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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTITUMORAL DOS
HIDROBENZOFURANÓIDES ISOLADOS DAS FOLHAS DA
Tapirira guianensis (ANACARDIACEAE)
PATRICIA MARÇAL DA COSTA
Fortaleza – CE
2006
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2
Universidade Federal do Ceará
Faculdade de Medicina
Departamento de Fisiologia e Farmacologia
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTITUMORAL DOS
HIDROBENZOFURANÓIDES ISOLADOS DAS FOLHAS DA Tapirira
guianensis (ANACARDIACEAE)
Patricia Marçal da Costa
Dissertação submetida à Coordenação do Curso
de Pós-Graduação em Farmacologia do
Departamento de Fisiologia e Farmacologia da
Universidade Federal do Ceará como requisito
parcial para a obtenção do título de Mestre em
Farmacologia.
Orientadora:
Prof
a
Dr
a
Claudia do Ó Pessoa
Fortaleza - CE
Dezembro, 2006
2
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3
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTITUMORAL DOS
HIDROBENZOFURANÓIDES ISOLADOS DAS FOLHAS DA Tapirira
guianensis (ANACARDIACEAE)
Palavras chaves: antitumoral, hidrobenzofuranóides, Anacardiaceae.
Patricia Marçal da Costa
Dissertação submetida à coordenação do curso de Pós-graduação em Farmacologia
como parte dos requisitos necessários para a obtenção do grau de Mestre em
Farmacologia outorgado pela Universidade Federal do Ceará.
Este documento encontra-se a disposição dos interessados na biblioteca setorial as
referida universidade. A citação de qualquer trecho deste trabalho é permitida, desde
que seja feita em conformidade com as normas da ética científica.
BANCA EXAMINADORA
Prof
a
Dr
a
Claudia do Ó Pessoa
Universidade Federal do Ceará
- Orientadora -
Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes
Universidade Federal do Ceará
Prof
a
Dr
a
Francisca Cléa Florenço de Sousa
Universidade Federal do Ceará
3
4
A Deus
4
5
AGRADECIMENTOS
À Drª. Claudia do Ó Pessoa, pela orientação deste trabalho, pela ajuda,
incentivo e paciência demonstrada em todos os momentos de trabalho em
comum;
À Drª. Letícia Veras Costa Lotufo por todas as dúvidas esclarecidas no
desenvolver da pesquisa;
Ao Dr. Manoel Odorico de Moraes, pela contribuição à pesquisa no Laboratório
de Oncologia Experimental e pela amizade;
À Profª. Raquel Montenegro pelo auxílio prestado e dicas essenciais;
À Profª. Ana Paula Negreiros Nunes Alves, pelos esclarecimentos sobre
patologia e as analises histopatológicas;
À Profª, Francisca Cléa Florenço de Sousa por ter aceitado participar desta
banca de dissertação;
À Profª Otília Deusdênia pelo auxílio no estudo químico de estrutura-atividade
dos hidrobenzofuranóides;
Aos Professores Jorge Maurício David da Universidade Federal da Bahia e
Suzimone Correia da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, por terem
cedido as amostras e suas respectivas estruturas químicas;
Ao grande amigo Paulo Michel Pinheiro Ferreira pela enorme ajuda no
desenvolvimento deste trabalho e pela amizade verdadeira desde o início desta
caminhada;
À amiga Gardenia Carmen Gadelha Militão pela dedicação e ajuda neste
trabalho;
Aos pós-graduandos do Laboratório de Oncologia Experimental: Hélio Nobre,
André Viana, Márcio Roberto, Diego Veras, Rômulo Feio, Daniel Pereira,
Patrícia Bonavides, Marne Vasconcellos, Bruno Cavalcante, Hemerson
Magalhães, Danilo Rocha, Paula Jimenez e Ivana Dantas pela ajuda de todos
os dias e pela amizade;
5
6
Aos alunos da graduação que participam das atividades do Laboratório de
Oncologia Experimental: Elthon Ferreira, Carla Sombra, Lidiane Arruda,
Washington Araújo, Fernanda Oliveira e em especial ao bolsista de iniciação
científica Andrew Sá Nunes pela amizade e auxílio nos experimentos;
Aos técnicos Silvana França, Luciana França, Adriano Santos e Maria de
Fátima Teixeira cuja dedicação é essencial para o laboratório e ao David pela
ajuda nos experimentos do Labomar;
Aos diretores do Laboratório Professor Eleutério de Costa (LABPEC), Dr.José
Eleutério Júnior e Dra. Diane Isabelle Cavalcante, pelo auxílio na confecção
das lâminas histológicas e pelo apoio durante a graduação;
Aos professores do Curso de Ciências Farmacêuticas da Universidade de
Fortaleza (UNIFOR), em especial, Maria Angelina Medeiros (orientadora de
Trabalho de Conclusão), pelos ensinamentos imprescindíveis na graduação;
Às amigas da Universidade de Fortaleza (UNIFOR), Ana Karenina Gondim,
Karla Mota e Raphaella Della Guardia pela amizade e força doadas até hoje;
Aos meus pais, que se dedicaram de maneira grandiosa para me darem a
oportunidade de realizar este trabalho;
Ao meu filho Davi, por ser grande parte do estímulo de meus objetivos e pela
compreensão nos momentos de ausência;
Aos professores da Pós-graduação em Farmacologia por todas as lições;
Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Áurea,
Chiquinho, Fernando, Mônica e Íris que tentam resolver ou indicar o melhor
caminho para os problemas do dia a dia;
A todos que, diretamente ou indiretamente, contribuíram para a minha
formação pessoal e acadêmica ou para a execução deste trabalho;
À Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Farmacologia pelo apoio e
incentivo;
Aos órgãos financiadores dos projetos de pesquisa do Laboratório de
Oncologia Experimental, CNPq, FINEP, FUNCAP e BNB;
6
7
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
pelo apoio financeiro, sem o qual seria impossível a realização desse trabalho.
7
8
ÍNDICE
Lista de Figuras...................................................................................... xi
Lista de Tabelas...................................................................................... xiii
Lista de Símbolos e Abreviaturas......................................................... xiv
Resumo.................................................................................................... xvii
Abstract................................................................................................... xix
1. INTRODUÇÃO...................................................................................... 21
1.1. Câncer............................................................................................... 21
1.2. Produtos naturais............................................................................... 23
1.3. A família Anacardiaceae.................................................................... 29
1.4. Gênero Tapirira.................................................................................. 31
2. OBJETIVOS ........................................................................................ 37
2.1. Geral ................................................................................................. 37
2.2. Específicos ........................................................................................ 37
3. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................... 39
3.1. Materiais Utilizados ........................................................................... 39
3.1.1. Equipamentos ............................................................................ 39
3.1.2. Reagentes e Soluções .............................................................. 40
3.2. Metodologia Experimental ................................................................ 45
3.2.1. Obtenção dos hidrobenzofuranóides.......................................... 45
3.2.2. Estudo da atividade citotóxica in vitro................................... 47
3.2.2.1. Avaliação da atividade antiproliferativa em células
tumorais....................................................................................................
47
- Procedimento Experimental.......................................................... 49
- Análise dos Dados ....................................................................... 49
3.2.2.2. Avaliação da atividade hemolítica em eritrócitos de
camundongos Mus musculus Swiss.........................................................
50
- Procedimento Experimental.......................................................... 50
3.2.2.3. Estudo da Toxicidade aguda em larvas de Artemia
sp..............................................................................................................
51
- Procedimento Experimental.......................................................... 51
- Análise dos Dados........................................................................ 52
8
9
3.2.3. Estudo do mecanismo de ação em células leucêmicas....... 53
3.2.3.1. Curva de Crescimento Celular.............................................. 53
- Procedimento Experimental.......................................................... 53
- Análise dos Dados........................................................................ 53
3.2.3.2 Viabilidade celular - Exclusão por Azul de Tripan ................. 54
- Procedimento Experimental.......................................................... 54
- Análise dos Dados ....................................................................... 54
3.2.3.3. Inibição da síntese de DNA – BrdU...................................... 55
- Procedimento Experimental.......................................................... 55
- Análise dos Dados ....................................................................... 56
3.2.3.4. Análise morfológica – Coloração diferencial por H/E............ 56
- Procedimento Experimental.......................................................... 56
- Análise dos Dados........................................................................ 57
3.2.3.5. Análise morfológica – Coloração Diferencial por BE/AL....... 57
- Procedimento Experimental.......................................................... 58
- Análise dos Dados........................................................................ 58
3.2.4. Estudos de Genotoxicidade....................................................
59
3.2.4.1. Teste do cometa..................................................................
59
- Preparação das Amostras...........................................................
59
- Preparação das lâminas e lise celular.........................................
60
- Neutralização e Eletroforese.......................................................
60
- Fixação e Coloração....................................................................
61
- Escore das lâminas......................................................................
61
- Análise Estatística........................................................................
62
3.2.5 Teste de relaxamento de DNA.................................................
63
- Procedimento experimental......................................................... 63
- Análise do gel.............................................................................. 63
3.2.6. Estudo da atividade antitumoral in vivo................................ 64
3.2.6.1. Obtenção e manutenção dos animais ............................. 64
2.2.6.2. Avaliação do efeito da SJC-8 em camundongos
transplantados com Sarcoma 180............................................................
64
- Procedimento Experimental....................................................... 65
- Análise dos dados..................................................................... 66
3.2.6.3. Analise morfológica e histopatológica................................ 66
9
10
- Procedimento Experimental....................................................... 66
- Análise dos Dados..................................................................... 67
4. RESULTADOS..................................................................................... 69
4.1. Estudo da atividade citotóxica in vitro ..................................... 69
4.1.2. Inibição da Proliferação de Células Tumorais in vitro –
Ensaio do MTT..........................................................................................
69
4.1.3. Atividade Hemolítica................................................................ 72
4.1.4. Toxicidade aguda em Artemia sp............................................ 72
4.2. Estudo do mecanismo de ação em células leucêmicas.......... 72
4.2.1. Curva de crescimento celular.................................................. 72
4.2.2. Viabilidade celular - Exclusão por Azul de Tripan.................... 76
4.2.3. Inibição da síntese de DNA – Incorporação de BrdU.............. 78
4.2.4. Análise morfológica – Coloração diferencial por H/E............... 80
4.2.5. Análise morfológica – Coloração Diferencial por BE/AL.......... 82
4.3 Estudo de Genotoxicidade
84
4.3.1 Teste do cometa 84
4.4 Teste de relaxamento do DNA
87
4.5. Estudo da atividade antitumoral in vivo....................................
88
4.5.1. Avaliação do efeito da SJC-8 em camundongos
transplantados com Sarcoma 180............................................................
88
4.5.2. Analise morfológica e histopatológica.................................... 90
5. DISCUSSÃO......................................................................................... 98
6. CONCLUSÃO ...................................................................................... 112
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................... 114
10
11
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Fotografia da Tapirira guianensis .............................................. 33
Figura 2
Fotografia de um náuplio de Artemia sp .................................... 52
Figura 3
Fotografia dos tipos de cometa .................................................. 62
Figura 4
Curva de crescimento de células HL-60 humana tratada com
SJC-8 ......................................................................................... 75
Figura 5
Efeito da SJC-8 na viabilidade das células HL-60 determinado
por exclusão de azul de tripan depois de 24 horas de
incubação ................................................................................... 77
Figura 6
Efeito da SJC-8 na inibição da incorporação do 5-bromo-2´-
deoxyuridine (BrdU) em células HL-60 depois de 24 horas de
incubação ................................................................................... 79
Figura 7
Fotomicrografia das células HL-60 coradas com
hematoxilina/eosina ................................................................... 81
Figura 8
Efeito da SJC-8 em células HL-60, analisado por Brometo de
Etídio/Laranja de Acridina depois de 24 horas de
incubação.................................................................................... 82
Figura 9
Fotomicrografia das células HL-60 coradas com Brometo de
Etídio/Laranja de Acridina .......................................................... 83
Figura 10
Efeito da SJC-8 nos tipos de dano causados ao DNA em
células HL60 obtidos através do teste do cometa depois de 24
horas de incubação .................................................................... 86
Figura 11
Efeito da SJC-8 sobre o relaxamento do DNA pela inibição da
atividade da enzima Topoisomerase 1 ...................................... 87
Figura 12
Efeito sobre a massa tumoral de animais transplantados com
Sarcoma 180 .............................................................................. 89
Figura 13
Histopatologia dos rins de camundongos transplantados com
células tumorais de Sarcoma 180............................................... 93
Figura 14
Histopatologia do fígado de camundongos transplantados com 94
11
12
células tumorais de Sarcoma 180 ..............................................
Figura 15
Histopatologia dos baços de camundongos transplantados
com células tumorais de Sarcoma 180 ...................................... 95
Figura 16
Histopatologia dos tumores de camundongos transplantados
com células tumorais de Sarcoma 180 ...................................... 96
Figura 17
Estrutura química do derivado alquilado da ciclohexanona
isolado da Tapirira guianensis ................................................... 99
12
13
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Estruturas químicas dos hidrobenzofuranóides (SJC-1 a
SJC-5) isolados das folhas da Tapirira guianensis .............. 34
Tabela 2
Estruturas químicas dos hidrobenzofuranóides (SJC-7 a
SJC-9) isolados das folhas da Tapirira guianensis .............. 35
Tabela 3
Lista de reagentes e soluções ............................................. 40
Tabela 4
Linhagens tumorais utilizadas no ensaio de citotoxicidade
in vitro .................................................................................. 48
Tabela 5
Atividade citotóxica dos sete hidrobenzofuranóides em
linhagens de células tumorais ............................................. 70
Tabela 6
Atividade citotóxica da SJC-8 em linhagens de células
tumorais ................................................................................ 71
Tabela 7
Atividade cinética da citotoxicidade da SJC-8 em células
HL-60 durante o crescimento celular ................................... 74
Tabela 8
Efeito da SJC-8 nos índices e freqüências de dano ao DNA
em HL-60 obtidos através do teste do cometa após 24
horas de tratamento com SJC-8 .......................................... 85
Tabela 9
Efeito da SJC-8 ou 5-fluorouracil sobre o peso dos órgãos
(fígado, rins e baço) dos animais transplantados com
Sarcoma 180 ........................................................................ 92
13
14
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
% Porcentagem
& E
μL
Microlitro
μM
Micromolar
o
C Graus Celsius
[ ] Concentração
< Menor que
> Maior que
ANOVA Analisys of Variance (Análise de variância)
BrdU Bromodeoxiuridina
BE/LA Brometo de etídio / laranja de acridina
CE
50
Concentração efetiva média
CI
50
Concentração inibitória média
DAB Diaminobenzidina
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucléico
E.P.M. Erro padrão da média
5-FU 5-Fluorouracil
g Grama
h Hora
H/E Hematoxilina/Eosina
H
2
O Água destilada
IC Intervalo de confiança
L Litro
14
15
M Molar
mg Miligrama
mL Mililitro
mM Milimolar
MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H tetrazolina
bromido
n
o
Número
PBS Phosphate buffer solution (Tampão fosfato)
pH Potencial hidrogeniônico
q.s.p. Quantidade suficiente para
SDS Sodium Dodecyl Sulfato
SJC Suzimone Jesus Correia (responsável pelo isolamento)
TBS Tris buffer solution (Tampão tris)
US-NCI United States National Cancer Institute (Instituto
Nacional do Câncer dos Estados Unidos)
X Vezes
15
16
Resumo
16
17
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTITUMORAL DOS
HIDROBENZOFURANÓIDES ISOLADOS DAS FOLHAS DA TAPIRIRA
GUIANENSIS (ANACARDIACEAE) Dissertação de Mestrado. Autora: Patrícia
Marçal da Costa. Orientadora: Drª. Cláudia do Ó Pessoa. Departamento de
Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal do Ceará.
Os hidrobenzofuranóides obtidos da Tapirira guianensis são derivados
alquilados da ciclohexanona, que parecem ser possíveis precursores dos
lipídios fenólicos. O presente trabalho avaliou, inicialmente, a atividade dos
nove hidribenzofuranóides em linhagens de células, onde a amostra SJC-8
mostrou a citotoxicidade mais elevada. Posteriormente, foram avaliados os
possíveis mecanismos pelo qual esta amostra desenvolve seu efeito citotóxico.
No teste de MTT em painel de linhagens adicionais a SJC-8 apresentou valores
de CI
50
variando de 0.3 a 6.2µg/mL. No teste de toxicidade aguda em náuplios
de artêmia e de atividade hemolítica em eritrócitos de camundongos, a SJC-8
não desenvolveu toxicidade e hemólise, respectivamente. O mecanismo de
ação da SJC-8 foi, então, estudado. A viabilidade das células HL-60 foi afetada
pela SJC-8 após um período de exposição de 24h, quando analisada por
exclusão por azul de tripan. Nas menores concentrações não houve aumento
do número de células não-viáveis, mas apenas uma redução da proliferação
celular (ação citostática), enquanto que nas duas maiores concentrações,
houve redução do número de células viáveis e aumento do número de células
não-viáveis (efeito citotóxico), o que corrobora com os achados da analise
morfológica, onde observou-se um aumento do número de células mortas. A
atividade citotóxica da SJC-8 está relacionada com a inibição da síntese de
DNA, como revelado pela incorporação do BrdU, além de poder estar envolvida
com a inibição da Topoisomerase 1. Submetida ao estudo de toxicogenética
pelo teste do cometa em HL-60, a SJC-8 elevou os índices e freqüências de
dano de maneira concentração-dependente, sendo observados tipos de danos
maiores nas concentrações mais elevadas. A administração de SJC-8 (25 ou
50mg/kg/dia) inibiu o desenvolvimento de tumor sólido em camundongos
transplantados com Sarcoma 180 em 12,3 e 59,8% respectivamente. A
atividade antitumoral da SJC-8 está relacionada com a inibição da proliferação
do tumor. A análise histopatológica mostrou de forma reversível, que o fígado é
o alvo de toxicidade da droga. De fato, a atividade antitumoral da SJC-8 esta
relacionada com um efeito antiproliferativo direto nas células tumorais, sendo
possível assim que esta amostra possa atuar como possível protótipo de novos
agentes antitumorais.
17
18
Abstract
18
19
ANTITUMOR POTENTIAL OF HYDROBENZOFURANOIDS ISOLATED
FROM THE LEAVES OF TAPIRIRA GUIANENSIS (ANACARDIACEAE)
Master’s dissertation. Author: Patrícia Marçal da Costa. Supervisor: Dr. Cláudia
do Ó Pessoa. Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade
Federal do Ceará.
The hydrobenzofuranoids obtained from Tapirira guianensis are alkylated
derivates of cyclo-hexanone, which appear to be precursors of phenolic lipids.
The present study initially examined the activity of nine hydrobenzofuranoids in
cell lines, where the compound SJC-8 showed the highest cytotoxicity. In later
studies, the cytotoxicity of this sample was investigated with regard to the
possible mechanism of action. In the MTT assay, SJC-8 showed IC
50
values of
0.3 to 6.2µg/mL in a panel of cell lines. In acute toxicity assays in artemia
nauplii and hemolytic activity in mouse erythrocytes, SJC-8 did not demonstrate
any toxicity or hemolysis, respectively. The mechanism of action of SJC-8 was
then studied. SJC-8 affected cell viability in HL-60 after an exposure period of
24h, when determined by trypan blue exclusion. At lower concentrations, there
was no increase in the number of non-viable cells but only a reduction in cell
proliferation (cytostatic effect). However, at the two highest concentrations,
there was a decrease in the number of viable cells and increase in number of
non-viable cells (cytotoxic effect), which corroborate the findings of morphologic
analysis showing an increase in the number of dead cells. The cytotoxicity of
SJC-8 involves the inhibition of DNA synthesis, as revealed by inhibition of
BrdU incorporation into DNA and of topoisomerase 1 activity. SJC-8 was tested
for genotoxicity using the comet assay in HL-60 cells, and was found to cause
an increase in the frequency of DNA damage in a concentration-dependent
manner, where more severe damage was seen at higher concentrations of
SJC-8. The administration of SJC-8 (25 or 50 mg/kg/day) inhibited solid tumor
growth in mice transplanted with sarcoma 180, by 12.3 and 59.8%, respectively.
The antitumor activity of SJC-8 is attributed to inhibition of tumor cell
proliferation. Histopathologic analysis showed in a reversible manner that the
liver is the target of drug toxicity. In conclusion, SJC-8 has antitumor activity
where it has a direct antiproliferative effect on tumor cells, and may therefore
serve as a prototype for new antitumor agents.
19
20
Introdução
20
21
1. INTRODUÇÃO
1.1 Câncer
A palavra câncer vem do latim câncer que significa caranguejo e da
palavra grega karkinos (crustáceo, caranguejo). Foi usada pela primeira vez
por Galeno (131-201) d.c. na Ásia Menor, para designar um tumor maligno de
mama, por ele estudado, em que as veias, inturgecidas e ramificadas,
lembravam as patas de um caranguejo (PY & JACQUES, 2003).
O câncer é uma doença genética e têm como denominador comum um
crescimento desordenado de células que podem surgir em diversos tecidos e
nos mais diferentes órgãos, com a propriedade de se disseminar para outras
regiões do corpo. Dividindo-se rapidamente, as células malignas tendem a ser
muito agresssivas e incrontroláveis, determinando a formação de tumores
devido ao acúmulo de células cancerosas, na forma de neoplasias malignas
(PY & JACQUES, 2003).
Estas alterações celulares podem se dar por três vias, a saber, dieta
inadequada (35%), predisposição genética (20%) e pela via ambiental, que
quando associada a fatores genéticos leva a um maior número de casos
(REDDY et al, 2003).
A lesão genética é adquirida nas células somáticas, através de agentes
ambientais, ou hereditária, na linha germinativa. Três classes de genes são os
alvos da lesão genética: os proto-oncogenes que promovem o crescimento, os
genes supressores dos tumores que inibem o crescimento e os genes que
regulam a apoptose.(ROBBINS, 1995) Os produtos de genes supressores de
tumor são proteínas com função regulatória negativa de crescimento e sua
perda de função também promovem a carcinogênese (PERKINS & STERN,
1997).
Com raras exceções, algumas destas malignidades podem se formar a
partir de infecções virais ou imunossupressão, nesse caso o câncer resulta de
mutações em genes reguladores do crescimento celular ou que mantêm a
21
22
integridade do genoma. Mais comumente, as mutações são adiquiridas por
eventos somáticos que podem ser acumulados com a exposição de agentes
ambientais, mas que habitualmente aparecem como uma conseqüência
inevitável de causar erros em processos intrínsecos levando a célula a entrar
em stress oxidativo. Algumas vezes, no entanto, as mutações são hereditárias
e, portanto, de origem constitucional (BENSON, 2006).
Neste contexto, tem se obtido sucesso ao avaliar que a hereditariedade
é um dos maiores fatores de risco para adquirir câncer. No carcinoma coloretal,
por exemplo, avaliou-se que cerca de 10% dos casos são atribuídos a fatores
Mendelianos (MERG et al, 2005). Os genes BCRA1 e BCRA2 também
possuem fatores Mendelianos que conferem fatores de risco quase inevitáveis
para desenvolvimento de câncer de mama e de ovário (NAROD & FOULKES,
2004). Outro exemplo é o de variantes comuns para o gene Chk2, que apesar
de serem fracamente penetrantes, aumentam bastante o risco para
desenvolver câncer de mama na população em geral (MEIJERS-HEIJBOER,
2002; SHAAG et al, 2005).
Há cerca de 25 anos a “guerra contra o câncer” foi lançada nos Estados
Unidos pelo presidente Nixon e a partir daí vários investimentos foram
atribuídos para o estudo do câncer, sendo estes dirigidos em sua maior parte e
com auxílio das revolucionárias biologia celular e molecular. Durante as últimas
cinco décadas o tratamento do câncer tem sido realizado primariamente com
uso de várias formas de quimioterapia citotóxica e terapia de radiação. Mas em
todos os casos a efetividade dos tratamentos citotóxicos, são limitados pela
geração de efeitos colaterais desses agentes nos tecidos e células normais
bem como resistência celular. (HANNUN, 1997)
O homem moderno é confrontado com um aumento na incidência e
mortalidade por câncer. O aumento na incidência e mortalidade por câncer é
fato, existindo mais de cem tipos de cânceres, como exemplo pode-se citar o
de pele, pulmão, mama, fígado, estômago, rim, ovário, cérebro, próstata,
pâncreas e ossos, sendo responsáveis anualmente pela morte de milhões de
pessoas em todo mundo. Nos Estados Unidos, por exemplo, de cada quatro
22
23
mortes uma está relacionada a essa doença (www.cancer.gov, acesso em 17
de maio de 2006).
No Brasil, assim como em vários países desenvolvidos, não se conhece
o número real de casos novos que são diagnosticados a cada ano pelos
serviços de saúde, mas as estimativas para o ano de 2006 apontaram que
ocorreriam 472.050 casos novos de câncer. Os tipos mais incidentes, à
exceção do câncer de pele não melanoma, serão os de próstata e pulmão no
sexo masculino e mama e colo do útero no sexo feminino, acompanhando o
mesmo perfil da magnitude observada no mundo (INCA, 2006). Deste modo,
são esperados 234.570 casos novos para o sexo masculino e 237.480 para o
sexo feminino. Estima-se que o câncer de pele não melanoma (116 mil casos
novos) será o mais incidente na população brasileira, seguido pelos tumores de
mama feminina (49 mil), próstata (47 mil), pulmão (27 mil), cólon e reto (25 mil),
estômago (23 mil) e colo do útero (19 mil) (INCA, 2006).
O tratamento do câncer vem sendo suportado por terapias
convencionais, as quais causam sérios efeitos colaterais, podendo ainda
desencadear processos de resistência ao agente usado no tratamento, e no
melhor dos casos, conseguem estender meramente a vida do paciente por
alguns anos, não aliando a isto uma melhora na qualidade de vida do mesmo.
Há assim, uma clara necessidade de utilizar conceitos e/ou terapias
alternativas na prevenção e tratamento do câncer (
REDDY et al, 2003).
1.2. Produtos naturais
A Organização Mundial de Saúde (OMS) define planta medicinal como
sendo “todo e qualquer vegetal que possui, em um ou mais órgãos,
substâncias que podem ser utilizadas com fins terapêuticos ou que sejam
precursores de fármacos semi-sintéticos” (WHO, 1998). A utilização de plantas
com fins medicinais, para tratamento, cura e prevenção de doenças é uma das
mais antigas formas de prática medicinal da humanidade, tendo seu início
provavelmente na pré-história (AKERELE, 1993). Os homens primitivos, assim
23
24
como os animais iniciaram as "práticas de saúde", alimentando-se de
determinadas plantas, pelo instinto de sobrevivência. Exemplificando, o aparato
médico egípcio de 2.500 a.C. era constituído por drogas de procedências
diferentes, dentre elas, produtos vegetais, animais e minerais; por volta de
1550 a.C., foi encontrado no livro de Papiro a utilização de mais de 700 plantas
usadas como fármacos (CORRÊA, 1998).
A biodiversidade de nossos vegetais representa uma grande riqueza em
potencial para a saúde humana. Apesar disso, somente 1% das espécies
vegetais conhecidas da Terra foram estudadas e várias espécies estão
desaparecendo do planeta num ritmo sem precedentes, devido aos
desmatamentos, além do constante aumento do nível de poluição das águas,
solos e ar (CORRÊA, 1998).
Esses fatos levam a uma preocupação constante, pois uma numerosa
parte dos medicamentos comercializados são derivados de produtos naturais,
principalmente de plantas. Adicionalmente, sabe-se que, os produtos naturais
na medicina alternativa (homeopatia, florais de Bach) ou fitoterápica (produtos
de origem vegetal, como ervas medicinais) são utilizados por aproximadamente
80% da população mundial (IUCN, 1993). As atividades biológicas destes
produtos naturais são descobertas primeiramente com bases folclóricas
populares e só mais tarde é que se tem o desenvolvimento com embasamento
científico, podendo citar como exemplo a efedrina, um agente antiasmático
isolado da Ephedra sinica (LEE, 2004).
A descoberta de produtos naturais com propriedades biológicas têm
seguido um via tradicional: Alvos moleculares são expostos a extratos brutos
de plantas e no caso de existirem evidências de atividade, os extratos são
fracionados e o composto ativo é isolado e identificado (ROUHI, 2003).
Essa busca guiada por novos compostos é um elemento crucial no
campo da pesquisa farmacêutica moderna. Os produtos naturais, durante
centenas de anos, provavelmente foram uma das únicas fontes farmacêuticas
existentes, tendo estes dado enormes colaborações no campo saúde humana,
podendo ser citados exemplos como as quininas, morfina, aspirina (análogo de
produto natural), digoxina, dentre outros. De fato, fazendo uma breve
24
25
retrospectiva, o uso de produtos naturais como fonte de compostos bioativos
tem se mostrado como uma das mais simples estratégias de sucesso para as
mais novas descobertas da medicina moderna (TULP & BOHLIN, 2002;
CRAGG, 2005).
O atual interesse na busca de novos agentes antimitóticos, por exemplo,
é consequência de sua importância para o tratamento de diferentes formas de
tumores malignos. Além dos esforços contínuos do Instituto Nacional do
Câncer dos Estados Unidos (US-NCI) ao longo de quase quarenta anos
buscando novos agentes antitumorais de origem natural (SUFFNESS &
DOUROS, 1982; CRAGG & NEWMAN, 1999). Muitas drogas correntemente
em uso na terapia do câncer foram descobertas de forma racional, baseada no
desenho da estrutura, e muitas outras têm sido descobertas por processos
empíricos. A avaliação da atividade antineoplásica dessas drogas, através de
programas de screening, começou com a mostarda nitrogenada em 1940 e
hoje existem mais de 50 drogas anti-câncer viáveis, onde 60% das drogas
comercializadas são de origem natural.
No processo de descoberta de drogas anticâncer, o screening pré-clínico
no Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos (US-NCI) em linhagens
tumorais humanas in vitro e seleção de testes in vivo ajudam a identificar a
maioria das drogas alvos. No próximo estágio de desenvolvimento de drogas,
ensaios toxicológicos, de produção e de formulação são realizados antes da
droga iniciar uma triagem clínica (LEE, 1999).
Um grande número de drogas usadas no tratamento do câncer
atualmente, vêm sendo sintetizadas a partir dos produtos naturais. Desde 1961
sete compostos derivados de plantas têm sido usados como drogas anti-câncer
nos EUA, a saber: vimblastina (Velban®), vincristina (Oncovin®), etoposídeo
(VP-16®), tenoposídeo (VM-26®), paclitaxel (Taxol®), vinorelbina (Navelbine®)
e mais recentemente em 1996, docetaxel (Taxotere®), topotecano (Hycamtin®)
e irinotecano (Camptosar®). Outros onze agentes estão sendo usados na
medicina chinesa, sendo todos considerados importantes fármacos
introduzidos na terapêutica nos últimos 20 anos e fundamentais para o
25
26
renascimento do interesse nos produtos naturais por parte da indústria
farmacêutica (WANG & LEE, 1997; VIEGAS, et al 2006).
É importante ressaltar que as descobertas da campotecina e do taxol
têm muito mais em comum do que apenas seu uso terapêutico, pois ambos os
fármacos foram descobertos no mesmo grupo de pesquisa. Em 1966, Wall e
colaboradores relataram, pela primeira vez, o isolamento da campotecina a
partir de uma árvore chinesa, Camptotheca acuminata (WALL, 1966;
OBERLIES, 2004). Mais tarde Moertel e colaboradores (1972) demonstraram
em estudos pré-clínicos que a campotecina possuía apreciável atividade contra
células da linhagem leucêmica L1210. A alta solubilidade da campotecina em
água encorajou vários pesquisadores a realizar investigações clínicas da droga
com seu sal de sódio solúvel em água. Infelizmente, a inibição tumoral
insuficiente associada aos numerosos efeitos colaterais decorrentes do
tratamento acabaram por suspender a triagem desta droga.
Então, em 1985, o interesse pela campotecina foi restabelecido a partir
da descoberta de que a Topoisomerase 1 era um dos principais alvos celulares
da droga, estabilizando a enzima de maneira covalente, pela formação de um
complexo binário com a fita do DNA, inibindo sua síntese e causando morte
celular na fase S do ciclo celular. Desta forma, desde esta descoberta, a
campotecina tem sido alvo de numerosos estudos, a saber; dois análogos
foram aprovados para uso clínico – os semi-sintéticos, análogos do topotecan
(Hycantina ®) solúveis em água e o irinotecam (Camptosar ®) (HSIANG, 1985).
Praticamente na mesma época da descoberta da campotecina, em
1962, o grupo de Wall que pesquisava a atividade citotóxica de C. acuminata, o
“National Cancer Institute” (NCI) dos EUA, selecionou o extrato das cascas de
“Yew tree” (Taxus brevifolia) para avaliação de sua eventual atividade
antitumoral. Entretanto, nos modelos in vivo utilizados pelo NCI, este extrato
não foi muito ativo. Entre 1985 e 1995, estes dados e a forte pressão de
militantes ambientalistas, motivaram intensos esforços no sentido de se
encontrar fontes naturais alternativas para o taxol. O insucesso nestas
iniciativas culminou quando, em 1994, a Bristol-Myers Squibb decidiu
interromper o uso das cascas de T. brevifolia. (WALL, 1998).
26
27
Por outro lado, Wall havia observado uma forte correlação entre a
atividade citotóxica in vitro em células 9KB e a atividade anti-câncer in vivo, o
que estimulou seu grupo a prosseguir um estudo de fracionamento, que
resultou no isolamento do taxol em 1966 (OBERLIES, 2004; VIEGAS, et al
2006). Estas duas substâncias foram aprovadas pelo “Food and Drug
Administration” (FDA) dos EUA, em 1996, e atualmente são comercializadas
pela GlaxoSmithKline e Pfizer (Pharmacia), respectivamente, para tratamento
de câncer de cólon e de ovário (VIEGAS, et al 2006).
Em 1979, um grupo de pesquisa descobriu que o mecanismo de ação do
taxol se dava pela promoção da polimerização da tubulina, diferentemente dos
já conhecidos na época, alcalóides das vinca que agiam por inibição da
polimerização da tubulina. Desta forma o mecanismo de ação do taxol estava
seguindo direção oposta, demonstrando que o mesmo não era apenas mais
um agente citotóxico. Atualmente, nenhum agente quimioterápico de ocorrência
natural tem se mostrado tão eficaz no tratamento do câncer quanto o Taxol®,
hoje conhecido como paclitaxel, que é inclusive reconhecido como uma das
mais importantes drogas usadas no tratamento do câncer de mama e ovário
(KINGSTON, 2005).
Outro exemplo importante a ser citado é o grupo de drogas representado
pelos aminoglicosídeos antraciclínicos, que são considerados um grande
classe de antibióticos obtidos a partir da fermentação de diferentes
microorganismos pertencentes ao gênero Streptomyces. As antraciclinas são
metabólitos microbianos pertencentes a larga família de policetídeos,
compreendendo vários grupos estruturais biologicamente ativos como as
tetraciclinas e compostos antiparasitários como a avermectina (BROCKMANN,
1963; O’HAGAN, 1991). A atividade antitumoral da antraciclina biosintética foi
reportada pela primeira vez em 1959, onde foi encontrada ação contra
carcinoma de Ehrrlich murino e sarcoma 180. Como exemplos de drogas dessa
classe podemos citar a daunorrubicina e a doxorrubicina que tem por
mecanismo de ação a ligação ao DNA, inibindo a síntese de DNA e RNA, e
interferindo na ação da enzima Topoisomerase 1 (ARCAMONE, 1961; TEWEY,
1984).
27
28
Em decorrência desses fatos as estratégias para o desenvolvimento de
novas drogas têm mudado ao longo dos anos. Os programas de screening
começaram no início dos anos 50 no Instituto Nacional do Câncer dos Estados
Unidos, e consistiam no teste inicial de novos compostos, principalmente
produtos naturais, em camundongos inoculados com leucemias L1210 e P388.
Esse modelo foi bastante questionado, uma vez que não era considerado
representativo dos tumores humanos, na sua maioria sólidos
(SCHWARTSMANN & WORKMAN, 1993). Sendo assim, esse modelo foi
reconsiderado e, atualmente, os programas de screening incluem uma etapa
inicial de testes in vitro em linhagens tumorais humanas utilizando técnicas
automatizadas (High troughtput screening). O desenvolvimento das chamadas
técnicas automatizadas acelerou a pesquisa de novas drogas anti-câncer,
levando a uma grande demanda por bibliotecas de novas e promissoras
moléculas (NEWMAN et al., 2003). Sendo assim, as fontes naturais associadas
à química combinatória continuam sendo as principais fontes dos ensaios
bioguiados para descoberta de novas drogas com potencial terapêutico. A
maior vantagem no estudo de produtos oriundos de fontes naturais é a sua
diversidade estrutural que está diretamente relacionada à biodiversidade das
fontes estudadas.
Neste contexto, o Brasil é considerado o país com a maior
biodiversidade do mundo, sendo que o número total de espécies presentes em
seus biomas permanece desconhecido. Com relação as plantas superiores,
estima-se que o Brasil possua um terço das espécies do mundo, contando
ainda com um alto grau de endemismo. A grande diversidade reflete o número
de biomas descritos para o país, a saber: floresta amazônica, mata atlântica,
cerrado, caatinga e pantanal (ELISABETSKY & COSTA-CAMPOS, 1996;
LEWINSOHN & PRADO, 2002).
Outro ponto relevante é a riqueza de conhecimentos etnofarmacológicos
das espécies brasileiras. A maioria da população brasileira utiliza
medicamentos obtidos a partir de plantas medicinais. Os estudos com plantas
medicinais brasileiras vêm sendo objeto de revisão em alguns livros, que já
descrevem a utilização terapêutica de cerca de mais de 1500 espécies (MORS
et al., 2000; YUNES & CALIXTO, 2001; LORENZI & MATOS, 2002).
28
29
Estes fatos, certamente têm estimulado a busca por novos agentes com
potencial anti-câncer a partir de fontes naturais, com a finalidade de obter
novos protótipos, com mecanismos de ação mais seletivos, eficaz contra
tumores resistentes e menor toxicidade, buscando uma melhor terapêutica.
1.2.1 A família Anacardiaceae
Anacardiaceae inclui 76 gêneros com 600 tipos de espécie, das quais
está relatado na literatura que 25 gêneros contêm espécies venenosas. A
função principal destes agentes químicos secundários nesta família seria usada
como defesa contra animais herbívoros (HARTLEY, 1998). Estas oleoresinas
das Anacardiaceas causam dermatite de contato mediada por células, levando
a uma reação de hipersensibilidade 24 a 72 horas após a exposição. De modo
geral, as espécies venenosas desta família estão restritas às tribos
Anacardieae, Rhoeae e Semecarpeae (BAER, 1983; VOGL, 1995; VOGL,
1996).
A dermatide de contato é um efeito provocado por esta família de
plantas, sendo atribuído principalmente a compostos fenólicos e catecólicos ou
a mistura destas substâncias, denominados lipídios fenólicos. Nos últimos
anos, a origem dos lipídios fenólicos e derivados também foi objeto de
investigação, com o principal intuito de descobrir os princípios ativos ou
misturas destes, que desencadeiam a dermatide de contato, Kalish, 1995,
descreveu que as oleoresinas de Anacardiaceaes que induziam dermatide de
contato eram derivadas de misturas de compostos fenólicos, além disso,
espécies da família Anacardiaceae têm se mostrado bastante promissoras na
busca de substâncias bioativas (CORREIA, 2006).
Existem várias espécies da família Anacardiaceae comercializadas no
Brasil como a pimenta rosa brasileira (Schinus terebinthifolius), usada como
tempero e manga (Mangifera indica L.), usada comumente no país como fruta
comestível e que cresce em regiões tropicais e subtropicais é usada na
29
30
medicina popular para uma variedade de remédios (COE, 1996). Estudos
químicos têm sido realizados com uma série de extratos aquosos das cascas
de Mangifera indica. Estes extratos são usados em formulações farmacêuticas
em Cuba (VIMANG®) como antioxidante, que recentemente demonstrou
atividade antiinflamatória, in vivo e in vitro e anti-nociceptiva (GARRIDO et al,
2004). A árvore de laca oriental japonesa, (Toxicodentron vernicifluum formely
Rhus vernicifera) tem sua seiva cultivada, servindo como verniz natural
constituído de congêneres químicos derivados do urishiol (DU, et al, 1984).
A castanha do caju (Anacardium occidentale L.), também faz parte desta
espécie. Nos anos mais recentes ela teve seu consumo aumentado,
especialmente nos locais onde é cultivado, como no Brasil, onde seu suco é
bastante popular. Os princípios ativos presentes nesta bebida, demonstraram
atividade antitumoral superior quando comparados a muitos produtos de
origem não natural, além disso, vários autores têm relatado que o ácido
anacárdico presente nos extratos da fruta, possui atividade antibacteriana
contra Helicobacter pylori, atividade molusculicida e citotóxica (KUBO et al,
1993; KUBO et al, 1999; SULLIVAN, 1982; HIMEJIMA, 1991; ITOKAWA, 1989).
A atividade molusculicida do ácido anacárdico, relatada por Sullivan e col.
(1982) veio inclusive a servir como meio para prevenção de Schistosomose,
em decorrência da atividade anti-vetorial no controle do crescimento da
população de caracóis (Biomphalaria glabrata) no Brasil e na África.
Tyman e Morris (1967) decreveram a composição do óleo da castanha
como 71,7% de ácido anacárdico, 18,7% de cardol, 4,7% de cardanol, 2,7% de
fenóis originais e 2,2% de dois ingredientes menores. O óleo da castanha do
cajú é usado como linimento para freios e isolamento elétrico (MITCHELL &
MORI, 1987). Do mesmo óleo, o ácido anacárdico, 2-metilcardol e cardóis
isolados de várias partes da castanha (Anacardium occidentale) todos
compostos fenólicos, tem exibido atividade inibitória de tirosinoquinase, de
forma competitiva pela inibição da oxidação de L- 3,4 dihidroxifenilalanina (L-
DOPA) (KUBO et al, 1994).
Outros testes de atividade citotóxica já foram realizados com plantas
desta espécie. O material seco de 14 espécies, submetido à extração com
30
31
etanol (70% v/v) foi submetido ao teste do MTT para avaliar seu poder
citotóxico contra células tumorais de Colo 320 (HARTLEY, 1998).
Neste contexto, a família Anacardiaceae faz parte de um excepcional
grupo de plantas, de onde seus compostos químicos secundários são
encontrados exercendo potencial terapêutico sobre a vida humana. Apesar de
serem bastante citados na literatura, pesquisas adicionais precisam ser feitas,
pois somente 12 dos 25 gêneros existentes têm sido analisados quimicamente
e somente uma das poucas espécies de cada gênero tem sido bem estudada
(MITCHELL, 1990).
1.2.2 O gênero Tapirira
O gênero Tapirira é composto de aproximadamente 15 espécies,
pertencem a família Anacardiaceae e é encontrada primariamente no México e
em todo território da América do Sul. (CORREIA et al., 2001) Tapirira
guianensis Aubl. é uma árvore alta que ocorre usualmente na floresta atlântica
do Brasil. (Figura 1). Esta planta é comumente chamada de pau-pombo de
onde a casca é usada pela população local contra lepra, diarréia e sífilis.
(BRAGA, 1976). Pesquisas realizadas revelaram que o extrato etanólico
(EtOH) aquoso seco da planta total, demonstrou citotoxicidade e efeitos tóxicos
gerais (SUFFNESS et al, 1988). Entretanto, não há relato na literatura dos
constituintes químicos dessa planta (CORREIA, 2001). Um programa de busca
da descoberta de novos agentes antitumorais revelou que o extrato
clorofórmico das sementes de Tapirira guianensis apresenta atividade
citotóxica contra linhagens de células de câncer de próstata humano. Nos
últimos anos fitocompostos obtidos da Tapirira foram isolados, os quais são
derivados alquilados da ciclohexanona que parecem ser possíveis precursores
dos lipídios fenólicos (DAVID et al, 1998; CORREIA, 2001).
As sete estruturas inéditas de hidrobenzofuranóides isoladas das folhas
da Tapirira Guianensis e a análise desses derivados químicos foram
caracterizadas a partir da análise dos dados no IV, UV, EM (IE, APCI, ESI) e
31
32
RMN (
1
H,
13
C, incluindo técnicas bidimensionais), esta caracterização foi
realizada no Departamento de química da Universidade Federal da Bahia
(Tabelas 1 e 2) (CORREIA, 2005).
Desta forma, a importância dos produtos naturais, como no caso em
questão, de vegetais superiores, é indiscutível, principalmente quando estes
servem como fonte para desenvolvimento de projetos de screening e futura
descoberta de novas drogas usadas na terapia do câncer ou até mesmo como
ferramenta farmacológica usado no auxílio da pesquisa pré-clínica.
32
33
Fonte: www.arvores.brasil.nom.br/cerrd.tapiriri.jpg
Figura 1: Fotografia da Tapirira Guianensis.
33
34
Nome Químico Nome Estrutura
(2S,3aR,5S,6R,7aS)-2-[(8'Z)-
Pentadec-8'-enil]-hexa-hidro-
1-benzofurano-3a,5,6,7a-
tetrol.
SJC-1
O
OH
OH
OH
OH
1
2
3
3a
4
5
6
7
7a
8' 9'
15'
(2S,3aR,5S,6S,7aS)-2-
[Heptadecil]-hexa-hidro-1-
benzofurano-3a,5,6,7ª-tetrol.
SJC-3
O
OH
OH
OH
OH
1
2
3
4
5
6
7
1'
3a
7a
17'
(2S,3aR,5S,6R,7aS)-2-[(8'Z)-
Pentadec-8'-enil]-7a-metoxi-
hexa-hidro-1-benzofurano-
3a,5,6(4H)-triol.
SJC-4
O
OH
O
OH
OH
CH
3
1
2
3
3a
4
5
6
7
7a
8' 9'
15'
(2S,3aR,5S,6S,7aS)-2-[(8'Z)-
Pentadec-8'-enil]-hexa-hidro-
1-benzofurano-3a,5,6,7a-
tetrol.
SJC-5
OH
OH
O
OH
OH
2
1
4
3
3a
5
7
7a
6
1'
9'
8'
15'
Tabela 1: Estruturas químicas dos hidrobenzofuranóides (SJC-1 a SJC-
5) isolados das folhas da Tapirira guianensis.
34
35
Nome Químico Nome Estrutura
Mistura de Tetracosanoato de
(1R,2R)-3-metoxi-5-oxo-ciclo-
hexila e Tetracosanoato de
(1S,2R)-3-metoxi-5-oxo-ciclo-
hexila.
SJC-7
O
O
O
O
CH
3
( )
n
1
2
3
4
5
6
O
O
O
O
CH
3
( )
n
1
2
3
4
5
6
3a,7a-Di-hidroxi-2-[(8'Z)-
heineicosan-8'-enil]-2,3,3a,7a-
tetra-hidro-1-benzofuran-
5(4H)-ona.
SJC-8
O
O
OH
OH
1
2
3
4
5
3a
6
7
7a
1'
21'
Mistura de (2S,4S)-2-
nonadecil-ciclo-hex-5-eno-
1,2,4-triol e (4S,6S)-6-
nonadecil-4,6-di-hidroxi-ciclo-
hex-2-en-1-ona.
SJC-9
2
3
1
4
6
5
OH
1´
CH
3
OH
OH
( ) n
2
3
1
4
6
5
O
1`
CH
3
OH
OH
( ) n
19'
19'
Tabela 2: Estruturas químicas dos hidrobenzofuranóides (SJC-7 a SJC-
9) isolados das folhas da Tapirira guianensis.
35
36
Objetivos
36
37
2. OBJETIVOS
2.1. Geral
Avaliar o Potencial Antitumoral dos Hidrobenzofuranóides Isolados das
Folhas da Tapirira guianensis, através dos estudos antitumorais in vitro e in
vivo.
2. 2. Específicos
2.2.1 Determinar a atividade antiproliferativa, nas linhagens de células
tumorais humanas, dos sete hidrobenzofuranóides isolados da Tapirira
guianensis;
2.2.2 Determinar a atividade hemolítica do hidrobenzofuranóide
selecionado no item 2.2.1 com o mais citotóxico, (3a,7a-Di-hidroxi-2-[(8'Z)-
heineicosan-8'-enil]-2,3,3a,7a-tetra-hidro-1-benzofuran-5(4H)-ona (SJC-8);
2.2.3 Determinar a toxicidade do hidrobenzofuranóide SJC-8 em larvas
da Artemia salina;
2.2.4 Caracterizar o possível mecanismo de ação do
hidrobenzofuranóide SJC-8, utilizando células HL-60;
2.2.5 Avaliar o potencial genotóxico in vitro, do hidrobenzofuranóide
SJC-8 utilizando células HL-60;
2.2.6 Determinar a atividade antitumoral in vivo do hidrobenzofuranóide
SJC-8, selecionado in vitro, no tumor experimental Sarcoma 180.
37
38
Materiais e Métodos
38
39
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Materiais utilizados
3.1.1. Equipamentos
Agitador de placa MLW Modelo Thys 2
Aquário marinho
Banho-maria (Fanem®)
Centrífuga Excelsa Baby I FANEN Modelo 206
Centrífuga de placas Eppendorf Modelo Centrifuge 5403
Centrífuga de lâminas Shandon Southern Cytospin
Cuba e fonte para eletroforese (BioRad®)
Espectrofotômetro de placas Packard Spectra Count
Estufa (Fanem®)
Fluxo lâminar (Veco®)
Frascos para cultura de células Corning®
Geladeira e freezer (Consul®)
Incubadora de células (CO
2
Water-Jacket Incubator) NUAIRE TS Autoflow
Lâminas e lamínulas
Microondas (Panasonic®)
Microscópio de fluorescência Olympus Modelo BX41
Microscópio óptico Metrimpex Hungary/PZO-Labimex Modelo Studar lab
Microscópio óptico de inversão Nikon Diaphot
39
40
Pipetas automáticas (Gilson®) e pipetas Pasteur
Seringas descartáveis de 10mL e agulhas 25 x 7mm
Tubos Falcon® 15mL
Vidrarias, bastões de vidro e pipetas
3.1.2. Reagentes e Soluções
NOMES CONCENTRAÇÕES
MARCA ®
Ácido Acético 32 N REAGEN
Ácido Clorídrico 0,1 N VETEC
Agarose LMP (0,5%) 0,5 agarose + 100ml PBS GIBCO
Agarose NMP (1,5%) 1,5 agarose + 100ml PBS GIBCO
Água do mar filtrada - -
1g de acridina laranja (100µg/mL) FLUKA Acridina Laranja
H
2
O q.s.p. 10mL de solução -
Álcool Etílico 70% VETEC
1 μL de anticorpo anti-BrdU
SIGMA
Anticorpo Anti – BrdU
BSA 5% q.s.p. 500 μL de solução
DAKO
10 mg de Azul de tripan SIGMA Azul de tripan 10%
PBS q.s.p. 100 mL de solução -
40
41
BrdU
10mM SIGMA
1mg de Brometo de etídeo SIGMA
Brometo de etídio 100 μg/mL
(para acrina-orange)
PBS q.s.p 10 mL de solução -
0,2mg de Brometo de etídio SIGMA
Brometo de etídio 20 μg/mL
(para cometa)
PBS q.s.p 10 mL de solução -
Citocalasina B - SIGMA
DMSO – Dimetilsulfóxido VETEC
5 μL de DAB
IMMUNOTECH
1 mL de Tris-Hcl (Tris 0,05M) pH=
7,6
PROQUIMIOS
Diaminobenzidina (DAB)
2 μL de H
2
O
2
PROQUIMIOS
Doxorrubicina
0,3 μg/mL
ZODIAC
Etanol
100%
VETEC
0,5 g de Eosina DOLES
80 mL de EtOH VETEC
0,5 mL de Ácido acético VETEC
Eosina 0,5%
20 mL de H
2
O -
10μL de estreptavidina-
fluoresceína
BOEHRINGER
Estreptavidina – fluoresceína
500μL do tampão de incubação
-
41
42
Estreptavidina – peroxidase
1μL de Estreptavidina – peroxidase
SIGMA
BSA 5% q.s.p. 100 μL de solução
DAKO
100 mL de Formaldeído 37% VETEC
4 g de Fosfato de sódio monobásico LABSYNTH
6,5 g Fosfato de sódio dibásico LABSYNTH
Formalina neutra 10%
H
2
O q.s.p. 900 mL -
Ficoll (SIGMA®) - SIGMA
5- Fluorouracil 250 mg/10 mL
ICN
FARMACÊUTI
CA
0,5 g de Hematoxilina DOLES
10 mL de Glicerina LABSYNTH
25 g de Sulfato de alumínio LABSYNTH
Hematoxilina 0,1%
0,1 g de Iodeto de potássio LABSYNTH
Kit Topo I Drug Screening Kit - TopoGEN, Inc.
37,3 g de Cloreto de potássio LABSYNTH KCl 0,5M
H
2
O q.s.p 1 L de solução. -
5,595 g de Cloreto de potássio LABSYNTH
KCl 0,075M
H
2
O q.s.p 1 L de solução -
Meio de cultura de células Diluído em água deionizada e CULTILAB
42
43
RPMI 1640 esterelizada, filtrado em filtro
millipore – 0,22 mm – e
complementado com 10% SBF, 1%
de glutamina, 1% de antibióticos,
1% de bicarbonato de sódio (0,75%)
e 25 mM de HEPES
Metanol 100% VETEC
50mg de MTT SIGMA MTT (5mg/mL)
PBS q.s.p. 10 mL de solução -
N-Lauroylsarcosine SIGMA
Penicilina 10.000 U.I./mL CULTILAB
Penicilina – estreptomicina
Estreptomicina 10 mg/mL CULTILAB
PBS
NaCl (8,766g), Na
2
HPO
4
(2,76g) e
NaH
2
PO
4
(0,274g)
EDTA QEEL
NaOH VETEC
NaCl SYNTH
Sais (para cometa)
Tris SIGMA
Solução Fixadora
3 Metanol : 1 Ácido Acético -
8,5 g de Cloreto de sódio (0,85%) LABSYNTH Solução salina (para
hemólise)
1,11 g de Cloreto de cálcio (10 mM) REAGEN
43
44
H
2
O q.s.p 1 L de solução -
Solução de Neutralização
0,4M Tris; pH 7,5 -
Solução de Eletroforese
1mM EDTA, 300mM NaOH; pH>13 -
Soro fetal bovino - CULTILAB
Citrato de sódio 0,15 M
GRUPO
QUÍMICA
Cloreto de sódio 1,5 M LABSYNTH
SSC 10X
H
2
O -
2,14 g de NaHPO4.7H
2
O LABSYNTH
0,276 g de NaHPO4.H
2
0 LABSYNTH
H
2
0 q.s.p. 1 L de solução (pH = 7,2) -
Tampão fosfato (PBS)
8,766 g de Cloreto de sódio LABSYNTH
Tris 0,5 M (pH= 7,6)
PROQUÍMIOS
Cloreto de sódio 1,5 M LABSYNTH
Tampão Tris (TBS) 10X
H
2
O
-
0,125 g de EDTA PROQUÍMIOS
50 mL de Tripsina 2,5% CULTILAB
Tripsina 0,25%
500 mL de PBS -
44
45
H
2
O q.s.p. 100 mL de solução -
Triton X -100 1%
1 mL de Triton X-100 ISOFAR
Tabela 3. Lista de reagentes e soluções
3.2. Metodologia Experimental
3.2.1. Obtenção dos hidrobenzofuranóides
Os hidrobenzofuranóides foram obtidos das folhas da Tapirira
guianensis, tendo sido coletadas no estado da Bahia na forma de dois
espécimens. As moléculas foram gentilmente cedidas pelos professores
doutores Jorge David da Universidade Federal da Bahia e Suzimone Correia da
Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia.
O espécimen de T. guianensis (1) foi coletado em 05 de setembro de
1996, no Campus de Ondina, nas proximidades do Instituto de Química da
Universidade Federal da Bahia, Salvador-BA. O outro espécimen de T.
guianensis (2) foi coletado na subida do Morro para o Pati, município de
Andaraí-BA (Lat 12º 46´23´´S; Long 41º 20´46´´ W) em 10 de maio de 2003.
Ambos espécimens foram identificados pela Profª Maria Lenise S. Guedes,
curadora do Herbário Alexandre Leal da Costa do Instituto de Biologia da
Universidade Federal da Bahia, onde as exsicatas dos espécimens encontram-
se depositadas sob os números 031077 e 61884, respectivamente.
As folhas de Tapirira guianensis coletadas em 05/09/1996 (espécime
1), após secagem (2668 g) foram maceradas em hexano PA e o resíduo foi
macerado em metanol. O extrato hexânico foi lavado com MeOH:H2O (9:1). A
fase hidrometanólica (26,0 g) foi submetida à CC em SiO2, eluída com CH2Cl2,
CHCl3, e misturas de CHCl3/CH3OH (98:2, 95:5 e 90:10). A fração eluída com
45
46
CHCl3/CH3OH 90:10 (6,02 g) foi submetida a CC (SiO2, CH2Cl2/CH3OH em
gradiente de polaridade).
A partir desse procedimento, a fração eluída com CH2Cl2/CH3OH
98:2 (279,5 mg), após ser submetida à CCDP, eluída duas vezes com mistura
de CHCl3-CH3OH 98:2 possibilitou o isolamento de SJC-4 (100,4 mg).
A fração eluída com CH2Cl2-CH3OH 97:3 (422,0 mg) foi purificada por
CC sob média pressão de N2 em gel de sílica 60H, eluída com misturas de
CHCl3-CH3OH em gradiente crescente de polaridade, o que possibilitou o
isolamento de SJC-1 (137,8 mg).
A fração eluída com CH2Cl2-CH3OH 93:7 (236,7 mg) foi submetida à
CCDP em gel de sílica. As placas foram eluídas três vezes com mistura de
CHCl3-CH3OH 9:1. Deste procedimento, após revelação com radiação UV e
vapores de iodo, foram isoladas SJC-5 (97,3 mg) e SJC-3 (65,7 mg)
O extrato metanólico foi solubilizado em MeOH:H2O (9:1), filtrado e
extraído com hexano. A fração hexânica do extrato metanólico (11,83 g) foi
submetida à CC, em gel de sílica 60 eluída em hexano-AcOEt em gradiente de
polaridade. A fração eluída em acetato puro (835,82 mg) foi purificada por CC
submetida a fracionamento por em gel de sílica 60, eluída com Hexano-AcOEt
em gradiente de polaridade. A fração eluída com Hexano-AcOEt 6:4, após ser
submetida à cromatografia por permeação em gel em Sephadex LH20
possibilitou a obtenção de SJC-9 (9,3 mg) e SJC-7 (14,3 mg).
As folhas de um segundo espécime de T. guianensis (4139,0 g),
coletado no Morro do Pati, município de Andaraí-BA (Lat 12º 46´23´´S; Long
41º 20´46´´ W) em 10/05/2003 (espécime 2), foram submetidas ao mesmo
protocolo que as folhas do espécime 1. A partir dos mesmos procedimentos
foram isolados SJC-1 e SJC-4. Além dessas substâncias foi identificado SJC-8
como substância majoritária. SJC-8 (237,6 mg) foi obtida a partir do
fracionamento da fase hidrometanólica do extrato hexânico (5,50 g) quando
esta foi submetida à CC em SiO2, eluída com CHCl3/CH3OH 95:5.
46
47
3.2.2. Estudo da atividade citotóxica in vitro
3.2.2.1. Avaliação da atividade antiproliferativa em células tumorais
A citotoxicidade foi obtida através do método do 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-
2,5-difenil-2-H-brometo de tetrazolium (MTT) (MOSMANN, 1983) utilizando as
seguintes linhagens celulares: HL-60 (leucemia), K-562 (leucemia), HCT-8
(cólon), MDA/MB-435, MDA/MB-231, MX-1 (mama) M-14, UACC-62 e UACC-
257 (melanoma) e SF-295 (sistema nervoso central) obtidas através de doação
do Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos (Bethesda, MD) (Tabela
4). O ensaio consiste em uma análise colorimétrica baseada na conversão do
sal MTT para formazan, pela atividade da enzima succinil-desidrogenase
presente na mitocôndria da célula viável, permitindo dessa maneira quantificar
a porcentagem de células vivas.
As linhagens celulares foram cultivadas em frascos plásticos para cultura
(Corning, 25 cm
2
, volume de 50 mL para células aderidas e 75 cm
2
, volume de
250 mL para células em suspensão); utilizando o meio de cultura RPMI 1640
complementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibióticos
(penicilina/estreptomicina). As células foram incubadas em estufa a 37°C com
atmosfera de 5% de CO
2
, seguido da observação do crescimento celular com
ajuda de microscópio de inversão a cada 24 horas, quando necessário as
células foram replicadas em meio de cultura novo, em uma concentração de
0,5-1,0 x 10
6
células/mL (BUTLER & DAWSON, 1992).
47
48
Linhagem Tipo Histológico Origem
HL-60 Leucemia promielocítica humana
K-562
Leucemia mielocítica
crônica
humana
HCT-8 Carcinoma de cólon humana
MX-1 Mama
humana
MDA/MB-231 Mama
humana
MDA/MB-435 Mama humana
M-14 Melanoma humana
UACC-62 Melanoma humana
UACC-257 Melanoma humana
SF-295 Sistema Nervoso Central humana
Tabela 4 - Linhagens tumorais utilizadas no ensaio de citotoxicidade in vitro
48
49
Procedimento Experimental
As células em suspensão ou monocamadas foram distribuídas em
multiplacas de 96 cavidades numa densidade de 0,3 x 10
6
células/mL, para
células suspensas K-562 e HL-60; 0,7 x 10
5
células/mL para células aderidas
HCT-8; 0,1 x 10
6
, para células também aderidas MDA/MB-435, MX-1,
MDA/MB-231, SF-295, M-14, UACC-62, UACC-257. As substâncias testes
foram incubadas durante 72 horas juntamente com a suspensão de células
com concentrações variando de 0,39 a 25 μg/mL. A doxorrubicina foi utilizada
como controle positivo com concentrações variando de 0,003 a 0,25 μg/mL.
Após o período de incubação, as placas foram centrifugadas (15 g/15 min), e o
sobrenadante foi descartado. Cada cavidade recebeu 200 μL da solução de
MTT (10% em meio RPMI 1640) e foi reincubada durante 3 horas, em estufa a
37°C e a 5% CO
2
. Após esse período, as placas foram novamente
centrifugadas (30 g/10 min), o sobrenadante foi desprezado, e o precipitado foi
ressuspendido em 150μL de DMSO. Para a quantificação do sal reduzido nas
células vivas, as absorbâncias foram lidas com o auxílio do espectrofotômetro
de placa, no comprimento de onda de 550nm. Essa técnica tem a capacidade
de analisar a viabilidade e o estado metabólico da célula, sendo assim,
bastante útil para avaliar a citotoxicidade.
Análise dos dados
As amostras foram testadas em diluição seriada, em duplicata ou
triplicata. Foi registrada a porcentagem de inibição x log da concentração a fim
de determinar suas CI
50
(concentração inibitória média capaz de provocar 50%
do efeito máximo) e seus respectivos intervalos de confiança (IC 95%)
realizado a partir de regressão não-linear utilizando o programa Prism versão
3.0 (GraphPad Software).
49
50
3.2.2.2. Avaliação da atividade hemolítica em eritrócitos de camundongos
Mus musculus Swiss
Esta metodologia, foi descrita segundo Costa-Lotufo et. al. 2002; Dresch
et al. 2005, permite avaliar o potencial das substâncias-testes em causar
lesões na membrana plasmática da célula, seja pela formação de poros ou pela
ruptura total.
Procedimento Experimental
Foi coletado o sangue de três camundongos (Mus musculus Swiss) por
via orbital, sendo diluído em 30 volumes de solução salina (NaCl 0,85% +
CaCl
2
10 mM). Os eritrócitos foram lavados 2 vezes em solução salina por
centrifugação (15 g/3 min.) para redução da contaminação plasmática e
ressuspensos em solução salina para obtenção de uma suspensão de
eritrócitos (SE) a 2%. Os ensaios foram realizados em multiplacas com 96
cavidades. Cada poço da 1ª fileira recebeu 100 μL da solução salina. Na 2ª, os
poços receberam 50 μL da solução salina e 50 μL do veículo de diluição da
substância teste, neste caso, DMSO 10%. Aos poços da 3ª fileira, foram
adicionados 100 μL de solução salina e 100 μL da substância teste em
solução. Da 4ª fileira em diante os poços receberam 100 μL da solução salina,
excetuando-se os da última fileira, que receberam 80 μL de solução salina e 20
μL de Triton X – 100 1% (controle positivo). As diluições foram feitas da 3ª à
11ª cavidade, retirando-se 100 μL da solução da cavidade anterior e
transferindo para a seguinte de modo que as concentrações foram sempre
diluídas pela metade, variando de 1,5 a 200 μg/mL. Em seguida, 100 μL da
suspensão de eritrócitos foram plaqueados em todos os poços.
Após incubação de 1 hora, sob agitação constante à temperatura
ambiente (26 ± 2ºC), a amostra foi centrifugada (50 g/3 min.) e o sobrenadante
transferido para uma outra placa para a leitura da absorbância no
50
51
espectrofotômetro de placa a 540nm. A atividade da substância teste foi
determinada de maneira relativa ao valor dos controles positivo e negativo.
Neste ensaio, a substância é considerada ativa quando apresenta CE
50
<
200μg/mL.
3.2.2.3. Estudo da toxicidade aguda em larvas de Artemia sp.
O gênero Artemia é classificado como pertencente ao Filo Artropoda,
Subfilo Crustacea, Classe Branchiopoda (RUPERT & BARNES, 1996). Artemia
sp. é um pequeno crustáceo que tem sido bastante utilizado em muitos estudos
fisiológicos. A Artemia sp. possui o desenvolvimento indireto, com capacidade
de encistamento. Os náuplios (larvas características) são facilmente obtidos
através da hidratação dos cistos. Passam por vários estágios larvais, antes da
maturação. No primeiro estágio, náupilo I, o trato digestivo desses animais não
entra em contato com o meio externo e sua alimentação consiste basicamente
do vitelo do próprio ovo. Com a mudança para o estágio II, os náuplios
começam a se alimentar de matéria orgânica em suspensão, através da
ingestão contínua da água circulante. Sendo os náupilos mais sensíveis nesse
estágio, os mesmos são utilizados nos testes de toxicidade. É uma metodologia
simples que permite a avaliação da toxicidade aguda de extratos brutos,
frações ou substâncias puras provenientes de produtos naturais.
Procedimento Experimental
Os cistos de Artemia sp. foram mantidos por 24h em um béquer com
água do mar filtrada, sob aeração suave e iluminação intensa, até a eclosão
dos náuplios I. Estas larvas foram separadas em um segundo béquer onde
foram mantidas por mais 24h para atingirem o estágio de náuplio II. O
plaqueamento foi realizado pela adição de 10 náuplios em placas com 24
poços, contendo os compostos em concentrações diferentes (1, 3, 10, 30 e 100
51
52
μg/mL), em triplicata. Como controle negativo, foi utilizado água do mar filtrada
e o veículo usado para diluir as substâncias (DMSO). As placas foram
incubadas à temperatura ambiente, por 24h. Depois foram contados as larvas
vivas e mortas correspondentes a cada poço (JIMENEZ et al., 2003).
Fonte: Bezerra (2005)
Figura 2 – Fotografia de um náuplio de Artemia sp.
Análise dos dados
O cálculo da dose que causa letalidade de 50% dos náuplios (DL
50
) foi
obtido pelo método dos probitos (LITCHFIELD & WILCOXON, 1949). Os dados
correspondem à média e ao erro-padrão da média de dois experimentos
independentes realizado em triplicata.
52
53
3.2.3. Estudo do mecanismo de ação em células leucêmicas
3.2.3.1. Curva de Crescimento Celular
A construção da curva de crescimento celular pode fornecer informações
importantes sobre a cinética da cultura de células em questão. A observação,
em curtos intervalos de tempo, dessas culturas tratadas permite avaliar a ação
citotóxica temporal da amostra, SJC-8, assim como o acompanhamento das
alterações morfológicas das células a medida que vão acontecendo.
Procedimento Experimental
Inicialmente, as células HL-60 foram distribuídas em multiplacas de 24
cavidades numa densidade de 0,3 x 10
6
células/mL e incubadas com SJC-8
nas concentrações de 0.5; 1.0; 2.0; 3.0 e 4.0 μg/mL. Nos intervalos
programados de 6h, 12h, 24h, 36h, 48h, 60h e 72h após o plaqueamento, uma
alíquota de cada amostra foi retirada e as células viáveis foram diferenciadas
por exclusão de azul de tripan e contadas em câmera de Neubauer.
Análise dos dados
O valor obtido para cada contagem foi plotado em um gráfico e
construído uma curva com as variáveis: porcentagem de células viáveis x log
da concentração, para cada tempo analisado, para a observação da cinética de
crescimento das células tratadas. Foram determinadas suas CI
50
(concentração
inibitória média capaz de provocar 50% do efeito máximo) e seus respectivos
intervalos de confiança (IC 95%) realizado a partir de regressão não-linear
utilizando o programa Prism versão 3.0 (GraphPad Software). Para verificação
53
54
da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os valores
das CI
50
foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida de
Student Newman Keuls (p<0,05).
3.2.3.2. Estudo da Viabilidade celular - Exclusão por Azul de Tripan
O teste de exclusão por azul de tripan permite quantificar
separadamente as células viáveis das células mortas pela substância testada.
O corante penetra em todas as células, porém somente as células viáveis
conseguem bombear o tripan para fora, sendo possível dessa maneira
observar uma coloração azulada nas células mortas.
Procedimento Experimental
Células da linhagem HL-60, foram plaqueadas na concentração de 0,3 x
10
6
células/mL, e incubadas por 24 h com a SJC-8 nas concentrações 1.0; 2.0
e 4.0μg/mL, (2.2, 4.4 e 8.8μM respectivamente) tendo sido examinadas ao
microscópio de inversão. As concentrações foram estimadas a partir do valor
da CI
50
encontrada nas curvas de crescimento para a mesma linhagem celular.
A Doxorrubicina (0,3 μg/mL) foi usada como controle positivo. Foram retirados
90μL da suspensão de células e adicionado a 10μL do azul de tripan. As
células viáveis e as não viáveis foram diferenciadas e contadas em câmara de
Newbauer. (VERAS et al., 2004).
Análise dos dados
Os dados foram analisados a partir da média e do erro padrão da média
de n experimentos. Para verificação da ocorrência de diferenças significativas
54
55
entre os diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de
variância (ANOVA) seguida de Student Newman Keuls (p<0,05).
3.2.3.3. Inibição da síntese de DNA – BrdU
A bromodeoxiuridina (BrdU) é uma base nitrogenada análoga a Timidina.
Quando as células estão sintetizando DNA o BrdU é incorporado no lugar da
timidina. A detecção do BrdU incorporado nas células é feita por técnicas
imunohistoquímicas. O BrdU é adicionado 3h antes do término do período de
incubação (24 horas), para que esse seja incorporado ao DNA das células em
mitose. Em seguida são adicionados os anticorpos e um cromógeno específico,
a diaminobenzidina (DAB). Para corar as células não marcadas pelo
cromógeno, utiliza-se Hematoxilina (0,1%). São contadas as 200 (duzentas)
primeiras células observadas em microscópio óptico. Consideram-se positivas
para proliferação, as células de núcleo corado pelo DAB (cor marrom) e,
negativas, as células de núcleo corado com Hematoxilina (cor azul).
Procedimento Experimental
Células da linhagem HL-60, foram plaqueadas na concentração de 0,3 x
10
6
células/mL, e incubadas por 24 h com a SJC-8 nas concentrações 1.0; 2.0
e 4.0μg/mL, (2.2, 4.4 e 8.8μM respectivamente) tendo sido examinadas ao
microscópio de inversão. A Doxorrubicina (0.3 μg/mL) foi usada como controle
positivo. Três horas após a adição do BrdU (0.01 μM) na cultura de células HL-
60, as lâminas para cada concentração da SJC-8 foram preparadas e postas
para secar por 2 h. Após o período de secagem foram fixadas em metanol:
ácido acético (7:1,5) por 5 minutos. As células foram lavadas com tampão Tris
(TBS) e incubadas em solução desnaturante por 90 minutos a 70
o
C e pH 7.4.
Após uma segunda lavagem com TBS, as células foram circuladas com caneta
hidrofóbica e incubadas com anticorpo primário e deixadas na geladeira
55
56
durante a noite em câmara úmida. As células foram incubadas com anticorpo
secundário biotinilado por 20 minutos e, em seguida, com a solução de
estreptavidina-fluoresceína por mais 20 minutos. Foi adicionado o cromógeno
DAB por 1-5 minutos e, em seguida, removido com água destilada. A contra
coloração das células foi realizada com hematoxilina da Hanks a 0.1%.
(VERAS et al., 2004).
Análise dos dados
Duzentas células foram contadas, diferenciando-as entre núcleo marrom
(incorporaram o BrdU) e não-marrom. Para verificação da ocorrência de
diferenças significativas entre os diferentes grupos, os dados foram
comparados por análise de variância (ANOVA) seguida de Student Newman
Keuls (p<0,05).
3.2.3.4. Análise morfológica – Coloração diferencial por
hematoxilina/eosina
A coloração utilizada nesse experimento permite distinguir o citoplasma
e o núcleo, sendo possível analisar a célula quanto a sua integridade nuclear,
bem como alterações no citoplasma. A hematoxilina é um corante alcalino que
tem afinidade pelas proteínas nucleares, dando ao núcleo uma cor azul. A
eosina, ao contrário, liga-se ao citoplasma conferindo-lhe uma coloração rósea.
Procedimento Experimental
Células da linhagem HL-60, foram plaqueadas na concentração de 0,3 x
10
6
células/mL, e incubadas por 24 h com a SJC-8 nas concentrações 1.0; 2.0
56
57
e 4.0μg/mL, (2.2, 4.4 e 8.8μM respectivamente) tendo sido examinadas ao
microscópio de inversão. A Doxorrubicina (0.3 μg/mL) foi usada como controle
positivo. Para observar a morfologia, 50μL da suspensão de células foram
utilizados na preparação das lâminas em citocentrífuga (cytospin). Após a
adesão das células na lâmina a fixação foi feita com metanol 96% por 5
minutos e a coloração primeiramente utilizada foi a hematoxilina, seguida pela
eosina. (VERAS et al., 2004).
Análise dos dados
As lâminas contendo as células coradas foram levadas ao microscópio
para avaliação das suas características morfológicas e comparadas ao controle
(não-tratadas). O registro das alterações celulares foi feito por fotografia.
3.2.3.5. Análise morfológica por fluorescência – Coloração Diferencial por
Brometo de Etídio/Laranja de Acridina
O método de coloração pelo brometo de etídio / laranja de acridina
(MCGAHON et al., 1995) permite diferenciar células viáveis daquelas em
processo de morte por apoptose ou necrose através da coloração diferencial
por fluorescência. Este método baseia-se na revelação das células (controle e
tratadas) com a coloração por brometo de etídio (BE) e laranja de acridina (LA)
no núcleo. A laranja de acridina intercala-se ao DNA, conferindo aparência
verde ao núcleo celular, sendo capaz de atravessar membranas intactas. O
brometo de etídio é incorporado majoritariamente por células não viáveis (com
instabilidade de membrana), intercalando-se ao DNA corando-o de laranja;
ligando-se fracamente ao RNA, que se mostrará com uma coloração vermelha.
As células viáveis com membrana intacta apresentam núcleo uniformemente
corado de verde pela LA; O BE marca muito fracamente ou muitas vezes não
marca, pois não atravessa a membrana íntegra. As células em apoptose inicial
57
58
(membrana ainda intacta) apresentam manchas verdes brilhantes no núcleo
(condensação da cromatina) e não são marcadas por BE; morfologicamente
observam-se alterações da membrana em decorrência da formação de
corpúsculos apoptóticos. As células em necrose (lesão de membrana)
apresentam um padrão de coloração uniforme, laranja-avermelhada e não há
formação de corpos apoptóticos. Possivelmente, as membranas plasmáticas
permaneçam intactas durante o fenômeno apoptótico até os últimos estágios
quando se tornam permeáveis aos solutos normalmente retidos (KUMMAR et.
al. 2004).
Procedimento Experimental
Células da linhagem HL-60, foram plaqueadas na concentração de 0,3 x
10
6
células/mL, e incubadas por 24 h com a SJC-8 nas concentrações 1.0; 2.0
e 4.0μg/mL, (2.2, 4.4 e 8.8μM respectivamente) tendo sido examinadas ao
microscópio de inversão. A Doxorrubicina (0.3 μg/mL) foi usada como controle
positivo. A suspensão de células foi transferida para um tubo eppendorf e
centrifugada por 3 min em baixa rotação. O sobrenadante foi descartado e as
células foram ressuspendidas nos tubos em 20μL de solução de PBS. Em
seguida, 1μL da solução de BE:LA (100 μg/mL) foi adicionado a cada tubo e
uma alíquota dessas células foi transferida para uma lâmina e montada com
lamínula. Posteriormente essas lâminas foram levadas ao microscópio de
fluorescência para observação dos eventos celulares. (GENG et al., 2003).
Análise dos Dados
Foram contadas 300 células, em duplicata, para quantificação do
percentual de cada evento celular (viáveis, necróticas e apoptóticas) para cada
concentração. Em seguida as lâminas foram fotografadas para o registro visual
dos efeitos. Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os
58
59
diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de variância
(ANOVA) seguida de Student Newman Keuls (p<0,05).
3.2.4. Estudo de Genotoxicidade
3.2.4.1. Teste do cometa
Desenvolvido por OSTLING & JOHANSON (1984) e modificado por
OLIVE (1989) e SINGH et al. (1988), o teste do cometa, também chamado de
Single-cell gel electrophoresis (SCGE), vem sendo proposto para estudos de
toxicogenética devido a suas peculiaridades e vantagens quando comparado a
outros testes para detecção de substâncias genotóxicas (RIBEIRO et al., 2003)
e, portanto, alcançou o status de um ensaio padrão em uma bateria de testes
usados para avaliar a segurança de novos fármacos e outros compostos
(COLLINS, 2001).
A análise do teste do cometa alcalino avalia a extensão de quebra ao
DNA após exposição das células a substâncias com potencial genotóxico. Este
teste não é utilizado para detectar mutações, mas sim lesões genômicas que,
após serem processadas, podem resultar em mutação. Diferente das
mutações, as lesões detectadas pelo teste do cometa podem ser de correção
ou levar a apoptose. Assim sendo, este teste pode ser utilizado em estudos de
análise de reparo do DNA (RIBEIRO et al., 2003).
Neste trabalho, foram usadas células de leucemia promielocítica HL-60.
Preparação das Amostras
Neste ensaio foi utilizado como controle positivo a doxorrubicina
(0.3μg/mL) e, como controle negativo as células HL-60 foram expostas ao
DMSO (0.5%). As células foram incubadas com a SJC-8 nas concentrações
59
60
0.5, 1.1, 2.2, 4.4 e 8.8 μg/mL (1.1, 2.4, 4.8, 9.6 e 19.2μM, respectivamente) por
24h a 37ºC, assim como os grupos controle positivo e negativo.
Ao término da incubação em cada cultura, foi retirada uma alíquota de
20μL de células, a qual foi adicionada a 110μL de agarose de baixo ponto de
fusão 0,5% para preparo das lâminas. Para estes testes as lâminas foram
preparadas em duplicata, com dois experimentos independentes.
Preparação das lâminas e lise celular
As lâminas foram previamente cobertas por solução de agarose de
ponto de fusão normal 1,5% a 60°C e mantidas a temperatura ambiente por
24h até a solidificação da agarose. Esta camada foi utilizada para promover a
adesão da segunda camada de agarose de baixo ponto de fusão, a qual foi
preparada previamente. Em seguida, foram cobertas com lamínulas
(24x60mm) para uniformizar a distribuição das células e mantidas a 4°C para
solidificação da agarose. Após solidificação da agarose, a lamínula foi
gentilmente removida e a lâmina mergulhada em solução de lise a 4ºC
(mantida na geladeira), protegida da luz por no mínimo 1h antes da corrida de
eletroforese.
Neutralização e Eletroforese
Depois de removidas da solução de lise, as lâminas foram neutralizadas
por 15min em solução de neutralização e dispostas horizontalmente na cuba de
eletroforese. A cuba foi mantida em “banho de gelo” para a manutenção da
temperatura em torno de 4ºC, tendo sido acrescentada a solução de
eletroforese até completa imersão das lâminas.
Antes de iniciar a corrida de eletroforese, as lâminas ficaram em repouso
por 20min para permitir o desenrolamento do DNA, o afrouxamento de suas
ligações e a exposição dos sítios álcali-lábeis. Posteriormente, a eletroforese
60
61
foi conduzida em baixa luminosidade, usando 25v (volts) e corrente de 300mA
por 20min. Após a eletroforese, as lâminas foram retiradas da cuba e
mergulhadas na solução de neutralização por 5 minutos, a fim de neutralizar a
alcalinidade.
Fixação e Coloração
As lâminas foram fixadas em etanol 100%. Posteriormente, foram
coradas com 50μl de solução de Brometo de Etídio (20μg/mL) e, em seguida,
cobertas com lamínula, sendo analisadas em microscópio de fluorescência.
Escore das lâminas
A análise foi realizada de acordo com o padrão de escores previamente
determinados pelo tamanho e intensidade da cauda do cometa (figura 5).
Foram contados 50 cometas por lâmina e classificados dentre as cinco
categorias (0; 1; 2; 3 e 4) que representam a porcentagem de DNA na cauda
do cometa, indicando o grau de lesão sofrido pela célula.
0 = sem danos (<5%)
1 = baixo nível de danos (5-20%)
2 = médio nível de danos (20-40%)
3 = alto nível de danos (40-95%)
4 = dano total (95%)
61
62
O índice de dano foi obtido pela seguinte fórmula: ID = , onde
in
i
i
×
∑
=
4
0
i
n
é o número de células com nível de dano (0, 1, 2, 3 ou 4). A freqüência de
dano (FD) representa a porcentagem de células que sofreram danos no DNA.
i
Fonte: Collins (2004)
Figura 3: Tipos de cometa: Representação dos cometas, sendo indicado
o escore atribuído a cada cometa de acordo com o dano ao DNA.
Análise Estatística
Para análise estatística dos experimentos, foram utilizados os testes
ANOVA e Tukey no software Prism® versão 4.0 (GraphPad Prism Software),
sendo os resultados considerados significantes quando p<0,05.
62
63
3.2.5 Teste de relaxamento de DNA
As Topoisomerases 1 e 2 do DNA são enzimas que modulam o estado
topológico do DNA. Alterações como a superhelicoidização do DNA são
consideradas processos que influenciam a replicação, transcrição e
empacotamento de DNA. O presente experimento é capaz de demonstrar a
capacidade de inibição destas enzimas pelo método de eletroforese em gel de
agarose.
Procedimento Experimental
Os efeitos inibitórios da SJC-8 nas concentrações de 10 e 20 μg/mL
(22 e 44μM) na Topoisomerase 1 foram medidos usando o kit Topo I
(TopoGEN, Inc.). O plasmídeo superhelicoidizado (250ng) foi incubado com
quatro unidades de Topoisomerase 1 humana a 37°C por trinta minutos em
tampão de relaxamento (10 mM de tampão Tris pH 7.9, 1 mM EDTA, 0.15 M
NaCl, 0.1% BSA, 0.1 mM espermidina e 5% glicerol), na ausência ou presença
de 10 e 20μg/mL de SJC-8 (final 20μL). Campotecina (0.1mM) foi usada como
controle positivo. A reação foi terminada com adição de 10% de SDS (2μl) e
proteinase K (50μg/mL), seguida de incubação a 37 ºC por 30 minutos. As
amostras de DNA foram adicionadas com o tampão de leitura (2μl) e
submetidos a eletroforese em gel de agarose a 1% por 120 minutos a
temperatura ambiente, sendo visualizados pela coloração com brometo de
etídio.
Análise do Gel
Na análise foi avaliada a capacidade da SJC-8 de intercalar ou inibir o
desenrolamento do DNA, através da intensidade das bandas visualizadas no
gel.
63
64
3.2.6. Estudo da atividade antitumoral in vivo
3.2.6.1. Obtenção e manutenção dos animais
Os testes para avaliação da atividade antitumoral in vivo foram
realizados utilizando camundongos (Mus musculus Swiss) fêmeas pesando
entre 25-30g oriundos do biotério do Departamento de Fisiologia e
Farmacologia da UFC, mantidos com água e alimento ad libitum. O manejo dos
animais foi realizado procurando seguir todos princípios éticos, de forma a
amenizar ao máximo o sofrimento dos animais.
3.2.6.2. Avaliação do efeito da SJC-8 em camundongos transplantados
com Sarcoma 180
A avaliação da atividade antitumoral está relacionada à regressão total
de tumores nos animais, à redução no crescimento dos tumores sensíveis ao
composto ou ao aumento da expectativa de vida durante o tratamento,
comparado com os não tratados. Ficou demonstrado que o melhor resultado
desses fatores depende do procedimento do tratamento, que deverá ser
começado até 48 h após o transplante. Neste período, as células tumorais já
teriam iniciado a formação do nódulo tumoral (SCHABEL et al., 1977). O tumor
utilizado foi o Sarcoma 180 o qual foi descoberto em 1914 no Crocker
Laboratory (Columbia University, New York), é originalmente um tumor sólido,
surgido espontaneamente na região axilar de camundongos, e foi inicialmente
classificado como carcinoma mamário. Após vários transplantes subcutâneos,
assumiu a forma sarcomatosa, por volta de 1919, e mantem-se sem alterações
até os dias de hoje.
64
65
Procedimento Experimental
Para o teste de atividade antitumoral, foi utilizado o tumor sólido do tipo
Sarcoma 180, com 10 dias de implantação na região axilar. O animal doador,
ou da manutenção, foi sacrificado por deslocamento cervical, sendo realizado
assepsia com álcool iodado. Em seguida, foi retirado o líquido ascítico da
cavidade abdominal, tendo sido preparado uma suspensão de células com
5,0mL de Ringer lactato, 0,2mL de gentamicina (5mg/mL) e 0,5mL do líquido
ascítico, para posterior contagem de células. Nos animais receptores, foram
injetadas 2 x 10
6
céls/0,5mL na região axilar direita dos camundongos (Mus
musculus Swiss). Nesse experimento, foram utilizados 10 animais por grupos,
num total de 6 grupos, sendo todas fêmeas, apresentando massa corpórea
variando entre 25-30 g, os quais foram inoculados com tumor Sarcoma 180.
Em seguida, 24 h após a inoculação do tumor foi iniciado o tratamento durante
7 dias consecutivos, utilizando as doses de 25 ou 50 mg/Kg para SJC-8 e no
controle positivo 25 mg/Kg de 5 - Fluorouracil, além dos animais tratados com
veículo (DMSO 2%). Vinte quatro horas após o termino do tratamento os
animais foram sacrificados, sendo em seguida retirados os tumores, rins,
fígado e baço para pesagem e análise histológica.
O percentual de inibição do crescimento tumoral (IT) foi calculado pela
fórmula:
IT (%) = [(A-B)/A] x 100
Onde:
A = média dos pesos dos tumores no grupo controle.
B = média dos pesos dos tumores nos animais tratados.
65
66
Análise dos dados
Os dados foram analisados a partir da média e do erro padrão da média
de n experimentos. Para verificação da ocorrência de diferenças significativas
entre os diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de
variância (ANOVA) seguida de Student Newman Keuls (p<0,05).
3.2.6.3. Analise morfológica e histopatológica
A técnica de coloração hematoxilina e eosina (H/E) permite diferenciar o
citoplasma do núcleo, possibilitando, assim, a análise de algumas estruturas
celulares. A análise morfológica e histopatológica de tecidos dos animais
tratadas permitem identificar alterações que possam estar ocorrendo e fornecer
subsídios para sugerir os efeitos tóxicos causados pela droga.
Procedimento Experimental
Após o sacrifício dos animais, ocorreu a retirada e pesagem de órgãos e
tumores, os quais foram armazenados em formol a 10%. As peças foram
retiradas do formol e seccionadas em pequenas fatias para posterior
preparação das lâminas. O material foi fixado em formol a 10% por 24 horas,
desparafinizado em xilol por 15 minutos, e desidratado em concentrações
crescentes de álcool até 70% (mergulhando-se rapidamente as lâminas), sendo
posteriormente lavadas em água destilada até ter sido removido todo o álcool.
Posteriormente as lâminas foram coradas com Hematoxilina 0,1%.
66
67
Análise dos dados
As lâminas, contendo as células coradas, foram levadas ao microscópio
para avaliação das suas características morfológicas e comparadas ao controle
(não-tratadas). O registro das alterações celulares foi feito por fotografia.
67
68
Resultados
68
69
4. RESULTADOS
4.1. Estudo da atividade citotóxica in vitro
4.1.2. Inibição da Proliferação de Células Tumorais in vitro
O potencial citotóxico dos sete hidrobenzofuranóides foi avaliado em
células de linhagens tumorais humanas e (HL-60, MDA/MB-435, HCT-8 e SF-
295) através do método do MTT, após 72 horas de exposição. A tabela 5
apresenta os valores das CI
50
obtidos.
Neste ensaio foi observado que as amostras SCJ-3, SCJ-5, SCJ-7 e SC-
9 não apresentaram potencial citotóxico em nenhumas das linhagens testadas,
cujas CI
50
foram superior a 13μg/mL. Enquanto, as amostras SJC-1 e SCJ-4
apresentaram potencial citotóxico apenas em uma linhagem celular, cuja CI
50
foi 4.7μg /mL para célula HCT-8 e 4.4 μg /mL para célula MDAMB-435
respectivamente. A amostra SJC-8 foi a que mais apresentou potencial
citotóxico, uma vez que suas CI
50
variaram entre 1.7 a 5.2μg/mL, não sendo
seletiva para nenhuma das linhagens testadas (Tabela 5).
Posteriormente, a SJC-8 foi testada em adicionais linhagens celulares,
cuja citotoxicidade foi mais elevada para as linhagens de melanoma, com CI
50
de 0.3μg/mL para UACC-62, e 0.4μg/mL para M-14 e UACC-257. Enquanto
que para as células de mama foram 2.6μg/mL para MX1 e 2.7μg/mL para MDA
MB-231. Tendo sido menos citotóxica para a K-562 cuja CI
50
foi de 6.2μg/mL
(Tabela 6)
69
70
Linhagem
celular
HCT-8 HL-60 MDA/MB-435 SF-295
Doxorrubicina
CI
50
[µg/m]
0.01 (0.02)
0.01 – 0.02
0.02 (0.03)
0.01 – 0.02
0.01 (0.02)
0.01 – 0.02
-
SJC-1 4.70
2.3-9.3
6.5
4.8-8.6
>25 17.2
12.5-23.5
SJC-3 > 25 18.2
14.6-22.8
13.0
8.3-20.4
>25
SJC-4 > 25 12.2
8.6-17.5
4.4
1.8-10.4
>25
SJC-5 16.69
8.2-33.8
21.6
13.2-35.1
19.2
13.8-26.7
20.59
13.6-30.9
SJC-7 >25 >25 >25 >25
SJC-8 3.7
2.4-5,7
1.7
1.2-2.4
1.9
1.4-2.7
5.2
2.8-9.8
SJC-9 >25 >25 >25 >25
Tabela 5 – Atividade citotóxica dos hidrobenzofuranóides em linhagens
de células tumorais. A tabela esta apresentando os valores de CI
50
e o intervalo
de confiança de 95% de dois experimentos independentes realizado em
triplicata pelo método do MTT após 72 horas de incubação com as amostras.
70
71
SJC-8
Linhagem
celular
CI
50
[µg/ml(µM)]
M-14 0.4 (0.8)
0.3-0.5
UACC-62
0.3 (0.6)
0.2-0.3
UACC-257 0.4 (0.8)
0.3-0.4
K-562 6.2 (13.6)
2.7-8.3
MX-1
2,6 (5.7)
2,2 - 3,1
MDA/MB-231 2,71 (5.9)
2,3 - 3,1
Tabela 6 – Atividade citotóxica do composto 3a,7a-Di-hidroxi-2-[(8'Z)-
heineicosan-8'-enil]-2,3,3a,7a-tetra-hidro-1-benzofuran-5(4H)-ona (SJC-8) em
linhagens de células tumorais. A tabela esta apresentando os valores de IC
50
e
o intervalo de confiança de 95% de dois experimentos independentes realizado
em triplicata pelo método do MTT após 72 horas de incubação com a amostra.
71
72
4.1.3. Atividade Hemolítica
O efeito hemolítico da SJC-8 foi avaliado em eritrócitos de camundongos
Mus musculus Swiss. Neste ensaio, foi observada ausência de atividade
hemolítica nas concentrações testadas até 200μg/mL, sendo este o valor
máximo testado.
4.1.4. Toxicidade Aguda em Artemia sp.
No teste de toxicidade aguda em larvas de Artemia sp., a SJC-8
apresentou valor para a dose letal média maior que 100μg/mL. Nenhuma
concentração conseguiu reduzir o número de larvas vivas não sendo possível
determinar a DL
50
.
4.2. Estudo do mecanismo de ação em células leucêmicas
4.2.1. Curva de crescimento celular
Este ensaio avaliou a cinética de crescimento das células tratadas com
SJC-8 nos intervalos de tempo de 6h, 12h, 24h, 36h, 48h, 60h e 72h na célula
HL-60. A SJC-8 causou uma significativa redução na viabilidade celular da
linhagem celular de leucemia humana testada, que ocorreu de modo
dependente da concentração X tempo de exposição, de acordo com suas CI
50
(Figura 4).
Nas células expostas à SJC-8 por 6h e 12h não foram observadas
alterações na viabilidade celular. Depois de 24h de exposição à SJC-8, ocorreu
uma redução no número de células viáveis em todas as concentrações
testadas. (p < 0,05). Assim, baseado nos dados de três experimentos
72
73
independentes realizados em duplicata, os valores de CI
50
após 24h foram de
2.9 ± 0.06 μg/ml (6.3 μM), para as células leucêmicas HL-60 (Tabela 7).
Durante a exposição de 36h, a citotoxicidade da SJC-8 foi mais elevada
do que a encontrada no tempo de exposição de 24h (p < 0,05). Os valores da
CI
50
no tempo de 36h foram de 1.1 ± 0.15 μg/ml (2.4μM), para as células HL-60
(Tabela 7). Após 36 horas de exposição o efeito citotóxico da SJC-8 aumentou
de maneira tempo e dose dependente entre os intervalos de 48h, 60h e 72h
Não houve diferença estatística na atividade citotóxica da SJC-8 entre os
tempos 48h e 60h de exposição, cujas CI
50
foram de 1.0 ± 0.01μg/mL e 0.9 ±
0.16μg/mL respectivamente, entretanto no intervalo de 72h a CI
50
foi de 0.7 ±
0.01μg/mL (1.5 μM), tendo sido significativo quando comparado entre os
intervalos de tempo analisados, p > 0,05. (Figura 4).
73
74
Tempo
HL-60
µg/ml(µM)
6 horas
> 4
(> 8.7)
12 horas
> 4
(> 8.7)
24 horas
2.9 ± 0.06
a
(6.3)
36 horas
1.1 ± 0.15
a
(2.4)
48 horas
1.0 ± 0.10
(2.2)
60 horas
0.9 ± 0.16
(1.9)
72 horas
0.7 ± 0.01
a
(1.5)
Tabela 7 – Determinação cinética da citotoxicidade da SJC-8 em linhagem de
célula de leucemia humana. Os dados correspondem aos valores de CI
50
(média ± E.P.M.) de três experimentos independentes realizados em duplicata
para as células de leucemia humana HL-60 (leucemia promielocítica).
a
(p <
0,05) ANOVA seguido por Student Newman Keuls comparado entre as horas
de HL-60. Os valores de CI
50
foram determinados por regressão não-linear
usando o programa Prism versão 4.0 (Graphpad Software, Inc).
74
75
-1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0
0
20
40
60
80
100
24
36
48
60
72
Concentração log (μg/mL)
N° de células
(% controle)
Figura 4 – Curva de crescimento da célula de leucemia humana tratadas
com SJC-8. A viabilidade celular foi determinada por exclusão de azul de tripan
nos tempos de 24 (■), 36 (▲), 48 (▼), 60 (◊) e 72 (●) horas após a incubação.
Os dados correspondem à média ± E.P.M. de três experimentos independentes
realizado em duplicata para as células de leucemia humana HL-60. Os
resultados com 6h e 12h não foram mostrados.
75
76
4.2.2. Viabilidade celular - Exclusão por Azul de Tripan
O ensaio da viabilidade celular de exclusão por azul de tripan permitiu a
comparação do padrão de crescimento das células tratadas e não-tratadas pela
contagem diferencial das células viáveis e não-viáveis de cada tratamento.
As análises da viabilidade celular em linhagem leucêmica HL-60 por
exclusão de azul de tripan, depois de 24 horas de exposição demonstram que
a SJC-8 causou uma significante redução no número de células viáveis e um
aumento do número de células não viáveis apenas na concentração de 4μg/ml
(8.8μM) (p < 0,05), Não houve diferenças significativas entre as concentrações
1μg/mL (2.2μM) e 2μg/mL (4.4μM). A doxorrubicina foi testada como controle
positivo na concentração de 0.3μg/mL causando 58% de redução no número
de células viáveis para HL-60. (Figura 5)
76
77
C D 1,0 2,0 4,0
0
10
20
30
40
50
Viáveis
Não-viáveisl
(μg/mL)
a
SJC 8
a
a
_________________
Número de células
(x 10
4
/mL )
Figura 5 – Efeito da SJC-8 na viabilidade das células leucêmicas HL-60
determinada por exclusão de azul de tripan depois de 24 horas de incubação.
O controle negativo (C) foi tratado com o veículo usado para diluir a droga
(DMSO 0,2%). Doxorrubicina (0.3 μg/mL) foi usada como controle positivo (D).
Os dados correspondem à média ± E.P.M. de três experimentes
independentes. a, p < 0,05 comparado com o controle por ANOVA seguido
pelo teste de Student Newman Keuls.
77
78
4.2.3. Inibição da síntese de DNA – Incorporação de BrdU
Neste ensaio, foi avaliada a capacidade proliferativa das células tratadas
em comparação as não-tratadas pela incorporação de BrdU no DNA. A figura 6
apresenta o efeito da SJC-8 na incorporação de BrdU por células leucêmicas
HL-60 depois de 24 horas de exposição.
Na concentração de 1µg/ml, a SJC-8 causou uma incorporação de BrdU
de 43%, enquanto na concentração de 2µg/mL a incorporação foi de 38%, não
havendo diferença nestas concentrações. Porém, na concentração de 4µg/mL
a incorporação foi de 27%, havendo diferença significativa em relação as duas
últimas concentrações (p < 0,05) (Figura 6). A doxorrubicina (0.3µg/mL) foi
usada como controle positivo e causou incorporação de BrdU em 24% em HL-
60.
78
79
C D 1 2 4
0
10
20
30
40
50
60
70
(μg/ml)
SJC8
a
a
a
a
Cél. BrdU positiva (%)
Figura 6 – Efeito da SJC-8 na incorporação da 5-bromo-2´-deoxiuridina
(BrdU) em células leucêmicas HL-60 depois de 24 horas de incubação. O
controle negativo (C) foi tratado com o veículo usado para diluir a droga (DMSO
0,2%). Doxorrubicina (0.3μg/mL) foi usada como controle positivo (D). Os
dados correspondem à média ± E.P.M. de três experimentos independentes. a,
p < 0,05 comparado com o controle por ANOVA seguido pelo teste de Student
Newman Keuls.
79
80
4.2.4. Análise morfológica – Coloração diferencial por
hematoxilina/eosina
A figura 7 apresenta a análise morfológica das células HL-60 tratadas e
não-tratadas com SJC-8. A coloração das células não-tratadas permitiu
observar que estas se apresentaram normais, com núcleos volumosos,
citoplasmas homogêneos e ocasionais figuras mitóticas.
As células tratadas com SJC-8 na concentração de 1µg/mL
apresentaram poucas alterações, diferindo do controle negativo apenas em
raras vacuolizações do citoplasma e irregularidades na membrana (Figura C).
Na concentração de 2μg/mL, a SJC-8 causou condensação da cromatina
irregular e fragmentação nuclear, juntamente com irregularidades na
membrana (Figura 7D). Na concentração de 4μg/mL houve aparente redução
no volume das células e perda da integridade da membrana plasmática,
indicando um aumento no número de células mortas (Figura 7E). Condensação
da cromatina e fragmentação nuclear também foram observadas na presença
da doxorrubicina 0.3μg/ml (Figura 7B).
A
80
81
Figura 7 – Fotomicrografia das células HL-60 coradas com
hematoxilina/eosina. Células não-tratadas (A), tratadas com SJC-8 (1,0 μg/mL,
C), (2,0 μg/mL, D) ou (4,0 μg/mL, E) em células leucêmicas HL-60 analisados
por microscopia óptica (x400). Doxorrubicina (0.3μg/mL) foi usada como
controle positivo (B). As setas brancas indicam fragmentação e condensação
da cromatina irregular, as setas pretas indicam núcleo picnóticos, as setas
pretas tracejadas restos celulares e as setas brancas tracejadas irregularidade
de membrana.
81
82
4.2.5. Análise morfológica – Coloração Diferencial por Brometo de
Etídio/Laranja de Acridina
Após as 24 horas de exposição das células HL-60 com SJC-8, nas
concentrações de 1 e 2μg/mL foi observado uma significativa diminuição de
células viáveis e aumento do numero de células apoptóticas (p<0,05).
Entretanto na concentração de 4μg/mL, observamos além dessas mesmas
alterações o aumento do número de células necróticas, p < 0,05 (Figura 8 e 9).
As células tratadas com doxorrubicina apresentaram características de células
apoptóticas e raríssimas células necróticas (Figura 9B). O controle negativo
experimental apresentou ocasionais células apoptóticas (Figura 9A).
C D 1,0 2,0 4,0
0
25
50
75
100
a
_______________
SJC 8
a
a
a
a
a
a
a
a
Céls. viáveis Céls. apoptóticas
Céls. necróticas
N° de células
Figura 8 – Efeito da SJC-8 em células leucêmicas HL-60 analisados por
Brometo de Etídio/Laranja de Acridina depois de 24 horas de incubação. O
controle negativo (C) foi tratado com o veículo usado para diluir a droga (DMSO
2%). Doxorrubicina (0.3μg/mL) foi usada como controle positivo (D). Os dados
correspondem à média ± E.P.M. de três experimentos independentes. a, p <
0,05 comparado com o controle por ANOVA seguido pelo teste de Student
Newman Keuls.
82
83
A
D
C
B
E
A
D
C
B
E
Figura 9 – Fotomicrografia das células HL-60 coradas com Brometo de
Etídio/Laranja de Acridina. Células não-tratadas (A), tratadas com SJC-8,
1,0μg/mL (C), 2,0 μg/mL (D) e 3,0μg/mL (E) em células HL-60 e analisados por
microscopia de fluorecência (x400). Doxorrubicina (0,3μg/mL) foi usada como
controle positivo (B). As setas verdes indicam células viáveis, as amarelas
indicam células apoptóticas e as vermelhas indicam células necróticas.
83
84
4.3 Teste de Genotoxicidade
4.3.1 Teste do cometa
O dano ao DNA nas células HL-60 induzido pela SJC-8 foi intenso nas
diferentes concentrações testadas, apresentando índice de dano superior a
77.00 ± 6.55 em todas as amostras a partir da concentração de 0.5μg/mL
(1.1µM), Na concentração de 8.8μg/mL (19.2µM), o índice de dano foi de
235.66 ± 3.21, o qual não diferenciou da amostra tratada com a doxorrubicina
na concentração de 0,3μg/mL, cujo o índice foi de 240.66 ± 4.72 (Tabela 8)
A freqüência de dano a partir de 0,5μg/mL (1.1µM), foi superior a 60%
em todas as concentrações, atingido o valores próximos de 100% de dano na
maior concentração de 8.8μg/mL (19.2µM) (Tabela 8).
Todas as concentrações testadas induziram dano ao DNA de maneira
concentração – dependente e os valores de índice e frequência de dano foram
estatisticamente diferentes quando comparadas ao controle negativo.
Os tipos dos danos foram comparados ao controle negativo, onde a
SCJ-8 na concentração de 0.5μg/mL (1.1µM), causou danos do tipo 0, 1 e 2,
enquanto na concentração de 1.1μg/mL (2.4µM) iniciou a presença do dano
tipo 3, o qual permaneceu nas concentrações de 2.2; 4.4 e 8.8μg/mL (4.8, 9.6 e
19.2μM). Já, o dano tipo 4 apareceu nas concentrações 4.4 e 8.8μg/mL (9.6 e
19.2μM) (Figura 10).
84
85
Substância
Concentração
(μg/mL)
ID ± DP FD ± DP
13.33 ± 4.93 12.33 ± 3.21
DMSO
Doxorrubicina
0.3 240.66 ± 4.72 89.00 ± 3.60
0.5 77.00 ± 6.55
*
60.66 ± 2.51
*
1.1 114.66 ± 15.53
*
83.00 ± 2.00
*
2.2 145.00 ± 13.07
*
86.33 ± 3.78
*
4.4 196.33 ± 5.68* 95.66 ± 2.08
*
8.8 235.66 ± 3.21* 99.33 ± 0.57*
SJC-8
Tabela 8: Índices de danos (ID) e freqüências de danos (FD) ao DNA de
células tumorais da linhagem HL-60 (leucemia humana) obtidos através do
teste do cometa após 24 horas de tratamento com SJC-8 nas concentrações
0.5, 1.1, 2.2, 4.4 e 8.8 μg/mL. A doxorrubicina (0.3μg/mL) foi utilizada como
controle positivo. Valores ± desvio padrão (DP). *p<0,001.
85
86
.
.
0.5 1.1 2.2 4.4 8.8 DMSO Dox
0
20
40
60
80
100
0
1
2
3
4
SJC-8
% de dano
Figura 10: Porcentagem dos tipos de danos causados em células da
linhagem tumoral HL-60 (leucemia humana), obtidos através do teste do
cometa após 24 horas de tratamento com a SJC-8 nas concentrações 0.5, 1.1,
2.2, 4.4 e 8.8μg/mL. A doxorrubicina (0.3μg/mL) foi utilizada como controle
positivo.
86
87
4.4. Teste de relaxamento do DNA
A síntese de DNA pode ser alterada por diversos processos como, por
exemplo, alteração na topologia do DNA. A SJC-8 foi capaz de inibir a enzima
a enzima Topoisomerase 1 apenas na concentração de 20µg/mL (44µM)
(Figura 11).
EDCBA EDCBA
Figura 11. Efeito da SJC-8 nas concentrações de 20 e 10 µg/mL (C e D)
sobre o relaxamento do DNA pela inibição da atividade da enzima
Topoisomerase 1. Branco (A) DNA-SC e DMSO. O controle negativo (B) foi
tratado com o veículo usado para diluir a droga (DMSO), DNA-SC e enzima.
Campotecina 0.1mM (E) foi usada como controle positivo. Amostras
submetidas a eletroforese (80v) em gel de agarose 1%.
87
88
4.5. Estudo da atividade antitumoral in vivo
4.5.1. Avaliação do efeito da SJC- 8 em camundongos transplantados com
Sarcoma 180
A atividade antitumoral
in vivo da SJC-8 foi determinada utilizando o
modelo experimental do Sarcoma 180. Foi observado que a SJC-8 reduziu de
forma significativa o crescimento tumoral apenas na dose de 50 mg/kg. 24
horas após a ultima dose os animais foram sacrificados e os tumores foram
dessecados e pesados. A figura 12 apresenta valores da massa úmida dos
tumores dos animais tratados e não-tratados. A massa úmida dos tumores dos
animais controle (DMSO 2%) foi de 1.68 ± 0.14g, enquanto que os animais
tratados com SJC-8 foram de 1.45 ± 0.10g e 0.66 ± 0.26g para as doses de 25
e 50mg/kg/dia respectivamente (p < 0,05). Já os animais tratados com 5-
Fluorouracil (25mg/kg/dia) apresentaram valores de 0.42 ± 0.06g (p < 0,05). Os
percentuais para inibição do crescimento tumoral foram de 12.30% e 59.80%
nas doses de 25 e 50mg/Kg/dia (p < 0,05 para a última dose). Nos animais
tratados com 5-fluorouracil (25mg/Kg/dia), a inibição tumoral foi de 74.07% (p <
0,05) (Tabela 9).
88
89
C 5-FU 25 50
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
a
a
(mg/Kg)
_____________
SJC-8
Tumor (g)
Figura 12 – Efeito da SJC-8 (25 e 50mg/Kg/dia) sobre a massa tumoral
de animais transplantados com Sarcoma 180. O controle negativo (C) foi
tratado com o veículo usado para diluir a droga (DMSO 2%). 5-Fluorouracil (5-
FU) (25mg/Kg/dia) foi usado como controle positivo. Os valores correspondem
a média ± E.P.M. de dez animais. a, p < 0,05 comparado com o grupo controle
por ANOVA seguido por Student Newman Keuls.
89
90
4.5.2. Analise morfológica e histopatológica
Após o tratamento com a SJC-8, os pesos dos rins, fígados e baços não
mostraram diferenças significantes em nenhuma das doses utilizadas (25 ou
50mg/Kg/dia) quando comparados com o grupo controle (p < 0,05). Já o
tratamento com 5-fluorouracil (25mg/Kg/dia) apresentou uma redução
significante nos pesos dos baços (p < 0,05) em relação ao grupo controle, não
havendo alteração dos pesos nos rins e fígado (Tabela 9).
As análises histopatológicas dos animais do grupo controle
apresentaram o rim com estrutura glomerular preservada e hemorragia
glomerular tubular. As análises histopatológicas dos rins dos animais tratados
com SJC-8 mostraram estrutura glomerular preservada com hemorragia
glomerular do epitélio tubular proximal, uma discreta tumefação turva e
presença de raríssimos cilindrohialino. (Figura 13A e B).
As análises histopatológicas dos fígados dos animais do grupo controle,
mostrou discreta tumefação turva dos hepatócitos e hiperplasia das células de
Kupffer, com presença de dilatação e congestão da veia centrolobular,
congestão portal e discreta hemorragia sinusoidal, enquanto que nos animais
tratados foi observada uma tumefação turva dos hepatócitos mais intensa nas
duas doses. (Figura 14A).
Diferente do que foi observado nos rins, a análise histopatológica da
toxicidade dos fígados dos animais tratados com SJC-8 apresentou-se de
maneira mais intensa. Não foi encontrada diferença nas análises dos baços
dos animais tratados com a SJC-8 em relação ao grupo controle. (Figura 15A e
C). Somente nos animais tratados com 5-FU (25mg/Kg/dia) foi observada
diminuição significante do peso úmido dos baços (p<0,05) e algumas
alterações histopatológicas. (Tabela 5).
As análises histopatológicas realizadas nos rins após tratamento com 5-
FU (25mg/Kg/dia) apresentaram discretas áreas de tumefação turva do epitélio
tubular, hemorragia glomerular e tubular e foco inflamatório justa-glomerular
com preservação da estrutura glomerular. (Figura 13B) Enquanto no fígado
90
91
foram observadas: congestão da veia portal e dilatação da veia centrolobular,
tumefação turva dos hepatócitos (indicando intenso trabalho do fígado para a
metabolização da droga), moderada hiperplasia das células de Kupffer, discreta
hiperplasia sinusoidal e moderada esteatose em microgotas. Estas alterações
indicam discreta hepatotoxicidade, porém de natureza reversível. (Figura 14B)
As análises histopatológicas realizadas nos baços no grupo controle
revelaram estrutura normal com visualização de folículos linfóides e
megacariócitos dispersos pela medular e cortical não diferindo assim dos baços
do grupo tratado com SJC-8. (Figura 15A e C) Após tratamento com 5-FU
(25mg/Kg/dia) e visualização de folículos linfóides bem circunscritos e raros
megacariócitos dispersos pela medular e cortical. (Figura 15B)
As análises histopatológicas dos tumores retirados de camundongos do
grupo controle negativo mostraram neoplasia constituída por células redondas
e poligonais, com núcleos hipercromáticos, exibindo por vezes binucleação,
anisocariose e graus variados de pleomorfismo celular e nuclear. (Figura 16A)
Foi visulalizado elevado nível mitótico, invasão muscular e áreas de necrose de
coagulação. Nos tumores dos animais tratados com 5-FU e SJC-8, as áreas de
necrose de coagulação eram mais extensas do que as observadas no grupo
controle, com baixo índice mitótico e presença de mitoses atípicas,
demonstrando morte celular (Figura 16B e C).
91
92
Droga
Dose
(mg/kg/dia)
Fígado
(g/100g de massa
corpórea)
Baço
(g/100g de massa
corpórea)
Rins
(g/100g de massa
corpórea)
Controle -
4.6 ± 0.23 0.74 ± 0.10 1.16 ± 0.04
25
4.88 ±0.12 0.62 ± 0,06 1.26 ± 0.07
SJC-8
50
5.09 ± 0.34 0.52 ± 0.04 1.47 ±.0.10
5-FU 25
4.47 ± 0.17 0.36 ± 0.10
a
1.19 ±0.07
Tabela 9 – Efeito da SJC-8 (25 ou 50mg/Kg/dia) e 5-Fluorouracil
(25mg/Kg/dia) sobre os pesos dos órgãos (fígado, rins e baço) dos
animais, transplantados com Sarcoma 180. Os valores correspondem à
média ± E.P.M. de dez animais.
a
, p < 0,05 comparado com o grupo
controle por ANOVA seguido por Student Newman Keuls.
92
93
Foco inflamatório
Tumefação turva
B
Hemorragia
glomerular e tubular
Tumefação turva
40X
C
Hemorragia
tubular
Cilindrohialin
o
Hemorragia
glomerular
400X
D
Glomérulo
preservado
Hemorragia glomerular e
tubular
A
40X 40X
Foco inflamatório
Tumefação turva
B
Foco inflamatório
Tumefação turva
B
Hemorragia
glomerular e tubular
Tumefação turva
40X
C
Hemorragia
tubular
Cilindrohialin
o
Hemorragia
glomerular
400X
D
Glomérulo
preservado
Hemorragia glomerular e
tubular
A
40X
Glomérulo
preservado
Hemorragia glomerular e
tubular
A
40X 40X
Figura 13 – Histopatologia dos rins de camundongos transplantados
com células tumorais de Sarcoma 180. O controle negativo (A) foi tratado com
o veículo usado para diluir a droga (DMSO 2%). 5-fluorouracil (5-FU)
25mg/Kg/dia (B) foi usado como controle positivo. Os animais foram tratados
com SJC-8, 25 (C) e 50 mg/Kg/dia (D).
93
94
Congestão da veia
centrolobular
Hepatócitos
40X
Célula de Kupffer
Congestão da veia
centrolobular
Hiperplasia das
células de Kupffer
Intensa tumefação
turva
40X
A
C
Hemorragia sinusoidal
Tumefação
celular
400X
Esteatose em
microgotas
40X
D
B
Congestão da veia
centrolobular
Hepatócitos
40X
Célula de Kupffer
Congestão da veia
centrolobular
Hiperplasia das
células de Kupffer
Intensa tumefação
turva
40X
Congestão da veia
centrolobular
Hiperplasia das
células de Kupffer
Intensa tumefação
turva
40X
A
C
Hemorragia sinusoidal
Tumefação
celular
400X
Esteatose em
microgotas
40X
Esteatose em
microgotas
40X
D
B
Figura 14 – Histopatologia do fígado de camundongos transplantados
com células tumorais de Sarcoma 180. O controle negativo (A) foi tratado com
o veículo usado para diluir a droga (DMSO 2%). 5-fluorouracil (5-FU)
25mg/Kg/dia (B) foi usado como controle positivo. Os animais foram tratados
com SJC-8, 25 (C) e 50 mg/Kg/dia (D).
94
95
4X
Folículos linfóides
circunscritos
Polpa branca
Polpa vermelha
10X
Folículos linfóides
4X
A
C
B
Arteríola central
Polpa branca
400X
D
4X
Folículos linfóides
circunscritos
4X
Folículos linfóides
circunscritos
Polpa branca
Polpa vermelha
10X
Folículos linfóides
4X
A
C
B
Arteríola central
Polpa branca
400X
D
Figura 15 – Histopatologia do baço de camundongos transplantados
com células tumorais de Sarcoma 180. O controle negativo (A) foi tratado com
o veículo usado para diluir a droga (DMSO 2%). 5-fluorouracil (5-FU)
25mg/Kg/dia (B) foi usado como controle positivo. Os animais foram tratados
com SJC-8, 25 (C) e 50mg/Kg/dia (D).
95
96
Mitose
40X
Invasão muscular
40X
Mitoses atípicas
40X
BA
C
Necrose
Células tumorais
400X
D
Mitose
40X
Mitose
40X
Invasão muscular
40X
Invasão muscular
40X
Mitoses atípicas
40X
Mitoses atípicas
40X
BA
C
Necrose
Células tumorais
400X
Necrose
Células tumorais
400X
D
Figura 16 – Histopatologia do tumor de camundongos transplantados
com células tumorais de Sarcoma 180. O controle negativo (A) foi tratado com
o veículo usado para diluir a droga (DMSO 2%). 5-fluorouracil (5-FU)
25mg/Kg/dia (B) foi usado como controle positivo. Os animais foram tratados
com SJC-8, 25 (C) e 50mg/Kg/dia (D).
96
97
Discussão
97
98
5. DISCUSSÃO
A grande maioria das drogas convencionais, usadas no tratamento do
câncer são largamente derivadas de plantas superiores e embora o número de
plantas terrestres seja em torno de quatro milhões de espécies, menos de 10%
delas tem sido extraídas e avaliadas quanto a sua a atividade antitumoral
básica (PESSOA, 2000a).
Neste sentido, este trabalho objetivou estudar uma planta da família
Anacardiaceae, a qual é constituída por cerca de 76 gêneros. Seus gêneros
são subdivididos em cinco tribos (Anacardieae, Dobineae, Rhoeae,
Semecarpeae e Spondiadeae). Do ponto de vista químico, os gêneros mais
estudados nesta família são
Tapirira, Mangifera, Rhus (Toxicodendron),
Anacardium, Spondias, Lannea, Semecarpus, Schinus, Pistacia, Lithraea,
Melanorrhoea, Mangifera, Rhus e Anacardium. Essas se destacam pelo
número de investigações relativas à composição química de suas espécies e
atividades biológicas de seus extratos e metabólitos (CORREIA, 2006).
Sendo que do ponto de vista químico, as mais estudadas são Mangifera
indica, Anacardium occidentalle, nesta ultima foram realizados estudos para
avaliar a atividade citotóxica contra células de carcinoma de mama humano
(BT20) IC
50
< 20µg/mL (KUBO et al., 1993), além de algumas espécies de
Rhus, isso se deve provavelmente devido à importância econômica e a
toxicidade demonstrada por essas espécies. Extrato da castanha de caju
Semecarpus Anacardium L. (Anacardiaceae), apresentou efeito citotóxico, com
valores de IC
50
variando de 1,4 a 1,6µg/ml (HARTLEY, 1998). No entanto estes
estudos representam menos de 10% das espécies descritas para estes
gêneros. Onde, menos de menos de 7% das espécies conhecidas dessa
família tiveram estudos fitoquímicos e de atividade biológica realizados
(CORREIA, 2006).
Assim, a partir do estudo fitoquímico da
Tapirira guianensis foram
isolados sete derivados de lipídios fenólicos inéditos, os quais são
considerados não usuais na família Anacardiaceae, porém são identificados
98
99
nas espécies dos gêneros Tapirira e Lannea. Isso ocorre, devido ao
isolamento dos derivados alquilados da ciclohexanona (Figura 17) os quais são
precursores dos lipídios fenólicos (CORREIA, 2001). Portanto, nos poucos
estudos fitoquímicos pode-se constatar a presença de duas classes químicas
predominantes nessa família: os flavonóides, especialmente biflavonóides e os
lipídios fenólicos, encontrados em espécies que normalmente apresentam
propriedades tóxicas ou alergênicas.
OH
O
CH
3
OH
10'
17'
Figura 17: Estrutura química do derivado alquilado da ciclohexanona
isolado da
Tapirira guianensis.
Dessa maneira, a atividade antiproliferativa dos sete
hidrobenzofuranóides foi avaliada em modelo celular de linhagem tumoral
humana. Onde, dos sete compostos, dois não apresentaram atividade
citotóxica em nenhuma linhagem testada, os SJC-9 e SCJ-7 e essa ausência
de atividade provavelmente se deve ao fato de que as respectivas estruturas
químicas não apresentam o anel benzofurano, o qual está presente nos demais
fitocompostos, SJC-1, SJC-3, SJC-4, SJC-5 e SJC-8. Provavelmente a
presença desse anel induza uma moderada toxicidade nas demais amostras.
Os compostos SJC-1 e SJC-4 apresentaram atividade moderada em apenas
uma linhagem testada, HCT-8 e MDA/MB-435, respectivamente, essa atividade
se deve provavelmente a configuração cis das hidroxilas nos carbonos C5 e
C6, valendo ressaltar que a configuração trans das hidroxilas provavelmente
seja responsável pela diminuição da atividade citotóxica, como podemos
observar nos compostos SJC-3 e SJC-5. A SJC-8 apresentou uma elevada
99
100
citotoxicidade, quando comparada dentre os sete fitocompostos estudados,
uma vez que sua CI
50
variou entre 1.7- 5.2µg/mL.
O potencial citotóxico da SJC-8 possivelmente se deve pelo fato da
presença de uma dupla ligação, entre os carbonos 6 e 7, conjugada a uma
carbonila formando o sítio farmacofórico da molécula (complexo cetona α β
insaturado) e uma região eletrofílica no Carbono 7, que favorece adições de
Michael aumentando a afinidade da molécula, SJC-8, aos grupos amino do
DNA celular e levando a um efeito citotóxico mais elevado.
O potencial citotóxico da SJC-8 foi evidenciado em um painel adicional
de células, obtidos de tumores sólidos e de leucemia mielocítica crônica (K-
562). Onde, apenas na linhagem K-562 ela apresentou moderada atividade
citotóxica cuja CI
50
foi de 6.2µg/mL, enquanto nas demais linhagens a CI
50
variou entre 0.3- 2.7µg/mL. Essa resistência apresentada na linhagem K-562,
possivelmente se deve ao fato de que ela é resistente à apoptose induzida por
vários agentes anti-câncer incluindo etoposídeo e cisplatina. Esta apresenta o
cromossomo Ph, que confere resistência a vários agentes antileucêmicos.
(SLUPIANEK
et al., 2000; DI BACCO et al., 2000; LIU et al., 2002).
Como observado no screening, a SJC-8 apresentou os resultados mais
promissores como agente citotóxico, enquanto que os outros compostos foram
apenas fracamente ativos ou até mesmo inativos frente as linhagens testadas.
Assim, a SJC-8 foi estudada quanto ao seu mecanismo de ação em modelos
experimentais
in vitro e in vivo.
Um dos primeiros ensaios foi avaliação do seu potencial em induzir lise
em hemácias de camundongos. Neste ensaio, a mesma não apresentou efeito
hemolítico nas concentrações testadas. Sugerindo, que o mecanismo de
citotoxicidade desta amostra não está relacionado a danos nas membranas
celulares, mais provavelmente esteja atuando por caminhos mais específicos,
talvez por seletividade a linhagens de células tumorais. Essa análise é peculiar,
pois determinadas drogas podem alterar significativamente a estrutura delicada
da membrana dos eritrócitos (NG
et al., 1986; BADER et al., 1996; GRINBERG
et al., 1997; ZHANG et al., 1997).
100
101
Posteriormente, foi realizado o ensaio da letalidade de organismos
simples, como o microcrustáceo marinho
Artemia sp., o qual permite a
avaliação da toxicidade geral e é considerado um bioensaio preliminar no
estudo de extratos e metabólitos secundários com potencial atividade biológica
(MEYER
et al., 1982). Este ensaio, apesar de não selecionar compostos com
atividade antitumoral, tem mostrado uma boa correlação com a existência de
substâncias que possuem esse tipo de toxicidade e tem sido amplamente
utilizado para
screening com essa finalidade (MUNRO et al., 1987). Entretanto,
no estudo com SJC-8 essa correlação não pode ser verificada, uma vez que a
SJC-8 não apresentou toxicidade nas larvas da Artemia, o que não
inviabilizada o seu potencial citotóxico e antitumoral.
Em seguida, foi realizada a construção da curva de crescimento celular a
qual fornece informações importantes sobre a cinética da cultura de células em
questão. A observação, em curtos intervalos, dessas culturas tratadas permite
avaliar a ação citotóxica temporal da substância, assim como o
acompanhamento das alterações morfológicas das células a medida que vão
acontecendo. Assim, foi avaliado o efeito da SJC-8 durantes vários intervalos
de tempo em células leucêmicas (HL-60) nas diferentes concentrações,
baseadas no valor da IC
50
de 24 horas. Foi observado que a SJC-8 apenas foi
capaz de afetar a viabilidade celular depois de um período de exposição de 24
horas, sugerindo que a atividade citotóxica da SJC-8 pode ser devida a alguma
interferência com uma fase específica do ciclo celular, necessitando um maior
tempo de exposição da substância com as células, independente da
concentração.
A SJC-8 apresentou um efeito citostático e citotóxico dependente da
concentração. Nas duas maiores concentrações, a SJC-8 causou uma redução
do número de células viáveis associada com um aumento do número de
células não-viáveis, o que seria um efeito citotóxico. Entretanto, nas menores
concentrações não houve um aumento do número de células não-viáveis, mas
apenas uma redução da proliferação celular, o que corresponde a uma ação
citostática. Isto sugere a participação da SJC-8 em mais de uma via patológica,
na qual dependendo da intensidade do dano e do tempo de exposição esta
pode apresentar-se como uma droga citotóxica ou citostática. Isto confirma que
101
102
a indução da morte celular e o efeito citostático causada pela SJC-8 são devido
a alterações em alguma fase específica do ciclo celular (KIRSCH-VOLDERS
et
al., 1997; FENECH, 2000), o que corrobora com sua ação mais seletiva em
tumores sólidos.
Modelos celulares são ferramentas úteis e necessárias para estudar o
potencial citotóxico de um composto, traduzido, inicialmente, pela sua
capacidade de induzir a morte celular, e a linhagem HL-60 (leucemia
promielocítica) é um dos modelos celulares de origem mielóide mais
amplamente utilizados (GRZANKA
et al., 2003; DELGADO et al., 2005), sendo
a mesma escolhida para o estudo do possível mecanismo de ação citotóxico da
SJC-8.
Os modelos propostos para estudar a citotoxicidade da SJC-8 em
células HL-60 após 24h foram: análise da viabilidade celular por exclusão de
azul de tripan, inibição da síntese de DNA por incorporação do BrdU, análise
morfológica por coloração diferencial por hematoxilina/eosina, brometo de
etídio/acridina laranja e análise da inibição da enzima Topoisomerase 1. Além
disso, foi realizado o teste do cometa para avaliar o comportamento genotóxico
da SJC-8 nesta linhagem.
A exclusão por azul de tripan é um ensaio de viabilidade celular em que
a absorção deste corante é um forte indicativo de dano na membrana
plasmática que culmina na morte celular e fornece uma resposta sobre a
viabilidade através da comparação do padrão de crescimento das células
tratadas e não-tratadas pela contagem diferencial de células viáveis e não-
viáveis (HYNES
et al., 2003). Neste ensaio, a SJC-8 nas menores
concentrações, 1μg/mL (2.2μM) e 2μg/Ml (4.4μM), não diminuíram o número de
células viáveis, nem aumentou o número de células não-viáveis. Apenas na
maior concentração, 4μg/ml (8,8μM) foi observada de forma significativa a
diminuição de células viáveis concomitante com o aumento de não-viáveis,
esses dados confirmam com os encontrados na curva de crescimento celular,
indicando que possivelmente seu efeito consista no possível bloqueio da
divisão celular.
102
103
Para avaliar se a inibição de proliferação celular observada tanto na
curva de crescimento quanto no teste de exclusão por azul de tripan era devido
ao bloqueio da divisão celular, foi realizada a análise da síntese de proteína
e/ou DNA, onde a SJC-8 foi testada quanto a sua capacidade de inibir a
síntese de DNA através da detecção da incorporação de BrdU (DOLBEARE
et
al., 1983). Nesse ensaio, a SJC-8 diminuiu a síntese de DNA em todas as
concentrações testadas, sendo o efeito mais pronunciado na maior
concentração, 4μg/ml (8,8μM), resultando em menor número de divisões
celulares, o que complementa os resultados do ensaio do MTT, a curva de
crescimento celular e a exclusão por azul de tripan. Provavelmente, a SJC-8
estaria interferindo na fase S, de síntese, do ciclo celular impedindo a
fabricação de novo material genético, mecanismo de ação este observado em
vários agentes antineoplásicos que são condiderados ciclo celular específicos
(CCS). Um exemplo é o do agente antimetabólico 5-fluorouracil que exerce
seus efeitos bloqueando bioquimicamente a síntese do DNA e, portanto, sendo
restritos à fase S do ciclo celular. (ALMEIDA
et al, 2005)
Nas análises das alterações dos processos celulares são observados os
fatores de sinalização molecular. Este fenômeno é verificado de maneira bem
similar em muitos compostos testados como drogas com potencial anti-câncer
(CZYZ,
et al., 2005). Dependendo da concentração usada, vários processos
celulares diferentes podem ser influenciados. Assim, tentando encontrar o
mecanismo responsável pelo efeito citotóxico do composto testado nós
acessamos as mudanças na morfologia celular, no processo de indução de
apoptose e/ou necrose celular, usando as concentrações correspondentes a
IC
50
/2, IC
50
e IC
50
x 2, no período de 24 horas.
As colorações por H/E e brometo de etídio e acridina laranja (BE/AL)
permitem analisar as características morfológicas das células, estas são úteis
para sugerir o tipo de morte celular, seja por necrose ou apoptose. A morte
celular é um fenômeno essencial para manter a homeostase e sua ocorrência
tem sido documentada durante o desenvolvimento embrionário e pós-
embrionário. Esta não é apenas importante para o desenvolvimento normal,
mas também para a vida adulta de muitos organismos vivos (GERCHENSON &
ROTELLO, 1992). Apoptose e necrose são dois distintos modos de morte
103
104
celular que diferem na forma em que os compostos citotóxicos podem afetar
tanto a morfologia quanto o mecanismo da proliferação celular normal (SAVILL,
1994).
Diferente da apoptose, a necrose normalmente ocorre em consequência
de uma lesão celular. Entretanto, pesquisas recentes têm revelado que o início
do processo necrótico possa depender da concentração do composto usado e
da duração do tratamento, considerando que a indução de necrose é uma
resposta tardia relativa ao acontecimento da apoptose. Assim, eventos
intracelulares que levam a apoptose e necrose podem ocorrer
sequencialmente, onde numa primeira fase uma dose relativamente baixa do
composto testado causa um colapso no potencial de membrana mitocondrial e
inibidores da caspase podem prevenir a morte celular; e durante uma segunda
fase, usando uma dose maior, ocorre rompimento da membrana plasmática,
levando ao processo necrótico (ROY, 2006).
Na análise morfológica, por coloração com H/E, das células tratadas
com SJC-8, por 24 horas, na menor concentração, 1µg/mL (2.2μM), as
alterações morfológicas incluíram poucas vacuolizações do citoplasma
mantendo os núcleos volumosos e ocasionais figuras mitóticas. Entretanto, na
concentração de 2,0µg/mL (4.4μM) a presença da condensação da cromatina e
fragmentação do DNA irregular foram observadas, revelando uma aparência de
sinais morfológicos de apoptose (HU
et al., 2003). Estes sinais podem ser
decorrentes da presença do complexo cetona αβ instaurada presente na
molécula da SJC-8, grupamento este encontrado em outros análogos da
ciclohexanona, onde em trabalhos de relação estrutura atividade, se
comprovou que a atividade citotóxica e indução de apoptose está relacionada
com a presença deste grupamento químico (DIMMOCK
et al., 2000). Na
concentração de 4μg/mL (8.8μM), houve diminuição do volume celular e perda
da integridade da membrana, sendo estas, características que indicam
ocorrência do processo necrótico (DEZOIZE, 1992). Estes dados reforçam os
resultados revelados pela coloração de brometo de etídio e acridina laranja
(BE/AL), onde nas menores concentrações foram vistas características de
apoptose e na maior concentração figuras necróticas constantes
acompanhadas de desestabilização da membrana plasmática, sendo esta
104
105
última uma marca predominante do processo necrótico. De forma resumida, a
ocorrência de fragmentação do DNA e alterações nucleares em concomitância
com a manutenção da integridade de membrana são características de
apoptose, enquanto que a desestabilização da membrana é característica
marcante de necrose (KUMMAR
et al., 2004; DARTSCH, 2002; COHEN, 1993).
A indução do processo de apoptose, promove a morte celular de forma
altamente regulada que elimina células ou tecidos indesejados protegendo o
organismo contra a formação de neoplasia ou levando a uma redução do
volume tumoral (MAJNO & JORIS, 1995). Desse modo, a indução de apoptose
em células tumorais é vista como um grande benefício na quimioterapia do
câncer (LOS,
et al., 2003). Mas não podemos esquecer que, por outro lado a
necrose ativa a cascata do processo inflamatório e mobiliza o sistema imune
auxiliando o ataque ao tumor. Esta ação pode vir a desencadear um efeito mais
profundo e longo do que a apoptose.
Desta maneira, a morte celular programada é vista como um importante
mecanismo para manutenção da homeostase celular e pode ser
morfologicamente diferenciado do processo necrótico (KERR, 1972).
Entretanto, o impacto gerado pela morte celular programada na quimioterapia
deixa algumas dúvidas, pois esta via pode não ser a única a ativar de forma
efetiva a morte celular no tumor. Kiaris e Schally têm sugerido que, por várias
razões, quando comparada com a morte celular programada, a indução de
necrose pode ser preferível na quimioterapia do câncer. Além disso, há uma
evidência de que durante a eliminação da malignidade por agentes anti-câncer
em geral, existe morte de células normais podendo ocorrer também por
necrose (BLAGOSKLONNY, 2000; GONZALEZ, 2001).
Vários medicamentos com atividade anti-câncer são inibidores da
Topoisomerase (GRYNBERG, 2002). A superhelicoidização do DNA é um
processo precisamente regulado que influencia a replicação, transcrição e
empacotamento de DNA. As Topoisomerases são enzimas que modulam o
estado topológico do DNA. Como já mencionado, existem duas classes de
topoisomerases: Tipo 1 que age apenas em umas das fitas duplas de DNA e o
Tipo 2 que age em ambas fitas e é dependente de ATP (WANG, 1996). O
105
106
interesse nessas enzimas tem crescido nos últimos anos, pois elas são alvos
de muitas drogas efetivas no tratamento do câncer, especialmente as oriundas
de produtos naturais. Interessantemente, flavonóides de ocorrência em plantas
verdes possuem atividade inibitória em uma variedade de enzimas, incluindo
topoisomerases (MIDDLETON & KANDASWAMI, 1993).
O efeito inibitório da SJC-8 na Topoisomerase 1 foi testado pelo
relaxamento do plasmídeo de DNA superhelicoidizado. A SJC-8 foi capaz de
inibir a ação da Topoisomerase 1, na concentração de 20µg/mL, dado que
reforça os resultados obtidos no do teste de inibição de BrdU (síntese de DNA).
Uma vez que, a síntese de DNA pode ser alterada por diversos processos
como topologia e organização intracelular de DNA, as Topoisomerases (I e II)
desenvolvem uma função celular crítica, alterando a topologia do DNA, sendo
uma das suas maiores funções impedir o superespiralamento excessivo do
DNA intracelular, embora esta enzima possa estar envolvida também em
processos proliferativos como replicação e transcrição de DNA, condensação e
segregação de cromossomos, podendo a mesma ser alvo para a ação de uma
larga variedade de drogas com ação anti-câncer (WANG, 1996).
Neste contexto, um agente com potencial genotóxico pode interagir com
a molécula de DNA e provocar danos em regiões de genes com fundamental
importância no controle do ciclo de divisão celular (CANALLE
et al., 2001). Fato
esse observado com a SJC-8, em que a partir da menor concentração,
0.5μg/mL (1.1μM), causou índice de dano superior a 77,00 ± 6.55 e freqüência
de dano superior a 60% na linhagem tumoral de leucemia promielocítica (HL-
60). Em todas as concentrações, foi observada diferença significante (p<0,001)
das freqüências (12.33 ± 3.21) e índices de dano (13.33 ± 4.93), quando
comparadas com o controle negativo (DMSO 0,5%).
O teste do cometa é usado para detectar dano ao DNA, bem como a
fragmentação do DNA no curso do processo apoptótico, a qual pode constituir
um dado para a correta interpretação do teste do cometa, como indicador de
genotoxicidade. Assim, cometas com perda total ou parcial de cabeça (dano
tipo 4), considerados como “células fantasmas”, são geralmente interpretados
como imagens microscópicas de células apoptóticas ou necróticas. (BRINK
et
106
107
al, 2006) Nas concentrações de 1.1µg/mL (2.4µM) e 2.2µg/mL (4.8µM) a
presença de danos do tipo 1, 2 e 3 foi observada, mas a partir da concentração
de 4.4µg/mL (9.6µM) já foi observada presença, também, de dano tipo 4,
sugerindo dose dependência na agressividade dos tipos de dano. Assim,
comparando esses dados com os resultados das análises morfológicas pelas
colorações de hematoxilina/eosina e acridina/laranja, foi observado que na
dose de 2.0µg/mL (4.4µM) e na maior dose de 4.0µg/mL (8.8µM) ocorreram
eventos apoptóticos e necróticos, respectivamente.
Apesar disso, a correlação desses dados nem sempre indicam que o
aumento da fragmentação de DNA é uma marca constante da presença de
processo apoptótico, visto que estágios muito iniciais de apoptose podem gerar
resultados falso-positivos no teste do cometa. (HARTMANN
et al, 2003)
Foi identificado que a genotoxicidade da SJC-8, em relação ao índice de
dano nas duas maiores concentrações e a frequência de dano, com exceção
da menor concentração (0.5μg/mL), apresentou um perfil genotóxico
semelhante à doxorrubicina (0.3μg/mL), que é um antineoplásico estabelecido
usado no tratamento de leucemias agudas. Isso é de se esperar de todos os
compostos que têm potencial atividade anti-câncer, já que as suas ações
interferem de algum modo na estabilidade do DNA. A doxorrubicina liga-se ao
DNA e inibindo a síntese de DNA e RNA, em decorrência de sua principal ação
na interferência na ação da Topoisomerase 1 (TEWEY
et al, 1984). Esse perfil
de ação foi o caracterizado de maneira semelhante com a SJC-8, uma vez que
a mesma causou alterações na estrutura do DNA, inibindo a Topoisomerase 1.
A evolução da oncologia experimental tem permitido a identificação de
parâmetros que vêm sendo utilizados na descoberta de diversos compostos
úteis no tratamento clínico das neoplasias (CARTER, 1980). Acredita-se que a
quimioterapia do câncer, em animais e no homem, tem como objetivo reduzir o
número de células tumorais viáveis, abaixo do qual, as células que sobrevivam
ao tratamento á droga não sejam capazes de restabelecer a doença. Dessa
maneira, os critérios estabelecidos das condições experimentais são
primordiais. Assim, a seleção de tumores deverá ser baseada em alguns
fatores como: diferentes índices cinéticos (
pool proliferativo), diferentes
107
108
susceptibilidades a compostos antitumorais conhecidos, ser universalmente
usado e fazer comparações com resultados obtidos por outros investigadores,
ser preferencialmente realizado em camundongos para reduzir a quantidade
necessária do composto a ser testado, entre outras (PESSOA, 2000b).
Fundamentado no uso de tumores experimentais para a identificação de
produtos naturais originais de plantas com potencial antitumoral, a atividade
antitumoral da SJC-8 foi avaliada em modelo experimental usando
camundongos transplantados com Sarcoma 180. O 5-fluorouracil, um agente
anti-câncer de amplo espectro, vastamente utilizado na clínica para o
tratamento de tumores sólidos, foi usado como controle positivo na dose de
25mg/kg.
Sarcoma 180 é um tumor original de camundongo e uma das linhagens
celulares mais freqüentemente usadas na pesquisa de atividade antitumoral
in
vivo (LEE et al., 2003). Apenas na maior dose, (50mg/Kg) a SJC-8 apresentou
atividade antitumoral apreciável, com um percentual de inibição de crescimento
tumoral correspondente a 59.80%, neste modelo. Este foi o primeiro trabalho a
relatar a atividade antitumoral
in vivo e in vitro de um hidrobenzofuranóide
isolados das folhas de
Tapirira guianensis.
Quanto à análise do tecido tumoral, os animais do grupo controle
negativo apresentaram áreas de necrose de coagulação, sendo, provavelmente
devido à hipóxia tecidual causada durante o processo cirúrgico de retirada dos
tumores. (KUMMAR
et. al., 2004). Nos grupos tratados com a SJC-8 essas
áreas devem-se provavelmente a atividade antitumoral. Nenhumas das duas
doses usadas causaram alterações renais, sendo as alterações epiteliais
observadas nos rins consideradas reversíveis, não indicando quadro de
nefrotoxicidade. Nos outros órgãos analisados, não foi observado aumento ou
diminuição da massa úmida significante com nenhuma das doses testadas,
diferentemente do que foi visto nos animais tratados com 5-fluorouracil, onde
houve diminuição da massa dos baços nos animais tratados. Alguns autores
indicam a perda de massa deste órgão como um dado sugestivo de efeito
imunosupressor (DOGRA
et al, 2004).
108
109
As análises histopatológicas dos órgãos removidos de animais tratados
com a SJC-8 sugerem que o fígado pode ser considerado como alvo potencial
de toxicidade. Isso condiz com muitos achados de drogas com atividade
antitumoral
in vivo, onde ocasionalmente e amplamente suas ações
farmacológicas dão origem às lesões importantes
in vivo no fígado (SCHEUER
& LEFKOWITCH, 2000).
De qualquer modo, regeneração do tecido hepático ocorre em muitas
doenças, exceto quando ocorre um grande dano. Até quando a necrose
hepatocelular está presente, mas o tecido conjuntivo está preservado, a
regeneração é quase completa. As alterações hepáticas observadas nos
animais tratados com SJC-8 podem ser consideradas reversíveis (MCGEE
et
al., 1992; SCHEUER & LEFKOWITCH, 2000; KUMMAR, 2004).
Tendo em vista que, nos animais do grupo controle também foi
visualizada uma discreta tumefação turva dos hepatócitos e áreas de
congestão portal e da veia centrolobular, é sugerido que estes efeitos estão
relacionados ao metabolismo dos hepatócitos. Além disso, os animais tratados
com 5-FU também apresentaram hiperplasia das células de Kupffer, o que
sugere a toxicidade da droga, diferindo apenas na presença de esteatose em
microgotas neste grupo (KUMMAR
et al., 2004).
Os dados
in vivo aqui apresentados reforçam o potencial antitumoral in
vitro
deste hodrobenzofuranóide, sugerindo que ele apresenta potencial
atividade antitumoral
in vivo. A possível via para esta ação seria de maneira
direta na célula, por induzir genotoxicidade, inibindo a síntese de DNA da célula
tumoral, através da inibição de enzimas envolvidas no processo proliferativo,
possivelmente a Topoisomerase 1, o que levaria a morte celular por a apoptose
e de uma maneira mais tardia, dependendo da dose, indução de morte por
necrose.
Além destes fatores, temos em vista que, a toxicidade da droga testada
in vivo, foi baixa, comparando com a do controle positivo, sendo as alterações
histopatológicas observadas consideradas reversíveis. Aliado a isto, foi
observada também uma redução do volume tumoral na maior dose testada.
Estudos mais detalhados são necessários para elucidar o mecanismo de ação
109
110
da SJC-8, bem como produzir novos derivados químicos para avaliar a relação
estrutura-atividade que justifique de forma mais detalhada o poder citotóxico da
mesma, frente aos outros hidrobenzofuranóides e até mesmo outros análogos
derivados da ciclohexanona.
110
111
Conclusão
111
112
6. CONCLUSÃO
Dos sete hidrobenzofuranóides isolados das Folhas de
Tapirira
guianensis, apenas o fitocomposto, 3a,7a-Di-hidroxi-2-[(8'Z)-heineicosan-8'-
enil]-2,3,3a,7a-tetra-hidro-1-benzofuran-5(4H)-ona (SCJ-8), apresentou
potencial antitumoral
in vivo, reduzindo o crescimento do tumor da linhagem
Sarcoma 180 e inibindo o crescimento celular nas linhagens tumorais humanas
in vitro, não tendo mostrado atividade hemolítica. Essa ação foi devida a sua
capacidade de inibir a síntese de DNA, possivelmente por ação inibitória na
enzima Topoisomerase 1, levando a apoptose e necrose celular.
112
113
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