mL, foram
preparadas a partir de diluições seriadas da solução-padrão estoque preparada na
concentração de 1 mg/mL. A partir desta solução, foram feitas diluições com pool de
plasma branco, previamente centrifugado, para o preparo dos padrões da curva de
calibração nas seguintes concentrações: 2 ng/mL, 10 ng/mL, 20 ng/mL, 50 ng/mL,
100 ng/mL, 250 ng/mL, 625 ng/mL, 1.250 ng/mL e 2.500 ng/mL (tabela 5). A partir
desta solução, também foram feitas diluições com pool de plasma branco,
previamente centrifugado, para o preparo dos padrões do controle de qualidade nas
seguintes concentrações: 20 ng/mL (controle de qualidade baixo), 625 ng/mL
(controle de qualidade médio) e 1.250 ng/mL (controle de qualidade alto) (tabela
6).
A solução-padrão de carbamazepina (padrão interno), na concentração de
5000 ng/mL, também foi preparada a partir de diluições seriadas da solução-padrão
estoque preparada na concentração de 1 mg/mL. Em todas as amostras, exceto no
plasma branco, foram adicionadas 25 µL da solução-padrão do padrão interno, na
concentração de 5000 ng/mL, em 0,2 mL de plasma de rato para obter um
concentração plasmática de 125 ng/mL.
Materiais e Métodos
- 102 -
Tabela 5 – Preparo das amostras para a curva de calibração da piplartina.
Amostra Concentração da
solução-padrão
(ng/mL)
Volume pipetado da
solução-padrão (µL)
Volume de
plasma (mL)
Concentração
no plasma
(ng/mL)
Branco - - - -
Piplartina 16 25 0,2 2
Piplartina 80 25 0,2 10
Piplartina 160 25 0,2 20
Piplartina 400 25 0,2 50
Piplartina 800 25 0,2 100
Piplartina 2.000 25 0,2 250
Piplartina 5.000 25 0,2 625
Piplartina 10.000 25 0,2 1.250
Piplartina 20.000 25 0,2 2.500
Materiais e Métodos
- 103 -
Tabela 6 – Preparo das amostras para controle de qualidade (baixo, médio e alto)
da piplartina.
Amostra Concentração da
solução-padrão
(ng/mL)
Volume pipetado da
solução-padrão (µL)
Volume de
plasma (mL)
Concentração
no plasma
(ng/mL)
Controle de
Qualidade
(Baixo)
160 25 0,2 20
Controle de
Qualidade
(Médio)
5.000 25 0,2 625
Controle de
Qualidade
(Alto)
10.000 25 0,2 1250
Materiais e Métodos
- 104 -
3.6.10.1.3. Procedimento de extração do analito do plasma de ratos
As amostras foram analisadas após extração líquido-líquido do analito do
plasma de ratos (figura 13). Alíquotas de 0,2 mL de plasma de rato, 25 µL da
solução-padrão (5 µg/mL, resultando em uma concentração plasmática de 125
ng/mL) e 1 mL de tolueno foram adicionados para extração em tubos âmbar e
submetidos à agitação mecânica horizontal (200 rpm) por 30 minutos a temperatura
ambiente (22 ± 2 º C). As amostras foram centrifugadas a 2000 G por 10 minutos a
temperatura ambiente. A fase orgânica foi coletada e evaporada sob fluxo de ar
comprimido. O resíduo foi dissolvido em 50 µL de fase móvel e agitado em vórtex
por 20 segundos. Uma alíquota de 20 µL foi injetada na coluna para ser analisado.
Materiais e Métodos
- 105 -
Figura 13 – Procedimento de preparação das amostras de plasma de ratos
empregando a extração líquido-líquido.
- Evaporação sob fluxo de ar comprimido
- Agitação constante a 200 rpm por 30 minutos;
- Centrifugação a 2.000 G por 10 minutos;
0,2 mL de plasma
25 µL da solução-padrão
1 mL de tolueno
Descarte da fase
aquosa
Recuperação de 0,8 mL
da fase orgânica
Dissolução do resíduo em
50 µL de fase móvel
Injeção na coluna
cromatográfica
Materiais e Métodos
- 106 -
3.6.10.1.4. Validação do método
3.6.10.1.4.1. Especificidade
3.6.10.1.4.1.1. Princípio do teste
Especificidade é a capacidade de um método analítico em diferenciar e
quantificar o analito na presença de outros componentes na amostra denominados
interferentes. Os interferentes podem ser originários de fontes endógenas
(metabólitos e/ou precursores; produtos de degradação do fármaco; co-
administração de fármacos, vitaminas e/ou seus metabólitos, produtos de interação
de fármaco, componente biológico e outras substâncias que ocorrem naturalmente
em fluidos biológicos, isto é, hormônios, proteínas, lipídios, substâncias dietéticas,
etc) e/ou exógenas (impurezas dos reagentes usados, substâncias liberadas pelos
recipientes em uso ou resultantes de lavagem inadequadas de vidrarias,
equipamentos e instrumentos) (BRESSOLE et al., 1996; CAUSON, 1997;
GUIDANCE FOR INDUSTRY, 2001; BRASIL, 2003).
3.6.10.1.4.1.2. Procedimento experimental
Para testar a especificidade, diferentes brancos (amostras sem o fármaco ou
padrão interno) de plasma de ratos foram testados nas condições descritas para o
método analítico.
3.6.10.1.4.1.3. Análise dos dados
A análise dos dados deu-se pela comparação das amostras de plasma de
ratos branco com as soluções-padrão do fármaco com concentrações próximas ao
limite de quantificação.
Materiais e Métodos
- 107 -
3.6.10.1.4.2. Recuperação
3.6.10.1.4.2.1. Princípio do teste
A recuperação é a medida da eficiência de um método em extrair todos os
analíticos de interesse presentes na amostra original. Porcentagens próximas a
100% são desejáveis, porem admite-se valores menores, desde que a recuperação
seja precisa e exata (BRESSOLE et al., 1996; CAUSON, 1997; GUIDANCE FOR
INDUSTRY, 2001; BRASIL, 2003).
3.6.10.1.4.2.2. Procedimento experimental
Tal parâmetro foi determinado analisando amostras (controles de qualidade
baixo, médio e alto) de plasma adicionadas de padrão de piplartina e padrão interno,
submetidos a processo de extração e as mesmas amostras preparadas em solução
e não submetidas a esse processo de extração.
3.6.10.1.4.2.3. Análise dos dados
O cálculo da recuperação do fármaco foi feito comparando-se as áreas dos
picos da piplartina (controles de qualidade baixo, médio e alto) das amostras
extraídas do plasma com as áreas dos picos da piplartina preparados em solução
(solução não extraída). O cálculo da recuperação do padrão interno foi feito de
maneira semelhante.
3.6.10.1.4.3. Determinação do limite de quantificação
3.6.10.1.4.3.1. Princípio do teste
Materiais e Métodos
- 108 -
O limite de quantificação representa a menor concentração que pode ser
determinada, distinguindo-se do ruído, com exatidão e precisão aceitáveis
(BRESSOLE et al., 1996; CAUSON, 1997; GUIDANCE FOR INDUSTRY, 2001;
BRASIL, 2003).
3.6.10.1.4.3.2. Procedimento experimental
Para a determinação do limite de quantificação, foram feitas análises da
matriz biológica contendo concentrações decrescentes do fármaco até o menor nível
quantificável com precisão e exatidão aceitáveis, em cinco repetições. Com isto,
tentou-se assegurar que os menores valores possíveis fossem analisados, por meio
de repetições de análises, com valores sucessivamente menores, quando os
inicialmente escolhidos fossem quantificados com precisão e exatidão aceitáveis.
3.6.10.1.4.3.3. Análise dos dados
Foi considerado o valor para o limite de quantificação a concentração com
mínima com exatidão entre 80-120% em relação à concentração nominal do padrão,
com coeficiente de variação de, no máximo, 20 %.
3.6.10.1.4.4. Linearidade
3.6.10.1.4.4.1. Princípio do teste
A linearidade, representada pela curva de calibração, indica a relação entre a
concentração do analito e a resposta do método. O método de regressão linear dos
mínimos quadrados normalmente é utilizado para definir matematicamente a curva
de calibração. Em geral, um fator de peso (1/X ou 1/x
2
) é usado para evitar a
Materiais e Métodos
- 109 -
inclinação da curva de calibração em favor das concentrações mais elevadas
(BRESSOLE et al., 1996; CAUSON, 1997; GUIDANCE FOR INDUSTRY, 2001;
BRASIL, 2003).
3.6.10.1.4.4.2. Procedimento experimental
Para a determinação da curva de calibração analisaram-se amostras
extraídas da matriz biológica em seis concentrações variadas. A curva de calibração
incluiu a análise da amostra branca (matriz biológica isenta de padrão interno e do
padrão do fármaco) e mais seis amostras contendo padrão do fármaco e padrão
interno contemplando o limite de variação esperado. As amostras contendo padrão
do fármaco e o padrão interno foram analisados em duplicata. As concentrações dos
padrões foram definidas em testes preliminares, incluindo a primeira quantificação
de amostras, levando-se em consideração a sensibilidade do método e a faixa
prevista das concentrações das amostras a serem determinadas. A linearidade da
curva de calibração foi avaliada dentro dos seguintes critérios: Desvio menor ou
igual a 20% em relação à concentração nominal do limite de quantificação, em pelo
menos duas das triplicatas; Desvio menor ou igual a 15% em relação à
concentração nominal para as outras concentrações da curva de calibração, em pelo
menos duas das triplicatas; No mínimo 4 de 6 concentrações da curva de calibração
devem cumprir com os critérios descritos, incluindo o limite de quantificação e a
maior concentração da curva de calibração; O coeficiente de correlação é aceito
quando foi igual ou maior do que 0,98.
3.6.10.1.4.4.3. Análise dos dados
Estabeleceu-se correlação linear entre o inverso da concentração,
considerada variável independente (1/X) e a área sob o pico do sinal cromatográfico,
considerando variáveis dependentes. A análise foi realizada automaticamente
utilizando o programa MassLynx software 3.5 (Waters
®
).
Materiais e Métodos
- 110 -
3.6.10.1.4.5. Precisão
3.6.10.1.4.5.1. Princípio do teste
A precisão (repetibilidade) de um método bioanalítico consiste na medida do
erro aleatório. È definida como a concordância entre várias medidas da mesma
amostra, sendo expressa como coeficiente de variação (C.V.%) dessas medidas. A
precisão intra-ensaio refere-se ao coeficiente de variação obtido por repetição do
método com o mesmo analista, utilizando o mesmo equipamento e os mesmos
reagentes, em um curto intervalo de tempo (no mesmo dia, por exemplo). A precisão
enter-ensaio é obtida por meio de alterações de condições, como mudança de
analista, reagentes ou equipamentos, ou pela utilização do método durante várias
semanas ou messes. O coeficiente de variação não deve exceder valores superiores
a 15 %, exceto para o limite de quantificação, para o qual se admitem valores
menores ou iguais a 20% (BRESSOLE et al., 1996; CAUSON, 1997; GUIDANCE
FOR INDUSTRY, 2001; BRASIL, 2003).
3.6.10.1.4.5.2. Procedimento experimental
Este parâmetro foi determinado pela análise de amostras de plasma de
controle de qualidade em três diferentes concentrações e cinco réplicas no mesmo
dia (precisão intra-ensaio) e em cinco réplicas por dia durante três dias consecutivos
(precisão inter-ensaio).
Materiais e Métodos
- 111 -
3.6.10.1.4.5.3. Análise dos dados
O cálculo da precisão foi realizado segundo a equação abaixo:
C.V. (%) = DP x 100,
CMD
Onde: C.V. = coeficiente de variação; DP = desvio padrão; e CMD = concentração
média determinada.
3.6.10.1.4.6. Exatidão
3.6.10.1.4.6.1. Princípio do teste
A exatidão (reprodutibilidade) de um método bioanalítico é uma medida do
erro sistemático definida como a concordância entre o valor medido e o valor real. O
valor da exatidão para as amostras não deve exceder ± 15% do valor nominal e para
o limite de quantificação admitiu-se desvios menores ou iguais a 20% (BRESSOLE
et al., 1996; CAUSON, 1997; GUIDANCE FOR INDUSTRY, 2001; BRASIL, 2003).
3.6.10.1.4.6.2. Procedimento experimental
Este parâmetro foi determinado pela análise de amostras de plasma de
controle de qualidade em três diferentes concentrações e cinco réplicas no mesmo
dia (exatidão intra-ensaio) e em cinco réplicas por dia durante três dias consecutivos
(exatidão inter-ensaio).
Materiais e Métodos
- 112 -
3.6.10.1.4.6.3. Análise dos dados
O cálculo da exatidão foi realizado segundo a equação abaixo:
Exatidão (%) = CMD x 100,
CT
Onde: CMD = concentração média determinada; e CT = concentração teórica.
3.6.10.1.4.7. Estabilidade
3.6.10.1.4.7.1. Princípio do teste
Os dados de estabilidade são necessários para mostrar que a concentração
do analito no momento da análise corresponde á sua concentração no memento da
coleta. Foram avaliadas a estabilidade em ciclos de congelamento e
descongelamento e a estabilidade de curta duração (BRESSOLE et al., 1996;
CAUSON, 1997; GUIDANCE FOR INDUSTRY, 2001; BRASIL, 2003).
3.6.10.1.4.7.2. Procedimento experimental
Na determinação da estabilidade em ciclos de congelamento e
descongelamento, foram utilizadas triplicatas de amostras de plasma de controle de
qualidade em três concentrações diferentes, submetidas as seguintes condições:
congelamento a -20 ºC por 24 horas, descongelamento e recongelamento por mais
12 horas e assim sucessivamente até completar três ciclos.
Materiais e Métodos
- 113 -
Na determinação da estabilidade de curta duração, foram utilizadas triplicatas
de amostras de plasma de controle de qualidade em três concentrações diferentes,
mantidas a temperatura ambiente (± 22 ºC) durante 4 horas.
3.6.10.1.4.7.3. Análise dos dados
A concentração do fármaco nas amostras de plasma de controle de qualidade
foi determinada após os ciclos de congelamento e descongelamento e após as 4
horas a temperatura ambiente (± 22 ºC) e os resultados obtidos foram comparados
com os resultados de amostras recém-preparadas e analisadas imediatamente após
o preparo. Para avaliação da ocorrência de diferenças significativas entre os
diferentes grupos, os dados foram comparados por Student's t-test com a utilização
do programa GraphPad Prisma versão 5.0.
Este estudo de desenvolvimento e validação da metodologia bioanalítica para
a quantificação da piplartina em plasma de ratos foi realizado na Universidade de
São Paulo – Ribeirão Preto, sob a orientação do professor Dr. Norberto Peporine
Lopes, da professora Drª Pierina Sueli Bonato e da Drª Valquíria Aparecida Polisel
Jabor.
3.6.10.2. Estudo de disposição cinética da piplartina
3.6.10.2.1. Princípio do teste
Em um estudo de disposição cinética é avaliada a absorção de um fármaco
após sua administração. O conhecimento da farmacocinética de um fármaco, neste
caso, o comportamento deste em relação à absorção, fornece subsídios para
melhores condições de aplicações deste.
3.6.10.2.2. Procedimento experimental
Materiais e Métodos
- 114 -
Foram coletadas amostras de aproximadamente 4 mL de sangue de ratos
conscientes, através do plexo orbital, em tubo heparinizados a 0; 0,083; 0,166; 0,25;
0,5; 1; 2; 3; 6; 12 e 24 horas (n = 3 para cada tempo de coleta) após uma única
administração da piplartina (50 mg/kg) por via intraperitoneal, dissolvido em DMSO
10%. As amostras foram centrifugadas (2.000 G por 10 minutos) e o plasma,
acondicionado em duplicatas, foi congelado a - 20 ºC, em freezer, e sob proteção da
luz até a realização do ensaio para quantificação do fármaco. A dose utilizada da
piplartina neste estudo foi previamente determinada (BEZERRA et al., 2006). O
experimento foi realizado de acordo com os princípios éticos de experimentação
animal preconizados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade
Federal do Ceará.
A quantificação das amostras de plasma foi realizada conforme metodologia
descrita no item 3.6.11.1. As amostras de plasma dos ratos que receberam piplartina
foram analisadas paralelamente à curva de calibração com sete pontos e amostras
em triplicatas de controle de qualidade em três diferentes concentrações (alta, média
e baixa). A análise das amostras de controle de qualidade concomitante a amostra
de plasma dos ratos é uma garantia da qualidade e da estabilidade das mesmas
durante o procedimento analítico empregado.
Os parâmetros farmacocinéticos (tabela 7) tais como área sob a curva do
tempo zero a 24 horas (ASC
0-24
), área sob a curva do tempo zero ao infinito (ASC
0-
∞
), concentração máxima atingida (C
max
), clearance total (Cl), constante de
eliminação (K
el
), meia vida plasmática (t
1/2
), o tempo correspondente à concentração
máxima do fármaco atingida no plasma (T
max
) e o volume de distribuição (Vd) foram
calculados.
Este estudo de disposição cinética da piplartina foi realizado na Universidade
de São Paulo – Ribeirão Preto, sob a orientação do professor Drº Norberto Peporine
Lopes, da professora Drª Pierina Sueli Bonato e da Drª Valquíria Aparecida Polisel
Jabor.
Materiais e Métodos
- 115 -
3.6.10.2.3. Análise dos dados
A determinação das concentrações plasmáticas da piplartina foi obtida
através da análise da curva de calibração e das amostras de plasmas coletadas,
realizado automaticamente utilizando o programa MassLynx software 3.5 (Waters
®
).
Os parâmetros farmacocinéticos foram obtidos através do método dos trapezóides.
Materiais e Métodos
- 116 -
Tabela 7 - Parâmetros farmacocinéticos avaliados.
Símbolo Descrição
AUC
0-24h
Área sob a curva de concentração do fármaco versus tempo, do tempo
0 (zero) ao tempo 24h. Relaciona-se com a quantidade ou extensão de
absorção do fármaco. A quantidade da absorção sistêmica do fármaco
é diretamente relacionada com AUC que é calculada pelo método
trapezoidal e expresso em unidades de concentração vezes tempo.
AUC
0-∞
Área sob a curva de concentração do fármaco versus tempo, do tempo
0 (zero) ao infinito.
C
max
Concentração máxima atingida no plasma. Concentração mais elevada
do fármaco atingida na circulação sanguínea após administração de
um fármaco. Relaciona-se a intensidade da resposta farmacológica.
Este é obtido diretamente dos dados.
Cl
Estimativa do clearance total.
K
el
Constante de eliminação K, representa a soma de todas as taxas
constantes para remoção do fármaco do corpo, incluindo a taxa
constante da excreção renal e metabolismo (biotransformação) como
descrito através da equação: K
el
= K
e
+ K
m
, onde K
e
= constante de
excreção renal e K
m
= constante de metabolismo. Determina a taxa de
eliminação do fármaco dos vasos sanguíneos. Serve para determinar a
concentração do fármaco em um tempo t. É inversamente relacionada
á meia vida do fármaco: K
el
= 0,693/t
1/2
.
t
1/2
Meia vida de eliminação do fármaco. Representa o tempo em que a
concentração do fármaco no plasma é reduzida à metade. Este é
obtido diretamente dos dados.
T
max
Tempo correspondente à concentração máxima do fármaco atingida
no plasma.
Vd
Estimativa do volume de distribuição.
Materiais e Métodos
- 117 -
3.6.11. Avaliação da associação do 5-Fluourouracil com a piplartina
Na avaliação da associação do 5-Fluourouracil com a piplartina, foram
realizados estudos in vitro e in vivo. O efeito da associação do 5-fluorouracil (5-FU)
com a piplartina foi avaliado in vitro sobre a proliferação de células tumorais
humana. Os efeitos dos tratamentos com a piplartina (50 mg/kg/dia), o 5-FU (10
mg/kg/dia) ou a associação do 5-FU (10 mg/kg/dia) com a piplartina (50 mg/kg/dia)
foram avaliados em camundongos saudáveis ou transplantados com o tumor
Sarcoma 180. Adicionalmente, análises histopatológicas, bioquímicas e
hematológicas foram realizadas com o intuito de avaliar efeitos tóxicos causados
pelo tratamento dos animais com os compostos.
3.6.11.1. Avaliação da associação do 5-fluorouracil (5-FU) com a piplartina
sobre a proliferação de células tumorais humanas in vitro
3.6.11.1.1. Principio do teste
A avaliação da associação do 5-FU com a piplartina sobre a proliferação
celular foi realizada em células tumorais humanas (HL-60 - leucemia promielocítica,
HCT-8 – carcinoma de cólon, SF-295 – glioblastoma e MDA-MB-435 – melanoma)
através do método do MTT após 72 horas de incubação. Ver item 3.6.7.1.1.
3.6.11.1.2. Procedimento experimental
A citotoxicidade do 5-FU foi avaliada na presença e na ausência da piplartina
(5 µM). A análise foi realizada de acordo com o item 3.6.7.1.2.
3.6.11.1.3. Análise dos dados
Materiais e Métodos
- 118 -
As substâncias foram testadas em diluições seriadas, em duplicata ou
triplicata. Foi registrada a percentagem de inibição x log da concentração e
determinado suas CI
50
(concentração inibitória média capaz de provocar 50% do
efeito máximo) e seus respectivos erros padrão da média obtidos a partir de
regressão não-linear utilizando o programa Prisma versão 5.0 (GraphPad Software).
3.6.11.2. Avaliação da associação do 5-Fluourouracil com a piplartina em
camundongos transplantados com tumor Sarcoma 180
3.6.11.2.1. Princípio do teste
Na quimioterapia do câncer, fármacos antineoplásicas são freqüentemente
usadas em combinação. Este tipo de tratamento (poliquimioterapia) apresenta
resultados mais eficazes, pois consegue maior resposta a cada aplicação,
diminuindo o risco de resistência aos fármacos e conseguindo atingir as células em
diferentes fases do seu ciclo. Com esse intuito foi avaliado o efeito da associação do
5-FU com piplartina em camundongos transplantados com Sarcoma 180.
O sarcoma 180, ou tumor de Crocker, é um tumor indiferenciado que foi
descrito pela primeira vez em camundongos em 1914. Este tumor foi encontrado na
região axilar direita e diagnosticado na época como carcinoma, mas o tecido de
origem não foi especificado, de forma que não se sabe se era uma neoplasia
cutânea ou mamária. Estudos posteriores demonstraram que suas células não
produzem laminina, o que não permite sua caracterização como de origem epitelial.
O tumor invade músculo esquelético, tecido adiposo, nervos e vasos sangüíneos
(STEWART et al., 1959). O Sarcoma 180 pode ser transplantado por inoculação
subcutânea, intramuscular ou intraperitoneal e cresce rapidamente em 90 a 100%
dos animais inoculados, havendo uma taxa de regressão natural de 8 a 10%
(ZUCKERBERG, 1973). Apesar de seu comportamento agressivo local, esse tumor
não desenvolve metástases (KURASHIGE & MITSUHASHI, 1982).
O Sarcoma 180 tem sido utilizado no estudo da ação de componentes
químicos, físicos e biológicos sobre o crescimento, patogênese, imunologia,
Materiais e Métodos
- 119 -
citogenética e terapêutica de células tumorais. A vantagem da utilização de
neoplasias transplantáveis, em comparação às demais, recai sobre o conhecimento
prévio da quantidade e das características iniciais das células tumorais a serem
inoculadas e sobre o desenvolvimento rápido da neoplasia, que restringe o tempo de
estudo (STEWART et al., 1959).
3.6.11.2.2. Procedimento experimental
Para o teste de atividade antitumoral, foi utilizado o tumor sólido do tipo
Sarcoma 180, com 8 dias de implantação na região axilar direita. O animal doador,
ou da manutenção, foi sacrificado por deslocamento cervical, sendo realizado
assepsia com álcool iodado. Em seguida, foi retirado o líquido ascítico da cavidade
abdominal, tendo sido preparado uma suspensão de células com 5,0 mL de Ringer
lactato, 0,2 mL de gentamicina (5 mg/mL) e 0,5 mL do líquido ascítico, para posterior
contagem de células (BEZERRA et al., 2006).
Nos animais receptores, foram injetadas 2 x 10
6
céls/0,5 mL na região axilar
esquerda dos camundongos (Mus musculus Swiss). Nesse experimento, foram
utilizados 20 animais por grupos, sendo todas fêmeas, apresentando massa
corpórea variando entre 25-30 g, os quais foram 10 animais de cada grupo foram
inoculados com tumor Sarcoma 180 os outros 10 animais de cada grupo foram
utilizados para o estudo toxicológico. Em seguida, 24 h após a inoculação do tumor
foi iniciado o tratamento durante 7 dias consecutivos de acordo com os grupos
abaixo:
Grupo I –– Tratados com o veículo (DMSO 10%) utilizado para diluir as
substâncias (grupo controle negativo);
Grupo II – Tratados com 5-fluourouracil 10 mg/kg/dia;
Grupo III – Tratados com piplartina 50 mg/kg/dia;
Grupo IV – Tratados com 5-Fluourouracil 10 mg/kg/dia associado com
piplartina 50 mg/kg/dia.
Todos os grupos foram tratados por via intraperitoneal. As doses utilizadas
neste estudo foram previamente determinadas (BEZERRA et al., 2006). Vinte quatro
Materiais e Métodos
- 120 -
horas após o termino do tratamento, os animais foram anestesiados e seu sangue
periférico foi coletado através do plexo orbital, em tubos heparinizados, para
análises bioquímicas e hematológicas. Em seguida, os animais foram sacrificados,
sendo retirados os tumores, rins, fígados e baços para pesagem, análise
histopatológica. Todos os animais foram pesados no inicio e no final do tratamento.
O experimento foi realizado de acordo com os princípios éticos de experimentação
animal preconizados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade
Federal do Ceará.
3.6.11.2.3. Análise dos dados
O percentual de inibição do crescimento tumoral (IT) foi calculado pela
fórmula:
IT (%) = [(A-B)/A] x 100
Onde: A = média dos pesos dos tumores no grupo controle e B = média dos pesos
dos tumores nos animais tratados.
Os dados foram analisados a partir da média ± E.P.M. de n experimentos.
Para avaliação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos,
os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de
Student Newman-Keuls com a utilização do programa GraphPad Prisma versão 5.0.
3.6.11.3. Parâmetros toxicológicos avaliados
3.6.11.3.1. Avaliação dos parâmetros bioquímicos
3.6.11.3.1.1. Princípio do teste
Dentre os parâmetros bioquímicos, foram avaliados testes de dano hepático e
testes de função renal.
Materiais e Métodos
- 121 -
A alanina transaminase (ALT), também chamada transaminase glutâmica
pirúvica sérica (SGPT ou TGP) ou alanina aminotransferase (ALAT), é uma enzima
presente nos hepatócitos (células do fígado). Quando uma célula é danificada, ela
libera esta enzima no sangue, onde é medida. A ALT aumenta drasticamente em
lesões hepáticas agudas. A aspartato transaminase (AST), também chamada de
transaminase glutâmica oxalacética sérica (SGOT ou TGO) ou aspartato
aminotransferase (ASAT), é similar à ALT de modo que é outra enzima associada às
células parenquimais do fígado. Está aumentada na lesão hepática aguda, mas
também está presente nas hemácias e músculos esqueléticos e cardíacos, não
sendo então uma enzima específica do fígado (GAW et al., 2004).
Como parâmetro da função renal, foi avaliado a concentração de úreia
plasmatica. A uréia é uma substância que provém dos alimentos que contém
proteínas como, por exemplo, os alimentos de origem animal (carne, ovos), e que
devem ser quase totalmente eliminada do organismo através da urina. Quando os
rins estão com a sua função de filtração prejudicada, a uréia fica acumulada no
sangue, provocando alterações em vários órgãos, estabelecendo a uremia.
Entretanto, a concentração sérica de uréia não é tão precisa como medida da função
glomerular. A ingestão de proteínas na dieta afeta a concentração de uréia
plasmática. O sangramento gastrintestinal fará com que a uréia do plasma esteja
elevada. E ainda, a uréia é reabsorvida pelos túbulos (GAW et al., 2004).
3.6.11.3.1.2. Procedimento experimental
Para avaliar os parâmetros bioquímicos, sangue periférico foi coletado através
do plexo orbital, em tubos heparinizados, onde o plasma foi utilizado para avaliar a
função renal e danos hepáticos. Para investigação de dano hepático foram
determinados os níveis séricos das transaminases: aspartato aminotransferase
(AST) e alanina aminotransferase (ALT). Para tanto, utilizaram-se kits da LABTEST
®
sistemas para diagnostico, seguindo-se metodologia descrita pelo fabricante. A
função renal foi avaliada pelo parâmetro sérico clássico da integridade renal: a uréia.
Para tanto, também se utilizou o kit da LABTEST
®
sistemas para diagnostico,
seguindo-se metodologia descrita pelo fabricante.
Materiais e Métodos
- 122 -
3.6.11.3.1.3. Análise dos dados
Os dados foram analisados a partir da média ± E.P.M. de n animais. Para
avaliação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os
dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de
Student Newman-Keuls com a utilização do programa GraphPad Prisma versão 5.0.
3.6.11.3.2. Avaliação dos parâmetros hematológicos
3.6.11.3.2.1. Princípio do teste
A análise dos parâmetros hematológicos consta de uma série de provas que
possibilitam detectar anormalidades que se apresentam em certos fenômenos
fisiopatológicos importantes nos animais e nos homens e que se refletem no sangue
(LORENZI, 2006).
3.6.11.3.2.2. Procedimento experimental
Foram realizadas as seguintes provas hematológicas: dosagem de
hemoglobina, contagem de plaquetas e leucócitos realizada em hematocitômetro. A
contagem diferencial leucocitária foi realizada por meio de esfregaços sanguíneos e
foram determinados valores relativos e absolutos de linfócitos, neutrófilos,
eosinófilos, monócitos e basófilos.
3.6.11.3.2.3. Análise dos dados
Os dados foram analisados a partir da média ± E.P.M. de n animais. Para
avaliação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os
Materiais e Métodos
- 123 -
dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de
Student Newman-Keuls com a utilização do programa GraphPad Prisma versão 5.0.
Estes estudos dos parâmetros bioquímicos e hematológicos da piplartina
foram realizados no Laboratório de Farmacologia e Bioquímica, sob a orientação da
professora Drª Nylane Maria Nunes Alencar.
3.6.11.3.3. Análise histopatológica
3.6.11.3.3.1. Princípio do teste
A técnica de coloração hematoxilina e eosina (H/E) permite diferenciar o
citoplasma do núcleo, possibilitando, assim, a análise de algumas estruturas
celulares. A análise morfológica e histopatológica de tecidos dos animais tratadas
permitem identificar alterações que possam estar ocorrendo e fornecer subsídios
para sugerir os efeitos tóxicos causados pelo fármaco.
3.6.11.3.3.2. Procedimento experimental
Após o sacrifício dos animais, ocorreu a retirada e pesagem de órgãos e
tumores, os quais foram armazenados em formol a 10%. As peças foram retiradas
do formol e seccionadas em pequenas fatias para posterior preparação das lâminas.
O material foi fixado em formol a 10% por 24 horas, desparafinizado em xilol por 15
minutos, e desidratado em concentrações crescentes de álcool até 70%
(mergulhando-se rapidamente as lâminas), sendo posteriormente lavadas em água
destilada até ter sido removido todo o álcool. Posteriormente as lâminas foram
coradas com hematoxilina e eosina.
3.6.11.3.3.3. Análise dos dados
Materiais e Métodos
- 124 -
As lâminas contendo as células coradas foram levadas ao microscópio para
avaliação das suas características morfológicas e comparadas ao controle (não
tratadas).
Este estudo histopatológico da piplartina foi realizado no Laboratório de
Patológica Bucal, sob a orientação da professora Drª Ana Paula Negreiros Nunes
Alves.
- 125 -
Resultados
Resultados
- 126 -
4. Resultados
4.1. Estudo da atividade citotóxica
O estudo da atividade citotóxica da piplartina e seus análogos foi realizado em
células humana tumorais. Adicionalmente, a atividade citotóxica da piplartina foi
avaliada em células humana normais.
4.1.1. Avaliação da atividade citotóxica da piplartina e seus análogos em
células tumorais humana
A tabela 8 apresenta os resultados encontrados no ensaio de citotóxico da
piplartina e seus análogos, em células tumorais humana. A piplartina apresentou
citotoxicidade em todas as linhagens tumorais testadas, com valores de CI
50
que
variaram de 0,33 µg/mL (1,04 µM) a 0,96 µg/mL (3,03 µM) para as linhagens de HL-
60 e MDA-MB-435, respectivamente. A doxorrubicina, usada como controle positivo,
também apresentou citotoxicidade em todas as linhagens tumorais testadas, com
valores de CI
50
que variaram de 0,01 µg/mL (0,02 µM) a 0,48 µg/mL (0,88 µM) para
as linhagens de HCT-8 e MDA-MB-435, respectivamente. Entretanto, nenhuns dos
análogos (30-34) da piplartina apresentaram atividade citotóxica nas linhagens de
células tumorais testadas (valores de CI
50
> 25 µg/mL). Para este ensaio, foram
consideradas citotóxicas aquelas substâncias que apresentaram CI
50
< 1 µg/mL ou 1
µM (PESSOA et al., 2000; COSTA-LOTUFO et al., 2004; BEZERRA et al., 2008).
Resultados
- 127 -
Tabela 8 – Atividade citotóxica da piplartina e seus análogos em linhagens de
células tumorais humana. A doxorrubicina foi usada como controle positivo.
Linhagem celular
Substâncias
HL-60
CI
50
[µg/mL]
(µM)
HCT-8
CI
50
[µg/mL]
(µM)
SF-295
CI
50
[µg/mL]
(µM)
MDA-MB-435
CI
50
[µg/mL]
(µM)
Piplartina
0,33 (1,04)
0,19 – 0,58
0,38 (1,20)
0,29 - 0,49
0,83 (2,62)
0,65 – 1,06
0,96 (3,03)
0,81 – 1,15
(30) >25 (77,88) >25 (77,88) >25 (77,88) >25 (77,88)
(31) >25 (93,63) >25 (93,63) >25 (93,63) >25 (93,63)
(32) >25 (88,64) >25 (88,64) >25 (88,64) >25 (88,64)
(33) >25 (105,04) >25 (105,04) >25 (105,04) >25 (105,04)
(34) >25 (75,75) >25 (75,75) >25 (75,75) >25 (75,75)
Doxorrubicina
0,02 (0,04)
0,01 – 0,03
0,01 (0,02)
0,01 – 0,02
0,24 (0,44)
0,17 – 0,36
0,48 (0,88)
0,34 – 0,66
A tabela apresenta os valores de CI
50
e o intervalo de confiança de 95% de três
experimentos independentes realizados em duplicata pelo método do MTT após 72
horas de exposição com as células HL-60 (leucemia promielocítica), HCT-8 (cólon),
SF-295 (glioblastoma) e MDA-MB-435 (melanoma) obtidos por regressão não-linear
através do programa GraphPad Prisma versão 5.0.
Resultados
- 128 -
4.1.2. Avaliação da atividade citotóxica da piplartina em células normais
humana
A tabela 9 apresenta os resultados encontrados no ensaio de citotóxicidade
da piplartina, em células normais humana. Quando a atividade citotóxica da
piplartina foi avaliada em células humana normais (PBMC), o valor de CI
50
encontrado foi de 14,34 µg/mL (45,24 µM). Assim, a piplartina apresenta um índice
de seletividade de aproximadamente 45 vezes em relação à linhagem leucêmica HL-
60. A doxorrubicina, usada como controle positivo, apresentou um valor de IC
50
de
0,97 µg/mL (1,78 µM), para PBMC. O índice de seletividade da doxorrubicina foi de
aproximadamente 50 vezes em relação à linhagem leucêmica HL-60.
Resultados
- 129 -
Tabela 9 – Atividade citotóxica da piplartina em células humanas normais. A
doxorrubicina foi usada como controle positivo.
Substância PBMC
CI
50
[µg/mL]
(µM)
HL-60
CI
50
[µg/mL]
(µM)
Índice de
seletividade
Piplartina 14,34 (45,24)
11,05 - 18,60
0,33 (1,04)
0,19 – 0,58
45
Doxorrubicina 0,97 (1,78)
0,52 - 1,80
0,02 (0,04)
0,01 – 0,03
50
A tabela apresenta os valores de CI
50
o intervalo de confiança de 95% de três
experimentos independentes realizados em duplicata pelo método do alamar blue
após 72 horas de exposição com as células PBMC (peripheral blood mononuclear
cell – linfócitos e monócitos) obtidos por regressão não-linear através do programa
GraphPad Prisma versão 5.0. O calculo do índice de seletividade foi calculado em
relação a linhagem leucêmica HL-60.
Resultados
- 130 -
4.2. Estudo do mecanismo de ação citotóxico em células HL-60
O estudo do mecanismo de ação citotóxico da piplartina foi realizado
utilizando a linhagem leucêmica HL-60 como modelo. Foram avaliados a viabilidade
celular, o potencial transmembrânico da mitocôndria e o conteúdo de DNA nuclear
da célula, que reflete as fases do ciclo celular, por citometria de fluxo. O efeito da
piplartina sobre a ativação da caspase-3 também foi avaliado. Adicionalmente, o
índice mitótico foi determinado por coloração diferencial por hematoxilina/eosina.
4.2.1. Determinação da viabilidade celular
A piplartina causou uma redução significativa na proliferação celular, de
maneira dependente da concentração, apenas 24 horas após a incubação (figura
14). Na avaliação da viabilidade celular, foi observado perda da integridade da
membrana citoplasmática, a partir de 12 horas de incubação com a concentração de
10 µg/mL. Apenas após 24 horas de incubação foi observado perda da integridade
da membrana citoplasmática na concentração 5 µg/mL (figura 15). A doxorrubicina,
por sua vez, reduziu a proliferação celular sem alterar a integridade da membrana
citoplasmática.
As figuras 16, 17, 18 e 19 mostram os gráficos de dispersão do volume celular
e granulosidade representativos, obtidos por citometria de fluxo após 3, 6, 12 e 24
horas de incubação com a piplartina, respectivamente. A redução no volume celular
resulta numa diminuição da luz desviada para frente (FSC) e a condensação da
cromatina causa um aumento transitório do desvio da luz para o lado (SSC), seguido
por uma redução da SSC nos estágios finais da apoptose. Na análise do desvio da
luz incidida sobre as células, foi observado um aumento do número de células
apoptóticas, a partir de 3 horas de incubação em todas as concentrações testadas.
Com 6 e 12 horas de incubação com a piplartina, as células apresentaram padrões
morfológicos de células em apoptose, entretanto, após 24 horas de incubação a
morfologia apresentou-se típica de células em necrose, provalvemente tratar-se de
uma apoptose tardia, já que nas primeras horas a morfologia era de padrão celular
Resultados
- 131 -
de apoptose. A doxorrubicina, usada como controle positivo, também apresentou
padrão celular típico de apoptose também a partir de 3 horas de incubação.
Resultados
- 132 -
CN CP 2,5 5 10
0
2
4
6
8
10
Piplartina
(µg/mL)
A
Número de
Células (x 10
5
/mL)
CN CP 2,5 5 10
0
2
4
6
8
10
Piplartina
(µg/mL)
B
Número de
Células (x 10
5
/mL)
CN CP 2,5 5 10
0
2
4
6
8
10
Piplartina
(µg/mL)
C
Número de
Células (x 10
5
/mL)
CN CP 2,5 5 10
0
2
4
6
8
10
Piplartina
(µg/mL)
a
a
D
a
a
Número de
Células (x 10
5
/mL)
Figura 14 - Efeito da piplartina sobre a proliferação de células leucêmicas HL-60
determinado por citometria de fluxo usando iodeto de propídeo após 3 (A), 6 (B), 12
(C) e 24 (D) horas de incubação. O controle negativo (CN) foi tratado com o veículo
usado para diluir a substância. A doxorrubicina (0,3 µg/mL) foi usada como controle
positivo (CP). Os valores correspondem à média ± E.P.M. de três experimentos
independentes realizados em triplicata. Cinco mil eventos foram analisados em cada
experimento. Os debris celulares foram excluídos das análises. a, P < 0,05 quando
comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (análise da variância)
seguido por Student Newman-Keuls.
Resultados
- 133 -
CN CP 2,5 5 10
0
20
40
60
80
100
Piplartina
(µg/mL)
A
Integridade da
Membrana (%)
CN CP 2,5 5 10
0
20
40
60
80
100
Piplartina
(µg/mL)
B
Integridade da
Membrana (%)
CN CP 2,5 5 10
0
20
40
60
80
100
Piplartina
(µg/mL)
a
C
Integridade da
Membrana (%)
CN CP 2,5 5 10
0
20
40
60
80
100
Piplartina
(µg/mL)
D
a
a
Integridade da
Membrana (%)
Figura 15 - Efeito da piplartina sobre a integridade da membrana citoplasmática de
células leucêmicas HL-60 determinado por citometria de fluxo usando iodeto de
propídeo após 3 (A), 6 (B), 12 (C) e 24 (D) horas de incubação. O controle negativo
(CN) foi tratado com o veículo usado para diluir a substância. A doxorrubicina (0,3
µg/mL) foi usada como controle positivo (CP). Os valores correspondem à média ±
E.P.M. de três experimentos independentes realizados em triplicata. Cinco mil
eventos foram analisados em cada experimento. Os debris celulares foram excluídos
das análises. a, P < 0,05 quando comparado com o grupo controle negativo por
ANOVA (análise da variância) seguido por Student Newman-Keuls.
Resultados
- 134 -
Figura 16 - Efeito da piplartina (2,5 µg/mL, C – 5 µg/mL, D - 10 µg/mL, E) sobre a
morfologia de células leucêmicas HL-60 determinado por citometria de fluxo usando
o FSC (Forward scatter - desvio da luz para frente) e SSC (Side Scatter - desvio da
luz para o lado) como parâmetros de tamanho relativo da célula e granulosidade ou
complexidade interna da célula, respectivamente, após 3 horas de incubação. O
controle negativo (A) foi tratado com o veículo usado para diluir a substância. A
doxorrubicina (0,3 µg/mL) foi usada como controle positivo (B). Os resultados são
representativos de três experimentos independentes realizados em triplicata Os
debris celulares foram excluídos das análises. Cinco mil eventos foram analisados
em cada experimento.
A
B
C D E
Células viáveis
Células apoptóticas
Células necróticas
Resultados
- 135 -
Figura 17 - Efeito da piplartina (2,5 µg/mL, C – 5 µg/mL, D - 10 µg/mL, E) sobre a
morfologia de células leucêmicas HL-60 determinado por citometria de fluxo usando
o FSC (Forward scatter - desvio da luz para frente) e SSC (Side Scatter - desvio da
luz para o lado) como parâmetros de tamanho relativo da célula e granulosidade ou
complexidade interna da célula, respectivamente, após 6 horas de incubação. O
controle negativo (A) foi tratado com o veículo usado para diluir a substância. A
doxorrubicina (0,3 µg/mL) foi usada como controle positivo (B). Os resultados são
representativos de três experimentos independentes realizados em triplicata Os
debris celulares foram excluídos das análises. Cinco mil eventos foram analisados
em cada experimento.
A
B
C E
D
Células viáveis
Células apoptóticas
Células necróticas
Resultados
- 136 -
Figura 18 - Efeito da piplartina (2,5 µg/mL, C – 5 µg/mL, D - 10 µg/mL, E) sobre a
morfologia de células leucêmicas HL-60 determinado por citometria de fluxo usando
o FSC (Forward scatter - desvio da luz para frente) e SSC (Side Scatter - desvio da
luz para o lado) como parâmetros de tamanho relativo da célula e granulosidade ou
complexidade interna da célula, respectivamente, após 12 horas de incubação. O
controle negativo (A) foi tratado com o veículo usado para diluir a substância. A
doxorrubicina (0,3 µg/mL) foi usada como controle positivo (B). Os resultados são
representativos de três experimentos independentes realizados em triplicata Os
debris celulares foram excluídos das análises. Cinco mil eventos foram analisados
em cada experimento.
A
B
C E
D
Células viáveis
Células apoptóticas
Células necróticas
Resultados
- 137 -
Figura 19 - Efeito da piplartina (2,5 µg/mL, C – 5 µg/mL, D - 10 µg/mL, E) sobre a
morfologia de células leucêmicas HL-60 determinado por citometria de fluxo usando
o FSC (Forward scatter - desvio da luz para frente) e SSC (Side Scatter - desvio da
luz para o lado) como parâmetros de tamanho relativo da célula e granulosidade ou
complexidade interna da célula, respectivamente, após 24 horas de incubação. O
controle negativo (A) foi tratado com o veículo usado para diluir a substância. A
doxorrubicina (0,3 µg/mL) foi usada como controle positivo (B). Os resultados são
representativos de três experimentos independentes realizados em triplicata Os
debris celulares foram excluídos das análises. Cinco mil eventos foram analisados
em cada experimento.
A
B
C E
D
Células viáveis
Células apoptóticas
Células necróticas
Resultados
- 138 -
4.2.2. Determinação do potencial transmembrânico da mitocôndria
A figura 20 mostra os resultados encontrados. Foi observada despolarização
mitocondrial em células leucêmicas HL-60 tratadas com a maior concentração da
piplartina (10 µg/mL) a partir de 3 horas de incubação. Entretanto, após 24 horas de
incubação apenas o tratamento com a menor concentração da piplartina (2,5 µg/mL)
apresentou despolarização mitocondrial. A doxorrubicina, usada como controle
positivo, apresentou despolarização mitocondrial também a partir de 3 horas de
incubação.
4.2.3. Determinação da ativação da caspase-3
A figura 21 mostra os resultados encontrados. Foi observada ativação da
caspase-3 em células leucêmicas HL-60 tratadas apenas com a menor
concentração da piplartina (2,5 µg/mL).
Resultados
- 139 -
CN CP 2,5 5 10
0
10
20
30
40
50
a
Piplartina
(µg/mL)
A
a
Despolarização
Mitocondrial (%)
CN CP 2,5 5 10
0
10
20
30
40
50
Piplartina
(µg/mL)
a
a
B
Despolarização
Mitocondrial (%)
CN CP 2,5 5 10
0
10
20
30
40
50
Piplartina
(µg/mL)
a
a
a
C
Despolarização
Mitocondrial (%)
CN CP 2,5 5 10
0
10
20
30
40
50
Piplartina
(µg/mL)
a
a
D
Despolarização
Mitocondrial (%)
Figura 20 - Efeito da piplartina sobre o potencial transmembrânico de células
leucêmicas HL-60 determinado por citometria de fluxo usando rodamina 123 após 3
(A), 6 (B), 12 (C) e 24 (D) horas de incubação. O controle negativo (CN) foi tratado
com o veículo usado para diluir a substância. A doxorrubicina (0,3 µg/mL) foi usada
como controle positivo (CP). Os valores correspondem à média ± E.P.M. de três
experimentos independentes realizados em triplicata. Cinco mil eventos foram
analisados em cada experimento. Os debris celulares foram excluídos das análises.
a, P < 0,05 quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (análise
da variância) seguido por Student Newman-Keuls.
Resultados
- 140 -
CN CP 2,5 5,0 10,0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
(µg/mL)
Piplartina
a
a
Ativação da caspase-3
(UI/mg de proteína)
Figura 21 – Efeito da piplartina sobre a ativação da caspase-3 em células
leucêmicas HL-60 após 24 horas de incubação. O controle negativo (CN) foi tratado
com o veículo usado para diluir a substância. A doxorrubicina (0,3 µg/mL) foi usada
como controle positivo (CP). Os resultados estão expressos como atividade
especifica. Os valores correspondem à média ± E.P.M. de três experimentos
independentes realizados em triplicata. a, P < 0,05 quando comparado com o grupo
controle negativo por ANOVA (análise da variância) seguido por Student Newman-
Keuls.
Resultados
- 141 -
4.2.4. Determinação do conteúdo de DNA nuclear da célula
A tabela 10 mostra os resultados encontrados. A piplartina induziu parada do
ciclo celular em G
2
/M, em todas as concentrações testadas, após 3 horas de
incubação (22,13 % do controle contra 27,03 %, 27,31 % e 28,03 % das células
tratadas com piplartina nas concentrações de 2,5 µg/mL, 5 µg/mL e 10 µg/mL,
respectivamente). A parada do ciclo celular foi seguida de fragmentação do DNA
(sub-G
1
) celular (2,77 % do controle contra 7,43 %, 7,55 % e 9,11 % das células
tratadas com piplartina nas concentrações de 2,5 µg/mL, 5 µg/mL e 10 µg/mL,
respectivamente, após 6 horas de incubação).
Após 12 horas de incubação, foi observado citotoxicidade, como observado
pela fragmentação do DNA, preferencialmente para as células em G
2
/M (21,56 % do
controle contra 5,48 %, 6,06 % e 6,40 % das células em G
2
/M e 2,53 % do controle
contra 14,55 %, 19,56 % e 20,42 % das células em sub-G
1
das células tratadas com
piplartina nas concentrações de 2,5 µg/mL, 5 µg/mL e 10 µg/mL, respectivamente).
Após 24 horas de incubação, a maioria das células apresentava o DNA
fragmentado (2,60 % do controle contra 33,21 %, 40,53 % e 51,59 % das células
tratadas com piplartina nas concentrações de 2,5 µg/mL, 5 µg/mL e 10 µg/mL,
respectivamente). A doxorrubicina, usada como controle positivo, também
apresentou parada do ciclo celular G
2
/M após 3 horas de incubação, seguido por
fragmentação do DNA celular.
Resultados
- 142 -
Tabela 10 – Efeito da piplartina sobre distribuição do ciclo celular de células
leucêmicas HL-60 determinado por citometria de fluxo usando iodeto de propídeo. A
doxorrubicina foi usada como controle positivo (CP). O controle negativo (CN) foi
tratado com o veículo usado para diluir a substância.
Conteúdo de DNA (%)
Substâncias
Concentrações
(µg/mL)
Sub-G
1
G
1
S G
2
/M
3 horas de incubação
CN - 2,56 ± 0,27 50,09 ± 2,18 22,30 ± 0,66 22,13 ± 1,07
CP 0,3 3,54 ± 0,24
a
46,25 ± 0,60 20,68 ± 0,67 28,18 ± 0,41
a
Piplartina 2,5 2,53 ± 0,12 46,70 ± 0,78 22,03 ± 0,44 27,03 ± 1,00
a
5 2,73 ± 0,23 48,72 ± 0,94 20,72 ± 1,21 27,31 ± 0,37
a
10 3,01 ± 0,14 49,78 ± 1,03 18,59 ± 1,14 28,03 ± 0,49
a
6 horas de incubação
CN - 2,77 ± 0,38 57,59 ± 0,97 21,07 ± 0,64 19,26 ± 0,62
CP 0,3 13,94 ± 1,57
a
51,52 ± 1,92 23,02 ± 1,08 16,70 ± 0,69
a
Piplartina 2,5 7,43 ± 0,87
a
58,67 ± 2,45 19,32 ± 0,66 18,35 ± 2,02
5 7,55 ± 0,45
a
59,14 ± 1,33 19,63 ± 0,69 20,59 ± 0,56
10 9,11 ± 1,07
a
60,25 ± 1,42 18,96 ± 0,40 19,46 ± 0,25
12 horas de incubação
CN - 2,53 ± 0,21 54,17 ± 0,52 21,96 ± 1,04 21,56 ± 0,57
CP 0,3 33,12 ± 3,88
a
48,45 ± 1,17
a
14,80 ± 3,303
a
4,48 ± 1,56
a
Piplartina 2,5 14,55 ± 1,64
a
49,53 ± 1,03 23,96 ± 0,96 5,15 ± 0,93
a
5 19,56 ± 0,95
a
53,94 ± 1,65 24,30 ± 0,31 6,06 ± 0,80
a
10 20,42 ± 1,72
a
56,93 ± 1,43 25,28 ± 0,23 6,41 ± 0,29
a
24 horas de incubação
CN - 2,60 ± 0,42 50,70 ± 1,170 20,70 ± 0,52 23,64 ± 0,48
a
CP 0,3 69,98 ± 1,59
a
27,76 ± 0,97
a
2,155 ± 0,36
a
0,78 ± 0,10
a
Piplartina 2,5 33,21 ± 2,89
a
43,96 ± 1,76
22,71 ± 1,48
3,28 ± 0,73
a
5 40,53 ± 2,23
a
42,89 ± 1,66
19,26 ± 0,46
2,55 ± 0,43
a
10 51,59 ± 3,04
a
33,28 ± 0,68
a
14,66 ± 1,39
a
1,97 ± 0,32
a
A tabela apresenta os valores correspondentes à média ± E.P.M. de três
experimentos independentes realizados em triplicata. Cinco mil eventos foram
analisados em cada experimento. Os debris celulares foram excluídos das análises.
a, P < 0,05 quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (análise
da variância) seguido por Student Newman-Keuls.
Resultados
- 143 -
4.2.5. Determinação do índice mitótico
Desde que a piplartina foi capaz de induzir parada do ciclo celular em G
2
/M, o
índice mitótico foi calculado após 3 horas de incubação com o fármaco a fim de
avaliar o efeito deste sobre a mitose. As figuras 22 e 23 mostram os resultados
encontrados. A piplartina não alterou o índice mitótico nas condições testadas. A
comparação dos valores do índice mitótico com os resultados do ciclo celular,
realizado por citometria de fluxo, sugeriu que a parada em G
2
/M é na verdade uma
parada na fase G
2
. A doxorrubicina, usada como controle positivo, também
apresentou parada do ciclo celular na fase G
2
.
Resultados
- 144 -
Figura 22 – Avaliação do efeito da piplartina sobre o índice mitótico de células
leucêmicas HL-60 determinado por coloração diferencial com hematoxilina/eosina
em células leucêmicas HL-60 após 3 horas de incubação. O controle negativo (CN)
foi tratado com o veículo usado para diluir a substância. A doxorrubicina (0,3 µg/mL)
foi usada como controle positivo (CP). Os valores correspondem à média ± E.P.M.
de três experimentos independentes realizados em triplicata. Mil células foram
analisadas em cada lâmina. a, P < 0,05 quando comparado com o grupo controle
negativo por ANOVA (análise da variância) seguido por Student Newman-Keuls.
Resultados
- 145 -
Figura 23 – Análise do índice mitótico demonstrando uma parada do ciclo celular em
G
2
associada com o tratamento com a piplartina. O índice mitótico foi determinado
por coloração diferencial com hematoxilina/eosina em células leucêmicas HL-60
após 3 horas de incubação. A porcentagem de células em G
2
/M corresponde aos
valores da tabela 10. O controle negativo (CN) foi tratado com o veículo usado para
diluir a substância. A doxorrubicina (0,3 µg/mL) foi usada como controle positivo
(CP). Os valores correspondem à média ± E.P.M. de três experimentos
independentes realizados em triplicata. Mil células foram analisadas em cada
lâmina. a, P < 0,05 quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA
(análise da variância) seguido por Student Newman-Keuls.
Resultados
- 146 -
4.3. Estudo da atividade genotóxica e mutagênica
No estudo da atividade genotóxica in vitro, o ensaio do cometa, em células
V79 (fibroblastos de pulmão de Hamster Chinês), foi realizado para avaliar danos à
fita simples e à fita dupla do DNA induzidos pela piplartina. Adicionalmente, o estudo
do mecanismo de ação genotóxica foi avaliado por citometria de fluxo. A atividade
mutagênica da piplartina foi investigada em dois modelos clássicos: ensaio de
mutação gênica reversa em Salmonella typhimurium (modelo procariótico) e ensaio
de mutagenicidade e recombinogênese em Saccharomyces cerevisiae (modelo
eucariótico). Para avaliar o potencial genotóxico/mutagênico in vivo da piplartina, o
ensaio do micronúcleo em medula óssea foi realizado em camundongos.
4.3.1. Avaliação da genotoxicidade in vitro - Dano ao DNA - Ensaio do cometa
Inicialmente foi avaliada a atividade citotóxica da piplartina na linhagem V79,
no ensaio de formação de colônias em placas. A piplartina apresentou ser citotóxica
em concentrações maiores que 10 µg/mL. Nas concentrações inferiores não foram
detectados efeitos citotóxicos e, por tanto, foi estabelecida a concentração de 10
µg/mL como limite superior para o estudo da atividade genotóxica.
A tabela 11 apresenta o efeito genotóxico da piplartina, como avaliado pelo
ensaio do cometa. A piplartina aumentou o índice de dano (ID) e a freqüência de
dano (FD) em ambas as versões do ensaio do cometa, condições alcalina e
condições neutra, de maneira dependente da concentração. Sugerindo a quebra da
fita dupla do DNA como principal responsável pela atividade genotóxica da
piplartina. O metano sulfonato de metila, usado como controle positivo, também
aumentou o índice e a freqüência de danos ao DNA em ambos os ensaios,
validando, assim, o ensaio.
Resultados
- 147 -
Tabela 11 – Atividade genotóxica da piplartina em células V79 (fibroblastos de
pulmão de Hamster Chinês) avaliada pelo teste do cometa após 3 horas de
incubação. O metano sulfonato de metila foi usado como controle positivo (CP). O
controle negativo (CN) foi tratado com o veículo usado para diluir a substância.
Substâncias Concentrações
(µg/mL)
Índice de Dano
(ID)*
Freqüência de Dano
(FD)#
Cometa alcalino (pH~13,0)
CN - 26,75 ± 3,68 23,66 ± 4,04
CP 40 225,5 ± 9,20
a
93,33 ± 3,78
a
Piplartina 1 39,75 ± 6,70 26,00 ± 3,91
2,5 92,75 ± 3,13
a
48,25 ± 6,18
a
5 134,0 ± 6,97
a
63,25 ± 2,06
a
10 181,0 ± 8,16
a
77,00 ± 5,59
a
Cometa neutro (pH~8,0)
CN - 10,72 ± 7,54 7,50 ± 0,57
CP 40 95,46 ± 2,93
a
50,0 ± 2,30
a
Piplartina 1 22,75 ± 2,62
a
20,01 ± 5,71
a
2,5 38,75 ± 2,50
a
27,27 ± 2,62
a
5 64,00 ± 3,16
a
38,00 ± 3,36
a
10 101,5 ± 9,67
a
55,25 ± 2,50
a
A tabela apresenta os valores correspondentes à média ± D.P. de quatro
experimentos independentes realizados em duplicata, obtidos a partir da contagem
de 100 células por experimento. *, escores obtidos pela multiplicação do número de
células de cada classe (0, 1, 2, 3 e 4) pela classe de dano, variando de 0 (sem dano)
a 400 (dano máximo). #, valores calculados como percentual de dano (%). a, P <
0,05 comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste de
comparações múltiplas de Tukey.
Resultados
- 148 -
4.3.2. Estudo do mecanismo de ação genotóxico em células V79
O estudo do mecanismo de ação genotóxico da piplartina foi realizado na
linhagem celular V79 (fibroblastos de pulmão de Hamster Chinês). Foram avaliados
a viabilidade celular, o potencial transmembrânico da mitocôndria e o conteúdo de
DNA nuclear da célula, que reflete as fases do ciclo celular, por citometria de fluxo.
4.3.2.1. Determinação da viabilidade celular
A piplartina não causou redução significativa na proliferação celular nem na
viabilidade celular (figura 24 e 25). A doxorrubicina, por sua vez, também não alterou
estes parâmetros. Entretanto, morfologia celular foi alterada em ambas as
concentrações testadas. A figura 26 mostra os gráficos de dispersão do volume
celular e granulosidade representativos. Na análise do desvio da luz incidida sobre
as células, foi observado um aumento do número de células apoptóticas em ambas
as concentrações testadas. A doxorrubicina, usada como controle positivo, também
apresentou padrão celular típico de apoptose.
Resultados
- 149 -
CN CP 5 10
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Piplartina
(µg/mL)
Número de Células (x 10
5
/mL)
Figura 24 - Efeito da piplartina sobre a proliferação de células V79 (fibroblastos de
pulmão de Hamster Chinês) determinado por citometria de fluxo usando iodeto de
propídeo após 3 horas de incubação. O controle negativo (CN) foi tratado com o
veículo usado para diluir a substância. A doxorrubicina (1 µg/mL) foi usada como
controle positivo (CP). Os valores correspondem à média ± E.P.M. de três
experimentos independentes realizados em triplicata. Cinco mil eventos foram
analisados em cada experimento. Os debris celulares foram excluídos das análises.
Resultados
- 150 -
CN CP 5 10
0
20
40
60
80
100
Piplartina
(µg/mL)
Integridade da Membrana (%)
Figura 25 - Efeito da piplartina sobre a integridade da membrana citoplasmática de
células V79 (fibroblastos de pulmão de Hamster Chinês) determinado por citometria
de fluxo usando iodeto de propídeo após 3 horas de incubação. O controle negativo
(CN) foi tratado com o veículo usado para diluir a substância. A doxorrubicina (1
µg/mL) foi usada como controle positivo (CP). Os valores correspondem à média ±
E.P.M. de três experimentos independentes realizados em triplicata. Cinco mil
eventos foram analisados em cada experimento. Os debris celulares foram excluídos
das análises.
Resultados
- 151 -
Figura 26 - Efeito da piplartina (5 µg/mL, C - 10 µg/mL, D) sobre a morfologia de
células V79 (fibroblastos de pulmão de Hamster Chinês) determinado por citometria
de fluxo usando o FSC (Forward scatter - desvio da luz para frente) e SSC (Side
Scatter - desvio da luz para o lado) como parâmetros de tamanho relativo da célula e
granulosidade ou complexidade interna da célula, respectivamente, após 3 horas de
incubação. O controle negativo (A) foi tratado com o veículo usado para diluir a
substância. A doxorrubicina (1 µg/mL) foi usada como controle positivo (B). Os
resultados são representativos de três experimentos independentes realizados em
triplicata Os debris celulares foram excluídos das análises. Cinco mil eventos foram
analisados em cada experimento.
Células viáveis
Células apoptóticas
Células necróticas
Resultados
- 152 -
4.3.2.2. Determinação do potencial transmembrânico da mitocôndria
A figura 27 mostra os resultados encontrados. Foi observada despolarização
mitocondrial em células V79 tratadas com ambas as concentração da piplartina. A
doxorrubicina, usada como controle positivo, também apresentou despolarização
mitocondrial.
4.3.2.3. Determinação do conteúdo de DNA nuclear da célula
A tabela 12 mostra os resultados encontrados. A piplartina induziu parada do
ciclo celular em G
2
/M, em ambas as concentrações testadas (22,85 % do controle
contra 28,51 % e 26,97 % das células tratadas com piplartina nas concentrações de
5 µg/mL e 10 µg/mL, respectivamente). A parada do ciclo celular foi acompanhada
de fragmentação do DNA (sub-G
1
) celular (1,41 % do controle contra 5,79 % e 9,82
% das células tratadas com piplartina nas concentrações de 5 µg/mL e 10 µg/mL,
respectivamente).
Resultados
- 153 -
CN CP 5 10
0
5
10
15
20
25
Piplartina
(µg/mL)
a
a
a
Despolarização Mitocondrial (%)
Figura 27 - Efeito da piplartina sobre o potencial transmembrânico de células V79
(fibroblastos de pulmão de Hamster Chinês) determinado por citometria de fluxo
usando rodamina 123 após 3 horas de incubação. O controle negativo (CN) foi
tratado com o veículo usado para diluir a substância. A doxorrubicina (1 µg/mL) foi
usada como controle positivo (CP). Os valores correspondem à média ± E.P.M. de
três experimentos independentes realizados em triplicata. Cinco mil eventos foram
analisados em cada experimento. Os debris celulares foram excluídos das análises.
a, P < 0,05 quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (análise
da variância) seguido por Student Newman-Keuls.
Resultados
- 154 -
Tabela 12 – Efeito da piplartina sobre a distribuição do ciclo celular em células V79
(fibroblastos de pulmão de Hamster Chinês) determinado por citometria de fluxo
usando iodeto de propídeo. A doxorrubicina foi usada como controle positivo (CP). O
controle negativo (CN) foi tratado com o veículo usado para diluir a substância.
Conteúdo de DNA (%) Substâncias Concentrações
(µg/mL)
Sub-G
1
G
1
S G
2
/M
CN - 1,41 ± 0,28 48,97 ± 1,18 21,97 ± 0,81 22,85 ± 0,91
CP 1,0 15,22 ± 0,76
a
47,64 ± 1.52 23,32 ± 0,45 13,51 ± 1,10
a
Piplartina 5 5,79 ± 1,58
a
38,94 ± 1,68
a
23,74 ± 1,24 28,51 ± 0,94
a
10 9,82 ± 0,71
a
38,31 ± 3,34
a
22,85 ± 1,59 26,97 ± 0,36
a
A tabela apresenta os valores correspondentes à média ± E.P.M. de três
experimentos independentes realizados em triplicata. Cinco mil eventos foram
analisados em cada experimento. a, P < 0,05 quando comparado com o grupo
controle negativo por ANOVA (análise da variância) seguido por Student Newman-
Keuls.
Resultados
- 155 -
4.3.3. Avaliação da mutagenicidade no ensaio de mutação gênica reversa em
Salmonella typhimurium – Teste de Ames
Inicialmente, o efeito citotóxico da piplartina foi avaliado usando a linhagem
TA 100. A piplartina apresentou citotóxicidade em concentrações maiores que 40
µg/mL. Nas concentrações inferiores não foram detectados efeitos citotóxicos e, por
tanto, foi estabelecida a concentração de 40 µg/mL como limite superior para o
estudo da atividade mutagênica no ensaio de Ames.
A tabela 13 apresenta os resultados obtidos para a atividade mutagênica por
deslocamento do quadro de leitura ou frameshift (his+) nas linhagens TA98 e TA97a
e a tabela 14 apresenta os resultados obtidos para a atividade mutagênica por
substituição de pares de bases (his+) nas linhagens TA100 e TA102. Os resultados
mostram o número de revertentes his+/placa, bem como o índice de
mutagenicidade, para a piplartina nas diferentes concentrações testadas na
presença e ausência de ativação metabólica (S9). Verifica-se que não ocorreu
aumento da freqüência de mutantes revertentes na presença de piplartina nas
diferentes concentrações testadas e os índices de mutagenicidade foram todos
menores que 2, indicando ausência de atividade mutagênica no teste de Ames. O 4-
nitroquinolina-N-óxido, a aflatoxina B e a azida sódica, usados como controles
positivos, aumentaram o índice de mutagenicidade validando, assim, o ensaio.
Resultados
- 156 -
Tabela 13 – Avaliação da atividade mutagênica por deslocamento do quadro de
leitura ou frameshift (his+) nas linhagens TA98 e TA97a de Salmonella typhimurium
após tratamento com piplartina sem (-S9) ou com (+S9) ativação metabólica. O 4-
nitroquinolina-N-óxido (para -S9) e a aflatoxina B1 (para o +S9) foram usados como
controle positivo (CP). O controle negativo (CN) foi tratado com o veículo usado para
diluir a substância.
Linhagens de S. typhimurium
TA98 TA97a
Substâncias
Concentrações
(µg/mL)
Rev./placa IM Rev./placa IM
Sem ativação metabólica (-S9)
CN -
23 ± 4
-
158 ± 16
-
CP 0,5
301 ± 29
12,9
798 ± 134
5,1
Piplartina 8
21 ± 4
0,9
184 ± 25
1,0
16
23 ± 6
1,0
159 ± 15
0,9
24
26 ± 3
1,1
167 ± 31
0,9
32
16 ± 3
0,7
167 ± 7
0,9
40
19 ± 4
0,6
119 ± 21
1,0
Com ativação metabólica (+S9)
CN -
25 ± 1
-
153 ± 30
-
CP 1
1031 ± 139
41,8
709 ± 214
4,6
Piplartina 8
25 ± 2
1,0
182 ± 12
1,2
16
22 ± 7
0,9
180 ± 35
1,2
24
26 ± 3
1,1
166 ± 44
1,1
32
21 ± 2
0,8
156 ± 13
1,0
40
27 ± 6
1,1
150 ± 8
1,0
A tabela apresenta o número de revertentes por placa (Rev./placa) correspondente à
média ± D.P. e índice de mutagenicidade (IM – nº de revertentes na placa teste/ nº
de revertentes do controle negativo) de três experimentos independentes realizados
em triplicata. A substância é considerada mutagênica quando o IM for maior ou igual
a 2, em pelo menos uma das doses testadas e, quando houver uma relação dose
resposta entre as concentrações testada e o número de revertentes induzidos.
Resultados
- 157 -
Tabela 14 – Avaliação da atividade mutagênica por substituição de pares de bases
(his+) nas linhagens TA100 e TA102 de Salmonella typhimurium após tratamento
com piplartina sem (-S9) ou com (+S9) ativação metabólica. O 4-nitroquinolina-N-
óxido (para -S9 na linhagem TA102), azida sódica 5µg/mL (para –S9 na linhagem
TA100) e a aflatoxina B1 (para o +S9) foram usados como controle positivo (CP). O
controle negativo (CN) foi tratado com o veículo usado para diluir a substância.
Linhagens de S. typhimurium
TA100 TA102
Substâncias
Concentrações
(µg/mL)
Rev./placa IM
Rev./placa IM
Sem ativação metabólica (-S9)
CN -
137 ± 12
-
340 ± 28
-
CP 0,5
972 ± 36
7,1
2703 ± 134
7,9
Piplartina 8
136 ± 20
1,0
378 ± 68
1,1
16
116 ± 1
0,8
282 ± 13
0,8
24
130 ± 10
0,9
365 ± 11
1,1
32
119 ± 15
0,9
317 ± 61
0,9
40
153 ± 22
1,1
299 ± 13
0,9
Com ativação metabólica (+S9)
CN -
93 ± 16
-
403 ± 11
-
CP 0,5
1054 ± 163
11,3
972 ± 233
2,4
Piplartina 8
80 ± 17
0,9
567 ± 47
1,4
16
89 ± 3
0,9
572 ± 14
1,4
24
92 ± 11
1,0
588 ± 31
1,4
32
85 ± 17
0,9
632 ± 14
1,6
40
114 ± 9
1,2
355 ± 262
0,9
A tabela apresenta o número de revertentes por placa (Rev./placa) correspondente à
média ± D.P. e índice de mutagenicidade (IM – nº de revertentes na placa teste/ nº
de revertentes do controle negativo) de três experimentos independentes realizados
em triplicata. A substância é considerada mutagênica quando o IM for maior ou igual
a 2, em pelo menos uma das doses testadas e, quando houver uma relação dose
resposta entre as concentrações testada e o número de revertentes induzidos.
Resultados
- 158 -
4.3.4. Avaliação da mutagenicidade e recombinogênese em Saccharomyces
cerevisiae
Inicialmente foi avaliada a atividade citotóxica da piplartina em fase
exponencial de crescimento e em fase estacionária de crescimento na linhagem
XV185-14c de S. cerevisiae. A piplartina não apresentou citotoxicidade em S.
cerevisiae durante a fase estacionária de crescimento, entretanto, apresentou ser
citotóxica durante a fase exponencial de crescimento em concentrações maiores que
100 µg/mL. Portanto, foi estabelecida a concentração de 100 µg/mL como limite
superior para o estudo da atividade mutagênica e recombinogênica.
A tabela 15 apresenta os resultados obtidos para a indução de mutação
reversa e para frente ou forward (can1) na linhagem haplóide N123 de S. cerevisiae
e a tabela 16 apresenta os resultados obtidos para a indução de mutação pontual
(his-7 e lys1-1) e mutação por deslocamento do quadro de leitura ou frameshift
(hom3-10) na linhagem haplóide XV185-14c de S. cerevisiae. A piplartina não
induziu mutagenicidade em nenhuma das linhagens de S. cerevisiae em culturas
com PBS, mas mostrou-se como um agente mutagênico quando as linhagens foram
cultivadas com meio de cultura. A indução de mutação reversa e para frente ou
forward (can1) na linhagem N123 ou mutação por deslocamento do quadro de leitura
ou frameshift (hom3-10) na linhagem XV185-14c foram observada apenas nas
maiores concentrações testadas. A indução de mutação pontual (his-7 e lys1-1) na
linhagem XV185-14c foi observada em todas as concentrações testadas. O 4-
nitroquinolina-N-óxido, usado como controle positivo, também apresentou resultados
positivos nos testes realizados, validando, assim, o ensaio.
O efeito da piplartina em induzir recombinações mitóticas intergênicas ou
crossing-over (+/cyh2) e intragênicas ou conversão gênica (leu1-1/leu1-12) foi
avaliado na linhagem diplóide XS2316 de S. cerevisiae (tabela 17). A piplartina
causou recombinogênese em S. cerevisiae cultivada em PBS apenas na maior
concentração testada. Entretanto, causou recombinações mitóticas intergênica e
intragênica em todas as concentrações testadas quando a levedura foi cultivada com
meio de cultura. O 4-nitroquinolina-N-óxido, usado como controle positivo, também
apresentou resultados positivos neste teste, validando, assim, este ensaio.
Resultados
- 159 -
Tabela 15 – Indução de mutação reversa e para frente ou forward (can1) na
linhagem haplóide N123 de Saccharomyces cerevisiae após tratamento com
piplartina em fase exponencial de crescimento. O 4-nitroquinolina-N-óxido foi usado
como controle positivo (CP). O controle negativo (CN) foi tratado com o veículo
usado para diluir a substância.
Substâncias
Concentrações
(µg/mL)
Sobrevivência
(%)
Revertentes Can/10
7
Sobreviventes*
Culturas com PBS (sem condições de crescimento)
CN - 100 (321)# 3,03 ± 0,22
CP 0,5 55,09 (177) 17,36 ± 1,41
a
Piplartina 10 94,70 (304) 3,61 ± 0,27
25 90,87 (292) 3,95 ± 0,16
50 81,21 (261) 4,72 ± 0,2
100 69,70 (224) 6,1 ± 0,28
Cultura com meio de cultura (com condições de crescimento)
CN - 100 (250) 4,01 ± 0,35
CP 0,5 48,06 (120) 26,68 ± 0,44
a
Piplartina 10 83,55 (208) 5,27 ± 0,50
25 72,61 (181) 7,16 ± 0,77
a
50 69,57 (173) 9,22 ± 1,06
a
100 60,18 (150) 13,94 ± 1,63
a
A tabela apresenta os valores correspondentes à média ± D.P. de três experimentos
independentes realizados em triplicata. *, Revertentes de lócus-específico. #,
Número entre parênteses corresponde ao número de colônias contadas. a, P < 0,05
comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste de comparações
múltiplas de Tukey.
Resultados
- 160 -
Tabela 16 – Indução de mutação pontual (his-7 e lys1-1) e mutação por deslocamento do quadro de leitura ou frameshift (hom3-
10) na linhagem haplóide XV185-14c de Saccharomyces cerevisiae após tratamento com piplartina em fase exponencial de
crescimento. O 4-nitroquinolina-N-óxido foi usado como controle positivo (CP). O controle negativo (CN) foi tratado com o veículo
usado para diluir a substância.
Substâncias
Concentrações
(µg/mL)
Sobrevivência
(%)
Revertentes
His/10
7
Sobreviventes*
Revertentes
Lys/10
7
Sobreviventes#
Revertentes
Hom3/10
7
Sobreviventes*
Culturas com PBS (sem condições de crescimento)
CN - 100 (124)§
12,39 ± 1,63 1,87 ± 0,46 2,16 ± 0,57
CP 0,5 58,51 (72) 114,25 ± 1,92
a
41,17 ± 4,85
a
21,07 ± 1,37
a
Piplartina 10 96,54 (120) 11,09 ± 0,34 1,52 ± 0,15 1,67 ± 0,10
25 86,74 (102) 13,92 ± 0,65 2,16 ± 0,51 2,16 ± 0,51
50 80,78 (100) 14,98 ± 1,47 2,93 ± 0,99 1,98 ± 1,00
100 75,20 (93) 16,06 ± 1,77 3,57 ± 1,19 3,58 ± 0,70
Cultura com meio de cultura (com condições de crescimento)
CN - 100 (382) 9,88 ± 1,27 7,33 ± 0,10 4,27 ± 0,76
CP 0,5 45,23 (172) 56,92 ± 3,54
a
50,36 ± 5,12
a
22,10 ± 2,01
a
Piplartina 10 89,95 (343) 22,67 ± 1,88
a
11,61 ± 2,36 5,03 ± 0,51
25 84,78 (323) 22,07 ± 0,91
a
13,78 ± 1,33
a
5,46 ± 0,50
50 58,09 (222) 26,51 ± 1,31
a
18,15 ± 0,63
a
8,41 ± 1,06
a
100 47,17 (180) 30,56 ± 1,65
a
20,93 ± 1,71
a
10,0 ± 0,95
a
A tabela apresentao os valores correspondentes à média ± D.P. de três experimentos independentes realizados em triplicata. *,
Revertentes de lócus-específico. #, Revertentes de lócus-não específico. §, Número entre parênteses corresponde ao número de
colônias contadas. a, P < 0,05 comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste de comparações múltiplas de
Tukey.
Resultados
- 161 -
Tabela 17 – Indução de recombinações mitóticas intergênica ou crossing-over (+/cyh2) e intragênica ou conversão gênica (leu1-
1/leu1-12) na linhagem diplóide XS2316 de Saccharomyces cerevisiae após tratamento com piplartina em fase exponencial de
crescimento. O 4-nitroquinolina-N-óxido foi usado como controle positivo (CP). O controle negativo (CN) foi tratado com o veículo
usado para diluir a substância.
Substâncias
Concentrações
(µg/mL)
Sobrevivência
(%)
Recombinações intergênica/10
5
Sobreviventes
Recombinações intragênica/10
5
Sobreviventes
Culturas com PBS (sem condições de crescimento)
CN - 100 (473)# 11,31 ± 1,58 2,66 ± 0,55
CP 0,5 45,44 (215) 86,73 ± 1,82
a
44,19 ± 2,82
a
Piplartina 10 83,23 (394) 14,67 ± 2,02 4,35 ±0,52
25 79,81 (378) 19,39 ±1,38
a
5,38 ± 0,03
50 76,12 (361) 25,30 ± 0,47
a
6,15 ± 0,74
a
100 63,01 (298) 30,29 ± 1,82
a
6,63 ± 0,58
a
Cultura com meio de cultura (com condições de crescimento)
CN - 100 (782) 30,08 ± 1,71 3,79 ± 0,12
CP 0,5 44,43 (347) 101,74 ± 5,89
a
32,01 ± 2,21
a
Piplartina 10 87,85 (687) 46,95 ± 1,52
a
5,77 ± 0,30
25 83,71 (655) 51,51 ± 2,01
a
6,38 ± 0,19
a
50 79,84 (624) 52,72 ± 1,57
a
6,99 ± 0,30
a
100 66,55 (520) 60,76 ± 5,63
a
9,48 ± 0,36
a
A tabela apresenta os valores correspondentes à média ± D.P.M. de três experimentos independentes realizados em triplicata. #,
Número entre parênteses corresponde ao número de colônias contadas. a, P < 0,05 comparado com o controle negativo por
ANOVA seguido pelo teste de comparações múltiplas de Tukey.
Resultados
- 162 -
4.3.5. Avaliação da genotoxicidade/mutagenicidade em medula óssea de
camundongos – Teste do micronúcleo in vivo
A tabela 18 apresenta os resultados encontrados. A piplartina aumentou
significantemente a fequência de eritrócitos policromáticos micronúcleados
(EPCM) após 24 horas de tratamento, quando comparado com o grupo controle.
Entretanto, não foi observado aumento significante na freqüência de micronúcleos
após 48 de tratamento, provavelmente devido à regeneção medular. Houve uma
relação dose resposta entre a indução de EPCM e as diferentes doses do fármaco
administrado. Não houve diferenças estatisticamente significante entre os animais
machos ou fêmeos, sugerindo que o estrógeno não interfere nesta ação. De
qualquer modo, a piplartina não alterou a relação de eritrócitos policromáticos
(EPC) e eritrócitos normocromáticos (ENC) em nenhum período analisado (tabela
19).
De acordo com os resultados, a piplartina apresentou resultado positivo
neste ensaio, ou seja, apresenta atividade genotóxica/mutagênica in vivo. Esta
resposta positiva pode ser atribuída a uma atividade clastogênica e/ou
aneuploidogênica da piplartina.
Resultados
- 163 -
Tabela 18 – Freqüência de eritrócitos policromáticos micronúcleados (EPCM) em
medula óssea em camundongos após tratamento com piplartina. O metano
sulfonato de etila foi usado como controle positivo (CP). O controle negativo (CN)
foi tratado com o veículo usado para diluir a substância.
24 horas 48 horas
Substâncias
Dose
(mg/kg)
Nº de
animais
Total de
EPC
contados
Nº de
EPCM/animal
EPCM
(%)
Nº de
EPCM/animal
EPCM
(%)
Machos
CN
- 5 10000 4,80 ± 0,20 0,24 4,20 ± 0,80 0,21
CP
200 5 10000 37,40 ± 4,45
a
1,87 30,80 ± 3,29
a
1,54
Piplartina 50 5 10000 4,00 ± 0,55 0,20 4,00 ± 0,32 0,20
100 5 10000 15,60 ± 1,81* 0,78 7,00 ± 3,03 0,35
Fêmeas
CN
- 5 10000 6,60 ± 1,29 0,33 4,00 ± 0,84 0,20
CP
200 5 10000 43,00 ± 2,19
a
2,15 41,20 ± 0,80
a
2,06
Piplartina 50 5 10000 5,60 ± 1,89 0,28 5,00 ± 1,52 0,25
100 5 10000 16,00 ± 1,98
a
0,80 7,80 ± 1,24 0,39
A tabela apresenta os valores correspondentes à média ± E.P.M. de n animais. a,
P < 0,05 comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste de
comparações múltiplas de Tukey.
Resultados
- 164 -
Tabela 19 - Proporção de eritrócitos policromáticos (EPC) e eritrócitos
normocromáticos (ENC) de medula óssea em camundongos após tratamento com
piplartina. O metano sulfonato de etila foi usado como controle positivo (CP). O
controle negativo (CN) foi tratado com o veículo usado para diluir a substância.
24 horas 48 horas
Substâncias
Dose
(mg/kg)
Nº de
animais
Total de
EPC
contados
Nº de
EPC/animal
EPC/
(EPC +
ENC) (%)
Nº de
EPC/animal
EPC/
(EPC +
ENC) (%)
Machos
CN
- 5 1000 506,2 ± 14,36 50,62 500,2 ± 10,97 50,02
CP
200 5 1000 278,4 ± 30,46
a
27,84 372,8 ± 33,42
a
37,28
Piplartina 50 5 1000 498,2 ± 7,36 49,82 456,6 ± 11,11 45,66
100 5 1000 476,0 ± 24,51 47,60 438,6 ± 28,12 43,86
Fêmeas
CN
- 5 1000 495,8 ± 10,93 49,58 479,6 ±14,14 47,96
CP
200 5 1000 309,0 ± 56,07
a
30,90 233,8 ± 26,26
a
23,38
Piplartina 50 5 1000 496,2 ± 12,65 49,62 475,0 ± 20,02 47,50
100 5 1000 455,2 ± 13,95 45,52 473,6 ± 26,05 47,36
A tabela apresenta os valores correspondentes à média ± E.P.M. de n animais. a,
P < 0,05 comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste de
comparações múltiplas de Tukey.
Resultados
- 165 -
4.4. Estudo farmacocinético
Dentre o estudo farmacocinético, foi estudada à cinética de absorção da
piplartina após uma única dose de 50 mg/kg em ratos. Para tanto, inicialmente a
metodologia bioanalítica de detecção da piplartina em plasma de ratos foi
desenvolvida e validada.
4.4.1. Desenvolvimento e validação da metodologia bioanalítica
Os dados apresentados nesta seção mostram os resultados obtidos com os
procedimentos laboratoriais utilizados para demonstrar que o método analítico
descrito é adequado e confiável para as análises propostas. O método analítico
proposto foi desenvolvido e validado segundo os seguintes critérios:
especificidade, recuperação, limite de quantificação, linearidade, precisão,
exatidão e estabilidade.
A determinação da piplartina em plasma de ratos foi realizada por
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detecção por espectrometria de
massas no modo MS/MS utilizando a carbamazepina como padrão interno.
A piplartina e o padrão interno, carbamazepina, foram extraídos do plasma
de ratos por meio de extração líquido-líquido utilizando tolueno. Após a extração,
as amostras foram secas sob fluxo de ar comprimido, ressuspendidas em fase
móvel, acetonitrila/água (70:30 v/v) mais 0,2 % de ácido acético, e analisados por
HPLC com detecção por espectrometria de massas.
4.4.1.1. Especificidade
A figura 28 mostra os resultados encontrados. O método proposto mostrou-
se específico, pois a análise da amostra de plasma de rato com piplartina mostrou
que não foi encontrada interferência significativa no tempo de retenção do fármaco
ou do padrão interno quando se compararam os cromatogramas obtidos do
Resultados
- 166 -
plasma de ratos branco. Assim, o analito apresentou tempo de retenção de 3,45
minutos e m/z 317,42 > 220,9 e o padrão interno apresentou tempo de retenção
de 2,93 minutos e m/z 236,4 > 193,83. Os tempos de retenção permaneceram
inalterados durante todo o procedimento de validação e quantificação do fármaco.
4.4.1.2. Recuperação
Tendo em vista os critérios de validação para a eficiência do procedimento
de extração utilizado no método analítico, a tabela 20 apresenta os resultados das
análises da recuperação do fármaco e do padrão interno. Como pode ser
observado na tabela, o analito apresentou as seguintes percentagens de
recuperação referentes às análises do controle de qualidade baixo, médio e alto,
respectivamente: 86.07 %, 68.62 % e 72,23 %.
4.4.1.3. Determinação do limite de quantificação
Os resultados das corridas analíticas, realizadas com cinco amostras
extraídas com piplartina 2 ng/mL, permaneceram dentro dos critérios exigidos para
determinação da menor quantidade de um analito numa amostra que pode ser
determinada quantitativamente com precisão e exatidão aceitáveis. Deste modo, a
resposta do pico para o limite de quantificação foi 5 vezes maior que qualquer
interferência na amostra branco no tempo de retenção do fármaco, sendo esta
resposta identificável e reprodutível com precisão de 20% e exatidão entre 80-
120% em relação à concentração nominal do padrão.
Resultados
- 167 -
Figura 28 – Perfil cromatográfico mostrando a especificidade referente ao método
analítico para quantificação da piplartina em plasma de ratos por HPLC com
detecção por espectrometria de massas. (a) Plasma de ratos branco. (b) Plasma
de ratos branco adicionado da piplartina (2 ng/mL). (c) Plasma de ratos branco
adicionado de padrão interno (carbamazepina, 145 ng/mL). As análises foram
realizadas em HPLC acoplada ao espectrômetro de massas (MS/MS) operando no
modo positivo. Foi utilizada uma coluna C18 e acetonitrila e água (70:30, v/v) mais
0,2 % de ácido acético, como fase móvel, em um fluxo de 1 mL/min. As amostras
foram submetidas à extração líquido-líquido.
Resultados
- 168 -
Tabela 20 – Recuperação absoluta média do procedimento de purificação das
amostras de plasma de ratos para a piplartina, empregando extração liquido-
liquido. Os valores são apresentados como médias dos percentuais de
recuperação e os respectivos valores de prescisão, expressos em coeficientes de
variação (C.V., %) de três análises independentes.
Piplartina Concentração da piplartina
(ng/mL)
Recuperação absoluta
(%)
Prescisão
(C.V., %)
20 86,07 2,59
625 68,62 1,8
1250 72,23 3,29
Resultados
- 169 -
4.4.1.4. Curva de calibração/linearidade
O método atendeu as especificações descritas tendo sido linear nas
concentrações testadas de 2, 10, 50, 250, 500 e 1.250 ng/mL, e permitiu
linearidade até 2.500 ng/mL com um coeficiente de correlação (r
2
) maior que 0,98
(r
2
=0,9968). Uma típica equação da reta foi: y = 0,00838139 * x + 0,0230658,
onde y representa a razão entre a área do pico da piplartina e do padrão interno, e
x representa a concentração da piplartina (figura 29).
A linearidade da metodologia foi validada uma vez que as análises, em
triplicata, dos seis padrões de calibração apresentaram desvio menor que 20% em
relação à concentração nominal do limite de quantificação (2 ng/mL), desvio
menor que 15% em relação a concentração nominal para as outras concentrações
da curva de calibração e coeficiente de correlação maior que 0,98.
4.4.1.5. Precisão e exatidão
Para obter a precisão e a exatidão, foram utilizadas 3 concentrações
distintas dentro da faixa das concentrações esperadas, incluindo o limite de
quantificação e as concentrações do controle de qualidade. Por definição, o
coeficiente de variação (CV), para a precisão, não pode exceder 15% para cada
concentração analisada (tolerância até 20% da concentração do limite de
quantificação). Em se tratando da exatidão, deve estar dentro de 15% do valor
atual em relação à média das amostras de cada concentração (tolerância até 20%
da concentração do limite de quantificação). As análises da precisão e exatidão
intra-ensaio e inter-ensaio estão apresentadas nas tabelas 21.
Resultados
- 170 -
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
0
100
200
300
400
500
600
700
800
r
2
= 0,9968
y = 0,00838139 * x + 0,0230658
Concentração (ng/mL)
Resposta do detector
Figura 29 - Curva analítica mostrando a linearidade referente ao método analítico
para quantificação da piplartina em plasma de ratos por HPLC com detecção por
espectrometria de massas. A curva foi construída com intervalos de concentração
de 2 a 2.500 ng/mL da piplartina. As amostras foram submetidas à extração
líquido-líquido.
Resultados
- 171 -
Tabela 21 - Precisão e exatidão intra-ensaio e inter-ensaio referentes ao método
analítico para quantificação da piplartina em plasma de ratos por HPLC com
detecção por espectrometria de massas. Cada valor representa a média de seis
determinações para a precisão e exatidão intra-ensaio e cinco análises por dia
durante 3 dias para a precisão e exatidão inter-ensaio.
Concentração
(ng/mL)
Concentração
determinada
(ng/mL)
Precisão
(%)
Exatidão
(%)
Intra-ensaio
20 18,59 6,70 -7,05
625 638,75 3,42 2,20
1.250 1205,22 4,03 -3,58
Inter-ensaio
20 18,86 5,97 -5,70
625 630,41 3,73 0,87
1.250 1230,44 6,46 -1,56
Resultados
- 172 -
4.4.1.6. Estabilidade
A tabela 22 apresenta os resultados das análises feitas com as amostras do
controles de qualidade contendo piplartina submetidos aos três ciclos de
congelamento e descongelamento ou após permanência á temperatura ambiente
por 4 horas, respectivamente. A finalidade destes testes foi verificar a ocorrência
de degradação de fração significativa do fármaco durante os ciclos ou durante a
anlise das amostras.
Os resultados mostram que não houve alteração significante na
concentração no analito durante os três ciclos de congelamento e
descongelamento ou após permanência à temperatura ambiente por 4 horas.
Resultados
- 173 -
Tabela 22 – Estabilidade da piplartina em amostra de plasma, analisadas
imediatamente após o preparo, mantidas a temperatura de – 20 ºC e submetidas a
três ciclos de congelamentos e descongelamentos ou após permanência á
temperatura ambiente por 4 horas. Cada resultado representa a média de três
análises.
Concentração
(ng/mL)
Piplartina
(valor de P)
a
Ciclos de congelamentos e descongelamentos
20 0,0821
1.250 0,0613
4 horas à temperatura ambiente
20 0,0722
1.250 0,0687
a
P ≤ 0,05 foi considerado estatisticamente significante (Student's t-test).
Resultados
- 174 -
4.4.2. Estudo de disposição cinética da piplartina
As concentrações plasmáticas médias da piplartina, após a administração
intraperitoneal de uma única dose de 50 mg/kg em ratos (n = 3 para cada tempo
de coleta), estão sendo apresentadas na tabela 23.
A curva média de decaimento plasmático da piplartina, após a
administração intraperitoneal de uma única dose de 50 mg/kg em ratos (n = 3 para
cada tempo de coleta), esta sendo apresentado na figura 30.
A tabela 24 apresenta os valores dos parâmetros farmacocinéticos
calculados a partir da curva de disposição cinética da piplartina, após a
administração intraperitoneal de uma única dose de 50 mg/kg em ratos (n = 3 para
cada tempo de coleta).
Resultados
- 175 -
Tabela 23 – Concentrações plasmáticas da piplartina após a administração
intraperitoneal de uma única dose de 50 mg/kg em ratos (n = 3 para cada tempo
de coleta).
Tempo (h) Concentração plasmática
(ng/mL)
0 N.Q.
0,083 3.580 ± 157,7
0,166 3.255 ± 35,84
0,25 2.275 ± 54,49
0,5 1.805 ± 22,58
1 1.123 ± 114,6
2 650,5 ± 140,7
3 479,9 ± 17,34
6 331,7 ± 51,52
12 274,6 ± 39,28
24 46,57 ± 2,66
N.Q. Valores não quantificáveis. Os valores estão sendo mostrados como média ±
E.P.M.
Resultados
- 176 -
0 3 6 9 12 15 18 21 24
0
1000
2000
3000
4000
Tempo (horas)
Concentração plasmática (ng/mL)
Figura 30 – Curva de decaimento plasmático da piplartina após a administração
intraperitoneal de uma única dose de 50 mg/kg em ratos (n = 3 para cada tempo
de coleta).
Resultados
- 177 -
Tabela 24 – Parâmetros farmacocinéticos calculados a partir da curva de
disposição cinética da piplartina, após a administração intraperitoneal de uma
única dose de 50 mg/kg em ratos (n = 3 para cada tempo de coleta).
Símbolo Resultados
AUC
0-24h
8.471,26 ng/h/L
AUC
0-∞
8.505,25 ng/h/L
C
max
3.580,0 ng/mL
Cl
5,88 L/kg/h
K
el
1,37 h
t
1/2
0,5 h
T
max
0,083 h
Vd
13.888,9 L
Resultados
- 178 -
4.5. Avaliação da associação do 5-Fluourouracil com a piplartina
Na avaliação da associação do 5-Fluourouracil com a piplartina, foram
realizados estudos in vitro e in vivo. O efeito da associação do 5-fluorouracil (5-
FU) com a piplartina foi avaliado in vitro sobre a proliferação de células tumorais
humana. Os efeitos dos tratamentos com a piplartina (50 mg/kg/dia), o 5-FU (10
mg/kg/dia) ou a associação do 5-FU (10 mg/kg/dia) com a piplartina (50 mg/kg/dia)
foram avaliados em camundongos saudáveis ou transplantados com o tumor
Sarcoma 180. Adicionalmente, análises histopatológicas, bioquímicas e
hematológicas foram realizadas com o intuito de avaliar efeitos tóxicos causados
pelo tratamento dos animais com os compostos.
4.5.1. Avaliação da associação do 5-fluorouracil (5-FU) com a piplartina
sobre a proliferação de células tumorais humanas in vitro
A tabela 25 apresenta os valores de CI
50
obtidos para o 5-FU na presença e
na ausência da piplartina. A concentração de 5-FU que causa 50% de inibição da
proliferação celular (CI
50
) em células HL-60, MDA-MB-435, SF-295 e HCT-8 foi
84,68, 9,19, 2,33 e 11,18 µM, respectivamente. A piplartina aumentou a eficácia
do 5-FU, como observado pelo menor valor de CI
50
. Por exemplo, quando o 5-FU
foi usado em combinação com a piplartina o valor de CI
50
diminuiu de 2,33 para
0,49 µM em células SF-295.
Resultados
- 179 -
Tabela 25 – Efeito da associação do 5-fluorouracil (5-FU) com a piplartina sobre a
proliferação de células tumorais humanas.
5-Fluorouracil
CI
50
(µM)
Linhagens
- Piplartina (5µM)
HCT-8 11,18 ± 0,71 4,70 ± 0,55
a
SF-295 2,33 ± 0,51 0,49 ± 0,11
a
HL-60 84,68 ± 0,66 38,13 ± 0,43
a
MDA-MB-435 9,19 ± 0,85 1,95 ± 0,27
a
A tabela apresenta os valores de CI
50
± E.P.M. de dois experimentos
independentes realizados em quadruplicata pelo método do MTT após 72 horas
de exposição com as células HL-60 (leucemia promielocítica), HCT-8 (cólon), SF-
295 (glioblastoma) e MDA-MB-435 (melanoma) obtidos por regressão não-linear
através do programa GraphPad Prisma versão 5.0. a, P < 0,05 quando comparado
com o 5-FU na ausência da piplartina por ANOVA (análise da variância) seguido
por Student Newman-Keuls.
Resultados
- 180 -
4.5.2. Avaliação do efeito da associação do 5-fluorouracil com a piplartina
sobre a massa tumoral de camundongos transplantados com o tumor
Sarcoma 180
O efeito da associação do 5-FU com a piplartina em camundongos
transplantados com o tumor Sarcoma 180 esta apresenta na figura 31. Houve
redução significante (P < 0,05) dos tumores de animais tratados com o 5-FU e
com a piplartina, bem como de animais tratados com o 5-FU associado com a
piplartina. No 8º dia após o transplante do tumor, a massa tumoral média dos
animais controle foi de 1,90 ± 0,12 g, enquanto que dos animais tratados com a
piplartina foi de 1,43 ± 0,12 g e 0,99 ± 0,10 g dos tratados com o 5-FU. Quando os
animais foram tratados com o 5-FU associado com a piplartina, a massa tumoral
foi de 0,61 ± 0,10 g. Houve diferenças estatisticamente significantes (P < 0,05)
entre a piplartina, o 5-FU ou o tratamento do 5-FU associado com a piplartina em
relação ao controle e entre si.
O percentual de inibição tumoral da piplartina foi de 24,61 %, enquanto que
para o 5-FU foi de 47,71 %. O percentual de inibição do 5-FU aumentou para
68,04 % quando associado à piplartina. Assim, os resultados mostram que o efeito
da associação do 5-FU com a piplartina sobre a massa tumoral de camundongos
transplantados com o tumor Sarcoma 180 é do tipo adição. Isso indica que a
piplartina pode aumentar a atividade antitumoral de agentes antineoplásicos, como
observado para o quimioterápico 5-FU.
As análises histopatológicas dos tumores (figura 32) retirados de
camundongos transplantados com o tumor Sarcoma 180 do grupo controle
mostraram características de neoplasia maligna constituída por células redondas e
poligonais, com núcleos hipercromáticos, exibindo por vezes binucleação e graus
variados de pleomorfismo celular e nuclear. Foram visualizadas mitoses, invasão
muscular e áreas de necrose de coagulação. Nos tumores dos animais tratados
com a piplartina, o 5-FU ou pela associação do 5-FU com a piplartina, as áreas de
necrose de coagulação foram mais extensas do que as observadas nos animais
do grupo controle, demonstrando morte celular.
Resultados
- 181 -
0.0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
Massa tumoral
Percentual de inibição
0
10
20
30
40
50
60
70
Piplartina - - 50 50
5-Fluorouracil - 10 - 10
(mg/kg)
(mg/kg)
a
a
a,c
a,c
a,b,c
a,b,c
Tumor (g)
Inibição tumoral (%)
Figura 31 – Efeito da associação do 5-fluorouracil (5-FU) com a piplartina sobre a
massa tumoral de animais transplantados com o tumor Sarcoma 180. O controle
negativo foi tratado com o veículo usado para diluir os compostos (DMSO 10%).
Os valores correspondem à média ± E.P.M. de dez animais. a, P < 0,05 quando
comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (análise da variância)
seguido por Student Newman-Keuls. b, P < 0,05 quando comparado com o grupo
tratado com a piplartina por ANOVA (análise da variância) seguido por Student
Newman-Keuls. c, P < 0,05 comparado com o grupo tratado com o 5-FU por
ANOVA (análise da variância) seguido por Student Newman-Keuls.
Resultados
- 182 -
Figura 32 - Histopatologia dos tumores de camundongos transplantados com o
tumor Sarcoma 180. O controle negativo (A) foi tratado com o veiculo usado para
diluir o composto (DMSO 10%). Os animais foram tratados com o 5-fluorouracil
(10 mg/Kg, B), piplartina (50 mg/Kg, C) ou pela associação (D) do 5-fluorouracil
(10 mg/Kg) com a piplartina (50 mg/Kg). Aumento de 400X.
Tumor
Necrosi
Células necróticas
Células tumorais Células tumorais
Células tumorais
Células tumorais
Células necróticas
Células necróticas
A B
C
D
Resultados
- 183 -
4.5.3. Avaliação dos aspectos toxicológicos
4.5.3.1. Efeito da associação do 5-fluorouracil com a piplartina sobre a
massa corpórea e a massa úmida dos órgãos de camundongos saudáveis ou
transplantados com o tumor Sarcoma 180
A tabela 26 apresenta os resultados encontrados. Nenhuma diferença foi
encontrada na massa corpórea dos animais tratados quando comparados com o
grupo controle (P > 0,05). Em relação à massa úmida dos órgãos (fígado, baço e
rins) dos animais tratados com a piplartina ou 5-FU associado com a piplartina em
camundongos, saudáveis ou transplantados com o tumor Sarcoma 180, não foram
observadas alterações (P > 0,05). Por outro lado, o tratamento dos animais com 5-
FU causou significante (P < 0,05) redução da massa dos baços, quando
comparado com o grupo controle.
Houve diferença estatisticamente significante (P < 0,05) em relação ao
tamanho dos baços dos camundongos saudáveis e transplantados com o tumor
Sarcoma 180. A massa úmida do baço dos camundongos transplantados com o
tumor Sarcoma 180 (0,56 ± 0,03 g para o grupo salina) apresentou-se aumentada
em relação a dos camundongos saudáveis (0,23 ± 0,02 g para o grupo salina),
sugerindo uma esplenomegalia e hematopoiese esplênica induzida pelo tumor
Sarcoma 180. Não foram encontradas diferenças na massa úmida dos demais
órgãos analisados em relação a camundongos transplantados com o tumor
Sarcoma 180 ou camundongos saudáveis.
Resultados
- 184 -
Tabela 26 – Efeito da associação do 5-fluorouracil (5-FU) com a piplartina sobre a
massa corpórea e a massa úmida dos órgãos (fígado, rins e baço) de
camundongos saudáveis ou transplantados com o tumor Sarcoma 180.
Substâncias
Dose
(mg/kg)
Aumento
na massa
corpórea
(g)
Fígado
(g/100g de
massa
corpórea)
Baço
(g/100g de
massa
corpórea)
Rins
(g/100g de
massa
corpórea)
Camundongos saudáveis
Salina - 3,24 ± 1,19 4,51 ± 0,18 0,23 ± 0,02
1,09 ± 0,03
DMSO 10% - 3,15 ± 1,02 4,29 ± 0,20 0,40 ± 0,08 1,11 ± 0,05
5-FU 10 2,87 ± 1,06 4,57 ± 0,27 0,45 ± 0,01
1,05 ± 0,08
Piplartina 50 2,98 ± 1,04 4,28 ± 0,40 0,31 ± 0,04 1,15 ± 0,05
Piplartina + 5-FU 50 + 10 3,05 ± 1,00 4,32 ± 0,22 0,33 ± 0,08 1,14 ± 0,04
Camundongos transplantados com o tumor Sarcoma 180
Salina - 4,99 ± 1,05 5,22 ± 0,09 0,56 ± 0,03
b
1,32 ± 0,05
DMSO 10% - 4,64 ± 1,03 5,05 ± 0,12 0,62 ± 0,08
b
1,15 ± 0,09
5-FU 10 4,48 ± 1,11 4,26 ± 0,52 0,40 ± 0,10
a
1,06 ± 0,03
Piplartina 50 4,56 ± 1,15 4,58 ± 0,26 0,63 ± 0,05
b
1,04 ± 0,05
Piplartina + 5-FU 50 + 10 4,81 ± 1,06 5,07 ± 0,87 0,62 ± 0,24
b
1,19 ± 0,10
A tabela apresenta os valores correspondentes à média ± E.P.M. de dez animais.
a, P < 0,05 quando comparado com o grupo controle negativo (DMSO 10%)
experimental por ANOVA (análise da variância) seguido por Student Newman-
Keuls. b, P < 0,05 quando comparado com o grupo salina de animais saudáveis
por ANOVA (análise da variância) seguido por Student Newman-Keuls.
Resultados
- 185 -
4.5.3.2. Efeito da associação do 5-fluorouracil com a piplartina sobre os
parâmetros bioquímicos de sangue periférico de camundongos saudáveis
ou transplantados com o tumor Sarcoma 180
A tabela 27 apresenta os resultados encontrados. Não foram encontradas
alterações significantes (P > 0,05) nos níveis plasmáticos dos parâmetros
bioquímicos analisados em nenhum dos grupos tratados seja de camundongos
saudáveis ou transplantados com o tumor Sarcoma 180. Entretanto, foi observado
um discreto aumento nos níveis plasmáticos da AST em camundongos saudáveis
tratados com DMSO 10% (108,0 ± 4,6 UI/L) quando comparados com o grupo
salina (82,3 ± 11,5 UI/L), sugerindo uma leve hepatotoxicidade intrínseca do
DMSO 10%. O mesmo foi observado quando o grupo salina de camundongos
saudáveis (82,3 ± 11,5 UI/L) foi comparado com o grupo salina de camundongos
transplantados com o tumor Sarcoma 180 (113,9 ± 9,7 UI/L), agora sugerindo uma
leve hepatotoxicidade intrínseca do tumor sarcoma 180. De qualquer modo,
nenhuma dessas alterações foi estatisticamente significante (P > 0,05).
Em relação aos níveis da ALT ou uréia não foi encontrada nenhuma
alteração seja em relação aos grupos controle DMSO 10% ou salina, seja em
relação aos grupos de camundongos saudáveis ou transplantados com o tumor
Sarcoma 180.
Resultados
- 186 -
Tabela 27 – Efeito da associação do 5-fluorouracil (5-FU) com a piplartina sobre
os parâmetros bioquímicos (aspartato aminotransferase - AST, alanina
aminotransferase – ALT e uréia) de sangue periférico de camundongos saudáveis
ou transplantados com o tumor Sarcoma 180.
Substâncias
Dose
(mg/kg)
AST
(UI/L)
ALT
(UI/L)
Uréia
(mg/dL)
Camundongos saudáveis
Salina - 82,3 ± 11,5 52,1 ± 9,3 34,1 ± 6,2
DMSO 10% -
108,0 ± 4,6 47,9 ± 12,7 29,8 ±8,5
5-FU 10 115,9 ± 10,5 45,8 ± 11,3 29,2 ± 9,3
Piplartina 50 112,9 ± 9,3 41,8 ± 7,4 40,4 ± 5,2
Piplartina + 5-FU 50 + 10 99,0 ± 12,9 58,9 ± 9,2 37,5 ± 3,2
Camundongos transplantados com o tumor Sarcoma 180
Salina - 113,9 ± 9,7 45,2 ± 15,9 28,5 ± 6,1
DMSO 10% - 106,4 ± 9,6 50,8 ± 10,7 31,6 ± 9,1
5-FU 10 119,6 ± 14,1 35,9 ± 14,3 27,5 ± 5,3
Piplartina 50 112,9 ± 9,3 41,8 ± 7,4 40,4 ± 5,2
Piplartina + 5-FU 50 + 10 99,0 ± 12,9 58,9 ± 9,2 37,5 ± 3,2
A tabela apresenta os valores correspondentes à média ± E.P.M. de cinco
animais.
Resultados
- 187 -
4.5.3.3. Efeito da associação do 5-fluorouracil com a piplartina sobre os
parâmetros hematológicos de sangue periférico de camundongos saudáveis
ou transplantados com o tumor Sarcoma 180
A tabela 28 apresenta os resultados encontrados. Em todos os
camundongos transplantados com o tumor Sarcoma 180, incluindo os grupos
controle tratados apenas com solução salina ou DMSO 10%, houve um aumento
significante (P < 0,05) no número total de leucócitos circulantes quando
comparado com os camundongos saudáveis. Além disso, houve uma diferença
significante (P < 0,05) na relação do percentual de linfócitos e neutrófilos
circulantes nos grupos controles de camundongos transplantados com o tumor
Sarcoma 180 (linfócito 56,8 % e neutrófilos 39,5 % para o grupo salina) em
relação aos camundongos saudáveis (linfócito 70,52 % e neutrófilos 16,2 % para o
grupo salina), sugerindo que o tumor Sarcoma 180 pode estar atuando na
produção de fator estimulador de colônia.
Quando os camundongos saudáveis ou transplantados com o tumor
Sarcoma 180 foram tratados com o 5-FU, uma redução significante (P < 0,05) no
número de leucócitos foi observada. Já o tratamento dos animais transplantados
com o tumor Sarcoma 180 com a piplartina não modificou o número de leucócitos
circulantes e ainda normalizou a alteração na proporção dos leucócitos. A
associação do 5-FU com a piplartina reduziu a leucopenia induzida pelo 5-FU e
ainda normalizou as percentagens de leucócitos circulantes. Não foram
encontradas alterações nos parâmetros hematológicos analisados em
camundongos saudáveis tratados com a piplartina.
Resultados
- 188 -
Tabela 28 – Efeito da associação do 5-fluorouracil (5-FU) com a piplartina sobre os parâmetros hematológicos (hemoglobina,
plaquetas e leucócitos) de sangue periférico de camundongos saudáveis ou transplantados com o tumor Sarcoma 180.
Contagem diferencial de leucócitos (%)
Substâncias
Dose
(mg/kg)
Hemoglobina
(g/dL)
Plaquetas
(10
7
céls/µL)
Leucócitos
totais
(10
3
céls/µL)
Eosinófilo Linfócito Neutrófilo Monócito
Camundongos saudáveis
Salina - 14,15 ± 0,41 8,91 ± 0,47 5,66 ± 0,52 0,98 77,52 16,2 5,3
DMSO 10% - 13,25 ± 0,53 7,42 ± 0,59 4,25 ± 0,43 0,8 69,62 23,0 7,0
5-FU 10 12,49 ± 0,53
8,02 ± 0,39 3,04 ± 0,23
a
1,3 55,4
a
40,0
a
3,3
Piplartina 50 14,34 ± 0,83
6,98 ± 0,45 6,69 ± 0,44
1,3 78,5 12,9 7,3
Piplartina + 5-FU 50 + 10 13,9 ± 0,21
7,42 ± 0,59 5,73 ± 0,77
c
0,79 65,9 26,9 6,4
Camundongos transplantados com o tumor Sarcoma 180
Salina - 13,02 ± 0,32 7,1 ± 0,65 8,18 ± 0,53
a
1,0 56,8
a
39,5
a
2,7
DMSO 10% -
12,04 ± 0,53 8,6 ± 0,53 7,95 ± 0,78
a
1,0 53,9
a
42,3
a
2,8
5-FU 10 12,42 ± 0,49
9,2 ± 0,62 3,32 ± 0,42
a,b
1,6 52,3
a
42,9
a
3,2
Piplartina 50 14,58 ± 0,72 9,5 ± 1,20 9,65 ± 1,05
a
0,9 69,2 26,4 3,5
Piplartina + 5-FU 50 + 10 12,45 ± 0,69 9,4 ± 0,78 6,19 ± 0,98
a,c
1,9 72,6
b
21,0
b
4,5
A tabela apresenta os valores correspondentes à média ± E.P.M. de cinco animais. a, P < 0,05 quando comparado com o grupo
salina de camundongos saudáveis por ANOVA (análise da variância) seguido por Student Newman-Keuls. b, P < 0,05 quando
comparado com o grupo salina de camundongos transplantados com tumor Sarcoma 180 por ANOVA (análise da variância)
seguido por Student Newman-Keuls. c, P < 0,05 comparado com o grupo tratado com o 5-FU experimental por ANOVA (análise da
variância) seguido por Student Newman-Keuls.
Resultados
- 189 -
4.5.3.4. Análise histopatológica dos órgãos de camundongos, saudáveis ou
transplantados com o tumor Sarcoma 180, tratados com o 5-fluorouracil
associado com a piplartina
As análises histopatológicas dos fígados e rins dos animais tratados com a
piplartina, o 5-FU ou tratados com a associação do 5-FU com a piplartina mostraram
leve hepatotoxicidade e nefrotoxicidade desses compostos nas doses testadas.
Alguns dos achados histopatológicos incluíram hiperplasia das células de
Kupffer, áreas de congestão venosa centrolobular, infiltrado local de células
inflamatórias crônicas, intensa tumefação turva dos hepatócitos e hemorragia
sinusoidal para o fígado (figura 33) e discretas alterações no epitélio tubular
proximal, com preservação da estrutura glomerular, para os rins (figura 34). Todos
os achados histológicos foram encontrados tanto no grupo controle quanto nos
grupos tratados, entretanto foram mais evidentes nos animais tratados com o 5-FU e
tratados com a associação do 5-FU com a piplartina. Não foram encontradas
diferenças em relação aos camundongos saudáveis ou transplantados com o tumor
Sarcoma 180.
As análises histopatológicas dos baços (figura 35) dos animais tratados com
a piplartina apresentaram poupa branca circunscrita, megacariócitos por toda
extensão e folículos linfóides evidentes. Por outro lado, não foram evidenciadas
alterações significantes nos outros grupos experimentais em comparação com o
grupo controle.
Resultados
- 190 -
Figura 33 - Histopatologia dos fígados de camundongos transplantados com o tumor
Sarcoma 180. O controle negativo (A) foi tratado com o veiculo usado para diluir o
composto (DMSO 10%). Os animais foram tratados com o 5-fluorouracil (10 mg/Kg,
B), piplartina (50 mg/Kg, C) ou pela associação (D) do 5-fluorouracil (10 mg/Kg) com
a piplartina (50 mg/Kg). Aumento de 400X.
A B
C
D
Hepatócitos
Células de Kupffer
Congestão centro lobular
Degeneração dos hepatócitos
Degeneração dos hepatócitos
Resultados
- 191 -
Figura 34 - Histopatologia dos rins de camundongos transplantados com o tumor
Sarcoma 180. O controle negativo (A) foi tratado com o veiculo usado para diluir o
composto (DMSO 10%). Os animais foram tratados com o 5-fluorouracil (10 mg/Kg,
B), piplartina (50 mg/Kg, C) ou pela associação (D) do 5-fluorouracil (10 mg/Kg) com
a piplartina (50 mg/Kg). Aumento de 400X.
A B
C
D
Glomérulo
Perda da borda em escova
Hemorragia
Hemorragia
Resultados
- 192 -
Figura 35 - Histopatologia dos baços de camundongos transplantados com o tumor
Sarcoma 180. O controle negativo (A) foi tratado com o veiculo usado para diluir o
composto (DMSO 10%). Os animais foram tratados com o 5-fluorouracil (10 mg/Kg,
B), piplartina (50 mg/Kg, C) ou pela associação (D) do 5-fluorouracil (10 mg/Kg) com
a piplartina (50 mg/Kg). Aumento de 400X.
A B
C
D
Arteríola central
Arteríola central
Megacariócitos
Megacariócitos
Resultados
- 193 -
4.6. Resumo dos resultados obtidos com a piplartina
No estudo da relação estrutura-atividade, o grupo carbonila α-β-insaturada do
anel amídico mostrou ser essencial para atividade citotóxica da piplartina. O índice
de seletividade foi de aproximadamente 45 vezes, quando comparada a sua
atividade citotóxica em linhagem leucêmica versus PBMC. Seu mecanismo de ação
esta relacionado com bloqueio do ciclo celular na fase G
2
e induziu morte celular por
apoptose com participação da via intrínseca (via mitocondrial).
A piplartina apresentou-se como um agente genotóxico, quando avaliado pelo
teste do cometa, sugerindo a quebra da fita dupla do DNA como principal
responsável por esse efeito. Esta não foi mutagênica para a bactéria S. typhimurium,
quando testada no ensaio de Ames (modelo procariótico) na ausência e na presença
da fração S9. Entretanto, apresentou-se como um potente agente mutagênico e
recombinogênico para a levedura S. cerevisiae (modelo eucariótico). A atividade
genotóxica/mutagênica da piplartina foi confirmada no modelo do micronúcleo em
medula óssea de camundongos.
Em relação ao estudo farmacocinético, o método bioanalítico desenvolvido e
validado para a quantificação da piplartina em plasma de ratos apresentou-se
específico, sensível, preciso e exato, justificando sua aplicação em estudos
farmacocinéticos. Quando submetida a um estudo de disposição cinética, a
piplartina apresentou um perfil de absorção característico de um modelo
monocompartimental. Esta apresentou os seguintes valores para os parâmetros
farmacocinéticos: AUC
0-24
= 8.471,26 ng/h/L, AUC
0-∞
= 8.505,25 ng/h/L, C
max
=
3.580,00 ng/mL, Cl = 5,88 L/h, Vd = 13.888,9 L, K
el
= 1,37 h, t
1/2
= 0,5 h e T
max
=
0,083 h.
Por fim, a piplartina aumentou o efeito antitumoral do quimioterápico 5-FU e
ainda diminuiu seus efeitos colaterais.
A tabela 29 mostra, de forma resumida, todos os resultados encontrados aqui
com o estudo da atividade citotóxica da piplartina.
Resultados
- 194 -
Tabela 29 – Resumo dos resultados encontrados para o estudo da atividade
citotóxica da piplartina.
Estudo Resultados
1. Estudo da atividade citotóxica
1.1. Relação estrutura-atividade O grupo carbonila α-β-insaturada
do anel amídico é essencial para
a atividade citotóxica
1.2. Seletividade Aproximadamente 45X
2. Estudo do mecanismo de ação citotóxico
2.1. Efeito sobre a indução de morte celular Apoptose com participação da
via intrínseca
2.2. Efeito sobre o ciclo celular Parada em G
2
3. Estudo da atividade genotóxica e mutagênica
3.1. Ensaio do cometa Genotóxico
3.2. Estudo do mecanismo de ação genotóxico
3.2.1. Efeito sobre a indução de morte celular Apoptose com participação da
via intrínseca
3.2.2. Efeito sobre o ciclo celular Parada em G
2
/M
3.3. Ensaio de Ames (modelo procariótico) Não mutagênico
3.4. Ensaio com S. cerevisiae (modelo eucariótico) Mutagênico
3.5. Ensaio do micronúcleo in vivo Mutagênico
4. Estudo farmacocinético
4.1. Validação do método Sensível, preciso e exato
4.2. Estudo de disposição cinético Modelo monocompartimental
5. Estudo da associação do 5-FU com a piplartina
5.1. Ensaios in vitro Potencializa o 5-FU
5.2. Ensaios in vivo Potencializa o 5-FU
5.2.1. Toxicidade
5.2.1.1. Parâmetros bioquímicos Não alterado
5.2.1.2. Parâmetros hematológicos Previne leucopenia induzida pelo
5-U
5.2.1.3. Análise histopatológica Leve hepatotoxicidade e
nefrotoxicidade
- 195 -
Discussão
Discussão
- 196 -
5. Discussão
Os produtos naturais apresentam atividades biológicas altamente específicas
baseadas em novos mecanismos de ação. Assim, os produtos naturais continuam
sendo uma das principais fontes de novos compostos para o desenvolvimento de
novos fármacos (PEZZUTO, 1997; NEWMAN et al., 2003; AGGARWAL &
SHISHODIA, 2006; NEWMAN & CRAGG, 2007).
A piplartina, um conhecido alcalóide amida encontrado em algumas pimentas
(Piper spp. – Piperaceae), apresenta atividades biológicas diversas. Dentre estas
atividades, destaca-se a atividade anticâncer. A piplartina apresentou citotoxicidade,
em várias linhagens de células tumorais humanas, e atividade antimitótica, em ovos
de ouriço do mar (DUH et al., 1990a; DUH et al., 1990b; TSAI et al., 2005;
BEZERRA et al., 2005; BEZERRA et al., 2007). Além disso, quando submetida a
testes pré-clínicos in vivo, esta reduziu o crescimento de células da linhagem
tumoral Sarcoma 180, o que a confere um promissor potencial antitumoral
(BEZERRA et al., 2006). A atividade antiproliferativa da piplartina parece está
relacionada com a da síntese de DNA e indução de morte celular por ambas as vias,
apoptose e necrose (BEZERRA et al., 2007).
Com o objetivo de melhor entender a atividade anticâncer deste produto
natural, aqui foi realizado um estudo farmacológico no que se diz respeito às
propriedades anticâncer da piplartina. Inicialmente, foram avaliadas a relação
estrutura-atividade citotóxica da piplartina e sua seletividade em relação a células
normais e tumorais. Foi também estudado o mecanismo de ação citotóxico deste
composto.
O produto natural não precisa ser necessariamente o melhor composto para o
uso farmacêutico (KINGSTON, 1996). Esses compostos podem servir como
protótipo para o desenho e desenvolvimento de uma segunda geração de agentes
com características melhoradas, como o aumento da eficácia e da estabilidade, a
melhora das propriedades farmacocinéticas e a diminuição dos efeitos colaterais
(ORTHOLAND & GANESAN, 2004). A obtenção de análogos é um processo
comumente utilizado para descobrir os grupamentos essenciais à atividade
biológica, através do estudo da relação estrutura-atividade biológica.
Discussão
- 197 -
Apesar das inúmeras vantagens das novas técnicas de estudo da relação
estrutura-atividade, onde novos agentes terapêuticos podem ser desenvolvidos pela
análise de dados teóricos, obtidos por técnicas recentes de modelagem molecular,
as técnicas tradicionais de modificação molecular e relação estrutura-atividade,
apesar de serem dispendiosas e requer extenso período de investigação, são,
ainda, de suma importância na descoberta e na caracterização de novos fármacos
(WERMUTH et al., 1998; THOMAS, 2000).
Os estudos clássicos da relação estrutura-atividade exigem a síntese de
diversos análogos, estruturalmente relacionados a um composto protótipo, e a
realização de sucessivos testes de atividade biológica. Assim, é possível
estabelecer algumas generalizações sobre a influência de mudanças estruturais
específicas nos efeitos biológicos, incluindo o tamanho e formato da cadeia
carbônica, a natureza e o grau de substituição e a estereoquímica de um composto
protótipo (THOMAS, 2000).
Assim, com o intuito de avaliar a relação estrutura-atividade citotóxica da
piplartina, cinco derivados foram sintetizados e avaliados quanto ao seu potencial
citotóxico. Entretanto, nenhum dos análogos (sintetizados) da piplartina (30-34)
apresentam atividade citotóxica nas linhagens de células tumorais testadas.
Certos grupos funcionais são essenciais para a atividade biológica, como os
aceptores de Michael, como a carbonila α-β-insaturada, que é reconhecida como
grupo químico responsável pela atividade citotóxica de compostos orgânicos em
geral por interagirem com o DNA e/ou proteínas (NAKAYACHI et al., 2004; AHN &
SOK, 1996). Duh et al. (1990b) sugeriram que os dois grupos carbonila α-β-
insaturada presente na estrutura da piplartina era responsável pela atividade
citotóxica desta molécula. De fato, a redução das insaturações nos grupos carbonila
α,β-insaturada da piplartina levou a um composto (30) (tabela 30, em amarelo e
verde) não citotóxico. Isto confirma que os dois grupos carbonila α-β-insaturada são
grupos importantes para a atividade citotóxica da piplartina (tabela 30, em vermelho
e azul), sugerindo que a piplartina pode estar atuando como um aceptor de Michael
e, assim, sua atividade citotóxica pode estar relacionada com a interação desta
molécula com o DNA celular.
Discussão
- 198 -
Adicionalmente, derivados hidrolizados ou/e com a presença de 2-
diaminoetano, ester dimetil ou grupo tiofeno mostraram-se como uma alternativa
inviável quando se desejou aumentar a atividade citotóxica do composto natural,
pela obtenção dos compostos (31-34). De todo modo, estes compostos apresentam
um dos dois grupos carbonila α-β-insaturada (tabelas 30 e 31, em vermelho) e não
são citotóxicos, sugerindo que apenas um dos grupos é essencial para a atividade
citotóxica. Assim, apenas a carbonila α-β-insaturada do anel amídico é importante
para a atividade citotóxica da piplartina. De fato, o N-(3-metoxi-4,5-
metilenodioxidihidrocinamoil)-∆
3
-piridin-2-ona (35) (tabela 31, em azul), um
composto estruturalmente relacionado com a piplartina, é citotóxico e apenas
apresenta a carbonila α-β-insaturada do anel amídico (DUH et al., 1990a). Além
disso, diferentes grupos funcionais do anel benzeno (N-(3,4-dimetoxicinamoil)-∆
3
-
piridin-2-ona (36) e N-(3-metoxi-4,5-metilenodioxicinamoil)-∆
3
-piridin-2-ona (37)) não
alteram a atividade citotóxica do composto (tabela 31, em verde pardo), sugerindo
que estes radicias pouco interferem na atividade anticâncer (DUH et al., 1990b).
Entretanto, o 5,6-dihidro-2(1H)-piridona (38) (tabela 31, em azul), a carbonila α-β-
insaturada no anel amídico sem o restante da estrutura da piplartina, o qual parece
ser o grupo farmacofórico para a atividade citotóxica deste composto, não é
citotóxico (TSAI et al., 2005). Portanto, podemos concluir que apesar da carbonila α-
β-insaturada do anel amídico ser essencial para atividade citotóxica da piplartina
outros grupos da molécula também contribuem, de alguma forma, para a sua
atividade anticâncer.
Discussão
- 199 -
Tabela 30 – Estrutura química de compostos relacionados à piplartina.
Composto Estrutura química
Faixa de CI
50
[µg/mL]
(µM)
Referências
Piplartina
N
OO
H
3
CO
H
3
CO
OCH
3
0,1 – 2,7
(0,3 – 8,5)
DUH et al., 1990a,b;
TSAI et al., 2005;
BEZERRA et al.,
2005; 2007
(30)
N
OO
OCH
3
CH
3
O
CH
3
O
>25 (77,9) Presente trabalho
(31)
H
N
O
OCH
3
CH
3
O
CH
3
ONH
2
>25 (93,6) Presente trabalho
(32)
O
O
OCH
3
CH
3
O
CH
3
OOH
>25 (88,6) Presente trabalho
(33)
OH
O
OCH
3
CH
3
O
CH
3
O
>25 (105,0) Presente trabalho
Discussão
- 200 -
Tabela 31 – Estrutura química de compostos relacionados à piplartina (continuação).
Composto Estrutura química
Faixa de CI
50
[µg/mL]
(µM)
Referências
(34)
S
O
OCH
3
CH
3
O
CH
3
O
>25 (75,8) Presente
trabalho
(35)
N
O
O
O
O
Me
O
2,2 – 5,8
(7,7 – 20,0)
DUH et al.,
1990a
(38)
NH
O
>50 (515,5) TSAI et al.,
2005
(36)
N
O
H
O
O
Me
O
Me
0,8 – 3,2
(2,9 – 11,3)
DUH
et al.,
1990b
(37)
N
O
OH
2
CO
OH
2
CO
O
Me
O
0,4 – 2,6
(1,2 – 7,4)
DUH et al.,
1990b
Discussão
- 201 -
A quimioterapia clássica tem como mecanismo fundamental a inibição não-
seletiva da proliferação celular. A maior parte dos alvos moleculares sobre os quais
os quimioterápicos atuam estão também presentes em células não tumorais, de
forma que esses agentes apresentam baixa ou nenhuma seletividade. De fato, os
mecanismos que conferem à seletividade, ainda que mínima, apresentada por
alguns quimioterápicos não são bem esclarecidos. Esses fármacos exibem, de modo
geral, estreitas janelas terapêuticas, onde as diferenças entre as doses que
produzem o efeito antitumoral e as que causam toxicidade são bastante pequenas.
Dessa forma, nas doses em que precisam ser administrados para que os efeitos
terapêuticos sejam obtidos, severa toxicidade é com freqüência observada. Portanto,
se aumentar à distância entre as curvas dose-resposta e a curva dose-toxicidade, o
manejo clínico dos quimioterápicos poderá ser significativamente aprimorado.
De acordo com vários autores, na avaliação do potencial citotóxico de uma
substância, é de extrema importância à utilização de células normais a fim de se
avaliar a seletividade para célula normal ou tumoral (ZUCO et al., 2002; ANAZETTI
et al., 2003). Quando a atividade citotóxica da piplartina foi avaliada em células
humanas normais (PBMC), esta apresentou um índice de seletividade de
aproximadamente 45 vezes em relação à linhagem HL-60. Este valor ficou próximo
do índice de seletividade da doxorrubicina, usada como controle positivo, que foi de
aproximadamente 50 vezes também em relação à linhagem HL-60.
Com o intuito de avaliar o estudo do mecanismo de ação citotóxico da
piplartina, foram realizados estudos a níveis celulares e moleculares utilizando a
linhagem HL-60 como modelo. Foram avaliados a integridade da membrana celular,
o potencial transmembrânico da mitocôndria e o conteúdo de DNA nuclear da célula,
que reflete as fases do ciclo celular, por citometria de fluxo. O efeito da piplartina
sobre a ativação da caspase-3 também foi avaliado. Adicionalmente, o índice
mitótico foi determinado por coloração diferencial por hematoxilina/eosina.
A piplartina reduz de maneira dependente da concentração a proliferação
celular. A viabilidade celular, avaliada pela integridade da membrana plasmática, foi
determinada pela incorporação do iodeto de propídeo. A piplartina não causou dano
na membrana citoplasmática nas primeiras horas avaliadas em nenhuma das
concentrações testadas. Entretanto, causou perda da integridade da membrana, na
Discussão
- 202 -
maior concentração testadas, 12 e 24 horas após o período de incubação. De fato,
quando analisada através de morfologia diferencial por hematoxilina/eosina e/ou
laranja de acridina/brometo de etídio após 24 horas de exposição, nas
concentrações de 5 e 10 µg/mL, a piplartina apresentou padrões celulares típicos de
necrose (BEZERRA et al., 2007). Adicionalmente, na análise do desvio da luz
polarizada, a piplartina apresentou eventos celulares típicos de células em processo
apoptótico desde as primeiras horas analisadas em todas as concentrações
testadas. Além disso, foi observado fragmentação do DNA celular desde as
primeiras horas (períodos em que não havia alteração na integridade da membrana
citoplasmática) de incubação com o composto na maior concentração testada.
Assim, as células que apresentaram perda da integridade da membrana
citoplasmática após 12 e 24 horas após a incubação com a piplartina podem ser
consideradas células apoptóticas em estágios finais ou necrose secundária.
O processo de apoptose induz a morte celular de forma altamente regulada
que elimina células ou tecidos indesejados protegendo o organismo contra a
formação de neoplasias. O mecanismo defeituoso de apoptose pode ocasionar
diversas patologias, inclusive câncer (MAJNO & JORIS, 1995; OPALKA et al., 2002).
Em contraste a apoptose, a morte por necrose é, freqüentemente, atribuída
simplesmente a perturbações metabólicas ou injúrias mecânicas, onde há uma
rápida desestabilização da membrana plasmática, sendo relacionada com a
resposta inflamatória. Muitos estímulos indutores de apoptose (por exemplo
citocinas, isquemia, calor, irradiação e patógenos) fazem com que células da mesma
população morram por necrose (SERGEY et al., 2003).
Em relação ao processo apoptótico, ocorre à perda da assimetria dos
fosfolipídeos de membrana e a exposição da fosfatidilserina na sua superfície
externa, ativação das vias intrínsecas e/ou extrínsecas, ativação da cascata de
caspases, seguida da clivagem das alças de DNA (VERMES, 1995), porém sem a
ruptura da integridade da membrana celular (KOOPMAN, 1994; MAJNO & JORIS,
1995; MERCHANT, 2001). A quebra em fragmentos de 30 a 50 kpb é um evento
inicial na apoptose (BROWN, 1993) e ocorre pela ação de uma endonuclease que
cliva o DNA. Já na etapa final do processo, ocorre uma degradação incompleta do
DNA nas regiões internucleossomais, produzindo fragmentos de, aproximadamente,
Discussão
- 203 -
200pb que aparecem no gel de eletroforese como uma banda (ORMEROD, 1998).
Na necrose ocorre à perda da integridade da membrana celular.
Os estudos relacionados ao tipo de morte celular foram prosseguidos com o
intuito de melhor caracterizar a via apoptótica envolvida. A mitocôndria desempenha
papel chave na deflagração da apoptose em algumas condições celulares. A via
extrínseca da apoptose é também conhecida como via mitocondrial, tendo como o
principal modulador dessa via, a proteína Bcl-2 da super família Bcl-2, que consiste
de membros pró-apoptóticos e anti-apoptóticos, e a interação do equilíbrio global
entre o balanço dessas proteínas pode determinar o destino da célula (ORRENIUS,
2004). A alteração no potencial transmembrânico mitocondrial pode ser medida para
avaliação indireta da ativação da via intrínseca. Modelos atuais sugerem que o
Bax/Bak, que é um subgrupo de moléculas (Bax, Bak, Bok e Bcl-x5), com função
pró-apoptótica central e são mantidas e verificadas pela proteína antiapoptótica Bcl-
2. Essas moléculas são, por sua vez, inativadas pela “BH3-only”, uma família de
proteínas como a Bim, Bid, Bik, Noxa e Puma. O “BH3-only” faz uma ligação
hidrofóbica com as proteínas da família Bcl-2 e atua como sensores celulares que
regulam a ativação da morte celular por apoptose na via intrínseca (STRASSER,
2005). Esta via é ativada por uma multiplicidade de estímulos, incluindo fármacos
citotóxicos, estresse genotóxico, retirada de fatores de crescimento, dano no DNA,
perda de ancoragem e pelos chamados modificadores de resposta imune como as
imidazoquiloninas (LEVERKUS, 2004). É importante que muitas proteínas devam
ser inativadas para expressão do Bax/Bak, e estas, por sua vez, conduzirem o
processo da apoptose através da mitocôndria (CORY et al, 2003).
A perda do potencial transmembrânico da mitocôndria é refletida pela menor
capacidade da mitocôndria de acumular rodamina 123. A piplartina causou
despolarização da mitocôndria inicialmente (após 3 horas de incubação) apenas
após a exposição das células com a maior concentração da piplartina, em seguida,
foi observado despolarização mitocondrial em células tratadas com a menor
concentração da piplartina. Estes resultados corroboram com os dados encontrados
no estudo da viabilidade e morfologia celular. Estes dados sugerem, ainda, a
participação da via intrínseca da apoptose na morte celular induzida pela piplartina.
A indução da apoptose pela piplartina foi posteriormente confirmada em
ensaio de ativação de caspase-3. Os resultados mostram ativação da caspase-3,
Discussão
- 204 -
após 24 horas de incubação, apenas na menor concentração testadas. A ativação
das caspases é reconhecida como um processo fundamental no desenvolvimento da
apoptose. Numerosos estímulos podem ativar as caspases, que vão da ativação de
receptores de membrana celular até os que causam disfunção mitocondrial
(SALVESEN & DIXIT, 1997). As caspases podem ser divididas em iniciadoras
(caspases-8 e -9), sendo as executoras as responsáveis pela ativação de
mecanismos que levam às mudanças de morfologia celular características da
apoptose e fragmentação do DNA (CAI et al., 1998). A ativação da caspase-9,
especificamente, ocorre via mitocôndria (via intrínseca), por meio da clivagem pelo
apoptossoma, formando, entre outros compostos, pelo citocromo c liberado da
mitocôndria, e responsável pelo desencadeamento da cascata apoptótica,
evidenciando assim uma disfunção nessa organela e culminando na ativação da
caspase-3. Entretanto, não foi possível avaliarmos o efeito da piplartina sobre a
ativação da caspase-9 para confirmar a participação da via mitocondrial na apoptose
induzida pela piplartina.
È bem estabelecido que o desequilíbrio no metabolismo energético ou no
estado redox celular pode ativar mecanismos que conduzam a morte celular por
necrose ou apoptose, com importantes participações da transição de permeabilidade
mitocondrial. A transição de permeabilidade mitocondrial tem sido associada com
necrose ou apoptose de acordo com os níveis de ATP da célula. Assim, enquanto a
apoptose depende da ação de caspases iniciadoras e efetoras, a necrose é
dependente preferencialmente da exaustão do ATP. Por outro lado, o ATP é
necessário para o desencadeamento da apoptose, de tal forma que a passagem
deste processo para necrose pode ser determinado por estresse oxidativo que seja
suficiente para inativar caspases e uma disfunção mitocondrial suficiente para
exaurir o ATP (GRATTAGLIANO et al., 2002). Isso pode justificar o fato de que
apesar da piplartina mostrar-se com padrões celulares e moleculares de morte
celular por apoptose nas primerias horas de incubação, após o final do período de
exposição ocorreu a passagem do processo de apoptose para uma necrose
secundária. Isso explica os resultados encontrados com a ativação de caspase-3,
onde apenas na menor concentração testada foi encontrado resultado positivo.
A piplartina causou parada do ciclo celular em G
2
/M, como observada pela
análise do ciclo celular por citometria de fluxo, em todas as concentrações após 3
Discussão
- 205 -
horas de incubação, seguido de fragmentação do DNA celular, preferencialmente,
das células em fase de G
2
/M. A análise do índice mitótico foi decisiva para
demonstrar que há uma parada do processo de divisão celular na fase G
2
do ciclo
celular.
Todo o DNA nuclear devem ser replicado antes de iniciar a divisão celular,
completando a fase S para proceder à fase M. O controle do sistema de ciclo celular
tem atividade de enzimas e proteínas responsáveis por conduzir cada etapa do
processo no tempo apropriado, e acompanhado da desativação dessas, logo que o
processo for completado. Se a síntese de DNA for lenta ou paralisada (por causa de
um prejuízo no DNA que requer reparo, por exemplo), mitose e divisão celular serão
então adiadas. Isto é necessário também para garantir que cada estágio do ciclo
seja completado antes que se inicie o próximo (ALBERTS et al., 1998; ALBERTS et
al., 2002).
Este sistema-controle do ciclo celular está baseado em duas famílias de
proteínas que são chave para seu funcionamento. A primeira é a família das
proteinoquinases dependentes das ciclinas (cdk), as quais induzem processos
dependentes da fosforilação de serinas e treoninas em proteínas selecionadas. A
segunda é uma família de proteínas ativadoras especializadas, chamadas ciclinas,
que se ligam às moléculas de cdk e controlam sua habilidade em fosforilar
proteínas-alvo apropriadas. A formação, ativação e a separação dos complexos
ciclinas-cdk são os eventos fundamentais que coordenam o ciclo celular (ALBERTS
et al., 1998; ALBERTS et al., 2002).
A exposição de células a certos agentes antineoplásicos também causam
parada do ciclo celular na fase G
2
. Este pode ser causado por danos aos
cromossomos e é irreversível. O bloqueio do ciclo celular na fase G
2
é característico
de agentes que induzem quebra de fita dupla to DNA, como os inibidores de
topoisomerase II (CLIFFORD et al., 2003; LARSEN et al., 2003; BARTEK & LUKAS,
2007; PLESCA et al., 2007).
A relação entre a atividade citotóxica, genotóxica e mutagênica ainda não
está bem esclarecida. Sabe-se que vários agentes alquilantes, bem como a
irradiação ionizante, são considerados leucemogênicos. Além disso, muitos outros
agentes antineoplásicos de uso clínico são genotóxicos e mutagênicos como, por
Discussão
- 206 -
exemplo, o etoposídeo (8), tenoposídeo (9), ansacrina, doxorrubicina, entre outros
(ANDERSON & BERGER, 1994; DE MESA et al., 2002). Apesar do risco de um
agente quimioterápico induzir um novo tipo de câncer ao paciente, o benefício
resultante da remissão ou cura da neoplasia é considerado. De qualquer modo, já
existem indicações de que certos agentes alquilantes, por exemplo, a ciclofosfamida,
podem ser menos carcinogênicos que outros. A avaliação sistemática da
carcinogenicidade dos agentes citotóxicos em diversas espécies animais permite a
identificação e o desenvolvimento de agentes menos tóxicos que irão substituir
outros agentes mais carcinogênicos nos esquemas de quimioterapia (AYDEMIR &
BILALOGLU, 2003).
Vários ensaios para identificação de agentes mutagênicos e/ou genotóxicos
vem sendo desenvolvidos (MACGREGOR et al., 2000). As mutações são detectadas
freqüentemente através da expressão fenotípica, causada por uma mudança súbita
ou hereditária no genótipo de um organismo, alterando suas características. A
ocorrência de mutações, no entanto, depende da natureza da lesão e das respostas
celulares aos danos no DNA. Basicamente, as mutações são divididas em duas
grandes categorias: mutações gênicas e cromossômicas (SILVA et al., 2003a).
As mutações gênicas são alterações que ocorrem na seqüência de
nucleotídeos do DNA e as cromossômicas são as que produzem alterações no
número ou na estrutura dos cromossomos e são detectadas através de análises
citogenéticas (FRIEDBERG et al.,1995). Dependendo do tipo de lesão que se quer
detectar são necessários, portanto, diferentes testes.
Bactérias como Salmonella typhimurium e Escherichia coli são utilizadas nos
métodos mais amplamente empregados para detecção de mutações gênicas. Mas,
como estas bactérias são organismos simples, os resultados obtidos nem sempre
são válidos para células animais ou outros eucariontes. Portanto, para se obter
dados sobre mutação gênica em eucariotos há testes em leveduras (Saccharomyces
cerevisiae), em Drosophila ou mesmo mutações somáticas em mamíferos, pelo teste
de HGPRT (gene de hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase, ligado ao
cromossomo X dos mamíferos). Para detectar mutações cromossômicas os testes
mais utilizados incluem as aberrações cromossômicas e micronúcleos, sendo que
estes testes exigem que as células estejam em estado proliferativo (LE-CURIEUX et
Discussão
- 207 -
al., 1993; TICE et al., 1998, MACGREGOR et al., 2000). Além disso, estes ensaios
também são úteis na elucidação de mecanismos de ação.
Estes testes têm um sistema de validação internacional e podem ser
desenvolvidos tanto in vitro como in vivo, desde que se conheça adequadamente a
biologia do organismo-teste. Um outro teste, o ensaio do cometa, que detecta
quebras no DNA, também tem sido recomendado (FAIRBAIRN et al., 1995; TICE,
1995; SINGH & STEPHENS, 1996; SINGH, 2000).
Com o intuito de avaliar o potencial carcinogênico da piplartina, esta foi
submetida a uma bateria de testes para avaliar sua atividade genotóxica e
mutagênica. No estudo da atividade genotóxica, o ensaio do cometa, em células
V79, foi realizado para avaliar danos à fita simples e à fita dupla do DNA induzidos
pela piplartina. Posteriormente, o mecanismo de ação genotóxico foi também
avaliado. A atividade mutagênica da piplartina foi investigada em dois modelos
clássicos: ensaio de mutação gênica reversa em S. typhimurium (modelo
procariótico) e ensaio de mutagenicidade e recombinogênese em S. cerevisiae
(modelo eucariótico).
A piplartina foi capaz de induzir danos ao DNA, como observado pelo ensaio
do cometa alcalino e cometa neutro, em células V79. A versão alcalina do teste,
descrita por Singh et al. (1988), permite medir a ocorrência de quebra da fita simples
e dupla, sítios alcali-lábeis e cross-links no DNA, já a versão neutra do teste, descrita
por Wojewodzka et al. (2002), permite medir apenas a ocorrência de quebra da fita
dupla no DNA. A piplartina apresentou-se atividade em ambas as versões do ensaio
do cometa, condições alcalina e condições neutra, sugerindo a quebra da fita dupla
do DNA como principal responsável pela atividade genotóxica da piplartina.
Contudo, o ensaio do cometa não prevê necessariamente o potencial mutagênico
das substâncias testadas, uma vez que detecta alterações no DNA que podem ou
não ser reparadas eficientemente.
Em relação ao estudo do mecanismo de ação genotóxico, foi avaliado o efeito
da piplartina sobre o ciclo celular e indução de morte celular. A piplartina não alterou
a proliferação celular de células V79 após 3 horas de incubação. A viabilidade
celular também não foi modificada. Entretanto, a análise morfológica mostrou
padrões celulares típicos de células em apoptose. Estes resultados foram
Discussão
- 208 -
confirmando com a análise do potencial transmembrânico da mitocôndria. Estes
dados sugerem, assim, a participação da via intrínseca da apoptose na morte celular
induzida pela piplartina. Adicionalmente, a piplartina causou parada do ciclo celular
em G
2
/M, como observada pela análise do ciclo celular por citometria de fluxo, em
ambas as concentrações após 3 horas de incubação, acompanhado de
fragmentação do DNA celular. Estes resultados encontrados em células V79
corroboram com os estudos de mecanismo de ação citotóxica em células
leucêmicas HL-60, sugerindo que o mecanismo de ação citotóxico e genotóxico
ocorre pela mesma via.
Muitos alcalóides causam danos diretos ao DNA de células de mamíferos,
principalmente por efeitos intercalantes (ANSAH et al., 2005; ANSARI et al., 2005;
DING et al., 1999; KLUZA et al., 2003; MA et al., 2004; VAN-DER-HEIJDEN et al.,
2004). De fato, os compostos que apresentam o grupo carbonila α-β-insaturada, o
grupo farmacofórico para a atividade citotóxica da piplartina, em suas estruturas são
conhecidos pela sua ação genotóxica. A genotoxicidade destes compostos é
baseada em uma interação direta com as bases dos ácidos nucléicos via adição de
Michael ou formação de bases de Schiff (HENSCHLER & EDER, 1986; CZERNY et
al., 1998). Estes compostos são altamente reativos com o DNA, o qual resulta em
danos ao DNA, formação de ductos com o DNA ou proteínas, mutações e inibição
enzimática
(EDER et al., 1993; JANZOWSKI et al., 2003). De fato a piplartina induz
quebra da fita dupla do DNA.
Nos experimentos realizados nas quatro linhagens de S. typhimurium (TA
97a, TA 98, TA 100 e TA 102) em ambas as situações (com ou sem ativação
metabólica), os resultados mostraram que não houve aumento do número de
revertentes obtidos nas placas tratadas. Este resultado é comparado ao respectivo
controle negativo e controles positivos utilizados para cada cepa na ausência e na
presença da fração S9. Estes resultados indicaram que a piplartina não é
mutagênica pelo teste de Ames nas condições testadas.
A especificidade das linhagens fornece informações sobre os tipos de
mutações que são induzidas por agentes genotóxicos. Existem bancos de dados
disponíveis contendo resultados do teste com Salmonella para uma grande
variedade de compostos químicos, medicamentos e misturas complexas
(GRIFFITHS et al, 2002). Na bateria de cepas testadas, todas possuem mutações
Discussão
- 209 -
em diferentes pontos no operon histidina além das mutações rfa, uvrB que
aumentam a sensibilidade das mesmas aos mutágenos (MARON & AMES, 1983;
GOMES-CARNEIRO, 1997).
A TA 97a apresenta a mutação hisGD6610 em um hot spot presente no gene
hisD, que é constituído por uma seqüência de seis citosinas. Esta mutação é
revertida por mutagênicos frameshift que causam a deleção de um par de bases,
dando origem a uma pseudo histidinol desidrogenase, contendo um resíduo extra de
prolina que, embora apresente 60% da atividade da enzima produzida pela cepa
selvagem, ainda permite um crescimento bacteriano normal em meio mínimo. A TA
98 é capaz de detectar substâncias que causam mutações do tipo frameshift
(mutação que ocasiona um deslocamento no quadro de leitura dos códons)
revertendo uma mutação pré-existente hisD3052 no gene hisD que, por sua vez,
codifica a síntese da enzima histidinol desidrogenase que participa da biossíntese da
histidina (MARON & AMES, 1983; GOMES-CARNEIRO, 1997).
A TA 100 apresenta a mutação hisG46 no gene hisG que codifica a primeira
enzima da biossíntese da histidina. Essa mutação é revertida por substituição de um
par de bases da trinca que codifica a prolina, restituindo a trinca original que codifica
a leucina. (GOMES-CARNEIRO, 1997). A cepa TA102 contém a mutação ochre TAA
no gene hisG e detecta eficientemente mutágenos como formaldeído, glioxal, vários
hidroperóxidos, bleomicina, fenilidrazina, raios-X, luz UV, estreptonigrina e agentes
cross-link, como mitomicina-C. Esta linhagem detecta principalmente danos
oxidativos (MARON & AMES, 1983; GOMES-CARNEIRO, 1997).
Este teste de mutação gênica utiliza células procarióticas, as quais diferem
das células de mamíferos em fatores como permeabilidade, metabolismo, estrutura
dos cromossomos e processo de reparo do DNA. O teste não fornece informação
direta sobre a potência mutagênica em mamíferos, apesar da alta concordância dos
resultados com o teste de Ames e ensaios de carcinogenicidade com roedores
(RABELO-GAY et al, 1991).
Os ensaios com leveduras têm sido de grande utilidade na determinação de
agentes mutagênicos ambientais ou farmacológicos, servindo para complementar os
ensaios de mutagenicidade realizados em bactérias (HENRIQUES et al., 1987; POLI
et al., 1999; TERZIYSKA et al., 2000).
Discussão
- 210 -
A levedura S. cerevisiae é um organismo eucariótico amplamente estudado e
notavelmente semelhante às células de mamíferos no que se referem às
macromoléculas, organelas e proteínas com homologia a proteínas humanas,
tornando-a uma ferramenta importante nas pesquisas sobre mutagênese, reparo do
DNA e mecanismos que respondem ao estresse oxidativo (COSTA & FERREIRA,
2001).
Quando o potencial mutagênico da piplartina foi avaliado nas linhagens
haplóides de S. cerevisiae (N123 e XV185-14c), esta se apresentou como um
potente agente mutagênico. A atividade mutagênica da piplartina ocorreu de maneira
dependente da fase de crescimento e da concentração. Além disso, a piplartina foi
citotóxica, em doses altas (50 µg/mL e 100 µg/mL), durante a fase exponencial de
crescimento em culturas com PBS (sem condições de crescimento) ou meio de
cultura (com condições de crescimento), não apresentando atividade na fase
estacionária do crescimento.
A piplartina foi mutagênica nas linhagens haplóides de S. cerevisiae apenas
na fase exponencial de crescimento em culturas meio de cultura, não apresentando
efeito com culturas em PBS. Isto sugere que a atividade mutagênica da piplartina
pode estar relacionada, pelo menos em partes, com sua habilidade de interagir
diretamente com o DNA, pois sua atividade citotóxica e mutagênica foi verificada
principalmente em condições de crescimento celular, onde a molécula de DNA é
mais acessível.
A reversão de auxotrofia para prototrofia pode ser causada por uma
substituição, inserção ou deleção de pares de bases, ou ainda uma mutação
induzida por supressor do gene mutante original (HENRIQUES et al., 1987). Para
que seja identificada a mutação reversa é necessária à utilização de uma linhagem
com alterações genéticas adequadas. Na linhagem haplóide N123 de S. cerevisiae
há a detecção de indução de mutação reversa e para frente ou forward (can1). Na
linhagem haplóide de S. cerevisiae XV185-14c há detecção de dois tipos de
mutações lócus específico: reversões do alelo ocre lys1-1 (alteração no códon UAA
de término de cadeia) ou do alelo missense his1-7 (códon alterado codifica um
aminoácido diferente), e reversões por deslocamento do quadro de leitura do DNA
(frameshift) verificadas no lócus hom3-10 (VON-BORSTEL et al., 1971;
Discussão
- 211 -
HAWTHORNE, 1969; SCHULLER & VON-BORSTEL, 1974; PARRY & PARRY,
1984; VON-BORSTEL & HIGGINS, 1998).
Reforçando a hipótese da interação da piplartina com o DNA, este composto
induziu recombinações mitóticas intergênica (crossing-over) (+/cyh2) e intragênica
(conversão gênica) (leu1-1/leu1-12) na linhagem diplóide XS2316 de S. cerevisiae,
provavelmente como conseqüência à quebra da fita dupla do DNA induzida pela
piplartina. Estes dados também corroboram com os resultados encontrados para o
ensaio do cometa. Vários outros alcalóides têm sido descrito por serem capazes de
induzir danos ao DNA e serem mutagênicos e recombinogênicos (MA et al., 2004;
BOEIRA et al., 2002; LAGO et al., 2007; CAO et al., 2007).
Em um estudo semelhante, o etoposídeo (8) e tenoposídeo (9), falham em
induzir mutagenicidade nas linhagens TA 98, TA 100 e TA 1535 de S. typhimurium
ou nas linhagens 113/143 e WP2 uvrA de Escherichia coli no teste de Ames, mas
são capazes de induzir mutagenicidade em células de mamíferos, como indicado
pela indução de danos ao DNA, indução de mutações na enzima hipoxantina-
guanina-fosforibosil-transferase e indução de troca entre cromátides irmãs em
células de ovário de Hamster (NAKANOMYO et al., 1986; GUPTA et al., 1987). Além
disso, estes quimioterápicos são capazes de induzir genotoxicidade em células da
medula óssea de camundongos (NAKANOMYO et al., 1986).
Muitos agentes quimioterápicos, como a ansacrina, etoposídeo (8) e
tenoposídeo (9), são potentes agentes clastogênicos em células de mamíferos, mas
não são mutagênicos em bactérias. Estas observações têm sido atribuídas às
interações destes compostos com a enzima nuclear topoisomerase II (GUPTA,
1990). Isto pode ser explicado devido às diferenças entre a fisiologia da enzima
nuclear topoisomerase II de células procarióticas e de células eucarióticas (GUPTA,
1990; HOROWITZ et al., 1997). Isso sugere que a piplartina pode apresentar um
efeito inibitório sobre a atividade da enzima topoisomerase II de células eucarióticas.
Assim, a para do ciclo celular em G
2
e indução de quebra da fita dupla do DNA
causadas pela piplartina podem ser conseqüências de um efeito inibitório sobre a
atividade da enzima topoisomerase II.
O potencial genotóxico/mutagênico in vivo da piplartina também foi avaliado.
Para tanto, o ensaio do micronúcleo em medula óssea foi realizado em
Discussão
- 212 -
camundongos saudáveis 24 e 48 horas após a administração do fármaco. Um
aumento na freqüência de eritrócitos policromáticos micronúcleados, de forma
tempo- e dose-dependente, foi observado após o tratamento dos animais com
piplartina. A piplartina aumentou significantemente a fequência EPCM após 24 horas
de tratamento, entretanto, alterou a freqüência de EPCM após 48 de tratamento,
provavelmente devido à regeneção medular.
O teste do micronúcleo em medula óssea de roedores in vivo visa detectar e
quantificar a ação genotóxica/mutagênica de agentes indutores, sendo amplamente
aceito pelas agências internacionais e instituições governamentais como parte de
uma bateria de testes recomendada para se estabelecer a avaliação e o registro de
novos produtos químicos e farmacêuticos que entram anualmente no mercado
mundial (CHOY, 2001).
Este teste avalia danos aos cromossomos, uma vez que este método permite
a avaliação confiável tanto da perda quanto da ruptura do cromossomo, (FENECH,
2005). Este teste é capaz de revelar a ação de agentes clastogênicos (que quebram
cromossomos) e aneugênicos (que induzem aneuploidia ou segregação
cromossômica anormal) em células em estágio de divisão celular (MACGREGOR et
al.,1987). Esse ensaio apresenta algumas vantagens em relação aos outros, entre
as quais podem ser citadas sensibilidade, custo e confiabilidade. Esse teste pode
ser executado praticamente em qualquer população de células que esteja em
constante divisão, sendo a medula óssea de mamíferos uma das regiões mais
adequadas, visto que suas células levam de 22 a 24 horas para completar um ciclo
de divisão (HEDDLE, 1973).
Portanto, os resultados encontrados no teste do micronúcleo em medula
óssea de camundongos podem ser atribuídos a uma ação clastogênica e/ou
aneugênica da piplartina. Estes resultados corroboram com os dados encontrados in
vitro no ensaio do cometa, em células V79, e no modelo de mutagenicidade e
recombinogênese, em S. cerevisiae.
Assim, os resultados apresentados aqui mostram uma ação citotóxica,
genotóxica e mutagênica da piplartina. Seu mecanismo de ação parece estar
relacionado ações (intercalação/danos) da piplartina sobre o DNA celular
acarretando em uma inibição da atividade da enzima topoisomerase II seguido de
Discussão
- 213 -
indução de quebra de fita dupla do DNA. As conseqüências desse efeito genotóxico
é a parada do ciclo celular em G
2
, seguido de morte celular por apoptose e/ou
indução de mutações (figura 36). Infelizmente, não foi possível realizar um ensaio
que avaliasse o efeito da piplartina sobre a atividade da enzima topoisomerase II
e/ou a intercalação deste alcalóide com o DNA.
Discussão
- 214 -
Figura 36 – Mecanismo de ação proposto para a atividade citotóxica/genotóxica
da piplartina.
Discussão
- 215 -
Dando continuidade ao estudo farmacológico da piplartina, esta foi avaliada
em relação a sua farmacocinética. Foi estuda à cinética de absorção da piplartina
após uma única dose em ratos. Para tanto, inicialmente a metodologia bioanalítica
de detecção da piplartina em plasma de ratos foi desenvolvida e validada.
A validação de um método bioanalítico deve garantir, por meio de estudos
experimentais, que o método atenda às exigências das aplicações analíticas,
assegurando a confiabilidade dos resultados (FINDLAY et al., 2000; SHAH et al.,
2000; MEI et al., 2003; KIMANANA, 1998; HARTMANN et al., 1998). Para tanto,
deve apresentar precisão, exatidão, linearidade, limite de detecção e limite de
quantificação, especificidade, reprodutibilidade, estabilidade e recuperação
adequadas à análise (BRASIL, 2003).
As técnicas mais utilizadas no desenvolvimento de uma metodologia
bioanalítica para quantificação de fármacos e/ou metabólitos em matrizes biológicas,
tais como sangue, soro, plasma ou urina são a cromatografia gasosa (CG),
cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e estas combinadas com a
espectrometria de massas (MS) tais como, LC-MS, LC-MS-MS, CG-MS e CG-MS-
MS (SHAH et al., 2000).
O método utilizando a cromatografia líquida de alta eficiência acoplada ao
detector de massas foi selecionado por possibilitar a quantificação da piplartina em
amostras de plasma com especificidade, precisão e exatidão. O método
desenvolvido mostrou-se especifico e, durante a aplicação do mesmo, comprovou-
se sensibilidade adequada á aplicação em estudos de farmacocinética, no qual a
detecção de pequenas concentrações plasmáticas é de extrema importância.
Durante o desenvolvimento de métodos cromatográficos, uma consideração
importante é a escolha do uso de padrão externo ou padrão interno. Sempre que é
possível obter um padrão estruturalmente semelhante ao analito, a utilização do
padrão interno é a opção de escolha. O padrão interno é adicionado inicialmente ás
amostras, passando por todas as etapas de pré-tratamento. Para determinar a
concentração do analito, utiliza-se a razão entre as respostas do analito e padrão
interno, possibilitando minimizar os erros oriundos de possíveis perdas durante o
preparo das amostras (CAUSON, 1997). No método aqui desenvolvido, utilizou-se a
carbamazepina como padrão interno, pois esta apresentou adequada seletividade
no método desenvolvido.
Discussão
- 216 -
As amostras biológicas contendo fármacos devem passar por um tratamento
prévio à sua análise cromatográfica, objetivando uma separação cromatográfica livre
de interferentes (QUEIROZ et al., 2001). Neste trabalho, as amostras foram
purificadas por extração líquido-líquido simples, utilizando-se tolueno como solvente
extrator, possibilitando maior recuperação do analito e do padrão interno.
A fase móvel utilizada neste método constitui-se por uma mistura de
acetonitrila e água, na proporção 70:30 (v/v), acrescida de 0,2 % de ácido acético.
Esse ultimo foi utilizado para favorecer a protonação da piplartina. O tempo de
corrida de cada análise cromatográfica foi de 5 minutos. Um tempo de análise
reduzido representa uma redução da quantidade de fase móvel utilizada e aumento
de vida útil da coluna cromatográfica.
O método desenvolvido e validado mostrou-se linear na faixa de concentração
de 2 – 2.500 ng/mL, com índice de correlação (r
2
) de 0,995. O limite de quantificação
encontrado foi de 2 ng/mL com precisão e exatidão aceitável. Esta faixa de
linearidade e este valor de limite de quantificação são adequados à aplicação do
método em estudos farmacocinéticos.
Além de um método bioanalítico ser específico e sensível este deve ser
preciso e exato. A precisão representa o grau de repetibilidade entre os resultados
de análises individuais em idênticas condições de ensaio e a exatidão, o grau de
concordância entre os resultados individuais encontrados e um aceito como
referência. Um método bioanalítico é considerado preciso e exato quando as
análises dos controles de qualidade baixo, médio, alto e limite de quantificação
mostrarem valores não excedentes a ± 15% do valor nominal analisado e para o
limite de quantificação este desvio não deve exceder ± 20% tanto para as mesmas
corridas (Intra-ensaio) quanto para corridas analíticas diferentes (Inter-ensaio)
(BRASIL, 2003; GUIDANCE FOR INDUSTRY, 2001; BRESSOLLE et al., 1996;
DADGAR & BURNETT, 1995).
Os valores obtidos para a análise da piplartina nos estudos intra-ensaio
variaram de 3,42 a 6,7 % para a precisão e de -7,05 a 2,2 % para a exatidão. As
amostras analisadas em dias diferentes (inter-ensaios) apresentaram precisão entre
3,73 a 5,97 % e exatidão entre -5,70 a 0,87 %. Os resultados apresentados estão de
acordo com o estabelecido pelas diretrizes para a validação de métodos analíticos
(BRESSOLE et al., 1996).
Discussão
- 217 -
As amostras de piplartina em plasma a – 20 ºC permaneceram estáveis ao
serem submetidas a três ciclos de congelamento e descongelamento. A análise de
amostras de plasma descongeladas e mantidas à temperatura ambiente por 4 horas
também demonstrou que esta permanece estável, indicando adequabilidade do
método ao tempo e condições de análise.
Assim, o método bioanalítico (LC-MS-MS) desenvolvido e validado para
determinação da piplartina em plasma de ratos apresentou-se especifico, sensível,
preciso e exato, justificando sua aplicação em estudos farmacocinéticos.
O método desenvolvido foi aplicado em um estudo de disposição cinética em
ratos. Neste estudo, a piplartina foi administrada por via intraperitoneal, em dose
única de 50 mg/kg. Após a administração da piplartina, a curva de concentração
plasmática (na escala logarítima) versus tempo declinou linearmente, assim o perfil
de decaimento plasmático pode ser descrito por uma única função exponencial. Esta
situação é descrita como modelo monocompartimental (SHARGEL & YU, 1999;
DIPIRO, 2002).
O modelo de um compartimento, ou monocompartimental, é considerado o
mais simples, pois inclui somente um compartimento e representa fármacos que
após a administração, se distribuem para todos os tecidos atingindo rapidamente o
equilíbrio em todo o organismo. A administração pode se por via intravascular ou
extravascular (WELLING, 1997; SHARGEL & YU, 1999; DIPIRO, 2002).
Os processos de absorção e eliminação que ocorrem após administração de
um fármaco por via extravascular, e que definem o perfil plasmático resultante, são
adequadamente descritos por modelos de primeira ordem, os quais permitem a
determinação dos parâmetros K
ab
(constantes de absorção de primeira ordem), F
(fração da dose absorvida) e K
el
(constante de eliminação terminal). Assim, utilizando
o modelo monocompartimental aberto com absorção e eliminação de primeira ordem
é possível à determinação dos parâmetros farmacocinéticos AUC
0-t
, AUC
0-∞
, C
max
,
Cl, Vd, K
el
, t
1/2
e T
max
(WELLING, 1997).
A piplartina apresentou os seguintes valores para os parâmetros
farmacocinéticos: AUC
0-24
= 8.471,26 ng/h/L, AUC
0-∞
= 8.505,25 ng/h/L, C
max
=
3.580,00 ng/mL, Cl = 5,88 L/h, Vd = 13.888,9 L, K
el
= 1,37 h, t
1/2
= 0,5 h e T
max
=
0,083 h.
Discussão
- 218 -
Assim, a piplartina atinge níveis plasmáticos em torno de 4.000 ng/mL que
são próximos dos valores encontrados para a sua atividade citotóxica in vitro para
células tumorais (efeito anticâncer) e valores abaixo em relação as encontrados para
a atividade citotóxica em PBMC (efeitos tóxicos). Isto confirma que a atividade
biológica da piplartina seja devido a uma atuação direta deste composto nos sítios
de ações celulares.
No passo seguinte, a associação do 5-FU com a piplartina foi avaliada em
estudos in vitro e in vivo. O efeito da associação do 5-fluorouracil (5-FU) com a
piplartina foi avaliado in vitro sobre a proliferação de células tumorais humana. Os
efeitos dos tratamentos com a piplartina (50 mg/kg/dia), o 5-FU (10 mg/kg/dia) ou a
associação do 5-FU (10 mg/kg/dia) com a piplartina (50 mg/kg/dia) foram avaliados
em camundongos saudáveis ou transplantados com o tumor Sarcoma 180.
Adicionalmente, análises histopatológicas, bioquímicas e hematológicas foram
realizadas com o intuito de avaliar efeitos tóxicos causados pelo tratamento dos
animais com os compostos.
A piplartina aumentou a eficácia do 5-FU in vitro e in vivo. Em relação a
proliferação celular in vitro, a piplartina diminuiu os valores de CI
50
do quimioterápico
5-FU, corroborando que a piplartina apresenta uma ação direta sobre as células do
tumor. A administração concomitante do 5-FU com a piplartina apresentou-se como
uma associação útil para a redução do tumor experimental Sarcoma 180. A atividade
antitumoral da piplartina já havia sido descrita no modelo experimental Sarcoma 180,
nas doses de 50 e 100 mg/kg, onde esta foi capaz de reduzir o crescimento tumoral,
provavelmente por uma ação direta sobre o tumor, como observada pela
quantificação do marcador de proliferação tumoral Ki67 (BEZERRA et al., 2006). Os
resultados encontrados com a combinação do 5-FU com a piplartina indicam uma
opção de melhora na eficácia da terapêutica antineoplásica.
Na quimioterapia do câncer, fármacos antineoplásicas são freqüentemente
usadas em combinações. Este tipo de tratamento (poliquimioterapia) apresenta
resultados mais eficazes, pois consegue maior resposta a cada aplicação,
diminuindo o risco de resistência aos fármacos e conseguindo atingir as células em
diferentes fases do seu ciclo (MORINAGA et al., 2003). Um bom exemplo disso é a
quimioterapia da leucemia linfoblástica aguda. A eficácia do tratamento da leucemia
linfoblástica aguda aumentou expressivamente ao longo dos anos. A sobrevida livre
Discussão
- 219 -
de evento aumentou de cerca de 10% na década de 60 para aproximadamente 80%
atualmente. Esse avanço se deve em grande parte a adoção da poliquimioterapia a
partir dos anos 80. A refratariedade ao tratamento é observada com freqüência na
quimioterapia, não obstante o uso da poliquimioterapia que tem por objetivo atingir
diferentes alvos moleculares e vias intracelulares justamente para reduzir essa
probabilidade (CHEOK & EVANS, 2006). Entretanto, a quimioterapia do câncer
ainda encontra limitações determinadas pela elevada incidência de toxicidade.
Devido a essas elevadas incidências de toxicidade, com freqüência,
internações são necessárias para o tratamento de intercorrências (especialmente
infecciosas) que, além do risco iminente que representam por si mesmas,
determinam interrupção do tratamento quimioterápico, aumentando, portanto a
incidência de ineficácia da quimioterapia. Esses são eventos comuns para diversos
tipos de câncer. De todo modo, a associação do 5-FU com a piplartina não apenas
foi eficiente para aumentar a resposta antitumoral do antineoplásico, mas também
reduziu os efeitos colaterais deste agente quimioterápico. Como visto nos
resultados, a leucopenia induzida pelo 5-FU foi prevenida com a associação com a
piplartina.
As células da medula óssea são bastante sensíveis à agressão causada
pelos agentes quimioterápicos. Como conseqüência, os glóbulos brancos
(leucócitos) e vermelhos (hemácias), assim como as plaquetas podem ter sua
produção comprometida, determinando queda em suas contagens no sangue
(KATZUNG, 2003).
Os leucócitos são as células do sangue encarregadas da defesa do
organismo contra infecções. Sendo constantemente produzidos pela medula óssea,
circulam no sangue por alguns dias e migram para os tecidos onde vão destruir os
microorganismos invasores. Por isso, a queda na contagem de leucócitos no sangue
(leucopenia) predispõe o organismo a infecções (KATZUNG, 2003; TAKIGUCHI et
al., 2001). Assim, a associação do 5-FU com a piplartina é vista como uma
combinação benéfica.
Além disso, o fator estimulador de colônias, produzido pelo tumor Sarcoma
180, aumenta o numero de células polimorfonucleares em sangue periférico
(OKAWA et al., 1992). Os resultados confirmam que o tumor Sarcoma 180 modifica
os parâmetros leucocitários. Houve também diferenças em relação ao tamanho dos
Discussão
- 220 -
baços dos camundongos saudáveis e transplantados com o tumor Sarcoma 180,
sugerindo uma esplenomegalia e hematopoiese esplênica induzida pelo tumor
Sarcoma 180. Por outro lado, o tratamento dos animais com 5-FU causou
significante redução da massa dos baços. Adicionalmente, o tratamento com a
piplartina normaliza a proporção de leucócitos em sangue periférico, compensando o
efeito do tumor, e prevenindo a redução do baço causada pelo 5-FU.
Os glóbulos vermelhos permanecem na circulação por períodos muito
maiores que os leucócitos. Assim, a anemia - queda na contagem dos glóbulos
vermelhos no sangue - torna-se evidente somente após alguns ciclos de
quimioterapia. Por isso, não foi evidenciada anemia, induzida pelo 5-FU, no modelo
experimental adotado.
A toxicidade de uma substância também pode ser avaliada investigando-se o
aspecto macroscópico e a massa de seus órgãos. O fígado e rins são órgãos
responsáveis pela detoxicação do organismo, e em casos de intoxicação podem ter
seu volume e/ou peso aumentado. Os animais foram avaliados quanto à massa do
fígado e dos rins. A massa corporal absoluta dos animais, assim como a massa do
fígado e dos rins não apresentou diferenças significativas entre os grupos testes e o
grupo controle. Estes resultados indicam que as doses testadas não produziram
toxicidade a níveis macroscópicos.
Ainda em relação ao estudo toxicológico, foram realizados testes de dano
hepático (níveis plasmáticos das transaminases: aspartato aminotransferase - AST e
alanina aminotransferase - ALT) e teste da função gromerular renal (níveis
plasmáticos de uréia). Além disso, análises histopatológicas foram realizadas nos
fígados e ríns de animais tratados.
Na análise das transaminases, sensíveis indicadores da injuria celular
hepática, não foram encontradas alterações em relação aos grupos tratados e grupo
controle. As análises histopatológicas dos fígados removidos de animais tratados
sugerem que o fígado pode ser considerado como alvo potencial da toxicidade da
piplartina, caracterizando uma leve hepatoxicidade do composto. De qualquer modo,
regeneração do tecido hepático ocorre em muitas doenças, exceto quando ocorre
um grande dano. Até quando a necrose hepatocelular está presente, mas o tecido
conjuntivo está preservado, a regeneração é quase completa (SCHEUER &
LEFKOWITCH, 2000; KUMMAR, 2004). As alterações hepáticas observadas nos
Discussão
- 221 -
animais tratados com piplartina podem ser consideradas reversíveis (SCHEUER &
LEFKOWITCH, 2000; KUMMAR, 2004; MCGEE et al., 1992). Estes dados
corroboram com os encontrados na literatura (BEZERRA et al., 2006).
Na análise dos níveis plasmáticos da uréia, um marcador da taxa de filtração
glomerular, também não foi encontrado alterações em relação aos grupos tratados e
grupo controle. O nível de uréia sanguíneo é geralmente usado para diagnosticar e
indicar, a severidade da insuficiência renal, porque ela é comparativamente mais
fácil de ser estimada. Entretanto, os níveis aumentados de uréia podem ser devidos,
não somente a uma alteração na excreção, mas a um aumento na produção,
associado a dietas ricas em proteínas, febre, hemorragias gastrointestinais e
fármacos que estimulam o catabolismo e o anabolismos (VARLEY et al., 1980). A
determinação da creatinina tem sido preferida porque ela parece ser independente
da ingestão de proteínas e sua produção a partir da degradação da fosfocreatina do
músculo é relativamente constante (VARLEY et al., 1980). Entretanto, tecnicamente
a determinação não é tão simples. Em animais de pequeno porte, como os
camundongos, os valores encontrados são geralmente muito baixos e raramente
apresentam algum significado. Além de que seus níveis sanguíneos caem com o
desgaste muscular. Vacuolização do epitélio e trechos hemorrágicos foram alguns
dos achados histopatológicos dos rins de animais tratados com a piplartina,
sugerindo discreta nefrotoxicidade, entretanto, como o tecido estava preservado, a
regeneração pode ser completa. Assim, as alterações observadas nos animais
tratados com a piplartina podem ser consideradas reversíveis (TISHER &
BRENNER, 1994). Estes dados também corroboram com os encontrados na
literatura (BEZERRA et al., 2006).
Assim, os resultados sugerem que a piplartina, não apenas apresenta
atividade antitumoral, mas também, pode aumentar a eficácia do quimioterápico 5-
FU. Este composto apresenta baixa toxicidade e ainda possui ação protetora contra
os danos hematológicos induzido pelo quimioterápico 5-FU.
Por fim, podemos afirmar que a piplartina, um produto natural encontrado em
pimentas, apresenta potencial anticâncer promissor. A determinação do grupo
farmacofórico para a atividade citotóxica da piplartina, bem como a avaliação do seu
potencial mutagênico, de seu mecanismo de ação, da sua eficácia em modelos
animais e estudo de absorção são de extremo valor para o conhecimento
Discussão
- 222 -
farmacológico da atividade anticâncer deste alcalóide. Os resultados obtidos neste
estudo vêm para contribuir com os estudos farmacodinâmicos, a níveis celulares e
moleculares, e farmacocinéticos deste alcalóide. De qualquer modo, estudos
complementares que contemplem análises de alvo molecular, modelagem estrutural,
eficácia em modelos xenográficos e estudos toxicológicos e farmacocinéticos
adicionais pré-clínicos e clínicos são requeridos para a validação deste fármaco para
uso humano.
- 223 -
Conclusão
Conclusão
- 224 -
6. Conclusão
• Por fim, podemos afirmar que a piplartina, um produto natural encontrado em
pimentas, apresenta uma atividade anticâncer promissora.
• No estudo da relação estrutura-atividade, o grupo carbonila α-β-insaturada do
anel amídico mostrou ser essencial para atividade citotóxica da piplartina.
• O índice de seletividade foi de aproximadamente 45 vezes, quando
comparada a sua atividade citotóxica em linhagem leucêmica versus PBMC.
• Seu mecanismo de ação esta relacionado com bloqueio do ciclo celular na
fase G
2
e induziu morte celular por apoptose com participação da via
intrínseca (via mitocondrial).
• A piplartina apresentou-se como um agente genotóxico, quando avaliado pelo
teste do cometa, sugerindo a quebra da fita dupla do DNA como principal
responsável por esse efeito.
• Esta não foi mutagênica para a bactéria S. typhimurium, quando testada no
ensaio de Ames (modelo procariótico) na ausência e na presença da fração
S9. Entretanto, apresentou-se como um potente agente mutagênico e
recombinogênico para a levedura S. cerevisiae (modelo eucariótico).
• A atividade genotóxica/mutagênica da piplartina foi confirmada no modelo do
micronúcleo em medula óssea de camundongos.
• Em relação ao estudo farmacocinético, o método bioanalítico desenvolvido e
validado para a quantificação da piplartina em plasma de ratos apresentou-se
específico, sensível, preciso e exato, justificando sua aplicação em estudos
farmacocinéticos. Quando submetida a um estudo de disposição cinética, a
piplartina apresentou um perfil de absorção característico de um modelo
monocompartimental.
• Por fim, a piplartina aumentou o efeito antitumoral do quimioterápico 5-FU e
ainda diminuiu seus efeitos colaterais.
- 225 -
Referências Bibliográficas
Referências Bibliográficas
- 226 -
7. Referências Bibliográficas
AGGARWAL, B.B.; SHISHODIA, S. Molecular targets of dietary agents for prevention
and therapy of cancer. Biochemical Pharmacology, v.71, p.1397 – 1421, 2006.
AHMED, S.A.; GOGAL, R.M.; WALSH, J.E. A new rapid and simple non-radioactive
assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes an alternative to [3H]
thymidine incorporation assay. Journal of immunological methods, v.170, p.211 -
224, 1994.
AHN, B.Z.; SOK, D.E. Michael acceptors as a tool for anticancer drug design.
Current Pharmaceutical Design, v.2, p.247 – 262, 1996.
ALBERTS, B.; BRAY, D.; LEWIS, J.; RAAF, M.; ROBERTS, K.; WATSON, J.D.
Molecular Biology of the Cell. 4
th
Edn., Garland Publishing, Inc. New York, 1294p.,
2002.
ALBERTS, B.; BRAY, D.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAAF, M.; ROBERTS, K.;
WALTER, P. Essential Cell Biology. An Introduction to the Molecular Biology of
the Cell. Garland Publishing, Inc. New York, 630p., 1998.
ANAZETTI, M.C.; MELO, P.S.; DURAN, N.; HAUN, M. Comparative cytotoxicity of
dimethylamide-crotonin in the promyelocytic leukemia cell line (HL-60) and human
peripheral blood mononuclear cells. Toxicology, v.188, p.261 – 274, 2003.
ANDERSON, D.; YU,T.W.; PHILLIPS, B.J.; SCHMEZER, P. The effect of various
antioxidants and other modifying agents on oxygen-radical-generated DNA damage
in human lymphocytes in the Comet assay. Mutation Research, v.307, p.261 - 271,
1994.
ANDERSON, R.D.; BERGER, N.A. International commission for protection against
environmental mutagens and carcinogens. mutagenicity and carcinogenicity of
topoisomerase-interactive agents. Mutation Research, v.309, p.109 – 142, 1994.
Referências Bibliográficas
- 227 -
ANSAH, C.; KHAN, A.; GOODERHAM, N.J. In vitro genotoxicity of the West African
anti-malarial herbal Cryptolepis sanguinolenta and its major alkaloid cryptolepine.
Toxicology, v.208, p.141 – 147, 2005.
ANSARI, K.M.; DHAWAN, A.; KHANNA, S.K.; DAS, M. In vivo DNA damaging
potential of sanguinarine alkaloid, isolated from argemone oil, using alkaline Comet
assay in mice. Food and Chemical Toxicology, v.43, p.147 – 153, 2005.
APTSIAURI, N.; CABRERA, T.; MENDEZ, R.; GARCIA-LORA, A.; RUIZ-CABELLO,
F.; GARRIDO, F. Role of altered expression of HLA class I molecules in cancer
progression. Advances in Experimental Medicine and Biology, v.601, p.123 –
131, 2007.
ATAL, C.K.; DHAR, K.L.; SINGH, J. The chemistry of Indian Piper species. Lloydia,
v.38, p.256 – 264, 1975.
ATKIN, A.L.; RIAZI, M.A.; GREER, C.L.; ROY, K.L.; BELL, J.B. The functional
analysis of nonsense suppressors derived from in vitro engineered Saccharomyces
cerevisiae tRNA (Trp) genes. Genes, v.134, p.57 - 65, 1993.
AUSUBEL, F.; BRENT, R.; KINGSTON, R.E. Current Protocols in Molecular
Biology. John Wiley and Sons, New York, 1989.
AYDEMIR, N.; BILALOGLU, R. Genotoxicity of two anticancer drugs, gemcitabine
and topotecan, in mouse bone marrow in vivo. Mutation Research, v.537 p.43 – 51,
2003.
BARTEK, J.; LUKAS, J. DNA damage checkpoints: from initiation to recovery or
adaptation. Current Opinion in Cell Biology, v.19, p.238 – 245, 2007.
BEZERRA, D.P.; CASTRO, F.O.; ALVES, A.P.N.N.; PESSOA, C.; MORAES, M.O.;
SILVEIRA, E.R.; LIMA, M.A.S.; ELMIRO, F.J.M.; COSTA-LOTUFO, L.V. In vivo
growth-inhibition of sarcoma 180 by piplartine and piperine, two alkaloid amides from
Referências Bibliográficas
- 228 -
Piper. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v.39, p.801 – 807,
2006.
BEZERRA, D.P.; MILITÃO, G.C.G.; CASTRO, F.O.; PESSOA, C.; MORAES, M.O.;
SILVEIRA, E.R.; LIMA, M.A.S.; ELMIRO, F.J.M.; COSTA-LOTUFO, L.V. Piplartine
induces inhibition of leukemia cell proliferation triggering both apoptosis and necrosis
pathways. Toxicology in Vitro, v.21, p.1 – 8, 2007.
BEZERRA, D.P.; PESSOA, C.; MORAES, M.O.; SILVEIRA, E.R.; LIMA, M.A.S.;
ELMIRO, F.J.M.; COSTA-LOTUFO, L.V. Antiproliferative Effects of Two Amides,
Piperine and Piplartine, from Piper Species. Zeitschrift fur Naturforschung C, v.60,
p.539 – 543, 2005.
BEZERRA, D.P.; PESSOA, C.; MORAES, M.O.; ALENCAR, N.M.; MESQUITA, R.O.;
LIMA, M.W.; ALVES, A.P.; PESSOA, O.D.; CHAVES, J.H.; SILVEIRA, E.R.; COSTA-
LOTUFO, L.V. In vivo growth inhibition of sarcoma 180 by piperlonguminine, an
alkaloid amide from the Piper species. Journal of Applied Toxicology, v.28, p.599 -
607, 2008.
BODIWALA, H.S.; SINGH, G.; SINGH, R.; DEY, C.S.; SHARMA, S.S.; BHUTANI,
K.K.; SINGH, I.P. Antileishmanial amides and lignans from Piper cubeba and Piper
retrofractum. Journal of Natural Medicines, v.61, p.418 - 421, 2007.
BOEIRA, J.M.; VIANA, A.F.; PICADA, J.N.; HENRIQUES, J.A. Genotoxic and
recombinogenic activities of the two beta-carboline alkaloids harman and harmine in
Saccharomyces cerevisiae. Mutation Research, v.500, p.39 – 48, 2002.
BRASIL. Resolução Nº 899, de 29 de maio de 2003. Guia para validação de
métodos analíticos e bioanalíticos. Diário oficial da República Federativa do
Brasil, Poder executivo, Brasília, 2003.
BRAZ-FILHO, R.; SOUZA, M.P.; MATTOS, M.E.O. Piplartine-dimer A, a new alkaloid
from Piper tuberculatum. Phytochemistry, v.20, p.345 – 346, 1981.
Referências Bibliográficas
- 229 -
BRESSOLE, F.; BROMET-PETIT, M.; AUDRAN, M. Validation of liquid
chromatographic and gas chromatographic methods. Applications to
pharmacokinetics. Journal of chromatography B, v.686, p.3 - 10, 1996.
BRIZEL, D.M. Pharmacologic approaches to radiation protection. Journal of Clinical
Oncology, v.25, p.4084 – 4089, 2007.
BROWN, D.G.; SUN, X.M.; COHEN, G.M. Dexamethasone-induced apoptosis
involves cleavage of DNA to large fragments prior internucleossomal fragmentation.
Journal of Biological Chemistry, v.268, p.3037 - 3041, 1993.
BURKE, D.; DAWSON, D.; STEARNS, T. Methods in yeast genetics. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 2000.
BURLINSON, B.; TICE, R.R.; SPEIT, G.; AGURELL, E.; BRENDLER-SCHWAAB,
S.Y.; COLLINS, A.R.; ESCOBAR, P.; HONMA, M.; KUMARAVEL, T.S.; NAKAJIMA,
M.; SASAKI, Y.F.; THYBAUD, V.; UNO, Y.; VASQUEZ, M.; HARTMANN, A. Fourth
international workgroup on genotoxicity testing: results of the in vivo comet assay
workgroup. Mutation Research, v.627, p.31 – 35, 2007.
BUTLER, M.S. The role of natural products in drug discovery. Journal of Natural
Products, v.67, p.2141 – 2153, 2004.
CAI, J.; YANG, J.; JONES, D.P. Mitocondrial control of apoptosis. The role of
cytochrome c. Biochimica et Biophysica Acta, v.1366, p.139 – 149, 1998.
CAO, R.; PENG, W.; WANG, Z.; XU, A. beta-Carboline alkaloids: biochemical and
pharmacological functions. Current Medicinal Chemistry, v.14, p.479 – 500, 2007.
CAPRON, M.A.; WIEMER, D.F. Piplaroxide, an ant-repellent piperidine epoxide from
Piper tuberculatum. Journal of Natural Products, v.59, p.794 – 795, 1996.
CAUSON, R. Validation of chromatographic methods in biomedical analysis:
Viewpoint and discussion. Journal of Chromatography B, v.689, p.175 - 180, 1997.
Referências Bibliográficas
- 230 -
CHABNER, B.A.; LONGO, D.L. Cancer chemotherapy and biotherapy; 2
th
edn.,
Lippincott-Raven, Philadelphia, 1996.
CHEOK, M.H.; EVANS, W.E. Acute lymphoblastic leukaemia: a model for the
pharmacogenomics of cancer therapy. Nature Reviews Cancer, v.6, p.117 – 129,
2006.
CHEUNG, E.; WADHERA, P.; DORFF, T.; PINSKI, J. Diet and prostate cancer risk
reduction. Expert Review of Anticancer Therapy, v.8, p.43 – 50, 2008.
CHOY, W.N. Regulatory Genetic toxicology tests. In: Choy, W. N. (ed.), Genetic
Toxicology and Cancer Risk Assessment. Marcel Dekker, Inc, New York, p.93 -
113, 2001.
CIBAS, E.S. Applications of flow cytometric DNA analysis to diagnostic cytology.
Diagnostic cytopathology, v.13, p.166 – 171, 1995.
CLARDY, J.; WALSH, C. Lessons from natural molecules. Nature, v.432, p.829 –
837, 2004.
CLIFFORD, B.; BELJIN, M.; STARK, G.R.; TAYLOR, W.R. G
2
Arrest in response to
topoisomerase ii inhibitors: the role of p53. Cancer Research, v.63, p.4074 - 4081,
2003.
CLINTON, S.K.; EMENHISER, C.; SCHWARTZ, S.J.; BOSTWICK, D.G.; WILLIAMS,
A.W.; MOORE, B.J.; ERDMAN, J.W.JR. Cis-trans lycopene isomers, carotenoids,
and retinol in the human prostate. Cancer Epidemiology, Biomarkers &
Prevention, v.5, p.823 – 833, 1996.
CLINTON, S.K. Lycopene: Chemistry, biology, and implications for human health and
disease. Nutrition Reviews, v.56, p.35 – 51, 1998.
Referências Bibliográficas
- 231 -
COLWELL, R.R. Fulfilling the promise of biotechnology. Biotechnology Advances,
v.20, p.215 – 228, 2002.
CONNORS, J.M. State-of-the-Art Therapeutics: Hodgkin's Lymphoma. Journal of
Clinical Oncology, v.23, p.6400 – 6408, 2005.
CORY, S.; HUANG, D.C.; ADAMS, J.M. The Bcl-2 family: roles in cell survival and
oncogenesis. Oncogene, v.22, p.8590 – 8607, 2003.
COSTA, V.; FERREIRA, P.M. Oxidative stress and signal transduction in
Saccharomyces cerevisiae: insights into ageing, apoptosis and diseases. Molecular
Aspects of Medicine, v.22, p.217 - 246, 2001.
COSTA-LOTUFO, L.V.; SILVEIRA, E.R.; BARROS, M.C.; LIMA, M.A.; MORAES,
M.E.; MORAES, M.O.; PESSOA, C. Antiproliferative effects of abietane diterpenes
from Aegiphila lhotzkyana. Planta Medica, v.70, p.180 – 182, 2004.
CRAGG, G.M.; NEWMAN, D.J. Antineoplastic agents from natural sources:
achievements and future directions. Expert Opinion on Investigational Drugs, v.9,
p.2783 – 2797, 2000.
CRAGG, G.M.; NEWMAN, D.J. Plants as a source of anti-cancer agents. Journal of
Ethnopharmacology, v.100, p.72 – 79, 2005.
CRAGG, G.M.; NEWMAN, D.J.; YANG, S.S. Natural product extracts of plant and
marine origin having antileukemia potential. The NCI experience. Journal of Natural
Products, v.69, p.488 – 498, 2006.
Referências Bibliográficas
- 232 -
CROKER, A.K.; ALLAN, A.L. Cancer Stem Cells: Implications for the progression and
treatment of metastatic disease. Journal of Cellular and Molecular Medicine, v.12,
p.374 - 390, 2008.
CZERNY, C.; EDER, E.; RUNGER, T.M. Genotoxicity and mutagenicity of the , -
unsaturated carbonyl compound crotonaldehyde (butenal) on a plasmid shuttle
vector. Mutation Research, v.407, p.125 – 134, 1998.
DADGAR, D.; BURNETT, P.A. Issues in evaluation of bioanalytical method selectivity
and drug stability. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, v.14, p.23
- 31, 1995.
DE MESA, R.L.; DE CERAIN; SALSAMENDI, A.L.; ARIZNABARRETA, L.S.;
AGABEYNZANO, M.J.C.; PATINO-GARCIA, A. Measurement and analysis of the
chemotherapy-induced genetic instability in pediatric cancer patients. Mutagenesis,
v.17, p.171 – 175, 2002.
DEVITA, V.T.JR.; HELLMAN, S.; ROSENBERG, S.A. Cancer: Principles and
Practice of Oncology, 5
th
edn., Lippincott Williams & Wilkins, 1996.
DING, Q.; CHICHAK, K.; LOWN, J.W. Pyrroloquinoline and pyridoacridine alkaloids
from marine sources. Current Medicinal Chemistry, v.6, p.1 – 27, 1999.
DIPIRO, J.T.; SPRUILL, W.J.; BLOUIN, R.A.; PRUEMER, J.M. Concepts in Clinical
Pharmacokinetics. 3
th
edn., American Society of Health-System Pharmacists,
Bethesda, p.200, 2002.
DRUMEA, K.; YANG, Z.F.; ROSMARIN, A. Retinoic acid signaling in myelopoiesis.
Current Opinion in Hematology, v.15, p.37 – 41, 2008.
DUH, C.Y.; WU, Y.C.; WANG, S.K. Cytotoxic pyridone alkaloids from the leaves of
Piper aborescens. Journal of Natural Products, v.53, p.1575 – 1577, 1990a.
Referências Bibliográficas
- 233 -
DUH, C.Y.; WU, Y.C.; WANG, S.K. Cytotoxic pyridone alkaloids from Piper
aborescens. Phytochemistry, v.29, p.2689 – 2691, 1990b.
EDER, E.; SCHECKENBACH, S.; DEININGER, C.; HOFFMAN, C. The possible role
of α-β-unsaturated carbonyl compounds in mutagenesis and carcinogenesis.
Toxicology Letters, v.67, p.87 – 103, 1993.
ELEGBEDE, J.A.; MALTZMAN, T.H.; ELSON, C.E.; GOULD, M.N. Effects of
anticarcinogenic monoterpenes on phase II hepatic metabolizing enzymes.
Carcinogenesis, v.14, p.1221 – 1223, 1993.
ERNST, E. Can allium vegetables prevent cancer? Phytomedicine, v.4, p.79 – 83,
1997.
FAIRBAIRN, D.W.; OLIVE, P.L.; O’NEILL, K.L. The Comet Assay: a comprehensive
review. Mutation Research, v.339, p.37 - 59, 1995.
FELIPE, C.F.B.; SOUSA-FILHO, J.T.; SOUZA, L.E.O.; SILVEIRA, J.A.; UCHOA,
E.A.; SILVEIRA, E.R.; PESSOA, O.D.L.; VIANA, G.S.B. Piplartine, an amide alkaloid
from Piper tuberculatum, presents anxiolytic and antidepressant effects in mice.
Phytomedicine, v.14, p.605 – 612, 2007.
FENECH, M. In vitro micronucleus technique to predict chemosensitivity. Methods in
Molecular Medicine, v.111, p.3 - 32, 2005.
FINDLAY, J.W.A.; SMITH, W.C.; LEE, W.; NORDBLOM, G.D.; DESILVA, I.; DAS,
B.S.; KHAN, M.N.; BOWSHER, R.R. Validation of immunoassays for bioanalysis: A
pharmaceutical industry perspective. Journal of pharmaceutical and biomedical
analysis, v.21, p.1249 – 1273, 2000.
Referências Bibliográficas
- 234 -
FRAZER, I.H.; LOWY, D.R.; SCHILLER, J.T. Prevention of cancer through
immunization: Prospects and challenges for the 21st century. European Journal of
Immunology, v.37, p.S148 – 155, 2007.
FRIEDBERG, E.C.; WALKER, G.C.; SIEDE, W. DNA Repair and Mutagenesis.
American Society for Microbiology, Washington, 1995.
GANESAN, A. Natural products as a hunting ground for combinatorial chemistry.
Current Opinion in Biotechnology, v.15, p.584 – 590, 2004.
GAPTER, L.A.; YUIN, O.Z.; NG, K.Y. S-Allylcysteine reduces breast tumor cell
adhesion and invasion. Biochemical and Biophysical Research Communications.
v.367, p.446 – 451, 2008.
GATEHOUSE, D.; HAWORTH, S.; CEBULA, T.; GOCKE, E.; KIER, L.;
MATSUSHIMA, T.; MELCION, C.; NOHMI, T.; OHTA, T.; VENITT,
S. Recommendations for the performance of bacterial mutation assays. Mutation
Research, v.312, p.217 – 233, 1994.
GAW, A.; MURPHY, M.J.; COWAN, R.A.; O’REILLY, D.S.T.J.; STEWART, M.J.;
SHEPHERD, J. Clinical Biochemistry: An Illustrated Colour. 3ª ed., Churchill
Livingstone, 2004.
GEBHARDT, R. In vitro screening of plant extracts and phytopharmaceuticals: novel
approaches for the elucidation of active compounds and their mechanisms. Planta
Medica, v.66, p.99 – 105, 2000.
GIOVANNUCCI, E.; ASCHERIO, A.; RIMM, E.B.; STAMPFER, M.J.; COLDITZ, G.A.;
WILLETT, W.C. Intake of carotenoids and retinol in relation to risk of prostate cancer.
Journal of the National Cancer Institute, v.87, p.1767 – 1776, 1995.
GOMES-CARNEIRO, M.R. Avaliação do potencial mutagênico de monoterpenos
presentes em óleos essenciais. Dissertação de Mestrado. Instituto Oswaldo Cruz,
1997.
Referências Bibliográficas
- 235 -
GRAHAM, H.N. Green tea composition, consumption and polyphenol chemistry.
Preventive Medicine, v.21, p.334 – 350, 1992.
GRIFFITHS, A.J.F.; MILLER, J.H.; SUZUKI, D.T.; LEWONTIN, R.C.; GELBART,
W.M. Introdução à genética. 7ª ed., Guanabara-Koogan, São Paulo, p.794, 2002.
GUERITTE, F.; FAHY, J. The vinca alkaloids. In: Cragg, G.M., Kingston, D.G.I.,
Newman, D.J. (Eds.), Anticancer Agents from Natural Products. Brunner-Routledge
Psychology Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL, p. 123 – 136, 2005.
GUIDANCE FOR INDUSTRY. Bioanalytical Method Validation, US Department of
Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug
Evaluation and Research (CDER), 2001.
GUPTA, R. Tests for the genotoxicity of m-AMSA, etoposide, teniposide and
ellipticine in Neurospora crassa. Mutation Research, v.240, p.47 – 58, 1990.
GUPTA, R.S.; BROMKE, A.; BRYANT, D.W.; GUPTA, R.; SINGH, B.; MCCALLA,
D.R. Etoposide (VP16) and teniposide (VM26): novel anticancer drugs, strongly
mutagenic in mammalian but not prokaryotic test systems. Mutagenesis, v.2, p.179
– 186, 1987.
HAJEK, R.; VORLICEK, J.: SLAVIK, M. Paclitaxel (Taxol
®
); A review of its antitumor
activity in clinical studies. Neoplasma, v.43, p.141 – 154, 1996.
HANAHAN, D., WEINGERG, R.A. The hallmarks of cancer. Cell, v.100, p.57 – 70,
2000.
HARBOWY, M.E.; BALENTINE, D.A. Tea Chemistry. Critical Reviews in Plant
Sciences, v.16, p.415 – 480, 1997.
HARTMANN, A.; SPEIT, G. The contribution of cytotoxicity to DNA-effects in the
single cell gel test (Comet assay). Toxicology Letters, v.90, p.183 - 188, 1997.
Referências Bibliográficas
- 236 -
HARTMANN, C.; SMEYERS-VERBEKE, J.; MASSART, D.L.; McDOWALL, R.D.
Validation of bioanalytical chromatographic methods. Journal of pharmaceutical
and biomedical analysis, v.17, p.193 - 218, 1998.
HASEGAWA, S.; MIYAKE, M. Biochemistry and biological functions of citrus
limonoids. Food Reviews International, v.12, p.413 – 435, 1996.
HASLER, C.M. A new look at an ancient concept. Chemistry & Industry, v.2, p.84 –
89, 1998.
HAWTHORNE, D.C.; LEOPOLD, U. Current topics in microbiology and
immunology. Springler Verlag, Berlin, 1974.
HAWTHORNE, D.C. Identification of nonsense codons in yeast. Journal of
Molecular Biology, v.43, p.71 – 75, 1969.
HEDDLE, J.A. A rapid in vitro test for chromosomal damage. Mutation Research,
v.18, p.187 – 190, 1973.
HENRIQUES, J.AP.; VALSA, J.O.; GOMES, R.A. Utilização de testes de
microrganismos para detecção de atividade mutagênicas e/ou potencialmente
mutagênicas. In: PINTO, S.O C.(ed) Genética molecular de microrganismos. São
Paulo, Manole, p.330-350, 1987.
HENSCHLER, D.; EDER, E. Structure-activity relationships of alpha, beta-
unsaturated carbonylic compounds. International Agency for Research on Cancer
- Scientific Publications, v.70, p.197 – 205, 1986.
Referências Bibliográficas
- 237 -
HERR, H.W.; MORALES, A. History of bacillus Calmette-Guerin and bladder cancer:
an immunotherapy success story. Journal of Urology, v.179, p.53 – 56, 2008.
HOROWITZ, S.; MAOR, R.; PRIEL, E. Characterization of DNA topoisomerase
activity in two strains of Mycoplasma fermentans and in Mycoplasma pirum. Journal
of Bacteriology, v.179, p.6626 – 6632, 1997.
HUANG, Z.Y.; WU, Y.; HEDRICK, N.; GUTMANN, D.H. T-cadherin-mediated cell
growth regulation involves G
2
phase arrest and requires p21(CIP1/WAF1)
expression. Molecular and Cellular Biology, v.23, p.566 – 578, 2003.
INCA, Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Atenção à Saúde. Instituto
Nacional de Câncer. Coordenação de Prevenção e Vigilância de Câncer.
Estimativas 2008: Incidência de Câncer no Brasil. Rio de Janeiro, p.94, 2007.
IWASHITA, M.; OKA, N.; OHKUBO, S.; SAITO, M.; NAKAHATA, N. Piperlongumine,
a constituent of Piper longum L., inhibits rabbit platelet aggregation as a
thromboxane A(2) receptor antagonist. European Journal of Pharmacology, v.570,
p.38 – 42, 2007.
JANZOWSKI, C.; GLAAB, V.; MUELLER, C.; STRAESSER, U.; KAMP, H.G.;
EISENBRAND, G. , -Unsaturated carbonyl compounds: induction of oxidative DNA
damage in mammalian cells. Mutagenesis, v.18, p.465 - 470, 2003.
JUNG, A.; BRABLETZ, T.; KIRCHNER, T. The migrating cancer stem cells model--a
conceptual explanation of malignant tumour progression. Ernst Schering
Foundation Symposium Proceedings, v.5, p.109 – 124, 2006.
KATZUNG, G.B. Basic and Clinical Pharmacology, 9
th
edn., McGraw-Hill Medical,
United States of America, p.1088, 2003.
Referências Bibliográficas
- 238 -
KHOSRAVI-SHAHI, P.; FERNÁNDEZ-PINEDA, I. Tumoral angiogenesis: review of
the literature. Cancer Investigation, v.26, p.104 – 108, 2008.
KIMANANI, E.K. Bioanalytical calibration curves: proposal for statistical criteria.
Journal of pharmacological and biomedical analysis, v.16, p.1117 - 1124, 1998.
KINGSTON, D.G.I. Taxol and its analogs. In: Cragg, G.M., Kingston, D.G.I.,
Newman, D.J. (Eds.), Anticancer Agents from Natural Products. Brunner-Routledge
Psychology Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL, p. 89 – 122, 2005.
KINGSTON, D.G.I. The Chemistry of Taxol. Pharmacology & Therapeutics, v.52,
p.1 - 34, 1991.
KINGSTON, D.G.I. Recent advances in the chemistry of taxol. Journal of Natural
Products, v.63, p.726 - 734, 2000.
KINGSTON, D.G.I. Natural products as pharmaceuticals and sources for lead
structures. In: The Practice of Medicinal Chemistry. Ed. by Wermuth CG.
Academic Press Limited, p.102 - 114, 1996.
KLUZA, J.; BALDEYROU, B.; COLSON, P.; RASOANAIVO, P.; MAMBU, L.;
FRAPPIER, F.; BAILLY, C. Cytotoxicity and DNA binding properties of the plant
alkaloid burasaine. European Journal of Pharmaceutical Sciences, v.20, p.383 –
391, 2003.
KOOPMAN, G.; REUTELINGSPERGER, C.P.; KUIJTEN, G.A.; KEEHNEN, R.M.;
PALS, S.T.; VAN OERS, M.H. Annexin V for flow cytimetric detection of
phosphatidlserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood, v.84, p.1415 -
1420, 1994.
KUMAR, V.; ABBAS, A.; FAUSTO, N.; ROBBINS, S.L.; COTRAN, R.S. Pathology
Basis of Disease, 7
th
edn., WB Saunders, China, p.1552, 2004.
Referências Bibliográficas
- 239 -
KURASHIGE, S.; MITSUHASHI, S. Macrophage activities in sarcoma 180-bearing
mice and EL4-bearing mice. Gann, v.73, p.85 – 90, 1982.
KUSUZAKI, K.; MURATA, H.; MATSUBARA, T.; SATONAKA, H.; WAKABAYASHI,
T.; MATSUMINE, A.; UCHIDA, A. Review. Acridine orange could be an innovative
anticancer agent under photon energy. In Vivo, v.21, p.205 – 214, 2007.
LAGO, J.H.; CHAVES, M.H.; AYRES, M.C.; AGRIPINO, D.G.; YOUNG, M.C.
Evaluation of antifungal and DNA-damaging activities of alkaloids from branches of
Porcelia macrocarpa. Planta Medica, v.73, p.292 – 295, 2007.
LARSEN, A.K.; ESCARGUEIL, A.E.; SKLADANOWSKI, A. From DNA damage to G
2
arrest: the many roles of topoisomerase II. Progress in Cell Cycle Research, v.5,
p.295 – 300, 2003.
LE-CURIEUX, F.; MARZIN, D.; ERB, F. Comparison of the three short-term assays:
results of seven chemicals. Potental contribution to the control of water genotoxicity.
Mutation Research, v.319, p.223 - 236, 1993.
LEE, K.H.; XIAO, Z. Podophyllotoxins and analogs. In: Cragg, G.M., Kingston,
D.G.I., Newman, D.J. (Eds.), Anticancer Agents from Natural Products. Brunner-
Routledge Psychology Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL, p. 71 – 88,
2005.
LEVERKUS, M. Imiquimod: unexpected killer. The Journal of investigative
dermatology, v.122, p.15 - 16, 2004.
LI, N.; SONG, Y.; ZHANG, W.; WANG, W.; CHEN, J.; WONG, A.W.; ROBERTS, A.
Evaluation of the in vitro and in vivo genotoxicity of magnolia bark extract.
Regulatory Toxicology and Pharmacology, v.49, p.154 – 159, 2007.
LI, Y.; ELIE, M.; BLANER, W.S.; BRANDT-RAUF, P.; FORD, J. Lycopene, smoking
and lung cancer. Proceedings of the American Association for Cancer Research,
v.38, p.A758, 1997.
Referências Bibliográficas
- 240 -
LORENZI, T.F. Manual de Hematologia: Propedêutica e Clínica. 4º ed., Medsi,
p.722, 2006.
MA, J.; JONES, S.H.; MARSHALL, R.; JOHNSON, R.K.; HECHT, S.M. A DNA-
damaging oxoaporphine alkaloid from Piper caninum. Journal of Natural Products,
v.67, p.1162 – 1164, 2004.
MACGREGOR, J.T.; CASCIANO, D.; MULLER, L. Strategies and testing methods for
identifying mutagenic risks. Mutation Research, v.455, p.3 - 20, 2000.
MACGREGOR, J.T.; HEDDLE, J.A.; HITE, M.; MARGOLIN, B.H.; RAMEL, C.;
SALAMONE, M.F.; TICE, R.R.; WILD, D. Guidelines for the conduct of micronucleus
assays in mammalian bone marrow erythrocytes. Mutation Research, v.189, p.103
– 112, 1987.
MACKLIS, J.D.; MADISON R.D. Progressive incorporation of propidium iodide in
cultured mouse neurons correlates with declining electrophysiological status: a
fluorescence scale of membrane integrity. Journal of Neuroscience Methods, v.31,
p.43 – 46, 1990.
MAJNO, G.; JORIS, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis: an overview of cell death.
American Journal of Pathology, v.146, p.3 - 15, 1995.
MANN, J. Natural products in cancer chemotherapy: past, present and future. Nature
Reviews Câncer, v.2, p.143 – 148, 2002.
MARCHETTI, P.; CASTEDO, M.; SUSIN, S.A.; ZAMZAMI, N.; HIRSCH, T.; MACHO,
A.; HAEFFNER, N.; HIRSCH, F.; GEUSKENS, M.; KROEMER, G. Mitochondrial
permeability transition is a central coordinating event of apoptosis. Journal of
Experimental Medicine, v.184, p.1155 – 1160, 1996.
MARON, D.M.; AMES, B.N. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test,
Mutation Research, v.113, p.173 – 215, 1983.
Referências Bibliográficas
- 241 -
MCGEE, J.O.D.; ISAACSON, P.A.; WRIGHT, N.A. Oxford Textbook of Pathology:
Pathology of Systems. Oxford University Press, New York, p.1708, 1992.
MEHMET, H. Apoptosis: caspase Wnds a new place to hide. Nature, v.403, p.29 –
30, 2002.
MEI, H.; HSIEH, Y.; NARDO, C.; XU, X.; WANG, S.; KORFMACHER, K.; NG, W.A.
Rapid commun. Mass Spectrometry, v.17, p.97 – 103, 2003.
MELAMED, M.R.; MULLANEY, P.F.; MENDELSON, M.L. Flow cytometry and
sorting. John Wilwy & sons, 1979.
MERCHANT, S.H.; GONCHOROFF, N.J.; HUTCHISON, R.E. Apoptotic index by
Annexin V flow cytometry: adjunt to morphologic and cytogenetic diagnosis os
myelodisplastic syndromes. Cytometry, v.46, p.28 - 32, 2001.
MESSINA, M.; BARNES, S. The role of soy products in reducing risk of cancer.
Journal of the National Cancer Institute, v.83, p.541 – 546, 1991.
MESSINA, M.; BARNES, S.; SETCHELL, K.D.R. Phytooestrogens and breast
cancer. Lancet, v.350, p.971 - 972, 1997.
MEYSKENS, F.L.JR.; SZABO, E. Diet and cancer: the disconnect between
epidemiology and randomized clinical trials. Cancer Epidemiology, Biomarkers &
Prevention, v.14, p.1366 – 1369, 2005.
MILITAO, G.C.G.; DANTAS, I.N.F.; PESSOA, C.; FALCÃO, M.J.C.; SILVEIRA, E.R.;
LIMA, M.A.S.; CURI, R.; LIMA, T.; MORAES, M.O.; COSTA-LOTUFO, L.V. Induction
of apoptosis by pterocarpans from Platymiscium floribundum in HL-60 human
leukemia cells. Life Sciences, v.78, p.2409 - 2417, 2006.
Referências Bibliográficas
- 242 -
MORINAGA, Y.; SUGA, Y.; EHARA, S.; HARADA, K.; NIHEI, Y.; SUZUKI, M.
Combination effect of AC-7700, a novel combretastatin A-4 derivative, and cisplatin
against murine and human tumors in vivo. Cancer Science, v.94, p.200 – 204, 2003.
MORTELMANS, K.; ZEIGER, E. The Ames Salmonella/microsome mutagenicity
assay. Mutation Research, v.455, p.29 – 60, 2000.
MOSMANN, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application
to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of immunological methods, v.16,
p.55 – 63, 1983.
MYERS, L.; ADAMS, N.; KIER, L.; RAO, T.K.; SHAW, B.; WILLIAMS, L.
Microcomputer software for data management and statistical analysis of the
Ames/Salmonella test. In: Krewski, D. and C. A. Franklin (Eds.), Statistics in
Toxicology, Gordon and Breach, New York, p.265 – 279, 1991.
NADIN, S.B.; VARGAS-ROIG, L.M.; CIOCCA, D.R. A silver staining method for
single-cell gel assay. Journal of histochemistry and cytochemistry, v.49, p.1183 –
1186, 2001.
NAKANOMYO, H.; HIRAOKA, M.; SHIRAYA, M. Mutagenicity tests of etoposide and
teniposídeo. Journal of Toxicological Sciences, v.11, p.301 – 310, 1986.
NAKAYACHI, T.; YASUMOTO, E.; NAKANO, K.; MORSHED, S.R.M.; HASHIMOTO,
K.; KIKUCHI, H.; NISHIKAWA, H.; KAWASE, M.; SAKAGAMI, H. Structure-activity
relationships of α,β-unsaturated ketones as assessed by their cytotoxicity against
oral tumor cells. Anticancer Research, v.24, p.737 – 742, 2004.
NAVICKIENE, H.M.; ALECIO, A.C.; KATO, M.J.; BOLZANI, V.D.; YOUNG, M.C.;
CAVALHEIRO, A.J.; FURLAN, M. Antifungal amides from Piper hispidum and Piper
tuberculatum. Phytochemistry, v.55, p.621 – 626, 2000.
Referências Bibliográficas
- 243 -
NEWMAN, D.J.; CRAGG, G.M.; SNADER, K.M. The influence of natural products
upon drug discovery. Natural Product Reports, v.17, p.215 – 134, 2000.
NEWMAN, D.J.; CRAGG, G.M.; SNADER, K.M. Natural products as sources of new
drugs over the period 1981-2002. Journal of Natural Products, v.66, p.1022 –
1037, 2003.
NEWMAN, D.J.; CRAGG, G.M. Natural products as sources of new drugs over the
last 25 years. Journal of Natural Products, v.70, p.461 – 477, 2007.
O'BRIEN, J.; WILSON, I.; ORTON, T.; POGNAN, F. Investigation of the Alamar Blue
(resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity.
European journal of biochemistry, v.267, p.5421 - 5426, 2000.
OKAWA, Y.; MURATA, Y.; KOBAYASHI, M.; SUZUKI, M.E.; SUZUKI, S.
Argumentation of host resistance to Candida albicans infection in ascite tumor-
bearing mice. Microbiology and Immunology, v.36, p.517 – 521, 1992.
OLIVEIRA, E.D. Mecanismo de ação vasorelaxante de piplartina, uma alcamida
isolada das raízes e do caule de Piper tuberculatum jacq. (piperaceae), em aorta
de rato. Dissertação de mestrado em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos.
Universidade Federal da Paraíba, UFPB, 2000.
OPALKA, B.; DICKOPP, A.; KIRCH, H.C. Apoptotic genes in cancer therapy. Cells
Tissues Organs, v.172, p.126 - 132, 2002.
OECD (ORGANIZATION FOR ECONOMIC CO-OPERATION AND
DEVELOPMENT). Guideline for testing of chemicals nº 474. Genetic Toxicology:
Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test, 1997.
ORMEROD, M.G. The study of apoptotic cells by flow cytometry. Leukemia, v.12,
p.1013 - 1025, 1998.
Referências Bibliográficas
- 244 -
ORRENIUS, S. Mitochondrial regulation of apoptotic cell death. Toxicology Letters,
v.149, p.19 - 23, 2004.
ORTHOLAND, J.Y.; GANESAN, A. Natural products and combinatorial chemistry:
back to the future. Current Opinion in Chemical Biology, v.8, p.271 - 280, 2004.
PARK, B.S.; SON, D.J.; PARK, Y.H.; KIM, T.W.; LEE, S.E. Antiplatelet effects of
acidamides isolated from the fruits of Piper longum L. Phytomedicine, v.14, p.853 –
855, 2007.
PARMAR, V.S.; JAIN, S.C.; BISHT, K.S.; JAIN, R.; TANEJA, P.; JHA, A.; TYAGI,
O.M.; PRASAD, A.K.; WENGEL, J.; OLSEN, C.E.; BOLL, P.M. Phytochemistry of the
genus Piper. Phytochemistry, v.46, p.597 – 673, 1997.
PARRY, E.M.; PARRY, J.M. The assay of genotoxicity of chemicals using the
budding yeast Saccharomyces cerevisiae. In: Mutagenicity testing: A practical
approach, Venitt, S.; Parry, S. M (Eds.), ORL Press, Oxford, Washington, 1984.
PÉREZ, L.; DANISHEFSKY, S.J. Chemistry and biology in search of antimetastatic
agents. ACS Chemical Biology, v.2, p.159 – 162, 2007.
PESSOA, C. Determinação do mecanismo de ação citotóxica de alguns
compostos extraídos de plantas do nordeste brasileiro. Tese de Doutorado.
Curso de Pós-Graduação em Farmacologia, Universidade Federal do Ceará, UFC,
2000.
PESSOA, C.; SILVEIRA, E.R.; LEMOS, T.L.; WETMORE, L.A.; MORAES, M.O.;
LEYVA, A. Antiproliferative effects of compounds derived from plants of Northeast
Brazil. Phytotherapy research, v.14, p.187 – 191, 2000.
PEZZUTO, J.M. Plant-derived anticancer agents. Biochemical Pharmacology, v.53,
p.121 - 133, 1997.
Referências Bibliográficas
- 245 -
PHILLIPSON, J.D.; ANDERSON, L.A. Ethnopharmacology and Western medicine.
Journal of Ethnopharmacology, v.25, p.61 – 72, 1989.
PICADA, J.N.; MARIS, A.F.; CKLESS, K.; SALVADOR, M.; KHROMOV-BORISOV,
N.N.; HENRIQUES, J.A.P. Differential mutagenic, antimutagenic and cytotoxic
responses induced by apomorphine and its oxidation product, 8-oxo-apomorphine-
semiquinone, in bacterial and yeast. Mutation Research, v.539, p.29 – 41, 2003.
PINTO, A.C.; SILVA, D.H.S.; BOLZANI, V.S.; LOPES, N.P.; EPIFANIO, R.A.
Produtos naturais: atualidade, desafios e perspectivas. Química Nova, v.25, p.45 -
61, 2002.
PITTLER, M.H.; ERNST, E. Clinical effectiveness of garlic (Allium sativum).
Molecular Nutrition & Food Research, v.51, p.1382 – 1385, 2007.
PLASSCHAERT, S.L.A.; KAMPS, W.A.; VELLENGA, A.; VRIES, E.G.E.; DE-BONT,
E.S.J.M. Prognosis in childhood and adult acute lymphoblastic leukemia: a question
of maturation? Cancer Treatment ReviewsN, v.30, p.37 – 51, 2004.
PLESCA, D.; CROSBY, M.E.; GUPTA, D.; ALMASAN, A. E2F4 function in G2:
maintaining G2-arrest to prevent mitotic entry with damaged DNA. Cell Cycle, v.6,
p.1147 – 1152, 2007.
POLI, P.; BUSCHINI, A.; CANDI, A.; ROSSI, C. Bleomycin genotoxicity alteration by
glutathione and cytochromo P-450 cellular content in respiratory proficient and
deficient strains of Saccharomyces cerevisiae. Mutagenesis, v.14, p.233 - 238,
1999.
PRADEEP, C.R.; KUTTAN, G. Effect of piperine on the inhibition of lung metastasis
induced B16F-10 melanoma cells in mice. Clinical & Experimental Metastasis,
v.19, p.703 – 708, 2002.
Referências Bibliográficas
- 246 -
QUEIROZ, S.C.N.; COLLINS, C.H.; JARDIM, I.C.S.F. Métodos de extração e/ou
concentração de compostos encontrados em fluidos biológicos para posterior
determinação cromatográfica. Química Nova, v.24, p.68 - 76, 2001.
RABBITTS, T.H. Chromosomal translocation master genes, mouse models and
experimental therapeutics. Oncogene, v.20, p.5763 – 5777, 2001.
RABBITTS, T.H.; APPERT, A.; CHUNG, G.; COLLINS, E.C.; DRYNAN, L.;
FORSTER, A.; LOBATO, M.N.; MCCORMACK, M.P.; PANNELL, R.; SPANDIDOS,
A.; STOCKS, M.R.; TANAKA, T.; TSE, E. Mouse models of human chromosomal
translocations and approaches to cancer therapy. Blood Cells, Molecules, and
Diseases, v.27, p.249 – 259, 2001.
RABELO-GAY, M.N.; RODRIGUES, M.A.P.R.; MONTELEONE-NETO, R.
Mutagênese, teratogênese e carcinogênese: métodos e critérios de avaliação.
Revista Brasileira de Genética, v.1, p.246, 1991.
RAFFOUL, J.J.; SARKAR, F.H.; HILLMAN, G.G. Radiosensitization of prostate
cancer by soy isoflavones. Current Cancer Drug Targets, v.7, p.759 – 765, 2007.
RAHIER, N.J.; THOMAS, C.J.; HECHT, S.M. Camptothecin and its analogs. In:
Cragg, G.M., Kingston, D.G.I., Newman, D.J. (Eds.), Anticancer Agents from Natural
Products. Brunner-Routledge Psychology Press, Taylor & Francis Group, Boca
Raton, FL, p. 5 – 22, 2005.
RIVLIN, R.S. Nutrition and cancer prevention: New insights into the role of
phytochemicals. Future directions. Advances in Experimental Medicine and
Biology, v.492, p.255 – 262, 2001.
ROLLA, H.C. Avaliação da atividade mutagênica de amostras de sendimento do
Rio Guaíba e lodo proveniente da industria de papel e celulose. Tese de
mestrado, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, UFRGS, 1995.
Referências Bibliográficas
- 247 -
ROTHENBERG, M.L.; CARBONE, D.P.; JOHNSON, D.H. Improving the evaluation
of new cancer treatments: challenges and opportunities. Nature Reviews, v.3, p.303
- 309, 2003.
RUSTHOVEN, K.E.; RABEN, D.; BALLONOFF, A.; KANE, M.; SONG, J.I.; CHEN, C.
Effect of Radiation Techniques in Treatment of Oropharynx Cancer. Laryngoscope,
v.118, p.635 - 639, 2008.
SALVESEM, G.S.; DIXIT, V.M. Caspases: intracellular signaling by proteolysis. Cell,
v.91, p.443 – 446, 1997.
SCHEUER, P.J.; LEFKOWITCH, J.H. Drugs and toxins. In: Liver Biopsy
Interpretation, 6
th
edn., Scheuer PJ, Lefkowitch JH (eds). WB Saunders, London,
p.134 – 150, 2000.
SCHMID, W. The micronucleus test. Mutation Research, v.31, p.9 – 15, 1975.
SCHULLER, R.C.; VON-BORSTEL, R.C. Spontaneous mutability in yeast. I. Stability
of lysine reversion rates to variation of adenine concentration. Mutation Research,
v.24, p.17 – 23, 1974.
SCHWARTSMANN, G.; RATAIN, M.J.; CRAGG, G.M.; WONG, J.E.; SAIJO, N.;
PARKINSON, D.R.; FUJIWARA, Y.; PAZDUR, R.; NEWMAN, D.J.; DAGHER, R.; DI-
LEONE, L. Anticancer drug discovery and development throughout the world.
Journal of Clinical Oncology, v.20, p.47S - 59S, 2002.
SCHWARZ, S.; OBERMÜLLER-JEVIC, U.C.; HELLMIS, E.; KOCH, W.; JACOBI, G.;
BIESALSKI, H.K. Lycopene inhibits disease progression in patients with benign
prostate hyperplasia. Journal of Nutrition, v.138, p.49 – 53, 2008.
SELVENDIRAN, K.; BANU, S.M.; SAKTHISEKARAN, D. Protective effect of piperine
on benzo(a)pyrene-induced lung carcinogenesis in Swiss albino mice. Clinica
Chimica Acta, v.350, p.73 – 78, 2004.
Referências Bibliográficas
- 248 -
SELVENDIRAN, K.; SINGH, J.P.V.; SAKTHISEKARAN, D. In vivo effect of piperine
on serum and tissue glycoprotein levels in benzo(a)pyrene induced lung
carcinogenesis in Swiss albino mice. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics,
v.19, p.107 – 111, 2006.
SEREN, S.; LIEBERMAN, R.; BAYRAKTAR, U.D.; HEATH, E.; SAHIN, K.; ANDIC,
F.; KUCUK, O. Lycopene in cancer prevention and treatment. American Journal of
Therapeutics, v.15, p.66 – 81, 2008.
SERGEY, Y.A.P.; ANATOLI, G.K.; GABAI, V.L. Necrosis: a specific form of
programmed cell death? Experimental Cell Research, v.283, p.1 - 16, 2003.
SHAH, V.P.; MIDHA, K.K.; FINDLAY, J.W.A.; HILL, H.M.; HULSE, J.D.;
MCGILVERAY, I.J.; MCKAY, G.; MILLER, K.J.; PATNAIK, R.N. POWELL, M.L.;
TONELLI, A.; VISWANATHAN, C.T.; YACOBI, A. Bioanalytical method validation – A
revisit with a decade of progress. Pharmaceutical Research, v.17, p.1551 – 1557,
2000.
SHAPIRO, H.M. Pratical flow cytometry. Alan R. Liss, Inc., New York, 1985.
SHARGEL, L.; YU, A.B.C. Applied Biopharmaceutics and Pharmacokinetics, 4
th
ed., Appleton & Lange, Stamford, p.768, 1999.
SHUKLA, Y.; KALRA, N. Cancer chemoprevention with garlic and its constituents.
Cancer Letter, v.247, p.167 – 181, 2007.
SILVA, J.; ERDTMANN, B.; HENRIQUES, J.A.P.; Genética Toxicologia. Porto
Alegre, Alcance, p.422, 2003a.
SILVA, M.N.; FERREIRA, V.F.; SOUZA, M.C.B.V. Um panorama atual da química e
da farmacologia de naftoquinonas, com ênfase na β-lapachona e derivados.
Química Nova, v.26, p.407 - 416, 2003b.
Referências Bibliográficas
- 249 -
SILVA, R.V.; NAVICKIENE, H.M.; KATO, M.J.; BOLZANI, V.D.A.S.; MEDA, C.I.;
YOUNG, M.C.; FURLAN, M. Antifungal amides from Piper arboreum and Piper
tuberculatum. Phytochemistry, v.59, p.521 – 527, 2002.
SINGH, N.P.; MACCOY, M.T.; TICE,R.R.; SCHNEIDER, E.L. A simple technique for
quantification of low levels of DNA damage in individual cell. Experimental Cell
Research, v.175, p.184 - 191, 1988.
SINGH, N.P.; STEPHENS, R.E. Microgel eletrophoresis: sensitivity, mechanisms and
DNA eletrostretching. Mutation Research, v.383, p.167 - 175, 1996.
SINGH, N.P. Microgels for estimation of DNA strand breaks, DNA protein cross links
and apoptosis. Mutation Research, 455, 111 - 127, 2000.
SINGH, Y.N.; SINGH, N.N. Therapeutic potential of kava in the treatment of anxiety
disorders. Central Nervous System Drugs, v.16, p.731 – 743, 2002.
SOREIDE, J.A.; EIRIKSSON, K.; SANDVIK, O.; VISTE, A.; HORN, A.; JOHNSEN,
G.; GRONBECH, J.E. Surgical treatment of liver metastases from colorectal cancer.
Tidsskr nor Laegeforen, v.128, p.50 – 53, 2008.
SOUZA, M.V.N. Novos produtos naturais capazes de atuar na estabilização de
microtúbulos, um importante alvo no combate ao câncer. Química Nova, v.27, p.308
- 312, 2004.
SPANDIDOS, D.A. Oncogenes and tumor suppressor genes as paradigms in
oncogenesis. Journal of Buon, v.12 Suppl 1, p.S9 – 12, 2007.
SPANDIDOS, D.A. Mechanism of carcinogenesis: The role of oncogenes,
transcriptional enhancers and growth factors. Anticancer Research, v.5, p.485 −
498, 1985.
SPENCE, R.A.J.; JONHSTON, P.G. Oncology, Oxford University Press, Oxford,
p.536, 2001.
Referências Bibliográficas
- 250 -
STEINMETZ, K.A.; KUSHI, H.; BOSTICK, R.M.; FOLSOM, A.R; POTTER, J.D.
Vegetables, fruit, and colon cancer in the Iowa Women's Health Study. American
Journal of Epidemiology, v.139, p.1 – 15, 1994.
STEWART, H.L.; SNEU, K.C.; DUNHAM, L.J.; SCHLYEN, S.M. Transplantable and
Transmissible Tumors of Animals. Armed Forces Institute of Pathology,
WashIngton, p.324 – 329, 1959.
STRASSER, A. The role of BH3-only proteins in the immune system. Nature
Reviews Immunology, v.5, p.189 - 200, 2005.
SUBRAMANIAN, B.; NAKEFF, A.; TENNEY, K.; CREWS, P.; GUNATILAKA, L.;
VALERIOTE, F. A new paradigm for the development of anticancer agents from
natural products. Journal of Experimental Therapeutics & Oncology, v.5, p.195 –
204, 2006.
SUNILA, E.S.; KUTTAN, G. Immunomodulatory and antitumor activity of Piper
longum Linn. and piperine. Journal of Ethnopharmacology, v.90, p.339 – 346,
2004.
SYED, D.N.; KHAN, N.; AFAQ, F.; MUKHTAR, H. Chemoprevention of prostate
cancer through dietary agents: progress and promise. Cancer Epidemiology,
Biomarkers & Prevention, v.16, p.2193 – 2203, 2007.
TAKIGUCHI, N.; SAITO, N.; NUNOMURA, M.; KOUDA, K.; ODA, K.; FURUYAMA,
N.; NAKAJIMA, N. Use of 5-FU plus hyperbaric oxygen for treating malignant tumors:
evaluation of antitumor effect and measurement of 5-FU in individual organs. Cancer
Chemotherapy and Pharmacology, v.47, p.11 – 14, 2001.
TERZIYSKA, A.; WALTSCHEWA, L.; VENKOV, P. A new sensitive test based on
yeast cells for studying environmenal pollution. Environmental Pollution, v.109,
p.43 - 52, 2000.
Referências Bibliográficas
- 251 -
THOMAS, G. Medicinal Chemistry: An Introduction. John Wiley & Sons,
Chichester, 2000.
TICE, R.R.; AGURELL, E.; ANDERSON, D.; BURLINSON, B.; HARTMANN, A.;
KOBAYASHI, H.; MIYAMAE, Y.; ROJAS, E.; RYU, J.C.; SASAKI, Y.F. Single cell
gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing.
Environmental and Molecular Mutagenesis, v.35, p.206 – 221, 2000.
TICE, R.R.; ORMISTON, B.G.; BOUCHER, R.; LUKE, C.A.; PAQUETTE, D.S.
Environmental bomonitorng with feral rodent species. In: Sandhu, S., Waters, M.D.
(Eds) Application of short-term bioassays in the analysis of complex
environmental mixtures. Plenum Publishing Cco, New York, p.175 - 180, 1998.
TICE, R.R. Applications of the single cell gel assay to environmetal biomonitoring for
genotoxic pollutants. In: Butterworth, B.E., Corkun, L.D., Guzmán-Rincón, J.(Eds)
Biomonitors and Biomarkers as Indicators of Environment Change. Plenum
Press, New York, p.69 - 79, 1995.
TISHER, C.C.; BRENNER, B.M. Renal pathology: with clinical and functional
correlations. JB Lippincott Company, Philadelphia, 1994.
TRIPATHI, Y.B.; TRIPATHI, P.; ARJMANDI.; B.H. Nutraceuticals and cancer
management. Frontiers in Bioscience, v.10, p.1607 – 1618, 2005.
TSAI, I.L.; LEE, F.P.; WU, C.C.; DUH, C.Y.; ISHIKAWA, T.; CHEN, J.J.; CHEN, Y.C.;
SEKI, New cytotoxic cyclobutanoid amides, a new furanoid lignan and anti-platelet
aggregation constituents from Piper arborescens. Planta Medica, v.71, p.535 – 542,
2005.
VAN-DER-HEIJDEN, R.; JACOBS, D.I.; SNOEIJER, W.; HALLARD, D.;
VERPOORTE, R. The Catharanthus alkaloids: pharmacognosy and biotechnology.
Current Medicinal Chemistry, v.11, p.607 – 628, 2004.
Referências Bibliográficas
- 252 -
VARLEY, H.; GOWENLOCK, A.M.; BELL, M. In: Practical Clinical Biochemistry,
Vol 1, 5
th
edn., William Heinmann Medical Books, London, p.452, 1980.
VERMES, I., HAANEN, C., STEFFENS-NAKKEN, H., REUTELINGSBERGER, C.A
novel for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatydilserine expression on
early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of
Immunological Methods, v.184, p.39 - 51, 1995.
VON-BORSTEL, R.C.; CAIN, K.T.; STEINBERG, C.M. Inheritance of spontaneous
mutability in yeast. Genetics, v.69, p.17 – 27, 1971.
VON-BORSTEL, R.C.; HIGGINS, J.A. Janus carcinogens and mutagens. Mutation
Research, v.402, p.321 – 329, 1998.
WELLING, P.G. Pharmacokinetics: processes, mathematics, and applications.
2
nd
edn., American Chemical Society, Washington, p.393, 1997.
WERMUTH, G.; GANELLIN, C.R.; LINDBERG, P.; MITSCHER, L.A.; Glossary of
terms used in medicinal chemistry. Pure and Applied Chemistry, v.70, p.1129 -
1143, 1998.
WERNERT, N. Immunohistochemistry of the prostate and prostate carcinomas.
Veroffentlichungen aus der Pathologie-Progress in Pathology, v.135, p.1 - 163.
1991.
WESTERTERP-PLANTENGA, M.; DIEPVENS, K.; JOOSEN, A.M.; BÉRUBÉ-
PARENT, S.; TREMBLAY, A. Metabolic effects of spices, teas, and caffeine.
Physiology & Behavior, v.89, p.85 – 91, 2006.
WESTWELL, A.D.; STEVENS, M.F.G. Hitting the chemotherapy jackpot: strategy,
productivity and chemistry. Drug Discovery Today, v.9, p.625 – 627, 2004.
Referências Bibliográficas
- 253 -
WOJEWODZKA, M.; BURACZEWSKA, I.; KRUSZEWSKI, M. A modified neutral
comet assay: elimination of lysis at high temperature and validation of the assay with
anti-single-stranded DNA antibody. Mutation Research, v.518, p.9 – 20, 2002.
WOLFE, K.L.; LIU, R.H. Apple peels as a value-added food ingredient. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, v.51, p.1676 – 1683, 2003.
World Health Organization. Cancer (WHO). Fact sheet n° 297. Feb 2006.
[homepage on the internet]. Geneva: World Health Organization; Available from:
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/print.html.
WU, A.H.; YU, M.C.; TSENG, C.C.; PIKE, M.C. Epidemiology of soy exposures and
breast cancer risk. British journal of cancer, v.98, p.9 – 14, 2008.
YUNES, R.A.; PEDROSA, R.C.; CECHINEL-FILHO, V. Fármacos e fitoterápicos: a
necessidade do desenvolvimento da indústria de fitoterápicos e fitofármacos no
Brasil. Química Nova, v.24, p.147 - 152, 2001.
ZIMMERMANN, F.K. Procedures used in the induction of mitotic recombination and
mutation in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Mutation Research, v.31, p.71 -
86, 1975.
ZUCKERBERG, C. Ultrastructure of Sarcoma 180. Cancer Research, v.33, p.2278 -
2282, 1973.
ZUCO, V.; SUPINO, R.; RIGHETTI, S.C.; CLERIS, L.; MARCHESI, E.;
GAMBACORTI-PASSERINI, C.; FORMELLI, F. Selective cytotoxicity of betulinic acid
on tumor cell lines, but not on normal cells. Cancer Letters, v.175, p.17 – 25, 2002.
- 254 -
Anexos
Comiss20
de
Btica
em
Pesquisa Animal
-
CEPA
Rua: Coronel
Nunes
de Mela,
1
127
Rodolfo Te6filo
Cep:
60430-970
Fortaleza-CE
Tel:
(85)
4009-8338
Fax
(85) 4009-8333
Declaramos que o protocolo para uso de animais em experimentaqfio ng 45/05, sobre
o projeto intitulado
"Determinaqiio do mecanismo de aqIo
e
estudo da relaqiio
estrutura-atividade da piplartina e seus an8logos",
esta de acordo com os Principios
~ticos na Experimentaqtio Animal adotados pelo CoMgio Brasileiro de Experimentaqtio
Animal (COBEA).
Declaramos ainda que o referido projeto foi aprovado pela Comisstio de ~tica em
Pesquisa Animal
-
CEPA em reuniilo realizada em 15 de dezembro de 2005.
Fortaleza,
16
de dezembro de 2005
Coordenadora d
isa Animal
-
CEPA
156 D. P. BEZERRA ET AL.
Copyright © 2007 John Wiley & Sons, Ltd. J. Appl. Toxicol. 2008; 28: 156–163
DOI: 10.1002/jat
JOURNAL OF APPLIED TOXICOLOGY
J. Appl. Toxicol. 2008; 28: 156–163
Published online 31 May 2007 in Wiley InterScience
(www.interscience.wiley.com) DOI: 10.1002/jat.1261
In vitro and in vivo antitumor effect of 5-FU combined
with piplartine and piperine
Daniel P. Bezerra,
1
Fernanda O. de Castro,
1
Ana Paula N. N. Alves,
2
Cláudia Pessoa,
1
Manoel Odorico
de Moraes,
1
Edilberto R. Silveira,
3
Mary Anne S. Lima,
3
Francisca Juliana M. Elmiro,
3
Nylane M. N.
de Alencar,
1
Rodney O. Mesquita,
1
Michael W. Lima
1
and Letícia V. Costa-Lotufo
1,
*
1
Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Caixa Postal 3157,
60430-270 Fortaleza, Ceará, Brazil
2
Departamento de Clínica Odontológica, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, Ceará, Brazil
3
Departamento de Química Orgânica e Inorgânica, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, Ceará, Brazil
Received 2 February 2007; Revised 21 March 2007; Accepted 23 March 2007
ABSTRACT: It has been reported that piplartine and piperine, alkaloid/amide compounds from Piper species, show
antitumor activities. In the present paper, the effects of the combination of 5-fluorouracil (5-FU) with piplartine or piperine
was determined using in vitro and in vivo experimental models. Hematological and biochemical analyses, as well as
histopathological and morphological analyses of the tumor and the organs, including liver, spleen and kidney, were per-
formed in order to evaluate the toxicological aspects associated with different treatments. The incubation of tumor cell
lines with 5-FU in the presence of piplartine or piperine produced an increase in growth inhibition, as observed by
lower IC
50
values for 5-FU. These effects were also observed in vivo, where the combination with piplartine but not
piperine with 5-FU led to a higher tumor growth inhibition. The results indicated that either piplartine- or 5-FU-
treated animals showed a low inhibition rate when they were used individually at low doses of 28.67% and 47.71%,
respectively, but when they were combined at the same dose, the inhibition rate increased significantly to 68.04%.
The histopathological analysis showed that the livers and the kidneys of treated animals were only slightly and reversibly
affected. Neither the enzymatic activity of transaminases nor the urea levels were significantly modified when compared
with the control group. Hematological analysis showed leukopenia after 5-FU treatment, which was reversed by the com-
bined use of piplartine and piperine. These findings indicate that piplartine may enhance the therapeutic effectiveness
of chemotherapeutic drugs, and moreover, this combination could improve immunocompetence hampered by 5-FU.
Copyright © 2007 John Wiley & Sons, Ltd.
KEY WORDS: piplartine; piperine; 5-fluorouracil; antitumor activity; toxicity
Introduction
Natural products are the most consistent source of drug
leads. Newer developments based on natural products
include many anticancer agents, such as vindesine,
vinorelbine, etoposide, docetaxel and topotecan (Cragg
and Newman, 2005). Therefore, the use of natural prod-
ucts has been the single most successful strategy for the
discovery of new medicines used in anticancer therapy.
Many naturally occurring plant-derived substances
ingested in the human diet exhibit anticarcinogenic and
* Correspondence to: L. V. Costo-Lotufo, Department of Physiology and
Pharmacology, UFC, Rua Cel. Nunes de Melo, 1127, 60430-270 Fortaleza,
Ceará, Brazil.
E-mail: [email protected]
Contract/grant sponsor: CNPq.
Contract/grant sponsor: Instituto Claude Bernard.
Contract/grant sponsor: FUNCAP.
Contract/grant sponsor: Banco do Nordeste.
Contract/grant sponsor: FINEP.
antimutagenic effects (Reen and Singh, 1991; Annu
et al., 1998). Many authors have emphasized that the
phytochemicals isolated from spices, such as peppers, are
potent biological agents with interesting anticancer prop-
erties (Lampe, 2003). Various amides bearing isobutyl,
pyrrolidine, dihydropyridone and piperidine moieties have
been isolated from Piperaceae species (Parmar et al.,
1997). These amides have generated interest as a result of
their potent cytotoxic activity towards tumor cell lines
(Tsai et al., 2005).
Piperine is a major plant alkaloid/amide present in
black and long peppers (Piper nigrum and Piper
longum), which is one of the most common spices con-
sumed by a large number of people worldwide. It is
shown to possess diverse pharmacological activities
(reviewed by Parmar et al., 1997). Concerning anticancer
related properties, piperine has been reported to inhibit
lung metastasis (Pradeep and Kuttan, 2002), and to
possess antitumor activities in different animal models
(Sunila and Kuttan, 2004; Bezerra et al., 2006).
ANTITUMOR EFFECT OF 5-FU WITH PIPLARTINE AND PIPERINE 157
Copyright © 2007 John Wiley & Sons, Ltd. J. Appl. Toxicol. 2008; 28: 156–163
DOI: 10.1002/jat
Piplartine is also an alkaloid/amide present in Piper
species. Biological activities described for this amide
include antifungal, antiplatelet, cytotoxic and antitumor
activities (Duh and Wu, 1990; Duh et al., 1990; Silva
et al., 2002; Tsai et al., 2005, Bezerra et al., 2005;
2006; 2007).
The aim of this study was to investigate the effect
of piplartine and piperine in combination with the
chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU) using both
in vitro and in vivo experimental models. In order to
evaluate the toxicological aspects related to different
treatments, hematological, biochemical, histopathological
and morphological analyses of treated animals were
performed.
Material and Methods
Drugs
Piplartine was purified from the roots of Piper tuber-
culatum as described by Bezerra et al. (2005). Briefly,
420.0 g of ground roots of P. tuberculatum was macer-
ated with a mixture of petroleum/ethyl acetate 1:1 (1.5 l)
for 24 h (3×). The solvent mixture was evaporated under
reduced pressure to yield a yellowish solid (13.24 g),
which provided piplartine (4.35 g) (Fig. 1) after crystal-
lization from MeOH. Piplartine, obtained as a pure
compound, was characterized particularly by 1D and
2D NMR analyses and m.p. 122.2–122.6 °C (Lit. 128–
130 °C and 124 °C, Atal et al., 1975; Braz-Filho et al.,
1981).
Piperine, from black pepper seeds, was purchased
from Acros Organics (New Jersey, USA) (Fig. 1). 5-FU
was purchased from Sigma Aldrich Co. (St Louis, MO,
USA).
Animals and Tumor Cells
In vitro cytotoxicity was determined in tumor cells using
HL-60 (leukemia), MDA-MD-435 (breast), SF295 (cen-
tral nervous system) and HCT-8 (colon) human cell lines
obtained from the National Cancer Institute, Bethesda,
MD, USA. All cell lines were maintained in RPMI
1640 supplemented with 10% fetal bovine serum, 2 mM
glutamine, 100 U ml
−1
penicillin, 100 μgml
−1
strepto-
mycin at 37 °C with 5% CO
2
.
A total number of 140 Swiss mice (female, 25–30 g)
obtained from the Central Animal House of the Federal
University of Ceará, Brazil were used. Animals were
housed in cages with free access to food and water.
All animals were kept under a 12 h:12 h light-dark cycle
(lights on at 6:00 a.m.). Animals were treated accord-
ing to the ethical principles of animal experimentation
of COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação
Animal), Brazil. The Animal Studies Committee of
Federal University of Ceará approved the experimental
protocol.
Sarcoma 180 tumor cells were maintained in the
peritoneal cavities of the Swiss mice in the Laboratory of
Experimental Oncology from the Federal University of
Ceará since the mid 1980s.
Cell Proliferation Assays
For all experiments, cells were plated in 96-well plates
(10
5
cells/well for adherent cells or 0.5 × 10
5
cells/
well for suspended cells in 100 μl of medium). The
cytotoxicity of 5-FU was accessed in the absence or pres-
ence of piplartine (5 μM) or piperine (50 μM). Piplartine
and piperine concentrations were determined from previ-
ous experiments to avoid any cytotoxic activity related to
amide treatments. The vehicle was used as a negative
control. Tumor cell growth was assessed according to
changes in the viable cell number as determined by
the ability of living cells to reduce the yellow dye 3-
(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium
bromide (MTT) to a purple formazan product (Mosmann,
1983). At the end of incubation (72 h), the plates were
centrifuged and the medium was then replaced by fresh
medium (200 μl) containing 0.5 mg ml
−1
MTT. Three
hours later, the MTT formazan product was dissolved in
150 μl DMSO, and the absorbance was measured using
a multiplate reader (Spectra Count, Packard, Ontario,
Canada). The drug effect was quantified as the percent-
age of control absorbance of reduced dye at 595 nm.
Figure 1. Chemical structure of piplartine {5,6-dihydro-
1-[1-oxo-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-2-propenyl]-
2(1H)pyridinone} and piperine {1-5-(1,3)-benzodioxol-
5-yl)-1-oxo-2,4-pentadienyl]piperidine}
158 D. P. BEZERRA ET AL.
Copyright © 2007 John Wiley & Sons, Ltd. J. Appl. Toxicol. 2008; 28: 156–163
DOI: 10.1002/jat
Assay of Antitumor Activity and Toxicological
Study
Ten-day-old Sarcoma 180 ascites tumor cells (2 ×
10
6
cell/500 μl) were implanted subcutaneously into the
left hind groin of the mice. One day after inoculation,
piplartine or piperine (50 mg kg
−1
) alone or combined
with 5-FU (10 mg kg
−1
) was dissolved in 10% DMSO
and administered intraperitoneally for 7 days in mice
transplanted with sarcoma 180 tumor and in healthy
mice. These doses were selected based on their rate inhi-
bition obtained from previous work (Bezerra et al.,
2006). 5-FU (10 mg kg
−1
) was used as a positive control.
The negative control was injected with 10% DMSO or
0.9% NaCl. On day 8, the mice were killed. Tumors,
livers, spleens and kidneys were extirpated, weighed
and fixed in 10% formaldehyde. The tumor inhibition
ratio (%) was calculated by the following formula: inhi-
bition ratio (%) = [(A-B)/A] × 100, where A is the mean
tumor weight of the negative control, and B is that of the
treated group. Body weights were measured at the start
and at the last day of treatment. Peripheral blood was
obtained by retro-orbital venous plexus sampling with
a heparinized capillary tube from healthy mice or mice
transplanted with sarcoma 180 tumor and used for
hematological and biochemical analyses.
Biochemical and Hematological Parameters
Blood samples of the treated-animals were collected
from the retro-orbital plexus under light ether anesthesia.
Biochemical analyses were performed in serum samples
obtained after centrifugation of total blood without anti-
coagulants, at 2500 rpm for 15 min. Standardized diag-
nostic kits from LABTEST
®
(Lagoa Santa, MG, Brazil)
were used in the spectrophotometric determination of
aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotrans-
ferase (ALT) and urea.
For the hematological analysis, an aliquot of blood per
animal was placed in ethylenediaminetetraacetic acid
(EDTA) and various hematological parameters (hemo-
globin content, platelet count, total and differential count
of leukocytes) were carried out by standard manual pro-
cedures using light microscopy.
Histopathology and Morphological Observations
After being fixed with formaldehyde, tumors, livers,
spleens and kidneys were grossly examined for size or
color changes and hemorrhage. Subsequently, portions of
the tumor, liver, spleen and kidney were cut into small
pieces, followed by staining with hematoxylin and eosin
of the histological sections. Histological analyses were
performed by light microscopy. The occurrence and the
extent of liver or kidney lesions attributed to drugs were
recorded.
Statistical Analysis
Data are presented as mean ± SEM. The differences
between experimental groups were compared by ANOVA
followed by Student Newman Keuls or Bonferroni tests
(P < 0.05).
Results
Effects of 5-FU combined with Piplartine or
Piperine on Tumor Cells In Vitro
Before determining the effects of 5-FU combined with
piplartine or piperine, the IC
50
of piplartine and piperine
were determined separately. The obtained IC
50
values
were in the range 6.0–7.8 μM and 77.1– > 87.56 μM
for piplartine and piperine, respectively (Bezerra et al.,
2005). To investigate the effects of 5-FU, the cytotoxicity
was accessed in the absence or in the presence of
piplartine (5 μM) or piperine (50 μM), considering that
these concentrations do not account for more than 20%
of the effect itself. Table 1 shows the IC
50
values attained
for 5-FU in the absence and presence of piplartine or
piperine. The 5-FU concentration required to cause 50%
growth inhibition (IC
50
) in HL-60, MDA-MB435, SF295
Table 1. In vitro cytotoxicity of 5-FU in the absence and presence of piplartine or piperine on tumor cell lines.
Data are presented as IC
50
± SEM values from two independent experiments performed in quadruplicate (n = 8) for
leukemia (HL-60), colon (HCT-8), brain (SF295) and breast (MDA-MB435) cancer cells
5-Fluorouracil
Cell line – Piperine (50 μM) Piplartine (5 μM)
HCT-8 11.18 ± 0.71 9.13 ± 0.39 4.70 ± 0.55
a
SF-295 2.33 ± 0.51 2.40 ± 0.30 0.49 ± 0.11
a
HL-60 84.68 ± 0.66 55.53 ± 0.39
a
38.13 ± 0.43
a
MDA-MB435 9.19 ± 0.85 4.91 ± 0.59
a
1.95 ± 0.27
a
a
P < 0.05 compared with 5-FU alone by ANOVA followed by Student Newman-Keuls.
ANTITUMOR EFFECT OF 5-FU WITH PIPLARTINE AND PIPERINE 159
Copyright © 2007 John Wiley & Sons, Ltd. J. Appl. Toxicol. 2008; 28: 156–163
DOI: 10.1002/jat
and HCT-8 cells was 84.68, 9.19, 2.33 and 11.18 μM,
respectively.
Piplartine increased the efficacy of 5-FU in all cell
lines tested as observed by the lower IC
50
value. For
example, when 5-FU was used in combination with 5 μM
piplartine, the IC
50
value diminished from 2.33 to 0.49 μM
in SF-295 cells. On the other hand, piperine increased the
cytotoxicity of 5-FU in only HL-60 and MDA-MB435
cells. Table 1 indicates that combined treatment with
piperine (50 μM) reduced the IC
50
of 5-FU from 84.68 to
55.53 μM in HL-60 and from 9.19 to 4.91 μM in MDA-
MB435 cells.
Effects of 5-FU combined with Piplartine
or Piperine on Sarcoma 180 Tumor in Mice
transplanted In Vivo
The effects of 5-FU combined with piplartine or piperine
on sarcoma 180-transplanted mice are shown in Table 2.
Piplartine and piperine doses were determined by previ-
ous experiments using sarcoma 180 tumor cells as a
model (Bezerra et al., 2006). There was a significant
reduction in tumor weight in animals treated with 5-FU,
piperine or piplartine, as well as with 5-FU combined
with piperine or piplartine (P < 0.05). On day 8, the
mean tumor weight of the control mice was 1.90 ±
0.12 g, while in the drug-treated mice it was 1.43 ±
0.12 g with piplartine, 1.04 ± 0.15 g with piperine and
0.99 ± 0.10 g with 5-FU. When the animals were treated
with 5-FU combined with piplartine or piperine, the mean
tumor weights were 0.61 ± 0.10 g and 0.99 ± 0.11 g,
respectively. There were statistically significant differ-
ences between the two alkaloids and among doses in
relation to the control group, but only piplartine added
to 5-FU was statistically different from 5-FU alone (P <
0.05). Tumor growth inhibition increased to 68.04% with
5-FU plus piplartine, but was not modified by the com-
bination of 5-FU with piperine at the same concentration.
Histopathological analyses of the tumors extirpated
from control mice showed groups of large, round and
polygonal cells, with pleomorphic shapes, hyperchromatic
nuclei and binucleation. Several degrees of cellular and
nuclear pleomorphism were seen. Mitosis, muscle inva-
sion and coagulation necrosis were also noticed. In the
tumors extirpated from treated animals, extensive areas of
coagulative necrosis were observed.
Thus, the results indicated that piplartine, piperine or
5-FU inhibited tumor growth when used individually, but
when 5-FU was combined with piplartine at the same
doses, tumor growth inhibition increased significantly.
This indicated that piplartine may increase the antitumor
activity of 5-FU.
Toxicological Aspects of 5-FU Treatment with
and without Piplartine or Piperine
No significant changes in the renal (urea level) or liver
(enzymatic activity of transaminases AST and ALT)
parameters were seen in any animals treated with piplar-
tine or piperine alone or in combination with 5-FU
(P > 0.05) in mice transplanted with sarcoma 180 tumor
or healthy mice (Table 3).
The animals transplanted with sarcoma 180 tumor
and treated only with saline showed a significant increase
Table 2. The percent inhibition of 5-FU combined with piplartine or piperine in mice transplanted with sarcoma
180 tumor or healthy mice
Dose Liver (g 100 g
−1
Spleen (g 100 g
−1
Kidney (g 100 g
−1
Inhibition
Drug (mg kg
−1
) body weight) body weight) body weight) Tumor (g) (%)
Healthy mice
Saline – 4.51 ± 0.18 0.23 ± 0.02 1.09 ± 0.03 – –
10% DMSO – 4.29 ± 0.20 0.40 ± 0.08 1.11 ± 0.05 – –
5-FU 10 4.57 ± 0.27 0.45 ± 0.01 1.05 ± 0.08 – –
Piplartine 50 4.28 ± 0.40 0.31 ± 0.04 1.15 ± 0.05 – –
Piplartine + 5-FU 50 + 10 4.32 ± 0.22 0.33 ± 0.08 1.14 ± 0.04 – –
Piperine 50 4.73 ± 0.22 0.20 ± 0.02 1.13 ± 0.03 – –
Piperine + 5-FU 50 + 10 4.72 ± 0.61 0.21 ± 0.03 1.19 ± 0.12 – –
Mice transplanted with S180
Saline – 5.22 ± 0.09 0.56 ± 0.03 1.32 ± 0.05 2.74 ± 0.15 –
10% DMSO – 5.05 ± 0.12 0.62 ± 0.08 1.15 ± 0.09 1.90 ± 0.12 –
5-FU 10 4.26 ± 0.52 0.40 ± 0.10
a
1.06 ± 0.03 0.99 ± 0.10
a
47.71
Piplartine 50 4.58 ± 0.26 0.63 ± 0.05 1.04 ± 0.05 1.43 ± 0.12
a,c
24.61
Piplartine + 5-FU 50 + 10 5.07 ± 0.87 0.62 ± 0.24 1.19 ± 0.10 0.61 ± 0.10
a,b,c
68.04
Piperine 50 4.40 ± 0.24 0.48 ± 0.06 1.02 ± 0.04 1.04 ± 0.15
a
45.00
Piperine + 5-FU 50 + 10 4.70 ± 0.49 0.37 ± 0.14
a
1.11 ± 0.15 0.99 ± 0.11
a
47.95
Data are presented as mean ± SEM of ten animals.
a
P < 0.05 compared with 10% DMSO experimental group by ANOVA followed by Newman-Keuls.
b
P < 0.05 compared with piplartine experimental group by ANOVA followed by Newman-Keuls.
c
P < 0.05 compared with 5-FU experimental group by ANOVA followed by Newman-Keuls.
160 D. P. BEZERRA ET AL.
Copyright © 2007 John Wiley & Sons, Ltd. J. Appl. Toxicol. 2008; 28: 156–163
DOI: 10.1002/jat
(P < 0.05) in the total number of circulating peripheral
leukocytes compared with normal animals. Moreover,
there was a significant difference (P < 0.05) in lympho-
cyte and neutrophil percentages in the peripheral blood
of animals transplanted with sarcoma 180 tumor when
compared with the normal group treated with saline
(Table 4). When the normal animals or those transplanted
with sarcoma 180 were treated with 5-FU, a marked re-
duction in leukocytes was seen in both groups. Further-
more, piplartine and piperine in combination with 5-FU,
not only induced an increase in the number of total
leukocytes, but also normalized the leukocyte propor-
tions. In addition, piplartine and piperine alone were also
able to normalize lymphocyte and neutrophil percentages
in peripheral blood of sarcoma 180 inoculated animals.
No significant changes in hematological parameters were
seen in any animals treated with piplartine or piperine
alone in healthy mice.
The organs removed from the treated animals were
weighed. No significant changes in organ weights were
seen in any animals treated with piplartine alone or in
combination with 5-FU or piperine alone (Table 2). How-
ever, after treatment with 5-FU combined with piperine
or 5-FU alone, the spleen weights were significantly
reduced when compared with the control group (P <
0.05), but only in mice transplanted with sarcoma 180.
No significant changes in the body weights were seen in
any groups (P > 0.05) (data not shown).
Histopathological analyses of the kidneys from treated
animals showed a discrete hydropic change in the pro-
ximal tubular epithelium and glomerular and tubular
hemorrhage, but the glomerular structure was essentially
preserved. Besides the toxic effects observed in the
kidney, the liver histopathological analyses indicated that
it was also a target organ for alkaloid amide toxicity. The
effects observed in the liver of 5-FU + piperine treated
animals were more marked than in other groups. These
effects included Kupffer cell hyperplasia, portal tracts
and centriolobular venous congestion, focal infiltrate of
chronic inflammatory cells, intense ballooning degenera-
tion of hepatocytes, and sinusoidal hemorrhage. However,
only with 5-FU combined with piperine were areas of
microvesicular steatosis observed.
In addition, spleen histopathology in piplartine treated
animals indicated marked white pulps, megakaryocytes
throughout and visualization of lymphoid follicles. There
was no significant change in the spleen in the other
experimental groups when compared with the control
group.
Discussion
In clinical cancer chemotherapy, anticancer drugs are
often used in combination. The discovery of useful com-
bination chemotherapy is expected to increase the re-
sponse rate and the frequency of long-term survival
(Morinaga et al., 2003). In treatment with piplartine or
piperine, it will be important to determine the effect of
these amides on the antitumor activity and toxicological
effects related to 5-FU treatment.
It has been reported that piplartine and piperine show
in vitro and in vivo antitumor activity (Duh et al., 1990;
Duh and Wu, 1990; Sunila and Kuttan, 2004; Bezerra
et al., 2005, 2006, 2007). The present study investigated
the in vitro and in vivo effect of piplartine or piperine in
combination with 5-FU on antitumor activity using
experimental models. The chemotherapeutic agent 5-FU
was used as it is highly cited in other works facilitating
comparison of the data. In addition, some parameters
Table 3. Effect of 5-FU combined with piplartine or piperine on the biochemical parameters in peripheral blood
from mice transplanted with sarcoma 180 tumor or healthy mice
Drug Dose (mg kg
−1
) AST (UI l
−1
) ALT (UI l
−1
) Urea (mg dl
−1
)
Healthy mice
0.9% NaCl – 82.3 ± 11.5 52.1 ± 9.3 34.1 ± 6.2
10% DMSO – 108.0 ± 4.6 47.9 ± 12.7 29.8 ± 8.5
5-FU 10 115.9 ± 10.5 45.8 ± 11.3 29.2 ± 9.3
Piplartine 50 112.9 ± 9.3 41.8 ± 7.4 40.4 ± 5.2
Piplartine + 5-FU 50 + 10 99.0 ± 12.9 58.9 ± 9.2 37.5 ± 3.2
Piperine 50 106.4 ± 12.3 37.8 ± 6.9 36.8 ± 6.2
Piperine + 5-FU 50 + 10 108.0 ± 15.9 58.3 ± 9.4 31.9 ± 3.9
Mice transplanted with S180
0.9% NaCl – 113.9 ± 9.7 45.2 ± 15.9 28.5 ± 6.1
10% DMSO – 106.4 ± 9.6 50.8 ± 10.7 31.6 ± 9.1
5-FU 10 119.6 ± 14.1 35.9 ± 14.3 27.5 ± 5.3
Piplartine 50 112.9 ± 9.3 41.8 ± 7.4 40.4 ± 5.2
Piplartine + 5-FU 50 + 10 99.0 ± 12.9 58.9 ± 9.2 37.5 ± 3.2
Piperine 50 106.4 ± 12.3 37.8 ± 6.9 36.8 ± 6.2
Piperine + 5-FU 50 + 10 108.0 ± 15.9 58.3 ± 9.4 31.9 ± 3.9
Data are presented as mean ± SEM of five animals.
ANTITUMOR EFFECT OF 5-FU WITH PIPLARTINE AND PIPERINE 161
Copyright © 2007 John Wiley & Sons, Ltd. J. Appl. Toxicol. 2008; 28: 156–163
DOI: 10.1002/jat
were analysed in order to evaluate the toxicological
aspects of drug treatment. The in vivo antitumor activity
for piperine and piplartine was previously demonstrated
(Sunila and Kuttan, 2004; Bezerra et al., 2006). In order
to explore the inhibitory effects of combination treat-
ments in different tumor cells, the cell lines HL-60,
MDA-MB435, SF295 and HCT-8 were tested with 5-FU
in the absence and presence of piplartine (5 μ
M) or
piperine (50 μM). The results showed that the incubation
of tumor cell lines with 5-FU in the presence of
piplartine or piperine produced an increase in growth
inhibition, as observed by lower IC
50
values. Piplartine
produced stronger effects in all cell lines tested. Piperine,
in contrast, only increased 5-FU cytotoxicity in HL-60
and MDA-MB435 cells, respectively.
In previous work, the direct cytotoxicity of these
amides was assessed on the brine shrimp lethality assay,
sea urchin egg development, 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-
2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide (MTT) assay using
tumor cell lines and lytic activity on mouse erythrocytes
(Bezerra et al., 2005). The results obtained demonstrated
that both compounds displayed significant cytotoxic
effects, piplartine being more strongly active than
piperine when considering tumor cells and sea urchin
eggs, which could justify the higher efficacy of piplartine
in the increase of 5-FU cytotoxicity, even at a concentra-
tion 10 times lower than piperine.
The combination of piplartine, but not piperine, with 5-
FU also increased the in vivo antitumor activity against
sarcoma 180 tumor in mice. These data suggest that
piplartine has different mechanisms from piperine, which
result in a stronger antitumor activity in combination with
5-FU both in vitro and in vivo. Despite stronger in vitro
cytotoxic effects observed with piplartine treatment
compared with piperine, both amides showed similar
antitumor activity in vivo using the sarcoma 180 model
(Bezerra et al., 2006).
According to some authors, the antitumor activity of
piperine is related to its immunomodulatory properties,
which involves the activation of cellular and humoral
immune responses (Sunila and Kuttan, 2004). In fact,
piperine possesses only weak cytotoxic activity (Pradeep
and Kuttan, 2002; Sunila and Kuttan, 2004; Bezerra
et al., 2005), which indicates that its antitumor activity is
not related to direct antiproliferative effects on tumor
cells. In a previous study, it was shown that piperine did
not change the rate of sarcoma 180 cell proliferation, as
observed by the number of Ki67 positive cells (Bezerra
et al., 2006), which reinforces the fact that piperine
activity is not related to a reduction in the tumor prolif-
eration rate. However, its immunomodulatory activity still
remains controversial, since Dogra et al. (2004) demon-
strated that piperine at a dose of 4.5 mg kg
−1
had a con-
sistent immunosuppressive effect, suppressing the weight
and cell population of spleens in treated animals. In
addition, in a previous work, a reduction of spleen weight
Table 4. Effect of 5-FU combined with piplartine or piperine on the hematological parameter in peripheral blood from mice transplanted w
ith sarcoma 180
tumor or healthy mice
Dose Hemoglobin Platelet Total leukocytes
Differential count of leukocytes (%)
Drug (mg kg
−1
) (g dl
−1
)(10
7
cells μl
−1
)(10
3
cells μl
−1
) Eosinophil Lymphocyte Neutrophil Monocyte
Healthy mice
Saline – 14.15 ± 0.41 8.91 ± 0.47 5.66 ± 0.52 0.98 77.52 16.2 5.3
10% DMSO – 13.25 ± 0.53 7.42 ± 0.59 4.25 ± 0.43 0.8 69.62 23.0 7.0
5-FU 10 12.49 ± 0.53 8.02 ± 0.39 3.04 ± 0.23
a
1.3 55.4
a
40.0
a
3.3
Piplartine 50 14.34 ± 0.83 6.98 ± 0.45 6.69 ± 0.44 1.3 78.5 12.9 7.3
5-FU + Piplartine 50 + 10 13.59 ± 0.21 7.42 ± 0.59 5.73 ± 0.77
c
0.79 65.9 26.9 6.4
Piperine 50 11.98 ± 0.73 8.62 ± 0.29 5.69 ± 0.66 1.6 70.4 18.7 9.3
5-FU + Piperine 50 + 10 12.69 ± 0.47 6.35 ± 0.49 4.98 ± 0.38
c
1.7 67.4 25.6 5.3
Mice transplanted with S180
Saline – 13.02 ± 0.32 7.1 ± 0.65 8.18 ± 0.53
a
1.0 56.8
a
39.5
a
2.7
10% DMSO – 12.04 ± 0.53 8.6 ± 0.53 7.95 ± 0.78
a
1.0 53.9
a
42.3
a
2.8
5-FU 10 12.42 ± 0.49 9.2 ± 0.62 3.32 ± 0.42
a,b
1.6 52.3
a
42.9
a
3.2
Piplartine 50 14.58 ± 0.72 9.5 ± 1.20 9.65 ± 1.05
a
0.9 69.2 26.4 3.5
5-FU + Piplartine 50 + 10 12.45 ± 0.69 9.4 ± 0.78 6.19 ± 0.98
b,c
1.9 72.6
b
21.0
b
4.5
Piperine 50 13.48 ± 0.52 9.3 ± 1.43 6.74 ± 0.79
a
0.9 65.9 27.2 6.0
5-FU + Piperine 50 + 10 12.35 ± 0.49 8.4 ± 1.02 5.79 ± 0.43
b,c
1.1 69.0
b
24.5
b
5.4
Data are presented as mean ± SEM of five animals.
a,b
P < 0.05 compared with saline in healthy mice and mice transplanted with sarcoma 180, respectively.
c
P < 0.05 compared with 5-FU experimental group; ANOVA followed by Bonferroni.
162 D. P. BEZERRA ET AL.
Copyright © 2007 John Wiley & Sons, Ltd. J. Appl. Toxicol. 2008; 28: 156–163
DOI: 10.1002/jat
was observed in piperine-treated animals, but only at
100 mg kg
−1
(Bezerra et al., 2006).
Piplartine, on the other hand, could be considered a
strong cytotoxic alkaloid. These findings suggest that the
presence of two
α
,
β
-unsaturated carbonyl moieties is an
important structural requirement for cytotoxic activity
(Duh et al., 1990; Duh and Wu, 1990; Bezerra et al.,
2005).
The liver is the detoxification organ of mammals and
the kidney the most important excretory organ, and both
are susceptible to cancer drugs. Hepatic dysfunction
induced by mithramycin and renal toxicity induced by
docetaxel are such examples (Katzung, 2003). In the
present study, it was shown that amide treatment alone or
in combination with 5-FU did not change the enzymatic
activity of transaminases.
However, histopathological analyses suggested that the
liver is the main organ affected by 5-FU plus piperine
treatment. Ballooning degeneration of hepatocytes accom-
panied by microvesicular steatosis in some areas was
observed in the group treated with piperine in com-
bination with 5-FU, suggesting intrinsic hepatotoxicity.
However, regeneration of hepatic tissues occurs in many
diseases, except in the most deleterious. This occurs even
when hepatocellular necrosis is present, but the con-
junctive tissue is preserved and regeneration is almost
complete (Scheuer and Lefkowitch, 2000; Kumar et al.,
2004). Thus, the hepatic alterations observed after treat-
ment with 5-FU combined with piperine could be consid-
ered reversible (Scheuer and Lefkowitch, 2000; Kumar
et al., 2004; McGee et al., 1992).
Renal parameters were also evaluated in the present
investigation. The histopathological analysis suggested
that the kidney is also a toxicological target for these
amides. This result corroborated a previous study that
showed a reversible renal toxicity induced by piplartine
(Bezerra et al., 2006). However, blood urea was not
raised after amide treatment alone or when combined
with 5-FU. The kidney eliminates waste products of
metabolism from the body. In renal failure, therefore,
other waste products accumulate, particularly nitrogenous
substances such as non-protein nitrogen, urea and uric
acid. It has been reported that the non-protein nitrogen
level is elevated in those conditions when blood urea is
also increased (Varley et al., 1980). On the other hand,
blood urea is increased only after a long time after the
renal alteration, which may explain why the amide treat-
ment did not induce any blood urea alteration.
Apart from hepatotoxic and nephrotoxic effects, anti-
cancer drugs also produce delayed hematopoietic depres-
sion, as observed in treatment with methotrexate and
5-FU (Katzung, 2003). In fact, most chemotherapeutic
drugs, including 5-FU, are immunosuppressive because
they kill many normal cells as well as tumor cells
(Takiguchi et al., 2001) and have negative side effects.
One of the risks of radiation and chemotherapy in the
treatment of cancer patients is the development of
leukopenia, which substantially increases the risk of
infections. Leukopenia was observed with sole 5-FU
treatment, which was prevented by the association with
piplartine, but not piperine, indicating a protective effect
of piplartine against delayed hematopoietic depression
induced by 5-FU. The combination of piplartine and 5-
FU did not lead to substantial changes in biochemical,
hematological and histopathological parameters. It is
possible that this combination augments the antitumor
activity without augmenting side effects, and, moreover,
it could even attenuate 5-FU toxicity. Moreover, colony-
stimulating factor (CSF) produced by tumor cells in
sarcoma 180, increases the number of circulating periph-
eral polymorphonuclear cells (PMN) (Okawa et al.,
1992). The results demonstrated that sarcoma 180 tumor
significantly modifies these leukocyte parameters.
Piplartine and piperine not only appear to contain the
tumor, but also normalize the leukocyte proportions,
compensating the effects of the disease.
In addition, the spleen weights of animals treated with
5-FU was significantly lower than in the control group,
which also indicated an immunosuppressive side effect of
5-FU. Nevertheless, when the mice transplanted with
tumor sarcoma 180 were treated with combined 5-FU and
piplartine, but not 5-FU and piperine, their spleen weights
were not decreased when compared with the control
group.
Finally, the combination of 5-FU with piplartine did
not severely change the biochemical, hematological or
histopathological parameters examined. These findings
suggest that piplartine not only possesses in vitro and
in vivo antitumor effects, but can also increase the
antitumor activity of chemotherapeutic drugs. It is pos-
sible that this combination augments the antitumor activ-
ity of 5-FU and also decreases side effects.
Acknowledgements—We wish to thank CNPq, Instituto Claude Bernard,
FUNCAP, Banco do Nordeste and FINEP for the financial support in
the form of grants and fellowship awards. We thank Silvana França
dos Santos, Luciana França and Maria de Fátima Teixeira for technical
assistance. Dr A. Leyva provided English language editing of the
manuscript.
References
Annu K, Neelima T, Usha Z, Bedi KL. 1998. Piperine modulation of
carcinogen induced oxidative stress in intestinal mucosa. Mol. Cell
Biochem. 189: 113–118.
Atal CK, Dhar KL, Singh J. 1975. The chemistry of Indian Piper
species. Lloydia 38: 256–264.
Bezerra DP, Castro FO, Alves APNN, Pessoa C, Moraes MO, Silveira
ER, Lima MAS, Elmiro FJM, Costa-Lotufo LV. 2006. In vivo
growth-inhibition of sarcoma 180 by piplartine and piperine,
two alkaloid amides from Piper. Braz. J. Med. Biol. Res. 39: 801–
807.
Bezerra DP, Militão GCG, Castro FO, Pessoa C, Moraes MO, Silveira
ER, Lima MAS, Elmiro FJM, Costa-Lotufo LV. 2007. Piplartine
induces inhibition of leukemia cell proliferation triggering both
apoptosis and necrosis pathways. Toxicol. in Vitro 21: 1–8.
ANTITUMOR EFFECT OF 5-FU WITH PIPLARTINE AND PIPERINE 163
Copyright © 2007 John Wiley & Sons, Ltd. J. Appl. Toxicol. 2008; 28: 156–163
DOI: 10.1002/jat
Bezerra DP, Pessoa C, Moraes MO, Silveira ER, Lima MAS, Elmiro
FJM, Costa-Lotufo LV. 2005. Antiproliferative effects of two amides,
piperine and piplartine, from Piper species. Z. Naturforsch. 60: 539–
543.
Braz-Filho R, Souza MP, Mattos MEO. 1981. Piplartine-dimer A, a
new alkaloid from Piper tuberculatum. Phytochemistry 20: 345–346.
Cragg MG, Newman J. 2005. Plants as a source of anti-cancer agents.
J. Ethnopharmacol. 100: 72–79.
Dogra RKS, Khanna S, Shanker R. 2004. Immunotoxicological effects
of piperine in mice. Toxicology 196: 229–236.
Duh CY, Wu YC. 1990. Cytotoxic pyridone alkaloids from the leaves
of Piper aborescens. J. Nat. Prod. 53: 1575–1577.
Duh CY, Wu YC, Wang SK. 1990. Cytotoxic pyridone alkaloids from
Piper aborescens. Phytochemistry 29: 2689–2691.
Katzung GB. 2003. Basic and Clinical Pharmacology, 9th edn.
McGraw-Hill Medical: USA, 1088.
Kumar V, Abbas A, Fausto N, Robbins SL, Cotran RS. 2004. Patho-
logy Basis of Disease, 7th edn. WB Saunders: China, 1552.
Lampe JW. 2003. Spicing up a vegetarian diet: chemopreventive effects
of phytochemicals. Am. J. Clin. Nutr. 78: 579S–583S.
McGee JOD, Isaacson PA, Wright NA. 1992. Oxford Textbook of
Pathology: Pathology of Systems. Oxford University Press:
New York; 1708.
Morinaga Y, Suga Y, Ehara S, Harada K, Nihei Y, Suzuki M. 2003.
Combination effect of AC-7700, a novel combretastatin A-4 deriva-
tive, and cisplatin against murine and human tumors in vivo. Cancer
Sci. 94: 200–204.
Mosmann T. 1983. Rapid colorimetric assay for cellular growth and
survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J.
Immunol. Methods 16: 55–63.
Okawa Y, Murata Y, Kobayashi M, Suzuki ME, Suzuki S. 1992.
Argumentation of host resistance to Candida albicans infection in
ascite tumor-bearing mice. Microbiol. Immunol. 36: 517–521.
Parmar VS, Jain SC, Bisht KS, Jain R, Taneja P, Jha A, Tyagi OM,
Prasad AK, Wengel J, Olsen CE, Boll PM. 1997. Phytochemistry of
the genus Piper. Phytochemistry 46: 597–673.
Pradeep CR, Kuttan G. 2002. Effect of piperine on the inhibition of
lung metastasis induced B16F-10 melanoma cells in mice. Clin. Exp.
Metastasis 19: 703–708.
Reen RK, Singh J. 1991. In vitro and in vivo inhibition of pulmonary
cytochrome P450 activities by piperine. J. Exp. Biol. 29: 568–573.
Scheuer PJ, Lefkowitch JH. 2000. Drugs and toxins. In Liver Biopsy
Interpretation, 6th edn, Scheuer PJ, Lefkowitch JH (eds). WB
Saunders: London; 134–150.
Silva RV, Navickiene HMD, Kato MJ, Bolzani VS, Méda CI, Young
MCM, Furlan M. 2002. Antifungal amides from Piper arboreum and
Piper tuberculatum. Phytochemistry 59: 521–527.
Sunila ES, Kuttan G. 2004. Immunomodulatory and antitumor activity
of Piper longum Linn. and piperine. J. Ethnopharmacol. 90: 339–
346.
Takiguchi N, Saito N, Nunomura M, Kouda K, Oda K, Furuyama N,
Nakajima N. 2001. Use of 5-FU plus hyperbaric oxygen for treating
malignant tumors: evaluation of antitumor effect and measurement of
5-FU in individual organs. Cancer Chemother. Pharmacol. 47: 11–
14.
Tsai IL, Lee FP, Wu CC, Duh CY, Ishikawa T, Chen JJ, Chen YC,
Seki H, Chen IS. 2005. New cytotoxic cyclobutanoid amides, a new
furanoid lignan and anti-platelet aggregation constituents from Piper
arborescens. Planta Med. 71: 535–542.
Varley H, Gowenlock AM, Bell M. 1980. In Practical Clinical
Biochemistry, Vol 1, 5th edn. William Heinmann Medical Books:
London; 452.
A
vailable online at www.sciencedirect.com
Mutation Research 652 (2008) 164–174
Evaluation of the genotoxicity of piplartine, an alkamide of
Piper tuberculatum, in yeast and mammalian V79 cells
Daniel Pereira Bezerra
a,1
, Dinara Jaqueline Moura
b,1
, Renato Moreira Rosa
b
,
Marne Carvalho de Vasconcellos
a
, Ana Catarina Romano e Silva
b
,
Manoel Odorico de Moraes
a
, Edilberto Rocha Silveira
c
, Mary Anne Sousa Lima
c
,
Jo
˜
ao Antonio Pegas Henriques
b,d
, Let
´
ıcia Veras Costa-Lotufo
a
, Jenifer Saffi
b,d,∗
a
Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Cear´a, Fortaleza, Cear´a, Brazil
b
Departamento de Biof´ısica e Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil
c
Departamento de Qu´ımica Orgˆanica e Inorgˆanica, Universidade Federal do Cear´a, Fortaleza, Cear´a, Brazil
d
Laborat´orio de Gen´etica Toxicol´ogica, Universidade Luterana do Brasil, Canoas, RS, Brazil
Received 17 November 2007; received in revised form 31 January 2008; accepted 4 February 2008
Available online 12 February 2008
Abstract
The genus Piper belongs to the Piperaceae family, and includes species of commercial and medicinal importance. Chemical studies on Piper
species resulted in the isolation of several biologically active molecules, including alkaloid amides, such as piplartine. This molecule, isolated
from Piper tuberculatum, has significant cytotoxic activity against tumor cell lines, and presents antifungal, anti-platelet aggregation, anxiolytic,
and antidepressant effects. In order to understand the biological properties of piplartine, this study investigated the genotoxicity and the induction
of apoptosis by piplartine in V79 cells and its mutagenic and recombinogenic potential in Saccharomyces cerevisiae. Piplartine induced dose-
dependent cytotoxicity in S. cerevisiae cultures in either stationary—or exponential growth phase. In addition, piplartine was not mutagenic when
cells were treated during exponential-growth phase and kept in buffer solution, but it increased the frequencies of point, frameshift, and forward
mutations when cells were treated in medium during growth. Piplartine treatment induced DNA strand breaks in V79 cells, as detected by neutral
and alkaline comet assay. In cell cycle analysis, piplartine induced G2/M cell cycle arrest, probably as a consequence of the DNA damage induced
and repair. Moreover, piplartine treatment induced apoptosis in a dose-dependent manner, as observed by a decrease in mitochondrial membrane
potential and an increase in internucleosomal DNA fragmentation. These data suggest that the DNA damage caused by piplartine induces G2/M
cell cycle arrest, followed by apoptosis. Moreover, we suggest that cells surviving piplartine-induced DNA damage can accumulate mutations,
since this alkaloid was mutagenic and recombinogenic in S. cerevisiae assays.
© 2008 Elsevier B.V. All rights reserved.
Keywords: Piplartine; Genotoxicity; Mutagenesis; Recombinogenesis; Apoptosis
1. Introduction
Focus on plant research has recently increased all over the
world, and a large body of evidence has been collected to
show the immense potential of medicinal plants used in tra-
ditional medicine. Several medicinal plants have been identified
∗
Corresponding author at: Laborat
´
orio de Gen
´
etica Toxicol
´
ogica, Avenida
Farroupilha 8001, Pr
´
edio 01 Sala 122; Bairro S
˜
ao Jos
´
e, CEP 92425-900, Canoas,
RS, Brazil. Tel.: +55 51 34774000x2774; fax: +55 51 34779214.
E-mail address: jenifer.saffi@ulbra.br (J. Saffi).
1
These authors contributed equally to this work.
and studied using modern scientific approaches, revealing their
potential use in pharmacology [1,2].
The genus Piper belongs to the Piperaceae family and
includes more than 1000 species widely distributed through-
out the tropical and subtropical regions of the world. Members
of the Piper genus are of commercial, economical and medic-
inal importance. Economically, the plants of this family are
employed in the production of pepper in worldwide spice mar-
kets [3]. Piper species also are important medicinal plants
used in Chinese medicine, in the Indian ayurvedic system
and in folk medicine practices of Latin America and West
Indies. They are applied to treat asthma, bronchitis, fever,
1383-5718/$ – see front matter © 2008 Elsevier B.V. All rights reserved.
doi:10.1016/j.mrgentox.2008.02.001
D.P. Bezerra et al. / Mutation Research 652 (2008) 164–174 165
hemorrhoidal afflictions, gastrointestinal diseases, and rheuma-
tism, and the preparations obtained from these plants have
shown anti-inflammatory, insecticidal, anti-hypertensive, anti-
diabetics, immunomodulatory and antimutagenic effects [3–6].
Chemical studies on Piper species resulted in the isolation of
several biologically active natural products, such as pyrones,
lignanes, neolignanes, terpenes, propenylphenols, chalcones,
flavones, benzopyranes, chromenes, lactones, and amides [3].
The amide alkaloids, known as alkamydes, are characteristic
metabolites of this family, and are classified as isobutyl, pir-
rolydine, pirydonil, and pyperidines with various biological
effects [7–9]. Indeed, the pharmacology of the these alka-
mides revealed interesting molecules with hormone-modulating
[10], anticancer [11–15], anti-hypertensive [16], antioxidant
[9,17], anti-lipidemic [18], enzyme-inhibiting [19], anxiolytic
and antidepressant [8], as well as anti-inflammatory effects
[20,21]. However, it was shown that some alkamides potenti-
ate benzo(a)pyrene-induced DNA damage [22], have neurotoxic
properties [23], and generate oxidative stress by changing thiol
cellular status [24].
Piplartine (5,6-dihydro-1-[1-oxo-3-(3,4,5-trimethoxyphe-
nyl)-2-propenyl]-2(1H) pyridinone) (Fig. 1) is an amide alka-
loid component of Piper species. This secondary metabolite has
significant cytotoxic activity against tumor cell lines, especially
human leukemia cell lines, such as HL-60, K562, Jurkat, and
Molt-4, as well antifungal, anti-platelet aggregation, anxiolytic
and antidepressant properties [8,25–27].
In order to further understand the biological properties of
piplartine, this study aimed at investigating the genotoxic poten-
tial and the induction apoptosis in cultured mammalian cells by
this molecule, employing a permanent cell line derived from
Chinese hamster lung fibroblasts (V79 cell line), as well as its
mutagenic and recombinogenic potential in the simple eukaryote
Saccharomyces cerevisiae. This information is very important
for the evaluation of the safety of this compound for possible
future pharmacological applications, and to explore the possible
mechanisms underlying its antiproliferative effects.
2. Materials and methods
2.1. Chemicals
Yeast extract, yeast nitrogen base, bacto-peptone, and bacto-agar were
obtained from Difco Laboratories (Detroit, MI, USA). Dulbecco’s modified
Fig. 1. Chemical structure of piplartine {5,6-dihydro-1-[1-oxo-3-(3,4,5-
trimethoxyphenyl)-2-propenyl]-2(1H)-pyridinone}.
Eagle Medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), trypsin-EDTA, l-glutamine,
and antibiotics were purchased from Gibco BRL (Grand Island, NY, USA).
Acridine orange (AO), ethidium bromide (EB), rhodamine 123, propidium
iodide, methyl methanesulphonate (MMS), 4-nitroquinoline-N-oxide (4-NQO),
amino acids (l-histidine, l-threonine, l-methionine, l-tryptophan, l-leucine,
l-lysine) and nitrogen bases (adenine and uracil) were obtained from Sigma
(St. Louis, MO, USA). Low-melting point agarose and agarose were obtained
from Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Canavanine and cycloheximide were
purchased from Calbiochem (CA, USA). All others reagents were of analytical
grade.
2.2. Piplartine isolation and identification
The roots of Piper tuberculatum were harvested in September, 2004, from
a wild population in the Pici Campus of Federal University of Cear
´
a, Fortaleza,
Cear
´
a, Brazil. A voucher specimen (# 34736) was deposited at Prisco Bezerra
herbarium (EAC), Biology Department, Universidade Federal do Cear
´
a. A total
weight of 420.0 g of ground roots of P. tuberculatum were macerated with a
mixture of petroleum ether/ethyl acetate 1:1 (1.5 L) for 24 h (3×). The sol-
vent mixture was evaporated under reduced pressure to yield a yellowish solid
(13.24 g), which gave the first crop of piplartine (4.35 g, Fig. 1) after crystal-
lization with hot methanol. Piplartine was characterized by 1D and 2D NMR
(nuclear magnetic resonance) analyses and melting point determination [28].
2.3. Strains and media for yeast assays
The relevant genotypes of S. cerevisiae strains used in this study are listed
in Table 1. Media, solutions and buffers were prepared as previously described
[29]. The complete medium (YPD), containing 0.5% yeast extract, 2% peptone,
and 2% glucose was used for routine growth. Minimal medium (MM) contained
0.67% yeast nitrogen base without amino acids, 2% glucose and 2% bacto-agar.
The synthetic complete medium (SC) consisted of MM supplemented with 2 mg
adenine, 2 mg arginine, 5 mg lysine, 1 mg histidine, 2 mg leucine, 2 mg methio-
nine, 2 mg uracil, and 2 mg tryptophan per 100 mL MM. For plates, the medium
was solidified with 2% bacto-agar. For determination of forward mutagenesis in
strain N123, plates lacking arginine were supplemented with 60 g/mL cana-
vanine (SC + can). For mutagenesis in strain XV185-14c, the omission media,
lacking lysine (SC-lys), histidine (C-his) or homoserine (SC-hom), were supple-
mented with 0.1 mg lysine, histidine, or methionine, respectively, per 100 mL
omission medium. For recombinogenesis, leucine was omitted from the syn-
thetic medium (SC-leu), or supplemented with 200 g cyclo-heximide (SC-cyh)
per 100 mL SC.
2.4. Yeast growth
Stationary-phase cultures were obtained by inoculating an isolated colony
into liquid YPD medium, and incubation at 30
◦
C for 48 h with aeration by
shaking. Cultures were grown to 1–2 × 10
8
cell/mL. Exponential phase cul-
tures (1–2 × 10
7
cell/mL) were obtained by inoculating 5 × 10
5
cells/mL of the
stationary-phase YPD culture in fresh YPD medium at 30
◦
C for 3–4 h. Cells
were harvested and washed twice with saline solution (%)). Cell concentration
and percentage of budding cells in each culture were determined in a Neubauer
chamber by microscope counts.
Table 1
Saccharomyces cerevisiae strains used in this study.
Strain Genotype Source
XV185-14c Mat␣ ade2-2 arg 4-17 his1-7
lys1-1 trp5-48 hom3-10
R.C. Von Borstel
N123 MATa his1-7 J.A.P. Henriques
XS2316 MATa/␣ ADE6/ade6
leu1-1/leu1-12 trp5-48/TRP5;
CYH2/cyh2 MET13/met13
LYS5/lys5-1 his1-1/his1-1
I. Machida; S. Nakaia
166 D.P. Bezerra et al. / Mutation Research 652 (2008) 164–174
2.5. Survival assays
The relative sensitivity of S. cerevisiae strain XV185-14c to piplartine
was assayed by suspending 2 × 10
8
cells/mL of stationary- or exponential-
phase cultures in 1 mL phosphate-buffered saline solution (PBS; Na
2
HPO
4
, and
NaH
2
PO
4
; 20 mM; pH 7.4), containing different piplartine concentrations, and
incubation with aeration by rotary shaking at 30
◦
C for 3 h. In order to determine
colony-forming ability, suitable aliquots were plated on YPD. Plates were incu-
bated at 30
◦
C for 3–5 days before the surviving colonies were counted. Assays
were repeated at least three times, and plating was carried out in triplicate for
each dose.
2.6. Detection of piplartine-induced reverse, frameshift, and
forward mutation in yeast
XV-185-14c and N123 haploid strains were used to test piplartine muta-
genicity. A suspension of 2 × 10
8
cells/mL of stationary or exponential phase
was incubated with different piplartine concentrations in PBS at 30
◦
C for
3 h. To test the relative piplartine sensitivities during growth 5 × 10
6
cells/mL
from a exponential growing was treated in YPD medium with aeration by
rotatory shaking at 30
◦
C for 3 h. Survival was determined in SC (2–3 days,
30
◦
C), and mutation induction (HIS, LYS, HOM revertants, or CAN mutants)
in appropriate supplementation media (4–5 days, 30
◦
C). While his1-7 is a
non-suppressible missense allele, and reversions result from mutations at the
locus itself [30], lys1-1 is a suppressible ochre nonsense mutant allele, which
can be reverted either by locus-specific or forward mutation in a suppressor
gene [31,32]. True reversions and forward (suppressor) mutations at lys1-
1 locus was differentiated according to [33], with reduced adenine content
of SC-Lys medium showing true reversions as red colonies, and suppressor
mutations as white colonies [34]. The hom3-10 mutant allele of XV185-
14c haploid strain was used to detect putative frameshift mutagenesis. It is
believed that hom3-10 contains a frameshift mutation due to its response
to several diagnostic mutagens [32]. Forward mutation was measured by
canavanine resistance assay (CAN1 → can1). Wild-type yeast strains express
arginine transporter, which also internalize canavanine, a toxic analogue of
arginine, leading to cell death. Changes in CAN1 gene that impair Can1p func-
tion may increase cell survival in the presence of canavanine. Assays were
repeated at least three times, and plating was performed in triplicate for each
dose.
2.7. Detection of induced mitotic recombination in yeast
Suspensions of cells in exponential growth phase (2 × 10
7
cells/ml) were
incubated in PBS at 30
◦
C for 3 h with different piplartine concentrations. When
testing piplartine during growth phase, 5 × 10
6
cells/ml were treated in YPD
as described in Section 2.6. After treatments, cells were diluted in saline solu-
tion, plated on three different media (SC, SC-leu, and SC + cyh), and incubated
at 30
◦
C for 3–10 days. Colonies grown on SC medium yielded cell survival
data, and colonies grown on SC-leu and SC+cyh were scored for intragenic
recombination (gene conversion) and intergenic recombination (crossing-over),
respectively.
In order to measure the exact frequency of reciprocal crossing-over, it was
necessary to eliminate the possibility that some cycloheximide-resistant colonies
had resulted from reversion at the CYH2 locus, as well as from chromosome VII
monosomy. For this purpose, cycloheximide-resistant colonies were replica-
plated on a series of plates with SC-lys, SC-met, and SC-ade media in order to
screen cyh2 markers. Assays were repeated at least three times, and plates were
performed in triplicate for each dose.
2.8. V79 cell culture and treatment
Chinese hamster lung fibroblast cells (V79 cells) were cultured under
standard conditions in DMEM supplemented with 10% heat-inactivated-FBS,
0.2 mg/mL l-glutamine, 100 IU/mL penicillin, and 100 g/mL streptomycin.
Cells were kept in tissue-culture flasks at 37
◦
C in a humidified atmosphere,
containing 5% CO
2
in air, and were harvested by treatment with 0.15%
trypsin–0.08% EDTA in phosphate-buffered saline solution (PBS).
2.9. Cytotoxicity evaluation by colony-forming ability (clonal
survival)
Exponentially growing V79 cells were treated according to the experi-
mental protocol, after which they were trypsinized, and 500 cells/60 mm dish
were seeded in triplicate in order to determine their colony-forming ability.
An aliquot of piplartine stock solution was thawed, diluted, and used for the
treatment of attached cells (3 h). After 5–10 days incubation, colonies were
fixed with methanol and acetic acid (3:1), stained with crystal violet (1%),
counted, and their survival was calculated as a percentage relative to the control
treatment.
2.10. Comet assay
Alkaline Comet assay was performed as described by Singh et al. [20,35],
with minor changes. Cells were seeded (3 × 10
6
cells) in 5 mL complete medium
in a 25-cm
2
flask, and grown for 1 day up to 60–70% confluence before treat-
ment with the test substance. Piplartine added to FBS-free medium to obtained
the different concentrations proposed, and the cells were treated at 37
◦
C for
3 h in humidified atmosphere, containing 5% CO
2
. At the end of the treat-
ment, cells were washed with ice-cold PBS, and trypsinized with 100 L trypsin
(0.15%). Immediately thereafter, 20 L of cell suspension (∼10
6
cells/mL) were
dissolved in 0.75% low melting point agarose [36], and spread on regular pre-
coated agarose-point (1%) microscope slides. Cells were ice-cold lysed (2.5 M
NaCl, 100 mM EDTA, and 10 mM Tris, pH 10.0, with freshly added 1% Triton
X-100 and 10% DMSO) at 4
◦
C for at least 1h in order to remove cellular proteins
and membranes, with DNA remaining as “nucleoids”. Slides were then placed
in a horizontal electrophoresis box, containing freshly prepared alkaline buffer
(300 mM NaOH and 1 mM EDTA, pH ∼13.0) at 4
◦
C for 20 min in order to allow
DNA unwinding. A 300 mA and 25 V (0.90 V/cm) electric current was applied
for 20 min to perform DNA electrophoresis. The assay at pH 8.5 was carried out
following essentially the same procedure as the alkaline version except for the
pH value. In the neutral version, electrophoresis was run in buffer consisting of
100 mM Tris and 300 mM sodium acetate at pH 8.5 [37]. Electrophoresis was
conducted for 60 min, after a 60 min equilibrium period in neutral electrophore-
sis buffer, at 12 mA and 14 V (0.5 V/cm). All the above steps were performed
under yellow light or in the dark in order to prevent additional DNA damage.
Slides were then neutralized (0.4 M Tris, pH 7.5), stained with silver nitrate as
described by Nadin et al. [38], and analyzed using an optic microscope. One
hundred cells (50 cells from each of two replicate slides of each organ or tissue)
were selected, and analyzed for DNA migration. When selecting cells, edges
and cells around air bubbles were disconsidered [39]. Cells were visually scored
according to tail length into five classes: (1) class 0: undamaged, with no tail;
(2) class 1: with tail shorter than the diameter of the head (nucleus); (3) class 2:
with tail as long as 1–2× the diameter of the head; (4) class 3: with tail longer
than 2× the diameter of the head; and (5) class 4: comets with no heads. Inter-
national guidelines and recommendations for the comet assay visual scoring
of comets consider as a valid evaluation method [35,39,40]. A value (damage
index) was assigned to each comet according to its class. Damage index (DI)
is an arbitrary score calculated for cells in different damage classes, which are
visually scored by measuring DNA migration length and the amount of DNA in
the tail. Damage frequency (DF) is the proportion of cells presenting tails after
electrophoresis, and this was also considered in our analyses. DI ranges from 0
(no tail: 100 cells × 0) to 400 (with maximum migration: 100 cells × 4) [35,39].
Damage frequency (%) was calculated based on number of cells with tails as
compared with those with no tail. Results are expressed as mean and standard
deviation of three independent experiments.
2.11. Flow cytometry and morphological analyses of treated V79
cells
V79 cells (2 × 10
5
cells/mL) were seeded on 6-well tissue culture plates,
and grown for 1 day before treatment with the tested substances. Piplartine was
added at the concentrations of 5 and 10 g/mL. The negative control was treated
with DMSO and with doxorubicin (1.0 g/mL) as positive control. Cells were
incubated at 37
◦
C for 3 h in humidified atmosphere containing 5% CO
2
, after
which the following analyses were performed.
D.P. Bezerra et al. / Mutation Research 652 (2008) 164–174 167
2.12. Cell cycle distribution and internucleosomal DNA
fragmentation analysis
Cell cycle distribution determination and internucleosomal DNA fragmen-
tation analysis followed the procedure described by [41]. Briefly, V79 cells
were incubated at 37
◦
C for 3 h in the dark, in a lysis solution contain-
ing 0.1% citrate, 0.1% triton X-100, and 50 (g/mL propidium iodide. Cell
fluorescence was determined by flow cytometry in a Guava
®
EasyCyte
TM
Mini System cytometer (Guava Technologies Inc. Industrial Blvd. Hayward,
CA, USA), using the CytoSoft 4.1 software. Five thousand events were
evaluated per experiment, and cellular debris was omitted from the analy-
sis.
2.13. Measurement of mitochondrial transmembrane potential
Mitochondrial transmembrane potential was determined by rhodamine 123
dye retention using flow cytometry, as previously described. Cells were washed
with PBS, incubated with rhodamine 123 (5 g/mL) at 37
◦
C for 15 min in
the dark and washed twice. Cells were incubated again in PBS at 37
◦
C for
30 min in the dark, and fluorescence was measured. Five thousand events were
evaluated per experiment, and cellular debris was omitted from the analy-
sis.
2.14. Morphological analysis with hematoxylin–eosin staining
Morphological changes of untreated or piplartine-treated V79 cells were
examined under light microscopy. In order to evaluate nuclear morphology,
cultured cells were harvested, transferred to cytospin slides, fixed with methanol
for 30 s and stained with hematoxylin–eosin [26].
2.15. Morphological analysis with fluorescence microscope
After incubation, treated and untreated V79 cells were harvested and
re-suspended in 25 L PBS. Then, 1 L acridine orange/ethidium bromide
(AO/EB, 100 g/mL) aqueous solution was added, and cells types were observed
under fluorescence microscope. Three hundred cells were counted per sample
and were classified as viable cells, apoptotic cells, or necrotic cells [26].
2.16. Statistical analysis
All experiments were independently repeated at least three times, with trip-
licate samples for each treatment. Results are expressed as mean ± S.D. Data
were analyzed by one-way analysis of variance (ANOVA) and means com-
pared using the test of Tukey test, with P < 0.05 considered as statistically
significant.
3. Results
3.1. Cytotoxic and mutagenic effects in yeast
Piplartine induced dose-dependent cytotoxic effects both in
stationary and exponential phase cultures of the haploid yeast
S. cerevisiae. However, this effect was more pronounced in
exponentially growing cells (Fig. 2). Therefore, we chosed sub-
cytotoxic concentrations of this alkaloid (ranging from 10 to
100 g/ml) in the experiments carried out to verify its muta-
genic effect on the studied strains of S. cerevisiae. Piplartine
did not induce mutagenic effects on S. cerevisiae N123 and
XV185-14c strains in stationary phase (data not shown). When
cells were treated in exponential phase, mutant frequencies of
piplartine for the his1 locus were significant only at higher con-
centrations, while the mutant frequencies for lys1, hom3 loci
and forward mutation were not significant in the same doses
Fig. 2. Sensitivity to piplartine of XV185-14c haploid strain treated during
stationary-growth phase (solid circle) and exponential-growth phase (open cir-
cle) in PBS after 3 h of treatment.
(Tables 2 and 3, upper panel). However, in cultures treated
during growth phase in YPD medium, mutation frequencies at
hom3 and lys1 loci were significant at higher concentrations,
and mutation frequency at his1 locus was significant at almost
every applied concentration (Table 3, lower panel). Under the
same conditions, higher concentrations of piplartine induced for-
Table 2
Induction of forward mutation (can1) in haploid N123 strain of S. cerevisiae
after piplartine treatment
Agent Treatment (g/mL) Survival (%) Can/10
7
survivors
a
Exponential cells treated in PBS
NC
b
0 100 (321)
d
3.03 ± 0.22
e
4NQO
c
0.5 55.09 (177) 17.36 ± 1.41***
Piplartine
10 94.70 (304) 3.61 ± 0.27
25 90.87 (292) 3.95 ± 0.16
50 81.21 (261) 4.72 ± 0.2
100 69.70 (224) 6.1 ± 0.28
25 90.87 (292) 3.95 ± 0.16
Cells treated during growth in YPD
NC
b
0 100 (250) 4.01 ± 0.35
4NQO
c
0.5 48.06 (120) 26.68 ± 0.44***
Piplartine
10 83.55 (208) 5.27 ± 0.50
25 72.61 (181) 7.16 ± 0.77*
50 69.57 (173) 9.22 ± 1.06**
100 60.18 (150) 13.94 ± 1.63***
*Significant difference as compared to negative control group at P < 0.05;
**P < 0.01; ***P < 0.001/one-way ANOVA Tukey’s multiple comparison test.
a
Locus-specific revertants.
b
Negative control (solvent).
c
Positive control.
d
Number of colonies.
e
Mean and standard deviation of three independent experiments.
168 D.P. Bezerra et al. / Mutation Research 652 (2008) 164–174
Table 3
Induction of point mutation (his1-7), ochre allele (lys1-1), and frameshift (hom3-10) mutation in haploid XV185-14c strain of S. cerevisiae after piplartine treatment
Agent Treatment (g/mL) Survival (%) His/10
7
survivors
a
Lys/10
7
survivors
b
Hom3/10
7
survivors
a
Exponential cells treated in PBS
NC
c
100 (124)
e
12.39 ± 1.63
f
1.87 ± 0.46
f
2.16 ± 0.57
f
4NQO
d
0.5 58.51 (72) 114.25 ± 1.92*** 41.17 ± 4.85*** 21.07 ± 1.37***
Piplartine
10 96.54 (120) 11.09 ± 0.34 1.52 ± 0.15 1.67 ± 0.10
25 86.74 (102) 13.92 ± 0.65 2.16 ± 0.51 2.16 ± 0.51
50 80.78 (100) 14.98 ± 1.47 2.93 ± 0.99 1.98 ± 1.00
100 75.20 (93) 16.06 ± 1.77* 3.57 ± 1.19 3.58 ± 0.70
Cells treated during growth in YPD
NC
c
100 (382) 9.88 ± 1.27 7.33 ± 0.10 4.27 ± 0.76
4NQO
d
0.5 45.23 (172) 56.92 ± 3.54*** 50.36 ± 5.12*** 22.10 ± 2.01***
Piplartine
10 89.95 (343) 22.67 ± 1.88** 11.61 ± 2.36 5.03 ± 0.51
25 84.78 (323) 22.07 ± 0.91** 13.78 ± 1.33* 5.46 ± 0.5
50 58.09 (222) 26.51 ± 1.31*** 18.15 ± 0.63** 8.41 ± 1.06**
100 47.17 (180) 30.56 ± 1.65*** 20.93 ± 1.71** 10.0 ± 0.95**
*Significant difference as compared to negative control group at P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001/one-way ANOVA Tukey’s multiple comparison test.
a
Locus-specific revertants.
b
Locus non-specific revertants (forward mutation).
c
Negative control.
d
Positive control.
e
Number of colonies.
f
Mean and standard deviation of three independent experiments.
ward mutation in the evaluated yeast strains (Table 2, lower
panel).
3.2. Recombinogenic effects on yeast
The recombinogenic effect of piplartine on exponential-
growth diploid cultures maintained under either growth or
non-growth conditions were investigated (Table 4). Piplartine
induced statistically significant recombinogenic events on cells
in PBS only at higher concentrations (upper to 25 g/mL). A
significant crossing-over and gene conversion induced by piplar-
tine was observed both in PBS and in growing cultures at all
concentrations.
3.3. Cytotoxicity in V79 cells
Dose-dependent changes in the viability of piplartine-treated
cells were evaluated based on their effects on cell growth.
Results presented in Fig. 3 indicated that, in concentrations
up to 20 g/mL, this alkamide exerts cytotoxic effect in a
Table 4
Induction of crossing-over (+/cyh2) and gene conversion (leu1-1/leu1-12) in diploid XS2316 strain of S. cerevisiae after piplartine treatment
Agent Treatment (g/mL) Survival Crossing-over/10
5
survivors Gene conversion/10
5
survivors
Exponential cells treated in PBS
NC
a
100 (473)
c
11.31 ± 1.58
d
2.66 ± 0.55
d
4NQO
b
0.5 45.44 (215) 86.73 ± 1.82*** 44.19 ± 2.82***
Piplartine
10 83.23 (394) 14.67 ± 2.02 4.35 ± 0.52
25 79.81 (378) 19.39 ± 1.38* 5.38 ± 0.03*
50 76.12 (361) 25.30 ± 0.47** 6.15 ± 0.74*
100 63.01 (298) 30.29 ± 1.82*** 6.63 ± 0.58**
Cells treated during growth in YPD
NC
a
100 (782) 30.08 ± 1.71 3.79 ± 0.12
4NQO
b
0.5 44.43 (347) 101.74 ± 5.89*** 32.01 ± 2.21***
Piplartine
10 87.85 (687) 46.95 ± 1.52** 5.77 ± 0.30*
25 83.71 (655) 51.51 ± 2.01** 6.38 ± 0.19*
50 79.84 (624) 52.72 ± 1.57** 6.99 ± 0.30**
100 66.55 (520) 60.76 ± 5.63*** 9.48 ± 0.36**
*Significant difference as compared to negative control group at P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001/one-way ANOVA Tukey’s multiple comparison test.
a
Negative control.
b
Positive control.
c
Numbers of scored colonies.
d
Mean and standard deviation of three independent experiments.
D.P. Bezerra et al. / Mutation Research 652 (2008) 164–174 169
Fig. 3. Clonogenic survival of V79 cells after exposure to piplartine for 3 h.
dose–responsive manner. Piplartine reduced relative survival at
40 g/mL to 7%.
3.4. DNA damaging effects in V79 cells
For quantification purposes and to support the observations
above, single-cell electrophoresis (comet assay) was used. In this
assay, fragmented DNA migrate through permeabilized nuclear
membranes, as well as through plasmatic membranes, producing
a “tail” from the nuclear head. Single-strand and double-strand
break (DSB) induction in V79 cell line using both the alka-
line and the neutral versions of the comet assay was analyzed.
Table 5 shows the effects of piplartine on DI and DF, as mea-
sured by DNA damage in V79 cells, according to the comet
Table 5
Induction of DNA strand breaks by piplartine in V79 cells as evaluated by the
Comet assay
Agent Treatment (g/mL) Damage index
c
Damage frequency (%)
c
Alkaline conditions (pH ∼ 13.0)
NC
a
26.75 ± 3.68 23.66 ± 4.04
MMS
b
40 225.5 ± 9.20*** 93.33 ± 3.78***
Piplartine
1.0 39.75 ± 6.70 26.00 ± 3.91
2.5 92.75 ± 6.13** 48.25 ± 6.18**
5.0 134.0 ± 6.97*** 63.25 ± 2.06***
10.0 181.0 ± 8.16*** 77.00 ± 5.59***
Neutral conditions (pH ∼ 8.0)
NC
a
10.75 ± 7.54 7.5 ± 0.57
MMS
b
4.41 95.46 ± 2.93*** 50.0 ± 2.30***
Piplartine
1.0 22.75 ± 2.62** 20.01 ± 5.71**
2.5 38.75 ± 2.5*** 27.25 ± 2.62***
5.0 64.00 ± 3.16*** 38.00 ± 3.36***
10.0 101.5 ± 9.67*** 55.25 ± 2.50***
*Significant difference as compared to negative control group at P < 0.05;
**P < 0.01; ***P < 0.001/One-way ANOVA Tukey’s multiple comparison test.
a
Negative control (solvent).
b
Positive control.
c
Means value and standard deviation obtained from an average of 100 cells
per experiment—total of three experiments per dose for each substance.
assay. Piplartine clearly resulted in a significant increase in DI
and DF means as compared to the control groups, to the alkaline
version at concentrations up to 2.5 g/mL and to neutral version
at all concentrations. In addition, this increase in damage score
occurred in a dose-related manner. Therefore, it is possible to
infer that piplartine mainly induces DNA DSBs, as significant
double-strand breaks were quantitatively evident in V79 cells
(Table 5, lower panel).
3.5. Cell cycle profile evaluation and determination of
apoptosis induction
The results of the effect of piplartine on cell cycle distribu-
tion showed that total number of G1 cells decreased, and G2/M
cell number increased, indicating cell cycle arrest during this
phase (Table 6). The percentage of G2/M cells was 22.85% in
the control treatment, and this percentage increased with piplar-
tine treatment, achieving 28.51% at 5 g/mL and 26.97% at
10 g/mL. These results indicate that piplartine treatment causes
G2/M arrest in V79 cells. In addition, the percentage of cells
presenting internucleosomal DNA fragmentation also increased
after piplartine treatment (Fig. 4A), suggesting that cells arrested
in G2/M had undergone apoptosis.
Fig. 4B shows that the treatment of V79 cells with piplar-
tine caused mitochondrial membrane potential loss, as flow
cytometry analysis determined that piplartine treatment induced
significant increase in cells with depolarized mitochondria as
compared to control cells, as measured by rhodamine-123 incor-
poration. These data confirm that piplartine induces apoptosis
in V79 cells.
Morphological examination of treated and untreated V79
cells revealed drug-mediated changes. At both studied con-
centrations, piplartine induced chromatin condensation and
morphological changes consistent with apoptosis when evalu-
ated under light microscopy (Fig. 5C and D). Morphology of
treated cells was also analyzed using AO/EB staining for fluo-
rescent microscopy, and the percentages of viable, apoptotic and
necrotic cells were calculated. Uniformly green live cells with
normal morphology were observed in V79 control groups, with
more than 90% of cells counted. After treatment of V79 cells
with piplartine for 3 h, an increasing number of apoptotic cells
was observed (Fig. 6).
4. Discussion
Alkaloids are considered an important class of natural
products capable of interacting with DNA and other cellular
components, leading to a wide spectrum of DNA lesions, includ-
ing lethal cell damage, DNA strand breaks, and chromosomal
aberrations [3,42–51]. The present study clearly indicates that
piplartine, an amide alkaloid present in the roots of P. tubercu-
latum, possesses DNA damaging potential in V79 cells, using
two versions of comet assay, as well as mutagenic and recom-
binogenic effects on yeast.
The cytotoxic effects of piplartine on S. cerevisiae depend on
the growth phase and the drug concentration. Piplartine induced
mild cytotoxic effect on cultures of cell during stationary-growth
170 D.P. Bezerra et al. / Mutation Research 652 (2008) 164–174
Table 6
Effect of piplartine on cell cycle distribution in V79 cells as determined by flow cytometry
Drug Concentration (g/mL) Cell cycle phase (%)
G
0
/G
1
SG
2
/M
Negative Control
a
– 48.97 ± 1.18
c
21.97 ± 0.81
c
22.85 ± 0.91
c
Doxorubicin
b
1.0 47.64 ± 1.52 23.32 ± 0.45 13.51 ± 1.10*
Piplartine
5.0 38.94 ± 1.68* 23.74 ± 1.24 28.51 ± 0.94*
10.0 38.31 ± 3.34* 22.85 ± 1.59 26.97 ± 0.36*
*Significant difference as compared to negative control group at P < 0.05/one-way ANOVA Tukey’s multiple comparison test.
a
Negative control (solvent).
b
Positive control.
c
Data are presented as mean values ± S.D. of three independent experiments performed in triplicate. Five thousand events were analyzed in each experiment.
phase (Fig. 2a). In contrast, this compound promoted cyto-
toxic effect both on haploid (Fig. 2, Tables 2 and 3) and on
diploid (Table 4) cells in exponential-growth phase cultures
at the highest employed concentrations (50 and 100 g/mL)
either in PBS or under culture conditions. In addition, piplar-
Fig. 4. Effect of piplartine on V79 cells after 3 h of incubation as measured by
flow cytometry. Panel A, internucleosomal DNA fragmentation was determined
using propidium iodide. Panel B, effect of piplartine in V79 cell mitochondrial
transmembrane potential as determined by flow cytometry using rhodamine 123.
Negative control (NC) was treated with solvent. Doxorubicin (1.0 g/mL) was
used as positive control (DOX). Data are presented as mean values ± S.D. of
three independent experiments performed in triplicate. Five thousand events
were analyzed in each experiment. *P < 0.05 as compared to the control by
one-way ANOVA and Tukey’s multiple comparison test.
tine was weakly mutagenic when cells were treated during
exponential-growth phase in PBS (Tables 2 and 3, upper panel),
but it increased the frequencies of point, frameshift, and for-
ward mutations when cells were treated in medium during
growth (Tables 2 and 3, lower panel). Hence, piplartine tox-
icity may be linked, at least in part, to its ability to directly
interact with DNA, because these cytotoxic and mutagenic
effects are verified mainly during growth, when the DNA is
more accessible. In addition, it is possible that piplartine can
be metabolized into one or more genotoxic compounds by
metabolic activation, since cells in exponential growth phase are
metabolically active. Consistent with this hypothesis, piplartine
induced recombinational events, mainly crossing over (Table 4),
probably as consequence of DNA breaks. Similarly, alkaloids
from Porcelia macrocarpa branches can cause DNA damage
in S. cerevisiae [49]. The beta carbolinic alkaloids harman and
harmine also show cytotoxic, mutagenic, and recombinogenic
effect in yeast strains [43,48]. Oxoaporphine, a Piper cani-
nun alkaloid, induced DNA damage in the yeast S. cerevisiae
lacking DNA repair pathway by homologous recombination
[3].
Piplartine treatment induced DNA damage in V79 cells, as
detected by neutral and alkaline comet assay. We found that
DNA DSB, as detected by neutral comet assay, was signifi-
cantly higher in V79 cells following exposure to this substance
(Table 5). Several alkaloids have direct impact on DNA in mam-
malian cells, mainly by intercalant effects [3,50–54]. Similarly,
it was recently shown that sanguinarine, which is present in
argemone oil, causes DNA damage in whole blood cells in vitro
[50]. Cryptolepine has DNA damaging properties, as verified by
comet assay, and it is mutagenic at high concentrations in V79
mammalian cells [51].
In our cell cycle profile analysis, piplartine induced G2/M cell
cycle arrest (Table 6), probably as a consequence of DNA dou-
ble strand breaks generation and repair. DNA damage response
checkpoints were identified at the G1/S and G2/M boundaries,
as well during S phase and potentially in mitosis; however,
G2/M arrest is characteristic of agents that induce DSB [55,56].
Therefore, cell cycle distribution profile results support the con-
clusions obtained in the comet assay, and could indicate that
the cytotoxic effect is linked to apoptotic cell death. Similarly,
cryptolepine, swainsonine, ellipticine, and tetrandine induce
G2/M phase block in cancer cultured cells [57–60]. In con-
D.P. Bezerra et al. / Mutation Research 652 (2008) 164–174 171
Fig. 5. Microscopic analysis of hematoxylin/eosin-stained V79 cells. Cells were untreated (A); treated with doxorubicin (1.0 g/mL (B) positive control), treated
with piplartine at 5.0 g/mL (C) or at 10.0 g/mL (D), and analyzed under light microscopy (400×). White arrows indicate vacuolization, and black arrows indicate
chromatin condensation.
trast, sanguinarine- and berberine-treated cells extend G0/G1
cell cycle arrest [61,62].
The extension of DNA damage induced by piplartine may
trigger repair mechanisms and subsequent cell death or muta-
genic/recombinogenic events if cell repair fails [63,64]. This is
supported by our results, which showed piplartine to be cytotoxic
and genotoxic to V79 cells, and mutagenic/recombinogenic
to yeast. Thus, it is possible that its cytotoxicity to several
cancer cell lines in vitro [25,26] is partially due to its DNA
damaging effects, since DNA damage is a potent stimulus to
apoptotic cell death [65,66]. This lead us to evaluate the nature
Fig. 6. Effect of piplartine on DNA nuclear fragmentation in V79 cells after 3 h
incubation and staining with acridine orange and ethidium bromide (AO/EB).
Negative control (NC) was treated with solvent. Doxorubicin (1.0 g/mL) was
used as positive control (DOX). Data are expressed as mean values ± S.D. of
three independent experiments performed in triplicate. *P < 0.05 as compared
to control by One way ANOVA and Tukey’s multiple comparison test.
of cell death involved in the piplartine cytotoxicity to V79
cells.
Cell apoptosis is important to destroy undesired cells
during the development and homeostasis of multicellular
organisms, and it is characterized by distinct morphological
changes, such as plasma membrane blebbing, cell shrink-
age, mitochondria depolarization, chromatin condensation, and
DNA fragmentation [67,68]. Indeed, apoptosis induction is a
powerful tool in anticancer therapy [68,69]. Several method-
ologies were developed to evaluate the nature and molecular
mechanisms of cell death [70,71]. In the present study, apop-
tosis induction in piplartine-treated V79 cells was evaluated
by chromatin condensation using differential morphologi-
cal analysis with hematoxylin–eosin and AO/EB staining,
internucleosomal DNA fragmentation detection, and mito-
chondrial dysfunction evaluation employing flow cytometry
analysis.
The detection of the mitochondria membrane potential event
provided an early indication of apoptosis initiation, because,
when the disruption of mitochondria potential is dissipated,
the cell would enter the irreversible apoptotic process [73,74].
The results of the present experiment demonstrated that the
treatment with piplartine increased mitochondria membrane
potential loss in a dose-dependent manner (Fig. 4), indicating
that this alkamide induces cell death by apoptosis in V79 cells.
In addition, several alkaloids, such as berberine, swainsonine,
AMD-5, piperine, and solanine, induce changes in mitochon-
drial membrane permeability as an event that triggers apoptosis
[59,61,62,73,75–77].
172 D.P. Bezerra et al. / Mutation Research 652 (2008) 164–174
Fig. 7. Summarized model of piplartine effects.
A mitochondrial stimulus precedes the pathways that activate
endonucleases, leading to DNA fragmentation [78,79]. Consis-
tent with this finding, in piplartine-treated V79 cells, apoptotic
fragmentation DNA was observed under light and fluorescence
microscopy. When the integrity of cell plasma membrane was
assessed, there were no signs of damage or lysis, which are clear
indications of necrosis (data no shown), as necrotic cells exhibit
plasma membrane lysis before any significant changes in nuclear
morphology occur [80]. Finally, piplartine treatment clearly
generated internucleossomal DNA fragmentation (Fig. 4), evi-
denced as sub-G1 peak in flow cytometry, reinforcing that cell
death was caused by apoptosis.
In this study, we showed that the alkaloid piplartine is cyto-
toxic and genotoxic to mammalian V79 cells by DSB generation.
These DNA lesions cause G2/M cell cycle arrest and induced
apoptosis, as verified by morphological analysis and mitochon-
drial membrane potential determination. In addition, we believe
that the cells that survive piplartine-induced DNA damage can
accumulate mutations, since this alkaloid was mutagenic and
recombinogenic, as observed in S. cerevisiae assays. A summa-
rized model of piplartine effects is shown in Fig. 7. It indicates a
possible mechanism of the antiproliferative effect of piplartine.
Further studies are needed to identify the molecular mechanism
underlying piplartine induced-apoptosis in several cell lines.
Conflict of interest
None.
Acknowledgments
This work was supported by grants from the Brazilian
Agencies “Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient
´
ıfico
e Tecnol
´
ogico (CNPq)”, “Coordenac¸
˜
ao de Aperfeic¸oamento
de Pessoal de Ensino Superior (CAPES)” and GENOTOX,
Genotoxicity Laboratory, Instituto Royal-Biotechnology Cen-
ter, UFRGS. Dinara Moura has a doctoral grant from CNPq and
Daniel Bezerra, Renato Rosa and Marne Vasconcellos have a
doctoral grant from CAPES.
References
[1] L.C. Tapsell, I. Hemphill, L. Cobiac, C.S. Patch, D.R. Sullivan, M. Fenech,
S. Roodenrys, J.B. Keogh, P.M. Clifton, P.G. Williams, V.A. Fazio, K.E.
Inge, Health benefits of herbs and spices: the past, the present, the future,
Med. J. Aust. 185 (2006) S4–S24.
[2] V. Triggiani, F. Resta, E. Guastamacchia, C. Sabba, B. Licchelli, S.
Ghiyasaldin, E. Tafaro, Role of antioxidants, essential fatty acids, carnitine,
vitamins, phytochemicals and trace elements in the treatment of diabetes
mellitus and its chronic complications, Endocr. Metab. Immune Disord.
Drug Targets 6 (2006) 77–93.
[3] J. Ma, S.H. Jones, R. Marshall, R.K. Johnson, S.M. Hecht, A DNA-
damaging oxoaporphine alkaloid from Piper caninum, J. Nat. Prod. 67
(2004) 1162–1164.
[4] L.S. Arambewela, L.D. Arawwawala, W.D. Ratnasooriya, Antidiabetic
activities of aqueous and ethanolic extracts of Piper betle leaves in rats,
J. Ethnopharmacol. 102 (2005) 239–245.
[5] E.S. Sunila, G. Kuttan, Piper longum inhibits VEGF and proinflamma-
tory cytokines and tumor-induced angiogenesis in C57BL/6 mice, Int.
Immunopharmacol. 6 (2006) 733–741.
D.P. Bezerra et al. / Mutation Research 652 (2008) 164–174 173
[6] S. Ganguly, S. Mula, S. Chattopadhyay, M. Chatterjee, An ethanol extract
of Piper betle Linn. mediates its anti-inflammatory activity via down-
regulation of nitric oxide, J. Pharm. Pharmacol. 59 (2007) 711–718.
[7] C.D. Dodson, L.A. Dyer, J. Searcy, Z. Wrigh, D.K. Letourneau,
Cenocladamide, a dihydropyridone alkaloid from Piper cenocladum,Phy-
tochemistry 53 (2000) 51–54.
[8] F. Cicero Bezerra Felipe, J. Trajano Sousa Filho, L.E. de Oliveira Souza,
J. Alexandre Silveira, D. Esdras de Andrade Uchoa, E. Rocha Silveira,
O. Deusdenia Loiola Pessoa, G.S. de Barros Viana, Piplartine, an amide
alkaloid from Piper tuberculatum, presents anxiolytic and antidepressant
effects in mice, Phytomedicine (2007).
[9] I.L. Tsai, F.P. Lee, C.C. Wu, C.Y. Duh, T. Ishikawa, J.J. Chen, Y.C. Chen,
H. Seki, I.S. Chen, New cytotoxic cyclobutanoid amides, a new furanoid
lignan and anti-platelet aggregation constituents from Piper arborescens,
Planta Med. 71 (2005) 535–542.
[10] S. Panda, A. Kar, Piperine lowers the serum concentrations of thyroid hor-
mones, glucose and hepatic 5
D activity in adult male mice, Horm. Metab.
Res. 35 (2003) 523–526.
[11] C.R. Pradeep, G. Kuttan, Effect of piperine on the inhibition of lung metas-
tasis induced B16F-10 melanoma cells in mice, Clin. Exp. Metastasis 19
(2002) 703–708.
[12] K. Selvendiran, S.M. Banu, D. Sakthisekaran, Oral supplementation of
piperine leads to altered phase II enzymes and reduced DNA damage and
DNA-protein cross links in Benzo(a)pyrene induced experimental lung
carcinogenesis, Mol. Cell. Biochem. 268 (2005) 141–147.
[13] K. Selvendiran, R. Padmavathi, V. Magesh, D. Sakthisekaran, Preliminary
study on inhibition of genotoxicity by piperine in mice, Fitoterapia 76
(2005) 296–300.
[14] K. Selvendiran, J. Prince Vijeya Singh, D. Sakthisekaran, In vivo effect
of piperine on serum and tissue glycoprotein levels in benzo(a)pyrene
induced lung carcinogenesis in Swiss albino mice, Pulm. Pharmacol. Ther.
19 (2006) 107–111.
[15] K. Selvendiran, C. Thirunavukkarasu, J.P. Singh, R. Padmavathi, D. Sak-
thisekaran, Chemopreventive effect of piperine on mitochondrial TCA
cycle and phase-I and glutathione-metabolizing enzymes in benzo(a)pyrene
induced lung carcinogenesis in Swiss albino mice, Mol. Cell. Biochem. 271
(2005) 101–106.
[16] C. de Mattos Duarte, H. Verli, J.X. de Araujo-Junior, I.A. de Medeiros,
E.J. Barreiro, C.A. Fraga, New optimized piperamide analogues with
potent in vivo hypotensive properties, Eur. J. Pharm. Sci. 23 (2004) 363–
369.
[17] R.S. Vijayakumar, N. Nalini, Efficacy of piperine, an alkaloidal constituent
from Piper nigrum on erythrocyte antioxidant status in high fat diet and
antithyroid drug induced hyperlipidemic rats, Cell Biochem. Funct. 24
(2006) 491–498.
[18] R.S. Vijayakumar, N. Nalini, Piperine, an active principle from Piper
nigrum, modulates hormonal and apo lipoprotein profiles in hyperlipidemic
rats, J. Basic Clin. Physiol. Pharmacol. 17 (2006) 71–86.
[19] S.W. Lee, M.C. Rho, H.R. Park, J.H. Choi, J.Y. Kang, J.W. Lee, K. Kim,
H.S. Lee, Y.K. Kim, Inhibition of diacylglycerol acyltransferase by alka-
mides isolated from the fruits of Piper longum and Piper nigrum, J. Agric.
Food Chem. 54 (2006) 9759–9763.
[20] Y.N. Singh, N.N. Singh, Therapeutic potential of kava in the treatment of
anxiety disorders, CNS Drugs 16 (2002) 731–743.
[21] J.R. Stohr, P.G. Xiao, R. Bauer, Constituents of Chinese Piper species and
their inhibitory activity on prostaglandin and leukotriene biosynthesis in
vitro, J. Ethnopharmacol. 75 (2001) 133–139.
[22] C.Y. Chu, J.P. Chang, C.J. Wang, Modulatory effect of piperine on
benzo[a]pyrene cytotoxicity and DNA adduct formation in V-79 lung
fibroblast cells, Food Chem. Toxicol. 32 (1994) 373–377.
[23] S. Unchern, K. Nagata, H. Saito, J. Fukuda, Piperine, a pungent alkaloid,
is cytotoxic to cultured neurons from the embryonic rat brain, Biol. Pharm.
Bull. 17 (1994) 403–406.
[24] A. Khajuria, R.K. Johrn, U. Zutshi, Piperine mediated alterations in lipid
peroxidation and cellular thiol status of rat intestinal mucosa and epithelial
cells, Phytomedicine 6 (1999) 351–355.
[25] D.P. Bezerra, F.O. Castro, A.P. Alves, C. Pessoa, M.O. Moraes, E.R. Sil-
veira, M.A. Lima, F.J. Elmiro, L.V. Costa-Lotufo, In vivo growth-inhibition
of Sarcoma 180 by piplartine and piperine, two alkaloid amides from Piper,
Braz. J. Med. Biol. Res. 39 (2006) 801–807.
[26] D.P. Bezerra, G.C. Militao, F.O. de Castro, C. Pessoa, M.O. de Moraes, E.R.
Silveira, M.A. Lima, F.J. Elmiro, L.V. Costa-Lotufo, Piplartine induces
inhibition of leukemia cell proliferation triggering both apoptosis and
necrosis pathways, Toxicol. In Vitro 21 (2007) 1–8.
[27] H.M. Navickiene, S. Bolzani Vda, M.J. Kato, A.M. Pereira, B.W. Bertoni,
S.C. Franca, M. Furlan, Quantitative determination of anti-fungal and insec-
ticide amides in adult plants, plantlets and callus from Piper tuberculatum
by reverse-phase high-performance liquid chromatography, Phytochem.
Anal. 14 (2003) 281–284.
[28] C.K. Atal, K.L. Dhar, J. Singh, The chemistry of Indian Piper species,
Lloydia 38 (1975) 256–264.
[29] D. Burke, D. Dawson, T. Stearns, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 2000.
[30] S. Snow, Absence of suppressible alleles at the his 1 locus of yeast, Mol
Gen Genet 164 (1971) 341–342.
[31] D.C. Hawthorne, R.K. Mortimer, Suppressors in yeast, Genetics 48 (1963)
617–620.
[32] R.C. Von Borstel, K.T. Cain, C.M. Steinberg, Inheritance of spontaneous
mutability in yeast, Genetics 69 (1971) 17–27.
[33] D.C. Hawthorne, Identification of nonsense codons in yeast, J. Mol. Biol.
43 (1969) 71–75.
[34] R.C. Schuller, R.C. Von Borstel, Spontaneous mutability in yeast. I. Stabil-
ity of lysine reversion rates to variation of adenine concentration, Mutat.
Res. 24 (1974) 17–23.
[35] A. Hartmann, G. Speit, The contribution of cytotoxicity to DNA-effects in
the single cell gel test (comet assay), Toxicol. Lett. 90 (1997) 183–188.
[36] A. Hartmann, A. Elhajouji, E. Kiskinis, F. Poetter, H. Martus, A. Fjallman,
W. Frieauff, W. Suter, Use of the alkaline comet assay for industrial geno-
toxicity screening: comparative investigation with the micronucleus test,
Food Chem. Toxicol. 39 (2001) 843–858.
[37] M. Wojewodzka, I. Buraczewska, M. Kruszewski, A modified neutral
comet assay: elimination of lysis at high temperature and validation of
the assay with anti-single-stranded DNA antibody, Mutat. Res. 518 (2002)
9–20.
[38] S.B. Nadin, L.M. Vargas-Roig, D.R. Ciocca, A silver staining
method for single-cell gel assay, J. Histochem. Cytochem. 49 (2001)
1183–1186.
[39] R.R. Tice, E. Agurell, D. Anderson, B. Burlinson, A. Hartmann, H.
Kobayashi, Y. Miyamae, E. Rojas, J.C. Ryu, Y.F. Sasaki, Single cell
gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology
testing, Environ. Mol. Mutagen. 35 (2000) 206–221.
[40] B. Burlinson, R.R. Tice, G. Speit, E. Agurell, S.Y. Brendler-Schwaab, A.R.
Collins, P. Escobar, M. Honma, T.S. Kumaravel, M. Nakajima, Y.F. Sasaki,
V. Thybaud, Y. Uno, M. Vasquez, A. Hartmann, Fourth international work-
group on genotoxicity testing: results of the in vivo comet assay workgroup,
Mutat. Res. 627 (2007) 31–35.
[41] I. Nicoletti, G. Magliorati, M.C. Pagliacci, F. Grignani, C. Riccardi, A rapid
and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide
staining and flow cytometry, J Immunol Methods 139 (1991) 271–279.
[42] J.M. Boeira, J. da Silva, B. Erdtmann, J.A. Henriques, Genotoxic effects
of the alkaloids harman and harmine assessed by comet assay and chromo-
some aberration test in mammalian cells in vitro, Pharmacol. Toxicol. 89
(2001) 287–294.
[43] J.M. Boeira, A.F. Viana, J.N. Picada, J.A. Henriques, Genotoxic and recom-
binogenic activities of the two beta-carboline alkaloids harman and harmine
in Saccharomyces cerevisiae, Mutat. Res. 500 (2002) 39–48.
[44] M.M. Cohen, Y. Shiloh, Genetic toxicology of lysergic acid diethylamide
(LSD-25), Mutat. Res. 47 (1977) 183–209.
[45] S. Ohmori, Y. Morimoto, Dihydroetorphine: a potent analgesic: pharma-
cology, toxicology, pharmacokinetics, and clinical effects, CNS Drug Rev.
8 (2002) 391–404.
[46] Y. Pommier, Topoisomerase I inhibitors: camptothecins and beyond, Nat.
Rev. Cancer 6 (2006) 789–802.
[47] J.N. Picada, R. Roesler, J.A. Henriques, Genotoxic, neurotoxic and
neuroprotective activities of apomorphine and its oxidized derivative 8-
oxo-apomorphine, Braz. J. Med. Biol. Res. 38 (2005) 477–486.
174 D.P. Bezerra et al. / Mutation Research 652 (2008) 164–174
[48] R. Cao, W. Peng, Z. Wang, A. Xu, Beta-carboline alkaloids: biochemical
and pharmacological functions, Curr. Med. Chem. 14 (2007) 479–500.
[49] J.H. Lago, M.H. Chaves, M.C. Ayres, D.G. Agripino, M.C. Young, Evalua-
tion of antifungal and DNA-damaging activities of alkaloids from branches
of Porcelia macrocarpa, Planta Med. 73 (2007) 292–295.
[50] K.M. Ansari, A. Dhawan, S.K. Khanna, M. Das, In vivo DNA damag-
ing potential of sanguinarine alkaloid, isolated from argemone oil, using
alkaline Comet assay in mice, Food Chem. Toxicol. 43 (2005) 147–153.
[51] C. Ansah, A. Khan, N.J. Gooderham, In vitro genotoxicity of the West
African anti-malarial herbal Cryptolepis sanguinolenta and its major alka-
loid cryptolepine, Toxicology 208 (2005) 141–147.
[52] Q. Ding, K. Chichak, J.W. Lown, Pyrroloquinoline and pyridoacridine
alkaloids from marine sources, Curr. Med. Chem. 6 (1999) 1–27.
[53] R. van Der Heijden, D.I. Jacobs, W. Snoeijer, D. Hallard, R. Verpoorte, The
Catharanthus alkaloids: pharmacognosy and biotechnology, Curr. Med.
Chem. 11 (2004) 607–628.
[54] J. Kluza, B. Baldeyrou, P. Colson, P. Rasoanaivo, L. Mambu, F. Frappier,
C. Bailly, Cytotoxicity and DNA binding properties of the plant alkaloid
burasaine, Eur. J. Pharm. Sci. 20 (2003) 383–391.
[55] P.A. Jeggo, M. Lobrich, Contribution of DNA repair and cell cycle check-
point arrest to the maintenance of genomic stability, DNA Repair (Amst)
5 (2006) 1192–1198.
[56] J. Bartek, J. Lukas, DNA damage checkpoints: from initiation to recovery
or adaptation, Curr. Opin. Cell Biol. 19 (2007) 238–245.
[57] P.L. Kuo, Y.L. Hsu, Y.C. Kuo, C.H. Chang, C.C. Lin, The anti-proliferative
inhibition of ellipticine in human breast mda-mb-231 cancer cells is through
cell cycle arrest and apoptosis induction, Anticancer Drugs 16 (2005)
789–795.
[58] L.T. Ng, L.C. Chiang, Y.T. Lin, C.C. Lin, Antiproliferative and apoptotic
effects of tetrandrine on different human hepatoma cell lines, Am. J. Chin.
Med. 34 (2006) 125–135.
[59] J.Y. Sun, M.Z. Zhu, S.W. Wang, S. Miao, Y.H. Xie, J.B. Wang, Inhibition of
the growth of human gastric carcinoma in vivo and in vitro by swainsonine,
Phytomedicine 14 (2007) 353–359.
[60] H. Zhu, N.J. Gooderham, Mechanisms of induction of cell cycle arrest
and cell death by cryptolepine in human lung adenocarcinoma a549 cells,
Toxicol. Sci. 91 (2006) 132–139.
[61] J. Malikova, A. Zdarilova, A. Hlobilkova, Effects of sanguinarine
and chelerythrine on the cell cycle and apoptosis, Biomed. Pap.
Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech. Repub. 150 (2006) 5–
12.
[62] S. Jantova, L. Cipak, S. Letasiova, Berberine induces apoptosis through a
mitochondrial/caspase pathway in human promonocytic U937 cells, Toxi-
col. In Vitro 21 (2007) 25–31.
[63] J.H. Houtgraaf, J. Versmissen, W.J. van der Giessen, A concise review
of DNA damage checkpoints and repair in mammalian cells, Cardiovasc.
Revasc. Med. 7 (2006) 165–172.
[64] B.X. Hoang, S.A. Levine, P. Pham, D.G. Shaw, Hypothesis of the cause
and development of neoplasms, Eur. J. Cancer Prev. 16 (2007) 55–61.
[65] W.P. Roos, B. Kaina, DNA damage-induced cell death by apoptosis, Trends
Mol. Med. 12 (2006) 440–450.
[66] N. Zhou, H. Xiao, T.K. Li, E.K.A. Nur, L.F. Liu, DNA damage-mediated
apoptosis induced by selenium compounds, J. Biol. Chem. 278 (2003)
29532–29537.
[67] K. Vermeulen, D.R. Van Bockstaele, Z.N. Berneman, Apoptosis: mecha-
nisms and relevance in cancer, Ann. Hematol. 84 (2005) 627–639.
[68] E.G. Levin, Cancer therapy through control of cell migration, Curr. Cancer
Drug Targets 5 (2005) 505–518.
[69] R. Kim, M. Emi, K. Tanabe, The role of apoptosis in cancer cell survival
and therapeutic outcome, Cancer Biol. Ther. 5 (2006) 1429–1442.
[70] I. Vermes, C. Haanen, C. Reutelingsperger, Flow cytometry of apoptotic
cell death, J. Immunol. Methods 243 (2000) 167–190.
[71] R. Mirakian, K. Nye, F.F. Palazzo, A.W. Goode, L.J. Hammond, Methods
for detecting apoptosis in thyroid diseases, J. Immunol. Methods 265 (2002)
161–175.
[73] S.Y. Gao, Q.J. Wang, Y.B. Ji, Effect of solanine on the membrane poten-
tial of mitochondria in HepG2 cells and [Ca2+]i in the cells, World J.
Gastroenterol. 12 (2006) 3359–3367.
[74] C.L. Hsu, G.C. Yen, Effects of capsaicin on induction of apoptosis and
inhibition of adipogenesis in 3T3-L1 cells, J. Agric. Food Chem. 55 (2007)
1730–1736.
[75] C.S. Lee, E.S. Han, Y.K. Kim, Piperine inhibition of 1-methyl-4-
phenylpyridinium-induced mitochondrial dysfunction and cell death in
PC12 cells, Eur. J. Pharmacol. 537 (2006) 37–44.
[76] M.A. Altinoz, A. Bilir, R.F. Del Maestro, S. Tuna, E. Ozcan, G. Gedikoglu,
Noscapine, Noscapine and diltiazem augment taxol and radiation-induced
S-phase arrest and clonogenic death of C6 glioma in vitro, Surg. Neurol.
65 (2006) 478–484 (discussion 485).
[77] C. Griffin, N. Sharda, D. Sood, J. Nair, J. McNulty, S. Pandey, Selec-
tive cytotoxicity of Pancratistatin-related natural Amaryllidaceae alkaloids:
evaluation of the activity of two new compounds, Cancer Cell Int. 7 (2007)
10.
[78] A. Yoshida, Y. Pommier, T. Ueda, Endonuclease activation and chromoso-
mal DNA fragmentation during apoptosis in leukemia cells, Int. J. Hematol.
84 (2006) 31–37.
[79] M. Zhang, Y. Li, H. Zhang, S. Xue, BAPTA blocks DNA fragmen-
tation and chromatin condensation downstream of caspase-3 and DFF
activation in HT-induced apoptosis in HL-60 cells, Apoptosis 6 (2001)
291–297.
[80] J.A. Collins, C.A. Schandi, K.K. Young, J. Vesely, M.C. Willingham, Major
DNA fragmentation is a late event in apoptosis, J. Histochem. Cytochem.
45 (1997) 923–934.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
