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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
Estudo dos efeitos renais do veneno da serpente Crotalus
durissus collilineatus
DANIELA NASCIMENTO AMORA
Fortaleza-Ceará
2005
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
Estudo dos efeitos renais do veneno da serpente Crotalus
durissus collilineatus
DANIELA NASCIMENTO AMORA
Dissertação apresentada à Coordenação de Pós-Graduação em
Farmacologia da Universidade Federal do Ceará para a obtenção do
título de Mestre em Farmacologia
Orientadora
Profa. Dra. Helena Serra Azul Monteiro
Fortaleza-Ceará
2005
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
Esta dissertação foi submetida como parte dos requisitos necessários à obtenção
do grau de Mestre em Farmacologia, outorgado pela Universidade Federal do
Ceará e encontra-se à disposição dos interessados na Biblioteca setorial desta
instituição.
Daniela Nascimento Amora
Data da Defesa: 12 de Janeiro de 2005
Banca Examinadora:
Profa. Dra. Helena Serra Azul Monteiro
Profa. Dra. Francisca Cléa Florenço de Sousa
Profa. Dra. Gisela Costa Camarão
4
À minha mãe
5
“Curar a alma por meio dos sentidos,
e os sentidos por meio da alma”.
Oscar Wilde
6
Agradecimentos
À Profa. Dra. Helena Serra Azul Monteiro por ter me proporcionado a chance de
crescer profissionalmente.
À Profa. Dra. Rita Maria Dantas Nogueira que é a responsável pela minha
decisão de seguir carreira nas áreas de docência e de pesquisa e que é uma das
pessoas que mais admiro, tanto no campo profissional quanto pessoal.
À Profa. Dra.Gisela Costa Camarão que será sempre para mim um exemplo de
professora e de pesquisadora a ser seguido.
Ao Doutorando Paulo Sérgio Ferreira Barbosa, uma pessoa que sempre me
ajudou nos experimentos e que me fez sentir integrada ao grupo de pesquisa.
À Profa. Dra.Alice Maria Costa Martins, uma pessoa com quem sempre pude
contar.
Ao Prof. Dr. Dalgimar Beserra de Menezes por sua indispensável ajuda.
À Profa. Dra. Marta Regina Magalhães, coordenadora do Centro de Estudos e
Pesquisas Biológicas da Universidade Católica de Goiás, por ter gentilmente
cedido, parte do veneno utilizado nos experimentos.
Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia Íris, Francisco,
Fernando e Rose.
Às amigas Fernanda Carvalho Bezerra e Gracyene Maria Varela.
À amiga Karla Graziela Moreira que mesmo morando longe continua sendo uma
pessoa muito importante na minha vida.
Ao colega farmacêutico Carlos Tiago Moura, por sua ajuda, em diversas
ocasiões, desde da época da monitoria em Farmacologia até agora.
À mestranda Ticiana Meireles Sousa, uma pesquisadora nata, com quem sempre
pude contar e que é um exemplo de competência em tudo que faz.
Às doutorandas e amigas Regilane e Karinne.
7
Aos colegas Renata Alves e René Duarte.
Aos colegas do Laboratório do IBIMED: Cleidiana, Daniel Freire, Diego,
Franzé, João Paulo, Monique e Pedro.
Aos colegas do Laboratório de Farmacologia da Dor (LAFAD): Airton, Camila,
Felipe, Juliana, Karinne, Marcelo, Régis e Ruth.
Às funcionárias do curso de Pós-graduação em Farmacologia Áurea e Sílvia.
Aos funcionários do Instituto de Biomedicina (IBIMED): Jociê, José e Kátia.
Ao Dr. Domingos Barreto pela ajuda indispensável ajuda na realização das
análises bioquímicas.
À Sílvia Maria Silva França pela imprescindível ajuda nos experimentos.
Aos amigos Daniela, Fábio, Helano, Isabel, Isabeli, Mara, Marília, Milena,
Mônica e Raquel.
À minha família.
À Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(FUNCAP) pelo apoio financeiro que me proporcionou condições ideais para a
dedicação exclusiva ao curso de Mestrado.
8
ÍNDICE
Lista de Figuras 10
Lista de Abreviaturas 13
Resumo 14
Abstract 15
1. Introdução 17
2. Objetivos 39
3. Material e Métodos 41
3.1. Estudo da toxicidade aguda do veneno da serpente
Crotalus durissus collilineatus 41
3.1.1. Animais 41
3.1.2. Material 41
3.1.3. Procedimento experimental 41
3.2. Perfusão de rim isolado de rato 42
3.2.1. Animais 42
3.2.2. Substâncias utilizadas 42
3.2.3. Preparo da solução perfusora 42
3.2.4. O sistema de perfusão de rim isolado de rato 43
3.2.5. Calibração do sistema de perfusão de rim isolado
de rato 45
3.2.6. Técnica cirúrgica 47
3.2.7. Procedimento experimental 47
3.2.8. Análise histológica 49
3.2.9. Grupos experimentais 49
3.2.10. Cálculo dos parâmetros renais 50
3.2.11. Estatística 52
9
3.3. Aspectos éticos 52
4. Resultados 54
4.1.Estudo da toxicidade aguda do veneno bruto da
serpente Crotalus durissus collilineatus 54
4.2.Perfusão de rim isolado de rato 56
4.3.Análise histológica dos grupos da perfusão renal 70
5. Discussão 74
6. Conclusão 81
7. Referências Bibliográficas 83
10
LISTA DE FIGURAS
Figura 01 Fotografia da serpente Crotalus durissus collilineatus 18
Figura 02
Esquema dos mecanismos que contribuem para o decréscimo do
ritmo de filtração glomerular (RFG) na insuficiência renal aguda 23
Figura 03
Desenho esquemático do sistema de perfusão de rim isolado
de rato 45
Figura 04
Calibração do sistema. Velocidade da bomba versus pressão 46
Figura 05
Calibração do sistema. Velocidade da bomba versus medida
do fluxômetro 47
Figura 06
Calibração do sistema. Velocidade da bomba versus fluxo na
ponta da cânula 47
Figura 07 Fotografia da técnica cirúrgica do método de perfusão de rim
isolado de rato 49
Figura 08
Análise histológica de fígado do grupo tratado com veneno bruto da
serpente Crotalus durissus collilineatus na dose de 3600 μg/kg, onde
se observa microvacuolização discreta em hepatócitos. 56
Figura 09
Análise histológica de fígado do grupo tratado com veneno bruto
da serpente Crotalus durissus collilineatus na dose de 4800μg/kg,
onde se observa microvacuolização discreta em hepatócitos. 57
Figura 10 Análise histológica de fígado do grupo tratado com veneno bruto
da serpente Crotalus durissus collilineatus na dose de 7200 μg/kg,
onde se observa microvacuolização discreta em hepatócitos.
57
Figura 11
Efeitos renais promovidos pelo veneno bruto (10 e 30μg/mL) e
pelas frações (10μg/mL) da serpente Crotalus durissus
collilineatus na pressão de perfusão (PP) 61
Figura 12
Efeitos renais promovidos pelo veneno bruto (10 e 30μg/mL) e
pelas frações (10μg/mL) da serpente Crotalus durissus
collilineatus na resistência vascular renal (RVR) 62
11
Figura 13 Efeitos renais promovidos pelo veneno bruto (10 e 30μg/mL) e
pelas frações (10μg/mL) da serpente Crotalus durissus
collilineatus no fluxo urinário (FU) 63
Figura 14
Efeitos renais promovidos pelo veneno bruto (10 e 30μg/mL) e
pelas frações (10μg/mL) da serpente Crotalus durissus
collilineatus no ritmo de filtração glomerular (RFG) 64
Figura 15 Efeitos renais promovidos pelo veneno bruto (10 e 30μg/mL) e
pelas frações (10μg/mL) da serpente Crotalus durissus collilineatus
no percentual de transporte tubular total de sódio (%TNa
+
) 65
Figura 16 Efeitos renais promovidos pelo veneno bruto (10 e 30μg/mL) e
pelas frações (10μg/mL) da serpente Crotalus durissus collilineatus
no percentual de transporte tubular total de potássio (%TK
+
) 66
Figura 17
Efeitos renais promovidos pelo veneno bruto (10 e 30μg/mL) e
pelas frações (10μg/mL) da serpente Crotalus durissus collilineatus
no percentual de transporte tubular total de cloreto (%TCl
-
) 67
Figura 18 Efeitos renais promovidos pelo veneno bruto (10 e 30μg/mL) e
pelas frações (10μg/mL) da serpente Crotalus durissus
collilineatus no percentual de transporte tubular proximal de
sódio (%pTNa
+
) 68
Figura 19 Efeitos renais promovidos pelo veneno bruto (10 e 30μg/mL) e
pelas frações (10μg/mL) da serpente Crotalus durissus
collilineatus no percentual de transporte tubular proximal de
potássio (%pTK
+
) 69
Figura 20 Efeitos renais promovidos pelo veneno bruto (10 e 30μg/mL) e
pelas frações (10μg/mL) da serpente Crotalus durissus
collilineatus no percentual de transporte tubular proximal de
cloreto (%pTCl
-
) 70
Figura 21 Efeitos renais promovidos pelo veneno bruto (10 e 30μg/mL) e
pelas frações (10μg/mL) da serpente Crotalus durissus
collilineatus no clearance osmótico (C
osm
) 71
Figura 22 Análise histológica dos rins do grupo controle 72
12
Figura 23 Aspecto morfológico de rim perfundido com veneno bruto da
serpente Crotalus durissus collilineatus (10μg/mL), analisado
através de microscopia óptica, onde observa-se o acúmulo de material
proteináceo no espaço glomerular (seta menor) e a presença de degeneração
hidrópico vacuolar das células tubulares (seta tracejada). 73
Figura 24
Aspecto morfológico de rim perfundido rim perfundido com veneno
bruto da serpente Crotalus durissus collilineatus (30μg/mL), analisado
através de microscopia óptica, onde observa-se o acúmulo de material
proteináceo nos espaços glomerular (seta menor) e tubular
(seta maior).
73
Figura 25
Aspecto morfológico de rim perfundido com a fração crotoxina do
veneno da serpente Crotalus durissus collilineatus (10μg/mL),
analisado através de microscopia óptica, onde observa-se o acúmulo
de material proteináceo no espaço tubular (setas).
74
Figura 26
Análise histológica dos rins perfundidos com a fração fosfolipase A
2
do veneno da serpente Crotalus durissus collilineatus (10μg/mL),
analisado através de microscopia óptica, onde observa-se o acúmulo
de material proteináceo no espaço glomerular (setas). 74
13
LISTA DE ABREVIATURAS
AMP
c
Adenosina monofosfato cíclico
CB Subunidade B da crotoxina
CA Subunidade A da crotoxina ou crotapotina
Cdc10 10μg de veneno bruto da serpente Crotalus durissus collilineatus
Cdc30 30μg de veneno bruto da serpente Crotalus durissus collilineatus
COX-1 Ciclooxigenase 1
COX-2 Ciclooxigenase 2
CTX Crotoxina
FLA
2
Fosfolipase A
2
FLA
2c
Fosfolipase A
2
citosólica
FLA
2s
Fosfolipase A
2
secretória
FLA
2
-D49 Fosfolipase A
2
com atividade hidrolítica
FLA
2
-K49 Fosfolipase A
2
sem atividade hidrolítica
FSR Fluxo sangüíneo renal
FU Fluxo urinário
H
+
-K
+
-ATPase Bomba de prótons
IRA Insuficiência renal aguda
kDa Quilodaltons
K
f
Coeficiente de ultrafiltração
mL Mililitro
Na
+
-K
+
-ATPase Bomba de sódio e potássio
NO Óxido nítrico
NOS Enzima óxido nítrico sintetase
PGE
2
Prostaglandina E2
PGI
2
Prostaglandina I2 ou prostaciclina
PGFs Prostaglandinas F
PP Pressão de perfusão
PTK Proteína tirosina quinase
RFG Ritmo de filtração glomerular
RVR Resistência vascular renal
Receptor A
1
Receptor de adenosina tipo 1
20-HETE Ácido 20-hidroxieicosatetranóico
11,12-EET Ácido 11,12-epoxieicosatrienóico
μg Micrograma
%TNa
+
Percentual de transporte tubular total de sódio
%TK
+
Percentual de transporte tubular total de potássio
%TCl
-
Percentual de transporte tubular total de cloreto
14
RESUMO
Efeitos renais do veneno bruto e das frações da serpente Crotalus durissus collilineatus
Departamento de Fisiologia e Farmacologia – Faculdade de Medicina – Universidade
Federal do Ceará. Daniela Nascimento Amora, Dissertação de Mestrado em
Farmacologia – UFC, 2005. Orientadora: Dra. Helena Serra Azul Monteiro.
A serpente Crotalus durissus collilineatus é encontrada na região do Cerrado e o acidente
causado por esta espécie constitui um problema de saúde pública. A insuficiência renal aguda
é a alteração sistêmica mais séria, apesar dos seus mecanismos não serem completamente
esclarecidos. O objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos biológicos produzidos pelo
veneno bruto de Crotalus durissus collilineatus e pelas frações crotoxina e fosfolipase A
2
. Foi
realizado o estudo da toxicidade aguda do veneno bruto de C d collilineatus, através da
análise histológica de coração, cérebro, rins, pulmões e fígado de ratos tratados com doses
crescente do veneno. Nesse estudo foi observada a presença de alterações hepáticas como
microvacualização e esteatose, enquanto os demais órgãos apresentaram aspectos normais. Os
efeitos renais foram avaliados através do método de perfusão de rim isolado de rato. O veneno
bruto, usado na dose de 10μg, causou um aumento na pressão de perfusão (PP), no fluxo
urinário (FU) e no ritmo de filtração glomerular (RFG), com efeito máximo aos 120min (PP:
controle
120
110,3±3,69; veneno
120
126,8±10,2;FU: controle
120
0,19±0,03; veneno
120
0,23±0,06;
RFG: controle
120
0,79±0,07; veneno
120
1,17±0,4). Essa dose não produziu alterações no
transporte tubular de sódio (%TNa
+
), potássio (%TK
+
) e de cloreto (%TCl
-
). A dose mais
elevada de veneno bruto (30μg) causou um decréscimo significativo, com efeito máximo, aos
120min, na PP(controle
120
110,3±3,69; veneno
120
96,7±8,1), na RVR (controle
120
6,42±0,78;
veneno
120
4,8±0,56), no FU (controle
120
0,19±0,03; veneno
120
0,12±0,01) e no RFG (controle
120
0,79±0,07; veneno
120
0,53±0,09). Não ocorreram alterações no transporte tubular de
eletrólitos. A fração crotoxina não produziu alterações no RFG (controle
120
0,79±0,07;
crotoxina
120
0,31±0,10). Esta fração também reduziu os %TK
+
(controle
120
69,94±6,49;
crotoxina
120
33,28±4,78)
e %TCl
-
(controle
120
79,53±2,67, crotoxina
120
64,62±6,93). O grupo
perfundido com FLA
2
apresentou um decréscimo no RFG (controle
120
0,79±0,07; FLA
2
120
0,52±0,07), enquanto a PP, a RVR, o FU e o %TNa
+
permaneceram estáveis. Foram
observadas reduções no %TK
+
aos 120min (controle
120
69,94±6,49; FLA
2120
56,26±6,81) e
aos 60min, no %TCl
-
(controle
60
82,25±2,72; FLA
260
75,04±4,26). Foi observada degeneração
hidrópico vacuolar e a presença de material proteináceo nos túbulos renais, na análise
histológica dos rins perfundidos tanto com veneno bruto quanto com as frações. Estes
resultados indicam que o veneno de Crotalus durissus collilineatus causou alterações
significativas nos parâmetros renais e nos aspectos morfológicos hepáticos.
Palavras-chave: Crotalus; veneno de serpente; crotoxina; rim; perfusão.
15
ABSTRACT
Renal Effects of Crotalus durissus collilineatus Crude Venom and Its Fractions
Departament of Physiology and Pharmacology – Faculty of Medicine – Federal
University of Ceara.
Daniela Nascimento Amora, Master’s Dissertation – UFC, 2005.
Professor: Dr. Helena Serra Azul Monteiro.
Crotalus durissus collilineatus is a snake usually found in semideciduous forest, the Cerrado
region and its bites constitutes an important health problem. The most serious systemic
change and primary cause of death is acute renal failure although the mecanisms of the
damaging effects are not totally understood. We investigated the biological effects promoted
by Crotalus durissus collilineatus crude venom and its fractions crotoxin and phopholipase
A
2
. The toxic effects of C d collilineatus crude venom were evaluated by the histopathological
analysis of organs such as heart, kidney, brain, lung and liver. Wistar rats were inoculated
intraperitoneally with C d collilineatus crude venom. The liver showed steatosis and
microvacuolation.The other organs showed normal morphological aspects. Renal effects were
evaluated by the isolated perfused rat kidney method.The crude venom used at the lowest
dose (10μg) increased perfusion pressure (PP), urinary flow (UF), and glomerular filtration
rate (GFR), with maximal effect at 120min (PP: control
120
110.3±3.69; venom
120
126.8±10.2;
UF: control
120
0.19±0.03; venom
120
0.23±0.06; GFR: control
120
0.79±0.07; venom
120
1.17±0.4).
There was no effect on the percent of sodium tubular transport (%TNa
+
), the percent of
potassium tubular transport (%TK
+
) and the percent of chloride tubular transport (%TCl
-
) The
highest dose of the crude venom (30μg) caused a significantly decrease in PP (control
120
110.3±3.69; venom
120
96.7±8.1), RVR (control
120
6.42±0.78; venom
120
4.8±0.56), UF
(control
120
0.19±0.03; venom
120
0.12±0.01) and GFR (control
120
0.79±0.07;
venom
120
0.53±0.09). There was not effect on the percent of electrolytes tubular transport
(%TNa
+
, %TK
+
and %TCl
-
). Crotoxin (10μg) produced a decrease in GFR (control
120
0.79±0.07; crotoxin
120
0.31±0.10), while PP, RVR and UF remained stable. Crotoxin also
reduced %TK
+
(control
120
69.94±6.49; crotoxin
120
33.28±4.78)
and %TCl
-
(control
120
79.53±2.67; crotoxin
120
64.62±6.93) with maximal effect at 120min. Kidney perfused with
phospholipase A
2
(PLA
2
) showed a decrease in GFR (control
120
0.79±0.07; PLA
2 120
0.52±0.07) at 120min, whereas PP, RVR, UF and %TNa
+
remained stable. PLA
2
also reduced
%TK
+
(controle
120
69.94±6.49; PLA
2 120
56.26±6.81) and %TCl
-
(controle
60
82.25±2.72; PLA
2
60
75.04±4.26) at 60min. These results altogether indicate that Crotalus durissus collilineatus
venom caused significative alterations in the renal parameters as well as hepatic damage.
Keywords: Crotalus; Snake venom; Crotoxin; Kidney; Perfusion.
16
Introdução
17
1. Introdução
Venenos são encontrados em várias espécies de seres vivos, de
unicelulares a pássaros (Russel e Dart, 1991; Dumbacher et al., 2000).
Animais peçonhentos são todos aqueles que produzem veneno e têm
estruturas especializadas para injetá-lo. O veneno é produzido por glândulas
específicas e tem a função de captura da presa e digestão do alimento e também
de defesa contra agressores. No caso das serpentes, estas apresentam ainda um
órgão sensorial importante que é a fosseta loreal – um sensor térmico muito
desenvolvido – situado entre a narina e os olhos. Através desse sensor, a
serpente pode localizar a sua presa em ambientes escuros apenas pela captação
do calor (Nogueira e Sakate, 2004).
O animal não-peçonhento é aquele cujos tecidos, ou partes deles, são
parcial ou totalmente tóxicos e que não possui mecanismo ou estrutura para a
liberação de veneno (Russel e Dart, 1991).
Dentre as serpentes peçonhentas encontradas no Brasil e de interesse
clínico, existem as pertencentes à família Viperidae, subfamília Crotalinae, com
os gêneros Bothrops (conhecida popularmente como jararaca ou urutu), Crotalus
(vulgarmente chamada de cascavel ou maracambóia) e Lachesis (também
conhecida como surucucu); e as pertencentes à família Elapidae com subfamília
Elapinae representada pela espécie Micrurus - conhecida como coral verdadeira
ou boicorá (Nogueira e Sakate, 2004).
As serpentes do gênero Crotalus estão representadas no Brasil por apenas
uma espécie, a Crotalus durissus e classificadas nas subespécies Crotalus
durissus terrificus, encontrada nas regiões sul oriental e meridional; Crotalus
durissus collilineatus (Figura 1), distribuídas nas regiões secas do Centro-Oeste,
em Minas Gerais e no norte de São Paulo; Crotalus durissus cascavella,
encontrada nas áreas de caatinga da região Nordeste; Crotalus durissus ruruima,
18
observada na região Norte; e a Crotalus durissus marajoensis, observada na Ilha
de Marajó (Pinho e Pereira, 2001).
Figura 1. Fotografia da serpente Crotalus durissus collilineatus.
Além das diferenças morfológicas e de comportamento dessas serpentes,
observa-se uma distribuição geográfica particular para cada espécie. Assim, as
crotálicas, por exemplo, são encontradas principalmente em regiões secas,
pedregosas, arenosas, em encostas de morros, cerrados e raramente na faixa
litorânea ou florestas úmidas (Nogueira e Sakate, 2004).
19
Vital Brazil foi o pesquisador responsável pelo primeiro levantamento do
número de óbitos por picadas de serpentes peçonhentas no estado de São Paulo
nos anos de 1897, 1899 e 1900 (Bochner e Struchiner, 2003). Segundo estes
autores, nos últimos cem anos, o perfil da epidemiologia dos acidentes ofídicos
manteve-se inalterado, com uma maior freqüência de acidentes no início e no
final do ano, em pessoas do sexo masculino, em trabalhadores rurais, na faixa
etária de 15 a 49 anos, e com o gênero Bothrops sendo o maior responsável por
tais acidentes. No estado do Ceará, no período de 1992 a 1995, ocorreram cerca
de 688 acidentes por serpentes peçonhentas, com uma média anual de 172 casos
(Feitosa et al., 1997).
A identificação do animal causador do acidente, principalmente através da
avaliação dos sintomas da vítima, é um procedimento importante na medida em
que possibilita a dispensa imediata de maioria dos pacientes picados por
serpentes não peçonhentas e viabiliza o reconhecimento das espécies de
importância médica em nível regional além de auxiliar na indicação do
antiveneno a ser administrado (Pinho e Pereira, 2001). Há um caso de
antiveneno preparado a partir da peçonha de cascavel do Nordeste do Brasil que
não promoveu proteção em vítimas picadas em regiões do Sudeste e, portanto,
confirmou a necessidade de produção local de antiveneno (Chippaux et al.,
1991).
A maioria dos venenos exerce seus efeitos em quase todas as células e
tecidos; e suas propriedades farmacológicas são determinadas pela quantidade
de um constituinte específico e biologicamente ativo que se acumula num sítio
de reconhecimento onde é capaz de produzir injúria (Russel et al., 1996). Além
disso, em acidentes ofídicos ocorrem reações inflamatórias intensas com a
liberação de muitos mediadores inflamatórios como as prostaglandinas, as
citocinas, a bradicinina, as frações do complemento e o fator de agregação
plaquetária (Barraviera et al., 1995).
20
Vários trabalhos apontam uma possível implicação entre níveis elevados
de interleucina 8 (IL-8), que são observados em pacientes picados por serpentes
crotálicas, e reações sistêmicas como insuficiência respiratória e choque
(Petricevich, 2004; Barraviera et al.,1997). Petricevich (2004) sugere que o
choque seria decorrente da ativação maciça de citocinas pró-inflamatórias nesses
tipos de acidentes.
Os componentes dos venenos têm um conjunto de ações tanto sobre as
presas quanto sobre as vítimas humanas (Chippaux et al., 1991). Eles
apresentam sua toxicidade em tempos variados e algumas diferenças nas
manifestações clínicas são decorrentes não só das suas propriedades específicas,
mas também das diferenças na velocidade de absorção e na habilidade de
penetrar em membranas e tecidos (Chippaux et al., 1991). Segundo Sanchez e
colaboradores (1992), as amostras de veneno de Crotalus durissus têm maior
atividade letal quando injetadas pela via intraperitoneal do que pela via
intravenosa. Além disso, o conteúdo e a potência da peçonha em uma dada
serpente variam de acordo com o tamanho, a idade, o hábito alimentar, o clima e
a época do ano (Chippaux et al., 1991).
O desenvolvimento de métodos experimentais para a identificação das
diferentes atividades dos componentes de venenos de diversas espécies tem
permitido a determinação do nível de variação destes, assim como a origem de
tais variações (Chippaux et al., 1991).
Além disso, testes detalhados de várias toxinas e de modificações
sintéticas destas têm demonstrado que partes das moléculas são importantes para
as suas atividades. Sabe-se, por exemplo, que algumas fosfolipases A
2
, isoladas
de serpentes da família Viperidae, são desprovidas de atividade catalítica,
devido à substituição em resíduos críticos na alça de ligação de cálcio,
particularmente na posição 49, onde um resíduo de ácido aspártico é substituído
por lisina (Diaz et al., 2001).
21
O tratamento do envenenamento pode variar de acordo com o tipo, a
natureza e a severidade dos sintomas ou com os sinais específicos diretamente
relacionados aos componentes tóxicos do veneno (Petricevich, 2004).
Portanto, através desses estudos, tem-se uma expansão do conhecimento
da variabilidade intraespecífica, o que pode permitir um tratamento mais eficaz
das vítimas de acidentes com animais peçonhentos de um modo geral (Chippaux
et al., 1991).
É possível fazer a distinção entre acidente botrópico, crotálico e laquético
na maioria dos casos de pacientes picados, com base nos diferentes quadros
clínicos apresentados.
Em envenenamentos por Bothrops ocorre intensa inflamação na região da
picada, com grande destruição tecidual, alteração da coagulação sangüínea, o
que facilita a ocorrência de sangramentos. No envenenamento por Crotalus e
por Micrurus pode ocorrer paralisia flácida da musculatura esquelética,
principalmente a musculatura facial (MS/FUNASA, 2001). As principais
manifestações do acidente por serpentes laquéticas são dor e edema no local da
picada, incoagulabilidade sangüínea, hipotensão arterial grave e bradicardia
(França e Fan, 1992).
Ao estudar os óbitos por serpentes peçonhentas no estado de São Paulo,
Ribeiro e colaboradores (1998) mostraram a ocorrência de insuficiência
respiratória em todos os acidentes crotálicos que levavam ao óbito, enquanto
ocorreu em pouco mais da metade dos acidentes botrópicos. Os autores
justificaram essa maior freqüência no primeiro caso, como resultante da
rabdomiólise generalizada, e principalmente, da paralisia flácida, com
conseqüente insuficiência respiratória restritiva.
Nishioka e colaboradores (2000) propuseram a ausência de atividade
citotóxica do veneno crotálico, como uma explicação plausível para a rara
ocorrência de infecções locais nesses acidentes.
22
No acidente crotálico ocorre também miotoxicidade sistêmica, com
intensa mioglobinúria e insuficiência renal aguda por necrose tubular aguda
(Ribeiro et al., 1998).
A capacidade dos rins de responderem às variações hemodinâmicas
garante uma habilidade imprescindível para a manutenção da homeostasia
corporal. A água e os eletrólitos são reabsorvidos a partir do filtrado glomerular,
enquanto os excretas remanescentes - incluindo aqui toxicantes em potencial -
permanecem na luz tubular (Hewitt et al.,1991). Portanto, as células tubulares
dos rins são particularmente vulneráveis às mais diversas injúrias devido a sua
exposição desproporcional às substâncias circulantes e devido aos processos de
transporte que produzem concentrações intracelulares dessas substâncias.
A insuficiência renal aguda (IRA) é caracterizada por um declínio abrupto
do ritmo de filtração glomerular com resultante azotemia (Goldstein e
Schnellmann, 1996). Nos últimos 50 anos, ocorreram avanços significativos no
entendimento da patogênese da IRA nefrotóxica e da IRA isquêmica,
principalmente através de modelos experimentais, no entanto, ocorreram poucas
mudanças em termos de mortalidade (Schrier et al., 2004).
Apesar da patogênese da IRA ser complexa, alguns mecanismos
intrarenais (Figura 2) podem ser associados ao dano glomerular induzido
quimicamente, como o aumento na resistência vascular renal e/ou o dano
tubular, sendo estes dois últimos, os principais mecanismos envolvidos no
decréscimo do ritmo de filtração glomerular induzido por substâncias
nefrotóxicas (Goldstein e Schnellmann, 1996). Além disso, o dano vascular
direto, causado por edema das células endoteliais e por estímulo da liberação de
endotelina, pode também reduzir o fluxo sangüíneo (Goldstein e Schnellmann,
1996).
23
Injúria
Renal
Aguda
Efeitos vasculares
Efeitos tubulares
↓Coeficiente
↓Fluxo
de sangüíneo
ultrafiltração renal
Obstrução Estase
retrógrada
↓ Força de filtração
↓Ritmo de filtração
glomerular
Figura 2. Esquema dos mecanismos que contribuem para o decréscimo do ritmo de
filtração glomerular (RFG) na insuficiência renal aguda. K
f
, coeficiente de ultrafiltração;
FSR, fluxo sangüíneo renal [Modificado de Brezis M, et al., (1993): p.129-152.]
24
A injúria ao epitélio tubular é uma alteração geralmente observada IRA.
Sabe-se que a injúria primária da célula tubular resulta, de forma característica,
da isquemia, da injúria tóxica ou de ambas (Racusen e Nast, 1999). A injúria
celular resulta em rompimento do epitélio e perturbação da sua capacidade de
reabsorção e pode levar à obstrução do lúmen tubular (Racusen e Nast, 1999).
Alterações tubulares, como o desprendimento de células tubulares, a perda
da borda em escova, a presença de células edemaciadas, de cilindros hialinos e
de massas protéicas amorfas no lúmen dos túbulos, são sinais comuns de injúria
e disfunção renais, particularmente, de necrose tubular aguda (Cruz-Höfling et
al., 2001).
A formação de cilindros decorre, geralmente, da exfoliação celular e do
acúmulo de células intactas e de fragmentos celulares que podem ser vistos no
sedimento urinário (Racusen e Nast, 1999). Células necróticas podem ser vistas
também in situ, ao longo do epitélio tubular ou no lúmen tubular, mas
geralmente a necrose celular total não é proeminente. A apoptose das células
tubulares após injúria também é observada (Racusen e Nast, 1999).
As alterações renais induzidas por venenos ofídicos foram estudadas por
diversos pesquisadores.
Monteiro e Fonteles (1999), estudando o veneno de Bothrops jararaca em
rim isolado de rato, observaram que ele diminuía o fluxo urinário, a pressão de
perfusão, o ritmo de filtração glomerular e o transporte tubular de sódio e de
potássio. Havt e colaboradores (2001) demonstraram que o veneno de Bothrops
jararacussu diminuía a pressão de perfusão, a resistência vascular renal e o
transporte de sódio e de potássio, produzia um aumento no ritmo de filtração
glomerular e no fluxo urinário, nos últimos 30 minutos de cada experimento. O
veneno de Bothrops moojeni apresentou efeitos semelhantes aos de Bothrops
jararacussu em estudo também realizado em rim isolado de rato (Barbosa et al.,
2002).
25
Esse mesmo grupo de pesquisa, ao investigar os efeitos renais do veneno
de Bothrops jararaca, demonstrou que o fator de agregação plaquetária tem
participação na mediação da necrose tubular induzida pelo veneno (Monteiro e
Fonteles, 1999).
Martins e colaboradores (1998) mostraram que as alterações renais
induzidas pelo veneno de Crotalus durissus cascavella eram resultantes do
efeito direto deste sobre o rim isolado de rato, e que a dexametasona era capaz
de bloquear todas as alterações renais induzidas nesse modelo.
Num estudo sobre os efeitos renais do veneno de Crotalus durissus
terrificus, foi observado que este produziu um aumento no ritmo de filtração
glomerular e no fluxo urinário, mas de forma contrária ao ocorrido com o
veneno de Crotalus durissus cascavella, produziu um decréscimo na pressão de
perfusão (Martins et al., 1998; Monteiro et al., 2001).
Os efeitos desses venenos poderiam ser decorrentes da modulação da
síntese e liberação intrarenal de mediadores vasoativos como óxido nítrico,
prostanóides, endotelina e adenosina (Kuan et al., 1993; Martins et al., 2002;
Ruschitzka et al., 1998; Schrier et al., 2004).
Ao estudar a participação dos macrófagos no efeito do veneno Crotalus
durissus cascavella, Martins e colaboradores (2003) demonstraram que o
sobrenadante estimulado pelo veneno causou um aumento no ritmo de filtração
glomerular e no fluxo urinário assim como um decréscimo no transporte de
sódio. Segundo os autores, isso sugere que o veneno induz a liberação de
mediadores inflamatórios que então promoveriam a nefrotoxicidade.
Os macrófagos podem diminuir o ritmo de filtração glomerular de néfron
isolado, ao produzir tromboxano A
2
(TXA
2
) que atua através da contração das
células mesangiais, com conseqüente diminuição da área de superfície
disponível para a filtração (Hewitt et al., 1991). Além do tromboxano, os
26
macrófagos produzem prostacicilina, preferencialmente pela via da COX-2
(Ueno et al., 2001).
Esses estudos mostraram também que a fosfolipase A
2
e as
prostaglandinas têm uma participação crucial na mediação dos efeitos
hemodinâmicas induzidos pelo veneno de cascavel.
O veneno da serpente crotálica da América do Sul é composto
principalmente de toxinas (convulxina, crotamina, crotoxina e giroxina),
enzimas (5-nucleotidase, fosfodiesterase, trombina-símile, L-amino-oxidase,
calicreína tecidual e NAD-hidrolase) e peptídios (Rangel-Santos et al., 2004).
Quanto à participação individual dos componentes de veneno, foi
demonstrado que a crotoxina, a principal toxina, causa alterações nos
glomérulos e na vasculatura renal; que a giroxina diminui a reabsorção tubular e
que a convulxina não produz alterações significativas (Martins et al., 2002).
O veneno bruto de Crotalus durissus terrificus possui um efeito duplo
sobre a função dos macrófagos, ao inibir o espraiamento e a fagocitose e ao
estimular a produção de peróxido de hidrogênio, a atividade antimicrobiana e o
metabolismo de glicose e de glutamina dessas células (Petricevich, 2004).
A crotoxina, no entanto, mesmo inibindo a capacidade de espraiamento e
de fagocitose dos macrófagos, não é capaz de estimular a produção de peróxido
de hidrogênio (Sampaio et al., 2003). Segundo estes autores, isso sugere que
esses efeitos são derivados de outro (s) componente (s) do veneno bruto.
Cardoso e colaboradores (2001) demonstraram ainda que a administração
de crotoxina em camundongos induz um aumento nos níveis de interleucina-10,
uma citocina que inibe a função dos leucócitos.
A crotoxina foi isolada do veneno de Crotalus durissus terrificus por
Slotta e Frankel-Conrat em 1938 e, posteriormente, do veneno da subespécie
Crotalus durissus collilineatus por Lennon e Kaiser em 1990. Ela é uma
neurotoxina pré-sináptica potente, que age na junção neuromuscular produzindo
27
bloqueio neuromuscular e paralisia flácida progressiva de intensidade variada e
que também induz injúria seletiva severa na musculatura esquelética (Bucaretchi
et al., 2002).
A crotoxina é formada por duas subunidades – a subunidade básica (CB) e
a subunidade ácida (CA ou crotapotina). A primeira é hidrofóbica e apresenta
intensa atividade fosfolipásica, além de apresentar forte tendência a formar
oligômeros e a ligar-se de forma não específica às membranas, quando não
complexada com a subunidade ácida (Bon et al., 1979; Jeng et al., 1978; KriŽaj
et al., 1996; Radvanyi e Bon, 1982). A crotapotina é um polipeptídio desprovido
de atividade tóxica ou enzimática (Rangel-Santos et al., 2004).
Apesar da crotoxina apresentar um perfil eletroforético semelhante nas
subespécies Crotalus durissus cascavella, Crotalus durissus collilineatus e
Crotalus durissus terrificus, existem diferenças em suas atividades, talvez
relacionadas à existência de isoformas dessa proteína (Rangel-Santos et al.,
2004).
As fosfolipases A
2
(FLA
2
) catalisam a hidrólise da ligação éster da
posição sn-2 dos fosfolipídios de membrana produzindo ácidos graxos e
lisofosfolipídios (Chacur et al., 2003). Elas estão entre os componentes de
venenos mais estudados (Valentin e Lambeau, 2000). A abundância e sua fácil
purificação são algumas das razões apontadas para o interesse nesse componente
(Valentin e Lambeau, 2000).
Existem vários tipos de FLA
2
que são classificadas de acordo com sua
localização nas células e com suas estruturas primárias (Forte-Dias et al., 1999;
Landucci et al., 2000).
Existem as FLA
2
citosólicas (FLA
2c
) e as secretórias (FLA
2s
); sendo as
primeiras intracelulares e de alto peso molecular (31-110kDa), enquanto as
segundas são extracelulares e de baixo peso molecular (14-18kDa) (Forte-Dias
et al.1999). Até o ano de 2001, cerca de 199 fosfolipases A
2
secretórias foram
28
identificadas e classificadas de acordo com suas estruturas primárias (Dunn e
Broady, 2001).
Além de serem encontradas em venenos de serpentes, as FLA
2
secretórias
ocorrem em uma grande variedade de fluidos biológicos como secreções
pancreáticas, exsudatos inflamatórios e venenos de artrópodes e de moluscos
(Chacur et al., 2003).
As FLA
2
são divididas nos grupos I, II e III de acordo com sua estrutura
proteíca primária. As do grupo I são encontradas tanto no pâncreas de
mamíferos quanto em venenos de serpente das famílias Elapidae e
Hydrophidae; as do segundo grupo são encontradas nos venenos de serpentes
das famílias Crotalidae e Viperidae; e o grupo III é composto pela FLA
2
isoladas de venenos de abelha (Apis mellifera) e de lagartos (Landucci et al.,
2000). Pesquisas recentes relataram a existência de FLA
2
do grupo III em
coração, fígado, rins e músculo esquelético humanos (Dunn e Broady, 2001).
Receptores de fosfolipase A
2
têm sido encontrados em várias espécies.
Eles são classificados em receptores do tipo neuronal (tipo-N) - que são
altamente expressos no tecido cerebral - e do tipo muscular (tipo-M) que foi
identificado pela primeira vez em músculo esquelético de coelhos (Dunn e
Broady, 2001).
A existência de uma proteína solúvel - identificada no surfactante
pulmonar humano - com estrutura semelhante à do receptor do tipo-M e de uma
variante transcrita no rim humano sugerem que uma forma solúvel desse
receptor é expressa em tecido humano (Dunn e Broady, 2001). Além disso, o
receptor do tipo-M é encontrado em grandes quantidades no fígado e coração
(Valentin e Lambeau, 2000).
Foram encontrados também receptores semelhantes aos do tipo-N em
órgãos como pulmões, fígado, coração e rins, o que sugere a existência de uma
29
diversidade de receptores do tipo neuronal em diferentes tecidos (Valentin e
Lambeau, 2000).
Inibidores de FLA
2
de venenos, com estrutura semelhante ao receptor do
tipo-M, têm sido identificados como complexos solúveis no plasma de serpentes
da família Viperidae (Dunn e Broady, 2001).
Os inibidores endógenos de FLA
2
são encontrados tanto em tecidos de
mamíferos quanto de serpentes (Dunn e Broady, 2001). Foi identificado, por
exemplo, um inibidor de FLA
2
(CNF-fator neutralizante da Crotalus) na fração
globulina-α
1
do plasma de serpentes crotálicas da América do Sul (Forte-Dias et
al.,1994).
Inúmeras atividades inflamatórias têm sido descritas para as fosfolipases
A
2
de venenos como indução de edema, recrutamento de células inflamatórias,
desgranulação de mastócitos entre outras (Chacur et al., 2003).
A identificação de uma miríade de proteínas de ligação às fosfolipases A
2
secretórias (FLA
2s
), com diferentes estruturas, sugere que FLA
2s
distintas
também funcionam com ligantes específicos (Valentin e Lambeau, 2000). Os
autores relacionam ainda essa descoberta ao fato de que a trombina e as
proteases relacionadas a esta, terem sido inicialmente consideradas como
enzimas proteolíticas, mas que agora são reconhecidas por agirem também como
ligantes, através de receptores acoplados à proteína G (Valentin e Lambeau,
2000).
A convulxina, uma proteína de alto peso molecular, foi isolada por
Franceschi em 1981. Ela induz convulsões e distúrbios respiratório e circulatório
em camundongos, gatos, cães e cobaias; e causa agregação plaquetária in vitro
em várias espécies de mamíferos (Sano-Martins et al., 2001). Apesar da
trombocitopenia não ter sido relatada nos envenenamentos por Crotalus
durisssus terrificus, Franceschi e colaboradores (1980,1981) mostraram a
convulxina induz trombocitopenia in vivo e in vitro. Eles mostraram também
30
que ela é o agente estimulante específico para plaquetas do veneno de Crotalus
durisssus cascavella. Segundo Hawgood (1982), o veneno de Crotalus durisssus
collilineatus contém quantidades apreciáveis de convulxina.
A giroxina é um peptídio trombina-símile com atividades amidásica,
esterásica e fibrinolítica (Camilo apud Martins et al., 2002). Ela induz rotações
no corpo do animal no eixo longitudinal quando injetada por via intravenosa
(Sano-Martins et al., 2001).
A crotamina é um componente do veneno de Crotalus durissus
collilineatus que pertence à família de proteínas miotóxicas que possui
toxicidade leve (Nicastro et al., 2003). Além de modificar especificamente os
canais de sódio-voltagem dependentes, tem sido sugerido que a crotamina
também exibe atividades analgésica e mionecrótica (Nicastro et al., 2003). Ela é
uma miotoxina que quando injetada pela via intramuscular tem a capacidade de
induzir a contração da musculatura esquelética e conseqüente necrose (Mebs e
Ownby, 1990).
Apesar das inúmeras investigações sobre as ações farmacológicas e
fisiopatológicas da crotamina, o mecanismo de ação exato pelo qual ela causa
contração e degeneração das células dos músculos esqueléticos não é claro
(Mebs e Ownby, 1990). O consenso sobre o mecanismo de ação das miotoxinas,
como a crotamina, é que a membrana plasmática é o principal local de ação.
Evidências de danos iniciais da membrana plasmática vêm da observação direta
de membranas rompidas assim como, de observações que mostram um aumento
nos níveis de cálcio intracelular, indicando uma mudança na permeabilidade da
membrana para esse íon (Mebs e Ownby, 1990). Entretanto, não há consenso
sobre a necessidade ou não de atividade hidrolítica dessas fosfolipases A
2
para
suas ações nas células musculares esqueléticas (Mebs e Ownby, 1990).
A enzima do tipo trombina é responsável pela ação coagulante do veneno,
causando hipofibrinogenemia ou consumo completo de fibrinogênio, o que
31
causa incoagulabilidade parcial ou total do sangue (Sano-Martins et al., 2001;
Bucaretchi et al., 2002).
Mesmo com os avanços no entendimento da patogênese da insuficiência
renal aguda produzida por substâncias nefrotóxicas, não houve uma melhora
significativa em termos de diminuição da mortalidade (Schrier et al., 2004). O
entendimento da fisiopatologia da injúria renal induzida por substância
nefrotóxica tem implicações para as terapias em potencial e para as medidas
preventivas (Schnellmann e Kelly, 1999).
A ciclooxigenase (COX), também conhecida por prostaglandina H
sintetase, é uma enzima que limita a velocidade do catabolismo do ácido
araquidônico às várias prostaglandinas bioativas (Yang, 2003). Existem as
isoformas COX-1 e COX-2 que são as formas constitutiva e induzível,
respectivamente (Yang, 2003). A primeira é utilizada, principalmente, na
biossíntese imediata de prostaglandinas, o que ocorre dentro de alguns minutos
após o estímulo por mobilizadores de cálcio (Ueno et al., 2001). A segunda um
produto gênico de resposta imediata nas células inflamatórias e imunes (Foegh e
Ramwell, 2001).
O mecanismo de ação envolve das prostaglandinas envolve a ativação de
receptores celulares resultando na iniciação subseqüente de cascatas
sinalizadoras envolvendo proteínas G e AMP cíclico (Cummings et al., 2000).
Sabe-se que em várias condições fisiológicas e fisiopatológicas, como o
excesso no consumo de sais, a privação de água, entre ouros, a estimulação renal
da COX-2 é restrita à medula renal, apesar do mecanismo da indução da COX-2
nesse local não ser completamente elucidado (Yang, 2003).
Tanto a medula renal quanto o córtex renal sintetizam prostaglandinas,
porém a capacidade de síntese da medula é significativamente maior (Foegh e
Ramwell, 2001). Algumas delas, particularmente PGE
2
e PGI
2
, causam
32
vasodilatação no rim e aumentam a liberação de renina (Kramer et al., 1985;
Foegh e Ramwell, 2001).
A PGE
2
, um modulador importante da hemodinâmica renal, exerce efeitos
diuréticos e natriuréticos (Schneider et al., 2004).Em coelhos, as células renais
capazes de produzir PGE
2
em quantidades significativas incluem: mácula densa,
ductos coletores medulares e corticais e células intersticiais medulares, enquanto
que os túbulos proximais produzem pouca PGE
2
(Schneider et al., 2004).
A PGE
1
, a PGE
2
e a PGI
2
aumentam a excreção de água e de sódio (Foegh
e Ramwell, 2001). A PGI
2
é preferencialmente produzida em macrófagos via
COX-2, sendo esta enzima a maior fonte de PGI sistêmica produzida em
humanos normais (Ueno et al., 2001).
Segundo Ganong (1996), no intestino, as PGEs e PGFs estimulam o
movimento de água e de eletrólitos para dentro do lúmen intestinal.Tais efeitos
podem responder pela diarréia aquosa que acompanha a administração oral
dessas substâncias. De forma oposta, a PGI
2
não induz diarréia, e ainda impede
que outras prostaglandinas a induzam (Ganong, 1996).
Ainda em relação à produção e ao metabolismo das prostaglandinas, sabe-
se que a ciclooxigenase está localizada principalmente na medula renal,
enquanto a enzima inativadora - prostaglandina desidrogenase - está localizada
principalmente no córtex (Bowman e Rand, 1980). As células endoteliais
contêm, primariamente, prostaciclina sintetase (Bowman e Rand, 1980; Foegh e
Ramwell, 2001). No caso específico da PGE
2
, sua biossíntese envolve múltiplas
etapas enzimáticas e requer a ação seqüencial da fosfolipase A
2
, das
ciclooxigenases e das PGE
2
sintetases (Schneider et al., 2004).
Estudos recentes têm mostrado que a produção de prostaglandinas regula
hemodinâmica renal (Deng et al., 1996; Ueno et al., 2001; Yang, 2003). Sabe-
se, por exemplo, que no ducto coletor, uma região crítica para a regulação
hormonal da excreção de água e de eletrólitos, a manutenção da integridade
33
estrutural e funcional da medula renal é controlada, em parte, pelas
prostaglandinas (Yang, 2003).
Outras substâncias, como o óxido nítrico, podem também preservar a
vasodilatação renal e impedir um decréscimo excessivo no ritmo de filtração
glomerular, apesar de que o papel exato do óxido nítrico nos rins não está
estabelecido (Stolte et al., 1979; Ogungbade et al., 2003).
O papel desempenhado por leucotrienos e produtos do citocromo P450 em
rins humanos continua especulativo. Recentemente, foi constatado que o 5,6-
epóxido é um poderoso vasodilatador em experimentos realizados em animais,
e que os radicais livres atuam em fosfolipídios que contêm ácido araquidônico,
produzindo uma 8-epi-PGF
2α
cujas propriedades poderosas se assemelham às do
tromboxano (Hondeghem e Roden, 2001).
A bradicinina é peptídio vasoativo potente gerado tanto no plasma quanto
na parede vascular (Pompermayer et al., 2002). Ela pode promover aumento no
ritmo de filtração glomerular, ao estimular a liberação de óxido nítrico a partir
do endotélio renal (Koeppen e Stanton, 1997). Além disso, ela causa natriurese
ao inibir a reabsorção no ducto coletor. Sua ação sobre a perfusão renal parece
ser limitada pela presença de peptidades renais que causariam o término da ação
desse mediador (Pompermayer et al., 2002).
O interesse no estudo das ações da bradicinina intensificou-se em 1949,
quando Rocha e Silva e colaboradores relataram que a tripsina e certos venenos
de serpentes agiam na globulina plasmática para produzir uma substância que
diminuía a pressão sangüínea e causava contração de desenvolvimento lento no
intestino. Por causa dessa resposta lenta, eles denominaram essa substância de
bradicinina (Brown e Roberts II, 2001). Em 1970, Ferreira e colaboradores
isolaram um fator que potencializava a bradicinina, a partir do veneno de
serpente Bothrops jararaca (Brown e Roberts II, 2001).
34
Pompermayer e colaboradores (2002) demonstraram que a liberação de
óxido nítrico, o metabolismo de ácido araquidônico via monooxigenases
dependentes do citocromo P450 e a ativação de canais de potássio dependentes
de cálcio estão envolvidos na vasodilatação induzida pela bradicinina no rim
isolado de rato. Além disso, tem sido relatado que o efeito vasodilatador da
bradicinina é dependente das prostaglandinas no rim de cães e de radicais livres
derivados do oxigênio em artéria cerebral em ratos (Pompermayer et al., 2002).
A adenosina é um nucleosídio que ocorre naturalmente em todo o
organismo. Estima-se que a sua meia-vida seja de 10 segundos. Seu mecanismo
de ação envolve um aumento na concentração de potássio e inibição do influxo
de cálcio induzido pelo AMP
c
(Hondeghem e Roden, 2001). A adenosina é
produzida dentro dos rins onde causa várias mudanças funcionais como
diminuição do fluxo sangüíneo renal e do ritmo de filtração glomerular, inibição
da liberação de renina pelas células justaglomerulares, aumento no cálcio
intracelular nas células do ducto coletor de coelhos, entre outras (Takeda et al.,
1993). Ela promove vasoconstrição da arteríola aferente, daí a diminuição do
fluxo sangüíneo renal e no ritmo de filtração glomerular (Koeppen e Stanton,
1997).
Os efeitos fisiológicos da adenosina endógena são mediados,
principalmente, pela ativação de dois subtipos de receptores ligados à
membrana, um receptor A
1
de alta afinidade e que requer concentrações
nanomolares do ligante para ativação; e um receptor A
2
de baixa afinidade que
requer concentrações micromolares (Balakrishnan et al., 1993).
Estudos in vitro sugerem que a adenosina pode também induzir contração
das células mesangiais em cultura, um efeito que é bloqueado por antagonistas
seletivos do receptor A
1
e reproduzido por agonistas seletivos deste receptor
(Balakrishnan
et al., 1993).
35
Uma parte das ações da adenosina – mediada através do receptor A
1
– é
acoplada com ativação da fosfolipase C, resultando no aumento de inositol -
1,4,5 - trifosfato e diacilglicerol (Takeda et al.,1993). Os autores comentam
também que em glândula retal de tubarão, a adenosina endógena inibe o
transporte de cloreto estimulado por hormônio através da diminuição do AMP
c
e
de outros mecanismos.
O óxido nítrico (NO) tem um papel importante na regulação da
hemodinâmica renal, na filtração glomerular, no transporte tubular e na secreção
de renina (Beltowski et al., 2003). O óxido nítrico produzido pelas células
tubulares e/ou vasculares adjacentes regula o transporte tubular de forma
autócrina/parácrina (Beltowski et al., 2003). Segundo Ogungbade e
colaboradores (2003), o óxido nítrico inibe a atividade epoxigenase e a inibição
da enzima óxido nítrico sintetase (NOS) endógena revela um sistema
vasoconstritor renal operando através do metabolismo da epoxigenase
dependente do citocromo P450, que contribui para a hemodinâmica e os efeitos
excretórios renais que são decorrentes da supressão da NOS.
Beltowski e colaboradores (2003) demonstraram que o doador de NO,
nitroprussiato de sódio - administrado através da infusão local - diminui a
atividade da enzima Na
+
-K
+
-ATPase da medula renal, enquanto não tem efeito
na enzima cortical.
Já enzima H
+
-K
+
-ATPase, que é encontrada na membrana apical das
células tubulares e está envolvida na reabsorção de potássio e na acificação da
urina, é inibida por produtos do metabolismo do ácido araquidônico via
citocromo P450, como o ácido 20- hidroxieicosatetraenóico (20-HETE) e o
ácido 11,12-epoxieicosatrienóico (11,12-EET). Estes metabólitos também
inibem a atividade da Na
+
-K
+
-ATPase medular,sendo a Na
+
-K
+
-ATPase mais
sensível ao 20-HETE do que a H
+
-K
+
-ATPase (Beltowski et al., 2003).
36
A relação entre estrutura e função das fosfolipases A
2
(FLA
2
) é
importante para o entendimento dos determinantes estereoquímicos que estão
envolvidos na expressão das atividades miotóxica, neurotóxica, cardiotóxica,
anticoagulante, convulsivante, hipotensiva e edematogênica (Murakami e Arni,
2003).
Várias abordagens têm sido utilizadas para delinear a (s) região (ões)
crítica (s) para a expressão dessas atividades, especialmente em relação à
neurotoxicidade e à miotoxicidade (Murakami e Arni, 2003). Essas abordagens
são baseadas em seqüência homóloga, distribuição de cargas, perfis
hidropáticos, modificação química, síntese peptídica e estudos sobre a estrutura
(Murakami e Arni, 2003).
Muitos estudos têm mostrado que FLA
2
secretórias de venenos de
serpentes e de abelhas são responsáveis por injúria celular (Cummings et al.,
2000).
O mecanismo catalítico das FLA
2
s tem sido elucidado baseando-se nas
análises estruturais das enzimas das classes I, II e III no estado nativo e no
estado de transição complexado com análogos (Murakami e Arni, 2003).
As FLA
2
secretórias da classe II podem ser subdivididas ainda em, pelo
menos, duas subclasses: análogos de FLA
2
-D49 e de FLA
2
-K49 (Murakami e
Arni, 2003). As primeiras hidrolisam fosfolipídios naturais, isto é, são
cataliticamente ativas; enquanto as últimas não hidrolisam (Murakami e Arni,
2003).
Vários canais de potássio têm sido identificados através das técnicas de
patch-clamp e de clonagem molecular no rim (Wang, 2004). Estudos recentes
apontam a participação da proteína tirosina quinase (PTK), da quinase induzida
por soro e por glicocorticóide e da quinase sem lisina na regulação da secreção
de potássio no ducto coletor cortical (Wang, 2004).
37
Um dos subtipos de PKC é ativado por ácido araquidônico, de modo que a
ativação da PKC também pode ocorrer com agonistas que ativam essa enzima
(Rang et al., 2001).
Grandes avanços nas pesquisas com toxinas e enzimas ofídicas
desenvolveram-se nos últimos trinta anos como advento das análíses da estrutura
bioquímica, principalmente dos venenos elapídicos, em conseqüência de sua
maior letalidade. Contudo, novas descobertas do fracionamento e estudo de
toxinas geraram grande interesse para o estudo com a família Viperidae. A
pesquisa com o veneno bruto da Crotalus durissus collilineatus e suas frações
poderá abrir novas perspectivas na descoberta de novas ferramentas
farmacológicas e substâncias que ajudarão no tratamento e prevenção de várias
doenças.
38
Objetivos
39
2. Objetivos
Objetivo geral
Estudar o veneno bruto e suas frações obtidas da serpente Crotalus durissus
collilineatus na perspectiva de elucidação do mecanismo de ação renal e
descoberta de novas ferramentas farmacológicas e de substâncias para utilização
na terapêutica clínica.
Objetivos específicos
1-Estudar a toxicidade aguda do veneno bruto da Crotalus durissus collilineatus.
2- Estudar o veneno bruto da Crotalus durissus collilineatus em rim isolado de
rato.
3- Avaliar as alterações renais causadas pelas frações do veneno da serpente
Crotalus durissus collilineatus.
40
Materiais e Métodos
41
3.1. Estudo da toxicidade aguda do veneno de Crotalus durissus collilineatus
3.1.1. Animais
Foram utilizados ratos Wistar machos, pesando entre 260 e 300g,
provenientes do biotério do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da
Universidade Federal do Ceará. Os animais foram mantidos em jejum 24 horas
antes do experimento com água ad libitum.
3.1.2. Marterial
O veneno bruto da serpente Crotalus durissus collilineatus foi gentilmente
cedido pela Dra. Marta R. Magalhães da Universidade Católica de Goiás e
fracionado e purificado pelo Dr. Marcus H. Toyama da UNESP/UNICAMP.
O veneno bruto utilizado no teste da toxicidade aguda foi diluído em
solução salina a 0,9%.
3.1.3. Procedimento experimental
Os ratos inoculados com veneno (50) foram divididos em grupos de 10
animais, sendo administradas, pela via intraperitoneal, as seguintes doses: 1200,
2400, 3600, 4800 e 7200μg/kg de peso corpóreo. Cinco animais de cada grupo
foram escolhidos aleatoriamente e necropsiados 24 horas após a administração
do veneno. Os rins, fígado, coração, cérebro e pulmões foram fixados em uma
solução de formaldeído a 10% e submetidos à coloração hematoxilina-eosina
para análise através de microscopia óptica.Os resultados foram submetidos à
análise qualitativa através da observação da presença e localização das lesões ou
alterações encontradas.Todas as lâminas foram confeccionadas no Laboratório
de Patologia-BIOPSE, e analisadas no Departamento de Patologia e Medicina
Legal da Universidade Federal do Ceará pelo Prof. Dalgimar Beserra Menezes
.
42
3.2. Perfusão de rim isolado de rato
3.2.1. Animais
Foram utilizados ratos Wistar machos, pesando entre 260 e 300g,
provenientes do biotério do Instituto de Biomedicina (IBIMED) e do biotério do
Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal do Ceará.
Os animais foram mantidos em jejum 24 horas antes de cada experimento com
água ad libitum.
3.2.2. Substâncias utilizadas
Foi utilizado o veneno bruto da serpente Crotalus durissus collilineatus
foi gentilmente cedido pela Dra. Marta R. Magalhães da Universidade Católica
de Goiás e fracionado e purificado pelo Dr. Marcus H. Toyama da
UNESP/UNICAMP.
Foram utilizadas na preparação da solução perfusora as seguintes
substâncias: NaHCO
3
(Synth), NaH
2
PO
4
.H
2
O (Synth), NaCl (Synth),
MgSO
4
.7H
2
O (Reagen), uréia (Reagen), KCl (Merck), glicose (Squibb),
penicilina G potássica cristalina (Squibb), fração V de albumina bovina
(SIGMA) e inulina (SIGMA).
No procedimento cirúrgico foram utilizados pentobarbital sódico
(SIGMA) a 3% , manitol (Reagen) e heparina (Cristálida).
3.2.3. Preparo da solução perfusora
O meio de perfusão consistia na solução de Krebs-Henseleit modificada
contendo na sua composição (em mmol/L): 147 de Na
+
, 5 de K
+
, 2,5 de Ca
2+
, 2
de Mg
2+
, 110 de Cl
-
, 2,5 HCO
3
-
, 2,5 de SO
4
2-
e 2,5 de PO
4
2-
; 6g de albumina
bovina (BSA fração V) da Sigma Chemical Co.; 0,075g de uréia (Reagen),
0,075g de inulina (SIGMA), 0,15g de glicose (Squibb) e penicilina G potássica
43
cristalina (Squibb). A solução perfusora foi equilibrada com uma mistura de
oxigênio e
gás carbônico durante a perfusão (95%O
2
/5%CO
2
). A solução
perfusora foi dialisada por 48 horas antes do experimento para a retirada de
várias substâncias contaminantes, como citrato, piruvato, lactato.
3.2.4.O sistema de perfusão de rim isolado
Em nossos experimentos foi utilizado o sistema de perfusão de rim
isolado de rato. Os rins isolados permitem o estudo da função renal na ausência
de influências sistêmicas (Nizet, 1975). Nos últimos 40 anos, essa técnica tem
sido utilizada para investigar os aspectos da fisiologia, farmacologia e
farmacocinética renais (Wang et al., 2004).
O sistema utilizado é constituído dos seguintes componentes:
Banho-maria – manutenção de uma temperatura constante do pulmão
tipo silástico entre 36 e 37
o
C.
Bomba aquecedora com termostato – manutenção de uma temperatura
constante no sistema entre 36 e 37
o
C.
Bomba de perfusão Watson – bombeia a solução de perfusão ao longo
do sistema.
Catabolhas – evita a entrada de bolhas nos rins (embolia).
Coletor de urina – frasco que coleta a urina. É trocado a cada 10
minutos.
Condensador – mantém a solução aquecida na temperatura de 37
o
C
durante todo o experimento.
Filtro Millipore 5 μm – filtração da solução perfusora.
Fluxômetro – medida do fluxo de perfusão (mL/hora).
Manômetro de mercúrio – medida da pressão de perfusão (mmHg).
Pulmão tipo silástico – promoção das trocas gasosas (95% O
2
e 5%
CO
2
).
44
Seringa coletora – seringa coletora de perfusato. A coleta é realizada a
cada 10 minutos.
O sistema de perfusão de rim isolado está esquematizado na figura 3.
45
Fluxômetro
Seringa
Oxigenador
Cata-bolhas
Manômetro
Cânula
arterial
Coletor
de urina
Aquecedor
O
2
/CO
2
FiltroBomba
Aquecedor
Figura 3 – Desenho esquemático do sistema de perfusão de rim isolado de rato.
46
3.2.5. Calibração do sistema de perfusão de rim isolado de rato
A calibração foi realizada na presença de solução de cloreto de sódio a
0,9% em temperatura de 37
o
C. Foram observados a pressão de perfusão, a
medida do fluxômetro e o volume de salina para cada unidade da bomba de
perfusão (1, 2, 3, 4 e 5). O fluxo de salina foi colhido em proveta milimetrada
(fluxo na ponta da cânula). Para uma melhor adaptação do sistema às unidades,
a coleta de dados foi realizada em intervalos de 3 minutos. As figuras 4, 5 e 6
mostram que o sistema manteve-se constante em todos os grupos experimentais.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
12345
Velocidade da Bomba (rpm x 10)
Pressão (mmHg)
Figura 4. Calibração do sistema. Velocidade da bomba versus pressão.
47
0
0,02
0,04
0,06
12345
Velocidade da Bomba (rpm x 10)
Fluxômetro (Litros/Hora)
Figura 5. Calibração do sistema. Velocidade da bomba versus medida do fluxômetro.
0
10
20
30
40
50
60
12345
Velocidade da Bomba (rpm x 10)
Fluxo (mL/min)
Figura 6. Calibração do sistema. Velocidade da bomba versus fluxo na ponta da cânula.
48
3.2.6. Técnica cirúrgica
O rim direito foi exposto sob anestesia com pentobarbital sódico
(50mg/kg) através de uma incisão mediana no abdômen e o fluxo urinário foi
interrompido através da ligação do ureter. Administrou-se 3mL de manitol a
20% pela veia femoral durante a cirurgia. Efetuou-se o isolamento da adrenal
direita e posterior descapsulação do rim correspondente.O ureter direito foi
canulado, para a coleta de urina, através de tubo de polietileno (PE50). A artéria
renal foi canulada através da artéria mesentérica para evitar a interrupção do
fluxo segundo o método descrito por Balhlmann et al. (1967), Nishiitsutji-Uwo
et al. (1967), Ross (1978) e Fonteles et al. (1983).O rim foi isolado e transferido
para um sistema fechado e perfundido com 100mL de perfusato mantido a 37
o
C
(Figura 7).
3.2.7. Procedimento experimental
A pressão de perfusão e o fluxo foram mantidos constantes durante os 30
minutos iniciais. Após esse período, considerado como controle interno, foi
adicionada a substância-teste e observadas as mudanças nos parâmetros renais
até os 120 minutos.
A variabilidade funcional de cada rim foi avaliada através do ritmo de
filtração glomerular, que foi determinado pela depuração renal de inulina, pelo
fluxo urinário e pela percentagem de reabsorção tubular de água, sódio, potássio
e cloreto.
Para a análise da reabsorção tubular foram coletadas amostras de
perfusato e urina em intervalos de 10 minutos, durante um período total de 120
minutos. O volume urinário foi medido, pelo método gravimétrico, em
recipientes de vidro previamente pesados. Amostras de perfusato (1,5mL) foram
coletadas em recipientes de vidro no ponto médio de cada intervalo de coleta de
49
A
B
F
C
D
F
Figura 7 – Técnica cirúrgica. A – veia femoral; B – ureter direito canulado; C – artéria
renal; D – artéria mesentérica; E – aorta; F – cânula arterial.
50
urina. As amostras de urina e de perfusato foram analisadas através do método
da espectrofotometria de chama. As leituras fotométricas foram realizadas em
fotômetro de chama (Flame Photometer - modelo 443 IL); o kit LabTest foi
utilizado para a dosagem de cloreto; a inulina foi determinada seguindo o
método descrito por Fonteles e Leibach (1982); e a medida de osmolalidade
através de osmômetro (Vapor pressure osmometer- modelo 5100c ESCOR).
Todas as dosagens bioquímicas foram realizadas na Unidade de Pesquisas
Clínicas e assessoradas pelo farmacêutico bioquímico Domingos Barreto.
3.2.8. Análise histológica
Os fragmentos dos rins direitos, utilizados no sistema de perfusão, como
dos rins esquerdos (controle externo) foram retirados ao final de cada
experimento e acondicionados numa solução de formal a 10%, para posterior
análise através de microscopia óptica. Todas as lâminas foram confeccionadas
no Laboratório de Patologia-BIOPSE, e analisadas no Departamento de
Patologia e Medicina Legal da Universidade Federal do Ceará pelo Prof. Dr.
Dalgimar Beserra Menezes.
3.2.9. Grupos experimentais
Os estudos com veneno bruto de Crotalus durissus collilineatus e suas
frações (crotoxina e fosfolipase A
2
) foram iniciados após um período de controle
interno de 30 minutos, e as observações foram feitas durante os 90 minutos
seguintes.
1. Grupo controle - perfusão somente com solução de Krebs-Henseleit
(n=6);
51
2. Perfusão com o veneno bruto de Crotalus durissus collilineatus -
10μg/mL (n=6);
3. Perfusão com o veneno bruto de Crotalus durissus collilineatus -
30μg/mL (n=6);
4. Perfusão com a fração crotoxina do veneno de Crotalus durissus
collilineatus - 10μg/mL (n=6);
5. Perfusão com a fração fosfolipase A2 do veneno de Crotalus durissus
collilineatus - 10μg/mL (n=6).
3.2.10. Cálculo dos parâmetros renais
Para a determinação dos parâmetros renais foram utilizadas as seguintes
fórmulas:
• PP - pressão de perfusão (mmHg)- dado obtido do
manômetro de mercúrio
• FU - fluxo urinário (mL.g
- 1
.min
-1
)
FU = peso do volume urinário / peso do rim esquerdo x 10
• FPR - fluxo de perfusão renal (mL. g
-1
.min
-1
)
FPR= fluxo registrado a cada 10min / intervalo de tempo x peso
do rim
• RVR = resistência vascular renal (mmHg.mL.g
-1
.min
-1
)
RVR = PP/FPR
• RFG - ritmo de filtração glomerular ( mL.g
-1
.min
-1
)
RFG=DOU
in
/ DOP
in
x FU, onde
DOU
in
= densidade ótica da inulina na urina
DOP
in
= densidade ótica da inulina no perfusato
• FNa
+
- sódio filtrado (μEq.g
-1
.min
-1
)
FNa
+
= RFG x PNa
+
,onde
PNa
+
= concentração de sódio no perfusato
52
• ENa
+
- sódio excretado (μEq.g
-1
.min
-1
)
ENa
+
= FU x UNa
+
,onde
UNa
+
= concentração de sódio na urina
• TNa
+
- sódio transportado (μEq.g
-1
.min
-1
)
TNa
+
= FNa
+
- ENa
+
• %TNa
+
- percentual de sódio transportado
%TNa
+
= TNa
+
x 100/ FNa
+
• Cosm - clearance osmótico (mL.g
-1
.min
-1
)
Cosm = (U
osm
/ P
osm
) x FU, onde
U
osm
= osmoridade urinária
P
osm
= osmoridade de perfusato
• CH
2
0 - clearance de água livre (mL.g
-1
.min
-1
)
CH
2
0= FU-C
osm
• dTNa
+
- transporte distal de sódio (mL.g
-1
.min
-1
)
dTNa
+
= CH
2
0 x PNa
+
• Ad Na
+
- aporte distal de sódio (μEq.g
-1
.min
-1
)
Ad Na
+
= dTNa
+
+ ENa
+
• pTNa
+
= transporte proximal de sódio (μEq.g
-1
.min
-1
)
pTNa
+
= FNa
+
x AdNa
+
• %pTNa
+
= percentual de transporte proximal de sódio
%pTNa
+
= pTNa
+
x 100/FNa
+
Todos os cálculos realizados para a determinação dos parâmetros foram
repetidos para o potássio e o cloreto.
53
3.2.11. Estatística
Foi usado um computador PC – AMD (950MHz) e programa GraphPrism
para análise de dados, expressos como a média ± erro padrão da média (E.P.M.).
Todas as tabelas e gráficos que avaliaram os parâmetros renais foram estudados
de acordo com a variável tempo, compilados em quatro grupos de 30 minutos
denominados: 30, 60, 90 e 120 minutos. Os dados foram avaliados através da
análise da variância (ANOVA) e teste de Bonferroni, como comparativo entre os
grupos, com significância de 5%.
3.3. Aspectos Éticos
O presente trabalho foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa com Animais da Universidade Federal do Ceará.
54
Resultados
55
4. Resultados
4.1.Estudo da toxicidade aguda do veneno bruto de Crotalus durissus
collilineatus
Após a análise histológica dos rins, fígado, coração, pulmão e cérebro, foi
observado que os corações, cérebros, rins e pulmões de animais tratados com
veneno bruto de Crotalus durissus collilineatus nas doses de 1200 (n=5), 2400
(n=5), 3600 (n=5), 4800 (n=5) e 7200μg/kg (n=5) de peso corporal,
apresentaram aspectos normais.
Foi observado microvacuolização discreta em hepatócitos, dispersa nas
zonas 1, 2 e 3 do lóbulo e esteatose em todos os animais tratados com as doses
3600, 4800 e 7200μg/kg (Figuras 8, 9 e 10, respectivamente). Enquanto que em
animais tratados com as doses de 1200 (n=5) e 2400μg/kg (n=5), apenas um
animal de cada apresentou tais alterações.
56
Figura 8. Análise histológica de fígado do grupo tratado com veneno bruto da serpente
Crotalus durissus collilineatus na dose de 3600 μg/kg, onde se observa microvacuolização
discreta em hepatócitos.
57
Figura 9. Análise histológica de fígado do grupo tratado com veneno bruto da serpente
Crotalus durissus collilineatus na dose de 4800 μg/kg, onde se observa microvacuolização
discreta em hepatócitos.
Figura 10. Análise histológica de fígado do grupo tratado com veneno bruto da serpente
Crotalus durissus collilineatus na dose de 7200 μg/kg, onde se observa microvacuolização
discreta em hepatócitos.
58
4.2.Perfusão de rim isolado de rato
O veneno bruto da serpente Crotalus durissus collilineatus e as suas
frações crotoxina (CTX) e fosfolipase A
2
(FLA
2
) foram administrados no
sistema de perfusão de rim isolado de rato 30 minutos após o início dos
experimentos. Os 30 minutos iniciais foram considerados como controle interno
de cada experimento. Os grupos tratados foram comparados a um grupo
controle, onde os rins foram perfundidos apenas com a solução de Krebs-
Henseleit.
O veneno bruto da serpente Crotalus durissus collilineatus foi utilizado
nas doses de 10 e 30μg e as frações crotoxina e fosfolipase A
2
foram testadas na
dose de 10μg.
A dose de 10μg do veneno bruto causou alterações na fisiologia renal, nos
parâmetros de pressão de perfusão (PP) e ritmo de filtração glomerular (RFG).
Foi observado um aumento na PP nos períodos de 90 e 120 minutos (Figura 11)
e no RFG apenas no período de 60 minutos (Figura 14). O fluxo urinário (FU)
apresentou uma tendência de aumento, apesar de não ser estatisticamente
significante (Figura 13).
Os parâmetros de percentual de transporte total de sódio (%TNa
+
),
potássio (%TK
+
) e cloreto (%TCl
-
) não foram modificados após a administração
do veneno bruto na dose de 10μg (Figuras 15, 16 e 17).
Foi observado que a dose de 30μg do veneno bruto (Cdccolli) causou
diminuição estatisticamente significativa nos parâmetros de PP e de RVR nos
período de 120 minutos (Figuras 11 e 12, respectivamente). Houve um
decréscimo também no FU nos períodos de 90 e 120 minutos (Figura 13) e no
RFG no período de 120 minutos (Figura 14).
59
Os parâmetros de %TNa
+
, %TK
+
e %TCl
-
não apresentaram modificações
após a administração do veneno bruto utilizado na dose de 30μg (Figuras 15, 16
e 17).
A fração crotoxina (CTX) causou uma diminuição no RFG nos períodos
de 60, 90 e 120 minutos (Figura 14), enquanto o FU permaneceu estável (Figura
13).
O percentual de transporte total de potássio foi diminuído em todos os
períodos, após a administração da CTX (Figura 16), enquanto houve diminuição
no percentual de transporte total de cloreto nos períodos de 60 e 120 minutos
(Figura 17).
Observou-se que a fração fosfolipásica promoveu uma diminuição no
RFG no período de 120 minutos (Figura 14), enquanto a PP, a RVR e o FU
permaneceram inalterados (Figuras 11,12 e 13). Houve uma diminuição no
percentual de transporte total potássio nos períodos de 60,90 e 120 minutos
(Figura 16) e de cloreto no período de 60 minutos (Figura 17), entretanto o
percentual de transporte total de sódio permaneceu inalterado (Figura 15).
Os percentuais de transporte proximal de sódio (%pTNa
+
) apresentaram
redução, aos 120 minutos, apenas no grupo tratado com crotoxina (Figura 18). A
redução máxima, no percentual de transporte proximal de potássio (%pTK
+
)
ocorreu aos 120 minutos, no grupo tratado com crotoxina, enquanto com o
grupo tratado com fosfolipase A
2
ocorreu aos 60 minutos. Os grupos perfundidos
com veneno bruto não apresentaram alterações no transporte proximal do
potássio (Figura 19). Os percentuais de transporte proximal de cloreto (%pTCl
-
)
dos grupo tratados com veneno bruto e com fosfolipase A
2
não foram alterados,
apenas o grupo perfundido com crotoxina apresentou redução no transporte
desse íon (Figura 20).
O clearance osmótico apresentou um aumento, apesar de não ser
estatisticamente significativo, no grupo tratado com veneno bruto na dose de
60
10μg, e uma redução no grupo tratado com veneno bruto na dose de 30μg. Não
houve alteração nos grupos tratados com crotoxina e com fosfolipase A
2
(Figura
21).
4.3.Análise histológica dos grupos da perfusão renal
Após a análise histológica dos rins perfundidos com veneno bruto de
Crotalus durissus collilineatus e as frações crotoxina e fosfolipase A
2
, foi
observado a presença de alterações morfológicas significativas.
Os rins perfundidos com veneno bruto, na dose de 10μg apresentaram
glomérulos com quantidade significativa de material proteináceo e quantidade
moderada nos túbulos (Figura 23). Além disso, foi observada a presença de
degeneração hidrópico vacuolar. Os vasos e o interstício apresentavam aspectos
normais.
No grupo experimental onde os rins foram perfundidos com dose maior
do veneno bruto (30μg), foram observadas alterações semelhantes ao do grupo
anterior. No entanto, a deposição de material proteináceo nos glorérulos foi
moderada. Além disso, foi constatada a presença de necrose tubular focal e de
glóbulos hialinos (Figura 24).
Os rins perfundidos com crotoxina, na dose de 10μg, apresentaram
glomérulos normais e uma quantidade moderada de material proteináceo nos
túbulos e nos espaços urinários (Figura 25), enquanto os rins perfundidos com
fosfolipase A
2
apresentaram uma quantidade intensa de material proteináceo
depositado nos glomérulos, nos túbulos e nos espaços urinários. Neste último
grupo, foi observado também a ocorrência de necrose tubular focal (Figura 26).
61
0
20
40
60
80
100
120
140
160
30 60 90 120
Tempo (min)
PP (mmHg)
Controle
Cdc10
Cdc30
CTX
FLA2
*
*
*
Tempo
(min)
Controle Cdc10 Cdc30 CTX FLA2
30
110,1±3,68 111,1±3,5 107,3±4,6 110,6±3,2 110,3±3,1
60
108,3±4,88 106,2±4,2 106,8±5,0 109,6±7,0 111,5±5,1
90
108,7±5,08 120,6±5,1* 103,2±4,1 108,4±9,1 107,9±6,5
120
110,3±3,69 126,8±10,2* 96,7±8,1* 108,3±10,0 108,3±8,4
Figura 11. Efeitos renais promovidos pelo veneno bruto (10 e 30μg/mL) e pelas frações
(30μg/mL) da serpente Crotalus durissus collilineatus na pressão de perfusão (PP). Os
dados são expressos por média ± E.P.M. compilados em quatro períodos de 30 minutos (30,
60, 90 e 120 minutos). A análise estatística foi feita por ANOVA e teste de Bonferroni com
p<0,05. * = comparação entre os grupos tratados (n=6) e o grupo controle (n=6). Cdc10 =
veneno bruto na dose de 10 μg; Cdc30 = veneno bruto na dose de 30 μg; CTX = crotoxina na
dose de 10 μg e FLA2 = fosfolipase A2 na dose de 10 μg.
62
0
1
2
3
4
5
6
7
8
30 60 90 120
Tempo (min)
RVR
(mmHg/mL.g
-1
.min
-1
)
Controle
Cdc10
Cdc30
CTX
FLA2
*
Tempo
(min)
Controle Cdc10 Cdc30 CTX FLA2
30
5,65±0,42 5,85±0,75 5,61±0,86 5,84±0,60 5,57±0,43
60
5,88±0,44 6,03±0,63 5,58±0,86 5,79±0,71 5,64±0,49
90
6,38±0,76 6,27±0,70 5,33±0,74 5,72±0,77 5,46±0,51
120
6,42±0,78 6,67±0,94 4,8±0,56* 5,72±0,84 5,48±0,57
Figura 12. Efeitos renais promovidos pelo veneno bruto (10 e 30μg/mL) e pelas frações
(30μg/mL) da serpente Crotalus durissus collilineatus na resistência vascular renal
(RVR). Os dados são expressos por média ± E.P.M. compilados em quatro períodos de 30
minutos (30, 60, 90 e 120 minutos). A análise estatística foi feita por ANOVA e teste de
Bonferroni com p<0,05. * = comparação entre os grupos tratados (n=6) e o grupo controle
(n=6). Cdc10 = veneno bruto na dose de 10 μg; Cdc30 = veneno bruto na dose de 30 μg;
CTX = crotoxina na dose de 10 μg e FLA2 = fosfolipase A2 na dose de 10 μg.
63
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
30 60 90 120
Tempo (min)
FU (mL/g
-1
.min
-1
)
Controle
Cdc10
Cdc30
*
*
CTX
FLA2
Tempo
(min)
Controle Cdc10 Cdc30 CTX FLA2
30
0,18±0,02 0,19±0,03 0,19±0,02 0,19±0,02 0,19±0,03
60
0,19±0,03 0,21±0,03 0,18±0,01 0,20±0,04 0,21±0,02
90
0,19±0,03 0,21±0,04 0,15±0,005* 0,17±0,05 0,19±0,02
120
0,19±0,03 0,23±0,06 0,12±0,01* 0,15±0,05 0,15±0,025
Figura 13. Efeitos renais promovidos pelo veneno bruto (10 e 30μg/mL) e pelas frações
(30μg/mL) da serpente Crotalus durissus collilineatus no fluxo urinário (FU). Os dados
são expressos por média ± E.P.M. compilados em quatro períodos de 30 minutos (30, 60, 90 e
120 minutos). A análise estatística foi feita por ANOVA e teste de Bonferroni com p<0,05. *
= comparação entre os grupos tratados (n=6) e o grupo controle (n=6). Cdc10 = veneno bruto
na dose de 10 μg; Cdc30 = veneno bruto na dose de 30 μg; CTX = crotoxina na dose de 10 μg
e FLA2 = fosfolipase A2 na dose de 10 μg.
64
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
30 60 90 120
Tempo (min)
RFG (mL/g
-1
.min
-1
)
Controle
Cdc10
Cdc30
CT
*
X
FLA2
*
*
*
*
Tempo
(min)
Controle Cdc10 Cdc30 CTX FLA2
30
0,87±0,07 0,83±0,13 0,88±0,13 0,80±0,20 0,86±0,16
60
0,78±0,06 1,05±0,20* 0,78±0,20 0,50±0,09* 0,76±0,14
90
0,81±0,08 0,94±0,20 0,67±0,10 0,40±0,10* 0,81±0,13
120
0,79±0,07 1,17±0,40 0,53±0,09* 0,31±0,10* 0,52±0,07*
Figura 14. Efeitos renais promovidos pelo veneno bruto (10 e 30μg/mL) e pelas frações
(30μg/mL) da serpente Crotalus durissus collilineatus no ritmo de filtração glomerular
(RFG). Os dados são expressos por média ± E.P.M. compilados em quatro períodos de 30
minutos (30, 60, 90 e 120 minutos). A análise estatística foi feita por ANOVA e teste de
Bonferroni com p<0,05. * = comparação entre os grupos tratados (n=6) e o grupo controle
(n=6). Cdc10 = veneno bruto na dose de 10 μg; Cdc30 = veneno bruto na dose de 30 μg;
CTX = crotoxina na dose de 10 μg e FLA2 = fosfolipase A2 na dose de 10 μg.
65
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
30 60 90 120
Tempo (min)
%TNa
+
C
ontrole
Cdc10
Cdc30
CTX
FLA2
Tempo
(min)
Controle Cdc10 Cdc30 CTX FLA2
30
79,63±2,24 80,60±4,52 77,94±1,36 79,43±7,29 79,67±2,64
60
79,50±1,80 82,78±3,06 79,31±2,04 73,75±6,39 76,78±3,29
90
79,43±2,75 78,21±3,41 78,16±2,19 72,83±6,42 79,24±2,81
120
79,14±2,53 80,38±3,53 78,94±2,44 66,03±7,22 74,71±3,88
Figura 15. Efeitos renais promovidos pelo veneno bruto (10 e 30μg/mL) e pelas frações
(30μg/mL) da serpente Crotalus durissus collilineatus no percentual de transporte
tubular total de sódio (%TNa
+
). Os dados são expressos por média ± E.P.M. compilados
em quatro períodos de 30 minutos (30, 60, 90 e 120 minutos). A análise estatística foi feita
por ANOVA e teste de Bonferroni com p<0,05. * = comparação entre os grupos tratados
(n=6) e o grupo controle (n=6). Cdc10 = veneno bruto na dose de 10 μg; Cdc30 = veneno
bruto na dose de 30 μg; CTX = crotoxina na dose de 10 μg e FLA2 = fosfolipase A2 na dose
de 10 μg.
66
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
30 60 90 120
Tempo (min)
%TK
+
*
*
*
*
*
*
Controle
Cdc10
Cdc30
CTX
FLA2
Tempo
(min)
Controle Cdc10 Cdc30 CTX FLA2
30
69,13±4,5 70,57±5,09 64,78±8,27 64,69±5,14 69,59±4,61
60
69,04±6,2 69,41±6,45 69,45±4,32 47,62±4,53* 54,52±6,32*
90
71,84±4,5 70,46±4,71 67,33±6,94 42,61±4,75* 62,19±4,62*
120
69,94±6,49 76,79±3,28 74,27±7,87 33,28±4,78* 56,26±6,81*
Figura 16. Efeitos renais promovidos pelo veneno bruto (10 e 30μg/mL) e pelas frações
(30μg/mL) da serpente Crotalus durissus collilineatus no percentual de transporte
tubular total de potássio (%TK
+
). Os dados são expressos por média ± E.P.M. compilados
em quatro períodos de 30 minutos (30, 60, 90 e 120 minutos). A análise estatística foi feita
por ANOVA e teste de Bonferroni com p<0,05. * = comparação entre os grupos tratados
(n=6) e o grupo controle (n=6). Cdc10 = veneno bruto na dose de 10 μg; Cdc30 = veneno
bruto na dose de 30 μg; CTX = crotoxina na dose de 10 μg e FLA2 = fosfolipase A2 na dose
de 10 μg.
67
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
30 60 90 120
Tempo (min)
%TCl
-
Controle
Cdc10
Cdc30
CTX
FLA2
*
*
*
Tempo
(min)
Controle Cdc10 Cdc30 CTX FLA2
30
80,9±1,15 80,10±5,33 81,94±2,98 81,18±7,55 80,07±3,89
60
82,25±2,72 81,78±4,51 80,83±2,76 67,62±6,96* 75,04±4,26*
90
78,32±2,54 76,30±4,88 78,79±6,40 71,97±6,40 78,51±4,59
120
79,53±2,67 79,45±5,21 79,66±6,25 64,62±6,93* 73,43±6,01
Figura 17. Efeitos renais promovidos pelo veneno bruto (10 e 30μg/mL) e pelas frações
(30μg/mL) da serpente Crotalus durissus collilineatus no percentual de transporte
tubular total de cloreto (%TCl
-
). Os dados são expressos por média ± E.P.M. compilados
em quatro períodos de 30 minutos (30, 60, 90 e 120 minutos). A análise estatística foi feita
por ANOVA e teste de Bonferroni com p<0,05. * = comparação entre os grupos tratados
(n=6) e o grupo controle (n=6). Cdc10 = veneno bruto na dose de 10 μg; Cdc30 = veneno
bruto na dose de 30 μg; CTX = crotoxina na dose de 10 μg e FLA2 = fosfolipase A2 na dose
de 10 μg.
68
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
30 60 90 120
Tempo (min)
%pTNa
+
Controle
Cdc10
Cdc30
CTX
FLA2
*
Tempo
(min)
Controle Cdc10 Cdc30 CTX FLA2
30
74,43±0,65 71,6±5,38 73,75±2,48 75,77±3,35 74,2±1,2
60
75,22±1,52 75,63±4,62 72,41±2,12 69,80±3,08 69,7±2,7
90
73,53±4,99 70,38±4,25 69,83±3,66 71,28±2,27 72,6±3,8
120
75,53±5,72 73,82±4,76 71,12±5,14 65,76±2,22* 69,0±5,7
Figura 18. Efeitos renais promovidos pelo veneno bruto (10 e 30μg/mL) e pelas frações
(30μg/mL) da serpente Crotalus durissus collilineatus no percentual de transporte
tubular proximal de sódio (%pTNa
+
). Os dados são expressos por média ± E.P.M.
compilados em quatro períodos de 30 minutos (30, 60, 90 e 120 minutos). A análise estatística
foi feita por ANOVA e teste de Bonferroni com p<0,05. * = comparação entre os grupos
tratados (n=6) e o grupo controle (n=6). Cdc10 = veneno bruto na dose de 10 μg; Cdc30 =
veneno bruto na dose de 30 μg; CTX = crotoxina na dose de 10 μg e FLA2 = fosfolipase A2
na dose de 10 μg.
69
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
30 60 90 120
Tempo (min)
%pTK
+
Controle
Cdc10
Cdc3
*
*
*
*
0
CTX
FLA2
Tempo
(min)
Controle Cdc10 Cdc30 CTX FLA2
30
64,66±4,73 62,93±4,33 62,1±6,2 58,8±6,9 62,79±6,32
60
68,40±6,23 62,52±4,73 58,4±6,5 41,8±5,5* 47,08±8,7*
90
68,27±9,88 60,71±3,91 55,5±5,3 39,7±5,2* 55,99±6,20
120
65,56±12,02 72,37±4,64 63,0±5,9 26,1±5,3* 49,24±8,39
Figura 19. Efeitos renais promovidos pelo veneno bruto (10 e 30μg/mL) e pelas frações
(30μg/mL) da serpente Crotalus durissus collilineatus no percentual de transporte
tubular proximal de potássio (%pTK
+
). Os dados são expressos por média ± E.P.M.
compilados em quatro períodos de 30 minutos (30, 60, 90 e 120 minutos). A análise estatística
foi feita por ANOVA e teste de Bonferroni com p<0,05. * = comparação entre os grupos
tratados (n=6) e o grupo controle (n=6). Cdc10 = veneno bruto na dose de 10 μg; Cdc30 =
veneno bruto na dose de 30 μg; CTX = crotoxina na dose de 10 μg e FLA2 = fosfolipase A2
na dose de 10 μg.
70
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
30 60 90 120
Tempo (min)
%pTCl
-
*
*
*
Controle
Cdc10
Cdc30
CTX
FLA2
Tempo
(min)
Controle Cdc10 Cdc30 CTX FLA2
30
78,82±1,24 75,64±6,6 76,8±3,3 75,5±6,4 77,20±5,04
60
80,49±3,00 78,63±5,4 74,8±3,1 67,6±7,0* 73,53±6,26
90
78,58±1,14 72,47±5,0 72,0±5,4 65,8±6,9* 77,90±5,12
120
78,36±2,87 76,89±5,6 73,4±7,1 57,5±7,4* 72,19±6,68
Figura 20. Efeitos renais promovidos pelo veneno bruto (10 e 30μg/mL) e pelas frações
(30μg/mL) da serpente Crotalus durissus collilineatus no percentual de transporte
tubular proximal de cloreto (%pTCl
-
). Os dados são expressos por média ± E.P.M.
compilados em quatro períodos de 30 minutos (30, 60, 90 e 120 minutos). A análise estatística
foi feita por ANOVA e teste de Bonferroni com p<0,05. * = comparação entre os grupos
tratados (n=6) e o grupo controle (n=6). Cdc10 = veneno bruto na dose de 10 μg; Cdc30 =
veneno bruto na dose de 30 μg; CTX = crotoxina na dose de 10 μg e FLA2 = fosfolipase A2
na dose de 10 μg.
71
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
30 60 90 120
Tempo (min)
C
osm
(mL/g
-1
.min
-1
)
Controle
Cdc10
Cdc30
CTX
FLA2
*
*
Tempo
(min)
Controle Cdc10 Cdc30 CTX FLA2
30
0,15±0,02 0,16±0,03 0,15±0,03 0,14±0,02 0,16±0,02
60
0,14±0,02 0,18±0,03 0,12±0,01 0,14±0,03 0,18±0,02
90
0,16±0,01 0,18±0,05 0,09±0,01* 0,11±0,04 0,16±0,02
120
0,15±0,02 0,20±0,07 0,05±0,02* 0,10±0,05 0,13±0,02
Figura 21. Efeitos renais promovidos pelo veneno bruto (10 e 30μg/mL) e pelas frações
(30μg/mL) da serpente Crotalus durissus collilineatus no clearance osmótico (C
osm
). Os
dados são expressos por média ± E.P.M. compilados em quatro períodos de 30 minutos (30,
60, 90 e 120 minutos). A análise estatística foi feita por ANOVA e teste de Bonferroni com
p<0,05. * = comparação entre os grupos tratados (n=6) e o grupo controle (n=6). Cdc10 =
veneno bruto na dose de 10 μg; Cdc30 = veneno bruto na dose de 30 μg; CTX = crotoxina na
dose de 10 μg e FLA2 = fosfolipase A2 na dose de 10 μg.
72
Figura 22 Análise histológica dos rins do grupo controle.
73
Figura 23 Aspecto morfológico de rim perfundido com veneno bruto da serpente Crotalus
durissus collilineatus (10μg/mL), analisado através de microscopia óptica, onde observa-se o
acúmulo de material proteináceo no espaço glomerular (seta menor) e a presença de
degeneração hidrópico vacuolar das células tubulares (seta tracejada). (Aumento de 400x ;
coloração H.E.)
Figura 24 Aspecto morfológico de rim perfundido rim perfundido com veneno bruto da
serpente Crotalus durissus collilineatus (30μg/mL), analisado através de microscopia óptica,
onde observa-se o acúmulo de material proteináceo nos espaços glomerular (seta menor) e
tubular (seta maior). (Aumento de 400x ; coloração H.E.).
74
Figura 25 Aspecto morfológico de rim perfundido com a fração crotoxina do veneno da
serpente Crotalus durissus collilineatus (10μg/mL), analisado através de microscopia óptica,
onde observa-se o acúmulo de material proteináceo no espaço tubular (setas). (Aumento de
400x ; coloração H.E.).
Figura 26 Análise histológica dos rins perfundidos com a fração fosfolipase A
2
do veneno da
serpente Crotalus durissus collilineatus (10μg/mL), analisado através de microscopia óptica,
onde observa-se o acúmulo de material proteináceo no espaço glomerular (setas). (Aumento
de 100x ; coloração H.E.).
75
Discussão
76
5. Discussão
As respostas do rim isolado de rato ao veneno da serpente Crotalus
durissus collilineatus fazem parte de uma estratégia para avaliar as alterações
dos parâmetros renais causadas por tais substâncias.
Comparando-se os resultados de estudos prévios (Martins et al., 1998,
2002, 2003; Monteiro et al., 2001) realizados com os venenos das subespécies
Crotalus durissus terrificus e Crotalus durissus cascavella com os resultados de
nossos experimentos, observa-se que os venenos de C d terrificus e de C d
collilineatus induzem alterações renais semelhantes entre si no que diz respeito
aos parâmetros de pressão de perfusão, de resistência vascular renal, de fluxo
urinário e de ritmo de filtração glomerular. Todos estes parâmetros apresentaram
uma tendência de redução, enquanto os transportes tubulares dos íons sódio,
potássio e cloreto permaneceram inalterados.
É importante destacar que foram observadas semelhanças entre os
venenos brutos de C d cascavella (Martins et al., 1998) e de C d collilineatus,
nos parâmetros supracitados, apenas com a dose mais baixa (10μg) deste último,
enquanto que a infusão na dose mais alta (30μg) produziu alterações renais
semelhantes às do veneno bruto de Crotalus durissus terrificus (Monteiro et al.,
2001).
Com base nesses dados, é razoável sugerir que essa diferença seja
decorrente da existência de sinergismo ou antagonismo do efeito de alguns
componentes do veneno bruto.
A fração crotoxina do veneno de Crotalus durissus collilineatus causou
diminuição de vários parâmetros renais. Pode-se sugerir que a diminuição no
percentual de transporte proximal de sódio, produzida pela fração crotoxina,
77
poderia produzir um grande aporte de sódio para o néfron distal, o que
estimularia a secreção de potássio, levando à caliurese (Fonteles et al., 1998).
Foi observado que a fração fosfolipase A
2
do veneno de C d collilineatus
não causou alteração na resistência vascular renal, de forma semelhante à
crotoxina. No entanto, em relação ao transporte de eletrólitos, observou-se uma
diminuição no transporte de potássio e cloreto sem qualquer efeito no transporte
tubular de sódio.
A presença de transporte de cloreto independente de sódio, no ramo
ascendente delgado da alça de Henle (Liu et al., 2002), poderia explicar essa
alteração específica no transporte de cloreto que ocorreu no grupo perfundido
com a fração fosfolipase A
2
.
A análise histológica dos rins perfundidos com veneno bruto de C d
collilineatus e com as frações deste, revelou a ação nefrotóxica direta do veneno.
Achados histológicos e efeitos nefrotóxicos diretos foram
correlacionados por Boer-Lima e colaboradores (1999), ao demonstrarem que as
alterações morfológicas vistas nos glomérulos e túbulos renais, causadas pelo
veneno de Bothrops moojeni, foram compatíveis com as alterações tubulares
agudas que ocorrem na insuficiência renal aguda, como a diminuição no ritmo
de filtração glomerular.
Segundo Cruz-Höfling e colaboradores (2001), alterações tubulares como
presença de vacúolos, células edemaciadas, cilindros hialinos e massas
proteináceas amorfas no lúmen dos túbulos são sinais comuns de injúria e
disfunção renais, particularmente de necrose tubular aguda. Além disso,
alterações na composição fosfolipídica da membrana têm sido descritas como
causa da disfunção da membrana (Boer-Lima et al., 1999).
Portanto, a presença de material proteináceo nos túbulos pode ter
contribuído para a diminuição no ritmo de filtração glomerular observada com
78
nos rins perfundidos com veneno bruto na dose de 30μg e nos grupos tratados
com as frações crotoxina e fosfolipase A
2
.
Há relatos de interferência com a função de membrana e atividade
fosfolipásica A
2
(Cummings et al., 2000). Os lisofosfolipídios, produzidos pela
ação da FLA
2
, podem alterar as características de permeabilidade e desacoplar a
respiração mitocondrial (Goldstein e Schnellmann, 1996). Além disso, a
ativação da FLA
2
pelo cálcio tem mostrado contribuir para a injúria tubular renal
em processos isquêmicos (Choi apud Schrier et al., 2004).
O ritmo de filtração glomerular é considerado um dos parâmetros mais
importantes para a avaliação funcional dos rins (Wang et al., 2004).
Estudos dirigidos aos mecanismos da queda do ritmo de filtração
glomerular pela adenosina têm demonstrado que a contração das células
mesangiais e a diminuição na pressão hidrostática glomerular resultam da
vasoconstrição pré-glomerular e de uma vasodilatação pós-glomerular de
desenvolvimento mais lento (Oldroyd et al.,2000).
A adenosina exógena, quando infundida diretamente dentro da artéria
renal em animais, produz um efeito pronunciado sobre a hemodinâmica dos rins,
com uma diminuição sustentada no fluxo sangüíneo renal e na fração de filtrado
(Balakrishnan et al.,1993). De forma semelhante, quando níveis de adenosina
endógena são aumentados através de manobras farmacológicas, também há uma
diminuição sustentada no ritmo de filtração glomerular (Balakrishnan et
al.,1993).
A queda no ritmo de filtração glomerular é relacionada a uma
vasoconstrição da arteríola aferente mediada pelo receptor A
1
da adenosina, e
em menor extensão, à vasodilatação da arteríola eferente mediada pelo receptor
A
2
(Kuan et al.,1993).
Soares e colaboradores (2001) sugerem que outras regiões moleculares da
subunidade CB da crotoxina, além da região catalítica, podem participar das
79
atividades tóxicas exercidas pela fração fosfolipase A
2
do veneno de Crotalus
durissus terrificus. Além disso, a atividade da FLA
2
pode variar em até três
vezes, e esta variação parece estar relacionada às quantidades diferentes de
isoformas de crotoxina presentes nos venenos (Francischetti et al., 2000).
Segundo Cummings e colaboradores (2000), vários estudos têm mostrado
que a toxicidade das fosfolipases A
2
secretórias (FLA
2s
) pode ser independente
da sua habilidade de produzir ácido araquidônico. Além disso, tem sido
demonstrado que FLA
2s
requerem fosfolipídios de membrana específicos para
mediar a injúria celular (Diaz et al., 2001; Soares et al., 2001).
Assim, poderíamos sugerir que a fração fosfolipase A
2
do veneno bruto de
Crotalus durissus collilineatus, atuaria mais como agonista da adenosina do que
como enzima catalítica, levando-se em consideração que essa fração possui a
menor atividade fosfolipásica, quando comparada com as frações fosfolipásicas
A
2
dos veneno das subespécies Crotalus durissus cascavella e Crotalus durissus
terrificus (Rangel-Santos et al.,2004; Santoro et al.,1999).
No entanto, alguns estudos têm demonstrado que o processo inflamatório
participa da injúria celular produzida pelas fosfolipases A
2
secretórias,
provenientes de venenos de serpentes (Han et al., 1999; Landucci et al., 2000;
Rangel-Santos et al., 2004).
Uma explicação para a atividade das FLA
2s
sobre a membrana plasmática
foi proposta por Sevanian (1988). Esse autor propôs que os insultos celulares
resultam da ativação prolongada de isoformas de FLA
2s
, com conseqüente
liberação dos produtos da hidrólise de fosfolipídios que poderiam agir como
detergentes e alterar a fluidez da membrana, diminuindo a integridade desta
organela. Além disso, a liberação de fosfolipídios de membrana como resultado
da peroxidação lipídica induzida por oxidante e/ou pelo metabolismo de FLA
2
,
poderiam diminuir a integridade da membrana independentemente dos ácidos
graxos livres ou liso-fosfolipídios (Sevanian, 1988).
80
Uma explicação para a aparente ausência de efeitos deletérios do veneno
bruto sobre os rins, observada no teste da toxicidade aguda, vem das
observações de Schrier e colaboradores (1999), que apontam que mesmo na
insuficiência renal aguda instalada, a presença de necrose tubular aguda é
observada apenas em células tubulares ocasionais, e em alguns casos, pode não
ser detectável. Além disso, os glomérulos podem se apresentar
morfologicamente normais (Schrier et al., 2004).
Boer-Lima e colaboradores (1999) apontam que lesões subcelulares, não
visualizadas pela microscopia óptica, são suficientes para provocar as alterações
observadas. Os autores citam um trabalho de Solez e colaboradores (1979) que
relataram que alterações morfológicas na necrose tubular aguda em humanos
eram relativamente sutis, quando comparadas com a intensa redução observada
no ritmo de filtração glomerular.
Boer-Lima e colaboradores (1999) comentam ainda que, do ponto de vista
funcional, a severidade da necrose tubular aguda pode ser correlacionada mais
com o número total de néfrons danificados e/ou obstruídos do que com o total de
tecido renal afetado.
Portanto, alterações morfológicas sutis, mas importantes poderiam ser
imperceptíveis por causa do tamanho da amostra tecidual examinada.
Alguns estudos demonstram que o veneno de Crotalus durissus terrificus
apresenta uma maior seletividade para tecido hepático de rato (Bancher et al.,
1973; Barraviera et al., 1995). Também foi relatada a ocorrência de lesões
hepáticas induzidas, experimentalmente, pela administração de veneno crotálico
em coelhos, ratos e em cães (Amorin et al., 1951). Ainda com relação às
alterações histológicas, Saliba e colaboradores (1983) demonstraram que o
veneno causa degeneração hidrópica, esteatose hepática e necrose do miocárdio
em bovinos. Em seres humanos, as alterações podem ser produzidas através de
81
dois mecanismos: lesão de mitocôndrias e efeito de citocinas nos hepatócitos,
principalmente interleucinas 6 e 8 (Barraviera et al.,1995).
Na experimentação em rim isolado de rato, a análise da urina, do
perfusato e a histopatologia são úteis para estabelecer um perfil razoável dos
efeitos funcionais e morfológicos de uma substância sobre o rim. Com as
informações obtidas dessas análises, pode-se estabelecer a identificação do
local, da natureza e da extensão da lesão nefrotóxica.
O estudo da variabilidade molecular das fosfolipases A
2
secretórias
encontradas, tantos nos tecidos de mamíferos quanto nos venenos de serpentes, e
a elucidação dos diferentes mecanismos fisiopatológicos das diversas FLA
2
podem auxiliar no entendimento das funções biológicas de todas essas diferentes
FLA
2
s. O estudo de tais substâncias apresenta-se, portanto, como uma
promissora área de pesquisa.
82
Conclusões
83
6. Conclusões
O veneno bruto da serpente Crotalus durissus collilineatus causou as
alterações hepáticas observadas no teste de toxicidade aguda.
O veneno bruto da serpente Crotalus durissus collilineatus causou
importantes alterações renais no modelo de rim isolado de rato,
promovendo diminuição no fluxo urinário e no ritmo de filtração
glomerular assim como alterações na pressão de perfusão e na resistência
vascular renal.
As principais alterações renais produzidas pelas frações crotoxina e
fosfolipase A
2
,
do veneno da serpente Crotalus durissus collilineatus
foram diminuição no transporte de tubular de íons e redução no ritmo de
filtração glomerular.
As frações crotoxina e fosfolipase A
2
causaram uma diminuição no
transporte tubular de potássio.
84
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