( PDF ) Avaliação da eficácia antimicrobiana do extrato hidroalcoólico dos frutos de punica granatum L. (romã) na placa bacteriana

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SILVANA MAGALHÃES SIQUEIRA MENEZES

AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA ANTIMICROBIANA DO EXTRATO

HIDROALCOÓLICO DOS FRUTOS DE Punica granatum L. (ROMÃ) NA

PLACA BACTERIANA.

Dissertação submetida à Coordenação do

Curso de Pós-Graduação em Farmacologia,

da Universidade Federal do Ceará, como

requisito parcial para obtenção do grau de

Mestre em Farmacologia Clínica.

Orientadora: Profa. Dra. Glauce Socorro

Barros Viana.

FORTALEZA

2004

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SILVANA MAGALHÃES SIQUEIRA MENEZES

AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA ANTIMICROBIANA DO EXTRATO

HIDROALCOÓLICO DOS FRUTOS DE Punica granatum L. (ROMÃ) NA

PLACA BACTERIANA.

Dissertação submetida à Coordenação do

Curso de Pós-Graduação em

Farmacologia, da Universidade Federal do

Ceará, como requisito parcial para

obtenção do grau de Mestre em

Farmacologia Clínica.

Aprovada em 29/10/2004

BANCA EXAMINADORA

Profa. Dra. Glauce Socorro Barros Viana (Orientadora)

Universidade Federal do Ceará - UFC

Profa. Dra. Francisca Cléa Florenço de Sousa

Universidade Federal do Ceará - UFC

Profa. Dra. Cláudia do Ó Pessoa

Universidade Federal do Ceará - UFC

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Aos meus pais SIQUEIRA e EDITH, a quem devo minha formação e educação.

Ao meu esposo GILBERTO JUNIOR, pela compreensão e companheirismo.

Aos meus filhos GILBERTO NETO e GUILHERME, pelo amor incondicional.

AGRADECIMENTOS

À Professora Doutora Glauce Socorro Barros Viana, pela sua inesgotável dedicação,

incentivo e exemplo de profissionalismo no direcionamento de mais um trabalho

científico.

À Luciana Nunes Cordeiro, em quem encontrei confiança, paciência e respeito.

À Faculdade de Medicina de Juazeiro do Norte – FMJ, por acreditar e propiciar

recursos para o desenvolvimento da pesquisa.

À Lucia Nobre, pelo seu apoio na realização desta pesquisa.

Aos Professores do Mestrado em Farmacologia da Universidade Federal do Ceará

pelos conhecimentos transmitidos.

Aos pacientes voluntários, pela colaboração e participação no desenvolvimento

deste estudo.

RESUMO

A avaliação, in vivo, do efeito do Extrato hidroalcóolico dos frutos da Punica

granatum L. (EHA) na inibição da placa bacteriana supragengival, foi realizada

em portadores de aparatologia ortodôntica fixa. O material foi coletado pela

manhã, após 24 horas sem higiene oral, de 23 homens e 37 mulheres (com

idade variando entre 9 e 25 anos), em consultório odontológico, na cidade de

Crato (Ceará), Brasil. Após randomização, foram divididos em três grupos de

vinte indivíduos cada. Grupo 1 - EHA; Grupo 2 - gluconato de clorhexidina a

0,12% (CLX); Grupo 3 (controle) – água destilada . Cada grupo recebeu, sob a

forma de bochecho de 1 minuto, 15 ml do EHA (60mg/ml), do CLX e da água

destilada. A placa dentária foi coletada antes e após o bochecho com uma

destas três substâncias. As colônias bacterianas foram contadas para

determinação de unidades formadoras de colônias (UFC/ml) e determinou-se a

concentração inibitória mínima (CIM) e o tempo de duração do efeito do EHA

sobre os microorganismos da placa dentária. Avaliou-se a atividade

antimicrobiana in vitro do EHA e da CLX sobre 14 linhagens patogênicas do

Banco de Microorganimos da Faculdade de Medicina de Juazeiro – FMJ. Foi

determinada a CIM do EHA frente a quatro linhagens sensíveis (S.

hemoliticus, S.aureus, P. aeruginosa e C. albicans). A análise estatística

(Mann-Whitney U) não mostrou diferença entre os grupos EHA e CLX (p =

0.7251), mas uma diferença significante foi observada no EHA (p< 0.0001),

quando comparado com o grupo controle. As porcentagens de inibição foram

de 83.5% e 79%, após bochecho com EHA e CLX, respectivamente. A CIM do

EHA sobre os microorganismos da placa dentária foi de 15 mg/ml. Houve uma

redução em UFC/ml de 72.2% e de 63.8%, imediatamente após o bochecho

com EHA e 1 hora depois, respectivamente. O EHA apresentou um efeito

antibacteriano semelhante ao observado com a CLX, ambos mostraram-se

ativos contra as linhagens de S. aureus, S. β-hemolyticus, S. β-hemolyticus, P.

aeruginosa, E. coli, K. pneumoniae e P. vulgaris. O EHA foi efetivo contra C.

albicans. A CIM do EHA sobre linhagens de S.

-hemolyticus, S. aureus, P.

aeruginosa e C. albicans foram, respectivamente, 1.87, 3.75, 7.5 e 15 mg/ml. O

EHA apresenta uma atividade significante contra microorganismos presentes

na placa dentária.

Palavras-chave: Punicaceae – Efeitos de drogas – Microbiologia – Placa

dentária – Ortodontia

ABSTRACTS

The in vivo, evaluation, of the effect of the hydroalcoholic extract from Punica

granatum L. (HAE) in the inhibition of the supragengival dental plaque, was

carried with 60 voluntaries using fixed orthodontic appliance. The material was

collected in the morning after 24h without oral hygiene, from 23 men and 37

women (age ranging from 9 to 25 years) at the city of Crato (Ceará), Brasil. The

voluntaries were randomly distributed in to 3 groups of 20 subjects. Group 1:

HAE; group 2: 0.12% Chlorhexidine gluconate (CLX); group 3 (control): distilled

water. Each group received, under the form of a mouth-rinse for 1 minute, 15

ml of either HAE; CLX or distilled water. The dental plaque was collected before

and after the mouth-rinse with one of these three substances. The bacteria

colonies were counted and results expressed as colony forming unities (CFU).

The minimum inhibitory concentration (MIC) and duration of the antimicrobial

effect of HAE on the dental plaque were determined. The bacterial

susceptibility tests in vitro to HAE and chlorhexidine on 14 pathogenic bacterial

strains of the FMJ Bank, were assessed and MIC values for each bacterial

strain susceptible to HAE were also determined. The statistics analysis (Mann-

Whitney U) showed no difference between HAE and CLX groups (p = 0, 7251),

but a significant difference was observed in the HAE group (p<0.0001) as

compared against control. The percentages of inhibitions of the order of 83.5%

and 79% after mounth-rinse with the HAE and CLX respectively. The MIC of

the HAE on the microorganisms of the dental plaque was of 15 mg/ml. The

antibacterial effect of the HAE lasted for at least 1h and the percentage of

inhibition of the CFU was 72.2% after the mounth-rinse and 63.8%, 1h later.

The HAE presents an antimicrobial efficacy similar to that shown by CLX, both

being actives against S. aureus, S. β-hemoliticus, S. β-hemoliticus, P.

aeruginosa, K. pneumoniae, P. vulgaris and E. coli. The HAE was also effective

against C. albicans. The MICs of HAE on the strains of S.

-hemoliticus, S.

aureus, P. aeruginosa and C. albicans were 1.87, 3.75, 7.5 and 15 mg/ml,

respectively. The HAE presents a significant activity against microorganisms

present in the dental plaque.

Keywords: Pomegranate – Effects of drugs – Microbiology - Dental plaque -

Orthodontics

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1- Punica granatum L, mostrando detalhes das flores da planta...... 15

FIGURA 2 - Gluconato de Clorhexidina (PM 505.45) - DL-50 = 22mg/kg

(intravenosa) e 1800mg/kg (via oral) em camundongos...............

FIGURA 3 - Casca e sementes de P. granatum............................................... 27

FIGURA 4 - Frutos de Punica granatum L........................................................ 34

FIGURA 5 - Fluxo laminar contendo material utilizado na determinação da

concentração inibitória mínima do Extrato hidroalcóolico de P.

granatum sobre linhagens patogênicas........................................

FIGURA 6 - Tubos de ensaio com BHI caldo, contendo os microorganismos

utilizados na determinação da concentração inibitória mínima

(CIM) do Extrato hidroalcóolico de P. granatum (EHA) sobre

estas linhagens.............................................................................

FIGURA 7 - Material usado para montagem do teste de avaliação da

sensibilidade da microbiota bucal frente ao Extrato

hidroalcóolico de P. granatum (EHA)............................................

FIGURA 8 - Estufa incubadora a 37°C contendo as placas de Petri

semeadas com a microbiota dos voluntários. ..............................

FIGURA 9 - Resultado do teste de difusão em disco para verificação da

atividade antimicrobiana do Extrato hidroalcóolico de P.

granatum (EHA) sobre microorganismos da cavidade bucal..........

FIGURA 10 - Resultado da concentração inibitória mínima do EHA(60mg/ml)

frente as bactérias Pseudomonas aeruginosa(PA), Streptococcus

β-hemolyticus(SH) , Stafilococcus aureus(SA) e Cândida

albicans(CA) . PA-CON : Placa controle, contendo cultura ativa

de Pseudomonas aeruginosa; PA-7,5 : Placa demonstrando a

CIM (7,5mg/ml) do EHA sobre a PA ; SH-CON : Placa controle,

com Streptococcus

-hemolyticus; SH – 1,87 : Placa

determinando a CIM (1,87 mg/ml) do EHA sobre o SH; SA-CON :

Placa controle, com S. aureus; SA - 3,75 : Placa demonstrando a

CIM (3,75mg/ml) do EHA sobre o SA; CA-CON : Placa controle,

contendo C. albicans ; CA – 15 : Placa demonstrando a CIM

(15mg/ml) do EHA sobre a CA....................................................... 51

FIGURA 11 - Efeito do Extrato hidroalcóolico de P. granatum (EHA),

Clorhexidina e água destilada (controle) sobre microorganismos

da placa dental...... .......................................................................

FIGURA 12 - Duração do efeito antimicrobiano do Extrato hidroalcóolico de P.

granatum (EHA)............................................................................

FIGURA 13 - Cocos e bacilos Gram positivos isolados da microbiota bucal....... 56

FIGURA 14 - Cocos Gram negativos isolados da microbiota bucal ................. 57

FIGURA 15 - Folhas de P. granatum.................................................................. 59

LISTA DE TABELAS

TABELA 1- Antibióticos utilizados no antibiograma............................... 36

TABELA 2 - Espectro de resistência das linhagens bacterianas Gram

negativas e Gram positivas aos antibióticos comerciais.....

TABELA 3 - Teste de sensibilidade ao Extrato de romã (EHA) e

clorhexidina.........................................................................

TABELA 4 - Atividade antimicrobiana do extrato hidroalcóolico de P.

granatum através do teste de difusão em disco frente a

microrganismos da placa dental de voluntários antes de

serem submetidos ao tratamento.......................................

TABELA 5 - Determinação da concentração inibitória mínima (CIM)

em UFC x 10

do extrato hidroalcóolico Punica granatum

(EHA) sobre Staphylococcus aureus, Streptococcus

beta-hemoliticus, Pseudomonas aeruginosa e Candida

albicans...............................................................................

TABELA 6 - Efeito do Extrato hidroalcóolico de P. granatum (EHA), da

clorhexidina e água (controle) sobre microorganismos da

placa dental........................................................................

TABELA 7 - Análise estatística entre os grupos testados: Extrato

hidroalcóolico de P. granatum (EHA), clorhexidina e água

(controle).............................................................................

TABELA 8 - Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) do

Extrato hidroalcóolico Punica granatum (EHA) sobre a

microbiota da placa dental..................................................

TABELA 9 -

Duração do efeito antimicrobiano do Extrato

hidroalcóolico de P. granatum (EHA)..................................

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ATCC American Type Culture Collection (EUA)

BHI ÁGAR brain heart infusion agar (Infusão de cérebro e coração de

carneiro)

BHI CALDO brain heart infusion (Infusão de cérebro e coração de carneiro)

DL Dose Letal

EHA Extrato hidroalcóolico de Punica granatum L.

FMJ Faculdade de Medicina de Juazeiro do Norte

mcg Microgramas

ml Mililitros

mg miligramas

mg/ml Miligrama por mililitro

CIM Concentração inibitória mínima

PBS Phosphate Buffered Saline

PM Peso Molecular

Spread plate Plaqueamento em superfície

UFC Universidade Federal do Ceará

UFC/ml Unidades formadoras de colônias por mililitro

µl

Microlitro

v/v volume/volume

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

1 INTRODUÇÃO............................................................................................ 13

1.1 A placa bacteriana associada ao uso de aparelho ortodôntico fixo......... 15

1.2 A utilização da clorhexidina no controle químico da placa bacteriana..... 19

1.3 A utilização de substâncias naturais sobre afecções da cavidade bucal 23

1.3.1 Atividades farmacológicas da Punica granatum L…............................ 26

2. OBJETIVOS……………………………………………….…………………… 30

3. MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................... 31

3.1 Material.................................................................................................... 31

3.2 Métodos................................................................................................... 33

3.2.1 Substâncias utilizadas como controle positivo e negativo.................... 33

3.2.2 Obtenção da planta e preparo do Extrato Hidroalcóolico de Punica

granatum L(EHA)...........................................................................................

3.2.3 Avaliação in vitro da atividade antibacteriana e fungicida do Extrato

hidroalcóolico de P. granatum (EHA) e do Gluconato de clorhexidina a

0,12%.............................................................................................................

3.2.3.1 Avaliação da resistência bacteriana a antibióticos............................ 35

3.2.3.2 Teste de sensibilidade de linhagens patogênicas do Banco de

Microorganismos frente ao Extrato hidroalcóolico de P. granatum e ao

gluconato de clorhexidina a 0,12%)...............................................................

3.2.3.3 Análise da atividade antimicrobiana do Extrato hidroalcóolico de P.

granatum(EHA), sobre a microbiota da placa bacteriana, utilizando discos

de papel de filtro...........................................................................................

3.2.3.4 Determinação da Concentração Inibitória Mínima do Extrato

hidroalcóolico de Punica granatum L.(EHA) sobre linhagens patogênicas

do Banco de Microorganismos da FMJ.........................................................

3.3 Casuística............................................................................................... 39

3.4 Descrição da amostra.............................................................................. 40

a) Descrição do tipo de estudo a ser conduzido........................................... 40

3.5 Coleta e Processamento da Placa Bacteriana....................................... 42

3.5.1 Avaliação da sensibilidade da microbiota presente na placa

bacteriana frente ao extrato hidroalcóolico de P. granatum (EHA), ao

gluconato de clorhexidina e à água destilada (estudos in vivo).....................

3.5.2 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) do Extrato

hidroalcóolico de P. granatum (EHA) sobre a microbiota da placa dental....

3.5.3 Determinação do tempo de duração do efeito do Extrato

hidroalcóolico de P. granatum (EHA).............................................................

3.6 Diferenciação da microbiota bucal através do método de coloração de

Gram.............................................................................................................

3.7 Análise Estatística............................................................................... 46

3.8 Aprovação do Projeto pelo Comitê de Ética em Pesquisa...................... 46

4 RESULTADOS........................................................................................... 47

5 DISCUSSÃO............................................................................................... 58

6 CONCLUSÃO............................................................................................. 63

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................... 64

ANEXO A ..................................................................................................... 76

ANEXO B ...................................................................................................... 79

- 13 -

1. INTRODUÇÃO

Os métodos convencionais de higiene bucal, principalmente a associação

de escovação com fio dental, são considerados os mais eficientes na remoção da

placa bacteriana. No entanto, embora a higienização bucal consiga reduzir a placa

dentária, em muitas situações não se consegue atingir todos os objetivos somente

com o controle mecânico da placa, uma vez que o mesmo demanda tempo,

motivação e, habilidade manual. Assim, diversas substâncias químicas têm sido

utilizadas como complementação da higiene bucal.

A placa dentária é uma comunidade bacteriana formada pela interação

entre os microorganismos e o seu meio ambiente. A placa, junto com o meio

ambiente, constitui uma unidade estrutural e funcional, um ecossistema microbiano

(Carlsson e Egelberg, 1965), o seu controle dentro das diversas especialidades da

Odontologia é de grande importância para a manutenção da saúde bucal.

A Ortodontia como uma das especialidades da Odontologia, preocupa-se

com os princípios básicos de prevenção bucal e vem utilizando todo o arsenal

disponível para o controle efetivo da placa bacteriana.

Segundo Silva Filho e colaboradores (1989), com a evolução tecnológica

dos acessórios e dispositivos ortodônticos, bem como o avanço dos meios de

diagnóstico e planificação do tratamento ortodôntico, a Ortodontia conquistou o seu

espaço de destaque na determinação de uma oclusão normal, dentro dos conceitos

estáticos e funcionais. No entanto, não conseguiu superar um dos seus efeitos

negativos, aquele relacionado com a placa bacteriana .

Os acessórios ortodônticos (bandas metálicas e bráquetes) fixados nas

coroas dentais, associados aos fios corretores, molas e elásticos, favorecem a

retenção de placa bacteriana e indultos, aumentando tanto o risco de cárie quanto o

de gengivite. Em virtude das dificuldades apresentadas para controlar a placa

bacteriana mecanicamente, por meio da escovação e uso do fio dental, busca-se

uma alternativa através da utilização de agentes químicos que sejam eficazes contra

os microorganismos periodontopatogênicos (Martin e Campana 1989).

Diversas substâncias têm sido consideradas para o controle químico da

placa bacteriana. Feist, Micchelli e Sarian (1989) ao realizarem extensa revisão de

- 14 -

literatura, concluíram que a clorhexidina pode ser considerada, entre as substâncias

químicas existentes, a que melhor inibe o desenvolvimento da placa supragengival.

Gjermo et al. (1975), relataram que este quimioterápico parecia ser o

agente mais eficaz no controle químico da placa bacteriana, em função de suas

propriedades: boa substantividade (tempo que a substância permanece ativa na

cavidade oral), estabilidade, segurança e eficácia. No entanto, segundo Stefani e

Lima (1996), a clorhexidina quando utilizada por um longo período, apresenta alguns

efeitos colaterais: pigmentação dos dentes e língua, alteração do paladar,

descamação epitelial, sensação de queimação e sabor amargo.

O Brasil é o país com a maior diversidade genética vegetal do mundo,

com cerca de 55 mil espécies vegetais catalogadas, sendo que 10 mil podem ser

consideradas medicinais, aromáticas e úteis (Barata e Queiroz, 1995).Com base em

estimativas da Organização Mundial de Saúde, Castro et al.(2000) afirmam que 80%

da população do planeta já fizeram uso de algum tipo de erva medicinal, sendo 30%

por indicação médica.

A Punica granatum L. é uma erva da família Punicaceae, popularmente

conhecida no Brasil como “romã”. É um arbusto ou árvore, da região do

Mediterrâneo, que atinge de 4 a 6 metros de altura. Tem folhas simples e flores

isoladas, de corola vermelha alaranjada e cálices esverdeados, duros e coriáceo.

Fruto tipo baga, redondo, de casca coriácea, amarela ou avermelhada contendo

inúmeras sementes envolvidas por um arilo polposo, róseo-avermelhado. Sabor

doce, levemente acidulado. (Figura 1)

De acordo com Garcia et al. (1991), a Punica granatum L. tem sido

largamente empregada pela população como uma droga adstringente,

antihelmíntica, antidiarréica, antiinflamatória e antibacteriana.

Tendo em vista, a existência de poucas pesquisas relacionadas à ação

antibacteriana, in vivo, da Punica granatum L., consideramos que o estudo da

eficiência do extrato hidroalcóolico da romã sobre a placa dentária supragengival de

pacientes portadores de aparelhagem ortodôntica fixa é de extrema importância.

- 15 -

FIGURA 1 – Punica granatum L., mostrando detalhes das flores da

planta. (www.kuebelgarten.de/.../punica_granatum_nana.jpg)

O controle químico tem sido utilizado como um método alternativo ou

coadjuvante no controle mecânico da placa dentária. Com o propósito de conhecer o

efeito da Punica granatum L. sobre a placa bacteriana supragengival de pacientes

com aparelhagem ortodôntica fixa, será realizada uma revisão da literatura sobre a

ação antimicrobiana desta planta medicinal, bem como sobre o efeito antiplaca da

clorhexidina, visto que a mesma será utilizada como controle positivo neste estudo.

1.1 A placa bacteriana associada ao uso de aparelho ortodôntico fixo

Muitos termos têm sido utilizados para classificar os depósitos orgânicos

que se formam sobre a superfície dos dentes. Listgarten (1976), estabeleceu

algumas definições para estes depósitos:

• Restos alimentares – este material consiste de resíduos de alimentos

aderidos aos dentes e geralmente está presente, apenas transitoriamente

entre as refeições.

- 16 -

• Matéria Alba – material de consistência mole e branca, que pode ser

removido por um jato de água.

• Película adquirida – é uma biopelícula fina formada através das proteínas

salivares. Diferentemente da placa bacteriana, as bactérias não são

necessárias para a formação da película.

• Cálculo Dentário – material de consistência dura, resultante da

mineralização da placa bacteriana.

• Placa Bacteriana – massa bacteriana transparente, que se encontra

aderida, firmemente, às superfícies dentárias.A placa bacteriana localizada

dentro do sulco gengival e/ou bolsa periodontal é denominada de “placa

subgengival”, e a que se encontra acima da margem da gengiva é

chamada de “placa supragengival”.

Gibbons e Banghart (1967), conceituaram placa bacteriana como uma

massa densa não calcificada que se encontra aderida, firmemente, às superfícies

dentais.De acordo com Krembel, Frank e Deluzarche (1969) a placa contém cerca

de 80% de água e 20% de sólidos. As proteínas são os principais componentes, 40

a 50% do peso seco da placa; os carboidratos contribuem em 13 a 18% e os

lipídeos em 10 a 14%. O conteúdo inorgânico da placa depende tanto da sua

localização, quanto da sua idade. A placa contém cálcio, fosfato e flúor em maiores

concentrações que a saliva (Birkeland e Charlton, 1976).

Alguns fatores, tais como superfícies dentárias rugosas, lesões de cárie,

falhas em margens de restaurações e irregularidades no posicionamento dos dentes,

influenciam tanto a velocidade de desenvolvimento da placa, como a quantidade de

placa formada (Bibby, 1970). Porém, mesmo na ausência de tais condições, a placa

se desenvolverá sobre os dentes de pessoas que cessem o uso dos métodos de

higiene bucal.

Bergenholtz (1972) verificou que os eventos envolvidos com a formação

da placa, especialmente sobre superfícies de esmalte limpo, são resultados de

análises seqüenciais tanto morfológicas quanto microbiológicas. Esses eventos

podem ser considerados em três fases: 1) colonização inicial; 2) crescimento

bacteriano rápido e 3) remodelagem. Na realidade, existem mudanças graduais e

não fortemente definidas nas fases progressivas.

A colonização inicial ocorre durante as primeiras oito horas após uma

superfície dentária ter sido limpa e envolver a deposição de bactérias derivadas da

- 17 -

saliva ou das superfícies mucosas vestibular ou linguais adjacentes ao dente. Esse

processo é rápido e seletivo, com a adsorção de diferentes espécies bacterianas

(Gibbons e Van Houte, 1975). A fase de remodelagem da placa aparece depois de

mais ou menos dois dias e continua indefinidamente, porque a massa bacteriana

não é uma entidade estática. Os Streptococcus, Neisseria e Actinomyces

predominam inicialmente na placa. Em seguida há o predomínio de uma flora mais

anaeróbica, como Veillonella e Fusobacterium (Tonzetich, 1977).

A placa supragengival contém principalmente microorganismos aeróbios

facultativos gram-positivos. As espécies gram-positivas regularmente encontradas

incluem o Streptococcus sanguis, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Rothia

dentocariosa, Actinomyces israelli, Actinomyces naeslundii, Actinomyces viscosus,

espécies Peptostreptococcus e Staphylococcus epidermidis. As espécies gram-

negativas encontradas incluem a Veillonella alcalescens, Veillonella parvula,

Fusobacteria e Bacteróides oralis (Thomson et al., 1980). Para Sanz e Newman

(1997) a placa “madura” ou associada à gengivite é composta basicamente por

espécies de Streptococcus, Actinomyces, Fusobacterium, Veilonella, Eikenella e

espiroquetas.

Loesche (1976), reconheceu três tipos de placa bacteriana: placa

associada à ausência de doença (rica em Streptococcus sanguis), outra associada à

cárie, com predominância de Streptococcus mutans e Lactobacillus, e uma terceira

associada à doença periodontal com elevadas proporções de microorganismos

anaeróbios gram-negativos.

Socransky (1976) afirma que independente da idade da placa e da dieta

prévia, os microorganismos predominantes são cocos gram-positivos do gênero

Streptococcus, os quais constituem cerca de 50% do total das unidades formadoras

de colônias (UFC/ml) e que são recuperáveis da placa jovem. Estes estreptococos

encontram-se divididos em vários grupos baseados em sua morfologia colonial .

Os aparelhos ortodônticos são classificados como um dos fatores locais

responsáveis pelo desenvolvimento da doença periodontal. A presença do aparelho

ortodôntico altera o controle da higiene oral, provocando um aumento nos índices

gengival e de placa dental, favorecendo o aparecimento da hiperplasia gengival

(Lascala e Moussalli,1999).

Estudando os efeitos do uso do aparelho ortodôntico fixo sobre o meio

bucal, Tosello (1977) constatou que havia maior índice de gengivite, maior formação

- 18 -

de placa bacteriana e uma queda no pH da saliva e verificou que a presença do

aparelho é um fator de alteração do meio bucal, pois ele modifica as características,

físicas e biológicas da placa bacteriana, ocasionando aumentos significativos na

quantidade de bactérias principalmente os lactobacilos e os estreptococcos.

Zachrisson (1977) confirma que o acúmulo de placa bacteriana sobre as superfícies

dentais aumenta em pacientes submetidos à terapia ortodôntica fixa.

Parreira e Novaes (1977) ao realizarem um estudo de evidenciação de

placa bacteriana, na Clínica Ortodôntica da Faculdade de Odontologia da UFMG,

em pacientes portadores de aparelhos ortodônticos fixos, obtiveram uma média de

54% na incidência de placa dental e afirmaram que deve ser realizada uma

avaliação periódica da higiene oral nesses pacientes. Segundo Zachrisson (1978),

apesar de uma boa higiene, a maioria dos indivíduos desenvolveu gengivite

hiperplásica generalizada, um a dois meses após a instalação do aparelho

ortodôntico fixo.

Uetanabaro et al.(1984) ao pesquisarem o acúmulo de placa bacteriana

tanto nos dentes com bandas metálicas quanto naqueles com bráquetes, concluíram

que o acúmulo de placa pode ser diminuído, submetendo-se os pacientes, antes e

durante a terapia ortodôntica, a um rigoroso programa de higiene bucal e controle de

placa bacteriana.

Embora o controle da placa bacteriana através dos recursos mecânicos

seja suficiente para prevenir a doença periodontal, Nakae et al. (1986) afirmam que

a busca por substâncias químicas capazes de eliminar ou controlar a placa

bacteriana, sem induzir a um desequilíbrio na microbiota bucal, é a grande meta da

Odontologia.

Lundstrom e Krasse (1987) afirmam que a colocação de aparelho

ortodôntico fixo resulta num aumento do número de Streptococcus mutans. Já

Husser et al.(1990) mostraram um aumento crescente na porcentagem de

espiroquetas filamentosas e fusiformes e um aumento significante no índice de placa

e sangramento nos dentes bandados em comparação com o grupo controle.

Ghersel e Ghersel (1990) realizaram um estudo para avaliar o índice de

placa bacteriana em 50 pacientes portadores de aparelho ortodôntico fixo verificaram

um aumento significativo nos índices de placa destes pacientes, sugerindo a

tendência de um maior acúmulo de placa após a instalação de aparelhos fixos, bem

- 19 -

como um aumento proporcional de pH, carboidratos e população de Streptococcus e

Lactobacillus .

Gehlen et al.(2000) ao estudarem o efeito do bochecho de clorhexidina a

0,12% sobre a microbiota bucal em doze adolescentes portadores de aparelho

ortodôntico, constataram que houve um aumento significativo no número de

bactérias/ml no grupo controle (bochecho com flúor), e diminuição significativa no

grupo teste (clorhexidina). O estudo foi realizado com dois períodos teste de 48

horas, com intervalo de cinco dias. Foram coletadas amostras de placa

supragengival.

1.2 A utilização da clorhexidina no controle químico da placa bacteriana

“O controle químico da placa bacteriana tem como objetivos: inibir o

desenvolvimento da placa bacteriana e da colonização bacteriana na superfície

dental; eliminar a placa dental existente e promover alteração da placa patogênica

para não patogênica.” (LOE, 1978 apud LANG e BRECK ,1986).

Vários agentes antimicrobianos têm sido efetivos como coadjuvantes no

controle mecânico da placa bacteriana. Cury (1997) descreve os principais agentes

químicos para o controle da placa dentária : moléculas orgânicas catiônicas

(Clorhexidina), alcalóides de plantas de várias espécies tais como, Sanguinarina

canadensis, compostos quaternários de amônia (Cloreto de Cetilpiridínio),

compostos metálicos (Fluoreto estanhoso, Sais de zinco), compostos fenólicos não-

carregados (Triclosan, Óleos essenciais), peróxidos e antibióticos.

O triclosan é um agente antimicrobiano não-iônico de amplo espectro de

atividade contra bactérias gram-positivas (S. mutans, S. sanguis e S. salivarius) e

gram-negativas (Walker et al. , 1994). Apresenta baixa toxicidade e não provoca

desequilíbrio na microflora da cavidade bucal. Este agente possui baixa

substantividade devendo ser combinado com produtos que aumentem o seu tempo

de retenção. A adição de um copolímero de polivinilmetil éter e ácido maléico

(gantrez) aos dentifrícios contendo triclosan e flúor aumentou grandemente a sua

biodisponibilidade (Nabi et al.,1989). Saxton (1986) utilizou uma combinação de 1%

de citrato de zinco e 0,5% de triclosan em indivíduos que se abstiveram da

higienização bucal por 4 dias. A combinação aumentou a capacidade de inibição em

- 20 -

50% comparada a cada um dos componentes usados separadamente (Saxton,

1986).

O zinco pode reduzir a colonização bacteriana e a subsequente maturação

da placa pela modificação das propriedades da superfície celular das bactérias. Uma

grande atuação do zinco tem sido proposta como tendo ele a capacidade inibir o

metabolismo da glicose pelo S. mutans, S. sanguis e Actinomyces naeslundii

(Cummins e Watson, 1989).

Os óleos essenciais são compostos fenólicos que agem inespecificamente

sobre as bactérias, não havendo o desequilíbrio da microbiota bucal e nem a

proliferação de microorganismos oportunistas (Hancock e Newell, 1994). Na

Odontologia, o produto comercial Listerine contém composto isolado de óleos

essenciais tais como, mentol, timol, metil-salicilato e eucaliptol num veículo

hidroalcoólico. Estudos demonstraram que a aplicação de Listerine através de

bochechos, duas vezes ao dia, por trinta segundos, promoveu uma redução da

placa bacteriana em 20 a 34% e da gengivite em torno de 28 a 34% (Mandel, 1994).

O fluoreto estanhoso é um antimicrobiano que age ligando-se à membrana

celular, alterando o metabolismo e diminuindo a adesão bacteriana, sendo mais

efetivo que o fluoreto de sódio na prevenção de cáries, por apresentar um efeito

antibacteriano adicional, havendo eliminação seletiva dos S. mutans e inibição da

produção de ácidos (Rolla e Ellingsen, 1994).

O cloreto de cetilpiridínio é um composto amônio quaternário, que age

provocando um aumento da permeabilidade celular e um rompimento da parede

bacteriana. Apresenta as desvantagens de rápida liberação dos sítios de ligação,

neutralização por ânions e de proporcionar aumento no conteúdo de cálcio e fósforo

da placa bacteriana (Kozlovsky, 1994). Está disponível comercialmente para

bochechos em concentrações de 0,05% ou 0,1%, e quando utilizado a 0,5% reduz a

formação de placa bacteriana em 20 a 30% (Mendes et al., 1995).

Os agentes oxigenantes, como os peróxidos e os perboratos, atuam nos

microorganismos anaeróbios da cavidade bucal. O uso prolongado pode causar

desequilíbrios na microbiota bucal, sendo seu uso recomendado em situações

específicas e por um tempo limitado, em casos de GUNA (gengivite úlcero

necrosante aguda) e pericoronarite (Mandel, 1994).

A clorhexidina, é um bisguanídio catiônico, disponível na forma de sais de

gluconato, digluconato ou acetato, sendo o digluconato o mais indicado, pois tem

- 21 -

maior solubilidade em água e em pH fisiológico dissocia-se liberando o componente

catiônico (Mendes et al. 1995). Dentre as propriedades de um agente químico ideal

para o controle da placa, a clorhexidina é a substância que tem apresentado as

melhores características devido às seguintes propriedades: substantividade,

estabilidade, segurança e eficácia (Lang, 1992). Apresenta ação contra bactérias

Gram-positivas, Gram-negativas e fungos (Heasman e Seymour, 1994). (Figura 2)

A clorhexidina age através da interação eletrostática de suas cargas

positivas com as negativas da parede celular bacteriana, ocorrendo a ruptura da

mesma, precipitando o citoplasma e causando a morte da bactéria (Carvalho et

al.,1991). Denton (1991) acrescentou que os níveis de clorhexidina necessários para

exercer efeito bactericida variam conforme a espécie bacteriana. Segundo Van

Grusven e Cardoso (1995) em altas concentrações (100 ppm, durante a aplicação),

a clorhexidina é bactericida e, em baixas concentrações (até 0,1 ppm durante a

liberação pelos sítios receptores) é bacteriostática . Estes autores acrescentam que

a clorhexidina por apresentar forte afinidade pela parede celular dos

microorganismos, hidroxiapatita, placa bacteriana, proteínas salivares e mucosa

bucal, tem uma alta substantividade (propriedade que um determinado agente

químico tem de aderir-se à superfícies teciduais e então ser liberado gradualmente

na cavidade oral).

Os testes de segurança em relação aos efeitos agudos e crônicos da

clorhexidina mostram níveis baixos de toxicidade local e sistêmica e ausência de

alterações teratogênicas. Caso a clorhexidina seja ingerida, é pouco absorvida

sendo a maior parte excretada nas fezes. A pequena quantidade que pode ser

absorvida é metabolizada no fígado e rins (Neidle e Yagiela, 1991).

A eficácia da clorhexidina em reduzir significantemente a placa e a

gengivite (comparada a placebos) quando usada duas vezes ao dia como um

suplemento da escovação , foi comprovada por Mandel (1994). Utilizando duas

concentrações diferentes, uma com 0,2% e outra com 0,12% de clorhexidina, houve

uma redução de placa na faixa de 50 a 55% e de gengivite ao redor de 45% para

ambas as concentrações. A solução a 0,12% é mais indicada, pois esta

concentração diminui os riscos de efeitos adversos, bem como mantém a eficácia

contra os microorganismos. A clorhexidina a 0,12% em álcool 11,6% e com um pH

de 5,5, tem sido aceita pela American Dental Association (ADA) e Food and Drug

Administration (FDA) em bases de prescrição sob monitoramento profissional. O

- 22 -

uso recomendado é bochechar 15 ml duas vezes ao dia como um coadjuvante da

escovação. Uma técnica adicional é deixar um intervalo de pelo menos 30 minutos

entre a escovação e o bochecho devido a ocorrência de uma interação entre o lauril-

sulfato de sódio (SLS), um detergente aniônico de dentifrícios comuns, e

clorhexidina catiônica (Ursi et al., 1997).

FIGURA 2 – Gluconato de Clorhexidina (PM 505.45) - DL-50 = 22mg/kg

(intravenosa) e 1800mg/kg (via oral) em camundongos.

Emilson (1977) avaliou in vitro a sensibilidade antimicrobiana de vários

microorganismos a clorhexidina. Foram obtidas 133 cepas de 21 espécies de

microorganismos coletados da placa supragengival e saliva. A CIM foi obtida pelo

teste de difusão em agar, utilizando-se discos de clorhexidina e análise de formação

de halos de inibição no meio. Baixos valores da CIM foram encontrados para

espécies de estafilocococos, S. mutans, S. salivarius e E. coli. No entanto, cepas de

Proteus sp., Pseudomonas sp. e Klebsiella apresentaram menor sensibilidade à

substância.

- 23 -

Foi demonstrado que bochechos com clorhexidina a 0,12% duas vezes

por dia durante um período teste de 2 anos reduziram significativamente a

quantidade total de bactérias por dente (anaeróbios totais). Populações

microbiológicas individuais, como os gram-positivos (Estreptococcos e Actinomyces)

e gram-negativos (Veilonella e Fusobactéria), também foram reduzidas. (Briner et al.,

1989)

A análise da eficácia clínica de bochechos com clorhexidina a 0,12%

durante 2 anos, mostrou uma redução da placa dentária supragengival da ordem de

35%, em relação a um grupo controle. (Banting et al., 1989)

Trinta cepas de Candida albicans, isoladas da cavidade bucal, foram

testadas quanto à sensibilidade ao cloreto de cetilpiridíneo , a uma formulação de

malva e ao digluconato de clorhexidina (Candido et al. ,1996). A clorhexidina

mostrou-se o agente mais eficaz, inibindo todas as cepas de leveduras na

concentração de 6,4µg/ml. Nesta mesma concentração, malva e cloreto de

cetipiridíneo inibiram respectivamente 30% e 0% das cepas.

Rivera e Cavieres (1998), ao avaliarem a efetividade do digluconato de

clorhexidina em solução para bochecho a 0,1 e 0,2% no controle da placa bacteriana

e inflamação gengival de pacientes sob tratamento ortodôntico, relataram que em

ambas as concentrações , houve uma significante redução da placa dental e

gengivite.

Do mesmo modo, Matos, Viana e Pitta (2003), ao analisarem os índices de

placa e gengival de pacientes com acessórios ortodônticos (grupos de dentes de

acordo com o acessório ortodôntico empregado), assim como o efeito do controle

mecânico e químico da placa dentária, revelaram que o grupo, representado pela

clorhexidina, promoveu uma maior redução dos índices de placa e gengival, quando

comparado com o grupo de controle mecânico.

1.3 A utilização de substâncias naturais sobre afecções da cavidade bucal

Lee et al. (1986) ao avaliarem o efeito do chá verde e preto, comparado ao

do flúor, na prevenção da cárie em ratos, constataram que os chás verde e preto

reduziram a incidência de cárie em dentina.

- 24 -

Willershausen, Gruber e Hamm (1994) ao realizarem um estudo com

estudantes de Odontologia, utilizando um creme dental a base de plantas das

espécies, Echinacea angustifolia, Salvia officinalis L., Commiphora myrrha,

Krammeria triantra e Matricaria chamomilla L., junto com óleo de Mentha piperita L.,

associado a um enxagüatório bucal contendo os mesmos ingredientes herbais do

creme dental, observaram uma redução do índice de placa de 40,85 para 23,9%.

Com o propósito de analisarem a redução do índice de placa bacteriana,

Simões et al. (1995) submeteram 30 crianças a escovação dentária supervisionada

utilizando o pó de Juá individualmente ou associado a um creme dental. Os

resultados mostraram que o pó de Juá (utilizado individualmente) ou associado ao

creme dental, seguramente age na redução do índice de placa bacteriana.

Em um estudo in vitro da ação antimicrobiana das tinturas de Malva

sylvestris L., Salvia officinalis L., Matricaria chamomilla L., Thymus vulgaris L.,

Theobroma cacau e própolis sobre o Streptococcus mutans e Streptococcus

sobrinus, Gebara et al. (1996) sugerem a possibilidade de emprego destas

substâncias no controle destes microorganismos da placa dentária.

Foi realizada a análise das propriedades antibacterianas da própolis

etanólica a 29% e do mel contra bactérias orais in vitro e in vivo. No estudo in vivo o

mel promoveu uma redução de 60% na contagem bacteriana total e de 58% na

contagem de Streptococcus mutans, enquanto a própolis promoveu uma redução

de 38% na contagem bacteriana total e de 42% na contagem de Streptococcus

mutans (Steinberg, Kaine e Gedalia ,1996).

Kakiuchi et al. (1996) demonstraram o mecanismo de ação de algumas

plantas utilizadas na medicina popular, tais como Galha rhois, Paeoniae rubrae R.,

Uvae ursi F. e Punica granatum L., sobre os Streptococcus mutans. Estas espécies

produzem um efeito inibitório que interfere na síntese do glucano pela enzima

glucosiltransferase, produzido pelo S. mutans que, conseqüentemente, irá intervir no

mecanismo de aderência deste microorganismo sobre as superficies dos dentes.

Filho et al. (1998) realizaram a preparação e a análise clínica de um anti-

séptico bucal à base do óleo essencial de Lippia sidoides Cham. (Alecrim pimenta).

O óleo essencial das folhas de Lippia sidoides Cham foi obtido por destilação com

arraste de vapor de água e a análise revelou 66% de timol em sua composição. O

estudo foi conduzido em 20 voluntários, divididos em dois grupos, onde 10 destes

fizeram uso exclusivo deste anti-séptico bucal por 7 dias, não sendo permitido

- 25 -

durante este período realizar escovação ou qualquer outro tipo higienização bucal.

Os outros 10 voluntários, fizeram uso de uma solução placebo, seguindo as mesmas

instruções do grupo anterior. O anti-séptico bucal à base de Lippia sidoides reduziu

em 6% a placa bacteriana nos indivíduos avaliados. Com o grupo que utilizou a

solução placebo, houve um aumento da placa bacteriana na ordem de 12%.

Celeste et al. (1998) ao realizarem uma pesquisa sobre a ação do extrato

da Sálvia officinalis na placa dental e gengivite, demonstraram uma redução

significante dos índices de placa. Enquanto um outro estudo (Azevedo et al. 1999)

avaliou a diluição inibitória mínima de um produto comercial à base de própolis e do

Periogard (gluconato de clorhexidina a 0,12%) frente a microorganismos do gênero

Cândida presentes na cavidade oral. Os resultados indicaram a possibilidade de

utilizar estes anti-sépticos na prevenção e tratamento da candidíase oral.

Em um estudo pré-clínico e clínico das ações antiinflamatória e analgésica

do Eupatorium laevigatum (planta silvestre muito comum no Cerrado brasileiro), em

pacientes com estomatite ulcerada simples (tipo mais comum de aftas), Filho (2000)

verificou que esta espécie demontrou completa resolução das úlceras em 40%

destes pacientes e alívio da dor em 70% deles.

As propriedades antiinflamatórias e antibacterianas do Aloe Vera foram

avaliadas sob a forma de um enxagüatório bucal (concentração 50% de gel de Aloe

Vera) na redução da placa bacteriana e da inflamação gengival. Foi observada uma

redução significativa nos índices de placa e gengival no grupo experimental tratado

com Aloe Vera. (Villalobos, et. al., 2001)

Lucas e Lucas (2001) demonstraram in vitro a ação de diferentes

dentifrícios sobre os Streptococcus mutans, Streptococcus sanguis e Lactobacilus

acidofilus. Neste experimento um dos dentifrícios avaliados continha a sanguinarina

que é um alcalóide extraído da planta Sanguinarina canadensis. Foi demonstrado

nesta pesquisa, que esta planta apresentou atividade antibacteriana frente aos três

microorganismos testados.

Em um estudo in situ, sobre a ação da própolis de Apis mellifera no

desenvolvimento da cárie dentária e na formação do biofilme dental, os resultados

revelaram que a própolis atua sobre o biofilme dental, diminuindo a população dos

microoganismos avaliados e reduz a perda mineral na lesão de cárie de esmalte

(Zárate, 2003).

- 26 -

Limsong et al. (2004) ao investigarem o efeito inibitório dos extratos de

Andrographus paniculata, Cassia alata, Camellia sinensis, Psidium guajava,

Harisonia perforata e Streblus asper sobre a aderência do Streptococcus mutans in

vitro, encontraram que todos estes extratos, exceto o de Streblus asper, mostraram

significante efeito inibitório na aderência do S. mutans á superficie do esmalte.

1.3.1. Atividades farmacológicas da Punica granatum L.

A espécie P. granatum pertence à família Punicaceae e é uma planta

originária da Ásia. Dentre os constituintes presentes no fruto estão os alcalóides

(peletierina, metilpeletierina, pseudopeletierina e isopeletierina), manita, vários

fenóis, ácidos elágico e ácido gálico. A casca da romã contém aproximadamente

20% de taninos, incluindo punicalina, punicalagina, granatinas A e B,

galagildilactona, casuarinina, pedunculagina, telimagrandina I e corilagina (Fetrow e

Ávila ,2000) . El-Toumy e Rauwald (2003) isolaram de P. granatum, dois novos

ácidos elagicos ramnosídeos, ácido metilelágico-3-O ramnopiranosídeo 4-O-αL e

ácido dimetilelágico 3,4’-O ramnopiranosídeo 4 -O-αL. (Figura 3)

Segura et al. (1990) avaliaram a atividade biológica de alcalóides e taninos

extraídos de raízes de Punica granatum contra linhagens de Entamoeba histolytica e

E. invadens. Os alcalóides na concentração de 1 mg/ml não demonstraram atividade

amebicida, entretanto taninos na concentração de 10 µg/ml para E. histolytica e 100

µg/ml para E. invadens, promoveram uma inibição do crescimento destes

microrganismos em cerca de 100%.

- 27 -

FIGURA 3 – Casca e sementes de P. granatum.

(www.floridata.com/ref/p/puni_gra.cfm)

Guevara, Chumpitaz e Valencia (1994) avaliaram a ação das plantas

Cichorium intybus, Althaea officinalis, Psorela glandulosa, Geranium maculatum,

Punica granatum, Malus sativa, Cydonia oblonga, Chenopodium ambrosoides,

Krameria triandria, Tea chinensis, Daucus carota, Persea gratissima, Psidium

guayaba e Lippia dulcis, usadas no tratamento popular da diarréia pela população

peruana foram testadas quanto ao efeito in vitro contra o Vibrio cholerae 01. Dentre

estas plantas a decocção e o chá de Punica granatum, apresentaram o melhor efeito

bactericida, sendo sugerido o uso destes no controle do cólera. Por outro lado, Das

et al. (1999) utilizando extrato metanólico de sementes P. granatum testaram o

potencial terapêutico deste extrato como antidiarréico em ratos. Os resultados do

estudo estabeleceram a eficácia do extrato de P. granatum como um agente

antidiarréico.

Tripathi e Singh (2000) observaram a atividade moluscicida de P.

granatum e Canna indica contra o molusco Lymnaea acuminata. O extrato etanólico

de P. granatum (24h LC

: 22.42 mg/l), foi mais efetivo do que o de C. indica (24h

: 55.65 mg/l) na eliminação destes moluscos.

- 28 -

Outras atividades biológicas são também atribuídas a P. granatum. Assim,

Das et al., (2001) investigaram a atividade hipoglicêmica de extratos de semente de

Punica granatum Linn. (Família Punicaceae) em ratos com diabete induzida pela

estreptozotocina (STZ). Os resultados do estudo comprovaram que o extrato

promoveu uma redução significante nos níveis de glicose sangüínea.

Um outro estudo preliminar acerca da atividade imunomodulatória de

romã, demonstrou que o pó da casca de Punica granatum em doses orais de 100

mg/kg como suspensão aquosa, apresenta atividade estimulante para os

componentes humoral e celular do sistema imune em coelhos (Gracious,

Selvasubramanian e Jayasundar, 2001).

No Brasil, a romã e suas partes (folhas, casca de caule e frutos), são

usadas no tratamento de infecções de garganta, rouquidão e febre, e como anti-

séptico e antiviral em processos inflamatórios da mucosa oral e contra herpes

genital. Por sua vez, o suco apresenta-se benéfico no tratamento da lepra. Além

disso, a casca do caule é também usada como vermífugo (Matos, 2002).

Aviram et al. (2002) estudaram o efeito dos polifenóis presentes no suco

de romã em inibir a oxidação do LDL (lipoproteína de baixa densidade), e a

formação celular de macrófagos e arteriosclerose. Os polifenóis de romã podem

proteger o LDL contra a oxidação celular mediada via dois modelos, interação direta

de polifenóis com a lipoproteína e/ou como efeito indireto através da acumulação de

polifenóis em macrófagos arteriais. Os autores concluíram que a acumulação de

polifenóis de romã em macrófagos arteriais reduziu a oxidação do LDL e que em

uma dieta suplementada com suco de romã ocorreu inibição significativa de lesões

arterioscleróticas, possivelmente devido ao seu efeito antioxidativo e antiaterogênico.

Singh et al. (2002) avaliaram frações ricas em antioxidantes extraídas de

cascas de romã e sementes (Punica granatum), usando etil acetato, metanol e água.

Os extratos foram testados quanto ao seu poder antioxidante usando vários modelos

in vitro. O extrato metanólico da casca de romã apresentou a melhor atividade

antioxidante. Devido a isto os autores abrem o precedente para estudos futuros

explorando a possível aplicação dos extratos para a preservação de produtos

alimentares, bem como seu uso como suplemento vitamínico. Em um outro estudo

Noda et al. (2002) comprovaram que as antocianidinas (delfinidina, cianidina e

pelargonidina) presentes no extrato de romã (Punica granatum L.) apresentam

atividade antioxidante .

- 29 -

Chidambara, Jayaprakasha e Singh (2002) afirmam que o Extrato de

cascas de romã (Punica granatum) possui significante atividade antioxidante em

vários modelos in vitro. Realizando um estudo in vivo, avaliaram o efeito

hepatoprotetor do extrato da casca da romã contra os efeitos tóxicos de CCl4

(tetracloreto de carbono), analisando cortes histopatológicos de fígado. Os autores

observaram que o extrato de romã apresentou um efeito protetor, restaurando a

arquitetura hepática normal. Segundo Cerda et al. (2003), a punicalagina é o

composto responsável pela alta atividade antioxidante da P. granatum. Ao

realizarem um estudo sobre a biodisponibilidade e metabolismo da punicalagina em

ratos, estes autores observaram que apenas 3-6% da punicalagina ingerida foi

detectada como metabolitos na urina e fezes, entretanto a maioria dos elagitaninos

foram convertidos em metabólitos indetectáveis.

Um trabalho recente investigou a possível ação quimiopreventiva do óleo

de romã para o câncer de pele (Hora et al., 2003). O óleo de romã mostrou um

decréscimo significante na incidência de tumores de pele, sendo considerado um

efetivo agente quimiopreventivo contra o câncer de pele. Em outros estudos, Kawaii

e Lansky (2004) estudaram a atividade de extratos de P. granatum na promoção da

diferenciação em células leucêmicas humanas HL-60 promielociticas. Frações de

polifenóis de P. granatum ricas em flavonóides exercem ação antiproliferativa, anti-

invasiva, anti-eicosanoide e pró-apoptótica em células cancerígenas de mama e

próstata e atividade anti-angiogênica in vitro e in vivo. Os extratos proporcionaram

efeitos inibitórios sobre a proliferação de células HL-60.

Em uma análise da ação do óleo de sementes de romã, contendo 70% cis

(2004), demonstraram que o óleo de romã pode suprimir a carcinogênese química

induzida pelo azoximetano (AMO) em ratos, devido ao aumento de CAL.

Mori-Okamoto et al. (2004) afirmaram que a romã contém estrógenos

(estradiol, estrona e estriol) e apresenta atividade estrogênica em ratos. Estes

autores, avaliaram o efeito do extrato de romã na síndrome menopausal

experimental em ratos ovariectomizados, observando que a romã é clinicamente

efetiva no estado de depressão e da perda óssea na síndrome menopausal.

- 30 -

2. OBJETIVOS

Com base nas considerações expostas anteriormente, este estudo

utilizou voluntários portadores de aparatologia ortodôntica fixa para:

• Avaliar o efeito do extrato hidroalcóolico (EHA) de Punica granatum L. sobre

a placa bacteriana supragengival dos voluntários, utilizando grupos teste

(tratado com EHA), controle positivo (gluconato de clorhexidina a 0,12%) e um

grupo controle negativo (água destilada). A eficácia do EHA foi avaliada

através da contagem do número de unidades formadoras de colônias

(UFC/ml) presentes na placa dentária.

• Determinar a concentração inibitória mínima (CIM) e a duração do efeito

antimicrobiano do EHA sobre os microorganismos da placa bacteriana.

• Verificar a atividade antimicrobiana in vitro do EHA e da clorhexidina sobre 14

linhagens bacterianas e 1 linhagem de levedura do Banco de Microorganimos

da Faculdade de Medicina de Juazeiro – FMJ.

• Verificar a atividade antimicrobiana in vitro do EHA sobre a linhagem de

levedura Cândida albicans, do Banco de Microorganismos da Faculdade de

Medicina de Juazeiro-FMJ.

• Determinar a CIM de quatro linhagens sensíveis ao EHA : S.

-hemolyticus,

S. aureus, P. aeruginosa e C. albicans.

- 31 -

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Material

Transporte da placa dentária

• Solução tampão PBS

• Caixa isopor com bolsas de gelo

Equipamentos

• Estufa de incubação (Coel, Brasil)

• Fluxo laminar (Quimis, Brasil)

• Placa aquecedora (Quimis, Brasil)

• Balança analítica (Gehaka AG 200, Germany)

• Agitador de tubos – Vortex (Quimis, Brasil)

• Bico de Bunsen

• Microscópio óptico fotobinocular (Taimim, Brasil)

• Autoclave (Quimis, Brasil)

• Geladeira Duplex (Brastemp , Brasil)

• Pipetas automáticas (5-40µl ; 40-200µl ; 200-1000µl) – (Kacil, Brasil)

Microorganismos

Linhagens bacterianas

• Gram-negativos: Shiguella flexineri, Salmonella thiphinurum, Pseudomonas

aeruginosa, Pseudomonas sp, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris,

Providencia alcalifaciens, Alcaligens, E. coli.

• Gram-positivos: Staphylococcus aureus, Staphyococcus epidermidis,

Staphylococcus

-hemolyticus, Streptococcus

-hemolyticus.

Linhagem de levedura

• Candida albicans (ATCC – 007)

- 32 -

Material de consumo

• Meios de cultura:

* BHI Caldo e BHI Agar (Acumedia)

• Extrato hidroalcóolico de Punica granatum

• Gluconato de clorhexidina a 0,12%

• Água destilada estéril

• Álcool absoluto

• Solução de cristal violeta

• Solução de lugol

• Solução de safranina

• Água destilada estéril

• Gaze

• Algodão

• Curetas periondontais n° 19 e 20

• Espelhos odontológicos

• Bandejas inox

• Tubos eppendorfs

• Tubos de ensaio

• Estantes para tubos

• Placas de Petri

• Béqueres

• Erlemeyers

• Ponteiras descartáveis para pipetas automáticas

• Alça de Drigauskí

• Alça de platina

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• Caneta marcadora

• Régua

• Lâminas de vidro para microscopia

• Discos de antibióticos comerciais (Cecon)

• Discos de papel de filtro

• Luvas descartáveis

3.2 Metódos

3.2.1 Substâncias utilizadas como controle positivo e negativo

Controle positivo: gluconato de clorhexidina a 0.12%, Periogard, [1,1-bis

hexametileno (5-clorofenil biguanida di-D-gluconato] da Kolynos do Brasil, São

Paulo, Brasil).

Controle negativo: água destilada estéril. A solução de etanol e água

destilada (1:1, v/v), foi submetida ao aquecimento 60°C para evaporação total do

etanol, sendo o volume final restaurado com água destilada estéril.

3.2.2 Obtenção da planta e preparo do Extrato Hidroalcóolico de Punica

granatum L.

Os frutos de P. granatum foram coletados na cidade de Crato, estado do

Ceará, Brasil, e a exsicata da planta esta depositada no Herbário Prisco Bezerra da

Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, Brasil, com o número 33069. (Figura 7)

- 34 -

FIGURA 4 – Frutos de Punica granatum L.

(www.serendipity.gr/photographs/garden%20shots/pomegranate1.jpg)

O extrato foi preparado no Laboratório de Biofisiologia da Faculdade de

Medicina de Juazeiro do Norte (FMJ). Para a obtenção do Extrato de P. granatum,

inicialmente os frutos foram cortados em pedaços pequenos, incluindo casca e

sementes, e pesados. Após a pesagem, foi realizada a trituração em liquidificador

adicionando-se álcool absoluto e água destilada (30:70 v/v) e posteriormente, a

filtragem com algodão. Do material triturado, obtivemos uma suspensão.

Em uma placa aquecida (60°C), colocou-se todo o extrato em um béquer a

fim de que todo o álcool evaporasse, evitando assim a influência desta substância

na possível ação terapêutica do Extrato de P. granatum. Não foram empregadas

substâncias conservantes, aromatizantes ou antifúngicas.

O extrato foi então removido da placa aquecedora a 60°C, acondicionado

em frascos de vidro fosco. Após resfriamento, retirou-se uma alíquota (1 ml), a qual

foi colocada em béquer de 5 ml previamente pesado. O material foi colocado em

estufa (Coel, Brasil) a 80ºC até completa secagem e pesado novamente. Dessa

maneira foi obtido o resíduo sólido em mg/ml (material insolúvel do extrato). A

concentração do extrato obtido para as análises foi de 60 mg/ml.

- 35 -

Este extrato de P. granatum (EHA) foi utilizado para a realização dos

bochechos supervisionados de acordo com a metodologia do experimento, para

determinar a sua curva de tempo, e a sua CIM, ou seja, a menor concentração

capaz de inibir o crescimento de microorganismos da placa dentária. O EHA foi

também utilizado para verificar a atividade antimicrobiana in vitro sobre 15 linhagens

patogênicas do Banco de Microorganimos da Faculdade de Medicina de Juazeiro –

FMJ., bem como para determinar a CIM de quatro linhagens sensíveis ao EHA : S.

-hemolitico, S. aureus, P. aeruginosa e C. albicans (ATCC-007). Vale ressaltar que

este extrato foi submetido ao Teste do Fator de Contaminação, onde se espalhou

uma quantidade de extrato (1ml) em placa de Petri com meio “brain heart agar” - BHI

Agar (Acumedia), incubando por 12 horas a 37ºC, a fim de verificarmos a ausência

total de fungos, bactérias ou qualquer outro microorganismo, que interferissem na

qualidade do mesmo.

3.2.3 Avaliação in vitro da atividade antibacteriana e fungicida do Extrato

hidroalcóolico de P. granatum (EHA)e do Gluconato de clorhexidina a 0,12%

Os microoganismos armazenados no Banco da FMJ foram inicialmente

submetidos a um antibiograma, para determinação do perfil de resistência dos

microrganismos a vários antibióticos. Em seguida foram realizados os seguintes

testes: - Avaliação da sensibilidade de linhagens patogênicas do Banco de

Microorganismos frente ao EHA e a clorhexidina; - Análise da atividade

antimicrobiana do EHA sobre a microbiota da placa dental e Determinação da

Concentração Inibitória Mínima do EHA sobre linhagens patogênicas do Banco de

Microorganismos.

3.2.3.1 Avaliação da resistência bacteriana a antibióticos

Treze linhagens bacterianas (Shiguella flexineri, Salmonella thiphinurum,

Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus

-hemolyticus,

Streptococcus

-hemolyticus, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas sp,

Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Providencia alcalifaciens, Alcaligens, E.

coli), patogênicas isoladas da população do Cariri Cearense e mantidas no Banco de

- 36 -

Microrganismos da Faculdade de Medicina de Juazeiro do Norte - FMJ foram

testadas quanto a sua resistência a antibióticos comerciais através do método de

difusão em disco (Bauer et al, 1966). Foram utilizados vinte antibióticos comerciais

da marca CECON para avaliar o espectro de resistência bacteriana. Os discos

continham 30 µg de cada antibiótico. (tabela 1)

As linhagens bacterianas foram renovadas em tubos de ensaio contendo

meio de cultura BHI caldo por 12 h a 37ºC. Em seguida, espalhou-se um volume de

100 µL de cultura bacteriana, em placas de Petri previamente contendo meio de

cultura BHI Agar. Após a secagem das linhagens bacterianas, os discos de

antibióticos foram colocados nas placas, as quais foram incubadas a 37ºC em estufa

e o crescimento bacteriano foi verificado após 24 horas. O controle foi elaborado na

ausência de antibióticos. Os resultados foram mensurados através da medida do

halo. As linhagens que apresentaram um halo ≥ 19 mm foram consideradas

sensíveis e as resistentes apresentaram um halo ≤ 15 mm. Todos os procedimentos

foram realizados na câmara de fluxo laminar (Quimis).

TABELA 1 – Antibióticos utilizados no antibiograma.

Classe de antibióticos Antibióticos

penicilinas ampicilina (AMP), amoxacilina (AX), amoxicilina (AMO)

β-lactâmicos

cefalosporinas

1° geração - cefalotina (CFL), cefadroxil (CA)

2° geração - cefaclor (CFC), cefuroxima (CRX 30)

3 geração - ceftriaxona (CRO), cefotaxima (CTX 30),

ceftazidima (CAZ)

β-lactâmicos especiais

imipenem (IM) aztreonam (AST)

aminoglicosídeos kanamicina (KN) tobramicina (TB) amicacina (AMI 30)

Fluoroquinolona ciprofloxacina (CIP 5)

Cloranfenicol cloranfenicol (CLO)

Tetraciclina tetraciclina (TET)

Glicopeptídeos vancomicina (VAN 30)

Sulfa sulfametrim (SZT 25)

- 37 -

3.2.3.2 Teste de sensibilidade de linhagens patogênicas do Banco de Microorganismos

frente ao Extrato hidroalcóolico de P. granatum (EHA) e ao gluconato de clorhexidina a

0,12%.

As bactérias patogênicas e a levedura Candida albicans (ATCC – 007),

que são armazenadas em tubos de ensaio com meio BHI ágar e óleo mineral, no

Banco de Microrganismos, foram renovadas em tubos de ensaio contendo meio de

cultura BHI caldo por 12h a 37ºC. Utilizando-se Placas de Petri contendo 20 ml de

meio de cultura BHI Agar, realizou-se o plaqueamento em superfície em volumes de

250, 500 e 1000 µL (utilizando uma alça de Drigauskí) do Extrato hidroalcóolico de P.

granatum, respectivamente, correspondente às concentrações de 15, 30 e 60 mg/ml.

E volumes de 250, 500 e 1000 µL do gluconato de clorhexidina a 0,12%,

respectivamente, correspondente às concentrações de 0,03, 0,06 e 0,12%.

Em seguida, as placas foram divididas em 6 partes, com o auxílio de uma

régua e de uma caneta marcadora, realizando em cada espaço a estria da bactéria

correspondente, utilizando-se uma alça de platina. A C. albicans não foi testada frente

ao gluconato de clorhexidina. O controle consistiu em placas sem nenhum dos dois

tratamentos. As placas foram montadas em duplicatas e incubadas a 37ºC em estufa

e o crescimento das linhagens foi verificado após 24 horas, para verificação da

atividade antimicrobiana do EHA e/ou do gluconato de clorhexidina. Todos estes

procedimentos foram realizados na câmara de fluxo laminar .

O controle de qualidade do EHA foi realizado utilizando-se placas de Petri

contendo meio BHI Agar e espalhando-se 1000 µl (60 mg/ml) deste extrato (EHA).

Posteriormente, estas placas foram incubadas por 24 horas a 37°C. A ausência de

crescimento microbiano é um fator indicativo de qualidade do extrato. Este

experimento foi realizado em duplicata.

3.2.3.3. Análise da atividade antimicrobiana do Extrato hidroalcóolico de P. granatum

(EHA) , sobre a microbiota da placa bacteriana, utilizando discos de papel de filtro.

A análise da atividade antimicrobiana do Extrato hidroalcóolico de P.

granatum em bactérias isoladas da microbiota bucal dos voluntários, foi realizada de

acordo com o método descrito por PELCZAR et al. (1981). Aleatoriamente foram

selecionados três voluntários para realização do teste. Amostras de 100 µl de

culturas ativas da microbiota bucal foram inoculadas por espalhamento com auxílio

- 38 -

da alça de Drigauski estéril, em placas de Petri contendo meio BHI Ágar. Os discos

de papel de filtro, estéreis e impregnados com o EHA, em concentrações de 60, 30,

12, 6 e 1 mg/ml, foram transferidos para as placas de Petri inoculadas com os

microorganismos. O controle do teste consistiu em discos embebidos em água

destilada estéril. A atividade inibitória do crescimento a 37°C, após 24 horas de

incubação, foi determinada pela medição da zona de inibição (halo inibitório ≥ 7mm).

FIGURA 5 – Fluxo laminar contendo material utilizado na determinação da

Concentração Inibitória Mínima do EHA sobre linhagens patogênicas.

3.2.3.4 Determinação da Concentração Inibitória Mínima do Extrato hidroalcóolico de

Punica granatum L. sobre linhagens patogênicas do Banco de Microorganismos.

A concentração inibitória mínima (CIM) é importante para determinar o

grau de atividade de um agente antimicrobiano contra determinados patógenos e

pode ser definida como a menor concentração do agente necessária para inibir o

crescimento bacteriano.

- 39 -

A levedura Candida albicans e as linhagens bacterianas que se mostraram

sensíveis ao Extrato hidroalcóolico de P. granatum foram selecionadas para

determinação da concentração inibitória mínima (CIM). Entretanto, dentre as

linhagens bacterianas, escolheu-se aleatoriamente dois representantes de microor -

ganismos Gram positivos e um representante Gram negativo. (Figura 8)

As colônias de Streptococcus

-hemolitico (19), Staphylococcus aureus

(25), Pseudomonas aeruginosa (17) e Candida albicans (ATCC-007) foram

renovadas em BHI caldo e incubadas em estufa a 37º C por 12 horas. Em seguida,

placas de Petri contendo BHI Agar, receberam por plaqueamento em superfície, os

seguintes volumes de Extrato hidroalcóolico de P. granatum: 8, 16, 33, 63, 125, 250,

500 e 1000µl. Posteriormente, 100 µl das suspensões dos microorganismos foram

semeadas nas placas contendo os volumes de EHA descritos acima e em seguida,

estas placas de Petri foram incubadas a 37ºC por 24 horas. Após este período,

realizou-se a contagem do número de UFC/ml para a determinação da CIM do EHA

sobre as linhagens patogênicas. O experimento foi realizado em duplicata. O

controle consistiu de placas de Petri com BHI Agar , sem EHA , contendo somente

as amostras de culturas ativas das bactérias descritas acima e da levedura C.

albicans. (Figura 6)

3.3 Casuística

Este estudo, previamente aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa da

Universidade Federal do Ceará, foi conduzido com 60 voluntários portadores de

aparatologia ortodôntica fixa, recrutados em um consultório odontológico localizado

na Clínica Bárbara de Alencar, na cidade do Crato, estado do Ceará.

A amostra da população estudada foi constituída por voluntários de ambos

os sexos, com idade variando entre 9 e 25 anos, clinicamente saudáveis e sem

relato de antibioticoterapia nos 7 dias que antecederam à coleta da placa bacteriana.

Não houve restrições de grupos étnicos.

Os voluntários foram divididos em três grupos de vinte indivíduos cada.

Grupo teste (I) - bochecho com Extrato hidroalcóolico de Punica granatum (EHA);

Grupo controle positivo (II) - gluconato de clorhexidina a 0,12%; Grupo controle

negativo (III) – água destilada.

- 40 -

FIGURA 6 – Tubos de ensaio com BHI caldo, contendo os

microorganismos utilizados na determinação da concentração inibitória mínima do

Extrato hidroalcóolico de P. granatum sobre estas linhagens.

3.4 Descrição da amostra

No consultório odontológico os voluntários tiveram um esclarecimento

inicial sobre as condições nas quais seriam desenvolvidos os experimentos. Em

seguida, os voluntários e/ou responsáveis assinaram o Termo de Consentimento,

para a participação no estudo. (Anexo A)

Na avaliação inicial, foi preenchida uma ficha clínica para cada voluntário,

registrando-se os dados pessoais, a história médica, a história buco-dental e a data

do exame. (Anexo B)

a) Descrição do tipo de estudo a ser conduzido

Estudo analítico, prospectivo, intervencional e não-cego, randomizado

bloqueado, no qual os voluntários após a randomização integraram o Grupo I

- 41 -

(Extrato hidroalcóolico de P. granatum), Grupo II (gluconato de clorhexidina a 0,12%)

ou Grupo III (água destilada ). Cada grupo recebeu, sob a forma de bochecho de 1

minuto, com volumes iguais de 15 ml do extrato de romã, do gluconato de

clorhexidina a 0,12% e da água destilada. A placa bacteriana foi coletada antes e

após o bochecho com uma destas três substâncias, conforme randomização. A

randomização bloqueada foi realizada da seguinte maneira: Os três grupos

utilizados no estudo foram o Grupo I, Grupo II e Grupo III, desta forma foi

selecionado dentre os 60 voluntários, seis de cada vez, fazendo-se combinações

entre estes três grupos, da seguinte maneira:

Grupo I

Grupo II

Grupo III

I II III; I III II; II I III ; II III I ; III I II ; III II I.

Estas combinações foram anotadas em papéis, e dobradas a fim de que

os voluntários sorteassem apenas uma delas. Para que não houvesse o risco de

vícios, a cada sorteio, a combinação sorteada era devolvida ao depósito que

continha os papéis, a fim de garantir a randomização deste estudo. O sorteio foi

realizado até que os seis voluntários estivessem agrupados devidamente da

seguinte forma:

• Dois voluntários no Grupo I (Pacientes que sortearam as combinações I II III

ou I III II)

• Dois voluntários no Grupo II (Pacientes que sortearam as combinações II I III

ou II III I)

• Dois voluntários no Grupo III (Pacientes que sortearam as combinações III I II

ou III II I)

Este mesmo procedimento foi realizado dez vezes, tendo em vista que

este estudo estabeleceu uma amostra de 60 voluntários, distribuídos em três grupos

de vinte voluntários.

- 42 -

3.5 Coleta e Processamento da Placa Bacteriana

3.5.1 Avaliação da sensibilidade da microbiota presente na placa bacteriana frente

ao extrato hidroalcóolico de P. granatum, ao gluconato de clorhexidina e à água

destilada (estudo in vivo)

No consultório odontológico foi realizada a coleta de material, ou seja, de

placa bacteriana, para a realização dos testes que avaliaram a eficácia do Extrato de

P. granatum (EHA), do gluconato de clorhexidina a 0,12% e da água destilada,

envolvendo os sessenta voluntários. O material coletado foi então analisado

microbiologicamente a fim de se determinar o número de UFC/ml (Unidades

Formadoras de Colônias) presentes na placa bacteriana supragengival. De acordo

com o processo de randomização descrito, respeitou-se a divisão dos pacientes nos

três grupos.

Foi padronizada a parte cervical da face vestibular do primeiro molar

permanente, bem como dos incisivos centrais e laterais, de ambas as arcadas

dentárias, para a remoção da placa dentária supragengival, em função da facilidade

de observação direta. A placa foi removida, com uma cureta periodontal, e colocada

em tubos eppendorf contendo 1ml de tampão PBS (Phosphate Buffered Saline),

estéreis, previamente identificados e pesados em balança analítica (Gehaka AG 200,

Germany).

Os voluntários dos três grupos suspenderam todas as medidas de higiene

oral por 24 horas. No dia seguinte, os voluntários compareceram ao consultório

odontológico, no período da manhã, quando então se realizou:

1ª Coleta: coleta da placa bacteriana, utilizada como controle e

acondicionada em tubo eppendorf contendo solução salina tamponada.

2ª Coleta: logo após a primeira coleta da placa supragengival, os

voluntários realizaram o bochecho da seguinte maneira:

- Grupo I: 15 ml de Extrato hidroalcóolico de P. granatum durante 1 minuto.

- Grupo II: 15 ml de gluconato de clorhexidina a 0,12% durante 1 minuto.

- Grupo III: 15 ml de água destilada durante 1 minuto.

Em seguida, os tubos contendo a placa bacteriana foram colocados em

uma caixa de isopor, contendo gelo, e transportados ao Laboratório de Microbiologia

da Faculdade de Medicina de Juazeiro do Norte - FMJ. Em uma câmara de fluxo

laminar (Quimis), as amostras de cada voluntário foram homogeneizadas por 30

- 43 -

segundos em um agitador de tubos (Vortex-Quimis) visando à obtenção de uma

suspensão uniforme. Foram realizadas então, diluições seriadas sucessivas, de 10

-1

a 10

-4

, e a partir da diluição 10

-4

, foram semeadas 100 µl de suspensão bacteriana

de cada voluntário em placas de Petri, em triplicata, contendo meio de cultura BHI

Agar, perfazendo um total aproximado de 10

UFC/ml. As placas foram incubadas

em estufa de cultura a 37ºC, por 48 horas, quando então foi realizada a contagem

das colônias bacterianas (UFC/ml). (Figura 7 e 8)

FIGURA 7 – Material usado para montagem do teste de avaliação da sensibilidade

da microbiota bucal frente ao Extrato hidroalcóolico de P. granatum

- 44 -

FIGURA 8 – Estufa incubadora a 37°C contendo as placas de Petri semeadas com a

microbiota dos voluntários.

3.5.2 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) do Extrato hidroalcóolico

de P. granatum sobre a microbiota da placa dental.

A concentração inibitória mínima do Extrato EHA sobre a microbiota bucal,

foi realizada através da coleta da placa dental de um dos voluntários, após 24 horas

sem higienização oral. Inicialmente as concentrações decrescentes do EHA 60, 30,

15, 7.5 e 3.75 mg/ml foram espalhadas em placas contendo meio BHI Agar.

Posteriormente, a amostra coletada do voluntário, foi homogeneizada, obtendo-se

uma suspensão uniforme. Após a homogeneização, realizou-se a diluição seriada

sucessiva de 10

-1

a 10

-4

e a partir da diluição 10

-4

, semeou-se 100 µl desta

suspensão bacteriana nas placas de Petri contendo as concentrações de EHA

descritas acima. As placas foram então incubadas a 37°C, por 48 horas. O

experimento foi realizado em duplicata. O controle consistiu de placas com meio BHI

Agar, sem EHA , contendo somente a suspensão bacteriana. Após este período,

realizou-se a contagem do número de unidades formadoras de colônias (UFC/ml)

para a determinação da concentração inibitória mínima do EHA sobre a microbiota

da placa dental.

- 45 -

3.5.3 Determinação do tempo de duração do efeito do Extrato hidroalcóolico de P.

granatum

Foram selecionados, aleatoriamente três voluntários, participantes do

experimento para realização da curva de tempo do Extrato hidroalcóolico de P.

granatum (EHA). Estes voluntários suspenderam a higienização bucal por 24 horas.

No dia seguinte foi realizada uma coleta da placa bacteriana, que foi utilizada como

controle, e em seguida os 3 voluntários foram submetidos a um bochecho de 15 ml

do Extrato hidroalcóolico por 1 minuto, sendo coletadas amostras da placa

bacteriana. Após 1 hora, com ausência de bochechos, foi realizada a última coleta

de placa bacteriana destes voluntários.

As amostras de placa dentária dos três voluntários foram coletadas em

tubos eppendorf, contendo solução tampão PBS. Na câmara de fluxo laminar as

amostras foram diluídas até 10

-4

e semeadas 100 µl de cada suspensão bacteriana

em placas de Petri em duplicata, contendo meio de cultura BHI Agar, perfazendo um

total aproximado de 10

UFC/ml. As placas foram incubadas em estufa de cultura a

37ºC, por 48 horas. Após este período foi realizada a leitura das placas para a

verificação da duração do efeito antimicrobiano do EHA.

3.6 Diferenciação da microbiota bucal através do método de coloração de

Gram

A coloração é uma etapa fundamental para a identificação de bactérias e

tem a finalidade de facilitar a observação microscópica das células bacterianas,

diferenciando de acordo com as suas propriedades tintoriais. A coloração de Gram

consiste em dividir as bactérias em dois grandes grupos, partindo da capacidade que

têm as células coradas de resistirem ou não a uma descoloração pelo álcool:

bactérias Gram negativas tem um conteúdo lipídico mais elevado que o das

bactérias Gram positivas.

As colônias bacterianas presentes na microbiota bucal dos pacientes

foram isoladas de acordo com a morfologia destas colônias, em tubos contendo

meio de cultura BHI Agar. Antes da realização da coloração de Gram, procedeu-se a

renovação dessas colônias em BHI caldo por 12 horas a 37ºC. Após a renovação,

utilizou-se lâmina desengordurada para a realização dos esfregaços das culturas

- 46 -

bacterianas, as quais foram secas ao ar e fixadas pelo calor, passando-se a lâmina

rapidamente três a quatro vezes, pela chama do bico de Bunsen. Este aquecimento

serviu para fixar e matar os microorganimos contidos nas lâminas.

Após a fixação, os esfregaços foram corados com solução de cristal

violeta durante 1 minuto. O excesso de corante foi desprezado e o esfregaço coberto

por uma solução de lugol durante 1 minuto. Em seguida as lâminas foram escorridas

e descoradas com álcool etílico 95%, até que não houvesse mais desprendimento

de corante (30 segundos). Por fim, adicionou-se uma solução de safranina por 1

minuto, sendo lavadas em água corrente e postas para secar ao ar.

As células bacterianas Gram negativas aparecem ao microscópico com

uma coloração vermelha, enquanto as células Gram positivas permanecem com a

tonalidade azul escura.

3.7 Análise Estatística

Os dados obtidos na avaliação da sensibilidade da microbiota presente na

placa bacteriana frente ao EHA, ao gluconato de clorhexidina e a água destilada,

foram analisados do ponto de vista estatístico segundo as variáveis mencionadas,

através de teste não-paramétrico de Mann-Whitney U e os resultados foram

considerados significantes a p< 0.05.

3.8 Aprovação do Projeto pelo Comitê de Ética em Pesquisa

O Comitê de Ética em Pesquisa e Complexo Hospitalar da Universidade

Federal do Ceará - COMEPE, dentro das normas que regulamentam a pesquisa em

seres humanos, do Conselho Nacional de Saúde – Ministério da Saúde, Resolução

nº 196 de 10 de outubro de 1996 e Resolução nº 251 de 07 de agosto de 1997,

publicadas no Diário Oficial, em 16 de outubro de 1996 e 23 de setembro de 1997,

aprovou o Projeto de título: “Avaliação in vivo da atividade antimicrobiana do extrato

de Punica granatum Linn. sobre a placa bacteriana supragengival”, na reunião do dia

18 de dezembro de 2003. Este projeto foi protocolado no COMEPE com o número

242/03.

- 47 -

4. RESULTADOS

O resultado do teste para o controle de qualidade do Extrato

hidroalcóolico de Punica granatum (EHA), mostrou ausência de crescimento

microbiano, podendo desta forma ser o mesmo utilizado com segurança nos

procedimentos que avaliaram a sua eficácia frente aos microorganismos deste

estudo.

Na determinação do espectro de resistência das linhagens bacterianas

Gram negativas e Gram positivas aos antibióticos comerciais, verificou-se , conforme

exposto na tabela 2, que as 13 linhagens testadas, foram resistentes a todos os

antibióticos utilizados.

Os resultados demonstraram que o Extrato hidroalcóolico de Punica

granatum, apresentou uma eficácia antimicrobiana semelhante àquela apresentada

pela Clorhexidina utilizada como controle positivo. Ambos foram ativos contra

Staphyloccocus aureus, Staphyloccocus

-hemolyticus, E. coli, Klebsiella

pneumoniae, Streptoccocus

-hemolyticus e Proteus vulgaris. Algumas linhagens

bacterianas como E. coli, S. aureus, S. beta-hemoliticus e a levedura C. albicans

foram sensíveis ao EHA em baixas concentrações (15 mg/ml). Porém, enquanto S.

epidermidis foi sensível ao EHA, mostrou-se resistente à ação antimicrobiana da

clorhexidina. (Tabela 3)

A análise da atividade antimicrobiana do EHA, através do teste de

difusão em disco frente a bactérias coletadas da microbiota bucal de três voluntários,

apresentou um perfil de inibição com halo ≥ 7mm nas respectivas concentrações de

60, 30, 12 e 6mg/ml. (Tabela 4 e Figura 9)

A tabela 5 mostra os resultados do teste para determinação da

concentração inibitória mínima (CIM) do EHA sobre as linhagens de Streptococcus

-hemolyticus (19), Stafilococcus aureus (25), Pseudomonas aeruginosa (17) e

Candida albicans (ATCC-007), as quais mostraram-se sensíveis ao EHA que

apresentou, ,respectivamente, as seguintes concentrações inibitória mínima, 1.87,

3.75, 7.5 e 15 mg/ml de EHA. (Figura 10)

TABELA 2 – Espectro de resistência das linhagens bacterianas Gram negativas e Gram positivas aos antibióticos comerciais

R – Resistente

ast – Astreonam; ax – Amoxacilina; amp – Ampicilina; ami – Amicacina; amo – Amoxicilina; crx – Cefuroxina; ctx – Cefatoxina; ca –

Cefadroxi; cfc – Cefaclor; cfl – Cefalotina; caz – Ceftazidima; cro – Ceftriaxona; cp – Ciprofloxacina; clo – Cloranfenicol; im – Imipenem; kn –

Kanamicina; szt – Sulfametrim; tet – Tetraciclina; tb – Tobramicina; van – Vancomicina.

Microrganismo Resistência a antibióticos

Shiguella flexineri

ast

; ax

; amp

; amo

; crx

; ca

; cfc

; cfl

; cro

; im

; kn

; van

; tb

Salmonella thiphynurum

ast

; ax

; amo

; crx

; ca

; cfc

; im

; kn

; van

; tb

Staphylococcus aureus

ast

; ax

; amp

; amo

; ca

; cfc

; cfl

; caz

; cip

; clo

; im

; kn

; tet

; van

; tb

Staphylococcus epidermidis

ast

; ax

; amo

; ca

; cfc

; caz

; cro

; im

; kn

; van

Staphylococcus

-hemolyticus

ast

; ax

; amp

; ami

; crx

; ctx

; ca

; cfc

; cfl

; caz

; cro

; imr; kn

; szt

; van

; tb

Streptococcus

-hemolyticus

ast

; ax

; amp

; ami

; amo

; ca

; cfc

; caz

; cro

; im

; kn

; van

; tb

Pseudomonas aeruginosa

ast

; ax

; amp

; ami

; amo

; crx

; ctx

; ca

; cfc

; cfl

; caz

; cro

; cip

; clo

; im

;

; szt

; tet

; van

; tb

Pseudomonas sp.

ast

; ax

; amp

; ami

; amo

; crx

; ca

; cfc

; cfl

; caz

; cip

; clo

; im

; kn

; szt

;

tet

; van

; tb

Klebsiella pneumoniae

ast

; ax

; amp

; amo

; crx

; ca

; cfc

; cfl

; cip

; clo

; im

; kn

; tet

; van

Proteus vulgaris

ast

; ax

; amp

; ami

; amo

; ca

; cfc

; cfl

; im

; kn

; tb

Providencia alcalifaciens

ast

; ax

; ami

; amo

; crx

; ctx

; ca

; cfc

; cfl

; caz

; im

; kn

; szt

; van

; tb

Alcaligenes sp.

ast

; ax

; amo

; crx

; ctx

; ca

; cfc

; cfl

; caz

; cro

; im

; szt

; van

Escherichia coli

ast

; ax

; amp

; ami

; amo

; crx

; ctx

; ca

; cfc

; cfl

; caz

; cro

; cip

; clo

; im

;

; szt

; tet

; van

; tb

TABELA 3 – Teste de sensibilidade ao Extrato hidroalcoólico de P. granatum (EHA)

e clorhexidina frente a diferentes espécies de microorganismos e levedura.

EHA (mg/ml) CLORHEXIDINA (%)MICROORGANISMOS

CONTROLE

60 30 15 0,12 0,06 0,03

Shiguella flexineri - - - - - - -

Salmonella thiphinurum - - - - - - -

Stafilococcus aureus - + + + + + +

Stafilococcus epidermidis - + + - - - -

Stafilococcus

hemolyticus

- + + + + + +

Streptococcus

hemolyticus

- + + + + + +

Pseudomonas

aeruginosa

- + + + + - -

Pseudomonas sp - + - - - - -

Klebsiella pneumoniae - + + + + + +

Proteus vulgaris - + + + + + +

Providencia alcalifaciens - - - - - - -

Alcaligens - - - - - - -

E. coli - + + + + + +

Candida albicans - + + + n.d n.d n.d

A concentração inicial do extrato hidroalcóolico de P. granatum (EHA) foi 60 mg/ml e da Clorhexidina

foi 0.12%. (+) sensibilidade; (-) resistência; (n.d) não determinado.

TABELA 4 - Atividade antimicrobiana do extrato hidroalcóolico de P. granatum

através do teste de difusão em disco frente a microrganismos da placa dental de

voluntários antes de serem submetidos ao tratamento.

Microorganismo da placa dental Extrato hidroalcóolico de P. granatum

(mg/ml)

Voluntário 60 30 12 6 1

+ + + + -

+ + - - -

+ + + - -

(+) sensibilidade (zona de inibição ≥ 7 mm) (-) ausência de sensibilidade

FIGURA 9– Resultado do teste de difusão em disco para verificação da atividade

antimicrobiana do EHA de P. granatum sobre microorganismos da cavidade bucal.

TABELA 5 – Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) em UFC x 10

do extrato hidroalcóolico Punica granatum (EHA) sobre Staphylococcus aureus,

Streptococcus beta-hemolyticus, Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans.

Concentração EHA (mg/ml)

Microorganismos

60 30 15 7,5 3,75 1,87 0,93 0,46

Staphylococcus aureus

0 0 0 0 0* 36 300 600

Streptococcus

hemolyticus

0 0 0 0 0 0* 13 31

Pseudomonas aeruginosa

0 0 0 0* 1 1 11 17

Candida albicans

0 0 0* 55,5 166,5 156,5 380 405

* = CIM. Este experimento foi realizado em duplicata.

FIGURA 10 – Resultado da determinação da concentração inibitória mínima do EHA

de P. granatum (60 mg/ml) frente as bactérias Pseudomonas aeruginosa(PA) ,

Streptococcus β-hemolyticus(SH) , Stafilococcus aureus(SA) e Cândida

albicans(CA) . PA-CON : Placa controle, contendo cultura ativa de Pseudomonas

SH-1,87

SH-CON

SA-CON

CA-15 CA-CON

PA-CON PA-7,5

SA-3,75

aeruginosa; PA-7,5 : Placa demonstrando a CIM (7,5mg/ml) do EHA sobre a PA ;

SH-CON : Placa controle, com Streptococcus

-hemolyticus; SH – 1,87 : Placa

determinando a CIM (1,87 mg/ml) do EHA sobre o SH; SA-CON : Placa controle,

com S. aureus; SA - 3,75 : Placa demonstrando a CIM (3,75mg/ml) do EHA sobre o

SA; CA-CON : Placa controle, contendo C. albicans ; CA – 15 : Placa demonstrando

a CIM (15mg/ml) do EHA sobre a CA.

O teste para avaliação da sensibilidade da microbiota bucal frente ao EHA,

ao gluconato de clorhexidina e à água destilada, demonstrou uma resposta inibitória

do EHA no que se refere ao crescimento de microorganismos da placa dental,

determinada pelo número de unidades formadoras de colônias (UFC), antes e após

o bochecho, em todos os 20 voluntários deste estudo. O decréscimo em número de

UFC após o bochecho com EHA foi cerca de 81% (UFC, antes = 154.4 ± 41.18;

após = 25.4 ± 7.76). Os resultados foram semelhantes aos observados com

clorhexidina, que diminuiu em 80% aproximadamente o número de UFC (antes =

208.7 ± 58.81; após = 44.0 ± 15.85). Embora, nos voluntários do grupo controle, a

redução de UFC foi somente 11,3% (antes = 81.1 ± 10.12; após = 71.9 ± 8.68). Não

foi observada uma diferença significativa entre os grupos EHA e Clorhexidina (p =

0.7251), mas uma diferença significante foi observada entre EHA (p< 0.0001), bem

como Clorhexidina (p< 0.0001), quando comparados com o grupo controle. (Tabela

6 e 7; Figura 11)

TABELA 6 - Efeito do Extrato hidroalcóolico de P. granatum (EHA), da clorhexidina e

água (controle) sobre microorganismos da placa dental

UFC x 10

Grupo Antes do bochecho Após bochecho % inibição

EHA 154.4 ± 41.18 25.4 ± 7.76 83.5

Clorhexidina 208.7 ± 58.81 44.0 ± 15. 85 79.0

Água (controle) 81.1 ± 10.12 71.9 ± 8.68 11.3

Valores são médias ± EPM de UFC dos 20 voluntários por grupo, antes e após bochechos.

O experimento foi realizado como descrito nos métodos.

TABELA 7 - Análise estatística (Mann-Whitney) entre os grupos testados: Extrato

hidroalcóolico de P. granatum (EHA), clorhexidina e água (controle).

Comparações Valor de p Significância estatística

Grupo EHA x Grupo Agua < 0.0001 *

Grupo Clorhexidina x Grupo Agua < 0.0001 *

Grupo EHA x Grupo Clorhexidina p=0,7251 N/S

* =diferença estatística nos valores de probabilidade apresentados para cada comparação

entre 2 grupos (p< 0.05); N/S = não significante estatisticamente

FIGURA 11 – Efeito do Extrato hidroalcóolico de P. granatum (EHA), Clorhexidina e

água destilada (controle) sobre os microorganismos da placa dental.

* p<0.005 quando comparado ao grupo controle.

Na determinação da concentração inibitória mínima do Extrato

hidroalcóolico de Punica granatum L. (EHA) sobre os microorganismos da placa

dental, os resultados demonstraram que o EHA nas concentrações de 60, 30 e 15

mg/ml, promoveu inibição de todos os microorganismos presentes no meio de

cultura. Entretanto, considera-se como concentração inibitória mínima à

concentração de 15 mg/ml, pois ocorre crescimento microbiano nas concentrações

menores de EHA (7.5; 3.75 mg/ml), onde a porcentagem de inibição foi cerca de

89.3 e 76.6, respectivamente. (Tabela 8)

A tabela 9 mostra o tempo de duração do efeito antimicrobiano do EHA até

1 hora. Os resultados demonstram que a porcentagem de UFC diminuiu entre 72.2 e

63.8%, imediatamente após o bochecho e 1 hora depois, respectivamente. Isto

indica que o efeito antimicrobiano do EHA manteve-se pelo menos até 1 hora, após

o bochecho. É possível que o efeito seja duradouro e estenda-se por um tempo mais

prolongado, tendo em vista que os percentuais de UFC apresentaram valores

semelhantes quando determinados imediatamente e após 1 hora do bochecho com

EHA. (Figura 12)

TABELA 8 – Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) do Extrato

hidroalcóolico Punica granatum (EHA) sobre a microbiota da placa dental

Grupo Concentração (mg/ml) CIM (UFC x 10

-5

)

controle

173,5

7,50

18.5

EHA (mg/ml)

3,75

40.5

Este experimento foi realizado em duplicata.

TABELA 9 – Duração do efeito antimicrobiano do Extrato hidroalcóolico de P.

granatum (EHA).

EHA

UFC % Inibição

Antes do bochecho 134,6 ± 44.77 ----

Imediatamente após

bochecho

37,3 ± 18,08

72.2 ± 4.98

1 hora após bochecho

48,6 ± 33,75

63.8 ± 14.9

Os valores representam média ±EPM de 3 voluntários.

* p<0.005 quando comparado ao grupo controle.

FIGURA 12 – Duração do efeito antimicrobiano do Extrato hidroalcóolico de P.

granatum (EHA). p<0.005 quando comparado ao grupo controle.

As linhagens bacterianas da microbiota bucal foram submetidas à

coloração de Gram, para identificar as linhagens Gram negativas e Gram positivas, e

para a observação da presença de bacilos e cocos. (Figura 13 e 14)

FIGURA 13 – Cocos e bacilos Gram positivos isolados da microbiota bucal.

FIGURA 14 - Cocos Gram negativos isolados da microbiota bucal.

5. DISCUSSÃO

A Punica granatum L. é uma planta cultivada em quase todo o mundo,

seja como medicinal, seja como ornamental. A casca do fruto contém tanino,

alcalóides e uma substância com atividade antimicrobiana. As cascas do caule e

das raízes contêm peletierina, alcalóide tóxico para platelmintos (vermes chatos) e

de propriedade vermífuga para tênia (solitária), além de outros componentes, tais

como metilpeletierina, pseudopeletierina e isopeletierina e manitol, fenóis,ácido

elágico e ácido gálico. A casca da árvore contém, aproximadamente 20% de taninos,

incluindo punicalina, punicalagina, granatinas A e B, galagildilactona,

casuarinina,pedunculagina, telimagrandina I e corilagina. A casca do fruto tem

atividades anti-sépticas, adstringentes e antiviral contra o herpes genital. Esta planta

é considerada útil como anti-helmíntico , sendo utilizada como antidiarréico na Ásia e

na América do Sul. (Matos et al., 2001)

Neste estudo, demonstramos que o Extrato hidroalcóolico dos frutos de

Punica granatum (EHA), apresentou uma atividade significante contra

microorganismos comumente presentes na placa dental. O efeito foi observado

imediatamente após o voluntário realizar bochecho, quando o número de unidades

formadoras de colônias (UFC/ml) foi reduzido em 80% quando comparado aos

valores de UFC/ml antes do bochecho. Os resultados foram semelhantes aos da

Clorhexidina, quando os valores de UFC/ml foram também determinados antes e

após o bochecho. Embora nossas condições experimentais não permitiram

identificar as linhagens de microorganismos presentes na placa dental, vários relatos

indicam que P. granatum tem atividade antibacteriana. Um estudo realizado por

Kakiuchi et al. (1986) , constatou que os constituintes presentes na casca do fruto da

P. granatum (granatina A, granatina B, punicalina e punicalagina) causam uma

inibição relativamente alta sobre a aderência do Streptococcus mutans nas

superfícies dos dentes. Um outro estudo realizado por Pereira et al. (2001), verificou

a ação da P. granatum sobre as três espécies de microorganismos aeróbios

predominantes na placa supragengival: S. mutans, S. mitis e S. sanguis. Os

resultados deste estudo, comprovaram a ação antibacteriana, in vitro, do extrato

hidroalcóolico da casca do fruto, sobre as três linhagens bacterianas estudadas,

demonstrando ser um excelente anti-séptico, quando comparado ao gluconato de

clorhexidina.

Além disto, Das et al. (2001), demonstraram que o extrato etanólico de

folhas de P. granatum foi seletivamente ativo contra Vibrio cholerae (linhagens

0.139 e 01 EI Tor ogawa), mas foi ineficaz contra a linhagem 01 Classical Inaba.

Contudo, o extrato acetônico de folhas de P. granatum apresentou atividade

vibriocida para todas as linhagens usadas nesta investigação. (Figura 15)

Entre os principais compostos bioativos presentes no extrato de P.

granatum, estão os taninos, e um destes, o tanino elágico, punicalagina, tem

atividade contra linhagens de Staphyloccocus aureus meticilina resistentes (MRSA)

(Machado et al., 2002). De acordo com estes autores a atividade da punicalagina,

fornece uma zona clara de inibição de 20 mm para todas bactérias testadas e a

concentração inibitória mínima (CIM) para linhagens de S. aureus foi estabelecida

como 61.5 µg/ml.

Punicalagina de outras espécies como Terminalia citrine, foi efetiva contra

várias linhagens bacterianas, e para linhagens de Staphyloccocus aureus meticilina

resistentes (MRSA) foi obtido como valor de MIC 768 µg/ml. (Burapadaja e Bunchoo,

1995).

FIGURA 15 – Folhas de P. granatum.

(www.cuyamaca.net/OH170/plant_TNails/punica_granatum_leaves_9-27-99_3.jpg)

Vasconcelos et al. (2003), ao utilizarem um gel de P. granatum no

tratamento da candidose associada com a estomatite protética, observaram a

eficácia de P. granatum como agente antifúngico tópico para leveduras do gênero

Cândida, enquanto Sastravaha et al. (2003), ao avaliarem o efeito do extrato de P.

granatum no tratamento periodontal, concluíram que os sinais clínicos da

periodontite crônica foram significantemente reduzidos após o tratamento.

Além disso, Lin et al. (2001), ao estudarem a atividade da punicalagina e

punicalina, isoladas de folhas de outras espécies de alguns gêneros, como é o caso

da Terminalia catappa, mostraram que esta espécie apresenta atividade

antihepatotóxica, mas o tratamento com altas doses aumentou as lesões hepáticas.

Estes resultados sugerem que, quando comparadas punicalagina e punicalina

mostram uma atividade antioxidante em baixas doses, o tratamento com altas doses

pode induzir toxicidade celular. Entretanto, Cérda et al. (2003), relataram

recentemente um efeito não tóxico de punicalina em ratos depois de repetida

administração oral de uma dieta contendo 6% de punicalina durante 37 dias.

Diferenças não significantes foram encontradas em ratos tratados em todos os

parâmetros sanguíneos analisados (incluindo as enzimas antioxidantes, glutationa

peroxidase e dismutase superóxido). As análises histopatológicas de fígado e rim,

desses animais corroboraram a ausência de toxicidade nas condições experimentais

deste estudo.

As cascas do fruto do caule de P. granatum (casca e caule) são

conhecidas por conterem um grande número de alcalóides pertencentes ao grupo

piridina, tal como peletierina, pseudopeletierina, isso-peletierina e metilso-peletierina.

Os efeitos benéficos para a saúde atribuídos aos frutos e vegetais são devidos, pelo

menos em parte, a sua atividade antioxidante, resultante principalmente da presença

de polifenóis na planta. O Extrato da casca da romã é rico em polifenóis, os quais

tem apresentado um forte efeito anti-séptico e também atividade antibacteriana

contra bactérias gram negativas e gram positivas.(Negi e Jayaprakasha ,2003).

Estudos acerca do potencial terapêutico adjuvante e quimioprotetor de P.

granatum, identificaram que os polifenóis de P. granatum são ativos bloqueadores

endógenos na biossíntese do estrógeno, causando inibição da atividade da enzima

aromatase em 60-80%, bem como da hidroxesteróide-17 beta-desidrogenase,

comprovando sua ação terapêutica em pacientes com câncer de mama. Como

exemplo prático, o extrato da casca de romã, possui uma significante atividade

antioxidante em vários modelos in vitro e in vivo. (Kim et. al. ,2002). Gharzouli et al.

(1998), ao avaliarem o efeito do extrato aquoso e etanólico de frutos de P. granatum

em ratos, observaram o efeito gastroprotetor. A administração oral destes extratos

induziu uma redução significante sobre as lesões gástricas (47.7–76%). O conteúdo

ácido do estômago foi significantemente reduzido pelo extrato etanólico de P.

granatum (368%). Estes resultados sugerem que os polifenóis monoméricos e

poliméricos podem fortalecer a mucosa gástrica.

Anesini e Perez (1993) avaliaram o potencial antimicrobiano de extratos de

plantas nativas usadas na medicina popular da Argentina contra Staphylococcus

aureus, Escherichia coli e Aspergillus niger. As plantas Tabebuia impetiginosa,

Achyrocline sp., Larrea divaricata, Rosa borboniana, Punica granatum, Psidium

guineense, Lithrea ternifolia e Allium sativum foram os mais efetivos contra estes

microorganismos.

Navarro et al., (1996) realizaram uma avaliação antimicrobiana com doze

extratos metanólicos de plantas usadas na medicina tradicional em Morelos no

México para curar doenças infecciosas. Os extratos foram avaliados quanto ao seu

potencial antimicrobiano contra Staphylococcus aureus, Escherichia coli,

Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans. Os resultados mostraram que os

extratos de Eucalyptus globolus Labill, Punica granatum L., Artemisia mexicana

Wild., e Bocconia arborea Watt. possuem atividade antimicrobiana in vitro contra os

microorganismos testados.

Vidal et. al. (2003) objetivando avaliar a toxicicidade do Extrato

hidroalcóolico de frutos de P. granatum, partindo de estudos que comprovaram a

atividade anti-influenza do extrato, concluíram que o efeito tóxico de P. granatum

ocorreu em doses elevadas, ou seja, doses maiores que as efetivas na atividade

anti-viral.

Voravuthikunchai et al. (2004) avaliaram 58 extratos aquosos e etanólicos

de 38 espécies de plantas medicinais usadas na Tailândia para o tratamento de

infecções gastrointestinais. Os extratos aquoso e etanólico de Quercus infectoria e

extrato aquoso de Punica granatum foram altamente efetivos contra a linhagem

enterohemorrágica de Escherichia coli (ECEH) O157:H7. Estas plantas podem ser

uma alternativa no tratamento de infecções por E. coli O157:H7.

Fungos e bactérias são causadores de importantes doenças humanas,

onde os antibióticos e agentes antifúngicos comumente usados tornaram-se

ineficazes devido ao surgimento de linhagens multiresistentes, impondo a busca

permanente de novas alternativas terapêuticas. Conforme avaliamos a eficácia do

extrato hidroalcóolico de frutos de Punica granatum, verificamos uma inibição

significante dos microorganismos da microbiota bucal, bem como uma inibição in

vitro de 69% das linhagens patogênicas multiresistentes testadas.

6. CONCLUSÃO : Os resultados do presente trabalho nos permitem concluir que:

1. houve diferença significativa entre o grupo Extrato hidroalcóolico de

Punica granatum (EHA) e o grupo controle (p< 0.0001), ou seja

ocorreu diminuição significativa no número total de microorganismos

presentes na placa bacteriana dos 20 voluntários do grupo EHA .

2. não houve diferença significativa entre EHA e o grupo Clorhexidina

(p=0.7251) e portanto os 2 grupos inibiram de modo semelhante o

número de UFC/ml.

3. a CIM do EHA sobre os microorganismos da placa dental foi em torno

de 15 mg/ml.

4. o EHA apresentou um efeito antimicrobiano pelo menos até 1 hora

após a realização do bochecho, observando-se uma redução de 63%

nos valores de UFC/ml, enquanto que logo após o bochecho a

redução foi de 72%.

5. o EHA apresentou uma atividade antibacteriana in vitro sobre as

linhagens de Staphyloccocus aureus e Streptoccocus beta-

hemolyticus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella

pneumoniae e Proteus vulgaris, com exceção de Shiguella e

Salmonella . O perfil antibacteriano foi semelhante ao observado com a

Clorhexidina.

6. a CIM do EHA sobre as linhagens de Streptococcus

-hemolitico,

Stafilococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans ,

foram, respectivamente, 1.87, 3.75, 7.5 e 15 mg/ml.

7. os bochechos com Extrato hidroalcóolico de P. granatum podem ser

benéficos no tratamento dos microorganismos da placa dental. Como

tratamento poderá certamente ser mais barato e melhor tolerado pelos

pacientes, visto que as plantas medicinais são amplamente usadas

pela população em países menos desenvolvidos, incluindo o Brasil.

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f. Tese (Doutorado em Odontologia) – Faculdade de Odontologia, Universidade de

São Paulo, São Paulo, 2003.

ANEXO A – Modelo do Termo de Consentimento assinado pelos sessenta

voluntários do experimento.

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARA

Faculdade de Medicina

Departamento de Fisiologia e Farmacologia

Programa de Pós-Graduação em Farmacologia

Unidade de Farmacologia Clínica – UNIFAC

Mestrado Profissional em Farmacologia Clínica

TERMO DE CONSENTIMENTO

INSTRUÇÕES PARA PREENCHIMENTO

1. Este termo conterá o registro das informações que o pesquisador fornecerá ao sujeito

da pesquisa, em linguagem clara e acessível, evitando-se vocábulos técnicos não

compatíveis com o grau de conhecimento do interlocutor.

2. A avaliação do grau de risco deve ser minuciosa, levando em conta qualquer

possibilidade de intervenção e de dano à integridade física do sujeito da pesquisa.

3. Este termo deverá ser elaborado em duas vias, ficando uma via em poder do paciente

ou seu representante legal e outra deverá ser anexada a ficha clínica do paciente.

4. A via do Termo de Consentimento submetida à análise do Comitê de Ética em

Pesquisa da Universidade Federal do Ceará, credenciado pelo CONEP – Conselho

Nacional de Saúde/MS, deverá ser idêntica àquela que será fornecida ao sujeito da

pesquisa.

I – DADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO SUJEITO DA PESQUISA OU

RESPONSÁVEL LEGAL

1. NOME DO PACIENTE _____________________________________________________

DOCUMENTO DE IDENTIDADE Nº ___________________ SEXO: M____/ F_____

DATA DE NASCIMENTO: ____/____/____

ENDEREÇO: ____________________________________Nº__________APTO__________

BAIRRO: _______________________________ CIDADE: __________________________

CEP: _____________________ TELEFONE: DDD (_____) __________________________

2RESPONSÁVEL LEGAL: ___________________________________________________

NATUREZA (grau de parentesco, tutor, curador etc):________________________________

DOCUMENTO DE IDENTIDADE Nº _____________________ SEXO: M_____/ F______

DATA DE NASCIMENTO: _____/_____/_____

ENDEREÇO: ____________________________________Nº__________APTO__________

BAIRRO: _______________________________ CIDADE: __________________________

CEP: _____________________ TELEFONE: DDD (_____) __________________________

II – DADOS SOBRE A PESQUISA CIENTIFICA

1. TITULO DO PROTOCOLO DE PESQUISA: Avaliação, In Vivo, do efeito do

Extrato hidroalcóolico da Punica granatum L. (Romã) na inibição da placa bacteriana.

PESQUISADOR: Silvana Magalhães Siqueira Menezes

CARGO/FUNÇÃO: Aluna do Mestrado Profissional em Farmacologia Clínica

INSCRIÇÃO CONSELHO REGIONAL DE ODONTOLOGIA: Nº 2507

ORIENTADOR: Glauce Socorro Barros Viana, MD, Ph.D.

2 AVALIAÇÃO DO RISCO DA PESQUISA:

SEM RISCO ______ RISCO MÍNIMO ______ RISCO MÉDIO _______

RISCO ________ RISCO MAIOR_______

(probabilidade de que o indivíduo sofra algum dano como conseqüência imediata ou tardia do

estudo)

3. DURAÇÃO DA PESQUISA: Estima-se um prazo de 04 a 06 meses, após a aprovação do

Estudo pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFC.

III – REGISTRO DAS EXPLICAÇÕES DO PESQUISADOR AO PACIENTE OU SEU

REPRESENTANTE LEGAL SOBRE A PESQUISA, CONSIGNANDO:

1. Justificativa e os objetivos da pesquisa; 2. procedimentos que serão utilizados e propósitos,

incluindo a identificação dos procedimentos que são experimentais; 3. desconfortos e riscos

esperados; 4. benefícios que poderão ser obtidos; 5. procedimentos alternativos que possam

ser vantajosos para o indivíduo.

O estudo se propõe a testar o efeito da Punica granatum L. (romã), em forma de bochecho no

controle da placa bacteriana supragengival, de pacientes portadores de aparelhagem

ortodôntica fixa. Através deste projeto, pode-se utilizar um anti-séptico bucal, a partir de uma

substância natural, beneficiando desta forma uma grande parte da população em geral. Os

participantes desta pesquisa farão bochecho com uma destas três substâncias: Extrato

hidroalcóolico de Punica granatum, gluconato de clorhexidina a 0,12% ou água destilada. Os

pacientes devem ficar 24 horas, sem realizar higienização bucal. No dia seguinte serão

realizadas duas coletas de placa bacteriana por paciente, ou seja, a 1º coleta será realizada

antes do bochecho com uma das três substâncias descritas acima e a 2º coleta será executada

após o bochecho. Poderá ser observado um gosto amargo do extrato de romã, bem como

sensação de queimação na mucosa bucal decorrente do bochecho com o gluconato de

clorhexidina. Como benefícios temos a possibilidade de utilizarmos uma substância de fácil

aquisição pela população, como anti-séptico bucal. Desta forma, poderá ser obtido um

produto natural no controle da placa bacteriana supragengival.

IV – ESCLARECIMENTOS DADOS PELO PESQUISADOR SOBRE GARANTIAS DO

SUJEITO DA PESQUISA:

1. acesso, a qualquer tempo, às informações sobre procedimentos, riscos e benefícios

relacionados à pesquisa, inclusive para dirimir eventuais dúvidas.

2. liberdade de retirar seu consentimento a qualquer momento e de deixar de participar

do estudo, sem que isto traga prejuízo à continuidade da assistência.

3. salvaguarda da confidencialidade, sigilo e privacidade.

4. disponibilidade de assistência no Consultório Odontológico da Clínica Bárbara de

Alencar, por eventuais danos à saúde, decorrentes da pesquisa.

5. viabilidade de indenização por eventuais danos à saúde, comprovadamente decorrente

da pesquisa.

V – INFORMAÇÕES DE NOME E TELEFONE DO RESPONSÁVEL PELO

ACOMPANHAMENTO DA PESQUISA, PARA CONTATO EM CASO DE

INTERCORRÊNCIAS CLÍNICAS E REAÇÕES ADVERSAS.

Responsável: Silvana Magalhães Siqueira Menezes

Endereço Comercial: Clínica Bárbara de Alencar – Praça da Sé, nº 608 – Centro –

Crato/CE

Telefone: (88) 523 1005

Endereço Residencial: Rua Cícero Araripe, nº 307 – Pimenta – Crato/CE

Telefone: (88) 523 4162

VI – CONSENTIMENTO

Declaro que, após convenientemente esclarecido pelo pesquisador e ter entendido o que me

foi explicado, consinto em participar do presente Protocolo de Pesquisa.

Crato, _____ de ______________ de 2003.

________________________________________ ______________________

assinatura do sujeito da pesquisa ou responsável legal assinatura do pesquisador

ANEXO B – Modelo de ficha de identificação dos sessenta voluntários participantes

do experimento.

FICHA CLÍNICA

Nº____

01.EXAME INICIAL:____/___________/_____

02. IDENTIFICAÇÃO:

NOME:_______________________________________________

ENDEREÇO:__________________________________________

TEL:____________ SEXO:________ IDADE:________

GRUPO DE PESQUISA:___________

03.HISTÓRIA MÉDICA:

1. Tem alergia a algum medicamento ou a alguma substância?---------------------

2. Está fazendo uso de algum medicamento ou fez uso de medicamentos nos

últimos 7 dias? -------------------

3. É fumante?---------

4. Ingere algum tipo de bebida alcoólica?-----------

5. Possui algum problema cardíaco ? ---------

6. Tem alteração na pressão arterial? -----------

7. Está grávida? -----------

8. Tem diabetes? ---------

9. Possui asma ou outra doença respiratória? --------

04. HISTÓRIA BUCO-DENTAL:

1. Com que freqüência escova os dentes?

---nunca ------vezes por semana -------uma vez por dia

------duas vezes por dia ------três vezes por dia ------mais de três vezes

2. Quando escova, qual(is) o(s) horário(s)?

-------manhã ---------tarde --------noite ---------outros

3. Usa outro recurso de higiene oral?

-----fio dental ----palitos ------ escovas interdentais --------

-------escova elétrica --------revelador de placa --------outros

4. Suas gengivas sangram? Se sim, quando?

-----não ------qualquer pressão ------quando come ------quando escova

5. Quanto tempo leva para escovar os dentes?-----------

6. Alguém já lhe ensinou a fazer higiene oral? O que sabe?-----------------

7. Está fazendo uso de alguma substância para bochechar?----------

8. Tem mau hálito?------------

_______________________________________________________________

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