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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MONTES CLAROS – UNIMONTES
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – PPGCB
MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE ADJUVANTE DE EXTRATOS DE
ORIGEM VEGETAL NA INDUÇÃO DE RESPOSTA IMUNE DE
COBAIOS VACINADOS CONTRA O PARVOVÍRUS SUÍNO
FERNANDA CÂNDIDA FILGUEIRAS
MONTES CLAROS – MINAS GERAIS
JULHO DE 2008
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FERNANDA CÂNDIDA FILGUEIRAS
AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE ADJUVANTE DE EXTRATOS DE
ORIGEM VEGETAL NA INDUÇÃO DE RESPOSTA IMUNE DE
COBAIOS VACINADOS CONTRA O PARVOVÍRUS SUÍNO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Biológicas da Universidade
Estadual de Montes Claros, como requisito para
obtenção do Título de Mestre em Ciências
Biológicas, área de concentração: Biologia e
Conservação.
ORIENTAÇÃO: Prof. Dr. Henrique Maia Valério
CO-ORIENTAÇÃO: Profª Drª Betânia Paiva Drumond
Dr. Igor Viana Brandi
MONTES CLAROS – MINAS GERAIS
JULHO DE 2008
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Filgueiras, Fernanda Cândida.
F481a Avaliação da capacidade adjuvante de extratos de origem vegetal na
indução de resposta imune de cobaios vacinados contra o parvovírus
suíno [manuscrito] / Fernanda Cândida Filgueiras. – 2008.
59 f. : il.
Referências : f. 46-58.
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Montes Claros –
Unimontes, Programa de Pós-
Graduação em Ciências Biológicas, área
de concentração Biologia e Conservação, 2008.
Orientador: Prof. Dr. Henrique Maia Valério.
1.Extratos vegetais. 2. Vacinas. 3. Adjuvantes. 4. Parvovírus suíno
.
I. Valério, Henrique Maia
. II. Universidade Estadual de Montes Claros.
III. Título.
Catalogação Biblioteca Central Prof. Antonio Jorge
“Não vos preocupeis, pois, com o dia de amanhã:
o dia de amanhã terá as suas preocupações próprias.
A cada dia basta o seu cuidado.”
(Mt 6, 34)
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pelo direcionamento, fortaleza e conforto. À Maria pela evidente
companhia.
Ao Igor pelo incentivo para o início desta dissertação, pela prontidão para o seu andamento
e pelo apoio na conclusão.
Aos professores Henrique Valério e Betânia Drumond, pelo apoio em momentos críticos e
pela atenção dispensada nas correções deste trabalho.
À todos os companheiros e amigos da Vallée, que me acompanharam durante toda essa
jornada e estavam sempre prontos a me ajudar.
Aos meus familiares pela torcida, paciência e compreensão nos momentos de ausência.
À Adler pelo apoio constante e pelos conselhos nos momentos difíceis.
À amiga Fran, pela amizade e auxílio.
Aos professores, colegas e funcionários do PPGCB, pelos ensinamentos, prontidão e
amizade.
Agradeço a Ronaldo pela exaustiva paciência e orientação nas análises estatísticas.
À Vallée S/A, que possibilitou a execução desse trabalho.
SUMÁRIO
RESUMO 1
ABSTRACT 2
LISTA DE FIGURAS 3
LISTA DE TABELAS 4
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS 5
1. INTRODUÇÃO 6
1.1. Parvovírus Suíno 6
1.2. Modelos animais 8
1.3. Adjuvantes de Vacinas 8
1.4. Emulsões 10
1.5. Nutrientes e Minerais imunoestimulantes 12
1.6. Extratos de origem vegetal 14
1.6.1. Própolis 15
1.6.2. Buriti (Mauritia flexuosa Mart.) 15
1.6.3. Amendoim (Arachis hypogaea) 16
2. JUSTIFICATIVA 17
3. OBJETIVO 19
3.1. Objetivo geral 19
3.2. Objetivos específicos 19
4. MATERIAL E MÉTODOS 20
4.1. Local 20
4.2. Soluções e Reagentes 21
4.2.1. Meio de Cultura celular e viral 21
4.2.2. Meio de Congelamento Celular 21
4.2.3. Tripsina 22
4.2.4. Tampão Salino Fosfatado 22
4.3. Pesquisa pelos adjuvantes teste 22
4.4. Linhagem Celular 22
4.4.1. Produção do Banco de Células 23
4.4.2. Sistema de Cultivo 23
4.5. Cepa Viral
23
4.5.1. Multiplicação Viral 23
4.6. Titulação Viral 24
4.7. Inativação Viral 24
4.8. Estudo de Adjuvantes 25
4.9. Testes de emulsão 25
4.10. Esterilidade das vacinas 27
4.11. Modelo experimental 27
4.12. Esquema de vacinação 27
4.13. Avaliação de inocuidade das vacinas 28
4.14. Coletas de sangue dos cobaios vacinados 28
4.15. Titulação de anticorpos neutralizantes 29
4.16. Avaliação da resposta imunológica de animais vacinados ao longo do
tempo 29
4.17. Análise Estatística 30
5. RESULTADOS 31
5.1. Cultivo das células SK6 31
5.2. Multiplicação e inativação viral 31
5.3. Testes de EHL dos óleos de amendoim e buriti 32
5.4. Teste de inocuidade das vacinas 34
5.5. Avaliação da capacidade adjuvante dos óleos de amendoim, buriti e extrato
de própolis verde sobre a síntese de anticorpos contra o parvovírus suíno 34
5.6. Comparação da resposta imunológica induzida pelas vacinas experimentais
frente a uma vacina comercial 36
6. DISCUSSÃO 38
7. CONCLUSÕES 45
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 46
9. ANEXO 59
RESUMO
Um aspecto importante no desenvolvimento de vacinas inativadas é o adjuvante. Muitos
dos adjuvantes de uso comum não são considerados ideais porque induzem resposta imune
inapropriada ou apresentam contra-indicações. Nesse trabalho foram formuladas vacinas
contra o parvovírus suíno (PVS) com o intuito de avaliar a capacidade adjuvante de
extratos de origem vegetal, como óleo de amendoim, óleo de buriti e extrato de própolis
verde em potencializar a resposta imune em cobaios. Os experimentos foram divididos em
duas etapas. Os resultados da primeira etapa demonstraram títulos de anticorpos maiores
induzidos pela vacina associada ao óleo de amendoim, aos 15 dias após a primeira
vacinação, quando comparada com a vacina sem adjuvante. Porém esse mesmo resultado
não foi observado na última coleta sorológica. Os adjuvantes formulados a base de extrato
de própolis verde e hidróxido de alumínio produziram resposta de títulos de anticorpos
semelhante entre si e diferentes da vacina sem adjuvante. A vacina com óleo de buriti não
exerceu atividade adjuvante quando comparada à vacina controle, sem adjuvante, em
nenhum dos dois tempos de coleta. Na segunda etapa do trabalho formulou-se novamente a
vacina contendo própolis verde, hidróxido de alumínio e outra contendo a associação de
hidróxido com própolis verde. Essas formulações e uma vacina comercial, considerada
como de boa aceitação no mercado, foram inoculadas em cobaios. Os resultados
demonstraram efeito adjuvante semelhante do hidróxido de alumínio, da associação de
hidróxido com própolis verde e da vacina comercial. Diferente do resultado obtido nos
estudos da primeira etapa, a vacina adicionada de própolis verde, separadamente, induziu
os menores títulos de anticorpos dentre todas as outras vacinas formuladas para essa
segunda parte do trabalho, sendo essa resposta diferente estatisticamente. Os resultados
desse estudo demonstram que o extrato de própolis verde pode ser utilizado juntamente
com o hidróxido de alumínio como adjuvante de vacina inativada contra o parvovírus
suíno com boa resposta imunológica.
Palavras-chave: extratos vegetais, vacinas, adjuvantes, parvovirus suíno
ABSTRACT
An important aspect in development of inactivated vaccines is the adjuvant. The majority
of adjuvants that are commonly used is not considered ideal because they induce
inappropriate immune response or present side effects. In this work, vaccines against
porcine parvovirus have been formulated to assess the adjuvant capacity of vegetal extracts
as peanut oil, buriti oil and the extract of green propolis in inducing the immune response
in guinea pigs. The experiments were divided in two stages. The vaccine formulated with
peanut oil induced higher antibodies titers after 15 days post vaccination (dpv), but not
after 60 dpv when compared to the vaccine formulated without adjuvant (control). The
extract of green propolis and aluminum hydroxide induced similar antibody titers that were
higher than the antibody titers induced by the vaccine without any adjuvant. The buriti oil
didn’t show adjuvant activity when it was compared to control vaccine. In the second stage
of the work, vaccines were formulated using green propolis, aluminum hydroxide and
hydroxide and green propolis association. These formulations and a commercial vaccine
have been inoculated in guinea pigs. Similar antibody titers were observed in animals
vaccinated with vaccine formulated with aluminum hydroxide and the association of
hydroxide and green propolis and with the commercial vaccine. This study has been
demonstrated that the extract of green propolis can be used with the aluminum hydroxide
as adjuvant of inactivated vaccine against the porcine parvovirus providing a satisfactory
immunologic response.
Key words: vegetal extracts, vaccines, adjuvants, porcine parvovirus
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Cobaios (Cavia porcellus) utilizados como modelo experimental das vacinas
formuladas com diferentes adjuvantes contra o parvovírus suíno 21
Figura 2. Titulação viral do parvovírus suíno pela técnica da hemoaglutinação 24
Figura 3. Células SK6 infectadas pelo parvovírus suíno 31
Figura 4. Teste de emulsões com diferentes valores de EHL para o óleo de amendoim 32
Figura 5. Teste de emulsão para o óleo de buriti utilizando EHL de 1,8 33
Figura 6. Teste de emulsões com diferentes valores de EHL para o óleo de buriti 33
Figura 7. Títulos de anticorpos anti-PVS em cobaios induzidos por vacinas formuladas
com diferentes adjuvantes, na resposta primária 35
Figura 8. Títulos de anticorpos anti-PVS em cobaios induzidos por vacinas formuladas
com diferentes adjuvantes, na resposta secundária 36
Figura 9. Síntese de anticorpos neutralizantes produzidos por cobaios em resposta às
vacinas formuladas com diferentes adjuvantes ao longo de 60 dias 37
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Equilíbrio Hidrófilo-Lipófilo (EHL) utilizados para os testes de emulsões dos
óleos de amendoim e buriti 26
Tabela 2. Relação da fase oleosa, aquosa e dos tensoativos Tween 80
e Span 80
definidos para estabelecer o Equilíbrio Hidrófilo-Lipófilo (EHL) do óleo de amendoim 26
Tabela 3. Relação da fase oleosa, aquosa e dos tensoativos Tween 80
e Span 80
definidos para estabelecer o Equilíbrio Hidrófilo-Lipófilo (EHL) do óleo de buriti 27
Tabela 4. Vacinas teste para os ensaios de avaliação imunológica 28
Tabela 5. Esquema de coleta de sangue dos animais para a avaliação da resposta
imunológica ao longo do tempo 30
Tabela 6. Medidas da separação de fase das emulsões de amendoim utilizando EHL de 5,0
a 7,5 e óleo de buriti com EHL de 1,8 a 7,5 33
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
A/O
Emulsões de água em óleo
ATCC
American Type Culture Collection
ABIPECS
Associação Brasileira da Indústria Produtora e Exportadora de carne suína
BSA
Soro Albumina Bovina (Albumin Bovine Serum)
COBEA
Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
DMEM
Dulbbeco’s Modified Eagle’s Médium
DMSO
Dimetilsulfóxido
ECP
Efeito Citopático
EHL
Equilíbrio Hidrófilo-Lipófilo
HA
Hemoaglutinação
HEPES
N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid
HI
Inibição da Hemoaglutinação
IBAMA
Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis
LTV
Laboratório de Tecnologia de Vacinas
O/A
Emulsões de óleo em água
PBS
Tampão salino-fosfatado (phosphate buffer solution)
PVS
Parvovírus Suíno
SFB
Soro Fetal Bovino
SINDAN
Sindicato Nacional da Indústria de Produtos para Saúde Animal
SK6
Swine Kidney tipo 6
UHA
Unidades Hemoaglutinantes
6
1. INTRODUÇÃO
O mercado de produtos para saúde animal movimenta cerca de 17 bilhões de
dólares por ano em todo o mundo. O Brasil ocupa a terceira colocação em receita no
ranking mundial deste setor, tendo obtido um faturamento de R$ 2,4 bilhões no ano de
2007. De acordo com o Sindicato Nacional da Indústria de Produtos para Saúde Animal
(SINDAN), o setor registrou um crescimento de 7,8% em relação ao ano de 2006,
praticamente o dobro em relação a média que vinha registrando nos últimos dois anos
(GAZETA MERCANTIL, 2008).
Segundo o relatório anual ABIPECS (2006) a produção nacional de carne suína
vem crescendo nos últimos anos. No ano de 2006, esta cresceu quase 6,0%, atingindo 2,86
milhões de toneladas, o que corresponde a 162 mil toneladas a mais do que o ano de 2005.
Em 2007, a produção foi de 3,0 milhões de toneladas. Diante deste cenário de crescimento
do mercado, diversas empresas estão focando esforços no desenvolvimento de vacinas que
resultem no aumento da produtividade da carne suína por reduzir o índice de doenças que
ocasionam perda da produção animal (FERNANDES, 2005).
A parvovirose suína é a principal responsável pela perda de produtividade dos
rebanhos de suínos no Brasil, devido a falhas reprodutivas. Martins e colaboradores (1984)
verificaram elevada ocorrência de anticorpos contra o parvovírus suíno (PVS) em
propriedades cujos animais não eram vacinados, indicando que este vírus já está
estabelecido no país desde, pelo menos, a década de sessenta. As vacinas contra o
parvovírus suíno, existentes no mercado, são formuladas, usualmente, com o antígeno
inativado adicionado de adjuvantes aquosos ou oleosos.
1.1. Parvovírus suíno
O parvovírus suíno (PVS) pertence à família Parvoviridae, subfamília Parvovirinae
e gênero Parvovirus. É um dos menores vírus que se conhece, com cerca de 20 nm de
diâmetro, de forma icosaédrica, não envelopado, com genoma composto por uma única fita
de DNA (TSAO et al., 1991 citado por FIELDS et al., 2001). O PVS causa uma
enfermidade reprodutiva que acomete fêmeas suínas soronegativas quando estas são
expostas ao vírus por via oronasal e os fetos ou embriões são infectados
transplacentariamente (MENGELING, 1992).
A parvovirose suína apresenta uma distribuição mundial, sendo considerada uma
das principais causas infecciosas de problemas reprodutivos nos suínos (THACKER e
7
GONZALEZ, 1988; DEE, 1995). A eficiência produtiva de uma suinocultura está
intimamente relacionada com a eficácia reprodutiva, ou seja, número de leitões produzidos
por porca, durante o ano. As manifestações clínicas da infecção pelo PVS em um rebanho
incluem morte embrionária e fetal com reabsorção, fetos mumificados, pequenas
leitegadas, natimortalidade e aumento do intervalo entre partos (VAN LEENGOED et al.,
1983) sem causar, contudo, quaisquer outros sinais clínicos em animais adultos (SOARES
e BERSANO, 1998).
Gouveia e colaboradores (1984) estudando a prevalência de anticorpos contra o
PVS no Estado de Minas Gerais, observaram 55,3% de positividade em 608 soros
examinados, sendo que todos os rebanhos testados apresentaram animais soropositivos. Em
outro estudo de plantéis suínos no Estado de São Paulo, 96% dos animais testados
apresentaram títulos de anticorpos anti–PVS, quando as amostras de soro eram submetidas
à técnica de Inibição da Hemoaglutinação (BERSANO et al., 1993). Martins e
colaboradores (1984), estudando animais pertencentes à granjas dos Estados de Santa
Catarina e Rio Grande do Sul, encontraram cerca de 80% dos animais sorologicamente
positivos para o PVS.
Na região sul do Brasil, considerada como o pólo mais tecnificado da suinocultura
brasileira, os dados referentes a reprodução e a produção são da ordem de 9,5 leitões/parto
e 1,9 partos/porca/ano, respectivamente. Leitoas que apresentam soroconversão para o
parvovírus produziram 0,9 leitões/ano a menos do que as não infectadas (GOMES 1992).
Parke e Burgess (1993) realizaram uma análise econômica da doença: num rebanho com
100 matrizes eles constataram perdas de aproximadamente 6 mil dólares em um ano,
demonstrando que a parvovirose é um grande problema do desempenho reprodutivo e
produtivo da suinocultura.
A prevenção desta doença tem sido feita pela vacinação, ou pelo método de
retroinfecção, objetivando a imunização de todas as leitoas de rebanhos infectados antes da
primeira cobrição (LOBATO et al., 1993). A vacinação é o método de controle específico
mais seguro e eficaz de proporcionar imunidade a um plantel suíno frente à parvovirose
suína. Vacinas atenuadas e inativadas têm sido produzidas e testadas em animais de
laboratório e suínos por vários pesquisadores, mas, devido a maior segurança, as vacinas
inativadas são as mais utilizadas em todo o mundo (THOMSON e PROZESKY, 1994). O
esquema de vacinação varia, mas de uma maneira geral todos os animais, duas semanas
após serem vacinados, devem receber um reforço (FERNANDES, 2005).
8
O diagnóstico direto da parvovirose suína é baseado na detecção e identificação de
antígenos virais pelas técnicas de hemoaglutinação em suspensão de órgãos fetais (HA) ou
imunofluorescência em cortes de tecidos fetais (MENGELING e PAUL, 1986).
1.2. Modelos animais
O estabelecimento de modelos animais tem dinamizado as pesquisas em diversas
áreas da microbiologia, incluindo estudos de patogenia, desenvolvimento de vacinas e
terapêuticos. O uso de modelos experimentais apresenta vantagens para testes de vacinas
como a possibilidade de avaliar grande número de animais, permitindo maior
reprodutibilidade dos resultados, a manutenção desses animais em condições controláveis,
minimizando fatores que possam interferir nos resultados, a facilidade de obtenção de
animais que não tiveram contato prévio com o agente contra o qual a vacina está sendo
testada e a redução dos custos (NIEWIESK e PRINCE, 2002).
Lobato (1990) comparando os títulos de anticorpos em suínos e cobaios após
inoculação de duas doses de uma vacina inativada contra o parvovírus suíno mostrou que
os cobaios responderam com diferentes títulos a diferentes quantidades de antígeno e
apresentaram boa resposta à primeira e à segunda vacinação. Diante destes resultados, o
autor afirma que o cobaio é um animal eficiente para estabelecer o valor de vacinas
inativadas contra o parvovírus suíno. Da mesma forma, Fernandes (2005), em seu estudo
com vacinas inativadas contra o parvovírus suíno, verificou um perfil de resposta em
suínos bastante semelhante ao perfil da resposta em cobaios. Desta forma utilizou-se neste
trabalho o cobaio como modelo experimental.
1.3. Adjuvantes de vacinas
As principais categorias de vacinas veterinárias comerciais são as inativadas e as
atenuadas. As vacinas que apresentam os agentes de infecção atenuados geneticamente
apresentam mecanismos endógenos que aumentam a resposta imune celular e humoral,
porém podem ser responsáveis por efeitos adversos (SHIRODKAR et al., 1990;
BOMFORD, 1989). Essas reações podem ser contornadas pelo uso de vacinas contendo o
antígeno inativado. No entanto, o antígeno inativado é um imunógeno fraco, gerando
resposta imune apenas do tipo humoral, em muitas ocasiões com baixo título de anticorpos
e que persistem por curto período de tempo (CORTESE et al., 1998), necessitando assim
de agentes exógenos para alcançar níveis apropriados de imunogenicidade (SHIRODKAR
et al., 1990).
9
O termo adjuvante (do latim, adjuvare, ajudar) foi primeiramente descrito na
década de 1920 como uma substância que, usada em combinação com um antígeno
específico, produz mais imunidade que o antígeno sozinho (SINGH e O’HAGAN, 1999),
potencializando as respostas imune humoral e/ou celular (ZUFFA et al., 1985; STORNI et
al., 2005; BARR et al., 2006). A adição desses adjuvantes imunológicos em vacinas
inativadas pode induzir resposta imune mais potente e duradoura, ou seja, tanto em relação
aos títulos médios de anticorpos quanto ao período de proteção pós-vacinal (THOMAS,
1986). Além disso, os adjuvantes podem servir para outros propósitos como, aumentar a
estabilidade de vacinas que contenham mais de um componente, reduzir a toxicidade dos
constituintes da vacina e reduzir a quantidade de antígeno ou o número de imunizações
necessárias para uma proteção imunológica específica (SHIRODKAR et al., 1990).
Aumentando a potência das vacinas pelo uso de adjuvantes também pode-se reduzir a dose
de vacina requerida para atingir uma resposta imune protetora. Por exemplo, quando
adicionado de adjuvante, utilizou-se apenas 10% do antígeno de superfície do vírus da
hepatite B quando comparado ao antígeno puro (DONELLY, 1997).
Ungar (1966) trabalhando com vacina antitetânica observou que para o incremento
da imunogenicidade do toxóide tetânico e conseqüente taxa de imunização foi necessária a
inclusão de adjuvantes imunológicos e que um bom adjuvante pode aumentar a potência de
toxóides comerciais em níveis superiores a 1000 vezes.
Teoricamente, cada molécula ou substância capaz de amplificar ou intensificar a
cascata de eventos imunológicos que compõem a resposta imune pode ser reconhecida
como adjuvante (SCHIJNS, 2000).
Os adjuvantes podem ser divididos em dois grupos principais: adjuvantes solúveis
em água e adjuvantes oleosos (WOODARD, 1990). Adjuvantes aquosos incluem o
hidróxido de alumínio, o qual é amplamente utilizado clinicamente (HORZINEK et al,
1997) sendo o único adjuvante aprovado para o uso em humanos (BOMFORD, 1989). Sua
atividade biológica consiste de pelo menos três componentes: formação de depósito de
antígeno nos tecidos levando à exposição prolongada, produção de antígenos particulados
para facilitar a ação das células apresentadoras de antígeno e ativação do complemento e
estimulação de macrófagos por induzir retenção e ativação de linfócitos (revisado por
HUNTER, 2002). Preparações de adjuvantes oleosos, são extensivamente usados em
vacinas veterinárias e caracterizam-se pela formação de depósitos, esta massa depositada
de adjuvante e antígenos permanece no tecido por um período prolongado, atraindo assim
leucócitos. Os géis de alumínio e os óleos minerais são os principais adjuvantes de vacinas
10
veterinárias (HORZINEK et al, 1997). Devido a alguns efeitos adversos provocados pelos
óleos minerais, como a formação de lesões ulcerativas no local da injeção, os óleos
vegetais, por conterem componentes que são metabolizados ou excretados pelo organismo
do animal, são testados na tentativa de superar as objeções dos adjuvantes oleosos de base
mineral (EDELMAN, 1980).
Atualmente, alguns tipos de óleos vegetais vêm sendo estudados como adjuvantes
alternativos como por exemplo, o óleo de soja e o de amendoim (CHANG et al., 1998),
principalmente pelo fato de serem biodegradáveis e de baixo custo de obtenção. Além
disso eles apresentam, normalmente, menos reações adversas indesejáveis, como ocorre
com adjuvantes baseados em óleos de natureza mineral.
As primeiras análises sobre o efeito de óleos vegetais utilizados como adjuvantes de
vacinas foram realizados por Hilleman em 1966. Na ocasião, uma formulação que continha
86% de óleo de amendoim, 10% de Arlacel A
(surfactante) e 4% de monoesterato de
alumínio (estabilizador), nomeada adjuvant 65
, mostrou-se muito potente, segura e
comparável ao Adjuvante Incompleto de Freund, ao ser testada em humanos. Porém,
mesmo tendo sido licenciada em alguns países, seu uso foi suspenso devido à reatividade
em humanos quando presente em determinados lotes de vacinas. Murray e colaboradores
(1972), mostraram que a tal reatividade poderia estar relacionada ao Arlacel A
, composto
químico carcinógeno em alguns tipos de camundongos.
Kimura e colaboradores (1978), mostraram que a emulsão de óleo de sésamo é tão
efetiva quanto o adjuvante incompleto de Freund na estimulação da produção de
anticorpos, permanecendo estável por pelo menos três meses a 4ºC, sem diminuir sua
capacidade adjuvante, causando menor reação nos tecidos e linfonodos regionais.
1.4. Emulsões
Emulsões são sistemas heterogêneos compostos, geralmente, por dois líquidos
imiscíveis, um dos quais está disperso no outro na forma de gotículas, caracterizando cada
qual uma fase da emulsão, ou seja, uma fase aquosa e uma fase oleosa (SILVA e
SOARES, 1996; LIEBERMAN et al., 1988). Para uma emulsão é necessário que um
líquido se encontre dividido em pequeníssimos glóbulos no seio de um outro, sendo que a
fase que se apresentar dividida constitui a fase interna, dispersa ou descontínua, ao passo
que o líquido que rodeia as gotículas da fase dispersa é denominado fase externa,
dispersante ou contínua (PRISTA et al., 1992).
11
A estabilidade das emulsões deve-se, principalmente, ao uso de tensoativos na sua
preparação, compostos anfifílicos em cuja molécula existem grupamentos hidrófilos e
lipófilos, que posicionam-se entre as duas fases da emulsão (aquosa e oleosa), originando a
película interfacial que diminui a tensão entre elas estabilizando o sistema (GRIFFIN,
1949; LACHMAN et al., 1986).
A instabilidade de uma emulsão é causada pela incompatibilidade entre os dois
líquidos que formam a emulsão, gerando forças de repulsão entre os líquidos. Quanto
maior a tensão interfacial, tanto maior será a repulsão e mais rápida a separação dos
líquidos. A propriedade que gera a tensão interfacial é a polaridade da molécula. Quanto
maiores as diferenças de polaridade entre os líquidos a serem combinados em uma
emulsão, tanto mais difícil será manter a emulsão estável (CARMINI, 1997).
A formulação de antígenos em emulsões de óleo em água (O/A) permite uma
disseminação mais rápida da fase oleosa, reduzindo a inflamação no lugar da aplicação
comparado com a emulsão de água em óleo (A/O) (WOODARD, 1989), conhecida como
adjuvantes depósito. Estes tipos de adjuvantes aumentam as respostas dos anticorpos
lentamente e liberam pequenas quantidades do antígeno durante um longo período de
tempo (ALEXANDER e BREWER, 1995). Para produzir uma emulsão óleo em água são
utilizadas misturas de fase aquosa e oleosa contendo emulsificantes para estabilizar as
gotículas de óleo (OTT et al.,1995). Antígenos podem ser incorporados na emulsão
durante o processo de emulsificação ou adicionados à emulsão após ela ter sido formada
(DONELLY, 1997). Os antígenos hidrofílicos pode ser emulsificados em A/O e os
antígenos lipofílicos em emulsões de O/A (BECHER, 1965).
O Equilíbrio Hidrófilo-Lipófilo (EHL) é uma característica dos tensoativos e está
intimamente ligado à estrutura da molécula do tensoativo. EHL representa um sistema de
classificação dos tensoativos, tendo como base os parâmetros de solubilidade desses
compostos em solventes polares e/ou apolares (TREGUIER et al., 1972).
A determinação do EHL é realizada pela preparação de emulsões seriadas dos óleos
obtidas a custa de um emulgente ou um par destes de EHL conhecidos, misturados em
proporções variáveis, de modo a originarem valores definidos e escalonados de EHL. O
EHL de um determinado óleo corresponderá ao EHL da mistura do par de tensoativos que,
dentro das condições operatórias de trabalho, permitirá obter com esse óleo uma emulsão
mais estável (PRISTA et al., 1992; TREGUIER et al., 1972).
12
O EHL da mistura receberá um valor intermediário entre os valores de EHL dos
dois tensoativos. A fórmula abaixo é utilizada para calcular o valor do EHL da mistura dos
tensoativos:
onde:
EHLm = equivale ao EHL da mistura de tensoativos
EHLa = equivale ao EHL do tensoativo lipófilo
EHLb = equivale ao EHL do tensoativo hidrófilo
X = equivale a fração percentual do tensoativo lipófilo
Em muitos estudos realizados com o intuito de encontrar um par de tensoativos
ótimo para obter um sistema emulsionado estável, é prática comum manter constante a
quantidade total da mistura de tensoativos, enquanto os limites dos tensoativos hidrófilos e
lipófilos são variados. Embora o sistema EHL seja muito simples de trabalhar, sua
principal desvantagem tem sido a falta de precisão para predizer a composição ótima
requerida para formular emulsões (LIN, 1991).
1.5. Nutrientes e minerais imunoestimulantes
Há alguns anos identificou-se que algumas substâncias biológicas podem
influenciar na prevenção de várias doenças por ativar o sistema de defesa do organismo.
Estas substâncias foram designadas imunoestimulantes, e podem ser produzidas por
diferentes fontes (ENGSTAD e ROBERTSEN, 1993).
Várias classes de substâncias, naturalmente presentes nos alimentos, apresentam
propriedades funcionais fisiológicas. Os minerais e nutrientes mais conhecidos que
atribuem funções fisiológicas no sentido de estimular o sistema imune são selênio, zinco,
β-caroteno, piridoxina (vitamina B
6
), vitamina B
12,
ácido ascórbico (vitamina C), α-
tocoferol (vitamina E), colecalciferol (vitamina D) e flavonóides (KRUNGER e MANN,
2003; ASSIS, 2007; BRUNETTO et al., 2007).
Os carotenóides têm sido relacionados com a ativação do sistema imune e a
redução do risco de doenças degenerativas. Tais efeitos biológicos estão atribuídos à
propriedade antioxidante dos carotenóides (BRITTON, 1995). Dos mais de 600
carotenóides conhecidos, aproximadamente 50 são precursores da vitamina A. Entre os
carotenóides, o β-caroteno é o mais abundante em alimentos e o que apresenta a maior
atividade desta vitamina (AMBRÓSIO et al., 2006).
EHL
m
= EHLa . (X) + EHLb . (100-X)
100
13
A vitamina A exerce inúmeras funções no organismo, destacando, por sua
relevância, a visão, o crescimento, a manutenção do tecido epitelial e da função
imunológica (OLSON, 1969; LI e NORRIS, 1996; EL BEITUNE et al., 2003). Em estudos
experimentais, a deficiência de vitamina A associa-se à redução da produção de anticorpos
contra polissacarídeos bacterianos e antígenos protéicos (PARENT et al., 1984).
As concentrações fisiológicas dos retinóides estão relacionadas à resistência
orgânica contra as infecções. Nesse contexto, há evidências de que os retinóides modulam
a resposta de células fagocitárias, estimulando a fagocitose e a ativação da citotoxicidade
mediada por células (GARBE et al., 1992; SEMBA et al.,1993).
Entre os imunoestimulantes mais estudados estão o zinco orgânico e a vitamina E
(revisado por CARDOSO et al., 2004). A vitamina E está presente em grandes quantidades
nos óleos vegetais e sementes oleaginosas (AZZI e STOCKER, 2000) e tem atuação
importante sobre o sistema imune. Possui influência na proliferação das células que
compõe o sistema imune e de produção de anticorpos, e também apresenta ação
antioxidante e protetora da integridade das membranas (revisado por CARDOSO et al.,
2004). A vitamina E estimula a atividade de macrófagos e neutrófilos circulantes e também
é relatada como estimulante da atividade de linfócitos T, resultando no aumento na
atividade fagocítica e de produção de anticorpos contra diversos antígenos (revisado por
CARDOSO et al.,2004).
A vitamina E tem a capacidade de impedir a propagação das reações induzidas
pelos radicais livres nas membranas biológicas. Os danos oxidativos podem ser inibidos
pela ação antioxidante dessa vitamina, juntamente com a vitamina C e os carotenóides,
constituindo um dos principais mecanismos de defesa endógena do organismo (BIANCHI
e ANTUNES, 1999).
De acordo com Tengerdy e Lacetera (1991), as vitaminas A e E são
imunopotenciadores porque elas protegem as células sensíveis do sistema imune dos danos
oxidativos e aumentam a interação celular por alteração da membrana.
Os flavonóides englobam uma classe importante de substâncias de origem natural
encontrados com frequência na natureza, unicamente em vegetais. Tais compostos
possuem uma série de propriedades farmacológicas que os fazem atuar sobre os sistemas
biológicos, por exemplo, como imunoestimulante (LOPES, 2003).
14
1.6. Extratos de origem vegetal
A utilização de extratos vegetais naturais data de milhares de anos e muitos deles
têm fornecido a base para modernos medicamentos (UTIYAMA, 2004). Os compostos
naturais, além de diversos, são extremamente específicos nas suas atividades biológicas,
constituindo uma das maiores fontes para a descoberta de novos produtos. O interesse por
esses compostos voltou a crescer tendo como expectativa diminuir o custo de pesquisa e
desenvolvimento de produtos (WERBACH e MURRAY, 1994). Recentemente, o
desenvolvimento de produtos, a partir de espécies vegetais, tem sido retomado no cenário
mundial, acompanhado de um aumento significativo nos investimentos em pesquisa. A
prospecção de novas moléculas volta a constituir uma demanda da indústria farmacêutica
no sentido de diminuir custos e aumentar a eficácia dos produtos comerciais voltados para
saúde humana e animal (VILLAS BOAS e GADELHA, 2007).
Apesar de pouco explorados, os produtos vegetais continuam sendo uma das
maiores fontes para a descoberta de novos medicamentos. Cerca de 50% dos
medicamentos utilizados são de origem sintética e cerca de 30% são originários de plantas,
isoladas diretamente ou produzidos por síntese a partir de um precursor vegetal
(KIRKPATRICK, 2002). Dos produtos anticâncer e antimicrobianos presentes no mercado
cerca de 60-80% são derivados dos vegetais (CRAGG et al., 1997).
O desenvolvimento de produtos de base natural ainda é complexo, envolvendo
estudos químicos, farmacológicos e clínicos (DREWS, 2000). Muitas vezes, o
conhecimento da população sobre os produtos naturais que as rodeiam pode ajudar os
pesquisadores a direcionar suas buscas por produtos que realmente apresentam efetividade.
Extratos oleosos de origem vegetal representam uma fonte de ácidos graxos
(COLLI, 2003) e vitaminas. O papel dos ácidos graxos poliinsaturados sobre o sistema
imune vem sendo bastante estudado nos últimos anos. Os interesses atuais giram em torno
dos ácidos graxos ômega 3 (ácido linolênico) e 6 (ácido linoléico), que são encontrados em
peixes, óleos vegetais e alguns tipos de sementes oleaginosas (ANDRADE e DO CARMO,
2006; PIMENTEL et al., 2005). Além de possuírem alto valor energético, eles apresentam
grande importância pelo seu papel farmacológico, pois participam de reações
inflamatórias e estão diretamente relacionados à resistência imune (WAITZBERG e
BORGES, 2002; CURI et al, 2002; MAHAN, 1998).
15
1.6.1. Própolis
A própolis, que revela uma variedade de atividades biológicas contra vírus,
bactérias, fungos, protozoários patogênicos e também células tumorais, é um material
resinoso produzido por abelhas (CASTRO, 2001). Muitos trabalhos ilustram a diversidade
de atividades biológicas da própolis e, dentre elas, a imunomoduladora, apesar de que
muitos dos mecanismos de ação ainda são desconhecidos (ORSI et al., 2000; CASTRO,
2001; PARK, 2002; GONSALES et al., 2006; ORSI et al., 2006;).
Estudos químicos revelaram a complexa composição da própolis, com mais de 300
constituintes, incluindo alguns compostos fenólicos tais como flavonóides e derivados dos
ácidos hidroxicinâmico. Estas características podem variar de acordo com as espécies das
abelhas e o período do ano. No entanto, a origem botânica parece ser o fator mais
importante a ser considerado na tentativa de explicar a variabilidade química entre
diferentes amostras de própolis (BANKOVA et al.,2000).
A própolis verde, encontrada somente no Brasil, é produzida a partir de uma planta
comumente conhecida como “Alecrim do Campo” (Baccharis dracunculifolia). Esta
espécie não é adaptada às condições naturais de outros países conferindo para a própolis
verde características químicas e biológicas próprias (MIYATAKA et al.,1997).
1.6.2. Buriti (Mauritia flexuosa Mart.)
O buriti, de bom aproveitamento econômico no estado selvagem, e mais ainda se
for racionalmente melhorado e cultivado, atualmente encontra-se sub utilizado. O seu
aproveitamento atual se restringe apenas aos interesses domésticos das populações locais.
É encontrado principalmente na região norte, como também em extensas áreas do Brasil
Central (GODOY e RODRIGUEZ-AMAYA, 1995).
Fruta nativa do cerrado, o buriti apresenta teores de vitaminas do complexo B, tais
como as vitaminas B1, B2 e PP, equivalentes ou superiores aos encontrados em frutas
como o abacate, a banana e a goiaba, tradicionalmente consideradas como boas fontes
destas vitaminas (EMBRAPA, 2008).
Existem vários alimentos que são fontes de carotenóides, entretanto o buriti e o
dendê, que são frutos de palmeiras, se destacam como as fontes mais ricas de pró-vitamina
A, encontradas na biodiversidade brasileira (RODRIGUEZ-AMAYA, 1997). Devido às
grandes quantidades de β-caroteno, α-caroteno e γ-caroteno, o buriti é uma das maiores
reservas naturais de pró-vitamina A, apresentando um valor de vitamina A em torno de
6.500 ER (equivalentes de retinol) / 100 g, levando-se em consideração apenas as pró-
16
vitaminas e suas respectivas atividades (GODOY e RODRIGUEZ-AMAYA, 1995). O teor
de vitamina A do óleo de buriti é também superior ao óleo de milho refinado, óleo de
fígado de bacalhau e de cenoura (PEIXOTO, 1973).
O óleo de buriti revelou-se 10 vezes mais rico em β-caroteno que o óleo de dendê
(MARIATH et al., 1989), sendo detectado em quantidades substanciais, numa faixa de
334,8 a 398,1 µg/g, representando em média 70% dos carotenóides totais presentes no
buriti (GODOY e RODRIGUEZ-AMAYA, 1995). O buriti também é rico em cálcio (113
mg/100 g), possui 26 mg/100 g de ácido ascórbico, 19 mg/100 g de fósforo, 3,5 mg/100 g
de ferro e 11,4 g/100 g de fibra (PEIXOTO, 1973). A polpa corresponde a 30% do fruto,
apresentando 23% de óleo que contém alto teor de ácido oléico e ácidos insaturados
(EMBRAPA CERRADOS, 2002).
1.6.3. Amendoim (Arachis hypogaea)
O amendoim é rico em energia e seu grão contém 45-50% de óleo (KASAI et al.,
1998), composto principalmente pelos ácidos oléico, linoléico e palmítico, perfazendo
mais de 80% do total dos ácidos graxos da semente do amendoim. A importância do
consumo do amendoim reside no fato de ser um alimento de alto valor nutricional, rico em
proteínas, vitaminas do complexo B e E e vários minerais, em que o potássio, magnésio,
fósforo, ferro e zinco são os principais (EMBRAPA, 2005).
Amendoins são uma boa fonte de niacina, portanto contribuem para uma boa saúde
do cérebro e da circulação sangüínea (BUTTERWORTH, 2004). Pesquisas recentes sobre
amendoins e nozes em geral encontraram antioxidantes e outras substâncias químicas que
podem trazer benefícios à saúde (DILLEHAY, 2007). São também uma fonte importante
de resveratrol, um composto químico estudado por suas características contra o
envelhecimento e também por estar associado à redução de algumas doenças
cardiovasculares e de risco de câncer (YAO, 2004).
De acordo com o PDCAAS (protein digestibility corrected amino acids score), as
proteínas do amendoim e de outros legumes, como a soja, por exemplo, apresentam valores
nutricionais equivalentes as proteínas da carne e de ovos para o crescimento e saúde
humanos (YAO, 2004).
17
2. JUSTIFICATIVA
Dados do IBAMA relatam que o Brasil detém cerca de 20% de toda a
biodiversidade do planeta. O fato do Brasil contar com uma notável riqueza biológica lhe
dá uma vantagem competitiva para o desenvolvimento da biotecnologia, gerando maior
agilidade nos processos de transformação do conhecimento científico em produtos e
processos inovadores. Produtos de origem vegetal atendem aos mais diversos segmentos
industriais, devido às propriedades medicinais e o seu uso sustentável proporciona o
desenvolvimento de produtos de uso comercial e a conservação dos recursos naturais.
A prospecção de novos produtos, a partir de espécies vegetais, contribui para o
conhecimento da biodiversidade e do seu potencial, favorecendo o crescimento econômico.
Portanto, pesquisas com extratos vegetais são promissoras e de fundamental importância
na área da bioprospecção, sendo fomentadas por diversas instituições públicas e privadas.
A indústria farmacêutica tem experimentado ondas de inovações, com o
surgimento, nos últimos anos, de um crescente interesse nas substâncias de fontes naturais.
Os óleos vegetais, por exemplo, apresentam inúmeros benefícios, muitos contêm vitaminas
e minerais que exercem importante papel no funcionamento do sistema imune. Além disso,
os óleos são fontes de ácidos graxos, importantes para a regulação de processos
fisiológicos do organismo, sendo alguns deles reportados como agentes
imunorreguladores, exercendo ação sobre células-T.
Progressos recentes no desenvolvimento de vacinas têm permitido seu uso não
somente como produto profilático, mas também no tratamento de câncer, desordens
imunológicas e infecções crônicas. A produção de vacinas virais inativadas é um processo
que envolve a propagação celular seguida da introdução do vírus para sua multiplicação.
Ao final do processo, o agente infeccioso é submetido a uma etapa de inativação e, na
formulação final do produto, adicionam-se, ainda, adjuvantes à suspensão de antígenos.
As vacinas virais inativadas são normalmente produzidas a partir de amostras
virulentas, que são tratadas com agentes químicos ou físicos que levam à perda de
infectividade, mas não da imunogencidade. Desde que elaboradas adequadamente, essas
vacinas são seguras, pois não há multiplicação do agente infeccioso. Entretanto, as vacinas
inativadas devem conter grandes quantidades do antígeno e, normalmente, exigem mais de
uma aplicação, além do uso de adjuvantes para induzir uma resposta imunológica
adequada.
18
Há mais de 60 anos os adjuvantes vêm sendo utilizados na imunologia
experimental e na vacinação animal onde seu uso adequado dispensa doses elevadas, bem
como aplicações freqüentes do antígeno sensibilizante. A escolha do adjuvante de uma
vacina é, sem dúvida, uma das principais etapas a serem cumpridas durante o projeto de
desenvolvimento de um produto. O seu uso nas vacinas é uma tendência do mercado por
conferir imunidade com altos índices de eficácia, induzindo e prolongando a resposta
imune.
A parvovirose suína é uma doença infecciosa causada pelo parvovírus suíno,
caracterizada por perdas econômicas devido a falhas reprodutivas nos animais infectados.
É um dos problemas mais sérios da suinocultura industrial em todo o mundo, sendo
enzoótica em grande número de rebanhos sorologicamente testados. O uso de vacinas
inativadas tem-se mostrado o método mais efetivo para o controle da parvovirose suína,
garantindo que fêmeas adultas desenvolvam imunidade ativa antes da primeira procriação.
Neste estudo, a capacidade adjuvante de extratos de origem vegetal é testada na
formulação de vacinas contendo o parvovírus suíno inativado como antígeno, sendo
avaliada a resposta imunológica de cobaios vacinados. A execução do projeto foi realizada
em parceria da Universidade Estadual de Montes Claros (Unimontes) com a Vallée S.A.
(Montes Claros - MG), empresa nacional do setor veterinário, promovendo a integração
entre esses dois setores para o desenvolvimento de novos produtos imunobiológicos.
19
3. OBJETIVO
3.1. Objetivo Geral
Avaliar a capacidade de extratos de origem vegetal como adjuvante de vacinas
experimentais inativadas contra o parvovírus suíno.
3.2. Objetivos Específicos
- Avaliar o potencial do extrato de própolis verde e óleos de buriti e amendoim em
estimular o sistema imunológico, quando incorporado a vacinas contra o parvovírus
suíno.
- Determinar o valor do Equilíbrio Hidrófilo-Lipófilo (EHL) para os óleos de amendoim
e buriti que proporcione uma maior estabilidade das emulsões.
- Avaliar a inocuidade do extrato de própolis verde e óleos de buriti e amendoim quando
utilizado como adjuvante nas vacinas contra o Parvovírus Suíno.
- Comparar a resposta imune dos animais vacinados com a vacina experimental frente a
vacina comercial disponível contra o parvovírus suíno.
20
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Local
O trabalho foi realizado no Laboratório de Tecnologia de Vacinas (LTV) da Vallée
S/A. A imunização dos animais foi realizada no Biotério de pesquisa e desenvolvimento da
Vallée S/A, que possui salas separadas para criação, infecção e quarentena de cobaios.
Utilizou-se na pesquisa cobaios (Cavia porcellus) de ambos os sexos e de peso
variando de 350 g a 450 g. Os animais foram mantidos em instalações projetadas para
criação e/ou infecção de animais de forma a atender às recomendações do Colégio
Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA). Os cobaios foram alojados em gaiolas de
polipropileno, que eram limpas três vezes por semana, substituindo as gaiolas sujas por
outras limpas e forradas com maravalha especial de pinus.
No Biotério, os animais foram mantidos à temperatura de 22 a 24ºC. As salas de
criação são dotadas de um sistema de ventilação para controlar a temperatura e umidade,
com 10 a 15 trocas de ar por hora. Foi estabelecido o fotoperíodo nas salas dos animais
para 12 horas de claro e 12 horas de escuro.
Foram fornecidas, aos animais, água filtrada em frascos de plástico com rolhas de
borracha, usadas como tampa, e bico em aço inox além de ração peletizada específica para
cobaios (Figura 1). Tanto a ração quanto a água eram trocadas às segundas, quartas e
sextas-feiras. Todos os resíduos gerados no biotério foram destinados à incineração.
Os experimentos com a utilização dos animais foram aprovados quanto aos
princípios éticos de experimentação animal pela Comissão de Ética em Experimentação
Animal da Universidade Federal de Minas Gerais, conforme protocolo 229/2007 e
certificado de aprovação para uso de animais (Anexo 1).
21
Figura 1: Cobaios (Cavia porcellus) utilizados como modelo experimental das vacinas
formuladas com diferentes adjuvantes contra o parvovírus suíno.
4.2. Soluções e Reagentes
4.2.1. Meio de cultura celular e viral
Utilizou-se para o cultivo das células o meio Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
– DMEM (Invitrogen
®
) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (Cultilab
®
), 1,5 g/L
de bicarbonato de sódio e de solução de antibiótico e antimicótico, composta de 7 g/L de
penicilina G potássica, 16 g/L de sulfato de neomicina e 0,025 g/L de fungizon. Para o
preparo utilizou-se água ultrapura produzida pelo sistema Milli Q (Millipore
®
). O pH foi
ajustado para 7,0.
O meio de infecção possui a mesma constituição do meio de células acrescido de
5,6 g/L de tampão HEPES (GIBCO
®
) e suplementado com 5% de Soro Fetal Bovino
(SFB).
A esterilização dos meios formulados foi feita por filtração em filtro descartável de
0,22 µm (Millipore
®
). Os meios foram armazenados a temperatura de 4ºC até o momento
do uso (FERNANDES, 2005)
4.2.2. Meio de congelamento celular
Utilizou-se para o congelamento das células o meio DMEM suplementado com
20% de Soro Fetal Bovino e 10% de Dimetilsulfóxido – DMSO (Merck
®
). O meio foi
esterilizado por filtração em membrana de 0,22 µm (Millipore
®
) (conforme Procedimento
Operacional Padrão (POP) – LTV/Vallée).
22
4.2.3. Tripsina
A formulação da solução de tripsina, utilizada para o desprendimento celular,
continha cloreto de sódio (10 g/L), cloreto de potássio (0,25 g/L), fosfato de sódio bibásico
(1,44 g/L), fosfato de potássio monobásico (0,25 g/L), fungison (0,0025 g/L), penicilina
(0,07 g/L), Verseno triplex – EDTA (0,5 g/L), tripsina 1:250 (2,5 g/L) e solução de
vermelho de fenol a 1% (1,2 mL/L). A esterilização da solução foi feita por filtração em
membrana de 0,22 µm (Millipore
®
) e esta foi armazenada a –20ºC (conforme POP –
LTV/Vallée).
4.2.4. Tampão salino-fosfatado
Preparou-se tampão salino-fosfatado (PBS) para diluição do vírus, de soro e para a
lavagem das hemácias. A solução foi preparada pela mistura de cloreto de sódio (8,5 g/L),
fosfato de sódio bibásico (1,2 g/L), fosfato de sódio monobásico (0,253 g/L) e solução de
Soro albumina bovina – BSA (Sigma
®
) a 22% (4,55 mL/L). O pH foi ajustado para 7,2
com solução de hidróxido de sódio 1,0 N ou ácido clorídrico 1,0 N. A solução foi filtrada
em membrana 0,22 µm (Millipore
®
) e armazenada a 4ºC (conforme POP – LTV/Vallée).
4.3. Pesquisa pelos adjuvantes testes
Durante a pesquisa dos adjuvantes a serem testados seguiu-se alguns passos.
Primeiramente buscou-se extratos de origem vegetal que apresentassem substâncias com
potencial em estimular o sistema imunológico e que pertencessem a flora nacional. Dessa
forma seriam agregados a prospecção de espécies vegetais, com potencial comercial, e o
uso sustentável dos recursos naturais. Um outro passo foi à busca por empresas que
trabalhassem com os extratos de interesse.
De posse de lista de espécies tidas como promissoras buscou-se fornecedores
especializados no ramo de extração. O óleo de buriti, amendoim e extrato de própolis verde
atenderam aos requisitos propostos, sendo cedidos gentilmente pelas empresas Croda do
Brasil Ltda, Campestre Indústria e Comércio de Óleos Vegetais Ltda e MN Própolis Ind. e
Com. Exp. Ltda, respectivamente.
4.4. Linhagem Celular
A multiplicação do vírus foi realizada em células de rim de suínos, SK6 (Swine
Kidney), obtidas junto à American Type Culture Collection (ATCC).
23
4.4.1. Produção do Banco de células
Para a produção do Banco de Trabalho de Células, culturas iniciadas com 1,0 x 10
5
céls/mL e 48 horas de cultivo, foram tratadas com tripsina para o desprendimento das
células. A concentração celular foi determinada por contagem em câmara de neubauer e as
células suspensas em meio de congelamento de forma a obter uma concentração final de
6,0 x 10
6
céls/mL. A suspensão celular foi distribuída em criotubos e as ampolas
transferidas para o ultrafreezer (ThermoForma
®
), onde permaneceram à temperatura de –
80ºC até o momento do uso (conforme POP – LTV/Vallée).
4.4.2. Sistema de Cultivo
As células foram produzidas em garrafas tipo T de poliestireno (Corning
®
) com
área de 75 cm
2
. Realizou-se sub-cultivos a cada 2 dias com o meio DMEM, preparado
conforme item 4.2.1, e mantidos à temperatura de 37ºC. Para isso utilizou-se 3 mL de PBS
para lavar a monocamada e cerca de 3 mL de solução de tripsina para a dissociação das
células por degradação da matriz extracelular, permitindo a suspensão e determinação da
concentração celular e início de um novo cultivo, com uma concentração inicial de 1,0 x
10
5
céls/mL (conforme POP – LTV/Vallée).
4.5. Cepa viral
Utilizou-se a cepa NADL2 do Parvovírus Suíno proveniente da ATCC para a
produção do antígeno viral.
4.5.1. Multiplicação viral
O vírus foi multiplicado em células SK6, de acordo com protocolo descrito por
Fernandes (2005). Monocamadas confluentes de SK6 foram tratadas com tripsina e
suspensas em meio de cultura celular na concentração de 1,0 x 10
5
céls/mL. As células
foram distribuídas em garrafas T75 e, após 24 horas, inoculadas com 3 mL da cepa padrão
NADL2 (ATCC) com título de 512 UHA, diluída 1000 x. As células foram incubadas a
37ºC por uma hora. A cada 15 minutos a garrafa era lentamente agitada para proporcionar
uma melhor adsorção viral. Após a adsorção, completou-se o volume para 19 mL com
meio de infecção (conforme POP – LTV/Vallée).
As células inoculadas foram incubadas a 37ºC por 120 horas. Visando o
rompimento celular e a conseqüente liberação das partículas virais ao meio externo foram
24
realizados três ciclos de congelamento e descongelamento. A suspensão viral foi coletada
e clarificada por centrifugação a 320 x g, por 15 minutos (SOARES e BERSANO, 1998).
4.6. Titulação viral
A titulação viral foi feita pelo teste de hemoaglutinação (HA), realizada em placas
de microtitulação de 96 poços com fundo em V, segundo o método descrito por Joo et al.
(1976).
O vírus produzido foi acrescido nas placas e realizada diluição seriada (1: 2 a 1:
2.048) utilizando tampão fosfato salina (PBS) como diluente. Hemácias de cobaios foram
lavadas com PBS e diluídas a fim de se obter suspensão de hemácias a 0,6% de células em
100 mL de PBS e transferida aos poços da microplaca. As placas foram incubadas durante
60 minutos à temperatura de 25ºC.
Realizou-se a leitura pela observação ou não da aglutinação das hemácias. A
presença de hemácias aglutinadas indicava a presença do vírus. O título foi dado pela
recíproca da maior diluição que produziu a completa aglutinação das hemácias.
Como títulos hemoaglutinantes são expressos como a recíproca da maior diluição
do vírus que causa hemoaglutinação completa (Figura 2C) (JOO et al, 1976), diluições
contendo suspensões virais que apresentavam aglutinação parcial ou incompleta (Figura
2B), não foram considerados para a titulação.
Figura 2. Titulação viral do parvovírus suíno pela técnica da hemoaglutinação. Poços da
microplaca com ausência do parvovírus suíno, demonstrada pela precipitação das hemácias
(A); poços da microplaca com aglutinação incompleta das hemácias (B) e poços da
microplaca com aglutinação completa das hemácias (C).
4.7. Inativação Viral
Após a clarificação viral foi adicionado ß-propiolactona na concentração final de
0,4% e a suspensão foi mantida a 100 rpm, 37ºC por seis horas. O pH foi ajustado para 7,5
com bicarbonato de sódio 7,5%, sempre que necessário (LOBATO, 1990). Após a
inativação, a suspensão viral foi mantida sob refrigeração a 4°C até o momento do uso.
25
O controle de vírus residual não inativado foi feito através da inoculação de uma
alíquota de vírus inativado em células SK6, que foram observadas quanto à presença ou
ausência de efeito citopático (ECP). Realizou-se três sub-cultivos com sete dias de
incubação cada (adaptado de Fernandes, 2005).
4.8. Estudos de Adjuvantes
Após a inativação, foram preparadas cinco formulações de vacinas, duas oleosas e
três aquosas. A quantidade de antígeno foi padronizada com título de 15.360 unidades
hemoaglutinantes (UHA)/dose em todas as vacinas formuladas. As vacinas oleaginosas
foram formuladas na proporção de 58% de fase oleosa, 2% de tensoativo e 40% de fase
antigênica (vírus inativado) com título hemoaglutinante de 1024 UHA. Já as vacinas
aquosas foram obtidas pela adição de 20% de adjuvante na porção viral inativada. As
vacinas aquosas foram mantidas em agitação para que ocorresse a adsorção do antígeno
com o adjuvante e as oleosas foram emulsionadas.
Os experimentos foram realizados em duas etapas. Na primeira etapa foram
formulados 05 tipos de vacinas com vírus inativado e os seguintes adjuvantes:
a) óleo de buriti, obtido junto à empresa Croda do Brasil Ltda, Campinas – SP.
b) óleo de amendoim, obtido junto à empresa Campestre Indústria e Comércio de Óleos
Vegetais Ltda, São Bernardo do Campo – SP.
c) extrato de própolis verde, com concentração de 20% (m/v), obtido junto à empresa MN
Própolis Ind. e Com. Exp. Ltda, Mogi das Cruzes – SP.
d) hidróxido de alumínio produzido pela Vallée S/A como controle positivo dos adjuvantes
aquosos.
e) meio de cultura: controle negativo.
4.9. Testes de emulsão
Realizou-se a determinação do Equilíbrio Hidrófilo-Lipófilo (EHL) das preparações
contendo óleos de amendoim e buriti. Foram testadas emulsões seriadas dos óleos
utilizando tensoativos de EHL conhecidos, misturados em proporções variáveis, de modo a
obter valores definidos e escalonados de EHL. Os tensoativos utilizados foram Trioleato de
sorbitana (Span 85
, de EHL 1,8), Monooleato de sorbitana (Span 80
, EHL 4,3) e
Monooleato de polioxietilenosorbitano (Tween 80
, EHL 15).
26
Utilizou-se 40% da fase aquosa, 58% da fase oleosa e 2% de tensoativos. As
emulsões foram preparadas utilizando agitador mecânico Silverson
®
a 5000 rpm por 10
minutos. Os valores de EHL testados estão representados na Tabela 1.
Tabela 1. Equilíbrio Hidrófilo-Lipófilo (EHL) utilizados para os testes de emulsões dos
óleos de amendoim e buriti.
As emulsões preparadas foram mantidas em repouso à temperatura de 4ºC. Admite-
se que o valor de EHL da emulsão mais estável corresponde ao do óleo em ensaio (ZANIN
et al., 2002). O EHL da emulsão é a soma dos valores correspondentes aos do EHL dos
seus constituintes, de acordo com as respectivas concentrações (WILKINSON et al.,
1990). Para a formulação das vacinas a serem testadas, utilizou-se a emulsão que
apresentou maior estabilidade dentre todos os valores de EHL testados (Tabelas 2 e 3).
Tabela 2. Relação da fase oleosa, aquosa e dos tensoativos Tween 80
e Span 80
definidos para estabelecer o Equilíbrio Hidrófilo-Lipófilo (EHL) do óleo de amendoim.
Emulsão Tween 80 (%) Span 80 (%) Fase oleosa (mL) Fase aquosa (mL) EHL
1 7 93 58 40 5,0
2 9 91 58 40 5,3
3 15 85 58 40 5,9
4 20 80 58 40 6,4
5 25 75 58 40 7,0
6 30 70 58 40 7,5
Para a emulsão 7 utilizou-se o óleo de buriti. Os volumes da fase oleosa e aquosa
corresponderam aos apresentados na tabela 3 e como surfactante empregou-se o Span 85
,
representando 100% do tensoativo utilizado para este teste de emulsão, sendo o valor do
EHL de 1,8.
ÓLEOS
Amendoim 5,0; 5,3; 5,9; 6,4; 7,0 e 7,5
Buriti 1,8; 5,0; 5,3; 6,4; 7,0 e 7,5
EHL
27
Tabela 3. Relação da fase oleosa, aquosa e dos tensoativos Tween 80
e Span 80
definidos para estabelecer o Equilíbrio Hidrófilo-Lipófilo (EHL) do óleo de buriti.
4.10. Esterilidade das vacinas
Empregou-se caldo tioglicolato e triptose, para a verificação do crescimento de
bactérias e ágar Sabouraud, para a observação da possível presença de fungos. Amostras
das vacinas foram transferidas para tubos contendo caldo tioglicolato e triptose, mantidos a
37ºC e caldo Sabouraud, incubados à temperatura ambiente. Realizou-se as leituras
diariamente por um período de 14 dias (USP, 2007).
4.11. Modelo experimental
Como o enfoque deste trabalho é o da prospecção por extratos com potencial
adjuvante em vacinas contra o PVS, utilizou-se cobaios como modelo experimental com o
intuito de obter uma visão geral da atuação dos diferentes adjuvantes experimentais. Além
disso, o uso desses animais contribui por diminuir o custo para sua aquisição e manutenção
além da facilidade de manejo para as coletas dos volumes sanguíneos adequados às
necessidades da análise.
4.12. Esquema de vacinação
Os testes de avaliação imunológica das vacinas foram realizados no biotério
experimental da Vallée S.A. Os animais foram divididos ao acaso em seis grupos de 10
animais para cada vacina. A Tabela 4 apresenta os grupos de animais vacinados. Os
animais do grupo 5 receberam vacina contendo meio de cultura, os do grupo 6 não foram
vacinados.
Os animais foram vacinados revacinados 15 dias após a primeira vacinação
(LOBATO et al., 1993). A via de administração das vacinas foi subcutânea.
Emulsão Tween 80 (%) Span 80 (%) Fase oleosa (mL) Fase aquosa (mL) EHL
8 7 93 58 40 5,0
9 9 91 58 40 5,3
10 20 80 58 40 6,4
11 25 75 58 40 7,0
12 30 70 58 40 7,5
28
Tabela 4: Vacinas teste para os ensaios de avaliação imunológica.
4.13. Avaliação de Inocuidade das vacinas
Todas as formulações de vacinas foram avaliadas quanto à inocuidade em cobaios.
Os animais foram avaliados durante 7 dias depois de cada uma das doses. Manifestação
dolorosa no local da aplicação, desenvolvimento de nódulos e alterações de
comportamento foram os principais parâmetros avaliados.
4.14. Coletas de sangue dos cobaios vacinados
Coletou-se amostras de sangue dos animais vacinados no dia 0 (dia da vacinação) e
dias 15 e 60 após a primeira vacinação (FERNANDES, 2005). As coletas de sangue foram
realizadas por punção cardíaca, permitindo a coleta de sangue em quantidade satisfatória
para obtenção de soro para realização da titulação de anticorpos neutralizantes em
triplicata.
Cada animal foi injetado por via subcutânea com atropina, na dose de 0,044 mg/ kg.
De 10 a 15 minutos após, os animais foram anestesiados via intramuscular com 100
µL/100 g peso vivo de uma solução contendo 2,5 mg/ 0,1 mL quetamina e 1 mg/ 0,1 mL
de cloridrato de xilazina. No momento da coleta, o cobaio foi posicionado em decúbito
lateral direito, fixando-se firmemente as extremidades. Uma área de aproximadamente 1,25
cm
2
, cobrindo o 4
o
e 5
o
espaços inter-costais, e 2,5 cm da linha média, foi desinfectada com
álcool iodado. A posição do coração foi localizada mediante a palpação digital de seus
batimentos. A punção foi realizada com agulha 20 x 38 mm através do espaço intercostal
correspondente, permitindo que o sangue fluísse lentamente para o interior da seringa e
quando se completou a extração, a seringa foi retirada lentamente (MANSONE, 1999).
Cerca de 2 mL de sangue foram coletados em tubos de ensaio. As amostras foram
processadas, por centrifugação a 400 x g por 15 minutos, para obtenção de um soro
límpido e livre de hemácias que foi então armazenado à temperatura de –20ºC. Estas
Grupos Vacinas
1 Adjuvante buriti
2 Adjuvante amendoim
3 Adjuvante própolis verde
4 Adjuvante hidróxido de alumínio
5 Sem adjuvante
6 Grupo controle
29
amostras de soro foram testadas para verificar a presença de anticorpos neutralizantes
contra o parvovírus suíno.
4.15. Titulação de anticorpos neutralizantes
Os anticorpos contra o parvovírus suíno foram detectados e titulados através do
teste de Inibição da Hemoaglutinação (HI). As reações de HI foram realizadas conforme
descrito por Joo et al. (1976).
Resumidamente, os soros foram inativados pelo calor (56ºC por 30 minutos) e
adsorvidos à temperatura ambiente por uma hora com uma solução de caulim a 25% em
solução salina borato (pH 9,0). Os adsorventes foram removidos por centrifugação a 1.500
x g por 10 minutos e o sobrenadante tratado com eritrócitos de cobaio à temperatura de 4ºC
por 1 hora. Novamente as amostras foram centrifugadas e o sobrenadante utilizado. Os
soros originais foram considerados como tendo sido diluídos 1:4 durante este tratamento.
Utilizou-se 100 µL de cada amostra de soro para a realização de diluições seriadas
na base 2. Os soros foram diluídos de 1: 8 até 1: 262.144 em PBS seriadamente, de forma a
completar um volume final de 50 µL para cada diluição, sobre as quais foram adicionados
50 µL de amostra viral positiva em HA, diluída de forma a conter 4 unidades
hemoaglutinantes (UHA)/50 µL de solução. A mistura vírus/soro foi incubada por uma
hora a 25ºC. Em seguida, foram adicionados 50 µL de hemácias de cobaios 0,6% de
células para 100 mL de PBS. Realizou-se a leitura das placas, após a incubação por duas
horas à temperatura de 25ºC, pela observação ou não da aglutinação das hemácias. O título
foi dado pela recíproca da maior diluição que resultou em HA negativo, demonstrada pela
ausência de hemoaglutinação das hemácias.
4.16. Avaliação da resposta imunológica de animais vacinados ao longo do tempo
Na segunda etapa avaliou-se a resposta das melhores vacinas frente a uma vacina
comercial. A vacina que induziu a produção de maior título de anticorpos neutralizantes
dentre as testadas na primeira etapa e a vacina controle foram formuladas novamente e
comparadas com uma vacina comercial contra o parvovírus suíno, como forma de inferir
sua eficácia.
Nesta fase utilizou-se quatro grupos de animais e cada grupo foi inoculado com
uma das vacinas. Em intervalos de 15 dias, iniciando no dia da primovacinação, subgrupos
de 3 animais foram anestesiados e amostras de sangue coletadas. A Tabela 5 apresenta o
esquema de coleta de sangue dos animais para a avaliação da resposta imunológica. As
30
amostras de sangue foram processadas para a titulação de anticorpos neutralizantes. Todas
as análises da segunda etapa deste trabalho foram realizadas nas mesmas condições que as
análises da primeira etapa.
Tabela 5. Esquema de coleta de sangue dos animais para a avaliação da resposta
imunológica ao longo do tempo.
4.17. Análise Estatística
A análise estatística foi realizada utilizando o programa ‘R’ versão 2.6.0. A
normalidade dos dados foi avaliada utilizando o teste ‘F’. As médias aritméticas dos
logaritmos na base 2 (Log 2) dos títulos de anticorpos foram submetidas a análise de
variância, considerando 5% de probabilidade, e para verificar diferença estatística entre as
médias foram realizadas comparações de médias com utilização do contraste.
0 15 30 45 60
1 3 3 3 3 3 15
2 3 3 3 3 3 15
3 3 3 3 3 3 15
4 3 3 3 3 3 15
Vacinas
Dias de coleta de sangue
Total de animais
31
5. RESULTADOS
5.1. Cultivo das células SK6
O cultivo das células SK6 utilizando garrafas T 75 como sistema de cultivo se
desenvolveu sem dificuldades. Após 72 horas de incubação a 37ºC, o meio apresentava-se
ácido e com células em suspensão, mas a monocamada mostrava-se completa. A fim de
reduzir a acidez do meio as células passaram a ser cultivadas no tempo de 48 horas, onde a
monocamada também apresentava-se completa.
5.2. Multiplicação e Inativação Viral
O vírus utilizado para a produção do banco de trabalho apresentava título viral de
256 UHA/ 50µL. Na multiplicação o título hemoaglutinante subiu de 256 UHA/ 50µL para
512 UHA/ 50µL. O parvovírus suíno, do banco de trabalho, foi multiplicado em 19
garrafas T 75, contendo células SK6, a fim de produzir antígeno para formulação das
vacinas. Após cerca de 72 horas de infecção já se observava buracos na monocamada em
decorrência do desprendimento celular. O vírus foi coletado com 120 horas de incubação,
momento em que a monocamada apresentava-se bastante destruída (Figura 3). O título
hemoaglutinante desta produção foi de 1024 UHA/ 50µL.
Figura 3. Células SK6 infectadas pelo parvovírus suíno. Aspecto da monocamada de
células SK6 íntegra (A); monocamada de células SK6 com efeito citopático provocado
pelo parvovírus suíno após 96 horas de incubação (B).
Ao final do teste de pesquisa de vírus residual não foi observado alterações na
monocamada das células quando esta foi comparada à monocamada de células não
infectadas, sendo a suspensão viral considerada inativada que posteriormente foi utilizada
para a formulação das vacinas.
32
5.3. Testes de EHL dos óleos de amendoim e buriti
A análise das emulsões com o óleo de buriti e óleo de amendoim foi feita por
visualização macroscópica da separação de fases oleosas e aquosas (Figuras 4, 5 e 6). A
emulsão 2, composta de 58% do óleo de amendoim, 40% de fase aquosa e 2% dos
tensoativos Tween 80
e Span 80
, nas proporções de 9 e 91 %, respectivamente, mostrou-
se a mais homogênea, correspondendo a emulsão de maior estabilidade dentre todas
testadas com o óleo de amendoim (Tabela 6). A emulsão 1, composta de fase oleosa e
aquosa igual a da emulsão 2 e com porcentagens dos tensoativos Tween 80
e Span 80
correspondente a 7 % e 93 %, respectivamente e com EHL de 5,0, apresentou separação de
fases de menor porcentagem (21%) em relação as emulsões 3 (15% Tween 80
e 85%
Span 80
), 4 (20% Tween 80
e 80% Span 80
), 5 (25% Tween 80
e 75% Span 80
) e 6
(30% Tween 80
e 70% Span 80
), que tiveram completa separação de fases, e
consequentemente perda verdadeira da estabilidade da emulsão (Tabela 6 e Figura 4).
Figura 4. Teste de emulsões com diferentes valores de EHL para o óleo de amendoim.
Controle oleoso (0), EHL=5 (1), EHL=5,3 (2), EHL=5,9 (3), EHL=6,4 (4), EHL=7,0 (5).
33
Figura 5. Teste de emulsão para o óleo de buriti utilizando EHL de 1,8.
Figura 6. Teste de emulsões com diferentes valores de EHL para o óleo de buriti. EHL=5,3
(9), EHL=6,4 (10), EHL=7,0 (11), EHL=7,5 (12).
Tabela 6: Medidas da separação de fase das emulsões de amendoim utilizando EHL de 5,0
a 7,5 e óleo de buriti com EHL de 1,8 a 7,5.
Emulsão Óleos EHL Separação de fases (%)
1 Amendoim 5,0 21,0
2 Amendoim 5,3 2,8
3 Amendoim 5,9 40,3
4 Amendoim 6,4 40,3
5 Amendoim 7,0 40,7
6 Amendoim 7,5 40,8
7 Buriti 1,8 (*)
8 Buriti 5,0 21,3
9 Buriti 5,3 28,0
10 Buriti 6,4 21,5
11 Buriti 7,0 31,4
12 Buriti 7,5 32,8
* não houve separação de fase evidente
Obs: os valores de separação de fases correspondem à fração aquosa, calculados com base no volume total de amostra
34
Diante desses resultados, verificou-se que o valor de EHL que proporcionou uma
maior estabilidade em emulsões com o óleo de amendoim na concentração de 58% foi
próximo de 5,3.
Utilizando o óleo de buriti para os testes de emulsões, o valor de EHL que
proporcionou uma emulsão mais estável foi de 1,8. Já as emulsões 8 a 12 apresentaram
separação de suas fases. As figuras 5 e 6 mostram as emulsões para o óleo de buriti.
Com base nestes resultados, para a formulação das vacinas foram utilizados EHLs
nos valores de 5,3 e 1,8 para os óleos de amendoim e de buriti, respectivamente.
5.4. Teste de inocuidade das vacinas
As vacinas inoculadas em cobaios não induziram manifestações adversas nos
animais durante o período de observação, que foi de 7 dias. O comportamento dos animais
vacinados não diferiu dos animais que não receberam vacina, não houve queda de peso e o
local da aplicação permaneceu inalterado para todas as vacinas testadas.
5.5. Avaliação da capacidade adjuvante dos óleos de amendoim, buriti e extrato de
própolis verde sobre a síntese de anticorpos contra o parvovírus suíno.
A presença de anticorpos nos soros dos cobaios de cada grupo experimental foi
avaliada pelo teste de Inibição da Hemoaglutinação (HI) após a vacinação dos animais com
vacinas contendo diferentes adjuvantes. Os animais do grupo controle, que não receberam
vacina, foram mantidos no mesmo ambiente e não apresentaram anticorpos contra o PVS,
indicando que não houve infecção dos animais e que os títulos de anticorpos demonstrados
pela técnica empregada são devidos ao estímulo imunológico promovido pelas vacinas.
Durante a primeira etapa desse trabalho, verificou-se que os títulos de anticorpos
anti-PVS dos animais inoculados com a vacina formulada com o óleo de amendoim como
adjuvante, no tempo de 15 dias após a primovacinação, foram maiores e diferiram
significativamente dos títulos de anticorpos dos animais vacinados com vacinas contendo
própolis, óleo de buriti, hidróxido de alumínio ou vacina sem adjuvante (Figura 7). O
efeito adjuvante do óleo de amendoim contudo, não foi persistente, não apresentando
diferença significativa em relação ao grupo que recebeu vacina sem adjuvante, no último
tempo de coleta (Figura 8).
Sessenta dias após a primovacinação, os títulos de anticorpos dos animais que
receberam a vacina contendo própolis ou hidróxido de alumínio foram maiores do que os
títulos dos cobaios inoculados com a vacina que não continha adjuvante. Os títulos de
35
anticorpos dos animais vacinados com a vacina contendo o extrato de própolis verde como
adjuvante não diferiu significativamente dos títulos dos animais inoculados com a vacina
controle contendo hidróxido de alumínio em nenhum dos dois tempos de coleta de soro
desta primeira etapa do teste (Figuras 7 e 8).
Ainda nesse último tempo de coleta, os títulos de anticorpos induzidos pela vacina
contendo óleo de amendoim foram similares aos títulos dos animais inoculados com a
vacina sem adjuvante (Figura 8). A vacina formulada com o óleo de buriti não exerceu
atividade adjuvante quando comparada a vacina controle, sem adjuvante, nos dois tempos
analisados (Figuras 7 e 8).
Figura 7. Títulos de anticorpos anti-PVS em cobaios induzidos por vacinas formuladas
com diferentes adjuvantes, na resposta primária.
36
Figura 8. Títulos de anticorpos anti-PVS em cobaios induzidos por vacinas formuladas
com diferentes adjuvantes, na resposta secundária.
5.6. Comparação da resposta imunológica induzida pelas vacinas experimentais
frente a uma vacina comercial
De acordo com os resultados de títulos de anticorpos dos animais imunizados com
as diferentes formulações de vacinas na primeira etapa desse trabalho, foram formuladas
novamente as vacinas que apresentaram melhores resultados e comparadas com uma
vacina comercial, tida como indutora de boa resposta imunológica contra a parvovirose
suína.
Na primeira etapa verificou-se semelhança na resposta imune induzida pela vacina
contendo extrato de própolis verde, que é uma vacina experimental, quando comparada ao
seu controle, hidróxido de alumínio. Dessa forma decidiu-se desenvolver novamente a
vacina contendo própolis (20%) e uma outra contendo a mistura do extrato de própolis e
hidróxido (10 % de cada componente). Estas vacinas foram usadas paralelamente com a
vacina comercial e vacinas contendo como adjuvante hidróxido de alumínio (20%).
Estatisticamente, os títulos de anticorpos nos animais vacinados com as vacinas
contendo o hidróxido de alumínio e a mistura de hidróxido com própolis foram similares e
apresentaram mesmo padrão de diferença quando comparados com os títulos de anticorpos
37
dos animais com a vacina comercial. Já a vacina contendo própolis verde induziu uma
menor produção de títulos de anticorpos quando comparada às outras vacinas utilizadas
nessa etapa, sendo esta diferença significativa (Figura 9).
Figura 9. Síntese de anticorpos neutralizantes produzidos por cobaios em resposta às
vacinas formuladas com diferentes adjuvantes ao longo de 60 dias.
38
6. DISCUSSÃO
Muitas espécies encontradas na pesquisa pelos adjuvantes a serem testados nesse
trabalho foram consideradas promissoras, mas o seu uso foi impossibilitado devido à falta
de extratos comerciais destas plantas. Como a ótica de uma instituição privada é, muitas
vezes, mais direcionada ao aumento de escala de produção, torna-se mais viável a busca
por fornecedores que trabalhem no ramo da extração dos compostos vegetais, para
obtenção de matéria-prima de qualidade que garanta uniformidade dos resultados. Caso os
estudos clínicos mostrem que o produto induz proteção, para uma maior chance de
reprodutibilidade dos resultados as vacinas posteriores devem ser produzidas com as
mesmas especificações da preparação utilizada nos testes.
Os óleos de amendoim e buriti para serem incorporados nas vacinas oleosas foram
testados quanto à estabilidade de suas emulsões. De todos os experimentos conduzidos
para buscar a estabilidade das emulsões desses óleos, apenas duas situações se
aproximaram da maior estabilidade, quando analisada macroscopicamente. Lashmar e
colaboradores (1995) concluíram que a estabilidade de emulsões representa o maior
desafio para a formulação de vacinas, sendo esta afetada pelo procedimento de fabricação,
pelos tensoativos e óleos utilizados. Essa dificuldade também foi observada neste trabalho
ao preparar as emulsões do tipo água em óleo para os óleos de amendoim e buriti. Já Silva
(2000) demonstrou facilidade ao preparar emulsões com três diferentes óleos vegetais
(soja, milho e oliva) utilizando a Fração V da ovalbumina nas proporções de 1:1. Estas
emulsões foram feitas manualmente, com a ajuda de seringas e foram consideradas
adequadas, pois quando gotejadas em água, não perderam a sua forma original. Silva
(2000) não explicitou o momento de inoculação das formulações e se a esterilidade foi
mantida com esse procedimento. No caso deste trabalho, essa forma manual de
emulsificação não foi testada, no entanto, mesmo ao utilizar agitador mecânico Silverson
,
específico para preparação de emulsões, apenas duas misturas apresentaram maior
estabilidade, quando comparada às outras tentativas.
Silva e Soares (1996) demonstraram que a mistura de tensoativos de baixo e alto
valores de EHL pode originar sistemas melhores, formando película interfacial mais
compacta e estável. Esta técnica foi utilizada neste trabalho para o óleo de amendoim com
bons resultados onde foram misturados tensoativos com valores de EHL de 15 e 4,3
obtendo considerável estabilidade da emulsão. Já para o óleo de buriti a estabilidade foi
conferida apenas com tensoativo de baixo valor de EHL demonstrando a necessidade de
39
surfactantes mais lipofílicos para a sua estabilidade em uma emulsão água em óleo. Dessa
forma observou-se neste trabalho, que a mistura de tensoativos de baixo e alto valores de
EHL aplicou-se para o óleo de amendoim, mas não para o de buriti.
Zanin e colaboradores (2002), trabalhando com 16 óleos diferentes de origem
vegetal (óleos de amêndoa doce, abacate, apricot, avelã, gergelim, girassol, gérmen de
trigo, macadâmia, prímula, borragem, rosa mosqueta, jojoba, camelina, semene de
maracujá, semente de uva e coco), demonstraram os valores de EHL variando entre 6,76 e
7,79. Estes valores não corresponderam aos encontrados com os óleos de amendoim e
buriti aqui estudados, provavelmente devido a variações nas concentrações dos óleos, dos
tensoativos e metodologias adotadas.
Segundo Griffin (1949) um óleo ou uma mistura de óleos pode ter dois valores de
EHL: um valor mais baixo, correspondendo ao valor para formar a emulsão água em óleo e
um outro mais alto, correspondendo ao valor para formação de emulsão óleo em água.
Tanto para o óleo de amendoim quanto o de buriti, os EHLs utilizados corresponderam a
emulsões do tipo água em óleo. Na emulsão água em óleo, as pequenas gotículas de água
são estabilizadas por surfactante em uma fase de óleo contínua, ou seja, antígenos solúveis
em água podem ser emulsionados com óleo (BECHER, 1965). Este tipo de emulsão é
preferencial para uma liberação gradual do antígeno durante um longo período de tempo
(ALEXANDER e BREWER, 1995). Apesar da emulsão feita com o óleo de buriti
representar uma emulsão do tipo água em óleo, não foi observado efeito adjuvante superior
ao encontrado com a vacina que não recebeu adjuvante. Segundo Mota (2006), o efeito
depósito dos adjuvantes oleosos não deve ser o único mecanismo responsável pela ação
adjuvante de emulsões lipídicas. Ao estudar ação adjuvante do óleo de arroz comercial
comestível e óleo de amendoim da marca Sigma quando associados a uma proteína
(ovalbumina) e utilizando camundongos “swiss” como modelo experimental, Mota (2006)
verificou que o óleo de arroz apresentou a emulsão mais estável e, portanto, com maior
efeito depósito, no entanto este óleo não foi o melhor adjuvante em todas as etapas
testadas. Ainda em seus estudos, o óleo de amendoim da marca Sigma apresentou emulsão
menos estável e efeito adjuvante melhor. No presente trabalho, observou-se uma emulsão
estável macroscopicamente para o óleo de buriti e uma separação de fases de 2,8 %, para o
óleo de amendoim. No entanto, o óleo de amendoim exerceu melhor atividade adjuvante
que o óleo de buriti quando associados a antígenos inativados do parvovírus suíno, embora
esta atividade não tenha sido persistente (Figura 8).
40
Jordão (2006) ao realizar teste de inocuidade com uma vacina viral com o óleo ISA
(SEPPIC) 50 e antígeno inativado do vírus da diarréia viral bovina (BVDV) verificou
formação de abscesso nos sítios de aplicação em cobaios, com posterior regressão e
cicatrização. Esta manifestação clínica não foi observada no presente trabalho para os
óleos vegetais de amendoim e buriti, demonstrando sua inocuidade. Jordão (2006) ainda
não verificou reação indesejada nos locais de aplicação de uma vacina aquosa contra o
BVDV adsorvido com o hidróxido de alumínio na concentração de 20%. Resultados
parecidos foram encontrados neste trabalho, em que a utilização de hidróxido nessa mesma
concentração não provocou danos visíveis nos locais de aplicação da vacina, indicando que
a concentração de 20% desse adjuvante não provoca abscesso no local da injeção.
Cunha e colaboradores (1998) em um estudo utilizando vacinas inativadas contra a
doença de Aujeszky, demonstraram que a resposta humoral foi mais precoce e maior nos
grupos experimentais que receberam duas doses de vacina. Vannier (1982) concluiu que
uma dupla vacinação é necessária para a promoção de uma imunidade sólida com vacina
inativada. Estudos realizados por Alva-Valdes e colaboradores (1983) demonstraram que
89% dos suínos vacinados com duas doses de vacina inativada contra a pseudoraiva, eram
sororreagentes no primeiro mês após a vacinação. Esses dados foram compatíveis com o
resultados obtidos nesse estudo. A resposta imune, representada pela produção de
anticorpos neutralizantes, foi observada na totalidade dos animais após a primovacinação e
revacinação, sendo que a prática de aplicação de um reforço vacinal propiciou uma
resposta imune de maior intensidade, demonstrando que a aplicação de uma segunda dose
para vacinas inativadas contra o parvovírus suíno desencadeia uma maior produção de
anticorpos. Chamelet e colaboradores (1982) explicam que o desenvolvimento de uma
resposta imune mais rápida e mais intensa após a segunda aplicação de vacinas inativadas
ocorre em razão da presença de um aumento no número de células imunocompetentes de
memória.
A soroconversão de todos os animais, independente do tipo de adjuvante recebido,
revelou que o PVS inativado estava presente em títulos suficientes para ativar o sistema
imunológico dos cobaios vacinados. Como a resposta imune induzida por antígenos
inativados é dependente da concentração de antígeno (CHEN, 1985), o título viral de
15360 UHA/dose das vacinas formuladas neste trabalho pode ter sido responsável pela
produção de anticorpos neutralizantes observados em todos os animais que receberam
doses das vacinas, incluindo a vacina sem adição de adjuvante. No entanto,
quantitativamente, observou-se diferença no perfil sorológico pós-vacinal induzido pelas
41
vacinas avaliadas, o que pode ser explicado pela estimulação da resposta imune pelos
diferentes adjuvantes utilizados.
Analisando os resultados obtidos, verificou-se que os animais que receberam vacina
com óleo de amendoim como adjuvante tiveram maiores títulos de anticorpos
neutralizantes, duas semanas após a primovacinação, quando comparados com animais que
receberam a vacina que não continha adjuvante. Quando os títulos de anticorpos desses
mesmos animais foram comparados no tempo de 60 dias após a primovacinação não mais
se observou diferença de títulos entre os animais que receberam essas duas vacinas. Essa
diferença de título de anticorpos obtida em tempos diferentes ocorreu provavelmente
devido à metabolização do óleo pelo organismo do animal, indicando que o óleo de
amendoim não fica retido no local da aplicação da vacina por longos períodos. Silva
(2000), estudando efeito adjuvante do óleo de milho sobre a síntese de imunoglobulinas
totais anti-ovalbumina, verificou diferença significativa em relação a vacina sem adjuvante
e semelhança com a vacina contendo hidróxido de alumínio, aos 14 dias da resposta
primária e queda do título aos 35 dias após a primeira vacinação. Os resultados
encontrados por Silva (2000) ao estudar o óleo de milho como adjuvante são semelhantes
aos resultados desse trabalho para o óleo de amendoim.
Nos tempos de 15 e 60 dias após a primovacinação, a vacina contendo extrato de
própolis verde demonstrou exercer efeito parecido ao do hidróxido de alumínio, que é o
único adjuvante aprovado para uso em humanos e também muito utilizado em vacinas
veterinárias. As vacinas contendo hidróxido de alumínio e extrato de própolis verde
demonstraram possuir ação a longo prazo ao passo que a vacina com o óleo de amendoim
apresentou ação a curto prazo. Isso indica que as vacinas com hidróxido de alumínio e
extrato de própolis seriam mais indicadas em programas de vacinação preventiva por
apresentarem títulos de anticorpos mais elevados em um período maior de proteção pós-
vacinal, quando comparados com as vacinas formuladas com o óleo de amendoim e sem
adjuvante. A importância do uso dos adjuvantes hidróxido e própolis também se deve a um
maior intervalo de proteção pós-vacinal, o que direciona a redução de práticas de manejo e
de custos de vacinação. Por outro lado, o óleo de amendoim associado a antígenos contra o
parvovírus suíno poderia ser indicado para estudos de resposta primária precoce onde há a
necessidade de uma maior concentração de anticorpos, no organismo do animal, em um
curto intervalo de tempo onde, possivelmente, seria capaz de impedir surtos da doença,
além de representar uma formulação inócua, sem reações adversas de ordem geral e/ou
local para os animais.
42
Apesar de sua alta concentração de carotenóides, substâncias precursoras da
vitamina A, relacionadas com a ativação do sistema imune (BRITTON, 1995), o óleo de
buriti não exerceu atividade adjuvante quando comparado à vacina sem adjuvante. Esse
óleo pode ter sido absorvido pelo organismo do animal mais rapidamente que o óleo de
amendoim e não apresentou retenção do antígeno no local da injeção, sendo rapidamente
degradado e removido, estimulando fracamente o sistema imunológico dos animais para
produção de anticorpos contra o parvovírus suíno. O’Hagan e colaboradores (2001)
mostraram que, diferentes adjuvantes tendem a favorecer tipos específicos de resposta
possibilitando a seleção do adjuvante para cada situação. Gupta e Siber (1995) relatam a
capacidade adjuvante limitada como um problema no processo de obtenção de adjuvantes
para vacinas e que ocorre pelo fato de que alguns adjuvantes são efetivos para alguns
antígenos e ineficazes para outros. Dessa forma, considerando o potencial medicinal do
óleo de buriti, este ainda poderia ser testado como adjuvante em associação a outros tipos
de antígenos inativados.
A busca por adjuvantes de origem vegetal que induzam uma boa resposta
imunológica baseia-se no fato de que muitos dos adjuvantes minerais que fazem parte de
muitas emulsões oleosas de vacinas utilizadas atualmente apresentam algumas
desvantagens como longa permanência de resíduos nos tecidos causando reações adversas
locais indesejadas e/ou sistêmicas, além de poderem ser carcinogênicos (ALTKEN e
SURVASHE, 1974; EDELMAN, 1980). Esses efeitos colaterais dos adjuvantes de base
mineral são devido ao fato de estes não serem biodegradáveis. Foi visando eliminar as
desvantagens da utilização do óleo mineral, que adjuvantes a base de óleos vegetais de
amendoim e buriti foram testados neste trabalho.
Em geral, os adjuvantes oleosos permitem a liberação do antígeno no organismo do
hospedeiro de forma gradual e por um período de tempo prolongado, conferindo
imunidade mais duradoura do que aquela induzida por adjuvantes aquosos ou vacinas
vivas, mas para os adjuvantes de base vegetal testados isso não foi observado. Tal
resultado provavelmente ocorreu porque os óleos vegetais são mais facilmente absorvidos
pelo organismo do animal do que os óleos minerais (EDELMAN, 1980), não exercendo
assim atividade total de liberação gradual do antígeno.
Na segunda etapa deste trabalho, foi avaliada a resposta imunológica de cobaios
vacinados com diferentes formulações e comparada com a resposta induzida por uma
vacina comercial, de boa aceitação no mercado, ao longo de 60 dias. Durante a formulação
da vacina contendo o extrato de própolis verde, separadamente, observou-se uma perda do
43
extrato nas paredes do frasco utilizado para a mistura da própolis com o antígeno. Já na
formulação da vacina contendo a mistura de própolis com hidróxido não foi verificada
perda alguma dos adjuvantes, demonstrando compatibilidade entre os dois componentes.
O fato de não haver diferença na resposta de título de anticorpos neutralizantes
pelos animais vacinados com a formulação contendo apenas hidróxido e da formulação em
que a própolis foi associada ao hidróxido de alumínio demonstra que a própolis pode ser
utilizada juntamente com o hidróxido como adjuvante de vacina com uma boa resposta
imunológica. Como as vacinas veterinárias se encontram atreladas ao uso dos sais de
alumínio ou de emulsões oleosas (HORZINEK et al., 1997), o uso da própolis para
estimular resposta imune a antígenos seria apropriado considerando que um dos problemas
encontrados na produção de vacinas é a disponibilidade de substâncias que potencializam a
ação de antígenos poucos imunogênicos ao induzir resposta imune potente, duradoura e
sem contra-indicações.
O uso do extrato de própolis verde em uma formulação contendo hidróxido de
alumínio seria apropriado pela capacidade de redução de possíveis efeitos colaterais nos
animais, provocados pelo hidróxido, por se tratar de um produto natural que apresenta
inúmeras propriedades terapêuticas. A própolis se destaca por possuir ação antiviral,
antiinflamatória, antioxidante, antiparasitária e antitumoral (CASTRO, 2001; ANSORGE
et al., 2003; FISCHER et al., 2005; DANTAS et al., 2006,). Além disso, a própolis
também tem sido descrita como uma substância com atuação sobre o sistema imunológico
(ORSI et al., 2000), promovendo a ativação de macrófagos, que desempenham um papel
fundamental na defesa do organismo através da fagocitose (ORSOLIC e BASIC, 2003).
Tendo em vista que a resposta da vacina comercial, considerada de boa aceitação
no mercado e aprovada pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, não
difere significativamente da associação de própolis e hidróxido de alumínio como
adjuvante sugere-se que esta vacina experimental é capaz de gerar uma resposta imune em
cobaios com resultados promissores. Porém mais estudos devem ser conduzidos para
avaliar a capacidade da própolis como adjuvante junto a espécie alvo e outros antígenos .
Fischer e colaboradores (2007), ao estudarem a associação de um extrato de
própolis com o hidróxido de alumínio e antígeno do herpesvírus suíno tipo 1, verificaram
um aumento na resposta imune quando comparado com um tratamento em que o antígeno
foi utilizado isoladamente com o hidróxido de alumínio. No presente trabalho, não foi
encontrada diferença significativa entre os títulos de anticorpos dos animais vacinados com
hidróxido separadamente dos que receberam vacina com a mistura de hidróxido e própolis.
44
O melhor aproveitamento da própolis por Fisher e colaboradores (2007), pode ser devido
ao uso do extrato seco da própolis, proporcionando um melhor resultado que o encontrado
neste trabalho. Eles ressaltaram ainda que o efeito adjuvante da própolis verde tornou-se
mais evidente no teste de capacidade de proteção vacinal, uma vez que a inclusão do
extrato etanólico da própolis verde nas vacinas experimentais aumentou o percentual de
animais protegidos após o desafio com o herpesvírus suíno tipo 1.
Como durante esta última etapa verificou-se perda do extrato de própolis no frasco
durante a formulação da vacina contendo este adjuvante e a resposta de título de anticorpos
foi menor que a apresentada na primeira etapa do trabalho, decidiu-se formular novamente
essa vacina com o propósito de esclarecer o efeito adjuvante desse tipo de extrato. A nova
formulação apresentou deposição do extrato de própolis no fundo do frasco e na tentativa
de suspender a massa depositada, o fundo do frasco foi imerso em banho maria à 37ºC por
1 minuto. O procedimento foi bem sucedido, sendo essa a forma utilizada no
desprendimento da massa do extrato depositada no fundo do frasco no momento de
aplicação da vacina. Desta forma, este trabalho tem ainda como perspectiva, o teste da
própolis isoladamente como adjuvante vacinal.
Os resultados desse trabalho permitiram o conhecimento do potencial adjuvante de
extratos de origem vegetal pertencentes à biodiversidade brasileira. O óleo de amendoim e
extrato de própolis verde apresentaram importância biológica quando associados a vacinas
inativadas contra o parvovírus suíno. Com base em mais estudos, a possibilidade de uso
comercial de vacinas formuladas com estes extratos poderá favorecer o crescimento
econômico ao gerar empregos e impostos, além de melhorar o nível científico do país a
partir de pesquisas que levem a um maior conhecimento das funções exercidas por estas
substâncias naturais. Ainda se destaca o uso desses extratos associados a práticas de
conservação da biodiversidade, quando se pensa no uso sustentável dos recursos como
forma de valorização das riquezas naturais.
45
7. CONCLUSÕES
- A emulsão de óleo de amendoim que foi mais estável foi a formulada com 58% de fase
oleosa, 40% de fase aquosa e 2% de tensoativos ( 9% de Tween 80
e 91% de Span
80
).
- A emulsão macroscopicamente estável do óleo de buriti foi formulada com 58% de
fase oleosa, 40% de fase aquosa e 2% do tensoativo Span 85
.
- Nas condições experimentais utilizadas, os valores de EHL para os óleos de buriti e
amendoim estão em torno de 1,8 e 5,3, respectivamente.
- As vacinas formuladas com os adjuvantes experimentais não induziram reações
adversas nos locais de aplicação das mesmas, bem como no comportamento dos
animais.
- A vacina experimental com óleo de amendoim induziu a produção de anticorpos
neutralizantes após a primovacinação, contudo esta não foi persistente.
- O óleo de buriti não apresentou atividade adjuvante no modelo estudado, neste
trabalho.
- As vacinas contendo hidróxido de alumínio ou própolis, como adjuvante, induziram a
produção de níveis similares de anticorpos, tanto na resposta primária quanto na
secundária.
- As vacinas contendo hidróxido de alumínio, extrato de própolis verde com o hidróxido
de alumínio ou a vacina comercial apresentaram capacidade similar na indução de
anticorpos neutralizantes contra o parvovírus suíno em cobaios, sendo de considerada
importância estudos para avaliar a resposta dessas vacinas na espécie alvo.
46
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
ABIPECS, Relatório Anual ABIPECS 2006. Disponível em:
<http://www.abipecs.org.br/relatorios/ABIPECS_relatorio_2006_pt.pdf>. Acesso em
13/Fev/2008.
ALEXANDER, J., BREWER, J. M. Adjuvants and their modes of action. Livestock
Production Science. v. 42. p. 153-162. 1995.
ALTKEN, I. D., e SURVASHE, B. D. Observations on the serological and dermal
responses of turkeys to a single subcutaneous inoculation of inactivated Newcastle disease
vaccine in mineral oil adjuvant. Avian Pathology. v. 3. p. 211-222. 1974.
ALVA-VALDES, R., GLOCK, R. D., KLUGE, J. P., HILL, H. T. The effects of challenge
on the humoral and cellular immune responses in pseudorabies vaccinated swine. Canadian
Journal of Comparative Medicine. v. 47. n. 4. p. 451-455. 1983.
AMBRÓSIO, C. L. B, CAMPOS, F. A. C. S, FARO, Z. P. Carotenóides como alternativa
contra a hipovitaminose. Revista de nutrição. v. 19. n. 2. p. 233-243. 2006.
ANDRADE, P. M. M. e DO CARMO, M. G. T. Ácidos graxos n-3: um link entre
eicosanóides, inflamação e imunidade. Mn metabólica. v.8. n. 3. 2006.
ANSORGE, S., REINHOLD, D., LENDECKEL, U. Propolis and some of its constituents
down-regulate DNA synthesis and inflammatory cytokine production but induce TGF-β1
production of human immune cells. Zeitschrift fur Naturforschung. v. 58. 2003.
ASSIS, F. A. Efeito do selênio orgânico e da vitamina ‘E’ no crescimento tumoral e na
resposta imunológica ao tumor experimental de Ehrlich. Belo Horizonte. [Dissertação
(Mestrado) – Universidade Federal de Minas Gerais – UFMG]. 109 p. 2007.
AZZI A, STOCKER A. Vitamin E: non-antioxidant roles. Progress in Lipid Research. v.
39. n. 3. p. 231-55. 2000.
47
BANKOVA, V. S., CASTRO, S. L., MARCUCCI, M. C. Propolis: recent advances in
chemistry and plant origin. Apidologie. v. 31. p. 3-15. 2000.
BARR, T. A., CARLRING, J., HEATH, A. W. Co-stimulatory agonists as immunological
adjuvants. Vaccine. v. 24. p. 3399-3407. 2006.
BECHER, P. Testing and emulsion properties. Emulsions: Theory and Practice. Reinhold.
2ª ed. New York. p. 381. 1965.
BERSANO, J. G., SCHOTTEN, M. H. S., KROEFF, S. S., BASTOS, G. M. Dados
preliminares sobre a ocorrência de anticorpos para o Parvovírus Suíno no Estado de São
Paulo. In: Reunião Anual do Instituto Biológico. São Paulo. Resumos. v.6. p. 17. 1993.
BIANCHI, M. L. P, ANTUNES, L. M. G. Radicais livres e os principais antioxidantes da
dieta. Revista de Nutrição. v. 12. n. 2. p. 123-130. 1999.
BOMFORD, R. Adjuvants for anti-parasite vaccines. Veterinary Parasitology. v. 5. p. 41-
46. 1989.
BRITTON, G. Structure and properties of carotenoids in relation to function. Faseb
Journal. v. 9. n. 15. p. 15518. 1995.
BRUNETTO, M. A., GOMES, M. O. S., JEREMIAS, J. T., OLIVEIRA, L. D.,
CARCIOFI, A. C. Imunonutrição: o papel da dieta no restabelecimento das defesas
naturais. Acta Scientiae Veterinariae. v. 35. p. 230-232. 2007.
BUTTERWORTH, J. China, Peoples Republic of Oilsees and Products, China’sPeanut
Sector, USDA Foreign Agricultural Service GAIN Report. 2004.
CARDOSO, A. L. S. P., ALBUQUERQUE, R., TESSARI, E. N. C. Influência de Níveis
de Zinco e Vitamina E, isolados e associados, sobre a Resposta Imunológica Humoral em
Frangos de Corte Vacinados. Arquivos do Instituto Biológico - São Paulo v.71. p.741-749.
2004.
48
CARMINI, M. A. Estabilidade de emulsões cosméticas: Estudos de variáveis e parâmetros
de influência. Encontro Científico Empresarial para as indústrias farmacêuticas e
cosméticas. São Paulo. 1997.
CASTRO, S. L. Propolis: biological and pharmacological activities. Therapeutic uses of
this bee-product. Journal of Biomedical Science. v.3. p. 49-83. 2001.
CHAMELETI, E. L. B.; AZEVEDO I, M. P. A.; FAVORETTO , S. R.; KERBRIEI, S. V. K.;
SOUZA, L. T. M. A reduced schedule for anti-rabic pre-exposure vaccination in humans and
annual assessment booster doses. Revista de Saúde Pública. v. 16. n. 3. p. 144-148. 1982.
CHANG, J. C. C., DIVELEY, J. P., SAVARY, J. R., JENSEN, F. C. Adjuvant activity of
incomplete Freund’s adjuvant. Advanced Drug Delivery Review. v. 32. p. 173-186. 1998.
CHEN, K. S. Adjuvant enhacement of humoral immune response to chemically inactivated
bovine viral diarrhea virus. Canadian Journal of Comparative Medicine. v. 49. p. 91-94.
1985.
CRAGG, G. M. NEWMAN, D. J. SNADER, K. M. Natural products in drug discovery and
development. Journal of Natural Products. v. 60. p. 52-60. 1997.
COLLI C, SARDINHA F, FILISETTI TMCC. Alimentos Funcionais. In: Guia de
Medicina Ambulatorial e Hospitalar. São Paulo. p. 66-67. 2003.
CORTESE, V. S. WHITTAKER, R. ELLIS, J. RIDPATH, J. F. BOLIN, S. R. Specificity
and duration of neutralizing antibodies induced in healthy cattle after administration of a
modified live-virus vaccine against bovine diarrhea. American Journal of Veterinary
Research. v. 59. p. 848-850. 1998.
CUNHA, E. M. S., PEIXOTO, Z. M. P., KOTAIT, I., BERSANO, J. G., ISHIZUKA, M.
M., BACCARO, M. R. Eficácia de vacina inativada contra a doença de Aujeszky: infecção
experimental em suínos. Journal of Veterinary Research and Animal Science v. 35. n. 4. p.
188-194. 1998.
49
CURI, R., MIYASAKA C.K., POMPÉIA C., PROCOPIO J. Entendendo a gordura-os
ácidos graxos. Manole. p. 43-48. 2002.
DANTAS, A. P., OLIVIERI, B. P., GOMES, F. H. M., DE CASTRO, S. L. Treatment of
Trypanosoma cruzi – infected mice with propolis promotes changes in the immune
response. Journal of Ethnopharmacology. v. 103. p. 187-193. 2006.
DEE, S.A. Viral causes of porcine reproductive failure - part II. Compendium Veterinary
Practice v.17. p. 1159-1170. 1995
DONELLY, J. J. New developments in adjuvants. Elsevier Science Ireland Ltd. 1997.
DREWS, J. Drug discovery: a historical perspective. Science. v. 287. p. 1960-1964. 2000.
EDELMAN, R. Vaccine Adjuvants. Reviews of infectious diseases. v. 2. n. 3. 1980.
EMBRAPA CERRADOS. Frutas nativas do cerrado brasileiro: aproveitamento alimentar.
Planaltina: Embrapa Cerrado. Biblioteca: CPAC (FD FD079 UMT) 2002.
EMBRAPA. Frutas nativas do cerrado: qualidade nutricional e sabor peculiar. Disponível
em: <http://www.cenargen.embrapa.br/cenargenda/pdf/nativacerrado.pdf>. Acesso em
21/Jan/2008 a.
EMBRAPA. Cozinha experimental de amendoim. Disponível em: <
http://www.embrapa.br/imprensa/noticias/2005/setembro/foldernoticia.20056.8798480371/
noticia.2005-09-28.7443987696/?searchterm=amendoim>. Acesso em 04/Mar/2008 b.
ENGSTAD, R. E.; ROBERTSEN, B. Recognition of yeast cell wall glucan by atlantic
salmon (Salmon salar L.) macrophages. Developmental and Comparative Immunology.
v.17. p. 319. 1993.
FERNANDES, F. T. Desenvolvimento de uma vacina inativada contra parvovirose suína.
São Paulo. [Dissertação (Mestrado) – Interunidades em Biotecnologia USP/ Instituto
Butantan/ IPT]. 119 p. 2005.
50
FIELDS, B. N.; MUZYCZKA, N.; BERNS, K.I. Fields Virology. 4
th
ed. vol. 2. Lippincott
– Raven Pub. Philadelphia. 2001.
FISCHER, G., DUMMER, L. A., VIDOR, T., PAULINO, N., PAULINO, A. S. Avaliação
da ação antiviral de uma solução de própolis sobre o Herpesvírus Bovino e o Vírus da
Diarréia Viral dos Bovinos. In: Encontro de pós-graduação. Pelotas. RS. Anais. Pelotas.
2005.
FISCHER, G., CONCEIÇÃO, F. R., LEITE, F. P. L., DUMMER, L. A., VARGAS, L. D.,
HUBNER, S. O., DELLAGOSTIN, O. A., PAULINO, A. S., VIDOR, T.
Immunomodulation produced by a green propolis extract on humoral and cellular
responses of mice immunized with SuHV-1. Vaccine. v. 25. p. 1250-1256. 2007.
GARBE A; BUCK J., HAMMERLING U. Retinoids are important cofactors in T cell
activation. Journal of Experimental Medicine. V. 176. p. 109-117. 1992.
GAZETA MERCANTIL. Dobram vendas de produtos veterinários. Disponível em:
<http://www.gazetamercantil.com.br/integraNoticia>. Acesso em 13/Fev/2008.
GRIFFIN, W. C. Classification of Surface-Active Agents by “HLB”. Journal of the
Society of Cosmetic Chemists. p. 311-326. 1949.
GODOY, H. T. & RODRIGUEZ-AMAYA. Buriti (Mauritia vinifera Mart.), uma fonte
riquíssima de pró-vitamina A. Archives of Biology and Technology. v. 38. n. 1. p. 109-
120. 1995.
GOMES, M. F. M. Documentos 26, Embrapa Concórdia. 108 p. 1992.
GONSALES, G. Z., ORSI, R. O., FUNARI, S. R. C., FERNANDES JUNIOR, A.
Antibacterial Activity of Propolis collected in different regions of Brazil. Journal of
Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases v. 12. p. 124-32. 2006.
51
GOUVEIA, A.M.G., GOMEZ, M.C., REIS, R. Alterações reprodutivas e prevalência de
anticorpos inibidores de hemoaglutinação para o parvovírus suíno no estado de Minas
Gerais. Pesquisa Veterinária Brasileira. v.4. p.17-22. 1984.
GUPTA, R. K., SIBER, G. R. Adjuvant for human vaccines – current status, problems and
future prospects. Vaccine. v. 13. n. 14. p. 1263-1276. 1995.
HILLEMAN, M. R. Critical Appraisal of emulsified oil adjuvants applied to viral vaccine.
Progress in Medical Virology. v. 8. n. 15. p. 131-182. 1966.
HOGENESCH, H. Mechanisms of stimulation of the immune responses by aluminum
adjuvants. Vaccine. v. 20. p. 34-39. 2002.
HORZINEK, M. C.; SCHIJNS, V. E. C. J.; DENIS, M.; DESMETTRE, P.; BABIUK, L.
A. Veterinary Vaccinology. Capítulo 6. 1997.
HUNTER, R. L. Overview of vaccine adjuvants: present and future. Published by Elsevier
Science Ltd. 2002.
JOO, H. S., DONALDSON – WOOD, C. R. and JOHNSON, R. H.. A standardised
haemagglutination inhibition test for porcine parvovirus antibody. Australian Veterinary
Journal. v. 52. p. 422-424. 1976.
JORDÃO, R. S. Resposta sorológica de cobaias imunizadas com vacinas inativadas, oleosa
e aquosa, contendo isolado brasileiro do vírus da diarréia viral bovina (BVDV) em
comparação com vacina comercial. São Paulo. [Dissertação (Mestrado) – Instituto de
Ciências Biomédicas da Universidde de São Paulo]. 62 p. 2006.
KASAI, FRANCISCO SEIITI; ATHAYDE, MANOEL LUIZ FERREIRA; GODOY,
IGNÁCIO JOSÉ DE. Adubação Fosfatada e Épocas de Colheita do Amendoim: Efeitos na
Produção de Óleo e de Proteína. Bragantia. Campinas v. 57. n. 1. 1998.
KIMURA, J., NARIUCHI, H., WATANABE, T., MATUHASI, T., OKAYASU, I.,
HATAKEYAMA, S. Studies on the adjuvant effect of water-in-oil-in-water emulsion
52
(w/o/w) of sesame oil. I. Enhanced and persistent antibody formation bu antigen
incorporated into the water-in-oil-in-water emulsion. Japanese Journal Experimental
Medicine. v. 48. n. 2. p. 149-202. 1978.
KIRKPATRICK, P. Antibacterial drugs: stitching together naturally. Nature Reviews Drug
Discovery. v. 1. p. 748. . 2002.
KRUNGER, C. L, MANN, S. W. Safety evaluation of funcional ingredients. Food and
Chemical Toxicology. v. 41. p. 793-805. 2003.
LACHMAN, L.; LIERBERMAN, H. A.; KANIG, J. L. The theory and practice of
industrial pharmacy. Philadelphia:Lea & Febiger. p. 514-517. 1986.
LASHMAR, U. T., RICHARDSON, J. P., ERBOD, A. Correlation of physical parameters
of an oil-in-water emulsion with manufacturing procedures and stability. International
Journal of Pharmaceutics. v. 125. p. 315-325. 1995.
LIN, T. J. Adverse effects of excess surfactants upon emulsification. Cosmet. & Toilet. v.
106. p. 71-80. 1991.
LIEBERMAN, H. A., RIEGER, M. M., BANKER, G. S. Pharmaceutical dosage forms:
disperse systems. 2. Ed. New York: Maecel Dekker. v.1. 1988.
LOBATO, Z. I. P. Avaliação da resposta sorológica de suínos imunizados contra
parvovirose suína com uma vacina inativada experimental e pelo método de feed back
(retroinfecção). [Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Minas Gerais]. 90 p.
1990.
LOBATO, Z. I. P., REIS, R. LEITE, M. C. Avaliação da resposta sorológica de suínos
imunizados contra parvovirose suína com uma vacina inativada experimental Arquivo
Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia v. 45. n.2. p. 161-171. 1993.
LOPES, R. M. Flavonóides. Biotecnologia: Ciência e Desenvolvimento. p. 18-22. 2003.
53
MAHAN L. K., ESCOTT-STUMP S. Lipídeos. In: Krause: alimentos, nutrição &
dietoterapia. 9ª ed. São Paulo: Roca. p. 51-53. 1998.
MANSONE, F. Anestesiologia veterinária: Farmacologia e técnicas. 3 ed. Guanabara
Koogan. Rio de Janeiro. Brasil. 255 p. 1999.
MARIATH, J. G. R.; LIMA, M. C. C.; SANTOS, L. M. P. Vitamin A activity of buriti
(Mauritia vinifera Mart.) and its effectiveness in the treatment and prevention of
xerophtalmia. American Journal Clinical Nutrition. v. 49. P. 849-853. 1989.
MARTINS, R. M., ROEHE, P. M., GUIMARÃES, L. G. In: Congresso Nacional de
Veterinários Especialistas em Suínos. Anais. Curitiba. p. 19. 1984.
MENGELING, W. L. Porcine Parvovirus infection. In: LEMAN, A. D., STRAW, B.,
GLOCK, R. D. Diseases of swines. 6. ed. Ames: Iowa State University. p. 411-424. 1992.
MENGELING, W. L., PAUL, P. S. Interepizootic Survival of Porcine Parvovirus. Journal
of the American Veterinary Medical Association. v. 11. p. 1293-1295. 1986.
MIYATAKA, H. NISHIKI, M. MATSUMOTO, H. FUJIMOTO, T. MATSUKA, M.
ISOBE, A. SATOH, T. Evaluation of propolis. I: Evaluation of Brazilian and chinese
propolis by enzymatic and physico-chemical methods. Biological & pharmaceutical
bulletin v.20. p. 496-501. 1997.
MOTA, E. F. Atividade adjuvante dos óleos de amendoim (Arachis hypogaea L.), algodão
(Gossypium hirsutum L.) e arroz (Oryza sativa L.) na resposta imune humoral e celular.
Fortaleza. [Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Ceará]. 181 p. 2006.
MURRAY, R.; COHEN, P.; HARDEGREE, M. C. Mineral oil adjuvants: Biologiacal and
chemical studies. Annals os Allergy. v. 30. n.3. p. 146-151. 1972.
NIEWIESK, S., PRINCE, G. Diversifying animal models: the use of hispid cotton rats
(Sigmodon hispidus) in infectious diseases. Laboratory Animals. v. 36. p. 357-372. 2002.
54
O’HAGAN, D. T., MACKICHAN, M. L., SINGH, M. Recent developments in adjuvants
for vaccines against infectious diseases. Biolmolecular Engineering. v. 18. p. 69-85. 2001.
ORSI, R. O., FUNARI, S. R. C., SOARES, A. M. V. C., CALVI, S. A., OLIVEIRA, S. L.,
SFORCIN, J. M., BANKOVA, V. Immunomodulatory action of propolis on macrophage
activation. Journal of Venomous Animals and Toxins. v. 6. p. 205-219. 2000.
ORSI, R. O., SFORCIN, J. M., FUNARI, S. R. C., FERNANDES JR. A., BANKOVA, V.
Synergistic effect of propolis and antibiotics on the Salmonella Thypi. Brazilian journal of
microbiology. v. 37. p. 108-12. 2006.
ORSOLIC, N., BASIC, I. Immunomodulation by water-soluble derivative of propolis: a
factor of antitumor reactivity. Journal of Ethnopharmacology. v. 84. p. 265-273. 2003.
OTT, G., BARCHFELD, G. L., VAN NEST, G. Enhancement of humoral response against
human influenza vaccine with the simple submicron oil/water emulsion adjuvant MF59.
Vaccine. v. 13. P.1557-1562. 1995.
PARENT G; ROUSSEAUX-PREVOST R; CARLIER Y & CAPRON A. Influence of
vitamin A on the immune response of Schistosoma mansoni-infected rats. Transactions of
the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. v. 78. p. 380-384. 1984.
PARK, Y. K. Própolis produzida no sul do Brasil, Argentina e Uruguai: Evidências
fitoquímicas de sua origem vegetal. Ciência Rural. v.32. n.6. p.997-1003. 2002.
PARKE, C. R., BURGESS, G. W. An Economic assessment of porcine parvovirus
vaccination. Australian Veterinary Journal. v. 70. p. 177. 1993.
PEIXOTO, A. R. Plantas oleaginosas arbóreas. São Paulo. 284 p. 1973.
PIMENTEL, B. M. V, FRANCKI, M., GOLLUCKE, B. P. Alimentos funcionais:
introdução as principais substâncias bioativas em alimentos. São Paulo: Editora Varella.
2005.
55
PRISTA, S. M.; ALVES, A. C.; MORGADO, R. Técnica Farmacêutica e Farmácia
Galênica. Calouste Gulbenkian. 4 ed. v1. p. 169-170. 1992.
RESENDE, F. C. B., PASSOLD, J., FERREIRA, S. I. A. C., ZANETTI, C. R., LIMA, H.
C. Adjuvantes de vacinas: possibilidades de uso em seres humanos ou animais. Revista
Brasileira de Alergia e Imunopatologia v. 27. n. 3. p. 116-124. 2004.
RODRIGUEZ-AMAYA, D. B. Carotenoids and food preparation: the retention of
provitamin A carotenoids in prepared, processed, and stored foods. John Snow, Inc/OMNI
Project. 88p. 1997.
SCHIJNS, V. E. J. C. Immunological concepts of vaccine adjuvant activity. Current
opinion in immunology. v.12. p. 456-463. 2000.
SEMBA R. D; MUHIL AL; WARD BJ; GRIFFIN DE; SCOTT AL; NATADISASTRA G;
WEST KP JR & SOMMER A. Abnormal Tcell subset proportions in vitamin-A-deficient
children. Lancet. v. 341. p. 5-8. 1993.
SHIRODKAR, R. L. HUTCHINSON, D. L. PERRY, J. L. Aluminum compounds used as
adjuvants in vaccines. Pharmaceutical Research. v. 7. p. 1282-1288. 1990.
SILVA, C. E., SOARES, C. I. Tecnologia de emulsões. Cosmet. & Toilet. ed. português.
v.8. p. 37-46. 1996.
SILVA, A. C. M. Atividade imunoadjuvante e inflamatória de óleos vegetais. Fortaleza. [
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Ceará]. 77 p. 2000.
SINGH, M., O’HAGAN, D. T. Advances in vaccine adjuvants. Nature Biotechnology. v.
17. p. 1075-1081. 1999.
SOARES, R. M. & BERSANO, J. G. Isolamento de Parvovírus Suíno de tecidos fetais de
fêmeas suínas acometidas por distúrbios reprodutivos no Estado de São Paulo. Arquivos do
Instituto Biológico - São Paulo. v.65. n.2. p.79-85. 1998.
56
STORNI, T., KUNDIG, T. M., SENTI, G., JOHANSEN, P. Immunity in response to
particulate antigen-delivery systems. Advanced Drug Delivery. v. 57. p. 333-355. 2005.
TENGERDY, R. P. & LACETERA, N. G. Vitamin E adjuvant formulations in mice.
Vaccine. v. 9. p. 204-205. 1991.
THACKER, B. J. & GONZALEZ, P. L. Infectious reproductive diseases in swine.
Compendium on Continuing Education for the Practicing Veterinarian. v.10. p. 669 – 680.
1988.
THOMAS, P. C. BASS, E. P., HENNING, E. R., SHARP, A. J. Can an
immunomodulating adjuvant enhance and extend the protection of killed BVD virus
vaccine? Veterinary Medicine. v. 81. p. 974-976. 1986.
TREGUIER, J. P., LO, I., SEILLER, M., PUISIEUX, F. La formulation des émulsions
méthodes utilisées pour le choix des émulsionnants. journal of pharmaceutical science and
technology. v. 7. p. 371-381. 1972.
UNGAR, J. Panel and discussions on Immunology. In: BERN & STUTGART Principles
on Tetanus. Hans Huber Publ. p. 232-329. 1966.
UNITED STATES PHARMACOPEIA CONVENTION. US Pharmacopeia 29. Sterility
tests <71>. 2007.
UTIYAMA, C. E. Utilização de agentes antimicrobianos, probióticos, prebióticos e
extratos vegetais como promotores do crescimento de leitões recém-desmamados. São
Paulo [Tese (Doutorado) - Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”.
Universidade de São Paulo]. 94 p. 2004.
VAN LEENGOED, L. A., VOS, J., GRUYS, E., RONDHUIS, P., BRAND, A. Porcine
parvovirus infection: review and diagnosis in a sow herd with reproductive failure.
Veterinary Quarterly. v.5. p. 131-141. 1983.
57
VANNIER, P. Efficiency of na inactivated virus vaccine against Aujeszky’s disease for
fattening pigs with or without passive immunity. In: Aujeszky’s disease. Current Topics in
Veterinary Medicine and Animal Science. v. 17. p. 181-190. 1982.
VILLAS BOAS, G. K e GADELHA, C. A. G. Oportunidades na indústria de
medicamentos e a lógica do desenvolvimento local baseado nos biomas brasileiros: bases
para a discussão de uma política nacional. Cad. Saúde Pública. v.23. n. 6. p. 1463-1471.
2007.
ZANIN, S. M. W., MIGUEL, M. D., CHIMELLI, M. C., OLIVEIRA, A. B. Determinação
do equilíbrio hidrófico-lipófilo (EHL) de óleos de origem vegetal. Curitiba. Visão
acadêmica. v.3. n. 1. p. 13-18. 2002.
ZUFFA, A., ZUFFA, T., ZAJAC, J. Study of immunity induced by the inactivated oil-
adjuvant vaccine after natural infection with the vírus of infectious bovine rhinotracheitis
(IBR) in cattle. Journal of the American Veterinary Medical Association. v. 32. p. 724-735.
1985.
WAITZBERG D. L, BORGES V. C. Gorduras. In: Nutrição oral, Enteral e Parenteral na
Prática Clínica. 3ª edição. São Paulo: Atheneu. p. 59-64. 2002.
WERBACH, M. R., MURRAY, M. T. Botanical influences on illness: a sourcebook of
clinical research. Los Angeles: Third line Press. 1994.
WILKINSON, J. B., MOORE, R.J. Cosmetologia de Harry Madrid: Ediciones Dias de
Santos S.A. p. 806-818. 1990.
WOODARD, L. F.. Adjuvant activity of water insoluble surfactants. Lab. Animal Sci. v.39
p. 222-225. 1989.
WOODARD, L. F., Surface chemistry and classification on vaccine adjuvants and
vehicles. In: Mizraki, A. (Ed. ). Bacterial Vaccines. Alan R. Liss, Inc., New York. p. 281-
306. 1990.
58
YAO, G. Peanut Production and Utilization in the People’s Republic of China, University
of Georgia, 2004.
59
ANEXO
60
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