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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
Departamento de Farmacologia
David do Carmo Malvar
“Estudo do envolvimento da PGE
2
na resposta febril induzida
por LPS, endotelina-1 e veneno de Tityus serrulatus”
RIBEIRÃO PRETO - SP
2008
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David do Carmo Malvar
“Estudo do envolvimento da PGE
2
na resposta febril induzida
por LPS, endotelina-1 e veneno de Tityus serrulatus”
Dissertação a ser apresentada à Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de
São Paulo para obtenção do título de Mestre em
Ciências.
Área de Concentração: Farmacologia
Orientadora:
Profa. Dra. Glória Emília Petto de Souza
RIBEIRÃO PRETO - SP
2008
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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL
DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO TRADICIONAL OU
ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO OU PESQUISA, DESDE QUE
CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Malvar, David do Carmo
Estudo do envolvimento da PGE
2
na resposta febril induzida por LPS,
endotelina-1 e veneno de Tityus serrulatus. Ribeirão Preto, 2008.
100 p.
Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto/USP. Área de concentração: Farmacologia.
Orientador: Souza, Glória Emília Petto de.
1. Febre. 2. PGE
2
. 3. LPS. 4. ET-1. 5. Veneno de Tityus serrulatus.
FOLHA DE APROVAÇÃO
David do Carmo Malvar
“Estudo do envolvimento da PGE
2
na resposta febril induzida por
LPS, endotelina-1 e veneno de Tityus serrulatus”
Dissertação a ser apresentada à Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São
Paulo para obtenção do título de Mestre em
Ciências.
Área de Concentração: Farmacologia
Aprovado em:
Banca Examinadora
Prof. Dr. Carlos Amílcar Parada
Instituição: UNICAMP – IB Assinatura:________________________________
Profa. Dra. Kênia Cardoso Bícego
Instituição: UNESP – FCAV Assinatura:_______________________________
Profa. Dra. Glória Emília Petto de Souza
Instituição: FCFRP – USP Assinatura:_______________________________
DEDICO ESTE TRABALHO
A Deus, por ter me abençoado ao longo de toda minha
caminhada, sempre abrindo as portas nos momentos
mais difíceis.
Aos meus Pais, Paulo N. do C. Malvar e Fátima do
R. C. Malvar se cheguei até aqui, foi graças a vocês e
por vocês, que são os meus exemplos de vida, sucesso,
dignidade, retidão, caráter e humildade.
A minhas irmãs, Paula do C. Malvar e Roberta do
C. Malvar, minhas melhores amigas. Vocês duas me
ensinaram a significado de amar incondicionalmente,
dividir, ajudar, brigar, fazer as pazes, cuidar e apoiar.
Eu não teria conseguido estar onde estou se vocês não
existissem.
À minha Noiva Sabrina Graziani pelo amor, carinho,
companheirismo, apoio e compreensão que foram
fundamentais para que eu suportasse a dor da distância
de casa.
Vocês são o meu verdadeiro tesouro.
Obrigado por estarem na minha vida.
AGRADECIMENTOS
Ac CNPq e FAPESP pelo apoio financeiro;
A Profa. Dra. Glória E. P. de Souza, por todo apoio profissional e cultural e,
ainda, pelo carinho maternal que muitas vezes me ajudou a suportar a distância da
minha família;
Aos queridos amigos do Laboratório de inflamação e febre, da Farmacologia da
FCFRP-USP: Alexandre Kanashiro, Andréa Pessini, Daniela Longhi, Denis
Soares, Fernando Armani, Juliano Martins, Lívia Yamashiro, Maria José
Figueiredo, Renes Machado e Maria Carolina por proporcionar momentos que me
fizeram sentir em família, além do apoio científico e profissional;
Aos companheiros da República, Evandro Augusto, Evandro Neto, Quintino
Jr., Luiz Oliveira e Sidney Domingues, que se tornaram, ao longo desses anos,
verdadeiros irmãos;
A todos os Pós-graduandos e alunos de iniciação científica do Laboratório de
Farmacologia agradeço o companheirismo, e apoio nos momentos difíceis;
À Míriam Melo, Rubens Melo, Juliana Vercesi, Mayara Gomes, por todo o
apoio profissional e por me proporcionarem tanta alegria no cotidiano;
A Marlene Silva e Aparecida Rosa, por todo apoio profissional e pelo carinho
maternal que muitas vezes me ajudaram a suportar a distância da minha família;
Às Professoras da disciplina de farmacologia Profa. Dra. Lusiane Bendhack,
Profa. Dra. Ana Maria de Oliveira, Profa. Dra. Sâmia Joca, e Profa. Dra.
Valquiria Bortoli por todo convívio, apoio e pelas discussões no laboratório;
Aos membros da Comissão examinadora, Prof. Dr. Carlos Amílcar Parada e
Profa. Dra. Kênia Cardoso Bícego, pelo aceite e pela atenção a mim dispensada;
A todos os docentes do Departamento de Farmacologia da FMRP-USP pela
contribuição para com a minha formação científica, meu muito obrigado pelo exemplo
de dedicação à ciência e à docência;
Ao Dr. Carlos Sorgi do laboratório de Imunologia da FCFRP-USP e MSc.
Fabíola Mestriner do laboratório de Inflamação da FMRP-USP pelo apoio técnico e
científico;
Ao Reinaldo, funcionário do Biotério da FCFRP-USP, pelo companheirismo,
profissionalismo e atenção;
A todos os alunos do Departamento de Farmacologia da FMRP-USP;
Aos funcionários da secretaria do Departamento de Farmacologia da FMRP-
USP: Fátima Petean, José Ramon e Sônia Stefanelli por todo apoio e carinho;
Aos meus mestres do DCF/IB-UFRRJ, Prof. Dr. Emerson Olivares, Prof. Dr.
Fábio Rocha, Prof. Dr. Luis Reis, Profa. Dra. Magda Medeiros, Prof. Dr.
Wellington Côrtes e, principalmente, ao Prof. Dr. Frederico Vanderlinde, pela
orientação científica, amizade e carinho paternal;
A todos meus amigos de Nova Iguaçu – RJ, em especial aos meus irmãos
DeMolay, Camila Baptista, Rodrigo Moulin e a tia Maria;
A todos meus amigos da UFRRJ, principalmente a galera do 521 (Brenno,
Ícaro, Ronald, Leonardo, Fabiano, Flávio, Matheus, Kadu e Jopa), a Priscila, a
Kátia e a Beatriz;
A minha família que sempre me apoiou e torceu por meu sucesso;
A família da minha noiva, em especial a Solange, Jarbas e Suellen pelo apoio,
respeito, confiança e carinho que sempre tiveram por mim;
E a todos que de alguma forma contribuíram, direta ou indiretamente, para que
este trabalho fosse concluído.
ÍNDICE
LISTA DE ABREVIATURAS..................................................................................................i
RESUMO..................................................................................................................................iv
SUMMARY.............................................................................................................................vii
1- INTRODUÇÃO....................................................................................................................1
1.1 Termorregulação.............................................................................................................2
1.2 Resposta de Fase Aguda e Resposta Febril ....................................................................4
1.3 Mediadores da Resposta Febril ......................................................................................5
1.3.1 Citocinas....................................................................................................................6
1.3.2 Fator liberador de corticotropina (CRF)..................................................................8
1.3.3 Endotelinas................................................................................................................9
1.3.4 Prostaglandinas.......................................................................................................12
1.3.5 Veneno de Tityus serrulatus....................................................................................15
1.4 Controle Farmacológico da Resposta Febril................................................................20
1.5 Problemática.................................................................................................................23
2 OBJETIVOS........................................................................................................................25
2.1 Objetivo geral................................................................................................................26
2.2 Objetivos específicos.....................................................................................................26
3 MATERIAIS E MÉTODOS...............................................................................................27
3.1 Animais..........................................................................................................................28
3.2 Esterilização..................................................................................................................28
3.3 Soluções, drogas e reagentes ........................................................................................28
3.3.1 Líquido Cérebro-espinhal Artificial (aCSF)...........................................................28
3.3.2 Solução Tampão TRIS-HCl 0,2M............................................................................28
3.3.3 Solução de Corante Azul de Evans..........................................................................29
3.3.4 Vias de Administração e Drogas.............................................................................29
3.4 Cirurgia para implante de cânulas no ventrículo lateral .............................................31
3.5 Determinação da variação da temperatura retal por telemetria..................................32
3.6 Coleta do fluido cerebroespinhal (CSF).......................................................................32
3.7 Determinação da concentração de PGE
2
no CSF ........................................................34
3.8 Coleta do hipotálamo....................................................................................................34
3.9 Determinação da concentração de PGE
2
no hipotálamo.............................................34
3.10 Análise estatística........................................................................................................35
4 RESULTADOS....................................................................................................................36
4.1 Efeito da indometacina sobre a febre induzida pela injeção de LPS, ET-1 e veneno
de Tityus serrulatus.............................................................................................................37
4.2 Efeito da dipirona sobre a resposta febril induzida pela injeção de LPS, ET-1 e
veneno de Tityus serrulatus.................................................................................................39
4.3 Efeito da indometacina sobre síntese de PGE
2
e a resposta febril induzida pelo LPS....... 41
4.4 Efeito da dipirona sobre síntese de PGE
2
e a resposta febril induzida pelo LPS.........45
4.5 Efeito da indometacina sobre síntese de PGE
2
e a resposta febril induzida pela ET-1 ..... 49
4.6 Efeito da dipirona sobre síntese de PGE
2
e a resposta febril induzida pela ET-1 .......51
4.7 Efeito da indometacina sobre síntese de PGE
2
e a resposta febril induzida pelo
veneno de Tityus serrulatus.................................................................................................53
4.8 Efeito da dipirona sobre síntese de PGE
2
e a resposta febril induzida pelo veneno
de Tityus serrulatus.............................................................................................................56
4.9 Efeito do antagonista seletivo de receptores EP3 L-826266 sobre a febre induzida
pela injeção intracerebroventricular de PGE
2
...................................................................59
4.10 Efeito do antagonista seletivo de receptores EP3 L-826266 sobre a febre induzida
pela injeção intravenosa de LPS.........................................................................................61
4.11 Efeito do antagonista seletivo de receptores EP3 L-826266 sobre a febre induzida
pel a injeção i.c.v. de ET-1 e i.p. de veneno de Tityus serrulatus.......................................64
4.12 Efeito do antagonista seletivo de receptores EP3 L-826266 sobre o edema
induzido pela injeção intraplantar de PGE
2
.......................................................................66
5 DISCUSSÃO........................................................................................................................68
6 CONCLUSÕES....................................................................................................................80
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..............................................................................83
LISTA DE ABREVIATURAS
_____________________________________________________ Lista de Abreviaturas
ii
aCSF Fluido cerebroespinhal artificial
COX Ciclooxigenase
CRF Fator liberador de corticotropina
CSF Fluido cerebroespinhal
ET Endotelina
HDM Hipotálamos dorso medial
I.C.V. Intracerebroventricular
I.M. Intramuscular
I.P. Intraperitoneal
IFN Intérferon
IL Interleucina
IL-1ra Antagonista de receptor de IL-1
IML Coluna de células intermediolateral
LPS Lipopolissacarídeo
MDP Muramil-dipeptídeo
MIP-1 Proteína inflamatória derivada de macrófago
MnPO Área pré-óptica mediana
MPO Área pré-óptica medial
NPV Núcleo paraventricular hipotalâmico
PBS Tampão fosfato salina
PFPF Fator pirogênico pré-formado em macrófagos estimulados com LPS
PG Prostaglandina
POA/HA área pré-óptica do hipotálamo anterior
rRPa Núcleo palido da rafe rostral
S.C. Subcutâneo
_____________________________________________________ Lista de Abreviaturas
iii
SAL Salina
SNC Sistema nervoso central
SPN Neurônio pré-glanglionar simpático
TNF Fator de necrose tumoral
V.O. Via oral
vTs veneno de Tityus serrulatus
RESUMO
_______________________________________________________________ Resumo
v
Vários trabalhos demonstram que a febre induzida pelo LPS requer a produção
periférica de citocinas e central de prostaglandina (PG)E
2
e PGF
2α
por uma via sensível à
indometacina. Entretanto, vários estudos de nosso grupo sugerem a existência de uma via
insensível à indometacina e independente de PGE
2
, devido ao fato de que não existe relação
entre a febre induzida pela endotelina (ET)-1 e o aumento das concentrações de PGE
2
no
fluido cerebroespinhal (CSF). Além disso, também mostramos que o veneno de Tityus
serrulatus (vTs) causa uma resposta febril que não é alterada pelos inibidores de
ciclooxigenase (COX) ibuprofeno e celecoxib. Adicionalmente, a febre induzida pela ET-1 ou
vTs foi abolida pela dipirona, uma droga antipirética que parece produzir seu efeito por
mecanismo independente da inibição de COX. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi
avaliar a relação entre a quantidade de PGE
2
no CSF e no hipotálamo durante a febre induzida
pelo LPS, ET-1 e vTs em ratos, bem como o efeito da indometacina e da dipirona nesses
parâmetros. Além disso, a participação do receptor EP
3
para PGE
2
na febre induzida pelo
LPS, ET-1 e vTs também foi avaliado. O CSF e o hipotálamo foram coletados de acordo com
a curva-temporal da resposta febril induzida por cada um desses estímulos. O presente estudo
demonstrou que a injeção de LPS (5µg/kg, i.v.) e ET-1 (1pmol/rat, i.c.v.) induziu uma
resposta febril acompanhada de um aumento das concentrações de PGE
2
no CSF e no
hipotálamo, enquanto que a injeção de vTs (150 µg/kg, i.p.) induziu febre sem alterar as
concentrações de PGE
2
no CFS e no hipotálamo. A indometacina (2 mg/kg, i.p.) somente
reduziu a resposta febril induzida pelo LPS na terceira hora, entretanto previniu o aumento de
PGE
2
no hipotálamo e no CSF na segunda e terceira horas após a injeção de LPS. Como
esperado, a indometacina não modificou a febre induzida pela ET-1 e vTs, porém diminuiu a
concentração de PGE
2
no CFS e no hipotálamo induzido pela ET-1. Por outro lado, a dipirona
(120 mg/kg, i.p.) inibiu a resposta febril induzida pelo LPS, ET-1 e vTs e reduziu a
concentração de PGE
2
no CSF durante a febre induzida pelo LPS e ET-1, sem modificar a
quantidade de PGE
2
no hipotálamo após a injeção de LPS e ET-1. Adicionalmente,
observamos que a injeção intracerebroventricular do antagonista seletivo de receptores EP
3
L-
826266 inibiu a febre induzida pela PGE
2
(35%), mas não alterou a febre induzida pelo LPS,
ET-1 ou vTs. Em síntese, esses resultados indicam que nem todas as febres dependem de
PGE
2
para o seu desenvolvimento (ex., febre induzida pela ET-1 e vTs) e que a dipirona
exerce seu efeito antipirético sem reduzir a quantidade de PGE
2
no hipotálamo. Uma vez que
a dipirona aboliu a febre insensível à indometacina induzida pela ET-1 e a febre induzida pelo
vTs, que não aumenta a concentração de PGE
2
no CSF ou tecido hipotalâmico, é possível
enfatizar que o efeito antipirético da dipirona pode depender do bloqueio da síntese/liberação
_______________________________________________________________ Resumo
vi
de outros mediadores que não a PGE
2
. Alem disso, nossos resultados demonstram que o
receptor EP
3
está envolvido na febre induzida pela PGE
2
, mas não apresenta relevância
crucial na febre induzida pelo LPS, ET-1 ou vTs.
Palavras-chave: Febre, PGE
2
, LPS, ET-1, veneno de Tityus serrulatus
SUMMARY
______________________________________________________________ Summary
viii
Several studies demonstrated that LPS-induced fever requires peripheral cytokines
and central prostaglandin (PG)E
2
and PGF
2α
production in an indomethacin-sensitive
pathway. However, previous data from our group have suggested the existence of an
indomethacin-insensitive and PGs-independent pathway due to the fact that there is no
relationship between endothelin-1 (ET-1)-induced fever and the increase in the
cerebrospinal fluid (CSF) PGE
2
concentration. Furthermore, we also showed that Tityus
serrulatus venom (Tsv) causes an integrated febrile response which was altered by neither
ibuprofen nor celecoxib, two cyclooxygenase inhibitors. Additionally, ET-1 or vTs-
induced fever was abolished by dipyrone, an antipyretic drug that seems to produce its
effect through a COX inhibition-independent pathway. Thus, the aim of this study was to
evaluate the relationship between PGE
2
amount in the CSF and hypothalamus during LPS,
ET-1 and Tsv-induced fever in rats as well as the effect of dipyrone and indomethacin on
these parameters. Moreover the role of EP
3
receptors in these responses was also
evaluated. Both CSF and hypothalamus was collected according to the fever development
of each stimulus. The present study verified that LPS (5 µg kg
-1
; i.v.) and ET-1 (1 pmol
rat
-1
; i.c.v.) injections induced fever and increased both hypothalamic and CSF PGE
2
concentrations while vTs (150 µg kg
-1
; i.p.) injection induced a febrile response without
any change in the hypothalamic and CSF PGE
2
concentration. Indomethacin (2 mg kg
-1
,
i.p.) only reduced the febrile response induced by LPS three hours later but prevented the
PGE
2
increase in the hypothalamus and CSF at two and three hours after LPS injection. As
expected, indomethacin failed to modify the ET-1 and Tsv-induced fever but reduced both
CSF and hypothalamic PGE
2
concentration during ET-1 induced-fever. On the other hand,
dipyrone (120 mg kg
-1
, i.p.) inhibited LPS, ET-1 and Tsv-induced febrile response and
reduced the CSF PGE
2
concentration during the LPS- and ET-1-induced fever without any
modification in the hypothalamic PGE
2
content. In addition, we observed that the
intracerebroventricular injection of the selective EP
3
receptor antagonist L-826266
inhibited the PGE
2
-induced fever (35%) without any change in the LPS-, ET-1- or vTs-
induced fever. Taken together these findings suggest that not all fever depends on PGE
2
for its development (ex. Tsv- and ET-1 induced fever) and that dipyrone exerts its
antipyretic effect without reducing the PGE
2
content in the hypothalamus. Since dipyrone
abolished the indomethacin insensitive fever induced by ET-1 and also the fever induced
by Tsv, which does not increase PGE
2
in the CSF and hypothalamic tissue, it is possible to
suggest that the antipyretic effect of dipyrone might rely on the blockage of
______________________________________________________________ Summary
ix
synthesis/release of mediators others than PGE
2
. Finally, our results demonstrated that
EP
3
receptor is involved in the PGE
2
-induced fever but not in those induced by LPS, ET-1
and vTs.
Key Words: Fever, PGE
2
, LPS, ET-1, Tityus serrulatus venom.
1 INTRODUÇÃO
_______________________________________________________________Introdução
2
1.1 – TERMOREGULAÇÃO
A regulação da temperatura corporal ocorre por meio de uma complexa integração de
conexões neuronais envolvendo uma série de estruturas dispostas hierarquicamente, tais como
o hipotálamo, o sistema límbico, o tronco encefálico, a formação reticular, a medula espinhal
e os gânglios simpáticos (Boulant, 2000). O hipotálamo, mais precisamente a área pré-óptica
do hipotálamo anterior (POA/HA), está envolvida na regulação da temperatura corporal por
meio de um balanço térmico relativamente constante (Romanovsky, 2004). Nesta região são
encontrados neurônios termosensíveis, cuja freqüência de disparo é afetada tanto por
variações na temperatura sanguínea da área adjacente, como por influência de conexões
diretas com termoreceptores distribuídos na pele e nos músculos (Dinarello et al., 1988). Em
resposta a variações de temperatura, os neurônios hipotalâmicos iniciam respostas
termorreguladoras apropriadas para de manter uma temperatura interna aproximadamente
constante.
Em estudos de estimulação térmica, o resfriamento localizado na POA/HA inicia
mecanismos de retenção de calor por vasoconstrição cutânea, piloereção, e várias respostas
comportamentais de conservação de calor. De maneira oposta, o aquecimento dessa área
provoca vasodilatação cutânea, sudorese e várias respostas comportamentais de perda de
calor. Assim, a integridade dos diversos sistemas é fundamental para que os mecanismos de
produção e retenção de calor sejam contra-balanceados com aqueles associados à perda de
calor para o meio ambiente (Boulant, 2000).
Existem pelo menos duas vias termosensíveis ascendentes oriundas dos neurônios
termoceptivos e dos neurônios de segunda ordem (presentes no corno dorsal): a via
espinotalamocortical, que transmite informações de percepção e discriminação da sensação
termal cutânea ao cortex somatosensorial; e a via espinoparabraquiopréoptica, que transmite
informações sobre a temperatura cutânea para a POA/HA, ativando respostas
_______________________________________________________________Introdução
3
termorreguladoras quando preciso (Morrison et al, 2008). Dessa forma, a via
espinoparabraquiopréoptica é a responsável pelas respostas termorreguladoras autonômicas,
tais como vasodilatação/vasoconstrição da pele, sudorese, ativação do tecido adiposo marrom
ou tremores da musculatura esquelética; e a via espinotalamocortical pelas respostas
termorreguladoras comportamentais, tais como a locomoção para ambientes termicamente
favoráveis (Morrison et at, 2008).
As vias eferentes para a termorregulação ainda não foram bem caracterizadas em
humanos. Em ratos, alguns circuitos neurais que conectam os neurônios sensíveis ao calor aos
termoefetores autonômicos têm sido descritos na última década. As três vias
termorreguladoras eferentes mais investigadas são a termogênese do tecido adiposo marrom
(BAT – termogênese nonshivering) e a contração da musculatura esquelética (termogênese
shivering), efetores para a produção de calor, e a modulação do tônus vascular a pele do rabo,
um órgão especializado em troca de calor (Romanovsky, 2007).
A BAT e a modulação do tônus vascular a pele do rabo são controlados por um
gânglio simpático, com os corpos dos neurônios pré-glanglionares localizados na coluna
intermédiolateral da medula espinal. Esses neurônios medulares recebem impulsos diretos de
células localizadas primariamente na área peripiramidal/rafe da medula. Essas células
medulares estão sob o controle de neurônois do hipotálamo (núcleos dorsomedial e
paraventricular), do tronco cerebral (substância cinzenta periaquedutal e área tegumentar
ventral) e da ponte (locus coerulos) que recebem impulsos de neurônios sensíveis ao calor da
POA-HA. Na termogênese shivering, motoneurônios γ e α do corno ventral recebem impulsos
diretos e indiretos do mesencéfalo e tronco encefálico, incluindo o núcleo peripiramidal/rafe
da medula. Axônios dos neurônios mesencefálicos descendem a medula espinal com o trato
retículoespinal e rubroespinal. Esses neurônios mesencefálicos estão sob controle de
_______________________________________________________________Introdução
4
neurônios do hipotálamo posterior, que, por sua vez, recebem impulsos inibitórios de
neurônios sensíveis ao calor da POA-HA (Romanovsky, 2007).
As vias efetoras descritas acima são tonicamente inibidas e, conseqüentemente, sua
ativação envolve a desinibição desses neurônios. Os termoefetores são controlados
relativamente independentes uns dos outros, sendo influenciados por grupos independentes de
neurônios pré-ópticos e/ou por diferentes limiares de temperatura (Kanosue et al., 1997;
Romanovsky, 2007).
1.2 - RESPOSTA DE FASE AGUDA E RESPOSTA FEBRIL
A resposta de fase aguda consiste em uma reação imediata e inespecífica, mas
altamente complexa do organismo animal a uma variedade de agressões, tais como, infecções
de origem bacteriana, viral ou parasitária, trauma químico, mecânico ou térmico, necrose
isquêmica ou tumores. Neste tipo de resposta, a reação local manifesta-se como inflamação
aguda, enquanto que a reação sistêmica inclui uma variedade de respostas fisiopatológicas,
tais como alterações neurológicas, endócrinas e metabólicas que podem se manifestar como
febre, astenia, anorexia, leucocitose, aumento da liberação de vários hormônios, diminuição
dos níveis plasmáticos de ferro e zinco, aumento da produção das proteínas de fase aguda,
ativação dos sistemas de coagulação e complemento e formação de cininas (Zeisberger,
1999).
A febre, um dos componentes da resposta de fase aguda mais facilmente reconhecido,
é definida como uma elevação regulada da temperatura interna de um organismo para níveis
acima dos normais em decorrência da alteração do balanço térmico modulado pelo
hipotálamo (Dinarello et al., 1988).
A febre tem sido descrita em todos os grupos de animais vertebrados, entre os
mamíferos, aves, crocodilos, lagartos, cobras, tartarugas, salamandras, sapos, peixes, entre
outros, e em alguns grupos de invertebrados, como as lesmas, caranguejos, camarões e várias
_______________________________________________________________Introdução
5
espécies de insetos. Esta ocorrência difundida entre diferentes espécies indica que a resposta
febril tem uma história filogenética antiga e que evoluiu como uma maneira de potencializar
as respostas de defesa do hospedeiro à infecção (Bicego et al., 2007).
Estudos demonstraram que quando o organismo encontra-se com temperatura corporal
acima dos valores normais ocorre aumento de migração e motilidade de neutrófilos e
monócitos, de fagocitose e pinocitose, proliferação e potencialização das ações das células T
helper, maior liberação e potenciação das ações do interferon, aumento da produção de
anticorpos, aumento do efeito bactericida de antimicrobianos e, ainda, cria um ambiente
térmico desfavorável para o crescimento e sobrevida de microorganismos (revisado por
Kluger, 1991). Entretanto, o aumento da temperatura corporal também provoca sensações de
mal-estar e desconforto, podendo ainda ser potencialmente perigoso em situações de
desidratação, caquexia, lesões encefálicas e/ou hepáticas, doenças cardiorespiratórias,
gravidez e, nos aumentos acima dos níveis tolerados, pode ser incompatível com a
manutenção da vida (Blatteis, 2006).
Por isso, vários tipos de terapias antipiréticas têm surgido ao longo do tempo.
Entretanto, algumas destas drogas promovem efeitos indesejados como, por exemplo, no
tratamento com antibióticos e outros medicamentos, ficando evidente a importância de
estudar a mediação desse complexo evento da resposta de fase aguda, a febre, permitindo a
introdução de novos medicamentos antipiréticos ou a utilização mais racional dos já
existentes.
1.3 – MEDIADORES DA RESPOSTA FEBRIL
No encéfalo, a resposta febril resulta de uma complexa interação entre citocinas,
prostanóides, neuropeptídeos e neurotransmissores. Além disso, a febre depende do equilíbrio
entre a liberação e a atividade de mediadores pirogênicos e de mediadores que controlam a
resposta febril, os denominados criogênios (Melo-Soares, 2008).
_______________________________________________________________Introdução
6
As substâncias que induzem febre são designadas de pirogênios e podem ser divididos
em exógenos e endógenos. Em geral, a maioria dos pirogênios exógenos é oriunda de
produtos gerados por microorganismos como vírus, bactérias, fungos e parasitas (Zeisberger,
1999) ou por toxinas de veneno de animais peçonhentos, tais como o veneno da cobra indiana
(Gurin et al., 1985) ou do veneno do escorpião Tityus serrulatus (Pessini, et al., 2006). Os
pirogênios endógenos compreendem as proteínas termosensíveis e os mediadores lipídicos.
Sua produção é geralmente estimulada pelos pirogênios exógenos, mas também por lesões,
traumas e estresse.
Durante a metade do último século surgiram as primeiras evidências de que os
pirogênios exógenos atuam por meio da produção e/ou liberação de pirogênios endógenos
pelas células do hospedeiro (Ivan & Bennett, 1948a e b; Bennett & Beeson, 1953a e b). Estes,
por sua vez, seriam os responsáveis pela ativação das regiões encefálicas envolvidas na
regulação da temperatura corporal, promovendo elevação desta (Atkins, 1960). Atualmente,
entretanto, a ação direta de pirogênios exógenos não pode ser descartada, pois existem
receptores específicos para componentes da parede celular bacteriana (Dinarello, 2004; Akira
2007). Entre os pirogênios exógenos mais estudados podemos citar o LPS (lipopolissacarídeo
de bactérias Gram negativas) e o MDP (Muramil-dipeptídeo, componente da parede celular de
bactéria Gram positivas). Entre os principais pirogênios endógenos estão as citocinas,
quimiocinas, prostaglandinas, fator liberador de corticotropina (CRF) e endotelina (revisado
por Roth & Souza, 2001; Fabrício et al., 2005).
1.3.1 Citocinas
As citocinas compreendem uma grande família de polipeptídios que incluem as
interleucinas, quimiocinas, fator de estimulação de crescimento, fator de necrose tumoral e
interferons (Rothwell, 1991).
_______________________________________________________________Introdução
7
As citocinas podem ser definidas como proteínas reguladoras secretadas pelos
leucócitos e por uma variedade de outras células no corpo. Ações pleiotrópicas das citocinas
incluem numerosos efeitos nas células do sistema imune e modulação de respostas
inflamatórias (Turnbull & Rivier, 1999; revisado por Dantzer & Kelley, 2007).
É bem demonstrado que vários tipos celulares incluindo macrófagos, células
endoteliais, linfócitos e astrócitos, produzem citocinas com atividade pirogênica. Dentre elas,
IL-1β, IL-6 e TNF-α são consideradas as principais citocinas envolvidas na resposta febril
(Revisado por Roth et al., 2006).
A IL-1 constitui uma família de três polipeptídios relacionados e codificados por
genes distintos: IL-1α, IL-1β e o antagonista endógeno de receptores de IL-1, IL-1ra
(Dinarello, 1994). Estudos demonstraram que tanto a IL-1α como a IL-1β induzem febre em
coelhos e ratos quando administradas por via intravenosa (i.v.) ou intracerebroventricular
(i.c.v.). Todavia, a febre induzida pela injeção i.v. ou i.c.v. de IL-1β é muito mais intensa que
aquela induzida pela IL-1α, em diversas espécies (Dascombe et al., 1989; Morimoto et al.,
1988; Davidson et al., 1990; Rothwell et al., 1990b; Zampronio et al., 1994b).
Adicionalmente, a administração i.v. de soro anti-IL-1β, bem como a administração
intraperitoneal (i.p.) ou i.c.v. de IL-1ra inibem a febre induzida por endotoxina em ratos
(Long et al., 1990; Smith & Kluger, 1992; Luheshi & Rothwell, 1996).
Juntamente com a IL-1 β, a IL-6 é considerada um importante pirogênio endógeno
(Xin & Blatteis, 1992). Em 2000, Zampronio e colaboradores detectaram concentrações
elevadas de IL-6 no plasma, no fluido cerebroespinhal e nos perfusatos hipotalâmicos durante
a febre induzida por endotoxina em ratos. Adicionalmente, De SOUZA e colaboradores
(2002) demonstraram que a infusão central de IL-6, em uma dose correspondente às
concentrações detectadas no hipotálamo de ratos induz febre nesses animais. Em outro estudo
realizado por Miller et al. (1997), demonstrou-se que a injeção de LPS numa bolha de ar
_______________________________________________________________Introdução
8
subcutânea em ratos promove aumento na concentração de IL-6 no plasma e da temperatura
corporal, que o aumento de temperatura corporal é abolido pelo pré-tratamento com soro anti-
IL-6 (Cartmell et al., 2000).
Outra citocina também classificada como pirogênio endógeno e liberada por
macrófagos em resposta a endotoxina, como o LPS, é o fator de necrose tumoral alfa (TNF-
α). O TNF-α, quando administrado por via periférica ou central, induz resposta febril em
coelhos (Dinarello et al., 1986), ratos (Kettelhut & Goldberg, 1988; Zampronio et al., 2000a)
e humanos (Michie et al., 1988). Contudo, o tratamento de ratos com uma dose não pirogênica
de TNF-α promove redução da resposta febril ao LPS, enquanto que o tratamento com
receptor solúvel de TNF exacerba a febre induzida pelo LPS, evidenciando, desta forma, uma
ação antipirética do TNF-α em determinadas condições experimentais (Klir et al., 1995;
revisado por Conti et al, 2004).
Apesar de as citocinas serem importantes mediadores da resposta febril, vários estudos
demonstram que elas não são os mediadores finais da febre. Há evidências de que as citocinas
induzem febre por meio de estimulação da síntese de prostaglandinas e CRF (Davidson et al.,
2001; Engblom et al., 2002; Rothwell, 1989; 1990a).
1.3.2 Fator liberador de corticotropina (CRF)
O CRF (fator liberador de corticotropina) é um peptídeo composto de 41 aminoácidos,
sintetizado nas células parvocelulares do núcleo paraventricular hipotalâmico (PVN). O CRF
está envolvido na mediação da resposta febril (Rothwell, 1989; 1990a) e exerce seus efeitos
por meio da ativação de dois subtipos de receptores, CRF1 e CRF2. A administração i.c.v. de
CRF em ratos aumenta a atividade simpática (Brown et al., 1982), estimula a atividade
termogênica do tecido adiposo marrom (Lefeuvre et al., 1987) e eleva a temperatura corporal
_______________________________________________________________Introdução
9
(Diamant & De Wied, 1991), sugerindo a participação deste fator na indução da termogênese
nesta espécie.
O CRF também medeia ações centrais de citocinas (Rothwell, 1989; 1990a). Tem sido
proposto que o CRF atua no sistema nervoso central como um dos mediadores da febre
induzida pela injeção central da IL-1β, IL-6, IL-8 e PGF
2α
(Rothwell, 1989; Rothwell et al.,
1991; Strijbos et al., 1992), pois injeções de anticorpos anti-CRF ou do antagonista não-
seletivo de receptores de CRF (α-helical CRF9-41) atenuam significativamente essas
respostas. Por outro lado, as respostas febris induzidas por IL-1α e TNF-α não são alteradas
pelo tratamento dos animais com este antagonista (Rothwell, 1989). Além disso, Zamprônio e
colaboradores (2000a) demonstraram que o antagonista não seletivo para receptores de CRF
abole o aumento da temperatura corporal induzido pela injeção central de PFPF (fator
pirogênico pré-formado em macrófagos) e que, assim como a IL-1, induz a liberação in vitro
de CRF em explantes hipotalâmicos de ratos.
Fabrício e colaboradores (2006) evidenciaram a participação do CRF na febre
induzida pela endotelina, uma vez que o tratamento com bosentan, um antagonista não
seletivo para receptores ETA e ETB para endotelina, ou com BQ-788, um antagonista seletivo
de receptor ETB, reduziram a febre induzida pela injeção i.c.v. de CRF.
A atividade pirogênica do CRF não é inibida por fármacos bloqueadores de COX
(Strijbos et al., 1992; Zampronio et al., 2000a), sugerindo que possam existir mecanismos de
indução de febre independentes da participação de PGs, porém dependentes da liberação de
CRF e de endotelinas (Fabricio et al., 2006).
1.3.3 Endotelinas (ET)
A descoberta da ET (Yanagisawa et al., 1988), um potente peptídeo vasoconstrictor
secretado por células endoteliais, tem estimulado grande interesse por apresentar uma grande
_______________________________________________________________Introdução
10
variedade de propriedades biológicas. A família das endotelinas é composta por peptídeos
relacionados compreendendo a ET-1, a ET-2, e a ET-3 (Inoue et al., 1989) e o “contrator
intestinal vasoativo” (VIC), equivalente à ET-2 de rato e presente em camundongos (Saida et
al., 1989; Bloch, et al., 1991).
Foram clonados três receptores distintos para a ET, os receptores ET
A
, ET
B
e ET
C
. O
receptor ET
A
tem maior afinidade para ET-1 e ET-2 (Arai et al., 1990). O receptor ET
B
apresenta afinidades similares para os três pepitídeios (Sakurai et al., 1990) e o receptor ET
C
,
que foi clonado somente em anfíbios, exibe maior afinidade para ET-3 (Karne et a., 1993).
Além disso, com base em evidências funcionais, tem sido proposta a existência de subtipos
para os receptores ET
A
(ET
A1
e ET
A2
) e ET
B
(ET
B1
e ET
B2
) e também de receptores que não se
enquadram no perfil dos receptores ET
A
ou ET
B
(Bax & Saxena, 1994; Yoneyama et al.,
1995).
Os receptores ET
A
e ET
B
são acoplados às múltiplas vias de transdução de sinal por
meio das proteínas G, incluindo aumento intracelular da concentração de cálcio, troca de
Na
+
/H
+
e ativação de fosfolipases C, A
2
e D (Simonson et al., 1989; Âmbar et al., 1993). Pela
ativação da fosfolipase C, as ETs estimulam a formação de 1,4,5-trifosfato de inositol (IP
3
) e
de diacilglicerol (DAG). O IP
3
promove um rápido aumento da concentração de cálcio
intracelular por mobilização dos estoques intracelulares deste íon, podendo ativar proteínas
quinases dependentes de cálcio e também a fosfolipase A
2
e o DAG, por outro lada, ativa a
proteína quinase C. A ativação de fosfolipase A2 pode disponibilizar o ácido araquidônico
para a síntese de prostaglandinas ou leucotrienos (revisado por Hyslop & De Nucci, 1992).
Koshi e colaboradores (1992) foram os pioneiros em investigar a influência da ET
sobre a temperatura corporal, e demonstraram que a injeção i.v. de ET-1 ou 4-Ala-ET-1
(agonista seletivo do receptor ETB) causam aumento significativo da temperatura corporal de
coelhos não-anestesiados.
_______________________________________________________________Introdução
11
Em 1998, Fabrício e colaboradores demonstraram que a administração i.c.v. de ET-1
em ratos induziu aumento significativo da temperatura retal. Este efeito é totalmente
prevenido pelo bloqueio seletivo de receptores ETB com BQ-788, porém não alterado pelo
BQ-123, um antagonista seletivo de receptores ETA. Estes autores demonstraram também que
a resposta febril induzida pela administração i.v de LPS em ratos foi substancialmente
reduzida pela injeção i.c.v. de BQ-788 e pela injeção intravenosa de bosentan, um antagonista
não seletivo de receptores ETA e ETB. No entanto, esta febre alterada pela injeção i.c.v. de
BQ-123. A partir desses dados os autores sugeriram que as ETs participam da resposta febril
induzida pelo LPS, via ativação central de receptores ETB juntamente com outros
mediadores. Corroborando esses dados, em 2005 estes mesmos autores demonstraram que a
injeção i.v. de LPS, em dose que causa febre de longa duração, promove aumento na
produção de ET-1 e seu precursor imediato, a big-endotelina, no CSF de ratos. (Fabrício et al,
2005).
Posteriormente, utilizando vários antagonistas de receptores específicos para
mediadores da resposta febril como IL-1ra (IL-1α, β), α-helical CRF
9-41
(CRF); bosentan,
BQ-123 e BQ-788 (endotelinas) e em conjunto com dados obtidos em experimentos
anteriores, Fabrício et al., (1998, 2005a), propuseram que a ET-1 seja um mediador
intermediário na febre induzida pelo LPS, participando de uma via independente de PGs, que
envolve a liberação de PFPF, CRF, ET-1 (via receptores ETB), e por último a IL-1β (Fabrício
et al., 2006).
Recentemente, nosso grupo demonstrou que a ET-1, além do LPS e outros pirogênios
endógenos (exceto a IL-1β e as prostaglandinas), recrutam o sistema opióide para causar uma
febre independente de PGE
2
e mediada pelos receptores µ (Fraga et al., 2008).
_______________________________________________________________Introdução
12
1.3.4 Prostaglandinas (PGs)
As prostaglandinas são moléculas de origem lipídica derivadas do metabolismo do
ácido araquidônico, o qual é formado a partir da clivagem de fosfolipídios de membrana pela
ação das fosfolipases, principalmente a fosfolipase A
2
. A conversão do ácido araquidônico em
endoperóxidos cíclicos (PGG
2
e PGH
2
) ocorre pela ação da enzima ciclooxigenase (COX). A
COX existe em duas isoformas, codificadas por genes distintos, referidas como COX-1 e
COX-2. Ao contrário da COX-1 que é expressa constitutivamente, a COX-2 é induzida por
pirogênios exógenos, como o LPS e o MDP, e endógenos, como a IL-1 e o TNF-α (Cao et al.,
1997). Entretanto, a expressão constitutiva de COX-2 tem sido detectada em vários órgãos
como os rins, pulmões, útero e encéfalo de rato (revisado por Vane & Botting, 1998). Cao et
al. (1995) demonstraram que a injeção sistêmica de LPS ou IL-1, induz a expressão de RNAm
para COX-2 que acompanha o curso temporal da febre em diferentes tipos celulares no
encéfalo de ratos. A partir desses resultados, foi levantada a hipótese de que a IL-1β poderia
atuar sobre o seu receptor presente em células endoteliais da vasculatura encefálica induzindo
a expressão de COX-2, o que poderia constituir o mecanismo responsável pela elevação da
concentração de PGE
2
no SNC e conseqüente indução da resposta febril.
Vários estudos apontam as PGs como os prováveis mediadores responsáveis pela
modulação dos neurônios termosensíveis da POA/HA, uma vez que foi observada rápida
elevação da concentração de PGE
2
no líquido cérebro-espinhal (CSF) do terceiro ventrículo
de animais experimentais após administração sistêmica de LPS (Milton, 1989). Além disso, a
microinjeção de inibidores de ciclooxigenase na POA/HA reduz a febre induzida por LPS
(Scammell et al., 1998). Stitt (1973) mostrou que PGE
2
injetada i.c.v. induz febre em ratos e
coelhos. A PGE
2
ainda é considerada o principal eicosanóide envolvido na resposta febril
(Feleder et al., 2004), embora outros derivados do ácido araquidônico, particularmente a
_______________________________________________________________Introdução
13
PGF
2α
, também possam induzir febre em animais experimentais (Coelho et al., 1993, De
Souza et al., 2002).
A PGE
2
exerce suas ações biológicas por meio de 4 subtipos de receptores (EP)
acoplados à proteína G, EP
1
, EP
2
, EP
3
e EP
4
. Os receptores acoplados a proteína G, também
conhecidos como receptores metabotrópicos, são receptores de membrana que estão
acoplados a sistemas efetores intracelulares por uma proteína G. O receptor EP
1
é acoplado à
proteína Gq e aumenta os níveis de cálcio intracelular; os receptores EP
2
e EP
4
são acoplados
à proteína Gs e aumentam os níveis de AMPc intracelular. O receptor EP
3
tem pelo menos 3
splicing, os receptores EP
3α
e EP
3β
são acoplados a proteína Gi diminuindo a atividade da
adenilato ciclase e a concentração de AMPc; e receptor EP
3γ
são acoplado tanto à proteína Gs
aumentando a atividade da adenilato ciclase e a concentração de AMPc, quanto à proteína Gi,
reduzindo a concentração de AMPc (revisado por Sugimoto & Narumiya, 2007). Entretanto,
somente os receptores EP
1
, EP
3
e EP
4
têm sido identificados na POA-HA (Oka et al., 2000;
Lazarus et al., 2007).
Utilizando nanoinjeções de pequenas doses de PGE
2
(1 ng em 10 nL de veículo), as
regiões dentro da POA foram detalhadamente avaliadas quanto a sua sensibilidade a PGs para
a indução de febre, evidenciando então a importância da área pré-óptica medial (MPO) e da
área pré-óptica mediana (MnPO) (Scammell et al., 1996). Nessas sub-regiões da POA, o
receptor EP
3
é localizado em muitos corpos celulares e dendritos neuronais. Embora a
expressão do RNAm dos receptores EP
1
e EP
4
também seja detectada na POA (Oka et al.,
2000), a análise de camundongos deficientes para cada um desses conhecidos subtipos de
receptores de PGE
2
mostrou que somente o camundongo deficiente do receptor EP
3
falhou
completamente em desenvolver resposta febril a PGE
2
, IL-1β ou endotoxina (LPS) (Ushikubi
et al., 1998), e que camundongos deficientes do receptor EP
1
mostraram uma atenuação
parcial da febre induzida por endotoxina (LPS) (Oka et al., 2003). Além disso, a deleção
_______________________________________________________________Introdução
14
gênica do receptor EP
3
especificamente em neurônios distribuídos na MnPO e MPO abole a
resposta febril induzida por PGE
2
ou LPS (Lazarus et al., 2007). Esta linha de evidências
indica que o receptor EP
3
na porção somato-dendrítica de neurônios da POA é o principal
alvo da ação pirogênica da PGE
2
e que a ativação desses receptores pela PGE
2
dispara o
processo neuronal para a indução da febre (Morrison et al., 2008).
A hibridização in situ da POA de camundongos demonstrou uma expressão
predominante da isoforma EP
3α
(aproximadamente 85%) uma considerável expressão da
isoforma EP3γ (15%) e rara expressão da isoforma EP
3β.
Além disso, a distribuição dessas
isoformas não é alterada pela injeção de LPS, indicando que a distribuição e os splicings dos
receptores EP
3
não são ativados independentemente (Vasilache et al., 2007).
A via neural da febre mediada pela PGE
2
mais aceita na literatura está esquematizada
na Figura 01. Neurônios da POA que expressam o receptor EP
3
, potencialmente a população
de neurônios descritos como sensíveis ao calor por Boulant (2006), normalmente promovem
uma inibição GABAérgica tônica em neurônios termogênicos do hipotálamo dorso medial
(HDM) e/ou do núcleo pálido da rafe rostral (rRPa) que, por sua vez, recebem estímulos
excitatórios de regiões encefálicas ainda desconhecidas. Durante o processo infeccioso, PGE
2
local ou sistêmica se liga aos receptores EP
3
e reduz a freqüência de disparos tônicos dos
neurônios sensíveis ao calor, levando à desinibição dos neurônios termogênicos em regiões
encefálicas caudais e à ativação de efetores termorreguladoras para o aumento da produção de
calor e a redução de perda de calor.
Resultados recentes de nosso laboratório demonstraram que doses baixas de celecoxib
(1 mg/kg, via oral), um inibidor seletivo da COX-2, e indometacina (2 mg/kg, i.p.), um
inibidor não-seletivo das COXs, em dose que reduzem a febre induzida por várias citocinas
(De Souza et al., 2002), abolem o aumento de PGs no CSF após a injeção i.c.v. de PFPF,
endotelina-1 (ET-1) e MIP-1α sem produzir efeito antipirético. Por outro lado, a
_______________________________________________________________Introdução
15
administração de uma dose maior de celecoxib (5 mg/kg) aboliu tanto o aumento da
concentração de PGs no CSF quanto a febre por PFPF, ET-1 e MIP-1α. Estes resultados
sugerem que não existe uma relação direta entre a ocorrência de febre e o aumento da
concentração de PGs no fluido cérebroespinal, levando-nos a hipotetizar que a febre induzida
pelo PFPF, ET-1 e MIP-1α são independentes de PGE
2,
e que existem diferentes vias de
mediação da resposta febril induzida por LPS: uma via dependente de prostaglandinas em
resposta a produção e/ou liberação de TNF-α, IL-1α, IL-6 e PGF
2α
onde a PGE
2
e o CRF
atuariam como mediadores finais e uma via alternativa, envolvendo a produção de IL-1 e
opióides endógenos no SNC, em resposta ao PFPF, CRF e ET-1, independente da síntese e/ou
liberação das PGs (Fig. 02) (Mello-Soares et al., 2006; Fabrício et al., 2005; 2006; Fraga et
al., 2008).
1.3.5 Veneno de Tityus serrulatus
Os escorpiões são artrópodes pertencentes à classe Arachnida, ordem Scorpionida,
taxionomicamente divididas em 6 famílias principais: Chactidae, Scorpionidae,
Diplocentridae, Buthriuridae, Vejovidae e Buthidae (Prendini & Wheeler, 2005). O escorpião
brasileiro T. serrulatus (escorpião amarelo), mede cerca de 6-7 cm, apresenta o tronco
marrom-escuro e pinças e cauda amarelas e, na face dorsal da cauda há uma serrilha.
No Brasil, e em outras regiões tropicais e subtropicais, os escorpiões são razões de
estudos, não somente pela alta incidência deles, mas também pelas manifestações clínicas
graves e fatais. O T. serrulatus figura em primeiro lugar na lista de acidentes, seguido pelo T.
bahiensis, T. stigmurus, T. cambridgei e T. trivitatus (Sisson, 1990). O T. serrulatus é
considerado o escorpião mais perigoso da América do Sul. No Brasil, anualmente cerca de
10.000 casos humanos de picadas de escorpiões são notificados e tratados em hospitais. A
_______________________________________________________________Introdução
16
maior parte dessas ocorrências envolvem crianças, com até 20% de casos fatais. (Bücherl,
1979; Freire-Maia et al., 1994).
A composição do veneno pode variar dependendo da área habitada pelo animal e do tipo
de dieta. O veneno do escorpião T. serrulatus (vTs) consiste de proteínas neurotóxicas básicas
de baixo peso molecular, muco, oligopeptídeo, nucleotídeo, aminoácido e alguns
componentes orgânicos. Entretanto, as neurotoxinas são os principais componentes que
confere a alta toxicidade desse veneno em humanos (Possani et al., 1977). O vTs é
parcialmente solúvel em água e pode ser subdivido por centrifugação, obtendo-se uma fração
insolúvel, não tóxica, constituída por mucoproteínas e restos de membranas. Na parte solúvel
encontram-se os componentes tóxicos e, em menor proporção, outros compostos como
aminoácidos livres, sais inorgânicos, lipídios, nucleotídeos e um pequeno conteúdo
enzimático (Watt, 1964).
A terapia do envenenamento por escorpião se divide em “tratamento do veneno” (uso do
antiveneno para inativação de componentes ativos do veneno) e “tratamento do paciente”
(utilização de drogas para controlar os sintomas induzidos pelo veneno e suporte das
condições vitais). Os sintomas gerais não são sempre observados, e não aparecem na
seqüência: hiperexcitabilidade, inquietação, febre, taquipnéia, dispnéia, taquicardia ou
bradicardia, transpiração profusa, náusea, vômito, hiperdistenção gástrica, diarréia,
lacrimejamento, midríase, fotofobia, salivação excessiva, secreção nasal, disfonia, tosse,
broncorréia, edema pulmonar, hipertensão ou hipotensão arterial, falência cardíaca, choque
circulatório, convulsões, ataxias, fasciculações e coma (Amitai, 1998; Freire-Maia et al.,
1994).
Pacientes picados por T. serrulatus apresentam altas concentrações séricas de IL-1α.
Pacientes com quadro severo de envenenamento apresentaram, ainda, altos níveis de IL-6,
IFN-γ e GM-CSF (Magalhães et al., 1999). Em ratos e/ou camundongos, o vTs induz
_______________________________________________________________Introdução
17
neutrofília circulante e local e eosinofília local, aumento das concentrações sanguíneas de IL-
1α, IL-6 e TNF-α, aumento da concentração de bradicinina local e no SNC (Pessini, 2002),
aumento do hematócrito, diminuição da velocidade de hemossedimentação e aumento da
proteína α
2
-macroglobulina, específica de fase aguda, 2 dias após o envenenamento (Pessini,
2000) e febre (Pessini et al., 2006), caracterizando uma resposta inflamatória local e
sistêmica.
Recentemente demonstramos que a febre induzida pelo vTs é dependente de IL-1,
bradicinina, óxido nítrico e da neurotransmissão vagal e insensível ao celecoxib, inibidor
seletivo da COX-2, e ao ibuprofeno, inibidor não-seletivo das COXs, sugerindo que essa
resposta seja independente da síntese de prostaglandinas. Entretanto, a febre induzida por este
agente foi abolida pela dipirona (Pessini et al., 2006), uma droga antipirética cujo mecanismo
de ação parece envolver mecanismos adicionais ao da inibição da síntese de prostaglandinas
(De Souza et al., 2002; Hinz et al., 2007).
_______________________________________________________________Introdução
18
Fig. 01 - Hipótese atual da via neural que medeia a febre envolvendo os receptores EP
3
(Nakamura et
al, 2005). Neurônios da POA que expressam o receptor EP
3
(neurônios sensíveis ao calor),
normalmente promovem uma inibição GABAérgica tônica em neurônios termogênicos do hipotálamos
dorso medial (DMH) e/ou do núcleo palido da rafe rostral (rRPa) que, por sua vez, recebem estímulos
excitatórios de regiões encefálicas ainda desconhecidas. Durante o processo infeccioso, PGE
2
local ou
sistêmica se liga aos receptores EP
3
e reduz a freqüência de disparo tônico dos neurônios sensíveis ao
calor, levando à desinibição dos neurônios termogênicos em regiões encefálicas caudais e à ativação
de efetores termorreguladores para o aumento da produção de calor e redução de perda de calor
(Nakamura et al, 2005; Karetsky et al, 2006; revisado por Morrison et al, 2008). PGE
2
, prostaglandina
E
2
; EP
3
, subtipo 3 do receptor de PGE
2
, POA, área pré-óptica; DMH, hipotálamo dorso medial; rRPa,
núcleo palido da rafe rostral; IML, coluna intermediolateral; SPN, neurônio pré-glanglionar simpático.
_______________________________________________________________Introdução
19
Fig. 02 - Representação esquemática das vias envolvidas na febre induzida por LPS em ratos. A
injeção intravenosa de LPS estimula a liberação de citocinas pirogênicas, IL-1β, TNF-α, IL-6 e PFPF,
por diferentes células de defesa do hospedeiro ativando vias pirogênicas paralelas. Uma delas
dependente de PGE
2
e PGF
2α
derivadas da COX (elipses brancas). A outra via é insensível à
indometacina e ao celecoxib e requer produção central de ET-1 acompanhada de liberação de IL-1
e/ou OE (opióide endógeno) (elipses hachuradas). O CRF é implicado em ambas as vias e o MIP-1α
pode estar sendo induzido pela PGF
2α
e, assim, produzindo febre via indução de CRF.
Adicionalmente, tem sido sugerido, que o TNF-α também pode induzir febre pela liberação de OE
(modificado de Fabricio et al., 2005; Fraga et al., 2008).
MIP-1α ?
_______________________________________________________________Introdução
20
1.4 - CONTROLE FARMACOLÓGICO DA RESPOSTA FEBRIL
Como ressaltado anteriormente, embora a febre desempenhe importante papel na
resposta de defesa do hospedeiro, em algumas circunstâncias a resposta febril pode ser
prejudicial. A febre aumenta a atividade dos componentes dos sistemas de defesa imune
(celular e humoral) ou não-imune e, em doenças auto-imunes controladas ou inativas como o
lupus e artrite reumatóide, ocorrem reincidências da doença (revisador por Blatteis, 2006).
Além disso, o aumento da temperatura corporal pode ser potencialmente perigoso em
situações de desidratação, caquexia, lesões cerebrais e/ou hepáticas, doenças
cardiorespiratórias, gravidez e, nos aumentos acima dos níveis tolerados, pode ser
incompatível com a manutenção da vida (Blatteis, 2006).
Nesse sentido, o homem vem tentando descobrir drogas capazes de auxiliar no controle da
resposta febril desde a antiguidade. Registros históricos relatam a utilização de produtos naturais
com atividade antipirética pelos Assírios, Egípcios, Romanos e Chineses. Hipócrates,
influenciado pela doutrina médica egípcia, recomendava o uso de extratos da casca do salgueiro
para aliviar a dor do parto e reduzir a febre (revisado por Mackowiack, 2000).
Entretanto, a primeira descrição científica do emprego de extratos naturais de plantas é
atribuída ao Reverendo Edward Stone que, em 1763, enviou uma carta ao presidente da
Sociedade Real de Londres descrevendo a eficácia antipirética da casca do salgueiro para o
tratamento da malária (Stone, 1973).
Em 1829, Leroux isolou a salicina a partir do salgueiro e demonstrou suas
propriedades antipiréticas (Leroux, 1930), desencadeando vários estudos que levaram ao
advento do ácido acetilsalicílico (aspirina) por Heinrich Dreser em 1899 (Vane et al, 1990).
Em seguida outros compostos antipiréticos foram descobertos e inseridos na clínica: antipirina
(1884), fenacetina (1887), acetominofeno (1888), piramidona (1896), indometacina (1964) e
ibuprofeno (1969) (revisado por Mackowiack, 2000).
_______________________________________________________________Introdução
21
Entretanto não havia uma explicação adequada para as propriedades antipiréticas,
analgésicas e antiinflamatórias apresentadas por grupos químicos tão diferentes. Foi então que
Vane, em 1971, relacionou o efeito dessas drogas antiinflamatórias não esteroides (AINES) à
inibição da síntese das PGs e que Milton & Wendlandt (1971) propuseram que as substâncias
pirogênicas poderiam induzir febre por meio da produção de PGs específicas e que essas
drogas antipiréticas (tais como a aspirina e a indometacina), reduziriam a febre por meio do
bloqueio da sua síntese.
Os AINES apresentam propriedades antiinflamatórias, analgésicas e antipiréticas, por
inibirem a atividade das enzimas ciclooxigenases (COX-1 e 2), responsáveis pela produção
das PGs (Vane et al, 1998; Giuliano & Warner, 1999; Hawkey, 1999).
Após a descoberta da COX-2, houve interesse em desenvolver inibidores específicos
para essa isoforma. Têm sido desenvolvidas drogas com alta seletividade para
COX-2, entre elas o Celecoxibe (Penning et al., 1997) e o Lumiracoxibe (Brune & Hins,
2004; Zelenakas et al., 2004), que apresentam atividade antiinflamatória e antipirética, com
reduzida toxicidade gástrica.
Os inibidores da COX são classificados em quatro tipos (Penninig et. al., 1997;
Hawkey, 1999):
• drogas que causam inibição irreversível de COX-1 e COX-2 por acetilação do aminoácido
serina como é o caso do ácido acetil salicílico;
• drogas que inibem reversivelmente as duas isoformas de COX como é o caso da indometacina;
• drogas que causam uma pequena inibição tempo dependente de COX-1 e COX-2, formando
ligações do tipo ponte salina entre o grupo carboxila da droga e o resíduo de aminoácido
arginina da posição 120 de ambas COX como é o caso do ibuprofeno;
• drogas que inibem seletivamente COX-2 em processo tempo dependente como é o caso do
celecoxibe.
_______________________________________________________________Introdução
22
Entretanto, os efeitos dos AINES parecem envolver outros mecanismos que não
apenas a inibição da COX. Entre estes a inibição da ativação do NFκ-B pelo salicilato de
sódio, aspirina (Kopp & Gosh, 1994), celecoxibe e ibuprofeno (Bharti & Aggarwal, 2002;
Tegeder et al., 2001; Takada et al., 2004; Shishodia & Aggarwal, 2004 a e b) e a inibição da
ligação de um fator nuclear à região promotora de TNF-α pelo salicilato de sódio, aspirina,
ibuprofeno e indometacina (Aeberhard et al., 1995) inibindo a formação de vários pirogênios
endógenos cuja síntese depende da ativação desses fatores de transcrição.
Adicionalmente, tem sido descrito que o efeito antipirético do salicilato, da
indometacina e do ibuprofeno é inibido pelo antagonista de receptores V1 para AVP
(Alexander et al., 1989; Wilikinsin & Kasting, 1989; Melo-Soares, manuscrito em
preparação), demonstrando o envolvimento desse antipirético endógeno nos mecanismos de
ação dessas drogas.
Outra importante droga antipirética e analgésica é a dipirona, um derivado
pirazolônico amplamente utilizado em vários países. No entanto, esta droga é praticamente
desprovida de efeito antiinflamatório, possui baixa atividade antiedematogênica (Lorenzetti
& Ferreira, 1985) e é um fraco inibidor, reversível e competitivo, das ciclooxigenases (Lüthy
et al., 1983; Eldor et al., 1984).
De Souza e colaboradores (2002) verificaram que a dipirona não inibe a atividade da
COX-1 ou da COX-2 em células COS-7 tranfectadas com estas isoformas, entretanto, reduz a
resposta febril induzida pela injeção central de PGF
2α
. Adicionalmente, esses autores
demonstraram que a dipirona inibe a febre induzida por ácido araquidônico (AA), substrato da
COX-1 constitutiva, bem como aquela decorrente da indução de COX-2 (injeção i.c.v. de AA
em animais pré-tratados com IL-1β, administrados em doses que não induziram febre quando
administradas separadamente). Em conjunto, estes resultados sugerem que o efeito
antipirético da dipirona não está relacionado à inibição da COX-1 ou COX-2.
_______________________________________________________________Introdução
23
Adicionalmente, foi demonstrado que a dipirona, além de inibir a febre induzida por
mediadores pirogênicos que promovem resposta dependente da liberação de CRF, inibe
também a liberação deste fator de explantes hipotalâmicos. Por essa razão, tem sido proposto
que um dos mecanismos antipiréticos exercidos pela dipirona possa estar relacionado à
inibição da síntese e/ou liberação do CRF (De Souza et al., 2002).
Entretanto, estudos ex vivo e in vitro recentes demonstraram que doses altas de
dipirona inibe tanto a enzima COX-1 quanto a COX-2 (Brune et al., 2007; Hinz et al, 2007)
por ação de dois dos seus metabólitos ativos, 4-metilaminoantipirina (4-MAA, inibidor de
COX-1 e COX-2) e 4-aninoantipirina (4-AA, inibidor COX-2) (Pierre et al., 2007) em
humanos.
1.5 - PROBLEMÁTICA
É procedimento de nosso laboratório, como de tantos outros, dosar PGs no fluído
cérebro-espinal (CSF), um líquido aquoso que preenche os ventrículos, o espaço
subaracnóideo (ocupando a superfície encefálica externa) e banha a superfície encefálica
interna. O CSF tem pelo menos duas funções essenciais: serve de função excretora e
reguladora do meio químico do SNC e atua como um canal de comunicação química dentro
do SNC. Produtos neuro-químicos como as PGs, liberado por neurônios na adjacência dos
ventrículos, como os neurônios hipotalâmicos, adentram o CSF e podem ser captados em
locais do assoalho e paredes ventriculares por células especializadas que forram as cavidades
ventriculares (Martin, 1998). Sendo assim, um aumento das concentrações de PGs no CSF de
um animal febril pode ser reflexo de um aumento das concentrações de PGs no hipotálamo.
Entretanto, as PGs são sintetizadas em diferentes tipos celulares no encéfalo dos ratos,
incluindo vasos sangüíneos, neurônios de outras áreas encefálicas e leptomeninges (Cao,
1995). Assim, animais tratados com baixas doses de inibidores da COX podem apresentar
concentrações de PGs no CSF sem diferença significativa quando comparado aos valores
_______________________________________________________________Introdução
24
basais, devido à inibição global das COXs encefálicas sem impedir o aumento das
concentrações de PGs no hipotálamo e, conseqüentemente, a resposta febril. Dessa forma, a
ausência de alterações da resposta febril, mas sim das concentrações de PGE
2
no CSF de
animais tratados com inibidores da COX e injetados com PFPF, ET-1 ou MIP-1α, não exclui
categoricamente o envolvimento de PGs como mediadores da febre induzida por esses
estímulos. Portanto, a dosagem de PGs no tecido hipotalâmico representa uma medida mais
fidedigna para avaliar o envolvimento desses eicosanóides na resposta febril induzida pela
ET-1 e pelo veneno de escorpião T. serrulatus.
Diante da relevância conferida por estudos recentes ao receptor EP
3
para o
desenvolvimento da resposta febril induzida pela PGE
2
e pelo LPS, a avaliação do efeito de
antagonistas de receptores EP
3
também auxiliaria a avaliação da importância da PGE
2
na febre
induzida por estes agentes pirogênicos. Dessa forma, o recente desenvolvimento da droga L-
826266, antagonista seletivo de receptores EP
3
(Claudino et al., 2006; Kassuya et al., 2007),
certificará a importância desses receptores e da PGE
2
na febre induzida pela ET-1 e pelo
veneno do escorpião Tityus serrulatus.
2 OBJETIVO
_________________________________________________________________Objetivo
26
2.1 - OBJETIVO GERAL
Apoiados em resultados anteriores do nosso grupo, os quais sugerem que a ET-1 e o
vTs promovem resposta febril independente da síntese de PGs, o objetivo do presente estudo
foi reavaliar o papel destes eicosanóides na febre induzida por ambos estímulos. Para efeito de
comparação utilizamos o LPS, o qual sabidamente depende da síntese de PGs para a indução
da resposta febril.
2.2 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Avaliar se existe paralelismo entre a resposta febril induzida por LPS, ET-1 e vTs e o
aumento de PGE
2
no CSF;
2. Avaliar se existe paralelismo entre a resposta febril induzida por LPS, ET-1 e vTs e o
aumento de PGE
2
no hipotálamo;
3. Avaliar se existe paralelismo entre a quantidade de PGE
2
no CSF e no hipotálamo;
4. Avaliar o efeito da indometacina, inibidor não-seletivo das ciclooxigenases, sobre a
concentração de PGE
2
no CSF, no hipotálamo e sobre a resposta febril induzida por
LPS, ET-1 e vTs;
5. Avaliar o efeito da dipirona sobre a concentração de PGE
2
no CSF, no hipotálamo e
sobre a resposta febril induzida por LPS, ET-1 e vTs;
6. Investigar a participação do receptor EP
3
na febre induzida por PGE
2
, LPS, ET-1 e
vTs.
3 MATERIAL E MÉTODOS
________________________________________________________Material e Métodos
28
3.1 - ANIMAIS
Foram utilizados ratos Wistar (Ratus novergicus) machos, com peso de 180 a 200 g,
provenientes do Biotério Central do Campus da Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.
Estes animais foram mantidos à temperatura de 24°C e ciclo claro/escuro de 12/12h, com
livre acesso à água e à ração. Os experimentos foram realizados de acordo com as normas do
Comitê de Ética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (nº 147/2005).
3.2 - ESTERILIZAÇÃO
Os materiais utilizados nos experimentos foram autoclavados a 127°C por 30 min
(material plástico e soluções), esterilizados por calor seco a 180°C por 2 h (material de vidro e
metal), ou ainda por luz ultravioleta.
3.3 - SOLUÇÕES, DROGAS E REAGENTES
3.3.1 Líquido Cérebro-espinhal Artificial (aCSF)
Cloreto de sódio P.A. (Merck): 8,10g
Cloreto de potássio P.A. (Merck): 0,25g
Cloreto de cálcio P.A. (Baker): 0,14g
Bicarbonato de sódio (Reagen): 1,00g
Água deionizada q.s.p.: 1,00 L
A solução foi filtrada em Millipore com poros de 0,22 µm de diâmetro e autoclavada por 30 min.
3.3.2 Solução Tampão TRIS-HCl 0,2M
Tris(hidroximetil)-aminometano P.A. (Serva): 24,2g
Água destilada q.s.p.: 1,00 L
O pH foi ajustado para 8,2 com HCl 1N e em seguida a solução foi autoclavada por 30 min.
________________________________________________________Material e Métodos
29
3.3.3 - Solução de Corante Azul de Evans
Azul de Evans (Merck): 2,5g
Água deionizada q.s.p.: 100 mL
A solução foi filtrada em filtros Whatman nº 2
3.3.4 - Vias de Administração e Drogas
a. Intracerebroventricular (i.c.v.):
As drogas foram administradas em um volume de 2 µL no ventrículo lateral
direito por meio de uma agulha de microinjeção (30 G) conectada a uma seringa Hamilton (25
µL) por um tubo de polipropileno P20. A agulha excedeu a cânula em 2,5 mm.
b. Intraperitoneal (i.p.):
As drogas foram administradas por via intraperitoneal em um volume de 1
mL/kg, utilizando agulhas 13 x 4,5 e seringas de 1 mL.
c. Intravenosa (i.v.):
As drogas foram administradas na veia caudal dos animais em um volume de 1
mL/kg, utilizando agulhas 13 x 4,5 e seringas de 1 mL.
d. Subcutânea (s.c.):
Foi efetuada a administração das drogas por via subcutânea em um volume de
1 mL/kg, utilizando-se agulhas 13 x 4,5 e seringas de 1 mL.
e. Via oral (v.o.):
Foi efetuado o tratamento por via oral em um volume de 1 mL/animal
utilizando-se tubo de polipropileno P20 conectado a uma seringa de 3 mL.
________________________________________________________Material e Métodos
30
• Dipirona - AINES (Metamizol sódico, Hoechst Laboratórios, SP, Br), diluído em salina:
120mg/kg, i.p.;
• Endotelina-1 (American Peptide Co., Sunnyvale, CA, EUA) (ET-1): 1 pmol/rato i.c.v.;
• Indometacina - AINES (Merck, Shap & Dohme, SP, Br), diluído em TRIS-HCl: 2mg/kg
i.p.;
• L-826266 – Antagonista seletivo de receptor EP
3
(Merck Frosst (Kirkland, QC, Canada),
diluído em etanol a 7%, i.c.v.;
• LPS (endotoxina de E. coli 0111:B4, Sigma Chem Co., St. Louis, EUA): 5 µg/kg, i.v.;
• Veneno de Tityus serrulatus (Phoneutria Biotecnologia e Serviços LTDA, Belo Horizonte
– MG) (vTs): 150 µg/kg, i.p.;
• Cloridrato de oxitetraciclina - Antibiótico (Terramicina
®
, Pfizer, SP, Br): 400mg/kg, i.m.;
• Cloridrato de cetamina – Anestésico (Ketamina Agener
®
, União Química Farmacêutica
Nacional S/A, Br): 58mg/kg, i.p.;
• Xilazina – Relaxante muscular (Dopaser
®
, Laboratórios Calier S/A - Esp): 20mg/kg, i.p.
O Veneno de Tityus serrulatus, Lutz & Mello (1922), foi extraído por estímulo
elétrico do telson do animal, liofilizado e armazenado a -20 ºC. Para a realização dos
experimentos, o veneno foi solubilizado em solução salina estéril 0,9%, numa concentração
de 0,5 mg/ml e centrifugado à 11269 x g durante 5 minutos. Para determinação da
concentração de proteínas, foram realizadas leituras do sobrenadante em espectrofotômetro
(modelo Hitachi U-2001) à 205-280 nm.
f) Kits de Dosagens:
• Kit de ELISA para dosagem de PGE
2
e PGF
2α
(Caymam Chemical Co., EUA)
________________________________________________________Material e Métodos
31
3.4 - CIRURGIA PARA IMPLANTAÇÃO DE CÂNULAS NO VENTRÍCULO LATERAL
Os ratos foram anestesiados com cloridrato de cetamina e xilazina, via i.p. Após
tricotomia e assepsia com álcool iodado da pele, as cabeças dos animais foram imobilizadas
em um aparelho esterotáxico (David-Kopf, modelo 900-USA). Foi administrado, então,
0,2ml de solução injetável de lidocaína a 3% com norepinefrina (s.c.) na parte superior da
cabeça que foi seguida de uma incisão na pele, de aproximadamente 1 cm de diâmetro, para
a exposição da calota craniana. Esse procedimento facilita a remoção do periósteo e a
implantação das cânulas, por inibir o estímulo doloroso e diminuir o sangramento, por se
tratar de um anestésico local associado a um vasoconstritor.
As cânulas, constituídas de um segmento de agulha hipodérmica BD-7, com 10 mm de
comprimento e 0,7 mm de diâmetro, foram fixada ao esterotáxico. Assumindo o bregma como
ponto de referência, os parâmetros esterotáxicos utilizados para a perfuração do crânio e
posterior implantação da cânula i.c.v. foram situados a -1,5 mm anteroposterior e -1,6 mm
lateralmente ao bregma, com uma inclinação da barra incisal de -2,5 mm. As cânulas foram
introduzidas no tecido cerebral com coordenada ventral 2,5 mm abaixo da superfície craniana.
As coordenadas utilizadas foram determinadas com base no Atlas de Paxinos e Watson (1986).
A fixação das cânulas foi realizada por meio de uma prótese de acrílico auto-
polimerizável com o auxílio de dois parafusos rosqueados à calota craniana. No final da
cirurgia, os animais receberam injeção intramuscular de cloridrato de oxitetraciclina. Os
animais recém-operados foram mantidos em caixas, sem restrição de água ou ração, em sala
com temperatura controlada a 24ºC, com ciclos dia-noite de 12 horas, por no mínimo sete
dias, para recuperação pós-cirúrgica.
Após o término do experimento, os animais foram anestesiados com éter e 3 µl de
corante azul de Evans foram injetados no local correspondente à microinjeção. Em seguida, os
animais foram decapitados e os encéfalos extraídos. Foi realizado um corte transversal na
________________________________________________________Material e Métodos
32
região correspondente à localização da cânula e o local da microinjeção foi verificado
macroscopicamente. Os animais cujos ventrículos laterais não estivessem corados tiveram
suas medidas de temperatura desconsideradas durante o cálculo dos resultados.
3.5 - DETERMINAÇÃO DA VARIAÇÃO DA TEMPERATURA RETAL POR TELEMETRIA
A temperatura retal dos animais foi medida por inserção de sonda (YSI, n° 402, USA)
conectada a um teletermômetro (modelo 46 TUC, YSI, EUA) a 4,0 cm de profundidade no
reto dos animais, sem que os animais fossem retirados de suas respectivas caixas. Os animais
foram adaptados às condições experimentais por meio da realização desse procedimento duas
vezes no dia anterior ao experimento, a fim de minimizar variações de temperatura induzidas
por estresse decorrente do manuseio.
No mínimo 48 h antes do início do experimento, os animais foram colocados em uma
sala cuja temperatura ambiente foi controlada a 24±1°C. Durante o experimento a temperatura
ambiente foi controlada a 28±1°C.
Após o transporte dos animais para a sala onde os experimentos foram realizados,
permitiu-se que os animais permanecessem por no mínimo 15 horas em repouso e, só então,
suas temperaturas basais foram determinadas por 3 ou mais medidas, a intervalos de 30
minutos, antes da administração de qualquer estímulo pirogênico. Somente os animais com
temperatura corporal estável e na faixa de 36,8 a 37,4°C foram utilizados. As medidas foram
feitas a intervalos de 30 min a partir da administração dos estímulos.
3.6 - COLETA DO FLUIDO CEREBROESPINHAL (CSF)
A técnica de coleta do CSF foi padronizada segundo o método descrito por Consiglio &
Lucion (2000) e foi efetuada na terceira hora após a administração do estímulo febril. O animal
foi anestesiado com cloridrato de cetamina e xilazina (i.p.) e fixado ao aparelho estereotáxico. A
cabeça foi colocada no plano de fixação dos incisivos superiores com o occiptal posicionado
________________________________________________________Material e Métodos
33
quase no plano horizontal. O corpo do animal foi posicionado por baixo das barras auriculares de
forma que o tórax ficará posicionado verticalmente (Fig. 03). Com o animal nessa posição é
possível a visualização de uma pequena depressão entre a protuberância occipital e o processo
espinhoso do Atlas. Esta depressão torna-se ainda mais visível após a tricotomia e passando-se
um algodão embebido em álcool sobre esta superfície. Um “scalp” conectado a uma seringa de
1mL foi inserido verticalmente e centralmente nesta superfície. Com uma leve aspiração o CSF
foi coletado no “scalp”. O tempo transcorrido entre a última medida de temperatura e a coleta do
CSF não ultrapassou 5 minutos. Para a determinação das concentrações de PGE
2
o CSF coletado
foi imediatamente acondicionado em um microtubo contendo 5 µg de indometacina em 2µL de
tampão TRIS pH 8.2, protegido de luz por papel alumínio e mantido em gelo até a centrifugação.
Todas as amostras de CSF foram centrifugadas logo após a coleta a 50 g por 10 minutos a 4ºC.
Quando constatado qualquer traço de sangue durante a coleta do CSF após a centrifugação, a
amostra foi prontamente desprezada. As amostras foram conservadas em freezer a -70ºC até a
realização das dosagens.
Fig. 03 - Coleta de fluido cerebroespinhal (CSF). Representação esquemática do posicionamento de
um rato adulto anestesiado para coleta de CSF da cisterna magna com o auxílio de um “scalp”
(Consiglio & Lucion, 2000).
________________________________________________________Material e Métodos
34
3.7 - DOSAGEM DA CONCENTRAÇÃO DE PGE
2
NO CSF
As concentrações de PGE
2
no CSF coletado dos animais foram determinadas pelo
ensaio imunoenzimático (ELISA), utilizando kits comerciais (Cayman Chemical Co., EUA),
e procedendo ao ensaio enzimático como determinado no manual do kit. O limite de
detecção do kit foi de 15 pg/mL. Os coeficientes de variação intra e inter-ensaio foi de
menos de 10%. Os dados de reatividade cruzada foram os seguintes: 43% com PGE
3
; 18.7%
com PGE
1;
1% com 6-keto-PGF
1α
; 0,25% com 8-iso-PGF
2α
e menos de 0,01% com todos os
outros prostanóides.
3.8 - COLETA DO HIPOTÁLAMO
Os animais foram sacrificados por decapitação, logo após a coleta do CSF, e seus
encéfalos foram rapidamente removidos. O hipotálamo foi dissecado conforme descrito por
Fabrício e colaboradores (2006), com os seguintes limites: a borda anterior do quiasma
óptico, a borda anterior dos corpos mamilares e o sulco hipotalâmico lateral, com uma
profundidade de 2mm. O tempo de dissecção total foi de, aproximadamente, 2 minutos após
a decapitação e, em seguida, foi congelado em nitrogênio líquido e estocado a – 70 ºC. O
tempo transcorrido entre a última medida de temperatura e a coleta do hipotálamo nunca
ultrapassou 10 minutos.
3.9 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PGE
2
NO HIPOTÁLAMO
O hipotálamo, aproximadamente 100mg de tecido, foi homogeneizado em 1mL de
meio RPMI contendo indometacina (2mg/mL), utilizando um sonicador (Virsonic 100
®
–
VirTis Company /USA) , e acidificado (pH = 3,5 – 4,0) com HCl 1N. Os tubos contendo o
homogenato foram centrifugados a 20.000g (≅ 15000 rpm) por 10 min a 4ºC e o
sobrenadante (800µL) foi coletado. A PGE
2
foi extraída do sobrenadante usando uma mini-
________________________________________________________Material e Métodos
35
coluna de C18 e eluída da coluna com 2mL de etanol absoluto. As amostras foram secas em
speed vaccum (Hetovac
®
modelo CT110) por 18 horas. No dia da dosagem, as amostras
secas foram ressuspendidas em 1mL de Tampão EIA (tampão próprio do kit de ELISA para
dosagem de PGE
2
) e a concentração de PGE
2
foi determinada por ELISA, procedendo ao
ensaio enzimático como determinado no manual do kit (Cayman Chemical Co., EUA). A
quantidade de PGE
2
foi normalizada de acordo com o peso do hipotálamo.
Os coeficientes de variação intra e inter-ensaio foi de menos de 10%. O limite
detecção do kit foi de 15 pg/mL. Os dados de reatividade cruzada foram os seguintes: 43%
com PGE
3
; 18.7% com PGE
1
; 1% com 6-keto-PGF
1α
; 0,25% com 8-iso-PGF
2α
e menos de
0,01% com todos os outros prostanóides.
3.10 - ANÁLISE ESTATÍSTICA
Todas as variações da temperatura dos animais foram expressas como a média ± EPM
(erro padrão da média) a partir da temperatura corporal basal média (ºC) em diferentes tempos
após a injeção do estímulo pirogênico.
Os dados relativos à variação da temperatura corporal dos animais foram
submetidos à análise de variância Two-Way ANOVA seguido pelo pós-teste de Bonferroni,
ao passo que os dados relativos à concentração de PGE
2
foram submetidos à análise de
variância One-way ANOVA seguido pelo pós-teste de Tukey. Os resultados foram expressos
pela média ± (EPM). O nível de significância considerado foi de 5% (P<0,05). Para realização
da análise estatística usou-se o programa Graph Pad Prism 4,0.
4 RESULTADOS
______________________________________________________________ Resultados
37
4.1 - EFEITO DA INDOMETACINA SOBRE A FEBRE INDUZIDA PELA INJEÇÃO DE
LPS, ET-1 E VENENO DE Tityus serrulatus (vTs)
O efeito antipirético das drogas antiinflamatórias não-esteroides está relacionado à
inibição da síntese das prostaglandinas (PGs). Entretanto, alguns estímulos pirogênicos, como
a ET-1 e o vTs, parecem induzir resposta febril independente da síntese destes eicosanóides
(Fabricio et al., 1998; 2005; Pessini et al., 2006)
Objetivando avaliar melhor a participação da PGE
2
na febre induzida pela ET-1 e pelo
vTs utilizamos para comparação o LPS, o protótipo dos pirogênios exógenos. Como
protótipo de inibidor não seletivo das COXs utilizamos a indometacina. O pré-tratamento
intraperitoneal, 30 minutos antes, com indometacina (2mg/kg) reduziu significativamente, a
partir da terceira hora, a resposta febril induzida pela injeção i.v. de LPS (5µg/kg, Fig. 04A).
Entretanto, como esperado, a indometacina não alterou a febre induzida pela ET-1 (1 pmol,
i.c.v., Fig. 04B) ou pelo vTs (150 µg/kg, i.p., Fig. 04C), e tão pouco a temperatura dos
animais controle que receberam salina.
______________________________________________________________ Resultados
38
0 1 2 3 4 5 6
0.0
0.5
1.0
Veículo / aCSF (n=4)
Veículo / ET-1 (n=4)
Indo / ET-1 (n=4)
#
#
#
#
#
#
#
#
#
#
B
Indo / aCSF
(n=4)
Tempo (h)
∆
T (ºC)
0 1 2 3 4 5 6
0
1
2
Veículo / Salina (n=5)
Indo / LPS (n=7)
Veículo / LPS (n=7)
Indo / Salina (n=6)
*
*
*
*
*
*
*
A
Tempo
∆
T (ºC)
0 1 2 3 4 5 6
0
1
2
Veículo / Salina (n=5)
Veículo/ vTs (n=5)
Indo / vTs (n=5)
C
#
#
#
#
#
#
#
#
#
#
#
Indo / Salina (n=5)
Tempo (h)
∆
T(ºC)
Fig. 04 - Efeito da indometacina sobre a febre induzida por LPS, ET-1 e veneno de Tityus
serrulatus (vTs). A indometacina (Indo, 2 mg/kg, i.p.) ou o veículo (TRIS, pH 8,2) foram
administrados 30 minutos antes da injeção i.v. de 5 µg/kg de LPS (painel A), i.c.v. de ET-1 (1
pmol/rato, painel B) ou i.p. do veneno de T. serrulatus (150 µg/kg, painel C). Os valores representam
a média ± EPM das variações na temperatura retal (∆T). As temperaturas basais anteriores aos
experimentos foram de 36,8 a 37,4 ºC. *p<0,05 e
#
p<0,05 quando comparado ao valor correspondente
ao grupo veículo/LPS e ao grupo controle, respectivamente.
______________________________________________________________ Resultados
39
4.2 - EFEITO DA DIPIRONA SOBRE A RESPOSTA FEBRIL INDUZIDA PELA
INJEÇÃO DE LPS, ET-1 E VENENO DE Tityus serrulatus
A dipirona (metamizol) é amplamente utilizada como fármaco antipirético e
analgésico. No entanto, esta droga é praticamente desprovida de efeito antiinflamatório e seu
mecanismo de ação antipirético ainda não se encontra totalmente elucidado.
O pré-tratamento dos animais com dipirona, na dose de 120 mg/kg (via i.p., 30 min),
reduziu tanto a febre induzida pela injeção i.v. de LPS (5 µg/kg; Fig. 05A), quanto à febre
induzida pela injeção i.c.v. de ET-1 (1 pmol/animal; Fig. 05B) e pela injeção i.p. de vTs
(150µg/kg, Fig. 05C), sem alterar a temperatura dos animais controles.
______________________________________________________________ Resultados
40
0 1 2 3 4 5 6
0.0
0.5
1.0
Veículo / Endotelina (n=11)
Dipirona / Endotelina (n=11)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
B
Dipirona / Salina
(n=6)
Veículo / aCSF (n=7)
*
Tempo (h)
∆
T (ºC)
0 1 2 3 4 5 6
0
1
2
Veículo / Salina (n=5)
Veículo / LPS (n=5)
Dipirona / LPS (n=5)
Dipirona / Salina (n=5)
*
*
*
*
A
Tempo (h)
∆
T (ºC)
0 1 2 3 4 5 6
-1
0
1
2
3
Veículo / vTs
(n=7)
Dipirona / vTs (n=8)
Dipirona / Salina (n=6)
*
*
*
*
*
*
*
C
Veículo / Salina (n=6)
Tempo (h)
∆
T (
°
C)
Fig. 05 - Efeito da dipirona sobre a resposta febril induzida pela injeção de ET-1, LPS e veneno
de Tityus serrulatus. A dipirona (120 mg/kg, i.p.) ou o veículo (salina) foram administrados 30
minutos antes das injeções i.v. de LPS (5 µg/kg, painel a), i.c.v. de ET-1 (1 pmol/rato, painel b) ou i.p.
do veneno de T. serrulatus (150 µg/kg, vTs, painel c). Os valores representam a média ± EPM das
variações na temperatura retal (∆T). As temperaturas basais anteriores aos experimentos foram de 36,8
a 37,4 ºC. *p<0,05 quando comparado ao valor correspondente ao grupo veículo/LPS, veículo/ET-1
ou veículo/vTs.
______________________________________________________________ Resultados
41
4.3 - EFEITO DA INDOMETACINA SOBRE A SÍNTESE DE PGE
2
E A RESPOSTA
FEBRIL INDUZIDA PELO LPS
Para investigar se o aumento de PGE
2
no hipotálamo está relacionado com a febre do
LPS, bem como se existe uma relação entre a quantidade de PGE
2
no hipotálamo e a
concentração de PGE
2
no CSF, inibimos a síntese de PGE
2
com indometacina e dosamos esse
prostanóide no CSF e no hipotálamo de animais injetados com LPS.
O tratamento intraperitoneal, 30 minutos antes, com indometacina (2 mg/kg)
reduziu significativamente a resposta pirogênica na terceira hora após a injeção
intravenosa de 5 µg/kg de LPS (de 1,3 ± 0,1ºC para 0,7 ± 0,1ºC; Fig. 06A).
Imediatamente após a última mensuração da temperatura corporal, os animais foram
anestesiados e o CSF e o hipotálamo coletados. Em animais que receberam salina i.v.
(controles), a quantidade de PGE
2
no hipotálamo foi de 938,7 ± 282,4 pg de PGE
2
/g de
tecido e não detectável no CSF. A injeção de LPS induziu um aumento significativo na
concentração de PGE
2
tanto no CSF (1511,2 ± 286,5 pg/ml) quanto no hipotálamo (2330,7
± 491,2 pg de PGE
2
/g de tecido). As figuras 06B e C mostram que o tratamento com a
indometacina reduziu em 76,9% o aumento de PGE
2
no CSF (349,1 ± 110,2 pg/ml) e
66,1% no hipotálamo (790,3 ± 159,6 pg de PGE
2
/g de tecido).
Para avaliar a concentração de PGE
2
no CSF e no hipotálamo durante o período no
qual a indometacina não apresentou efeito antipirético, 1,5 – 2,5 horas, após a injeção de LPS,
esse experimento foi reproduzido realizando a coleta de CSF e hipotálamo 2 horas após a
injeção intravenosa de LPS para dosagem de PGE
2
.
Duas horas após a injeção de LPS, a indometacina não alterou a febre induzida pelo
LPS (veículo/LPS: 1,6 ± 0,1ºC e indometacina/LPS: 1,5 ± 0,2ºC; Fig. 07A). Em animais
injetados com salina, a quantidade de PGE
2
no hipotálamo foi de 303,7 ± 45,2 pg de PGE
2
/g
de tecido e não detectada no CSF. A injeção de LPS induziu um aumento significativo dos
______________________________________________________________ Resultados
42
níveis de PGE
2
tanto no CSF (1050,0 ± 120,4 pg/ml) quanto no hipotálamo (891,6 ± 141,5 pg
de PGE
2
/g de tecido). O tratamento com a indometacina reduziu em 74,6% a concentração de
PGE
2
no CSF (267,1 ± 58,6 pg/ml) e em 54,0% no hipotálamo (409,7 ± 102,7 pg de PGE
2
/g
de tecido) (Fig. 07B e C).
______________________________________________________________ Resultados
43
0 1 2 3
0.0
0.5
1.0
1.5
Veículo / Salina (n=5)
Veículo / LPS (n=5)
Indo / LPS (n=5)
*
A
Tempo (h)
∆
T (ºC)
0
500
1000
1500
2000
ND
B
Veículo Veículo Indo
Salina
LPS
*
#
PGE
2
(pg/mL)
0
1000
2000
3000
Veículo Veículo Indo
Salina
LPS
#
*
C
PGE
2
(pg/g de Tecido)
Fig. 06 - Efeito da indometacina sobre a síntese de PGE
2
e a resposta febril induzida pelo LPS, 3
horas após a injeção do estímulo. A indometacina (Indo, 2 mg/kg, i.p.) ou veículo (TRIS, pH 8,2,
i.p.) foram administrados 30 minutos antes da injeção intravenosa de 5 µg/kg de LPS. A: média ±
EPM das variações na temperatura retal (∆T). B: Concentração de PGE
2
no CSF. C: Quantidade de
PGE
2
por grama de tecido hipotalâmico, coletados 3 horas após a injeção do LPS. As temperaturas
basais anteriores aos experimentos foram de 36,8 a 37,4 ºC. ND: não detectável. *p<0,05 e
#
p<0,05
quando comparado ao valor correspondente ao grupo veículo/salina e ao grupo veículo/LPS,
respectivamente.
______________________________________________________________ Resultados
44
0 1 2
0
1
2
Veículo / LPS
(n=5)
Indo / LPS (n=5)
Veículo / Salina (n=5)
*
*
A
Tempo (h)
∆
T(ºC)
0
500
1000
1500
Veículo Veículo Indo
Salina
LPS
ND
*
B
#
PGE
2
(pg/mL)
0
400
800
1200
#
*
C
Veículo Veículo Indo
Salina
LPS
PGE
2
(pg/g de Tecido)
Fig. 07 - Efeito da indometacina sobre a síntese de PGE
2
e a resposta febril induzida pelo LPS, 2
horas após a injeção do estímulo. A indometacina (Indo, 2 mg/kg, i.p.) ou veículo (TRIS, pH 8,2,
i.p.) foram administrados 30 minutos antes da injeção intravenosa de 5 µg/kg de LPS. A: média ±
EPM das variações na temperatura retal (∆T). B: Concentração de PGE
2
no CSF. C: Quantidade de
PGE
2
por grama de tecido hipotalâmico, coletados 2 horas após a injeção do LPS. As temperaturas
basais anteriores aos experimentos foram de 36,8 a 37,4 ºC. ND: não detectável. *p<0,05 e
#
p<0,05
quando comparado ao valor correspondente ao grupo veículo/salina e ao grupo veículo/LPS,
respectivamente.
______________________________________________________________ Resultados
45
4.4 - EFEITO DA DIPIRONA SOBRE SÍNTESE DE PGE
2
E A RESPOSTA FEBRIL
INDUZIDA PELO LPS
Para avaliar se o efeito antipirético da dipirona envolve a inibição da síntese de PGE
2
,
bem como se existe uma relação entre a quantidade de PGE
2
no hipotálamo e a concentração
de PGE
2
no CSF, tratamos os animais com dipirona e dosamos esse prostanóide no CSF e no
hipotálamo após o LPS.
O pré-tratamento i.p. com dipirona (120 mg/kg) aboliu a resposta pirogênica até a
terceira hora após a injeção i.v. de 5 µg/kg de LPS (de 1,3 ± 0,1ºC para 0,3 ± 0,1ºC; Fig.
08A). Em animais tratados com salina (controles), a quantidade de PGE
2
no hipotálamo
foi de 938,7 ± 282,4 pg de PGE
2
/g de tecido e não detectável no CSF. A injeção de LPS
induziu um aumento significativo da concentração de PGE
2
tanto no CSF (1511,2 ±
286,5 pg/ml) quanto no hipotálamo (2330,7 ± 491,2 pg de PGE
2
/g de tecido). A dipirona
inibiu o aumento dos níveis de PGE
2
em 76,9% no CSF (270,3± 88,2 pg/ml), sem alterar
a quantidade de PGE
2
no hipotálamo (2104,8 ± 281,1pg de PGE
2
/g de tecido) (Fig. 08B
e C).
A dipirona na dose usada nesse estudo perdeu seu efeito antipirético 60 minutos
após o tempo selecionado para a coleta (terceira hora) (Fig. 05A) e, ainda, essa droga foi
incapaz de inibir a síntese de PGE
2
no hipotálamo 3 horas após a injeção de LPS. Esses
resultados sugerem, porém não claramente, a existência de mecanismos antipiréticos
adicionais ao da inibição da síntese de prostaglandinas quanto ao efeito antipirético da
dipirona. Para confirmar essa hipótese, esse experimento foi reproduzido e avaliamos a
concentração de PGE
2
no CSF e no hipotálamo coletado 2 horas após a injeção i.v. de
LPS
.
Na segunda hora, a dipirona aboliu a febre induzida pelo LPS (de 1,6 ± 0,1ºC para 0,3
± 0,1ºC; Fig. 09A). Em animais controles, que receberam salina, a quantidade de PGE
2
no
______________________________________________________________ Resultados
46
hipotálamo foi de 303,7 ± 45,2 pg de PGE
2
/g de tecido e não significativa no CSF. A injeção
de LPS induziu um aumento significativo dos níveis de PGE
2
tanto no CSF (1050,0 ± 120,4
pg/ml) quanto no hipotálamo (891,6 ± 141,5 pg de PGE
2
/g de tecido). A dipirona inibiu o
aumento dos níveis de PGE
2
em 94,7% no CSF (55,8 ± 27,6 pg/ml), sem alterar a quantidade
de PGE
2
no hipotálamo (785,7 ± 137,3 pg de PGE
2
/g de tecido) (Fig. 09B e C).
______________________________________________________________ Resultados
47
0 1 2 3
0.0
0.5
1.0
1.5
Veículo / Salina (n=5)
Veículo / LPS (n=5)
Dipirona / LPS (n=5)
*
*
*
*
A
Tempo (h)
∆
T (ºC)
0
500
1000
1500
2000
#
*
Veículo Veículo Dipirona
Salina LPS
ND
B
PGE
2
(pg/mL)
0
1000
2000
3000
*
C
*
Veículo Veículo Dipirona
Salina LPS
PGE
2
(pg/g de Tecido)
Fig. 08 - Efeito da dipirona sobre síntese de PGE
2
e a resposta febril induzida pelo LPS, 3 horas
após a injeção do estímulo. A dipirona (120 mg/kg, i.p.) ou veículo (salina, i.p.) foram administrados
30 minutos antes da injeção i.v. de 5 µg/kg de LPS. A: média ± EPM das variações na temperatura
retal (∆T). B: Concentração de PGE
2
no CSF. C: Quantidade de PGE
2
por grama de tecido
hipotalâmico, coletados 3 horas após a injeção do LPS. As temperaturas basais anteriores aos
experimentos foram de 36,8 a 37,4 ºC. ND: não detectável. *p<0,05 e
#
p<0,05 quando comparado ao
valor correspondente ao grupo veículo/Salina e ao grupo veículo/LPS, respectivamente.
______________________________________________________________ Resultados
48
0 1 2
0
1
2
Dipirona / LPS
(n=5)
Veículo / LPS (n=5)
Dipirona / Salina (n=5)
*
*
A
Tempo (h)
∆
T(ºC)
0
500
1000
1500
ND
*
B
#
Veículo Veículo Dipirona
Salina LPS
PGE
2
(pg/mL)
0
400
800
1200
Veículo Veículo Dipirona
Salina
LPS
*
*
C
PGE
2
(pg/g de Tecido)
Fig. 09 - Efeito da dipirona sobre síntese de PGE
2
e a resposta febril induzida pelo LPS, 2 horas
após a injeção do estímulo. A dipirona (120 mg/kg, i.p.) ou veículo (salina, i.p.) foram administrados
30 minutos antes da injeção i.v. de 5 µg/kg de LPS. A: média ± EPM das variações na temperatura
retal (∆T). B: Concentração de PGE
2
no CSF. C: Quantidade de PGE
2
por grama de tecido
hipotalâmico, coletados 2 horas após a injeção do LPS. As temperaturas basais anteriores aos
experimentos foram de 36,8 a 37,4 ºC. ND: não detectável. *p<0,05 e
#
p<0,05 quando comparado ao
valor correspondente ao grupo veículo/Salina e ao grupo veículo/LPS, respectivamente.
______________________________________________________________ Resultados
49
4.5 - EFEITO DA INDOMETACINA SOBRE SÍNTESE DE PGE
2
E A RESPOSTA
FEBRIL INDUZIDA PELA ET-1
Diante da eficácia da indometacina em reduzir a valores basais a concentração de
PGE
2
no CSF sem alterar a febre induzida pela ET-1 (Fabricio et al., 2005), quantificamos
agora a concentração desse prostanóide também no hipotálamo de ratos pré-tratados ou não
com indometacina com o objetivo de verificar a existência de uma relação entre a febre e a
concentração de PGE
2
no hipotálamo.
Como mostra a figura 10A o tratamento i.p. com indometacina (2mg/kg, 30 minutos
antes) não alterou a resposta febril induzida pela administração i.c.v. de ET-1 (1 pmol/rato).
Três horas após a administração i.c.v. de aCSF, a concentração de PGE
2
no hipotálamo foi de
485,7 ± 43,71 pg de PGE
2
/g de tecido e não detectável no CSF. A injeção de ET-1 induziu um
aumento significativo da concentração de PGE
2
tanto no CSF (416,5 ± 74,6 pg/ml) quanto no
hipotálamo (820,3 ± 73,6 pg de PGE
2
/g de tecido). O tratamento com a indometacina inibiu o
aumento de PGE
2
em 97,2% no CSF (11,6 ± 7,5 pg/ml) e 86,6% no hipotálamo (110,0 ± 61,9
pg de PGE
2
/g de tecido) em animais injetados com ET-1 (Fig. 10B e C).
______________________________________________________________ Resultados
50
0 1 2 3
0.0
0.4
0.8
1.2
Veículo / aCSF
(n=5)
Veículo / ET-1 (n=6)
Indometacina / ET-1 (n=5)
*
*
*
*
*
*
A
Tempo (h)
∆
T(ºC)
0
250
500
Veículo Veículo Indo
aCSF ET-1
ND ND
*
B
PGE
2
(pg/mL)
0
500
1000
#
*
Veículo Veículo Indo
ET-1
C
aCSF
PGE
2
(pg/g de Tecido)
Fig. 10 - Efeito da indometacina sobre síntese de PGE
2
e a resposta febril induzida pela ET-1, 3
horas após a injeção do estímulo. A indometacina (Indo, 2 mg/kg, i.p.) ou veículo (TRIS, pH 8,2,
i.p.) foram administrados 30 minutos antes da injeção i.c.v. de ET-1 (1 pmol/rato). A: média ± EPM
das variações na temperatura retal (∆T). B: Concentração de PGE
2
no CSF. C: Quantidade de PGE
2
por grama de tecido hipotalâmico, coletados 3 horas após a injeção do ET-1. As temperaturas basais
anteriores aos experimentos foram de 36,8 a 37,4 ºC. ND: não detectável e NS: não significativo.
*p<0,05 e
#
p<0,05 quando comparado ao valor correspondente ao grupo veículo/aCSF e ao grupo
veículo/ET-1, respectivamente.
______________________________________________________________ Resultados
51
4.6 - EFEITO DA DIPIRONA SOBRE SÍNTESE DE PGE
2
E A RESPOSTA FEBRIL
INDUZIDA PELA ET-1
A dipirona foi capaz de diminuir a febre induzida pela ET-1. Dessa forma, tratamos os
animais com dipirona e dosamos a concentração de PGE
2
no CSF e hipotálamo, a fim de
entendermos melhor o mecanismo da ação antipirética da dipirona.
O pré-tratamento com dipirona (120mg/kg; i.p.) aboliu a resposta febril promovida
pela administração i.c.v. de ET-1 (1 pmol/rato) até a terceira hora (Fig. 11A). Em animais
injetados com aCSF, a quantidade de PGE
2
no hipotálamo 3h após a administração de ET-1
foi de 485,7 ± 43,71 pg de PGE
2
/g de tecido e não detectável no CSF. A ET-1 induziu um
aumento significativo das concentrações de PGE
2
tanto no CSF (416,5 ± 74,6 pg/ml) quanto
no hipotálamo (820,3 ± 73,6 pg de PGE
2
/g de tecido). A dipirona inibiu o aumento de PGE
2
no CSF a valores não detectáveis, sem alterar significativamente a quantidade de PGE
2
no
hipotálamo (758,5 ± 93,6 pg de PGE
2
/g de tecido) (Fig. 11B e C).
______________________________________________________________ Resultados
52
0 1 2 3
0.0
0.4
0.8
1.2
Veículo / aCSF
(n=5)
Veículo / ET-1 (n=6)
Dipirona / ET-1 (n=5)
*
*
*
*
*
*
A
Tempo (h)
∆
T(ºC)
0
250
500
ND
ND
*
Veículo Veículo Dipirona
aCSF ET-1
B
PGE
2
(pg/mL)
0
500
1000
Veículo Veículo Dipirona
aCSF ET-1
*
*
C
PGE
2
(pg/g de Tecido)
Fig. 11 - Efeito da dipirona sobre síntese de PGE
2
e a resposta febril induzida pela ET-1, 3 horas
após a injeção do estímulo. A dipirona (120 mg/kg, i.p.) ou veículo (salina, i.p.) foram administrados
30 minutos antes da injeção i.c.v. de ET-1 (1 pmol/rato). A: média ± EPM das variações na
temperatura retal (∆T). B: Concentração de PGE
2
no CSF. C: Quantidade de PGE
2
por grama de
tecido hipotalâmico, coletados 3 horas após a injeção da ET-1. As temperaturas basais anteriores aos
experimentos foram de 36,8 a 37,4 ºC. ND: não detectável. *p<0,05 e
#
p<0,05 quando comparado ao
valor correspondente ao grupo veículo/aCSF e ao grupo veículo/ET-1, respectivamente.
______________________________________________________________ Resultados
53
4.7 - EFEITO DA INDOMETACINA SOBRE SÍNTESE DE PGE
2
E A RESPOSTA
FEBRIL INDUZIDA PELO VENENO DE Tityus serrulatus
De forma similar ao observado na febre induzida pela ET-1, a indometacina não altera
a resposta febril induzida pelo vTs. Investigamos então, em animais tratados ou não com
indometacina, se existe correlação entre febre e concentração de PGE
2
no hipotálamo e CSF
na primeira hora, quando a febre já ultrapassa 1 ºC, após a administração i.p. do vTs.
A administração i.p. do veneno do escorpião T. serrulatus induziu uma resposta febril
de 1,3 ± 0,2 ºC na primeira hora e de 2,3 ± 0,3 ºC na segunda hora. O pré-tratamento com
indometacina (2 mg/kg) não alterou a febre induzida pelo veneno (1h: 1,2 ± 0,1ºC e 2h: 2,1 ±
0,1 ºC; Fig. 12A; 13A).
Em animais controles, tratados com salina, a concentração basal de PGE
2
no
hipotálamo foi de 390,4 ± 41,6 pg de PGE
2
/g de tecido na 1ª h e de 323,7 ± 40,9 pg de PGE
2
/g
de tecido na 2ª h, porém não detectável no CSF em nenhum dos tempos. A injeção do vTs não
alterou significativamente a concentração de PGE
2
tanto no CSF (não detectável) quanto no
hipotálamo (1h: 368,4 ± 69,9 pg de PGE
2
/g de tecido e 2h: 388,3 ± 30,5 pg de PGE
2
/g de
tecido) (Fig. 12B e C; 13B e C).
O tratamento com a indometacina, em animais injetados com vTs, não alterou a
concentração de PGE
2
no CSF (não detectável), entretanto reduziu a síntese deste prostanóide
no hipotálamo na primeira hora em 95,5% (16,6 ± 10,5 pg de PGE
2
/g de tecido) e na segunda
hora em 95,0% (19,6 ± 9,3 pg de PGE
2
/g de tecido) (Fig. 12B e C; 13B e C).
______________________________________________________________ Resultados
54
0.0 0.5 1.0
0.0
0.5
1.0
1.5
Veículo / Salina (n = 5)
Veículo / vTs (n = 6)
Indo / vTs (n = 5)
*
A
Tempo (h)
∆
T (ºC)
0
50
100
Veículo Veículo Indo
Salina vTs
ND ND
B
ND
PGE
2
(pg/mL)
0
100
200
300
400
500
#
Veículo Veículo Indo
Salina
vTs
C
PGE
2
(pg/g de Hipotálamo)
Fig. 12 - Efeito da indometacina sobre síntese de PGE
2
e a resposta febril induzida pelo veneno
de Tityus serrulatus, 1 hora após a injeção do estímulo. A indometacina (Indo, 2 mg/kg, i.p.) ou
veículo (TRIS, pH 8,2) foram administrados 30 minutos antes da injeção i.p. do veneno de T.
serrulatus (150 µg/kg, vTs). A: média ± EPM das variações na temperatura retal (∆T). B:
Concentração de PGE
2
no CSF. C: Concentração de PGE
2
por grama de tecido hipotalâmico,
coletados 1 hora após a injeção do veneno. As temperaturas basais anteriores aos experimentos foram
de 36,8 a 37,4 ºC. ND: não detectável. *p<0,05 e
#
p<0,05 quando comparado ao valor correspondente
ao grupo veículo/salina e ao grupo veículo/veneno, respectivamente.
______________________________________________________________ Resultados
55
0 1 2
0
1
2
3
Veículo / vTs
(n=5)
Indometacina / vTs (n=5)
Veículo / Salina (n=5)
*
*
*
A
Tempo (h)
∆
T(ºC)
0
250
500
Veículo Veículo Indo
Salina
vTs
ND
ND
ND
B
PGE
2
(pg/mL)
0
250
500
#
C
Veículo Veículo Indo
Salina
vTs
PGE
2
(pg/g de Tecido)
Fig. 13 - Efeito da indometacina sobre síntese de PGE
2
e a resposta febril induzida pelo veneno
de Tityus serrulatus, 2 horas após a injeção do estímulo. A indometacina (Indo, 2 mg/kg, i.p.) ou
veículo (TRIS, pH 8,2) foram administrados 30 minutos antes da injeção i.p. do veneno de T.
serrulatus (150 µg/kg, vTs). A: média ± EPM das variações na temperatura retal (∆T). B:
Concentração de PGE
2
no CSF. C: Concentração de PGE
2
por grama de tecido hipotalâmico,
coletados 2 horas após a injeção do veneno. As temperaturas basais anteriores aos experimentos foram
de 36,8 a 37,4 ºC. ND: não detectável. *p<0,05 e
#
p<0,05 quando comparado ao valor correspondente
ao grupo veículo/salina e ao grupo veículo/veneno, respectivamente.
______________________________________________________________ Resultados
56
4.8 - EFEITO DA DIPIRONA SOBRE SÍNTESE DE PGE
2
E A RESPOSTA FEBRIL
INDUZIDA PELO VENENO DE Tityus serrulatus
Até o momento, a dipirona foi demonstrada como a única droga antipirética capaz de
inibir a febre induzida pelo vTs (Pessini et al., 2006). Dessa forma, para entender o
mecanismo de ação desse antipirético, dosamos a quantidade de PGE
2
no hipotálamo e no
CFS na primeira hora após a administração de vTs a animais pré-tratados com dipirona.
O veneno do escorpião T. serrulatus induziu uma resposta febril de 1,3 ± 0,2 ºC na
primeira hora e de 2,3 ± 0,3 ºC na segunda hora após a injeção intraperitoneal do vTs. O pré-
tratamento com dipirona (120 mg/kg) aboliu a febre induzida pelo veneno (1h: 0,1 ± 0,1 ºC e
2h: 0,1 ± 0,1ºC; Fig. 14A e 15A).
Os animais controles, que foram injetados com salina, apresentaram uma concentração
basal de PGE
2
no hipotálamo (1h: 390,4 ± 41,6 pg de PGE
2
/g de tecido e 2h: 323,7 ± 40,9 pg
de PGE
2
/g de tecido), porém não detectável no CSF. A injeção do vTs não alterou
significativamente a concentração basal de PGE
2
tanto no CSF (não detectável) quanto no
hipotálamo (1h: 368,4 ± 69,9 pg de PGE
2
/g de tecido e 2h: 388,3 ± 30,5 pg de PGE
2
/g de
tecido) (Fig. 14B e C; 15B e C).
O tratamento com a dipirona reduziu a concentração hipotalâmico de PGE
2
na
primeira hora em 88,4% (42,9 ± 26,1 pg de PGE
2
/g de tecido) e na segunda hora em 70,8%
(113,4 ± 10,1 pg de PGE
2
/g de tecido) (Fig. 14B e C; 15B e C).
______________________________________________________________ Resultados
57
0.0 0.5 1.0
0.0
0.5
1.0
1.5
Veículo / Salina (n = 5)
Veículo / vTs (n = 6)
Dipirona / vTs (n = 6)
*
A
Tempo (h)
∆
T (ºC)
0
50
100
ND
Veículo Veículo Dipirona
Salina vTs
B
ND
ND
PGE
2
(pg/mL)
0
250
500
#
Veículo Veículo Dipirona
Salina vTs
C
PGE
2
(pg/g de Hipotálamo)
Fig. 14 - Efeito da dipirona sobre síntese de PGE
2
e a resposta febril induzida pelo veneno de
Tityus serrulatus, 1 hora após a injeção do estímulo. A dipirona (120 mg/kg, i.p.) ou o veículo
(salina) foram administrados 30 minutos antes da injeção i.p. de veneno de T. serrulatus (150 µg/kg,
vTs). A: média ± EPM das variações na temperatura retal (∆T). B: Concentração de PGE
2
no CSF. C:
Concentração de PGE
2
por grama de tecido hipotalâmico coletados 1 horas após a injeção do veneno.
As temperaturas basais anteriores aos experimentos foram de 36,8 a 37,4 ºC. ND: não detectável.
*p<0,05 e
#
p<0,05 quando comparado ao valor correspondente ao grupo veículo/salina e ao grupo
veículo/veneno, respectivamente.
______________________________________________________________ Resultados
58
0 1 2
0
1
2
3
Dipirona / vTs
(n=5)
Veículo / vTs (n=5)
Veículo / Veículo (n=5)
*
*
*
A
Tempo (h)
∆
T(ºC)
0
250
500
Veículo Veículo Dipirona
Salina
vTs
ND
ND
ND
B
PGE
2
(pg/mL)
0
250
500
#
C
Veículo Veículo Dipirona
Salina
vTs
PGE
2
(pg/g de Tecido)
Fig. 15 - Efeito da dipirona sobre síntese de PGE
2
e a resposta febril induzida pelo veneno de
Tityus serrulatus, 2 horas após a injeção do estímulo. A dipirona (120 mg/kg, i.p.) ou o veículo
(salina) foram administrados 30 minutos antes da injeção i.p. de veneno de T. serrulatus (150 µg/kg,
vTs). A: média ± EPM das variações na temperatura retal (∆T). B: Concentração de PGE
2
no CSF. C:
Concentração de PGE
2
por grama de tecido hipotalâmico coletados 2 horas após a injeção do veneno.
As temperaturas basais anteriores aos experimentos foram de 36,8 a 37,4 ºC. ND: não detectável.
*p<0,05 e
#
p<0,05 quando comparado ao valor correspondente ao grupo veículo/salina e ao grupo
veículo/veneno, respectivamente.
______________________________________________________________ Resultados
59
4.9 - EFEITO DO ANTAGONISTA SELETIVO DE RECEPTORES EP
3
, L-826266,
SOBRE A FEBRE INDUZIDA PELA INJEÇÃO INTRACEREBROVENTRICULAR DE
PGE
2
A investigação do envolvimento das prostaglandinas na resposta febril induzida por
diferentes agentes, neste estudo e em estudos anteriores de nosso grupo, foi feita até agora
utilizando como ferramenta fármacos que essencialmente reduzem a síntese de PGs e a
resposta febril induzida pelo LPS. Nessa parte do estudo, visamos certificar o envolvimento
da PGE
2
, utilizando como ferramenta o antagonista seletivo de receptores EP
3
L-826266.
O receptor EP
3
tem sido descrito por diversos grupos de pesquisa como um receptor
crucial para o desenvolvimento da febre induzida pela injeção central de PGE
2
ou sistêmica
de LPS (Ushikubi et al., 1998; Nakamura, 2005; Lazarus et al., 2007; Vasilache et al., 2007;
revisado por Morrison et al., 2008).
O pré-tratamento i.c.v. com o L-826266, antagonista seletivo de receptores EP
3
, 15
minutos antes da injeção i.c.v. de PGE
2
(250 ng/rato) reduziu em 37,5% a resposta febril
induzida pela PGE
2
(1,6 ± 0,1ºC) nas doses de 4,2 µg/rato (1,0 ± 0,1ºC; 1 molécula de
PGE
2
:10 moléculas de L-826266) e 8,4µg/rato (1,0 ± 0,2ºC; 1 molécula de PGE
2
:20
moléculas de L-826266), sem alterá-la na dose 2,1µg/rato (1,3 ± 0,2ºC; 1 molécula de PGE
2
:5
moléculas de L-826266). O L-826266 na dose 8,4 µg/rato não alterou a temperatura dos
animais controles (Fig. 16). Esses resultados indicam que, em ratos, o receptor EP
3
possui
apenas um papel parcial na instalação da resposta febril induzida pela injeção central de
PGE
2
.
______________________________________________________________ Resultados
60
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
0.0
0.5
1.0
1.5
Veículo / PGE
2
(n=10)
L-826266 2,1µg/rato / PGE
2
(n=5)
L-826266 4,2µg/rato / PGE
2
(n=11)
L-826266 8,4µg/rato / PGE
2
(n=6)
Veículo / Veículo (n=8)
L-826266 8,4µg/rato / Veículo (n=5)
*
Tempo (h)
Fig. 16 - Variação da temperatura dos animais tratados com L-826266 e injetados com PGE
2
. L-
826266 (2,1 µg/rato, 4,2 µg/rato ou 8,4 µg/rato, i.c.v.) ou o veículo (etanol 7%) foram administrados
15 minutos antes da injeção i.c.v. de PGE
2
(250 ng/rato). Os valores representam a média ± EPM das
variações na temperatura retal (∆T). As temperaturas corporais basais anteriores aos experimentos
foram de 36,8 a 37,4 ºC. *p<0,05 quando comparado ao grupo veículo/PGE
2
.
______________________________________________________________ Resultados
61
4.10 - EFEITO DO ANTAGONISTA SELETIVO DE RECEPTORES EP
3
, L-826266,
SOBRE A FEBRE INDUZIDA PELA INJEÇÃO INTRAVENOSA DE LPS
Diante da inibição parcial da febre induzida pela PGE
2
, o efeito antipirético do L-
826266 foi avaliado sobre a febre induzida pelo LPS. De forma inesperada, o pré-tratamento
i.c.v. 15 minutos antes com o L-826266 nas doses 0,5; 1,0; 2,1 e 4,2µg/rato não alterou a
resposta febril induzida pela injeção de LPS (5 µg/kg, i.v.) (Fig. 17). Na dose de 8,4µg/rato, o
L-836266 também não diminuiu a febre induzida pelo LPS, entretanto, reduziu
significativamente em 34,6% a febre induzida pela injeção i.c.v. de PGE
2
(250 ng/rato) (de
2,6 ± 0,1ºC para 1,7 ± 0,3ºC; Fig. 18).
______________________________________________________________ Resultados
62
0 1 2 3 4 5 6
0
1
2
L-826266 2,1µg/rato / LPS
L-826266 1,0µg/rato / LPS
L-826266 0,5µg/rato / LPS
Veículo / LPS
Veículo / Salina
A
Tempo (h)
∆
T (ºC)
0 1 2 3 4 5 6
0
1
2
L-826266 4,2µg/rato / LPS
L-826266 2,1µg/rato / LPS
Veículo / Salina
Veículo / LPS
B
Tempo (h)
∆
T (ºC)
Fig. 17 - Variação da temperatura dos animais pré-tratados com L-826266 e injetados com LPS.
L-826266 (0,5; 1,0; 2,1 ou 4,2 µg/rato, i.c.v.) ou o veículo (etanol 7%) foram administrados 15
minutos antes da injeção de LPS (5 µg/kg, i.v.). Os valores representam a média ± EPM das variações
na temperatura retal (∆T). As temperaturas basais corporais anteriores aos experimentos foram de 36,8
a 37,4 ºC.
______________________________________________________________ Resultados
63
Fig. 18 - Variação da temperatura dos animais pré-tratados com L-826266 e injetados com LPS
e PGE
2
. L-826266 (8,4 µg/rato, i.c.v.) ou veículo (etanol 7%) foram administrados 15 minutos antes
da injeção de PGE
2
(250 ng/rato; i.c.v.; A) ou LPS (5 µg/kg, i.v.; B). Os valores representam a média
± EPM das variações na temperatura retal (∆T). As temperaturas corporais basais anteriores aos
experimentos foram de 36,8 a 37,4 ºC. *p<0,05 quando comparado ao grupo veículo/PGE
2
.
0 1 2 3 4 5 6
0
1
2
3
Veículo / PGE
2
(n=5)
L-826266 8,4µg/rato / PGE
2
(n=6)
*
Veículo / Veículo (n=5)
A
Tempo (h)
∆
T (ºC)
0 1 2 3 4 5 6
0
1
2
Veículo / LPS (n=5)
L-826266 8,4µg/rato / LPS (n=5)
Veículo / Salina (n=4)
B
Tempo (h)
∆
T (ºC)
______________________________________________________________ Resultados
64
4.11 - EFEITO DO ANTAGONISTA SELETIVO DE RECEPTORES EP
3
, L-826266,
SOBRE A FEBRE INDUZIDA PELA INJEÇÃO I.C.V. DE ET-1 E I.P. DE VENENO
DE Tityus serrulatus
De forma esperada, o pré-tratamento i.c.v. 15 minutos antes, com o L-826266 (8,4
µg/rato) também não alterou a febre induzida pela injeção i.c.v. de ET-1 (1 pmol/rato) ou i.p.
de vTs (150 µg/kg) (Fig. 19), descartando uma participação relevante do receptor EP
3
na
resposta febril induzida pela injeção central de ET-1 e sistêmica de veneno do escorpião
Tityus serrulatus.
.
______________________________________________________________ Resultados
65
0 1 2 3 4 5 6
0.0
0.5
1.0
1.5
veículo / ET-1 (n=7)
L-826266 8,4µg/rato / ET-1 (n=8)
Veículo / aCSF (n=4)
L-826266 8,4mg/rato / aCFS (n=5)
Tempo (h)
∆
T (ºC)
0 1 2 3 4 5 6
0
1
2
3
L-826266 8,4µg/rato / vTs (n=4)
Salina / vTs (n=5)
Veículo / Salina (n=5)
L-826266 8,4µg/rato / Salina (n=5)
B
Tempo (h)
∆
T (ºC)
Fig. 19 - Variação da temperatura dos animais pré-tratados com L-826266 e injetados com ET-1
ou veneno do escorpião Tityus serrulatus. L-826266 (8,4 µg/rato, i.c.v.) ou veículo (etanol 7%) foram
administrados 15 minutos antes da injeção de ET-1 (1 pmol/rato, i.c.v.; A) ou vTs (150 µg/kg, i.p.; B).
Os valores representam a média ± EPM das variações na temperatura retal (∆T). As temperaturas
corporais basais anteriores aos experimentos foram de 36,8 a 37,4 ºC.
______________________________________________________________ Resultados
66
4.12 - EFEITO DO ANTAGONISTA SELETIV,O DE RECEPTORES EP
3
, L-826266,
SOBRE O EDEMA INDUZIDO PELA INJEÇÃO INTRAPLANTAR DE PGE
2
Claudino e colaboradores (2006) demonstraram que o antagonista seletivo de
receptores EP
3
L-826266 inibe o edema induzido pela injeção de PGE
2
em camundongos.
Diante da redução de apenas 35% da febre induzida pela injeção central de PGE
2
e da
inesperada ineficácia antipirética na febre induzida pela injeção sistêmica de LPS do
tratamento com o L-826266, resolvemos testar o efeito antiedematogênico do L-826266 no
edema induzido pela injeção intraplantar de PGE
2
em ratos, a fim de avaliar se nossa amostra
de L-826266 preservava sua capacidade de antagonizar os efeitos da PGE
2
dependentes do
receptor EP
3
.
O pré-tratamento, 30 minutos antes, intraplantar com L-826266 (10 nmol/pata) inibiu
significativamente em 64,4% e 53,4% nos primeiros 15 e 30 minutos, respectivamente, o
edema induzido pela injeção intraplantar de PGE
2
(3 nmol/pata) (Fig. 20), confirmando que
nossa amostra de L-826266 possui a capacidade de antagonizar os efeitos da PGE
2
dependentes da ativação do receptor EP
3
.
______________________________________________________________ Resultados
67
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
L-826266 (10nmol/pata) / PGE
2
Veículo / PGE
2
*
*
Tempo (h)
∆
volume da pata (mL)
Fig. 20 – Efeito anti-edematogênico do L-826266 em ratos injetados com PGE
2
. L-826266 (10
nmol/pata, intraplantar) ou veículo (etanol) foram administrados 30 minutos antes da injeção de PGE
2
(3 nmol/pata, intraplantar). Os valores representam a média ± EPM da variação (∆) no volume da pata.
*p<0,05 quando comparado ao grupo veículo/PGE
2
.
5 DISCUSSÃO
_______________________________________________________________ Discussão
69
Os resultados do presente estudo confirmam dados anteriores de nosso laboratório de
que a resposta febril induzida pela administração central de ET-1 ou sistêmica do veneno de
Tityus serrulatus (vTs) independem da síntese de PGE
2
(Fabrício et al., 2005; Pessini et al.,
2006). Adicionalmente, evidenciamos que existe uma correlação, embora não temporal, entre
a presença de PGE
2
no CSF e no hipotálamo de animais que receberam indometacina
anteriormente ao LPS.
De forma inesperada, este estudo demonstrou que o vTs não promove aumento da
concentração de prostaglandinas seja no hipotálamo ou no CSF, porém induz febre alta e
extremamente sensível à dipirona, corroborando com resultados anteriores de nosso grupo de
que a dipirona atue sobre outros alvos no desenvolvimento de sua ação antipirética (De Souza,
2002).
Outro resultado também surpreendente do presente estudo foi a aparente inoperância
dos receptores EP
3
sobre a resposta febril induzida pelo LPS.
Efeito da indometacina e da dipirona sobre a resposta febril induzida pelo LPS, pela
ET-1 e pelo veneno do escorpião Tityus serrulatus
Em 1971, Vane relacionou o efeito das drogas antiinflamatórias não-esteroides
(AINES) à inibição da síntese das prostaglandinas (PGs), e Milton & Wedlandt (1971)
propuseram que as substâncias pirogênicas poderiam induzir febre por meio da produção de
PGs específicas e que essas drogas antiinflamatórias reduziriam a febre por meio do bloqueio
da sua síntese.
As PGs são moléculas de origem lipídica, derivadas do metabolismo do ácido
araquidônico, o qual é formado a partir da clivagem de fosfolipídeos de membrana pela ação
das fosfolipases, principalmente da fosfolipase A
2
. A conversão do ácido araquidônico em
endoperóxidos cíclicos (PGG
2
e PGH
2
) ocorre pela ação da enzima ciclooxigenase (COX).
_______________________________________________________________ Discussão
70
Essa enzima existe em duas isoformas, referidas como COX-1 e COX-2. A COX-1 é
constitutivamente expressa em vários tecidos, sendo em maior intensidade na micróglia, no
hipocampo e em neurônios corticais do cérebro de ratos (Yagami, 2006). Já a COX-2 não é
expressa em condições fisiológicas, exceto no sistema nervoso central (SNC), rins, pulmão e
órgãos reprodutivos. No SNC a COX-2 têm sido constitutivamente detectada no córtex,
hipotálamo, hipocampo, amígdala e medula espinal (Breder, et al., 1995; Beiche, et al., 1996;
Hétu & Riendeau, 2005). A COX-2 é induzida no encéfalo em resposta a diversos estímulos
inflamatórios, tais como o LPS e a ET-1 (Fabrício et al., 2005), e tem sido implicada na
geração de febre e hiperalgesia (Hétu & Riendeau, 2005).
No presente estudo estudo, verificamos que a indometacina, um inibidor não-seletivo
de COX-1/COX-2, embora tenha reduzido significativamente a resposta febril induzida pela
injeção i.v. de LPS (5µg/kg), não alterou a febre induzida pela injeção i.c.v. de ET-1
(1pmol/rato) ou pela injeção i.p. de veneno do escorpião T. serrulatus (150µg/kg) (Fig. 04).
Em contrapartida, o tratamento com dipirona reduziu significativamente a febre induzida pelo
LPS, ET-1 e veneno do escorpião T. serrulatus (Fig. 05). Esses resultados estão de acordo
com resultados prévios do nosso laboratório (De Souza et al., 2002; Fabrício, 2002; Pessini et
al., 2006) e sugerem que a febre induzida pela ET-1 e vTs são independentes da síntese de
PGE
2
e, ainda, que a dipirona induz febre por mecanismos independentes da inibição da
síntese de prostaglandinas.
Efeito da indometacina e da dipirona sobre síntese de PGE
2
e a resposta febril induzida
pelo LPS
Para elucidar se o aumento da concentração de PGE
2
no CSF durante a resposta febril
induzida pelo LPS reflete aquela formada no hipotálamo de ratos, o CSF e o hipotálamo de
animais pré-tratados com indometacina ou dipirona e injetados com LPS foram coletados e a
_______________________________________________________________ Discussão
71
PGE
2
foi dosada. Corroborando resultados prévios de nosso laboratório (De Souza et al.,
2002; Fabrício et al., 2005), na segunda hora, apenas a dipirona apresentou efeito antipirético,
entretanto, na terceira hora após a injeção sistêmica de LPS tanto a indometacina quanto a
dipirona apresentaram efeito antipirético. Desse modo, esses períodos foram selecionados
para a realização das coletas de CSF e hipotálamo.
Os animais controles, tratados com salina, apresentaram na segunda hora uma
quantidade basal média de PGE
2
de 303,7 pg/g no hipotálamo e concentrações não detectáveis
no CSF. Duas horas após a injeção de LPS ocorreu um aumento dos níveis de PGE
2
no CSF e
no hipotálamo, assim como observado anteriormente por Sehic e colaboradores (1996). O
tratamento com indometacina não alterou a febre, porém reduziu significativamente o
aumento da concentração de PGE
2
tanto no CSF quanto no hipotálamo nessa mesma hora
(Fig. 07), demonstrando uma ausência de relação entre a febre e a quantidade de PGE
2
tanto
no CSF quanto no hipotálamo durante o início da febre induzida pelo LPS. Três horas após a
injeção de salina, os animais controles apresentaram uma quantidade basal média de PGE
2
de
938,7 pg/g no hipotálamo e níveis não detectáveis no CSF. Como esperado, o LPS induziu um
aumento de PGE
2
no CSF (Fabrício et al, 2005) e no hipotálamo (Fabrício et al, 2006), três
horas após sua injeção. A indometacina reduziu significativamente a febre e o aumento dos
níveis de PGE
2
tanto no CSF quanto no hipotálamo na terceira hora após a injeção do LPS
(Fig. 06), evidenciando uma relação positiva entre a febre e a quantidade de PGE
2
nessa hora.
Em concordância com os nossos resultados, Sehic e colaboradores (1996) também
demonstraram em cobaias que a indometacina na dose de 10mg/kg atenua e na dose de
50mg/kg inibe a febre e que ambas abolem a síntese de PGE
2
na POA, durante todo o
experimento.
Esses resultados demonstram que existe uma correlação, embora não temporal, entre a
presença de PGE
2
no CSF e hipotálamo de animais que receberam indometacina
_______________________________________________________________ Discussão
72
anteriormente ao LPS e, ainda, sugerem que o gatilho da febre induzida pelo LPS pode não
depender da síntese de PGE
2
, entretanto, a manutenção dessa resposta é dependente desta
prostaglandina.
A dipirona aboliu a febre e inibiu o aumento dos níveis de PGE
2
no CSF, porém não
alterou a concentração de PGE
2
no hipotálamo na segunda e na terceira hora após a
administração de LPS (Fig. 08 e 09). Esses resultados demonstram que o aumento de PGE
2
no
CSF não está, necessariamente, relacionado com um aumento da concentração de PGE
2
no
hipotálamo e evidenciam ainda a importância da dosagem da PGE
2
na área encefálica de
interesse. Além disso, esse resultado confirma sugestão anterior de nosso grupo de que a
dipirona apresenta mecanismos antipiréticos adicionais ao da inibição da síntese de
prostaglandinas (De Souza et al., 2002), uma vez que esta droga inibiu a febre sem alterar
significativamente a concentração de PGE
2
no hipotálamo.
Efeito da indometacina e da dipirona sobre síntese de PGE
2
e a resposta febril induzida
pela ET-1
Resultados anteriores do nosso laboratório sugerem que a ET-1 seja um mediador
intermediário na febre induzida pelo LPS, participando de uma via independente de PGs que
envolve a liberação de PFPF, CRF, ET-1 (via receptores ET
B
) e IL-1β ou opióides endógenos
(Fig. 02, Fabrício et al., 2006; Fraga et al., 2008). Para confirmar a participação da ET-1 na
via independente de PGE
2
proposta por nosso laboratório, o CSF e o hipotálamo de animais
pré-tratados com indometacina ou dipirona e injetados centralmente com ET-1 (1 pmol/rato,
i.c.v.) foram coletados para dosagem de PGE
2
.
Os animais injetados com salina apresentaram uma quantidade basal média de PGE
2
de 485,7 pg/g no hipotálamo e concentrações não detectáveis no CSF. Como esperado, a
injeção de ET-1 induziu um aumento de PGE
2
no CSF (Fabricio et al., 2005) e no hipotálamo
_______________________________________________________________ Discussão
73
(Fabrício et al., 2006). Também esperado foi o fato de a indometacina, três horas após a
injeção da ET-1, não alterar a febre, porém inibir o aumento da quantidade de PGE
2
no CSF
(Fabricio et al., 2005) e também no hipotálamo (Fig. 10) (Sehic et al., 1996). Esses resultados
demonstram que a ET-1 induz febre mesmo na ausência de PGE
2
, o que corrobora com
nossos resultados anteriores, reforçando a proposta de que a ET-1 independe da síntese de
PGE
2
para exercer seus efeitos pirogênicos (Fabricio et al., 1998; 2005).
Nos mesmos tempos acima estudados, a dipirona inibiu significativamente a febre e o
aumento da concentração de PGE
2
no CSF, porém não alterou a quantidade de PGE
2
no
hipotálamo (Fig. 11). Esse resultado reforça nossa proposta de que o aumento de PGE
2
no
CSF não está necessariamente relacionado a um aumento da PGE
2
hipotalâmica e evidencia a
importância da dosagem da PGE
2
nesta área encefálica. Adicionalmente, esse resultado
também reforça nossa proposta de que a dipirona apresenta mecanismos antipiréticos
adicionais ao da inibição da síntese de prostaglandinas, uma vez que esta droga inibiu a febre
sem alterar significativamente a concentração de PGE
2
no hipotálamo (De Souza et al., 2002).
Efeito da indometacina e da dipirona sobre síntese de PGE
2
e a resposta febril induzida
pelo vTs
A resposta febril induzida pelo veneno do escorpião Tityus serrulatus (vTs) é
insensível ao inibidor seletivo da COX-2, celecoxibe, e ao não-seletivo das COXs, ibuprofeno
(Pessini et al., 2006), sugerindo um possível efeito pirogênico independente da síntese de
PGs. Entretanto, a febre induzida por este agente é sensível à dipirona (Pessini et al., 2006). A
fim de avaliar a participação da PGE
2
na febre induzida pelo vTs, o CSF e o hipotálamo de
animais pré-tratados com indometacina ou dipirona e injetados com o vTs (150µg/kg, i.p.)
foram coletados para dosagem de PGE
2
. Devido à diferente curva-temporal da febre induzida
_______________________________________________________________ Discussão
74
pela injeção de vTs com pico entre a 1ª h e 2,5ª h após a injeção do vTs, a coleta do CSF e
hipotálamo foram realizadas na primeira e segunda hora após a injeção de vTs.
Nossos resultados mostraram que os animais que receberam salina, animais controle,
apresentaram uma quantidade hipotalâmica basal média de PGE
2
na primeira hora de 390,4
pg/g de tecido e concentrações não detectáveis no CSF e que a injeção de vTs induziu uma
resposta febril de 1,3 ºC na primeira hora, sem alterar a concentração de PGE
2
no hipotálamo
ou no CSF nesse tempo. Além disso, verificamos que tanto a indometacina quanto a dipirona
diminuíram a concentração hipotalâmica de PGE
2
na primeira hora em 97,7% e 88,4% (Fig.
12), respectivamente, ficando abaixo dos valores basais, provavelmente pela inibição de
enzimas COXs constitutivas. Contudo, somente a dipirona aboliu a resposta febril induzida
pelo veneno (Fig. 14).
Entretanto, sabe-se que o vTs é um indutor periférico da síntese de PGE
2
(De Matos et
al., 1997; Nascimento et al., 2005) e, dessa forma, é possível que na primeira hora ainda não
seria tempo suficiente para o vTs induzir um aumento na síntese de PGE
2
no CSF e/ou
hipotálamo. Por isso, esse experimento foi reproduzido e o CSF e o hipotálamo foram
coletados na segunda hora, momento da resposta febril máxima, a fim de avaliar se o vTs
induz a síntese central de PGE
2
nesse momento e, ainda, se essa PGE
2
participa da febre
induzida pelo vTs.
Na segunda hora após a injeção de salina, os animais apresentaram uma quantidade
hipotalâmica basal média de PGE
2
de 323,7 pg/g de tecido e concentrações não detectáveis no
CSF. A injeção de vTs induziu uma resposta febril de 2,3 ºC, sem alterar os níveis de PGE
2
no
hipotálamo ou no CSF nesse mesmo tempo. Além disso, tanto a indometacina quanto a
dipirona diminuíram as concentrações hipotalâmicos de PGE
2
na segunda hora em 98,5% e
70,8% (Fig. 13), respectivamente, ficando abaixo dos valores basais, provavelmente pela
inibição de enzimas COX-1 e COX-2 constitutivas do hipotálamo (Hétu & Riendeau, 2005).
_______________________________________________________________ Discussão
75
Entretanto, somente a dipirona aboliu a resposta febril induzida pelo veneno (Fig. 15). Esses
resultados reforçam os dados de Pessini et al (2006), que desvinculam a participação deste
prostanóide na febre induzida pelo vTs uma vez que observaram que tanto o celecoxibe
quanto o ibuprofeno não inibem esta resposta e, ainda, demonstram que o mecanismo
antipirético da dipirona independe da inibição da síntese de PGE
2
.
Recentes estudos demonstraram que a injeção i.v. de LPS em cobaias ativa terminais
vagais pirogênico que projetam fibras para o núcleo trato solitário (NTS) que, por sua vez,
eniam projeções noradrenérgicas para a área pré-óptica ventro medial (VMPO), culminando
na liberação de noradrenalina na POA. A ação da noradrenalina em receptores α
2
de
astrócitos induz uma resposta febril tardia e dependente de PGE
2
, ao passo que sua ligação em
receptores α
1
de neurônios sensíveis ao calor induz uma resposta febril rápida e independente
de PGE
2
(Feleder et al., 2007; revisado por Blatteis, 2008). Nosso grupo demonstrou que a
febre induzida pelo vTs depende da neurotransmissão vagal (Pessini, 2006) e, dessa forma,
uma ativação seletiva de receptores α
1
de neurônios sensíveis ao calor poderia explicar a febre
independente de PGE
2
induzida pelo vTs. Além disso, recentemente mostramos que os
opióides endógenos participam da via pirogênica independente de PGE
2
do LPS, como um
dos mediadores finais (Fraga et al., 2008). Esta evidência nos recomenda futuras
investigações da participação dos opióides endógenos na febre induzida pelo vTs, uma vez
que o vTs poderia induzir febre pelo recrutamento do sistema opióide, explicando seu efeito
pirogênico independente de PGE
2
.
Mecanismo antipirético da dipirona
A dipirona (metamizol) é um derivado pirazolônico amplamente utilizado devido a sua
eficácia como antipirético e analgésico, sendo uma droga de primeira escolha na terapia
antipirética em vários países do mundo. No entanto, esta droga é praticamente desprovida de
_______________________________________________________________ Discussão
76
efeito antiinflamatório (Lorenzetti & Ferreira, 1985; Abramson & Weissmann, 1989; Lüthy et
al., 1983; Eldor et al., 1984) e seu mecanismo de ação antipirético ainda não se encontra
totalmente elucidado.
Após sua administração, a dipirona é rapidamente convertida por hidrólise em 4-
metilaminoantipirina (MAA), que é metabolizado em seguida a 4-formilaminoantipirina
(FAA), 4-aminoantipirina (AA) e 4-acetilaminoantipirina (AAA) (Cohen et al., 1998).
Estudos ex vivo e in vitro recentes demonstraram que a dipirona inibe tanto a enzima COX-1
quanto a COX-2 (Brune et al., 2007) por ação de dois dos seus metabólitos ativos, MAA
(inibidor de COX-1 e COX-2) e AA (inibidor COX-2) (Pierre et al., 2007). Em humanos, os 4
principais metabólitos da dipirona estão presentes no CSF entre 15 e 30 minutos após a
administração oral da dipirona, sugerindo que a dipirona e/ou seus metabólitos são capazes de
atravessar a barreira hematoencefálica (Cohen et al., 1998), justificando a inibição da síntese
de PGE
2
no CSF de animais injetados com LPS ou ET-1 (Fig. 05B e 06B). Não existem
estudos que avaliaram a chegada desses metabólitos em uma região encefálica específica, e a
ausência da inibição da síntese de PGE
2
no hipotálamo induzida pela injeção de LPS ou ET-1
(Fig. 05C e 06C) sugere que esses metabólitos, na dose antipirética de dipirona utilizada nesse
estudo (120 mg/kg), podem não alcançar a área hipotalâmica em concentração efetiva para a
inibição da síntese de PGE
2
frente a estímulos indutores da enzima COX-2. Entretanto, a
dipirona foi capaz de diminuir a quantidade de PGE
2
no hipotálamo abaixo dos valores basais
em animais injetados com vTs (Fig. 11C e 12C), sugerindo a chegada de seus principais
metabólitos ao hipotálamo em quantidade efetiva para inibir a síntese de PGE
2
na ausência de
um estímulo indutor de COX-2.
Nossos resultados indicam que o efeito antipirético da dipirona não está relacionado
com a inibição da síntese de PGE
2
(Fig. 08; 09; 11; 14 e 15). Tem sido observado que a
dipirona bloqueia a hipernocicepção induzida pelo glutamato em camundongos (Beirith et al.,
_______________________________________________________________ Discussão
77
1998). Adicionalmente, vários trabalhos têm evidenciado a participação deste
neurotransmissor tanto na via de sinalização (Huang et al., 2004; Huang et al., 2006; Kao et
al., 2007; Kao et al., 2007), quanto na via efetora da febre (Madden & Morrison, 2003 e 2004;
Nakamura et al., 2004; Cao & Morrison, 2006) e nas vias envolvidas na termorregulação
(Nakamura & Morrison, 2008a e 2008b). Dessa forma, é possível que a dipirona possa reduzir
a febre pelo bloqueio do glutamato, como ocorre na hiperalgesia (Beirith et al., 1998).
Participação do receptor EP
3
na febre induzida pela PGE
2
, pelo LPS, pela ET-1 e pelo
vTs
Estudos recentes demonstraram que o antagonista seletivo do receptor EP
3
L-826266
aboliu tanto a hipernocicepção quanto o edema de pata induzido pela PGE
2
em doses
equivalentes a 5 moléculas de L-826266 para cada molécula de PGE
2
(Claudino et al., 2006;
Kassuya et al., 2007). A análise de camundongos deficientes para os subtipos de receptores
EP
1
ou EP
3
de PGE
2
mostrou que somente o camundongo deficiente do receptor EP
3
falha
completamente em desenvolver resposta febril a PGE
2
, IL-1β ou LPS e, ainda, apresenta uma
intensificação na resposta hipotérmica induzida pelo LPS; e ainda que camundongos
deficientes em receptor EP
1
demonstraram uma atenuação apenas parcial da febre induzida
por LPS (Oka et al., 2003; Ushikubi et al., 1998). Além disso, a deleção gênica do receptor
EP
3
especificamente em neurônios distribuídos na MnPO e na MPO abole a resposta febril
induzida por PGE
2
ou LPS (Lazarus et al., 2007). Essa linha de evidências indica que o
receptor EP
3
na porção somatodendrítica de neurônios da POA é o principal alvo de ação da
PGE
2
para a sua ação pirogênica, e que a ativação desses receptores pela PGE
2
dispara o
processo neuronal para a indução da febre (Morrison et al., 2008).
No presente estudo, injeções i.c.v. do L-826266 nas doses de 1,05 µg/rato (2,5
moléculas de L-826266 : 1 de PGE
2
) e 2,10 µg/rato (5 moléculas de L-826266 : 1 de PGE
2
)
_______________________________________________________________ Discussão
78
não alterou a febre induzida pela PGE
2
e reduziu apenas parcialmente essa resposta, em
aproximadamente 35%, nas doses 4,2µg/rato (10 moléculas de L-826266 : 1 de PGE
2
) e
8,4µg/rato (20 moléculas de L-826266 : 1 de PGE
2
) (Fig. 16).
De forma inesperada, o pré-tratamento com L-826266 em diversas doses (0,5; 1,0; 2,1;
4,2; 8,4 µg/rato) não alterou a resposta febril induzida pela injeção intravenosa de LPS (Fig.
17 e 18), sugerindo que esse receptor parece não ser essencial para o desenvolvimento da
resposta febril. De forma previsível, o pré-tratamento com L-826266, na dose de 8,4 µg/rato,
também não alterou a febre induzida por injeção central de ET-1 ou injeção sistêmica de vTs,
desvinculando a participação desse receptor na febre induzida por esses estímulos (Fig. 19).
O fato do L-826266 apresentar um efeito apenas parcial na febre induzida pela PGE
2
e
nenhum efeito sobre a febre induzida pelo LPS nos levou a pensar que nossa amostra de L-
826266 pudesse ter perdido sua atividade de antagonizar o receptor EP
3
. Por isso, realizamos
o experimento de edema de pata induzida pela PGE
2
, com o objetivo de reproduzir o
experimento publicado por Claudino e colaboradores (2006). Em nosso experimento, o L-
826266 inibiu significativamente o edema de pata induzido pela PGE
2
em ratos (Fig. 20) de
forma similar à inibição encontrada em camundongos por Claudino e colaboradores (2206),
demonstrando que nossa amostra de L-826266 preservava sua capacidade de bloquear os
efeitos da PGE
2
dependente do receptor EP
3
. Entretanto, o L-826266 apresentou efeito
antipirético e antiedematogênico apenas nos primeiros 30 minutos após a injeção de PGE
2
, o
que pode sugerir uma meia vida muito curta e justificar sua ausência de efeito sobre a febre
induzida pelo LPS, uma vez que essa resposta só inicia 1,5 - 2h após a injeção de LPS.
Baseando-se em estudos utilizando camundongos knockout dos receptores EP
3
(Ushikubi et al., 1998; Lazarus et al., 2007) a maioria dos autores atribuíram uma maior
relevância a este receptor no gatilho da resposta febril (Nakamura, 2005; Lazarus et al., 2006;
Morrison et al., 2008). Entretanto, alguns estudos contradizem essa hipótese e indicam que o
_______________________________________________________________ Discussão
79
subtipo de receptor de PGE
2
importante na gênese da febre pode variar de acordo com a
espécie animal em estudo. Parrott e Vellucci (1996) evidenciaram que os receptores EP
2
e EP
3
estão diretamente relacionados com a febre induzida pela injeção i.c.v. de PGE
2
em porcos.
Estudos em ratos Sprague-Dawley utilizando agonistas seletivos para os diferentes subtipos
de receptores de PGE
2
sugerem que tanto o receptor EP
1
quanto o EP
3
são importantes na
instalação da febre induzida pela PGE
2
(Oka et al., 2003). Além disso, esse mesmo estudo
indica que o receptor EP
4
pode ter um papel regulador promovendo uma resposta hipotérmica,
evitando, assim, um aumento exagerado da temperatura corporal, e que o EP
2
não participa da
febre induzida pela PGE
2
(Oka et al., 2003).
Em nosso estudo, o L-826266 inibiu apenas parcialmente a febre induzida pela PGE
2
(Fig. 16 e 18), provavelmente, devido à ativação de receptores EP
1
pela PGE
2
. A ausência de
efeito do L-826266 sobre a febre induzida pela injeção de LPS (Fig. 17) sugere que esse
receptor não seja crucial na instalação da resposta febril, possivelmente devido a uma ativação
indireta pela da indução da síntese de PGE
2
na POA, de receptores EP
1
capaz de induzir a
resposta pirogênica máxima. Oka e colaboradores (2003) demonstraram que: i) a
administração i.v. de 10µg/kg e 100µg/kg de LPS induz uma resposta febril dose dependente
em camundongos selvagens; ii) a injeção dessas doses em camundongos knockout para
receptores EP
3
induz hipotermia também de forma dose dependente e; iii) a injeção de doses
que causam hipotermia nos selvagens (1mg/kg) acentua essa resposta nos knockout dos
receptores EP
3
. Esses dados sugerem a participação desse receptor na proteção contra a
hipotermia induzida pelo LPS. Sendo assim, nosso estudo também indica que o receptor EP
3
não participa da proteção contra a hipotermia induzida pelo LPS em ratos. Adicionalmente,
nossos resultados também demonstram que o receptor EP
3
não participa da febre induzida
pela ET-1 e pelo vTs.
6 CONCLUSÕES
______________________________________________________________Conclusões
81
6.1 - CONCLUSÕES PARCIAIS
1)
O aumento de PGE
2
no CSF não sugere necessariamente um aumento na concentração
de PGE
2
no hipotálamo e evidenciam a importância da dosagem da PGE
2
na área
encefálica de interesse;
2) Existe uma correlação, embora não temporal, entre a presença de PGE
2
no CSF e no
hipotálamo de animais que receberam indometacina anteriormente ao LPS, sugerindo
que o gatilho da febre induzida pelo LPS pode não depender da síntese de PGE
2
,
entretanto que a manutenção dessa resposta provavelmente seja dependente de PGE
2
;
3)
A ET-1 induz aumento da síntese de PGE
2
no CSF e no hipotálamo, entretanto não
existe uma relação entre o aumento desse prostanóide e a resposta febril induzida pela
ET-1 em animais pré-tratados com indometacina, o que desvincula a participação da
PGE
2
na febre induzida pela ET-1;
4)
O vTs não induz aumento da síntese de PGE
2
no CSF ou no hipotálamo, o que
desvincula a participação desse prostanóide na febre induzido pelo vTs;
5) Na dose utilizada, a dipirona inibiu a síntese de PGE
2
no CSF, porém não alterou a
quantidade de PGE
2
no hipotálamo de animais injetados com indutores de COX-2,
LPS e ET-1, sugerindo que a dipirona e/ou seus metabólitos não atingem
concentrações efetivas para uma inibição significativa de COX induzida no
hipotálamo. Contudo, quantidades suficientes deste antipirético em outras áreas
encefálicas e/ou células endoteliais dos órgãos circunventriculares poderia ser
responsável pela redução significativa da síntese de PGE
2
nessas regiões e,
conseqüentemente, da quantidade desse prostanóide no CSF;
6)
Na dose utilizada, a dipirona inibiu a síntese de PGE
2
no hipotálamo de animais
injetados com vTs, sugerindo que a dipirona e/ou seus metabólitos chegam em
concentrações efetivas para uma inibição significativa de COXs constitutivas no
______________________________________________________________Conclusões
82
hipotálamo, nessas condições em que o pirogênio exógeno não induz a formação de
PGE
2
no hipotálamo;
7)
O efeito antipirético da dipirona na dose utilizada não depende da inibição da síntese
de PGE
2
no hipotálamo;
8)
O antagonista seletivo do receptor EP
3
inibiu apenas parcialmente a febre induzida
pela injeção i.c.v. de PGE
2
, indicando que esse receptor tem importância apenas
parcial na resposta febril induzida pela PGE
2
;
9)
O antagonista seletivo de receptor EP
3
L-826266 não alterou a febre induzida pelo
LPS, sugerindo que este não seja crucial na instalação da resposta febril induzida por
esse estímulo e, adicionalmente, sugerindo uma relevante participação do receptor EP
1
nessa resposta;
10)
O receptor EP
3
também parece não ter relevância na febre induzida pela injeção i.c.v.
de ET-1 ou i.p. de vTs.
6.2 - CONCLUSÃO GERAL
Nosso estudo demonstrou que os estímulos indutores de febre podem ser
dependentes de PGE
2
(LPS), independentes, porém indutores da síntese de PGE
2
(ET-1)
ou independentes e não indutores da síntese de PGE
2
(vTs). Este estudo também
demonstrou que os mecanismos de ação dos antipiréticos não se restringem à inibição da
síntese de PGE
2
, haja vista a dipirona, que aboliu tanto respostas febris dependentes
quanto independentes de PGE
2
sem alterar a quantidade de PGE
2
hipotalâmica.
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
__________________________________________________ Referências Bibliográficas
84
ABRAMSON, S.R.; WEISSMANN, G. The mechanisms of action of non-steroidal anti-
inflammatory drugs. Arthrits Rheum., v. 32, p.1-9, 1989.
AEBERHARD, E.E.; HENDERSON, S.A.; ARABOLOS, N.S.; GRISCAVAGE, J.M.;
CASTRO, F.E.; BARRETT, C.T.; IGNARRO, L.J. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs
inhibit expression of the inducible nitric oxide synthase gene. Biochem. Biophys. Res.
Commun., v.208, p.1053-1059, 1995.
AIHARA, E.; NOMURA, Y.; SASAKI, Y.; ISE, F.; KITA, K.; TAKEUCHI, K. Involvement
of prostaglandin E receptor EP
3
subtype in duodenal bicarbonate secretion in rats. Life
Sci. n. 80, v. 26, p. 2446-53, 2007.
AKIRA, S. TLR signaling. Curr Top Microbiol Immunol. v.311, p.1-16, 2006.
ALEXANDER, S.J.; COOPER, K.E.; VEALE, W.L. Sodium salicylate: alternate mechanism
of central antipyretic action in the rat. Pflugers Arch. v. 413, n. 5, p. 451-455, 1989.
AMITAI, Y. Clinical manifestations and management of scorpion envenomation. Public
Health Rev. v. 26, n. 3, p. 257-263, 1998.
ARAI, H.; HORI, S.; ARAMORI, I.; OHKUBO, H.; NAKANISHI, S. Cloning and
expression of a cDNA encoding an endothelin receptor. Nature. v. 348, n. 6303, p. 730-
732, 1990.
ATKINS, E. Pathogenesis of fever. Physiol Rev. v. 40, p. 580-646, 1960.
BARNES, P.J.; KARIN, M.. Nuclear factor-kappaB: a pivotal transcription factor in chronic
inflammatory diseases. N. Engl. J. Med., v. 336, n. 15, p. 1066-71, 1997.
BAX, W.A.; SAXENA, P.R. The current endothelin receptor classification: time for
reconsideration? Trends Pharmacol Sci. v. 15, n. 10, p. 379-386, 1994.
BENNETT, Jr.; BEESON, P.B. Studies on the pathogenesis of fever. I. The effect of injection
of extracts and suspensions of uninfected rabbit tissues upon the body temperature of
normal rabbits. Journal of Experimental Medicine. v. 98, n. 5, p. 477-492, 1953a.
__________________________________________________ Referências Bibliográficas
85
BENNETT, Jr.; BEESON, P.B. Studies on the pathogenesis of fever. II. Characterization of
fever-producing substances from polymorphonuclear leukocytes and from the fluid of
sterile exudates. Journal of Experimental Medicine. v. 98, n. 5, p. 493-508, 1953b.
BEICHE, F., SCHEUERER, S., BRUNE, K., GEISSLINGER, G.; GOPPELT-STRUEBE, M.
Up-regulation of cyclooxygenase-2 mRNA in the rat spinal cord following peripheral
inflammation. FEBS Lett. v. 390, p. 165–169, 1996.
BEIRITH, A.; SANTOS, A.R.; RODRIGUEZ, A.L.; CRECZYNSK-PASA, T.B.; CALIXTO,
J.B.. Spinal and supraspinal antinociceptive action of dipyrone in formalin, capsaicin and
glutamate tests. Study of the mechanism of action. Eur. J. Pharmacol. v. 345, n.3, p.
233-245, 1998.
BHARTI, A.C.; AGGARWAL, B.B. Nuclear factor-kappa B and cancer: its role in
prevention and therapy. Biochem Pharmacol. v. 64, n. 5-6, p. 883-888. 2002.
BICEGO, K.C.; BARROS, R.C.; BRANCO, L.G. Physiology of temperature regulation:
comparative aspects. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. v. 147, n. 3, p.
616-639, 2007.
BILSON, H.A.; MITCHELL, D.L.; ASHB, Y.B. Human prostaglandin EP
3
receptor isoforms
show different agonist-induced internalization patterns. FEBS Lett. v. 572, n. 1-3, p.
271-5, 2004.
BLATTEIS, C.M. Endotoxic fever: new concepts of its regulation suggest new approaches to
its management. Pharmacol Ther. v. 111, n. 1, p.: 194-223, 2006.
BLATTEIS, C.M. The onset of fever: new insights into its mechanism. Prog Brain Res. v.
162, p. 3-14, 2007.
BLOCH, K.D.; HONG, C.C.; EDDY, R.L.; SHOWS, T.B.; QUERATERMOUS, T. cDNA
cloning and chromosomal assignment of the endothelin-2 gene: vasoactive intestinal
contractor peptide is rat endothelin-2. Genomics, v. 10, p. 236-242, 1991.
__________________________________________________ Referências Bibliográficas
86
BOULANT, J.A. Role of the preoptic – anterior hypothalamus in thermoregulation and fever.
Clin. Infect. Dis., v. 31, p. S157-S161, 2000.
BREDER; C.D., DEWITT; D. KRAIG; R.P. Characterization of inducible cyclooxygenase in
rat brain. J. Comp. Neurol. v. 355, p. 296–315, 1995.
BROWN, M.R.; FISHER, L.A.; RIVIER, J.; SPIESS, J.; RIVIER, C.; VALE, W.
Corticotrophin-releasing factor: effects on the sympathetic nervous system and oxygen
consumption. Life Sci., v. 30, p. 207-210, 1982.
BRUNE, K. Prostaglandins and the mode of action of antipyretic analgesic drugs. Am. J.
Med., v.75, p.19-23, 1983.
BUCHERL, W. Acúleos que matam. São Paulo, Revista dos tribunais, 153p., 1979.
CAO, C.; MATSUMURA, K.; WATANABE, Y. Induction by lipopolysaccharide of COX-2
mRNA in the brain: its possible role in the febrile response. Brain Res., v. 697, p.
187-96, 1995.
CAO, C.; MATSUMURA, K.; WATANABE, Y. Induction of COX-2 in the brain by
cytokines. Ann. NY Acad. Sci., v. 813, p. 307-9, 1997.
CAO, W.H.; MORRISON, S.F. Glutamate receptors in the raphe pallidus mediate brown
adipose tissue thermogenesis evoked by activation of dorsomedial hypothalamic neurons.
Neuropharmacology. v. 51, n. 3, p. 426-437, 2006.
CARTMELL, T.; POOLE, S.; TURNBULL, A.V.; ROTHWELL, N.J.; LUHESHI, G.N.
Circulating interleukin-6 mediates the febrile response to localised inflammation in rats. J
Physiol. v. 526 (Pt 3), p. 653-61, 2000.
COELHO, M.M.; PELÁ, I.R.; ROTWELL, N.J. Dexamethasone inhibits the pyrogenic
activity of prostaglandin F
2α
but not prostaglandin E
2
. Eur. J. Pharmacol., v. 238, p.
391-394, 1993.
__________________________________________________ Referências Bibliográficas
87
COHEN, O.; ZYLBER-KATZ, E.; CARACO, Y.; GRANIT, L.; LEVY, M. Cerebrospinal
fluid and plasma concentrations of dipyrone metabolites after a single oral dose of
dipyrone. Eur J Clin Pharmacol. v. 54, n. 7, p. 549-53, 1998.
CONSIGLIO, A.R.; LUCION, A.B. Technique for collecting cerebrospinal fluid in the
cisterna magna of non-anesthetized rats. Brain Research Protocols., v. 5, p. 109-114,
2000.
CONTI, B.; TABAREAN, I.; ANDREI, C.; BARTFAI, T. Cytokines and fever. Front Biosci.
v. 9, p. 1433-1449, 2004.
DANTZER, R.; KELLEY, K.W. Twenty years of research on cytokine-induced sickness
behavior. Brain Behav Immun. v. 21, n. 2, p. 153-160, 2007.
DASCOMBE, M.J.; ROTHWELL, N.J.; SAGAY, B.O.; STOCK, M.J. Pyrogenic and
thermogenic effects of interleukin 1α in the rat. Am. J. Physiol., v. 256, p. E7-E11, 1989.
DAVIDSON, J.; MILTON, A.S.; ROTONDO, D. A study of the pyrogenic actions of
interleukin-1α and interleukin-1β: interactions with a steroidal and a non-steroidal anti-
inflammatory agent. Br. J. Pharmacol., v. 100, p. 542-546, 1990.
DAVIDSON, J.; ABUL, H.T.; MILTON, A.S.; ROTONDO, D. Cytokines and cytokine
inducers stimulate prostaglandin E2 entry into the brain. Pflugers Arch. v. 442, n. 4, p.
526-33. 2001.
De SOUZA, G.E.; CARDOSO, R.A.; MELO, M.C.C.; FABRICIO, A.S.C.; SILVA, V.M.S.;
LORA, M.; DE BRUM-FERNANDES, A.J.; FERREIRA, S.H.; ZAMPRONIO, A.R.
Comparative study of antipyretic profiles of indometacin and dipyrone in rats. Inflam.
Res., v. 51, p. 24-32, 2002.
DIAMANT, M.; De WIED, D. Autonomic and behavioral effects of centrally administered
corticotropin-releasing factor in rats. Endocrinology, v. 129, n. 1, p. 466-454, 1991.
__________________________________________________ Referências Bibliográficas
88
DINARELLO, C.A.; CANNON, J.G.; WOLFF, S.M.; BERNHEIM, H.; BEAUTLER, B.;
CERAMI, A.; FIGARI, I.S.; PALLADINO, M.A.Jr.; O’CONNOR, J.V. Tumor necrosis
factor (cachectin) is an endogenous pyrogen and induces production of interleukin 1. J.
Exp. Med., v. 163, p. 1433-50, 1986.
DINARELLO, C.A.; CANNON, J.G.; WOLFF, S.M. New concepts on the pathogenesis of
fever. Rev. Infect. Dis., v. 10, n. 1, p. 168-89, 1988.
DINARELLO, C.A. Interleukin-1. Adv Pharmacol., v. 25: p. 21-51. 1994.
DINARELLO C. A. Infection, fever, and exogenous and endogenous pyrogens: some
concepts have changed. J Endotoxin Res. v. 10, n. 4, p. 201-22, 2004.
ELDOR, A.; ZYLBER-KATZ, E.; LEVY, M. The effect of oral administration of dipyrone on
the capacity of blood platelets to synthesize thromboxane A
2
in man. Eur J Clin
Pharmacol. v. 26, n. 2, p. 171-176, 1984.
ENGBLOM, D.; EK, M.; SAHA, S.; ERICSSON-DAHLSTRAND, A.; JAKOBSSON, P.J.;
BLOMQVIST, A. Prostaglandins as inflammatory messengers across the blood-brain
barrier. J Mol Med. v. 80, n. 1, p.5-15, 2002.
FABRICIO, A.S. Mecanismos envolvidos na participação da endotelina na resposta febril em
ratos. Tese de doutorado apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo. 2002.
FABRICIO A.S., VEIGA F.H., CRISTOFOLETTI R., NAVARRA P., SOUZA G.E.. The
effects of selective and nonselective cyclooxygenase inhibitors on endothelin-1-induced
fever in rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. v. 288, n. 3, p. 671-7,
2005.
FABRICIO A.S., RAE G.A., ZAMPRONIO A.R., D'ORLEANS-JUSTE P., SOUZA G.E.
Central endothelin ET(B) receptors mediate IL-1-dependent fever induced by preformed
__________________________________________________ Referências Bibliográficas
89
pyrogenic factor and corticotropin-releasing factor in the rat. Am J Physiol Regul Integr
Comp Physiol. v. 290, n. 1, p. 164-71, 2006.
FELEDER, C.; PERLIK, V.; BLATTEIS, C.M., Preoptic α
1
- and α
2
-noradrenergic agonists,
induce, respectively, PGE
2
-independent and PGE
2
-dependent hyperthermic responses in
guinea pigs. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. v. 286, p. 1156-1166,
2004.
FELEDER C, PERLIK V, BLATTEIS CM. Preoptic norepinephrine mediates the febrile
response of guinea pigs to lipopolysaccharide. Am J Physiol Regul Integr Comp
Physiol. v. 293, n. 3, p. R1135-43, 2007.
FRAGA, D.; MACHADO, R.R.; FERNANDES, L.C.; SOUZA, G.E.; ZAMPRONIO, A.R.
Endogenous opioids: role in prostaglandin-dependent and -independent fever. Am J
Physiol Regul Integr Comp Physiol. v. 294, n. 2, p. R411-420, 2008.
FREIRE-MAIA, L.; CAMPOS, J.A.; AMARAL, C.F. Approaches to the treatment of
scorpion envenoming. Toxicon. v. 32, n. 9, p. 1009-1014, 1994.
GIULIANO, F.; WARNER, T.D. Ex vivo assay to determine the cyclooxygenase selectivity
of non-steroidal anti-inflammatory drugs. Br J Pharmacol. v. 126, n. 8, p. 1824-1830,
1999.
GURIN, V.N.; TSARIUK, V.V.; FITTON, A. Central action of snake venoms on body
temperature in rats. Farmakol Toksikol. v. 48, n. 6, p. 99-101, 1985.
HAWKEY, C.J. COX-2 inhibitors. Lancet. v. 353, p. 307-314, 1999.
HELLE, M.; BRAKENHOFF, J.P.; DE GROOT, E.R.; ARDEN, L.A. Interleukin 6 is
involved in interleukin 1-induced activities. Eur. J. Immunol., v. 18, n. 6, p. 957-959,
1988.
HÉTU, P.O.; RIENDEAU, D. Cyclo-oxygenase-2 contributes to constitutive prostanoid
production in rat kidney and brain. Biochem J.; v. 391 (Pt 3), p. 561-6, 2005.
__________________________________________________ Referências Bibliográficas
90
HINZ, B.; CHEREMINA, O.; BACHMAKOV, J.; RENNER, B.; ZOLK, O.; FROMM, M.F.;
BRUNE, K. .Dipyrone elicits substantial inhibition of peripheral cyclooxigenases in
humans: new insights into the pharmacology of an old analgesic. FASEB J. v. 21, n. 10,
p. 2343-51, 2007.
HUANG, W.T.; WANG, J.J.; LIN, M.T. Antipyretic effect of acetaminophen by inhibition of
glutamate release after staphylococcal enterotoxin A fever in rabbits. Neurosci Lett. v.
355, n. 1-2, p. 33-36, 2004.
HUANG, W.T.; LIN, M.T.; CHANG, C.P. An NMDA receptor-dependent hydroxyl radical
pathway in the rabbit hypothalamus may mediate lipopolysaccharide fever.
Neuropharmacology. v. 50, n. 4, p. 504-511, 2006.
HYSLOP, S.; DE NUCCI, G. Vasoactive mediators released by endothelins. Pharmacol Res.
v. 26, n. 3, p.223-242, 1992.
INOUE, A.; YANAGISAWA, M.; KIMURA, S.; KASUYA, Y.; MIYAUCHI, T.; GOTO, K.;
MASAKI, T. The human endothelin family: three structurally and pharmacologically
distinct isopeptides predicted by three separate genes. Proc Natl Acad Sci U S A. v. 86,
n. 8, p. 2863-2867, 1989.
IVAN, L.; BENNETT, Jr. Observations on the fever caused by bacterial pyrogens: I. A study
of the relationship between the fever caused by bacterial pyrogens and the fever
accompanying acute infections. J. Exp. Med. v. 88, p. 267-78, 1948a.
IVAN, L.; BENNETT, Jr. Observations on the fever caused by bacterial pyrogens: II. A study
of the relationship between the fevers caused by bacterial pyrogens and by the
intravenous injection of the sterile exudates of acute inflammation. J. Exp. Med. v. 88,
p. 267- 84, 1948b.
KAO, C.H.; KAO, T.Y.; HUANG, W.T.; LIN, M.T. Lipopolysaccharide- and glutamate-
induced hypothalamic hydroxyl radical elevation and fever can be suppressed by N-
__________________________________________________ Referências Bibliográficas
91
methyl-D-aspartate-receptor antagonists. J Pharmacol Sci. v. 104, n. 2, p. 130-136,
2007a.
KAO, T.Y.; HUANG, W.T.; CHANG, C.P.; LIN, M.T. Aspirin may exert its antipyresis by
inhibiting the N-methyl-D-aspartate receptor-dependent hydroxyl radical pathways in the
hypothalamus. J Pharmacol Sci. v. 103, n. 3, p. 293-298, 2007b.
KARNE, S.; JAYAWICKREME, C.K.; LERNER, M.R. Cloning and characterization of an
endothelin-3 specific receptor (ET
C
receptor) from Xenopus laevis dermal melanophores.
J Biol Chem. v. 268, n. 25, p. 19126-19133, 1993.
KASSUYA, C.A.; FERREIRA, J.; CLAUDINO, R.F.; CALIXTO, J.B. Intraplantar PGE
2
causes nociceptive behaviour and mechanical allodynia: the role of prostanoid E
receptors and protein kinases.Br J Pharmacol., v. 150, n. 6, p. 727-37, 2007.
KETTELHUT, I.C.; GOLDBERG, A.L. Tumor necrosis factor can induce fever in rats
without activating protein breakdown in muscle or lipolysis in adipose tissue. J Clin
Invest. v. 81, n. 5, p. 1384-1389, 1988.
KLIR, J.J.; MCCLELLAN, J.L.; KOZAK, W.; SZELÉNYI, Z.; WONG, G.H.; KLUGER,
M.J. Systemic but not central administration of tumor necrosis factor-alpha attenuates
LPS-induced fever in rats. Am J Physiol. v. 268(2 Pt 2), p. R480-486, 1995.
KLUGER, M.J. Fever: role of pyrogens and cryogens. Physiol. Rev., v. 71, n. 1, p. 93-127,
1991.
KOPP, E.; GHOSH, S. Inhibition of NF-κB by sodium salicylate and aspirin. Science. v.
265, p. 956-559, 1994.
KOSHI, T.; EDANO, T.; ARAI, K.; CHIYOKA, S.; EHARA, Y.; HIRATA, M.; OHKUCHI,
M.; OKABE, T. Pyrogenic action of endothelin in conscious rabbit. Biochem. Bioph.
Res. Commun., v. 186, n. 3, p. 1322-1326, 1992.
__________________________________________________ Referências Bibliográficas
92
LAZARUS, M. The differential role of prostaglandin E
2
receptors EP
3
and EP
4
in regulation
of fever. Mol Nutr Food Res. v. 50, n. 4-5, p. 451-5. 2006.
LAZARUS, M.; YOSHIDA, K.; COPPARI, R.; BASS, C.E.; MOCHIZUKI, T.; LOWELL,
B.B.; SAPER, C.B. EP
3
prostaglandin receptors in the median preoptic nucleus are
critical for fever responses. Nat Neurosci., v. 10, n. 9, p. 1131-3, 2007.
LeFEUVRE, R.A.; ROTHWELL, N.J.; STOCK, M.J. Activation of brown fat thermogenesis
in response to central injection of corticotrophin releasing hormone in the rat.
Neuropharmacology., v. 26, n. 8, p. 1217-1221, 1987.
LEROUX, H. J. Chem. Med. v. 6, p. 341, 1830.
LOPEZ-VALPUESTA, F.J.; MYERS, R.D. Fever produced by interleukin-11 (IL-11)
injected into the anterior hypothalamic pre-optic area of the rat is antagonized by
indomethacin. Neuropharmacology., v. 33, n. 8, p. 989-994, 1994.
LONG, N.C.; OTTERNESS, I.; KUNKEL, S.L.; VANDER, A.J.; KLUGER, M.J. Roles of
interleukin 1β and tumor necrosis factor in lipopolysaccharide fever in rats. Am.
J.Physiol., v. 259, p. R724-R728, 1990.
LORENZETTI, B.B.; FERREIRA, S.H. Mode of analgesic action of dipyrone: direct
antagonism of inflammatory hyperalgesia. Eur. J. Pharmacol., v. 114, p. 375-381, 1985.
LUHESHI, G.; ROTHWELL, N. Cytokines and fever. Int. Arch. Allergy Immunol., v.
109, p. 301-307, 1996.
LÜTHY, C.; MULTHAUPT, M.; OETLIKER, O.; PERISIC, M. Differential effect of
acetylsalicylic acid and dipyrone on prostaglandin production in human fibroblast
cultures. Br J Pharmacol. v. 79, n. 4, p. 849-54. 1983
LUTZ, A.; MELLO CAMPOS, O. Cinco novos escorpiões brasileiros dos gêneros Tityus e
Rhopalurus. Folha Médica, v. 3, p. 25-26, 1992.
__________________________________________________ Referências Bibliográficas
93
MADDEN, C.J.; MORRISON, S.F. Excitatory amino acid receptor activation in the raphe
pallidus area mediates prostaglandin-evoked thermogenesis. Neuroscience. v. 122, n. 1,
p. 5-15, 2003.
MADDEN, C.J.; MORRISON, S.F. Excitatory amino acid receptors in the dorsomedial
hypothalamus mediate prostaglandin-evoked thermogenesis in brown adipose tissue. Am
J Physiol Regul Integr Comp Physiol. v. 286, n. 2, p. R320-325, 2004.
MACKOWIAK, P.A. Brief history of antipyretic therapy. Clin Infect Dis. v.31 (Suppl 5), p.
S154-156, 2000.
MAGALHÃES, M.M.; PEREIRA, M.E.; AMARAL, C.F.; REZENDE, N.A.; CAMPOLINA,
D.; BUCARETCHI, F.; GAZZINELLI, R.T.; CUNHA-MELO, J.R. Serum levels of
cytokines in patients envenomed by Tityus serrulatus scorpion sting. Toxicon. v. 37, n. 8,
p. 1155-1164, 1999.
MARTIN, J. H. Neuroamatomia:Texto e Atlas, 2 ed, edn. Artes Médicas, Porto Alegre, 1998,
p.133-4.
MELO-SOARES, D.; HIRATSUKA VEIGA-SOUZA, F.; SUELI COELHO FABRÍCIO, A.;
JAVIER MIÑANO, F.; PETTO SOUZA, G.E.. Macrophage inflammatory protein (MIP)-
1α induces fever and increases PGE
2
in CSF of rats. Effects of steroidal and nonsteroidal
antipyretics drugs. Brain Res., v. 1109, n. 1, p. 83-92, 2006.
MELO SOARES, D. Estudo da resposta febril induzida pela injeção i.p. de Escherichia coli,
Tese de doutorado apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo. 2008.
MICHIE, H.R.; SPRIGGS, D.R.; MANOGUE, K.R.; SHERMAN, M.L.; REVHAUG, A.;
O'DWYER, S.T.; ARTHUR, K.; DINARELLO, C.A.; CERAMI, A.; WOLFF, S.M.
Tumor necrosis factor and endotoxin induce similar metabolic responses in human
beings. Surgery. v. 104, n. 2, p. 280-286, 1988.
__________________________________________________ Referências Bibliográficas
94
MILLER, A.J.; LUHESHI, G.N.; ROTHWELL, N.J.; HOPKINS, S.J. Local cytokine
induction by LPS in the rat air pouch and its relationship to the febrile response. Am J
Physiol. v. 272 (3 Pt 2), p. R857-61, 1997.
MILTON, A.S.; WEDLANDT, S. Effects on body temperature of prostaglandins of the A, E
and F series on injection into the third ventricle of unanesthetizes cats and rabbits. J.
Physiol., v. 218, p. 325-336, 1971.
MILTON, A.S. Thermoregulatory actions of eicosanoids in the central nervous system with
particular regard to the pathogenesis of fever. Ann. N.Y. Acad. Sci., v. 559, p. 392-
410, 1989.
MORIMOTO, A.; NAKAMORI, T.; WATANABE, T.; ONO, T.; MURAKAMI, N. Patter
differences in experimental fevers induced by endotoxin, endogenous pyrogen, and
prostaglandins. Am. J. Physiol., v. 254, p. R633-R640, 1988.
MORRISON, S.F.; NAKAMURA, K., MADDEN, C.J. Central control of thermogenesis in
mammals. Exp Physiol. v. 93, n. 7, p. 773-797, 2008.
NAKAMURA, K.; MORRISON, S.F. A thermosensory pathway that controls body
temperature. Nat Neurosci. v. 11, n. 1, p. 62-71, 2008a.
NAKAMURA, K.; MORRISON, S.F. Preoptic mechanism for cold-defensive responses to
skin cooling. J Physiol. v. 586, n. 10, p. 2611-2620, 2008b.
NAKAMURA. K.; MATSUMURA, K.; HÜBSCHLE, T.; NAKAMURA, Y.; HIOKI, H.;
FUJIYAMA, F.; BOLDOGKÖI, Z.; KÖNIG, M.; THIEL, H.J.; GERSTBERGER, R.;
KOBAYASHI, S.; KANEKO, T. Identification of sympathetic premotor neurons in
medullary raphe regions mediating fever and other thermoregulatory functions. J
Neurosci. v. 24, n. 23, p. 5370-5380, 2004.
NAKAMURA, Y.; NAKAMURA, K.; MATSUMURA, K.; KOBAYASHI, S.; KANEKO,
T.; MORRISON, S.F. Direct pyrogenic input from prostaglandin EP3 receptor-expressing
__________________________________________________ Referências Bibliográficas
95
preoptic neurons to the dorsomedial hypothalamus. Eur J Neurosci. v. 22, n. 12, p. 3137-
3146, 2005.
OKA, T.; OKA, K.; SCAMMELL, T.E.; LEE, C.; KELLY, J.F.; NANTEL, F.; ELMQUIST,
J.K.; SAPER, C.B. Relationship of EP(1-4) prostaglandin receptors with rat hypothalamic
cell groups involved in lipopolysaccharide fever responses. J Comp Neurol., v. 428, n. 1,
p. 20-32, 2000.
PARROTT RF, VELLUCCI SV. Effects of centrally administered prostaglandin EP receptor
agonists on febrile and adrenocortical responses in the prepubertal pig. Brain Res Bull.
v. 41, n. 2, p. 97-103, 1996.
PAXINOS, G.; WATSON, C. The rat brain in stereotaxic coordinates, 2 nd, edn. Academic
Press, Sydney, 1986.
PENNING TD, TALLEY JJ, BERTENSHAW SR, CARTER JS, COLLINS PW, DOCTER
S, GRANETO MJ, LEE LF, MALECHA JW, MIYASHIRO JM, ROGERS RS, ROGIER
DJ, YU SS, ANDERSONGD, BURTON EG, COGBURN JN, GREGORY SA,
KOBOLDT CM, PERKINS WE, SEIBERT K, VEENHUIZEN AW, ZHANG YY,
ISAKSON PC. Synthesis and biological evaluation of the 1,5-diarylpyrazole class of
cyclooxygenase-2 inhibitors: identification of 4-[5-(4-methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)-
1H-pyrazol-1-yl]benze nesulfonamide (SC-58635, celecoxib). J Med Chem. v. 40, n. 9,
p.1347-1365, 1997.
PESSINI, A.C. Estudo das Alterações Sangüíneas Induzidas pelo Veneno de Tityus
serrulatus e pela TsTX-I. Dissertação de mestrado apresentada a FCFRP/USP. 2000.
PESSINI, A.C. Mecanismos Envolvidos na Resposta Febril Induzida pelo Veneno de Tityus
serrulatus e pela suas Frações em Ratos. Tese de doutorado apresentada a FMRP/USP.
2004.
__________________________________________________ Referências Bibliográficas
96
PESSINI, A.C.; SANTOS, D.R.; ARANTES, E.C.; SOUZA, G.E. Mediators involved in the
febrile response induced by Tityus serrulatus venom in rats. Toxicon, v. 48, p. 556-
566, 2006.
POSSANI, L.S. et al. Arch. Biochem. Biophys. v. 180, p. 394-403, 1977.
PRENDINI, L.; HEELER, W.C. Scorpion higher phylogeny and classification, taxonomic
anarchy, and standards for peer review in online publishing. Cladistics. v. 21 (5), p. 446-
494, 2005.
ROMANOVSKY, A.A. Do fever and anapyrexia exist? Analysis of set point-based
definitions. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. v. 287, n. 4, p. R992-R995,
2004.
ROMANOVSKY, A.A. Thermoregulation: some concepts have changed. Functional
architecture of the thermoregulatory system. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol.
v. 292, n. 1, p. R37-46, 2007.
ROTH, J.; SOUZA, G.E. Fever induction pathways: evidence from responses to systemic or
local cytokine formation. Braz. J. Med. Biol. Res., v. 34, n. 3, p. 301-314, 2001.
ROTHWELL, N.J.; HARDWICK, A.J.; LINDLEY, I. Central actions of interleukin-8 in the
rat are independent on prostaglandins. Horm. Metab. Res., v. 22, n. 11, p. 595-596,
1990a.
ROTHWELL, N.J.; BUSBRIDGE, N.J.; HUMPHRAY, H.; HISSEY, P. Central action of
interleukin-1β on fever and thermogenesis. In: Physiological and Pathological Effects
Cytokines. Wiley-Liss, Inc., p. 307-311, 1990b.
ROTHWELL, NJ.; BUSBRIDGE, N.J.; LEFEUVRE, R.A.; HARDWICK, A.J.; GAULDIE,
J.; HOPKINS, S.J. Interleukin-6 is a centrally acting endogenous pyrogen in the rat. Can
J Physiol Pharmacol., v. 69, n. 10, p. 1465-1469, 1991.
__________________________________________________ Referências Bibliográficas
97
SAIDA, K.; MITSUI, Y.; ISHIDA, N. A novel peptide, vasoactive intestinal contractor, of a
new (endothelin) peptide family. Molecular cloning, expression and biological activity. J.
Biol. Chem., v. 264, p. 14613-14616, 1989.
SAKURAI, T.; YANAGISAWA, M.; TAKUWA, Y.; MIYAZAKI, H.; KIMURA, S.;
GOTO, K.; MASAKI, T. Cloning of a cDNA encoding a non-isopeptide-selective
subtype of the endothelin receptor. Nature. v. 348, n. 6303, p. 732-735, 1990.
SCAMMELL, T.E.; GRIFFIN, J.D.; ELMQUIST, J.K.; SAPER, C.B. Microinjection of
ciclooxigenase inhibitor into the anteroventral preoptic region attenuates LPS fever. Am.
J. Physiol., v. 274, p. R783-R789, 1998.
SCAMMELL, T.E.; ELMQUIST, J.K.; GRIFFIN, J.D.; SAPER, C.B. Ventromedial preoptic
prostaglandin E
2
activates fever-producing autonomic pathways. J Neurosci. v. 16, n. 19,
p. 6246-6254, 1996.
SEHIC, E.; SZÉKELY, M.; UNGAR, A.L.; OLADEHIN, A.; BLATTEIS, C.M.
Hypothalamic prostaglandin E
2
during lipopolysaccharide-induced fever in guinea pigs.
Brain Res Bull. v. 39, n. 6, p. 391-399, 1996.
SHISHODIA, S.; AGGARWAL, B.B. Guggulsterone inhibits NF-kappaB and IkappaBalpha
kinase activation, suppresses expression of anti-apoptotic gene products, and enhances
apoptosis. J Biol Chem. v. 279, n. 45, p. 47148-47158, 2004a.
SHISHODIA, S.; AGGARWAL, B.B. Nuclear factor-kappaB: a friend or a foe in cancer?
Biochem Pharmacol. v. 68, n. 6, p. 1071-1080, 2004b.
SISSOM, W.D. Systematic, biogeography, paleontology. In: Polis, G.A. (ed) The biology of
the scorpions, California, Stanford University Press, p. 587, 1990.
SMITH, B.K.; KLUGER, M.J. Human IL-1 receptor antagonist partially suppresses LPS
fever but not plasma levels of IL-6 in Fischer rats. Am J Physiol. v. 263 (3 Pt 2), p.
R653-5. 1992
__________________________________________________ Referências Bibliográficas
98
STITT, J.T. Prostaglandin E
1
fever induced in rabbits. J. Physiol. Lond., v. 232, p. 163-179,
1973.
STONE, E. An account of the success of the bark of the willow in the cure of agues. Philos
Trans. R. Soc. Lond. v. 53, p. 195-200, 1763.
STRIJBOS, P.J.; HARDWICK, A.J.; RELTON, J.K.; CAREY, F.; ROTHWELL, N.J.
Inhibition of central actions of cytokines on fever and thermogenesis by lipocortin-1
involves CRF. Am. J. Physiol., v. 263, p. E632-E636, 1992.
SOARES, D.M. A Injeção Central deMIP-1α (CCL3) Induz Resposta Febril Independente da
Síntes de PGE
2
em Ratos. Tese apresentada a Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,
2002.
SUGIMOTO, Y.; NARUMIYA, S. Prostaglandin E receptors. J Biol Chem., v. 282, n.
16, p. 11613-11617, 2007.
TAKADA Y, BHARDWAJ A, POTDAR P, AGGARWAL BB. Nonsteroidal anti-
inflammatory agents differ in their ability to suppress NF-kappaB activation, inhibition of
expression of cyclooxygenase-2 and cyclin D1, and abrogation of tumor cell
proliferation. Oncogene. v. 23, n. 57, p. 9247-9258, 2004.
TEGEDER I, PFEILSCHIFTER J, GEISSLINGER G. Cyclooxygenase-independent actions
of cyclooxygenase inhibitors. FASEB J. v. 15, n. 12, p. 2057-2072, 2001.
THOMPSON, A.W. (ed): The Cytokine Handbook. London, UK, Academic, 1991.
TURNBULL, A.V.; RIVIER, C.L. Sprague-Dawley rats obtained from different vendors
exhibit distinct adrenocorticotropin responses to inflammatory stimuli.
Neuroendocrinology. v. 70, n. 3, p.186-195, 1999.
USHIKUBI, F.; SEGI, E.; SUGIMOTO, Y.; MURATA, T.; MATSUOKA, T.;
KOBAYASHI, T.; HIZAKI, H.; TUBOI, K.; KATSUYAMA, M.; ICHIKAWA, A.;
TANAKA, T.; YOSHIDA, N.; NARUMIYA, S. Impaired febrile response in mice
__________________________________________________ Referências Bibliográficas
99
lacking the prostaglandin E receptor subtype EP
3
. Nature. v. 395, n. 6699, p. 281-284,
1998.
VANE, J.R. Inhibition of prostaglandin synthesis as a mechanism of action for aspirin-like
drugs. Nature New Biol., v. 231, p. 232-235, 1971.
VANE, J.R.; FLOWER, R.J.; BOTTING, R.M. History of aspirin and its mechanism of
action. Stroke. v. 21 (12 Suppl), p. IV12-23, 1990.
VANE JR, BAKHLE YS, BOTTING RM. Cyclooxygenases 1 and 2. Annu Rev Pharmacol
Toxicol. v. 38, p.97-120, 1998.
VASILACHE, A.M.; ANDERSSON, J.; NILSBERTH, C. Expression of PGE
2
EP3 receptor
subtypes in the mouse preoptic region. Neurosci Lett., v. 423, n. 3, p. 179-183, 2007.
VEIGA-SOUZA, F.H.; FABRICIO A.S.;
SOARES, D.M.; MELO, M.C.; ZAMPRONIO,
A.R.; SOUZA, G.E. Lack of relationship between fever and CSF prostaglandin level
after i.c.v. injection of PFPF. Fund. Clin. Pharmacol. (submetido).
XIN, L.; BLATTEIS, C.M. Hypothalamic neuronal responses to interleukin-6 in tissue slices:
effects of indomethacin and naloxone. Brain Res Bull. v. 29, n. 1, p. 27-35, 1992.
WATT, D.D. Biochemical studies of the venom from the scorpion, Centruroides sculpturatus.
Toxicon. v. 69, p. 171-80, 1964.
WILKINSON MF, KASTING NW. Central vasopressin V1-blockade prevents salicylate but
not acetaminophen antipyresis. J Appl Physiol. v. 68, n. 5, p. 1793-1798, 1990.
YAGAMI, T. Cerebral arachidonate cascade in dementia: Alzheimer's disease and vascular
dementia. Curr Neuropharmacol. v. 4, n. 1, p. 87-100, 2006.
YANAGISAWA, M.; KURIHARA, H.; KIMURA, S.; TOMOBE, Y.; KOBAYASHI, M.;
MITSUI, Y.; YASAKI, Y.; GOTO,K.; MASAKI, T. A novel potent vasoconstrictor
peptide produced by vascular endothelial cells. Nature. v. 332, p. 441-445, 1988.
__________________________________________________ Referências Bibliográficas
100
YONEYAMA, T.; HORI, M.; MAKATANI, M.; YAMAMURA, T.; TANAKA, T.;
MATSUDA, Y.; KARAKI, H. Subtypes of endothelin ET
A
and ET
B
receptors mediating
tracheal smooth muscle contraction. Biochem Biophys Res Commun. v. 207, n. 2,
p. 668-674, 1995.
ZAMPRONIO, A.R.; SOUZA, G.E.; SILVA, C.A.; CUNHA, F.Q.; FERREIRA, S.H.
Interleukin-8 induces fever by a prostaglandin-independent mechanism. Am. J. Physiol.,
v. 266, p. R1670-1674, 1994a.
ZAMPRONIO, A.R.; MELO, M.C.C.; SILVA, C.A.; PELÁ, I.R.; HOPKINS, S.J.; SOUZA,
G.E. A pré-formed pyrogenyc factor released by lipopolysacharide stimulated
macrofages. M. Inflam., v. 3, p. 365-373, 1994b.
ZAMPRONIO, A.R.; MELO, M.C.C.; HOPKINS, S.J.; SOUZA, G.E.P. Involvement of CRH
in fever induced by a distinct pre-formed pyrogenic factor. Inflam. Res., v. 49, p. 1-7,
2000.
ZARETSKY DV, HUNT JL, ZARETSKAIA MV, DIMICCO JA. Microinjection of
prostaglandin E
2
and muscimol into the preoptic area in conscious rats: comparison of
effects on plasma adrenocorticotrophic hormone (ACTH), body temperature, locomotor
activity, and cardiovascular function. Neurosci Lett., v. 397, n. 3, p.291-296, 2006.
ZEISBERGER, E. From humoral fever to neuroimmunological control of fever. J.Thermal
Biol., v. 24, p. 287-326, 1999.
ZELENAKAS K, FRICKE JR JR, JAYAWARDENE S, KELLSTEIN D. Analgesic efficacy
of single oral doses of lumiracoxib and ibuprofen in patients with postoperative dental
pain. Int J Clin Pract. v. 58, n. 3, p. 251-256, 2004.
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