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UNIVERSIDADEDESÃOPAULO
FACULDADEDEMEDICINADERIBEIRÃOPRETO
DEPARTAMENTODEFARMACOLOGIA
PARTICIPAÇÃODONÚCLEOPRETECTALANTERIORNO
SISTEMANOCICEPTIVOINIBITÓRIODESCENDENTEEM
RATOSSUBMETIDOSAELETROACUPUNTURACOM2HZ
E100HZ
MarceloLourençodaSilva
RIBEIRÃOPRETO
2008
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Livros Grátis
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UNIVERSIDADEDESÃOPAULO
FaculdadedeMedicinadeRibeirãoPreto
DepartamentodeFarmacologia
LaboratóriodeMecanismosCentraisdoControledaDor
PARTICIPAÇÃODONÚCLEOPRETECTALANTERIORNO
SISTEMANOCICEPTIVOINIBITÓRIODESCENDENTEEM
RATOSSUBMETIDOSAELETROACUPUNTURACOM2HZ
E100HZ
MARCELOLOURENÇODASILVA
RIBEIRÃOPRETO
2008
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MarceloLourençodaSilva
PARTICIPAÇÃODONÚCLEOPRETECTALANTERIORNO
SISTEMANOCICEPTIVOINIBITÓRIODESCENDENTEEM
RATOSSUBMETIDOSAELETROACUPUNTURACOM2HZ
E100HZ
Dissertação apresentada à Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo, para
obtençãodograudeMestreemCiências.
ÁreadeConcentração:Farmacologia
Orientador:Prof.Dr.WiliamAlvesdoPrado.
RibeirãoPreto
2008
AUTORIZOAREPRODUÇÃOE/OUDIVULGAÇÃOTOTALOUPARCIALDESTE
TRABALHO,PORQUALQUERMEIOCONVENCIONALOUELETRÔNICO,PARA
FINSDEESTUDOEPESQUISA,DESDEQUECITADAAFONTE.
FICHACATALOGRÁFICA
PreparadapelaBibliotecaCentraldoCampusAdministrativode
RibeirãoPreto/USP
Silva,MarceloLourençoda
Participaçãodonúcleopretectalanteriornosistema
nociceptivoinibitóriodescendenteemratossubmetidosa
eletroacupunturacom2hze100hz/MarceloLourençodaSilva;
Orientador:WiliamAlvesdoPrado–RibeirãoPreto,2008.
91f.
Dissertação(MestradoemCiências–Áreade
Concentração:Farmacologia)–FaculdadedeMedicinade
RibeirãoPretodaUniversidadedeSãoPaulo.
1.Nocicepção.2.Eletroacupuntura.3.Núcleopretectal
anterior.4.Funículodorsolateral.5.Inibiçãodescendente
FOLHADEAPROVAÇÃO
MarceloLourençodaSilva
Participaçãodonúcleopretectalanteriornosistemanociceptivoinibitório
descendenteemratossubmetidosaeletroacupunturacom2hze100hz
Dissertação apresentada à Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo, para a
obtençãodograudeMestreemCiências.
ÁreadeConcentração:Farmacologia
BancaExaminadora
Prof.Dr.WiliamAlvesdoPrado
Instituição:FMRP–USP Assinatura:__________________________
Profa.Dra.ChristieRamosAndradeLeitePanissi
Instituição:FORP–USP Assinatura:__________________________
Prof.Dr.CarlosAmilcarParada
Instituição:FMRP–USP Assinatura:__________________________
TrabalhorealizadocomauxíliofinanceirodaCAPES(Coordenaçãode
AperfeiçoamentodePessoaldeNívelSuperior),CNPqeFAPESP.
DEDICATÓRIA
Àminhaamadaesposa,Josie.
Vocêébelaeadorável.
Saibaminhaquerida,quevocêmefazmuitofeliz.
Euteamoequeroviveresteamorportodaa
minhavida.
Aosmeuspais,ÍcaroeMyriameaosmeus
irmãos,Luciana,GustavoeLeandro.
Nosmomentosdeminhaausênciadedicadosao
estudo,semprefizeramentenderqueofuturoéfeito
apartirdaconstantededicaçãonopresente.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr.Wiliam Alves do Prado, pelo privilégio de sua orientação, pelo
incentivo e confiança. Por assumir a responsabilidade de um trabalho pioneiro.
Exemplodededicação,pesquisadorepessoa.Meurespeito,admiraçãoegratidão.
Aos membros da banca examinadora: Profa. Dra. Christie Ramos Andrade
Leite Panissi e Prof. Dr. Carlos Amílcar Parada, pelas sugestões que
engrandeceramoconteúdodestetrabalho.
Ao professor Dr. João Eduardo de Araújo, incentivador no período de
graduação, onde aprendi o valor da pesquisa e da investigação como forma de
engrandecimentoprofissional.
A professora Dra. Márcia Valéria Rizzo Scognamillo Szabó pelos primeiros
passosnaexperimentaçãoeincentivonabuscadapós-graduação.
EmmemóriadoProfessorMarcoAurélioResendeOttoni,exemplodepessoa
edededicaçãoparacomosalunos,pacienteseamigos.“Vocêtembrilhointerior”.
Ondequerqueesteja,seiqueolhaportodosnós.Obrigadopelosensinamentose
peloincentivo.
A todos os professores do Departamento de Farmacologia da FMRP pela
contribuiçãoàminhaformaçãocientífica.
Aos técnicos, Paulo Roberto Castania e Marcos Antônio de Carvalho pela
disposiçãoecolaboraçãocomoquesemprenecessitavanafaseexperimentaldeste
trabalho.
Aossecretários,SôniaMariaStefanelli,FátimaHelenaFerreiraPeteaneJosé
Waldik Ramon, que com muita dedicação e competência, nos auxiliam com as
dificuldadesburocráticas.
ÀsSras.ElianaeMariaInês,pelotratamentoecuidadosomanejodenossos
animaisdobiotério.
Aos meus colegas de laboratório, Gláucia, João Walter, Quintino, Liliane,
Karina, Carol e Ariane por terem colaborado, ajudado e incentivado em todos os
momentos.Pelaalegreconvivênciaeamizade.
Ao amigo Guilherme Bertolino, que compartilhou problemas, momentos de
tristeza,mastambémmuitasalegrias.
AtodososcolegasdodepartamentodeFarmacologia.
Enfim, a todos aqueles que contribuíram direta ou indiretamente para a
realizaçãodessetrabalho.
RESUMO
SILVA, M.L. Participação do núcleo pretectal anterior no sistema nociceptivo
inibitóriodescendenteemratossubmetidosaeletroacupunturacomdoisHze100
Hz.2008.91f.Dissertação(Mestrado)–FaculdadedeMedicinadeRibeirãoPreto,
UniversidadedeSãoPaulo,RibeirãoPreto,2008.
Onúcleopretectalanterior(NPtA)éumaestruturadomesencéfaloqueparticipados
mecanismos nociceptivos e antinoceptivos. O papel do NPtA no controle
antinociceptivo é demonstrado pela estimulação elétrica que produz forte
antinocicepção no modelo de dor fásica acompanhada pela ausência de
comportamentosaversivos. Foidemonstrado que a administração de naloxana no
NPtAbloqueiaainibiçãodalatênciainduzidapelaeletroacupunturadebaixa(LEA),
mas não de alta (HEA) freqüência. Entretanto, o conhecimento preciso sobre os
mecanismosneuraissubjacentesàmodulaçãodanocicepçãopelaEAaindarequer
estudosfuturos.EsteestudoinvestigouoenvolvimentodoNPtAnaantinocicepção
induzida pelaeletroacupuntura em modelode dor agudaem ratos. Ratosmachos
Wistars (160g) foram submetidos à lesão do funículo dorsolateral (FDL) e
submetidos a 20 minutos de LEA ou HEA nos pontos Zusanli (E36) e Sanyinjiao
(BP6)eposteriormenteaotestederetiradadecauda(R.C.)por30min.Emoutro
grupo foram implantadas cânulas bilateralmente no NPtA ou na porção dorsal do
NPtA (dNPtA) e submetidos à LEA e HEA e ao teste de R.C por 30 min. A LEA
produzaumentoimediatodalatênciadeR.C.durante30minutos,significativamente
maioresdoqueasdogrupocontrole.AHEAtambémproduziuaumentoimediatoda
latência de R.C. resultando curva semelhante ao da LEA, porém, decaiu
acentuadamente 10minutosapósa estimulação.ComalesãodoFDL a LEAea
HEAproduziramlatênciassignificativamentemenoresdoqueasdogrupocontrole.
O bloqueio neural do NPtA com lidocaína impediu por completo o efeito
antinociceptivodaLEA,noentantonaHEAobloqueioatenuou,masnãoimpediuo
aumento imediato das latências de R.C. e ainda reduziu também a duração. O
bloqueiododNPtAaboliuoefeitoantinociceptivodaLEA,masnãoimpediuoefeito
da HEA. Estesresultadosnoslevarama concluir que: (1)a LEAe aHEA produz
antinocicepção,comcaracterísticasdiferentesemrelaçãoàintensidadeeaduração
do efeito; (2) a lesão do FDL abole os efeitos da LEA e da HEA; (3) o bloqueio
neuraldoNPtAaboleoefeitodaLEA,ereduzaintensidadeeaduraçãodoefeito
obtidopelaHEA;(4)obloqueiododNPtAaboleoefeitodaLEAenãointerferena
antinocicepçãoobtidapelaHEA.
ABSTRACT
SILVA,M.L.Involvementoftheanteriorpretectalnucleusondescendingnociceptive
inhibitorysysteminratssubmittedtoelectroacupuncturein2Hzor100Hz.2008.91
f. Dissertation (Master) – School of Medicine of Ribeirão Preto, University of São
Paulo,RibeirãoPreto,2008.
The anterior pretectal nucleus (APtN) is a midbrain structure that participates in
nociceptive and antinociceptive mechanisms. Supporting a role for APtN in
involvementofantinociceptionisthedemonstrationthatbriefelectricalstimulationof
thisnucleusproducesstrongantinociceptiveeffectsintherattailflickaccompanied
by no signs of aversiveness. It has been reported that naloxone applied to APtN
blocked the antinociception induced by low (LEA), but not high frequency
electroacupuncture(HEA).Howeverthemechanismsinvolvedinpainmodulationby
electroacupuncturestillremainsacomplexandchallengingfieldforfutureresearch.
This study investigated the involvement of the APtN in the electroacupuncture-
inducedantinociceptiveeffectinamodelofphasicpain.Inafirstexperiment,male
Wistar rats (160g) were submitted to the bilateral lesion of dorsolateral funicullus
(LDLF).Oneweeklatertheanimalsweresubmittedtoa20-minperiodofLEAor
HEA in Zusanli (ST36) and Sanyinjiao (SP6) acupoints and the tail flick latencies
werereevaluatedat5-mininterrvalsforupto30min.TheLEAevokedastrongand
long-lasting (over 30 min) antinociceptive effect. The HEA produced similar strong
effectsbuttheyhadashorterduration.TheLEAorHEAwerebothnon-effectivein
LDLF–lesioned rats. In a second experiment, rats were chronically implanted with
guide cannula above the APtN, bilaterally. Bilateral injection of lidocaine into the
APtNreducedbothdurationandintensityoftheantinociceptiveeffectsofLEA,and
reducedtheduration,butnottheintensityoftheantinociceptiveeffectsof HEA.In
thelastexperimentanimalswerechronicallyimplantedwithguidecannulaabovethe
dorsalAPtN(dAPtN)bilaterally.BilateralinjectionoflidocaineintothedAPtNreduced
bothdurationandintensityoftheantinociceptiveeffectsofLEA,butdidnotchange
theintensityordurationoftheantinociceptiveeffectsofHEA.Weconcludethat:(1)
LEAandHEAinducesantinociceptionintherattailflicktestthatdifferregardingthe
duration of the effect; (2) the effects of LEA and HEA were not obtained in DLF-
lesioned rats; (3) the neural block ofAPtNabolishesthe antinociceptive effects of
LEA, and reduces intensity and duration of HEA; (4) the neural block of dAPtN
abolishes the antinociceptive effects of LEA but does not alter the antinociceptive
effectsofHEA.
ÍNDICEDEFIGURAS
pág.
Figura1 Demonstração do animal fixado em aparelho
estereotáxico, para ser submetido à cirurgia de implante
decânula-guianoNPtA.
18
Figura2 Aparatoutilizadoparaarealizaçãodotestederetiradade
cauda.
20
Figura3 Aparatoutilizadoparaarealizaçãodaeletroacupuntura 21
Figura4 Posição das agulhas de acupuntura nos pontos Zusanli
(E36)eSanyinjiao(BP6)comeletrodosdoaparelho.
22
Figura5 Curvas intensidade-duração do efeito antinociceptivo
produzido pela aplicação de diferentes freqüências de
eletroacupuntura nos pontos Zusanli (E36) e Sanyinjiao
(BP6)emratos(EA)durante20minutos.
32
Figura6 Curvas intensidade-duração do efeito antinociceptivo
produzido após aplicação de eletroacupuntura de baixa
freqüência (2 Hz) nos pontos Zusanli (E36) e Sanyinjiao
(BP6) em ratos com e sem a lesão do funículo
dorsolateral.
34
Figura7 Curvas intensidade-duração do efeito antinociceptivo
produzido após aplicação de eletroacupuntura de baixa
freqüência(100Hz)nospontosZusanli(E36)eSanyinjiao
(BP6) em ratos com e sem a lesão do funículo
dorsolateral.
36
Figura8 Corteshistológicosdemonstrandoaextensãodalesãodo
animal4dogrupoLFDL/EA2Hz,coradosemvermelho
neutro.
37
Figura9 Curvas intensidade-duração do efeito antinociceptivo
produzido após aplicação de eletroacupuntura de baixa
freqüência (2 Hz) nos pontos Zusanli (E36) e Sanyinjiao
(BP6) em ratos com microinjeção de lidocaína ou salina
noNPtA.
39
Figura10 Localizaçãodossítiosdeinjeçãodelidocaínabilateralno
NPtA dos grupos Lidocaína/2Hz e Lidocaína/Sham
adicionadosapranchasdoatlas.
39
Figura11 Curvas intensidade-duração do efeito antinociceptivo
produzido após aplicação de eletroacupuntura de alta
freqüência(100Hz)nospontosZusanli(E36)eSanyinjiao
(BP6) em ratos com microinjeção de lidocaína ou salina
noNPtA.
41
Figura12 Localizaçãodossítiosdeinjeçãodelidocaínabilateralno
NPtA dos grupos Lidocaína/100Hz e Lidocaína/Sham
adicionadosapranchasdoatlas.
41
Figura13 Curvas intensidade-duração do efeito antinociceptivo
produzido após aplicação de eletroacupuntura de baixa
freqüência (2 Hz) nos pontos Zusanli (E36) e Sanyinjiao
(BP6) em ratos com microinjeção de lidocaína ou salina
naregiãodorsaldoNPtA.
43
Figura14 Localizaçãodossítiosdeinjeçãodelidocaínabilateralno
dNPtA dos grupos Lidocaína/2Hz e Salina/2Hz
adicionadosapranchasdoatlas.
43
SUMÁRIO
RESUMO
ABSTRACT
ÍNDICEDEFIGURAS
1INTRODUÇÃO 1
1.1.Conceitodedorenocicepção 2
1.2Mecanismosnociceptivos 3
1.3Sistemasinibitóriosdanocicepção 5
1.4Acupuntura 9
1.5Eletroacupuntura 11
2OBJETIVOS 14
2.1Objetivogeral 15
2.2Objetivosespecíficos 15
3MATERIALEMÉTODOS 16
3.1Animais 17
3.2Cirurgia 17
3.2.1LesãodoFunículoDorsolateral
17
3.2.2Implantedecânula-guia
18
3.3Injeçãointracerebral 19
3.4Testederetiradadecauda
19
3.5Eletroacupuntura 20
3.5.1Métodoparaidentificaranimaisnão-respondentesaeletroacupuntura
22
3.6Histologia 23
3.7Drogas 23
3.8Protocolosexperimentais 24
3.8.1 Efeito da lesão bilateral do funículo dorsolateral sobre a antinocicepção induzida por
eletroacupunturadebaixaealtafreqüêncianotestederetiradadecauda.
24
3.8.2 Efeitos do bloqueio neural do NPtA sobre a antinocicepção induzida por
eletroacupunturadebaixaealtafreqüência.
25
3.8.3Efeitos dobloqueioneural da regiãodorsal doNPtAsobrea antinocicepçãoinduzida
poreletroacupunturadebaixaealtafreqüência.
27
3.9Análiseestatística 29
4RESULTADOS 30
4.1Antinocicepçãoinduzidaporeletroacupunturadebaixaealtafreqüência
notestederetiradadecauda.
30
4.2 O funículo dorsolateral participa da antinocicepção induzida por
eletroacupunturadebaixaealtafreqüêncianotestederetiradadecauda?
33
4.3 O núcleo pretectal anterior participa da modulação da antinocicepção
induzidaporeletroacupunturadebaixaealtafreqüêncianotestederetirada
decauda?
38
4.4Aantinocicepçãoinduzidaporeletroacupunturadebaixaealtafreqüência
dependedaintegridadedaregiãodorsaldonúcleopretectalanterior(dNPtA)?
42
5DISCUSSÃO 46
6CONCLUSÃO 54
7REFERÊNCIASBIBLIOGRÁFICAS 56
Introdução
Introdução
Silva,M.L.
2
1INTRODUÇÃO
1.1.Conceitodedorenocicepção
Adoréumaexperiênciaperceptualcomplexa,envolvendotodososdomínios
da vida de um indivíduo. É uma resposta resultante da integração central de
impulsos de nervos periféricos ativados por estímulos locais e tem a função de
sinalizar aos centros nervosos a respeito da ocorrência de lesões teciduais,
permitindoquemecanismosdedefesaoufugasejamadotados(CALVINO&GRILO,
2006). Noentanto,porsua inerente naturezaaversiva, dependendo da duraçãoe
intensidade,adorpoderepresentarseveraagressãoaoorganismo,influenciandoo
comportamentodoindivíduo.
Apesardesuauniversalidade,adornãoéumaentidadesimples,émúltiplae
variadaeenglobaosdesconfortoshumanos(MELZACK&WALL,1965).Adefinição
dedormaisusadaatualmenteéasugeridapelocomitêdaAssociaçãoInternacional
para o Estudo da Dor (IASP) que a considera como “experiência sensorial e
emocional desagradável associada a um dano tecidual potencial ou de fato, ou
ainda,descritaemtermosquesugeretaldano”(MERSKEY&BOGDUK,1994).
Adoréumfenômenomultifacetado,possuindocomponentesdiscriminativos,
emocionais-afetivos, cognitivos e locomotores associados. Conseqüentemente, a
experiênciadedorvariadeacordocomamaneiranaqualtodosessesfatoressão
combinados.Comisso,otermodorseriamaisadequadoquandonosreferirmosao
queaconteceaohomem,enquantootermonocicepção(dolatimnocere,“nocivo”)
seria mais indicado para os modelos animais de experimentação, pois define
somente a percepção de estímulos e a codificação de sinais para informar ao
Introdução
Silva,M.L.
3
sistema nervoso central da existência de injúria tissular (NOBACK et al., 1996,
BROOKS&TRACEY,2005).
Entretanto, o termo hiperalgesia, usado para descrever a sensação de dor
maisintensaàaplicaçãodeestímulonormalmentenocivo,tambéméempregadoem
modelosexperimentais.Noentanto,hipernocicepçãoéotermomaisadequadopara
indicar a redução do limiar de resposta do animal a estímulos nociceptivos
(NOBACKetal.,1996).
1.2Mecanismosnociceptivos
O estímulo nociceptivo seja ele físico (mecânico e térmico) ou químico
(bradicinina, histamina, serotonina, potássio, acetilcolina, ATP, H
+
, NGF), é
identificado por terminações nervosas livres denominadas nociceptores, que se
encontram espalhados por quase todas as partes do corpo humano (músculos,
articulações, vísceras e principalmente a pele), formando campos receptivos
ativados especialmente pelos estímulos nocivos. O nociceptor é diferenciado dos
outrostiposdereceptoresparaestímulosmecânicosetérmicosporapresentaralto
limiar de estimulação, ou seja, responder normalmente apenas a estímulos
nociceptivos(JULIUS&BASBAUM,2001).
Os nociceptores são terminações livres de neurônios pseudo-unipolares,
cujos corpos celulares estão localizados nos gânglios da raiz dorsal da medula
espinal ou nos gânglios trigeminais. Esses neurônios, denominados aferentes
primários,alémdoramoperiférico,possuemumprolongamentocentralqueadentra
ocornodorsaldamedulaespinalpelaraizdorsal(MILLAN,2002).
Introdução
Silva,M.L.
4
As fibras primárias são classificadas em quatro tipos, de acordo com o
diâmetro:FibrasAαeAβsãoaferentesdegrandediâmetro,aopassoqueasfibras
AδeCsãoaferentesdepequenodiâmetro(MILLAN,2002).
AsfibrasdotipoCsãopolimodaisenão-mielinizadas,tembaixavelocidade
decondução(0,5-2,0m/s)esãoativadasporestímulosnocivosquímicos,térmicos
(caloroufrio)emecânicos(MILLAN,2002).
AfibraAδ,aocontráriodafibraC,éfinamentemilelinizada,temvelocidadede
conduçãointermediária(12-30m/s)eéativadaporestímulosmecânicos,térmicose
químicosdealtaintensidade.Poroutrolado,asfibrasAβsãodegrandediâmetroe
mielinizadaseconduzeminformaçãosensorialnão-nociceptivacomaltavelocidade
(30-100 m/s) e respondem apenas a estímulos de baixo limiar (MILLAN, 2002;
D'MELLO&DICKENSON,2008).
O impulso elétrico gerado pela ativação de um nociceptor percorre toda a
extensão do neurônio aferente primário, passando pela raiz dorsal da medula
espinal, onde a informaçãoé processada (MUNGLIANI& HUNT,1995;JULIUS &
BASBAUM,2001;SCHAIBLE&RICHTER,2004).
No corno dorsal da medula espinal, as fibras nociceptivas e as não-
nociceptivas, formam um complexo circuito disposto ao longo de divisões ou
lâminas. Na medula espinal, a passagem da informação nociceptiva do neurônio
aferenteprimárioparaoneurônioespinal,denominadoneurôniodesegundaordem,
envolvealiberaçãodediferentesneurotransmissores,comopeptídeos,serotonina,
aminoácidos,substânciaP,glutamatoeadenosina-5-trifosfato(ATP)(SANDKÜLER,
1996;MILLAN,2002).
Apóssuaintegraçãonocornodorsal,ainformaçãonociceptivaéconduzida
por neurônios de segunda ordem para altos centros do sistema nervoso central
Introdução
Silva,M.L.
5
(SNC).Oconjuntodessesneurôniosédenominadotratoouvianeuralascendente,
se projeta para diversas regiões supraespinais, dentre elas o tálamo, córtex
somatossensorial e sistema límbico (hipotálamo, complexo amigdalóide, área
septal), e ainda, várias regiões do tronco cerebral, incluindo a matéria cinzenta
periaquedutal(SCP),regiãopontinaparabraquial,formaçãoreticularbulbarenúcleo
pontinoarqueado(VANEGAS&SCHAIBLE,2004).
Asprincipaisviasdeconduçãodainformaçãonociceptivaascendematravés
do quadrante anterolateral da medula espinal. Dentre estas vias, estão os tratos:
espinotalâmico, espinocervical e espinomesencefálico (MILLAN, 2002). Algumas
vias também podem utilizar o quadrante dorsal, como é o caso da via da coluna
dorsal-leminisco medial e do trato espinocervical (WILLIS & WESTLUND, 1997;
MILLAN,2002).
1.3Sistemasinibitóriosdanocicepção
A primeira hipótese da existência de mecanismos endógenos capazes de
controlar a sensação dolorosa foi postulada por Head e Holmes (1911) e
considerava que a atividade do tálamo, o centro da percepção da dor, era
continuamente modulada pelo neocórtex, o centro discriminativo da percepção.
Posteriormente, Hagbarth e Kerr (1954) e Carpenter et. al. (1965) forneceram as
primeiras evidênciasdiretas de que regiões supraespinais poderiam controlarvias
ascendentes,presumivelmentesensoriais(verGOFFAUXetal.,2007).
Noentanto,somenteapartirda“TeoriadoPortão”,postuladaporMelzacke
Wall (1965), aventou-se à existência de um sistema específico de modulação da
nocicepção. De acordo com esta teoria, a estimulação da pele geraria impulsos
Introdução
Silva,M.L.
6
elétricos que seriam conduzidos por fibras de pequeno e grande calibre até a
substância gelatinosa da medula espinal. Desta forma, o fenômeno da dor seria
determinado pela interação entre estas fibras, células da substância gelatinosa e
neurôniosdeprojeção.Estascélulasteriampapelcentralnessateoriaporfuncionar
como“portão”e,destaforma,regularaativaçãodeneurôniosprojeção(GOFFAUX
etal.,2007).
Asprimeirasevidênciasdaexistênciadesistemasdescendentesmodulatórios
da dor foram obtidas com a estimulação elétrica de discretas áreas do sistema
nervosocentral(MAYERetal.,1971;MAYER&PRICE,1976;REYNOLDS,1969).
Reynolds (1969)mostrou a importânciade sistemas descendentesno controle da
dor, aoobservar que a estimulaçãoelétrica da PAGcausavaforteantinocicepção
emratos.Desdeentão,amplomapeamentodesítiosencefálicostemsidofeitoafim
de encontrar locais onde a estimulação elétrica induza antinocicepção. Entre as
estruturasencontradasdestacam-se,alémdaPAG,onúcleodorsaldarafe(NDR),
núcleosdobulborostroventral(RVM)eonúcleopretectalanterior(NPtA).
Em1985,Pradoe Robertsestimularameletricamente114sítiosencefálicos
noratoeobservaramquenamaioriadossítiosestudadosaantinocicepçãoavaliada
pelo teste de retirada da cauda foi precedida de aversão durante a estimulação.
Umadaspoucasáreasqueproduziramantinocicepçãosemreaçãoaversivadurante
a estimulação foi o complexo pretectal. Estudo posterior conduzido por Roberts e
Rees(1986),revelouqueoNPtAéosítiodocomplexomaissensívelàestimulação.
Nestemesmoestudoosautoresavaliaramtambémoefeitodaestimulaçãoelétrica
do NPtAsobre acapacidade motoraeatenção dosanimais,a fimde descartar a
possibilidade dequeoaumentoda latênciapararetiradadacauda decorressede
alteração de outras modalidades sensoriais. Eles observaram que a estimulação
Introdução
Silva,M.L.
7
elétricadoNPtAnãoafetaaperformancemotoraenemarespostadesobressaltoa
ruído intenso, indicadora do grau de atenção do animal. Desta forma, concluíram
que o aumento do limiar nociceptivo produzido pela estimulação elétrica do NPtA
nãoestáassociadocomalteraçãomotoradetectávelnemcomreduçãodaresposta
deestímulosexternos.Essesautoresobservaramaindaqueaestimulaçãoelétrica
dos sítios dorsal, ventral ou lateral ao NPtA não alterou a resposta ao estímulo
nocivo, sugerindo que o efeito antinociceptivo é próprio do NPtA e não de sítios
vizinhosaele.
O NPtA é um dos núcleos que formam o complexo pretectal, estrutura
bilaterallocalizadaentreomesencéfaloeodiencéfalo(WEBER&HARTING,1980).
AantinocicepçãodecorrentedaestimulaçãoelétricadoNPtAemratosfoiobservada
tambémnostestesdaformalina,pressãodapata(WILSONetal.,1991),eabertura
damandíbula(CHIANGetal.,1989).UmavezdemonstradoqueoNPtAéaorigem
da antinocicepção, eque esta não está relacionada com aversão ou alteração de
outras modalidades sensoriais, os estudos que se seguiram visaram elucidar os
mecanismosenvolvidosnesseefeito.
Estudos eletrofisiológicos desenvolvidos por Rees e Roberts (1987)
forneceram as primeiras indicações a este respeito. Eles observaram que a
estimulação elétrica do NPtA inibe a resposta de neurônios multirreceptivos
profundos (lâmina V) do corno dorsal da medula espinhal à estimulação térmica
nociva, sem afetar a resposta a estímulos não nocivos, sendo que esse efeito é
abolidopelalesãodofunículodorsolateralipsilateral.
Rees et al. (1995) confirmaram esses resultados e constataram que a
estimulação do NPtA, de modo inverso ao que foi observado em neurônios
convergentes profundos, facilita a resposta de neurônios nociceptivos específicos
Introdução
Silva,M.L.
8
daslâminassuperficiais(IeII)docornodorsalespinalaoestimulotérmiconocivo.A
partirdestasobservaçõesosautoressugeremqueaestimulaçãodoNPtAativavias
descendentes que, passando pelo funículo dorsolateral, inibem a resposta de
neurônios multirreceptivos profundos no corno dorsal à estimulação periférica
nociva,masnãoaestímulosperiféricosinócuos.Arespostadecélulasdascamadas
superficiais no corno dorsal a estímulos periféricos nocivos é facilitada pela
estimulação elétrica do NPtA, sugerindo a participação do núcleo tanto na
nocicepçãoquantonaantinocicepção.
Estudos posteriores confirmaram a participação do NPtA nos mecanismos
descendentes de controle da dor, principalmente pela supressão espinal da
informação nociceptiva periférica, ativando células neuronais superficiais do corno
posterior da medula e inibindo as de camadas espinais mais profundas (REES e
ROBERTS,1993;VILLARREALetal.,2003).
Estudo realizado por VILLARREAL et al. (2004) demonstrou que a
estimulaçãodediferentespartesdoNPtAproduzefeitosantinociceptivosdiferentes
em relação à intensidade e a duração, dependendo do sítio de estimulação no
núcleoedomodeloexperimentalutilizado.Aestimulaçãoelétricadaporçãodorsal
doNPtAémaiseficazqueaestimulaçãodaporçãoventralparareduziradorfásica
dotestederetiradadacauda.Noentanto,aestimulaçãoelétricadaporçãoventral
donúcleofoimaisefetivadoqueaestimulaçãodaporçãodorsalnocontroledador
persistentedomodelodeincisãonapata.
Introdução
Silva,M.L.
9
1.4Acupuntura
A palavra acupuntura deriva dos radicais latinos acus e pungere, que
significamagulhaepuncionar(inserir),respectivamente.Aacupunturavisaàterapia
dasenfermidadespelaaplicaçãodeestímulosatravésdapele,comainserçãode
agulhasempontosespecíficos,chamadosacupontos(JAGGAR,1992;WANGetal.,
2008a).Trata-setambémdeumaterapiareflexa,emqueoestímulodeumaárea
age sobre outra. Para este fim, utiliza principalmente o estímulo nociceptivo da
inserçãodaagulha(LUNDEBERG,1993;WANGetal.,2008a;WANGetal.,2008b).
Osacupontosforamempiricamentedeterminadosnotranscorrerdemilhares
deanosdepráticamédica(WANGetal.,2008a).Acupontoéumaregiãodapeleem
queégrandeaconcentraçãodeterminaçõesnervosassensoriais(LIetal.,2005).
Essa região está em relação íntima com nervos, vasos sangüíneos, tendões,
periósteose cápsulasarticulares (VICKERSetal.,2002).Estudosmorfofuncionais
identificaram plexos nervosos, elementos vasculares e feixes musculares como
sendo os mais prováveis sítios receptores dos acupontos (BROWN, 2005; KIM,
2006).Outrosreceptoresencapsulados,principalmenteoórgãodeGolgidotendão
e bulbos terminais de Krause também participam da condução do estímulo do
acupontoaoSNC(HWANG,1992).Alémdisso,comparadosàsáreasadjacentes,os
acupontos possuem propriedades elétricas diversas: condutância elevada, menor
resistência,padrõesdecampoorganizadosediferençasdepotencialelétrico(HAN
& TERENIUS, 1982; LO, 2002). Por isso, acupontos são considerados pontos de
baixa resistência elétrica da pele e podem ser localizados na superfície da pele
atravésdeumlocalizadordepontos(CHO&CHUN,1994).
Introdução
Silva,M.L.
10
A combinação das características descritas torna o ponto de acupuntura
extremamentereativoaopequenoestímulocausadopelainserçãodaagulha(HAN
&TERENIUS,1982;DOWNSetal.,2005),modificandoaativaçãoe/ouinibiçãode
diferentesáreasnocérebro(BIELLAetal.,2001;CHIUetal.,2003;ZHANGetal.,
2003;LEWITHetal.,2005).
SegundoGUNNetal.(1976),osacupontospodemserdivididosem:tipoIou
pontos motores; tipo II, localizados nas linhas medianas posterior e anterior (ou
dorsal e ventral) do organismo e tipo III, que apresentam leitura difusa com
neurômetro. Quantoàsua localização,os acupontosdosmembrose troncoestão
distribuídos em linhas imaginárias, chamadas de meridianos, que seguem, em
muitoscasos,otrajetodosprincipaisnervosevasossangüíneos.
Sims (1997) demonstrou que a analgesia induzidapelaacupuntura envolve
modulaçãocentral.Modelosatuaisdemonstramquequandoopontodeacupuntura
éestimulado,fibrasgrossas(Aβ)efibrasfinas(Aδ)sãoestimuladasseletivamente.
Isto resulta na ativação de neurônios nas camadas profundas e superficiais na
medula espinhal (LEE e BEITZ, 1993) que transmitem
a informação ao sistema
nervosocentral(FUKAZAWAetal.,2005),ondeváriosnúcleospodemserativados
(TODA, 1982;TAKESHIGE et al., 1992; LEE eBEITZ, 1993; MEDEIROS e cols.,
2003a, 2003b; GUO et al., 2004; GUO & LONGHURST, 2007). Esses núcleos,
principalmenteaPAGeNMRparecemserimportantesnocontroledadorinduzida
pelaacupuntura(LIU&WANG,1988),poissuasprojeçõesdescendempelofunículo
dorsolateral (DLF) (KOVOLOWSKI, 1999; LEE et al., 2007) inibindo os neurônios
multirreceptivosprofundosdamedulaespinhal(SANDKÜHLER&GEBHART,1984;
ABBOTTecols.,1996;LIAetal.,2007).
Introdução
Silva,M.L.
11
1.5Eletroacupuntura
Aeletroacupuntura(EA)consistenaestimulaçãodasagulhasdeacupuntura
com um aparelho elétrico com alta ou baixa freqüência (KIM et al., 2004). A
eletroacupuntura de baixa freqüência (2 Hz) produz aumento dos níveis de
encefalina,masnãoosdedinorfinaAnoperfusatoespinal.Jáaeletroacupunturade
altafreqüência(100Hz)elevaosníveisdedinorfinaA,masnãoalteraosníveisde
encefalina (HAN, 2003, 2004; HAHM, 2007). Alguns estudos ainda demonstraram
queaβ-endorfinaeaendomorfina(HANetal.,1999)produzemefeitossimilaresaos
da estimulação de baixa freqüência. Com isso, pode-se sugerir que a
eletroestimulação de alta freqüência produz analgesia pela liberação de dinorfina,
agonista em receptores opióides κ, enquanto a estimulação de baixa freqüência
libera endomorfinas e β-endorfinas, agonistas em receptores opióides δ e µ, e
encefalinas(HUANGetal.,2000;HAN,2004).Noentanto,outrosmediadorescomo
a serotonina (5HT) (CHENG & POMERANZ, 1981; HAN & TERENIUS, 1982;
CHANG et al., 2004), noradrenalina (NA) (ZHU et al., 1997; KIM et al., 2005),
glutamato(GLU)(ZHANGetal.,2003)eácidogama-aminobutírico(GABA)(HAN,
1982;FUSUMADAetal.,2007)tambémpodemestarenvolvidosnaantinocicepção
induzidaporEA.
Estudosdemonstramqueaeletroacupunturaativapequenasfibrasnervosas
mielinizadasnomúsculo,asquaisenviamsinaiselétricosparaocornoposteriorda
medula, através dos neurônios aferentes primários (ULETT etal., 1998), ativando
estruturas na medula espinal, mesencéfalo e o sistema pituitária-hipotálamo para
produzir analgesia (TAKAGI et al., 1996). Na medula espinal as encefalinas e as
dinorfinaspodembloquearossinaisaferentes(MUNGLIANI&HUNT,1995;XINGet
Introdução
Silva,M.L.
12
al., 2007). No mesencéfalo, as encefalinas podem ativar sistemas descendentes
inibitórios,queinibematransmissãonociceptivamedularatravésdasmonoaminas,
serotonina e noradrenalina (PORRECA et al., 2002). No sistema pituitária-
hipotálamo, o estímulo da eletroacupuntura pode estimular a liberação de β-
endorfina no sangue para produzir analgesia à distância (WANG et al., 2008a).
Esses efeitos analgésicos podem ser inibidos com naloxona, antagonista opióide
inespecífico(CHENG&POMERANZ,1981;TAKAGIetal.,1996).
ArelaçãoentreafreqüênciadaEAeaativaçãodecélulasimunoreativasa
FOSemnúcleoscerebraisfoidemonstradanotrabalhodeLee&Beitz(1993).Neste
trabalho, os autores demonstraram que diferentes freqüências, 4 e 100 Hz, eram
capazesdeaumentaronúmerodecélulasimunoreativasaFOS.Nogrupotratado
com baixa freqüência, havia aumento de células marcadas para proteína FOS no
núcleo cuneiforme, porções dorsais e dorsolaterais da PAG, núcleo habenular,
núcleo hipotalâmico arqueado e nos núcleos hipotalâmicos lateral e lateroventral.
Com EA de 100 Hz, os mesmos núcleos aumentavam o número de células
imunoreativas,noentantooúniconúcleoquenaaltafreqüênciaapresentavamaior
númerodecélulasreativasàFOSequenãoapresentavaesteaumentocombaixa
freqüênciafoiobulborostrolaterovental.
O bloqueio da PAG por naloxona ou a utilização de anticorpos para
receptoresµouδopióidesatenuasignificativamenteaanalgesiainduzidapelaEA
(HANetal.,1984;LIU&WANG,1988).Similarmente,obloqueiodoefeitodaEAfoi
obtido também pela microinjeção de naloxone na área pré-óptica, habenula, área
septal,núcleoaccubens,amígdalaounonúcleocaudado(HEetal.,1985;WUetal.,
1995).Amicroinjeçãodenaloxona nonúcleotalâmicosubmédio(SM)bloqueiaa
analgesia induzida por EA de alta, mas não pela baixa freqüência, enquanto que
Introdução
Silva,M.L.
13
resultadosopostossãoencontradosquandoanaloxonaéadministradanoNPtAem
ratos(ZHUetal.,2004).EssesresultadossugeremquereceptoresopióidesnoSMe
noNPtAestãoenvolvidosnaantinocicepção mediadapelaativaçãodefibrasAδ/Ce
Aβ, respectivamente. Deste modo, torna-se interessante investigar se a analgesia
induzidapelaEAdealta(100Hz)ebaixa(2Hz)freqüênciasdefatoenvolvemvias
descendentes de controle de nocicepção e se tais vias dependem ou não da
participaçãodoNPtA.
.
Objetivos
15
Objetivos
Silva,M.L.
2.OBJETIVOS
2.1Objetivogeral
O presente estudo investiga o envolvimento do NPtA na antinocicepção
induzidapelaeletroacupuntura.
2.2Objetivosespecíficos
1.Avaliarseaantinocicepçãoinduzidapelaeletroacupunturadealtaebaixa
freqüênciadependedaintegridadedofunículodorsolateral;
2. Investigar se a antinocicepção induzida pela eletroacupuntura de alta e
baixafreqüênciadependedaintegridadedoNPtA.
3.Verificarseaantinocicepçãoinduzidapelaeletroacupunturadealtaebaixa
freqüênciadependedaintegridadedaporçãodorsaldoNPtA.
Materialemétodos
17
Materialemétodos
Silva,M.L.
3MATERIALEMÉTODOS
3.1Animais
Foram utilizados ratos Wistar machos (n=102), pesando entre 140-160g,
provenientesdoBiotérioCentraldoCampusdeRibeirãoPretodaUSP,mantidosem
gaiolascomcincoanimais,sobcicloclaro/escurode12/12h,temperaturaentre22-
23°Celivreacessoàcomidaeágua.Osexperimentosforamrealizadossegundoas
normasque regulamentamaspectoséticosdautilização deanimaisdelaboratório
elaborados pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da FMRP-USP
(processo067/2008).
3.2Cirurgia
3.2.1LesãodoFunículoDorsolateral
Osanimaisforamanestesiadoscomhidratodeclorala4%(1ml/100g)e,após
incisãodapele,foramsubmetidosàlaminectomia(T1-T5)soblupacirúrgica.Adura-
máterfoiabertaeumasoluçãodelidocaínaa2%foiaplicadanasuperfíciemedular.
Apóscincominutos,alesãobilateralfoirealizadapormeiodeumcortenasporções
dorsolateraiscomumalâminadebisturi(Solidor,nº24).Apósalesãofoirealizadaa
sutura por planos. Animais que apresentaram comprometimento motor após esta
cirurgia foram excluídos do trabalho. Animais falso-operados (LFDL sham) foram
submetidos ao mesmo procedimento, exceto a lesão do quadrante dorsolateral.A
extensãodaslesõesfoiverificadaemtodososanimaisaofinaldosexperimentos.
18
Materialemétodos
Silva,M.L.
3.2.2Implantedecânula-guia
Os animais foram anestesiados com Tribomoetanol (2,5 %, 50 mg/kg,
intraperitoneal) e fixados em aparelho estereotáxico (DKI). A calota craniana foi
expostaeosanimaisreceberamimplantecrônicobilateraldecânulas-guiasdeaço
inoxidável (23G) de 12 mm de comprimento (Figura 1). As cânulas foram
direcionadas de modo a manter a extremidade inferior 3 mm acima dos núcleos
alvos (NPtA direito e esquerdo), segundo as coordenadas estabelecidas por
PAXINOS&WATSON(1986).Osimplantesforamfixadoscomacrílicopolimerizável
ancorado por dois parafusos de aço inoxidável rosqueados na calota craniana do
animal.Paraevitarobstruçãodacânula-guiaummandrilfoiintroduzidonointeriorda
mesmaatéomomentodoexperimento.Apósacirurgiaosanimaisforamtratados
com injeção intramuscular de 0,3 ml de antibiótico (Pentabiótico Veterinário) e
permaneceramnobiotériodoDepartamentoporumperíodomínimoderepousode
setedias.
Figura 1: Animal fixado em aparelho estereotáxico, para ser submetido à cirurgia de implante de
cânula-guianoNPtA.
19
Materialemétodos
Silva,M.L.
3.3Injeçãointracerebral
A injeção intracerebral foi feita através de agulha de vidro (70-90 µm)
conectada a um tubo de aço inoxidável (30G) conforme descrito anteriormente
(AZAMIetal.,1982).Oconjuntofoiprotegidoporsistematelescópicodetubosde
aço inoxidável composto porum tubo de aço 30G conectado a tubo 23G. O tubo
30Gdaagulhafoiconectadoaumcateter(tubodepolietilenoPE10)sobrepostoa
umatiradepapelmilimetrado.Odeslocamentodevolumefoiobtidopelapressão
exercidaporseringavaziade50mLconectadaaocateter,oqualfoipreenchidocom
soluçãoemumsistemaquefoicalibradodemodoqueodeslocamentode6mmou
3 mm da solução dentro do cateter corresponde a 0,25 µL ou 0,10 µL,
respectivamente.
3.4Testederetiradadecauda
O grau de antinocicepção foi medido pelo teste de retirada da cauda
(D`AMOUR & SMITH, 1941) modificado por Azami et al. (1982). O animal foi
gentilmenteimobilizadoeaporçãodacauda,entre4e6cmdesuaextremidade,
posicionadasobreumfilamentodeníquel-cromoquefoiaquecidoprogressivamente
(aproximadamente 9ºC/segundo)apartirda temperaturaambiente (22ºC±1ºC)
atéatingirtemperaturanociva(53ºC),emaproximadamente3segundos(Figura2).
O aquecimento foi automaticamente interrompido ao alcançar 6 segundos
com intuito de se evitar dano tecidual. Antes do tratamento, os animais foram
testadosparadeterminaçãodolimiarbasalparaoreflexoderetiradadecaudaem
trêsmedidasconsecutivaseaintervalosde5minutos.
20
Materialemétodos
Silva,M.L.
Após a medida basal, os animais foram levemente anestesiados via cone
nasalporvaporizaçãodeIsoflurano(0,5%)comoxigênio(5ml)emumacapelade
exaustão de acrílico (80cm X 60cm X 60 cm) e posicionados em decúbito dorsal
paraexposiçãodospontosdeacupunturaaseremutilizados.
Os testes de retirada da cauda foram realizados antes (pré anestesia),
determinando a linha de base, após (pós anestesia) por isoflurano, e após a
eletroacupuntura (pós eletroacupuntura) a intervalos de cinco minutos por até 30
minutos.
Figura 2 Aparato utilizado para a realização do teste de retirada de cauda: A) plataforma com a
espiraldeníquel-cromo;B)sistemadecontroledeaquecimentodaespiralecronômetrodigitalpara
marcaraslatências;C)acionadordoaquecimentodaespiraledocronômetro.
3.5Eletroacupuntura
Com os animais levemente anestesiados por vaporização de Isoflurano
(0,5%), o procedimento de eletroacupuntura iniciou-se com aplicação nos pontos
Zusanli (E36) e Sanyinjiao (BP6) nos membros posteriores (CASSU et al., 2008).
A
C
B
21
Materialemétodos
Silva,M.L.
ConformedemonstradoporYinetal.(2008)opontoE36seencontraentreatíbiae
afíbulaaproximadamente5mmlateralàtuberosidadedatíbiaeopontoBP6fica3
mmproximalàbordasuperiordomaléolomedial,nabordaposteriordatíbia.Foram
utilizadas agulhas de acupuntura (DBC, de 0,15 mm de espessura e 25 mm de
comprimento) (Figura 3). Para a execução da eletroestimulação foi utilizado o
aparelho EL 608 (NKL) com parâmetros de 2 Hz e 100 Hz de freqüência, com
largura de pulso de 500 microssegundos, duração de 20 minutos, intensidade
ajustávelacadaanimalnolimiardecontraçãomuscular(entre0,7a1,0mV)(Figura
4). Animais falso-estimulados (EA sham) foram submetidos ao mesmo
procedimento, exceto que o aparelho de eletroacupuntura foi mantido desligado
duranteos20minutosdeestimulação.
Figura3Aparatoutilizadoparaarealizaçãodaeletroacupuntura:A)capeladeacrílicocomexaustor;
B) vaporizador de anestésico volátil; C) plataforma para fixação do animal para realização da
eletroacupuntura.
B
A
C
22
Materialemétodos
Silva,M.L.
Figura4PosiçãodasagulhasdeacupunturanospontosZusanli(E36,entreatíbiaeafíbula,5mm
lateralàtuberosidadedatíbia)eSanyinjiao(BP6,3mmproximalàbordasuperiordomaléolomedial)
comeletrodosdoaparelho.
3.5.1Métodoparaidentificaranimaisnão-respondentesaeletroacupuntura
Deacordocomamagnitudedaanalgesiaproduzidapelaeletroacupuntura,os
animais normais podem ser classificados em não-respondentes, pouco
respondenteserespondentes(TANGecols.,1997).
Osanimaisforamentãosubmetidosaumpré-teste7diasantesdainjeçãono
NPtA. No pré-teste os animais foram inicialmente testados para determinação do
limiar basal para o reflexo de retirada de cauda e o procedimento de
eletroacupuntura executado como descrito antes. Durante a eletroacupuntura os
animaisforamreavaliadosnotestederetiradadacaudanostempos5e10minutos.
Osanimaisforamclassificadoscomonão-respondentesquandoalatêncianoteste
deretiradadacaudanãoseelevouacimade50%dovalorbasal,sendoexcluídos
doestudo(TANGecols.,1997).
23
Materialemétodos
Silva,M.L.
3.6Histologia
Terminados os testes, os animais foram anestesiados com tiopental sódico
(50mg/Kg,i.p.)ereceberammicroinjeçãode0,25µldeFastGreen(1%)nolocal
correspondenteaodainjeçãodasdrogas.Emseguidaforamperfundidosatravésdo
ventrículoesquerdocomsoluçãodeNaCl(0,9%)emvolumesuficientepararetirar
todoosanguedoanimal,seguidadesoluçãotamponadadeformaldeído(10%)em
volume suficienteparafixar ostecidos. Osencéfalosforam removidos emantidos
emformaldeído(10%)pornomínimo2dias.
Apósesteperíododefixação,osencéfalosforamcongeladosecortadosno
plano frontal em fatias de 50 µm de espessura. Os cortes foram montados em
lâminas de vidro gelatinizadas, secos ao ar e corados com solução de vermelho
neutro (1 %) e analisados com o auxílio de uma lupa. A posição da injeção foi
anotadasobrefigurasretiradasdoAtlasdePAXINOS&WATSON(1986).
3.7Drogas
•2,2,2-tribromoetanol(Sigma-Aldrich,St.Louis,USA).
• Pentabiótico (1.200.000UI, Fort Dodge Saúde Animal, Campinas, SP,
Brasil).
•Tiopentalsódico(Abbott,SãoPaulo,SP,Brasil).
•Isoflurano(Abbott,SãoPaulo,SP,Brasil)
•CloridratodeLidocaína2%(Cristália,Itapira,SP,Brasil).
24
Materialemétodos
Silva,M.L.
3.8Protocolosexperimentais
3.8.1Efeitodalesãobilateraldofunículodorsolateralsobreaantinocicepção
induzidaporeletroacupunturadebaixaealtafreqüêncianotestederetiradade
cauda.
GruposLFDL/EA
Osanimaiscomlesãobilateraldofunículodorsolateralforamsubmetidosao
teste de retirada de cauda para determinação do limiar basal antinociceptivo,
conforme descrito no ítem 3.5. Após leve anestesia por isoflurano, receberam 20
minutosdeeletroacupunturacomfreqüênciade2Hz(EA2HZ)ou100Hz(EA100HZ)
nos pontos Zusanli (E36) e Sanyinjiao (BP6) sendo em seguida avaliadas as
latênciasderetiradadecaudaaintervalosde5mindurante30min.
GruposLFDL/EAsham
Osanimaiscomlesãobilateraldofunículodorsolateralforamsubmetidosao
testederetiradadecaudaparadeterminaçãodolimiarbasalantinociceptivo.Após
leveanestesiaporisoflurano,receberamagulhasdeacupunturanospontosZusanli
(E36) e Sanyinjiao (BP6) com estimulador sendo mantido desligado (EAsham)
Lesãodo
Funículo
Dorsolateral
Pré-teste
Linhade
base
Linhade
baseapós
isoflurano
0min30min
Perfusãoe
análise
histológica
7dias
20minutos
Medidasdas
latências
Eletroacupuntura
2Hzou100Hz
25
Materialemétodos
Silva,M.L.
durante 20 minutos. As latências de retirada de cauda foram então avaliadas a
intervalosde5mindurante30min.
GruposLFDLsham/EA
Osmesmosprocedimentosforamaplicadosparaosgruposdeanimaiscom
falsalesãodosfunículosdorsolateraisequereceberameletroacupuntura(EA2HZe
EA100HZ).
GrupoLFDLsham/EAsham
Osmesmosprocedimentosforamaplicadosparaosgruposdeanimaiscom
falsalesãodosfunículosdorsolateraisequereceberamfalsaeletroacupuntura
(EA2HZeEA100HZ).
3.8.2EfeitosdobloqueioneuraldoNPtAsobreaantinocicepçãoinduzidapor
eletroacupunturadebaixaealtafreqüência.
GruposNPtAlido/EA
Os animais destes grupos foram submetidos à cirurgia estereotáxica para
implantedecânulas-guiasdirecionadasaoNPtAbilateralmente.Apósoregistrodo
limiar basal no teste de retirada de cauda, os animais receberam injeção
intracerebralbilateraldelidocaína2%(0,25µl).Cincominutosmaistardeosanimais
foramlevementeanestesiadosporisofluranoeemseguidaforamsubmetidosa20
minutosdeeletroacupunturacomfreqüênciade2Hzou100Hz(EA2HZeEA100HZ)
nos pontos Zusanli (E36) e Sanyinjiao (BP6) sendo em seguida avaliadas as
latênciasderetiradadecaudaaintervalosde5mindurante30min.
26
Materialemétodos
Silva,M.L.
GruposNPtAsal/EA
Os animais destes grupos foram grupo foram submetidos à cirurgia
estereotáxica para implante de cânulas-guias direcionada ao NPtA bilateralmente.
Após o registro limiar basal no testede retirada de cauda, os animais receberam
injeçãointracerebralbilateraldesalina(0,25µl).Cincominutosapósamicroinjeção,
os animais foram levemente anestesiados por isoflurano e em seguida foram
submetidos a 20 minutos de eletroacupuntura com freqüência de 2Hz ou 100Hz
(EA2HZeEA100HZ)sendoemseguidaavaliadasaslatênciasderetiradadecauda
aintervalosde5mindurante30min.
GruposEAsham
Os mesmos procedimentosforamaplicados para os grupos que receberam
injeção intracerebral bilateral de salina (NPtAsal) ou lidocaína (NPtAlido) e
receberamfalsaeletroacupuntura(EAsham).
Implantede
cânulano
NPtA
Pré-teste
Linhade
base
Linhade
baseapós
isoflurano
0min30min
Perfusãoe
análise
histológica
7dias
20minutos
Medidasdas
latências
5minutos
Injeçãodelidocaína
ousalinanoNPtA
Eletroacupuntura
2Hzou100Hz
27
Materialemétodos
Silva,M.L.
3.8.3 Efeitos do bloqueio neural da região dorsal do NPtA sobre a
antinocicepçãoinduzidaporeletroacupunturadebaixaealtafreqüência.
GruposdNPtAlido/EA
Os animais destes grupos foram submetidos à cirurgia estereotáxica para
implante de cânulas-guias direcionadas ao NPtA dorsal bilateralmente. Após o
registrodolimiarbasalnotestederetiradadecauda,osanimaisreceberaminjeção
intracerebralbilateraldelidocaína2%(0,10µl).Cincominutosmaistardeosanimais
foramlevementeanestesiadosporisofluranoeemseguidasubmetidosa20minutos
deeletroacupunturacomfreqüênciade2Hzoude100Hz(EA2HZeEA100HZ)nos
pontosZusanli(E36)eSanyinjiao(BP6)sendoemseguidaavaliadasaslatênciasde
retiradadecaudaaintervalosde5mindurante30min.
GruposdNPtAsal/EA
Os animais destes grupos foram submetidos à cirurgia estereotáxica para
implantedecânulas-guiasdirecionadasaoNPtAdorsalbilateralmente.
Após o registro do limiar basal no teste de retirada de cauda, os animais
receberam injeçãointracerebralde 0,10µldesalina.Cincominutosmais tardeos
Implantede
cânulano
dNPtA
Pré-teste
Linhade
base
Linhade
baseapós
isoflurano
Eletroacupuntura
2Hzou100Hz
0min30min
Perfusãoe
análise
histológica
7dias
20minutos
Medidasdas
latências
5minutos
Injeçãodelidocaína
ousalinanodNPtA
28
Materialemétodos
Silva,M.L.
animaisforamlevementeanestesiadosporisofluranoesubmetidosa20minutosde
eletroacupunturacomfreqüênciade2Hzoude100Hz(EA2HZeEA100HZ)sendo
em seguida avaliadas as latências de retirada de cauda a intervalos de 5 min
durante30min.
GruposEAsham
Osmesmosprocedimentosanterioreforamaplicadosparaosgruposque
receberaminjeçãointracerebralbilateraldesalina(dNPtAsal)oulidocaína
(dNPtAlido)ereceberamfalsaeletroacupuntura(EAsham).
3.9Análiseestatística
Osefeitosdaeletroacupunturanotestederetiradadecaudaforamavaliados
por análise de variância multivariada (MANOVA). Os fatores analisados foram
tratamentos,tempoeinteraçãotratamento-tempo.Nocasodediferençasignificativa
entretratamentose/ouinteraçãotempo-tratamentosignificativa,osdadosparacada
tempo foram submetidos à análise de variância (One-Way) seguida pelo teste de
Tukey. Diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando P <
0,05. Todas as análises estatísticas foram realizadas no programa estatístico
SPSS/PC
+
.
Resultados
30
Resultados
Silva,M.L.
4RESULTADOS
4.1Antinocicepçãoinduzidaporeletroacupunturadebaixaealtafreqüênciano
testederetiradadecauda.
DozeanimaisforamsubmetidosàEAnospontosZusanli(E36)eSanyinjiao
(BP6)comalta(6animais)oubaixafreqüência(6animais)eosresultadosobtidos
estãonaFigura5.Naestimulaçãoa2Hzhouveaumentoimediatodalatênciade
retiradadecauda,chegandoaatingirovalormáximode6,0segequesemanteve
significativamenteacimadaslatênciasdogrupofalsoestimulado(controle)nostrinta
minutos seguintes à eletroacupuntura. A estimulação de alta freqüência (100 Hz)
também produziu aumento imediato e máximo da latência de retirada de cauda,
efeitoesteque,noentanto,decaiuacentuadamenteapartirdaleituraefetuada10
minutosapósaeletroacupuntura,emboramantendo-sesignificativamenteacimado
controleporpraticamentetodooperíododeexperimentação.Nãohouvediferença
significativa entre as latências basais e as latências pós-anestesia inalatória
(Demonstradoem Figuras apenas para ogrupo controle). A análiseestatística foi
realizadaconsiderandoascurvasobtidascomasduasfreqüênciasutilizadas,sendo
o controle (ShamEA, n = 6) o mesmo para as duas curvas testes. As curvas da
Figura5foramsignificativamentediferentesquantoaotratamento(F
2,15
=330,42;p
<0,001)etempo(F
10,150
=400,59;p<0,001)edemonstraramsignificativainteração
tratamentoxtempo(F
20,150
=104,63;p<0,001).
31
Resultados
Silva,M.L.
-15 -10 -5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
2Hz
100Hz
0 5 10 15 20 25 30
EASham
Tempo(min)
Latência(s)
Anest
EA
Figura5Curvasintensidade-duraçãodoefeitoantinociceptivoproduzidopelaaplicaçãodediferentes
freqüênciasdeeletroacupunturanospontosZusanli(E36)eSanyinjiao(BP6)emratos(EA)durante
20minutos.Setaindicainíciodaanestesiainalatóriacomisoflurano(0,5%).Ospontosrepresentam
média ± E.P.M. de 6 animais. (*) diferente do grupo EA Sham (controle); (#) diferente do grupo
100Hz.(P<0,05).
*
*
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#
#
#
#
#
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32
Resultados
Silva,M.L.
4.2 O funículo dorsolateral participa da antinocicepção induzida por
eletroacupunturadebaixaealtafreqüêncianotestederetiradadecauda?
Dez animais foram estimulados com EA nos pontos Zusanli (E36) e
Sanyinjiao (BP6) com alta (5 animais) ou baixa (5 animais) freqüência. Na
estimulação de baixa freqüência em animais falso lesados (LFDL sham/EA 2Hz)
houveaumentoimediatoemáximodalatênciaderetiradadecauda,efeitoquese
manteveacimados5,0segundosnostrintaminutosposterioresàeletroacupuntura.
Quando os animais foram submetidos à lesão bilateral do funículo
dorsolateral, aeletroacupuntura debaixa freqüência(LFDL/EA 2Hz) nãofoi capaz
deinduziraumentodaslatênciascomonogrupofalsolesado(LFDLsham/EA2Hz).
Nestegrupoaslatênciasforamsemelhantesàsdogrupofalsoestimulado(Figura6).
Nãohouvediferençasignificativaentreosgruposcom(LFDL/EAsham)esemlesão
(LFDLsham/EAsham)nofunículodorsolateralemrelaçãoaogrupoEAsham.
As curvas da Figura 6 foram significativamente diferentes quanto ao
tratamento (F
3,18
= 15,68; p < 0,001) e tempo (F
10,180
= 24,23; p < 0,001) e
demonstraramsignificativainteraçãotratamentoxtempo(F
30,180
=8,20;p<0,001).
33
Resultados
Silva,M.L.
-15 -10 -5
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
LFDLsham/EA2Hz
LFDL/EA2Hz
LFDLsham/EAsham
LFDL/EAsham
0 5 10 15 20 25 30
Tempo(min)
Latência(s)
Anest
EA
Figura 6 Curvas intensidade-duração do efeito antinociceptivo produzido após aplicação de
eletroacupunturadebaixafreqüência(2Hz)nospontosZusanli(E36)eSanyinjiao(BP6)emratos
comesemalesão dofunículodorsolateral.EAindicaoperíodo deeletroacupunturaesetaindica
início da anestesia inalatória com isoflurano (0,5%). Os pontos representam média ± E.P.M. de 5
animais.(*)diferentedogrupocontrole(P<0,05).
*
*
*
*
*
*
*
34
Resultados
Silva,M.L.
A estimulação de alta freqüência (EA 100 Hz) nos animais falso lesados
(LFDLsham/EA100Hz)produziuaumentoimediatoemáximodalatênciaderetirada
decauda,porémhouvequedaimportantedoefeitojáaos10minutosapósotérmino
daeletroacupuntura,porémmantendo-sesignificativamentediferentedogrupofalso
estimulado(LFDLsham/EAsham)porquasetodoperíododeexperimentação.
Em animais submetidos à lesão bilateral do funículo dorsolateral, a
eletroacupuntura (LFDL/EA 100Hz) produziu latências significativamente menores
queasdogrupocontrole(LFDLEAsham)nostempos5,20e30(Figura7).Não
houve diferença significativa entre os grupos com (LFDL/EA sham) e sem lesão
(LFDL sham/EA sham) no funículo dorsolateral em relação ao grupo submetido à
falsaeletroacupuntura.
As curvas da Figura 7 foram significativamente diferentes quanto ao
tratamento (F
3,18
= 102,17; p < 0,001) e tempo (F
10,180
= 46,05; p < 0,001) e
demonstraramsignificativainteraçãotratamentoxtempo(F
30,180
=24,77;p<0,001).
A localização dos sítios de lesão do funículo dorsolateral correspondentes está
indicadanafigura8.
35
Resultados
Silva,M.L.
-15-10 -5
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
LFDLsham/EA100Hz
LFDLsham/EAsham
LFDLEAsham
LFDL/EA100Hz
0 5 10 15 20 25 30
Tempo(min)
Latência(s)
Anest
EA
Figura 7 Curvas intensidade-duração do efeito antinociceptivo produzido após aplicação de
eletroacupunturadebaixafreqüência(100Hz)nospontosZusanli(E36)eSanyinjiao(BP6)emratos
comesemalesão dofunículodorsolateral.EAindicaoperíodo deeletroacupunturaesetaindica
início da anestesia inalatória com isoflurano (0,5%). Os pontos representam média ± E.P.M. de 5
animais.(*)diferentedogrupocontrole(P<0,05).
#
#
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*
*
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#
36
Resultados
Silva,M.L.
Figura 8 Corteshistológicos demonstrando a extensãoda lesão do animal 4 dogrupoLFDL / EA
2Hz,emAeB,vermelhoneutro.DiagramacomasáreasdelesãodosanimaisdogrupoLFDL/EA
2Hz,emC,edogrupoLFDL/EA100Hz,emD.Abarrarepresenta500µmnaobjetivade2x.
B
D
A
C
37
Resultados
Silva,M.L.
4.3 O núcleo pretectal anterior participa da modulação da antinocicepção
induzidaporeletroacupunturadebaixaealtafreqüêncianotestederetiradade
cauda?
Vinteequatroanimaisforaminicialmentetratadosbilateralmentecomsalina
(0,25 µl) ou lidocaína 2% (0,25 µl) no NPtA e, em seguida, procedeu-se à
eletroacupuntura de baixa ou altafreqüência.Na estimulação de baixafreqüência
em animais tratados com salina (NPtA sal / EA 2Hz) houve aumento imediato e
máximodalatênciaderetiradadecaudaquesemanteveacimados5,0segundos
nos trinta minutos posteriores à eletroacupuntura. Observou–se que o bloqueio
neural do NPtA com lidocaína impediu por completo o efeito antinociceptivo da
eletroacupunturadebaixafreqüência (Figura 9). Animaisshamestimulados(NPtA
sal/EAsham)epreviamentesubmetidosaobloqueioneuraldoNPtA(NPtAlido/
EAsham)nãoexibiramalteraçõessignificativasdalatênciaderespostaaoteste.As
curvasobtidasforamdiferentesquantoaotratamento(F
3,20
=282,70;p<0,001)e
tempo(F
10,200
=90,64;p<0,001)edemonstraramsignificativainteraçãotratamento
xtempo(F
30,200
=92,19;p<0,001).OssítiosdeinjeçãonoNPtAestãoindicadosna
figura10.
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Resultados
Silva,M.L.
-15-10 -5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
Lidocaína/2Hz
Salina/2Hz
Salina/ShamEA
Lidocaína/ShamEA
0 5 10 15 20 25 30
Tempo(min)
Latência(s)
Anest
EA
Figura 9 Curvas intensidade-duração do efeito antinociceptivo produzido após aplicação de
eletroacupunturadebaixafreqüência(2Hz)nospontosZusanli(E36)eSanyinjiao(BP6)emratos
com microinjeção de lidocaína ou salinano NPtA. EA indicao período de eletroacupuntura e seta
indicainíciodaanestesiainalatóriacomisoflurano(0,5%).Ospontosrepresentammédia±E.P.M.de
6animais.(*)diferentedogrupocontrole(P<0,05).
Figura10LocalizaçãodossítiosdeinjeçãodelidocaínabilateralnoNPtAdosgruposLidocaína/2Hz
(círculospretos)eLidocaína/Sham(círculosbrancos)adicionadosapranchasdoatlasdePaxinose
Watson(1986).Cadasímbolocorrespondeaumsítiodemicroinjeção.
3.70
3.80
4.20
4.48
*
*
*
*
*
*
*
39
Resultados
Silva,M.L.
Na estimulação de alta freqüência em animais tratados bilateralmente com
salina (NPtA sal / EA 100Hz) houve aumento imediato e máximo da latência de
retirada de cauda com queda importante nas latências aos 10 minutos após a
eletroacupuntura, mantendo-se o efeito significativamente acima do grupo falso
estimulado(EAsham)porpraticamentetodoperíododeexperimentação.Observou–
se que o bloqueio neural do NPtA com lidocaína atenuou mas não impediu o
aumento imediato das latências de retirada de cauda. A duração do efeito da EA
também foi acentuadamente reduzida, sendo que 20 minutos após seu
encerramento,nãohouvediferençaemrelaçãoaoscontroles(Figura11).Animais
sham estimulados (NPtA sal / EA sham) e previamente submetidos ao bloqueio
neural do NPtA (NPtA lido / EA sham) não exibiram alterações significativas da
latência de resposta ao teste. As curvas obtidas foram diferentes quanto ao
tratamento (F
3,20
= 138,42; p < 0,001) e tempo (F
10,200
= 116,82; p < 0,001) e
demonstraramsignificativainteraçãotratamentoxtempo(F
30,200
=45,98;p<0,001).
OssítiosdeinjeçãonoNPtAestãoindicadosnafigura12.
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Resultados
Silva,M.L.
-15 -10 -5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
Lidocaína/100Hz
Salina/100Hz
Salina/ShamEA
Lidocaína/ShamEA
0 5 10 15 20 25 30
Tempo(min)
Latência(s)
Anest
EA
Figura 11 Curvas intensidade-duração do efeito antinociceptivo produzido após aplicação de
eletroacupunturadealtafreqüência(100Hz)nospontosZusanli(E36)eSanyinjiao(BP6)emratos
com microinjeção de lidocaína ou salinano NPtA. EA indicao período de eletroacupuntura e seta
indicainíciodaanestesiainalatóriacomisoflurano(0,5%).Ospontosrepresentammédia±E.P.M.de
6 animais. (*) diferente do grupo controle (#) diferença entre os grupos Lidocaína/100Hz e
Salina/100Hz(P<0,05)
Figura 12 Localização dos sítios de injeção de lidocaína bilateral no NPtA dos grupos
Lidocaína/100Hz (círculos pretos) e Lidocaína/Sham (círculos brancos) adicionados a pranchas do
atlasdePaxinoseWatson(1986).Cadasímbolocorrespondeaumsítiodemicroinjeção.
3.80
4.20
4.48
3.70
*
*
*
*
*
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Resultados
Silva,M.L.
4.4Aantinocicepçãoinduzidaporeletroacupunturadebaixaealtafreqüência
dependedaintegridadedaregiãodorsaldonúcleopretectalanterior(dNPtA)?
Vinteequatroanimaisforaminicialmentetratadosbilateralmentecomsalina
oulidocaína2%(0,10µl)nodNPtAeemseguida,procedeu-seàeletroacupuntura
debaixaoualtafreqüência.Naestimulaçãodebaixafreqüênciaemanimaistratados
com salina (NPtAsal/EA2Hz)aeletroacupunturapromoveuaumentoimediatoe
máximo da latência de retirada de cauda
que se mantiveram acima dos 5,0
segundos nos trinta minutos posteriores à eletroacupuntura. Observou–se que o
bloqueioneuraldodNPtAcomoanestésicolocalimpediuoefeitoantinociceptivoda
eletroacupunturadebaixafreqüência(Figura13).Ascurvasobtidasforamdiferentes
quantoaotratamento(F
3,16
=554,70;p<0,001)etempo(F
10,160
=91,96;p<0,001)
e demonstraram significativa interação tratamento x tempo (F
30,160
= 118,23; p <
0,001).OssítiosdeinjeçãonodNPtAestãoindicadosnafigura14.
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Resultados
Silva,M.L.
-15 -10 -5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
Lidocaína/2Hz
Salina/2Hz
0 5 10 15 20 25 30
Salina/ShamEA
Lidocaína/ShamEA
Tempo(min)
Latência(s)
Anest
EA
Figura 13 Curvas intensidade-duração do efeito antinociceptivo produzido após aplicação de
eletroacupunturadebaixafreqüência(2Hz)nospontosZusanli(E36)eSanyinjiao(BP6)emratos
com microinjeção de lidocaína ou salina na região dorsal do NPtA. EA indica o período de
eletroacupuntura e seta indica início da anestesia inalatória com isoflurano (0,5%). Os pontos
representammédia±E.P.M.de6animais.(*)diferentedogrupocontrole(P<0,05)
Figura14LocalizaçãodossítiosdeinjeçãodelidocaínabilateralnodNPtAdosgruposLidocaína/2Hz
(triângulospretos)eSalina/2Hz(triângulosbrancos)adicionadosapranchasdoatlasdePaxinose
Watson(1986).Cadasímbolocorrespondeaumsítiodemicroinjeção.
4.20
4.48
*
*
*
*
*
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Resultados
Silva,M.L.
Na estimulação de alta freqüência em animais tratados bilateralmente com
salina (dNPtA sal / EA 100Hz) houve aumento imediato e máximo da latência de
retirada de cauda, seguida de queda importante nas latências 10 minutos após o
término da eletroacupuntura, mantendo-se significativamente diferente do grupo
falso estimulado (EA sham) por praticamente todo período de experimentação e
deixandodesersignificativoapenastrintaminutosapósaeletroacupuntura(Figura
15). Quando houve o bloqueio neural com lidocaína do dNPtA o efeito foi
semelhanteaodogrupodeanimaistratadoscomsalinanodNPtA,istoé,aumento
imediatodalatênciaderetiradadecauda,comquedaimportantenaslatênciasapós
10minutosdaeletroacupuntura,mantendo-sesignificativamentediferentedogrupo
falso estimulado (EA sham) por praticamente todo período de experimentação,
deixandodesersignificativoapenastrintaminutosapósaeletroacupuntura.
Ascurvasforamdiferentesquantoaotratamento(F
3,16
=114,85;p<0,001)e
tempo(F
10,160
=136,39;p<0,001)edemonstraramsignificativainteraçãotratamento
xtempo(F
30,160
=49,84;p<0,001).Animaisshamestimulados(NPtAsal/EAsham)
epreviamentesubmetidosaobloqueioneuraldodNPtA(dNPtAlido/EAsham)não
exibiram alterações significativas da latência de resposta ao teste. Os sítios de
injeçãonodNPtAestãoindicadosnafigura16.
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Resultados
Silva,M.L.
-15 -10 -5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
Salina/100Hz
Lidocaína/100Hz
0 5 10 15 20 25 30
Salina/ShamEA
Lidocaína/ShamEA
Tempo(min)
Latência(s)
Anest
EA
Figura 15 Curvas intensidade-duração do efeito antinociceptivo produzido após aplicação de
eletroacupunturadealtafreqüência(100Hz)nospontosZusanli(E36)eSanyinjiao(BP6)emratos
com microinjeção de lidocaína ou salina na região dorsal do NPtA. EA indica o período de
eletroacupuntura e seta indica início da anestesia inalatória com isoflurano (0,5%). Os pontos
representammédia±E.P.M.de6animais.(*)diferentedogrupocontrole(P<0,05)
Figura 16 Localização dos sítios de injeção de lidocaína bilateral no dNPtA dos grupos
Lidocaína/100Hz(triângulospretos)eSalina/100Hz(triângulosbrancos)adicionadosapranchasdo
atlasdePaxinoseWatson(1986).Cadasímbolocorrespondeaumsítiodemicroinjeção.
4.20
4.48
*
*
*
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*
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*
*
Discussão
46
Discussão
Silva,M.L.
5DISCUSSÃO
AacupunturatemsidoutilizadanamedicinaChinesahámaisde2.000anos
notratamentodeváriasdesordens,quepodemsertratadascomousodeinserção
deagulhaslongasefinasempontosespecíficosdapele(WANGetal.,2008b).Esta
técnicafoiaceitanacomunidadeocidentalcomométododetratamentosomentea
partir da década de 90, quando o NIH (National Institutes of Health) publicou um
consensoquecolocavaaacupunturacomopartedasintervençõesterapêuticasda
medicina complementar. Atualmente a OMS (Organização Mundial da Saúde)
reconhece a utilização da técnica para o tratamento de 43 tipos diferentes de
doençaseaacupunturaéutilizadaemmaisde160países.
Como forma terapêutica, a acupuntura ainda permanece controversa, pois
muitosacreditamqueelaatuadeformapaliativa(LUNDEBERG&VICTORIN,2002)
podendoemalgunscasossuplantaradorouqualquersintomainespecífico,oque
dificultariaadetecçãoprecocedadoença(ULETTetal.,1998;WANGetal.,2008b).
Na prática clínica ainda é inevitável considerar que a acupuntura envolve fatores
psicológicos (KONG et al., 2005). Conseqüentemente, na última década houve
grande aumento nos estudos que envolvem os fatores psicológicos e bioquímicos
dos mecanismos da acupuntura, particularmente os mecanismos cerebrais
envolvidosnaanalgesiainduzidapelaacupuntura.
A evolução na pesquisa em animais em relação à acupuntura têm sido
proporcionalaevoluçãocientíficaetecnológicamundial,oqueproporcionoumaior
conhecimentodasestruturaseatividadesdocorpohumanoatravésdaressonância
magnéticafuncional(fMRI)etomografiaporemissãodepósitron(PET)(BIELLAet
al.,2001;MA,2004;LEWITHetal.,2005).Algumasáreascerebraissãoativadasou
47
Discussão
Silva,M.L.
desativadas e depende do tratamento realizado utilizar acupuntura manual ou
eletroacupunturaemdiferentesfreqüências.
Na experimentação animal, muitos tipos de estímulos podem induzir o
comportamentodenocicepção,incluindoestímulosquímicos,térmicosemecânicos
em tecidosperiféricos alémde estimulaçãoelétricaou lesãodeneurônioaferente
primário. O modeloderetirada dacaudacausanocicepçãofásica(ONTTONEN&
PERTOVAARA,2000),éintegradoemnívelespinalsendosensívelamanipulações
de estruturas supraespinais (MAYER et al., 1971). Este efeito provavelmente se
deveàativaçãodeviasdescendentesquemodulamatransmissãonociceptivana
medulaespinal,umavezqueoreflexoderetiradadecaudaéumreflexopuramente
espinal(SANDKÜLER,1996;PRADO,2003).
Oestressedamanipulaçãoéumfatorcapazdealterarolimiardenocicepção
notestederetiradadecauda(MICZEKetal.,1986;BRANDAOetal.,2000).Para
contornarestalimitação,omodelopornósutilizadoparaavaliarosefeitostemporais
da estimulação pela eletroacupuntura exigiu a anestesia leve dos animais com
anestésico inalatório (WEN, 2007). Os resultados obtidos não demonstraram
diferençadoslimiaresderespostaaotestederetiradadecaudaobtidosanteselogo
apósoiníciodaanestesiainalatória,sugerindoqueoaumentodalatênciadoreflexo
deretiradadecaudainduzidopelaEAocorreusemainterferênciadofatorestresse
e sem a participação do anestésico inalatório. A literatura mostra de forma
contundentequeautilizaçãodeanestésicoinalatórionãomodificaasrespostasdo
animalaotestenociceptivoderetiradadacauda(OLIVEIRA&PRADO,2000;KOO
etal.,2002;MEDEIROSetal.,2003;KOOetal.,2007;WEN,2007).
Do mesmo modo, para se ter um controle efetivo do efeito da
eletroacupuntura nas latências de retirada da cauda dos animais, utilizamos a
48
Discussão
Silva,M.L.
técnicadefalsa-eletroacupuntura(shamEA)nosgruposcontrolesdosexperimentos.
Essatécnicavariadeacordocomalgunsautores.Medeirosetal.(2003a)utilizam
como controle a falsa-eletroacupuntura com estimulação elétrica das agulhas nas
mesmasfreqüênciasdosanimaistratados,porémasagulhassãocolocadasforado
acuponto.JáAlmeidaetal.(2008)realizamoscontrolesutilizandooutrosacupontos
comoformadecomparação.Huangetal.(2002),dogrupodoDr.Ji-ShenHanda
UniversidadedePequim,inseremagulhasnosacupontos,conectaoseletrodosnas
agulhas, mas mantém o aparelho desligado no período do experimento. Este
formatodecontroleexperimentalfoiomesmoutilizadonopresentetrabalho.
Para verificar se os animais utilizados neste experimento seriam ou não
respondendesàeletroacupuntura,foirealizadopré-testevisandoexcluirosanimais
quenãorespondiamàtécnica.
Foipossívelobservarquedeumtotalde169animaistestados,somente102
animais foram respondentes à eletroacupuntura, ou seja, 60,36% dos animais
testados apresentavam elevação do limiar nociceptivo após a EA.
Conseqüentemente, 39,64% dos animais não demonstraram nenhuma resposta à
EA,sendoentãoretiradosdoprotocoloexperimental.
Amanifestação,ounão,deanalgesiainduzidapelaeletroacupunturaaindaé
objetodeestudodevárioscentrosdepesquisa(SEKIDOetal.,2003;HUANGetal.,
2007). E a pergunta ainda não foi respondida: o que de fato torna um animal
respondente,ounão,àeletroacupuntura?Umimportanteexperimentorealizadopor
Seikido et al (2003) revelou os diferentes efeitos da antinocicepção induzida pela
eletroacupuntura em animais normais e em ratos com inflamação induzida por
injeçãode carragenina.Os autoresdemonstraramqueemanimaisquenãoforam
submetidosanenhumtipodetratamento,aeletroacupunturapodeounãofuncionar.
49
Discussão
Silva,M.L.
No entanto, todos os animais com hiperalgesia inflamatória interessantemente
manifestavamantinocicepçãoquandoestimuladoscomeletroacupuntura.
Outrostrabalhos tentam explorara conversãode animaisnão-respondentes
em animais respondentes (TANG et al., 1997; TIAN et al., 1998) e obtiveram
sucesso ao compararo balanço entre peptídeos opióides endógenos e peptídeos
anti-opióides como o colecistocinina octapeptídeo (CCK-8) no sistema nervoso
central (HAN, 1995). Assim, animais respondentes poderiam se tornar não-
respondentes após administração intracerebroventricular de vetor de expressão
CCK-cDNA,queinduzaumentonaexpressãodeCCK-8(ZHANGetal.,1992).Por
outro lado, aadministração de antagonista parareceptoresCCK,que diminuiria a
ação do CCK-8 no cérebro, converte animais não-respondentes em animais
respondentes(TANG,1997).Destaforma,épossívelqueumanimalnãoresponda
àeletroacupuntura,oquepoderiasetornarumproblemaexperimental.Realizandoo
pré-testeumasemanaantesdoexperimentoeselecionandoosquerespondemao
estímulo,apossibilidadedequealgumdestesanimaisnãomanifestaremanalgesia
pelaeletroacupuntura,anãoserpelotratamento,éremota.
Nosnossosexperimentos,tantoaEAdebaixa,quantoadealtafreqüência
promoveu aumento da latência de retirada de cauda, mas a duraçãodo efeito da
baixa freqüência foi maior do que o da alta freqüência. Esses resultados são
comparáveis aos obtidos em experimentos anteriores e que demonstram a
existência de dois possíveis mecanismos dependentes da freqüência: baixas
freqüências liberamencefalinas,enquantoquealtasfreqüênciasliberamdinorfinas
(FEIetal.,1987;ROMITAetal.,1997;HAN,2003;WANGetal.,2005;TAGUCHI&
TAGUCHI,2007).Essesachadosforamtambémconfirmadosemhumanos(HANet
al.,1991).Altasfreqüênciasestãorelacionadastambémcomaumentodaliberação
50
Discussão
Silva,M.L.
de serotonina, particularmente no NMR e na medula espinal (HAN et al., 1979;;
TODA,1982;ZHUetal.,2004).LesõeseletrolíticasdoNMRoudepleçãoseletivada
serotonina 5,6 diidroxitriptamina (5,6-DHT) atenua a analgesia induzida pela EA
(HAN & TERENIUS, 1982), assim como também acontece com o bloqueio de
receptoresserotoninérgicosporcinaserinaoumetisergida(CHANGetal.,2004,KIN
etal.,2005).
Observou–se também que quando foi realizada a lesão do funículo
dorsolateral bilateralmentefoiabolidoo aumentoda latência de retiradada cauda
induzida pela eletroacupuntura tanto de baixa quanto de alta freqüência. Este
resultadoprovavelmentesedeveàinterrupçãodeviasdescendentesquemodulam
atransmissãonociceptivanamedulaespinal,umavezqueoreflexoderetiradade
caudaéreflexopuramenteespinalequeamaiorpartedaseferênciasdescendentes
trafega pelo funículo dorsolateral (KOVELOWSKI et al., 1999). Resultados
semelhantes foram obtidos por Du & Zhao (1975) que demonstraram que a
estimulaçãodoNRMpotencializaoefeitodaanalgesiainduzidaporEA,enquanto
que a lesão do funículo dorsolateral, que contém fibras descendentes do NMR,
reduzsignificativamenteoefeitodaeletroacupuntura.
SendoconhecidasaseferênciasdescendentesprincipalmentedoNMR,RVM
ePAG,seriapossívelqueaantinocicepçãoinduzidapelaeletroacupunturadebaixa
e alta freqüência dependesse da integridade do NPtA. Terenzi et al. (1995)
demonstrouaexistênciadeconexõesentreoNPtApararegiõesdomesencéfaloe
diencéfalo. Foram encontradas projeçõesparao tálamo(complexo centro-laterale
posterior), hipotálamo (lateral, posterior e ventromedial), zona incerta, colículo
superior, substânciacinzenta,regiãoparabraquialpontinae núcleopontino.Essas
conexõespodemexplicaroefeitoantinociceptivodaestimulaçãoelétricadoNPtA.
51
Discussão
Silva,M.L.
Prado(1989)mostrouqueaadministraçãodel-glutamato,serotoninaoumorfinano
NPtA induz antinocicepção dose-dependente no teste de retirada de cauda,
resultadoquepermitesugeriraparticipaçãodereceptoresserotoninérgicos,opióides
ecolinérgicosmuscarínicosnamodulaçãodanocicepçãopeloNPtA.
ObloqueioneuraldoNPtAaboliucompletamenteoaumentodalatênciada
retiradadacaudadeanimaissubmetidosaEA2Hz.NosanimaisquereceberamEA
100Hz,todavia,obloqueioneuraldoNPtAreduziu,masnãoaboliuaintensidadee
aduraçãodoefeitoanalgésicodaEA.Épossível,então,concluirqueaintegridade
doNPtAéimportanteparaaproduçãodeanalgesiaporEAdebaixafreqüência.No
entanto,oNPtAnãodeveseroúnicorelêenvolvidonomecanismodaanalgesiapor
EA, uma vez que o efeito da eletroacupuntura de alta freqüência não foi
completamenteabolidoapósbloqueiodestenúcleo.Nossosresultadoscorroboram
os de ZHU et al. (2004) que demonstraram quea injeçãode naloxona no núcleo
talâmicosubmédio(SM)bloqueiaaanalgesiainduzidaporEAdealta,masnãoade
baixafreqüência.Poroutrolado,quandoanaloxonafoiinjetadanoNPtA,ocorreu
bloqueiodaanalgesiainduzidaporEAdebaixa,masnãodealtafreqüência.
O NPtA está envolvido no sistema descendente de controle dos estímulos
nociceptivosnamedulaespinaleparticipadarespostafisiológicanormalaestímulos
nocivos (REES & ROBERTS, 1993; TERENZI et al., 1995; MAMEDE ROSA &
PRADO, 1997; VILLARREAL & PRADO, 2007). Em um estudo anterior deste
laboratório, a estimulação elétrica da porção dorsal do NPtA produziu efeito
analgésico significantemente maior e mais duradouro do que a porção ventral, no
modelo de dor fásica. Por outro lado, a estimulação da porção ventral foi
significantementemaisefetivadoqueaporçãodorsaldoNPtAnareduçãodador
persistenteincisional(VILLARREALetal.,2004a).Estesresultadossãosugestivos
52
Discussão
Silva,M.L.
dequeasporçõesdorsaleventraldoNPtAparticipamdemododiferenteconforme
aintensidadee/ouduraçãodoestímulonociceptivoutilizado.
Quando o bloqueio neural foi restrito à parte dorsal do NPtA, a analgesia
induzidapelaEAdebaixafreqüênciafoitotalmenteimpedida,resultadosemelhante
aoobservadoquandodobloqueioneuralmaisabrangentedonúcleo.
Jáaanalgesia
porEAdealtafreqüênciafoiplenamenteobtidamesmonavigênciadobloqueiodo
NPtAdorsal.
AEAdebaixafreqüênciaparece,então,dependerdecircuitoneuronal
no NPtA dorsal. Além disso, parece que a atenuação do efeito analgésico da
eletroacupuntura de alta freqüência depende do bloqueio da porção do NPtA que
nãoadorsal.
Porfim,entendendoqueobloqueioneuralcomlidocaínainibetantocorpos
celularesquantofibrasdepassagemnoNPtA,estudosposterioressãonecessários
para se determinar os substratos neuroquímicos envolvidos na modulação da
nocicepçãoencontradosnoNPtA.
Conclusão
54
Conclusão
Silva,M.L.
6CONCLUSÃO
Nossosresultadosnospermitemsugerirasseguinteshipótesesemrelaçãoà
participação do Núcleo Pretectal Anterior na antinocicepção induzida por
eletroacupunturadebaixaealtafreqüência:
1.Aeletroacupunturadebaixaedealtafreqüênciaproduzemantinocicepção,
comcaracterísticasdiferentesemrelaçãoàintensidadeeaduraçãodoefeito.
2. A lesão do funículo dorsolateral abole os efeitos da eletroacupuntura de
altaedebaixafreqüência.
3. O bloqueio neural do NPtA abole o efeito da eletroacupuntura de baixa
freqüência, e reduz a intensidade e a duração do efeito obtido pela
eletroacupunturadealtafreqüência.
4. O bloqueio do dNPtA abole o efeito da eletroacupuntura de baixa
freqüênciaenãointerferenaantinocicepçãoobtidapelaeletroacupunturade
altafreqüência.
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