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Marlon Felix Pazian
CITOGENÉTICA DE POPULAÇÕES DE Piabina argentea
(TELEOSTEI, CHARACIFORMES, CHARACIDAE) DAS
BACIAS DOS RIOS PARANAPANEMA E TIETÊ.
BOTUCATU-SP
2008
Dissertação apresentada ao
programa de pós-graduação em
Ciências Biológicas (Zoologia) do
Instituto de Biociências de Botucatu,
para a obtenção do título de mestre.
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Marlon Felix Pazian
CITOGENÉTICA DE POPULAÇÕES DE Piabina argentea
(TELEOSTEI, CHARACIFORMES, CHARACIDAE) DAS
BACIAS DOS RIOS PARANAPANEMA E TIETÊ.
Botucatu - SP
2008
Dissertação apresentada ao
programa de pós-graduação em
Ciências Biológicas (Zoologia) do
Instituto de Biociências de Botucatu,
para a obtenção do título de mestre.
Orientador: Prof. Dr. Fausto Foresti
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“Para acumular conhecimento,
acrescente uma coisa nova todos
os dias. Para acumular
sabedoria, descarte algo todos os
dias”. Lao Tsé
iv
AGRADECIMENTOS
Com estas palavras espero conseguir expressar meus sinceros
agradecimentos a todas as pessoas que de alguma forma contribuíram para a
realização desta dissertação.
Gostaria de agradecer primeiramente a Deus.
Agradeço ao CNPq pela bolsa concedida, que sem ela não poderia ter
desenvolvido este projeto.
Gostaria de agradecer ao Prof. Dr. Fausto Foresti pela paciência, disposição,
pelo entusiasmo e pela orientação.
Ao prof.Dr. Claudio de Oliveira por sempre estar pronto a ajudar no que foi
preciso.
Ao Zeca, que sem ele hoje não estaria aqui, obrigado
Ao Artur, muito obrigado pelos ensinamentos como professor e como pessoa.
A Cristiane pela amizade, grande paciência e disposição para ajudar e pelas
discussões e ensinamentos que foram muito úteis.
A toda minha família e em especial aos meus pais por sempre acreditarem
em mim mesmo nos momento em que eu já não acreditava.
Ao Renato pela disposição em ajudar nas coletas, nas preparações
cromossômicas e pelas nossas conversas.
Ao Igor o Heleno e o Treco por me acolherem em Botucatu por um mês.
Ao Alex (Alfinete), Celso, Dani, Fábio (Fio), Guilherme (Varvito), Heraldo,
Jefferson (Menudo), Kelly, Luiz (Ziriguidum), Márcio, Michele (Virgim), Mahmoud,
Tati e Vanessa, pelo companheirismo.
Aos amigos de longa data, Hugo e Marcio, em especial ao Hugo que
agüentou dividir a mesma casa por um ano.
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A todos os integrantes do Laboratório de Biologia e Genética de Peixes pela
ajuda e companheirismo: Alex, Andréia Alves, Bruno, Claudinha, Celso, Cristiane,
Daniela, Emanuel, Fábio, Fernando, Gláucia, Gleise, Guilherme (Varvito), Guilherme,
Gustavo, Heraldo, Jefferson, Karina, Kelly, Lessandra, Luiz, Márcio, Marina,
Mahmoud, Natália, Patrícia, Renato, Ricardo, Tati, Vanessa, Zeca.
Também gostaria de agradecer ao Fábio, Fernanda, Diogo e Tati e todo o
pessoal do Laboratorio de Genética de Peixes de Bauru pela colaboração.
Gostaria de agradecer aos integrantes da sessão de pós-graduação pela
grande disposição em ajudar. Obrigado.
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Resumo
Foi realizada a análise citogenética de duas espécies do Gênero Piabina, P.
anhembi e P. argentea, utilzando-se técnicas de coloração cromossômica
convencional com Giemsa, localização das Ag-RONs, coloração com CMA
3
,
hibridação in situ com as sondas de DNAr 18S e 5S e bandamento C. Todas as
quatro amostras de P. argentea apresentaram 2n=52 cromossomos e números
fundamentais diferentes, com exceção de duas amostras populacionais coletadas na
bacia do rio Paranapanema. Três apresentaram Ag-RONs múltiplas (Avaré, Botucatu
e Bauru) e a amostra da população coletada na localidade Itatinga apresentou Ag-
RONs simples e um polimorfismo de tamanho das mesmas. A hibridação in situ com
o uso de sondas de DNAr 5S mostrou diferenças entre as amostras das populações.
O bandamento C marcou em sua maioria as regiões terminais e centroméricas dos
cromossomos. As análises evidenciaram a existência de diferenças citogenéticas
entre as amostras de P. argentea coletadas, sugerindo a existência de diferenciação
populacional. As diferenças citogenéticas encontradas podem ocorrer devido ao fato
de que P. argentea habite apenas riachos, o que poderia levar ao isolamento destas
populações. Também foi analisada a amostra de uma população de P. anhembi
coletada no município de Salesópolis, que também apresentou 2n=52 cromossomos,
Ag-RONs simples e polimorfismos de tamanho das Ag-RONs. A hibridação in situ
com a utilização da sonda de DNAr 18S mostrou três cromossomos marcados e com
a sonda de DNAr 5S mostrou dois cromossomos marcados. O Bandamento C
mostrou bandas nas regiões pericentromérica de dois pares cromossômicos nos
exemplares desta espécie. Considerando-se o fato deste grupo habitar geralmente
regiões específicas dos ambientes de cabeceira dos riachos, isto pode constituir um
fator determinante de fixação de modificações pontuais ocorridas nos cromossomos,
sem, contudo causar alterações na macroestrutura cariotípica das espécies.
vii
Abstract
Two species of the genus Piabina have been analyzed, P. argentea and P.
anhembi using cytogenetic techniques (Staining of Giemsa, staining of Ag-NORs,
fluorescent staining CMA
3
, hybridization in situ using probe of rDNA 18S and 5S and
C-band). All samples of P. argentea presented 2n=52 chromosome and different
fundamental numbers, with exception of the individuals of two population collected in
the Paranapanema river basin. Three samples analyzed from Avaré, Botucatu and
Bauru presented multiple NORs and individuals from Itatinga presented the single
NOR and the polymorphic NOR. The in situ hybridization technique using the DNAr
5S probe showed differences between samples of all the populations. The technique
C-banding showed marks in most of terminals and centromeric regions of the
chromosomes. The existence of cytogenetic differences between the individuals of
different samples collected of P. argentea, suggests a possible population
differentiation. The occurrence of cytogenetic differences happened by the fact that
P. argentea live only in upper stream rivers, and this can determine a process of
population isolation. A sample of P.anhembi collected in the Salesópolis city was also
analyzed and presented 2n=52 chromosomes, simple Ag-NORs and polymorphism
of the NORs. The use of in situ hybridization technique with DNAr 18S probe
revealed three labellad chromosomes, and with the rDNA 5S probe showed two
labellad chromosomes. The technique of C-banding revealed the presence of
heterochromatin in the pericentromeric regions of two chromosome pairs. The
species Piabina argentea most of the time live in a specific environment in upper
stream rivers. This possible isolation can fix spot modifications in the chromosome if
it occurs. However this fact don`t change the macro structure of the chromosome in
different generations.
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SUMÁRIO
1 - Introdução
1.1 - Aspectos sistemáticos e taxonômicos
1.2 - Aspectos citogenéticos
2 - Objetivos
3 - Materiais e Métodos
3.1 - Materiais
4 - Métodos
4.1 - Métodos citogenéticos
4.2 - Estimulação de células mitóticas
4.3 - Obtenção de cromossomos mitóticos
4.4 - Coloração convencional com Giemsa
4.5 - Localização das regiões organizadoras de nucléolos (Ag-
RONs), através da técnica de impregnação com nitrato de Prata
4.6 - Localização de heterocromatina constitutiva utilizando a
técnica de bandamento C
4.7 - Coloração com o fluorocromo base-específico Cromomicina
A
3
(CMA
3
)
4.8 - Hibridação in situ por fluorescência – FISH
4.9 - Estudos cariotípicos
4.10 - Montagem dos cariótipos
5 - Resultados
5.1 - Localidade Avaré-SP (Rio Novo)
5.2 - Localidade Botucatu – SP (ribeirão Araquá)
5.3 - Localidade Botucatu – SP (ribeirão Araquá)
5.4 - Localidade Bauru-SP (ribeirão Campo Novo)
5.5 - Localidade Salesópolis-SP (ribeirão Paraitinguinha)
6 - Discussão
7 - Conclusões
8 - Referências Bilbliográficas
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4
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28
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35
42
43
1
1 – INTRODUÇÃO
1.1 - Aspectos sistemáticos e taxonômicos
Os peixes constituem mais da metade do número total de espécies de
vertebrados existentes (Pough, 2003). Segundo Nelson (2006), existem
aproximadamente 54.711 espécies de vertebrados, das quais cerca de 27.977 são
espécies válidas de peixes. Deste total, cerca de 26.761 espécies são Actinopterygii
(peixes com nadadeiras raiadas), 10.100 são Chondrichthyes (tubarões, raias e
quimeras), 108 são Myxinoidea e Petromyzontoidea (feiticeiras e lampréias) e oito são
Actinistia e Dipnoi (celacanto e pirambóia). As demais 26.734 espécies de
vertebrados estão incluídas no grupo dos tetrápodas (Nelson, 2006).
A ictiofauna de água doce Neotropical é a mais rica de todo o planeta (Schaefer,
1998). De acordo com Reis et al. (2003), das 13.000 espécies de peixes de água
doce existentes estimadas, aproximadamente 6.000 espécies encontram-se na região
Neotropical, das quais 4.475 são consideradas válidas e cerca de 1.550 são
conhecidas, porém ainda não descritas formalmente. A fauna de peixes de águas
continentais do Brasil é a mais rica do mundo com cerca de 2.587 espécies já
descritas e existindo ainda, muitas desconhecidas (Buckup et al., 2007). Dentro desse
universo de espécies de água doce destacam-se os representantes da superordem
Ostariophysi que representam 71% da ictiofauna de água doce neotropical (Fink e
Fink, 1981; Reis et al., 2003).
Entre os Ostariophysi, os Characiformes são peixes exclusivamente de água doce
e encontram-se distribuídos nas Américas e na África, atingindo maior diversidade
nas principais drenagens Neotropicais (Buckup, 1998). Esta ordem compreende 1.460
espécies divididas em 14 famílias, sendo quatro africanas e as demais Neotropicais
(Reis et al., 2003). Os Characiformes apresentam uma grande variação na forma
corporal, estrutura da mandíbula, dentição e anatomia interna (Vari, 1998). Além
disso, nessa ordem são encontradas desde espécies predadoras, que alcançam
cerca de 100 cm de comprimento total até espécies cujas formas adultas não
ultrapassam 15 mm de comprimento total, as chamadas espécies miniaturas
(Weitzman e Vari, 1988).
A família Characidae é o grupo com maior número de espécies entre os
Characiformes, abrangendo cerca de 12 subfamílias, 170 gêneros e 950 espécies
2
válidas (Reis et al., 2003), o que corresponde à aproximadamente 65% das espécies
da ordem. Ao longo dos anos, essa família vem sofrendo várias modificações na sua
classificação, mas muito pouco se conhece sobre as relações filogenéticas de seus
membros constituintes. A própria condição de monofilia da família ainda é muito
discutida. Entre os vários trabalhos realizados em diversos táxons de Characidae, o
realizado por Lucena (1993) propôs a primeira hipótese filogenética abrangente para
a família. Nesse estudo, o autor considerou a família Characidae monofilética e incluiu
neste clado gêneros de Characiformes africanos e outros pertencentes às famílias
Cynodontidae e Acestrorhynchidae. Estudos filogenéticos posteriores sugeriram
diversos rearranjos na família Characidae, questionando profundamente sua monofilia
(Lucena e Menezes, 1998; Weitzman e Malabarba, 1998; Zanata, 2000). Portanto, as
dúvidas ainda existentes em relação à família Characidae, assim como muitas de
suas subfamílias e gêneros, fazem com que não possa ser considerada monofilética,
tornando necessárias análises cladísticas mais abrangentes a fim de investigar a
monofilia de seus táxons e as relações destes com os demais Characiformes
(Weitzman e Malabarba, 1998).
A subfamília Tetragonopterinae, outrora considerada como a subfamília mais bem
sucedida entre os Characidae, estando presente em quase todos os ambientes
neotropicais (Géry, 1977), não pode ser reconhecida como monofilética, assim como
muitos de seus gêneros mais especiosos (Weitzman e Malabarba, 1998, Malabarba e
Weitzman, 2003). Recentemente, para assegurar a monofilia de Tetragonopterinae,
somente o gênero Tetragonopterus foi mantido no grupo e todos os demais gêneros
de Tetragonopterinae foram considerados Incertae Sedis em Characidae (Reis et al.,
2003). Desta forma, dos 88 gêneros, envolvendo cerca de 620 espécies,
anteriormente alocados em Tetragonopterinae, Cheirodontinae, Characinae,
Bryconinae, Paragoniatinae e Aphyocharacinae, foram alocados como “Incertae
Sedis” em Characidae (Reis et al., 2003). Entre esses gêneros estão alguns dos
grupos com maior quantidade de espécies e taxonomicamente pouco conhecidos de
Characidae, como Hyphessobrycon (97 espécies), Astyanax (86 espécies),
Moenkhausia (58 espécies), Bryconamericus (51 espécies), Hemigrammus (43
espécies) e Creagrutus (64 espécies) (Reis et al., 2003). Portanto, somente as
subfamílias de Characidae que apresentavam alguma evidência de monofilia foram
mantidas no grupo, sendo elas: Clupeacharacinae (uma espécie), Agoniatinae (duas
espécies), Tetragonopterinae (duas espécies), Roadsiinae (seis espécies),
3
Aphyocharacinae (10 espécies), Stethaprioninae (12 espécies), Bryconinae (43
espécies), Cheirodontinae (46 espécies), Glandulocaudinae (50 espécies),
Characinae (70 espécies) e Serrasalminae (72 espécies), num total de 79 gêneros e
cerca de 325 espécies (Reis et al., 2003).
O gênero Piabina anteriormente estava alocado na subfamília Tetragonopterinae.
Devido à incerteza do monofiletismo de Teragonopterinae foi criado o grupo “Incertae
Sedis” em Characidae, sendo que o gênero Piabina passou a fazer parte deste grupo
(Reis et al., 2003). O gênero e a espécie tipo, P. argentea, foram descritos por
Reinhardt em 1867. Em 1910, Eigenmmann descreveu uma nova espécie pertencente
ao gênero Piabina que recebeu o nome de P. piquira. Posteriormente, P. piquira foi
considerada sinônimo de P. argentea (Eigenmmann e Myers 1929). As outras duas
espécies descritas até então como pertencentes ao gênero Piabina, P. analis (Reis et
al., 2003) e P. Beni (Pearson, 1924), hoje pertencem, respectivamente, aos gêneros
Piabarchus e Creagrutus (Reis et al., 2003). Vari e Harold (1998; 2001) chegaram à
conclusão de que Piabina é um gênero monotípico, grupo irmão do gênero
Creagrutus. Segundo Vari e Harold (2001), P. argentea ocorre em toda a bacia do alto
Paraná, no nordeste do Paraguai e sudeste do Brasil (acima dos saltos de Guairá) e
no rio São Francisco, rio Itapicuru, rio Paraíba do Sul e rio Itapemirim (bacias do leste
do Brasil). Godoy (1975) reporta que a espécie P. argentea, no alto Paraná, fica apta
à reprodução no mês de setembro. O autor também reporta que essa espécie, nas
suas primeiras fases de desenvolvimento, alimenta-se de fitoplâncton e diversos
grupos de insetos aquáticos (Chironomidae, Ephemerophtera, Odonata, Simulidae e
Trichoptera). No conteúdo estomacal de exemplares desta espécie foram encontrados
restos de insetos, pequenas sementes intactas, sementes trituradas e uma pequena
quantidade de fitoplâncton. Da Silva e Kaefer (2003) descreveram uma nova espécie
denominada Piabina anhembi para a região do alto rio Tietê. No entanto, ainda são
escassas as informações sobre esta espécie.
1.2 - Aspectos citogenéticos
Nos primeiros estudos citogenéticos de peixes no Brasil a citogenética clássica
era a mais utilizada. E relevou sua importância para tornar a área de pesquisa
conhecida. No inicio, a maioria das publicações na área eram descrições cariotípicas
4
que incluíam dados de coloração convencional com Giemsa, bandamento C e a
localização das RONs pelo Nitrato de prata (Ag-RONs). Neste período constatou-se
uma grande diversidade nos cariótipos dos peixes neotropicais, com a descrição de
variações numéricas, polimorfismos estruturais, cromossomos supranumerários e
sistemas sexuais. Na última década, as metodologias usadas na citogenética de
peixes passaram por várias modificações. Os cariótipos de várias espécies de peixes
foram descritos e alguns cariótipos já descritos foram corroborados. Atualmente são
estudadas a estrutura e composição dos cromossomos. Com a utilização de
fluorocromos base-específicos, substâncias análogas de bases e enzimas de
restrição foi possível a identificação e localização de segmentos cromossômicos
específicos e também de genes, com a aplicação da técnica de Hibridação in situ com
fluorescência (FISH). A hibridação de sondas de DNA em núcleos interfásicos e em
cromossomos metafásicos é de grande auxílio na construção de mapas
cromossômicos e na descrição dos cariótipos dos peixes. A fusão da citogenética
básica e da citogenética molecular mostra um grande potencial no entendimento da
estrutura e composições dos cromossomos. Neste sentido, considera-se que a
citogenética molecular está ainda no seu início e poderá ser muito explorada (Foresti,
2008).
Em uma análise geral, os dados citogenéticos disponíveis em peixes indicam que
os estudos estão concentrados principalmente na fauna de peixes neotropicais.
Segundo Oliveira et al. (2006) existem informações citogenéticas para cerca de 475
espécies de Characiformes, 318 Siluriformes, 48 Gymnotiformes, 199 espécies não
pertencentes à superordem Ostariophysi e 109 espécies de peixes marinhos. Nestes
dados, estão incluídos os números e a estrutura dos cromossomos e também
informações a respeito da presença de cromossomos sexuais, supranumerários e a
localização das regiões organizadoras de nucléolo (RONs) (Almeida-Toledo et al.,
2000). Os estudos citogenéticos vêm demonstrando a enorme variabilidade cariotípica
dos peixes, tanto em relação ao número de cromossomos quanto à morfologia.
Segundo Almeida-Toledo et al. (2000), dentre as espécies de peixes neotropicais já
estudadas citogeneticamente, o número cromossômico varia de 2n=20 em Pterolebias
longipinnis (Oliveira et al., 1988) a 2n=134 em Corydoras aeneus (Turner et al., 1992),
podendo ser identificados grupos de espécies bastante conservados em relação ao
número e à morfologia dos cromossomos e também grupos bastante variáveis.
5
Os primeiros estudos citogenéticos na família Characidae foram realizados por
Post (1965), que relatou os números cromossômicos de 18 espécies. No trabalho de
Falcão (1988), foi realizado um levantamento dos dados cariotípicos de 135 espécies
de Characidae, evidenciando uma grande variabilidade cromossômica, com uma
variação de 2n=28 em Hemigrammus sp (grupo neon) (Scheel, 1973) a 2n=64 para
Serrasalmus holandi (Muramoto et al., 1968). No entanto, a maioria das espécies de
Characidae apresenta números cromossômicos compreendidos entre 2n=48 e 2n=54
(Oliveira et al., 1988). Os peixes pertencentes à família Characidae possuem grande
variabilidade de número e fórmula cariotípica entre espécies de um mesmo gênero
(Falcão et al.,1984), e entre populações de uma mesma espécie (Moreira-Filho e
Bertollo, 1991). Os Characidae “Incertae Sedis” possuem uma variabilidade cariotípica
considerável, pois eles apresentam números diplóides que variam de 2n=28 até
2n=54 cromossomos (Oliveira et al., 2006). O gênero mais estudado é o Astyanax e
as espécies desse grupo apresentam uma macroestrutura cariotípica não
conservativa, em particular o complexo de espécies A. scabripinnis que possui
números diplóides de 2n=46 (Moreira-Filho e Bertollo, 1991; Maistro et al., 2000;),
2n=48 (Maistro et al.; 2000; Alves e Martins-Santos, 2002;) e 2n=50 (Moreira-Filho e
Bertollo, 1991; Maistro et al.,1998) com diversas fórmulas cariotípicas, padrões de
distribuição de heterocromatina constitutiva, número e posição das regiões
organizadoras de nucléolo, além da presença ou ausência de cromossomos
supranumerários.
Entretanto, algumas famílias de Characiformes (Anastomidae, Curimatidae,
Hemiodontidae, Paradontidae, Prochilodontidae) apresentam estabilidade na
macroestrutura cariotípica com 2n=54 cromossomos tipo
metacêntrico/submetacêntrico (Pauls e Bertollo, 1990; Galetti Jr et al., 1994;
Margarido e Galetti Jr, 2000, entre outros). De acordo com Vari (1983), as famílias
Anastomidae, Chilodontidae, Curimatidae e Prochilodontidae são filogeneticamente
relacionadas, sugerindo-se que a similaridade cariotípica possa ser conseqüência da
relação evolutiva entre esses grupos.
Dados citogenéticos obtidos em diferentes populações de Piabina argentea
demonstraram número diplóide de 2n=52 cromossomos, com várias fórmulas
cariotípicas. Portela et al. (1988) descreveram o cariótipo de exemplares de P.
argentea do rio Mogi Guaçu que apresentaram 2n=52 cromossomos
(26M+SM/26ST+A). Wasko (1996) realizou uma análise citogenética em exemplares
6
dessa espécie, coletados no rio Piracicaba e descreveu número diplóide de 2n=52
cromossomos (2M+10SM+16ST+24A) e número fundamental igual a 80. Peres (2005)
estudou exemplares de P. argentea da bacia hidrográfica do rio São Francisco e
relatou para a espécie 2n=52 cromossomos (8M+14SM+16ST+14A) e número
fundamental igual a 90. De acordo com os trabalhos descritos na literatura, a técnica
de detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolo (Ag-RONs) por meio da
impregnação por nitrato de prata, marca vários pares de cromossomos portadores
das Ag-RONs (Portela et al.,1988; Wasko,1996). Entretanto, a população de
P.argentea do rio São Francisco apresentou Ag-RONs simples (Peres et al ., 2008).
A técnica de Ag-RONs é muito utilizada em vários organismos. No entanto, esta
técnica possui limitações na sua interpretação, pois, o nitrato de prata liga-se apenas
às proteínas associadas à estrutura nucleolar e não às regiões de DNA ribossomal,
ou seja, ela identifica apenas as RONs que estiverem ativas na interfase precedente
(Goodpasture e Bloom 1975; Miller et al., 1976; Hofgatner et al. 1979; Howell e Black
1980; Roussel et al, 1996; Zurita et al, 1997; Paintner-Marques et al, 2002; Gromicho
et al, 2004). Já a coloração com fluorocromos GC específicos como a cromomicina A
3
e a mitramicina MM, geralmente detecta nos peixes as Ag-RONs independente da
sua atividade (Schimid, 1980). Porém, estes fluorocromos podem, em algumas
espécies, evidenciar regiões heterocromáticas ricas em GC não associadas às Ag-
RONs (Souza et al., 2001) ou mesmo deixar de marcar alguma região de DNAr 18S
(Souza et al., 2001). A técnica de FISH que consiste em realizar uma hibridação com
sondas de DNAr marcadas com compostos isotópicos ou não isotópicos em
preparações citogenéticas, tem se mostrado eficiente na localização e investigação
dos genes ribossomais (Long e Dawid 1980). Assim, pode-se identificar as Ag-RONs
independentemente da atividade da região.
O conhecimento sobre a localização cariotípica dos genes ribossomais 18S e 5S
no genoma da espécie Piabina argentea por meio da técnica de FISH é ainda muito
restrito. No trabalho de Peres et al. (2008), é descrito pela primeira vez a localização
in situ de genes ribossomais 18S e 5S, Sendo o DNAr 18S observado na região
terminal de seis cromossomos subtelocêntricos/acrocêntricos e o DNAr 5S também
observado na região terminal, mas em dois cromossomos submetacêntricos e dois
cromossomos subtelocêntricos/acrocêntricos.
Estudos de bandamento C evidenciaram a presença de heterocromatina
constitutiva nas regiões centroméricas, intersticiais e terminais em Piabina argentea
7
na população do rio Piracicaba (Wasko, 1996). No entanto, Peres (2005) descreveu
bandas C positivas para região das Ag-RONs e para a região pericentromérica de
alguns cromossomos em exemplares da população do rio São Francisco.
Estudos realizados anteriormente em alguns grupos de peixes evidenciaram que
em diversas bacias ou em diferentes tributários pertencentes a uma mesma bacia
hidrográfica pode-se encontrar espécies ou até mesmo populações de mesma
espécie distintas citogeneticamente (Bertollo et al., 2000). Assim, devido à pequena
quantidade de estudos citogenéticos e a possível ocorrência de diferenças
citogenéticas entre as espécies e entre as populações, faz-se necessário a realização
de estudos citogenéticos de diversos grupos de peixes pertencentes às bacias
hidrográficas dos rios Paranapanema e Tietê. Neste contexto, o presente trabalho
visou estudar citogeneticamente populações de Piabina destas duas bacias. O estudo
desse gênero se faz necessário devido às escassas informações existentes e a
maioria destes estudos não serem detalhados, apresentando poucos dados para a
espécie P. argentea. Já para a espécie P. anhembi ainda não existe nenhum trabalho
citogenético disponível.
8
2 - Objetivos
O presente trabalho consistiu em realizar a análise cariotípica de exemplares das
espécies Piabina argentea e P. anhembi, a fim de identificar suas particularidades
cromossômicas e avaliar a possível ocorrência de variabilidade entre as
populações/espécies naturais existentes nas cabeceiras de alguns tributários dos rios
Paranapanema e Tietê. Assim este estudo teve como principais objetivos:
a) Caracterizar as populações/espécies de P. argentea e P. anhembi por meio da
utilização de marcadores citogenéticos (Giemsa, Banda C, Ag-RONs e CMA
3
), e
citogenéticos-moleculares (FISH) com a utilização de sondas dos genes ribossomais
DNAr 5S e DNAr 18S;
b) Contribuir com informações cariotípicas para a taxonomia desse grupo, bem como
para o entendimento dos mecanismos envolvidos no processo de diversificação,
ocorridos no sentido de esclarecer possíveis relações evolutivas entre as espécies.
9
3 - Materiais e Métodos
3.1 - Materiais
No presente trabalho foram analisadas duas espécies de peixes do gênero
Piabina, P. argentea e P. anahembi (Figura 01), capturadas nos componentes das
bacias hidrográficas dos rios Paranapanema e Tietê. Todos os exemplares foram
coletados utilizando-se peneirões e/ou redes de arrasto. Os exemplares coletados
foram levados ao laboratório onde foram acondicionados em aquários e logo depois
sacrificados e submetidos à análise cromossômica. Depois de sacrificados e
analisados os exemplares foram fixados em formol a 10% e conservados em álcool
70% e se encontram depositados na Coleção do Laboratório de Biologia e Genética
de Peixes da UNESP de Botucatu, São Paulo.
Locais de Coleta
Os exemplares de P. argentea e P. anahembi foram cletados nas localidades
abaixo relacionadas e constam na Tabela 01 e Figura 02.
Piabina argentea
Foram alisados exemplares de quatro populações de Piabina argentea num total
de cinqüenta e sete exemplares, das seguintes localidades:
- doze exemplares (04 machos e 08 fêmeas) da localidade Avaré, ribeirão rio
Novo, bacia do rio Paranapanema, município de Avaré, São Paulo (S 23° 01’ 26.2’’ W
48° 49’ 32.6’’).
- quatorze exemplares (05 machos 09 fêmeas) da localidade Itatinga, ribeirão
Tamanduá, bacia do rio Paranapanema, município Itatinga, São Paulo (S 23° 13’ 50’’
W 48° 31’ 58’’).
- onze exemplares (05 machos e 06 fêmeas) da localidade Botucatu, ribeirão
Araquá, bacia do rio Tietê, município de Botucatu, São Paulo (S 22° 47.135’ W 48°
28.892’).
- vinte exemplares (12 machos e 08 fêmeas) da localidade Bauru, ribeirão Campo
Novo, bacia do rio Tietê, município de Bauru, São Paulo (S 22° 20’ 27.1’’ W 48° 56’
05.0’’).
10
Piabina anhembi
Foram analisados exemplares de uma população dessa espécie, com uma
amostragem constituída de dez indivíduos (07 machos e 03 fêmeas) da localidade
Salesópolis, ribeirão Paraitinguinha, bacia do Tietê, município de Salesópolis, São
Paulo (S 23° 30’ 40.3’’ W 45°51’ 32.6’’)
Tabela 01 - Sumário das espécies e populações de Piabina estudadas
.
Espécie
Exemplares
M F
Localidade Bacia
Hidrográfica
Localidade
P. argentea
04 08 Avaré Paranapanema Avaré-SP
P. argentea
05 09 Itatinga Paranapanema Itatinga-SP
P. argentea
05 06 Botucatu Tietê Botucatu-SP
P. argentea
12 08 Bauru Tietê Bauru-SP
P. anhembi
07 03 Salesópolis Tietê Salesópolis-SP
(M=macho e F= fêmea)
Figura
02
.- Mapa do Estado de São Paulo indicando os
locais
de coleta de exemplares de peixes do gênero Piabina
. 1 Avaré
(ribeirão Rio Novo);
2 Itatinga (ribeirão Tamanduá); 3 Botucatu
(ribeirão Araquá); 4 Bauru (ribeirão Campo N
ovo); 5
Salesópolis (ribeirão Paraitinguinha).
Figura
01
-
. a) Foto de exemplar de P. argentea e b) Foto de exemplar de
P.
anhembi
.
11
4 - Métodos
4.1 - Métodos citogenéticos
Foram obtidas preparações cromossômicas dos exemplares de Piabina argentea
e Piabina anhembi coletados para a caracterização citogenética pelos métodos de
coloração convencional com Giemsa, detecção das Ag-RONs, bandamento C,
coloração com o fluorocromo CMA
3
e hidridação in situ fluorescente (FISH).
4.2 - Estimulação de células mitóticas
Com o objetivo de conseguir uma maior quantidade de células mitóticas nas
preparações, foi utilizada a técnica de injeção prévia de uma solução de fermento
biológico nos animais, descrita inicialmente por Cole e Levans (1971) para répteis e
anfíbios e adaptada por Oliveira et al (1988) para peixes. Foi seguido o seguinte
protocolo:
1) Preparação de uma solução de fermento biológico na seguinte proporção: 0,5 g
de fermento, 0,5 g de açúcar e 7,0 ml de água destilada. A solução foi encubada
em estufa por aproximadamente 20 minutos;
2) Injetou-se esta solução na região dorso-lateral do animal, na proporção de 1,0 ml
para 100 g de peso vivo. O animal é então acondicionado em um aquário bem
aerado e com a temperatura mantida em torno de 26º C por um período de
aproximadamente 48 horas;
Algumas variações do procedimento acima citado foram testadas para se obter
melhores preparações. A que apresentou melhores resultados foi a seguinte:
1) Preparar uma solução de fermento biológico na seguinte proporção: 0,5 g de
fermento, 0,5 de açúcar e 14 ml de água destilada. A solução foi encubada em
estufa por aproximadamente 20 minutos e injetou-se 0,5ml dessa solução para
cada 100g de peso vivo.
2)
Proceder á técnica de obtenção de cromossomos mitóticos
.
12
4.3 - Obtenção de cromossomos mitóticos
Para a obtenção de cromossomos mitóticos foi utilizada a técnica anteriormente
descrita por Egozcue (1971), Cestari (1973) e posteriormente adaptada para peixes por
Foresti et al., (1981). Essa metodologia consiste em inibir a polimerização dos
microtúbulos do fuso mitótico com a utilização de colchicina. A metodologia é descrita a
seguir:
1) injetar solução aquosa de colchicina 0,025% (na proporção de 0,5ml/100g de peso
do animal) intra-abdominalmente no animal com uma seringa, entre as nadadeiras
peitorais e ventrais. Deixá-lo nadando livremente por 34 minutos.
2) sacrificar o animal para retirada do rim (região anterior), brânquias e testículos com
o auxílio de tesoura e pinças de ponta fina;
3) colocar o tecido retirado em placa de Petri contendo 6,0 ml de solução hipotônica
(KCl 0,075 M), dissociar o material, procurando obter uma suspensão de células.
Para tal, primeiro deve-se dissociar o material com pinças de ponta fina, depois,
homogeneizar com o auxílio de uma Pipeta Pasteur;
4) transferir a solução obtida para um tubo de centrífuga e manter em estufa a 37
º
C
durante 21 minutos;
5) retirar a suspensão celular da estufa, colocar 7 gotas de solução fixadora (metanol e
ácido acético na proporção de 3:1, respectivamente) gelada. Agitar levemente a
mistura com o auxílio de uma pipeta Pasteur. Deixar em repouso por 5 minutos à
temperatura ambiente;
6) adicionar cerca de 6,0 ml do fixador e novamente agitar a mistura. Levar para
centrífuga a 1000 rpm por 10 minutos;
7) retirar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 6,0 ml de fixador.
Centrifugar por 7 minutos a 1000 rpm;
8) centrifugar por mais 2 ou 3 vezes durante 7 minutos;
9) pingar o material em lâminas e secas ao ar livre.
13
4.4 - Coloração convencional com Giemsa
As preparações cromossômicas depositadas nas lâminas passaram pelo seguinte
processo de coloração:
1) hidrolisar o material contido na lâmina em HCL 1N a 60ºC por
aproximadamente 3 minutos;
2) corar com solução de Giemsa a 5% em tampão fosfato (ph=6,7) por 10
minutos.
4.5 - Localização das regiões organizadoras de nucléolos (Ag-RONs), pela
técnica de impregnação com nitrato de Prata.
As Ag-RONs foram localizadas utilizando a técnica descrita por Howell e Black
(1980), com modificações. Foram utilizadas duas soluções:
Solução A: solução coloidal reveladora: dissolver 1,0 g de gelatina em 50,0 ml de
água destilada. Acrescenta-se 0,5 ml de ácido fórmico.
Solução B: solução de nitrato de prata: 1,0 g de AgNO
3
dissolvida em 2,0 ml de
água destilada.
O procedimento de coloração das RONs é o seguite:
Hidrolisar o material por 3 minutos em HCl 1N à temperatura de 60ºC; lavar em
água destilada e deixar secar ao ar. Pingar sobre uma lâmina, preparada conforme a
técnica adotada para cromossomos mitóticos, 1 gota de solução A a 2% (acrescida de
ácido fórmico na proporção de 1,0 ml para cada 100,0 ml de solução) mantida em
frasco escuro e em geladeira. Pode-se utilizar gelatina comercial sem sabor e incolor.
Adicionar, sobre a gota anterior, 2 gotas de solução B a 50% mantida em frasco
escuro e a 4
o
C. Misturar bem e cobrir com uma lamínula. Incubá- la no interior do
banho-maria a 60
o
C, sobre um suporte, por aproximadamente 3 minutos. Após a
preparação assumir uma tonalidade amarelada, lavar em água destilada,
possibilitando que a lamínula seja retirada pela própria água. Pode-se corar com
Giemsa a 5% diluído em tampão fosfato (pH 6.8), durante 20 a 30 segundos. Lavar
em água corrente e deixar secar ao ar.
14
4.6 - Localização de heterocromatina constitutiva utilizando a técnica de
bandamento C
Para a obtenção de Bandas C, foi utilizada a técnica descrita por SUMNER
(1972), com algumas modificações, que consiste em tratar o material preparado
segundo a técnica descrita para obtenção de cromossomos mitóticos com HCl 0,2 N à
temperatura ambiente durante 30 minutos. Lavar a lâmina em água corrente e deixar
secar ao ar. Mergulhar a lâmina em solução aquosa de hidróxido de bário
(Ba(OH)
2
.8H
2
O) 5%, recém-preparada e filtrada, a 60
o
C, por aproximadamente 6
segundos. Para interromper a ação da solução de hidróxido de bário, submergir
rapidamente a lâmina em solução de HCl 1 N e lavá-la em água destilada. Colocar a
lâmina em solução salina 2xSSC a 60
o
C durante 30 minutos. Após este período, lavá-
la em água destilada e deixar secar ao ar. Corar com solução de Giemsa diluída a 2%
em tampão fosfato (pH=6.8), durante 15 minutos.
4.7 - Coloração com o fluorocromo base-específico Cromomicina A
3
(CMA
3
)
.
Para a detecção de regiões ricas em pares de bases G-C foi utilizada a técnica
descrita por SCHWEIZER (1976), empregando o corante CMA
3.
Esta técnica consiste em confeccionar a lâmina conforme a técnica descrita
para cromossomos mitóticos, colocar sobre as lâminas uma solução de tampão
Mcllvaine + MgCl
2
e cobrir com lamínula. Incubar em placa de Petri umidecida com
o mesmo tampão por 10 minutos. Posteriormente retirar o tampão da lâmina com
pipeta Pasteur e, sem lavar as lâminas, secar a parte de trás das mesmas. Após
isso, depositar as lâminas em placa de Petri, colocar 150,0 µl de CMA
3
(0,5
mg/ml), cobrir com lamínulas lavadas com etanol no momento do uso e deixar o
conjunto dentro de uma caixa escura por 15 minutos. Então, retirar as lamínulas
em tampão Mcllvaine lavando as lâminas vagarosamente nessa solução, incubar
as lâminas em solução de Methyl-greem\Hepes por 15 minutos e lavar as lâminas
em solução de Hepes\NaCl. Secar as lâminas e pingar uma gota de glicerol com
2,5% de propilgalato sobre elas, a seguir deve-se depositar uma lamínula para
montagem de uma lâmina permanente. Deixar as lâminas no escuro e na
geladeira por pelo menos 30 dias antes da análise.
15
4.8 - Hibridação in situ por fluorescência – FISH
O protocolo descrito a seguir foi baseado nos procedimentos adotados por Pinkel
et al. (1986) com modificações:
4.8.1 - Obtenção e Marcação da sonda
A sonda de DNAr 18S a ser utilizada na hibridação “in situ” fluorescente foi obtida
através da PCR utilizando-se os oligonucleotídeos desenhados para a região do DNAr
18S, NS1 (5’ – GTAGTCATATGCTTGTCTC - 3’) e NS8 (5’ –
TCCGCAGGTTCACCTACGGA – 3’) (White, 1990). A sonda de DNAr 5S foi obtida
também através da PCR com a utilização dos oligonucleotídeos (primer A 5’ –
TACGCCCGATCTCGTCCGATC – 3’ e primer B 5’ –
CAGGCTGGTATGGCCGTAAGC – 3’) segundo descrito por Wasko e Galletti (2000).
A sonda foi marcada pelo método de nick translation utilizando o Kit BioNick
TM
Labeling System (Invitrogen). Utilizou-se o seguinte protocolo:
a) para cada lâmina preparar um mix contendo:
1,0 µL 10x dNTP mix;
1,0 µL do DNA sonda (200ng/µL);
1,0 µL do mix de enzima;
6,0 µL de água Milli Q.
b) misturar bem, centrifugar brevemente e incubar a 16ºC por 30 minutos;
c) adicionar 1,0 µl de stop buffer, 1,0 µl de acetato de sódio 3M e o dobro do volume
(22,0 µl) de etanol 100% gelado;
d) misturar invertendo o tubo, centrifugar rapidamente e colocar em ultrafreezer (-
70ºC) por 1 hora;
e) centrifugar por 15 minutos a 15.000 rpm a 4ºC;
f) descartar o sobrenadante e adicionar 50,0 µl de etanol 70% gelado;
g) centrifugar por 5 minutos a 15.000 rpm a 4º C;
h) descartar o sobrenadante com cuidado e deixar secar;
i) ressuspender em 12,0 µl de água Milli-Q.
16
4.8.2 - Tratamento das lâminas
As lâminas podem ser preparadas com os cromossomos com um dia de
antecedência ou no momento do uso. Para cada lâmina:
a) colocar 100,0 µl de RNAse (0,4µl de RNAse 10mg/mL e 99,6µl de 2xSSC) sobre a
lamínula, aderir a lâmina sobre esta lamínula e deixar em câmara úmida
(umedecida com 2xSSC) a 37ºC por 1 hora e 30 minutos;
b) lavar a lâmina duas vezes em 2xSSC durante 10 minutos cada;
c) desidratá-las em série alcoólica 70%, 85% e 100% gelado durante 10 minutos
cada;
d) mergulhar a lâmina em formamida 70% em 2xSSC por 4 minutos a 70ºC (guardar
a formamida para reutilizá-la no dia seguinte);
e) desidratar em série alcoólica 70%, 85% e 100% a – 20ºC por 5 minutos cada
(este passo é muito importante, pois as lâminas devem ser passadas rapidamente
da formamida para o álcool). Deixar secar ao ar.
4.8.3 - Solução de hibridação
Em um tubo Eppendorf contendo 12,0 µl da sonda, adicionar 30,0 µl de
formamida (concentração final 50%), 12,0 µl de sulfato de dextrano 50%
(concentração final 10%) e 6,0 µl de 20xSSC (concentração final de 2xSSC).
Desnaturar a sonda a 95º C por 10 minutos e passar imediatamente ao gelo.
4.8.4 - Hibridação
Colocar 60,0 µl de solução de hibridação sobre a lamínula e inverter a lâmina
sobre a lamínula. Manter as lâminas com o material voltado para baixo em câmara
úmida (2xSSC) a 37ºC de 12 a 18 horas.
17
4.8.5 - Lavagens
Lavar em 2xSSC em temperatura ambiente apenas para tirar a lamínula e
escorrer bem a lâmina sem deixar secar. Deste momento em diante as lâminas não
podem secar:
a) lavar em formamida 50%/2XSSC por 15 minutos a 37º C (utilizar a mesma
solução do dia anterior – formamida 70% e transformá-la para 50%);
b) lavar em 2xSSC por 15 minutos a 37ºC por uma vez;
c) lavar em 2xSSC por 15 minutos à temperatura ambiente;
d) lavar em 4xSSC à temperatura ambiente (só para enxaguar).
4.8.6 - Detecção e amplificação do sinal da sonda
a) sobre uma lamínula colocar 0,1µl de avidina-FITC 0,07% em 70,0 µl de tampão C
(0,1M de bicarbonato de sódio, pH 8,5 e 0,15M de NaCl);
b) inverter a lâmina sobre esta lamínula e deixar por 1 hora em câmara úmida com
2xSSC a 37º C;
c) após este tempo, lavar as lâminas 3 vezes por 5 minutos cada, com agitação, em
tampão de bloqueio (NaHCO
3
1.26% / citrato de sódio 0, 018% / Triton 0,0386%
em água destilada pH 8,0 e leite em pó desnatado 1%) recém-preparado a 42ºC.
Escorrer a lâmina e secá-la por baixo;
d) sobre uma lamínula colocar 80,0 µl de anti-avidina biotina-conjugada 2,5% (2,0 µl
de anti-avidina estoque em 78,0 µl de tampão de bloqueio), inverter a lâmina
sobre a lamínula e deixar em câmara úmida com 2xSSC a 37ºC por 30 minutos;
e) novamente lavar em tampão de bloqueio três vezes por 5 minutos cada com
agitação a 42ºC;
f) repetir os passos de (a) até (e);
g) aplicar novamente o FITC e fazer as lavagens como descrito no passo (e);
h) lavar em 4xSSC/Triton 2% duas vezes por 3 minutos cada com agitação;
i) lavar em 4xSSC/Triton 0,2% duas vezes por 3 minutos cada com agitação;
j) escorrer as lâminas e deixar secando ao ar.
18
4.8.7 - Montagem das lâminas
Secar a lâmina e montar com iodeto de propídio na proporção de 20,0 µl de meio
de montagem antifading com 0,7µl de solução de iodeto de propídio a 50 µg/mL.
4.9 - Estudos cariotípicos
A partir dos dados obtidos através das análises e contagens dos cromossomos de
cerca de 30 metáfases em cada indivíduo estudado, foi estabelecido o número
diplóide modal para os exemplares de cada espécie.
Assim sendo, as melhores metáfases, bem como as que apresentaram uma
melhor dispersão e morfologia mais nítida dos cromossomos, foram fotografadas em
fotomicroscópio digital (OLYMPUS BX-UCB) com objetiva de imersão de 100x, do
Departamento de Morfologia do Instituto de Biociências de Botucatu (IBB). As
preparações de FISH foram analisadas em microscópio de fluorescência. Foi utilizado
nas análises das fotos o programa Adobe PhotoShop 7.0.
4.10 - Montagem dos cariótipos
Os cromossomos foram arranjados de acordo com os tipos metacêntrico (M),
submetacêntrico (SM), subtelocêntrico (ST) e acrocêntrico (A), seguindo a
classificação proposta por Levan et al., (1964), emparelhados com seus prováveis
homólogos e organizados em ordem decrescente de tamanho para a disposição final
do cariótipo.
19
5 - Resultados
Foram analisados exemplares de quatro populações de Piabina argentea e uma
de P. Anhembi. Entre as populações de P. argentea analisadas, duas são
pertencentes à bacia hidrográfica do rio Tietê e duas pertencentes à bacia
hidrográfica do rio Paranapanema (Figura 02). A população de P. anhembi foi
coletada no rio Paraitinguinha, bacia do rio Tietê - Salesópolis/SP (Figura 02).
Os resultados obtidos são apresentados a seguir por localidade:
5.1 - Localidade Avaré-SP (Rio Novo).
No rio Novo, bacia do rio Paranapanema-Avaré/SP, foram analisados 12
exemplares (04 machos e 08 fêmeas) de P. argentea (Tabela 01). A análise com
Giemsa mostrou que os indivíduos da população do rio Novo apresentam número
diplóide de 2n=52, (08M+16SM+12ST+16A) (Figura 03a) e número fundamental igual
a 88 (Tabela 02). Não foram encontrados polimorfismos cromossômicos ligados ao
sexo nos indivíduos analisados. A impregnação das preparações cromossômicas por
nitrato de prata marcou cinco cromossomos do tipo submetacêntricos (Figura 04b) e a
distribuição de regiões ricas em GC com a utilização do fluorocromo CMA
3,
mostrou
seis cromossomos com regiões ricas em GC na sua porção terminal (Figura 04a). A
análise da distribuição da heterocromatina constitutiva mostrou a presença de blocos
centroméricos e terminais em vários cromossomos (Figura 03b).
20
Figura
0
3
-
a) Cariótipo de um exemplar de P. argentea com
2n=52, após coloração convencional com Giemsa, b)
Cariótipo de um exemplar de P. argentea com 2n=52, após o
emprego do bandamento C.
21
Figura
0
4
- a)
Metáfase somática após aplicação do fluorocromo GC
especifico CMA
3
de um exemplar de P. argentea
. As setas indicam as regiões
de cromomicina A
3
positiva, b)
Metáfase somática após impregnação com
nitrato de prata. As setas indicam as regiões organizadoras de nucléolo (Ag
-
RONs).
22
5.2 - Localidade Itatinga-SP (Ribeirão Tamanduá).
No ribeirão Tamanduá, bacia do rio Paranapanema-Itatinga/SP, foram analisados
14 exemplares (05 machos 09 fêmeas) de P. argentea (Tabela 01). A análise com
Giemsa mostrou que os indivíduos dessa população apresentaram número diplóide
de 2n=52 cromossomos, (06M+22SM+08ST+16A) (Figura 05a) e número
fundamental igual a 88 (Tabela 02). Não foram encontrados polimorfismos
cromossômicos ligados ao sexo nos indivíduos analisados. A impregnação das
preparações cromossômicas por nitrato de prata, a marcação ocorreu em dois
cromossomos subtelocêntricos (Figura 05a) e detectou um polimorfismo de tamanho
desta região (Figura 06b). A coloração por CMA
3
mostrou um par de cromossomos
subtelocêntricos com marcações na região terminal (Figura 06a). A hibridação in situ
mostrou sítios ribossomais nos braços menores de um par de cromossomos
subtelocêntricos, coincidentes com as marcações evidenciadas pela prata (Figura
06c). A hibridação in situ utilizando se a sonda de DNAr 5S evidenciou quatro regiões
portadoras dos genes (Figura 06d). A análise de distribuição de heterocromatina
constitutiva mostrou a presença de marcações centroméricas na maioria dos
cromossomos e o braço menor de um par de cromossomos submetacêntricos
completamente heterocromáticos (par 05) (Figura 06b).
23
Figura 05
- a) Cariótipo de um exemplar de P. argentea com 2n=52,
após coloração convencional com Giemsa. No detalhe, os
cromossomos portadores das Ag-RONs (par 15), b) Cariótipo de um
exemplar de P. argentea com 2n=52, após o emprego do
bandamento C.
24
Figura 06 - a)
Metáfase somática após aplicação do fluorocromo GC especifico
CMA
3
de um exemplar de P. argentea
. As setas indicam as regiões de
cromomicina A
3
positiva, b) polimorfismo de
tamanho das regiões
organizadoras de nucléolo evidenciado por Impregnação por nitrato de prata
(01)(par 15), coloração com CMA
3
(02) (par 15) e hibridação in situ
utilizando a
sonda 18S (03)(par 15), c)
Metáfase somática após aplicação da técnica de
hibridação in situ com a sonda de DNAr 18S.
As setas indicam as regiões onde
estão presentes os genes DNAr 18S e d)
Metáfase somática após aplicação da
técnica de hibridação in situ com a sonda de DNAr 5S.
As setas indicam as
regiões onde estão presentes os genes DNAr 5S.
25
5.3 - Localidade Botucatu – SP (ribeirão Araquá).
No ribeirão Araquá, bacia do rio Tietê - Botucatu/SP foram analisados 11
exemplares (05 machos e 06 fêmeas) de P. argentea (Tabela 01). A análise com
Giemsa mostrou que os indivíduos possuem número diplóide igual a 2n=52
cromossomos, (08m+16SM+18ST+10A) (Figura 07a) e número fundamental igual a
94 (Tabela 02). Não foram encontrados polimorfismos cromossômicos ligados ao
sexo nos indivíduos analisados. A impregnação das preparações cromossômicas por
nitrato de prata marcou quatro cromossomos, sendo dois submetacêntricos e dois
subtelocêntricos (Figura 08b). A distribuição de regiões ricas em GC com a utilização
do fluorocromo CMA
3
mostrou dois cromossomos subtelocêntricos e dois
submetacêntricos, coincidentes com as marcações obtidas com a prata (Figura 08c).
A hibridação in situ utilizando a sonda de DNAr 5S evidenciou seis regiões portadoras
dos genes (Figura 08d). A análise da distribuição da heterocromatina constitutiva
mostrou–se restrita ás regiões centroméricas da maioria dos cromossomos do
complemento cariotípico (Figura 07b).
26
Figura
0
7
- a) Cariótipo de um exemplar de P. argentea com
2n=52, após coloração convencional com Giemsa, b) Cariótipo de
um exemplar de P. argentea com 2n=52, após o emprego do
bandamento C.
27
Figura 08 - a)
Metáfase somática após coloração convencional com Giemsa,
b)
Metáfase somática após impregnação com nitrato de prata de um exemplar
de P. argentea. As setas indicam as regiões organizadoras de nucléolo (Ag-
RONs), c)
Metáfase somática após aplicação do fluorocromo GC especifico
CMA
3
. As setas indicam as regiões de cromomicina A
3
positiva e d)
Metáfase
somática após aplicação da técnica de hibridação in situ
com a sonda de
DNAr 5S. As setas indicam as regiões onde e
stão presentes os genes DNAr
5S.
28
5.4 - Localidade Bauru-SP (ribeirão Campo Novo).
No ribeirão Campo Novo, bacia do rio Tietê-Bauru/SP foram analisados 20
exemplares (12 machos e 08 fêmeas) de P. argentea (Tabela 01). A análise com
Giemsa mostrou que os indivíduos da população desta localidade apresentaram
numero diplóide igual a 2n=52, (08M+22SM+10ST+12A) (Figura 09a) e número
fundamental igual a 92 (Tabela 02). Não foram encontrados polimorfismos
cromossômicos ligados ao sexo nos indivíduos analisados. A impregnação das
preparações cromossômicas por nitrato de prata marcou três cromossomos
submetacêntricos (Figura 10b) e a distribuição de regiões ricas em GC com a
utilização do fluorocromo CMA
3,
mostrou quatro cromossomos com regiões ricas em
GC na sua porção terminal (Figura10c). A hibridação in situ utilizando se a sonda de
DNAr 5S evidenciou oito regiões portadoras dos genes (Figura 10d). A análise da
distribuição da heterocromatina nos cromossomos mostrou que ela está distribuída
nas regiões centroméricas na maioria dos cromossomos, estando localizada também
na região terminal nos pares números dois, cinco e dezessete (Figura 09b).
29
Figura
0
9
-
a) Cariótipo de um exemplar de P. argentea com
2n=52, após coloração convencional com Giemsa, b) Cariótipo
de um exemplar de P. argentea com 2n=52, após o emprego do
bandamento C.
30
Figura 10 - a) Metáfase somática após coloração convencional com Giemsa de
um exemplar de P. argentea, b) Metáfase somática após impregnação com
nitrato de prata. As setas indicam as regiões organizadoras de nucléolo (Ag-
RONs), c) em destaque os cromossomo possuidores de regiões de cromomicina
A
3
positiva (Pares 02 e 08), d) Metáfase somática após aplicação da técnica de
hibridação in situ com a sonda de DNAr 5S. As setas indicam as regiões onde
estão presentes os genes DNAr 5S.
31
5.5 - Localidade Salesópolis-SP (ribeirão Paraitinguinha).
No ribeirão Paraitinguinha, bacia do Tietê-Salesópolis/SP foram analisados 10
indivíduos (07 machos e 03 fêmeas) de P. anhembi (Tabela 01), a análise com
Giemsa mostrou que os indivíduos da população do ribeirão Paraitinguinha
apresentam número diplóide de 2n=52 cromossomos (8M+10SM+16ST+18A) (Figura
11a) e número fundamental igual a 104 (Tabela 02). Não foram encontrados
polimorfismos cromossômicos ligados ao sexo nos indivíduos analisados. A
impregnação das preparações cromossômicas por nitrato de prata marcou dois
cromossomos subtelocêntricos (Figura 11a) e a distribuição de regiões ricas em GC
com a utilização do fluorocromo CMA
3,
mostrou duas regiões marcadas na porção
terminal de dois cromossomos subtelocêntricos, coincidentes com as marcações
obtidas com a prata (Figura 12a). A hibridação in situ utilizando a sonda de DNAr 18S
revelou três marcações (Figura 12c), a hibridação utilizando-se a sonda 5S evidenciou
duas regiões portadoras dos genes (Figura 12d). A análise da distribuição da
heterocromatina constitutiva mostrou a presença de blocos de heterocromatina
constitutiva na região centromérica de alguns cromossomos, na região
pericentromérica de dois pares de cromossomos subtelocêntricos (pares 10 e 12) e
na região terminal de um par de metacêntricos (par 01) (Figura 11b).
32
Figura
11
- a) Cariótipo de um exemplar de P. anhembi com 2n=52,
após coloração convencional com Giemsa. No detalhe, os
cromossomos portadores das Ag-RONs (par 21), b) Cariótipo de um
exemplar de P. anhembi com 2n=52, após o emprego do
bandamento C.
33
Figura 12 - a) Metáfase
somática após aplicação do fluorocromo GC especifico
CMA
3
de um exemplar de P. anhembi
. As setas indicam as regiões de
cromomicina A
3
positiva, b) polimorfismo
de tamanho das regiões organizadoras
de nucléolo evidenciado por Impregnação por nitrato de prat
a (01) (par 21),
coloração com CMA
3
(02) (par 21), c)
Metáfase somática após aplicação da
técnica de hibridação in situ com a sonda de DNAr 18S.
As setas indicam as
regiões onde estão presentes os genes DNAr 18S e d)
Metáfase somática após
aplicação da técnica de hibridação in situ com a sonda de DNAr 5S.
As setas
indicam as regiões onde estão presentes os genes DNAr 5S.
34
Tabela 02: Representação das fórmulas cariotípicas, número fundamental, Ag-RONs, CMA
3,
Hibridação in situ utilizando as sondas de DNAr 18S e 5S,
Bandamento C e localidades de coleta dos exemplares de P.argentea e P.anhembi.
Espécie Localidade Fórmula cariotípica NF
Ag-
RONs
CMA3 5S 18S Bandamento C Autor
P. argentea Rio Mogi Guaçu-SP 26M,SM+26ST,A - 04 - - - -
Portela et
al. (1988)
P. argentea Rio Piracicaba-SP. 02M+10SM+16ST+24A 80 05 - - - Cen, Int, Ter, Per
Wasko,
(1996)
P. argentea Três Marias-MG (São Francisco) 08M+14SM+16ST+14A 90 02 - 06 04 Per
Peres
(2005)
P. argentea Avaré-SP (rib. Novo) 08M+16SM+12ST+16A 88 05 06 - - Cen e Ter
Presente
trabalho
P. argentea Itatinga-SP (rib. Tamanduá) 06M+22SM+08ST+16A 88 02 02 04 - Cen e bh
Presente
trabalho
P. argentea Botucatu-SP (rib. Araquá) 08M+16SM+18ST+10A 94 04 04 06 - Cen
Presente
trabalho
P. argentea Bauru-SP (rib. Campo Novo) 08M+22SM+10ST+12A 92 04 04 08 - Cen e Ter
Presente
trabalho
P. anhembi Salesópolis-SP (rib. Paraitinga) 08M+10SM+16ST+18A 104 02 02 03 03 Cen, Per e Ter
Presente
trabalho
(Int.=intersticial, bh.= braço curto heterocromático, Cen.=centromérica, Per.=pericentromérica, Ter.=terminal)
35
6 - Discussão
A região de Botucatu possui uma situação geomorfológica particularmente
interessante para o estudo de peixes, pois engloba parte da Cuesta Basáltica (Serra
de Botucatu) e parte de depressão Periférica, apresentando relevo constituído por
partes altas e baixas, com desníveis de 300 a 400 metros (Moreira e Camelier,
1977). Estas características possivelmente isolem populações de peixes, uma vez
que a drenagem da região envolve rios que nascem na Cuesta e deságuam no Tietê
e Paranapanema.
Os dados citogenéticos obtidos dos exemplares das populações de P. argentea
capturados na localidade Avaré, Itatinga, Botucatu e Bauru e da população de P.
anhembi, de Salesópolis (Tabela 02), mostraram número diplóide de 2n=52
cromossomos e não foram constatadas diferenças entre os sexos, como é descrito
anteriormente para P. argentea (Portela et al., 1988; Wasko, 1996; Peres, 2005). No
presente estudo encontramos fórmulas cariotípicas distintas para cada população
(Tabela 02). A existência de várias fórmulas cariotípicas nas diferentes populações
de uma mesma espécie é comum no grupo dos peixes. Estudos realizados em
Hoplias malabaricus evidenciaram que em diversas bacias ou em diferentes
tributários pertencentes a uma mesma bacia hidrográfica podem ser encontradas
populações distintas citogeneticamente (Bertollo et al., 2000). Isso ocorre porque
algumas espécies possivelmente migrem pequenas distâncias ou não realizem
migrações, ou possuam diferenças ecológicas, conservando uma identidade própria
para cada grupo de indivíduos.
Nas populações de P. argentea coletadas nos tributários dos rios
Paranapanema e Tietê observou-se variação no número de braços dos
cromossomos, com correspondente modificação das fórmulas cariotípicas, quando
comparadas aos trabalhos existentes para a espécie. O número de braços em P.
argentea variou de 80 a 94 (Tabela 02). A população de P. anhembi analisada
apresentou número de braços igual a 104 (Tabela 02). Tal variação sugere a
possível ocorrência de eventos não robertsonianos nos cariótipos destas espécies.
Os valores de número fundamental (NF) das amostras analisadas por Wasko
(1996) e Peres (2005) diferiram dos encontrados neste trabalho (Tabela 02). As
duas populações do rio Paranapanema apresentaram o mesmo NF e isso
36
possivelmente ocorra em função da proximidade das cabeceiras dos riachos
amostrados. No entanto, o NF das populações da bacia do rio Paranapanema é
diferente dos observados para as duas amostras dos tributários do rio Tietê (Tabela
02). Além disso, o NF variou entre as amostras da bacia do Tietê.
Nas quatro populações de P. argentea analisadas, em três foi constatada a
existência de Ag-RONs múltiplas (Avaré, Botucatu e Bauru). Portela et al. (1988) e
Wasko (1996) também relatam a ocorrência de Ag-RONs múltiplas para a espécie. A
população de Itatinga apresentou Ag-RONs simples (Figura 05a) e, além de dois
cromossomos marcados, foi encontrado também um polimorfismo de tamanho
(Figura 06b), uma forma com o segmento duplicado e outra com o segmento
simples. São observados indivíduos homozigotos para a forma não duplicada e
indivíduos heterozigotos, porém nenhum indivíduo analisado apresentou a forma
homozigota para a forma duplicada. Nos trabalhos anteriores é descrita a ocorrência
de Ag-RONs simples apenas para uma população de P. argentea coletada na Bacia
hidrográfica do rio São Francisco (Peres, 2005) no qual não foi evidenciado
polimorfismo das Ag-RONs. A população de P. anhembi apresentou Ag-RONs
simples (Figura 11a) e também apresentou polimorfismo de tamanho. Foram
encontrados indivíduos homozigotos para a forma não duplicada, e indivíduos
heterozigotos (Figura 12b), e, como na população de P. argentea de Itatinga,
também não foram encontrados indivíduos homozigotos para a forma duplicada. No
entanto, os indivíduos de P. anhembi que apresentaram o cariótipo heterozigoto teve
apenas o homólogo que possui a duplicação marcado. O polimorfismo de tamanho
das Ag-RONs é relativamente comum em peixes neotropicais (Foresti et al., 1981;
Brum et al., 1998; Vicari., 2006; entre outros) e é descrito também para outras
espécies, incluindo humanos (Markovic et al., 1978), suínos (Zenzes et al., 1977) e
anuros (Ward, 1977). A ocorrência de polimorfismos dos sítios homólogos das Ag-
RONs dos exemplares de P. argentea coletados pode ter ocorrido devido a
permutas desiguais entre cromátides irmãs durante a meiose ou trocas entre
cromátides irmãs ou ainda devido à duplicação envolvendo a seqüência desta
região.
O fato de encontrarmos somente a forma heterozigota do polimorfismo das Ag-
RONs possivelmente seja devido ao tamanho da amostragem, ou a freqüência
desse polimorfismo na forma homozigota ser um fenômeno de ocorrência de muito
baixa freqüência nas populações estudadas. Numa hipótese alternativa o
37
polimorfismo na sua forma homozigota poderia apresentar um fenótipo letal, como
proposto para a espécie Oncorhynchus mykiss (Porto-Foresti et al., 2004),
determinando a sua ausência na população. A técnica de detecção das Ag-RONs
tem sido exaustivamente estudada em peixes e é considerada um bom marcador
citogenético, auxiliando em estudos citotaxonômicos das espécies (Galetti Jr, 1998).
Esta técnica tem demonstrado a alta variabilidade da região das Ag-RONs nos
diferentes grupos de peixes em termos de número, localização e tamanho dos
cistrons ribossomais (Foresti et. al., 1981; Jesus e Moreira-Filho, 2003). A marcação
de apenas um cromossomo do par que possui as RONs observado na população de
P. anhembi (Figura 12b), poderia ser explicada também pelo fato de um dos
cromossomos homólogos do par ter essa região inativa na interfase anterior.
A aplicação da técnica de coloração por nitrato de prata permite evidenciar as
Ag-RONs, mas apresenta a limitação de que a prata não se liga às regiões de DNAr
mas sim às proteínas associadas a estrutura nucleolar, limitando-se a identificar
apenas as Ag-RONs que estavam ativas na interfase anterior (Goodpasture e Bloom
1975; Miller et al., 1976; Hofgatner et al. 1979; Howell e Black 1980; Roussel et al,
1996; Zurita et al, 1997; Paintner-Marques et al, 2002; Gromicho et al, 2004).
A técnica de impregnação com cromomicina (CMA
3
), por sua vez, evidencia as
regiões organizadoras de nucléolo, tanto ativas quanto as inativas, pois esta
substância liga-se as regiões ricas em GC presentes na seqüência do DNAr
(Schweizer, 1976; Schmid e Guttenbach, 1988 e Ozouf-Costaz e Foresti, 1992). No
presente trabalho a coloração com CMA
3
foi coincidente com as regiões
organizadoras de nucléolo evidenciadas pela impregnação por nitrato de prata (Ag-
RONs). Ajudou também a identificar as possíveis regiões de RONs inativas, que não
foram reveladas pela técnica de impregnação por nitrato de prata, como no caso do
polimorfismo das RONs identificado na espécie P. anhembi (Figura 12b), no qual
havia sido evidenciado apenas um cromossomo do par portador da RON. Desta
forma, a técnica de impregnação por cromomicina (CMA
3
) mostrou-se um bom
marcador para identificar estas regiões nestas espécies.
Para confirmar a localização das RONs nos cromossomos de indivíduos das
populações analisadas foi empregada a técnica de hibridação in situ (FISH) com a
sonda de DNAr 18S. Esta técnica vem sendo utilizada atualmente por ser mais
confiável na identificação destas regiões, uma vez que ela se utiliza de sondas de
DNAr previamente conhecidas e marcadas, as quais tem homologia com as regiões
38
a serem identificadas, evitando-se assim a obtenção de falsos-positivos. Esse fato
pode ocorrer quando se aplica as outras duas técnicas (Ag-RONs e CMA
3
), que
possuem algumas limitações já referidas. A técnica por Ag-RONs marca somente as
RONs ativas e a técnica por CMA
3
marca regiões ricas em GC, podendo assim
marcar, além das RONs, regiões heterocromáticas presentes ao longo do
cromossomo, as quais também podem ser ricas em GC. No entanto, por limitações
técnicas, só foi possível obter a marcação por 18S em duas das populações
analisadas. As marcações obtidas para a população de P. argentea, de Itatinga
(Figura 06c) e de P. anhembi, de Salesópolis (Figura 12c), corroboraram os dados
obtidos pelas técnicas de Ag-RONs e CMA
3
.
A técnica de hibridação in situ (FISH) utilizando a sonda de DNAr 5S marcou
quatro cromossomos nas populações de P. argentea de Itatinga e Botucatu e seis na
população de Bauru. Para a população de P. argentea de Avaré, por problemas
técnicos, não foi possível obter pela sonda do DNAr 5S. Na população de P.
Anhembi de Salesópolis foram obtidas marcações para um par de cromossomos. A
localização nos cromossomos da região de DNAr 5S é descrita para mais de 60
espécies de peixes pertencentes a sete ordens, (Characiformes, Siluriformes,
Acipenseriforme, Perciforme, Cypriniformes, Aguilliformes e Tetraodontiformes). Os
estudos nestas ordens se mostram de grande importância para a compreensão da
organização e estrutura das seqüências de DNAr 5S existentes nos cromossomos
dos peixes (revisão Martins e Wasko, 2004). Em muitos vertebrados o gene DNAr
5S está em apenas um par cromossômico (Suzuki et al., 1996; Makinem et al.,
1997). Em anfíbios (Schimid et al., 1987; Lucchini et al., 1993) e peixes (Martins e
Wasko, 2004; Mazzei et al., 2004; Nirchio e Oliveira, 2006) o gene pode ser
detectado em dois ou em vários cromossomos. No gênero Leporinus foi identificada
a existência de mais de uma classe de DNAr 5S. E as classes de DNAr 5S
identificadas consistiam de duas unidades, uma de aproximadamente 200 pb e a
outra de 920 pb (Martins e Galetti, 2001). Cada classe apresentou seqüências
distintas nos NTS (espaçador não transcrito) e estavam em pares cromossômicos
distintos (Martins e Galetti, 2001). Nos Perciformes (Martins et al., 2002) e
Salmoniformes (Pendás et al.,1994) observa-se a presença de dois tipos de
repetições em tandem deste RNA ribossômico. Vários estudos tem identificado tipos
variantes do DNAr 5S que são caracterizados por diferenças nos NTSs. Além das
variações nos NTS, nestes segmentos genômicos também são encontrados
39
pseudogenes do DNAr 5S (Martins et al., 2002). Variações do DNAr 5S podem
ocorrer, portanto, devido à presença de pseudogenes, inserções, deleções e mine
repetições, os quais tem sido freqüentemente caracterizado para vários organismos
(Suzuki et al., 1996; Baum e Bailey, 1997; Sadjak et al., 1998; Martins et al., 2002 e
Alves-Costa et al., 2006).
Nos Characidae encontramos como exemplo, em Astyanax, estudos que relatam
um par cromossômico portador do gene DNAr 5S e em outras populações/espécies
de Astyanax que mostram a existência de quatro cromossomos portadores do DNAr
5S (Ferro et al., 2001; Almeida-Toledo et al., 2002; Domingues, 2005; Mantovani et
al., 2005; Vicari, 2006). Nos exemplares de A. scabripinnis estudados por Vicari
(2006) foram encontrados quatro cromossomos portadores das regiões DNAr 5S,
que também foram identificados em outros exemplares pertencentes ao complexo A.
scabripinnis (Ferro et al., 2001; Almeida-Toledo et al., 2002; Mantovani et al., 2005).
Já em Astyanax janeiroensis foi constatado apenas um par de cromossomos
portador das regiões de DNAr 5S (Vicari, 2006). Estudo realizado na espécie A.
altiparanae mostrou que apenas dois cromossomos possuíam marcações
(Domingues, 2005).
Na espécie P. argentea é descrita a ocorrência de quatro cromossomos que
possuem as regiões DNAr 5S (Peres, 2008). Tais referências são coincidentes com
os dados obtidos para a população de Itatinga analisada no presente trabalho
(Figura 06d). No entanto, para a população de Bauru foram encontradas marcações
em oito cromossomos (Figura 10d) e na população de Botucatu foram encontrados
seis cromossomos marcados (Figura 08d), mostrando a utilidade dessa técnica
como ferramenta na separação e identificação de diferentes populações como já
demonstrado para representantes do gênero Astyanax (Ferro et al., 2001; Almeida-
Toledo et al., 2002; Domingues, 2005; Mantovani et al., 2005; Vicari, 2006). Assim,
para a espécie em estudo tal fato também foi evidenciado, tendo sido encontradas
quatro ou seis marcações para P. argentea e apenas duas para P. anhembi (Figura
12d).
A técnica de bandamento C realizada nas populações de P. argentea estudadas
no presente trabalho marcaram regiões heterocromáticas nas posições terminais, no
braço menor de um par de cromossomos e principalmente na região centromérica.
Na população de Itatinga o braço menor do par de cromossomos submetacêntricos
número cinco é heterocromático e o par dois possui um bloco de heterocromatina na
40
sua porção terminal. A população de Bauru também possui o braço menor do par
seis heterocromático. Já na população de P. anhembi foram evidenciados blocos
heterocromáticos na região pericentromérica dos pares número 10 e 12 (Figura
12b), que estabelece diferença visível com as das populações de P. argentea
analisadas no presente estudo, além das marcações centroméricas e terminais em
vários cromossomos. Os resultados do bandamento C marcaram, na sua maioria, as
regiões centroméricas e terminais que são regiões importantes para o cromossomo,
e possuem grande quantidade de DNA repetitivo. Apenas dois estudos realizados
anteriormente relatam a distribuição de segmentos de banda C positivos (Wasko,
1996; Peres, 2005) para a espécie P. argentea. Os estudos relatam a presença de
regiões heterocromáticas na região centromérica, intersticial, terminal e
pericentromérica. Porém no presente trabalho foram evidenciadas marcações
principalmente nas regiões centroméricas e terminais. A técnica de Bandamento C
vem se mostrando muito útil nos estudos citogenéticos de peixes detectando
eficientemente as regiões de heterocromatina constitutiva. Ela possibilita a detecção
de diferenças na distribuição de heterocromatina cromossomal e tem sido
considerada como um importante marcador em vários grupos de peixes
neotropicais. As diferenças na distribuição de segmentos positivos de bandas C
podem nos dar indícios para a caracterização de gêneros, espécies e populações
(Mantovani et al., 2000).
Entre as populações de P. argentea analisadas no presente trabalho foram
encontradas diferenças cromossômicas que também foram observadas quando
comparadas com os dados da literatura. Essas diferenças dão indícios da existência
de populações estruturadas em cada local de coleta. Como a formação da Cuesta
data de aproximadamente 13 milhões de anos e não há registro de fenômeno de
captura de cabeceiras entre as bacias do Tietê e Paranapanema, considera-se que
desde então o fluxo gênico entre as populações de uma mesma espécie que
habitam os tributários do Tietê e Paranapanema só poderiam se manter através do
rio Paraná (Caramaschi, 1986). Porém, segundo Lowe MC Connell (1969) os
grandes rios tropicais poderiam se apresentar como barreiras físicas, químicas ou
bióticas, que gerariam “isolamento geográfico” para as espécies de pequeno porte
que habitam as cabeceiras de seus tributários. Desta forma, populações de
diferentes tributários estariam isoladas, submetidas ao seu próprio e independente
modelo de evolução. Em Lowe MC Connell (1999) é relatado que as espécies do
41
gênero Piabina são endêmicas de riachos na bacia do alto rio Paraná. Tais
observações levariam a crer na hipótese de que os rios Paranapanema, Paraná e
Tietê atuariam como barreiras que isolariam as diferentes populações de P.
argentea, explicando assim, a ocorrência das diferenças citogenéticas nas
populações coletadas. Análises moleculares utilizando marcadores do tipo
microssatélite ou do DNA mitocondrial podem confirmar os resultados citogenéticos
obtidos no presente trabalho sobre a origem e processos de diferenciação existentes
nas diferentes populações de P. argentea nos tributários dos rios Paranapanema e
Tietê.
42
7 - Conclusões
As análises citogenéticas realizadas em espécies e populações de peixes
pertencentes ao gênero Piabina, capturadas em tributários das bacias dos rios
Paranapanema e Tietê, permitiram concluir que:
O gênero Piabina possui o seu número diplóide conservado. No entanto, nota-se
uma heterogeneidade do ponto de vista citogenético nas populações analisadas,
com a variação da estrutura dos cariótipos.
A análise dos dados citogenéticos dos exemplares de P. argentea fornece
indícios de que as populações formam grupos únicos em cada localidade estudada
no presente trabalho, caracterizando citótipos específicos.
O fato de existir uma conservação no número de cromossomos dos cariótipos
desta espécie e diferentes fórmulas cariotípicas parece indicar que rearranjos
estruturais dos cromossomos, possivelmente inversões ou translocações, estariam
determinando o processo de diferenciação das fórmulas cariotípicas dos indivíduos
destas populações.
43
8 - REFERÊNCIAS BILBLIOGRÁFICAS
Almeida-Toledo LF, Foresti F, Toledo-Filho SA (2000) Karyotypic evolution in
Neotropical freshwater fish. Chromosome Today vol.13, pg169-182.
Almeida-Toledo LF, Ozouf-Costaz C, Foresti F, Bonilho C, Porto-Foresti F, and
Daniel-Silva MFZ (2002) Conservation of the 5S-bearing chromosome pair and
co-localization with major rDNA clusters in five species of Astyanax (Pisces,
Characidae). Animal Cytogenetics and Comprative Mapping. Vol: 97, 229-233.
Alves-Costa FA, A P Wasko, C Oliveira, F Foresti, C Martins (2006) Genomic
organization and evolution of the 5S ribossomal DNA in Tilapiini fishes. Genetica
127:243-252.
Alves, A.L. e Martins-Santos, I.C. (2002). Cytogenetics Studies in Two Population of
Astyanax scabripinnis with 2n=48 Chromosome (Teleostei, Characidae).
Cytologia, v.67, p. 117-202.
Baum, B.R.e Bailey, L.G. (1997). The Molecular Diversity of the 5S rRNA gene in
kengyilia alatavica (Dobov) J.L Yang, Yen e Baum (Poaceae:Triticeae): potential
genomic assignment of different rDNA units. Genome v. 40, P. 215-228.
Bertollo, L.A.C; Born, G.G.; Dergam, J.A.; Fenocchio, A.S.; Moreira- Filho, O. (2000).
A biodiversity approach in the neotropical Erythrinidae fish, Hoplias malabaricus.
Karyotipic survey, geographic distribuition of cytotypes and cytotatoxonomic
considerations. Chromosome Res, v.8, p. 603-613.
Brum, M.J.I.; Muratori, C.F.M.L.; Lopes, P.R.D.; Viana, P.R.G. (1998). A ictiofauna do
sistema lagunar de Marica (RJ). Acta Biol Leopoldensia, v. 16, p. 45-55.
Buckup, P.A. (1998). Relationships of the Characidiinae and phylogeny of
characiform fishes (Teleostei: Ostariophisy). Pp. 123-144. In: Malabarba, L.R.;
44
R.E. Reis; R.P. Vari; Z.M. Lucena e C.A. Lucena. (Eds.). Phylogeny and
Classification of Neotropical Fishes. Porto Alegre, Edipucrs, 603 pp.
Buckup, P.A.; Menezes, N.A. e Ghazzi, M.S. (eds.) (2007). Catalogo das espécies
de peixes de água doce do Brasil. Série livros 23. Museu Nacional. Universidade
Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro.
Caramaschi, E.P. (1986). Distribuição da Ictiofauna de riachos das bacias do Tietê e
do Paranapanema, junto ao divisor de águas (Botucatu-SP). Tese de
Doutorado,Programa de pós-graduação em ecologia e recursos naturais do
Departamento de Ciências Biológicas da UFSCar, São Paulo, PP.245.
Cestari, A.N. (1973). Métodos de estudo dos cromossomos de vertebrados. In
Azevedo, T.L. e Costas, S.O.P.da org. Exercicios Práticos de Genética, Editora
da Universidade de São Paulo, SP. P. 29-31.
Cole, C.J., e Levans, C.R. (1971). Chromosome preparations of amphibians and
reptiles: improved technique. Herpetol, v.49, p.102.
Da Silva, J.F.P.e kaefer C.C. (2003). Uma nova Espécie de Piabina reinhardt, 1867
(Teleostei:Ostariophysy:Characidae) para o Alto Tietê,São Paulo,Brasil.
Domingues, M.S. (2005). Citogenética Comparativa de Astyanax altiparanae Garrutti
e Britski, 2000 do rio Tibagi e do alto rio Iguaçu. Dissertação de mestrado, Curso
de pós-graduação em Genética, Setor de Ciencias Biologicas, Universidade
Federal Do Paraná, p.66.
Egozcue, J (1971). Técnicas em Citogenética. Editorial Espaxs, Barcelona, pp. 144.
Eigenmann,C.H. and G.S. Myers. (1929). The American characidae, Part. 5. Men.
Mus. Comp. Zool., 43 (5): 429-558.
45
Eigenmann,C.H.(1910). Catalogue of the freshwater Fishes of Tropical and South
Temperate America. Reports of the Princeton University Expedition to Patagonia,
1896-1899, 3(4):375-511.
Falcão, J.N. (1988). Carcterização Cariotipica em peixes do Genero Triportheus
(Teleostei, Characiformes, Characidae). Tese de Doutorado, Departamento de
Genética e matematica Aplicada a Biologia. USP- Ribeirão Preto, São Paulo,
p.137.
Falcão, J.N.; moreira-Filho, O.; Bertollo, L.A.C. (1984). Na additional chromosome in
two fish species.Rev. Brasil. Genetic. V. 11(1),109-118.
Ferro, D.A.M.; Moreira-Filho, O.; Bertollo, L.A.C. (2001). Nucleolar organizing
regions, 18S and 5S in Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae): Population
distribuition and Functional diversity. Genetica, v.110, p.147-153.
Fink, S.V.; Fink, W.L. Interreations of the Osthariophysan fishes (Teleostei).
Zoological Journal of the Linnean Society, v.72, n.4, p.297-353, 1981.
Foresti F, Almeida-Toledo LF and Toledo SA (1981) – Polymorphic nature of
nucleolus organizer regions in fishes. Cytogen. Cell Genet. 31: 137-144.
Foresti, F. (2008). A brief history of fish geetics in Brazil. Genetics and Molecular
Biology, v. 31,1 (suppl), 385-388.
Galetti Jr, P.M.; (1994). Trends in chromosome evolution in Neotropical fishes.
Caryologia, v. 47. P. 289-297.
Galetti Jr., P.M. (1998). Chromosome diversity in neotropical fishes: NOR studies.
Ital.J. Zool., v.65,p.53-56.
Géry, J. (1977). Characoids of the world. T. F. H. Publications, Neptune City, New
Jersey, 672 pp.
46
Godoy, M.P. (1975). Peixes do Brasil: sub-ordem Characoidei; bacia do rio Mogi
Guaçu. Piracicaba, São Paulo: Editora Fransciscana, v.4, p.629-487.
Goodpasture C, Bloom SE (1975) Visualization of nucleolar organizer regions in
mammalian chromosome using silver staining. Chromosoma 53: 37±50.
Gromicho M, Collares-Pereira MJ: Polymorphism of major ribosomal gene
chromosomal sites (NOR-phenotypes) in the hybridogenetic fish Squalius
alburnoides complex (Cyprinidae) assessed through crossing experiments.
Genetica 122:291-302 (2004).
Hofgatner, FJ, Krone, W and Jain, K (1979). Correlated inhibition of ribosomal RNA
synthesis and silver staining actinomycin D. Hum. Genet. 47: 329-333.
Howell, WM and Black, DA (1980). Controlled silver staining of nucleolus organizer
regions with a protective colloidal developer: a 1-step method. Experientia 36:
1014-1015.
Jesus, C.M. e Moreira-Filho, O. (2003). Chomossomal localization of 5S and 18S
rRNA genes in Prochilodus lineatus (Characiformes, Prochilodontidae).
Caryologia, v.56, p. 281-287.
Kantek, D.L.Z.; Cipriano, R.R.; Noleto, R.B.; Fenocchio, A.S.; Artoni, R.F.; Cestari,
M.M. (2007). Population analysis of a Chromosome polymorphism in Astyanax
(Teleostei, Characiformes) species endemic to Iguaçu River. Genetics and
molecular Biology, v.31, (1) (suppl),p. 239-242.
Levan A, Fredga K and Sandberg AA, (1964). Nomenclature for centromeric position
of chromosomes. Hereditas 52: 201–220.
Long, E.O. and David, I.D. (1980). Repeated genes in eukaryotes. Annu. Rev.
Biochem. 49: 727-764.
47
Lowe MC Connell, R.H. (1969). Speciation in Tropical Freshwater fishes. Biol. J.
Linn. Soc. V.1, p. 51-57.
Lowe MC Connell, R.H. (1999). Estudo ecológico de comunidades de peixes
tropicais. Editora da Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil, 534p.
Lucchini S, Nardi I, Barsacchi G, Batistoni R, Andronico F (1993). Molecular
cytogenetics of the ribosomal (18S + 28S and 5S) DNA loci in primitive and
advanced urodele amphibians. Genome 36: 762–773.
Lucena, C.A.S. (1993). Estudos filogenéticos da família Characidae com uma
discussão dos grupos naturais propostos (Teleostei, Ostariophysi,
Characiformes). São Paulo. Tese de Doutorado apresentada à Universidade de
São Paulo.
Lucena, C.S.A., e Menezes, N.A. (1998). A phylogenetic analysis of the Roestes
Gunther and Gilbertolus Eigenmann, with a hypothesis on the relationships of the
Cynodontidae and Acestrorhynchidae ( Teleostei: Ostariophisy: Characiformes).
Pp: 261-278. In: Malabarba, L.R., Reis R.E., Vari, R.P., Lucena, Z.M., Lucena,
C.A.S. (Eds.). Phylogeny and Classification of Neotropical Fishes. EDIPUCRS,
Porto Alegre. Pp. 261-278.
Maistro, E.L.; Oliveira, C.; Foresti, F. (1998).Comparative citogenetic and
morphological analysis of Astyanax scabripinnis paranae (Pisces, Characidae,
Tetragonopterinae). Genetica and Molecular Biology . v. 21, p. 201-206.
Maistro, E.L.; Oliveira, C.; Foresti, F. (2000). Cytogenetic analysis of A and B
chromosomes of Prochilodus lineatus (Teleostei, Prochilodontidae) using
different restriction enzyme banding and staining methods. Genetica, v.108,
p.119-125.
48
Makinem, A.; Zijlstra, C.; De Haan, N.A.; Mellink, C.H.M.; Bosma, A.A.; (1997).
Localization of 18S plus 28S and 5S ribosomal RNA genes in the dog by
fluporescet in situ hybridization. Cytogenetics and Cell Genetics. V. 78, p.231-
235.
Malabarba, LCR., Weitzman, S.H. (2003). Description of a new genus with six new
species from southern Brazil, Uruguay and Argentina, with a discussion of a
putative characid clade (Teleostei: Characiformes: Characidae). Comun. Mus.
Ciênc. Tecnol. PUCRS, Sér. Zool., 16 (1): 67-151.
Mantovani, M.; Abel, L.D.S.; Mestriner, C.A.; Moreira-Filho, O. (2000). Accentuated
polimorphism of heterocromatinand nuclear organizer regions in Astyanax
scabripinnis ( Pisces, Characidae): tools for understanding karyotype evolution.
Genetica, v.109, p.161-168.
Mantovani, M.; Abel, L.D.S.; Moreira-Filho, O. (2005). Conservade 5S e variable 45S
rDNA chromosomal localization revelead by FISH in Astyanax scabripinnis
(Pisces, Characidae). Genetica, v.123, p.211-216.
Margarido, V.P. e Galetti Jr., P.M. (2000). Amplication of a GC-rich heterocromatin in
the freshwater fish Leporinus desmotes (Characiformes, Anastomidae).Genetics
and Molecular Biology, 23, 3, 596-573.
Markovic, .D.; Worton, R.G.; and Berg, J.M. (1978). Evidence for the inheritance of
silver-stained nucleolus organizer regions. Genet. V,41, p.181-187.
Martins C, Wasko AP (2004). Organization and evolution of 5s ribosomal DNA in the
fish genome.In: Focus on Genome Researche (CR Willians ed.)Nova
SciencePublishers, Hauppauge, NY, USA, 289-319pp.
49
Martins, C. e Galetti,P.M.Jr. (2001). Organization of 5S rDNA in species of the fish
Leporinus: two different genomic localizations are characterized by distinct
nontranscribed spacers. Genome 44; 903-910.
Martins, C.; Wasko, A.P.; Oliveira, C.; Porto-Foresti, F.; Parise-Maltempi, P.P.;
Wright, J.; and Foresti, F. (2002). Dynamics of 5S r DNa in the tilapia
(Oreochromis niloticus) genome: repeat units, inverted sequences, pseudogenes
and chromosome loci. Cytogenet. Genome Res. V.98,p. 78-85.
Mazzei,F.; Ghigliotti, L.; Bonillo, C.; Coutanceau, J.P.; Ozouf-Costaz, C.; Pisano, E.;
(2004). Chromosomal patterns of major 5S ribosomalDNa in six icefish species
(Perciformes, Notothenioidei, Channichthyidae). Polar Biology. V. 28, p.47-55.
Miller, D.A.; Dev, V.G.; Tantravashi, R.; Miller, O.J. (1976). Supression of buman
nucleolus organizer activity in mouse-buman somatic hybrid cells. Expl. Cell Res,
v.101, p. 235-243.
Moreira, A.A.N. e Camelier, C. (1977). Relevo. In IBGE, Geografia do Brasil do
Brasil. Sergraf: Ibge, Rio de janeiro, Vol. 3 , PP.1-47.
Moreira-Filho, O.; and Bertollo L.A.C. (1991). Astyanax scabripinnis (Pisces,
Characidae) a specie complex. Revista Brasileira de Genética, Ribeirão preto,
v.14, n2, p.331-357.
Muramoto, J.; Ohno,S.; and Atikin, N.B. (1968). On the diploid stage of the fish order
Ostariophusi. Chromosoma (Berl.) v. 24, p.59-66.
Nelson, J. S. (2006). Fishes of the World. 4
th
ed., John Wiley e sons, Inc., H
onboken, New Jersey, 600 pp.
Nirchio, M.; and Oliveira, C.; (2006). Citogenetica de Peces. Universidad de Oriente,
Cumaná, Venezuela. p. 216.
50
Oliveira, C.; Almeida-Toledo, L.F.; Foresti, F. (2006). Karyotypic Evolution em in
Neotropical Fishes. (Pisano, E.; Ozouf-Costaz, C.; Foresti, F.; Kaapoor, B.G.
eds) Fish Citogenetics.USA, Science Publisher, p.111-152.
Oliveira, C.; Almeida-Toledo, L.F.; Foresti, F.; Britski, H.A.; and Toledo-Filho, S.A.;
(1988). Chromosome formulae of Neotropical freshwater fishes. Ver. rasil.
Genet., v.11,p. 577-624.
Ozouf-Costaz, C. and Foresti, F. (1992). Fish Cytogenetic Research: Advances,
Applications and Perspectives. Netherlands Journal of Zoology.42 (2-3):277-290.
Paintner-Marques TR, (2002). Estudos citogenéticos em duas populações de
Bryconamericus (Characidae, Tetragonopterinae). Master Thesis. Universidade
Estadual de Londrina, PR, Brazil.
Pauls, E e Bertollo,L.A.C. (1990). Distribution of supranumerary chromosome system
and aspcts of karyotypic evolution in the genus Prochilodus (Pisces,
Prochilodontidae). Gentica 81: 117-123.
Pearson, N.E. (1924). The fishes of the Eastern Slope of the andes. Indiana Universit
Studies. V.11 (64), p.1-83.
Pendás, AM, Morán, P, Freije, JP, and Garcia-Vazquez, E (1994). Chromosomal
mapping and nucleotide sequence of two tandem repeats of Atlantic salmon.
Cytogenet. Cell Genet. 67: 31–36.
Peres, W.A.M.; Bertollo, L.A.C.; Moreira-Filho, O. (2008). Physical mapping of the
18S and s ribosomal genes in nine Characidae species (Teleostei,
Characiformes). Genetics and Molecular Biology, V.1 (suppl), 222-226.
Peres,W.A.M. (2005). Análise da Diversidade CariotípicaDe Characidae Da Bacia Do
São Francisco.Tese de Mestrado.São Carlos: UFSCAR.102p.
51
Pinkel, D., Straume, T. e Gray, J.W. Cytogenetic analysis using quantitative,
highsensitivity, fluorescence hybridization. Proc. Natl Acad. Sci. USA 83, 2934–
2938 (1986).
Portela, A.L.B.S.; Galetti JR, P.M. AND Bertollo. L.A.C.. (1988). Considerations on
the Chromosome Evolution Of Tetragonopterinae (Pisces, Characidae). Rev.
Brasil. Genet. 11,307-316.
Porto-Foresti, F.; Oliveira, C.; Gomes, E.A.; Tabata, Y.A.; Rigolino, M.G.; Foresti, F.
(2004). A lethal effect associated with polymorphism of the NOR-bearing
chromosomes in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Genetics and Molecular
Biology, Brasil, v. 27, p. 51-54.
Post, A. (1965). Vergeichende untersuchungen der chromosomenzahlen bei
susswasser teleosteein. Z.Zool. Syst. Evol. Forsch, v.3, p. 47-93.
Pough, F.H., Janis, C.M., Heiser, J.B. (2003). A vida dos vertebrados. 3º ed.,
Atheneu Editora. São Paulo. 699 pp.
Reinhardt, J.T. (1867). Om trend, fromeentligt ubeskrevne fisk af Characinernes eller
Karpelaxenes Familie.Oversigt over der Kongelige danske Videnskabernes
Selskabs Forhandlinger (volume for 1866):49-68.
Reis, R.E.; kullander, S.O.; Ferraris, C. (2003). Check List of freshwater Fishes of
South and Central America. Porto Alegre: Edipucrs, 742 p.
Roussel, P, André C, Comai L, and Hernandez-Verdun D. (1996). The rDNA
transcription machinery is assembled during mitosis in active NORs and ab-sent
in inactive NORs. J. Cell Biol. 133:235–246.
Sajdak, S.L.; Reed, K.M.; Phillips, R.B. (1998). Intraindividual and interspecies
variation in the 5S rDNA of coregonid fish. J Mol Evol 46: 680±688.
52
Schaefer, S.A. (1998). Conflict ando resolution impact of new taxa on philogenetic
studies of Neotropical cascudinhos (Siluroide: Loticaridae). In: Phylogeny and
classification of Neotropical fishes.(Malabarba L.R., Reis R.E., Vari,R.P., Lucena
Z.M.S., Lucana, C. A. S., eds). EDIPUCRS, Porto Alegre, Brasil.
Scheel, J.J. (1973). Fish chromosome and their evolution. Internal Report of
Denmarks Akvarium, Charlottenlund, Denmark, 22 pp.
Schimid, M. (1980). Chromosome banding in Amphibia IV. Differentiation of GC and
AT-rich chromosome regions in Anura. Chromosoma, v. 77, p. 83-103.
Schimid, M. e Guttenbach, M. (1988). Evolutionary diversity of reverse (R)
fluorescente chromosome bands in vertebrates.Chromossoma 97:101-114.
Schmid M, Vitelli L and Batistoni R (1987). Chromosome banding in Amphibia. IV.
Constitutive heterochromatin, nucleolus organizers, 18S+28S and 5S ribosomal
RNA genes in Ascaphidae, Pipidae, Discoglossidae and Pelobatidae.
Chromosoma 95: 271-284.
Schweizer D (1976) Reverse fluorescent chromosome banding with chromomycin
and DAPI. Chromosoma 58:307-324.
Souza, I.L.; Galián, J.; De La Rúa, P.; Bertollo, L.A.C.; Moreira-Filho, O. (2001). Non-
random distribuition of the GC-rich heterocromatin and nuclear rDNA sites on
Astyanax scabripinnis. Cytologia, v.66, p.85-91.
Sumner, AT (1972). A simple technique for demonstrating centromeric
heterochromatin. Exp. Cell Res. 75: 304-306
Suzuki T, Yuasa H, and Machida Y (1996) Phylogenetic position of the Japanese
river otter Lut ra nippon inferred from the nucleotide sequence of 224 bp of the
mitochondrial cytochrome b gene. Zool Sci 13: 621-626.
53
Turner, B.J.; Diffoot, N.; Rasch, E.M. (1992). The callichthyid catfish Corydoras
aeneus is an unresolved diploid-tetraploid sibling complex. Ichthyol Explor
Freshwater, v.3: p.17-23.
Vari, R.P. (1983). Phylogenetics relations of families Curimatidae, Prochilodontidae,
Anastomidae and Chilodontidae (Pisces, Characiformes). Smithisonian
Contribuitions to Zoology, v.378, p.1-60.
Vari, R.P. e Harold, A. S. 1998. The genus Creagrutus (Teleostei:Characi-
formes:Characidae) Monophyly, Relationships, and Undetected Diversity. P.245-
260, in Malabarba,L.R.;Vari,R.P.; Lucena, Z.M. e Lucena,C.A.S. (eds). phylogeny
and Classification of Neotropical fishes. Porto Alegre. Brasil:Edipucrs. 603 p.
Vari, R.P. e Harold, A.S. (2001). Phylogenetic Study of Neotropical Fish Genera
Creagrutus Gunther and Piabina Reinhardt (teleostei;
Ostariophysi:Characiformes), with a Revision of Cis-Andean Species.Smithsonian
Contributions to Zoology,613:1-239.
Vicari, M.R., (2006). Diversidade de peixes residentes em cabeceiras de rios. Uma
abordagem cromossômica em três diferentes biomas aquáticos da região sul do
Brasil. Tese de Doutorado. UfSCar, São Carlos, SP, Brasil. p. 158.
Ward, O.G.; (1977). Dimophic nucleolar organizer regiões in frog Rana blairi. Can. J.
Genet. Cytol. 19: 51-57.
Wasko, A.P. (1996). Estudos Citogenéticos no Gênero Bryconamericus (Pisces,
Characidae). Uma abordagem Citotaxonômica-Evolutiva. Dissertação de
mestrado. São Carlos,UFSCar ,SP, Brasil.p 165.
Wasko, A.P. e Galleti Jr, P.M. (2001). Mapping 18S ribosomal genes in fish of the
genus Brycon (Characidae) by fluorescence in situ hybridization (FISH). Genetics
and Molecular Biology, v. 23, p. 135-138.
54
Weitzman, S.H., e Vari, R.P.; (1988). Miniaturização in South America freshwater
fishes; an overview and discussion. Poceedings of Biological Society of
Washington, 101 (2): 444-465.
Weitzman, S.H., Malabarba, L.R. (1998). Perspectives about the phylogeny and
classification of the Characidae (Teleostei: Characiformes). Pp. 161-170. In:
Malabarba, L.R.; R.E. Reis.; R.P. Vari.; Z.M. Lucena. e C.A. Lucena. (Eds.).
Phylogeny and Classification of Neotropical Fishes. Porto Alegre, Edipucrs, 603
pp.
White, T.J.; Bruns, T.; Lee, S.; Taylor, J.; (1990). Amplification and direct sequencing
of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics in PCR protocols: a guide to
methods and applications. Academic Press Inc., San Diego, pp. 315-322.
Zanata, A.M.; (2000). Estudo das relações filogenéticas de gênero Brycon Muller e
Troschel, 1844 (Characidae; Characiformes). Tese de Doutorado. Universidade
de São Paulo, São Paulo, 358 pp.
Zenzes, M.T; Schimid, M., and Engel, W. (1977). Silver stained nucleolus organizers
in guinea pig, Cavia cobaya. Cytogenet. Cell Genet. 19:368-372.
Zurita, F.; Sánchez, A.; Burgos, M.; Jiménez, R.; and Díaz de la Guardia, R.; (1997).
Interchromosomal, intercellular and interindividual variability of NORs studied with
silver staining and in situ hybridization. Heredity 78, 229-234.
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