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UFRRJ
INSTITUTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA
ANIMAL
DISSERTAÇÃO
Avaliação da Qualidade Ambiental da Bacia do Rio Paraíba do
Sul e Reservatório do Funil, Sudeste, Brasil, Utilizando
Biomarcadores e Bioindicadores em Peixes.
Claudio Nona Morado
2008
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ii
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA ANIMAL
AVALIAÇÃO DA QUALIDADE AMBIENTAL DA BACIA DO
RIO PARAÍBA DO SUL E RESERVATÓRIO DO FUNIL,
SUDESTE, BRASIL, UTILIZANDO BIOMARCADORES E
BIOINDICADORES EM PEIXES.
CLAUDIO NONA MORADO
Sob a Orientação do Professor
Francisco Gerson Araújo
Sob a Co-Orientação do Professor
Francisco José Roma Paumgartten
Dissertação submetida como
requisito parcial para obtenção do
grau de Mestre em Ciências, no
Programa de Pós-Graduação em
Biologia Animal.
Seropédica, RJ
Abril de 2008
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iii
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA ANIMAL
CLAUDIO NONA MORADO
Dissertação submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em
Ciências, no Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal.
DISSERTAÇÃO APROVADA EM / / 2008.
Francisco Gerson Araújo – UFRRJ
(Orientador)
Francisco José Roma Paumgartten - FIOCRUZ
(Co-Orientador)
Sérgio Noboru Kuriyama – FIOCRUZ
João Paulo Machado Torres - UFRJ
iv
Aos meus pais Armindo e Gilca, pela minha existência nesta vida e por todo
apoio, incentivo e dedicação incondicional.
DEDICO
À minha futura esposa Juliana Ribeiro, por sua ajuda no meu processo de
autoconhecimento e busca da paz e da serenidade (ainda temos um longo
caminho a percorrer); por seu apoio e incentivo constantes, que nunca me
deixaram esmorecer; por seu entusiasmo e alegria contagiantes, poderosas
alavancas para a superação dos obstáculos surgidos. Por tudo isso, e pela
felicidade de tê-la ao meu lado.
OFEREÇO
v
AGRADECIMENTOS
Ao meu pai Armindo por todo o apoio, dedicação e paciência. As palavras são
limitadas para expressar toda minha gratidão.
Ao meu orientador Professor Francisco Gerson Araújo, co-responsável pelo meu
crescimento científico. Pesquisador incansável, que exatamente por ser exigente com seus
orientandos, faz com que nos superemos a cada dia. Obrigado por tudo que me ensinou e pela
paciência.
Ao meu co-orientador, Francisco José Roma Paungartten, por ter aberto as portas do
seu prestigiado laboratório para o desenvolvimento de parte desta pesquisa, pelas valiosas
explicações dadas, e por ter me recebido tão bem durante o período em que aí estive.
À doutora Ana Cecília e ao mestrando Thiago Parente, pela aprendizagem e ajuda no
desenvolvimento de todas as etapas das análises das atividades de EROD.
Ao Thiago e à sua estagiária Helen pelo desenvolvimento das análises da atividade de
EROD na fração microssomal para o capítulo IV.
Aos mestres Kátia e Manoel pelas orientações para o preparo das lâminas para os
testes de micronúcleo.
À Rosângela, por seu importante auxílio nas reservas do carro junto à garagem da
FIOCRUZ para a realização das coletas.
À Laisa por fornecer os dados brutos para a realização do segundo capítulo.
Ao Renan, pela ajuda em algumas saídas de campo.
A todos os outros membros do Laboratório de Toxicologia Ambiental da Fundação
Oswaldo Cruz: Regina, Sérgio, Mara, Igor, Flávio, Karen e Márcia. Pelos momentos
agradáveis e descontraídos, que ajudaram a aliviar os medos gerados pelas dificuldades que
iam surgindo durante o desenvolvimento do trabalho.
À doutora Iracema, do Laboratório de Ecologia de Peixes da Universidade Federal
Rural do Rio de Janeiro, pelo treinamento referente à abertura dos peixes, retirada dos órgãos
e reconhecimento dos estádios de maturação sexual para a realização dos trabalhos de campo
antes do início do projeto.
Ao Antônio, Thiago, Iracema e Paulo, pela ajuda nos trabalhos de campo na Baía de
Sepetiba, visando meu treinamento para a realização dos trabalhos de campo desta pesquisa.
Ao Marco, Leonardo e Hamilton, por terem me aceito em seu projeto quando iniciei
meu estágio no LEP, pelo incentivo e amizade.
vi
Ao Benjamin, por todo apoio recebido quando “migrei” para a água doce. Pela valiosa
ajuda no desenvolvimento deste projeto, tanto no laboratório quanto no campo, pelas
sugestões, pelo incentivo e amizade.
Ao Ruan, pela preciosa ajuda ao longo do desenvolvimento deste trabalho, pelo
incentivo e amizade.
Ao Eduardo, pelas boas sugestões e ajuda prática referente ao campo e pela amizade.
Ao Thiago, Paulo, José, Tatiana, Leonardo, Renata, José Fernando, Albieri, Wagner,
Sérgio, André Santista, Iracema, Benjamin, Ruan e Alexandre pela ajuda nos trabalhos de
campo.
Ao Vitor, pela confecção dos mapas, e pela amizade.
À noiva do Eduardo e sua família, pela amável acolhida em sua confortável pousada
em uma das saídas de campo.
Ao “gambazinho”, filho do prefeito de Paraibuna (SP), que gentilmente nos ofereceu
um excelente local para hospedagem. E pela ajuda constante, a ponto de ter se tornado
membro temporário da equipe e se revelado um Biólogo em potencial.
Ao Charles e sua família, por terem gentilmente nos abrigado em sua casa em Volta
Redonda. Obrigado por nos receberem tão bem.
E mais uma vez ao Thiago Parente, que ainda não satisfeito por toda sua ajuda tanto
no campo quanto no laboratório, também emprestou seu sítio em Santa Rita do Jacutinga
(MG) para ficarmos durante as coletas para a realização do bioensaio. Obrigado a você e à sua
família, pela ajuda, carinho e amizade.
À EMATER de Rio das Flores, por ter conseguido um ótimo lugar para ficarmos
durante as coletas no rio Preto.
Ao “Mineiro”, por ter nos guiado pelo rio Preto em direção aos “acarás” Geophagus
brasiliensis que ele sabia exatamente onde estavam. E pelo seu bom humor e amizade.
Aos ribeirinhos de São José dos Campos, por terem oferecido gentilmente suas casas
para que pudéssemos desenvolver nosso trabalho com mais infra-estrutura (luz, pia, etc.) e
tivéssemos um lugar para pernoitar com mais conforto. E a todos os ribeirinhos ao longo da
bacia do rio Paraíba do Sul, sempre dispostos a ajudar de boa vontade.
À Márcia e Paulinha, pelo incentivo, carinho e amizade.
Ao Joaquim, pelas várias vezes em que me ajudou desde que entrei no laboratório, e
pela amizade.
vii
Aos demais componentes e ex-componentes da equipe do LEP, que de alguma forma
também colaboraram para o desenvolvimento deste trabalho: André Pessanha, Igor, Bianca,
Silvana, Débora, Camila, Alex, Fernanda, Chico, Márcio, Rosane, Deca, Jorginho e Roberto.
Aos professores Francisco Manoel de Souza Braga e Afonso Celso Dias Bainy, pela
gentileza e atenção de me enviar prontamente seus respectivos trabalhos quando os solicitei, o
que em muito contribuiu para um melhor desenvolvimento desta pesquisa.
Ao Curso de Pós-Graduação em Biologia Animal da Universidade Federal Rural do
Rio de Janeiro e a todos os professores deste curso.
À FIOCRUZ, por ter cedido o carro para as saídas de campo.
Ao CNPq, Conselho Nacional de desenvolvimento Científico e Tecnológico, (projeto:
CT-HIDRO), pela concessão da bolsa.
À tia Thomires, por ter me recebido gentilmente em sua casa durante os períodos de
realização das análises de laboratório na FIOCRUZ. Por todo o carinho e dedicação.
Ao Fábio, por ter me emprestado seu computador por um tempo, seu carro para uma
das saídas de campo, por ter ajudado nas anotações em uma das coletas e pela amizade.
Ao meu irmão Marco, pelo seu apoio, incentivo e amizade.
À minha sobrinha Marcelli, por existir.
À minha noiva Juliana, pela felicidade de crescermos juntos.
Aos meus pais, pelo dom da vida e pelo cuidado.
viii
“O homem é parte da natureza e sua guerra contra a natureza
é inevitavelmente uma guerra contra si mesmo...Temos pela
frente um desafio como nunca a humanidade teve, de provar nossa maturidade e
nosso domínio, não da natureza, mas de nós mesmos”.
Rachel Carson
“Seja a mudança que deseja ver no mundo”.
Mahatma Gandhi
ix
RESUMO
MORADO, Claudio Nona. Avaliação da qualidade ambiental da bacia do rio Paraíba do
Sul e reservatório do Funil utilizando biomarcadores e bioindicadores em peixes. 2008.
127p. Dissertação (Mestrado em Biologia Animal). Instituto de Biologia, Departamento de
Biologia Animal, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2008.
A avaliação do uso de quatro espécies de peixes (Geophagus brasiliensis, Pimelodus
maculatus, Hypostomus affinis e Hypostomus aurogutatus) como biomarcadores e/ou
bioindicadores de exposição à xenobióticos foi estudada no rio Paraíba do Sul (RPS), em
diferentes locais e períodos do ano. Adicionalmente, este estudo foi realizado com apenas
uma espécie (P. maculatus) no reservatório do Funil, visando testar se gradientes de qualidade
ambiental correspondem a variações nos biomarcadores/bioindicadores. No trecho médio-
inferior do rio Paraíba do Sul foram utilisados como biomarcadores a atividade de
etoxiresorufina-O-desetilase (EROD) e Freqüências de Micronúcleos (MN) e como
bioindicadores, o Índice hepato-somático (IHS), o Índice gonado-somático (IGS) e Fator de
Condição (FC) em duas espécies (G. brasiliensis e P. maculatus) para a comparação de sete
locais: 1 – reservatório do Funil; 2 – RPS em Volta Redonda; 3 – reservatório de Ribeirão das
Lajes; 4 – RPS em Três Rios; 5 – rio Preto (Referência); 6 – rio Paraibuna (MG); e 7 – rio
Piabanha. Com exceção do IGS, todos os biomarcadores e bioindicadores apresentaram
diferenças significativas entre os locais para ambas as espécies. Os locais mais críticos foram,
em ordem decrescente, 7, 6, 4 e 2, concordando com a hipótese de que locais com maior
proximidade de centros urbanos que introduzem cargas de efluentes industriais, domésticos,
agrícolas, bem como a proximidade de represas apresentam maiores alterações. Sazonalmente
(verão/úmido versus inverno/seco), foram testados o IHS e FC em três espécies (G.
brasiliensis, H. affinis, H. aurogutatus) em dez locais: 1 – Paraitinga/Paraibuna (Referência);
2 – RPS em São José dos Campos; 3 – RPS em Barra Mansa/Volta Redonda; 4 – rio Preto
(Referência); 5 – rio Paraibuna (MG); 6 – rio Piabanha; 7 – RPS em Três Rios/Anta/Sapucaia;
8 – rio Grande; 9 – rio Muriaé; 10 – RPS em Campos/São João da Barra. Os maiores IHS para
as três espécies foram registrados nos locais 3 (RPS em Barra Mansa/Volta Redonda) e 6 (rio
Piabanha), que são localizados próximos a grandes centros urbanos que poderiam estar
contribuindo para introdução de xenobióticos. Os maiores IHS ocorreram no inverno/seco,
sugerindo maiores concentrações de poluentes neste período. Os menores valores do FC
ocorreram no local 1 (Referência) para G. brasiliensis, e os maiores no local 3 (RPS em Barra
Mansa/Volta Redonda). Sazonalmente, maiores FC foram registrados no verão/úmido,
provavelmente relacionado à maior entrada de material alóctone no período das chuvas. Tais
resultados corroboram a hipótese de que o aumento tanto do IHS quanto do Fator de
Condição podem indicar sinais de estresse ambiental, com o IHS refletindo melhor a
avaliação ambiental nos locais estudados. No reservatório do Funil foram utilizados os
biomarcadores EROD e MN e os bioindicadores IHS, IGS e FC em P. maculatus em quatro
locais ao longo de um gradiente longitudinal: 1 – RPS à montante do reservatório; 2 – parte
superior do reservatório; 3 – parte inferior do reservatório; 4 – RPS à jusante do reservatório.
Os maiores valores de EROD e menores valores de IGS ocorreram no local 4, em relação aos
locais 2 e 1, respectivamente, com diferença significativa (P<0.05), sugerindo que as águas
que deixam o reservatório provávelmente possuem a maior presença de xenobióticos. Este
padrão não concorda com a hipótese de que o reservatório do Funil atua como filtro para o
sistema Paraíba do Sul. A avaliação das respostas de indução em Geophagus brasiliensis a
poluentes ambientais através de bioensaios. A avaliação das respostas de indução a poluentes
ambientais em G. brasiliensis realizadas através da exposição por três dias aos compostos de
x
hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HPAs) beta-naftoflavona (BNF) e
dimetilbenzoantraceno (DMBA), mostraram-se significativamente aumentadas da atividade
de EROD nos indivíduos tratados com BNF, e elevação na Freqüência de Micronúcleos no
grupo tratado com DMBA em relação ao grupo controle. Tais resultados sugerem uma
modulação da BNF no metabolismo de biotransformação (EROD) e a modulação do DMBA
na genotoxicidade (MN). Concluimos que, dos locais analisados neste trabalho, os que
apresentaram sinais de maior alteração devido à presença de xenobióticos foram: rio
Piabanha, rio Paraibuna (MG), Três rios, Volta Redonda e São José dos Campos. O que
confirma a hipótese de que locais próximos a grandes centros urbano-industriais apresentam
maiores concentrações de poluentes químicos. Na bacia do rio Paraíba do Sul o período de
inverno/seco parece ser o que ocorre os maiores níveis de concentração de xenobióticos,
possívelmente devido ao menor volume d’água e conseqüente menor proporção de diluição
dos poluentes neste período em relação ao verão úmido. O reservatório do Funil não serve
como um filtro para xenobióticos das águas do rio Paraíba do Sul da região a montante para
jusante da represa. Além disso, provávelmente a estrutura da barragem, assim como as
operações para a produção de energia hidrelétrica podem estar liberando xenobióticos no rio
Paraíba do Sul a jusante do reservatório, o que pode estar comprometendo as populações de P.
maculatus neste local, já que muitos desses compostos possuem propriedades
antiestrogênicas. O uso integrado dos diferentes biomarcadores e bioindicadores mostrou-se
eficiente para a avaliação da qualidade ambiental da bacia do rio Paraíba do Sul e do
reservatório do Funil, contribuindo para um diagnóstico mais completo sobre a saúde dos
peixes expostos a xenobióticos nesses locais. Geophagus brasiliensis mostrou-se uma espécie
adequada para a realização de estudos de biomonitoramento em países tropicais.
Palavras-chave: Biomonitoramento, peixes, poluentes, rio, reservatório.
xi
ABSTRACT
MORADO, Claudio Nona. Environmental qualities evaluation of the Paraíba do Sul river
bacin and Funil reservoir using biomarkers and bioindicators in fishes. 2008. 127p.
Dissertation (Master in Animal Biology). Institute of Biology, Departament of Animal
Biology, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2008.
An evaluation of the suitability of four fish species (Geophagus brasiliensis, Pimelodus
maculatus, Hypostomus affinis e Hypostomus aurogutatus) as biomarkers and bioindicators of
xenobiotic exposure was assessed in the Paraíba do Sul river (PSR) in differente sites and
seasons. Additionally, one species (P. maculatus) was used in Funil to test environmental
quality gradient along the axis river – reservoir. The biomarkers activity of ethoxyresorufin-
O-deethylase (EROD) and Frequency of Micronuclei (MN) and the bioindicators
Hepatosomatic Index (HSI), Gonadosomatic Index (GSI) and Condition Factor (CF) were
used. In the middle-lower reaches of the PSR the two fish species G. brasiliensis and P.
maculatus were use studied in seven sites: 1 – Funil reservoir; 2 – PSR at Volta Redonda; 3 –
Ribeirão das Lajes reservoir; 4 – RPS at Três Rios; 5 – Preto river (Reference); 6 – Paraibuna
river (MG); and 7 – Piabanha river. All biomarkers and bioindicators, except GSI, showed
significant differences among sites for both species. The most impaired sites, in decreasing
order, were 7, 6, 4 and 2, corroborating the hypothesis that sites near to urban centers that
introduce large industrial, domestic and agricultural loads into the river show higher values in
biomarkers and bioindicators. Seasonally (sumer/wet versus winter/dry), HSI and CF were
tested for the thre species (G. brasiliensis, H. affinis, and H. aurogutatus) at 10 sites: 1 –
Paraitinga/Paraibuna (Reference); 2 – PSR at São José dos Campos; 3 – PSR at Barra
Mansa/Volta Redonda; 4 – Preto river (Reference); 5 – Paraibuna river (MG); 6 – Piabanha
river; 7 – PSR at Três Rios/Anta/Sapucaia; 8 – Grande river; 9 – Muriaé river; 10 – PSR at
Campos/São João da Barra. Higher HSI for the three species were recorded at PSR at Barra
Mansa/Volta Redonda and site 6 (Piabanha river), both located near to large urban centers that
may contribute to large amont of xenobiotics into the river. Higher HSI occured in winter/dry
season, suggesting higher cocnentrations os pollutants in this period. Lower CF ocorred at site
1 (Reference) for G. brasiliensis, and the higher for site 3 (PSR at Barra Mansa/Volta
Redonda). Seasonally, higher CF occured in summer/wet, probably related to large amount of
allocthone material brought into the river mainly in rainfall season. Such results corroborate
the hypethesis that larger the HSI and CF indicate environmental stress, with HSI reflecting
more consistently signals of environmental stress. In Funil reservoir the biomarkers EROD
and MN and the bioindicators HSI, GSI and CF were measured in P. maculatus at four sites
along na longitudinal gradient: 1 – PSR at headwates of the reservoir; 2 – upper part of the
reservoir; 3 – lower part of the reservoir; 4 – PSR after the reservoir dam. Higher EROD
activity and lower GSI were recorded at site 4, compared with sites 2 e 1, respectively, with
signficant differences (P<0.05), suggesting that waters after the reservoir probably have
presence of xenobiotics. This pattern does not confirm the hypothesis that Funil reservoir acts
as a pollution filter for PSR waters. Induction of xenobiotics in Geophagus brasiliensis were
tested through bioessays after three days of exposure at Hydrocarbons Policyclical Aromatic
(HPAs) ß-naphthoflavone (BNF) and dimethylbenz(a)antracene (DMBA). A significant
increasing in EROD activity treated with BNF, and increasing in Micronuclei Frequency
(MN) with DMBA exposure were detected. Such results suggest a BNF modulation in
biotransformation metabolism (EROD) and a DMBA modulation in genotoxicity (MN). We
conclude that the more alterated sites due to the probable presence of xenobiotics were:
Piabanha river, Paraibuna river (MG), Três Rios, Volta Redonda and São José dos Campos.
xii
The hypothesis that sites near to large urban-industrial centers have more concentrations of
chemical pollutants is confirmed. In the Paraíba do Sul basin the winter/dry season seems to
present the highest xenobiotic concentration, possibly due to the lower water levels and
consequently lower capacity of pollutants dillution compared with the summer/wet season.
Funil reservoir did not work as a xenobiotic filter for upstreams for Paraíba do Sul river
waters. Furthermore, the dam and operation procedures for power generation, may be spilling
out xenobiotics for the Paraíba do Sul river downstream the dam, with effect on P. maculatus
populations, since these compounds have antistrogenic proprieties. Integrated uses of
biomarkers and bioindicators were efficient to assess environmetnal quality of the Paraiba do
Sul river and Funil reservoir, contributing to a holist view of fish health that are exposed to
xenobiotic in these systems. Geophagus brasiliensis was a suitable species to be used in
biomonitoring aquatic tropical systems.
Key words: Biomonitoring, fishes, pollutants, river, reservoir.
xiii
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO I
Tabela1. Comprimento total médio ± desvio padrão e o número de espécimes de cada espécie
capturada em cada local. N= número de indivíduos....................................................... 20
Tabela 2. Atividade de etoxiresorufina-O-desetilase (EROD) em G. brasiliensis coletados em
sete locais da bacia do rio Paraíba do Sul (locais: 5 – referência; 1 – reservatório do Funil; 2 –
Volta Redonda; 3 – reservatório de Ribeirão das Lajes; 4 – Três Rios; 6 – rio Paraibuna
Mineiro; 7 – rio Piabanha - alterados). N = Número de indivíduos; Valores: Média ± Desvio
padrão. ............................................................................................................................ 23
Tabela 3. Atividade de etoxiresorufina-O-desetilase (EROD) em P. maculatus coletados em
três locais da bacia do rio Paraíba do Sul (locais: 1 – reservatório do Funil; 4 - Três Rios; 7 –
rio Piabanha). N = Número de indivíduos; Valores: Média ± Desvio padrão.................24
Tabela 4. Freqüência de Micronúcleos (MN) no sangue de G. brasiliensis e P. maculatus nos
seis locais de estudo (locais: 1 – reservatório do Funil; 2 – Volta Redonda; 4 – Três Rios; 5 –
rio Preto; 6 – rio Paraibuna; 7 – rio Piabanha). N = Número de indivíduos; Valores: Média ±
Desvio padrão................................................................................................................. 25
Tabela 5. Índice hepato-somático (IHS) em G. brasiliensis e P. maculatus nos locais de coleta
na bacia do rio Paraíba do Sul (locais: 5 – referência; 1 – reservatório do Funil; 2 – Volta
Redonda; 3 – reservatório de Ribeirão das Lajes; 4 – Três Rios; 6 – rio Paraibuna Mineiro; 7 –
rio Piabanha - alterados). N = Número de indivíduos; Valores: Média ± Desvio padrão.26
Tabela 6. Índice gonado-somático em G. brasiliensis nos locais de coleta na bacia do rio
Paraíba do Sul (locais 5 – referência; 1 – reservatório do Funil; 2 – Volta Redonda; 3 –
reservatório de Ribeirão das Lajes - alterados). Não houve diferença significativa ...... 26
Tabela 7. Fator de Condição (FC) em G. brasiliensis e P. maculatus nos locais de coleta na
bacia do rio Paraíba do Sul (locais: 5 – referência; 1 – Reservatório do Funil; 2 – Volta
Redonda; 3 – Reservatório de Ribeirão das Lajes; 4 – Três Rios; 6 – Rio Paraibuna Mineiro; 7
– Rio Piabanha - alterados). N = Número de indivíduos; Valores: Média ± Desvio padrão.
........................................................................................................................................ 27
CAPÍTULO II
Tabela 1. Número de peixes examinados, por local, estação do ano, tamanho e estádio de
maturação sexual de Geophagus brasiliensis. N = número de indivíduos. Comprimento: Min
– Máx. Sexo/Estádio de maturação: F = Fêmeas; FM = Fêmeas maduras; M = Machos.43
Tabela 2. Hypostomus affinis nos diferentes períodos sazonais com as respectivas áreas,
número de indivíduos, faixas de comprimento, sexo e estádios de maturação sexual. N =
número de indivíduos. Comprimento: Min – Máx. Sexo/Estádio de maturação: F = Fêmeas;
FM = Fêmeas maduras; M = Machos............................................................................. 44
xiv
Tabela 3. Hypostomus aurogutatus nos diferentes períodos sazonais com as respectivas áreas,
número de indivíduos, faixas de comprimento e estádios de maturação sexual. N = número de
indivíduos. Comprimento: Min – Máx. Sexo/Estádio de maturação: F = Fêmeas; FM =
Fêmeas maduras; M = Machos....................................................................................... 44
Tabela 4. Comparações dos valores do Índice hepato-somático entre os sites nas diferentes
períodos sazonais por espécie, sexo e estádio de maturação sexual (para as fêmeas).
**P<0.001 – Altamente significativo; *P<0.05 – Significativo. ................................... 46
Tabela 5. Comparações sazonais do Índice hepato-somático considerando-se as espécies, o
sexo e o estádio de maturação sexual (para as fêmeas). **P<0.001 – Altamente significativo;
*P<0.05 – Significativo; Períodos sazonais: 1 = Verão Úmido; 2 = Inverno Seco. ...... 46
Tabela 6. Comparações dos valores do Fator de Condição entre os sites nos diferentes
períodos sazonais considerando cada espécie, sexo e estádio de maturação sexual (para as
fêmeas). **P<0.001 – Altamente significativo; *P<0.05 – Significativo......................47
Tabela 7. Comparações sazonais do Fator de Condição, considerando-se as espécies, os sexos
e o estádio de maturação sexual (para as fêmeas). **P<0.001 – Altamente significativo;
*P<0.05 – Significativo; Períodos sazonais: 1 = Verão úmido; 2 = Inverno seco......... 47
CAPÍTULO III
Tabela 1. Número de indivíduos, tamanho, sexo e estádio de maturação das fêmeas de P.
maculatus examinados. FM = fêmeas maduras; F = fêmeas imaturas; M = machos..... 64
Tabela 2. Diferenças entre os locais para os diferentes marcadores / indicadores biológicos
........................................................................................................................................ 67
CAPÍTULO IV
Tabela 1. Grupo, peso, comprimento, sexo e peso do fígado dos indivíduos.................83
Tabela 2. Diferenças estatísticas dos biomarcadores e bioindicadores nos diferentes grupos.
CONT = controle; BNF = tratado com beta-naftoflavona; DMBA = tratado com DMBA.
....................................................................................................................................... .85
xv
LISTA DE FIGURAS
INTRODUÇÃO GERAL
Figura 1. Geophagus brasiliensis......................................................................................6
Figura 2. Pimelodus maculatus.........................................................................................6
Figura 3. Hypostomus affinis............................................................................................7
Figura 4. Hypostomus aurogutatus...................................................................................7
Figura 5. Bacia do rio Paraíba do Sul e represa do Funil, com destaque para os locais
de coleta............................................................................................................................8
CAPÍTULO I
Figura 1. Bacia do rio Paraíba do Sul, com destaque para os sete locais de estudo. Locais: 1 –
Reservatório do Funil; 2 – Volta Redonda; 3 – Represa de Ribeirão das Lajes; 4 – rio Paraíba
do Sul em Três Rios; 5 – rio Preto (referência); 6 – rio Paraibuna (MG); 7 – rio Piabanha.
........................................................................................................................................ 17
Figura 2. Atividade EROD na fração S9 hepática em G. brasiliensis, medida em (pmoles
resor/mg prot/min).......................................................................................................... 24
Figura 3. Atividade EROD na fração S9 hepática em P. maculatus, medida em (pmoles
resor/mg prot/min).......................................................................................................... 25
CAPÍTULO II
Figura 1. Bacia do rio Paraíba do Sul com os 10 locais de coleta. Locais inseridos nos
círculos foram tomados em conjunto. ............................................................................ 42
Figura 2. Diferenças entre os sexos para o IHS e FC para cada espécie e período sazonal.
........................................................................................................................................ 48
CAPÍTULO III
Figura 1. Mapa do Reservatório do Funil com os quarto locais de estudo. ................... 63
Figura 2. Gráficos com os valores dos cinco marcadores / indicadores em cada local.. 68
CAPÍTULO IV
Figura 1. Atividade de EROD nos diferentes grupos: controle (CONT.) e tratado com beta-
naftoflavona (BNF). ....................................................................................................... 85
Figura 2. Frequência de MN nos diferentes grupos: controle (CONT), tratado com beta-
naftoflavona (BNF), e tratado com dimetilbenzoantraceno (DMBA)............................ 86
xvi
Lista de Abreviaturas e Siglas
ANA - Agência Nacional de Águas
Ah - Aril hidrocarboneto
AhR - Receptor aril hidrocarboneto
Aw - Clima quente e úmido com verão chuvoso (classificação de Köppen)
BPCs - Bifenilas policloradas
BKME - Bleached Kraft pulp Mill effluent (sistema de tratamento de efluentes)
BNF - Betanaftoflavona
ß-NADP - Beta-Nicotinamida adenina dinucleotídeo
BSA - Soro Albumina Bovina
CETESB - Companhia Estadual de Tecnologia e Saneamento Ambiental
Cfa - Clima subtropical com verão quente (classificação de Köppen)
CONAMA - Conselho Nacional de Meio Ambiente
CSN - Companhia Siderúrgica Nacional
Cwa - Clima tropical de altitude com verão quente e chuvoso (classificação de Köppen)
CYP1A - Citocromo P450 isoforma 1A
DDPCs - Dibenzodioxinas policloradas
DDT - diclorodifeniltricloroetano
DFPCs - Dibenzofuranos policlorados
DMBA - Dimetilbenzoantraceno
DNAEE - Departamento Nacional de Águas e Energia Elétrica
DNA - Ácido desoxiribonucleico
DO - Densidade ótica
EDTA - Ácido etilenodiaminotetraacético
Em - Emissão
ENA - Anormalidade nuclear eritrocítica
EROD - Etoxiresorufina-O-desetilase
ERX - Elementos responsivos a xenobióticos
Ex - Excitação
FC - Fator de condição
FEEMA - Fundação Estadual de Engenharia do Meio Ambiente
FIOCRUZ - Fundação Oswaldo Cruz
FEAM - Fundação Estadual do Meio Ambiente (MG)
HCH - Hexaclorociclohexano
HPAs - Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos
IGS - Índice gonado-somático
IHS - Índice hepato-somático
KCl - Cloreto de potássio
Kg - Kilograma
K2HPO4 - Fosfato de hidrogênio dipotássio
KH2PO4 - Dihidrogenofosfato de potássio
MFO - Oxidases de função mixta
MG - Minas Gerais
MgCl2 - Cloreto de magnésio
mg - miligrama
min - minuto
ml - mililitro
xvii
µl - microlitro
mM - milimolar
MN - Micronúcleo
NaCl - Cloreto de sódio
NADPH - Nicotinamida adenina dinucleotídeo
pH - potencial hidrogenionico
pmol - picomol
POPs - Poluentes orgânicos persistentes
prot - proteína
res - resorufina
RJ - Rio de Janeiro
RPS - Rio Paraíba do Sul
SP - São Paulo
TCDD - Tetraclorodibenzo-p-dioxina
VTG - Vitelogênio
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA ............................................................................................................ iv
AGRADECIMENTOS................................................................................................... v
RESUMO........................................................................................................................ ix
ABSTRACT ................................................................................................................... xi
LISTA DE TABELAS................................................................................................. xiii
LISTA DE FIGURAS................................................................................................... xv
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ................................................................. xv i
1 INTRODUÇÃO GERAL ............................................................................................ 1
1.1 Contaminação em ecossistemas aquáticos.............................................................. 1
1.2 Biomarcadores e bioindicadores da qualidade ambiental.................................... 2
1.3 Poluentes orgânicos persistentes (POPs)............................................................ …4
2 HIPÓTESES ................................................................................................................ 5
3 MODELOS BIOLÓGICOS........................................................................................ 6
4 ÁREA DE ESTUDO.................................................................................................... 8
CAPÍTULO I
RESUMO....................................................................................................................... 10
ABSTRACT .................................................................................................................. 11
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 12
2 OBJETIVOS .............................................................................................................. 15
2.1 Gerais....................................................................................................................... 15
2.2 Objetivos específicos............................................................................................... 15
3 ÁREA DE ESTUDO.................................................................................................. 16
4 MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................... 20
4.1 COLETA ................................................................................................................. 20
4.2 QUÍMICOS............................................................................................................. 21
4.3 ATIVIDADES DE LABORATÓRIO................................................................... 21
4.3.1 Determinação da atividade enzimática – EROD .............................................. 21
4.3.1.1 Preparação da fração citosólica (S9) hepática ............................................... 21
4.3.1.2 Determinação da concentração de proteínas na fração S9........................... 21
4.3.1.3 Determinação da Atividade enzimática - EROD........................................... 21
4.3.2 Determinação da Freqüência de Micronúcleos (MN) ...................................... 22
4.3.3 Bioindicadores...................................................................................................... 22
4.4 ANÁLISES ESTATÍSTICAS................................................................................ 22
5 RESULTADOS.......................................................................................................... 23
5.1 Atividade de EROD................................................................................................ 23
5.2 Freqüência de Micronúcleos (MN) ....................................................................... 25
5.3 Índice hepato-somático .......................................................................................... 25
5.4 Índice gonado-somático.......................................................................................... 26
5.5 Fator de Condição .................................................................................................. 26
6 DISCUSSÃO .............................................................................................................. 28
7 CONCLUSÕES.......................................................................................................... 31
8 REFERÊNCIAS ........................................................................................................ 32
CAPÍTULO II
RESUMO....................................................................................................................... 38
ABSTRACT .................................................................................................................. 39
1 INTRODUCÃO ......................................................................................................... 40
2 MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................... 42
2.1 Área de estudo......................................................................................................... 42
2.2 Coletas dos peixes ................................................................................................... 42
2.3 Tratamento dos dados............................................................................................ 44
3 RESULTADOS.......................................................................................................... 46
3.1 Índice hepato-somático (IHS)................................................................................ 46
3.2 Fator de Condição (FC) ......................................................................................... 47
3.3 Diferenças entre os sexos........................................................................................ 47
4 DISCUSSÃO .............................................................................................................. 49
5 CONCLUSÕES.......................................................................................................... 52
6 REFERÊNCIAS ....................................................................................................... .53
CAPÍTULO III
RESUMO....................................................................................................................... 58
ABSTRACT .................................................................................................................. 59
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 60
2 MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................... 63
2.1 Área de estudo......................................................................................................... 63
2.2 Coleta de dados....................................................................................................... 64
2.3 Químicos.................................................................................................................. 64
2.4 Trabalho de laboratório......................................................................................... 65
2.4.1 Biomarcadores ..................................................................................................... 65
2.4.1.1 Determinação da Atividade Enzimática – EROD ......................................... 65
2.4.1.2 Preparação da fração citosólica (S9) hepática ............................................... 65
2.4.1.3 Determinação da concentração de proteínas na fração S9........................... 65
2.4.1.4 Determinação da Atividade enzimática - EROD........................................... 65
2.4.1.5 Determinação da Freqüência de Micronúcleos (MN) ................................... 65
2.4.2 Bioindicadores...................................................................................................... 66
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................. 67
4. CONCLUSÕES......................................................................................................... 72
5 REFERÊNCIAS ........................................................................................................ 73
CAPÍTULO IV
RESUMO....................................................................................................................... 79
ABSTRACT .................................................................................................................. 80
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 81
2 MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................... 83
2.1 Animais teste ........................................................................................................... 83
2.2 Tratamento.............................................................................................................. 83
2.3 Preparação da fração microssomal....................................................................... 83
2.4 Determinação da concentração de proteínas na fração S9................................. 84
2.5 Determinação da Atividade enzimática - EROD................................................. 84
2.6 Químicos.................................................................................................................. 84
2.7 Procedimentos para micronúcleos ........................................................................ 84
2.8 Análises estatísticas ................................................................................................ 84
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................. 85
4 CONCLUSÕES.......................................................................................................... 87
5 REFERÊNCIAS ........................................................................................................ 88
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS....................................................................................92
7 CONCLUSÕES GERAIS.........................................................................................94
8REFERÊNCIAS.........................................................................................................95
1
1 INTRODUÇÃO GERAL
1.1 Contaminação em ecossistemas aquáticos
Alterações ambientais em bacias hidrográficas têm sido constantes e crescentes no
Brasil. O rio Paraíba do Sul (RPS) é um dos sistemas lóticos mais usados do Brasil, por se
localizar em uma das mais importantes regiões industriais do país e, conseqüentemente, não
foge a esse processo de deterioração, sendo considerado um dos rios mais impactados por
poluentes (PFEIFFER et al. 1986; CARVALHO & TORRES 2002). Suas águas, além do
abastecimento para populações de grandes e pequenas cidades, são utilizadas para várias
outras atividades, tais como: produção de energia através de barragens de hidrelétricas,
navegação, pesca, resfriamento de máquinas de parques industriais, introdução e diluição de
efluentes domésticos e agrícolas (Fundação Estadual de Engenharia do Meio Ambiente -
FEEMA 1999; CARVALHO & TORRES 2002).
No geral a bacia do rio Paraíba do Sul recebe 207 toneladas de esgoto doméstico e
industrial, sendo que quase 8 milhões de habitantes; 54 mil indústrias; 175 cidades; cerca de
33 hidrelétricas; e grandes áreas de agricultura intensiva localizadas às suas margens em
alguns trechos também poluem o rio Paraíba do Sul. Contudo, de acordo com informações da
Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental (CETESB 1999), apesar de toda a
poluição, em apenas 2 locais (Caçapava e Aparecida) cerca de 400 km de extensão, as águas
do rio Paraíba do Sul são consideradas ruins, em todo o resto é definida como “aceitável”, ou
seja, que podem ser consumidos após tratamento. Essas informações necessitam ser
reavaliadas e estudos de biomonitoramento devem ser realizados para que se tenha uma
compreensão mais realista da presença e das alterações causadas por poluentes na bacia do rio
Paraíba do Sul, diagnosticando a extensão e tendências espacias e temporais da poluição
difusa por xenobióticos neste importante sistema.
O reservatório do Funil, situado no Município de Resende, na divisa do Estado de São
Paulo com o Estado do Rio de Janeiro, construído na década de 60, com o objetivo de geração
de energia hidrelétrica, devido à sua importância para a qualidade das águas do rio Paraíba do
Sul à sua jusante, e de receber grande quantidade de poluentes provenientes de grandes
centros urbano-industriais e áreas de agricultura intensiva das cidades do Estado de São Paulo
à sua montante, também foi avaliado quanto à presença de contaminantes químicos.
O monitoramento biológico em rios é essencial para identificar as respostas do
ambiente aos impactos causados pela ação antrópica, além de fornecer diretrizes que possam
regulamentar o uso dos recursos hídricos, possibilitando o desenvolvimento de alternativas
para minimizar a degradação dos rios (KARR et al. 2000).
Peixes são expostos a substâncias tóxicas de maneira similar a outros vertebrados,
podendo ser utilizados para avaliar a presença de substâncias potencialmente teratogênicas e
carcinogênicas em humanos (HARSHBARGER & CLARK 1990). A utilização de respostas
biológicas para avaliação da qualidade ambiental é vantajosa em relação às medidas físicas e
químicas da água, desde que estas registram apenas o momento em que foram coletadas,
necessitando de muitas análises para a realização de um monitoramento temporal eficiente
(METCALFE 1989). Além disso, a poluição de corpos d’água reduz sua qualidade e é
estressante para a biota (GAGNÉ et al. 2002; VAN DER OOST et al. 2003). Esses eventos
usualmente precedem efeitos mais sérios nas populações e/ou comunidades (ADAMS et al.
2001). Portanto, a qualidade da água também pode ser acessada usando parâmetros biológicos
(ILIOPOULOU-GEORGUDAKI et al. 2003) devido aos organismos aquáticos serem os
receptores, enquanto os índices químicos não incorporam todos os poluentes presentes na
água nem as mixturas complexas que são formadas deles e que já são implicadas como a fonte
primária de muitos problemas ambientais mostrados hoje.
2
A toxicocinética e a toxicodinâmica de um contaminante em uma espécie em
particular determina se uma exposição é capaz de uma resposta adversa. Uma aproximação
baseada em biomarcador fornece uma medida direta dos efeitos tóxicos nas espécies afetadas
(DICKERSON et al. 1994).
1.2 Biomarcadores e bioindicadores da qualidade ambiental
De acordo com WALKER et al. (2001) biomarcadores ou marcadores biológicos são
alterações xenobioticamente induzidas em componentes ou processos, estruturas ou funções
celulares ou bioquímicas que podem ser medidas em um sistema biológico ou amostra, tal
como uma variação nos flúidos celulares corporais, tecidos, ou orgãos dentro de um
organismo; respostas enzimáticas e produção de metabólitos são exemplos de biomarcadores
(LAM & WU 2003; VAN DER OOST et al. 2003), que podem ser relacionados a exposição
a, ou efeitos tóxicos do ambiente (ADAM et al. 2001). A presença de um xenobiótico, seu
metabólito ou o produto da interação entre um agente xenobiótico e uma molécula alvo (ou
célula) que é medida num compartimento de um organismo, pode ser classificada como um
biomarcador de exposição. Os biomarcadores são definidos como indicadores de uma
habilidade inerente ou adquirida de um organismo em responder a mudanças de exposição a
xenobióticos. Estes biomarcadores ajudam a elucidar o grau de resposta relacionada à
exposição. Esta divisão é algumas vezes ambígua, mas serve para agrupar biomarcadores.
O principal órgão responsável pela biotransformação é o fígado, que tem a função de
receber e processar substâncias químicas absorvidas pelo trato gastrointestinal antes que elas
sejam distribuídas para outros tecidos. No fígado, então, os xenobióticos são modificados
quimicamente, podendo, a partir daí ser armazenados, secretados na bile ou distribuídos pela
circulação para outros tecidos. O metabolismo de xenobióticos também pode ocorrer em
outros tecidos ou órgãos. Por ser o sistema enzimático mais importante na catálise dessas
reações, o citocromo P450, tem sua atividade metabólica aumentada quando o indivíduo está
exposto a determinados xenobióticos. Como demonstrado a alguns anos atrás por PAYNE
(1976) e confirmado por extensa literatura, a estimulação da atividade das enzimas do
citocromo P450 no fígado representa um dos sinais biológicos mais precoces da exposição a
poluentes na água. É sabido que a subfamília CYP1A está relacionada com processos da
biotransformação de determinados poluentes tais como: HPAs, BPCs, e outros
organoclorados. É através da reação de desalquilação da etoxiresorufina–O–desetilase
(atividade de EROD) que se pode quantificar a atividade enzimática desta subfamília e inferir
sobre a poluição aquática. Entre os indutores mais potentes de CYP1A estão os
hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HPAs), as dibenzodioxinas policloradas (DDPCs) e
os dibenzofuranos policlorados (DFPCs), azobenzenos e azóxibenzenos, as bifenilas
policloradas (BPCs), e os naftalenos (CASARETT 1991; SCHOLZ & SEGNER 1999). Em
geral, compostos altamente clorados são resistentes a biotransformação e causam prolongada
indução do citocromo P450 e de outras enzimas (CASARETT 1991). Portando, o aumento da
atividade enzimática (EROD) em peixes, pode ser um indicador da presença de substâncias
contaminantes indutoras, organoclorados, no rio. Assim, a determinação da atividade de
EROD pode ser usada como biomarcador.
Outro biomarcador muito utilizado é a Freqüência de Micronúcleos que avalia a
poluição aquática através de danos genotóxicos na célula de algumas espécies de peixes, ou
seja, formações de micronúcleos no citoplasma. Os micronúcleos são formados por danos
genotóxicos (clastogênicos) - fragmentos de cromossomos ou cromossomos acêntricos que
não são incorporados no núcleo principal das células filhas no momento da anáfase da mitose
(METCALFE 1988). Estudos de correlação entre o aparecimento de micronúcleos e a
exposição a determinadas substâncias são utilizados em peixes para detectar a presença de
substâncias químicas genotóxicas no sistema aquático, devido esses organismos apresentarem
várias espécies com alto grau de sensibilidade mesmo quando em contato com baixas
3
concentrações de agentes genotóxicos (CRISOLIA 2001; HOOFTMAN & DE RAAT 1982;
AL-SABTI 1994). Além disso, segundo AL-SABTI (1995) o teste de micronúcleos em
eritrócitos de peixes é simples, confiável e sensível.
Bioindicadores são respostas a efeitos ambientais que ocorrem em níveis mais altos de
organização biológica do que sub-organismo, e eles podem ser medidos a nível individual,
populacional (sucesso reprodutivo, mortalidade, distribuição de tamanho, redução na
abundância e biomassa), comunidades (produção primária, distribuição do ciclo de nutrientes)
ou a níveis de ecossistemas (WALKER et al. 2001; OERTEL & SALÁNKI 2003); medidas
biométricas e mudanças na composição específica podem ser considerados como
bioindicadores (LAM & WU 2003). Biomarcadores e bioindicadores são largamente usados
para determinar respostas de organismos a agentes estressores, biomarcadores sendo mais
específicos e com maior variabilidade de respostas, comparados aos bioindicadores (ADAMS
et al. 2001; WALKER et al. 2001; SCHMITT et al. 2005). O uso de ambos os tipos de
respostas contribui para o diagnóstico do risco ecológico e para estabelecer estratégias
adequadas de conservação para as espécies mais afetadas por poluentes.
Os bioindicadores utilizados neste trabalho foram: Índice hepato-somático (IHS),
Índice gonado-somático (IGS), Fator de Condição. Devido à estocagem de energia e às
funções metabólicas do fígado, alterações no tamanho do fígado devido a estressores
ambientais são de grande interesse. Portanto, a avaliação do IHS deve considerar o papel tanto
dos fatores endógenos quanto dos fatores exógenos. Dos índices organo-somáticos, o IHS é
um dos mais freqüentemente associados a exposição a contaminantes (ADAMS & MCLEAN
1985). Vários investigadores têm sugerido que o alargamento relativo do fígado em peixe
indica exposição a carcinógenos ambientais ou outros químicos tóxicos (POELS et al. 1980;
FLETCHER et al. 1982; FABACHER & BAUMANN 1985; KICENIUK & KHAN 1987;
GALLAGHER & DI GIULIO 1989; ADAMS et al. 1989). Por outro lado, alguns estudos em
laboratório apresentaram uma diminuição do IHS em peixes expostos a químicos
(CLAMBERS 1979; HICKIE & DIXON 1987).
O Índice gonado-somático (IGS) enquadra-se em uma categoria de indicadores que
fornece informação mais a nível estrutural do que funcional; informação a respeito da saúde
gonadal e estágio de maturação. O Índice gonado-somático é um dos vários índices organo-
somáticos, que, a exemplo do IHS, estabelece uma relação entre o órgão e o corpo inteiro. Há
evidência substancial de que a maioria dos animais sofre ciclo reprodutivo e, freqüentemente,
variação dramática no tamanho gonadal é observada através deste ciclo (DE VLAMING et al.
1981). Conseqüentemente, o cálculo do peso gonadal como uma percentagem do peso do
corpo tem sido usado rotineiramente para determinar a maturidade reprodutiva, assim como
acessar mudanças gonadais em resposta às dinâmicas ambientais (e.g. mudanças sazonais) ou
estresses exógenos (e.g. exposição a contaminantes). Existem evidências significativas de que
exposição a várias classes de poluentes ambientais pode resultar em alterações gonadais tais
como uma diminuição no IGS, mudanças morfológicas, ou ambos (SAKAMOTO et al. 2003;
PARKS et al. 2001; SEPÚLVEDA et al. 2002b).
O Fator de Condição é um reconhecido indicador de saúde de peixes (BULGER et al.
1995). Em geral, o Fator de Condição varia diretamente com a nutrição (TYLER & DUNN
1976; BRAGA 1986). Uma correlação negativa tem sido vista entre doença e condição em
peixes (MÖLLER 1985). Contudo, o Fator de Condição pode variar em uma ou outra direção
fora dos limites do alcance normal em resposta a exposição química. O Fator de Condição
pode também variar sazonalmente, (GRIFFITHS & KIRKWOOD 1995; SABOROWSKI &
BUCHHOLZ 1996; LIMA-JUNIOR & GOITEIN 2005), possívelmente devido a mudanças
na disponibilidade alimentar ou metabolismo e com mudanças no estatus gonadal
(CHELLAPPA et al. 1995). O Fator de Condição, assim como IHS e IGS, são indicadores da
saúde do peixe; entretanto, estes índices devem ser interpretados com cautela. Fatores com
4
potencial para confundir necessitam ser reconhecidos quando usamos um desses índices para
comparar grupos de peixes em relação aos efeitos de contaminantes. Uma restrição primária é
que o Fator de Condição e índices organo-somáticos podem ser comparados apenas dentro de
uma espécie ou entre espécies similares. E também o protocolo de estudo deve ser consistente
e conservativo em termos de amostragem, particularmente desde que o IHS pode ser alterado
dentro de minutos pelo estresse da captura.
Neste contexto, peixes vêm sendo amplamente utilizados em estudos de toxicologia e
monitoramento ambiental, na avaliação da saúde dos ecossistemas aquáticos tanto com
relação à presença quanto aos efeitos de poluentes, desde que estes provocam alterações no
ambiente, causando estresse, que se reflete em alterações bioquímicas e fisiológicas nos
organismos expostos; por isso a utilização de peixes no monitoramento e avaliação de
sistemas aquáticos vem alcançando grande importância na detecção precoce de impactos de
origem antrópica (GOKSØYR & FÖRLIN 1992; SWAMI et al. 1992; HAASCH et al. 1993;
EGGENS et al. 1995b; STEGEMAN et al. 1997; BAINY et al. 1999; BARRA et al. 2001;
KHAN 2003 a, b; GALLOWAY et al. 2003; PARENTE et al. 2004; GALLOWAY et al.
2004; ANTUNES & GIL 2004; BEHRENS & SEGNER 2005; FACEY et al. 2005;
VIJAYAN et al. 2006; KIRBY et al. 2007).
1.3 Poluentes orgânicos persistentes (POPs)
Poluentes orgânicos persistentes (POPs) são substâncias químicas eminentemente
produzidas pelo homem e que persistem no ambiente, por serem de difícil degradação
bioacumulam através da cadeia alimentar, e possuem um risco de causar efeitos adversos à
saúde humana e ao meio ambiente (FILLMAN et al. 2002). Com a evidência do transporte de
longo alcance dessas substâncias para regiões onde elas nunca foram usadas ou produzidas e a
conseqüente ameaça que elas representam ao ambiente de todo o globo, a comunidade
internacional tem agora, em várias ocasiões, chamado a atenção para ações globais urgentes
para se reduzir e eliminar o lançamento desses químicos (UNEP 2008). Poluentes orgânicos
persistentes são caracterizados pela baixa solubilidade em água e alta solubilidade em lipídios,
resultando em bioacumulação nos tecidos gordurosos de organismos vivos. Os compostos
organoclorados persistem por longos períodos no ambiente, com isso atuam cronicamente
sobre os organismos vivos sendo capazes de induzir alterações genéticas nos organismos
expostos, podendo levar a alterações congênitas e neoplasias diversas (ALI &
SREEKRISHNAN 2001), atuando negativamente, sobretudo como disruptor dos sistemas
reprodutivo, imunológico e endócrino, além de serem carcinogênicos (SHEFFIELD et al.
1998; YOSHIDA et al. 2000; SEPÚLVEDA et al. 2004; REYNAUD et al. 2006). Tais
compostos são transportados no ambiente em baixas concentrações pelos movimentos das
águas continentais e marinhas e o fato de serem semi-voláteis permite moverem-se por longas
distâncias na atmosfera, o que determina sua ampla distribuição através do planeta. Num
esforço para proteção do ambiente aquático, agências governamentais, em diversos países,
têm adotado legislação que visa reduzir ou mesmo eliminar descargas industriais tóxicas
(WHITE et al. 1996).
Alguns dos principais xenobióticos são: hidrocarbonetos policíclicos aromáticos
(HPAs), bifenilas policloradas (BPCs), diclorodifeniltricloroetano (DDT),
hexaclorocicloexano (HCH), dibenzodioxinas policloradas (DDPCs) e dibenzofuranos
policlorados (DFPCs).
O presente estudo tem por objetivo a utilização de uma bateria de biomarcadores e
bioindicadores de exposição a xenobióticos para detectar possíveis alterações bioquímicas e
fisiológicas em algumas espécies de peixes, refletindo o nível de estresse ambiental
provocado por poluentes organoclorados na bacia do rio Paraíba do Sul e reservatório do
Funil. Para tanto serão testadas algumas hipóteses.
5
2 HIPÓTESES
• Ecossistemas aquáticos próximos a grandes centros urbano-industriais apresentam
maiores concentrações de poluentes.
• Um aumento tanto do IHS, quanto do FC podem significar efeitos deletérios de um
estressor.
• O nível de concentração de poluentes no rio Paraíba do Sul pode apresentar variações
sazonais.
• O reservatório do Funil funciona como um filtro para poluentes das águas do rio
Paraíba do Sul à montante.
• A utilização de uma bateria de biomarcadores e bioindicadores é melhor para estudos
de biomonitoramento em relação à utilização de apenas uma ferramenta.
• Geophagus brasiliensis é uma espécie adequada para estudos de biomonitoramento.
6
3 MODELOS BIOLÓGICOS
Geophagus brasiliensis (QUOY & GAIMARD 1824) (Figura 1) conhecido
popularmente como acará. De acordo com MENEZES et al. (2007) esta espécie possui dados
ecológicos semelhantes ao de Geophagus iporangensis, que são as seguintes: é encontrada em
quase todos os tipos de ambientes, desde lóticos, como os riachos de altitude, até os lênticos
dos rios de planície, e também nos lagos e lagoas. Alimenta-se de invertebrados, que
encontram revolvendo o substrato. Apresenta dimorfismo sexual, sendo o macho maior do
que a fêmea e, durante a época da reprodução, desenvolve uma protuberância acentuada na
cabeça. Estado de conservação: não ameaçada ou em perigo (OYAKAWA et al. 2006).
Figura 1. Geophagus brasiliensis
Pimelodus maculatus LACÉPÈDE 1803 (Figura 2) popularmente chamado de mandi
ou bagre, vive em rios grandes, principalmente em áreas de correnteza fraca e moderada. Os
espinhos das nadadeiras peitorais e dorsal são duros e pungentes. Alimenta-se de insetos
aquáticos e suas larvas, procurando-os ativamente no substrato, principalmente no período
noturno e no crepúsculo. Estado de conservação: não ameaçada ou em perigo (OYAKAWA et
al. 2006; MENEZES et al. 2007).
Figura 2. Pimelodus maculatus
7
Hypostomus affinis (STEINDACHNER 1865) (Figura 3) encontrada em trechos
lênticos e lóticos, tanto de rios pequenos como grandes, em fundos rochosos ou arenosos.
Estado de conservação: Não ameaçada ou em perigo MENEZES et al. (2007).
Figura 3. Hypostomus affinis
Hypostomus aurogutatus (STEINDACHNER 1877) (Figura 4) encontrada nas correntezas de
grandes rios com fundos rochosos. Estado de conservação: Não ameaçada ou em perigo
MENEZES et al. (2007).
Figura 4. Hypostomus aurogutatus
8
4 ÁREA DE ESTUDO
Figura 5. Bacia do rio Paraíba do Sul e represa do Funil, com destaque para os locais
de coleta.
9
Capítulo I
Biomarcadores e bioindicadores em duas espécies de
peixes do trecho médio-inferior da Bacia do rio Paraíba do
Sul, Brasil.
10
RESUMO
O trecho médio-inferior da bacia do rio Paraíba do Sul é o que apresenta maiores alterações
ambientais em função da grande presença de centros urbano-industriais, amplas áreas de
agricultura intensiva e muitas barragens para geração de energia hidrelétrica. O objetivo
deste estudo foi o de acessar os níveis de contaminação por xenobióticos em 7 locais no
trecho médio-inferior da bacia do rio Paraíba do Sul utilizando biomarcadores e
bioindicadores em duas espécies de peixes: Geophagus brasiliensis e Pimelodus maculatus e
verificar se as espécies respondem de maneira semelhante. A hipótese a ser testada neste
trabalho é a de que os locais com maior entrada de efluentes urbanos, industriais e agrícolas
(poluição difusa), assim como maior número de barragens apresentem maior presença de
poluentes químicos xenobióticos. Neste trabalho foram usados dois biomarcadores (a
atividade de etoxiresorufina–O–desetilase (EROD), medida fluorimetricamente na fração S9
hepática, e Freqüência de Micronúcleos (MN), observada no citoplasma dos eritrócitos); e
três bioindicadores (Índice hepato-somático – IHS, - Índice gonado-somático - IGS -, e Fator
de Condição – FC -) em G. brasiliensis e P. maculatus, espécies amplamente distribuídas no
sistema. Os locais amostrados foram: 1 – reservatório do Funil; 2 – Volta Redonda; 3 –
represa de Ribeirão das Lajes; 4 – Três Rios; 5 – rio Preto (Referência); 6 – rio Paraibuna
(MG); 7 – rio Piabanha. Com exceção do IGS, todos os biomarcadores e bioindicadores
apresentaram diferenças significativas entre os locais para ambas as espécies. De acordo com
os mesmos, possivelmente os locais mais críticos quanto à presença de xenobióticos no
trecho médio-inferior da bacia do rio Paraíba do Sul são os locais 7, 6, 4 e 2, concordando
com a hipótese de que locais com maior quantidade de efluentes industriais, domésticos,
agrícolas e de represas para geração de energia hidrelétrica apresentam maiores quantidades
de químicos xenobióticos. As espécies responderam de maneira semelhante tanto aos
biomarcadores quanto aos bioindicadores. A indução de CYP1A, apesar de ter obtido
respostas semelhantes entre as espécies, apresentou maiores valores em G. brasiliensis para
todos os locais onde foram realizadas atividade de EROD em ambas as espécies: 1, 4 e 7.
Palavras-chave: Biomonitoramento, peixes, poluição, rio Paraíba do Sul.
11
ABSTRACT
The middle-lower river Paraíba do Sul (PSR) watershed is the most alterated segment in
environmental conditions due to the presence of large urban-industrial centers, with large
áreas of intensive agriculture and dams obstruction for hydreletic purposes. The aim of this
study was to assess xenobiotic contamination at 7 sites in the middle-lower PSR reaches
using biomarkers and bioindicators in two fish species: Geophagus brasiliensis and
Pimelodus maculatus and to test wheter this two species respond in a similar way to
xenobiotic exposure. The tested hypothesis is that sites near to efluent discharges from
urban, industrical and agricultural areas (difuse pollution), and near to dams have larger
xenobiotic influence. Biomarkers used were ethoxyresorufin–O–deethylase activity (EROD),
measured fluorimetricaly at S9 hepatic fraction, and Micronucleus Frequency (MN),
observed in eritrocits in cytoplasm. The three bioindicators used were the Hepatosomatic
Index (HSI), the Gonadosomatic Index (IGS) and Condition Factor (CF) in G. brasiliensis
and P. maculatus, species widely distributed througout the system. The sampled sites were: 1
– Funil reservoir; 2 – PSR at Volta Redonda; 3 – Ribeirão das Lajes reservoir; 4 – PSR at
Três Rios; 5 – Preto river (Reference); 6 – Paraibuna river (MG); 7 – Piabanha river. All
biomarkers and bioindicator, except GSI, showed significant difference among sites for both
species. The most impaired sites due to the xenobiotic presence in the middle-lower PSR
reaches were probably 7, 6, 4 e 2, confirming the hypothesis that sites near to larger amount
of industrial, domestic and agricultural efluents and reservoir for hydreletric purposes have
large amount of xenobiotics. The species reponded similarly to biomarkes and bioindicators.
Induction of CYP1A, in spite of showing similar responses between the species, showed
higher values for G. brasiliensis at all sites where EROD activity occurred, mainly sites 1, 4
e 7.
Key words: Biomonitoring, fishes, pollution, Paraíba do Sul river.
12
1 INTRODUÇÃO
A bacia do rio Paraíba do Sul (Figura 1) vem sofrendo intensa pressão antrópica sob a
forma de despejos em suas águas de xenobióticos originados principalmente através de
atividades industriais, agricultura intensiva, efluentes domésticos e construção de barragens
para geração de energia elétrica. Tais atividades vêm crescendo em todo mundo nas últimas
décadas e vem sendo alvo de intenso debate devido aos impactos sobre a saúde dos
ecossistemas (SINDERMAN 1996). O trecho médio-inferior do rio Paraíba do Sul é
considerado o de maior nível de alteração devido à existência de grandes centros urbano-
industriais, além da presença de represas para a obtenção de energia hidrelétrica. A começar
pelo reservatório do Funil, que recebe as águas do rio Paraíba do Sul com uma grande carga
de poluentes proveniente de algumas das principais cidades do Estado de São Paulo, o mais
industrializado da América Latina, situadas à sua montante; mais para baixo encontram-se os
pólos de Barra Mansa-Volta Redonda, no canal principal; o município de Juiz de Fora que é
drenado pelo rio Paraíbuna (MG); e o município de Petrópolis, que é drenado pelo rio
Piabanha, sendo este represado por duas barragens ao longo de seu curso; os dois últimos são
grandes tributários do rio Paraíba do Sul, ambos encontrando-se com este na altura da cidade
de Três Rios. Por outro lado, o rio Preto, tributário do Paraíbuna (MG), pode ser considerado
um local pouco alterado visto não existir nenhum grande centro urbano-industrial, barragem
nem agricultura intensiva em sua área de drenagem.
O acesso de poluentes xenobióticos tais como hidrocarbonetos aromáticos policíclicos
(HPAs), bifenilas policloradas (BPCs), e diclorofeniltricloroetano (DDT) ao meio ambiente
ocorre através de derramamentos e lançamentos industriais, depósitos irregulares de produtos
químicos em áreas abertas, lixo doméstico e industrial que recebe esses tipos de
contaminantes, carreamento de fertilizantes, pesticidas e fungicidas pelas águas da chuva de
regiões agrícolas para os rios e acidentes (vazamento, explosão ou superaquecimento de
transformadores). Desde a metade da década de 80, o uso de pesticidas organoclorados tem
sido restrito no Brasil. Alguns estudos durante as décadas passadas mostraram que no Brasil,
como em outras partes do mundo, a contaminação por micropoluentes orgânicos deriva não
apenas de campos agrícolas, mas também de áreas urbanas (TOMASI 1985; LUCHINI et al.
1981).
A utilização de peixes como parâmetro para se avaliar o nível de poluição de
ecossistemas aquáticos por compostos organoclorados tem sido cada vez mais constante
(STEGEMAN et al. 1997; BAINY et al. 1999; PARENTE et al. 2004; FERREIRA et al.
2004; FACEY et al. 2005; KIRBY et al. 2007). Os organismos ou compartimentos desses
organismos assim utilizados recebem o nome de biomarcadores ou bioindicadores,
dependendo de seu nível de organização.
Biomarcadores moleculares podem ser ferramentas de alerta inicial, prevenindo danos
irreversíveis em organismos, comunidades e ecossistemas (LOPEZ-BAREA & PUEYO
1998). Um biomarcador é definido como uma mudança (molecular, bioquímica, fisiológica,
estrutural ou comportamental) ou aberração em um organismo, que pode ser usado para
estimar exposição a químicos, ou efeitos resultantes dessa exposição (HANDY et al. 2003).
O uso de uma bateria de biomarcadores pode ser usado para avaliar as várias respostas
a misturas de poluentes em organismos sob estresse (AARAB et al. 2004). Hidrocarbonetos
policíclicos aromáticos (HPAs), bifenilas policloradas (BPCs), dioxinas e furanos são
poluentes amplamente encontrados em ambientes aquáticos com potencial para exercer uma
ampla gama de efeitos adversos sobre a biota. Devido à alta lipofilicidade característica dos
compostos orgânicos de alto peso molecular, esses poluentes tendem a se acumular em
13
tecidos vivos (IEOPOPS 1990; MACKAY & PATERSON 1982). Dessa forma, esses
poluentes são acumulados ao longo da cadeia trófica (biomagnificação). O potencial
carcinogênico causado por essas moléculas estão listados pela Agência de Proteção Ambiental
dos Estados Unidos como poluentes prioritários. Estima-se que mais de um milhão de
toneladas de BPCs tenham sido produzidas e comercializadas (WHO 1993).
A biotransformação de xenobióticos é o processo pelo qual a molécula hidrofóbica do
composto parental é gradualmente transformada em outro composto mais hidrofílico para
facilitar sua excreção do organismo. O processo de biotransformação ocorre principalmente
no fígado e é mediado por algumas famílias de enzimas (CASARETT et al. 1991). Essas
enzimas de biotransformação participam também do metabolismo endógeno e são geralmente
divididas em duas fases: fase I, onde grupos funcionais são adicionados ou expostos ao
composto parental, nesta fase desenvolvem-se em sua maioria reações de oxidação e hidrólise
e, em alguns casos, reações de redução, e as reações de fase II, onde as moléculas endógenas
são conjugadas ao produto da fase I ou diretamente ao xenobiótico. Os produtos finais são
mais hidrofílicos, e menos reativos podendo ser excretados do organismo (VAN DER OOST
et al. 2003). Entretanto, em alguns casos o metabólito produzido é mais reativo (tóxico) do
que a substância original, sendo que o sistema enzimático citocromo P450 é o principal
envolvido neste processo (STINE & BROWN 1996).
Os citocromos P450 são as principais enzimas da fase I da biotransformação. A
indução de isoformas da subfamília CYP1A em fígado de peixes tem sido utilizada como
biomarcador de exposição a poluentes industriais, tanto em águas continentais como em
ecossistemas marinhos (HAASCH et al. 1993; BAINY et al. 1999; PARENTE et al. 2004;
KIRBY et al. 2007). A indução de CYP1A ocorre pela ligação do indutor (poluente) ao
receptor de hidrocarbonetos aromáticos (Receptor Aril hidrocarbon - AhR) no citoplasma dos
hepatócitos, em seguida, o complexo AhR-poluente é translocado para o núcleo celular onde
se liga a regiões reguladoras da expressão gênica (conhecidas como elementos responsivos a
xenobióticos – ERX) induzindo a expressão de diversas proteínas, entre elas o CYP1A. A
atividade catalítica do CYP1A pode ser medida pela determinação da reação de desetilação da
etoxiresorufina (etoxiresorufina-O-desetilase - EROD). A determinação da atividade de
EROD é um dos métodos mais utilizados para se avaliar a indução do CYP1A (GOKSOYR
1995).
Outro método utilizado para estudos de biomonitoramento ambiental em peixes é a
Freqüência de Micronúcleos (MN) em eritrócitos no sangue periférico. Estudos de correlação
entre o aparecimento de micronúcleos e a exposição a determinadas substâncias são
atualmente realizados em várias espécies, inclusive peixes para detectar a presença de
substâncias químicas genotóxicas no ambiente aquático. Apesar de mais simples do que a
atividade de EROD, este método também é considerado confiável e sensível (AL-SABTI &
METCALFE 1995). O teste de micronúcleo (MN), considerado como sendo um dos métodos
mais usados para avaliar a genotoxicidade em sistemas aquáticos, tem sido extensivamente
aplicado em espécies de peixes (AL-SABTI & METCALFE 1995; ÇARVAŞ & ERGENE
GÖZÜKARA 2005a, b). Micronúcleos são formações de material nuclear que aparecem no
citoplasma como pequenos núcleos satélites do núcleo principal das células filhas. Sua
formação indica dano genotóxico, mais especificamente, clastogênico. Após exposição a
diferentes poluentes genotóxicos, clastogênicos, tanto sob condições de laboratório quanto de
campo, eritrócitos do sangue periférico em peixes apresentaram alta Freqüência de
Micronúcleos (AL-SABTI 1994; CRISOLIA & STARLING 2001; RODRIGUEZ-CEA et al.
2003; ÇAVAŞ 2005a; DA SILVA SOUZA & FONTANETT 2006). A hipótese a ser testada é
a de que os locais com maior entrada de efluentes urbanos, industriais e agrícolas (poluição
difusa), assim como locais com maior número de barragens apresentam maior presença de
poluentes químicos xenobióticos, registradas pelos maiores valores de atividade de EROD,
14
Freqüência de Micronúcleos (MN), Índice hepato-somático (IHS) e menores valores de Índice
gonado-somático (IGS) em relação aos locais de referência. E se as espécies respondem da
mesma maneira.
15
2 OBJETIVOS
2.1 Gerais
O presente trabalho tem como objetivo geral avaliar a qualidade ambiental em locais
selecionados do trecho médio-inferior da bacia do rio Paraíba do Sul através do uso de
biomarcadores (atividade de EROD e Freqüência de Micronúcleos) e bioindicadores (Índice
hepato-somático, Índice gonado-somático e Fator de Condição).
2.2 Objetivos específicos
•
••
• Avaliar a indução da atividade de EROD na fração S9 hepática de peixes coletados no
trecho médio-inferior da bacia do rio Paraíba do Sul;
• Avaliar tendências espaciais ao longo dos locais amostrados;
• Verificar Freqüência de Micronúcleos (MN) entre os locais amostrados;
• Comparar os valores do Índice hepato-somático (IHS) entre os locais amostrados;
• Comparar os valores do Índice gonado-somático (IGS) entre os locais amostrados;
• Comparar os valores do Fator de Condição (FC) entre os locais amostados;
• Verificar se as espécies respondem da mesma forma.
16
3 ÁREA DE ESTUDO
O rio Paraíba do Sul (RPS) (Figura 1) é formado pelo encontro do rio Paraitinga com o
rio Paraibuna, a 1.800 m de altitude na Serra da Bocaina, no Estado de São Paulo e sua foz
localiza-se na cidade de São João da Barra, no Estado do Rio de Janeiro, onde se encontra
com o Oceano Atlântico. Representa o principal recurso hídrico da Região Sudeste, a mais
industrializada do Brasil, banhando os Estados de São Paulo, Rio de Janeiro e Minas Gerais.
Sua bacia hidrográfica está situada entre as latitudes 20˚26' e 23˚39'Sul e as longitudes de
41˚e 46˚30'Oeste, possuindo uma área total de cerca de 55.500 km
2
e uma extensão de 1.150
km. É o principal manancial de água lóticas do Estado do Rio de Janeiro, abastece cerca de
80% do suprimento de água da população de aproximadamente 10 milhões de pessoas da área
metropolitana do Grande Rio, quando cerca de 40% de sua vazão é desviada para o rio
Guandu após atravessar a divisa de São Paulo com o Rio de Janeiro, sendo também
responsável por cerca de 20% da produção de energia hidrelétrica deste estado. Ao todo suas
águas são utilizadas por mais de 20 milhões de pessoas para os mais diversos fins: indústria,
agricultura, energia elétrica através da construção de várias represas ao longo do seu percurso,
consumo, lazer, pesca, preservação da fauna e flora. Por tão grande importância, justifica-se a
adoção de medidas de controle e ações preventivas e de acompanhamento permanente da
qualidade de suas águas.
O clima é subtropical com um regime de precipitação bem caracterizado onde ocorrem
chuvas entre novembro e janeiro. Essas chuvas pesadas ocasionalmente causam grandes
enchentes do rio Paraíba do Sul. O período entre junho e agosto é o mais seco do ano. O fluxo
máximo do rio é observado durante o verão (4380 m
3
s
-1
) e o período de descargas mais
baixas ocorre geralmente no inverno (180 m
3
s
-1
) (DNAEE 1983; ROSSO et al. 1991). De
acordo com DNAEE (1983), que usou a classificação de Köppen, ao longo da porção média o
tipo Cwa (tropical de altitude com verão quente e chuvoso) domina, e nas regiões inferiores
Cfa (subtropical com verão quente) e Aw (quente e úmido com verão chuvoso). A temperatura
no trecho médio e inferior do RPS é mais alta, com máxima alcançando entre 32 e 34ºC
(DNAEE 1983).
17
Figura 1. Bacia do rio Paraíba do Sul, com destaque para os sete locais de estudo.
Locais: 1 – Reservatório do Funil; 2 – Volta Redonda; 3 – Represa de Ribeirão das
Lajes; 4 – rio Paraíba do Sul em Três Rios; 5 – rio Preto (referência); 6 – rio Paraibuna
(MG); 7 – rio Piabanha.
Abaixo estão descritas algumas características dos 7 locais do trecho médio-inferior da
bacia do rio Paraíba do Sul estudados no presente trabalho:
Local 1: (Reservatório do Funil)
O Reservatório do Funil localiza-se no Estado do Rio de Janeiro, na divisa com o
Estado de São Paulo, no Município de Resende entre as coordenadas (22°30ʹS, 44°45ʹW,
altitude 440 m), onde represa o rio Paraíba do Sul no seu trecho médio, além de dois
tributários: Santana e Lages. O reservatório apresenta uma superfície de 40 km
2
, profundidade
média de 22 m, profundidade máxima de 70m e volume total de 890 × 10
6
m
3
. O tempo de
retenção é de 10 a 50 dias, de acordo com a estação do ano (BRANCO et al. 2002).
Local 2: (Volta Redonda)
Volta Redonda é um grande centro urbano-industrial localizado no Vale do Paraíba no
Sul Fluminense, Estado do Rio de Janeiro. Possui além de outras grandes indústrias a
Companhia Siderúrgica Nacional (CSN), a maior siderúrgica da América Latina. Em Volta
Redonda o rio Paraíba do Sul sofre uma diminuição em sua vazão média em relação a Barra
Mansa, município situado imediatamente à sua montante. Essa diminuição da vazão é devido
ao grande consumo de água pela CSN.
18
Local 3: (Reservatório de Ribeirão das Lajes)
O Reservatório de Lajes corresponde ao maior represamento do Estado do Rio de
Janeiro, localizando-se nas vertentes da Serra do Mar, entre os municípios de Piraí e Rio
Claro. O lago artificial ocupa cerca de 30 km
2
de superfície, e sua principal finalidade é a
geração de energia elétrica pela LIGHT (Serviços de Eletricidade S.A).
Local 4: (Três Rios)
A drenagem nesta área é bastante elevada, constituída pelo aporte de dois grandes
tributários do rio Paraíba do Sul: na margem esquerda o rio Paraíbuna (MG), drenando
grandes áreas do Sudeste de Minas, e o rio Piabanha, na margem direita, drenando áreas de
altitude a partir de Petrópolis. Área predominantemente ocupada por pastagem e capoeira. É
um local onde apresenta uma qualidade ambiental da água ruim.
Local 5: (rio Preto) - LOCAL DE REFERÊNCIA -
O rio Preto nasce na Serra da Mantiqueira, no estado de Minas Gerais, banhanhando
as comunidades de Maromba e Maringá (município de Itatiaia) e Visconde de Mauá, Lote
Dez, Campo Alegre e Rio Preto (em Resende - RJ), até desaguar no Rio Paraibuna (MG),
que tem sua foz no rio Paraíba do Sul na altura de Três Rios (RJ), a tempo de abastecer
cidades como Campos e outras. Possui poucas indústrias ao longo de seu curso, assim como
agricultura extensiva, além disso, não possui nenhuma barragem para geração de energia
elétrica. Tais características o tornam apropriado para ser utilizado como local de referência.
Local 6: (Paraibuna Mineiro)
O rio Paraibuna banha os estados de Minas Gerais e do Rio de Janeiro. Nasce na Zona
da Mata Mineira e recebe como principais afluentes os rios Preto, Cágado e do Peixe antes de
desaguar no rio Paraíba do Sul próximo à cidade de Três Rios, no Rio de Janeiro. Dentre os
municípios banhados pelo rio Paraibuna, destaca-se Juiz de Fora, importante pólo industrial
de Minas Gerais. Ao longo do vale do Paraibuna foram abertas estradas que historicamente
marcaram o povoamento e o desenvolvimento de Minas Gerais e da Zona da Mata, como o
Caminho Novo das Minas em 1707, a Estrada União e Indústria em 1856 e também a Estrada
de Ferro Central do Brasil. O rio Paraibuna também está ligado ao pioneirismo da utilização
dos rios brasileiros para a geração de energia. Nele foi construída em 1889, próxima a Juiz de
Fora, a Usina de Marmelos, primeira usina hidrelétrica da América do Sul. Embora com
influência de área urbana ao longo do seu trecho em Levy Gasparian, na ecologia da paisagem
predominam pastagens e alguns pequenos fragmentos florestais em recuperação. Assim como
o Piabanha representa neste sistema estudado, um dos tributários de maior porte e alta
complexidade ambiental. No setor mineiro da bacia, segundo a Fundação estadual do Meio
Ambiente (FEAM) Apud (GRUBEN et al., 2002), localizam-se cerca de 2000 indústrias, das
quais 1000 se situam na sub-bacia do rio Paraibuna. O Município de Juiz de Fora comporta
83% das indútrias potencialmente poluentes, incluindo metalúrgicas, químicas, têxteis,
alimentícias, de papel e outras. A maior parte dos municípios da bacia do Paraibuna não
possuem nenhum tipo de tratamento, ou apenas dispõem de simples desinfecção da água.
19
Local 7: (rio Piabanha)
A bacia hidrográfica do rio Piabanha que abrange uma área de 2.065 km
2
, percorrendo
quatro municípios fluminenses – Areal, Petrópolis, Teresópolis e São José do Vale do Rio
Preto, onde vivem cerca de 400 mil pessoas.
Seu principal afluente é o rio Paquequer, com curso de 75 km, banhando Teresópolis e
São José do Vale do Rio Preto. A principal fonte de poluição nessa região é o lançamento de
esgoto doméstico in natura e de efluentes industriais, além de represas para geração de
energia hidrelétrica.
Nas estações monitoradas pela Fundação Estadual de Engenharia e Meio Ambiente
(FEEMA 1999), uma delas no centro de Petrópolis e outra próxima à sua foz, se confirmou o
recebimento em suas águas de despejos domésticos sem tratamento, além de despejos
industriais. Petrópolis é um dos três municípios do Estado do Rio de Janeiro que privatizaram
os serviços de abastecimento de água. Todos os sistemas de esgotos são operados e mantidos
por serviços ou companhias ligadas à prefeituras ou pelas concessionárias privadas. Em
esgoto sanitário os índices de atendimento podem ser assim considerados: 45,0% das
populações urbanas são atendidas por rede coletora, e, dessas, apenas 3,5% possuem
tratamento, mesmo assim de forma parcial (GRUBEN et al. 2002).
20
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 COLETA
As espécies selecionadas para este estudo foram: Geophagus brasiliensis (Quoy &
Gaimard 1824) e Pimelodus maculatus Lacepéde 1803. A escolha dessas espécies foi devido
ao fato de ambas serem abundantes ao longo de todo o trecho do rio Paraíba do Sul, pelos
hábitos alimentares e o local de preferência no espaço físico do rio; para que se pudesse ter
um maior nível de abrangência sobre a qualidade ambiental desse sistema. Pimelodus
maculatus é iliófago e bentônico; enquanto G. brasiliensis, é onívoro e nectônico, tendo
preferência pelas margens rasas.
As coletas dos peixes foram realizadas nos meses de maio a setembro de 2006. Para a
captura foram utilizadas tarrafas e redes de espera. Logo após a captura, os peixes foram
anestesiados em banho de gelo e sacrificados por secção cervical, em seguida foram
dissecados com auxílio de material cirúrgico. Foram coletados indivíduos machos e fêmeas de
ambas as espécies em todos os locais amostrados, com exceção do rio Preto onde não foi
capturado nenhum espécime de P. maculatus.
Os indivíduos foram pesados em balança eletrônica portátil Acculab VI-600 e tomados
os comprimentos totais. O sexo foi determinado através de inspeção das gônadas, após incisão
da cavidade celomática, os órgãos da cavidade abdominal foram cuidadosamente retirados e
os fígados foram pesados em balança eletrônica portátil - Acculab VI-200, embalados em
papel laminado, previamente identificados, e rapidamente congelado em galão portátil de
nitrogênio líquido até a chegada ao laboratório. O comprimento total dos indivíduos de G.
brasiliensis nos locais foi de 15.83 (cm) a 24.83 (cm) (Min-Máx) (Tabela 1), e o comprimento
total dos indivíduos de P. maculatus nos locais foi de 19.79 (cm) a 27.25 (cm) (Min-Máx)
(Tabela 1).
Tabela 1. Comprimento total médio ± desvio padrão e o número de espécimes de cada
espécie capturada em cada local. N= número de indivíduos.
Espécies Locais Comprimento médio ±
Desvio padrão
N
G. brasiliensis
1 20.29±3.55 7
2 23.00±3.40 10
3 24.83±3.59 6
4 22.21±2.45 7
5 16.98±2.05 9
6 15.83±2.52 3
7 16.75±1.66 5
P. maculatus 1 27.25±4.34 4
4 24.67±4.26 6
7 19.79±3.35 8
21
4.2 PRODUTOS QUÍMICOS
O substrato (etoxiresorufina), o produto da reação (resorufina), ß-NADP, glicose-6-
fosfato, glicose-6-fosfatodesidrogenase, albumina sérica bovina e o reagente de Bradford
foram todos comprados de Sigma Chemical Company, St Louis MO, USA. TRIS, MgCl
2
e
outros sais foram de classe analítica e fornecidos por Merck SA Indústrias Químicas, Rio de
Janeiro, Brasil.
4.3 ATIVIDADES DE LABORATÓRIO
4.3.1 Determinação da atividade enzimática – EROD
4.3.1.1 Preparação da fração citosólica (S9) hepática
Os fígados foram colocados em placa de Petri e descongelados em banho de gelo para
a preparação da fração S9. A homogeneização de cada fígado foi realizada à temperatura de
4ºC - em homogeneizadores de vidro do tipo Potter-Elvejhem com pistilo de teflon - em
solução contendo TRIS 50mM, sacarose 250mM, EDTA 100mM e glicerol 20% num volume
correspondente a 4 vezes o seu peso, a uma velocidade angular de aproximadamente 1200
rpm. O homogeneizado foi, em seguida, levado à centrifugação (Eppendorf ®5804R) à 4ºC e
9000g por 30 minutos. Após a centrifugação, o sobrenadante de cada amostra foi filtrado em
gaze e transferido para 3 criotubos.
4.3.1.2 Determinação da concentração de proteínas na fração S9
Para a dosagem de proteínas totais na fração S9 usou-se o método colorimétrico
descrito por BRADFORD et al. (1976), adaptado para microplaca, utilizando o corante Azul
de Coomassie G-250 e leitura de densidade ótica (DO) a 595 nm (espectrofotômetro de
microplaca Molecular Devices - Spectra Max Plus 384). As curvas de calibração foram
realizadas com albumina sérica bovina – BSA Sigma Chemical Co - 1,4 mg/ml diluída em
solução tampão fosfato (KH
2
PO
4
50 mM e NaCl 150 mM, pH 7,2) para se obter
concentrações adequadas. Para determinação da concentração de proteínas na fração S9, esta
foi diluída 1:30 e colocado 5 µl de amostra diluída na microplaca. Em seguida foram
adicionados 250µl de reagente de Bradford – Merck em cada poço da microplaca. Cada valor
de densidade ótica foi convertido em concentração de proteína, empregando-se a curva
padrão. Foram feitas correções para cada fator de diluição, e as concentrações de proteína na
fração S9 calculadas como a média obtida (média final) a partir do valor de cada réplica e
expressas como mg de proteína / ml de S9. As determinações foram realizadas em triplicata
considerando um coeficiente máximo de variação de 10%.
4.3.1.3 Determinação da Atividade enzimática - EROD
A determinação da atividade de EROD foi realizada em espectrofluorímetro de
microplaca. Inicialmente, foi adicionado em cada poço tampão fosfato de potássio dibásico.
Em seguida, a cada poço foi adicionado volume exato da fração S9 para a obtenção de 25
microgramas de proteínas totais por poço e o substrato. A microplaca foi, então, encubada por
2 minutos a 30°C e a reação iniciada pela adição de um sistema regenerador de elétrons em
cada poço. A reação ocorreu durante 10 minutos, quando foi terminada pela adição de
acetonitrila nos poços. O produto final, resorufina, foi quantificado em spectrofotômetro (Em:
50; Ex: 582).
22
4.3.2 Determinação da Freqüência de Micronúcleos (MN)
No momento da dissecção dos peixes adicionou-se uma gota de sangue periférico de
cada indivíduo em lâminas para microscopia devidamente identificadas e fez-se o esfregaço
sanguíneo. As lâminas foram mantidas em estantes à temperatura ambiente até que estivessem
secas e posteriormente as amostras foram fixadas com etanol PA por 20 minutos e novamente
secas à temperatura ambiente.
Em laboratório, a coloração das lâminas foi feita com Giemsa por 6 minutos. As
lâminas foram lavadas em água corrente até o excesso de corante ser retirado completamente.
Após a secagem das lâminas, os eritrócitos dos peixes foram observados ao microscópio
óptico Olympus BX 45 no aumento final de 1000 vezes (imersão). Foram examinadas 1000
células em cada lâmina.
Foram consideradas apenas hemácias nucleadas com membranas nucleares e
citoplasmáticas intactas. Os micronúcleos foram considerados como os corpúsculos que em
relação ao núcleo apresentaram até 1/3 do seu tamanho, estando nitidamente separados, com
bordas distinguíveis, mesma cor e refringência.
4.3.3 Bioindicadores
Foram calculados três bioindicadores: Índice hepato-somático (IHS), Índice gonado-
somático (IGS) e Fator de Condição (FC), através das seguintes equações:
IHS = (Peso do fígado / Peso total)
*100
;
IGS = (Peso da gônada / Peso total
)*100
;
FC =
(Peso total / Comprimento padrão
3
)*100.
4.4 Análises estatísticas
Atividade enzimática (EROD), Freqüência de Micronúcleos (MN), Índice hepato-
somático (IHS), Índice gonado-somático (IGS), e Fator de Condição (FC) foram comparados
entre os locais amostrados através da análise de variância (ANOVA), seguida pelo teste “a
posteriori” de diferenças de média de Tukey ao nível de confiança de 95% (P<0.05) para
determinação de que médias foram significativamente diferentes.
23
5 RESULTADOS
5.1 Atividade de EROD
O rio Piabanha (local 7) foi o local que apresentou a maior indução de EROD em G.
brasiliensis dentre todos os locais estudados, tendo sido detectado mais que o dobro de
indução de CYP1A do que a verificada para o local 5 (rio Preto -referência-), (Tabela 2,
Figura 2). A atividade de EROD para G. brasiliensis no rio Piabanha foi significativamente
diferente (F=22.5; P=0.0000**) em relação a todos os demais locais estudados.
Tabela 2. Atividade de etoxiresorufina-O-desetilase (EROD) em G. brasiliensis coletados em
sete locais da bacia do rio Paraíba do Sul (locais: 5 – referência; 1 – reservatório do Funil; 2 –
Volta Redonda; 3 – reservatório de Ribeirão das Lajes; 4 – Três Rios; 6 – rio Paraibuna
Mineiro; 7 – rio Piabanha - alterados). N = Número de indivíduos; Valores: Média ± Desvio
padrão.
Locais Comprimento
(cm)
Peso (g) N Atividade de
EROD
(pmoles
resor/mg
prot/min)
Diferenças-
Tukey
5 (Referência) 16.98±2.05 93.00±41.47
9
130.18±46,72 A
1 20.29±3.55 151.83±75.51
7
62.14±1.75 A
2 23.00±3.40 277.00±114.63
10
86.72±2.24 A
3 24.83±3.59 251.35±83.75
6
131.79±4.85 A
4 22.21±2.45 225.00±75.05
7
134.38±60.16 A
6 15.83±2.52 85.25±30.66
3
182.52±65.72 A
7 16.75±1.66 84.00±33.62
5
284.06±100.32
B
24
Figura 2. Atividade EROD na fração S9 hepática em G. brasiliensis, medida
em (pmoles resor/mg prot/min).
Para Pimelodus maculatus foram detectados maiores valores de atividade de EROD
nos locais 4 (Três Rios) e 7 (rio Piabanha) (Tabela 3, Figura 3), ambos com diferença
significativa (F=4.49; P=0.012*) em relação ao local 1 (reservatório do Funil).
Tabela 3. Atividade de etoxiresorufina-O-desetilase (EROD) em P. maculatus coletados em
três locais da bacia do rio Paraíba do Sul (locais: 1 – reservatório do Funil; 4 - Três Rios; 7 –
rio Piabanha). N = Número de indivíduos; Valores: Média ± Desvio padrão.
Locais Parâmetros
dos peixes
N EROD
(pmoles
resor/mg
prot/min)
Dif. Tukey
Comprimento
(cm)
Peso (g)
1 27.25±4.34 249.75±104.57 4 42.25±0.99 A
4 24.67±4.26 185.05±100.03 6 72.80±9.57 B
7 19.79±3.35 63.62±43.98 8 92.75±29.68 B
0.00
50.00
100.00
150.00
200.00
250.00
300.00
350.00
F
U
N
I
L
VOLTA REDONDA
R
I
BE
I
R
ÃO D
AS
LA
JE
S
T
R
ÊS RI
O
S
RIO PRETO
P
A
RA
I
BU
N
A M
IN
EIR
O
P
I
A
BAN
H
A
pmoles resor/mg prot/min
25
Figura 3. Atividade EROD na fração S9 hepática emP. maculatus, medida em
(pmoles resor/mg prot/min).
5.2 Freqüência de Micronúcleos (MN)
A Freqüência de Micronúcleos MN (‰) nos eritrócitos de G. brasiliensis foi mais
elevada nos locais 4 (Três Rios) e 7 (rio Piabanha) (Tabela 4). Ambos apresentaram
diferenças significativas (F=26.91; P=0.001**) em relação aos locais 1 (reservatório do
Funil), 2 (Volta Redonda) e 5 (rio Preto-Referência).
Tabela 4. Freqüência de Micronúcleos (MN) no sangue de G. brasiliensis e P. maculatus nos
seis locais de estudo (locais: 1 – reservatório do Funil; 2 – Volta Redonda; 4 – Três Rios; 5 –
rio Preto; 6 – rio Paraibuna; 7 – rio Piabanha). N = Número de indivíduos; Valores: Média ±
Desvio padrão.
Locais G. brasiliensis P. maculatus
N MN N MN
1
2
7
9
0±0
0.56±0.73
4
0
0.25±0.5
-
4 6 3.3±1.4 5 3.2±1.6
5 8 0.13 ±0.35 0 -
6 0 - 6 1.8±1.2
7 5 2.2±0.4 9 1.6±1.0
Pimelodus maculatus apresentou a maior Freqüência de Micronúcleos (MN) para o
local 4 (Três Rios) (Tabela 4), sendo significativamente diferente (F=4.98; P=0.010*) em
relação ao local 1.
5.3 Índice hepato-somático
Em Geophagus brasiliensis os maiores valores do IHS foram detectados no local 2
(Volta Redonda) (Tabela 5), com diferença significativa (F=6.31; P=0.00007**) em relação
aos outros seis locais estudados.
0.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
120.00
FUNIL TRÊS RIOS PIABANHA
pmoles resor/mg prot/min
26
Tabela 5. Índice hepato-somático (IHS) em G. brasiliensis e P. maculatus nos locais de
coleta na bacia do rio Paraíba do Sul (locais: 5 – referência; 1 – reservatório do Funil; 2 –
Volta Redonda; 3 – reservatório de Ribeirão das Lajes; 4 – Três Rios; 6 – rio Paraibuna
Mineiro; 7 – rio Piabanha - alterados). N = Número de indivíduos; Valores: Média ± Desvio
padrão.
Locais N IHS - G. brasiliensis N IHS - P. maculatus
5 (Referência) 9 1.08±0.49
- -
1 7 0.83±0.40 4 0.62±0.21
2 10 1.97±0.75
- -
3 6 0.77±0.34
- -
4 7 1.07±0.23 10 1.03±0.20
6 3 0.89±0.38 4 0.60±0,14
7 5 0.97±0.32 8 0.96±0.23
Para Pimelodus maculatus este índice apresentou maiores valores no local 4 em
relação aos locais 1 e 6 (Tabela 5) com diferença significativa (F=7.18; P=0.00155*) e maior
valor no local 7 em relação ao local 6 (Tabela 5) com diferença significativa (F=7.18;
P=0.00155*).
5.4 Índice gonado-somático
Geophagus brasiliensis não apresentou diferença significativa entre os locais
analisados (1, 2, 3, 5) para o Índice gonado-somático (Tabela 6).
Tabela 6. Índice gonado-somático em G. brasiliensis nos locais de coleta na bacia do rio
Paraíba do Sul (locais 5 – referência; 1 – reservatório do Funil; 2 – Volta Redonda; 3 –
reservatório de Ribeirão das Lajes - alterados). Não houve diferença significativa
Locais N IGS – G. brasiliensis
5 (Referência) 10 1.24±1.10
1 6 1.86±1.86
2 10 1.85±1.09
3 6 0.34±0.26
5.5 Fator de Condição
Para o Fator de Condição, os maiores valores em G. brasiliensis foram detectados nos
locais 2 e 4 (Tabela 7), tendo ambos apresentado diferença significativa (F=3.73;
P=0.00430**) em relação ao local 3.
27
Tabela 7. Fator de Condição (FC) em G. brasiliensis e P. maculatus nos locais de coleta na
bacia do rio Paraíba do Sul (locais: 5 – referência; 1 – Reservatório do Funil; 2 – Volta
Redonda; 3 – Reservatório de Ribeirão das Lajes; 4 – Três Rios; 6 – Rio Paraibuna Mineiro; 7
– Rio Piabanha - alterados). N = Número de indivíduos; Valores: Média ± Desvio padrão.
Locais N FC - G. brasiliensis N FC – P. maculatus
5 (Referência) 9 1.85±0.29 -
1 7 1.88±0.27 4 1.17±0.16
2 10 2.19±0.29 -
3 6 1.60±0.14 -
4 7 2.08±0.25 10 1.14±0.33
6 3 1.93±0.31 4 0.63±0.08
7 5 1.84±0.19 8 0.78±0.21
Entre os quatro locais analisados para o Fator de Condição em P. maculatus, os locais 1
e 4 apresentaram maiores valores em relação ao local 6 (Tabela 7), com diferença
significativa (F=6.30; P=0.00963**). E o local 4 também apresentou maiores valores em
relação ao local 7 (Tabela 7), tendo apresentado diferença significativa (F=6.30;
P=0.00963**).
28
6 DISCUSSÃO
Em Geophagus brasiliensis os maiores valores de EROD foram apresentados pelos
indivíduos do local 7 (rio Piabanha) com diferença significativa (P<0.001) em relação a todos
os outros locais analisados. Os indivíduos desta espécie coletados no local 6 (rio Paraibuna
(MG) apresentaram o segundo maior valor de indução (Tabela 2, Figura 2), apesar de não ter
tido diferença significativa em relação aos demais locais estes valores podem sugerir uma
grande presença de poluentes químicos no local 6. PARENTE et al. (2004) utilizando a
indução de CYP1A na fração S9 hepática de Oreochromis niloticus – espécie pertencente à
mesma família de G. brasiliensis – para detectar possíveis alterações em três locais do rio
Guandu (RJ), encontrou uma magnitude de indução de 17.7 vezes entre locais de referência e
locais mais alterados. No presente estudo, G. brasiliensis apresentou magnitude de apenas 2.2
vezes entre o local considerado de referência (rio Preto) e o local de maiores indicações de
alteração (rio Piabanha), porém apresentou uma diferença de 4.5 vezes em relação ao local 1
(reservatório do Funil), onde foram detectados menores valores de indução, indicando que
estudos mais detalhados precisam ser realizados ou que bioensaios são necessários para
estimar parâmetros confiáveis e que possam ser associados com níveis de exposição.
Em Pimelodus maculatus, foram detectados maiores valores de indução nos
indivíduos dos locais 4 (Três Rios) e 7, comparados aos indivíduos do local 1, com os
primeiros apresentando diferença significativa (P<0.05) em relação ao último (Tabela 3,
Figura 3). Apesar de terem apresentado resultados semelhantes em relação aos locais, os
valores de indução em G. brasiliensis (Tabela 2, Figura 2) foram sempre superiores aos de P.
maculatus (Tabela 3, Figura 3). Essas diferenças de respostas de indução entre as espécies
podem estar relacionado com diferenças na eficiência dos processos de
metabolismo/excreção; diferenças na distribuição de lipídios pelo corpo; distintas estratégias
alimentares ou estilos de vida. FERREIRA et al. (2004) estudando os níveis de indução de
CYP1A por compostos organoclorados em “flounder” (Platichthys flesus) e “mullet” (Mugil
cephalus) no estuário do rio Douro, Portugal, levantaram as mesmas possibilidades para os
diferentes valores de indução apresentados por estas espécies.
Estes valores aumentados de EROD nos locais 4 e 7 sugerem que os peixes do rio
Paraíba do Sul na cidade de Três Rios e do rio Piabanha, um dos seus principais tributários,
foram expostos a maiores concentrações de contaminantes indutores de CYP1A em relação
aos outros locais do trecho médio-inferior. O rio Paraíba do Sul na altura de Três Rios
provávelmente concentra os poluentes de dois de seus principais tributários (rio Paraibuna
Mineiro e rio Piabanha), ambos possuem grandes centros urbano-industriais a montante das
áreas onde os peixes foram coletados (Juiz de Fora e Petrópolis, respectivamente).
Possivelmente, a grande quantidade de despejos de resíduos industriais sem um prévio
tratamento seja a razão dos valores de indução de CYP1A em G. brasiliensis para o local 6
(rio Paraibuna (MG)) (Tabela 2), visto que tais práticas são comuns em todos os municípios
ao longo desta bacia hidrográfica.
Quanto ao rio Piabanha, além de percorrer a cidade de Petrópolis, que possui várias
indústrias e grande concentração populacional, este rio possui também duas represas para
geração de energia hidrelétrica em seu curso, o que deve estar agravando de forma
significativa os níveis de poluição por compostos organoclorados neste rio, contribuindo desta
forma para os maiores valores de indução de CYP1A verificados nos indivíduos de ambas as
espécies de peixes coletados neste rio, desde que HPAs podem ser introduzidos no ambiente
através da geração de energia hidrelétrica (ALBERS 1995; PINTO 2001). Além disso, as
aplicações mais importantes dos BPCs em termos de tonelagem foram os óleos de
transformadores e os condensadores (DE VOOGT & BRINKMAN 1989). Em óleos de
29
transformadores, os BPCs foram misturados com clorobenzenos (principalmente
triclorobenzenos e tetraclorobenzenos) como solventes (SWAMI et al. 1992; DE VOOGT &
BRINKMAN 1989).
A maior Freqüência de Micronúcleos (MN) em G. brasiliensis detectada para os locais
4 e 7 (Tabela 4) com diferença significativa (P<0.001) em relação aos locais 1, 2 (Volta
Redonda) e 3 (reservatório de Ribeirão das Lajes) (Tabela 4); assim como a maior Freqüência
de Micronúcleos verificada para o local 4 (Tabela 4) em relação ao local 1, com diferença
significativa (P<0.05) em P. maculatus sugerem que os locais 4 e 7 estejam mais poluídos por
contaminantes responsáveis por efeitos genotóxicos. Tais resultados corroboram com os
observados para atividade de EROD, reforçando a possibilidade de que esses locais sejam
dois dos mais críticos em relação à quantidade de poluentes xenobióticos dentre os locais
pesquisados neste trabalho, desde que testes de micronúcleo em eritrócitos de peixes
respondem positivamente a um grande número de substâncias mutagênicas e carcinogênicas,
tais como aflatoxinas, benzidinas, metais pesados e hidrocarbonetos aromáticos policíclicos
(HPAs) (AL-SABTI & METCALFE 1995; PACHECO & SANTOS 2002; GRAVATO &
SANTOS 2003; BARSIENÉ et al. 2006).
Pimelodus maculatus apresentou valores de MN abaixo dos observados para G.
brasiliensis, tanto no local 4 quanto no local 7 (Tabela 4). Segundo ERGENE et al. (2007),
diferenças na anormalidade nuclear podem ser atribuídas às diferenças nos hábitos
alimentares das espécies.
Os maiores valores de IHS no local 2 (Tabela 5) em G. brasiliensis e nos locais 4 e 7
em P. maculatus (Tabela 5) sugerem altos níveis de poluentes nestes locais. Excetuando-se o
local 2, estes resultados também corroboram com os verificados para EROD e MN neste
trabalho. Muitos estudos dos efeitos de efluentes de indústrias de papel registram um aumento
correspondente no IHS em peixes com altas atividades de EROD (BANKEY et al. 1994;
HUUSKONEN & LINDSTRÖM-SEPPA 1995; LARSSON et al. 1988). Tipicamente,
aumentos no peso do fígado seguindo exposição a receptor agonista Ah é devido à
proliferação do retículo endoplasmático liso como o resultado da síntese aumentada de
proteínas relacionadas à CYP1A (LARSSON et al. 1988). HUUSKONEN & LINDSTRÖM-
SEPPA (1995) e STEPHENSEN et al. (2000) registraram que altos valores de IHS
encontrados em “perch” (Perca fluviatilis) e “sculpin” (Myoxocephalus scorpius) podem ser
indicativos de atividade aumentada de enzimas de biotransformação de xenobióticos.
SLOOFF et al. (1983) também sugerem uma relação positiva entre o peso relativo do fígado e
enzimas que metabolizam xenobióticos de peixes de águas poluídas.
Os menores valores de EROD em G. brasiliensis no local 2 (Volta Redonda), uma
área de grande influência de poluentes urbano-industriais, quando comparados com o local de
referência (Local 5- rio Preto) podem ser devido a um mau funcionamento do fígado gerado
por uma exposição crônica a poluentes nesta primeira área. Embora estudos histopatológicos
não tenham sido feitos neste trabalho, observações macroscopicas de campo dos fígados de
todos os indivíduos coletados no local 2 apresentavam um aspecto de decomposição
(necrose), fraca consistência (quebradiço); e metade deles possuía grande quantidade de
gordura aderida. Devido aos processos de absorção e metabolização, lesões observadas no
fígado podem estar relacionadas à exposição crônica a poluentes. Estes tipos de lesões têm
sido registrados em peixes de áreas impactadas por múltiplos contaminantes (MARTY et al.
2003; STENTIFORD et al. 2003; OLIVEIRA RIBEIRO et al. 2005). Tais lesões causam
prejuízos funcionais e estruturais no fígado de peixes (STENTIFORD et al. 2003), diminuem
a funcionalidade, podendo causar a falência do órgão e conseqüentemente afetar maiores
níveis de organização biológica (RABITTO et al. 2005). Enquanto a acumulação de lipídios
pode ser uma estocagem fisiológica normal, ela pode ser também um mecanismo de defesa
contra contaminantes liposolúveis (BIAGIANTI-RISBOURG et al. 1997). Os indivíduos
30
coletados nesse local também apresentaram grande quantidade de gordura visceral (15,42 g –
soma da gordura visceral de todos os indivíduos).
Os resultados do FC em G. brasiliensis foram consistentes com os obtidos para IHS e
MN nesta espécie, reforçando a possibilidade de que os locais 2 e 4 estejam entre os mais
poluídos por contaminantes químicos no trecho médio-inferior da bacia do rio Paraíba do Sul.
Os maiores valores do FC em P. maculatus no local 4 (Tabela 7) concordam com os
maiores valores de IHS, MN e EROD verificados para este local. Porém, os maiores valores
deste bioindicador também foram registrados para o local 1 nesta espécie, o que não concorda
com nenhum dos outros biomarcadores e bioindicadores, que ao contrário, apresentaram os
menores valores para este local.
Apesar da idéia geral de que indivíduos com maior peso em um dado comprimento
estão em melhor condição, este bem estar tem sido relacionado a como o animal aproveita os
recursos disponíveis existentes em uma determinada época do ano, ou seja, associado
diretamente à nutrição (TYLER & DUNN 1976 Apud SCHMITT & DETHLOFF 2005;
BRAGA 1986). Entretanto, a presença de poluentes xenobióticos no ambiente pode fazer o
Fator de variar em uma ou outra direção, saindo do alcance normal em resposta a exposição
química. Elevados valores do Fator de Condição têm sido encontrados em “white sucker”
(Catostomus commersoni) e “redbreast sunfish” (Lepomis auritus) para locais poluídos com
efluentes da produção de papel (MCMASTER et al. 1991; ADAMS et al. 1992a ). Por outro
lado, uma diminuição no Fator de Condição foi registrada em “Atlantic cod” (Gadus morhua)
expostos a petróleo (KICENIUK & KHAN 1987). Nossos resultados concordam mais com o
primeiro caso, uma vez que para ambas as espécies estudadas o Fator de Condição apresentou
os maiores valores para alguns dos locais em que outros biomarcadores/bioindicadores
sugeriram maior presença de contaminantes, à exceção do local 1.
Os dados fornecidos dificultam a explicação em alguns casos, por exemplo, o baixo
nível de indução no local 1 (reservatório do Funil), que recebe resíduos industriais e agrícolas
de cidades do Estado de São Paulo a montante. Isto sugere que é necessário se saber muito
mais em relação às influências ambientais na atividade da enzima antes que dados para
monitoramento possam ser utilizados de maneira mais confiável para interpretar os efeitos
biológicos de contaminantes. Contudo, a utilização de uma bateria de biomarcadores e
bioindicadores nos permitiu avaliar e formular um bom retrato dos diferentes efeitos da
poluição em peixes nos diferentes locais estudados do trecho médio-inferior da bacia do rio
Paraíba do Sul.
31
7 CONCLUSÕES
1. Os resultados deste trabalho sugerem que os tributários Piabanha e Paraibuna (MG), assim
como o canal principal do rio Paraíba do Sul na altura das cidades de Três Rios e Volta
Redonda sejam os locais que se encontram em situação mais crítica em relação à presença de
poluentes xenobióticos no trecho médio-inferior da bacia do rio Paraíba do Sul.
2. Diferenças quanto à atividade de EROD entre as espécies Geophagus brasiliensis e
Pimelodus maculatus foram constatadas com a primeira espécie apresentando valores mais
elevados.
3. Ambas as espécies mostraram-se adequadas para estudos de biomonitoramento ambiental
por atividade de EROD.
4. Estudos utilizando a indução de CYP1A em espécies de peixes nativas, visando melhor
detalhar o comportamento desta isoenzima são necessários, o que viabilizará o
biomonitoramento por atividade de EROD em sistemas lóticos tropicais.
5. Peixes expostos a poluentes químicos podem também apresentar maiores valores do FC,
indicando menor qualidade ambiental em relação à poluição, diferindo da interpretação deste
índice quanto à melhor qualidade ambiental relacionada à maior disponibilidade alimentar
onde os maiores valores são, ao contrário, associados à melhor qualidade ambiental.
6. O uso de uma bateria de biomarcadores e bioindicadores mostrou-se importante para se
avaliar a qualidade ambiental do trecho médio-inferior do rio Paraíba do Sul, pois a
comparação dos resultados das diferentes ferramentas ajudou na interpretação geral dos
efeitos dos poluentes sobre a saúde dos peixes.
32
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37
Capítulo II
Bioindicadores da condição de saúde de três espécies de peixes na
bacia do rio Paraíba do Sul, Brasil.
38
RESUMO
O objetivo deste estudo foi usar bioindicadores fisiológicos inespecíficos (Índice hepato-
somatico - IHS e Fator de Condição - FC) de exposição a poluentes orgânicos persistentes
(POPs) em peixes para a avaliação da presença destes xenobióticos em um grande rio tropical
do sudeste do Brasil. A hipótese a ser testada é a de que os locais que recebem maior aporte
de poluição difusa apresentam maiores concentrações de poluentes químicos xenobióticos, e,
portanto, devem apresentar maiores valores destes índices em relação às áreas de referência.
Os peixes foram coletados em 10 locais do rio Paraíba do Sul e maiores tributários, em dois
períodos (Verão/Úmido versus Inverno/Seco) entre dezembro de 2002 e novembro de 2003.
Os locais 1 (Paraitinga/Paraibuna) e 4 (Rio Preto) foram selecionados como locais de
referência devido à inexistência de grandes centros urbanos-industriais, com o entorno do rio
sendo usado basicamente em atividades de agricultura extensiva. Os Peixes capturados foram
imediatamente anestesiados em banho de gelo e em seguida sacrificados, tendo sido medidos,
pesados e dissecados para retirada do fígado, que foi pesado em separado. Os maiores IHS
para as três espécies foram registrados nos locais 3 (rio Paraíba do Sul - Barra Mansa/Volta
Redonda) e 6 (rio Piabanha), localizados próximos a grandes centros urbanos que poderiam
estar contribuindo para introdução de xenobióticos. Sazonalmente, os maiores IHS ocorreram
no Inverno/Seco. Por outro lado, os menores valores do Fator de Condição ocorreram no local
1 (local de referência) para G. brasiliensis, e os maiores no local 3. Sazonalmente, os maiores
FC foram registrados no Verão/Úmido. Tais resultados corroboram a hipótese de que o
aumento tanto do IHS quanto do Fator de Condição indicam sinais de estresse ambiental, com
o IHS refletindo melhor a avaliação ambiental nos locais estudados. Diferenças sazonais entre
estes dois índices sugerem que o IHS é um indicador mais consistente da qualidade ambiental,
haja vista sua menor variação em função de entradas de material alóctone no período das
chuvas.
Palavras-chave: Bioindicadores, FC, IHS, peixes, rio.
39
ABSTRACT
The aim of this work is to use the inespecific physiological bioindicators Hepatosomatic
Index (HSI) and Condition Factor (CF) to assess the presence of Persistent Organic Pollutants
(POPs) in a large tropical river of Southeastern Brazil, using fish species. The tested
hypothesis is that river sites near to entrance of diffuse pollution show higher concentration of
xenobiotics, and have fish with higher index values compared with reference or least alterated
sites (reference). Fishes were collected at 10 sites in the Paraíba do Sul (PSR) river and main
tributaries, in two seasons (summer/wet versus winter/dry) between December 2002 and
November 2003. Sites 1 (Paraitinga/Paraibuna river) and 4 (Preto river) were selected as
reference sites due to non-existence of large urban-industriais centers nearby, with the
drainage area being used basically by extensive agricultural activities. Fishes collected were
imediatelly anesthesed in ice bath and killed, measured, weithted and dissected for romoving
liver that were weighted. Higher HSI for the three fish species were recorded at sites 3 (PSR
at Barra Mansa/Volta Redonda) and 6 (Piabanha river), both located near to large urgan
centers that could be contributing to large introduction of xenobiotics. Seasonally, higher HSI
ocurred in winter/dry season. On the other hand, lower Condition Factor was recorded at site
1 (Reference) for G. brasiliensis, and the highest at site 3. Seasonally, higher CF was
recorded in summer/wet season. Such results corroborate the hypothesis that increasin HSI
and CF indicate signals of environmental stress, with HSI reflecting in a better way
environmental evaluation for the studied sites, since its comparatively lower variation
according to entrance of alloctone materials during the rainfall season.
Key words: Bioindicators, CF, HSI, fishes, river.
40
1 INTRODUCÃO
A integridade biótica é freqüentemente refletida pela saúde dos organismos que
residem em um determinado ecossistema. Em ecossistemas aquáticos, os peixes são
considerados bons indicadores da saúde do sistema (ADAMS et al. 1993). Quando a
ictiofauna é exposta a poluentes químicos lipossolúveis persistentes, tais como bifenilas
policloradas (BPCs), hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) e dioxinas, tais como
diclorodifeniltricloroetano (DDT) e tetraclorodibenzo-p-dioxina (TCDD), alterações nas
populações e comunidades deste ecossistema podem ocorrer. Neste contexto, a determinação
de parâmetros biológicos selecionados, que são conhecidos por variar em resposta aos efeitos
tóxicos de poluentes, vem sendo constantemente recomendada para avaliar o estado de saúde
ambiental de ecossistemas aquáticos. Estes parâmetros biológicos são conhecidos como
indicadores biológicos ou bioindicadores (VIARENGO et al. 2000).
Os bioindicadores vêm sendo utilizados como importantes ferramentas na utilização
em programas de avaliação e manejo de sistemas aquáticos e podem ser avaliados a partir de
mudanças celulares, alterações bioquímicas, moleculares ou fisiológicas em um organismo,
indicando exposição aos efeitos de poluentes ambientais. Os bioindicadores em nível de
órgãos, notadamente o Índice hepato-somático (IHS) (VAZZOLER 1996), estão
freqüentemente relacionados à exposição a diversos contaminantes (GOEDE & BARTON
1990). Segundo CASARETT et al. (1991), o fígado é o principal órgão envolvido no
processo de biotransformação de químicos xenobióticos, e com isso tal exposição pode gerar
um aumento no tamanho do fígado por hipertrofia (aumento no tamanho), hiperplasia
(aumento no número de hepatócitos), ou ambos (GOEDE & BARTON 1990; HINTON &
LAUREN 1990). Freqüentemente o IHS é utilizado para avaliar o tamanho relativo do fígado,
sendo expresso pelo peso do fígado como percentagem do peso corporal total (FACEY et al.
1999).
Outra forma de avaliar o efeito dos poluentes é a partir dos bioindicadores individuais
(ARIAS et al. 2007), com o Fator de Condição (LE CREN 1951) sendo um índice
freqüentemente usado para estudos da biologia do peixe, fornecendo informações importantes
relacionadas ao estado fisiológico, baseado no princípio de que indivíduos de um dado
comprimento exibem maior peso quando estão em melhor condição (DE SILVA et al. 1998;
FITZGERALD et al. 1998; VILA-GISPERT & MORENO-AMICH 2001). Alguns autores
(LE CREN 1951; BOLGER & CONNOLLY 1989; BRAGA 1986; 1993; BRAGA &
ANDRADE 2005) afirmam que o Fator de Condição implica alterações de bem estar das
populações de peixes ao longo do ciclo sazonal. Desta forma, a variação deste índice durante
o ano tem sido usada como um dado adicional para estudos de reprodução e ciclos sazonais de
processos alimentares. Neste contexto, o estudo comparativo de populacões distintas permite
avaliar a qualidade dos ambientes nos quais o animal vive (BRAGA 1986; BOLGER &
CONNOLLY 1989).
Por outro lado, segundo alguns autores (WEGE & ANDERSON 1978; LEHTONEN
& JOKIKOKKO 1995) um aumento no Fator de Condição, assim como no Índice hepato-
somático, podem também sinalizar efeitos deletérios de um estressor. Ainda segundo esses
autores, embora a interpretação geral seja a de que um grande peso relativo ao comprimento
indique uma condição de saúde (para o organismo individual), a presença de poucos
indivíduos maiores e mais robustos pode significar uma condição anormal ou de desequilíbrio
ao nível de população ou comunidade. Um estresse no ambiente natural pode ter um efeito
sobre a saúde e condição total do peixe. Portanto, o Fator de Condição pode ser empregado
como um bioindicador integrativo.
41
O rio Paraíba do Sul, situado no Sudeste do Brasil, é responsável pelo abastecimento
de água de várias cidades do Estado do Rio de Janeiro e para 90% da população
Metropolitana do grande Rio, a partir da transposição de 160 m
3
/s de suas águas para o
Sistema Light-Cedae. Porém o histórico de poluição da bacia do rio Paraíba do Sul vem
ocorrendo desde o século XVI, com a abertura de caminhos ao longo de suas margens e o
conseqüente povoamento durante o ciclo do ouro. A degradação agravou-se no século XVII,
durante o ciclo da cana de açúcar, responsável pela devastação de boa parte da cobertura
vegetal, seguida pelo ciclo do café nos séculos XVIII e XIX. A partir da década de 1950
iniciou-se o desenvolvimento industrial (PASIN 1988) e a conseqüente expansão urbana,
além da construção de barragens para a produção de energia hidrelétrica. Atualmente as
margens do rio Paraíba do Sul são ocupadas por áreas urbanas, áreas de pastagens, cana de
açúcar na parte inferior e indústrias. Tais indústrias são principalmente dos ramos têxteis,
metalúrgicos, de celulose, petróleo, petroquímica, química e mecânica.
Outras importantes atividades antrópicas que contribuem para o crescente aumento e
concentração de poluentes neste sistema são as grandes plantações de arroz no trecho médio
superior, particularmente no município de Canas, e a construção de barragens para geração de
energia elétrica ao longo de seu percurso. Segundo AMORIM (1998), o maior problema que
aflige as áreas urbanas do Vale do Paraíba é constituído pela contaminação das águas do rio
Paraíba do Sul, pelos esgotos sanitários e disposição inadequada de resíduos industriais. Cerca
de 1 bilhão de litros de esgotos sanitários, praticamente sem tratamento, são lançados por dia,
nos rios da bacia do rio Paraíba do Sul, além dos efluentes industriais, muitas vezes tóxicos, e
de toda a espécie de lixo que a própria população atira em suas águas. Tais problemas
ambientais agravam a qualidade das águas, contribuindo para a degradação da qualidade da
Bacia, que é de extrema importância para o desenvolvimento da região do Vale do Paraíba.
O objetivo deste estudo foi o de utilizar bioindicadores fisiológicos inespecíficos
(Índice hepato-somático (IHS) e Fator de Condição (FC)) de exposição a compostos químicos
xenobióticos, em três espécies de peixes (Geophagus brasiliensis, Hypostomus affinis e
Hypostomus aurogutatus) para a avaliação da presença de poluentes orgânicos persistentes
(POPs) em 10 locais ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul em dois períodos sazonais
(Verão/Úmido Versus Inverno/Seco). A hipótese a ser testada é a de que os locais com maior
entrada de efluentes urbanos, industriais e agrícolas (poluição difusa) apresentem maior
presença de poluentes químicos xenobióticos, registradas pelos maiores Índice hepato-
somático (IHS) em relação às áreas de referência. E complementado com o Fator de Condição
(FC).
42
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Área de estudo
A bacia do rio Paraíba do Sul (Figura 1) abrange três dos quatro estados da região
Sudeste: São Paulo, Rio de Janeiro e Minas Gerais. Formando-se em São Paulo, na Serra da
Bocaina, a 1800 m de altitude no encontro do rio Paraitinga com o rio Paraibuna Paulista; a
maioria de seus principais tributários vêm de Minas Gerais, e sua foz localiza-se na cidade de
São João da Barra, no Estado do Rio de Janeiro, onde deságua no Oceano Atlântico. A bacia
do rio Paraíba do Sul encontra-se entre as latitudes 20˚26' e 23˚39'Sul e as longitudes de 41˚e
46˚30'Oeste, apresentando uma área total de cerca de 55.500 km
2
e uma extensão de 1.150
km. Ao todo suas águas são utilizadas por mais de 20 milhões de pessoas para os mais
diversos fins: indústria, agricultura, energia elétrica através da construção de várias represas
ao longo do seu curso, consumo, lazer, pesca, preservação da fauna e flora.
Os locais de estudo (Figura 1) foram: 1 – Paraitinga/Paraibuna (local de referência); 2
– São José dos Campos; 3 – Barra Mansa/Volta Redonda; 4 – rio Preto (local de referência); 5
– rio Paraibuna (MG); 6 – rio Piabanha; 7 – (Três Rios/Anta/Sapucaia); 8 – rio Grande; 9 –
rio Muriaé; 10 – Campos/São João da Barra.
Figura 1. Bacia do rio Paraíba do Sul com os 10 locais de coleta. Locais
inseridos nos círculos foram tomados em conjunto.
2.2 Coletas dos peixes
Os peixes foram coletados entre dezembro de 2002 e novembro de 2003, em 10 locais
ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul, utilizando-se redes de espera e tarrafa. Alguns locais
foram tomados em conjunto, seguindo-se critérios de proximidade. Foram selecionados
indivíduos de uma faixa de tamanho entre 13 e 27 cm para G. brasiliensis (Tabela 1), entre 19
e 37 cm para H. affinis (Tabela 2) e entre 19 e 30 cm para H. auroguttatus (Tabela 3). Nesta
43
faixa de tamanho, todos os peixes são adultos visando minimizar variações fisiológicas
decorrentes de fases do crescimento.
Imediatamente após a captura os peixes foram pesados em balança eletrônica portátil
Acculab VI-600 e tomados os comprimentos totais, em seguida os indivíduos foram
anestesiados em banho de gelo e posteriormente sacrificados através de secção transversal, os
órgãos da cavidade celomática foram cuidadosamente retirados e o fígado foi pesado em
balança eletrônica portátil Acculab VI-200.
Tabela 1. Número de peixes examinados, por local, estação do ano, tamanho e estádio de
maturação sexual de Geophagus brasiliensis. N = número de indivíduos. Comprimento: Min –
Máx. Sexo/Estádio de maturação: F = Fêmeas; FM = Fêmeas maduras; M = Machos.
G. brasiliensis / Verão úmido
G. brasiliensis / Inverno seco
Local
N Comprimento (cm) Sexo / Est. Mat. Local
N Comprimento (cm) Sexo / Est. Mat.
1 3
16.5-18.0 F
4 1
22.0
F
2 3
17.0- 22.0 F
5 4
14.5–17.5
F
6 1
20.5 F
8 2
19.5–20.5
F
1 4
15.0-17.0 FM
9 2
18.0
F
3 10
16.5-19.0 FM
10 1
18.5
F
6 7
14.0–19.6 FM
1 9
14.0-19.0
FM
8 5
15.0-18.0 FM
3 5
16.0-22.0
FM
9 4
18.0–20.5 FM
4 2
15.0-20.0
FM
10 2
20.0 FM
5 5
14.0-16.0
FM
1 3
17.5–20.0 M
7 6
13.0-17.0
FM
3 11
17.0–23.5 M
8 5
14.0-20.0
FM
6 4
14.5-23.0 M
9 5
17.0–20.5
FM
8 6
15.0-21.0 M
10 3
17.0-19.0
FM
9 6
17.5–27.0 M
1 9
16.5-20.0
M
10 4
16.5-20.0 M
3 10
15.0-25.0
M
4 7
21.0–25.5
M
5 11
13.0–24.5
M
7 11
14.5-21.0
M
8 1
23.0
M
9 3
21.0-22.0
M
44
Tabela 2. Hypostomus affinis nos diferentes períodos sazonais com as respectivas áreas, número de
indivíduos, faixas de comprimento, sexo e estádios de maturação sexual. N = número de indivíduos.
Comprimento: Min – Máx. Sexo/Estádio de maturação: F = Fêmeas; FM = Fêmeas maduras; M =
Machos.
H. affinis / Verão úmido H. affinis / Inverno seco
Local N Comprimento (cm) Sexo / Est. Mat. Local N Comprimento (cm) Sexo / Est. Mat.
5 2 24.5-26.5 F 1 1 25.5 F
10 1 28.5 F 3 1 24.5 F
1 4 19.5-30.0 FM 7 1 23.0 F
3 2 26.5-27.0 FM 1 6 18.0-28.5 FM
5 1 26.5 FM 3 4 26.5-35.5 FM
6 2 30.5-31.5 FM 7 1 29.5 FM
10 2 24.5-28.5 FM 1 3 23.0-31.0 M
1 1 26.5 FM 2 4 24.0-32.0 M
3 2 31.0-37.0 M 3 8 31.0-37.0 M
5 7 23.5-31.5 M 7 2 17.0-18.5 M
6 5 26.0-33.5 M
10 7 20.5-27.0 M
Tabela 3. Hypostomus aurogutatus nos diferentes períodos sazonais com as respectivas áreas, número de
indivíduos, faixas de comprimento e estádios de maturação sexual. N = número de indivíduos.
Comprimento: Min – Máx. Sexo/Estádio de maturação: F = Fêmeas; FM = Fêmeas maduras; M =
Machos.
H. aurogutatus / Verão úmido H. aurogutatus / Inverno seco
Local N Comprimento (cm) Sexo / Est. Mat. Local N Comprimento (cm) Sexo / Est. Mat.
3 3 24.0-27.0 F 4 1 19.5 F
4 1 28.0 F 5 3 25.0-29.0 F
3 5 23.0-28.0 FM 4 1 24.0 FM
4 1 22.0 FM 5 1 27.0 FM
5 3 23.0-25.0 FM 7 2 29.5-30.0 FM
3 1 25.0 M 4 4 26.0-27.0 M
4 6 24.5-29.0 M 5 3 25.5-28.0 M
5 4 20.0-27.0 M 7 5 21.0-25.0 M
2.3 Tratamento dos dados
Os locais 1 e 4 foram selecionados como locais de referência devido à pouca presença
de indústrias e agricultura intensiva em áreas próximas a esses rios. Para minimizar a
influência do sexo e do estádio de maturação sexual as sub-populações foram comparadas
considerando-se estes fatores em separado, além disso, também foram feitas análises
comparando-se os diferentes sexos nas mesmas áreas e períodos sazonais.
45
O Índice hepato-somático foi calculado através do percentual do peso do fígado em
relação ao peso do corpo, de acordo com a fórmula: IHS = (Peso do fígado (g) / Peso total
(g))*100, (VAZZOLER, 1996).
O Fator de Condição foi expresso pela fórmula: FC = (Peso total / Comprimento
total
3
)*100. Os dados foram transformados e comparados com ANOVA entre os 10 locais e
os dois períodos sazonais, seguida pelo teste “a posteriori” de diferenças de médias de Tukey
ao nível de confiança de 95% (P<0.05) para determinação de que médias foram
significativamente diferentes.
46
3 RESULTADOS
3.1 Índice hepato-somático (IHS)
Machos e fêmeas maduras de Geophagus brasiliensis apresentaram no verão os
maiores IHS nos locais 3 (Barra Mansa/Volta Redonda) e 6 (rio Piabanha) (Tabela 4).
Diferenças significativas foram detectadas entre os maiores valores no local 3 em relação aos
locais 8 (rio Grande), 9 (rio Muriaé) e 10 (Campos/São João da Barra) para fêmeas maduras, e
em relação aos locais 8 e 10 para machos (Tabela 4). Tanto machos quanto fêmeas maduras
também apresentaram diferenças significativas com maiores valores no local 6 em relação ao
local 8 (Tabela 4). No inverno, machos também apresentaram maiores valores para o local 3
em relação aos dois locais tomados como referência (1 - Paraitinga/Paraibuna e 4 – rio Preto)
e em relação ao local 5 (rio Paraibuna - MG) (Tabela 4).
Machos de Hypostomus affinis apresentaram no verão os maiores valores de IHS para
o local 6 em relação aos locais 5 e 10 (Campos/São João da Barra) enquanto fêmeas ovadas
de H. aurogutatus apresentaram maiores valores para o local 3 em relação ao local 5 (Tabela
4).
Tabela 4. Comparações dos valores do Índice hepato-somático entre os locais nos diferentes
períodos sazonais por espécie, sexo e estádio de maturação sexual (para as fêmeas).
**P<0.001 – Altamente significativo; *P<0.05 – Significativo.
Espécie Período sazonal Sexo IHS Tukey
N
F P
G. brasiliensis Verão Fêmeas M. 9.133 0.000** 3>8, 9, 10; 6>8 32
G. brasiliensis Verão Machos 5.674 0.001** 3>8,10; 6>8 34
G. brasiliensis Inverno Machos 5.429 0.001** 3>1, 4, 5 51
H. affinis Verão Machos 12.00 0.000** 6>5, 10 21
H. aurogutatus Verão Fêmeas M. 5.875 0.039* 3>5 8
Sazonalmente, foram feitas comparações apenas para dois locais: 9 (rio Muriaé) e 4
(rio Preto). Fêmeas maduras de G. brasilienis no local 9 e machos de H. aurogutatus no local
4, apresentaram os maiores IHS no Inverno/Seco (Tabela 5).
Tabela 5. Comparações sazonais do Índice hepato-somático considerando-se as espécies, o
sexo e o estádio de maturação sexual (para as fêmeas). Períodos sazonais: 1 = Verão Úmido;
2 = Inverno Seco. **P<0.001 – Altamente significativo; *P<0.05 – Significativo.
Espécie Local Sexo IHS Tukey N
F P
G. brasiliensis 9 Fêmeas M. 7.1862 0.03151* 2>1 9
H. aurogutatus 4 Machos 13.713 0.00602* 2>1 10
47
3.2 Fator de Condição
Geophagus brasiliensis machos, fêmeas e fêmeas ovadas apresentaram tanto no verão
quanto no inverno menores valores do Fator de Condição para o local 1 (local de referência),
com diferenças significativas em relação aos locais 2 (São José dos Campos), 3, 6, 7 (Três
Rios/Anta/Sapucaia), 8, 9 e 10 (Tabela 6).
Tabela 6. Comparações dos valores do Fator de Condição entre os locais nos diferentes
períodos sazonais considerando a espécie, sexo e estádio de maturação sexual (para as
fêmeas). **P<0.001 – Altamente significativo; *P<0.05 – Significativo.
Espécie Período sazonal Sexo Fator de Condição Tukey N
F P
G. brasiliensis Verão Fêmeas 8.457 0.044* 2>1 6
G. brasiliensis Verão Machos 4.162 0.006** 3, 6, 9, 10>1 36
G. brasiliensis Inverno Fêmeas M. 5.321 0.000** 3>1, 7, 8; 9>1 40
G. brasiliensis Inverno Machos 4.856 0.001** 3, 7>1 51
Sazonalmente, foram feitas comparações apenas para três locais: 9 (rio Muriaé), 4 (rio
Preto – local de referência) e 1 (Paraitinga/Paraibuna – local de referência). Machos de G.
brasiliensis no local 10, machos de H. aurogutatus no local 4 e fêmeas maduras de H. affinis
no local 1 apresentaram os maiores valores do FC no Verão Úmido (Tabela 7).
Tabela 7. Comparações sazonais do Fator de Condição, considerando-se as espécies, os sexos
e o estádio de maturação sexual (para as fêmeas). Períodos sazonais: 1 = Verão úmido; 2 =
Inverno seco. **P<0.001 – Altamente significativo; *P<0.05 – Significativo
Espécie Local Sexo Fator de Condição Tukey N
F P
G. brasiliensis 9 Machos 7.0148 0.03301* 1>2 9
H. aurogutatus
4
Machos 47.573 0.00012** 1>2
10
H. affinis
1
Fêmeas M. 18.689 0.01242* 1>2
10
3.3 Diferenças entre os sexos
Diferenças entre os sexos (Figura 2) foram analisadas no verão para o Fator de
Condição em G. brasiliensis no local 1 – fêmeas vs machos – e para o IHS nos locais 3, 6, 8 e
10 – fêmeas maduras vs macho; e no inverno para o Fator de Condição com a mesma espécie
nos locais 1, 3 e 7– fêmeas maduras vs machos. Essas análises não revelaram diferenças
significativas (P<0.05).
48
Fig. 2. Diferenças entre os sexos para o IHS e FC para cada espécie e período sazonal.
49
4 DISCUSSÃO
Maiores valores de IHS foram consistentemente registrados nos peixes provenientes
de locais próximos a grandes concentrações urbano-industriais, como foi o caso do local 3
(Barra Mansa/Volta Redonda) (Tabela 4), onde se destaca o complexo siderúrgico de Volta
Redonda; uma única exceção foi registrada para machos de H. affinis no verão, onde o local 6
(rio Piabanha), que também recebe elevada carga de efluentes provenientes da cidade de
Petrópolis, e possui 2 represas para geração de energia hidrelétrica ao longo de seu curso,
apresentou os maiores valores de IHS (Tabela 4). O rio Paraíba do Sul percorre no Estado do
Rio de Janeiro áreas de extensa urbanização, recebendo despejos de efluentes domésticos e
industriais, que são lançados diretamente neste sistema sem tratamento prévio, sendo o trecho
considerado de maior nível de poluição entre Barra Mansa e Barra do Piraí (COSTA &
NEVES 1993; PFEIFFER et al.1986), representado neste trabalho pelo local 3 (Barra
Mansa/Volta Redonda). Segundo o projeto: RIO PARAÍBA DO SUL – VALE VIDA (2000),
somente a Companhia Siderúrgica Nacional (CSN), localizada em Volta Redonda, libera 55
toneladas diárias de descargas de poluentes, sendo que 300 kilos são fenóis, cianetos e metais
pesados, representando a maior carga de poluentes da bacia do rio Paraíba do Sul.
SHEAHAN et al. (2002) utilizando “truta arco-íris” no rio Aire, UK, verificaram que
os maiores valores do Índice hepato-somático foram significativamente maiores nos locais
controles ou à montante da entrada de poluentes, do que nos sites à jusante da entrada de
poluentes de uma estação de tratamento de esgotos. FACEY et al. (2005) compararam os
valores de IHS em Burlington Harbor, Vermont antes e após a melhoria no tratamento de
efluentes, utilizando “rock bass” Ambloplites rupestris e verificaram uma diferença
significativa (P<0.05) nos valores deste índice, com o período após a melhoria do tratamento
tendo apresentado IHS comparativamente menores. Segundo esses autores, tais resultados
sugerem que o estresse fisiológico na população de rock bass tem diminuído em função da
redução à exposição aos poluentes.
Sazonalmente, o Índice hepato-somático (IHS) apresentou diferenças significativas
(P<0.05) com maiores valores no inverno em relação ao verão (Tabela 5), padrão contrário ao
verificado para os valores sazonais do Fator de Condição (Tabela 7). A maior concentração
dos contaminantes químicos, devido à menor vazão de água no rio Paraíba do Sul no período
de Inverno/Seco, gerando uma menor proporção de diluição talvez seja a explicação para os
maiores valores do Índice hepato-somático nesse período em relação ao verão, quando são
registrados os maiores fluxos devido às maiores cargas pulviométricas. SANTIAGO (2006)
estudando a biologia reprodutiva do “pacu” Myleus micans no rio São Francisco na região de
Três Marias (MG) também encontrou maiores valores do Índice hepato-somático no período
de inverno em machos. SCOTT & PANKHURST (1992) apud SANTIAGO (2006)
demonstraram que em vários estádios do ciclo reprodutivo dos machos de teleósteos, o fígado
não influencia na maturação dos testículos, diferentemente das fêmeas. SOUZA (2005)
utilizando o ensaio cometa e freqüência de ocorrência de micronúcleos e de anormalidades
nucleares em eritrócitos de Oreochromis niloticus (Perciforme, Cichlidae), mesma família de
G. brasiliensis, para avaliar a presença de poluentes no rio Paraíba do Sul em São José dos
Campos também verificou maiores concentrações de contaminantes no período de
Inverno/Seco em relação ao Verão/Úmido. WILHELM FILHO et al. (2001) estudando a
influência do período sazonal e da poluição nas defesas antioxidantes de Geophagus
brasiliensis detectou um aumento no Índice hepato-somático nos peixes coletados locais
poluídos em relação ao local de referência, porém estes mesmos autores não encontraram uma
diferença clara em relação ao grau de contaminação entre os diferentes períodos sazonais.
50
O Fator de Condição apresentou diferenças significativas apenas para a espécie G.
brasiliensis, tendo o local 1 (local de referência) apresentado os menores valores nos dois
períodos sazonais analisados para ambos os sexos (machos, fêmeas e fêmeas maduras)
(Tabela 6). Por outro lado, o local 3 (Barra Mansa/Volta Redonda) apresentou os maiores
valores em três de quatro análises (machos e fêmeas maduras no verão e machos no inverno)
(Tabela 7). E ainda as fêmeas no verão apresentaram maiores valores no local 2 (São José dos
Campos) em relação ao local 1 (local de referência). Tais resultados somados ao já aqui
exposto para o IHS verificado neste trabalho corroboram com a hipótese de que um aumento
tanto no IHS quanto no FC podem sinalizar efeitos de um estressor (WEGE & ANDERSON
1978; LEHTONEN & JOKIKOKKO 1995).
Elevados valores de Fator de Condição têm sido encontrados em “white sucker”
(Catostomus commersoni) e “redbreast sunfish” (Lepomis auritus) para locais poluídos com
sistemas de tratamento de efluentes (MCMASTER et al. 1991; ADAMS et al. 1992a ).
Segundo AMORIM (1998), com relação à poluição hídrica de origem industrial, apenas 18 do
total de indústrias presentes na Bacia do rio Paraíba do Sul, concentradas principalmente ao
longo do trecho da Rodovia Presidente Dutra, entre Jacareí e Guaratinguetá (SP), são
responsáveis por 85% dos despejos lançados nas águas dos rios. A cidade de São José dos
Campos localiza-se entre estas cidades. De acordo com a Companhia Estadual de Tecnologia
e Saneamento Ambiental (CETESB 1992), a cidade de São José dos Campos tem a maior
potência de poluição comparada com algumas outras cidades localizadas no trecho médio
superior da bacia do rio Paraíba do Sul, enquanto que o local 1 (local de referência), menos
alterado, apresentou os menores valores deste índice em todas as análises.
De acordo com JENKINS (2004), muitos estressores biológicos e físicos, juntamente
com estressores químicos, podem impactar negativamente organismos aquáticos assim como
a vida selvagem dependente da água. Estes estressores ambientais podem ser naturais, como
as variações diárias de temperatura, ou antropogênicos como os contaminantes, efluentes
térmicos ou modificações físicas no meio ambiente. As diferenças nos valores do Fator de
Condição podem ocorrer por influência de mais de uma variável, muitas vezes não mensurada
(LE CREN 1951).
Uma diminuição no Fator de Condição (FC), no Índice hepato-somático (IHS), ou
ambos é considerado por alguns autores como sendo um reflexo da depleção nas reservas de
energia porque esses índices são positivamente relacionados ao conteúdo de músculo total e
de energia no fígado havendo, portanto, uma ligação lógica entre essa depleção de reservas de
energia e problemas potenciais à saúde para o peixe (LAMBERT & DUTIL 1997; GOEDE &
BARTON 1990). Entretanto, apesar da idéia geral de que de que indivíduos com maior peso
em um dado comprimento estão em melhor condição, este bem estar, neste sentido, tem sido
mais relacionado a como o animal aproveita os recursos disponíveis existentes em uma
determinada época do ano, ou seja, variando diretamente com a nutrição (TYLER & DUNN
1976; BRAGA 1986), do que com a presença de poluentes xenobióticos no ambiente, que por
sua vez pode fazer o Fator variar em uma ou outra direção, saindo do alcance normal em
resposta a exposição química. Elevado Fator de Condição tem sido encontrado em “white
sucker” (Catostomus commersoni) e “redbreast sunfish” (Lepomis auritus) para locais
poluídos com sistemas de tratamento de efluentes (ADAMS et al. 1992a; MCMASTER et al.
1991). E menor Fator de Condição tem sido visto em “white sucker” para locais com elevadas
concentrações de misturas de metais e em “Atlantic cod” (Gadus morhua) expostos a petróleo
(MUNKITTRICK & DIXON 1988; MILLER et al. 1992; KICENIUK & KHAN 1987).
Nossos resultados concordaram mais com o primeiro caso, desde que o local 3 (Barra
Mansa/Volta Redonda), que como já foi citado neste trabalho é considerado o trecho de
maior nível de poluição, apresentou os maiores valores para o Fator de Condição em três de
quatro análises que indicaram diferenças significativas (P<0.05).
51
Quanto à variação sazonal, as três espécies examinadas apresentaram diferenças
significativas nos valores do FC (P<0.05). Machos de G. brasiliensis e H. aurogutatus dos
locais 9 (rio Muriaé) e 4 (rio Preto – local de referência), respectivamente, e fêmeas ovadas de
H. affinis do local 1 (Paraitinga/Paraibuna – local de referência) apresentaram maior FC no
período do verão úmido. O regime de chuvas no Brasil apresenta uma sazonalidade marcante
evidenciando uma estação de verão chuvoso e outra de inverno seco que acontece em épocas
diferentes de acordo com a localização geográfica (FIGUEROA & NOBRE 1990). Além da
variação mensal da chuva, seu ciclo diurno também varia espacialmente (ANGELIS et al.
2004) e isso pode afetar as concentrações das variáveis físico-químicas presentes nos rios.
Uma interpretação prudente do FC deve considerar que os fatores de condição podem variar
sazonalmente devido a mudanças na atividade alimentar e disponibilidade de nutrientes
(JENKINS 2004). De acordo com TEIXEIRA et al. (2005) em estudos realizados ao longo de
toda a extensão do rio Paraíba do Sul, foi verificado que no verão as maiores pluviosidades
carreiam para o rio maior quantidade de material alóctone, aumentando a disponibilidade de
alimento; em áreas de intensa atividade humana, perturbações podem ser causadas por picos
de pluviosidade, devido ao aumento do material em suspensão. Neste contexto, a maior
disponibilidade de nutrientes, assim como de materiais em suspensão no verão úmido pode
estar colaborando para a diferença significativa (P<0.05) para o Fator de Condição, com
maiores valores para este período em relação ao inverno seco. Provavelmente a chuva esteja
carreando também maior quantidade de poluentes oriundos da indústria e agricultura para o
rio neste período. WOLFF (2007) em estudo realizado em dois locais do rio das Pedras,
Guaparuava PR, utilizando Astyanax sp também encontrou menores valores do FC no período
do inverno. O mesmo autor atribui tal resultado à menor variedade e disponibilidade de
alimentos neste período devido à menor entrada de material alóctone no rio. Além disso,
LIMA-JUNIOR & GOITEIN (2005) utilizando Pimelodus maculatus, uma espécie de peixe
Siluriforme, mesma ordem de duas das três espécies utilizadas neste estudo também
observaram que, para o rio Piracicaba, a variação sazonal do FC não está diretamente
relacionada ao desenvolvimento gonadal, e que os indivíduos apresentam maiores índices de
condição corporal após períodos de intensa atividade alimentar.
Segundo JENKINS (2004) na análise do Fator de Condição devem ser consideradas as
diferenças espaciais devido às diferenças nas sub-populações, assim como os estádios de
maturação sexual, quando a energia é transferida dos processos somáticos para os processos
gonadais, e as diferenças de sexo. Porém, neste trabalho nenhuma das comparações entre os
sexos considerando-se os mesmos indivíduos para o mesmo local apresentaram diferenças
significativas (P<0.05), tanto para o Fator de Condição quanto para o Índice hepato-somático
(Figura 2). Em conclusão, os dados do presente trabalho apontam os locais mais
industrializados apresentando peixes com maiores IHS e FC, o que corrobora a hipótese de
que um aumento no FC também pode sinalizar efeitos deletérios de estressores nas
populações.
52
5 CONCLUSÕES
1. A hipótese de que um aumento tanto do Fator de Condição quanto do Índice hepato-
somático podem sinalizar efeitos deletérios de um estressor foi corroborada no presente
estudo, uma vez que locais próximos a maiores entradas de efluentes apresentaram tanto
maiores FC quanto IHS. No presente estudo, os pólos industriais de Volta Redonda/Barra
Mansa, rio Piabanha e São José dos Campos foram, dos 10 locais pesquisados, os mais
alterados de acordo como os bioindicadores utilizados.
2. O Índice hepato-somático apresentou maiores valores no inverno seco em relação ao verão
úmido, podendo estar sugerindo maior concentração de poluentes xenobióticos no período de
inverno seco, quando as menores vazões acarretam maiores concentrações dos estressores.
3. O local de referência 1 (Paraitinga/Paraibuna) apresentou os menores valores do Fator de
Condição em todas as situações analisadas, sugerindo melhores condições deste local quanto à
presença de poluentes xenobióticos, o que constitui uma outra abordagem deste índice.
4. Peixes expostos a poluentes químicos podem apresentar maiores valores do FC, indicando
menor qualidade ambiental em relação à poluição, diferindo da interpretação deste índice
quanto à melhor qualidade ambiental relacionada à maior disponibilidade alimentar onde os
maiores valores são, ao contrário, associados à melhor qualidade ambiental.
53
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Universidade Federal do Paraná), Guarapuava – Paraná; 119p.
57
Capítulo III
Biomarcadores e bioindicadores da condição de saúde de
Pimelodus maculatus (Osteichthyes, Pimelodidae) no reservatório
do Funil, Brasil.
58
RESUMO
O reservatório do Funil recebe através do rio Paraíba do Sul uma crescente entrada de
contaminantes xenobióticos provenientes das cidades do Estado de São Paulo, localizado à
sua montante configurando poluição difusa de difícil mensuração. A hipótese a ser testada
neste trabalho é se o reservatório do Funil funciona como um filtro de poluentes xenobioticos
do rio Paraíba do Sul, melhorando a qualidade da água à jusante da represa. Neste trabalho
foram usados dois biomarcadores (a atividade de etoxiresorufina–O–desetilase (EROD),
medida fluorimetricamente na fração S9 hepática, e Freqüência de Micronúcleos (MN),
observada no citoplasma dos eritrócitos); e três bioindicadores (Índice hepato-somático – IHS,
- Índice gonado-somático - IGS -, e Fator de Condição – FC -) em Pimelodus maculatus, uma
espécie de peixe amplamente distribuída no sistema. Quatro locais do reservatório do Funil
foram amostrados: 1 – rio acima do reservatório; 2 – parte superior do reservatório; 3 – parte
inferior do reservatório; 4 – rio abaixo do reservatório. Atividade de EROD, Índice hepato-
somático e Índice gonado-somático foram os indicadores biológicos que apresentaram
diferenças significativas (P<0.05) entre os locais. A atividade de EROD foi mais baixa no
local 2 e mais alta no local 4; IHS foi mais baixo no local 2 e mais alto no local 1; e IGS foi
mais baixo no local 4 e mais alto no local 1. De acordo com esses indicadores, a pior condição
foi detectada no local 4, sugerindo que as águas que deixam o reservatório provávelmente
possuem a maior presença de poluentes organoclorados. Este padrão não concorda com a
hipótese de que o reservatório do Funil atua como um filtro para o sistema Paraíba do Sul.
Palavras-chave: Biomonitoramento, peixes, poluentes, reservatório.
59
ABSTRACT
The Funil reservoir receives a large amount of xenobiotic contaminants from the Paraíba do
Sul river (PSR) due the presence of large industrial municipalities in the São Paulo State,
located nearby the river before the impoundment. The raised hypothesis is that Funil reservoir
acts as a filter for the xenobiotic pollution of the PSR waters, improving river water quality
after the dam. Two biomarkers, the ethoxyresorufin–O–deethylase activity (EROD),
measured as fluorimetricly in S9 hepatic fraction, and Micronuclei Frequency (MN), observed
in eritrocits of the cytoplasm, and three bioindicators, Hepatosomatic Index (HIS),
Gonadosomatic Index (GSI) and Condiction Factor (FC) were used in Pimelodus maculatus, a
fish species widely distributed in the system. Four sites were searched: 1 – river upstream the
reservoir; 2 – upper reservoir; 3 – lower reservoir; 4 – river downstream the reservoir. EROD
activity, hepatosomatic index and gonadosomatic index showed significant difference among
the sites (P<0.05). EROD activity was lower at site 2 and higher at site 4; HSI was lower at
site 2 and higher at site 1; and GSI was lower at site 4 and higher at site 1. According to these
indicator, the lower condiction was detected at site 4, suggesting that waters downstream the
reservoir probably have organocloride pollutants. This pattern do not confirm the hypothesis
that Funil reservoir acts as a filter for the Paraíba do Sul river.
Key-word: Biomonitoring, fishes, pollutants, reservoir.
60
1 INTRODUÇÃO
O desenvolvimento das atividades agrícolas e industriais tem conduzido à síntese de
compostos químicos, sobretudo orgânicos, cujas configurações estruturais envolvem átomos
ou grupos funcionais raramente ou nunca encontrados naturalmente, com o objetivo de se
obter propriedades únicas como a estabilidade térmica ou atividade biológica. Uma vez
introduzidos no ambiente, tais compostos, denominados xenobióticos, podem se tornar
poluentes caso determinem efeitos indesejáveis em conseqüência de sua toxicidade e
concentração. Esta, por sua vez, depende de sua distibuição e transformação nos diferentes
compartimentos ambientais (HUTZINGER & VEERKAMP 1981).
Medidas diretas de poluentes orgânicos fornecem informações detalhadas com
respeito à distribuição espacial de contaminação (WOODHEAD et al. 1999), mas possui
pouca indicação a respeito dos impactos biológicos destes compostos. Os recentes avanços no
campo da ecotoxicologia têm fornecido um número de “biomarcadores” (parâmetros
moleculares, celulares e/ou fisiológicos que significam exposição a, ou danos incorridos pelos
poluentes ambientais) que calculam o impacto desses compostos tóxicos sobre a saúde dos
organismos aquáticos expostos. O uso integrado desses biomarcadores tem sido sugerido
como um efetivo meio de determinar o impacto da poluição no ambiente aquático (MC
CARTHY & SCHUGART, 1990; REYNOLDS et al. 2003).
Segundo WALKER et al. (2001), um biomarcador é uma variação induzida por
estressores em components ou processos celulares ou bioquímicos, estruturas ou funções que
é mensurável em um sistema ou amostragem biológica, tal como uma variação nos flúidos no
corpo da célula, tecidos ou órgãos dentro de um organismo; respostas enzimáticas e produção
de metabólitos são exemplos de biomarcadores (VAN DER OOST et al. 2003), que podem
ser relacionados com exposição a, ou efeitos tóxicos do ambiente (ADAM et al. 2001). De
acordo com outros autores (MOORE & SIMPSON 1992; PACHECO & SANTOS 2002), a
informação fornecida por cada biomarcador individualmente é de limitada relevância, devido
à grande probabilidade de interpretações incorretas; por isso, biomarcadores são melhor
usados como baterias selecionadas de testes mais do que individualmente. Já os
bioindicadores são respostas aos efeitos ambientais que ocorrem aos maiores níveis de
organização biológica que o sub-organismo, e eles podem ser medidos a níveis individuais, de
população (sucesso reprodutivo, mortalidade, distribuição de tamanho, redução na abundância
e biomassa), de comunidade (produção primária, interrupção do ciclo de nutrientes) ou
mesmo a nível de ecossistemas (WALKER et al. 2001); medidas biométricas e mudanças na
composição específica podem ser considerados como bioindicadores (LAM & WU 2003).
Biomacadores e bioindicadores são largamente usados para determiner a resposta de um
organism a agentes estressores, biomarcadores são mais especificos e com maior variabilidade
de respostas comparados aos bioindicadores (ADAMS et al. 2001; WALKER et al. 2001).
A inducão do citocromo P450 – monooxigenase dependente medida como atividade
de EROD é um sensitivo indicador de exposição a poluentes em peixes (STEGEMAN &
LECH 1991; STEGEMAN et al. 1997). Neste contexto, atividade de EROD tem sido usada
como uma sensitiva sonda catalítica para determinar as respostas indutivas do sistema
citocromo P450 em peixes (GOKSØYR & FÖRLIN 1992). Os mais potentes indutores para
esta isoforma são os poluentes do grupo das bifenilas policloradas (BPCs), hidrocarbonetos
aromáticos policíclicos (HPAs) e dioxinas (e. g. tetraclorodibenzo-p-dioxina (TCDD) e
diclorodifeniltricloroetano (DDT)) (JUNG et al. 2001; SCHLENK & DI GIULIO 2002). A
indução da família CYP1A é remediada pelo receptor Aryl hydrocarboneto (AhR)
(BILLIARD 2002). Seguindo sua interação com substâncias xenobióticas, e é levado para o
núcleo, onde ele é a causa do aumento da expressão dos genes para CYP1A e,
61
subseqüentemente, do aumento da síntese de proteínas deste citocromo. Muitos dos efeitos
tóxicos de dibenzo-p-dioxinas cloradas (PCDDs) e PCBs co-planares mostram-se dependente
de sua alta afinidade de ligação e subseqüente ativação do AhR (VAN DEN BERG et al.
1998). O modelo da atividade de CYP1A é a enzima etoxiresorufina–O–desetilase (EROD),
que possui a capacidade para converter substratos em produtos demonstrando fluorescência,
que pode então ser medida. Por isso, a atividade de EROD no fígado de peixes tem sido
largamente utilizada como biomarcador de contaminação aquática por poluentes industriais
tanto em águas continentais quanto em ambientes marinhos (NARBONNE et al. 1991;
HAASCH et al. 1993; PARENTE et al. 2004; KIRBY et al. 2007).
Outro importante biomarcador utilizado neste trabalho foi a Freqüência de
Micronúcleos (MN), um dos métodos mais usados para se avaliar a genotoxicidade em
sistemas aquáticos, tem sido extensivamente utilizado em espécies de peixes (AL-SABTI &
METCALFE 1995; ÇAVAŞ & ERGENE GOZU-KARA 2005a, b). Apesar de mais simples
do que a atividade de EROD, este método também é considerado confiável e sensível (AL-
SABTI & METCALFE 1995). Micronúcleos são biomarcadores em nível celular quando a
exposição do peixe a compostos genotóxicos pode causar a fragmentação de cromossomos,
atrasos de cromossomos no momento da anáfase da mitose devido à falta do centrômero,
dano, ou um defeito na citocinese.
Um dos bioindicadores a nível de órgão utilizados neste trabalho foi o Índice hepato-
somático (IHS). Este índice também tem sido extensivamente utilizado como bioindicador de
exposição a contaminantes (GOEDE & BARTON 1990). Devido à importância do fígado no
processo de detoxificação, a exposição a contaminantes pode levar a um aumento no tamanho
do fígado por hipertrofia (aumento no tamanho), hiperplasia (aumento no número) de
hepatócitos (GOEDE & BARTON 1990); ou ambos. Estudos avaliando o tamanho relativo do
fígado de peixes de locais contaminados e de referência freqüentemente utilizam o IHS, que
expressa o peso do fígado como uma percentagem do peso total do corpo (FACEY et al.
1999).
Outro índice organo-somático é o Índice gonado-somático (IGS). O IGS integra uma
categoria de indicadores que fornece informação estrutural, mais do que funcional a respeito
da saúde e estádio de maturação gonadal. Há evidência de que a maioria das espécies de
animais sofre ciclo reprodutivo e, freqüentemente, variação no tamanho gonadal é observado
através do ciclo (DE VLAMING et al. 1981). Conseqüentemente, calculando o peso gonadal
como uma percentagem do peso do corpo tem rotineiramente sido usado para se determinar a
maturidade reprodutiva, assim como acessar mudanças gonadais em resposta a dinâmicas
ambientais (e.g., mudanças sazonais) ou estresse exógeno (e. g., exposição a contaminantes).
Há evidência significativa que exposição a vários poluentes ambientais pode resultar em
alterações gonadais tais como diminuição do IGS, mudanças morfológicas, ou ambos.
O bioindicador com maior nível de organização utilizado neste trabalho foi o Fator de
Condição, que é um bioindicador a nível de organismo. O Fator de Condição (LE CREN
1951) é um indicador quantitativo do grau de higidez ou de bem estar do peixe, refletindo
condições alimentares recentes. Ele é uma proporção do peso em relação ao comprimento;
sendo uma medida indireta das reservas de energia do peixe. Algum estresse no ambiente
natural pode ter um efeito na condição e saúde total do peixe, portanto, o Fator de Condição
pode ser empregado como um bioindicador integrativo
(SUTTON et al. 2000).
Desde que começou a operar em 1969, o reservatório do Funil vem recebendo poluentes
xenobióticos oriundos de efluentes domésticos e industriais das grandes cidades localizadas
no Estado de São Paulo, maior pólo industrial da América Latina - situado à sua montante -
dentre as quais se destacam os municípios de Jacarei, São José dos Campos, Taubaté, e
Guaratinguetá. Nestas regiões estão localizadas grandes indústrias do ramo do petróleo,
petroquímica, química e mecânica (ARAÚJO & NUNAN 2005). Além do mais, o cultivo de
62
arroz em grandes áreas no Município de Canas pode estar contribuindo para a contaminação
do rio Paraíba do Sul por xenobióticos através da liberação de fertilizantes e pesticidas
(resultados de trabalho ainda não publicado), agravando a poluição do reservatório do Funil
por poluentes orgânicos. Apesar de não haver uma captação direta nesta represa, as águas que
saem do Funil são desviadas para o sistema Ribeirão das Lajes-Guandu através da captação na
represa de Santa Cecília (situada a jusante do reservatório do Funil). Essa captação representa
cerca de 80 % da água consumida por mais de 14 milhões de pessoas no Grande Rio e
adjacências; portanto, as águas que saem do reservatório do Funil têm contribuição direta
sobre a qualidade da água consumida por essa população.
Segundo KAPLLER (2003) em países menos desenvolvidos grandes reservatórios
funcionam como sistemas de tratamento de esgoto. Aeração natural resolve os problemas
apenas parcialmente e muitos poluentes tendem a se acumular nos sedimentos. E ainda de
acordo com (KLAPPER 1998) Apud BRANCO (2002), o reservatório do Funil atua como um
filtro natural para poluentes e sedimentos, melhorando a qualidade da água rio abaixo.
O objetivo deste estudo é avaliar a qualidade ambiental ao longo de um perfil
longidutinal do sistema rio Paraíba do Sul-reservatório do Funil, através de biomarcadores e
bioindicadores em uma espécie de peixe Siluriforme de ampla distribuição, tando do rio como
no ambiente represado. Será testada a hipótese de que o reservatório funcione como filtro das
águas que chegam do rio Paraíba do Sul com elevado nível de poluição, e que a situação a
jusante do reservatório é de melhor qualidade quando comparada com a montante. Para isto,
serão feitas as seguintes perguntas: 1. Existe diferenças nos biomarcadores e bioindicadores
entre os locais amostrados que indique gradiente de poluição? 2. Os marcadores / indicadores
e a espécie de peixe utilizada são eficientes para indicação de alterações ambientais? 3. O
reservatório do Funil melhora a qualidade das águas do rio Paraíba do Sul?
63
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Área de estudo
O reservatório do Funil (Figura 1) localiza-se no Estado do Rio de Janeiro, na divisa
com o Estado de São Paulo, no Município de Resende entre as coordenadas (22°30’S,
44°45’W; 44°30’W, altitude 440 m), onde represa o rio Paraíba do Sul no seu trecho médio.
O rio Paraíba é o principal contribuinte da água que entra no sistema, que também tem
contribuição de dois tributários: Santana e Lages. O reservatório apresenta uma superfície de
40 km
2
, profundidade média de 22 m, profundidade máxima de 70 m e volume total de 890 ×
10
6
m
3
. O tempo de retenção é de 10 a 50 dias, de acordo com a estação do ano. A
Temperatura varia de 23°C a 32°C, a pluviosidade é maior no período de verão chuvoso que
não coincide como a cota do reservatório.
Figura 1. Mapa do reservatório do Funil com destaque para os quarto locais de estudo.
64
2.2 Coleta de dados
A espécie de estudo Pimelodus maculatus Lacépède, 1803 foi escolhida por ser
abundante no reservatório do Funil. Esta espécie possui hábito alimentar onívoro com
tendência à carnivoria e apresenta hábito bentônico. As coletas foram realizadas em quarto
locais, separadas da seguinte forma: local 1 – rio acima do reservatório; local 2 – parte
superior do reservatório; local 3 – parte inferior do reservatório; local 4 – rio abaixo do
reservatório. Estas coletas foram realizadas em novembro de 2006, período em que as fêmeas
dessa espécie devem estar sexualmente maduras. Para a captura foram utilizadas redes de
espera. Em cada local foram coletados 10 indivíduos adultos. Os peixes foram sexados,
medidos, e para as fêmeas foi determinado macroscopicamente o estádio de maturação sexual.
O comprimento total médio entre todos os espécimes foi de 25.93 cm, variando entre 17 e
34.5 cm (Tabela 1).
Tabela 1. Número de indivíduos, tamanho, sexo e estádio de maturação das fêmeas de P.
maculatus examinados. FM = fêmeas maduras; F = fêmeas imaturas; M = machos.
Local N Comprimento (cm) Sexo / Estádio de Maturação
1 10 25.5-31.0 FM
2 7 20.5-31.5 FM
2 3 18.7-28.5 F
3 4 27.0-34.5 FM
3 3 17.5-19.0 F
3 3 17.0-18.5 M
4 8 20.0-31.0 F
4 2 24.5-26.0 M
Os indivíduos foram pesados em balança eletrônica portátil Acculab VI-600 ou VI-200
e tomados os comprimentos totais e padrão. Os peixes foram anestesiados em banho de gelo e
posteriormente dissecados para a retirada dos órgãos. O sexo foi determinado através de
inspeção das gônadas, após incisão da cavidade celomática, os órgãos da cavidade abdominal
foram cuidadosamente retirados e o fígado pesado em balança eletrônica portátil - Acculab
VI-200, embalado em papel laminado previamente identificado, e rapidamente congelado em
galão portátil de nitrogênio líquido (-192 °C) até a chegada ao laboratório.
2.3 Produtos Químicos
O substrato (etoxiresorufina), o produto da reação (resorufina), ß-NADP, glicose-6-
fosfato, glicose-6-fosfatodesidrogenase, albumina sérica bovina e o reagente de Bradford
foram todos comprados de Sigma Chemical Company, St Louis MO, USA. TRIS, MgCl
2
e
outros sais foram de classe analítica e fornecidos por Merck SA Indústrias Químicas, Rio de
Janeiro, Brasil.
65
2.4 Trabalho de laboratório
2.4.1 Biomarcadores
2.4.1.1 Determinação da Atividade Enzimática – EROD
2.4.1.2 Preparação da fração citosólica (S9) hepática
Os fígados foram colocados em placa de Petri e descongelados em banho de gelo para
a preparação da fração S9. A homogeneização de cada fígado foi realizada à temperatura de
4ºC - em homogeneizadores de vidro do tipo Potter-Elvejhem com pistilo de teflon - em
solução contendo TRIS 50mM, sacarose 250mM, EDTA 100mM e glicerol 20% num volume
correspondente a 4 vezes o seu peso, a uma velocidade angular de aproximadamente 1200
rpm. O homogeneizado foi, em seguida, levado à centrifugação (Eppendorf ®5804R) à 4ºC e
9000g por 30 minutos. Após a centrifugação, o sobrenadante de cada amostra foi filtrado em
gaze e transferido para 3 criotubos.
2.4.1.3 Determinação da concentração de proteínas na fração S9
Para a dosagem de proteínas totais na fração S9 usou-se o método colorimétrico
descrito por Bradford et al. (1976), adaptado para microplaca, utilizando o corante Azul de
Coomassie G-250 e leitura de densidade ótica (DO) a 595 nm (espectrofotômetro de
microplaca Molecular Devices - Spectra Max Plus 384). As curvas de calibração foram
realizadas com albumina sérica bovina – BSA Sigma Chemical Co - 1,4 mg/ml diluída em
solução tampão fosfato (KH
2
PO
4
50 mM e NaCl 150 mM, pH 7,2) para se obter
concentrações adequadas. Para determinação da concentração de proteínas na fração S9, esta
foi diluída 1:30 e colocado 5 µl de amostra diluída na microplaca. Em seguida foram
adicionados 250µl de reagente de Bradford – Merck em cada poço da microplaca. Cada valor
de densidade ótica foi convertido em concentração de proteína, empregando-se a curva
padrão. Foram feitas correções para cada fator de diluição, e as concentrações de proteína na
fração S9 calculadas como a média obtida (média final) a partir do valor de cada réplica e
expressas como mg de proteína / ml de S9. As determinações foram realizadas em triplicata
considerando um coeficiente máximo de variação de 10%.
2.4.1.4 Determinação da Atividade enzimática - EROD
A determinação da atividade de EROD foi realizada em espectrofluorímetro de
microplaca. Inicialmente, foi adicionado em cada poço tampão fosfato de potássio dibásico.
Em seguida, a cada poço foi adicionado volume exato da fração S9 para a obtenção de 25
microgramas de proteínas totais por poço e o substrato. A microplaca foi, então, encubada por
2 minutos a 30°C e a reação iniciada pela adição de um sistema regenerador de elétrons em
cada poço. A reação ocorreu durante 10 minutos, quando foi terminada pela adição de
acetonitrila nos poços. O produto final, resorufina, foi quantificado em espectrofotômetro
(Em: 550; Ex: 582).
2.4.1.5 Determinação da Freqüência de Micronúcleos (MN)
No momento da dissecção dos peixes adicionou-se uma gota de sangue periférico de
cada indivíduo em lâminas para microscopia devidamente identificadas e fez-se o esfregaço
sanguíneo. As lâminas foram mantidas em estantes à temperatura ambiente até que estivessem
secas.
Em laboratório, a coloração das lâminas foi feita com Giemsa por 6 minutos. As
lâminas foram lavadas em água corrente até que o excesso de corante tivesse sido retirado
completamente. Após a secagem das lâminas, os eritrócitos dos peixes foram observados ao
microscópio óptico Olympus BX 45 no aumento final de 1000 vezes (imersão). Foram
examinadas 1000 células em cada lâmina.
66
Foram consideradas apenas hemácias nucleadas com membranas nucleares e
citoplasmáticas intactas. Os micronúcleos foram considerados como os corpúsculos que em
relação ao núcleo apresentaram aproximadamente 1/3 do seu tamanho, estando nitidamente
separados, com bordas distinguíveis, mesma cor e refringência.
2.4.2 Bioindicadores
Foram calculados três bioindicators: Índice hepato-somático (IHS), Índice gonado-
somático (IGS) e Fator de Condição (FC), através das seguintes equações:
IHS = (Peso do fígado
/ Peso total)
*100
;
IGS = (Peso da gônada / Peso total) *100
;
FC =
(Peso total / Comprimento padrão
3
)*100.
2.4.3 Análises estatísticas
As médias dos biomarcadores e dos bioindicadores foram comparadas entre os quatro
locais através da análise de variância (ANOVA), seguida pelo teste “a posteriori” de Tukey
(P<0.05) para determinação de que médias foram significativamente diferentes.
67
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A atividade de EROD mostrou os mais baixos valores para local 2 e os mais altos
valores para o local 4 (P<0.05) (Tabela 2, Figura 2). Vários estudos têm demonstrado um
aumento na atividade de EROD em peixes expostos a diferentes poluentes, como HPAs,
BPCs, e TCDDs (VAN DER WEIDEN et al. 1992; GADAGBUI et al. 1996; PACHECO &
SANTOS 1998). Indução de atividade de EROD hepática foi também encontrada tanto nos
microssomos quanto na fração S9 do fígado de tilapia Oreochromis niloticus capturados em
áreas poluídas (BAINY et al. 1999; PARENTE et al. 2004). Entretanto, informações a
respeito de diferenças na atividade de EROD de peixes expostos a poluentes através de um
perfil longitudinal de um reservatório são escassas.
Tabela 2. Diferenças entre os locais para os diferentes marcadores / indicadores biológicos.
**P<0.001 – Altamente significativo; *P<0.05 – Significativo.
Marc. / Ind. F
P Tukey
EROD 4.9716
0.00300** 4>2
MN 2.0565
0.12870 NS
HIS 3.2001
0.03684* 1>2
IGS 4.6533
0.00787** 1>4
FC 2.8466
0.05109 NS
68
40,0
42,5
45,0
47,5
50,0
EROD
0,0
0,5
1,0
MN
0,6
0,8
1,0
IHS
0,0
2,5
5,0
IGS
1 2 3 4
1,0
1,2
1,4
1,6
FC
Figura 2. Gráficos com os valores dos cinco marcadores / indicadores em cada local.
Os maiores valores de indução no local 4 (49,47±3,75) (média±desvio padrão;
medidos em pmol res/mg prot/min) - rio Paraíba do Sul a jusante da barragem -, em relação
aos valores do local 2 (42,87±4,14) (média±desvio padrão) - início do reservatório – (Figura
2) podem sugerir que as águas do rio Paraíba do Sul após o Reservatório do Funil apresentam
maiores níveis de contaminação por xenobióticos do que as que adentram ao reservatório. Tal
fato pode ser uma conseqüência da própria natureza tanto estrutural quanto operacional da
barragem do reservatório. Segundo PINTO (2001) óleo Ascarel - uma mixtura de congeneres
de BPCs - foi anteriormente empregada como um flúido insulador na maioria dos
transformadores usados no Rio de Janeiro e adjacências. Devido à inadequada estocagem sob
condições de céu aberto, o tempo leva à corrosão de containers de ascarel desse modo
causando um vazamento de BPCs no solo e corpos d’água. Adicionalmente, este desperdício
químico local pode ter produzido uma quantidade substancial de dibenzo-dioxinas-
policloradas e furanos (PINTO 2001) Apud (PARENTE et al. 2004). De maneira geral, as
aplicações mais importantes dos BPCs em termos de tonelagem foram os óleos de
transformadores e os condensadores (DE VOOGT & BRINKMAN 1989). Em óleos de
transformadores, os BPCs foram misturados com clorobenzenos (principalmente
triclorobenzenos e tetraclorobenzenos) como solventes (SWAMI et al. 1992; DE VOOGT &
BRINKMAN 1989). Segundo ALBERS (1995) HPAs podem ser introduzidos no ambiente
através da geração de energia hidrelétrica.
As diferenças significativas (P<0.05) nos valores de EROD apresentadas entre os
locais 4 (rio abaixo do reservatório) e 2 (parte superior do reservatório) também poderiam ser
explicadas, em parte, pelas diferenças na quantidade de gordura visceral entre os indivíduos
das diferentes sub-populações. De acordo com ALURU et al. (2004) ocorre uma
redistribuição dos contaminantes lipofílicos dos depósitos de lipídio para tecidos críticos. O
modo de ação do BPC pode envolver um impacto direto nas atividades da enzima ou impactar
indiretamente pelo impining na mudança de energia no tecido do animal (VIJAYAN et al.
1997). Portanto, se houvesse uma quantidade muito maior de gordura visceral nos indivíduos
69
do local 4 em relação aos do local 2, essa diferença poderia estar colaborando para os maiores
valores de indução do primeiro. Contudo, a pouca diferença nos valores deste parâmetro
(2,93g e 2,55g, locais 4 – maior indução - e 2 – menor indução –, respectivamente), diminui
essa possibilidade.
Um fator que pode estar colaborando para os menores valores de atividade de EROD
no local 2 é a grande ocorrência de fêmeas ovadas neste local (70%). É bem conhecido que
atividade de EROD em fêmeas sexualmente maduras é mais baixo do que em fêmeas imaturas
ou fêmeas desovadas (ELSKUS et al. 1992), e que este fenômeno é ligado aos elevados níveis
do hormônio sexual estrogênio e sua habilidade em atuar como supressor de P450/EROD
(GRAY et al. 1991; SAKAMOTO et al. 2003). E tem sido registrado que fêmeas maduras
sexualmente durante a produção do ovo e no período de desova têm níveis muito baixos, ou
não induzíveis de CYP1A que foi associado com um alto nível de estrogênio, embora em
machos maduros a indução de CYP1A tenha alcançado os maiores valores (FORLIN &
HAUX 1990). Porém, neste trabalho todos os indivíduos coletados no local 1 foram de
fêmeas maduras, e este local não apresentou diferença significativa quanto aos valores de
atividade de EROD em relação ao local 4 (Tabela 1). Por outro lado, os baixos valores de
expressão de atividade de monooxigenase hepática no local 2 também podem ser devido à
possível concentração dos poluentes neste site tornando-o um ambiente de exposição crônica
a xenobióticos, por isso, uma aumentada atividade de EROD pode ter sido mascarada. Neste
contexto, de acordo com alguns autores (ELSKUS et al. 1999; NACCI et al. 1999;
BRAMMELL et al. 2004), peixes que vivem em habitats cronicamente contaminados
desenvolvem resistência a poluentes. Esses peixes falham em expressar elevados níveis de
CYP1A quando expostos a compostos indutores.
De acordo com SCOTT & SLOMAN (2004) os diferentes padrões de alterações,
inerentes a cada composto e a cada organismo, possibilitam que o efeito de uma variedade de
substâncias possa ser distintamente avaliado em diversos organismos através de uma resposta
integrada dos mesmos a diferentes poluentes presentes no ambiente, já que tais efeitos são
precedidos por mudanças sub-letais em moléculas e células.
Entre os bioindicadores o IHS apresentou os maiores valores para o local 1 (rio antes
do reservatório) com diferença significativa em relação local 2 (parte superior do
reservatório), que apresentou os menores valores (Tabela 2, Figura 2). Os menores valores de
IHS no local 2 coincidem com os menores valores de EROD que, como já foi visto, também
apresentaram os menores valores neste local. Tais resultados quanto ao IHS, que é dos índices
organo-somáticos, um dos mais freqüentemente associados com exposição a contaminantes
(ADAMS & MCLEAN 1985), sugerem que o local 1 seja o mais alterado por poluentes,
enquanto que os menores valores observados para o local 2 insinuam menores concentrações
de químicos xenobióticos neste local. Alguns autores utilizando o IHS registraram maiores
valores deste índice em locais mais alterados (ADAMS & RYON 1994; KARELS et al. 1998;
VAN DER OOST et al. 1996; BILLIARD & KHAN 2003). Por outro lado, segundo (FACEY
et al. 2005; VIJAYAN et al. 2006) a redução no IHS pode ser devido à diminuição no
tamanho do fígado devido a uma menor armazenagem de gordura mais do que uma melhora
da qualidade ambiental. Os mesmos autores relacionam a menor armazenagem de gordura
com uma menor disponibilidade alimentar. Entretanto, como já foi discutido neste trabalho, o
local 2 é o que apresenta o maior aporte de nutrientes, portanto, a acentuada diminuição do
valor de IHS neste local provavelmente não está relacionada à carência alimentar.
Muitos estudos dos efeitos de sistemas de tratamento de efluentes da produção de
papéis registram um concomitante aumento no IHS em peixe com alta atividade de EROD
(BANKEY et al. 1994; HUUSKONEN & LINDSTRÖM-SEPPA 1995; LARSSON et al.
1988). Tipicamente, aumentos no peso do fígado seguindo exposição ao receptor agonista, aril
hidrocarboneto (Ah), é devido a uma proliferação do retículo endoplasmático liso como um
70
resultado da síntese aumentada de proteínas relacionadas ao CYP1A (LARSSON et al. 1988).
Neste contexto, os resultados deste trabalho mostraram o local 2 com menores valores tanto
de IHS quanto de atividade de EROD. Por outro lado, a maior expressão de CYP1A
verificada para o local 4 não foi acompanhada pelo IHS, que apresentou os maiores valores
para o local 1. Provavelmente os valores da atividade de monooxigenase hepática no local 1
não acompanharam os do IHS devido às influências do estádio de maturação. O fato de todos
os indivíduos coletados no local 1 serem de fêmeas ovadas provavelmente contribuiu para a
menor expressão de CYP 1A neste site, já que o citocromo P450 está envolvido na síntese de
hormônios e outros esteróides, o que pode significar um maior comprometimento deste
sistema nos períodos reprodutivos (PEDROSA et al. 2001). Este fato poderia explicar, em
parte, a menor expressão da isoforma CYP4501A no local 1 em relação ao local 4,
considerando que no primeiro o sistema citocromo P450, como um todo, estaria envolvido em
processos metabólicos basais. Por isso uma aumentada atividade de enzimas de
biotransformação de xenobióticos no local 1 pode ter sido mascarada pelos aumentos
fisiológicos que são associados com o status reprodutivo (isto é particularmente verdade no
caso de fêmeas devido ao aumento na síntese de vitelogênio (VTG)) (SEPÚLVEDA et al.
2004).
Neste contexto, uma redução no IGS e prejuízo no desenvolvimento gonadal
(crescimento e patologias estruturais) têm sido registrados em resposta a inseticidas
organofosfato em fêmeas de “striped catfish” (Mystus vittatus) (CHOUDHURY et al. 1993).
SAKAMOTO et al. (2003) estudando a indução do citocromo P450 e status de alteração
gonadal em (Cyprinus carpio) associado com a descarga de efluentes contaminados por
dioxinas para o rio Hikiji, Japão encontraram que o IGS para fêmeas do local contaminado
foram 2.1 vezes mais baixo do que para fêmeas do local de referência. SEPÚLVEDA et al.
(2004) avaliando os efeitos de sistemas de tratamento de efluentes de papel (BKME) nos
parâmetros reprodutivos de Micropterus salmoides floridanus observaram relação inversa
entre VTG e IGS e atividade de EROD em fêmeas.
Tais resultados concordam com os verificados para o IGS neste trabalho, onde os
maiores valores deste índice foram verificados para o local 1 e os menores para o local 4, que
apresentou os maiores valores de atividade de EROD, reforçando a possibilidade de que o
local 4 apresente maior presença de compostos xenobióticos. Além do mais, o fato de não ter
ocorrido nenhuma fêmea madura no local 4 também pode sugerir que estes poluentes possam
estar associados com efeitos antiestrogênicos nesta espécie. De acordo com GRAY et al.
(1991) o estrogenio é o mais potente agente endógeno que afeta a atividade de CYP1A. E tem
sido registrado que fêmeas sexualmente maduras durante a produção do ovo e desova têm um
nível de CYP1A muito baixo, não induzível, que foi associado com alto nível de estrogenio,
embora em um macho maduro a indução de CYP1A alcançou os maiores valores (FORLIN &
HAUX 1990). Um dos principais papéis do estrogenio, um dos hormônios esteróides de maior
importância, é de estimular o fígado a produzir a proteína da gema, vitelogenio, que é então
incorporado no desenvolvimento do ovócito e é responsável pelo maior aumento no peso
gonadal nas fêmeas.
Segundo alguns autores (STEGEMAN et al. 1992; BAINY 1993) é necessário clareza
na interpretação dos resultados, de forma que seja possível diferenciar resultados devidos à
exposição aos contaminantes de oscilações fisiológicas normais. Neste sentido, de
considerável interesse em toxicologia aquática é se alterações na atividade de EROD hepática
são relacionadas a mudanças nas funções reprodutivas ou outras funções fisiológicas.
Múltiplos caminhos para possíveis efeitos toxicológicos têm sido sugerido desde que o papel
biológico da CYP1A inclui o metabolismo de compostos xenobióticos, assim como também,
a síntese e degradação de compostos endógenos, tais como esteróides e compostos derivados
de esteróides, ácidos graxos, e seus derivados (SAKAMOTO et al. 2003). Numerosos estudos
71
têm registrado alterações nas concentrações de hormônios esteróides em peixes expostos a
poluentes industriais e a alteração foi diretamente conectada com a interrupção da função
reprodutiva (MCMASTER et al. 1991; MUNKITTRICK et al. 1992).
Cada um dos indicadores acima possui vantagens e desvantagens, mas analisá-los
juntos pode ajudar a superar o ponto fraco individual de algum teste. Individualmente, os
biomarcadores e bioindicadores podem fornecer apenas informações limitadas quanto aos
efeitos de estressores ambientais. Entretanto, quando usados juntos, os indicadores biológicos
utilizados neste trabalho podem fornecer um relato mais holístico da saúde do animal e, por
extensão, do ambiente.
Neste contexto, o fato do local 4 ter apresentado maiores valores de atividade de
EROD e menores valores de IGS pode ser um indicativo de maior presença de xenobióticos
antiestrogênicos neste local, já que para ambos os indicadores tais resultados estão geralmente
associados a piores condições ambientais, o que pode significar que as águas que saem do
reservatório estão mais poluídas por compostos xenobióticos do que as que nele adentram, e
isso pode significar tanto um risco para as populações de P. maculatus e outras espécies de
peixes no rio Paraíba do Sul a jusante do reservatório, como para a saúde da pessoas que
utilizam essas águas para consumo. Tais resultados podem ser decorrência da própria
estrutura e funcionamento da barragem, que pode estar sendo responsável pela liberação de
poluentes organoclorados tais como BPCs e HPAs durante o processo de produção de energia
hidrelétrica. Por outro lado, os maiores valores de IHS no local 1 sugerem o contrário, pois os
maiores valores deste índice geralmente estão relacionados a maiores efeitos tóxicos causados
por poluentes. Os menores valores tanto de IHS quanto de EROD para o local 2 podem estar
significando menor quantidade de poluentes neste site, esta situação possívelmente deva-se
aos efeitos remediadores do processo de fotólise que deve ser maior neste local devido à sua
topografia, após uma grande curva, o que diminui o fluxo das águas, aumentando o tempo de
exposição destas aos raios solares, o que pode estar contribuindo para a diminuição da
toxicidade de alguns poluentes orgânicos no início do reservatório. Por outro lado, pelo
mesmo motivo o local 2 pode ser onde os poluentes orgânicos primeiramente se acumulam, já
que substâncias lipofílicas associam-se ao material particulado, especialmente ao sedimento, o
que pode ter tornado este local um habitat de exposição crônica, fazendo com que os peixes
que vivem ali tenham desenvolvido resistência a poluentes e não expressem a indução de
CYP1A.
Tais resultados não concordam com a hipótese de que o Reservatório do Funil serve
como um filtro para contaminantes organoclorados das águas do rio Paraíba do Sul da região
a montante para a jusante da represa.
72
4 CONCLUSÕES
1. Os maiores valores de atividade de EROD e menores valores de IGS no local 4 sugerem
que as águas que saem do reservatório do Funil possuem maior quantidade de poluentes
organoclorados do que as que adentram ao reservatório, e que tais poluentes podem estar
prejudicando a reprodução de Pimelodus maculatus neste local, já que muitos desses
compostos possuem propriedades antiestrogênicas.
2. Os menores valores de atividade de EROD e IHS no local 2 podem ser o resultado da
grande presença de fêmeas maduras, ou então da possibilidade dos peixes que habitam este
local terem adquirido resistência à poluição devido à exposição crônica e por isso expressem
pouca indução de CYP1A.
3. A indução da atividade de EROD hepática é um efetivo marcador de poluentes
xenobióticos em P. maculatus e pode estar associado com efeitos antiestrogênicos nesta
espécie.
4. O uso integrado de diferentes biomarcadores e bioindicadores mostrou-se eficiente para
avaliação da qualidade ambiental do reservatório do Funil.
5. O reservatório do Funil não serve como um filtro para contaminantes organoclorados das
águas do rio Paraíba do Sul da região a montante para jusante da represa.
73
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78
Capítulo IV
Efeitos da beta-naftoflavona e dimetilbenzoantraceno no
metabolismo hepático de Geophagus brasiliensis (Perciformes,
Cichlidae), e freqüência de ocorrência de micronúcleos
79
RESUMO
Os efeitos de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) tais como beta-naftoflavona
(BNF) e dimetilbenzoantraceno (DMBA) foram investigados separadamente em uma espécie
de peixe tropical (Geophagus brasiliensis). Os peixes foram expostos por 3 dias a 50 mg/Kg
via injeção intraperitoneal (i. p.). No dia 3 de exposição a atividade de etoxiresorufina-O-
desetilase mostrou-se significativamente elevada no grupo tratado com BNF em relação ao
grupo controle (não tratado), e no mesmo período a Freqüência de Micronúcleos mostrou-se
significativamente elevada no grupo tratado com DMBA em relação ao grupo controle. Tais
resultados sugerem uma modulação da BNF no metabolismo de biotransformação em G.
brasiliensis, expressa como aumento da atividade de EROD hepática; assim como a
modulação do DMBA na genotoxicidade da espécie, expressa como aumento da Freqüência
de Micronúcleos (MN). Concluímos que Geophagus brasiliensis é uma espécie apropriada
para estudos de biomonitoramento em países tropicais.
Palavras chave: Biomarcadores, CYP1A, EROD, peixes.
80
ABSTRACT
Effects of policyclic hydrocarbons aromatics (HPAs) such as ß-naphthoflavone (BNF) and
dimethylbenz(a)anthracene (DMBA) were investigated in Geophagus brasiliensis, a specie
widely distributed in brazilian rivers. Fishes were exposed during 3 days to 50 mg/Kg via
intraperitoneal injection (i. p.). In the day 3 of exposure ethoxyresorufin-O-deethylase activity
was significantly high in the group treated with BNF compared with the control group, while
the Micronuclei Frequency was significantly high in the group treated with DMBA compared
with the control group. Such results suggest that modulation of BNF ocurr in
biotransformation metabolism, indicated by increasing hepatic EROD activity. Modulation of
DMBA in genotoxity was indicated by increasing Micronuclei Frequency (MN). Geophagus
brasiliensis showed to be a specie suitable for biomonitoring studies in tropical areas.
Key words: ß-naphthoflavone, CYP1A, dimethylbenz(a)anthracene, EROD, Geophagus
brasiliensis, micronuclei.
81
1 INTRODUÇÃO
Organismos aquáticos, sabidamente peixes, vivendo em ambientes contaminados com
hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) podem absorver estes compostos da água
através da guelra e pela ingestão de sedimentos ou alimentos contaminados (VARANASI et
al. 1989). Contaminação por HPAs é um dos principais problemas ambientais porque além de
bioconcentrarem-se em muitos animais aquáticos (CONNEL 1990), eles possuem
propriedades mutagênicas (MYERS et al. 1991) e carcinogênicas (GRIMMER 1983; STEIN
et al. 1990).
Em anos recentes, tem havido um aumento na preocupação sobre a possível
degradação de ambientes aquáticos por poluição química. Isto tem levado a um aumento nos
esforços para compreender a relação causal entre: exposição a contaminantes e efeitos
biológicos mensuráveis em organismos aquáticos (DE FLORA et al. 1991). O uso de peixes
como organismos em programas de monitoramento ambiental e em pesquisas investigando a
resposta ao insulto tóxico é agora bem estabelecido. Entretanto, ainda há uma brecha
importante no corrente conhecimento concernente à medida dos biomarcadores e sua ligação
com os níveis de contaminantes no ambiente (GOKSØYR et al. 1996). Tal deficiência
mostra-se particularmente grave em países tropicais em desenvolvimento, onde estudos tanto
de biomonitoramento quanto dos efeitos da exposição a contaminantes em espécies de peixes
nativas são escassos.
A síntese das isoformas específicas do citocromo P450 tal como o citocromo P450 1A
é bem associada com atividades como etoxiresorufina-O-desetilase (EROD) e mostrou-se
como sendo específicamente modulada (induzida ou inibida) em fígado de peixes pelos
(HPAs) (STEGEMAN & KLOEPPER-SAMS 1987). A biotransformação de químicos
lipofílicos a compostos mais solúveis em água é um requisito para sua detoxificação e
excreção em invertebrados e em peixes (GOKSØYR & FÖRLIN, 1992). Particularmente, a
indução do sistema enzimático citocromo P450 (CYP450), uma superfamília de
hemeproteínas estruturalmente e funcionalmente relacionadas capazes de se ligar e
metabolisar uma variedade de classes de produtos químicos (BEND 1994; LIVINGSTONE
1998; STEGEMAN & LIVINGSTONE 1998), tem sido sugeridas como um sistema de alerta
inicial para se avaliar a exposição a algumas classes de contaminantes químicos como
hidrocarbonetos clorados e policlorados (HAASH et al. 1993).
Essas enzimas de biotransformação participam também do metabolismo endógeno e
são geralmente divididas em duas fases: fase I, onde grupos funcionais são adicionados ou
expostos no composto parental, nesta fase desenvolvem-se em sua maioria reações de
oxidação e hidrólise e, em alguns casos, reações de redução, e as reações de fase II, onde as
moléculas endógenas são conjugadas ao produto da fase I ou diretamente ao xenobiótico. Os
produtos finais são mais polares, solúveis em água, e menos reativos podendo ser excretados
do organismo (VAN DER OOST et al. 2003). Entretanto, em alguns casos o metabólito
produzido é mais reativo (tóxico) do que a substância original, sendo que o sistema
enzimático citocromo P450 é o principal envolvido neste processo (STINE & BROWN
1996). Uma isoforma específica, CYP1A, é largamente usada como biomarcador em
aplicações ecotoxicológicas desde que ela está envolvida na biotransformação de
contaminantes ambientais bem conhecidos (GOKSØYR & FÖRLIN 1992). Neste contexto, a
expressão da enzima CYP1A, medida com atividade de EROD tem sido empregada como um
índice de resposta primária para avaliar os efeitos biológicos destes poluentes em peixes
(STEGEMAN & LECH 1991; PACHECO & SANTOS 1997, 1998) e é agora largamente
utilisada como uma ferramenta de biomonitoramento em estudos de campo (STEGEMAN
82
1995; VAN DER OOST et al. 1996b, 1997; BAINY et al. 1999; BARRA et al. 2001;
PARENTE et al. 2004; KIRBY et al. 2007).
O teste de micronúcleo (MN) em eritrócito de peixes tem sido aplicado para avaliar o
impacto genotóxico de poluentes ambientais tanto sob condições de campo quanto de
laboratório, revelando interessantes correlações com a exposição a um número de agentes
físicos e químicos (AL-SABTI & METCALFE 1995; GUSTAVINO et al. 2001). Freqüência
de micronúcleos (MN) é considerada como sendo um dos métodos mais usados para a
avaliação da genotoxicidade em sistemas aquáticos, e tem sido extensivamente aplicado em
espécies de peixes (AL-SABTI & METCALFE 1995; ÇAVAŞ & ERGENE GÖZÜKARA
2005a, b). Atividades mutagênicas em ambientes aquáticos têm sido determinadas em estudos
citogenéticos pela detecção in vivo de MN (HOOFTMAN & DE RAAT 1982; DAS &
NANDA 1986).
Medidas tais como atividade de EROD e frequência de MN pode fornecer uma
ferramenta útil quando considerando exposições de curto-período a químicos tais como
HPAs.
Os contaminantes investigados neste trabalho, beta-naftoflavona (BNF), e
dimetilbenzoantraceno (DMBA) são modelos indutores de P4501A e sua habilidade em
aumentar a atividade de EROD hepática tem sido registrada em várias espécies de peixes de
clima temperado (SCHULTZ & SCHULTZ 1982; HENDRICKS et al. 1985; FONG et al.
1983; RAZA et al. 1995; GRAVATO & SANTOS 2002; MARIA et al. 2002).
A beta-naftoflavona é um derivativo sintético de uma ampla classe de compostos
flavonóides que ocorrem naturalmente (VYAS et al., 1983), é um forte tipo de HPA indutor
de atividade de EROD hepática (STEGEMAN et al. 1987; PACHECO & SANTOS 1998). O
dimetilbenzoantraceno é um dos compostos pertencente a esta mesma classe de poluentes, e é
considerado como um dos mais carcinogênicos. Ele é extremamente eficiente para induzir
tumores em espécies de mamíferos e seu mecanismo de bioativação e interação com o DNA
em sistemas de mamíferos tem sido extensivamente estudada (BAIRD & DIPPLE 1997;
DIPPLE et al. 1983, 1984; DEVANESAN et al. 1993). Dimetilbenzoantraceno também se
mostrou altamente tumorigênica em “truta arco-íris” (Onchorhynchus mykiss) (FONG et al.
1993; REDDY et al. 1995).
O presente trabalho ojetivou investigar a indução do sistema de monooxigenase
dependente P450, medida como atividade de EROD, assim como grau de genotoxicidade
medido pela Frequência de Micronúcleos (MN) em uma espécie de peixe tropical nativa
Geophagus brasiliensis, após 3 dias de exposição a diferentes compostos de HPAs, BNF e
DMBA, separadamente via injeção intraperitonial (i.p.) com o objetivo de assessar a
adequabilidade de G. brasiliensis para estudos de biomonitoramento a esta classe de poluentes
químicos.
A hipótese a ser testada é se ocorrerá um aumento na atividade de EROD, assim como
de Freqüência de Micronúcleos (MN) em G. brasiliensis no dia 3 de exposição, constatando
aumento da expressão de CYP1A e mutações celulares decorrentes de alterações moleculares
e celulares, respectivamente, em função da exposição à HPAs, caracterizando esta espécie de
peixe como adequada para estudos de biomonitoramento a esta classe de poluentes em países
tropicais.
83
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Animais teste
Espécimens de G. brasiliensis (QUOY & GAIMARD 1824), capturados no rio Preto,
no município de Santa Rita do Jacutinga (MG), pesando entre 44,6-238,9 g (Tabela 1), foram
transportados em uma caixa d’água de 500 litros com água aerada. Em laboratório foram
aclimatados por uma semana em tanques de 700 litros com água corrente, aerada e
declorificada naturalmente. A temperatura média da água foi de 24°C (23 – 25
o
C) e o
fotoperíodo foi natural. Todos os indivíduos foram alimentados duas vezes ao dia com
“pellets” de ração para peixes.
Tabela 1. Grupo, peso, comprimento, sexo e peso do fígado dos indivíduos.
Grupo Peso (g) Comp. (cm) Sexo Peso do fígado
CONT. 1 66.00 17.5 M 1.70
CONT. 2 65.42 16.0 FM 1.63
CONT. 3 149.15 20.4 FM 1.60
CONT. 4 48.72 14.5 M 1.17
CONT. 5 100.23 18.7 FM 1.55
CONT. 6 95.96 18.5 M 1.74
BNF 1 168.60 22.00 M 3.36
BNF 2
BNF 3
BNF 4
69.27
88.65
50.93
16.50
18.00
15.00
FM
M
F
1.38
1.14
0.55
DMBA 1 238.91 25.00 M 3.66
DMBA 2 186.20 23.50 M 3.24
DMBA 3 44.60 14.50 M 0.25
DMBA 4 124.70 20.00 M 0.73
2.2 Tratamento
Posteriormente os animais foram divididos em três grupos (controle, tratados com
beta-naftoflavona BNF, e tratados com dimetilbenzoantraceno DMBA), o grupo controle não
recebeu nenhum tratamento e os indivíduos foram mortos no dia 0, quando os outros peixes
foram tratados. Os dois grupos tratados receberam uma quantidade de 50 mg/kg de apenas um
dos poluentes via injeção intraperitonial (i.p.), e cada grupo foi colocado em tanques
separados. Após 3 dias os peixes tratados foram sacrificados por decaptação, após terem sido
anestesiados com banho de gelo, e os fígados foram retirados de forma rápida e cuidadosa,
embalados em papel laminado previamente identificados e armazenados em galão de
nitrogênio líquido (-192 °C) até a chegada ao laboratório, onde foram transferidos para um
freezer (-80 °C) até a realização das análises.
2.3 Preparação da fração microssomal
Para a realização das análises os fígados foram descongelados em banho de gelo,
homogeneizados em homogeneizadores do tipo Potten-Elverjem com pistilo de teflon em
solução contendo (Tris 100mM, KCl 25 mM pH 7,4) num volume correspondendo a 4 vezes
o seu peso. Os homogeneizados foram, em seguida, centrifugados a 9000g por 30 minutos a
4°C. O sobrenadante foi recolhido e centrifugado a 100000g por 1 hora a 4°C. O sobrenadante
foi, então, desprezado e o pellet ressuspenso em tampão Tris e novamente centrifugado a
100000g por 1 hora a 4°C. O pellet foi ressuspenso em 2 ml de tampão para congelamento
(K
2
HPO
4
– 100mM pH 7,4) e armazenado em congelador - 70°C até a dosagem de proteínas.
84
2.4 Determinação da concentração de proteínas na fração S9
Para a dosagem de proteínas totais na fração S9 usou-se o método colorimétrico
descrito por BRADFORD et al. (1976), adaptado para microplaca, utilizando o corante Azul
de Coomassie G-250 e leitura de densidade ótica (DO) a 595 nm (espectrofotômetro de
microplaca Molecular Devices - Spectra Max Plus 384). As curvas de calibração foram
realizadas com albumina sérica bovina – BSA Sigma Chemical Co - 1,4 mg/ml diluída em
solução tampão fosfato (KH
2
PO
4
50 mM e NaCl 150 mM, pH 7,2) para se obter
concentrações adequadas. Para determinação da concentração de proteínas na fração S9, esta
foi diluída 1:30 e colocado 5 µl de amostra diluída na microplaca. Em seguida foram
adicionados 250µl de reagente de Bradford – Merck em cada poço da microplaca. Cada valor
de densidade ótica foi convertido em concentração de proteína, empregando-se a curva
padrão. Foram feitas correções para cada fator de diluição, e as concentrações de proteína na
fração S9 calculadas como a média obtida (média final) a partir do valor de cada réplica e
expressas como mg de proteína / ml de S9. As determinações foram realizadas em triplicata
considerando um coeficiente máximo de variação de 10%.
2.5 Determinação da Atividade enzimática - EROD
A determinação da atividade de EROD foi realizada em espectrofluorímetro de
microplaca. Inicialmente, foi adicionado em cada poço tampão fosfato de potássio dibásico.
Em seguida, a cada poço foi adicionado volume exato da fração S9 para a obtenção de 25
microgramas de proteínas totais por poço e o substrato. A microplaca foi, então, encubada por
2 minutos a 30°C e a reação iniciada pela adição de um sistema regenerador de elétrons em
cada poço. A reação ocorreu durante 10 minutos, quando foi terminada pela adição de
acetonitrila nos poços. O produto final, resorufina, foi quantificado em spectrofotômetro
(Em:550, Ex:582).
2.6 Produtos Químicos
BNF, DMBA, o substrato (etoxiresorufina), o produto da reação (resorufina), ß-
NADP, glicose-6-fosfato, glicose-6-fosfatodesidrogenase, albumina sérica bovina e o reagente
de Bradford foram todos comprados de Sigma Chemical Company, St Louis MO, USA.
TRIS, MgCl
2
e outros sais foram de classe analítica e fornecidos por Merck SA Indústrias
Químicas, Rio de Janeiro, Brasil.
2.7 Procedimentos para micronúcleos
O teste de MN foi desenvolvido em eritrócitos de G. brasiliensis. O resultado final de
cada grupo foi expresso como o valor médio (‰). Foram consideradas para contagem apenas
hemácias nucleadas com membranas nucleares e citoplasmáticas intactas. Os micronúcleos
foram considerados como os corpúsculos que em relação ao núcleo apresentaram até 1/3 do
seu tamanho, estando nitidamente separados, com bordas distinguíveis, mesma cor e
refringência.
2.8 Análises estatísticas
As médias dos 3 grupos (controle; tratado com BNF; tratado com DMBA) foram
comparadas através da análise de variância (ANOVA), seguida pelo teste “a posteriori” de
Tukey (P<0.05) para determinação de que médias foram significativamente diferentes.
85
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foi observado um aumento significativo (P<0.05) na indução de atividade de EROD
hepática no grupo tratado com (50 mg/kg) de BNF (73.70±21.65) (média±desvio padrão;
medidas em pmol res/mg prot/min) em relação ao grupo controle (54.33±8.78) no dia 3 após a
exposição (Tabela 2, Figura 1). Esse resultado é suportado por estudos prévios em
Dicentrarchus labrax (VIARENGO et al. 1997a; NOVI et al. 1988; JAKSIC et al. 1998)
tratados por diferentes injeções intraperitoniais de BNF, onde um aumento na atividade de
EROD hepática foi observado. De acordo com NOVI et al. (1998), uma injeção de (80 mg/kg)
de BNF induziu um significativo aumento da atividade de EROD hepática em sea bass após
uma exposição de 1 dia, alcançando seu máximo após 3 dias de exposição.
Tabela 2. Diferenças estatísticas dos biomarcadores nos diferentes grupos. CONT = controle;
BNF = tratado com beta-naftoflavona; DMBA = tratado com DMBA. **P<0.001 – Altamente
significativo; *P<0.05 – Significativo.
0.00
10.00
20.00
30.00
40.00
50.00
60.00
70.00
80.00
90.00
100.00
CONT BNF
pmoles resor/mg prot/min
Figura 1. Atividade de EROD nos diferentes grupos: controle (CONT.)
e tratado com beta-naftoflavona (BNF). Medidos em (pmoles res/mg prot/min).
TELES et al. (2001) também detectaram um significativo aumento da atividade de
EROD de 4 a 72 horas em Anguilla Anguilla após exposição a BNF dissolvida na água,
porém uma freqüência inalterada de anormalidades nucleares eritrocíticas (ENA), incluindo
MN, no dia 3 após exposição a este poluente. Por outro lado, alguns autores encontraram que
a indução de CYP1A pode gerar compostos intermediários reativos (STEGEMAN & HAHN
1994; VARANASI et al. 1985) e os conseqüentes efeitos genotóxicos e/ou carcinogênicos
(TUVIKENE et al. 1999). Neste contexto, a indução de CYP1A em G. brasiliensis expostos a
BNF não parece estar relacionada a efeitos genotóxicos, já que também não houve aqui, no
mesmo período, um aumento significativo na Freqüência de Micronúcleos (Tabela 2, Figura
2).
Marc. ANOVA TUKEY
EROD
F P
5.4306 0.03096*
BNF>CONT.
MN 7.2351 0.00868** DMBA>CONT.; BNF
86
0
1
2
3
4
5
6
CONT BNF DMBA
MN
Figura 2. Freqüência de MN nos diferentes grupos: controle (CONT), tratado
com beta-naftoflavona (BNF), e tratado com dimetilbenzoantraceno (DMBA).
Outros autores (PACHECO & SANTOS 2002), ao utilizarem BNF em (Anguilla
anguila), em diferentes períodos de tempo (3, 6 e 9 dias) também verificaram que seus
ensaios genotóxicos revelaram uma freqüência inalterada de MN no dia 3 após exposição a
este poluente, demonstrando a inabilidade do mesmo em induzir danos genéticos neste
período de tempo. Porém, no dia 6 um abrupto aumento de MN foi encontrado, demonstrando
alta genotoxicidade. A explicação dada pelos autores para este fato foi que o processo de
detoxificação em (A. anguila), nomeadamente a conjugação do metabólito na fase II, assim
como o sistema de reparo do DNA foram eficientes durante um menor esforço de tempo, 3
dias, evitando o dano de DNA e aparecimento de ENA. Tendo o mecanismo de detoxificação
protetor tornado-se exausto ou ineficiente ao final do sexto dia de exposição, permitindo a
expressão de genotoxicidade como ENA. Portanto, o fato de não ter havido um aumento
significativo da Freqüência de Micronúcleos em G. brasiliensis sob a ação de BNF no dia 3
de exposição não significa que tal poluente não seja genotóxico para esta espécie.
Já a resposta da Frequência de Micronúcleos (MN) em Geophagus brasiliensis
expostos a DMBA foi claramente diferente. Um aumento significativo (P<0.01) na
Freqüência de Micronúcleos foi observada após 3 dias de exposição a este poluente (Tabela 2,
Figura 2). Este aumento pode ser devido à natureza eletrofílica deste composto e sua
conseqüente capacidade de se ligar a adutores de DNA. De acordo com CHENG et al.
(1988a,b) a região baía do diol epóxido de DMBA é um metabólito eletrofílico altamente
reativo que se liga ao DNA. Outros estudos mostraram ainda que o DMBA ligou-se ao DNA
hepático de juvenis de truta in vivo (SCHNITZ & O’CONNOR 1992) e ao DNA de embriões
de truta in vivo (FONG et al. 1993). E ainda, já é sabido que o metabolismo de DMBA pode
resultar na formação de metabólitos reativos que se ligam a proteínas (LAMBARD et al.
1991) ou ao DNA (CUSACK et al. 1989).
Estudos utilisando BNF em G. brasiliensis em diferentes comprimentos de tempo são
necessários para se examinar de forma mais abrangente o potencial genotóxico deste poluente
na espécie. Além disso, posteriores estudos visando a caracterização das interações da BNF e
do DMBA com células de G. brasiliensis também são necessários para fornecer informações
mais esclarecedoras sobre os mecanismos de bioativação e reparo de DNA nesta espécie.
87
4 CONCLUSÕES
1. BNF pode modular o metabolismo de biotransformação em G. brasiliensis, expresso como
aumento da atividade de EROD hepática. Este aumento não parece estar relacionado a efeitos
genotóxicos nesta espécie. Contudo, mais estudos devem ser realizados utilizando-se BNF por
maiores períodos de tempo para se avaliar melhor a toxicodinâmica deste poluente em G.
brasiliensis.
2. DMBA pode modular a genotoxicidade em G. brasiliensis, expressa como aumento da
Freqüência de Micronúcleos. Este aumento pode estar relacionado à natureza eletrofílica deste
composto e sua conseqüente capacidade de se ligar a adutores de DNA.
3. Geophagus brasiliensis mostrou-se uma espécie adequada para estudos de
biomonitoramento a HPAs em países tropicais, especialmente considerando sua larga
distribuição geográfica.
88
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92
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Este trabalho objetivou avaliar a qualidade ambiental do rio Paraíba do Sul e do
reservatório do Funil utilizando uma bateria de biomarcadores e bioindicadores em quatro
espécies de peixes nos diferentes períodos sazonais (Inverno/Seco versus Verão Úmido).
Além disso, foi realizado um bioensaio em uma das espécies (Geophagus brasiliensis) para
um melhor conhecimento sobre suas respostas bioquímicas e celulares frente à exposição a
poluentes xenobióticos.
No capítulo I foram utilizados biomarcadores (EROD e MN) e bioindicadores (IHS,
IGS, e FC) para a avaliação da qualidade das águas do trecho médio-inferior da bacia do rio
Paraíba do Sul quanto à presença de poluentes xenobióticos. Os resultados demonstraram que
dos locais analisados os locais: 2, 4, 6, e 7 (Volta Redonda, Três Rios, rio Paraibuna mineiro e
rio Piabanha), respectivamente, são os que possívelmente apresentam maiores presenças de
xenobióticos. Porém, no local 1 (reservatório do Funil), as coletas foram realizadas dentro do
reservatório, onde pode estar ocorrendo processo de remediação por fotólise. Essa
possibilidade foi levantada no capítulo III, onde foi sugerida uma possível maior presença de
xenobióticos nas águas que saem deste reservatório, através da detecção de maiores valores de
atividade de EROD e menores valores de IGS em P. maculatus no local de coleta situado a
jusante da barragem, comparando-se o mesmo com o rio Paraíba do Sul a montante do
reservatório, com o início do reservatório, e com o local próximo à barragem. Tais resultados
foram atribuídos à própria natureza da estrutura e funcionamento da barragem para fins de
geração de energia hidrelétrica, que podem estar utilizando e/ou produzindo alguns compostos
organoclorados, tais como BPCs e HPAs (DE VOOGT & BRINKMAN 1989; SWAMI et al.
1992; ALBERS 1995; PINTO 2001).
Portanto, de acordo com os resultados do capítulo III, se for considerado a qualidade
das águas que saem do reservatório do Funil, este local também pode ser considerado como
um dos mais críticos do trecho médio-inferior quanto à presença de químicos xenobióticos.
Além disso, esses mesmos resultados não concordam com a hipótese de que o reservatório do
Funil funcione como um filtro de poluentes, melhorando a qualidade das águas do rio Paraíba
do Sul a jusante (KLAPPER 1998). E ainda, considerando-se que os indivíduos foram
coletados em um dos períodos de reprodução da espécie (novembro), os baixos valores do
IGS verificados nas espécies coletadas no rio Paraíba do Sul a jusante do reservatório do Funil
podem servir como um sinal de alerta de que a provável grande presença de xenobióticos
neste local pode também estar impactando negativamente as populações desta espécie neste
local, já que alguns destes compostos possuem propriedades antiestrogênicas. Estudos feitos
com peixes expostos especificamente a sistema de tratamento de efluentes (BKME), por
exemplo, têm demonstrado que os mesmos apresentam baixas concentrações de hormônios
reprodutivos circulando, tamanho gonadal reduzido, aumento para a idade de maturação
sexual, ovos pequenos, e reduzida expressão das características sexuais secundárias
comparados aos peixes dos locais de referência (ANDERSSON et al. 1988; MCCASTER et
al. 1996; MUNKITTRICK et al. 1998).
Um objetivo secundário do capítulo I foi o de comparar as respostas de duas espécies
de peixe (Geophagus brasiliensis e Pimelodus maculatus), que possuem hábitos alimentares
diferentes (G. brasiliensis é onívoro preferencialmente bentófago, e P. maculatus é detritívoro
preferencialmente carnívoro) para se saber se respondem da mesma maneira à exposição a
poluentes xenobióticos nos mesmos locais. Apesar de não termos conseguido capturar
indivíduos de P. maculatus em todos os locais em que foram coletados os espécimens de G.
brasiliensis, e ter havido problemas técnicos com os fígados dos indivíduos de P. maculatus
do local 6 (rio Paraibuna (MG)), contudo, nos três locais onde foram feitas as análises de
93
atividade de EROD hepática para ambas as espécies: 1, 4 e 7, reservatório do Funil, Três Rios
e rio Piabanha, respectivamente, foi constatado o mesmo padrão de indução, tendo as
subpopulações coletadas no rio Piabanha apresentado os maiores valores, seguidas das do
canal principal do rio Paraíba do Sul na cidade de Três Rios, e com os menores valores de
indução para as subpopulações das duas espécies tendo sido verificado para o reservatório do
Funil. Entretanto, para todos os 3 locais as subpopulações de G. brasiliensis apresentaram
valores mais elevados de indução, sugerindo ser esta espécie mais apropriada para estudos de
biomonitoramento no rio Paraíba do Sul em relação a P. maculatus. Trabalhos de bioensaio
devem ser realizados em P. maculatus para se avaliar sua adequabilidade para estudos de
biomonitoramento.
O capítulo II teve por objetivo verificar a qualidade ambiental da bacia do rio Paraíba
do Sul utilizando dois bioindicadores (IHS e FC) em dois períodos sazonais (Inverno/seco vs
Verão/úmido) utilizando três espécies de peixes (G. brasiliensis, Hypostomus affinis e
Hypostomus aurogutatus). Os resultados deste capítulo demonstraram que os locais
provávelmaente mais contaminados por poluentes na bacia do rio Paraíba do Sul, dentre os
examinados foram: São José dos Campos, Barra Mansa, Volta Redonda, e rio Piabanha. Os
três últimos corroborando com os resultados do capítulo I para o trecho médio-inferior da
bacia do rio Paraíba do Sul. Em relação aos períodos sazonais, os resultados do capítulo II
demonstraram que os poluentes na bacia do rio Paraíba do Sul apresentaram uma tendência a
se concentrar mais no período do inverno/seco, tal fato provávelmente deve-se à menor
diluição dos contaminantes neste período em relação ao verão chuvoso.
Outro fato interessante no capítulo II foi a concordância de seus resultados com a
hipótese de que um aumento tanto do IHS quanto do FC pode também ser um indício de
menor qualidade ambiental (WEGE & ANDERSON 1978; LEHTONEN & JOKIKOKKO
1995), Já que maiores valores de ambos os índices foram detectados para alguns dos locais
com maiores alterações urbano-industriais. Em relação ao Fator de Condição, apesar da idéia
geral de que indivíduos com maior peso em um dado comprimento estão em melhor condição,
este bem estar tem sido relacionado diretamente à disponibilidade alimentar (TYLER &
DUNN 1976 Apud SCHMITT & DETHLOFF 2005; BRAGA 1986). Entretanto, a presença
de poluentes xenobióticos no ambiente pode fazer o Fator de variar em uma ou outra direção,
saindo do alcance normal em resposta a exposição química. Para peixes expostos à
contaminantes têm sido registrados tanto elevados valores do Fator de Condição
(MCMASTER et al. 1991; ADAMS et al. 1992a), quanto uma diminuição do mesmo
(KICENIUK & KHAN 1987). Os resultados tanto do capítulo II quanto do capítulo I
concordam com o primeiro caso, desde que elevados valores do Fator de Condição em ambos
os capítulos foram verificados em locais mais alterados.
Interpretar respostas obtidas em campo representa um desafio devido à complexidade
das interações dos diversos poluentes entre si e com os organismos a eles expostos e suas
respectivas respostas bioquímicas e fisiológicas. Por isso, a utilização de uma bateria de
biomarcadores e bioindicadores proporciona uma visão mais holística dos efeitos dos
contaminantes sobre a saúde do peixe, o que permite uma avaliação mais realista das
condições do ambiente estudado.
Estudos de laboratório também fornecem subsídios para uma melhor compreensão dos
resultados obtidos em campo uma vez que detectam as respostas bioquímicas de uma espécie
em nível específico. Dentro desta perspectiva justifica-se a realização dos estudos
apresentados no capítulo IV, que trata da exposição de G. brasiliensis a diferentes poluentes
organoclorados (BNF e DMBA), pertencentes à classe dos HPAs, amplamente presentes em
ecossistemas aquáticos (VAN DE OOST 1996a; IRWIN et al. 1997; WOODHEAD et al.
1999).
94
7 CONCLUSÕES GERAIS
1. Dos locais analisados neste trabalho quanto à presença de xenobióticos, os que
apresentaram o pior quadro foram: rio Piabanha, rio Paraibuna (MG), Três Rios, Volta
Redonda e São José dos Campos. O que confirma a hipótese de que locais com grandes
centros urbano-industriais apresentam maiores concentrações de poluentes químicos.
2. Peixes expostos crônicamente a diversas classes de poluentes químicos podem apresentar
maiores valores do FC, podendo significar pior qualidade ambiental. O que é contrário ao
geralmente aceito quanto à avaliação da qualidade ambiental relacionada à presença de
nutrientes, onde os maiores valores deste índice são tomados como melhor qualidade
ambiental.
3. No rio Paraíba do Sul o período de inverno/seco parece ser o que ocorre os maiores níveis
de concentração de xenobióticos, possívelmente isso se deve ao menor volume de água e
conseqüentemente menor proporção de diluição dos poluentes neste período em relação ao
verão/úmido.
4. O reservatório do Funil não serve como um filtro para xenobióticos das águas do rio
Paraíba do Sul da região a montante para jusante da represa. Além disso, provávelmente a
estrutura da barragem, assim como as operações para a produção de energia hidrelétrica
podem estar liberando poluentes no rio Paraíba do Sul a jusante do reservatório, o que pode
estar comprometendo as populações de P. maculatus neste local, já que muitos desses
compostos possuem propriedades antiestrogênicas.
5. O uso integrado dos diferentes biomarcadores e bioindicadores mostrou-se eficiente para a
avaliação da qualidade ambiental da bacia do rio Paraíba do Sul e do reservatório do Funil,
contribuindo para um diagnóstico mais completo sobre a saúde dos peixes expostos a
xenobióticos nesses locais.
6. Geophagus brasiliensis é uma espécie adequada para estudos de biomonitoramento.
95
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