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ATIVIDADE E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DE SUPERÓXIDO
DISMUTASE E CATALASE EM EPIDÍDIMO E SÊMEN DE EQUINOS
(Equus caballus)
THAISA FRANCIELLE SOUZA DOMINGOS
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY
RIBEIRO - UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES-RJ
FEVEREIRO/ 2008
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ATIVIDADE E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DE SUPERÓXIDO
DISMUTASE E CATALASE EM EPIDÍDIMO E SÊMEN DE EQUINOS
(Equus caballus)
THAISA FRANCIELLE SOUZA DOMINGOS
Dissertação de mestrado
apresentada ao Centro de
Biociências e Biotecnologia da
Universidade Estadual do
Norte Fluminense, como parte
dos requisitos para obtenção
do título de Mestre em
Biociências e Biotecnologia
com ênfase em Biologia
Celular.
ORIENTADOR: Dr. CLAUDIO ANDRÉS RETAMAL MARTÍNEZ
CO-ORIENTADOR: Drª. MARIA LUISA LÓPEZ ALVAREZ
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY
RIBEIRO - UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES-RJ
FEVEREIRO/ 2008
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ATIVIDADE E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DE SUPERÓXIDO
DISMUTASE E CATALASE EM EPIDÍDIMO E SÊMEN DE EQUINOS
(Equus caballus)
THAISA FRANCIELLE SOUZA DOMINGOS
Dissertação de mestrado
apresentada ao Centro de
Biociências e Biotecnologia da
Universidade Estadual do
Norte Fluminense, como parte
dos requisitos para obtenção
do título de Mestre em
Biociências e Biotecnologia
com ênfase em Biologia
Celular.
Aprovado em 20 de fevereiro de 2008.
Comissão Examinadora:
Drª. Maria Clara Caldas Bussiere (LMGA – UENF)
___________________________________________________________________
Dr. Renato Augusto DaMatta (LBCT – UENF)
Dr. Wanderley de Souza (BIOFÍSICA – UFRJ)
Dr. Claudio Andrés Retamal Martínez (LBCT – UENF)
(orientador)
Drª. Maria Luisa López Alvarez (LBCT – UENF)
(co-orientadora)
Este trabalho foi desenvolvido no
Laboratório de Biologia celular e
Tecidual (Setor Biologia da
Reprodução) do Centro de
Biociências e Biotecnologia da
Universidade Estadual do Norte
Fluminense, sob orientação dos
pesquisadores Claudio Andrés
Retamal Martínez e Maria Luisa
López.
Apoio Financeiro:
UENF
FAPERJ
TECNORTE
i
Dedicatória:
Aos meus pais, Wilson e Vilma, por mais
uma vez terem me proporcionado apoio
e confiança necessários para seguir
adiante.
ii
AGRADECIMENTOS
A Deus, em primeiro lugar, por todas as bênçãos que me concedeu, por me
colocar nesse caminho, proporcionando-me a conclusão de mais uma etapa da minha
vida.
Ao meu orientador Dr. Claudio Retamal pela amizade, paciência, confiança,
incentivo e pelo conhecimento transmitido a mim.
À professora Drª. Maria Luisa López pela amizade, confiança e pela incansável
disposição em colaborar e ajudar a todos.
Ao professor Dr. Renato Da Matta por ser o revisor desse trabalho.
Aos membros da banca examinadora, agradeço desde já a atenção dispensada.
Ao meu pai, Wilson Domingos, e minha mãe, Vilma Domingos, que mesmo com
todas as dificuldades e limitações, não pouparam esforços para me educar e oferecer
as condições necessárias para que eu estudasse, e por me apoiarem em cada etapa da
minha vida, me ajudando e me incentivando em tudo.
Aos meus irmãos Thalia Catlheen e Thalles Wilson e Maria Fernanda, por
sempre estarem do meu lado, me dando todo apoio e me entendendo nos meus vários
momentos de estresses.
Ao meu namorado Felipe Paranhos pelo apoio, compreensão, incentivo,
paciência, companheirismo e amor.
A todos que fazem ou fizeram parte do Setor de Biologia da Reprodução, Arthur
Rodrigues, Fernanda Brasil, Fernanda Rodrigues, Glauber Dias, Joseph Albert, Nathália
Curty, Paula Karolina, Renata Vasconcelos e Roberta Fernandes pela convivência, pelo
aprendizado, pela diversão e pelo elo de amizade formado.
Aos professores e alunos do Laboratório de Melhoramento Genético Animal
(LMGA-CCTA), Ângelo Burla, Cláudio Wermelinger e Guilherme Valente, que
contribuíram na obtenção das amostras.
Às minhas amigas Renata Morley, Ana Carolina Mercadante e Shayany Felix
pela amizade, pelo apoio e pelos momentos memoráveis de alegria e descontração.
À minha família, que mesmo de longe, me incentivaram e me apoiaram em tudo.
E por último, a todos que de certa forma colaboraram para realização desse
trabalho.
iii
RESUMO
Espermatozóides de eqüinos são capazes de gerar espécies reativas de oxigênio
(EROs), que cumprem importantes funções na capacitação espermática, reação
acrossômica e fusão com o ovócito. No entanto, a produção excessiva de EROs é
prejudicial a função espermática. Os espermatozóides possuem capacidade limitada de
resistir ao estresse oxidativo, tornando-se altamente dependentes do microambiente no
qual estão imersos. O objetivo desse trabalho foi detectar e caracterizar atividade de
enzimas superóxido dismutases (SODs) e catalases (CATs) no epidídimo e sêmen de
Equus caballus.
Amostras de fluido epididimário (obtidas das regiões de cabeça
proximal, cabeça distal, corpo e cauda), plasma seminal e espermatozóides de
garanhões sexualmente maduros foram submetidas a eletroforeses em condições
nativas e desnaturantes, na presença e ausência de 2-mercaptoetanol. Atividades SODs
foram detectadas usando um meio contendo riboflavina, EDTA e NBT
2+
. Atividade CAT
foi determinada utilizando solução contendo peroxidase, H
2
O
2
e DAB. Cianeto foi usado
para distinguir isoformas de SOD. Nossos resultados mostraram que CuZn-SOD, Mn-
SOD e CAT estão presentes tanto em fluido epididimário e plasma seminal quanto em
espermatozóides maduros e imaturos, apresentando alta atividade específica. CuZn-
SOD com mobilidade eletroforética (R
f
)
0.40 é predominante em fluido epididimário.
Ambas isoformas foram detectadas em espermatozóides epididimário (R
f
0.32, R
f
0.47)
e em espermatozóides maduros (Rf 0.50, Rf 0.53, Rf 0.58). As proteínas com atividade
catalásica apresentaram R
f
0.11, R
f
0.15 (fluido epididimário e plasma seminal) e R
f
0.21, R
f
0.54, R
f
0.62 (espermatozóides). As massas moleculares das principais
proteínas com atividade SODs foram 38kDa, 50kDa, 72kDa e 98kDa em fluido
epididimário; 35kDa, 75kDa e 135kDa em espermatozóides; e 21kDa, 65kDa, 130kDa e
250kDa em plasma seminal. Catalase apresentou massa molecular 202kDa em
espermatozóides; 105kDa e 116kDa em plasma seminal; 250kDa, 160kDa, 110kDa,
66kDa e 28 kDa em fluido epididimário. Analisados em conjunto, nossos resultados
sugerem que SODs e CATs em epidídimo e plasma seminal podem estar presentes em
forma monomérica ou em diferentes estados de agregação.
iv
ABSTRACT
Spermatozoa are capable of generating reactive oxygen species (ROS), which are
thought to play a physiological role during sperm capacitation, acrosome reaction and
oocyte fusion. In contrast, excessive generation of ROS can have a detrimental effect on
sperm function. The spermatozoa have a limited capacity to resist to the oxidative
stress. Because of this, they are depended of antioxidant defense system present in the
microenvironment of the reproductive tract. The aim of this work was to verify the
presence and characteristics of the superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT)
activity in the epididymides and semen of
Equus caballus.
Samples from epididymal fluid
(obtained proximal and distal caput, corpus and cauda epididymal regions), seminal
plasma and spermatozoa from sexually mature stallion were submitted to
electrophoresis under both non-denaturing and denaturing conditions, with and without
2-mercaptoethanol. The SOD activity was assessed using a medium with riboflavine,
EDTA and NBT
2+
. CAT activity was determined using a solution containing peroxidase,
H
2
O
2
and DAB. Cyanide was used to distinguish SODs isoforms. Our results showed
that CuZn-SOD, Mn-SOD and CAT are present in the epididymal fluid and seminal
plasma as well as in immature and mature spermatozoa, displaying a high specific
activity. CuZn-SOD (R
f
0.40) is predominant in the epididymal fluid. Both isoforms were
detected in epididymal spermatozoa (R
f
0.32, R
f
0.47) and in mature spermatozoa (Rf
0.50, Rf 0.53, Rf 0.58). The proteins that showed catalase activity displayed R
f
0.11, R
f
0.15 (epididymal fluid and seminal plasma) and R
f
0.21, R
f
0.54, R
f
0.62 (sperm
samples). The molecular mass of the main proteins with SODs activity were 38kDa,
50kDa, 72kDa and 98kDa in epididymal fluid; 35kDa, 75kDa and 135kDa in sperm cells;
21kDa, 65kDa, 130kDa and 250kDa in seminal plasma. Catalase showed molecular
mass 202kDa in sperm cells; 105kDa and 116kDa in seminal plasma; 250kDa, 160kDa,
110kDa, 66kDa and 28 kDa in epididymal fluid. Taking together, our results suggest that
SODs and CATs found in epididymides and seminal plasma can be present in
monomeric form or in different aggregation state.
v
Lista de abreviaturas, siglas:
•
RL – radical livre
•
EROs – espécies reativas de oxigênio
•
SOD – superóxido dismutase
•
CAT – catalase
•
GPX – glutationa peroxidase
•
NADPH - adenina nicotinamida dinucleotídeo fosfato oxidase
•
O
2
•
-
- ânion superóxido
•
RS
•
- radicais tióis
•
H
2
O
2
- peróxido de hidrogênio
•
•
OH - radical hidroxil
•
L
•
- radical lipídico
•
LO
•
- radical alcoxil
•
LOO
•
- radical peroxil
•
LOOH - hidroperóxidos lipídicos
•
G6PD - glicose-6-fosfato desidrogenase
•
NOX5 - NADPH oxidase
•
PUFA - ácido graxo poli-insaturado
•
LPO – Lipoperoxidação
•
CuZn-SOD - Superóxido dismutase contendo cobre e zinco.
•
Mn-SOD – Superóxido dismutase contendo manganês
•
Ni-SOD - Superóxido dismutase contendo níquel
•
Fe-SOD - Superóxido dismutase contendo ferro
•
EC-SOD - Superóxido dismutase extracelular
vi
Lista de figuras:
• Figura 1:
Fontes de radicais livres e sistemas antioxidantes de defesa................4
• Figura 2:
Dismutação do radical superóxido por ação da superóxido dismutase
(SOD)......................................................................................................................5
•
Figura 3:
Aparelho reprodutor de
Equus caballus
...............................................11
• Figura 4:
Reação catalisada pela GPX e reação de redução da GSSG pela GR
..............................................................................................................................15
•
Figura 5:
Reação de decomposição do peróxido de hidrogênio pela
catalase................................................................................................................18
• Figura 6:
Regiões do epidídimo de
Equus caballus
............................................21
•
Figura 7: Obtenção da amostra de sêmen..........................................................21
•
Figura 8:
Atividade de superóxido dismutase em fluido epididimário de
E.
caballus.
Gel nativo 8% sem 2-mercaptoetanol............................. .....................26
• Figura 9:
Atividade superóxido dismutase em fluido obtido da região de cauda
do epidídimo. Géis 2D (nativo 8%/nativo 12%) sem 2-
mercaptoetanol.....................................................................................................27
•
Figura 10: Densitograma do gel nativo 8%, sem 2-mercaptoetanol, de fluido
epididimário com atividade superóxido dismutase...............................................28
• Figura 11:
Atividade de superóxido dismutase em espermatozóides epididimário
de
E. caballus.
Gel nativo 8% sem 2-mercaptoetanol..........................................29
•
Figura 12:
Atividade de superóxido dismutase em plasma seminal de
E.
caballus.
Gel nativo 8% sem 2-mercaptoetanol...................................................29
•
Figura 13: Atividade superóxido dismutase em espermatozóides obtido da região
de cauda do epidídimo. Géis 2D (nativo 8%/nativo 12%) sem 2-
mercaptoetanol.....................................................................................................30
•
Figura 14:
Atividade superóxido dismutase em plasma seminal. Géis 2D (nativo
8%/nativo 12%) sem 2-mercaptoetanol................................................................31
• Figura 15:
Densitograma do gel nativo 8%, sem 2-mercaptoetanol, de
espermatozóides epididimário com atividade superóxido dismutase...................32
vii
• Figura 16:
Densitograma do gel nativo 8%, sem 2-mercaptoetanol, de plasma
seminal com atividade superóxido dismutase......................................................32
•
Figura 17:
Atividade de superóxido dismutase em espermatozóides maduros de
E. caballus.
Gel nativo 8%, com dentitograma, sem 2-
mercaptoetanol.....................................................................................................33
•
Figura 18:
Atividade de superóxido dismutase em fluido epididimário de
E.
caballus.
Gel nativo 8%, com densitograma, com 2-mercaptoetanol...................34
•
Figura 19: Atividade de superóxido dismutase em espermatozóides epididimário
de
E. caballus.
Gel nativo 8%, com densitograma, com 2-
mercaptoetanol.....................................................................................................35
•
Figura 20:
Atividade de superóxido dismutase em plasma seminal de
E.
caballus.
Gel nativo 8%, com densitograma, com 2-mercaptoetanol...................36
• Figura 21:
Atividade de superóxido dismutase em espermatozóides maduros
.
Gel nativo 8%, com densitograma, com 2-mercaptoetanol..................................37
• Figura 22:
Atividade de catalase em fluido epididimário de
E. caballus.
Gel nativo
8% sem 2-mercaptoetanol....................................................................................38
•
Figura 23:
Atividade de catalase em fluido obtido da região de cauda do
epidídimo. Géis 2D (nativo 8%/nativo 12%) sem 2-mercaptoetanol....................39
• Figura 24:
Densitograma do gel nativo 8%, sem 2-mercaptoetanol, de fluido
epididimário com atividade de catalase................................................................39
• Figura 25:
Atividade de catalase em espermatozóides epididimário de
E.
caballus.
Gel nativo 8% sem 2-mercaptoetanol...................................................40
•
Figura 26:
Atividade de catalase em espermatozóides obtido da região de cauda
do epidídimo. Géis 2D (nativo 8%/nativo 12%) sem 2-
mercaptoetanol.....................................................................................................40
•
Figura 27:
Densitograma do gel nativo 8%, sem 2-mercaptoetanol, de
espermatozóides epididimário com atividade de catalase...................................41
•
Figura 28: Atividade de catalase em plasma seminal de
E. caballus.
Gel nativo
8%, com densitograma, sem 2-mercaptoetanol...................................................42
• Figura 29:
Atividade de catalase em plasma seminal de
E. caballus
. Géis 2D
(nativo 8%/nativo 12%) sem 2-mercaptoetanol....................................................43
viii
• Figura 30:
Atividade de catalase em espermatozóides maduros de
E. caballus.
Gel nativo 8%, com densitograma sem 2-mercaptoetanol...................................43
•
Figura 31:
Atividade de catalase em fluido epididimário de
E. caballus.
Gel nativo
8% com 2-mercaptoetanol....................................................................................44
• Figura 32:
Atividade de catalase em espermatozóides epididimário de
E.
caballus.
Gel nativo 8% com 2-mercaptoetanol...................................................45
• Figura 33:
Atividade de catalase em plasma seminal de
E. caballus.
Gel nativo
8% com 2-mercaptoetanol....................................................................................45
•
Figura 34:
Atividade de catalase, utilizando 50mM de H
2
O
2
, em fluido
epididimário de
E. caballus.
Gel nativo 8%, com densitograma, sem 2-
mercaptoetanol,....................................................................................................47
•
Figura 35:
Atividade de catalase, utilizando 50mM de H
2
O
2
, em fluido obtido da
região de cauda do epidídimo. Géis 2D (nativo 8%/nativo 12%) sem 2-
mercaptoetanol.....................................................................................................48
• Figura 36:
Atividade de catalase, utilizando 50mM de H
2
O
2
, em espermatozóides
epididimário de
E. caballus.
Gel nativo 8%, com densitograma, sem 2-
mercaptoetanol,....................................................................................................49
• Figura 37:
Atividade de catalase, utilizando 50mM de H
2
O
2
, em fluido obtido da
região de cauda do epidídimo. Géis 2D (nativo 8%/nativo 12%) sem 2-
mercaptoetanol.....................................................................................................50
• Figura 38:
Atividade de catalase, utilizando 50mM de H
2
O
2
, em plasma seminal
de
E. caballus.
Gel nativo 8%, com densitograma, sem 2-
mercaptoetanol,....................................................................................................51
•
Figura 39: Atividade de catalase, utilizando 50mM de H
2
O
2
, em plasma seminal.
Géis 2D (nativo 8%/nativo 12%) sem 2-
mercaptoetanol.....................................................................................................52
•
Figura 40:
Purificação de catalase. Gel nativo 8%, sem 2-
mercaptoetanol.....................................................................................................53
• Figura 41:
Purificação de catalase. Gel nativo 8%, sem 2-
mercaptoetanol.....................................................................................................53
ix
• Figura 42:
Atividade de superóxido dismutase e catalase, em fluido epididimário
de
E. caballus.
Gel nativo de poro transverso (4% - 16%), sem 2-
mercaptoetanol.....................................................................................................55
• Figura 43:
Atividade de superóxido dismutase e catalase, em espermatozóides
epididimário de
E. caballus.
Gel nativo de poro transverso (4% - 16%), sem 2-
mercaptoetanol.....................................................................................................56
•
Figura 44: Atividade de superóxido dismutase e catalase, em plasma seminal de
E. caballus.
Gel nativo de poro transverso (4% - 16%), sem 2-
mercaptoetanol.....................................................................................................57
•
Figura 45: Gráfico que representa a relação entre coeficiente angular negativo e
massa molecular..................................................................................................58
• Figura 46:
Atividade de superóxido dismutase em fluido epididimário de
E.
caballus.
Gel SDS–PAGE 12%, com densitograma, sem 2-
mercaptoetanol.....................................................................................................61
• Figura 47:
Gel nativo 8% utilizado para a purificação de superóxido dismutase e
gel SDS-PAGE 12%, sem 2-mercaptoetanol, em fluido da região de cauda
epididimário..........................................................................................................62
•
Figura 48: Gel nativo 8% utilizado para a purificação de superóxido dismutase e
gel SDS-PAGE 12%, com 2-mercaptoetanol, em fluido da região de cauda
epididimário..........................................................................................................62
•
Figura 49:
Atividade de catalase em fluido epididimário de
E. caballus.
Gel SDS–
PAGE 12%, sem 2-mercaptoetanol......................................................................63
• Figura 50:
Gel nativo 8% utilizado para a purificação de catalase e gel SDS-
PAGE 12%, sem 2-mercaptoetanol, em fluido da região de cauda
epididimário..........................................................................................................64
•
Figura 51: Gel nativo 8% utilizado para a purificação de catalase e gel SDS-
PAGE 12%, com 2-mercaptoetanol, com densitograma, em fluido da região de
cauda epididimário...............................................................................................65
•
Figura 52:
Atividade de superóxido dismutase em espermatozóides epididimário
de
E. caballus.
Gel SDS–PAGE 12%, com densitograma, sem 2-
mercaptoetanol.....................................................................................................66
x
• Figura 53:
Atividade de superóxido dismutase em espermatozóides epididimário
de
E. caballus.
Gel SDS–PAGE 12%, com densitograma, com 2-
mercaptoetanol.....................................................................................................67
• Figura 54:
Atividade de catalase em espermatozóides epididimário de
E.
caballus.
Gel SDS–PAGE 12%, sem 2-mercaptoetanol.......................................68
•
Figura 55:
Atividade de catalase em espermatozóides epididimário de
E.
caballus.
Gel SDS–PAGE 12%, com 2-mercaptoetanol.......................................68
•
Figura 56: Atividade de superóxido dismutase em plasma seminal de
E.
caballus.
Gel SDS–PAGE 12%, com densitograma, sem 2-
mercaptoetanol.....................................................................................................69
•
Figura 57:
Gel nativo 8% utilizado para a purificação de catalase e gel SDS-
PAGE 12%, sem 2-mercaptoetanol, em plasma seminal.....................................70
• Figura 58:
Atividade de superóxido dismutase em plasma seminal de
E.
caballus.
Gel SDS–PAGE 12%, com densitograma, com 2-
mercaptoetanol.....................................................................................................71
•
Figura 59: Gel nativo 8% utilizado para a purificação de catalase e gel SDS-
PAGE 12%, com 2-mercaptoetanol, em plasma seminal.....................................72
• Figura 60:
Purificação de atividade de superóxido dismutase em plasma seminal
de eqüinos. Gel nativo 8%, sem 2-mercaptoetanol..............................................72
•
Figura 61:
Purificação de atividade de superóxido dismutase em plasma seminal
de eqüinos. Gel 2D (nativo 8% - nativo 12%), sem 2-
mercaptoetanol.....................................................................................................73
• Figura 62:
Purificação de atividade de superóxido dismutase em plasma seminal
de eqüinos. Gel 2D (nativo 8% - nativo 12%), sem 2-
mercaptoetanol.....................................................................................................74
• Figura 63:
Purificação de atividade de superóxido dismutase em plasma seminal
de eqüinos. Gel SDS 12%, sem 2-mercaptoetanol..............................................75
•
Figura 64:
Modelo do estado de agregação correspondente às proteínas
purificadas de plasma seminal.............................................................................84
xi
Lista de tabelas:
• Tabela 1:
Relação do coeficiente angular negativo com proteínas de massas
moleculares conhecidas.......................................................................................58
•
Tabela 2:
Massas moleculares nativas de SOD e CAT de amostras de fluido da
região de cauda epididimária............................................................................... 59
•
Tabela 3: Massas moleculares nativas de SOD e CAT das amostras de
espermatozóides epididimário..............................................................................59
• Tabela 4:
Massas moleculares nativas de SOD e CAT das amostras de plasma
seminal.................................................................................................................59
•
Tabela 5:
Formação de agregados de proteínas com atividade SOD em fluido da
região de cauda do epidídimo..............................................................................82
• Tabela 6:
Formação de agregados de proteínas com atividade SOD em
espermatozóides da região de cauda do epidídimo.............................................82
• Tabela 7:
Formação de agregados de proteínas com atividade SOD em plasma
seminal.................................................................................................................83
xii
Sumário:
1. Introdução.................................................................................................................. 1
2. Revisão Bibliográfica
.................................................................................................3
2.1. Radicais livres e espécies reativas............................................................................3
2.1.1. Conceito e formação de radicais livres e espécies reativas...................................3
2.1.2. Espécies reativas de oxigênio em espermatozóides............................................. 6
2.2. Epidídimo como protetor do processo de maturação espermática..........................10
2.3 Espécies reativas de oxigênio e potencial fertilizante..............................................13
2.4. Sistema de defesas antioxidantes...........................................................................14
3. Objetivos
...................................................................................................................19
3.1. Objetivo Geral..........................................................................................................19
3.2. Objetivos específicos...............................................................................................19
4. Materiais e métodos
.................................................................................................20
4.1. Reagentes...............................................................................................................20
4.2. Obtenção das amostras..........................................................................................20
4.3. Detecção de atividade superóxido dismutase e catalase após eletroforeses em géis
de poliacrilamida.............................................................................................................22
4.4 Ensaios de inibição de SOD.....................................................................................24
4.5. Análise densitométrica.............................................................................................24
4.6. Determinação da massa molecular nativa e estado de agregação em condição não
desnaturante (nativa) e desnaturante................................................................................24
4.7. Purificação protéica para detecção de SOD e CAT................................................25
5. Resultados
................................................................................................................26
5.1. Detecção de atividade SOD no epidídimo e plasma seminal de eqüinos...............26
5.2. Detecção da enzima catalase no epidídimo e plasma seminal de eqüinos............38
5.3. Determinação das massas moleculares e estudo do estado de agregação de
SODs e CAT...................................................................................................................54
6. Discussão
................................................................................................................76
7. Conclusões
..............................................................................................................86
8. Referências Bibliográficas
..............................................................................................
88
1
1. INTRODUÇÃO
Um número cada dia maior de pesquisadores focalizam seu interesse nos
mecanismos que subjazem ao processo de maturação espermática e fertilização em
mamíferos. Esses estudos têm como base a hipótese de que a qualidade espermática,
em termos de motilidade e reconhecimento do ovócito, é fortemente dependente das
modificações pós-testiculares que ocorrem no epidídimo. O gradual desenvolvimento do
potencial fertilizante do espermatozóide durante o percurso epididimário oferece a
oportunidade única de investigar o que distingue o espermatozóide fértil do infértil, e
que mecanismos estão envolvidos nesta transformação. A identificação de moléculas
e/ou fatores espermáticos envolvidos no reconhecimento da zona pelúcida cresce dia a
dia (EDDY & O’BRIAN, 1994; GATTI
et al.
, 2004; SULLIVAN, 2005; COOPER, 2007;
CORNWALL
et al.
, 2007). Esses dados são importantes não só por interesse científico,
mas também por uma futura possível aplicação em problemas de infertilidade e/ou
tecnologias contraceptivas (JONES
et al.
, 2007).
O lúmen epididimário representa um meio extracelular único, onde ocorre o
processo de maturação espermática. Embora existam diversos trabalhos sobre a
interação entre macromoléculas secretadas pelo epidídimo e espermatozóides, ainda
são escassos os dados sobre como este complexo microambiente se mantém, incluindo
os mecanismos que previnem ou controlam proteínas que podem não estar na sua
forma nativa após serem secretadas. Visto que proteínas não enoveladas
podem
formar agregados citotóxicos, a existência de mecanismos de controle de radicais livres
é fundamental (CORNWALL
et al.
, 2007). Alterações na função epididimária e/ou
flutuações do microambiente epididimário são críticas para o desenvolvimento e
sobrevida do gameta nas vias seminais (COOPER & HAMILTON, 1977; HOLSTEIN,
1978; WEISSENBERG
et al
., 1994; LÓPEZ & BUSTOS, 1995; JONES
et al.
, 2007).
Evidências acumuladas nas últimas décadas indicam um aumento gradual das
patologias genito – urinárias, tais como câncer testicular; criptorquidia, entre outras
alterações do desenvolvimento e/ou da função do trato genital masculino.
Concomitantemente, tem-se observado forte declínio na qualidade do sêmen
(CARLSEN
et al.,
1992; AUGER & JOUANNET, 1997). As causas responsáveis por
este fenômeno não estão bem elucidadas, mas existe a hipótese que espécies reativas
2
de oxigênio e estresse oxidativo teriam um papel chave na etiologia destas patologias
(CARLSEN
et al
., 1992).
O papel deletério dos numerosos compostos químicos
presentes no meio ambiente também tem sido sugerido (CARLSEN
et al.,
1992).
As células espermáticas possuem capacidade limitada de resistir ao estresse
oxidativo. Os sistemas de produção enzimática são de origem citoplasmática e este é
escasso no espermatozóide maduro (AITKEN
et al
., 1994; AITKEN
et al
., 1996). No
entanto, o microambiente do trato reprodutivo masculino contém estratégias
enzimáticas e não enzimáticas que lhe permitem proteger o espermatozóide contra
xenobióticos e radicais de oxigênio, preservando sua estrutura e função (VERNET
et
al
., 2004).
Apesar de ser reconhecida a importância do epidídimo na função reprodutiva, o
fator epididimário é geralmente esquecido durante a investigação do macho infértil.
Uma aproximação diagnóstica correta demanda cuidadosa atenção não só das lesões
orgânicas como também da integridade funcional deste órgão, alvo da ação
androgênica.
Considerando que o estabelecimento dos mecanismos de geração e eliminação
de radicais livres na linha germinal masculina é um tema relevante na área da biologia e
fisiopatologia da reprodução, e tendo como base a importância do microambiente das
vias seminais na sobrevida espermática, o presente estudo focalizou-se na detecção de
atividade de enzimas antioxidantes no epidídimo e sêmen de eqüinos.
3
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Radicais livres e espécies reativas
2.1.1. Conceito e formação de radicais livres e espécies reativas
Do ponto de vista químico, um radical livre (RL) é definido como um átomo,
grupo de átomos ou molécula capaz de existir sob forma independente e que contém
um ou mais elétrons não pareados, se comportando como moléculas altamente reativas
(HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999; HICKS, 2001). Portanto, os RLs podem ser
formados pela adição ou perda de um elétron de uma substância não-radical (DRÖGE,
2002). Estes podem causar danos por reagir com diversas biomoléculas, removendo
elétrons para manter sua estabilidade. Entretanto, existem compostos igualmente
reativos aos radicais livres que não possuem elétrons não pareados na última camada
e são denominados, de maneira mais geral, espécies reativas de oxigênio (EROs) e
espécies reativas de nitrogênio (ERNs) (DRÖGE, 2002).
As EROs geralmente têm curta duração de vida e sua recombinação química é
quase imediata por ter forte tendência para estabilizar sua órbita externa, captando um
elétron de outro átomo ou molécula (RICE-EVANS & BURDON, 1993).
Uma fonte importante de RLs é o sistema de transporte de elétrons mitocondrial
(DEL MAESTRO, 1980; SOUTHORN & POWIS, 1988), sendo seu principal sítio de
formação o complexo citocromo b-ubiquinona (TYLER, 1975). Na mitocôndria, a
citocromo oxidase promove a redução completa de uma molécula de O
2
em uma
molécula de água e, para isso, são necessários quatro elétrons e quatro prótons, como
é mostrado na reação abaixo:
O
2
+ 4H
+
+ 4e
-
→ 2H
2
O
Contudo, nem sempre o oxigênio origina água diretamente. Como conseqüência
de sua configuração eletrônica, a molécula de oxigênio tem forte tendência em receber
um elétron de cada vez formando uma série de intermediários tóxicos e reativos
(MENEGHINI, 1987), tais como: o ânion superóxido (O
2
•-
), o radical hidroxil (
•
OH) e o
4
peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
). Este último não possui elétrons livres, portanto não é um
RL, no entanto é classificado como uma ERO. O H
2
O
2
é uma molécula muito reativa,
pode ser precursora de radicais
•
OH na presença de metais de transição (HICKS,
2001).
O superóxido é o primeiro intermediário formado a partir da redução incompleta
do oxigênio molecular na formação da H
2
O (HARRIS, 1995), e a partir dele podem se
formar outras EROs como
•
OH e o H
2
O
2
(ESTERBAUER
et al.
, 1986). Muitos sistemas
enzimáticos como xantina oxidase, flavina oxidases e peroxidases catalisam a redução
do oxigênio à radical superóxido (FRIDOVICH, 1976; MCCORD, 1987) (figura 1).
Figura 1: Fontes de radicais livres e sistemas antioxidantes de defesa. RE, retículo endoplasmático;
CTEM, cadeia transportadora de elétrons mitocondrial;
•
OH, radical hidroxil; O
2
•
-
, radical superóxido;
H
2
O
2
, peróxido de hidrogênio; FADH
2
, flavina adenina dinucleotídeo; CuZn-SOD, superóxido dismutase
contendo cobre e zinco; Mn-SOD, superóxido dismutase contendo manganês; NADPH, adenina
nicotinamida dinucleotídeo fosfato; CAT, catalase; GPX, glutationa peroxidase; GSH, glutationa reduzida;
GR, glutationa redutase; GSSH, glutationa oxidada.
Fonte: http://www.caymanchem.com/images/scientificIllustrations/full/cayman2070.jpg
Em condições fisiológicas, H
2
O
2
é formado na mitocôndria em função da
atividade metabólica. Tem sido mostrado que, em alguns órgãos, a atividade celular
leva à formação de H
2
O
2
, tanto pelos peroxissomos quanto por enzimas citosólicas
5
(CHANCE et al., 1979). O H
2
O
2
é gerado a partir do superóxido por meio da
dismutação, sendo esta reação catalisada pela enzima superóxido dismutase (SOD)
(figura 2) (FRIDOVICH, 1975, 1978). A isoforma da SOD presente na matriz
mitocondrial é dependente de manganês (MnSOD), enquanto a isoforma da SOD
presente no citosol é dependente de cobre e zinco (CuZnSOD) (FRIDOVICH, 1978).
Figura 2: Dismutação do radical superóxido por ação da superóxido dismutase (SOD)
Ainda que os radicais livres de O
2
representem um dos mecanismos de defesa
do organismo durante uma infecção, já que causam a lise bacteriana, um excesso na
produção dessas espécies reativas produz danos pelo estresse oxidativo (HICKS,
2001), o qual pode provocar dano mitocondrial e morte celular (LIU
et al.,
2000). Esse
tipo de estresse é definido como um desequilíbrio entre RLs e mecanismos de defesa
do organismo, que envolvem sistemas enzimáticos e diversas moléculas orgânicas,
entre as quais são incluídas algumas vitaminas como a E e C (FREI, 1999; AGARWAL
et al.
, 2003). Os substratos moleculares mais freqüentes dos RLs incluem os ácidos
graxos poli-insaturados (PUFAs) das membranas celulares, nucleotídeos, proteínas e
carboidratos (BECKMAN & AMES, 1998). A conseqüência do estresse oxidativo mais
comumente descrita na literatura científica é a lipoperoxidação (LPO). Essa oxidação
prejudica a função da membrana celular (THOMAS, 2003). A interação entre radicais
livres e lipídeos envolve reações em cadeia em três etapas: iniciação, propagação e
terminação. Essas reações em cadeia podem ser verificadas abaixo, onde o L
representa o lipídeo:
LH + OH• (ou LO•) ------------> L• + H
2
O (ou LOH) Iniciação
L• + O
2
------------> LOO•
Propagação
LH + LOO• ------------> L• + LOOH Propagação
LOO• + L•------------> LOOL
Terminação
LOO
•
+ LOO
•
-----------> LOOL +
O
2
Terminação
6
Na etapa de iniciação ocorre o seqüestro do hidrogênio do ácido graxo
insaturado da membrana celular. Tal seqüestro pode ser realizado pelo radical hidroxil
(OH•) ou pelo radical alcoxil (LO•) com conseqüente formação do radical lipídico L•. Na
propagação, o L• reage com O
2
, resultando no radical peroxil (LOO•) que, por sua vez,
seqüestra novo hidrogênio do ácido graxo insaturado, tornando-o novamente L•,
formando hidroperóxido lipídico (LOOH) e continuando a etapa da propagação. O
término da lipoperoxidação ocorre quando L• ou LOO• se propaga até se neutralizar
(FERREIRA & MATSUBARA, 1997).
Os ácidos graxos poliinsaturados encontrados nas membranas biológicas são,
particularmente, vulneráveis ao processo de iniciação e propagação devido às suas
múltiplas duplas ligações ao longo de sua cadeia. O dano oxidativo de membranas
resulta na formação de ligações cruzadas entre proteínas e fosfolipídios, destruindo o
arranjo espacial da membrana e inativando-a, irreversivelmente. O dano oxidativo
resulta também no aumento da fluidez o que irá afetar a homeostase da célula e
comprometer a integridade da mesma (SIES, 1985; CLARKSON & THOMPSON, 2000;
HONG
et al
., 2004).
2.1.2. Espécies reativas de oxigênio em espermatozóides
Segundo Fisher & Aitken (1997) as células germinais masculinas, em seus vários
estados de diferenciação, possuem o potencial
de gerar EROs. As EROs cumprem
importantes funções na fisiologia espermática normal. Entretanto o desequilíbrio entre
sua produção e degradação pode induzir danos na integridade das membranas
espermáticas, diminuição da motilidade e viabilidade dos espermatozóides e
conseqüentemente infertilidade (BAUMBER
et al.
, 2000; BALL
et al.
, 2002).
O espermatozóide pode gerar EROs através da cadeia transportadora de
elétrons, na mitocôndria, e pelo sistema β adenina nicotinamida dinucleotídeo fosfato
(NADPH) oxidase, presente na membrana plasmática (AITKEN
et al.,
1992). Similar a
NADPH oxidase presente em outros tipos celulares, a oxidase espermática gera O
2
•-
,
que é dismutado, espontaneamente ou na presença de SOD, a H
2
O
2.
Acredita-se que
esta geração espontânea de radicais livres é mediada por uma NADPH oxidase ligada
à membrana cuja função seria gerar peróxidos necessários para servir como aceptores
7
de hidrogênio para glutationa peroxidase (GPX) na indução da condensação da
cromatina (AITKEN & VERNET, 1998). O O
2
•-
, devido a sua baixa reatividade e curta
meia vida, é pouco prejudicial, mas ao reagir com radicais tióis (RS·) pode produzir
espécies mais tóxicas e lipo-oxidação (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1989). O H
2
O
2
é
relativamente mais estável e tem um potencial oxidante maior já que, sem carga, pode
livremente atravessar membranas celulares (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1989).
Postula-se que os espermatozóides humanos provavelmente contêm uma forma
reduzida de NADPH oxidase, similar a encontrada em leucócitos fagocíticos (BABIOR,
1999; ARMSTRONG
et al.
, 2002). Essa hipótese é baseada principalmente em duas
observações. Primeira: adicionando doses farmacológicas de NADPH em suspensões
espermáticas purificadas, ocorre um aumento na produção de O
2
•-
, que está associado
com redução da função espermática (AITKEN
et al.
, 1997; RICHER & FORD, 2001;
O’FLAHERTY
et al.
, 2003). Segunda: esse aumento pode ser inibido pela SOD, que
protege o espermatozóide contra efeitos tóxicos de NADPH (AITKEN
et al.
, 1997;
AITKEN
et al.
, 1992; GRIVEAU & LE LANNOU, 1997). A enzima citoplasmática glicose-
6-fosfato desidrogenase (G6PD) controla a taxa do fluxo de glicose e a disponibilidade
intracelular de NADPH através da via hexose-monofosfato. Esta via, alternadamente, é
utilizada como fonte de elétrons pelo espermatozóide para geração de EROs através da
NADPH oxidase (NOX 5) (SALEH & AGARWAL, 2002; AITKEN
et al.
, 1997). O papel
da NOX 5 na produção de EROs pelo espermatozóide não é bem elucidado, embora a
produção de EROs esteja relacionada com o espermatozóide imaturo e defeituoso pela
extrusão incompleta de citoplasma (AITKEN
et al.
, 1994; GAVELLA
et al.
, 1995; ZINI
et
al.
, 1998; HUSZAR
et al
., 1998; GIL-GUZMAN
et al.
, 2001).
Os espermatozóides são células extremamente vulneráveis ao ataque oxidativo,
já que contêm altas concentrações de PUFAs. Estas células são constantemente
expostas a espécies reativas, geradas por neutrófilos contaminantes ou por elas
mesmas (AITKEN
,
1995). A membrana plasmática das células espermáticas é rica em
PUFAs, particularmente ácido decanohexadecenóico, o qual apresenta seis duplas
ligações por molécula. Estes compostos contribuem à fluidez da membrana plasmática,
atributo necessário para eventos de fusão de membranas, associados à fertilização. A
maioria dos PUFAs de membranas apresenta ligações duplas, separadas por grupos
metilenos. A ligação carbono–hidrogênio desta configuração é fraca, fácil de reagir.
8
Quando isso ocorre, o radical produzido é estabilizado por rearranjo das duplas
ligações, que formam um radical dieno conjugado que pode ser oxidado. Dienos
conjugados reagem rapidamente com o oxigênio formando um radical peroxil-lipídico
(LOO
•
), o qual é um poderoso iniciador da cascata de LPO, já que retira átomos de
hidrogênio de outras moléculas lipídicas para formar hidroperóxidos lipídicos (LOOH).
Os hidroperóxidos lipídicos são estáveis sob condições fisiológicas, porém quando
contatam metais de transição, como sais de ferro e cobre, geram radicais alcoxil e
peroxil, que continuam a reação em cadeia na membrana, propagando o dano através
da célula (HALLIWELL, 1990; AGARWAL
et al
., 2003). Assim, quando as EROs atacam
as duplas ligações presentes nos ácidos graxos insaturados inicia-se uma cascata de
LPO que conduz uma perda de fluidez, integridade da membrana e,
conseqüentemente, um decréscimo do potencial fertilizante dessas células (ALVAREZ
& STOREY, 1995; AITKEN
et al.
, 1998). Segundo Sanoka & Kurpisz (2004), a
propagação da LPO vai depender da estratégia antioxidante empregada pelo
espermatozóide.
Dois tipos de danos parecem caracterizar a linha germinal masculina: erro de
replicação e fragmentação do DNA. Este último é particularmente freqüente em
ejaculados de indivíduos sub-férteis (IRVINE
et al.
, 2000). A fragmentação do DNA,
induzido por EROs, que causa quebras da dupla hélice e dano oxidativo de bases, pode
acelerar o processo de apoptose, conduzindo a um declínio na concentração
espermática e qualidade do sêmen (AGARWAL
et al.
, 2003). Apesar da fragmentação
do DNA não constituir por si só uma mutação, considera-se uma mudança pró-
mutagênica, já que tem o potencial de gerar mutações na descendência como
conseqüência de reparação inadequada. Tais danos vêm de várias fontes potenciais,
entre elas: estresse oxidativo, apoptose, deficiências nos processos de recombinação
e/ou no empacotamento da cromatina. Além da fragmentação do DNA tem-se descrito
modificações de bases nitrogenadas, produção de sítios com bases livres, deleções e
rearranjos cromossômicos (DURU
et al.
, 2000).
O paradoxo é que os próprios espermatozóides são conhecidos como produtores
de EROs, moléculas que parecem ser chave moduladora de mecanismos de
transdução de sinais de eventos prévios à fertilização, interferindo assim
fisiologicamente na regulação de funções espermáticas (AITKEN
et al
., 1995). Diversos
9
estudos indicam que baixas concentrações de EROs têm um efeito positivo nos
processos de capacitação espermática (DE LAMIRANDE & GAGNON, 1993; GRIVEAU
et al.
, 1994), reação acrossômica (DE LAMIRANDE & GAGNON, 1993; GRIVEAU & LE
LANNOU,1997), hiperativação (DE LAMIRANDE & GAGNON, 1993) e interação
gamética (AITKEN
et al
., 1995; 1998), sugerindo que as vias de sinalização envolvidas
nesses processos estariam sob controle redox.
A suscetibilidade das células germinativas masculinas ao estresse oxidativo se
conhece desde longa data, a partir dos trabalhos pioneiros de Macleod (1943) que
mostraram que espermatozóides humanos incubados
in vitro,
sob uma alta tensão de
oxigênio, perdiam sua motilidade via algum mecanismo que podia ser revertido
adicionando catalase no meio de incubação. Jones
et al
. (1979) demonstraram que este
mecanismo envolvia a indução de dano peroxidativo na membrana espermática.
Estudos subseqüentes geraram evidências de produção de EROs em espermatozóides
humanos e demonstraram aumento significativo dessa produção em casos de
infertilidade masculina (AITKEN
et al.,
1998).
Além dos efeitos citotóxicos de EROs gerados intracelularmente, os
espermatozóides podem sofrer danos por EROs geradas por leucócitos infiltrados no
ejaculado, células germinativas precursoras ou células espermáticas anormais (DE
LAMIRANDE & GAGNON, 1995; PLANTE, 1994). Tais danos são particularmente
significantes no contexto de terapia de concepção assistida. Contudo, a significância
clínica da leucocitoespermia (definida pela OMS como a presença de leucócitos
peroxidase positivos em uma concentração maior que 1x 10
6
por mL de sêmen) é ainda
tema de controvérsia (AGARWAL
et
al.
, 2003). Leucócitos peroxidase positivos incluem
leucócitos polimorfonucleares (50-60% dos leucócitos seminais) e macrófagos (que
representam 20-30%). Leucócitos peroxidase positivos no sêmen são aportados pela
próstata e vesículas seminais. Os leucócitos ativados podem produzir uma quantidade
100 vezes maior de EROs que os não ativados. Estes podem ser ativados em reposta a
uma variedade de estímulos incluindo inflamação e infecção (PASQUALATTO
et al
.,
2000). Os leucócitos ativados aumentam a produção de NADPH pela via hexose-
monofosfato (AGARWAL
et
al.
, 2003).
Não está claro na literatura se a interação entre leucócitos e espermatozóides
implica um efeito estimulatório direto ou indireto, porém existem dados que sugerem
10
que a presença de leucócitos aumenta a produção de EROs pelo espermatozóide, quer
seja por contato direto entre ambas as células ou por liberação de produtos solúveis
dos leucócitos (AGARWAL
et
al.
, 2003).
Os espermatozóides possuem capacidade limitada de resistir ao estresse
oxidativo. Os sistemas de produção enzimática são de origem citoplasmática e este é
escasso no espermatozóide maduro. Além disso, o citoplasma espermático residual
está concentrado em uma região específica, a gota citoplasmática, localizada na região
proximal da peça intermediária nos espermatozóides imaturos, e na região distal da
peça intermediária nos espermatozóides obtidos da região do corpo do epidídimo,
desaparecendo nos espermatozóides maduros. Esta localização, altamente
compartimentalizada, não favorece a proteção da membrana plasmática dos diferentes
domínios do espermatozóide (AITKEN, 1994).
Dois fatores protegem o espermatozóide do estresse oxidativo, o
empacotamento característico do DNA e a presença de antioxidantes nas secreções do
trato reprodutivo masculino (TWIGG
et al.
, 1998).
2.2. Epidídimo como protetor do processo de maturação espermática
O epidídimo forma parte do trato reprodutivo do macho e está anatomicamente
conectado à borda medial do testículo, separando-se parcialmente a superfície lateral
deste. O conduto epididimário é uma estrutura altamente enovelada que em eqüinos
pode alcançar em torno de 70m de comprimento. Os espermatozóides permanecem no
conduto epididimário entre 10-15 dias (dependendo da espécie), e durante esse
período experimentam uma série de complexas modificações nas suas características
físicas, bioquímicas, morfológicas e fisiológicas, que são reunidas sob a denominação
genérica de maturação espermática. Algumas destas remodelações são necessárias
para que se produza o reconhecimento entre gametas homólogos e a fertilização;
outras são requeridas para estabilizar e proteger o espermatozóide durante seu trajeto
pelas vias seminais; existindo também aquelas subseqüentes do envelhecimento
celular (LÓPEZ, 1996).
11
Convencionalmente, o epidídimo divide-se em três regiões macroscopicamente
bem definidas, cabeça, corpo e cauda (MCKINNON & VOSS 1993; LÓPEZ, 1996). A
cabeça do epidídimo normalmente é subdividida em regiões proximal e distal (figura 3).
Figura 3: Morfologia do epidídimo eqüino. Regiões de cabeça proximal (1), cabeça distal (2), corpo (3) e
cauda (4).
As características morfológicas, limites, componentes e funções de cada uma
delas podem variar entre espécies. Em eqüinos, como em humanos, a região proximal
da cabeça é parte do extenso sistema de condutos eferentes. A cauda epididimária é
inconspícua no homem, no entanto em grande parte das espécies é uma estrutura
bulbosa (FOURNIER-DELPECH & THIBAULT, 1993).
Vários tipos celulares encontram-se no epitélio epididimário: células principais,
ciliadas (exclusivamente na região proximal da cabeça), basais, apicais e leucócitos
intra-epiteliais. As células principais possuem propriedades de absorção, secreção e
síntese de vários compostos do fluido epididimário (LÓPEZ
et al.
, 1989; FOURNIER
DELPECH & THIEBAULT, 1993; RETAMAL
et al.
, 2000). Na região proximal, há uma
considerável absorção de água e fluido provenientes da
rete testis
; nas regiões de
cabeça e corpo os espermatozóides adquirem o potencial fertilizante; e a região de
cauda é o local onde estas células ficam armazenadas, mantendo importantes reservas
que representam o conteúdo de mais que dez ejaculados (FOURNIER-DELPECH &
THIBAULT, 1993). Estruturalmente, o retículo endoplasmático rugoso abundante e
membranas do sistema de Golgi muito desenvolvidas refletem as propriedades de
12
síntese e secreção protéica das células epermáticas (ROBAIRE & HERMO, 1988;
LÓPEZ
et al.
, 1989).
O fluido epididimário é hiperosmótico e difere em composição do plasma
sangüíneo, do fluido testicular e do plasma seminal. Entre os constituintes orgânicos do
fluido epididimário, além de L-carnitina, mioinositol, glicerilfosforilcolina, ácido siálico,
esteróides e outros, encontram-se diferentes íons e várias proteínas como transferrina,
albumina, clusterina, imobilina, metaloproteínas e enzimas (glicosidases,
glicosiltransferases, glutationa-peroxidase, superóxido-dismutase, transpeptidases,
entre outras) (SETCHELL
et al.
, 1994). As proteínas detectadas neste fluido podem ser
de origem epididimária ou ter origem testicular, chegando via fluido da
rete testis
ao
lúmen deste órgão (FOUCHÉCOURT
et al.
, 2000). A ação de cada uma destas
moléculas na fisiologia do epidídimo não está bem definida, mas tem-se sugerido que
poderiam estar envolvidas na osmoregulação, na maturação espermática e no
metabolismo de espermatozóides e células epiteliais epididimárias (SETCHELL
et al.
,
1994).
Os espermatozóides epididimários são mantidos em estado quiescente por
fatores do fluido luminal. A produção e movimento constantes do fluido proveniente dos
testículos, a corrente que produzem os cílios e as microvilosidades das células
epiteliais, a reabsorção de água na região proximal do conduto e as contrações
peristálticas das células mióides e da musculatura lisa que envolve o epitélio
epididimário, facilitam o transporte dos gametas (TURNER, 1979).
Os espermatozóides estão expostos a um microambiente em constante
transformação como resultado da atividade de absorção e secreção das células
epididimárias. Este meio oferece as condições que permitem tanto o bom
desenvolvimento do processo de maturação espermática como a viabilidade destas
células (LÓPEZ
et al
., 1989; 1997). Isto inclui uma rápida eliminação de metabólitos
tóxicos e a proteção do espermatozóide contra dano oxidativo, xenobióticos ou agentes
químicos tóxicos (HINTON
et al
. 1995).
O epidídimo utiliza uma série de mecanismos de proteção ao espermatozóide,
entre eles: barreiras estruturais, como a existência de uma barreira hemato-epididimária
formada pela zona oclusiva da superfície apical das células epiteliais (HINTON
et al
.
1995; LÓPEZ
et al
., 1997) e a produção de proteínas que protegem da proteólise, como
13
a HE4, um polipeptídeo ácido, rico em cisteína (10kDa), que se detecta na região de
corpo e cauda epididimária. O gene que codifica essa proteína contém uma seqüência
nucleotídica com inibidores de proteases associadas a secreções de mucosas humanas
(HINTON
et al
., 1995); ou as proteínas CRES da superfamília de inibidores de cisteína -
proteases. Estas proteínas podem proteger o espermatozóide e/ou o epitélio
epididimário de dano proteolítico resultante da liberação prematura de enzimas
acrossomais durante o armazenamento dos espermatozóides. O epidídimo emprega
estratégias poderosas e sofisticadas (enzimáticas e não enzimáticas) para controlar a
geração de EROs e sua captura (HINTON
et al
., 1995).
Vários sistemas antioxidantes de defesa têm sido estudados no fluido
epididimário de mamíferos (HINTON
et al
, 1995). Estes incluem glutationa peroxidase
(GPX), superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT), enzimas que fisiologicamente
participam do balanço entre a produção de ROS e sua neutralização (KANKOFER
et
al
., 2005). O O
2
•
-
é convertido através da SOD a H
2
O
2
. As enzimas GPX e CAT
convertem o H
2
O
2
em água e oxigênio, eliminando as EROs.
Alternativamente ambos O
2
•
-
e H
2
O
2
podem ser neutralizados por antioxidantes
não enzimáticos, como glutationa, ácido ascórbico, tocoferol e selênio (FRIDOVICH,
1978; MRUK
et al
., 2002). Nos últimos anos, tem sido postulada (em camundongos) a
participação de uma indolamina dioxigenase no balanço geração / reciclagem de EROs
no epidídimo (VERNET
et al
., 2004).
2.3 Espécies reativas de oxigênio e potencial fertilizante
Alguns trabalhos têm demonstrado alta concentração de EROs no sêmen de 25-
40% dos homens inférteis (SIKKA, 2001) e ocorrência de LPO associada a problemas
de infertilidade (AGARWAL
et al
., 2003).
A presença de altos níveis de EROs no sêmen provoca um desequilíbrio entre
sua produção e degradação por antioxidantes, que poderia induzir anormalidades
bioquímicas e/ou fisiológicas com subseqüente disfunção espermática ou morte celular
(AITKEN & FISHER, 1994). Em outras palavras, o balanço entre a produção e
eliminação de EROs (no tempo e local exato) é crucial na aquisição do potencial
fertilizante do gameta masculino.
14
No contexto da reprodução humana, a produção excessiva de EROs pode
sobrepassar as estratégias de defesa antioxidante do sêmen causando estresse
oxidativo. Todos os componentes celulares do espermatozóide, incluindo lipídeos,
proteínas, ácidos nucléicos e açucares são alvos potenciais ao estresse oxidativo (DE
LAMIRANDE
et
al.
, 1997; SIKKA, 2001). A extensão do dano vai depender não só da
natureza e quantidade de EROs, mas também da duração da exposição a estes
radicais e de fatores extracelulares como temperatura, tensão de oxigênio e
composição do meio no qual a célula está imersa (AGARWAL
et al
., 2003).
Como foi mencionado, a presença de antioxidantes nas secreções do trato
reprodutivo masculino protege o espermatozóide do estresse oxidativo (TWIGG
et al.
,
1998). SOD, CAT e GPX têm sido detectadas no plasma seminal de algumas espécies.
O plasma seminal contém vitaminas E e C, ascorbatos, uratos, hipotaurina e ácido
úrico, antioxidantes que contribuem significantemente para a proteção do
espermatozóide (DE LAMIRANDE
et al.,
1995; VAN OVERVELD
et al.,
2000). Uma
outra estratégia de defesa antioxidante é a união de metais iônicos, ferro e cobre que
impedem a iniciação da reação em cadeia (SIES, 1993)
O nível de antioxidantes no plasma seminal de indivíduos inférteis é
significativamente menor que aquele dos indivíduos férteis. Não obstante, o nível
patológico de EROs detectado no plasma seminal é principalmente conseqüência de
uma produção aumentada destas espécies do que produto de uma capacidade
antioxidante reduzida (AGARWAL
et al
., 2003).
2.4. Sistema de defesa antioxidante
Os seres vivos dispõem de mecanismos protetores para evitar o acúmulo de
EROs, que incluem mecanismos enzimáticos e não enzimáticos (Figura 1). As
principais enzimas antioxidantes são SOD, CAT e GPX. Essas enzimas evitam o
acúmulo de O
2
•
-
, de H
2
O
2
e a conseqüente produção de
•
OH, contra o qual não existe
nenhum
sistema enzimático de defesa. Existem substâncias que neutralizam a ação do
•
OH, levando à formação de produtos menos tóxicos. As substância que neutralizam os
RLs na fase de iniciação ou de propagação da LPO, levando à formação de produtos
menos tóxicos são denominados
scavengers
, enquanto aquelas que atuam absorvendo
15
a energia de excitação dos RLs, neutralizando-os, são chamados de
quenchers
(MRUK, et al., 2002).
As defesas não enzimáticas incluem os antioxidantes lipofílicos (tocoferóis,
carotenóides e bioflavonóides) e hidrofílicos (glutationa e ascorbato) (HALLIWELL &
GUTTERIDGE, 1999).
Glutationa Peroxidase (GPX)
Entre as diferentes enzimas antioxidantes encontradas em células eucarióticas, a
glutationa peroxidase (GPX EC 1.11.1.9), descoberta por Mills em 1957, ocupa uma
posição peculiar na cascata de eventos de controle de ROS (MILLS, 1960). Diferente
da catalase (CAT), que somente utiliza peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) como substrato e
funciona quando sua concentração está acima dos níveis fisiológicos, a GPX usa
diferentes substratos, como peróxidos orgânicos, em adição ao H
2
O
2
, e atua mesmo em
pequenas concentrações, gerando H
2
O como produto. Portanto, a atividade GPX
representa a primeira resposta protetora para pequenas concentrações de H
2
O
2
sob
condições fisiológicas normais (DREVET, 2006).
Há dois tipos de GPX:
1) A que utiliza o selênio como cofator, encontrada tanto na mitocôndria como
no citosol;
2) A que não depende de selênio, encontrada no citosol e responsável pela
metabolização de hidroperóxidos orgânicos.
A GPX catalisa a reação de hidroperóxidos com a glutationa reduzida (GSH)
para formar glutationa oxidada (GSSG) e produto de redução do hidroperóxido (figura
4A). Fisiologicamente, a GPX atua acoplada a enzima glutationa redutase (GR) que,
por sua vez, catalisa a redução de GSSG, usando NADPH como coenzima (figura 4B)
(MILLS, 1960; MAIORINO
et al
., 1990).
Figura 4:
(A) Reação catalisada pela GPX. O substrato também pode ser outros hidroperóxidos além de
do H
2
O
2
. (B) Reação de redução da GSSG pela GR, usando NADPH como coenzima.
16
A família de proteínas glutationa peroxidase é dividida em cinco classes: GPX1 a
GPX5 (CHU, 1994, DREVET, 2006), segundo sua seqüência primária, especificidade
por substrato e localização subcelular.
No trato reprodutor masculino de mamíferos, tem se detectado GPX1, GPX3,
GPX4, GPX5. Falhas na expressão de GPX em espermatozóides foram relacionadas
com infertilidade em humanos (IMAI
et al
., 2001, DREVET, 2006).
A GPX1 é a principal forma celular de GPX encontrada em todos os tipos
celulares. GPX1 é encontrada no testículo, próstata, vesículas seminais e epidídimo
(ZINI & SCHLEGEL, 1997). A GPX3, também conhecida com GPX de plasma, é
principalmente expressada em rins, porém há níveis consideráveis de GPX3 no
epidídimo e vaso deferente (SCHWAAB
et al.,
1995). No epidídimo o comportamento
dessa enzima é peculiar. Na região de cabeça epididimária, onde sua expressão é
muito baixa, a GPX3 é secretada, enquanto que na cauda, principal sítio de expressão
em epidídimo de camundongo, a proteína permanece no citosol das células epiteliais
(SCHWAAB
et al.,
1998). A GPX4 pode ser encontrada livre no citosol ou ligada a
membranas em muitos tecidos de mamíferos. O testículo exibe alta atividade de GPX4.
Em espermatozóides epididimários de ratos, GPX4 é encontrada na cabeça e na peça
intermediária dos espermatozóides. Além disso, essa enzima também é encontrada no
núcleo espermático (GODEAS, 1997). A GPX5, isolada inicialmente do trato reprodutor
masculino (GHYSELINK & DUFAURE, 1990), se expressa na região de cabeça
epididimária (FAURE
et al.,
1991), é secretada no lúmen epididimário (VERNET
et al.,
1997) e pode ser encontrada como proteína solúvel no fluido ou fracamente ligada a
membranas espermáticas e/ou aos epididimossomas (REJRAJI
et al
., 2002).
Superóxido dismutase (SOD)
As superóxidos dismutases (SODs, EC 1.15.1.1) pertencem à família de
metaloenzimas que catalisam a dismutação do ânion superóxido (O
2
-
) gerando peróxido
de hidrogênio (H
2
O
2
) e oxigênio (O
2
) (figura 2)
.
Essa reação pode acontecer
espontaneamente em condições fisiológicas, porém quando catalisada pela SOD a
velocidade de dismutação é 10
4
vezes maior (SOUTHORN & POVIS, 1988).
17
A descoberta da atividade de SODs foi reportada em 1968-1969 por McCord e
Fridovich (MCCORD & FRIDOVICH , 1968; MCCORD & FRIDOVICH, 1969), mas a
proteína já tinha sido descoberta antes de conhecer sua função. Mann e Keilin (MANN
& KEILIN, 1938 - citado por MCCORD, 2005) purificaram essa proteína de sangue de
fígado bovino, 30 anos antes, como uma proteína ligante de cobre de função
desconhecida. Essa proteína com massa molecular em torno de 34kDa (MCCORD &
FRIDOVICH, 1969) foi chamada de eritrocupreína ou hepatocupreína ou, mais tarde,
citocupreína. Essa purificação foi baseada somente no conteúdo de cobre. O
superóxido, substrato para SODs, foi descoberto na década de 30 por Linus Pauling
(PAULING, 1979 – citado por MCCORD J.M., 2005). Knowles
et al
., em 1969
(KNOWLES
et al
., em 1969 – citado por McCORD J.M., 2005) mostrou que a enzima
xantina oxidase poderia, de fato, produzir superóxido. McCord e Fridovich
demonstraram que a proteína ligante de cobre de Mann e Keilin poderia cataliticamente
eliminar o radical livre descrito por Pauling.
A família de SODs compreende enzimas contendo cobre e zinco (CuZn-SOD)
(MCCORD & FRIDOVICH, 1969), manganês (Mn-SOD) (KEELE
et al
., 1970); ferro (Fe-
SOD) (YOST E FRIDOVICH, 1973) ou níquel (Ni-SOD) (YOUN
et
al.
, 1996) em seus
sítios ativos. Também tem sido descrita uma SOD extracelular (EC-SOD), a qual é uma
glicoproteína homotetrâmera com alta afinidade para sulfato de heparina (TIBELL
et al.
,
1993). Presumivelmente sua função é de captura de O
2
•
-
que é liberado da superfície
das células (FRIDOVICH, 1998).
As enzimas CuZn-SODs têm Cu e Zn em seus sítios ativos. Durante o ciclo
catalítico, o Cu sofre mudanças na sua camada de valência, enquanto que o zinco
possui um papel principalmente estrutural. A CuZn-SOD citosólica é um homodímero
(TAINER
et al
.,1982). CuZn-SODs são encontradas em células eucarióticas, em
bactérias gram-negativa, em plastídeos de plantas e na matriz extracelular de tecidos
de mamíferos.
As enzimas Mn-SODs são ativadas seguindo o mesmo princípio da ativação de
CuZn-SODs, no entanto elas podem ser dímeras ou tetrâmeras. Elas contêm uma
unidade de Mn (III) por subunidade em sua estrutura (WAGNER
et al.
, 1993).
SODs contendo níquel (Ni-SODs) são homotetrâmeras e foram descritas de
Streptomyces griseus
, que também contém FeSOD homotetrâmera. A Ni-SOD possui
18
uma subunidade com massa molecular 13kDa, enquanto que Fe-SOD possui 22kDa
(FRIDOVICH, 1998). Em mamíferos, há três isoenzimas SOD, a citosólica dímera
CuZn-SOD, a Mn-SOD que está presente na matriz mitocondrial, e a extracelular
tetrâmera EC-SOD (PEEKER
et al
., 1997).
Catalase (CAT)
A catalase (CAT EC 1.11.1.6) decompõe 2H
2
O
2
em água e O
2
(figura 5) (AGAR
et al
., 1986).
Figura 5: Reação de decomposição do peróxido de hidrogênio pela catalase.
Essa enzima está presente em todos os tipos celulares de mamíferos e está
localizada, principalmente, nos peroxissomas. Embora ela tenha sido uma das primeiras
enzimas isoladas e purificadas (CHANCE, 1947), sua regulação e função fisiológica são
pouco compreendidas. Experimentos com eritrócitos sem CAT evidenciaram que essa
enzima é a principal linha de defesa contra H
2
O
2
(MUELLER
et al
., 1997). As CATs de
mamíferos são proteínas homotetrâmeras com massa por subunidade de
aproximadamente 60kDa e contém ferro na sua estrutura. Essas enzimas são mais
eficientes quando relacionadas com concentrações relativamente altas de H
2
O
2
devido
a sua constante de afinidade (Km) baixa (REID
et al
., 1981, FRIDOVICH, 1998).
A presença dessa enzima em espermatozóides foi demonstrada em humanos e
ratos (TRAMER
et al.,
1998). A CAT tem sido detectada também no conteúdo luminal
do trato reprodutivo (ZINI
et al.,
1993).
19
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral:
Analisar a presença de sistema antioxidante no epidídimo e sêmen de eqüinos
(
E. caballus).
3.2. Objetivos Específicos:
Verificar a presença da atividade de catalase (CAT) e isoformas de superóxidos
dismutases (SODs) no epidídimo (fluido e espermatozóides) e no sêmen de eqüinos;
Caracterizá-las verificando as massas moleculares e o estado de agregação.
20
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Reagentes:
Os reagentes utilizados foram obtidos da: Bio Rad (Hercules, CA, USA) [ácido
etilleno-diamina-tetra-acético (EDTA), acrilamida, persulfato de amônio, N,N,N’,N’-
Tetramethylethylenediamine (TEMED), Tris, glicina, padrões de massa molecular
conhecida para SDS-PAGE]; Sigma (St. Louis, MO, USA) [ 2- mercapto etanol, Bis
Acrilamida, Azul de Bromofenol, Azul de Coomassie R-250, Azul Brilhante Coomassie
G, Triton X-100, Nitroblue Tetrazolium (NBT
2+
), Riboflavina, Cianeto de potássio,
Peroxidase, 3,3’-diaminobenzidina]; Calbiochen (San Diego, CA, USA) [Dodecil Sulfato
de Sódio]; reagentes de uso geral como ácido clorídrico, glicerol, metanol, etanol,
fosfato de potássio monobásico, fosfato de potássio dibásico foram obtidos da Merck,
SA (SP, Brasil) ou VETEC (RJ, Brasil).
4.2. Obtenção das amostras:
Os epidídimos utilizados foram aproveitados de castrações de animais sadios,
sexualmente maduros, de Haras da Região Norte Fluminense – RJ. As castrações
cirúrgicas foram realizadas utilizando procedimentos de rotina. Os epidídimos foram
cuidadosamente dissecados, retirando-se o tecido conjuntivo adjacente, e divididos em
quatro regiões: cabeça proximal, cabeça distal, corpo e cauda (figura 6). Estas regiões
epididimárias foram fragmentadas em soro fisiológico pH 7,2, em gelo. O conteúdo
luminal, obtido por filtração em gaze, foi centrifugado a 700
g
por 30 minutos a 4ºC
(LÓPEZ
et al.
, 1987). As amostras de fluido epididimário foram novamente
centrifugadas a 17000
g
durante 30 minutos a 4ºC. O sobrenadante e os
espermatozóides foram devidamente aliquotados, identificados e estocados a –20ºC.
Para obtenção das proteínas, os espermatozóides foram lavados em PBS pH
7.0, sonicados em um equipamento Sonic Dismembrator 60 de alta intensidade (20 W)
durante 3 minutos [6 ciclos de 30 segundos cada] e centrifugados a 17000
g
(4 ºC) por
30 minutos. Os sobrenadantes foram armazenados a -20ºC.
21
Figura 6: Diagrama mostrando as diferentes regiões do epidídimo: cabeça proximal (1); cabeça distal (2);
corpo (3); cauda(4).
O sêmen foi coletado com o auxílio de uma vagina artificial modelo Hannover, de
garanhões adultos sadios entre 3 e 12 anos de idade (figura 7).
Figura 7: Obtenção da amostra de sêmen.
Após a remoção, por filtração, da fração gelatinosa, o sêmen foi centrifugado a
500
g
por 15 minutos a 4ºC, para separar os espermatozóides do plasma seminal. Este
foi novamente centrifugado a 17000 g e armazenado a -20ºC. Os espermatozóides
foram lavados e sonicados como já descrito para os espermatozóides epididimários,
para extrair as proteínas.
1
2
3
4
22
4.3. Deteção de atividade superóxido dismutase e catalase após eletroforeses em
géis de poliacrilamida:
Ensaios Eletroforéticos:
Em todos os experimentos, a migração eletroforética foi realizada sob uma
tensão de 90 V durante a passagem pelo gel concentrador e 110 V durante a migração
pelo gel separador.
Géis Unidimensionais (1D):
As amostras de espermatozóides, fluido de todas as regiões epididimárias,
plasma seminal e espermatozóides maduros foram submetidas a eletroforeses
unidimensionais em mini-géis de poliacrilamida (PAGE) SDS 12% (v/v) (LAEMMLI,
1970) e Nativo 8% (v/v), com e sem 2-mercaptoetanol. Foi acrescentado nas amostras
uma solução salina contendo NaCl 400mM, K
2
HPO
4
8mM. Após a migração, os géis
foram processados para detecção da atividade SOD, CAT e corados com azul de
Coomassie R-250.
Géis Bidimensionais (2D)
(SUN & PAN, 1999; DIAS, 2002):
Foram realizados géis 2D nativo 8% - nativo 12% e nativo 8% - SDS 12%.
Primeiramente, foram feitos géis de poliacrilamida (PAGE) nativos 8% (v/v) com as
amostras de plasma seminal, espermatozóides e fluido epididimário. Um volume de
500µL de cada amostra foi depositado em um poço de 2,8 cm para a migração
eletroforética (Nativo 8%). Uma vez completada a eletroforese, tiras verticais de 0,7 cm
de largura foram cortadas do gel. Foi utilizada uma tira para detecção da atividade de
SOD, uma para detecção da atividade CAT, outra para corar com azul de Coomassie R-
250 e o restante foi incubado em tampão de amostra 2X, por 20 minutos a temperatura
ambiente, para a realização das segundas dimensões. Após esse período, a tira foi
inserida no aparelho de eletroforese já contendo o gel separador (Nativo 12%) e o gel
concentrador previamente polimerizados, tomando-se cuidado para não deixar formar
23
bolhas entre a tira e o gel concentrador. Logo, os géis foram processados para
detecção enzimática, e corado com azul de Coomassie R-250. As eletroforeses em
condições nativas foram realizadas sob condições de refrigeração.
Detecção da atividade de superóxido dismutase:
A atividade de SOD foi determinada segundo Beauchamp e Fridovich (1971).
Os géis unidimensionais nativo 8% e SDS 12%; e bidimensionais nativo 8% -
nativo 8% e nativo 8% - SDS 12%, com e sem 2-mercaptoetanol, foram embebidos por
30 minutos, na ausência de luz, em uma solução de incubação contendo 50mM de
tampão fosfato de potássio pH 7.8, 1mM de EDTA, 0,05mM de riboflavina, 0,1mM de
NBT
2+
, 0,3% de TEMED, obtendo um volume final de 30 mL.
Os géis com SDS, antes de serem embebidos na solução de reação, foram
lavados com 2,5% Triton X-100 diluídos em H
2
O por 2h e, posteriormente, com H
2
O
destilada (3X de 10 minutos). Após 30 minutos de incubação em local escuro, os géis
foram expostos à luz fraca para visualizar a reação enzimática. Durante a iluminação, a
riboflavina, reduzida fotoquimicamente, reduz o O
2
a O
2
•
-
, e este reduz o
NBT
2+
para
seu formazana roxo. A SOD intercepta o fluxo fotoquímico de O
2
•
-
criando bandas
acromáticas contra o fundo roxo do formazana.
Detecção da catalase:
A atividade foi detectada segundo a técnica de Clare
et al.
(1984). Os géis foram
incubados com 50µg/ml de peroxidase em 50mM de tampão fosfato, pH 7.0, por 45
minutos. Adicionou-se H
2
O
2
(5mM) e o gel permaneceu incubado por mais 10 minutos.
Logo após, o gel foi lavado com H
2
O destilada e incubado em 50mM de tampão fosfato,
pH 7.0 contendo 0.5mg/ml de 3,3’-diaminobenzidina até que a atividade enzimática
aparecesse. A 3,3’-diaminobenzidina oxidada pelo H
2
O
2
cria um formazana laranja. A
CAT intercepta essa reação de oxidação formando bandas acromáticas contra o fundo
laranja do formanzana.
24
4.4. Ensaios de inibição de CuZn-SOD:
Para determinação de isoformas CuZn-SOD e Mn-SOD os géis foram incubados
em uma solução para inibição de CuZn-SOD contendo 50mM de tampão fosfato de
potássio pH 7.8, 1mM de EDTA, 0,3% de TEMED, 0,05mM de riboflavina, 0,1mM de
NBT
2+
, onde foram adicionados: 1) 3mM de KCN e 5mM H
2
O
2
(AZEVEDO
et al
., 1998);
2) 3mM de KCN e50mM H
2
O
2
.
Os ensaios com 50mM H
2
O
2
também são utilizados para detecção de catalase,
além de inibir CuZn-SOD, mostrando Mn-SOD e CAT no mesmo gel.
4.5. Análise densitométrica:
A quantidade relativa das diversas proteínas foi determinada por densitometria,
usando o programa computacional "Gel Perfect" (BOZZO & RETAMAL, 1991; RETAMAL
et al
., 1999), a partir das imagens dos géis no formato TIF. O programa calcula a
mobilidade relativa (R
f
) de cada banda corada e a área ocupada por ela, dando também
uma representação diagramática das bandas protéicas e sua concentração relativa em
relação ao total de proteínas por canal.
4.6. Determinação da massa molecular nativa e estado de agregação em condição
não desnaturante (nativa) e desnaturante:
Foram feitos géis em condição não desnaturante poro transverso (RETAMAL &
BABUL, 1988) a fim de determinar a massa molecular relativa da enzima e seu estado
de agregação em condição nativa.
A determinação da massa molecular relativa foi determinada relacionando a
mobilidade das proteínas das amostras em estudo com aquelas de proteínas de massa
molecular conhecida, que co-migraram no mesmo gel, utilizando o programa
computacional "Gel Perfect" (BOZZO & RETAMAL, 1991; RETAMAL
et al
., 1999).
25
4.7. Purificação protéica para detecção de SOD e CAT:
Proteínas das amostras de fluido epididimário e plasma seminal foram
purificadas de acordo com a técnica descrita por Retamal
et al.
(1999). Foram
realizados géis de poliacrilamida sem desnaturante (nativo) 8% (v/v) com as amostras.
Após a eletroforese, o gel foi cortado em tiras, uma foi corada para atividade SOD ou
CAT, e outra foi corada para proteínas. As atividades visualizadas no gel foram
utilizadas como padrão para fazer as incisões de cada uma das bandas de interesse.
Cada banda cortada do gel foi sonicada em tubo falcon contendo tampão para
detecção da atividade SOD ou atividade CAT, 12x, em ciclos de 30s. Posteriormente foi
realizada uma re-eletroforese em gel de poliacrilamida nativo 8% (v/v) ou SDS 12%
(v/v) para detecção das atividades enzimáticas.
26
5. RESULTADOS
5.1. Detecção de atividade SOD no epidídimo e plasma seminal de eqüinos:
Nossos resultados revelaram a presença de atividade de SOD em fluido e
espermatozóides coletados das diferentes regiões do epidídidimo, plasma seminal e
espermatozóides maduros.
Como se observa na figura 8, de um gel nativo 8% (v/v), o fluido coletado das
diferentes regiões do epidídimo tem uma banda de atividade SOD, com mobilidade
eletroforética relativa (R
f
) de 0.40.
Ensaios utilizando inibidores para CuZn-SOD mostraram que esta é a isoforma
predominante no fluido epididimário de eqüinos. Isso pode ser claramente visualizado
na figura 8C, visto que todas as bandas de atividade foram inibidas.
Figura 8: Atividade de superóxido dismutase (SOD) em fluido das regiões de cabeça proximal (1),
cabeça distal (2), corpo (3) e cauda (4) do epidídimo. Gel nativo 8% sem 2-mercaptoetanol. A- gel corado
com Coomassie, B- atividade SOD, C- inibição de CuZn-SOD (3mM KCN e 5mM H
2
O
2
). R
f
- mobilidade
eletroforética relativa.
A atividade SOD foi também detectada em géis bidimensionais (2D) (nativo 8% -
nativo 12%) da região de cauda epididimária sem 2-mercaptoetanol (figura 9). No gel
corado com azul de Coomassie observa-se uma reta diagonal de proteínas com regiões
mais concentradas (figura 9A); uma delas apresenta uma alta atividade específica para
CuZn-SOD (figura 9B). No entanto, analisando o gel 2D, pôde-se perceber uma banda
27
fraca de atividade (figura 9C) que corresponde a isoforma Mn-SOD. Na sobreposição
dos géis de atividade SOD total e atividade SOD com inibidor (figura 9D), nota-se a
área relativa de CuZn-SOD e Mn-SOD, esta indicada pela seta preta.
1D Nativo 8%
Figura 9:
Atividade de superóxido dismutase em fluido da região de cauda epididmária. Gel 2D
nativo 8%
– nativo 12%, realizado sem 2-mercaptoetanol. A- gel corado com azul de Coomassie; B- atividade
superóxido dismutase; C- inibição de CuZn-SOD (3mM KCN e 5mM H
2
O
2
); D- sobreposição dos géis B e
C. Atividade de Mn-SOD.
A análise densitométrica (figura 10) dos géis 1D de proteínas e atividade SOD
de fluido epididimário (figura 8) indica que esta enzima possui alta atividade específica,
pois uma pequena concentração protéica (setas azuis) corresponde a alta atividade
(setas pretas). A região de cabeça proximal, que em eqüinos é formado pelo conduto
eferente mostra maior atividade específica.
2D
Nativo
12%
28
.
Figura 10: Densitograma do gel nativo 8%, sem 2-mercaptoetanol, de fluido das regiões de
cabeçaproximal (1); cabeça distal (2); corpo (3) e cauda (4) do epidídimo com os R
fs
de SOD. A-
densitograma do gel de proteínas; B- densitograma do gel com atividade SOD.
Espermatozóides coletados do epidídimo e plasma seminal também
apresentaram atividade SOD, como se observa nos géis 1D (figuras 11 e 12) e 2D
(figuras 13 e 14). Nossos resultados demonstram a presença das isoformas de SOD:
CuZn-SOD e Mn-SOD.
A figura 11 mostra duas regiões bem definidas uma de R
f
= 0,32 que
corresponderia a Mn-SOD e outra com R
f
=0,47 que corresponderia a CuZn-SOD. Uma
situação similar se detecta em plasma seminal (figura 12): a Mn-SOD possui R
f
= 0,15 e
a CuZn-SOD possui R
f
= 0,45 e R
f
= 0,54. As bandas de atividade Mn-SOD e CuZn-SOD
são melhores representadas nos géis 2D nativo 8% - nativo 12% (figuras 13 e 14).
29
Figura 11: Atividade de superóxido dismutase em espermatozóides das regiões de cabeça proximal (1),
cabeça distal (2), corpo (3) e cauda (4) do epidídimo. Gel nativo 8% sem 2 mercaptoetanol. A- gel corado
com Coomassie, B- atividade SOD, C- inibição de CuZn-SOD (3mM KCN e 5mM H
2
O
2
). R
f
- mobilidade
eletroforética relativa.
Figura 12: Atividade de superóxido dismutase em plasma seminal. Gel nativo 8% sem 2-mercaptoetanol.
A- gel corado com Coomassie, B- atividade SOD, C- inibição de CuZn-SOD (3mM KCN e 5mM H
2
O
2
). R
f
-
mobilidade eletroforética relativa.
B
C
A
30
Figura 13: Atividade de superóxido dismutose em espermatozóides da região de cauda epididimária. Gel
2D nativo 8% – nativo 12%, realizado sem 2-mercaptoetanol. A- gel corado com azul de Coomassie; B-
atividade superóxido dismutase; C- inibição de CuZn-SOD (3mM KCN e 5mM H
2
O
2
); D- sobreposição dos
géis B e C.
2D
Nativo
12%
1D Nativo 8%
31
Figura 14: Atividade de superóxido dismutase em plasma seminal. Gel 2D nativo 8% – nativo 12%,
realizado sem 2-mercaptoetanol. A- gel corado com azul de Coomassie; B- atividade superóxido
dismutase; C- inibição de CuZn-SOD (3mM KCN e 5mM H
2
O
2
); D- sobreposição dos géis B e C.
Como se observa nas figuras 13 e 14 a sobreposição dos géis de atividade SOD
total e atividade SOD com inibidor (figuras 13D e 14D) mostra claramente as áreas
relativas de CuZn-SOD e Mn-SOD. As setas pretas correspondem à atividade Mn-SOD,
que é mais expressa em espermatozóides epididimários que em plasma seminal.
As figuras 15 e 16 mostram as análises densitométricas dos géis de
espermatozóides (figura 11) e plasma seminal (figura 12), respectivamente. Os R
fs
das
enzimas, já citados anteriormente, estão representados por setas. Em plasma seminal,
as proteínas com atividade CuZn-SOD estão representadas por setas azuis, e as
proteínas com atividade Mn-SOD por setas pretas.
2D
Nativo
12%
1D Nativo 8%
32
Figura 15: Densitograma do gel nativo 8%, sem 2-mercaptoetanol, de espermatozóides das regiões de
cabeça proximal (1); cabeça distal (2); corpo (3) e cauda (4) do epidídimo com os R
fs
de SOD. A-
densitograma do gel de proteínas; B- densitograma do gel com atividade SOD, C- densitograma do gel
de inibição de CuZn-SOD (3mM KCN e 5mM H
2
O
2
).
Figura 16:
Densitograma do gel nativo 8%, sem 2-mercaptoetanol, de plasma seminal com os R
fs
de
SOD. 1- densitograma do gel de proteínas; 2- densitograma do gel com atividade SOD, 3- densitograma
do gel de inibição de CuZn-SOD (3mM KCN e 5mM H
2
O
2
).
Nossos resultados mostraram maior atividade específica das enzimas em
espermatozóides quando comparadas com as de fluido epididimário.
33
Espermatozóides maduros apresentaram ambas as isoformas de SOD, porém ao
contrário do que ocorreu com espermatozóides imaturos, coletados do epidídimo, que
tiveram uma proporção parecida de CuZn-SOD e Mn-SOD, a enzima predominante
nessas amostras foi Mn-SOD (figura 17 I).
Figura 17: I- Atividade de superóxido dismutase em espermatozóides maduros. Gel nativo 8% sem 2-
mercaptoetanol. 1- gel corado com Coomassie, 2- atividade SOD, 3- inibição de CuZn-SOD (3mM KCN e
5mM H
2
O
2
). II- Densitograma do gel nativo 8%, sem 2-mercaptoetanol de espermatozóides maduros com
os R
fs
de SOD. 1- densitograma do gel de proteínas; 2- densitograma do gel com atividade SOD e do gel
de inibição de CuZn-SOD (3mM KCN e 5mM H
2
O
2
). R
f
- mobilidade eletroforética relativa.
Analisando o densitograma dos géis de espermatozóides maduros com atividade
SOD percebe-se que quando tratadas com inibidor, as Mn-SOD apresentaram atividade
com maior intensidade (figura 17 II).
Os ensaios realizados utilizando 2-mercaptoetanol mostraram que apesar da
atividade enzimática ter sido detectada, a presença do agente redutor interfere na
I
II
34
visualização e resolução das bandas. As figuras 18, 19, 20 e 21 mostram atividade
SOD em géis nativos 8% e seus respectivos densitogramas, em fluido e
espermatozóides epididimários, espermatozóides maduros e plasma seminal,
respectivamente.
Figura 18: I- Atividade de superóxido dismutase em fluido das regiões de cabeça proximal (1), cabeça
distal (2), corpo (3) e cauda (4) do epidídimo. Gel nativo 8% com 2-mercaptoetanol. A- gel corado com
Coomassie, B- atividade SOD, C- inibição de CuZn-SOD (3mM KCN e 5mM H
2
O
2
). II- Densitograma do
gel nativo 8%, com 2-mercaptoetanol, de fluido das regiões de cabeça proximal (1); cabeça distal (2);
corpo (3) e cauda (4) do epidídimo com os R
fs
de SOD. A- densitograma do gel de proteínas; B-
densitograma do gel com atividade SOD e do gel de inibição de CuZn-SOD (3mM KCN e 5mM H
2
O
2
). R
f
-
mobilidade eletroforética relativa.
I
II
35
Figura 19: I- Atividade de superóxido dismutase em espermatozóides das regiões de cabeça distal (1),
corpo (2) e cauda (3) do epidídimo. Gel nativo 8% com 2-mercaptoetanol. A- gel corado com Coomassie,
B- atividade SOD, C- inibição de CuZn-SOD (3mM KCN e 5mM H
2
O
2
). II- Densitograma do gel nativo 8%,
com 2-mercaptoetanol, de espermatozóides das regiões cabeça distal (1); corpo (2) e cauda (3) do
epidídimo com os R
fs
de SOD. A- densitograma do gel de proteínas; B- densitograma do gel com
atividade SOD, do gel de inibição de CuZn-SOD (3mM KCN e 5mM H
2
O
2
) e do gel de inibição de CuZn-
SOD (3mM KCN e 50mM H
2
O
2
). R
f
- mobilidade eletroforética relativa.
I
II
36
Figura 20: I- Atividade de superóxido dismutase em plasma seminal. Gel nativo 8% com 2-
mercaptoetanol. A- gel corado com Coomassie, B- atividade SOD, C- inibição de CuZn-SOD (3mM KCN
e 5mM H
2
O
2
). II- Densitograma do gel nativo 8%, com 2-mercaptoetanol, de plasma seminal com os R
fs
de SOD. A- densitograma do gel de proteínas; B- densitograma do gel com atividade SODe do gel de
inibição de CuZn-SOD (3mM KCN e 5mM H
2
O
2
). R
f
- mobilidade eletroforética relativa.
I
II
37
Figura 21: I- Atividade de superóxido dismutase em espermatozóides maduros. Gel nativo 8% com 2-
mercaptoetanol. 1- gel corado com Coomassie, 2- atividade SOD, 3- inibição de CuZn-SOD (3mM KCN e
5mM H
2
O
2
). II- Densitograma do gel nativo 8%, com 2-mercaptoetanol de espermatozóides maduros com
os R
fs
de SOD. 1- densitograma do gel de proteínas; 2- densitograma do gel com atividade SOD e do gel
de inibição de CuZn-SOD (3mM KCN e 5mM H
2
O
2
). R
f
- mobilidade eletroforética relativa.
Os géis com amostras de fluido epididimário mostram um arraste de atividade
SOD, causado pela presença de 2-mercaptoetanol, no entanto analisando o
densitograma desses géis pode-se dizer que a banda com R
f
= 0,33 é levemente mais
expressa que as demais. As atividades SODs sofrem inibição quando tratadas com
KCN e H
2
O
2
. Porém não é uma inibição total, indicando a presença tanto de CuZn-SOD
quanto Mn-SOD (figura 18).
O mesmo ocorre com espermatozóides coletados de todas as regiões do
epidídimo. A atividade SOD total é representada por um arraste, com destaque para a
I
II
38
banda com R
f
= 0,25, que seria Mn-SOD visto que não foi inibida quando tratada com
inibidor desta enzima (figura 19).
As bandas de atividade com R
f
= 0,15 e R
f
= 0,36 foram mais expressas em
plasma seminal e espermatozóides maduros, respectivamente. Como em
espermatozóides epididimário (figura 19), essa banda representa a enzima Mn-SOD
(figura 20 e 21). Estes resultados sugerem que essa enzima poderia estar em diferentes
estados de agregação.
5.2. Detecção da enzima catalase no epidídimo e plasma seminal de eqüinos:
A atividade CAT foi detectada em todas as amostras estudadas. Em fluido
epididimário, todas as regiões apresentaram atividade (figura 22 e 23). Analisando o
densitograma dos géis 1D (figura 24) observaram-se duas bandas de atividade de R
f
=
0,11 e R
f
= 0,15 no fluido da região de cabeça proximal do epidídimo, e somente uma
banda com R
f
= 0,11 nas regiões de cabeça distal, corpo e cauda. Essa enzima, como a
SOD, também possui alta atividade específica.
Figura 22:
Atividade de catalase em fluido das regiões de cabeça proximal (1), cabeça distal (2), corpo
(3) e cauda (4) do epidídimo. Gel nativo 8% sem 2-mercaptoetanol. A- gel corado com Coomassie, B-
atividade CAT. R
f
- mobilidade eletroforética relativa.
39
Figura 23: Atividade de catalase em fluido da região de cauda epididimária. Gel 2D nativo 8% – nativo
12%, realizado sem 2-mercaptoetanol. A- gel corado com azul de Coomassie; B- atividade catalase.
Figura 24:
Densitograma do gel nativo 8%, sem 2-mercaptoetanol, de fluido das regiões de cabeça
proximal (1); cabeça distal (2); corpo (3) e cauda (4) do epidídimo com os R
fs
de CAT. A- densitograma
do gel de proteínas; B- densitograma do gel com atividade CAT.
Em espermatozóides coletados de todas as regiões do epidídimo, a atividade
CAT pode ser visualizada tanto em gel 1D nativo como em gel 2D nativo 8% (v/v) -
nativo 12% (v/v) (figura 25 e 26). Nos géis um 1D detectou-se duas bandas de
atividade, com maior intensidade na região de cabeça proximal, que de acordo com a
análise densitométrica, possuem R
f
=
0,21 e R
f
= 0,62 (figura 27). O gel 2D de
espermatozóides da região de cauda epididimária apresentou uma banda de atividade,
com R
f
= 0,21 (figura 26).
2D
Nativo
12%
1D Nativo 8%
40
Figura 25: Atividade de catalase em espermatozóides das regiões de cabeça proximal (1), cabeça distal
(2), corpo (3) e cauda (4) do epidídimo. Gel nativo 8% sem 2-mercaptoetanol. A- gel corado com
Coomassie, B- atividade CAT. R
f
- mobilidade eletroforética relativa.
Figura 26: Atividade de catalase em espermatozóides da região de cauda epididimária. Gel 2D nativo 8%
– nativo 12%, realizado sem 2-mercaptoetanol. A- gel corado com azul de Coomassie; B- atividade
catalase.
2D
Nativo
12%
1D Nativo 8%
41
Figura 27: Densitograma do gel nativo 8%, sem 2-mercaptoetanol, de espermatozóides das regiões de
cabeça proximal (1); cabeça distal (2); corpo (3) e cauda (4) do epidídimo com os R
fs
de CAT (retângulo
vermelho). A- densitograma do gel de proteínas; B- densitograma do gel com atividade CAT.
Comparando as duas proteínas com atividade CAT em espermatozóides, a que
possui R
f
=0,21 tem maior atividade específica que a proteína com R
f
= 0,62. As setas
azuis nos densitogramas de proteínas (figura 27) mostram a concentração destas que
possuem atividade CAT. De todas as regiões epididimárias, espermatozóides da região
de cabeça proximal possuem CAT com maior expressão com alta atividade específica.
Isso é verificado nos géis 1D e pelo densitograma que mostra pouca concentração
relativa de proteínas quando comparada à alta expressão de atividade CAT.
As figuras 28 e 29 mostram géis 1D nativo 8% (v/v) e 2D nativo 8% (v/v) - nativo
12% (v/v) de plasma seminal com proteínas com atividade CAT. Essa enzima é mais
expressa nessa amostra quando comparadas com a encontrada em fluido e
espermatozóides epididimários. A análise densitométrica mostra que a enzima CAT
possui R
f
= 0,15 com alta atividade relativa específica.
42
Figura 28: I- Atividade de catalase em plasma seminal. Gel nativo 8% sem 2-mercaptoetanol. A- gel
corado com Coomassie, B- atividade CAT. II- Densitograma do gel nativo 8%, com 2-mercaptoetanol, de
plasma seminal com os R
fs
de CAT. 1- densitograma do gel de proteínas; 2- densitograma do gel com
atividade CAT. R
f
- mobilidade eletroforética relativa.
I
II
43
Figura 29: Atividade de catalase plasma seminal. Gel 2D nativo 8% – nativo 12%, realizado sem 2-
mercaptoetanol. A- gel corado com azul de Coomassie; B- atividade catalase.
Em espermatozóides maduros a atividade CAT detectada apresentou Rf= 0,54
(figura 30).
Figura 30: I- Atividade de catalase em espermatozóides maduros. Gel nativo 8% sem 2-mercaptoetanol.
1- gel corado com Coomassie, 2- atividade CAT. II- Densitograma do gel nativo 8%, sem 2-
mercaptoetanol de espermatozóides maduros com os R
fs
de CAT. 1- densitograma do gel de proteínas;
2- densitograma do gel com atividade CAT. R
f
- mobilidade eletroforética relativa.
I
II
2D
Nativo
12%
1D Nativo 8%
44
Foram realizados géis nativos 8% (v/v) com 2-mercaptoetanol para detecção de
atividade CAT. Porém, este agente redutor interferiu no processo de detecção dessa
enzima (figuras 31, 32, 33). Os géis mostram algumas manchas claras que não
correspondem a bandas de atividade catalásica.
Figura 31:
Atividade de catalase em fluido das regiões de cabeça proximal (1), cabeça distal (2), corpo
(3) e cauda (4) do epidídimo. Gel nativo 8% com 2-mercaptoetanol. A- gel corado com Coomassie, B-
atividade CAT.
45
Figura 32: Atividade de catalase em espermatozóides das regiões de cabeça distal (1), corpo (2) e cauda
(3) do epidídimo. Gel nativo 8% com 2-mercaptoetanol. A- gel corado com Coomassie, B- atividade CAT.
Figura 33: Atividade de catalase em plasma seminal. Gel nativo 8% com 2-mercaptoetanol. A- gel corado
com Coomassie, B- atividade CAT.
46
Em nosso laboratório foi desenvolvida uma metodologia para mostrar a atividade
Mn-SOD e CAT no mesmo gel, com o intuito de visualizar se essas enzimas interagem.
Como já foi demonstrado, a CuZn-SOD é inibida com presença de KCN 3mM e H
2
O
2
5mM na solução de reação. As próximas figuras mostram que quando a concentração
de H
2
O
2
é aumentada 10 vezes (50mM) observa-se uma nova banda de.baixa
mobilidade eletroforética. Durante os ensaios para detecção de CAT (figuras 22 a 29),
vimos que a banda que representa a atividade dessa enzima é semelhante à
encontrada nos experimentos tratados com 50mM de H
2
O
2
. As figuras 34 e 35 mostram
atividade CAT e inibição de CuZn-SOD, utilizando
3mM de KCN e 50mM de H
2
O
2
,
em
amostras de fluido epididimário.
Analisando os perfis dos géis e comparando seus densitogramas, sugerimos que
essas bandas representam a mesma proteína. (figura 34 e 35).
47
Figura 34: I- Atividade de catalase em fluido das regiões de cabeça proximal (1), cabeça distal (2), corpo
(3) e cauda (4) do epidídimo. Gel nativo 8% sem 2-mercaptoetanol. A- gel corado com Coomassie, B-
atividade CAT, C- inibição de CuZn-SOD (3mM KCN + 50mM H
2
O
2
). II- Densitograma do gel nativo 8%,
sem 2-mercaptoetanol, de fluido das regiões de cabeça proximal (1); cabeça distal (2); corpo (3) e cauda
(4) do epidídimo com os R
fs
de CAT. A- densitograma do gel de proteínas; B- densitograma do gel com
atividade CAT, C- inibição de CuZn-SOD (3mM KCN + 50mM H
2
O
2
). R
f
- mobilidade eletroforética relativa.
I
II
48
Figura 35: Atividade catalase em fluido da região de cauda epididmária. Gel 2D nativo 8% – nativo 12%,
realizado sem 2-mercaptoetanol. A- gel corado com Coomassie; B- inibição de CuZn-SOD (3mM KCN e
5mM H
2
O
2
); C- atividade catalase; D- inibição de CuZn-SOD (3mM KCN e 50mM H
2
O
2
). Nova banda
de atividade.
Uma situação similar foi observada nas amostras de espermatozóides
epididimários. Essas amostras apresentam as duas isoformas da enzima SOD, com
grande expressão, portanto os géis que foram tratados com 3mM de KCN e 50mM de
H
2
O
2
, além de apresentar a nova banda, também apresentaram as bandas
correspondentes às proteínas com atividade Mn-SOD (figuras 36 e 37). A sobreposição
do gel de inibição de CuZn-SOD (3mM KCN e 5mM H
2
O
2
) e o gel de atividade CAT
(figura 36D) mostra claramente o que é visto no gel de inibição de CuZn-SOD porém
com 50mM de H
2
O
2
, fazendo aparecer a banda CAT (figura 36C).
2D
Nativo
12%
1D Nativo 8%
49
Figura 36: I- Atividade de catalase em espermatozóides das regiões de cabeça proximal (1), cabeça
distal (2), corpo (3) e cauda (4) do epidídimo. Gel nativo 8% sem 2-mercaptoetanol. A- gel corado com
Coomassie, B- atividade CAT, C- inibição de CuZn-SOD (3mM KCN + 50mM H
2
O
2
), D- sobreposição dos
géis de inibição de CuZn-SOD (3mM KCN e 5mM H
2
O
2
) (figura 10C) e gel com atividade CAT. II-
Densitograma do gel nativo 8%, sem 2-mercaptoetanol, de espermatozóides das regiões de cabeça
proximal (1); cabeça distal (2); corpo (3) e cauda (4) do epidídimo com os R
fs
de CAT (em preto). A-
densitograma do gel de proteínas; B- densitograma do gel com atividade CAT, C- inibição de CuZn-SOD
(3mM KCN + 50mM H
2
O
2
). R
f
- mobilidade eletroforética relativa.
I
II
50
Figura 37:
Atividade catalase em espermatozóides da região de cauda epididmária. Gel 2D
nativo 8% –
nativo 12%, realizado sem 2-mercaptoetanol A- gel corado com Coomassie; B- inibição de CuZn-SOD
(3mM KCN e 5mM H
2
O
2
); C- atividade catalase; D- inibição de CuZn-SOD (3mM KCN e 50mM H
2
O
2
).
Nova banda de atividade.
Nos géis e no densitograma da figura 36, os R
fs
em preto representam a
atividade CAT e o R
f
em azul representa a atividade Mn-SOD. A banda circulada em
vermelho no gel C da figura 37 não aparece no gel B e C da figura 13, mostrando que
essa proteína não é uma SOD.
As figuras 38 e 39 mostram os resultados obtidos com plasma seminal.
2D
Nativo
12%
1D Nativo 8%
51
Figura 38:
I-
Atividade de catalase em plasma seminal. Gel nativo 8% sem 2-mercaptoetanol. A- gel
corado com Coomassie, B- atividade CAT, C- inibição de CuZn-SOD (3mM KCN + 50mM H
2
O
2
). II-
Densitograma do gel nativo 8%, sem 2-mercaptoetanol, de plasma seminal com os R
fs
de CAT. 1-
densitograma do gel de proteínas; 2- densitograma do gel com atividade CAT, 3- inibição de CuZn-SOD
(3mM KCN + 50mM H
2
O
2
). R
f
- mobilidade eletroforética relativa.
I
II
52
Figura 39: Atividade catalase em plasma seminal. Gel 2D nativo 8% – nativo 12%, realizado sem 2-
mercaptoetanol. A- gel corado com Coomassie; B- inibição de CuZn-SOD (3mM KCN e 5mM H
2
O
2
); C-
atividade catalase; D- inibição de CuZn-SOD (3mM KCN e 50mM H
2
O
2
). Nova banda de atividade.
Na amostra de plasma seminal a atividade de Mn-SOD e CAT apresentaram o
mesmo R
f
= 0,15. No entanto, sabendo que foi aplicado a mesma concentração de
proteína em todos os géis da primeira dimensão, ao analisar os géis 2D nativo 8% -
nativo 12% (figura 39B e D), percebe-se uma banda com maior intensidade no gel
tratado com 50mM de H
2
O
2
(figura 36 D) quando comparada com a que representa Mn-
SOD (figura 39 B). Isso pode indicar que são proteínas diferentes.
Uma outra maneira de verificar se essa proteína poderia mesmo ser a CAT foi
purificá-la de amostras de fluido epididimário da seguinte forma: foi feito um gel nativo
8% (v/v) e parte desse gel foi corado para inibição de CuZn-SOD utilizando 50mM de
H
2
O
2
para a indução do aparecimento da nova banda. Esse gel corado foi utilizado
como padrão para o corte das bandas de atividade. Esses cortes foram posteriormente
2D
Nativo
12%
1D Nativo 8%
53
sonicados em tampão fosfato 50mM pH 7,4 e re-eletroforeses foram realizadas. Porém,
dessa vez, para detecção de CAT foi utilizado o protocolo original de detecção
(peroxidase e DAB). Esse experimento está demonstrado nas figuras 40 e 41.
Figura 40:
Purificação de catalase. Gel nativo 8%. 1- gel corado com azul de Coomassie; 2- inibição
CuZn-SOD (3mM KCN + 50mM H
2
O
2
); 3- imagem invertida do gel 2. R
f
- mobilidade eletroforética
relativa.
Figura 41: Purificação de catalase. Gel nativo 8%. 1- gel corado com azul de Coomassie; 2- inibição
CuZn-SOD (3mM KCN + 50mM H
2
O
2
); 3- imagem invertida do gel 2; 4- atividade CAT; 5- imagem
invertida do gel 4. R
f
- mobilidade eletroforética relativa.
A figura 40 mostra o gel padrão tratado com 50mM de H
2
O
2
utilizado para
purificação. Esse gel mostra claramente a nova banda de atividade. A figura 41 mostra
os géis feitos após a purificação da banda com atividade. Dessa vez os géis foram
Rf 0,11
Rf 0,11
54
corados das duas maneiras: da forma tradicional, utilizando peroxidase e DAB, e
utilizando a solução para detecção de Mn-SOD porém com 50mM de H
2
O
2
. A banda
com atividade apareceu com ambos os tratamentos, apresentando o mesmo R
f
= 0,11.
5.3. Determinação das massas moleculares e estudo do estado de agregação de
SODs e CAT:
No intuito de determinar o estado de agregação das enzimas nas diferentes
amostras estudadas, foram determinadas as massas moleculares na ausência e
presença de agentes desnaturantes.
As massas moleculares nativas foram determinadas através do gráfico de
Ferguson descrito por Retamal e Babul (1988). Através da análise da curva formada
pela proteína no gel poro transverso com relação ao gradiente de acrilamida imposto,
foram obtidas as massas moleculares nativas das enzimas SODs e CAT, em fluido e
espermatozóides obtidos da região de cauda epididimária, e plasma seminal. As
figuras 42, 43 e 44 mostram os géis de fluido e espermatozóides da região de cauda do
epididimário, e plasma seminal, respectivamente, utilizados para a determinação das
massas moleculares.
55
Figura 42: Gel nativo de poro transverso (4 -18%), realizado sem 2-mercaptoetanol, utilizando como
amostra fluido da região de cauda epididimária. A- Gel corado com azul de Coomassie; B- atividade
catalase; C- atividade superóxido dismutase; D- inibição de CuZn-SOD (3mM KCN e 5mM H
2
O
2
).
56
Figura 43:
Gel nativo de poro transverso (4 -18%), realizado sem 2-mercaptoetanol, utilizando como
amostra espermatozóides da região de cauda epididimária. A- Gel corado com azul de Coomassie; B-
atividade catalase; C- atividade superóxido dismutase; D- inibição de CuZn-SOD (3mM KCN e 5mM
H
2
O
2
).
57
Figura 44:
Gel nativo de poro transverso (4 -18%), realizado sem 2-mercaptoetanol, utilizando como
amostra espermatozóides da região de cauda epididimária. A- Gel corado com azul de Coomassie; B-
atividade catalase; C- atividade superóxido dismutase; D- inibição de CuZn-SOD (3mM KCN e 5mM
H
2
O
2
).
Os gráficos de Ferguson foram desenhados a partir do logaritmo dos valores de
mobilidade eletroforética da proteína [100 x log (100xR
f
)] versus
a concentração de
acrilamida. Os coeficientes angulares das retas geradas foram utilizados para inferir a
massa molecular baseado nas retas obtidas a partir dos experimentos realizados com
proteínas de massas conhecidas (padrão) (figura 45 e tabela 1).
Desta forma, as
massas moleculares nativas das enzimas SODs e CAT foram determinadas.
58
Figura 45:
Gráfico que representa a relação entre coeficiente angular negativo e massa molecular
Tabela1: Relação do coeficiente angular negativo com proteínas de massas moleculares conhecidas.
Fonte: Retamal, 1988
Os valores das massas moleculares de todas as amostras estão dispostos nas
tabelas abaixo (tabela 2, 3 e 4):
59
Tabela 2: Massas moleculares nativas de SOD e CAT de amostras de fluido da região de cauda
epididimária.
Tabela 3:
Massas moleculares nativas de SOD e CAT das amostras de espermatozóides epididimário.
Tabela 4: Massas moleculares nativas de SOD e CAT das amostras de plasma seminal.
Em fluido da região de cauda epididimária foram encontradas SODs com massas
moleculares aproximadamente 50kDa e 100kDa. Quando submetidas à inibição, a
proteína com massa 50kDa não foi inibida, indicando que esta é uma isoforma Mn-
SOD. Em compensação, a proteína com massa molecular 100kDa representa uma
CuZn-SOD. A enzima CAT apresentou massa molecular 160kDa (tabela 2).
60
Foram encontradas SODs com massas moleculares 35kDa e 148kDa em
espermatozóides coletados da região de cauda do epidídimo. Analisando o gel da
figura 43 tratado para inibição de CuZn-SOD, foram encontradas duas proteínas com
mesma massa molecular 75kDa, porém com R
fs
diferentes. Isso indica que são
proteínas com relação carga/massa diferentes, sendo que a com R
f
= 0,30 possui
relação carga/massa mais positiva. Além disso, pode-se dizer que essa proteína é um
agregado, ou parte de um agregado de Mn-SOD. Ela pode ser parte da proteína de
148kDa ou um dímero formado por duas proteínas de 35kDa. A enzima CAT presente
em espermatozóides possuem massa molecular 202kDa (tabela 3).
As amostras de plasma seminal apresentaram SODs com massas moleculares
entre 30kDa e 155kDa (tabela 4). Como em espermatozóides epididimários essas
enzimas também formam agregados. Analisando o gel da figura 41 tratado com
inibidor, pode-se determinar a presença de três enzimas Mn-SOD, uma com 90kDa e
duas com 250kDa. Estas últimas não podem ser consideradas a mesma proteína
porque analisando o R
f
de ambas, percebe-se que a com R
f
= 0,07 possui relação
carga/massa altamente positiva quando comparada com a enzima com R
f
= 0,32.
Provavelmente a enzima de 90kDa é um trímero formado por três enzimas de 30kDa
enquanto que as enzimas com 250kDa podem ser dímeros de enzimas com 130kDa.
Foram encontradas CATs com massas 105kDa e 116kDa em plasma seminal.
As massas moleculares e o estado de agregação, em presença de SDS, foram
determinadas através de géis 1D SDS-PAGE – 12%.
Fluido epididmário:
A figura 46 mostra a massa molecular da proteína com atividade SOD em fluido
epididimário. A massa molecular encontrada foi de 72kDa em todas as regiões. Essa
proteína corresponde a CuZn-SOD, porque foi inibida com KCN e H
2
O
2
.
61
Figura 46: I- Atividade de superóxido dismutase em fluido das regiões de cabeça proximal (1), cabeça
distal (2), corpo (3) e cauda (4) do epidídimo. Gel SDS-PAGE 12% sem 2-mercaptoetanol. A- gel corado
com Coomassie; B- atividade SOD; C- inibição CuZn-SOD (3mM KCN + 5mM H
2
O
2
). St.: padrão de
massa molecular. II- Densitograma do gel desnaturante , sem 2-mercaptoetanol, de fluido das regiões de
cabeça proximal (1); cabeça distal (2); corpo (3) e cauda (4) do epidídimo com a massa molecular de
SOD. A- densitograma do gel de proteínas; B- densitograma do gel com atividade SOD.
Além do gel realizado com fluido de todas as regiões do epidídimo, foi
determinada a massa molecular de SOD purificada de fluido da região de cauda
epididimária, na ausência (Figura 44) e presença (figura 45) de 2-mercaptoetanol.
I
II
62
Figura 47: A- Gel nativo 8% utilizado para a purificação de superóxido dismutase em fluido da região de
cauda epididimárioa; 1- gel corado para proteínas, 2- gel corado para atividade SOD;
B- Atividade SOD purificada em fluido da região de cauda do epidídimo. Gel SDS-PAGE 12% sem 2-
mercaptoetanol.
1-
gel corado com Coomassie;
2-
atividade SOD;
3-
imagem invertida do gel 2;
4-
inibição CuZn-SOD (3mM KCN + 5mM H
2
O
2
). St.: padrão de massa molecular;
Figura 48: A- Gel nativo 8% utilizado para a purificação de superóxido dismutase em fluido da região de
cauda epididimárioa; 1- gel corado para proteínas, 2- gel corado para atividade SOD;
B- Atividade SOD purificada em fluido da região de cauda do epidídimo. Gel SDS-PAGE 12% com 2-
mercaptoetanol.
1-
gel corado com Coomassie;
2-
atividade SOD;
3-
imagem invertida do gel 2;
4-
inibição CuZn-SOD (3mM KCN + 5mM H
2
O
2
). St.: padrão de massa molecular.
55 kDa
63
As massas moleculares encontradas na ausência de agente redutor foram
42kDa, 46kDa e 55kDa. Na presença de 2-mercaptoetanol foram encontradas massas
moleculares 38kDa, 46kDa, 49kDa e 55kDa. Analisando os géis com bandas
purificadas com o gel da figura 46, pode-se dizer que essa enzima é capaz de formar
agregados, que podem ter sido clivados com a purificação. Na presença de agente
redutor, novas bandas protéicas com atividade SOD apareceram. Isso mostra que as
essas enzimas possuem pontes dissulfetos, estas que podem colaborar para a
formação de agregados.
Para determinação da massa molecular, em condições desnaturantes, da enzima
CAT, também foram realizados SDS-PAGE 12%. Todavia, visto que géis com SDS não
são apropriados para detecção dessa enzima, nenhuma banda pôde ser visualizada
nesse ensaio (figura 49).
Figura 49: Atividade de catalase em fluido das regiões de cabeça proximal (1), cabeça distal (2), corpo
(3) e cauda (4) do epidídimo. Gel SDS-PAGE 12% sem 2-mercaptoetanol. A- gel corado com Coomassie;
B- atividade CAT. St.: padrão de massa molecular.
Uma alternativa para esse problema foi a purificação da banda de atividade de
fluido da região de cauda epididimária através de géis nativos 8% seguido de SDS-
PAGE 12%. A atividade CAT foi determinada pelo protocolo de inibição de CuZn-SOD
com 50mM de H
2
O
2
, já explicado acima, além do protocolo tradicional (figura 50).
64
Figura 50: A- Gel nativo 8% utilizado para a purificação de catalase em fluido da região de cauda
epididimárioa; 1- gel corado para proteínas, 2- gel corado para atividade CAT; B- Atividade CAT
purificada em fluido da região de cauda do epidídimo. Gel SDS-PAGE 12% sem 2-mercaptoetanol. 1- gel
corado com Coomassie; 2- inibição CuZn-SOD (3mM KCN + 50mM H
2
O
2
); 3- atividade CAT com
protocolo tradicional; St.: padrão de massa molecular.
As massas moleculares encontradas foram aproximadamente 250kDa e 66kDa.
Também foram feitos ensaios com 2-mercaptoetanol, mas só obtivemos
resultados satisfatórios no gel para proteínas. Analisando esse gel, podemos perceber
que também houve aumento do número de bandas, indicando a presença de pontes
dissulfetos que foram clivadas pelo agente redutor. As massas moleculares
encontradas foram 28kDa, 55kDa, 60kDa, 82kDa, 96kDa e 110kDa (figura 51).
65
Figura 51: I- A- Gel nativo 8% utilizado para a purificação de catalase em fluido da região de cauda
epididimárioa; 1- gel corado para proteínas, 2- gel corado para atividade CAT; B- Gel 12% com 2-
mercaptoetanol de CAT purificadas de fluido da região de cauda epididimária corado para proteínas. St.:
padrão de massa molecular.II- Densitograma do gel desnaturante, sem 2-mercaptoetanol, de fluido da
região de cauda epididimária corado para proteínas com a massa molecular de CAT.
Espermatozóides epididimário:
Foram realizados SDS-PAGE 12% para determinação da massa molecular da
enzima SOD em espermatozóides coletados do epidídimo. As proteínas com atividade
CuZn-SOD apresentaram massa molecular 80 kDa e as proteínas com atividade Mn-
SOD apresentaram massa molecular 67 kDa (figura 52).
I
II
66
Figura 52: I- Atividade de superóxido dismutase em espermatozóides das regiões de cabeça distal (1),
corpo (2) e cauda (3) do epidídimo. Gel SDS-PAGE 12% sem 2-mercaptoetanol. A- gel corado com
Coomassie, B- atividade SOD; C- inibição CuZn-SOD (3mM KCN + 5mM H
2
O
2
). St.: padrão de massa
molecular.
II-
Densitograma do gel desnaturante, sem 2-mercaptoetanol, de espermatozóides das regiões
de cabeça distal (1); corpo (2) e cauda (3) do epidídimo com a massa molecular de SOD. A-
densitograma do gel de proteínas; B- densitograma do gel com atividade SOD; C- inibição CuZn-SOD
(3mM KCN + 5mM H
2
O
2
). Setas azuis – CuZn-SOD; setas pretas – Mn-SOD.
I
II
67
Nos ensaios com 2-mercaptoetanol, tanto CuZn-SOD quanto Mn-SOD
apresentaram massa molecular 78kDa (figura 53).
Figura 53: I- Atividade de superóxido dismutase em espermatozóides das regiões de cabeça distal (1),
corpo (2) e cauda (3) do epidídimo. Gel SDS-PAGE 12% com 2-mercaptoetanol. A- gel corado com
Coomassie, B- atividade SOD; C- inibição CuZn-SOD (3mM KCN + 5mM H
2
O
2
). St.: padrão de massa
molecular. II- Densitograma do gel desnaturante, com 2-mercaptoetanol, de espermatozóides das regiões
de cabeça distal (1); corpo (2) e cauda (3) do epidídimo com a massa molecular de SOD. A-
densitograma do gel de proteínas; B- densitograma do gel com atividade SOD; C- densitograma do gel
de inibição de CuZn-SOD (3mM KCN + 5mM H
2
O
2
).
I
II
68
Em espermatozóides, não puderam ser detectadas as massas moleculares de
CAT, tanto na presença quanto na ausência de 2-mercatoetanol (figuras 54 e 55,
respectivamente).
Figura 54: Atividade de catalase em espermatozóides das regiões de cabeça distal (1), corpo (2) e cauda
(3) do epidídimo. Gel SDS-PAGE 12% sem 2-mercaptoetanol. A- gel corado com Coomassie; B-
atividade CAT. St.: padrão de massa molecular.
Figura 55: Atividade de catalase em espermatozóides das regiões de cabeça distal (1), corpo (2) e cauda
(3) do epidídimo. Gel SDS-PAGE 12% com 2-mercaptoetanol. A- gel corado com Coomassie; B-
atividade CAT. St.: padrão de massa molecular.
69
Plasma Seminal:
Foram realizados com plasma seminal somente ensaios para determinação de
massas moleculares de SOD.
As massas moleculares de SOD em plasma seminal são aproximadamente 67
kDa e 130 kDa (figura 56). Essas proteínas também foram detectadas no gel nativo (4%
- 18%) de poro transverso (tabela 4) mostrando que não sofreram nenhum tipo de
separação.
Figura 56:
I-
Atividade de superóxido dismutase em plasma seminal. Gel SDS-PAGE 12% sem 2-
mercaptoetanol. A- gel corado com Coomassie, B- atividade SOD, C- inibição CuZn-SOD (3mM KCN +
5mM H
2
O
2
). II- Densitograma do gel desnaturante de plasma seminal. 1- densitograma do gel de
proteína; 2- densitograma do gel com atividade SOD; 3- densitograma do gel de inibição de CuZn-SOD
(3mM KCN + 5mM H
2
O
2
).
I
II
70
Da mesma forma como foi feito com fluido epididimário, também foi detectada a
massa molecular de SOD em amostras de plasma seminal purificadas (figura 57). As
massas determinadas foram 22kDa, 25kDa e 77kDa. Essas proteínas com baixas
massas moleculares mostram que o simples método de purificação rompe agregados
protéicos.
Figura 57: A- Gel nativo 8% utilizado para a purificação de superóxido dismutase em plasma seminal; 1-
gel corado para proteínas, 2- gel corado para atividade SOD; B- Atividade SOD purificada de plasma
seminal. Gel SDS-PAGE 12% sem 2-mercaptoetanol. 1- gel corado com Coomassie; 2- atividade SOD;
St.: padrão de massa molecular.
Os ensaios com 2-mercaptoetanol foram realizados com amostra total e
purificada de plasma seminal. A figura 58 mostra que as massas moleculares
encontradas na amostra total foram 58 kDa e 66 kDa.
71
Figura 58: I- Atividade de superóxido dismutase em plasma seminal. Gel SDS-PAGE 12% com 2-
mercaptoetanol. A- gel corado com Coomassie, B- atividade SOD, C- inibição CuZn-SOD (3mM KCN +
5mM H
2
O
2
). II- Densitograma do gel desnaturante de plasma seminal indicando as massas moleculares
encontradas.
Com a amostra purificada, as massas moleculares encontradas foram 21kDa,
25kDa, 28kDa, 33kDa, 52kDa e 72kDa como mostra a figura 59. Ambos os géis
mostram que essas proteínas possuem várias pontes dissulfetos que foram rompidas
pela presença do agente redutor.
I
II
72
Figura 59: A- Gel nativo 8% utilizado para a purificação de SOD em plasma seminal; 1- gel corado para
proteínas, 2- gel corado para atividade SOD;
B- Atividade SOD purificada de plasma seminal. Gel SDS-
PAGE 12% com 2-mercaptoetanol. 1- gel corado com Coomassie; 2- atividade SOD; St.: padrão de
massa molecular.
Analisando os géis com amostra purificada de plasma seminal, pode-se perceber
a presença de agregados protéicos. A figura 60 mostra o gel utilizado como molde para
realização das incisões das bandas com atividade SOD e os géis após a re-eletroforese
com as amostras sonicadas.
Figura 60: Purificação de atividade de superóxido dismutase em plasma seminal de eqüinos. Gel nativo
8%. A- gel utilizado como molde para realização das incisões das bandas com atividade SOD; B- corte 1;
C-
corte 2;
D-
corte 3;
E-
corte 4;
F-
corte 5.
1-
géis corados para proteínas;
2-
géis corados para
atividade SOD.
Comparando as análises dos géis corados para proteínas e atividade SOD pode-
se dizer que cada corte corresponde a uma região diferente do gel molde. Porém,
percebe-se que a posição da banda com atividade SOD não corresponde à região na
73
qual existe maior concentração protéica (figura 60). Isso também é visualizado nos géis
2D nativo8%-SDS12% (figura 61).
Figura 61: Purificação de atividade de superóxido dismutase em plasma seminal de eqüinos. Gel 2D
nativo 8% - nativo 12%. A- gel corado para proteínas; B- gel corado para atividade SOD. molecular. 1-
corte 1; 2- corte 2; 3- corte 3; 4- corte 4. St- padrão de massa molecular.
2D
Nativo
8%
1D Nativo 8%
74
A figura 62, representando o gel 2D nativo 8% - SDS 12% realizado com a
amostra proveniente do corte 3, mostra que existe atividade SOD em local onde
proteínas não podem ser visualizadas. Essa enzima encontrada possui massa
molecular aproximada de 74 kDa e partiu de um gel nativo que continha proteína com
R
f
= 0,40.
Figura 62:
Purificação de atividade de superóxido dismutase em plasma seminal de eqüinos. Gel 2D
nativo 8% - nativo 12%. A- gel corado para proteínas; B- gel corado para atividade SOD. St- padrão de
massa molecular.
Os géis 1D com SDS mostram que essas proteínas se comportam como
agregados que quando em contato com agente desnaturante SDS são rompidos
gerando proteínas com massas moleculares 21 kDa, 25 kDa e 80 kDa. O mais
interessante é que essas proteínas pequenas fazem parte de agregados com diferente
relação carga/massa porque elas apareceram em todos os cortes realizados (figura 63).
A
B
75
Figura 63: Purificação de atividade de superóxido dismutase em plasma seminal de eqüinos. Gel SDS
12%.
1-
corte 1;
2-
corte 2;
3-
corte 3;
4-
corte 4.
A-
géis corados para proteínas;
B
géis corados para
atividade SOD. St- padrão de massa molecular.
76
6. DISCUSSÃO
Tendo em vista a extrema vulnerabilidade do espermatozóide ao ataque
oxidativo (pelas altas concentrações de ácidos poli-insaturados que contém na
membrana plasmática e pela constante exposição a espécies reativas, geradas por
neutrófilos e macrófagos ou por eles mesmos), consideramos de interesse verificar a
presença de mecanismos de sistema de defesa antioxidante que o espermatozóide de
Equus caballus
possa vir a utilizar dado seu escasso citoplasma. Espermatozóides de
todas as regiões epididimárias exibem espontaneamente capacidade de produzir íon
superóxido, a qual pode ser aumentada por exposição a NADPH, particularmente nos
espermatozóides imaturos coletados da região da cabeça do epidídimo (AITKEN
et al.,
1992).
Com base em critérios morfométricos, citoquímicos e ultraestruturais, estudos
prévios realizados em nosso laboratório caracterizaram seis sub-regiões
morfologicamente distintas ao longo do conduto epididimário de
Equus caballus
(LÓPEZ
et al
., 1989; LÓPEZ, 1996). Não é surpreendente que as regiões epididimárias
exibam diferentes características morfo-citoquímicas, uma vez que exercem variadas
funções. As células principais do epidídimo de garanhões adultos mostram
características estruturais concordantes com atividades de absorção e secreção, as
quais representam variações regionais. A função de absorção é predominante nas
células epiteliais da região proximal do conduto, enquanto secreção de diversas
moléculas existe ao longo de todo o conduto epididimário (LÓPEZ, 1996). Os perfis
eletroforéticos de proteínas obtidas de tecido e fluido das regiões de cabeça, corpo e
cauda do epidídimo diferem não só do plasma sangüíneo homólogo, mas também nas
diferentes regiões do conduto (RETAMAL
et al
., 2000). O epidídimo modula a
composição de seu conteúdo luminal pelas funções de secreção seletiva e absorção
das células epiteliais. Portanto, flutuações no volume do fluído, eletrólitos, proteínas e
enzimas nas regiões de cabeça, corpo e cauda epididimária são críticas, tanto para o
desenvolvimento normal do processo de maturação espermática quanto para o
armazenamento e sobrevida dos espermatozóides (JONES, 2007).
Um dos aspectos menos estudado da função epididimária é o papel que
desenvolve na proteção dos espermatozóides. O percurso do espermatozóide no
77
conduto epididimário é de aproximadamente entre 10 - 15 dias, dependendo da
espécie, sendo assim constantemente exposto a um microambiente em constante
transformação. Este deve, portanto, oferecer condições que permitam eliminar
rapidamente produtos de resíduo metabólico, agentes que provoquem dano oxidativo,
xenobióticos ou agentes químicos tóxicos, permitindo a viabilidade da célula
espermática. O epidídimo tem, portanto, um importante papel na armazenagem e
proteção do espermatozóide contra espécies reativas do oxigênio (MOORE, 1996;
BASSOLS
et al
., 2004).
Dependendo da espécie estudada, os espermatozóides podem ser protegidos de
espécies reativas de oxigênio por SOD, CAT ou GPX. Acredita-se que além de
proteínas e enzimas, solutos orgânicos e íons presentes no fluido epididimário e plasma
seminal, podem também participar na proteção do espermatozóide (HINTON
et. al.,
1995; ZINI
et al
., 2002 ).
No presente trabalho demonstrou-se a presença de atividade SOD e CAT, tanto
no epidídimo quanto no sêmen de eqüinos. Estas enzimas participariam dos
mecanismos de defesa contra dano peroxidativo tanto do espermatozóide como das
células epididimárias.
Os experimentos realizados com fluido e espermatozóides epididimários
demonstraram a presença de CuZn-SOD, Mn-SOD e CAT. A identificação no fluido
epididimário destas enzimas, provavelmente secretadas e sintetizadas pelo epidídimo,
é um passo inicial na pesquisa de sua interação com a membrana espermática. Em
epidídimo humano foi verificado, através de imunoistoquímica, que CuZn-SOD está
presente nas células basais sugerindo o envolvimento dessas células na proteção
antioxidante local do epidídimo e/ou secreção dessa enzima para o lúmen epididimário
(NONOGAKI et al., 1992). Tanto SOD quanto CAT possuem alta atividade específica,
porém a enzima CAT apresentou maior atividade específica em espermatozóides e
fluido coletados da região de cabeça proximal do epidídimo, região onde ocorre uma
importante reabsorção trans-epitelial de íons. Os processos metabólicos que
estabelecem ou mantêm gradientes iônicos, são altamente vulneráveis ao O
2
•-
intracelular (THAETE
et al.
, 1985). Esses dados corroboram os resultados obtidos por
Lanzana (2007), que mostrou, por espectrofotometria, que a enzima CAT presente na
fração solúvel de homogeneizados de tecido epididimário da região de cabeça proximal
78
apresentou maior atividade catalásica, resultando numa maior proteção do
espermatozóide imaturo.
Jervis & Robaire (2001) demonstraram a presença de CuZn-SOD em epidídimo
de rato. O mRNA para essa enzima é expressado em altos níveis ao longo do conduto
epididimário, não detectando–se diferenças significativas na concentração da enzima
entre as regiões desse órgão.
A forma predominante da enzima em fluido epididimário nos cavalos utilizados
nesse trabalho é a CuZn-SOD;, contudo observou-se também em alguns géis uma leve
expressão de atividade Mn-SOD. Em espermatozóides epididimários, nossos ensaios
revelaram a presença das duas isoformas de SOD com grande expressão de ambas,
ao contrário do que ocorreu com as amostras de fluido. Em espermatozóide de
humanos tem-se descrito a presença de grande quantidade de CuZn-SOD. A presença
deste antioxidante pode ser importante para reduzir os efeitos mutagênicos de EROS
durante a espermatogênese e percurso do gameta pelas vias seminais tanto do macho
como da fêmea. Tyler, em 1975, realizou experimentos mostrando que em touros, a
atividade CuZn-SOD reside na região da peça intermediária/ flagelo, onde as
mitocôndrias e o resíduo citoplasmático são encontrados. De acordo com esse autor, é
improvável a presença de SOD na cabeça e região acrossomal dos espermatozóides.
Além de CuZn-SOD, os espermatozóides humanos também possuem Mn-SOD, esta foi
encontrada somente na peça intermediária (WEISIGER & FRIDOVICH, 1973).
O plasma seminal humano contém alta atividade SOD, sendo que a isoforma
mais abundante é CuZn-SOD (PEEKER, 1997). CuZn-SOD não é sintetizada com um
peptídeo sinal, sendo localizada no citosol e núcleo (MCCORD & FRIDOVICH, 1969).
Postula-se que a glândula prostática seria a principal fonte de CuZn-SOD presente no
sêmen. A atividade do plasma seminal final é de aproximadamente 10% do citosol da
glândula prostática (SANDSTRÖM, 1993).
Nossos resultados mostraram que além de CuZn-SOD, plasma seminal de
eqüinos possui Mn-SOD. Estes resultados corroboram os de Baumber & Ball (2005)
que postulam a presença de proteínas com atividade SOD em plasma seminal de
eqüinos, a qual teria provavelmente origem da próstata. De acordo com esses autores,
a remoção do plasma seminal durante o processo de congelamento do sêmen pode
aumentar o estresse oxidativo dos espermatozóides de eqüino. Em 1980, Mennella &
79
Jones realizaram experimentos que mostram a presença de SOD em plasma seminal
de diversos mamíferos, entre eles eqüinos, os quais apresentaram alta concentração
relativa dessa enzima. Esses mesmos autores realizaram experimentos com plasma
seminal de javali mostrando a presença das duas isoformas de SOD: a enzima
citoplasmática sensível ao cianeto CuZn-SOD que elimina-se facilmente se a
membrana espermática estiver danificada e a enzima insensível ao cianeto Mn-SOD
que é encontrada na matriz mitocondrial.
Nossos experimentos utilizando 2-mercaptoetanol revelaram que apesar da
atividade enzimática ter sido detectada, a presença do agente redutor interfere na
visualização e resolução das bandas. Muitas proteínas dependem de pontes dissulfeto,
intra / inter-molecular, para seu correto funcionamento (ELLGAARD & RUDDOCK,
2005). Tainer
et al
. (1982), mostraram, através de cristalografia de raio-X, que o sítio
ativo de CuZn-SOD é mantido por uma ponte dissulfeto intracadeia formada por duas
cisteínas altamente conservadas. Essa ponte dissulfeto é essencial para atividade
enzimática. Esses dados podem explicar porque na presença de agente redutor, as
enzimas se expressam de forma diferente, visto que as pontes dissulfetos, que são
essenciais para que ocorra a reação, são rompidas. Foi visualizado um arraste de
atividade nos géis de todas as amostras, no entanto algumas proteínas tiveram
destaque apresentando um leve aumento na intensidade da atividade. As amostras de
fluido epididimário, na presença do agente redutor, mostraram a banda com R
f
= 0,33
levemente mais intensa que as demais. Além disso, pode ser detectada tanto CuZn-
SOD quanto Mn-SOD. Espermatozóides coletados do epidídimo, quando tratadas com
agente redutor apresenta uma banda em destaque com R
f
= 0,25, o ensaio de inibição
indica que corresponderia a Mn-SOD. Já em espermatozóides maduros, a banda com
maior intensidade de atividade SOD apresentou R
f
= 0,36. Em plasma seminal, a banda
de atividade com Rf= 0,15 foi mais expressa. Como em espermatozóides maduros,
essa banda representa a enzima Mn-SOD.
Além de SOD, outra enzima antioxidante, a CAT, foi detectada em nossos
experimentos. Todas as amostras estudadas apresentaram essa enzima. Amostras de
plasma seminal mostraram maior atividade CAT, quando comparadas com amostras de
fluido e espermatozóides de todas as regiões do epidídimo. Nossos resultados
corroboram os dados de Ball
et al
., em 2000. Esses autores realizaram experimentos
80
que mostram que plasma seminal de eqüinos contém alta atividade de CAT. Trabalhos
realizados com humanos e ratos mostram a presença dessa enzima em baixa
concentração em espermatozóides (TRAMER,
et al.
, 1998). A enzima CAT está
ausente em espermatozóides de coelhos (HOLLAND & STOREY, 1981) e
camundongos (ALVAREZ & STOREY, 1984).
Analisando os géis nativos realizados em nosso laboratório, pode-se dizer que
essa enzima possui relação carga/massa altamente positiva, com R
fs
entre 0,11 e 0,21.
Somente em espermatozóides epididimários foi encontrada uma proteína com atividade
CAT com relação carga/massa R
f
= 0,62.
As massas moleculares determinadas neste estudo para SOD e CAT em plasma
seminal e epidídimo sugerem que essas enzimas podem ser encontradas em forma
monomérica ou na forma de agregados.
As massas moleculares de SODs presentes em fluido epididimário foram 50kDa
e 98kDa na sua forma nativa e massas entre 38kDa e 72kDa, na presença de agentes
desnaturantes como SDS e 2-mercaptoetanol. Estudos realizados por Marklund (1982)
revelam que a isoforma CuZn-SOD é um homodímero com massa molecular em torno
de 34kDa. De acordo com esses dados, podemos dizer que a enzima com massa
molecular 38kDa que detectamos na presença de 2-mercaptoetanol é um dímero que
pode ser encontrado em forma de agregados apresentando massas moleculares mais
altas, como no caso da enzima com massa molecular 72kDa, que provavelmente seria
um dímero de dímero. De acordo com Fridovich (1989), a isoforma Mn-SOD encontrada
em humanos são homotetrâmeras com cada subunidade possuindo massa molecular
aproximada de 22kDa. Nossos resultados com fluido epididimário revelam a presença
de Mn-SOD com massa molecular nativa 50kDa. Isso indica que essa enzima,
in vitro
,
encontra-se em estado de agregação. Nesse caso, a Mn-SOD encontraria-se na forma
de dímero.
Em espermatozóides foram encontradas CuZn-SOD com massas moleculares
aproximadas de 35kDa e 148kDa, em sua forma nativa, e na presença de agentes
desnaturantes massa molecular aproximada de 67kDa. Esses dados, como em fluido
epididimário, também indicam a presença de um dímero (35kDa). Em condições
nativas, foram encontradas duas enzimas Mn-SOD com massa molecular aproximada
de 75kDa. De acordo com a mobilidade eletroforética das duas enzimas, podemos
81
concluir que são proteínas com mesma massa molecular, porém com relação
carga/massa distintas visto que possuem R
f
diferentes (tabela 3). Em condições
desnaturantes foram encontradas enzimas Mn-SOD com massas moleculares
aproximadas de 78kDa e 80 kDa. Também foram determinadas as massas moleculares
de SOD em amostras de plasma seminal. Em condições nativas foram determinadas
enzimas CuZn-SOD com massas entre 30kDa e 155kDa. Na presença de agentes
desnaturantes foram encontradas enzimas SOD com massas entre 21kDa e 130kDa.
Nesse caso, pode-se dizer que a enzima SOD é encontrada em vários estados de
agregação. De acordo com a literatura, a enzima com massa molecular 21kDa é um
monômero. Em plasma seminal também podem ser encontrados trímeros (58kDa e
66kDa) e tetrâmeros (77kDa). As enzimas Mn-SOD detectadas em géis nativos
apresentaram massas moleculares 90kDa e 250kDa. Da mesma forma que ocorreu
com espermatozóides, plasma seminal também apresentou duas enzimas com mesma
massa molecular, porém com relação carga/massa diferentes. Nessa amostra, essas
enzimas apresentaram massa molecular aproximada de 250kDa. Além de
apresentarem cargas diferentes também poderia-se dizer que são trímeros formados
por enzimas com massas moleculares aproximadas de 90kDa.
A enzima CAT presente em fluido epididimário apresentou massa molecular
nativa em torno de 160kDa, e entre 28kDa e 250kDa em condições desnaturantes.
Espermatozóides apresentaram CAT com massa molecular 202 kDa. No plasma
seminal foram detectadas CATs com massas em torno de 105kDa e 116kDa. Nessas
duas últimas amostras as massas moleculares foram determinadas somente em
condição nativa.
Nicholls & Schonbaum (1963) realizaram ensaios para determinação da massa
molecular de CAT. De acordo com esses autores, essa enzima é tetrâmera com massa
molecular 240kDa. Portanto, as enzimas com massas moleculares em torno de 60kDa e
65kDa encontradas em fluido epididimário de eqüinos poderiam estar na forma de
monômeros. Estas podem formar dímeros de 160 kDa. Além disso, também
encontraram-se enzimas tetrâmicas com massa molecular aproximada de 250kDa. De
acordo com os resultados discutidos, podemos concluir que ambas as enzimas SOD e
CAT,
in vitro
, são encontradas em sua forma monomérica e/ou em diversos estados de
agregação.
82
Analisando as massas moleculares de SOD em amostras de fluido e
espermatozóides epididimários e plasma seminal, foram feitas tabelas mostrando
alguns possíveis agregados que as proteínas com atividade SOD dessas amostras
podem formar (tabela 5, 6 e 7).
Tabela 5: Formação de agregados de proteínas com atividade SOD em fluido da região de cauda do
epidídimo.
1- Marklund (1982)
2- Fridovich (1989)
Tabela 6: Formação de agregados de proteínas com atividade SOD em espermatozóides da região de
cauda do epidídimo.
1- Marklund (1982)
2- Fridovich (1989)
83
Tabela 7:
Formação de agregados de proteínas com atividade SOD em plasma seminal.
1- Marklund (1982)
2- Fridovich (1989)
De acordo com que foi exposto nas tabelas, pode-se dizer que os resultados
obtidos com amostras de fluido e espermatozóides coletados da região de cauda
epididimária demonstram que as enzimas SODs são encontradas na forma monomérica
e na forma de agregados. No entanto, comparando nossos resultados com dados já
publicados, os quais revelam que uma subunidade de SOD possui massa molecular
aproximada de 20 kDa, as enzimas SODs encontradas na região de cauda do epidídimo
encontram-se em dímeros, tetrâmeros e até mesmo octâmeros. Por outro lado, em
plasma seminal encontramos monômeros (21 kDa), dímero, trímero e tetrâmero dessa
enzima.
Os espermatozóides ficam armazenados na região de cauda do epidídimo até o
momento da ejaculação, podendo acarretar um aumento da geração de EROs visto
maior concentração de células espermáticas nessa região. Isso pode explicar a
presença de agregados de enzimas SODs tanto nos espermatozóides quanto no
ambiente em que eles se encontram. Esses agregados poderiam estar sendo formados
para melhorar eficiência da dismutação do ânion superóxido.
A geração de EROs no microambiente epididimário é uma ameaça para o
espermatozóide epididimário. Experimentos realizados por
Free et al.
(1974) que
revelam a tensão de oxigênio no lúmen de diferentes regiões do trato reprodutivo
masculino de ratos mostraram que os espermatozóides encontram um aumento
84
progressivo da oxigenação do microambiente luminal dos tubos seminíferos,
rete testis
e
fluido da região de cabeça proximal epididimária.
Com o resultado obtido com amostra purificada de plasma seminal foi elaborado
um modelo teórico das enzimas SOD representando os diferentes estados de agregação
destas quando foram estudadas em diferentes condições.
O modelo do estado de agregação corresponde às proteínas purificadas de
plasma seminal que é mostrado na figura 64. De acordo com nossos resultados, as
enzimas SOD de 74 kDa está acompanhada de 3 proteínas com massas moleculares
21 kDa, 25 kDa e 80 kDa, porém com proporções diferentes. O corte 1 mostra que para
1 molécula de 80kDa, existem 2 de 21 kDa e 3 moléculas de 25 kDa. No corte 2, para
uma molécula de 80 kDa, existem 2 moléculas de 25 kDa e 4 de 21 kDa. No corte 3,
para cada molécula de 80 kDa, existem 20 de 21 kDa e 40 de 25 kDa. Essas
proporções foram obtidas através da análise densitométrica que determinou a área
relativa das enzimas das amostras purificadas. A região em vermelho representa a
enzima SOD.
Figura 64: Modelo do estado de agregação correspondente às proteínas purificadas de plasma seminal.
85
Considerados em seu conjunto, os dados obtidos no presente trabalho nos
permitem sugerir que as enzimas superóxido dismutases presentes no plasma seminal
e fluido epididimário podem estar na forma de monômeros, dímeros, trímeros,
tetrâmeros. Essas enzimas podem ainda formar monômeros de dímeros, dímeros de
dímeros, dímeros de trímeros, tetrâmeros de dímeros, e outras conformações. As
ligações atuantes na formação dessas enzimas seriam de tipo S-S e ligações não
covalentes.
86
7. CONCLUSÕES
Nossos resultados revelaram a presença de atividade SOD em fluido e
espermatozóides coletados das diferentes regiões do epidídidimo. A enzima apresenta
uma alta atividade específica;
Ensaios utilizando inibidores para CuZn-SOD mostraram que esta é a isoforma
predominante no fluido epididimário, apresentando R
f
= 0,40; no entanto observou-se a
isoforma Mn-SOD em uma menor concentração;
Os ensaios de inibição demonstraram a presença de ambas isoformas da enzima
no plasma seminal: CuZn-SOD (R
f
= 0,45 e R
f
= 0,54) e Mn-SOD (R
f
= 0,15). A banda de
Rf= 0,15 foi predominante;
Espermatozóides coletados do epidídimo apresentaram atividade CuZn-SOD e
Mn-SOD, com R
f
= 0,32 e R
f
= 0,47, respectivamente ; enquanto que espermatozóides
maduros apresentaram proteínas com atividade SOD com R
f
= 0,50 (CuZn-SOD), R
f
=
0,53 e R
f
= 0,58 (Mn-SOD);
Experimentos realizados utilizando 2-mercaptoetanol mostraram que apesar de
detectar-se atividade enzimática, a presença do agente redutor interfere na visualização
e resolução das bandas, provavelmente devido a presença de enlaces dissulfeto.
Amostras de fluido epididimário, na presença do agente redutor, mostraram uma banda
levemente mais intensa com R
f
= 0,33. Ambas as enzimas (CuZn-SOD / Mn-SOD) foram
detectadas. Espermatozóides imaturos e maduros, quando tratadas com agente redutor
apresentaram uma banda em destaque com R
f
= 0,25 e R
f
= 0,36, respectivamente. Em
plasma seminal, foi encontrada uma banda mais intensa com R
f
= 0,15.
A atividade CAT foi detectada em todas as amostras estudadas. Essa enzima,
como a SOD, também possui alta atividade específica. As bandas positivas para
atividade catalásica em fluido epididimário mostraram uma mobilidade eleltroforética de
R
f
= 0,11 e R
f
= 0,15. Em espermatozóides epididimários, as bandas de atividade CAT
87
possuem R
f
=
0,21 e R
f
= 0,62, e em espermatozóide maduros R
f
= 0,54. Em plasma
seminal observou-se uma banda protéica com atividade catalásica com R
f
= 0,15;
Um excesso de H
2
O
2
no meio de detecção para SOD, atua como substrato para
catalase, observando-se a atividade de ambas as enzimas no mesmo gel;
Analisando as massas moleculares das enzimas SODs e CAT encontradas em
todas as amostras estudadas podemos dizer que essa enzima pode ser encontrada em
forma monomérica ou em agregados.
88
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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