ads:
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA
RAFAEL ELIAS MARTINS
ESTUDO DA IMOBILIZAÇÃO DE CELULASE EM GÉIS DE QUITOSANA
SÃO CARLOS - SP
2007
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
RAFAEL ELIAS MARTINS
ESTUDO DA IMOBILIZAÇÃO DE CELULASE EM GÉIS DE QUITOSANA
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em
Engenharia Química da Universidade Federal de São Carlos
como requisito parcial para a obtenção do Grau de Mestre em
Engenharia Química, área de concentração em Pesquisa e
Desenvolvimento de Processos Químicos.
Orientadora: Profa.Dra. Raquel de Lima Camargo Giordano
SÃO CARLOS - SP
2007
ads:
Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da
Biblioteca Comunitária da UFSCar
M386ei
Martins, Rafael Elias.
Estudo da imobilização de celulase em géis de quitosana
/ Rafael Elias Martins. -- São Carlos : UFSCar, 2007.
97 f.
Dissertação (Mestrado) -- Universidade Federal de São
Carlos, 2007.
1. Tecnologia de enzimas. 2. Celulase. 3. Imobilização. 4.
Quitosana. 5. Bagaço de cana. I. Título.
CDD: 660.634 (20
a
)
MEMBROS DA BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO DE
RAFAEL ELlAS MARTINS, APRESENTADA AO PROGRAMA DE PÓS-
GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUíMICA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE
SÃO CARLOS, EM 29 DE JANEIRO DE 2007.
BANCA EXAMINADORA:
R~~Lll. ~~~
P~~ Dra.Raquel~ ca~arg~GiOrdano
Orientadora, PPG-EQ/UFSCar
QLY(j~~ (. ~
Dra.Célia Maria Araújo ~ O
CTC-Piracicaba
Dedico este trabalho a Deus, a minha mãe
Elizabeth, meu irmão Luciano, minha
esposa Josiane e às pessoas amadas que
já foram: meu pai Eurípides e meu
sobrinho Allan.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, pela persistência a execução deste trabalho.
À Professora Raquel de Lima Camargo Giordano que tanto contribuiu para meu
crescimento humano e profissional durante a orientação desta dissertação e por sua paciência
e confiança no meu trabalho. O meu muito obrigado.
Ao Professor Roberto Giordano pelas contribuições dadas para o desenvolvimento desta
dissertação.
Aos Professores do Departamento de Engenharia Química da Universidade Federal de
São Carlos, pelas disciplinas oferecidas.
Ao Professor e amigo Enrique J.Mammarella pelas valiosas discussões.
Aos meus amigos do laboratório de Tecnologia Enzimática: Adriano, Dasciana, Dany,
pelo companheirismo e ajuda.
Ao amigo Wellington em especial, por todas as orientações e discussões dadas no
decorrer desse trabalho, ajuda essa valiosa para meu crescimento profissional e acadêmico.
A CNPq pelo apoio financeiro de fundamental importância para realização deste trabalho.
"A satisfação de uma conquista só é plena se for realizada através de muito esforço;
portanto, não desanime”.
(João Cardoso Pereira Netto)
Resumo
Celulases catalisam hidrólise de celulose à glicose e a imobilização e estabilização da mesma
podem viabilizar o processo enzimático, pois reduz custos em sua utilização. Neste trabalho,
Celluclast 1.5L (Novozymes A/S, Denmark) e CG 200 (Genencor) foram imobilizadas em
géis de quitosana e quitosana-alginato ativados com glutaraldeído e glicidol para posterior
hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar. O processo de imobilização foi acompanhado
medindo-se proteína e atividade hidrolítica da enzima em papel de filtro. Avaliaram-se
rendimento de imobilização, atividade recuperada, estabilidade térmica, temperatura e pH
ótimo de atividade enzimática. Os melhores derivados foram obtidos com quitosana-alginato,
ativados com glicidol com temperatura de imobilização de 27°C e pH 7,0 sendo 11,2 vezes
mais estáveis que a enzima livre, com rendimento em torno de 40,6% e atividade recuperada
em torno de 56,3%. A temperatura ótima para os derivados foi cerca de 10 graus maior que a
da enzima livre (50°C), enquanto que o pH deslocou-se de 4,2 (enzima livre) para a região
entre 2,5 e 3, para os derivados. Com o melhor derivado, realizou-se a hidrólise do bagaço de
cana-de-açúcar, que apresentou conversão de 1,8 vezes (70,0%) superior à enzima livre
(38,9%).
PALAVRAS-CHAVE: celulase; imobilização; quitosana; alginato de sódio, bagaço da cana-
de-açúcar.
Abstract
Cellulases are enzymes that catalyze the hydrolysis of cellulose producing glucose.
Immobilization and stabilization of these enzymes could improve enzymatic process making
it more attractive by reducing costs during their use. In this work, Celluclast (Novozymes
A/S, Denmark) and CG 200 (Genencor) were immobilized into chitosan and into a
chitosan/alginate hybrid support, after activation of the support with glutaraldehyde and
glycidol under different conditions of immobilization such as temperature and pH.
Immobilization process was evaluated by calculating the immobilization yield, coupling yield
and thermal stability at 65°C. Temperature and pH optimum of enzymatic activity were
analyzed as well. The best derivatives were obtained with chitosan – alginate activated with
glycidol, after immobilization at 27°C, pH 7.0, for 16 hours. The biocatalyst presented 56.3%
of immobilization yield, 40.6% of coupling yield and it 11.2 – fold more stable than free
enzyme at 65°C. The temperature and pH for maximum activity of the derivatives and soluble
enzyme was 60°C and 50°C, pH 2.5-3.0 and 4.2, respectively. Finally, the performance of the
best biocatalyst developed in this work in the hydrolysis of sugarcane bagasse was compared
to one observed using soluble enzyme. Although a higher conversion has been obtained with
soluble enzyme in the beginning of the reaction, the immobilized enzyme allowed to reach a
higher final conversion, 70%, than the one obtained with free Celluclast, 38.9%.
KEY – WORDS: cellulase; immobilization; chitosan, sodium alginate, sugarcane bagasse.
SUMÁRIO
Capítulo 1 - Introdução..................................................................................................
1
Capítulo 2 - RevisãoBibliográfica..................................................................................
4
2.1 Combustível Fóssil: Petróleo com fonte de energia.................................... 4
2.2 Biocombustível: Uso da biomassa na geração de energias renováveis....... 5
2.3 Processamento das frações lignocelulolíticas produzidas por biorrefinaria 9
2.4
Utilização do bagaço de cana-de-açúcar como matéria-prima
Lignocelulolítico ........................................................................................
11
2.5 Catalisadores enzimáticos............................................................................ 12
2.6 Enzimas celulolíticas................................................................................... 15
2.7 Microrganismos produtores de celulase...................................................... 20
2.8 Aplicações Biotecnológicas da enzima celulase......................................... 21
2.9
Tecnologia enzimática em processos biotecnológicos: Imobilização de
Enzimas.......................................................................................................
22
2.10 Classificação de sistemas de imobilização de enzimas............................... 24
2.11 Imobilização por ligação covalente multipontual........................................ 26
2.12 Parâmetros da imobilização........................................................................ 27
2.13 Suportes para imobilização......................................................................... 29
2.14 Quitosana..................................................................................................... 30
2.15 Alginato de sódio........................................................................................ 35
2.16
Princípio de formação de hidrogéis de quitosana com diferentes
copolímeros.................................................................................................
36
2.17 Modificação química do suporte................................................................ 37
Capítulo 3 - Material e Métodos........................................................................
42
3.1 Enzimas....................................................................................................... 42
3.2 Suportes e ativadores................................................................................... 42
3.1.3 Substratos ................................................................................................... 42
3.2 Metodologia experimental........................................................................... 42
3.2.1 Metodologia de preparação dos géis de quitosana e quitosana – alginato.. 42
3.2.1.1 Preparação das partículas de quitosana....................................................... 42
3.2.1.2 Preparação das partículas de quitosana – alginato....................................... 43
3.3 Ativação dos suportes.................................................................................. 43
3.3.1 Ativação dos suportes utilizando glutaraldeído........................................... 43
3.3.2 Preparação do suporte quitosana – glioxil pré-ativados com glutaraldeído 44
3.3.3
Preparação do suporte quitosana – glioxil - amino pré-ativados com
glutaraldeído................................................................................................
45
3.4
Imobilização covalente multipontual de celulase em matrizes de
quitosana e quitosana – alginato..................................................................
45
3.5 Determinação da Atividade celulolítica...................................................... 45
3.6 Determinação da concentração de proteína................................................. 46
3.7
Caracterização das propriedades cinéticas da celulase livre e
imobilizadas.................................................................................................
46
3.7.1 Influência do pH.......................................................................................... 46
3.7.2 Influência da temperatura ........................................................................... 47
3.7.3 Estabilidade térmica.................................................................................... 47
3.8 Cálculo dos parâmetros de imobilização..................................................... 48
3.8.1 Cálculo do rendimento de imobilização...................................................... 48
3.8.2 Cálculo da atividade recuperada.................................................................. 49
3.8.3 Cálculo do fator de estabilidade.................................................................. 49
3.9 Avaliação do enlace enzima – suporte........................................................ 50
3.10 Tratamento térmico do bagaço de cana-de-açúcar..................................... 50
3.11
Ensaios de hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar utilizando celulase
imobilizada em híbridos de quitosana.........................................................
50
Capítulo 4 - Resultados e Discussão..............................................................................
51
4.1
Caracterização das enzimas livres estudadas Celluclast 1.5 L e Genencor
(CG 200)......................................................................................................
51
4.2 Influência do pH......................................................................................... 53
4.3 Influência da temperatura............................................................................ 54
4.4
Preparação dos suportes de quitosana e estudo dos parâmetros de
imobilização.................................................................................................
54
4.5
Influência da adição de alginato de sódio e de diferentes condições de
imobilização de celulase em quitosana.......................................................
56
4.6
Influência dos métodos de ativação na imobilização da celulase em
híbridos de quitosana...................................................................................
59
4.6.1 Ativados com glutaraldeído......................................................................... 59
4.6.2 Ativados com glicidol.................................................................................. 60
4.6.3 Ativados com glicidol-amino..................................................................... 62
4.7 Influência da temperatura e do pH na atividade enzimática........................ 63
4.8 Testes de Dessorção Enzimática................................................................. 64
4.9 Hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar....................................................... 64
Capítulo 5 -
Conclusões................................................................................................... 67
Referências Bibliográficas....................................................................................................
69
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1: Esquema geral de uma biorrefinaria utilizando diferentes tipos de biomassa
(Giordano,2004).......................................................................................................................
8
Figura 2.2: Esquema de uma biorrefinaria utilizando materiais lignocelulósicos (Giordano,
2004)........................................................................................................................................
9
Figura 2.3: Produção de produtos químicos por diferentes vias reacionais a partir da
hidrolise da celulose (Schuchardt,2000)..................................................................................
10
Figura 2.4: Formação de vários produtos a partir a hemicelulose, utilizando a hidrolise e
explosão a vapor (Schuchardt, 2000).......................................................................................
11
Figura 2.5: Síntese de novos produtos a partir da lignina proveniente de resíduos
lignocelulósicos (Schuchardt, 2000)........................................................................................
12
Figura 2.6: Representação da estrutura geral de um aminoácido............................................ 14
Figura 2.7: Ligação peptídica entre as moléculas de aminoácidos formadores das enzimas.. 14
Figura 2.8: Célula vegetal, representando as fibras de celulose, hemicelulose em estrutura.. 17
Figura 2.9: Cadeia linear polimérica da celulose, mostrando as ligações β-1,4 das unidas
β-D-glicopiranosil....................................................................................................................
17
Figura 2.10: Celulase de Trichoderma ressei (Sandgren et al, 2005).................................... 17
Figura 2.11: Fibras cristalinas de celulose, ilustrando a influência das pontes de hidrogênio 18
Figura 2.12: Mecanismo da degradação da celulose e o sinergismo do complexo
enzimático................................................................................................................................
19
Figura 2.13: Clivagem da celobiose catalisada pela enzima β-glicosidase............................. 20
Figura 2.14. Estrutura dos biopolímeros quitina, quitosana e celulose................................... 32
Figura 2.15: Estrutura química do alginato de sódio............................................................... 37
Figura 2.16: Reação de ativação entre glutaraldeído e quitosana............................................ 40
Figura 2.17: Reação de ativação do gel utilizando glicidol .................................................... 41
Figura 3.1: Aparato utilizado para preparação das partículas de quitosana (Galvão, 2004)... 45
Figura 3.2: Quitosana ativada com glutaraldeído.................................................................... 46
Figura 4.1:Inativação térmica da Celluclast 1,5 L a 65°C e pH 4,8. A curva foi obtida
ajustando o modelo de Sadana-Henley aos pontos experimentais obtidos..............................
55
Figura 4.2:Inativação térmica da CG 200 a 65°C e pH 4,8. A curva foi obtida ajustando o
modelo de Sadana-Henley aos pontos experimentais obtidos.................................................
55
Figura 4.3:Influência do pH na atividade hidrolítica da celulase livre (Celluclast 1,5 L)....... 55
Figura 4.4:Influência do pH na atividade hidrolítica da celulase livre (CG 200).................... 55
Figura 4.5: Influência da temperatura na atividade hidrolítica da celulase livre (Celluclast
1.5L).........................................................................................................................................
57
Figura 4.6: Influência da temperatura na atividade hidrolítica dos derivados livre (CG 200) 57
Figura 4.7: Inativação térmica do derivado de celulase (Celluclast 1,5 L) a 65°C e pH 4,8.
A curva foi obtida ajustando o modelo de Sadana-Henley aos pontos experimentais
obtidos......................................................................................................................................
58
Figura 4.8: Inativação térmica do derivado de celulase (CG 200) a 65°C e pH 4,8. A curva
foi obtida ajustando o modelo de Sadana-Henley aos pontos experimentais
obtidos......................................................................................................................................
58
Figuras 4.9: Estabilidade térmica a 65 °C para as celulase livre e imobilizada ativados com
glutaraldeído a 4 °C (A), (▲) enzima livre, (■) enzima imobilizada em quitosana 2,5% –
alginato 2,5%, (●) enzima imobilizada em quitosana 2,5%...........................................
61
Figuras 4.10: Estabilidade térmica a 65 °C para as celulase livre e imobilizada ativados
com glutaraldeído a 27 °C (B), (▲) enzima livre, (■) enzima imobilizada em quitosana
2,5% – alginato 2,5%, (●) enzima imobilizada em quitosana 2,5%........................................
61
Figura 4.11: Inativação térmica do derivado de celulase em quitosana 2,5% a 65°C e pH
4,8 ativados com glutaraldeído. A curva foi obtida ajustando o modelo de Sadana-Henley
aos pontos experimentais obtidos............................................................................................
63
Figura 4.12: Inativação térmica do derivado de celulase em quitosana 2,5% - alginato
2,5% a 65°C e pH 4,8 ativados com glutaraldeído. A curva foi obtida ajustando o modelo
de Sadana-Henley aos pontos experimentais obtidos..............................................................
63
Figura 4.13: Inativação térmica do derivado de celulase em quitosana 2,5% a 65°C e pH
4,8 ativados com glicidol. A curva foi obtida ajustando o modelo de Sadana-Henley aos
pontos experimentais obtido....................................................................................................
64
Figura 4.14: Inativação térmica do derivado de celulase em quitosana 2,5% - alginato
2,5% a 65°C e pH 4,8 ativados com glicidol. A curva foi obtida ajustando o modelo de
Sadana-Henley aos pontos experimentais obtidos...................................................................
64
Figura 4.15: Inativação térmica do derivado de celulase em quitosana 2,5% a 65°C e pH
4,8 ativados com glicidol-amino. A curva foi obtida ajustando o modelo de Sadana-Henley
aos pontos experimentais obtidos............................................................................................
66
Figura 4.16: Inativação térmica do derivado de celulase em quitosana 2,5% - alginato
2,5% a 65°C e pH 4,8 ativados com glicidol-amino. A curva foi obtida ajustando o modelo
de Sadana-Henley aos pontos experimentais obtidos..............................................................
66
Figura 4.17 Influência do pH na atividade enzimática (A), (●) enzima livre enzima
imobilizada (■)........................................................................................................................
67
Figura 4.18: Influência da temperatura na atividade enzimática (B), (●) enzima livre
enzima imobilizada (■)............................................................................................................
67
Figura 4.19. Conversão do bagaço da cana-de-açúcar (60 °C e pH 4,8), enzima solúvel a
350 mg/L (■); enzima solúvel a 700 mg/L ( ●); enzima imobilizada em quitosana 2,5%-
alginato 4,5% ativados com glicidol (1,7 mg de proteína/ grama de gel (▲).........................
69
LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1: Composição de alguns resíduos lignocelulósicos.............................................. 9
Tabela 2.2: Classificação dos suportes conforme a composição (Pereira, 1996)......... 30
Tabela 2.3: Estabilidade térmica de enzimas imobilizadas em suportes de quitosana......... 36
Tabela 4.1: Valores das atividades enzimática (FPU/mL
de extrato
) e específica (FPU/mg
de
proteína
) das enzimas livres, em pH 4,8 a 50°C em tampão citrato 50 mM por 1hora de
incubação (Mendels, 1969)...................................................................................................
54
Tabela 4.2: Valores de meia-vida e fator de estabilidade térmica (65 °C) para as enzimas
comerciais utilizadas na forma livre.....................................................................................
54
Tabela 4.3: Parâmetros de imobilização de celulase em quitosana 2,5% pH 7,0 a 27°C
em suportes ativados com glutaraldeído 2,5% v/v com carga enzimática de 10 mg de
proteína/g de gel...................................................................................................................
58
Tabela 4.4: Parâmetros de imobilização de celulase em pH 7,0 a 4°C em suportes
ativados com glutaraldeído com carga enzimática de 10 mg de enzima.g
-1
de gel.
59
Tabela 4.5: Parâmetros de imobilização de celulase em pH 7,0 a 27°C em suportes
ativados com glutaraldeído com carga enzimática de 10 mg de enzima.g
-1
de gel..............
59
Tabela 4.6: Valores de meia-vida e fator de estabilidade (65 °C) para os suportes
ativados com glutaraldeído com carga enzimática de 10 mg de enzima.g
-1
de gel e
enzima livre..........................................................................................................................
60
Tabela 4.7 Influencia do pH durante imobilização da celulase ativada com glutaraldeído
2,5% v/v a 27°C com carga enzimática de 10mg de proteína /g de gel...............................
62
Tabela 4.8: Caracterização dos derivados de celulase imobilizada a 27°C e pH 7,0
usando diferentes suportes com carga enzimática de 10 mg de proteína/g de gel...............
62
Tabela 4.9: Caracterização dos derivados de celulase imobilizada a 27°C e pH 7,0
usando diferentes suportes com carga enzimática de 10 mg de proteína/g de gel...............
64
Tabela 4.10: Caracterização dos derivados de celulase imobilizada a 27°C e pH 7,0
usando diferentes suportes com carga enzimática de 10 mg de proteína/g de gel...............
65
Tabela 4.11: Conversão do bagaço de cana-de-açúcar a pH 4.8 a 50 °C............................. 69
14
1 – Introdução
A crescente demanda por energia no mundo, que acelera o inevitável esgotamento das
reservas petrolíferas mundiais, principal fonte de energia na Terra, tem como conseqüência o
aumento no preço dos combustíveis fósseis, particularmente o petróleo. Assim, antes de se
atingir o limite físico da exaustão, o uso do petróleo se verá inviabilizado pelo alto custo.
Acrescente-se a isso o risco de colapso ambiental: a natureza vem sendo transformada em
uma velocidade muito maior com que consegue se recompor. Torna-se premente, pois, em
todos os países, a busca de fontes alternativas e renováveis de energia, as chamadas energias
limpas. Nesse cenário, o uso de etanol produzido por fermentação de matérias-primas
renováveis aparece como uma atraente fonte substitutiva aos combustíveis fósseis.
(Schuchardt, 2001; Giordano, 2004).
Resíduos lignocelulósicos como o bagaço-de-cana e a palha de cereal moída são
abundantemente produzidos no Brasil e estão disponíveis para utilização biotecnológica
(Coelho et al.; 2001, Ramos, 2003). No caso do Brasil, o bagaço de cana de açúcar,
subproduto da indústria sucroalcooleira, destaca-se como um dos materiais lignocelulósicos
mais abundantes, com produção superior a 100 milhões de toneladas, dos quais cerca de 8%
não tem uma destinação apropriada. Uma das formas de utilização do bagaço de cana é na co-
geração de energia, uma prática muito utilizada nas usinas, com produção média em torno de
30 kW/h/tonelada de cana moída (MAPA, 2005).
Bagaço de cana é constituído basicamente de três polímeros: celulose (polímero de
glicose), hemicelulose (cadeias ramificadas de açúcares, maioria aldopentoses, principalmente
xilose) e lignina (polímero de fenilpropano) na proporção aproximada de 50:30:20. Uma
tonelada de bagaço gera 192 kg de lignina, 500 kg de celulose e 250 kg de hemicelulose.
(Coelho et al. 2001).
Celulose é um polissacarídeo constituído por cerca de quarenta cadeias glicosídicas unidas
em um feixe compacto. Cada cadeia tem grau de polimerização em torno de 10000 unidades
de glicose, unidas por ligações β-1,4. As muitas pontes de hidrogênio intra e intermoleculares
presentes na estrutura da celulose tornam esse polímero muito recalcitrante à hidrólise. A
hemicelulose mais comumente encontrada na parede celular de plantas terrestres é a xilana,
composta de resíduos de ligações β (1-4) D-xilopiranosídicas e que se apresentam na forma
15
de heteropolissacarídeos, contendo diferentes grupos substituintes nas cadeias centrais e
laterais, sendo os mais comuns os grupos acetil, arabinosil e glucuronosil (Adsul et al, 2004).
Dentro do moderno conceito de ‘biorrefinaria’ a separação seletiva de frações
constituintes de uma dada biomassa permite a utilização de cada fração para geração de
produtos de alto valor agregado. Dessa forma, a celulose, hemicelulose e lignina presentes nos
resíduos lignocelulósicos poderão gerar glicose, pentoses, principalmente xilose, e
fenilpropano, os quais poderão ser transformados em diferentes novos produtos (Laser et al.,
2002; Lynd et al., 1999; Garrote et al., 2002; Giordano, 2004). A produção de etanol por
fermentação da celulose requer sua separação dos outros dois componentes presentes e
posterior hidrólise para geração de glicose.
Vários pré-tratamentos vêm sendo estudados para separação dos componentes do
bagaço da cana e/ou hidrólise dos polímeros, os quais podem ser utilizados individualmente
ou de forma combinada, pois todos têm aspectos positivos e negativos. Cozimento sob
pressão hidrata nas regiões da celulose mais resistentes ao ataque ácido ou enzimático e
descompressão rápida separa e expõe as fibras, mas pode induzir excessiva degradação da
hemicelulose a furfural e derivados dependendo das condições operacionais utilizadas (Sasaki
et al, 2003); hidrólise ácida em condições severas é eficiente, mas gera produtos inibidores
para o microrganismo que irá fermentar os açúcares (Gurgel et al., 1998). Lignina é solúvel
em solvente orgânico ou álcali a quente, mas esse tratamento envolve altos custos,
preocupações ambientais adicionais e pode, no caso do tratamento alcalino, degradar a
hemicelulose, gerando furfural, inibidor da fermentação. Tratamento mecânico por moagem
facilita a separação das fibras, mas é caro, energeticamente intensivo. Por outro lado,
celulases, um complexo de enzimas, podem hidrolisar celulose em condições suaves sem
gerar subprodutos tóxicos. A hidrólise enzimática é, portanto, uma alternativa recomendável
para a fermentação de materiais lignocelulósicos, após separação das frações. Nesse sentido,
hidrólise controlada com ácido diluído pode romper ligações lignina-hemicelulose, extraindo
hemicelulose e disponibilizando celulose para o ataque enzimático. Assim, cozimento rápido
sob pressão de bagaço impregnado com ácido diluído com descompressão rápida parece ser
uma alternativa promissora para disponibilizar os polímeros para o ataque enzimático (Emmel
et al. 2003).
16
Os resultados obtidos até agora pelos pesquisadores que vêm trabalhando com
lignocelulósicos mostram que a hidrólise enzimática vem se inviabilizando pelos altos custos
com as enzimas celulases e xilanases, um complexo de endo e exoenzimas envolvidas na
degradação de celulose e xilanas (Philippidis & Hatzis, 1997). Estudos indicam que até 60%
do custo operacional do processo enzimático corresponde à reposição do complexo
enzimático de celulases, e muito esforço vem sendo investido na obtenção de enzimas mais
baratas. Além disso, um dos principais problemas na hidrólise enzimática reside na
necessidade de alta estabilidade térmica das enzimas para se trabalhar com altas temperaturas
e assim atingir altas velocidades de reação e solubilidade dos reagentes.
A imobilização/estabilização de celulases e xilanases poderá auxiliar a superar essa
grande desvantagem da rota enzimática, pois permite fácil recuperação da enzima e aumenta
sua vida operacional, reduzindo, portanto, custos com o catalisador (Tyagi et al., 1995, Naby-
Abdel et al, 1997, Gama et al, 2002, Shen & Xia, 2004, Gu et al, 2005). A insolubilização
das enzimas é tema que vem sendo estudado há vários anos. Messing, em 1975, por exemplo,
já enumerava numerosas técnicas de imobilização então desenvolvidas tais como
confinamento, adsorção, encapsulação, intercruzamento, união covalente, copolimerização.
Essas eram soluções para a recuperação das enzimas e sua posterior reutilização. Não
obstante, se mantinha o problema da baixa resistência à desativação, o que requeria um
processo de estabilização adicional do derivado enzimático (enzima ligada a suporte
insolúvel), etapa chave para estender sua aplicação na indústria.
A obtenção de derivados enzimáticos estabilizados é possível mediante o projeto de
estratégias racionais de estabilização. A união da enzima ao suporte pode realizar-se através
de seus grupos carboxílicos ou de aminos, sendo estes últimos os mais adequados pela sua
reatividade, abundância e presença majoritária na superfície enzimática (Guisan, 1988).
Aumentos maiores que 200 vezes na meia-vida da enzima imobilizada em relação à enzima
solúvel podem ser obtidos (Tardioli et al, 2003 a, b). Assim, hidrólise do bagaço usando
enzima imobilizada poderá atingir conversões superiores às obtidas com igual concentração
inicial de enzima livre, pois enquanto esta última se desativa com o tempo a imobilizada
continuará catalisando a reação de hidrólise.
A literatura reporta inúmeros suportes para imobilização de enzimas. Agarose vem
sendo amplamente utilizada devido a sua alta área superficial e resistência mecânica. A
17
quitosana é um biopolímero obtido através da desacetilação da quitina, possuindo dois grupos
funcionais reativos, amino e hidroxila, sendo utilizados como sítios de reação e coordenação.
Na busca de melhores suportes para imobilização, os géis híbridos aparecem como
alternativas interessantes (Taqieddin et al. 2002). Híbridos de quitosana-alginato são relatados
na literatura como suportes para imobilização de enzimas (Villalonga et al, 2006). Alginato de
sódio é um polissacarídeo extraído de algas marrons capazes de encapsular biomoléculas ou
células (Dellacheire et al. 1996). Sendo a quitosana um polímero policatiônico e o alginato
um polianiônico, as interações iônicas entre eles permitem formar géis rígidos (Huguet &
Dellacherie, 1996).
Uma vez que no uso da enzima imobilizada para hidrólise de bagaço substrato e
catalisador são insolúveis, o processo irá requerer ou o uso conjunto de parte da enzima livre,
ou uma prévia liquefação, química ou enzimática do bagaço, como já ocorre na produção de
etanol a partir de amido (Silva, 1980, Giordano et al, 2000). O tratamento prévio a ser
utilizado dependerá da estratégia global a ser utilizada para produção de etanol a partir do
bagaço de cana.
Visando, pois, colaborar com o desenvolvimento de um processo economicamente
viável de produção de etanol a partir de bagaço de cana, este projeto de dissertação teve como
objetivo desenvolver um biocatalisador para hidrólise da celulose presente em compostos
lignocelulósicos como o bagaço de cana-de-açúcar. Procurou-se desenvolver um derivado
imobilizado de celulase que fosse, ao mesmo tempo, estável e de baixo custo. Diante desta
realidade, este trabalho se propôs a estudar a imobilização de celulase em quitosana e em
suporte híbrido quitosana-alginato, usando diferentes métodos de ativação dos suportes e
condições de imobilização.
18
2 - REVISÃO BIBIOGRÁFICA
2.1 – Combustível fóssil: Petróleo com fonte de energia
As reservas mundiais de petróleo totalizam 1.147,80 bilhões de barris e o consumo
deste combustível fóssil está estimado em 80 milhões de barris/dia (Padua, 2005). Importante
ressaltar que nesse cálculo não foi contabilizada a tendência do crescimento no consumo
dessa matéria-prima, o que leva à conclusão de que se não houver descobertas de novas
reservas de petróleo este acabará dentro de 100 anos (Campbell, 1998). Portanto, é de se
prever que antes do esgotamento das reservas o preço do petróleo ficará tão elevado que a sua
utilização como combustível não seria mais interessante, denotando uma necessidade da
obtenção de alternativas de recursos energéticos que permitam a substituição do petróleo
(Shushardt, 2000; Ramos, 2003; Giordano, 2004). Além disso, as questões sociais (emprego,
renda, fluxos migratórios) e ambientais (mudanças climáticas, poluição) reforçam a
necessidade do uso de combustíveis produzidos a partir de biomassa.
Estudos já apontam que, a utilização da biomassa para fins energéticos vem tendo uma
participação crescente na matriz energética mundial, estimando-se que até o ano de 2050
deverá dobrar o uso mundial de biomassa disponível (Fischer, 2001), considerando-se que o
crescimento da demanda por agroenergia nos países desenvolvidos ocorrerá principalmente
em função da exigência da sociedade pela substituição de combustíveis fósseis, fundamentada
em questões ambientais.
As pesquisas mostram que a concentração de CO
2
atmosférico teve um aumento de
31% nos últimos 250 anos. Os números tendem a aumentar significamente se as fontes
emissoras de gases que causas efeito estufa sendo uma das mais importantes a queima de
combustíveis fósseis não forem controladas. Um dos avanços para tomada de decisão foi à
criação do Protocolo de Kyoto, discutido e negociado no Japão em 1997, que estabelece o
compromisso de diversos países de, a partir de 2005, reduzir a emissão dos gases que
provocam o efeito estufa em cerca de 5,2% até 2012 em relação aos níveis mensurados em
1990.
Outros acordos, como a Diretiva para Obtenção de Eletricidade de Fontes Renováveis
do Parlamento Europeu, são instrumentos indutores do uso da bioenergia. Assim a exaustão
de fontes não renováveis e as exigências devido a aspectos ambientais devem acarretar maior
19
aproveitamento energético de biomassa, matéria orgânica de origem animal ou vegetal que é
considerada uma fonte de energia renovável e menos poluente que as de origem fóssil.
2.2 – Biocombustível: Uso da biomassa na geração de energias renováveis
A utilização de combustíveis renováveis tem despertado um interesse cada vez maior
em todo o mundo. Os impactos positivos do uso dos combustíveis renováveis, em substituição
aos fósseis, não se restringem apenas ao campo econômico, mas também a questões
estratégicas e ambientais. Além de reduzir a dependência externa de petróleo e os gastos com
energia, o uso de tais combustíveis resulta em uma diminuição significativa das emissões de
gases tóxicos para a atmosfera. Esse último aspecto constitui um apelo cada vez maior para a
substituição dos derivados de petróleo pelos assim chamados "biocombustíveis".A procurar
por substitutos para o petróleo e matéria-prima para a indústria química é tema de projetos
entre vários centros de pesquisas. O preço do barril de petróleo no segundo semestre de 2006
era cerca de US$ 70, este alto preço torna o etanol e biodiesel economicamente viáveis no
setor energético. Segundo previsões, o consumo de petróleo irá aumentar significativamente
até por volta do ano 2014, quando então o preço do barril deverá subir tanto que forçará a
diminuição do consumo (Evans, 1999). Nesse contexto, busca-se tecnologias para a
substituição do petróleo como fonte de insumos e energia. Em princípio, os combustíveis
fósseis, como o gás natural e o carvão mineral, podem ser utilizados e poderiam substituir o
petróleo (Campbell, 1998). Porém, eles são de difícil transformação em matéria-prima para a
indústria química e não iriam resolver o outro grande problema relacionado com o petróleo: o
impacto ambiental devido à formação de CO
2
e gases sulfurados na sua queima ou
transformação. Para um país tropical como o Brasil, o substituto natural para o petróleo é a
biomassa (Schuchardt, 2000).
As principais fontes de biomassa provêm dos resíduos agrícolas, madeira e plantas
como a cana-de-açúcar e palha de cereais. Portanto materiais lignocelulósicos se tornam
interessantes para produção de energias renováveis reduzindo a poluição, pois são formadas a
partir de CO
2
e H
2
O, aproveitando a energia solar (Cortez, 1997). Considerando-se que 1
tonelada de biomassa corresponde a aproximadamente 2,9 barris de petróleo (valor calorífico
médio do petróleo = 10000 kcal/kg; biomassa base seca = 4000 kcal/kg) (Compet, 1999), o
Brasil precisa atualmente de 1.800.000 barris de petróleo por dia (90 x 10
6
toneladas de
20
petróleo por ano) (Compet, 1999; Amoco, 1999). Isso poderia ser suprido por 225 x 10
6
toneladas de biomassa por ano. Levando em conta que no mundo são produzidas cerca de 100
x 10
9
toneladas de biomassa por ano (Kuhad, 1993), e que a produção no Brasil é da ordem de
21 x 10
9
toneladas de biomassa por ano, seria necessário somente 1% da biomassa produzida
anualmente no Brasil para substituir o petróleo, não exigindo devastação ou qualquer outra
forma de agressão às florestas (Cortez, 1997). Os recursos renováveis representam cerca de
20% do suprimento total de energia no mundo, sendo 14% proveniente de biomassa e 6% de
fonte hídrica. Segundo dados do Balanço Energético Nacional (edição 2003), a participação
da biomassa na matriz energética brasileira é de 27% - incluindo lenha e carvão vegetal
(11,9%), bagaço de cana-de-açúcar (12,6%) e outros (2,5%). Na Europa e América do Norte a
preocupação com fontes alternativas de insumos é muito grande. Como exemplo, citamos a
realização da conferência Biomass for Energy and Industry, que ocorre a cada dois anos na
Europa. Isso envolve principalmente países onde a fotossíntese é desfavorecida em função da
localização geográfica (Kyritsis, 2000).
Os componentes da biomassa precisam ser separados antes da sua transformação em
substâncias químicas para geração de produtos de altos valores agregados. Neste contexto, o
conceito de ‘biorefinaria’ tem por base a separação seletiva de frações constituintes de uma
dada matéria prima, a Biomassa, de acordo com suas características químicas e dos produtos
a serem obtidos (Laser et al., 2002; Lynd et al., 1999; Garrote et al., 2002). A figura 2.1,
apresenta um esquema geral de uma biorrefinaria ilustrando novas rotas e transformações,
aplicação de novas tecnologias, surgindo assim o conceito 3R, que significa: Reduzir (R1, o
impacto ambiental através de novos processos, novos catalisadores e projetos de novos
equipamentos com o intuito de otimizar e aumentar a eficiência de processos “clássicos”, pois
maiores conversões implicam menores volumes de rejeito; Reutilizar (R2), toda a forma de
matéria-prima, desde as nobres até os rejeitos industriais para geração de novos produtos e
energia, fazendo que gradativamente a matriz energética seja acrescida de mais fontes
renováveis; Reciclar (R3), não apenas o produto, mas a também a própria biosfera, utilizando
a bioremediação frente aos impactos ambientais (Giordano, 2004).
21
Figura 2.1: Esquema geral de uma biorrefinaria utilizando diferentes tipos de biomassa (Giordano, 2004).
Entre as matérias-primas renováveis de grande interesse tecnológico, encontram-se os
materiais lignocelulósicos, principalmente sob a forma de resíduos agroindustriais e florestais,
constituídos por três frações fundamentais. A fração mais abundante é a celulose, um
homopolissacarídeo linear formado por unidades de glicose. O grau de ordenação da celulose
resulta numa alta cristalinidade, que se traduz na resistência ao ataque hidrolítico. Uma
segunda fração, denominada hemicelulose, apresenta composição heteropolissacarídica e é
constituído por vários açúcares, cujas proporções dependem da origem do material. No
entanto, na hemicelulose da maioria dos resíduos agroindustriais verifica-se a presença de
pentoses, em particular xilose e arabinose, configuradas numa cadeia facilmente hidrolisável.
Por último encontram-se álcoois aromáticos polimerizados, constituindo a fração denominada
lignina, que unida à hemicelulose envolve a matriz celulósica (Sun, 2002). A figura 2.2,
apresenta uma biorrefinaria utilizando materiais lignocelulósicos para produção de vários de
produtos de interesse.
22
Figura 2.2: Esquema de uma biorrefinaria utilizando materiais lignocelulósicos (Giordano, 2004).
Como observado na figura 2.2, os compósitos lignocelulósicos constituem uma
matéria-prima renovável e abundante para produção de produtos químicos e seus recursos
disponíveis (celulose, hemicelulose e lignina) como discutidos, a Tabela 2.1, ilustra a
composição de celulose, hemicelulose e lignina de algumas fontes lignocelulolíticas
(Rodrigues, 1988).
Tabela 2.1: Composição de alguns resíduos lignocelulósicos.
Fonte Celulose (%) Hemicelulose (%) Lignina (%)
Lixo urbano 61 2 9
Madeira mole 45 a 50 25 a 35 25 a 35
Madeira dura 40 – 55 24 a 40 18 a 25
Bagaço de cana-de-açúcar 25 a 40 25 a 50 10 a 30
23
2.3. Processamento das frações lignocelulolíticas produzidas por
biorrefinaria
A celulose é utilizada na produção de polpas celulolíticas e na obtenção de fibras
naturais como algodão, rayon e tencel. Sua transformação em insumos químicos ocorre a
partir da glicose obtida pela sua hidrólise. Esta glicose pode ser fermentada para etanol, e por
sucessivas reações químicas fornece etileno, buteno (dimerização de etileno), propileno
(metátese de buteno com etileno), butadieno (via acetaldeído, processo da Coperbo) e ácido
acrílico (via ácido láctico). Através de outros processos de fermentação pode-se ainda obter
butanol, isopropanol, 2,3-butadienol, glicerol, acetona, ácido acético e ácido butírico. A
hidrólise da glicose com ácidos diluídos leva ainda ao hidroximetilfurfural, que pode ser
clivado em ácido levulínico (ácido g-ceto-pentanóico) e ácido fórmico. O ácido levulínico
pode ser um interessante insumo para poliésteres (Schuchardt, 2000). A figura 2.3, ilustra a
utilização da fração celulósica produzindo vários produtos químicos por diferentes vias
reacionais.
Figura 2.3: Produção de produtos químicos por diferentes vias reacionais a partir da hidrolise da celulose.
(Schuchardt, 2000)
A pré-hidrólise em condições suaves hidrolisa as hemiceluloses em açúcares,
formando principalmente pentoses que podem ser fermentados, obtendo-se etanol. Se as
hemiceluloses forem separadas por explosão a vapor (tratamento com vapor superaquecido e
despressurização rápida), obtém-se furfural como produto principal, que forma resinas com
fenol ou uréia, ou pode ser hidrolisado a ácido maleico (Silva, 1995; Mckillip, 1989). Pode-se
24
ainda produzir, por hidrogenação catalítica, xilitol (umectante, adoçante, plastificante, aditivo
de alimentos) a partir de xilose (Melaja, 1977), manitol (adoçante, plastificante, secante) a
partir de manose (Dwivedi, 1991). A figura 2.4, mostra as etapas de transformação da
hemicelulose em produtos de valores agregados através de vários processos.
Figura 2.4: Formação de vários produtos a partir a hemicelulose, utilizando a hidrolise e explosão a vapor
(Schuchardt, 2000).
As ligninas são mais hidrofóbicas e podem ser transformadas em óleos com
características semelhantes ao petróleo através da hidrogenólise (Costa, 1989). Processos
pirolíticos, que fornecem fenol e ácido acético como produtos principais, são provavelmente
mais interessantes para a indústria química (Greudenberg, 1941). Processos oxidativos
também fornecem fenol, vanilina e lignina oxidada como produtos principais (Gonçalves,
1995). Ligninas podem ainda ser utilizadas com vantagem na produção de resinas fenol-
formaldeído (Benar, 1996). Ligninas também são adequadas para gaseificação com oxigênio
(Schuchardt, 2000), fornecendo gás de síntese, que é essencial na produção de metanol, que
pode ser utilizado como composto chave para a produção de uma grande variedade de
produtos químicos. A figura 2.5 mostra a síntese de vários produtos de alto valor agregado
como fonte os resíduos lignocelulósicos a partir da lignina através de várias vias reacionais.
25
Figura 2.5: Síntese de novos produtos a partir da lignina proveniente de resíduos lignocelulósicos (Schuchardt,
2000).
2.4 – Utilização do bagaço de cana-de-açúcar como matéria-prima
lignocelulolítica
O Brasil, maior produtor de cana - de - açúcar, gera como subproduto o bagaço de
cana, um resíduo lignocelulósico oriunda da indústria sucroalcooleira. Nas últimas safras a
produção superou os 100 milhões de toneladas. Destes, entre 6% e 10% não tem uma
destinação apropriada (MAPA, 2005). Para cada tonelada de cana-de-açúcar processada são
gerados em média 230 kg de bagaço (Santana e Souza,1984). A composição química do
bagaço integral é de 46,0% de celulose, 25,2% de hemicelulose e 20,7% de lignina (Bofo,
2005).
Uma das formas de utilização desse resíduo é cogeração de energia através da queima
do bagaço em caldeira, sendo uma prática tradicional em todo o mundo. No Brasil para cada 1
tonelada de cana moída é produzida cerca de 30 kW/h de energia. A cogeração de energia
através do bagaço irá certamente melhorar a economicidade da produção sucroalcooleira,
aumentando a competitividade do álcool carburante. Portanto existe um excedente de 16
milhões de toneladas de bagaço de cana-de-açúcar que podem ser utilizado para produção de
produtos de interesse como o biocombustível (bioetanol), tecnologia desenvolvida pela Dedini
com parceria da Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP. A
“DHR”, Dedini Hidrolise Rápida como é chamada, baseada na hidrólise ácida do bagaço de
cana-de-açúcar para obtenção de etanol. Em palestra proferida por José Luiz Olivério, vice-
26
presidente de operações da Dedini, em uma palestra proferida no Seminário Internacional de
Biocombustíveis, em Brasília, em abril de 2006, como exemplo do potencial da tecnologia,
foi detalhado: com um hectare de cana, é colhido 80 toneladas de cana limpa, Essas 80
toneladas produzem, pelo processo convencional, 6.400 litros do etanol hidratado. Se a
empresa passar a colher a cana integral, que inclui a palha hoje deixada no campo, a produção
por hectare passa a ser de 96 toneladas. Além dos 6.400 litros de etanol hidratado produzido a
partir do caldo resultante do processo convencional, a empresa poderá produzir mais 5.650
litros de etanol com o uso da tecnologia DHR para extração de mais açúcar do bagaço e a
queima da palha para gerar energia que antes era produzida a partir do bagaço. Somam-se,
assim, 12.050 litros produzidos por hectare, ou seja, dobra-se a produção se a tecnologia DHR
for empregada e se a palha for usada para geração de energia para a usina.
A hidrólise dos polissacarídeos presentes nos materiais lignocelulósicos pode ser feita
com diferentes tecnologias utilizadas individualmente ou combinadas: cozimento com vapor a
alta pressão seguida ou não de descompressão rápida, hidrólise ácida, hidrólise alcalina, uso
de peróxido de hidrogênio, dissolução da linina a quente com solvente orgânico ou álcali,
entre outros. Dependendo da severidade do processo utilizado o tratamento pode gerar grande
quantidade de sub-produtos tóxicos aos microrganismos que irão utilizar os açúcares
produzidos. Por outro lado um complexo de enzimas, celulases e xilanases, pode catalisar essa
hidrólise em condições suaves de reação, sem geração de sub-produtos.
Evidentemente, será necessário um pré-tratamento do material para facilitar a ação das
enzimas, mas esse deve ser suave. Ramos (2003) discute os diferentes tratamentos que podem
ser utilizados, suas vantagens e desvantagens. Concentração do ácido ou base, temperatura e
tempo de processo são variáveis decisivas na composição do hidrolisado resultante.
Cozimento rápido sob pressão, utilizando ácido diluído por curto tempo, seguido de
descompressão rápida pode ser um bom caminho para se preparar o material para o ataque
enzimático.
27
2.5 - Catalisadores enzimáticos
As enzimas são catalisadores biológicos que aumentam a velocidade das reações
bioquímicas. Enzimas em sua totalidade são proteínas, com exceção de alguns grupos de
moléculas de RNA (Gama, 2003). As figuras 2.6 e 2.7 ilustram consecutivamente a estrutura
geral de um aminoácido e formação uma proteína. Para formar proteínas, os aminoácidos se
ligam através das chamadas ligações peptídicas, ligação dos grupos amino de um aminoácido
e carboxila de outro, com eliminação de uma molécula de água. As propriedades funcionais
das enzimas dependem essencialmente do número dos resíduos desses aminoácidos e a sua
atividade catalítica, da integridade conformacional da proteína ativa. Portanto, a atividade é
perdida caso esta enzima sofra alterações em sua conformação estrutural. Para serem ativas,
algumas não requerem nenhum outro grupo químico além de seus resíduos de aminoácidos.
Outras requerem componentes químicos denominados cofatores. Um cofator pode ser um ou
mais íons inorgânicos tais como: Mg
2+
, Fe
2+
, Mn
2+
ou um grupamento orgânico chamado de
coenzimas. Algumas enzimas requerem ambos para exercer sua atividade. Uma enzima
completa, cataliticamente ativa, unida a sua coenzima e/ou grupo inorgânico é chamada
holoenzima, já a parte exclusivamente protéica é denominada apoenzima (Lehninger, 1999).
2.6: Representação da estrutura geral de um aminoácido.
Figura 2.7: Ligação peptídica entre as moléculas de aminoácidos formadores das enzimas.
28
Enzimas como catalisadores biológicos são extremamente eficientes, podendo acelerar
em média de 10
9
até 10
12
vezes a velocidade da reação. Essa velocidade é função da
concentração de substrato e geralmente seguem cinética de Michaelis-Menten, onde a
velocidade da reação é função hiperbólica da concentração de substrato. Dessa forma, torna-
se importante medir a atividade da enzima sob condições padrão, ou seja, mesmo pH,
temperatura, força iônica e concentração de substrato de modo a permitir a análise
comparativa de resultados (Gonçalves, 2001).
Para que esses processos sejam possíveis, a enzima é dotada de um ambiente
específico em sua estrutura tridimensional na qual a reação é energeticamente mais favorável.
A reação catalisada pela enzima ocorre confinada numa espécie de “bolso” denominado sítio
ativo, ao qual se liga o substrato para formar o complexo enzima-substrato, servindo-se de
alto grau de especificidade da enzima. A estrutura molecular alterada muda à conformação do
sítio ativo e conseqüentemente inibe a atividade catalítica da enzima. As enzimas têm um pH
ótimo de atividade, então, a alteração deste para cima ou para baixo, alterará a conformação
de cadeias laterais de aminoácidos que agem como ácido ou base fracos que modificam
diretamente o sítio ativo da molécula. Temperaturas altas, geralmente acima de 37ºC
modificam a estrutura de cadeia dos aminoácidos constituintes das enzimas. A força iônica é
muitas vezes ignorada, mas está intimamente ligada ao pH. Portanto, a força iônica de uma
solução tampão deve ser utilizada usando sais neutros e não inibitórios como o KCl ou NaCl .
Geralmente, sais que aumentam a solubilidade de aminoácidos facilitam a inativação da
enzima (Gonçalves, 2001).
A introdução de novas técnicas de engenharia de proteínas e pela tecnologia do DNA
recombinante através da grande área da Biotecnologia têm revolucionado o desenvolvimento
de novas enzimas industriais permitindo a modificação de propriedades cinéticas e da
estabilidade, o desenvolvimento de novas soluções ao nível da tecnologia de reatores
enzimáticos e das técnicas de imobilização. A utilização de enzimas vem de encontro aos
pressupostos da chamada Química Verde. O crescimento no mercado de enzimas é de
aproximadamente 4-5% ao ano, acompanhada pela redução de preço devido ao grande
número de empresas que vem comercializando enzimas com preços mais competitivos. O
crescimento para os próximos 4 anos também está estimado em torno de 3%, com estimativa
para 2009 de U$ 2,4 bilhões de dólares (Rajan, 2004)
29
2.6 – Enzimas celulolíticas
Celulases são capazes hidrolisar a celulose, que é a matéria-prima mais abundante do
planeta, a principal fonte de carbono (Zhang, 2006), sendo encontradas nas paredes celulares
de vegetais. Apresenta-se na forma amorfa e cristalina (Ramos, 2003). A figura 2.8, ilustra
uma célula vegetal evidenciando a forma estrutural da celulose, polímero em maior
quantidade na composição de uma célula vegetal.
Figura 2.8: Célula vegetal, representando as fibras de celulose, hemicelulose em estrutura.
30
Do ponto de vista químico, a celulose é um polissacarídeo composto de unidades β-D-
glicopiranosil, ligados por pontes β-(1,4), formando um polímero linear (Ramos, 2003; Lynd,
2004). A figura 2.9 apresenta a estruturas linear da celulose.
2.9: Cadeia linear polimérica da celulose, mostrando as ligações β-1,4 das unidas β-D-glicopiranosil.
A celulase é classificada como sendo uma hidrolase e segundo a nomenclatura
enzimática (E.C. 3.2.1), hidrolases O-glicosídicas são baseadas em sua especificidade ao
substrato e ocasionalmente no seu mecanismo molecular. De acordo com a nomenclatura, o
número 3 refere-se à hidrolases; 3.2 glicosilases e 3.2.1. glicosidases, isto é, enzimas que
hidrolisam compostos O-glicosil ou S-glicosil. Atualmente as hidrolases glicosídicas são
agrupadas em 87 famílias (Wulff, 2002). A figura 2.10, apresenta a estrutura de uma celulase
de Trichoderma reesei.
Figura 2.10: Celulase de Trichoderma reesei (Sandgren et al, 2005).
31
A conversão enzimática da celulose em glicose é uma tarefa árdua, devido à natureza
física do substrato. Na sua forma nativa, a celulose é composta principalmente de fibras
cristalinas insolúveis, chamadas de microfibrilas, nas quais as pontes de hidrogênio mantêm
as moléculas unidas. Essas fibras são embebidas em uma matriz de hemicelulose e lignina, a
qual reduz a acessibilidade às enzimas celulolíticas (Béguin, 1990). A figura 2.11, ilustra as
pontes de hidrogênio formando redes/fibras cristalinas insolúveis.
Figura 2.11: Fibras cristalinas de celulose, ilustrando a influência das pontes de hidrogênio (www.biologie.uni-
hamburg.de/b-online/e26/26a.htm).
Na hidrolise da celulose é necessário um consórcio de enzimas: endoglucanase,
exocelulases, β-glucosidase, descritas na literatura como tendo uma ação sinérgica entres elas
(Monti, 1989; Nidtzky et al., 1994; Tanner, 2002; Wulff, 2002). Este grupo reúne:
I – Endoglucanases (EG I,II,III e V; EC 3.2.1.4), são enzimas que catalisam a
hidrólise interna de ligações β–(1,4) D-glicosídicas da celulose. Podem hidrolisar também
ligações β–(1,4) em D-glicanas que contém ligações β-(1,3). As endoglucanases são também
conhecidas como carboximetilcelulases ou endocelulase. Seu substrato natural é a celulose e
xiloglicana, apresentando especificidade variável sobre carboximetilcelulose (CMC), avicel
(celulose cristalina), β–glicana e xilana.
32
II – Exoglucanase ou Celobioidrolases (CBH I e II; EC 3.2.91), conhecida como
avicelases ou exocelulase. Catalisam a hidrólise de ligações β-(1,4)-D-glicosídicas na celulose
e celotetraose, liberando celobiose das extremidades não redutoras da cadeia.
III - β-Glicosidases (EC 3.2.1.21), conhecida como celobiases . Catalisa a hidrólise
de resíduos β-D-glicose terminais não redutoras, liberando β-D-glicose. Apresentam ampla
especificidade por β-D-glicosídeos, podendo hidrolisar também β-galactosídeos, α-L-
arabinosídeos, β-D-xilonosídeos.
As endoglucanases e as celobiohidrolases degradam celodextrinas solúveis e celulose
amorfa, enquanto somente as celobiohidrolases, com notáveis exceções, degradam a celulose
cristalina eficientemente (Shülein, 1998 apud Wulff, 2002).
Figura 2.12: Mecanismo da degradação da celulose e o sinergismo do complexo enzimático.
Na figura 2.12, é representado o mecanismo da degradação da celulose e pode
verificar o sinergismo das enzimas. A endocelulase quebra aleatoriamente a cadeia
polimérica, posteriormente a exocelulase quebra o final dessa cadeia em um dímero de glicose
33
(Celobiose). Por último, a β – glicosidase converte a celobiose em glicose (Saddler, 1986
apud Wulff, 2002).
As hidrolises enzimáticas das pontes glicosídicas ocorrem através de catálise ácida
geral, onde são necessários dois aminoácidos críticos, um doador de prótons (ácido) e um
nucleófilo. A catálise ácida é usualmente promovida pelos resíduos aspartato ou glutamato, ou
em ambos resíduos (Gilkes et al., 1991 apud Wulff, 2002). Nesta catálise, ocorre uma reação
de remoção simples ou dupla, resultando em inversão ou retenção da configuração anomérica
do átomo de carbono do glicosídeo hidrolisado (Davies et al.,1995 apud Wulff, 2002). A
figura 2.13, apresenta o esquema reacional da β-glicosidase.
Figura 2.13: Clivagem da celobiose catalisada pela enzima β-glicosidase.
As celulases apresentam múltiplos domínios, podendo possuir domínios catalíticos
ligadores de celuloses e seqüenciadores de ligações (Gilkes et al., 1991 apud Wulff, 2002). As
enzimas dos domínios são menos variáveis do que as dos domínios com atividade catalítica,
pois nos domínios com atividade catalítica conferem diferenças sutis na especificidade e no
mecanismo (Gilkes et al., 1991 apud Wulff, 2002). Embora os domínios ligadores de celulose
não sejam essenciais para a atividade catalítica, eles modulam a atividade específica das
enzimas em substrato celulolíticos solúveis e insolúveis. Segundo Tomme et al., 1995 apud
Wulff, 2002 os domínios ligadores de celulose são identificados como módulos ligadores de
carboidrato e são definidos como uma seqüência de aminoácidos avizinhados, dentro de uma
enzima ativa sobre carboidrato e sua estrutura terciária independe da estrutura do domínio
catalítico.
34
Enzimas com seqüências similares às dos domínios catalíticos apresentam diferentes
especificidade (exo ou endo), o que sugere que a atividade seja conseqüência de detalhes na
estrutura tridimensional da proteína (Wulff, 2002). Gilkes et al., 1991 apud Wulff, 2002
pesquisou a produção de hidrolases glicosídicas de Caldocellun saccharolyticum e observou
que para as endoglicanase CelB tem-se um domínio exoglicanase N-terminal e outro domínio
C-terminal, na qual pertencem a diferentes famílias, tornado-a uma enzima bifuncional.
Estudos realizados por Béguin, 1990 mostraram que os microrganismos degradadores de
celulose cristalina secretam sistemas complexos de celulases e tais sistemas são compostos de
uma variedade de enzimas com especificidade e modo de ação diferenciada, as quais agem em
sinergia hidrolisando a celulose. Henrissat et al., 1985 afirmaram que as enzimas
endoglicanases e celobiohidrolases mostram diferentes tipos de sinergias na hidrólise da
celulose cristalina, verificando outros tipos de ações sinérgicas das endoglicanas e β-(1,4)-
celobioidrolases enquanto Béguin, 1990, estudou os mecanismos de síntese de celulases
demonstrando dois tipos de mecanismos que controlam a síntese e secreção da celulase. Na
maioria dos organismos, a produção é reprimida na presença de altas concentrações de fonte
de carbono prontamente metabolizáveis. Em diversos sistemas, a síntese de celulase é
regulada pela celobiose, que são geradas a partir da degradação da celulose por pequenas
quantidades de celulases. Pesquisas a respeito da capacidade hidrolítica das celulases,
observaram que algumas são capazes de efetuar transglicosilação que é a formação de
trímeros e tetrâmeros a partir de celobiose, verificando a capacidade transglicosídica de uma
celulase de Trichoderma viride (Naby-Abdel,1997)
2.7- Microrganismos produtores de celulase
A literatura reporta vários microrganismos produtores de celulase, portanto o trabalho
de seleção mais idôneo para produção de celulase extracelular foi desenvolvido pelo grupo de
Natick da U.S Army Research and Development Comand em Natick, laboratório norte
americano que se interessou nos estudos de microrganismos celulolíticos (Monti, 1989). Esse
grupo destacou como o principal microrganismo promissor para produção de celulase o fungo
filamentoso Trichoderma viride (Resse, 1976 apud Monti, 1989; Agbhevor, 2004). Os
estudos se basearam em comparações como diversas espécies produtoras na qual o grupo de
Nitick possuía um acervo de mais de 14.000 cepas de microrganismos isolados de materiais
35
celulóliticos em decomposição e relataram ao final do estudo que a celulase não era uma
intidade simples, mas um complexo de enzimas.
Alguns microrganismos poderiam consumir rapidamente todas as formas de celulose,
enquanto que outro não. Foi verificado também, que a produção dessa enzima é relativa,
muitos microrganismos produzem grandes quantidades outros pouquíssimas. Verificou-se que
das enzimas extracelulares produzidas, algumas poderiam degradar apenas algodão e
derivados solúveis de celulose enquanto outras enzimas poderiam somente degradar apenas
derivados de celulose (Resse, 1976 apud Monti,1989). Wen et al., (2004) utilizaram
Trichoderma reesei para produção de celulase. O estudo teve interesse na degradação da
forragem pela indústria leiteira através da digestão anaeróbica para conversão de produtos
bioenergéticos. Alguns trabalhos apresentam como produtores de celulase Aspergilus niger ,
por exemplo, Kim et al., (2004) pesquisaram a produção de celulase e hemecelulase em
fermentação em estado sólido usando como substrato diferentes concentrações de palha de
arroz e farelo de trigo.
2.8 - Aplicações biotecnológicas da enzima celulase
Há várias aplicações da celulase em processos biotecnologicos na qual em sua grande
maioria são utilizados fungos filamentosos do gênero Trichoderma para degradação de
materiais lignocelulolíticos e a enzima livre comercialmente disponível (Wen et al., 2004,
Kim et al., 2004). As indústrias de alimentos, papel e celulose, biocombustível, têxtil,
farmacêutica, medicina, química fina, agroindústria e de alimentação animal e silagem vem
aplicando essa tecnologia enzimática para redução de custos operacionais, aumento da
qualidade e buscando processos mais limpos diminuindo assim os impactos ambientais. A
produção de etanol utilizando biomassa lignocelulolítica atrai as atenções de pesquisadores
em busca de energia alternativa (Sheng, 1998; Agbhevor, 2004). Kim et al., (2004),
propuseram a fermentação em meio sólido da palha de arroz e farelo de trigo por Aspergillus
niger para produção de etanol. Tal processo consiste em hidrolisar os materiais
lignocelulolíticos reduzindo-os principalmente em glicose e xilose e transformá-los
posteriormente em caldo de açúcares para bioconversão em etanol (Heleng, 2001 apud Kim,
2004). Outras aplicações da hidrólise enzimática são descritas por Kuhard e Singh (1993), que
36
pesquisaram o uso de vários substratos para a produção de produtos químicos (polifenois,
ácido orgânicos) e solventes orgânicos (acetona, butanol) (Sheng, 1998).
As enzimas celulolíticas são usadas como aditivos biológicos na preparação de
silagem (Islan, 2001). Mühlbach et al., (2000), utilizaram celulase como aditivo biológico
para melhoramento da fermentação da alfafa e na melhoria da qualidade da silagem. Lopes et
al.,(2002) complementou celulases em rações animais para melhoramento da digestibilidade
de leitões utilizando como fonte farelo de arroz integral.
Na indústria têxtil as celulases são capazes de tornar os tecidos mais lisos e macios,
degradando as fibras da superfície. Também são usadas no tratamento de jeans para dar a
aparência nos tecido Denim (Dienes, 2004).
Na indústria alimentícia, as celulases são usadas em vários processos, principalmente
na extração de componentes do chá verde, proteína de soja, óleos essenciais, aromatizantes e
do amido da batata doce. Essas enzimas participam ainda dos processos de produção de
vinagre de laranja e do ágar e na extração e clarificação de sucos de frutas cítricas (Orbeg,
1981 apud Rugger, 2004). Estudos voltados à ação e produção da celulase também são
verificados na literatura. Xia et al., (2003) estudou o pré-tratamento de resíduos de derivados
de milho como fonte de substrato, Kansoh et al., (1998), utilizou bagaço da cana-de-açúcar na
preparação de novos derivados celulolíticos. Resíduos fibrosos de soja são aproveitados como
substrato para a produção de enzimas celulolíticas e produtos de valor agregado por
Lactobacillus subtilis isolados da água e do solo da região amazônica (Ayab et al., 2002).
2.9 - Tecnologia enzimática em processos biotecnológicos: Imobilização de
enzimas
O elevado custo das enzimas torna difícil viabilizar-se economicamente a utilização de
enzima livre em bioprocessos industriais, portanto, os processos biotecnológicos utilizando
microrganismos produtores de enzimas celulolíticos se tornam atraentes, mas devido à biota
nele existente a contaminação microbiológica é um fator predominante na escolha do
bioprocesso (Xia, 2003; Wen, 2004; Kim, 2004; Nako, 2006). Trabalhos para otimizações de
processos enzimáticos vêm sendo explorados por inúmeros centros de pesquisa, e uma das
tecnologias empregada é a imobilização de enzimas e células. As principais vantagens obtidas
37
pelo processo de imobilização são: o aumento da estabilidade térmica do biocatalisador,
aplicação em reatores com maior controle do processo, podendo ser usadas elevadas
concentrações de enzimas, permitindo a sua reutilização sem perda significativa da sua
atividade catalítica, bem como o aumento de sua estabilidade. As principais desvantagens
deste processo são: alteração da conformação nativa da enzima, custo do suporte e perda de
atividade durante o processo de imobilização, interação suporte-enzima e a redução da
atividade catalítica devido aos efeitos difusionais, de microambiente e estéricos-
conformacionais (Arroyo, 1998; Vitolo, 2001; Gama, 2003). Portanto a possibilidade de
reutilização ou uso contínuo, insolubilidade e estabilidade são características desejadas
comercialmente, oferecidas por uma enzima quando esta se encontra imobilizada em um
suporte inerte adequado (Bickerstaff, 1995).
A prática de se imobilizar enzimas e células vem se expandindo extensivamente nos
últimos 30 anos na medida em que seus benefícios vêm sendo reconhecidos para aplicações
analíticas, médicas e em biotransformações. Demonstra-se que nos casos onde o uso de
enzima imobilizada foi possível, os custos de processo diminuíram em cerca de 50%, tal
como observado por Chibata et al., 1976, na separação de racemados de aminoácidos com
aminoacilase imobilizada em DEAE-Sephadex-A-25; Sheng (1998) imobilizou a enzima
celulase em membrana polimérica como o objetivo de diminuir os custos operacionais
modificando a celulase com PAN, observando ganhos nas estabilidades frente ao pH e
temperatura; Villalonga, 2001 estudou a estabilização de celulase conjugada com quitosana
ativada com periodato; Xia 2003 imobilizou celulase (esporos de A. niger) em géis se alginato
de sódio para conversão de materiais lignocelulósicos em açúcar solúveis. Sheng, 2004
estudou a imobilização da celulase em nanofibras de PVA. Gu et al., 2005 imobilizou a
celulose em géis de quitosana obtendo valores significativos de fator de estabilidade térmica.
Nakao, 2006 imobilizou a celulase em lipossomas, obtendo ganhos na atividade específica de
cerca de 10 vezes quando comparados aos sistemas convencionais e uma menor inibição pelo
produto.
Em conseqüência disso houve a expansão das técnicas de imobilização, que buscam
melhor adaptar-se às variabilidades individuais de cada enzima (Bickerstaff, 1995). Apesar de
muita pesquisa realizada nos últimos anos acerca das variadas formas utilizadas para
imobilizar enzimas, não se chegou a uma padronização de qual método ou material é o ideal
38
para cada tipo de imobilização. O uso e a aplicação da enzima imobilizada irão definir as
características requeridas ao conjunto suporte e método de imobilização, mensuradas de
acordo com os seguintes aspectos:
• físicos: área superficial disponível, forma, porosidade, volume de poro, densidade;
• químicos: disponibilidade de grupos reativos, hidrofobicidade;
• estabilidade: estocagem, atividade recuperada, estabilidade mecânica;
• resistência: ataque de fungos, pH, temperatura, solventes orgânicos;
• segurança: toxicidade de reagentes, segurança de utilização;
• econômicos: disponibilidade e custo de suporte e reagentes, equipamentos, impacto
ambiental;
• reacionais: cinética de reação, tipo de reator a ser utilizado, limitações difusionais.
A seleção do método de imobilização deve ser baseada em parâmetros como atividade
global do derivado imobilizado, características de regeneração e desativação, custo do
procedimento de imobilização, toxicidade dos reagentes de imobilização e propriedades finais
desejadas para a enzima imobilizada (Malcata et al., 1990).
2.10 - Classificação de sistemas de imobilização de enzimas
Os métodos de imobilização de enzimas podem ser separados em duas grandes
classes: método químico e método físico.
O químico envolve a formação de pelo menos uma ligação covalente entre uma ou
mais moléculas de enzima e um polímero insolúvel. O processo é irreversível e a enzima
geralmente não pode ser recuperada posteriormente. No método físico a imobilização não
depende de formação de ligação covalente e sim de forças físicas, como a eletrostática, iônica,
interação proteína – proteína. Esses métodos em geral são completamente reversíveis
(Zaborsky, 1977).
39
A ligação covalente da enzima ao suporte é o método mais interessante de
imobilização sob ponto de vista industrial, pois envolvem grupos amino e carboxílicos
superficiais da enzima, normalmente não relacionados com seu sítio ativo. Nesse método, o
primeiro passo é a ativação do suporte e o segundo o acoplamento da enzima ao suporte
ativado (Sinisterra, 1997).
Nos métodos químicos, depende-se da ligação covalente formada e essa ligação pode ocorrer
de diferentes maneiras a seguir:
• Ligação covalente: Envolve normalmente grupos amino dos aminoácidos da enzima
(NH
2
), que cedem elétrons ao suporte fortemente eletrofílico (+). A escolha do suporte se
deve em função da máxima preservação da atividade. A ligação não pode envolver sítio
ativo da enzima.
• Ligação cruzada: Ligação intercruzada das moléculas de enzima para formação de
uma estrutura tridimensional complexo. Uso de reagente multifuncional, normalmente
relacionado a baixas estabilidades.
• Copolimerização: Incorporação da enzima em uma cadeia polimérica crescente.
Nos métodos físicos, podemos citar:
• Adsorção: Forças de interação entre suporte e enzima: van der Waals, iônica, pontes
de hidrogênio. Ligações fracas, porém numerosas. Pode ocorrer dessorção devido a
mudanças no meio (pH, agitação) – contaminação do produto pela enzima.
• Aprisionamento: Moléculas de enzima livres, mas restritas em movimento, presas à
estrutura do gel. Sérios efeitos difusivos.
• Encapsulação: Enzima contida em uma microcápsula de membrana porosa
semipermeável, por onde permeiam substrato e produtos. Limitações difusionais presentes.
Possibilidade de co-imobilização de enzimas e células
• Membrana: Enzima contida em uma membrana semipermeável, por onde permeiam
substrato e produtos.
40
2.11 - Imobilização por ligação covalente multipontual
O método de ligação covalente multipontual consiste na imobilização e estabilização
da enzima através da formação de ligação covalente entre grupos amino da enzima (-NH
2
), e
grupos aldeído do suporte. Esses grupos aldeído que se encontram ligeiramente afastados da
superfície do suporte, são introduzidos através de sua ativação prévia, e tornam o suporte
fortemente eletrofílico para se ligar aos grupos doadores de elétrons dos aminoácidos da
superfície da enzima (Guisán, 1988)
O ligeiro distanciamento dos grupos aldeído provocado pela ativação permite a
formação de ligações multipontuais – bases de Schiff - entre enzima e suporte, ligações
adicionais que são menos estáveis, porém que aumentam consideravelmente a estabilidade do
derivado obtido, em relação à enzima livre. A possibilidade de que ligações adicionais sejam
efetivadas aumenta consideravelmente com o aumento da densidade superficial de grupos
aldeídos ativados no suporte.
Normalmente, a primeira ligação que ocorre entre a enzima e o suporte é rápida e
reversível, pois existe um equilíbrio entre as formas ligadas e não ligadas do sistema enzima-
suporte. A estabilidade do derivado cresce significativamente com a efetivação da segunda
ligação entre enzima e suporte, pois havendo agora duas ligações semelhantes, mas
reversíveis, essas funcionam na prática como uma única ligação irreversível no derivado.
Além disso, tornam alinhados os grupos amino presentes na enzima e os grupos aldeído da
superfície do suporte, facilitando, dessa forma, o processo de efetivação de outras ligações.
Essa estratégia é um importante e adequado sistema de insolubilização e estabilização
de enzimas, cujas principais características são: ausência de impedimento estérico para a
reação química do grupo amino com o grupo ativado no suporte, alta estabilidade dos grupos
aldeído até em pH mais alcalinos, e reversibilidade de cada reação individual amino-aldeído.
Essas características favorecem a formação de ligação multipontual enzima-suporte sem
causar mudanças conformacionais dramáticas na estrutura da enzima (Guisán, 1988).
Ao contrário da primeira ligação formada (amino), as demais ligações (Bases de
Schiff) demandam de tempo para se efetivar. É importante, portanto, que a estabilidade do
composto aldeído utilizado na ativação do suporte seja alta (Guisán, 1988; Blanco et.al.,
1989).
41
A finalização do processo se dá através da redução das bases de Schiff formadas na
reação amino-aldeído por borihidreto de sódio (NaBH
4
), que atua sobre as bases de Schiff
rapidamente reduzindo-as a estáveis ligações amino secundárias, o que pode controlar a
intensidade das interações enzimas-suporte que, quando muito fortes, podem causar
distorções da enzima (Blanco et al., 1989). Os grupos aldeído remanescentes são convertidos
a grupos hidroxila inertes.
A imobilização de enzimas com ligação covalente multipontual tem sido citada por
diversos autores, como uma maneira de aumentar a estabilidade em relação à enzima livre
(Otero, 1995; Fernandez-Lafuente et al., 1995; Mateo, 2000), sendo também capaz de alterar
a especificidade e seletividade. Por serem moléculas mais rígidas, têm mais resistência a
mudanças conformacionais induzidas por calor e solventes orgânicos (Guisán, 1988; Mozahev
et al., 1999) e outras espécies de desnaturação, como quebra de ligação peptídica, oxidação do
grupo funcional (Wu et al., 2001).
A escolha de um sistema de imobilização e estabilização adequado deve considerar,
inicialmente, a morfologia da estrutura porosa do suporte, o grupo funcional da enzima e o
método de ativação a ser usado (Blanco, 1989) sendo fundamental que se evite o
envolvimento dos aminoácidos do sítio catalítico da enzima no processo de insolubilização da
enzima (Zaborsky, 1977).
Por outro lado, algumas propriedades da enzima e seu comportamento podem mudar
com a imobilização. Muitos fatores levam a alteração dos parâmetros cinéticos da enzima
imobilizada, em relação à livre, diminuindo o rendimento do processo de imobilização. A
literatura nos reporta vantagens e desvantagens em relação aos métodos de imobilização
(Zaborsky, 1977; Bickerstaff, 1995).
2.12 -Parâmetros da imobilização
Algumas propriedades da enzima e seu comportamento podem mudar com a
imobilização. Muitos fatores levam a alteração dos parâmetros cinéticos da enzima
imobilizada, em relação à livre, diminuindo o rendimento do processo de imobilização. A
literatura nos reporta vantagens e desvantagens em relação aos métodos de imobilização
(Zaborsky, 1977, Bickerstaff, 1995).
42
Dentre as características que descrevem os diversos sistemas de imobilização de
enzimas, merecem destaque quando se investiga uma nova metodologia para imobilizar
enzimas, o Rendimento da Imobilização, que é definido como a razão entre a atividade
oferecida ao suporte e a atividade desaparecida do sobrenadante; a Atividade da enzima
imobilizada (atividade do derivado); Atividade Recuperada (razão entre a atividade medida do
derivado e a atividade desaparecida do sobrenandante e teoricamente imobilizada) e o Fator
de Estabilidade (relação entre a meia-vida da enzima imobilizada e a da enzima livre).
Algumas propriedades da enzima e seu comportamento podem mudar com a
imobilização. Muitos fatores levam à alteração dos parâmetros cinéticos da enzima
imobilizada, em relação aos valores da enzima livre (intrínsecos):
• Efeito conformacional: a conformação tridimensional da molécula de enzima pode
ser modificada durante o processo de imobilização, ocasionando a alteração dos valores dos
parâmetros cinéticos da enzima imobilizada. Este efeito não pode ser alterado, e, portanto, é
característico de cada sistema enzima-suporte. Os parâmetros cinéticos da enzima imobilizada
descontados de seus efeitos eletrostáticos e difusionais são denominados parâmetros inerentes.
• Efeitos eletrostáticos: a concentração de espécies químicas importantes (íons H
+
,
moléculas de substrato) no micro-ambiente da enzima imobilizada pode ser diferente das
concentrações no bulk devido a propriedades físico-químicas do suporte e de efeitos
difusionais.
• Efeitos difusionais: a cinética observada da enzima imobilizada pode não estar sendo
governada apenas por interações entre enzima e substrato, mas pode também estar sendo
limitada pela taxa de difusão do substrato à superfície do suporte, ou internamente, por entre
os poros do suporte. Nesse caso a concentração real de substrato que está em equilíbrio com a
enzima imobilizada (sistema heterogêneo) é menor que a que haveria caso reagente e
catalisador fossem solúveis (sistema homogêneo). Em conseqüência, a velocidade de reação
com enzima imobilizada (velocidade real, aparente ou observada) é menor que a que se
obteria para a mesma concentração de reagente no bulk.
Os efeitos eletrostáticos e difusionais, apesar de influenciar bastante nos parâmetros
observados da enzima, podem ser calculados ao se aplicar princípios básicos de engenharia de
reações químicas que, ao serem solucionados, permitirão a determinação dos parâmetros
43
cinéticos inerentes da enzima imobilizada, que podem ou não serem iguais aos intrínsecos,
dependendo da existência ou não de efeitos conformacionais e eletrostáticos.
2.13 - Suportes para imobilização
Segundo Messing (1975), suportes para imobilização de enzimas podem ser
classificados conforme sua composição e morfologia. A Tabela 2.2 mostra a classificação de
suportes em termos de composição.
Tabela 2.2: Classificação dos suportes conforme a composição (Pereira, 1996).
Suportes inorgânicos são mais adequados para o uso industrial devido as suas
propriedades físicas, além disso, apresentam uma série de vantagens em relação aos suportes
orgânicos como: elevada força mecânica, estabilidade térmica, resistência a solventes
orgânicos e ataque de microrganismos e fácil regeneração por processo de pirólise. No mais,
materiais inorgânicos não apresentam modificação na estrutura em uma larga faixa de
pressão, temperatura e pH. Contudo, a maioria das enzimas imobilizadas e comercializadas é
obtida com matrizes orgânicas, provavelmente, devido a grande variedade de grupos
funcionais reativos que podem ser “introduzidos” em suportes orgânicos (Kennedy, 1987).
Quanto à morfologia, os suportes podem ser: porosos, não porosos e estrutura gel. Os
suportes porosos, tanto orgânicos quanto os inorgânicos, apresentam como vantagem grande
área superficial interna disponível para imobilização da enzima, que neste caso fica protegida
de turbulência externa. Observa-se que a morfologia interna dos suportes porosos permite não
só a imobilização da enzima, como também o acesso das moléculas de produtos e substratos.
ORGÂNICOS INORGÂNICOS
NATURAIS SINTÉTICOS MINERAIS FABRICADOS
POLISSACARÍDEOS PROTEÍNAS POLIESTIRENO AREIA VIDRO DE POROSIDADECONTROLADA
CELULOSE COLÁGENO POLIACRILATOS BETONITA CÊRAMICA DE POROSIDADE CONTROLADA
ÁGAR ALBUMINA POLIVINILOS HOMEBLERDA SÍLICA DE POROSIDADE CONTROLADA
AMIDO SEDA NYLON PEDRA-POME ÓXIDO DE FERRO
44
Os não-porosos eliminam a resistência à transferência de massa interna, contudo, apresentam
uma limitada área superficial disponível para imobilização de enzimas. Para aumentar a carga
de enzima imobilizada, utilizam-se partículas finas ou fibras, porém, estas são dificilmente
removidas da mistura reacional, limitando o uso em reações contínuas, desde que levadas a
uma alta pressão em reatores de leito fixo. Além disso, influem no grau de escoamento se
utilizadas em reatores de leito fluidizado (Pereira, 1996).
Os géis, embora de uso simples, são úteis apenas nos casos em que a grade formada
seja de malha suficiente para reter a enzima sem implicar em restrições difusionais sérias para
o substrato.
Os polímeros naturais e sintéticos são uma classe de suportes muito importantes no
campo da imobilização de biocatalisadores. Os polímeros sintéticos exibem variedades de
formas físicas e estruturas químicas que podem ser combinadas para formar um suporte ideal,
porém os polímeros naturais levam algumas vantagens quando comparados aos sintéticos,
pois geralmente apresentam baixo custo e são facilmente degradáveis não causando danos ao
meio ambiente. Dentre os suportes orgânicos naturais têm sido extensamente utilizados como
matrizes para a insolubilização de enzimas e os mais utilizados são agarose, alginato e
quitosana, visto pelo grande número de trabalhos relatados na literatura (Bastida et al., 1999;
Palomo et al., 2002; López-Gallego et al., 2005; Tardioli et al., 2003a,b; Martins et al., 2006;
Desai et al., 2006; Oliveira et al., 2006).
2.14 - Quitosana
A quitosana é a forma desacetilada da quitina, o segundo polímero mais abundante na
natureza, depois da celulose (George e Abraham, 2006). É um produto natural, de baixo custo,
renovável e biodegradável, de grande importância econômica e ambiental. As carapaças de
crustáceos são resíduos abundantes e rejeitados pela indústria pesqueira, que em muitos casos
as consideram poluentes. Sua utilização reduz o impacto ambiental causado pelo acúmulo nos
locais onde é gerado ou estocado. Este biopolímero possui uma estrutura molecular
quimicamente similar à celulose, diferenciando-se somente nos grupos funcionais (Krajewska,
2004). Grupos hidroxila (OH) estão dispostos na estrutura geral dos biopolímeros, mas a
principal diferença entre eles é a presença de grupos amino (NH
2
) na estrutura da quitosana.
45
Este biopolímero é solúvel em meio ácido diluído, formando um polímero catiônico, com a
protonação do grupo amino (NH
3
+
), que confere propriedades especiais diferenciadas em
relação às fibras vegetais (Berger et al., 2004). A Figura 2.14 mostra a estrutura química dos
biopolímeros quitina, quitosana e celulose.
Figura 2.14. Estrutura dos biopolímeros quitina, quitosana e celulose.
A quitina é frequentemente obtida de exoesqueletos de crustáceos como, por exemplo,
de caranguejo e camarão. O biopolímero é adicionado em uma solução aquosa fria de HCl 2%
para a remoção de compostos minerais como carbonato de cálcio. Em seguida, é realizada
hidrólise alcalina a quente em solução aquosa de NaOH 5% (w/w) para remoção de proteínas.
Após esta etapa, obtém-se a quitina com um grau de acetilação superior a 50% (Gupta e
Jabrail, 2006). Para a obtenção da quitosana, a quitina é desacetilada empregando solução de
NaOH a 50% (w/w) a 60
0
C (Krajewska, 2004). O grau de desacetilação da quitosana é
controlado por esta etapa, podendo atingir total desacetilação empregando hidrólise alcalina
em etapas consecutivas.
Na etapa de desacetilação alcalina, parte das ligações N-acetil da quitina são rompidas
com formação de unidades de D-glucosamina que contém um grupo amínico livre. Entretanto,
46
a quitosana não é uma macromolécula quimicamente uniforme, porque apresenta diferente
grau de desacetilação acima de 30% já podem ser considerados como quitosana, sendo que as
aplicações e características do polímero dependem fundamentalmente do grau de
desacetilação e tamanho da cadeia polimérica (Berger et al., 2004). Este biopolímero tem três
tipos de grupos reativos funcionais, um grupo amino na posição C-2 e duas hidroxilas, uma
primária e outra secundária, nas posições C-3 e C-6, respectivamente (Li e Bai, 2005). É
solúvel em diversos ácidos orgânicos e inorgânicos diluídos (Kumar et al., 2000a).
Devido a suas propriedades: hidrofilicidade, biocompatibilidade, biodegenerabilidade,
atividade antimicrobiana, entre outras, apresenta inúmeras possibilidades de aplicação
industrial, como na clarificação de sucos, agente emulsificante, agente floculante na
purificação de água, formação de filmes biodegradáveis, além de ser usado como fibra
dietética em alimentos devido a seu efeito hipocolesterolêmico (Arruda, 1999). Além disso,
esse polímero reaproveitado do processamento da indústria pesqueira tem sido fortemente
investigado como suporte para imobilização de enzimas (Braun et al., 1989), mostrando ser a
melhor opção dentre muitos suportes testados para imobilização com fim industrial da enzima
β-Galactosidase (Martino et al., 1996ab).
A quitina pode ser encontrada naturalmente de três formas: α, β, e γ. A forma α é
encontrada em carapaças de crustáceos, insetos e na parede celular de fungos, tendo como
característica uma estrutura onde há um arranjo alternado de cadeias paralelas e anti-paralelas.
Na forma β, predominante em lulas e algas marinhas microscópicas, há um arranjo de cadeias
paralelas. A forma γ não foi ainda bem estudada. Wu et al., (2001); cita a forma β da quitina
como a que gerou um derivado de quitosana de maior intumescimento, devido à presença de
poros de maior volume no derivado, melhorando sua capacidade de adsorção de íons
metálicos, em comparação com o derivado obtido da quitina na forma α.
A presença de grupos amino livres na quitosana proporciona a maior solubilidade e
reatividade que a quitina e a celulose (Monteiro e Airoldi, 1999). É atraente economicamente,
por ser o segundo polímero natural mais abundante, atrás apenas da celulose (Wu et al.,
2001).
47
Alguns exemplos de aplicações da quitosana em diversas áreas são mostrados a seguir:
• Tratamento de Efluentes: Remoção de íons metálicos, floculante e coagulante de
proteínas e pigmentos;
• Indústria de Alimentos: Remoção de sólidos suspensos, agente conservante,
estabilização de cores e aditivo de alimento animal;
• Medicina-Farmacêutica: Controle de taxa de colesterol sangüíneo, controle de
liberação de drogas, queimadura de pele e lentes de contato;
• Biotecnologia: Imobilização de enzimas, separação de proteínas, recuperação e.
imobilização de células e cromatografia;
• Agricultura: Cobertura de sementes e fertilizante;
• Cosméticos: Condicionador, cremes de face e mãos e loção de banho;
• Papel e Papelão: Tratamento de superfície;
• Membranas: Controle de permeabilidade e osmose reversa
Dentro do vasto campo da Biotecnologia, destacamos o uso da quitosana como suporte
para imobilizar enzimas. Encontram-se na literatura vários trabalhos, com diferentes enzimas:
Martino et al., (1996), após explorar diferentes suportes, otimizou a quitosana para
imobilizar β-Galactosidase e utilizá-la para o melhoramento de vinhos. O método de
imobilização foi adsorção, seguido de crosslinking com glutaraldeído e os resultados obtidos
foram rendimentos de imobilização entre 55 e 85% e aumento de estabilidade térmica de 5
vezes em relação a enzima livre a temperatura ambiente.
Spagna et.al., (1998), estudou a imobilização da enzima α-L-arabinofuranosidase em
quitosana por conjugação e crosslinking com glutaraldeído. Foram observados rendimentos de
imobilização de até 30% e ganhos de estabilidade de 4 vezes em relação a enzima livre a uma
temperatura de 57ºC.
48
Cetinus et al., (2000), imobilizou a enzima Catalase
®
em filme de quitosana ativado
com glutaraldeído e obteve a 5ºC um aumento de estabilidade térmica de apenas 1,4 vezes em
relação a enzima em sua forma solúvel.
Adriano et al., (2003), obtiveram ganhos de estabilidade da Penicilina G Acilase
imobilizada em pellets de quitosana ativados com glutaraldeído de cerca de 5 vezes em
relação a enzima livre em ensaios realizados a uma temperatura de 50ºC. Os rendimentos de
imobilização chegaram a 82%.
Gu et al., (2005) imobilizaram celulase em géis de quitosana obtendo um ganho na
estabilidade térmica de 1,7 vezes em relação à enzima livre em ensaios realizados a 65 ºC.
Para a mesma enzima e condições de ensaio, Martins et al., (2006), obtiveram valor para o
fator de estabilidade térmica de 1,9 vezes. Portanto, quando utilizaram híbridos de quitosana
com copolímeros (quitosana – alginato), o valor obtido para o fator de estabilidade térmica foi
de 2,9 com rendimento de imobilização de 55,8%.
Os exemplos citados sugerem que, apesar de estar sendo bastante explorada como
suportes para imobilizar enzimas, ainda não foram alcançados 100% de rendimento e não
foram atingidos altos valores de estabilização térmica. Apesar disso, é fundamental que se
continue com a exploração deste material e o aperfeiçoamento dos métodos de imobilização
de enzimas em quitosana, visto que é um material bastante barato.
49
Os exemplos descritos encontram-se resumidos na tabela 2.3, em que se destaca a
estabilização térmica.
Tabela 2.3: Estabilidade térmica de enzimas imobilizadas em suportes de quitosana.
Referência Enzima Método de Imobilização Temp. °C Ganho de estab.
em relação a E.
livre
Martino et al., 1996 β-Galactosidase Quitosana crosslinking
com glutaraldeído
25 5 vezes
Spagna et al., 1998 α-arabinofura-nosidase Quitosana conjugação
com glutaraldeído
57 4 vezes
Cetinus et al., 2000 Catalase Filme de quitosana
ativado com glutaraldeído
5 1,4 vezes
Adriano, 2003 Penicilina G Acilase Quitosana (pellets)
ativada com glutaraldeído
50 5 vezes
Gu et al, 2003 Celulase Gel de Quitosana ativada
com glutaraldeído
65 1,7 vezes
Martins et al, 2006 Celulase Gel de Quitosana ativada
com glutaraldeído
65 1,9 vezes
Martins et al, 2006 Celulase Gel de Quitosana ativada
com glutaraldeído
65 2,9 vezes
2.15 – Alginato de sódio
Alginato é um polímero amplamente usado para imobilização e tecnologias de
microencapsulação (Funduenanu et al., 1999; Velten et al., 1999). Alginato é um extrato de
alga composto por de cadeias alternadas de ácido α-L-gulurônico e resíduos ácidos de β-D-
manurônico (Sriamornsak, 1998). Suportes de alginato normalmente são feitos por
entrecruzamento do grupo carboxil do ácido α-L-gulurônico com uma solução catiônica
geleificante como cloreto de cálcio, cloreto de bário (Draget et al., 1997; Smidsrod et al.,
1990). O alginato de sódio, ou algina, é o carboidrato purificado extraído de vegetais
marítimos pelo uso de uma diluição alcalina. É extraído, sobretudo da alga
Macrocystispyrifera. A algina é encontrada em todas as espécies de sargaços (Classe
Phaeophyceae), e é possível fazer uso comercial de espécies de Ascophyllum, Emonia,
50
Laminaria e Nereocystis, entre outras. A Macrocystis pyrifera é colhida em várias zonas
temperadas do oceano Pacífico: nos Estados Unidos, a área do sul da Califórnia é a principal
produtora. A algina é constituída principalmente pelo sal sódico do ácido algínico, polímero
linear do ácido L-gulurônico e do ácido D-manurônico. Este último é o principal componente,
mas há alguma variação, dependendo a alga de origem (figura 2.15).
Figura 2.15: Estrutura química do alginato de sódio.
A molécula de ácido algínico é um copolímero de unidades de ácido
manopiranosilurônico com ligação (1,4), de unidades de ácido gulopiranosiltirônico com
ligação 1,4 e de segmentos em que esses ácidos urônicos se alternam com ligações 1,4. O
alginato de sódio ocorre como pó fino ou grosso quase inodoro e insípido, de cor branco-
amarelada. É bastante hidrossolúvel, formando uma solução coloidal viscosa. Trata-se de um
agente suspensor. É usado na indústria alimentícia, para cosméticos em suspensão, como
goma e como ligante e espessante em comprimidos. Os sais de vários cátions polivalentes e o
ácido algínico têm propriedades úteis para formação de géis. O alginato de sódio tem
aplicação na geleificação para vários fins como imobilização enzimática, formação de
membranas, encapsulação de drogas.
51
2.16 -Princípio de formação de hidrogéis de quitosana com diferentes
copolímeros
Hidrogéis são estruturas poliméricas tridimensionais, hidrofílicas, capazes de sorverem
grandes quantidades de água ou fluidos biológicos. Estas matrizes são insolúveis em água
devido à presença de pontos de reticulação químicos ou físicos (Berger et al., 2004). Este fato
se deve aos grupos ionizáveis presentes na estrutura dos biopolímeros como grupos amino,
carboxílicos e hidroxilas que possuem afinidade com a molécula de água. Os hidrogéis têm
uma vasta aplicação no campo biomédico e farmacêutico como sistemas de liberação
controlada de fármacos. Uma vez que os hidrogéis podem ser preparados com uma vasta
gama de tamanhos de poros eles podem ser utilizados tanto na liberação de fármacos de
pequeno peso molecular como, por exemplo, agentes antiinflamatórios, anti-sépticos e solutos
de elevado peso molecular, como proteínas, fatores de crescimento, entre outros (Kumar,
2000b). Os hidrogéis podem ser constituídos de um ou mais biopolímeros (Berger et al.,
2004).
De acordo com a literatura, a quitosana é um dos principais compostos empregados na
síntese de hidrogéis, como também alginato, carragenina, gelatina e outros (George e
Abraham, 2006). Os compósitos quitosana-copolímeros são formados com o objetivo de obter
hidrogéis mais versáteis, com diferentes estruturas química e física, o que pode melhorar sua
atuação em uma determinada aplicação. Uma outra importante aplicação dos hidrogéis é na
imobilização de enzimas para diversas aplicações, principalmente no desenvolvimento de
biossensores (Oliveira et al., 2006). Sua estrutura é mantida por interações iônicas ou
covalentes. As ligações iônicas são fortemente influenciadas pelo pH do meio reacional,
influenciando também na capacidade de retenção de água no hidrogel.
Alginato tem sido utilizado como veículo para a liberação de fármacos e proteínas,
juntamente com a quitosana, complexo quitosana-alginato (Tapia et al., 2004). O complexo
quitosana-alginato é formado por interações iônicas entre os grupos carboxílicos do alginato e
os grupos amino da quitosana (Tapia et al., 2004). O hidrogel formado sofre redução de
porosidade, reduzindo o tempo de liberação do fármaco encapsulado (Huguet et al., 1996). A
elevada solubilidade da quitosana é minimizada na presença de alginato, pois este
biopolímero é insoluvel em pH ácido e em pH alcalino é facilmente solubilizado, o que não é
52
observado para a quitosana. Deste modo, o complexo quitosana-alginato pode ser utilizado
em uma ampla faixa de pH (George e Abraham, 2006).
No intuito de aumentar a estabilidade química e física dos hidrogéis de quitosana e
quitosana-copolímeros, diversas alternativas têm sido utilizadas. Dentre elas, a modificação
química do hidrogel empregando agentes bifuncionais é a mais utilizada (Monteiro e Airoldi,
1999; Li e Bai, 2005; Oliveira et al., 2006; Altun e Etinus, 2007).
2.17 - Modificação química do suporte
A maioria das proteínas apresenta alguns resíduos de lisina os quais geralmente não
estão envolvidos no sítio ativo da enzima. Grupos amino são polares e estes ficam geralmente
expostos para o meio na superfície da proteína e, quando desprotonados, são muito reativos e,
mesmo sem prévia ativação, atuam como agente nucleofílico contra os átomos com carga
parcial positiva localizados na superfície do suporte.
O método de ativação do suporte mais adequado deve ser aquele que produza grupos
aldeídos moderadamente afastados do suporte para evitar impedimento estérico. A principal
vantagem de se utilizar grupos aldeídos deve-se à reversibilidade da ligação amino-aldeído,
que facilita a imobilização da enzima sem causar importantes distorções na estrutura protéica,
enquanto reagem reversivelmente com grupos amino da enzima (Pereira, 1996).
Esta modificação química, ou seja, ativação, objetiva aumentar a resistência mecânica,
alterar a hidrofibicidade, biocompatibilidade e estabilidade química tornando-a mais resistente
(Vieira, 2004). Para ativação de diversos suportes, vários agentes bifuncionais têm sido
utilizados.
O glutaraldeído é o dialdeído mais popular empregado para a ativação de suportes para
imobilizar enzimas (Guisán, 1988) e tem sido extensivamente citado como agente ativador de
matrizes para imobilização de enzimas e proteínas. Apesar de sua reação com grupos amino
primários para promover reticulação covalente ter sido explorada em várias circunstâncias, o
mecanismo preciso dessa reação e a estrutura dos componentes químicos formados não foram
ainda estudados em detalhe (Monteiro e Airoldi, 1999). Esses grupos podem reagir com
vários grupos laterais das proteínas, como hidroxila, carbonila, amino e sulfidrila (Arruda,
1999). Suas características são a alta reatividade dos grupos aldeídicos com aminas primárias
53
inclusive a pH inferiores ao dos grupos aminos da enzima. Estes grupos são capazes de
imobilizar proteínas através de bases de Schiff em uma larga faixa de condições (baixas
temperaturas e curto tempo de contato enzima-suporte), inclusive utilizando suportes com
baixo grau de ativação (Cardias, 1999). Entretanto, as moléculas de enzima podem ser
imobilizadas de tal maneira a distorcer o centro catalítico desta e tornando estes muitas vezes
inacessíveis ao acesso direto por moléculas de substrato grande. Múltiplas camadas de
proteína no interior dos poros dificultam o acesso do substrato ao interior do poro (Tardiolli
2003a). Outra característica é a produção de derivados com baixa estabilidade e alta restrição
difusional. A figura 2.16, mostra a ligação formada entre o grupo aldeído e o grupo amino da
quitosana.
Suportes contendo apenas grupos hidroxila, tais como agarose, não podem ser ativados
diretamente com glutaraldeido. Nesse caso ativação com epóxidos, glicidol ou epicloridrina,
seguida de oxidação com periodato, gerando grupos aldeído glioxil, é uma boa alternativa.
Outras possíveis ativações partindo-se do grupo aldeído glioxil são reação com etilenodiamina
para gerar grupos amino reativos com grupos ácidos da enzima, por exemplo, ou ainda, reação
desse grupo amino obtido com etilenodiamina com glutaraldeido e gerando assim novamente
grupo aldeído, mas com diferente distância do suporte e com a grande reatividade típica do
glutaraldeido.
- 1 H
2
O
+
glutaraldeído
Figura 2.16: Reação de ativação entre glutaraldeído e quitosana.
Quitosana - glutaraldeído
54
Suportes glioxil têm se mostrado bastante eficazes para imobilizações covalentes
multipontuais. Diversas enzimas vêm sendo estabilizadas por este método de ativação. Há
formação de grupos aldeídicos lineares que possibilitam a imobilização enzimática através da
formação de bases de Schiff (Blanco et al., 1988). Suportes ativados com glicidol e
epicloridrina não são capazes de promover imobilização de proteínas a pH neutro sendo
necessário um pH moderadamente alcalino cerca de 10,0. A pH alcalinos, a imobilização
acontece mais rapidamente devido à forte concentração de aminoácidos lisina não ionizados.
A ativação de suportes via epóxidos (glicidol e epicloridrina) de um modo geral se dá em duas
etapas: na primeira ocorre a eterificação do suporte com o epóxido, resultando em grupos
gliceril, e na segunda a oxidação com periodato de sódio, de onde resultam grupos aldeído, de
acordo com a figura 2.17.
Figura 2.17: Reação de ativação do gel utilizando glicidol .
R = OH (glicidol)
R = Cl (epicloridrina)
S-OH + CH
2
– CH – CH
2
R
Gel Epóxido
O
(NaOH + NaBH
4
)
CH
2
CH CH
2
O S
OH
OH
CH
2
CH CH
2
O S
OH
OH
(IO
-
4
)
H C CH
2
O S
+ H-CH
O
Glioxil Formaldeído
O
Gliceril
55
Mateo et al., (2005) descobriram a possibilidade do grupo glioxil permitir a
imobilização de proteínas mesmo em pH neutro, isto é, algum resíduo da molécula de enzima
pode estar exposto com significante reatividade.
Vieira (2004) utilizou quitosana ativada com glutaraldeído e epicloridrina para
adsorção de íons Hg
2+
de efluentes industriais e observou que conseguia uma melhor adsorção
ao se reticular a quitosana com glutaraldeído, mesmo para diferentes valores de pH.
Arruda (1999) estudou a adsorção de β-amilase em quitosana ativada com
glutaraldeído, concluindo ser um agente bifuncional de boa eficácia e fácil aplicação.
Tiller et al., (1999) ativou polímeros derivados de celulose com L-ácido ascórbico
para imobilização de enzimas como glicose oxidase, lactato oxidase e peroxidase observando
que esta reação de ativação pode ser utilizada para imobilização covalente de enzimas e
demais compostos aminados de alta e baixa massa molecular e este agente bifuncional
apresentou um derivado de melhor estabilidade em relação ao glutaraldeído.
Cardias et al., (1999) estudou a influência da concentração de glutaraldeído nos
parâmetros de imobilização da PGA em sílica, observando que esta variável afetava as taxas
de imobilização, bem como, a quantidade de proteína ligada covalentemente ao suporte.
Tardioli et al., (2002) prepararam vários derivados de alcalase sobre diferentes
suportes ativados com diferentes agentes bifuncionais como: glioxil-agarose, glutaraldeído-
agarose e brometo de cianogênio-agarose sendo o derivado ativado com glicidol (glioxil) mais
estável e com glutaraldeído, gerou o derivado menos estável em relação à enzima solúvel.
Eldin et al., (2000) estudaram a influência da concentração de glutaraldeído e do tempo
de ativação durante imobilização de PGA em partículas de nylon amino alquiladas e
observaram que um aumento na concentração de glutaraldeído aumentou a atividade
enzimática numa concentração máxima de 2,5%, diminuindo a atividade obtida fora dessa
faixa de concentração. Os autores não observaram nenhum efeito no tempo de ativação, no
intervalo de 1 a 3 horas. O pH da solução de glutaraldeído foi analisado numa faixa de 6,0 a
10,0, obtendo-se atividade máxima da enzima em pH 9,0.
Ichikawa et al., (2002) imobilizaram quitosanase em gel agar e observaram que a
concentração de glicidol utilizada influenciava na termoestabilidade da enzima imobilizada,
bem como, na percentagem de enzima imobilizada. Ao se ativar o suporte com concentrações
56
de 0,7 a 4,8 molar de glicidol, obtinha-se rendimento de 82%, contudo, em concentração de
glicidol de 0,25 molar, o rendimento diminuiu para 62,5%. Os autores concluíram que o
rendimento de imobilização era proporcional à quantidade de grupos aldeídos existentes no
suporte e que a partir de uma determinada concentração de glicidol, o rendimento do processo
não sofria alterações.
57
3 – MATERIAL E MÉTODO
3.1 – Materiais
3.1.1 - Enzimas
Foram utilizadas preparações de celulases de origem microbiana de Trichoderma
reesei gentilmente fornecidas pelas empresas Novozymes A/S, Denmark (Celluclast 1.5 L) e
Genencor (CG 220);
3.1.2 - Suportes e ativadores
Foram utilizados como suporte para a imobilização: quitosana 85% de desacetilação
adquirida da Polymar S. A. (Ceará, Brasil) e alginato de sódio, adquirido comercialmente da
Vetec (São Paulo, Brasil). Os agentes de ativação empregados foram glicidol (Sigma-
Aldrich), e glutaraldeído 25% (Vetec). Todos os outros reagentes utilizados foram de grau
analítico.
3.1.3 - Substratos
Foram utilizados como substratos para a dosagem da atividade hidrolítica da celulase,
Papel de filtro Whatman n°1 e bagaço de cana-de-açúcar previamente tratado com vapor sob
pressão.
3.2 - Metodologia experimental
3.2.1 - Metodologia de preparação dos géis de quitosana e quitosana – alginato
3.2.1.1 - Preparação das partículas de quitosana
Quitosana em pó foi dissolvida em ácido acético 5% (v/v) nas seguintes
concentrações: 1,0%; 2,5% e 5,0% (m/v). As soluções resultantes foram deixadas em
homogeneização por 10 minutos. Os sistemas solubilizado foram aspergidos em NaOH
58
100mM em uma razão de 1:10 (v/v) e deixado em repouso por 24h à temperatura ambiente.
Após este tempo, foram lavadas com água destilada até a neutralidade como pode ser
observado na figura 3.1.
Figura 3.1: Aparato utilizado para preparação das partículas de quitosana (Galvão, 2004).
3.2.1.2 - Preparação das partículas de quitosana - alginato
Quitosana em pó foi dissolvida em ácido acético 5% (v:v) e a esta solução foi
adicionado o alginato de sódio. A solução resultante foi deixada em homogeneização por 30
minutos. O sistema solubilizado foi aspergido em NaOH 100mM em uma razão 1:10 (v/v) e
deixado em repouso por 24h. Após este tempo, as partículas foram lavadas com água
destilada. Os seguintes suportes foram preparados: quitosana 1,0% - alginato 1,0 %; quitosana
2,5% - alginato 2,5%; quitosana 5,0% - alginato 5,0%; sendo todas as concentrações em
percentagem massa: volume. O aparato utilizado está representado na figura 3.1.
Dissolução
Biopolimero
Ác. Acético
5% (v/v)
Solução de
Quitosana
Filtração à Vácuo da
Solução de Quitosana
Bico
Disperso
Ar
Comprimido
Filtração/Lavagem em
Peneiras de Aço Inox
até neutralização
(NaOH ) 100 mM)
Estocagem a 4
o
C
Neutralização/Lavagem
sob vácuo
(NaOH 100 mM)
Solução
Coagulante
NaOH 100 mM
com Agitação
Magnética
59
3.3 Ativação dos suportes
3.3.1 - Ativação do suporte utilizando glutaraldeído
A ativação do suporte foi realizada com glutaraldeído 5% (v:v) em tampão fosfato
100mM, pH 7,0 por 1h a 25°C sob agitação branda (razão m
gel
: V
total
de 1:10). O glutaraldeído
funciona como agente ativante para facilitar a imobilização da enzima e para evitar a
dessorção da mesma. Depois da ativação, as partículas foram lavadas com excesso de tampão
fosfato 100mM pH 7,0 para retirar o excesso de glutaraldeído. A Figura 3.2, mostra a ligação
formada entre o grupo aldeído e o grupo amino da quitosana.
Figura 3.2: Quitosana ativada com glutaraldeído.
3.3.2 – Preparação do suporte quitosana – glioxil pré-ativados com glutaraldeído
O suporte já fora ativado com glutaraldeído como descrito no item 3.3.1. Este novo
suporte foi obtido por eterificação com glicidol e posterior oxidação com periodato de sódio.
Para cada grama de suporte adicionava-se 10mL de água destilada, 0,33mL de NaOH 1,7 M
contendo borohidreto de sódio 0,75M e 0,24 mL de glicidol em banho de gelo. A suspensão
era mantida sob agitação branda a temperatura ambiente por 24 horas e depois lavado em
excesso com água destilada e resuspenso em uma proporção de 1:10 (razão m
gel
: V
total
de
1:10) para posterior oxidação a glioxil. Para cada grama de suporte eram adicionados 2,0 mL
de uma solução de periodato de sódio 100mM e deixado em reação por 2 horas à temperatura
HOC
Quitosana
NH
2
HOC
HOC
- 1 H
2
O
N
C
Quitosana
H
+
(glutaraldeído)
60
ambiente. Oxidado o suporte, este era lavado e utilizado para posterior imobilização
enzimática.
3.3.3 – Preparação do suporte quitosana – glioxil - amino pré-ativados com
glutaraldeído
Gel quitosana-glioxil fora preparado conforme descrito no item 3.3.2. Ao gel foi
acrescentada solução de etilenodiamina 2M, pH 10. Suspensão essa, que foi mantida em
agitação por 2 horas em temperatura ambiente, e depois reduzida com NaBH
4
(5,71% da
massa inicial do gel) por mais duas horas. O gel foi lavado com 1L de solução tampão acetato
100mM a pH 4,0 para eliminação do borohidreto residual, em seguida, com tampão borato
100mM a pH 9,0 para o restabelecimento das cargas e, finalmente, com água destilada. Após
esse período, o gel foi lavado e usado imediatamente para imobilização de celulase.
3.4 - Imobilização covalente multipontual de celulase em matrizes de quitosana e
quitosana - alginato
Foram empregados como suportes, os géis de quitosana e quitosana alginato ativados
com glutaraldeído, glicidol e glicidol-amino para a imobilização da celulase. Foi utilizado um
carregamento de proteína de 10 mg por grama de gel. A imobilização da celulase foi realizada
em tampão fosfato 100mM, pH 7,0 (razão m
gel
:V
total
de 1:10). O gel foi lavado com água
destilada em abundância para a remoção de enzima residual e tampão até pH neutro. Após a
imobilização, foi quantificada no sobrenadante, a concentração de proteína e atividade
hidrolítica residual.
3.5 - Determinação da Atividade celulolítica
A atividade celulolítica das preparações enzimáticas foram determinadas pelo método
de hidrólise do papel, conforme metodologia de Mendels (Mendels et al., 1969). O substrato
foi preparado cortando-se papel de filtro Whatman n° 1 sob medida de 1,0 cm de largura x
6,0 cm comprimento. Os tubos foram incubados a 50°C por 60 min sob agitação. A liberação
de açúcar redutor foi quantificado pelo método DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico) (Miller,
61
1956). A unidade utilizada foi a FPU (Filter Paper Unit). Uma unidade FPU é dada pela
produção de um µmol de açúcar redutor por minuto nas condições descritas, conforme descito
na equação 3.1.
(3.1)
Sendo C
Ar
a concentração de açúcar redutor (g/L), V
R
o volume reacional (L), V
SE
o volume da solução
enzimática (mL), t
H
o tempo da hidrólise (min) e 5,5.10
3
, o fator para conversão em µmol de açúcar redutor.
3.6 - Determinação da concentração de proteína
O teor de proteína das amostras de preparações enzimáticas foi dosado pelo método de
Bradford (Bradford, 1976), baseado na ligação do corante Coomassie Brilliant Blue G-250 à
proteína. Este método foi o selecionado em função de não sofrer interferências significativas
de cátions e carboidratos, presentes em algumas das amostras de enzimas. Albumina bovina
cristalina (BSA) foi usada como padrão para construir a curva de calibração na faixa de 0,0 a
0,6 mg/mL.
3.7 - Caracterização das propriedades cinéticas da celulase livre e imobilizada
A cinética enzimática lida com os fatores que afetam a velocidade das reações
catalisadas por enzimas, nos quais os principais fatores são: concentração de enzima,
concentração de ligantes (substratos, inibidores e ativadores), pH, força iônica e
temperatura.Quando essas fatores são analisados apropriadamente, é possivel conhecer a
natureza da reação enzimática. Foram estudas a influência do pH, temperatura e estabilidade
térmica.
3
)/
(
10.5,5×
×
×
=
HSE
RAr
mLFPU
tV
VC
At
62
3.7.1 - Influência do pH
A atividade da celulase livre e imobilizada foi estudada utilizando-se a reação de
hidrólise do papel de filtro Whatman n° 1 na faixa de pH entre 2,0 a 8,0 com incremento de
1,0. Foi empregada a metodologia descrita no item 3.5 variando o pH do tampão na
temperatura de 50°C, conforme metodologia proposta por Mendels, 1969. Foram utilizados
tampão citrato 50mM na faixa de pH de 2,0 a 5,0 e tampão fosfato 50mM na faixa de pH de
7,0 a 8,0.
3.7.2 - Influência da temperatura
Foi verificada a influência da temperatura sobre a atividade da celulase livre e
imobilizada empregando a reação de hidrólise do papel de filtro Whatman n° 1, conforme
metodologia descrita no item 3.5, na faixa de temperatura entre 20 a 80 °C.
3.7.3 - Estabilidade térmica
Celulase livre e imobilizada foi suspensa em tampão citrato 50mM, pH 4,8. A
atividade enzimática no início foi denominada 100%. Tanto a solução de enzima livre quanto
os derivados imobilizados foram incubados a 65°C e em intervalos de tempo pré-
determinados, mediu-se a atividade enzimática, expressa como porcentagem da atividade
inicial. O modelo de desativação enzimática proposta por Sadana-Henley (Tardioli et al.,
2003 a) foi empregado para estimativa do tempo de meia-vida (t
1/2
). Fatores de estabilidade
(F
E
) foram obtidos como a razão entre o tempo de meia vida dos derivados e o tempo de meia
vida da celulase livre. A constante de desativação térmica foi calculada pela equação 3.2,
utilizando o método de ajuste exponencial não-linear de Sadana e Henley (1987).
αα
+−=
− tkd
eAR
.
.)1(
(3.2)
Em que: AR é a atividade relativa (A/A
0
); α é a razão entre a atividade enzimática do estado final (A) e a
atividade enzimática do estado inicial (A
0
); K
d
é a constante de inativação térmica de primeira ordem (h
-1
) e t é o
tempo de incubação da solução enzimática (h).
63
O tempo de meia-vida da enzima, definido como o tempo necessário para que ocorra uma
redução de 50% da atividade inicial, foi calculado pela equação 3.3.
)1(.
)5,0(ln
2/1
α
α
−
−
=
kd
t
(3.3)
Em que: t
1/2
é o tempo de meia-vida da enzima (h).
3.8 - Cálculo dos parâmetros de imobilização
3.8.1 - Cálculo do rendimento de imobilização
O rendimento de imobilização foi estimado com base na atividade enzimática
oferecida e a atividade enzimática presente no meio reacional após o processo de
imobilização, como mostrada na equação (3.4).
100.(%)
0
0
U
UU
RI
f
−
=
(3.4)
Em que: RI é a porcentagem de proteína imobilizada (%); U
0
é a atividade oferecida no início da imobilização
(FPU/g de gel) e U
f
é a atividade residual presente no sobrenadante após a imobilização (FPU/g de gel).
3.8.2 - Cálculo da atividade recuperada
O cálculo da atividade recuperada foi determinado pela relação entre a atividade
hidrolítica contida no gel e as atividades inicial e final presentes no sobrenadante, conforme
mostrada na equação 3.5.
100.(%)
0 f
gel
UU
U
AR
−
=
(3.5)
Em que: AR é a atividade recuperada (%); U
gel
é a atividade hidrolítica contida no gel (FPU/g de gel); U
o
é a
atividade oferecida no início da imobilização (FPU/g de gel) e U
f
é a atividade residual presente no sobrenadante
após a imobilização (FPU/g de gel).
64
3.8.3. Cálculo do fator de estabilidade
O fator de estabilidade (FE) foi calculado pela relação entre o tempo de meia-vida da
celulase imobilizada e a celulase livre, medidos a 65°C através da hidrólise do papel de filtro
Whatman n°1, como mostrado na equação 3.6.
livret
aimobilizadt
FE
2/1
2/1
=
(3.6)
Em que: FE é o fator de estabilidade; t
1/2
livre é o tempo de meia-vida para a Celulase livre e t
1/2
imobilizada é o
tempo de meia-vida para a celulase imobilizada.
3.9 – Avaliação do enlace enzima – suporte
O tipo de enlace enzima suporte (ligação covalente ou simplesmente adsorção física) foi
avaliado incubando-se os derivados em meio fortemente iônico (NaCl 200 mM) sob suave
agitação por 24 horas. Caso a enzima estivesse interagindo com o suporte por interações
iônicas, esta dessorveria ao passar do tempo. Com a formação de ligações de natureza
covalente entre enzima e suporte, a celulase permaneceria imobilizada nos suportes devido à
natureza irreversível destas ligações.
3.10 – Tratamento térmico do bagaço de cana-de-açúcar
O pré-tratamento por explosão a vapor é uma das técnicas mais viáveis de pré-
tratamento de biomassa para aumentar sua susceptibilidade à conversão biotecnológica. Na
parede celular das plantas, as fibras de celulose estão reticuladas em uma matriz
extremamente rígida, composta majoritariamente por hemicelulose e lignina. Portanto, para
hidrolisar a celulose e as hemicelulose, é preciso despolimerizar, solubilizar ou remover a
lignina presente nos materiais lignocelulósicos. Dos métodos de pré-tratamento, o processo de
explosão a vapor seguido de deslignificação alcalina, tem se revelado um dos mais
promissores para o fracionamento dos três constituintes principais da fitobiomassa,
paralelamente a um aumento significativo da susceptibilidade da celulose à sacarificação
enzimática (Ramos, 2003).
65
O tratamento foi conduzido medindo-se 100 g do bagaço de cana lavado e moído, que
foi autoclavado (121°C; 30 minutos) com 2L de solução de hidróxido de sódio a 4%. O
material recuperado após filtração foi neutralizado com ácido fosfórico a10% e seco em estufa
a 65°C. Ao bagaço obtido, foi adicionado a mesma quantidade de água destilada, autoclavado
em seguida a 121°C por 30 minutos. A suspensão foi filtrada e o material sólido seco a 65°C
até massa constante (Menezez E Aguiar, 2002).
3.11 – Ensaio de hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar utilizando celulase imobilizada
em híbridos de quitosana
Os ensaios de hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar com enzima livre e imobilizada
foram feitos em frascos adequados e incubados em tampão citrato 50mM, pH 4,8 a 50 °C. A
conversão da reação foi determinada através do método de DNS para quantificação dos
açúcares redutores ao longo do tempo. A conversão da hidrólise foi calculada de acordo com
a equação 3.7
X
100
521,0
% ×
×
×
=
Mb
VC
RAR
(3.7)
Em que: X é a conversão celulose em glicose; C
AR
é a concentração de açúcar redutor (g/L); V
R
é o volume
reacional (L); 0,521 fator de conversão; Mb é a massa do bagaço de cana-de-açúcar.
66
4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pretendeu-se nesta dissertação realizar a produção de derivados estabilizados de
celulase por imobilização covalente multipontual da enzima em quitosana e quitosana-
alginato utilizando glutaraldeído e glicidol como agentes ativantes. A seguir são apresentados
e discutidos os resultados obtidos e organizados dentro dos seguintes tópicos:
• Caracterização das enzimas livres estudadas;
•
Preparação dos suportes de quitosana e estudo dos parâmetros de imobilização;
•
Influência da adição de alginato de sódio e de diferentes condições de imobilização de
celulase em quitosana;
•
Influência dos métodos de ativação utilizando glutaraldeído e glicidol na imobilização
da celulase em híbridos de quitosana;
•
Influência da temperatura e do pH na atividade enzimática;
•
Performance do melhor derivado obtido na hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar.
67
4.1 - Caracterização das enzimas livres estudadas: Celluclast 1.5 L e Genencor (CG 200)
Para a caracterização das enzimas livres foram investigadas a atividade enzimática
(FPU/mL de extrato) e atividade específica (FPU/mg
de proteína
) bem como a influência da
temperatura e pH. Celulases comerciais de diferentes fornecedores: Celluclast 1.5 L da
Novozymes A/S, Denmark e Genencor (CG 200) foram estudadas. A tabela 4.1 fornece os
valores das atividades enzimáticas e específicas das respectivas enzimas analisadas.
Observa-se que os valores para a atividade enzimática e específica foram maiores para
a enzima CG 200, ou seja, esta possui maior quantidade de proteínas com atividade catalítica
e está mais pura em termos de proteína.
Quanto à estabilidade térmica a 65°C, a enzima CG 200 apresentou-se cerca de 5
vezes mais estável que a Celluclast 1.5 L, possivelmente devido à presença de agentes
estabilizantes que tornam a molécula protéica mais resistente. A tabela 4.2, fornece os valores
de meia-vida e fator de estabilidade para as enzimas livres. As figuras 4.1 e 4.2 mostram os
ajustes dos pontos experimentais segundo modelo de Sadana- Henly.
Tabela 42: Valores de meia-vida e fator de estabilidade térmica (65 °C) para as enzimas
comerciais utilizadas na forma livre.
Biocatalisador t
1/2
(min)
Kd α
Celluclast 1.5 L 18,9 0,0426 ± 0,0095
0,0306 ± 0,0613
CG 200 90,7 0,0077 ± 0,0003
0 ± 0
Tabela 4.1: Valores das atividades enzimática (FPU/mL
de extrato
) e específica (FPU/mg
de
proteína
) das enzimas livres, em pH 4,8 a 50°C em tampão citrato 50 mM por 1hora de
incubação (Mendels, 1969).
Enzima Atividade enzimática
FPU/mL
de extrato
Atividade Específica
FPU/mg
proteína
Celluclast 1.5 37,2 1,04
CG 200 68,8 1,12
68
4.2 – Influência do pH
A maioria das enzimas apresenta um valor de pH ótimo, no qual sua atividade é
máxima. Acima ou abaixo desse valor, a atividade é reduzida. O pH do meio determina as
cargas dos resíduos de aminoácidos que constituem enzima e a alteração dessas cargas pode
induzir alterações conformacionais nas moléculas do biocatalisador. Além disso os
aminoácidos que formam o sítio ativo precisam estar num estado iônico específico para
realizarem a catálise, o mesmo podendo ocorrer com os substratos, se ionizáveis, estado esse
que depende do pH do meio. A inter-relação da atividade enzimática com o pH, para
qualquer enzima, depende do comportamento ácido-básico do meio, natureza do substrato,
ponto isoelétrico, estado de pureza da enzima e força iônica (Gama, 2003). Os resultados
apresentados na figura 4.3 e 4.4 mostram que as celulases apresentaram valores de pH ótimos
em meio ácido .
0 50 100 150 200 250 300
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Atividade Relativa
Tempo (minutos)
0 50 100 150 200 250
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Atividade Relativa
Tempo (minutos)
Figura 4.1: Inativação térmica da Celluclast 1,5
L a 65°C e pH 4,8. A curva foi obtida ajustando
o modelo de Sadana-Henley aos pontos
experimentais obtidos.
Figura 4.2: Inativação térmica da CG 200 a 65°C
e pH 4,8. A curva foi obtida ajustando o modelo
de Sadana-Henley aos pontos experimentais
obtidos.
69
Pode-se observar que para a enzima Celluclast a melhore atividade relativa ocorreu
próxima do pH 4,8 e para a GC200 a pH 4,0. Resultados semelhantes são encontrados na
literatura, Villalonga et al (2001) encontraram a máxima atividade em pH 3,0. Gu et al (2005)
obtiveram o maior valor da atividade relativa em pH próximo a 4,5.
2345678
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Atividade Realativa
pH
2345678
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Atividade Relativa
pH
Figura 4.3: Influência do pH na atividade
hidrolítica da celulase livre (Celluclast 1,5 L).
Figura 4.4: Influência do pH na atividade
hidrolítica da celulase livre (CG 200).
4.3 – Influência da temperatura
A atividade hidrolítica da celulase em função da temperatura é demonstrada nas figuras 4.5 e
4.6 que mostra o comportamento da enzima em pH 4,8 em todas as temperaturas avaliadas.
Pode-se observar pelos valores de atividade relativa que a enzima livre atua bem em
temperatura de aproximadamente 55°C. Entretanto a 70°C, a enzima perdeu 60% da sua
capacidade hidrolítica, demonstrando que temperaturas acima de 60°C não são recomendáveis
para a atuação da celulase.
70
20 30 40 50 60 70 80
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Atividade Relativa
Temperatura C
20 30 40 50 60 70 80
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Atividade Relativa
Temperatura C
Figura 4.5: Influência da temperatura na
atividade hidrolítica da celulase livre
(Celluclast 1,5 L).
Figura 4.6: Influência da temperatura na atividade
hidrolítica dos derivados livre (CG 200).
4.4 - Preparação dos suportes de quitosana e estudo dos parâmetros de imobilização
Foram preparados dois diferentes tipos de derivados utilizando as duas preparações
enzimáticas aqui analisadas. A tabela 4.3 apresenta os parâmetros de imobilização para estes
derivados de celulase obtidos. Pode-se observar que para a Celluclast 1,5 L, o derivado
apresentou 37,3% de rendimento de imobilização com 35,9% de atividade recuperada sendo
1,9 vezes mais estável que a enzima solúvel. Valores semelhantes foram obtidos para CG 200.
Entretanto, quanto ao tempo de meia-vida, este se apresentou 2 vezes menor quando
comparado à primeira enzima. Essa diminuição deve ter sido devido à presença de
estabilizantes existentes na composição do consórcio enzimático CG 200 que não foram
imobilizados no suporte. Uma alternativa seria dialisar a enzima para eliminar esses
estabilizantes e se poder estudar a possível estabilização obtida pela imobilização da enzima.
Contudo, purificar celulase não é trivial (as membranas comerciais são de celulose) e como
não era esse o objetivo deste trabalho decidiu-se continuar a pesquisa com a Celluclast 1.5L
nos demais ensaios ao decorrer deste trabalho. As figuras 4.7 e 4.8 mostram o comportamento
da inativação pelo modelo de Sadana-Henley.
71
4.5 - Influência da adição de alginato de sódio e de diferentes condições de imobilização
de celulase em quitosana
Tabela 4.3: Parâmetros de imobilização de celulase em quitosana 2,5% pH 7,0 a 27°C em
suportes ativados com glutaraldeído 2,5% v/v com carga enzimática de 10 mg de proteína/g de
gel.
Biocatalisador R
I
(%) A
R
(%) t
1/2
(min)
F
E
Com Celluclast 1.5 L 37,3 35,9 35,7 1,9
Com CG 200 33,7 37,6 17,2 0,2
0 50 100 150 200 250 300
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Atividade Relativa
Tempo (minutos)
0 50 100 150 200 250
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Atividade Realtiva
Tempo (min)
Figura 4.7: Inativação térmica do derivado de
celulase (Celluclast 1,5 L) a 65°C e pH 4,8. A
curva foi obtida ajustando o modelo de
Sadana-Henley aos pontos experimentais
obtidos.
Figura 4.8: Inativação térmica do derivado de
celulase (CG 200) a 65°C e pH 4,8. A curva foi
obtida ajustando o modelo de Sadana-Henley aos
pontos experimentais obtidos.
72
Foram preparados dois tipos de suporte para posterior ativação com glutaraldeído e
duas temperaturas de imobilização foram propostas (4°C e 27°C) a pH 7,0.
A tabela 4.4, apresenta os parâmetros de imobilização para estes derivados de celulase
obtidos em temperatura de imobilização de 4°C. Pode-se observar que o melhor resultado
apresentou 54,8% de rendimento de imobilização com 39,7% de atividade recuperada. Na
tabela 4.5, observa-se que o melhor resultado apresentou 55,8% de rendimento de
imobilização com 39,1% de atividade recuperada.
A quitosana interage formando pontes de hidrogênio com alginato. Essa interação
dificulta o entrecruzamento entre grupos amino da quitosana e glutaraldeído, funcionando o
alginato como uma espécie inerte e diminuindo a grande e incontrolável reatividade do agente
ativador. A presença desse polímero deve assim melhorar as condições intra-partícula para
interação entre enzima e suporte ativado, aumentando a porosidade do suporte. A temperatura
de imobilização não afetou o rendimento, isso se deve a alta reatividade do glutaraldeído
mesmo em baixas temperaturas em longo tempo de incubação. O glutaraldeído também
permite a imobilização de proteínas mesmo em pH neutro, isto é, algum resíduo da molécula
de enzima pode estar exposto com significante reatividade (Mateo et al. 2005). Vale ressaltar
Tabela 4.4: Parâmetros de imobilização de celulase em pH 7,0 a 4°C em suportes ativados
com glutaraldeído com carga enzimática de 10 mg de enzima.g
-1
de gel.
Suporte R
I
(%) A
R
(%)
Quitosana 1,0% 48,4 45,0
Quitosana 2,5% - alginato 2,5% 54,8 39,7
Tabela 4.5: Parâmetros de imobilização de celulase em pH 7,0 a 27°C em suportes ativados
com glutaraldeído com carga enzimática de 10 mg de enzima.g
-1
de gel.
Suporte R
I
(%) A
R
(%)
Quitosana 1,0% 53,7 35,5
Quitosana 2,5% - alginato 2,5% 55,8 39,1
73
que os valores de rendimentos de imobilização foram baixos para o suporte de quitosana em
comparação aos híbridos, devido à concentração no preparo dos géis. Suportes com maiores
quantidades de grupos funcionais estarão propensos a um maior grau de ativação,
conseqüentemente mais moléculas de proteína serão imobilizadas. Esses são, portanto
resultados iniciais que poderão assim ainda ser otimizados. Observa-se na tabela 4.6 que o
derivado quitosana-alginato foi o melhor, com valores de F
E
de 2,9 vezes a mais em relação à
enzima livre quando imobilizada a 27°C.
Tabela 4.6: Valores de meia-vida e fator de estabilidade (65 °C) para os suportes ativados
com glutaraldeído com carga enzimática de 10 mg de enzima.g
-1
de gel e enzima livre.
Biocatalisador
Temperatura de
imobilização (°C)
t
1/2
(min)
F
E
Enzima Livre - 18,9 1,0
Quitosana 2,5% - alginato 2,5% 4°C 40,4 2,1
Quitosana 2,5% - alginato 2,5% 27°C 53,7 2,9
Quitosana 1% 4°C 32,1 1,7
Quitosana 1% 27°C 35,7 1,9
Observa-se também que as estabilidades térmicas para os derivados com quitosana
foram baixas em relação aos compósitos de alginato conforme as figuras 4.9 e 4.10 as quais
apresentaram um bom ajuste do modelo de Sadana-Henley aos pontos experimentais obtidos.
Essa baixa estabilidade pode ser devido à protonação dos grupos amino da quitosana em pH
ácido de hidrólise (pH 4,8), somando com a temperatura elevada, fazendo com que o gel de
quitosana fosse dissolvido nestas condições drásticas de pH e temperatura (Fávere et al,
2006). Com os compósitos (quitosana-alginato), a interação entre os polímeros permitiu que
houvesse mais enlaces e mais poros que serviram como uma malha que favoreceu a
estabilização da enzima, bem como, tornou o suporte mais resistente a altas temperaturas e
pH
. Quanto ao aumento da estabilidade dos derivados imobilizados a 27°C comparados a 4°C
é devido ao aumento de ligações multipontuais formadas entre enzima-suporte (Berger et al.,
2005).
74
Figuras 4.9: Estabilidade térmica a 65 °C para as celulase livre e imobilizada ativados com glutaraldeído a 4 °C
(A), (▲) enzima livre, (■) enzima imobilizada em quitosana 2,5% – alginato 2,5%, (●) enzima imobilizada em
quitosana 2,5%. Figuras 4.10: Estabilidade térmica a 65 °C para as celulase livre e imobilizada ativados com
glutaraldeído a 27 °C (B), (▲) enzima livre, (■) enzima imobilizada em quitosana 2,5% – alginato 2,5%, (●)
enzima imobilizada em quitosana 2,5%.
De acordo com a tabela 4.7, pode-se observar que os melhores valores para o
rendimento de imobilização, atividade recuperada e estabilidade térmica foram durante a
imobilização em pH 7,0 a 27°C. Isso pode ser devido à alta reatividade do glutaraldeído em
pH neutro/básico, bem como a desprotonação de alguns aminoácidos da proteína que
favorecem a formação de bases de Schiff fazendo que haja maior rendimento de imobilização
e estabilidade do derivado.
Por outro lado, em pH 4,8 há uma possível protonação de resíduos proteícos e a
diminuição da reatividade do agente ativante desfavorecendo assim a formação de ligações
covalentes e consequentemente uma diminuição na estabilidade do derivado
0 50 100 150 200 250 300
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Atividade Relativa
Tempo (minutos)
0 50 100 150 200 250 300
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Atividade Relativa
Tempo (minutos)
(A) (B)
75
Tabela 4.7 Influencia do pH durante imobilização da celulase ativada com glutaraldeído 2,5%
v/v a 27°C com carga enzimática de 10mg de proteína /g de gel.
pH de imobilização (7,0) pH de imobilização (4,8)
Suporte
R
I
(%) A
R
(%) F
E
R
I
(%) A
R
(%) F
E
Quitosana 2,5 % 49,2 33,5 1,3 34,2 29,5 1,8
Quitosana 2,5%-Alginato 2,5 % 42,2 46,3 5,5 36,5 31,4 2,1
4.6 - Influência dos métodos de ativação na imobilização da celulase em híbridos de
quitosana
4.6.1 – Ativados com glutaraldeído:
Com base nos ensaios anteriores foram preparados dois suportes para posterior
ativação com glutaraldeído e esses derivados foram caracterizados quanto ao rendimento de
imobilização R
I
(%), atividade recuperada A
R
(%) e fator de estabilidade (F
E
). A tabela 4.8
apresenta os resultados obtidos para estes derivados de celulase.
Pode-se observar que o melhor derivado foi o híbrido de quitosana 2,5% - alginato
2,5% que apresentou 42,2 % de rendimento de imobilização com 46,3% de atividade
recuperada sendo 5,5 vezes mais estável que a enzima livre. Observa-se uma melhora no
resultado quando comparado aos valores obtidos na tabela 4.8, mostrando que a concentração
de quitosana disponibilizou mais sítios de imobilização permitindo uma melhor congruência
Tabela 4.8: Caracterização dos derivados de celulase imobilizada a 27°C e pH 7,0 usando
diferentes suportes com carga enzimática de 10 mg de proteína/g de gel.
Suporte R
I
(%) A
R
(%) F
E
Quitosana 2,5% 49,2 33,5 1,3
Quitosana 2,5% – Alginato 2,5 %
42,2 46,3 5,5
76
geométrica entre enzima e suporte, bem como tornando mais fortes as interações entre os
polímeros. As figuras 4.11 e 4.12 apresentam o ajuste da inativação térmica pelo modelo de
Sadana-Henley.
4.6.2 – Ativados com glicidol:
Para as ativações com glicidol, foram experimentados somente dois suportes cuja de acordo
com a tabela 4.9. Pode-se observar que o melhor derivado obtido foi quitosana 2,5% –
alginato 2,5 %. Ao se utilizar o glicidol, houve um processo de formação de interações
enzima-suporte mais lento e ordenado de modo a formar mais ligações multipontuais. Ao
aumentar o número de enlaces favorece uma maior estabilização da enzima (Cardias et al.,
1999).
-100 0 100 200 300 400 500 600 700 800
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Atividade Relativa
Tempo (minutos)
-100 0 100 200 300 400 500 600 700 800
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Atividade Relativa
Tempo (minutos)
Figura 4.11: Inativação térmica do derivado de
celulase em quitosana 2,5% a 65°C e pH 4,8
ativados com glutaraldeído. A curva foi obtida
ajustando o modelo de Sadana-Henley aos
pontos experimentais obtidos.
Figura 4.12: Inativação térmica do derivado de
celulase em quitosana 2,5% - alginato 2,5% a
65°C e pH 4,8 ativados com glutaraldeído. A
curva foi obtida ajustando o modelo de Sadana-
Henley aos pontos experimentais obtidos.
77
Tabela 4.9: Caracterização dos derivados de celulase imobilizada a 27°C e pH 7,0 usando
diferentes suportes com carga enzimática de 10 mg de proteína/g de gel ativado com
glicidol.
Suporte R
I
(%) A
R
(%) F
E
Quitosana 2,5%
25,8 ± 7,9 62,0 ± 10,0 13,6 ± 3,1
Quitosana 2,5% – Alginato 2,5 %
40,6 ± 8,0 56,3 ± 5,5 11,2 ± 0,6
Nota-se um bom ajuste pelo modelo de Sadana-Henley dos pontos experimentais dos
obtidos (figuras 4.13 e 4.14).
-100 0 100 200 300 400 500 600 700 800
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Atividade Relativa
Tempo (minutos)
-100 0 100 200 300 400 500 600 700 800
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Atividade Relativa
Tempo (minutos)
Figura 4.13: Inativação térmica do derivado de
celulase em quitosana 2,5% a 65°C e pH 4,8
ativados com glicidol. A curva foi obtida
ajustando o modelo de Sadana-Henley aos
pontos experimentais obtidos.
Figura 4.14: Inativação térmica do derivado de
celulase em quitosana 2,5% - alginato 2,5% a
65°C e pH 4,8 ativados com glicidol. A curva foi
obtida ajustando o modelo de Sadana-Henley aos
pontos experimentais obtidos.
78
4.6.3 – Ativados com glicidol-amino:
As ativações com glicidol – amino apresentaram bons valores, observando a tabela 4.10, o
melhor resultado para os parâmetros de imobilização foi o derivado hibrido de quitosana 2,5%
- alginato 2,5%. Esse incremento nos parâmetros pode ser devido aos grupos aminos
provenientes da ativação com glicidol - amino, favorecendo uma conformação geométrica
mais estável ao sítio ativo da enzima e consequentemente mais ligações multipontuais se
formaram entre os copolímeros.
Tabela 4.10: Caracterização dos derivados de celulase imobilizada a 27°C e pH 7,0 usando
diferentes suportes com carga enzimática de 10 mg de proteína/g de gel ativado com
glicidol-amino.
Suporte R
I
(%) A
R
(%) F
E
Quitosana 2,5% 36,5 ± 10,0 53,0 ± 10,0 8,7 ± 0,5
Quitosana 2,5 %- Alginato 2,5 % 39,7 ± 2,3
42,5 ± 3,0 12,7 ± 1,0
As figuras 4.15 e 4.16 apresentam os ajustes da estabilidade térmica de acordo com
Sadana Henley.
79
4.7 - Influência da temperatura e do pH na atividade enzimática dos derivados
imobilizados em gel de quitosana
Nas figuras 4.17 e 4.18 apresentam as atividades enzimáticas relativas das enzimas
livres e imobilizadas (gel de quitosana 2,5%) em função do pH e temperatura do meio.
Observa-se que a partir de 70°C, a enzima perdeu boa parte da sua capacidade
hidrolítica, demonstrando que temperaturas acima de 60°C não são recomendáveis para a
atuação da celulase imobilizada. Gu et al., (2005) também obteve valor máximo da atividade
relativa a 60°C para derivados imobilizados de celulase. Observamos um acréscimo no valor
da temperatura e um decréscimo no valor do pH para os derivados em suas máximas
atividades, isso acontece devido às modificações conformacionais nas moléculas do
biocatalisador devido aos efeitos causados pela imobilização (Vitolo, 2001; Gama, 2003).
Pode-se observar que para a enzima livre a maior atividade relativa da enzima livre
ocorreu próxima do pH 4,5 e para o derivado imobilizado próximo de pH 3,5. Resultados
semelhantes são encontrados na literatura, Villalonga (2001) encontraram a máxima atividade
em pH 3,0. Gu et al (2005) obtiveram o maior valor da atividade relativa em pH próximo ao
4,5.
-100 0 100 200 300 400 500 600 700 800
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Atividade Relativa
Tempo (minutos)
-100 0 100 200 300 400 500 600 700 800
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Atividade Relativa
Tempo (minutos)
Figura 4.15: Inativação térmica do derivado de
celulase em quitosana 2,5% a 65°C e pH 4,8
ativados com glicidol-amino. A curva foi
obtida ajustando o modelo de Sadana-Henley
aos pontos experimentais obtidos.
Figura 4.16: Inativação térmica do derivado de
celulase em quitosana 2,5% - alginato 2,5% a
65°C e pH 4,8 ativados com glicidol-amino. A
curva foi obtida ajustando o modelo de Sadana-
Henley aos pontos experimentais obtidos.
80
Figura 4.17 Influência do pH na atividade enzimática: (A), (■) enzima livre, enzima imobilizada (●). Figura
4.18: Influência da temperatura na atividade enzimática (B), (■) enzima livre, enzima imobilizada (●).
4.8 - Testes de Dessorção Enzimática
Depois de finalizada a reação de imobilização, os derivados de celulase foram
submetidos a testes de dessorção, com longos períodos de lavagem com tampão fosfato de
sódio 0,2M ou com longos tempos de incubação e agitação em solução salina de 0,2 e 0,4M.
O teste de dessorção tem por finalidade a eliminação de toda enzima eventualmente apenas
adsorvida no suporte, que não tenha estabelecido ligação com os grupos reativos deste. Com
altas cargas iônicas presentes na solução de lavagem, moléculas de enzima soltas migrariam
para a solução, dessorvendo do suporte.
Nenhuma atividade foi detectada nas soluções de lavagem dos derivados, o que indica
que a enzima efetivamente ligou-se ao suporte covalentemente.
2345678
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Atividade Realativa
pH
20 30 40 50 60 70 80
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Atividade Relativa
Temperatura C
(A) (B)
81
4.9 – Hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar
Os resultados apresentados na figura 4.19 mostram os perfis de conversão em função
do tempo de hidrólise para enzima livre e imobilizada em híbridos de quitosana-alginato
ativado com glicidol. Nota-se que a enzima livre apresentou velocidade de reação maior no
início, conduzindo a maior conversão quando comparada ao derivado até pouco mais de dois
dias de reação. Esse comportamento é devido à ausência de efeitos difusionais na reação
catalisada pela enzima solúvel, isso pode ser percebido pelo rápido aumento na conversão e
depois na redução da velocidade da reação. Já para o derivado obtido a conversão foi mais
lenta no início do processo devido ao problema de difusão e talvez ao fenômeno de
impedimento estérico do substrato. Assim sendo a enzima deve ter sido imobilizada de uma
maneira que dificultou o acesso do substrato ao centro catalítico. È importante ressaltar,
contudo, que apesar da maior conversão no início, à enzima livre conduz a menor conversão
final, devido a sua menor estabilidade operacional, pois sua estabilidade térmica
aproximadamente 12 vezes menor que o biocatalisador. Assim, com o passar das horas a
enzima livre vai inativando enquanto que a imobilizada permanece ativa. A figura 5 e a
Tabela 4.11 mostram os valores para as conversões da enzima livre e imobilizada
durante oito dias de processo em batelada sob agitação e temperatura controlada de 50 °C e
pH 4,8 (tampão citrato 50 mM).
82
02468
0
20
40
60
80
Conversão %
Tem po (dias)
Figura 4.19. Conversão do bagaço da cana-de-açúcar (60 °C e pH 4,8), enzima solúvel a 350 mg/L (■); enzima
solúvel a 700 mg/L ( ●); enzima imobilizada em quitosana 2,5%-alginato 2,5% ativados com glicidol (1,7 mg de
proteína/ grama de gel) (▲).
Tabela 4.11: Conversão do bagaço de cana-de-açúcar a pH 4.8 a 50 °C.
Conversão enzimática (%) do bagaço de cana-de-açúcar
Tempo (horas)
Enzima livre
(350 mg/L)
Enzima livre
(700mg/L)
Enzima imobilizada
(1,7 mg de proteína/g de gel)
0 0 0 0
24 23,39 29,76 20,56
48 29,10 34,88 29,67
72 33,10 36,58 39,18
96 34,88 39,03 48,67
120 36,51 42,89 53,64
144 38,07 44,07 60,61
168 38,22 45,41 66,92
192 38,88 45,85 70,02
83
6 – CONCLUSÃO E SUGESTÃO
6.1 – Conclusões
Em geral, a celulase imobilizada em quitosana e quitosana-alginato ativada com
glutaraldeído mostram vantagens significantes quando comparadas à enzima livre. Os
resultados obtidos permitiram verificar que há uma influência positiva na adição de
copolímeros e de diferentes métodos de ativação no protocolo de imobilização de celulase em
quitosana. Para géis ativados com glutaraldeído, o compósito quitosana-alginato apresentou
melhores resultados com rendimento de imobilização de 42,2%, atividade recuperada de
46,3% , estabilidade térmica de 5,5 vezes em relação à enzima solúvel a 65°C enquanto para o
glicidol, com rendimento de imobilização de 40,6%, atividade recuperada de 56,3% e
estabilidade térmica de 11,2 vezes em relação à enzima solúvel a 55°C.
As estabilidades térmicas das enzimas imobilizadas foram melhores que a obtida para
enzima livre, os resultados foram superiores ao obtido por Gu et al. (2005) que obteve um
aumento de 1,7. Villalonga et al. (2001), obtiveram um valor de F
E
de 1,5. Embora os valores
de estabilidade térmica e atividade enzimática sejam baixos em comparação com as demais
enzimas reportadas na literatura, para a celulase os valores são considerados satisfatórios. Gu
et al. (2005) citam que a celulase possui baixa atividade em relação à amilase, portanto
estudos são realizados para se obter um acréscimo na utilização da enzima em processo
industrial.
A conversão da hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar utilizando o derivado de
celulase mostrou ser promissor no desenvolvimento de um processo industrial, os resultados
mostraram uma conversão de 1,8 vezes em relação à enzima livre, viabilizando um custo mais
acessível em bioprocessos industriais para hidrólise de produtos lignocelulósicos.
Trata-se de um suporte de fácil obtenção e o processo de imobilização é simples, tornam-se
estes biocatalisadores promissores na aplicação e desenvolvimento de processos industriais
envolvendo a biocatálise de materiais celulolíticos e estimula a continuidade dos estudos
visando sua otimização.
84
6.2 – Sugestões
Como continuidade deste trabalho, pode-se sugerir:
•
Desenvolver novos protocolos de imobilização em busca de se melhorar os parâmetros
de imobilização e capazes de reduzir as limitações difusivas;
•
Pesquisar as atividades enzimáticas entre as celulases em relação aos específicos
substratos: carboximetilcelulose, avicel, celobiose;
•
Otimização dos protocolos de imobilização utilizados neste trabalho;
•
Realizar modelagem matemática da cinética de hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar
catalisada por celulase imobilizada em quitosana e quitosana-alginato.
85
REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA
ADRIANO, W.S.; FILHO, E.H.C.; SILVA, J.A.; GONÇALVES, L.R.B. Stabilization of
penicillin g acylase by immobilization on glutaraldehyde-activated chitosan.
Brazilian
Journal of Chemical Engineering v.22, p.529-538, 2005.
ADSUL M.G., GHULE J.E., SINGH R., SHAIK H., BASTAWDE K.B., GOKHALE D.V.,
VARMA A.J. Polysaccharides from bagasse: applications in cellulase and xylanase
production.
Carbohydrate Polymers. 57, 67-72, 2004.
AGBLEVOR, F.A. JOST. WEBER. Microbubble fermentation of Trichoderma reesei for
cellulase prodution.
Process Biochesmistry, v. 40. p. 669-679. 2004
ALTUN, G. D.; ETINUS, S. A. (2007). Immobilization of pepsin on chitosan beads. Food
Chemistry, v. 100, p. 964–971
AMOCO, B.P. Statistical
Review of World Energy, 1999.
ARROYO, M. (1998). Inmovilización de enzimas. Fundamentos, métodos y aplicaciones.
Ars
Pharmaceutica, v. 39, n. 2, p. 23-29.
ARRUDA, E.J. Concentração e Purificação de β-amilase de Extrato de Soja por Adsorção em
Gel de Afinidade Quitosana-fenilboronato.1999.
Tese (Doutorado – Engenharia
Química) Faculdade de Engenharia Química, UNICAMP, Campinas, 1999.
AYUAB. A.Z. et al. Cellulase an Xylanase production by isolated amazon bacillus strains
using soybean industrial residue based solid-state cultivation.
Brazilian Journal of
Microbiology.
v. 33.p. 231-218. de 2002.
BASTIDA, A.; FERNÁNDEZ-LAFUENTE, R.; FERNÁNDEZ-LORENTE, G.; GUISÁN, J.
M.; PAGANI, G.; TERRINI, M. (1999). Regioselective hydrolysis of peracetylated α-
D-glucopyranose catalyzed by immobilized lipases in aqueous medium. A facile
preparation of useful intermediates for oligosaccharide synthesis.
Bioorganic &
Medicinal Chemistry Letters, v. 9, n. 4, p. 633-636.
BÉLGUIN, P. Molecular biology of cellulase degradation.
Annual Rewien of Microbiology,
v. 44. p. 219-248, 1990
BENAR, P.
Tese de Doutorado – Instituto de Química - UNICAMP, Campinas, 1996.
86
BERGER, J.; REIST, M.; MAYER, J. M.; FELT, O.; PEPPAS, N. A.; GURNY, R. (2004).
Structure and interactions in covalently and ionically crosslinked chitosan hydrogels
for biomedical applications.
European Journal of Pharmaceutics and
Biopharmaceutics, v. 57, p. 19-34.
BICKERSTAFF, G. Immobilization of Enzymes and Cells –
Some Practical Considerations,
Methods in Biotechnology 1995, pp.1-9
BLANCO, R. E GUISÁN, J.M. Protecting effect of competitive inhibitors during very intense
insolubilized enzyme – activated support multipoint attachments: trypsin (amine)-
agarose (aldehyde) system,
Enzyme Microb. Technol. 10, pp. 227-232, 1988.
BLANCO, R.; CALVETE, J.; E GUISÁN, J.M. Immobilization – Stabilization of Enzymes -
Variables that control the intensity of trypsin (amine)-agarose (aldehyde) multipoint
attachment,
Enzyme Microb. Technol. 11, pp. 353-359, 1989.
BOFO, et al: Comparação da eficiência de imobilização das leveduras Saccharomyces
cerevisiae CB-IX (osmotolerante) e S. cerevisiae ATCC 9763, em bagaço de cana-de-
açúcar.
Braz. J. Food Technol., 5º SIPAL, março, 2005 121 - 124
BRAUN, J.; CHANU, P.L. E GOFFIC, F.L. The immobilization of Penicillin G Acylase on
Chitosan,
Biotechnology and Bioengineering 33, pp. 242-246, 1989.
BRADFORD, M.M. Rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of
protein utilizing principle of protein-dye binding.
Analytical Biochemistry v.72 (1-2),
p.248-254, 1976.
CAMPBELL, C. J.; Laherrére,
J. H.; Sci. Am., Março 1998, 60.
CARDIAS, H.C.T.; GRININGER, C.C.; TREVISAN, H.C.; GUISAN, J.M. e GIORDANO,
R.L.C. Influence of Activation on the Multipoint Immobilization of Penicillin G
Acylase on Macroporous Silica.
Brazilian Journal of Chemical Engineering. v.16, p.
141-148, 1999.
CETINUS, S.A e ÖZTOP, H.N. Immobilization of Catalase on Chitosan Film.
Enzyme and
Microbial Technology, v.26, p.497-501, 2000.
87
CHIBATA, I., TOSA,T., SATO., T., MORI, T. Prodution of L-aminoacids by
aminoacilacylase adsorbed on DEAE-Sephadex. In: MOSBACH, K.
Methods in
enzymoly: immobilized enzyme. New York , Academic Press, 1976.p.746-759.v.44.
COELHO, M. Z.; LEITE, S. G, F.; ROSA, M, F.; Furtado. Aproveitamento de resíduos
agroindustriais: Produção de enzimas a partir da casca de coco verde.
CEPP v.19, n1,
p.33- 42, 2001.
COMPET – Petrobrás;
Balanço Energético Nacional – MME, julho 1999.
CORTEZ, L. A. B.; LORA, E. S.; Tecnologia de Conversão de Biomassa, Universidade do
Amazonas – EFEI, Manaus, 1997.
COSTA, J. L. M.;
Tese de Doutorado – Instituto de Química - UNICAMP, Campinas, 1989.
DELLACHERIE, E.; HUGUET, M, Calcium-alginate beads coated with chitosan: effect of
structure of encapsulamented materials on theirs release.
Process Biochemistry v.
31(8), p.745-751, 1996.
DESAI, P. D.; DAVE, A. M.; DEVI, S. (2006). Alcoholysis of salicornia oil using free and
covalently bound lipase onto chitosan beads.
Food Chemistry, v. 95, p. 193-199.
DIENES.,D. Treatment of recycled fiber with Trichoderma cellulases.
Industrial Crosps And
Products an International Journal.v.20.p. 11-21 2003.
DWIVEDI, B. K. Sorbitol and Mannitol In:
Alternative Sweeteners, L. O. Nabors & R.C.
Gelardi (eds), MarcelDekker, 2nd. ed, New York, 1991.
DRAGET, K.I.; SKJAK-BRAEK, G.; SMIDSROD O. Alginate based new materials.
International Journal Biological Macromolecules, v.21, p.47–55,1997.
ELDIN, M.S.M.; SCHRÖEN, C.G.P.H.; JANSSEN, A.E.M.; MITA, D.G e TRAMPER, J.
Immobilization of Penicillin G acylase onto Chemically Grafted nylon Particles.
Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, v.10, p.445-451, 2000.
EMMEL, A, MATHIAS, A.L., WYPYCH, F.; RAMOS, L. P. Fractionation of Eucalyptus
grandis chips by dilute acid-catalysed steam explosion.
Bioresource
Technology,V.86, 2, p. 105-115, 2003.
EVANS, J.;
Chemistry in Britain, August 1999, 38.
88
FÁVERE, T, V.; LAUS, R.; LARANJEIRA, M, C, M.; MARTINS, A, O.; PEDROSA, R.;
BENASSI, J.; GEREMIAS, R. Microesferas de quitosana reticuladas com
tripolifosfato utilizadas para remoção da acidez, ferro(III) e manganês(II) de águas
contaminadas pela mineração de carvão.
Química. Nova, v. 29 (1), p. 1, 34-39, 2006.
FERNÁNDEZ-LAFUENTE, R.; COWAN, D. A.; WOOD, A. N. P. (1995).
Hyperstabilization of a thermophilic esterase by multipoint covalent attachment.
Enzyme and Microbial Technology, v. 17, p. 366–372.
FISCHER, G.; SCHRATTENHOLZER, L. Global bioenergy potencials through 2050.
Biomass & Bioenergy, Pergamon, v.20, n.3, p. 151-159, mar., 2001.
FUNDUENANU, G.; NASTRUZZI, C.; CARPOV, A.; DESBRIERES, J.; RINAUDO, M.
Physico-chemical characterization of Ca-alginate microparticles produced by different
methods.
Biomaterials, v. 20, p.1427–1435,1999.
GALVÃO, C. M. A. (2004). Hidrólise controlada do soro lático usando tripsina e
quimotripsina imobilizadas em diferentes suportes.
Tese de Doutorado, Universidade
Federal de São Carlos.
GAMA, F, M.; MOTA, M.; BASTOS, M.; DOURADO, F. Studies on the properties of
Celluclast/Eudragit L-100 conjugate.
Journal of Biotechnology v. 99, p. 121-131,
2002.
GAMA, F M. AIRES-BARROS, M.R. CABRAL, J.M.S.
ENGENHARIA ENZIMÁTICA.
Lisboa, Portugal, Lidel, 2003.
GARROTE, G.; DOMINGUEZ, H.; PARAJÓ, J. C. Autohydrolysis of corncob: study of non-
isothermal operation for xylooligosaccharide production.
J. Food Eng., n. 52, p. 211-
218, 2002.
GEORGE, M.; ABRAHAM, T. E. (2006). Polyionic hydrocolloids for the intestinal delivery
of protein drugs: Alginate and chitosan – a review.
Journal of Controlled Release, v.
114, p. 1-14.
89
GIORDANO, R. L. C.; GONÇALVES, L. R. B.; HIRANO, P.N.; SCHMIDELL NETTO, W.
Study of a biocatalyst to produce ethanol from starch: Co-immobilization of
glucoamylase and yeast in gel.
Applied Biochemistry and Biotechnology 84-86, 643-
654, 2000.
GIORDANO, R.L.C.; Perspectiva e desafios para a engenharia química no século XXI em
busca do equilíbrio , ou uma política 3R para o planeta Terra.
Revista Brasileira de
Engenharia Química; v 21, n. 3, p. 26-30, 2004.
GONÇALVES, L.R.B. Estudo Cinético da Síntese de Amoxicilina Catalisada por Penicilina
G Acilase Imobilizada em glioxil-agarose.2001.
Tese (Doutorado em Engenharia
Química), Departamento de Engenharia Química, UFSCar, São Carlos, 2001.
GONÇALVES, A. R.;
Tese de Doutorado – Instituto de Química - UNICAMP, Campinas,
1995.
GREUDENBERG, K.; Adam, K.; Berichte 1941, 74, 387.
GU, L.;MAO, X.; GUO, G.; HUANG, J.; DU, Z.; HUANG, Z.; MA, L.; LI, P. A novel
methodo to prepare chitosan powder and its aplication in cellulase immobilization.
Journal Chem Technol Biotecnol (in press). 2005.
GUISÁN, J. M. Aldehyde-agarose gels as activated supports for immobilization-stabilization
of enzymes.
Enzyme and Microbial Technology 10, 375-382, 1988.
GUPTA, K.C.; JABRAIL, F. H. (2006). Effects of degree od deacetylation and cross-linking
on physical characteristics, swelling and release behavior of chitosan microspheres.
Carbohydrates Polymers, in press.
GURGEL, P.V., FURLAN, S.A., MARTINEZ, S.E.R., MANCILHA, I.M.. Evaluation of
sugarcane bagasse acid hydrolyzate treatments for xylitol production.
Braz. J. Chem.
Eng., 15, 3,1998.
HENRISSAT B.et al., Synergism of cellulases from Trichoderme reesei in the degradation of
cellulose .
Biotechnology.v.3.p. 722-726, 1985.
HUGUET, M. L.; DELLACHERIE, E. (1996). Calcium-alginate beads coated with chitosan:
effect of the structure of encapsulated materials on their release.
Process
Biochemistry, v. 31, p. 745-751.
90
ICHIKAWA, S.; TAKANO, K.; KUROIWA, T.; HIRUTA, O.; SATO, S e MUKATAKA, S.
Immobilization and Stabilization of Chitosanase by Multipoint Attachment to Agar
gel Suport,
Journal of Bioscience and Bioengineering, v.93, n.2, p.201-206, 2002.
ISLAM, M. et al. Energy and protein utilization by goats fed Italian ryegrass silagem trated
with molasses, urea, cellulase or cellulase + lactic acid bacteria.
Small Ruminat
Research. v. 42. p. 49-60.Jlho 2001.
KANSOH, A.L et al. Biodegradation and utilization of bagasse with Trichoderma reesei.
Polymer Degradation and Stability. v. 63. p. 373-278. 1998.
KENNEDY, J.F. Enzyme Technology.
Biotechnology, VHC Alemanha, v.7a,1987.
KIM, S. W. Production of cellulase and hemicellulase by Aspergillus niger KK2 from
lignocellulosic biomass.
Bioresource Technology. v. 91. p. 153-156. 2004.
KRAJEWSKA, B. (2004). Application of chitin- and chitosan-based materials for enzyme
immobilizations: a review.
Enzyme and Microbial Technology, v. 35, p. 126-139.
KUHAD, R.C.; SINGH, A.;
Critical Reviews in Biotechnology, Cleveland, 1993, 13, 151.
KUMAR, M. N. V. R. (2000a). A review of chitin and chitosan applications.
Reactive &
Functional Polymers, v. 46, p. 1-27.
KUMAR, G.; BRISTOW, J.F.; SMITH, P.J. Enzymatic gelation of the natural polymer
chitosan.
Polymer v.41, n.6, p.2157-2168, 2000b.
KYRITSIS, S; CARRASCO, J.E. First
World Conference and Exhibition on Biomass for
Energy and Industry,
Sevilha-Espanha, junho 2000.
LASER, M,; SCHULMAN, D.; ALLEN, S.G.; LICHWA, J.; ANTAL, M. J.; LYND, L.R. A
comparison of liquid hot water and steam pretreatments of sugar cane bagasse for
bioconversion to ethanol.
Bioresource Tech., v. 81, n. 1, p. 33-44, 2002.
LI, N.; BAI, R. (2005). A novel amine-shielded surface cross-linking of chitosan hydrogel
beads for enhanced metal adsorption performance.
Industrial & Engineering
Chemistry Research, v. 44, p. 6692-6700.
LEHNINGER, A.L. Princípios De Bioquímica. Traduzido por W.R. Lodi, A.A. Simmes, São
Paulo, Sarvier, 1999.
91
LÓPEZ-GALLEGO, F.; BETANCOR, L.; HIDALGO, A.; MATEO, C.; GUISÁN, J. M.;
FERNÁNDEZ-LAFUENTE, R. (2004). Optimization of an industrial biocatalyst of
glutaryl acylase: stabilization of the enzyme by multipoint covalent attachment onto
new amino-epoxy Sepabeads.
Journal of Biotechnology, v. 111, p. 219–227.
LOPES, J. et al. Fitase e/ou celulase sobre a redução de nitrogênio de fósforo na excreta , em
dieta de suínos contendo 50% de farelo de arroz integral.UFRGS. Porto Alegre, 2002.
LYND, L. R.; WYMAN, C. E.; GERNGROSS, T. U.
Biocommodity engineering. Biotech.
Progress, n. 17, p. 777- 793, 1999.
LYND. R.L., ZHANG. P. H.Y. (2004) Toward an aggregated understanding of enzymatic
hydrolisis of cellulose: noncoplexed cellulase systems (Review).
Wiley Periodics, Inc.
http://www.intersciense.wiley.com.
MALCATA, F. X.; REYES, H. R.; GARCIA, H. S.; HILL Jr, C. G.; AMUNDSON, C. H.
(1990). Immobilized lipase reactors for modification of fats and oils. A review.
Journal of the American Oil Chemist’s Society, v. 67, n. 12, p. 890-910.
MAPA (Ministério de agricultura, pecuária e abastecimento).
Estatísticas de
produção.Departamento de cana-de-açúcar e agroenergia, www.agricultura.gov.br,
2005.
MARTINO, A; DURANTE, M.; PIFFERI, P.G.; SPAGNA, G.; BIANCHI, G.
Immobilization of β-Glucosidase from Commercial Preparation Part 1. A
Comparative Study of Natural Supports,
Process Biochemistry 31, nº3, pp. 281-285,
1996a.
MARTINO, A.; PIFFERI, P.G.; SPAGNA, G.; Immobilization of β-Glucosidase from
Commercial Preparation Part 2. Optimization of the Immobilization Process on
Chitosan,
Process Biochemistry 31, nº3, pp. 287-293, 1996b.
MARTINS, E, M; ADRIANO,W,S;GIORDANO, R,L,C. Obtenção de derivados imobilizados
de celulases em géis de quitosana.
XV Congresso Brasileiro de Engenharia Química,
XV Congresso Brasileiro de Engenharia Química, 2005. Anais do XV Congresso
Brasileiro de Engenharia Química, Recife, 2005.
92
MATEO, C.; Increase in conformational stability of enzymes on epoxy-activated supports by
favouring additional multipoint covalent attachment,
Enzyme Microb. Technol. 26,
pp. 509-515, 2000.
MATEO, C.; ABIAN, O.; ERNEDO, M.B. Some special features of glyoxyl supports to
immobilize proteins.
Enzyme and Microbial Technology v.37 (4), p. 456-462, 2005.
MCKILLIP, W. J.; COLLIN, G.; HÖKE, H; ULLMANN’S.
Encyclopedia of Industrial
Chemistry, VCH, Weinheim 1989; Vol. A12, p.119.
MELAJA, A. J.; HAMALAINEN, L. Process for making xylitol. US Patent 4.008.285 Dep.
18/6/75, Publ. 15/2/77.
MENEZEZ e AGUIAR, Conversão enzimática do bagaço de cana-de-açúcar.
Biotecnologia,
Pesquisa e Desenvolvimento. n.26.maio/junho, 2002.
MENDELS, M.; WEBER, J. The production of cellulase.
Advance in Chemistry Series v. 95.
p. 391-414, 1969.
MESSING R. A. Immobilized enzymes for industrial reactors, Ed. Messing R.A.,
Academic
Press, p.63, 1975.
MILLER, G, L. Use of de dinitrosalicylic acid reagent of determination of reducing sugar.
Analytical Chemistry v. 31(3), p. 426-428, 1959.
MONTI, R. Produção de celulase e xilanase pelo fungo termófilo Humicola grisea variedade
thermoidea RP-17: fatores que afetam a produção e propriedades bioquímicas das
enzimas.
Pós-Gradução em Bioquímica-FMRP-USP-Ribeirão Preto, 1989.
MONTEIRO Jr., O. A. C.; AIROLDI, C. (1999). Some studies of crosslinking chitosan-
glutaraldehyde interaction in a homogeneous system. International
Journal of
Biological Macromolecules, v. 26, p. 119-128.
MOZAHEV, V.V.; MELIK-NUBAROV, N.S.; SERGEEVA, M.V.; SIKSNIS, V.;
MARTINEK, K.; Strategy for stabilizing enzymes- Part 1: Increasing Stability of
Enzymes via their multipoint.
93
MÜHLBACH, P.R.F. et al. Silagem de alfafa colhida no início do florescimento e submetida
ao emurchicimento e à ação de aditivos biológicos.
Revista brasileira de zootecnia, v.
29, p. 349-356.2000.
NABY-ABDEL, M, A.; NABY-ABDEL, A, F.; OSMAN M, Y.; Production and
immobilization of cellobiase from Aspergilus niger A20.
Chemical Engineering
Journal. v. 68, p. 189-196, 1997.
NAKO, K., LI. C., YOSHIMIMOTO. Y., FUKUNAGA. K. (2006) Characterization and
immobilization of liposome-bound cellulase for hydrolysis of insoluble cellulose.
Bioresource Technology. in press.
NIDETZKY, B. STNEINER, W. HAYN, M. CLAEYSSENS, M. Cellulose hydrolysis by the
cellulases from Trichoderma reesei: a new model for synergistic interaction.
Biochm.
J. 298. 705-710.1994.
OTERO, C.; ROBLEDO, L.; ALCANTARA, A. R. (1995). Study of the stabilization of pure
lipases: comparison of two different lipase-microgel derivates.
Journal of Molecular
Catalysis B: Enzymatic, v. 1, p. 23-28
OLIVEIRA, I. R. W. Z.; FERNANDES, S. C.; VIEIRA, I. C. (2006). Development of a
biosensor based on gilo peroxidase immobilized on chitosan chemically crosslinked
with epichlorohydrin for determination of rutin.
Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis, v. 41, p. 366-372.
PADUA, A. D. et al. Biodiesel: Uma alternativa estratégica na matriz energética brasileira?
PALOMO, J. M.; MUÑOZ, G.; FERNANDEZ-LORENTE, G.; MATEO, C.; FERNANDEZ-
LAFUENTE, R.; GUISÁN, J. M. (2002). Interfacial adsorption of lipases on very
hydrophobic support (octadecyl–Sepabeads): immobilization, hyperactivation and
stabilization of the open form of lipases.
Journal of Molecular Catalysis B:
Enzymatic
, v. 19-20, p. 279-286.
PEREIRA, G.H.A. Estudo da Imobilização Multipontual da Penicilina G Acilase em Sílica
Ativada com Grupos Glioxil. 1996.
Dissertação (Mestrado em Engenharia Química),
Departamento de Engenharia Química, Universidade Federal de São Carlos, São
Carlos, 1996.
94
PHILIPPIDIS, G. P.; HATZIS, C.Biochemical engineering analysis of critical process factors
in the biomass-to-ethanol technology.
Biotechnology Progress 13:33, 222-231, 1997
RAMOS, L.P. et al. Biodiesel: Um Projeto de sustentabilidade econômica e sócio-ambiental
para o Brasil.
Revista biotecnologia & desenvolvimento, São Paulo, v. 31, jul./dez.,
2003.
RAMOS, L.P. THE CHEMISTRY INVOLVED IN THE STEAM TREATMENT OF
LIGNOCELLULOSIC MATERIALS.
Quimica. Nova, Vol. 26, No. 6, 863-871, 2003.
RAJAN, M. (2004). Global market for industrial enzymes to reach $2.4 million by 2009
Business Communications Company, Inc. RC-147U Enzymes for Industrial
Applications. http://www.bccresearch.com/editors/RC-147U.html. Acessado em 29 de
outubro de 2006.
RODRIGUEZ, J.L.R.Contribuição ao estudo de aproveitamento de resíduoas
lignocelulósicos.
Tese (Doutorado em Química) Instituto de Química, Universidade
Estadual de Campinas, Campinas, 1988.
RUEGGER. J.S. et al. Atividade da celulase de fungos isolados do solo da estação ecológica
de Juréia – Itatins, São Paulo, Brasil.
Revista Brasileira de Botânica. v. 27 n.2 p. 205-
211. Junho 2004.
SADANA, A.; HENLEY, J. P. (1987). Single-step unimolecular non-first-order enzyme
deactivation kinetics.
Biotechnology and Bioengineering, v. 30, p. 717-723.
SANDRENA,M; J,S, MITCHINSON. Struture and biochemical studies of GH family 12
cellulases: improved thermal stability, and ligand complex.
Process in Biophysics and
Molecular Biology. 8. 9246-291, 2005.
SANTANA, J.; SOUZA, S.O. Subproduto da cana-deaçúcar.
Informe Agropecuário, 10:22-
26,1984.
SASAKI, M., ADSCHIRI, T. AND ARAI,K. Fractionation of sugarcane bagasse by
hydrothermal treatment.
Bioresource Technology, Vol.86, Issue 3, Pages 301-304,
2003.
SHEN XL, XIA LM. Production and immobilization of cellobiase from Aspergillus niger ZU
07.
Process Biochemistry 39, 1363-1367, 2004.
95
SHENG JING et al. Immobilization of cellulase using acrylamide grafted acrylonitrile
copolymer membranes.
Journal of membrane science. v. 155. p. 101-106. 1998.
SILVA G.H. Processamento em batelada e contínuo de material amiláceo para produção de
etanol.
Boletim Técnico Petrobrás 23, 49-57, 1980
SILVA, F. T.;
Tese de Doutorado – Instituto de Química - UNICAMP, Campinas, 1995.
SINISTERRA, J.; Immobilization of enzymes on inorganic supports by covalent methods,
Immobilization of Enzymes and cells pp.331, 1997
SHUSHARDT, U. et al. A indústria petroquímica no próximo século: como substituir o
petróleo como matéria-prima?
Quim. Nova, Vol. 24, No. 2, 247-251, 2001
SMIDSROD, O.; SKAK-BRAEK, G. Alginate as immobilization matrix for cells.
Trends of
Biotechnology v.8, p.71-78, 1990.
SPAGNA, G.; ANDREANI, F.; SALATELLI, E. Immobilization of alpha-L-
arabinofuranosidase on chitin and chitosan,
Process Biochemistry v.33, n.1, p.57-62,
1998.
SRIAMORNSAK P. Preliminary investigation of some polysaccharides as a carrier for cell
entrapment.
European Journal Pharm Biopharm v.46, p. 233–226,1998.
SUN, Y.; CHENG, J. Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a
review.
Bioresource Tech., v. 83, n. 1, p. 1-11, 2002.
TAQIEDDIN, E.; LEE, C.; AMIJI, M. Perm-selective chitosan-alginato hibrid microcapsules
for enzyme immobilization technology.
Journal of ISPE Reprinted from
Pharmaceutical Engineering v. 22(6), p.1-3, 2002.
TAPIA, C.; ESCOBAR, Z.; COSTA, E.; SAPAG-HAGAR, J.; VALENZUELA, F.;
BASUALTO, C.; GAI, M. N.; YAZDANI-PEDRAM, M. (2004). Comparative
studies on polyelectrolyte complexes and mixtures of chitosan–alginate and chitosan–
carrageenan as prolonged diltiazem clorhydrate release systems
. European Journal of
Pharmaceutics and Biopharmaceutics, v. 57, p. 65-75.
TANNER, D.R. et al. The effect of pH on the foam fractionation of β-glucosidase and
cellulase.
Bioresource Technology.v.87.p. 247-253. 2002.
96
TARDIOLI, P. T.; PEDROCHE, J.; GIORDANO, R. L. C.; FERNÁNDEZ-LAFUENTE, R.;
GUISÁN, J. M. (2003 a). Hydrolysis of proteins by immobilized–stabilized alcalase-
glyoxyl agarose.
Biotechnology Progress, v. 19, p. 352–360.
TARDIOLI, P. T.; FERNÁNDEZ-LAFUENTE, R.; GUISÁN, J. M.; GIORDANO, R. L. C.
(2003 b). Design of new immobilized–stabilized carboxypeptidase A derivative for
production of aromatic free hydrolysates of proteins.
Biotechnology Progress, v. 19,
p. 565–574.
TARDIOLI, P. W.; JUSTO PEDROCHE, J.; GIORDANO, R. L. C.; FERNANDEZ-
LAFUENTE, R.; e GUISÁN, J. M. Estabilização de Alcalase por Imobilização
Covalente Multipontual sobre Suportes com uma Alta Concentração de Grupos
Glioxil.In:
XIV Congresso Brasileiro de Engenharia Química, 2002. Anais do XIV
Congresso Brasileiro de Engenharia Química, Natal, 2002.
TILLER, J.; BERLIN. P e KLEMM, D. A Novel Efficient Enzyme-Immbilization Reaction
on NH2 Polymers by Means of L-Ascorbic Acid,
Biotechnology Applied
Biochemistry, v.30, p. 155-162, 1999.
TYAGI R, GUPTA MN. Immobilization of aspergillus niger xylanase on magnetic latex
beads.
Biotechnology and Applied Biochemistry 21, 217-222, 1995.
VELTEN F, LAUE C, SCHREZENMEIR J. The effect of alginate andhyaluronate on the
viability and function of immunoisolated neonatal rat islets.
Biomaterials v. 20, p.
2161–7,1999.
VIEIRA, R.S. Remoção e Recuperação de Hg (II) Utilizando Quitosana Natural e Reticulada.
2004.
Dissertação (Mestrado em Engenharia Química), Faculdade de Engenharia
Química, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2004.
VILLALONGA, R.; GÓMEZ, L.; RAMÍREZ, H, L.; VILLALONGA, M,L.; HERNÁNDEZ,
J. Immobilization of chitosan-modified invertase on alginate-coated chitin support via
polyelectrolyte complex formation.
Enzyme and Microbial Technology v. 38 (1-2), p.
22-27, 2006.
VILLALONGA , R.; DARIA, R. Function stabilization of cellulase by convalent modification
with chitosan.
Journal Chem Technol Biotecnol v. 76, p. 489-493, 2001.
97
VITOLO, M.
Biotecnologia Industrial-Processos Fermentativos e Enzimáticos, São
Paulo:Edgard Blücher, 2001. Cap.18, v.3
XIA. L., SHEN. X. Production and immobilization of cellobiase from Aspergillus niger ZU-
07.
Process Biochemistry. V. 39.p. 1363-1367.(2004).
WEN, ZHIYOU et al. Production of cellulase by Trichoderma reesei from dairy manure.
Bioresource Technology. v. 96. p. 491-499. 2004.
WU, F-C.; TSENG, R-L; JUANG, R-S.; Enhanced abilities of highly swollen chitosan beads
for colour removal and tyrosinase immobilization,
Journal of Hazardous Materials
81, pp. 167-177, 2001.
WULFF, N, A. Caracterização enzimática das celulases XF-810, XF-818 e XF-2708 de
Xylella fastidiosa e purificação da proteína XF-818, expressas em Eschirichia coli.
Pós-graduação em Agronomia , Área de Concentração em Microbiologia Agrícola-
(Doutorado).Escola Superior de Agricultura “Luis de Queiros”-USP. Piracicaba, São
Paulo,2002
ZABORSKY, O.R.; Immobilized Enzymes, National Science Foundation CRC Press inc., 2nd
edition, 1977.
ZHANG. P. H.Y., HIMMEL. M.E., MIELENZ. J. R. Outlook for cellulase improvement:
Screening and selection strategies.
Biotechnology Advances, v. 24.p.452-481, 2006.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
