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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
ESTUDO DAS ATIVIDADES ANTITUMORAL E
IMUNOESTIMULANTE DO POLISSACARÍDEO SULFATADO
ISOLADO DE Champia feldmannii DIAZ-PIFFERER (1977).
KÉZIA OLIVEIRA ABRANTES DE LACERDA LINS
Fortaleza – CE
2008
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KÉZIA OLIVEIRA ABRANTES DE LACERDA LINS
ESTUDO DAS ATIVIDADES ANTITUMORAL E IMUNOESTIMULANTE DO
POLISSACARÍDEO SULFATADO ISOLADO DE Champia feldmannii DIAZ-
PIFFERER (1977).
Dissertação submetida à Coordenação do programa de
Pós-Graduação em Farmacologia do Departamento de
Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal do
Ceará como requisito parcial para a obtenção do grau
de Mestre em Farmacologia.
Orientadora:
Prof
a
Dr
a
Letícia Veras Costa Lotufo
Fortaleza - CE
2008
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KÉZIA OLIVEIRA ABRANTES DE LACERDA LINS
ESTUDO DAS ATIVIDADES ANTITUMORAL E IMUNOESTIMULANTE DO
POLISSACARÍDEO SULFATADO ISOLADO DE Champia feldmannii DIAZ-
PIFFERER (1977).
Aprovada em 15 de julho de 2008
Dissertação submetida à coordenação do programa de Pós-graduação em Farmacologia como parte
dos requisitos necessários para a obtenção do grau de Mestre em Farmacologia outorgado pela
Universidade Federal do Ceará.
A citação de qualquer trecho deste trabalho é permitida, desde que seja feita em conformidade com as
normas da ética científica.
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________________
Profa. Dra. Letícia Veras Costa-Lotufo
Universidade Federal do Ceará
- Orientadora –
__________________________________________________
Profa. Dra. Ana Maria Sampaio Assreuy
Universidade Estadual do Ceará
__________________________________________________
Profa. Dra. Alice Maria Costa Martins
Universidade Federal do Ceará
AGRADECIMENTOS
À Profª Drª Letícia Veras Costa-Lotufo, pela orientação deste trabalho, por toda a ajuda, e por
ser um exemplo de orientadora;
À Profª Drª Claudia do Ó Pessoa, pelo apoio no laboratório;
Ao Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes, pela contribuição à pesquisa no Laboratório de
Oncologia Experimental;
À Profª Drª Raquel Carvalho Montenegro, pelo apoio;
Ao Prof. Wladimir Ronald Lobo Farias, pelo fornecimento do material e toda a ajuda;
À Profª Drª Ana Paula Negreiros Nunes Alves, pelos esclarecimentos sobre patologia e as
análises histopatológicas;
À Profª Drª Nylane Maria Nunes Alencar, pela ajuda com os testes bioquímicos;
À Profª Drª Helena Serra Azul Monteiro, por oferecer o seu laboratório e por todos os
esclarecimentos;
À Profa. Dra. Ana Maria Sampaio Assreuy, pela participação na banca;
À Profa. Dra. Alice Maria Costa Martins, pela participação na banca;
Ao amigo Daniel, pela orientação e ajuda sempre;
Aos colegas da graduação e pós-graduação do Laboratório de Oncologia Experimental pela
amizade e ajuda;
Aos colegas do LAFAVET, por toda a ajuda e os bons momentos juntos;
Aos técnicos Silvana, Luciana, Adriano e Maria de Fátima, por toda a colaboração nos
experimentos;
Aos professores da Pós-graduação em Farmacologia pelos ensinamentos;
Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia;
Aos meus pais, pelo amor incondicional e torcida constante;
Aos meus irmãos, Levi e Mateus, por fazerem parte da minha história e pelo computador
emprestado;
Ao meu amado esposo, com o qual eu tenho passado os melhores momentos da minha vida.
A todos que, diretamente ou indiretamente, contribuíram para a minha formação pessoal e
acadêmica ou para a execução deste trabalho;
Aos órgãos financiadores dos projetos de pesquisa do Laboratório de Oncologia
Experimental, CNPq, FINEP, FUNCAP e BNB;
Ao CNPq pelo apoio financeiro.
Índice
Lista de Figuras
Lista de Tabelas
Lista de Símbolos e Abreviaturas
Resumo
Abstract
1. Introdução....................................................................................................................... 20
1.1. Câncer....................................................................................................................... 21
1.2. Polissacarídeos como modificadores da resposta biológica..................................... 29
1.3. Algas como fonte de produtos bioativos...................................................................
36
2. Objetivos.......................................................................................................................... 41
2.1. Geral..........................................................................................................................
42
2.2. Específicos ............................................................................................................... 42
3. Material e Métodos......................................................................................................... 43
3.1. Materiais utilizados................................................................................................... 44
3.1.1. Equipamentos................................................................................................... 44
3.1.2. Reagentes.......................................................................................................... 45
3.1.3. Fármacos........................................................................................................... 46
3.1.4. Células............................................................................................................... 46
3.2. Coleta e limpeza do material.................................................................................... 47
3.3. Extração dos polissacarídeos.................................................................................... 47
3.4. Fracionamento dos Polissacarídeos Sulfatados........................................................ 49
3.5. Atividade citotóxica in vitro..................................................................................... 49
3.5.1. Ensaio do MTT................................................................................................. 49
3.5.1.1. Manutenção das células............................................................................ 49
3.5.1.2. Procedimento experimental...................................................................... 50
3.5.1.3. Análise dos dados..................................................................................... 50
3.6. Estudo da atividade antitumoral in vivo....................................................................
50
3.6.1. Obtenção e manutenção dos animais................................................................ 50
3.6.2. Procedimento experimental.............................................................................. 51
3.6.3. Análise dos dados............................................................................................. 51
3.6.4. Análise morfológica e histopatológica............................................................. 51
3.6.4.1. Procedimento experimental...................................................................... 51
3.6.4.2. Análise dos dados..................................................................................... 52
3.6.5. Determinação dos parâmetros hematológicos e bioquímicos........................... 52
3.6.5.1. Procedimento experimental....................................................................... 52
3.6.5.2. Análise dos dados...................................................................................... 52
3.7. Atividade Imunoestimulatória.................................................................................. 53
3.7.1. Atividade edematogênica................................................................................. 53
3.7.1.1. Procedimento experimental...................................................................... 53
3.7.1.2. Análise dos dados...................................................................................... 53
3.7.2. Imunização subcutânea..................................................................................... 54
3.7.2.1. Procedimento experimental...................................................................... 54
3.7.2.2. Análise dos dados..................................................................................... 54
3.7.3. Ativação de macrófagos in vivo........................................................................ 55
3.7.4. Tratamento de Sarcoma 180 com sobrenadante de macrófagos ativados........
55
3.7.4.1. Procedimento experimental...................................................................... 55
3.7.4.2. Análise dos dados.....................................................................................
56
3.7.5. Migração de neutrófilos.................................................................................... 56
3.7.5.1. Procedimento experimental...................................................................... 56
3.7.5.2. Análise dos dados..................................................................................... 57
3.7.6. Produção de NO................................................................................................ 57
3.7.6.1. Procedimento experimental..................................................................... 57
3.7.6.2. Análise dos dados.................................................................................... 58
3.8. Perfusão de rim isolado.............................................................................................
58
3.8.1. Obtenção e manutenção dos animais................................................................ 58
3.8.2. Sistema de perfusão.......................................................................................... 58
3.8.2.1. Calibração do sistema............................................................................... 60
3.8.2.2. Solução perfusora..................................................................................... 61
3.8.2.3. Técnica cirúrgica.......................................................................................
61
3.8.2.4. Procedimento experimental...................................................................... 64
3.8.2.5. Análises bioquímicas................................................................................ 64
3.8.2.6. Cálculos de parâmetros funcionais renais.................................................
64
3.8.2.7. Estudo histológico.................................................................................... 66
3.9. Perfusão de leito vascular isolado.............................................................................
66
3.9.1. Procedimento experimental......................................................................... 66
3.9.2. Análise dos dados........................................................................................ 68
4. Resultados........................................................................................................................
69
4.1. Atividade citotóxica in vitro..................................................................................... 70
4.2. Estudo da atividade antitumoral in vivo...................................................................
70
4.2.1. Inibição tumoral...........................................................................................
70
4.2.2. Análise morfológica e histopatológica........................................................ 72
4.2.3. Determinação dos parâmetros hematológicos e bioquímicos...................... 78
4.3. Atividade imunoestimulatória...................................................................................
81
4.3.1. Atividade edematogênica............................................................................
81
4.3.2. Imunização subcutânea............................................................................... 82
4.3.3. Tratamento de Sarcoma 180 com sobrenadante de macrófagos
Ativados.....................................................................................................
84
4.3.4. Migração de neutrófilos............................................................................... 85
4.3.5. Produção de NO...........................................................................................
86
4.4. Perfusão de rim isolado.............................................................................................
86
4.5. Perfusão de leito vascular isolado.............................................................................
95
5. Discussão..........................................................................................................................
96
6. Conclusão.........................................................................................................................
107
7. Referências Bibliográficas..............................................................................................
109
Lista de Figuras
Figura 1
Ilustração esquemática das capacidades adquiridas do câncer.......................... 23
Figura 2
Ilustração esquemática da ativação da célula T................................................ 26
Figura 3
Ilustração esquemática do mecanismo proposto para ativação de células
imunes por polissacarídeos modificadores da resposta biológica.....................
35
Figura 4
Fotografia da alga Champia feldmannii............................................................ 40
Figura 5
Fluxograma de extração de polissacarídeos sulfatados..................................... 48
Figura 6
Desenho esquemático do sistema de perfusão de rim isolado (LAFAVET)..... 59
Figura 7
Valores de pressão de perfusão (PP) registrados durante a calibração do
sistema............................................................................................................... 60
Figura 8
Valores registrados pelo Fluxômetro (L/h) durante a calibração do sistema ...
60
Figura 9
Valores de volume urinário (mL/min) registrados durante a calibração do
sistema..............................................................................................................
61
Figura 10
Procedimento cirúrgico para retirada de rim isolado de rato. A: isolamento
da artéria femural; B: isolamento e fixação da cânula ao ureter; C:
isolamento das artérias mesentérica e renal; D: cânula fixada à artéria renal
(LAFAVET-UFC)............................................................................................. 63
Figura 11
Desenho esquemático do sistema de perfusão de leito vascular mesentérico
(LAFAVET-UFC)............................................................................................. 67
Figura 12
Efeito do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-
PLS) sobre a massa tumoral de camundongos transplantados com Sarcoma
180.....................................................................................................................
71
Figura 13
Microfotografias dos cortes histológicos (400X) dos tumores de
camundongos transplantados com células tumorais de Sarcoma 180..............
74
Figura 14
Microfotografias dos cortes histológicos (400X) dos fígados de
camundongos transplantados com células tumorais de Sarcoma
180.....................................................................................................................
75
Figura 15
Microfotografias dos cortes histológicos (400X) dos rins de camundongos
transplantados com células tumorais de Sarcoma 180. A- grupo controle
(salina); B- 5-FU (10 mg/Kg/dia); C- Cf-PLS (10 mg/Kg/dia); D- Cf-PLS +
5-FU (10 mg/Kg/dia); E- Cf-PLS (25 mg/Kg/dia)............................................ 76
Figura 16
Microfotografias dos cortes histológicos (400X) dos baços de camundongos
transplantados com células tumorais de Sarcoma 180. A- grupo controle
(salina); B- 5-FU (10 mg/Kg/dia); C- Cf-PLS (25 mg/Kg/dia); D- Cf-PLS +
5-FU (10 mg/Kg/dia)......................................................................................... 77
Figura 17
Efeito do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-
PLS) sobre a formação de edema em ratos.......................................................
81
Figura 18
A - Efeito de polissacarídeo sulfatado isolado de Champia feldmannii (Cf-
PLS) na produção de anticorpos Ig total (), IgE (), IgG1 (▲) and IG2a
(∆). B – Efeito de Cf-PLS na produção de anticorpos específicos contra a
ovalbumina (OVA)............................................................................................
83
Figura 19
Efeito do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-
PLS) sobre a inibição de tumor Sarcoma 180................................................... 84
Figura 20
Efeito do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-
PLS) sobre a migração de neutrófilos...............................................................
85
Figura 21
Efeitos do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-
PLS) na Pressão de Perfusão (PP) em rim isolado............................................ 87
Figura 22
Efeitos do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-
PLS) na Resistência Vascular Renal (RVR) em rim isolado............................ 87
Figura 23
Efeitos do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-
PLS) no Fluxo Urinário (FU) em rim isolado................................................... 88
Figura 24
Efeitos do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-
PLS) no Ritmo de Filtração Glomerular (RFG) em rim isolado....................... 88
Figura 25
Efeitos do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-
PLS) na Porcentagem de Transporte Tubular de Sódio (%T NA
+
) em rim
isolado................................................................................................................
89
Figura 26
Efeitos do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-
PLS) na Porcentagem de Transporte Tubular de Potássio (%T K
+
) em rim
isolado...............................................................................................................
89
Figura 27
Efeitos do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-
PLS) na Porcentagem de Transporte Tubular de Cloreto (%T Cl
-
) em rim
isolado................................................................................................................
90
Figura 28
Efeitos do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-
PLS) na Porcentagem de Transporte Tubular Proximal de Sódio (%pT NA
+
)
em rim
isolado...............................................................................................................
90
Figura 29
Porcentagem de Transporte Tubular Proximal de Potássio (%pT K
+
) no
grupo tratado com o polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia
feldmannii (Cf-PLS) em rim isolado................................................................. 91
Figura 30
Efeitos do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-
PLS) na Porcentagem de Transporte Tubular Proximal de Cloreto (%pT Cl
-
)
em rim isolado...................................................................................................
91
Figura 31
Efeitos do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-
PLS) na Excreção de Sódio (ENA
+
) em rim isolado......................................... 92
Figura 32
Efeitos do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-
PLS) na Excreção de Potássio (EK
+
) em rim isolado........................................
92
Figura 33
Efeitos do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-
PLS) na Excreção de Cloreto (ECl
-
) em rim isolado.........................................
93
Figura 34
Microfotografias dos cortes histológicos (400X) dos rins de ratos................... 94
Figura 35
Pressão de leito mesentérico no grupo tratado com o polissacarídeo sulfatado
isolado da alga Champia feldmannii (Cf-PLS)................................................. 95
Lista de Tabelas
Tabela 1
Linhagens tumorais utilizadas no ensaio de citotoxicidade in vitro.......... 46
Tabela 2
Cálculos para determinação de parâmetros funcionais renais.................... 65
Tabela 3
Efeito do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii
(Cf-PLS) em camundongo transplantado com tumor Sarcoma-
180.............................................................................................................. 73
Tabela 4
Efeito do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii
(Cf-PLS) nos parâmetros bioquímicos de sangue periférico de
camundongos transplantados com tumor S180.......................................... 79
Tabela 5
Efeito do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii
(Cf-PLS) nas alterações hematológicas de sangue periférico de
camundongo transplantado com tumor S180............................................. 80
Lista de Símbolos e Abreviaturas
5-FU
5-Fluorouracil
ALT Alanina aminotransferase
ANOVA Análise de variância
MTT Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio
CI
50
Concentração inibitória média
DMSO Dimetilsulfóxido
E.P.M.
Erro padrão da média
FGF Fator de crescimento do fibroblasto
VEGF Fator de crescimento endotelial vascular
TNF-α
Fator de Necrose Tumoral
FU Fluxo Urinário
IL-1 Interleucina 1
IL-6 Interleucina 6
M Molar
MHC Molécula do complexo de histocompatibilidade
PBS Phosphate buffer solution (Tampão fosfato)
% pT Cl
-
Porcentagem de Transporte Tubular proximal de Cl
-
% pT K
+
Porcentagem de Transporte Tubular proximal de K
+
% pT Na
+
Porcentagem de Transporte Tubular proximal de Na
+
% T Cl
-
Porcentagem de Transporte Tubular total de Cl
-
% T K
+
Porcentagem de Transporte Tubular total de K
+
% T Na
+
Porcentagem de Transporte Tubular total de Na
+
PP Pressão de Perfusão
pRb Proteína retinoblastoma
EGFR Receptor do fator de crescimento epidérmico
RVR Resistência Vascular Renal
RFG Ritmo de Filtração Glomerular
RESUMO
ESTUDO DAS ATIVIDADES ANTITUMORAL E IMUNOESTIMULANTE DO
POLISSACARÍDEO SULFATADO ISOLADO DE Champia feldmannii DIAZ-
PIFFERER (1977). Kézia Oliveira Abrantes de Lacerda Lins. Orientadora: Letícia Veras
Costa Lotufo. Dissertação de Mestrado. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia.
Departamento de Fisiologia e Farmacologia, UFC, 2008.
O câncer é uma doença que afeta cada vez mais um número maior de pessoas em todo o
mundo. As terapias atuais utilizadas para o tratamento do câncer são ainda insatisfatórias.
Produtos naturais têm sido avaliados para seleção de compostos ativos, capazes de reduzir os
tumores malignos de uma forma mais eficiente e com menos efeitos indesejáveis. O
polissacarídeo sulfatado extraído da alga Champia feldmannii (Cf-PLS) foi testado para
avaliação do seu potencial antitumoral e imunoestimulante. Além disso, foram feitos testes de
toxicidade do fígado, rins e baço após o tratamento com Cf-PLS. Os resultados demonstraram
que Cf-PLS não apresenta citotoxicidade in vitro, mas é capaz de reduzir o tumor Sarcoma
180 implantado em camundongos em 48,16% e 48,62% nas doses de 10 e 25mg/kg,
respectivamente, e reduz 68,32% quando administrado juntamente com 5-Fluorouracil (5-
FU). As análises do fígado e rins revelaram que houve certa toxicidade no rim, com áreas de
necrose tubular aguda na maior dose. Os testes da perfusão renal revelaram que Cf-PLS causa
aumento da pressão de perfusão, resistência vascular renal, ritmo de filtração glomerular e
fluxo urinário, além da excreção de sódio, cloreto e potássio. Não houve alterações nos
percentuais de transporte totais ou tubular proximais de sódio, cloreto ou potássio. Houve
discreta deposição protéica nos glomérulos e túbulos renais. Não houve alterações nas
análises bioquímicas e os testes hematológicos revelaram uma leucopenia causada por 5-FU,
entretanto esta foi revertida pelo tratamento com Cf-PLS. Também foi demonstrado que Cf-
PLS age como agente imunoestimulante e imunomodulador, aumentando a produção de
anticorpos totais e específicos contra Cf-PLS e OVA, aumentando também a polpa branca e o
número de megacariócitos nos baços dos animais tratados e induzindo a migração de
neutrófilos para a cavidade peritoneal de camundongos. Pode-se concluir que Cf-PLS
apresenta atividade antitumoral e que esta atividade pode estar relacionada com suas
propriedades imunoestimulantes.
Palavras-chave: Champia feldmannii, polissacarídeos sulfatados, antitumoral,
imunomodulatório, toxicidade.
ABSTRACT
ANTITUMOR AND IMMUNOSTIMULANT PROPERTIES OF A SULFATED
POLYSACCHARIDE ISOLATED FROM Champia Feldmannii DIAZ-PIFFERER
(1977). Kézia Oliveira Abrantes de Lacerda Lins. Advisor: Letícia Veras Costa Lotufo.
Master. Postgraduate Program on Pharmacology. Department of Physiology and
Pharmacology, Federal University of Ceara, UFC, 2008.
Cancer is a disease that occurs in a larger number of people each year. The therapies used to
treat it are still not satisfatory. Natural products have been studied to select new compounds
capable of reducing tumours and with fewer side effects. The sulfated polysaccharide isolated
from the seaweed C. feldmannii (Cf-PLS) was investigated for its antitumor and
immunostimulating properties and also for the toxicological aspects related to Cf-PLS
treatment. The Cf-PLS did not show any significant in vitro cytotoxic effect, but showed a
strong in vivo antitumor effect. The inhibition rates of sarcoma 180 tumor development were
48.16 % and 48.62% at the doses of 10 and 25 mg/kg, respectively, and 68.32% when treated
together with 5-fluorouracil (5-FU). The histopathological analysis of liver and kidney
showed that the kidneys were affected by Cf-PLS-treatment, presenting some focal areas of
acute tubular necrosis at the higher dose. Cf-PLS caused considerable changes in renal
physiology, as shown by an increase in parameters such as perfusion pressure, renal vascular
resistance, glomerular filtration rate, urinary flow and sodium, chloride and potassium
excretion. Neither enzymatic activity of alanine aminotransferase, urea nor creatinin levels
were significantly altered. In hematological analyses, leucopeny was observed after 5-FU
treatment, but this effect was prevented when the treatment was associated with the Cf-PLS. It
was also demonstrated that Cf-PLS acts as an immunomodulatory agent, raising the
production of specific antibodies, and also increasing the production of OVA-specific
antibodies. In addition, it induced a discreet increase of the white pulp and nest of
megakaryocytic in spleen of treated mice and the neutrophil migration to the intraperitoneal
cavity of mice. In conclusion, Cf-PLS has some interesting antitumour activity that could be
associated with its immunostimulanting properties.
Keywords: Champia feldmannii, sulfated polysaccharides, antitumor activity,
immunomodulatory activity, toxicity.
Introdução
Introdução
21
1. INTRODUÇÃO
1.1. Câncer
O câncer é uma doença responsável pela morte de mais de sete milhões de pessoas por
ano em todo o mundo, o que representa 13% do total de 58 milhões de mortes ocorridas no
ano de 2005. No Brasil, estima-se que no ano de 2008 ocorrerão 466.730 novos casos de
câncer, sendo os mais incidentes, com exceção do câncer de pele do tipo não melanoma, os
cânceres de próstata e de pulmão, no sexo masculino, e os cânceres de mama e de colo do
útero, no sexo feminino (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007).
Existem mais de 100 tipos diferentes de câncer. Observações em modelos de cânceres
animais e humanos concluem que o desenvolvimento de tumores acontece através de um
processo análogo à evolução Darwinista, onde há uma sucessão de mudanças genéticas, cada
uma permitindo algum tipo de vantagem no crescimento celular, levando à conversão de
células humanas normais a células cancerígenas (FOULDS, 1954; HANAHAN &
WEINBERG, 2000; NOWELL, 1976).
De acordo com Hanahan & Weinberg (2000), a maioria, ou talvez todos os tipos de
tumores de câncer, tenham adquirido um conjunto de alterações na fisiologia da célula
durante o seu desenvolvimento, as quais coletivamente irão promover um crescimento de
forma maligna (Figura 1).
Uma das capacidades adquiridas pelas células cancerígenas é a auto-suficiência de
sinais de crescimento. Estes são requeridos durante o processo de mitose pelas células
normais na passagem de um estado quiescente para um estado proliferativo. As células
tumorais são capazes de gerar seus próprios sinais de crescimento, diminuindo a dependência
do microambiente ao redor. Para isso, agem a nível de receptores dos sinais de crescimento
extracelulares, dos transdutores transcelulares e dos efetores que traduzem os sinais dentro da
célula (FEDI et al., 1997) .
Introdução
22
Para manter a homeostase nos tecidos, vários sinais antiproliferativos são usados a fim
de forçar as células normais a saírem de um estado proliferativo para um estado quiescente até
que haja uma mudança nos sinais extracelulares, ou induzi-las a entrar em um estado pós-
mitótico, onde seu potencial proliferativo será permanentemente perdido. Para prosperarem,
as células cancerígenas precisam tornar-se insensíveis a esses sinais. Isso ocorre,
principalmente, através de uma ação, a nível molecular, no circuito de sinalização da proteína
retinoblastoma (pRb). Quando em seu estado hipofosforilado, a pRb impede a proliferação ao
seqüestrar e alterar funções do fator de transcrição E2F, que controla a expressão de genes
essenciais para a progressão da fase G1, onde há a síntese de proteínas, para a fase S, onde
ocorre a replicação das moléculas de DNA (WEINBERG, 1995).
O mecanismo que a célula usa para impedir que erros sejam propagados durante a
replicação celular é a morte celular programada ou, apoptose. Uma vez iniciada, após uma
variedade de sinais fisiológicos, acontece uma série de eventos: as membranas celulares são
rompidas, o esqueleto citoplasmático e nuclear é quebrado, o citosol é expelido, os
cromossomos degradados, e o núcleo é fragmentado, tudo isso no tempo de 30 a 120 minutos.
No final, os restos celulares são englobados pelas células vizinhas e desaparecem, geralmente
dentro de 24 horas (WYLLIE et al., 1980). Em mais de 50% dos cânceres em humanos,
observa-se que há uma mutação no gene supressor p53, causando uma inativação do seu
produto, a proteína p53, um dos componentes principais na detecção de danos ao DNA e
conseqüente indução da cascata apoptótica (HARRIS, 1996).
Mesmo com todas essas características em relação aos sinais entre as células de um
mesmo tecido, existem ainda os controles da própria célula, que são intrínsecos a ela, que
limitam sua multiplicação. Isso acontece devido aos telômeros, porções de DNA no final dos
cromossomos com seqüências de pares de bases repetidos. Estes vão diminuindo a cada ciclo
celular, em função da incapacidade da enzima DNA polimerase de replicar completamente o
final 3´ do DNA, deixando-o, assim, desprotegido, e causando a morte da célula (COUNTER
et al., 1992). A grande maioria das células malignas adquire um potencial replicativo
ilimitado, pois consegue manter os telômeros, através da supra-regulação da expressão da
enzima telomerase, a qual adiciona nucleotídios no final do DNA (BRYAN & CECH, 1999).
Introdução
23
Figura 1 - Ilustração esquemática das capacidades adquiridas do câncer (modificado de
HANAHAN & WEINBERG, 2000).
Auto-suficiência
em sinais de
Insensibilidade a
sinais
Invasão de
tecidos e
Potencial de
replicação
Angiogênese
favorecida
Evasão da
apoptose
Introdução
24
Assim como todas as outras células do corpo humano, as células cancerígenas
necessitam do suprimento de oxigênio e nutrientes oferecidos pelos capilares ao seu redor.
Inicialmente, elas não possuem a habilidade de angiogênese, o que seria um fator limitante da
sua expansão. Assim, para que haja um aumento de tamanho, as neoplasias incipientes
precisam adquirir também esta capacidade (BOUCK et al., 1996; FOLKMAN, 1997;
HANAHAN & FOLKMAN, 1996). Para isso os tumores parecem mudar o equilíbrio que há
entre os indutores e os inibidores da angiogênese, aumentando a expressão do fator de
crescimento endotelial vascular (VEGF) e do fator de crescimento do fibroblasto (FGF), ou
ainda diminuindo a expressão dos inibidores endógenos como a trombospondina-1 ou o
interferon-β (SINGH et al., 1995; VOLPERT et al., 1997).
Durante o desenvolvimento da maioria dos cânceres humanos, algumas células saem
do tumor inicial e invadem tecidos adjacentes também indo para locais distantes no corpo,
onde não há limitação de espaço e nutrientes, para tentar formar novas colônias. Este processo
é conhecido como metástase e é responsável por 90% das mortes por câncer (SPORN, 1996).
Para aquisição desta habilidade é essencial a ativação de proteases extracelulares e alteração
da especificidade de ligação de caderinas, de moléculas de adesão intercelular (CAMs) e de
integrinas (APLIN et al., 1998). Entretanto, os mecanismos moleculares que regulam essas
alterações ainda estão pouco estabelecidos.
Apesar de acreditar-se que todos os tipos de cânceres possuam essas seis
características principais, a ordem cronológica em que elas são adquiridas pode variar
significativamente entre os diversos tipos de cânceres. O conhecimento das lesões sofridas
pelas células durante o processo de transformação em células malignas permitirá uma análise
a nível genético e bioquímico de cada câncer e permitirá também estudos para que surjam
novos alvos terapêuticos que, combinados, levarão a melhores resultados.
Os tratamentos tradicionais que são utilizados atualmente, como a cirurgia, hormônios,
radiação e quimioterapia nem sempre alcançam resultados satisfatórios. Uma nova forma de
tratamento que vem sendo amplamente estudada é a imunoterapia, que explora a própria
imunidade antitumoral do corpo (SALGALLER, 2000).
Durante o desenvolvimento de tumores é produzida constantemente uma grande
quantidade de antígenos, que podem ser detectados pelo sistema imune. Em seguida, o
sistema imune inicia uma resposta para eliminar as células transformadas e inibir o
Introdução
25
desenvolvimento do tumor (BURNET, 1970; DUNN et al., 2002). A resposta produzida pelo
sistema imune pode ser do tipo inata ou adquirida. A imunidade adquirida tem a vantagem de
apresentar especificidade por antígenos e gerar uma memória imunológica. Ela pode ser
dividida em humoral ou mediada por célula. Enquanto a resposta humoral é direcionada
contra antígenos nativos, normalmente extracelulares, a resposta mediada por célula elimina
patógenos intracelulares e células modificadas (QUATAN et al., 2004).
O reconhecimento de uma célula tumoral pelo sistema imune se dá através da ligação
entre os receptores dos linfócitos T (LTR) e pequenos peptídios que estão na superfície das
moléculas do complexo de histocompatibilidade (MHC). No geral, as moléculas de MHC da
classe I apresentam peptídios antigênicos para as células T citotóxicas (CD8
+
), enquanto as
células T auxiliares (CD4
+
) reconhecem os peptídios apresentados pelas moléculas MHC da
classe II. Para que ocorra a ativação das células T, é necessário que se tenha uma ligação do
seu receptor com os peptídios das moléculas MHC presentes nas células dendríticas (DC), que
são células apresentadoras de antígenos derivadas da medula óssea. É necessário ainda uma
co-estimulação através da interação entre CD80 e CD86 das células dendríticas e do CD28 da
célula T, tudo isso na presença da IL-12 (Figura 2). Todo este processo de ligação cruzada é
conhecido como “cross-priming” (HEATH & CARBONE, 1999; 2001).
Com o conhecimento que se tem hoje sobre antígenos associados a tumores, estão
sendo estudadas diferentes vacinas como uma forma de imunoterapia. Estudos sobre o
potencial de vacinas para prevenção do câncer têm demonstrado que um sistema imune alerta
pode bloquear eficientemente os processos carcinogênicos causados pela superexpressão de
oncogenes específicos (IINUMA et al., 2004; LOLLINI et al., 2006; XIA et al., 2003).
Antígenos que estão diretamente envolvidos no desenvolvimento de processos neoplásicos
são ideais para esse tipo de vacina, já que são essenciais para o crescimento do tumor e sua
infra-regulação é improvável de ocorrer. Esses antígenos podem ser administrados nas mais
diferentes formas: DNA, RNA, proteínas, peptídios, vírus ou lisado celular.
Introdução
26
Figura 2 - Ilustração esquemática da ativação da célula T (modificado de QUATAN et al.,
2004). DC- célula dendrítica; IL-12- Interleucina-12; LTR-receptores de linfócitos T; MCH I-
moléculas do complexo de histocompatibilidade do tipo I. CD- receptores.
Estudos feitos com o antígeno tumoral da subunidade da enzima telomerase
transcriptase reversa humana (hTERT), presente em quase todas as células tumorais e que
aumenta durante o progresso do tumor de carcinoma in situ para tumor primário e para
tumores metastásicos, mostram que eles são apresentados por moléculas MHC I para os
linfócitos T (MINEV et al., 2000; VONDERHEIDE et al., 1999). Estes linfócitos in vitro são
capazes de matar uma variedade de células tumorais hTERT-positivas (VONDERHEIDE et
al., 1999).
Microorganismos são a causa de 10-20% de todos os tumores humanos. Vacinas que
previnam ou controlem infecções associadas a vírus envolvidos no desenvolvimento de câncer
são uma importante estratégia (LOLLINI et al., 2006). Já estão disponíveis duas vacinas para
esses casos. A primeira é contra o vírus da Hepatite B, que reduz as chances de
desenvolvimento de carcinoma hepatocelular (KAO & CHEN, 2002), e a outra é para o
Papiloma Vírus Humano (HPV) que protege contra o câncer cervical (MAO et al., 2006).
CD
peptídi
MHC I
LT
R
CD80/86
IL
-
12
Resposta T
DC
Introdução
27
De acordo com Rescigno et al. (2007) as vacinas terapêuticas que estão direcionadas
ao tratamento contra tumores já estabelecidos, podem ser distinguidas como imunoterapia
passiva ou ativa. A imunoterapia passiva é baseada na transferência de células imunes
ativadas ex-vivo, imunomoduladores (incluindo citocinas) ou anticorpos tumores-específicos,
enquanto a imunoterapia ativa consiste na ativação do sistema imune do próprio paciente. Isso
se dá através da administração de uma vacina terapêutica, como por exemplo, no uso de
células dendríticas como adjuvantes.
A terapia com anticorpos monoclonais tem trazido bastante benefício à imunoterapia.
Alguns deles podem agir diretamente bloqueando vias de transdução de sinais, como por
exemplo, ao serem direcionados a receptores de sinais de crescimento, ou indiretamente via a
ativação de células natural killer. Atualmente estão sendo utilizados anticorpos direcionados
ao receptor HER2/neu para tratamento de câncer de mama (NAHTA & ESTEVA, 2006),
anticorpos para moléculas CD20 no tratamento de linfoma não-Hodgkin (MALONEY, 2005)
e anticorpos direcionados ao fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) ou ao receptor
do fator de crescimento epidérmico (EGFR) para o tratamento de câncer coloretal (GIUSTI et
al., 2007; PANARES & GARCIA, 2007).
A fim de otimizar a imunoterapia, estão sendo utilizadas substâncias que ajudam a
acionar e manter a resposta a agentes específicos. Essas substâncias são conhecidas como
imunoadjuvantes, e foram originariamente descritas como substâncias usadas em combinação
com um antígeno específico e que produz mais imunidade do que o antígeno isolado
(RAMON et al., 1952). O objetivo do uso de adjuvantes é melhorar a resposta imune para os
antígenos presentes nas vacinas. Eles podem aumentar a imunogenicidade de antígenos
fracos, elevar a velocidade e duração da resposta imune, e modular a atividade de anticorpos.
Podem ainda estimular células T CD4
+
, promover indução da imunidade em mucosas e
aumentar a resposta imune em indivíduos imaturos imunologicamente (SINGH &
O´HAGAN, 1999).
Alguns adjuvantes comumente usados são o adjuvante de Freund, um óleo mineral que
contém micobactéria. Também a vacina contra a tuberculose, Bacillus-Calmette-Guérin
(BCG), tem uma ótima atividade adjuvante e suscita tanto a resposta humoral como a mediada
por célula. Por causa da sua segurança, tem sido amplamente utilizada como adjuvante em
testes clínicos (ALEXANDROFF et al., 1999; DUDA et al., 1995). A hemocianina, uma
proteína derivada de moluscos, tem sido usada como adjuvante imunológico e como antígeno
Introdução
28
marcador substituto na avaliação de respostas mediadas por célula a vacinas (MOLTO et al.,
1991; SHIMIZU et al., 2001). Também as saponinas, glicosídeos triterpenóides isolados da
planta Quillaja saponaria, como a QS21 possuem um forte poder adjuvante para indução de
células T citotóxicas, citocinas Th1, como IL-2 e INF-γ, e anticorpos IgG2a. Além disso,
DNA bacterial tem efeitos imunoestimulatórios em células imunes in vitro, devido à presença
de dinucleotídeos CG não metilados. Isso induz as células do sistema imune, como
macrófagos e células dendríticas, a aumentar a expressão de moléculas MHC II e de
moléculas co-estimulatórias, além de promover a transcrição de mRNA de citocinas e secretar
citocinas pró-inflamatórias (DAVIS et al., 1998; JAKOB et al., 1998).
Outra abordagem da imunoterapia é o uso de células dendríticas para apresentar
antígenos associados a tumores aos linfócitos T. Células dendríticas podem ser adicionadas
aos antígenos ex vivo e depois serem reincorporadas ao paciente, ou podem ser usadas para
ativar linfócitos ex-vivo que serão administrados ao paciente posteriormente (FONG &
ENGLEMAN, 2000; SCHULER et al., 2003). Também estão sendo testadas formas de levar
os antígenos até as células dendríticas in vivo, sem necessitar de todo o trabalho e custo das
manipulações ex vivo, através da recombinação com nanopartículas (REDDY et al., 2006;
UTO et al., 2007).
Estudos clínicos em pacientes com linfoma e pacientes com câncer de próstata
demonstraram que o uso de células dendríticas como adjuvantes pode levar a resultados
promissores na imunoterapia do câncer (FONG et al., 2001; TIMMERMAN et al., 2002). A
administração de células dendríticas associadas com citocinas, prostaglandinas e ligantes do
receptor Toll-like (TLR), são capazes de aumentar a capacidade imunoestimulatória dessas
células (WECK et al., 2007). Diversos compostos naturais ou sintéticos podem agir como
ligantes para os receptores Toll-like, como lipopolissacarídeos, RNAs e DNAs bacterianos. O
imiquimode, atualmente utilizado para o tratamento de carcinomas, é possivelmente um
imunomodulador e funciona como um ligante de TLR, aumentando a imunogenicidade e
sobrevivência das células dendríticas (PRINS et al., 2006).
Introdução
29
1.2. Polissacarídeos como Modificadores da Resposta Biológica
Os carboidratos são biomoléculas encontradas em toda a Terra. Certos carboidratos,
como o açúcar comum e o amido são a base da alimentação humana na maioria das partes do
mundo e a oxidação de carboidratos é a principal via metabólica que libera energia em muitas
células não-fotossintetizantes. São considerados carboidratos poliidroxialdeídos e
poliidroxicetonas ou substâncias que liberam esses compostos por hidrólise. Polissacarídeos
consistem de longas cadeias contendo centenas ou milhares de unidades de monossacarídeos
(açúcar simples), formado por uma unidade de poliidroxialdeído ou poliidroxicetona
(LEHNINGER et al., 2002). Alguns deles podem conter também nitrogênio, fósforo ou
enxofre. Quando comparado com outras macromoléculas como proteínas e ácidos nucléicos,
os polissacarídeos oferecem a maior capacidade de carregar informações biológicas, devido
ao seu grande potencial de variabilidade estrutural, podendo se conectar em vários pontos e
formar diferentes estruturas lineares ou ramificadas (SHARON & LIS, 1993).
Modificadores da resposta biológica são substâncias que têm a capacidade de melhorar
o sistema imune. Estas podem ser citocinas que são produzidas de forma endógena no corpo
por células imunes ou derivados de outros organismos. Estes modificadores da resposta
biológica exógenos podem ser ácidos nucléicos, lipídios, proteínas ou polissacarídeos. Dentre
eles, os polissacarídeos são os que estão presentes em maior abundância na natureza. Sua
origem pode ser de uma bactéria, fungo, alga ou planta. A nível celular, sua fonte pode ser a
partir de reservas de polissacarídeos do citoplasma, ou polissacarídeos estruturais presentes
nas membranas ou paredes celulares dos organismos. Os métodos de extração e purificação
estão diretamente relacionados com a forma como as moléculas de polissacarídeos se
encontram arranjadas (LEUNG et al., 2006).
As propriedades terapêuticas que foram encontradas nos diversos polissacarídeos
modificadores da resposta biológica incluem atividade antiviral (JUNG et al., 2004;
NISHINO et al., 1994; SASAKI et al., 2001), antibacteriana (LI et al., 2004; RUIZ-BRAVO
et al., 2001), antifúngica (SAKURAI et al., 1995; STUART et al., 1997), antiparasitária
(HRCKOVA & VELEBNY, 2001; YUN et al., 1997) e antitumoral (HAYASHI et al., 2000;
NISHINO et al., 1994; OHNISHI et al., 1994; YALIN et al., 2005).
Introdução
30
A possibilidade de utilizar esses polissacarídeos como agentes antitumorais tem
atraído muita atenção nas áreas da bioquímica e medicina. Isso é conseqüência de uma
profunda insatisfação com os atuais tratamentos disponíveis para o câncer, como a
quimioterapia e a radioterapia. Muitos dos compostos que foram descobertos como agentes
citotóxicos contra células cancerígenas também apresentam toxicidade para as células
normais do hospedeiro. Além disso, muitas drogas com potencial anticâncer também
apresentam consideráveis efeitos colaterais, sendo assim pouco utilizadas na clínica.
Atualmente, a descoberta e identificação de novas substâncias que sejam realmente efetivas
contra tumores malignos tem se tornado uma importante meta nas pesquisas biomédicas. O
aumento ou potencialização dos mecanismos de defesa do hospedeiro surge como uma
possível alternativa para inibir o crescimento tumoral sem prejudicar o hospedeiro (OOI &
LIU, 2000). Isso é muito importante, já que a formação e desenvolvimento do tumor está
relacionada com o estado imune do hospedeiro. A função imune decresce progressivamente
com o crescimento persistente do tumor, ficando clara a imunodeficiência de pacientes com
tumores no seu estágio final (HADDEN, 2003).
Nas últimas décadas, vários polissacarídeos foram isolados de fungos, algas, liquens e
plantas superiores, e têm atraído elevada atenção devido ao seu amplo espectro de
propriedades terapêuticas e uma toxicidade relativamente baixa (PAULSEN, 2001;
TZIANABOS, 2000; WASSER, 2002). Mais de 35 espécies de plantas pertencentes a 22
famílias diferentes apresentam atividade antitumoral e imunoestimulantes, como Panax
ginseng (SONG et al., 2002), Morinda citrifolia (HIRAZUMI & FARUSAWA, 1999), Pinus
parviflora (SAKAGAMI et al., 1987), Glycine max (LIAO et al., 2001), Curcuma zedoaria
(KIM et al., 2000), Angelica sinensis (CHOY et al., 1994), Aloe vera L. var. chinensis (LIU et
al., 2006), entre outras. Polissacarídeos contendo arabinogalactanos extraídos de Juniperus
scopolorum apresentam potentes propriedades imunoestimulatórias em macrófagos humanos,
demonstrado pela expressão de iNOS, produção de NO e aumento da produção tanto de
citocinas inflamatórias (IL-1, IL-6, IL-12, e TNF-α) como anti-inflamatórias (IL-10)
(SCHEPETKIN et al., 2005). Polissacarídeos isolados também de pólen de plantas têm
apresentado atividade antitumoral e imunoestimulante (GAO et al., 2003; LOTHAR et al.,
2005). Yang et al. (2007) isolaram um polissacarídeo do pólen de Brassica napus L. que
apresentou atividade antitumoral in vivo contra Sarcoma-180 e melanoma B-16, através da
imunomodulação, ação leucogênica e antianêmica. Liu et al., 2007, baseado na medicina
tradicional chinesa, que utiliza ouriços na alimentação como forma de melhorar o sistema
Introdução
31
imune, verificou a presença de atividade antitumoral de polissacarídeos isolados dos ovos de
Strongylocentrotus nudus em camundongos implantados com sarcoma-180.
A maioria dos estudos está ainda em fase experimental pré-clínica, utilizando animais.
Estudos clínicos têm sido realizados principalmente na China e Japão, onde alguns
polissacarídeos já estão sendo comercializados.
A lentinana, produzida pelo fungo Lentinus edodes, é um β-D-glucano puro,
inicialmente estudado por Chihara et al. (1970), que demonstraram seu elevado potencial
antitumoral relacionado aos outros polissacarídeos de fungos. Ela é capaz de elevar os níveis
de expressão gênica da IL-1α e IL-1β, citocinas que agem em diversos alvos, como células B
e T e monócitos, além de induzir a produção de outras citocinas como o TNF-α (LIU et al.,
1999). A lentinana obteve sucesso na sobrevida de pacientes com câncer, especialmente os
portadores de câncer de estômago e cóloretal (FURUE & KITOH, 1981; TAGUCHI, 1985).
Em um estudo aleatório em pacientes tratados com um quimioterápico (tegafur) isolado, ou
uma combinação do quimioterápico com o polissacarídeo lentinana, observou-se que houve
um aumento significativo nas taxas de sobrevida no grupo de pacientes tratados com a
combinação do quimioterápico e a lentinana: 19,5% sobreviveram mais de um ano, 10,4%
mais de dois anos e 6,5% sobreviveram mais de três anos. Foram observados apenas raros
efeitos adversos. A lentinana, quando usada em conjunto com agentes quimioterápicos, tem a
capacidade de reduzir drasticamente os efeitos indesejáveis da quimioterapia, como náuseas,
dores, perda de cabelo e imunodepressão (DABA & EZERONYE, 2003).
A schizophyllana é também um β-glucano, produzida pelo fungo Schizophyllum
commune e tem demonstrado ação citostática em tumor sólido Sarcoma 180, quando injetada
via intraperitonial ou intravenosa. Recentemente tem-se observado um aumento da sobrevida
em pacientes com câncer na cabeça e no pescoço (KIMURA et al., 1994). Em testes clínicos
envolvendo 312 pacientes tratados com cirurgia, radioterapia, quimioterapia (Fluorouracil) e
schizophyllana em várias combinações, foi verificado que pacientes tratados com o
polissacarídeo apresentaram uma melhor taxa de sobrevida do que os pacientes que não
receberam o polissacarídeo (MIYAZAKI et al., 1995).
Um polissacarídeo ligado a proteínas (PSK) isolado a partir do fungo Coriolus
versicolor no Japão exibe um marcante efeito antitumoral contra tumores alogênicos como
Sarcoma 180 e carcinoma de Ehrlich em animais experimentais, quando administrado tanto
por via oral ou intraperitonial (KOBAYASHI et al., 1993). Ele age estimulando a ativação de
Introdução
32
células T e induzindo a expressão gênica de algumas citocinas como IFN-γ, IL-2, TNF-α, IL-
1, IL- 8 e IL-6 in vitro e in vivo (KATO et al., 1995). Quando o PSK é injetado na massa de
um tumor gástrico humano anteriormente à cirurgia, ele torna as células T ao redor do local
capazes de se infiltrar no tumor e desenvolver uma elevada capacidade citotóxica contra ele.
Estes resultados foram encontrados com a administração durante 14 dias do PSK a pacientes
com câncer na bexiga (MIZUTANI & YOSHIDA, 1991).
Na China, um polissacarídeo ligado a peptídeos (PSP), similar ao PSK, também
isolado de Coriolus versicolor, apresentou semelhantemente uma ampla e potente atividade
antitumoral, inibindo tumores de Ehrlich, leucemia PS33 e leucemia monocítica (YANG et
al., 1992). Ele também age como um modificador da resposta biológica, estimulando a
ativação de células T e induzindo a produção de IFN-γ e IL-2 (YANG & YUN, 1999).
Outros polissacarídeos β-glucanos com propriedades antitumorais foram isolados dos
fungos Grifola frondosa (OKAZAKI et al., 1995), Isaria farinosa (JIANG et al., 2006),
Pleurotus tuberregium (TAO et al., 2006) e Sclerotinia sclerotiorum (BORCHERS et al.,
1999), assim como dos líquens Cetraria islandica (INGOLFSDOTTIR et al., 1994) e
Thamnolia subuliformis (OLAFSDOTTIR et al., 1999). Também polissacarídeos α-glucanos
sulfatados isolados de Lentinus edodes (ZHANG & CHEUNG, 2002) e de Poria cocos
(HUANG et al., 2006) têm sido estudados e apresentam também atividade antitumoral.
Os estudos clínicos têm demonstrado que os polissacarídeos modificadores da resposta
biológica são capazes de melhorar a qualidade de vida e prolongar a sobrevida dos pacientes.
Os parâmetros normalmente utilizados para avaliar a qualidade de vida são o apetite, sono,
náuseas, vômitos, dores abdominais ou diarréias (KIMURA et al., 2003; NAKANO et al.,
1999). São utilizados ainda placebos aleatórios para o controle e as vias de administração do
polissacarídeo são a via intravenosa, ou a via oral. Nesses estudos não foram observados
nenhum efeito adverso causado pelos polissacarídeos, mesmo na maior dose utilizada
(OHWADA et al., 2003).
Essas respostas biológicas promovidas pelos polissacarídeos estão relacionadas com o
padrão de expressão e os eventos moleculares que são acionados pelos seus respectivos
receptores e proteínas às quais eles se ligam. Esses receptores e proteínas são derivados do
sistema imune inato. Os polissacarídeos se ligam aos receptores de reconhecimento de padrão
(PRRs), como os receptores Toll-like (TLRs), receptores scavenger (SRs), receptores
β-
Introdução
33
glucanos, receptor do complemento do tipo 3 (CR3), receptor de manose e proteínas do
plasma das vias do complemento.
TLRs são expressos nas células mielóides (monócitos, macrófagos e células
dendríticas), além das células epiteliais, mastócitos e neutrófilos (IWASAKI &
MEDZHITOV, 2004). Dos dez tipos de TLRs identificados, sabe-se que o TLR-2 e TLR-4
reconhecem polissacarídeos modificadores da resposta biológica (BROWN et al., 2003; LI et
al., 2004). SRs são expressos em macrófagos, células dendríticas, células endoteliais e do
músculo liso (PEISER et al., 2002). Sabe-se que os SRs são responsáveis pelo
reconhecimento do fucano, um polissacarídeo sulfatado isolado de alga parda (KIM et al.,
2003). O receptor β-glucano é amplamente expresso em monócitos, macrófagos, células
dendríticas, neutrófilos, eosinófilos e linfócitos T e B (WILLMENT et al., 2005). O receptor
de manose é expresso em macrófagos, células dendríticas, células endoteliais hepáticas,
células mesangiais e células do músculo liso traqueal (SHEPHERD et al., 1991; LINEHAN et
al., 1999). Nele se ligam os polissacarídeos do tipo manano. Os receptores CR3 são
principalmente expressos em macrófagos e neutrófilos, e também em alguns subtipos de
células B e T e células natural killer (NK) (ROSS & VETVICKA, 1993).
As células mielóides, que têm um importante papel tanto no sistema imune inato
quanto o adquirido, são o principal alvo dos polissacarídeos modificadores da resposta
biológica (ESTRADA et al., 1997; LEE et al., 2001). Os efeitos estimulatórios dos
polissacarídeos sobre os macrófagos (uma das principais células mielóides) são o aumento da
fagocitose (STUART et al., 1997), da produção de espécies reativas de oxigênio (LIM et al.,
2004), da expressão de marcadores da ativação, como o receptor Fc (MATSUMOTO &
YAMADA, 1995), e da secreção de citocinas (ESTRADA et al., 1997; KODAMA et al.,
2004). Polissacarídeos modificadores da resposta biológica têm então a capacidade de
melhorar a função efetora dos macrófagos, a capacidade de processar antígenos e de modular
a imunidade adquirida através da secreção de citocinas, apresentação de antígenos e expressão
de moléculas de adesão celular. A ativação direta de outras células imunes como as células
natural killer (NK) e linfócitos são consideradas como um evento secundário (LEUNG et al.,
2006).
Polissacarídeos modificadores da resposta biológica são geralmente fortes
mitogênicos. Macrófagos, Linfócitos T e B e células NK proliferam em resposta à
estimulação com esses polissacarídeos, que é mediada através da ligação do polissacarídeo ao
Introdução
34
seu receptor correspondente. Essa ativação mitogênica é caracterizada pelo uso de proteínas
quinases (MAPKs) nos eventos de sinalização intracelular (GARCIA-LORA et al., 2003;
HAN et al., 2003). Este pode ser um fenômeno comum a todas as células imune que podem
ser estimuladas por polissacarídeos.
Outro mecanismo imunomodulatório dos polissacarídeos é o de ser anti-apoptótico.
Hwang et al. (2003) demonstrou que polissacarídeos isolados de Artemisia iwayomogi têm a
capacidade de suprimir a apoptose em esplenócitos de camundongos in vitro e in vivo. Além
da ativação celular, os polissacarídeos acionam vias do complemento do sistema imune.
Estudos demonstram que polissacarídeos que contém manano, pectina ou β-glucanos agem
através das vias do complemento (GLOVSKY et al., 1983; MICHAELSEN et al., 2000). Esta
auxilia a defesa contra patógenos de forma direta ou indiretamente através da ativação de
macrófagos. Os mecanismos pelo quais os polissacarídeos agem estão resumidos na Figura 3.
Introdução
35
Figura 3 – Ilustração esquemática do mecanismo proposto para ativação de células imunes
por polissacarídeos modificadores da resposta biológica (modificados de LEUNG et al.,
2006).
Poliossacarídeo
Complemento
Complemento
ativado
Macrófagos
Linfócitos T
Linfócitos T
Citotóxicos
Citocinas Citocinas
Linfócitos B
Anticorpos
Linfócito T
Cel. Acessórias
Células NK
Células NK
ativadas
Estimulação antigênica
Macrófagos
ativados
Agentes
Patogênicos:
• Virus
• Bactérias
• Fungos
• Parasitas
• Células
Tumorais
Introdução
36
1.3. Algas como fonte de produtos bioativos
As algas são organismos eucariotas e autótrofos, que realizam fotossíntese para
elaborar o alimento de que precisam. Fazem parte de um grupo que apresenta uma grande
diversidade de formas, abrangendo desde células microscópicas, com apenas alguns
micrômetros de diâmetro (microalgas) às algas da Antártica (macroalgas) que chegam a medir
vários metros de comprimento e possuir o peso de uma árvore (ROUND, 1973). Elas podem
ser diferenciadas de acordo com seus pigmentos, suas substâncias de reserva, componentes da
parede celular, habitat e número, posição e comprimento dos flagelos (BOLD, 1998). As três
divisões encontradas das macroalgas são: Chlorophyta, grupo formado pelas algas verdes,
sendo esta divisão a mais abundante; Phaeophyta, composta pelas algas pardas, e
Rhodophyta, que compreende as algas vermelhas.
A utilização das algas no comércio global é uma indústria que gera bilhões de dólares.
O maior uso delas é através de cultura de espécies em cativeiro para obtenção de agar,
carrageninas e alginatos. Dentre estes, os hidrocolóides têm maior significância comercial,
devido às suas propriedades de formar gel, reter água e emulsificar (RENN, 1997). Nos anos
50, as propriedades medicinais das algas eram restritas à medicina tradicional e popular
(LINCOLN et al., 1991). Entretanto, os organismos marinhos passaram a ser pesquisados
pelas suas propriedades biológicas ou farmacológicas, sendo as algas uma fonte de
aproximadamente 35% dos compostos químicos descobertos entre os anos de 1977 a 1987,
seguido de esponjas (29%) e cnidários (22%) (IRELAN et al., 1993).
A parede celular das algas marinhas contém polissacarídeos sulfatados que não são
encontrados em plantas terrestres e que possuem funções específicas na regulação iônica
(KLOAREG & QUATRANO, 1988). Nos últimos anos, polissacarídeos de algas têm sido
bastante estudados por apresentarem diversas atividades biológicas e fisiológicas.
Alguns polissacarídeos de algas vermelhas possuem atividades antivirais contra
viroses responsáveis por doenças humanas infecciosas. As mais evidentes são Aghardhiella
tenera e Nothogenia fastigiata. Polissacarídeos sulfatados isolados tanto de A. tenera
(WITVROUW et al., 1994) quanto de N. fastigiata (DAMONTE et al., 1994; KOLENDER et
al., 1995) foram testados contra o vírus HIV, vírus da Herpes do tipo 1 e 2 e vírus sincicial
respiratório. Estes apresentaram atividade durante o primeiro estágio de replicação do RNA
viral, quando o vírus entra na superfície da célula (DE CLERCQ, 1996). Um requerimento
Introdução
37
importante para a utilização de uma substância como composto farmacológico em humanos é
que ela tenha baixa toxicidade em células de mamíferos e a maioria dos polissacarídeos de
algas, inclusive destas duas espécies possuem essa característica. Polissacarídeos sulfatados
de Schizymenia pacifica (NAKASHIMA et al., 1987) inibem a enzima transcriptase reversa
do vírus HIV, enquanto os de Gracilaria corticata agem em vírus da Herpes do tipo 1 e 2
(MAZUMDER et al., 2002). Substâncias isoladas de Gigartina skottsbergii (CARLLUCI et
al., 1999) e Stenogramme interrupta (CÁRCERES et al., 2000) também apresentaram
atividade antiviral.
Fucanos são polissacarídeos sulfatados encontrados abundantemente no espaço
extracelular e na matriz mucilaginosa de algas. Fucanos de Fucus vesiculosus e Ascophyllum
nodosum foram patenteados como substâncias anticoagulantes. Eles possuem ainda atividade
antitrombótica, mediada por inibidores da coagulação como cofator II e antitrombina III
(CHURCH et al., 1989; COLLIEC et al., 1991) e inibem a interação inicial do esperma com o
óvulo humano, sendo um candidato potencial para o desenvolvimento de fármacos
microbicidas vaginais com propriedades contraceptivas (OEHNINGER et al., 1991).
Galactanas sulfatadas de Botryocladia occidentalis apresentaram um interessante efeito que
produzia uma ação anticoagulante em baixas doses e, quando a dose era aumentada, induzia a
agregação plaquetária (FARIAS et al., 2001).
Muitos polissacarídeos sulfatados de algas apresentam propriedades citotóxicas. Os
fucanos possuem atividade antitumoral, anticâncer, antimetástase e fibrinolítica quando
estudados em camundongos (COOMBE et al., 1987; MARUYAMA et al., 1987), além de
reduzirem a proliferação celular (RELIGA et al., 2000). Fucanos isolados da alga parda
Sargassum thunbergii apresentaram atividade antitumoral e antimetastática provavelmente
devido sua ação imunoestimulante e imunomoduladora (ITOH et al., 1995). Essas ações
antitumorais parecem estar relacionados com a quantidade dos grupos sulfatados na molécula
e com sua posição (KOYANAGI et al., 2003). Estudos ressaltam a importância do peso
molecular, da distribuição dos monossacarídeos constituintes e das cargas presentes como
influentes no potencial antitumoral dos polissacarídeos (ZHANG et al., 2007). Assim, a
adição de grupos sulfatos em polissacarídeos que são insolúveis em água, tornando-os assim
solúveis, é capaz de aumentar a sua atividade antitumoral (HUANG et al., 2006).
Carragenina é um termo coletivo para um grupo de polissacarídeos sulfatados,
compostos por galactanos, extraídos de algas vermelhas. Dependendo do número e posição
Introdução
38
dos grupos sulfatos, pode ser dividido em diferentes tipos, como as κ-carrageninas, ι-
carrageninas, ou λ-carrageninas (JI, 1997). Estudos com λ-carrageninas de diferentes pesos
moleculares isoladas de Chondrus ocellatus demonstraram que elas apresentavam atividade
antitumoral e imunoestimulante e que os polissacarídeos que tinham menor peso molecular
eram os que apresentavam uma maior taxa inibitória do tumor (ZHOU et al., 2004). Yuan et
al. (2005) verificou que κ-carrageninas de Kappaphycus striatum também possuem atividade
antitumoral em animais implantados com o tumor sarcoma-180 e que essa ação se deve
provavelmente à sua atividade imunomoduladora. Ogata et al. (1999) verificou que as
carrageninas são altamente pró-inflamatórias em camundongos, induzindo a produção de
TNF-α por leucócitos em resposta ao lipopolissacarídeo bacteriano.
A partir de Omphalia lapidescens, pode-se produzir 1→3:1→6-β-D-glucanos com
propriedades antitumorais (SAITO et al., 1992). Estudos realizados por Kaeffer et al. (1999)
demonstraram que polissacarídeos sulfatados de algas verdes possuem propriedades
citotóxicas ou citostáticas contra células cancerígenas do epitélio do cólon. Um polissacarídeo
sulfatado isolado de Ulva rigida, o ulvana, composto principalmente por um dissacarídeo de
ácido glucurônico e ramnose, é capaz de modular a ação de macrófagos, tendo ação
inflamatória (LEIRO et al., 2007).
Além destes, outros polissacarídeos apresentando atividade antitumoral e
imunoestimulante foram isolados das algas Porphyra yezoensis (YOSHIZAWA et al., 1993),
Gracilaria verrucosa (YOSHIZAWA et al., 1996), Marginisporum crassissimum (HIROISHI
et al., 2001), Sargassum vulgare (SOUSA et al., 2006) e Hijikia fusiforme (OKAI et al.,
1997).
Segundo Hoek et al. (1995), existem aproximadamente 5.500 espécies de algas
vermelhas (Rhodophyta). A alga Champia feldmannii Diaz-Pifferer 1977 (Figura 4) pertence
à ordem Rhodymeniales, família Lomentariaceae. As espécies pertencentes ao gênero
Champia crescem em tufos, sendo epífitas de outras algas. Apresentam coloração rósea-
cárnea, translúcidas, com ramos cilíndricos e segmentados (JOLY, 1965). No litoral brasileiro
ela pode ser encontrada no Ceará, Rio Grande do Norte, Paraíba, Pernambuco, Bahia, Espírito
Santo e Rio de Janeiro.
Poucos estudos têm sido realizados com essa alga. Apenas recentemente Assreuy et al.
(2008) começou a estudar algumas propriedades biológicas de polissacarídeos sulfatados de
C. feldmannii, avaliando modelos experimentais de inflamação, coagulação e nocicepção. O
Introdução
39
polissacarídeo sulfatado isolado desta alga apresentou um efeito pró-inflamatório, causando
edemas com pico de atividade após 1 hora de administração, além de aumentar a
permeabillidade vascular. Foi observado também um aumento do número de leucócitos na
cavidade peritonial de ratos, acompanhada por uma migração de neutrófilos. Além disso, este
polissacarídeo apresentou atividade anticoagulante e antinociceptiva. O presente trabalho
busca estudar um pouco mais sobre as propriedades biológicas do polissacarídeo sulfatado
isolado da alga C. feldmannii, com ênfase na atividade antitumoral.
Introdução
40
Figura 4 - Fotografia da alga Champia feldmannii.
Objetivos
Objetivos
42
2. OBJETIVOS
2.1. Geral
Verificar o potencial antitumoral e imunoestimulante, bem como a toxicidade do
polissacarídeo sulfatado isolado da macroalga Champia feldmannii.
2.2. Específicos
- Avaliar a citotoxicidade in vitro do polissacarídeo em células tumorais.
- Avaliar o potencial antitumoral in vivo do polissacarídeo em camundongos
transplantados com tumor Sarcoma 180.
- Avaliar a atividade imunoestimulatória do polissacarídeo, através da formação de
edema, produção de anticorpos e ativação de macrófagos.
-Determinar a toxicidade do polissacarídeo sobre alguns órgãos de camundongos,
como o baço, fígado e rins, através dos exames histopatológico, hematológico e bioquímico
do animal tratado com o polissacarídeo.
- Examinar o grau de nefrotoxicidade em sistema de perfusão renal e leito mesentérico
isolados de ratos.
Material e Métodos
Material e Métodos
44
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Materiais utilizados
3.1.1. Equipamentos
• Agitador de placa, MLW modelo Thys 2
• Agitador vortex, AD8850
• Balança analítica, GEHAKA AG200
• Balança para pesar animais, Filizola
• Banho-Maria, MOD. 105 DI DELLTA
• Centrífuga centimicro, FANEM Modelo 212
• Centrífuga de lâminas, Shandon Shoutern Cytospin
• Centrífuga de placas Eppendorf, Modelo Centrifuge 5403
• Centrífuga excelsa Baby I, FANEM Modelo 206
• Contador manual, Division of Bexton, Dickinson and Company
• Destilador de água
• Espectrofotômetro de placas, DTX 880 multimode detector, Beckman Coulter
• Fisiógrafo, Narco BioSystems
• Fluxo laminar, VECO
• Fotômetro de chama, 443 IL
• HTS (High throuput screeing biomek 3000), Beckman Coulter
• Incubadora de células (CO2 Water-Jacket Incubator), NUAIRES TS Autoflow
• Microscópio óptico, Metripex Hungray PZO-Labimex Modelo Studar lab
• Microscópio óptico de inversão, Nikon Diaphot
• Micrótomo – SLEE - MANZ BR1
Material e Métodos
45
• Osmômetro de pressão a vapor, 5100c - WESCOR
• Pipetas automáticas, Gilson
• Pletismômetro, UGO BASILI
• Transdutor, Statham P23, Gould
3.1.2. Reagentes
• Albumina bovina, Sigma
• Acetato de sódio, Vetec
• Ácido Acético, Vetec
• Ácido clorídrico (HCl), Vetec
• Ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA), Proquímios
• Aminobenzenosulfanilamida, Sigma
• Bicarbonato de Sódio, Dinâmica
• Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT), Sigma
• Cloreto de sódio (NaCl), Vetec
• Dimetilsulfóxido (DMSO), Vetec
• Eosina, Vetec
• Etanol, Vetec
• Formaldeído, Dinâmica
• Fosfato de sódio, Labsynth
• Hematoxilina, Doles
• Hidróxido de sódio (NaOH), Vetec
• Meio de cultura para células RPMI, Cultilab
• N-naftil-etilenodiamino (Need)
• Solução salina, Vetec
Material e Métodos
46
• Soro fetal bovino (SFB), Cultilab
3.1.3. Fármacos
• Carragenina, FMC
• 5 – Fluorouracil, Sigma
• Gentamicina, Novafarma
• Zimosan, Sigma
3.1.4. Células
As células utilizadas no ensaio de citotoxicidade estão listadas quanto ao tipo
histológico e origem na tabela 1. Todas as linhagens são pertencentes ao Laboratório de
Oncologia Experimental da Universidade Federal do Ceará.
Tabela 1 - Linhagens tumorais utilizadas no ensaio de citotoxicidade in vitro.
Linhagem Tipo Histológico Origem
HL-60 Leucemia promielocítica
humano
HCT-8 Carcinoma de cólon humano
MDA- MB435 Melanoma humano
SF-295
Carcinoma do sistema
nervoso
humano
Material e Métodos
47
3.2. Coleta e limpeza do material
A alga marinha vermelha Champia feldmannii foi coletada na Praia do Pacheco,
Município de Caucaia - Ceará, durante as marés de sizígia. Em seguida, transportada em saco
plástico até o laboratório, sendo cuidadosamente separada das epífitas e lavada com água
destilada para a retirada de impurezas. Após a limpeza, a alga foi desidratada à luz solar e
cortada em pequenos pedaços para, posteriormente, ser submetida ao processo de extração.
3.3. Extração dos polissacarídeos
A extração foi realizada a partir do tecido seco, previamente cortado e hidratado com
100 mL de tampão acetato de sódio 0,1M, pH 5,0 + EDTA 5mM + cisteína 5mM. Em
seguida, adicionou-se 6,8 mL de uma solução de papaína (30 mg/mL), sendo a mistura
incubada a 60 ºC por 24 horas.
Após esse período, a mistura foi filtrada e centrifugada (14.000 rpm; 20 min; 4ºC),
separando-se o resíduo do sobrenadante. Ao sobrenadante, foram adicionados 6,4 mL de
solução à 10% de cloreto de cetilpiridino (CPC) para precipitar os polissacarídeos sulfatados
por 24 horas, à temperatura ambiente. Após a precipitação, os polissacarídeos sulfatados
foram centrifugados, descartando-se o sobrenadante. O precipitado foi lavado com 200 mL
de CPC 0,05% e, posteriormente, dissolvido em 70 mL de uma solução de NaCl 2M:etanol
(100:15; v:v). Em seguida, os polissacarídeos foram novamente precipitados com a adição
de 122 mL de etanol absoluto, por 24 horas a 4°C.
Finalmente, os polissacarídeos sulfatados foram lavados duas vezes com 200 mL de
etanol 80% e uma vez com 122 mL de etanol absoluto, sendo levados à estufa a 60ºC para
secagem, obtendo-se os polissacarídeos sulfatados (Figura 5).
Material e Métodos
48
ALGA DESIDRATADA
Hidratação (tampão AcNa pH 5.0 + EDTA 5mM + cis 5mM)
Digestão - Papaína (30mg/mL) à 60 ºC por 24 h
Resíduo (re- extração) Sobrenadante
Precipitação (CPC 10%; 24 h)
Lavagem (CPC 0,05%)
NaCl 2M: etanol absoluto (100:15;v:v)
Precipitação (etanol absoluto; 24 h; 4 ºC)
Precipitado Sobrenadante
Lavagem (etanol 80%; 2x)
Lavagem (etanol absoluto; 1x)
Secagem em estufa (60
ºC; 24h)
Polissacarídeos sulfatados totais
Figura 5 - Fluxograma de extração de polissacarídeos sulfatados.
Material e Métodos
49
3.4. Fracionamento dos polissacarídeos sulfatados
O extrato bruto foi submetido a uma cromatografia de troca iônica em coluna de
DEAE-celulose. A coluna foi equilibrada com tampão acetato de sódio 0,1M, pH 5,0 + EDTA
5mM + cisteína 5mM e o fluxo mantido em 60mL/h. Em todas as cromatografias, foi aplicada
uma amostra de 1 mL de uma solução contendo 1 mg/mL de extrato bruto de polissacarídeos.
A eluição da coluna foi realizada, passo a passo, com o tampão de equilíbrio contendo cloreto
de sódio na concentração de 0,2 a 2 M. O rendimento foi de 36,2%.
3.5. Atividade citotóxica in vitro
3.5.1. Ensaio do MTT
Este ensaio pode ser utilizado para determinar citotoxicidade, proliferação e ativação
celular. É uma análise colorimétrica que quantifica indiretamente as células viáveis, baseada
na redução do sal 3-(4,5-dimetiltiazol-2l)-2,5-difeniltetrazolium bromida (MTT), um
composto de cor amarela, a formazan, de coloração púrpura, pelos substratos celulares
NADH, NADPH e Succinato (MOSSMAN, 1983). No presente trabalho, este ensaio foi
utilizado para monitoramento da atividade do polissacarídeo sulfatado isolado de C.
feldmannii (Cf-PLS) em diferentes linhagens celulares tumorais (HL-60 - leucemia
promielocítica, HCT-8 – carcinoma de cólon, SF-295 – glioblastoma e MDA-MB-435 –
melanoma).
3.5.1.1. Manutenção das Células
As células foram cultivadas em frascos plásticos para cultura (75cm², volume de
250mL); o meio de cultura RPMI 1640 foi utilizado, complementando com 10% de soro fetal
bovino e 1% de antibióticos. As células foram incubadas em estufa a 37°C com atmosfera de
5% de CO
2
, sendo observado o crescimento celular com ajuda de microscópio de inversão a
cada 24 horas. Quando necessário, as células eram repicadas em meio de cultura novo, em
uma concentração de 0,5-1,0 x 10
6
células/mL.
Material e Métodos
50
3.5.1.2. Procedimento Experimental
As células em suspensão foram plaqueadas em multiplacas de 96 cavidades numa
densidade de 3 x 10
5
células/mL. A substância teste foi incubada durante 72 horas juntamente
com a suspensão de células em concentrações que variam de 0,5 a 100 µg/mL. Após o
período de incubação, as placas foram centrifugadas (1500 rpm/15 min), e o sobrenadante
descartado. Cada cavidade recebeu 200µL da solução de MTT a 0,5 mg/mL, sendo
reincubada por mais 3 horas, em estufa a 37°C e 5% CO
2
. Após esse período, as placas foram
novamente centrifugadas (3000 rpm/10min), o sobrenadante desprezado e o precipitado
ressuspendido em 150µL de solução salina. Para a quantificação do sal reduzido nas células
vivas, as absorbâncias foram lidas com o auxílio do fluorímetro, no comprimento de onda de
550nm.
3.5.1.3. Análise dos Dados
O experimento foi analisado segundo suas médias e respectivos erros-padrão.
3.6. Estudo da atividade antitumoral in vivo
3.6.1. Obtenção e manutenção dos animais
Os testes foram realizados utilizando camundongos (Mus musculus Swiss) fêmeas
pesando entre 25-30g oriundos do biotério central da Universidade Federal do Ceará,
mantidos com água e alimento ad libitum. O manejo deles procurou seguir todos os princípios
éticos, de forma a amenizar ao máximo o sofrimento dos animais. Foi utilizado o tumor
Sarcoma 180.
O animal de manutenção foi anestesiado com éter etílico e sacrificado por meio de
deslocamento cervical. O procedimento asséptico foi feito com álcool iodado e coletado o
líquido ascítico da cavidade abdominal, sendo preparada uma suspensão de células com 5,0
mL de solução de Ringer lactato, 0,2 mL de gentamicina (5 mg/mL) e 0,5 mL do líquido
ascítico para posterior contagem das células. Os animais receptores foram inoculados com 2 x
10
6
células/0,5 mL na região intraperitoneal.
Material e Métodos
51
3.6.2. Procedimento experimental
Foram injetadas 2 x 10
6
células/0,5 mL na região axilar esquerda em 6 grupos de
camundongos, cada um com 8 animais. Após 24h de inoculação do tumor, foi iniciado o
tratamento durante 7 dias consecutivos, utilizando 10 e 25 mg/Kg/dia dos polissacarídeos,
10mg/Kg/dia dos polissacarídeos associados a 10mg/Kg/dia de 5-Fluorouracil (5-FU), 10
mg/Kg de 5-Fluorouracil para o controle positivo e solução salina para o controle negativo.
Todos os grupos foram tratados pela via intraperitoneal. Após 24h do término do tratamento
os animais foram sacrificados e retirados os tumores, rins, fígado e baço para pesagem e
análise histológica. O percentual de inibição do crescimento tumoral (IT) foi calculado pela
fórmula: IT (%) = [(A-B)/A] x 100, onde A é a média dos pesos dos tumores no grupo
controle e B, a média dos pesos dos tumores nos animais tratados.
3.6.3. Análise dos dados.
Os dados foram analisados a partir da média e do erro padrão da média de n animais.
Para verificação de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os dados foram
comparados por análise de variância (ANOVA) seguida do teste de Student Newman Keuls (p
< 0,05).
3.6.4. Análise morfológica e histopatológica
A técnica usada nessa análise foi a da coloração por hematoxilina e eosina (H/E), que
permite diferenciar o citoplasma do núcleo e assim, analisar as estruturas celulares e
identificar possíveis alterações que possam estar ocorrendo. Essa análise morfológica e
histopatológica pode então fornecer dados para sugerir os efeitos tóxicos causados pela droga.
3.6.4.1. Procedimento experimental
Após o sacrifício dos animais, foram retirados e pesados o fígado, baço, rins e tumor,
os quais foram armazenados em formol 10% e em seguida seccionado em pedaços pequenos
para posterior preparação das lâminas. O material foi fixado em formol 10% por um período
de 24 horas, em seguida desparafinizado em xilol por 15 minutos, e desidratado em
concentrações crescentes de álcool até 70%, com o mergulho rápido das lâminas, sendo
Material e Métodos
52
posteriormente lavadas em água destilada até ser removido todo o álcool. Em seguida, as
lâminas foram coradas com hematoxilina 0,1%.
3.6.4.2. Análise dos dados
As lâminas contendo as células coradas foram levadas ao microscópio para avaliação
de suas características morfológicas e comparadas ao controle (não-tratadas).
3.6.5. Determinação dos parâmetros hematológicos e bioquímicos
A determinação dos parâmetros hematológicos serve para avaliar possíveis mudanças
na concentração de leucócitos totais e na contagem diferencial de leucócitos (linfócitos,
monócitos, neutrófilos e eosinófilos). Os testes bioquímicos são utilizados para avaliar a
função renal através dos parâmetros séricos de dois marcadores da integridade renal, a uréia e
a creatinina. Para investigação de dano no hepatócito é determinada, no soro dos animais, a
atividade da alanina amino transaminase (ALT), enzima de elevada atividade no hepatócito,
portanto importante como marcador de dano neste órgão.
3.6.5.1. Procedimento experimental
Após 24 horas do término do tratamento, o sangue foi coletado do plexo orbital,
imediatamente antes do sacrifício dos animais. Em seguida, foram colocados 20µL de sangue
em 380µL de solução de Turk para contagem total de leucócitos em câmara de Newbauer em
microscópio ótico. Para a contagem diferencial de leucócitos foram feitas lâminas do sangue,
que foram submetidas à contagem em microscópio ótico.
Para análise bioquímica foram utilizados kits da LABTEST® sistemas para
diagnóstico, seguindo-se a metodologia descrita por este fabricante.
3.6.5.2. Análise dos dados
Os efeitos nos parâmetros hematológicos e bioquímicos foram avaliados utilizando o
programa Prisma versão 4.0 (GraphPad Software). Os dados foram analisados a partir da
média e do erro padrão da média.
Material e Métodos
53
3.7. Atividade Imunoestimulatória
3.7.1. Atividade edematogênica
O teste do edema de pata em ratos é realizado a fim de avaliar uma possível atividade
inflamatória da substância teste, através da medição do volume do edema formado na pata
traseira do animal.
3.7.1.1. Procedimento experimental
O volume da pata traseira esquerda de cada animal foi medido usando um pletismômetro
antes da injeção do estímulo inflamatório (tempo zero). Em seguida, foi injetado 0,1 ml do
estímulo por via sub-plantar nos animais nessa mesma pata. O grupo controle recebeu salina
estéril, como controle positivo foi usado a carragenina (300µg/pata) e os grupos do
polissacarídeo receberam 500, 1000 e 1500µg/pata (n=6). O volume da pata foi avaliado após
30 minutos, 1, 2, 3 e 4 horas da injeção do polissacarídeo, usando o mesmo pletismômetro.
Foram utilizados esses tempos de medição já que o pico do edema induzido pela carragenina
ocorre na 3ª hora após a injeção desse estímulo e ela também é um polissacarídeo obtido de
alga. O edema foi calculado como a variação de volume, isto é, a diferença entre o volume em
um determinado tempo após o estímulo e o volume da pata antes do estímulo inflamatório
(tempo zero).
3.7.1.2. Análise dos dados
Os dados foram analisados a partir da média e do erro padrão da média de n animais.
Para verificação de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os dados foram
comparados por análise de variância (ANOVA) seguida de Student Newman Keuls (p <
0,05).
Material e Métodos
54
3.7.2. Imunização subcutânea
A imunização subcutânea em camundongos foi realizada para avaliar a ação
imunoadjuvante e imunoestimulante do polissacarídeo, através da quantificação de anticorpos
totais (Ig total) e específicos (IgE, IgG1 e IgG2a) presentes no soro do animal imunizado.
3.7.2.1. Procedimento experimental
Quatro grupos de 8 camundongos Mus musculus Swiss foram imunizados
subcutaneamente com salina, Cf-PLS (40 mg/kg), ovalbumina (2 mg/kg), ou ovalbumina (2
mg/kg) mais o Cf-PLS (40 mg/kg). Os camundongos tiveram o sangue colhido do plexo retro-
orbital para obtenção do soro antes da imunização e após 7, 14 e 21 dias. Os anticorpos totais
e específicos foram detectados por reação enzimática através do ensaio de imunoabsorbância
(ELISA). A fim de avaliar a capacidade do Cf-PLS de elevar a resposta induzida pela
ovalbumina (OVA), anticorpos totais (Ig) contra o grupo imunizado apenas com a OVA ou
com a OVA mais o Cf-PLS foram determinados utilizando-se placas contendo 50 µg/poço de
OVA. Para avaliar as propriedades imunoestimulantes do Cf-PLS, os anticorpos IgE, IgG1 e
IgG2a, contra o grupo imunizado com o Cf-PLS, foram determinados usando placas contendo
50 µg/poço de Cf-PLS. As placas foram incubadas por 1h a 37°C e lavadas com 0,05% de
PBS-tween por três vezes. As placas foram em seguida bloqueadas com leite desnatado 5%
em 10mM de PBS, pH 7,2 e NaCl 0,9% por 2h a 37°C. Em seguida as placas foram lavadas e
adicionou-se 100 µL do soro diluído em PBS e foi re-incubada por 2h a 37°C. As placas
foram novamente lavadas com PBS-Tween 0,05% e tratadas com imunoglobulinas
conjugadas antimouse rabit (100 µL/poço, diluição final 1:1000) por 2h à temperatura
ambiente. As placas foram então lavadas três vezes com PBS-Tween. A reação foi
desenvolvida pela adição de orto-fenilenidiamina seguida de incubação por 20min a 37°C. O
resultado da intensidade da coloração foi lido a 450nm.
3.7.2.2. Análise dos dados
As leituras foram analisadas no programa Prisma 4.0 através do teste de análise de
variância (ANOVA) seguida de Student Newman Keuls (p < 0,05).
Material e Métodos
55
3.7.3. Ativação de macrófagos in vitro
Foi feita uma cultura primária a partir de macrófagos retirados da cavidade peritoneal
de camundongos Swiss fêmeas (Mus musculus). Os animais foram mantidos com ração
apropriada e água ad libitum.
Para a obtenção dos macrófagos, os camundongos foram inoculados com 2 mL de
tioglicolato 3% envelhecido a fim de estimular os macrófagos periféricos. Três dias depois os
animais foram sacrificados por asfixia, com éter etílico em câmara de vidro. Em seguida foi
feita assepsia com álcool 70% e a cavidade peritoneal foi lavada com 5 mL de meio de cultura
RPMI completo. Após uma leve massagem foi feita uma incisão com bisturi para coleta do
líquido com seringas de 3 mL. Posteriormente, as células foram centrifugadas a 1.000 rpm por
5 minutos. O sobrenadante foi desprezado e o “pellet” de células foi ressuspenso em meio
RPMI completo. A contagem de células foi realizada em câmara de Neubauer, e a seguir, as
células foram plaqueadas em placa de cultura estéril com 1 mL por poço e colocadas para
aderir durante uma hora a 37°C em atmosfera de 5% de CO
2
. Após esse período o
polissacarídeo foi incubado nas concentrações de 1, 10 e 100 µg/mL durante 1h. Como
controle negativo, foi utilizado salina e como controle positivo, o zimosan 10 µg/mL. Em
seguida a placa foi lavada, para retirada da droga, e adicionado mais 2 mL de meio RPMI
completo para uma última incubação de 3h, onde depois foi retirado o sobrenadante utilizado
nos testes seguintes. Todo o procedimento foi cuidadosamente elaborado de forma
apirogênica.
3.7.4. Tratamento de Sarcoma-180 com sobrenadante de macrófagos ativados
Este teste busca avaliar a capacidade da substância teste em induzir a ativação de
macrófagos em cultura, que irá liberar no seu sobrenadante substâncias como citocinas, como
por exemplo, TNF-α e IL-1. Essas substâncias presentes no sobrenadante seriam capazes de
ativar outros macrófagos e inibir o crescimento tumoral em camundongos transplantados com
Sarcoma-180.
3.7.4.1. Procedimento experimental
Foram injetadas 2 x 10
6
células/0,5 mL na região axilar esquerda nos grupos de
camundongos fêmeas Swiss, cada um com 8 animais. Após 24h de inoculação do tumor, foi
Material e Métodos
56
iniciado o tratamento durante 7 dias consecutivos, utilizando 1mL do sobrenadante dos
macrófagos ativados com 10 e 100 µg/mL de Cf-PLS ou com zimosan (10 µg/mL) para o
controle positivo e solução salina para o controle negativo. Todos os grupos foram tratados
por via intraperitoneal. Após 24h do término do tratamento os animais foram sacrificados e
retirados os tumores para pesagem. O percentual de inibição do crescimento tumoral (IT) foi
calculado pela fórmula: IT (%) = [(A-B)/A] x 100, onde A é a média dos pesos dos tumores
no grupo controle e B, a média dos pesos dos tumores nos animais tratados.
3.7.4.2. Análise dos dados.
Os dados foram analisados a partir da média e do erro padrão da média de n animais.
Para verificação de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os dados foram
comparados por análise de variância (ANOVA) seguida de Student Newman Keuls (p <
0,05).
3.7.5. Migração de neutrófilos
Este teste busca avaliar a capacidade da substância teste de induzir uma elevação na
migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal do animal, mostrando assim uma ação
imunoestimulante.
3.7.5.1. Procedimento experimental
Foram injetados intraperitonealmente, em camundongos Swiss fêmeas, 100 µL do
sobrenadante dos macrófagos previamente estimulados com salina, zimosan ou Cf-PLS nas
concentrações de 1, 10 e 100 µg/mL. Após quatro horas, os animais foram sacrificados com
éter etílico e tiveram a cavidade peritoneal lavada com 2 mL da solução de PBS heparinizado.
Após uma leve massagem foi feita uma incisão com bisturi para coleta do líquido com pipeta
Pasteur. As contagens total e diferencial foram feitas de acordo com o método descrito por
Souza & Ferreira em 1985.
Do líquido colhido, 20µL foram diluídos em 380 µL de solução de Turk (1:20 v/v) e
utilizados para contagem total de células em câmara de Neubauer. Para contagem diferencial
de células, 80
µL do exsudato foram colocados em citocentrífuga (2800 rpm/ 10 min). Em
Material e Métodos
57
seguida, as lâminas foram coradas com corante hematoxilina/eosina (HE). A contagem foi
realizada em microscópio óptico, com objetiva de imersão (aumento de 100x). Foram
contadas 100 células por lâmina e o número total de neutrófilos foi estimado calculando-se as
percentagens com relação ao número total de leucócitos encontrados.
3.7.5.2. Análise dos dados
Os dados foram avaliados através do teste de análise de variância (ANOVA) seguida
de Student Newman Keuls (p < 0,05).
3.7.6. Produção de NO
Devido ao tempo de meia vida do óxido nítrico ser muito curto, a determinação da
produção deste radical por macrófagos é mensurada através formação do nitrito (NO
2-
), um
produto de degradação estável e não volátil. A dosagem de nitrito foi realizada pelo método
de Griess, no qual o princípio de reação é baseado na formação de um azo composto. Neste
método, o nitrito primeiramente reage com a sulfanilamida em meio ácido para formar um
composto intermediário, o sal de diazônio. Em seguida, este sal reage com N-naftil-
etilenodiamina (NED) formando um composto azo estável de coloração púrpura, podendo
assim ser analisado em espectrofotômetro em comprimento de onda de 550 nm (GREEN et
al., 1982; SUN et al., 2003).
3.7.6.1. Procedimento experimental
Neste trabalho foi utilizado o seguinte protocolo para a dosagem de nitrito: o reagente
de Griess foi preparado pela mistura de duas soluções na proporção 1:1, imediatamente antes
do uso. A primeira solução era constituída por N-naftil-etilenodiamino 0,1% (p/v) em ácido
orto-fosfórico 5% (v/v) e a outra solução por sulfonamina paminobenzeno 1% (p/v) em ácido
fosfórico 5% (v/v) (GREEN et al., 1982). Em uma placa de 96 poços foram colocados 100 µL
do sobrenadante dos macrófagos previamente estimulados com salina, zimosan ou Cf-PLS
nas concentrações de 1, 10 e 100 µg/mL. Em seguida adicionou-se em cada poço 100 µL do
reagente de Griess. Após dez minutos, a absorbância foi medida em 550 nm e comparado com
uma curva padrão de NaNO
2
.
Material e Métodos
58
3.7.6.2. Análise dos dados
Os dados foram avaliados através do teste de análise de variância (ANOVA) seguida
de Student Newman Keuls (p < 0,05).
3.8. Perfusão de rim isolado
3.8.1. Obtenção e manutenção dos animais
Os testes foram realizados utilizando ratos Wistar adultos e machos, pesando entre
250-300g oriundos do biotério central da Universidade Federal do Ceará. Os animais foram
mantidos em jejum 8 a 12 horas antes dos experimentos, com água ad libitum. O manejo deles
procurou seguir todos os princípios éticos, de forma a amenizar ao máximo o sofrimento dos
animais.
3.8.2. Sistema de perfusão
A técnica utilizada para avaliar os mecanismos de controle da função renal usa um
sistema de perfusão de rim isolado com recirculação (FONTELES et al., 1983) com dois
subsistemas, um in situ e outro em circuito fechado, para perfusão in vitro, ambos mantidos à
temperatura de 37°C. O sistema utilizado permite a manutenção constante dos parâmetros
funcionais renais, com o uso de albumina na solução perfusora, mantendo constantes as
substâncias dialisáveis, e com oxigenação adaptada ao próprio sistema (Figura 6).
Material e Métodos
59
Figura 6: Desenho esquemático do sistema de perfusão de rim isolado (LAFAVET).
Fluxômetro
Seringa
Oxigenador
Catabolhas
Manômetro
Cânula
arterial
Coletor
de urina
Aquecedor
O
2
/CO
2
Filtro
Bomba
Aquecedor
Material e Métodos
60
3.8.2.1. Calibração do sistema
O sistema foi calibrado sempre antes do início dos experimentos. Foi avaliado em cada
uma das bombas a pressão de perfusão (PP) em mmHg, o fluxo urinário (mL/min) e o volume
de urina coletado em um minuto (mL/min). Os resultados estão demonstrados nas figuras 7, 8
e 9.
0 1 2 3 4 5
0
20
40
60
80
100
Bomba
PP (mmHg)
Figura 7: Valores de pressão de perfusão (PP) registrados durante a calibração do sistema
(n=6).
0 1 2 3 4 5
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
Bomba
Fluxo (mL/min)
Figura 8
: Valores registrados pelo Fluxômetro (L/h) durante a calibração do sistema (n=6).
Material e Métodos
61
0 1 2 3 4 5
0
10
20
30
40
50
60
Bomba
Volume urinário
(mL/min)
Figura 9
: Valores de volume urinário (mL/min) registrados durante a calibração do sistema
(n=6).
3.8.2.2. Solução perfusora
A solução perfusora utilizada foi Krebs-Henseleit, contendo 114,0mM de NaCl;
4,96mM de KCl; 1,24mM de KH
2
PO4; 0,5mM de MgSO4.7H2O; 24,99mM de NaHCO
3
;
2,10mM de CaCl
2
.2H
2
O e 3,60mMde glicose, adicionada de albumina a 6g%, e dialisada por
48 horas antes do experimento para retirar substâncias contaminantes como citrato, piruvato e
lactato (HANSON & BALLARD, 1968).
3.8.2.3. Técnica cirúrgica
Os animais foram anestesiados com pentobarbital sódico na dose 50 mg/Kg. Em
seguida a veia femoral foi isolada e foi administrado 100 mg de manitol, um diurético, para
facilitar a fixação da cânula ao ureter.
Após assepsia da parede abdominal, foi feita uma incisão mediana e duas incisões
perpendiculares à linha alba, para permitir uma melhor observação das estruturas anatômicas.
Em seguida a artéria mesentérica superior foi identificada e dissecada, assim como o
ureter e a glândula supra-renal. O rim direito foi desencapsulado e a glândula supra-renal
isolada. A cânula arterial renal foi introduzida na artéria mesentérica superior até alcançar a
artéria renal, onde foi feita sua fixação (Figura 10).
Material e Métodos
62
Logo no início do procedimento cirúrgico, uma parte da solução já oxigenada (40 mL)
foi desviada para o sistema de perfusão in situ, para poder perfundir o rim ainda in vivo, a fim
de evitar isquemia ao órgão. O rim foi então transportado para o sistema de perfusão in vitro,
sem a interrupção do fluxo.
Material e Métodos
63
Figura 10:
Procedimento cirúrgico para retirada de rim isolado de rato. A: isolamento da
artéria femural; B: isolamento e fixação da cânula ao ureter; C: isolamento das artérias
mesentérica e renal; D: cânula fixada à artéria renal (LAFAVET-UFC).
Material e Métodos
64
3.8.2.4. Procedimento experimental
Os experimentos foram iniciados após a estabilização e adaptação do órgão às novas
condições. Os primeiros 30 minutos foram utilizados como controle interno do experimento.
Após esse período inicial, adicionou-se Cf-PLS na concentração de 10 µg/mL (n=6 por dose).
A cada cinco minutos foram registrados a pressão de perfusão em um manômetro, e o fluxo
de perfusão através de um fluxômetro, por um período total de 120 minutos. As amostras de
urina e perfusato foram coletadas a cada dez minutos, e em seguida congeladas a -20°C, para
posterior dosagem de sódio, potássio, cloreto, inulina e osmolaridade, importantes na
determinação dos parâmetros da função renal.
3.8.2.5. Análises bioquímicas
Nas amostras de urina e perfusato foram realizadas dosagens de sódio e potássio pelo
método de fotometria de chama. As dosagens de cloreto foram realizadas utilizando o kit de
dosagem do fabricante (Labtest). A inulina presente no perfusato e na urina foi determinada
por hidrólise direta, conforme Walser et al., 1955; Fonteles et al., 1983, com algumas
modificações. A osmolaridade das amostras de urina e de perfusato foi medida através de
osmômetro de pressão a vapor. Os testes bioquímicos para determinação de uréia e creatinina
foram realizados por técnica enzimático-colorimétrica, de acordo com as recomendações do
fabricante (Labtest). Todos os testes bioquímicos foram realizados no Departamento de
Análises Clínicas e Toxicológicas da Universidade Federal do Ceará e na Unidade de
Pesquisas Clínicas.
3.8.2.6. Cálculos de parâmetros funcionais renais
A tabela 2 apresenta as fórmulas utilizadas para determinação dos parâmetros
funcionais renais (MARTINEZ-MALDONADO et al., 1978).
Material e Métodos
65
Tabela 2
: Cálculos para determinação de parâmetros funcionais renais.
1. FU (mL.g
-1
.min
-1
) = Fluxo Urinário
FU = Peso do volume urinário/ Peso do rim esquerdo x 10
2. PP (mmHg) = Pressão de perfusão
* Obtida diretamente através da análise em manômetro de mercúrio.
3. FPR (mL.g
-1
.min
-1
) = Fluxo plasmático renal ou fluxo de perfusão
* Fluxo registrado a cada 10min/ intervalo de tempo x Peso do rim.
4. RVR (mmHg/mL.g
-1
.min
-1
) = Resistência vascular renal
RVR = PP (mmHg) / FPR
5. RFG (mL.g
-1
.min
-1
) = Ritmo de filtração glomerular
RFG =DOUin/ DOPin x FU, sendo DOUin = Densidade ótica da inulina na urina e DOPin =
Densidade ótica da inulina no perfusato
6. FNa
+
= (µ
µµ
µEq.g
-1
.min
-1
) = Sódio filtrado
FNa
+
= RFG x PNa
+
, onde PNa
+
= Concentração de sódio no perfusato
7. ENa
+
= (µ
µµ
µEq.g
-1
.min
-1
) = Sódio excretado
ENa
+
= FU x UNa
+
, onde UNa
+
= Concentração de sódio na urina
8. TNa
+
= (µ
µµ
µEq.g
-1
.min
-1
) = Sódio transportado
TNa
+
= FNa
+
- ENa
+
9. %TNa
+
= Percentual de sódio transportado
%TNa
+
= TNa
+
x 100/FNa
+
10. Cosm (mL.g
-1
.min
-1
) = Clearance osmótico
Cosm = (Uosm / Posm ) x FU, onde Uosm = Osmolaridade Urinária e Posm = Osmolaridade
do perfusato
11. FK
+
= (µ
µµ
µEq.g
-1
.min
-1
) = Potássio filtrado
FK
+
= RFG x PK
+
, onde PK
+
= Concentração de potássio no perfusato
12. EK
+
= (µ
µµ
µEq.g
-1
.min
-1
) = potássio excretado
EK
+
= FU x UK
+
, onde UK
+
= Concentração de potássio na urina
13. TK
+
= (µ
µµ
µEq.g
-1
.min
-1
) = potássio transportado
TK
+
= FK
+
- EK
+
14. %TK
+
= Percentual de potássio transportado
%TK
+
= TK
+
x 100/FK
+
15. TCl
-
= (µ
µµ
µEq.g
-1
.min
-1
) = Cloreto transportado
TCl
-
= FCl
-
- ECl
-
16. %TCl
-
= Percentual de cloreto transportado
%TCl
-
= TCl
-
x 100/FCl
-
Material e Métodos
66
3.8.2.7. Estudo histológico
Ao final de cada experimento foi retirado um fragmento longitudinal do rim direito
(perfundido) e do rim esquerdo (não perfundido), os quais foram armazenados em formol
10% para posterior exame histológico. Os fragmentos foram desidratados e diafanizados, e
em seguida cortados em espessuras de 5µm, para serem feitas as lâminas. Estas foram coradas
com hematoxilina-eosina (HE) e analisadas em microscópio ótico. Para controle dos rins
perfundidos, foi feita também uma análise destes com apenas solução de Krebs-Henseleit
modificada.
3.9. Perfusão de leito vascular isolado
O sistema de perfusão do leito vascular isolado é um método utilizado para avaliar se a
substância teste possui alguma atividade diretamente nos vasos sanguíneos.
3.9.1. Procedimento experimental
O experimento seguiu a metodologia descrita por Mcgregor (1965). Ratos Wistar
machos, pesando entre 280-350g foram anestesiados com pentobarbital sódico (50 mg/Kg).
Após terem seus abdomens abertos, a artéria mesentérica superior foi isolada e canulada com
uma cânula de polietileno (PE20). O intestino foi separado do leito mesentérico e em seguida
o mesentério foi perfundido em sistema aberto (Figura 11), com solução de Krebs-Henseleit,
contendo: 114,0mM de NaCl; 4,96mM de KCl; 1,24mM de KH
2
PO
4
; 0,5mM de
MgSO
4
.7H
2
O; 24,99mM de NaHCO
3
; 2,10mM de CaCl
2
.2H
2
O e 3,60mM de glicose. A
solução foi mantida a 37°C e o leito perfundido a um fluxo constante (4 mL/min), enquanto a
variação de pressão foi mensurada pela média das pressões de perfusão através de um
transdutor conectado ao sistema. As variações na pressão de perfusão foram registradas
continuamente por um fisiógrafo quatro-canais. Com isso foi avaliado o efeito vascular do Cf-
PLS isolado de Champia feldmannii (10µg/mL/min; n=6), infundido a uma taxa constante de
0,1mL/min, comparado com a infusão do veículo sozinho.
Material e Métodos
67
Figura 11
: Desenho esquemático do sistema de perfusão de leito vascular mesentérico
(LAFAVET-UFC).
Material e Métodos
68
3.9.2. Análise dos dados
Os dados foram analisados a partir da média e do erro padrão da média de seis
experimentos em cada grupo. Para verificação de diferenças significativas entre os diferentes
grupos, os dados foram comparados por teste t de Student ou análise de variância (ANOVA)
seguida do teste de Mann-Whitney (p < 0,05).
Resultados
Resultados
70
4. RESULTADOS
4.1. Atividade citotóxica
in vitro
O polissacarídeo sulfatado isolado de Champia feldmannii não apresentou atividade
citotóxica in vitro contra as células das linhagens tumorais HL-60, HCT-8, MDA- MB435 e
SF-295 através do método do MTT até a maior concentração testada (25 µg/mL).
4.2. Estudo da atividade antitumoral
in vivo
4.2.1. Inibição tumoral
A atividade antitumoral in vivo foi determinada utilizando-se o modelo experimental
Sarcoma 180. A massa úmida dos tumores dos animais controle (salina) foi de 2,16 ± 0,21g.
O grupo controle positivo, tratado com o 5-Fluorouracil na dose de 10 mg/Kg/dia, apresentou
a média da massa úmida dos tumores em 1,11 ± 0,22g. Nos animais tratados com Cf-PLS, as
massas foram de 1,10 ± 0,10g para a dose de 25 mg/Kg/dia e de 1,12 ± 0,18g para os animais
tratados com a menor dose, de 10 mg/Kg/dia. A massa do tumor foi de 0,68 ± 0,17g no grupo
onde houve uma combinação de Cf-PLS com o 5-Fluorouracil, ambos na dose de 10
mg/Kg/dia. Todas essas inibições foram significativas (p < 0,05). Nos animais tratados com o
5-Fluorouracil a inibição tumoral foi de 48,66%. Os percentuais de inibição tumoral para o
Cf-PLS foram de 48,16% e 48,62% nas doses de 10 e 25 mg/Kg/dia respectivamente. Já no
tratamento do Cf-PLS combinado com o 5-Fluorouracil, ambos na dose de 10 mg/Kg/dia, o
percentual de inibição foi de 68,32% (Figura 12).
Resultados
71
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
*
*
*
5-FU - 10 - - 10
Cf-PLS - - 25 10 10
(mg/kg)
(mg/kg)
*
Tumor (g)
Figura 12 -
Efeito do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii
(Cf-PLS) sobre a massa tumoral de camundongos transplantados com Sarcoma 180. O
controle negativo foi tratado com o veículo para diluir a droga (salina). O 5-Fluorouracil (10
mg/Kg/dia) foi usado como controle positivo (5-FU). Os dados apresentam a média ± E.P.M.
* (p < 0,05) quando comparado com o grupo salina por ANOVA seguido por Newman-Keuls
(n = 8).
Resultados
72
4.2.2. Análise morfológica e histopatológica
Após o tratamento com Cf-PLS, os pesos dos rins e fígados não mostraram diferenças
significantes em nenhuma das doses utilizadas quando comparados com o grupo controle,
enquanto os pesos dos baços dos animais tratados com Cf-PLS nas duas doses (10 e 25
mg/Kg/dia) mostraram um aumento percentual significativo, de 91,7% e 105%
respectivamente (p < 0,05) (Tabela 3).
As análises histopatológicas dos tumores retirados de camundongos tanto do grupo
dos animais com o tumor tratados com salina, como dos outros grupos analisados mostraram
neoplasia maligna constituída por células redondas e ovaladas, pleomórficas, com
anisocariose e bi-nucleação em escasso estroma. Há áreas de necrose de coagulação nos
grupos tratados com Cf-PLS e no caso do grupo Cf-PLS combinado com o 5-Fluorouracil
houve invasão celular (Figura 13).
As análises histopatológicas dos fígados revelaram a presença de congestão portal e da
veia centrolobular no grupo tratado com o 5-FU, além de hiperplasia das células de Kupffer e
intensa tumefação dos hepatócitos, com focos discretos de esteatose em microgotas. Nos
grupos tratados com Cf-PLS, houve a presença de alterações passíveis de reversão
representadas por tumefação dos hepatócitos, hiperplasia das células de Kupffer, focos
inflamatórios e algumas raras áreas de hemorragias. Entretanto, essas alterações foram
similares ao do grupo controle e são consideradas reversíveis (Figura 14).
Com relação aos rins, as análises demonstraram moderada tumefação do epitélio
tubular, glomérulos preservados e evidenciação dos capilares dos glomérulos no grupo
controle. Já nos grupos Cf-PLS, houve hemorragia glomerular e tubular na menor dose, e
focos de necrose tubular aguda na maior dose, além de cilindrohialino. A hemorragia também
foi encontrada nos grupos tratados com a combinação de Cf-PLS com o 5-FU e no grupo
tratado com o 5-FU isolado. Essas alterações, entretanto, são passíveis de reversão (Figura
15).
Nas análises dos baços, os folículos linfóides estavam evidentes e haviam
megacariócitos ao longo da amostra no grupo com tumor tratado com salina. O grupo tratado
com 5-FU apresentou baços de tamanho menor que os do controle negativo e, nos grupos
tratados com Cf-PLS, o tamanho dos baços estava aumentado. Na dose de 25 mg/Kg/dia os
megacariócitos estavam em maior número e, por vezes, em agregados (Figura 16).
Resultados
73
Tabela 3 -
Efeito do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-PLS)
em camundongos transplantados com tumor Sarcoma-180.
Dados apresentam a média ± E.P.M. a, (p<0,05) quando comparado com o grupo de animais
saudáveis por ANOVA seguido por Newman-Keuls. b, (p<0,05) quando comparado com
animais transplantados com o tumor e tratados com salina por ANOVA seguido por Newman-
Keuls.
Droga Dose
(mg/kg/dia)
Fígado
(g/100g peso
corpóreo)
Baço
(g/100g peso
corpóreo)
Rins
(g/100g peso
corpóreo)
n
Animais
saudáveis
Salina
- 4.59 ± 0.19
0.18 ± 0.03
1.46 ± 0.05
Salina - 5,10 ± 0,53 0,60 ± 0,29
a
1,02 ± 0,04 16
5-FU 10 5,14 ± 0,66 0,68 ± 0,31
a
1,06 ± 0,31 8
Cf-PLS 25 5,65 ± 0,14 1,23 ± 0,09ª
,b
1,13 ± 0,03 8
Cf-PLS 10 4,62 ± 0,32 1,15 ± 0,36ª
,b
1,21 ± 0,15 8
Animais transplantados com tumor S180
Cf-PLS + 5-FU 10 4,80 ± 0,33 0,71 ± 0,15
a
1,05 ± 0,15 8
Resultados
74
A B
C D
Figura 13 -
Microfotografias de cortes histológicos (400X) de tumores de camundongos
transplantados com células tumorais de Sarcoma 180. A- grupo controle (salina); B- 5-FU (10
mg/Kg/dia); C- Cf-PLS (10 mg/Kg/dia); D- Cf-PLS + 5-FU (10 mg/Kg/dia).
HE 400X
Invasão
vascular
HE 400X
HE 400X
HE 400X
Resultados
75
A B
C D
C D
E
Figura 14 -
Microfotografias de cortes histológicos (400X) de fígados de camundongos
transplantados com células tumorais de Sarcoma 180. A- grupo controle (salina); B- 5-FU (10
mg/Kg/dia); C- Cf-PLS (10 mg/Kg/dia); D- Cf-PLS + 5-FU (10 mg/Kg/dia); E- Cf-PLS (25
mg/Kg/dia).
HE 400X
Tumefação
Espaço
Foco
inflamatório
Céls. Kupffer
HE 400X
Cél.
Tumefação
Espaço
HE 400X
HE 400X
Espaço
Tumefação
Céls.
HE
400X
Resultados
76
A B
C D
E
Figura 15 -
Microfotografias de cortes histológicos (400X) de rins de camundongos
transplantados com células tumorais de Sarcoma 180. A- grupo controle (salina); B- 5-FU (10
mg/Kg/dia); C- Cf-PLS (10 mg/Kg/dia); D- Cf-PLS + 5-FU (10 mg/Kg/dia); E- Cf-PLS (25
mg/Kg/dia).
Tumefação
HE 400X
Glomérul
Hemorragia glomerular e
tubular
HE 400X
Hemorragia glomerular e
HE 400X
HE 400X
HE 400X
Cilindrohiali
NTA
Resultados
77
A B
C D
Figura 16 -
Microfotografias de cortes histológicos (400X) de baços de camundongos
transplantados com células tumorais de Sarcoma 180. A- grupo controle (salina); B- 5-FU (10
mg/Kg/dia); C- Cf-PLS (25 mg/Kg/dia); D- Cf-PLS + 5-FU (10 mg/Kg/dia).
Polpa
Polpa
HE 400X
Arte
ríola
Arteríola
Polpa
Polpa branca
HE 400X
Megacariócitos
HE 400X
Arteríola central
Polpa
branca
HE 400X
Resultados
78
4.2.3. Determinação dos parâmetros hematológicos e bioquímicos
Foi realizada a análise bioquímica do sangue dos camundongos transplantados com o
tumor Sarcoma 180 e observou-se que os animais tratados com Cf-PLS nas duas doses, os
animais tratados com o 5-FU e os do tratamento combinado Cf-PLS + 5-FU não apresentaram
alterações nos níveis séricos dos indicadores de função renal analisados, nesse caso, creatinina
e uréia, em relação ao grupo controle. Com relação aos níveis séricos da enzima hepática
alanina aminotransferase (ALT), também não houve nenhuma alteração significativa em
nenhum dos grupos analisados (Tabela 4).
A partir da análise hematológica (Tabela 5), observou-se que o número de leucócitos
totais foi fortemente diminuído no grupo tratado com o 5-FU (10mg/Kg/dia) quando
comparado com o grupo controle experimental.
Os animais tratados com Cf-PLS em ambas as doses de 10 e 25mg/Kg/dia
apresentaram um expressivo aumento no número de leucócitos totais em relação ao grupo
tratado com o 5-FU (10mg/Kg/dia). Esta leucopenia causada pelo quimioterápico é revertida
quando este é administrado juntamente com Cf-PLS.
Observa-se que o número de linfócitos nos animais tratados com apenas salina e nos
animais tratados com o 5-FU diminui significativamente em relação aos animais saudáveis,
enquanto o número de neutrófilos aumenta. O tratamento com Cf-PLS também normalizou
este quadro.
Resultados
79
Tabela 4
- Efeito do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-PLS)
sobre os parâmetros bioquímicos de sangue periférico de camundongos transplantados com
tumor S180. ALT = Alanina aminotransferase.
Substância
Dose
(mg/kg/dia)
Creatinina
(mg/dL)
Urea
(mg/dL)
ALT
(UI/L)
Animais
saudáveis
Salina
- 0,14 ± 0,02 34,10 ± 6,20 52,10 ± 9,30
Salina - 0,09 ± 0,01 32,83 ± 2,32 33,50 ± 4,08
5-FU 10 0,07 ± 0,01 32,94 ± 2,55 27,70 ± 1,63
Cf-PLS 25 0,06 ± 0,01 32,50 ± 2,48 27,48 ± 2,77
Cf-PLS 10 0,07 ± 0,03 28,50 ± 1,32 30,25 ± 5,57
Animais transplantados com S180
Cf-PLS + 5-FU 10 + 10 0,07 ± 0,01 34,75 ± 3,68 28,50 ± 2,90
Os dados correspondem à média ± E.P.M. de cinco animais.
Resultados
80
Tabela 5 -
Efeito do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-PLS)
sobre as alterações hematológicas de sangue periférico de camundongo transplantado com
tumor S180.
Contagem diferencial (%)
Substância
Dose
(mg/kg/dia)
Leucócitos
totais
(10
3
cel./
µ
µµ
µ
L)
Linfócitos
Neutrófilo
Monócito Eosinófilo
Animais
saudáveis
Salina
-
5,66 ± 0,52 67.8 26.2 5.3 0.7
Salina -
8,18 ± 0,53 43,5
c
51,4
c
4,2
0,9
5-FU 10
3,59 ± 0,29
a
53,9
c
38,7
c
6,1
1,3
Cf-PLS 25 12,03 ±1,52
b
68,0 22,2 8,8 0,8
Cf-PLS 10 7,28 ± 0,55
b
69,0 23,4 6,8 0,8
Animais transplantados com S180
Cf-PLS
+ 5-FU
10 + 10 6,18 ± 1,36
b
69,2 25,2 4,8 0,6
a, p < 0,05 para os leucócitos totais comparados com o grupo salina com tumor. b, p < 0,05
para os leucócitos totais comparados com o grupo 5-FU. c, p < 0,05 para a contagem
diferencial comparado com os animais saudáveis por ANOVA seguido por Bonferroni. Os
dados correspondem à média ± E.P.M. de cinco animais.
Resultados
81
4.3. Atividade imunoestimulatória
4.3.1. Atividade edematogênica
O teste do edema de pata foi baseado na capacidade da substância teste de induzir
aumento de volume na pata traseira do animal (edema). Os resultados revelaram que a
administração de Cf-PLS é capaz de causar formação de edema em ratos a partir da menor
dose utilizada (500 µg/pata), de forma dose-dependente (p < 0,05). O seu pico de ação
acontece após a 2ª hora e começa a diminuir a partir da 3ª hora após a sua administração. O
controle positivo utilizado, a carragenina, tem o seu pico de ação a partir da 3ª hora (Figura
17).
0 1 2 3 4 5
0.0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
Tempo (h)
Edema (mL)
*
*
*
Figura 17 -
Efeito do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-PLS)
sobre a formação de edema em ratos. O controle negativo foi tratado com salina estéril (■),
enquanto a carragenina foi usada como controle positivo na dose de 300 µg/pata (●). Cf-PLS
foi administrado nas doses de 500 µg/pata (▼), 1000 µg/pata (▲) e 1500 µg/pata (□). Os
dados apresentam a média ± E.P.M. * (p < 0,05) quando comparado com o grupo salina por
ANOVA seguido por Newman-Keuls.
Resultados
82
4.3.2. Imunização subcutânea
A fim de investigar os efeitos de Cf-PLS na resposta imune de camundongos
imunizados com Cf-PLS ou OVA, foram determinados os anticorpos totais e específicos
presentes no soro dos animais através do teste ELISA. Os resultados estão mostrados na
Figura 18. O tratamento com Cf-PLS aumentou a produção de anticorpos específicos,
observado com o aumento do Ig total (p < 0,05). Entretanto, a produção de IgE, Ig1 e Ig2a
não foi modificada em animais tratados com Cf-PLS (Figura 18A). Além disso, Cf-PLS
aumentou significativamente a produção de anticorpos totais específicos contra OVA no soro
de animais tratados na dose de 40 mg/Kg, com relação ao grupo controle (p < 0,05, Figura
18B).
Resultados
83
A
0 7 14 21
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Dias após a imunização
pré-imune
absorbância
*
*
*
B
0 7 14 21
0.0
0.5
1.0
1.5
Dias após a imunização
Pré-imune
*
*
*
Absorbância
Figura 18
–
A
- Efeito do polissacarídeo sulfatado isolado de Champia feldmannii (Cf-PLS)
na produção de anticorpos Ig total (), IgE (), IgG1 (▲) and IG2a (∆). Os camundongos
foram imunizados subcutaneamente com Cf-PLS (40 mg/kg).
B –
Efeito de Cf-PLS na
produção de anticorpos específicos contra a ovalbumina (OVA). Os camundongos foram
imunizados subcutaneamente com OVA (2 mg/kg, ○) ou OVA (2 mg/kg) + Cf-PLS (40
mg/kg, ●). O soro foi coletado antes da imunização e após 7, 14 e 21 dias após a imunização.
Os anticorpos foram detectados por ELISA. Os dados apresentam a média ± E.P.M. * (p <
0,05) quando comparado com o grupo salina por ANOVA seguido por Newman-Keuls.
Resultados
84
4.3.3. Tratamento de Sarcoma 180 com sobrenadante de macrófagos ativados
A fim de investigar os efeitos do sobrenadante de macrófagos ativados com Cf-PLS na
inibição tumoral, 1 mL do sobrenadante foi administrado na cavidade peritoneal de
camundongos contendo o tumor Sarcoma 180, durante 7 dias consecutivos. O sobrenadante
de macrófagos incubados com Cf-PLS nas doses de 10 e 100 µg/mL não foi capaz de inibir
significativamente o crescimento do tumor Sarcoma 180 em camundongos. O mesmo foi
observado com o controle positivo utilizado, o zimosan (Figura 19).
salina
RPMI
zimosan
Cf-PLS 10
Cf-PLS 100
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
peso tumor (g)
Figura 19 –
Efeito do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-PLS)
sobre o tumor Sarcoma 180. O sobrenadante de macrófagos incubados com Cf-PLS (10, 100
µg/mL) foi injetado na cavidade peritoneal de camundongos contendo o tumor S-180. Salina e
meio RPMI foram usados como controle negativo e zimosan como controle positivo. Os
dados apresentam a média ± E.P.M. de 6 animais.
Resultados
85
4.3.4. Migração de neutrófilos
Avaliou-se o efeito do sobrenadante de macrófagos incubados com Cf-PLS na indução
da migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal de camundongos. Os resultados
demonstraram que o número de neutrófilos foi significativamente aumentado nos grupos de
Cf-PLS, tanto na concentração de 10 µg/mL (46,5 x 10
4
células/mL), como na concentração
de 100 µg/mL (121,5 x 10
4
células/mL), quando comparado com o grupo salina (7,2 x
10
4
cell/mL). Este aumento na indução da migração também foi significativo com relação ao
grupo controle positivo (31,2 x 10
4
células/mL). Os dados estão representados na Figura 20.
Salina RPMI Zimosan Cf-PLS 1 Cf-PLS 10 Cf-PLS 100
0
50
100
150
200
*
#
*
*
#
N° de neutrófilos x 10
4
/ mL
Figura 20
– Efeito do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-PLS)
sobre a migração de neutrófilos. O sobrenadante de macrófagos incubados com Cf-PLS (1,
10, 100 µg/mL) foi injetado na cavidade peritoneal de camundongos e em seguida foi feita a
contagem do número de neutrófilos. Salina e meio RPMI foram usados como controle
negativo e zimosan (10 µg/mL) como controle positivo. Os dados apresentam a média ±
E.P.M. * (p < 0,05) quando comparado com o grupo salina e # (p < 0,05) quando comparado
com o grupo zimosan, por ANOVA seguido por Newman-Keuls.
Resultados
86
4.3.5. Produção de NO
Foi avaliado o efeito de Cf-PLS na ativação de macrófagos, induzindo a liberação de
NO no seu sobrenadante. Os resultados mostraram que não houve liberação de NO pelos
macrófagos incubados com Cf-PLS no período e dose testados. O mesmo aconteceu com o
controle positivo utilizado, zimosan, nas mesmas concentrações.
4.4. Perfusão de rim isolado
O experimento da perfusão no rim isolado de ratos foi realizado para avaliar os efeitos
renais de Cf-PLS. No grupo tratado com o polissacarídeo (10µg/mL) foi observado aumento
da pressão de perfusão (
PP
Cf-PLS
30
= 98,5±3,3;
PP
Cf-PLS
90
= 134,1±9,5*;
PP
Cf-PLS
120
=
150,2±10,1* mmHg), da resistência vascular renal (
RVR
Cf-PLS
30
= 3,6±0,3;
RVR
Cf-PLS
120
=
7,3±1,7* mmHg/mL/g/min), do fluxo urinário (
FU
Cf-PLS
30
= 0,15±0,01;
FU
Cf-PLS
90
=
0,28±0,03*;
FU
Cf-PLS
120
= 0,42±0,03* mL/g/min) e do ritmo de filtração glomerular (
RFG
Cf-
PLS
30
= 0,5±0,3;
RFG
Cf-PLS
90
= 0,95±1,1*;
RFG
Cf-PLS
120
= 1,25±1,4* mL/min/g). Houve
aumento significativo da excreção de sódio, cloreto e potássio nos tempos de 90 e 120
minutos (p < 0,05). Não foi observada nenhuma alteração dos percentuais de transportes totais
ou tubular proximais de sódio, cloreto e potássio (p > 0,05). Os resultados se encontram nas
Figuras 21 a 33.
Com relação às análises histopatológicas, os rins tratados com Cf-PLS apresentaram
uma deposição protéica moderada nos túbulos renais; nos glomérulos, houve discreta
deposição de material protéica (Figura 34). Não foi visto nenhuma alteração nos interstícios
ou nos vasos das lâminas observadas.
Resultados
87
3
0
60
90
120
0
50
100
150
200
*
*
Cf-PLS
controle
Tempo (min)
PP (mmHg)
Figura 21
– Efeitos do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-PLS)
na Pressão de Perfusão (PP) em rim isolado. Cf-PLS foi adicionado ao sistema de perfusão de
rim isolado na concentração de 10 µg/mL. Os dados apresentam a média ± E.P.M. * (p <
0,05) quando comparado com o controle por ANOVA seguido por Bonferroni.
3
0
60
90
120
0
2
4
6
8
10
*
*
controle
Cf-PLS
Tempo (min)
RVR (mmHg/mL/g/min)
Figura 22
– Efeitos do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-PLS)
na Resistência Vascular Renal (RVR) em rim isolado. Cf-PLS foi adicionado ao sistema de
perfusão de rim isolado na concentração de 10 µg/mL. Os dados apresentam a média ±
E.P.M. * (p < 0,05) quando comparado com o controle por ANOVA seguido por Bonferroni.
Resultados
88
3
0
60
90
120
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
*
*
Cf-PLS
controle
Tempo (min)
FU (mL/min/g)
Figura 23
– Efeitos do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-PLS)
no Fluxo Urinário (FU) em rim isolado. Cf-PLS foi adicionado ao sistema de perfusão de rim
isolado na concentração de 10 µg/mL. Os dados apresentam a média ± E.P.M. * (p < 0,05)
quando comparado com o controle por ANOVA seguido por Bonferroni.
3
0
60
90
120
0.0
0.5
1.0
1.5
*
*
controle
Cf-PLS
Tempo (min)
RFG (mL/min/g)
Figura 24
– Efeitos do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-PLS)
no Ritmo de Filtração Glomerular (RFG) em rim isolado. Cf-PLS foi adicionado ao sistema
de perfusão de rim isolado na concentração de 10 µg/mL. Os dados apresentam a média ±
E.P.M. * (p < 0,05) quando comparado com o controle por ANOVA seguido por Bonferroni.
Resultados
89
3
0
60
90
120
0
20
40
60
80
100
controle
Cf-PLS
Tempo (min)
%T Na+
Figura 25
– Efeitos do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-PLS)
na Porcentagem de Transporte Tubular de Sódio (%T NA
+
) em rim isolado. Cf-PLS foi
adicionado ao sistema de perfusão de rim isolado na concentração de 10 µg/mL. Os dados
apresentam a média ± E.P.M.
3
0
60
90
120
0
20
40
60
80
100
controle
Cf-PLS
Tempo (min)
%T K+
Figura 26
– Efeitos do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-PLS)
na Porcentagem de Transporte Tubular de Potássio (%T K
+
) em rim isolado. Cf-PLS foi
adicionado ao sistema de perfusão de rim isolado na concentração de 10 µg/mL. Os dados
apresentam a média ± E.P.M.
Resultados
90
3
0
60
90
120
0
20
40
60
80
100
controle
Cf-PLS
Tempo (min)
%T Cl-
Figura 27
– Efeitos do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-PLS)
na Porcentagem de Transporte Tubular de Cloreto (%T Cl
-
) em rim isolado. Cf-PLS foi
adicionado ao sistema de perfusão de rim isolado na concentração de 10 µg/mL. Os dados
apresentam a média ± E.P.M.
3
0
60
90
120
0
50
100
150
controle
Cf-PLS
Tempo (min)
%pT Na+
Figura 28
– Efeitos do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-PLS)
na Porcentagem de Transporte Tubular Proximal de Sódio (%pT NA
+
) em rim isolado. Cf-
PLS foi adicionado ao sistema de perfusão de rim isolado na concentração de 10 µg/mL. Os
dados apresentam a média ± E.P.M.
Resultados
91
3
0
60
90
120
0
50
100
150
controle
Cf-PLS
Tempo (min)
%
pT K+
Figura 29
– Efeitos do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-PLS)
na Porcentagem de Transporte Tubular Proximal de Potássio (%pT K
+
) em rim isolado. Cf-
PLS foi adicionado ao sistema de perfusão de rim isolado na concentração de 10 µg/mL. Os
dados apresentam a média ± E.P.M.
3
0
60
90
120
0
20
40
60
80
100
controle
Cf-PLS
Tempo (min)
%
pT Cl-
Figura 30
– Efeitos do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-PLS)
na Porcentagem de Transporte Tubular Proximal de Cloreto (%pT Cl
-
) em rim isolado. Cf-
PLS foi adicionado ao sistema de perfusão de rim isolado na concentração de 10 µg/mL. Os
dados apresentam a média ± E.P.M.
Resultados
92
30
6
0
90
1
20
0
20
40
60
*
*
controle
Cf-PLS
Tempo (min)
ENa+
Figura 31
– Efeitos do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-PLS)
na Excreção de Sódio (ENA
+
) em rim isolado. Cf-PLS foi adicionado ao sistema de perfusão
de rim isolado na concentração de 10 µg/mL. Os dados apresentam a média ± E.P.M. * (p <
0,05) quando comparado com o controle por ANOVA seguido por Bonferroni.
30
6
0
90
1
20
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
*
*
controle
Cf-PLS
*
Tempo (min)
EK+
Figura 32
– Efeitos do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-PLS)
na Excreção de Potássio (EK
+
) em rim isolado. Cf-PLS foi adicionado ao sistema de perfusão
de rim isolado na concentração de 10 µg/mL. Os dados apresentam a média ± E.P.M. * (p <
0,05) quando comparado com o controle por ANOVA seguido por Bonferroni.
Resultados
93
30
6
0
90
1
20
0
20
40
60
*
*
*
controle
Cf-PLS
Tempo (min)
ECl-
Figura 33
– Efeitos do polissacarídeo sulfatado isolado da alga Champia feldmannii (Cf-PLS)
na Excreção de Cloreto (ECl
-
) em rim isolado. Cf-PLS foi adicionado ao sistema de perfusão
de rim isolado na concentração de 10 µg/mL. Os dados apresentam a média ± E.P.M. * (p <
0,05) quando comparado com o controle por ANOVA seguido por Bonferroni.
Resultados
94
A
B
Figura 34 -
Microfotografias dos cortes histológicos (400X) dos rins de ratos. A- grupo
controle (rim esquerdo não perfundido); B- Cf-PLS (10 µg/mL).
Deposição
protéica
Resultados
95
4.5. Perfusão de leito vascular isolado
O experimento de leito vascular isolado de ratos foi realizado para avaliar os efeitos de
Cf-PLS na pressão vascular. Cf-PLS não causou nenhuma alteração na pressão vascular do
leito mesentérico, enquanto que a fenilefrina, utilizada como controle do experimento elevou
a pressão a até 100 mmHg (Figura 35).
Figura 35
– Pressão de leito mesentérico no grupo tratado com o polissacarídeo sulfatado
isolado da alga Champia feldmannii (Cf-PLS). Nos primeiros vinte minutos a pressão basal
foi registrada como controle e após esse tempo Cf-PLS foi adicionado durante 20 minutos, a
10 µg/mL/min. Em seguida a fenilefrina foi utilizada como controle positivo, para verificar a
eficácia do experimento.
0 20 40 60
0
20
40
60
80
100
120
BASAL
Cf-PLS
FENILEFRINA
TEMPO (min)
PRESSÃO (mmHg)
Discussão
Discussão
97
5. DISCUSSÃO
O potencial de algas marinhas como fonte de substâncias bioativas é um campo ainda
pouco explorado. Apenas recentemente, a partir da década de 80, é que se tem começado a
estudar as algas em busca de compostos com atividades biológicas e propriedades
farmacológicas (SMIT, 2004).
Os polissacarídeos isolados de algas têm atraído uma grande atenção na área
biomédica devido à grande variedade de propriedades terapêuticas apresentada aliada à
relativa baixa toxicidade (TZIANABOS, 2000). Neste trabalho foi estudado o polissacarídeo
sulfatado isolado da alga vermelha marinha Champia feldmannii (Cf-PLS), uma alga ainda
pouco estudada, porém presente em boa parte do litoral brasileiro.
Uma forma de buscar novas substâncias com propriedades antitumorais é através de
screening com modelos in vitro. Neles são determinados a citotoxicidade das substâncias de
forma rápida e eficaz (CRAGG & NEWMANN, 2000). Neste contexto, os testes em
linhagens celulares humanas substituíram os ensaios com células leucêmicas in vivo,
mostrando mais rapidez, economia e reprodutibilidade (VENDITI, 1983; SHOEMAKER et
al., 1984; FORNELLI et al., 2004). Entretanto, aqueles compostos com mecanismos de ação
dependente do hospedeiro ou que sofrem processos de metabolização não são detectados
nesses testes.
As análises in vitro foram realizadas para avaliar o efeito antiproliferativo dos
polissacarídeos sobre quatro linhagens tumorais: HL-60, HCT-8, MDA- MB435 e SF-295. No
teste in vitro, os resultados demonstraram que o polissacarídeo não apresentou nenhuma
atividade citotóxica direta sobre as células tumorais nas concentrações testadas, obtendo um
IC
50
maior do que 25µg/mL.
A ausência de citotoxicidade em modelos in vitro nos estudos com macromoléculas,
incluindo os polissacarídeos, é comum na literatura. Entretanto, estudos têm demonstrado
que, quando administrados no animal, muitos deles são capazes de inibir o crescimento
tumoral (OOI & LIU, 2000; ZHOU et al., 2004). Pode-se citar como exemplo, um
polissacarídeo isolado do fungo Ganoderma lucidum, que não foi capaz de impedir a
proliferação do tumor in vitro, mas quando administrado no animal com Sarcoma 180, foi
capaz de inibir até 61,88% na maior dose utilizada, de 200 mg/kg (CAO & LIN, 2004). Os
alginatos isolados da alga Sargassum vulgare também são inativos em modelos in vitro, mas
Discussão
98
apresentam potente atividade antitumoral em modelos murinos tanto quando administrados
por via intraperitoneal, quanto por via oral (Sousa et al., 2007)
As análises in vivo foram realizadas utilizando-se o modelo experimental do Sarcoma
180. O Sarcoma 180 foi identificado no Croker Laboratory (Columbia University, New York)
em 1914. É um tumor de natureza sólida, inicialmente classificado como carcinoma mamário,
por surgir espontaneamente na região axilar de camundongos. Em 1919, transformou-se na
forma sarcomatosa e manteve-se sem alterações (SCHABEL et al., 1977).
O tratamento com o Cf-PLS na dose de 25 mg/Kg/dia inibiu significativamente o
tumor Sarcoma 180 transplantado nos camundongos (48,6%). Esta inibição também foi
observada mesmo após uma diminuição da dose para 10 mg/Kg/dia, sendo ela de 48,16%.
Esses resultados sugerem que na menor dose já observa-se o efeito máximo do polissacarídeo.
Na prática clínica a dose de um fármaco é um fator muito importante. Quanto menor a
dose, menor a incidência de efeitos colaterais, o que aumenta consideravelmente a qualidade
de vida do paciente. Com base no resultado anterior, a eficácia da associação do Cf-PLS com
o 5-FU foi avaliada. O 5-Fluorouracil é um quimioterápico da classe dos agentes
antimetabólicos análogos da pirimidina que, em última instância, levam a um bloqueio da
timidilato sintase, sendo bastante utilizado na clínica (HARDMAN & LIMBIRD, 1996). Os
animais tratados com o polissacarídeo na dose de 10 mg/Kg/dia associado ao 5-FU na mesma
dose, tiveram a inibição do tumor elevada de forma significativa, em torno de 68,3%. Isso é
um fato interessante, já que uma forma de aumentar a eficácia dos tratamentos contra o câncer
é desenvolvendo melhores combinações dos fármacos quimioterápicos, aumentando assim a
eficácia da terapia e reduzindo os efeitos colaterais indesejados (Morinaga et al., 2003).
Muitos polissacarídeos sulfatados isolados de algas marinhas têm apresentado
atividade antitumoral em modelos experimentais (Coombe et al., 1987; Maruyama et al.,
1987; Kaeffer et al., 1999; Saito et al., 1992). Zhou et al. (2004) fizeram experimentos com
uma galactana sulfatada isolada da alga vermelha Condrus ocellatus, a λ-carragenina, e
observaram que amostras com diferentes pesos moleculares apresentavam atividade
antitumoral em tumor Sarcoma 180. Esta era baixa quando a carragenina estava isolada (32%
de inibição do tumor), mesmo que em altas doses (100mg/Kg/dia), porém aumentava quando
em associação com o 5-FU, chegando a ter uma inibição de 63,8% na dose de 100mg/Kg/dia
de carragenina associada a 25mg/Kg/dia de 5-FU. Esta galactana também foi capaz de
melhorar a imunocompetência de animais tratados com o 5-FU. Esta capacidade foi avaliada
Discussão
99
através do aumento no peso do baço e nos níveis de TNF-α nos camundongos transplantados
com o tumor. No presente trabalho, observou-se percentual de inibição semelhante mesmo
utilizando doses menores tanto do quimioterápico 5-FU (10mg/Kg), quanto do CF-PLS
(10mg/Kg).
Outro estudo demonstrou que um polissacarídeo sulfatado, fucano, isolado de
Sargassum thunbergii, também foi capaz de potencialiazar a ação do 5-FU, inibindo de forma
significativa o número de metástases de pulmão em camundongos, através dos seus efeitos
imunomodulatórios e imunoestimulantes (ITOH et al., 1995).
Muitas das propriedades dos polissacarídeos modificadores da resposta biológica
ainda não têm um mecanismo completamente conhecido, e ainda existem muitas
controvérsias em volta da relação entre a estrutura e a atividade antitumoral desses
polissacarídeos.
Koyanagi et al. (2003) avaliaram a influência do aumento de grupos sulfatados em
fucano, um polissacarídeo isolado da alga marinha parda Fucus vesiculosus, nas suas
propriedades antitumorais e anti-angiogênica. Os resultados demonstraram que tanto os
fucanos naturais, quanto os que possuíam grupos sulfatados adicionados foram capazes de
inibir o crescimento dos tumores Sarcoma 180, melanoma B16 e carcinoma de Lewis.
Entretanto, essa atividade antitumoral foi aumentada na presença de grupos sulfatados.
Geralmente fatores que afetam a atividade biológica dos polissacarídeos são a sua
solubilidade em água, o peso molecular, e a presença de grupos sulfatados. Experimentos
realizados com polissacarídeos, onde sua solubilidade em água era aumentada ou grupos
sulfatados eram adicionados, apresentaram um aumento da atividade antitumoral (HUANG et
al., 2006; TAO et al., 2006; ZHANG et al., 2002). Vale ressaltar que a caracterização química
do Cf-PLS ainda não foi realizada, não sendo possível inferir sobre influências da sua
estrutura na determinação da sua atividade biológica.
Acredita-se que os mecanismos pelos quais os polissacarídeos vegetais exerçam seus
efeitos terapêuticos benéficos sejam através da potenciação da defesa do hospedeiro,
induzindo uma melhora na sua imunidade (SCHEPETKIN & QUINN, 2006). Tem sido
sugerido que os polissacarídeos isolados de algas também atuam dessa maneira, agindo como
modificadores da resposta biológica. Eles estariam envolvidos na ativação de várias células,
como macrófagos, neutrófilos, células T e células NK (LEUNG et al., 2006).
No presente trabalho, o grupo dos animais inoculados com o tumor Sarcoma 180 e
tratados com o 5-FU teve os baços diminuídos de tamanho, enquanto que os baços dos grupos
Discussão
100
tratados com o polissacarídeo nas doses de 10 e 25mg/Kg/dia tiveram sua massa úmida
bastante aumentada, apresentando também megacariócitos em maior número e por vezes
agregados. Os megacariócitos são células precursoras sanguíneas, e sua presença em grande
quantidade caracteriza uma proliferação do baço nestes grupos. Isso vem sugerir um efeito
imune, já que o baço é um dos órgãos responsáveis pelo sistema imunológico. Camundongos
transplantados com tumor Sarcoma 180 e tratados com λ-carragenina isolada de Chondrus
ocellatus também apresentaram resultados semelhantes aos encontrados com Cf-PLS, tendo
sua massa úmida do baço aumentada (ZHOU et al., 2004).
Muitos quimioterápicos utilizados atualmente na clínica, inclusive o 5-FU são
imunossupressores (TAKAGUCHI et al., 2001). As análises hematológicas realizadas com o
sangue dos camundongos transplantados com o Sarcoma 180 e tratados com o 5-FU
revelaram um quadro de leucopenia quando comparado com o grupo com tumor tratado com
salina. Na contagem diferencial de leucócitos, observa-se que o grupo inoculado com tumor
tratado apenas com salina apresenta uma diminuição significativa no número de linfócitos,
enquanto o número de neutrófilos aumenta em relação aos animais saudáveis. O mesmo
acontece com a contagem de linfócitos e neutrófilos no grupo 5-FU em relação aos animais
saudáveis, demonstrando uma imunossupressão.
Os grupos do polissacarídeo nas doses de 10 e 25 mg/Kg/dia apresentaram um nível
normal de leucócitos e, no caso do grupo onde o polissacarídeo estava associado com o
quimioterápico 5-FU, houve uma reversão do quadro de leucopenia apresentado pelo uso do
quimioterápico isolado e a normalização dos níveis de linfócitos e neutrófilos, demonstrando
que ele pode agir estimulando o sistema imune.
A inoculação do tumor causa por si só uma reação leucemóide em animais
experimentais, a qual é caracterizada por granulocitose e esplenomegalia (KODAMA et al.,
1974; OKAWA et al., 1992; SATO et al., 2005). No presente trabalho, os animais que foram
inoculados com o tumor Sarcoma 180 apresentaram um aumento do peso do baço,
acompanhado por um aumento do número de granulócitos. De acordo com Okawa et al.
(1992), pode-se observar um aumento da resistência do hospedeiro a infecções por fungos em
animais transplantados com tumor, e a supressão da resposta imune que foi observada nos
animais com tumor ou nos pacientes é geralmente causada pelo tratamento do câncer com a
quimioterapia. Resultados semelhantes foram encontrados nos animais tratados com o 5-FU
neste trabalho.
Discussão
101
O tratamento com Cf-PLS foi capaz de induzir uma esplenomegalia, e elevou o
número de leucócitos circulantes, enquanto a contagem diferencial de leucócitos foi
semelhante a dos animais saudáveis. Outros polissacarídeos isolados de algas também são
capazes de provocar as mesmas reações em animais transplantados com tumores, e essas
alterações são geralmente relacionadas com suas propriedades imunoestimulantes (ITOH et
al., 1995; SOUSA et al., 2007).
Como os resultados dos testes in vitro foram negativos, demonstrando que este
polissacarídeo não possui uma atividade citotóxica direta, é provável que a atividade
antitumoral deste polissacarídeo não esteja apenas relacionada com um efeito antiproliferativo
diretamente nas células tumorais, mas que seja mediada pelo hospedeiro.
Assreuy et al. (2008) avaliaram os efeitos pró-inflamatórios de Cf-PLS, demonstrando
que Cf-PLS é capaz de potencializar o edema causado por carragenina, dextran e zimosan,
além de causar edema quando administrado isoladamente, nas doses de 100, 300 e 900 µg/kg.
No presente trabalho foi utilizada essa mesma metodologia, obtendo-se resultados
semelhantes. Entretanto as doses do presente estudo foram maiores do que o reportado na
literatura, sendo que a menor dose utilizada seria correspondente a 2 mg/kg. Além disso,
Assreuy et al. (2008) também avaliaram o efeito do Cf-PLS sobre a permeabilidade vascular e
migração de neutrófilos, verificando que Cf-PLS aumenta a permeabilidade vascular quando
injetado subcutaneamente na pata de animais e quando administrado peritonealmente causa
migração de neutrófilos em ratos. Estes resultados indicam que Cf-PLS possui propriedades
imunoestimulantes. Experimentos utilizando substâncias inibidoras sugeriram a participação
de citocinas primárias, prostaglandinas e histamina nos efeitos pró-inflamatórios de Cf-PLS.
A fim de avaliar os efeitos imunoadjuvantes e imunoestimulantes de Cf-PLS, foi feita
a análise de anticorpos específicos contra Cf-PLS ou OVA. O tratamento dos animais com o
polissacarídeo sulfatado induziu a produção de anticorpos específicos e também aumentou a
produção de anticorpos contra a OVA, corroborando com as hipóteses de ação
imunoadjuvante e imunoestimulante de Cf-PLS.
Em vários estudos utilizando animais experimentais, demonstrou-se que extratos de
algas marinhas apresentam compostos biologicamente ativos envolvidos com a resposta
imune através do aumento da atividade fagocítica e secretória de macrófagos e indução da
produção de ROS, NO e citocinas (TNF-α, IL-1 e IL-6) (YOSHIZAWA et al., 1996; OKAI et
Discussão
102
al., 1997). Entretanto, não se sabe muito sobre os mecanismos moleculares desta ativação por
polissacarídeos.
A fim de avaliar a capacidade de Cf-PLS de ativar macrófagos, foram realizados
experimentos com uma cultura primária de macrófagos retirados da cavidade peritoneal de
camundongos. O sobrenadante dos macrófagos incubados com Cf-PLS não inibiu o
crescimento do tumor Sarcoma 180 em camundongos. Cf-PLS também não induziu liberação
de óxido nítrico quando incubado com a cultura primária de macrófagos. Apesar do zimosan
ser um potente estimulante inflamatório, o sobrenadante dos macrófagos incubados com
zimosan também não foi capaz de inibir o crescimento do tumor Sarcoma 180 ou de liberar
NO de forma significativa. Isto sugere que a metodologia utilizada não é suficiente para
explicar os mecanismos da atividade antitumoral do Cf-PLS. Além disso, Assreuy et al.
(2008) verificaram que o pré-tratamento com L-NAME não foi capaz de inibir o edema
causado por Cf-PLS, sugerindo que o seu efeito pró-inflamatório não está relacionado com a
liberação de NO.
Os mecanismos de ação de cada polissacarídeo e os seus sítios de ligação podem
variar. Assim, os efeitos destes compostos podem estar envolvidos com diferentes tipos de
células, como as células hematopoiéticas, o sistema imune inato ou adquirido ou também as
diversas vias de sinalização ou de liberação de citocinas.
Em 1999, Shan et al. demonstraram que extratos de algas marinhas estimulam a
proliferação in vitro de linfócitos T do sangue periférico, aumentam a atividade dos linfócitos
T citotóxicos contra células tumorais e a produção de imunoglobulinas pelas células B, bem
como estimulam a liberação de TNF a partir de monócitos humanos e murinos. O
fracionamento realizado posteriormente demonstrou que os compostos bioativos não eram de
natureza protéica, mas que polissacarídeos estavam relacionados com a potencialização da
resposta imunológica.
Pugh & Pasco, em 2001, isolaram polissacarídeos da alga Aphanizomenon flos-aquae
e verificaram que eles ativavam o fator de transcrição nuclear (NF-κB) e aumentavam a
afinidade deste fator de transcrição para se ligar ao seu sítio no DNA.
Polissacarídeos sulfatados isolados da alga Ulva rígida agem em diversas vias da
inflamação, aumentando a expressão gênica de várias citocinas, seus receptores, de óxido
nítrico, prostaglandinas, e algumas enzimas, como a cicloxigenase-2 e a óxido nítrico sintase-
2 (LEIRO et al., 2007). Estudos realizados por Itoh et al., 1995, demonstraram que fucanos
Discussão
103
isolados da alga parda Sargassum vulgare agem na via C3, aumentando a ligação dos
produtos da clivagem da via C3 (C3b) nos seus respectivos receptores.
Outra forma que um composto pode agir causando inflamação é através da ativação de
macrófagos, induzindo a liberação de um fator quimiotático de neutrófilos, que vai atrair os
neutrófilos para o local da inflamação. Alencar et al., 2007, verificaram que uma lectina
isolada de Vatairea macrocarpa induz a liberação de um fator quimiotático de neutrófilos por
macrófagos de forma tempo e dose-dependente. Acredita-se que esse mediador inflamatório
seja provavelmente uma citocina, como o TNF-α. Inclusive, Assreuy et al. (2008) verificaram
que, quando Cf-PLS é injetado em ratos, ele é capaz de aumentar a migração de neutrófilos
para a cavidade peritoneal.
O presente trabalho demonstrou que, quando administrado o sobrenadante dos
macrófagos incubados com Cf-PLS em camundongos sadios, há um aumento da migração de
neutrófilos para a cavidade peritoneal destes camundongos, demonstrando que Cf-PLS é
capaz de induzir também a liberação de um fator quimiotático de neutrófilos por macrófagos,
justificando os resultados anteriores de Assreuy et al. (2008).
Um dos grandes problemas enfrentados pela indústria farmacêutica que dificultam o
desenvolvimento de novos fármacos é a toxicidade da molécula. Há uma busca constante por
compostos químicos com potencial citotóxico específico para células tumorais e que não
apresentem toxicidade também para células não neoplásicas. Muitas drogas contra o câncer
possuem consideráveis efeitos colaterais e, portanto, um uso clínico limitado (OOI & LIU,
2000).
Este estudo também avaliou a integridade dos fígados e rins dos animais tratados com
Cf-PLS através de análises bioquímicas e histopatológicas. As análises histopatológicas dos
órgãos removidos dos animais tratados com 5-FU revelaram a presença de congestão portal e
da veia, além de hiperplasia das células de Kupffer e intensa tumefação dos hepatócitos, com
focos discretos de esteatose em microgotas, o que sugere a toxicidade desta droga
(KUMMAR et al., 2004). Um grande número de compostos químicos de diferentes classes e
com variadas atividades farmacológicas levam a importantes lesões hepáticas (SCHEUER &
LEFKOWITCH, 2000). Apesar disso, o fígado possui uma grande capacidade adaptativa e
regenerativa.
Nos animais tratados com o polissacarídeo também houve alterações como hiperplasia
das células de Kupffer, discreta tumefação celular de hepatócitos, congestão portal e da veia
Discussão
104
centrolobular. As modificações observadas foram dose-dependentes. Entretanto, essas
diferenças morfológicas são consideradas reversíveis, já que o tecido intersticial estava
preservado.
Além disso, a análise bioquímica no sangue periférico dos camundongos
transplantados com o tumor Sarcoma 180 revelou que os níveis de ALT, uma transaminase
responsável pelo diagnóstico de danos hepáticos, estavam todos semelhantes ao controle
salina, sugerindo uma função do fígado normal.
Com relação ao rim, um nível elevado de imunoglobulinas no plasma pode estar
relacionado com uma deposição de agregados de imunoglobulinas no rim e assim, com uma
nefrotoxicidade caracterizada por glomerulonefrite e alterações morfológicas compatíveis
com nefrose osmótica (LEVY & PUSEY, 2000; ORBACH et al., 2004; DEMEULE et al.,
2006). De acordo com a literatura, estes níveis só são atingidos em alguns pacientes que
receberam infusões de imunoglobulinas. Nesses casos, o glomérulo parece ser o alvo principal
dos danos renais (LEVY & PUSEY, 2000; ORBACH et al., 2004).
No presente estudo, a análise histopatológica dos rins demonstrou que, no grupo do
Cf-PLS, observou-se hemorragia glomerular e tubular na menor dose e focos de necrose
tubular aguda na maior dose, assim como a presença de cilindrohialino. Entretanto, a estrutura
dos glomérulos estava preservada. Além disso, as alterações morfológicas encontradas foram
diferentes das que estão associadas com a nefrotoxicidade causada por agregados de
imunoglobulinas.
De acordo com Olsen & Solez (1994), pode ocorrer necrose do epitélio tubular renal
como conseqüência da administração de diversas classes químicas, mas mesmo se houver um
grande dano celular, a regeneração depende da integridade dos tecidos intersticiais. Alginatos
isolados de Sargassum vulgare também induziram necrose do epitélio tubular renal em
animais experimentais e esses efeitos foram considerados reversíveis (SOUSA et al., 2007).
Como nos rins dos animais tratados com o Cf-PLS observou-se uma preservação do tecido
intersticial, com ausência de edema ou infiltração de linfócitos, há uma possibilidade de
regeneração do dano, sendo então essas alterações também consideradas passíveis de reversão
(CURRAN, 1990; OLSEN & SOLEZ, 1994).
Os níveis de creatinina e uréia, índices que podem diagnosticar uma possível
insuficiência renal não foram alterados após o tratamento com Cf-PLS. Todavia, os níveis de
Discussão
105
uréia no sangue só são alterados após um longo período de danos renais, o que pode explicar
o porquê do tratamento com Cf-PLS não ter causado nenhuma alteração nos níveis de uréia.
Em busca de um entendimento maior dos efeitos de Cf-PLS especificamente no rim,
foi feito o experimento da perfusão em rins isolados de ratos, assim como o experimento do
leito vascular mesentérico, para observar se os efeitos de Cf-PLS no rim poderiam estar
relacionados a alterações vasculares. A dose utilizada nos testes foi de 10 µg/mL, escolhida de
acordo com a maior dose utilizada nos experimentos antitumorais in vivo. Os resultados
demonstraram que Cf-PLS tem uma ação direta na função do rim, causando um aumento da
pressão de perfusão, da resistência vascular renal, do ritmo de filtração glomerular, do fluxo
urinário e da excreção de sódio, cloreto e potássio. Não foi observada nenhuma alteração dos
percentuais de transportes totais ou tubular proximais de sódio, cloreto ou potássio.
A pressão arterial renal pode variar entre 80 e 200 mmHg, mantendo o fluxo
sangüíneo renal constante. As arteríolas aferentes e eferentes do rim possuem inervação
simpática que provoca vasoconstrição através da estimulação de receptores adrenérgicos α-1.
Um aumento na atividade simpática nas arteríolas aferentes leva a um aumento do fluxo
sangüíneo renal, que eleva o ritmo de filtração glomerular (STRASSER et al., 1992).
Alginatos isolados de Sargassum vulgare também causaram efeitos renais semelhantes
aos efeitos causados por Cf-PLS (SOUSA et al., 2008). Esse aumento na pressão de perfusão
e na resistência vascular renal estaria relacionado a um efeito vascular direto, o que foi
confirmado pelo efeito vasoconstrictor induzido pelos alginatos no leito vascular mesentérico.
Entretanto, o mesmo não aconteceu com Cf-PLS, que não induziu uma vasoconstricção no
leito vascular mesentérico. O aumento da pressão de perfusão de perfusão pode ter sido
responsável por um aumento do fluxo urinário. Assim, não se pode afirmar que os efeitos
encontrados no rim após o tratamento com Cf-PLS sejam devido a uma ação direta nos vasos
sangüíneos.
Martins et al. (2003) demonstraram que os componentes do sobrenadante de
macrófagos ativados pelo veneno da Crotalus durissus cascavella possuem efeitos
nefrotóxicos in vitro, tais como aumento da pressão de perfusão, taxa de filtração glomerular,
fluxo urinário e diminuição do transporte tubular e proximal de sódio. Dentre os componentes
com atividade nefrotóxica liberado a partir de macrófagos destaca-se os efeitos promovidos
pela fosfolipase A2 e ciclooxigenase. Estas sintetizam mediadores inflamatórios originados do
ácido araquidônico, bem como a liberação de citocinas, principalmente o TNF-
α.
Discussão
106
As análises histopatológicas revelaram que os rins tratados com Cf-PLS apresentaram
uma deposição protéica moderada nos túbulos renais e que nos glomérulos, houve uma
discreta deposição de material protéico. Esse extravasamento de proteína que foi observado
pode ser explicado pelo aumento da pressão de perfusão causado por Cf-PLS.
Os resultados obtidos no teste da perfusão renal poderiam ser devido à liberação de
mediadores inflamatórios vasoativos por células mesangiais do endotélio. Estudos
comprovam que citocinas, prostanglandinas, frações de complemento e fator ativador de
plaquetas podem ser liberados por células renais (HAVT et al., 2001). Os dados aqui
apresentados mostram que o Cf-PLS, de fato, estimula macrófagos isolados da cavidade
peritoneal, o que suscinta a possibilidade deste mecanismo estar associado às alterações da
função renal observadas.
Conclusão
Conclusão
108
6. CONCLUSÃO
O presente trabalho demonstrou que o polissacarídeo sulfatado isolado da alga
marinha vermelha Champia feldmannii (Cf-PLS) apresenta atividade antitumoral em
camundongos transplantados com tumor Sarcoma 180. Os ensaios in vitro concluíram que
esse potencial não está relacionado com uma atividade citotóxica direta. A partir das análises
do peso dos baços, dos resultados hematológicos e dos experimentos com relação aos efeitos
de Cf-PLS no sistema imune, pôde-se concluir que essa atividade antitumoral de Cf-PLS seja
através de uma ação imunomoduladora, através da ativação de leucócitos.
Apesar de exibir um bom potencial antitumoral, os achados histopatológicos e a
análise da função renal demonstraram que o Cf-PLS apresenta toxicidade, sendo o rim o
principal órgão envolvido nesta toxicidade, entretanto, os efeitos observados são moderados e
passíveis de reversão.
Além disso, a associação de Cf-PLS com o 5-FU mostrou ser uma importante
estratégia terapêutica para redução da toxicidade do quimioterápico e melhora da resistência
do hospedeiro, o que aumenta a eficácia do tratamento contra o câncer.
Referências
Bibliográficas
Referências Bibliográficas
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