( PDF ) Efeitos do 2,4 dinitrofenol na memória de roedores - avaliação do aprendizado em diferentes idades

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Universidade Federal do Rio de Janeiro

Instituto de Bioquímica Médica

Programa de Bioquímica e Biofísica Celular

Efeitos do 2,4 dinitrofenol na memória de

roedores – avaliação do aprendizado em

diferentes idades

Ana Paula Wasilewska Sampaio

Rio de Janeiro

Setembro de 2008

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UFRJ

Ana Paula Wasilewska

Sampaio

Efeitos do 2,4 dinitrofenol na memória

de roedores – avaliação do aprendizado

em diferentes idades

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Ana Paula Wasilewska Sampaio

Efeitos do 2,4 dinitrofenol na memória de roedores – avaliação do aprendizado em

diferentes idades

Tese de doutorado apresentada ao programa de

Pós-Graduação de Bioquímica e Biofísica celular no

Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal

do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos

necessários para obtenção de título de doutor em

Química Biológica, modalidade médica

Orientadora: Fernanda Guarido De Felice

Co-orientador: Sérgio T. Ferreira

Rio de Janeiro

2008

Ana Paula Wasilewska Sampaio

Efeitos do 2,4 dinitrofenol na memória de roedores – avaliação do aprendizado em

diferentes idades

Rio de Janeiro, 22 de setembro de 2008

Fernanda Guarino De Felice

(Orientadora- Professora adjunta do Instituto de Bioquímica Médica, UFRJ)

Sérgio T. Ferreira

(Co-orientador- Professor titular do Instituto de Bioquímica Médica, UFRJ)

Vivian Mary Barral Dodd Rumjanek

(Professora titular do Instituto de Bioquímica Médica, UFRJ)

Antonio de Pádua Carobrez

(Professor adjunto do Centro de Ciências Biológicas, UFSC)

Fernando Garcia de Mello

(Professor titular do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ)

Flávia Carvalho Alcantara Gomes

(Revisora- Professora adjunta do Instituto de Ciências Biomédicas, UFRJ)

Andrea Thompson DaPoain

(Professora adjunta do Instituto de Bioquímica Médica, UFRJ)

Aos meus queridos pais

AGRADECIMENTOS

Aos meus orientadores Sérgio e Fernanda.

A minha querida revisora Flávia Gomes.

Aos professores Antonio de Pádua, Vivian Rumjanek, Fernando Mello e Andrea

Da Pioan, por fazer parte da banca.

Ao “Mestre” Ivan Izquierdo e ao Martín.

Aos amigos do Laboratório do Prof. Rafael Linden.

Aos amigos do Laboratório do Prof. Fernando Mello.

As meninas do Biotério, Paula e Giane. Dona Teresa secretária.

A todos os amigos do Centro de Memória.

A todos os amigos do Instituto de Bioquímica Médica.

Aos amigos Andrea Autista, Adriano Fofys, Claudinha Darling, Joana Joscy

Theresa Traki, Samantha Shigue, Sofia Sori, Fabio Glia, Rodrigo Madeiro,

Mariângela Mariola, Charles Cabeça de Amendoim, Helena Catarina, Vivian Marri,

Mariana Silveirinha, Marcelo Marcelitcho, Rogério Rogeroso, Margaret Maguinha,

Léo 02, Leonardo, Jordano Jovem, Juliana Jujubel, Adriana Bolota, Júnior

Juniores, Clarissa Classuda, Ana Paula Anete Pinto, Carolina Carolzinha, Donato

Donatelo, Leandro Insolente, Letícia da Cor do Pecado, Luisa Lully, Milena Mille,

Mariana Nana, Brian, Mona Lisa, Janine Nine, Juliana Jú PoA, Pâmela Pam Pam

Pam, Ramón Ramôndegas, Fernando Fer, José Zé, Rose Rosilda, Nilson, Gisele

Seu Barriga, Omar Omarelinho, Montanha, Luciana Lu patinadora.

A minha aluna Axa Paula Axita.

Aos meus pais, Mario Lucio e Ladislava, e minhas irmãs, Lucia e Rafa, pelo

constante apoio. E ao Pedrinho pelas brincadeiras.

A melhor forma de manter viva cada memória

em particular é recordando-a.

Como isso nem sempre é possível, e certamente não desejável,

devemos nos aprimorar na prática da arte de esquecer.

Iván Izquierdo

RESUMO

A memória é uma das funções cognitivas mais impressionantes de várias

espécies. As memórias são constantemente formadas e muitas vezes apagadas

ou reforçadas. Durante o envelhecimento, a memória e o aprendizado estão

notadamente afetados. Neste trabalho, analisamos os efeitos do composto 2,4

dinitrofenol (DNP) em roedores de diferentes idades (ratos de 2-4 meses, 10

meses, 18-24 meses; camundongos de 2 meses e 8 meses) utilizando as

seguintes tarefas comportamentais: labirinto aquático de Morris (LAM),

reconhecimento de objetos (RO), medo condicionado (MC) e campo aberto. Os

resultados mostraram que o DNP melhorou a memória de ratos de meia idade (10

meses) no teste do LAM e do RO e a memória de camundongos de meia idade (8

meses) no LAM, e não teve efeito nos testes realizados com animais adultos

jovens (2-4 meses). Verificamos também que o DNP provocou déficit de memória

em ratos idosos (18-24 meses) submetidos ao LAM. Testes adicionais mostraram

que o DNP não alterou o comportamento dos animais experimentais no teste de

campo aberto, indicando ausência de efeitos locomotores e na capacidade

exploratória. Estes resultados indicam que os efeitos do DNP na memória de

roedores são dependentes da idade. Os níveis da proteína tau e das formas

fosforiladas das proteínas ERK (“extracellular signal regulated kinase”; pERK) e

CREB (“cAMP-response element binding protein”; pCREB) se encontraram

elevados no hipocampo de animais tratados com DNP em relação aos níveis no

hipocampo de animais controle. O bem conhecido envolvimento de pERK e

pCREB em processos relacionados à formação e consolidação de memórias

sugere, portanto, um possível mecanismo molecular pelo qual o DNP favoreça a

memória em animais de meia idade. Estudos adicionais revelaram ausência de

efeitos do DNP nos níveis totais de CREB, do antígeno nuclear neuronal NeuN, do

marcador pré-sináptico sinaptofisina e do marcador pós-sináptico PSD-95.

Estudos prévios de nosso grupo mostraram que o DNP estimula a neuritogênese

in vitro e previne o impacto do peptídeo beta-amilóide, a principal neurotoxina da

doença de Alzheimer (DA), em células neuronais. Os efeitos benéficos do DNP na

memória aqui descritos podem ser de interesse para o desenvolvimento de novas

abordagens terapêuticas na DA e em outras doenças neurodegenerativas que

causem comprometimento da memória.

ABSTRACT

Memory represents one of the most extraordinary cognitive functions of various

species. Memories are constantly being formed and often forgotten or reinforced.

Memory and learning are notably affected by aging. In this work, we analyzed the

effects of the compound 2,4-dinitrophenol (DNP) in rodents of different ages (2-4,

10 and 18-24 months old rats; 2 and 8 months old mice), using the Morris water

maze (MWM), object recognition (OR), fear conditioning (FC) and open field tests.

Animals received intraperitoneal injections of vehicle or DNP during 14 days prior

to behavioral tests. The results showed that DNP enhanced the memory of middle-

aged (10 months old) rats in both MWM and OR tasks, as well as the memory of

middle-aged (8 months old) mice in MWM. DNP had no effect on the performance

of young (2-4 month old) rats or mice in MWM test. Unexpectedly, DNP caused

cognitive deficits in old (18-24 month old) rats in the MWM test. Additional tests

showed that DNP did not affect the behavior of rodents in the open field test,

indicating lack of effects on locomotor and exploratory activities. These results

indicate that the effects of DNP on the memory of rodents are dependent on age of

the animals. Levels of tau, MAP2 and of the phosphorylated forms of both ERK

(extracellular signal regulated kinase, pERK) and CREB (cAMP-response element

binding protein, pCREB) were elevated in hippocampi from DNP-treated middle-

aged rats compared to control animals. The well-known involvement of pERK and

pCREB in both processing and consolidation of memory suggest a possible

mechanism by which DNP enhances the memory of middle-aged animals.

Additional studies showed lack of effects of DNP on total hippocampal levels of

CREB, NeuN (neuronal nuclear antigen), synaptophysin (pre-synaptic marker) and

PSD95 (post-synaptic marker). Previous studies from our group showed that DNP

stimulates neuritogenesis in vitro and prevents the neuronal impact of beta-amyloid

peptide, the main neurotoxin in Alzheimer's disease (AD). The memory-enhancing

effects of DNP described here may be useful to the development of novel

therapeutic approaches in AD and in other neurodegenerative diseases that cause

memory impairment.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1: Anatomia básica do hipocampo

Figura 2: Áreas associadas ao hipocampo

Figura 3: Sistemas de memória

Figura 4: Taxonomia da memória de longa duração e estruturas

cerebrais associadas

Figura 5: Circuitos básicos do hipocampo

Figura 6: Indução da Potenciação de longa duração

Figura 7: Eventos celulares envolvidos na regulação de CREB

Figura 8: Labirinto aquático de Morris

Figura 9: Paradigma reconhecimento de objetos

Figura 10: Aparato do medo condicionado

Figura 11: Campo aberto

Figura 12: Teste do Labirinto Aquático de Morris realizado com ratos

de 4 meses de idade

Figura 13: Falta de efeito do DNP na tarefa do reconhecimento de

objetos em ratos de 2 meses

Figura 14: A administração mais prolongada de DNP não altera o

aprendizado de ratos no LAM

Figura 15: Aprendizado reverso de ratos de 2 meses de idade após

administração prolongada de DNP

Figura 16: DNP melhora o desempenho e a memória de ratos de 10

meses de idade no Labirinto Aquático de Morris

Figura 17: DNP não altera o comportamento de ratos de 10 meses de

idade no aprendizado reverso

Figura 18: DNP melhora a memória de reconhecimento de objetos

em ratos de 10 meses de idade

Figura 19: DNP não interfere no aprendizado do Teste do Medo

Condicionado

Figura 20: DNP provoca déficit de memória em ratos de 18-24 meses

no Labirinto Aquático de Morris

Figura 21: Aprendizado reverso de ratos de 18-24 meses

Figura 22: Falta de efeito do DNP na tarefa do Reconhecimento de

Objetos em ratos de 18-24 meses

Figura 23: DNP melhora a memória de camundongos BALB/C de 8

meses de idade testados no Labirinto Aquático de Morris

Figura 24: DNP não afeta atividades locomotora e exploratória de

ratos de 10 meses e camundongos de 8 meses e nem a memória de

habituação

Figura 25: Efeitos do DNP nos níveis das proteínas tau e MAP2 em

ratos de 10 meses de idade que foram submetidos aos testes de RO

e LAM.

Figura 26: Efeitos do DNP nos níveis das proteínas pCREB e CREB

em ratos de 10 meses de idade que foram submetidos aos testes de

RO e LAM.

Figura 27: Efeitos do DNP nos níveis de pERK em ratos de 10 meses

de idade que foram submetidos aos testes de RO e LAM

Figura 28: Ausência de efeitos do DNP nos níveis das proteínas

Sinaptofisina em ratos de 10 meses de idade que foram submetidos

aos testes de RO e LAM

Figura 29: Ausência de efeitos do DNP nos níveis da proteína PSD95

em ratos de 10 meses de idade que foram submetidos aos testes de

RO e LAM

Figura 30: Efeitos benéficos do 2,4 dinitrofenol

110

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: DNP não altera as atividades exploratória e locomotora de

ratos e camundongos de diferentes idades.

Tabela 2: Velocidades e distâncias percorridas pelos ratos durante o

teste comprobatório.

LISTA DE ABREVIATURAS

AMPA – receptores do tipo ácido alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-

isoxazolepropionic

ATP – adenosina trifosfato

A - peptídeo beta amilóide

BCA – ácido bicinconico

BDNF – brain derived neurotrophic factor (fator neurotrófico derivado

de cérebro)

BSA – bovine serum albumin (soro de albumina bovina)

CaMKII - proteína cinase Ca

/calmodulina-dependente do tipo II

cAMP – adenosina monofosfato cíclica

CBP - cAMP binding protein (proteína ligadora de cAMP)

CKII - caseína cinase II

CPFm – córtex pré-frontal medial

CREB – cAMP responsive element binding

d2 –índice de discriminação

DA – Doença de Alzheimer

DNP – 2,4-dinitrofenol

EDTA – ácido etileno diamino tetraacetico

EPAC - exchange protein directly activated by cAMP

EPSPs - excitatory post-synaptic potentials (potenciais pós-

sinápticos excitatórios)

ERK – extracellular regulated kinase (kinase regulada por sinal

extracelular)

EROs – espécies reativas de oxigênio

GEF - guanine nucleotide exchange factor

IgG – Imunoglobulina G

LAM – labirinto aquático de Morris

LTD – long term depression (depressão de longa duração)

LTM – long term memory (memória de longa duração)

LTP - long term potentiation (potenciação de longa duração)

MAP2 – microtubule associated protein 2 (proteína associada a

microtúbulo 2)

MAPK - Proteína cinase ativada por mitógeno

MC – medo condiocionado

NaCl – cloreto de sódio

NGF – nerve growth factor (fator de crescimento de nervo)

NMDA – receptores do tipo N- metil- D -aspartato

PKA – Proteína cinase dependente de cAMP

PKC – Proteína cinase dependente de cálcio

PKG -Proteína cinase dependente de cGMP

PSD 95 – post sinaptic density 95 (densidade pós- sináptica 95)

RO – reconhecimento de objetos

SDS-PAGE – sódio duodecil sulfato poliacrilamida gel eletroforese

STM - short-term memory (memória de curta duração)

TBI – traumatic brain injury (injúria cerebral provocada por truma)

TBS-T- -tampão tris - HCl tween 20

Tris-HCl – tris – ácido clorídrico

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO

1.1. Aprendizado e memória

1.2. Hipocampo e estruturas relacionadas com a formação da

memória

1.3. Tipos e classes temporais da memória

1.4. Extinção da memória ou esquecimento?

1.5. Mecanismos celulares e moleculares da formação da memória

1.5.1. Plasticidade sináptica

1.5.2. Potenciação de longa duração

1.5.3. AMP cíclico e o fator CREB

1.6. Envelhecimento e memória

1.7. Doença de Alzheimer e memória

1.7.1. DNP: um desacoplador clássico da fosforilação oxidativa

1.7.2. Efeitos benéficos do DNP

2. OBJETIVOS

3. METODOLOGIA

3.1. Labirinto aquático de Morris

3.2. Reconhecimento de objetos

3.3. Medo Condicionado

3.4. Teste do campo aberto

3.5. “Western Blotting”

4. RESULTADOS

4.1. Efeitos do DNP no desempenho cognitivo de ratos adultos

jovens

4.2. Efeitos do DNP no desempenho cognitivo de ratos de meia idade

4.3. Efeitos do DNP no desempenho cognitivo de ratos idosos

4.4. Efeitos do DNP no desempenho cognitivo de camundongos de

meia idade

4.5. Efeitos do DNP nas atividades locomotora e exploratória de ratos

e camundongos de diferentes idades

4.6. Efeitos do DNP nos níveis das proteínas tau, pCREB, pERK e

MAP2 no hipocampo de ratos

5. DISCUSSÃO

5.1. DNP melhora a memória de ratos e camundongos de meia idade

5.2. DNP não interfere na memória de ratos de 2-4 meses de idade

101

5.3. Ratos idosos (18-24 meses) apresentaram déficit cognitivo após

o tratamento com DNP

103

5.4. Ratos de meia idade tratados com DNP apresentaram um

aumento dos níveis de proteínas relacionadas com a formação da

memória

105

6. CONCLUSÕES

111

REFERÊNCIAS

113

ANEXO

135

1) INTRODUÇÃO

 1.1. Aprendizado e memória

Tanto a capacidade de estocar uma informação adquirida pela experiência

quanto a sua evocação, quando necessária, são funções altamente complexas

exercidas pelo cérebro. Sem essas habilidades, outras funções cognitivas não

seriam possíveis. O aprendizado é o processo pelo qual uma nova informação é

adquirida pelo sistema nervoso e a memória compreende os mecanismos de

estocagem e recuperação dessa informação. Segundo Eric Kandel, o aprendizado

pode ser definido como o processo pelo qual adquirimos conhecimento sobre o

Mundo (Kandel, 2000). Essa definição muito ampla pode ser complementada por

outra, que descreve aprendizado como um processo no qual mudanças mais ou

menos permanentes no comportamento ocorrem como resultado da prática, que

consiste na repetição de algo (Kimble, 1961). O aprendizado pode também ser visto

como um fortalecimento diferencial de uma dentre várias respostas evocadas pela

circunstância, ou seja, pela situação. Um novo estímulo pode levar ao fortalecimento

de uma reposta já existente e também à formação de novas respostas (Hull, 1943).

Parece, portanto, que aprendizado ainda não possui uma definição conclusiva, mas

pode ser geralmente descrito como o fortalecimento de uma resposta existente ou a

formação de uma nova resposta a um estímulo, que acontece por causa da prática

ou da repetição (Kandel, 2000). O aprendizado e a memória são os dois

mecanismos mais importantes pelos quais o ambiente altera o comportamento. A

memória compreende um conjunto de diversas capacidades cognitivas pelas quais

humanos e vários outros animais retêm informação e reconstituem experiências

passadas, normalmente para um propósito presente (Gazzaniga e cols., 2006).

Apesar da grande quantidade de informação guardada em nosso cérebro, ainda

somos capazes de continuamente adquirir novas informações e guardar novas

memórias. A memória pode ser considerada uma fase do aprendizado. O

aprendizado ocorre e pode ser aperfeiçoado pela prática de uma tarefa ou pela

simples exposição continuada à informação (Gazzaniga e cols., 2006). O

aprendizado possui três principais estágios: i) Codificação da informação, momento

no qual a ação é memorizada. Nessa fase, a informação deve ser registrada em

arquivos sensoriais; ii) Retenção dessa nova aquisição por um determinado tempo.

Ocorre o armazenamento, que mantém e cria um registro da informação

consolidada, iii) Evocação, quando é reproduzido aquilo que foi aprendido (Muller e

cols., 1900; Izquierdo e Medina, 1997; Lent, 2004; Dudai e Eisenberg, 2004;

Stickgold e Walker, 2007).

 1.2. Hipocampo e estruturas relacionadas com a formação da memória

Existem várias evidências que demonstram a participação do hipocampo na

consolidação e formação da memória de longa duração (descrito com mais detalhes

adiante), incluindo estudos envolvendo infusões locais de drogas e lesões do

hipocampo com posterior verificação da integridade da memória através de tarefas

comportamentais (Siegel, 1999; Sweatt, 2004). Um dos mais famosos casos em

humanos que demonstra a importância dessa estrutura para a memória foi relatado

em 1966 por Brenda Milner e colaboradores. O paciente H. M. sofreu uma remoção

bilateral dos lobos temporais mediais, o que inclui o hipocampo, amígdala e parte da

área multimodal associativa para controlar uma epilepsia, até então sem tratamento.

Após a remoção, H. M. teve melhoras significativas das convulsões, porém,

apresentou déficits de memória irreparáveis – H. M. estava profundamente

amnésico. Ele continuava sendo capaz de formar uma memória de curta duração

(item 1.3), mas não era mais capaz de guardar informações por mais de alguns

minutos. Entretanto, as memórias formadas antes da cirurgia permaneciam intactas.

Ele se lembrava de eventos que aconteceram na infância, continuava tendo domínio

da linguagem com um bom vocabulário, não apresentando mudanças em sua

personalidade ou motivação. Por outro lado, H. M. era incapaz de manter por mais

de um minuto uma informação sobre fatos, pessoa e lugares. Também apresentava

dificuldades para orientar-se espacialmente.

Para a formação de memórias declarativas (item 1.3), o hipocampo tem um

papel dependente do tempo. Gradualmente, as memórias se tornam independentes

desta estrutura, sendo transferidas para o neo-córtex para uma estocagem de longa

duração (Zola-Morgan e cols., 1986; Wiltgen e cols., 2004). As memórias mais

antigas causam uma forte ativação de áreas do neo-córtex frontal e temporal,

enquanto as mais recentes causam ativação do hipocampo (Bontempi e cols., 1999

Takashima e cols., 2006). Vários estudos têm demonstrado que o córtex pré-frontal

medial (CPFm) é crítico para a consolidação de memórias dependentes do

hipocampo. A expressão do ―immediate early gene‖ zif268 é aumentada no CPFm

durante testes de memória remota mas não recente (Frankland e cols., 2004).

Adicionalmente, aplicação local de antagonistas NMDA no CPFm causa déficit na

consolidação de memória de longa duração (Takehara-Nishiuchi e cols., 2006).

Análises de imageamento funcional em humanos revelam que, quando os intervalos

de retenção aumentam, a recuperação da memória produz gradativas e intensas

ativações no CPFm, enquanto o oposto é visto no hipocampo (Takashima e cols.,

2006).

O hipocampo se encontra caudalmente entre o neo-córtex e o diencéfalo,

voltado para o lobo temporal (Martin e Clark, 2007). A formação hipocampal pode

ser dividida em regiões, baseadas na morfologia e no critério citoarquitetônico. As

sub-regiões são denominadas CA1, CA2, CA3, CA4 e giro denteado. Os principais

neurônios encontrados nessas regiões são piramidais glutamatérgicos (Swett, 2004).

O hipocampo recebe informações sensoriais polimodais, possuindo três vias

principais de projeções: i) via perfurante, que recebe projeções do córtex entorrinal

nas células granulares do giro denteado, ii) via das fibras musgosas, que contém os

axônios das células granulares do giro denteado que vão ao encontro das células

piramidais da região CA3 e iii) via dos colaterais de Schaffer, que consiste nas

projeções das células piramidais colaterais da região CA3 sobre as células da região

CA1 (Figura 1).

Figura 1: Anatomia básica do hipocampo (Modificado de Guilherme Neves, Sam F. Cooke e

Tim V. P. Bliss, Nature Neuroscience, 2008).

A informação sensorial de várias áreas corticais chega até o hipocampo via

córtices entorrinal e perirrinal. Suas eferências se projetam até o giro denteado e

para o hipocampo propriamente dito. Os neurônios eferentes do hipocampo são os

encontrados na região CA1. Seus axônios são glutamatérgicos e é a partir dessas

células piramidais que a informação é levada do hipocampo. Esses axônios se

projetam, principalmente, para os córtices entorrinal contra e ipsilateral, sendo que o

fórnix também recebe, contralateralmente, projeções da região CA1. Eferências

secundárias dos neurônios piramidais da CA1 também se projetam para regiões

sub-corticais, como a estriatura ventral (Squire e Zola-Morgan, 1991; Sweatt, 2004).

A formação hipocampal e os córtices adjacentes têm função essencial tanto na

formação da memória quanto no processamento cognitivo, sendo importante

ressaltar a ligação entre hipocampo e amígdala através do córtex entorrinal. O

hipocampo e o córtex pré-frontal também estão funcionalmente interconectados:

neurônios piramidais da região CA1 do hipocampo têm uma rota direta até os

neurônios do córtex pré-frontal (Sweatt, 2004; Neves e cols., 2008).

 1.3. Tipos e classes temporais da memória

Em vertebrados, a memória pode ser dividida em duas fases: o primeiro traço

tem uma duração curta, de aproximadamente até 6 horas, independente de síntese

de RNA e de proteína e é chamado de memória de curta duração (STM, do inglês

―short-term memory‖). O segundo traço depende de síntese de RNA e proteína,

podendo perdurar por dias ou meses – a chamada memória de longa duração

(LTM, do inglês -―long-term memory‖) (Izquierdo e Medina, 1997; Medina e cols.,

2008). O papel da memória de curta duração é manter a resposta do indivíduo ao

aprendizado recentemente adquirido, enquanto a memória de longa duração é

lentamente construída.

Existe ainda um tipo de memória ultra-rápida denominada de memória

sensorial (Lent, 2004; Gazzaniga e cols., 2006). A característica principal dos traços

de memória sensorial é o rápido decaimento. Ela contém uma representação da

informação com base em sensações. O indivíduo é apresentado rapidamente (50

milissegundos) a estímulos, como letras organizadas em fileiras. Imediatamente

após a exposição, o indivíduo não será capaz de relatar todas as letras de todas as

fileiras. Porém, se imediatamente após a apresentação do estímulo, for pedido o

relato das letras de somente uma fileira, o indivíduo será capaz de relatar

corretamente todos os itens.

Kandel e colaboradores foram os pioneiros na utilização de Aplysia

californica, um molusco marinho, como modelo de estudo dos eventos neuronais

associados com habituação, sensitização e condicionamento clássico. Alguns dos

achados com este organismo ajudaram a formular os mecanismos moleculares e

celulares do aprendizado, que revelaram mudanças nas conexões sinápticas

envolvidas na formação das memórias de curta e longa duração. A transmissão

sináptica pode tanto ser aumentada quanto diminuída pela atividade neuronal e

essas mudanças se apresentam em domínios temporais que vão desde

milissegundos até horas, dias e por toda uma vida (Baylei e cols., 1996, Siegel,

1999). Nos experimentos realizados com Aplysia, a memória de curta duração pode

ser avaliada através da utilização de um pequeno número de estímulos ou de

sessões de treino. Quando o número de sessões é aumentado, a memória se torna

mais rígida e mais prolongada (Kandel, 2000, Bailey e Kandel, 2008). Em roedores,

por exemplo, a memória de curta duração é formada durante as sessões de treino,

enquanto a de longa duração precisa ser consolidada e avaliada somente algumas

horas após o treino.

Vários estudos realizados em peixes, roedores e alguns invertebrados têm

mostrado que a formação da memória de curta duração e a de longa duração pode

ser distinguida pela susceptibilidade a agentes que bloqueiam a síntese protéica,

como anisomisina, cicloheximida e puromicina (Judge e Quartermain 1982;

Przybyslawski e Sara 1997; Nader e cols., 2000; Milekic e Alberini, 2002; Rossato e

cols., 2006). Algumas proteínas envolvidas no processo de formação da memória de

curta duração já foram descritas, como adenilato ciclase, proteína cinase A (PKA,

―protein kinase A‖), α-integrina e fasciclina II em Drosophila (Waddell e Quinn, 2001),

PKA e proteína cinase C (PKC ―protein kinase C‖) em Aplysia (Burrell e Sahley,

2001). Porém, o conhecimento acerca das bases moleculares requeridas para a

codificação da STM em mamíferos ainda é relativamente escasso e fragmentado

(Burrell e Sahley, 2001; Izquierdo e cols., 2002). A evocação da STM requer um

pequeno número de processos moleculares do hipocampo, sendo essa a natureza

intrínseca do papel da STM na cognição (Izquierdo e cols., 2001, Cammarota e

cols., 2005).

Uma visão prevalente descreve que memórias são inicialmente frágeis e se

tornam mais estáveis com o tempo, isto é, precisam de tempo para se estabilizar ou

consolidar. (McGaugh, 2000; Izquierdo e cols., 2007). A memória de longa duração

depende de mudanças na eficácia da transmissão de conexões sinápticas

relevantes e crescimento e reorganização dessas sinapses. Esse tipo de memória e

os mecanismos envolvidos na sua formação serão descritos com mais detalhes nos

tópicos seguintes.

Existem dois tipos fundamentalmente diferentes de memória: uma para

habilidades e outra para conhecimento (Squire, 2004). O que sabemos sobre

pessoas, lugares e coisas e seus significados é o que podemos denominar de

memória explícita. A memória explícita, também chamada de memória declarativa,

é recordada por esforço consciente e deliberado, sendo uma memória flexível e que

envolve a associação de várias informações. A formação da memória explícita

requer o hipocampo e áreas corticais associadas (Squire e Zola, 1996, Kandel, 2000

Squire, 2004).

Vários estudos com pacientes e também com animais experimentais sugerem

que o conhecimento retido como memória explícita é inicialmente adquirido através

do processamento em um ou mais dos três córtices associativos (pré-frontal, límbico

ou parieto-occipto-temporal), que sintetizam as informações visuais, auditivas e

somáticas (Kandel, 2000; Sweatt, 2004). Dessas áreas, a informação é conduzida

em seqüência para os córtices parahipocampal e perirrinal, para o córtex entorrinal,

giro denteado, hipocampo, subículo e, finalmente, de volta ao córtex entorrinal. A

partir daí, a informação é enviada de volta para os córtices parahipocampal e

perirrinal e, finalmente, para as áreas associativas polimodais do neocórtex (Kandel,

2000; Sweatt, 2004) (Figura 2).

Figura 2: Áreas associadas ao hipocampo. (A) Os componentes principais do

lobo temporal medial envolvidos no aprendizado e na memória. (B) Blocos em forma

de diagrama mostrando as vias aferentes e as eferentes da formação hipocampal.

(Modificado de Kandel, ER, JH Schwartz e TM Jessell (2000) Principles of Neural

Science. New York: McGraw-Hill.).

Córtex

parahipocampal

Córtex

entorrinal

giro

denteado

O córtex entorrinal possui duas funções principais. Uma delas é ser a fonte de

aferências para o hipocampo. Ele se projeta para o giro denteado através da via

perfurante e é por essa via que o que o hipocampo recebe informações polimodais

provenientes dos córtices associativos (Kandel, 2000; Sweatt, 2004; Neves e cols.,

2008). Por outro lado, o córtex entorrinal também é a principal saída do hipocampo.

As informações vindas do hipocampo para os córtices associativos convergem no

córtex entorrinal (Kandel, 2000; Sweatt, 2004; Neves e cols., 2008). Lesões na

amígdala não alteram a memória explicita. Embora a amígdala guarde componentes

de memória relacionados a emoções, ela não retém informação factual. Lesões

seletivas no hipocampo ou em áreas associativas polimodais no córtex temporal

com as quais o hipocampo se conecta – córtices entorrinal e parahipocampal –

produzem um déficit na memória explícita (Squire e Zola, 1996).

A memória é formada por quatro processamentos seqüenciais: codificação,

consolidação, estocagem e evocação (Figura 3) (Kandel, 2000, Lent, 2004).

- Codificação - A codificação é o processo pelo qual a nova informação aprendida

será processada. É o primeiro contato com um novo conhecimento, quando

identificamos uma nova informação e codificamos, por exemplo, uma imagem, uma

palavra ou um rosto. A intensidade e a natureza desse primeiro contato são críticas

para determinar o quanto essa informação será relembrada e estocada. Para que a

memória persista e seja relembrada, a nova informação recebida deve ser

completamente codificada. É importante integrar a nova informação com

conhecimentos prévios, que já foram estabelecidos na memória. Uma nova

informação adquirida, inicialmente sujeita a interferências do meio, pode ser

consolidada, isto é, pode ocorre a conversão de uma forma lábil numa forma mais

estável (Izquierdo e cols., 2004, 2006).

- Consolidação - A consolidação pode ser definida, por alguns neurocientistas,

como um processo duradouro, que pode acontecer dentro de poucas horas após a

aquisição, meses ou até mesmo pela vida toda (Izquierdo e cols., 2006). A

consolidação envolve a expressão de genes e a síntese de novas proteínas e

mudanças estruturais nas sinapses. Enquanto a codificação inicial da memória é um

processo rápido, que ocorre em milissegundos, a consolidação da memória é um

processo contínuo, que pode acontecer por horas ou até mesmo anos.

- Estocagem - A estocagem é o processamento da memória no qual esta será retida

pelo período em que será utilizada. A estocagem da memória de longa duração tem

uma capacidade quase ilimitada, enquanto a memória de curta duração é bastante

restrita.

- Evocação - A evocação ocorre quando a informação guardada é recuperada e

utilizada. Esse processo envolve a integração de diferentes informações, que são

estocadas separadamente em diferentes sistemas de estocagem.

Figura 3: Sistemas de memória (Lent, 2004).

A memória implícita é aquela que envolve a informação sobre o treinamento

de habilidades reflexas, motoras ou perceptuais. A memória implícita, ou não

declarativa, é recordada inconscientemente. Ela é rígida e fortemente conectada às

condições de estímulos originais sob as quais o aprendizado ocorreu (Kandel, 2000,

Lent, 2004; Squire, 2004; Gazzaniga e cols., 2006). Ela pode ser formada em várias

regiões do cérebro, incluindo cerebelo e neocórtex. A memória implícita pode ser

subdividida em associativa e não-associativa (Figura 4) (Kandel, 2000; Lent, 2004;

Squire, 2004; Gazzaniga e cols., 2006).

Habituação e sensitização são dois tipos de memória não-associativa muito

bem estudados. (Siegel, 1999; Kandel, 2000). A habituação é o decréscimo da

resposta a um estímulo benigno quando este estímulo é apresentado repetidas

vezes. Já a sensitização é um aumento da resposta a um estímulo que representa

uma experiência intensa e/ou nociva. Por exemplo, um animal pode ser acordado

por um ruído de baixa intensidade. Após várias repetições, o mesmo ruído não mais

afetará o comportamento do animal. Isso indica que houve uma habituação. No caso

da sensitização, podemos usar o exemplo da apresentação de um ruído de alta

intensidade a um animal antes de um estimulo que cause dano ou dor. Nesse caso,

o animal apresenta uma resposta mais vigorosa com a apresentação posterior de

vários ruídos de menor intensidade. No aprendizado associativo, dois estímulos

estão associados entre si, ou uma resposta está associada com um evento ou tem

uma conseqüência (Kandel, 2000). O condicionamento clássico, uma das

classificações do aprendizado implícito demonstrado por Pavlov em 1927,

estabelece um procedimento no qual interferências racionais podem fazer uma

relação entre mudanças do comportamento (aprendizado) e o meio ambiente

(estímulo). O paradigma de Pavlov pode se exemplificado pelos procedimentos

experimentais realizados com cães. A apresentação repetida de um estímulo não

condicionado, como o cheiro de carne, sem a intervenção de um experimentador,

provoca salivação no animal. Cada nova apresentação do estímulo provoca uma

resposta do animal. Caso uma sineta seja acionada antes da apresentação do

estímulo, o cão passa a associar a sirene ao cheiro da carne e, antecipadamente, já

inicia a salivação, sem mesmo sentir o cheiro de carne. Portanto, há uma resposta

não condicionada (salivação) a um estímulo não condicionado (apresentação do

cheiro de carne). Com a introdução de uma sirene, o estímulo passa a ser

classificado como condicionado, com uma resposta condicionada, isto é, após a

sirene o cão passa a salivar. O condicionamento clássico pode ser interpretado,

portanto, como um aprendizado que prevê eventos no meio ambiente (Pavlov, 1927;

Siegel, 1999; Kandel, 2000; Lent, 2004).

O condicionamento operante é o segundo maior paradigma de aprendizado

associativo (Siegel, 1999; Lent, 2004). O indivíduo aprende a utilizar uma alavanca

ou uma chave e recebe um reforço positivo ou negativo. Podemos citar como

exemplo, um rato numa caixa onde uma das paredes possui uma alavanca. Todas

as vezes que o rato acionar a alavanca, ele recebe um reforço positivo, como

comida. O oposto também pode acontecer: acionada a alavanca o indivíduo recebe

um reforço negativo.

Figura 4: Taxonomia da memória estruturas cerebrais associadas. Modificado

de Squire, 2004. Neurobiology of Learning and memory.

 1.4. Extinção da memória ou esquecimento?

A expressão da informação gerada pelo processo de aprendizado é

denominada evocação da memória e o estabelecimento duradouro de uma memória

é o resultado de uma longa fase de consolidação, através da qual a informação

MEMÓRIA

adquirida se torna progressivamente mais estável e resistente a interferências

(Izquierdo, 1989; Kandel e Squire, 2000; Cammarota e cols., 2007).

Entretanto, a teoria da consolidação vem sendo modificada por achados que

descrevem que a evocação é um processo dinâmico que pode reforçar ou alterar

uma memória já consolidada (Nader e cols., 2000; Stickgold e Walker, 2007). A

evocação da memória pode iniciar dois processos opostos: a reconsolidação ou a

extinção (Pedreira e Maldonado, 2003; Suzuki e cols., 2004). A memória

consolidada pode ser levada novamente a um estado lábil (Nader e cols., 2000;

Sara, 2000) e neste momento a reativação da memória pode seguir dois caminhos:

ou um segundo processo de consolidação, chamado de reconsolidação (Nader e

cols., 2000; Sara, 2000) ou a memória pode sofrer extinção. É conhecido

classicamente, que a apresentação do estímulo condicionado sem a apresentação

do estímulo não condicionado leva à extinção da resposta ao aprendizado (Pavlov,

1927). Várias evidências sugerem que o hipocampo e a amígdala basolateral são as

áreas envolvidas no processo de extinção (Vianna e cols., 2001; Myers e Davis,

2007; Bahar e cols., 2004). Podemos citar como exemplo, o treinamento realizado

na esquiva inibitória. A partir da primeira vez que os animais são expostos ao

ambiente sem o choque, isto é, sem o estímulo não condicionado, o processo de

extinção se inicia (Rescorla, 2001; Cammarota e cols., 2005).

A extinção pode ser intensificada pela exposição aumentada ao componente

da memória que não causa medo (estímulo não condicionado). Ratos treinados na

esquiva inibitória (treinados por um dia), quando expostos ao aparato, no dia do

teste de retenção, sem a apresentação do choque, tem a extinção da memória

aumentada no final de cinco dias de exposição.

Portanto, uma das formas de se inibir a lembrança de uma memória, é

através do processo de extinção. Mas essa inibição pode acontecer também por

outro processo, através da repressão da memória (Anderson e cols., 2004). A

repressão foi descrita também por Freud (1962) e é um fenômeno ainda não bem

compreendido. As bases biológicas eram bastante desconhecidas até 2004, quando

Anderson e colaboradores verificaram, que áreas do córtex pré-frontal dorso-lateral

são ativadas durante o processo de repressão, áreas que se projetam para o

hipocampo, através do córtex entorrinal.

Tanto as memórias extinguidas como as reprimidas podem voltar à tona, quer

espontaneamente quer como conseqüência de estímulos específicos (Rescorla,

2001; Izquierdo e cols., 2002; Cammarota e cols., 2004). Porém, existem memórias

que duram pouco tempo, e se não repetidas, desaparecem por falta de uso. A falta

de uso causa atrofia das sinapses (Eccles, 1957), e isso explica desde há pelo

menos cinqüenta anos por que as memórias nunca lembradas, assim como os

movimentos não mais feitos ou os pensamentos nunca mais revisitados,

desaparecem (Izquierdo e cols., 2006).

Conforme citado anteriormente, durante a evocação a informação pode ser

reconsolidada. A memória de longa duração pode se tornar novamente vulnerável,

principalmente, quando farmacologicamente interceptada. (Judge e Quartermain

1982; Przybyslawski e Sara 1997; Nader e cols., 2000; Milekic e Alberini 2002) e

para persistir é necessária uma nova síntese protéica, para que essa nova fase (de

reconsolidação) fique estável (Sara, 2000; Duvarci e Nader 2003; Eisenberg e Dudai

2004; Lee e cols., 2004). Inicialmente restrita a uma forma particular de tarefa

motivada pelo medo, a reconsolidação atualmente tem sido descrita em diversos

paradigmas de aprendizado e com diferentes modelos animais (Debiec e cols.,

2002; Kida e cols., 2002; Eisenberg e cols., 2003; Gainutdinova e cols., 2005;

Rossato e cols., 2006). Porém, a reconsolidação ainda não é uma unanimidade.

Vários laboratórios têm fracassado na detecção desse processo em paradigmas já

bem estabelecidos (Squire e Zola, 1996; Biedenkapp e Rudy 2004; Cammarota e

cols., 2004; Hernandez e Kelley 2004).

 1.5. Mecanismos celulares e moleculares da formação da memória

1.5.1 Plasticidade sináptica

Uma das mais importantes e fascinantes propriedades do cérebro dos

mamíferos é a sua plasticidade, isto é, a capacidade da atividade neural gerada por

uma experiência modificar a função de um circuito neural e seu subseqüente efeito

em pensamentos, sentimentos e no comportamento (Citri e Malenka, 2007). A

plasticidade sináptica se refere especificamente a mudanças da eficácia ou

intensidade da transmissão sináptica em sinapses pré-existentes (Citri e Malenka,

2007). Há muito tempo, tem sido proposto que a plasticidade exerce um papel

central na capacidade do cérebro de incorporar experiências transientes em traços

de memória permanente. A plasticidade do sistema nervoso também desempenha

uma importante função no desenvolvimento da rede neuronal e várias evidências já

demonstram que falhas nos mecanismos da plasticidade contribuem para o

desenvolvimento de desordens neuropsiquiátricas e neurodegenerativas (Citri e

Malenka, 2007).

A fosforilação de alguns tipos de proteínas pode ser vista como uma memória

molecular. O aprendizado e a memória são estabelecidos pelo acúmulo de vários

tipos de eventos de fosforilação que alteram o funcionamento de neurônios

individualmente e na rede neural a qual eles pertencem (Siegel, 1999). A fosforilação

de proteínas associadas a vesículas sinápticas regula a liberação de

neurotransmissores; a fosforilação de proteínas do citoesqueleto regula o transporte

axonal, o crescimento de neuritos, a forma, a sobrevivência e a elaboração da rede

neurítica. A fosforilação de fatores de transcrição também pode regular a expressão

de genes específicos induzindo, numa última etapa, a plasticidade neural (Siegel,

1999).

Diversas condições experimentais que influenciam no aprendizado também

podem provocar mudanças estruturais anatômicas e químicas no cérebro. Por

exemplo, quando ratos jovens são expostos a um ambiente enriquecido e são

treinados para aprender uma determinada tarefa, apresentam um melhor

desempenho que animais que não foram expostos ao ambiente enriquecido (Siegel,

1999). Esses estímulos induzem um aumento do número de sinapses e também da

complexidade das ramificações dendríticas dos córtices frontal e occiptal. Além das

mudanças neuronais, o cérebro apresenta uma maior área de superfície dos

astrócitos e vascularização. Observações de melhora no desempenho de tarefas

aprendidas também foram verificadas em ratos idosos (van Praag e cols., 1999,

2005). Quando submetidos a um ambiente enriquecido, ratos de mais de 20 meses

apresentam aumento na angiogênese e ramificações neuronais. Essas observações

enfatizam a importância da estimulação mental e da atividade física para a função e

plasticidade do cérebro (van Praag e cols, 1999, 2005). Portanto, mudanças no meio

ambiente podem evocar respostas da plasticidade sináptica.

De acordo com a hipótese mais aceita, a hipótese da plasticidade

sináptica, traços da memória são estocados no cérebro através de mudanças

estruturais das conexões sinápticas, com mudanças da eficiência sináptica e,

adicionalmente, a formação de um novo padrão da atividade neural (Hebb, 1949). As

implicações funcionais de alguns aspectos da plasticidade morfológica ainda não

foram muito bem estabelecidas. A teoria de Hebb foi primeiramente confirmada

quase duas décadas depois, através de experimentos nos quais a ativação rápida e

intensa de sinapses resulta no processo de potenciação de longa duração e no

fortalecimento de sinapses no hipocampo (Bliss e Lomo, 1973).

1.5.2. Potenciação de longa duração

Experimentos realizados por Timothy Bliss e colaboradores, em 1973,

descreveram pela primeira vez um possível modelo para a formação da memória, a

potenciação de longa duração (LTP -―long term potentiation‖). A aplicação de

estimulo elétrico de alta freqüência por poucos segundos provocava um aumento da

transmissão sináptica em hipocampos de coelhos. Mais recentemente, vários

progressos na compreensão dos mecanismos envolvidos na LTP têm sido feitos in

vitro utilizando-se fatias vivas de hipocampo (Kandel, 2000; Neves e cols., 2008;

Raymond, 2007).

Os dendritos das células piramidais da região CA1 formam uma banda

espessa (stratum radiatum) que recebe sinapses dos colaterais de Schaffer (os

axônios das células piramidais da região CA3). A estimulação elétrica dos colaterais

de Schaffer gera potencias pós-sinápticos excitatórios (EPSPs- ―excitatory post-

synaptic potentials‖) nas células pós-sinápticas da região CA1. Se os colaterais de

Schaffer são estimulados duas ou três vezes por minuto, o tamanho dos EPSPs

evocados na região CA1 permanece constante; se, entretanto, os estímulos são de

alta freqüência, ocorre um aumento da amplitude do EPSPs nos neurônios da região

CA1 do hipocampo. Essa facilitação, chamada LTP, pode ser evidenciada no

hipocampo e também em outras partes do córtex, cerebelo e amígdala (Figura 8)

(Lent, 2004; Neves e cols., 2008).

Figura 5: Circuitos básicos do hipocampo. O esquema mostra a facilitação

nos colaterais de Schaffer e as regiões CA1, CA2 CA3 e giro denteado (Lent,

2004).

Os terminais da via das fibras musgosas liberam glutamato como

neurotransmissor, que se liga tanto em neurônios NMDA (isto é, que apresentam

receptores de glutamato do tipo NMDA) quanto não NMDA nas células piramidais da

região CA3 do hipocampo. Sabe-se que o influxo de cálcio tem um papel

fundamental nas células pré-sinápticas. O influxo de cálcio ativa uma adenilato

ciclase dependente de cálcio/calmodulina, levando a um aumento dos níveis de

cAMP (adenosina monofosfato cíclica) (Kandel, 2000). Assim como as células da via

musgosa, os neurônios colaterais de Schaffer também são glutamatérgicos. Essa via

requer a ativação cooperativa de várias aferências e a LTP só ocorre quando os

canais NMDA são ativados, se tornando funcionais e conduzindo cálcio. Essa

condição ocorre quando glutamato se liga a receptores pós- sinápticos do tipo

NMDA e o potencial de membrana neuronal estiver suficientemente despolarizado.

Os receptores NMDA apresentam uma forte dependência de voltagem devido ao

seu bloqueio ocorrer por magnésio extracelular em potenciais de membrana

negativos. Como resultado, esse tipo de receptor pouco contribui para respostas

pós-sinápticas durante a atividade neuronal basal (Westbrook e Mayer, 1984;

Kandel, 2000).

Várias proteínas cinases e fosfatases têm sido implicadas na plasticidade

sináptica e já é conhecido que a atividade dessas proteínas apresenta uma diferente

sensibilidade ao aumento de cálcio (Lisman e Goldring, 1988). Muitas delas se

encontram próximas a receptores NMDA (Husi e cols., 2000), mediando uma

possível regulação da sinalização por ativação desses receptores. Para a LTP,

várias evidências demonstram o envolvimento de proteína cinase Ca

/calmodulina-

dependente do tipo II (CaMKII), proteína cinase C (PKC), proteína cinase

dependente de cAMP (PKA), proteína cinase dependente de cGMP (PKG), caseína

cinase II (CKII), proteína cinase ativada por mitógeno (MAPK).

Um dos mecanismos de expressão da LTP na região CA1 do hipocampo

envolve o aumento do número de receptores glutamatérgicos do tipo AMPA na

densidade pós-sináptica (Malinow e Malenka, 2002; Song e Huganir, 2002; Bredt e

Nicoll, 2003; Derkach e cols., 2007). Esse tipo de receptor é permeável a cátions

monovalentes (Na

e K

) e a sua ativação provoca a entrada de corrente que gera a

resposta sináptica durante o potencial de membrana (Figura 6).

Figura 6: Indução da Potenciação de longa duração (Kandel, ER, JH

Schwartz and TM Jessell (2000) Principles of Neural Science. New York: McGraw-

Hill.).

Um evento oposto à LTP é a depressão de longa duração (LTD – ―long- term

depression‖). A transmissão sináptica é enfraquecida pelo estimulo de baixa

freqüência (Siegel, 1999). O influxo de cálcio é requerido tanto na LTP quanto na

LTD. Influxos relativamente rápidos de cálcio produzem LTP enquanto influxos mais

baixos e prolongados induzem a LTD (Siegel, 1999). Portanto, um dos

determinantes para ocorrer a LTP ou LTD é a quantidade de cálcio na célula pós-

sináptica. A LTD, de maneira oposta à LTP resulta da ativação de fosfatases

dependentes de cálcio. A LTD tem sido implicada em processos de aprendizado

motor do cerebelo, que medeia a coordenação, aquisição e estocagem de

movimentos complexos (Siegel, 1999). A LTD faz decair a eficiência sináptica tanto

no cerebelo quanto no hipocampo.

1.5.3. AMP cíclico e o fator CREB

O AMP cíclico é produzido pela ação da enzima adenilato ciclase, que tem

sua atividade regulada por neurotransmissores, pela ativação de receptores e de

vias de sinalização intracelulares (Dash e cols., 1991; Carlezon e cols., 2005). O

maior alvo de ação do AMP cíclico, na maioria das células, é a proteína cinase

dependente de AMP cíclico (PKA) (Sánchez e cols., 2004) (Figura 7).

Dentre as proteínas que são fosforiladas pela PKA se encontra o fator de

transcrição CREB (―cAMP response element-binding protein‖) (Carlezon e cols.,

2005). Os genes ativados por CREB são aqueles que possuem uma seqüência

consenso CRE (TGACGTCA) na região promotora (Carlezon e cols., 2005; McClung

e Nestler, 2007). CREB é expressa em todo o cérebro, apresentando-se em altas

concentrações no hipocampo e córtex (Carlezon e cols., 2005; McClung e Nestler,

2007). Os passos-chaves envolvidos na transcrição de genes mediada pelo CREB

incluem sua dimerização, ligação a elementos responsivos no DNA e fosforilação

(Shaywitz e cols., 1999; Mayr e Montminy, 2001; Carlezon e cols., 2005). É

importante notar que o aumento da fosforilação de CREB pode ser induzido por

fatores que aumentam os níveis intracelulares de cAMP. Sendo assim, fatores como

CREB são cruciais para o acoplamento estímulo-transcrição (Carlezon e cols.,

2005). Numerosas vias de sinalização intracelular estão envolvidas na transmissão

da informação iniciada por ações mediadas por receptores de membrana até o

núcleo celular, onde haverá interação com CREB para iniciar processos que irão

culminar com a transcrição gênica (Carlezon e cols., 2005). Uma grande variedade

de estudos tem demonstrado a capacidade da via de sinalização ser iniciada pela

interação de receptores acoplados a proteína G que estimulam a ativação da

adenilato ciclase.

Além do envolvimento da adenilato ciclase e do cAMP, a participação da

MAPK (―mitogen activated protein kinase‖) tem sido foco de várias pesquisas

(Carlezon e cols., 2005). PKA, cinase dependente de Ca

/calmodulina IV (CaMK IV,

―Ca

/calmodulin-dependent kinase‖) e cinase S6 (―MAPK-activated ribosomal S6

kinases‖, RSKs) fosforilam a CREB na serina 133, o que estimula o recrutamento da

CBP (―cAMP binding protein‖) sinalizando a transcrição gênica (Dash e cols., 1991;

Deisseroth e cols., 1996). Em contraste, a CAMKII fosforila a CREB na serina 142,

que promove a dissociação do dímero da CREB, reduzindo assim, a transcrição

(Matthews e cols., 1994; Wu e cols., 2001) (Figura 7)

A conexão entre CREB e formação da memória foi inicialmente caracterizada

em Aplysia (Kaang e cols., 1993) e, posteriormente, em vários outros organismos,

usando métodos capazes de interferir com a função do fator. A indução de um

mutante dominante negativo ou deleção da forma chave da CREB em Drosophila e

em camundongos (Bourtchuladze e cols., 1994, Kwok e cols., 1994) resultou no

bloqueio da formação da memória de longa duração.

Em 1998, foi descrito outro alvo de ação do AMP cíclico, denominado EPAC

(―Exchange Protein Directly Activated by cAMP‖) (De Rooij e cols., 1998). Este fator

pertence à família dos GEFs (―guanine nucleotide exchange factors‖), que também

possui os membros Rap1GEF, C3G, PDZ-GEF, dentre outros (De Rooij e cols.,

1998; Bos e cols., 2003). As GEFs também medeiam a ativação de Rap-1 como

uma conseqüência da ativação de receptor tirosina cinase. É interessante ressaltar

que trabalhos muito recentes de indução da neuritogênese pela ativação de

integrinas em culturas de neurônios de retina de rato demonstraram efeitos da

elevação dos níveis de AMP cíclico de forma independente de ativação de PKA,

EPAC ou Rap-1, sugerindo a existência de um novo alvo de ação do AMP cíclico

(Ivins e cols., 2004). Um recente trabalho demonstrou que a sinalização promovida

pelo EPAC e por PKA juntas são requeridas na recuperação da memória (Ouyang e

cols., 2008).

Figura 7: Eventos celulares envolvidos na regulação de CREB (Carlezon e

cols., 2005).

 1.6. Envelhecimento e memória

O processo de envelhecimento, tanto em humanos quanto em animais é

acompanhado por um declínio na capacidade de aprendizado, particularmente, na

memória espacial (Uttl e Graf, 1993; Mizumori e Kalyani, 1997; Wilson e cols., 2004).

Adicionalmente, esse declínio cognitivo está associado com a deterioração da

plasticidade e circuitaria hipocampal, sugerindo uma relação entre o declínio

associado com a idade e a deficiência do processamento da informação espacial

pelo hipocampo (Fischer e cols., 1992; Barnes, 1993). Vários dados experimentais

em modelos animais de envelhecimento têm demonstrado que os déficits de

memória são muito semelhantes àqueles induzidos por lesões do hipocampo

(Sutherland e cols., 1983; Jarrard, 1983; McNaughton e cols., 1989) e que as

mudanças morfológicas do hipocampo de ratos de diferentes idades correspondem

à diferença cognitiva encontrada (Kadar e cols., 1990).

A perda da memória e o envelhecimento estão estritamente associados

quando verificamos intensos déficits com o envelhecimento em patologias, como a

Doença de Alzheimer (DA). Essa enfermidade apresenta uma alta incidência em

indivíduos idosos que demonstram um quadro grave de perda de memória,

inabilidade de formação de novas memórias e ao dano de outras habilidades

cognitivas (Maurer e cols., 2006) e já está muito bem estabelecida a sua relação

com a atividade hipocampal diminuída (Chapman e cols., 1999; Liu e cols., 2008;

Frye e cols., 2008).

Alguns trabalhos indicam que a densidade neuronal permanece estável

durante a vida (Landfield e cols., 1981; Calhoun e cols., 1998; West, 2002; Keuker e

cols., 2003) e quando ocorre a diminuição, esta é restrita a região CA1 do

hipocampo (Kerr e cols., 1991; West, 2002; Miller e O'Callaghan, 2005). Ratos

idosos apresentam uma menor quantidade de acetilcolina no hipocampo, porém,

fator de crescimento de nervo (NGF) e BDNF permanecem com quantidades

constantes (Ypsilanti e cols., 2007).

Entretanto, as alterações cognitivas relacionadas com o envelhecimento são

muito variáveis dentro de uma mesma população. Podemos citar como exemplo, o

desempenho de animais idosos no labirinto aquático de Morris. Alguns trabalhos

mostram animais idosos cognitivamente deficientes, enquanto outros demonstram

um comportamento similar a indivíduos jovens (Gage e cols., 1988; Markowska e

cols., 1989; Rapp e Amaral, 1992; Gallagher e Nicolle, 1993; Bach e cols., 1999).

Tendo em vista essas variações, podemos verificar que cada tipo de memória não é

afetado da mesma forma. Com o passar dos anos a capacidade de escrever ou

dirigir não é esquecida e muitas vezes o vocabulário é enriquecido com o

envelhecimento (Erickson e Barnes, 2003).

 1.7. Doença de Alzheimer e memória

Algumas considerações devem ser relacionadas a certos eventos

neuropatológicos que levam a desordens neurodegenerativas, como a doença de

Alzheimer (DA), e como esses eventos podem ser distinguidos de mudanças

neurológicas associadas como o envelhecimento normal. Na DA, as conexões

sinápticas são perdidas e neurônios seletivamente vulneráveis morrem e os circuitos

neuronais são deteriorados. Já no déficit de memória associado com a idade, a

perda da memória ocorre na ausência de uma perda significante de neurônios, e sim

devido a alterações nas espinhas sinápticas (Kelly e cols., 2006).

A Doença de Alzheimer (DA) é uma demência progressiva que tem como

principais características a disfunção sináptica e a neurodegeneração em áreas

específicas do cérebro, como o hipocampo e córtex, que levam a um quadro grave

de perda de memória, inabilidade de formação de novas memórias e ao dano de

outras habilidades cognitivas (Maurer e cols., 2006). Como principais características

neuropatológicas ocorrem a formação de placas amilóides extracelulares, que

contêm principalmente o peptídeo -amilóide (A ) e emaranhados neurofibrilares

intracelulares, formados pela proteína tau hiperfosforilada. Adicionalmente, a

distrofia neurítica e a perda de sinapses, assim como a morte neuronal, também são

características patológicas marcantes encontradas na DA (Selkoe, 2002; Lacor e

cols., 2004). É crescente o reconhecimento de que oligômeros solúveis do A são

formas neurotóxicas, encontradas em cérebros de pacientes de DA, causando

disfunções nas células nervosas. Esses oligômeros são ligantes patogênicos de

sinapses, que afetam, portanto, processos relacionados com a plasticidade sináptica

e a formação de memória (Klein e cols., 2001; Caughey e cols., 2003; Walsh e

Selkoe, 2004; Sweatt, 2004; Squire, 2004).

Há alguns anos, nosso grupo descreveu que o 2,4 dinitrofenol (DNP) funciona

como um composto neuroprotetor e antiamiloidogênico, pois protege culturas de

neurônios corticais contra a ação neurotóxica do A e bloqueia a formação de fibrilas

amilóides e de oligômeros solúveis de A (De Felice e cols., 2001, 2004). Mais

recentemente, nosso grupo descreveu que, em baixas concentrações, o DNP

promove neuritogênese, fenômeno verificado após análise morfométrica de neuritos

em culturas primárias neuronais, induz diferenciação neuronal em linhagem de

neuroblastoma N2A, aumenta os níveis da proteína tau na sua forma não fosforilada

e também os níveis intracelulares de AMP cíclico (cAMP) (Wasilewska-Sampaio e

cols., 2005, De Felice e cols., 2007).

1.7.1. DNP: um desacoplador clássico da fosforilação oxidativa

Desde o começo do século passado, várias substâncias, dentre as quais o

2,4-dinitrofenol (DNP), ficaram conhecidas pela sua capacidade de desacoplar o

transporte de elétrons da síntese de ATP (Liao e Oehme, 1980; Alberts e cols.,

2002). Perkins, em 1919, observou os primeiros efeitos tóxicos do DNP em

humanos, durante a primeira guerra mundial, em trabalhadores franceses que

manipulavam munições compostas por DNP e trinitrofenol. A adição desses

compostos às células interrompe a síntese de ATP pelas mitocôndrias sem bloquear

a captação de oxigênio (Harper e cols., 2001; Alberts e cols., 2002; Kadenbach,

2003). Na presença de um desacoplador, como o DNP, o transporte de elétrons e o

bombeamento de prótons continuam num ritmo acelerado, porém não há geração de

gradiente eletroquímico. Esses agentes desacopladores são ácidos fracos, solúveis

em lipídeos, que carreiam prótons (ionóforos de prótons) e fornecem uma rota

adicional para o fluxo de prótons através da membrana mitocondrial interna além da

ATP sintase (Alberts e cols., 2002). Com isso, a força próton-motriz é dissipada e

não há mais síntese de ATP.

Nas décadas de 1930-1940, o DNP foi amplamente utilizado no tratamento da

obesidade pelo seu poder desacoplador da fosforilação oxidativa, acelerando o

metabolismo (Liao e Oehme, 1980; Harper e cols., 2001). DNP diminui o gradiente

de prótons e a quantidade de ATP formada pelo transporte de elétrons, com o

conseqüente aumento do consumo de oxigênio e da temperatura corporal. Uma

série de estudos realizados na Universidade de Stanford, EUA, durante a década de

30 demonstrou que as respostas dos pacientes ao tratamento de obesidade eram

muito variáveis (Harper e col., 2001). Entretanto, existia uma relação entre a dose

administrada e o aumento da taxa metabólica. Doses acima de 0,5 mg/ kg eram bem

toleradas e esses pacientes relatavam um aumento da transpiração e calor.

Pacientes tratados com doses entre 5-10 mg/kg relatavam uma profunda sudorese,

mas sem evidências de aumento da temperatura corporal (Harper e cols., 2001).

Doses terapêuticas de DNP não afetavam a pressão sanguínea, nem tampouco a

freqüência cardíaca em pacientes normais em tratamento. A habilidade do DNP de

reduzir o peso sem a necessidade de uma dieta com restrição calórica causou o uso

indiscriminado desta droga para o tratamento da obesidade. Isso levou à ocorrência

de overdoses acidentais ou deliberadas, resultando no aparecimento de vários

casos de cataratas em pessoas que realizavam o tratamento, além da morte de

pacientes que utilizavam doses elevadas de DNP (Liao e Oehme, 1980; Harper e

cols., 2001).

1.7.2. Efeitos benéficos do DNP

A investigação dos processos de produção de espécies reativas de oxigênio

(EROs) tem bastante importância no estudo de várias doenças neurológicas, como

Alzheimer, Parkinson e Huntington, uma vez que essas espécies participam do dano

neuronal que ocorre nessas patologias. Um desacoplamento mitocondrial moderado,

com uma diminuição do gradiente eletroquímico, pode prevenir uma produção

excessiva de EROs e também o dano oxidativo em determinadas condições

patológicas. A mitocôndria é a maior produtora de EROs dentro da célula, tanto em

condições normais, quanto patológicas. A formação de EROs ocorre a partir da

redução monoeletrônica do oxigênio, gerando um íon ânion superóxido no lugar da

água na etapa final da fosforilação oxidativa. Esse superóxido, e outras espécies

reativas, estão presentes em concentrações aumentadas quando o gradiente

eletroquímico da membrana mitocondrial está alto (De Felice e Ferreira, 2006).

Tendo como foco seu efeito indutor de um desacoplamento moderado da

cadeia de transporte de elétrons, alguns trabalhos recentes têm descrito efeitos

neuroprotetores do DNP. Maragos e colaboradores (2003) demonstraram que o

DNP atua como agente neuroprotetor contra a toxicidade induzida por ácido

quinolínico no estriato de ratos adultos. Esse mesmo grupo demonstrou,

recentemente, que o DNP é capaz de proteger ratos contra injúria cerebral causada

por trauma (TBI – ―traumatic brain injury‖), promovendo uma redução significativa do

dano cerebral e também evitando o déficit cognitivo causado pela injúria (Pandya e

cols., 2007). Outra característica importante dos desacopladores é o efeito na

longevidade. A restrição calórica aumenta o tempo de vida numa variedade de

espécies, como leveduras, ratos e camundongos (Sohal e Weindruch, 1996;

Partridge e Gems, 2002; Roth e cols., 2004), e um dos efeitos centrais é promover

mudanças nas taxas da respiração mitocondrial, diminuindo a formação de EROs

(Barros e cols., 2004; Tahara e cols., 2007). Um recente trabalho demonstrou que o

DNP, em baixas doses, promove efeitos benéficos de restrição calórica, incluindo a

redução de estresse oxidativo, e que um desacoplamento moderado aumenta

significativamente o tempo de vida de camundongos (Caldeira da Silva e cols.,

2008).

A capacidade do DNP de aumentar os níveis de cAMP é uma importante

propriedade deste composto (Wasilewska-Sampaio e cols., 2005, De Felice e cols.,

2007). O cAMP é um sinalizador intracelular, que afeta várias vias de sinalização, e

que a estimulação ou modulação de vias dependentes de cAMP apresentam uma

possível aplicação terapêutica no tratamento de doenças neurodegenerativas, como

a doença de Alzheimer, Parkinson e Huntington e outras desordens caracterizadas

pela distrofia neurítica, morte neuronal, déficits em múltiplas funções neuronais e

cognitivas e, em alguns casos, na presença de agregados amilóides. Podemos

implicar, portanto, que compostos como o DNP, que, simultaneamente, são capazes

de atacar os agregados amilóides, fortalecer a rede neuronal e modular vias

dependentes de cAMP são possibilidades para o controle e tratamento de doenças

neurodegenerativas, como a DA.

2) OBJETIVOS

 Verificar os efeitos do 2,4-dinitrofenol na memória de ratos, utilizando animais

jovens (2-4 meses), de meia idade (10 meses) e idosos (18-24 meses),

realizando os testes de reconhecimento de objetos, labirinto aquático de Morris,

medo condicionado e campo aberto.

 Verificar os efeitos do 2,4 dinitrofenol na memória de camundongos, utilizando

animais jovens (2 meses) e de meia idade (8 meses), através de tarefas de

labirinto aquático de Morris e campo aberto.

 Verificar se o 2,4 dinitrofenol induz alterações nos níveis de proteínas

relacionadas à memória e à neuritogênese no hipocampo de ratos.

3) METODOLOGIA

Os testes comportamentais foram realizados no Centro de Memória, na PUC-

RS e no Laboratório de Doenças Neurodegenerativas, Instituto de Bioquímica

Médica, UFRJ.

Testes comportamentais

Animais: Foram utilizados ratos Wistar de faixas etárias diferentes: 2-4, 10 e

18-24 meses de idade, e camundongos BALB/C de 2 e 8 meses de idade. Os

animais foram divididos em dois grupos: um grupo controle, ao qual foi administrado

veículo, e outro grupo administrado com DNP. Foram utilizadas duas espécies

diferentes para analisar os efeitos do DNP, tendo em vista as diferenças

comportamentais apresentadas por cada uma delas. Os ratos são bons modelos de

aprendizado, enquanto camundongos BALB/C são considerados por vários

trabalhos da literatura como modelos pobres de aprendizado.

Drogas: Para os animais do grupo tratado, foram dadas injeções

intraperitoneais contendo DNP dissolvido em solução de hidróxido de sódio 0,007N

(pH final 9,2). No caso dos animais do grupo controle, estas injeções continham

apenas o veículo (hidróxido de sódio, 0,007N). O volume das injeções foi calculado

de acordo com o peso de cada animal, para que se alcançasse a dose de 5 mg

DNP/Kg (Maragos e cols. 2003). O período de tratamento foi de 14 ou 21 dias

consecutivos.

Manipulação dos animais: os animais foram manipulados por três dias

consecutivos antes da realização dos testes comportamentais. Todos os

procedimentos envolvendo animais foram analisados e aprovados pela Comissão de

Ética com Animais do CCS/UFRJ (CEUA-CCS; Protocolo # IBQM 020).

 3.1. Labirinto aquático de Morris

O labirinto aquático de Morris (LAM) é um teste estabelecido para avaliar a

memória espacial. É uma tarefa sensível a danos causados no hipocampo (Morris e

cols., 1982) e no fórnix (Devan e White, 1999; Pouzet e cols., 1999) e parece

também envolver outras partes do cérebro, como os córtices entorrinal e perirrinal,

mostrando resultados variáveis nas tarefas de navegação e aprendizado espacial

(Aggleton e cols., 2000).O LAM é uma tarefa que requer também uma boa atividade

motora e sensorial, sendo o desempenho afetado por variações emocionais e

motivacionais. É um teste em que o aprendizado é aversivamente motivado e vários

estudos já demonstraram que o comportamento do animal depende do seu estado

de estresse (Holscher, 1999).

O teste do LAM foi realizado numa piscina circular de cor preta, com 2 metros

de diâmetro (para camundongos, o diâmetro da piscina foi diminuído pela colocação

de um cilindro com 1 metro de diâmetro), dividida em quatro quadrantes imaginários.

A temperatura da água é mantida entre 23-25ºC. Uma plataforma de escape foi

colocada no centro de um dos quadrantes, 2 cm abaixo do nível da água, ficando,

desta forma, submersa e invisível. Durante o teste, os animais aprendem a

localização da plataforma utilizando pistas visuais, que estão fora da piscina (Figura

8). O teste é iniciado quando os animais são colocados dentro da piscina, virados

para a parede, a partir de quatro pontos cardeais diferentes (N, S, L e O) de maneira

semi-randômica. Os ratos foram submetidos a seis ou quatro tentativas por dia,

durante cinco dias consecutivos, período em que a plataforma permaneceu sempre

na mesma posição. Essa fase é denominada fase de aquisição, na qual o rato é

treinado para nadar e encontrar a plataforma submersa. O animal teve 60 segundos

para encontrar a plataforma e permanecer sobre ela durante 30 segundos. Esse

tempo de permanência é importante para que o animal explore o ambiente e faça o

reconhecimento das pistas visuais. Vinte e quatro horas após o último dia de testes,

o animal teve sua memória declarativa de longa duração avaliada no teste

comprobatório, verificando-se, assim, a consolidação da informação. O teste

comprobatório foi realizado depois da retirada da plataforma da piscina. Os animais

nadam durante 60 segundos e o tempo que cada animal permaneceu em cada

quadrante é contado. O tempo de permanência do quadrante alvo de ser igual ou

maior que 40% do tempo total de exploração.

Aprendizado reverso: após o teste comprobatório, os ratos foram submetidos

ao aprendizado reverso. A plataforma foi colocada num novo quadrante, oposto ao

anterior. Os animais foram colocados na piscina a partir dos mesmos pontos

cardeais (N, S, L e O) por oito tentativas seguidas, durante apenas um dia, tendo

novamente 60 segundos para encontrar a plataforma e ficar sobre ela durante 30

segundos. O teste comprobatório foi realizado 24 horas depois do treino.

Cronograma de injeções durante o treino reverso

Todo o procedimento do LAM e do aprendizado reverso foi filmado por uma

câmera digital, registrando os desempenhos dos animais e os testes

comprobatórios. Os resultados foram analisados estatisticamente (ANOVA de duas

vias seguida de teste Bonferonni).

Figura 8: Labirinto aquático de Morris (Centro de Memória, PUC-RS).

Cronograma de administração prolongada de DNP

 3.2. Reconhecimento de objetos

Os roedores possuem uma tendência natural a explorar novos objetos. Eles

exploram preferencialmente novos objetos a objetos já conhecidos, denominados

familiares. Esses animais tocam, cheiram e manipulam com suas patas dianteiras os

objetos, e esse comportamento pode ser facilmente quantificado e utilizado como

ferramenta de estudo da memória de reconhecimento. O teste de reconhecimento

de objetos (RO) é uma tarefa que mede o comportamento espontâneo do animal,

não requer o aprendizado espacial, deprivação de água ou comida e nem a

aplicação de um estímulo de reforço (comida ou choques, por exemplo). Da mesma

maneira, não requer treinamentos longos e não induz situações de estresse e nem

desafiadoras, permitindo sua aplicação em condições bem próximas daquelas em

que a memória de reconhecimento em humanos é medida (Dere e cols., 2007).

O teste de reconhecimento de objetos requer a recuperação de uma memória

relativa a uma prévia apresentação de objetos após um período de declínio da

retenção da memória (Prickaerts e cols., 2002). Essa tarefa é sensível tanto para a

verificação de modelos experimentais cognitivamente deficientes (Ennaceur e

Meliani, 1992; Puma e cols., 1998; Woolley e cols., 2003) quanto para modelos

cognitivamente aperfeiçoados (Ennaceur e cols., 1989; Puma e cols., 1998).

O teste de reconhecimento de objetos foi realizado em duas caixas

comportamentais medindo 50 cm x 50 cm x 39 cm. Três das quatro paredes e o

chão destas caixas eram de madeira revestida de fórmica branca e uma das

paredes era feita de vidro. O teste foi realizado num ambiente de penumbra (Figura

9). Somente ratos foram submetidos a esta tarefa. O teste de reconhecimento de

objetos foi dividido em três fases: habituação, treinamento e teste.

Habituação: os ratos foram habituados à caixa comportamental durante 4 dias

consecutivos, 20 minutos por dia, na ausência de objetos.

Treinamento: após os dias de habituação, os ratos foram colocados nas

caixas comportamentais contendo dois objetos idênticos fixados ao chão (a1 e a2).

Cada rato permaneceu 5 minutos na caixa e o tempo em que explorava cada objeto

foi medido. A exploração é medida segundo o contato direto do animal sobre o

objeto, com as patas ou com o focinho.

Teste: vinte e quatro horas após o treino, os ratos foram colocados na caixa

comportamental contendo um objeto familiar (a1) e um objeto novo (B), ambos

fixados ao chão. Eles permaneceram na caixa durante 5 minutos, ao longo dos quais

o tempo que cada animal passou explorando cada objeto foi medido. Em seguida, o

Índice de descriminação é calculado de acordo com a fórmula: d2 = (B−a)/e2, onde:

B representa o tempo pelo qual o objeto B foi explorado (objeto novo),

a representa o tempo pelo qual o objeto a foi explorado (objeto familiar),

e2 representa o somatório do tempo de exploração de A e B.

As caixas foram limpas com álcool 70% entre a retirada de um rato e a

colocação de outro para que se assegurasse a ausência de estímulos olfatórios.

Após o fim dos testes, os resultados foram analisados estatisticamente (Teste t

student).

Figura 9: Paradigma reconhecimento de objetos (Centro de memória, PUC-

RS).

 3.3. Medo Condicionado

O medo parece produzir um complexo padrão de respostas altamente

correlacionadas. Dentre elas, destacam-se a interrupção do comportamento motor,

dilatação da pupila, alteração da freqüência cardíaca, hipersensibilidade a estímulos

sensoriais, aumento da vigilância e atenção, dentre outras. Apesar desta

complexidade, o medo pode ser medido facilmente no laboratório. Durante a fase de

aquisição do medo condicionado, um estímulo neutro é pareado a um estímulo

aversivo, tornado-se assim um estímulo condicionado. Durante a fase de evocação,

o estímulo condicionado (que era inicialmente neutro) é apresentado sozinho,

passando a apresentar respostas condicionadas de medo, similares àquelas

produzidas pelo estímulo aversivo. O congelamento é uma das respostas mais

comuns produzidas por ratos e camundongos. O teste do medo condicionado avalia

uma importante característica cognitiva do circuito hipocampo-amígdala: a memória

emocional. O rato foi colocado na caixa comportamental (Figura 10) e o contexto

apresentado a ele por 3 minutos. O chão dessa caixa é formado por barras de metal

e, após o tempo de exploração, o rato recebeu choques de 0,8 miliamperes de

intensidade, por 2 segundos. Foram dados três choques, com intervalos de 30

segundos entre eles. Após dois minutos, o animal foi retirado da caixa. Desta

maneira, o rato forma uma importante relação entre a caixa e o estímulo. O rato

contextualiza o ambiente apresentado com o choque, algo desagradável. Vinte e

quatro horas após o treinamento foi realizada uma avaliação do seu comportamento.

O rato foi colocado novamente na caixa e o estado de congelamento medido por

cinco minutos.

Figura 10: Aparato do medo condicionado (Centro de Memória, PUC-RS)

 3.4. Teste do campo aberto

Para analisar as atividades exploratória e locomotora, os animais foram

submetidos ao teste do campo aberto. A caixa comportamental foi a mesma utilizada

no teste RO. O piso da caixa foi dividido em 12 quadrantes e os ratos colocados na

caixa por cinco minutos, para explorar o ambiente livremente. O número de vezes

que os animais cruzam os quadrantes (cruzamentos) e que levantam o corpo

ficando apoiado somente nas patas traseiras (levantamentos, ou ―rearings‖, em

ingles) é contado, indicando suas atividades locomotora e exploratória,

respectivamente. Quando esse procedimento é feito por dois dias seguidos, avalia-

se a memória de habituação.

Figura 11: Campo aberto (Centro de memória, PUC-RS).

Cruzamentos

Levantamentos

Análises Bioquímicas

 3.5. “Western Blotting”

Os animais foram sacrificados 24 horas após o último dia de teste. A cabeça

foi cortada com a utilização de uma guilhotina e o encéfalo retirado da caixa

craniana. Os passos seguintes do procedimento foram realizados sobre uma placa

de Petri mantida no gelo. Os hemisférios cerebrais foram separados e os

hipocampos dissecados e rapidamente congelados em nitrogênio líquido. Em

seguida, após a dissecção dos hipocampos de todos os animais, foi realizada a

homogeneização em tampão de amostra. O tampão é constituído por Tris-HCl 100

mM, pH 7,5, SDS 1%, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, pirofosfato de sódio 20 mM,

fluoreto de sódio 20 mM, ortovanadato de sódio 1 mM e um coquetel de inibidores

de protease.

A quantidade de proteína total presente em cada amostra foi dosada pelo

método de BCA. Para a separação por SDS-PAGE, aplicaram-se 80 µg de proteína

em cada poço, em géis de gradiente de 4 a 10% de poliacrilamida. A

eletrotransferência das proteínas para uma membrana de nitrocelulose foi realizada

segundo o método de Towbin. Em seguida, foi realizado o bloqueio por 16 horas das

membranas, usando solução composta por BSA 5% em TBS-T (Tris-HCl 10 mM, pH

7,2, NaCl 150 mM, Tween 20 0,1%). Em seguida, foi feita a incubação por 16 horas

a 4 °C com os anticorpos primários (anti-pCREB, origem camundongo, 1:1000; anti-

CREB, origem coelho, 1:2000; anti-pERK, 1:1000; anti-PSD-95, origem coelho,

1:2000; anti-MAP2, origem camundongo 1:1000 e anti-sinaptofisina, origem cabra,

1:1000, todas de Santa Cruz, Califórnia, EUA e anti-tau, coelho, 1:5000, Dako,

Glostrup, Dinamarca) e com anticorpo primário do controle de carregamento de

proteínas (anti-ciclofilina B, origem coelho, 1:10000, Zymed, San Francisco, EUA),

diluídos na solução de bloqueio. Em seguida, as membranas foram lavadas com

TBS-T e incubadas com anticorpos secundários conjugados à peroxidase (anti-IgG

de camundongo, anti-IgG de coelho ou anti-IgG de cabra) por duas horas. As

membranas foram reveladas com um kit quimioluminescente ―SuperSignal West

Femto‖, e a luminescência foi capturada em um filme fotográfico T- mat Kodak . As

bandas reveladas foram, então, digitalizadas e as intensidades das bandas de

proteína foram quantificadas utilizando o programa ―Image J‖ (NIH; versão para

Windows).

 3.5. Análise estatística

Os dados são apresentados como média ± erro padrão. Para análise dos

resultados apresentados no LAM, foi utilizado o programa ―sigma plot‖, versão 3.1,

análise de variância (ANOVA) de duas vias, seguida pelo teste de Bonferonni. O

teste de RO e as intensidades das bandas foram analisadas pelo programa Excel,

versão 2007, teste ―T-student‖.

4) RESULTADOS

 4.1. Efeitos do DNP no desempenho cognitivo de ratos adultos jovens

Inicialmente, avaliamos o desempenho de ratos adultos jovens (de 2-4 meses

de idade) através do teste do labirinto aquático de Morris (LAM). Como descrito

anteriormente, o LAM é um teste que avalia memória hipocampal espacial (item 3.1).

Esse teste foi realizado com um treinamento de 4 tentativas diárias. Como mostra a

Figura 12A, os dois grupos (controle e tratado com DNP) adquiriram a informação

da localização da plataforma, apresentando desempenhos parecidos durante os

cinco dias de treinamento. Porém, no teste comprobatório, realizado 24 horas após o

quinto dia de treino, os dois grupos apresentaram tempos de permanência no

quadrante alvo menor que 40% do tempo total (Figura 12B). Isso indica que nem o

grupo tratado com DNP nem o grupo controle aprendeu efetivamente a localização

da plataforma, na medida em que os grupos não conseguiram reter esta informação

por um período de 24 horas pós-treino.

O paradigma de reconhecimento de objetos também foi feito em ratos adultos

jovens (2 meses de idade, administrados por 14 dias consecutivos). Quando

realizado com dois objetos idênticos (a1 e a2) durante a fase de treinamento e com

um intervalo entre o treino e o teste maior que 4 horas, o teste de RO tem como

finalidade avaliar possíveis efeitos de melhora da memória, pois neste protocolo

animais controle não aprendem a tarefa (Prickaerts e cols., 2004, 2005). Desta

forma, a possível ação de um determinado composto na melhora da memória

poderá ser bem determinada. Como podemos verificar na Figura 13A, ambos os

grupos exploraram os dois objetos durante o mesmo tempo (aproximadamente 50%

do tempo total cada objeto a1 e a2) durante a fase de treino. Vinte e quatro após, no

dia do teste, um dos objetos familiares é trocado por um objeto novo (a1 é mantido e

a2 trocado por b). Podemos observar que os dois grupos exploram igualmente os

dois objetos familiar e novo, demonstrando que o tratamento com DNP não afeta a

memória de reconhecimento de ratos de 2 meses.

Os resultados obtidos no teste de RO também podem ser avaliados através

da análise do índice de reconhecimento ou discriminação (d2). O índice d2 é

calculado a partir do tempo de exploração dos objetos, como descrito em

―Metodologia‖. Um índice d2 próximo a zero indica que o animal não aprendeu a

tarefa (ou seja, ele não é capaz de discriminar entre o objeto novo e o familiar). Por

outro lado, um índice d2 maior do que zero indica que o animal aprendeu a tarefa.

Podemos observar que o índice de reconhecimento d2 dos animais controle e

tratados com DNP foi bem próximo a zero, demonstrando que o DNP não afeta a

memória de reconhecimento de ratos de 2 meses de idade (Figura 13B)

Figura 12: Teste do Labirinto aquático de Morris realizado com ratos de 4 meses de

idade. Essa tarefa foi realizada com apenas 4 tentativas diárias na fase de

treinamento. (A) Curvas de desempenho dos grupos tratado (n = 10) e controle (n =

10). Os símbolos representam médias ± erro-padrão dos tempos de latência de

escape para a plataforma. (B) Teste comprobatório realizado 24 horas após o último

dia de treino na ausência da plataforma. As barras representam médias ± erro-

padrão das percentagens do tempo total de teste em que os animais permanecem

no quadrante-alvo, em que originalmente se encontrava a plataforma.

Figura 13: Falta de efeito do DNP na tarefa do reconhecimento de objetos em ratos

de 2 meses (A) Média (± erro padrão) do tempo de exploração dos objetos idênticos

(a1 e a2) durante o dia do treino e durante o dia do teste (a1 e b, objetos diferentes).

(B) Índice de discriminação (d2) representado como a média ± erro padrão. DNP n =

14; controle n = 17.

Nos testes descritos acima, a administração intraperitoneal de DNP foi

interrompida antes do início da realização dos testes, ou seja, foi realizada durante

14 dias prévios aos testes (conforme descrito em Metodologia). Com a finalidade de

verificar os possíveis efeitos da administração um pouco mais prolongada de DNP,

ratos de 2 meses de idade receberam administração intraperitoneal de DNP ou

veículo durante 21 dias consecutivos, sendo o teste do LAM iniciado no 15° dia de

administração. Os ratos foram treinados por cinco dias consecutivos, por seis

tentativas diárias. Mesmo com o tratamento mais prolongado com DNP, observamos

que ratos controle e ratos tratados com DNP apresentaram o mesmo desempenho

no LAM (Figura 14A), e o tempo de permanência no quadrante alvo foi bem próximo

a 40 % do tempo total (Figura 14B). Esses resultados indicam que a administração

prolongada de DNP não afeta a memória de ratos de 2 meses de idade.

Em seguida, foi feito o teste do aprendizado reverso, no qual ambos os

grupos apresentaram um bom desempenho durante o treinamento (como indicado

pelo fato de que os animais adquiriram a informação da nova localização da

plataforma já na segunda saída; Figura 15A). Porém, não consolidaram a

informação da nova localização da plataforma (como indicado pela observação de

que no teste comprobatório nenhum dos dois grupos apresenta preferência pelo

quadrante reverso; Figura 15B). Esses resultados indicam que nenhum dos dois

grupos aprendeu a nova localização da plataforma no aprendizado reverso.

Figura 14: A administração mais prolongada de DNP não altera o aprendizado de

ratos no LAM. (A) Labirinto aquático de Morris realizado com ratos de 2 meses de

idade que receberam (n = 8) ou não (n = 8) a administração de DNP por 21 dias. Os

testes foram iniciados no 15° dia de administração. Os símbolos representam medias

± erro-padrão dos tempos de latência de escape para a plataforma. (B) Teste

comprobatório realizado 24 horas após a última sessão de treinamento. As barras

representam medias ± erro-padrão das percentagens do tempo total de teste em que

os animais permanecem no quadrante-alvo, em que originalmente se encontrava a

plataforma.

Figura 15: Aprendizado reverso de ratos de 2 meses de idade após administração

prolongada de DNP. (A) Curva de aprendizado dos grupos tratado (n = 8) e controle

(n = 8). (B) Teste comprobatório realizado 24 horas após o aprendizado. As barras

representam médias ± erro-padrão das percentagens do tempo total de teste em que

os animais permanecem no quadrante-alvo, em que originalmente se encontrava a

plataforma, ou no quadrante oposto (reverso).

4.2. Efeitos do DNP no desempenho cognitivo de ratos de meia idade

Em seguida, avaliamos o desempenho de ratos de 10 meses de idade que

receberam administração intraperitonial de DNP por 14 dias. Para analisar a

cognição desses animais, inicialmente realizamos testes com o LAM. Por se tratar

de um grupo de animais um pouco mais velho do que os jovens adultos utilizados

nos testes descritos na seção acima, esse teste foi realizado com um treinamento de

6 tentativas diárias. Observamos que tanto o grupo de ratos controle quanto o grupo

tratado com DNP adquiriram de forma semelhante a informação sobre a localização

da plataforma ao longo dos dias de treinamento (Figura 16A). No quinto dia de

treino, pela primeira vez, detectamos uma diferença estatisticamente significativa,

embora pequena, nos tempos de latência de escape entre os grupos DNP e

controle. Embora um efeito bastante modesto, esse foi um primeiro indício de que o

DNP poderia estar tendo um efeito benéfico no aprendizado de ratos de meia idade.

Em seguida, verificamos através do teste comprobatório que o grupo tratado com

DNP de fato passava mais tempo do que o grupo controle no quadrante alvo, em

que a plataforma estava originalmente localizada (p < 0,03) (Figura 16B). Esses

resultados sugerem que o tratamento com DNP melhora a consolidação da memória

em ratos de 10 meses de idade.

Figura 16: DNP melhora o desempenho e a memória de ratos de 10 meses de idade

no Labirinto aquático de Morris. (A) Curva de desempenho durante cinco dias de

treinamento. Os resultados estão representados como a média (± erro padrão) dos

tempos de latências de escape até a plataforma submersa das seis tentativas

realizadas em cada dia de treino para os animais da cada grupo. (B) Resultado do

teste comprobatório. As barras representam a média (± erro padrão) do percentual

do tempo total gasto no quadrante alvo. *Indica uma diferença estatisticamente

significativa (p < 0,03; Anova de duas vias seguida de teste Bonferonni). DNP n=16,

controle n=16

Em seguida, realizamos o treinamento do aprendizado reverso. Como

podemos verificar na Figura 17A, todos os ratos já apresentam tempos de latência

de escape bem baixos na segunda tentativa, adquirindo rapidamente a informação

sobre a nova localização da plataforma. Assim, observamos que os desempenhos

dos ratos tratados com DNP e dos ratos do grupo controle foram bem semelhantes.

O teste comprobatório foi realizado 24 horas após o treino do aprendizado reverso.

Neste teste, nenhum dos dois grupos permaneceu por pelo menos 40% do tempo

total no quadrante alvo, o que seria esperado de animais que aprenderam a

localização da plataforma (Bekinschtein e cols., 2007, Rossato e cols., 2006, Bonini

e cols., 2006; Ruiz-Opaz e cols., 2004). Como nem os ratos controle nem os ratos

tratados com DNP atingiram o tempo necessário de permanência no quadrante,

esses resultados indicaram que nenhum dos dois grupos aprendeu a nova

localização da plataforma (Figura 17B).

Como os resultados obtidos no teste do LAM indicavam que o DNP causava

uma melhora na memória de ratos de meia idade, fomos investigar, a seguir, os

efeitos do DNP utilizando outro paradigma, com o objetivo de verificar a melhora da

memória de longa duração. O teste escolhido foi o de reconhecimento de objetos

(RO).

Figura 17: DNP não altera o comportamento de ratos de 10 meses de idade no

aprendizado reverso. (A) Curva de desempenho do aprendizado reverso.

Representação da média (± erro padrão) dos tempos de latência até a plataforma no

quadrante reverso. (B) Teste comprobatório do aprendizado reverso realizado 24

horas após o treino. As barras representam a média (± erro padrão) do percentual do

tempo total gasto em cada quadrante. Alvo - quadrante alvo, Reverso - quadrante

reverso, Adj1 - quadrante adjacente 1 ao quadrante alvo, Adj2 - quadrante adjacente

2 ao quadrante alvo.

Resultados iniciais obtidos durante a fase de treino com o teste de RO

mostraram que ratos de 10 meses que receberam administração intraperitoneal de

DNP por 14 dias e ratos controle exploram do mesmo modo os objetos iguais (a1 e

a2) (Figura 18A) No dia do teste, quando um dos objetos familiares é trocado por

outro novo (a1 é mantido e a2 substituído por b), observamos que os animais

tratados com DNP exploram por mais tempo o objeto novo (65% do tempo total

explorando o objeto novo e 35% o objeto familiar), enquanto que o grupo controle

não apresenta esse comportamento, explorando igualmente os dois objetos (46% e

54% do tempo total de exploração gastos explorando os objetos a1 e b,

respectivamente) (Figura 18A).

Os animais tratados com DNP apresentaram um maior índice d2 quando

comparados com o grupo controle (Figura 18B). Animais controle, que não

aprenderam a tarefa, apresentaram um índice médio d2 = 0,089. Já no grupo de

animais tratados com DNP, o valor médio do índice encontrado foi d2 = 0,3, sendo a

diferença entre os grupos estatisticamente significativa (p<0,01, teste t de Student)

(Figura 18B). Portanto, podemos concluir que o DNP, quando administrado

intraperitonealmente durante 14 dias consecutivos, melhora a memória de

reconhecimento em ratos de 10 meses de idade.

Figura 18: DNP melhora a memória de reconhecimento de objetos em ratos de 10

meses de idade. (A) Os ratos foram apresentados a dois objetos idênticos (a1 e a2)

durante cinco minutos no dia 1 (treino). No dia 2 (teste), os ratos foram expostos a

um objeto familiar (a1) e a um novo objeto (b). Os resultados são apresentados

como a média (± erro padrão) do percentual do tempo de exploração de cada objeto

sobre o tempo total de exploração. * Indica uma diferença estatisticamente

significativa (p < 0,001; Teste t de Student). (B) Índice de discriminação (d2) entre o

objeto novo e o objeto familiar. ** Indica diferença estatisticamente significativa (p <

0,02; Teste t de Student). DNP n = 14; controle n = 14.

Dando continuidade à nossa investigação, realizamos, em seguida, o teste de

medo condicionado (MC), que avalia uma forma de aprendizado que envolve uma

relação emocional. Normalmente, o tempo que um animal permanece paralisado

neste tipo de paradigma é de aproximadamente 70-80% do tempo total do teste

(Abrari e cols., 2008; Bekinschtein e cols., 2007). Como podemos verificar, os ratos

controle ficam 75,7% do tempo em estado congelado e os tratados com DNP 82,9%.

Esses valores não são estatisticamente diferentes. Assim, nossos resultados

indicam que o DNP não interferiu no tempo em que o animal permaneceu

congelado, demonstrando que o tratamento não afeta o condicionamento provocado

pelo medo (Figura 19).

Figura 19: DNP não interfere no aprendizado do Teste do Medo Condicionado.

Ratos de 10 meses de idade controle (n = 10) e tratados com DNP (n = 10) por 14

dias consecutivos foram submetidos ao teste do medo condicionado (como descrito

em ―Metodologias‖). As barras indicam a média (± erro padrão) do percentual do

tempo de congelamento.

 4.3. Efeitos do DNP no desempenho cognitivo de ratos idosos

Após observarmos que o DNP melhora a memória de ratos de meia idade, o

nosso próximo objetivo foi o de investigar se o DNP também teria um efeito benéfico

em ratos idosos (18 a 24 meses) Alguns trabalhos prévios já demonstraram que

ratos idosos apresentam déficit no aprendizado espacial e, com o avanço da idade,

várias espécies de roedores apresentam dificuldades de aprendizado em

determinadas tarefas comportamentais (Ruiz-Opaz e cols., 2004; Scali e cols.,

1997). Inicialmente, observamos o desempenho desses animais no LAM. Conforme

podemos observar na Figura 20A, ratos controle e ratos tratados com DNP

apresentaram o mesmo desempenho durante a fase de treinamento no LAM.

Durante o teste comprobatório, porém, verificamos que o grupo tratado com DNP

não aprendeu a localização da plataforma, pois permaneceu somente 25% do tempo

no quadrante alvo, enquanto que o grupo controle permaneceu, em média, 40% do

tempo total no quadrante alvo neste teste (Figura 20B). Isso indica que os animais

idosos tratados com DNP apresentaram um déficit na consolidação da memória.

Durante o treinamento no teste de aprendizado reverso (Figura 21A), ambos

os grupos apresentam um desempenho parecido. Podemos verificar pela

semelhança encontrada entre as duas curvas de aquisição. Entretanto, nenhum dos

dois grupos permaneceu tempo suficiente (aproximadamente 40 % do tempo total)

no quadrante reverso no teste comprobatório (Figura 21B). Assim, o teste de

aprendizado reverso indicou que animais controle e tratados com DNP não foram

capazes de aprender a nova localização da plataforma.

Figura 20: DNP provoca déficit de memória em ratos de 18-24 meses no Labirinto

aquático de Morris. (A) Curva de desempenho dos grupos tratado com DNP (n = 9) e

controle (n = 9), representando a média (± erro padrão) dos tempos de latência de

escape até a plataforma. (B) Teste comprobatório realizado 24 horas após a última

sessão de treino. As barras representam a média (± erro padrão) do tempo gasto

pelos animais no quadrante alvo. (* representa diferença estatisticamente

significativa, p < 0,05).

Figura 21: Aprendizado reverso de ratos de 18-24 meses. (A) Curva de

desempenho do aprendizado reverso. Representação da média (± erro padrão) dos

tempos de latência até a plataforma no quadrante reverso. (B) Teste comprobatório

do aprendizado reverso realizado 24 horas após o treino. As barras representam a

média (± erro padrão) do percentual do tempo total gasto em cada quadrante. Alvo -

quadrante alvo, Reverso - quadrante reverso, Adj1 - quadrante adjacente 1 ao

quadrante alvo, Adj2 - quadrante adjacente 2 ao quadrante alvo.

Em seguida, avaliamos a memória dos ratos idosos (com idade entre 18 e 24

meses) através do teste de RO. Conforme discutido no tópico 4.1, animais controle

não retêm a informação após um período de 24 horas e, durante a fase de teste,

exploram igualmente os objetos novo e familiar. A Figura 22A mostra que tanto

animais controle quanto animais tratados com DNP exploraram durante o mesmo

tempo os objetos iguais a1 e a2 durante a fase de treino. Na fase de teste, onde

objeto familiar (a1) é confrontado com objeto novo (b), ambos os grupos também

exploraram o objeto novo e o objeto familiar durante aproximadamente o mesmo

tempo, demonstrando que não aprenderam a tarefa. Isso pode ser confirmado pela

determinação do índice de discriminação d2, já que os valores médios encontrados

para ambos os grupos foram bem próximos de zero (Figura 22B). Esses resultados

indicam que animais idosos tratados com DNP não apresentam uma melhora no

aprendizado do teste do RO.

Figura 22: Falta de efeito do DNP na tarefa do reconhecimento de objetos em ratos

de 18-24 meses. (A) Média (± erro padrão) do tempo de exploração dos objetos

idênticos (a1 e a2) durante o dia do treino e durante o dia do teste (a1 e b, objetos

diferentes). (B) Índice de discriminação (d2) representado como a média ± erro

padrão. DNP n = 9; controle n = 9.

 4.4. Efeitos do DNP no desempenho cognitivo de camundongos de meia

idade

Conjuntamente, os dados obtidos acima indicavam que o DNP é capaz de

melhorar apenas a memória de ratos de meia idade. A nossa próxima etapa foi

avaliar os efeitos do DNP em roedores de meia idade de outra espécie. Para isso,

utilizamos camundongos BALB/C de 8 meses de idade. Normalmente, esse não é

um modelo escolhido para testes de memória e alguns artigos descrevem esses

animais como modelos pobres de aprendizado (Buchanan e cols., 2008; Brown e

Wong, 2007). Justamente por esse motivo, entretanto, foi este o modelo escolhido

em nosso trabalho para verificarmos possíveis efeitos benéficos do DNP na

memória. Durante 14 dias seguidos, camundongos BALB/C de 8 meses de idade

receberam injeções IP de 5 mg/kg de DNP. Os animais não receberam injeções

adicionais de DNP durante o teste. A Figura 23A mostra o perfil comportamental de

camundongos controle, com uma curva típica de animais que não apresentam boa

aquisição da informação da localização da plataforma. Por outro lado, camundongos

que receberam DNP apresentaram tempos de latência bem menores do que os

camundongos controle, sendo capazes de adquirir a localização da plataforma

(Figura 23 A) No teste comprobatório observamos que os animais tratados com

DNP passaram significativamente mais tempo do que os animais controle

procurando a plataforma no quadrante correto (Figura 23B). Esses resultados

indicam que, assim como observado em ratos de meia idade, o tratamento com DNP

leva à melhora no aprendizado de camundongos BALB/C de meia idade.

0 1 2 3 4 5

Controle

DNP

Latência de escape (s)

Dias de treinamento

Figura 23: DNP melhora a memória de camundongos BALB/C de 8 meses de idade

testados no labirinto aquático de Morris. (A) Curva de desempenho dos animais

tratados com DNP (n = 15) e controle (n = 14). Representação da média (± erro

padrão) dos tempos de latência até a plataforma no quadrante reverso (*) Indica

diferença estatisticamente significativa (p < 0,001). (B) Teste comprobatório realizado

24 após o último dia de treino. As barras representam a média (± erro padrão) do

percentual do tempo total gasto no quadrante alvo. (**) Indica diferença

estatisticamente significativa (p < 0,01).

Controle

DNP

 4.5. Efeitos do DNP nas atividades locomotora e exploratória de ratos e

camundongos de diferentes idades.

Com a finalidade de analisar as atividades locomotora e exploratória de ratos

e camundongos BALB/C de diferentes idades utilizados nos testes descritos

anteriormente, contabilizamos os números de cruzamentos (―crossings‖) e

levantamentos (―rearings‖) realizados por aqueles animais durante o teste do campo

aberto. A Tabela 1 mostra que não há diferenças significativas neste teste entre os

grupos controle e tratados dentro de uma mesma faixa etária. Ratos adultos jovens

de 4 meses de idade e ratos de 10 meses de idade apresentaram número de

cruzamentos e levantamentos bem parecido, o que pode ser igualmente comparado

entre os grupos tratado com DNP e controle. Conforme alguns trabalhos da literatura

(Ruiz-Opazo e cols., 2004; Scali e cols., 1997), animais mais velhos, com idade

variando entre 18 e 24 meses, apresentam um menor número de cruzamentos do

que os animais mais jovens. Porém, não observamos diferença no número de

cruzamentos entre os nossos dois grupos experimentais. Embora apresentando um

menor número de cruzamentos, o número de levantamentos realizados pelos ratos

mais velhos é bem semelhante ao dos animais mais jovens, indicando que o

comportamento exploratório não foi alterado pelo envelhecimento. Da mesma forma

que com os cruzamentos, não houve diferença entre os grupos experimentais após

o tratamento.

Tabela 1: DNP não altera as atividades exploratória e locomotora de ratos e

camundongos de diferentes idades.

Cruzamentos

Levantamentos

Controle

DNP

Controle

DNP

Ratos de 4

meses

38,9 ± 6,0

(n =10)

43,9 ± 6,8

(n =10)

16,1 ± 2,5

17,0 ± 2,6

Ratos de 10

meses

44,3 ± 8,6

(n = 8)

41,6 ± 6,7

(n = 8)

19,7 ± 3

24,7 ± 4

Ratos de 18-24

meses

23,7 ± 4,7

(n = 8)

26,4 ± 4,6

(n = 8)

14,3 ± 2,5

13,7 ± 1,9

Camundongos

2 meses

159,1 ± 28

(n = 10)

171,1 ± 17

(n= 10)

27 ± 4,8

25,3 ± 3,6

Camundongos

8 meses

101,1 ± 10,6

(n = 14)

94,7 ± 11,6

(n = 15)

24,7 ± 3,7

33,0 ± 4,8

Os animais são colocados numa caixa de 50 cm x 50 cm x 39 cm para realização do

teste de campo aberto (veja ―Metodologia‖). O número de cruzamentos (―crossings‖)

e o número de levantamentos (―rearings‖) foram contados por 5 minutos (± erro

padrão).

Conjuntamente, esses resultados demonstraram que o tratamento com DNP

não interfere nas atividades locomotora e exploratória de ratos ou camundongos

BALB/C de diferentes idades. Este era um controle experimental importante para

que pudéssemos nos assegurar de que os resultados obtidos com DNP nos testes

de memória de fato refletissem alterações no aprendizado e não meramente na

capacidade exploratória ou na movimentação dos animais. Em seguida, buscamos

informações sobre a memória de habituação, outra informação que pode ser obtida

através do teste de campo aberto. A análise desse tipo de memória pode ser

realizada quando o animal é colocado na caixa de comportamento por dois dias

seguidos. O primeiro dia funciona como um dia de treino, enquanto o segundo

funciona como um dia de teste. É natural que o animal explore menos a caixa, uma

vez que o contexto já foi apresentado. Quanto maior o numero de dias de exposição

à caixa, menor o número de cruzamentos e levantamentos que o animal irá realizar.

Ratos com 10 meses de idade submetidos ao campo aberto por dois dias seguidos

apresentaram um menor número de cruzamentos (Figura 24A) e levantamentos

(Figura 24B) no dia de teste do que no dia de treino (*p < 0,04). Ratos de 2 meses e

18-24 meses também habituam ao teste do campo aberto e o tratamento com DNP

não afeta esse perfil (dados não mostrados). Esses resultados demonstram que os

ratos se habituam ao ambiente e exploram menos a caixa, sugerindo que o

tratamento com DNP não afeta a memória de habituação desses animais.

Por outro lado, camundongos BALB/C com 8 meses não apresentam esse

perfil comportamental. No dia de teste, tanto o número de cruzamentos (Figura 24C)

como o de levantamentos (Figura 24D) são bem similares àqueles encontrados no

dia do treino, demonstrando que os camundongos não apresentam memória de

habituação nessas condições. O tratamento com DNP não afetou o desempenho de

camundongos no campo aberto e nem na memória de habituação. Dados similares

foram encontrados em camundongos de 2 meses submetidos ao campo aberto por

dois dias seguidos, onde o tratamento com DNP não afetou a memória de

habituação e nem o número de levantamentos e o de cruzamentos (dados não

mostrados).

Figura 24: DNP não afeta atividades locomotora e exploratória de ratos de 10 meses

(A e B) e camundongos de 8 meses (C e D) e nem a memória de habituação. As

barras representam médias (± erro padrão) do número de cruzamentos e

levantamentos realizados no teste de campo aberto durante o treino (barras cinza) e

durante o teste (barras negras). (*) Indica diferença estatisticamente significativa (p <

0,04).

Análise Bioquímica

 4.6. Efeitos do DNP nos níveis das proteínas tau, pCREB, pERK e MAP2 no

hipocampo de ratos

Como havíamos observado que o DNP melhora a cognição em ratos de meia

idade, o próximo passo de nosso projeto consistiu na análise dos níveis de algumas

proteínas já conhecidamente envolvidas com os processos de formação da memória

e também de outras proteínas que apresentam uma possível relação com esses

processos. Para isto, realizamos imunoblottings com extratos dos hipocampos dos

ratos de meia idade que foram submetidos aos testes comportamentais. De maneira

interessante, observamos que os hipocampos de ratos tratados com DNP

apresentaram níveis da proteína tau mais elevados do que os hipocampos de

animais controle (Figura 25A). O nosso grupo mostrou recentemente que o

tratamento com DNP aumenta os níveis da proteína tau em culturas primárias de

neurônios de hipocampo e córtex cerebral de ratos embrionários (Wasilewska-

Sampaio e cols., 2005) e foi importante fazermos essa correlação com os nossos

novos dados in vivo. Adicionalmente, investigamos os níveis de MAP2, outra

proteína associada a microtúbulos. Os níveis de MAP2 também se encontraram

aumentados nos hipocampos dos ratos de meia idade que receberam tratamento

com DNP (Figura 25B) Esses resultados sugerem que um dos mecanismos pelos

quais o DNP melhora a memória dos ratos de meia idade possa envolver o aumento

dos níveis de proteínas do citoesqueleto, resultando em um possível efeito

estimulador do crescimento e arborização dendríticos.

Figura 25: Efeitos do DNP nos níveis das proteínas tau (A) e MAP2 (B) em ratos de

10 meses de idade. Cada ponto do gráfico representa, para cada animal

experimental, a quantificação da intensidade da banda da proteína de interesse

normalizada pela intensidade do controle de carregamento (ciclo B). As barras

horizontais representam as médias das intensidades. ―Western blotting‖

representativo para tau (A) e para MAP2 (B).

Em seguida, investigamos os níveis de proteínas envolvidas em processos

relacionados à formação de memória. O possível impacto do DNP nos níveis da

forma fosforilada do fator CREB foi inicialmente investigado. Como podemos verificar

na Figura 26A, os níveis de pCREB nos extratos dos hipocampos dos animais

tratados com DNP foram maiores que no grupo controle, embora os níveis de CREB

total não tenham sido alterados pelo tratamento com DNP (Figura 26B). Esse

resultado nos indica que o tratamento com DNP modula a sinalização que envolve

fosforilação de CREB, um processo reconhecidamente importante nas etapas da

formação da memória.

A proteína ERK na sua forma fosforilada também está relacionada com

processos de formação da memória. Assim, resolvemos também investigar os níveis

de pERK no hipocampo dos animais. Conforme mostrado na Figura 27, os extratos

dos hipocampos dos ratos tratados com DNP apresentaram níveis aumentados de

pERK quando comparados com ratos controle. Em conjunto, esses resultados

indicam que o DNP aumenta in vivo os níveis de proteínas importantes para os

processos de formação da memória.

Em seguida, estendemos os nossos estudos e avaliamos os níveis das

proteínas sinaptofisina, NeuN e PSD95 nos hipocampos de ratos de meia idade

controle e tratados com DNP. Não observamos diferenças nos níveis totais dessas

proteínas nos dois grupos experimentais (Figuras 28 e 29, respectivamente).

Esses resultados indicam que o tratamento com DNP não afete os níveis de

proteínas relacionadas à formação de sinapses. O fato de não observarmos

aumento de todas as proteínas analisadas é um indício de que os efeitos do DNP

não são inespecíficos.

Figura 26: Efeitos do DNP nos níveis de pCREB (A) e CREB (B) em ratos de 10

meses de idade. Cada ponto do gráfico representa, para cada animal experimental,

a quantificação da intensidade de cada banda normalizada pelo controle de

carregamento (ciclo B). As barras horizontais representam as médias das

intensidades. ―Western blotting‖ representativo para pCREB (A) e para CREB total

(B).

Figura 27: Efeitos do DNP nos níveis de pERK em ratos de 10 meses de idade que

foram submetidos aos testes de RO e LAM. Cada ponto do gráfico representa, para

cada animal experimental, a quantificação da intensidade de cada banda

normalizada pelo controle de carregamento (ciclo B). As barras horizontais

representam as médias das intensidades. ―Western blotting‖ representativo para

pERK.

Figura 28: Ausência de efeitos do DNP nos níveis das proteínas Sinaptofisina (A) e

NeuN (B) em ratos de 10 meses de idade que foram submetidos aos testes de RO e

LAM. Cada ponto do gráfico representa, para cada animal, a quantificação da

intensidade de cada banda normalizada pelo controle de carregamento (ciclo B). As

barras horizontais representam as médias das intensidades. ―Western blotting‖

representativo para sinaptofisina.

Figura 29: Ausência de efeitos do DNP nos níveis da proteína PSD95 em ratos de

10 meses de idade. Cada ponto do gráfico representa, para cada animal

experimental, a quantificação da intensidade da banda da proteína de interesse

normalizada pela intensidade do controle de carregamento (ciclo B). As barras

horizontais representam as médias das intensidades. ―Western blotting‖

representativo para PSD95.

DISCUSSÃO

Os resultados apresentados nesta tese demonstraram que o DNP promove

melhora da memória de ratos de 10 meses de idade e que esses animais

apresentam aumento dos níveis das proteínas tau, MAP2, pCREB e pERK; Os

níveis de PSD95, sinaptofisina e NeuN permanecem inalterados em extratos de

hipocampo, quando comparados com animais controle. Podemos sugerir também,

que, segundo os dados encontrados nesta Tese, o tratamento de ratos idosos (18-

24 meses) afetou a consolidação da memória e que ratos adultos jovens, com idade

entre 2 e 4 meses não tiveram seu perfil comportamental alterado após o tratamento

com DNP. A memória de camundongos de 8 meses também foi avaliada e, mais

uma vez, o tratamento com DNP foi eficiente, melhorando a memória desses

animais. Por outro lado, o tratamento com DNP em camundongos de 2 meses de

idade não alterou o aprendizado desses animais.

5.1. DNP melhora a memória de ratos e camundongos de meia idade

Os efeitos na melhora da memória promovidos pelo DNP foram demonstrados

em ratos de 10 meses e em camundongos de 8 meses de idade. Algumas

diferenças foram encontradas, uma vez que os efeitos na memória espacial,

verificada pelo LAM, foram menores que os efeitos encontrado na memória de

reconhecimento nos ratos. Porém, quando o modelo utilizado passa a ser

camundongos BALB/C, o efeito do DNP aparece mais evidente no LAM, por se tratar

de um modelo com déficits no aprendizado.Esses resultados mostram que o

tratamento com DNP melhora também a memória de camundongos de 8 meses de

idade.

O teste de RO foi realizado utilizando um protocolo onde animais controle não

aprendem a tarefa quando o intervalo de tempo entre o treinamento e o teste é

superior a 4 horas e os objetos utilizados durante o treino são iguais (Ennaceur e

Delacour, 1988; Prickaerts e cols., 2002). Esse protocolo é muito útil para

experimentos onde a finalidade é a verificação de efeitos de tratamentos na melhora

da memória de roedores. Utilizamos em nosso modelo um intervalo de 24 horas,

importante para determinar que o aprendizado avaliado foi de longa duração. Não

podemos determinar em que fase do aprendizado o DNP atuou para promover seus

efeitos, uma vez que o tratamento foi contínuo, durante 14 dias antes do início dos

testes. Podemos sugerir que, devido à natureza da tarefa, onde a retenção não

passa de 4 horas em animais normais, o DNP possivelmente estaria atuando na

consolidação ou na retenção da memória de reconhecimento. Por outro lado, não

podemos determinar esse efeito na memória de camundongos BALB/C, uma vez

que o teste de RO não foi realizado nessa espécie.

Outros trabalhos já demonstraram efeitos de compostos na melhora de

roedores. Scali e colaboradores, em 1997, descreveram os efeitos de metrifonato,

um inibidor de colinesterase, na memória de ratos idosos (idade entre 22 e 24

meses) utilizando a tarefa de RO. Nesse trabalho, os efeitos do metrifonato foram

bem evidentes, mostrando uma melhora na memória de reconhecimento de ratos

idosos tratados. Utilizando também o paradigma do RO, Prickaerts e colaboradores,

em 2005, demonstraram que Donepezil, outro inibidor de colinesterase, e sildenafil,

um inibidor de fosfodiesterase, foram capazes de melhorar a memória de ratos com

idades entre 4 e 5 meses.

O teste de LAM utiliza um protocolo mais complexo onde os animais precisam

aprender a nadar, a encontrar a plataforma submersa e fazer as relações das pistas

visuais da sala de comportamento com a localização da plataforma. Ratos e

camundongos são nadadores natos, porém, só utilizarão essa habilidade após entrar

em contato com uma situação onde nadar é necessário. Os resultados apresentados

nesta Tese demonstram que o tratamento com DNP promove uma pequena

diferença no desempenho de ratos de meia idade no LAM, (quinto dia de treino) e,

adicionalmente, o melhor desempenho de camundongos de 8 meses tratados com

DNP foi bem evidente durante o treinamento (Figura 23). Essas diferenças

encontradas sugerem, portanto, que o DNP melhora a memória de ratos e

camundongos, atuando, possivelmente, na fase de aquisição do aprendizado do

LAM.

O teste comprobatório, realizado 24 horas após o último dia de teste,

demonstra que o DNP também melhora a consolidação da memória de longa

duração, o que pode ser evidenciado pela diferença do tempo de permanência no

quadrante alvo tanto nos ratos quanto nos camundongos tratados (Figuras 16B e

23B). Embora o desempenho dos camundongos tratados com DNP e controle

tenham sido bem diferentes, demonstrando que o grupo controle não adquire a

informação da localização da plataforma, não podemos desprezar o resultado

encontrado no teste comprobatório, onde o grupo controle passa aproximadamente

40% do tempo procurando a plataforma no quadrante alvo.

O LAM utiliza tanto estratégias de aprendizado alocêntricas quanto

egocêntricas (Morris e cols., 1982; Moghaddam & Bures, 1996; Wang & Spelke,

2002; Kealy e cols, 2008) O uso de pistas alocêntricas para aprender a tarefa já foi

muito bem descrito e vários estudos já demonstram que esta é a primeira estratégia

de aprendizado empregada pelos animais (Morris e cols., 1981; Maaswinkel e

Whishaw, 1999). Por outro lado, o papel das pistas internas (egocêntricas), como,

por exemplo, os movimentos gerados pelo próprio animal durante a navegação

espacial, permanecem pouco elucidados (Morris e cols., 1981; Kealy e cols, 2008).

Para aprender a tarefa do LAM, tipicamente, os animais utilizam a combinação

dessas duas estratégias: os indivíduos começam o aprendizado pela alocêntrica,

quando inicialmente aprendem a localização da plataforma; então, trocam para a

estratégia egocêntrica, o que acontece durante as sessões de treinamento da tarefa

(Chang & Gold 2003, Packard & McGaugh, 1996, Kealy e cols., 2008). Podemos

justificar o tempo de procura no quadrante alvo dos camundongos controle por esse

componente egocêntrico.

Camundongos BALB/C são modelos de aprendizado menos utilizados que

outras linhagens de camundongos, por apresentarem deficiência no aprendizado de

tarefas espaciais, como o LAM. Alguns trabalhos já descreveram que camundongos

BALB/C são modelos pobres de aprendizado em tarefas de habilidade espacial

devido a anormalidades morfológicas hipocampais (Schröder e Sund, 1984; Roullet

e cols, 1993; Sunyer e cols, 2007). Entretanto, podemos definir esse modelo como

sendo útil em protocolos onde o objetivo é a verificação da melhora da memória. De

maneira bem variável, o desempenho depende da linhagem e do teste

comportamental utilizados. Estudos com camundongos BALB/C, suíços, C57BL e

129/Sv e demonstraram que as três primeiras linhagens são bons modelos de

aprendizado no teste de RO (Sık e cols, 2003, De Bruin e Pouzet, 2006), enquanto

que no teste do LAM camundongos BALB/cByJ e BALB/cJ, apresentam um

desempenho muito inferior quando comparados com camundongos C57BL (Brown e

Wong, 2007). Barad e colaboradores (1998) descreveram os efeitos do rolipram na

melhora da memória de C57BL utilizando a tarefa do LAM. Camundongos C57BL de

3 meses e 19 meses submetidos a exercícios apresentaram uma melhora da

memória, também quando testados no LAM (van Praag e cols, 1999, 2005).

Devemos citar também que o teste do LAM é muito utilizado para verificação

da reversão de déficits cognitivos provocados por estresse (Nicholas e cols., 2006) e

também para verificar a influência de proteínas ou peptídeos neurotóxicos na

memória (De Rosa e cols., 2005; Rossato e cols, 2006; Yuossef e cols., 2008).

Em nosso modelo, verificamos que o treinamento reverso foi realizado com

sucesso, uma vez que ratos tratados e controle apresentaram o mesmo perfil

durante o processo de aquisição (Figura 17A). Porém, o teste comprobatório do

aprendizado reverso, realizado 24 horas após o treino, mostrou que nenhum dos

dois grupos aprendeu a nova localização da plataforma e não apresentou

preferência por nenhum quadrante. Podemos sugerir que esse protocolo não foi

eficiente para verificar esse tipo de aprendizado em animais com idade um pouco

mais avançada. Observamos que os animais tratados com DNP apresentaram uma

pequena diferença, porém não significativa, entre o tempo gasto no quadrante alvo e

reverso (Figura 17). Esses dados podem indicar que o tratamento com DNP poderia

estar levando a uma tendência de melhora na aquisição de uma nova informação (a

nova localização da plataforma) em ratos de meia idade. Entretanto, esse é um dado

não conclusivo, pois o tempo gasto no quadrante adjacente 1 foi bem semelhante ao

gasto no quadrante reverso (Figura 17B).

No aprendizado reverso, os animais continuam retendo o as informações do

procedimento (chegar a uma plataforma de escape), porém, esquecem ou

extinguem o aspecto declarativo (achar o quadrante correto usando as pistas

visuais) e substituem a memória por outro traço (a nova localização da plataforma)

(Izqueirdo e cols. 2004; Cammarrota e cols., 2004; Rossato e cols., 2006). No

resultado apresentado na Figura 17B, os ratos esqueceram (ou extinguiram) a

informação inicialmente adquirida e o DNP não alterou esse comportamento.

Nossos resultados indicam que o tratamento com DNP não afeta as

atividades locomotora e exploratória de ratos e camundongos de meia idade (Tabela

1) e podemos ressaltar que a velocidade de natação e a distância percorrida pelos

grupos controle e tratado com DNP não foram diferentes durante o teste

comprobatório (Tabela 2). O teste do campo aberto é um importante controle para

avaliar se os efeitos do tratamento verificados nos testes comportamentais ocorrem

devido a mudanças da ansiedade ou da capacidade motora, o que não foi

observado nos nossos experimentos. A avaliação da velocidade de natação

corrobora esses achados, uma vez que os grupos de meia idade controle e tratados

com DNP apresentam valores similares.

Tabela 2: Velocidades e distâncias percorridas pelos ratos durante o teste

comprobatório.

A velocidade de natação e a distância percorrida é medida durante o teste

comprobatório. As velocidades estão expressas em cm/segundo e as distâncias

percorridas em cm. * Indica diferença estatisticamente significativa entre os grupos

controle e tratados com DNP (p<0,003).

Outra informação fornecida pelo teste do campo aberto foi a memória de

habituação. A memória de habituação de ratos de meia idade não foi afetada pelo

tratamento com DNP (Figuras 24A e B). Podemos citar, também, que o tratamento

não afeta a memória de habituação de ratos de 2-4 meses e de ratos de 18-24

meses (dados não mostrados). Esse comportamento é bem descrito na literatura e

sabe-se que situações de estresse e intervenções farmacológicas afetam esse perfil

(Réus e cols., 2008; Mello e cols., 2008). A administração de doses acima de

5mg/kg de memantina, um antagonista não competitivo de receptores NMDA, afeta

Velocidade

(cm/segundo)

Distância percorrida

(cm)

Controle

DNP

Controle

DNP

Ratos de 2

meses

22 ± 1,56

24 ± 1,87

465 ± 121

605,4 ± 162

Ratos de 10

meses

26 ± 1,0

24 ±1,3

500 ± 62

569 ± 68

Ratos de 18-24

meses

27 ± 0,6

28 ± 0,8

602 ± 45*

395 ± 29*

100

a memória de habituação em ratos, tanto no número de cruzamento quanto o de

levantamentos (Réus e cols., 2007).

Podemos fazer uma interessante observação no teste do campo aberto

quanto ao número de cruzamentos e levantamentos dos animais com idade mais

avançada. Os dados apresentados mostram que os ratos mais velhos (18 -24

meses) e os camundongos mais velhos (8 meses) cruzam menos que os animais

mais jovens (Tabela 1). Porém, o número de levantamentos é bem parecido quando

comparamos ratos de 2-4 meses com ratos de 18-24 meses e também quando

comparamos camundongos de 2 meses com camundongos de 8 meses. Essas

observações interessantes podem sugerir que a vontade de explorar (uma

capacidade cognitiva) não está diminuída com a idade e sim, a atividade locomotora

está diminuída. No processo de envelhecimento, as habilidades físicas entram em

declínio, em geral, antes das cognitivas (Erickson e Barnes, 2003). Podemos,

portanto, explicar a diminuição da atividade motora dos animais idosos. Em geral, a

atividade em algumas regiões do cérebro de animais idosos está diminuída (Grady,

2008).

Uma busca na literatura nos mostrou que existem poucos trabalhos que

mostram a memória de habitação em camundongos BALB/C. Um deles descreve

que o estado de ansiedade naturalmente maior dessa linhagem afeta a memória de

habituação (Tang e cols., 2002). Porém, Sik e colaboradores descreveram em 2003,

que a tarefa do RO em camundongos BALB/C é muito bem aprendida. O

aprendizado desta tarefa depende da etapa de habituação, que neste trabalho foi

realizada por três dias consecutivos, duas vezes por dia. Portanto, uma maior

exposição à arena talvez seja necessária para uma melhor avaliação da memória de

habituação em camundongos BALB/C. Esse perfil pode ser interpretado como

101

favorável para a avaliação de melhora da memória de habituação, demonstrando,

assim, que o tratamento com DNP não afeta esse tipo de memória.

Os ratos tratados com DNP submetidos ao teste do medo condicionado não

apresentaram diferenças comportamentais quando comparados com ratos controle

(Figura 19). Esse dado nos fornece informações sobre outro tipo de aprendizado,

que envolve a memória implícita. De modo geral, o conjunto de resultados obtidos

através dos testes de LAM e RO (que avaliam memória explicita) e dos testes de

habituação e MC (que avaliam memória implicita), podemos formular uma hipótese

de que o DNP promove uma melhora da memória explícita de ratos de meia idade,

não interferindo na memória implícita.

5.2. DNP não interfere na memória de ratos de 2-4 meses de idade

Grupos de ratos adultos jovens controle ou tratados com DNP apresentaram o

mesmo perfil comportamental apresentando desempenhos semelhantes (Figuras

12, 13 e 15) nas tarefas de RO e LAM. Particularmente, na tarefa do LAM, o teste

comprobatório demonstrou que ambos os grupos não aprenderam a localização da

plataforma, passando menos que 40% do tempo no quadrante alvo.

É bem descrito na literatura que ratos de 2 a 4 meses de idade são ótimos

modelos de aprendizado (Morris e cols., 1982; Broadbent e cols., 2004, Clark e cols.,

2007, Tse e cols., 2007). Portanto, para que pudéssemos verificar um possível papel

do DNP na melhora da memória, o teste foi dificultado através da redução do

número de saídas por dia de treino (utilizamos 4 saídas, Figura 12). Como o grupo

controle não aprendeu a localização da plataforma, esse dado indica que o número

de saídas escolhido no teste de LAM não tenha sido suficiente para o treinamento

102

desses animais. Van Praag e colaboradores, em 2005, descreveram os efeitos

benéficos do exercício físico no aprendizado. O protocolo utilizado foi semelhante ao

nosso, utilizando 4 saídas por dia, durante 5 dias de treinamento. Naquele trabalho,

camundongos C57BL controle de 3 meses de idade permaneceram somente

aproximadamente 30% do tempo explorando o quadrante alvo durante o teste

comprobatório. Portanto, esse protocolo é útil para avaliação de tratamentos ou

intervenções para a melhora da memória. Sendo assim, podemos concluir que o

DNP não afeta a memória de ratos de 2-4 meses.

Quando o tempo de administração de DNP foi prolongado por 21 dias e o

LAM realizado, verificamos que os ratos de 2 meses de idade apresentaram o

mesmo desempenho (Figura 14A). Neste caso, o número de saídas foi maior (6

tentativas diárias), mostrando que ambos os grupos aprenderam a tarefa e o

tratamento continuado com DNP não afetou a aquisição da informação da

localização da plataforma e nem a consolidação (Figura 14B).

O teste do aprendizado reverso mostrou que ambos os grupos não

aprenderam a nova localização da plataforma (tempo menor que 40% no quadrante

reverso, Figura 15B), mesmo apresentando um excelente desempenho, observado

pela curva do treino. (Figura 15A). Podemos explicar esse resultado observado

devido a uma possível extinção da memória, sem a substituição da nova informação

(Cammarota e cols., 2004; Rossato e cols., 2006).

Podemos confirmar ainda a ausência de efeitos do DNP pelos dados obtidos

no paradigma de RO (Figura 13). Mais uma vez, o protocolo foi utilizado com o

objetivo de verificar a melhora da memória (dois objetos iguais no dia do treino, com

um intervalo de 24 horas).

103

5.3. Ratos idosos (18-24 meses) apresentaram déficit cognitivo após o

tratamento com DNP.

Através do teste do LAM, verificamos que tanto o grupo tratado com DNP

quanto o grupo controle apresentaram o mesmo perfil durante o treinamento (Figura

20A). Porém, no teste comprobatório os ratos tratados com DNP permaneceram

somente 25% do tempo total no quadrante alvo (Figura 20B). Podemos sugerir que

o DNP não afeta a memória durante a fase de aquisição, porém, a consolidação e a

retenção da memória podem ter sido comprometidas pelo tratamento com DNP. O

perfil do treinamento reverso para ambos os grupos foi muito heterogêneo, tanto

para o grupo controle quanto para o grupo tratado com DNP, onde o podemos

perceber que ambos os grupo mais, uma vez, não aprenderam a localização da

plataforma (Figura 21).

De acordo com os valores de distância percorrida e velocidade dos ratos

idosos (Tabela 2) podemos concluir que o DNP não afeta a locomoção (também

confirmado pelo teste do campo aberto, Tabela 1) e sim o tempo de procura pela

plataforma no quadrante alvo. A distância percorrida pelo grupo controle é

significativamente maior que o grupo tratado, mostrando que o déficit provocado

pelo DNP provavelmente está ocorrendo na fase de consolidação da memória dos

ratos idosos.

Segundo a literatura, os estudos realizados com animais que foram

administrados com DNP por via oral são muito deficientes no protocolo experimental.

Faltam informações importantes como peso, idade, sexo e, ainda, o número de

animais utilizados. Podemos, também, descrever outras falhas nos estudos

realizados com humanos, como, por exemplo, a falta de testes estatísticos e de

104

grupo controle para comparação (De Felice & Ferreira, 2006). Em ratos, a

administração de DNP não provoca um significativo aumento da taxa metabólica em

doses orais de 10 mg/ kg. O aumento da taxa metabólica só é verificado em doses

acima de 10 mg/ kg (Liao & Oehme, 1980).

O teste do RO foi realizado nesses animais e mais uma vez não verificamos

efeitos na melhora de memória nos ratos tratados com DNP (Figura 22A e B).

Nesse teste, conforme citado anteriormente, animais controle não aprendem a tarefa

após intervalo de 24 horas. Esses dados apresentados sugerem que o DNP provoca

um déficit na memória espacial e análises complementares são necessárias para

avaliação dos seus efeitos na memória de reconhecimento de ratos idosos, assim

como uma melhor investigação da concentração usada e o tempo de administração.

Trabalhos realizados pelo grupo de Amy Arnsten têm demonstrado que a

ativação de vias de cAMP no córtex pré-frontal provoca déficits em ratos idosos

(Taylor e cols., 1999; Ramos e cols., 2003; Arnsten e cols., 2005). Mais

recentemente, o mesmo grupo mostrou que os efeitos benéficos de guanfacina, um

agonista de receptores adrenérgicos, resultam da inibição da sinalização

dependente de cAMP (Ramos e cols., 2006). Tendo em vista os efeitos in vitro do

DNP, aumentando os níveis de cAMP (Wasilewska-Sampaio e cols., 2005),

podemos relacionar os efeitos não benéficos provocados pelo DNP em animais

idosos com esses dados da literatura. O DNP poderia estar provocando um aumento

de cAMP em indivíduos idosos e causando um déficit de memória. Para confirmar

essa hipótese de acordo com os dados encontrados nesta Tese, devemos analisar o

hipocampo desses animais, relacionando assim, os níveis de proteínas associadas

com a formação da memória e o perfil comportamental. As relações entre os níveis

protéicos e o perfil comportamental serão mais discutidas adiante.

105

A memória de habituação analisada no campo aberto não foi alterada,

mostrando mais uma vez que o DNP não afeta a memória implícita (dados não

mostrados).

5.4. Ratos de meia idade tratados com DNP apresentaram um aumento

dos níveis de proteínas relacionadas com a formação da memória

O hipocampo é a parte do cérebro mais bem descrita envolvida em processos

de aprendizado que envolvem a formação de memória explícita (Squire e Zola,

1996, 2004; Kandel, 2000). Tanto no LAM quanto no RO, os ratos utilizam a rede

neural do hipocampo e áreas relacionadas para formar esse tipo de memória (Morris

e cols., 1982; Broadbent e cols., 2004; Brown e Aggleton, 2001, Hannesson e cols.,

2004). Verificamos o aumento dos niveis de tau, MAP2, CREB fosforilada e ERK

fosforilada nos hipocampos de ratos de meia idade tratados com DNP (Figuras 25 e

26A e 27). Por outro lado, PSD95, NeuN e Sinaptofisina não sofreram alteração nos

seus níveis protéicos quando comparados grupo tratado com grupo controle

(Figuras 28 e 29).

As proteínas tau e MAP2 são proteínas associadas a microtúbulos que

promovem a orientação da polimerização e concentração de microtúbulos. O

trabalho publicado pelo nosso grupo em 2005, onde culturas neuronais tratadas com

DNP apresentaram um aumento nos níveis da proteína tau quando comparadas com

culturas controle (Wasilewska-Sampaio e cols., 2005) já havia nos fornecido uma

informação importante quanto aos efeitos do DNP na neuritogênese in vitro, uma vez

que o aumento de tau nas culturas tratadas sugeriu um efeito do DNP no

fortalecimento da rede de microtúbulos. Seguindo os dados encontrados com a

106

utilização de culturas de neurônios, foi interessante observar que o DNP também

aumenta os níveis dessa proteína nos hipocampos dos ratos de meia idade. É

importante ressaltar que a proteína tau é uma proteína central na estabilização de

microtúbulos, funcionando como uma peça chave no alongamento e crescimento de

neuritos do sistema nervoso central (Drubin e Kirschner, 1986; Ávila e cols, 2004).

Em condições fisiológicas, tau é necessária para o estabelecimento da polaridade de

células neuronais. É determinante para o crescimento e transporte dos axônios e

manutenção de sua morfologia, sendo observado um aumento da expressão da tau

concomitante com a extensão de neuritos (Saragoni e cols., 2000).

Com o mesmo objetivo, os níveis de outra MAP também foram investigados.

É descrito que a imunoreatividade para MAP2 na região CA1 do hipocampo de ratos

e camundongos idosos está diminuída, sugerindo-se que os dendritos e axônios

desta região se encontram mais susceptível aos processos de envelhecimento

(Himeda e cols, 2005, Di Stefano e cols, 2001). Camundongos deficientes em

―Collapsin Response Mediator Protein-1‖, uma fosfoproteína neuronal que tem o

papel de guiar os cones de crescimento, apresentam dendritos da região CA1 do

hipocampo formados de modo incorreto, onde a MAP2 não está bem distribuída, e

esses animais apresentam déficits de memória no LAM (Su e cols, 2007).

O crescimento e a retração de neuritos são muito importantes para a

plasticidade e regeneração neuronal. O estado dinâmico dos microtúbulos permite a

maturação dos neurônios com a retração de neuritos velhos e extensão de novos.

Essa trajetória de crescimento é determinada por uma estrutura especializada,

chamada de cone de crescimento, que recebe informações do meio extracelular que

promovem o alongamento axonal (Lent, 2002). O alongamento dos axônios e

dendritos no momento e direção corretos formam a base para a conectividade e,

107

conseqüentemente, para a atividade neuronal (da Silva e Dotti, 2003). Desta forma,

podemos formular a hipótese de que o DNP melhora a memória de animais de meia

idade, atuando na rede de microtúbulos in vivo, um processo importante para a

neuritogênese. Adicionalmente, esses resultados indicam que um dos mecanismos

pelos quais o DNP está agindo na melhora da memória de ratos pode envolver o

fortalecimento da rede de microtúbulos e também a polaridade neuronal.

Os níveis da proteína CREB também foram investigados. Vários trabalhos já

associaram a ativação do fator de transcrição CREB a processos de aprendizado e

memória e também em vias envolvidas na plasticidade sináptica (Kaang e cols,

1993; Gong e cols, 2004). Nesta Tese, verificamos que o DNP aumenta os níveis do

fator CREB na sua forma fosforilada no hipocampo de ratos de meia idade que

foram submetidos aos testes de RO e LAM (Figura 26A). Adicionalmente, foi

demonstrado que os níveis da CREB total não estão alterados entre os grupos

controle e tratado com DNP (Figuras 26A e B).

Um estudo recente demonstrou que a administração aguda de rolipram induz

o aumento de CREB fosforilada em camundongos modelo para DA, que foram

submetidos ao teste do LAM. Esses animais apresentam um melhor desempenho

quando comparados a animais controle (Gong e cols, 2004). O rolipram é um

inibidor específico de fosfodiesterase (PDE ―phosphodiesterase‖) tipo IV. Essa

enzima hidrolisa o cAMP em 5′-AMP, sendo responsável pelo retorno aos níveis

basais intracelulares de cAMP. Outro trabalho interessante demonstra que animais

que super expressam adenilato cilase, apresentam melhor desempenho em várias

tarefas comportamentais e que essa melhora é acompanhada de aumento nos

níveis de pCREB (Wang e cols., 2004). Dados prévios do nosso grupo mostram que

o DNP aumenta os níveis de cAMP em culturas neuronais (Wasilewska-Sampaio e

108

cols, 2005). Sendo assim, podemos sugerir que o DNP está agindo em processos de

formação da memória através da fosforilação do fator CREB em ratos de meia

idade.

O evento de fosforilação da CREB é descrito como um dos mecanismos da

formação da memória e sua ativação no processo de aprendizado no hipocampo

(Monti e cols, 2006, Genoux e cols, 2002, Bourtchuladze e cols, 1994; Dalley e cols,

1999; Kogan e cols, 2000) e também no córtex perirrinal (Warburton e cols, 2005).

Não podemos deixar de citar que a conexão entre CREB e memória de longa

duração já foi estabelecida em vários organismos (Carlezon e cols, 2005). Mutações

ou deleções de isoformas chaves de CREB bloqueiam a memória de longa duração

em Drosophila e também em camundongos (Yin e cols, 1994; Bourtchuladze e cols,

1994; Carlezon e cols, 2005).

A participação de ERK (extracellular regulated kinase) tem sido demonstrada

em processo de plasticidade, aprendizado e memória (Sweatt, 2001). Estudos

recentes utilizando animais transgênicos para MEK, a cinase que ativa ERK,

fosforilando-a, demonstram que esses animais apresentam déficits cognitivos no

LAM (Kelleher III e cols, 2004). Conforme visto pelo nosso grupo, o efeito do DNP in

vitro na diferenciação de linhagem de neuroblastoma N2A envolve a ativação de

ERK (Wasilewska-Sampaio e cols, 2005). Observamos que ratos de meia idade

tratados com DNP apresentaram níveis de ERK fosforilada maiores que os ratos

controle (Figura 27), sugerindo que os efeitos desse composto melhorando a

memória de ratos possam envolver a ativação dessa via.

PSD95 e sinaptofisina, que são importantes marcadoras pós- e pré-

sinápticas, respectivamente, não tiveram seus níveis modificados após o tratamento

com DNP. Podemos sugerir, então, que o tratamento com DNP não afeta os níveis

109

dessas proteínas em ratos de meia idade e que seus efeitos na melhora da

memória, possivelmente, não envolvem alterações nos níveis destas proteínas

sinápticas. Não houve mudança dos níveis de NeuN, uma proteína nuclear de

neurônios. Esse dado é um indício de que o DNP não está afetando a proliferação

neuronal. Porém, este é um evento que precisa ser confirmado por técnicas

imunohistológicas dos hipocampos desses animais.

Os cérebros dos animais idosos, que apresentaram déficit cognitivo, não

foram analisados por ―western blotting‖. Entretanto, podemos levantar uma hipótese

sobre as mudanças comportamentais encontradas e os níveis de proteínas

relacionadas com a memória. Como visto nos animais que tiveram uma melhora na

memória os níveis de pCREB, tau e MAP2 se encontraram aumentados, é possível

que a quantidade dessas proteínas nos hipocampos do animais idosos esteja

diminuída. Da mesma forma, podemos sugerir que os níveis protéicos nos

hipocampos dos ratos de 2-4 meses controle e tratados com DNP estejam

inalterados.

A Figura 30 apresenta aos efeitos benéficos do DNP encontrado pelo nosso

grupo, desde a caracterização inicial de composto neuroprotetor contra o peptídeo

beta amilóide até os achados descritos nesta Tese.

110

Figura 30: Efeitos benéficos do 2,4 dinitrofenol (DNP). a) O DNP bloqueia a

agregação do peptídeo beta-amilóide, impedindo a formação de oligômeros e fibras

amilóides (De Felice e cols., 2001, 2004). Desta forma, a ação neurotóxica dos

oligômeros e fibras amilóides é bloqueada, impedindo a degeneração neuronal

provocada por estes agregados. b) Em culturas neuronais saudáveis, o DNP

promove a neuritogênese, o que possivelmente está relacionado ao aumento nos

níveis de cAMP e da proteína estabilizadora de microtúbulos tau (Wasilewska-

Sampaio e cols., 2005). c) In vivo, o DNP tem um efeito benéfico na memória de

roedores de meia-idade, ao mesmo tempo em que induz aumentos nos níveis das

proteínas estabilizadoras de microtúbulos tau e MAP2, e das formas fosforiladas das

proteínas ERK e CREB (pERK e pCREB, respectivamente) nos hipocampos dos

animais experimentais.

111

6) CONCLUSÕES

Não podemos atribuir os efeitos do DNP na memória dos roedores analisando

as tarefas separadamente. O resultado encontrado no LAM para ratos de meia idade

não foi arrebatador. Observamos uma pequena diferença na última sessão e

também no teste comprobatório, que nos levou a investigar os efeitos do DNP em

outras tarefas que pudessem responder conclusivamente esses efeitos. Na tarefa do

RO, encontramos um efeito mais robusto. Logo, essas duas tarefas, em conjunto,

nos forneceram dados importantes sobre a ação do DNP na melhora da memória. A

avaliação da memória de camundongos de meia idade corrobora os dados

encontrados com ratos, e reforça os efeitos do DNP na melhora da memória.

De modo geral, acreditamos que o DNP aumenta a arborização neuronal,

aumenta os níveis de proteínas importantes relacionadas com a formação da

memória e que, como conseqüência, melhora a memória ratos de meia idade. Por

outro lado, o DNP não mostrou efeitos benéficos em ratos mais velhos. São

necessárias outras investigações para determinar a causa do déficit provocado pelo

tratamento e, mais ainda, a utilização de outras doses ou outros períodos de

tratamento.

Em ratos com idade entre 2-4 meses, o DNP não afetou o comportamento,

mesmo com a utilização de administração mais prolongada. Esses dados nos

fornecem uma informação importante: a melhora provocada pelo DNP não é um

efeito inespecífico. Ele acontece num sistema ainda bem funcional, como nos

animais de meia idade, que podem estar no início de um processo de declínio

comportamental.

112

Conjuntamente, os dados apresentados nesta Tese demonstraram efeitos

benéficos do DNP na memória de ratos e camundongos de meia idade, o que foi

bem evidenciado no teste do RO em ratos e no LAM nos camundongos. Concluímos

que o DNP melhora a memória desses animais e que essa melhora é acompanhada

pelo aumento dos níveis de tau, MAP2, CREB fosforilada e ERK fosforilada nos

hipocampos desses animais.

113

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CURRICULUM VITAE

Nome: Ana Paula Wasilewska Sampaio

Nascimento: 02/08/1976

Naturalidade: Rio de Janeiro

Formação acadêmica

- Graduação em Farmácia pela Universidade Federal do Rio de Janeiro (1998/2001)

- Mestrado em Química Biológica, área de concentração em Química Biológica, pelo Instituto

de Ciências Biomédicas, na Universidade Federal do Rio de Janeiro (2002/2004).

- Doutorado em Química Biológica, área de concentração em Química Biológica, pelo

Instituto de Bioquímica Médica, na Universidade Federal do Rio de Janeiro (2004/2008).

Orientação de estudante

1-Axa Paula Baltazar da Motta Sales. Início: Jan/2007. Iniciação científica (Graduando em

Farmácia) - Universidade Federal do Rio de Janeiro

2-Anna Carolina A P Barbosa. Início 2005 até 2007. (Biologia) - Universidade Federal do Rio

de Janeiro.

Orientação em monografia

Efeitos do 2,4-dinitrofenol no aprendizado e memória de ratos e camundongos. 2007.

Monografia de conclusão de curso (Aperfeiçoamento/Especialização em Biologia) -

Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Comunicação em congresso

6 comunicações em congressos nacionais

1 comunicação em congresso internacional

Publicações

De Felice, F. G., Wasilewska-Sampaio, A.P., Barbosa, A. C., Gomes, F. C., Klein, W. L.,

Ferreira, S. T. (2007) Cyclic AMP enhancers and Abeta oligomerization blockers as potential

therapeutic agents in Alzheimer's disease. Curr Alzheimer Res. 4(3):263-71.

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M., Linden, R. Ferreira, S. T., De Felice, F. G. (2005) Neuritogenesis and neuronal

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