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ERON FÁBIO MIRANDA
A INFLUÊNCIA DO AZUL DE METILENO NA CICATRIZAÇÃO DE
ANASTOMOSES INTESTINAIS SUBMETIDAS À ISQUEMIA E
REPERFUSÃO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Clínica Cirúrgica da Pontifícia
Universidade Católica do Paraná, como
requisito parcial para a
obtenção do título de Mestre em Medicina.
Orientador: Prof. Dr. Fernando Hintz Greca
Coordenador: Prof. Dr. Luiz Carlos Von Bahten
CURITIBA
2006
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2
Miranda, Eron Fábio
A influência do azul de metileno nas anastomoses intestinais
submetidas à isquemia e reperfusão / Eron Fábio Miranda. –
Curitiba, 2006.
xi, 76f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Fernando Hintz Greca.
Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em
Clínica Cirúrgica da Pontifícia Universidade Católica do Paraná.
1.Cicatrização de feridas. 2.Isquemia intestinal. 3.Reperfusão.
4.Azul de metileno. I.Título.
NLM WI 400
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3
A verdadeira ciência descobre Deus
à espera atrás de cada porta
.
Papa Pio XII
4
Aos meus pais maravilhosos, Liége e Renato,
pelo exemplo de humildade e perseverança. Fica a lição de
que nada na vida se conquista sem o devido sacrifício.
5
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Luiz Carlos Von Bahten, pela oportunidade de estar entre o grupo de
mestrandos do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia da Pontifícia Universidade
Católica do Paraná. Agradeço o exemplo profissional e pessoal na época da residência em
Cirurgia Geral, o qual foi fundamental para minha formação.
Ao Prof. Dr. Fernando Hintz Greca, pela oportunidade concedida de atuar na linha de
pesquisa de um profissional tão respeitado nacional e internacionalmente.
Ao Prof. Dr. João Carlos Repka, pela maneira contagiante de transmitir conhecimento na
pesquisa científica. Minha sincera gratidão à sua dedicação nas oportunidades em que
atuamos juntos.
À Prof.ª Dr.ª Maria Cristina Sartor, pelos conhecimentos a mim transmitidos na vida
acadêmica e pela preocupação com a minha colocação profissional, concedendo-me a honra
de hoje sermos colegas de trabalho e grandes amigos.
Ao Prof. Dr. Renato Araújo Bonardi, a quem agradeço o primeiro contato e o despertar do
interesse pela coloproctologia. Agradeço por toda a sua dedicação com respeito à minha
formação durante a residência médica. Sua postura e conhecimento como professor e
médico servirão de exemplo para toda a minha vida.
6
Ao Prof. Dr. Zacarias Alves de Souza Filho, pelo exemplo de honestidade, decência
profissional e seriedade. Minha grande admiração.
Ao Prof. Dr. Iwan Augusto Colaço, pelo exemplo de dedicação à formação dos seus
residentes e da humanidade ao tratar os pacientes.
Aos Médicos do Hospital Universitário Cajuru, pela diversidade de conhecimentos a mim
transmitidos.
Aos Médicos do Hospital Erasto Gaertner, pela rigorosa e eficiente orientação profissional
e acadêmica.
À Prof.
a
Dr.
a
Lúcia Noronha pela sua valiosa ajuda na histologia e sugestões pertinentes.
Ao Dr. Luiz Roberto Kotze, pelo apoio na leitura das lâminas de histologia.
Ao Acadêmico de medicina Michel Risnic Rubin, pelo valoroso auxílio na extenuante fase
experimental do trabalho.
7
À Prof.
a
Márcia Olandoski pela disponibilidade e competência na realização do estudo
estatístico.
Ao Dr. Norton Luiz Nóbrega, colega de profissão e amigo, exemplo de honestidade e
dedicação ao próximo, por toda ajuda, cumplicidade e incentivo.
Ao Dr. Fábio Henrique de Carvalho, pela seriedade e competência profissional.
Aos Funcionários da Disciplina de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da
Pontifícia Universidade Católica do Paraná: Sra. Rosana Nunes Ferreira, Sr. Álvaro
Roberto Gonçalves Machado, Sr. Daniel Fidler e Sr Misael Barbosa. Agradeço por toda a
presteza, experiência e paciência a mim dedicados. Meu sincero respeito.
Aos Funcionários da Patologia Experimental da Pontifícia Universidade Católica do
Paraná, em especial à Farmacêutica Ana Paula Camargo Martins e à Estagiária Milena
Covalezuk.
Ao Dr. Indalécio Mainardes Sutil, médico veterinário responsável pelo Biotério da
Pontifícia Universidade Católica do Paraná, por toda a ajuda na obtenção dos animais de
experimentação e pelos cuidados dedicados aos mesmos.
8
À Prof. Orésia Gérios por sua ajuda na correção ortográfica e pelas orientações na
compreensão da língua portuguesa.
À Bibliotecária Aurea Maria Costin pela presteza na verificação das normas adotadas neste
estudo.
Às pessoas com quem convivi durante este período, pela paciência e compreensão a mim
dedicadas nos momentos de estresse e de ausência.
9
SUMÁRIO
LISTA DE QUADROS............................................................................... ix
LISTA DE FIGURAS................................................................................. x
RESUMO.................................................................................................. xi
ABSTRACT xii
1 INTRODUÇÃO..........................................................................................
1.1 OBJETIVO..........................................................................................
01
05
2 REVISÃO DA LITERATURA....................................................................
2.1 CICATRIZAÇÃO GASTROINTESTINAL............................................
2.2 MECANISMOS DE LESÃO PELA ISQUEMIA-REPERFUSÃO.........
2.3 ANASTOMOSES INTESTINAIS E ISQUEMIA-REPERFUSÃO.........
2.4 ESTRATÉGIAS PROTETORAS CONTRA OS DANOS DECORRENTES
DA ISQUEMIA-REPERFUSÃO INTESTINAL.................
2.5 AZUL DE METILENO.........................................................................
06
07
09
13
15
18
3 MÉTODOS................................................................................................ 22
3.1 ANIMAL DE EXPERIMENTAÇÃO.....................................................
3.1.1 Caracterização da Amostra.......................................................
3.1.2 Ambiente de Experimentação...................................................
3.1.3 Organização dos Grupos de Estudo.........................................
3.1.4 Anestesia..................................................................................
3.1.5 Preparo da Pele e Posicionamento da Mesa............................
3.1.6 Laparotomia..............................................................................
3.1.7 Procedimento............................................................................
3.1.8 Laparorrafia...............................................................................
3.1.9 Pós-operatório..........................................................................
3.1.10 Eutanásia................................................................................
23
23
23
24
24
24
24
25
25
26
26
3.2 AVALIAÇÃO MACROSCÓPICA.......................................................
3.2.1 Anastomoses Intestinais..........................................................
3.2.2 Estudo Tensiométrico...............................................................
27
27
27
3.3 AVALIAÇÃO MICROSCÓPICA........................................................ 28
3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA.................................................................... 29
4 RESULTADOS.........................................................................................
4.1 O MODELO ANIMAL.........................................................................
4.2 AVALIAÇÃO MACROSCÓPICA........................................................
4.3 AVALIAÇÃO MICROSCÓPICA..........................................................
4.3.1 Avaliação da inflamação.........................................................
4.3.1.1 Células polimorfonucleares.........................................
4.3.1.2 Edema.........................................................................
4.3.1.3 Congestão vascular....................................................
4.3.1.4 Células monomorfonucleares.....................................
4.3.1.5 Tecido da granulação.................................................
4.3.1.6 Fibrose........................................................................
4.3.2 Avaliação do colágeno.............................................................
30
31
31
34
34
38
39
40
41
42
43
45
5 DISCUSSÃO............................................................................................. 48
6 CONCLUSÕES......................................................................................... 55
7 REFERÊNCIAS ....................................................................................... 57
10
NORMAS ADOTADAS................................................................................ 75
11
LISTA DE QUADROS
Quadro 1- Variáveis usadas para estabelecer o escore final quanto à
inflamação..............................................................................
28, 34
Quadro 2- Avaliação macroscópica nos grupos de estudo .................. 32
Quadro 3- Resultados dos testes aplicados na comparação entre os grupos-
avaliação macroscópica.............................................
33
Quadro 4- Análise dos parâmetros inflamatórios com seus respectivos
escores nos grupos de estudo............................
35
Quadro 5- Valores médios e análise estatística dos parâmetros inflamatórios
para os grupos de estudo.................................
35
Quadro 6- Avaliação microscópica nos grupos de estudo-análise da
inflamação..............................................................................
44
Quadro 7- Estatística descritiva do colágeno dos grupos em
estudo.....................................................................................
46
12
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Aspecto das alças intestinais após injeção de azul de metileno e
desclampeamento....................................................
26
Figura 2- Fotomicrografia da área de anastomoses com coloração pela
hematoxilina-eosina (x-40).......................................................
36
Figura 3- Representação gráfica dos valores médios dos parâmetros
inflamatórios para os grupos de estudo..................................
37
Figura 4- Representação gráfica do escore das células polimorfonucleares nos
grupos de estudo...............................
38
Figura 5- Representação gráfica do escore do edema nos grupos de
estudo........................................................................................
39
Figura 6- Representação gráfica do escore de congestão vascular nos grupos de
estudo......................................................................
40
Figura 7- Representação gráfica do escore das células monomorfonucleares nos
grupos de estudo.............................
41
Figura 8- Representação gráfica do escore de tecido de granulação nos grupos
de estudo................................................................
42
Figura 9- Representação gráfica do escore de fibrose nos grupos de
estudo.......................................................................................
43
Figura 10- Representação gráfica do escore do colágeno Tipo I nos grupos de
estudo......................................................................
45
Figura 11- Representação gráfica do escore do colágeno Tipo III nos grupos de
estudo......................................................................
45
Figura 12- Fotomicrografia da área de anastomoses de animal do grupo azul de
metileno (picrus sirius x200).........................................
47
13
RESUMO
Introdução: A isquemia intestinal é uma das mais sérias alterações intra-abdominais, com
morbidade e mortalidade extremamente elevadas. A reoxigenação dos tecidos isquêmicos,
fundamental para o reparo tecidual, produz eventos inflamatórios deletérios, com
conseqüências mais sérias que a isquemia propriamente dita. O azul de metileno, pela sua
ação como inibidor da formação de radicais livres, poderia interferir favoravelmente no
processo de cicatrização. Objetivo: Avaliar experimentalmente a influência do azul de
metileno nas anastomoses intestinais de ratos submetidos à isquemia e reperfusão.
Métodos: Utilizaram-se 45 ratos Wistar, machos, divididos em 3 grupos: controle, grupo
isquemia sem o uso de azul de metileno e grupo isquemia com o uso de azul de metileno.
Foram submetidos a laparotomia, com identificação e isolamento da artéria mesentérica
cranial. Nos animais do grupo controle foi realizada enterotomia e anastomose intestinal
sem nenhuma lesão prévia, enquanto nos grupos 2 e 3 ocorreu oclusão temporária,
segmentar da artéria mesentérica cranial pelo tempo de 45 minutos. Passado tal período,
foram instilados na cavidade peritoneal 2ml de azul de metileno a 0,5% estéril no grupo 2 e
2ml de solução salina isotônica estéril no grupo 3. Após a reperfusão, foi realizada
enterotomia e anastomose intestinal, como no grupo controle. Realizou-se a eutanásia no
7.º dia de pós-operatório, com anotações sobre alterações na cavidade abdominal e aferição
das aderências perianastomóticas. A área da anastomose foi então ressecada para tomada de
pressão de ruptura e estudo histopatológico. Resultados: Houve um óbito no grupo
controle e seis óbitos nos grupos experimento. Devido ao grande número de aderência
perianastomóticas, a tomada da pressão de ruptura só foi possível num número reduzido de
casos. A presença de líquido livre ou abscesso na cavidade peritoneal foi raramente
observada. Na avaliação da inflamação, entre os três grupos, o da isquemia sem o uso do
azul de metileno apresentou escore mais elevado para as células monomorfonucleares
(p=0,021) e tecido de granulação (p=0,044), em relação ao grupo controle e ao da isquemia
com o uso do azul de metileno. Na comparação dos níveis de colágeno Tipo I e III não
houve diferença significante. Conclusão: Observou-se maior freqüência de aderências
perianastomóticas nos ratos submetidos à isquemia e ao uso do azul de metileno. Em
relação aos parâmetros analisados, não foi possível afirmar efeito benéfico do azul de
metileno na cicatrização das anastomoses intestinais submetidas à isquemia e reperfusão..
DESCRITORES: 1.Cicatrização de Feridas. 2.Isquemia Intestinal. 3.Reperfusão
4.Azul de Metileno.
14
ABSTRACT
Introduction: Intestinal ischemia is one of the most serious intra-abdominal alterations and
reflects extremely elevated morbidity and mortality. Re-oxygenation of the ischemic tissue,
fundamental in tissue repair, produces deleterious inflammatory events with consequences
even more severe than the ischemia itself. Methylene blue, due to its action as an inhibitor
of free-radical formation, can favorably interfere in the scarring process. Objective: To
experimentally evaluate the influence of methylene blue in the intestinal anastomoses of
rats after ischemia and reperfusion.Methods: We utilized 45 male Wistar rats, divided into
3 groups: control, ischemia group without the use of methylene blue, and the ischemia
group using methylene blue. The rats underwent laparotomy, identifying and isolating the
mesenteric cranial artery. The animals in the control group underwent enterotomy and
intestinal anastomoses with no prior lesion, while those in groups 2 and 3 underwent
temporary occlusion and segmenting of the cranial mesenteric artery for 45 minutes. After
this period, 2 ml of sterile methylene blue at 0.5% were injected into the peritoneal cavity
of the rats in groups 2. In group 3, 2 ml of sterile isotonic saline solution were instilled.
After reperfusion, enterotomy and intestinal anastomoses were performed as in the control
group. On the seventh day alterations in the abdominal cavity were noted, perianastomotic
adherences were verified, and the animals were subsequently sacrificed. The area of
anastomoses was then resected to measure rupture pressure and for histopathological study.
Results: There was one death in the control group and six in the experimental groups. Due
to the great number of perianastomotic adherences, the measurement of rupture pressure
was only possible in a small number of cases. The presence of free liquid or abscess in the
peritoneal cavity was rarely observed. In the evaluation of inflammation, among the three
groups, that of ischemia without methylene blue presented higher scores for mono-
morphonuclear cells (p=0.021) and granulation tissue (p=0.044), with respect to the control
group and the ischemia groups using methylene blue. Comparing type I and type III
collagen levels, there was no significant difference.Conclusion: A greater frequency of
perianastomotic adherences was observed in the rats having undergone ischemia using
methylene blue. With respect to the parameters analyzed, it was not possible to confirm
beneficial effects of methylene blue in the scarring of the intestinal anastomoses after
ischemia and reperfusion.
Key Words: tissue scarring, intestinal ischemia, reperfusion,
methylene blue.
15
1 INTRODUÇÃO
16
A isquemia mesentérica aguda é uma das mais sérias alterações intra-
abdominais, com morbidade e mortalidade extremamente elevadas. Ocorre após
súbita redução do fluxo sangüíneo intestinal e, desde que suficientemente intensa
e prolongada, causa necrose do intestino
1
.
A incidência de tal fenômeno tem aumentado substancialmente nas
últimas décadas
1-3
. Este incremento se deve ao aumento do número de pacientes
idosos com doenças cardiovasculares, mantidos estáveis em decorrência dos
avanços farmacológicos e terapêuticos. Assim sendo, muitos pacientes que
anteriormente poderiam ir a óbito, hoje, sobrevivem, porém com a possibilidade de
desenvolvimento de isquemia mesentérica.
Em crianças e neonatos, a isquemia intestinal afeta o prognóstico de
muitas doenças, como na enterocolite necrotizante, na má rotação intestinal, no
volvo e no estrangulamento ileal. Representa grande empecilho ao sucesso dos
transplantes intestinais
4
.
A interrupção do fluxo sangüíneo intestinal pode ser causada por embolia,
trombose ou ser da forma não oclusiva. A sobrevida varia de acordo com a
doença responsável envolvida: nos casos da embolia, a taxa de mortalidade é de
50%, sendo de 95% nos pacientes com trombose, 67% na isquemia mesentérica
não oclusiva e de 30% nas tromboses venosas mesentéricas
5
. O prognóstico
depende da presença e da extensão do infarto intestinal
6
.
Com a melhor compreensão da fisiopatologia da isquemia mesentérica,
desenvolveram-se novos métodos de tratamento, como as técnicas de cateterismo
percutâneo, usadas tanto para diagnóstico, como para tratamento. Devido a tais
avanços, houve aumento das indicações operatórias, com intervenções muitas
vezes mais precoces, levando à melhoria das taxas de mortalidade. A abordagem
da isquemia mesentérica, quando feita em conjunto com profissionais de
diferentes especialidades: clínico, radiologista intervencionista, cirurgião e
intensivista, leva à melhor sobrevida
7
.
17
O intestino recebe 20% do débito cardíaco no repouso e 35% no período
pós-prandial. Desta quantidade, 70% irriga a mucosa intestinal. Normalmente,
ocorre auto-regulação esplâncnica, a qual atua no metabolismo e no relaxamento
miogênico das arteríolas, o que assegura que a perfusão seja mantida dentro de
toda a gama de variação de pressão sistêmica
8,9
.
No jejum, apenas um entre cinco capilares mesentéricos é mantido
patente. No nível de 70mmHg, a pressão arterial conserva uma relação linear com
a pressão sistêmica, o que mantém a viabilidade tissular. Abaixo de 40mmHg,
ocorre falha no mecanismo compensatório e o intestino torna-se progressivamente
mais isquêmico. O metabolismo anaeróbio toma lugar do aeróbio. A lesão passa,
então, a ser de acordo com a duração e da extensão anatômica da isquemia
8,9
.
Dentro de 15 minutos de absoluta isquemia, há dano estrutural nas
vilosidades. Após três horas ocorre necrose da mucosa intestinal. Mesmo neste
estado, com restabelecimento do fluxo sangüíneo, pode ocorrer regeneração e
formação de novo epitélio nas criptas. Após seis horas de isquemia, ocorre
progressão da necrose para toda a parede intestinal. Nesta fase, sem intervenção
cirúrgica, ocorrerá perfuração intestinal, sepse e falência de múltiplos órgãos. Nos
quadros menos graves de isquemia, especialmente quando localizada, pode
ocorrer reparo tecidual e a formação de estenose
10
.
A apresentação do quadro clínico no início da enfermidade é inespecífica,
o que leva comumente à demora em se fazer o diagnóstico. A natureza e a
rapidez do processo de isquemia é afetada pela integridade da circulação colateral
e por desordens da circulação esplâncnica. A primeira ocorre de diversas formas e
em pontos anatômicos dentro do sistema gastrointestinal: por meio das arcadas
secundárias e terciárias do intestino delgado, da artéria marginal de Drummond e
da arcada de Riolan (ligação entre a artéria cólica médica e artéria cólica
esquerda), da artéria de Moscowitz (ligação entre a artéria cólica média e o ramo
ascendente da artéria cólica esquerda), da arcada de Bühler (ligação entre o
tronco celíaco e a artéria cólica média), assim como na rede de vasos sangüíneos
submucosos que existem ao longo do intestino
11
.
18
Na presença de doença associada, como a aterosclerose, a auto-
regulação pode tornar-se deficitária, mesmo na presença de pressão arterial
sistêmica normal. Os efeitos combinados do tônus do sistema nervoso simpático e
das catecolaminas circulantes (endógenas ou exógenas), da ação dos receptores
alfa, do sistema renina-angiotensina, da vasopressina, dos tromboxanos e dos
leucotrienos, assim como drogas, podem induzir vasoespasmo e isquemia
intestinal na ausência de oclusão arterial, mesmo com circulação colateral
desenvolvida
11
.
Muitas vezes é possível restaurar a circulação, sem a necessidade de
extensas ressecções das alças intestinais. A oxigenação dos tecidos isquêmicos é
fundamental para o reparo tecidual, restaurando o suporte energético e
removendo os metabólitos tóxicos. Porém, paradoxalmente, a reperfusão dos
tecidos isquêmicos produz eventos inflamatórios, os quais lesam os tecidos
12
,
com conseqüências mais sérias que a isquemia propriamente dita
13
.
O mecanismo específico de dano tecidual ainda permanece discutível.
Tem sido relatado o aumento da permeabilidade vascular e da leuco-
seqüestração, além das próprias lesões das mucosas
14
. A xantina-oxidase é uma
enzima citoplasmática (molibdoproteína) conhecida por seu envolvimento no
catabolismo das purinas
15
. A oxidação da hipoxantina e da xantina em ácido úrico
pela xantina oxidase é acompanhada pela redução do oxigênio molecular a
superóxido. Esta reação gera radicais livres de oxigênio
16
, os quais têm papel
importante como mediadores da lesão de reperfusão
12
.
Em situações normais, existe a xantina-desidrogenase intracelular e
quando ocorre a isquemia, a mesma é lançada na circulação e transforma-se em
xantina-oxidase por proteólise. Com a reperfusão, o oxigênio torna-se disponível e
ocorre a oxidação dos metabólitos por meio da xantina-oxidase. Isto provoca
degradação dos metabólitos que reagiram com o oxigênio, causando lesão
tissular. Tal reação, além de afetar localmente o intestino, atinge outros órgãos à
distância
17
, o que pode contribuir para a falência de múltiplos órgãos.
19
O efeito local da isquemia-reperfusão nas anastomoses intestinais foi
avaliado em vários estudos. Foi demonstrado que a cicatrização é pior nos
segmentos submetidos à agressão por isquemia-reperfusão
18,19
em decorrência
do aumento do processo inflamatório que já ocorre normalmente pelo trauma
cirúrgico, na área da anastomose, somado ao evento próprio da isquemia-
reperfusão. Torna a resposta inflamatória exagerada, leva a colagenólise na área
perianastomótica e compromete sobremaneira a cicatrização
18
.
Para prevenir a formação de radicais livres de oxigênio, várias substâncias
têm sido investigadas, sendo a inibição da xantina-oxidase uma delas. O
alopurinol, o mais conhecido inibidor da xantina-oxidase, é comprovadamente um
agente eficaz
20-22
. Esse análogo da purina compete com o sítio de purina da
enzima.
O azul de metileno apresenta-se como outra substância a ser utilizada, por
ser pouco tóxico, solúvel em água e aprovado para uso humano
23
. É consenso
que esta substância faça parte de uma nova classe de drogas antioxidantes as
quais inibem, por competição, a formação dos radicais livres de oxigênio, agindo
com se fosse um receptor alternativo de elétrons da xantina-oxidase
24
. Pares de
elétrons de cada oxidação enzimática são transferidos para o azul de metileno a
partir do centro ferro-sulfúrico da xantina-oxidase, inibindo a conversão do
oxigênio e a formação de radicais superóxido.
Existe a possibilidade do azul de metileno, por sua ação como inibidor da
formação dos radicais livres, interferir favoravelmente no processo de cicatrização
das anastomoses intestinais. Justifica-se a utilização de tal substância pelo
potencial de minimizar as complicações pós-operatórias decorrentes da isquemia-
reperfusão.
1.1 OBJETIVO
Avaliar a influência do azul de metileno na cicatrização das anastomoses
intestinais submetidas à isquemia e reperfusão.
20
2 LITERATURA
21
2.1 CICATRIZAÇÃO GASTROINTESTINAL
Afecções sistêmicas graves comumente afetam a função gastrointestinal,
de modo a interferir na motilidade, na absorção e na função de barreira. Severas
alterações vasculares locais levam à lesão tecidual e ao comprometimento do
processo de cicatrização. Muitas vezes, faz-se necessária a realização de
anastomose em tais áreas, o que aumenta as chances de complicações. Em
situações eletivas, dentro de condições ideais, falhas na anastomose acontecem
em 3% a 5% dos casos. Em situações emergenciais, como no trauma, na
isquemia e na perfuração, as complicações podem se sobrepor, umas às outras
com grande aumento na morbi-mortalidade
25
.
O resultado da lesão tecidual é o desencadeamento de complexa
cascata de eventos bioquímicos e celulares, formando cicatriz, embora imperfeita,
mas mecanicamente eficaz. A submucosa é extremamente importante, uma vez
que suporta os pontos de sutura. É formada por tecido conjuntivo, o qual contém a
maioria das matrizes protéicas.
Embora a cicatrização do sistema gastrointestinal siga as mesmas fases
da cicatrização da pele, o conhecimento desses eventos é mais limitado
26
. A
composição da matriz protéica é diferente à da pele, pois contém grande
quantidade de colágeno tipo I e menos do tipo III, além de conter também
colágeno V. As células musculares lisas são as produtoras predominantes de
matrizes protéicas. A submucosa é ricamente vascularizada, com plexos arteriais,
venosos e rede de linfáticos. A muscular própria é composta por duas faixas de
musculatura lisa: circular e longitudinal. A serosa contém células mesoteliais
22
dispostas em uma fina faixa de células mesenquimais e matriz, sendo
intensamente vascularizada.
A cicatrização gastrointestinal é didaticamente dividida três fases:
inflamação, proliferação e maturação tecidual, embora exista sobreposição entre
as mesmas
27
. Se a mucosa for a única camada lesada, pode haver recuperação
da mesma por meio da migração e proliferação. Quando ocorre lesão tecidual
mais extensa, há resposta fibroblástica e formação de cicatriz.
A fase inflamatória ocorre logo após a agressão e é caracterizada por
infiltração celular e edema, normalmente confinada à submucosa e que dura cerca
de duas semanas. Os granulócitos são predominantes nas primeiras 24 horas e os
macrófagos nas 48 horas subseqüentes. A Angiogênese inicia dois a três dias
após a agressão
28
. Fibroblastos e principalmente células musculares lisas
começam a produzir matriz protéica, inicialmente na submucosa e na subserosa.
As células musculares lisas contribuem mais para a formação absoluta do
colágeno do que propriamente os fibroblastos.
A recuperação da mucosa é rápida e acontece dentro de uma semana. Se
a lesão for severa, com destruição tecidual e proliferação bacteriana, os eventos
podem ser mais pronunciados e demorados. Após uma a duas semanas, a
barreira epitelial é totalmente restabelecida , com formação granulomatosa devida
à proliferação de fibroblastos e musculatura lisa
29
. A reconstituição da rede de
colágeno é de suma importância à regeneração epitelial. Durante a reparação, a
anastomose torna-se mais fina, todavia a muscular da mucosa e a muscular
própria permanecem desorganizadas, o que permite o reconhecimento do local da
cicatriz por até um ano após a lesão inicial
30
.
23
2.2 MECANISMOS DE LESÃO PELA ISQUEMIA-REPERFUSÃO
A primeira manifestação do processo isquêmico é o aumento da
permeabilidade capilar e a formação de edema. À medida que o dano é mais
pronunciado, ocorre quebra de enzimas citoplasmáticas na circulação, com
alterações teciduais graves, destruindo-os. Nos tecidos isquêmicos reperfundidos
há abundante produção de radicais livres de oxigênio, agravando ainda mais os
danos iniciais da isquemia
17
.
Radical livre é uma molécula que, por conter número ímpar de elétrons,
tem capacidade de ligação, o que lhe confere possibilidade de reação química. Se
dois radicais reagem, ambos são eliminados. Se um radical reage com um não
radical, disso pode surgir um radical livre. Tal característica capacita os radicais
livres a participar de reações em cadeia, que podem ser milhares. A peroxidação
de ácidos graxos insaturados pelo oxigênio molecular pode ser iniciada por um
radical livre. Radicais podem servir como oxidantes ou redutores.
Como os tecidos isquêmicos tornam-se hipóxicos e até anóxicos, segundo
Mc Cord
17
, existe razão para crer que na isquemia há metabolismo aberrante do
oxigênio ou ocorre elevada produção de radicais livres de oxigênio, como os
superóxidos e as hidroxilas. A maneira como a peroxidação lipídica contribui para
os danos causados por infarto e reoxigenação protegida pelos varredores de
radicais livres, levou a Meerson et al.
31
a propor a existência de um metabolismo
de radicais livres de oxigênio na lesão isquêmica cardíaca. Haglund e Lundgren
32
mencionaram que parte substancial da lesão ocorre pela reperfusão pós-
isquêmica, no momento em que o oxigênio molecular é reintroduzido no tecido
isquêmico.
Os mediadores estudados no mecanismo de lesão da isquemia-reperfusão
intestinal são os seguintes: xantina-oxidade
33-37
, endotelinas
38-40
, proteínas de
choque quente
41-46
, neutrófilos polimorfonucleares
47-62
, óxido nítrico
63-79
, heme
oxigenase
80-92
, citocinas pró-inflamatórias
93-100
, complemento
101-106
e ferro
107,108
.
24
A maior fonte de superóxidos é a enzima xantina-oxidase, tendo sido a
primeira fonte biológica de radical superóxido documentada
109
. A xantina-oxidase
é uma complexa molibdoflavoproteína, participante do catabolismo das purinas na
maioria das células
15
.
A xantina-oxidase é distribuída em vários tecidos, mas é no intestino, no
fígado e nos pulmões onde se encontram as mais ricas fontes, na maioria das
espécies. A enzima é sintetizada como xantina-desidrogenase, forma presente em
90% dos tecidos saudáveis, e a conversão para xantina-oxidase ocorre nos
tecidos isquêmicos
52
. O mecanismo proposto para tal conversão é que a
diminuição do fluxo sangüíneo tecidual é suficiente para limitar a disponibilidade
do oxigênio para a produção de adenosina trifosfato (ATP). Como diminui a carga
de energia das células, a capacidade de manutenção dos gradientes iônicos entre
as membranas celulares atenua e ocasiona a redistribuição dos íons cálcio. A
concentração plasmática elevada de cálcio ativa uma protease capaz de converter
desidrogenase em oxidase. Concomitantemente, a depleção do ATP celular
resulta em alta concentração de adenosina monofosfato (AMP). O AMP é
metabolizado em adenosina, inosina e em seguida em hipoxantina. A hipoxantina,
assim como a xantina, funciona como substrato da purina para a xantina
desidrogenase e oxidase. Durante a isquemia, uma nova atividade enzimática
ocorre e na reperfusão, o oxigênio molecular serve como substrato para a ativação
da xantina-oxidase, seguida por uma explosão na produção de radicais superóxido
e hidroxila
109
.
Sackler
111
descreveu que a mucosa intestinal contém a mais alta
concentração de xantina-desidrogenase que qualquer outro tecido. Além do mais,
a mucosa intestinal é provavelmente o tecido com maior sensibilidade à lesão
isquêmica.
Jarasch et al.
112
estudaram a função biológica da xantina-oxidase nas
células endoteliais capilares. Pesquisaram que tal enzima torna-se atuante quando
há lesão na célula endotelial, quer seja por ataque microbiano, quer por outros
efeitos externos que fazem a ativação da enzima na corrente sangüínea,
25
transformando da forma inofensiva desidrogenase, para a perigosa forma oxidase,
quando em contato com oxigênio. Neste estudo, encontraram aumento da
concentração de anticorpos xantina-oxidase específicos em todos os humanos
testados, sugerindo genericamente, que a formação de tais anticorpos aconteça
por auto-imunização dos capilares, talvez induzido por múltiplas pequenas lesões
no endotélio. Não explicaram o mecanismo pelo qual o sistema imunológico
mantém níveis altos de auto-anticorpos e não adquire tolerância imunológica à
xantina-oxidase.
Poggetti et al.
113
demonstraram que a isquemia-reperfusão intestinal causa
simultaneamente disfunção hepática e pulmonar e que os neutrófilos ativados têm
papel fundamental nesse processo. A xantina-oxidase é aceita como a maior fonte
de metabólitos reativos do oxigênio, gerados durante a reperfusão, estando a
mesma presente na mucosa intestinal e no endotélio vascular
112-114
. A importância
dos neutrófilos na lesão pela reperfusão é bem destacada e a aderência dos
mesmos ao endotélio apresenta-se como um segundo passo necessário. A
interação entre as células endoteliais e os polimorfonucleares parece amplificar a
produção dos metabólitos ativos do oxigênio e esses polimorfonucleares
seqüestrados e aderidos na microvasculatura contribuem para a isquemia
115
.
Polimorfonucleares ativos também liberam proteases e elastases, as quais
causam danos adicionais. O exato mecanismo desencadeante do recrutamento
dos polimorfonucleares é incerto.
A conversão da xantina-desidrogenase para xantina-oxidase foi bem
observada em células endoteliais quando as mesmas são expostas a
polimorfonucleares ativados. Isto sugere que uma determinada agressão que ative
polimorfonucleares circulantes deva provocar uma interação remota
polimorfonucleares-células endoteliais que gera metabólitos ativos do oxigênio,
reação dependente da xantina-oxidase ou nadph-oxidase (
β
-nicotinamide adenine
dinucleotide phosfate). Isso posto, as conseqüências da isquemia-reperfusão
podem ser evitadas pela depleção de polimorfonucleares ou pela inativação da
xantina-oxidase
115
.
26
Hakgüder et al.
116
comprovaram, com estudos radiológicos do intestino de
ratos que a isquemia-reperfusão altera a motilidade intestinal. Avaliaram também o
efeito da isquemia na microcirculação intestinal. Concluíram que com o uso do
alopurinol, no intuito de inibir a enzima xantina-oxidase, houve retorno do tempo
de trânsito gastroanal, semelhante ao grupo controle.
As endotelinas são potentes peptídeos vasoconstritores derivados do
endotélio vascular, as quais, pelo mecanismo de vasoconstrição, podem estar
envolvidas na isquemia intestinal
38-40
. Quando ocorre inibição das mesmas,
ocorre diminuição das lesões mucosas, aumento do fluxo sangüíneo e diminuição
da adesão leucocitária
117
.
As proteínas de choque quente são substâncias intracelulares que se
acumulam após a isquemia intestinal
41
.O exato mecanismo de ação protetora de
tais proteínas é incerto. O mecanismo mais provável seria pela inibição do
leucotrieno-b4 e subseqüente prevenção da ativação neutrofílica e da
quimiotaxia
45
.
Os polimorfonucleares também estão entre os possíveis mediadores
envolvidos na fisiopatologia da isquemia-reperfusão intestinal. Massberg et al.
51
mostraram que a primeira manifestação ocorrida na isquemia-reperfusão intestinal
é decorrente da interação dos leucócitos com as células endoteliais nas vênulas
submucosas.
O óxido nítrico é um radical livre e uma substância extremamente reativa.
É sintetizado a partir da L-arginina, de uma família de enzimas conhecidas por
óxido nítrico sintases
64
. Existem várias possíveis fontes de óxido nítrico no
intestino: no tecido intestinal intrínseco (epitélio, mastócitos, músculo liso e plexo
neural) e nos leucócitos (polimorfonucleares e monócitos)
67
. A atuação do óxido
nítrico ainda é controversa
68
.
A expressão da heme-oxigenase em vários modelos de isquemia-
repefusão intestinal tem mostrado efeito citoprotetor durante a cascata de eventos
da isquemia e reperfusão
80-83
. É uma enzima relacionada com a conversão do
heme, do monóxido de carbono e do ferro livre
84
. Exerce importância central na
27
manutenção da homeostase dos processos antioxidativos e oxidativos durante a
lesão celular
85
.
Os eventos bioquímicos precisos de interação da geração de radicais
livres e da secreção de mediadores inflamatórios pelas células endoteliais não são
bem entendidos. As proteínas pró-inflamatórias são provavelmente sintetizadas
pela influência do óxido nítrico
93
, mas seu mecanismo exato como mediadoras na
isquemia intestinal é incerto.
Vários autores têm sugerido o sistema complemento como o maior
resposável no entendimento da patogênese da isquemia-reperfusão intestinal
101-
104
. A ativação do sistema complemento leva a uma série de potentes eventos
inflamatórios, como a expressão do gene ICAM-1, ao aumento das citocinas do
fator alfa de necrose tumoral e das interleucinas
104
.
O ferro é uma substância aceleradora do processo de formação de
radicais livres. Durante a isquemia, metabólitos como o ácido lático, acumulam-se,
o que aumenta o ph intracelular. Isso desestabiliza as membranas lisossomais,
ativa enzimas de lise lisossômica, inibe a ligação do ferro com suas proteínas
carreadoras e torna o mesmo livre. O ferro, nessa condição, reage com a água e
gera a formação do deletério radical hidroxila
108
.
2.3 ANASTOMOSES INTESTINAIS E ISQUEMIA-REPERFUSÃO
A isquemia, muitas vezes, causa necrose de segmentos do intestino, os
quais se tornam inviáveis, exigindo ressecção. Sempre que possível, o objetivo é a
criação de anastomose na tentativa de restabelecer o trânsito intestinal da
maneira mais fisiológica possível. Porém, o intestino próximo ao ressecado,
aparentemente viável, pode ter sido submetido à isquemia transitória significativa,
o que pode alterar o processo de cicatrização.
Vários fatores são implicados no sucesso ou na falha do processo de
cicatrização das anastomoses intestinais. O suprimento sangüíneo e a oxigenação
28
das anastomoses são de suma importância e dependem da vascularização
intrínseca
26
. A falha de numerosos mediadores vasoativos, peptídeos endoteliais,
radicais livres de oxigênio e a ativação de leucócitos decorrentes da reperfusão
intestinal levam à disfunção endotelial, ao edema tecidual e ao não retorno do
fluxo sangüíneo, o que pode comprometer a perfusão anastomótica
118-120
.
Ponsky et al.
121
estudaram os efeitos da isquemia transitória nas
anastomoses intestinais de ratos submetidos à isquemia e reperfusão. Dividiram a
amostra em três grupos de animais, sendo um controle (sem isquemia), outro,
isquemia por 30 minutos e o terceiro, isquemia por 45 minutos. Os animais foram
submetidos à eutanásia no sétimo e décimo dia de pós-operatório, com tomada da
medida de pressão de ruptura das anastomoses. Não observaram diferença
significante entre os grupos.
Bergren et al.
122
avaliaram a eficácia da enzima superóxido-
dismutase, que age como um varredor de radicais livres, nas anastomoses
intestinais submetidas à isquemia segmentar e reperfusão. Dividiram os ratos em
três grupos de dez: um deles com anastomose sem isquemia; um segundo grupo
com isquemia e anastomose e um terceiro com isquemia, anastomose e
superóxido-dismutase. A eutanásia ocorreu após duas semanas. Tomadas as
medidas da pressão de ruptura, análise histológica e percentagem de sobrevida,
concluíram que o varredor de radicais livre superóxido-dismutase aumentou a
sobrevida e limitou a morbidade. Não foi observada alteração no processo de
cicatrização.
Segundo Demirogullari et al.
18
, apesar do grande número de trabalhos
referentes à cicatrização intestinal, não foram suficientemente estudados os
efeitos da isquemia-reperfusão nas anastomoses intestinais. Compararam as
anastomoses intestinais após isquemia, feitas em tempos diferentes durante o
período de reperfusão. Foram 30 ratos alocados em 5 grupos (quatro
experimentos e um controle). Realizaram clampeamento arterial intestinal por 40
minutos, com anastomose após 20 minutos, noventa minutos, seis horas e 24
horas após a reperfusão. Fez-se a eutanásia no quinto dia de pós-operatório, com
29
análise da pressão de ruptura e estudo histológico das anastomoses. Comentaram
que as anastomoses realizadas precocemente são mais resistentes que as feitas
tardiamente. A razão disso é incerta. Notaram maiores alterações na mucosa
intestinal quando a anastomose era realizada precocemente ( 20 e 90 minutos).
Udassin et al.
9
demonstraram dano aparente à mucosa intestinal após 10
minutos de reperfusão. Quase 80% deste dano desaparece após 6 horas e há
resolução completa após 12 horas de clampeamento transitório segmentar da
artéria mesentérica cranial do rato.
Kuzu et al.
19
pesquisaram o efeito da lesão por reperfusão na cicatrização
das anastomoses intestinais. Utilizaram 102 ratos, distribuídos em três grupos,
sendo um controle. Houve clampeamento da artéria mesentérica cranial num
grupo por 30 minutos, porém no terceiro grupo, realizaram o que chamaram de
isquemia profunda. Tal isquemia consistiu no clampeamentp de vasos sangüíneos
intestinais colaterais associado ao clampeamento da artéria mesentérica cranial.
Os animais de cada grupo foram submetidos à eutanásia no terceiro ou no sétimo
dia de pós-operatório, com avaliação da cicatrização da parede abdominal,
aderências intracavitárias, complicações anastomóticas, pressão de ruptura e local
da ruptura. Demonstraram que a isquemia-reperfusão impede a cicatrização
anastomótica, mas não houve diferença significante na cicatrização e nas
complicações entre os grupos de isquemia habitual e profunda.
2.4 ESTRATÉGIAS PROTETORAS CONTRA OS DANOS DECORRENTES DA
ISQUEMIA E REPERFUSÃO INTESTINAL
Várias modalidades terapêuticas têm sido utilizadas com sucesso na
atenuação dos danos decorrentes da isquemia–reperfusão em modelos animais.
São elas: pré-condionamento isquêmico, suplementação de óxido nítrico, terapia
anticomplemento, terapia antileucocitária, perfluorocarbonos, nutrição enteral,
suplementação de glutamina e de glicina e uso de antioxidantes.
30
O pré-condicionamento isquêmico é definido pela breve exposição de um
tecido a isquemia, com o objetivo de protegê-lo dos efeitos deletérios de uma
isquemia prolongada
123
. Tal fenômeno foi descrito pela primeira vez em 1986 no
coração canino
124
. Efeitos benéficos de tal modalidade foram demonstrados no
fígado
125
, no músculo esquelético
126
, no cérebro
127
, na coluna espinhal
128
, no
rim
129
, pulmão
130
, na retina
131
e no intestino
132-135
. A primeira descrição do pré-
condicionamento isquêmico no intestino foi feita por Hotter et al. em 1996
136
, o
que representou particular avanço no transplante intestinal
137
.
A suplementação de óxido nítrico demonstrou-se eficaz na atenuação da
isquemia-reperfusão em gatos e cães
138,139
. Demonstrou-se efeito benéfico pela
inalação de óxido nítrico em baixa concentração, dado pela profunda ação
antiaderência leucocitária
140
.
A terapia anticomplemento diminuiu significativamente os danos
decorrentes da isquemia-reperfusão, pela administração de um antagonista de
receptor de complemento (C5a) em ratos
102
. Tal antagonista inibiu a expressão do
fator alfa de necrose tumoral e conseqüentemente a lesão tissular.
Existem três estratégias conhecidas para atenuar a agressão leucocitária: -
inibição da ativação leucocitária; - inibição da síntese molecular de adesão
leucocitária e inibição da adesão leucócito-endotelia
141
. A ativação dos leucócitos
na isquemia-reperfusão intestinal é auxiliada por mediadores inflamatórios como o
leucotrieno b4, pelo fator ativador de plaquetas e pelo fator alfa de necrose
tumoral
56
. Estudos demonstraram que o uso de antagonistas do leucotrieno b4
142
,
de antagonistas do fator ativador de plaquetas
143,144
e de inibidores do fator alfa
de necrose tumoral
145
limitam a ativação leucocitária na isquemia-reperfusão
intestinal. Em relação à inibição da síntese molecular de adesão leucocitária pode-
se recorrer à transcripção de tais fatores que regulam a adesão leucocitária
146,147
.
A terceira estratégia, que consiste em limitar a adesão leucócito-endotélio, pode
ser obtida pelo uso de substâncias como alopurinol e superóido-dismutase
148
e
anticorpos monoclonais
149
.
31
Os perfluorocarbonos são moléculas hidrocarbônicas nas quais os átomos
de hidrogênio são substituídos por fluorina. Esses elementos têm a capacidade de
dissolver 20 a 25 vezes mais oxigênio do que o plasma, em temperatura ambiente.
A administração intraluminal de perfluorocarbonos oxigenados dentro do intestino
demonstrou-se benéfica quanto à preservação da integridade da mucosa, após
isquemia e reperfusão
150
.
A nutrição enteral comprovadamente reduz a morte e as lesões orgânicas à
distância em ratos
151
. A nutrição também mantém a imunidade mucosa e a
resistência contra infecções. Ratos mantidos com nutrição parenteral e sem
receber alimentação enteral tiveram os níveis de ICAM-1(intercelluar adhesion
molecule-1) e de P-seletina aumentados e, com isso aumentaram a atração de
polimorfonucleares para o intestino, em comparação com ratos submetidos a
nutrição enteral
152
. Além disso, a perda do aporte nutricional enteral altera os
níveis de interleucina–4 e de interleucina-10 na lâmina própria intestinal,
responsáveis por inibir a expressão endotelial do ICAM-1(intercellular adhesion
molecule-1)
153
.
A glutamina, que é considerada um aminoácido não essencial, torna-se
extremamente importante durante lesão severa
154
. É o aminoácido mais
abundante do plasma e da musculatura esquelética em condições normais, mas
seus níveis caem substancialmente após lesões ou operações
155
. Estudos
demonstraram que a suplementação de glutamina via enteral e parenteral diminuiu
a translocação bacteriana, atenuou colite experimental e melhorou a adaptação da
mucosa intestinal após ressecção intestinal
156,157
. Em modelos animais de
transplante intestinal, a glutamina melhorou a absorção de nutrientes e também a
função de barreira mucosa
158
. Ikeda et al.
159
, em modelo de isquemia-reperfusão
intestinal em ratos, demonstraram que a suplementação com glutamina melhorou
a integridade mucosa, pela preservação dos níveis de imunoglobulia-a nos
pulmões e no intestino, além de reduzir a expressão de ICAM-1 no intestino e a
adesão neutrofílica.
32
A glicina, outro aminoácido não essencial, protege o intestino da isquemia-
reperfusão
160-162
. A glicina é conhecida por seu efeito antiinflamatório,
imunomodulador e pelas funções citoprotetoras diretas
161-163
Em ratos, a
administração de 20% de glicina atenuou o dano à mucosa, preservou o conteúdo
protéico intestinal , reduziu a translocação bacteriana e aumentou a sobrevida
(160)
.
A glicina atua nas células inflamatórias como nos macrófagos, e suprime a
ativação de fatores de transcripção e a formação de radicais livres e de citocinas
inflamatórias
164
.
O corpo humano é dotado de uma série de antioxidantes naturais, mas,
infelizmente, não são capazes de proteger o organismo contra agressões mais
sérias, como na isquemia-reperfusão intestinal. Foram estudados vários tipos de
antioxidantes efetivos no combate aos danos decorrentes da isquemia-reperfusão
intestinal: alopurinol
165
, anti-trombina-III
166
, bilirrubina
92
, edavarone
91
, captopril
167
, ciclosporina
168
, desferrioxamine
169
, fator de crescimento epidérmico
170
,
glutamina
171
, melatonina
172
, n-acetil cisteína
144
, nitroglicerina
173
, piruvato
174
,
rapamicina
168
, sod
148
, trimetazidina
175
, verapamil
176
, vitamina C e vitamina E
177
,
e azul de metileno
178
.
2.5 AZUL DE METILENO
Há descrições do uso do azul de metileno no tratamento da tuberculose
urinária, da intoxicação por cianida, da metahemoglobinemia, da intoxicação por
nitrito, das infecções do trato urinário (apud Salaris et al.
24
) e do envenenamento
pelo herbicida Paraquat
23
.
O azul de metileno foi apontado originalmente como eliminador da
produção de superóxidos na presença do citocromo C e seu uso na lesão por
reperfusão por Mc Cord e Fridovich
179
e mais tarde por Kelner et al.
180
. Atua pela
competição com o oxigênio molecular para a transferência de elétrons pela
xantina-oxidase. Pares de elétrons de cada oxidação enzimática são transferidos
33
para o azul de metileno. Tal transferência de elétrons desvia seu fluxo do centro
ferro-sulfúrico enzimático, onde o oxigênio molecular é convertido em radicais
superóxido e então, a geração desses mediadores citotóxicos é atenuada
23,24
.
Esses últimos autores, revisando os mecanismos de ação do azul de metileno,
constataram a possibilidade de sua utilização na inibição de superóxidos nos
tecidos isquêmicos. Salaris et al.
24
, instigados por tais observações, avaliaram o
papel do azul de metileno como possível inibidor da produção de superóxido pela
xantina-oxidase. Propuseram que o azul de metileno poderia atenuar os efeitos da
lesão por reperfusão: se fosse dado um pré-tratamento (antes da isquemia), de
forma a atenuar o acúmulo de hipoxantina durante a isquemia ou se fosse
administrado azul de metileno logo após a isquemia-reperfusão, de maneira a
inibir a produção de superóxido. Apontaram que o mesmo exerce um efeito
antioxidante efetivo na isquemia-reperfusão.
Estudaram-se os efeitos do azul de metileno na síntese e nos efeitos
biológicos do óxido nítrico. Constatou-se ser o azul de metileno inibidor da óxido
nítrico sintase, a qual bloqueia o relaxamento da musculatura lisa endotelial
181
. O
óxido nítrico é sintetizado a partir da L-arginina. A vasodilatação mediada pelo
óxido nítrico é dependente da ativação da guanilil-ciclase e o azul de metileno foi
descrito como inibidor da guanilil-ciclase solúvel, tanto in vivo quanto in vitro
182
.
A produção aumentada de óxido nítrico tem papel central no
desenvolvimento do choque séptico. Keaney Jr et al.
183
avaliaram o efeito do azul
de metileno no choque séptico induzido pela administração de lipopolissacarídeos,
em coelhos e constataram que o mesmo reverte a hipotensão causada pela ação
das endotoxinas.
Zhang et al.
184
examinaram várias doses de azul de metileno na alteração
do fluxo sangüíneo e da viabilidade tecidual na circulação mesentérica, renal e
femoral, em cães submetidos a choque endotóxico. Doses baixas a moderadas
aumentaram significativamente a pressão arterial e doses baixas seletivamente
aumentaram o fluxo sangüíneo mesentérico. Quando usado em altas doses,
poderia ser potencialmente deletério por hipertensão pulmonar.
34
Estudos in vitro de isquemia, seguida de reoxigenação demonstraram que
o azul de metileno é efetivo na prevenção dos danos causados, pelos radicais
livres de oxigênio, ao fígado e aos rins
24
. Galili et al.
14
investigaram os efeitos do
azul de metileno na lesão pulmonar causada pela reperfusão após isquemia
intestinal. Notaram que, após uma hora de oclusão da artéria mesentérica cranial,
a reperfusão induziu à lesão pulmonar, manifestada por edema intersticial e
alveolar, além de seqüestro de neutrófilos. Concluíram que o azul de metileno
atenuou tais lesões, com efeito protetor no tecido pulmonar.
Peter et al.
185
, com o objetivo de prevenir encefalopatia induzida pelo
quimioterápico ifosfamida, avaliaram a farmacocinética e a distribuição do azul de
metileno oral e intravenoso. O azul de metileno é utilizado de rotina na prevenção
e tratamento de tal complicação, embora o mecanismo e o sítio de ação
permaneçam incertos. Verificaram que é bem absorvido pelo sistema
gastrointestinal, mas a distribuição aos órgãos é diferente em relação à via
endovenosa. A sua distribuição endovenosa tem padrão multifásico e meia-vida de
5,25 horas. A excreção urinária é maior após a administração endovenosa. Se o
sítio de ação do azul de metileno na prevenção da encefalopatia causada pela
ifosfamida for o fígado (onde a ifosfamida é ativada e potencialmente gera
metabólitos tóxicos), a administração oral e endovenosa tem efeito semelhante.
Contudo, se o sítio de ação for o sistema nervoso central, a administração
endovenosa resulta em maiores concentrações do azul de metileno no cérebro,
devendo ser a via preferencial.
Weinbroun et al.
186
avaliaram os efeitos do azul de metileno na atenuação
da deterioração metabólica e hemodinâmica decorrente da isquemia e reperfusão.
Compararam a infusão de azul de metileno em várias doses, por meio da via intra-
traqueal e intra-peritoneal. As alterações eram verificadas pela dosagem da
pressão sangüínea, gasometria e medida do nível da xantina-oxidase e xantina-
desidrogenase. Ilustraram a capacidade dose-dependente do azul de metileno em
conter o desenvolvimento dos efeitos deletérios após isquemia-reperfusão e da
similaridade de ambas as vias de administração. Consideram ser o azul de
metileno componente já estabelecido clinicamente como inibidor da geração de
35
radicais livres de oxigênio. Adicionalmente, tem efeito vasoconstritor, pois
antagoniza os efeitos do óxido nítrico no relaxamento da musculatura lisa
vascular, pelo bloqueio dos sítios de ligação do óxido nítrico e guanilil-ciclase.
Memis et al.
187
infundiram azul de metileno em pacientes durante sepsis
severa, com o intuito de verificar se havia alteração nos níveis de citocinas. Foram
medidos: fator alfa de necrose tumoral, interleucina 1, receptor da interleucina 2,
interleucina 6 e interleucina 8. Após, foram aferidos parâmetros hemodinâmicos,
gases sangüíneos, metahemoglobina e parâmetros bioquímicos . Quando
comparado com o grupo placebo, o grupo azul de metileno teve maior aumento do
nível médio de pressão arterial e da metahemoglobinemia, esta última apenas
logo após a infusão. Verificaram também que o azul de metileno não alterou os
níveis de citocinas ou interferiu na sobrevida, na sepsis severa. Resultou apenas
em aumento transitório da pressão arterial.
Ilhan et al.
4
determinaram os efeitos do anticorpo monoclonal anti-ICAM-1,
do alopurinol e do azul de metileno na lesão por isquemia-reperfusão intestinal. O
ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1) é um importante mediador da adesão de
neutrófilos ao endotélio vascular. Presente na superfície das células endoteliais
num grau moderado pode ser fortemente aumentado em um curto período pelas
citocinas. O fator alfa de necrose tumoral é uma das citocinas e pode ser ativado
por uma série de células, incluindo hepatócitos, células T, neutrófilos e
macrófagos. Verificaram as alterações histopatológicas, o nível de fator alfa de
necrose tumoral e a atividade da mieloperoxidase nos ratos submetidos à
isquemia-reperfusão intestinal. Evidenciaram neste estudo que a aplicação de
alopurinol e do ICAM-1 atenuou o efeito deletério da isquemia-reperfusão, porém,
ainda não se sabe ao certo qual o melhor momento de aplicação dos produtos,
nem o tempo de duração da isquemia. O azul de metileno não foi efetivo para
prevenir ou atenuar a lesão tissular intestinal. Os autores sugeriram novos estudos
com doses diferentes para confirmação ou não de tais resultados.
36
3 MÉTODOS
37
Para realização deste estudo obedeceu-se à Lei Federal 6.638¹ e às
orientações do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), entidade
filiada ao Internacional Council for Laboratory Animal Science. O projeto foi
aprovado pelo Comitê de Ética de Pesquisa com Animais da Pontifícia
Universidade Católica do Paraná, conforme protocolo número 013/03.
3.1 ANIMAL DE EXPERIMENTAÇÃO
3.1.1 Caracterização da Amostra
Utilizaram-se 45 ratos machos (Rattus norvergicus albinus, Rodentia
mammalia), da linhagem Wistar, provenientes do Biotério da Pontifícia
Universidade Católica do Paraná, distribuídos aleatoriamente em 3 grupos de 15
animais: grupo controle e grupo isquemia sem o uso de azul de metileno e grupo
isquemia com o uso de azul de metileno. As idades variaram entre 100 e 150 dias
e peso entre 250 e 400 gramas , com média de 337,13 gramas e desvio padrão de
54,53 gramas.
3.1.2 Ambiente de Experimentação
Mantiveram-se os animais em grupos de quatro animais, em caixas de
polipropileno, de dimensões apropriadas para a espécie, no Biotério da Pontifícia
Universidade Católica do Paraná. O ciclo claro/escuro era de 12 horas e a
umidade relativa do ar ambiental era o mesmo do ambiente geral, sem regulagem
artificial e a temperatura de 20 + 2ºC. Receberam ração específica para a espécie
(NUVILAB, NUVITAL®) e água ad libitum.
1
BRASIL. Lei Federal n.º 6638 de 8 de maio de 1979. Estabelece normas para a prática
didático-científica da vivissecção de animais e determina outras providências. Diário Oficial
da República Federativa do Brasil, Brasília, p.1, 10 de maio de 1979.
38
Realizaram-se as operações no Centro Cirúrgico da Disciplina de Técnica
Operatória e Cirurgia Experimental da PUC-PR.
3.1.3 Organização dos Grupos de Estudo
Separaram-se os ratos em três grupos, sendo o grupo 1 (controle) sem
clampeamento arterial e os grupos 2 e 3 com clampeamento. Destes, o grupo 2 foi
tratado com placebo (solução salina isotônica) e o grupo 3 com azul de metileno.
3.1.4 Anestesia
Induziu-se anestesia geral por injeção intramuscular de 60mg/kg de
Cetamina (Ketamin - 50mg/ml) associada a 7,5mg/kg de Xilasina (Rompun -
2g/100ml). Os animais permaneceram anestesiados até o final da operação.
3.1.5 Preparo da Pele e Posicionamento da Mesa
Realizou-se depilação da parede abdominal ventral por tricótomo elétrico e
fixação do animal em prancheta cirúrgica na posição de decúbito dorsal. Em
seguida, fez-se a anti-sepsia da pele com polivinilpirrolidona-iodo ativo a 1%.
3.1.6 Laparotomia
Utilizou-se incisão mediana de 4,0 cm, iniciando na borda superior da pube,
com abertura de todos os planos da parede abdominal e exposição da cavidade
abdominal.
39
3.1.7 Procedimento
Nos três grupos a 20cm do piloro fez-se secção completa do intestino
delgado e anastomose término-terminal, com 8 pontos separados em um único
plano de síntese, extramucoso, com fio monofilamentar de náilon 6-0.
Nos animais do grupo 1 construiu-se anastomose intestinal sem nenhuma
lesão prévia, enquanto nos grupos 2 e 3 (isquemia-reperfusão), ocorreu oclusão
temporária segmentar da artéria mesentérica cranial pelo tempo de 45 minutos.
Para esse fim utilizou-se segmento de submucosa intestinal porcina, a qual era
amarrada delicadamente ao redor do vaso.
Após a oclusão vascular nos grupos 2 e 3, realizou-se laparorrafia
provisória, de modo a minimizar desidratação e perda excessiva de temperatura.
Após 45 minutos (tempo relativo à oclusão vascular), reabriu-se a cavidade
abdominal nos grupos 2 e 3. Neste momento, instilaram-se na cavidade abdominal
2ml de solução de azul de metileno a 0,5% estéril no grupo 2 e de 2ml de solução
salina isotônica no grupo 3 (Figura 1) e imediatamente após realizou-se a
liberação da oclusão vascular. Assim que confirmada a reperfusão por meio de
pulsação da artéria mesentérica, confeccionou-se anastomose intestinal no local
acima descrito, como no grupo controle.
3.1.8 Laparorrafia
Realizou-se laparorrafia com dois planos de síntese. O primeiro, peritôneo-
músculo-aponeurótico e o segundo, o da pele, com aplicação de sutura
monofilamentar de náilon 3-0.
40
Figura 1- Aspecto das alças intestinais após injeção de azul de metileno e desclampeamento
3.1.9 Pós-operatório
Após a recuperação anestésica, devolveram-se os ratos às suas caixas,
devidamente identificadas, onde receberam água e ração padrão comercial ad
libitum. Permaneceram sob este regime até a data prevista para aferição do
experimento.
3.1.10 Eutanásia
Realizou-se eutanásia com dose letal da solução anestésica de Cetamina e
Xilazina utilizada nas operações, no 7.º dia de pós-operatório.
41
3.2 AVALIAÇÃO MACROSCÓPICA
3.2.2 Anastomoses Intestinais
Constatada a morte, fixaram-se os animais em pranchetas cirúrgicas e
reabriu-se a parede abdominal pela mesma incisão da primeira operação.
Classificaram-se as aderências nas anastomoses em graus 0, I, II, III e IV,
conforme a escala convencionada:
-grau 0: ausentes
-grau I: presentes, comprometendo ¼ da circunferência anastomótica;
-grau II: presentes, comprometendo 2/4 da circunferência anastomótica;
-grau III: presentes, comprometendo ¾ da circunferência anastomótica;
-grau IV: presentes, compromentendo 4/4 da circunferência anastomótica.
3.2.3 Estudo Tensiométrico
Ressecou-se um segmento de intestino delgado de aproximadamente 4cm,
que continha a anastomose, o qual foi lavado com solução salina a 0,9% e
colocado dentro de um recipiente cúbico contendo água. Tal recipiente continha
uma entrada de ar em uma de suas paredes laterais, com válvula unidirecional,
sob a forma de “bico”.
Amarrou-se a extremidade proximal do segmento intestinal ressecado com
ligadura dupla de fio de algodão 3-0 em torno da entrada de ar, de modo que o
“bico” de ar ficasse dentro do intestino, o que permitia entrada de oxigênio para a
sua luz. Na extremidade distal do intestino, realizou-se sutura em bolsa, de modo
a bloquear a saída de oxigênio vindo da outra extremidade. O intestino, então,
permaneceu na posição horizontal e totalmente submerso na água. Introduziu-se
um cateter de 0,7mm de diâmetro por 70mm de comprimento na luz do intestino e
conectado à entrada de ar. Na entrada de ar havia um dispositivo, com uma via
conectada a um cilindro de oxigênio a 100%, no fluxo de 1 litro por minuto e outra
a uma coluna graduada de pressão em mmHg.
42
Após iniciado o fluxo de oxigênio, foram registrados os níveis pressóricos
no momento da ruptura, indicada pelo borbulhamento de ar vindo do interior da luz
intestinal.
Em seguida, abriu-se a peça cirúrgica longitudinalmente pela borda
antimesentérica, observou-se o aspecto interno da região anastomótica e avaliou-
se a epitelização, e se a mesma era maior ou menor que 50% da extensão da
anastomose.
As peças foram estendidas em papel filtro, mergulhadas em frascos
numerados e fixadas em formalina tamponada a 10% e assim encaminhadas a
estudo histopatológico.
3.3 AVALIAÇÃO MICROSCÓPICA
As peças foram emblocadas em parafina e dos blocos obtiveram-se cortes.
Analisaram-se os cortes histológicos corados pela hematoxilina-eosina, por meio
de microscópio óptico marca Olympus® modelo BX-51.
Avaliaram-se campos representativos da área de anastomose e neles os
achados de fibrose, reação inflamatória, edema, congestão vascular e presença
de tecido de granulação, seguindo-se escore numérico, com notas negativas para
as variáveis agudas e positivas para as crônicas
188
, segundo o quadro abaixo:
Quadro 1 : Variáveis usadas para estabelecer escore final quanto à inflamação
Processo
inflamatório
Variável Discreto Moderado Acentuado
Agudo -
Polimorfonucleares* -1 -2 -3
Edema -1 -2 -3
Congestão -1 -2 -3
Crônico +
Monomorfonucleares* 1 2 3
Fibrose 1 2 3
Tecido de Granulação 1 2 3
*Análise das células inflamatórias:
Até 50 células em ¼ de campo de grande aumento (x400) = 1
De 50 a 100 células em ¼ de campo de grande aumento (x400) = 2
Mais de 100 células em ¼ de campo de grande aumento (x400) = 3.
43
O escore final foi a soma de todas as seis variáveis. Resultados positivos
foram considerados como predomínio de resposta inflamatória crônica e
resultados negativos como predomínio de resposta inflamatória aguda.
Outros cortes histológicos das mesmas amostras foram submetidos à
coloração pelo corante sirius red, no intuito de se determinar a concentração do
colágeno. As fibras mais espessas e fortemente birrefringentes apresentaram-se
coradas em vermelho-alaranjado (colágeno tipo I), e as fibras mais finas,
dispersas, fracamente birrefringentes coraram-se de tons verdes (colágeno tipo
III), quando submetidas à luz polarizada
189
.
Estudaram-se cinco campos microscópicos com 200 aumentos submetidos
à luz polarizada. Campos representativos da área de anastomose, incluindo pelo
menos um superficial, um médio e um profundo, foram capturados utilizando-se
microscópio Olympus® BX-51. O microscópio conectava-se a câmera digital e a
um computador com software de análise de imagens (IMAGE-PRO-PLUS® - THE
PROVEN SOLUTION - Versão 4.5.1.23 para Windows 98/NT/ME/200/XP
Professional, Copyright 1993-2002 Media Cybernetics Inc.). Estes campos então
foram submetidos à análise da área ocupada pelo colágeno tipo I (tons de
vermelho e alaranjado) e do colágeno tipo III (tons de verde), conseguindo-se ao
final a percentagem da área relativa de um sobre o outro.
3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Recorreu-se à análise descritiva dos dados através de quadros e gráficos.
Para comprovação do objetivo levantado neste trabalho, foram utilizadas a Análise
de Variância para amostras independentes (ANOVA One Way) e os testes
paramétricos “t de Student” e os não-paramétricos “Mann-Whitney” e “Kruskal-
Wallis” (através do software “Primer of Biostatistics”) e “Exato de Fischer” (pelo
Epi-Info). O nível de significância (probabilidade de significância) adotado foi
menor que 5% (p<0,05).
44
4 RESULTADOS
45
4.1 O MODELO ANIMAL
Mesmo após ter sido definido o tempo de 45 minutos de clampeamento e a
dose de azul de metileno no estudo piloto, constatou-se o óbito nos animais dos
grupos, a saber: no controle: um óbito no pós-operatório imediato, por acidente
anestésico; no grupo isquemia: 2 óbitos no 4.º e 5.º dias de pós-operatório,
decorrentes de peritonite após deiscência da anastomose; no grupo azul de
metileno: 4 óbitos no 3.º, 4.º e 5.° dias, também por peritonite e deiscência
anastomótica.
Observou-se a presença de aderências em todas as anastomoses
intestinais, dificultou a preparação dos segmentos intestinais para o estudo
tensiométrico. A constatação de líquido livre ou abscesso na cavidade peritoneal
foi rara.
4.2 AVALIAÇÃO MACROSCÓPICA
Na comparação entre os grupos (Quadros 2 e 3) observou-se que:
• apenas o grupo controle apresentou líquido incolor e inodoro livre na
cavidade abdominal, quando comparado com o grupo de isquemia sem
o uso de azul de metileno (p=0,004) e com o grupo de isquemia com o
uso de azul de metileno (p=0,007);
46
• o grupo de isquemia com o uso de azul de metileno apresentou maior
quantidade de aderências perianastomóticas, quando comparado com o
grupo controle e com o grupo de isquemia sem o uso de azul de
metileno (p=0,008).
Quadro 2 – Avaliação macroscópica nos grupos de estudo
DADOS
CONTROLE
(n = 14)
ISQUEMIA
(n = 13)
AZUL
(n = 11)
TOTAL
(n = 38)
Nº % Nº % Nº % Nº %
FERIDA OPERATÓRIA
• Não 14
100,0
12
92,3
10
90,9
36
94,7
• Sim -
-
01
7,7
01
9,1
02
5,3
LÍQUIDO ABDOMINAL
• Não 07
50,0
13
100,0
11
100,0
31
81,6
• Sim 07
50,0
-
-
-
-
07
18,4
ABSCESSO INTRA-
ABDOMINAL
• Não 13
92,9
12
92,3
11
100,0
36
94,7
• Sim 01
7,1
01
7,7
-
-
02
5,3
ADERÊNCIA ANASTOMOSE
• Grau 0 04
28,6
-
-
-
-
04
10,5
• Grau I 06
42,9
06
46,1
04
36,4
16
42,1
• Grau II 02
14,3
05
38,5
06
54,5
13
34,2
• Grau III 01
7,1
02
15,4
01
9,1
04
10,5
• Grau IV 01
7,1
-
-
-
-
01
2,7
47
Quadro 3 – Resultado dos testes aplicados na comparação entre os
grupos – Avalição macroscópica
CONTROLE x ISQUEMIA
DADOS
Teste Aplicado
Valor
de p
Signifi-
cância
Ferida Operatória Fisher 0,481 NS*
Líquido Abdominal “ 0,006 S**
Abscesso Intra-Abdominal “ 1 NS*
Aderência na Anastomose Mann-Whitney 0,595 NS*
CONTROLE x AZUL
DADOS
Teste Aplicado
Valor
de p
Signifi-
cância
Ferida Operatória Fisher 0,440 NS*
Líquido Abdominal “ 0,008 S**
Abscesso Intra-Abdominal “ 1 NS*
Aderência na Anastomose Mann-Whitney 0,008 S**
ISQUEMIA x AZUL
DADOS
Teste Aplicado
Valor
de p
Signifi-
cância
Ferida Operatória Fisher 1 NS*
Líquido Abdominal - - -
Abscesso Intra-Abdominal Fisher 1 NS*
Aderência na Anastomose Mann-Whitney 0,008 S**
(*) NS: Não significante
(**) S: Significante
Ressalta-se que a pressão de ruptura não foi possível de analisar
estatisticamente em razão do pequeno número de dados.
48
4.3 AVALIAÇÃO MICROSCÓPICA
4.3.1 Avaliação da Inflamação
Na avaliação do escore (Quadros 4 e 5), comparando-se os três grupos
simultaneamente, observou-se que o grupo com isquemia sem uso do azul de
metileno apresentou escore entre discreto e moderado (mais elevado) para as
células monomorfonucleares (p=0,021) e tecido de granulação (p=0,044) (Gráfico 1).
Repete-se o quadro 1, com as variáveis utilizadas, no intuito de facilitar a
interpretação dos quadros 4 e 5.
Quadro 1 : Variáveis usadas para estabelecer escore final quanto à inflamação
Processo
inflamatório
Variável Discreto Moderado Acentuado
Agudo -
Polimorfonucleares* -1 -2 -3
Edema -1 -2 -3
Congestão -1 -2 -3
Crônico +
Monomorfonucleares* 1 2 3
Fibrose 1 2 3
Tecido de Granulação 1 2 3
*Análise das células inflamatórias:
Até 50 células em ¼ de campo de grande aumento (x400) = 1
De 50 a 100 células em ¼ de campo de grande aumento (x400) = 2
Mais de 100 células em ¼ de campo de grande aumento (x400) = 3.
49
Quadro 4 – Análise dos parâmetros inflamatórios com seus respectivos escores nos grupos de estudo
PMN EDEMA CONGESTÃO
MMN
TECIDO DE
GRANULAÇÃO
FIBROSE ESCORE*
Nº
C I A C I A C I A C I A C I A C I A C I A
1 -2 -1 -1 -1 -1 -3 -1 -2 -1 1 3 1 1 1 1 1 1 1
-1 1 -2
2 -3 -2 -2 -1 -2 -2 -1 -1 -1 1 2 1 1 2 1 1 1 1
-2 0 -2
3 -2 -3 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 1 1 1 1 2 1 1 3 1
-2 1 -2
4 -1 -3 -3 -1 -1 -1 -1 -1 -1 1 2 1 1 1 1 2 1 1
1 -1 -2
5 -1 -1 -2 -1 -1 -1 -1 -1 -2 1 2 1 1 2 1 1 1 1
0 2 -2
6 -2 -3 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 1 1 1 1 2 1 1 2 1
-1 0 0
7 -2 -1 -1 -2 -2 -3 -1 -1 -2 2 2 1 1 2 1 1 1 1
-1 1 -3
8 -1 -2 -2 -1 -2 -2 -1 -2 -2 1 1 1 1 1 1 1 1 2
0 -3 -2
9 -1 -1 -1 -1 -1 -2 -1 -1 -2 1 1 1 1 2 1 2 3 1
1 3 -2
10 -3 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 1 1 1 2 2 2 1 2
-1 -1 1
11 -2 -1 -2 -1 -2 -1 -2 -1 -2 1 1 1 2 1 1 1 2 2
-1 0 -1
12 -2 -1 -1 -1 -1 -1 1 1 1 1 1 2
-1 1
13 -2 -3 -2 -1 -2 -1 1 1 2 1 1 2
-2 -1
14 -1 -1 -2 1 2 1
0
NOTA: C = Controle; I = Isquemia; A = Azul.
Classificação do processo inflamatório: agudo acentuado (-3); agudo moderado (-2); agudo discreto (-1);
crônico discreto (1); crônico moderado (2); crônico acentuado (3).
* Escore = soma dos escores dos parâmetros inflamatórios
Quadro 5 – Valores médios e análise estatística dos parâmetros inflamatórios para
os grupos de estudo
DADOS
CONTROLE
(n = 14)
ISQUEMIA
(n = 13)
AZUL
(n = 11)
VALOR
DE p
(1)
POLIMORFONUCLEAR -1,79 -1,85 -1,73 0,972
EDEMA -1,21 -1,31 -1,64 0,323
CONGESTÃO -1,21 -1,23 -1,55 0,158
MONOMORFONUCLEAR 1,07 1,46 1,00 0,021*
TECIDO DE GRANULAÇÃO 1,21 1,54 1,09 0,044**
FIBROSE 1,21 1,62 1,27 0,272
ESCORE -0,71 -1,54 0,23 0,006***
(1) Kruskal-Wallis.
(*) C x I: valor de p=0,052; C x A: valor de p=0,375; I x A: valor de p=0,024
(**)C x I: valor de p=0,087; C x A: valor de p=0,413; I x A: valor de p=0,023
(***)C x I: valor de p=0,0541; C x A: valor de p=0,034; I x A: valor de p=0,005
50
Figura 2 –Fotomicrografia com coloração pela hematoxilina-eosina (x40), onde se observa (canto
superior esquerdo) o epitélio (E) do intestino delgado. No canto superior direito nota-se área
ulcerada (U) com deposição de fibrina (F), recobrindo um tecido de granulação (G), com grande
quantidade de vasos (V) e células inflamatórias. Abaixo da área de granulação há tecido
conjuntivo (C) neoformado.
E
U
G
V
V
C
F
51
Figura 3 – Representação gráfica dos valores médios dos parâmetros inflamatórios
para os grupos de estudo
Escore
FibroseTG
MMN
Congestão
PMN
Edema
-2,5
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
Controle
Isquemia
Azul
FONTE: Quadro 1
52
4.3.1.1 Células polimorfonucleares
Na avaliação das células polimorfonucleares (Quadros 6 e 7), comparando-se
os três grupos simultaneamente, observou-se que tanto o grupo controle como o
grupo com isquemia (sem e com uso do azul de metileno) apresentaram escore
médio moderado, porém sem diferença significativa (-1,79 x -1,85 x -1,73) (p=0,972)
(Gráfico 2).
Figura 4 - Representação gráfica do escore das células polimorfonucleares nos grupos
de estudo
-3
-2
-1
0
1
2
3
IsquemiaControle Azul
p=0,972
FONTE: Quadro 5
53
4.3.1.2 Edema
Na avaliação do edema (Quadros 6 e 7), comparando-se os três grupos
simultaneamente, observou-se que tanto o grupo controle como o grupo com
isquemia sem o uso do azul de metileno apresentaram escore médio de -1,21 e -1,31
(inflamação discreta), respectivamente, e o grupo de isquemia com o uso de azul de
metileno apresentou escore de -1,64 (inflamação entre discreta e moderada). Mesmo
sendo observado escore mais alto no grupo de isquemia com o uso de azul de
metileno, não foi observada diferença significativa (p=0,323) (Gráfico 3).
Figura 5 - Representação gráfica do escore do edema nos grupos de estudo
-3
-2
-1
0
1
2
3
IsquemiaControle Azul
p=0,323
FONTE: Quadro 5
54
4.3.1.3 Congestão vascular
Na avaliação da congestão vascular (Quadros 6 e 7), comparando-se os três
grupos simultaneamente, observou-se que tanto o grupo controle como o grupo com
isquemia sem o uso do azul de metileno apresentaram escore médio de -1,21 e -1,23
(inflamação discreta), respectivamente, e o grupo de isquemia com o uso de azul de
metileno apresentou escore de -1,55 (inflamação entre discreta e moderada). Mesmo
sendo observado escore mais alto no grupo de isquemia com o uso de azul de
metileno, não foi observada diferença significativa (p=0,158) (Gráfico 4).
Figura 6 - Representação gráfica do escore da congestão vascular nos grupos de estudo
-3
-2
-1
0
1
2
3
IsquemiaControle Azul
p=0,158
FONTE: Quadro 5
55
4.3.1.4 Células monomorfonucleares
Na avaliação das células polimorfonucleares (Quadros 6 e 7), comparando-se
os três grupos simultaneamente, observou-se que tanto o grupo controle como o
grupo com isquemia com o uso do azul de metileno apresentaram escore médio de
+1,07 e +1,00 (inflamação discreta), respectivamente, e o grupo de isquemia sem o
uso de azul de metileno apresentou escore de +1,46 (inflamação entre discreta e
moderada). Foi observado escore mais alto no grupo de isquemia sem o uso de azul
de metileno, demonstrando diferença significativa (p=0,021) (Gráfico 5).
Figura 7 - Representação gráfica do escore das células monomorfonucleares nos grupos
de estudo
-3
-2
-1
0
1
2
3
IsquemiaControle Azul
FONTE: Quadro 5
56
4.3.1.5 Tecido de granulação
Na avaliação do tecido de granulação (Quadros 6 e 7), comparando-se os três
grupos simultaneamente, observou-se que tanto o grupo controle como o grupo com
isquemia com o uso do azul de metileno apresentaram escore médio de +1,21 e
+1,09 (inflamação discreta), respectivamente, e o grupo de isquemia sem o uso de
azul de metileno apresentou escore de +1,54 (inflamação entre discreta e moderada).
Foi observado escore mais alto no grupo de isquemia sem o uso de azul de metileno,
demonstrando diferença significativa (p=0,044) (Gráfico 6).
Figura 8 - Representação gráfica do escore do tecido de granulação nos grupos de
estudo
-3
-2
-1
0
1
2
3
IsquemiaControle Azul
FONTE: Quadro 5
57
4.3.1.6 Fibrose
Na avaliação da fibrose (Quadros 6 e 7), comparando-se os três grupos
simultaneamente, observou-se que tanto o grupo controle como o grupo com
isquemia com o uso do azul de metileno apresentaram escore médio de +1,21 e
+1,27 (inflamação discreta), respectivamente, e o grupo de isquemia sem o uso de
azul de metileno apresentou escore de +1,62 (inflamação entre discreta e moderada).
Foi observado escore mais alto no grupo de isquemia sem o uso de azul de metileno,
porém sem diferença significativa (p=0,272) (Gráfico 7).
Figura 9 - Representação gráfica do escore da fibrose nos grupos de estudo
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
IsquemiaControle Azul
FONTE: Quadro 4
58
Os resultados detalhados do agrupamento dos escores são apresentados
no Quadro 6, a seguir.
Quadro 6 – Avaliação microscópica nos grupos de estudo – Análise da inflamação
DADOS CLASSE
CONTROLE
(n = 14)
ISQUEMIA
(n = 13)
AZUL
(n = 11)
TOTAL
(n = 38)
Nº % Nº % Nº % Nº %
POLIMORFONUCLEAR
• Discreta -1
05
35,7
06
46,1
04
36,4
15
36,5
• Moderada -2
07
50,0
03
23,1
06
54,5
16
42,1
• Acentuada -3
02
14,3
04
30,8
01
9,1
07
18,4
EDEMA
• Discreta -1
11
78,6
09
69,2
06
54,5
26
68,4
• Moderada -2
03
21,4
04
30,8
03
27,3
10
26,3
• Acentuada -3
-
-
-
-
02
18,2
02
5,3
CONGESTÃO
• Discreta -1
11
78,6
10
76,9
05
45,5
26
68,4
• Moderada -2
03
21,4
03
23,1
06
54,5
12
31,6
MONOMORFONUCLEAR
• Discreta 1
13
92,9
08
61,5
11
100,
0
32
84,2
• Moderada 2
01
7,1
04
30,8
-
-
05
13,2
• Acentuada 3
-
-
01
7,7
-
-
01
2,6
TECIDO DE
GRANULAÇÃO
• Discreta 1
11
78,6
06
46,2
10
90,9
27
71,1
• Moderada 2
03
21,4
07
53,8
01
9,1
11
28,9
FIBROSE
• Discreta 1
11
78,6
07
53,8
08
72,7
26
68,4
• Moderada 2
03
21,4
04
30,8
03
27,3
10
26,3
• Acentuada 3
-
-
02
15,4
-
-
02
5,3
59
4.3.2 Avaliação do Colágeno
Na comparação simultânea dos três grupos, em relação ao colágeno do
tipo I e colágeno do tipo III (Gráficos 8 e 9 e Quadro 7) não foi observada diferença
significativa (p=0,297).
Figura 10 – Representação gráfica do colágeno tipo I nos grupos de estudo
p = 0,297
0
20
40
60
80
100
Controle Isquemia Azul
Colágeno I (%)
Figura 11 – Representação gráfica do colágeno tipo III nos grupos de estudo
p = 0,297
0
20
40
60
80
100
Controle Isquemia Azul
Colágeno III (%)
FONTE: Quadro 1
60
Quadro 7 – Estatística descritiva do colágeno nos grupos de estudo
DADOS Nº MÉDIA
DESVIO
PADRÃO
MÍNIMO MÁXIMO
MEDIANA
COLÁGENO I 38
20,79
7,93
7,70
38,28
19,87
• Controle 14
18,20
7,85
7,70
37,49
17,70
• Isquemia 13
21,43
7,20
11,11
36,99
21,05
• Azul 11
23,32
8,54
14,67
38,28
23,78
COLÁGENO III 38
79,21
7,93
61,72
92,30
80,13
• Controle 14
81,80
7,85
62,51
92,30
82,30
• Isquemia 13
78,57
7,20
63,01
88,89
78,95
• Azul 11
76,68
8,54
61,72
85,33
76,22
Comparação dos grupos controle, isquemia e azul em relação ao colágeno I :
Valor de p=0,297 (teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis)
(o resultado é o mesmo para colágeno III, pois são valores complementares).
61
Figura 12 – Fotomicrografia de área de anastomose de animal do grupo azul de metileno
(Picrus Sirius x 200), onde se observam áreas polarizadas com duas colorações. As áreas
polarizadas em laranja/vermelho representam o colágeno tipo I. As áreas polarizadas em tons
de verde/amarelo representam o colágeno tipo III. As áreas escuras ou não polarizadas
representam estruturas não colagenizadas, como: vasos, células inflamatórias, músculo liso e
epitélio.
62
5 DISCUSSÃO
63
Occlusion of the mesenteric vessels is apt to be regarded as one of those
condition of witch(...)the diagnosis is impossible, the prognosis hopeless and
the treatment almost useless.
Cokkinis AJ,1926, apud Boley et al.
190
A maneira pessimista expressada pelo autor na época reflete a gravidade
da isquemia intestinal, de maneira a preocupar os profissionais envolvidos até nos
dias atuais. Contudo, o progresso no entendimento da fisiopatologia, diagnóstico e
tratamento possibilitou melhora no panorama geral da doença.
Mesmo com os avanços da medicina moderna, a taxa de mortalidade é
elevada, variando de 60 a 100%, de acordo com a causa da isquemia e doenças
associadas
191
.
A primeira descrição de uma oclusão vascular mesentérica, segundo Allbutt
et al, em 1909 foi atribuída a Antonio Beniviene no final do século XV. Em 1815,
Hogson reportou outro caso, seguido por Thiedman em 1843 Virchow em 1847 e
1854. Litten em 1875 publicou estudo experimental clássico a respeito dos efeitos
da ligadura da artéria mesentérica superior. Contudo, a não ser pelo valor da
descrição da ocorrência de gangrena intestinal, secundária à oclusão dos vasos
mesentéricos, houve pouco progresso até 1895. Neste ano, Elliot descreveu o
primeiro paciente a convalescer após ressecção de intestino infartado,
provavelmente ocorrido por trombose venosa mesentérica. Criou dois estomas e
os reanastomosou duas semanas após. Desta forma, o diagnóstico de gangrena
intestinal por laparotomia e seu tratamento por ressecção e anastomose tem sido
até os dias de hoje a principal seqüência de abordagem dos pacientes portadores
dessa enfermidade, apud Boley et al.
190
.
No presente estudo, foi utilizado o rato como animal de experimentação por
ser de baixo custo, de simples hospedagem, fácil de uniformizar a amostra e ter
64
ciclo de vida curto. Além disso, a distribuição do suprimento sangüíneo
mesentérico é análoga à dos humanos
19
.
Vários modelos de isquemia intestinal têm sido utilizados, com taxas de
mortalidade que variam de 8% a 80%, nas oclusões da artéria mesentérica cranial,
por períodos de um a 90 minutos
192-197,121,122,18,19
. Com relação à técnica de
oclusão vascular utilizada neste estudo, inicialmente, realizou-se estudo piloto com
11 animais. Alguns animais foram submetidos à oclusão na emergência da artéria
mesentérica cranial por sessenta minutos, com uso de microclampe vascular.
Contudo, nenhum rato sobreviveu além do 2º dia de pós-operatório. Como o
objetivo era atingir o sétimo dia de pós-operatório, optou-se, então, pela técnica de
isquemia segmentar pelo tempo de 45 minutos, que permitiu a sobrevivência da
maioria dos animais. Notou-se dificuldade com o instrumento cirúrgico usado na
oclusão do vaso mesentérico, o qual provocava lesão local. Optou-se pela
utilização de submucosa intestinal porcina na oclusão temporária do vaso, a qual
mostrou-se eficaz na obstrução temporária do fluxo sangüineo, sem lesar o vaso.
Megison et al.
198
estudaram o valor da circulação colateral após oclusão da
artéria mesentérica cranial e seus efeitos na severidade da lesão por isquemia.
Questionaram a inconsistência de relação entre mortalidade e duração da oclusão
arterial. Operaram grupos de ratos submetidos à oclusão da artéria mesentérica
cranial e dos vasos colaterais. Com o clampeamento somente da artéria
mesentérica cranial, ocorreu diminuição média de 83% do fluxo sangüíneo
mesentérico, com variação individual de 44% a 97%. Na interrupção dos vasos
colaterais associada, houve diminuição média de 97,8% do fluxo sangüíneo, com
variação individual de 91 a 100%. Chegaram então à conclusão que: 1: oclusão
isolada da artéria mesentérica cranial não reproduz isquemia e mortalidade e
portanto não deve ser usada para estudos de isquemia mesentérica; 2: o fluxo
mesentérico colateral é significativo, e é variável que torna os resutados
inconsistentes quando a oclusão isolada da artéria mesentérica cranial é utilizada;
3: isquemia consistente e profunda é obtida quando os vasos colaterais são
ocluídos em conjunto à artéria mesentérica cranial; 4: a técnica de oclusão da
artéria mesentérica cranial em conjunto com os vasos colaterais leva a índices de
65
mortalidade que são proporcionais à duração da isquemia. No estudo piloto
efetuado, não foi possível obter-se a sobrevivência dos animais expostos à
oclusão da artéria mesentérica cranial na sua origem além de 24 horas de pós-
operatótio. No presente estudo, como o objetivo era avaliar o processo de
cicatrização no sétimo dia de pós-operatório e não apenas a mortalidade, realizou-
se, então, isquemia segmentar dos ramos da artéria mesentérica cranial, de modo
a permitir a sobrevivência dos animais até a data prevista da eutanásia e a
viabilizar o estudo.
Bergren et al.
122
, em seu estudo sobre o efeito dos varredores de radicais
livres nas anastomoses intestinais após isquemia, também utilizaram
clampeamento segmentar dos vasos mesentéricos, na extensão de 3 a 5cm.
Concluíram que o uso da superóxido-dismutase como varredora de radicais livres,
não promoveu alteração significante no processo de cicatrização, mas que a
mortalidade pós operatória foi igual ao grupo controle e menor que no grupo da
isquemia sem tratamento.
Segundo Kuzu et al.
199
, a isquemia e a reperfusão influenciam
negativamente a cicatrização das anastomoses intestinais. Quando compararam a
oclusão da artéria mesentérica cranial isolada, com outro grupo com oclusão
associada dos vasos colaterais, não houve diferença significante na cicatrização.
Com relação à presença de líquido livre no interior da cavidade abdominal
dos ratos operados no presente estudo no momento da eutanásia, houve
diferença estatisticamente significante. O grupo controle apresentou maior
quantidade, porém o líquido encontrado era incolor e inodoro. O objetivo da
análise de tal parâmetro era verificar a presença de infecção na cavidade
peritoneal, traduzida por líquido espesso, com grumos e aspecto purulento, o que
não foi identificado.
Em nosso meio, Greca et al.
178
avaliaram o efeito do azul de metileno na
prevenção da lesão pulmonar após isquemia-reperfusão intestinal. Utilizaram
período de clampeamento de 60 minutos na artéria mesentérica cranial e azul de
metileno intraperitoneal a 2%, na dose de 2 ml. A eutanásia ocorreu 4 horas após
a reperfusão intestinal. A concentração do azul de metileno utilizada no presente
66
estudo foi de 0,5%, na quantidade de 2 ml intraperitoneal. Também por ocasião
do estudo piloto, constatou-se que a concentração de azul de metileno a 2% e a
1% não foi suportada pelos animais, os quais não sobreviveram na sua maioria ao
sétimo dia de pós-operatório.
Em virtude da complexidade do processo de cicatrização, para melhor
entendimento, existe a divisão didática em três fases: inflamatória (3º e 4º dia),
proliferativa (entre 7º e 10º dia) e maturação (variável, conforme a constituição
tecidual)
27
. Optou-se, neste estudo, estudar a cicatrização com eutanásia dos
animais no 7º dia de pós-operatório.
Na análise macroscópica das aderências perianastomóticas, o grupo de
ratos operados submetidos à isquemia com uso de azul de metileno apresentou
maior freqüência, com diferença estatística. A explicação para o achado pode ser
pela interferência do azul de metileno no processo inflamatório no local da
anastomose. A grande quantidade de aderências dificultou a dissecção e
manutenção da integridade das alças intestinais a serem submetidas à análise da
pressão de ruptura das anastomoses. Muitas peças rompiam-se no local da
anastomose, o que impedia a realização do método. Outras peças não
suportavam pressões mínimas quando submetidas ao método. Cada peça com
estes problemas foi descartada, o que por fim não permitiu análise estatística.
A isquemia-reperfusão promove resposta sistêmica mediada principalmente
por neutrófilos, citocinas e radicais livres de oxigênio
25
. Em nosso meio, Greca et
al.
178
, ao estudarem os efeitos do azul de metileno na prevenção das lesões
pulmonares decorrentes da isquemia-reperfusão, observaram menor seqüestração
de neutrófilos na análise histológica e diminuição do edema pulmonar. No entanto,
outro estudo de Greca et al., que ainda não foi publicado, avaliou a influência do
azul de metileno na prevenção das lesões intestinais e renais após isquemia e
reperfusão intestinal. Os autores concluíram, neste último estudo, que o azul de
metileno não exerce nenhum papel protetor nos órgãos avaliados. Isto motivou à
presente pesquisa, no intuito de avaliar se tais repercussões positivas poderiam
ocorrer no local da anastomose intestinal. Na avaliação microscópica da
inflamação no presente estudo, foram utilizados os seguintes parâmetros
67
inflamatórios: células polimorfonucleares, edema, congestão vascular, células
monomorfonucleares, tecido de granulação e fibrose.
Com relação às células polimorfonucleares, na comparação entre os três
grupos de estudo simultaneamente, observou-se escore de inflamação médio
moderado, sem diferença estatisticamente significativa.
Na avaliação do edema, observou-se que no grupo de isquemia com uso de
azul de metileno o escore foi mais alto (inflamação entre discreta e moderada),
mas sem diferença estatisticamente significativa.
Na verificação da congestão vascular, o escore também foi mais alto no
grupo de isquemia com uso de azul de metileno (inflamação discreta e moderada),
mas também sem diferença significativa. É importante ressaltar que tanto a
análise do escore da congestão vascular como do edema é subjetiva, o que
caracteriza pouco peso na interpretação de tais resultados.
No que diz respeito à contagem das células monomorfonucleares, houve
escore mais alto no grupo de isquemia sem o uso do azul de metileno (inflamação
entre discreta e moderada), em relação aos outros grupos (inflamação discreta).
Ressalta-se que o comportamento do grupo de isquemia com uso de azul de
metileno foi semelhante ao grupo controle, o que poderia sugerir efeito benéfico do
azul de metileno como quelante da reação inflamatória.
No caso da análise do tecido de granulação, houve diferença
estatisticamente significativa entre o grupo de isquemia sem o uso de azul de
metileno (inflamação entre discreta e moderada), quando comparado ao grupo
isquemia com uso de azul de metileno e grupo controle (inflamação discreta), o
que mantém o comportamento encontrado na análise dos monomorfonucleares.
Na análise da fibrose, quando comparados os grupos, observou-se o
mesmo comportamento dos monomorfonucleares e do tecido de granulação, ou
seja, escore mais alto no grupo de isquemia sem o uso de azul de metileno
(inflamação entre discreta e moderada) em relação aos grupos isquemia com azul
de metileno e grupo controle (inflamação discreta).
Com relação à concentração de colágeno, é sabido que os radicais livres de
oxigênio decorrentes da isquemia-reperfusão levam a colagenólise
107
. Radicais
68
superóxido derivados dos neutrófilos na região da anastomose podem também
contribuir para a colagenólise
107,200
. Tekin et al.
197
avaliaram a concentração
média de hidroxiprolina nas anastomoses de cólon de ratos submetidos à
isquemia e reperfusão e concluíram que o uso de antitrombina III previne seus
efeitos deletérios. O uso da antitrombina III leva a aumento significante da
concentração de colágeno, quando comparado ao grupo de ratos submetidos a
isquemia, sem o uso da substância.
Biondo-Simões et al.
196
avaliaram os efeitos da isquemia-reperfusão
intestinal na cicatrização das anastomoses do intestino delgado. Foram
comparadas as concentrações de colágeno no 3.° e no 7.° dias de pós-operatório.
No 7.° dia de pós-operatório, o grupo controle teve maior concentração de
colágeno total e o grupo com maior tempo de isquemia apresentou o menor valor
de colágeno.
Em nosso estudo, na comparação entre os três grupos, não houve
diferença significante no nível de colágeno Tipo I e Tipo III.
69
6 CONCLUSÕES
70
Os dados obtidos, estudando-se a influência do azul de metileno nas
anastomoses intestinais submetidas à isquemia e a reperfusão, permitem concluir:
1) Observou-se maior freqüência de aderências perianastomóticas nos ratos
submetidos à isquemia e ao uso do azul de metileno.
2) Em relação aos parâmetros inflamatórios e à análise da concentração e
na maturação do colágeno, não foi possível afirmar efeito benéfico do azul
de metileno nas anastomoses intestinais submetidas à isquemia e
reperfusão.
71
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