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Dissertação de mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas, área de concentração
Zoologia, do Instituto de Biociências da
Universidade Estadual Paulista, como
parte dos requisitos para a obtenção do
título de Mestre em Ciências (Ciências
Biológicas), área de concentração:
Zoologia.
Orientador: Prof. Dr. Fausto Foresti
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DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: Selma Maria de Jesus
Pescatori, Gustavo Luiz Rossetto.
Estudos citogenéticos em populações de Bryconamericus stramineus,
Eigenmann, 1908. (Teleostei, Characidae) em rios das bacias dos Rios Tietê e
Paranapanema / Gustavo Luiz Rossetto Pescatori. – Botucatu : [s.n.], 2008.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de
Biociências, Botucatu, 2008.
Orientador: Fausto Foresti
Assunto CAPES: 20203004
1. Peixe - Genética - Paranapanema, Rio 2. Peixe - Genética - Tietê, Rio
CDD 597.55
Palavras-chave:
Bryconamericus; Characidae; Incertae sedis; Citoge-
nética;
Sumário
Lista de figuras VI
Lista de tabelas X
Resumo XI
Abstract XIII
1.Introdução 1
1.1 Família Characidae 2
1.2 Estudos Citogenéticos em Peixes 4
1.3 Gênero Bryconamericus 7
2. Objetivos 10
3. Material 12
4. Métodos 16
4.1 Estimulação de Mitoses 16
4.2 Preparação de cromossomos mitóticos 16
4.3 Coloração com Giemsa 17
4.4 Localização das regiões organizadoras de nucléolos (Ag-RONs) 18
4.5 Detecção da heterocromatina constitutiva (Bandas C) 19
4.6 Bandamento com o fluorocromo base-específico Cromomicina A
3
19
4.7 Estudos Cariotípicos 20
4.8 Medidas Cromossômicas 21
4.9 Montagem dos Cariótipos 21
4.10 Hibridação “in situ” Fluorescente (FISH) 21
4.10.1 Marcação da sonda (a – b) 22
4.10.2 Parâmetros para amplificação (5S e 18S) 23
4.10.3 Precipitação da sonda 23
4.10.4 Soluções reagentes para hibridação 24
4.10.5 Hibridação 25
5. Resultados 28
5.1 Córrego Alambari 28
5.2 Córrego da Quinta 33
5.3 Córrego Jacutinga 38
5.4 Córrego Hortelã 43
5.5 Recanto dos Cambarás 48
6. Discussão 54
7. Conclusões 71
8. Referências 73
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Foto de um exemplar de Bryconamericus stramineus (pág. 13).
Figura 2: Mapa hidrológico do estado de São Paulo, evidenciando as Bacias dos
Rios Tietê e Paranapanema (pág. 13).
Figura 3: Ribeirão Alambari – Município de Botucatu (pág. 14).
Figura 4: Córrego da Quinta – Município de Botucatu (pág. 14).
Figura 5: Córrego Jacutinga – Município de Bofete (pág. 14).
Figura 6: Ribeirão Hortelã – Município de Botucatu (pág. 14).
Figura 7: Recanto dos Cambarás – Município de Itatinga (pág. 14).
Figura 8: Cariótipo de B. Stramineus com coloração convencional por Giemsa
(2n=52 cromossomos), de exemplar do Ribeirão Alambari (pág. 30).
Figura 9: Metáfase somática de exemplar B. Stramineus do Ribeirão Alambari,
submetida ao Bandamento C, evidenciando as regiões heterocromáticas (pág. 31).
Figura 10: Metáfase somática de exemplar de B. Stramineus do Ribeirão Alambari,
marcada com nitrato de prata. As setas estão evidenciando os cromossomos
portadores das RONs (pág. 31).
Figura 11: Metáfase somática de exemplar B. Stramineus do Ribeirão Alambari,
tratada com o fluorocromo Cromomicina (CMA
3
)
.
A seta indica a distribuição da
região rica em pares de base GC (pág. 32).
Figura 12: Metáfase somática de B. Stramineus do Ribeirão Alambari, submetida à
hibridação in situ fluorescente dupla (Double FISH) com a sonda de DNAr 5S
(marcação vermelha) e 18S (marcação verde) (pág. 32).
Figura 13: Cariótipo de B. Stramineus com coloração convencional por Giemsa
(2n=52 cromossomos) de exemplar do Córrego da Quinta (pág. 35).
Figura 14: Metáfase somática de exemplar de B. Stramineus do Córrego da
Quinta, submetida ao Bandamento C, evidenciando as regióes heterocromáticas
(pág. 36).
Figura 15: Metáfase somática de exemplar de B. Stramineus do Córrego da
Quinta, marcada com nitrato de prata. As setas estão evidenciando os
cromossomos portadores das RONs (pág. 36).
Figura 16: Metáfase somática de B. Stramineus do Córrego da Quinta, tratada
com o fluorocromo Cromomicina (CMA
3
)
.
As setas indicam as regiões ricas em
pares de base GC (pág. 37).
Figura 17: Metáfase somática de B. Stramineus do Córrego da Quinta, submetida
à hibridação in situ fluorescente dupla (Double FISH) com a sonda de DNAr 5S
(marcação vermelha) e 18S (marcação verde) (pág. 37).
Figura 18: Cariótipo de B. Stramineus com coloração convencional por Giemsa
(2n=52 cromossomos) de exemplar do Córrego Jacutinga (pág. 40).
Figura 19: Metáfase somática de exemplar de B. stramineus, do Córrego
Jacutinga, submetida ao Bandamento C, evidenciando as regiões heterocromáticas
(pág. 41).
Figura 20: Metáfase somática de exemplar B. stramineus do Córrego Jacutinga,
marcada com nitrato de prata. As setas estão evidenciando os cromossomos
portadores das RONs (pág. 41).
Figura 21: Metáfase somática de B. stramineus do Córrego Jacutinga, tratada com
o fluorocromo Cromomicina (CMA
3
)
.
As setas indicam as regiões ricas em pares de
base GC (pág. 42).
Figura 22: Metáfase somática de B. Stramineus do Córrego Jacutinga, submetida
à hibridação in situ fluorescente dupla (Double FISH) com a sonda de DNAr 5S
(marcação vermelha) e 18S (marcação verde) (pág. 42).
Figura 23: Cariótipo de B. Stramineus com coloração convencional por Giemsa
(2n=52 cromossomos) de exemplar do Ribeirão Hortelã (pág. 45).
Figura 24: Metáfase somática de exemplar de B. stramineus do Ribeirão Hortelã,
submetida ao Bandamento C, evidenciando as regióes heterocromáticas (pág. 46).
Figura 25: Metáfase somática de B. stramineus do Ribeirão Hortelã, marcada com
nitrato de prata. As setas estão evidenciando os cromossomos portadores das
RONs (pág. 46).
Figura 26: Metáfase somática de B. stramineus do Ribeirão Hortelã, tratada com o
fluorocromo Cromomicina (CMA
3
)
.
As setas indicam as regiões ricas em pares de
base GC (pág. 47).
Figura 27: Metáfase somática de B. Stramineus do Ribeirão Hortelã, submetida à
hibridação in situ fluorescente dupla (Double FISH) com a sonda de DNAr 5S
(marcação vermelha) e 18S (marcação verde) (pág. 47).
Figura 28: Cariótipo de B. Stramineus com coloração convencional por Giemsa
(2n=52 cromossomos) de exemplar do Recanto dos Cambarás (pág. 50).
Figura 29: Metáfase somática de exemplar de B. stramineus do Recanto dos
Cambarás, submetida ao Bandamento C, evidenciando as regiões
heterocromáticas (pág. 51).
Figura 30: Metáfase somática de B. stramineus do Recanto dos Cambarás,
marcada com nitrato de prata. As setas estão evidenciando os cromossomos
portadores das RONs (pág. 51).
Figura 31: Metáfase somática de B. stramineus do Recanto dos Cambarás, tratada
com o fluorocromo Cromomicina (CMA
3
)
.
As setas indicam as regiões ricas em
pares de base GC (pág. 52).
Figura 32: Metáfase somática de B. Stramineus do Recanto dos Cambarás,
submetida à hibridação in situ fluorescente dupla (Double FISH) com a sonda de
DNAr 5S (marcação vermelha) e 18S (marcação verde) (pág. 52).
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Locais de coleta da espécie Bryconamericus stramineus, em
componentes das Bacias Hidrográficas dos Rios Tietê e Paranapanema (pág.
15).
Tabela 2: Número diplóide, fórmula cariotípica e número fundamental dos
exemplares de Bryconamericus stramineus das bacias do Rio Tietê e Rio
Paranapanema (pág. 53).
Tabela 3: Dados citogenéticos comparativos no gênero Bryconamericus em
diferentes localidades do Brasil, dispostos em ordem crescente de número
fundamental (NF) (pág. 56).
RESUMO
A família Characidae é a maior e mais complexa dentre as famílias de peixes da
ordem Characiformes e grande parte dos peixes do Brasil encontra-se na família
Characidae. A maioria dos peixes desta família é conhecida popularmente como
lambaris, piracanjubas, peixes-cachorros, pacus, piranhas e dourados. Distribuem-
se no continente americano – desde a fronteira do México com os Estados Unidos
até o sul da Argentina. O gênero Bryconamericus possui aproximadamente 51
espécies identificadas e destas, cerca de 30 que vivem em distintas regiões do
Brasil, possuem um número diplóide relativamente estável de 2n=52
cromossomos, mas há muito pouca informação citogenética sobre os
representantes deste. No presente projeto, foi realizada a análise citogenética em
representantes de cinco populações de Bryconamericus stramineus, Eigenmann,
1908, em rios das bacias do Tietê e Paranapanema, região de Botucatu, SP. Para
tanto, foram caracterizados seus cariótipos através de coloração convencional com
Giemsa, a qual evidenciou um cariótipo padrão de 2n=52 cromossomos; foram
identificados os padrões de distribuição de heterocromatina constitutiva (Bandas C)
que revelaram blocos heterocromáticos centroméricos, intersticiais e teloméricos;
foram identificadas as regiões organizadoras de nucléolos (RONs) através de
impregnação com nitrato de prata, evidenciando-se RONs simple e múltiplas;
foram identificadas as regiões cromossômicas ricas em GC através de coloração
com o fluorocromo cromomicina (CMA
3
) que também se mostraram simples e
múltiplas, mostrando correspondência com as Ag-RONs; foram identificados ainda
os cístrons ribossômicos através de hibridação in situ fluorescente (FISH) com a
sonda de DNAr 18S, que revelou de duas e seis marcações e com a sonda de DNAr
5S que revelou de três a cinco marcações. Os dados obtidos, além de revelarem
aspectos citogenéticos desta espécie, podem também ser utilizados em
interpretações evolutivas, na inferência da estrutura genética das espécies e/ou
populações de Bryconamericus e ainda fornecer subsídios a futuros estudos que
visem a compreensão das relações entre as espécies deste grupo.
1. INTRODUÇÃO
A ictiofauna Neotropical de água doce é uma das mais ricas e diversificadas
do mundo. Segundo VARI e MALABARBA (1998), aproximadamente 24% da
diversidade mundial de peixes pode estar representada por peixes continentais da
América do Sul. Estimativas apontam que existam cerca de 8000 espécies de
peixes neotropicais de água doce encontradas nas Américas Central e do Sul
(SCHAEFER, 1998). REIS et. al. (2003), descreve 71 famílias e 4.475 espécies de
peixes neotropicais. Outros estudos relacionam aproximadamente 2.240 espécies
de peixes de água doce para o Brasil (ABILHOA & DUBOC, 2004). Porém,
pesquisas mais recentes confirmam que a fauna de peixes continentais do Brasil é
a mais rica do mundo, com cerca de 2.587 espécies já descritas e existindo ainda
muitas em fase de descrição ou desconhecidas (BUCKUP et al., 2007).
Apesar desta grande diversidade de espécies encontradas, muitas correm
risco de extinção e podem desaparecer sem ao menos terem sido estudadas.
Nesse cenário a destruição de habitats, bem como a introdução de espécies
exóticas, figuram como alguns dos principais fatores na diminuição da diversidade
dos ambientes aquáticos da região Neotropical (SUNAGA & VERANI, 1991; ORSI
& AGOSTINHO, 1999; BOJSEN & BARRIGA, 2002; LATINI & PETRERE JR.,
2004).
A maior parte dessa diversidade de peixes, mais especificamente a sul
americana, pertence a um dos cinco grupos dominantes: Characiformes,
Siluriformes, Gymnotiformes, Cyprinodontiformes e Ciclídeos (LUNDBERG et al.,
2000). Os Characiformes constituem um grupo dominante entre os peixes de água
continental da América do Sul, compreendendo formas herbívoras, iliófagas e
carnívoras, algumas das quais muito especializadas (BRITISKI et al., 1972). Dentro
da ordem Characiformes está inserida a família Characidae, que é a maior e mais
complexa entre as famílias desta ordem. Para se saber o número de gêneros e
espécies dentro da família Characidae e da ordem Characiformes, estudos foram
realizados por alguns autores, dentre eles NELSON em 1994 e 2006 e REIS e
colaboradores em 2003. Embora os estudos realizados por NELSON em 2006
sejam mais recentes, a referência mais comumente utilizada relaciona-se aos
estudos realizados por REIS et al. em 2003, que apresenta os Characiformes com
aproximadamente 237 gêneros e 1373 espécies e Characidae com 184 gêneros e
950 espécies.
1.1 FAMÍLIA CHARACIDAE
Characidae é considerada a maior e a mais complexa família de peixes
entre os Characiformes (NELSON, 1994). FINK (1979) critica os critérios utilizados
na sistemática dos Characidae, pois o sistema de classificação usado baseia-se
nos trabalhos realizados por EIGENMANN (1917) e estes já estariam
ultrapassados.
Os representantes da família Characidae estão presentes em diversos
ambientes de água doce e distribue-se no continente americano, desde a fronteira
do México com os Estados Unidos até o sul da Argentina e também no continente
africano (LUCENA, 1993; FROESE & PAULY, 2005).
De acordo com FINK & FINK (1981), a posição taxonômica da família
Characidae é a seguinte:
CLASSE: Osteichthyes SUPERORDEM: Ostariophysi
SUBCLASSE: Actinopterigii ORDEM: Characiformes
INFRACLASSE: Teleostei FAMÍLIA: Characidae
Os peixes mais comuns da família Characidae são os lambaris,
piracanjubas, peixes-cachorros, pacus, piranhas e dourados, sendo que todos os
representantes desta família possuem escamas e são muito conhecidos pelos
pescadores. Apresentam variados tamanhos, desde dois centímetros como as
pequiras, até mais de um metro como os dourados (BRITSKI, 1972). Estes animais
encontram-se em habitats bem variados e apresentam um diversificado hábito
alimentar, sendo herbívoros, onívoros ou carnívoros (BRITSKI et al., 1988). Os
peixes deste grupo são coletados com relativa facilidade na maioria dos cursos de
água, e caracterizam-se tanto pela abundância de espécies como pelo grande
número de espécimes em geral encontrados (DANIEL – SILVA, 1996).
Os estudos citogenéticos na família Characidae iniciaram-se com POST
(1965) relatando o número cromossômico haplóide e/ou diplóide para várias
espécies. Segundo FALCÃO (1988) existe uma grande amplitude numérica
cromossômica nas subfamílias deste grupo de peixes. OLIVEIRA et al. (1988a),
relacionaram 199 espécies de Characidae, cujos números haplóides e ou diplóides
já conhecidos evidenciaram uma grande diversidade cromossômica. Existe ainda
em Characidae uma acentuada predominância de números diplóides entre 48 e 52
cromossomos (83,7%), seguidos dos números entre 54 e 64 (10,2%) e depois,
entre 28 e 46 (5,9%) (CESTARI, 1996).
Apesar desta grande diversidade cariotípica, uma característica
relativamente constante em diversas espécies da família Characidae é a presença
de um par de cromossomos metacêntricos grandes, o primeiro do complemento
cariotípico, inicialmente observada por SCHEEL (1972) e ressaltada
posteriormente por diversos autores.
A família Characidae, além da grande variabilidade numérica, também
apresenta extensa variabilidade em relação ao número de cromossomos
portadores de regiões organizadoras de nucléolos, já tendo sido descritas espécies
com um número máximo de até treze pares de cromossomos nucleolares
(ROCON-STANGE & ALMEIDA-TOLEDO, 1993), embora a condição mais simples,
com apenas um par cromossômico envolvido com a organização nucleolar seja
mais freqüentemente encontrada.
Os estudos citogenéticos associados a taxonomia e a sistemática, podem
ser de extrema importância na identificação de novas espécies ou de espécies
taxonomicamente problemáticas (WEITZMAN & FINK, 1983; BERTOLLO et al.,
1986), como parece ocorrer dentro da família Characidae, e também no
entendimento dos problemas genéticos, evolutivos e sistemáticos deste grupo
(OJIMA, 1983).
1.2 ESTUDOS CITOGENÉTICOS EM PEIXES
Até o final dos anos 70, pouco se conhecia sobre as características
citogenéticas da ictiofauna neotropical. Os dados disponíveis limitavam-se ao
conhecimento do número cromossômico de algumas poucas espécies, muitas das
quais obtidas de espécimes de origem geográfica desconhecida (TOLEDO-FILHO
et al., 1978).
Os primeiros trabalhos publicados sobre citogenética de peixes Neotropicais
foram realizados na década de 70 e atualmente, vários outros têm sido
desenvolvidos com uma ampla abrangência dos grupos de peixes, resultando em
uma considerável quantidade de conhecimentos disponíveis, segundo revisão feita
por OLIVEIRA et al. (2006).
Tanto do ponto de vista citogenético, como também do ponto de vista
evolutivo, os peixes compõem um interessante grupo de estudo. Em termos
cariotípicos, diferentes particularidades já foram relatadas neste grupo, o que
justifica o aumento nas pesquisas envolvendo estes animais (AFFONSO, 2000).
Diferentemente de outros vertebrados, os peixes encontram-se confinados à água,
apresentando maiores restrições quanto à sua dispersão. No caso de peixes de
água doce, seu confinamento aos sistemas hidrológicos resulta em um estreito
relacionamento entre as histórias das bacias e a história natural-evolutiva destes
animais (KAVALCO e MOREIRA-FILHO, 2003).
Até recentemente, segundo PORTO-FORESTI et al. (2006), os exames
cariotípicos nos peixes eram considerados principalmente como uma ferramenta
para estudos básicos e evolutivos, não sendo utilizados no manejo e
monitoramento de estoques. Quando análises não são suficientes para caracterizar
precisamente os indivíduos, a identificação pode ser baseada em marcadores
cromossômicos estruturais. Entre os marcadores cromossômicos mais utilizados
em peixes, têm-se a detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs)
através do nitrato de prata, a caracterização dos padrões de heterocromatina
constitutiva pela técnica da Banda C, a coloração por fluorocromos base-
específicos e a localização de seqüências específicas com o uso da hibridação in
situ fluorescente (FISH) (OCALEWICZ et al., 2006; PORTO-FORESTI et al., 2006).
Os estudos citogenéticos em peixes tem mostrado um crescente interesse,
sendo que atualmente cerca de 2600 espécies de todo o mundo possuem seu
cariótipo identificado (OZOUF-COSTAZ e FORESTI, 1992). Hoje existem
informações citogenéticas disponíveis para cerca de 475 espécies de
Characiformes, 318 espécies de Siluriformes, 48 espécies de Gymnotiformes, 199
espécies não pertencentes à superordem Ostariophysi e 109 espécies de peixes
marinhos (OLIVEIRA et al., 2006).
Os dados citogenéticos disponíveis para os peixes de água doce revelam
uma variedade cromossômica surpreendente, além de possibilitarem a
identificação das principais tendências evolutivas e de algumas características
citogenéticas peculiares desta fauna (ALMEIDA-TOLEDO et al., 2000). Até o
presente momento, o menor número diplóide relatado para espécies da região
neotropical corresponde a 2n= 20 cromossomos para Pterolebias longipinnis
(OLIVEIRA et al., 1988a) e o maior, 2n= 134 cromossomos, para Corydoras
aeneus (TURNER et al., 1992). Além disso, entre seus representantes, há grupos
de espécies caracterizados por uma estabilidade nos números diplóides e fórmulas
cariotípicas e grupos que apresentam uma grande diversidade nestas
características (ALMEIDA-TOLEDO et al, 2000; ARTONI el al, 2000).
Técnicas para obtenção de cromossomos mitóticos como as de BERTOLLO
et al. (1978) e FORESTI et al. (1981) impulsionaram a realização de muitos
trabalhos de citotaxonomia em peixes neotropicais. O número diplóide de 52
cromossomos, além de ser comum entre as espécies das subfamílias de
Characidae (OLIVEIRA et al., 1988a; FALCÃO, 1988; AREFJEV, 1990), parece ser
relativamente comum também no gênero Bryconamericus.
Os estudos citogenéticos podem ser de extrema importância na identificação
de novas espécies ou de espécies taxonomicamente problemáticas (WEITZMAN &
FINK, 1983; BERTOLLO et al., 1986) como parece ocorrer dentro da família
Characidae, além de resultarem em informações de interesse e também para o
entendimento de problemas genéticos, evolutivos e sistemáticos neste grupo
(OJIMA, 1983).
1.3 GÊNERO BRYCOMAMERICUS
O gênero Bryconamericus, segundo REIS et al. (2003), pertence atualmente
ao grupo dos Incertae sedis. Anteriormente era classificado como sendo da
subfamília Tetragonopterinae (GÉRY, 1977), que constituía um grande
agrupamento heterogêneo de peixes. Hoje é identificado como uma subfamília
monotípica, restringindo-se somente ao gênero Tetragonopterus. Dentro de
Incertae sedis são descritos 88 gêneros, incluindo 620 espécies, sendo que destas,
51 espécies fazem parte do gênero Bryconamericus.
Bryconamericus exodon EIGENMANN (1907) é a espécie-tipo do gênero.
Na descrição original, EIGENMANN (1907) chama a atenção para o
desalinhamento dos dentes da série externa do pré-maxilar. A espécie é
morfologicamente semelhante à B. stramineus por apresentar corpo relativamente
baixo e alongado, sendo sua altura menos de 30% do comprimento padrão (vs.
mais de 30% do CP), boca terminal (vs. boca inferior) e série externa de dentes do
pré-maxilar desalinhada (vs. série externa de dentes do pré-maxilar alinhada)
(PITON, J. S.; LANGEANI, F., 2006).
Segundo EIGENMANN (1927), no gênero Bryconamericus estão incluídos
todos os peixes caracídeos que possuem linha lateral completa, uma fileira simples
de dentes no dentário, duas séries de dentes no pré-maxilar com quatro dentes na
série interna, o que o distingue do gênero Astyanax segundo BRITSKI (1972), um
baixo número de dentes ao longo da margem anterior da maxila, nadadeira caudal
nua com escamas apenas na base, terceiro infraorbital grande em contato com o
pré-opérculo ao longo de suas margens posterior e ventral, brânquias setiformes,
sistema completo de canal látero-sensorial no corpo e ausência de bolsa glandular
na nadadeira caudal dos machos (BRITSKI, 1972; BRITSKI et al. 1988; VARI &
SIEBERT, 1990).
A definição de Bryconamericus é muito ampla; mesmo EIGENMANN (1927)
já notava sua grande heterogeneidade e dividia o gênero em três ou quatro grupos
"derivados independentemente a partir de diferentes espécies de Astyanax e
Hemibrycon". VARI & SIEBERT (1990) comentam que "existe pouca confiança de
que Bryconamericus represente um grupo monofilético dentro de Characidae", no
que concordam MALABARBA & MALABARBA (1994). ROMÁN-VALENCIA (2000),
ao contrário, afirma que o gênero é natural (incluindo Knodus e Eretmobrycon).
As muitas espécies pertencentes ao gênero Bryconamericus -
aproximadamente 30 a 40 espécies já identificadas - são encontradas em distintas
regiões da América do Sul e América Central (GÉRY, 1977), embora, estudos mais
recentes realizados por REIS et al. (2003) identifiquem aproximadamente 51
espécies no gênero Bryconamericus. Este gênero é o mais diverso nas bacias do
Atlântico do continente americano, especialmente na Bacia Amazônica; conhece-
se nos rios brasileiros cerca de 30 espécies.
Bryconamericus stramineus Eigenmann, 1908, comumente conhecido como
pequira na região do alto do Rio Paraná, distribui-se desde o Rio Paraguai até o
Rio São Francisco (PLANQUETTE et al., 1996). É uma espécie forrageira que não
desperta interesse comercial devido ao seu pequeno tamanho, cerca de 76 mm de
comprimento (RINGUELET et al., 1967), porém é importante na cadeia alimentar
dos sistemas que habita, servindo de alimento para peixes piscívoros.
Conhece-se muito pouco sobre os cromossomos do gênero
Bryconamericus. O primeiro cariótipo descrito para o gênero foi relatado para a
espécie B. stramineus, com 2n=52 cromossomos e fórmula cariotípica
apresentando 13 pares de cromossomos meta-submetacêntricos e 13 pares de
subtelo-acrocêntricos (PORTELA et al., 1988). WASKO et al. (1996) reorganizou
este cariótipo e apresentou-o como tendo 6 cromossomos metacêntricos, 10
submetacêntrico, 16 subtelocêntricos e 20 acrocêntricos. Estudos mais recentes
sobre as diferentes espécies do gênero Bryconamericus revelam uma notável
variabilidade cariotípica. Entretanto, o número diplóide 2n=52 cromossomos
permanece constante (WASKO & GALETTI, 1998; MELO et al., 1999; PAINTNER-
MARQUES et al., 2002a-b, 2003; PORTELA-CASTRO et al., 2007; CAPISTANO et
al., 2008). Tendo em vista a escassez de informação citogenética e ainda a
existência de confusão taxonômica sobre este grupo, estudos mais apurados
fazem-se necessários, para melhor identificação dos seus componentes e para
compreesão das relações existentes entre as espécies.
2. OBJETIVOS
Constatando-se a necessidade de informações sobre os componentes deste
grupo e considerando-se a relativa insuficiência de dados citogenéticos no gênero
Bryconamericus, mais especificamente na espécie Bryconamericus stramineus, e
sabendo-se de sua ocorrência e diversidade em localidades no Estado de São
Paulo, foram realizadas investigações sobre as características citogenéticas deste
grupo, tendo por objetivos:
a) caracterizar citogeneticamente diferentes populações de Bryconamericus
stramineus dos componentes das bacias hidrográficas dos Rios Tietê e
Paranapanema (região de Botucatu), inicialmente através da coloração
convencional Giemsa;
b) identificar a localização e distribuição das regiões organizadoras de nucléolos
(RONs), nos representantes de populações desta espécie em diferentes
localidades, através de impregnação com nitrato de prata e Cromomicina A
3
(CMA
3
específica para regiões GC);
c) identificar os padrões de distribuições de heterocromatina constitutiva
(Bandas C) nos cromossomos;
d) identificar a presença de cístrons ribossômicos nos cromossomos do
complemento A, através de hibridação “in situ” fluorescente (FISH), utilizando
sondas de DNAr 5 S e 18S;
f) identificar com o uso das técnicas de bandeamento clássico e molecular,
marcadores que possam fornecer informações comparativas entre as diferentes
populações;
g) estabelecer os padrões de diversificação e interpretar os mecanismos de
especiação deste grupo de peixes;
h) contribuir com informações citogenéticas tanto para o gênero Bryconamericus
quanto para a espécie B. stramineus, correlacionando os resultados obtidos com
dados disponíveis na literatura.
3. MATERIAL
Os exemplares coletados foram previamente identificados no Laboratório de
Biologia e Genética de Peixes de Botucatu, para saber se correspondiam à espécie
que seria alvo de estudo. Foram analisados 113 exemplares da espécie
Bryconamericus stramineus (Figura 1) coletados nas bacias do Rio Tietê e
Paranapanema (Tabela 1 e Figura 2) em localidades da região de Botucatu, SP
(Figuras 3, 4, 5,6 e 7).
Os animais foram coletados com o auxílio de puçás e redes de arrasto. Após
serem coletados, foram transportados até o laboratório e mantidos em aquários
aerados até seu sacrifício para obtenção de preparações de cromossomos
metafásicos, através da extração de fragmentos de tecidos da porção anterior do
rim e brânquias em alguns casos. Para os estudos moleculares, foram coletadas
amostras de fígado ou tecido com o intuito de se proceder a extração e purificação
do DNA.
Após o processamento, os peixes foram numerados de acordo com o livro
de registros do laboratório, fixados inicialmente em formol a 10% e posteriormente
conservados em álcool etílico a 70% e depositados na coleção de peixes do
Laboratório de Biologia e Genética de Peixes do Departamento de Morfologia do
Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista, Campus de Botucatu,
São Paulo, Brasil.
Figura 1 – Foto de exemplares de Bryconamericus stramineus, fixados e
numerados para identificação e conservados em álcool.(
fonte:Gustavo Pescatori)
Figura 2 – Mapa hidrológico do estado de São Paulo, evidenciando as Bacias dos
Rios Tietê e Paranapanema. (
fonte:Google imagens)
Locais de coleta de Bryconamericus stramineus em componentes das Bacias dos
Rios Tietê e Paranapanema. Figura 3 – Ribeirão Alambari, município de Botucatu,
SP; Figura 4 – Córrego da Quinta, município de Botucatu, SP; Figura 5 – Córrego
Jacutinga, município de Bofete, SP; Figura 6 – Ribeirão Hortelã, município de
Botucatu, SP; Figura 7 – Recanto dos Cambarás, município de Itatinga, SP.
(fonte:GustavoPescatori).
Figura 3
Figura 4
Figura 5
Fi
gura 6
Figura 7
4. MÉTODOS
4.1 Estimulação de Mitoses
Para obtenção de um maior número de mitoses, foi utilizada a técnica de
estimulação da divisão celular através da injeção de solução de fermento biológico,
descrita inicialmente por COLE e LEAVENS (1971) para anfíbios e répteis, utilizada
por LEE E ELDER (1980) para pequenos mamíferos e adaptada para peixes por
OLIVEIRA et al. (1988b). O procedimento consiste em:
a) preparar uma solução de fermento biológico (Fleischmann) na seguinte proporção
- 0,5g de fermento, 0,5g de açúcar e 7ml de água destilada;
b) incubar a solução em banho-maria (40ºC) por cerca de 20 min;
c) injetar a solução dorso-lateralmente no peixe na proporção de 1ml/100g de peso
do animal;
d) deixar o animal em aquário bem aerado por 48 a 72 horas.
4.2 Preparação de cromossomos mitóticos
A técnica utilizada para a obtenção de preparações cromossômicas para a
análise citogenética, realizada em células extraídas da parte anterior do rim para a
obtenção de cromossomos metafásicos in vivo, foi a descrita por FORESTI et al.
(1981) e utilizada com algumas modificações. O procedimento consiste em:
a) injetar solução aquosa de colchicina 0,025% (na proporção de 1ml/100g de peso
do animal) intra-abdominalmente no animal com uma seringa, entre as nadadeiras
peitorais e ventrais. Deixá-lo nadando livremente por 50 minutos;
b) sacrificar o animal, retirando rins e brânquias com o auxílio de tesoura e pinças
de ponta fina;
c) colocar os tecidos retirados em placa de Petri contendo cerca de 6ml de solução
hipotônica (KCl 0, 075 M);
d) dissociar o material, procurando obter uma suspensão de células. Para tal,
primeiro deve-se dissociar o material com pinças de ponta fina, depois,
homogeneizar com o auxílio de uma Pipeta Pasteur;
e) retirar a suspensão celular da placa de Petri e colocá-la em um tubo de
centrífuga. Deixar o tubo no interior de uma estufa a 37
º
C, durante 21 minutos;
e) retirar a suspensão celular da estufa, colocar 7 gotas de solução fixadora gelada
(metanol e ácido acético na proporção de 3:1, respectivamente). Agitar levemente
a mistura com o auxílio de uma pipeta Pasteur. Deixar em repouso por 5 minutos à
temperatura ambiente;
f) adicionar cerca de 6ml do fixador e novamente agitar a mistura. Levar para
centrífuga a 1000rpm por 10 minutos;
g) retirar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 6ml de fixador;
h) centrifugar por 7 minutos a 1000rpm;
i) centrifugar por mais 2 ou 3 vezes;
j) pingar o material em lâminas e secá-las ao ar livre.
4.3 Coloração com Giemsa
Para coloração com Giemsa, utilizou-se o seguinte procedimento, que consiste
em:
a) hidrolisar o material em HCL 1N a 60ºC por cerca de 3 minutos.
b) corar com uma solução de Giemsa a 5% em tampão fosfato (pH = 6,7) por 10
minutos.
4.4 Localização das regiões organizadoras de nucléolos (Ag-RONs)
As RONs foram detectadas utilizando-se a técnica descrita por HOWELL &
BLACK (1980), seguindo o seguinte protocolo:
São utilizadas duas soluções:
- Solução A: solução coloidal reveladora: 1g de gelatina muito bem
dissolvida em 50ml de água deionizada. Acrescenta-se 0,5ml de ácido fórmico.
- Solução B: solução de Nitrato de Prata: 1g de AgNO3 dissolvida em 2ml de
água deionizada.
Essas soluções, depois de preparadas, devem ser mantidas em frascos
escuros, a 4ºC.
O procedimento utilizado para coloração das RONs foi o seguinte:
a) hidrolisar o material contido nas lâminas por 3 minutos em HCL 1N a 60ºC;
b) secar as lâminas;
c) pingar uma gota da solução A e duas gotas da solução B sobre o material na
lâmina; cobrir com lamínula;
d) deixar as lâminas sobre um suporte no interior de um banho-maria a 60ºC;
e) em alguns minutos (aproximadamente 3 minutos) a mistura das soluções se
torna marrom dourada;
f) lava-se a lâmina em água deionizada e deixa-se secar;
g) corar com Giemsa na proporção de 1:30 da solução-mãe em tampão fosfato (pH
= 6,7) por 30 segundos.
4.5 Detecção da heterocromatina constitutiva (Bandas C)
Para a obtenção de Bandas C foi utilizada a técnica descrita por SUMNER
(1972) com algumas adaptações, que consiste em:
a) hidrolisar as lâminas por 30 minutos em HCL 0,2N à temperatura ambiente;
b) lavar em água destilada;
c) passar por uma solução de hidróxido de bário Ba(OH)
2
por cerca de 1 minuto;
d) lavar em HCL 1N a 60ºC. Lavar em água destilada;
e) incubar por 30minutos em 2x SSC (pH = 6,8), a 60
o
C;
f) corar por aproximadamente 30minutos com Giemsa na proporção de 1:20 em
tampão fosfato (pH = 6,7).
4.6 Bandamento com o fluorocromo base-específico Cromomicina A
3
(CMA
3
)
Para a detecção de regiões cromossômicas ricas em pares de base GC, foi
utilizada a técnica descrita por SCHWEIZER (1976) que emprega o corante
Cromomicina A
3
(CMA
3
), que consiste em:
a) colocar sobre as lâminas uma solução tampão Mcllvaine + MgCl2 e cobrir com
lamínula. Incubar em placa de Petri umidecida com o mesmo tampão por 10
minutos;
b) retirar o tampão da lâmina com pipeta Pasteur e, sem lavar as lâminas, secar a
parte de trás das mesmas;
c) depositar as lâminas em placa de Petri, colocar 150 ul de cromomicina (0,5
mg/ml), cobrir com lamínulas lavadas em etanol no momento do uso e deixar o
conjunto dentro de uma caixa escura por 15 minutos;
d) retirar as lamínulas em tampão McIIvaine, lavando as lâminas nesta solução,
vagarosamente;
e) incubar as lâminas em solução de methyl-green/hepes por 15 minutos;
f) secar as lâminas, pingar sobre elas uma gota de glicerol com propilgalato e
depositar uma lamínula para montagem de uma lâmina permanente;
g) deixar as lâminas no escuro e na geladeira por pelo menos 20 dias antes da
análise;
h) observar e fotografar em microscopia de fluorescência.
4.7 Estudos Cariotípicos
As suspensões celulares convencionais foram analisadas em microscópio
óptico comum e a análise da coloração cromossômica com composto fluorescente
em fotomicroscópio digital de fluorescência.
As melhores metáfases, ou seja, as que apresentaram melhor dispersão e
cromossomos com morfologia mais nítida e melhores padrões de bandamento,
foram fotografadas em filme branco e preto 25 ASA AGFA-GEVAERT (suspensões
celulares convencionais) ou registradas no fotomicroscópio digital OLYMPUS BX-
UCB (suspensões celulares convencionais e de coloração cromossômica com
composto fluorescente).
O número fundamental (NF) de cada espécie foi obtido através da contagem
do número de braços cromossômicos. Assim, com relação ao NF, os cromossomos
metacêntricos, submetacêntricos e subtelocêntricos foram considerados como
tendo dois braços cromossômicos e os cromossomos acrocêntricos, como tendo
somente um braço.
4.8 Medidas Cromossômicas
Os cromossomos tiveram sua morfologia estabelecida de acordo com a
relação de braços (RB), proposta por LEVAN et al. (1964) e foram classificados em
metacêntrico (RB de 1,00 a 1,70), submetacêntrico (RB de 1,71 a 3,00),
subtelocêmtrico (RB de 3,01 a 7,00) e acrocêntricos (RB maior que 7,00).
4.9 Montagem dos Cariótipos
Feitas as medidas cromossômicas e estabelecido o número de
cromossomos metacêntricos (M), submetacêntricos (SM), subtelocêntricos e
acrocêntricos (A), os cromossomos foram arranjados segundo o tipo (M, SM, ST,
A) e em ordem decrescente de tamanho.
4.10 Hibridação “in situ” Fluorescente (FISH)
O protocolo descrito a seguir foi baseado nos procedimentos adotados por
PINKEL et al. (1986), com alterações, adaptado para a espécie estudada para a
realização da hibridação in situ fluorescente (FISH).
A sonda de DNAr 5S utilizada na hibridação in situ fluorescente foi obtida de
uma sequência do DNAr 5S da espécie Leporinus elongatus (Martins e Galetti Jr.,
1999), clonada no vetor pGEM-T e a sonda de DNAr 18S foi obtida de uma
sequência do DNAr 18S da espécie Prochilodus argenteus (Hatanaka e Galetti
Jr., 2004), clonada no vetor pGEM-T. As sondas foram gentilmente cedidas pelo
Prof. Dr. Marcelo Ricardo Vicari, professor do programa de pós-graduação em
Biologia Evolutiva da Universidade Estadual de Ponta Grossa, Paraná, Brasil.
4.10.1 Marcação da sonda
a- Marcação da sonda DNAr 5S por PCR – digoxigenina 11 dUTP
Reagentes
Concentrações
Quantidades
Tampão da enzima 10x 5,0 µl
DNA Variável 10-100ng(1µl)
dATP 2mM 1,0 µl
dCTP 2mM 1,0 µl
dGTP 2mM 1,0 µl
dTTP 2mM 0,7 µl
Digoxigenina 11 dUTP 1mM 0,6 µl
Primer F 10mM 0,5 µl
Primer R 10mM 0,5 µl
MgCL
2
(50mM) 2mM 4,0 µl
dH2O 34,2 µl
Taq pol 5U/µl 0,5 µl
Total
50 µl
b- Marcação da sonda de DNAr 18S por PCR – biotina 14 dATP
Reagentes
Concentrações
Quantidades
Tampão da enzima 10x 5,0 µl
DNA Variável 10-100ng
dATP 2mM 1,0 µl
dCTP 2mM 1,0 µl
dGTP 2mM 1,0 µl
dTTP 2mM 0,5 µl
Biotina 14 dATP 0,4 mM 2,5 µl
Primer F 2mM 2,5 µl
Primer R 2mM 2,5 µl
MgCL
2
2mM 4,0 µl
dH2O
Taq pol 5U/µl 0,5 µl
Total
50 µl
4.10.2 Parâmetros para amplificação de DNAr 5S e 18S
1- 94ºC – 5’
2- 94ºC – 1”
3- 53ºC – 45 35 ciclos
4- 72ºC – 2’
5- 72ºC – 5’
6- 4ºC – manutenção
OBS. Checar o produto da PCR em gel de agarose 0,8%.
4.10.3 Precipitação da sonda
- precipitar o produto da PCR com 1/10 do volume da reação com acetato de sódio
- 3M e duas vezes o volume total da reação com de etanol PA gelado;
- incubar a –20ºC overnight;
- centrifuguar a 14.000 rpm por 10 min;
- descartar o sobrenadante e lavar o pellet com 50 µl etanol 70%;
- centrifugar a 14.000 rpm 5 min;
- descartar o sobrenadante, secar em estufa a 37ºC e diluir em x µl de água (para
uso imediato) ou TE (para ser armazenada por um período maior).
4.10.4 Soluções reagentes para hibridação
a) Solução RNAse
- 5 µl RNAse 10mg/ml
- 995 µl 2xSSC
b) Solução pepsina
- 99 mL de H
2
O
- 1 mL de HCl 1M
- 50 µl de pepsina 10%
c) Solução de formaldeído
- 10 mL de PBS 10x
- 5 mL de MgCl
2
1 M
- 1 mL de formaldeído
- Completar para 100 ml com H
2
O destilada
d) Solução Formamida 70%
- 70 mL de formamida
- 30 mL de 2xSSC
e) Solução de Hibridação: (estringência 77%) duas sondas (DOUBLE FISH)
- 200 µl Formamida (50% de Formamida);
- 80 µl Sulfato de Dextrano 50% (conc final de 10%);
- 40 µl de 20xSSC (conc final 2xSSC);
- 8 µl DNA de placenta 10mg/ml (1µl/ lâmina);
- 36 µl de H
2
O qsp. Acrescentada a sonda A
- 36 µl de H
2
O qsp. Acrescentada a sonda B
- Volume final 400 µl.
f) Solução formamida 15%/0,2xSSC
- 30 mL de formamida
- 20 mL de 2xSSC
- 150 mL de H
2
O destilada
g) Solução de Tween 0,5%/4xSSC
- 200 mL de 20xSSC
- 5 mL solução estoque Tween 10%; ou 500 µl Tween puro
- completar para 1L de H
2
O
h) Tampão 5% NFDM/4xSSC
- 20 mL de 20xSSC
- 80 mL de água milli Q
- 5 g de leite em pó molico Ca
++
desnatado
OBS. antes de incubar alicotar 5 tubos com 1000 µl cada do tampão 5%
NFDM/4xSSC
4.10.5 Hibridação (protocolo para 10 lâminas)
Tratamento com RNAse (solução a)
1- lavar as lâminas em tampão PBS 1x durante 5 min. em temperatura
ambiente (shaker);
2- desidratar as lâminas em série alcoólica 70, 85 e 100%, 5 min cada (secar);
3- incubar as lâminas em 100 µl de RNAse (O,4% RNAse/2xSSC) a 37 C por
1h em câmara úmida com água milli-Q;
4- lavar 3 x por 5 min em 2xSSC;
5- lavar durante 5 min em PBS 1x.
OBS. durante a incubação na RNAse preparar o mix de hibridação, a formamida a
70% a 70ºC e o formaldeído;
Tratamento com Pepsina (solução b) - (opcional – pular para passo 8)
6- incubar as lâminas por 10 min em solução de pepsina 0,005% (em 10mM
HCl) a 37º C (pode ser Tº ambiente);
7- lavar em PBS 1x durante 5 min (shaker) a temperatura ambiente;
Fixação (solução c)
8- fixar a preparação em formaldeídeo 1% em PBS 1x/50mM MgCl
2
durante 10
min a temperatura ambiente;
9- lavar em PBS 1x por 5 min. (shaker);
10- desidratar as lâminas em série alcoólicas (70, 85, 100 %) por 5 min cada;
Pré-hibridação (solução d)
11- simultaneamente a desidratação em série alcoólica, desnaturar a solução
de hibridação a 100ºC por um período de 10 min e passá-la imediatamente
ao gelo;
12- desnaturar o DNA cromossômico com formamida 70% em 2xSSC a 70ºC
por 5 min;
13- desidratar o material em série alcoólica 70, 85 e 100% durante 5 min cada.
Obs. a série alcoólica deverá estar a –20ºC;
Hibridação (solução e)
14- preparar a câmara úmida a 37ºC (IMPORTANTE);
15- montar cada lâmina com 40 µl de solução de hibridação, cobrir com
lamínula e deixar o material incubando overnight a 37ºC;
Lavagens – Segundo dia (soluções f e g)
16- lavar 2 vezes em formamida 15%/0,2xSSC pH 7.0 a 42 ºC durante 10min
cada (Shaker);
17- lavar as lâminas 3 vezes em 0,1xSSC a 60ºC, por 5 min cada (Shaker);
18- lavar durante 5min em solução de Tween 0,5%/4xSSC, ambiente (Shaker);
Bloqueio (solução h)
19- incubar as lâminas em tampão 5% NFDM/4xSSC por 15 minutos;
20- lavar 2 x 5min com Tween 0,5%/4xSSC, ambiente (Shaker);
Detecção de duas sondas “DOUBLE FISH”
OBS. montar o mix de anticorpos respeitando as concentrações do fabricante.
21- montar um mix contendo 994 µl NFDM + 1 µl de avidina FITC conjugada +
5 µl de anti digoxigenina rodamina conjugada.
22- incubar as lâminas com 100 µl cada do mix de anticorpos durante 1 h em
câmara úmida e escura, a temperatura ambiente;
23- lavar 3 x 5min com Tween 0,5%/4xSSC, ambiente (Shaker);
24- desidratar em álcool 70, 85 e 100%, 5 min. cada (secar);
Montagem das lâminas com DAPI
25-Misturar 400 µl de antifading mais 1 µl de dapi (0,2 mg/mL);
26-Colocar 50 µl da mistura e cobrir com lamínula. Guardar no escuro.
5. RESULTADOS
Os exemplares de Bryconamericus stramineus das cinco populações
analisadas apresentaram número diplóide constante de 2n=52 cromossomos. No
entanto, foi identificada uma fórmula cariotípica diferenciada para cada localidade e
a ocorrência de três diferentes números fundamentais; não ocorreram diferenças
entre machos e fêmeas em quaisquer dos resultados obtidos com diferentes
metodologias empregadas (Tabela 2).
5.1 População de Bryconamericus stramineus do Ribeirão Alambari
(Município de Botucatu, SP).
Foram analisados 25 exemplares de B. stramineus, sendo 12 indivíduos
machos, 11 indivíduos fêmeas e 2 de sexo indeterminado. Após a análise com a
coloração convencional com Giemsa, foi constatado um número diplóide de 2n=52
cromossomos e sua fórmula cariotípica é composta de 10 cromossomos do tipo
metacêntrico,18 cromossomos do tipo submetacêntrico, 12 cromossomos do tipo
subtelocêntrico e 12 cromossomos do tipo acrocêntrico, sendo o número
fundamental (NF) igual a 92 (Figura 8, Tabela 2).
A análise da heterocromatina constitutiva, utilizando-se a técnica de
bandamento C, foi evidenciou a presença de blocos heterocromáticos
centroméricos e terminais distribuídos na maioria dos cromossomos do seu
complemento cariotípico (Figura 9).
A análise das RONS, evidenciadas através da técnica de impregnação por
nitrato de Prata, que marca apenas cístrons de DNAr ativos, ocorreu em dois
cromossomos do tipo submetacêntrico, com marcações na posição terminal do
braço curto (Figura10).
A análise das regiões ricas em GC, através da técnica de coloração por
fluorocromo CMA
3,
foi evidenciou em algumas células a marcação em apenas um
dos homólogos do par cromossômico portador das RONs, o que apresenta um
maior sítio ribossomal. Entretanto, outras marcações menos evidentes estão
presentes no complemento cariotípico (Figura11).
A aplicação da técnica de hibridação in situ fluorescente utilizando a sonda
de DNAr 18S para a localização dos genes ribossômicos, revelou dois
cromossomos com marcações bem evidentes, corroborando os resultados da
impregnação por nitrato de Prata (RONS) e pela coloração pelo fluorocromo CMA
3
.
Além disso, outros quatro cromossomos apresentaram marcações menos
evidentes nesta população de B. stramineus (Figura12)
A aplicação da técnica de hibridação in situ fluorescente utilizando a sonda
de DNAr 5S mostrou a presença de dois cromossomos com marcações bem
evidentes e a presença de um cromossomo com marcações mais fracas. (Figura
12).
Figura 8 – Cariótipo de B. stramineus com coloração convencional por Giemsa
(2n=52 cromossomos), de exemplar do Ribeirão Alambari.
Figura 9 – Metáfase somática de Bryconamericus stramineus do Ribeirão
Alambari, submetida ao Bandamento C, evidenciando as regiões heterocromáticas,
nas regiões centroméricas e teloméricas dos cromossomos.
Figura 10 – Metáfase somática de Bryconamericus stramineus do Ribeirão
Alambari, marcada com nitrato de prata. As setas evidenciam os cromossomos
portadores das RONs.
Figura 11 – Metáfase somática de Bryconamericus stramineus do Ribeirão
Alambari, tratada com o fluorocromo Cromomicina (CMA
3
). A seta indica as regiões
mais fortemente marcadas, regiões ricas em pares de base GC.
Figura 12 – Metáfase somática de Bryconamericus stramineus do Ribeirão
Alambari, submetida à hibridação in situ fluorescente (Double FISH) com a sonda
de DNAr 5S (marcação vermelha) e 18S (marcação verde).
5.2 População de Bryconamericus stramineus do Córrego da Quinta
(Município de Botucatu, SP).
Foram analisados 22 exemplares de B. stramineus, sendo 17 machos e 5
fêmeas. Após a análise com a coloração convencional com Giemsa, foi constatado
que todos apresentaram número diplóide de 2n=52 cromossomos. A fórmula
cariotípica é composta de 14 cromossomos do tipo metacêntrico, 12 cromossomos
do tipo submetacêntricos, 14 cromossomos do tipo subtelocêntrico e 12
cromossomos do tipo acrocêntrico, sendo seu número fundamental (NF) igual a 92
(Figura 13, Tabela 2).
A análise da heterocromatina constitutiva, através do bandamento C,
evidenciou a presença de blocos heterocromáticos teloméricos, centroméricos e
intersticiais distribuídos nos cromossomos do complemento cariotípico (Figura 14).
A análise das RONS, evidenciadas através da impregnação pelo nitrato de
prata, revelou marcação evidente em três cromossomos do tipo submetacêntrico
em um grende número de metáfases, indicando a ocorrência de um sistema do tipo
de RONs múltiplas, com marcações na posição terminal do braço curto dos
cromossomos (Figura 15).
A análise das regiões ricas em GC, através da coloração dos cromossomos
com o fluorocromo CMA
3,
evidenciou marcações coincidentes com as RONs nos
respectivos cromossomos (Figura 16).
Através da técnica de hibridação in situ fluorescente utilizando a sonda de
DNAr 18S, para a localização dos genes ribossômicos, foram observados pelo
menos três cromossomos com marcações bem evidentes e mais um
cromossomos com marcações menos evidentes nesta população de B. stramineus
(Figura17).
A aplicação da técnica de hibridação in situ fluorescente utilizando a sonda
de DNAr 5S mostrou a presença de três cromossomos com marcações evidentes e
a presença de um cromossomo com marcações mais fracas. (Figura 17).
Figura 13 – Cariótipo de B. stramineus com coloração convencional por Giemsa
(2n=52 cromossomos), de exemplar do Córrego da Quinta.
Figura 14 – Metáfase somática de Bryconamericus stramineus do Córrego da
Quinta, submetida ao Bandamento C, evidenciando as regiões heterocromáticas
nas regiões teloméricas, centroméricas e intersticiais.
Figura 15 – Metáfase somática de Bryconamericus stramineus do Córrego da
Quinta, marcada com nitrato de prata. As setas evidenciam os cromossomos
portadores das RONs.
Figura 16 – Metáfase somática de Bryconamericus stramineus do Córrego da
Quinta, tratada com o fluorocromo Cromomicina (CMA
3
). A seta indica as regiões
mais fortemente marcadas, regiões ricas em pares de base GC.
Figura 17 – Metáfase somática de Bryconamericus stramineus do Córrego da
Quinta, submetida à hibridação in situ fluorescente (Double FISH) com a sonda de
DNAr 5S (marcação vermelha) e 18S (marcação verde).
5.3 População de Bryconamericus stramineus do Córrego Jacutinga
(Município de Bofete, SP).
Foram analisados 23 exemplares de B. stramineus, sendo 19 machos e 4
fêmeas. Após a análise com a coloração convencional com Giemsa, foi constatado
que todos apresentaram um número diplóide 2n=52 cromossomos. Sua fórmula
cariotípica é composta de 12 cromossomos do tipo metacêntrico, 16 cromossomos
do tipo submetacêntrico, 16 cromossomos do tipo subtelocêntrico e 8
cromossomos do tipo acrocêntrico, sendo seu número fundamental (NF) igual a 96
(Figura 18, Tabela 2).
A análise da heterocromatina constitutiva, através do bandamento C,
evidenciou a presença de blocos heterocromáticos na maioria dos cromossomos.
Blocos centroméricos, intersticiais e teloméricos também foram observados em
alguns cromossomos do complemento cariotípico (Figura 19).
A análise das RONS, evidenciadas através da impregnação pelo nitrato de
prata, ocorreu em dois cromossomos do tipo submetacêntrico, com as marcações
localizadas na posição terminal do braço curto deste par cromossômico (Figura
20).
A análise das regiões ricas em GC, através da coloração dos cromossomos
com o fluorocromo CMA
3
,evidenciou marcações coincidentes com as RONs nos
respectivos cromossomos (Figura 21).
A aplicação da técnica de hibridação in situ fluorescente utilizando a sonda
de DNAr 18S, para a localização dos genes ribossômicos, revelou dois
cromossomos com marcações bem evidentes, corroborando os resultados da
impregnação por nitrato de Prata (RONS) e pela coloração pelo fluorocromo CMA
3
.
Além disso, mais um cromossomo apresentou marcações menos evidentes nesta
população de B. stramineus (Figura 22)
A aplicação da técnica de hibridação in situ fluorescente utilizando a sonda
de DNAr 5S mostrou a presença de dois cromossomos com marcações bem
evidentes e a presença de mais um cromossomo com marcação mais fraca.
(Figura 22).
Figura 18 – Cariótipo de B. stramineus com coloração convencional por Giemsa
(2n=52 cromossomos), de exemplar do Córrego Jacutinga.
Figura 19 – Metáfase somática de Bryconamericus stramineus do Córrego
Jacutinga, submetida ao Bandamento C, evidenciando as regiões heterocromáticas
nas regiões teloméricas, centroméricas e intersticiais.
Figura 20 – Metáfase somática de Bryconamericus stramineus do Córrego
Jacutinga, marcada com nitrato de prata. As setas evidenciam os cromossomos
portadores das RONs.
Figura 21 – Metáfase somática de Bryconamericus stramineus do Córrego
Jacutinga, tratada com o fluorocromo Cromomicina (CMA
3
). A seta indica as
regiões mais fortemente marcadas, regiões ricas em pares de base GC.
Figura 22 – Metáfase somática de Bryconamericus stramineus do Córrego
Jacutinga, submetida à hibridação in situ fluorescente (Double FISH) com a sonda
de DNAr 5S (marcação vermelha) e 18S (marcação verde).
5.4 População de Bryconamericus stramineus do Ribeirão Hortelã (Município
de Botucatu, SP).
Foram analisados 17 exemplares de B. stramineus, sendo 5 machos e 12
fêmeas. Após a análise com a coloração convencional com Giemsa, foi constatado
que todos apresentaram um número diplóide 2n=52 cromossomos. A fórmula
cariotípica é composta de 6 cromossomos do tipo metacêntrico, 12 cromossomos
do tipo submetacêntrico, 14 cromossomos do tipo subtelocêntrico e 20
cromossomos do tipo acrocêntrico, sendo seu número fundamental (NF) igual a 84
(Figura 23, Tabela 2).
A análise da heterocromatina constitutiva, através do bandamento C,
evidenciou a presença de blocos heterocromáticos centroméricos e teloméricos
distribuídos em alguns cromossomos do complemento cariotípico (Figura 24).
A análise das RONS, evidenciadas através da impregnação pelo nitrato de
prata, ocorreu em dois cromossomos do tipo submetacêntrico, com as marcações
na posição terminal do braço curto deste par cromossômico (Figura25).
A análise das regiões ricas em GC, através da coloração dos cromossomos
com o fluorocromo CMA
3,
evidenciaram marcações coincidentes com as RONs
nos respectivos cromossomos (Figura 26).
Através da técnica de hibridação in situ fluorescente utilizando a sonda de
DNAr 18S, para a localização dos genes ribossômicos, foi observado dois
cromossomos com marcações bem evidentes corroborando com os resultados da
impregnação por nitrato de Prata (RONS) e pela coloração pelo fluorocromo CMA
3
.
Além disso, mais um cromossomo apresentou marcações menos evidentes nesta
população de B. stramineus (Figura 27).
A aplicação da técnica de hibridação in situ fluorescente utilizando a sonda
de DNAr 5S mostrou a presença de dois cromossomos com marcações bem
evidentes e a presença de dois cromossomos com marcações mais fracas. (Figura
27).
Figura 23 – Cariótipo de B. stramineus com coloração convencional por Giemsa
(2n=52 cromossomos), de exemplar do Ribeirão Hortelã.
Figura 24 – Metáfase somática de Bryconamericus stramineus do Ribeirão
Hortelã, submetida ao Bandamento C, evidenciando as regiões heterocromáticas
nas regiões teloméricas e centroméricas.
Figura 25 – Metáfase somática de Bryconamericus stramineus do Ribeirão
Hortelã, marcada com nitrato de prata. As setas evidenciam os cromossomos
portadores das RONs.
Figura 26 – Metáfase somática de Bryconamericus stramineus do Ribeirão
Hortelã, tratada com o fluorocromo Cromomicina (CMA
3
). A seta indica as regiões
mais fortemente marcadas, regiões ricas em pares de base GC.
Figura 27 – Metáfase somática de Bryconamericus stramineus do Ribeirão
Hortelã, submetida à hibridação in situ fluorescente (Double FISH) com a sonda de
DNAr 5S (marcação vermelha) e 18S (marcação verde).
5.5 População de Bryconamericus stramineus do Recanto dos Cambarás
(Município de Itatinga, SP).
Foram analisados 26 exemplares de B. stramineus, sendo 23 machos e 3
fêmeas. Após a análise com a coloração convencional com Giemsa, foi constatado
que todos apresentaram um número diplóide 2n=52 cromossomos. A fórmula
cariotípica é composta de 6 cromossomos do tipo metacêntrico, 10 cromossomos
do tipo submetacêntrico, 28 cromossomos do tipo subtelocêntrico e 8
cromossomos do tipo acrocêntrico, sendo seu número fundamental (NF) igual a
104 (Figura 28, Tabela 2).
A análise da heterocromatina constitutiva, através do bandamento C,
evidenciou a presença de blocos heterocromáticos centroméricos, intersticiais e
teloméricos distribuídos em alguns cromossomos do complemento cariotípico
(Figura 29).
A análise das RONS, evidenciadas através da impregnação pelo nitrato de
prata, ocorreu freqüentemente em três cromossomos do tipo submetacêntrico,
evidenciando a ocorrência de RONs múltiplas, com as marcações ocorrendo na
posição terminal do braço curto dos cromossomos (Figura 30).
O tratamento dos cromossomos com o fluorocromo CMA
3
, analisando a
distribuição de regiões ricas em GC, evidenciou marcações brilhantes em apenas
dois cromossomos submetacêntricos, provavelmente coincidindo com os
portadores da Ag-RONs, que apresentam sítios ribossomais maiores (Figura 31).
A utilização da técnica de hibridação in situ fluorescente utilizando a sonda
de DNAr 18S, para a localização dos genes ribossômicos, revelou dois
cromossomos com marcações bem evidentes, corroborando os resultados da
coloração pelo fluorocromo CMA
3
nesta população de B. stramineus (Figura 32).
A aplicação da técnica de hibridação in situ fluorescente utilizando a sonda
de DNAr 5S mostrou a presença de três cromossomos com marcações bem
evidentes e a presença de dois cromossomo com marcações mais fracas. (Figura
32).
Figura 28 – Cariótipo de B. stramineus com coloração convencional por Giemsa
(2n=52 cromossomos), de exemplar do Recanto dos Cambarás.
Figura 29 – Metáfase somática de Bryconamericus stramineus do Recanto dos
Cambarás, submetida ao Bandamento C, evidenciando as regiões
heterocromáticas nas regiões teloméricas, centroméricas e intersticiais.
Figura 30 – Metáfase somática de Bryconamericus stramineus do Recanto dos
Cambarás, marcada com nitrato de prata. As setas evidenciam os cromossomos
portadores das RONs.
Figura 31 – Metáfase somática de Bryconamericus stramineus do Recanto dos
Cambarás, tratada com o fluorocromo Cromomicina (CMA
3
). A seta indica as
regiões mais fortemente marcadas, regiões ricas em pares de base GC.
Figura 32 – Metáfase somática de Bryconamericus stramineus do Recanto dos
Cambarás, submetida à hibridação in situ fluorescente (Double FISH) com a sonda
de DNAr 5S (marcação vermelha) e 18S (marcação verde).
6. DISCUSSÃO
Citogeneticamente, as espécies de Characidae são bastante diversificadas.
Apresentam variações quanto ao número diplóide (MORELLI, BERTOLLO e
MOREIRA-FILHO, 1983; OLIVEIRA et al., 1988a; PORTELLA, GALETTI Jr. e
BERTOLLO, 1988; AREFJEV, 1990), distribuição de heterocromatina constitutiva
(SOUZA, MOREIRA-FILHO e GALETTI Jr., 1996; MANTOVANI et al., 2000,
MANTOVANI et al., 2004), localização, número e tamanho das regiões
organizadoras de nucléolos (MOREIRA-FILHO, BERTOLLO e GALETTI Jr., 1984;
GALETTI Jr., 1998), presença de cromossomos supranumerários (MOREIRA-
FILHO et al, 2001), cromossomos sexuais (ARTONI e BERTOLLO, 2002)
diplocromossomos (SOUZA, MOREIRA-FILHO e BERTOLLO, 1995) e poliploidia
(FAUAZ, VICENTE e MOREIRA-FILHO, 1994). Entretanto, são poucos os casos
de polimorfismo cromossômico estrutural relatado para representantes desta
família (CENTOFANTE, PORTO e FELDBERG, 2002; PACHECO, GIULIANO-
CAETANO e DIAS, 2001).
O número diplóide 2n=52 cromossomos é um dos mais freqüentes no
gênero Bryconamericus - exceto para indivíduos de uma população estudada por
WASKO & GALETTI (1998) que apresenta 2n=54 cromossomos - sendo descrito
por diversos autores e apresentando fórmula cariotípica muito variável (Tabela 3).
Um complemento cromossômico de 2n= 52 cromossomos é muito comum entre as
espécies da família Characidae (OLIVEIRA et al. 1988a; FALCÃO, 1988;
AREFJEV, 1990) incluindo algumas outras espécies de Incertae sedis, como
Piabina argêntea (MOREIRA-FILHO, et al., 1978; PORTELLA, et al., 1988;
WASKO, 1996), Hemigramus aff. Schmardae e Hyphessobrycon stictus (SCHELL
e CRISTENSEN, 1970). No presente trabalho, os cariótipos analisados de
Bryconamericus mantiveram-se conservativos quanto ao número, sendo
encontrado um número diplóide 2n=52 cromossomos para todos os exemplares
analisados, nas cinco populações desta espécie, em duas Bacias Hidrográficas,
corroborando os resultados descritos para a espécie e para o gênero. WASKO E
GALETTI JR. (1998) acreditam que um cariótipo de 2n=52 cromossomos seja uma
característica primitiva em Bryconamericus.
Nas populações analisadas, cinco citótipos diferentes foram encontrados,
distintos dos já descritos para a espécie, apresentando uma pequena variação
para o gênero, porém com valores muito próximos aos já encontrados,
comprovando assim a alta variabilidade cariotípica descrita para o gênero
Bryconamericus (Tabela 3). Contudo, pequenas diferenças envolvendo a estrutura
cariotípica em peixes que apresentam quatro tipos de cromossomos (m, sm, st, a)
podem, algumas vezes, ser atribuídas a desvios na medida dos cromossomos no
momento da montagem dos cariótipos, visto que muitos cromossomos encontram-
se no limite entre um tipo e outro, segundo a classificação de LEVAN et al. (1964).
O número fundamental (NF) neste gênero varia de 84 a 102 (PORTELA et
al., 1988; WASKO et al., 1996; WASKO E GALETTI JR., 1998; PAINTNER-
MARQUES et al., 2002a, 2003; PORTELA-CASTRO et al., 2007; CAPISTANO et
al., 2008). Neste trabalho, os exemplares de uma das localidades apresentaram
um número fundamental NF=84, resultado este igual ao descrito por WASKO et al.
(1996) nesta espécie; duas localidades apresentaram o número fundamental
NF=92 e em outras duas o número fundamental foi NF=96, corroborando os
resultados da literatura (Tabela 3). As diferenças na estrutura cariotípica podem ter
sido evidenciadas principalmente por divergências no número de cromossomos
acrocêntricos. Variações do número fundamental (FN) podem ser resultados de
rearranjos cromossômicos, principalmente dos tipos translocações e inversões
pericêntricas, que podem ser considerados como mecanismo importante de
diversificação e evolução cariotípica neste grupo de peixes (WASKO et al., 1996;
WASKO E GALETTI JR., 1998). Contudo, DENTON (1973) e KIRPICHNIKOV
(1973) sugerem que as inversões pericêntricas são um dos principais tipos de
mecanismos responsáveis pela evolução cariotípica em peixes.
Tabela 3: Dados citogenéticos comparativos no gênero Bryconamericus em diferentes
localidades do Brasil, dispostos em ordem crescente de número fundamental (NF).
Espécies
Localidades
2n
NF Fórmula Cariotípica Referência
Rios (estados)
B. stramineus Ribeirão Hortelã (SP) 52
84 6M+12SM+14ST+20A presente estudo
B. stramineus Rio Mogi-Guaçu (SP) 52
84 6M+10SM+16ST+20A WASKO et al. (1996)
B. aff. exodon - cit.I
a
Riacho Três Bocas (PR) 52
86 16M+12SM+6ST+18A PAINTNER-MARQUES et al. (2002a)
Bryconamericus sp. B Rio Piracicaba (SP) 52
88 6M+10SM+16ST+20A WASKO and GALETTI (1998)
B. aff. Iheringii - cit. III
a
Riacho Tatupeba 52
88 8M+20SM+8ST+16A CAPISTANO, et al. (2008)
B. aff. Iheringii - cit. I
a
Rio Keller (PR) 52
90 12M+18SM+8ST+14A PORTELA-CASTRO et al. (2007)
Bryconamericus sp. C Riacho Três Bocas (PR) 52
90 6M+18SM+14ST+14A WASKO and GALETTI (1998)
Bryconamericus sp. D Riacho Avoadeira (MT) 52
90 8M+14SM+16ST+14A WASKO and GALETTI (1998)
B. aff. Iheringii - cit.I
a
Córrego Maringá (PR) 52
90 12M+18SM+8ST+14A CAPISTANO, et al. (2008)
B. stramineus Córrego da Quinta (SP) 52
92 14M+12SM+14ST+12A presente estudo
B. stramineus Ribeirão Alambari (SP) 52
92 10M+18SM+12ST+12A presente estudo
B. aff. exodon - cit.II
a
Riacho Três Bocas (PR) 52
92 10M+24SM+6ST+12A PAINTNER-MARQUES et al. (2002a)
B. aff. Iheringii Rio Água da Floresta (PR) 52
92 8M+22SM+10ST+12A PAINTNER-MARQUES et al. (2003)
B. aff. Iheringii - cit. II
a
Rio Keller (PR) 52
94 8M+28SM+6ST+10A PORTELA-CASTRO et al. (2007)
Bryconamericus sp. A Rio Piracicaba (SP) 52
94 6M+30SM+6ST+10A WASKO and GALETTI (1998)
B. stramineus Córrego Jacutinga (SP) 52
96 12M+16SM+16ST+8A presente estudo
B. stramineus Recanto dos Cambarás (SP) 52
96 6M+10SM+28ST+8A presente estudo
B. ornaticeps Rio Suruí, Roncador (RJ) 52
98 32M-SM+14ST+6A MELO et al. (1999)
Bryconamericus sp. E Riacho Avoadeira (MT) 54
102
10M+16SM+22ST+6A WASKO and GALETTI (1998)
O bandamento C tem sido amplamente utilizado em estudos citogenéticos
de peixes (ALMEIDA-TOLEDO et al., 1996; MARGARIDO e GALETTI JR., 1999;
MANTOVANI et al., 2004; entre outros). O padrão de distribuição da
heterocromatina constitutiva ao longo dos cromossomos tem sido utilizado para a
identificação de polimorfismos cromossômicos (MOLINA, 1995), para a
identificação de cromossomos sexuais (GALETTI & FORESTI, 1986; ANDREATA
et. al., 1992; entre outros) e para caracterizar espécies ou grupos de espécies
(GALETTI et. al., 1991; MARGARIDO & GALETTI, 1996, entre outros).
Entre os peixes, há uma tendência para a presença de blocos
heterocromáticos centroméricos e teloméricos (ALMEIDA-TOLEDO et al., 1981;
GOLD et al., 1986; GARCIA et al., 1987; FORESTI et al., 1989). DERGAN &
BERTOLLO (1990) indicam que há uma predominância de Bandas C
pericentroméricas entre os Characiformes. Entretanto, FORESTI et al. (1989)
afirmam que, no caso da família Characidae, não existem evidências que indiquem
uma tendência a uma localização específica de Bandas C para as espécies deste
grupo. A espécie Astyanax scabripinnis, por exemplo, tem uma predominância de
bandas heterocromáticas teloméricas (MOREIRA-FILHO e BERTOLLO, 1991;
MAISTRO et al., 1992), enquanto que em Moenkhausia santafilomenae a
heterocromatina intersticial está presente em vários cromossomos.
Através da técnica de bandeamento C, fazendo-se a análise da
heterocromatina constitutiva em Bryconamericus stramineus do Ribeirão Alambari,
Córrego da Quinta, Córrego Jacutinga, Ribeirão Hortelã e Recanto dos Cambarás
foi constatada a presença de um padrão de blocos heterocromáticos
preferencialmente em regiões centroméricas e teloméricas em diferentes
cromossomos do complemento cariotípico. Foi observada também a presença de
alguns pequenos blocos heterecromáticos intersticiais e a presença de blocos
maiores de heterocromatina nas regiões teloméricas, estas associadas às regiões
das RONs. Os resultados mostram que os exemplares de todas as localidades
analisadas mantiveram um mesmo padrão, uma mesma tendência na distribuição
da heterocromatina, não existindo grandes diferenças na quantidade de
heterocromatina sendo assim. Tais características corroboram com os resultados
descritos por outros autores para o gênero.
A distribuição da heterocromatina constitutiva é variável nas espécies de
Bryconamericus e parece não ter uma tendência geral quanto á sua localização.
Sendo assim, cada espécie pode ser caracterizada por um determinado padrão de
Banda C, de acordo com WASKO e GALETTI (1998). Em 1996, WASKO e
colaboradores em estudos realizados em duas populações de Bryconamericus,
observou em ambas a presença de blocos de heterocromatina preferencialmente
localizados nas regiões de centrômero e telômero dos cromossomos, além de
pequenos blocos intersticiais e também grandes blocos de heterocromatina
associados às NORs, principalmente aqueles detectados no par 21 de
Bryconamericus sp A e no par 13 de Bryconamericus sp B.
WASKO e GALETTI JR. (1998), observaram blocos heterocromáticos nas
regiões intersticial, telomérica e centromérica dos cromossomos de cinco
populações de Bryconamericus spp.; Bryconamericus sp A tinha uma grande
quantidade de heterocromatina no braço curto dos pares 4, 6 e 9; Bryconamericus
sp. B mostrou blocos heterocromáticos pericentroméricos nos pares 10, 11, 13, 20,
21 e 24; Bryconamericus sp. C apresentou heterocromatina telomérica no braço
curto dos pares 9 e 16; Bryconamericus sp. D mostrou heterocromatina
centromérica e telomérica e Bryconamericus sp. E mostrou grandes blocos de
heterocromatina nos pares 1, 2, 8 e 14, parecendo envolver todo o braço destes.
Em estudos realizados por PORTELLA-CASTRO (1999) Bryconamericus aff.
Iheringii, citótipos 1 e 2, e Bryconamericus spp. da bacia do Rio Ivaí (PR), blocos
heterocromáticos estão restritos as regiões centroméricas de praticamente todos
os cromossomos e também sobre braços curtos de pares correspondentes
àqueles com marcação de RONs. No rio Água da Floresta, parte da bacia do Rio
Tibagi (PR), PAINTNER-MARQUES et al. (2003) observou em Bryconamericus aff.
Iheringii, blocos heterocromáticos nas regiões centroméricas e teloméricas na
maioria dos cromossomos e também fortes marcações nas regiões teloméricas dos
pares 16, 17, 18, 19 e 20, todos subtelocêntricos, que podem ser considerados
marcadores heterocromáticas nesta espécie. Em estudos realizados por
PORTELLA-CASTRO et al. (2007) em Bryconamericus aff. Iheringii do Rio Keller
(afluente do Rio Ivaí – PR), a heterocromatina constitutiva foi detectada na região
pericentromérica e telomérica da maior parte dos cromossomos dos dois citótipos
descritos nessa população, no entanto, os pares 2, 9 e 12 do citótipo I e os pares
6, 7, e 11 do citótipo II, apresentam blocos heterocromáticos teloméricos, o que
permite a identificação de cada cariótipo.
Entre os peixes, uma correspondência entre as RONs e sítios de Banda C
positivos é relativamente comum (GALETTI JR. e RASH, 1993b; SOUZA,
MOREIRA-FILHO e GALETTI JR, 1996). Para MOREIRA-FILHO, BERTOLLO e
GALETTI (1984) a presença de heterocromatina na região de RONs poderia ter
influência nos rearranjos cromossômicos nestas regiões, podendo facilitar o
acúmulo desses loci (FUJIWARA et al., 1998).
Todos os indivíduos aqui analisados parecem apresentar RONs
coincidentes com regiões heterocromáticas. Geralmente, em peixes, as RONs
estão associadas a regiões heterocromáticas, ou seja, a regiões Banda C –
positivas, ao contrário do que ocorre em mamíferos (ALMEIDA–TOLEDO et. al.,
1981). Segmentos heterocromáticos coincidentes com as RONs, já foram relatados
em Apareiodon piracicabae (MOREIRA-FILHO et al., 1984), Leporinus (GALETTI
et al., 1991) e diversas espécies de Brycon (MARGARIDO & GALETTI, 1996). Esta
situação de congruência das RONs e das regiões de heterocromatina mostra um
aparente antagonismo, ou seja, uma região altamente ativa (RON), associada a
segmentos que apresentam comportamento de uma região inativa
(heterocromatina). Talvez a metodologia empregada para a detecção de regiões de
heterocromatina constitutiva e regiões organizadoras de nucléolos não forneça
nitidez suficiente para demonstrar que na realidade tais regiões não são
coincidentes, mas sim adjacentes ou intercaladas (WASKO, 1996). Situação similar
também foi detectada em diferentes espécies de Anura (SCHMID, 1978 e 1980;
KING, 1980).
As regiões organizadoras de nucléolos (RONs) podem constituir excelentes
marcadores citotaxonômicos, podendo inclusive ser utilizadas para formular
hipóteses filogenéticas. Em peixes, o número e/ou a localização das RONs foram
descritos para 231 espécies. Destas, 164 (71%) apresentaram RONs simples, 35
(15%) apresentaram 2 pares de cromossomos nucleolares e 32 (14%)
apresentaram mais de 2 pares de cromossomos portadores de RONs (OLIVEIRA &
FORESTI, 1994).
Algumas subfamílias de Characidae podem ser caracterizadas por
apresentarem RONs simples, como Bryconinae (ALMEIDA-TOLEDO et al., 1996;
MARGARIDO e GALETTI JR., 1996) ou múltiplas como Serrasalminae (GALETTI
JR., SILVA e CERMINARO, 1985b). Outros grupos podem apresentar tanto RONs
simples como múltiplas, como é o caso de Astyanax. Para este gênero, tem sido
descrito a presença de RONs simples ou múltiplas com até 15 cromossomos
marcados (ROCON-STANGE; ALMEIDA-TOLEDO, 1993).
Nas populações de Bryconamericus stramineus estudadas neste trabalho,
foi identificada a presença de RONs simples e múltiplas. A primeira RON simples
encontrada no gênero Bryconamericus foi observada em uma população de
Bryconamericus aff. Iheringii do rio Água da Floresta, bacia do rio Tibagi (PR), na
qual foram identificadas RONS em regiões teloméricas sobre o braço curto de um
par de cromossomos submetacêntricos grandes, em estudos realizados por
PAINTNER-MARQUES et al. (2003). Mais recentemente, CAPISTANO et al. (2008)
estudando a população do riacho Tatupeba (PR) revelou também um padrão de
RONs simples, marcando apenas um par de cromossomos submetacêntricos.
Embora seja rara a presença de RONs simples neste gênero, nos exemplares
analisados das populações do Ribeirão Alambari, Córrego Jacutinga e Ribeirão
Hortelã foram também observadas RONs simples, encontradas na região
telomérica sobre o braço curto de um par de cromossomos submetacêntricos
grandes, corroborando assim com resultados existentes para este gênero. RONs
simples são observadas em outros gêneros da subfamília Incertae sedis, como
Moenkausia (PORTELA, GALETTI E BERTOLLO, 1988), Gymnocorymbus
(ALBERDI e FERNOCCHIO, 1997); para a sub-família Bryconinae, também é
descrita a ocorrência de RONs simples (ALMEIDA-TOLEDO et al., 1996;
MARGARIDO; GALETTI JR., 1996). Na espécie Orthospinus franciscencis, RONs
simples foram descritas por PFISTER, MOREIRA-FILHO e BERTOLLO (1997).
Entre os mamíferos, os cariótipos com um único par de RONs podem ser
considerados como sendo ancestrais em relação aos cariótipos com múltiplas
RONs (HSU et. al., 1975). Considerando-se estas características e tomando-se
estes dados como verdadeiros também para peixes, as populações do Ribeirão
Alambari, Córrego Jacutinga e Ribeirão Hortelã podem ser considerados
ancestrais, com relação às regiões organizadoras de nucléolos, quando
comparadas a outras populações do gênero e às outras duas populações de B.
stramineus analisadas no presente estudo (Córrego da Quinta e do Recanto dos
Cambarás), que apresentam RONs múltiplas e seriam assim consideradas mais
recentes.
A presença de um sistema de RONs múltiplas é a condição mais freqüente
encontrada no gênero Bryconamericus, sendo descrita por vários autores. Em
estudos realizados por WASKO e GALETTI JR. (1999) em quatro espécies de
Bryconamericus, duas pertencentes ao rio Piracicaba (SP), uma população do
córrego Três Bocas (PR) e outra população do córrego Avoadeiras (MT), observou-
se nove fenótipos diferentes, baseados sobre o número e a localização das RONs.
Não há um fenótipo de RONs comum partilhada pelas quatro espécies mas, a
ocorrência de um fenótipo denominado 3p (NOR no braço curto de um acrocêntrico
médio) detectado em Bryconamericus sp. B, Bryconamericus sp.C e
Bryconamericus sp.D, indicando que esta poderia ser uma posição ancestral que
figura entre estes peixes. PORTELLA–CASTRO (1999), analisou três espécies de
Bryconamericus da bacia hidrogáfica do rio Ivaí (PR) e observou uma variação de
dois a quatro cromossomos nucleolares. PAINTNER-MARQUES et al. (2002b)
realizou estudos em Bryconamericus aff. exodon coletados no córrego Três Bocas
(PR) e relatou a ocorrência de dois a cinco cromossomos nucleolares nesta
população. Em estudos realizados por CAPISTANO et al. (2008) em populações
de Bryconamericus aff. iheringii do córrego Maringá (PR) e do rio Keller (PR),
ambas apresentaram dois a quatro cromossomos marcados pelo nitrato de prata.
Nas populações de Bryconamericus stramineus do Recanto dos Cambarás
e do Córrego da Quinta, através da técnica de impregnação por nitrato de prata
ficou evidente a marcação de três cromossomos do tipo submetacêntrico na
maioria das metáfases analisadas, estando as RONS presentes na posição
terminal do braço curto destes cromossomos, e enquadrando estas duas
populações no grupo de peixes que apresentam múltiplas RONs (GALETTI et al.,
1985a; ALMEIDA-TOLEDO & FORESTI, 1985).
Variações no número de cromossomos portadores de regiões organizadoras
de nucléolos são comuns também em outros peixes da subfamília Incertae Sedis.
Em estudos realizados por PORTELLA et al. (1988), Piabina argêntea apresentou
de um a quatro cromossomos com RONs; MORELLI (1981), estudando a espécie
Astyanax (A. bimaculatus, A. fasciatus e A. schubarti) detectou de três a seis
cromossomos portadores de RONs e Astyanax scabripinis (SOUZA & MOREIRA-
FILHO, 1992; ROCON-STANGE & ALMEIDA-TOLEDO, 1993) também apresenta
mais de um par de cromossomos nucleolares. Em outros Characidae, como em
Cynopotaminae (FALCÃO & BERTOLLO, 1985), Triporteinae (FALCÃO, 1988;
BERTOLLO & CAVALLARO, 1992) e Serrasalminae (GALETTI et al., 1985b;
CESTARI & GALETTI, 1992a, b; MARTINS-SANTOS et al., 1994; CESTARI, 1996)
também foram detectadas RONs múltiplas. Outra espécie de Characidae,
pertencente à subfamília Tetragonopterinae, Tetragonopterus chalceus
(PORTELLA et al., 1988) também apresenta mais de um par de cromossomos
portadores de RONs.
A localização dos sítios das RONs pela coloração com nitrato de prata não
pode, contudo, ser considerada como uma identificação definitiva, uma vez que só
identifica os sítios que estiverem funcionalmente ativos na interfase anterior
(GOODPASTURE & BLOOM, 1975; MILLER et al., 1976; HOWELL, 1977;
HOWELL & BLACK, 1980), tal fato se deve ao fato deste composto combinar-se às
proteínas ácidas presentes ao redor dos genes ribossômicos e não com o próprio
DNAr (HOWELL, 1977). Entretanto, estas RONs também podem ser evidenciadas,
independentemente de sua atividade transcricional, com o uso de corantes GC-
específicos, como a cromomicina A
3
(CMA
3
)
,
mitramicina (MM) (HOWELL, 1982;
SCHIMID et al., 1982; ROCCHI, 1982; SATYA-PRAKASH & PATHAK, 1984;
PHILLIPS et al., 1989a,b; SOLA et al., 1992a, b; GALETTI & RASCH, 1993a,b).
Geralmente a coloração com os fluorocromos GC específicos detecta as RONs
independentemente de suas atividades (SCHMID, 1980). O estudo das RONs com
fluorocromos, no entanto, também não pode ser considerado como definitivo, pois
podem evidenciar regiões heterocromáticas ricas em GC não associadas às RONs
(SOUZA et al., 2001) além de marcar alguns sítios de DNAr 18S (MANDRIOLI et
al., 2001; SOUZA et al., 2001). Alguns tipos de heterocromatina, aparentemente
não associados a regiões organizadoras de nucléolos, têm sido vistas
fluorescentes pela mitramicina ou pela cromomicina, em diferentes grupos de
peixes (PHILLIPS & HARTLEY, 1988; PENDÁS et al., 1993; MESTRINER, 1993;
ARTONI, 1996).
A correspondência entre as regiões de RONs positivas e CMA3 positivas
indica uma composição rica em bases GC na região de RONs, provavelmente
presente nas regiões espaçadoras dos genes ribossomais ou entre seqüências de
DNA repetitivos adjacentes (SCHMID, 1980). Em peixes, fluorocromos AT
específicos produzem pouca ou nenhuma banda positiva. Já os fluorocromos GC
específicos vêm sendo bastante utilizados no estudo de NORs, uma vez que,
apresentam uma notável relação com estas regiões (SOUZA, MOREIRA-FILHO,
BERTOLLO, 1995). Contudo, este tipo de abordagem deve ser feito com certas
ressalvas, visto que igualmente podem ocorrer regiões cromossômicas ricas em
GC sem correspondência com as RONs (ARTONI et al., 1999).
A análise do tratamento com o fluorocromo CMA
3
em preparações
cromossômicas de Bryconamericus stramineus da população do Córrego Alambari,
permitiu identificar uma marcação mais evidente e algumas outras bem menos
evidentes de fluorescência, enquanto que no tratamento com nitrato de prata
apenas duas marcações ficaram evidentes (RONs simples). O mesmo ocorreu na
população do Recanto dos Cambarás, que no tratamento com a cromomicina
apresentou apenas duas marcações e no tratamento com nitrato de prata foram
evidenciadas três marcações (RONs múltiplas). O que provavelmente ocorreu no
Ribeirão Alambari é que foram evidenciados somente os sítios ribossomais
maiores e as outras marcações menores não ficaram evidentes e no Recanto dos
Cambarás ficaram evidentes somente os sítios ribossomais, não ocorrendo
nenhuma outra marcação, diferindo dos resultados encontrados para as outras
localidades e também na literatura. O nitrato de prata mostra a atividade
transcricional das RONs, o que poderia explicar a variação encontrada, mas a
CMA
3
pode detectar tanto as regiões ativas quanto inativas das RONs (PHILIPS e
HARTLEY, 1988)
Exemplares das outras três localidades analisadas, Córrego da Quinta,
Córrego Jacutinga e Ribeirão Hortelã, apresentaram as marcações de nitrato de
prata coincidentes com as marcações de cromomicina, mostrando que estes sítios
são ricos em GC, corroborando assim os resultados descritos para este gênero e
outras espécies de peixes. PORTELLA-CASTRO (1999), utilizou o fluorocromo
CMA
3
em quatro populações de Bryconamericus (Bryconamericus sp. (1 e 2) e
Bryconamericus aff. iheringii (citótipos 1 e 2)) e observou uma correspondência
com os sítios de Ag-RONs. Nos estudos realizados por PAINTNER-MARQUES
(2002) em exemplares de Bryconamericus aff. exodon do Córrego Três Bocas
(PR), também foi observada uma correspondência entre as marcações do nitrato
de prata e do fluorocromo CMA
3.
Em exemplares de Bryconamericus aff. iheringii
do Rio Água da Floresta analisados por PAINTNER-MARQUES (2003) mostrou
concordância entre sítios detectados pela Ag-RONs e CMA
3
, indicando que as
RONs nesta espécie são ricas em GC.
A fim de se obter um melhor esclarecimento sobre a localização e a
quantidade exata de cístrons ribossômicos, foi a realizada a técnica de hibridização
in situ (FISH) com a utilização da sonda de DNAr 18S. Esta técnica vem se
mostrando uma ferramenta bastante utilizada na detecção e mapeamento das
RONs ao longo do complemento cromossômico, pois podem identificá-las
independente de ter sido ativa ou não na interfase (PERES, 2005).
Através da técnica de hibridização in situ com a utilização da sonda de DNAr
18S aplicada na população de Bryconamericus stramineus do Ribeirão Alambari,
foi evidenciado um número maior de sítios de DNAr 18S (seis marcações, sendo
duas mais evidentes e quatro pouco evidentes) em relação ao número de sítios de
Ag-RONs (duas marcações) e CMA
3
(uma marcação). As duas marcações mais
evidentes provavelmente correspondem às RONs. No Córrego da Quinta, foi
evidenciado também um número maior de sítios de DNAr 18S (quatro marcações,
sendo três mais evidentes e uma menos evidente) em relação ao número de sítios
de Ag-RONs (três marcações) e CMA
3
(três marcações). Neste caso, as três
marcações mais evidentes são possivelmente correspondentes às marcações das
Ag-RONs e CMA3. Nos exemplares estudados dos Córregos Jacutinga e Hortelã,
os resultados foram coincidentes, também evidenciam um número maior de sítios
de DNAr 18S (três marcações, sendo duas mais evidentes e uma menos evidente)
em relação ao número de sítios de Ag-RONs (duas marcações) e CMA
3
(duas
marcações). Estes sítios de DNAr 18S mais evidentes provavelmente
correspondem aos resultados das Ag-RONs e CMA
3
. No Recanto dos Cambarás
foi evidenciado um número menor de sítios de DNAr 18S (duas marcações
evidentes) em relação ao número de sítios de Ag-RONs (três marcações) mas em
relação às marcações evidenciadas pela cromomicina CMA
3
, os resultados são
iguais (duas marcações), diferindo dos demais resultados encontrados para a
espécie. Neste caso, poderia ser considerado que a prata estaria detectando
segmentos pequenos, não detectáveis pela CMA
3
ou pela sonda específica de
DNAr.
Rearranjos cromossômicos, como a transposição e/ou translocações
resultando na dispersão de genes ribossômicos, parece ocorrer em diversas
espécies piscícolas (GALETTI Jr. et al., 1995; CASTRO et al., 1996; MANTOVANI
et al., 2000). Estes mecanismos poderiam explicar estas variações nas RONs
destas populações.
Nas populações do Ribeirão Alambari, Córrego da Quinta, Córrego
Jacutinga e Ribeirão Hortelã o número de sítios de DNAr 18S foram superiores aos
de nitrato de prata (Ag-RONs) e ao de cromomicina (CMA3). Condição semelhante
já foi relatada para Bryconamericus aff. exodon por PAINTNER-MARQUES (2002)
onde após a impregnação por nitrato de prata (Ag-RONs) e o tratamento com o
fluorocromo cromomicina (CMA3) foram detectados dois a cinco cromossomos
marcados e o resultado da hibridização in situ com a sonda de DNAr 18S
apresentou oito sítios ribossomias. PAINTNER-MARQUES (2003) analisando uma
população de Bryconamericus aff. iheringii após o tratamento com nitrato de prata,
CMA3 e hibridação in situ com a sonda de DNAr 18S, observou uma
correspondência entre os resultados, com os sinais no braço curto de um par de
cromossomos submetacêntricos. CAPISTANO (2008), examinando duas
populações de Bryconamericus aff. iheringii com RONs múltiplas, também
observou um número maior de sítios de DNAr em relação aos de Ag-RONs e ao
examinar uma população de Bryconamericus aff. iheringii com RONs simples,
observou uma correspondência entre os resultados das Ag-RONs e FISH 18S.
É relativamente comum a ocorrência de um número maior de sítios
identificados pela hibridação in situ com a sonda de DNAr 18S que os identificados
pela técnica de impregnação por nitrato de prata como observado por exemplo em
Hoplias malabaricus (BORN e BERTOLLO, 2000) Astyanax scabripinnis (FERRO
et al., 2001; KAVALCO e MOREIRA-FILHO, 2003), Prochilodus lineatus (JESUS e
MOREIRA-FILHO, 2003).
A população do Recanto dos Cambarás apresentou um resultado diferente
das demais populações analisadas e descritas na literatura. O número de sítios
obtidos pela impregnação por nitrato de prata, que se mostrou múltipla, foi superior
ao número de sítios obtidos pela cromomicina CMA3 e hibridação in situ DNAr
18S, que mostraram-se simples. A presença de um único par de clusters de DNAr
18S tem sido referida como uma condição ancestral compartilhada por diversos
grupos de peixes.Tal condição é mais comum em peixes que apresentam após a
impregnação por nitrato de prata RONs simples, como por exemplo Astyanax
altiparanae e Astyanax lacustris (PERES, 2005) e após a hibridação são marcados
os mesmos cromossomos.
O gene ribossomal DNAr 5S é considerado altamente conservado (DANNA
et al., 1996). Por ser um gene conservado e localizado em diferentes áreas do
genoma, está sendo utilizado como ferramenta para estudos filogenéticos e como
um marcador populacional (MARTINS & GALETTI Jr., 2001). Ele é uma seqüência
menor de gene ribossomal que não participa da formação do nucléolo. A unidade
de repetição do DNAr 5S é uma seqüência de 120pb associada a espaçadores não
transcritos (LONG e DAVID, 1980) bastante variáveis que possibilita um grande
dinamismo a esses genes (WILLIAMS e STROBECK, 1985)
Entre os peixes, algumas espécies de Acipenseriformes, Anguiliformes,
Salmoniformes, Cypriniformes, Perciformes e Characiformes já possuem estudos
relacionados com a organização e/ou localização do DNAr 5S.
Analisando-se as populações de Bryconamericus stramineus estudadas no
presente trabalho através da hibridação in situ fluorescente (FISH) com a sonda de
DNAr 5S verifica-se que ocorreu uma variação de três a cinco cromossomos
apresentando sítios de DNAr 5S, umas marcações mais evidentes e outras menos
evidentes. Na literatura não foi encontrado nenhum outro estudo no gênero
Bryconamericus onde tenha sido aplicada a técnica de FISH com a sonda de DNAr
5S mas, os resultados encontrados estão entre os apresentados na literatura para
a família Characidae, da qual o gênero Bryconamericus faz parte.
Entre os Characiformes, a maioria das espécies estudadas apresenta um
número máximo de quatro sítios de DNAr 5S, localizados preferencialmente em
região intersticial, próxima ao centrômero, região esta que poderia ser considerada
estratégica para a manutenção e preservação do gene, uma vez que estaria
menos sujeita a rearranjos cromossômicos (MARTINS & GALETTI Jr., 2001).
Dados posteriores, principalmente na família Characidae, vêm mostrando ampla
variabilidade envolvendo o número e localização desses sítios (FERRO et al.,
2001; ALMEIDA-TOLEDO et al., 2002; KAVALCO et al., 2004; MANTOVANI et al.,
2005). Nas espécies ora analisadas observaram-se dois loci em Astyanax
altiparane, Astyanax lacustris, Myleus micans; quatro loci em Astyanax
scabripinnis, Piabina argêntea, Orthospinus franciscensis, Serrapinnus heterodon e
oito loci em Serrapinnus piaba, os quais se localizavam em três pares de
cromossomos homólogos. As posições ocupadas por esses sítios também são
diversas, podendo ser pericentromérica, intersticial ou terminal. Desse modo, a
localização e a posição dos sítios de DNAr 5S em Characidae tem se mostrado tão
variável quanto os sítios de DNAr 18S (PERES, 2005).
O aumento dos sítios de DNAr 5S poderia estar correlacionado com uma
dispersão dessas seqüências gênicas, levando a um aumento da variabilidade
genética para estas populações, segundo descrito por CENTOFANTE (2003). Este
autor observou tal situação em populações de Astyanax scabripinnis e em
Hyphessobrycon anisitsi. ABEL (2001) propõe que em populações isoladas em
pequenos corpos de água, como ocorre com A. scabripinnis, as alterações
cromossômicas seriam eventos importantes para a manutenção de sua
variabilidade genética.
7. CONCLUSÕES
- As análises citogenéticas na espécie Bryconamericus stramineus mostraram uma
estabilidade quanto ao número diplóide de 2n=52 cromossomos e uma
variabilidade na sua fórmula cariotípica, sendo que cada população analisada
apresentou um citótipo diferente, distintos dos já descritos.
- Não foram detectadas diferenças caritotípicas entre machos e fêmeas nas
populações analisadas, sugerindo que estas sejam citogeneticamente
homogaméticas.
- Foram encontrados três números fundamentais diferentes: 84, 92 e 96. As
diferenças na estrutura cariotípica podem ter sido determinadas por variações no
número de cromossomos acrocêntricos. Variações do número fundamental (NF)
pode ser resultado de rearranjos cromossômicos dos tipos translocações e
inversões pericêntricas, podendo ser considerado um mecanismo importante de
diversificação e evolução cariotípica neste grupo de peixes.
- A análise da heterocromatina constitutiva, através do bandeamento C revelou um
padrão bastante semelhante para todas as populações estudadas, com blocos
heterocromáticos centroméricos, intersticiais e teloméricos, sendo que todas
provavelmente possuem blocos heterocromáticos coincidentes com RONs,
corroborado com resultados apresentados por outros autores.
- A impregnação por nitrato de prata para a localização das RONs revelou em três
populações analisadas, embora rara neste gênero, a ocorrência de RONs simples.
Nas outras duas populações ocorreram RONs múltiplas, que é a condição mais
freqüente neste gênero.
- O tratamento com o fluorocromo cromomicina CMA
3
mostrou marcações
correspondentes com as posições das RONs em três populações, mostrando que
essas regiões são ricas em GC enquanto que nas outras duas a CMA
3
apresentou
um menor valor em relação às RONs, tendo evidenciado somente os sítios
ribossomais maiores.
- A aplicação da técnica de hibridação in situ fluorescente com a sonda de DNAr
18S revelou uma variação de dois a seis cromossomos marcados, sendo que em
quatro populações o número de marcações pelo FISH é superior ao das Ag-RONs
e CMA
3
e uma das populações apresentou as marcações do FISH iguais a de
CMA
3
e inferiores à das Ag-RONs.
- A técnica de hibridação in situ fluorescente com a sonda de DNAr 5S apresentou
de três a cinco cromossomos marcados por esta técnica, com algumas marcações
mais evidentes e outra menos. Estes resultados corroboram os dados disponíveis
para outros representantes da família Characidae, onde mostram que estes sitos
têm uma ampla variabilidade quanto ao número, localização e posição ocupada.
- Estudos citogenéticos no gênero Bryconamericus, principalmente no que diz
respeito ao uso da hibridação in situ com as sondas de DNAr 18S e 5S, que ao que
parece é a primeira vez que é utilizada para este gênero, ainda são muito escassos
e os dados obtidos no presente trabalho poderão colaborar com informações para
o entendimento dos padrões de diversificação, especiação e evolução deste grupo
de peixes.
8- REFERÊNCIAS
ABEL, L.D.S. (2001) A variabilidade do complexo de espécies scabripinnis
(PISCES, CHARACIDAE) como estratégia adaptativa. Estudo da
diversidade cariotípica do grupo com ênfase em populações da bacia do rio
São Francisco. Dissertação de Mestrado, Universidade Federal de São
Carlos, SP.
ABILHOA, V. & L.F. DUBOC. (2004). PEIXES – Água doce, p. 581-677. In: S.B.
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