Universidade Federal do Rio Grande do Sul

Instituto de Ciências Básicas da Saúde

Departamento de Bioquímica

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Bioquímica

AÇÃO DA ADENOSINA EXTRACELULAR SOBRE UMA LINHAGEM DE CÉLULA

ESTRELADA HEPÁTICA TRATADA COM TNF-α:

PAPEL DO RECEPTOR A

2B

Livros Grátis

Universidade Federal do Rio Grande do Sul

Instituto de Ciências Básicas da Saúde

Departamento de Bioquímica

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Bioquímica

ESTRELADA HEPÁTICA TRATADA COM TNF-α:

PAPEL DO RECEPTOR A

2B

Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências Biológicas: Bioquímica, da

Universidade Federal do Rio Grande do Sul, como requisito parcial da obtenção do grau de

Mestre em Bioquímica

DEDICATÓRIA

Agradeço a Deus, que sabe de todas as dificuldades pelas quais passei

Agradeço ao Departamento de Bioquímica, por todos os recursos que nos disponibilizam, que me

permitiram fazer boa parte desse trabalho

Agradeço ao pessoal da secretaria, da segurança e da limpeza também

Agradeço a todos os amigos que passaram pelo Lab. 23, desde minha época de IC, até agora.

Obrigada pelos momentos de descontração e risadas

Obrigado ao professor Rogério e à professora Fátima pelas discussões e pela disponibilidade em

ouvir

Agradeço às conversas de fluxo, aos problemas enfrentados nos fins de tarde de sexta-feira ou na

época de férias letivas

Agradeço, de um modo geral, a todos aqueles que conheci na Bioquímica e que me ajudaram, de

seguro. Obrigada por me dizer o que eu preciso ouvir, que não é, necessariamente, o que eu quero

ouvir. “A rosa pelo amor e a branca pela amizade e o carinho”

Obrigada à minha família: minha mãe, Laura, meu pai, Luiz e meu irmão, Lucas. Obrigada pelo

apoio incondicional, pelas conversas de madrugada, pelas caronas, pelas risadas, pelas alvoradas,

pelas brigas e conselhos. Por quererem meu bem e estarem sempre comigo.

ÍNDICE

RESUMO ......................................................................................................................... 1

ABSTRACT ..................................................................................................................... 2

LISTA DE ABREVIATURAS......................................................................................... 3

PARTE I........................................................................................................................... 4

1. INTRODUÇÃO............................................................................................................ 5

1.1. FIBROSE HEPÁTICA.......................................................................................... 5

1.1.1. A IMPORTÂNCIA DA CÉLULA ESTRELADA HEPÁTICA NA

FIBROSE E O MODELO EXPERIMENTAL GRX............................................... 7

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS.............................................................................. 18

PARTE II........................................................................................................................ 20

CAPÍTULO I.............................................................................................................. 21

CAPÍTULO II............................................................................................................. 28

CAPÍTULO IIa....................................................................................................... 29

CAPÍTULO IIb....................................................................................................... 55

CAPÍTULO IIc....................................................................................................... 63

CAPÍTULO IId....................................................................................................... 69

PARTE III ...................................................................................................................... 77

4. CONCLUSÕES.......................................................................................................... 93

5. PERSPECTIVAS ....................................................................................................... 94

6. REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 95

7. LISTA DE FIGURAS .............................................................................................. 109

8. LISTA DE TABELAS ............................................................................................. 111

RESUMO

Fibrose hepática é caracterizada pelo acúmulo de matriz extracelular fibrótica,

antiinflamatórias em diferentes tipos celulares e condições patológicas. TNF-α é uma

citocina pró-inflamatória com importantes funções no início e perpetuação do processo

fibrogênico. Tendo em vista o papel antiinflamatório da adenosina, este trabalho

investigou, em linhagem de HSC em cultura - GRX -, as ações desse nucleosídeo em

presença ou ausência dos sinais inflamatórios que acompanham o tratamento com TNF-

α. Assim, foram analisados os efeitos da adenosina extracelular na síntese lipídica,

avaliando a reversão fenotípica da GRX, e a apoptose em resposta à adenosina e/ou

TNF-α. Além disso, a regulação dos níveis de adenosina extracelular, bem como a

presença dos receptores de adenosina foram investigadas. O efeito de adenosina e/ou

TNF-α sobre a produção de óxido nítrico (NO) e atividade e expressão de gelatinases

extracelular, principalmente colágeno do tipo I, que contribui para a formação da

cicatriz fibrótica característica dessa condição patológica, que delimita o dano hepático,

mas também contribui para perda de área hepática funcional.

A importância da HSC não se limita apenas à progressão e iniciação da fibrose.

Conforme mencionado anteriormente, muitos trabalhos têm estudado a possibilidade de

quem substituiria as HSC nas funções desempenhadas pelas mesmas? A alternativa para

esse problema seria a reversão da estrelada hepática ao fenótipo lipocítico.

Devido à importância da HSC na fibrose hepática, muito modelos celulares já

foram estabelecidos e utilizados na literatura para estudar a fisiologia da estrelada

hepática (Gutierrez-Ruiz and Gomez-Quiroz, 2007; Herrmann et al., 2007). A

e sendo ativada no sétimo dia (Rockey et al., 1992), expandiu ainda mais o

estabelecimento de modelos que não estivessem sujeitos a essas variações. Um dos

primeiros modelos celulares estabelecidos foram as células GRX. Isoladas de um

Borojevic et al., 1985), podendo ser induzido a expressar o fenótipo lipocítico, mediante

tratamento com retinol ou indometacina (Margis and Borojevic, 1989). Além disso,

células GRX também podem expressar um fenótipo mais ativado, em resposta ao

tratamento com TNF-α, tornando-se um importante modelo que mimetiza alguns

aspectos da fisiologia da HSC in vivo.

O óxido nítrico (NO) é uma molécula rapidamente difusível, produzida a partir

de enzimas conhecidas como óxido nítrico sintases (NOS) que utilizam arginina como

substrato. Na literatura, essas enzimas estão divididas em dois grandes grupos: induzível

4

sugerindo ao óxido nítrico um papel regulador na hepatoxicidade produzida por esse

modelo (Chamulitrat et al., 1995; Leung et al., 2008). Posteriormente, alguns autores

demonstraram que NO, produzido principalmente por cNOS, participa na regulação da

hipertensão portal, freqüentemente associada a doenças hepáticas crônicas, através de

suas propriedades vasoativas que se opõem aos efeitos de endotelina-1 (Gonzalez-

Abraldes et al., 2002; Leung et al., 2008). Em modelos de doença hepática induzida pela

prejudica a recuperação hepática do dano causado pela administração de tioacetamida

em ratos, atribuindo um papel claramente pró-fibrótico aos inibidores de iNOS

(Lukivskaya et al., 2008).

Conforme mencionado anteriormente, os fatores que gerenciam os efeitos do NO

são muitos. A capacidade de combinação com ânions superóxido, produzindo a espécie

-

LPS e submetidos à isquemia de reperfusão (Ma et al., 1995). A deficiência produzida

na iNOS, em camundongos, pode reduzir a fibrose hepática, aumentando a expressão de

MMP-2 e MMP-9, atribuindo um papel deletério a essa enzima (Aram et al., 2008). Por

4,

em relação aos níveis de colágeno, bilirrubinas e transaminases aumentados. Apesar

disso, nos camundongos nocaute os níveis de peroxidação lipídica foram maiores,

entretanto os autores postulam que iNOS não participa da fibrose induzida por CCl

4

(Moreno and Muriel, 2006). Como pode ser observado nesses e em outros estudos, os

efeitos de NO, na fibrose hepática, ainda estão por ser elucidados.

Apesar da difusão do óxido nítrico a razoáveis distâncias, a evidência da sua

produção por parte das HSC proporcionou grande importância para a sinalização

autócrina e parácrina dessas células. Em células estreladas em cultura, foi evidenciada a

isoladas de fígado humano normal, expressam canais de K

+

modulam os efeitos do óxido nítrico (Gasull et al., 2001); além disso, a presença de

mRNA para iNOS já foi reportada, mostrando que citocinas, em conjunto com

endotoxinas, aumentam sua expressão (Casini et al., 1997). Nas HSC, os efeitos do

óxido nítrico são bastante variados. Em células estreladas quiescentes, isoladas de ratos,

o óxido nítrico funciona como um scavenger de ânions superóxido, diminuindo a

proliferação celular resultante do tratamento com doadores de ROS tanto em HSC

cultivadas por até três dias, quanto em estreladas hepáticas isoladas de fígado fibrótico

independente dessas células, através do tratamento com doadores de NO e da

superexpressão de eNOS (Langer et al., 2008). Recentemente, foi demonstrado que

células hepáticas sinusoidais diferenciadas previnem a ativação de HSC e promovem a

reversão fenotípica dessas células, através da produção de NO estimulada por VEGF

(fator de crescimento do endotélio vascular) (Deleve et al., 2008).

Inúmeros trabalhos já evidenciaram que a reestruturação da matriz extracelular

desencadeia sinais que colaboram com o início da fibrose hepática (Chan et al., 2006;

Iimuro and Brenner, 2008), logo, a regulação e execução desses sinais são de

ativação depende da clivagem do pró-domínio N-terminal, que interage com sítio

catalítico dessas enzimas, suprimindo a atividade proteolítica (Parks et al., 2004; Yan

and Boyd, 2007). Na literatura, a classe de metaloproteinases denominada gelatinase

(MMP-9 e -2) tem particular importância na fibrose hepática. MMP-9 e -2 degradam

colágeno do tipo IV, presente em condições hepáticas fisiológicas, auxiliando no

intersticial desnaturado (gelatinas), resultado da ação inicial de outras metaloproteinases

e presentes em grande quantidade na fibrose, colaborando para a remoção de parte da

matriz extracelular existente no fígado fibrótico (Benyon and Arthur, 2001). Em

2 e baixas quantidades de MMP-9, cuja atividade diminui conforme os dias de ativação

da HSC (Knittel et al., 1999). Nas HSC cultivadas em matriz de colágeno do tipo I, a

produção de MMP-2 e sua ativação foram estimuladas (Li et al., 1999; Wang et al.,

2003). Além disso, em células estimuladas com composto herbal (Sho-saiko-to), que

previne a fibrose in vivo, a atividade de MMP-2 foi aumentada (Sakaida et al., 2004).

Alguns autores sugerem que MMP-2 medeia proliferação e invasão das HSC (Olaso et

al., 2001), mediante diferentes estímulos, como estresse oxidativo, entre eles (Galli et

al., 2005). Com relação à MMP-9, alguns trabalhos relatam seu envolvimento com a

cascata de ativação/transdiferenciação das HSC (Han et al., 2007), inclusive mostrando,

de MMP-9 (Zhou et al., 2004).

A regulação da atividade das metaloproteinases é bastante ampla (Chakraborti et

al., 2003; Fu et al., 2008). A respeito da MMP-2, ocorre principalmente através de um

processo mediado por metaloproteinase do tipo-membrana (MT1-MMP ou MMP-14) e

TIMP-2 (Sato et al., 1996; Strongin et al., 1995), diferentemente do processo de

multímeros, homo e heterogêneos, cuja combinação pode ter implicações diversas, é

bastante comum (Kjeldsen et al., 1993; Malla et al., 2008).

1.1.3. ADENOSINA EXTRACELULAR E TNF-α: PARTICIPAÇÃO NA

FIBROSE HEPÁTICA E A IMPORTÂNCIA DAS HSC

atividade de óxido nítrico sintase, com conseqüente aumento na produção de óxido

nítrico (Lu et al., 2007), e, em diversos tipos celulares, adenosina regula a síntese de

citocinas como TNF-α (Kreckler et al., 2006; Ryzhov et al., 2008).

Na fibrose hepática, a adenosina tem função hepatoprotetora amplamente

demonstrada. Em modelos animais com cirrose induzida através de administração de

CCl

, o tratamento com adenosina diminui os níveis de colágeno tipo I no fígado,

relacionado à preservação da função mitocondrial e à manutenção do potencial redox

das células hepáticas (Hernandez-Munoz et al., 1994; Hernandez-Munoz et al., 1997),

entre outros efeitos protetores (Chagoya de Sanchez et al., 1995; Odashima et al., 2005).

Os níveis extracelulares de adenosina podem ser regulados por transportadores

de nucleosídeos e por enzimas ligadas à membrana plasmática, como fosfatases ou

adenosina deaminase (ecto-ADA), que hidrolisa adenosina à inosina (Yegutkin, 2008).

Na HSC, a presença de NTPDases funcionais, cuja expressão varia de acordo com o

estado de ativação in vitro dessas células, já foi demonstrada (Dranoff et al., 2004). Em

Os efeitos da adenosina extracelular podem ser mediados através de quatro

tipos de receptores, A

e A

3

, cujos efeitos são mediados via proteína G

i

, e receptores do

tipo A

2A

e A

2B

, ligados à proteína G

s,

cAMP e proteína quinase A (PKA) (Fredholm et al., 2000; Klinger et al., 2002; Klotz,

2000). Além dos mecanismos relativos ao cAMP, é importante ressaltar que o receptor

A

, ativando rotas que envolvem inositol trifosfato (IP

al., 1999). Receptores para nucleotídeos purinérgicos do tipo P

identificados por Dranoff et al (2004) anteriormente, seguindo trabalhos anteriores que

sugeriam a presença dos mesmos na HSC em cultura, que respondia a ATP, ADP, UTP

são dependentes do estado de ativação das HSC (Dranoff et al., 2004). Apesar disso, só

recentemente os receptores para adenosina foram identificados na HSC em cultura. Em

modelos de célula estrelada hepática isolada de rato e humano, a ocupação de receptores

do tipo A

promoveu produção de colágeno e camundongos nocautes para esse

receptor apresentaram proteção contra fibrose estimulada por CCl

ou tioacetamida

“sinal de parada” para esse nucleosídeo (Hashmi et al., 2007). Apesar deste último

trabalho demonstrar a expressão dos outros tipos de receptores de adenosina, nenhum

trabalho, até o momento, questionou a função dos mesmos. Além disso, esses mesmos

diversos tipos celulares. No fígado, TNF-α é secretado pelas células de Kuppfer (Jing et

al., 2008; Tomita et al., 2006) e pelas HSC (Thirunavukkarasu et al., 2006), em resposta

a um insulto patológico. A produção exacerbada dessa citocina está relacionada ao

desenvolvimento de desordens hepáticas alcoólicas (McClain et al., 1998) e a

administração de anticorpos anti-TNFα a ratos alimentados com etanol atenua a necrose

e inflamação hepática resultante (Iimuro et al., 1997). TNF-α pode mediar seus efeitos

via superfamília de receptores que se dividem em dois grandes grupos, TNFR1 e

TNFR2, separados de acordo com sua associação a domínios de morte. TNFR1, Fas

(CD95 ou APO-1) e P75 possuem tais domínios, ao contrário de TNFR2 e CD40

(Knittel et al., 1997). Paradoxalmente, essa citocina é anti-fibrogênica, diminuindo a

expressão de pro-colágeno I em diversos modelos de HSC (Armendariz-Borunda et al.,

1992; Varela-Rey et al., 2002). Em células GRX em cultura, TNF-α está envolvido na

proliferação(da Silva et al., 2003) e na regulação dos níveis de lipoperoxidação e na

modulação da atividade da catalase (Guimaraes et al., 2006). As células estreladas

NF-кB, devido à falha na fosforilação da parte inibitória desse complexo, IкB

(Hellerbrand et al., 1998).

TNF-α também está envolvido na modulação da apoptose de HSC. Em HSC

deficiente (Qu et al., 2007) ou através de inibidores de Iкк (enzima que fosforila a parte

inibitória do NF-Кb, IкB) (Oakley et al., 2005) levam HSC à apoptose, sugerindo que

NF-кB mediaria a resistência das HSC à apoptose induzida por TNF-α. Taimr P et al

(2003), analisaram linhagens de HSC humanas, LX-2, e demonstraram que essas células

expressam o receptor para ligantes indutores de apoptose relacionada ao TNF (TRAIL)

e que esses ligantes induzem apoptose na LX-2 (Taimr et al., 2003). Esses dados,

juntamente com outros estudos, indicam que a família de receptores de TNF não está

envolvida somente com efeitos anti-apoptóticos.

2.1. OBJETIVO GERAL

Considerando os dados reportados pela literatura a respeito da participação da

adenosina e TNF-α no metabolismo das HSCs e suas implicações na iniciação,

manutenção, perpetuação e regressão da fibrose hepática, estudos a respeito dos

mecanismos de ação α do TNF-α e, principalmente, da adenosina sobre fatores

importantes da fibrose são de extrema importância. O foco principal em relação à

adenosina vem dos estudos mostrando resultados ainda não esclarecidos a respeito de

um papel benéfico ou deletério em relação à célula estrelada hepática. Sendo assim, o

envolvimento da adenosina extracelular, em presença ou ausência de TNF-α, na

modulação de alguns fatores importantes na fibrose hepática e, principalmente, no

células GRX, bem como estudar os efeitos de adenosina e/ou TNF-α na apoptose dessas

células em cultura;

Quantificação da produção de nitrito

Para determinar a produção de óxido nítrico secretado pelas células GRX em

cultura, o meio de incubação foi utilizado para quantificação do produto final estável do

óxido nítrico em solução, nitrito (NO

1993). Células GRX em cultura foram incubadas por 24 h em DMEM com 5%SFB, em

fosfórico), na proporção 1:1, por 15 minutos e a quantidade de nitrito foi medida a uma

absorvância de 540 nm. Para investigar a participação do receptor de adenosina do tipo

A

e 30 minutos em presença de antagonista do receptor A

MRS1706 (Tocris) e inibidor

de ecto-adenosina deaminase, Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine (EHNA) 10 µM

Atividade de MMP-9 e -2 foram analisadas por zimografia (Wang et al., 2003),

com adaptações. Células GRX foram plaqueadas a uma densidade de 15 × 10

/ 9,4 cm

2

(BSA) (Gibco), em presença e ausência de TNF-α e/ou adenosina, durante 24 horas.

Após esse período, as células foram utilizadas para extração de RNA e posterior análise

com RT PCR em tempo real, de acordo com o seguinte tópico. O meio condicionado de

incubação foi recolhido e centrifugado, a 700 g, por 15 min, para eliminar debris

celulares. O sobrenadante foi tratado com 4 volumes de acetona gelada, a 0°C, por 30

min, e centrifugado novamente, por 15min a 700g. O sobrenadante foi descartado e o

pellet protéico ressuspendido em 1/5 do volume inicial em água destilada. Alíquotas de

20 µL, acrescidas de tampão de amostra 4 x concentrado (Tris 0,062 M, glicerol (v/v)

10%, SDS 1% e azul de bromofenol 0,001%, pH 6,8), foram submetidas à eletroforese

Temed 6µL e Persulfato de Sódio 0,07%). Eventualmente, os géis de separação

apresentaram concentração de 6% (acrilamida 6%, bis-acrilamida 0,15%, Tris 0,25M,

SDS 0,06%, Temed 10.5µL e Persulfato de sódio 0,056%) , com gel de entrada 4%

(acrilamida 4%, bis-acrilamida 0,10%, Tris 0,09M, SDS 0,07%, Temed 6µL e

Persulfato de Sódio 0,07%). Os géis foram submetidos à corrida prévia, em ausência de

separação foram lavados duas vezes com Triton X-100 2,5% e incubadas em tampão

(50 mM Tris, 10 mM CaCl

2

, 0.15 M NaCl), a 37ºC, por 24 horas. Finalmente, os géis

foram corados com 0.1% Coomassie Brilliant Blue R250 em 7.5% ácido acético e

quantificada por densitometria, através do programa IMAGE J. Os cálculos foram feitos

em relação à média do controle igual a 1. Para verificação dos pesos moleculares das

proteínas, padrão de peso molecular foi utilizado, com distância de duas canaletas entre

as amostras.

Extração de RNA total, síntese de cDNA e qRT-PCR em tempo real

RNA foi extraído das células, usando TRizol® (Invitrogen), seguindo o protocolo do

fabricante. Aproximadamente 1µg de RNA foi usado, por 30 µl de volume de reação

para a síntese de DNA complementar (cDNA), feita a 70ºC (anelamento) por 5 min e

42 °C (atividade da transcriptase reversa) for 1 h, using the primer T23V [5′ - ttt ttt ttt ttt

cactgcaggaggtcgtaggt – 3’ (direita)], MMP-2 [ 5’ – atgccatccctgataacctg – 3’(esquerda)

e 5’ – tgtgcagcgatgaagatgat – 3’ (direita)] e β-actina [ 5’ – tactcctgcttgctgatccacat –

3’(esquerda) e 5’ – tatgccaacacagtgctgtctgg – 3’ (direita)] As análises foram feitas em

quadruplicatas, em ciclador de tempo real Applied-Biosystem 7500. A programação de

reação foi composta de desnaturação inicial de 5 min a 94 °C, seguida de 40 ciclos de

0.1 °C/s para adquirir dados para produzir a curva de desnaturação dos produtos

amplificados.

Todos os resultados foram analisados pelo método de 2

− ∆∆CT

(Livak and

Schmittgen, 2001). β-actina foi utilizada como controle interno para todos os cálculos

Todos os resultados foram padronizados com os respectivos conteúdos protéicos,

determinados através do método de Lowry (Lowry et al., 1951).

CAPÍTULO II

RESULTADOS