( PDF ) Avaliação da resposta clínica e imunológica local de pacientes com neoplasia intra-epitelial cervical graus II e III tratadas com interferon alfa-2B intralesional

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO

AVALIAÇÃO DA RESPOSTA CLÍNICA E IMUNOLÓGICA LOCAL

DE PACIENTES COM NEOPLASIA INTRA-EPITELIAL CERVICAL

GRAUS II E III TRATADAS COM INTERFERON ALFA-2B

INTRALESIONAL

MARÍLIA DE CARVALHO MARDEGAN

UBERABA – MG

2008

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO

Avaliação da resposta clínica e imunológica local de pacientes com

neoplasia intra-epitelial cervical graus II e III tratadas com interferon

alfa-2b intralesional

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-

graduação em Patologia, área de

concentração em “Patologia Ginecológica e

Obstétrica”, da Universidade Federal do

Triângulo Mineiro, como requisito parcial

para obtenção do Título de Mestre.

Aluna: Marília de Carvalho Mardegan

Orientador: Prof. Dr. Eddie Fernando Candido Murta

Co-orientadoras: Profa. Dra. Márcia Antoniazi Michelin

Profa. Dra. Sheila Jorge Adad

Uberaba – MG

Setembro/2008

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iii

Dedico esta tese:

A Deus e a Nossa Senhora da Abadia

por serem o meu refúgio em todos os momentos difíceis; por iluminarem o meu caminho

todos os dias.

Ao meu esposo Antônio Fernando Mardegan Filho

por seu companheirismo, carinho e cumplicidade em todas as horas.

À minha filha Maria Luísa de Carvalho Mardegan

pela incrível experiência da maternidade, por sua paciência e compreensão nos inúmeros

momentos em que não lhe dei a devida atenção por estar envolvida na elaboração deste

trabalho.

À minha irmã Marisa de Carvalho Ramos

pela amizade incondicional e por sua colaboração no desenvolvimento deste trabalho.

À memória de minha mãe Ilma Isabel de Carvalho

pela vida; pelo carinho e por sua fundamental importância na minha formação humana.

Ao Prof. Dr. Eddie Fernando Candido Murta, Professor Titular da Disciplina de

Ginecologia e Obstetrícia da Universidade Federal do Triângulo Mineiro

pelo exemplo de dedicação e compromisso com a pesquisa e pela oportunidade de realizar

este trabalho.

zÜtwxv|ÅxÇàÉá

Agradeço à Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM), pela estrutura

proporcionada durante a minha formação profissional e na realização deste trabalho.

À Disciplina de Ginecologia e Obstetrícia, juntamente com todo seu corpo

docente, médicos, residentes e outros funcionários.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), à

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) e à Financiadora

de Estudos e Projetos (FINEP) pelo apoio financeiro.

Ao Prof. Dr. Eddie Fernando Cândido Murta, pelo constante incentivo e

orientação deste trabalho.

À Profa. Dra. Márcia Antoniazi Michelin e à Profa. Dra. Sheila Jorge Adad pela

co-orientação deste trabalho.

À Dra. Ana Cristina Barcelos por encaminhar as pacientes do ambulatório de

Colposcopia para participação neste estudo.

Aos técnicos de laboratório Celso Tadeu Barbosa dos Santos, por seu auxílio

fornecido no laboratório de Imunologia, e Heloísa Helena Vieira pela coleta de sangue das

pacientes.

Às secretárias Nilva Aparecida da Silva Aveiro, Zelma Rocha Camargos Pereira e

Dóris Lima Dayrell de Carvalho pela colaboração nos ambulatórios.

À Eliane Resende, funcionária da Biblioteca Frei Eugênio, pela grande eficiência

e rapidez na obtenção de artigos científicos.

Aos professores do Curso de pós-graduação em Patologia, pelos ensinamentos.

Aos meus familiares: Antônio (esposo), Maria Luísa (filha), Marisa (irmã), Ana

Maria e Antonio Fernando (sogros), Elza e José (tios) pelo constante apoio durante a

minha graduação e pós-graduação.

À Profa. Ana Maria Bertini Mardegan pela correção ortográfica deste trabalho.

A todas as pacientes que participaram deste projeto pela confiança e compromisso

possibilitando o desenvolvimento científico.

E a todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste

trabalho.

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viii

1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 19

2. HIPÓTESES................................................................................................................ 31

3. OBJETIVOS ............................................................................................................... 33

4. MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................... 35

5. RESULTADOS........................................................................................................... 51

6. DISCUSSÃO .............................................................................................................. 68

7. CONCLUSÕES........................................................................................................... 74

8. RESUMO.................................................................................................................... 76

9. ABSTRACT................................................................................................................ 80

10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 84

ANEXOS

ANEXO A – Parecer consubstanciado do Comitê de Ética

ANEXO B – Protocolo de Pesquisa

ANEXO C – Termo de consentimento

ANEXO D – Concentração de cada citocina durante o tratamento

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Figura 1.0. Exemplo de resultado gráfico de avaliação de citocinas Kit Th1/Th2........44

Figura 2.0. Exemplo de resultado gráfico de avaliação de citocinas inflamatórias

(Human Inflammation Kit)...................................................................... 44

Figura 3.0. Preparação de Diluições de padrão de citocinas........................................46

Figura 4.0. Médias ± DP da concentração de IFN-γ em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, de todas as pacientes. p =

0,7006 (Friedman)....................................................................................56

Figura 4.1. Médias ± DP da concentração de IFN-γ em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram falha

terapêutica. p= 0,5243 (Friedman)............................................................56

Figura 4.2. Médias ± DP da concentração de IFN-γ em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram

resposta terapêutica. p = 0,6522 (Friedman) ............................................ 56

Figura 5.0. Médias ± DP da concentração de IL-10 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, de todas as pacientes. p=0,7892

(Friedman).............................................................................................. 57

Figura 5.1. Médias ± DP da concentração de IL-10 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram falha

terapêutica. p= 0,7274 (Friedman)............................................................57

Figura 5.2. Médias ± DP da concentração de IL-10 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram

resposta terapêutica. p = 0,5612 (Friedman) ............................................ 57

Figura 6.0. Médias ± DP da concentração de IL-6 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, de todas as pacientes.

*p=0,0274 (Friedman) com p< 0,05 entre a 6ª aplic. e 18ª aplic. (Pós-

teste de Dunns) ........................................................................................58

Figura 6.1. Médias ± DP da concentração de IL-6 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram falha

terapêutica. p= 0,0538 (Friedman)........................................................... 58

Figura 6.2. Médias ± DP da concentração de IL-6 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram

resposta terapêutica. p = 0,1514 (Friedman) ............................................ 58

Figura 7.0. Médias ± DP da concentração de IL-4 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, de todas as pacientes. p=0,1062

(Friedman).............................................................................................. 59

Figura 7.1. Médias ± DP da concentração de IL-4 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram falha

terapêutica. p= 0,9097 (Friedman)........................................................... 59

Figura 7.2. Médias ± DP da concentração de IL-4 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram

resposta terapêutica. p = 0,1066 (Friedman) ............................................ 59

Figura 8.0. Médias ± DP da concentração de IL-2 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, de todas as pacientes. p=0,4936

(Friedman)...............................................................................................60

Figura 8.1. Médias ± DP da concentração de IL-2 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram falha

terapêutica. p= 0,7274 (Friedman)............................................................60

Figura 8.2. Médias ± DP da concentração de IL-2 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram

resposta terapêutica. p = 0,2982 (Friedman) .............................................60

Figura 9.0. Médias ± DP da concentração de IL-1β em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, de todas as pacientes. p=0,4663

(Friedman)...............................................................................................61

Figura 9.1. Médias ± DP da concentração de IL-1β em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram falha

terapêutica. p= 0,7273 (Friedman)........................................................... 61

Figura 9.2. Médias ± DP da concentração de IL-1β em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram

resposta terapêutica. p = 0,5206 (Friedman) .............................................61

Figura 10.0. Médias ± DP da concentração de IL-12 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, de todas as pacientes. p=0,9899

(Friedman)...............................................................................................62

Figura 10.1. Médias ± DP da concentração de IL-12 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram falha

terapêutica. p= 0,6076 (Friedman)............................................................62

Figura 10.2. Médias ± DP da concentração de IL-12 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram

resposta terapêutica. p = 0,8566 (Friedman) .............................................62

Figura 11.0. Médias ± DP da concentração de IL-8 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, de todas as pacientes. p=0,5915

(Friedman)...............................................................................................63

xii

Figura 11.1. Médias ± DP da concentração de IL-8 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram falha

terapêutica. p= 0,3420 (Friedman)............................................................63

Figura 11.2. Médias ± DP da concentração de IL-8 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram

resposta terapêutica. p = 0,6522 (Friedman) .............................................63

Figura 12.0. Médias ± DP da concentração de TNF-α em amostras de secreção

vaginal,colhidas durante o tratamento, de todas as pacientes. p=0,4673

(Friedman)...............................................................................................64

Figura 12.1. Médias ± DP da concentração de TNF-α em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram falha

terapêutica. p= 0,1476 (Friedman)............................................................64

Figura 12.2. Médias ± DP da concentração de TNF-α em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram

resposta terapêutica. p = 0,6522 (Friedman) .............................................64

Figura 13.0. Gráfico de médias de IL-6, durante o tratamento, por grupo de

pacientes com falha e resposta terapêutica (p< 0,05, teste de Mann

Whitney)..................................................................................................65

Figura 14.0. Gráfico de médias de TNF-α, durante o tratamento, por grupo de

pacientes com falha e resposta terapêutica (p< 0,05, teste de Mann

Whitney)..................................................................................................65

Figura 15.0. Médias ± DP da carga viral de HPV de alto risco, em amostras

colhidas antes do tratamento e ao seu término, nos grupos de pacientes

que apresentaram resposta e falha terapêutica...........................................66

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xiv

Tabela 1. Diagnóstico inicial e final por biópsia de todas as pacientes e conduta

tomada em cada caso, após o término do tratamento..................................... 52

Tabela 2. Carga viral de HPV de alto risco, em amostras colhidas antes do

tratamento e ao seu término, nos grupos de pacientes que apresentaram

resposta e falha terapêutica........................................................................... 66

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xvi

HPV: Papilomavírus humano

DNA: ácido desoxirribonucléico

IFN: interferon

NK: célula Natural Killer

INCA: Instituto Nacional de Câncer

NIC: Neoplasia intra-epitelial cervical

NIC I: Neoplasia intra-epitelial cervical grau I

NIC II: Neoplasia intra-epitelial cervical grau II

NIC III: Neoplasia intra-epitelial cervical grau III

LSIL: Lesão intra-epitelial escamosa de baixo grau

HSIL: Lesão intra-epitelial escamosa de alto grau

IgG: Imunoglobulina G

IgA: Imunoglobulina A

Th1: linfócitos T auxiliares tipo 1

Th2: linfócitos T auxiliares tipo 2

Th3: linfócitos T auxiliares tipo 3

IL: Interleucina

TGF-β: Fator de Crescimento Transformante-β

TNF: Fator de Necrose Tumoral

MHC: Complexo de Histocompatibilidade Principal

IFNAR1: Receptor de Interferon tipo 1

IFNAR2: Receptor de Interferon tipo 2

IRF: fatores reguladores de IFN

IFCPC: Federação Internacional de Patologia Cervical e Colposcopia

xvii

TAP: Tempo de Protombina

TTPA: Tempo de Tromboplastina Parcial Ativado

AST: Aspartato-aminotransferase

ALT: Alanino-aminotransferase

g: Unidade de medida da força centrífuga relativa

ul: microlitro

pg: picograma

ml: mililitro

C: Grau Célsio

BD CBA: Becton Dickinson Cytometric bead array

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1. INTRODUÇÃO

1.1 PAPILOMA VÍRUS HUMANO (HPV) 3

O Papilomavírus humano (HPV) é um DNA vírus de dupla fita, com 5

aproximadamente 8000 pares de bases, pertencente à família Papovaviridae, que é 6

transmitido pela relação sexual com parceiro portador. O vírus infecta a pele ou a mucosa 7

resultando em uma variedade de condições clínicas. Mais de 100 tipos de vírus já foram 8

identificados até hoje e cerca de um terço deles infecta o trato genital inferior. 9

(LONGWORTH & LAIMINS, 2004; DE VILLIERS et al., 2004). 10

Os tipos virais são divididos em duas categorias: baixo e alto risco. Os 11

primeiros, entre eles o HPV 6 e 11, induzem lesões benignas clinicamente representadas 12

pelas verrugas e condilomas. Já os últimos, HPV 16, 18, 31, 33, 45 entre outros, estão 13

associados ao câncer do trato genital inferior, sendo que 16 e 18 são os mais importantes 14

no desenvolvimento das lesões neoplásicas cervicais (SCHIFFMAN, 1995; CLIFFORD et 15

al., 2003). 16

No colo, os vírus infectam principalmente as células cervicais metaplásicas 17

sendo que o DNA viral incorpora-se ao DNA celular fazendo surgir, assim, os coilócitos 18

nas camadas intermediárias e superficiais do epitélio cervical. 19

O genoma viral pode ser dividido em três regiões: a região precoce (early) 20

contendo os genes E1, E2, E4, E5, E6 e E7 que são necessários à replicação viral e com 21

propriedades de transformação oncogênica; a região tardia (late) contendo os genes L1 e 22

L2 responsáveis pela formação de proteínas do capsídeo viral e a região regulatória (LCR), 23

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que contém a origem da replicação e controla a transcrição e replicação. O HPV pode ser 1

encontrado no material cervical nas formas epissomal ou integrada. Na forma epissomal o 2

DNA viral permanece no núcleo da célula hospedeira não estando integrado ao DNA da 3

mesma enquanto que, na forma integrada, ocorre incorporação do DNA viral a o DNA da 4

célula hospedeira havendo quebra do DNA viral entre a região E1 e L1 com perda do gene 5

E2 e, com isso, descontrole do feedback-negativo da expressão de oncogenes regulados 6

pela proteína E2. A freqüência com que o HPV 16 é encontrado em formas integradas, 7

geralmente aumenta com a progressão da lesão. Estudos mostram que essa integração faz 8

aumentar a expressão de E6 e E7 (JEON et al., 1995; JEON & LAMBERT, 1995) e essas 9

oncoproteínas levam a alterações dos genes supressores tumorais, p53 e pRb 10

respectivamente, sendo essenciais para indução da transformação celular e carcinogênese 11

(NARISAWA-SAITO & KIYONO, 2007). 12

A imunidade inata ao HPV é mediada por vários mecanismos, dentre eles, a 13

síntese de interferon (IFN), a ativação de macrófagos e de células Natural Killers (NK). O 14

HPV pode interagir com o sistema imune e evadir ou inativar a resposta imune 15

(STANLEY, 2001; STERN et al., 2000; KONYA & DILLNER, 2001). São múltiplos os 16

mecanismos de evasão do vírus: 1- o HPV não tem fase de disseminação sangüínea; 2- não 17

causa lise de queratinócitos, não induzindo assim resposta inflamatória; 3- a produção e 18

liberação do vírus ocorrem nas células escamosas diferenciadas, distantes das células 19

imunocompetentes da submucosa (TINDLE et al., 2002; FRAZER et al., 1999). 20

A infecção cervical pelo HPV é geralmente transitória na maioria das mulheres 21

infectadas (70 a 90%), ocorrendo a eliminação do vírus em 12 a 24 meses depois do 22

diagnóstico inicial. A persistência do HPV em 10 a 30%, especialmente com tipos 23

oncogênicos, está fortemente associada ao desenvolvimento de lesões intra-epitelias 24

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cervicais de alto grau (SCOTT et al., 1999). Existem evidências de que a interação de 1

citocinas/quimiocinas liberadas durante a resposta imune, celular e humoral, é responsável 2

pela regressão, persistência ou progressão de lesões associadas ao HPV, no entanto os 3

mecanismos envolvidos nessas respostas ainda são pouco conhecidos (GONÇALVES & 4

DONALDI, 2004). 5

1.2 CÂNCER DE COLO UTERINO E LESÕES PRECURSORAS – ASPECTOS 7

GERAIS 8

O câncer de colo uterino tem sido considerado um problema de saúde mundial. 10

É a segunda neoplasia mais comum entre as mulheres em todo o mundo, sendo responsável 11

por cerca de 500 mil casos novos e pela morte de aproximadamente 230 mil mulheres por 12

ano. No Brasil o número de casos novos esperados para 2008 é de 18.680 e, não 13

considerando os tumores de pele não-melanoma, ele é o mais incidente entre as mulheres 14

da região norte, o segundo mais incidente nas regiões Sul, Centro-Oeste e Nordeste e o 15

terceiro na região Sudeste (ficando atrás somente da neoplasia de mama e dos tumores do 16

cólon e reto). A taxa bruta de incidência estimada em 2008 é de 19,18 casos novos para 17

cada 100 mil mulheres no Brasil e variando de 12,23 a 16,29 no estado de Minas Gerais 18

(INCA-Estimativa de câncer, 2008) 19

Os carcinomas do colo uterino são precedidos por lesões pré-malignas, pré-20

invasivas denominadas neoplasias intra-epiteliais cervicais cuja evolução pode perdurar 21

por anos. O desenvolvimento dessas lesões e, conseqüentemente, do câncer de colo uterino 22

está intimamente associado à infecção pelo HPV. 23

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O termo Neoplasia Intra-epitelial Cervical (NIC) para as lesões precursoras do 1

câncer de colo uterino foi criado por Richart em 1967 e dividiu as lesões em três graus (I, 2

II e III ou carcinoma in situ). Em 1988 a classificação de Bethesda subdividiu as neoplasias 3

intra-epiteliais cervicais em: Lesão intra-epitelial escamosa de baixo grau (LSIL), 4

compreendendo: Displasia leve/ NIC I e alterações celulares associadas ao Papiloma Vírus 5

Humano (HPV); Lesão intra-epitelial escamosa de alto grau (HSIL): Displasia moderada/ 6

NIC II, Displasia severa, Carcinoma in situ / NIC III. 7

No estudo colposcópico a NIC se apresenta como uma zona de transformação 8

anormal representada pela presença de leucoplasia, epitélio acetobranco, mosaico, 9

pontilhado, vasos atípicos, orifícios glandulares espessados ou erosão (STAFL & 10

WILBANKS, 1991). 11

Histologicamente a NIC I se caracteriza pela presença de atipias celulares leves 12

acometendo apenas o 1/3 basal do epitélio; na NIC II s observa-se anormalidades nucleares 13

mais acentuadas e mitoses numerosas que se estendem até os 2/3 proximais do epitélio; na 14

NIC III as anormalidades nucleares e as mitoses são intensas e estão presentes em toda a 15

espessura do epitélio. 16

O diagnóstico precoce das lesões precursoras pode ser suspeitado a partir da 17

simples coleta da citologia cérvico-vaginal de rotina e confirmado pela biópsia guiada pela 18

colposcopia, o que possibilita o tratamento dessas lesões impedindo sua progressão para o 19

câncer. 20

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1.3 TRATAMENTO DAS NEOPLASIAS INTRA-EPITELIAIS CERVICAIS (NICs) 1

As NICs podem apresentar regressão espontânea ou progressão a lesões mais 3

graves. As lesões de baixo grau (LSIL) apresentam alto índice de regressão espontânea. 4

Estudos (SCHLECHT et al., 2003; MOSCICKI et al., 2004) mostraram que mais de 90 % 5

das pacientes com LSIL apresentaram regressão em 24 meses. O consenso publicado em 6

2006 para manejo de pacientes com neoplasia intra-epitelial (WRIGHT et al., 2007) 7

recomenda seguimento com citologia a cada 6 meses para pacientes com LSIL, devendo 8

ser complementada com colposcopia em caso de teste positivo para HPV, com retorno ao 9

seguimento anual de rotina após 2 citologias negativas para neoplasia intra-epitelial 10

cervical. 11

Já para as lesões de alto grau, NIC II e NIC III, o mesmo consenso (WRIGHT 12

et al., 2007) confirma a inaceitabilidade de seguimento apenas com citologia e colposcopia 13

desse tipo de lesão, devendo ser instituído tratamento, seja com métodos ablativos (laser) 14

ou excisionais (conização a frio, conização a laser, alça diatérmica), sendo os primeiros 15

somente indicados em caso de colposcopia satisfatória. As técnicas excisionais apresentam 16

a vantagem de permitir o estudo histológico e a avaliação das margens cujo 17

comprometimento é importante fator preditivo de recidiva. 18

Não há um consenso na literatura quanto às possíveis complicações durante a 19

gestação advindas de conização ou de alça diatérmica prévias. Alguns estudos não 20

apontam aumento da incidência de intercorrências obstétricas em gestantes anteriormente 21

submetidas a esses procedimentos (MILHEIRAS et al., 2005). Por outro lado outros 22

trabalhos mostram que essas intercorrências existem e são responsáveis por significativo 23

aumento da morbimortalidade perinatal. Entre as mais comuns estão: o trabalho de parto 24

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pré-termo, o baixo peso ao nascer e a ruptura prematura das membranas (SJØBORG et al., 1

2007; SADLER & SAFTLAS, 2007; JAKOBSSON et al., 2007; KYRGIOU et al., 2006). 2

Uma metanálise recentemente publicada (KYRGIOU et al., 2006) evidenciou que a 3

conização (a frio e a laser) se associou ao aumento do índice de trabalho de parto pré- 4

termo, do baixo peso fetal e à maior incidência de cesariana. A alça diatérmica esteve 5

significantemente associada ao aumento do índice de trabalho de parto pré-termo, do baixo 6

peso fetal e da ruptura prematura das membranas. 7

Tendo em vista o crescente número de infecção pelo HPV e o aparecimento de 8

NIC em jovens (MOSCICKI, 2007) cresce a preocupação com o desenvolvimento de 9

terapias que não interfiram com o futuro reprodutivo das pacientes. 10

O tratamento conservador com interferon intralesional pode estar entre as 11

opções terapêuticas de pacientes em idade fértil uma vez que não altera a anatomia do colo 12

uterino que é o maior fator gerador das complicações durante a gestação. 13

1.4 IMUNIDADE DO SISTEMA REPRODUTOR FEMININO 15

O trato genital inferior pode ser dividido em dois compartimentos: vagina e 17

ectocérvice com sua flora comensal e o útero e as tubas que são estéreis. A esterilidade 18

endocervical varia de acordo com alterações hormonais do ciclo menstrual. 19

O epitélio estratificado da vagina e ectocérvice e o muco secretado pelas 20

células endocervicais funcionam como uma importante barreira à entrada de agentes 21

infecciosos. Este muco é composto por água, íons, proteínas, imunoglobulinas, além de 22

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enzimas e lactoferrina que funcionam como agentes bacteriostáticos (SCHUMACHER et 1

al., 1977; QUAYLE et al., 1998; VALORE et al., 1998). 2

O sistema imune do trato genital feminino faz parte do extenso sistema de 3

imunidade de mucosas com algumas particularidades. A classe de imunoglobulinas 4

secretadas é principalmente IgG e não IgA e a resposta imune é muito influenciada pelas 5

alterações hormonais, o que não é observado em outros sítios (JOHANSSON & LYCKE, 6

2003) . 7

A resposta imune do trato genital inferior pode ser agrupada em duas 8

categorias: imunidade inata e adaptativa. Esta última é responsável por resposta específica 9

frente a determinado patógeno (bactérias, vírus e fungos), processo esse que inclui ativação 10

de linfócitos, produção de citocinas, citotoxidade e síntese de anticorpos por linfócitos B. 11

A resposta imune inata envolve células (macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, 12

células NK) e fatores solúveis (defensinas, óxido nítrico, componentes do complemento 13

entre outros) e, apesar não ser específica, representa a primeira linha de defesa contra a 14

invasão de patógenos (WIRA et al., 2005). 15

1.5 CITOCINAS 17

As citocinas são proteínas secretadas por células tanto da imunidade inata 19

como da adaptativa produzidas em resposta a microrganismos e outros antígenos e são 20

mediadoras e reguladoras de reações imunes e inflamatórias. A denominação interleucina 21

(IL) foi criada para citocinas produzidas por leucócitos e que atuam sobre os mesmos, 22

entretanto esse termo é empregado amplamente para a maioria das citocinas sendo usado 23

para classificá-las. Elas possuem vida média curta e atuam se ligando a receptores 24

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específicos na membrana da célula-alvo. Apresentam as seguintes propriedades: são 1

moléculas pleitrópicas (podem atuar em diversos tipos celulares), possuem efeitos 2

redundantes (várias citocinas podem efetuar as mesmas ações) e podem influir na ação de 3

outras citocinas de forma sinérgica ou antagônica (ABBAS & LICHMAN, 2005). 4

A resposta imunitária efetuada por linfócitos T CD4+ é classificada em perfis 5

de acordo com as citocinas que produzem, sendo três os mais estudados: Th1, Th2 e Th3 6

(OHTSUKA & SANDERSON, 2000). 7

As células Th1 secretam citocinas pró-inflamatórias como interferon γ (IFN-γ), 8

fator de necrose tumoral (TNF)-α e β, fator estimulador de colônias de granulócitos 9

macrófagos (GM-CSF), IL-1α e β, IL-2, IL-8 e IL-12. Essas citocinas promovem a 10

imunidade celular e são necessárias para efetuar respostas mediadas principalmente por 11

fagócitos contra microorganismos intracelulares (entre eles os vírus) e contra células 12

tumorais. Já as células Th2 produzem as citocinas IL-3, IL4, IL5, IL6, IL9, IL10, IL13 que 13

favorecem a resposta humoral contra patógenos extracelulares e respostas alérgicas 14

(BENDTZEN et al, 1995; GONÇALVES & DONADI, 2004). O padrão de resposta Th3 é 15

representado pela produção de TGF-β o qual inibe a proliferação e diferenciação de 16

linfócitos T e a ativação de macrófagos (citocina reguladora). 17

Existem evidências de que a resposta imune mediada por células, sistêmica e 18

local, é importante no curso da infecção pelo HPV (WU & KURMAN, 1997). Análises 19

quantitativas e qualitativas de citocinas têm sido usadas para caracterizar a resposta imune 20

em infecções pelo HPV associadas à NIC. 21

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1.6 IMUNOTERAPIA COM INTERFERON NO TRATAMENTO DAS LESÕES DE 1

ALTO GRAU 2

O complexo interferon (IFN) é uma família de glicoproteínas sintetizadas por 4

células de diferentes origens. Tem várias funções entre elas: 1- inibidora da multiplicação 5

viral, 2- imunomoduladora, estimulando células NK e monócitos, 3- anti-angiogênica e 6

anti-proliferativa (HALLER et al., 2006). 7

Até o momento são reconhecidos três tipos de IFNs : tipo I, tipo II e tipo III 8

(RANDALL & GOODBOURN, 2008). O tipo I inclui os IFNs -α, -β, -ω, -ε, -τ, -δ, e –κ. O 9

tipo II tem no IFN-γ seu representante único; enquanto o tipo III, de descrição mais 10

recente, é representado pelos IFNs-λ1, -λ2 e -λ3 (referidos respectivamente como IL-29, 11

IL-28A e IL-28B) (ANK et al., 2006 ; UZÉ & MONNERON, 2007). 12

Os IFNs -α, -β e -γ são os que estão mais diretamente implicados na resposta 13

imune durante a infecção viral. O IFN-α é produzido principalmente por linfócitos 14

infectados por vírus (sendo o interferon alfa-2b produzido com a tecnologia do DNA 15

recombinante), o IFN-β é sintetizado por vários tipos celulares, dentre eles os fibroblastos 16

e o IFN-γ, linfocina derivada do estímulo de linfócitos T e células NK (STELLATO, 17

1992). 18

Os interferons tipo I são proteínas compostas por 165 a 200 aminoácidos com 19

formato helicoidal, constituídas por cinco α-hélices (MITSUI & SENDA, 1997). São 20

codificados por genes do cromossomo 9 e possuem dois receptores, IFNAR1 e IFNAR2, 21

presentes na membrana celular (codificados por genes do cromossomo 21) (HARDY et al., 22

2004; UZÉ et al., 2007). O domínio intracelular desses receptores está associado com 23

específicas tirosino-quinases (Tyk-2) que são fosforiladas em outras tirosino-quinases 24

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(família Janus de proteínas quinases): JAK1 e JAK2. A ligação do IFN ao receptor também 1

resulta na fosforilação de IRFAR1 por Stat1 e Stat2. Essas Stats recrutadas para a 2

fosforilação de IFRAR1 formam dois complexos denominados fator ativador de IFN-α 3

(AAF) e fator genético 3 estimulador de IFN (ISGF3). Esses fatores são translocados para 4

dentro do núcleo e unidos a seqüências de DNA chamadas GAS (seqüência ativadora de 5

IFN-γ) e ISRE (elemento responsável pela estimulação de interferon). A sinalização de 6

IFN resulta na indução de transcrição de centenas de genes-alvo dentre eles o gene p53, 7

supressor de tumor. A indução de IFN-α /β é regulada por fatores reguladores de IFN (IRF) 8

(HONDA et al., 2005). 9

Células tumorais geralmente apresentam defeitos estruturais e são destruídas 10

por apoptose, morte celular programada. IFNs podem induzir apoptose por um mecanismo 11

que consiste em ativação de cascata de caspases (EARNSHAW et al.,1999; BARTON et 12

al., 2005; MUSCAT et al., 2006; SAIDI et al., 2006). A apoptose induzida por IFN-α está 13

associada à ativação de caspases 1, 2, 3, 8 e 9 (THYRELL et al., 2002). A 14

imunomodulação e a inibição da angiogênese são mecanismos antitumorais indiretos do 15

IFN. Quanto à imunomodulação os interferons atuam aumentando o número de células T 16

citotóxicas, células NK e células dendríticas. A inibição da angiogênese pode resultar da 17

apoptose de células endoteliais o que é importante na inibição do crescimento tumoral e na 18

formação de metástases (LINDNER, 2002). 19

Estudos recentes têm mostrado aplicabilidade do interferon no tratamento de 20

diversas patologias, entre elas: a hepatite viral, a esclerose múltipla e o câncer (BORDEN 21

et al., 2007). Desde o início dos anos 80, vários estudos têm utilizado o interferon no 22

tratamento do câncer ginecológico com respostas variadas (NOMELINI et al., 2007). 23

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Em se tratando do interferon-α, alguns trabalhos mostram remissão da doença 1

variando de 30 a 80% dos casos (CHOO et al., 1986; DUNHAM et al., 1990; STELLATO, 2

1992). Entretanto, outros autores aplicando interferon alfa-2b intralesional obtiveram 3

resultados semelhantes ao placebo (BYRNE et al., 1986; FROST et al., 1990). 4

Vários trabalhos (CINEL et al., 1991; PENNA et al., 1994; ROTOLA et al., 5

1995;

KATESMARK et al., 1999; MICHELETTI et al., 1992; GRISMONDI et al., 1995) 6

mostraram bons resultados com o uso do ß-Interferon no tratamento das NICs. 7

Estudos envolvendo o IFN-γ no tratamento das NICs apresentaram sucesso 8

terapêutico (IWASAKA et al., 1990) mas o resultado a longo prazo foi inferior ao 9

tratamento cirúrgico ( SIKORKI & ZRUBE, 2003). 10

Em se tratando de neoplasia invasiva, MURTA & MURTA (2004) obtiveram 11

cura de paciente com carcinoma invasivo de vagina tratado com interferon alfa-2b 12

intralesional. 13

O fato de a gravidez ser um evento cada vez mais tardio na vida da mulher, 14

aliado à ocorrência de infecção pelo HPV estar se tornando cada vez mais freqüente em 15

pacientes jovens urge que terapias clínicas, que não alterem o futuro reprodutivo das 16

pacientes, como, por exemplo, o uso do interferon, sejam testadas e aprimoradas. 17

Até o momento, nenhum estudo avaliou as alterações imunológicas 18

ocasionadas pelo interferon no ambiente vaginal e a relação dessas alterações com a 19

resposta clínica ao tratamento. O conhecimento das alterações imunológicas na terapêutica 20

com interferon é de fundamental importância para o desenvolvimento de estratégias no 21

tratamento do câncer e de suas lesões precursoras. 22

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2. HIPÓTESES

1- Pacientes com neoplasia intra-epitelial cervical graus II e III podem 3

apresentar regressão clínica da lesão quando tratadas com interferon alfa-2b 4

intralesional. 5

2- A variação da concentração das citocinas na secreção vaginal durante o 7

tratamento pode estar relacionada com a resposta clínica. 8

3- Ocorre diminuição da carga viral do HPV durante o tratamento com 10

interferon. 11

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3. OBJETIVOS

1- Avaliar a resposta clínica de pacientes com lesão de alto grau tratadas com 4

Interferon alfa-2b através de exame colposcópico e biópsia. 5

2- Avaliar parâmetros imunológicos, como a presença citocinas presentes na 7

secreção vaginal, antes, durante e após o tratamento (citocinas IL1β, IL2, 8

IL-4, IL6, IL8, IL-10, IL-12, TNF, INF-γ). 9

3- Avaliar a presença de HPV de alto risco e correlacionar a carga viral do 11

mesmo (antes e após o tratamento) com a resposta clínica. 12

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4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 MATERIAL 3

4.1.1 Pacientes 5

O grupo de estudo foi composto de pacientes com idade entre 18 e 50 anos 7

com diagnóstico de Neoplasia Intra-epitelial Cervical graus II e III não submetidas a 8

tratamento prévio. De cada paciente foram obtidas informações sobre idade, hábitos e 9

condições de vida (tabagismo, uso drogas, número de parceiros), métodos contraceptivos 10

usados, tendo sido orientado o uso de condon durante todo o tratamento. A identificação 11

das pacientes foi feita por números, sendo que a primeira paciente a participar do trabalho 12

recebeu a identificação “1”, a segunda “2” e assim por diante. 13

O estudo foi analisado e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da 14

Universidade Federal do Triângulo Mineiro (Anexo A). Além disso, também foi obtido 15

Consentimento livre e esclarecido, por escrito, de cada paciente ou de seus familiares 16

(Anexo C). 17

4.1.2 Critério de inclusão 19

Os critérios para inclusão foram: 21

a) ausência de sangramento durante o exame; 22

b) lesão maior que 1cm

; 23

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c) colposcopia satisfatória; 1

d) não utilização de antibióticos orais, fungicidas ou cremes vaginais durante 2

os 30 dias anteriores; 3

e) não utilização de antiinflamatórios ou imunodepressores 15 dias antes do 4

início do tratamento até o término do mesmo; 5

f) nenhuma atividade sexual, pelo menos dois dias antes do dia da coleta das 6

amostras; 7

g) nenhuma história prévia de tratamento para NIC. 8

4.1.3 Critérios de exclusão 10

Os critérios para exclusão foram: 12

a) pacientes portadoras de doenças imunodepressoras, cardiopatias graves ou 13

com alteração da função hepática ou renal; 14

b) gestantes; 15

c) pacientes cujo uso de antiinflamatórios ou imunodepressores não poderiam 16

ser suspensos durante o tratamento com interferon; 17

d) relato de intolerabilidade ao interferon; 18

e) ausência de lesão visível à colposcopia ou lesão muito pequena (inferior a 1 19

). 20

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4.2 MÉTODOS 1

4.2.1 Modelo de estudo 3

Foi realizado um estudo prospectivo no Hospital Escola da Universidade 5

Federal do Triângulo Mineiro, Ambulatório Maria da Glória, pelas Disciplinas de 6

Ginecologia e Obstetrícia, Imunologia e Patologia Cirúrgica. 7

4.2.2 Colposcopia 9

As pacientes selecionadas de acordo com os critérios descritos anteriormente 11

foram encaminhadas pelo ambulatório de Colposcopia da Universidade Federal do 12

Triângulo Mineiro (UFTM) e já tinham biópsia positiva para lesão de alto grau. Antes da 13

primeira e da última aplicação foram submetidas a exame colposcópio e tiveram as 14

imagens fotografadas através de videocolposcópio (Programa “Software” Vídeo 15

Diagnose

). 16

A exposição do colo uterino foi obtida através da introdução de espéculo 17

vaginal. Após tal procedimento foi instilado ácido acético a 3% , seguido de lugol e 18

bissulfito. A classificação colposcópica utilizada no estudo seguiu a da Internacional 19

Federation for Cervical Pathology and Colposcopy (IFCPC) determinada em Roma, no 20

ano de 1990 (STAFL & WILBANKS, 1991). De acordo com essa classificação, são 21

considerados achados normais o epitélio pavimentoso original, o epitélio cilíndrico e zona 22

de transformação normal. Os critérios de anormalidade são divididos, de acordo com a sua 23

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gravidade, em lesões maiores e lesões menores. São consideradas lesões menores as que 1

apresentam epitélio acetobranco fino, mosaico regular, leucoplasia fina e vasos típicos. Já 2

as lesões maiores caracterizam-se por epitélio branco espessado, mosaico irregular, 3

pontilhado irregular, leucoplasia espessada e vasos atípicos. 4

Na última aplicação do interferon foi realizada coleta de biópsia e de citologia 5

oncótica tríplice. A biópsia foi dirigida por colposcopia com auxílio de Pinça de Thomas 6

Gaylor de 24 cm, 2 mm. O fragmento foi embebido em solução de formaldeído e 7

encaminhado para estudo anátomo-patológico para confirmação da resposta ao tratamento. 8

4.2.3 Anátomo-patológico 10

Foi realizado estudo anátomo-patológico dos fragmentos de biópsia de colo 12

uterino embebidos em parafina, pelo Serviço de Patologia Cirúrgica do Hospital Escola - 13

UFTM, sendo que os casos foram revisados por um único observador (Profa. Dra. Sheila 14

Jorge Adad, co-orientadora do trabalho). Todos os dados clínicos, laboratoriais e 15

histológicos foram arquivados em banco de dados específico para o estudo. 16

4.2.4 Aplicação do interferon 18

Foi usado neste trabalho o Interferon alfa-2b humano recombinante 3.000.000 20

U (Blauferon B

R-

Blausiegel). Cada caixa da medicação é composta de um frasco-ampola 21

com pó liófilo acompanhado de ampola com diluente de 1,0 ml que foram acondicionados 22

em geladeira à temperatura de 4º C. O medicamento foi mantido fora do refrigerador por 23

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cerca de 15 minutos antes de sua utilização. 1

Para a reconstituição foram adotados os seguintes passos (orientados na bula 2

da medicação): 1-retirou-se o lacre de plástico do frasco-ampola do liofilizado, 2-fez-se a 3

limpeza da superfície da tampa com algodão umedecido com álcool, 3- abriu-se a ampola 4

de diluente e, com auxílio de uma seringa, retirou-se a água da ampola de diluente, 4- 5

perfurou-se a parte central da tampa do frasco-ampola do liofilizado e injetou-se o diluente 6

vagarosamente, 5- agitou-se suavemente aguardando a completa dissolução do liofilizado, 7

6- retirou-se com o auxílio de uma seringa de 1ml a solução reconstituída. 8

As aplicações foram feitas utilizando-se seringa de 1,0 ml e agulha 13 x 0,45 9

três vezes por semana em dias alternados (segundas, quartas e sextas-feiras), por 6 semanas 10

consecutivas, perfazendo um total de 18 aplicações, sendo que em cada aplicação era 11

administrada a dose de 3.000.000 U. 12

A exposição do colo uterino foi obtida através da introdução de espéculo 13

vaginal e a antissepsia do colo e paredes vaginais foi feita com gaze embebida em 14

polvidine tópico usando, para isso, pinça de Cherron. Procedia-se então à aplicação da 15

medicação. Em lesões múltiplas ou ocupando mais de um quadrante do colo, as aplicações 16

foram feitas alternadamente em cada lesão (no caso de lesões isoladas) ou em cada 17

quadrante (no caso de lesões contínuas). 18

Durante o tratamento foram dosados desidrogenase lática, hemoglobina, 19

leucócitos, plaquetas, fosfatase alcalina, tempo de protombina (TAP) e tempo 20

tromboplastina parcial ativada (TTPA), uréia, creatinina, AST e ALT uma vez que havia 21

possibilidade de influência do interferon nestes fatores. 22

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4.2.5 Coleta da secreção vaginal para dosagem de citocinas 1

A secreção vaginal foi coletada através da introdução da escova para citologia 3

e esta, após introduzida, girada uma vez no fundo de saco vaginal. A seguir a mesma foi 4

colocada em um tubo eppendorf

de 0,5 ml contendo 0,3ml de solução salina. Após 5

quebrar a haste, o tubo foi fechado, submetido a agitação em vortex por 1min, invertido e 6

realizado um orifício na parte inferior do mesmo. Com cuidado o mesmo foi encaixado em 7

um tubo eppendorf

de 1,5ml e submetido à centrifugação por 5 minutos a 300g. Após a 8

centrifugação, o tubo de cima foi descartado e

finalmente o volume foi acertado para 500ul 9

com solução salina e o material estocado a –20°C para posteriores dosagens. 10

A secreção vaginal foi colhida antes da primeira, da sexta, da décima segunda e 11

décima oitava (última) aplicação. 12

4.2.6 Técnica de Realização do Teste de Captura Híbrida 14

Para pesquisa do HPV foi realizado técnica de captura de híbridos. Todo o 16

procedimento de coleta foi realizado com base no manual de orientação da empresa Digene 17

do Brasil, fornecedora dos kits e equipamento utilizado no teste de captura híbrida. Para 18

coleta foi utilizado kit coletor especial, composto de um tubete com solução conservadora 19

para ácido desoxirribonucléico (DNA) e uma escova. Foi realizado exposição do colo 20

uterino através da introdução de um espéculo vaginal. Após realizar a remoção do excesso 21

de muco ao redor do orifício externo e da ectocérvix com utilização de uma gaze, foi 22

introduzido 1 cm da escova no canal cervical e procedeu-se o movimento de rotação por 23

três vezes no sentido horário. A seguir escovava-se a ectocérvix e as paredes vaginais. 24

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Imediatamente após a coleta a escova foi inserida no tubete, dentro de solução tampão; a 1

haste da escova foi quebrada e o tubete fechado. Movimento de agitação do mesmo foi 2

realizado por 30 segundos a fim de promover homogeneização da amostra. Após esse 3

procedimento o material foi congelado a uma temperatura de 70 graus negativos para fins 4

de conservação. 5

Foi utilizado aparelho marca Captura Híbrida

II System DML 2000 sistema 6

de microplaca com amplificação de sinal por quimioluminescência. As informações e a 7

metodologia abaixo descrita constam no manual de instrução fornecido pela Digene

do 8

Brasil. 9

Para a detecção do HPV o kit possui 18 tipos virais agrupados em dois pools 10

de sondas. As sondas para os vírus de baixo risco incluem os tipos 6, 11, 42, 43 e 44, 11

representando aproximadamente 70% desse grupo de vírus. Em relação aos vírus de alto 12

risco, o sistema contém as sondas com os tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 13

e 68, representando aproximadamente 99% desse grupo de vírus. A sensibilidade da 14

microplaca é de 1 pg/ml, equivalente a 0,1 cópia de vírus por célula. A primeira etapa do 15

teste consistiu na realização de digestão e desnaturação que foram feitas ao mesmo tempo 16

no próprio tubo de coleta. Adicionou-se à amostra, nessa etapa, uma solução contendo 17

hidróxido de sódio, que, além de digerir qualquer outra estrutura, desnaturava o DNA, 18

separando as pontes de hidrogênio que unem as bases nitrogenadas para facilitar a 19

hibridização. Na etapa de desnaturação, o DNA era submetido a altas temperaturas e a pH 20

alcalino, deixando as bases nitrogenadas livres para a hibridização. Para esse procedimento 21

necessitou-se de banho-maria à 65º C durante uma hora. Após a digestão e a desnaturação, 22

75 µl da amostra foram transferidos para os microtubos, a fim de que se proceder a 23

hibridização. Nessa etapa, as sondas de RNA foram diluídas em diluente próprio e 24

aliquotadas na quantidade de 25 µl nos microtubos. A hibridização demandou banho-maria 25

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à 65º C durante uma hora. Depois de hibridizado, o material foi transferido para uma 1

microplaca com paredes recobertas por anticorpos monoclonais, a fim de eliminar a 2

possibilidade de reação cruzada, “anti-RNA: DNA”, que iriam reagir com os híbridos 3

formados anteriormente. Essa etapa é denominada captura híbrida e se fez com um rotary-4

shaker à temperatura de 20-25º C durante uma hora. A partir da captura, quando já se 5

formou um complexo “anti-RNA: DNA - híbrido”, passou-se para a fase de detecção. Toda 6

a solução contida na microplaca foi desprezada, e foi adicionado “anti-RNA: DNA” 7

conjugado a fosfatase alcalina que reagiria com o complexo ligado à parede da microplaca. 8

Essa fase teve duração de 30 minutos à temperatura de 20-25º C. Após esse período, 9

novamente desprezou-se o material líquido da microplaca e uma única lavagem do ensaio 10

foi feita. Com ela retirou-se o excesso de fosfatase alcalina que não formou complexo 11

anticorpo-híbrido-anticorpo. O substrato Emerald era adicionado e degradado pela 12

fosfatase alcalina durante 15 minutos. O grau de degradação do substrato depende da 13

quantidade de enzima ligada ao complexo, o que produz diferentes intensidades de cor, que 14

foram lidas por quimioluminescência, em equipamento apropriado. Todo o teste de captura 15

híbrida conta com controles negativos e positivos, testados em triplicata. O ensaio usa as 16

leituras dos controles para validação e cálculo do cut off. A validação do teste e o cálculo 17

do cut off são feitas baseadas em alguns critérios: 18

a) o coeficiente de variação das leituras entre os microwells dos controles 19

negativos ou positivos não deverá ultrapassar 25%; 20

b) a divisão das médias das leituras de RLU (unidade relativa de luz) dos 21

controles positivos pelos negativos deverá ser superior a 2; 22

c) os controles negativos deverão respeitar o limite máximo de background de 23

250 RLU; 24

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d) o valor do cut off da reação será expresso pela média dos controles 1

positivos. 2

Houve ainda dois outros controles intra-teste. O primeiro quando se fez a 3

adição do reagente de desnaturação. Todas as amostras devem tornar-se de cor roxa, o que 4

dá certeza de que todas as amostras foram desnaturadas. O segundo, quando da adição das 5

sondas, a coloração deve mudar de roxo para amarelo, assegurando que todas as amostras 6

receberam a quantidade ideal de sonda. A leitura é totalmente automatizada, o 7

quimiolumiômetro é comandado por um software que analisa os números recebidos de 8

leitura e faz todos os cálculos de validação do ensaio. O relatório final do teste foi feito 9

pelo software, não havendo margem de erro nos cálculos. As etapas de digestão e 10

desnaturação foram realizadas uma única vez. O kit para detecção do HPV permite a 11

realização de 96 testes, sendo 42 testes para vírus de alto grau, 42 testes para vírus de baixo 12

grau, 3 controles negativos e 3 controles positivos para vírus de alto grau e 3 controles 13

negativos e 3 controles positivos para vírus de baixo grau. 14

4.2.7 Citometria de Fluxo 16

A detecção de moléculas IL1β, IL2, IL-4, IL6, IL8, IL-10, IL-12, TNF, INF-γ 18

foi feita por citometria de fluxo (Cytometric bead array) em Citômetro de Fluxo BD FACS 19

Calibur TM de acordo com protocolo sugerido pela Becton Dickinson (BD

CBA). 20

Citometria de fluxo é um método de análise que permite a discriminação de 21

diferentes partículas com base no tamanho e na cor. CBA emprega uma série de partículas 22

com intensidades distintas de fluorescência para detectar simultaneamente múltiplos 23

elementos solúveis. O BD CBA utiliza a sensibilidade de detecção amplificada de 24

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imunofluorescência através de citometria para medir elementos baseado no imunoensaio e 1

permite detecções múltiplas com pequeno volume. Foram utilizados dois kits sendo um 2

para citocinas inflamatórias (IL-8, IL-1β, IL-6, IL-10, TNF, IL-12) e outro para citocinas 3

Th1/Th2 (IL-2, IL4, IL-6 IL-10, TNF, IFN-γ). 4

As citocinas capturadas são incubadas com anticorpos e formam complexos 5

“sanduíches” que são lidos em BD CBA e o resultado é obtido na forma de gráficos (como 6

exemplificado nas figuras 1.0 e 2.0) e as concentrações são obtidas a partir de software da 7

Becton Dickinson (BD

CBA). 8

Foi utilizado aparelho Citômetro de Fluxo, marca “Cytometric Bead Array” 9

. Toda a metodologia descrita está padronizada nos catálogos de produtos da BD

, 10

empresa fornecedora do aparelho e dos kits usados neste trabalho. 11

Figura 1.0: Exemplo de resultado gráfico de avaliação de citocinas Kit Th1/Th2 17

Figura 2.0: Exemplo de resultado gráfico de avaliação de citocinas inflamatórias (Human 24

Inflammation Kit) 25

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INEC OLÓGI CA

–

UFTM

4.2.7.1 Metodologia para análise das citocinas “Kit Th1/Th2” 1

O Kit “Human Th1/Th2 cytokine II” (BD

CBA) contém: Capture beads de 3

IL-2 humana, Capture beads de IL-4 humana, Capture beads de IL-6 humana, Capture 4

beads de IL-10 humana, Capture beads de TNF humano, Capture beads de IFN-γ, 5

Reagente de detecção de Th1/Th2 humano “PE”, Padrão de citocinas humanas Th1/Th2, 6

uma amostra de Cytometer Setup beads, Detector PE de controle positivo, Detector FITC 7

de controle positivo, um frasco de Wash Buffer, um frasco de diluente teste e um frasco de 8

Serum Enhancemente Buffer. 9

Para a preparação do padrão para citocinas do Kit Th1/Th2 foram seguidos os 10

seguintes passos: 1- foi aberto um frasco de Padrão de Citocinas Humanas Th1/Th2 11

liofilizado e transferidas as esferas de padrão para um tubo de polipropileno rotulado como 12

tubo (tubo principal – top standart); 2- foram reconstituídos os padrões com 2,0 ml de 13

diluente padrão tendo sido utilizado uma pipeta para homogeneização lenta; 3- foram 14

rotulados 8 tubos de 12x75 mm seguindo a seguinte ordem: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 15

1:128 e 1:256; 4- foram pipetados 300µl de diluente padrão para cada um dos 8 tubos; 5- 16

foi realizado uma série de diluições sendo transferidos 300 µl do tubo top standart para o 17

tubo 1:2 e misturados vagarosamente a seguir, após 300 µl deste tubo para o tubo 1:4 e 18

assim por diante até o tubo 1:256 (figura 3.0) ; 6- foi preparado um tubo contendo diluente 19

padrão para servir como controle negativo: 0pg/ml. 20

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Figura 3.0: Preparação de Diluições de padrão de citocinas 2

Para a preparação das amostras seguiram-se os seguintes passos: 1- foram 4

misturados 10 µl de cada capture bead para cada tubo a ser analisado (32 amostras, 9 tubos 5

com padrão de citocinas e 1 controle negativo), 2- foram centrifugados a 200g por 5 6

minutos e aspirado o sobrenadante; 3- foi ressuspendida a mistura das beads com Serum 7

Enhancedment Buffer (o mesmo volume aspirado anteriormente); 4- foram incubados os 8

tubos com as misturas por 30 minutos protegido da exposição da luz; 5- transferidos 50 µl 9

da mistura das beads para cada tubo teste, 6- foram adicionados 50 µl de Reagente de 10

detecção Th1/Th2 humano PE para cada tubo teste, 7- foram adicionados 50 µl das 11

diluições de padrões de citocinas humanas Th1/Th2 para cada tubo teste, 8- foram 12

adicionados 50 µl da amostra para cada tubo teste, 9- foram incubados os tubos por 3 horas 13

protegidos da exposição da luz, e após esse período foi adicionado 1 ml de Wash Buffer em 14

cada tubo e centrifugado a 200g por 5 minutos, 10- foi desprezado o sobrenadante e 15

adicionado 300 µl de Wash Buffer em cada tubo. 16

Para a configuração do citômetro foram preparados 3 tubos denominados de A, 17

B e C. Em cada tubo foi adicionado 50 µl de Cytometer Setup beads. Adicionaram-se 50 µl 18

de Controle positivo FITC no tubo B e 50 µl de Controle positivo PE no tubo C. Os tubos 19

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foram incubados por 30 minutos protegidos da luz. Após esse procedimento adicionaram-1

se 400 µl de Wash Buffer nos tubos B e C e 450 µl de Wash Buffer no tubo A e então, os 2

tubos foram utilizados para configuração do citômetro. 3

Foi iniciada a análise das amostras no citômetro de fluxo (BD

CBA), sendo 4

que cada amostra era agitada por cerca de 3-5 segundos em vortex antes de cada análise. 5

4.2.7.2 Metodologia para análise das citocinas “Kit Human Inflammation” (BD

CBA) 7

O “Human Inflammation” (BD

CBA) contém: Capture beads de IL-8 9

humana, Capture beads de IL-1β humana, Capture beads de IL-6 humana, Capture beads 10

de IL-10 humana, Capture beads de TNF humano, Capture beads de IL-12p70, Reagente 11

de detecção de citocinas inflamatórias “PE”, Padrão de citocinas inflamatórias, uma 12

amostra de Cytometer Setup beads, Detector PE de controle positivo, Detector FITC de 13

controle positivo, um frasco de Wash Buffer, um frasco de diluente teste e um frasco de 14

Serum Enhancemente Buffer. 15

Para a preparação do padrão para citocinas inflamatórias foram seguidos os 16

seguintes passos (semelhantes aos anteriormente descritos para a preparação do padrão 17

para citocinas do “Kit Th1/Th2”): 1- foi aberto um frasco de Padrão de Citocinas 18

Inflamatórias Humanas liofilizado e transferido as esferas de padrão para um tubo de 19

polipropileno rotulado como tubo (tubo principal – top standart); 2- foram reconstituídos 20

os padrões com 2,0 ml de diluente padrão tendo sido utilizado uma pipeta para 21

homogeneização lenta; 3- foram rotulados 8 tubos de 12x75 mm seguindo a seguinte 22

ordem: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 e 1:256; 4- foram pipetados 300µl de diluente 23

padrão para cada um dos 8 tubos; 5- foi realizada uma série de diluições sendo transferidos 24

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300 µl do tubo top standart para o tubo 1:2 e misturado vagarosamente, após 300 µl deste 1

tubo para o tubo 1:4 e assim por diante até o tubo 1:256 (como mostrado na figura 3) ; 6- 2

foi preparado um tubo contendo diluente padrão para servir como controle negativo: 3

0pg/ml 4

Para a preparação das amostras foram seguidos os seguintes passos: 1- foram 5

misturados 10 µl de cada capture bead para cada tubo a ser analisado (32 amostras, 9 tubos 6

com padrão de citocinas e 1 controle negativo), 2- foram centrifugados a 200g por 5 7

minutos e aspirado o sobrenadante; 3- foi ressuspendida a mistura das beads com Serum 8

Enhancement Buffer (o mesmo volume aspirado anteriormente); 4- foram incubados os 9

tubos com as misturas por 30 minutos protegido da exposição da luz; 5- foram transferidos 10

50 µl da mistura das beads para cada tubo teste, 6- foram adicionados 50 µl das diluições 11

de padrões de citocinas inflamatórias para cada tubo teste; 7- foram adicionados 50 µl da 12

amostra para cada tubo teste; 8- os tubos foram incubados por 1,5 hora protegidos da 13

exposição à luz; 9- foi adicionado 1 ml de Wash Buffer em cada tubo e centrifugado a 200g 14

por 5 minutos; 10- foi aspirado o sobrenadante deixando aproximadamente 100 µl de 15

líquido em cada tubo; 11- foram adicionados 50 µl de Reagente de detecção de citocinas 16

inflamatórias PE para cada tubo teste, que foram agitados e novamente incubados por mais 17

1,5 hora protegidos de exposição à luz ; 12- após esse período foi adicionado 1 ml de Wash 18

Buffer em cada tubo e centrifugado a 200g por 5 minutos, 13- foi desprezado o 19

sobrenadante e adicionados 300 µl de Wash Buffer em cada tubo. 20

Foi feita a análise das amostras no citômetro de fluxo (BD

CBA), sendo que 21

cada amostra era agitada por cerca de 3-5 segundos em vortex antes de cada análise. 22

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4.2.8 Avaliação da resposta clínica 1

Foi considerada resposta o desaparecimento completo da lesão de alto grau 3

confirmado com estudo histológico e foi considerada falha terapêutica quando houve 4

persistência de lesão de alto grau ou progressão da mesma. 5

Todas as pacientes com NIC II ou III que apresentaram persistência de lesão de 6

alto grau foram encaminhadas imediatamente para tratamento cirúrgico complementar 7

(alça diatérmica ou conização). 8

4.2.9 Análise Estatística 10

A análise estatística foi realizada através do programa GraphPad Prism 4 e 12

Microsoft Excel. Os resultados das dosagens das citocinas em cada grupo de pacientes 13

(respostas e falhas) foram analisados pelo teste de Friedman seguido de teste de Dunn para 14

definir as diferenças entre as amostras (amostra inicial, 6

aplicação, 12

aplicação e 18

aplicação). Para analisar as diferenças entre as respostas e falhas em cada amostra foi 16

usado o teste de Mann Whitney. 17

Para comparar a carga viral, antes e após o tratamento, nos dois grupos, foi 18

usado o teste de Wilcoxon. 19

A significância estatística foi estabelecida em p< 0,05. 20

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xáâÄàtwÉá

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5. RESULTADOS

Participaram deste trabalho 8 pacientes. A idade mínima foi de 22 anos e 3

máxima de 50 anos com média de idade de 31,5 anos. 4

Quanto aos hábitos e condições de vida questionados no protocolo inicial 5

(paridade, tabagismo e número de parceiros sexuais) constatou-se que 75 % (n=6) eram 6

multíparas, 62,5% (n=5) das pacientes eram tabagistas, 62,5% já tinham tido 3 ou mais 7

parceiros sexuais e a idade média de sexarca foi 16,75 anos (mínima de 14 e máxima de 18 8

anos). 9

No diagnóstico inicial observou-se que 62,5 % (n= 5) foram de NIC II e 37,5 10

% (n= 3) de NIC III. Achados colposcópicos de lesões maiores foram observados em 11

100% das pacientes consistindo em epitélio acetobranco espessado (100%, n= 8), mosaico 12

irregular (50%, n= 4), pontilhado irregular (62,5 %, n= 5), e vasos atípicos (37,5%, n= 3). 13

Nas pacientes que apresentaram boa resposta clínica (62,5%), a análise colposcópica 14

evidenciou sinais de regressão da lesão a partir da segunda semana após o início das 15

injeções. O que pôde ser observado foi: fragmentação do mosaico e atenuação gradativa de 16

áreas de epitélio acetobranco espesso com substituição das mesmas por epitélio escamoso 17

metaplásico (prancha 1). 18

Quando avaliada a resposta clínica, 62,5% (n= 5) das pacientes tiveram boa 19

resposta enquanto que 37,5 % (n= 3) apresentaram falha terapêutica. Quanto ao tamanho 20

da lesão apresentado antes do tratamento: 25% (n= 2) das pacientes tinham lesão ocupando 21

apenas um quadrante do colo uterino e em 75% (n= 6) a lesão ocupava mais de um 22

quadrante. Relacionando-se a resposta clínica ao tamanho da lesão, as pacientes com lesão 23

ocupando apenas um quadrante (n= 2) tiveram 100% de resposta ao tratamento enquanto 24

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que as pacientes com lesão ocupando mais de um quadrante (n= 6) tiveram 50% de 1

resposta (n= 3) e 50% de falha terapêutica (n= 3). Desse modo todas as pacientes com 2

falha terapêutica tinham lesão ocupando mais de um quadrante. 3

Os efeitos colaterais referentes ao uso da medicação foram observados em 4

100% das pacientes e consistiram em: mialgia, febre baixa (em torno de 38º C) e astenia, 5

sintomas estes restritos ao dia da aplicação, iniciando em média 2 horas após a aplicação 6

com duração de até 8 horas. Em nenhum caso houve necessidade de se interromper ou 7

suspender o tratamento. Nenhuma paciente apresentou alteração de função hepática, renal 8

ou de coagulação e os exames colhidos durante o tratamento (desidrogenase lática, 9

hemoglobina, leucócitos, plaquetas, fosfatase alcalina, TAP e TTPA, uréia, creatinina, 10

AST e ALT) não mostraram alteração. 11

A tabela 1 mostra o diagnóstico inicial e final (após o término do tratamento) 12

de cada paciente assim como a resposta clínica ao tratamento e a conduta tomada em cada 13

caso. As pacientes com resposta foram encaminhadas para seguimento trimestral no 14

ambulatório de colposcopia enquanto que das que tiveram falha (n= 3), uma foi submetida 15

à alça diatérmica e duas à conização (indicação baseada principalmente no tamanho da 16

lesão). 17

Tabela 1 - Diagnóstico inicial e final por biópsia de todas as pacientes e conduta tomada 18

em cada caso, após o término do tratamento. 19

Paciente

Idade

(anos)

Diagnóstico

Inicial

Diagnóstico

final

Resposta/Falha Conduta

1 23 NIC II NIC I Resposta Seguimento

2 22 NIC III NIC I Resposta Seguimento

3 36 NIC III

Infecção pelo

HPV

Resposta Seguimento

4 50 NIC II NIC I Resposta Seguimento

5 25 NIC II NIC III

Falha

terapêutica

Alça

diatérmica

6 30 NIC II

Infecção pelo

HPV

Resposta Seguimento

7 38 NIC III NIC II

Falha

terapêutica

Conização

8 28 NIC II NIC II

Falha

terapêutica

Conização

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Prancha 1: Imagens colposcópicas das lesões antes do tratamento e após o seu término

Colposcopia da paciente 1 antes do tratamento

Colposcopia da paciente 1 no término do

tratamento (boa resposta)

Colposcopia da paciente 3 antes do tratamento

Colposcopia da paciente 3 no término do

tratamento (boa resposta)

Colposcopia da paciente 7 antes do tratamento

Colposcopia da paciente 7 no término do

tratamento (falha terapêutica)

Colposcopia da paciente 8 antes do tratamento

Colposcopia da paciente 8 no término do

tratamento (falha terapêutica)

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As médias de concentração de cada citocina, antes do tratamento e durante o 1

mesmo, estão representadas nas figuras de 4.0 a 14.0. 2

Nas mulheres que tiveram falha houve aumento da média de concentração de 3

IFN-γ (figura 4.1) e queda na última aplicação (p= 0,5243, teste de Friedman). Nas que 4

tiveram resposta (figura 4.2), os níveis foram praticamente constantes durante todo o 5

tratamento (p= 0, 6522, teste de Friedman). 6

Quanto à IL-10, as figuras 5.1 e 5.2 mostram que o conjunto das pacientes que 7

tiveram falha terapêutica apresentou média de concentração mais elevada na amostra 8

inicial do que as pacientes que tiveram resposta (p= 0,5714, teste de Mann Whitney). 9

Durante o tratamento, as pacientes que tiveram falha apresentaram níveis decrescentes nas 10

médias dessa interleucina (p= 0,7274, teste de Friedman) enquanto que nas que tiveram 11

resposta as médias mantiveram-se praticamente constantes (p= 0,5610, teste de Friedman). 12

A média da concentração de IL-6 (figura 13.0) mostrou-se significativamente 13

bem elevada na sexta aplicação no grupo de pacientes que teve falha quando comparado 14

com o grupo das que tiveram resposta na mesma aplicação (p= 0,0357, teste de Mann 15

Whitney). Analisando-se todas as pacientes (figura 6.0) a variação da média de 16

concentração dessa interleucina foi significativa (p= 0,0274, teste de Friedman). 17

A média da concentração de IL-4 (figuras 7.0, 7.1 e 7.2) manteve-se 18

praticamente constante no grupo das pacientes que tiveram falha terapêutica (p= 0,9097, 19

teste de Friedman) e no grupo das que tiveram resposta (p= 0,1066). Esse fato foi também 20

observado com a IL-2 (figuras 8.0, 8.1 e 8.2). 21

Quanto à IL-1β (figuras 9.0, 9.1 e 9.2), o grupo de pacientes que tiveram falha 22

terapêutica apresentou média de concentração bem elevada durante todo o tratamento (p= 23

0,7274, teste de Friedman) enquanto que nas pacientes que tiveram resposta, as 24

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concentrações se mantiveram mais baixas e quase que invariáveis (p= 0,5206, teste de 25

Friedman). 26

Avaliando-se a concentração média de IL-12 (figuras 10.0, 10.1 e 10.2), não 27

foi observada variação significativa nem no grupo das pacientes com falha (p= 0,6076, 28

teste de Friedman) e nem no grupo das pacientes que obtiveram boa resposta (p= 0,8566, 29

teste de Friedman). 30

Em se tratando da IL-8 (figuras 11.0, 11.1 e 11.2) foi observada constância na 31

concentração média nas pacientes que tiveram falha (p= 0,3420, teste de Friedman) e 32

diminuição dessa concentração, no grupo que apresentou resposta (p= 0,6522, teste de 33

Friedman), sendo que as amostras iniciais deste grupo tinham níveis superiores dessa 34

interleucina quando comparadas com as pacientes com falha terapêutica. 35

A média de concentração de TNF-α (figuras 12.0, 12.1, 12.2 e 14.0) foi 36

significativamente maior na sexta aplicação no grupo que apresentou falha terapêutica 37

quando comparado com o grupo das respostas na mesma aplicação (p= 0,0357, teste de 38

Mann Whitney). 39

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IFN-γ

IFN-χ

χχ

χ em todas as pacientes

A. Inicial 6a aplic 12a aplic 18a aplic

A. Inicial

6a aplic

12a aplic

18a aplic

Amostras de todas as pacientes

Concentração de IFN-

em pg/ml

Figura 4.0: Médias

DP da concentração de IFN-γ em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, de todas as pacientes. p = 0,7006

(Friedman)

IFN-χ

χχ

χ nas pacientes que tiveram falha

A. Inicial 6a aplic 12a aplic 18a aplic

A. Inicial

6a aplic

12a aplic

18a aplic

Amostras das pacientes que tiveram falha

Concentração de IFN-

em pg/ml

Figura 4.1: Médias

DP da concentração de IFN-γ em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram falha terapêutica.

p= 0,5243 (Friedman)

IFN-χ

χχ

χ nas pacientes que responderam

A. Inicial 6a aplic 12a aplic 18a aplic

A. Inicial

6a aplic

12a aplic

18a aplic

Amostras das pacientes que responderam

Concentração de IFN-

em pg/ml

Figura 4.2: Médias

DP da concentração de IFN-γ em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram resposta

terapêutica. p = 0,6522 (Friedman)

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IL-10

IL-10 em todas as pacientes

A.Inicial 6a aplic 12a aplic 18a aplic

A.Inicial

6a aplic

12a aplic

18a aplic

Amostras de todas as pacientes

Concentração de IL-10 em pg/ml

Figura 5.0: Médias

DP da concentração de IL-10 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, de todas as pacientes. p=0,7892

(Friedman)

IL-10 nas pacientes que tiveram falha

A.Inicial 6a aplic 12a aplic 18a aplic

A.Inicial

6a aplic

12a aplic

18a aplic

Amostras das pacientes que tiveram falha

Concentração de IL-10 em pg/ml

Figura 5.1: Médias

DP da concentração de IL-10 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram falha terapêutica.

p= 0,7274 (Friedman)

IL-10 nas pacientes que responderam

A.Inicial 6a aplic 12a aplic 18a aplic

A.Inicial

6a aplic

12a aplic

18a aplic

Amostras das pacientes que responderam

Concentração de IL-10 em pg/ml

Figura 5.2: Médias

DP da concentração de IL-10 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram resposta

terapêutica. p = 0,5612 (Friedman)

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IL-6

IL-6 em todas as pacientes

A.Inicial 6a aplic 12a aplic 18a aplic

500

1000

1500

2000

2500

A.Inicial

6a aplic

12a aplic

18a aplic

Amostras de todas as pacientes

Concentração de IL-6 em pg/ml

Figura 6.0: Médias

DP da concentração de IL-6 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, de todas as pacientes. *p=0,0274

(Friedman) com p< 0,05 entre a 6ª aplic. e 18ª aplic. (Pós-teste de Dunns)

IL-6 nas pacientes que tiveram falha

A.Inicial 6a aplic 12a aplic 18a aplic

500

1000

1500

2000

2500

A.Inicial

6a aplic

12a aplic

18a aplic

Amostras das pacientes que tiveram falha

Concentração de IL-6 em pg/ml

Figura 6.1: Médias

DP da concentração de IL-6 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram falha terapêutica.

p= 0,0538 (Friedman)

IL-6 nas pacientes que responderam

A.Inicial 6a aplic 12a aplic 18a aplic

500

1000

1500

2000

2500

A.Inicial

6a aplic

12a aplic

18a aplic

Amostras das pacientes que responderam

Concentração de IL-6 em pg/ml

Figura 6.2: Médias

DP da concentração de IL-6 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram resposta

terapêutica. p = 0,1514 (Friedman)

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IL-4

IL-4 em todas as pacientes

A.Inicial 6a aplic 12a aplic 18a aplic

A.Inicial

6a aplic

12a aplic

18a aplic

Amostras de todas as pacientes

Concentração de IL-4 em pg/ml

Figura 7.0: Médias

DP da concentração de IL-4 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, de todas as pacientes. p=0,1062

(Friedman)

IL-4 nas pacientes que tiveram falha

A.Inicial 6a aplic 12a aplic 18a aplic

A.Inicial

6a aplic

12a aplic

18a aplic

Amostras das pacientes que tiveram falha

Concentração de IL-4 em pg/ml

Figura 7.1: Médias

DP da concentração de IL-4 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram falha terapêutica.

p= 0,9097 (Friedman)

IL-4 nas pacientes que responderam

A.Inicial 6a aplic 12a aplic 18a aplic

A.Inicial

6a aplic

12a aplic

18a aplic

Amostras das pacientes que responderam

Concentração de IL-4 em pg/ml

Figura 7.2: Médias

DP da concentração de IL-4 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram resposta

terapêutica. p = 0,1066 (Friedman)

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IL-2

IL-2 em todas as pacientes

A.Inicial 6a aplic 12a aplic 18a aplic

A.Inicial

6a aplic

12a aplic

18a aplic

Amostras de todas as pacientes

Concentração de IL-2 em pg/ml

Figura 8.0: Médias

DP da concentração de IL-2 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, de todas as pacientes. p=0,4936

(Friedman)

IL-2 nas pacientes que tiveram falha

A.Inicial 6a aplic 12a aplic 18a aplic

A.Inicial

6a aplic

12a aplic

18a aplic

Amostras das pacientes que tiveram falha

Concentração de IL-2 em pg/ml

Figura 8.1: Médias

DP da concentração de IL-2 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram falha terapêutica.

p= 0,7274 (Friedman)

IL-2 nas pacientes que responderam

A.Inicial 6a aplic 12a aplic 18a aplic

A.Inicial

6a aplic

12a aplic

18a aplic

Amostras das pacientes que responderam

Concentração de IL-2 em pg/ml

Figura 8.2: Médias

DP da concentração de IL-2 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram resposta

terapêutica. p = 0,2982 (Friedman)

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132

133

134

135

136

137

138

139

140

141

142

143

144

IL-1β

IL-1 em todas as pacientes

A.Inicial 6a aplic 12a aplic 18a aplic

1000

2000

3000

4000

5000

A.Inicial

6a aplic

12a aplic

18a aplic

10000

20000

30000

Amostras de todas as pacientes

Concentração de IL-1 em pg/ml

Figura 9.0: Médias

DP da concentração de IL-1β em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, de todas as pacientes. p=0,4663

(Friedman)

IL-1 nas pacientes que tiveram falha

A.Inicial 6a aplic 12a aplic 18a aplic

1000

2000

3000

4000

5000

A.Inicial

6a aplic

12a aplic

18a aplic

26000

50000

74000

Amostras das pacientes que tiveram falha

Concentração de IL-1 em pg/ml

Figura 9.1: Médias

DP da concentração de IL-1β em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram falha terapêutica.

p= 0,7273 (Friedman)

IL-1 nas pacientes que responderam

A.Inicial 6a aplic 12a aplic 18a aplic

1000

2000

3000

4000

5000

A.Inicial

6a aplic

12a aplic

18a aplic

Amostras das pacientes que responderam

Concentração de IL-1 em pg/ml

Figura 9.2: Médias

DP da concentração de IL-1β em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram resposta

terapêutica. p = 0,5206 (Friedman)

ARÍLIA D E

AR VALHO

ARD EG AN

ESTRADO EM

AT OLOGI A

INEC OLÓGI CA

–

UFTM

145

146

147

148

149

150

151

152

153

154

155

156

157

158

159

160

IL-12

IL-12 em todas as pacientes

A.Inicial 6a aplic 12a aplic 18a aplic

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

A.Inicial

6a aplic

12a aplic

18a aplic

Amostras de todas as pacientes

Concentração de IL-12 em pg/ml

Figura 10.0: Médias

DP da concentração de IL-12 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, de todas as pacientes. p=0,9899

(Friedman)

IL-12 nas pacientes que tiveram falha

A.Inicial 6a aplic 12a aplic 18a aplic

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

A.Inicial

6a aplic

12a aplic

18a aplic

Amostras das pacientes que tiveram falha

Concentração de IL-12 em pg/ml

Figura 10.1: Médias

DP da concentração de IL-12 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram falha terapêutica.

p= 0,6076 (Friedman)

IL-12 nas pacientes que responderam

A.Inicial 6a aplic 12a aplic 18a aplic

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

A.Inicial

6a aplic

12a aplic

18a aplic

Amostras das pacientes que responderam

Concentração de IL-12 em pg/ml

Figura 10.2: Médias

DP da concentração de IL-12 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram resposta

terapêutica. p = 0,8566 (Friedman)

ARÍLIA D E

AR VALHO

ARD EG AN

ESTRADO EM

AT OLOGI A

INEC OLÓGI CA

–

UFTM

161

162

163

164

165

166

167

168

169

170

171

172

173

174

175

176

IL-8

IL-8 em todas as pacientes

A.Inicial 6a aplic 12a aplic 18a aplic

10000

20000

30000

40000

50000

A.Inicial

6a aplic

12a aplic

18a aplic

Amostras de todas as pacientes

Concentração de IL-8 em pg/ml

Figura 11.0: Médias

DP da concentração de IL-8 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, de todas as pacientes. p=0,5915

(Friedman)

IL-12 nas pacientes que tiveram falha

A.Inicial 6a aplic 12a aplic 18a aplic

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

A.Inicial

6a aplic

12a aplic

18a aplic

Amostras das pacientes que tiveram falha

Concentração de IL-12 em pg/ml

Figura 11.1: Médias

DP da concentração de IL-8 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram falha terapêutica.

p= 0,3420 (Friedman)

IL-8 nas pacientes que responderam

A.Inicial 6a aplic 12a aplic 18a aplic

10000

20000

30000

40000

50000

A.Inicial

6a aplic

12a aplic

18a aplic

Amostras das pacientes que responderam ao tratamento

Concentração de IL-8 em pg/ml

Figura 11.2: Médias

DP da concentração de IL-8 em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram resposta

terapêutica. p = 0,6522 (Friedman)

ARÍLIA D E

AR VALHO

ARD EG AN

ESTRADO EM

AT OLOGI A

INEC OLÓGI CA

–

UFTM

177

178

179

180

181

182

183

184

185

186

187

188

189

190

191

192

193

TNF-α

αα

α em todas as pacientes

A.Inicial 6a aplic 12a aplic 18a aplic

A.Inicial

6a aplic

12a aplic

18a aplic

Amostras de todas as pacientes

Concentração de TNF-

em pg/ml

Figura 12.0: Médias

DP da concentração de TNF-α em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, de todas as pacientes. p=0,4673

(Friedman)

TNF-α

αα

α nas pacientes que tiveram falha

A.Inicial 6a aplic 12a aplic 18a aplic

A.Inicial

6a aplic

12a aplic

18a aplic

Amostras das pacientes que tiveram falha

Concentração de TNF-

em pg/ml

Figura 12.1: Médias

DP da concentração de TNF-α em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram falha terapêutica.

p= 0,1476 (Friedman)

TNF-α

αα

α nas pacientes que responderam

A.Inicial 6a aplic 12a aplic 18a aplic

A.Inicial

6a aplic

12a aplic

18a aplic

Amostras das pacientes que responderam

Concentração de TNF-

em pg/ml

Figura 12.2: Médias

DP da concentração de TNF-α em amostras de secreção

vaginal, colhidas durante o tratamento, das pacientes que tiveram resposta

terapêutica. p = 0,6522 (Friedman)

ARÍLIA D E

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ESTRADO EM

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–

UFTM

500

1000

1500

2000

2500

A inicial 6a aplic 12a

aplic

18a

aplic

Amostras colhidas durante o

tratamento

Concentração de IL-6 em pg/ml

grupo que apresentou

falha terapêutica

grupo que apresentou

boa resposta

194

Figura 13.0: Gráfico de médias de IL-6, durante o tratamento, por grupo de pacientes com 195

falha e resposta terapêutica (p< 0, 05, teste de Mann Whitney). 196

197

A inicial 6a aplic 12a aplic 18a aplic

Amostras colhidas durante o

tratamento

Concentração de TNF em pg/ml

grupo que apresentou

falha terapêutica

grupo que apresentou

boa resposta

198

Figura 14.0: Gráfico de médias de TNF-

, durante o tratamento, por grupo de pacientes 199

com falha e resposta terapêutica (p< 0, 05, teste de Mann Whitney). 200

201

A carga viral de HPV de alto risco, de cada paciente, está expressa na tabela 2. 202

Comparando-se a carga viral, antes do tratamento e ao término do mesmo, no grupo das 203

pacientes que tiveram falha e no grupo das que tiveram resposta (figura 15.0), observou-se 204

queda significativa da carga viral nas pacientes com resposta (p= 0,0313, teste de 205

Wilcoxon). 206

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–

UFTM

Tabela 2 - Carga viral de HPV de alto risco, em amostras colhidas antes do tratamento e ao 207

seu término, nos grupos de pacientes que apresentaram resposta e falha 208

terapêutica. 209

210

Pacientes

com boa

resposta

Antes do

tratamento

Após o

tratamento

Pacientes com

falha

terapêutica

Antes do

tratamento

Após o

tratamento

Paciente 1 156,0 72,0 Paciente 5 110,0 264,0

Paciente 2 38846,0 6302,0 Paciente 7 2181,0 602,0

Paciente 3 40230,0 1378, 0 Paciente 8 16682,0 251482,0

Paciente 4 102,0 94,0

Paciente 6 62,0 54,0

211

212

213

214

215

216

217

218

219

220

Figura 15.0: Médias ± DP da carga viral de HPV de alto risco, em amostras colhidas antes 221

do tratamento e ao seu término, nos grupos de pacientes que apresentaram resposta e falha 222

terapêutica. 223

224

respostas antes respostas após falhas antes falhas após

10000

20000

100000

200000

Amostras das pacientes com resposta e falha terapêutica

ante s do tratamento e ao seu término

Carga Viral de HPV de alto risco (n

de cópias)

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|ávâááûÉ

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6. DISCUSSÃO

Existem evidências que diversos fatores aumentam o risco de infecção pelo 3

HPV e o desenvolvimento de NIC ou câncer, dentre eles pode-se citar o tabagismo, a 4

paridade (CASTELLSAGUÉ & MUÑOZ, 2003), o número de parceiros sexuais e o início 5

de atividade sexual antes dos 25 anos (AULT, 2006). Em nosso trabalho, todos esses 6

fatores foram observados: 75 % eram multíparas (3 ou mais partos), 62,5 % das pacientes 7

eram fumantes, 62,5% tinham história de já terem tido 3 ou mais parceiros e a idade média 8

de sexarca foi 16,75 anos. 9

O uso de Interferon no tratamento das NICs teve seu início da década de 80 e, 10

talvez por divergência quanto à obtenção de boa resposta clínica, os trabalhos abordando 11

essa terapêutica ficaram, em sua maioria, restritos a essa década. CHOO et al. (1986) 12

administrando interferon

e ß perilesional em pacientes com NIC, observaram que o 13

interferon

induziu remissão completa da lesão em 85,7% das pacientes e dessas 50% 14

apresentaram recidiva entre 12 e 24 meses após o tratamento; com o interferon ß a resposta 15

completa ocorreu em apenas 40% dos casos. Resultado semelhante com o uso do interferon 16

foi obtido por DUNHAM et al. (1990). STELLATO (1992) usando metodologia parecida 17

com a nossa, obteve resposta completa em 33% dos casos, regressão parcial em 58% e 18

falha terapêutica em 8% . MURTA & MURTA (2004) obtiveram cura de paciente com 19

neoplasia invasiva de vagina usando interferon alfa-2b intralesional. Entretanto, BYRNE et 20

al. (1986) usando gel de interferon

topicamente em NICs e FROST et al. (1990) 21

aplicando interferon alfa-2b intralesional obtiveram resultados semelhantes ao placebo. 22

Observamos em nosso grupo de estudo (n= 8) que 62,5 % das pacientes 23

apresentaram boa resposta ao tratamento com desaparecimento da lesão de alto grau, 24

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enquanto que 37,5 % das pacientes tiveram falha terapêutica, sendo que não foi por nós 1

abordado o seguimento a longo prazo. 2

Quanto às evidências colposcópicas de regressão da lesão, observadas durante 3

o tratamento (fragmentação do mosaico e atenuação gradativa de áreas de epitélio 4

acetobranco espesso com substituição das mesmas por epitélio escamoso metaplásico), 5

nossos achados são semelhantes aos observados por CHOO et al. (1986), sendo que na 6

avaliação desses autores, alterações já foram observadas a partir do terceiro dia de 7

tratamento enquanto que em nosso trabalho as mesmas foram observadas mais tardiamente 8

(a partir da segunda semana de tratamento). Avaliando-se o tamanho da lesão, nossos 9

achados sugerem que lesões menores têm maior probabilidade de resposta completa, mas a 10

presença de lesões maiores (ocupando mais de um quadrante) não contra-indica o 11

tratamento, tendo em vista que 50% das pacientes com esse tipo de lesão tiveram sucesso 12

terapêutico. 13

Os efeitos colaterais menores, previstos no bulário da medicação (Blauferon B 14

R-

Blausiegel), foram observados em 100 % dos casos durante o tratamento (febre, cefaléia, 15

mialgia e astenia) mas são concordantes com a literatura (STELLATO,1992). Efeitos 16

colaterais maiores (alteração do sistema nervoso central, cardiopatia, mielodepressão) não 17

foram observados e, em nenhum caso houve alteração de hemograma, coagulograma, 18

enzimas hepáticas e renais. 19

Na literatura, ainda não existe nenhum trabalho avaliando concentração de 20

citocinas na secreção vaginal com a resposta clínica das pacientes com NIC, submetidas ao 21

tratamento com interferon intralesional . 22

Experimentos sugerem que o aumento da produção de IL-10 e IL-4 poderia ser 23

um mecanismo usado por células tumorais para escapar do reconhecimento do sistema 24

imune (CLERICI et al., 1997; SEO et al., 2001). Sabe-se também que IL10 e TGF-

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inibem a maturação de células dendríticas e podem indiretamente bloquear respostas por 1

linfócitos T citotócicos (LOSKOG et al., 2006). Os efeitos biológicos de IL-10 resultam de 2

sua capacidade de inibir funções de macrófagos ativados, além de inibir a expressão de 3

moléculas MHC classe II em macrófagos o que, por sua vez, diminui a ativação de células 4

T e a imunidade mediada por células. A IL-4, principal estímulo para desenvolvimento de 5

células Th2, pode antagonizar os efeitos ativadores de IFN-

sobre os macrófagos e, desse 6

modo, inibir reações imunes mediadas por células (ABBAS & LITCHMAN, 2005). Em 7

nosso estudo, foram observadas concentrações iniciais de IL-10 superiores nas pacientes 8

que tiveram falha terapêutica (figura 5.1) e, embora tenha sido observada queda dessas 9

concentrações durante o tratamento, as mesmas se mantiveram em níveis mais elevados do 10

que os observados no grupo das pacientes que obtiveram boa resposta. Embora isso não 11

tenha sido estatisticamente comprovado, sugere-se que níveis mais elevados de IL-10 12

podem estar relacionados à falha ao tratamento. Quanto à IL-4 foram observados níveis 13

baixos dessa interleucina em todas as pacientes, durante o tratamento, não tendo sido 14

observada diferença significativa nas concentrações dessa interleucina entre os grupos de 15

resposta e falha terapêutica. 16

A IL-6, que atua tanto na resposta inata quanto na adquirida, mostrou 17

concentrações bastante elevadas nas pacientes que tiveram falha (em média maior que 500 18

pg /ml) e níveis mais baixos nas pacientes com resposta (p = 0,0357 pelo teste de Mann 19

Whitney, quando avaliada a sexta aplicação). Estudo recente observou aumento da 20

concentração de IL-6 e IL-8 na secreção vaginal de pacientes com NIC (TAVARES-21

MURTA et al., 2007). Já foi demonstrado que a expressão de IL-6 no câncer cervical está 22

relacionada ao tamanho do tumor (maior que 2 cm) e que a mesma promove a angiogênese 23

tumoral favorecendo o desenvolvimento do câncer cervical (WEI et al., 2001). Em nosso 24

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trabalho, todas as pacientes que tiveram falha terapêutica tinham lesão ocupando mais de 1

um quadrante o que pode justificar o aumento expressivo dessa citocina nesse grupo. 2

Já se observou aumento da concentração de IL-8 em secreção vaginal de 3

pacientes com câncer cervical, sendo ela também considerada uma citocina pró-4

inflamatória (TJIONG et al., 1999). Existem evidências de que essa interleucina tem um 5

papel fundamental na angiogênese e está associada aos tumores avançados do colo uterino 6

(FUJIMOTO et al., 2000). Nosso trabalho, embora não tenha evidenciado diferença 7

significativa na concentração de IL-8 entre os grupos (falhas e respostas), mostrou níveis 8

bem elevados dessa concentração em ambos os grupos (em média maior que 4000 pg/ml) o 9

que está de acordo com a literatura (TAVARES-MURTA et al., 2007). 10

Estudos apontam aumento da concentração de TNF-

em pacientes com NIC 11

(PARDO-GOVEA et al., 2005; AZAR et al., 2004). Entretanto, em outros trabalhos (BAIS 12

et al., 2007; LEE et al., 2004; EL-SHERIF et al., 2001) observou-se decréscimo sistêmico 13

de interleucinas Th1 (IFN-

, TNF-

e IL-2) relacionados ao aumento do grau da NIC. 14

SCOTT et al. (1999) sugere que a persistência da infecção viral do HPV se daria por falha 15

em expressar citocinas Th1. Observamos, em nosso estudo, níveis baixos (em média menor 16

que 15 pg) de IFN-

, TNF-

, IL-2 e IL-12 tanto nas pacientes que tiveram falha como nas 17

que responderam ao tratamento. Isso faz reforçar a idéia de que ocorre decréscimo de 18

citocinas Th1 nas lesões de alto grau, tendo em vista que todas as pacientes tinham esse 19

diagnóstico. 20

Quanto à IL-1

observamos níveis médios de sua concentração mais elevados 21

no grupo de pacientes que tiveram falha terapêutica (figura 9.1) o que não foi observado no 22

grupo das que responderam bem ao tratamento (p> 0,05). Esta interleucina produzida por 23

vários tipos celulares, inclusive queratinócitos, atua como um mediador na inflamação 24

local e, com base no observado no presente trabalho, sugere-se que níveis muito elevados 25

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dessa interleucina seria fator de falha terapêutica no tratamento com interferon 1

intralesional. 2

Estudos avaliando carga viral do HPV em pacientes com NIC sugerem que a 3

mesma aumenta com a progressão do grau da doença (SWAN et al., 1999; WOODMAN et 4

al., 2007). BYRNE at al. (1986), usando interferon gel topicamente, não observaram 5

alteração significativa na carga viral antes do tratamento e após o mesmo. ROTOLA et al. 6

(1995) usando

-Interferon no tratamento das NICs também não observaram alteração da 7

carga viral com a terapêutica. Nenhum trabalho, entretanto, avaliou a carga viral antes do 8

tratamento com interferon alfa-2b intralesional e após o seu término. Em nossa casuística, 9

após o término do tratamento, as pacientes com resposta clínica mostraram queda 10

significativa da carga viral (p< 0,05) o que não foi observado no grupo que apresentou 11

falha terapêutica. Isso faz pensar que o tratamento com interferon alfa-2b intralesional, 12

através de seu mecanismo de ação, levaria à diminuição da carga viral o que favoreceria a 13

involução das lesões de alto grau. 14

Mais estudos, com aumento do número de pacientes, ainda são necessários 15

para melhor elucidação do padrão de resposta imune no tratamento com o interferon alfa-16

2b e, então, será possível apontar características que possam sugerir maior chance de 17

resposta ao tratamento. 18

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7. CONCLUSÕES

O tratamento das NICs graus II e III com Interferon alfa-2b intralesional 3

apresentou boa resposta clínica na maioria das pacientes. 4

Durante o tratamento a concentração de IL-6 e TNF-

na secreção vaginal é 6

bem mais elevada no grupo de pacientes que apresentaram falha terapêutica 7

quando comparado com o grupo que obteve resposta. 8

Houve queda significativa da carga viral de HPV de alto risco nas pacientes 10

com resposta terapêutica. 11

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8. RESUMO

Introdução: O HPV é um DNA vírus de dupla fita que pode infectar o trato 3

genital inferior. A sua persistência, especialmente com tipos oncogênicos, está fortemente 4

associada ao desenvolvimento de lesões intra-epitelias cervicais de alto grau. O tratamento 5

dessas lesões é usualmente excisional (conização a frio, conização a laser, alça diatérmica) 6

e alguns estudos têm apontado aumento da incidência de intercorrências obstétricas em 7

mulheres previamente submetidas a tratamento excisional como, o trabalho de parto-pré 8

termo, o baixo peso ao nascer e a ruptura prematura das membranas. O tratamento 9

conservador com interferon intralesional pode estar entre as opções terapêuticas de 10

pacientes em idade fértil uma vez que não altera a anatomia do colo uterino que é o maior 11

fator gerador das complicações durante a gestação. 12

Objetivos: Avaliar a resposta clínica de pacientes com Neoplasia Intra-epitelial 13

Cervical (NIC) graus II e III tratadas com interferon alfa-2b através de exame colposcópico 14

e biópsia; analisar alteração de parâmetros imunológicos, como citocinas presentes na 15

secreção vaginal, antes, durante e após o tratamento (citocinas IL1

, IL2, IL-4, IL6, IL8 , 16

IL-10, IL-12, TNF, INF

); verificar a presença de HPV de alto risco e correlacionar a 17

carga viral (antes e após o tratamento) com a resposta clínica. 18

Material e Métodos: O grupo de estudo foi composto por pacientes com idade 19

entre 18 e 50 anos com diagnóstico de lesão de alto grau não submetidas a tratamento 20

prévio. Foi usado neste trabalho o interferon alfa-2b humano recombinante 3.000.000 U 21

(Blauferon B

R-

Blausiegel) intralesional (18 aplicações em dias alternados). Antes da 22

primeira e da última aplicação as pacientes foram submetidas a exame colposcópio com o 23

uso de videocolposcópio. Secreção vaginal foi colhida durante o tratamento para análise 24

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das citocinas o que foi feito por Cytometric bead array (Citômetro de Fluxo BD FACS 25

Calibur TM), protocolo sugerido pela Becton Dickinson (BD

CBA). A avaliação da 26

carga viral de HPV de alto risco foi feita por Captura híbrida. 27

Resultados: O diagnóstico inicial foi 62,5 % (n= 5) de NIC II e 37,5 % (n= 3) 28

de NIC III. Quanto à resposta ao tratamento: 62,5% (n=5) tiveram resposta enquanto que 29

37,5 % (n=3) tiveram falha terapêutica, sendo que essas últimas tinham lesão ocupando 30

mais de um quadrante. A média da concentração de IL-6 mostrou-se significativamente 31

bem elevada na sexta aplicação no grupo de pacientes que tiveram falha quando 32

comparadas com o grupo das que tiveram resposta na mesma aplicação (p= 0,0357, teste 33

de Mann Whitney). Analisando-se todas as pacientes, a variação da média de concentração 34

dessa interleucina foi significativa (p=0,0274, teste de Friedman). Quanto à IL-1

, o grupo 35

de pacientes que teve falha terapêutica apresentou média de concentração bem elevada 36

durante todo o tratamento (p= 0,7274, teste de Friedman) enquanto que, nas pacientes que 37

tiveram resposta, as concentrações se mantiveram mais baixas e quase que invariáveis (p= 38

0,5206, teste de Friedman). A média de concentração de TNF-

foi significativamente 39

maior na sexta aplicação no grupo que apresentou falha terapêutica quando comparado 40

com o grupo que obteve resposta, na mesma aplicação (p= 0,0357, teste de Mann 41

Whitney). Comparando-se a carga viral, antes do tratamento e após o término do mesmo, 42

grupo das pacientes que tiveram falha e no grupo das que tiveram resposta observou-se 43

queda significativa da mesma (p= 0,0313, teste de Wilcoxon). 44

Conclusões: O tratamento das NICs II e III com interferon alfa-2b intralesional 45

apresentou boa resposta clínica na maioria das pacientes. A concentração de IL-6 e TNF-

na secreção vaginal, durante o tratamento é bem mais elevada no grupo de pacientes que 47

apresentaram falha terapêutica quando comparado com o grupo que obteve resposta. A 48

média de concentração de TNF-

foi significativamente maior na sexta aplicação do grupo 49

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que apresentou falha terapêutica quando comparado com o grupo das respostas na mesma 50

aplicação. Existe queda significativa da carga viral de HPV de alto risco nas pacientes com 51

resposta terapêutica. 52

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9. ABSTRACT

Introduction: HPV is a DNA virus of tape double which can infect the lower 3

genital tract. Its persistence, especially with oncogenic types is highly associated with the 4

development of the high-grade squamous intraepithelial lesions. Treatment of these lesions 5

is usually excisional (cold conization, laser conization, diathermic conization) and some 6

studies have pointed the increase of the obstetric complications incidence in these women 7

such as, preterm labor, low birth weight and premature rupture of the membranes in 8

women previously submitted to these treatments. Conservative treatment with intralesional 9

interferon can be among the therapeutical options of patients in fertile age since it does not 10

alter the anatomy of the uterine cervix which is the greatest fact that causes complications 11

during pregnancy. 12

Objectives: Evaluate the clinical response of the patients with Cervical 13

Intraepithelial Neoplasia (CIN) II and III treated with interferon-

-2b through colposcopy 14

and biopsy; analyze alteration of the immunological parameters, such as cytokines present 15

in the vaginal secretion, before, during and after the treatment, (cytokines IL 1

, IL2, IL-4, 16

IL6, IL8, IL-10, IL-12, TNF, INF

); verify the presence of high-risk HPV and correlate 17

viral load (before and after the treatment) with the clinical response. 18

Material and Methods: The study group was made up by patients aged 18 to 19

50 years old, with a diagnosis of high-grade cervical intraepithelial neoplasia, not 20

submitted to previous treatment. In this work it was used Intralesional Human recombinant 21

Interferon-

-2b 3.000.000 (Blauferon B

R-

Blausiegel) (18 applications in alternate days). 22

Before the first and at the last application patients were submitted to a colposcopy with the 23

videocolposcopy. Vaginal secretion was collected during the treatment for cytokines 24

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analysis, what was done by Cytometric bead array (Flow cytometry BD FACS Calibur 1

TM, protocol suggested by Becton Dickinson (BD

CBA). Typing HPV was performed 2

by hybrid capture. 3

Results: Initial diagnosis was 62,5% (n=5) of CIN II and 37,5% (n=3) of CIN 4

III. Related to the treatment response: 62,5% (n=5) had response while 37,5% (n=3) had 5

therapeutic failure, with these last ones with lesion occupying more than one quarter. 6

Concentration average of IL-6 (picture 6) showed itself significantly high in the sixth 7

application in the group of patients which had failure compared to the group of the ones 8

who had response in the same application (p=0,357, Mann Whitney Test). Analyzing all 9

the patients (picture 6.1) the range of the average concentration of this interleukin was 10

significant (p=0,0274, Friedman’s test). Related to the IL-1

(picture 9), the group of 11

patients who had responses the concentrations continued lower and almost unchanged 12

(p=0,5206, Friedman’s test). Average TNF-

concentration (picture 12) was significantly 13

higher in the sixth application in the group that presented therapeutic failure when 14

compared to the group of responses for the same application (p=0,0357, Mann Whitney’s 15

test). Comparing the viral load, before and after the treatment in the group of patients who 16

had failure and in the group of those with response (picture 13) it was observed a 17

significant decrease of it in the patients with response (p=0, 0313, Wilcoxon’s test). 18

Conclusions: High-grade CINs treatment with Intralesional Interferon-

-2b 19

presented good clinical response in the majority of the patients. IL-6 and TNF-

concentration in the vaginal secretion, during the treatment, is higher in the group of 21

patients that presented therapeutic failure when compared to the group that had response. 22

TNF-

average concentration was significantly higher in the sixth application in the group 23

that presented therapeutic failure when compared to the group with responses in the same 24

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application. There is a significant decrease of the high-grade HPV viral load in the patients 1

with therapeutic responses. 2

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–

UFTM

59- SCHUMACHER, G. F.; KIM, M. H.; HOSSEINIAN, A. H.; DUPON, C. 197

Immunoglobulins, proteinase inhibitors, albumin, and lysozyme in human cervical 198

mucus. I. Communication: hormonal profiles and cervical mucus changes--methods 199

and results. Am. J. Obstet. Gynecol., St. Louis, v. 129, n. 6, p. 629-636, Nov. 200

1977. 201

60- SCOTT, M.; STITES, D. P.; MOSCICKI, A. B. Th1 cytokine patterns in cervical 202

human papillomavirus infection. Clin. Diagn. Lab. Immunol., Washington, v. 6, 203

n. 5, p. 751-755, Sept. 1999. 204

61- SEO, N.; HAYAKAWA, S.; TAKIGAWA, M.; TOKURA, Y. Interleukin-10 205

expressed at early tumour sites induces subsequent generation of CD4(+) T-206

regulatory cells and systemic collapse of antitumour immunity. Immunology, 207

Oxford, v. 103, n. 4, p. 449-457, Aug. 2001. 208

62- SIKORSKI, M.; ZRUBEK, H. Long-term follow-up of patients treated with 209

recombinant human interferon gamma for cervical intraepithelial neoplasia. Int. J. 210

Gynaecol. Obstet., New York, v. 82, n. 2, p. 179-185, Aug. 2003. 211

63- SIKORSKI, M.; ZRUBEK, H. Recombinant interferon gamma in the treatment of 212

cervical intraepithelial neoplasia(CIN) associated with human papillomavirus (HPV) 213

infection. Eur. J. Gynaecol. Oncol., Padua, v. 24, n. 2, p. 147-150, 2003. 214

64- SJOBORG, K. D.; VISTAD, I.; MYHR, S. S.; SVENNINGSEN, R.; HERZOG, C.; 215

KLOSTER-JENSEN, A.; NYGARD, G.; HOLE, S.; TANBO, T. Pregnancy 216

outcome after cervical cone excision: a case-control study. Acta Obstet. Gynecol. 217

Scand., Copenhagen, v. 86, n. 4, p. 423-428, 2007. 218

65- STAFL, A.; WILBANKS, G. D. An international terminology of colposcopy: report of 219

the Nomenclature Committee of the International Federation of Cervical Pathology 220

and Colposcopy. Obstet Gynecol., New York, v. 77, n. 2, p. 313-314, Feb. 1991. 221

66- STANLEY, M. A. Immunobiology of papillomavirus infeccions. J. Reprod. 222

Immunol., Amsterdam, v. 52, n.1-2, p. 45-49, Oct./Nov. 2001. 223

67- STELLATO, G. Intralesional recombinant alpha 2B interferon in the treatment of 224

human papillomavirus-associated cervical intraepithelial neoplasia. Sex. Transm. 225

Dis., Philadelphia, v. 19, n. 3, p. 124-126, May/June 1992. 226

68- STERN, P. L.; BROWN, M.; STACEY, S. N.; KITCHENER, H. C.; HAMPSON, I.; 227

ABDEL-HADY, E. S.; MOORE, J. V. Natural HPV immunity and vaccination 228

strategies. J. Clin. Virol., Amsterdam, v. 19, n. 1-2, p. 57-66, Oct. 2000. 229

69- SWAN, D. C.; TUCKER, R. A.; TORTOLERO-LUNA, G.; MITCHELL, M. F.; 230

WIDEROFF, L.; UNGER, E. R.; NISENBAUM, R. A.; REEVES, W. C.; 231

ICENOGLE, J. P. Human Papillomavirus (HPV) DNA Copy Number Is Dependent 232

on Grade of Cervical Disease and HPV Type. J. Clin. Microbiol., Washington, v. 233

37, n. 4, p. 1030–1034, Apr. 1999. 234

70- TAVARES-MURTA, B. M.; DE RESENDE, A. D.; CUNHA, F. Q.; MURTA, E. F. 235

Local profile of cytokines and nitric oxide in patients with bacterial vaginosis and 236

ARÍLIA D E

AR VALHO

ARD EG AN

ESTRADO EM

AT OLOGI A

INEC OLÓGI CA

–

UFTM

cervical intraepithelial neoplasia. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol., 237

Amsterdam v. 138, n. 1, p. 93-99, May 2008. 238

71- THYRELL, L.; ERICKSON, S.; ZHIVOTOVSKY, B.; POKROVSKAJA, K.; 239

SANGFELT, O.; CASTRO, J.; EINHORN, S.; GRANDÉR, D. Mechanisms of 240

interferon-alpha induced apoptosis in malignant cells. Oncogene, Basingstoke, v. 241

21, n. 8, p. 1251-1262, Feb. 2002. 242

72- TINDLE, R. W. Immune evasion in human papillomavirus-associated cervical cancer. 243

Nat. Rev. Cancer, London, v. 2, n. 1, p. 59-65, Jan. 2002 244

73- TJIONG, M. Y.; VAN DER VANGE, N.; TEN KATE, F. J.; TJONG-A-HUNG, S. P.; 245

TER SCHEGGET, J.; BURGER, M. P.; OUT, T. A. Increased IL-6 and IL-8 levels 246

in cervicovaginal secretions of patients with cervical cancer. Gynecol. Oncol., New 247

York, v. 73, n. 2, p. 285-291, May 1999. 248

74- UZÉ, G.; MONNERON, D. IL-28 and IL-29: newcomers to the interferon family. 249

Biochimie, Paris, v. 89, n. 6-7, p. 729-734, June/July 2007. 250

75- UZÉ, G.; SCHREIBER, G.; PIEHLER, J.; PELLEGRINI, S. The receptor of the type I 251

interferon family. Curr. Top. Microbiol. Immunol., Berlin, v. 316, p. 71-95, 252

2007. 253

76- VALORE, E. V.; PARK, C. H.; QUAYLE, A. J.; WILES, K. R.; McCRAY, P. B. Jr.; 254

GRANZ, T. Human beta-defensin 1: an antimicrobial peptide of urogenital tissues. 255

J. Clin. Invest., New Haven, v. 101, n. 8, p. 1633-1642, Apr. 1998. 256

77- WEI, L. H.; KUO, M. L.; CHEN, C. A.; CHENG, W. F.; CHENG, S. P.; HSIEH, F. J.; 257

HSIEH, C. Y. Interleukin-6 in cervical cancer: the relationship with vascular 258

endothelial growth factor. Gynecol. Oncol., New York, v. 82, n. 1, p. 49-56, July 259

2001. 260

78- WIRA, C. R.; FAHEY, J. V.; SENTMAN, C. L.; PIOLI, P. A.; SHEN, L. Innate and 261

adaptive immunity in female genital tract: cellular responses and interactions. 262

Immunol. Rev., Copenhagen, v. 206, p. 306-335, Aug. 2005. 263

79- WOODMAN, C. B.; COLLINS, S. I.; YOUNG, L. S. The natural history of cervical 264

HPV infection: unresolved issues. Nat. Rev. Cancer, London, v. 7, n. 1, p. 11-22, 265

Jan. 2007. 266

80- WRIGHT, T.C. Jr; MASSAD, L. S.; DUNTON, C. J.; SPITZER, M.; WILKINSON, 267

E. J.; SOLOMON, D.; 2006 AMERICAN SOCIETY FOR COLPOSCOPY AND 268

CERVICAL PATHOLOGY-SPONSORED CONSENSUS CONFERENCE. 2006 269

Consensus guidelines for the management of women with cervical intraepithelial 270

neoplasia or adenocarcinoma in situ. Am. J. Obstet. Gynecol., St. Louis, v. 197, n. 271

4, p. 340-345, Oct. 2007. 272

81- WU, T. C.; KURMAN, R. J. Analysis of cytokine profiles in patients with human 273

papillomavirus-associated neoplasms. J. Natl. Cancer Inst., Oxford, v. 89, n. 3, p. 274

245-250, Feb. 1997. 275

ARÍLIA D E

AR VALHO

ARD EG AN

ESTRADO EM

AT OLOGI A

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–

UFTM

ÇxåÉá

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ANEXO A: Parecer consubstanciado aprovado pelo CEP (folha 1/3)

ARÍLIA D E

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ESTRADO EM

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ANEXO A: Parecer consubstanciado aprovado pelo CEP (folha 2/3)

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ANEXO A: Parecer consubstanciado aprovado pelo CEP (folha 3/3)

ARÍLIA D E

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ANEXO B: Protocolo do Projeto (folha 1/2)

Protocolo de Pesquisa

Avaliação da resposta clínicae imunológica local de pacientes com Neoplasia

Intraepitelial Cervical graus II e III tratadas com Interferon alfa-2b intralesional.

Nome: _____________________________________________RG: __________

Endereço:________________________________________Tel:______________

Idade:_________Paridade : ____________ DUM :___________ Data:_________

Tabagismo: ( ) Sim ( ) Não

Número de parceiros:

Uso de Antibióticos orais, antifúngicos ou cremes vaginais nos últimos 30 dias :( ) Sim

( ) Não

Relação sexual nos últimos 2 dias: ( ) Sim ( ) Não

Método anticonceptivo em uso:___________________________________

Início da aplicação do interferon (data):

Fim da aplicação do interferon (data):

Semana/ data 1ª 6ª 12ª 18ª

Desid. lática

hemoglobina

leucócitos

plaquetas

Fosf. alcalina

Colposcopia :

Antes da aplicação do interferon (data):

ZTA

EAB tênue

EAB denso

Mosaico fino

Mosaico grosseiro

Vasos Atípicos

Leucoplasia tênue

Leucoplasia espessa

Erosão

JEC visível

( ) sim ( ) não

VCE n

e laudo:____________

Biópsia n

e laudo:____________

ARÍLIA D E

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ESTRADO EM

AT OLOGI A

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–

UFTM

ANEXO B: Protocolo do Projeto (folha 2/2)

18ª Aplicação do interferon (data):

ZTA

EAB tênue

EAB denso

Mosaico fino

Mosaico grosseiro

Vasos Atípicos

Leucoplasia tênue

Leucoplasia espessa

Erosão

JEC visível

( ) sim ( ) não

VCE n

e laudo:____________

Biópsia n

e laudo:____________

Resposta Clínica: ( ) boa resposta ( ) falha terapêutica

No caso de falha terapêutica tratamento posterior recomendado:

______________________________________________________________

Sintomatologia relatada durante o tratamento:

( ) cefaléia

( ) mialgia

( ) hipertermia

( ) astenia

( ) outros

ARÍLIA D E

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ESTRADO EM

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–

UFTM

ANEXO C: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (folha 1/2)

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Você tem um tipo de doença denominada neoplasia intraepitelial cervical (NIC)

de alto grau e está sendo convidada a participar do estudo “Avaliação da resposta

imunológica e clínica de pacientes com Neoplasia Intraepitelial Cervical de alto grau

tratadas com Interferon alfa-2b intralesional”. Os avanços na área de saúde ocorrem

através de estudos como este, por isso sua participação é importante. O objetivo do estudo

é:

•

Tratar esta doença com uma medicação denominada interferon alfa-2b que

será administrada dentro da lesão no colo do útero com auxílio de uma

seringa e agulha.

•

Será avaliada a resposta ao tratamento (por exemplo, se houve melhora ou

não da lesão) e se analisará a importância do sistema de defesa durante o

tratamento.

E caso você participe, será necessário coletar material para o estudo que

estamos propondo, alem dos que já são normalmente coletados para os exames de rotina. É

também importante saber que:

•

A medicação será aplicada 3 vezes por semana em dias alternados por 6

semanas (total de 18 aplicações);

•

É de suma importância o comparecimento nos dias das aplicações para não

prejudicar o tratamento;

•

Você deverá usar método anticonceptivo durante o tratamento, pois a

medicação pode acarretar vários danos para o bebê em caso de gestação no

curso do tratamento.

•

Esta medicação pode levar a alterações em algumas substâncias presentes

no organismo como desidrogenase lática, hemoglobina, leucócitos,

plaquetas e fosfatase alcalina, por isso essas substâncias serão dosadas

durante o tratamento. Para dosagem é necessário a coleta de sangue que

será realizada no laboratório do Hospital Escola;

•

A medicação pode ocasionar alguns efeitos colaterais como:

Febre, calafrios, mal esta geral, mialgia, diminuição do apetite, diminuição

dos leucócitos e das plaquetas.

•

No caso de não ocorrer melhora da doença ou mesmo se houver apenas

melhora parcial você será prontamente encaminhada para tratamento

cirúrgico complementar.

Você poderá ter todas as informações que quiser e poderá não participar da

pesquisa ou retirar seu consentimento a qualquer momento sem prejuízo no seu

atendimento. Pela sua participação no estudo, você não receberá qualquer valor em

dinheiro, mas terá a garantia de que todas as despesas necessárias para a realização da

pesquisa não serão de sua responsabilidade. Seu nome não aparecerá em qualquer

momento do estudo, pois você será identificada com um número.

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ANEXO C: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (folha 2/2)

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE, APÓS ESCLARECIMENTO

Eu, _______________________________________________, li e/ou ouvi o

esclarecimento acima e compreendi para que serve o estudo e qual procedimento a

que serei submetido. A explicação que recebi esclarece os riscos e benefícios do

estudo. Eu entendi que sou livre para interromper minha participação a qualquer

momento, sem justificar minha decisão e que isso não afetará meu tratamento. Sei

que meu nome não será divulgado, que não terei despesas e não receberei dinheiro

para participar do estudo. Eu concordo em participar do estudo.

Uberaba,......./......./......

________________________________ ____________________

Assinatura do voluntário ou seu Documento de identidade

Representante legal

___________________________________

Assinatura do pesquisador Responsável

Dra. Marília de Carvalho Mardegan

___________________________________

Assinatura do pesquisador Orientador

Prof. Dr. Eddie Fernando Cândido Murta

Telefone de contato dos pesquisadores: 3318-5326/3318-5565

Em caso de dúvida em relação a este documento, você pode entrar em contato com

o Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, pelo

telefone 3318-5854.

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UFTM

ANEXO D: Concentrações de cada citocina, por paciente, em amostras colhidas

durante o tratamento (folha 1/2).

Concentração em pg/ml Citocina Paciente

Amostra inicial 6ª Aplicação 12ªAplicação 18ªAplicação

IFN-γ 1 5,5 3,7 3,3 5,0

IFN-γ 2 0,0 2,0 3,0 4,9

IFN-γ 3 3,1 1,4 4,2 3,5

IFN-γ 4 2,7 2,2 4,0 3,9

IFN-γ 5 0,0 7,0 2,1 2,5

IFN-γ 6 1,6 2,8 2,7 0,0

IFN-γ 7 0,0 5,9 0,0 0,0

IFN-γ 8 13,6 7,4 19,4 0,0

IL-10 1 2,9 0,0 2,3 4,4

IL-10 2 2,6 2,7 3,6 3,2

IL-10 3 4,6 3,3 2,7 4,2

IL-10 4 2,1 4,5 4,1 3,0

IL-10 5 0,0 5,2 3,1 2,1

IL-10 6 3,2 1,6 2,4 3,7

IL-10 7 1,3 2,5 1,8 4,0

IL-10 8 37,5 13,0 9,4 2,4

IL-6 1 52,8 26,6 21,2 13,8

IL-6 2 55,1 44,4 747,6 9,9

IL-6 3 67,4 5,8 492,2 10,4

IL-6 4 4,6 452,7 1082,2 204,5

IL-6 5 297,9 1431,9 47,3 4,2

IL-6 6 117,6 368,0 75,3 18,6

IL-6 7 14,8 2336,8 983,3 602,2

IL-6 8 1437,3 2260,9 1632,2 217,2

IL-4 1 4,7 3,1 3,7 2,7

IL-4 2 1,6 2,9 3,1 2,4

IL-4 3 4,4 2,9 3,5 2,7

IL-4 4 2,7 3,2 3,2 3,1

IL-4 5 2,2 3,5 2,8 2,1

IL-4 6 2,4 1,8 2,3 0,0

IL-4 7 1,2 2,9 3,1 3,5

IL-4 8 4,7 3,8 4,5 1,7

IL-2 1 7,4 3,5 4,6 5,9

IL-2 2 2,0 3,9 5,4 5,2

IL-2 3 4,9 4,5 5,4 4,6

IL-2 4 3,5 8,0 7,1 2,9

IL-2 5 2,4 6,0 4,3 3,9

IL-2 6 4,8 3,6 4,9 3,4

IL-2 7 4,0 5,7 2,6 4,1

IL-2 8 7,4 5,5 5,9 3,1

IL-1β 1 48,4 131,1 17,0 4,2

IL-1β 2 29,7 134,7 503,3 15,9

IL-1β 3 268,2 1,3 93,9 3,4

IL-1β 4 21,3 8,9 40,3 91,5

IL-1β 5 2,1 20,5 6,9 3,6

IL-1β 6 10,5 8,7 5,3 3,2

IL-1β 7 160,4 49,1 263,1 632,1

IL-1β 8 12230,0 5000,0 115048,6 662,3

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ANEXO D: Concentrações de cada citocina, por paciente, em amostras colhidas

durante o tratamento (folha 2/2).

Concentração em pg/ml Citocina Paciente

Amostra inicial 6ª Aplicação 12ªAplicação 18ªAplicação

IL-12 1 1,5 1,3 1,8 1,2

IL-12 2 1,0 0,0 1,3 2,5

IL-12 3 9,4 1,1 1,5 1,6

IL-12 4 1,3 2,0 1,4 2,0

IL-12 5 1,4 1,8 1,3 0,0

IL-12 6 0,0 1,5 1,4 1,4

IL-12 7 1,6 1,8 1,1 1,5

IL-12 8 2,0 0,0 4,1 1,5

IL-8 1 5000,0 93348,8 2646,7 4171,2

IL-8 2 2372,9 2646,7 5000,0 8931,6

IL-8 3 4967,1 38,8 1975,7 687,1

IL-8 4 19635,9 17352,9 5781,5 13105,5

IL-8 5 813,7 5000,0 5989,0 62,5

IL-8 6 20471,1 1079,4 1109,6 400,0

IL-8 7 5000,0 6908,2 5000,0 5000,0

IL-8 8 5000,0 5000,0 5000,0 5000,0

TNF-α 1 4,7 3,1 6,0 6,7

TNF-α 2 2,3 3,7 5,4 4,6

TNF-α 3 6,9 1,9 5,8 4,1

TNF-α 4 2,7 4,4 5,1 3,1

TNF-α 5 2,6 5,7 2,9 3,9

TNF-α 6 4,6 1,3 5,0 1,9

TNF-α 7 3,5 3,5 3,5 3,6

TNF-α 8 73,8 261,4 52,4 2,2

Catalogação na fonte: Biblioteca da Universidade Federal do Triângulo Mineiro

M278a Mardegan, Marília de Carvalho.

Avaliação da resposta clínica e imunológica local de pacientes

com neoplasia intra-epitelial cervical graus II e III tratadas com interferon

alfa-2b intralesional / Marília de Carvalho Mardegan . – 2008.

90f. : tab. ; graf. ; fig.

Dissertação (Mestrado em Patologia Ginecológica) –

Universidade Federal do Triângulo Mineiro, Uberaba, MG, 2008.

Orientador: Prof. Dr. Eddie Fernando Candido Murta.

COLO DO ÚTERO

NEOPLASIA INTRA

EPITELIAL CERVICAL

IMUNOTERAPIA

NTERFERON ALFA

-2

ÍTULO

II.

URTA

DDIE

FERNANDO CANDIDO

CDU 618.146

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