( PDF ) Avaliação do perfil de metilação da região promotora de genes em hepatoblastoma

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AVALIAÇÃO DO PERFIL DE METILAÇÃO DA

REGIÃO PROMOTORA DE GENES EM

HEPATOBLASTOMA

LUÍS HENRIQUE TOSHIHIRO SAKAMOTO

Dissertação apresentada à Fundação Antônio

Prudente para obtenção do título de mestre

Área de concentração: Oncologia

Orientador: Dr. André Luiz Vettore de Oliveira

Co-Orientador: Profa. Dra. Beatriz de Camargo

São Paulo

2008

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FICHA CATALOGRÁFICA

Preparada pela Biblioteca da Fundação Antônio Prudente

Sakamoto, Luís Henrique Toshihiro

Avaliação do perfil de metilação da região promotora de genes

em hepatoblastoma / Luís Henrique Toshihiro Sakamoto - São Paulo,

2008.

84p.

Dissertação (Mestrado)-Fundação Antônio Prudente.

Curso de Pós-Graduação em Ciências - Área de concentração:

Oncologia.

Orientador: André Luiz Vettore de Oliveira

Descritores: 1. HEPATOBLASTOMA. 2. METILAÇÃO DO DNA. 3.

METALOTIONEINA. 4. REGIÕES PROMOTORAS (GENÉTICA).

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“A falsa ciência gera ateus; a verdadeira ciência leva

os homens a se curvar diante da divindade."

Voltaire

DEDICATÓRIA

Dedico esta dissertação aos meus queridos pais e àquelas que dão

sentido à minha vida: Ivana e Mariana.

À vocês com muito amor e carinho.

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

Meus eternos agradecimentos aos meus queridos pais pelo amor,

carinho e apoio incondicionais e por me fazerem entender que o

conhecimento é o maior bem que os pais podem dar aos filhos.

À minha amada alma-gêmea Ivana pelo carinho, incentivo e por

agüentar as minhas idas e vindas de Brasília para São Paulo.

Ao meus sogro, sogra e cunhados pelo apoio nesta jornada.

Aos meus amigos-irmãos: Gustavo, Martinho, Bruno e Sidney pela

amizade e momentos de descontração em Brasília.

AGRADECIMENTOS

Agradeço à Deus por toda a felicidade pessoal e profissional que ele

tem me proporcionado. Também agradeço por todos os percalços que Ele

colocou em meu caminho, pois eles me fizeram crescer e valorizar o produto

de meu esforço. Também agradeço por ter colocado nesse caminho

pessoas maravilhosas às quais devo muito do que sou hoje.

Parafraseando Issac Newton, se hoje sou um pouco melhor do que

ontem foi porque me apoiei sobre ombros de gigantes.

Agradeço ao meu orientador Dr. André Vettore, por ter aberto as

portas de seu laboratório e, mesmo sabendo que minha formação era

essencialmente médica e não laboratorial, aceitou o desafio de me orientar

em uma dissertação na área de biologia molecular. Muito obrigado!

Meus sinceros agradecimentos e admiração à minha co-orientadora

Profa. Dra. Beatriz de Camargo que sempre me incentivou em minha

formação como oncologista pediátrico e pesquisador. Certamente não teria

chegado até aqui sem você.

Ao Dr. André Lopes Carvalho, meus agradecimentos pelas

proveitosas discussões sobre metilação e pela ajuda com as análises

estatísticas do trabalho.

À Dra. Vilma Martins pelo apoio e ensinamentos em biologia celular e

molecular.

Agradeço também aos meus atuais colegas de trabalho do Núcleo de

Onco-hematologia Pediátrica da SES-DF/Brasília: Raquel, Paula e José

Carlos, por terem me incentivado a vir para São Paulo fazer a residência

médica em oncologia pediátrica e, principalmente, à Dra. Isis Quezado

Magalhães pelo incentivo e apoio prestados desde a época da universidade.

Ao término do mestrado, percebo que o caminho foi, para mim, muito

mais importante do que o destino. Ao longo dessa “estrada laboratorial”

aprendi muito, mas, principalmente, conheci pessoas às quais serei

eternamente grato.

Encontrei pessoas maravilhosas, cuja amizade pretendo levar para o

resto da vida. Muito obrigado à vocês: Claudinha, Robertinha, Val Andrade,

Carol, Alex e Dani.

À minha amiga e colega de profissão Viviane Sonaglio pelo apoio e

companheirismo nos momentos difíceis da residência médica e do mestrado.

Não posso deixar de agradecer também ao Fabrício Carvalho e

Luciane Kagohara por me ensinarem não só a técnica da MSP-Q, mas

também várias outras técnicas de laboratório. Aprendi muito com vocês!

Aos colegas de laboratório: Andréa Seixas, Andréa Trevisan, Fábio

Piccoli, Benjamin Heck, Cinthia Couto, Emerson, Marianna Rettori, Valéria

Paixão, Maria Isabel Achatz, Fernanda Góes, Luciana Pinto, Roberta Felix,

Ivete, Ivania, Simone e Manuela, muito obrigado pelo apoio, convivência,

ensinamento e pelos momentos de descontração.

Muito obrigado também aos demais colegas e funcionários do Instituto

Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer, em nome da Dra. Luisa Lina Villa, por

terem proporcionado um ambiente de pesquisa adequado ao meu trabalho.

Agradeço também ao Departamento de Anatomia Patológica do

Hospital A. C. Camargo, em nome do Dr. Fernando Augusto Soares e ao

Departamento de Anatomia Patológica da Santa Casa de Misericórdia de

São Paulo por terem fornecido as amostras do meu trabalho.

Um agradecimento especial à colega Mariana Cajaiba que realizou as

revisões das lâminas do meu estudo.

Às queridas meninas da Biblioteca do Hospital A. C. Camargo: Suely

Francisco, Francyne Pólen e Rosinéia Aguiar pela atenção e paciência na

busca dos “milhares” de artigos que solicitei ao longo desses anos e pela

ajuda na correção e formatação desta dissertação.

À todos do Serviço de Arquivo Médico e Estatístico (SAME) do

Hospital A. C. Camargo, em nome da Sra. Irde Contesini, por todo o auxílio

na busca por prontuários e coleta de dados.

Agradeço também à SOBOPE (Sociedade Brasileira de Oncologia

Pediátrica) pelo fornecimento dos dados clínicos dos nossos pacientes

escritos nos Protocolos SIOPEL. Obrigado Sandra e Cida pela ajuda.

Aos membros da minha banca de qualificação, Dra. Gilda Porta e Dra.

Cláudia Rainho, pela leitura dos relatórios e pelas proveitosas sugestões.

Agradeço também à Pós-graduação da Fundação Antônio Prudente,

em nome do Dr. Luiz Fernando Lima Reis, pela oportunidade de ter feito

parte deste programa de mestrado e por toda assistência prestada.

Agradecimentos especiais à Ana Maria Kuninari e Luciana Pitombeira pela

paciência e ajuda prestada desde o início.

Ao CNPQ e ao Instituto Ludwig pelo apoio financeiro à esta pesquisa.

Agradeço também à Banca Julgadora pelo tempo prestado à leitura e

avaliação dessa dissertação.

RESUMO

Sakamoto LHT. Avaliação do perfil de metilação da região promotora de

genes em hepatoblastoma. São Paulo; 2008. [Dissertação de Mestrado-

Fundação Antônio Prudente]

O hepatoblastoma é o tumor maligno hepático mais comum em crianças,

entretanto constitui apenas 1% do total de neoplasias na infância. Sua baixa

freqüência, portanto, dificulta a realização de estudos clínicos e pesquisas

de novas estratégias terapêuticas. Os fatores prognósticos relevantes para

essa doença estão relacionados, quase exclusivamente, ao grau de

ressecabilidade tumoral, não existindo, até o momento, dados suficientes

para a inclusão de fatores biológicos na estratificação dos pacientes por

grupos de risco. Estudos de microarray que compararam o perfil de

expressão de hepatoblastomas com tecido hepático normal, mostraram que

grande parte dos genes diferencialmente expressos estava, de fato,

hipoexpressa, o que pode, hipoteticamente, sugerir a interferência de

mecanismos de silenciamento genético como, por exemplo, a hipermetilação

do DNA. A técnica de MSP-Q foi utilizada na avaliação do perfil de metilação

de 25 genes em 20 amostras parafinadas de hepatoblastomas. Observou-se

a presença de hipermetilação de ilhas CpG em mais de 25% das amostras

para 8 genes (APC, CCND2, CDH1, COX2, HIN1, MT1G, RASSF1A e

SOCS1). A análise dos dados clínicos em conjunto com a pesquisa de

metilação mostrou não haver correlação entre a presença de metilação em

APC, RASSF1A, SOCS1 e MT1G e variáveis clínicas clássicas. No entanto,

tanto a presença quanto o nível de metilação de MT1G apresentou uma

correlação inversa com as taxas de sobrevida globais dos pacientes em

questão. À saber, este foi o primeiro relato de hipermetilação da região

promotora de MT1G em hepatoblastomas e de sua associação com o

prognóstico da doença.

SUMMARY

Sakamoto LHT. [Gene promoter hypermethylation pattern in patients

with hepatoblastoma]. São Paulo; 2008. [Dissertação de Mestrado-

Fundação Antônio Prudente]

Hepatoblastoma is the most common malignant liver tumor in childhood.

Nevertheless, it comprises 1% of all cancers in this age group. Because its

low frequency, there are few clinical trials and new drugs research. Few

prognostic factors were related to hepatoblastoma. Most of them are related

to resectability. Microarray studies comparing different expression patterns in

hepatoblastoma samples and normal liver tissue show that most of

differentially expressed genes are hipoexpressed in tumors. Aberrant DNA

hypermethylation might be the cause of this gene silence or hipoexpression.

We evaluated the methylation pattern of 25 genes in 20 paraffin-embedded

hepatoblastoma specimens by MSP-Q. DNA hypermethylation of CpG island

in more than 25% of samples was observed in 8 genes (APC, CCND2,

CDH1, COX2, HIN1, MT1G, RASSF1A and SOCS1). The statistical analysis

of clinical data and methylation pattern showed that there are no correlation

between APC, RASSF1A, SOCS1 and MT1G methylation and clinical

characteristics. Nevertheless, both the methylation positivity and methylation

level of MT1G showed inverse correlation with overall survival in these

patients. This was the first report of CpG island hypermethylation in MT1G

gene in hepatoblastoma and the first study that showed its association with

prognosis.

LISTA DE FIGURAS

Figura

Subtipos histológicos clássicos do hepatoblastoma e

suas freqüências. 4

Figura

Exames de imagem utilizados no diagnóstico de

hepatoblastoma 6

Figura

Sistema de Estadiamento PRETEXT do SIOPEL

Figura

Deaminação hidrolítica da 5-metil-citosina levando a

formação de timidina

Figura

Processo de metilação da base citosina através da

DNA metiltransferase

Figura

Possíveis Mecanismos de Silenciamento Gênico

através da Metilação do DNA

Figura

Comparação entre os padrões de metilação dos

dinucleotídeos CG em células normais e neoplásicas 18

Figura

Gráfico de comparação entre as sobrevidas globais em

5 anos no total de pacientes com hepatoblastoma

(n=35) e a população selecionada para o estudo

molecular (n=20). 39

Figura

Gráficos de comparações entre as taxas de sobrevida

conforme características clínicas.

44-5

Figura

Gráfico de porcentual de amostras metiladas para cada

um dos 25 genes avaliados no estudo-piloto.

Figura

Gráficos de dispersão com valores de PMR.

Figura

Gráfico de sobrevidas globais nos grupos de pacientes

que apresentam metilação detectável.

54-5

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Seqüência dos primers forward e reverse para amplificação

do fragmento de 133bp do gene ACTB. 28

Tabela 2 Seqüência dos primers forward e reverse para amplificação

do fragmento de 133bp do gene ACTB após tratamento do

DNA com bisulfito de sódio. 30

Tabela 3 Comparação das variáveis categóricas pesquisadas entre a

amostra total de 35 pacientes e a amostra selecionada de 20

pacientes. 38

Tabela 4 Comparação das variáveis contínuas pesquisadas entre a

amostra total de 35 pacientes e a amostra selecionada de 20

pacientes. 39

Tabela 5 Características clínicas dos 20 pacientes com

hepatoblastoma submetidos ao estudo molecular. 43

Tabela 6 Comparação entre nível de metilação nos genes estudados

e sobrevida global pelo modelo de Cox.

Tabela 7 Associação entre o estado de metilação do gene MT1G e

variáveis clínicas estudadas.

Tabela 8 Associação entre o estado de metilação do gene RASSF1A

e variáveis clínicas estudadas. 56

Tabela 9 Associação entre o estado de metilação do gene SOCS1 e

variáveis clínicas estudadas. 57

Tabela 10 Associação entre o estado de metilação do gene APC e

variáveis clínicas estudadas. 57

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 Síndrome genéticas constitucionais associadas ao

hepatoblastoma. 2

Quadro 2 Sistema de Estadiamento Children Oncology Group para

Hepatoblastomas. 9

Quadro 3 Sequência de primers e sondas dos genes avaliados no

estudo. 36

Quadro 4 Concentração de DNA nas amostras tumorais e margens

estimada por espectrofotometria e resultado da PCR para

ACTB após tratamento com bissulfito. 47

Quadro 5 Concentração de DNA nas amostras de tecido hepático

normal fetal (NF) e adulto e resultado da PCR para ACTB

após tratamento com bissulfito. 47

Quadro 6 Valores de PMR para as 20 amostras tumorais. 50

Quadro 7 Valores de PMR para as amostras de fígado normal fetal. 51

LISTA DE ABREVIAÇÕES

ACTB Homo sapiens actin, beta gene

AIM1 Homo sapiens absent in melanoma 1 gene

APC Homo sapiens adenomatosis polyposis coli gene

CALCA Homo sapiens calcitonin-related polypeptide alpha gene

CCNA1 Homo sapiens cyclin A1 gene

CCND2 Homo sapiens cyclin D2 gene

CDH1 Homo sapiens cadherin 1, type 1, E-cadherin (epithelial)

gene

COX2 (PTGS2) Homo sapiens prostaglandin-endoperoxide synthase 2

gene

Ct Cycle Threshold

DAPK Homo sapiens death-associated protein kinase 1 gene

DNA Ácido Desoxi-ribonucléico

ESR1 Homo sapiens estrogen receptor 1 gene

GSTP1 Homo sapiens glutathione S-transferase pi gene

HIC1 Homo sapiens hypermethylated in cancer 1 gene

HIN1(SCGB3A1) Homo sapiens secretoglobin, family 3A, member 1 gene

Kb kilobase

MGMT Homo sapiens O-6-methylguanine-DNA methyltransferase

gene

MINT31 Homo sapiens methylated in tumours 31 gene

MLH1 Homo sapiens mutL homolog 1, colon cancer,

nonpolyposis type 2

MT1G Homo sapiens metallothionein 1G gene

P14 ARF Homo sapiens cyclin-dependent kinase inhibitor 2A

(variante de splicing) gene

POG Pediatric Oncology Group

CDKN2B Homo sapiens cyclin-dependent kinase inhibitor 2B gene

CDKN2A Homo sapiens cyclin-dependent kinase inhibitor 2A

(variante de splicing) gene

pb par de base

PCR Reação em Cadeia da Polimerase

PMR Percentual of Methylated Reference

RARB Homo sapiens retinoic acid receptor, beta gene

RASSF1A Homo sapiens Ras association (RalGDS/AF-6) domain

family 1 gene

RB1 Homo sapiens retinoblastoma 1 gene

SFRP1 Homo sapiens secreted frizzled-related protein 1 gene

SIOPEL The International Childhood Liver Tumour Strategy Group

SEER Surveillance Epidemiology and End Results

SOCS1 Homo sapiens suppressor of cytokine signaling 1 gene

THBS1 Homo sapiens thrombospondin 1 gene

TIMP3 Homo sapiens TIMP metallopeptidase inhibitor 3 gene

ÍNDICE

1 INTRODUÇÃO 1

1.1 Hepatoblastoma 1

1.2 Alterações Genéticas Estruturais em Hepatoblastoma 10

1.3 Expressão Gênica em Hepatoblastoma 12

1.4 Metilação do DNA 12

1.5 Metilação do DNA e Câncer 18

1.6 Metilação em Hepatoblastoma 20

2 OBJETIVOS 23

2.1 Objetivo Geral 23

2.2 Objetivos Específicos 23

3 MATERIAL E MÉTODOS 25

3.1 Casuística 25

3.2 Dissecção Manual 26

3.3 Extração de DNA 27

3.4 Quantificação do DNA e Controle de Qualidade 28

3.5 Tratamento com Bissulfito de Sódio 29

3.6 Verificação da Qualidade do DNA após o Tratamento com

Bissulfito de Sódio 30

3.7 Methylation-Specific PCR Quantitativa (MSP-Q) 31

3.8 Metilação in Vitro de DNA de Linfócitos 34

3.9 Análise Estatística 35

4 RESULTADOS 37

4.1 Caracterização Clínica da População 37

4.2 Extração do DNA e Tratamento com Bissulfito de Sódio 45

4.3 Resultados da MSP-Q 48

4.3.1 Estudo Piloto 48

4.3.2 Comparação entre o nível de metilação nos tecidos estudados 49

4.4 Associação entre Características Clínico-Patológicas e

Hipermetilação 53

5 DISCUSSÃO 58

6 CONCLUSÕES 75

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 76

1 INTRODUÇÃO

1.1 HEPATOBLASTOMA

O hepatoblastoma consiste no tumor maligno hepático mais comum

da infância. Dados do programa de registro de câncer dos EUA, Surveillance

Epidemiology and End Results (SEER), estimam uma incidência de 0,5-1,5

casos novos por milhão de crianças ao ano, o que corresponde à cerca de

79% das neoplasias hepáticas em crianças menores de 15 anos e à cerca

de 1% do total de casos de cânceres nessa faixa etária (PERILONGO et al.

2000a; SCHNATER et al. 2003; ARONSON et al. 2005).

Essa baixa incidência é, possivelmente, responsável pela baixa

casuística dos estudos clínicos existentes e pela limitada quantidade de

estudos para desenvolvimento de quimioterápicos mais eficazes.

A maioria dos casos de hepatoblastoma ocorre em lactentes ou

crianças jovens, com mediana de idade ao diagnóstico de 16 meses,

segundo casuística do Pediatric Oncology Group (POG). De fato, segundo o

SEER, a incidência de tumores hepáticos malignos em lactentes, que é de

11,2 casos por milhão ao ano, sofre um declínio conforme o aumento da

idade na infância (TOMLINSON E FINEGOLD 2002).

Estudos epidemiológicos sugerem, ainda, que existe associação do

hepatoblastoma com prematuridade e baixo peso ao nascimento (HERZOG

et al. 2000). TANIMURA et al. (1998) observaram que o risco relativo para o

desenvolvimento de hepatoblastoma em recém-nascidos com menos de

1.000g é de 15,64, comparado com 2,53 para aqueles entre 1.000g e 1.500g

e 1,21 para recém-nascidos com peso entre 2.000g e 2.500g.

Uma incidência aumentada de hepatoblastoma tem sido observada

em pacientes com diferentes síndromes, como de Beckwith-Wiedemann, de

Li-Fraumeni, hemi-hipertrofia e polipose adenomatosa familiar (FAP)

(Quadro 1). DEBAUN e TUCKER (1998), com base em dados do registro de

pacientes com síndrome de Beckwith-Wiedemann, observaram um risco

relativo de desenvolvimento de hepatoblastoma de 2.280 vezes (intervalo de

confiança 95%: 928-1.165) nos primeiros quatro anos de vida (DEBAUN E

TUCKER 1998). Em pacientes portadores da FAP esse risco é de 1.220

vezes (intervalo de confiança 95%: 230-2.168) nos primeiros quatro anos

(GIARDIELLO et al. 1991).

Quadro 1 - Síndrome genéticas constitucionais associadas ao

hepatoblastoma.

Doença Localização Cromossômica Gene Envolvido

Polipose Adenomatosa Familial 5q21.22

APC

Síndrome de Beckwith-Wiedemann 11p15.5

P57KiP2, Wnt

Síndrome de Li-Fraumeni 17p13

TP53

Doenças de Depósito de Glicogênio Várias

Fonte: *Adaptado de MUELLER et al. (2006)

Em geral o hepatoblastoma se apresenta como um tumor abdominal

oligossintomático, mas pode ser acompanhado de perda ponderal, anorexia,

vômitos e dor abdominal, comumente, na presença de doença avançada. A

doença parece ser discretamente mais freqüente em meninos e entre os

caucasianos. A localização no lobo direito do fígado ocorre em 60-70% dos

casos (HERZOG et al. 2000; SCHNATER et al. 2003).

Em relação aos exames laboratoriais, sabe-se que a elevação dos

níveis séricos de alfafetoproteína acima do normal para a idade, ocorre em

mais de 90% dos casos de hepatoblastoma (HERZOG et al. 2000;

MUELLER et al. 2006). Esta proteína, normalmente produzida pelo

organismo durante a fase embrionária e fetal do desenvolvimento intra-

uterino, tem a sua produção gradativamente diminuída após o nascimento,

chegando aos valores normais de adulto (menos de 10ng/mL) ao final do

primeiro ano de vida. Alguns estudos demonstraram que níveis de

alfafetoproteína abaixo de 100ng/mL ao diagnóstico implicariam em menores

taxas de sobrevida em pacientes com hepatoblastoma (HERZOG et al.

2000; FUCHS et al. 2002). Entretanto, este não constitui ainda um fator

prognóstico universalmente aceito. Essa proteína pode ser, no entanto,

usada como marcador diagnóstico, na presença de tumor hepático em uma

criança em idade compatível com surgimento de hepatoblastoma, bem como

marcador de sucesso terapêutico, uma vez que após a retirada do tumor, os

níveis de proteína devem cair até seus valores normais. Também funciona

como marcador de recaída já que tende a aumentar quando o tumor recai.

Histologicamente, o hepatoblastoma constitui um tumor embrionário

que contém parênquima epitelial hepático e pode ser classificado como

epitelial (56%) ou epitelial/mesenquimal misto (44%). O tipo epitelial pode,

ainda, ser subdivido em: fetal puro (31%), embrionário (19%),

macrotrabecular (3%) e pequenas células indiferenciadas (3%). Quando

associado a algum componente mesenquimal (tipo misto), este geralmente é

composto por matriz osteóide ou cartilagem (Figura 1) (HERZOG et al.

2000).

Epitelial Puro

(56%)

Misto (44%)

Embrionário (19%)

Fetal (31%)

Macrotrabecular

(3%)

Anaplásico (3%)

Subtipos

Histológicos

Epitelial Puro

(56%)

Misto (44%)

Embrionário (19%)

Fetal (31%)

Macrotrabecular

(3%)

Anaplásico (3%)

Subtipos

Histológicos

Epitelial Puro

(56%)

Misto (44%)

Embrionário (19%)

Fetal (31%)

Macrotrabecular

(3%)

Anaplásico (3%)

Subtipos

Histológicos

Legenda: As lâminas coradas em HE são provenientes de pacientes do estudo.

Figura 1 - Subtipos histológicos clássicos do hepatoblastoma e suas

freqüências.

SAXENA et al. (1993), em estudo que enfatizou os efeitos da

quimioterapia sobre o hepatoblastoma, verificaram que a matriz osteóide

estava presente em cerca de 36% dos tumores não tratados com

quimioterapia. Quando o paciente recebia tratamento neoadjuvante este

porcentual subia para 82% e, na maioria dos casos, este componente

osteóide compunha mais de 90% da área tumoral, o que sugere que a

presença deste componente mesenquimal possa estar associada com

resposta à quimioterapia (SAXENA et al. 1993).

De fato, estudo de HAAS et

al. (1989) mostrou que a presença de elementos mesenquimais estava

associada com melhor prognóstico naqueles pacientes com doença

avançada (HAAS et al. 1989).

Entretanto, consensualmente, nenhum tipo histológico parece ter

valor prognóstico independente. Mesmo o subtipo fetal puro, apontado como

determinante de melhor prognóstico, parece perder a sua importância

estatística quando o tumor não é completamente ressecado (JUNG et al.

2001). Alguns autores mostram, contudo, que os hepatoblastomas de

pequenas células indiferenciadas parecem evoluir com maior freqüência de

recaídas e óbito (HAAS et al. 1989).

Os exames de imagem constituem ferramentas essenciais tanto para

o diagnóstico, quanto para o estadiamento do hepatoblastoma (figura 2). Ao

raio-X simples de abdome, as calcificações, que ocorrem em alguns casos,

podem ser visualizadas. Este exame, entretanto, tem pouco valor no

diagnóstico de massas hepáticas. A ultrassonografia de abdome pode ser

aplicada tanto no momento do diagnóstico, para verificação da presença do

tumor, quanto no estadiamento, para detecção de comprometimento de

grandes vasos, quanto no intra-operatório a fim de auxiliar o cirurgião no

momento da ressecção tumoral. À tomografia de abdome observa-se

geralmente um tumor hepático volumoso, com loculações, áreas de necrose

e calcificação. A ressonância magnética de abdome também pode ser

utilizada, no entanto tem a desvantagem de ser mais demorada que o

ultrassom e a tomografia (TOMLINSON e FINEGOLD 2002; MUELLER et al.

2006).

Legenda: a) Raio-X de abdome mostrando pequenas áreas de calcificação (seta vermelha)

em um volumoso hepatoblastoma. b) Ultrassom de abdome de diagnóstico mostrando

volumoso tumor hepático também com área de calcificação (seta vermelha). c) Tomografia

computadorizada com contraste venoso em que pode ser visualizado hepatoblastoma

acometendo ambos lobos hepáticos. d) O mesmo tumor apresenta áreas de calcificação

(setas vermelhas) que também podem ser vistas na tomografia.

Figura 2 - Exames de imagem utilizados no diagnóstico de hepatoblastoma.

A pedra angular do tratamento dos pacientes portadores de

hepatoblastoma, atualmente, consiste na completa ressecção da neoplasia,

uma vez que apenas estes alcançarão efetivamente a cura. Reflexo desta

importância reside no fato de que a extensão tumoral extra-hepática,

multifocalidade, invasão vascular e metástase à distância, fatores clássicos

de pior prognóstico para hepatoblastoma, são características que impedem

ressecção completa do tumor (HERZOG et al. 2000; JUNG et al. 2001;

CZAUDERNA et al. 2005).

Seguindo esse princípio, a estratégia de tratamento dessa doença

acabou se dividindo em duas grandes vertentes com eficácias equivalentes.

Uma prioriza a ressecção no início do tratamento, sempre que possível,

reservando a quimioterapia neoadjuvante para aqueles casos em que o

tumor é inicialmente irressecável (ORTEGA et al. 2000). A segunda,

representada principalmente pelo grupo cooperativo europeu SIOPEL,

preconiza que a quimioterapia neoadjuvante seja administrada a todos os

pacientes e, em seguida, após a redução volumétrica do tumor, seja

realizada a ressecção do mesmo (FINEGOLD 2002).

Tendo em vista essas duas linhas de tratamento, o estadiamento dos

pacientes com hepatoblastoma pode ser feito de duas formas. A primeira,

que valoriza critérios pré-operatórios do tumor, é adotada pelo grupo

europeu SIOPEL e foi denominado estadiamento PRETEXT. Neste sistema

o fígado é dividido em 4 setores analisados através de exames de imagem

(tomografia computadorizada ou ressonância magnética). Conforme

ilustrado na figura 3, a quantidade de setores livres de doença determina os

estádios: PRETEXT I, três setores adjacentes livres ou apenas 1 setor

acometido por neoplasia; PRETEXT II, dois setores adjacentes livres ou

tumor acometendo dois setores; PRETEXT III, 1 setor ou 2 setores não-

adjacentes livres (tumor envolvendo 2 ou 3 setores); PRETEXT IV, nenhum

setor livre (ou todos os 4 setores acometidos). Também são avaliados:

disseminação extra-hepática direta para linfonodos hilares (E), presença de

metástases à distância (M), envolvimento de veia porta (P) e envolvimento

de veia hepática (V) (ROEBUCK et al. 2007).

Legenda: Ao estádio PRETEXT são acrescentados: (E) se existe disseminação direta extra-

hepática para linfonodos hilares, (M) se existem metástases à distância, (P) se existe

envolvimento de veia porta e (V) se existe comprometimento de veia hepática.

Fonte: SCHNATER et al. (2003)

Figura 3 - Sistema de estadiamento PRETEXT do SIOPEL.

A segunda forma de estadiamento valoriza características pós-

cirúrgicas e é adotada pelo grupo norte-americano COG (Children Oncology

Group). Resumidamente, conforme descrito na Quadro 2, estádio I

representa doença completamente ressecada; estádio II, tumor ressecado

macroscopicamente, porém com doença residual microscópica ou tumores

ressecados após quimioterapia pré-operatória ou tumores com ruptura intra-

operatória; estádio III, tumores inicialmente irressecáveis, incluindo aqueles

parcialmente ressecados ou com envolvimento linfonodal; estádio IV,

presença de metástases à distância (MUELLER et al. 2006).

Quadro 2 - Sistema de Estadiamento Children Oncology Group para

Hepatoblastomas.

Estadiamento Característica

Estádio I

Tumor completamente ressecado com margens

microscópicas livres

Estádio II

Tumor ressecado macroscopicamente com

evidência de doença residual microscópica

Tumor ressecado após quimioterapia

neoadjuvante

Ruptura intra-operatória

Estádio III

Tumor irressecável

Tumor parcialmente ressecado

Envolvimento linfonodal

Estádio IV Presença de metástases à distância

Apesar de a cirurgia do tumor primário constituir a peça fundamental

no tratamento do hepatoblastoma, menos da metade dos pacientes

apresentam-se com doença ressecável ao diagnóstico. Assim, a introdução

dos esquemas quimioterápicos baseados em platina foi, sem dúvida, uma

das principais responsáveis pela melhora observada nas taxas de sobrevida

de portadores de hepatoblastoma. Assim, tumores inicialmente irressecáveis

na era pré-cisplatina, passaram a ser operáveis quando respondiam a este

esquema quimioterápico (TOMLINSON E FINEGOLD 2002; MUELLER et al.

2006).

Para pacientes com tumores irressecáveis mesmo após quimioterapia

neoadjuvante e com doença confinada ao fígado existe, ainda, a opção do

transplante hepático (OTTE et al. 2004).

Não existe consenso sobre o papel da radioterapia no tratamento dos

pacientes com hepatoblastoma (HABRAND e PRITCHARD 1991; HABRAND

et al. 1992), motivo pelo qual, nódulos metastáticos pulmonares que

continuam visíveis após quimioterapia neoadjuvante podem ter indicação de

retirada cirúrgica, principalmente se o tumor primário for completamente

ressecado (FEUSNER et al. 1993).

O prognóstico dos pacientes portadores de hepatoblastoma melhorou

significativamente nas últimas 3 décadas, passando de taxas de sobrevida

global em 5 anos de cerca de 30% para os atuais 75% quando analisados

todos os estádios conjuntamente. Separados por estádios, as taxas de

sobrevida livre de doença, segundo dados norte-americanos do COG são de

100% para estádio I (ressecção completa do tumor), 74% para estádio II

(doença residual microscópica), 50% para estádio III (doença residual

macroscópica) e 29% para estádio IV (doença metastática), resultados

estatisticamente semelhantes aos do grupo europeu SIOPEL (SCHNATER

et al. 2003).

1.2 ALTERAÇÕES GENÉTICAS ESTRUTURAIS EM

HEPATOBLASTOMA

Grande parte dos estudos referentes à biologia do hepatoblastoma se

concentra nas alterações citogenéticas presentes no tumor, entretanto, até o

momento, não se demonstrou a existência de um padrão consistente de

anormalidades cromossômicas. De fato, as alterações mais freqüentemente

encontradas (amplificações nos cromossomos 1q, 2q, 7q, 8, 17q e 20) ainda

não puderam ser relacionadas à etiologia e nem ao prognóstico da neoplasia

(HERZOG et al. 2000; SCHNATER et al. 2003). Além disso, a maioria dos

hepatoblastomas não apresentam alterações cromossômicas detectáveis.

Entretanto, algumas alterações funcionais, como silenciamento de

genes normalmente expressos, parecem ser mais relevantes no que se

refere à gênese deste tumor. Sabe-se que a perda da heterozigose (LOH) de

11p15 é observada em até um terço dos pacientes com hepatoblastoma e a

LOH de 1p em aproximadamente 33% dos mesmos (SCHNATER et al.

2003).

A associação entre hepatoblastoma e a polipose adenomatosa

familiar (FAP) incentivou a procura de inativação do gene APC neste tumor.

De fato, ODA et al. (1996) mostraram que cerca de 67% dos

hepatoblastomas esporádicos possuem alterações desse gene (ODA et al.

1996). Além disso, freqüência semelhante de mutações ativadoras do gene

da β-catenina pode ser encontrada em associação com hepatoblastoma

esporádico (KOCH et al. 1999; ANNA et al. 2000; UDATSU et al. 2001).

Estes dados sugerem que a via de sinalização Wnt possa estar envolvida na

gênese do tumor.

A presença ou ausência de mutação no gene da β-catenina não

parece estar envolvida com o prognóstico da doença. Entretanto, a

localização predominantemente nuclear, em contraposição à localização

citossólica normal, parece estar associada com pior evolução (PARK et al.

2001).

1.3 EXPRESSÃO GÊNICA EM HEPATOBLASTOMA

Na literatura existem dois estudos que avaliaram o perfil de expressão

gênica dos hepatoblastomas. Ambos utilizaram a técnica de cDNA

microarray. YAMADA et al. (2004), comparando os perfis de expressão de

amostras de hepatoblastoma e de tecido hepático normal, identificaram 86

genes diferencialmente expressos, sendo que 75 destes genes

encontravam-se hipoexpressos nas amostras tumorais (YAMADA et al.

2004). NAGATA et al. (2003) encontraram 26 genes diferencialmente

expressos em hepatoblastomas quando comparados à hepatócitos não-

neoplásicos, sendo que, 50% deles estavam hipoexpressos no tecido

maligno.

1.4 METILAÇÃO DO DNA

Um importante mecanismo envolvido no silenciamento da expressão

gênica em eucariotos superiores é a metilação do DNA. Este evento

epigenético envolve a adição de um radical metil no carbono da posição 5 da

base nitrogenada citosina (C) (SINGAL e GINDER 1999; HERMAN e

BAYLIN 2003).

Denominada por alguns de “a 5ª base nitrogenada”, a 5-metil-citosina

corresponde a cerca de 4% das citosinas totais do genoma e, apesar de já

ter sido descrita metilação no contexto “não-CpG”, observa-se que

praticamente toda a metilação do DNA de mamíferos ocorre nas citosinas

localizadas a 5´ de guaninas (G), ou seja, no dinucleotídeo CG (SINGAL e

GINDER 1999; HERMAN e BAYLIN, 2003; LAIRD 2003).

Surpreendentemente, a 5-metil-citosina é, aparentemente, flexível o

suficiente para variar o seu estado de metilação à depender do tipo celular

somático em questão (metilação do DNA parece ser tecido específica) e, ao

mesmo tempo, estável à ponto de se manter durante a mitose ou meiose

(LAIRD 2003).

Durante a evolução das espécies, o dinucleotídeo CG parece ter sido

progressivamente eliminado do genoma dos eucariotos superiores, sendo

que sua freqüência observada corresponde a apenas 5-10% da freqüência

esperada (GARDINER-GARDEN e FROMMER 1987; ATTWOOD et al.

2002). É provável que a metilação da citosina tenha exercido papel

importante nesse processo, uma vez que a maior parte dos sítios CG

perdidos parece ter sofrido deaminação hidrolítica de 5-metil-citosina para

timina (mutação do tipo transição – Figura 4). O restante dos dinucleotídeos

CG são distribuídos pelo genoma humano de forma não-randômica em

grandes extensões de seqüências com baixa freqüência deste dinucleotídeo

entremeadas por agrupamentos ricos em CG, denominados ilhas CpG

(SINGAL e GINDER 1999; HERMAN e BAYLIN 2003; LAIRD 2003).

Deaminação

hidrolítica

Timidina

5-metil-citosina

Deaminação

hidrolítica

Timidina

5-metil-citosina

Figura 4 - Deaminação hidrolítica da 5-metil-citosina levando a formação de

timidina

O tamanho dessas ilhas varia de 500pb a 5kb e elas correspondem a

1% a 2% do genoma total (GARDINER-GARDEN e FROMMER 1987;

ATTWOOD et al. 2002). Estima-se que exista no genoma humano,

aproximadamente 45 mil ilhas de CpGs e que essas seqüências estão

localizadas principalmente, nas regiões promotoras e nos primeiros exons de

cerca 60% dos genes (ANTEQUERA e BIRD 1993; NAKAO 2001). Em

células normais, estas regiões encontram-se protegidas da ação da

metilação, por mecanismos ainda não elucidados (ESTELLER 2005). Os

dinucleotídeos CpGs remanescentes que ocorrem fora das ilhas CpGs, são

amplamente metilados (ATTWOOD et al. 2002).

A metilação da citosina ocorre após a síntese de DNA através de uma

reação catalisada por uma família de enzimas denominada DNA

metiltransferase (DNMT). Essas enzimas transferem o grupo metil da S-

adenosil-metionina para o carbono 5 da citosina (Figura 5). Em mamíferos

foram identificados 3 subtipos de DNMT: DNMT1, DNMT3A e DNMT3B

(HERMAN e BAYLIN 2003; BESTOR 2000).

DNA Metiltransferase

S-Adenosil-metionina

5-metilcitosinacitosina

DNA Metiltransferase

S-Adenosil-metionina

5-metilcitosinacitosina

Figura 5 - Processo de metilação da base citosina através da DNA

metiltransferase

A DNMT1 constitui a principal enzima DNMT nos mamíferos e catalisa

a restauração dos sítios hemi-metilados, criados após a replicação semi-

conservativa do DNA (durante a meiose ou mitose), em sítios

completamente metilados, ou seja, é responsável pela manutenção do

padrão de metilação nas células-filhas (BESTOR 2000; HERMAN e BAYLIN

2003).

DNMT3A e DNMT3B parecem estar envolvidas no processo de

metilação de novos sítios, isto é da metilação de novo (BESTOR 2000;

HERMAN e BAYLIN 2003).

A metilação das ilhas CpG situadas na região promotora de certos

genes tem sido relacionada com seu silenciamento transcricional. De fato, já

foi demonstrada a importância fisiológica desse mecanismo no

desenvolvimento embrionário dos mamíferos, na proteção contra parasitas

intra-genômicos, na inativação de um dos cromossomos X em mulheres e no

imprinting genômico (SINGAL e GINDER 1999; ATTWOOD et al. 2002;

LAIRD 2003). Além disso, alterações patológicas no padrão normal de

metilação das citosinas estão possivelmente envolvidas no surgimento de

certas doenças mentais e na carcinogênese (LAIRD 2003; EGGER et al.

2004).

Existem três possíveis mecanismos pelos quais a metilação do DNA

pode levar ao silenciamento gênico, como ilustrado na Figura 6. O primeiro

mecanismo envolve a interferência direta das citosinas metiladas com a

ligação dos fatores de transcrição nos seus sítios de reconhecimento

específicos dentro da região promotora (6-b). Dentre os fatores de

transcrição que reconhecem seqüências CG e são sensíveis à metilação

estão AP-2, c-Myc/Myn, CREB, E2F e NF-kB. Outros fatores, entretanto, se

mostram resistentes à metilação, como por exemplo Sp1 e CTF. Portanto,

nestes casos, outra forma de silenciamento deve estar envolvida. Um

segundo mecanismo possível é através da alteração da estrutura

cromatínica para um estado mais condensado e inativo e, portanto,

inacessível aos fatores de transcrição (Figura 6-c). O terceiro mecanismo

proposto consiste na ligação de repressores transcricionais específicos

denominados methyl cytosine binding proteins 1 e 2 (MeCP) ao DNA

metilado e, com isso, impedindo a interação dos fatores de transcrição

(figuras 6-d e 6-e) (SINGAL e GINDER 1999).

MeCP 1 consiste em um grande complexo protéico que se liga a

múltiplos sítios CG metilados e impede a ligação dos fatores de transcrição e

da RNA polimerase II aos seus sítios de reconhecimento (Figura 6-d).

Células com deficiência de MeCP-1 demonstram repressão reduzida de

genes metilados. MeCP-2 é mais abundante do que o primeiro complexo e é

capaz de se ligar ao DNA contendo apenas um dinucleotídeo CG. Além

disso, MeCP-2 parece estar associado a um complexo co-repressor que

contém o repressor transcricional Sin3 e histona deacetilases. Assim, além

de impedir o acesso dos fatores de transcrição e a atividade da polimerase

II, MeCP-2, através de sua associação com histonas deacetilases, também

pode determinar uma alteração da estrutura da cromatina para um estado

inativo (figura 6-e) (SINGAL e GINDER 1999).

b) Repressão transcricional por inibição da ligação do fator de transcrição (FT)

Polimerase II

a) Transcrição ativa

Polimerase II

a) Transcrição ativa

DNAse I

Cromatina condensada

c) Repressão transcricional por formação de cromatina estruturalmente inativa

DNAse I

Cromatina condensada

DNAse I

Cromatina condensada

c) Repressão transcricional por formação de cromatina estruturalmente inativa

MeCP-1

Polimerase II

d) Repressão transcricional por MeCP-1

MeCP-1

Polimerase II

MeCP-1

Polimerase II

d) Repressão transcricional por MeCP-1

Sin3

HDAC

Polimerase II

MeCP 2

e) Repressão transcricional através de MeCP-2

Sin3

HDAC

Polimerase II

MeCP 2

Sin3

HDAC

Polimerase II

MeCP 2

e) Repressão transcricional através de MeCP-2

b) Repressão transcricional por inibição da ligação do fator de transcrição (FT)

Polimerase II

a) Transcrição ativa

Polimerase II

a) Transcrição ativa

DNAse I

Cromatina condensada

c) Repressão transcricional por formação de cromatina estruturalmente inativa

DNAse I

Cromatina condensada

DNAse I

Cromatina condensada

c) Repressão transcricional por formação de cromatina estruturalmente inativa

MeCP-1

Polimerase II

d) Repressão transcricional por MeCP-1

MeCP-1

Polimerase II

MeCP-1

Polimerase II

d) Repressão transcricional por MeCP-1

Sin3

HDAC

Polimerase II

MeCP 2

e) Repressão transcricional através de MeCP-2

Sin3

HDAC

Polimerase II

MeCP 2

Sin3

HDAC

Polimerase II

MeCP 2

e) Repressão transcricional através de MeCP-2

b) Repressão transcricional por inibição da ligação do fator de transcrição (FT)

Polimerase II

a) Transcrição ativa

Polimerase II

a) Transcrição ativa

DNAse I

Cromatina condensada

c) Repressão transcricional por formação de cromatina estruturalmente inativa

DNAse I

Cromatina condensada

DNAse I

Cromatina condensada

c) Repressão transcricional por formação de cromatina estruturalmente inativa

MeCP-1

Polimerase II

d) Repressão transcricional por MeCP-1

MeCP-1

Polimerase II

MeCP-1

Polimerase II

d) Repressão transcricional por MeCP-1

Sin3

HDAC

Polimerase II

MeCP 2

e) Repressão transcricional através de MeCP-2

Sin3

HDAC

Polimerase II

MeCP 2

Sin3

HDAC

Polimerase II

MeCP 2

e) Repressão transcricional através de MeCP-2

Legenda: a) Representação da região 5´de um gene com ilha CpG não metilada – os sítios

de ligação específica dos fatores de transcrição e da RNA polimerase II estão livres e,

portanto, a transcrição pode ocorrer (seta azul). b) Na presença de metilação das ilhas CpG

(CH

) os sítios de ligação dos fatores de transcrição (FT) ficam bloqueados e a transcrição é

impedida. c) Em um segundo mecanismo possível, a metilação do DNA induz uma

conformação condensada da cromatina, impedindo, portanto, a ligação dos fatores de

transcrição ao DNA. Esse mecanismo foi deduzido através de experimentos de

sensibilidade e resistência de cromossomos à DNAse I. d) Um terceiro mecanismo proposto

é através de recrutamento pelo DNA metilado da MeCP-1 ou MeCP-2 (e).

Fonte: Adaptada de SINGAL e GINDER (1999).

Figura 6 – Possíveis Mecanismos de Silenciamento Gênico através da

Metilação do DNA.

1.5 METILAÇÃO DO DNA E CÂNCER

Basicamente dois tipos de alterações do padrão de metilação do DNA

podem estar presentes em células neoplásicas. De fato, como ilustra a

Figura 7, quase todos os tipos de câncer apresentam tanto perda de

metilação em regiões pobres em dinucleotídeos CG, que deveriam estar

metilados (hipometilação do DNA), quanto ganhos de metilação em ilhas

CpG localizadas em regiões promotoras de genes (hipermetilação ou

metilação aberrante) (SINGAL e GINDER 1999; HERMAN e BAYLIN 2003).

CG MetiladoCG Não-metilado

Exon

CG MetiladoCG Não-metilado

Exon

1 2 3

Transcrição

1 2 3

Transcrição

1 2 3

Transcrição

1 2 3

Silenciamento

1 2 3

Silenciamento

1 2 3

Silenciamento

Normal

Câncer

Região

Promotora

CG MetiladoCG Não-metilado

Exon

CG MetiladoCG Não-metilado

Exon

1 2 3

Transcrição

1 2 3

Transcrição

1 2 3

Transcrição

1 2 3

Silenciamento

1 2 3

Silenciamento

1 2 3

Silenciamento

Normal

Câncer

CG MetiladoCG Não-metilado

Exon

CG MetiladoCG Não-metilado

Exon

1 2 3

Transcrição

1 2 3

Transcrição

1 2 3

Transcrição

1 2 3

Silenciamento

1 2 3

Silenciamento

1 2 3

Silenciamento

Normal

Câncer

Região

Promotora

Região

Promotora

Legenda: A figura esquematiza um suposto gene com 3 exons. A porção 5´ do gene

(quadro vermelho) apresenta alta concentração de dinucleotídeos CG (ilha CpG) que, em

condições normais, encontram-se não-metilados. Em células neoplásicas, entretanto, é

freqüente o achado de metilação nesses dinucleotídeos. Fora da região promotora (quadro

verde), cuja concentração de dinucleotídeos CG é menor do que a esperada, geralmente o

que se encontra é uma hipometilação desses resíduos em células provenientes de câncer.

Fonte: Adaptado de HERMAN e BAYLIN (2003)

Figura 7 - Comparação entre os padrões de metilação dos dinucleotídeos

CG em células normais e neoplásicas.

É possível que a hipometilação do DNA esteja envolvida com a

carcinogênese através da reversão do silenciamento transcricional de certas

regiões normalmente inativadas do genoma como, por exemplo, genes virais

inseridos, seqüências repetitivas e genes reprimidos pelo imprinting

genômico. Estudos em camundongos, nos quais se induz a perda de

metilação do DNA, demonstram uma freqüência aumentada de linfomas

tímicos, possivelmente devido ao aumento da instabilidade genética

(HERMAN e BAYLIN 2003).

Além disso, a perda de metilação poderia afetar a interação da fita de

DNA com outras estruturas nucleares, causando, desta forma, instabilidade

cromossômica funcional em células neoplásicas. Sabe-se, por exemplo, que

regiões pericentroméricas dos cromossomos são dependentes do nível de

metilação do DNA para que o fuso mitótico se ancore e, assim, a replicação

do DNA transcorra normalmente. Pacientes portadores da síndrome

imunodeficiência-instabilidade centromérica, associada com mutações

germinativas no gene da DNMT3B, apresentam alterações estruturais

evidentes em regiões pericentroméricas de certos cromossomos. Algumas

das alterações nessas regiões parecem estar presentes também em células

neoplásicas (SINGAL e GINDER 1999; HERMAN e BAYLIN 2003).

A inativação de genes supressores de tumor pode se dar tanto por

eventos mutacionais, como também pela hipermetilação de ilhas CpG

eventualmente presentes nas regiões promotoras desses genes. Seguindo a

hipótese de Knudson, a ruptura da função de um gene supressor de tumor

necessita da perda completa dos dois alelos codificantes. Quando causado

exclusivamente por alterações genéticas o primeiro evento mutacional em

um dos alelos pode se dar tanto na linhagem germinativa (nos casos de

câncer familiar), como em células somáticas (câncer esporádico). O segundo

evento geralmente ocorre devido a perdas cromossômicas somáticas em

regiões que contêm a sequência codificante do gene em questão, ou seja,

quando ocorre perda de heterozigose (LOH, da sigla em inglês) (SINGAL e

GINDER 1999; HERMAN e BAYLIN 2003).

A hipermetilação aberrante da região promotora pode ter o mesmo

efeito de uma mutação em região codificante em um dos alelos de

determinado gene, funcionando como o primeiro hit da hipótese de Knudson.

Normalmente a LOH atua com segundo hit associado. No câncer hereditário,

modificações epigenéticas não parecem atuar como primeiro hit, mas podem

causar o segundo, enquanto que no câncer esporádico não é rara a

observação de hipermetilação em ambas as cópias do gene) (SINGAL E

GINDER 1999; HERMAN e BAYLIN 2003).

De fato, observa-se que a quantidade de genes relacionados ao

câncer afetados por inativação epigenética é igual ou maior ao número de

genes inativados por mutação (LAIRD 2003).

1.6 METILAÇÃO EM HEPATOBLASTOMA

Até o momento, poucos estudos avaliaram a contribuição da

metilação aberrante do DNA na carcinogenese do hepatoblatoma. NAGAI et

al. (2003), verificaram que ilhas CpG localizadas na região promotora do

gene SOCS1 encontravam-se hipermetiladas em 7 de 15 casos de

hepatoblastomas avaliados, à semelhança do que ocorre em casos de

carcinoma hepatocelular, próprio de adultos. De fato, grande parte dos

estudos de metilação em tumores hepáticos estão relacionados aos

hepatocarcinomas que, apesar de também terem origem epitelial, como o

hepatoblastoma, acometem, geralmente, crianças de maior faixa etária

(maiores de 10 anos). HARADA et al. (2002), estudando a presença de

metilação aberrante na região promotora de RASSF1A em tumores

pediátricos e linhagens celulares, observaram presença da alteração em

19% dos casos de hepatoblastoma analisados. FUKUZAWA et al. (1999)

demonstraram que a perda de expressão do gene H19 em hepatoblastoma

estava relacionada ao imprinting do alelo paterno e a hipermetilação da

região promotora do alelo materno. Em outro estudo, a análise da frequência

de hipermetilação do gene CDKN2A em 24 casos de hepatoblastoma

demonstrou que 50% dos casos apresentavam a alteração na região

promotora deste gene. sendo que, dos 12 tumores que se mostraram

metilados, 8 apresentaram completa ausência de imunorreatividade para

proteína CDKN2A ao exame imunohistoquímico, demonstrando a

associação entre a hipermetilação do DNA e a inativação do gene (SHIM et

al. 2003).

Assim, apesar dos estudos citogenéticos e moleculares relatarem a

existência de alterações não randômicas relacionadas a esta neoplasia,

nenhuma destas é consistente o suficiente para explicar a gênese deste

tumor em sua maioria.

O fato de, provavelmente, a gênese do hepatoblastoma estar ligada a

eventos ocorridos durante a embriogênese hepática e o conhecimento de

que o mecanismo de metilação do DNA exerce fundamental importância na

organogênese podem favorecer a hipótese de que este processo esteja

também envolvido na tumorigênese dessa neoplasia.

A hipótese desse estudo baseia-se nos achados prévios em outros

tumores que evidenciaram a associação tanto entre a hipermetilação da

região promotora de certos genes e a gênese da doença, quanto ao seu

prognóstico. Além disso, alguns autores sugerem que a metilação do DNA

pode estar envolvida também na origem e progressão do hepatoblastoma (LI

et al. 1998; SUGAWARA et al. 2006)

Reforça essa hipótese o fato de que um dos únicos estudos com

tecnologia em larga escala relacionados com expressão gênica em

hepatoblastoma demonstrou que a maioria dos genes diferencialmente

expressos no tumor estavam hipoexpressos, ao contrário do que se poderia,

teoricamente, imaginar, uma vez que a maior parte das alterações

citogenéticas associadas são, de fato, amplificações. Esperar-se-ia, assim,

uma maior frequência de genes hiperexpressos. É possível, portanto, que a

metilação seja um mecanismo atuante na gênese dessa hipoexpressão.

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

O presente estudo visou avaliar a hipermetilação das regiões

promotoras de uma painel de 25 genes em amostras tumorais de

hepatoblastoma, incluídas em parafina, colhidas de pacientes submetidos a

tratamento cirúrgico pelo Departamento de Pediatria do Hospital do Câncer

A.C. Camargo, com objetivo de verificar a utilidade da determinação do perfil

de metilação destes genes como marcadores moleculares para este tipo

tumoral.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Determinar a freqüência de hipermetilação da região promotora dos

genes AIM1, APC, CALCA, CCNA1, CCND2, CDH1, COX2 (PTGS2),

DAPK, ESR1, GSTP1, MGMT, MINT31, MLH1, P14 ARF, CDKN2B,

CDKN2A, RARB, RASSF1A, RB1, SOCS1, THBS1, TIMP3, MT1G,

SFRP1, HIN1(SCGB3A1) em amostras tumorais de pacientes

submetidos a tratamento cirúrgico de hepatoblastoma e em amostras

de tecido hepático normal.

2. Correlacionar a presença de hipermetilação com características

clínicas e patológicas dos pacientes.

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 CASUÍSTICA

Foi feito levantamento de todos os pacientes com diagnóstico de

hepatoblastoma atendidos no Hospital do Câncer A. C. Camargo do período

de 1984-2005. A partir desse levantamento foram selecionadas amostras de

tecido tumoral parafinado do arquivo de anatomia patológica do hospital,

respeitando-se os seguintes critérios:

a) diagnóstico revisado e confirmado de hepatoblastoma por patologista

da instituição;

b) disponibilidade de tecido tumoral viável no bloco de parafina;

c) tratamento realizado na instituição;

d) disponibilidade de dados clínicos em prontuário.

Os dados clínicos dos pacientes foram extraídos dos prontuários

arquivados no Serviço de Arquivo Médico (SAME) do hospital e anotados em

ficha anátomo-clínica, que abordava aspectos epidemiológicos, clínico-

semiológicos, propedêuticos e patológicos assim definidos:

1. Epidemiológicos: idade, gênero e raça;

2. Clínico-semiológicos: sintomas ao diagnóstico, tempo de início dos

sintomas, síndrome hereditárias associadas, história de

prematuridade, história de baixo peso ao nascimento, estadiamento

SIOPEL, presença e sítios de metástases ao diagnóstico, medidas

tumorais iniciais e pós-quimioterapia estimados por tomografia

computadorizada, nível de alfa-fetoproteína ao diagnóstico e após

quimioterapia, presença e sítio de recaída, status atual do paciente e

data do último seguimento;

3. Propedêuticos: tempo de tratamento, tratamento inicial proposto,

quimioterápicos utilizados no tratamento, tipo de cirurgia realizada,

grau de ressecabilidade, necessidade de transplante hepático,

abordagem cirúrgica de metástases;

4. Patológicos: tipo histológico, comprometimento linfonodal ou de

margens cirúrgicas.

Através de uma colaboração com a Santa Casa de Misericórdia de

São Paulo também foram incluidas no estudo 5 amostras parafinadas de

fígado fetal normal provenientes de produtos de abortamentos.

A pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) em

06/02/2006 e está cadastrada no Sistema Nacional de Informações Sobre

Ética em Pesquisa (SISNEP) sob o número 1344.0.022.000-06.

3.2 DISSECÇÃO MANUAL

Após a confirmação do diagnóstico de hepatoblastoma por patologista

da instituição, uma lâmina corada com hematoxilina e eosina (HE) foi

demarcada para delineamento das áreas que apresentavam maior

representatividade tumoral.

Os cortes do bloco de parafina correspondentes a cada lâmina de HE

foram confeccionados com auxílio de micrótomo e dispostos em lâmina de

vidro para microscopia. Cada corte possuía espessura de 10μm.

As lâminas coradas com HE foram sobrepostas às lâminas que

continham o fragmento de parafina não corado, permitindo a visualização da

área tumoral e, conseqüentemente, a sua dissecção. Foram raspadas áreas

correspondentes ao tumor de 10 cortes de cada caso incluído no estudo.

Os tecidos hepáticos normais foram dissecados da mesma forma.

3.3 EXTRAÇÃO DE DNA

Para extração do DNA dos tecidos dissecados foi utilizado kit de

extração QIAmp DNA Mini Kit (QIAGen) conforme instruções do fabricante.

Basicamente, o material raspado foi desparafinizado com xileno 100%

por 30 minutos a 42

C e lavado com etanol 100% duas vezes. Após retirada

do etanol 100% a amostra foi incubada a 50

C com proteinase K e tampão

ATL (fornecidos no kit) até completa digestão do tecido (12-24h). Após

incubação em tampão AL, a solução digerida foi transferida para coluna de

purificação (QIAGen) e submetida a duas lavagens seqüenciais com

soluções AW1 e AW2. O DNA purificado foi então eluído da coluna em 50μL

de água.

3.4 QUANTIFICAÇÃO DO DNA E CONTROLE DE QUALIDADE

Um microlitro de solução de DNA extraído foi utilizado para

quantificação por espectrofotometria (Nanodrop® ND-1000) com leitura de

absorbância a 260nm.

A quantidade estimada de 30ng foi utilizada para realização de PCR

convencional com primers para a amplificação de um fragmento de 133

pares de base (bp) do gene ACTB (Tabela 1).

Tabela 1 - Seqüência dos primers forward e reverse para amplificação do

fragmento de 133bp do gene ACTB.

Primer Seqüência

Forward 5´ – TGGTGATGGAGGAGGCTCAGCAAGT – 3´

Reverse 5´ - AGCCAATGGGACCTGCTCCTCCCTTGA – 3´

As condições utilizadas nesta reação de PCR foram: 1,5mM de

MgCl

, 0,2mM de dNTPs, 0,4μM de cada primer, 1X tampão de PCR, 1U de

Taq DNA Polymerase (Invitrogen) e 30ng de DNA em um volume final de

reação de 25µL. O programa de PCR utilizado foi: 95

C por 2 minutos; 40

ciclos de 95

C por 30 segundos, 66

C por 45 segundos e 72

C por 45

segundos; por último um passo de 72

C por 7 minutos. Para visualização

dos produtos amplificados, as amostras foram resolvidas em gel de

poliacrilamida 8% e coradas com nitrato de prata (SANGUINETTI et al.

1994).

3.5 TRATAMENTO COM BISSULFITO DE SÓDIO

O tratamento com bissulfito de sódio foi baseado no método descrito

por EADS e LAIRD (2002), porém foi adaptado com o intuito de diminuir a

degradação do DNA durante a exposição ao bissulfito de sódio.

Essencialmente, a técnica consiste em uma etapa inicial de

desnaturação em que 2µg de DNA são incubados a 50

C por 30 minutos em

uma solução contendo NaOH 0,3M e Hering DNA (250mg/ml). Em seguida o

DNA desnaturado é submetido a um processo de sulfonação reversível e

deaminação através da incubação a 70

C por 3 horas em uma solução de

bissulfito de sódio contendo metabissulfito de sódio 2,7M (Sigma-Aldrich),

hidroquinona 135mM (Sigma-Aldrich) e NaOH 378mM (pH final=5,0),

protegido da luz.

Posteriormente, o DNA foi purificado com sistema Wizard DNA Clean-

Up (Promega), conforme instrução do fabricante, e eluído em 45μL de água.

O material, então, foi dessulfonado, através da incubação em solução

contendo NaOH 0,3M por 10 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, o

DNA foi precipitado com etanol 100% e acetato de amônia 5M e incubação a

-20

C durante a noite, seguido de centrifugação a 14000rpm por 30 minutos

e lavagem com etanol 70%. No final, o DNA foi ressuspendido em 110μL de

água e estocado a -70°C até o uso.

3.6 VERIFICAÇÃO DA QUALIDADE DO DNA APÓS O

TRATAMENTO COM BISSULFITO DE SÓDIO

Para verificar a eficiência do tratamento com bissulfito de sódio, 1µL

de DNA tratado foi utilizado em uma reação de PCR com primers

complementares a um segmento de 133bp do gene da ACTB após a

conversão pelo bissulfito (Tabela 2). O segmento de DNA ao qual esse par

de primers é complementar não contém dinucleotídeos CGs e, portanto,

permite a amplificação de todo DNA modificado pelo bissulfito de sódio,

independente do estado de metilação.

Tabela 2 – Seqüência dos primers forward e reverse para amplificação do

fragmento de 133bp do gene ACTB após tratamento do DNA com bisulfito

de sódio.

Primer Seqüência

Forward 5´ – TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT – 3´

Reverse 5´ - AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA – 3´

As condições utilizadas nesta reação de PCR foram: 1,5mM de

MgCl

, 0,2mM de dNTPs, 0,4μM de cada primer, 1X tampão de PCR, 1U de

Taq DNA Polymerase (Invitrogen) e 30ng de DNA em um volume final de

reação de 25µL. O programa de PCR utilizado foi: 95

C por 2 minutos; 40

ciclos de 95

C por 30 segundos, 60

C por 45 segundos e 72

C por 45

segundos; e um passo final de 72

C por 7 minutos. Para visualização dos

produtos amplificados, as amostras foram resolvidas em gel de

poliacrilamida 8% e coradas com nitrato de prata (SANGUINETTI et al.

1994).

3.7 METHYLATION-SPECIFIC PCR QUANTITATIVA (MSP-Q)

As reações de MSP quantitativa (MSP-Q - Quantitative Methylation

Specific PCR) foram realizadas conforme descrição de EADS et al. (2000).

As concentrações finais dos reagentes utilizados nas reações de

MSP-Q foram: 1X tampão de reação (16,6mM de sulfato de amônio, 67mM

de Tris-HCl pH 8,0, 6,7mM de MgCl

, 10mM de Mercaptoetanol, 0,1% de

DMSO), 0,2mM de dNTP (Invitrogen), 1,2μM de cada primer (direto e

reverso), 1X Rox dye (Invitrogen), 0,2μM de sonda TaqMan, 0,6U DNA

polimerase Taq Platinum (Invitrogen) e 3μL de DNA tratado com bissulfito,

em volume final de reação de 20μL. Para o gene CDKN2A a concentração

final de MgCl

utilizada no tampão de reação foi de 2,5mM. As condições de

reação foram: 95

C por 10 minutos, seguidos por 45 ciclos de 95

C por 15

segundos e 60

C por 1 minuto.

Todas as reações foram feitas em triplicatas e em placas de 96-wells,

utilizando-se o aparelho SDS 7500 (Applied Biosystems).

As amostras foram consideradas metiladas quando houve

amplificação de pelo menos duas amostras das triplicatas. A ausência de

amplificação ou amplificação de apenas uma das triplicatas indicava

amostras não metiladas. O Quadro 3 mostra as seqüências de primers e

sondas utilizados no estudo.

Para que seja determinada a quantidade de DNA metilado em uma

dada amostra é necessária a construção de uma curva padrão construída a

partir de diluições seriadas de um DNA sabidamente metilado para o gene

em questão. Essa curva foi confeccionada a partir de DNA de linfócito

humano de indivíduos sadios metilado in vitro pela ação da enzima SssI

CpG-Metilase (New England Biolabs) conforme instruções do fabricante e,

posteriormente, tratado com bissulfito de sódio. Espera-se, portanto, que

para todos os genes estudados estejam 100% metilados neste DNA

metilado in vitro. Seis diluições seriadas (1, 10

-1

, 10

-2

, 10

-3

, 10

-4

, 10

-5

) foram

feitas, partindo-se de uma concentração inicial estimada por

espectrofotometria de 30ng/μL, sendo que, para cada gene estudado foi

utilizada uma curva de diluição na mesma placa de reação.

A eficiência das reações foi calculada a partir do valor da medida de

inclinação da reta obtida pela regressão linear descrita acima (slope) através

da fórmula:

Eficiência = (10

-1/slope

)-1

Uma vez que as quantidades de DNA, que são inicialmente

adicionadas em cada tubo de reação, não são iguais é necessária a

normalização das mesmas para que as quantificações sejam comparáveis

entre si. Assim, a quantificação do gene alvo foi dividida pela quantificação

do gene ACTB, cujos primers e sonda foram desenhados para cobrir uma

região com ausência de CGs. Uma vez que a amplificação deste fragmento

independe do estado de metilação das citosinas, sua quantificação refletirá a

quantidade total de DNA tratado presente na reação. Desta forma, obtém-se

uma razão entre o número de cópias metiladas do gene alvo na amostra

pelo número máximo de cópias presentes na reação (número de cópias do

gene ACTB).

Sabe-se, entretanto, que existem variações de eficiência de reação

tanto quando comparados dois conjuntos de primers e sondas para genes

diferentes, quanto entre reações realizadas em momentos e placas

diferentes. Assim, para minimizar esse tipo de viés, a razão anterior foi

dividida pela razão entre o número de cópias metiladas do gene alvo em

uma amostra referência e o número de cópias do gene ACTB na mesma

amostra referência, conforme a fórmula a seguir, cujo resultado foi

denominado PMR (Percentual of Methylated Reference):

A amostra referência utilizada foi o mesmo DNA tratado com SssI

CpG-metilase e bissulfito de sódio utilizada para confecção da curva de

diluição e estava presente em todas as placas analisadas.

3.8 METILAÇÃO IN VITRO DE DNA DE LINFÓCITOS

Dez mililitros de sangue periférico de indivíduos saudáveis foram

submetidos a centrifugação por 10 minutos a 1.500 RPM para separação do

soro e da porção celular. À porção celular foram adicionados 10mL de TE

(10mM Tris-HCl pH8,0 e 1mM EDTA pH 8,0) para lise das hemácias. Após

centrifugação a 1.500 RPM por 5 minutos, o sobrenadante foi descartado e a

amostra foi submetida à nova lavagem com 10mL de TE. Novamente o

sobrenadante foi descartado e o pellet de linfócitos foi ressuspenso em 1mL

de TE. Os linfócitos foram transferidos para tubo de 1,5mL e submetidos à

centrifugação por 1 minuto a 13.000 RPM. O sobrenadante foi descartado e

o pellet de linfócitos armazenado a -70

C até o uso.

Para a obtenção do DNA foi utilizado o protocolo de digestão com

Proteinase K e extração do DNA com fenol-clorofórmio.

A metilação in vitro do DNA de linfócitos foi realizada através da ação

da enzima SssI CpG Methylase (New England Biolabs), segundo instruções

do fabricante. Resumidamente, 20µg de DNA de linfócitos foram misturados

a 0,032mM de SAM (S-adenosilmetionina) e 25 unidades da enzima SssI,

em um volume final de reação de 250µL. A reação foi incubada por 4 horas

a 37

C. Em seguida, foi adicionado mais 0,064mM de SAM e 12,5 unidades

da SssI. Após nova incubação de 4 horas a 37

C, as amostras foram

submetidas a extração com fenol-clorofórmio e precipitação com etanol. O

pellet de DNA metilado in vitro foi ressuspenso em 15µL de água e estocado

a -20

Vinte microgramas do DNA metilado in vitro (10 alíquotas de 2µg)

foram submetidas ao tratamento com bissulfito de sódio conforme descrito

anteriormente. No final todas as alíquotas foram ressuspensas em um

volume final de 50µL de água, quantificadas em espectrofotômetro e diluídas

para uma concentração de 30ng/µL.

O DNA de linfócitos metilado in vitro e tratado com bissulfito de sódio

foi empregado como controle positivo e na construção das curvas padrão

nas reações de MSP-Q.

3.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA

As medidas de dispersão e de tendência central foram avaliadas com

o auxílio do programa SPSS 10.0. A significância estatística das diferenças

entre as variáveis categóricas foi avaliada através do teste do qui-quadrado

ou teste exato de Fisher. Comparação das variáveis contínuas entre os

grupos estudados foi realizada através do teste T-student. A sobrevida

global foi estimada a partir do primeiro dia de tratamento até a data da morte

ou do último seguimento. As sobrevidas globais dos grupos de pacientes

estudados, bem como a estimativa da influência do estado de metilação

(variável categórica) nas mesmas, foram avaliadas pelo método de Kaplan-

Meier e comparadas através do teste de log-rank. A influência do nível de

metilação (variável contínua) na sobrevida global dos pacientes foi avaliada

através do modelo de regressão de Cox. Para todos os testes estatísticos foi

considerada significância estatística quando p < 0,05.

Quadro 3 – Sequência de primers e sondas dos genes avaliados no estudo.

Gene Forward 5´-3´ Probe 6FAM 5´-3´TAMRA Reverse 5´-3´ Genbank # Referência

ACTB TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA NM_001101 Eads et al. (2001) Cancer Res 61:3410–8

AIM1 CGCGGGTATTGGATGTTAGT GGGAGCGTTGCGGATTATTCGTAG CCGACCCACCTATACGAAAA NM_001624 The Johns Hopkins University (Lab. Dr. Sidransky)

APC GAACCAAAACGCTCCCCAT CCCGTCGAAAACCCGCCGATTA TTATATGTCGGTTACGTGCGTTTATAT NM_000038 Eads et al. (2001) Cancer Res 61:3410–8

CALCA GTTTTGGAAGTATGAGGGTGACG ATTCCGCCAATACACAACAACCAATAAACG TTCCCGCCGCTATAAATCG NM_001741.1 Eads et al. (2001) Cancer Res 61:3410–8

CCNA1 (CYCLIN A1) TCGCGGCGAGTTTATTCG CGTTATGGCGATGCGGTTTCGG CCGACCGCGACAAACG NM_003914 The Johns Hopkins University (Lab. Dr. Sidransky)

CCND2 (CYCLIN D2) TTTGATTTAAGGATGCGTTAGAGTACG AATCCGCCAACACGATCGACCCTA ACTTTCTCCCTAAAAACCGACTACG NM_001759 Lehmann et al. (2002) Am J Pathol 160:605-612

CDH1 AATTTTAGGTTAGAGGGTTATCGCGT CGCCCACCCGACCTCGCAT TCCCCAAAACGAAACTAACGAC NM_004360 Eads et al. (2001) Cancer Res 61:3410–9

COX2 (PTGS2) CGGAAGCGTTCGGGTAAAG TTTCCGCCAAATATCTTTTCTTCTTCGCA AATTCCACCGCCCCAAAC NM_000963 Eads et al. (2001) Cancer Res 61:3410–8

DAPK GGATAGTCGGATCGAGTTAACGTC TTCGGTAATTCGTAGCGGTAGGGTTTGG CCCTCCCAAACGCCGA NM_004938 Harden et al. (2003) Clinical Cancer Res 9:1370-1375

ESR1 GGCGTTCGTTTTGGGATTG CGATAAAACCGAACGACCCGACGA GCCGACACGCGAACTCTAA NM_000125 Eads et al. (2001) Cancer Res 61:3410–8

GSTP1 AGTTGCGCGGCGATTTC CGGTCGACGTTCGGGGTGTAGCG GCCCCAATACTAAATCACGACG NM_000852 Jeronimo et al. (2001) J Nat Cancer Inst 93:1747-1752

MGMT CGAATATACTAAAACAACCCGCG AATCCTCGCGATACGCACCGTTTACG GTATTTTTTCGGGAGCGAGGC NM_002412 Harden et al. (2003) Clinical Cancer Res 9:1370-1375

MINT31 GAGTGATTTATTAGGTTTCGTC ACGCCGAAAAACACTTCCCCAAC CGAAAACGAAACGCCGCGA The Johns Hopkins University (Lab. Dr. Sidransky)

MLH1 CGTTATATATCGTTCGTAGTATTCGTGTTT CGCGACGTCAAACGCCACTACG CTATCGCCGCCTCATCGT NM_000249 Eads et al. (2001) Cancer Res 61:3410–8

P14 (ARF) ACGGGCGTTTTCGGTAGTT CGACTCTAAACCCTACGCACGCGAAA CCGAACCTCCAAAATCTCGA NM_000077 Eads et al. (2001) Cancer Res 61:3410–8

P15/CDKN2B AGGAAGGAGAGAGTGCGTCG TTAACGACACTCTTCCCTTCTTTCCCACG CGAATAATCCACCGTTAACCG NM_004936 Eads et al. (2001) Cancer Res 61:3410–8

P16/CDKN2A TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC AGTAGTATGGAGTCGGCGGCGGG GACCCCGAACCGCGACCGTAA NM_000077 Harden et al. (2003) Clinical Cancer Res 9:1370-1375

RARB GGGATTAGAATTTTTTATGCGAGTTGT TGTCGAGAACGCGAGCGATTCG TACCCCGACGATACCCAAAC NM_000965 Hoque et al. (2005) J Clin Endocrinol Metab 90:4011-18

RASSF1A GCGTTGAAGTCGGGGTTC ACAAACGCGAACCGAACGAAACCA CCCGTACTTCGCTAACTTTAAACG NM_007182 Lehmann et al. (2002) Am J Pathol 160:605-612

RB1 TTAGTTCGCGTATCGATTAGCG TCACGTCCGCGAAACTCCCGA ACTAAACGCCGCGTCCAA NM_000321 Eads et al. (2001) Cancer Res 61:3410–8

SOCS-1 GCGTCGAGTTCGTGGGTATTT ACAATTCCGCTAACGACTATCGCGCA CCGAAACCATCTTCACGCTAA NM_003745 Müller et al. (2003) Cancer Res 7641-7645

THBS1 CGACGCACCAACCTACCG ACGCCGCGCTCACCTCCCT GTTTTGAGTTGGTTTTACGTTCGTT NM_003246 Eads et al. (2001) Cancer Res 61:3410–8

TIMP3 GCGTCGGAGGTTAAGGTTGTT AACTCGCTCGCCCGCCGAA CTCTCCAAAATTACCGTACGCG NM_000362 Eads et al. (2001) Cancer Res 61:3410–8

MT1G CGTTTAAGGGATTTTGTATTTGGTTTAT CGCGATCCCGACCTAAACTATACGCA CCGCTAAATCCGCACCG NM_005950 Weisenberger et al. (2006) Nature Genet 38(7):787-93

SFRP1 GAATTCGTTCGCGAGGGA CCGTCACCGACGCGAAAACCAAT AAACGAACCGCACTCGTTACC NM_003012 Weisenberger et al. (2006) Nature Genet 38(7):787-94

HIN1 (SCGB3A1) TAGGGAAGGGGGTACGGGTTT ACTTCCTACTACGACCGACGAACC CGCTCACGACCGTACCCTAA NM_052863 Fackler et al. (2004) Cancer Res. 64(13):4442-52

4 RESULTADOS

4.1 CARACTERIZAÇÃO CLÍNICA DA POPULAÇÃO

Foram inicialmente identificados 35 casos com diagnóstico confirmado

de hepatoblastoma no arquivo médico do Hospital do Câncer A. C. Camargo

no período de 1984-2005. Entretanto, de 5 destes não havia bloco de

parafina disponível para estudo (apenas lâmina para diagnóstico) e em

outros 6 casos o material emblocado era constituído apenas por tecido

necrosado. Portanto, os 24 casos que apresentavam tecido tumoral viável no

bloco de parafina foram incluídos no estudo, os dados de prontuário foram

coletados para análise clínica e foi realizada revisão anátomo-patológica dos

blocos.

Embora de todas os casos tenha sido obtido DNA de boa qualidade,

de 4 amostras não foi possível amplificação de DNA após o tratamento com

bissulfito de sódio. Portanto, 20 casos prosseguiram no estudo, sendo

obtidos tanto os dados clínicos quanto moleculares destes pacientes. Para

se detectar eventuais viéses de seleção da amostra, a população total de 35

pacientes com diagnóstico de hepatoblastoma confirmado à revisão

anátomo-patológica foi comparada com a população selecionada de 20

pacientes efetivamente analisados no estudo. Esta análise demonstrou que,

a população selecionada não parece diferir estatisticamente da população

total quando consideradas as variáveis categóricas (gênero, raça,

estadiamento SIOPEL e presença de metástases ao diagnóstico) (Tabela 3)

e não-categóricas (idade, nível de alfa-fetoproteína ao diagnóstico e tempo

de seguimento) (Tabela 4). A sobrevida global em 5 anos nos dois grupos

não foi estatisticamente diferente (74,67% e 77,01%, respectivamente)

(Figura 8). Dessa forma, a amostra selecionada de pacientes foi considerada

representativa do total de pacientes tratados no hospital.

Tabela 3 - Comparação das variáveis categóricas pesquisadas entre a

amostra total de 35 pacientes e a amostra selecionada de 20 pacientes.

População Total

População

Selecionada

Característica

No. % No. %

p-valor*

Total de pacientes 35 20

Gênero

Masculino 24 68,6 13 65

Feminino 11 31,4 7 35

0,507

Raça

Branca 25 71,4 16 80

Parda 7 20 2 10 0,628

Negra 3 8,6 2 10

PRETEXT SIOPEL

I e II 7 20 3 15

III e IV 28 80 17 85

0,470

Metástase ao diagnóstico

Não 28 80 14 70

Sim 7 20 6 30

0,301

Histologia

Fetal 28 90,3 17 85

Não-fetal 3 9,7 3 15

0,438

* Utilizado teste do qui-quadrado

Tabela 4 - Comparação das variáveis contínuas pesquisadas entre a

amostra total de 35 pacientes e a amostra selecionada de 20 pacientes.

População Total

(n=35)

População

Selecionada

(n=20)

Característica

Média DP Média DP

p-valor*

Idade (meses) 21,85 21,17 23,88 21,17 0,732

Alfa-fetoproteína ao

diagnóstico

529.566 2.016.396 823.056 678.189 0,568

Tempo de seguimento

(meses)

80,67 65,78 65,30 52,50 0,375

* Utilizado teste t-student para comparação entre médias

P=0,719

Meses

847260483624120

Sobrevida

1.0

0.0

Selecionado (n=20)

Total (n=35)

SG 5 anos=77,04%

SG 5 anos=74,67%

P=0,719

Meses

847260483624120

Sobrevida

1.0

0.0

Selecionado (n=20)

Total (n=35)

SG 5 anos=77,04%

SG 5 anos=74,67%

Figura 8 – Gráfico de comparação entre as sobrevidas globais em 5 anos no

total de pacientes com hepatoblastoma (n=35) e a população selecionada

para o estudo molecular (n=20).

A idade dos pacientes ao diagnóstico variou de 0,36 a 83,68 meses,

com média de 23,89 meses. Crianças do gênero masculino (65%) e brancas

(80%) foram mais acometidas. O síntoma mais freqüentemente relatado foi

tumor palpável em abdome (50%), seguido de aumento do volume

abdominal em 30% (dados não mostrados). O tempo de início dos sintomas

variou 0-12 meses com média de 3 meses. Dos 20 pacientes, 2 (10%)

apresentavam síndromes genéticas (1 neurofibromatose e 1 hemi-hipertrofia

isolada), nenhum tinha antecedente de prematuridade e apenas 1 nasceu

com baixo peso (dados não mostrados). PRETEXT SIOPEL classificados

como III e IV ocorreram em 85% dos casos estudados. Foram detectadas

metástases ao diagnóstico em 6 dos 20 pacientes (30%) e o pulmão foi o

sítio acometido em todos os casos. Em 3 dos pacientes metastáticos foi

realizada abordagem cirúrgica dos nódulos e em 2 deles havia evidência de

neoplasia viável. Obteve-se o nível de alfa-fetoproteína ao diagnóstico em 16

dos 20 pacientes estudados, sendo que 2 apresentavam níveis menores que

100ng/mL e vieram a falecer devido a doença. Em 19 dos 20 pacientes

(95%) o esquema de tratamento proposto foi quimioterapia neoadjuvante,

seguido de ressecção do tumor primário e quimioterapia adjuvante. Apenas

um paciente não foi tratado com neoadjuvância, entretanto o mesmo faleceu

por complicação decorrente da quimioterapia (cardiotoxicidade). O esquema

quimioterápico com cisplatina, carboplatina e doxorrubicina foi utilizado em

50% dos casos, enquanto cisplatina associada a doxorrubicina em 45%. Uso

isolado de cisplatina foi feito em apenas 1 paciente da amostra (dados não

mostrados). A mediana do tempo de tratamento foi de 6,6 meses. Os

procedimentos cirúrgicos realizados foram assim distribuídos: 2 (10%)

segmentectomias, 4 (20%) hemi-hepatectomias esquerdas, 11 (55%) hemi-

hepatectomias direitas e 3 (15%) hepatectomias totais seguidas de

transplante hepático (dados não mostrados). O tipo histológico misto

(presença de mesênquima) foi observado em 65% dos casos. O

componente fetal estava presente em 85% dos casos. O subtipo anaplásico

foi detectado em apenas 1 paciente. Morte pela doença ocorreu em 5

pacientes (25%), dos quais 3 recaíram após término do tratamento e 2

apresentaram refratariedade ao mesmo. Um paciente faleceu por

cardiotoxicidade à doxorrubicina. O tempo de seguimento para os pacientes

vivos sem evidência de doença variou de 23,06-184,90 meses, com mediana

de 54,72 meses (Tabela 5).

A análise das sobrevidas dos 20 pacientes mostrou que a ausência ou

presença de metástases ao diagnóstico influenciou a taxa de sobrevida

global em 5 anos (92,85% x 33,33%, respectivamente; p=0.0066) (Figura 9-

A). Apesar dos pacientes com PRETEXT SIOPEL mais avançados terem

apresentado taxas de sobrevida global em 5 anos menores (100%, 77,78% e

62,5%, para PRETEXT II, III e IV, respectivamente), não houve diferença

estatisticamente significativa entre os grupos, provavelmente devido ao

pequeno número de pacientes com PRETEXT II (Figura 9-B). No entanto,

quando feita estratificação de risco conforme critérios do SIOPEL, observou-

se diferença estatisticamente significativa nas taxas de sobrevida livre de

doença em 5 anos quando considerados os grupos de Alto Risco e Risco

Básico (55,5% X 100%, respectivamente; p=0.0217) (Figura 9-C). Foi

observada maior taxa de sobrevida global em pacientes que apresentavam

algum componente fetal ao exame histopatológico (81,33% fetal X 33,33%

não-fetal), entretanto a diferença não foi estatisticamente significativa

(p=0.0745) (Figura 9-D). Não houve diferença entre as taxas de sobrevida

daqueles que apresentavam componente mesenquimal quando comparados

àqueles com subtipo histológico puro (76,92% misto X 71,43% puro;

p=0,8151) (Figura 9-E).

Pacientes com idade inferior a 2 anos parecem ter evoluído com pior

taxa de sobrevida quando comparados àqueles maiores de 2 anos,

entretanto a diferença não foi estatisticamente significativa (61,64% X 100%,

respectivamente; p=0.0516) (Figura 9-F).

Tabela 5 - Características clínicas dos 20 pacientes com hepatoblastoma submetidos ao estudo molecular.

Paciente

Ano do

Diagn.

Idade ao

Diagnóstico

(meses) /

Gênero

Raça

Tempo de

início dos

sintomas

(meses)

Histologia

PRETEXT

SIOPEL

Metástase

Diagnóstico

Alfa-

fetoproteína

diagnóstico

Tempo de

Seguimento

(meses)

Status atual Observação

1 1993 9.74 / F Parda 2

Puro com componente fetal e

embrionário

III Não ignorado 142.17 Vivo sem doença

2 1996 29.44 / M Branca 0

Puro com componente fetal e

embrionário

II Não 6637 126.38 Vivo sem doença

3 1997 15.43 / M Branca 3 Misto com componente embrionário III Sim 400000 6.25 Morte pela doença

Refratariedade

ao tratamento

4 1998 7.63 / M Branca 0.1 Anaplásico IV Sim 3.2 9.24 Morte pela doença

Recaída após 6

meses

5 1999 11.58 / F Branca 1 Misto com componente fetal III Não ignorado 3.26

Morte por

complicação do

tratamento

Cardiotoxicidade

6 2002 83.68 / F Branca 0.1

Puro com componente fetal e

embrionário

II Não 18652 51.84 Vivo sem doença

7 2003 10.63 / M Branca 1 Misto com componente fetal IV Não 824.2 54.08 Vivo sem doença

8 2003 19.18 / F Branca 12

Misto com componente fetal e

embrionário

IV Sim 200000 23.22 Morte pela doença

Recaída após 3

meses

9 2003 25.76 / F Branca 7

Puro com componente fetal e

embrionário

III Não 130000 23.06 Vivo sem doença

10 2005 20.86 / M Branca 1 Misto com componente fetal IV Não 30000 43.29 Vivo sem doença

11 1995 73.26 / M Branca 6 Puro fetal II Não 17600 134.14 Vivo sem doença

12 1997 34.24/ M Branca 8

Misto com componente fetal e

embrionário

IV Sim 221500 102.8 Vivo sem doença

14 1998 42.43/ M Branca 3 Misto com componente fetal III Sim 533000 69.11 Vivo sem doença

15 1998 9.05 / M Branca 1 Misto com componente fetal III Não ignorado 55.36 Vivo sem doença

16 2002 22.5 / M Negra 3

Misto com componente fetal e

embrionário

IV Não 10976000 46.38 Vivo sem doença

17 2002 27.7 / F Negra 3 Misto com componente embrionário IV Não ignorado 50.3 Vivo sem doença

18 2003 0.36 / M Branca 0 Misto com componente fetal III Não 387040 53.32 Vivo sem doença

20 2005 9.74 / M Parda 4 Puro fetal IV Sim 223400 5.99 Morte pela doença

Hemihipertrofia

Refratariedade

ao tratamento

22 1987 15 / M Branca 5

Misto com componente fetal e

embrionário

III Não 24190 184.9 Vivo sem doença

23 2005 9.67 / F Branca 0.5 Misto com componente fetal III Não 63 120.89 Morte pela doença

Neurofibroma-

tose

Recaídas

múltiplas

Meses

847260483624120

Sobrevida

1.0

0.0

Metastático

Não-metastático

P=0,0066

SG 5 anos = 92,86%

SG 5 anos = 33,33%

Meses

847260483624120

Sobrevida

1.0

0.0

Metastático

Não-metastático

P=0,0066

SG 5 anos = 92,86%

SG 5 anos = 33,33%

Meses

847260483624120

Sobrevida

1.0

0.0

PRETEXT 4

PRETEXT 3

PRETEXT 2

P=0,38

SG 5 anos = 100%

SG 5 anos = 62,50%

SG 5 anos = 77,78%

Meses

847260483624120

Sobrevida

1.0

0.0

PRETEXT 4

PRETEXT 3

PRETEXT 2

P=0,38

SG 5 anos = 100%

SG 5 anos = 62,50%

SG 5 anos = 77,78%

Meses

847260483624120

Sobrevida

1.0

0.0

Alto Risco

Risco Básico

P=0,0217

SLD 5 anos = 100%

SLD 5 anos = 55,5%

Meses

847260483624120

Sobrevida

1.0

0.0

Alto Risco

Risco Básico

Meses

847260483624120

Sobrevida

1.0

0.0

Alto Risco

Risco Básico

P=0,0217

SLD 5 anos = 100%

SLD 5 anos = 55,5%

Meses

847260483624120

Sobrevida

1.0

0.0

Não-fetal

Fetal

P=0,0745

SG 5 anos = 81,93%

SG 5 anos = 33,33%

Meses

847260483624120

Sobrevida

1.0

0.0

Não-fetal

Fetal

P=0,0745

SG 5 anos = 81,93%

SG 5 anos = 33,33%

Meses

847260483624120

Sobrevida

1.0

0.0

puro

misto

P=0,8151

SG 5 anos = 76,92%

SG 5 anos = 71,43%

Meses

847260483624120

Sobrevida

1.0

0.0

puro

misto

P=0,8151

SG 5 anos = 76,92%

SG 5 anos = 71,43%

Meses

847260483624120

Sobrevida

1.0

0.0

maior que 2 anos

menor que 2 anos

P=0,0516

SG 5 anos = 100%

SG 5 anos = 61,64%

Meses

847260483624120

Sobrevida

1.0

0.0

maior que 2 anos

menor que 2 anos

P=0,0516

SG 5 anos = 100%

SG 5 anos = 61,64%

Legenda: A) presença de metástase ao diagnóstico; B) estadiamento PRETEXT SIOPEL;

C) Estratificação por grupo de risco SIOPEL D) subtipo histológico (fetal ou não-fetal); E)

tipo histológico (puro ou misto) e F) idade ao diagnóstico (maior ou menor de 2 anos).

Figura 9 - Gráficos de comparações entre as taxas de sobrevida conforme

características clínicas.

4.2 EXTRAÇÃO DO DNA E TRATAMENTO COM BISSULFITO DE

SÓDIO

Obteve-se para as amostras tumorais entre 0,11µg e 103,15µg de

DNA com o método de extração utilizado (Quadro 4). Dos tecidos hepáticos

normais foram obtidas quantificações entre 5,78µg e 20,30µg de DNA

(Quadro 5). O grau de contaminação do material com proteína ou RNA foi

avaliado através da relação das absorbâncias a 260nm e 280nm e, como

pode ser observado no Quadro 4, a grande maioria das amostras

apresentou valores ao redor de 1,8, o que atesta a boa qualidade do DNA

obtido.

Cerca de 2µg de DNA foram tratados com bissulfito de sódio. Caso a

amostra não apresentasse amplificação para o gene ACTB pós-conversão

pelo bissulfito, repetia-se o tratamento com 8µg de DNA.

Algumas amostras tumorais (13T, 19T, 21T e 24T) foram eliminadas

do estudo ou porque não havia DNA suficiente para um novo tratamento

(13T – quantidade total de 0,32µg e 19T – quantidade total de 0,11µg) ou

porque mesmo após aumento da quantidade de DNA tratado não houve

amplificação do DNA (21T e 24T).

Quadro 4 - Concentração de DNA nas amostras tumorais e margens

estimada por espectrofotometria e resultado da PCR para ACTB após

tratamento com bissulfito.

Amostra Tipo Concent. 260nm 260/280

Amplificação do gene

ACTB

(µg) após bissulfito

1T Tumor 103.15 1.179 1.80

Sim

2T Tumor 81.65 0.933 1.69

Sim

3T Tumor 43.95 0.502 1.86

Sim

4T Tumor 43.05 0.492 1.85

Sim

5T Tumor 42.35 0.484 1.84

Sim

6T Tumor 43.60 0.498 1.88

Sim

7T Tumor 11.80 0.135 1.70

Sim

8T Tumor 31.35 0.358 1.87

Sim

9T Tumor 25.05 0.286 1.85

Sim

10T Tumor 4.65 0.053 1.82

Sim

11T Tumor 25.47 10.191 1.93

Sim

12T Tumor 4.00 1.6 1.92

Sim

13T Tumor 0.32 0.128 1.82

Não

14T Tumor 0.58 0.236 2.13

Sim

15T Tumor 1.77 0.712 1.87

Sim

16T 1 Tumor1 2.06 0.827 1.94

Sim

16T 2 Tumor2 1.39 0.557 1.87

Sim

17T Tumor 6.01 2.406 1.97

Sim

18T Tumor 1.63 0.653 1.99

Sim

19T Tumor 0.11 0.047

Não

20T Tumor 10.07 4.031 1.6

Sim

21T Tumor 34.05 13.623 1.81

Não

22T Tumor 12.02 4.811 1.83

Sim

23T Tumor 17.96 7.188 1.84

Sim

24T Tumor 1.36 0.544 1.97

Não

Legenda: Espectrofotometria com leitura de absorbância a 260 e 280nm.

Quadro 5 - Concentração de DNA nas amostras de tecido hepático normal

fetal (NF) e adulto e resultado da PCR para ACTB após tratamento com

bissulfito.

Amostra Tipo Concent. 260nm 260/280

Amplificação do gene

ACTB

(µg) após bissulfito

1NF Fetal

20.30

8,117 1,84 Sim

2NF Fetal

8.74

3,496 1,87 Sim

3NF Fetal

7.92

3,168 1,9 Sim

4NF Fetal

12.16

4,867 1,85 Sim

5NF Fetal

5.78

2,312 1,81 Sim

Legenda: Espectrofotometria com leitura de absorbância a 260 e 280nm.

4.3 RESULTADOS DA MSP-Q

4.3.1 Estudo Piloto

Devido a pouca quantidade de DNA obtida de algumas amostras, não

seria possível a realização da pesquisa de hipermetilação dos 25 genes

(AIM1, APC, CALCA, CCNA1, CCND2, CDH1, COX2 (PTGS2), DAPK,

ESR1, GSTP1, MGMT, MINT31, MLH1, P14 ARF, CDKN2B, CDKN2A,

RARB, RASSF1A, RB1, SOCS1, THBS1, TIMP3, MT1G, SFRP1,

HIN1(SCGB3A1)) para todas as amostras do estudo. Para contornar este

problema, foi realizado um estudo piloto em que o perfil de metilação destes

25 genes foi avaliado primeiramente em 10 amostras tumorais. Nesta

análise não foi encontrada metilação detectável para os genes THBS1, RB1,

CDKN2A, P14 ARF, MLH1, MINT31, MGMT, DAPK, CCNA1 e AIM1 nas

amostras avaliadas, enquanto que 7 genes (CALCA, ESR1, GSTP1,

CDKN2B, RARB, TIMP3, SFRP1), apresentaram um nível baixo de

metilação (10-30%). Foram escolhidos para prosseguir no estudo aqueles

genes que tivessem algum nível de metilação detectável em pelo menos

40% das amostras avaliadas, sendo selecionados 8 genes (APC, CCND2,

CDH1, COX2, HIN1, MT1G, RASSF1A e SOCS1) para a pesquisa nos

demais indivíduos (Figura 10).

0 20406080

COX2

MT1G

RASSF1A

SOCS1

APC

CDH1

CCND2

HIN1

RARB

SFRP1

TIMP3

ES R

CDKN2B

CALCA

GSTP1

AIM1

CCNA1

DAPK

MGMT

MINT31

MLH1

P14 (ARF)

CDKN2A

RB1

THBS1

Genes

Descartados

Genes

Selecionados

Porcentual de Amostras Metiladas

0 20406080

COX2

MT1G

RASSF1A

SOCS1

APC

CDH1

CCND2

HIN1

RARB

SFRP1

TIMP3

ES R

CDKN2B

CALCA

GSTP1

AIM1

CCNA1

DAPK

MGMT

MINT31

MLH1

P14 (ARF)

CDKN2A

RB1

THBS1

Genes

Descartados

Genes

Selecionados

Porcentual de Amostras Metiladas

Figura 10 - Gráfico de porcentual de amostras metiladas para cada um dos

25 genes avaliados no estudo-piloto.

4.3.2 Comparação entre o nível de metilação nos tecidos estudados

O perfil de metilação dos 8 genes selecionados no estudo piloto foi

avaliado no restante das amostras tumorais (10) e nas amostras de tecido

hepático normal fetal (5).

Os resultados desta análise juntamente com o estudo piloto

demonstraram que RASSF1A (80%), COX2 (55%), MT1G (55%) e SOCS1

(40%) são os genes mais frequentemente metilados nos hepatoblastomas,

enquato que APC (30%), CCND2 (30%), CDH1 (30%) e HIN1 (25%)

encontram-se moderadamente metilados nestes tumores (Quadro 6).

Também pode ser observado que 95% das amostras tumorais avaliadas

apresentaram pelo menos um destes oito genes metilados (Quadro 6).

A análise das amostras normais revelou que COX2 (100%), CCND2

(80%) e HIN1 (80%) também estão frequentemente melilados em tecido

hepático fetal, enquanto que CDH1 (20%) e MT1G (20%) apresentam uma

discreta metilação nestes tecidos. Por outro lado, não foi detectada

metilação dos genes APC, RASSF1A e SOCS1 nas amostras normais

avaliadas (Quadro 7).

Quadro 6 - Valores de PMR para as 20 amostras tumorais.

Amostra /

Genes

APC CCND2 CDH1 COX2 HIN1 MT1G RASSF1A SOCS

% Genes

Metilados

Amostra

1T 0.00% 2.50% 15.50% 100.80% 13.60% 0.00% 29.80% 1.80% 75.00%

2T 3.90% 56.30% 10.50% 48.40% 0.00% 24.50% 0.00% 39.50% 75.00%

3T 0.00% 0.00% 0.00% 4.60% 4.90% 4.30% 91.50% 0.00% 50.00%

4T 28.60% 3.70% 3.80% 38.50% 8.20% 5.60% 0.40% 12.90% 100.00%

5T 0.00% 0.00% 0.00% 0.00% 0.00% 8.00% 0.00% 0.00% 12.5%

6T 0.00% 1.09% 4.69% 67.43% 0.00% 14.12% 101.63% 59.53% 25.00%

7T 0.00% 0.00% 2.50% 0.00% 0.00% 0.00% 0.00% 56.40% 25.00%

8T 34.60% 0.00% 0.00% 0.00% 0.00% 0.00% 89.90% 0.00% 25.00%

9T 22.20% 0.00% 0.00% 0.00% 0.00% 1.90% 0.50% 5.00% 50.00%

10T 0.00% 0.00% 0.00% 7.00% 0.00% 0.00% 6.60% 0.00% 25.00%

11T 0.00% 0.00% 0.00% 6.40% 0.00% 0.00% 102.00% 61.00% 37.50%

12T 0.00% 0.00% 0.00% 0.00% 0.00% 0.00% 30.80% 0.00% 12.50%

14T 0.00% 0.00% 0.00% 0.00% 0.00% 0.00% 0.00% 0.00% 0.00%

15T 54.30% 0.00% 2.50% 33.90% 1.40% 0.00% 94.00% 74.20% 87.50%

16T 0.40% 1.00% 0.00% 22.30% 27.80% 1.80% 3.70% 0.00% 75.00%

17T 0.00% 0.80% 0.00% 5.30% 0.00% 2.40% 30.70% 0.00% 50.00%

18T 0.00% 0.00% 0.00% 0.00% 0.00% 0.00% 61.40% 0.00% 12.50%

20T 0.00% 0.00% 0.00% 0.00% 0.00% 140.00% 38.10% 0.00% 25.00%

22T 0.00% 0.00% 0.00% 8.40% 0.00% 0.00% 79.20% 0.00% 25.00%

23T 0.00% 0.00% 0.00% 0.00% 0.00% 18.80% 39.00% 0.00% 25.00%

% de amostras

metiladas

30% 30% 30% 55% 25% 55% 80% 40%

* Sombreados aqueles genes que apresentaram algum nível de metilação na amostra

Quadro 7 - Valores de PMR para as amostras de fígado normal fetal.

Amostra /

Gene

APC

CCND2

CDH1

COX2

HIN1

MT1G

RASSF1A

SOCS

% Genes

Metilados

Amostra

1NF 0.00% 0.02% 0.00% 2.17% 0.00% 0.00% 0.00% 0.00% 25%

2NF 0.00% 0.05% 0.00% 1.51% 3.21% 0.00% 0.00% 0.00% 38%

3NF 0.00% 0.15% 0.01% 1.71% 6.53% 0.04% 0.00% 0.00% 63%

4NF 0.00% 0.01% 0.00% 1.04% 0.43% 0.00% 0.00% 0.00% 38%

5NF 0.00% 0.00% 0.00% 1.47% 2.05% 0.00% 0.00% 0.00% 25%

% de

Amostras

Metiladas

0% 80% 20% 100% 80% 20% 0% 0%

* Sombreados aqueles genes que apresentaram algum nível de metilação na amostra

Embora tenham sido considerados positivos, o nível de metilação dos

genes CDH1 e MT1G detectado em algumas das amostras de fígado normal

foi extremamente baixo (<0,05%) e, devido a alta sensibilidade do método

de quantificação utilizado, estes valores podem representar apenas leituras

de fundo (background), por isso, há estudos que defendem o

estabelecimento de linhas de corte como forma de descartar estes níveis

muito baixos de metilação, pois eles podem não representar efeitos

biológicos. Por outro lado, os genes CCND2, COX2 e HIN1 apresentaram

níveis indiscutíveis de metilação nas amostras normais (Figura 11)

Legenda: Gráficos (escala logarítmica), ilustrando a diferença entre os níveis de metilação

no fígado fetal normal e nos hepatoblastomas para os 8 genes estudados (APC, CCND2,

CDH1, COX2, HIN1, MT1G, RASSF1A e SOCS1).

Figura 11 - Gráficos de dispersão com valores de PMR.

4.4 ASSOCIAÇÃO ENTRE CARACTERÍSTICAS CLÍNICO-

PATOLÓGICAS E HIPERMETILAÇÃO

O passo seguinte foi verificar se existia correlação entre o perfil de

metilação aberrante e características clínico-patológicas dos pacientes.

Nesta análise foram incluidos os genes que apresentaram hipermetilação

específica para as amostras tumorais, ou seja, nenhuma metilação nas

amostras normais (APC, RASSF1A e SOCS1). O gene MT1G também

prosseguiu no estudo porque, apesar de estar metilado em uma baixa

porcentagem de amostras normais (20%), apresentou uma elevada

freqüência de metilação nas amostras tumorais (55%) e, além disso, a única

amostra normal positiva apresentou baixíssimo nível de metilação (0,04%).

Os genes CCND2, COX2 e HIN1 não foram submetidos à essa análise

porque apresentaram alta freqüência de metilação nas amostras de fígado

fetal normal. O gene CDH1 foi eliminado desta análise porque apresentou

um nivel de metilação baixo e semelhante tanto nas amostras de

hepatoblastoma (30%) quanto nas amostras normais (20%)

A comparação pelo teste de log-rank das sobrevidas globais mostrou

que aqueles pacientes que apresentam metilação no tumor (independente

do valor de PMR) para o gene MT1G apresentaram pior sobrevida quando

comparados aos que não tinham a alteração (SG 5 anos = 60% X 90%,

respectivamente; p=0,0431) (Figura 12-A). De forma mais contundente, a

análise univariada de sobrevida pelo modelo de regressão de Cox (Tabela 6)

mostrou que quanto maior o valor de PMR (variável contínua) para o gene

MT1G, menor a sobrevida global dos pacientes (p=0,033).

Para os genes RASSF1A, SOCS1 e APC não foi encontrada

diferença estatisticamente significativa entre as sobrevidas (Figuras 12-B-D,

respectivamente).

Meses

847260483624120

Sobrevida

1.0

0.0

Metilado (n=10)

Não-metilado (n=10)

P=0,0431

SG 5 anos = 90%

SG 5 anos = 60%

MT1G

Meses

847260483624120

Sobrevida

1.0

0.0

Metilado (n=10)

Não-metilado (n=10)

P=0,0431

SG 5 anos = 90%

SG 5 anos = 60%

MT1G

Meses

847260483624120

Sobrevida

1.0

0.0

Metilado (n=16)

Não-metilado (n=4)

RASSF1A

P=0,9151

SG 5 anos = 74,48%

SG 5 anos = 75%

Meses

847260483624120

Sobrevida

1.0

0.0

Metilado (n=16)

Não-metilado (n=4)

RASSF1A

P=0,9151

SG 5 anos = 74,48%

SG 5 anos = 75%

Meses

847260483624120

Sobrevida

1.0

0.0

Metilado (n=8)

Não-metilado (n=12)

SOCS1

P=0,158

SG 5 anos = 87,5%

SG 5 anos = 66,7%

Meses

847260483624120

Sobrevida

1.0

0.0

Metilado (n=8)

Não-metilado (n=12)

SOCS1

P=0,158

SG 5 anos = 87,5%

SG 5 anos = 66,7%

Meses

847260483624120

Sobrevida

1.0

0.0

APC

Metilado (n=6)

Não-metilado (n=14)

P=0,83

SG 5 anos = 78,6%

SG 5 anos = 62.5%

Meses

847260483624120

Sobrevida

1.0

0.0

APC

Metilado (n=6)

Não-metilado (n=14)

P=0,83

Meses

847260483624120

Sobrevida

1.0

0.0

APC

Metilado (n=6)

Não-metilado (n=14)

P=0,83

SG 5 anos = 78,6%

SG 5 anos = 62.5%

Legenda: Comparação entre aqueles pacientes que apresentam metilação detectável para

os genes MT1G, RASSF1A, SOCS1 e APC e pacientes que não apresentam metilação.

Figura 12 – Gráfico de sobrevidas globais nos grupos de pacientes que

apresentam metilação detectável.

Tabela 6 - Comparação entre nível de metilação nos genes estudados e

sobrevida global pelo modelo de Cox.

Gene

Significância (p-valor)*

APC 1,654 0,476

MT1G 2,196 0,033

RASSF1A 0,007 0,995

SOCS1 -5,222 0,271

*Análise univariada pelo modelo de regressão de Cox

Não foi possível detectar associação significativa entre o estado de

hipermetilação dos quatro genes-alvos avaliados e características clínicas

como: idade, presença de metástases ao diagnóstico, estadiamento SIOPEL

ou subtipo histológico (Tabelas 7, 8, 9 e 10).

Tabela 7 - Associação entre o estado de metilação do gene MT1G e

variáveis clínicas estudadas.

MT1G

Característica

Não-metilado Metilado

Significância

(p-valor)*

Idade

Menor que 2 anos 7 (53,8%) 6 (46,2%)

Maior ou igual a 2 anos 3 (42,9%) 4 (57,1%)

0,5

Metástase ao diagnóstico

Não 7 (50,0%) 7 (50,0%)

Sim 3 (50,0%) 3 (50,0%)

0,68

PRETEXT SIOPEL

I e II 1 (33,3%) 2 (66,7%)

III e IV 9 (52,9%) 8 (47,1%)

0,5

Presença de Mesênquima

Sim (Misto) 8 (61,5%) 5 (38,5%) 0,175

Não (Puro) 2 (28,6%) 5 (71,4%)

* Calculado pelo teste exato de Fisher

Tabela 8 - Associação entre o estado de metilação do gene RASSF1A e

variáveis clínicas estudadas.

RASSF1A

Característica

Não-metilado Metilado

Significância

(p-valor)*

Idade

Menor que 2 anos 2 (15,4%) 11 (84,6%)

Maior ou igual a 2 anos 2 (28,6%) 5 (71,4%)

0,439

Metástase ao diagnóstico

Não 3 (21,4%) 11 (78,6%)

Sim 1 (16,7%) 5 (83,3%)

0,657

PRETEXT SIOPEL

I e II 1 (33,3%) 2 (66,7%)

III e IV 3 (17,6%) 14 (82,4%)

0,509

Presença de Mesênquima

Sim (Misto) 3 (23,1%) 10 (76,9%)

Não (Puro) 1 (14,3%) 6 (85,7%)

0,561

* Calculado pelo teste exato de Fisher

Tabela 9 – Associação entre o estado de metilação do gene SOCS1 e

variáveis clínicas estudadas.

SOCS1

Característica

Não-metilado Metilado

Significância

(p-valor)*

Idade

Menor que 2 anos 9 (69,2%) 4 (30,8%)

Maior ou igual a 2 anos 3 (42,9%) 4 (57,1%)

0,251

Metástase ao diagnóstico

Não 7 (50%) 7 (50%)

Sim 5 (83,3%) 1 (16,7%)

0,187

PRETEXT SIOPEL

I e II 0 3 (100%)

III e IV 12 (70,6%) 5 (23,4%)

Presença de Mesênquima

Sim (Misto) 11 (84,6%) 2 (15,4%)

Não (Puro) 1 (14,3%) 6 (85,7%)

0,004

* Calculado pelo teste exato de Fisher

** Incalculável

Tabela 10 - Associação entre o estado de metilação do gene APC e

variáveis clínicas estudadas.

APC

Característica

Não-metilado Metilado

Significância

(p-valor)*

Idade

Menor que 2 anos 9 (69,2%) 4 (30,8%)

Maior ou igual a 2 anos 5 (71,4%) 2 (28,6%)

0,664

Metástase ao diagnóstico

Não 10 (71,4%) 4 (28,6%)

Sim 4 (66,7%) 2 (33,3%)

0,613

PRETEXT SIOPEL

I e II 2 (66,7%) 1 (33,3%)

III e IV

12 (70,6%) 5 (29,4%)

0,681

Presença de Mesênquima

Sim (Misto) 10 (76,9%) 3 (23,1%)

Não (Puro) 4 (57,1%) 3 (42,9%)

0,336

* Calculado pelo teste exato de Fisher

5 DISCUSSÃO

Uma das grandes dificuldades de se realizar estudos envolvendo

hepatoblastoma consiste na raridade desse tumor. No estudo clínico

multicêntrico e internacional SIOPEL 2 que contou com a contribuição de 72

centros de 19 países conseguiram-se agrupar apenas 150 pacientes

portadores da doença no período de 3 anos (PERILONGO et al. 2004),

número irrisório se comparado aos 2.169 pacientes alocados em 5 anos no

estudo BFM 95 de leucemia linfóide aguda, a neoplasia mais freqüente em

crianças (SCHRAPPE et al. 2000). Mesmo diante da baixa freqüência global,

a casuística de pacientes portadores de hepatoblastoma incluída neste

estudo (casos confirmados e tratados no Hospital do Câncer A. C. Camargo

em um período de cerca de 20 anos) foi de 35 indivíduos, o que certamente

constitui um número expressivo, tendo em vista se tratar de uma única

instituição.

Para o principal objetivo do estudo, entretanto, não bastava apenas a

obtenção dos dados clínicos desses pacientes, mas essencialmente a

existência de peças cirúrgicas com tecido tumoral passível de extração de

DNA em quantidade e qualidade suficientes para a análise de presença de

hipermetilação. Assim, o número de pacientes analisados passou de 35 para

20, pois 5 casos não possuíam material parafinado para pesquisa, em 6

casos todo o conteúdo armazenado era constituído apenas por necrose e de

4 casos não foi possível obter DNA com boa qualidade após o tratamento

com bisulfito de sódio. Os casos completamente necrosados poderiam

representar o subgrupo com melhor resposta à quimioterapia e a sua não

inclusão no estudo poderia levar a um viés na correlação entre os dados

clínicos e moleculares. Entretanto, as análises realisadas demonstraram não

haver diferença estatisticamente significativa entre o grupo total de casos

(35) e os submetidos a análise molecular (20) quanto às características

clínicas analisadas ou quanto ao prognóstico. Também cabe ressaltar que

devido a raridade desta neoplasia uma casuística de 20 casos é um grupo

de tamanho expressivo o que justificou a realização do estudo.

Por se tratar de um estudo retrospectivo, era essencial que os

prontuários possuíssem a maior quantidade de dados relevantes para

melhor caracterização clínica dos pacientes. Observou-se, no entanto, que

muitos dados, principalmente aqueles referentes às medidas tumorais por

exames de imagem, só passaram a ser descritos sistematicamente em

prontuário mais recentemente. Além disso, quando descritas as medidas,

notou-se que a obtenção das mesmas não era feita da mesma forma, o que,

portanto, poderia prejudicar a comparação entre os indivíduos. Optou-se,

portanto, por desconsiderar este dado. Por outro lado, a descrição dos

segmentos hepáticos acometidos foi obtida em todos os pacientes.

Notou-se também que o formato dos laudos anátomo-patológicos foi

muito modificado com o passar do tempo, com isso prejudicando a obtenção

dos dados sobre comprometimento linfonodal e de margens cirúrgicas

microscópicas.

Uma forma indireta de verificar se nossa pequena amostra (20 casos)

não era enviesada o suficiente para não permitir a detecção de diferenças

estatísticas confiáveis foi verificar se as características clínico-

epidemiológicas de nossa população se assemelhavam àquelas descritas

por outros grupos de pesquisa. Além disto, verificamos se os fatores

prognósticos clássicos da doença se mantinham estatisticamente relevantes

em nossa população estudada.

No estudo cooperativo alemão de tumores hepáticos HB-94, que

reuniu 69 crianças com hepatoblastoma em um período de 5 anos, a

mediana de idade ao diagnóstico foi de 16 meses e relação

masculino:feminino foi de 2,5:1,0. A distribuição dos estádios de acordo com

o sistema de estadiamento pós-cirúrgico foi: 39% estádio I, 5% estádio II,

36% estádio III e 29% estádio IV. Nesse estudo, os fatores que

estatisticamente foram associados a um pior prognóstico foram: volume

tumoral maior que 1000cm

, multifocalidade do tumor, invasão de grandes

vasos pelo tumor, presença de metástases à distância e níveis de alfa-

fetoproteína menores que 100ng/mL ao diagnóstico. A sobrevida livre de

doença conforme os estádios ficou assim distribuída: 96% estádio I, 100%

estádio II, 76% estádio III e 36% estádio IV (FUCHS et al. 2002). Em nosso

estudo, também encontramos uma freqüência maior de acometimento do

gênero masculino (relação masc : fem = 1,85:1,0). Apesar de não termos

obtido dados precisos sobre volume tumoral e invasão vascular tumoral,

observamos que a presença de metástases à distância foi um forte preditor

de pior prognóstico em nossos pacientes. Além disso, os únicos dois

pacientes que apresentavam níveis menores que 100ng/mL de alfa-

fetoproteína ao diagnóstico faleceram devido à doença. Evidentemente,

diferenças de sobrevidas entre pacientes com níveis baixos e altos de alfa-

fetoproteína não poderiam ser detectadas estatisticamente devido ao

reduzido número de indivíduos no primeiro grupo.

PERILONGO et al. (2000b) relataram no estudo SIOPEL1 a presença

de metástases pulmonares ao diagnóstico em 20% dos pacientes. Nestes, a

SLE em 5 anos foi de 28%, sendo significativamente pior do que a SLE dos

hepatoblastomas localizados (77% em 5 anos).

Em nossa casuística, 30% das crianças apresentavam metástases à

distância e, além disso, foi verificada diferença estatisticamente significativa

entre as sobrevidas globais dos pacientes metastáticos quando comparados

àqueles com doença localizada (33,3% X 92,86%, respectivamente).

O estudo SIOPEL 2, que estratificou os pacientes com

hepatoblastoma em risco básico (tumor confinado ao fígado com até 3

setores hepáticos acometidos) e alto risco (tumor acometendo os 4 setores

hepáticos e/ou metástases ou disseminação abdominal extra-hepática),

obteve uma SLD em 3 anos de 89% e 47% para os dois grupos,

respectivamente. Quando considerado apenas o estadiamento pré-cirúrgico

PRETEXT as taxas de sobrevida global em 3 anos para pacientes I, II, III e

IV foram, respectivamente, 100%, 95%, 84% e 61% (SCHRAPPE et al.

2000). Apesar de não ter sido encontrada diferença estatisticamente

significativa entre as sobrevidas globais dos nossos pacientes quando

considerado apenas o PRETEXT, verificamos que as mesmas se

assemelham àquelas obtidas pelo SIOPEL (100%, 77,8%, 62,5% para

PRETEXT II, III e IV, respectivamente). Além disso, quando estratificados

por risco, conforme critérios do SIOPEL, os pacientes classificados como

alto risco apresentaram menor sobrevida livre de doença em 5 anos se

comparados ao risco básico (55,5% X 100%, respectivamente; p=0.0217).

A ausência de pacientes PRETEXT I em nossa amostra de 20

indivíduos segue, em parte, a distribuição observada no SIOPEL 2, no qual

apenas 6 crianças de 135 (4,4%) foram classificadas nesse estádio

(PERILONGO et al. 2004). De fato, a detecção do hepatoblastoma em fase

inicial é um fato raro, mesmo em países ricos.

Tendo em vista a similaridade de nossos dados com as

características clínico-epidemiológicas de outros estudos publicados em

literatura, bem como a observação de que alguns dos fatores prognósticos

clássicos também se evidenciaram em nossa população, consideramos

possível que eventuais achados estatisticamente significativos identificados

pudessem ser confiáveis, apesar do pequeno tamanho da casuística

analisada.

Além da pequena casuística das pesquisas moleculares que

envolvem hepatoblastoma, observamos que os estudos descritos na

literatura referentes a análise de hipermetilação se limitam a examinar

poucos genes. Em nosso estudo, foi avaliado o perfil de hipermetilação do

DNA de 25 genes, o que constitui o maior número de genes pesquisados

em hepatoblastoma até o presente momento.

Além disto, os outros estudos que analisaram o perfil de metilação

dos hepatoblastoma utilizaram a técnica de MSP convencional. O nosso

estudo, pela primeira vez, utiliza um método quantitativo (MSP-Q) na análise

de metilação em hepatoblastoma, sendo este método capaz de detectar uma

cópia do gene metilado em meio a 10.000 cópias não-metiladas. A técnica

fornece, ainda, dados quantitativos à respeito do porcentual de metilação

presente em cada amostra, além de ser bastante automatizado, permitindo a

análise de várias amostras ao mesmo tempo, com pouca manipulação do

material após amplificação, o que reduz a possibilidade de erros. Além disso,

observa-se uma redução da subjetividade na análise dos resultados da

MSP-Q quando comparada a MSP convencional, uma vez que apenas

aquelas curvas de amplificação que cruzam o threshold são consideradas

positivas (EADS et al. 2000; TRINH et al. 2001; OGINO et al. 2006).

Uma vez que os tumores disponíveis para esta pesquisa eram

provenientes de tecidos fixados em formaldeído e parafinados, foi

necessária uma adequação de todo o método de análise para obtenção de

resultados satisfatórios. Sabe-se que, devido ao processo de fixação com

formaldeído, ocorrem ligações cruzadas entre as bases nitrogenadas dos

ácidos nucléicos, o que ocasiona fragmentação dos mesmos (WU et al.

2002). LEHMANN e KREIPE (2001) observaram que, utilizando fixação do

tecido com formaldeído tamponado com fosfato, o comprimento dos

fragmentos de DNA recuperados após extração variava entre 300-400bp.

Soma-se a isso a considerável degradação do DNA que ocorre durante a

exposição ao bissulfito de sódio, pois RAIZIS et al. (1995) demonstraram

que essa fragmentação ocorre em conseqüência da depurinação do DNA

durante o tratamento com bissulfito e que a mesma era dependente do

tempo de exposição e da concentração de bissulfito de sódio utilizada.

Tendo em vista que os fragmentos de DNA a serem amplificados durante a

reação de MSP-Q são pequenos (80-200bp), consegue-se contornar, em

parte, o problema da degradação do DNA proveniente de tecido parafinado.

Entretanto, em nossa investigação, é provável que a degradação do DNA

decorrente do processo de fixação e da exposição ao bissulfito de sódio

tenha sido o motivo pelo qual não se conseguiu amplificação (após

tratamento com bissulfito) de 4 amostras (16,6%) dos 24 pacientes

portadores de hepatoblastoma que tinham material disponível no arquivo do

Departamento de Patologia do Hospital A. C. Camargo.

Além disso, a fixação com formaldeído também parece induzir a

formação de ligações cruzadas entre a porção N-terminal das bases

nitrogenadas e as histonas, tornando a nucleoproteína resultante resistente

à digestão pela proteinase K (WU et al. 2002). A manutenção de estruturas

secundárias e terciárias do DNA durante o tratamento com bissulfito de

sódio pode dificultar a conversão das citosinas não metiladas em uracilas,

uma vez que apenas o DNA desnaturado está sujeito à sulfonação

(KITAZAWA et al. 2000; TRINH et al. 2001). Alguns métodos para contornar

este problema são descritos na literatura, tais como:, utilização de gel

desnaturante de agarose durante o tratamento, uso de uréia como agente

desnaturante, aquecimento do DNA acima de 95

C antes da exposição ao

bissulfito e aumento do tempo de incubação da reação de desnaturação do

DNA (OAKELEY 1999; TAN e DOBROVIC 2001). Os dois últimos foram

empregados no nosso estudo, sendo que o aumento do tempo de incubação

mostrou resultados mais satisfátórios.

KOSHIBA et al. (1993) demonstraram que existe maior degradação

do DNA quando o processo de fixação da peça cirúrgica era realizado em

pH baixo e temperatura ambiente. Ao contrário, quando a fixação era

realizada com formaldeído tamponado e à temperatura de 4

C, observava-

se maior preservação de DNA. A partir de 1997, o Hospital A. C. Camargo

passou a utilizar formaldeído tamponado com fosfato no emblocamento das

amostras tumorais. Este fato se reflete no porcentual de amostras

descartadas devido a baixa qualidade do DNA, sendo 40% (2 de 5) das

amostras coletadas antes de 1997 não puderam ser utilizadas. Por outro

lado, apenas 10% (2 de 19) das amostras oriundas de período posterior a

1997 foram rejeitadas.

Tendo em vista que cerca de 60% dos genes conhecidos possuem

ilhas de CpG em suas regiões promotoras (ANTEQUERA e BIRD 1993) e,

portanto, estão teoricamente sujeitos a hipermetilação em estados

patológicos, foram elaborados alguns critérios de seleção para os genes a

serem estudados.

Assim, genes que já tiveram seu perfil de metilação avaliado em

hepatoblastoma e já mostraram possuir alta frequência de metilação

(RASSF1A, CDKN2A e SOCS1), serviram como uma espécie de “controle

positivo” do nosso estudo, uma vez que esperávamos encontrar pelo menos

algumas amostras com metilação aberrante para esses genes.

Também foram pesquisados genes já avaliados em hepatoblastoma e

que demonstraram baixa frequência de metilação (RARB, GSTP1, MGMT,

APC, DAPK, CDH1), que serviriam de parâmetro “negativo” para nosso

estudo.

Genes descritos como frequentemente metilados em outros tumores,

mas que ainda não haviam sido avaliados em hepatoblastoma (AIM1,

CALCA, CCNA1, CCND2, COX2 (PTGS2), ESR1, MINT31, MLH1, P14 ARF,

CDKN2B, RB1, THBS1, TIMP3, MT1G, SFRP1, HIN1) também foram

incluídos no estudo, partindo-se do pressuposto que a metilação aberrante

pode estar envolvida na carcinogênese.

Por último, procurou-se determinar, através de estudos de expressão

em larga escala publicados na literatura, genes que se mostraram

hipoexpressos em hepatoblastomas, que possuíam ilhas de CpG em sua

região promotora e que nunca tiveram sua frequência de metilação estudada

neste tumor. Neste caso, apenas MT1G preencheu esses critérios.

Uma vez que o hepatoblastoma consiste em um tumor embrionário,

achamos mais conveniente que o seu perfil de metilação fosse comparado

àquele presente em um fígado fetal, que ainda deve manter parte das

caracteristicas embrionárias, e que foi pouco exposto aos efeitos de

potenciais carcinógenos. LEHMANN et al. (2005) compararam o perfil de

metilação de 9 genes-alvos (RASSF1A, CCND2, INK4A, DAPK, APC, RIZ-1,

HIN-1, GSTP-1 e SOCS-1) entre carcinomas hepatocelulares, margens

normais, lesões hepáticas benignas e fígado normal maduro.

Esse estudo

revelou a presença de metilação detectável em 57% dos fígados adultos não

neoplásicos pesquisados. Ao contrário, os autores não observaram

metilação detectável nos 9 genes estudados em 3 amostras de fígado

normal não neoplásico de crianças menores de 4 anos. Em parte esse dado

é concordante com os nossos, uma vez que não detectamos metilação nos

fígados fetais normais para os genes APC, CDH1, MT1G, RASSF1A e

SOCS1. Os genes HIN1 e CCND2, no entanto, mostraram-se metilados em

4 de 5 amostras de fígado fetal normal investigadas em nosso estudo.

Assim, concluímos que a comparação que melhor deve refletir o perfil de

metilação patológico deva ser feita entre hepatoblastoma e fígado fetal e não

amostras de fígado de adultos.

A presença de hipermetilação em 7 (RASSF1A, SOCS1, CDKN2A,

RARB, APC, CDH1 e GSTP1) dos 25 genes estudados já havia sido

avaliada em hepatoblastomas (HARADA et al. 2002; SUGAWARA et al.

2007). HARADA et al. (2002), estudaram o perfil de metilação da região

promotora de 9 genes (RASSF1A, RARB, GSTP1, p16INK4A, MGMT, APC,

DAPK, CDH1 e CDH13) em 175 tumores pediátricos dos quais 27 eram

hepatoblastoma, através de MSP convencional. Nesse estudo os autores

encontraram uma freqüência de hipermetilação de 19% para RASSF1A, de,

4% para RARB e 4% para GSTP1. Os autores não identificaram

hipermetilação para os outros 6 genes estudados. Estes números são

diferentes do encontrado em nosso estudo (80 % RASSF1A, 30% RARB,

30% APC e 10% GSTP1). O artigo publicado, entretanto, não descreve

quais dinucleotídeos CG supostamente metilados foram analisados e,

portanto, não podemos afirmar, com certeza, se o estudo pode ser

comparado ao nosso. Outro motivo pelo qual a frequência de hipermetilação

encontrada em nosso trabalho foi maior que a do estudo em questão é o fato

de termos utilizado MSP-Q, que é uma técnica mais sensível do que a MSP

convencional, método utilizado pelo primeiro autor.

O gene mais frequentemente hipermetilado em nossas análises foi o

RASSF1A, localizado no locus 3p21.3, que codifica uma proteína

semelhante a uma proteína efetora de RAS em camundongos (Nore1). O

produto deste gene parece interagir com a proteína de reparo XPA e

também inibir o acúmulo de ciclina D1, induzindo, dessa forma, a parada do

ciclo celular. Existem evidências de que a perda ou expressão alterada

desse gene esteja associada à patogênese do câncer de pulmão e mama

(SHIVAKUMAR et al. 2002; WONG et al. 2004; TOMMASI et al. 2005).

SUGAWARA et al. (2007), utilizando MSP convencional e

sequenciamento de DNA tratado com bissulfito, verificaram a presença de

hipermetilação na região promotora de RASSF1A em 38,5% dos 39 casos

de hepatoblastoma avaliados. Essa freqüência é, evidentemente, menor que

a encontrada em nossa pesquisa (80%), porém pode resultar tanto da maior

sensibilidade do método aplicado em nosso estudo, quanto apenas de

diferenças populacionais ou amostrais. No entanto, uma diferença relevante

entre as duas amostras é que o estudo de SUGAWARA et al. (2007) utilizou

apenas amostras pré-quimioterapia, enquanto as nossas foram todas

coletadas após neoadjuvância. Assim, pode-se questionar se a exposição ao

quimioterápico não teria alguma relação com essa diferença. De fato, estudo

de KOUL et al. (2004), revelou uma freqüência aumentada de hipermetilação

de RASSF1A em tumores de células germinativas resistentes à cisplatina

quando comparados aos sensíveis (KOUL et al. 2004).

É possível, portanto,

que em nossas amostras tenha ocorrido uma forma de seleção natural

durante a exposição à cisplatina, gerando uma maior representatividade de

clones resistentes à quimioterapia e, na hipótese de esta associação

realmente existir, uma maior freqüência de hipermetilação em RASSF1A.

Neste caso a hipermetilação de RASSF1A poderia ser útil como um

marcador de resistência ao tratamento com cisplatina.

A responsividade a drogas derivadas de platina incentivou a utilização

de esquemas de tratamento contendo quimioterapia neoadjuvante para

todos os casos de hepatoblastoma, independente da condição de

ressecabilidade tumoral no momento do diagnóstico. Uma das grandes

críticas a essa conduta é a possibilidade de se retardar o tratamento

definitivo curativo de um hepatoblastoma inicialmente ressecável com a

utilização de quimioterápicos para um tumor que pode ser quimiorresistente

(MUELLER et al. 2006). A identificação de genes relacionados à resistência

quimioterápica pode propiciar a descoberta de novas drogas

antineoplásicas, seguindo o princípio da terapia-alvo.

A aplicação dos conhecimentos relativos à metilação, neste sentido,

pode ser verificada nos estudos recentes de eficácia de inibidores da DNA

metiltransferase em uma série de neoplasias como revisados por LYKO e

BROWN (2005). De fato, desde a década de 90 se utilizava o agente 5-aza-

desoxicitidina, em altas doses, como agente citotóxico para o tratamento de

neoplasias. A partir de 2000, com o conhecimento de sua ação desmetilante,

o agente passou a ser utilizado em baixas doses no tratamento de

neoplasias hematológicas, com resultados promissores (MIYAMOTO E

USHIJIMA 2005). Assim, uma eventual relação causal entre metilação do

DNA e carcinogênese do hepatoblastoma poderia justificar a utilização de

tais agentes inibidores também nesse tipo de tumor.

Além disso, SUGAWARA et al. (2007) observaram também que os

pacientes que apresentavam RASSF1A metilado evoluíam com piores taxas

de sobrevida global em 6 anos quando comparados aos não-metilados (SG

6 anos = 40% X 95,8%, respectivamente; p<0,001). Em nosso estudo não

observamos diferença entre as taxas de sobrevida globais dos pacientes

quando comparados os estados de metilação de RASSF1A (SG 5 anos 75%

metilado X 74,45% não metilado; p=0,915). No entanto, como apenas 4

pacientes não apresentavam hipermetilação para este gene, a ausência de

diferença pode ter sido devido apenas à escassez de indivíduos neste grupo.

O gene APC constitui um supressor de tumor, localizado no

cromossomo 5q21 e codifica a proteína apc, envolvida na degradação de

CTNNB1 (que codifica a beta-catenina), participando da via de sinalização

Wnt. Defeitos deste gene estão relacionados com a gênese da Polipose

Adenomatosa Familial (FAP), sídrome de Gardner e síndrome de Turcot

(FOULKES 1995). Na maioria das vezes as mutações do gene APC levam à

produção de uma proteína truncada não fucional. Além disso, a inativação

de ambos os alelos deste gene parece ser necessária para o

desenvolvimento de adenomas e carcinomas na FAP (GALIATSATOS e

FOULKES 2006). Como mencionado anteriormente, pacientes portadores de

FAP possuem risco elevado de desenvolvimento de hepatoblastoma nos

primeiros 4 anos de vida (HERZOG et al. 2000). Além disso, em tumores

esporádicos, como o carcinoma hepatocelular, já foi demonstrada

hipermetilação da região promotora deste gene, bem como o seu

silenciamento (CSEPREGI et al. 2008). Dessa forma, é plausível imaginar

que a inativação de APC através da hipermetilação de sua região promotora

possa ser um mecanismo relacionado também à gênese do hepatoblastoma.

De fato, em nosso estudo encontramos 30% de metilação aberrante em

APC, sendo que nenhuma das amostras de fígado normal apresentou

alteração detectável.

O gene SOCS1, localizado no locus 16p13.13, codifica uma proteína

ligante de JAK que faz parte de um sistema de feedback negativo e tem

como função regular a transdução de sinal dependente de citocinas na via

JAK/STAT3. A ausência de SOCS1, portanto, poderia deixar livre a atividade

kinase de JAK, induzindo, em última instância, ao crescimento e proliferação

celular (NAGAI et al. 2003; WU et al. 2006). A associação entre

hipermetilação e silenciamento transcricional do gene SOCS1 já havia sido

descrita em hepatoblastomas por NAGAI et al. (2003). Nesse estudo, os

autores encontraram hipermetilação na região promotora de SOCS1 em 7 de

15 hepatoblastomas avaliados (46,6%). No entanto, este grupo avaliou a

presença de metilação em uma região diferente da avaliada em nosso

estudo, por isso as freqüências obtidas não podem ser comparadas. Além

disso, os autores não correlacionaram o achado de metilação deste gene

com características clínicas dos pacientes. Em nossa investigação

verificamos não haver associação entre a presença de metilação em SOCS1

e características prognósticas clássicas para o hepatoblastoma, entretanto

parece haver menor freqüência dessa alteração epigenética nos tumores

que apresentam componente mesenquimal (hepatoblastoma misto) quando

comparados aos subtipos puros. Apesar de não ser consensualmente aceita,

a presença de componente mesenquimal em hepatoblastomas após

quimioterapia neoadjuvante tem sido relacionada com maior resposta à

quimioterapia (SAXENA et al. 1993). Não existem relatos na literatura, até o

momento, de associações entre características clínicas de pacientes com

hepatoblastoma e presença de metilação em SOCS1. Entretanto, o fato de

esta alteração molecular estar presente em 40% dos tumores investigados e

em nenhuma amostra de fígado normal fetal, constitui indício de uma

possível associação entre este achado e o processo de carcinogênese do

hepatoblastoma. WU et al. (2006) investigaram a presença de metilação de

SOCS1 em pacientes com síndrome mielodisplásica, uma condição pré-

leucêmica. Foi verificado que a presença de metilação nesse gene estava

positivamente relacionada com mutações no gene NRAS e inversamente

associada com características cariotípicas de bom prognóstico. Além disso,

pacientes com metilação em SOCS1 possuíam um risco cumulativo maior de

transformação leucêmica, quando comparados aos seus pares.

Observamos em nosso estudo que não apenas a presença de

hipermetilação no gene MT1G estava relacionada a um pior prognóstico,

como também o nível dessa hipermetilação, ou seja, quanto maior o nível de

metilação pior o prognóstico. Este gene, localizado no locus 16q13, codifica

a proteína Metalotioneína 1G, que contém grande quantidade de resíduos

cisteína, e se liga a vários metais pesados. Aparentemente sua função

biológica está relacionada com a homeostase do zinco e cobre e com a

proteção contra toxicidade ao cádmio. JAHROUDI et al. (1990)

demonstraram que a atividade transcricional do gene aumenta com a

exposição a metais pesados e dexametasona. Nesse mesmo estudo os

autores demonstraram que a metilação do DNA se relaciona com o

silenciamento transcricional de MT1G em células de rim embrionário

(JAHROUDI et al. 1990). Além disso, HUANG et al. (2003) observaram

reexpressão de MT1G em linhagem celular K2 após tratamento com o

agente desmetilante 5-Aza e o inibidor de histona deacetilase Tricostatina

(HUANG et al. 2003). Mais recentemente, NAGATA et al. (2003)

compararam o padrão de expressão de hepatoblastomas com tecido

hepático normal não-tumoral através de experimentos de array de

oligonucleotídeos e, entre os genes que se mostraram hipoexpressos em

hepatoblastomas, encontrava-se o MT1G. HENRIQUE et al. (2005)

demonstraram que a hipermetilação de MT1G estava associada com

estádios mais avançados de câncer de próstata. Além disso, a metilação

para esse gene não foi encontrada em nenhuma das 13 amostras de

próstata normais investigadas, o que indica que essa alteração molecular

pode estar associada a estados patológicos.

Os nossos achados mostram que MT1G apresenta uma discreta

metilação em fígado fetal normal e que a taxa de sobrevida dos pacientes

com hepatoblastoma parece se correlacionar negativamente com os níveis

de hipermetilação deste gene. Estes fatos sugerem que este pode ser um

bom marcador tumoral de prognóstico em casos de hepatoblastoma.

Entretanto, a avaliação de um número maior de casos é necessária para

uma conclusão definitiva a respeito desta afirmativa.

7 CONCLUSÕES

1. Conseguimos avaliar o perfil de metilação de porcentual significativo

dos casos que tinham material disponível no arquivo do

Departamento de Patologia do Hospital A. C. Camargo (apenas 4 de

24 amostras não amplificaram após tratamento com bissulfito).

2. Através da técnica de MSP-Q foi determinada a freqüência de

hipermetilação da região promotora de 25 genes (AIM1, APC,

CALCA, CCNA1, CCND2, CDH1, COX2 (PTGS2), DAPK, ESR1,

GSTP1, MGMT, MINT31, MLH1, ARF, CDKN2B, CDKN2A, RARB,

RASSF1A, RB1, SOCS1, THBS1, TIMP3, MT1G, SFRP1,

HIN1(SCGB3A1)) em 20 amostras de hepatoblastoma e em 5

amostras de fígado normal fetal

3. Os genes mais frequentemente metilados nos tumores e com baixa

metilação nos tecidos normais foram RASSF1A (80%), o MT1G

(55%), o SOCS1 (40%) e o APC (30%).

4. Observamos associação estatisticamente significativa entre pior

sobrevida global e a presença de metilação no gene MT1G. Além

disso, através de análise por regressão de Cox, observamos que não

apenas a presença de metilação parece influenciar a sobrevida

desses pacientes, mas também que o nível de metilação de MT1G

pode ser importante, uma vez que quanto maior o nível de metilação,

menor a sobrevida estimada.

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Anna CH, Sills RC, Foley JF, Stockton PS, Ton TV, Devereux TR. Beta-

catenin mutations and protein accumulation in all hepatoblastomas examined

from B6C3F1 mice treated with anthraquinone or oxazepam. Cancer Res

2000; 60:2864-8.

Aronson DC, Schnater JM, Staalman CR, et al. Predictive value of the

pretreatment extent of disease system in hepatoblastoma: results from the

International Society of Pediatric Oncology Liver Tumor Study Group

SIOPEL-1 study. J Clin Oncol 2005; 23:1245-52.

Antequera F, Bird A. CpG islands as genomic footprints of promoters that

are associated with replication origins. Curr Biol 1999; 9:R661-7.

Attwood JT, Yung RL, Richardson BC. DNA methylation and the regulation of

gene transcription. Cell Mol Life Sci 2002; 59:241-57.

Bestor TH. The DNA methyltransferases of mammals. Hum Mol Genet

2000; 9:2395-402.

Csepregi A, Röcken C, Hoffmann J, et al. APC promoter methylation and

protein expression in hepatocellular carcinoma. J Cancer Res Clin Oncol

2008; 134:579-89.

Czauderna P, Otte JB, Aronson DC, et al. Guidelines for surgical treatment of

hepatoblastoma in the modern era--recommendations from the Childhood

Liver Tumour Strategy Group of the International Society of Paediatric

Oncology (SIOPEL). Eur J Cancer 2005; 41:1031-6.

DeBaun MR, Tucker MA. Risk of cancer during the first four years of life in

children from The Beckwith-Wiedemann Syndrome Registry. J Pediatr 1998;

132:398-400.

Eads CA, Danenberg KD, Kawakami K, et al. MethyLight: a high-throughput

assay to measure DNA methylation. Nucleic Acids Res 2000; 28:E32.

Eads CA, Laird PW. Combined bisulfite restriction analysis (COBRA).

Methods Mol Biol 2002; 200:71-85.

Egger G, Liang G, Aparicio A, Jones PA. Epigenetics in human disease and

prospects for epigenetic therapy. Nature 2004; 429:457-63.

Esteller M. Dormant hypermethylated tumour suppressor genes: questions

and answers. J Pathol 2005; 205:172-80.

Feusner JH, Krailo MD, Haas JE, Campbell JR, Lloyd DA, Ablin AR.

Treatment of pulmonary metastases of initial stage I hepatoblastoma in

childhood: Report from the Childrens Cancer Group. Cancer 1993; 71:859-

64.

Finegold MJ. Chemotherapy for suspected hepatoblastoma without efforts at

surgical resection is a bad practice. Med Pediatr Oncol 2002; 39:484-6.

Foulkes WD. A tale of four syndromes: familial adenomatous polyposis,

Gardner syndrome, attenuated APC and Turcot syndrome. QJM 1995;

88:853-63.

Fuchs J, Rydzynski J, Von Schweinitz D, et al. Pretreatment prognostic

factors and treatment results in children with hepatoblastoma: a report from

the German Cooperative Pediatric Liver Tumor Study HB 94. Cancer. 2002;

95:172-82.

Fukuzawa R, Umezawa A, Ochi K, Urano F, Ikeda H, Hata J. High frequency

of inactivation of the imprinted H19 gene in "sporadic" hepatoblastoma. Int J

Cancer 1999; 82:490-7.

Galiatsatos P, Foulkes WD. Familial adenomatous polyposis. Am J

Gastroenterol 2006; 101:385-98.

Gardiner-Garden M, Frommer M. CpG islands in vertebrate genomes. J Mol

Biol 1987; 196:261-82.

Giardiello FM, Offerhaus GJ, Krush AJ, et al. Risk of hepatoblastoma in

familial adenomatous polyposis. J Pediatr 1991; 119:766-8.

Haas JE, Muczynski KA, Krailo M, et al. Histopathology and prognosis in

childhood hepatoblastoma and hepatocarcinoma. Cancer 1989; 64:1082-95.

Habrand JL, Pritchard J. Role of radiotherapy in hepatoblastoma and

hepatocellular carcinoma in children and adolescents: results of a survey

conducted by the SIOP Liver Tumour Study Group. Med Pediatr Oncol

1991; 19:208.

Habrand JL, Nehme D, Kalifa C, et al. Is there a place for radiation therapy in

the management of hepatoblastomas and hepatocellular carcinomas in

children? Int J Radiat Oncol Biol Phys 1992; 23:525-31.

Harada K, Toyooka S, Maitra A, et al. Aberrant promoter methylation and

silencing of the RASSF1A gene in pediatric tumors and cell lines. Oncogene

2002; 21:4345-9.

Henrique R, Jerónimo C, Hoque MO, et al. MT1G hypermethylation is

associated with higher tumor stage in prostate cancer. Cancer Epidemiol

Biomarkers Prev 2005; 14:1274-8.

Herman JG, Baylin SB. Gene silencing in cancer in association with promoter

hypermethylation. N Engl J Med 2003; 349:2042-54.

Herzog CE, Andrassy RJ, Eftekhari F. Childhood cancers: hepatoblastoma.

Oncologist 2000; 5:445-53.

Huang Y, de la Chapelle A, Pellegata NS. Hypermethylation, but not LOH, is

associated with the low expression of MT1G and CRABP1 in papillary thyroid

carcinoma. Int J Cancer 2003; 104:735-44.

Jahroudi N, Foster R, Price-Haughey J, Beitel G, Gedamu L. Cell-type

specific and differential regulation of the human metallothionein genes.

Correlation with DNA methylation and chromatin structure. J Biol Chem

1990; 26511:6506-11.

Jung SE, Kim KH, Kim MY, et al. Clinical characteristics and prognosis of

patients with hepatoblastoma. World J Surg 2001; 25:126-30.

Kitazawa S, Kitazawa R, Maeda S. Identification of methylated cytosine from

archival formalin-fixed paraffin-embedded specimens. Lab Invest 2000;

80:275-6.

Koch A, Denkhaus D, Albrecht S, Leuschner I, von Schweinitz D, Pietsch T.

Childhood hepatoblastomas frequently carry a mutated degradation targeting

box ofthe beta-catenin gene. Cancer Res 1999; 59:269-73.

Koshiba M, Ogawa K, Hamazaki S, Sugiyama T, Ogawa O, Kitajima T. The

effect of formalin fixation on DNA and the extraction of high-molecular-weight

DNA from fixed and embedded tissues. Pathol Res Pract 1993; 189:66-72.

Koul S, McKiernan JM, Narayan G, et al. Role of promoter hypermethylation

in Cisplatin treatment response of male germ cell tumors. Mol Cancer 2004;

3:16.

Laird PW. The power and the promise of DNA methylation markers. Nat Rev

Cancer 2003; 3:253-66.

Lehmann U, Kreipe H. Real-time PCR analysis of DNA and RNA extracted

from formalin-fixed and paraffin-embedded biopsies. Methods 2001; 25:409-

18.

Lehmann U, Berg-Ribbe I, Wingen LU, et al. Distinct methylation patterns of

benign and malignant liver tumors revealed by quantitative methylation

profiling. Clin Cancer Res 2005; 11:3654-60.

Li X, Kogner P, Sandstedt B, et al. Promoter-specific methylation and

expression alterations of igf2 and h19 are involved in human

hepatoblastoma. Int J Cancer, 75: 176-180, 1998.

Lyko F, Brown R. DNA methyltransferase inhibitors and the development of

epigenetic cancer therapies. J Natl Cancer Inst 2005; 97:1498-506.

Miyamoto K, Ushijima T. Diagnostic and therapeutic applications of

epigenetics. Jpn J Clin Oncol 2005; 35:293-301.

Mueller BU, Lopez-Terrada D, Finegold MJ. Tumors of the liver. In: Pizzo PA,

Poplack DG, editors. Principles of practice of pediatric oncology. 5

ed.

Philadelphia: Lippincott Williams e Wilkins; 2006. p.887-904.

Nagai H, Naka T, Terada Y, et al. Hypermethylation associated with

inactivation of the SOCS-1 gene, a JAK/STAT inhibitor, in human

hepatoblastomas. J Hum Genet 2003; 48:65-9.

Nagata T, Takahashi Y, Ishii Y, et al. Transcriptional profiling in

hepatoblastomas using high-density oligonucleotide DNA array. Cancer

Genet Cytogenet 2003; 145:152-60.

Nakao M. Epigenetics: interaction of DNA methylation and chromatin. Gene

2001; 278:25-31.

Oakeley EJ. DNA methylation analysis: a review of current methodologies.

Pharmacol Ther 1999; 84:389-400.

Oda H, Imai Y, Nakatsuru Y, Hata J, Ishikawa T. Somatic mutations of the

APC gene in sporadic hepatoblastomas. Cancer Res 1996; 56:3320-3.

Ogino S, Kawasaki T, Brahmandam M, et al. Precision and performance

characteristics of bisulfite conversion and real-time PCR (MethyLight) for

quantitative DNA methylation analysis. J Mol Diagn 2006; 8:209-17.

Ortega JA, Douglass EC, Feusner JH, et al. Randomized comparison of

cisplatin/vincristine/fluorouracil and cisplatin/continuous infusion doxorubicin

for treatment of pediatric hepatoblastoma: a report from the Children's

Cancer Group and the Pediatric Oncology Group. J Clin Oncol 2000;

18:2665-75.

Otte JB, Pritchard J, Aronson DC, et al. Liver transplantation for

hepatoblastoma: results from the International Society of Pediatric Oncology

(SIOP) study SIOPEL-1 and review of the world experience. Pediatr Blood

Cancer 2004; 42:74-83.

Park WS, Oh RR, Park JY, et al. Nuclear localization of beta-catenin is an

important prognostic factor in hepatoblastoma. J Pathol 2001; 193:483-90.

Perilongo G, Shafford E, Plaschkes J; Liver Tumour Study Group of the

International Society of Paediatric Oncology. SIOPEL trials using

preoperative chemotherapy in hepatoblastoma. Lancet Oncol 2000a; 1:94-

100.

Perilongo G, Brown J, Shafford E, et al. Hepatoblastoma presenting with lung

metastases: treatment results of the first cooperative, prospective study of

the International Society of Paediatric Oncology on childhood liver tumors.

Cancer 2000b; 89:1845-53.

Perilongo G, Shafford E, Maibach R, et al. Risk-adapted treatment for

childhood hepatoblastoma. final report of the second study of the

International Society of Paediatric Oncology--SIOPEL 2. Eur J Cancer 2004;

40:411-21.

Raizis AM, Schmitt F, Jost JP. A bisulfite method of 5-methylcytosine

mapping that minimizes template degradation. Anal Biochem 1995;

226:161-6.

Roebuck DJ, Aronson D, Clapuyt P, et al. PRETEXT: a revised staging

system for primary malignant liver tumours of childhood developed by the

SIOPEL group. Pediatr Radiol 2007; 37:123-32.

Sanguinetti CJ, Dias Neto E, Simpson AJ. Rapid silver staining and recovery

of PCR products separated on polyacrylamide gels. Biotechniques 1994;

17:914-21.

Saxena R, Leake JL, Shafford EA, et al. Chemotherapy effects on

hepatoblastoma. A histological study. Am J Surg Pathol 1993; 17:1266-71.

Schnater JM, Köhler SE, Lamers WH, von Schweinitz D, Aronson DC. Where

do we stand with hepatoblastoma? A review. Cancer 2003; 98:668-78.

Schrappe M, Reiter A, Zimmermann M, Harbott J, et al. Long-term results of

four consecutive trials in childhood ALL performed by the ALL-BFM study

group from 1981 to 1995. Berlin-Frankfurt-Münster. Leukemia 2000;

14:2205-22.

Shim YH, Park HJ, Choi MS, et al. Hypermethylation of the p16 gene and

lack of p16 expression in hepatoblastoma. Mod Pathol 2003; 16:430-6.

Shivakumar L, Minna J, Sakamaki T, Pestell R, White MA. The RASSF1A

tumor suppressor blocks cell cycle progression and inhibits cyclin D1

accumulation. Mol Cell Biol 2002; 22:4309-18.

Singal R, Ginder GD. DNA methylation. Blood 1999; 93:4059-70.

Sugawara W, Haruta M, Sasaki F, Watanabe N, Tsunematsu Y, Kikuta A,

Kaneko Y. Promoter hypermethylation of the RASSF1A gene predicts the

poor outcome of patients with hepatoblastoma. Pediatr Blood Cancer 2007;

49:240-9.

Tan LW, Dobrovic A. Methylation analysis of formalin-fixed, paraffin-

embedded sections using a nontoxic DNA extraction protocol.

Biotechniques 2001; 31:1354, 56-7.

Tanimura M, Matsui I, Abe J, et al. Increased risk of hepatoblastoma among

immature children with a lower birthweight. Cancer Res 1998; 58:3032-5.

Tomlinson GE, Finegold MJ. Tumors of the liver. In: Pizzo PA, Poplack DG,

editors, Principles of practice of pediatric oncology 4

ed. Philadelphia:

Lippincott Williams e Wilkins; 2002. p.847-64.

Tommasi S, Dammann R, Zhang Z, et al. Tumor susceptibility of Rassf1a

knockout mice. Cancer Res 2005; 65:92-8.

Trinh BN, Long TI, Laird PW. DNA methylation analysis by MethyLight

technology. Methods 2001; 25:456-62.

Udatsu Y, Kusafuka T, Kuroda S, Miao J, Okada A. High frequency of beta-

catenin mutations in hepatoblastoma. Pediatr Surg Int 2001; 17:508-12.

Wong IH, Chan J, Wong J, Tam PK. Ubiquitous aberrant RASSF1A promoter

methylation in childhood neoplasia. Clin Cancer Res 2004; 10:994-1002.

Wu L, Patten N, Yamashiro CT, Chui B. Extraction and amplification of DNA

from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Appl Immunohistochem

Mol Morphol 2002; 10:269-74.

Wu SJ, Yao M, Chou WC, et al. Clinical implications of SOCS1 methylation in

myelodysplastic syndrome. Br J Haematol 2006; 135:317-23.

Yamada S, Ohira M, Horie H, et al. Expression profiling and differential

screening between hepatoblastomas and the corresponding normal livers:

identification of high expression of the PLK1 oncogene as a poor-prognostic

indicator of hepatoblastomas. Oncogene 2004; 23:5901-11.

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