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STUDO DO SISTEMA HETEROMÓRFICO DE AUTO
-
INCOMPATIBILIDADE EM UMA
POPULAÇÃO DE
P
SYCHOTRIA NUDA
(C
HAM
.
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CHLECHT
.)
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(R
UBIACEAE
):
MORFOLOGIA FLORAL
;
SUCESSO REPRODUTIVO
;
ASPECTOS
CELULARES E TECIDUAIS
;
E ANÁLISE DA COMPOSIÇÃO PROTÉICA DE PARTES
FLORAIS
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SPELLET
K
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STADUAL DO
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ORTE
F
LUMINENSE
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IBEIRO
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UENF
C
AMPOS DOS
G
OYTACAZES
,
RJ
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OVEMBRO
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2007
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I
E
STUDO DO SISTEMA HETEROMÓRFICO DE AUTO
-
INCOMPATIBILIDADE EM UMA
POPULAÇÃO DE
P
SYCHOTRIA NUDA
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MORFOLOGIA FLORAL
;
SUCESSO REPRODUTIVO
;
ASPECTOS
CELULARES E TECIDUAIS
;
E ANÁLISE DA COMPOSIÇÃO PROTÉICA DE PARTES
FLORAIS
D
ENISE
E
SPELLET
K
LEIN
“Tese apresentada ao Centro de Biociências
e Biotecnologia, da Universidade Estadual do
Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte
das exigências para obtenção do título de
Doutor em Biociências e Biotecnologia.”
U
NIVERSIDADE
E
STADUAL DO
N
ORTE
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LUMINENSE
D
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AMPOS DOS
G
OYTACAZES
,
RJ
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OVEMBRO
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II
E
STUDO DO SISTEMA HETEROMÓRFICO DE AUTO
-
INCOMPATIBILIDADE EM UMA
POPULAÇÃO DE
P
SYCHOTRIA NUDA
(C
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CHLECHT
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AWRA
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UBIACEAE
):
MORFOLOGIA FLORAL
;
SUCESSO REPRODUTIVO
;
ASPECTOS
CELULARES E TECIDUAIS
;
E ANÁLISE DA COMPOSIÇÃO PROTÉICA DE PARTES
FLORAIS
D
ENISE
E
SPELLET
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LEIN
“Tese apresentada ao Centro de Biociências
e Biotecnologia, da Universidade Estadual do
Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte
das exigências para obtenção do título de
Doutor em Biociências e Biotecnologia.”
Aprovada em 26 de novembro de 2007
Comissão Examinadora:
__________________________________________________________________
Prof. Flavio Costa Miguens (Doutor em Ciências Biológicas) – UENF
__________________________________________________________________
Prof. Jorge Ernesto de Araujo Mariath (Doutor em Ciências Biológicas) –
UFRGS
__________________________________________________________________
Prof. Maria Cristina Gaglianone (Doutora em Entomologia) – UENF
__________________________________________________________________
Prof. Leandro Freitas (Doutor em Biologia Vegetal) – JBRJ – Co-orientador
__________________________________________________________________
Prof. Maura Da Cunha (Doutora em Ciências Biológicas) – UENF -
Orientadora
III
A quatro pessoas maravilhosas:
Ao meu pai, um exemplo de vida e um
cúmplice no amor ao estudo da vida.
À minha mãe, cujo incentivo e crença nas
minhas capacidades são tão importantes
para mim.
À minha irmã, uma eterna fonte de
inspiração e amizade.
À Maura Da Cunha, que tem sido não só
uma orientadora, mas também uma grande
amiga com personalidade e força
admiráveis.
IV
Agradecimentos
À minha orientadora, Dra. Maura Da Cunha, pela orientação, cumplicidade,
confiança e incentivo.
Ao co-orientador Dr. Leandro Freitas (IPJBRJ) pelo interesse, incentivo, pelas
interessantes discussões e orientações sobre a reprodução em plantas.
À colaboradora Dra. Valdirene M. Gomes (LFBM) pelo apoio em todos os momentos,
discussão, auxílio e ensinamentos para as análises bioquímicas.
À colaboradora Dra. Orthrud Monika Barth (UFRJ/IB) pelo aprendizado em
palinologia e por ter aberto o seu laboratório para mim.
Ao colaborador Prof. Carlos H. Klein (FIOCRUZ/ENSP) pelos ensinamentos e auxílio
valoroso no desenvolvimento das análises estatísticas.
Ao colaborador Dr. Sebastião José da Silva Neto (JBRJ) pela identificação de
espécies e auxílio no entendimento da família Rubiaceae.
Ao colaborador Dr. Renato DaMatta (LBCT) pela indispensável ajuda na
manipulação e interpretação da microscopia confocal.
Às professoras Dra. Ângela Pierre, Dra. Kátia Valevski S. Fernandes e Dra. Maria
Cristina Gaglianone, pelos conselhos e discussão durante a defesa de projeto de
doutorado.
À Dra. Claudia Franca Barros (JBRJ) pelos valorosos conselhos, durante quase toda
a minha vida acadêmica e por sempre manter as portas abertas.
Aos responsáveis pelos laboratórios LBCT, LFBM e LQFPP da UENF; LBE do JBRJ;
Laboratório Herta Meyer e Laboratório de Palinologia da UFRJ por propiciarem as
condições necessárias para o desenvolvimento desse trabalho.
Ao Programa Mata Atlântica (JBRJ) que me ofereceu suporte para realização desta
tarefa.
À curadoria do arboreto do Jardim Botânico do Rio de Janeiro, pela permissão da
realização desse trabalho na área do Jardim Botânico do Rio de Janeiro.
À curadoria dos herbários do JBRJ e da UENF e aos funcionários que auxiliaram a
pesquisa nesses dois locais.
À Dra. Telma N. S. Pereira (LMGV/ UENF), pela permissão do uso do microscópio
de fluorescência.
Ao Dr. Cláudio A. Retamal (LBCT) e ao MSc. Joseph A. M. Evaristo pelo auxílio no
entendimento de dados da eletroforese.
Ao Dr. Flavio C. Miguens pelos ensinamentos e auxílio nos microscópios eletrônicos.
À Dra. Kátia Valevski S. Fernandes pela paciência durante uma criteriosa revisão e
pela interessante discussão sobre este manuscrito.
Aos professores Dr. Flavio C. Miguens, Dr. Jorge E. A. Mariath e Dra. Maria Cristina
Gaglianone por aceitarem participar da banca de defesa desta tese e pelo
oferecimento de suas visões sobre este trabalho.
Às instituições financiadoras CAPES, CNPq, FAPERJ, pelo auxílio financeiro.
Ao técnico Ricardo Matheus (Laboratório de Sementes/JBRJ) pela indicação da
trilha utilizada e informações sobre essa.
V
Aos técnicos do LBCT, em especial Beatriz, Giovana, Márcia Adriana e Noil (LFBM);
e do LBE (JBRJ) por todo o auxílio na confecção de soluções, grades, fotografias, no
uso dos microscópios, além da boa convivência nos laboratórios.
Às técnicas Jucélia (LQFPP) e Érica (LFBM) pelos imprescindíveis auxílios no
preparo das amostras para bioquímica de proteínas.
Aos amigos e colegas do “grupo da Maura” pois, apesar de todas as confusões que
a convivência no cotidiano traz, todos auxiliaram direta ou indiretamente na
realização desse trabalho. Emilio, Guilherme e Tarsila, eu aprendi muitas coisas com
vocês.
Aos amigos e companheiros que toparam ir a campo comigo, fosse por 30 minutos
ou um dia inteiro; uma vez só ou várias vezes nesses anos; sob o sol, e até sob
chuva. São eles: Ricardo Matheus, Emilio C. Miguel, Gabriela N. de Souza, Carlo A.
Zaldini, Carlos H. Klein, Gabriel U. dos Santos, Fernanda B. B. de Hollanda, Alex
Barreto, Branca M. O. Medina, Rubem S. Ávila Jr., José R. Vianna, Carlos W. de
Oliveira, Rodolfo C. R. Abreu, Nara L. Vasconcellos, Ivone S. M. Gallardo, Rafael
Maul C. Costa, Tatiana Fernandes, Fernanda Casares, Mariana Sá Viana, Leandro
Freitas, Roberto N. Ramos, Adriana Lobão, Fátima Freitas, Rafael (herbário), Andrea
L. Rosa, Valéria C. Marques, Beatriz S. Ferreira, Luisa, Maria Claudia Villicana T.,
Elisângela M. Almeida. Puxa... Espero não ter esquecido de ninguém.
Aos alunos Camilla Alexandrino, Caroline F. Ricardo, Felipe Rosário e Lidiane S. da
Rocha pelo grande auxílio nas tarefas do laboratório e por compartilharem o
interesse pelo estudo da anatomia do eixo reprodutivo.
Aos amigos e colegas de todos os laboratórios nos quais trabalhei, em especial
André e Izabela no LFBM e Cíntia no Laboratório de Palinologia, pelos
ensinamentos e auxílio na realização de técnicas.
Aos colegas Hérika, Neuma e Pedro (LMGV/UENF), aos alunos do Dr. Leandro
Freitas e demais alunos do curso “Sistemas de Reprodução em Angiospermas”
(ENBT/2003) pelas interessantes discussões sobre técnicas e conceitos da
reprodução.
Ao Dr. Antonio H. A. de Moraes Neto e Érick Vaz Guimarães por possibilitarem e
auxiliarem o uso do Microscópio Eletrônico de Transmissão do LBE – Depto. Ultra
Estrutura e Biologia Celular – IOC – Fiocruz.
Aos companheiros de tutoria do CEDERJ, pela eterna quebra da rotina e por me
agüentarem nesta fase difícil.
Aos meus pais e irmã e às famílias Espellet e Klein; sem a colaboração de vocês eu
não teria conseguido.
A todos os amigos, vocês sempre foram fontes de conselhos, felicidade, confiança e
estímulo.
VI
Sumário
Índice de figuras, gráficos e tabelas..................................................................
Resumo.............................................................................................................
Abstract.............................................................................................................
I. Introdução............................................................................................
II. Objetivos.............................................................................................
III.1 Capítulo 1 - Estudo da biologia reprodutiva de Psychotria nuda:
morfologia floral; sucesso reprodutivo; deposição de grãos de
pólen sobre o estigma; e distribuição das formas florais..................
1.1. Introdução...................................................................................
1.2. Objetivos.....................................................................................
1.3. Material e métodos.....................................................................
1.3.1. Espécie estudada...............................................................
1.3.2. Local do estudo..................................................................
1.3.2.1. Localização das populações utilizadas para
comparação...........................................................
1.3.3. Taxa de ocorrência das formas florais e distribuição
de vizinhos.........................................................................
1.3.4. Morfometria floral...............................................................
1.3.5. Sistema reprodutivo...........................................................
1.3.6. Visitantes florais.................................................................
1.3.7. Deposição de grãos de pólen sobre estigma.....................
1.4. Resultados..................................................................................
1.4.1. Taxa de ocorrência das formas florais e distribuição de
vizinhos.............................................................................
1.4.2. Morfometria floral...............................................................
1.4.2.1. Morfometria floral de Psychotria nuda na
Floresta da Tijuca...................................................
1.4.2.2. Comparação com os dados oriundos de
estudos prévios em outras populações..................
1.4.3. Resultados das polinizações..............................................
1.4.3.1. Resultados das polinizações de Psychotria
nuda na Floresta da Tijuca.....................................
IX
XII
XIV
01
11
12
12
15
16
16
16
16
17
17
19
20
20
22
22
22
22
23
24
24
VII
1.4.3.2. Comparação com os dados oriundos de
estudos prévios em outras populações..................
1.4.4. Deposição de grãos de pólen sobre estigma.....................
1.4.5. Visitantes florais.................................................................
1.5. Discussão...................................................................................
1.6. Conclusões.................................................................................
III.2 Capítulo 2 - Anatomia e micromorfologia do eixo reprodutivo de
Psychotria nuda: Superfície e atrativos florais..................................
2.1. Introdução...................................................................................
2.2. Objetivos.....................................................................................
2.3. Material e métodos.....................................................................
2.3.1. Material botânico.....................................................
2.3.2. Histoquímicas..........................................................
2.3.3. Microscopia óptica e eletrônica de transmissão................
2.3.4. Citoquímicas...........................................................
2.3.5. Microscopia eletrônica de varredura.......................
2.4. Resultados.................................................................................
2.4.1. Estruturas florais relacionadas à atração dos
polinizadores.....................................................................
2.4.2. Micromorfologia dos órgãos florais..........................
2.4.3. Tamanho das células nos estiletes.........................
2.4.4. Estrutura da parede periclinal externa em órgãos
florais................................................................................
2.5. Discussão...................................................................................
2.6. Conclusões.................................................................................
III.3 Capítulo 3 - Anatomia e micromorfologia do eixo reprodutivo de
Psychotria nuda: estrutura dos grãos de pólen.................................
3.1. Introdução..................................................................................
3.2. Objetivos....................................................................................
3.3. Material e métodos.....................................................................
3.3.1. Material botânico................................................................
3.3.2. Histoquímicas.....................................................................
3.3.3. Microscopia óptica.............................................................
3.3.4. Microscopia eletrônica de transmissão..............................
25
25
25
27
34
49
49
54
55
55
55
56
57
57
59
59
60
61
61
63
69
80
80
86
87
87
87
88
89
VIII
3.3.5. Microscopia eletrônica de varre dura.................................
3.3.6. Perfil protéico.....................................................................
3.4. Resultados.................................................................................
3.4.1. Caracterização estrutural dos grãos de pólen...................
3.4.2. Histoquímica dos grãos d e pólen......................................
3.4.3. Desenvolvimento dos estratos parietais das anteras.........
3.4.4. Caracterização anatômica dos grãos de pólen..................
3.4.5. Medições de amido em grãos de pólen.............................
3.4.6. Caracterização ultraestrutural dos grãos de pólen............
3.4.7. Perfis protéicos dos grãos de pólen...................................
3.5. Discussão...................................................................................
3.6. Conclusões................................................................................
III.4 Capítulo 4 - Anatomia e ultraestrutura do eixo reprodutivo de
Psychotria nuda: interação pólen-pistilo...........................................
4.1. Introdução..................................................................................
4.2. Objetivos....................................................................................
4.3. Material e métodos.....................................................................
4.3.1. Polinizações manuais........................................................
4.3.2. Visualização do crescimento dos tubos polínicos in
vivo....................................................................................
4.3.3. Análise da permeabilidade dos tubos polínicos in vivo.....
4.3.4. Anatomia e ultraestrutura do estigma e dos tubos
polínicos in vivo.................................................................
4.3.5. Perfil protéico dos pistilos polinizados e não polinizados..
4.4. Resultados.................................................................................
4.4.1. Interação entre células do estigma e os grãos de pólen...
4.4.2. Crescimento dos tubos polínicos.......................................
4.4.3. Diferenças celulares entre os tubos compatíveis e
incompatíveis brevistilas e longistilas...............................
4.4.4. Perfis protéicos dos pistilos polinizados............................
4.5. Discussão...................................................................................
4.6. Conclusões................................................................................
IV. Considerações finais.........................................................................
V. Referências bibliográficas..................................................................
89
89
92
92
92
93
93
93
94
94
96
102
109
109
114
115
115
115
116
116
117
119
119
120
121
126
128
139
152
155
IX
Índice de figuras, gráficos e tabelas
Capítulo 1
Figura 1.1: Flores, botões e fruto de Psychotria nuda..........................
Figura 1.2: Imagens de satélite das áreas estudadas..........................
Figura 1.3: Esquema de flor brevistila e longistila de Psychotria nuda.
Figura 1.4: Forma de utilização das flores de Psychotria nuda............
Figura 1.5: Visitantes florais de Psychotria nuda..................................
Tabela 1.1: Dimensões mensuradas nas flores de Psychotria nuda
da Floresta da Tijuca (FTij), Rio de Janeiro, Brasil....................
Figuras 1.6 a 1.8: Distribuição das medidas relacionadas à corola de
Psychotria nuda na Floresta da Tijuca.......................................
Figuras 1.9 e 1.10: Distribuição de medidas relacionadas às anteras
de Psychotria nuda na Floresta da Tijuca..................................
Figuras 1.11 a 1.14: Distribuição de medidas relacionadas ao
estigma de Psychotria nuda na Floresta da Tijuca....................
Figuras 1.15 a 1.17: Distribuição comparativa dos valores de
dimensões florais de brevistila e longistila de Psychotria nuda
na Floresta da Tijuca..................................................................
Tabela 1.2: Média, desvio padrão e limites inferior e superior de
intervalo de confiança (95%), dos parâmetros florais de
Psychotria nuda segregados por forma floral, das amostras
oriundas da floresta da Tijuca (FTij), Ilha Grande (IGra), Mata
do Paraíso (Para) e Picinguaba (Pici) – Brasil...........................
Tabela 1.3: Percentagem e limites inferior e superior de intervalo de
confiança (95%) da produção de frutos de Psychotria nuda
após tratamentos de polinização intermorfo, autopolinização,
polinização intramorfo, apomixia e controle, segregados por
forma floral, das amostras de Ilha Grande (IGra), Floresta da
Tijuca (FTij) e Picinguaba (Pici) – Brasil....................................
Figura 1.18: Grãos de pólen de Psychotria nuda..................................
Figuras 1.19 e 1.20: Distribuição das proporções de diferentes grãos
de pólen nos estigmas de flores brevistilas e longistilas
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
X
de Psychotria nuda na Floresta da Tijuca.................................
Capítulo 2
Figura 2.1: Análise em microscopia de partes florais de Psychotria
nuda, nectário e tricomas...........................................................
Figura 2.2 Flores e botões de Psychotria nuda, sob teste de
coloração com vermelho neutro.................................................
Figura 2.3: Microscopia eletrônica de varredura de partes florais de
Psychotria nuda..........................................................................
Figura 2.4: Microscopia eletrônica de varredura de partes florais de
Psychotria nuda..........................................................................
Figura 2.5: Microscopia eletrônica de varredura de partes do pistilo
de Psychotria nuda.....................................................................
Tabela 2.1: Médias, desvio padrão e número amostral (quantidade
de células medidas) das análises de comprimento das células
epidérmicas do estilete de cada forma floral de Psychotria
nuda...........................................................................................
Figura 2.6: Estigma de Psychotria nuda...............................................
Figura 2.7: Cortes à mão livre de partes florais de Psychotria nuda....
Figura 2.8: Microscopia eletrônica de transmissão da parede
periclinal externa de diferentes órgãos florais de Psychotria
nuda...........................................................................................
Tabela 2.2: Caracterização das regiões da parede periclinal externa
de diferentes órgãos da flor de Psychotria nuda........................
Capítulo 3
Figura 3.1: Grãos de pólen de Psychotria nuda....................................
Figura 3.2: Histoquímicas de grãos de pólen de Psychotria nuda........
Figura 3.3: Microscopia óptica de anteras e grão de pólen de
Psychotria nuda em diferentes estágios de desenvolvimento...
Figura 3.4: Secções de grãos de pólen de Psychotria nuda.................
Tabela 3.1: Dados obtidos através de medidas dos grãos de amido
provenientes de secções dos grãos de pólen de Psychotria
nuda...........................................................................................
Figura 3.5: Perfil protéico de grãos de pólen de Psychotria nuda em
eletroforese unidimensional (SDS-PAGE).................................
48
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
103
104
105
106
107
107
XI
Figura 3.6: Perfis protéicos de grãos de pólen de Psychotria nuda em
eletroforese bidimensional..........................................................
Figura 3.7: Representação gráfica dos spots protéicos observados
em eletroforese bidimensional de grãos de pólen de
Psychotria nuda..........................................................................
Capítulo 4
Figura 4.1: Microscopia eletrônica de transmissão de grãos de pólen
de Psychotria nuda localizados no estigma...............................
Figura 4.2: Microscopia de fluorescência dos tubos polínicos de
Psychotria nuda in vivo após diferentes tipos de polinização....
Tabela 4.1: Avaliação do crescimento dos tubos polínicos nos pistilos
de Psychotria nuda, 8 horas após o evento de polinização.......
Figura 4.3: Microscopia confocal de tubos polínicos de Psychotria
nuda in vivo expostos ao traçador celular LY, após diferentes
tipos de polinização....................................................................
Figura 4.4: Microscopia óptica de tubos polínicos compatíveis de
Psychotria nuda após o crescimento in vivo..............................
Figura 4.5: Microscopia eletrônica de transmissão de tubos polínicos
compatíveis de Psychotria nuda após o crescimento in vivo.....
Figura 4.6: Microscopia óptica de tubos polínicos incompatíveis de
Psychotria nuda após o crescimento in vivo..............................
Figura 4.7: Microscopia eletrônica de transmissão de tubos polínicos
brevistilas incompatíveis de Psychotria nuda após o
crescimento in vivo.....................................................................
Figura 4.8: Microscopia eletrônica de transmissão de tubos polínicos
longistilas incompatíveis de Psychotria nuda após o
crescimento in vivo.....................................................................
Figura 4.9: Eletroforese das proteínas de pistilos de Psychotria nuda,
em gel de SDS-PAGE...............................................................
Tabela 4.2: Concentração de algumas proteínas nos pistilos de
Psychotria nuda antes da polinização e 3 horas após o evento
de polinização............................................................................
108
108
141
142
143
144
145
146
147
148
149
150
151
XII
Resumo
Psychotria nuda apresenta distilia associada ao sistema heteromórfico de auto-
incompatibilidade, ainda que seja observada variabilidade nos parâmetros
morfológicos entre populações desta espécie. Como é esperado para uma espécie
distílica, P. nuda possui nas diferentes populações, a razão entre as formas florais
semelhante a 1:1 (número de indivíduos brevistila: longistila). Contudo, na população
estudada, localizada na Floresta da Tijuca/ RJ, foi observada a presença de
crescimento clonal associada a uma distribuição dos indivíduos diferente da
aleatória. A deposição dos grãos de pólen sobre os estigmas mostrou-se
extremamente variável, o que pode estar relacionado à presença de uma grande
diversidade de visitantes florais. As estruturas de atração nas flores de P. nuda
incluem, além das cores do cálice e corola, nectários e, possivelmente, osmóforos.
Mais estudos serão necessários para determinar se a textura papilosa encontradas
nas corolas também está relacionada à atração de polinizadores. Sobre a morfologia
floral foram encontradas não apenas características macromorfológicas que variam
entre as formas florais. Além de diferenças na altura do estigma, por exemplo, foram
observadas também algumas diferenças no tamanho das células epidérmicas do
estigma e do estilete. As diferenças micromorfológicas no tamanho das papilas
estigmáticas já foram registradas para várias espécies, assim como também já foram
relatadas na literatura variações no tamanho e na ornamentação de grãos de pólen
associadas a cada forma floral. As variações nos dois últimos parâmetros foram
observadas em P. nuda, além disso, esta espécie apresentou outras diferenças
associadas aos grãos de pólen, como presença de uma quantidade diferenciada de
reservas energéticas, sendo maior em grãos de brevistilas, e distinção entre os
perfis protéicos das duas formas florais. As diferenças nos perfis protéicos dos grãos
de pólen podem estar relacionadas ao sistema heteromórfico de auto-
incompatibilidade. A presença deste sistema foi demonstrada tanto pela frutificação
após tratamentos de polinização manual, quanto pela observação de respostas de
incompatibilidade aos tubos polínicos durante a interação entre pólen e pistilo nas
duas formas florais. Durante as análises dos tubos polínicos compatíveis e
incompatíveis de P. nuda foram observadas características de crescimento,
morfologia e citologia que se mostraram diferenciadas entre os tubos incompatíveis
XIII
de brevistilas e longistilas e entre esses e os tubos compatíveis de ambas as formas
florais. Essas respostas, aliadas à variação nos perfis protéicos de pistilos
polinizados e não polinizados, dão subsídios à hipótese de que cada forma floral
apresenta uma resposta de incompatibilidade diferenciada.
XIV
Abstract
Psychotria nuda presents distyly associated to the heteromorphic self-incompatibility
system, even considering variations at morphological features among some
populations. As expected for a distylous species, populations of P. nuda presented a
morph ratio similar to 1:1 (number of S-morph: L-morph plants), at all studied sites.
However, clonal growth and a not random distribution of each morph plants were
observed in the studied population, located at Floresta da Tijuca/ RJ. Results on the
pollen grain deposition over stigmas were highly variable. The great diversity of
flower visitors may be related to this variation. Attractive features of P. nuda flowers
include the presence of nectaries and possibly osmophores, besides the calyx and
corolla strong colors. Further studies are needed in order to verify if the microtexture
with papillae in corolla is also related to the attraction of pollinators.
Macromorphological features were not the only morphological differences between
flowers of the two morphs. Besides the difference of stigma height in each morph,
differences in the size of epidermal cells from stigma and style were found.
Micromorphological variations of stigmatic papillae were already registered for
several species, as have also been reported in the literature variations of pollen
grains size and ornamentation associated to each morph of heterostylous species.
These pollen grain parameters were seen in P. nuda. This species pollen presented
another differences such as the presence of higher amount of energetic reserves in
S-morph grains and distinct protein profiles for each morph. These later protein
profile differences may be related to the heteromorphic self-incompatibility system in
P. nuda. The presence of this system was demonstrated by the analyses of fruit set
after hand pollinations and during pollen-pistil interaction, through the observation of
incompatibility response to pollen tube at both morph flowers. While analyzing
compatible and incompatible pollen tubes of P. nuda, different data for growth rate,
cell morphology and cytology were found for incompatible tubes from S- and L-
morph, and between these and compatible pollen tubes of both morphs. These
aspects, together with the protein profile variation among pollinated and non-
pollinated pistils, support the hypothesis that each morph presents a different
response to incompatible pollen tubes.
1
I. Introdução
As flores têm sido alvo de observações desde os tempos mais remotos, pois
antes mesmo de surgir a escrita, a agricultura era praticada. A mudança do modo de
vida onde predominava a caça e a coleta para o início de uma economia baseada na
domesticação de plantas e de animais marcou a maior transição na história humana
(Smith, 2005). Essa domesticação das plantas só foi possível através do cultivo e
seleção dos organismos, o que certamente envolveu o manejo das suas estruturas
reprodutivas, as flores.
Em sua classificação dos seres vivos, Linnaeus separou as flores, ao referir-
se sobre a reprodução sexuada, em quatro grandes grupos: hermafroditas, dióicas,
monóicas e polígamas (Darwin, 1877). Entretanto, tal agrupamento não esclarece a
existência de sistemas reprodutivos como a heterostilia. Esta classificação é,
portanto, um reflexo das preocupações dos botânicos mais antigos, que tinham
como prioridades estabelecer relações sistemáticas e conhecer compostos
medicinais das plantas, e não compreender sua reprodução (Richards, 1997).
Em Angiospermae, existe uma grande variedade de sistemas de reprodução,
até mesmo dentre as espécies hermafroditas, o que promove diferentes
possibilidades de expor os grãos de pólen aos agentes polinizadores. Um exemplo
de sistema reprodutivo, que pode ser encontrado em diversos grupos de
hermafroditas de Angiospermae, é chamado de heterostilia. Esse sistema é
conceituado como um polimorfismo floral geneticamente controlado (Ganders,
1979), que é caracterizado morfologicamente pelo posicionamento recíproco de
anteras e estigmas entre duas ou três formas florais de uma mesma espécie
(Ganders, 1979; Ree, 1997). Esse fenômeno, apesar de pouco acreditado, foi
estudado e defendido durante o século XIX por pesquisadores como Charles Darwin
e Friederich H. G. Hildebrand. Charles Darwin chegou a considerar o dimorfismo
floral de uma espécie como um estágio evolutivo que levaria à dioecia, mudando de
idéia posteriormente; e Friederich Hildebrand criou o termo heterostílica para
classificar as espécies com este polimorfismo (Ornduff, 1992).
Antes das publicações das observações de Charles Darwin e Friederich
2
Hildebrand, muitos botânicos consideravam a presença das diferentes formas florais
em espécies heterostílicas como uma mera variabilidade na altura e posição de
partes florais (Ornduff, 1992). Entretanto, Darwin (1877), através de análises
morfométricas e experimentos como os de polinização manual demonstrou a
existência de duas ou três classes de indivíduos nas espécies heterostílicas, para as
quais a autopolinização e polinização entre indivíduos da mesma forma floral não
gerava frutos. No século XX alguns autores consideraram, de forma errônea,
espécies heterostílicas como duas espécies, baseando-se nas diferentes formas
florais para a separação do taxa (Robbrecht, 1988). Atualmente, esse fenômeno já
está bem estabelecido, sendo encontrado em pelo menos 28 famílias de
Angiospermae (Barrett et al., 2000). Apesar do reconhecimento amplo por parte dos
estudiosos, existem diversos aspectos que permanecem incógnitos. Os taxa que
apresentam heterostilia possuem diferentes origens evolutivas, de acordo com a
filogenia descrita para Angiospermae (Barrett, 1992), o que impossibilita o
tratamento igualitário desse sistema para as diferentes famílias em que é
encontrado. Sob esta condição, um dos aspectos mais surpreendentes é o fato de
que a heterostilia evoluiu em mais de 20 ocasiões separadamente dentro das
Angiospermae (Lloyd e Webb, 1992a).
A princípio, as duas formas florais de espécies distílicas foram chamadas de
“pin-eyed” (longistilas) e “thrum-eyed” (brevistilas) (Darwin, 1862 apud Ornduff,
1992). Grande parte dos autores que subseqüentemente estudaram o assunto
adotou os termos “pin” e “thrum” (Ornduff, 1992). Apesar desta nomenclatura ainda
ser usada atualmente, muitos trabalhos na língua inglesa adotam os termos “long-
styled” e “short-styled”, sendo usadas também as abreviações LS e SS. Em
português as duas formas florais são comumente referidas como longistilas e
brevistilas, associando à idéia de uma forma floral ter estilete longo e a outra, curto.
Um aspecto marcante observado na literatura é o fato de que a maior parte
das informações sobre o sistema heteromórfico de auto-incompatibilidade foi
inicialmente obtida a partir de espécies herbáceas que ocorrem em regiões
temperadas (Barret e Richards, 1990). O grupo de espécies heterostílicas do gênero
Primula, por exemplo, recebeu grande atenção desde o início das observações
sobre a heterostilia (Ornduff, 1992). Diversos trabalhos indicaram que diferenças no
habitat (em especial, temperatura e umidade) provocam alterações na taxa de
germinação do grão de pólen (Barrett, 1980; McKee e Richards, 1998) e o
3
crescimento diferenciado dos tubos polínicos (Lewis, 1943; Barrett, 1980; Shivanna
et al., 1981; McKee & Richards, 1998; Faivre, 2002, Hedhly et al., 2004). Com isso,
devido à variação dos habitats, é possível que existam diferenças na heterostilia
entre espécies dos trópicos e de regiões temperadas. Um grande grupo de espécies
tropicais já foi estudado chegando à confirmação da presença deste sistema.
Entretanto, poucas espécies tropicais tiveram aspectos celulares, fisiológicos
bioquímicos e moleculares de sua reprodução considerados, como algumas
espécies do gênero Turnera (Shore e Barrett 1985; Barrett e Shore 1987;
Athanasiou e Shore, 1997; Tamari et al., 2001; Athanasiou et al., 2003; Khosravi et
al., 2003; Khosravi et al., 2004; Shore et al., 2006; Tamari e Shore 2006). E mesmo
para estas espécies de Turnera, que foram estudadas em casa de vegetação no
Canadá, ainda não foi descoberto o mecanismo que provoca a inibição do tubo
polínico incompatível.
Cada espécie com heterostilia pode apresentar-se com um dos dois tipos: a
distilia, que consiste em dois tipos de indivíduos que diferem apenas com relação à
forma floral (Riveros et al., 1995); e a tristilia, que possui a existência de três formas
florais como única distinção entre os indivíduos da espécie. Sendo assim, em termos
de morfologia externa, flores de plantas distílicas devem possuir duas classes com
pequenas variações entre flores da mesma forma: longistila – correspondendo à
forma de estilete longo e filetes curtos; e brevistila – forma de estilete curto e filetes
longos (Faivre e McDade, 2001). No caso, em flores longistilas o estigma é
encontrado em uma posição superior às anteras, enquanto em flores brevistilas as
anteras são mais altas do que o estigma. Desta forma, em espécies que apresentam
distilia a hercogamia é encontrada em suas formas “approach” e “reverse”, sendo as
formas florais longistila e brevistila, respectivamente. O termo “posicionamento
recíproco de anteras e estigmas” é bastante usado por diversos autores, como
Ganders (1979), e refere-se à posição destes dois órgãos, pois a expectativa sobre
plantas heterostílicas é a de que as anteras de uma forma floral estejam na mesma
altura do estigma da outra forma.
A diversidade morfológica entre as duas classes, brevistila e longistila,
geralmente vai além das diferenças de tamanho do estilete e dos filetes. Em geral,
são observadas também variações no tamanho do estigma, das papilas estigmáticas
e dos grãos de pólen, assim como, na ornamentação e, em alguns casos, no
formato dos grãos de pólen. Com a evolução independente da heterostilia em
4
diferentes taxa, esse repertório tão constante de caracteres morfológicos sugere que
a morfologia tem um importante valor adaptativo para esse sistema reprodutivo
(Gibbs, 1986). Desde o trabalho seminal de Darwin existe uma tradição de
interpretação de características florais como adaptações que limitam as
conseqüências deletérias da autopolinização e que promovem a polinização cruzada
em espécies heterostílicas (Barrett, 2003).
A reprodução das Angiospermae inclui estratégias que envolvem
características das flores e inflorescências, que influenciam os padrões de dispersão
de pólen, e mecanismos posteriores à polinização, como os sistemas de auto-
incompatibilidade (Barrett, 2003). Para a heterostilia é sabido que mecanismos
fisiológicos estão associados à morfologia na atuação do sistema heteromórfico de
auto-incompatibilidade; apesar disso, a natureza dessa incompatibilidade ainda não
está bem estabelecida (Gibbs, 1986). Ganders (1979) afirmou que quase todas as
espécies heterostílicas são auto-incompatíveis, apesar de haver diferenças na força
e na expressão dessa incompatibilidade.
Um aspecto bem estabelecido para o sistema de auto-incompatibilidade de
espécies heterostílicas é a sua genética. A partir de estudos sobre espécies de
Prímula, foram encontradas evidências de que a distilia é controlada por uma série
de genes muito próximos, formando um complexo gênico, ou supergene, que
raramente é desarranjado por recombinação através de “crossing over” (revisado por
Lewis e Jones 1992). De acordo com Ganders (1979), os loci responsáveis pelo
controle da auto-incompatibilidade encontram-se muito próximos aos responsáveis
pelos polimorfismos florais. Os loci responsáveis pelos processos de auto-
incompatibilidade em plantas recebem a nomeação de S e, em geral, são
encontrados diferentes alelos S (Franklin-Tong, 2002). Os loci de auto-
incompatibilidade são tratados dessa forma também para espécies heterostílicas.
Lloyd e Webb (1992a) indicaram a necessidade de dominância dentre os alelos S
para espécies distílicas. Nas 15 espécies com distilia já examinadas, a maioria
apresentou dominância para a forma brevistila (Ss), portanto na maioria das
espécies as flores longistilas (ss) possuem apenas alelos recessivos (Lloyd & Webb,
1992a).
As plantas não apresentam comportamentos apresentados por animais, como
migração, territorialidade, fidelidade e escolha do parceiro para reprodução.
Entretanto, as plantas também podem possuir uma forma de comportamento, pois
5
respondem a estímulos externos de forma adaptativa e previsível; um exemplo disso
é a forma como algumas flores se abrem e fecham de acordo com a umidade do ar
ou se voltam para a direção do sol (Richards, 1997). Outra forma de resposta das
plantas relacionada à reprodução se dá através dos mecanismos de reconhecimento
entre o pólen e o pistilo, que ocorrem tanto em situações de compatibilidade, quanto
de incompatibilidade.
A autopolinização é um modo de reprodução comum entre as plantas, mas
gera importantes conseqüências na variação gênica dentro das populações
(Ingvarsson, 2002). Quando o sistema predominante é a autopolinização a
homozigoze de diversos alelos é uma característica comum às plantas que possuem
vigor. Contudo, a homozigoze em um grande número de alelos, frequentemente, é
uma característica negativa para espécies com sistemas que priorizam a fecundação
cruzada (Allard, 1999). Nessas plantas, o aumento na taxa de homozigose causa um
processo de “depressão endogâmica” que resulta na diminuição do vigor da
progênie (Allard, 1999, Cardoso, 2004).
Castric e Vekemans (2004), propuseram que a capacidade de prevenir a
auto-fecundação provavelmente foi desenvolvida como uma forma de evitar os
efeitos deletérios da endogamia em diversas espécies. Neste caso, para prevenir
que ocorra a auto-fecundação, mesmo com a inexistência de uma barreira
fisiológica, algumas espécies auto-compatíveis possuem mecanismos morfológicos
para que haja nos estigmas apenas a deposição de grãos de pólen de outros
indivíduos (Richards, 1997). Com isso, tais espécies podem apresentar maior
variabilidade gênica na população. Mesmo com essa possibilidade morfológica,
muitos grupos de Angiospermae possuem mecanismos fisiológicos para a
prevenção da auto-fecundação, como os sistemas de auto-incompatibilidade.
A auto-incompatibilidade em plantas pode ser definida como a capacidade de
uma planta de rejeitar o seu próprio pólen (Newbegin, 1996). Os sistemas de auto-
incompatibilidade permitem que o pistilo discrimine entre os grãos de pólen
geneticamente diversos, possibilitando apenas o crescimento dos compatíveis e não
dos incompatíveis (Silva e Goring, 2001). Com isso, apesar dos grãos de pólen e do
pistilo de uma flor possuirem o potencial para realizar as suas funções na formação
de sementes, durante uma reação de auto-incompatibilidade ocorre a inibição ou
prevenção da fertilização (Hogeboom, 1975). Portanto, com estes sistemas, torna-se
obrigatória a troca de gametas entre diferentes indivíduos para que ocorra a
6
formação de sementes, mesmo que dessa forma a reprodução seja menos eficiente,
em termos de número de flores polinizadas (Richards, 1997).
Em casos extremos, plantas fortemente auto-incompatíveis não formam frutos
e sementes a partir de flores autopolinizadas. Porém, na maioria dos casos, a auto-
incompatibilidade se expressa por uma baixa produtividade de frutos e sementes em
autopolinizações, quando comparado ao número de sementes e frutos formados por
polinizações cruzadas (Bittencourt Jr., 2003).
As Angiospermae apresentam uma variedade de sistemas de auto-
incompatibilidade. Baseando-se em diferenças morfológicas, estes sistemas são
divididos em dois grupos, o homomórfico e o heteromórfico (Stone e Goring, 2001).
As espécies com os sistemas homomórficos apresentam apenas um tipo de flor por
espécie, enquanto as com o sistema heteromórfico podem possuir dois ou três tipos
de flores (heterostilia). Os sistemas de auto-incompatibilidade também são
classificados como gametofíticos ou esporofíticos, de acordo com o fenótipo do
pólen que determina a auto-incompatibilidade. Por isso, quando esta reação é
determinada pelo próprio genótipo haplóide (gametofítica), ou pelo genótipo do
esporófito que gerou o pólen (esporofítica). As revisões sobre os sistemas de auto-
incompatibilidade seguem, em geral, um dos seguintes tipos de abordagem: (1)
inicial separação dos sistemas homomórficos em gametofítico e esporofítico, e em
seguida diferenciando o sistema heteromórfico; (2) a dicotomia inicial é feita entre
sistemas gametofíticos e esporofíticos, estando os heteromórficos associados aos
esporofíticos (Gibbs, 1986). Desta forma pode-se perceber a dificuldade em
posicionar a auto-incompatibilidade heteromórfica com relação aos outros sistemas.
Isto pode estar associado ao fato de que, em comparação aos estudos sobre os
sistemas de auto-incompatibilidade homomórfica, foram realizados muitos estudos
sobre a genética, a ecologia e a evolução, entretanto, sabe-se muito menos sobre a
fisiologia e a bioquímica das reações de auto-incompatibilidade para o sistema
heteromórfico (Barrett e Cruzan, 1994).
O sistema heteromórfico de auto-incompatibilidade, que é dialélico e
heterostílico, é proporcionado por um mecanismo “esporofítico”, pois durante o
reconhecimento no pistilo, o pólen possui sua compatibilidade determinada pelo
genótipo do esporófito (Gibbs, 1986). Com isso, seria possível imaginar que os
aspectos citológicos da inibição dos tubos polínicos em espécies com sistema de
auto-incompatibilidade homomórfico esporofítico, que é multialélico, são parecidos
7
com aqueles relacionados à inibição do pólen intramorfo (oriundo da mesma forma
floral que o pistilo polinizado) em espécies heterostílicas (Lloyd e Webb, 1992a).
Contudo, é muito provável que os mecanismos de auto-incompatibilidade de
espécies heterostílicas e não heterostílicas tenham evoluído de forma independente;
ou seja, ao contrário do indicado por alguns autores que propuseram que o sistema
heteromórfico se originou de um sistema homomórfico esporofítico (Gibbs, 1986).
Outro motivo que foi utilizado para uma discriminação entre os dois sistemas se
deve ao fato de que nenhum taxon heterostílico está relacionado filogeneticamente a
um taxon que apresente auto-incompatibilidade esporofítica multialélica (Ganders,
1979, Charlesworth, 1982). Contudo, estes dados não foram reavaliados após as
diversas reorganizações sistemáticas das quais Angiospermae tem sido alvo, devido
ao avanço da sistemática molecular nas últimas décadas; com isso, se faz
necessária uma nova avaliação sobre o posicionamento taxonômico das espécies
com os dois sistemas de auto-incompatibilidade.
Além da distância do relacionamento filogenético entre os diferentes sistemas
de auto-incompatibilidade, Lloyd e Webb (1992a) listaram uma série de
incongruências que corroboram com a idéia de que a heterostilia surgiu como um
sistema diferenciado de auto-incompatibilidade. Dentre estas observações estão: (1)
a diferença na quantidade de alelos que proporcionam as reações de inibição do
pólen – a diminuição no número de alelos de espécies multialélicas, em geral, traz a
perda da auto-incompatibilidade ou a extinção da espécie, e por isso não poderia
estar relacionada ao surgimento da heterostilia; (2) a diferença no número de células
dos grãos de pólen maduros – geralmente são encontrados três células em espécies
com sistema multialélico e apenas dois em espécies heterostílicas, o que também
contraria as expectativas dos estágios evolutivos; (3) no sistema homomórfico de
auto-incompatibilidade, os produtos que provocam as reações de incompatibilidade
são polipeptídeos codificados por um gene, que apresentam para cada alelo uma
variação específica; ou seja, se o polipeptídeo for o mesmo, no pólen e no pistilo,
estes dois são incompatíveis. Em espécies com o sistema heteromórfico, contudo, a
reação de incompatibilidade entre pólen e pistilo dentro de cada forma floral não
precisa ter a mesma base molecular em comum com a outra forma floral.
A observação de que cada forma floral pode possuir um tipo de barreira
diferenciada é oriunda de observações citológicas das reações de incompatibilidade
(Lewis, 1943; Gosh e Shivanna, 1980; Shivanna et al., 1981, 1983; Stevens e
8
Murray, 1982; Bawa e Beach, 1983; Anderson e Barrett, 1986; Wedderburn e
Richards, 1990; Scribailo e Barrett, 1991; Wong et al., 1994; Siar et al., 2001; Faivre,
2002) e ainda, de alguns testes fisiológicos, como a análise deste processo em
diferentes temperaturas (McKee e Richards, 1998). Estes estudos demonstram que,
em grande parte das espécies heterostílicas estudadas, o crescimento do tubo
polínico incompatível é diferenciado para as duas formas florais.
Os progressos na compreensão da biologia molecular de espécies com
sistema de auto-incompatibilidade heteromórfica têm sido muito lentos e, por isso,
pouco se sabe sobre como ocorrem os mecanismos de rejeição do pólen nestes
sistemas (Stone e Goring, 2001). Apesar de não identificar as moléculas em
questão, Stevens e Murray (1982) demonstraram que os materiais sobre a parede
dos grãos de pólen de Primula podem ser subtraídos sem que haja conseqüência
para o reconhecimento do pólen incompatível por parte do pistilo. Entretanto, a
remoção da película protéica sobre o estigma causou a perda da reação de
incompatibilidade. Estas evidências geraram novos questionamentos sobre as
moléculas de reconhecimento entre pólen e pistilo em espécies heterostílicas. Uma
das dúvidas está na forma pela qual o pólen é reconhecido como incompatível.
Depois de várias tentativas para identificar os produtos do gene S de espécies
heterostílicas, a maior parte para o gênero Primula, alguns esforços têm tido
sucesso e proporcionaram a identificação de moléculas em Turnera que
possivelmente estão envolvidas com os processos de auto-incompatibilidade
heteromórfica. Em investigações sobre o gênero Turnera série Turnera, foram
encontradas duas proteínas, uma poligalacturonase e uma α-dioxigenase em
estiletes de flores brevistilas. Contudo ainda há necessidade de maiores
investigações para descobrir se estas proteínas estão associadas aos processos de
auto-incompatibilidade heteromórfico (revisado por Shore et al., 2006).
Muitos autores defendem que as características morfológicas associadas às
flores heterostílicas estão também associadas ao sistema de auto-incompatibilidade
heteromórfico, ainda que estas características não sejam compartilhadas por todas
as espécies heterostílicas (Dulberger, 1992). As diferenças de tamanho,
especialmente de estruturas como os grãos de pólen e papilas estigmáticas, por
exemplo, já foram associadas a diferenças fisiológicas que contribuiriam com os
mecanismos de incompatibilidade (Shivanna et al., 1981). Contudo, particularmente
essas características podem não estar envolvidas diretamente nos processos de
9
auto-incompatibilidade, mas sim possuir outro papel, o de assegurar que as
polinizações compatíveis tenham o esperado sucesso.
Rubiaceae é uma das maiores famílias de Angiospermae e está distribuída
em regiões temperadas e tropicais (Robbrecht, 1988). Esta família contém a maior
quantidade de espécies heterostílicas, quando comparada a qualquer outra e,
provavelmente possui mais espécies heterostílicas do que todas as outras somadas
(Ganders, 1979). Contudo, a despeito desta grande quantidade, este grupo foi pouco
investigado em termos de diversidade da heterostilia (Ree, 1997) e de mecanismos
de incompatibilidade (Bawa e Beach, 1983).
Psychotria L. é um gênero pantropical que pertence à tribo Psychotrieae
(Robbrecht, 1988; Hamilton, 1989). Este gênero possui, aproximadamente, 1650
espécies (Hamilton, 1990) e é tipicamente distílico (Baker, 1958). Este é um dos
motivos pelo qual Hamilton (1990) declarou que Psychotria é um gênero apropriado
para o estudo da evolução e ecologia da distilia, assim como é ideal para o estudo
da diversificação em ambiente tropical. Contudo, referências sobre a distilia em
Psychotria são escassas e espalhadas na literatura (Hamilton, 1990), e ainda são
poucas em relação ao conjunto de espécies a ser representado. Apesar deste
histórico, houve um interesse crescente nas últimas décadas (Bawa e Beach, 1983;
Lima, 1988; Pérez-Nasser et al., 1993; Stone, 1995; 1996; Almeida e Alves, 2000;
Faivre e McDade, 2001; Castro e Oliveira, 2002; Faivre, 2002; Castro e Araújo,
2004; Coelho e Barbosa, 2004; Ramos, 2004; Teixeira e Machado, 2004a; Almeida,
2005; Lopes e Buzato, 2005; Rossi et al., 2005, Pereira et al., 2006).
Psychotria nuda (Cham. & Schlecht.) Wawra é uma espécie adequada ao
estudo da distilia nos trópicos, pois possui ampla distribuição, mecanismos de auto-
incompatibilidade, e a variação na morfologia entre as duas formas florais. Existem
ainda, diversos aspectos da heterostilia para essa espécie que permanecem
desconhecidos, como: a relação entre as diferenças de tamanho do pólen entre as
formas florais e o crescimento de tubos polínicos de tamanhos diferenciados; o tipo
de molécula que causa a reação de auto-incompatibilidade; e o que acontece às
células reprodutivas durante as interações compatíveis e incompatíveis. Portanto,
para responder essas e outras questões sobre distilia em espécies tropicais, se faz
necessária a realização de mais estudos sobre P. nuda e outras espécies distílicas.
A espécie enfocada neste projeto, P. nuda, já teve aspectos de seu sistema
reprodutivo estudados por Castro e Araújo (2004), Almeida (2005) e Pereira et al
10
(2006). Tais autoras concluíram que há a presença de heterostilia na espécie,
englobando tanto características morfológicas das flores, quanto a presença do
sistema heteromórfico de auto-incompatibilidade em diferentes populações na região
sudeste do Brasil.
Apesar de não ter sido encontrado estudo sobre os limites de ocorrência da
espécie P. nuda, foi possível encontrar o registro de ocorrência desta espécie em 6
estados do sudeste e sul brasileiro (MOBOT, 2007). Indivíduos de P. nuda já foram
coletados em florestas dos estados do Espírito Santo, Minas Gerais, Paraná, Rio de
Janeiro, Santa Catarina e São Paulo. Com isso, é possível afirmar que esta espécie
apresenta uma ampla distribuição.
Na cidade do Rio de Janeiro, após o aparecimento de uma praga para os
cafezais, em 1843, pouco a pouco os sítios e fazendas da Tijuca, Gávea e Serra da
Carioca foram abandonando as suas plantações (Bandeira, 1993). Contudo, o
desmatamento destas áreas foi compreendido, na época, como causador de seca e
conseqüente diminuição no abastecimento de água em diversas áreas da importante
cidade do Rio de Janeiro (Bandeira, 1993; Heynemann, 1995). Embasado em uma
proposta ecológica, o reflorestamento da região, em meados do século XIX, foi um
passo precursor e isolado de seu tempo, o que deu a seus formuladores e
executores um grande mérito (Heynemann, 1995). Grande parte desta floresta está
protegida desde dezembro de 1861, pela criação de um decreto que ordenava o
plantio e conservação da área que, posteriormente, se tornou o Parque Nacional da
Tijuca (Bandeira, 1993).
O conhecimento sobre o reflorestamento da floresta da Tijuca, contudo,
reforça o aspecto de condição de uma floresta secundária. Psychotria nuda pode ser
considerada como uma espécie clímax (Schorn e Galvão, 2006), e sua abundância,
assim como a presença de outras espécies clímax e o tempo de início do
reflorestamento, demonstram que esta floresta encontra-se em um estágio
sucessional avançado.
O presente estudo foi realizado em uma área conhecida como parte do
entorno do Jardim Botânico do Rio de Janeiro, que também é contígua ao Parque
Nacional da Tijuca (EMBRAPA, 1994).
11
II. Objetivos
O principal objetivo desta tese foi o de analisar diferentes aspectos do sistema
heteromórfico de auto-incompatibilidade de Psychotria nuda, para fornecer subsídios
ao conhecimento deste sistema em espécies de distribuição tropical. Cada capítulo
da tese corresponde a uma visão biológica diferente da heterostilia e uma posição
constante a todos os capítulos é a comparação entre as formas florais. O primeiro
capítulo abrange, principalmente, aspectos da macromorfologia floral e da biologia
reprodutiva; o segundo enfoca uma pesquisa sobre a superfície floral; o terceiro
engloba o entendimento de aspectos estruturais e bioquímicos dos grãos de pólen; e
o quarto capítulo relata detalhes da interação entre o pólen e o pistilo de P. nuda,
tanto referentes à interação compatível, quanto resultantes de interações
incompatíveis.
12
III.1 Capítulo 1
Estudo da biologia reprodutiva de Psychotria nuda: morfologia floral;
sucesso reprodutivo; deposição de grãos de pólen sobre o estigma; e
distribuição das formas florais
1.1. Introdução
Um dos aspectos mais importantes para o diagnóstico de uma espécie
heterostílica é a presença de um polimorfismo, através do qual as populações são
compostas por duas (distilia) ou três (tristilia) formas, as quais diferem-se
reciprocamente na altura dos estigmas e anteras (Barrett, 1992). Esta separação
entre estigmas e anteras, aliada à posição similar de anteras e estigmas de formas
florais diferentes, provavelmente promove a polinização cruzada entre indivíduos de
formas florais distintas (Darwin, 1877). A hercogamia, que está presente nessas
espécies heterostílicas, é considerada como um mecanismo que aumenta a taxa de
polinização cruzada em todas as espécies que a possuem, já que esta diminui a
interferência entre os órgãos femininos e masculinos em flores polinizadas por
animais (Arroyo et al., 2002). Nesse caso, em flores longistilas o estigma é
encontrado em uma posição superior às anteras, enquanto em flores brevistilas as
anteras são mais altas do que o estigma. Com isso, é esperado que a deposição de
grãos de pólen legítimos (oriundos de flores de outra forma floral) sobre o estigma
seja maior do que a de grãos ilegítimos (oriundos de auto-polinização e intramorfo -
de outra flor de mesma forma floral).
Além das alturas do estigma e anteras, existe um grande espectro de
características que apresentam polimorfismos em flores heterostílicas, incluindo
diferenças morfológicas e fisiológicas entre as formas florais (Dulberger, 1992). O
tamanho dos grãos de pólen, por exemplo, pode ser maior em indivíduos brevistilas,
devido ao fato dos tubos polínicos dessa forma floral cumprirem uma jornada mais
13
longa durante o crescimento no pistilo de flores longistilas, necessitando de mais
reservas do que o pólen de longistilas ao crescer no pistilo de brevistilas (Mazer e
Hultgard, 1993).
A presença de um supergene que inclui uma série de loci próximos que
controlam cada uma das variações morfológicas e fisiológicas da heterostilia é a
teoria mais aceita para a explicação desse sistema reprodutivo (Lewis e Jones,
1992). A heterostilia inclui o sistema heteromórfico de auto-incompatibilidade, no
qual apenas a polinização legítima, ou seja, entre as duas formas florais, gera frutos.
Com isso, é reforçada a tendência da taxa de ocorrência de 1:1 (número de
indivíduos brevistila: número de indivíduos longistila) entre as formas florais nas
populações com distilia (Pailler et al., 1998). Quando ocorre a autopolinização em
pequenas populações dimórficas, e esta é desigual entre as formas brevistila e
longistila, a taxa de ocorrência das formas florais pode ser desviada do padrão 1:1
(Ganders, 1979). Quando ocorre a reprodução vegetativa, em adição à sexuada,
provavelmente haverá também a formação de agregados de clones, de forma que
um indivíduo possui maior probabilidade de estar localizado próximo a outro de
mesma forma floral (Ree, 1997). Contudo, sob uma taxa de ocorrência de 1:1, nas
populações em que ocorre apenas a reprodução sexuada e mediante a manutenção
do sistema heteromórfico de auto-incompatibilidade, a expectativa é de que 50 %
dos indivíduos possuam vizinhos mais próximos com flores de uma forma floral e os
outros 50 % possuam vizinhos da outra forma.
A base dos conhecimentos sobre a heterostilia foi construída sobre estudos a
respeito do gênero Primula, feitos inicialmente por Darwin (1877), e outros gêneros
oriundos de regiões temperadas. Entretanto, a maior parte das espécies
heterostílicas é encontrada nos trópicos, e o número de informações sobre esses
taxa é ainda deficiente (Faivre, 2002). Outro ponto a ser considerado é a falta da
reciprocidade perfeita dos órgãos florais entre as formas florais, que tem sido
observada em muitas espécies tropicais. Esse desvio, do que seria considerado
como típico para espécies heterostílicas, é pouco entendido quando referido às
consequências para a adequação do sistema reprodutivo das espécies em questão
(Faivre e McDade, 2001). E gera, ainda, a dúvida se os grãos de pólen localizados
na antera de uma forma floral serão transferidos, de forma eficaz, para o estigma de
outra forma floral.
Variações morfológicas e diferenças na força do sistema de auto-
14
incompatibilidade entre populações têm sido encontradas em várias espécies
heterostílicas (ex.: Mazer e Hultgard, 1993; Pailler e Thompson, 1997; Faivre e
McDade, 2001; Alves dos Santos, 2002). Portanto, como a heterostilia pode variar
entre as populações de uma espécie, os estudos que retratam a situação de apenas
uma população não devem ser adequados para a descrição do sistema reprodutivo
desta espécie (Faivre e McDade, 2001). Esta consideração é válida especialmente
quando as populações são encontradas em áreas de florestas fragmentadas, devido
ao tamanho reduzido, a descontinuidade e o aumento da área de borda dos
fragmentos, fatores que podem impor diversos efeitos ecológicos e genéticos sobre
as plantas, tanto de forma direta como indireta (Aizen e Feinsinger, 1994). Além
disso, outras condições ambientais podem interferir na manutenção da heterostilia,
causando impactos tanto na manutenção de características morfológicas durante a
evolução dos organismos, quanto na atuação do sistema de auto-incompatibilidade.
Esta interferência já foi demonstrada para a espécie aquática Eichornia azurea
(Pontederiaceae), que, de acordo com os estudos de Alves dos Santos (2002),
apresenta a quebra da heterostilia apenas em uma população mais próxima do
oceano, enquanto em quatro populações mais distantes do oceano esta espécie
manteve a condição esperada para tristilia.
A presença de diferentes estruturas populacionais já foi observada para
algumas espécies de Psychotria. Sakai e Wright (2008), por exemplo, observaram
no Panamá a presença de populações monomórficas de três espécies desse gênero
que, de acordo com o estudo de Hamilton (1990), apresentam outras populações
dimórficas no mesmo país. A análise da heterostilia em diferentes populações de
Psychotria nuda só foi possível devido à realização de estudos anteriores, de outros
pesquisadores, sobre a morfologia floral, a taxa de ocorrência das formas florais e o
sistema reprodutivo. Os trabalhos de Castro e Araújo (2004), Almeida (2005) e
Pereira et al. (2006) foram realizados em diferentes áreas e foram utilizados para a
observação de metodologias e a comparação dos dados obtidos para a espécie.
Com isso, parte dos resultados deste capítulo foi obtida através de análises
comparativas com os referidos estudos.
15
1.2. Objetivos
Neste capítulo foram estudados aspectos da biologia reprodutiva de uma
população de Psychotria nuda (Cham. & Schlecht.) Wawra em uma área de Floresta
Atlântica sub-montana no sudeste do Brasil (Floresta da Tijuca), com os seguintes
objetivos específicos:
- Verificar a taxa de ocorrência das formas florais e a distribuição espacial de
brevistilas e longistilas na trilha amostrada;
- Registrar a variação de parâmetros morfométricos de caracteres florais entre
brevistilas e longistilas, comparando os resultados de morfometria floral e a taxa de
ocorrência das formas florais obtidos na Floresta da Tijuca com as observações em
outras três populações previamente estudadas;
- Verificar o sistema de auto-incompatibilidade de Psychotria nuda através da
verificação das proporções de produção de frutos, comparando os resultados de
formação de frutos de P. nuda obtidos na Floresta da Tijuca com as observações em
outras duas populações previamente estudadas;
- Comparar a deposição de grãos de pólen legítimos e ilegítimos sobre
estigmas de flores brevistilas e longistilas desta espécie.
16
1.3. Material e métodos
1.3.1. Espécie estudada
Psychotria nuda, comumente chamada de “sonhos-de-ouro” (EMBRAPA,
1994), é um arbusto com 1,0 – 5,0 m de altura (Klein, D. E., obs. pessoal, Almeida,
2005). Esta espécie está amplamente distribuída na Floresta Atlântica, que cobre a
costa oriental do Brasil. Suas inflorescências são cimosas e sésseis, contendo três
flores, na maioria dos casos. As flores apresentam heterostilia, possuindo duas
formas florais (figura 1.1A). A corola apresenta cor amarelo vivo, é tubular e as cinco
pétalas, completamente fundidas, são carnosas (figura 1.1B). O ovário tem
localização inferior, o estilete é claro e o estigma bífido. Os estames são epipétalos e
a deiscência da antera é longitudinal. Os frutos carnosos (figuras 1.1C e D) são
verdes enquanto imaturos e tornam-se púrpura na maturidade. Foram estudados
indivíduos de Psychotria nuda numa trilha próxima à Escola Nacional de Botânica
Tropical/ JBRJ, com cerca de 620 m de extensão, que está sempre aberta à
visitação.
1.3.2. Local do estudo
O presente estudo foi conduzido na Floresta da Tijuca, no Estado do Rio de
Janeiro, Brasil (figura 1.2A). Esta floresta é formada pela união de alguns
remanescentes da floresta Atlântica com áreas de floresta plantadas no século XIX
(Bandeira, 1993), de forma que podem ser encontrados vários estágios sucessionais
de vegetação (Oliveira et al., 1995). A Floresta da Tijuca (22
o
55', 23
o
01' S e 43
o
12',
43
o
19' W) possui temperatura média de 22
o
C e a precipitação média anual de
2.300 mm (Coelho Neto, 1992).
1.3.2.1. Localização das populações utilizadas para comparação (dados
oriundos de outros estudos)
Cada uma das populações previamente estudadas apresenta-se em uma
área diferenciada podendo variar tanto em relação às formações florestais, como ao
estágio de perturbação da floresta. Duas populações apresentam-se em áreas de
florestas com vegetação sempre-verde, pouco perturbadas e localizadas na costa
brasileira. São elas: a de Picinguaba, que se encontra no continente, que foi
estudada por Castro e Araújo (2004); e a de Ilha Grande, que pertence a uma ilha
17
oceânica e foi estudada por Almeida (2005). A terceira população, Paraíso, que foi
utilizada apenas para comparação da morfometria floral, encontra-se em um
pequeno fragmento de floresta secundária semi-decídua em estágios iniciais de
sucessão e foi estudada por Pereira et al. (2006). Estas populações foram
estudadas no Estado de São Paulo, no Parque Estadual da Serra do Mar – Núcleo
Picinguaba (Castro e Araújo, 2004), que apresenta ca. de 47.000 ha. (figura 1.2B);
no Estado do Rio de Janeiro, no Parque Estadual da Ilha Grande (Almeida, 2005),
que possui ca. de 15.000 ha. (figura 1.2C), sendo a maior parte desta área coberta
por floresta; e no Estado de Minas Gerais, na Estação de Pesquisa Treinamento e
Educação Ambiental Mata do Paraíso (EPTEAMP) (Pereira et al., 2006), que se
encontra em um pequeno fragmento de floresta com menos de 200 ha. (figura 1.2D).
As quatro populações estudadas de Psychotria nuda apresentam-se no
sudeste brasileiro; três são encontradas em regiões da costa e uma encontra-se
mais distante do mar (figura 1.2E). Para facilitar a disposição dos resultados cada
população foi tratada por um conjunto de quatro letras: Floresta da Tijuca – FTij; Ilha
Grande – IGra; Paraíso – Para; Picinguaba – Pici. As imagens de satélite das
diferentes áreas foram obtidas em maio de 2007, com o programa Google Earth –
software Google
®
.
1.3.3. Taxa de ocorrência das formas florais e distribuição de vizinhos
A taxa de ocorrência das formas florais na população foi estimada através da
identificação do tipo floral de todos os indivíduos, avistadas a partir da trilha, que
apresentavam flores (N = 166). Estas observações foram realizadas entre março e
abril de 2005. Para cada um dos indivíduos também foi registrado o tipo floral do
indivíduo mais próximo. As distâncias entre os indivíduos foram obtidas com trena.
Para testar a homogeneidade da distribuição das formas florais na população
de FTij, e a probabilidade de ocorrência do indivíduo mais próximo da mesma forma
ou de diferente forma floral, um teste chi-quadrado foi calculado (Noether, 1983).
1.3.4. Morfometria floral
Amostras para observação da morfometria floral foram obtidas no período de
Março a Junho de 2005. Os dados foram obtidos através de metodologia similar a
empregada por Castro e
Araújo (2004), Almeida (2005) e Pereira et al. (2006), de
forma a possibilitar a comparação entre os resultados. As mensurações foram
18
efetuadas conforme indicado no esquema da figura 1.3. O comprimento e diâmetro
da corola, altura do estigma e da antera, comprimento dos lacíneos do estigma e da
antera foram registrados para 68 flores brevistilas e 78 flores longistilas, oriundas de
18 e 20 indivíduos, respectivamente.
As flores utilizadas para obtenção de dados de morfometria floral, com
exceção das usadas para mensurar o diâmetro dos grãos de pólen, estavam
completamente abertas quando coletadas, sem prevenção de visitas florais no
estágio de botão. Estas amostras foram conservadas em etanol 70 %,
permanecendo nesta solução até a hora da medição. As mensurações em milímetro
foram obtidas com o auxílio de paquímetro digital (0,01 mm).
Duas medidas foram realizadas acerca dos grãos de pólen de cada forma
floral, uma referente ao tamanho e outra à quantidade de grãos por flor. Para a
avaliação do tamanho, foram registrados os comprimentos de dois eixos desta
estrutura. Os grãos de pólen de P. nuda possuem formato esferoidal e, por isso,
tiveram de ser medidos dois eixos, o maior e o menor (como esta espécie apresenta
grãos inaperturados, não é possível definir os eixos polar e equatorial). Estas
medidas foram realizadas em um total de 174 grãos de pólen de flores brevistila e
173 de longistila. Os grãos medidos foram obtidos a partir de cinco indivíduos de
cada forma floral, 31 a 37 grãos por indivíduo. Em seis flores de cada forma floral, o
número de grãos de pólen foi estimado após a contagem do total de grãos
encontrados em uma das anteras. Esse valor foi multiplicado pelo número de
anteras de cada flor, no caso, cinco.
Para estas análises, botões florais foram previamente protegidos com sacos
de filó para evitar a visita de polinizadores e conseqüente contaminação com grãos
de pólen oriundos de outras flores. Os grãos de pólen foram obtidos após o
esfregaço de anteras oriundas de flores abertas sobre lâminas contendo uma
solução aquosa de glicerol 50 % (método modificado de desidratação e conservação
das amostras para a observação em microscópio óptico – Sass, 1940).
Posteriormente, as lâminas foram levadas ao microscópio óptico Axioplan ZEISS
acoplado ao software soft imaging system, analySIS
®
. Através deste programa foram
registradas imagens dos grãos utilizadas para a medição do comprimento dos eixos
desta estrutura. De forma a padronizar o termo aplicado a este parâmetro, foi
utilizado o termo empregado por Almeida (2005): diâmetro do grão de pólen. A
medida do diâmetro do grão de pólen foi obtida através da média da soma do
19
comprimento dos eixos, calculada pela metade da soma dos comprimentos do maior
e o menor eixo do grão (X = (eixo
Maior
+ eixo
Menor
)/2).
O número de grãos por antera foi avaliado com o auxílio de um contador de
mesa. Os grãos de pólen viáveis foram diferenciados dos inviáveis pela morfologia
apresentada em microscopia óptica de campo claro.
Os dados obtidos sobre a morfometria floral de indivíduos de Psychotria nuda
de FTij foram comparados entre as formas florais e aos dados das populações de
Pici (Castro e Araujo, 2004), IGra (Almeida, 2005) e Para (Pereira et al. 2006). O
limite de 95 % dos intervalos de confiança foi definido para as médias de cada
parâmetro morfométrico obtido nas três populações. A significância nas diferenças
das médias foram verificadas por teste t- student (Dixon e Massey Jr, 1983). O
critério de decisão para uma diferença significante foi p<0,05.
1.3.5. Sistema reprodutivo
Dados sobre o sistema reprodutivo de Psychotria nuda em FTij foram obtidos
de março de 2004 a agosto de 2005. O sistema de auto- incompatibilidade foi
quantificado a partir da comparação na produção de frutos obtidos através de
experimentos de polinização manual em flores oriundas de 112 indivíduos (55
brevistilas e 57 longistilas).
As polinizações manuais consistiram nos seguintes tratamentos: apomixia
(sem nenhum grão de pólen sobre o estigma), autopolinização, polinização
intramorfo (entre duas flores de mesma forma floral) e intermorfo (entre duas flores
de diferentes formas florais). Para realizar tais tratamentos de polinização manual,
inflorescências contendo, em geral, um botão floral em pré-antese foram isoladas
em bolsas de filó (figura 1.4A). As flores permaneceram ensacadas antes e após o
evento de polinização manual. Desta forma foi evitado o contato entre as flores
abertas com os visitantes florais. Para os experimentos manuais de autopolinização,
polinizações intramorfo e intermorfo, foram utilizadas apenas flores recentemente
abertas. As polinizações manuais foram realizadas através do contato de uma
antera deiscente ou de grandes quantidades de pólen recentemente e
delicadamente extraídas com uma pinça com o estigma da flor alvo (figura 1.4B). Um
conjunto de flores, cuja antese e senescência foram acompanhadas, foi utilizado
para estimar a produção de frutos resultantes de polinização natural (controle). O
número de amostras utilizado para a realização das polinizações manuais e
20
controles variou entre 49 e 59 flores em cada tratamento.
As flores sujeitas aos diferentes tratamentos inclusive o controle, foram
marcadas com linha de algodão (figura 1.4C) e cobertas com a bolsa de filó até sua
senescência (com exceção das expostas à polinização natural). Cada tratamento
realizado recebeu uma cor código para possibilitar a posterior identificação.
Os experimentos no campo foram acompanhados até o desenvolvimento de
frutos grandes, porém imaturos (ex: figura 1.1C). Os frutos na sua forma madura
foram pouco observados na população, sendo provavelmente consumidos por
animais assim que seu desenvolvimento é completo (Almeida, E. M., comunicação
pessoal), e que assume coloração púrpura. Por este motivo, a presença de frutos
imaturos em estágio desenvolvido, apresentando um tamanho compatível ao de
frutos maduros, foi considerada como resultado positivo ao tratamento de
polinização manual ou controle, apesar da cor verde.
Assim como para a morfometria floral os dados sobre sucesso reprodutivo em
FTij foram comparados entre as formas florais e aos dados das populações de Pici
(Castro e Araujo, 2004), IGra (Almeida, 2005) e Para (Pereira et al. 2006). O limite
de 95 % dos intervalos de confiança foi definido e significância nas diferenças das
porcentagens da formação de frutos foram verificadas por teste t- student (Dixon e
Massey Jr, 1983). utilizando o teste exato de Fisher (Fisher, 1935). O critério de
decisão para uma diferença significante foi p<0,05. Devido à dificuldade de se
calcular o intervalo de confiança de uma proporção de 0 %, o intervalo de confiança
foi calculado como se uma das amostras, dentro de cada número de amostras,
tivesse sido avaliada de forma errada.
1.3.6. Visitantes florais
Os visitantes florais observados durante o trabalho no campo em FTij foram
registrados através de fotografias (figuras 1.5), mas a frequência de visitas não foi
registrada.
1.3.7. Deposição de grãos de pólen sobre estigma
A metodologia empregada para a observação dos grãos de pólen sobre o
estigma foi formulada através de modificações no tratamento proposto por Currier
(1957) para a observação de tubos polínicos em fluorescência. As etapas do método
modificado estão descritas abaixo.
21
A deposição de grãos de pólen sobre o estigma de ambas as formas florais,
sob condições de campo, foi examinada em estigmas de flores abertas por um dia
na população FTij. Tais estigmas foram conservadas em uma solução de etanol
70%. Em seguida, foi realizada uma etapa de clareamento pela exposição a uma
solução aquosa de hidróxido de sódio 1M, por 30 minutos. Após o clareamento, as
amostras foram lavadas em água corrente por duas vezes durante 5 minutos e,
posteriormente, coradas com safranina 1 %.
Os grãos de pólen aderidos ao estigma foram contados com o auxílio do
microscópio óptico Axioplan ZEISS acoplado ao software soft imaging system,
analySIS
®
. Para reconhecer a forma floral de cada grão, as medidas dos eixos dos
grãos de pólen foram usadas, de acordo com o descrito no item 1.3.3., de forma a
estabelecer as duas classes. Grãos de pólen de Psychotria nuda que apresentaram
a média do dois eixos menor do que 94,5 µm foram considerados como oriundos de
flores longistilas e os com o comprimento médio dos eixos maior do que 97 µm,
como provenientes de brevistilas. Os grãos de pólen que apresentaram diâmetro
entre as medidas 94,5 e 97 µm foram considerados como outros grãos, já que não
era seguro afirmar a origem destes. Também foi registrado o número dos grãos de
pólen inviáveis e oriundos de outras espécies (classificados como outros grãos).
22
1.4. Resultados
1.4.1. Taxa de ocorrência e distribuição espacial das formas florais
A taxa de ocorrência das formas florais observada na amostra estudada (N =
166) da população FTij foi: L/B = 1,18 (90 indivíduos longistilas e 76 brevistilas). O
teste chi-quadrado indicou que esta população é isoplética (χ
2
= 1,181; p<0,2), ou
seja, que não há desvio significativo da situação em que a metade dos indivíduos
possui um tipo floral e a outra metade o outro tipo.
A distribuição observada do vizinho mais próximo a cada indivíduo foi
diferente do esperado para uma distribuição randômica. Considerando a proporção
de indivíduos de cada forma floral na população estudada, a situação esperada era
a de que 45,8 % dos vizinhos deveriam ser do tipo brevistila, e os outros 54,2 % do
tipo longistila. Os resultados obtidos para P. nuda em FTij, contudo, foram: para os
indivíduos do tipo longistila, apenas 38,2 % de vizinhos foi do tipo brevistila e 61,8
%, longistila; e para brevistila, 35,6 % de vizinhos foi do tipo longistila e 64,4 %,
brevistila (χ
2
11,75; p<0,001).
1.4.2. Morfometria floral
1.4.2.1. Morfometria floral de Psychotria nuda na Floresta da Tijuca
As flores de P. nuda (FTij) apresentaram o dimorfismo esperado na altura do
estigma. Nas flores longistila foram encontrados conjuntos de estigma/estilete ca. de
0,9 cm maiores do que os das brevistilas. Outros parâmetros também apresentaram
dimorfismo entre as formas florais, que foram detectadas pela comparação das
médias das dimensões florais. Os estigmas de flores brevistilas estão claramente
localizados abaixo das anteras de flores do mesmo tipo e de estigmas de longistilas
(tabela 1.1). As médias dos seguintes parâmetros de flores brevistilas: altura das
anteras, diâmetro dos grãos de pólen e comprimento das anteras, estigma e corola;
foram significativamente maiores do que em flores longistilas (tabela 1.1). As médias
dos valores de diâmetro da corola (característica de número 2 na tabela 1.1) e do
número de grãos de pólen viáveis (brevistila = 4895,8 + 424,5 e longistila = 7315 +
615,8) e inviáveis (brevistila = 399,2 + 326,7 e longistila = 1290 + 204,4) se
mostraram significativamente maiores em longistila. As médias de diâmetro da
abertura do tubo da corola não diferiram significativamente quando comparadas às
formas florais (tabela 1.1).
23
Os parâmetros de distância entre estigma e antera, calculados a partir da
comparação de suas medidas de altura (tabela 1.1), mostram que ambas as formas
florais apresentam separação entre estes órgãos. As distâncias do estigma e da
antera em relação ao topo da corola foram significantivamente diferentes entre as
formas longistila e brevistila na população FTij, e também, houve uma diferença
obviamente maior na distância entre o topo do estigma e da corola em brevistila
quando os valores das duas formas florais foram comparados. Apesar da maior
parte dos parâmetros medidos em longistilas e brevistilas ter apresentado
dimorfismo, como detectado na comparação dos valores de média, na maioria dos
casos a distribuição dos valores medidos em cada flor apresentou sobreposição
entre as duas formas florais (figuras 1.6 a 1.13). Uma exceção foi encontrada na
distribuição dos valores de altura do estigma (figura 1.14).
Quando a dispersão dos valores de altura do estigma e da antera foram
considerados em diferentes eixos do gráfico, houve a separação dos valores de
cada forma floral (figura 1.15). O mesmo ocorreu quando os valores de comprimento
da corola foram plotados em relação à altura do estigma (figura 1.16). Entretanto, a
relação entre os valores de comprimento da corola e altura da antera (figura 1.17),
exibiu uma condição diferente: não houve separação entre os valores das duas
formas florais em ambos os eixos do gráfico da figura 1.17. Ainda assim, os três
gráficos apresentaram uma característica em comum, quando os valores de um eixo
são maiores os do outro eixo também se mostraram maiores, mesmo que houvesse
uma diferença de ângulo da reta entre as duas formas florais.
1.4.2.2. Comparação com os dados oriundos de estudos prévios em
outras populações
Em outras populações estudadas de P. nuda (na Ilha Grande, na mata do
Paraíso e Picinguaba, posteriormente tratadas aqui como IGra, Para e Pici,
respectivamente), o dimorfismo da altura do estigma, entre outras características
morfológicas também confirmaram a condição distílica (Almeida, 2005, Pereira et al.,
2006, Castro e Araújo, 2004, respectivamente). Para quase todas as dimensões
mensuradas, foram encontradas diferenças entre as quatro populações. Por vezes,
foram encontradas diferenças na média de um parâmetro em apenas uma das
populações e estas informações se mostraram independentes entre as formas florais
(tabela 1.2). Por exemplo, a média do comprimento da corola e o limite mínimo do
24
intervalo de confiança dessa medida, de flores do tipo brevistila em FTij foi maior do
que o observado em IGra, Para e Pici, enquanto para as flores longistilas os
intervalos de confiança se mostraram sobrepostos entre as quatro populações.
Geralmente, o padrão de variação de cada parâmetro entre as formas florais foi o
mesmo para todas as populações. Sendo assim, se a média encontrada para uma
determinada característica se apresentou menor em flores longistilas, por exemplo,
em uma população, o mesmo ocorreu nas outras. A única exceção foi a medida de
diâmetro da corola, que exibiu um padrão distinto em cada população. Em Pici a
corola apresentou, em média, diâmetros maiores em flores do tipo brevistila, o
oposto foi encontrado em FTij, enquanto em IGra não houve diferença significativa
(pois os intervalos de confiança das médias das duas formas florais se
sobrepuseram) entre as médias desse parâmetro nas duas formas florais (tabela
1.2).
Algumas das medidas foram efetuadas apenas em duas ou três das quatro
populações. O comprimento das anteras, por exemplo, foi mensurado em FTij, Para
e Pici e nestes locais foi encontrado dimorfismo dessa característica, sendo que as
flores brevistilas costumam possuir anteras maiores. O diâmetro de grãos de pólen
foi medido apenas em amostras oriundas de FTij e IGra. Nos dois lugares, os grãos
de pólen se mostraram maiores em flores brevistilas e não foram encontradas
diferenças significativas entre as médias desse diâmetro quando cada forma floral
das duas populações foi comparada (tabela 1.2).
1.4.3. Resultados das polinizações
1.4.3.1. Resultados das polinizações de Psychotria nuda na Floresta da
Tijuca
Em ambas as formas florais dos indivíduos localizados em FTij, a produção
de frutos foi maior após a polinização manual do tipo intermorfo e em flores expostas
à polinização natural (controle) do que a encontrada após os tratamentos de
autopolinização, polinização intramorfo e apomixia (tabela 1.3) Por outro lado, a
produção de frutos após as polinizações intermorfo e controle mostraram taxas
similares apenas em indivíduos do tipo longistila, enquanto para os do tipo brevistila
a polinização manual intermorfo se mostrou menos eficaz (tabela 1.3). Não foram
encontradas diferenças significativas entre as taxas de produção de frutos
resultantes da autopolinização, polinização intramorfo e apomixia das duas formas
25
florais (tabela 1.3).
1.4.3.2. Comparação com os dados oriundos de estudos prévios em
outras populações
O sucesso de cruzamentos legítimos (intermorfo) foi maior do que o dos
cruzamentos ilegítimos (autopolinização e intramorfo) e o da apomixia (tabela 1.3)
nas três populações examinadas, apesar de haver variações nas taxas de formação
de frutos entre os tipos longistila e brevistila e entre as três populações (IGra –
Almeida,2005; Pici – Castro e Araújo, 2004; e FTij – tabela 1.3). Entre todas as
polinizações manuais e tratamento de apomixia, apenas a taxa de produção de
frutos após polinização intermorfo em flores brevistilas de FTij exibiu uma diferença
significativa quando comparada às outras taxas obtidas após o mesmo tipo de
polinização em outras áreas, apresentando menor sucesso, de acordo com o teste
de Fisher (tabela 1.3 – observar os intervalos de confiança). As flores usadas como
controle (polinização natural) produziram taxas similares de formação de frutos para
ambas as formas florais em quase todas as localidades, entretanto, o tipo floral
longistila demonstrou menor sucesso em IGra (tabela 1.3).
1.4.4. Visitantes florais
Foram observados diversos animais em contato com flores e botões de
Psychotria nuda (figura 1.4). Não foi realizado um estudo de identificação das
espécies de visitantes florais em FTij. Ainda assim, os mesmos grupos de possíveis
agentes polinizadores, beija-flores, borboletas e abelhas, registrados para IGra e Pici
(Castro e Araujo, 2004, Almeida, 2005) foram observados visitando flores de P. nuda
neste local. Formigas foram observadas em flores de alguns indivíduos em
particular. Sob a mesma condição, pequenos insetos da ordem Thysanoptera foram
encontrados em algumas flores. Contudo, estes dois visitantes não carregavam
grãos de pólen e, por isso, não devem ser considerados como polinizadores.
1.4.5. Deposição de grãos de pólen sobre estigma
Foram observados grãos de pólen oriundos das duas formas florais nos
estigmas de flores brevistilas e longistilas (figura 1.18). Uma grande variação no
número total de grãos de pólen depositados sobre o estigma foi encontrada (média e
desvio padrão: estigma longistila = 108,08 +
151,25; estigma brevistila = 92,23 +
26
65,213 grãos). Por isso não foi possível avaliar a importância da relação entre a
altura do estigma ou da altura das anteras e a quantidade de grãos pólen
depositados nos estigmas de Psychotria nuda em FTij. A maioria dos estigmas
apresentou deposição de mais grãos de pólen ilegítimos do que de legítimos,
quando apenas estes foram comparados (figura 1.19). Um número maior de
estigmas proveniente de flores longistilas não exibiu nenhum pólen legítimo (10
estigmas em um total de 37 amostras), quando comparado aos oriundos de
brevistilas (2 estigmas em um total de 30 amostras). Ambas as formas florais
apresentaram uma grande e similar quantidade de estigmas com 0 a 20 % de grãos
de pólen legítimos sobre o total de pólen depositado (23 estigmas de longistilas e 20
de brevistilas).
Nenhum estigma examinado conteve apenas grãos de pólen legítimos (dado
não mostrado). Apenas alguns estigmas de flores brevistilas apresentaram valor
maior do que 1 para a razão “grãos de pólen legítimos/ soma de todos os outros
tipos de grãos depositados”, o mesmo não ocorreu com nenhuma flor do tipo
longistila (figura 1.20). Entretanto, o número de grãos de pólen legítimos em quatro
estigmas de flores longistilas foi maior do que 100, enquanto para as flores
brevistilas o maior número de grãos de pólen provenientes de longistilas foi igual a
55.
27
1.5. Discussão
As plantas distílicas são caracterizadas por vários parâmetros, mas as
principais características usadas no diagnóstico desta condição são: o dimorfismo
nas alturas das anteras e estigmas (hercogamia recíproca); e a presença do sistema
heteromórfico de auto-incompatibilidade. Psychotria nuda apresenta estas e outras
características florais que são comuns a outras espécies distílicas. A hercogamia
recíproca encontrada nesta espécie, entretanto, não é tão exata quanto a
encontrada em outras espécies de Rubiaceae, como Pentanisia angustifolia e P.
prunelloides (Massinga et al., 2005). Este fato se deve à observação de que as
alturas do estigma e das anteras das diferentes formas florais não são exatamente
equivalentes. Apesar disso, a reciprocidade da altura das anteras e estigma de
Psychotria nuda é similar à encontrada nas flores distílicas de Palicourea padifolia
(Ree, 1997) e Gaertnera vaginata (Pailler e Thompson, 1997), nas quais o estigma
de flores longistilas tende a ser mais exposto em relação ao tubo da corola do que
as anteras dos brevistilas. A média da altura do estigma de flores brevistila, no
entanto, coincidiu com a localização de uma região mediana das anteras de
longistilas em FTij, exibindo reciprocidade. Associado a isso, há distância entre o
estigma e as anteras em ambas as formas florais de P. nuda em FTij, o que reforça
a condição distílica, apesar da falta de uma reciprocidade perfeita.
Como é frequentemente observado nas espécies distílicas, muitas das
características florais secundárias (que não estão diretamente envolvidas na
polinização) medidas em flores de P. nuda em FTij apresentaram médias
significativamente diferentes entre as duas formas florais; e nas flores brevistilas
foram encontrados os maiores valores para estes parâmetros. A ocorrência de um
repertório limitado de características morfológicas em plantas heterostílicas sugere
que estes parâmetros possuem um valor adaptativo para a heterostilia, ainda que a
natureza precisa do papel destes parâmetros não seja clara (Gibbs, 1986). A
ocorrência de flores maiores (com o tubo da corola maior) e de anteras mais altas,
por exemplo, pode ser uma característica associada ao desenvolvimento floral, e
que auxilia a posicionar as anteras de flores brevistilas em uma altura próxima a dos
estigmas de longistilas (Ganders 1979; Dulberger 1992; Pailler e Thompson 1997;
Castro e
Araújo, 2004). A variação do comprimento da corola associada à
heterostilia (“heterocorollary”) é um importante componente para que haja
28
reciprocidade de órgãos florais em um grande número de espécies que apresentam
anteras presas à corola (Thompson e Dommée, 2000). Como foi observado após a
correlação da altura das anteras e do comprimento da corola, P. nuda parece ser
uma destas espécies.
O diâmetro maior da abertura do tubo das corolas de flores brevistilas pode
ser associado a um aumento da exposição do estigma dessas flores, já que nesta
forma floral este órgão está localizado profundamente dentro do tubo da corola. A
ocorrência de estigmas maiores em flores brevistilas tem sido relatada como uma
característica que favorece o fluxo de pólen legítimo (Dulberger, 1992; Ornelas et al.,
2004). Contudo, esta característica não se mostrou importante para P. nuda em FTij,
já que não foram detectadas diferenças no diâmetro da abertura do tubo da corola
entre as duas formas florais, ou uma quantidade maior de grãos de pólen sobre os
estigmas de brevistilas. O diâmetro da corola (que inclui os lóbulos, além da abertura
do tubo) mostrou-se maior em plantas do tipo longistila em FTij, mas a função desta
característica para a distilia não é clara. De fato, o significado adaptativo de várias
características florais secundárias ainda não foi estabelecido (Murray, 1990;
Dulberger, 1992; Lloyd e Webb, 1992a, b; Hernandez e Ornelas, 2003).
Alguns dos caracteres sexuais primários que foram observados em FTij estão
relacionados ao número, diâmetro médio e aspectos morfológicos de grãos de
pólen. Para P. nuda, esses parâmetros corresponderam ao dimorfismo esperado
para uma espécie distílica, apesar desses dimorfismos não serem encontrados em
todas as espécies heterostílicas (Dulberger, 1992). Como foi descrito para outras
espécies, a seleção de grãos de pólen maiores em brevistilas se dá provavelmente
devido ao maior requerimento de energia deste pólen para a sobrevivência a uma
jornada relativamente maior através do pistilo longistila (Mazer e Hultgard, 1993).
Por vezes, os grãos de pólen de espécies heterostílicas se mostram diferentes, entre
as formas florais, na coloração e/ou no formato, podendo variar em diâmetro; e
aparentemente também no seu conteúdo (Darwin, 1877), caráter verificado pela
diferença na opacidade dos grãos. O número de grãos é maior em flores do tipo
longistila de P. nuda, o valor médio dos eixos do pólen se mostrou menor nesta
forma floral e o tamanho das anteras, apesar de significativamente diferente, é
apenas um pouco menor do que a das brevistilas. Com isso, apesar de alguns
autores acreditarem que um investimento no aumento do tamanho das anteras
representa o aumento no número de grãos de pólen (ex.: Ganders, 1979), o
29
investimento no maior tamanho do pólen em P. nuda parece estar relacionado a
uma diminuição no número de grãos. Por isso, mesmo apresentando anteras
maiores, as flores brevistilas possuem um número menor de grãos. De acordo com
Mazer e Hultgard (1993), a maior quantidade de grãos de pólen em flores do tipo
longistila pode estar também relacionada ao pequeno sucesso na deposição de
pólen legítimo sobre os protegidos estigmas de flores brevistilas.
Não há para todas as flores de uma forma floral de P. nuda a posição
discriminada de várias características, como as anteras que podem ter regiões
sobrepostas quando flores de cada uma das formas florais são comparadas. Aliado
a isso, a sobreposição de valores observada na distribuição das medidas das duas
formas florais pode sugerir um enfraquecimento das condições adequadas ao fluxo
de grãos de pólen legítimos em FTij. Entretanto, o parâmetro floral mais importante
para o diagnóstico da heterostilia, a altura do estigma, apresenta distribuição
discreta em cada forma floral. Aliado a isso, a separação entre o estigma e as
anteras foi observada na grande maioria das flores, o que reforça a possibilidade da
deposição do pólen oriundo de flores brevistilas ser maior em estigmas longistilas, e
vice versa.
Ao contrário do observado para o comprimento do estilete, não foram
encontradas, em espécies heterostílicas, evidências do relacionamento entre o
comprimento do estame e o controle fisiológico da auto-incompatibilidade
(Dulberger, 1992). Conseqüentemente, é possível imaginar que os mecanismos de
constrição da seleção natural provavelmente foram menos fortes sobre os estames e
mais intensos sobre o tamanho do estilete em P. nuda.
O padrão de distribuição dos valores de altura das anteras, em oposição ao
encontrado para a altura do estigma, se mostrou preferencialmente associado às
formas florais, mas não foi encontrada obrigatoriedade na associação de valores de
altura das anteras a determinada forma floral. Os dois padrões, um que se mostra
discreto relativo à distribuição da altura do estigma, aonde cada forma floral possui
estigmas em uma faixa exclusiva de altura, e o outro, que mostra sobreposição de
medidas da altura das anteras, já foram observados para outra população de P.
nuda – Pici (Castro e Araújo, 2004) – e para outras espécies distílicas (por ex. Ree,
1997, Pailler e Thompson, 1997). A presença da separação entre estigma e antera
foi enfatizada após a observação de que o aumento da altura das anteras está
diretamente relacionado ao aumento na altura do estigma, em ambas as formas
30
florais.
A quantidade de grãos de pólen depositados sobre o estigma em plantas
heterostílicas é fortemente influenciada pela morfologia floral (McKenna, 1992).
Ganders (1979) indicou que superfícies estigmáticas maiores estão associadas com
uma melhoria na exposição desta epiderme em flores longistilas e que esta é a
causa da presença de um número maior de grãos de pólen sobre os estigmas desta
forma floral. Psychotria nuda, entretanto, apresenta estigmas maiores em brevistilas,
o que pode contrabalancear a menor exposição dessa superfície aos visitantes
florais, já que está inserida no tubo da corola. Em flores longistilas os estigmas
possuem menor área para captar os grãos, mas ficam mais expostos. Contudo, a
partir dos dados obtidos neste estudo, não foi possível relacionar as médias de
grãos de pólen depositados nos estigmas e o sucesso na deposição de pólen em
cada forma floral, devido à ampla dispersão destes dados. Sendo assim, não foi
encontrada evidência de relação entre tamanho e exposição dos estigmas com o
sucesso da polinização em cada forma floral.
A condição da hercogamia recíproca e o maior comprimento de corola e
estigma em flores brevistilas foram observados em todos os locais estudados,
apesar de terem sido encontradas variações nas medidas de cada parâmetro entre
as populações. Com isso, é possível inferir que a localização de P. nuda em
diferentes formações florestais, sob diferentes condições de preservação (enquanto
Picinguaba pertence a uma área que já é conservada há décadas, a Ilha Grande
possui uma história de preservação mais recente, ainda que a ilha não tenha uma
história de ocupação tão intensa quanto o Rio de Janeiro). É nesta cidade que se
localiza a Floresta da Tijuca, que além de reflorestada ainda sobre com as
construções irregulares não tem relação com os principais aspectos morfológicos
das flores relacionados ao padrão distílico. Comparando as diferenças entre as
médias dos parâmetros florais analisados nas quatro populações de P. nuda, é
possível observar que deve haver pressões seletivas diferenciadas agindo sobre
essas populações. Algumas características, como a altura dos estigmas, refletem
diferenças significativas entre as populações estudadas. Variações entre diferentes
populações da mesma espécie já foram observadas para outras espécies de
Rubiaceae. Hedyotis caerulea, por exemplo, apresenta uma quantidade maior de
grãos de pólen em flores de longistila em apenas uma das quatro localidades
estudadas; enquanto nas outras três populações foi encontrada a mesma
31
quantidade de pólen entre as formas florais (Ornduff, 1980). Os grãos de Amsinckia
vernicosa var. furcata (Boraginaceae) apresentaram diâmetros similares para as
duas formas florais em uma população, enquanto na outra o pólen de longistila era 8
% maior do que os de brevistila (Ganders, 1976). A espécie Fauria crista-galli
(Menyanthaceae) apresentou grãos de pólen maiores em flores brevistilas em uma
população e o contrário na outra (Ganders, 1979).
Os resultados sobre as taxas de frutificação nas três populações investigadas
indicam que Psychotria nuda é auto e intramorfo-incompatível e não-apomítica.
Mesmo tendo a produção resultado em 0 a 12 % de formação de frutos, após os
testes destes tratamentos, estes valores não foram estatisticamente considerados
como diferentes de 0 %, devido à sobreposição dos intervalos de confiança desses
tratamentos. O sucesso reprodutivo dos tratamentos controle foi menor para flores
longistilas da população IGra, quando comparado às outras populações de P. nuda.
Portanto, ao contrário das predições clássicas de Charles Darwin e outros autores, a
população que apresentou o maior nível de reciprocidade entre o estigma de
longistila e as anteras de brevistila, produziu menos frutos a partir de flores
longistilas. Sem realizar comparações com outras populações os testes estatísticos
de Almeida (2005) não foram suficientes para determinar uma menor produção de
frutos em longistila de P. nuda em IGra. Contudo, a outra espécie estudada pela
autora apresentou essa condição e essa diferença na taxa de frutificação das duas
espécies foi relacionada ao comportamento dos visitantes florais (Almeida, 2005).
Um estudo sobre o comportamento de visitantes florais de P. nuda de forma
comparativa entre as populações se faz necessário para o entendimento destes
dados.
A pequena quantidade de grãos de pólen legítimos em comparação com o
número de grãos ilegítimos depositados sobre a maior parte dos estigmas em FTij,
indica a menor importância da deposição de pólen apenas do tipo compatível na
produção dos frutos. Pois mesmo considerando fatores que podem provocar a
grande quantidade de pólen ilegítimo sobre os estigmas, como a falta de
reciprocidade perfeita entre estigmas e anteras das duas formas florais, a taxa de
frutificação de P. nuda é de cerca de 50 % em tratamentos do tipo controle.
A razão entre indivíduos das duas formas florais observada em FTij não se
mostrou significativamente diferente do esperado para um população isoplética. O
mesmo também foi observado nas outras localidades estudadas (Castro e Araújo,
32
2004; Almeida, 2005; Pereira et al., 2006). Razões não balanceadas entre as formas
florais, quando uma das formas florais é mais abundante que a outra, foram
reportadas para populações pequenas e isoladas de espécies heterostílicas de
Primula que ocorrem em habitats fragmentados (Jacquemyn et al., 2002; Van
Rossum e Triest, 2006). Os resultados apresentados para P. nuda indicam um
equilíbrio no sistema heteromórfico de auto-incompatibilidade dessa espécie, já que
as duas formas florais possuem um sucesso similar no estabelecimento de
indivíduos. Apesar disso existem alguns fatores que parecem não condizer com este
resultado, como, por exemplo, o fato da forma longistila formar menos frutos do que
a brevistila em IGra.
A maioria dos vizinhos de indivíduos de ambos os tipos pertenciam à mesma
forma floral em FTij, tanto para longistilas como para brevistilas. Esse resultado
indica a presença de reprodução vegetativa. Contudo, apesar da existência de
clones, a presença de muitas plântulas na população FTij (Klein, D. E., obs. pessoal)
e a não ocorrência de grandes aglomerados de cada forma floral (verificada pelo
exame da distribuição espacial dos indivíduos de cada forma floral em FTij),
corroboram com a idéia de que P. nuda depende tanto de reprodução vegetativa
quanto de sexual. Frequentemente, o crescimento clonal é relacionado à anisopletia
em populações de espécies heterostílicas. Barrett e Forno (1982), por exemplo,
encontraram populações monomórficas de Eichhornia crassipes que eram
compostas por um único clone. A condição de crescimento clonal também já foi
relacionada à formação de aglomerados de indivíduos de cada forma floral dentro de
populações. Psychotria ipecacuanha, que também possui crescimento clonal,
apresentou aglomerados das formas florais em populações naturais, exibindo a
isomorfia (presença de uma única forma floral nos aglomerados). Entretanto, as
populações estudadas de P. ipecacuanha, como um todo, apresentaram isopletia
(Rossi et al., 2005). Em FTij, P. nuda mostrou uma condição distinta destes dois
casos, pois apesar da existência de crescimento clonal, não foi observada a
monomorfia ou a presença de aglomerados isomórficos. Portanto, o recrutamento
via reprodução sexual parece ter um papel importante para a estrutura da
população. No futuro, estudos genéticos sobre os genótipos dos indivíduos dessa
população poderão indicar com mais precisão a proporção da importância das
formas de reprodução sexual e vegetativa nesta população.
Após a comparação com os dados obtidos em uma área de floresta atlântica
33
costeira bem conservada (Pici), é sugere-se que a condição de pertencer a uma
floresta secundária fragmentada e perturbada, encontrada em FTij, não afetou o
sucesso reprodutivo de P. nuda. Entretanto, o mesmo não foi encontrado para a
população localizada em uma Ilha oceânica (IGra). Esse resultado pode estar
associado à limitação de pólen para as flores longistilas de IGra, já que a limitação
polínica pode variar entre diferentes populações e períodos de floração (Buíde,
2006). A manutenção do sucesso reprodutivo em populações de pequenos
fragmentos já foi encontrada para a espécie Psychotria suterella; nesse caso, o
grande número de indivíduos e a presença constante de polinizadores não
permitiram a ocorrência de limitação polínica que é normalmente encontrada em
habitats fragmentados (Lopes e Buzato, 2007). Apesar disto, a taxa de frutificação
de P. suterella em fragmentos foi menor do que a encontrada em outras populações,
o que resultou, provavelmente da condição abiótica diferenciada durante a formação
dos frutos (Lopes e Buzato, 2005). Estudos experimentais se fazem necessários
para indicar se a menor taxa de frutificação de longistilas em IGra é uma resposta a
diferenças nas condições abióticas, ou resultado de limitação polínica, de forma a
auxiliar na compreensão deste fenômeno.
34
1.6. Conclusões
• Os indivíduos de Psychotria nuda estudados na Floresta da Tijuca/ RJ
apresentam características de uma espécie distílica, exibindo características
morfológicas da flor e sistema de auto-incompatibilidade esperados.
• A comparação com estudos de outras populações em áreas florestais do sudeste
brasileiro mostrou que grande parte das características morfológicas florais, em
especial aquelas relacionadas à distilia, são mantidas também nas outras
populações, independente do grau de perturbação e da formação florestal em
que ocorrem.
• A produção de frutos não apresenta diferença significativa entre as duas formas
florais de P. nuda na Floresta da Tijuca/RJ. Tais resultados também não se
distinguem daqueles encontrados em Picinguaba e para flores brevistilas na Ilha
Grande; a taxa de formação de fruto em flores longistilas da última população,
entretanto, se mostra menor do que as demais.
• Apesar da maior parte dos grãos de pólen encontrados sobre os estigmas em
ambas as formas florais são ilegítimos, ainda assim, não foi observado um
decrécimo na taxa de frutificação.
• Assim como nas outras populações estudadas, a ocorrência de P. nuda
apresenta-se isoplética na Floresta da Tijuca; contudo, a distribuição dos
indivíduos nesta população indica que a localização dos indivíduos das duas
formas florais não é randômica, já que a maior parte de plantas com uma das
formas florais apresenta-se mais próxima à outra da mesma forma.
• Os mesmos grupos de visitantes florais observados em outras duas populações
desta espécie foram registrados em flores de P. nuda da Floresta da Tijuca.
35
Figura 1.1: Flores, botões e fruto de Psychotria nuda; (A) flores longistila e brevistila
dissecadas; (B) flor e botões; (C) frutos imaturos; (D) fruto maduro. Legenda: B –
brevistila e L – longistila; - antera; - estigma.
A
B
C
D
L
L
B
B
36
Figura 1.2: Imagens de satélite das áreas estudadas (obtidas com o programa
Google Earth); (A) visualização da Floresta da Tijuca (FTij); (B) localização da área
utilizada por Castro e Araújo (2004) em Picinguaba (Pici); (C) localização da área
utilizada por Almeida (2005) na Ilha Grande (IGra); (D) localização da área utilizada
por Pereira et al. (2006), fragmento da EPTEAMP - Estação de Pesquisa,
Treinamento e Educação Ambiental Mata do Paraíso (Para); (E) visão de uma região
do sudeste brasileiro, aonde as quatro populações estudadas podem ser apontadas.
Legenda: círculo amarelo – IGra; círculo azul – Para; círculo verde – FTij; círculo
vermelho – Pici. Barras: (A), (B), (C) e (D) 3,72 Km; e (E) 117 Km.
A
C
D
E
37
7
1
2
10
3
4
5
8
6
9
12
14
11
13
C
D
A
B
eg
eg
el
el
a
a
c
c
Figura 1.3: Esquemas de flor brevistila (A e C) e longistila (B e D) de Psychotria nuda
com as marcações dos parâmetros analisados para morfometria. Note que ambas as
flores apresentam estigma bífido, porém, na representação de longistila, os lobos do
estigma estão superpostos. Legenda: (a) antera; (c) corola; (eg) estigma; (el)
estilete; (1) Comprimento da corola; (2) diâmetro da corola; (3) diâmetro do tubo da
corola, (4) altura da base das anteras; (5) altura do topo das anteras; (6)
comprimento das anteras; (7) Altura do estigma; (8) comprimento do estigma; (9)
largura do estigma; (10) espessura do estigma; (11) distância entre a base das
anteras e o topo do estigma; (12) distância entre a base do estigma e o topo das
anteras; (13) distância entre o topo das anteras e o topo da corola; (14) distância
entre o topo do estigma e o topo da corola.
38
Figura 1.4: Forma de utilização das flores de Psychotria nuda; (A) flor coberta por
saco de filó; (B) momento de realização da polinização manual; (C) flor recém
polinizada marcada com linha, e conjunto do cálice e receptáculo (incluindo o ovário)
já abortados e separados da planta após tratamento de apomixia.
39
Figura 1.5: Visitantes florais de Psychotria nuda. (A) Mariposa sobre botão floral; (C)
formiga sobre flor brevistila; (C) abelha com a probóscide inserida no tubo da corola
de flor brevistila; (D) borboleta sobre flor longistila. Legenda: - visitantes florais.
40
Tabela 1.1: Dimensões mensuradas nas flores de Psychotria nuda da Floresta da
Tijuca (FTij), Rio de Janeiro, Brasil. As medidas estão representadas pela média e
desvio padrão. Os números entre parênteses, que acompanham os parâmetros, se
referem aos dados citados na figura 1.3.
Dimensões florais (mm) e desvio padrão
Parâmetro
Brevistila (n = 68) Longistila (n = 78)
Comprimento (1) 25,27 + 1,72 21,47 + 1,21***
Diâmetro (2) 9,05 + 1,17 9,60 + 1,71*
Corola
Diâmetro do tubo (3) 2,95 + 0,40
3,02 + 0,36
NS
Altura das anteras (base) (4) 12,41 + 1,28 7,75 + 1,22***
Altura das anteras (topo) (5) 17,78 + 1,26 12,41 + 1,19***
Androceu
Comprimento da antera (6) 5,37 + 0,40 5,09 + 0,47*
Altura do estigma (7) 9,88 + 1,08 19,20 + 1,54***
Comprimento do estigma (8) 4,33 + 0,80 2,28 + 0,36***
Largura do estigma (9) 1,23 + 0,13 1,38 + 0,21*
Gineceu
Espessura do estigma (10) 1,64 + 0,23 1,45 + 0,23*
A base da antera e o topo do
estigma (11)
2,49 + 1,20 -------
A base do estigma e o topo da
antera (12)
------- 4,49 + 1,13
O topo da antera e o topo da
corola (13)
7,49 + 0,87 8,87 + 0,97***
Distância entre
O topo do estigma e o topo da
corola (14)
15,39 + 1,73 2,27 + 1,06***
*p<0,05
**p<0,01
***p<0,001
NS
Não Significativo (p>0,05)
41
Figuras 1.6 a 1.8: Distribuição das medidas relacionadas à corola de Psychotria
nuda na Floresta da Tijuca em gráficos de box plot. Dimensões: (1.6) Comprimento
da corola; (1.7) diâmetro da corola; (1.8) diâmetro da abertura do tubo da corola.
Legenda: 1 – Brevistilas e 2 – Longistilas.
5
7
9
11
13
15
diamflor
1 2
comprimento da corola (mm)
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
Corola
1 2
diâmetro do tubo da corola (mm)
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
diamaberflor
1 2
1.8
1.7
1.6
42
Figuras 1.9 e 1.10: Distribuição das medidas relacionadas às anteras de Psychotria
nuda na Floresta da Tijuca em gráficos de box plot. Dimensões: (1.9) Altura das
anteras (topo); (1.10) comprimento da antera. Legenda: 1 – Brevistilas e 2 –
Longistilas.
comprimento da antera (mm)
3
3.5
4
4.5
5
5.5
6
6.5
7
7.5
anteracomp
1 2
altura das anteras (mm)
8
10
12
14
16
18
20
22
anteraalt
1 2
1.9
1.10
43
Figuras 1.11 a 1.14: Distribuição das medidas relacionadas ao estigma de
Psychotria nuda na Floresta da Tijuca em gráficos de box plot. Dimensões: (1.11)
largura do estigma; (1.12) comprimento do estigma; (1.13) espessura do estigma;
(1.14) altura do estigma. Legenda: 1 – Brevistilas e 2 – Longistilas.
comprimento do estigma (mm)
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5
6
6.5
7
compestigma
1 2
altura do estigma (mm)
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
Pistilo
1 2
espessura do estigma (mm)
.5
1
1.5
2
2.5
espestigma
1 2
largura do estigma (mm)
.5
1
1.5
2
largestigma
1 2
1.11
1.12
1.13
1.14
44
Altura do estigma (mm)
Altura do estigma (mm)
Altura das anteras (mm)
Comprimento da corola (mm)
Comprimento da corola (mm)
Brevistila Longistila
Brevistila Longistila
Brevistila Longistila
1.1
5
1.1
6
1.1
7
Figuras 1.15 a 1.17: Distribuição comparativa dos valores de dimensões florais
de brevistila e longistila de Psychotria nuda na Flo
resta da Tijuca. (1.15) alturas
das anteras e do estigma. Note que a altura das anteras mostra-
se sobreposta
entre as formas florais; (1.16) comprimento da corola e da altura do estigma.
Note que comprimento da corola mostra-se sobreposto entre as formas f
lorais;
(1.17) altura das anteras e comprimento da corola. Note que ambos parâmetros
apresentam sobreposição de valores entre as formas florais, mesmo que as
longistila apresentem, em geral, valores menores.
Altura das anteras (mm)
45
Tabela 1.2: Média, desvio padrão e limites inferior e superior de intervalo de
confiança (95%), dos parâmetros florais de Psychotria nuda segregados por forma
floral, das amostras oriundas da floresta da Tijuca (FTij), Ilha Grande (IGra)
(Almeida, 2005), Mata do Paraíso (Para) (Pereira et al., 2006) e Picinguaba (Pici)
(Castro e Araújo, 2004). Os números entre parênteses, que acompanham os
parâmetros, se referem aos dados citados na figura 1.3.
Parâmetro
Forma
floral
População
Média
(mm)
Desvio
Padrão
Número
de obs.
Limite
inferior
(mm)
Limite
superior
(mm)
Altura do estigma (7) brevistila FTij 9,88 1,08 68 9,62 10,14
IGra 9,30 1,08 34 8,95 9,65
Para 9,35 0,41 10 9,09 9,61
Pici 10,00 0,92 30 9,66 10,34
longistila FTij 19,20 1,54 78 18,85 19,55
IGra 18,30 2,30 45 17,61 18,99
Para 20,08 0,58 10 19,71 20,45
Pici 19,20 1,52 30 18,63 19,77
Altura das anteras (5) brevistila FTij 17,78 1,26 68 17,48 18,08
IGra 17,30 1,70 34 16,71 17,89
Para 19,40 1,17 10 18,65 20,15
Pici 17,80 1,76 30 17,14 18,46
longistila FTij 12,41 1,19 78 12,14 12,68
IGra 13,70 1,30 44 13,30 14,10
Para 13,00 1,05 10 12,32 13,68
Pici 13,70 1,22 30 13,24 14,16
Comprimento da corola (1) brevistila FTij 25,27 1,72 68 24,85 25,68
IGra 24,00 2,40 32 23,13 24,87
Para 22,90 1,29 10 22,07 23,73
Pici 23,50 1,94 30 22,78 24,22
longistila FTij 21,47 1,21 78 21,20 21,74
IGra 21,80 2,00 40 21,16 22,44
Para 21,00 1,83 10 19,82 22,18
Pici 21,40 1,83 30 20,72 22,08
Comprimento do estigma (8) brevistila FTij 4,33 0,80 68 4,14 4,52
IGra 3,00 0,40 5 2,50 3,50
Para 2,79 0,27 10 2,55 3,03
Pici 2,70 0,40 30 2,55 2,85
longistila FTij 2,28 0,36 78 2,20 2,36
IGra 1,70 0,27 5 1,36 2,04
Para 1,32 0,16 10 1,18 1,46
Pici 1,80 0,60 30 1,68 2,02
Comprimento da antera (6) brevistila FTij 5,37 0,40 68 527 5,47
Para 5,40 0,47 10 5,10 5,70
Pici 5,50 0,49 30 5,32 5,68
longistila FTij 5,09 0,47 78 4,98 5,20
Para 4,43 0,49 10 4,12 4,74
Pici 4,70 0,44 30 4,54 4,86
Diâmetro da corola (2) brevistila FTij 9,05 1,17 68 8,77 9,33
IGra 7,30 1,20 29 6,84 7,76
Pici 6,80 0,53 30 6,60 7,00
longistila FTij 9,60 1,71 78 9,21 9,99
IGra 7,50 1,20 36 7,09 7,91
Pici 5,80 0,70 30 5,54 6,06
Diâmetro do pólen brevistila FTij 0,10879 0,00573 173 0,10794 0,10964
IGra 0,11080 0,01147 50 0,10734 0,11386
longistila FTij 0,08550 0,00510 174 0,08474 0,08626
IGra 0,08540 0,00710 50 0,08338 0,08742
46
Tabela 1.3: Percentagem e limites inferior e superior de intervalo de confiança (95%)
da produção de frutos de Psychotria nuda após tratamentos de polinização
intermorfo, autopolinização, polinização intramorfo, apomixia e controle, segregados
por forma floral, das amostras da Floresta da Tijuca (FTij), Ilha Grande (IGra)
(Almeida, 2005) e Picinguaba (Pici) (Castro e Araújo, 2004).
Polinização
Forma
floral
População
Frutificação
(%)
Número
de flores
Limite inferior
(mm)
Limite
superior (mm)
Intermorfo brevistila FTij
33,3
51
20,08 46,58
IGra 50,0 58 36,86 63,14
Pici 54,1 37 37,45 70,65
longistila FTij
55,8
45
41,98 69,62
IGra 45,0 52 29,89 60,11
Pici 42,9 28 23,70 62,00
Autopólen brevistila FTij
5,8
52
0,01 12,26
IGra 3,0 39 0,01 8,51
Pici 3,1 32 0,01 9,38
longistila FTij
3,9
51
0,01 9,34
IGra 0,0 37 0,01* 10,02*
Pici 0,0 30 0,01* 6,88*
Intramorfo brevistila FTij
2,0
49
0,01 6,10
IGra 7,0 30 0,01 16,51
Pici 13,5 37 2,12 24,90
longistila FTij
5,8
52
0,01 12,31
IGra 12,0 32 0,30 23,70
Pici 0,0 22 0,01* 13,69*
Apomixia (sem pólen) brevistila FTij
5,7
53
0,01 12,03
IGra 0,0 32 0,01* 9,40*
Pici 6,8 44 0,01 14,48
longistila FTij
8,5
59
1,23 15,77
IGra 3,0 33 0,01 9,04
Pici 7,7 39 0,01 16,32
Controle brevistila FTij
51,7
58
38,58 64,86
IGra 51,0 35 33,85 68,15
Pici 55,2 29 36,28 74,06
longistila FTij
51,8
56
38,43 65,17
IGra 33,0 33 16,34 49,66
Pici 53,1 49 38,72 67,38
*o intervalo foi construído levando-se em consideração a hipótese de que uma das observações coletadas
estava errada (exemplo: autopólen longistila em IGra – 1 amostra em 37, o que corresponde a formação de 2,1
% de frutos, a partir desse dado foi realizado o teste t de student e o intervalo foi calculado).
47
Figura 1.18: Grãos de pólen de Psychotria nuda em microscopia óptica de campo
claro. (A) Grãos oriundos de uma flor brevistila; (B) grãos oriundos de uma flor
longistila; (C) grãos de pólen dos tipos brevistila e longistila depositados sobre
estigma brevistila; (D) grãos de pólen dos tipos brevistila e longistila depositados
sobre estigma longistila. Legenda: B – grão de pólen brevistila; L – grão de pólen
longistila; O – grão inviável, contabilizado como outros grãos; P – papila estigmática.
Barras = 100µm.
48
Figuras 1.19 e 1.20: Distribuição das proporções de diferentes grãos de pólen nos
estigmas de flores brevistilas e longistilas de Psychotria nuda na Floresta da Tijuca.
(1.19) proporção da quantidade de grãos de pólen legítimos/quantidade de grãos de
pólen ilegítimos, em relação à altura do estigma – nesta observação não foram
contabilizados os grãos que não foram reconhecidos como pertencentes a uma ou
outra forma floral; (1.20) proporção da quantidade de grãos de pólen
legítimos/quantidade total de outros grãos de pólen, em relação à altura do estigma.
Observação: os estigmas que apresentam altura menor que 13 mm pertencem a
flores brevistilas, e os que são maiores de 16 mm são os de flores longistilas.
1.19
1.20
Legítimos > ilegítimos
Legítimos > outros grãos
49
III.2 Capítulo 2
Anatomia e micromorfologia do eixo reprodutivo de Psychotria nuda:
Superfície e atrativos florais
2.1. Introdução
Os órgãos portadores de gametas nas espécies de Angiospermae estão
dispostos em flores e os gametas masculinos e femininos se apresentam em regiões
diferenciadas da flor, necessitando, na grande maioria dos casos, de um agente
polinizador para que ocorra a fecundação. Em casos de plantas que necessitam de
animais para levar os grãos de pólen ao estigma (zoofilia), as flores são usadas na
sinalização entre a planta e o polinizador (Heiling et al., 2004). Em geral, é assumido
que a morfologia floral está adaptada a estes animais, assegurando assim a atração
e o contato dos polinizadores com as partes férteis da flor (Benitez-Vieyra et al.,
2006). Desta forma, para obter a polinização cruzada, as plantas com flores
oferecem atrativos para estimular a visitação de animais que vão promover a visita
em várias flores e, conseqüentemente, a deposição dos grãos de pólen de uma flor
no estigma de outra (Miyake e Yafuso, 2003; Poveda et al., 2005). Os atrativos
incluem odores indicativos, mecanismos táteis de reconhecimento à curta distância e
aspectos visuais, como cor e tamanho das flores (Poveda et al., 2005). A morfologia
da flor, incluindo as dimensões relativas e as configurações das partes, associada
aos estímulos visuais, olfativos e táteis específicos e, também, às recompensas
florais apropriadas, contribuem para a seleção de um polinizador em particular
(Davies et al., 2003).
Por muito tempo, houve uma tendência na literatura de generalizar a relação
entre as formas das flores e a associação dessas aos visitantes florais (Richards,
1997). O conjunto de caracteres florais, incluindo recompensas, associado à atração
e à utilização por um grupo específico de animais polinizadores, têm sido
50
tradicionalmente chamados de síndrome de polinização (Fenster et al., 2004).
Entretanto, na maioria dos casos, existe uma competição entre diferentes
polinizadores que podem se interessar por um recurso oferecido por uma flor cuja
síndrome de polinização normalmente está associada a outro tipo de polinizador
(Richards, 1997).
Encontrado em diversas flores, o osmóforo é uma estrutura secretora vegetal
comumente associada à emissão de odor e que pode ou não ser diferenciada dos
tecidos adjacentes (Stern et al., 1986). Outra estrutura secretora também muito
freqüente em órgãos do eixo reprodutivo é o nectário. Esta estrutura secreta o
néctar, e é representada por tecidos secretores localizados em diversas partes
florais (Fahn, 1979a). Devido ao papel significativo na atração de polinizadores
potenciais e pela serventia como precursor de mel e, por isso, possuindo
importância econômica, o néctar floral tem sido amplamente estudado
(Langenberger e Davis, 2002).
A ornamentação das estruturas florais, tanto as macroscópicas, quanto as
microscópicas, pode servir para o direcionamento dos polinizadores. As abelhas, por
exemplo, podem se direcionar após encontrar estímulos táteis na superfície da flor,
sendo as rugosidades, os tricomas e os calos importantes para esta função
(Richards, 1997).
Grande parte dos estudos sobre micromorfologia floral está associada a
descrições taxonômicas, sistemáticas e de desenvolvimento floral, como pode ser
observado nos estudos de Davies e Winters (1998), Huysman et al. (1998) Dessein
et al. (2001), Özcan (2002) e Prenner (2004). No entanto, alguns estudos como os
de Kevan e Lane (1985), Davies e Turner (2004), Wanntorp e Ronse De Creane
(2005) e Lumaga et al. (2006), associaram a micromorfologia de partes florais não
apenas a aspectos taxonômicos, mas também aos funcionais. Um exemplo de visão
funcional da micromorfologia é a variedade de funções que foram associadas às
papilas nas corolas de espécies de Maxillaria (Orchidaceaae), como a atração e o
direcionamento na flor durante a visita de insetos, obtidos através da combinação de
informações visuais, olfativas e táteis (Davies e Turner, 2004).
A geometria das células epidérmicas, onde são encontradas as micro-
esculturas, assim como os pigmentos contidos nestas células, podem influenciar a
absorção de raios ultravioleta (UV) e da radiação no espectro visível pela epiderme
de folhas e flores (Horváth et al., 2002). As células da epiderme foliar podem agir,
51
individualmente, como lentes em miniatura, levando o foco direto de luz a pequenas
partes do mesofilo de forma intensificada, em relação à irradiação no ambiente
(Vogelmann et al., 1996). Em flores e folhas, a característica de formação de um tipo
de lente nas células epidérmicas pode: alterar o fenômeno de refração da superfície;
gerar diferenças no ângulo e na polarização da luz; e direcionar o foco de luz para
os pigmentos vacuolares (Horváth et al., 2002). De acordo com Kay et al. (1981), a
função primária da epiderme com papilas em uma pétala é a de capturar a luz
incidente. As capacidades de refração e reflexão da luz neste órgão vão influenciar
na percepção das cores das flores por parte dos visitantes florais, em especial, as
abelhas; já que os receptores visuais destes animais dependem da intensidade, do
comprimento de onda, do ângulo e da polarização da luz (Horváth et al., 2002). Além
do formato de papilas, a presença de cutícula espessa nas papilas da corola
aumenta a aparência brilhante da epiderme, podendo atrair insetos com seu aspecto
refletivo (Davies e Turner, 2004).
A cutícula é uma característica que diferencia a parede periclinal externa de
órgãos aéreos de plantas vasculares e algumas briófitas de outras paredes celulares
(Jeffree, 1996). A estrutura da cutícula consiste numa membrana que forma um filme
delgado constituído por uma matriz de polímeros (cutina) que inclui polissacarídios e
os lipídios solúveis (Jeffree, 1996; Holloway, 1982). Existem diversos tipos de
cutículas que variam em sua estrutura, sendo estes o resultado de etapas de
desenvolvimento e biossíntese diferenciados (Jeffree, 1996). De acordo com
Nawrath (2006) a espessura da cutícula varia entre as espécies e pode variar
mesmo entre os diferentes órgãos de uma mesma planta, possuindo espessura
entre 0,2 a 200 µm.
A heterostilia pode ser facilmente reconhecida no campo pela presença de
polimorfismos na estrutura floral (Barrett, 1992). Com isso, a maior parte das
variações morfológicas estudadas para as flores heterostílicas são apenas
macromorfólogicas. Em comparação à quantidade de trabalhos sobre a ecologia e a
genética da heterostilia, existe uma pequena quantidade de estudos sobre detalhes
da estrutura e do desenvolvimento destas flores para grande parte dos grupos
heterostílicos (Barrett, 1992). Ainda assim, duas características micromorfológicas
destas flores têm sido descritas para diversas espécies: o tamanho das papilas
estigmáticas e a estrutura (tamanho, ornamentação e aberturas) dos grãos de pólen
(Dulberger, 1992). Poucos estudos relacionam a micromorfologia de outras partes
52
florais com o polimorfismo de espécies heterostílicas. Contudo, observações sobre o
comprimento de células do estilete de Primula vulgaris (Primulaceae) mostraram que
essas células são maiores em flores longistilas do que em brevistilas (Heslop-
Harrison et al., 1981). Diferenças específicas às formas florais também podem ser
observadas no comprimento das células do estilete de outras espécies de Primula
(Richards, 1997). Richards (1993) propôs que o comprimento das papilas
estigmáticas está associado ao comprimento das células do estilete em Primula
(apud Webster e Gilmartin, 2006).
Conforme relatado no capítulo 1, a macromorfologia das flores de Psychotria
nuda já foi examinada em diferentes populações (Castro e Araújo, 2004; Almeida,
2005; Pereira et al., 2006). Também foram estudados, para algumas destas
populações, o volume e concentração de néctar e os visitantes florais (Castro e
Araújo, 2004; Almeida, 2005); a influência da disponibilidade do néctar no
comportamento dos polinizadores; e o sucesso reprodutivo após um evento de
visitação de diferentes visitantes florais (Almeida, 2005). A produção e a
concentração de néctar mostraram-se similares nos dois estudos, no entanto,
algumas observações sobre os visitantes florais foram diferentes para as duas
populações (Castro e Araújo, 2004; Almeida, 2005), pois as abelhas e borboletas
observadas nas duas populações pertencem a diferentes taxa. Nestes dois
trabalhos, os beija-flores foram citados como os principais polinizadores de
Psychotria nuda. Na Ilha Grande, uma pequena quantidade de frutos foi formada
após uma única visita, a maioria após o contato com beija-flores, mas também
houve frutificação em flores exclusivamente visitadas por insetos (Almeida, 2005).
Ao contrário das observações descritas por Castro (2001) e Almeida (2005)
para diferentes populações, as flores de P. nuda na Floresta da Tijuca, conforme foi
identificado em excursões de campo, possuem um odor suave e adocicado. E,
conforme citado no capítulo anterior, os visitantes florais observados nesta
população pertencem aos mesmos grupos dos observados nas outras populações
(Castro e Araújo, 2004; Almeida, 2005).
Não foram encontradas informações sobre a micromorfologia floral de P. nuda
na literatura, deixando a dúvida se estas superfícies podem ter variação em relação
à heterostilia encontrada na espécie. E ainda se esta micromorfologia pode
representar um papel funcional para as flores. Também não foi encontrada
investigação sobre a possível presença de osmóforos e nem registros sobre os
53
aspectos anatômicos dos nectários nesta espécie. Tais aspectos morfológicos
podem auxiliar no entendimento do funcionamento desta estrutura. Com isso, o
presente capítulo foi elaborado de forma a preencher algumas lacunas acerca da
estrutura floral de P. nuda.
54
2.2. Objetivos
Neste capítulo foram estudados aspectos da anatomia, detalhes da superfície
e ultraestrutura floral de uma população de Psychotria nuda (Cham. & Schlecht.)
Wawra, com os seguintes objetivos específicos:
- Identificar a presença de estruturas nas flores de P. nuda que podem estar
relacionadas à atração de visitantes florais;
- Comparar a micromorfologia da superfície de diferentes órgãos florais de P.
nuda nas duas formas florais, relacionado-a a sua função;
- Analisar, comparativamente entre os diferentes órgãos, a organização da
parede periclinal externa em flores de P. nuda;
55
2.3. Material e métodos
2.3.1. Material botânico
As amostras de anteras, de cálices, de corolas, de estigmas, de estiletes e de
nectários de Psychotria nuda foram coletadas em uma área de Floresta Atlântica,
localizada na Floresta da Tijuca (22
o
55', 23
o
01' S e 43
o
12', 43
o
19' W). Amostras de
flores brevistilas e longistilas foram separadas para a realização de todos os
experimentos descritos a seguir.
2.3.2. Histoquímicas
Para a realização de testes histoquímicos foram utilizadas amostras frescas
de partes florais de P. nuda. Durante a investigação macroscópica sobre a presença
ou ausência de osmóforos foi efetuado um teste com o método de Vogel para
coloração de osmóforos (Stern et al., 1986). Para tal, diversas flores, botões intactos
e botões cortados ao meio, para permitir a exposição da superfície adaxial da corola,
permaneceram imersos no corante vermelho neutro por 30 minutos, sendo
posteriormente lavados em água destilada. O resultado desta análise foi observado
a olho nu e imagens foram registradas com a câmera digital Coolpix L1 – Nikon.
Os demais testes histoquímicos foram realizados em amostras de cálices, de
corolas e de nectários seccionadas à mão livre, enquanto as anteras, os estigmas e
os estiletes foram observados por esmagamento na lâmina. Para observação da
cutícula nas paredes periclinais externas dos órgãos citados, foram utilizados os
corantes Auramina O conforme a metodologia descrita por Heslop-Harrison e
Shivanna (1977) e Sudan IV, de acordo com o proposto por Gerlach (1984).
Para a observação da presença e continuidade da cutícula, cortes e partes
florais foram dispostos em lâminas e expostos, no escuro, a uma solução aquosa
contendo Auramina O 0,01%. Depois de 15 minutos de exposição, as amostras
foram cobertas com lamínula e levadas ao microscópio óptico. Os cortes corados
foram observados sob microscopia de fluorescência (filtro: excitação, 470 a 490 nm;
e emissão, 515 a 565 nm). A visualização dos mesmos cortes em microscopia óptica
de campo claro e a observação de cortes não expostos à Auramina O em
microscopia de fluorescência serviram como controle para a realização deste teste.
Para a coloração com Sudan IV, as amostras foram expostas a uma solução
alcoólica deste corante por ca. de 10 minutos. Em seguida, os cortes e as partes
56
florais foram levados à seguinte série de soluções: àlcool 70%, álcool 30% e água.
As amostras foram, então, posicionadas em lâminas que continham solução aquosa
de glicerina 50% e cobertas por lamínulas.
As amostras dos dois testes histoquímicos foram examinadas em um
microscópio Axioplan ZEISS e as imagens foram obtidas através da interface com o
software analySIS
®
.
2.3.4. Microscopia óptica e eletrônica de transmissão
Amostras dos diferentes órgãos florais foram fixadas por 2 horas em uma
solução do fixador de Karnovsky (1965) modificado, contendo 2,5 % de glutaraldeído
e 4,0 % de formaldeído, e com tampão cacodilato de sódio 0,05 M em pH 7,2.
Subseqüentemente, as amostras foram lavadas três vezes em tampão e pós-fixadas
por 2 horas em temperatura ambiente, com tetróxido de ósmio 1,0 % em tampão
cacodilato de sódio 0,05 M em pH 7,2. Os materiais foram, então, desidratados em
uma série gradual de soluções de acetona (30, 50, 70, 90 e 100 %) por uma hora
cada etapa. O material desidratado foi infiltrado e embebido em resina epoxy
(Polybed). As amostras em epon puro foram dispostas em moldes e levadas à estufa
(65
o
C) por 48 horas para obtenção de blocos.
Para observação em microscopia óptica, secções semi-finas, com ca. de 1
µm, foram obtidas em um ultramicrótomo Reichert ultracut e coradas com azul de
toluidina (0,05 % em solução aquosa). As lâminas foram seladas com Entellan
®
(Merck) e examinadas em um microscópio Axioplan ZEISS. As imagens foram
obtidas através da interface com o software analySIS
®
.
Para visualização das amostras em microscopia eletrônica de transmissão,
foram obtidos cortes ultrafinos, de prateados a dourados (aproximadamente 90 nm),
com auxílio de um ultramicrótomo Reichert ultracut e faca de diamante. Estes cortes
foram coletados em grades de cobre de 300 mesh. As grades com cortes foram
expostas por 40 minutos a uma solução de 1,0 % de acetato de uranila (Watson
1958) e, posteriormente, a uma solução de 5,0 % de citrato de chumbo por 5
minutos (Reynolds, 1963) para a contrastação de rotina. As secções foram
observadas no microscópio eletrônico de transmissão (ZEISS EM 900) em 80 kV.
Para a observação de feixes vasculares, algumas amostras de nectários
fixados foram cortadas à mão livre. Para tal, os nectários foram lavados em água
corrente e, depois de seccionados, foram expostos, por 1 minuto, à fucsina básica
57
0,5 %. Os cortes foram posicionados em uma lâmina contendo solução aquosa de
glicerina 50 % e observados no microscópio Axioplan – Zeiss.
2.3.5. Citoquímicas
Com o objetivo de obter uma melhor preservação e contrastação de lipídeos
insaturados dos estratos cuticulares da parede periclinal externa, foi utilizada a
técnica de marcação com imidazol (Angermüller e Fahimi, 1982). Para tal, os
fragmentos de órgãos florais foram fixados conforme o método descrito no tópico
2.3.3., lavados em tampão imidazol 0,05 M e pós-fixados em uma solução aquosa
de tetróxido de Ósmio 1,0 % e tampão imidazol 0,05 % por 72 horas. Em uma
próxima etapa, as amostras foram lavadas no mesmo tampão e, posteriormente, em
tampão cacodilato 0,05 M. A partir daí, o material foi desidratado, incluído,
emblocado e seccionado da forma descrita nos tópicos anteriores. Os cortes ultra-
finos foram coletados em grades de cobre de 300 mesh.
Para detecção de carboidratos da porção polissacarídica da parede periclinal
externa, foi empregada a técnica de marcação com vermelho de Rutênio (Luft,
1971), que é empregada na detecção de poliosídeos e mucopolissacarídeos ácidos.
Este método consiste na adição de 0,05 mg de vermelho de rutênio por cada mL da
solução fixadora (item 2.3.3), de tampão para lavagem (item 2.3.3) e de solução
para pós-fixação (item 3.3.3). À exceção do tempo da segunda lavagem, que durou
24 horas, o material seguiu um cronograma similar ao descrito no item 2.3.3,
incluindo a desidratação. A inclusão, o emblocamento e o seccionamento foram
realizados de acordo com os métodos descritos para microscopia eletrônica de
transmissão. Os cortes ultra-finos foram coletados em grades de cobre de 300 mesh.
Os resultados obtidos por estas técnicas foram observados e fotografados
com microscópio eletrônico de transmissão ZEISS – TEM 900, a uma aceleração de
voltagem de 80 kV.
2.3.6. Microscopia eletrônica de varredura
Fragmentos dos diferentes órgãos florais foram fixados, lavados, pós-fixados
e desidratados conforme a descrição no item 2.3.3. Posteriormente, as amostras
foram secas com o auxílio do aparelho Bal-Tec Critical Point Dryer CPD030, de
forma que toda acetona foi substituída por CO
2
líquido, em condições de alta
pressão. Desta maneira os danos causados pela tensão superficial associada à
58
evaporação são praticamente eliminados.
Após estas etapas, as amostras foram cuidadosamente afixadas com fita
adesiva de carbono e cola de prata em suportes próprios para o microscópio
eletrônico de varredura. Visando aumentar a condutividade eletrônica, as amostras
foram cobertas com uma fina camada de ouro de cerca de 20 nm (Bal-Tec Sputer
Coater - SCD050). A observação das amostras e as eletromicrografias foram obtidas
com o uso do microscópio eletrônico de varredura ZEISS - DSEM962, a uma
aceleração de voltagem de 20 a 25 kV, dependendo da amostra observada.
Para mensurar o tamanho de células do estilete das duas formas florais,
foram utilizados doze pistilos oriundos de flores de diferentes indivíduos, seis
brevistilas e seis longistilas. As imagens em mesmo aumento de duas regiões do
estilete, uma próxima ao ovário e outra próxima ao estigma, foram obtidas no
microscópio eletrônico de varredura DSEM 962 – ZEISS. Posteriormente, estas
imagens foram levadas a um programa de análise de imagens, o software
analySIS
®
, devidamente calibrado, com o auxílio do qual foram efetuadas medidas
lineares do comprimento das células. Ao todo foram medidas 35 a 50 células de
cada uma das regiões de seis amostras de estilete de cada forma floral.
A significância nas diferenças das médias foram consideradas através de
teste t-student (Dixon e Massey Jr, 1983). O critério de decisão para uma diferença
significante foi p<0,05.
59
2.4. Resultados
2.4.1. Estruturas florais relacionadas à atração dos polinizadores
A identificação de estruturas relacionadas à atração de visitantes florais de
Psychotria nuda se deu, em primeira instância, pela observação da macromorfologia
floral. Desta forma, na base do tubo da corola de flores recém abertas, antes da
visita de polinizadores e visitantes florais (observadas durante a realização dos
experimentos do capítulo 1) pode ser observada a presença de néctar e de um
nectário em forma de disco (figura 2.1A). Sobre estes nectários foi possível observar
a presença de estômatos na epiderme (figura 2.1B). Através de cortes anatômicos,
foram observadas uma camada de epiderme e diversas camadas de parênquima,
com pequenos espaços intercelulares e idioblastos contendo feixes de ráfides (figura
2.1C). Ambos os tecidos apresentam células com vacúolos ocupando a maior parte
do protoplasma (figura 2.1C). Foram observados também diversos feixes vasculares
pequenos cercados pelo tecido parenquimático do nectário e cristais do tipo
estilóide, sendo que estes cristais foram encontrados no parênquima apenas na
base do disco nectarífero. Durante a análise da ultraestrutura, foram encontrados
diversos plasmodesmas entre as células parenquimáticas do nectário. À exceção da
visualização de grandes núcleos, em microscopia óptica, as células do nectário
exibiram um aspecto similar ao esperado para células parenquimáticas. A maior
parte destas células mostrou, em sua ultraestrutura, vacúolo ocupando a maior parte
do protoplasma e uma porção citoplasmática limitada apenas a regiões muito
próximas à parede celular.
As flores de P. nuda são quase totalmente glabras, e a única região que
apresentou tricomas foi a base da corola (figura 2.1D). Contudo, as estruturas na
base da corola exibiram características de tricomas tectores e não de tricomas
secretores.
Indicativos da presença de osmóforos nas flores de P. nuda foram
encontrados através da coloração de partes da corola com vermelho neutro. A
coloração foi observada na face adaxial das corolas de flores em antese, na região
dos lóbulos, mas não no tubo da corola (figura 2.2). A ausência de coloração da
superfície adaxial da corola de botões florais indica que os osmóforos estão
funcionais apenas na antese. Este resultado foi semelhante ao mostrado para a
superfície abaxial dos botões florais (figuras 2.2D e E). Contudo, em cortes
60
anatômicos, não foram observadas diferenças; como a presença de substâncias
coradas de forma diferencial pelo azul de toluidina, ou ainda uma proporção maior
de protoplasma em relação ao vacúolo; entre os protoplasmas das células
epidérmicas das superfícies abaxial e adaxial da corola em antese.
2.4.2. Micromorfologia dos órgãos florais
Em geral, as superfícies abaxial e adaxial das flores de Psychotria
nuda apresentaram uma estrutura similar entre as duas formas florais. Sob o ponto
de vista da micromorfologia, ou seja, em relação ao formato, ornamentação e
tamanho das células, as superfícies da maior parte dos órgãos florais de P. nuda
não apresentam uma condição dimórfica quando flores brevistilas e longistilas são
comparadas. As superfícies abaxial e adaxial da corola e do cálice (figura 2.3),
assim como a superfície do nectário e das anteras (figuras 2.4A, B, C e D) não
apresentaram diferenças entre as duas formas florais. A exceção a este resultado foi
encontrada para o pistilo, já que os estigmas apresentam papilas visivelmente
maiores em flores brevistilas do que as de longistilas (figuras 2.4E e F). O aspecto
das células do estilete também se mostrou muito variável entre flores. Entretanto,
estas variações foram observadas não apenas entre brevistilas e longistilas, mas
também entre flores da mesma forma floral. Uma das variações encontradas na
superfície do estilete foi relativa à presença de papilas. Em geral, os estiletes de
flores longistilas apresentam papilas que podem ser observadas desde a base do
estigma até a metade da estrutura, ou até regiões mais próximas ao ovário. Os
estiletes de flores brevistilas apresentam papilas apenas na base do estigma e,
raramente, essas papilas foram observadas até o terço superior do estilete.
Apesar das semelhanças entre as formas florais, as superfícies dos diferentes
órgãos florais de P. nuda apresentam diversas topografias que variam de acordo
com o órgão e com a localização da região estudada. A superfície adaxial das
corolas exibe papilas de formato arredondado (figuras 2.3A, B e C) e estriado (figura
2.3C), enquanto a da superfície abaxial apresenta forma de polígono (figuras 2.3D, E
e F) sem estrias (figura 2.3F), mas os dois tipos de papilas deste órgão não são tão
grandes quanto as dos estigmas (figuras 2.4E, F e 2.5A e B). As superfícies adaxial
e abaxial dos cálices, assim como a dos nectários, não exibem grandes saliências
(figuras 2.3G, H, I, J, 2.4A e B), entretanto, são observadas diferenças entre estas. A
superfície dos nectários apresenta o desenho mais evidente do que aparentam ser
61
as regiões de paredes anticlinais da epiderme (figuras 2.4A e B). Além disso, a
epiderme adaxial dos cálices, ao contrário da abaxial e do nectário, não possui
estômatos. As anteras e os estiletes exibiram uma diversidade de variações
micromorfológicas. Essas epidermes apresentaram papilas em regiões mais
próximas ao estômio e ao estigma, nas anteras e estiletes, respectivamente.
Entretanto, quanto mais longe do estômio e do estigma, as superfícies mostraram-se
mais planas (figuras 2.4C, D e 2.5C a F). Em algumas regiões do estilete, a
superfície se mostrou estriada, como pode ser notado na figura 2.5D.
2.4.3. Tamanho das células nos estiletes
Ao contrário do observado para as células papilosas do estigma, as células da
epiderme do estilete apresentaram comprimento maior em pistilos de flores
longistilas (tabela 2.1). A razão entre as médias de comprimento das células do
estilete foi igual a 1,47:1 (longistila: brevistila).
A diferença entre as médias das formas florais mostrou-se maior do que as
diferenças entre as médias das duas regiões mensuradas do estilete, tanto em
brevistila, quanto em longistila (tabela 2.1). A diferença entre as duas regiões
examinadas na última forma floral foi inferior à diferença encontrada para brevistila
(tabela 2.1). Mesmo tendo sido encontradas grandes variações nas medidas de
comprimento as regiões mais próximas ao estigma (distal) apresentaram, em média,
células maiores do que as regiões próximas ao ovário em ambas as formas florais
(tabela 2.1).
2.4.4. Estrutura da parede periclinal externa em órgãos florais
O tamanho das papilas foi a única característica variável encontrada para o
estigma, já que as outras observações efetuadas, como a continuidade e a presença
da cutícula (figuras 2.6), se mostraram similares para as duas formas florais. O
mesmo pode ser dito sobre a cutícula dos outros órgãos florais investigados, quando
observadas através de técnicas de histoquímica. Todos os órgãos florais de P. nuda,
de ambas as formas florais, apresentaram uma cutícula contínua, que foi
evidenciada pela exposição ao Sudan IV (figuras 2.7A e B) e à Auramina O (figuras
2.7C, D, E e F).
A configuração dos estratos cuticulares e da camada polissacarídica das
diferentes paredes periclinais externas foi constatada através da microscopia
62
eletrônica de transmissão. As paredes periclinais externas de todas as amostras
estudadas se mostraram constituídas por uma região polissacarídica e pela
membrana cuticular (figuras 2.6D, E e 2.8). Entretanto, uma grande variação nas
proporções e na organização destas regiões pode ser notada quando diferentes
órgãos foram comparados. Em linhas gerais, apesar de haver variações em termos
de proporções e de tamanho das camadas, os órgãos dos verticilos protetores das
flores (cálice e corola), as anteras e os estiletes exibiram em suas paredes
periclinais externas camada polissacarídica, estratos cuticulares tanto com uma
região arborescente nítida quanto uma região reticulada, além da cutícula
propriamente dita (figuras 2.8A, B, C, E, F e G). Nos nectários e nos estigmas foi
identificada uma fina camada cuticular sobre a porção polissacarídica das paredes
não-arborescentes (figuras 2.6D, E e 2.8D). Um resumo sobre a presença de cada
região da parede periclinal externa nas epidermes dos diferentes órgãos estudados
pode ser visualizado na tabela 2.2. Sobre os testes citoquímicos, as observações
com vermelho de Rutênio e imidazol auxiliaram a identificação da camada
polissacarídica e dos estratos cuticulares, respectivamente (figuras 2.8D, E e G).
Outra observação pode ser feita sobre o aspecto das paredes periclinais
externas; em cada órgão estudado foi encontrado um grande espectro de
espessuras destas paredes (figuras 2.8F e G). Em alguns casos é possível que a
variação da espessura da parede periclinal externa esteja relacionada ao plano de
corte da amostra, que quanto mais enviesado, mais espessa será a aparência da
parede. Entretanto, independente dessa observação, as paredes do estilete e da
superfície adaxial da corola apresentam maior espessura em algumas regiões,
especialmente da camada polissacarídica (figuras 2.8A e B), formando as estrias na
superfície epidérmica (figuras 2.5D e 2.3C, respectivamente).
63
2.5. Discussão
As flores de ambas as formas florais de Psychotria nuda possuem diversas
estruturas que podem atuar na atração de visitantes florais. Além de uma coloração
que as destacam em relação aos órgãos vegetativos, essas flores possuem
nectários, osmóforos e variações morfológicas entre as superfícies abaxial e adaxial
da corola. Anteriormente, apenas as cores e os nectários haviam sido observados
em trabalhos sobre outras populações desta espécie (Castro e Araújo, 2004;
Almeida, 2005).
Existem diversos tipos de nectários florais, e estes podem ser evidentes na
superfície, ou podem estar incluídos em regiões mais internas da flor, como as
regiões dos septos entre os lóculos do ovário de monocotiledôneas (Fahn, 1988). Os
nectários de P. nuda pertencem ao primeiro grupo, formando um disco evidente
sobre o ovário e em torno do estilete. Vogel (1998) definiu estes nectários como
nupciais em disco tipo peristílicos (peristylous) e indicou que esses são
característicos de famílias como Rubiaceae e de Campanulales.
Os nectários, em geral, são constituídos por uma epiderme modificada, com
ou sem tricomas e papilas, e parênquima modificado; e estes podem estar próximos
ou incluir feixes vasculares (Fahn, 1988). Esta descrição mostra-se adequada para
os nectários de flores de P. nuda, que não apresentam tricomas ou papilas. Sobre
essa descrição geral, há um aspecto diferenciado nesta espécie: a presença de
idioblastos com cristais no parênquima. Ainda assim, apesar de ser pouco freqüente
na descrição de nectários de outras espécies, esta característica não é exclusiva de
P. nuda, pois também foi encontrada em algumas espécies de Orchidaceae (Galetto
et al., 1997).
Em fases pós-secretórias dos nectários, as células desta estrutura possuem
um grande vacúolo e uma pequena faixa de citoplasma (Figueiredo e Pais, 1992;
Zer e Fahn, 1992; Belmonte et al., 1994). Estas características foram encontradas
nas amostras observadas de P. nuda. Desta forma é possível indicar que em flores
recém abertas, os nectários dessa espécie já se encontram na fase pós-secretora. A
presença de núcleos evidentes, que foi observado em P. nuda, também já foi
comentada em outros estudos como uma característica dos nectários (Fahn, 1979b;
Fahn, 1988; Razem e Davis, 1999; Fahn e Shimony, 2001). Os plasmodesmas
presentes nas células localizadas entre o floema e a epiderme dos nectários de
64
Echinacea purpurea (Asteraceae) foram associados à rota simplástica de
componentes do pré-nectar (Wist e Davis, 2006). Esta rota não foi estudada em P.
nuda, ainda assim, essa espécie também apresentou plasmodesmas conectando o
citoplasma das células do tecido secretor.
Os nectários de Psychotria nuda não apresentam cera e possuem superfície
lisa, tendo sido encontrados estômatos nesse órgão. Em algumas espécies, os
estômatos estão associados à exudação da secreção dos nectários (Gaffal et al.,
1998). Nesses casos, a presença de estômatos e de espaços intercelulares garante
a liberação do néctar diretamente do parênquima. Enquanto em outras espécies, a
exudação ocorre pela presença de cavidades lisógenas, de pequenos poros na
cutícula, ou de estruturas similares a canais na parede periclinal externa de células
do nectário (Fahn, 1988). A presença de espaços intercelulares e de estômatos,
associada à ausência de poros na cutícula, de estruturas em forma de canal na
parede periclinal externa, e de cavidades lisógenas, indica que os estômatos e os
espaços intercelulares devem fazer parte da rota de liberação do néctar em P. nuda.
Os osmóforos são conhecidos como glândulas de odores das flores
(Ascenção et al., 2005). Apesar da função primária destes odores estar associada à
atração de polinizadores, a presença de substâncias voláteis nas flores pode estar
associada a outras funções, como defesa contra herbívoros e proteção contra
fatores abióticos (Davies e Turner, 2004; Knudsen et al., 2006). Com base nos
resultados obtidos, não foi possível concluir a que tipo de função os osmóforos de P.
nuda podem estar relacionados. Foram feitas, apenas, inferências sobre o local e o
período de funcionamento destes, pois a marcação para estas estruturas só foi
observada na superfície adaxial dos lóbulos da corola em flores abertas de primeiro
dia. A ausência de aspectos anatômicos que diferenciem os osmóforos das demais
células epidérmicas também sugere que estas estruturas já se encontram em um
estágio pós-secretor após a antese de flores de P. nuda.
Análises sobre a superfície da corola de P. nuda mostram que as superfícies
abaxial e adaxial possuem textura diferenciada. Em outros estudos, como o
realizado para espécies de Bupleurum (Umbelliferae), já havia sido relatado um
padrão diferenciado entre as superfícies abaxiais e adaxiais das pétalas (Özcan,
2002). Algumas espécies de abelhas percebem as diferentes texturas que são
apresentadas pelas epidermes das plantas (Kevan e Lane, 1985). Durante o
experimento destes autores, em labirintos em Y, as abelhas distinguiram a superfície
65
adaxial da corola de Helianthus anuus (Asteraceae), da superfície abaxial. Nesse
caso, a diferenciação entre as epidermes ocorreu devido a um estímulo tátil. Para
Psychotria nuda a condição de estímulo tátil para as papilas da corola é pouco
provável, pois as abelhas observadas não pousaram nas flores, escolhendo a flor
aberta como alvo sem a utilização de estímulos táteis. Em geral, os outros visitantes
florais também não pousaram sobre as flores durante as visitas. A única exceção
observada foi a de algumas borboletas que pousaram tanto sobre flores abertas
quanto sobre botões, demonstrando a incapacidade dessas em distinguir a
superfície adaxial e abaxial da corola. Com isso, mesmo no caso destas borboletas,
a superfície da corola não apresentou a função de estímulo tátil para os visitantes
florais.
Outra hipótese para a percepção da variação das diferentes estruturas
micromorfológicas das epidermes florais, por parte dos visitantes, envolve a
formação de lentes na epiderme. As pétalas, assim como algumas folhas, podem
apresentar células com papilas que formam um tipo de lente, pois possuem
protrusões a partir da surperfície (Kay et al., 1981). As diferenças na absorção de luz
por parte das células papilosas podem provocar alterações na incidência luminosa
das regiões da pétala que apresentam os pigmentos, quando comparadas às
superfícies lisas, ou seja, sem papilas (Gorton e Vogelmann, 1996). A cor das
diferentes superfícies é formada, então, através da absorção seletiva e do
espalhamento difuso da luz nos tecidos abaixo da cutícula, e, ao passar por essas
lentes um feixe de luz originalmente não polarizado, como seria o caso depois de
incidir em uma superfície lisa, pode se tornar parcialmente polarizado (Horváth et al.,
2002). Nesta situação, a sensação da cor para o observador pode se tornar diferente
quando a espécie apresenta uma superfície papilosa ao invés da lisa. A presença de
estrias nas superfícies, como foi encontrada na superfície adaxial da corola de P.
nuda, também afeta a quantidade de luz refletida pela pétala, geralmente reduzindo
a reflexão da luz (Davies et al., 2006). Entretanto, provavelmente, as estrias
espalham a luz emergente resultando no brilho constante da pétala (Kay et al.,
1981). Seguindo este raciocínio, o brilho da superfície adaxial da corola de P. nuda
deve ser mais intenso do que o da superfície abaxial.
A maior parte dos visitantes florais observados no campo se aproximou
apenas de flores abertas, à exceção de algumas borboletas (Klein, D. E. obs.
pessoal e Almeida, 2005). A variação nas superfícies abaxial e adaxial da corola
66
pode representar, para o visitante, diferenças na visualização da flor de P. nuda.
Desta forma pode ser possível a diferenciação entre flores e botões. Neste caso, as
diferenças entre as superfícies expostas nos botões e a exposta nas flores abertas
podem, também, estar associadas às substâncias produzidas e exudadas pelos
osmóforos.
Em Psychotria nuda foram encontradas diferenças entre flores brevistilas e
longistilas, que se referem ao tamanho das células no estigma e no estilete. As
células do estilete apresentaram maior comprimento em flores longistilas, contudo, a
razão entre as médias deste comprimento foi igual a 1,47:1, sendo
aproximadamente a metade do valor 3,05:1, que foi obtido para a razão entre os
estiletes das duas formas florais (para chegar a essa última razão o tamanho do
estilete foi alcançado através da subtração do comprimento do estigma dos valores
de altura do estigma, que estão dispostos na tabela 1.2; longistila: brevistila). Com
isso, fica evidente que o comprimento maior do estilete em flores longistilas ocorre
em função do aumento no comprimento e no número de células. Esta mesma
observação pôde ser feita para Primula vulgaris, para a qual foi observado que o
alongamento das células em longistila não pode ser o único responsável pela grande
diferença de tamanho entre os estiletes de longistilas e brevistilas (Heslop-Harrison
et al., 1981; Webster e Gilmartin, 2006).
Em espécies heterostílicas é comum a descrição de variação entre o tamanho
das papilas estigmáticas das formas florais (Ganders, 1979; Dulberger, 1992). A
maior parte dos estudos relata a presença de papilas maiores em flores longistilas
(Dulberger, 1992). Esta observação corresponde ao encontrado nas espécies de
Primula já estudadas (Heslop-Harrison et al., 1981; Webster e Gilmartin, 2006).
Entretanto, o oposto foi observado para P. nuda, na qual as papilas estigmáticas
apresentaram comprimentos maiores em flores brevistilas. Com isso, a hipótese de
que o tamanho das papilas estigmáticas está associado ao comprimento das células
do estilete (Richards, 1993 apud Webster e Gilmartin, 2006), não pode ser aplicado
à P. nuda. Este fato pode ser mais uma evidência de que a heterostilia é regida de
diferentes formas entre os grupos evolutivamente distantes.
A cutícula mostrou-se presente em todos os órgãos florais de P. nuda. Esta
observação está de acordo com o esperado, pois a cutícula ocorre em órgãos
aéreos de plantas terrestres, protegendo-os contra a perda de água para o ambiente
(Riederer e Schreiber, 2001). Entretanto, em algumas espécies de Angiospermae, a
67
cutícula de estruturas secretoras glandulares (incluindo estigmas úmidos) já foi
classificada como descontínua, possuindo poros ou um rompimento da cutícula para
que ocorra a exsudação (Esaú, 1974; Fahn, 1988). Essa característica não foi
observada em Psychotria nuda, onde os estigmas de ambas as formas florais
apresentaram o tipo seco e os nectários apresentaram uma cutícula fina, porém
íntegra.
A condição de apenas um tipo de estigma se mostrou diferenciada de
algumas espécies de Primula, nas quais as diferentes formas florais podem
apresentar diferentes tipos de estigma, secos e úmidos (Schou, 1984). Esta é mais
uma evidência da ocorrência de um sistema de heterostilia diferenciado entre
espécies não correlacionadas evolutivamente.
Em geral, estigmas secos são cobertos por uma cutícula contínua, que é
rompida apenas pelo tubo polínico ao penetrar no pistilo (Hiscock et al., 2002) ou
durante os processos de hidratação do pólen (Heslop-Harrison, 2000). Este tipo de
estigma foi observado em P. nuda, e também foi encontrada a cutícula intacta
anterior à ocorrência de grãos de pólen e tubos polínicos. Cabe lembrar que a
cutícula não representa uma barreira completamente impermeável. Apesar de
consideradas como estruturas lipofílicas, as cutículas apresentam, também,
estruturas hidrofílicas (Popp et al., 2005). Com isso, uma substância como a água
pode apresentar alta mobilidade e se difundir pela cutícula passando por
substâncias como a cutina; contudo, o índice de solubilidade da água na cutícula é
baixo (Schreiber, 2005). Considerando essa observação, fica possível entender que
a parede periclinal externa das papilas estigmáticas que apresentam cutícula
contínua também está envolvida, entre outras funções, na passagem de água para a
hidratação do grão de pólen. A presença de uma cutícula diferenciada dos tecidos
adjacentes pode estar relacionada a esta propriedade em estigmas de P. nuda. A
presença de cutículas finas em estigmas já foi observada em outras espécies, como
Primula vulgaris (Heslop-Harrison et al., 1981). O padrão, a distribuição e a
espessura da cutícula podem variar entre as diferentes espécies vegetais,
provocando, inclusive, variações fisiológicas no tempo e na forma de hidratação do
pólen (Heslop-Harrison, 2000).
Já foi comprovado que a presença de uma cutícula mais espessa, apesar de
ser uma idéia bastante difundida, não garante uma barreira mais eficiente contra a
perda de água (Riederer e Schreiber, 2001). Com isso, fica difícil formular hipóteses
68
sobre as propriedades de cada parede periclinal externa encontrada nos diferentes
órgãos florais estudados. Contudo, a presença de uma variação encontrada na
parede periclinal externa de uma das partes florais, que foi a observação de uma
fina camada de cera somente em cálices, deve estar associada às diferentes
funções cumpridas por esse órgão. Estas funções incluem a proteção de botões e
flores contra a desidratação e predadores. As ceras epicuticulares foram
identificadas como a barreira efetiva para a difusão de solutos e água (Riederer e
Schreiber, 2001).
A corola e o cálice apresentam diferentes funções. Enquanto o primeiro órgão
atrai, recebe, abriga e auxilia os polinizadores, as funções do segundo estão
associadas à proteção do botão floral e, em alguns casos, do ovário e do nectário
(Richards, 1997). Por este motivo, não foi surpreendente visualizar diferenças tanto
macro, quanto micromorfológicas entre a corola e o cálice de Psychotria nuda. A
barreira impermeabilizante promovida pelo cálice e o aspecto similar entre a
superfície do cálice e a superfície das folhas de P. nuda (Klein et al., 2006),
enfatizam a possibilidade de esta estrutura possuir papel de proteção e o não
envolvimento da micromorfologia desta estrutura floral nos processos de atração de
polinizadores. Ainda assim, o contraste das cores do cálice e da corola pode auxiliar
na atração dos visitantes florais.
69
2.6. Conclusões
- As flores de ambas as formas florais de Psychotria nuda possuem características
que podem atuar na atração de visitantes florais, como a coloração, os nectários, os
osmóforos e as variações morfológicas entre as superfícies abaxial e adaxial da
corola;
- Os nectários de P. nuda têm forma de disco e possuem estrutura anatômica
semelhante à descrição geral para essa estrutura, destaca-se a presença de
estômatos e idioblastos com cristais;
- Pela primeira vez foi registrada a presença de osmóforos apenas na superfície
adaxial do lóbulo de flores abertas de P. nuda;
- Variações entre as superfícies abaxial e adaxial da corola foram encontradas. Há
indícios de que estas possam servir para o visitante floral distinguir entre botões e
flores abertas;
- A micromorfologia dos diferentes órgãos florais mostrou-se variável entre os
órgãos, mas apenas os estigmas e estiletes apresentaram distinções entre as duas
formas florais;
- Quando as formas florais foram comparadas, as papilas dos estigmas de flores
brevistilas se apresentaram maiores, mas foram encontradas papilas em mais
regiões do estilete em longistilas e, também, as células epidérmicas exibiram, em
média, um comprimento maior no estilete dessa forma floral.
- Mesmo exibindo variações na espessura, as paredes periclinais externas dos
diferentes órgãos florais apresentaram estrutura semelhante, a maioria contendo
porção polissacarídica, estratos cuticulares arborescentes e reticulados, e cutícula
propriamente dita. Apesar disso, três exceções foram observadas: a presença de
projeções da camada polissacarídiica nas estrias da parede da corola e do estilete; a
ausência de estratos cuticulares nas paredes dos estigmas e dos nectários; e a
presença de cera epicuticular sobre o cálice.
70
Figura 2.1: Partes florais de Psychotria nuda, nectário e tricomas. (A) Disco
nectarífero, que se encontra sobre o receptáculo e ao redor de um fragmento do
estilete, em microscopia eletrônica de varredura; (B) detalhe da superfície do
nectário, apresentando estômato, em MEV; (C) secção longitudinal do nectário, em
microscopia óptica; (D) superfície adaxial da base da corola, onde são encontrados
tricomas, em MEV. Legenda: estrela – fragmento de estilete; seta – espaço
intercelular; círculo – feixe de ráfides; cabeça de seta – tricomas. Barras: (A) e (D)
500 µm; (B) 10 µm; (C) 50 µm.
71
Figura 2.2 Flores e botões de Psychotria nuda, sob teste de coloração com vermelho
neutro. Imagens (A), (B) e (C) – material no campo, usado como controle; (A) botão
floral; (B) flor longistila; (C) flor brevistila; Imagens (D) e (E) – superfície abaxial
botões após coloração com vermelho neutro; (D) botões brevistila; (E) vista frontal
de botão longistila; Imagens (F), (G), (H) e (I) – flores após coloração com vermelho
neutro; (F) vista frontal exibindo a superfície adaxial da corola, estigma e estilete de
flores longistila; (G) visão de uma flor longistila, apresentando a superfície abaxial da
corola e do cálice; (H) vista frontal exibindo a superfície adaxial da corola de flores
brevistila; (I) visão de uma flor brevistila, apresentando a superfície abaxial da corola
e do cálice. As flores brevistila apresentaram, em média, 25,3 mm de comprimento e
as longistilas 21,5 mm. Legenda: asterisco – estigma; círculo - lóbubos da corola;
quadrado – tubo da corola.
*
*
72
A B
D E
G H
I
J
C
F
Figura 2.3: Superfícies de partes florais de Psychotria nuda em microscopia
eletrônica de varredura. As imagens (A), (D), (G) e (I) são de flores brevistilas; e (B),
(C), (E), (F), (H) e (J) de flores longistilas; (A), (B) e (C) superfície adaxial da corola;
(D), (E) e (F) superfície abaxial da corola; (F) e (G) superfície adaxial do cálice; (H) e
(I) superfície abaxial do cálice. Legenda: quadrado – estômato. Barras: (A), (B), (D) e
(E) 200 µm; (C) e (F) 20 µm; (G), (H), (I) e (J) 50 µm.
73
Figura 2.4: Superfície de partes florais de Psychotria nuda em microscopia eletrônica
de varredura. As imagens (A), (C) e (E) são detalhes de flores brevistilas; e (B), (D) e
(F) detalhes de flores longistilas; (A) e (B) detalhe da superfície do nectário; (C) e (D)
detalhe da superfície da antera; (E) e (F) detalhe da superfície de estigma. Legenda:
estrela – abertura do estômio; cabeça de seta – região lisa da epiderme; e seta –
papila. Barras: (A) e (B) 100 µm; (C), (D), (E) e (F) 200 µm.
74
Figura 2.5: Superfície de partes do pistilo de Psychotria nuda em microscopia
eletrônica de varredura. Papilas do estigma de (A) brevistila; (B) longistila; (C) região
do estilete logo abaixo do estigma (flor longistila); (D) região mediana do estilete
mais próxima ao estigma (flor brevistila); (E) região mediana do estilete mais distante
do estigma (flor brevistila); e (F) região do estilete mais próxima ao ovário (flor
longistila). Legenda: elipse – região estriada da superfície; e seta – papila. Barras:
(A) e (B) 30 mm; (C) e (D) 50 mm; (E) e (F) 200 mm.
A
B
C
D
E
F
75
Tabela 2.1: Comprimento das células epidérmicas do estilete de cada forma floral de
Psychotria nuda. Médias, desvio padrão, número de células medidas (N) e resultado
do teste t (P).
Localização das células Forma floral
Média (µm)
Desvio padrão N P
Região distal 49,73 19,56 241
Região proximal
Brevistila
40,52 9,80 258 0,0000
Região distal 67,71 18,67 242
Região proximal
Longistila
64,45 16,86 270 0,0383
Brevistila 44,97 15,98 499
Média das duas regiões
Longistila 65,99 17,79 512 0,0000
76
Figura 2.6: Estigma de Psychotria nuda. Marcação histoquímica para verificação da
cutícula em (A) papilas do estigma na ausência de Auramina O, em microscopia
óptica de campo claro (controle); (B) papilas do estigma na ausência de Auramina O,
em microscopia de fluorescência (controle); (C) papilas do estigma coradas com
Auramina O, em microscopia de fluorescência; microscopia eletrônica de
transmissão da parede periclinal externa da papila de estigmas (D) brevistila; e (E)
longistila. Legenda: seta – cutícula; C1 – camada polissacarídica; C4 – cutícula
propriamente dita. Barra = (A) e (B) 100 µm, (C) 50 µm, (D) 0,3 µm e (E) 0,2 µm.
A
B
C
D
E
C1
C4
77
Figura 2.7: Cortes à mão livre de partes florais de Psychotria nuda. As imagens (A),
(C) e (D) são da face adaxial da corola; e (B), (E) e (F) da face adaxial do cálice. (A)
e (B) amostras coradas com Sudan IV, em microscopia óptica de campo claro; (C) e
(E) amostras coradas com Auramina O, em microscopia óptica de campo claro
(controle); (D) e (F) amostras coradas com Auramina O, em microscopia de
fluorescência. Legenda: seta – cutícula. Barras: (A) e (B) 20 µm; (C), (D), (E) e (F)
100 µm.
78
Figura 2.8: Microscopia eletrônica de transmissão da parede periclinal externa de
diferentes órgãos florais de Psychotria nuda. (A) região do estilete que apresenta
estrias, contrastação de rotina; (B) papilas da epiderme adaxial da corola,
contrastação de rotina; (C) face abaxial do cálice, contrastação de rotina; (D)
nectário, citoquímica – vermelho de Rutênio; (E) região menos papilosa do estilete,
citoquímica – vermelho de rutênio; (F) antera, contrastação de rotina; (G) antera,
citoquímica – Imidazol. Legenda: C1 – camada polissacarídica; C2 – região
arborescente do estrato cuticular; C3 – região reticulada do estrato cuticular; C4 –
cutícula propriamente dita; ce – cera epicuticular; seta – estria. Barras: (A) 0,6 µm;
(B) 0,4 µm; (C), (D), (E), (F) e (G) 0,25 µm.
79
Tabela 2.2: Caracterização das regiões da parede periclinal externa de diferentes órgãos da
flor de Psychotria nuda
Legenda: + presente; - ausente.
Membrana cuticular Região da
parede
periclinal
externa/
Camada cutinizada
Epiderme
Camada
polissacarídica
(celulose e
pectinas)
lamelada
Estrato
cuticular -
arborescente
Estrato
cuticular -
reticulado
Cutícula
propriamente
dita
Cera
epicuticular
Antera
+ + + + -
Estigma
+ - - + -
Estilete
+ + + + -
Nectário
+ - - + -
Corola
adaxial
+ + + + -
Corola
abaxial
+ + + + -
Cálice
adaxial
+ + + + +
Cálice
abaxial
+ + + + +
80
III.3 Capítulo 3
Anatomia e micromorfologia do eixo reprodutivo de Psychotria nuda:
estrutura dos grãos de pólen
3.1. Introdução
Os grãos de pólen atuam como portadores do gameta masculino, por isso são
chamados de gametófitos, e representam um importante papel para a reprodução
sexuada das espermatófitas. Durante o seu desenvolvimento, existe uma fase de
dispersão na qual o grão de pólen é transportado por centímetros ou por quilômetros
até atingir o seu alvo, o estigma (Franchi et al., 2002).
Os grãos de pólen possuem uma programação adequada à sobrevivência
durante a jornada até o pistilo, dependendo do ambiente ao qual a planta está
exposta e às circunstâncias de polinização (Dafni e Firmage, 2000). Esta
programação inclui determinadas características necessárias para a resistência e
outras necessárias para o cumprimento do papel especializado de suas células. Os
grãos de pólen devem, por exemplo, possuir paredes celulares resistentes, capazes
de manter os níveis necessários de água, durante a exposição desta estrutura às
diferenciadas condições ambientais, e a união das células que abriga; devem conter
moléculas especiais de reconhecimento das partes femininas da flor; devem possuir
uma quantidade de reservas energéticas que seja suficiente para sustentar o
crescimento do tubo polínico; e devem, ainda, portar um aparato celular que permita
o crescimento dessa estrutura de forma a permear os tecidos femininos.
Um importante componente do grão de pólen, que auxilia no cumprimento de
funções intrínsecas a essa estrutura, é a parede celular. A esta parede, em especial,
é aplicado o nome esporoderme; sua composição é muito complexa e é estratificada
em camadas distintas com propriedades químicas e físicas particulares. A
estratificação da esporoderme inclui: camadas da exina e a intina (Mariath et al.,
81
2006). Composta principalmente por esporopolenina, a exina compreende duas
camadas: a ectexina – camada externa geralmente esculturada de forma específica
– e a endexina – camada interna não esculturada. A intina pode ser descrita como o
estrato mais interno da esporoderme, apresentando constituição predominantemente
celulósica, acrescida de outros componentes como pectinas e proteínas (Mariath et
al., 2006). Em geral, a esporoderme apresenta-se coberta por substâncias oriundas
principalmente do tapete, que é a camada mais interna da antera e, portanto mais
próxima aos grãos de pólen durante o seu desenvolvimento (Dickinson et al., 2000).
A cobertura dos grãos de pólen possui composição química de grande complexidade
e pode ser classificada em dois tipos distintos, “tryphine” e “pollenkitt” (Pacini e
Hesse, 2005). As funções propostas para a cobertura do pólen já foram tratadas por
diversos trabalhos e incluem adesão a outros grãos, a vetores de polinização, e a
componentes do pistilo; resistência contra a radiação UV; prevenção contra o
ressecamento; coloração dos grãos; atração de polinizadores; e retenção de
moléculas sinalizadoras que vão participar dos processos de interação entre pólen e
estigma (Dickinson et al., 2000).
Palinologia é a ciência que se refere principalmente à parede dos grãos de
pólen e esporos, tratando do seu formato, ornamentação, tamanho e aberturas, mas
não lida com o interior vivo desses grãos (Erdtman, 1972). Em termos palinológicos,
a família Rubiaceae é euripolínica (Erdtman, 1972); ou seja, existem diversos tipos
polínicos nesse grupo taxonômico (Barth e Melhem, 1988). Entretanto, o tipo
tricolporado é o mais freqüente para o grupo (Robbrecht, 1988). A tribo Psychotriae
apresenta uma diversidade palinológica maior do que qualquer outra tribo de
Rubiaceae (Jansen et al., 1996). Por ter uma difícil delimitação genérica através de
caracteres vegetativos, a palinologia se torna um tópico de pesquisa promissor para
esse grupo taxonômico (Robbrecht, 1988).
Diversos estudos já foram realizados sobre o desenvolvimento das células
dos grãos de pólen de diferentes espécies. Em geral, em estágios iniciais da
formação do grão de pólen, a célula mãe do pólen sofre meiose, gerando quatro
células haplóides (Cutter, 1987), sendo que cada uma destas originará um grão de
pólen. Subseqüentemente, após diversas etapas de diferenciação e formação da
parede, a célula, até então única dentro do grão de pólen, sofre mitose, gerando
duas células assimétricas (célula vegetativa e célula generativa) que não estão
separadas por parede celulósica (Richards, 1997). É desta forma, bicelular, que
82
muitos grãos de pólen estão aptos para iniciar os processos de entrada no estigma.
Entretanto, em algumas espécies ocorre uma segunda mitose; ou seja, o grão
possui três células. Essa segunda divisão ocorre a partir da célula generativa,
gerando as duas células espermáticas. Para qualquer espécie, independente da
quantidade de células encontrada no grão de pólen, a fecundação com a oosfera só
ocorre após as três células estarem formados.
Além da parede celular especializada e do número de células, outras
estruturas também são muito importantes para o funcionamento deste gametófito,
como as células vegetativas que servem como “casa de força” (powerhouse) para
entregar as células generativas ao saco embrionário (Maraschin et al., 2005). Os
recursos energéticos do grão de pólen podem ser de diversos tipos (López et al.,
2006), incluindo reservas de amido, carboidratos solúveis e lipídeos (Plitman e
Levin, 1983; Santos e Mariath, 1999; Abreu et al., 2006; Pacini et al., 2006).
Após a observação de diversos grãos de pólen, Baker e Baker (1979)
propuseram que o diâmetro médio dos grãos com reserva de amido são maiores do
que os que possuem outro tipo de reserva. Entretanto, em estudos posteriores para
a família Zingiberaceae, não foi encontrada diferença significativa entre o tamanho
dos grãos de pólen com reserva de amido em comparação com os que possuem
outras reservas (Wang et al., 2004). Em espécies que apresentam heterostilia, é
freqüente a diferença de tamanho dos grãos de pólen entre as duas formas florais.
Darwin (1877) indicou que o dimorfismo do tamanho do pólen em espécies distílicas
poderia estar relacionado ao comprimento do estilete de cada forma floral. Após o
exame de diversos grupos de espécies heterostílicas com diferentes tipos de reserva
energética, Baker e Baker (1979) sugeriram que o maior tamanho de grãos de pólen
em brevistilas está relacionado a uma quantidade de reservas maior e esta, por sua
vez, é necessária para produzir tubos polínicos mais longos, requeridos em estiletes
de longistila (Mazer e Hultgard, 1993).
Conforme foi revisado por López et al. (2006), vários grupos de espécies que
não apresentam heterostilia exibem uma correlação positiva entre o tamanho do
grão de pólen e o comprimento do pistilo (Baker e Baker, 1982; Plitmann e Levin,
1983; Kirk, 1993; Harder, 1998; Torres, 2000; Aguilar et al., 2002). Entretanto há
grupos em que essa correlação não é encontrada (Cruden e Miller-Ward, 1981,
Cruden e Lyon, 1985).
A importância das reservas energéticas e da parede do pólen já foi
83
evidenciada em outras espécies. Em seus estudos sobre Vitis vinifera (Vitaceae),
Abreu et al. (2006) encontraram dois tipos diferenciados de grãos de pólen; um
destes possui reserva de grãos de amido e aberturas na parede polínica, enquanto o
outro tipo não apresenta nenhuma destas características. Dentre os dois tipos
polínicos descritos apenas o primeiro tipo exibiu a capacidade de fertilizar. Outro
exemplo pode ser visualizado em Trachycarpus fortunei (Arecaceae), pois foi
demonstrado que a viabilidade polínica desta espécie está associada à manutenção
de baixas porcentagens de água e altos níveis de sacarose e polissacarídeos
insolúveis no citoplasma, que são as reservas energéticas do pólen desta espécie
(Guarnieri et al., 2006).
A maior parte dos trabalhos que se referem às diferenças entre os grãos de
pólen de cada forma floral de espécies com distilia e tristilia relata apenas variações
no tamanho e na quantidade de grãos. Entretanto, existem também relatos sobre
diferenças no formato, cor, ornamentação da exina, ou sobre a presença e ausência
de amido nos grãos de pólen associada à forma floral (Ganders, 1979). A procura
por diferenças nos grãos de pólen é pertinente para Rubiaceae, família na qual a
heterostilia é freqüentemente associada à variação polínica dentro das espécies
(Robbrecht, 1988). Dulberger (1992) listou características da morfologia do grão de
pólen de espécies heterostílicas estudadas em diversos trabalhos, sendo que para
Rubiaceae foram apontadas: quatro espécies que apresentam diferenças em
tamanho dos grãos de pólen para as flores brevistila e longistila; dez espécies que
apresentaram variações nas esculturas da exina entre as duas formas florais; e nove
espécies que não apresentaram nenhum tipo de polimorfismo. Entretanto, cuidados
devem ser tomados com relação à bibliografia pesquisada, já que alguns estudos
foram realizados sobre os grãos de pólen de espécies que apresentam dimorfismo
floral, apontadas como heterostílicas, sem que haja a comprovação da existência da
auto-incompatibilidade heteromórfica (Bremekamp, 1963; Jung-Mendaçolli e
Melhem, 1995; Naiki e Nagamasu, 2003).
Os sistemas de auto-incompatibilidade em Angiospermae baseiam-se no
reconhecimento célula-célula de duas gerações – esporofítica e gametofítica – o que
pode levar ao isolamento da geração invasora (Bell, 1995). Para entender
mecanismos aos quais pertencem as compatibilidades ou incompatibilidades dessas
interações é preciso identificar moléculas de reconhecimento e seus mecanismos de
funcionamento (Cheung, 1996). Conforme revisado por Dickinson et al. (2000), a
84
diversidade de moléculas presentes na cobertura do pólen, por exemplo, possui
extrema importância para o sistema molecular de reconhecimento durante a
interação com o estigma. Para as espécies Populus deltoides e P. alba (Salicaceae)
foi encontrada a primeira evidência de que as proteínas extracelulares localizadas
sobre a parede do pólen agem nas reações de reconhecimento que determinam a
incompatibilidade interspecífica entre estas duas espécies (Ashfords e Knox, 1980).
Atualmente, são conhecidas diversas moléculas, em especial proteínas que atuam
nos sistemas homomórficos de auto-incompatibilidade.
Poucos estudos foram realizados sobre os grãos de pólen de espécies
heterostílicas que relacionam outros parâmetros além dos aspectos morfológicos. A
única investigação molecular sobre proteínas em grãos de pólen de uma espécie
heterostílica é recente, e se refere a uma espécie tristílica. Neste estudo foram
apontadas proteínas específicas de cada tipo de grão de pólen de Fagopyrum
esculentum (Polygonaceae), sendo estes oriundos de anteras altas, baixas ou
médias, em cada forma floral (Kalinowski et al., 2007). Outros aspectos têm sido
descritos sobre a interação molecular durante processos de auto-incompatibilidade,
entretanto, pouco é conhecido sobre esse tópico para espécies com sistema
heteromórfico de auto-incompatibilidade. Estudos sobre a aparelhagem molecular,
em especial protéica, já foram realizados sobre os pistilos de um pequeno número
de espécies. Um destes estudos sugeriu que proteínas diferenciais do estilete de
cada forma floral de Averrhoa carambola (Oxalidaceae) estão relacionadas ao
processo de auto-incompatibilidade da espécie (Wong et al., 1994). Posteriormente,
espécies heterostílicas da família Turneraceae foram estudadas com relação à
composição protéica dos pistilos das duas formas florais (Athanasiou e Shore, 1997;
Athanasiou et al., 2003; Khosravi et al., 2003). Através da marcação com anticorpos,
a presença de uma poligalacturonase se mostrou específica das flores brevistilas de
diversas espécies do gênero Turnera série Turnera. Entretanto, a mesma
poligalacturonase não foi evidenciada em espécies de outras séries de Turnera
(Khosravi et al., 2003), e ainda não foi observada a relação entre essa proteína e o
processo de incompatibilidade. A família Turneraceae não está proximamente
relacionada à Rubiaceae, de acordo com a APG (2007), Rubiaceae pertence à sub-
classe Euasterids I, enquanto Turneraceae está incluída na sub-classe Eurosids I.
Provavelmente, o sistema heteromórfico de auto-incompatibilidade evoluiu de forma
independente nos dois grupos; com isso, mesmo que a poligalacturonase em
85
questão seja responsável pela ativação do processo de incompatibilidade em
espécies de Turnera, o mesmo não necessariamente seria verdade para espécies
de Psychotria ou outros gêneros de Rubiaceae.
Psychotria nuda (Cham. & Schlecht.) Wawra é uma espécie distílica que
apresenta sistema de auto-incompatibilidade heteromórfica (Castro e Araújo, 2004;
Almeida, 2005; Pereira et al., 2006; ver capítulo 1) e dimorfismo no tamanho do grão
de pólen (Almeida, 2005; ver capítulo 1). Entretanto, não foram encontradas na
literatura informações sobre a estrutura dos grãos e a composição química do pólen
desta espécie.
86
3.2. Objetivos
Este capítulo foi dedicado à identificação de características dos grãos de
pólen de Psychotria nuda que possam estar relacionadas à heterostilia e às funções
desta estrutura. Para tal, foram realizadas diversas análises para cumprir os
seguintes objetivos específicos:
- Analisar, de forma comparativa entre as duas formas florais, a presença ou
ausência de diferentes tipos de reserva dos grãos de pólen de P. nuda;
- Estimar a área ocupada pela reserva energética nos grãos de pólen das
duas formas florais de P. nuda;
- Caracterizar, de forma comparativa, a superfície dos grãos de pólen das
duas formas florais de P. nuda;
- Descrever, de forma comparativa, os grãos de pólen das duas formas florais
de P. nuda no âmbito anatômico e ultraestrutural;
- Determinar e comparar os perfis protéicos dos grãos de pólen das duas
formas florais de P. nuda.
87
3.3. Material e métodos
3.3.1. Material botânico
As amostras de pólen e anteras de Psychotria nuda foram coletadas em uma
área de Floresta Atlântica localizada na Floresta da Tijuca (22
o
55', 23
o
01' S e 43
o
12', 43
o
19' W). Antes da coleta de amostras de pólen e anteras maduras usadas
neste capítulo, botões de P. nuda em estágio de pré-antese foram ensacados com
bolsas de filó para prevenir a visitação das flores e conseqüente troca de grãos de
pólen entre as flores. Anteras maduras e grãos de pólen foram obtidos em flores
abertas. Amostras de anteras em diferentes estágios de desenvolvimento também
foram coletadas em botões florais de tamanhos distintos.
3.3.2. Análises histoquímicas
Grãos de pólen foram coletados a partir de anteras frescas de cada forma
floral e corados com Sudan IV (Gerlach, 1984), reagente de Schiff – ácido periódico
(McManus, 1948), IKI (lugol) (Berlyn e Mikshe, 1976), azul brilhante de Coomassie
(Fisher, 1968) e com o reagente DAPI (4,6-diamino-2-fenil indol). Tais testes foram
realizados para avaliar a presença de material lipofílico, carboidratos, amido,
proteínas e para a visualização dos núcleos, respectivamente.
As colorações com lugol e azul brilhante de Coomassie foram efetuadas
através da colocação de 0,3 mL de corante em um tubo de 1,5 mL (“eppendorf”),
acrescidas de amostras de pólen retiradas direto das anteras. Após 10 minutos, o
material foi centrifugado por três minutos a ca. 6200 rpm, e o sobrenadante foi
descartado. As amostras foram ressuspensas em solução aquosa de glicerina 50 %,
dispostas em lâminas, cobertas por lamínulas, e levadas ao microscópio Axioplan
ZEISS. Para observação das amostras coradas com Sudan IV o protocolo foi similar,
sendo que, após a retirada do corante e antes da exposição à glicerina, o material foi
exposto a uma pequena série de re-hidratação das amostras (álcool 70 % e 30 %). A
cada etapa, o material foi exposto à solução alcoólica por cinco minutos, em seguida
foi centrifugado por três minutos a ca. 6200 rpm, e o sobrenadante foi descartado.
Etapas similares também foram efetuadas para a histoquímica com reagente de
Schiff, sendo que durante todas as etapas desta coloração o material permaneceu
no escuro. Para esta técnica, inicialmente as amostras foram expostas ao ácido
periódico por 15 minutos, centrifugadas como acima, lavadas com água destilada, e
88
posteriormente expostas ao regente de Schiff por 15 minutos. Após a centrifugação
e descarte do sobrenadante, as amostras foram lavadas com água destilada e
posicionadas em lâmina com solução aquosa de glicerina 50 %.
A exposição dos grãos de pólen ao reagente DAPI foi realizada através da
colocação de grãos de pólen frescos em uma gota desta substância sobre uma
lâmina. As lâminas foram cobertas com lamínulas e, após 30 minutos, foram
observadas em microscopia de fluorescência (filtro de excitação 365 nm e filtro de
emissão 420 nm). Em todas as etapas do processo de coloração o material
permaneceu no escuro.
As imagens de todos os testes histoquímicos foram obtidas com o auxílio do
software analySIS
®
acoplado a um microscópio Axioplan ZEISS.
3.3.3. Microscopia óptica
Anteras de cada forma floral, maduras e em desenvolvimento, foram fixadas
por 2 horas em uma solução contendo 2,5 % de glutaraldeído e 4,0 % de
formaldeído, e tampão cacodilato de sódio 0,05 M em pH 7,2. Subseqüentemente,
as amostras foram lavadas três vezes em tampão e pós-fixadas por 2 horas em
temperatura ambiente, com 1,0 % de tetróxido de ósmio em tampão cacodilato de
sódio 0,05 M em pH 7,2. As anteras foram, então, desidratadas em uma série
gradual de soluções de acetona (30, 50, 70, 90 e 100 %; por uma hora cada etapa).
O material desidratado foi infiltrado e embebido em resina epoxy (Polybed). Secções
semi-finas (1,0 µm) foram obtidas em um ultramicrótomo Reichert ultracut e coradas
com azul de toluidina 0,1 % em solução aquosa contendo bórax 0,1 %. As lâminas
foram seladas com Entellan
®
e examinadas em um microscópio Axioplan ZEISS.
As amostras de grãos de pólen isolados, oriundos de anteras já abertas,
foram processadas de acordo com o parágrafo acima, com exceção da pós-fixação.
Contudo, entre cada etapa as amostras foram centrifugadas por 3 minutos a ca.
6200 rpm.
As medidas de comprimento dos eixos maior e menor dos grãos de pólen,
dimensão de área e contagem do número de grãos de amido foram observadas em
cortes de grãos de pólen e obtidas com o auxílio do software analySIS
®
acoplado a
um microscópio Axioplan ZEISS. As diferenças foram testadas estatisticamente
através de análise de variância (ANOVA) (Stata Corp., 2002).
89
3.3.4. Microscopia eletrônica de transmissão
Anteras maduras de cada forma floral foram fixadas, pós-fixadas,
desidratadas e embebidas conforme as etapas descritas acima. Secções ultra-finas,
obtidas com auxílio de um ultramicrótomo Reichert ultracut, foram coletadas em
grades de cobre de 300 mesh. Estas grades com cortes foram expostas por 40
minutos a uma solução de 1,0 % de acetato de uranila (Watson 1958) e,
posteriormente, a uma solução de 5,0 % de citrato de chumbo (Reynolds, 1963) por
5 minutos para a contrastação de rotina. As secções foram observadas no
microscópio eletrônico de transmissão (ZEISS EM 900) em 50 kV.
3.3.5. Microscopia eletrônica de varredura
Grãos de pólen de cada forma floral foram espalhados sobre suporte próprio
para o uso no microscópio eletrônico de varredura cobertos com fita adesiva de
carbono, sendo, em seguida, expostos à dessecação na presença de sílica gel, por
uma noite. Posteriormente, estas amostras foram cobertas com uma camada de
aproximadamente 20 nm de ouro, e observadas em um microscópio eletrônico de
varredura (ZEISS DSEM 962) em 20 kV.
3.3.6. Perfil protéico
Grãos de pólen maduros de diversas flores de diferentes indivíduos de
Psychotria nuda foram removidos das anteras de forma delicada, com auxílio de
pinças, para não serem acompanhados por partes da antera. Ao todo foram
separados eppendorfs contendo 0,007 g de pólen de cada forma floral, e estes grãos
foram armazenados em freezer, a - 70°C. Com o auxílio de um pistilo apropriado, os
grãos de pólen foram esmagados e reduzidos a pó, na presença de nitrogênio
líquido, dentro de um eppendorf com capacidade para 1,5 mL. Para extração
protéica à frio, foram misturados 400 µL de uma solução tampão contendo Tris-HCl
0,1 M, pH 8,0 e PMSF 1 µM às amostras maceradas, que permaneceram sob
agitação por 4 horas, a temperatura de 4° C. As amo stras foram centrifugadas a
14.000 g por 5 minutos, a 4° C. Os sedimentos foram descartados, e os
sobrenadantes foram aproveitados e dessalinizados através de filtração em gel, em
uma coluna cromatográfica do tipo Sephadex G-10 (coluna de 1,0 x 15 cm). A
coluna foi equilibrada e desenvolvida com tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0. O
conteúdo de proteínas solúveis totais foi determinado de acordo com o método de
90
Bradford (1976) e BSA foi utilizado como padrão. Frações contendo o primeiro pico
cromatográfico de proteínas de cada amostra (brevistilas e longistilas) foram
reunidas e, posteriormente, aliquotadas de forma a obter 6 alíquotas de 1 mL para
cada amostra e conservadas a – 20° C. As amostras f oram utilizadas nas etapas a
seguir após a liofilização das alíquotas.
Cada material liofilizado foi solubilizado em uma mistura contendo 29 µL de
tampão Tris-HCl (100 mM, pH 8,0), 10 µL tampão de amostra (Tris-HCl 100 mM, pH
8,0 contendo 10 % SDS, 5 % sacarose e 0,001 % de azul de bromofenol) e 0,01 %
de β-mercaptoetanol. Essa solução foi aquecida a 100°C, centrifugada a 14000 g por
5 minutos e submetida à corrida eletroforética, para a análise unidimensional que
separou as proteínas de acordo com a massa molecular. Um gel de poliacrilamida
(SDS-PAGE) foi construído conforme descrito por Laemmli (1970). Para comparação
e determinação das massas moleculares, foi utilizado um marcador molecular
contendo proteínas de massas moleculares conhecidas. A corrida eletroforética foi
realizada em um sistema vertical para eletroforese (Bio-Rad) sob voltagem constante
de 100 V. As bandas protéicas puderam ser visualizadas após a precipitação com
prata, de acordo com o método descrito por Morrissey (1981).
Parte dos géis SDS-PAGE foi utilizada, após a corrida eletroforética, para a
visualização de glicoproteínas. A coloração destes géis foi realizada de acordo com
o protocolo que acompanha o kit para detecção de glicoproteínas (Glycoprotein
Detection Kit, Glyco Pro, Sigma, Saint Louis, Missouri, USA).
A análise bidimensional em gel de poliacrilamida foi realizada de acordo com
os métodos descritos por O´Farrell (1975) com algumas modificações (Gorg et al.
1980). De forma a realizar a análise bidimensional, os resíduos de amostras
liofilizadas foram expostos a re-hidratação em 125 µL de solução tampão (8 % de
uréia; 2 % de chaps; 0,5 % de anfólitos; 0,3 % de DTT; 0,002 % de azul de
bromofenol). Cada solução foi depositada sobre um strip holder, suporte adequado
para abrigar a tira de gel, onde ocorre a migração de proteínas na primeira
dimensão. A tira de gel da primeira dimensão (Bio-Rad IPG ready strip de 7 cm, pH
3,0 a 10,0) foi, então, colocada sobre a solução contendo a amostra no strip holder,
sendo coberta com óleo mineral apropriado. Para cada experimento o strip holder foi
transferido para a plataforma de focalização, IPG Phor. Após a focalização, as tiras
de gel foram imersas em tampão de equilíbrio (Tris-HCl 0,05 M, pH 8,8; uréia 6 M;
30 % de glicerol; 2 % de SDS; e 0,0002 % de azul de bromofenol).
91
Subseqüentemente, cada tira de gel da primeira dimensão foi adequadamente
posicionada sobre um gel SDS-PAGE (Laemmli, 1970, sem a solução stack) e as
corridas eletroforéticas foram seguidas conforme as etapas descritas para a análise
unidimensional. Os spots de proteínas puderam ser visualizados após a precipitação
com prata, de acordo com o método descrito por Morrissey (1981).
92
3.4. Resultados
3.4.1. Caracterização estrutural dos grãos de pólen
Os grãos de pólen maduros de Psychotria nuda apresentam-se como
mônades, ou seja, isolados; e possuem tamanho grande em flores do tipo longistila
e grande a muito grande em brevistilas (as médias dos diâmetros dos grãos de
pólen das duas formas florais estão dispostos na tabela 1.2, no capítulo 1), de
acordo com as classes propostas por Erdtman (1972). A forma destes grãos é
esferoidal, não sendo possível determinar se estes são do tipo oblato esferoidal ou
prolato esferoidal devido à ausência de estruturas que marquem o eixo polar e o
diâmetro equatorial. Os grãos de pólen das duas formas florais são inaperturados e
apresentam exina espiculada, estruturada de forma delicada e exibindo pequenos
grânulos na superfície (figura 3.1A e B). Apesar de a caracterização geral ser similar
às duas formas florais, a ornamentação da exina apresenta-se de forma diferenciada
entre os grãos dos dois tipos florais, sendo mais fina em grãos de longistila (figura
3.1A e B). A esporoderme, em ambas as formas florais, apresenta uma ectexina fina
endexina espessa, como pode ser observado em grãos de pólen retirados
diretamente das flores, com o auxílio da microscopia óptica (figura 3.1C e D).
Também através da observação de grãos frescos, é possível afirmar que os grãos
de pólen de flores brevistilas se apresentam mais opacos do que os de longistilas.
3.4.2. Histoquímica dos grãos de pólen
Nos grãos de pólen de Psychotria nuda das duas formas florais (figuras 3.2A
e B) foi possível observar a presença de proteínas (figuras 3.2C e D), carboidratos
neutros (figuras 3.2E e F) e amido (figuras 3.2E a H), mas não houve marcação para
a presença de lipídios (figuras 3.2I e J). Portanto, o tipo de reserva desses grãos
deve ser na forma de amido, com a possibilidade de haver, também, a presença de
carboidratos solúveis.
Nos grãos de pólen examinados, de flores brevistilas e longistilas, apenas
dois núcleos foram detectados através da marcação com o reagente DAPI. Os dois
nucléolos evidentes neste teste apresentam formato arredondado (figuras 3.2K e L)
e foram observados em diferentes regiões da célula, tanto próximos à parede do
grão, quanto mais ao centro do pólen.
93
3.4.3. Padrão dos estratos estéreis das anteras
De forma a comparar possíveis diferenças no desenvolvimento do pólen dos
dois tipos florais de Psychotria nuda, foi efetuada uma tentativa de visualizar células
de pólen em desenvolvimento. Entretanto, os métodos de processamento de
material, que se mostraram adequados ao estudo dos grãos maduros, não foram
adequados à observação das células do pólen em desenvolvimento (figuras 3.3A e
B). Ainda assim, foram visualizados estágios do desenvolvimento dos estratos
parietais das anteras de P. nuda. Os resultados a seguir foram observados tanto em
flores longistila quanto brevistila. As anteras apresentam células do tapete grandes,
formato quadrado, em corte transversal, e citoplasma denso quando o pólen ainda
estava no estágio de tétrades (figura 3.3A). Durante o desenvolvimento dos grãos de
pólen, as células do tapete se tornam achatadas, permanecendo com o citoplasma
denso, mesmo quando o pólen já se encontra individualizado (figura 3.3B); e apenas
na fase madura da antera estas células não são visualizadas (figuras 3.3C e D).
As outras camadas das anteras de P. nuda incluem a epiderme, o endotécio e
uma camada média formada por células parenquimáticas. Além das mudanças no
tapete foram observadas outras diferenças entre anteras jovens e maduras, como o
espessamento de algumas das paredes anticlinais do endotécio (figuras 3.3C e D); e
a presença do estômio, ou deiscência da antera (figura 3.3C). Estas características
foram encontradas apenas em anteras maduras.
3.4.4. Caracterização anatômica dos grãos de pólen
Em todas as secções examinadas, os grãos de pólen maduros das duas
formas florais apresentam citoplasma denso e grãos de amido evidentes (figuras
3.4A e B). Os núcleos apresentaram formato arredondado e nucléolo evidente , a
região em volta dos nucléolos apresenta uma coloração mais clara do que o
citoplasma, quando corada com azul de toluidina (figura 3.4B). Nos cortes
anatômicos a caracterização da esporoderme também foi confirmada, apresentando
uma ectexina fina e endexina espessa (figuras 3.4A e B).
3.4.5. Medições de amido em grãos de pólen
Os resultados de quantidade e área de grãos de amido medidos em secções
de pólen podem ser observados na tabela 3.1. As médias da área de cada grão de
94
amido e a da área de amido/µm
2
do grão de pólen são maiores para amostras
oriundas de flores do tipo brevistila quando comparadas com a de flores longistilas
(tabela 3.1). Ainda assim, o número de grãos de amido observados em área similar
do grão de pólen não se mostrou diferente entre as duas formas florais (p > 0,05 –
tabela 3.1).
3.4.6. Caracterização ultraestrutural dos grãos de pólen
Sob a visão ultraestrutural, os grãos de pólen de Psychotria nuda de ambas
as formas florais apresentam plastídios contendo grãos de amido; mitocôndrias;
vesículas de diversos tamanhos (figuras 3.4C e D); e aparelhos de Golgi (não
mostrado). O denso citoplasma observado na microscopia óptica mostra-se repleto
de ribossomos em microscopia eletrônica de transmissão. As subseqüentes
camadas, de dentro para fora, que constituem a esporoderme são: a intina, a
endexina, e a ectexina (figuras 3.4C e D). A ectexina apresenta-se descontínua,
enquanto a endexina e a intina cobrem continuamente todo o grão (figuras 3.4C e
D). As amostras apresentam uma camada de endexina mais fina do que a ectexina,
e ambas as camadas mostram-se homogêneas (figura 3.4C). A endexina apresenta-
se lamelada e possui grande espessura quando comparada às demais, enquanto a
intina é constituída por apenas uma camada delgada (figura 3.4C).
Nos grãos de pólen de P. nuda foi observada a presença de substâncias
elétron-translúcidas e elétron-densas permeando a estrutura da ectexina (figuras
3.4C e D). Estas substâncias são componentes do pollenkitt que fica depositado
sobre os grãos de pólen. Entretanto, estas substâncias não se mostraram presentes
de forma homogênea em todos os grãos estudados.
3.4.7. Perfis protéicos dos grãos de pólen
Os perfis protéicos obtidos através da eletroforese unidimensional em SDS-
PAGE apresentaram um grande número de bandas protéicas oriundas tanto de
grãos de pólen brevistila, quanto longistila. Diversas bandas parecem ser comuns ao
pólen de ambas as formas florais de P. nuda (figura 3.5). Os perfis protéicos
exibiram uma mistura de proteínas com massas moleculares que se distribuíram
entre cerca de 70 a 18 kDa, sendo que quatro proteínas se destacaram como
majoritárias em amostras de brevistila, com aproximadamente 38, 35, 21 e 19 kDa, e
cinco foram majoritárias em amostras de longistila, com aproximadamente 38, 35,
95
22, 20 e 19 kDa (figura 3.5). Apesar da baixa resolução oferecida pela técnica
aplicada, algumas bandas protéicas se mostram aparentemente exclusivas a apenas
uma das formas florais (figura 3.5) e outras parecem ser encontradas em ambas as
formas, no entanto, em concentrações diferentes. Não foram encontradas
glicoproteínas nos extratos protéicos do pólen de P. nuda.
As diferenças entre os perfis protéicos dos grãos de pólen das duas formas
florais se mostram ainda mais marcantes nas análises por eletroforese
bidimensional. Alguns spots de polipeptídeos que apresentam a mesma massa
molecular foram encontrados em diferentes valores de pI. Com isso, é possível dizer
que mais proteínas distintas foram observadas do que na análise da eletroforese
unidimensional. Os spots de proteínas encontrados em 36 e 19 kDa dos grãos de
pólen brevistila, e os de 36, 22 e 20 kDa de pólen longistila são exemplos de que as
referidas bandas na unidimensional são o conjunto de proteínas com diferentes pI.
As proteínas do pólen de longistila se apresentam distribuídas em uma faixa de pI
que se distribui entre 5,2 e 8,5, e as de brevistila estão distribuídas numa faixa mais
ampla de pI, cerca de 4,9 a 9,3 (figura 3.6). Vários spots protéicos são observados
em grãos de pólen de ambas as formas florais, como é o caso dos spots com ca. de
36 kDa com pI entre 5,0 a 6,8, por exemplo. Entretanto, outros spots que se
apresentaram intensamente corados foram encontrados em apenas uma das formas
florais, podemos citar como exemplo destas proteínas: os spots com ca. de 22 kDa e
pI de 5,7, e cerca de 20 kDa e pI de 6,5 em grãos do tipo longistila; e os cinco spots
de proteína localizados na faixa entre 16 e 19 kDa com pI entre 8,9 e 9,3 em
amostras de brevistila (figura 3.7). Através da investigação em eletroforese
bidimensional, foi observado um número maior de proteínas exclusivas a apenas
uma das formas florais (figura 3.6 e 3.7), do que através dos resultados obtidos a
partir da eletroforese unidimensional (fig. 3.5).
96
3.5. Discussão
Os grãos de pólen de Psychotria nuda, assim como o de diversas espécies
espécies heterostílicas apresentam características que diferenciam as duas formas
florais. Em adição ao tamanho, existem outras características da espécie que podem
ser relacionadas. Um exemplo disso, é a característica inaperturada dos grãos, que,
na subfamília Rubioideae, foi encontrada apenas em espécies heterostílicas
(Furness, 2007).
Nepi et al. (2001) sugeriram que a presença de parede delgada e a ausência
de aberturas no grão indicam que determinado o pólen apresenta-se parcialmente
hidratado quando maduro. Com isso, o transporte destes grãos da antera para o
estigma deve ser breve, evitando que o pólen resseque. O tamanho grande dos
grãos de pólen de Psychotria nuda, associado às demais características citadas, são
evidências que esses encontram-se parcialmente hidratados quando maduros.
Outras observações corroboram com a hipótese de que os grãos de pólen estão
parcialmente hidratados: a localização de P. nuda está associada a ambientes
úmidos e a floração desta espécie ocorre no final do período chuvoso do ano (Klein,
D. E. observação pessoal, Almeida e Alves, 2000). Conforme disposto no capítulo 1,
a formação de frutos através da polinização natural ocorre com sucesso neste
ambiente úmido, o que implica no sucesso do pólen sob esta condição. Contudo,
com as amostras disponíveis, não foi possível realizar um teste específico para a
verificação da hidratação dos grãos.
Em cada espécie de Angiospermae, o grão de pólen maduro pode se
apresentar de duas formas: bincelular ou tricelular. A presença de duas células em
ambos os tipos de grãos de P. nuda corrobora com o resultado encontrado para a
maior parte das espécies de Psychotria já estudadas (Puff, 1993). A variação na
quantidade de células nos grãos de pólen de cada espécie pode estar relacionada
ao tipo de estigma da espécie ou ao sistema de auto-incompatibilidade em questão.
Brewbaker (1957) encontrou uma associação entre os grãos bicelulares e o sistema
homomórfico gametofítico; e entre os tricelulares e os sistemas esporofíticos de
auto-incompatibilidade. Entretanto, exceções para a hipótese de que grãos
binucleados estão relacionados ao sistema esporofítico, foram encontradas em
gêneros com heterostilia. Lloyd e Webb (1992a) incluíram a condição bicelular dos
grãos de pólen de espécies heterostílicas como uma das razões pela qual o sistema
97
heteromórfico de auto-incompatibilidade não se originou do homomórfico
esporofítico, pois as espécies deste último sistema costumam apresentar grãos de
pólen tricelulares.
Por outro lado, o grão de pólen bicelular ocorre, normalmente, em espécies
com estigma do tipo úmido, enquanto o tricelular é mais facilmente encontrado em
espécies com estigma do tipo seco (Heslop-Harrison e Shivanna, 1977). Contudo,
este não é o caso de Psychotria nuda, pois os estigmas desta espécie são do tipo
seco (ver capítulo 2) e os grãos bicelulares. Esta classificação formulada por Heslop-
Harrison e Shivanna (1977) é apenas uma generalização para a qual os próprios
autores encontraram exceções. Esta classificação segue um raciocínio fisiológico
sob o qual os grãos de pólen teriam mais tempo para se desenvolver e sofrer a
segunda divisão mitótica em estigmas do tipo úmido.
A constituição química geral dos grãos de pólen, o número de células a
ultraestrutura e a aparência das anteras durante o desenvolvimento foram similares
para ambas as formas florais de P. nuda. Estes resultados indicam que alterações
na morfologia dos grãos de pólen das diferentes formas florais são específicas. As
diferenças entre os grãos de pólen de P. nuda das duas formas florais vão além da
variação do tamanho do grão. O tamanho dos grãos de pólen e três outras
características, que incluem escultura da exina, quantidade de amido e perfil
protéico, exibiram uma condição distinta para cada forma floral. Psychotria nuda, no
entanto, não apresentou variações na cor do pólen, como já foi observado em outras
espécies de Psychotria (Jung-Mendaçolli e Melhem, 1995) e em espécies de
Pentanisia (Massinga et al., 2005), outro gênero de Rubiaceae.
Quanto à morfologia externa e o tamanho dos grãos, Psychotria nuda exibiu
parâmetros similares aos encontrados para outros taxa da família. Existem diversos
relatos para Rubiaceae sobre tamanhos distintos dos grãos de pólen entre as duas
formas florais (por ex: Darwin, 1877; Bremekamp, 1963; Ornduff, 1970; Jung-
Mendaçolli e Melhem, 1995; Naiki e Nagamasu, 2003) e sobre variações na
escultura da exina (por ex: Ornduff, 1970; Jung-Mendaçolli e Melhem, 1995; Naiki e
Nagamasu, 2003). O resultado sobre o diâmetro dos grãos foi similar ao encontrado
para outra população de P. nuda, na Ilha Grande/RJ, para a qual já foi registrada a
variação de tamanho entre os grãos de pólen brevistilas e longistilas (Almeida,
2005).
A origem de todas as variações dimórficas em plantas distílicas já foi
98
associada à presença de um grupo de genes incluídos no mesmo alelo que também
inclui o loci que comanda o processo de auto-incompatibilidade (Lloyd e Webb,
1992a). A tênue diferença na escultura da exina das duas formas florais de P. nuda
pode ser o resultado de mais um gene encontrado no loci responsável pela
heterostilia, como foi proposto por diversos autores que trabalham com a heterostilia.
Entretanto, outra possibilidade é que esta diferença seja o resultado do dimorfismo
do tamanho do grão, conforme foi sugerido por Dulberger (1992). Como não foi
possível acompanhar as etapas de desenvolvimento do pólen das duas formas
florais, também não foi possível indicar se este desenvolvimento pode interferir para
a formação da escultura diferenciada da parede dos grãos. Em cortes ultrafinos, no
entanto, foi possível observar que a variação se refere apenas à organização da
escultura, pois a endexina e a intina lamelada se mostraram similares em grãos das
duas formas florais.
Em algumas espécies não-heterostílicas de Nyctaginaceae, que
apresentaram amido como reserva do pólen, foi detectada uma correlação positiva
entre o tamanho do pistilo e dos grãos de pólen (López et al., 2006). A explicação
destes autores para esta observação está relacionada ao fato de que os grãos de
pólen menores que um tamanho crítico não armazenaram amido suficiente para o
crescimento do tubo no pistilo. Seguindo esta idéia, a maior quantidade de amido
encontrada em grãos de pólen brevistilas de P. nuda está, provavelmente, associada
à formação de um tubo polínico compatível mais extenso do que o de longistilas.
O tipo de reserva encontrada no pólen de P. nuda corrobora com a hipótese
formulada por Baker e Baker (1979), de que espécies que não oferecem pólen como
um recurso, tendo aprodução de néctar, para esse fim, por exemplo, provavelmente
possuem reserva de amido no pólen. Contudo, além da forte marcação para o
amido, a coloração dos grãos de P. nuda com o reagente de Schiff e lugol não exclui
a interpretação de que existam outros carboidratos neutros, que podem estar
solúveis no protoplasto. Como citado anteriormente, é possível que os carboidratos
evidenciados sejam originados da quebra do amido. Em algumas espécies, as
reservas de amido acumuladas durante o desenvolvimento do pólen dão origem a
reservas de carboidratos solúveis na fase madura desta estrutura (Speranza et al.,
1997). Inclusive, a presença de sacarose, oriunda da quebra do amido, já foi
relacionada à proteção contra o dessecamento em grãos de pólen (Franchi et al.,
2002).
99
Em observações da ultraestrutura do grão de pólen de P. nuda foi encontrada
grande quantidade de vesículas contendo material não identificado. Como foi melhor
observado em tubos polínicos (ver o próximo capítulo), estas vesículas são
provavelmente originadas nos amiloplastos e devem conter material precursor da
parede celular do tubo polínico. É possível que estas vesículas tenham apresentado
reação positiva ao teste com o reagente de Schiff, entretanto, conforme citado
anteriormente, não podemos descartar a hipótese de que o denso citoplasma do
pólen possua carboidratos solúveis como já foi encontrado em outras espécies
(Speranza et al., 1997; Nepi et al., 2001).
Uma semelhança encontrada entre o pólen de brevistilas e longistilas foi a
presença de “pollenkitt” sobre os grãos maduros de ambas as formas florais. A
nomenclatura adotada para as substâncias sobre o pólen de Psychotria nuda, o
“pollenkitt”, segue a caracterização de Pacini e Hesse (2005). Estes autores
descrevem que a “tryphine” é formada apenas quando as células do tapete perdem
sua individualidade durante o estágio de micrósporo; enquanto o “pollenkitt” se forma
em estágios mais tardios. Apesar da dificuldade de se caracterizarem as amostras
de anteras jovens de P. nuda, foi possível observar que o tapete só foi
descaracterizado em estágios pré-antese.
A maior parte dos estudos sobre os grãos de pólen de espécies heterostílicas
está baseada em características morfológicas, o que resolve problemas taxonômicos
e, em alguns casos, de interação entre os grãos de pólen e os polinizadores, mas
não promove a elucidação de questões sobre o funcionamento do sistema
heteromórfico de auto-incompatibilidade. Entretanto, recentemente foi publicado um
estudo sobre proteínas do pólen de Lythrum salicaria (Lythraceae), uma espécie que
apresenta tristilia (Kalinowski et al., 2007). Neste estudo foram observados diversos
polipeptídeos característicos dos grãos de pólen de cada tipo de antera em cada
forma floral (cada forma floral de espécies tristílicas apresenta anteras posicionadas
em duas alturas diferentes, que não são equivalentes à altura do próprio estigma).
Contudo, através das avaliações realizadas não foi possível determinar o
envolvimento de qualquer molécula com o sistema heteromórfico de auto-
incompatibilidade de L. salicaria (Kalinowski et al., 2007).
Através de histoquímica foi possível confirmar a presença de proteínas nos
grãos de ambas as formas florais de Psychotria nuda. A avaliação sobre o perfil
protéico de grãos de pólen oriundo de flores brevistilas e longistilas indica a
100
existência de uma grande diversidade de polipeptídeos que são específicos para
apenas uma das duas formas florais. Não foram encontrados na literatura estudos
sobre o perfil protéico do pólen de espécies distílicas, de forma que não pudemos
comparar este resultado com o de outras espécies. Entretanto, alguns estudos sobre
perfis protéicos de outros órgãos florais de espécies distílicas indicaram que existem
proteínas exclusivas às diferentes formas florais (Wong et al., 1994; Athanasiou e
Shore, 1997; Khosravi et al., 2004; Miljuš-ðukić et al., 2004). No estudo sobre
proteínas solúveis obtidas a partir de Averroa carambola (Oxalidaceae) foi exibido
um número relativamente pequeno de polipeptídeos nos órgãos florais, quando
comparado a outras espécies não distílicas; contudo, foi registrada a presença de
uma proteína majoritária exclusiva do estilete de flores longistilas (Wong et al.,
1994). Em espécies do gênero Turnera (Turneraceae), foram encontradas proteínas
exclusivas no estilete de flores brevistilas, mas não em estiletes de longistilas
(Athanasiou e Shore, 1997). Uma das proteínas exclusivas do estilete de brevistila é
uma poligalacturonase, que, provavelmente, está relacionada aos eventos de auto-
incompatibilidade (Athanasiou et al., 2003). Em Piriqueta carolinea (Turneraceae),
no entanto, foi encontrada uma α-dioxigenase que está presente apenas no estilete
de flores longistilas, mas cuja função ainda não foi descoberta (Khosravi et al.,
2004). A investigação sobre Fagopyrum esculentum (Polygonaceae), diferente das
anteriores, foi realizada de forma a comparar os dois pistilos desta espécie após as
polinizações compatíveis e incompatíveis; através de análises em eletroforese
bidimensional, este estudo encontrou dois grupos de proteínas que estão
possivelmente envolvidas nas respostas de auto-incompatibilidade e um grupo em
longistila (Miljuš-ðukić et al., 2004). Diversas proteínas do pólen de Psychotria nuda,
apresentadas na eletroforese bidimensional, são específicas a cada forma floral. As
estruturas e funções destas proteínas, contudo, ainda permanecem desconhecidas.
Provavelmente, nem todas as proteínas exclusivas estão envolvidas diretamente nos
processos de auto-incompatibilidade. Este resultado é um forte indício de que esta
estrutura possui diferenças fisiológicas entre as formas florais.
Como foi indicado por Athanasiou e Shore (1997), ainda não se tem uma idéia
precisa de como ocorrem os mecanismos de incompatibilidade em nenhuma espécie
distílica. Dulberger (1992) formulou a hipótese de que entre espécies de diferentes
famílias botânicas devem ser encontrados mecanismos distintos de auto-
incompatibilidade heteromórfica. Sobre a porção protéica envolvida na reação de
101
auto-incompatibilidade, não é possível traçar uma comparação direta entre as
informações publicadas para outras espécies na literatura e os dados obtidos para
P. nuda, pois os enfoques utilizados nos estudos realizados até o momento são
diferentes. Contudo, o grande número de proteínas diferentes que foi encontrado
nesta espécie de Rubiaceae não foi encontrado durante as análises de pistilos de
outras espécies. Ainda assim, mais estudos são necessários para encontrar e
relacionar as proteínas responsáveis pelas respostas de auto-incompatibilidade e os
diferentes grupos taxonômicos que apresentam heterostilia.
102
3.6. Conclusões
• Os grãos de pólen de Psychotria nuda apresentam tamanho grande em
longistilas, e grande a muito grande em brevistilas; em ambas as formas florais o
formato dos grãos é esferoidal; estes não possuem aberturas, sua exina é
espiculada, desta forma apresentam semelhanças com outras espécies de
heterostílicas de Rubiaceae.
• Assim como outras espécies com o sistema heteromórfico de auto-
inconpatibilidade, ambas as formas florais apresentam grãos maduros
bicelulares;
• Os grãos de pólen das formas florais de P. nuda apresentam aspectos
dimórficos, além do tamanho, que incluem a ornamentação da exina, a
quantidade de amido (maior em grãos da forma brevistila) e o perfil protéico;
• A presença de amido nos grãos de pólen de P. nuda indica que este é o tipo de
reserva energética, podendo apresentar outros carboidratos neutros, e as
análises dos grãos de amido indicam que estes são mais acumulados em grãos
brevistilas;
• Os grãos de pólen maduros de P. nuda são bicelulares, mostrando assim,
aspecto similar a outras espécies do gênero e a espécies de outras famílias que
apresentam sistema heteromórfico de auto-incompatibilidade;
• Através da anatomia e da ultraestrutura é possível observar, nos protoplastos
dos grãos de pólen de P. nuda, citoplasma denso, amiloplastos, mitocôndrias,
vesículas de diversos tamanhos e aparelhos de Golgi, o que indica que esta
estrutura está capacitada para a formação do tubo polínico, ou seja, para o
cumprimento de sua função;
• Não foram encontradas glicoproteínas nos grãos de pólen de P. nuda, indicando
que o sistema de auto-incompatibilidade desta espécie provavelmente não
depende deste tipo de proteínas no pólen;
• Diversos polipeptídeos se apresentam exclusivamente em apenas uma das duas
formas florais, indicando uma possível ação de proteínas nos mecanismos de
auto-incompatibilidade do sistema heteromórfico da espécie.
103
Figura 3.1: Grãos de pólen de Psychotria nuda. (A) e (B) Microscopia eletrônica de
varredura da superfície dos grãos; (C) e (D) microscopia óptica, detalhe de um corte
óptico da parede do grão de pólen. (A) e (C) Oriundos de flores brevistilas; e (B) e
(D) longistilas. Legenda: ect – ectexina; end – endexina; in – intina; e seta – grânulos
da superfície. Barras: (A) e (B) 6 µm; (C) e (D) 10 µm.
104
Figura 3.2: Histoquímicas de grãos de pólen de Psychotria nuda. Microscopia óptica
– campo claro: (A) e (B) tratamento controle, sem coloração; (C) e (D) Coloração
com Coomassie; (E) e (F) Coloração com Lugol; (G) e (H) Coloração com reagente
de Schiff; e (I) e (J) coloração com Sudan IV. Microscopia de fluorescência: (K) e (L)
Marcação com DAPI. Grãos oriundos de flores (A), (C), (E), (G), (I) e (K) brevistilas;
e (B), (D), (F), (H), (J) e (L) longistilas. Legenda: seta – nucléolo. Barras: (A), (B),
(C), (D), (E), (F), (G), (H), (I) e (J) 20 µm; (K) e (L) 25 µm.
C
D
E
F
G
H
I
J
A
B
K
L
105
Figura 3.3: Microscopia óptica de anteras e grão de pólen de Psychotria nuda em
diferentes estágios de desenvolvimento. (A) antera jovem com micrósporos ainda
em tétrade; (B) estágio intermediário da antera com grãos de pólen individualizados,
e o tapete ainda presente; (C) Antera madura, onde já ocorreu a deiscência do
estômio; (D) Grão de pólen e detalhe dos estratos parietais da antera madura.
Legenda: Am – grão de amido CM – camada média; Co – conectivo; En – endotécio;
Ep – epiderme; Es – estômio; estrela – parede celular espessada do endotécio; GP
– grão de pólen; LA – lóculo da antera; Nu – núcleo; Ta – Tapete; Te – Tétrade.
Barras: (A) e (D) 20 µm; (B) 50 µm; (C) 100 µm.
106
Figura 3.4: Secções de grãos de pólen de Psychotria nuda. (A) e (B) Microscopia
óptica, cortes corados com azul de toluidina; (C) e (D) microscopia eletrônica de
transmissão da região da parede do grão. Grãos oriundos de flores (A) e (C)
brevistilas; e (B) e (D) longistilas. Legenda: am – grão de amido; ect – ectexina; end
– endexina; int – intina; mi – mitocôndria; PK – pollenkitt; ve – vesícula. Barras: (A) e
(B) 20 µm; (C) e (D) 0,5 µm.
A
B
C
D
int
int
end
end
ect
N
am
ve
PK
PK
ve
mi
am
ect
T
mi
am
am
end
ect
107
Tabela 3.1: Médias, desvios padrão, números amostrais (n) e análise de variância
(ANOVA) de dados obtidos através de medidas dos grãos de amido provenientes de
secções dos grãos de pólen de Psychotria nuda.
Média Desv. pad. n P (ANOVA)
Área (µm
2
) ocupada por amido em 1076 µm
2
de grãos de pólen brevistila
364,28 + 107,61 29
Área (µm
2
) ocupada por amido em 1076 µm
2
de grãos de pólen longistila
218,26 + 62,89 30 0,0000
Área (µm
2
) de cada grão de amido do pólen brevistila
2,82 + 0,920 29
Área (µm
2
) de cada grão de amido do pólen longistila
1,50 + 0,295 30 0,0000
Número de grãos de amido por µm
2
de grãos de pólen brevistila
0,066 + 0,035 29
Número de grãos de amido por µm
2
de grãos de pólen longistila
0,082 + 0,028 30 0,0677
Figura 3.5: Perfil protéico de grãos de pólen de Psychotria nuda em eletroforese
unidimensional. Legenda: A – amostra brevistila; B – amostra longistila; MM –
marcador molecular (kDa).
108
Figura 3.6: Perfis protéicos de grãos de pólen de Psychotria nuda em eletroforese
bidimensional. (A) Amostra brevistila; e (B) amostra longistila. Legenda: MM –
marcador molecular (kDa).
Figura 3.7: Representação gráfica dos spots protéicos observados em eletroforese
bidimensional de grãos de pólen de Psychotria nuda. Nesta representação estão
sobrepostos os spots de proteínas das duas formas florais, e as cabeças de seta
indicam alguns dos grupos de proteínas exclusivos a uma das formas florais.
Legenda: cabeça de seta e elipse pretas – amostra brevistila; cabeça de seta e
elipse cinza – amostra longistila; MM – marcador molecular (kDa).
109
III.4 Capítulo 4
Anatomia e ultraestrutura do eixo reprodutivo de Psychotria nuda:
interação pólen-pistilo
4.1. Introdução
O tubo polínico transporta o gameta masculino para o gameta feminino, sendo
esse um passo crucial no processo de formação de sementes (Hepler et al., 2001).
Contudo, para que essa ação seja finalizada, é necessário que o gameta masculino
atravesse diversos tecidos do pistilo. Para tanto, ao ser depositado no estigma, o
grão de pólen sofre uma dramática reorganização morfológica e celular, que culmina
na germinação e no crescimento do tubo polínico (Cheung, 1996). Ao germinar, os
grãos de pólen sofrem uma série de alterações bioquímicas, que incluem a
hidratação, um aumento na respiração celular, a utilização de substratos para o
alongamento do tubo polínico e a atividade de um metabolismo anabólico para
prover a célula de componentes para o crescimento (Sowa e Connor, 1995).
Para que estas e outras etapas ocorram, a reprodução sexuada das plantas é
controlada por um complexo sistema genético que regula os processos bioquímicos
e moleculares necessários para os eventos de interação celular envolvidos nesse
processo (Cheung, 1996). Com isso, o controle destas etapas inclui a produção de
moléculas que vão atuar no pistilo. As substâncias sobre a superfície receptora do
estigma, por exemplo, realizam diversas funções: capturar e reter o grão de pólen,
com suas propriedades adesivas; prover um meio para germinação do pólen;
reconhecer grãos de pólen compatíveis ou não; e auxiliar, por meio de ativação de
enzimas produzidas pelo pólen, a penetração da ponta do tubo polínico no estigma
(Heslop-Harrison e Heslop-Harrison, 1982a). A diversidade de moléculas presentes
no “pollenkitt” também possui extrema importância para o sistema molecular de
110
reconhecimento no estigma.
Após o reconhecimento inicial no estigma, normalmente, o gameta masculino
ainda tem que seguir um logo caminho até o gameta feminino. Até que o tubo
polínico alcance o saco embrionário, essa jornada ocorre na matriz extracelular dos
tecidos do pistilo (Cheung, 1995). Durante a sua formação e crescimento, o tubo
polínico sai de uma região ampla no estigma para uma área restrita que é o tecido
de transmissão no estilete. Ao entrar nesse tecido, o alongamento do tubo ocorre na
matriz extracelular das células de transmissão, quando o estilete é do tipo sólido; ou
seu crescimento se dá em meio à mucilagem se as células de transmissão formarem
um canal no estilete (Cheung, 1996; Richards, 1997). Com isso, o desempenho do
tubo polínico é influenciado tanto por características do próprio, quanto pelas
características do pistilo (Faivre, 2002).
A ultraestrutura da região distal do tubo polínico compatível com o pistilo
mostra características de uma célula com metabolismo bastante ativo para sustentar
o alongamento (Jensen e Fisher, 1969). O crescimento deste tubo, diferente da
maior parte das células de uma planta, é do tipo apical. Assim, todo o crescimento
celular está focado em uma única região especializada: o seu ápice. O processo do
crescimento apical aparenta ser bastante simples: os componentes necessários para
a adição de membrana plasmática e parede celular são levados à região apical e
são adicionados ao ápice celular através de vesículas secretoras, por meio do
processo de exocitose. Contudo, sob esta observação básica do processo, reside
um sistema complexo e dinâmico que inclui reciclagem de membrana, organização
polarizada do citoesqueleto e um gradiente de cálcio no citoplasma do ápice celular
(Cole e Fowler, 2006).
Outro aspecto importante sobre a estrutura do tubo polínico é a sua parede
celular. Esta parede, em geral, apresenta-se bipartida, com uma camada interna
constituída por calose e uma camada externa composta por pectinas, hemicelulose
e celulose. Na região apical, contudo, a parede de calose não costuma ser
observada (Taylor e Hepler, 1997). A parede destas células é formada através da
deposição dos materiais presentes nas vesículas do ápice celular, provavelmente
oriundos do complexo de Golgi, que contribuem como precursores da parede celular
(Heslop-Harrison e Heslop-Harrison, 1982b).
Durante uma reação de incompatibilidade entre pólen e pistilo, o tubo polínico
pode ter seu crescimento interrompido em qualquer região entre o estigma e o óvulo
111
(Cheung, 1995). O local de reação desta incompatibilidade pode estar relacionado
ao tipo de sistema em questão. Em uma polinização incompatível no sistema de
auto-incompatibilidade homomórfica gametofítica a forma mais freqüente é a reação
após a interação entre o tubo polínico e as células do tecido de transmissão, apesar
desta já ter sido observada no estigma e no ovário (Gibbs, 1986). O sítio de
incompatibilidade no sistema de auto-incompatibilidade homomórfica esporofítica é o
estigma. Neste sistema, os grãos de pólen incompatíveis podem gerar tubos
polínicos que logo terão seu crescimento interrompido, ou podem não ter sucesso na
etapa de germinação (Gibbs, 1986). Uma variedade de respostas que levam à
incompatibilidade foi encontrada em espécies heterostílicas, incluindo falhas na
adesão, na hidratação ou na germinação do pólen e na inabilidade do tubo em
penetrar o estigma, e ainda o fim do seu crescimento no estilete ou ovário (revisado
por Barrett e Cruzan, 1994). Além disso, conforme apresentado por Dulberger
(1992), algumas famílias que possuem sistema heteromórfico de auto-
incompatibilidade podem possuir variação nos sítios de incompatibilidade dos tubos
polínicos entre as formas florais. A família Rubiaceae está incluída neste grupo, pois
compreende diversas espécies em que o local da reação de incompatibilidade
ocorre no estigma de pistilos brevistila e em regiões do estilete de longistila (Bawa e
Beach, 1983; Faivre, 2002; Pereira et al., 2006).
Em geral, no sistema de auto-incompatibilidade homomórfico gametofítico, a
taxa de crescimento do tubo polínico incompatível dentro do estilete começa a
diminuir até que, eventualmente, cessa. A partir disso, a ponta desse tubo
freqüentemente estoura e ocorre a lise do conteúdo citoplasmático (Bell, 1995).
Geitmann et al. (2000) mostraram resultados drásticos sobre a organização do
citoesqueleto durante a exposição, in vitro, de tubos polínicos às proteínas S1 e S3
incompatíveis em Papaver rhoeas (Papaveraceae), uma espécie com auto-
incompatibilidade homomórfica gametofítica. Esses autores verificaram que a
organização dos filamentos de actina foi desfeita, impedindo o crescimento do tubo
polínico. Em espécies com auto-incompatibilidade homomórica esporofítica, durante
a germinação do grão de pólen e produção do tubo polínico incompatível no
estigma, a ponta do tubo pode provocar a formação de um bloco de calose na
parede da célula estigmática e o resultado líquido dos eventos de encontro com o
estigma é uma polinização ineficaz (Bell, 1995; Franklin et al., 1995).
Em comparação com as observações para outros sistemas, poucos relatos
112
foram feitos sobre a morfologia do tubo polínico incompatível em espécies
heterostílicas. Em geral, os trabalhos na área se referem apenas ao local onde a
resposta de incompatibilidade ocorre. Como, por exemplo, dois trabalhos que
descrevem a formação de tubos polínicos em pistilos de P. nuda (Castro e Araújo,
2004; Pereira et al., 2006). As poucas exceções são os trabalhos de Shivanna et al.
(1981), Bawa e Beach (1983), Anderson e Barrett (1986), Scribailo e Barrett (1991) e
Tamari et al. (2001).
Em algumas espécies de Rubiaceae os tubos polínicos formados através da
autopolinização em longistilas possuem um diâmetro menor e são menos marcados
para calose do que os observados em brevistilas (Bawa e Beach, 1983). As
observações sobre tubos polínicos incompatíveis em Primula vulgaris (Primulaceae)
mostraram que, quando o pólen consegue formar os tubos, estes crescem de forma
desordenada no estigma, diferente dos compatíveis (Shivanna et al., 1981). Alguns
tubos polínicos incompatíveis nas espécies com tristilia, Pontederia cordata e P.
sagittata (Pontederiaceae), também podem possuir crescimento aberrante, porém,
parte dos tubos oriundos de polinizações ilegítimas apresenta morfologia
semelhante aos compatíveis (Anderson e Barrett, 1986; Scribailo e Barrett, 1991).
Em P. cordata, freqüentemente, tubos polínicos incompatíveis apresentaram-se
dilatados e espiralados, na base do estigma (Anderson e Barrett, 1986). Durante o
evento em espécies dos gêneros Turnera e Piriqueta (Turneraceae), foram
observadas diferenças entre os tubos polínicos nos pistilos autopolinizados de
brevistilas e longistilas. Enquanto os primeiros não apresentaram tampões de calose
e possuíam aparência de que haviam estourado, os tubos de longistila apresentaram
tampões de calose, e não houve evidência de ruptura (Tamari et al., 2001). Estas
observações apontam para uma diversidade nas respostas de incompatibilidade e
para as lacunas de conhecimento sobre o sistema heteromórfico de auto-
incompatibilidade.
Os sistemas de auto-incompatibilidade em Angiospermae baseiam-se no
reconhecimento célula-célula de duas gerações – esporofítica e gametofítica – o que
pode levar ao isolamento da geração invasora (Bell, 1995). Para entender
mecanismos aos quais pertencem as compatibilidades ou incompatibilidades dessas
interações é preciso identificar moléculas de reconhecimento e seus mecanismos de
funcionamento (Cheung, 1996). Diversos aspectos a respeito da interação molecular
durante processos de auto-incompatibilidade têm sido descritos. Entretanto, pouco é
113
conhecido sobre esse tópico para espécies com sistema heteromórfico de auto-
incompatibilidade (Matsui et al., 2007).
Conforme relacionado na introdução geral e no capítulo 3, alguns estudos já
foram realizados para a detecção de proteínas específicas de pistilos de longistilas e
brevistilas (Gosh e Shivanna, 1980; Shivanna et al., 1981; Stevens e Murray 1982;
Wong et al., 1994; Athanasiou e Shore, 1997; Athanasiou et al., 2003; Khosravi et
al., 2003; Khosravi et al., 2004; Miljuš-ðukić et al., 2004; Tamari e Shore, 2006).
Entretanto, poucos progressos foram obtidos para o entendimento do sistema
heteromórfico de auto-incompatibilidade (Tamari e Shore, 2006). Estes trabalhos
podem ser separados em dois grupos: (1) os que investigaram as proteínas antes do
evento da polinização (Gosh e Shivanna, 1980; Shivanna et al., 1981; Stevens e
Murray, 1982; Wong et al., 1994; Athanasiou e Shore, 1997; Athanasiou et al., 2003;
Khosravi et al., 2003; Khosravi et al., 2004; Tamari e Shore 2006); e (2) o que
analisou pistilos polinizados (Miljuš-ðukić et al., 2004).
A comparação entre a morfologia polínica diferenciada e a presença de
proteínas exclusivas a uma das formas florais em Turnera serviu de subsídios para
que Tamari et al. (2001) sugerissem que cada forma floral possui um mecanismo
diferente de resposta de incompatibilidade. Chegando a essa mesma conclusão, o
trabalho sobre a detecção de proteínas após as polinizações compatíveis e
incompatíveis nas duas formas florais de Fagopyrum esculentum (Polygonaceae),
identificou alguns grupos de proteínas produzidas em reações de incompatibilidade,
que são diferenciados entre brevistilas e longistilas (Miljuš-ðukić et al., 2004).
114
4.2. Objetivos
Neste capítulo foram investigados aspectos estruturais e bioquímicos da
interação entre as células do pistilo e do pólen em Psychotria nuda. As condições
das estruturas do pistilo e pólen, prévias à interação, já foram relatadas nos
capítulos 2 e 3, respectivamente. Os objetivos específicos enfocados foram:
- Caracterizar as células do estigma e dos grãos de pólen, após a polinização
compatível e incompatível em cada forma floral;
- Observar o crescimento dos tubos polínicos compatíveis e incompatíveis nos
pistilos brevistilas e longistilas, em diferentes tempos após a polinização;
- Comparar a morfologia dos tubos polínicos compatíveis e incompatíveis nos
pistilos das duas formas florais;
- Verificar a permeabilidade dos diferentes tubos polínicos;
- Visualizar a anatomia e ultraestrutura de diferentes regiões dos tubos
polínicos compatíveis e incompatíveis, em cada forma floral;
- Determinar e comparar, através de eletroforese unidimensional, o perfil
protéico dos pistilos de flores brevistilas e longistilas não polinizadas e após as
diferentes polinizações.
115
4.3. Material e métodos
4.3.1. Polinizações manuais
Para a obtenção de resultados foram considerados quatro tratamentos de
polinização manual: (1) pólen brevistila X pistilo longistila, (2) pólen longistila X pistilo
brevistila (tratamentos compatíveis), (3) pólen brevistila X pistilo brevistila e (4) pólen
longistila X pistilo longistila (tratamentos incompatíveis). Para realizar os tratamentos
de polinização manual, inflorescências de plantas localizadas na Floresta da Tijuca,
contendo ao menos um botão floral em pré-antese, foram isoladas em bolsas de filó.
As polinizações manuais foram realizadas através do contato de uma antera
deiscente ou de grandes quantidades de pólen recentemente e delicadamente
extraídas com uma pinça com o estigma de uma flor recentemente aberta. As
polinizações manuais foram efetuadas conforme o descrito no capítulo 1 (item
1.3.5.). Após a polinização, as flores foram coletadas e mantidas em gel de ágar 2,5
%, até o momento da fixação.
4.3.2. Visualização do crescimento dos tubos polínicos in vivo
Pistilos polinizados de P. nuda foram fixados em álcool 70 %. A fixação foi
feita em dois momentos diferentes, 8 e 12 horas após as polinizações citadas no
item 4.3.1. Todos os materiais permaneceram pelo menos 24 horas no fixador. Em
seguida, cada amostra foi lavada em água corrente, sendo posteriormente exposta a
hidróxido de sódio 4 N, que é uma solução de clareamento, por 30 minutos. Após o
clareamento, as amostras foram lavadas em água destilada e, por fim, cada pistilo
foi posicionado em uma lâmina, contendo duas gotas de corante azul de anilina 0,1
% (Currier, 1957), em fosfato de potássio monobásico 0,8 M. As lamínulas foram
posicionadas sobre cada amostra, de forma a esmagar os pistilos e, em seguida, o
material foi observado por microscopia de fluorescência (Kearns e Inouye, 1993).
Foram utilizados os microscópios: B50 OLYMPUS, associado ao filtro WU (filtro de
excitação: 330 – 385 nm e filtro de emissão: 420nm) e Axioplan Zeiss com filtro para
DAPI (filtro de excitação: 330 – 385 nm e filtro de emissão: 420nm). As imagens
foram obtidas através de câmera fotográfica (B50 OLYMPUS), de câmeras digitais e
dos softwares Image PróPlus
®
(B50 OLYMPUS) e AnalySIS
®
(Axioplan ZEISS).
116
4.3.3. Análise da permeabilidade dos tubos polínicos in vivo
Pistilos de Psychotria nuda foram expostos ao traçador celular Lucyfer yellow,
40 minutos após as polinizações. Para tal, os pistilos foram separados das flores,
sendo seccionada apenas a região basal do estilete, e, imediatamente, posicionados
em tubos de 0,5 mL contendo solução de Lucyfer yellow 0,1 % suficiente para cobrir
2/3 do estilete. Os estigmas permaneceram sem contato com o traçador celular, de
forma que a possível entrada desta substância nos tubos polínicos só pudesse ser
proveniente dos tecidos do estilete. A exposição a esta solução durou 30 minutos no
escuro, e ao fim deste tempo os pistilos foram brevemente lavados em água
destilada e posicionados sobre lâminas contendo glicerina 50 %. As amostras foram
cobertas por lamínulas e examinadas por microscopia confocal de varredura a laser
– CSLM ZEISS.
4.3.4. Anatomia e ultraestrutura do estigma e dos tubos polínicos in vivo
Pistilos de Psychotria nuda foram fixados por 2 horas em uma solução do
fixador de Karnovsky (1965) modificado, contendo 2,5 % de glutaraldeído e 4,0 % de
paraformaldeído, e tampão cacodilato de sódio 0,05 M em pH 7,2, 40 minutos após
as polinizações citadas no item 4.3.1. As amostras foram seccionadas no fixador e
cada região, do estigma à base do estilete, foi identificada. Subseqüentemente, as
amostras foram lavadas três vezes em tampão e pós-fixadas por 2 horas em
temperatura ambiente com tetróxido de ósmio 1,0 % em tampão cacodilato de sódio
0,05 M, em pH 7,2. Os pistilos polinizados foram, então, desidratados em uma série
gradual de soluções de acetona (30, 50, 70, 90 e 100 %; por uma hora cada etapa).
O material desidratado foi infiltrado e embebido em resina epoxy (Polybed). Secções
semi-finas (1,0 µm) foram obtidas em um ultramicrótomo Reichert ultracut e coradas
com azul de toluidina 0,1 % em solução aquosa contendo bórax 0,1 %. As lâminas
foram seladas com Entellan
®
e examinadas em um microscópio Axioplan ZEISS.
Para a observação em microscopia eletrônica de transmissão, secções ultra-
finas (ca. de 70 nm), obtidas em um ultramicrótomo Reichert ultracut, foram
coletadas em grades de cobre de 300 mesh. Estas grades com cortes foram
expostas por 40 minutos a uma solução de 1,0 % de acetato de uranila e,
posteriormente, a uma solução de 5,0 % de citrato de chumbo por 5 minutos para a
contrastação de rotina. As secções foram observadas no microscópio eletrônico de
transmissão (ZEISS EM 900) em 50 kV.
117
4.3.5. Perfil protéico dos pistilos polinizados e não polinizados
Para a análise dos perfis protéicos foram utilizados pistilos não polinizados e
polinizados de acordo com o método descrito no item 4.3.1., com apenas uma
diferença, os pistilos só foram polinizados após a colocação das flores no ágar e
foram congelados 3 horas após a polinização. Todos os pistilios foram armazenados
em freezer a - 70°C. Um conjunto de oito pistilos para cada t ratamento (tanto os
polinizados, quanto os não polinizados) foi esmagado e reduzido a pó dentro de um
graal, na presença de nitrogênio líqüido, com o auxílio de um pistilo apropriado. Para
extração protéica a frio, foram efetuados dois métodos diferentes; o primeiro foi
realizado apenas com pistilos não polinizados e o segundo com todos os tipos de
amostras.
Em ambos os métodos utilizados, foram misturados 400 µL de uma solução
tampão contendo Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0 e PMSF 1 µM às amostras maceradas, que
permaneceram sob agitação por 4 horas, a temperatura de 4° C. As amostras foram
centrifugadas a 14.000 g por 5 minutos, a 4° C. Par a o primeiro método, 30 µL do
sobrenadante de cada amostra, logo após a extração à frio, foram misturados a 10
µL de tampão de amostra (Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, contendo 10 % SDS, 5 %
sacarose e 0,001 % de azul de bromofenol).
Para o segundo método, após a centrifugação, os sedimentos foram
descartados, os sobrenadantes foram aproveitados e dessalinizados através de
filtração em gel em uma coluna cromatográfica do tipo Sephadex G-10 (coluna de
1,0 x 15 cm). A coluna foi equilibrada e desenvolvida com tampão Tris-HCl 0,1 M, pH
8,0. O conteúdo de proteínas solúveis totais foi determinado de acordo com o
método de Bradford (1976) e BSA foi utilizado como padrão. Frações contendo o
primeiro pico cromatográfico de proteínas de cada amostra foram reunidas e,
posteriormente, aliquotadas de forma a obter três alíquotas de 1 mL para cada tipo
de amostra. As alíquotas foram conservadas em freezer a – 20° C. As amostras
utilizadas em seguida foram aproveitadas após a liofilização das alíquotas. Cada
material liofilizado foi solubilizado em uma mistura contendo 29 µL de tampão Tris-
HCl (100 mM, pH 8,0), 10 µL do mesmo tampão de amostra descrito para o primeiro
método, acrescentando, ainda, 0,01 % de β-mercaptoetanol.
Para os dois métodos, cada uma das soluções obtidas após a mistura ao
tampão de amostra foi aquecida a 100 °C, centrifuga da a 14000 g por 5 minutos e
118
submetida à corrida eletroforética. Durante a análise unidimensional as proteínas
foram separadas de acordo com a massa molecular. Géis de poliacrilamida (SDS-
PAGE) foram construídos conforme descrito por Laemmli (1970). Para comparação
e determinação das massas moleculares, foi utilizado um marcador molecular
contendo proteínas de massas moleculares conhecidas. As corridas eletroforéticas
foram realizadas em um sistema vertical para eletroforese (Bio-Rad) sob voltagem
constante de 100 V. As bandas protéicas foram visualizadas após a precipitação
com prata, de acordo com o método descrito por Morrissey (1981).
Parte dos géis obtidos através do segundo método foi utilizada, após a corrida
eletroforética, para a visualização de glicoproteínas. A coloração destes géis foi
realizada de acordo com o protocolo que acompanha o kit para detecção de
glicoproteínas (Glycoprotein Detection Kit, Glyco Pro, Sigma, Saint Louis, Missouri,
USA).
Devido à dificuldade de equalizar a quantidade de proteínas nas amostras
aplicadas ao gel, o software Gel Perfect
(Bozzo e Retamal, 1991; Retamal et al.,
1999) foi utilizado para inferir por densitometria a quantidade relativa de proteínas.
Como todos os perfis protéicos apresentavam a mesma banda majoritária, o perfil
que apresentou a maior densidade desta proteína foi considerado como
apresentando concentração de 100 % desta proteína. A partir deste perfil e desta
banda, a porcentagem de expressão de outras bandas deste e dos outros perfis
foram calculadas. A partir desse software também foram estimadas as massas
moleculares das bandas protéicas das amostras, de acordo com um cálculo
baseado na mobilidade relativa dos marcadores moleculares.
119
4.4. Resultados
Em Psychotria nuda foram observadas diferenças na interação pólen-pistilo
entre os tratamentos incompatíveis e os tratamentos compatíveis. Diferenças
também foram encontradas nos tubos polínicos após as polinizações incompatíveis
em flores brevistilas e em longistilas. Houve apenas uma diferença entre os
tratamentos compatíveis das duas formas florais, estando esta diferença relacionada
ao tempo de chegada dos tubos polínicos ao ovário.
4.4.1. Interação entre células do estigma e os grãos de pólen
A interação entre os grãos de pólen e as células do estigma de P. nuda
provocou algumas alterações em ambas as estruturas. As observações descritas a
seguir foram encontradas em todas as distintas situações de polinização, nas
interações compatíveis ou incompatíveis, em flores brevistilas ou em longistilas.
Os grãos de pólen apresentaram pollenkitt aderido à sua parede mesmo
depois do contato dos grãos com o estigma (figuras 4.1A e 4.1B). O citoplasma do
grão de pólen permaneceu denso na maior parte das amostras, mesmo depois do
tubo polínico já ter se expandido (figura 4.1B e 4.1C). Os grãos de pólen sobre o
estigma, que apresentam tubo polínico (figura 4.1C), possuem menos grãos de
amido do que os grãos de pólen maduros presentes na antera (observados no
capítulo 3).
Uma parte das células estigmáticas apresentou-se deformada após todos os
tipos de polinização, tanto as que estavam em contato direto com grãos de pólen,
quanto outras, que se apresentavam mais distantes dos locais de interação. Apesar
disso, muitas das células que não haviam entrado em contato com os grãos
apresentaram-se túrgidas e sem deformações. No caso das células em contato
direto com os grãos foi possível visualizar que a parede periclinal onde se
estabeleceu o contato apresenta-se moldada pela exina (figura 4.1D). Desta forma,
a parede assumiu um formato com re-entrâncias que se encaixam a ornamentação
da parede do pólen e um aspecto menos organizado, do que o apresentado antes
do contato com o pólen. O protoplasma das células do estigma apresentou um
grande vacúolo, apenas uma pequena faixa de citoplasma e poucas organelas,
mitocôndrias e retículo endoplasmático, antes da interação com o pólen.
Posteriormente à polinização, o citoplasma das células deformadas apresentou-se
120
menos organizado e foram observadas estruturas em processo de degradação
(figura 4.1B).
4.4.2. Crescimento dos tubos polínicos
Foram observados tubos polínicos provenientes de grãos de pólen brevistilas
e longistilas, tanto em tratamentos compatíveis quanto em incompatíveis. Em geral,
foi mais difícil visualizar tubos polínicos nos tratamentos de polinização em que o
pólen em questão era do tipo longistila, tanto em polinizações compatíveis, quanto
em incompatíveis.
Através da marcação para a calose, foi possível distinguir os tubos polínicos
que cresceram por entre as células do tecido de transmissão nos pistilos de
Psychotria nuda (figura 4.2). Os tubos polínicos apresentaram diferentes taxas de
crescimento quando as polinizações compatíveis e incompatíveis foram comparadas
e, também, entre as formas florais longistilas e brevistilas. Tubos polínicos em
polinizações compatíveis de pistilos longistilas atingiram a região do ovário oito
horas após a polinização; enquanto, em pistilos brevistila, foi observada uma
variação, pois nem todas as flores examinadas apresentaram tubos polínicos na
região do ovário oito horas depois da deposição do pólen (tabela 4.1). Todas as
flores expostas ao pólen compatível apresentaram tubos polínicos chegando até a
região do ovário 12 horas após a polinização. Os tubos polínicos compatíveis
apresentaram tampões de calose ao longo de sua estrutura. Tais tampões
apresentaram formatos variados, apresentando comprimento maior que a largura, ou
largura similar ao comprimento, com regiões mais finas e outras mais espessas, ou
ainda sem distinção de espessura entre regiões do tampão, tanto em pistilos
brevistilas, quanto em longistilas (figuras 4.2A a D).
Os tubos polínicos oriundos de polinizações incompatíveis apresentaram seu
crescimento interrompido em diversas regiões do pistilo. Os locais onde foram
observadas as interrupções do crescimento dos tubos polínicos mostraram-se
diferentes entre as duas formas florais, apesar da maior parte dos tubos polínicos ter
sido rejeitada na região do estigma (tabela 4.1). A maior parte dos tubos
provenientes de tratamentos incompatíveis não apresentou tampões de calose
(figura 4.2E e F). Contudo, mesmo com esta característica em comum, o ápice dos
tubos polínicos incompatíveis apresentou diferentes morfologias em flores longistilas
e brevistilas. A região apical destas células em brevistilas mostrou, em geral,
121
aparência inchada, com evidenciada deposição de calose (figura 4.2E) e, na maior
parte das longistilas, esta região apresentou-se mais afilada e pouco marcada para
calose (figura 4.2F).
4.4.3. Diferenças celulares entre os tubos compatíveis e incompatíveis
brevistilas e longistilas
A permeabilidade dos tubos polínicos de Psychotria nuda em pistilos mostrou-
se diferenciada em uma das condições estudadas. Os tubos compatíveis das duas
formas florais (exemplo de pistilo de longistila: figuras 4.3A e 4.3B) e os
incompatíveis de pistilos longistilas (figura 4.3C) não apresentaram permeabilidade
ao traçador celular utilizado (lucyfer yellow). O mesmo não foi observado para os
tubos incompatíveis de brevistilas, que se mostraram corados pelo lucyfer yellow
(figura 4.3D) após a exposição da base do estilete a esse corante. Este resultado
indica que a morfologia inchada do ápice do tubo polínico foi acompanhada pelo
rompimento desta estrutura.
Em cortes anatômicos, os tubos polínicos compatíveis que ainda não haviam
chegado ao ovário (amostras fixadas 40 minutos após a polinização) apresentam
duas regiões com o citoplasma diferenciado. A mais extensa foi a região que se
encontra próxima ao grão de pólen e distante do ápice do tubo polínico. Nesta
região, o citoplasma se mostra menos denso do que o observado no grão de pólen,
além disso, são encontrados grandes vacúolos (figuras 4.4A a 4.4C). Esta região
incluiu, em algumas amostras, uma área do fragmento do tubo na região mais
próxima do ápice, que já estava selada pelo tampão de calose (figura 4.4D). A outra
região, a que inclui o ápice do tubo polínico, apresentou protoplasma semelhante ao
encontrado no grão de pólen (figuras 4.4D e 4.4E). A forma do tubo polínico se
mostrou variável em corte transversal, se mostrando mais arredondado ou mais
achatado, mas nenhuma região foi encontrada inchada. Estes resultados foram
similares para ambas as formas florais.
A ultraestrutura dos tubos compatíveis se mostrou similar para as duas
formas florais. Na observação da região caracterizada anatomicamente pela
presença de vacúolos não foi encontrado tonoplasto (figura 4.5A). Nesta região, a
área central da célula apresentou-se menos densa do que a área próxima à parede
celular, ainda assim, foram observados materiais eletrondensos dispersos pela
célula (figura 4.5A). Em todas as regiões do tubo polínico foram encontradas
122
organelas intactas, mas na região mais próxima ao grão de pólen também foram
observadas organelas parcialmente degradadas. Nesta primeira parte do tubo foram
visualizados: poucos amiloplastos, complexos de Golgi, mitocôndrias, e diversas
vesículas pequenas e grandes (figuras 4.5B e 4.5C), como as encontradas nos
grãos de pólen (capítulo 3). A parede celular do tubo polínico apresentou uma
camada interna eletronluscente bem definida e uma região conseguinte a essa,
constituída por uma matriz lamelada e eletrondensa (figura 4.5B). Estas duas
camadas da parede puderam ser observadas com nitidez desde o grão de pólen até
as regiões anteriores ao ápice celular. Próximo aos grãos de pólen, foi possível
observar que a camada interna e a externa da parede do tubo são contínuas à intina
e à endexina, respectivamente. Contudo, quando o tubo está no tecido de
transmissão ficou mais difícil determinar a origem da camada mais eletrondensa, se
essa é oriunda apenas do tubo polínico ou se também pode ser formada pela união
com a lamela média do tecido de transmissão (figura 4.5D).
Na região apical do tubo polínico (figuras 4.5D), o citoplasma apresentou-se
muito semelhante ao encontrado nos grãos de pólen (capítulo 3), possuindo uma
grande quantidade das organelas relacionadas anteriormente. Algumas diferenças
entre o ápice do tubo e o resto dessa estrutura devem ser ressaltadas: os
amiloplastos na primeira região contêm grãos de amido aparentemente intactos
(figuras 4.5D), enquanto o amido nas regiões anteriores estava em processo de
degradação (figuras 4.5C); as vesículas maiores observadas no ápice exibem um
conteúdo mais eletrondenso (figuras 4.5D) do que o observado nas vesículas
maiores de outras regiões do tubo (figuras 4.5B). Além disso, as vesículas maiores
com conteúdo menos denso possuem algum tipo de cobertura; o mesmo não foi
observado para as vesículas do ápice do tubo. Durante a análise das amostras
foram observadas diversas imagens sobre as quais foi possível sugerir a fusão das
diferentes vesículas com a membrana plasmática do tubo. Esta possível fusão foi
observada tanto nas regiões apical, quanto nas anteriores ao ápice celular. As
vesículas cobertas contendo conteúdo menos eletrondenso apresentaram, também,
algum tipo de relação com os amiloplastos degradados. Na região apical, a parede
celular do tubo polínico mostrou-se menos evidente, não sendo possível distinguir a
camada interna que foi encontrada nas outras regiões (figuras 4.5D).
Os tubos polínicos incompatíveis se apresentaram diferentes não apenas
entre as duas formas florais, mas também houve variação nos aspectos anatômicos
123
nas amostras obtidas de cada forma floral. Grande parte dos tubos polínicos
brevistilas apresentou o protoplasma semelhante ao observado nos grãos de pólen
(figuras 4.6A a 4.6C), em toda a sua extensão. Entretanto, alguns tubos
apresentaram menor quantidade de grãos de amido e, também, um citoplasma
menos denso na região mais próxima ao grão de pólen (figura 4.6D). Ainda assim,
os tubos examinados possuem a região apical deformada, que foi exibida mais
alargada do que o resto do tubo (figuras 4.6A e 4.6B) e, em algumas amostras,
apresentou-se subdividida (figura 4.6C). Em tratamentos incompatíveis de brevistila
foram visualizadas regiões em que o protoplasma do pólen não se encontrou
cercado por parede celular, tanto entre as células do estigma, quanto entre células
do tecido de transmissão (figura 4.6B).
Uma parte dos tubos incompatíveis em pistilos longistila apresentou aspecto
semelhante ao visualizado em tubos compatíveis na região distante do ápice. Ou
seja, o citoplasma apresentou-se pouco denso (figuras 4.6E e F) e algumas regiões
do protoplasma se encontraram mais coradas (figura 4.6E). As principais diferenças
anatômicas, entre estes tubos e os compatíveis, residem no fato de que nos
incompatíveis não houve tampões de calose, nem variações entre o protoplasma da
extensão do tubo e o da área que se encontra mais próxima ao ápice. Nestes casos,
os grãos de pólen associados aos tubos incompatíveis exibiram o protoplasma
semelhante ao do tubo (figura 4.6F). Em outras amostras (dado não mostrado) os
grãos de pólen e o início do tubo possuíram um aspecto semelhante ao observado
nos grãos de pólen antes da polinização e em grande parte dos tubos incompatíveis
de brevistilas (figura 4.6D). Regiões dos tubos polínicos mais distantes do grão, no
entanto, apresentaram um aspecto diferenciado. As células encontraram-se mais
vacuolizadas, apresentando distância entre o citoplasma e a parede celular (figuras
4.6G e 4.6H).
Em microscopia eletrônica de transmissão, os tubos polínicos incompatíveis
apresentaram outros aspectos exclusivos a cada forma floral. Em brevistilas foi
possível observar que as regiões que apresentaram protoplasma denso em cortes
anatômicos, e que se encontravam mais distantes do ápice, apresentaram aspectos
celulares similares às regiões de protoplasma denso dos tubos compatíveis (figura
4.7A). Nestas regiões foram encontradas as mesmas organelas descritas para o
tubo compatível. Em diversas regiões, algumas vesículas pareciam estar se
fundindo à membrana plasmática e liberando seu conteúdo para a parede celular
124
(figura 4.7A). A parede celular dos tubos incompatíveis de brevistila também
apresentou duas camadas em regiões mais distantes do ápice (figura 4.7A), a
interna eletroluscente e contínua à intina; e a externa mais eletrondensa e contínua
à endexina.
Os tubos incompatíveis de brevistila que apresentaram regiões de
protoplasma menos denso exibiram aspectos de sua ultraestrutura diferentes dos
observados na mesma região de tubos compatíveis. Nesta situação o citoplasma
estava disposto em todas as regiões do protoplasma (figura 4.7B), e não apenas
próximo às paredes celulares. Diversos corpúsculos não identificados foram
encontrados nesta região. Alguns destes corpúsculos parecem ter sido originados
através da degradação de amiloplastos e outros através da união de vesículas
(figura 4.7B). Nesta região foram visualizadas diversas organelas deformadas (figura
4.7C).
A região apical dos tubos polínicos incompatíveis de brevistila apresentou,
também, a ultraestrutura diferenciada dos tubos compatíveis. Em regiões bem
próximas ao ápice do tubo polínico, a parede celular apresentou rupturas e parte do
protoplasma foi extravasada para os espaços intercelulares do tecido de
transmissão (figura 4.7D a 4.7F). Nestas regiões de protoplasma extravasado, foi
observada a fusão de muitas vesículas com conteúdo eletrondenso (figura 4.7D e
4.7F). Tal união de vesículas sugere a formação de uma parede celular que
encapsula parte do protoplasma (figura 4.7D). Contudo, a deposição de vesículas
sobre esta “nova parede celular” parece ocorrer tanto de dentro do protoplasma por
esta encapsulado, quanto por fora, através da deposição de vesículas presentes no
protoplasma extravasado (figura 4.7D e 4.7F). Em algumas regiões, foi observada
uma interação entre o protoplasma extravasado de tubos polínicos incompatíveis e a
matriz extracelular nos espaços intercelulares do tecido de transmissão (figura 4.7E).
Nestas regiões algumas vesículas do protoplasma do pólen foram observadas em
aparente fusão com a lamela média (figura 4.7E). Sobre as vesículas envolvidas
nesta fusão se faz necessário fazer uma ressalva; não foi observada membrana,
apesar de o conteúdo eletrondenso estar fortemente compactado. Os amiloplastos,
nas áreas em que a região apical do tubo estava intacta, apresentaram o amido com
aparência não degradada (figura 4.7A), mas estes se mostraram em início de
degradação quando próximos ao ápice celular rompido (figura 4.7D e 4.7E).
Conforme citado anteriormente, apenas alguns tubos polínicos incompatíveis
125
de longistila apresentaram citoplasma denso, sendo essa característica exclusiva da
região do tubo mais próxima ao grão de pólen. Foi observada uma grande
semelhança entre o protoplasma dessas células e o protoplasma do mesmo local de
tubos brevistila incompatíveis que apresentaram citoplasma denso. Também foi
notada a presença de amiloplastos, complexos de Golgi, mitocôndrias, diversas
vesículas pequenas e vesículas grandes com conteúdo eletrondenso. Contudo, uma
característica se mostrou diferenciada: os amiloplastos apresentaram grãos de
amido aparentemente degradados nesta região de tubos longistila incompatíveis
(figura 4.8A).
Nas regiões dos tubos incompatíveis de longistila que exibiram citoplasma
menos denso foram observadas todas as organelas encontradas em outras regiões.
Esta observação incluiu os dois tipos de vesículas de tamanho maior, tanto as com
conteúdo menos eletrondenso, quanto as com conteúdo mais eletrondenso (figuras
4.8B a 4.8D). Contudo, foi encontrada uma diferença entre regiões em que o tubo
polínico se apresentou menos denso. Em regiões mais distantes do ápice não foram
observadas organelas degradadas (figura 4.8C); estas foram encontradas apenas
em regiões mais próximas ao ápice (figura 4.8D).
Outro tipo de reação também foi verificado através de análises
ultraestruturais. Esta reação foi caracterizada quando as células do tubo mostraram
uma distância entre o protoplasto e a parede celular, conforme foi visualizado na
anatomia de tubos polínicos incompatíveis de longistila. Nestas células, o
protoplasma apresentou-se denso, porém a presença de diversos vacúolos limitou a
localização da maior parte do citoplasma e outras organelas a uma região mais
central do tubo (figura 4.8E), ainda que parte do citoplasma tenha sido encontrada
próximo à parede celular (figura 4.8E).
Nas diferentes amostras examinadas, à medida que foram analisadas as
regiões do tubo polínico incompatível de longistila que se encontravam mais
distantes do grão de pólen e mais próximas do ápice, o protoplasma foi se
mostrando menos denso. Em algumas regiões mais próximas ao ápice poucas
organelas foram visualizadas (figura 4.8F).
Os núcleos do tubo polínico não foram observados em nenhuma das
amostras estudadas.
126
4.4.4. Perfis protéicos dos pistilos polinizados
Os perfis protéicos obtidos através da eletroforese unidimensional em SDS-
PAGE apresentaram um grande número de bandas protéicas oriundas dos pistilos
de ambas as formas florais de P. nuda. As amostras de pistilos brevistila e longistila,
tanto as polinizadas com pólen compatível, quanto com pólen incompatível, e ainda
as sem polinização, apresentaram perfis protéicos muito parecidos (figura 4.9). Os
perfis protéicos exibiram uma mistura de proteínas com massas moleculares que se
distribuíram entre cerca de 70 a 13 kDa. Uma proteína se destacou como majoritária
em todas as amostras, apresentando, aproximadamente, 45 kDa (figura 4.9).
Após a análise com o programa Gel Perfect, algumas proteínas foram
detectadas apenas nas amostras de um dos pistilos e, às vezes, após um único tipo
de tratamento deste pistilo. Contudo, algumas bandas específicas que apareceram
fracamente coradas em amostras que apresentaram uma concentração maior de
proteínas, não foram registradas nestes resultados. Isto se deve à possibilidade de
que estas bandas só não foram detectadas em outros tratamentos devido à sua
baixa concentração. Apesar da sensibilidade do programa utilizado, as bandas
protéicas consideradas em nossos resultados foram apenas as que se apresentaram
evidentes na visualização do gel a olho nu.
De acordo com a análise no programa Gel Perfect, dois grupos de bandas
protéicas mostraram diferentes concentrações entre alguns dos tratamentos. O
primeiro grupo de bandas protéicas (sinalizado no gel pela letra a, figura 4.9) exibiu
uma diferença marcante para a banda protéica com ca. de 39 kDa. Esta foi
encontrada apenas nos pistilos brevistila e longistila não polinizados e no pistilo
longistila após polinização compatível. As outras duas bandas, sinalizadas dentro
deste mesmo grupo, foram encontradas em todas as amostras e apresentaram
diferenças de concentração entre os diferentes tratamentos.
A banda com ca. de 40 kDa foi a que apresentou maior variação de
concentração entre as amostras. Pistilos não polinizados de longistila exibiram uma
concentração relativa desta proteína duas vezes maior do que em brevistila (tabela
4.2), quando a banda majoritária de 45 kDa foi projetada para 100 % em todos os
tratamentos. Para os pistilos polinizados foi observado o seguinte padrão: nos
cruzamentos compatíveis, os níveis de concentração desta banda se mantiveram
muito próximos aos dos pistilos não polinizados; e nos tratamentos incompatíveis
houve variação nesses níveis, quando comparados aos de pistilos não polinizados
127
(tabela 4.2). Para longistila houve uma diminuição na densidade de coloração desta
banda após a polinização incompatível, e para brevistila houve um acréscimo (tabela
4.2).
Finalizando o grupo a, a banda com ca. de 41 kDa mostrou algumas
variações sendo que a tendência encontrada foi a de uma concentração maior em
pistilos longistilas do que brevistilas (tabela 4.2). Também houve a tendência de
aumento na concentração dessas proteínas após a polinização, sendo que, dentro
de cada forma floral, as maiores porcentagens foram encontradas para as
polinizações incompatíveis (tabela 4.2).
O conjunto de bandas denominado como grupo b (figura 4.9) também
apresentou três bandas protéicas, cuja variação entre os distintos tratamentos e as
formas florais chamou a atenção. Novamente, cada uma das três bandas
apresentou um comportamento diferenciado em cada situação. A proteína com ca.
de 28 kDa foi a mais pesada, sendo a única que não foi encontrada em pistilos
brevistila não polinizados (tabela 4.2). A concentração desta proteína em pistilos
brevistila após polinização incompatível mostrou-se duas vezes maior do que após a
polinização compatível (tabela 4.2). Uma razão semelhante foi encontrada para os
pistilos longistila após polinização incompatível, quando comparados com os pistilos
não polinizados (tabela 4.2). Os pistilos de longistila, após polinização compatível,
apresentaram uma concentração desta proteína intermediária, maior do que a dos
pistilos não polinizados; e menor do que a dos pistilos incompatíveis (tabela 4.2).
Duas bandas protéicas de 28 e 24 kDa, também incluídas em b (figura 4.9),
apresentaram pequena concentração nos pistilos não polinizados das duas formas
florais (tabela 4.2). Quanto aos pistilos polinizados, estas duas proteínas
apresentaram comportamentos similares. Em brevistila após o tratamento
compatível os níveis destas proteínas se mantiveram e o mesmo ocorreu para
longistila sob tratamento incompatível; enquanto após a polinização incompatível em
brevistila e compatível em longistila os níveis foram mais altos (tabela 4.2). Uma
ressalva, apenas deve ser feita em relação às concentrações da banda de 24 kDa
que, após o tratamento compatível em brevistila, apresentou níveis intermediários
entre os não polinizados e os incompatíveis (tabela 4.2).
Não foram encontradas glicoproteínas nos extratos protéicos dos pistilos de
P. nuda.
128
4.5. Discussão
A interação entre pólen e pistilo em Psychotria nuda causou diversas
alterações nas duas estruturas, que culminou em diferentes resultados após as
polinizações compatíveis e incompatíveis.
Os resultados da interação entre as células do estigma e a parede dos grãos
de pólen foram similares em ambas as interações compatíveis e incompatíveis. Esse
resultado, aliado à presença de tubos polínicos em todos os tratamentos, é um
indicativo de que as reações de incompatibilidade não afetam a germinação dos
grãos de pólen de P. nuda. Estas observações diferem do encontrado para Linum
grandiflorum (Linaceae), espécie distílica na qual ou grãos de pólen de longistilas
não germinaram em estigmas incompatíveis (Lewis, 1943). Em um grande número
de espécies de Primula, também foi encontrado um déficit na germinação de grãos
de pólen incompatíveis, e estes resultados se mostraram variáveis entre as espécies
estudadas e as formas florais de algumas destas espécies (Wedderburn e Richards,
1980). Particularmente em Primula vulgaris, grande parte dos grãos de pólen
incompatíveis apresentou deficiência no processo de germinação (Shivanna et al.,
1981). Em algumas flores de três espécies de Rubiaceae, incluindo duas do gênero
Psychotria, Faivre (2002) também registrou deficiência na germinação de grãos
incompatíveis; contudo, isto foi tratado como uma exceção pela autora, pois em
outras flores foram observados tubos polínicos após o mesmo tratamento.
Problemas de germinação não são freqüentemente relatados para a resposta de
incompatibilidade em espécies distílicas de Rubiaceae. Desta forma, o resultado
observado em P. nuda se assemelha ao encontrado em outras espécies da família.
Zinkl et al. (1999) observaram que 5 minutos após a interação com os grãos
de pólen as células do estigma se moldam à exina do grão em Arabidopsis
(Brassicaceae). Os testes efetuados por esses autores incluíram a polinização com
grãos de diferentes espécies de Brassicaceae, mutantes de Arabidopsis e grãos de
outras espécies do gênero lavados para a retirada da cobertura do pólen. Dentre
esses, apenas os grãos de outras espécies de Brassicaceae não causaram a
ondulação na parede periclinal externa do estigma, não havendo adesão entre os
grãos e o estigma. Esta parede moldada não foi observada para algumas espécies
com estigma úmido, pois nestas, o grão de pólen fica embebido na secreção sobre o
estigma (por ex., Onus, 2000), ou em uma matriz chamada de “attachment foot”
129
(Hiscock et al., 2002), sem que este fique em contato direto com a parede do
estigma. Assim como as espécies de Arabidopsis, P. nuda apresenta estigma do tipo
seco e a adesão dos grãos de pólen provoca uma mudança estrutural da parede
celular estigmática. Desta forma, as regiões do estigma que entraram em contato
com o pólen apresentaram-se moldadas a este. Em P. nuda, a propriedade de se
moldar à exina foi observada em estigmas das duas formas florais durante os
tratamentos de incompatibilidade, e em situações de compatibilidade. Estes
resultados também indicam que a adesão dos grãos de pólen não foi afetada pela
resposta de incompatibilidade desta espécie.
Em 40 minutos após o contato com grãos de pólen, as células do estigma de
P. nuda apresentaram um aspecto de desestruturação. Essa observação também
independe do tipo de polinização realizada. O fato de o estigma ter mostrado células
menos túrgidas após a polinização pode significar que estas células já estão
começando o processo de necrose, que normalmente é encontrado após o período
curto de receptividade do estigma (Zanettini e Lauxen, 2003). Em diversas espécies
de Angiospermae, os tecidos que dão passagem ao tubo polínico passam por um
processo de morte celular durante a polinização e o crescimento do tubo (Hiratsuka
et al., 2002). Em outras regiões do estigma de P. nuda, que não entraram em
contato com o pólen, algumas células se mantiveram túrgidas. Esta última
observação corrobora com a possibilidade de interação entre o estigma e uma nova
carga de polinização. A exposição de estigmas das espécies distílicas Turnera
ulmifolia (Turneraceae) e Pontederia cordata (Pontederiaceae) a grãos de pólen
incompatíveis, e subseqüente exposição ao pólen compatível, não causou efeitos
negativos na produção de sementes (Shore e Barrett, 1984; Barrett e Glover, 1985,
respectivamente). Contudo, para que este efeito fosse observado, em ambos os
estudos, o intervalo entre as polinizações ilegítimas e legítimas não foi muito longo.
Da mesma forma, nenhum efeito foi observado na formação de tubos polínicos após
polinização compatível quando os estigmas de Luculia gratissima (Rubiaceae)
haviam sido previamente polinizados com grãos incompatíveis (Murray, 1990). Em
Psychotria nuda, também não foi encontrada nenhuma estrutura anatômica que
fosse relacionada à obstrução do estigma após a deposição de grãos de pólen
incompatíveis.
Mesmo sendo reconhecido como um sistema esporofítico de auto-
incompatibilidade, o crescimento dos tubos polínicos de Psychotria nuda, assim
130
como o de outras espécies heterostílicas, pode ser interrompido em regiões
posteriores ao estigma. Em diversas espécies de Rubiaceae, assim como observado
em P. nuda, os tubos polínicos incompatíveis pararam de crescer ainda na região do
estigma em flores brevistilas (Bawa e Beach, 1983; Passos e Sazima 1995; Faivre,
2002; Coelho e Barbosa, 2004; Teixeira e Machado, 2004a; b). A visualização dos
tubos polínicos incompatíveis em flores longistilas da Floresta da Tijuca, no entanto,
se mostrou mais variável. Esta observação também foi coerente ao que acontece
com grande parte das espécies estudadas e descritas na literatura. Após a
polinização incompatível de flores longistilas, a inibição dos tubos polínicos ocorre
em regiões diferenciadas, mas uma grande parte ocorre no estilete (Bawa e Beach,
1983; Passos e Sazima 1995; Faivre, 2002; Coelho e Barbosa, 2004; Teixeira e
Machado, 2004a, b).
O menor tempo do crescimento do tubo polínico compatível de P. nuda foi
visualizado 40 minutos após a polinização, quando estes tubos já apresentavam
tampões de calose. As respostas de incompatibilidade nos pistilos brevistilas e
longistilas resultaram em diferentes aspectos celulares, mas um aspecto encontrado
em comum foi a não formação de tampões de calose, mostrando assim, que a
resposta de incompatibilidade nas duas formas florais é bastante rápida. Este
resultado indica que, apesar do crescimento de alguns tubos ter sido interrompido
em regiões além do estigma, a resposta de incompatibilidade pode ter sido iniciada
no estigma das duas formas florais. A interrupção do tubo em regiões além deste
tecido, portanto, pode ser provocada apenas por um crescimento residual desta
estrutura. Aliado a isso, pode-se supor também que, pelo menos em flores
longistilas, o pistilo não impõe nenhuma barreira estrutural ao crescimento do tubo
polínico.
A espécie P. nuda já havia sido investigada anteriormente quanto ao
crescimento dos tubos polínicos, em outras duas populações: Pici e Para (ver o
capítulo 1). Contudo, ao contrário do esperado, os tubos polínicos incompatíveis
apresentaram comportamentos diferenciados entre as três populações. Em Para, o
crescimento dos tubos incompatíveis foi interrompido no estigma das duas formas
florais (Pereira et al., 2006); como citado anteriormente, o mesmo ocorreu apenas
com os pistilos brevistilas e parte dos longistilas em FTij, e com grande parte dos
tubos ilegítimos em flores longistilas de Pici (Castro e Araújo, 2004). Um número
maior de tubos inibidos no estilete de flores brevistilas foi encontrado em Pici (Castro
131
e Araújo, 2004), entretanto a mesma observação foi feita para outra parte dos
pistilos longistilas em FTij. Cabe lembrar que as três populações apresentaram o
sistema heteromórfico de auto-incompatibilidade. Também foram encontradas
diferenças no crescimento dos tubos polínicos compatíveis entre as populações;
sendo em Para a situação mais diferenciada, em que os tubos só chegam ao ovário
ca. de 36 horas depois da polinização (Pereira et al., 2006). Em Pici, o menor tempo
examinado foi de 12 horas após a polinização e, nesse estágio, os tubos polínicos
em ambas as formas florais já haviam atingido o ovário (Castro e Araújo, 2004). Pela
falta de parâmetros, não se faz possível comparar o crescimento mais rápido nos
pistilos longistilas, que já apresentavam os tubos no ovário em grande parte das
amostras 8 horas após a polinização em FTij com o observado em Pici. Contudo, as
duas últimas populações apresentaram um tempo muito inferior para a chegada dos
tubos ao ovário do que o observado em Para. Estes resultados indicam que o
crescimento de tubos polínicos pode ser influenciado por diferenças nos habitats,
conforme foi sugerido por Faivre (2002). Diferenças entre os sítios de inibição dos
tubos polínicos incompatíveis entre populações de uma espécie distílica também
foram registradas para a forma floral longistila de Turnera subulata (Shore e Barrett,
1984; Tamari et al., 2001), entretanto, esses pesquisadores não apresentaram uma
hipótese para tentar explicar essa observação.
Mckee e Richards (1998) estudaram os eventos de polinização em espécies
distílicas de Primula e observaram que diferentes espécies podem responder à
variação de temperatura durante polinizações compatíveis. Um dos aspectos
observados por esses autores foi uma maior taxa de germinação dos grãos de pólen
incompatíveis em temperaturas mais elevadas, apesar de temperaturas mais altas
não estarem associadas à promoção de cruzamentos ilegítimos. Outro fator que
também foi observado afetando a formação e crescimento de tubos polínicos de
Primula vulgaris, foi a umidade. A germinação de grãos de pólen nesta espécie se
mostrou influenciada pela umidade, variando, inclusive, as respostas encontradas
para as duas formas florais quando tratadas sob as mesmas condições (Shivanna et
al., 1981).
Como foi indicado no capítulo 1, as diferentes populações de P. nuda
investigadas se encontram em ambientes de condições diversas. É possível que
estas condições sejam responsáveis pelas variações no crescimento de tubos
polínicos originados de polinizações compatíveis e incompatíveis. As áreas das
132
populações FTij e Pici apresentam condições ambientais e vegetações mais
similares, em florestas sempre verdes, quando comparadas a Para, que se situa em
uma floresta semi-decídua. Portanto, é possível que as condições ambientais sejam
mais similares nestes dois locais. Além disso, a observação de variações nas
respostas do crescimento dos tubos dentro de cada forma floral, em cada
população, pode estar associada ao tempo de resposta do grão de pólen à auto-
incompatibilidade e à plasticidade que cada organismo pode ter para oferecer uma
resposta a um estímulo. As polinizações foram realizadas em vários dias diferentes
e, por isso, os tratamentos foram, provavelmente, realizados sob diferentes
condições ambientais. Por este mesmo motivo, as diferenças citológicas para os
tubos polínicos incompatíveis dentro de cada forma floral em FTij também podem
estar relacionadas às diferentes condições ambientais e à capacidade de resposta
de cada indivíduo.
Além das diferentes regiões de respostas de incompatibilidade, as diferentes
morfologias dos tubos polínicos também podem indicar variações nas respostas
entre as formas florais, como foi observado para Psychotria nuda. A espécie
Bouvardia ternifolia, estudada por Faivre (2002), apresentou os tubos polínicos com
ápice inchado nas duas formas florais, enquanto P. poeppigiana e P. chiapensis
apresentaram situação semelhante em flores brevistilas, mas em pistilos longistilas o
ápice do tubo se mostrou menos evidente. O mesmo foi observado para P. elata e P.
chiapensis no estudo de Bawa e Beach (1983). Com isso, é possível afirmar que
outras espécies distílicas de Rubiaceae, e que pertencem ao gênero Psychotria,
apresentaram a morfologia do tubo incompatível semelhante às encontradas em P.
nuda.
De acordo com Barret (1992), a heterostilia evoluiu em mais de 20 ocasiões
separadamente dentro das Angiospermae, já que existem diferentes origens, de
acordo com a filogenia descrita para Angiospermae, dentre os 28 grupos que
apresentam esse sistema. Anderson (1973) formulou a hipótese de que a heterostilia
surgiu mais de uma vez durante a evolução da família Rubiaceae, mas até hoje não
existe um estudo comprobatório para essa teoria. A presença de um tipo de resposta
para o tubo polínico em situação de incompatibilidade, que foi observada como
diferenciada entre dois gêneros, pode ser mais um dado para sugerir as
independentes origens do sistema heteromórfico de auto-incompatibilidade na
família. Contudo mais estudos se fazem necessários para comprovar essa situação.
133
Algumas espécies de Rhododendron (Ericaceae), que não apresentam
sistema de auto-incompatibilidade, foram polinizadas manualmente de forma
interespecífica e para as diferentes espécies foram encontrados sete tipos
morfológicos de pontas nos tubos incompatíveis (Williams et al., 1982). Estes
autores associaram a interrupção dos tubos polínicos a dois fatores: a deficiência no
crescimento apical; e a deficiência na deposição da calose na parede dessas
células. Com isso, cada tipo de ápice apresentou um balanceamento específico
destas duas características. As observações acerca dos tubos polínicos de
Psychotria. nuda também sugerem que a resposta de cada forma floral ao
crescimento de um tubo incompatível provoca alterações específicas no ápice, que
também podem estar relacionadas às deficiências no crescimento apical e na
deposição de parede.
Durante o crescimento compatível, o tubo polínico compatível apresenta o
crescimento apical no qual o citoplasma e núcleo das células vegetativas e núcleos
das células espermáticas migram em direção ao ápice celular e, posteriormente,
estes são confinados por tampões de calose (Cheung, 1996). Com isso, a deposição
freqüente de tampões de calose restringe o citoplasma do pólen à região mais
distante do grão de pólen (Cheung et al., 2000). Apesar da importância dos tampões
de calose na limitação do volume citoplasmático dos tubos polínicos, a deficiência de
calose em um mutante de Arabidopsis não limitou o crescimento destes tubos in
vitro (Nishikawa et al., 2005). A presença destes tampões nos tubos polínicos é
comumente observada nas espécies de Angiospermae, e esta estrutura também foi
encontrada em tubos polínicos compatíveis de P. nuda. A função desta estrutura em
P. nuda parece estar relacionada aos fatores citados anteriormente, ou seja, na
segmentação dos tubos e limitação do volume citoplasmático da célula tubo. Esta
colocação pode ser feita pela observação de que em tubos compatíveis o citoplasma
denso mostrou-se restrito à região mais distante do ápice, enquanto as regiões
anteriores, encerradas pelos tampões de calose, apresentaram protoplasma pouco
denso.
Em P. nuda, os ápices dos tubos polínicos compatíveis e incompatíveis em
pistilos brevistila apresentaram muitas características em comum. Adicionalmente, o
ápice dos incompatíveis de longistila apresentou semelhanças com as regiões
anteriores ao ápice que foram encerradas pelo tampão de calose em tubos
compatíveis. As organelas e o citoplasma denso no ápice dos dois primeiros tipos de
134
tubo mostraram uma característica marcante que indica um zoneamento de
organelas no tubo: a presença de vesículas com conteúdo mais eletrondenso
apenas no ápice celular e as cobertas e com conteúdo menos eletrondenso nas
demais regiões. Vesículas semelhantes às de conteúdo eletrondenso foram
observadas em tubos polínicos de outras espécies, e estas são conhecidas como
“P-particles” (Heslop-Harrison e Heslop-Harrison, 1982b). As partículas-P (ou “P-
particles”) transportam pectinas e outros componentes constituintes da parede
celular do tubo. Essas vesículas são transportadas para o ápice devido ao forte fluxo
citoplasmático e são incorporadas à membrana plasmática em uma zona de
crescimento localizada, principalmente, na área convexa do ápice do tubo (Franklin-
Tong, 1999). As vesículas encontradas nos tubos polínicos contêm substâncias
similares às paredes do tubo e, por isso, estão associadas ao crescimento e
formação da parede celular desta estrutura (Mascarenhas, 1993). A presença de
dois tipos de vesículas nos tubos polínicos de Psychotria nuda deve estar
relacionada à formação da camada externa da parede do tubo (a partir das vesículas
mais eletrondensas no ápice) e da camada mais interna (a partir das vesículas
menos eletrondensas em regiões anteriores ao ápice). Duas fortes evidências de
que as vesículas do ápice se fundem e liberam seu conteúdo para a formação de
parede celular foram observadas durante a resposta de incompatibilidade dos tubos
polínicos de brevistila em P. nuda. A primeira evidência está na formação de uma
parede celular para encapsular parte do protoplasma do tubo após o seu
extravasamento. A união das vesículas, tanto as que se encontravam no interior da
região encapsulada, quanto as que se encontravam fora, gerou uma estrutura muito
similar à parede celular do tubo. A outra evidência está na surpreendente
observação da fusão de vesículas do protoplasma extravasado destes tubos e a
lamela média do tecido de transmissão, demonstrando assim a afinidade entre o
conteúdo das partículas-P e a lamela média.
A presença de amiloplastos com o amido degradado ocorreu associada a
regiões com vesículas cobertas e com conteúdo pouco eletrondenso, à exceção do
ápice com citoplasma extravasado em tubos incompatíveis de P. nuda.
Possivelmente, as vesículas menos eletrondensas se originam destes amiloplastos,
enquanto as vesículas mais eletrondensas já haviam sido observadas no
protoplasma dos grãos de pólen maduros (ver capítulo 3). De acordo com Heslop-
Harrison e Heslop-Harrison (1982b), as partículas-P podem ser formadas em
135
complexos de Golgi de grãos de pólen de espécies com rápido crescimento de tubo
polínico, de forma que a atividade destas organelas durante o crescimento dos tubos
é muito baixa. Freqüentemente, são encontrados poucos complexos de Golgi nos
tubos polínicos destas espécies. Uma situação similar a essa foi encontrada em P.
nuda. Contudo, mais estudos sobre a origem destas vesículas são necessários para
testar a hipótese de que as vesículas eletrondensas se originam do complexo de
Golgi.
A constituição da parede celular do tubo polínico de P. nuda não foi
investigada. Contudo, através da observação de sua estrutura, foi possível
demonstrar que a parede na região apical do tubo apresenta apenas uma camada e
que, em regiões anteriores ao ápice, esta parede possui duas regiões distintas, a
externa mais eletrondensa e a interna menos eletrondensa. O mesmo foi encontrado
em tubos polínicos de Pinus sylvestris (Pinaceae, Gymnospermae) (Derksen et al.,
1999). A parede dos tubos polínicos consiste de duas ou três camadas, a mais
interna é constituída principalmente por calose, enquanto as outras são, ou a outra é
composta, em geral, por pectinas e celulose (Geitmann et al., 1995). Através de uma
investigação com anticorpos, a parede na região do ápice celular de tubos polínicos
de Arabidopsis thaliana revelou a presença de homogalacturonanos muito
esterificados (que pertencem ao grupo de pectinas), mas não a presença de calose.
Já em regiões anteriores ao ápice celular foi observada marcação para calose na
parede do tubo (Lennon e Lord, 2000).
A presença de organelas degradadas e as características gerais dos tubos
polínicos incompatíveis de longistila, tanto dos que apresentaram protoplasma
menos denso, quanto dos que apresentaram faixas de citoplasma próximas à
parede, podem indicar que esta estrutura está sofrendo um processo de morte
celular. Contudo, as células dos tubos incompatíveis em brevistila apresentaram um
aspecto muito diferente, sem mostrar aspectos de senescência. Este aspecto já
permite a interpretação de que as respostas de incompatibilidade são específicas
para cada forma floral, dando suporte à hipótese sustentada por Tamari et al. (2001)
e Khosravi et al. (2003) de que os mecanismos de auto-incompatibilidade são
diferentes entre flores brevistilas e longistilas. Além das características do
protoplasma, o rompimento dos tubos de brevistila associado à presença massiva de
vesículas e a união destas para gerar uma parede, são características que não
foram visualizadas em longistila e, por isso, corroboram com esta idéia. A
136
interrupção do crescimento do tubo polínico em brevistilas, quando as células ainda
são capazes de manter a sua conformação funcional no protoplasma mostra que a
resposta de incompatibilidade não envolve a morte celular desta estrutura. Ao
mesmo tempo, a ausência de uma região repleta de vesículas em regiões do tubo
polínico incompatível em longistila deve estar associada ao término do crescimento
desta estrutura e, portanto, a uma resposta muito diferenciada do observado para
brevistilas.
Em Psychotria nuda, a menor eficácia do sistema de incompatibilidade não foi
observada, ainda que os tubos polínicos tenham crescido mais em longistila, os
tratamentos incompatíveis em ambas as formas florais resultaram na interrupção do
crescimento desta estrutura. A hipótese formulada para explicar os diferentes
comportamentos dos grãos está associada a uma resposta única que cada uma das
formas florais utiliza para interromper o crescimento do tubo incompatível. Com isso,
na forma floral brevistila, o aparato celular, incluindo organelas, vesículas e
citoplasma, é mantido durante a incompatibilidade e o tubo continua sendo hidratado
até o seu rompimento, o que indica que a resposta à incompatibilidade foi a não
permissão do alongamento do tubo. Em longistila foi permitida, ao tubo, a
continuidade do crescimento; contudo o aparato celular, observado em tubos
compatíveis, encontra-se desestruturado, impedindo que o alongamento desta célula
continue pelos tecidos do pistilo. Em flores em que o crescimento do tubo é
interrompido no estigma o resultado de uma região diferenciada para a interrupção
do crescimento do tubo polínico, entre as duas formas florais, foi interpretado como
um indicativo de que a incompatibilidade é mais fortemente expressa (Faivre, 2002;
Teixeira e Machado, 2004a, b). Desta forma, haveria um relaxamento no sistema de
auto-incompatibilidade maior na forma floral longistila, pois esta apresenta o
crescimento dos tubos polínicos incompatíveis até regiões do estilete, enquanto os
tubos incompatíveis em brevistila são, normalmente, interrompidos no estigma.
O conceito de que existe uma relação de causa e conseqüência entre os
polimorfismos florais e o mecanismo de auto-incompatibilidade heteromórfico
encontra-se permeado na literatura (Dulberger, 1992; Lloyd e Webb, 1992).
Contudo, Tamari et al. (2001) observaram que mesmo quando os grãos de pólen de
flores longistilas possuem o mesmo tamanho dos grãos de brevistila, estes ainda
sofrem interrupção no crescimento em pistilos de longistila. Estes autores,
relacionando a investigação protéica de pistilos realizada por Athanasiou e Shore
137
(1997), inferiram que este resultado sobre o tamanho dos grãos é um indício da
presença de um controle molecular nas respostas de auto-incompatibilidade, mais
especificamente de proteínas.
A dificuldade de obter amostras para o exame do perfil protéico foi grande,
especialmente para os pistilos polinizados de forma compatível e incompatível. Com
isso, não puderam ser realizadas análises mais aprofundadas acerca das proteínas
do pistilo. Ainda assim, em Psychotria nuda, apesar de ter sido observada uma
quantidade maior de proteínas exclusivas nos grãos de pólen (vide capítulo 3), foram
detectadas proteínas que diferenciam os pistilos das duas formas florais antes e
após as polinizações. A presença de proteínas exclusivas a uma das formas florais
foi observada anteriormente nos pistilos de algumas espécies distílicas (Gosh e
Shivanna, 1980; Shivanna et al., 1981; Stevens e Murray, 1982; Wong et al., 1994;
Athanasiou e Shore, 1997; Athanasiou et al., 2003; Khosravi et al., 2003; Khosravi et
al., 2004; Miljuš-ðukić et al., 2004; Tamari e Shore 2006). A partir das amostras e
análises realizadas para P. nuda, não foi possível afirmar a presença de proteínas
exclusivas, pois a pequena quantidade de proteínas em algumas amostras pode
mascarar os resultados.
A ausência de glicoproteínas nas amostras foi um resultado surpreendente,
tendo em vista que a presença desse tipo de substância, especialmente de
proteínas arabinogalactanos (AGPs), é comumente associada a importantes funções
durante a interação entre pólen e pistilo (Cheung, 1996). A realização de mais
estudos se faz necessária para determinar se a ausência de glicoproteínas
observada nos resultados é uma característica desta espécie ou se isto ocorreu
devido à metodologia empregada.
De acordo com o encontrado na literatura, diferenças no perfil protéico de
pistilos após a polinização foram mostradas para apenas uma espécie heterostílica
(Miljuš-ðukić et al., 2004). Os resultados obtidos para P. nuda indicam que durante
as respostas de compatibilidade e incompatibilidade, os pistilos de flores brevistilas e
longistilas mostraram diferenças na expressão de proteínas. Em cada tratamento de
polinização, dois grupos de bandas protéicas apresentaram variações, sendo estas
específicas para cada tipo de pistilo e polinização. Desta forma, uma banda protéica
de mesma massa, que teve sua concentração diminuída após a autopolinização e
mantida após polinização compatível em pistilos brevistila, pode ter tido sua
concentração mantida após autopolinização e diminuída após polinização
138
compatível em pistilos de longistila. Com isso, é possível sugerir que o
reconhecimento dos tubos compatíveis e incompatíveis deve provocar uma resposta
molecular diferenciada em cada forma floral. As respostas obtidas para espécies
distílicas, através da análise dos perfis protéicos, corroboram com a idéia de que as
espécies heterostílicas possuem um sistema de resposta de auto-incompatibilidade
em cada forma floral (Athanasiou e Shore, 1997; Miljuš-ðukić et al., 2004). Os
resultados encontrados, tanto sobre a investigação protéica, quanto sobre o
crescimento, morfologia e citologia dos tubos polínicos de P. nuda reforçam esta
idéia. Contudo, os mecanismos que controlam o sistema de auto-incompatibilidade
em espécies distílicas continuam desconhecidos.
139
4.6. Conclusões
- A interação entre as células do estigma e a parede dos grãos de pólen foi similar
entre as interações compatíveis e incompatíveis, de forma que as paredes do
estigma apresentaram-se moldadas ao grão de pólen. A presença de pollenkitt
também foi notada nos grãos aderidos ao estigma;
- Apenas as células do estigma que entraram em contato com o pólen
apresentaram-se desestruturadas 40 minutos após a polinização, indicando que o
estigma pode estar apto a receber novas cargas de pólen;
- O crescimento dos tubos polínicos se mostrou diferenciado entre as duas formas
florais de P. nuda. Os tubos incompatíveis em pistilos de longistila alcançaram, em
sua maioria, regiões do estilete, enquanto os de brevistila foram, geralmente,
inibidos logo abaixo da epiderme estigmática. Os tubos compatíveis em pistilos de
longistila, em geral, levaram menos tempo para chegar ao ovário;
- A morfologia do ápice dos tubos polínicos incompatíveis mostrou-se diferenciada
para as duas formas florais. A região apical em brevistilas tem aparência inchada, e
em longistilas se mostra pouco marcada para calose. Foi observada ruptura na
região apical dos tubos incompatíveis de brevistila, mas não em longistila;
- Os tubos polínicos compatíveis de P. nuda apresentam tampões de calose,
enquanto os incompatíveis não possuem esta estrutura;
- Os tampões de calose segmentam regiões citológicas distintas dos tubos
compatíveis de P. nuda, sendo que apenas a região apical destes tubos exibe um
protoplasma semelhante ao de grãos de pólen maduros. Os tubos compatíveis de P.
nuda apresentam organização característica de células com crescimento apical;
- A parede dos tubos polínicos de P. nuda exibiu duas camadas, à exceção da
região apical que apresentou apenas uma. A construção de cada camada de parede
celular pode estar relacionada à presença de vesículas diferenciadas encontradas
no ápice e em regiões anteriores à apical;
- Diferenças marcantes na citologia de tubos polínicos incompatíveis foram
observadas entre as duas formas florais. Este registro é mais um forte indício de que
as respostas de auto-incompatibilidade são diferenciadas para brevistila e longistila;
- Também foram encontradas diferenças citológicas para os tubos polínicos
incompatíveis dentro de cada forma floral. Esta diversidade pode estar relacionada
às condições ambientais variadas no campo e à capacidade de resposta de cada
140
indivíduo de Psychotria nuda durante a reação de incompatibilidade;
- Em brevistilas, a maioria dos tubos polínicos incompatíveis apresentou, em toda
sua extensão, protoplasma semelhante ao encontrado nos grãos de pólen e no
ápice de tubos compatíveis. Contudo, algumas regiões apresentaram organelas
degradadas;
- Na região do ápice celular de tubos polínicos incompatíveis de brevistila foi
encontrado protoplasma extravasado e algumas áreas onde pode ser observada a
união de diversas vesículas (partículas-P) formando estruturas similares à parede
celular. Esta observação indica a tendência destas vesículas em formar a parede
celular do tubo;
- Em longistilas, muitos tubos polínicos exibiram citoplasma menos denso, enquanto
outros apresentaram faixas de protoplasma restritas à regiões próximas à parede
celular. Desta forma, estes tubos se assemelham às regiões dos tubos polínicos
compatíveis anteriores ao ápice que estão separadas pelos tampões de calose. O
aspecto destas células sugere que estas estão sujeitas a um processo de morte
celular;
- As análises sobre os perfis protéicos nos pistilos de P. nuda não resultaram na
descoberta de proteínas exclusivas às diferentes formas florais. Contudo, foi
observada a concentração diferenciada em brevistilas e longistilas de algumas
bandas protéicas antes e após as polinizações compatíveis e incompatíveis;
Não foram encontradas glicoproteínas nos pistilos de P. nuda, contudo, novas
análises se fazem necessárias para verificar esta observação;
- A variação na concentração de proteínas após os diferentes tratamentos, assim
como o crescimento, a morfologia e a citologia dos tubos polínicos de P. nuda,
reforçam a idéia de que o sistema de auto-incompatibilidade é diferenciado nas duas
formas florais de P. nuda, pois, os pistilos e o pólen de brevistilas e longistilas
apresentam diferentes respostas durante o reconhecimento de tubos polínicos
incompatíveis.
141
Figura 4.1 – Microscopia eletrônica de transmissão de grãos de pólen localizados
sobre o estigma. (A) Detalhe da parede do grão exibindo a presença de substâncias
eletrondensas do pollenkit; (B) Grão de pólen sobre células do estigma, já
apresentando sinais de senescência da última; (C) parede e parte do protoplasma
de um grão de pólen após a germinação e protrusão do tubo polínico; (d) detalhe de
uma região de contato entre o grão de pólen e o estigma. Legenda: a – grão de
amido; e – estigma; ect – ectexina; end – endexina; in – intina; pk – pollenkitt; v –
vesículas. Barras: (A) 0,25 µm; (B) 2,0 µm; (C) 1,25 µm; (D) 0,6 µm.
142
Figura 4.2 – Microscopia de fluorescência dos tubos polínicos de Psychotria nuda in
vivo após diferentes tipos de polinização. (A) Tubos polínicos longistilas em pistilo
brevistila, polinização compatível; (B) tubos polínicos brevistilas em pistilo longistila,
polinização compatível; (C) detalhes dos tampões de calose de tubos polínicos
longistilas em pistilo brevistila; (D) detalhes dos tampões de calose de tubos
polínicos longistilas em pistilo brevistila; (E) tubos polínicos brevistilas em pistilo
brevistila, polinização incompatível; (F) tubos polínicos longistilas em pistilo longistila,
polinização incompatível. Legenda: cabeça de seta – tampão de calose; gp – grão
de pólen; seta – ápice do tubo. Barras: (A), (B), (C) e (F) 100 µm; (D) 50 µm; (F) 200
µm.
143
Tabela 4.1 – Avaliação do crescimento dos tubos polínicos de Psychotria nuda oito
horas após o evento da polinização. Disposição das porcentagens de pistilos em
relação à localização do ponto máximo de crescimento dos tubos polínicos
separados pelo tipo de pistilo e tipo de polinização. Os números amostrais estão
demonstrados entre parênteses (n).
Tubos compatíveis Tubos incompatíveis
Crescimento do tubo até: Longistilas (22) Brevistila (16) Longistilas (24) Brevistila (21)
Estigma 0 0 62,5 % 90,5 %
Terço superior do estilete 0 0 37,5 % 0
Terço médio do estilete 0 12,5 % 0 9,5 %
Terço inferior do estilete 0 25 % 0 0
Ovário 100 % 62,5 % 0 0
144
Figura 4.3 – Microscopia confocal de tubos polínicos de Psychotria nuda in vivo
expostos ao traçador celular LY após diferentes tipos de polinização. (A) Tubo
polínico longistila em pistilo brevistila, polinização compatível; (B) idem ao (A), porém
controle em campo claro; (C) tubo polínico longistila em pistilo longistila, polinização
incompatível; (D) tubo polínico brevistila em pistilo brevistila, polinização
incompatível. Legenda: seta – ápice do tubo. Barras: (A), (B), (C) 20 µm; (D) 40 µm.
145
Figura 4.4 – Microscopia óptica de tubos polínicos compatíveis de Psychotria nuda
após o crescimento in vivo. (A) Grão de pólen e tubo longistila sobre estigma de
brevistila; (B) tubo longistila sobre estigma de brevistila; (C) tubo brevistila
permeando o tecido de transmissão de longistila; (D) tubo brevistila permeando o
tecido de transmissão de longistila, detalhe de uma região que apresenta tampão de
calose; (E) região apical de tubos brevistila permeando o tecido de transmissão de
longistila. Legenda: e – estigma; tc – tampão de calose; tp – tubo polínico; tt – tecido
de transmissão. Barras: (A), (B) e (E) 20 µm; (C) e (D) 50 µm.
146
Figura 4.5 – Microscopia eletrônica de transmissão de tubos polínicos compatíveis
de Psychotria nuda após o crescimento in vivo. (A) Corte transversal de tubo
brevistila no tecido de transmissão de longistila; (B) detalhe de tubo longistila no
tecido de transmissão de brevistila; (C) detalhe de grão de amido e mitocôndria em
tubo longistila compatível; (D) região mais próxima do ápice de tubo brevistila no
tecido de transmissão de longistila. Legenda: a – amido; m – mitocôndria; pe –
parede celular externa do tubo; pi – parede celular interna do tubo; tp – tubo polínico;
tt – tecido de transmissão; v – vesícula. Barras: (A) 1,3 µm (B) e (D) 0,6 µm; (D) 0,15
µm.
147
Figura 4.6 – Microscopia óptica de tubos polínicos incompatíveis de Psychotria nuda
após o crescimento in vivo. (A) e (B) tubos brevistilas permeando o tecido de
transmissão brevistila; (C) e (D) tubo brevistila sobre o estigma brevistila; (E) tubo
longistila permeando o tecido de transmissão longistila; (F), (G) e (H) tubo longistila
sobre o estigma longistila. Legenda: e – estigma; seta – protoplasma extravasado; tp
– tubo polínico; tt – tecido de transmissão. Barras: (A), (B), (D), (F), (G) e (H) 50 µm;
(C) e (E) 20 µm.
148
Figura 4.7 – Microscopia eltrônica de transmissão de tubos polínicos brevistilas
incompatíveis de Psychotria nuda após o crescimento in vivo. (A) Região do tubo
próxima ao grão de pólen; (B) região do tubo com protoplasma menos denso; (C)
detalhe de (B), com organelas degradadas; (D) e (F) região mais próxima do ápice
de tubos rompidos; (E) protoplasma do tubo extravasado. Legenda: a – amido; cg –
complexo de Golgi; m – mitocôndria; pe – parede celular externa do tubo; pi –
parede celular interna do tubo; pre – protoplasma extravasado; tt – tecido de
transmissão; v – vesícula. Barras: (A), (B) e (C) 1,1 µm; (D) e (F) 0,15 µm; (D) 0,6
µm.
149
Figura 4.8 – Microscopia eletrônica de transmissão de tubos polínicos longistilas
incompatíveis de Psychotria nuda após o crescimento in vivo. (A) Região do tubo
próxima ao grão de pólen; (B) tubo polínico no tecido de transmissão; (C) detalhe de
(B); (D) detalhe de região mais distante do grão de pólen; (E) tubo em que o
protoplasma aparenta estar distante da parede celular (na óptica); (F) região do tubo
próxima ao ápice. Legenda: a – amido; cg – complexo de Golgi; e –estigma; m –
mitocôndria; pe – parede celular externa do tubo; pi – parede celular interna do tubo;
tt – tecido de transmissão; va – vacúolo; v – vesícula. Barras: (A), 0,06 µm; (B) 1,1
µm; (C) e (F) 0,4 µm; (D) 0,25 µm; (E) 1,7 µm.
150
151
Tabela 4.2 – Concentração de algumas proteínas dos pistilos de Psychotria nuda
antes da polinização e três horas após o evento de polinizações compatíveis e
incompatíveis em cada forma floral.
Massa
molecular
aprox. (kDa)
Brevi – não
polinizado
longi – não
polinizado
Brevi –
incompatível
Longi –
incompatível
Brevi –
compatível
Longi –
compatível
41 44 % 58 % 72 % 87 % 64 % 72 %
40 34 % 77 % 79 % 51 % 39 % 78 %
39 32 % 46 % Não detect. Não detect. Não detect. 53 %
28 Não detect. 30 % 61 % 59 % 24 % 44 %
26 19 % 26 % 58 % 32 % 21 % 61 %
24 18 % 19 % 39 % 14 % 28 % 58 %
152
IV. Considerações finais
Psychotria nuda apresenta distilia, ou seja, a presença de duas formas florais
que possuem diferentes alturas dos estigmas e anteras. A condição morfológica
desta espécie está associada ao sistema heteromórfico de auto-incompatibilidade.
Estas observações foram encontradas em todas as populações já estudadas, ainda
que tenha ocorrido uma variabilidade nos parâmetros morfológicos. Essa condição
morfológica deveria promover a troca legítima de grãos de pólen entre as formas
florais e minimizar a autopolinização ou a deposição ilegítima de grãos de mesma
forma floral. Contudo, a deposição de grãos de pólen compatíveis e incompatíveis
sobre os estigmas, mostrou-se muito variável em FTij, tendo sido encontrada
grandes quantidades de grãos de pólen ilegítimos. Foi observada, também, a
ocorrência de crescimento clonal nas plantas estudadas. Ainda assim, esses dois
fatores não provocaram desvio no balanceamento de indivíduos de cada forma
floral, pois esta população apresenta isopletia. Esses resultados indicam que, apesar
de algumas dificuldades, tanto a heterostilia, quanto o sistema de auto-
incompatibilidade associado apresentam sucesso na população estudada.
A presença de uma diversidade de visitantes florais nesta população
certamente auxilia a manutenção da reprodução sexuada. As flores de P. nuda
possuem alguns recursos e atrativos florais, além da cor do cálice e da corola, que
são utilizados na atração destes visitantes, como a presença de nectários e a
possível presença de osmóforos. Através de estudos micromorfológicos foi
observada uma grande variedade de microtexturas na superfície das flores.
Entretanto, mais estudos são necessários para indicar se estas texturas,
especialmente as da corola, exercem alguma função na relação entre a flor de P.
nuda e seus polinizadores.
Ainda sobre a morfologia floral, foram encontradas não apenas características
macromorfológicas que diferem entre brevistilas e longistilas. Além de diferenças na
altura do estigma e no comprimento da corola, por exemplo, foram observadas
também algumas diferenças no tamanho das células epidérmicas do estigma e do
estilete entre as formas florais de P. nuda. A variação no comprimento das células
153
epidérmicas do estilete, provavelmente, está associada às diferenças na altura dos
estigmas, ainda que o alongamento das células em longistilas não seja o único fator
responsável pela maior altura do estigma nesta forma floral. As diferenças
micromorfológicas no tamanho das papilas estigmáticas e no comprimento das
células epidérmicas do estilete também foram registradas para outras espécies
heterostílicas. Sobre os grãos de pólen, variações no tamanho e a ornamentação da
exina, associadas a cada forma floral, já foram citadas para espécies heterostílicas.
Os diâmetros dos grãos de pólen e a ornamentação da exina se mostraram
distintos em cada forma floral de Psychotria nuda. Além disso, esta espécie
apresentou outras diferenças associadas aos grãos de pólen, como uma maior
quantidade de reservas energéticas em grãos de brevistila e a distinção entre os
perfis protéicos das duas formas florais. Nesta espécie, a presença de uma
quantidade maior de proteínas diferenciadas entre as formas florais em grãos de
pólen, quando comparado aos pistilos. Isso pode estar associado à hipótese de que
componentes importantes da matriz extracelular, formada entre o pólen e o estigma,
podem ser encontrados na secreção de estigmas úmidos, contudo, durante a
evolução de estigmas secos, estes componentes passaram a ser encontrados no
pólen (Dickinson, 1995, Lyew et al., 2007). A matriz extracelular formada entre o
pólen e o pistilo é responsável pelas importantes funções de adesão,
reconhecimento, hidratação e germinação do pólen. Como já foi sugerido para
outras espécies, em P. nuda, algumas das proteínas exclusivas de cada forma floral
podem estar associadas ao sistema heteromórfico de auto-incompatibilidade.
A deposição dos grãos de pólen sobre os estigmas de P. nuda em FTij se
mostrou muito variável. Contudo, comparando a porcentagem de frutos formados a
partir da polinização natural com as polinizações compatíveis manuais, foi
observado que esta variação não inibe a formação de frutos. As análises anatômicas
e ultraestruturais demonstraram que a interação entre os grãos de pólen e os
estigmas causa alterações apenas nas células do estigma que entraram em contato
direto com os grãos de pólen. As demais células não apresentam modificações.
Baseado nessas observações e em estudos sobre outras espécies, é possível
sugerir que a presença de tubos polínicos incompatíveis nos estigmas não impede a
formação dos tubos compatíveis em P. nuda.
A presença do sistema heteromórfico de auto-incompatibilidade foi
demonstrada de duas formas: pela frutificação, ou diminuição na produção de frutos,
154
após tratamentos de polinização manual; e pela observação de respostas de
incompatibilidade aos tubos polínicos durante a interação entre pólen e pistilo nas
duas formas florais. Durante as análises dos tubos polínicos compatíveis e
incompatíveis de Psychotria nuda foram observadas características de crescimento,
morfologia e citologia que se mostraram diferenciadas entre os tubos incompatíveis
de brevistilas e longistilas e entre esses e os tubos compatíveis de ambas as formas
florais. Essas respostas aliadas à variação nos perfis protéicos de pistilos
polinizados e não polinizados comprovam a hipótese de que cada forma floral
apresenta uma resposta de incompatibilidade diferenciada. E indicam, ainda, que
existe um mecanismo molecular que coordena a reação de incompatibilidade. Desta
forma, as diferenças morfológicas entre as formas florais não são responsáveis pela
ação do sistema heteromórfico de auto-incompatibilidade, conforme sugerido na
literatura (Dulberger, 1992; Lloyd e Webb, 1992).
A relação entre o tamanho do grão e a quantidade de reserva de grãos de
amido de cada forma floral e o maior crescimento de tubos polínicos legítimos
formados a partir do pólen brevistila podem ser fatores associados à necessidade de
formação da parede celular do tubo polínico em P. nuda. Porém, durante as
respostas de incompatibilidade, o crescimento dos tubos apresentou outras
características que interferem nas células do pólen que não parecem estar
relacionadas a uma deficiência na formação da parede celular. Apesar de serem
necessárias mais análises sobre a relação entre os amiloplastos e a formação de
vesículas, e entre essas e a formação da parede de tubos polínicos, os resultados
obtidos indicam que não há associação entre o tamanho e a quantidade de reservas
dos grãos de pólen e a reação da auto-incompatibilidade em P. nuda.
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