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MESTRADO EM ODONTOLOGIA
Área de Concentração em Periodontia
MAIKE PAULINO DA SILVA
AMOXICILINA E METRONIDAZOL SISTÊMICOS
COMO COADJUVANTES À RASPAGEM E
ALISAMENTO RADICULAR NO TRATAMENTO DA
PERIODONTITE CRÔNICA- ESTUDO CLÍNICO E
MICROBIOLÓGICO.
.
Guarulhos
2008
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MAIKE PAULINO DA SILVA
AMOXICILINA E METRONIDAZOL SISTÊMICOS
COMO COADJUVANTES À RASPAGEM E
ALISAMENTO RADICULAR NO TRATAMENTO DA
PERIODONTITE CRÔNICA- ESTUDO CLÍNICO E
MICROBIOLÓGICO.
Dissertação apresentada à Universidade Guarulhos
para Obtenção do Título de Mestre em Odontologia
Área de concentração: Periodontia
Orientadora: Profa. Dra. Luciene C. de Figueiredo
Co-orientadora: Profa. Dra. Magda Feres
Guarulhos
2008
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Ficha catalográfica elaborada pela Coordenação da Biblioteca Fernando Gay da Fonseca
Silva, Maike Paulino da
S586a Amoxicilina e metronidazol sistêmicos como coadjuvantes à
raspagem e alisamento radicular no tratamento da periodontite
crônica: estudo clínico e microbiológico / Maike Paulino da Silva.
Guarulhos, 2008.
81 f. ; 31 cm
Dissertação (Mestrado em Odontologia, área de concentração
em Periodontia) - Centro de Pós-Graduação, Pesquisa e Extensão,
Universidade Guarulhos, 2008.
Orientadora: Profª. Drª. Luciene C. de Figueiredo.
Co-orientadora: Profª. Drª. Magda Feres.
1. Antibióticos. 2. Microbiologia bucal. 3. Periodontite crônica. 4.
Tratamento periodontal. I. Título. II. Universidade Guarulhos.
CDD 21
st
617.632
Dedico este trabalho as duas pessoas mais importantes da
minha vida, meus pais Irsemes Alves da Silva e Valdir
Paulino da Silva, exemplos de amor, honestidade,
dedicação, força, cumplicidade e humildade. Obrigado
pelos ensinamentos e por existirem.
“A alegria está na luta, na tentativa, no sofrimento envolvido. Não na
vitória propriamente dita.”
Mahatma Gandhi
“Dê-me um ponto de apoio e moverei o mundo.”
Arquimedes
Agradecimentos Especiais
A Deus, pela vida e sabedoria em todos os momentos. Agradeço à
benção a cada dia.
Aos meus orientadores da vida, meus pais Valdir Paulino e Irsemes
Alves, que abdicaram de necessidades próprias para minha
evolução pessoal e intelectual. Vocês são as maiores riquezas da
minha vida. Estaremos eternamente juntos.
À minha orientadora Profª. Drª. Luciene C. Figueiredo, pela
competente orientação deste trabalho e valorosos ensinamentos
científicos que absorvo desde que era seu aluno de iniciação
científica. Obrigado por ajudar a concretizar este sonho. Minha
eterna gratidão e respeito.
À minha co-orientadora Profª. Drª. Magda Feres, também pela
competente orientação deste trabalho e, pela força e incentivo dado
para que eu continuasse estudando. Minha eterna gratidão.
Ao grande amigo Profº. Drº. Jamil A. Shibli, um profissional
incansável e um exemplo de amor à profissão. Obrigado pelo
auxílio em tantos momentos, pelos conselhos e inestimáveis
experiências. Minha eterna admiração e respeito.
Ao Profº. Drº. Marcelo de Faveri pela competência,
acompanhamento e ajuda incomensuráveis para a realização deste
trabalho, além do indispensável auxílio na estatística do mesmo.
À Profª. Drª. Poliana M. Duarte pelo apoio e estímulo contínuo que
dedicou-me e, principalmente, pela amizade e carinho. Sua
competência e profissionalismo são grandes exemplos para mim.
Ao amigo e primeiro orientador e incentivador acadêmico Profº. Drº.
Marcelo W. B. Araújo. Obrigado por ter acreditado em mim na
iniciação científica, pelos conselhos e pela amizade sincera. Minha
eterna gratidão.
À minha grande companheira de pesquisa Tatiane O. Sirotto pela
força, competência e caráter. Sua calma e otimismo ajudaram-me a
superar o cansaço e as dificuldades. Tenho certeza que você
conquistará tudo o que deseja e que será uma mãe excelente.
Torço por ti.
Aos meus amigos professores do Mestrado e Doutorado Acadêmico
em Odontologia da UnG, Profº. Drº. André F. Reis, Profº. Drº. José
A. Rodrigues, Profª. Drª. Marta F. Bastos, Profª. Drª. Alessandra C.
Ferreira, Profª. Drª. Claúdia Ota-Tsuzuki, Profª. Drª. Cristiane M.
Amaral, pelos ensinamentos transmitidos e exemplo profissional.
Aos meus amigos Mestres e Futuros Mestres: Adriana Mendonça,
Beatriz Máximo, Daniel Sanches, Diêgo Souza, Marcel Bernal e
Mônica Padron por terem compartilhado este momento inesquecível
comigo.
Às alunas de iniciação científica Patrícia Moura e Camila Esteves
pelo indispensável trabalho nesta pesquisa. A extrema dedicação
delas mostra um futuro acadêmico brilhante.
À Bióloga Izilvânia Q. Barreto pela dedicação e trabalho
indispensável na fase laboratorial deste trabalho.
Aos funcionários da Universidade Guarulhos e principalmente do
Mestrado em Odontologia, Cínthia Lobo, Adriana Rose e Cristina
Zoucas, pelo apoio constante, alegria e amizade.
Aos pacientes pela compreensão da importância da pesquisa para o
conhecimento científico.
À Universidade Guarulhos que durante todos esses anos
proporcionou-me muitas oportunidades para o meu crescimento
profissional e científico.
À todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização
deste estudo.
RESUMO
O objetivo deste estudo foi avaliar e comparar as alterações clínicas e
microbiológicas promovidas pela RAR associada ou não ao metronidazol ou ao
metronidazol e a amoxicilina sistêmicos, no tratamento de indivíduos com
periodontite crônica, 90 dias pós-terapia. Trinta e seis indivíduos foram
aleatoriamente divididos em 3 grupos, controle (C, n=12) que recebeu RAR, Teste 1
(T
1
, n=10) que recebeu RAR e metronidazol sistêmico (400 mg, 3xdia por 14 dias), e
Teste 2 (T
2
, n=10) que recebeu RAR, metronidazol (400 mg) e amoxicilina (500 mg)
sistêmicos 3xdia por 14 dias. Os parâmetros clínicos avaliados em 6 sítios por dente
no início do estudo e aos 90 dias pós-terapia, foram: profundidade de sondagem
(PS), nível clínico de inserção (NCI), placa visível, sangramento gengival,
sangramento à sondagem e supuração. Nove amostras de biofilme subgengival
foram coletadas por indivíduo, 3 amostras em cada uma das seguintes categorias de
profundidade de sondagem iniciais: rasas (PS ≤ 3mm), intermediárias (PS 4-6mm) e
profundas (PS ≥ 7mm). As amostras foram avaliadas, quanto aos níveis e
proporções de 40 espécies bacterianas subgengivais pela técnica checkerboard
DNA-DNA hybridization. As três terapias promoveram melhoras em todos os
parâmetros clínicos aos 90 dias. O grupo T
2
apresentou a maior redução na média
do NCI, de boca toda, em comparação aos grupos C e T
1
que foram semelhantes
(p>0,05). Em relação às diferentes categorias de profundidade de sondagem inicial,
os melhores benefícios clínicos em PS e NCI foram observados nos sítios profundos
para os grupos que associaram a antibioticoterapia à RAR. A contagem total de
microrganismos foi reduzida (p<0,05) pelas três terapias. Aos 90 dias o grupo T
2
(1,0x10
7
) apresentou o menor número total de microrganismos (p<0,05) em relação
aos grupos T
1
(1,5x10
7
) e C (1,6x10
7
). As proporções do complexo vermelho
passaram de 30,8%, 31,6% e 22,2% no início para 15,7%, 8,0% e 8,3% aos 90 dias
nos grupos C, T
1
e T
2
, respectivamente. O complexo laranja foi afetado apenas pela
terapia que associou o metronidazol e a amoxicilina (42,5% para 22,8%). Por outro
lado, as espécies benéficas aumentaram, principalmente no grupo T
2
que mostrou
alterações significativas nos complexos azul, de 9,4% no início para 36,5% aos 90
dias, roxo (2,9% para 7,4%) e verde (5,8% para 7,3%), seguido pelo grupo T
1
,
especificamente o complexo azul (10,8% para 27,2%). Em conclusão, a associação
de antibióticos promoveu melhoras clínicas e microbiológicas superiores à RAR.
Benefícios mais marcantes foram evidenciados nos indivíduos que ingeriram
metronidazol e amoxicilina combinados à RAR.
Palavras-Chaves: Antibióticos; Microbiologia bucal; Periodontite crônica;
Tratamento periodontal.
ABSTRACT
The aim of this study was to evaluate and to compare the clinical and
microbiological changes provided by scaling and root planing (SRP) associated
or not with metronidazole or metronidazole and amoxicillin systemic in the
treatment of subjects with chronic periodontitis 90 days post-therapy. Thirty-six
subjects were randomly assigned to 3 groups, control (C, n=12) that received
SRP, Test 1 (T1, n=12) that received SRP and systemic metronidazole (400
mg, 3xday for 14 days), and Test 2 (T2, n=12) that received SRP, systemic
metronidazole (400mg) and amoxicillin (500 mg) 3xday for 14 days. The clinical
parameters evaluated at 6 sites per tooth at baseline and at 90 days post-
therapy were: probing depth (PD), clinical attachment level (CAL), visible
plaque, gingival bleeding, bleeding on probing and suppuration. Nine
subgingival biofilm samples were collected per subject, 3 samples in each of the
following initial PD categories: shallow (PD ≤ 3mm), moderate (PD 4-6 mm),
and deep (PD ≥ 7mm). The samples were evaluated for the levels and
proportions of 40 bacterial subgingival species using checkerboard DNA-DNA
hybridization. The three therapies provided improvements in all clinical
parameters at 90 days. The T
2
group showed higher CAL reduction mean, for
full mouth, comparing C and T
1
groups that were similar (p>0.05). Related to
the different categories of the initial probing depth the best clinical benefits in
PD and CAL were observed in deep pockets for the groups that combined
antibiotic therapy and SRP. The mean total counts were reduced (p<0.05) by
the three therapies. At 90 days the T
2
group (1.0x10
7
) presented the lowest total
level of microorganisms (p<0.05) in comparison to the T
1
(1.5x10
7
) and C
(1.6x10
7
) groups. The proportions of the red complex changed from 30.8%,
31.6% and 22.2% at baseline to 15.7%, 8.0% and 8.3% at days post-therapy in
C, T
1
e T
2
groups, respectively. The orange complex was affected only by the
therapy that combined metronidazole and amoxicillin (42.5% to 22.8%). On the
other hand, the beneficial species increased mainly in group T
2
that showed
significant changes in the blue complex from 9.4% at baseline to 36.5% at 90
days post-therapy, purple (2.9% to 7.4%) and green (5.8% to 7.3%), followed by
T
1
group, specially the blue complex (10.8% to 27.2%). In conclusion, the
association of antibiotics provided clinical and microbiological improvement that
were superior to SRP. Marked benefits were evidenced in the subjects that
used metronidazole and amoxicillin and SRP.
Key-words: Antibiotics; Oral Microbiology; Chronic periodontitis; Periodontal
treatment.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Delineamento experimental....................................................... 31
Figura 2 Representação gráfica do Minislot 30 (Immunetics,
Cambridge, MA, EUA) e resumo da preparação e colocação
das amostras de biofilme subgengival na membrana de nylon
(técnica checkerboard DNA-DNA hybridization)........................
38
Figura 3 Representação gráfica do Miniblotter 45 (Immunetics,
Cambridge, MA, EUA) e resumo das etapas de hibridização e
detecção das espécies bacterianas presentes nas amostras
de biofilme subgengival (técnica checkerboard DNA-DNA
hybridization).............................................................................
38
Figura 4 Representação esquemática do padrão de hibridização entre
as bactérias presentes nas amostras de biofilme e as sondas
de DNA (técnica checkerboard DNA-DNA hybridization)..........
40
Figura 5 Média dos parâmetros clínicos de boca toda analisados no
início do estudo e aos 90 dias pós-terapia, nos três grupos
terapêuticos...............................................................................
45
Figura 6 Alterações nas médias de profundidade de sondagem, nível
clínico de inserção e sangramento à sondagem, de boca
toda, ocorridas entre a consulta inicial e 90 dias pós-terapia
nos três grupos terapêuticos.....................................................
49
Figura 7 Alterações nas médias de profundidade de sondagem (PS) e
nível clínico de inserção (NCI), de acordo com as categorias
de profundidade de sondagem, ocorridas entre a consulta
inicial e 90 dias pós-terapia nos três grupos terapêuticos.........
50
Figura 8 Perfil microbiano das médias de contagem (x10
5
) e de
proporção (%) das 40 espécies bacterianas presentes nas
amostras de biofilme subgengival no início do estudo, nos
três grupos terapêuticos............................................................
54
Figura 9 Perfil microbiano das médias de contagem (x10
5
) das 40
espécies bacterianas presentes nas amostras de biofilme
subgengival no início do estudo e 90 dias pós-terapia, nos
três grupos terapêuticos............................................................
55
Figura 10 Perfil microbiano das médias de proporção (%) das 40
espécies bacterianas presentes nas amostras de biofilme
subgengival no início do estudo e 90 dias pós-terapia, nos
três grupos terapêuticos............................................................
56
Figura 11 Proporções dos complexos microbianos presentes nas
amostras de biofilme subgengival no início do estudo e 90
dias pós-terapia, nos três grupos terapêuticos..........................
57
Figura 12 Alterações nas proporções de espécies bacterianas benéficas
e patogênicas entre o tempo inicial e 90 dias pós-terapia, nos
grupos três grupos terapêuticos................................................
58
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Relação das cepas bacterianas empregadas para a confecção
das sondas de DNA......................................................................
36
Tabela 2 Índice utilizado para a determinação dos níveis dos
microrganismos nas amostras de biofilme subgengival ..............
40
Tabela 3 Média (±DP) dos parâmetros clínicos, no exame inicial e 90
dias pós-terapia, para os três grupos terapêuticos .....................
44
Tabela 4 Média (±DP) dos parâmetros clínicos (PS, NCI), no exame
inicial e 90 dias pós- terapia para os três grupos terapêuticos,
para as diferentes categorias de profundidade de sondagem
inicial.............................................................................................
48
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA .............................................. 14
1.1
Etiologia da doença periodontal ............................................... 15
1.2
Antibióticos no Tratamento da Doença Periodontal................ 18
1.2.1 Metronidazol ................................................................................. 19
1.2.2 Metronidazol combinado à amoxicilina.......................................... 23
2
PROPOSIÇÃO ............................................................................. 28
3
MATERIAL E MÉTODOS.............................................................. 29
3.1
Seleção de indivíduos ................................................................ 29
3.2
Critérios de inclusão e exclusão ............................................... 29
3.3
Delineamento experimental ....................................................... 30
3.4
Avaliação clínico-periodontal .................................................. 31
3.5
Procedimentos terapêuticos...................................................... 32
3.5.1 Terapia periodontal básica............................................................ 32
3.5.2 Administração de metronidazol e amoxicilina sistêmicos e
placebo..........................................................................................
33
3.6
Avaliação microbiológica........................................................... 34
3.6.1 Seleção dos sítios-testes............................................................... 34
3.6.2 Coleta das amostras de biofilme subgengival .............................. 34
3.6.3 Cepas bacterianas e condições de
crescimento....................................................................................
35
3.6.4 Isolamento do DNA e preparo das sondas.................................... 35
3.6.5 checkerboard DNA-DNA hybridization......................................... 37
3.6.6 Detecção das espécies.................................................................. 39
3.7
Análise estatística....................................................................... 41
3.7.1 Avaliação clínico-periodontal......................................................... 41
3.7.2 Avaliação microbiológica............................................................... 41
4
RESULTADOS ............................................................................. 43
4.1
Resultados clínicos .................................................................... 43
4.2
Resultados microbiológicos ...................................................... 51
5
DISCUSSÂO ................................................................................. 59
5.1
Aspectos clínico-periodontais.................................................... 62
5.2
Aspectos microbiológicos.......................................................... 64
6 CONCLUSÃO ............................................................................... 66
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................... 67
ANEXOS ...................................................................................................... 80
14
1 INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA
Caracterizada como uma doença infecciosa, a doença periodontal, tem
como fator etiológico microrganismos específicos presentes no biofilme bucal, que
acometem as estruturas de proteção e sustentação dos dentes, levando à perda de
inserção, de tecido ósseo, e eventualmente do elemento dentário (LÖE et al., 1965,
SOCRANSKY, 1970; LISTGARTEN et al., 1978; LOESCHE et al., 1985;
SOCRANSKY & HAFFAJEE, 1994a; HAFFAJEE & SOCRANSKY, 1994;
SOCRANSKY et al., 1998; ARMITAGE, 1999). A doença periodontal crônica é
reconhecida como a forma mais comum de periodontite e apesar de sua
etiopatogenia ser conhecida e bem estudada, ainda não está estabelecido o padrão
ideal e definitivo da terapia. A busca por uma terapêutica periodontal mais eficaz é
contínua, já que alguns pacientes ou sítios continuam a apresentar progressão de
doença, mesmo após o tratamento convencional de raspagem e alisamento radicular
(RAR) subgengival (HAFFAJEE et al., 1997; ROSLING et al., 2001).
O controle mecânico tem como objetivo desorganizar o biofime dental,
suprimir os patógenos periodontais da cavidade bucal e impedir a progressão da
doença (SOCRANSKY & HAFFAJEE, 2002). Entretanto, o debridamento mecânico
sozinho tem sido questionado para a eliminação de espécies periodontopatogênicas
como Aggregatibacter actinomycetemcomitans e Porphyromonas gingivalis dos
nichos subgengivais (SHILOAH et al., 1998; MOMBELLI et al., 2000), por essas
espécies apresentarem habilidade de atingir locais privilegiados, de difícil acesso,
invadindo células epiteliais orais (LAMONT & JENKINSON, 1998; FIVES-TAYLOR et
al., 1999; LAMONT & JENKINSON, 2000; RUDNEY et al., 2005). Alguns
microrganismos subgengivais não podem ser removidos porque estão localizados
em áreas fora do alcance da instrumentação periodontal, como as lesões de furca
profunda e dentina radicular (SLOTS & RAMS, 1991; ADRIAENS & ADRIAENS,
2004).
Além disso, a RAR tem um efeito limitado no biofilme extracrevicular, o qual
pode representar um importante reservatório para a reinfecção e recolonização dos
nichos subgengivais (DANSER et al., 1996; QUIRYNEN et al., 2001; MAGER et al.,
2003). Portanto, a permanência ou a rápida recolonização com microrganismos
periodontopatogênicos, após o debridamento subgengival, pode ser a razão de
15
resultados clínicos menos favoráveis (RODENBURG et al., 1990; RAMS et al.,
1996). Por outro lado, a terapia antimicrobiana coadjuvante sistêmica, tem o
potencial para afetar os patógenos periodontais nos sítios extracreviculares via
saliva e fluído crevicular e também em áreas subgengivais insuficientemente
afetadas pela instrumentação mecânica (BENJAMIN et al., 2005; PANKLA et al.,
2005).
Outro ponto a ser considerado é que a recente constatação de que a
microbiota bucal pode variar entre diferentes regiões geográficas (HAFFAJEE et al.,
2004; HERRERA et al., 2008), enfatiza a importância da realização de outros
estudos científicos na população brasileira, para que terapias mais específicas
possam ser instituídas para essas infecções e populações.
O conhecimento das limitações da terapia mecânica para o controle da
doença periodontal e o entendimento atual da especificidade do biofilme subgengival
e da existência de diferentes patógenos associados às diferentes formas de
infecções periodontais, levam à busca por uma terapia fundamentada nos fatores
etiológicos da infecção, que parece ser o caminho para melhores resultados clínicos
e microbiológicos a longo prazo.
1.1 Etiologia da Doença Periodontal
Estudos epidemiológicos realizados por várias décadas buscaram
encontrar os fatores etiológicos associados às doenças periodontais. Os estudos
realizados na década de 60 (LOVDAL et al., 1958; SCHEI et al., 1959; LÖE et al.,
1965; THEILADE et al., 1966; LÖE et al., 1967; RUSSEL, 1967), mostraram uma
relação positiva entre o acúmulo de biofilme dental e a patogenia da doença,
comprovando sua importância na etiologia das doenças periodontais. Portanto,
estabeleceu-se o conceito da “Hipótese da placa não-específica”, cuja idéia era que
qualquer acúmulo de biofilme na margem gengival levaria a produção de fatores
irritantes, tinha como conseqüência a inflamação gengival e a destruição periodontal
(THEILADE, 1986). O estudo clássico sobre “gengivite experimental” em humanos
de Löe et al. (1965) demonstraram, conclusivamente, uma forte relação entre o
acúmulo de biofilme, a inflamação gengival e as alterações nas proporções dos tipos
morfológicos bacterianos. O controle do biofilme dental foi capaz de reverter o
16
processo de inflamação gengival e levar as proporções e o perfil microbiano
novamente à situação associada à saúde periodontal (LÖE et al., 1965).
Estudos experimentais realizados em modelos animais (KEYES &
JORDAN, 1964; GIBBONS et al., 1966; GIBBONS & SOCRANSKY, 1966) sugeriram
a especificidade microbiana relacionada às doenças periodontais, relatando uma
possível transmissibilidade de infecções orais. Keyes & Jordan (1964) estudaram a
transmissibilidade da doença periodontal entre hamsters e observaram que animais
saudáveis em gaiolas com animais doentes poderiam ser infectados. Analisando o
biofilme em ambos, os autores observaram que somente a espécie conhecida como
Actinomyces viscosus era capaz de provocar a destruição óssea em animais sadios.
GIBBONS et al. (1966) e GIBBONS & SOCRANSKY (1966) constataram que a
inoculação de microrganismos provenientes de bolsas periodontais em animais
“germe-free”, levava ao aparecimento de perda óssea alveolar nestes animais. Os
estudos de Löe et al. (1978 e 1986) representaram uma grande contribuição
científica para o desenvolvimento do conceito da etiologia da doença periodontal.
Estes estudos foram realizados com os plantadores de chá do Sri Lanka, na qual
480 plantadores de chá foram observados durante 15 anos, e demonstraram que
11% destes indivíduos, não apresentavam progressão da doença periodontal,
independente da grande presença de depósitos de biofilme dental. Contrapondo os
princípios da inespecificidade do biofilme dental, estes estudos levaram o surgimento
da “Hipótese da placa específica”, que é sustentada e estudada até os dias atuais,
cujo conceito é de que a composição da microbiota do biofilme difere entre
indivíduos e entre as diversas alterações clínicas periodontais, tais como periodonto
saudável, gengivites e periodontites (LOESCHE, 1976).
O início e a progressão da doença periodontal estão associados à
presença de microrganismos específicos no sulco gengival e/ou sítio periodontal. Os
subprodutos derivados desse metabolismo microbiano também contribuem para o
desenvolvimento da doença periodontal (PENNEL & KEAGLE, 1977; LOESCHE et
al., 1985), já que estimulam uma resposta do sistema imunológico do hospedeiro
que, por sua vez, é influenciada por fatores de risco e fatores genéticos e,
dependendo da intensidade e duração do desafio bacteriano e da suscetibilidade do
hospedeiro, pode levar à reabsorção de tecido de suporte periodontal. À medida que
se estabelecem alterações inflamatórias no tecido gengival induzidas pelo biofilme,
ocorrem alterações quantitativas e qualitativas da microbiota dental (LÖE et al.,
17
1965). Os microrganismos, considerados periodontopatogênicos e associados tanto
à gengivite quanto às periodontites são, na maioria das vezes, Gram-negativos,
anaeróbios, dotados de motilidade e, menos freqüentemente microaerófilos
(SOCRANSKY, 1970; SOCRANSKY, 1977; SLOTS et al., 1978; THEILADE, 1986).
Entretanto, foi na década de 90 que o desenvolvimento de técnicas imunológicas e
de biologia molecular permitiram a detecção mais precisa das espécies bacterianas
que compõem os biofilmes orais e a relação dos diferentes perfis microbianos com
as diferentes formas de periodontite (CHRISTERSSON et al., 1987; SOCRANSKY &
HAFFAJJE et al., 1994b; ÁVILA-CAMPOS et al., 1999; GOMES et al., 2006). A
possibilidade de detecção de microrganismos fastidiosos como a Tannerella
forsythia e as espiroquetas, espécies difíceis de serem detectadas pelos métodos
tradicionais de diagnóstico, como a cultura bacteriana, é a grande vantagem dessas
técnicas.
Socransky et al. (1994c) descreveram a técnica de diagnóstico
microbiológico do checkerboard DNA-DNA hybridization que utilizando sondas de
ácido desoxirribonucléico (DNA) para o diagnóstico microbiológico, analisaram as
associações entre 40 espécies bacterianas presentes em 13.261 amostras de
biofilme subgengival de indivíduos com periodontite crônica (SOCRANSKY et
al.,1998). Os autores observaram a presença de 5 complexos bacterianos principais
neste ambiente subgengival, de acordo com a relação entre as diferentes espécies.
Um dos complexos, composto pelas espécies T. forsythia, P. gingivalis e Treponema
denticola, chamado de complexo vermelho, foi fortemente relacionado com
profundidade de sondagem (PS) e sangramento à sondagem (SS). Outro complexo,
o laranja, que parece preceder a colonização do complexo vermelho foi dividido em
2 grupos, um central, composto por Fusobacterium nucleatum, Fusobacterium
periodonticum, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens e Parvimonas micra; e
outro grupo periférico, formado por Eubacterium nodatum, Campylobacter rectus,
Campylobacter showae, Campylobacter gracilis, Streptococcus constellatus. Os
outros 3 complexos, o amarelo, o verde e o roxo demonstraram grande associação
entre si e menor associação com os 2 primeiros, e são compostos por diversas
espécies consideradas compatíveis com o hospedeiro. O complexo verde é formado
por Capnocytophaga sputigena, Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga
ochracea, Eikenella corrodens e A. actinomycetemcomitans sorotipo a; o complexo
amarelo é composto por um grupo de estreptococos: Streptococcus mitis,
18
Streptococcus sanguinis, Streptococcus oralis, Streptococcus gordonii e
Streptococcus intermedius; e o complexo roxo inclui Actinomyces odontolyticus e
Veillonella parvula. As espécies de Selenomonas noxia e A. actinomycetencomitans
sorotipo b não se correlacionaram com outras espécies. Posteriormente, algumas
espécies de actinomicetos (Actinomyces gerencseriae, Actinomyces israelii,
Actinomyces naeslundii sorotipos 1 e 2) foram agrupadas no complexo azul
(SOCRANSKY & HAFFAJEE, 2002).
1.2 Antibióticos no Tratamento da Doença Periodontal
O entendimento da especificidade do biofilme subgengival, das limitações
do controle mecânico da doença periodontal e dos mecanismos que os
microrganismos possuem para obter acesso a locais privilegiados, têm levado
pesquisadores à desenvolverem novas terapias coadjuvantes à RAR, para que
melhores resultados clínicos e microbiológicos sejam obtidos. Dentre as diversas
terapias coadjuvantes, o uso dos antibióticos sistêmicos têm sido empregado no
tratamento das doenças periododontais (VAN WINKELHOFF et al., 1997; FERES et
al., 1999a, 1999b, 1999c; GONÇALVES et al., 2000; MOEINTAGHAVI et al., 2007).
Os antibióticos são substâncias sintéticas e semi-sintéticas, produzidas
por organismos vivos (por exemplo, fungos e bactérias), com ação antimicrobiana,
ou seja, eliminam ou inibem o crescimento de microrganismos. De acordo com a
ação farmacológica, os antibióticos são classificados como bactericidas, quando são
capazes de, nas concentrações habitualmente atingidas, determinar a morte dos
microrganismos suscetíveis ou bacteriostáticos, quando apenas inibem o
crescimento e multiplicação dos microrganismos sensíveis, sem, todavia destruí-los.
Por meio dos mecanismos de ação, os antibióticos ainda podem ser divididos em
quatro grandes grupos: os que atuam sobre a parede celular, síntese de proteínas,
síntese de ácidos nucléicos e membrana citoplasmática (MONTGOMERY et al.,
2000).
A tetraciclina hidroclorada foi o agente mais utilizado até a década de 80,
principalmente pelas suas características farmacológicas de alcance do sulco
gengival (GORDON et al., 1981). Entretanto, somente na década de 70 os primeiros
estudos controlados utilizando tetraciclina sistêmica como coadjuvante ao tratamento
da periodontite agressiva localizada foram realizados (LISTGARTEN et al., 1978;
19
WILLIAMS et al., 1979) e apesar do seu amplo uso, as evidências de qualidade da
eficácia da tetraciclina são escassas. Hayes et al. (1992), na condução de uma
meta-análise, encontraram uma série de falhas metodológicas nos ensaios
publicados até o ano de 1989. Foram os resultados dos estudos de periodontite
agressiva que levaram a uma abordagem terapêutica mais específica, ou seja,
direcionada para a eliminação do fator etiológico, já que os resultados sugeriram que
o sucesso dessa forma de terapia estava relacionado à eliminação ou à supressão
do A. actinomycetemcomitans (GENCO et al., 1981; LINDHE, 1981; LINDHE &
LILJENBERG, 1984; NOVAK et al., 1988; NOVAK et al., 1991).
Os antibióticos mais utilizados na literatura como adjuntos à terapia
periodontal básica para a periodontite crônica, foram a tetraciclina e seus derivados,
doxiciclina e minociclina (HELLDEN et al., 1979; SLOTS et al., 1979; SCOPP et al.,
1980; CIANCIO et al., 1982; LINDHE et al.,1983b; MÜLLER et al., 1990;
SCHROEDER et al., 1992; FREEMAN et al., 1992; MULLER et al., 1993; CHAVES
et al., 1995; CROUT et al., 1996; LOESCHE et al., 1996; FERES et al., 1999b,
1999c; GONÇALVES, 2000); as penicilinas, principalmente a amoxicilina (HELOVUO
& PAUNIO, 1989; HULL et al., 1989; ABU-FANAS et al, 1991; HELOVUO et al.,
1993); o metronidazol (LINDHE et al., 1983a; LOESCHE et al., 1984, 1987, 1991,
1992, 1996; FERES et al., 1999a; CARVALHO et al., 2004; POULET et al., 2005;
HAFFAJEE et al., 2007); e a azitromicina (MASCARENHAS et al. 2005; DASTOOR
et al. 2007, GOMI et al., 2007a; GOMI et al., 2007b; HAFFAJEE et al., 2007). Outros
estudos mostraram excelentes resultados clínicos e microbiológicos no tratamento
da doença periodontal em indivíduos adultos utilizando a associação do
metronidazol e da amoxicilina (PAVICIC et al., 1994; LÓPEZ et al., 1998, 2000;
WINKEL, et al. 2001; LÓPEZ et al., 2006; DANNEWITZ et al., 2007;
MOEINTAGHAVI et al., 2007).
1.2.1 Metronidazol
O metronidazol é um composto sintético, derivado do nitroimidazol, com
atividade bactericida e protozoaricida sobre diversos protozoários. Atua penetrando
em células por difusão passiva e em condições de anaerobiose, tem seu nitrogrupo
reduzido, gerando metabólitos altamente tóxicos, que interagem com o DNA e outras
macromoléculas. O metronidazol penetra uniformemente bem em todas as células
20
bacterianas. Todavia, nos anaeróbios sensíveis, a porção nitro da droga é
enzimaticamente reduzida, sendo o metabólito resultante a forma ativa da droga. A
droga reage com o DNA bacteriano, causando a inibição da replicação do DNA,
fragmentação do DNA existente e com baixas doses de resistência. O metronidazol
é bem absorvido após a administração oral, e é geralmente bem tolerado; todavia,
alguns efeitos adversos mais comuns podem acontecer, como, náusea, dor
epigástrica, estomatite, língua saburrosa negra e gosto metálico na boca
(MONTGOMERY et al., 2000).
Após quatro anos de intensiva pesquisa, o metronidazol foi utilizado
primeiramente em 1958 em um ensaio clínico, por cientistas no laboratório de
Rhône-Poulenc - França, como antitricomonas e, posteriormente utilizado na terapia
de outras infecções parasitárias como amebíase e giardíase. Apesar de ter sido
desenvolvido para ser efetivo contra tricomonas, suas propriedades antimicrobianas
em relação aos anaeróbios estritos e sua aparente habilidade de evitar que
microrganismos susceptíveis tornem-se resistentes ao antimicrobiano têm sido
interessante sob o ponto de vista odontológico (TALLY et al., 1975).
Shinn, em 1962, foi o primeiro a utilizar o metronidazol em odontologia
após observar um alívio casual nos sintomas da gengivite ulcerativa necrosante
aguda, numa mulher em uso de metronidazol para o tratamento da tricomoníase
vaginal. Logo em seguida passou a ser usado como protocolo dessa alteração
periodontal (DAVIES et al., 1964; GLENWRIGHT & SIDAWAY, 1966; LOESCHE et
al., 1982).
A partir desta capacidade que o metronidazol demonstrou de suprimir
patógenos periodontais, um número considerável de estudos sobre seus efeitos
clínicos e microbiológicos como adjunto da terapia mecânica periodontal têm sido
publicados. Lindhe et al. (1983a) observaram que o metronidazol de uso sistêmico,
(200mg, 4 x dia - 3 períodos de 2 semanas com intervalos de 8 semanas),
associado com a RAR, obteve melhores resultados clínicos em comparação com a
raspagem somente, já que houve maior redução na média de profundidade de
sondagem e nível clínico de inserção periodontal, no índice gengival e no infiltrado
histológico de células inflamatórias. Gusberti et al. (1988) pesquisaram sítios com
recorrência da doença periodontal e os resultados clínicos mostraram que a
administração de metronidazol sistêmico (250mg, 3 x dia/ 7 dias) e RAR repetidos,
reduziu significantemente inflamação gengival, profundidade de sondagem e perda
21
de nível clínico de inserção em bolsas reinfectadas, e após o tratamento estes sítios
abrigavam menos espiroquetas e cepas gram-negativas e um maior número de
bactérias sem motilidade. Loesche et al. (1987, 1991, 1992, 1996) avaliaram nessa
série de estudos, à necessidade de realização de cirurgia periodontal, quando o
metronidazol sistêmico foi utilizado em combinação com a RAR. Os resultados
desses estudos, e principalmente de Loesche et al. (1996), sugeriram que o uso do
metronidazol pode reduzir a necessidade de cirurgia periodontal em até 93% e a
necessidade de extração de dentes em até 81%.
Ainda na década de 90, Söder et al. (1990) estudaram indivíduos com
periodontite recorrente moderada e avançada, e realizaram a terapia mecânica e
química por meio do metronidazol de uso sistêmico (400mg, 3x dia/ 7 dias). Os
resultados mostraram melhoras clínicas estatisticamente significantes, com redução
do número dos sítios com profundidade de sondagem >
5mm, sendo que o grupo
teste obteve uma redução de 30% e o grupo controle de 9%. Loesche et al. (1993)
estudaram a cooperação dos indivíduos no uso do metronidazol sistêmico (250mg
em múltiplas administrações) no tratamento periodontal e observaram um
significativo e rápido declíneo ou desaparecimento de espiroquetas do biofilme
dental naqueles que eram cooperativos, durante o intervalo de tempo em que o
metronidazol foi detectado na saliva. Além disso, esses indivíduos apresentaram os
melhores resultados clínicos e uma redução de necessidade cirúrgica de 8,3 dentes
em comparação a 3,6 dentes dos indivíduos não-cooperativos. Elter et al. (1997)
realizaram um estudo de meta-análise sobre o uso do metronidazol sistêmico como
parte da terapia periodontal e concluíram que o metronidazol apresenta benefícios
clínicos, quando em conjunto com a RAR; entretanto, esses resultados satisfatórios
foram observados somente em sítios com 4mm ou mais. Outros estudos corroboram
essa observação, enfatizando maior efetividade do tratamento com o metronidazol
em sítios profundos em relação aos sítios rasos (LOESCHE et al., 1981; CLARK et
al., 1983; LEKOIVIC et al., 1983; JOYSTON-BECHAL et al., 1984; LOESCHE et al.,
1984; STERRY et al., 1985; JOYSTON-BECHAL et al., 1986; CARVALHO et al.,
2004; HAFFAJEE et al., 2007).
Mais recentemente, os efeitos do uso sistêmico de diversos antibióticos
na composição da microbiota subgengival e nos parâmetros clínicos da doença
periodontal foram determinados por meio de uma série de estudos que utilizaram
sondas de DNA para 40 espécies bacterianas e avaliaram aproximadamente 4.000
22
amostras de biofilme subgengival (FERES et al., 1999a, 1999b, 1999c, 2001;
GOODSON & FERES, 1999; CARVALHO et al., 2005). Feres et al. (2001)
compararam o efeito do uso do metronidazol (250 mg, 3 x dia; 14 dias) ou da
amoxicilina (500mg, 3 x dia/ 14 dias) sistêmicos na microbiota subgengival e nos
parâmetros clínicos de indivíduos com periodontite crônica. O metronidazol
apresentou os melhores resultados clínicos e microbiológicos. Sua ação principal foi
na redução de patógenos dos complexos vermelho e laranja. As espécies
consideradas benéficas, como as do gênero Actinomyces, Streptococcus e
Capnocytophaga, foram minimamente afetadas por este agente. Clinicamente, a
média de profundidade de sondagem de boca toda foi significantemente reduzida e
houve um considerável ganho de inserção. Carvalho et al. (2004 e 2005) mostraram
que os indivíduos portadores de periodontite crônica que fizeram uso de
metronidazol sistêmico (400mg, 3 x dia/ 10 dias) com ou sem remoção profissional
do biofilme supragengival, obtiveram uma melhor resposta clínica nos sítios com
profundidade de sondagem maior de 6mm. Os resultados clínicos e as alterações
mais profundas na composição do biofilme subgengival, foram obtidos com a
utilização da remoção profissional do biofilme supragengival e, principalmente, do
metronidazol. Modificações benéficas importantes na composição do biofilme
subgengival tanto logo após o tratamento quanto um ano pós-terapia, foram
encontradas no grupo dos indivíduos que fizeram uso do metronidazol sistêmico.
Foram observadas reduções significativas nos níveis e nas proporções dos
patógenos do complexo vermelho nesses indivíduos, e adicionalmente, as espécies
consideradas benéficas, como os Actinomyces, Streptococcus e V. parvulla, foram
minimamente afetadas por esses agentes.
Pahkla et al. (2005) compararam a concentração do metronidazol
sistêmico (500mg, 2 ou 3 x dia, por pelo menos 2 dias) no plasma, saliva e fluído
crevicular gengival, em indivíduos com periodontite crônica generalizada avançada.
A freqüência da dosagem foi escolhida pelo examinador clínico dependendo da
atividade e extensão da doença. Os resultados revelaram uma boa penetração do
metronidazol no fluído crevicular gengival e saliva. As concentrações do
metronidazol no fluído crevicular foram similares as concentrações da droga
disponíveis no plasma. Portanto, considerando a farmacocinética do metronidazol,
os autores sugeriram sua aplicação no tratamento da doença periodontal. Ainda em
2005, Poulet et al. mostraram que a terapia antibiótica com metronidazol (250mg, 3 x
23
dia/ 6 dias) ou metronidazol (250mg, 3 x dia/ 6 dias) associado à espiramicina
(250mg, 3 x dia/ 6 dias) sistêmicos, apresentam resultados consistentes na atividade
antimicrobiana in vitro e nas concentrações antibióticas locais, sugerindo que o
metronidazol sozinho ou combinado pode ser importante para o tratamento da
periodontite.
Haffajee et al. (2007) acompanharam, por um período de um ano, um
grupo de indivíduos portadores de periodontite crônica submetidos à terapia
mecânica ou combinada ao metronidazol sistêmico (250mg, 3 x dia/ 14 dias),
azitromicina sistêmica (500mg, 1 x dia/ 3 dias) ou uma dose sub-clínica de
doxiciclina (20mg, 2 x dia por 3 meses). Os autores observaram que o sítios que
inicialmente apresentavam profundidade de sondagem maiores que 6mm,
demonstraram significativa redução de profundidade e um importante ganho de
inserção em indivíduos que receberam metronidazol ou azitromicina sistêmicos,
demonstrando que a terapia antibiótica possui efeitos adicionais sobre a raspagem e
o alisamento radicular particularmente em sítios periodontais inicialmente profundos.
Em 2008, Haffajee et al. publicaram os dados microbiológicos realizados
no tempo inicial, 2 semanas, e 3, 6 e 12 meses para avaliação de 40 espécies pela
técnica do checkerboard DNA-DNA hybridization. A porcentagem das espécies e dos
sítios colonizados por espécies resistentes para os antibióticos testes foram
determinados em cada tempo. Todos os tratamentos reduziram a contagem do
complexo vermelho e foi mantida por 12 meses, entretanto nenhuma diferença
estatística foi encontrada entre os grupos terapêuticos em todos os tempos. Ambos
antibióticos reduziram a contagem das espécies do complexo vermelho em duas
semanas. A porcentagem de isolados resistentes aumentou nas amostras de
biofilme em todas as terapias coadjuvantes tanto na máxima concentração
antibiótica quanto no final da administração, entretanto retornaram para os níveis
pré-tratamento em um ano.
1.2.2 Metronidazol combinado à amoxicilina
Em 1928, Alexander Fleming, enquanto trabalhava com variantes de
estafilococos no laboratório do St Mary´s Hospital em Londres, observou que um
fungo ao contaminar uma de suas placas de cultura, promovia uma inibição no
crescimento bacteriano. Fleming isolou o fungo em cultura pura e demonstrou que
24
ele produzia uma substância antibacteriana, e que, portanto foi denominada de
penicilina, já que esse fungo pertencia ao gênero Penicillium. Essa substância foi
posteriormente extraída e seus efeitos antibacterianos foram analisados por Florey &
Chain et al. em Oxford, em 1940. Esses pesquisadores demonstraram que a
penicilina possuía poderosas propriedades quimioterápicas em camundongos
infectados e que era atóxica (HARE, 1970).
Todas as penicilinas possuem o mesmo mecanismo básico de ação, isto
é, inibem as enzimas responsáveis pela ligação cruzada dos polímeros de
peptidoglicano durante o último estágio da síntese da parede celular, resultando na
inibição da formação de uma parede celular intacta e completa, e produzindo uma
célula bacteriana instável na osmolalidade dos líquidos orgânicos. As penicilinas
constituem-se na primeira opção como coadjuvantes no tratamento das infecções
odontológicas leves e moderadas. A amoxicilina tem um amplo espectro de atividade
contra espécies anaeróbias estritas e facultativas subgengivais (WALKER et al.,
1985; KULIK et al., 2008). Atua sobre microrganismos cocos e bacilos Gram-
negativos devida à capacidade de penetrar nas barreiras lipídicas e na parede
celular mais complexa destes microrganismos, agindo sobre as enzimas situadas na
parte externa da membrana celular bacteriana lipoprotéica (MONTGOMERY et al.,
2000).
As características benéficas individuais da amoxicilina e do metronidazol e
a possível complementariedade de ação farmacológica para a cura da doença
periodontal tem levado pesquisadores a associar ambas as medicações como uma
terapia adjunta a terapia mecânica, com o objetivo de suprimir ou eliminar os
patógenos envolvidos com a doença e obter melhores resultados em longo prazo.
Entretanto, até o presente momento, a literatura está escassa em informações sobre
esta combinação antibiótica.
A destruição dos tecidos periodontais está fortemente associada à
presença de vários patógenos periodontais. Um destes microrganismos é o A.
actinomycetemcomitans. A periodontite agressiva (SLOTS et al., 1980; MANDELL &
SOCRANSKY, 1981; MANDELL et al., 1987) e a periodontite crônica (BRAGD et al.,
1987) estão associadas a presença do A. actinomycetemcomitans, sendo
conseqüência da sua supressão uma melhor resposta periodontal (VAN
WINKELHOFF et al.,1989 e 1992).
25
Pavicic et al. (1994) avaliaram a presença do A. actinomycetemcomitans
subgengivalmente, na mucosa julgal, tonsila e na saliva após dois anos da terapia
mecânica associada ao metronidazol (250mg, 3 x dia/ 7 dias) e amoxicilina (375mg,
3 x dia/ 7 dias) sistêmicos. Observaram resultados negativos para a presença do A.
actinomycetemcomitans em 47 dos 48 indivíduos do estudo, além de reduções na
profundidade de sondagem, nível clínico de inserção, índice de placa, sangramento
à sondagem em 3 e 24 meses após terapia ativa, sugerindo que esta terapia pode
ser efetiva para a supressão do A. actinomycetemcomitans por um longo período de
tempo.
López et al. (1998) avaliaram os efeitos clínicos e microbiológicos da
amoxicilina (500mg, 3 x dia/ 7 dias) e do metronidazol (250mg, 3 x dia/ 7 dias)
sistêmicos como uma única terapia, durante uma semana, em indivíduos portadores
de periodontite crônica moderada e avançada. Foram incluídos no estudo indivíduos
que apresentaram pelo menos dois sítios com >
2mm de perda de inserção clínica.
Os parâmetros clínicos mensurados foram sangramento à sondagem, índice de
placa, profundidade de sondagem e nível clínico de inserção. A porcentagem dos
sítios sangrantes diminuiu significantemente, para o grupo teste, nos tempos 2 e 4
meses após a terapia; e aumentou para o grupo controle, que recebeu apenas
medicação placebo. A média dos valores de nível clínico de inserção para os tempos
de 2 e 4 meses pós-terapia foi significantemente melhor para o grupo teste em
relação ao grupo controle. O grupo teste mostrou significante redução de sítios com
P. gingivalis e P. intermedia em relação ao grupo controle, mostrando que terapia
antibiótica proposta usada isoladamente, altera a proporção de alguns
microrganismos subgengivais e promove benefícios clínicos nas condições
periodontais.
Ainda nesta linha de pesquisa, em 2000, López et al. selecionaram
indivíduos portadores de periodontite crônica avançada e moderada que
apresentassem perda de nível clínico de inserção de >
2mm. Os indivíduos foram
aleatorizados em dois grupos conforme o estudo anterior, sendo que o grupo teste
recebeu metronidazol (250mg, 3 x dia/ 7 dias) e amoxicilina (500mg, 3 x dia/ 7 dias)
sistêmicos como terapia única, e o grupo controle recebeu apenas medicação
placebo. As principais diferenças com a publicação anterior foi que o regime
antibiótico foi repetido após 4 e 8 meses, e a avaliação microbiológica não foi
realizada. Os resultados demonstraram que após 2 meses e nas avaliações
26
posteriores, o grupo teste mostrou melhoras clínicas significantes, enquanto o grupo
controle demonstrou uma progressiva piora do estado periodontal. Após um ano, os
indivíduos do grupo teste mostraram significativo ganho de inserção de 0,43mm
(p=0,005), diminuição de sítios ativos (p<0,03), aumento de sítios que ganharam
inserção clínica (p<0,01), redução de profundidade de sondagem (p<0,00006) e
diminuição da porcentagem de sangramento à sondagem (p<0,0005). Os sítios que
mostraram perda de inserção >
2mm em avaliações sucessivas e abcesso
periodontal foram observados somente no grupo controle.
Winkel et al. (2001) avaliaram clínica e microbiologicamente indivíduos
com periodontite crônica generalizada avançada. Os indivíduos foram aleatorizados,
sendo que o grupo controle foi submetido somente ao tratamento mecânico, e ao
grupo teste foi adicionado o uso do metronidazol (250mg, 3 x dia/ 7 dias) e da
amoxicilina (375mg, 3 x dia/ 7 dias) sistêmicos. Observaram as maiores reduções
em profundidade de sondagem e ganho de inserção clínica no grupo teste e nos
sítios que eram inicialmente >
7mm. O número de indivíduos positivos para P.
gingivalis, T. forsythia e P. intermedia no grupo teste mostrou-se significativamente
menor. As diferenças na redução da profundidade de sondagem entre P. gingivalis
positivo e negativo, foi particularmente evidente no grupo teste.
Já em 2006, López et al. selecionaram indivíduos com pelo menos seis
sítios com profundidade de sondagem >
4mm e perda de inserção > 3mm que foram
divididos em dois grupos: teste (metronidazol - 250mg, 3 x dia/ 7 dias, e amoxicilina -
500mg, 3 x dia/ 7 dias, como terapia única) e controle (RAR). Os indivíduos foram
submetidos ao exame clínico e microbiológico por meio do teste checkerboard DNA-
DNA hybridization, realizados no início, 3, 6, 9 e 12 meses. Os autores concluíram
que as duas terapias promoveram melhoras, e as alterações nos parâmetros clínicos
e microbiológicos foram semelhantes entre os grupos teste e controle.
Mais recentemente, Moeintaghavi et al. (2007) estudaram a amoxicilina
(500mg, 3 x dia/ 7 dias) e o metronidazol (250mg, 3 x dia/ 7 dias) sistêmicos como
coadjuvantes ao tratamento da periodontite crônica. O estudo foi aleatorizado, duplo
cego, paralelo e placebo. Os parâmetros clínicos realizados foram profundidade de
sondagem, nível clínico de inserção, índice de placa, sangramento à sondagem. Os
sítios >
5mm foram selecionados para a análise microbiológica. Os resultados
demonstraram diferenças estatísticas nos parâmetros clínicos entre o grupo teste e o
grupo controle. Paralelamente as mudanças clínicas, houve uma redução
27
significativa no número dos A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis e P. intermedia,
no grupo teste, em relação aos dados iniciais. Após a terapia havia diferenças
estatísticas entre o grupo teste e controle em número de indivíduos negativos para
A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis e P. intermedia (p=0,033).
Apesar dos estudos mostrarem evidentes resultados sobre a associação
do metronidazol e da amoxicilina como coadjuvante à RAR no tratamento da
periodontite crônica, a literatura está escassa de dados sobre esta combinação na
população brasileira.
28
2 PROPOSIÇÃO
Avaliar e comparar as alterações clínicas e microbiológicas promovidas
pela terapia de RAR associada ou não ao metronidazol ou ao metronidazol e a
amoxicilina sistêmicos, no tratamento de indivíduos portadores de periodontite
crônica.
29
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Seleção de indivíduos
A seleção foi realizada por dois mestrandos em Odontologia, área de
concentração em periodontia, sob supervisão dos professores da disciplina, após a
apreciação e aprovação do projeto pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
Universidade Guarulhos (UnG). Aproximadamente 400 indivíduos que
compareceram à Clínica Odontológica da UnG foram triados para que 36 indivíduos
portadores de periodontite crônica fossem incluídos neste estudo. Todos os
participantes foram informados dos objetivos do estudo, de seus riscos e benefícios,
incluindo os tipos de medições clínicas, coletas e terapias a serem utilizadas. A
participação na pesquisa foi voluntária e os indivíduos assinaram um Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido, estando de acordo com a Resolução n° 196/96
das Diretrizes e Normas do Conselho Nacional de Saúde.
3.2 Critérios de inclusão e exclusão
Critérios de inclusão
Para a inclusão no estudo, a seleção dos participantes respeitou os
seguintes critérios:
- Voluntários portadores de periodontite crônica;
- Idade igual ou superior a 30 anos;
- Possuir um mínimo de 15 dentes, excluindo-se os terceiros molares;
- Mínimo de 6 dentes com pelo menos 1 sítio interproximal, não contíguo,
com PS entre 5 e 7mm e NCI entre 5 e 10mm, preferencialmente distribuídos em
sextantes distintos.
Critérios de exclusão
Os critérios de exclusão foram os seguintes:
- Fumantes e ex-fumantes há menos de 15 anos.
- Gestantes ou lactantes;
30
- Histórico de tratamento periodontal prévio nos últimos seis meses;
- Histórico de antibioticoterapia nos últimos seis meses;
-
Doença sistêmica que comprometesse a resposta do hospedeiro ou
exigisse medicação profilática ao tratamento;
- Relato de alergia ao metronidazol e/ou à penicilina;
- Reabilitações protéticas extensas.
3.3 Delineamento experimental
Para determinação do tamanho da amostra foi realizado o cálculo de
potência para os parâmetros clínicos, com base nos resultados de Ximenez-Fyvie et
al. (2000) e Feres et al. (1999 e 2001), encontrando uma potência superior a 80%
para uma amostragem de 10 indivíduos.
No início deste estudo duplo cego, aleatorizado, placebo controlado,
todos os indivíduos (n=36) foram submetidos à anamnese, exame clínico periodontal
e coleta de amostras de biofilme subgengival dos sítios selecionados (ver 3.6.1
Seleção dos sítios-teste). Em seguida, um pesquisador não envolvido diretamente
no estudo, fez a distribuição aleatória dos indivíduos por meio de uma tabela de
números equiprováveis nos seguintes grupos terapêuticos (n=12):
- Grupo controle (C): RAR + amoxicilina placebo (500mg) e metronidazol
placebo (400mg) 3 vezes ao dia durante 14 dias;
- Grupo teste 1 (T
1
): RAR + metronidazol sistêmico (400 mg) e
amoxicilina placebo (500mg) 3 vezes ao dia durante 14 dias;
- Grupo teste 2 (T
2
): RAR + metronidazol (400 mg) e amoxicilina (500
mg) sistêmicos 3 vezes ao dia durante 14 dias;
A antibioticoterapia foi iniciada no mesmo dia da terapia básica de RAR,
que foi realizada em 6 sessões e finalizada em 21 dias. A avaliação clínica e
microbiológica foi repetida na consulta de reavaliação 90 dias após o término do
tratamento. O protocolo experimental está apresentado na Figura 1.
31
Tempo
inicial
Cl
M
RSP
IHB
-
21 -7 0
90 dias
CL
M
C/T
1
/T
2
RAR
Delineamento Experimental
RAR: Raspagem e alisamento radicular
MTZ: Metronidazol 400 mg 3x/dia 14 dias
AMOX: Amoxicilina 500 mg 3x/dia 14 dias
PCB: Placebo 3x/dia 14 dias
Cl: Exame clínico
M: Avaliação Microbiológica
IHB: Instrução de Higiene Bucal
RSP: Raspagem Supragengival
MTZ
MTZ+AMOX
PCB
C (controle): RAR + PCB
T
1
( Teste 1): RAR + MTZ
T
T
2
2
( Teste 2): RAR + MTZ + AMOX
Figura 1. Delineamento experimental.
3.4 Avaliação clínico-periodontal
O exame clínico-periodontal foi efetuado no início do estudo com o
objetivo de realizar o diagnóstico do indivíduo e selecionar os sítios-testes. Dois
examinadores foram treinados e calibrados com o objetivo de conseguir a máxima
reprodutibilidade nas medições realizadas por cada um deles e entre eles. A
metodologia utilizada para a calibração foi preconizada por Araújo et al. (2003), que
avaliaram o erro padrão da medida (e.p.m.) e o erro médio percentual (e.m.p.) para
os parâmetros clínicos periodontais contínuos (profundidade de sondagem e nível
clínico de inserção). O e.p.m e o e.m.p variaram entre 0,09mm-0,31mm e 2,0%-
5,79%, respectivamente. Para as variáveis categóricas considerando a presença ou
ausência do parâmetro clínico, foi realizada a média do nível de concordância para
cada examinador e entre eles, obtendo-se concordância superior a 92% (Teste
Kappa).
32
As mensurações clínicas foram realizadas no início do estudo e 90 dias
pós terapia, em 6 sítios por dente (mesiovestibular, vestibular, distovestibular,
mesiolingual, lingual, distolingual), em todos os dentes (exceto terceiros molares)
utilizando-se sonda periodontal milimetrada Carolina do Norte (PCPUNC-BR 15
HuFriedy do Brasil, Rio de Janeiro, RJ, Brasil). Os parâmetros clínicos avaliados
incluíram:
-Índice de Placa Visível - IPV (AINAMO & BAY, 1975): presença (escore
1) ou ausência (escore 0) de placa supragengival visível;
-Índice de Sangramento Gengival - ISG (AINAMO & BAY, 1975): presença
(escore 1) ou ausência (escore 0) de sangramento da gengiva marginal, após
percorrer levemente a sonda periodontal ao longo do sulco gengival;
-Profundidade de Sondagem - PS: distância, em milímetros, entre a
margem gengival livre e a porção mais apical sondável do sulco/bolsa periodontal;
-Nível Clínico de Inserção - NCI: distância, em milímetros, entre a junção
cemento-esmalte e a porção mais apical sondável do sulco/bolsa periodontal;
-Sangramento à Sondagem - SS: presença (escore 1) ou ausência
(escore 0) de sangramento, após 20 segundos da sondagem com a sonda
periodontal milimetrada;
-Supuração - SUP: presença (escore 1) ou ausência (escore 0) de SUP
espontânea ou após 20 segundos da sondagem com a sonda periodontal
milimetrada.
3.5 Procedimentos terapêuticos
3.5.1 Terapia periodontal básica
Após o registro das medidas clínicas e coleta de biofilme subgengival para
a análise microbiológica, todos os indivíduos foram submetidos a sessões de
adequação do meio bucal que incluíam instrução de higiene bucal (IHB), raspagem
supragengival de todos os dentes (RSP) com instrumentos manuais, desgaste de
33
restaurações em excesso, selamento provisório das lesões cariosas cavitadas,
curativos endodônticos e exodontias. Durante as sessões de instrução de higiene
bucal, os indivíduos foram orientados a utilizar escovas com cerdas macias,
juntamente com creme dental Colgate Total
®
(Anacol Ind. E Com. Ltda - Kolynos do
Brasil – Colgate Palmolive Co., São Bernardo do Campo, SP, Brasil). Em seguida,
os indivíduos receberam seis sessões de RAR com curetas Gracey, números 5/6,
7/8, 11/12 e 13/14 (Hufriedy) sob anestesia local. Estas sessões de RAR foram
realizados por dois alunos treinados do Mestrado em Odontologia da Universidade
Guarulhos, tiveram duração de aproximadamente 1 hora e foram realizadas em no
máximo 21 dias, sendo que os sítios mais comprometidos foram tratados nos
primeiros 14 dias.
Os dois examinadores realizaram os exames clínicos-microbiológicos e
também a terapia de RAR, porém aquele examinador responsável pela execução da
RAR não realizava os exames no mesmo indivíduo.
As necessidades adicionais de tratamento odontológico, quando
observadas, foram encaminhadas às demais disciplinas da clínica odontológica da
própria Universidade.
3.5.2 Administração de metronidazol e amoxicilina sistêmicos e placebos
Indivíduos dos grupos-teste receberam RAR e administração de 1,2 g/dia
de metronidazol (400 mg de 8/8 hs) somente, ou combinado com 1,5 g/dia de
amoxicilina (500 mg de 8/8 horas) via oral por 14 dias, iniciada em conjunto a terapia
periodontal básica. Os pacientes do grupo controle receberam comprimidos de
placebo e foram orientados a seguirem o mesmo regime dos pacientes que
receberam as substâncias ativas. O antibiótico e o placebo foram manipulados
especialmente para este estudo na Farmácia de Manipulação Ervanário (Maringá,
PR, Brasil). Todas as cápsulas (medicação ou placebo) apresentaram a mesma
coloração e tamanho, e foram estocados em frascos plásticos leitosos com 21
unidades, devidamente codificados. Quanto ao controle da ingestão da droga nos
intervalos pré-determinados, os indivíduos foram orientados a retornar na próxima
semana à clínica de Odontologia- UnG, trazendo o frasco vazio para depois receber
outro frasco contendo a mesma medicação. Além disso, também foram monitorados
34
de 4 em 4 dias, pessoalmente ou via telefone, por um aluno de iniciação científica.
Após o término do período de administração da droga e/ou placebo, os indivíduos
responderam a um questionário (ANEXO A) sobre possíveis reações adversas da
medicação.
3.6 Avaliação microbiológica
3.6.1 Seleção dos sítios-testes
Foram selecionados nove sítios em cada voluntário, distribuídos
uniformemente de acordo com a profundidade de sondagem inicial nas seguintes
categorias (3 sítios por categoria): rasas (PS ≤ 3mm), intermediárias (PS 4-6 mm), e
profundas (PS ≥ 7mm). Quando um dos 3 sítios profundos não foi encontrado, o
mesmo foi substituído por sítio intermediário. Estes sítios estavam localizados em
faces dentais interproximais não-contíguas, e preferencialmente distribuídos entre os
quatro quadrantes. Sítios localizados em dentes com próteses mal adaptadas, lesão
de cárie extensa e/ou lesão endo-periodontal não foram utilizados. Amostras de
biofilme foram coletadas no início do estudo e 90 dias pós-terapia.
3.6.2 Coleta das amostras de biofilme subgengival
Após a remoção de cálculo e biofilme supragengivais, as amostras de
biofilme subgengival foram retiradas com curetas Gracey do tipo minifive 11-12
estéreis, posicionadas na porção mais apical dos sítios e em um único golpe de
raspagem no sentido ápico-coronal. As amostras foram imediatamente depositadas
em tubos plásticos individuais contendo 150μL de solução tampão TE (10 mM Tris-
HCL (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA), 1 mM EDTA (Labsynth
Produtos para Laboratórios Ltda, Diadema, SP, Brasil), pH 7,6, e a estas foi
acrescentado 100μL de NaOH (Labsynth) a 0,5M para que o DNA bacteriano
permanecesse viável por um longo período de tempo. Esses tubos plásticos foram
previamente identificados com o código do indivíduo, data e sítio, e após a coleta
foram armazenados sob refrigeração a -20ºC até as amostras serem analisadas por
35
meio da técnica do checkerboard DNA-DNA hybridization para 40 cepas bacterianas
no Laboratório de Pesquisa em Odontologia II da UnG.
3.6.3 Cepas bacterianas e condições de crescimento
A lista das 40 cepas bacterianas utilizadas neste estudo para o preparo
das sondas de DNA está apresentada na Tabela 1. Todas as cepas foram
adquiridas liofilizadas da ATCC (Americam Type Culture Collection, Rockville, MD,
EUA) ou do Forsyth Institute (Boston, MA, EUA). O conteúdo liofilizado foi reidratado
em caldo para crescimento de Mycoplasma (Difco Laboratories, Detroit, MI, EUA) e
cultivado em ágar-triptose de soja (Difco) contendo 5% de sangue desfibrinado de
ovelha (BBL, Baltimore Biological Laboratories, Cockeysville, MD, EUA) a 35ºC sob
condição de anaerobiose (80% N
2
, 10% CO
2
, 10% H
2
). Algumas bactérias foram
cultivadas em meios de cultura enriquecidos de forma a suprir suas necessidades
nutricionais. T. forsythia, por exemplo, foi cultivada em ágar-triptose de soja com 5%
de sangue desfibrilado de ovelha e 10 μg/mL de ácido N-acetil murâmico (NAM)
(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA); enquanto P. gingivalis cresceu em um
meio similar, suplementado com 5% de sangue desfibrilado de ovelha, 0,3 μg/mL de
menadiona (Sigma) e 5 μg/mL de hemina (Sigma). As espécies T. denticola e
Treponema socranskii foram cultivados em caldo para crescimento de Mycoplasma
suplementado com 1 mg/mL de glicose (Sigma), 400 μg/mL de niacinamida (Sigma),
150 μg/mL de espermina tetraidroclorídrica (Sigma), 20 μg/mL de isobutirato de
sódio (ICN, Costa Mesa, CA, EUA), 1 mg/mL de L-cisteína (Sigma), 5 μg/mL de
tiamina pirofosfato (Sigma) e 0,5% de soro bovino (Laborclin, São José dos
Pinhais, PR, Brasil).
3.6.4 Isolamento do DNA e preparo das sondas
As cepas bacterianas foram cultivadas anaerobicamente na superfície de
ágar-sangue, com exceção das 2 espécies de espiroquetas, que foram cultivadas
em caldo, por 3 a 7 dias. As colônias foram raspadas e depositadas em tubos
plásticos para microcentrífuga de 1,5 mL contendo 1 mL de solução TE (pH 7,6). As
células foram lavadas 2 vezes por centrifugação na solução-tampão de TE a 3.500xg
36
por 10 minutos. Em seguida, as cepas gram-negativas foram novamente suspensas
e lisadas com SDS (dodecilsulfato de sódio, C
12
H
25
NaO
4
S, Labsynth) a 10% e
proteinase K (Sigma) em uma concentração de 20 mg/mL. As cepas de bactérias
gram-positivas foram lisadas em 150µL de uma mistura enzimática contendo 15
mg/mL de lisozima (Sigma) e 5 mg/mL de acromopeptidase (Sigma) em solução
tampão TE (pH 8,0).
Tabela 1. Relação das cepas bacterianas empregadas para a confecção das sondas
de DNA. As espécies estão agrupadas por complexos bacterianos (Socransky et al.,
1998; Socransky & Haffajee, 2002).
Espécies Cepas Espécies Cepas
C
C
o
o
m
m
p
p
l
l
e
e
x
x
o
o
A
A
z
z
u
u
l
l
C
C
o
o
m
m
p
p
l
l
e
e
x
x
o
o
L
L
a
a
r
r
a
a
n
n
j
j
a
a
(
(
c
c
o
o
n
n
t
t
.
.
)
)
Actinomyces gerencseriae
23860
a
Fusobacterium nucleatum ssp nucleatum
25586
a
Actinomyces israelii
12102
a
Fusobacterium nucleatum ssp polymorphum
10953
a
Actinomyces naeslundii I
12104
a
Fusobacterium nucleatum ssp vincentii
49256
a
Actinomyces naeslundii II
43146
a
Fusobacterium periodonticum
33693
a
C
C
o
o
m
m
p
p
l
l
e
e
x
x
o
o
R
R
o
o
x
x
o
o
Parvimonas micra
33270
a
Actinomyces odontolyticus
17929
a
Prevotella intermedia
25611
a
Veillonella parvula
10790
a
Prevotella nigrescens
33563
a
C
C
o
o
m
m
p
p
l
l
e
e
x
x
o
o
A
A
m
m
a
a
r
r
e
e
l
l
o
o
Streptococcus constellatus
27823
a
Streptococcus gordonii
10558
a
C
C
o
o
m
m
p
p
l
l
e
e
x
x
o
o
V
V
e
e
r
r
m
m
e
e
l
l
h
h
o
o
Streptococcus intermedius
27335
a
Tannerella forsythia
43037
a
Streptococcus mitis
49456
a
Porphyromonas gingivalis
33277
a
Streptococcus oralis
35037
a
Treponema denticola
B1
b
Streptococcus sanguinis
10556
a
O
O
u
u
t
t
r
r
a
a
s
s
E
E
s
s
p
p
é
é
c
c
i
i
e
e
s
s
C
C
o
o
m
m
p
p
l
l
e
e
x
x
o
o
V
V
e
e
r
r
d
d
e
e
Eubacterium saburreum
33271
a
Gemella morbillorum
27824
a
Actinobacillus
actinomycetemcomitans a + b
43718
a
29523
a
Leptotrichia buccalis
14201
a
Capnocytophaga gingivalis
33624
a
Neisseria mucosa
19696
a
Capnocytophaga ochracea
33596
a
Prevotella melaninogenica
25845
a
Capnocytophaga sputigena
33612
a
Eikenella corrodens
23834
a
Propionibacterium acnes I + II
11827
a
11828
a
C
C
o
o
m
m
p
p
l
l
e
e
x
x
o
o
L
L
a
a
r
r
a
a
n
n
j
j
a
a
Selenomonas noxia
43541
a
Campylobacter gracilis
33236
a
Streptococcus anginosus
33397
a
Campylobacter rectus
33238
a
Treponema socranskii
S1
b
Campylobacter showae
51146
a
Eubacterium nodatum
33099
a
a
ATCC (American Type Culture Collection);
b
Forsyth Institute
37
O DNA foi isolado e purificado como descrito por Smith et al. (1989). As
sondas genômicas foram preparadas para cada uma das 40 espécies pela marcação
de 1 μg do DNA bacteriano com digoxigenina, por meio do random primer
digoxigenin labeling kit (Roche Diagnostics, Indianápolis, IN, EUA), de acordo com o
método descrito por Feinberg & Vogelstein (1983). As espécies avaliadas foram
selecionadas segundo suas associações com diferentes tipos de doenças ou saúde
periodontal (SOCRANSKY & HAFFAJEE, 1994c; SOCRANSKY & HAFFAJEE,
2005).
3.6.5 checkerboard DNA-DNA hybridization
As suspensões contidas nos tubos plásticos foram fervidas em banho-
maria por 10 minutos e, em seguida, neutralizadas pela adição de 0,8 ml de acetato
de amônia a 5M. Cada suspensão de biofilme dental contendo o DNA livre foi
depositada em uma das canaletas do Minislot 30 (Immunetics, Cambridge, MA, EUA
– Figura 2) e transferida para a membrana de nylon (15 x 15 cm) com carga positiva
(Amersham Biosciences UK Limited, Buckinghamshire, Inglaterra). As duas últimas
das 30 canaletas do Minislot foram ocupadas por controles contendo uma mistura
das espécies de microrganismos investigados pelas sondas, nas concentrações
correspondentes a 10
5
e 10
6
células, ou seja, 1 ηg e 10 ηg de DNA de cada espécie,
respectivamente (SOCRANSKY et al., 1994c; HAFFAJEE et al.,1997). A membrana
foi removida do Minislot 30 e o DNA nela concentrado foi fixado por aquecimento em
forno a 120°C por 20 min.
A membrana foi pré-hibridizada a 42°C, por 1 hora, em uma solução
contendo 50% formamida (Vetec Química Fina Ltda, Rio de Janeiro, RJ, Brasil), 1%
caseína (Vetec), 5 x solução salina citratada (SSC) (1 x SSC= 150mM NaCl (Vetec),
15M de citrato de sódio (J.T.Baker, Edo. de Méx., México) , pH 7,0, 25mM de fosfato
de sódio (Na
2
HPO
4
, Labsynth) pH 6,5 e 0,5 mg/mL de RNA de levedura (Sigma).
Em seguida, a membrana foi posicionada no Miniblotter 45 (Immunetics,
Cambridge, MA, EUA – Figura 3) com as linhas contendo o DNA das amostras e dos
controles posicionadas perpendicularmente às canaletas do aparato. Em cada
canaleta do Miniblotter 45 foi adicionada uma sonda de DNA, diluída a
aproximadamente 20 ηg/mL, em 130 μL de solução de hibridização composta de
38
45% formamida, 5 x SSC, 20mM de Na
2
HPO
4
(pH 6,5), 0,2 mg/ml de RNA de
levedura, 10% de sulfato de dextrano (Amersham) e 1% caseína. A hibridização
ocorreu dentro de um período mínimo de 20 horas, a 42°C.
Canaleta
aberta
Canaleta
Canaleta
aberta
aberta
Membrana de
nylon
Membrana de
Membrana de
nylon
nylon
Filtro
Filtro
Filtro
Colocar amostra em
150µl solução tampão TE pH 7,6
Colocar amostra em
Colocar amostra em
150
150
µ
µ
l solu
l solu
ç
ç
ão tampão TE pH 7,6
ão tampão TE pH 7,6
Ferver durante 10 minutos
Ferver durante 10 minutos
Ferver durante 10 minutos
Adicionar 100µl NaOH 0,5M
Adicionar 100
Adicionar 100
µ
µ
l NaOH 0,5M
l NaOH 0,5M
Adicionar 800µl Acetato de
Amônia 5M
Adicionar 800
Adicionar 800
µ
µ
l Acetato de
l Acetato de
Amônia 5M
Amônia 5M
Depositar amostras nas
canaletas do MiniSlot 30
Depositar amostras nas
Depositar amostras nas
canaletas do
canaletas do
MiniSlot
MiniSlot
30
30
Fixar DNA na membrana a 120° C
por 20 min
Fixar DNA na membrana a 120
Fixar DNA na membrana a 120
°
°
C
C
por 20 min
por 20 min
Figura 2. Representação gráfica do Minislot 30 (Immunetics, Cambridge, MA, EUA) e
resumo da preparação e colocação das amostras de biofilme subgengival na membrana de
nylon (técnica checkerboard DNA-DNA hybridization).
Canaletas de
hibridização
Canaletas de
Canaletas de
hibridiza
hibridiza
ç
ç
ão
ão
Membrana de nylon
Membrana de
Membrana de
nylon
nylon
Lavagem de alta adstringência em
solução tampão SSC 0.4M a 65°C por
40 min
Lavagem de alta adstringência em
Lavagem de alta adstringência em
solu
solu
ç
ç
ão tampão SSC 0.4M a 65
ão tampão SSC 0.4M a 65
°
°
C por
C por
40 min
40 min
Anticorpo anti-digoxigenina conjugad
o
à fosfatase alcalina 1:10.000
Anticorpo
Anticorpo
anti
anti
-
-
digoxigenina
digoxigenina
conjugado
conjugado
à
à
fosfatase alcalina 1:10.000
fosfatase alcalina 1:10.000
Pré-hibridização a 42°C 1 hr
Pr
Pr
é
é
-
-
hibridiza
hibridiza
ç
ç
ão a 42
ão a 42
°
°
C 1 hr
C 1 hr
Girar membrana 90°
Girar membrana 90
Girar membrana 90
°
°
Hibridização em buffer de
formamida a 42°C 20 hrs
Hibridiza
Hibridiza
ç
ç
ão em
ão em
buffer
buffer
de
de
formamida a 42
formamida a 42
°
°
C 20
C 20
hrs
hrs
Detecção por quimioluminescência com
CDP-Star™ Detection Reagent
Detec
Detec
ç
ç
ão por
ão por
quimioluminescência
quimioluminescência
com
com
CDP
CDP
-
-
Star
Star
™
™
Detection
Detection
Reagent
Reagent
Sondas de DNA genômicas marcadas
com digoxigenina
Sondas de DNA
Sondas de DNA
genômicas
genômicas
marcadas
marcadas
com
com
digoxigenina
digoxigenina
Figura 3. Representação gráfica do Miniblotter 45 (Immunetics, Cambridge, MA, EUA) e
resumo das etapas de hibridização e detecção das espécies bacterianas presentes nas
amostras de biofilme subgengival (técnica checkerboard DNA-DNA hybridization).
39
3.6.6 Detecção das espécies
Após o período de hibridização, a membrana foi removida do Miniblotter
45 (Immunetcs), lavada por 40 minutos a 65ºC numa solução adstringente composta
por 1% de SDS, 1mM de EDTA e 20mM de Na
2
HPO
4
, a fim de remover sondas que
não hibridizaram completamente. Em seguida, a membrana foi imersa por 1 hora em
uma solução contendo 1% de ácido maleico (C
4
H
4
O
4
, Vetec), 3M NaCl, 0,2M NaOH
(Labsynth), 0,3% Tween 20 (Vetec), 0,5% caseína, pH 8,0, e, logo após, por 30
minutos, na mesma solução contendo o anticorpo anti-digoxigenina conjugado à
fosfatase alcalina (Roche) em uma concentração de 1:10.000. A membrana foi,
então, lavada 2 vezes, por 20 minutos, em uma solução de 0,1M de ácido maleico,
3M de NaCL, 0,2M de NaOH, 0,3% de Tween 20, pH 8,0, e 1 vez, por 5 minutos, em
uma solução de 0,1M de Tris HCl, 0,1M de NaCl, pH 9,5.
Para a detecção dos sinais a membrana foi incubada por 45 minutos a
37°C em uma solução detectora contendo substrato para fosfatase alcalina, CDP-
Star™ Detection Reagent (Amersham). Em seguida, a membrana foi colocada em
um cassete, Chassi Radiográfico 30 x 40 cm (Konex, São Paulo, SP, Brasil), sob um
filme radiográfico 18 x 24 cm (Agfa Gevaert, NV, Bélgica) por aproximadamente 40
minutos. O filme foi posteriormente revelado (Figura 4) manualmente pelo método
convencional temperatura-tempo, de acordo com orientações do fabricante. As
soluções utilizadas foram da marca Kodak (Kodak Brasileira Com. e Ind. Ltda, São
José dos Campos, SP, Brasil), mantidas a temperatura de 20ºC.
A leitura dos filmes radiográficos foi realizada por um único examinador
treinado, calibrado e cego para as terapias empregadas. A leitura foi realizada 2
vezes, em dias diferentes, para conferência de resultados. Cada sinal produzido por
uma determinada sonda na amostra de biofilme foi comparado, em intensidade, ao
sinal produzido pela mesma sonda nas 2 linhas de controles contendo 10
5
e 10
6
bactérias. Desta forma, o número 0 foi registrado quando não houve detecção do
sinal; 1 equivaleu a um sinal menos intenso que o controle de 10
5
células; 2
equivaleu a 10
5
células; 3 entre 10
5
e 10
6
células; 4 a aproximadamente 10
6
células
e 5 mais de 10
6
células (Tabela 2). Estes registros foram utilizados para determinar
os níveis das diferentes espécies investigadas nas diferentes amostras avaliadas.
40
Figura 4. Representação esquemática do padrão de hibridização entre as bactérias
presentes nas amostras de biofilme e as sondas de DNA (técnica checkerboard
DNA-DNA hybridization).
Tabela 2. Índice utilizado para a determinação dos níveis dos microrganismos nas
amostras de biofilme subgengival.
ÍNDICE NÍVEL DO MICRORGANISMO CONTAGEM
0 Não detectado 0
1 Menos de 10
5
células 10.000
2 Aproximadamente 10
5
células 100.000
3 Entre 10
5
e 10
6
células 500.000
4 Aproximadamente 10
6
células 1.000.000
5 Mais de 10
6
células 10.000.000
41
3.7 Análise estatística
3.7.1 Avaliação clínico-periodontal
A média dos parâmetros clínicos de boca toda avaliados foi computada
para cada indivíduo e, posteriormente, dentro de cada grupo. De maneira
semelhante, as médias das alterações dos parâmetros clínicos nos dois tempos
experimentais foram categorizadas em sítios rasos (PS ≤ 3mm), intermediários (PS
4-6 mm), e profundos (PS ≥ 7mm). Foram feitas as médias para cada um dos
valores clínicos separadamente dentro das 3 categorias, em cada indivíduo, e então
a média entre os indivíduos de um mesmo grupo, entre os tempos experimentais
(inicial e 90 dias pós-terapia), foram avaliadas utilizando o teste Wilcoxon. Os testes
de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney foram utilizados para examinar diferenças entre
os 3 grupos terapêuticos em cada tempo experimental. A significância estatística foi
estabelecida em 5% (p<0,05).
3.7.2 Avaliação microbiológica
Os dados microbiológicos resultaram da análise das 40 espécies
bacterianas em 9 amostras de biofilme subgengival por indivíduo, e foram expressos
de 2 maneiras: contagens (níveis) e % de contagem das sondas de DNA
(proporção). Todos os dados iniciais (níveis e proporções), foram analisados pelos
testes de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney para detectar possíveis diferenças
significantes entre os 3 grupos terapêuticos.
Os níveis médios (x 10
5
) e a proporção de cada espécie foram
computadas para cada sítio, depois foram calculadas as médias entre os sítios em
cada indivíduo, e então entre os indivíduos de um mesmo grupo terapêutico em
cada tempo experimental.
Diferenças nos níveis médios ou nas proporções de microrganismos
dentro de cada grupo, entre o início do estudo e 90 dias pós-terapia, foram avaliadas
por meio do teste Wilcoxon. A significância estatística foi estabelecida em 5%. Todas
as análises foram realizadas utilizando ajustes para comparações múltiplas, como
42
proposto por Socransky et al. (1991). Foi aplicada a fórmula 0,05 = 1 – (1-k)
40
, onde
k é o valor equivalente ao p<0,05, quando ajustado para comparação de 40
bactérias. Desta forma, as diferenças detectadas foram consideradas significativas
quando p<0,00125 (p<0,05).
43
4 RESULTADOS
Os dados obtidos nas avaliações clínicas e microbiológicas dos indivíduos
com doença periodontal crônica estão apresentados nas Tabelas 3-5 e nas Figuras
5-12. Dos 36 indivíduos, selecionados no início do estudo e aleatoriamente
distribuídos entre os três grupos terapêuticos, quatro foram excluídos da análise dos
resultados clínicos por terem faltado à consulta de reavaliação. Outros cinco
indivíduos foram excluídos da análise microbiológica devido a problemas durante o
processamento laboratorial das amostras. Sendo assim, no final do estudo, 12
indivíduos pertenciam ao grupo controle (C), 10 e 7 ao grupo que ingeriu
metronidazol (T
1
) e, 10 e 8 ao grupo que ingeriu metronidazol e amoxicilina (T
2
),
respectivamente para os resultados clínicos e microbiológicos.
4.1 Resultados clínicos
As características epidemiológicas e as médias dos parâmetros clínicos
avaliados no exame inicial e 90 dias pós-terapia, nos três grupos terapêuticos, estão
apresentadas na Tabela 3 e Figura 5. Os resultados demonstraram que os grupos
eram homogêneos no início do estudo em relação aos parâmetros clínicos.
As três terapias propostas promoveram melhoras clínicas nos três grupos
terapêuticos, evidenciadas por reduções estatisticamente significantes (p<0,01) em
todos os parâmetros clínicos (Figura 5). A Tabela 3 demonstra que após a terapia
não houve diferença entre os três grupos para os parâmetros PS, NCI e SUP
(p>0,05). Em relação ao percentual de sítios com IPV e SS escore 1, os grupos T
1
e
T
2
apresentaram valores semelhantes entre si (p>0,05), porém inferiores ao grupo C
que foram 40,7 +
8,7% e 40,6 + 6,2%, respectivamente. Já o percentual de sítios
com ISG=1 foi inferior no grupo T
2
(12,4 + 7,2%) em comparação aos grupos T
1
(22,1 + 9,5%) e C (24,0 + 12,3%), que não apresentaram diferenças estatísticas
(p>0,05).
44
Tabela 3. Média (±DP) dos parâmetros clínicos, no exame inicial e 90 dias pós-
terapia, para os três grupos terapêuticos.
Grupos terapêuticos
Controle T
1
T
2
Variáveis
(RAR) (RAR + M) (RAR + M + A)
n=12 n=10 n=10
Gênero (Ma / Fe) 6 / 6 4 / 6 4 / 6
Idade (anos) 48,9 + 12,4 38,6 + 6,1 45,5 + 9,6
Exame inicial
PS (mm) 3,79 + 0,56 3,82 + 0,61 3,91 + 0,61
NCI (mm) 4,37 + 0,90 4,21 + 0,86 4,32 + 0,6
% sítios
IPV 1 82,8 +
14,29 74,5 + 19,6 84,1 + 8,8
ISG 1 47,2 +
21,56 52,6 + 21,1 44,7 + 21,1
SS 1 79,2 +
18,9 87,2 + 9,2 80,5 + 14,1
Sup1 0,25 +
0,60 0,44 + 0,93 0,08 + 0,25
Exame 90 dias
PS (mm) 3,25 + 0,38 3,14 + 0,33 2,94 + 0,40
NCI (mm) 3,85 +
0,68 3,67 + 0,64 3,29 + 0,59
% sítios
PV 1 * 40,7 +
8,7ª 33,2 + 5,0
b
31,5 + 5,3
b
ISG 1* 24,0 +
12,3ª 22,1 + 9,5ª 12,4 + 7,2
b
SS 1* 40,6 +
6,2ª 33,3 + 5,6
b
27,6 + 6,3
b
Sup 1 0,05 +
0,20 0 0
RAR: Raspagem e alisamento radicular; M: Metronidazol; A: Amoxicilina; PS: Profundidade de
Sondagem; NCI: Nível Clínico de Inserção; IPV 1: Índice de Placa Visível (escore 1); ISG 1: Índice de
Sangramento Gengival (escore 1); SS 1: Sangramento à Sondagem (escore 1); Sup 1: Supuração
(escore 1).
* Teste Kruskal-Wallis (p<0,05).
Teste U de Mann-Whitney: Letras distintas entre os tratamentos indicam as diferenças
estatísticas existentes.
45
Figura 5. Média dos parâmetros clínicos de boca toda analisados no início do estudo e aos 90 dias pós-terapia, nos três grupos terapêuticos.
RAR: Raspagem e alisamento radicular; M: Metronidazol; A: Amoxicilina
Teste Wilcoxon: Diferenças entre as médias em cada grupo, ao longo do período experimental (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001).
46
Figura 6 apresenta as alterações nas médias de boca toda para os
parâmetros PS, NCI e SS entre o início do estudo e 90 dias pós-terapia. Houve
redução nos valores destes três parâmetros em todos os grupos terapêuticos. As
reduções nas médias de PS foram 0,54 +
0,2mm para o grupo C, 0,68 + 0,3mm para
o grupo T
1
e 0,9 + 0,4mm para o grupo T
2
, sem diferenças estatísticas entre eles.
Em relação ao SS, os grupos T
1
(53,9 + 10,6mm) e T
2
(52,9 + 9,2mm) apresentaram
valores semelhantes (p>0,05) e superiores ao grupo C (38,6 +
12,3mm, p<0,05).
Não foram observadas diferenças estatísticas entre as reduções do NCI dos grupos
C e T
1
, que obtiveram os valores de 0,52 + 0,3mm e 0,54 + 0,3mm, respectivamente;
porém o melhor resultado clínico foi evidenciado no grupo T
2
, com redução de 1,03 +
0,38mm (p<0,05).
Para um melhor entendimento do efeito das diferentes terapias e para
permitir comparações mais claras entre os grupos, os sítios foram divididos em
categorias baseadas nos valores iniciais de PS, sendo rasos (PS <
3mm),
intermediários (PS 4-6mm) e profundos (PS >
7mm). A Tabela 4 apresenta os
valores médios para os parâmetros clínicos PS e NCI no início do estudo e 90 dias
pós-terapia nas três categorias de PS estabelecidas inicialmente. Considerando os
sítios rasos, não foram observadas diferenças estatísticas quando as terapias
propostas foram comparadas dentro do mesmo tempo, ou os diferentes tempos em
cada grupo experimental, para as variáveis PS e NCI. As três terapias promoveram
melhoras clínicas em PS e NCI após 90 dias nos sítios intermediários e profundos.
Comparando os três grupos em cada tempo experimental, as diferenças apareceram
após 90 dias, quando os valores de PS nos sítios intermediários dos grupos C (3,69
+
0,36mm) e T
1
(3,64 + 0,28mm) não foram estatisticamente diferentes (p>0,05),
porém superiores ao grupo T
2
(3,31 + 0,42mm); e nos sítios profundos foram iguais
entre os grupos T
1
(4,52 + 1,00mm) e T
2
(4,33 + 0,66mm), e inferiores ao grupo C
(5,31 +
1,19mm). Em relação ao NCI, nos sítios intermediários não foram
observadas diferenças estatísticas entre os grupos T
1
(4,14 + 0,52mm) e T
2
(3,87 +
0,57mm) que foram inferiores ao grupo C (4,40 +
0,69mm). Resultados semelhantes
foram observados nos sítios profundos (C=6,79 +
2,21mm, T
1
= 5,22 + 1,33mm e
T
2
=5,34 + 0,104).
A Figura 7 apresenta as alterações ocorridas nas médias de PS e NCI aos
90 dias pós-terapia para os três grupos terapêuticos (C, T
1
e T
2
), de acordo com as
categorias iniciais de sondagem. Em uma análise geral, nota-se em todas as
47
categorias de profundidade de sondagem inicial (sítios rasos, intermediários e
profundos) que os grupos que receberam antibiótico como parte da terapia (T
1
e T
2
)
mostraram uma superioridade em relação à diminuição da média de PS e NCI em
comparação ao grupo C, principalmente o grupo que associou metronidazol e
amoxicilina (T
2
). As terapias com antibióticos reduziram mais efetivamente a PS e o
NCI dos sítios profundos em relação à terapia mecânica (grupo C, p<0,05), sendo
que não houve diferença estatística entre T
1
e T
2
.
48
RAR: Raspagem e alisamento radicular; M: Metronidazol; A: Amoxicilina; PSi: Profundidade de
Sondagem inicial; PS: Profundidade de Sondagem; PS 90: Profundidade de Sondagem aos 90 dias
pós-terapia; NCI: Nível Clínico de Inserção; NCI 90: Nível Clínico de Inserção aos 90 dias pós-
terapia.
Diferenças entre os grupos: * Teste Kruskal-Wallis (p<0,05) - Teste U de Mann-Whitney, letras
minúsculas distintas entre os grupos terapêuticos indicam as diferenças estatísticas existentes.
Diferenças entre os tempos: * Wilcoxon (p<0,05), letras maiúsculas distintas entre os tempos
experimentais indicam as diferenças estatísticas existentes.
Tabela 4. Média (±DP) dos parâmetros clínicos (PS, NCI), no exame inicial e 90
dias pós- terapia para os três grupos terapêuticos, para as diferentes categorias
de profundidade de sondagem inicial.
Grupos terapêuticos
Controle T
1
T
2
Variáveis
(RAR) (RAR + M) (RAR + M + A)
n=12 n=10 n=10
PSi <
3mm (sítios rasos)
PS 2,46 + 0,22 2,49 + 0,86 2,53 + 0,83
PS 90 2,25 + 0,31 2,50 + 0,22 2,35 + 0,25
NCI 3,22 + 0,56 3,00 + 0,42 3,01 + 0,74
NCI 90 3,01 +
0,52 3,08 + 0,50 3,02 + 0,54
PSi 4-6mm (sítios intermediários)
PS 4,75 + 0,19 A 4,71 + 0,20 A 4,76 + 0,22 A
PS 90* 3,69 + 0,36ª B 3,64 + 0,28ª B 3,31 + 0,42
b
B
NCI 5,37 + 0,64 A 5,04 + 0,46 A 5,08 + 0,40 A
NCI 90* 4,40 +
0,69ª B 4,14 + 0,52
b
B 3,87 + 0,57
b
B
PSi >
7mm (sítios profundos)
PS 8,07 + 0,71 A 8,08 + 0,83 A 7,72 + 0,49 A
PS 90* 5,31 + 1,19ª B 4,52 + 1,00
b
B 4,33 + 0,66
b
B
NCI 8,87 + 1,95 A 8,31 + 1,03 A 8,28 + 0,79 A
NCI 90* 6,79 +
2,21ª B 5,22 + 1,33
b
B 5,34 + 1,04
b
B
49
Figura 6. Alterações nas médias de profundidade de sondagem, nível clínico de inserção e sangramento à sondagem, de boca toda, ocorridas entre a
consulta inicial e 90 dias pós-terapia nos três grupos terapêuticos.
RAR: Raspagem e alisamento radicular; M: Metronidazol; A: Amoxicilina
Teste Kruskal-Wallis (p<0,01). Letras distintas indicam diferenças significativas entre os grupos (Teste U de Mann-Whitney, p<0,05).
50
Figura 7. Alterações nas médias de profundidade de sondagem (PS) e nível clínico de inserção
(NCI), de acordo com as categorias de profundidade de sondagem, ocorridas entre a consulta inicial e
90 dias pós-terapia nos três grupos terapêuticos.
RAR: Raspagem e alisamento radicular; M: Metronidazol; A: Amoxicilina
Teste Kruskal-Wallis (p<0,01)
Teste U de Mann-Whitney (p<0,05): Letras distintas indicam diferenças significativas entre os grupos.
51
4.2 Resultados microbiológicos
A Figura 8 apresenta a média de contagem (x10
5
) e a proporção das 40
espécies bacterianas avaliadas, nos três grupos experimentais (C, T
1
e T
2
) no início
do estudo. Os níveis e proporções médios de cada espécie bacteriana foram
computados para cada indivíduo e depois dentro do grupo. A composição da
microbiota subgengival nos três grupos terapêuticos mostrou-se com perfis
semelhantes, ou seja, não foram encontradas diferenças estatísticas em níveis ou
proporções para nenhuma das espécies bacterianas analisadas. Isso demonstra a
homogeneidade das amostras no início do estudo.
A média de contagem (x10
5
) das espécies subgengivais no início do
estudo e aos 90 dias pós-terapia, para os três grupos terapêuticos, está apresentada
na Figura 9. As três terapias alteraram significativamente os níveis de vários
microrganismos, principalmente, em relação aos complexos laranja e vermelho. Aos
90 dias foram observadas reduções em seis espécies bacterianas no grupo C (S.
sanguinis, C. gracilis, E. nodatum, P. micra, P. gingivalis, T. denticola), seis no grupo
T
1
(E. nodatum, P. micra, T. forsythia, P. gingivalis, T. denticola, Prevotella
melaninogenica) e, no grupo T
2
, 13 espécies reduziram (S. oralis, C. rectus, C.
showae, E. nodatum, Fusobacterium nucleatum ssp nucleatum, Fusobacterium
nucleatum ssp polymorphum, Fusobacterium nucleatum ssp vincentii, P. micra,
Streptococcus constellatus, T. forsythia, P. gingivalis, T. denticola, P.
melaninogenica) e três aumentaram, sendo Capnocytophaga gingivalis,
Streptococcus anginosus e S. noxia.
A média percentual da proporção das espécies de cada uma das 40
espécies avaliadas, antes e após o tratamento, está apresentada na Figura 10. De
maneira semelhante à contagem, as três terapias atuaram de modo mais marcante
sobre os complexos laranja e vermelho, principalmente no grupo T
2
. Aos 90 dias,
foram observadas reduções em cinco espécies bacterianas (S. sanguinis, C. gracilis,
P. micra, P. gingivalis, T. denticola) e aumento de Neisseria mucosa no grupo C; no
grupo T
1
, E. nodatum, P. micra, T. forsythia, P. gingivalis, T. denticola reduziram e a
proporção de P. melaninogenica aumentou. Já no grupo T
2
, 10 espécies reduziram
(S. mitis, C. rectus, E. nodatum, F. nuc. ssp. nucleatum, F. nuc. ssp. polymorphum,
P. micra, T. forsythis, P. gingivalis, T. denticola, Leptotrichia buccalis) e seis
52
aumentaram, sendo A. naeslundii 2, V. parvula, C. ochracea, N. mucosa, S.
anginosus e S. noxia.
É importante ressaltar que todas as terapias utilizadas levaram a uma
redução na contagem e proporção de pelo menos dois dos três patógenos do
complexo vermelho (P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola), porém apenas os grupos
que receberam antibióticos reduziram significativamente as três espécies. Os
melhores resultados (Figuras 9 e 10) em número de espécies reduzidas foram
observados para o grupo que associou metronidazol e amoxicilina (T
2
).
A Figura 11 mostra as alterações ocorridas nas proporções dos complexos
microbianos nas amostras de biofilme subgengival dos indivíduos dos três grupos
terapêuticos. As áreas dos gráficos foram ajustadas para refletir a contagem total de
microrganismos em cada grupo terapêutico, nos dois tempos experimentais. As 40
espécies microbianas identificadas por meio das sondas de DNA foram agrupadas
de acordo com os complexos microbianos descritos por Socransky et al. (1998). As
proporções das espécies pertencentes a cada complexo foram somadas e a
proporção total de cada complexo foi determinada.
Pode-se observar que as proporções dos diferentes complexos
microbianos foram semelhantes no início do estudo, sem diferenças estatísticas
entre os três grupos experimentais. Os complexos presentes em maiores proporções
no início do estudo foram o vermelho e o laranja. Todas as terapias levaram a uma
redução significativa nas proporções do complexo vermelho; sendo que essa
redução foi ainda mais marcante nos grupos T
2
(22,2% para 8,3%) e T
1
(31,6% para
8,0%) do que no grupo C (30,8% para 15,7%). Já a proporção do complexo laranja
foi afetada apenas pela terapia que associou o metronidazol e a amoxicilina (42,5%
para 22,8%). As proporções dos complexos considerados benéficos, verde, roxo,
amarelo e azul aumentaram após as terapias, sendo que esse aumento foi mais
pronunciado para o grupo T
2
que mostrou alterações significantes para os
complexos azul (9,4% para 36,5%), roxo (2,9% para 7,4%) e verde (5,8% para
7,3%), seguido pelo grupo T
1
, especificamente o complexo azul (10,8% para 27,2%).
Comparando os grupos terapêuticos no final do estudo, foi possível notar que os
grupos que associaram antibióticos obtiveram valores semelhantes entre si e
superiores ao grupo controle na proporção de complexo azul, e inferiores ao grupo
controle na proporção do complexo vermelho. Considerando a contagem total de
microrganismos, não foram observadas diferenças estatísticas entre os grupos no
53
início do estudo, porém aos 90 dias o grupo que associou o metronidazol e
amoxicilina, apresentou os resultados mais satisfatórios, ou seja, valores inferiores
ao grupo T
1
e C. Todas as terapias foram capazes de reduzir a contagem total de
bactérias (p<0,05).
As alterações nas proporções de espécies bacterianas benéficas e
patogênicas, entre o tempo inicial e 90 dias após o término da terapia, nos grupos
experimentais, estão apresentadas na Figura 12. As proporções de microrganismos
benéficos (complexos azul, roxo, amarelo e verde) aumentaram em 16,2%, 23,6% e
35,6% para os grupos C, T
1
e T
2
, respectivamente. Os grupos, que receberam
antibióticos, mostraram resultados superiores ao grupo que recebeu apenas a RAR.
Em relação às proporções de microrganismos patógenos (complexos laranja e
vermelho), o grupo que associou metronidazol e amoxicilina apresentou redução de
33,6%, um resultado estatisticamente diferente dos valores de 25,8% e 21,9%
encontrados para os grupos C e T
1
, respectivamente.
54
Figura 8. Perfil microbiano das médias de contagem (x10
5
) e de proporção (%) das 40 espécies
bacterianas presentes nas amostras de biofilme subgengival no início do estudo, nos três grupos
terapêuticos.
RAR: Raspagem e alisamento radicular; M: Metronidazol; A: Amoxicilina.
Teste Kruskal-Wallis (p>0,05). Os resultados foram ajustados para comparações múltiplas.
55
.
Figura 9. Perfil microbiano das médias de contagem (x10
5
) das 40 espécies bacterianas presentes nas amostras de biofilme subgengival no início do estudo
e 90 dias pós-terapia, nos três grupos terapêuticos.
RAR: Raspagem e alisamento radicular; M: Metronidazol; A: Amoxicilina.
Teste de Wilcoxon (* p<0,05). Os resultados foram ajustados para comparações múltiplas.
56
Figura 10. Perfil microbiano das médias de proporção (%) das 40 espécies bacterianas presentes nas amostras de biofilme subgengival no início do estudo e
90 dias pós-terapia, nos três grupos terapêuticos.
RAR: Raspagem e alisamento radicular; M: Metronidazol; A: Amoxicilina.
Teste de Wilcoxon (* p<0,05). Os resultados foram ajustados para comparações múltiplas.
57
Figura 11. Proporções (%) dos complexos microbianos presentes nas amostras de biofilme subgengival no início do estudo e 90 dias pós-terapia, nos três
grupos terapêuticos. As áreas dos gráficos foram ajustadas para refletir a quantidade total de microrganismos, expressas nos retângulos.
Teste de Wilcoxon (p<0,05): * e letras minúsculas indicam diferenças significativas entre os tempos;
Teste Kruskal-Wallis (p<0,01) - Teste U de Mann-Whitney (p<0,05): Letras distintas indicam diferenças significativas entre os grupos.
58
Figura 12. Alterações nas proporções de espécies bacterianas benéficas e patogênicas entre o
tempo inicial e 90 dias pós-terapia, nos grupos três grupos terapêuticos.
Microrganismos benéficos: complexos azul, roxo, amarelo e verde.
Microrganismos patogênicos: complexos laranja e vermelho.
Teste Kruskal-Wallis (p<0,01)
Teste U de Mann-Whitney (p<0,05): Letras distintas indicam diferenças significativas entre os grupos.
59
5. DISCUSSÃO
A RAR é considerada um tratamento periodontal convencional (AAP,
1996), entretanto seu efeito pode ser questionável para reduzir e/ou eliminar os
microrganismos patogênicos presentes no biofilme e também o cálculo radicular
quando os trabalhos que avaliaram a presença de cálculo residual sobre superfícies
tratadas com instrumentos manuais são analisados (CAFFESSE et al., 1986;
SHERMAN et al., 1990; ANDERSON et al., 1996). Entre os fatores que dificultam a
instrumentação deve-se destacar a anatomia dentária como concavidades, limite
esmalte-cemento, região de bi e tri-furcações, variações anatômicas, dificuldades de
acesso e de visibilidade do campo operatório. Os trabalhos demonstram que a
efetividade da remoção de cálculo em dentes uni-radiculares é maior do que nos
multi-radiculares (BUCHANAN & ROBERTSON, 1987; BRAYER et al., 1989), e que
quanto maior a profundidade de sondagem, menor a possibilidade da remoção
adequada dos fatores etiológicos (RABBANI et al., 1981; FLEISCHER et al., 1989;
COBB, 2002).
A doença periodontal crônica é reconhecida como a forma mais comum de
periodontite e, portanto o interesse em se definir uma terapia periodontal mais
efetiva à RAR, já que após o tratamento os indivíduos devem permanecer sob
manutenção periodontal para que níveis de inserção periodontal sejam mantidos
estáveis (LINDHE & NYMAN, 1975; NYMAN et al., 1975; ROSLING et al., 1976;
NYMAN et al., 1977; LINDHE et al., 1982; LINDHE et al., 1984).
Diversas terapias adjuntas à RAR têm sido propostas com o objetivo de
potencializar os efeitos benéficos dessa forma de tratamento. A utilização de
antimicrobianos de liberação local subgengival no tratamento da doença periodontal
tem alguns benefícios sobre as terapias sistêmicas (RAMS & SLOTS, 1992). Estes
agentes causam poucos efeitos adversos e interações medicamentosas, produzem
altas concentrações no sítio periodontal e minimizam os problemas de cooperação
do indivíduo, devido à aplicação ser profissional. Entretanto os efeitos sobre a
microbiota e sinais clínicos parecem ser transitórios, provavelmente por afetarem de
forma limitada os patógenos periodontais nos sítios profundos e áreas de furca
(SLOTS & RAMS, 1991; SLOTS & VAN WINKELHOFF, 1993; GRISI et al., 2002;
KANER et al., 2007a).
60
O tratamento antimicrobiano sistêmico oferece muitas vantagens nas
infecções periodontais (SLOTS & RAMS, 1991). Estes agentes entram em áreas
subgengivais via fluído crevicular e podem alcançar patógenos em sítios profundos,
além do potencial de suprimir patógenos em superfícies mucosas e outros sítios
bucais, e deste modo prolonga o tempo de re-infecção dos sítios periodontais.
(SLOTS & VAN WINKELHOFF, 1993). Os estudos com associação de antibióticos
sistêmicos à RAR mostram efeitos clínicos e microbiológicos benéficos no
tratamento de diversas formas de doenças periodontais, incluindo a periodontite
crônica (HELLDEN et al., 1979; LOESHE et al., 1982; GUSBERTI et al., 1988;
FREEMAN et al., 1992; VAN WINKELHOFF et al., 1997; FERES et al., 1999a,
1999b, 1999c; GONÇALVES et al., 2000; WINKEL et al., 2001; CARVALHO et al.,
2004; POULET et al., 2005; CARVALHO et al., 2005; DANNEWITZ et al., 2007;
HAFFAJEE et al., 2007; MOEINTEGHAVI et al., 2007; HAFFAJEE et al., 2008).
Sendo assim, o presente estudo avaliou os efeitos clínicos e
microbiológicos da RAR, associado ou não ao metronidazol ou ao metronidazol e à
amoxicilina, em indivíduos portadores de periodontite crônica. A terapia controle foi a
RAR por ser considerado um procedimento padrão no tratamento da doença
periodontal (LINDHE et al., 1983; HAFFAJEE et al., 1997; CUGINI et al., 2000). As
duas terapias testes adjuntas à RAR, metronidazol ou metronidazol em combinação
com a amoxicilina sistêmicos, também foram selecionadas com base em estudos
anteriores que sugeriram a efetividade clínica e microbiológica desses antibióticos
sistêmicos no tratamento periodontal (GUSBERTI et al., 1988; LOESCHE et al.,
1992; WINKEl et al., 1997; BERGLUNDH et al., 1998; WINKEL et al., 1998; SERINO
et al., 2001; FERES et al., 2001; ROONEY et al., 2002; CARVALHO et al., 2004 e
2005; DANNEWITZ et al., 2007; HAFFAJEE et al., 2007; MOEINTEGHAVI et al.,
2007). A amoxicilina sistêmica, associada à RAR, também sugere resultados clínicos
e microbiológicos benéficos em indivíduos com periodontite crônica (FERES et al.,
2001; ROONEY et al., 2002). Entretanto, a combinação da RAR apenas à
amoxicilina não foi avaliada no presente estudo pelo fato desta terapia ter um efeito
menos eficaz e duradouro sobre os patógenos periodontais do que quando se utiliza
o metronidazol (FERES et al., 2001; ROONEY et al., 2002) ou a associação destes
dois antibióticos (LÓPEZ et al., 2000; WINKEL et al., 2001; ROONEY et al., 2002;
DANNEWITZ et al., 2007; MOEINTEGHAVI et al., 2007).
61
A dosagem e duração ideais do metronidazol/amoxicilina para o uso no
tratamento da infecção periodontal ainda não foram testados. As prinicpais
discrepâncias são em relação à dosagem diária do metronidazol. Este estudo seguiu
a recomendação do Phisicians Desk Reference (Medical Economics Staff), que
recomenda até 1.500mg/dia de metronidazol para tratar infecções anaeróbias, e da
ANVISA – DEF (2007), que recomenda até 1.500mg/dia de amoxicilina. Alguns
protocolos terapêuticos distintos podem ser encontrados na literatura em relação ao
período de administração das drogas: metronidazol e/ou amoxicilina. Embora exista
a possibilidade de propor a antibioticoterapia por 7 dias (PAVICIC et al., 1994;
WINKEL et al., 2001; ROONEY et al., 2002; MOEINTAGHAVI et al., 2007), o
presente estudo preconizou a ingestão do metronidazol e/ou amoxicilina durante 14
dias em concordância com outros autores (LOESCHE et al., 1996; CARVALHO et
al., 2004 e 2005; HAFFAJEE et al., 2007 e 2008). A utilização da antibioticoterapia
por duas semanas está dentro dos limites biológicos aceitáveis e tem sido utilizada
no tratamento de outras infecções, como no caso de úlceras gástricas causadas por
Helicobacter pylori (UYGUN et al., 2007). Embora outros estudos tenham
empregado o uso da terapia antibiótica após a terapia mecânica (JENKINS et al.,
1989; LOESCHE et al., 1992; CARVALHO et al., 2004; CARVALHO et al., 2005;
KANER et al., 2007a, 2007b). Watts et al. (1986) e Walsh et al. (1986)
demonstraram que a terapia com metronidazol não concomitante à RAR promovia
um efeito limitado e transitório nos parâmetros clínicos e microbiológicos. De
maneira semelhante à Haffajee et al. (2007), o delineamento experimental do
presente estudo determinou que ambas as terapias (mecânica e antibiótica) fossem
iniciadas no mesmo momento. A escolha deste protocolo terapêutico, 14 dias de
antibioticoterapia iniciada junto com a RAR, visou à disponibilidade da droga no
ambiente subgengival pelo máximo de tempo possível em que a RAR estivesse
sendo realizada.
Em virtude do tempo mais prolongado da antibioticoterapia sistêmica,
algumas questões sobre os efeitos adversos dos medicamentos, sempre são
levantadas. Os impactos relatados pelo próprio paciente devem ser considerados
com cautela, pois até que ponto as respostas possuem uma variação subjetiva que
torne os dados confiáveis. Neste estudo foi possível observar que a variação
subjetiva existe, pois alguns indivíduos que ingeriram placebo (talco farmacêutico)
relataram certos desconfortos devido à ingestão de medicamentos (ANEXO B). Vale
62
considerar também que nenhum indivíduo dos grupos T
1
e T
2
foi excluído do estudo
devido à intolerância dos medicamentos, pois os efeitos adversos foram transitórios.
Outro ponto importante é o fato de que apesar de alguns indivíduos do grupo T
2
, que
associou metronidazol e amoxicilina, terem relatado algum desconforto, este foi o
grupo em que todos os indivíduos alegaram que tomariam novamente a medicação,
segundo o questionário de efeitos adversos (ANEXO A).
5.1 Aspectos clínico-periodontais
Apesar de todas as terapias terem levado a uma redução significativa nas
médias de boca toda em todos os parâmetros clínicos aos 90 dias pós-terapia
(Figura 5), os grupos T
1
e T
2
apresentaram valores semelhantes entre si (p>0,05),
porém inferiores ao grupo C em relação ao percentual de sítios com IPV e SS escore
1 (Tabela 3). Um dado interessante foi o menor percentual de sítios com placa
visível nos indivíduos dos grupos T
1
e T
2
aos 90 dias (Tabela 3). No início do estudo
não foram observadas diferenças entre os três grupos (p>0,05) e, além disso, todos
os participantes do estudo receberam as mesmas instruções e motivações para
realizarem a higiene bucal durante a participação na pesquisa. Uma possível
explicação para este fato pode ser o efeito da terapia na redução da inflamação e
conseqüentemente na quantidade de fluido crevicular (TÜTER et al., 2005). Uma vez
que o fluido proporciona peptídeos e outras moléculas essenciais para o crescimento
de muitos periodontopatógenos, estratégias que reduzem a inflamação podem
indiretamente modificar a composição do biofilme por restringir a disponibilidade de
nutrientes (MARSH & BRADSHAW, 1997). Os resultados deste estudo parecem
estar de acordo com essas observações. É possível notar que os grupos que
utilizaram antibióticos (T
1
e T
2
) além de apresentarem os melhores resultados para o
IPV, também demonstraram o menor percentual de sítios com SS aos 90 dias. O
parâmetro ISG deve ser considerado com cautela, pois apesar do grupo T
1
ter sido
semelhante ao C no final do estudo, este grupo (T
1
) iniciou com valores um pouco
superiores em comparação aos outros, apesar de não ter sido observada diferença
entre os grupos no início do estudo (p>0,05 – Tabela 3). Diferenças estatísticas não
foram observadas entre as reduções do NCI nos grupos C e T
1
, e o melhor resultado
clínico foi evidenciado no grupo T
2
(Figura 6). Outros estudos também sugeriram
efeitos clínicos benéficos adicionais à RAR quando indivíduos com periodontite são
63
tratados com RAR e metronidazol sistêmico (WINKEL et al., 1997; SÖDER et al.,
1990; FERES et al., 2001; ROONEY et al., 2002; CARVALHO et al., 2004;
HAFFAJEE et al., 2007) ou com a associação de metronidazol e amoxicilina (LÓPEZ
et al., 2000; WINKEL et al., 2001; DANNEWITZ et al., 2007; MOEINTAGHAVI et al.,
2007). Rooney et al. (2002) também encontraram os melhores resultados clínicos no
grupo que associou à RAR o metronidazol e a amoxicilina, em comparação ao grupo
que ingeriu apenas o metronidazol.
A observação de maior redução no percentual de sítios com SS nos
grupos T
1
e T
2
em relação ao grupo C (Figura 6) está de acordo com outros autores
que também já evidenciaram este achado (FERES et al., 2001; ROONEY et al.,
2002; CARVALHO et al., 2004).
Quando os sítios foram subdivididos de acordo com a PS inicial em rasos
(PS <
3mm), intermediários (PS 4-6mm) ou profundos (PS > 7mm), apesar de todos
os grupos terem mostrado melhoras clínicas (Figura 7), é possível observar que a
terapia que associou metronidazol e amoxicilina à RAR mostrou uma tendência a
resultados satisfatórios. A ligeira perda de inserção observada nos sítios com PS ≤
3mm no grupos T
1
e T
2
estão de acordo com outros estudos que mostraram que
bolsas rasas tendem a apresentar uma ligeira perda de inserção após a RAR
(KALDAHL et al., 1993; HEITZ-MAYFIELD et al., 2002; CARVALHO et al., 2004).
Nos sítios inicialmente intermediários (4-6mm), não foram observadas
diferenças estatísticas entre os grupos para as reduções de PS e NCI. Porém
quando os sítios profundos foram considerados, as maiores reduções nas médias de
PS e NCI foram notadas. Essas reduções foram significantivamente mais
pronunciadas nos grupos T
1
e T
2
em comparação ao grupo C. Tais resultados
corroboram com outros estudos que mostram o efeito clínico benéfico da associação
de metronidazol e/ou amoxicilina à RAR em sítios intermediários e profundos
(LOESCHE et al., 1981; CLARK et al., 1983; LEKOIVIC et al., 1983; JOYSTON-
BECHAL et al., 1984; LOESCHE et al., 1984; STERRY et al., 1985; JOYSTON-
BECHAL et al., 1986; FERES et al., 2001; WINKEL et al., 2001; HAFFAJEE et al.,
2007).
64
5.2 Aspectos microbiológicos
Todas as terapias empregadas neste estudo levaram a uma redução na
quantidade total de microrganismos na microbiota subgengival, logo após o
tratamento. Esse resultado era esperado, uma vez que todos os participantes do
estudo receberam RAR como parte da terapia, e já está bem demonstrado na
literatura que esse procedimento reduz a quantidade e altera as proporções
bacterianas do biofilme dental (LISTGARTEN et al., 1978; SOCRANSKY &
HAFFAJEE, 1993; HAFFAJEE et al., 1997; CUGINI et al., 2000).
A terapia que utilizou apenas a RAR teve uma melhora microbiológica
limitada em relação à redução nas proporções dos complexos vermelho e laranja
(Figuras 11 e 12). A limitação da terapia mecânica em reduzir patógenos
periodontais já está bem estabelecida na literatura (SÖDER et al., 1990; HAFFAJEE
et al., 1997; PALMER et al., 1999; WINKEL et al., 2001; VAN DER VELDEN et al.,
2003; CARVALHO et al., 2005; MASCARENHAS et al., 2005; MOEINTAGHAVI et
al., 2007).
Os grupos que receberam terapia antibiótica coadjuvante apresentaram as
alterações microbiológicas mais benéficas, principalmente em relação à redução dos
patógenos periodontais (Figuras 9-12). As proporções dos complexos considerados
benéficos, verde, roxo, amarelo e azul aumentaram após as terapias, sendo mais
pronunciado para o grupo T
2
que mostrou alterações significantes para os
complexos azul, roxo e verde, seguido pelo grupo T
1
, que obteve diferenças no
complexo azul. Por outro lado, as proporções dos complexos laranja e vermelho
reduziram. Esses resultados estão de acordo com outros estudos que também
demonstraram uma maior efetividade sobre os patógenos do complexo vermelho
quando o metronidazol e/ou amoxicilina foram utilizados (WINKEL et al.,
1997;.BERGLUNDH et al., 1998; LÓPEZ et al., 1998; WINKEL et al., 1998; WINKEL
et al., 2001; FERES et al., 2001; ROONEY et al., 2002; CARVALHO et al., 2005;
MOEINTAGHAVI et al., 2007). A importância destas alterações nas proporções
microbianas, ou seja, redução de patógenos e aumento de benéficos (Figura 12), em
relação à recolonização dos sítios tratados, foi recentemente observada por
Teughels et al. (2007) em um estudo realizado em animais. Os autores
demonstraram que a aplicação de bactérias benéficas após a RAR em sítios
periodontais de cães pode ser responsável pelo atraso na recolonização dos
65
periodontopatógenos em avaliação realizada até 12 semanas. Neste contexto,
Haffajee et al. (2008) demonstraram que os indivíduos que receberam antibióticos
(metronidazol ou amoxicilina) associados à RAR apresentaram as melhores
respostas clínicas, sugerindo que a rápida redução na contagem dos
periodontopatógenos do ambiente subgengival pode ser crucial para o sucesso da
terapia periodontal e estabilidade a longo prazo.
Uma limitação do presente estudo é o curto período de acompanhamento
dos indivíduos, pois alguns resultados clínicos e microbiológicos poderiam ser mais
evidentes se as avaliações fossem realizadas em longo prazo (VAN WINKELHOFF
et al., 1989; PAVICIC et al., 1994; FLEMMING et al., 1998; HAFFAJEE et al., 2004).
Assim, o acompanhamento longitudinal dos indivíduos que participaram deste
estudo será de extrema importância para se garantir que os resultados benéficos da
terapia antibiótica observados até o momento serão mantidos por longo período de
tempo.
66
6 CONCLUSÃO
A partir dos resultados obtidos é possível concluir que:
* A associação de antibióticos à RAR promoveu melhoras clínicas e
microbiológicas superiores à RAR
* Benefícios clínicos e microbiológicos mais marcantes foram evidenciados
nos indivíduos que ingeriram metronidazol e amoxicilina concomitantes à RAR.
67
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80
ANEXO A – QUESTIONÁRIO DE EFEITOS ADVERSOS
Nome:___________________________________________Data:____/_____/__
Marque um X na resposta para cada uma das perguntas
abaixo:
SIM
NÃO
NÃO
SEI
1) Você conseguiu tomar os medicamentos como lhe foi
orientado ?
2) Você sentiu algum mal-estar devido ao medicamento
que tomou?
3) Sentiu náuseas ou vômito?
4) Teve diarréia neste período?
5) Sentiu algum gosto metálico na boca?
6) Sentiu dor de cabeça ou tontura?
7) Caso tenha sentido algum dos problemas das perguntas
anteriores , isso atrapalhou o seu dia-a-dia?
8) Os medicamentos provocaram mau humor ou irritação?
09) Sentiu fraqueza ou falta de ânimo para o trabalho?
10) Teve sono excessivo devido aos medicamentos?
11) Os horários do medicamento prejudicaram o seu dia-a-
dia?
12) Você tomaria os medicamentos novamente caso fosse
necessário?
81
ANEXO B
Tabela. RESPOSTAS POSITIVAS (SIM).
Grupos
Perguntas
C
(RAR)
N= 12
T
1
(RAR + M)
N=10
T
2
(RAR+ M + A)
N=10
1. Você conseguiu tomar os
medicamentos como lhe foi
orientado?
12 10 10
2. Você sentiu algum mal-
estar devido ao medicamento
que tomou?
1 1 1
3. Sentiu náuseas ou vômito? 0 0 2
4. Teve diarréia neste
período?
0 1 0
5. Sentiu algum gosto
metálico na boca?
2 2 2
6. Sentiu dor de cabeça ou
tontura?
0 1 2
7. Caso tenha sentido algum
dos problemas das perguntas
anteriores, isso atrapalhou o
seu dia-a-dia?
0 0 0
8. Os medicamentos
provocaram mau humor ou
irritação?
0 0 1
9. Sentiu fraqueza ou falta de
ânimo para o trabalho?
0 0 1
10. Teve sono excessivo
devido aos medicamentos?
2 0 0
11. Os horários do
medicamento prejudicaram o
seu dia-a-dia?
0 0 1
12. Você tomaria os
medicamentos novamente
caso fosse necessário?
11 8 10
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