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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
BRUNO COÊLHO CAVALCANTI
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL GENOTÓXICO E MUTAGÊNICO DO ÁCIDO
CAURENÓICO, UM DITERPENO ISOLADO DA PLANTA
Copaifera langsdorffii Desf. (LEGUMINOSAE)
FORTALEZA
2006
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i
BRUNO COÊLHO CAVALCANTI
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL GENOTÓXICO E MUTAGÊNICO DO ÁCIDO
CAURENÓICO, UM DITERPENO ISOLADO DA PLANTA
Copaifera langsdorffii Desf. (LEGUMINOSAE)
Dissertação submetida à Coordenação do
Programa de Pós-Graduação em Farmacologia
do Departamento de Fisiologia e Farmacologia
da Universidade Federal do Ceará como
requisito parcial para a obtenção do título de
Mestre em Farmacologia.
Orientadora: Prof
a
. Dr
a
. Cláudia do Ó Pessoa
FORTALEZA
2006
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ii
C365a Cavalcanti, Bruno Coêlho
Avaliação do potencial genotóxico e mutagênico do ácido
caurenóico, um diterpeno isolado da planta Copaifera
langsdorffii Desf. (Leguminosae)/ Bruno Coêlho Cavalcanti.
2006.
95 f. : il.
Orientador: Prof
a
. Dr
a
. Cláudia do Ó Pessoa
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Ceará,
Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2006.
1. Copaifera langsdorffii. 2. Diterpenos. 2. Copaiva. 3.
Fabaceae. 4. Genotoxicidade. I. Pessoa, Cláudia do Ó
(Orient.). I. Título.
CDD 615.323322
iii
BRUNO COÊLHO CAVALCANTI
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL GENOTÓXICO E MUTAGÊNICO DO ÁCIDO
CAURENÓICO, UM DITERPENO ISOLADO DA PLANTA
Copaifera langsdorffii Desf. (LEGUMINOSAE)
Dissertação submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Farmacologia
do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal do Ceará como
requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Farmacologia.
Aprovada em 14/12/06
BANCA EXAMINADORA
___________________________________
Prof
a
. Dr
a
. Cláudia do Ó Pessoa (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará-UFC
___________________________________
Prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao
Universidade Federal do Ceará-UFC
___________________________________
Prof. Dr. Rommel Rodríguez Burbano
Universidade Federal do Pará-UFC
iv
AGRADECIMENTOS
À Dr
a
. Cláudia do Ó Pessoa, pela orientação deste trabalho, pela ajuda,
incentivo, amizade e paciência demonstrada em todos os momentos de trabalho em
comum;
À Dr
a
. Letícia Veras Costa Lotufo, por todas as dúvidas esclarecidas no
desenvolver da pesquisa;
Ao Dr. Manoel Odorico de Moraes, por ter me recebido de braços abertos em
seu laboratório e por sua contribuição à pesquisa no Laboratório de Oncologia
Experimental;
Ao Dr. Vietla Satyanarayana Rao, por sua contribuição a realização desse
trabalho;
Ao Dr. Edilberto Rocha Silveira, pela colaboração neste trabalho e pela amizade;
Aos Dr. João Antônio Pêgas Henriques e a Dr
a
. Jenifer Saffi, por terem me
recebido muito bem em seus Laboratórios na UFRGS e por terem me dado condições de
fazer vários experimentos importantes para o desenvolvimento dessa dissertação;
Ao Dr. Rommel Rodríguez Burbano, por ter me recebido em seu Laboratório na
UFPA de braços abertos, pelos ensinamentos em citogenética, pela colaboração à
realização desse trabalho e pela amizade;
À Dr
a
. Maria Emília Ramos da Universidade Federal de Feira de Santana
(Bahia), pela amizade e ensinamentos indispensáveis à realização desse trabalho;
Aos amigos e colegas do Grupo de Pesquisa do Laboratório de Genética
Toxicológica e Câncer da UFPA (GENTOC): André Khayat, Eleônidas Lima, Igor
Seligmann, Adriana Guimarães, Daniela Leite, Dani Calcagno e Patrícia Lima;
Aos amigos e colegas do GENOTOX/UFRGS: Renato Moreira Rosa, Dinara
Jaqueline Moura, Miriana Machado, Jaqueline Silveira, Juliana da Silva.
Aos amigos e colegas do LOE: Aílton Teles, Alessandra de Paula, André Viana,
Andrew Sá, Arenice Costa, Cecília Carvalho, Danilo Rocha, Delano, Eliane, Érika
Lima, Fernanda Castro, Gardênia Militão, Hélio Nobre, Hildebrando Mota, Ivana
Dantas, Jérsia, Kézia, Lidiane Arruda, Paulo Michel, Patrícia Bonavides, Patrícia
Marçal, Washington Barros;
Aos amigos da velha guarda do LOE: Diego Wilke, Márcio Roberto, Marne
Vasconcellos, Paula Jimenez, Raquel Montenegro e Sérgio Fortier pela amizade, apoio,
confiança e pelo exemplo acadêmico a ser seguido;
v
À amiga Carla Sombra, por ter me ajudado em boa parte desse trabalho;
Aos amigos Daniel Bezerra, Hemerson Iury, Elthon Ferreira e Rômulo Feio pela
amizade, apoio e colaborações intelectuais;
Aos técnicos do LOE: Silvana França, Luciana França e Adriano, pela amizade e
imensurável ajuda cedida a este e a todos os outros trabalhos realizados no laboratório;
Aos professores dos Departamentos de Biologia, Bioquímica e Biologia
Molecular e Fisiologia e Farmacologia da UFC, pela contribuição na minha formação
acadêmica e profissional;
Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da UFC: Íris,
Fernando, Áurea e Chiquinho;
Ao amigo Carlos Henrique, pela importante contribuição na formatação desse
trabalho;
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
pelo apoio financeiro, sem o qual seria impossível a realização desse trabalho;
A Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP), a Fundação Cearense de Apoio
ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP) e ao Banco do Nordeste
(BNB) pelo suporte financeiro indispensável à realização desse trabalho;
À Priscylla Tanara, minha Neguinha, pelo apoio, compreensão, companherismo,
amor e carinho nos momentos mais difíceis;
Aos meus pais, Majela e Regina, pela vida, pela educação e formação moral que
me transmitiram, pelo amparo nos momentos difíceis, pela eterna inspiração, devoção e
felicidade que lhes contagia nos momentos em que estou feliz e por nunca me deixar
abandonar os meus ideais;
Aos meus grandes e maravilhosos irmãos, Igor, Lívio e Diego, que sempre me
apoiaram e torceram por mim, pelos anos de fraternidade e experiências compartilhadas;
Aos demais familiares pelo exemplo de união e solidariedade;
À todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização desse
trabalho.
vi
“É preciso viver, não apenas existir”
(Plutarco)
vii
RESUMO
O ácido caurenóico (AC) é um diterpeno presente no óleo resinoso de espécies
de Copaifera. Assim como o óleo resinoso, o AC também apresenta uma ampla
variabilidade de aplicações medicinais. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o
potencial genotóxico e mutagênico do AC isolado da planta Copaifera langsdorffii em
linfócitos, células leucêmicas HL60 e em células da medula óssea de camundongos. O
AC não mostrou seletividade entre linfócitos e HL60 tendo induzido apotose e danos ao
DNA na mesma intensidade, avaliados pela coloração diferencial por brometo de
etídio/acridina laranja e pelo teste do cometa, respectivamente. De acordo com o teste
do cometa, mais de 80% dos danos induzidos ao DNA de linfócitos foi reparada 48
horas após o tratamento. Linfócitos tratados com AC apresentaram aumento,
siginificativo, na freqüência de micronúcleos e maior sensibilidade (citotoxicidade e
aberrações cromossômicas) nas fases G
1
e G
1
/S do ciclo celular, sem induzir aumento
no número de células poliplóides. Camundongos foram tratados com AC nas doses de
25, 50 e 100mg/kg e após 24 e 48 horas sacrificados, sendo, posteriormente, extraída a
medula óssea, e o material submetido às observações de perdas cromossômicas
(micronúcleos) em eritrócitos policromáticos. Uma maior incidência de micronúcleos
ocorreu no grupo de animais sacrificados 24 horas após o tratamento. A avaliação da
razão entre eritrócitos policromáticos e normocromáticos, foi menor para os animais
sacrificados 48 horas após o tratamento, indicando toxicidade em células da medula.
Nos ensaios de mutagênese com a levedura Saccharomyces cerevisea, o efeito
citotóxico e mutagênico do AC foi mais acentuado durante o crescimento exponencial
da levedura, no qual o DNA está mais acessível ao composto. O AC induziu mutações
lócus específicas e de deslocamento do quadro de leitura. Mutações do tipo
deslocamento do quadro de leitura tendem a serem induzidas por agentes intercalantes
de DNA e têm sido correlacionadas com as quebras de fitas de cadeia de DNA
induzidas pela inibição da ação de topoisomerase. No teste de relaxamento do DNA, o
AC inibiu a ação da topoisomerase I. A inibição da ação da topoisomerase I parece estar
relacionada à intercalação do AC no DNA. Assim, as quebras de fitas no DNA e
indução de micronúcleos e mutações de deslocamento do quadro de leitura, podem estar
relacionadas à ação intercalante do ácido caurenóico. A ausência de células poliplóides
sugere que o ácido caurenóico não interfere no aparelho mitótico da célula. Em
conclusão, o ácido caurenóico apresenta potencial genotóxico e mutagênico nos
modelos estudados.
Palavras-chave: Diterpenos. Copaiva. Fabaceae . Genotoxicidade.
viii
ABSTRACT
Kaurenoic acid (KA) is a diterpene presents in the oil-resin (copaiba oil) from
plants belongs to Copaifera spp. As copaiba oil, KA also displayed a great variability of
medicinal applications. In the present study, the genotoxic and mutagenic potential of
KA from Copaifera langsdorffii on human lymphocytes, human leukemia cells (HL60)
and bone marrow cells was evaluated. KA did not show selective action between
lymphocytes and leukemia cells, has been induced apoptosis and DNA damage at same
magnitude as valuated by bromide etidium/orange acridine and comet assay. Due to this
observation, lymphocytes were selected for further experiments. According with comet
assay results, more than 80% of lymphocytes DNA damage was repaired after 48 hours
post-treatment. Lymphocytes treated with KA (30 and 60µg/mL) showed increases on
micronucleus frequencies in relation to negative control group. On the chromosome
aberration test, lymphocytes treated at phse G
1
and transition phase G
1
/S showed great
sensibility (cytotoxicity and chromosomes aberrations) in comparison to cells treated at
another phases of cell cycle. After treatment, any increase of polyploidy cells number
was noted. Mices were treated with KA (25, 50 and 100mg/kg), and after 24 and 48
hours, they were sacrificed afterwards with the medulla extraction. This material was
submitted to chromosomal damage observations (microniclei) in polychromatic
erythrocytes (PCE). A great occurrence of micronucleated PCE was noted only at
animals groups sacrificed 24 hours after treatment. The rate between PCE and NCE
(normochromatic erythrocytes) was lower for animals sacrificed later. These
observations indicating toxicity effects on the bone marrow cells. The mutagenic assay
with yeast Saccharomyces cereviseae showed that the cytotoxic and mutagenic effects
of KA were more pronounced during exponential growth phase, when the access to
DNA is facilitated. KA induced locus and frameshift mutations. Frameshift mutations
induced by DNA-intercalanting drugs have been correlated with DNA strand breaks
induced by inhibition of DNA topoisomerases. On the DNA relaxation assay, KA
inhibited the action of topoisomerase I. This inhibition effect seens to be related to the
intercalanting ability of kaurenoic acid between DNA bases of pair. Thus, DNA strand
breaks, the occurrence of micronucleated cells and frameshift mutations could be
explained by the intercalanting action of kaurenoic acid. And the absence of polyploidy
cells suggests that kaurenoic acid did not interfere on mitotic apparatus of cell. In
conclusion, kaurenoic acid showed genotoxic and mutagenic effects on all the assays
used.
Keywords: Diterpenes. Copaiva. Fabaceae. Genotoxicity.
ix
LISTA DE FIGURAS
F
IGURA
1
-
C
OPAIFERA LANGSDORFFII
D
ESF
. ...............................................................................................20
F
IGURA
2
-
E
STRUTURA QUÍMICA DO ÁCIDO CAURENÓICO
(
ÁCIDO ENT
-
CAUR
-16-
EN
-19-
OICO
)...................22
F
IGURA
3
-
M
ATURAÇÃO DAS CÉLULAS DA LINHAGEM ERITROCITÁRIA
.......................................................29
F
IGURA
4
-
O
RIGEM DO MICRONÚCLEO A PARTIR DE UM FRAGMENTO CROMOSSÔMICO ACÊNTRICO E DE UM
CROMOSSOMO INTEIRO EM UMA CÉLULA BINUCLEADA PELO USO DE CITOCALASINA
B .....................29
F
IGURA
5
-
C
URVA DE CRESCIMENTO DE
S.
CEREVISEAE
..............................................................................34
F
IGURA
6
-
T
IPOS DE COMETA
.
C
LASSIFICAÇÃO POR CATEGORIA DE DANO
:
(0)
SEM DANO
(<
5%);
(1)
B
AIXO
NÍVEL DE DANO
(5
-
20%);
(2)
MÉDIO NÍVEL DE DANO
(20
-
40%);
(3)
ALTO NÍVEL DE DANO
(40
–
95%);
(4)
DANO MÁXIMO
(>
95%) .....................................................................................................44
F
IGURA
7
-.
E
RITRÓCITO NORMOCROMÁTICO
(A),
ERITRÓCITO POLICROMÁTICO
(B)
E ERITRÓCITO
POLICROMÁTICO MICRONUCLEADO
(C)..............................................................................................47
F
IGURA
8
-
F
OTOMICROGRAFIA DE LINFÓCITOS BINUCLEADOS PORTANDO MICRONÚCLEOS
.......................49
F
IGURA
9
-
E
FEITO DO ÁCIDO CAURENÓICO SOBRE A VIABILIDADE CELULAR DE LINFÓCITOS HUMANOS E
CÉLULAS LEUCÊMICAS
HL60
APÓS
4
HORAS DE
(A)
E
24
HORAS
(B)
DE EXPOSIÇÃO DETERMINADA
POR EXCLUSÃO DE AZUL DE TRIPAN
.
O
VEÍCULO UTILIZADO PARA DILUIR A DROGA
,
DMSO
(0,1%),
FOI UTILIZADO COMO CONTROLE NEGATIVO E A DOXORRUBICINA
(0,3
µG
/
M
L)
FOI UTILIZADA COMO
CONTROLE POSITIVO
.
O
S DADOS CORRESPONDEM À MÉDIA
±
DP
DE TRÊS EXPERIMENTOS
INDEPENDENTES
.
*
P
<0,001;
**
P
<0,01
E
***
P
<0,05
COMPARADO COM O CONTROLE NEGATIVO POR
ANOVA
SEGUIDO POR
S
TUDENT
N
EWMAN
K
EULS
...........................................................................55
F
IGURA
10
-
E
FEITO DO ÁCIDO CAURENÓICO EM LINFÓCITOS HUMANOS
(A)
E CÉLULAS LEUCÊMICAS
HL60
(B)
ANALISADOS PELA COLORAÇÃO DIFERENCIAL POR BROMETO DE ETÍDIO
/
ACRIDINA LARANJA APÓS
24
HORAS DE EXPOSIÇÃO
.
O
VEÍCULO UTILIZADO PARA DILUIR A DROGA
,
DMSO
(0,1%),
FOI
UTILIZADO COMO CONTROLE NEGATIVO E A DOXORRUBICINA
(0,3
µG
/
M
L)
FOI UTILIZADA COMO
CONTROLE POSITIVO
.
O
S DADOS CORRESPONDEM À MÉDIA
±
DP
DE TRÊS EXPERIMENTOS
INDEPENDENTES
.
*
P
<0,001
E
**
P
<0,01
COMPARADO COM O CONTROLE NEGATIVO POR
ANOVA
SEGUIDO POR
S
TUDENT
N
EWMAN
K
EULS
..........................................................................................56
F
IGURA
11
-
E
FEITO DO ÁCIDO CAURENÓICO SOBRE A AÇÃO DA ENZIMA TOPOISOMERASE
I
(TOPO
I).
A.
250
NG DE
DNA
SUPERCOMPACTADO FOI INCUBADO COM
4
UNIDADES DE TOPOISOMERASE
I
NA
PRESENÇA E NA AUSÊNCIA DE ÁCIDO CAURENÓICO
(10
E
30
µG
/
M
L).
B.
500
NG DE
DNA
SUPERCOMPACTADO FOI INCUBADO COM
4
UNIDADES DE TOPOISOMERASE
I
NA PRESENÇA E NA
AUSÊNCIA DE ÁCIDO CAURENÓICO
(10
E
30
µG
/
M
L).
O
RELAXAMENTO DO
DNA
FOI ANALISADO APÓS
ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE A
1%.
O
GEL FOI CORADO COM BROMETO DE ETÍDIO E
REVELADO COM AUXÍLIO DE LUZ ULTRAVIOLETA
..............................................................................57
F
IGURA
12
-
D
ISTRIBUIÇÃO DAS CLASSES DE COMETAS
(0
–
SEM DANOS A
4
–
DANO MÁXIMO
)
EM
LINFÓCITOS HUMANOS EXPOSTOS DURANTE
4
(A)
E
24
HORAS
(B)
E CÉLULAS LEUCÊMICAS
HL60
EXPOSTAS POR
4
(C)
E
24
HORAS
(D)
AO ÁCIDO CAURENÓICO ANALISADOS PELO TESTE DO COMETA
..
...........................................................................................................................................................58
x
F
IGURA
13
-
Í
NDICE DE DANO AO
DNA
DE LINFÓCITOS HUMANOS E CÉLULAS LEUCÊMICAS
HL60
TRATADAS
COM ÁCIDO CAURENÓICO DURANTE
4
(A)
E
24
HORAS
(B)
DETERMINADO PELO TESTE DO COMETA
.
O
VEÍCULO UTILIZADO PARA DILUIR A DROGA
,
DMSO
(0,1%),
FOI UTILIZADO COMO CONTROLE
NEGATIVO E A DOXORRUBICINA
(0,3
µG
/
M
L)
FOI UTILIZADA COMO CONTROLE POSITIVO
.
O
S DADOS
CORRESPONDEM À MÉDIA
±
DP
DE TRÊS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES
.
*
P
<0,001
COMPARADO
COM O CONTROLE NEGATIVO POR
ANOVA
SEGUIDO POR
T
UKEY
......................................................59
F
IGURA
14
-
R
EDUÇÃO DO ÍNDICE DE DANO AO
DNA
EM LINFÓCITOS HUMANOS TRATADOS DURANTE
4
HORAS
(
TEMPO
0
H
)
COM ÁCIDO CAURENÓICO NAS CONCENTRAÇÕES DE
10
(A),
30
(B)
E
60
µG
/
M
L
(C)
E RE
-
CULTIVADOS NA AUSÊNCIA DA DROGA
(2
A
48
H
).
O
S DADOS CORRESPONDEM À MÉDIA
±
DP
DE TRÊS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES
.
*
P
<0,05;
**
P
<0,01
E
***
P
<0,001
COMPARADO COM O
CONTROLE
(
TEMPO
0
H
)
POR
ANOVA
SEGUIDO POR
T
UKEY
...............................................................60
F
IGURA
15
-
R
EDUÇÃO DA FREQÜÊNCIA DE DANO AO
DNA
EM LINFÓCITOS HUMANOS TRATADOS DURANTE
4
HORAS
(
TEMPO
0
H
)
COM ÁCIDO CAURENÓICO NAS CONCENTRAÇÕES DE
10
(A),
30
(B)
E
60
µG
/
M
L
(C)
E RE
-
CULTIVADOS NA AUSÊNCIA DA DROGA
(2
A
48
H
).
O
S DADOS CORRESPONDEM À MÉDIA
±
DP
DE TRÊS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES
.
*
P
<0,05;
**
P
<0,01
E
***
P
<0,001
COMPARADO COM O
CONTROLE
(
TEMPO
0
H
)
POR
ANOVA
SEGUIDO POR
T
UKEY
...............................................................60
F
IGURA
16
-
E
FEITO DO ÁCIDO CAURENÓICO SOBRE A INCIDÊNCIA DE MICRONÚCLEOS EM LINFÓCITOS
HUMANOS
.
O
VEÍCULO UTILIZADO PARA DILUIR A DROGA
,
DMSO
(0,1%),
FOI UTILIZADO COMO
CONTROLE NEGATIVO E O AGENTE ALQUILANTE METIL
-
METANO
-
SULFONADO
(MMS)
A
4
X
10
-5
M
FOI UTILIZADO COMO CONTROLE POSITIVO
.
O
S DADOS CORRESPONDEM À MÉDIA
±
DP
DE TRÊS
EXPERIMENTOS INDEPENDENTES
.
*
P
<0,01
E
**
P
<0,001
COMPARADO COM O CONTROLE NEGATIVO
POR
ANOVA
SEGUIDO POR
T
UKEY
....................................................................................................62
xi
LISTA DE TABELAS
T
ABELA
1
-
P
ROTOCOLO DE TRATAMENTO DE LINFÓCITOS COM ÁCIDO CAURENÓICO NAS FASES DO CICLO
CELULAR
............................................................................................................................................50
T
ABELA
2
-
F
REQÜÊNCIA DE
M
ICRONÚCLEOS EM ERITRÓCITOS POLICROMÁTICOS
(EPC)
DA MEDULA ÓSSEA
DE CAMUNDONGOS APÓS O TRATAMENTO COM ÁCIDO CAURENÓICO
(AC)
E A RELAÇÃO ENTRE
EPC
E
ENC
(
ERITRÓCITOS NORMOCROMÁTICOS
)
EM DIFERENTES DOSES E TEMPOS PÓS
-
TRATAMENTO
.......61
T
ABELA
3
-
E
FEITO DO ÁCIDO CAURENÓICO SOBRE A PROLIFERAÇÃO E INDUÇÃO DE ABERRAÇÕES
CROMOSSÔMICAS NAS DIFERENTES FASES DO CICLO CELULAR DE LINFÓCITOS HUMANOS
.................63
T
ABELA
4
-
R
EVERSÃO DA MUTAÇÃO PONTUAL PARA
(
HIS
1-7),
ALELO OCRE
(
LYS
1-1)
E MUTAÇÕES DO TIPO
DESLOCAMENTO DO QUADRO DE LEITURA
(
HOM
3-10)
EM LINHAGEM HAPLÓIDE
XV185-14
C DE
S.
CEREVISIEAE APÓS TRATAMENTO COM ÁCIDO CAURENÓICO DURANTE
18
HORAS EM CONDIÇÕES DE
NÃO CRESCIMENTO
(PBS) ..................................................................................................................65
T
ABELA
5
-
R
EVERSÃO DA MUTAÇÃO PONTUAL PARA
(
HIS
1-7),
ALELO OCRE
(
LYS
1-1)
E MUTAÇÕES DO TIPO
DESLOCAMENTO DO QUADRO DE LEITURA
(
HOM
3-10)
EM LINHAGEM HAPLÓIDE
XV185-14
C DE
S.
CEREVISIEAE APÓS TRATAMENTO COM ÁCIDO CAURENÓICO EM CONDIÇÕES DE CRESCIMENTO
.......66
12
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
% Porcentagem
& E
µL Microlitro
°C Graus Celsius
< Menor que
AC Ácido Caurenóico
ANOVA
Análise de Variância (Analiysis of Variance)
BE/AL Brometo de Etídio/Acridina Laranja
CI
50
Concentração Inibitória Média
CO
2
Dióxido de Carbono
DL
50
Dose efetiva média
DMSO Dimetilsufóxido
DNA Ácido Desoxirribonucléico
DP Desvio Padrão da Média
EPC Eritrócito Policromático
ENC Eritrócito Normocromático
FD Freqüência de Dano
FISH Fluorescent in situ Hybridization
h Horas
ID Índice de Dano
IM Índice Mitótico
M Molar
mg Miligrama
mL Mililitro
ng Nanograma
MMS Metil-metano-sulfonado
4-NQO Óxido de Nitroquinolina
PBS Tampão Fosfato (Phosphate Buffer Solution)
pH Potencial Hidrogênico
RNA Ácido Ribonucléico
X Vezes
13
SUMÁRIO
1.1 Produtos Naturais ...............................................................................................................................16
1.2
Toxicidade de plantas medicinais (in natura ou manufaturados)...........................................17
1.3
Gênero Copaifera L. ...................................................................................................................19
1.3.1 Copaifera langsdorffii Desf. ..............................................................................................................19
1.3.2
Importância farmacológica do óleo-resina de copaíba .................................................................20
1.3.3 Ácido Caurenóico: fitocomposto estudado de C.langsdorffii ............................................................21
1.4
Genotoxicidade ...........................................................................................................................22
1.4.1 Teste de avaliação de genotoxicidade .............................................................................................24
1.4.1.1
Teste do Cometa ...........................................................................................................25
1.4.1.2
Teste do Micronúcleo in vivo........................................................................................26
1.4.1.3
Teste do Micronúcleo in vitro .......................................................................................28
1.4.1.4
Aberrações Cromossômicas ..........................................................................................29
1.4.1.5
Teste de Mutagenicidade ..............................................................................................31
1.4.1.5.1
A levedura Saccharomyces cerevisiae como modelo de estudo eucarioto............32
1.4.1.5.2
Mutagênese...........................................................................................................32
2 OBJETIVOS ...........................................................................................................35
2.1
Objetivo Geral ............................................................................................................................35
2.2
Objetivos Específicos..................................................................................................................35
•
Determinar e comparar o potencial genotóxico in vitro do ácido caurenóico em linfócitos
humanos e células tumorais leucêmicas (HL60) através do Teste do Cometa; ..........................................35
•
Avaliar a cinética de reparo do dano ao DNA induzido pelo ácido caurenóico em linfócitos
humanos através do Teste do Cometa;........................................................................................................35
•
Determinar o potencial de indução de micronúcleos in vitro e in vivo induzido pelo ácido
caurenóico, em linfócitos humanos e células da medula óssea de camundongos, respectivamente; ..........35
•
Estimar a indução de aberrações cromossômicas induzidas pelo ácido caurenóico sobre linfócitos
humanos;.....................................................................................................................................................35
•
Avaliar o potencial mutagênico do ácido caurenóico em modelo de mutagênese em
Saccharomyces cerevisiae. .........................................................................................................................35
3
MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................36
3.1
Materiais Utilizados....................................................................................................................36
3.1.1
Equipamentos ...............................................................................................................................36
3.1.2
Soluções e Reagentes ...................................................................................................................36
3.2
Isolamento do Ácido Caurenóico ..............................................................................................38
3.3
Linhagens Celulares ...................................................................................................................38
3.3.1
Isolamento dos Linfócitos ............................................................................................................38
3.3.2
Manutenção e Cultivo da Linhagem Celular Tumoral HL60 .......................................................38
3.4
Estudo de Mecanismos de Ação.................................................................................................39
14
3.4.1
Viabilidade Celular – Exclusão pro Azul de Tripan.....................................................................39
3.4.1.1
Análise estatística..........................................................................................................39
3.4.2
Análise Morfológica – Coloração Diferencial por Brometo de Etídio/Acridina Laranja .............39
3.4.2.1
Análise Estatística.........................................................................................................40
3.4.3
Avaliação da Inibição da Atividade da Enzima Topoisomerase I pelo Método de Relaxamento do
DNA 41
3.5
Teste do Cometa .........................................................................................................................41
3.5.1
Seleção de Voluntários e Obtenção do Material para Análise......................................................41
3.5.2
Tratamentos ..................................................................................................................................42
3.5.2.1
Avaliação Comparativa do Potencial Genotóxico sobre Linfócitos e HL60 .................42
3.5.2.2
Reparo do DNA em Linfócitos .....................................................................................42
3.5.3
Execução do Teste do Cometa......................................................................................................42
3.5.4
Análise Estatística ........................................................................................................................44
3.6
Teste do Micronúcleo in vivo .....................................................................................................44
3.6.1
Animais e Ambiente de Experimentação......................................................................................44
3.6.2
Grupos amostrais..........................................................................................................................45
3.6.3
Obtenção e Preparação do Material para Análise .........................................................................46
3.6.4
Análise de Micronúcleo................................................................................................................47
3.6.5
Análise Estatística ........................................................................................................................47
3.7
Teste do Micronúcleo in vitro ....................................................................................................48
3.7.1
Tratamento....................................................................................................................................48
3.7.2
Fixação das Células ......................................................................................................................48
3.7.3
Preparação das Lâminas ...............................................................................................................48
3.7.4
Análise de Micronúcleo................................................................................................................49
3.7.5
Análise Estatística ........................................................................................................................49
3.8
Aberrações Cromossômicas.......................................................................................................49
3.8.1
Tratamentos ..................................................................................................................................50
3.8.2
Preparação das Lâminas ...............................................................................................................50
3.8.3
Análise Citogenética.....................................................................................................................51
3.8.3.1
Critérios de análise........................................................................................................51
3.8.4
Análise Estatística ........................................................................................................................51
3.9
Teste de Mutagenicidade em Saccharomyces cerevisiae ..........................................................51
3.9.1
Linhagem e Meios de Cultura ......................................................................................................51
3.9.2
Condições de Crescimento de S. cerevisiae..................................................................................52
3.9.3
Teste de Sobrevivência.................................................................................................................52
3.9.4
Detecção da Atividade Mutagênica induzida pelo Ácido Caurenóico..........................................53
3.9.5
Análise Estatística ........................................................................................................................54
4
RESULTADOS .................................................................................................................55
4.1
VIABILIDADE CELULAR – EXCLUSÃO POR AZUL DE TRIPAN.......................55
4.2
Análise Morfológica – Coloração Diferencial por Brometo de Etídio/Acridina Laranja ....56
15
4.3
Efeito do Ácido Caurenóico Sobre a Enzima Topoisomerase I ..............................................56
4.4
Avaliação do Teste do Cometa...................................................................................................57
4.4.1
Avaliação Comparativa do Potencial Genotóxico do Ácido Caurenóico sobre Linfócitos
Humanos e HL60........................................................................................................................................58
4.4.2
Reparo do DNA............................................................................................................................59
4.5
Análise de Micronúcleo em Medula Óssea de Camundongo ..................................................60
4.6
Análise de Micronúcleo em Linfócitos Humanos.....................................................................61
4.7
Aberrações Cromossômicas.......................................................................................................62
4.8
Atividade Mutagênica do Ácido Caurenóico em S. cereviseae................................................63
4.8.1
Efeito Citotóxico ..........................................................................................................................63
4.8.2
Efeito Mutagênico ........................................................................................................................64
5
DISCUSSÃO......................................................................................................................67
6
CONCLUSÃO...................................................................................................................76
REFERÊNCIAS..........................................................................................................................77
16
1 INTRODUÇÃO
1.1 Produtos Naturais
A utilização de plantas com fins medicinais, para tratamento, cura e prevenção
de doenças, é uma das mais antigas formas de prática medicinal da humanidade
(BALUNAS; KINGHORN, 2005; TUROLLA; NASCIMENTO, 2006). Segundo
estimativas da Organização Mundial de Saúde (OMS), 80 % da população mundial
depende da medicina tradicional para suprir as necessidades de assistência médica
primária (FARNSWORTH, 1985; CRAGG; NEWMAN, 2000; FONSECA; PEREIRA,
2004; CRAGG; NEWMAN, 2005). Sendo que a maior parte das terapias tradicionais
envolve o uso de plantas in natura ou produtos manufaturados a partir de seus extratos
ou princípios ativos (MORAES et al., 2003). Segundo Shu (1998), das 252 drogas
consideradas como básicas e essenciais pela OMS, 11% são exclusivamente originadas
de plantas e um número significante são drogas sintéticas obtidas de precursores
naturais.
Sabe-se que 61% das 877 moléculas introduzidas na terapêutica entre os anos
1981 – 2002 foram inspiradas em produtos naturais, sendo que 6% delas são
empregadas diretamente como a substância original, 27% foram derivados de produtos
naturais, 5% são compostos sintéticos com farmacóforos derivados de produtos naturais
e 23% são sintéticos obtidos do desenho estrutural originado de um produto natural.
Esses dados mostram que os produtos naturais têm grande valor intrínseco decorrente
da sua atividade biológica, o que vem estimulando as companhias farmacêuticas
(CRAGG et al., 2003; OLIVEIRA; BRAGA, 2003).
Em países em desenvolvimento, como o Brasil, o uso terapêutico de plantas
medicinais e seus manufaturados ajudam a reduzir a importação de drogas, e ainda
incrementa o desenvolvimento econômico (FERREIRA, 1998). Além disso,
medicamentos derivados de plantas conhecidas tendem a ser mais aceitos pela
população, facilitando a aderência ao tratamento (WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 1999). Não há dúvidas de que as plantas medicinais são importantes
em países em desenvolvimento como opção para a prescrição na terapêutica
medicamentosa (WHO, 1998). De acordo com Calixto (2000), o número de plantas
nativas do Brasil usadas in natura ou manufaturadas como fitomedicamentos já
ultrapassa uma centena.
17
O Brasil é o país com a maior biodiversidade do mundo. Apesar de sua rica
flora, que representa mais de 20 % das espécies de plantas conhecidas no mundo
(TOMLINSON; AKERELE, 1993; KATO, 2001), uma vasta quantidade de espécies
vegetais brasileiras permanece sem nenhum tipo de estudo químico e/ou biológico
(CORDELL, 1995). Muito pouco tem sido feito no Brasil para estudar o seu potencial
como fonte de novas bases medicamentosas ou mesmo como fitoterápicos (FERREIRA,
1998).
1.2 Toxicidade de plantas medicinais (in natura ou manufaturados)
O uso de produtos naturais com fins terapêuticos aumentou consideravelmente
na sociedade contemporânea. Uma parcela significativa da sociedade faz uso dos
produtos naturais por achar que são seguros e promovem saúde, ao contrário dos
produtos sintéticos, frequentemente associados com efeitos colaterais indesejados
(YUNES et al., 2001; CHAN, 2003; MOREIRA et al., 2006).
Em algumas áreas, especialmente de países de clima tropical como o Brasil, a
abundância de plantas medicinais oferece acesso a diversos produtos utilizados, através
da automedicação, na prevenção e tratamento de doenças (COSTA et al., 1997;
MATOS et al., 2001; LORENZI; MATOS, 2002). Diferentemente do que ocorre nos
Estados Unidos e na Europa, onde se há mais controle no registro e na comercialização
dos produtos obtidos de plantas, no Brasil, as plantas medicinais da flora nativa são
consumidas com pouca ou nenhuma comprovação de suas propriedades farmacológicas.
Muitas vezes essas plantas são, inclusive, empregadas para fins medicinais diferentes
daqueles utilizados pelos silvícolas (VEIGA- JÚNIOR et al., 2005).
Apesar da importância das plantas medicinais, pouco se conhece acerca dos
efeitos biológicos da grande maioria dessas espécies de plantas (BAROOS et al., 2003;
CHOI; CHUNG, 2003; DE MIRANDA et al., 2004). Poucos produtos (in natura ou
manufaturados) foram suficientemente estudados do ponto de vista clínico e
toxicológico, de forma a confirmar a sua eficácia e segurança, como exigido para os
demais medicamentos (PETROVICK, 1997). A Agência Nacional de Vigilância
Sanitária (ANVISA) vem elaborando normas para a regulamentação de medicamentos
fitoterápicos, desde a Portaria n. 6 de 1995, que estabeleceu prazos para que as
indústrias farmacêuticas apresentassem dados de eficácia e segurança desses
18
medicamentos, passando pela RDC n. 17 de 2000, e a Resolução RDC n. 48 de 16 de
março de 2004, atualmente em vigor, que dispõe sobre o registro de medicamentos
fitoterápicos (TUROLLA; NASCIMENTO, 2006). Entretanto, essa resolução não vem
sendo obedecida por grande parte da indústria nacional de fitomedicamentos, que
continua a comercializá-los sem garantias da sua eficácia e segurança (YUNES et al.,
2001; LOSOVOI, 2002).
Os testes para avaliação de toxicidade das substâncias químicas estão bem
detalhados segundo os protocolos sugeridos pela OECD (1996). No Brasil, a Resolução
– RE n. 90, publicada em 16 de março de 2004, apresenta um guia para a realização de
estudos de toxicidade pré-clínica de fitoterápicos. Esta resolução foi elaborada em
conformidade com as normas da Organização Mundial de Saúde (OMS), e recomenda
estudos de toxicidade aguda, de doses repetidas e quando houver indicação de uso
contínuo ou prolongado do medicamento em humanos, estudos de genotoxicidade
(TUROLLA; NASCIMENTO, 2006).
A toxicidade de plantas medicinais é um sério problema de Saúde Pública. Os
efeitos adversos dos fitomedicamentos, possíveis de adulterações e toxidez, bem como a
ação sinérgica (interação com outras drogas) ocorrem comumente. Diversos
fitoterápicos usados no Brasil têm sido documentados como sendo seguros e eficazes,
baseados apenas em estudos pré-clínicos in vitro e in vivo, realizados em animais. No
entanto, esses estudos não garantem evidências suficientes para assegurar a sua eficácia
e segurança em seres humanos (PIMENTEL et al., 1998). Pesquisas realizadas para
avaliação do uso seguro de plantas medicinais e fitoterápicos no Brasil ainda são
incipientes, assim como o controle da comercialização pelos órgãos fiscais (VEIGA-
JÚNIOR et al., 2005; TUROLLA; NASCIMENTO, 2006).
Como exemplo de efeitos tóxicos de substâncias presentes em plantas, pode ser
citado os efeitos hepatotóxicos do apiol, safrol, lignanas e alcalóides pirrolizidínicos; a
ação tóxica renal que pode ser causada por espécies vegetais que contém terpenos e
saponinas e alguns tipos de dermatites causadas por espécies ricas em lactonas
sesquiterpênicas e produtos naturais do tipo furanocumarinas (CAPASSO et al., 2000).
Componentes tóxicos ou antinutricionais, como o ácido oxálico, nitrato e ácido erúcico
estão presentes em muitas plantas de consumo comercial, assim como, diversas
substâncias isoladas de plantas medicinais possuem atividades citotóxica ou genotóxica
e mostram relação com a incidência de tumores (ROMERO-JIMÉNEZ et al., 2005).
19
A predição acurada da toxicidade de drogas (naturais ou sintéticas) em humanos
requer, não somente a análise da relação dose-resposta, mas, também o claro
conhecimento a respeito dos mecanismos de toxicidade e dos fatores de risco
correspondentes (LI, 2004).
1.3 Gênero Copaifera L.
O gênero Copaifera L. pertence à família Leguminosae (subfamília:
Caesalpinoideae). São árvores de grande porte e crescimento lento, chegando a alcançar
uma altura de 25 a 40 metros, com troncos de 50 a 80 centímetros de diâmetro e folhas
compostas alternadas com três pares de folíolos de forma oval alargada (LIMA et al.,
1995; PINTO; VEIGA, 1998; VEIGA-JÚNIOR; PINTO, 2002). Seus frutos são
deiscentes, ovóides, com uma única semente e cobertas com um arilo amarelo
(ALMEIDA et al., 1998).
Estas árvores encontram-se distribuídas na África e em regiões tropicais e
subtropicais da América do Sul (WILLIS, 1973), principalmente no Brasil, Venezuela,
Guianas e Colômbia (LIMA, 1995). Suas espécies são popularmente conhecidas como:
copaíba, pau d’óleo, podói, cupaúba e cupiúva (PIO CORRÊA, 1984).
O gênero Copaifera possui 72 espécies (VEIGA-JÚNIOR; PINTO, 2002) e, de
acordo com os levantamentos realizados por Rizzini (1963), Braga (1976) e Pio Corrêa
(1984), o gênero Copaifera, no Brasil, é representado por 17 espécies, dentre as quais,
as espécies C. cearensis, C. langsdorffii, C. luetzelburgii e C. coriaceae podem ser
encontradas no Estado do Ceará.
1.3.1 Copaifera langsdorffii Desf.
A Copaifera langsdorffii Desf. (Figura 1) é uma espécie arbórea de grande porte,
podendo alcançar até 35 metros de altura. Suas folhas são alternas e compostas, cheias
de glândulas contendo óleo resinoso. Possui uma grande plasticidade ecológica
(capacidade de adaptação a diferentes ambientes). Apresenta ampla distribuição
geográfica na América do Sul, principalmente na Argentina, Bolívia e Brasil. Sua
distribuição no Brasil é relatada principalmente nos Estados do Ceará, Distrito Federal,
20
Goiás, Mato Grosso, Minas Gerais, Paraná, São Paulo e Tocantins (ALMEIDA et al.,
1998), além da Amazônia Ocidental (Amazonas, Acre e Rondônia) (SEBRAE, 1998).
Figura 1 - Copaifera langsdorffii Desf.
1.3.2 Importância farmacológica do óleo-resina de copaíba
Dentre as várias utilidades da copaíba destaca-se seu uso madeireiro, medicinal,
cosmético e industrial (CARVALHO, 1994). Sua utilização madeireira ocorre em
função de características como superfície lisa e lustrosa, textura média e uniforme,
durável e de alta resistência a ataque de xilófagos, e apresenta baixa permeabilidade,
sendo por isso, largamente utilizada na construção civil e naval (CARVALHO, 1994).
Porém, atualmente, seu uso está mais voltado para a área medicinal devido ao
óleo-resina extraído do caule de Copaíba que tem sido utilizado in natura como anti-
reumático, anti-tetânico, contra doenças pulmonares e urinárias, dentre outras aplicações
(BRAGA, 1953; PIO CORRÊA, 1984; Del NUNZIO, 1995; ALMEIDA et al., 1998;
VEIGA-JÚNIOR; PINTO, 2002).
O óleo-resina extraído da copaíba é uma mistura natural de diterpenos ácidos em
óleo essencial, composto, principalmente de sesquiterpenos (MAÍSTRO et al., 2005).
Estudos fitoquímicos com o óleo-resina, mostraram a presença de óleos essenciais (8%;
β-cariofileno, óxido de cariofileno, β-elemano, α-cis-bergamoteno, ar-curcumeno e α-
trans-bergamoteno) e uma mistura de diterpenos (70%; caur-16-en-19-oico e ácidos
poliálticos) (GRAMOSA et al., 1996). Estudos farmacológicos têm demonstrado que o
óleo-resina de copaíba possui atividade antiinflamatória, gastroprotetora e cicatrizante
(FERNANDES et al., 1992; PAIVA et al., 1998, 2002; CARVALHO et al., 2005),
21
bactericida (MARUZZELLA; SICURELLA, 1960; OPDYKE, 1976; CASCON et al.,
2000; TINCUSI et al., 2002), anti-helmíntica (PELLEGRINO, 1967; GILBERT et al.,
1972), analgésica (FERNANDES; PEREIRA, 1989), tripanocida (CASCON et al.,
1998), efeito protetor contra colite aguda (PAIVA et al., 2004) e antitumoral (OHSAKI
et al., 1994; LIMA et al., 1998, 2003).
Atualmente existe forte interesse em caracterizar o potencial genotóxico dos
extratos vegetais utilizados na saúde humana, uma vez que a maioria desses extratos
possuem substâncias genotóxicas. Essas, podem atuar como agentes mutagênicos e
carcinogênicos naturais (PANIGRAHI; RAO, 1982; ARAÚJO et al., 1999; BURIM et
al., 1999) ou como agente anti-mutagênicos (CHACON et al., 2002). Desmarchelier
(1998) reportou que o extrato metanólico de Copaifera reticulata possui elevado
potencial antioxidativo in vitro em baixas concentrações (CI
50
= 3µg/mL). Por outro
lado, a avaliação do potencial mutagênico do óleo-resina de copaíba em diferentes
espécies de roedores tem mostrado que, apesar das diferenças qualitativas entre os óleo-
resinas estudados, o padrão de toxicidade é similar em relação aos efeitos citotóxicos e
genotóxicos, ocorrendo, somente, em altas doses (MAÍSTRO et al., 2005).
Nesse contexto devemos ressaltar a importância de estabelecer uma relação entre
a composição química e atividades biológicas dos óleo-resinas de copaíba, a fim de
validar a segurança e o efeito medicinal do óleo-resina extraído das espécies de
Copaifera.
1.3.3
Ácido Caurenóico: fitocomposto estudado de C.langsdorffii
Os diterpenos caurânicos são precursores biossintéticos de várias substâncias do
metabolismo de fungos e plantas, incluindo hormônios de crescimento vegetal
(giberalinas). Assim, diterpenos dessa classe apresentam ampla distribuição no reino
vegetal, sendo normalmente encontrados em baixas concentrações. Alguns gêneros, no
entanto, destacam-se pelos elevados teores de diterpenos caurânicos, como Copaifera,
Xylopia, Annona e Mikania spp. (OLIVEIRA; BRAGA, 2003).
Diversas atividades biológicas in vivo e in vitro já foram relatadas para
diterpenos caurânicos, incluindo as atividades antimicrobiana, antiparasitária, inibidora
do apetite de insetos, citotóxica, anti-HIV, antifertilizante, hipotensora e
22
antiinflamatória, além de atividade sobre a gênese de esteróides e a regulação do
crescimento de plantas (GHISALBERT, 1997).
O ácido caurenóico (Figura 2) é um dos vários diterpenos encontrados no óleo
de copaíba. Diversos estudos têm demonstrado seu amplo espectro de atividades
biológicas como, por exemplo, a atividade in vitro anti-parasítica e anti-microbiana,
vasodilatadora e antiinflamatória (BOAKYE-YIDOM et al.; 1977, DAVINO et al.;
1989; BATISTA et al.; 1999, De MELO et al.; 2001; PAIVA et al., 2003; TIRAPELLI
et al., 2004). Campos-Bedolla et al. (1997) descreveu a ação inibitória, do ácido
caurenóico, sobre as contrações uterinas induzidas por serotonina, acetilcolina e
oxitocina. Costa-Lotufo et al. (2002) demonstrou a ação anti-proliferativa contra células
tumorais, efeito hemolítico em eritrócitos humanos e murinos, e embriotoxicidade em
embriões de ouriço-do-mar (Lytechinus variegatus).
A abundância em diterpenos caurânicos, e as diversas atividades relatadas para
esses compostos, leva à concluir que substâncias dessa classe podem constituir
protótipos moleculares para o desenvolvimento de novos fármacos. Nesse contexto,
diversos trabalhos foram realizados no Brasil visando o estudo fitoquímico e
farmacológico de diterpenos caurânicos, o que permitiu, em alguns casos, estabelecer
relações entre a estrutura química e a atividade farmacológica (MONTI et al., 1996;
GHISALBERT, 1997; VIEIRA et al., 2002).
Figura 2 - Estrutura química do ácido caurenóico (ácido ent-caur-16-en-19-oico)
1.4 Genotoxicidade
DNA das nossas células sofre, diariamente, mais de dez mil lesões, em parte,
devido ao próprio metabolismo celular e/ou erros durante a replicação do material
genético. Contudo, a exposição a agentes químicos, físicos e biológicos contribui para
23
incrementar a carga mutagênica a qual os seres humanos são expostos, a cada dia
(SLUPPHAUG et al., 2003). As pessoas são continuamente expostas a vários agentes
químicos que têm mostrado propriedades carcinogênicas ou mutagênicas em sistemas
experimentais (WOGAN et al., 2004; JEFFREY; WILLIAMS, 2005). O efeito
genotóxico de um agente potencialmente mutagênico, depende do seu alvo celular.
Alguns compostos químicos precisam ser metabolizados antes de adquirirem sua
capacidade mutagênica (pró-mutágenos). Os agentes mutagênicos podem induzir
mudanças genômicas por interagir diretamente ou indiretamente com o DNA ou por
interagir com proteínas envolvidas na manutenção da integridade do genoma (KIRSCH-
VOLDERS et al., 2003; HOUTGRAAFF et al., 2006).
A maioria dos estudos sobre genotoxicidade e mutagenicidade tem sido
realizada sobre produtos químicos industriais, farmacêuticos e contaminantes
ambientais (SNYDER; GREEN, 2001; WOGAN et al., 2004; AYDEMIR et al., 2005;
NG et al., 2006; MORALES-RAMÍRES et al., 2006; BRAMBILLA; MARTELLI,
2006). Estudos genotoxicológicos de substâncias químicas presentes na dieta alimentar
(aditivos e contaminantes) são cada vez mais comuns (JEFFREY; WILLIAMS, 2005).
No entanto, há pouca informação sobre a genotoxicidade de drogas vegetais (LOHMAN
et al., 2001).
Muitas plantas são capazes de produzir diferentes substâncias tóxicas em
grandes quantidades, aparentemente para sua defesa contra vírus, bactérias, fungos e
animais predadores (FONSECA; PEREIRA, 2004). Alguns metabólitos secundários
provenientes de plantas possuem propriedades antioxidantes, que podem prevenir o
material genético contra danos de natureza oxidativa (ZHANG et al., 2006; TRIPATHI
et al., 2007). Porém, muitos xenobiontes derivados de plantas medicinais são capazes de
induzir modificações químicas no DNA, as quais podem ser nocivas às células, pois
interferem em processos vitais, como a duplicação do DNA e a transcrição gênica, bem
como podem agredir a estrutura do DNA promovendo lesões gênicas e cromossômicas
(TRAORE et al., 2000; TAYLOR et al., 2003; VERSCHAEVE et al., 2004)
.
Para
alguns desses compostos químicos já foram detectadas propriedades mutagênicas e/ou
carcinogênicas (VARGAS et al., 1990; VARANDA et al., 1997), muitas dessas plantas
são, constantemente, correlacionadas com a alta freqüência de doenças e tumores
(MOREIRA et al., 2002). Alguns pesquisadores têm reportado, recentemente, o
potencial genotóxico e mutagênico de extratos vegetais de plantas medicinais
(ROMERO-JIMÉNEZ et al., 2005; STEENKAMP et al., 2005), como, Phyllantus
24
orbicularis (SÁNCHEZ-LAMAR et al., 2002), Chrysobalanus icaco L. (FERREIRA-
MACHADO et al., 2004) e Aloe vera (PAES-LEME et al., 2005). Contudo, a avaliação
dos efeitos genotóxicos e mutagênicos de compostos provenientes de plantas é
fundamental para a redução dos riscos de exposição a esses agentes.
1.4.1 Teste de avaliação de genotoxicidade
A detecção de danos ocorridos no material genético pode ser feita por vários
métodos, dentre estes, os citogenéticos são amplamente utilizados. Geralmente usando
células obtidas de animais ou linfócitos periféricos de indivíduos envolvidos. Os
linfócitos são indicadores sensíveis aos agentes genotóxicos, pois há correlação entre os
danos induzidos nas células do sangue e outras células somáticas, servindo de eficiente
modelo para pesquisas de genotoxicidade, além de apresentarem uma vida
relativamente longa, circulam por todos os tecidos, e ainda, são facilmente obtidos
(ALBERTINI et al., 2000).
Em geral, para compostos com limitada ou nenhuma exposição para humanos,
são usados pelo menos dois testes de curta-duração in vitro. Um medindo a habilidade
da substância em induzir mutações ao nível de genes em células bacterianas e outro ao
nível de cromossomos em células de mamíferos. No caso de substâncias em que se
espera exposição humana extensa e/ou direta (ex.: aditivos alimentares e fármacos),
muitas estratégias de teste têm sido propostas através dos anos, indicando três ou quatro
testes ao nível de genes e cromossomos. Incluindo muitas vezes um teste in vivo em
roedores. Devido à variedade de potenciais lesões moleculares relevantes ao
desenvolvimento do câncer e de defeitos genéticos transmissíveis, a análise de múltiplos
efeitos genéticos é geralmente necessária no screening em genotoxicidade de
substâncias. Desse modo, essas substâncias devem ser testadas em vários ensaios a fim
de se obter informações suficientes sobre o potencial genotóxico de cada uma
(EISENBRAND et al., 2002).
A toxicidade genética não é uma medida de carcinogenicidade, mas é
frequentemente usada como um indicador para o câncer, uma vez que os testes de
mutagenicidade medem um evento inicial ou intermediário da tumorigênese (FEARON;
VOGELSTEIN, 1990), havendo alta associação entre respostas positivas em testes de
toxicidade genética e carcinogenicidade – tanto em roedores como no homem
25
(McCANN et al., 1975, PURCHASE et al., 1978). Como resultados dessas
considerações, os testes genotóxicos são utilizados, rotineiramente, para uma avaliação
do espectro toxicológico de compostos químicos e medicamentos.
Um número de testes de curta-duração está disponível para a avaliação do perigo
genético. Esses modelos são frequentemente categorizados pelos indicadores biológicos
que avaliam, ou seja: mutação gênica, dano cromossômico ou lesão no DNA. A
associação íntima desses indicadores biológicos, bem caracterizados e facilmente
quantificados, com os mecanismos conhecidos de ativação de proto-oncogenes ou perda
de função de genes supressores de tumor, tem fortalecido a importância dos testes de
genotoxicidade.
Não existem dúvidas de que os testes de genotoxicidade devam fazer parte de
um sistema de avaliação de todos os novos agentes químicos. Ficando o sistema teste
apropriado, bem como o modelo do protocolo, à serem determinados, freqüentemente,
pelas diretrizes regulatórias internacionais: International Conference on Harmonization
(ICH), e da Organization for Economic Cooperation and Development (OECD). E no
Brasil ficando sobre a responsabilidade regulatória da Agência Nacional de Vigilância
Sanitária (ANVISA).
1.4.1.1 Teste do Cometa
Desenvolvido por Ostling e Johanson (1984) e modificado por Singh et al.
(1988) e, posteriormente, por Olive (1989), o teste do cometa, também conhecido como
Single-cell gel electrophoresis (SCGE), tem sido, rotineiramente, utilizado na avaliação
genotoxicológica de compostos químicos industriais, biocidas, agroquímicos e produtos
farmacêuticos (HARTMANN et al., 2003).
Durante os últimos dez anos, tornou-se um dos principais métodos no estudo de
lesões no DNA. Com aplicações em testes de genotoxicidade, epidemiologia molecular,
ecotoxicologia e biomonitoramento populacional. (COLLINS, 2004; FAUST et al.,
2004). O teste do cometa em comparação a outras metodologias empregadas na
toxicologia genética, apresenta muitas vantagens como, por exemplo, a simplicidade, o
baixo custo econômico e a rapidez de execução. Assim como a alta sensibilidade na
detecção de lesões específicas (quebras de fita simples e duplas). Algumas variações
foram introduzidas no ensaio, como a utilização de enzimas digestivas específicas que
26
permitem que mutações, incorporações erradas de uracila no DNA, danos nas bases
(pirimidinas oxidadas), sítios de reparo, ligações cruzadas (DNA-DNA ou DNA-
proteína) sejam transformados em quebras e possam, então, ser analisados pelo teste
(PFUHLER; WOLF, 1996; COLLINS et al., 1997a; DUTHIE; McMILLAN, 1997).
A versatilidade do método permitiu, ainda, que fossem feitas associações com
procedimentos de hibridização in situ (FISH) de seqüências específicas de DNA dentro
dos cometas (SANTOS et al., 1997; McKELVEY-MARTIN et al., 1998; TICE et al.,
2000).
O teste do cometa, ainda, pode ser utilizado em estudos in vivo quando se deseja
estudar o efeito genotóxico de uma dada substância em um órgão específico (SASAKI
et al., 2000; HARTMANN et al., 2004; BRENDLER-SCHWAAB et al., 2005).
O princípio do teste está baseado na capacidade do DNA sofrer migração em
uma matriz de agarose durante uma eletroforese. A detecção de migrações alteradas de
DNA depende de vários parâmetros como, por exemplo, a concentração da agarose no
gel, do pH, da temperatura, da voltagem e amperagem e da duração da eletroforese
(HARTMANN et al., 2003).
O teste do cometa não é utilizado para detectar mutações gênicas, mas, sim,
lesões genômicas que, após serem processadas, podem resultar em mutação. Diferente
das mutações, as lesões detectadas pelo ensaio são passíveis de reparo. Assim sendo, o
teste do cometa pode ser empregado em estudos de cinética de reparo de lesões no
DNA. Porém, o teste não permite a identificação fidedigna do processo envolvido no
reparo da lesão (RIBEIRO et al., 2003).
1.4.1.2 Teste do Micronúcleo in vivo
O teste do micronúcleo em medula óssea de roedores in vivo é amplamente
aceito pelas agências internacionais e instituições governamentais, como parte da
bateria de testes recomendada para se estabelecer a avaliação e o registro de novos
produtos químicos e farmacêuticos que entram atualmente no mercado mundial
(CHOY, 2001). È um teste rápido e eficaz na detecção de danos cromossômicos
induzidos por agentes clastogênicos, que induzem quebras cromossômicas ou por
agentes aneugênicos, que interferem na formação do fuso mitótico (SCHMID, 1975).
27
A utilização da análise de micronúcleos em células da medula óssea de roedores
teve início a partir de estudos pioneiros realizados na década de 1970 (MATTER;
SCHIMID, 1971; HEDDLE, 1973; SCHIMID, 1973, 1975). O objetivo desses estudos
era identificar parâmetros que poderiam servir como indicadores de danos citogenéticos
em células de medula óssea in vivo. Desses estudos, os autores concluíram que a
incidência de eritrócitos policromáticos (EPC) micronucleados é particularmente útil
como índice de dano citogenético na medula óssea dos roedores (HEDDLE et al., 1983;
GIMMLER-LUZ et al., 1997).
Micronúcleos são estruturas cromatídicas delimitada por membrana, separados
do núcleo principal e visíveis em células interfásicas. Podem ser resultantes de
fragmentos cromossômicos acêntricos ou cromossomos inteiros que não foram
incluídos no núcleo principal devido à ação de substâncias clastogênicas ou aneugênicas
(RIBEIRO et al., 2003).
O teste do micronúcleo com eritrócitos se baseia no fato de que durante o
processo de maturação dos eritroblastos, que resulta na formação dos eritrócitos, o
núcleo é expulso da célula, de modo que, na ausência de eventos clastogênicos ou
aneugênicos, nenhum material cromatídico está presente. Ao contrário do núcleo
principal, micronúcleos não são expulsos durante o processo de maturação dos
eritroblastos e, assim, na presença de agentes que induzam danos cromossômicos, sua
presença pode ser detectada e computada em eritrócitos jovens, onde são facilmente
reconhecidos. Os micronúcleos são tipicamente arredondados, medindo de 1/20 a 1/5 do
diâmetro do eritrócito (SCHIMID, 1976; HEDDLE et al., 1983; RABELLO-GAY,
1991).
Os micronúcleos são analisados em eritrócitos policromáticos (EPC), que são
eritrócitos em estágio intermediário de desenvolvimento que ainda contém RNA e,
portanto, podem ser distinguidos dos eritrócitos normocromáticos (ENC) – eritrócitos
maduros que não apresentam RNA - pela coloração seletiva para RNA (Figura 3). A
análise da proporção de EPC e ENC é importante na detecção de toxicidade excessiva
na medula óssea. Geralmente, essa toxicidade é dada por uma depressão na
porcentagem de EPC. Vale ressaltar que o tempo de vida do EPC é relativamente curto,
de modo que qualquer micronúcleo que ele contenha deva ter sido gerado como
resultado de danos cromossômicos induzidos recentemente (RABELLO-GAY, 1991;
RIBEIRO et al., 2003).
28
1.4.1.3 Teste do Micronúcleo in vitro
Nas últimas décadas foi verificada a contribuição da aneuploidia para o
desenvolvimento de tumores, adicionalmente ao que já é conhecido sobre o papel das
aneuploidias em grande parte dos casos de abortos espontâneos. Em virtude disso,
torna-se importante o desenvolvimento de ensaios biológicos que permitam a detecção
de agentes aneugênicos (KIRSCH-VOLDERS et al., 2002) e clastogênicos.
O micronúcleo representa perda de cromatina em consequência de danos
cromossômicos ou dano no aparelho mitótico. É importante ressaltar que os
micronúcleos são formados durante a mitose, independentemente do tipo de dano
ocorrido durante o ciclo celular. Por isso, os danos no DNA causados pela exposição de
agentes mutagênicos, por exemplo, somente serão expressos em micronúcleos após um
ciclo de divisão celular, sendo dependentes da proporção de células que estão se
dividindo. Consequentemente, a comparação da freqüência de micronúcleos entre
populações de células em divisão só seria segura quando a cinética de divisão nuclear
após o dano ao DNA fosse idêntica (FENECH, 1997; CLARE et al., 2006).
Diante desse fato, Fenech e Morley (1985a) modificaram a metodologia do
ensaio empregando a citocalasina B. A citocalasina B é um inibidor da polimerização da
actina requerida para a citocinese (CARTER, 1967). O uso da citocalasina B induz o
bloqueio da citocinese, mas não da divisão nuclear, resultando em um acúmulo de
células binucleadas a partir de células que passaram por apenas um ciclo de divisão,
independentemente do grau de sincronia e da proporção das células em divisão
(FENECH, 2000) (Figura 4).
O teste do micronúcleo com o emprego da citocalasina B pode ser utilizado para
monitoramento genotóxico de populações, para a avaliação do potencial mutagênico de
agentes químicos e físicos e para estudos específicos como a variação interindividual da
radiosensibilidade e predição da radiosensibilidade de tumores (SHIBAMOTO et al.,
1991; BURRIL et al., 2000; KIRSCH-VOLDERS et al., 2003).
29
100 %
80 %
60 %
40 %
20 %
8
0
60
40
20
RNA
Concentração de RNA e hemoglobina durante a
maturação do eritrócito
Hemoglobina
ERITROBLASTO
BASÓFILO
ERITROBLASTO
POLICROMÁTICO
E
E
R
R
I
I
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T
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Ó
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M
M
Á
Á
T
T
I
I
C
C
O
O
ERITROBLASTO
ORTOCROMÁTICO
PRÓ-ERITROBLASTO
µ
m
2
Amadurecimento da célula expresso
pelo tamanho do núcleo
Figura 3 - Maturação das células da linhagem eritrocitária.
Fonte: Ribeiro et al. (2003)
Figura 4 - Origem do micronúcleo a partir de um fragmento cromossômico acêntrico e de um
cromossomo inteiro em uma célula binucleada pelo uso de citocalasina B
Fonte: Fenech (2000)
1.4.1.4 Aberrações Cromossômicas
Uma grande variedade de ensaios citogenéticos tem sido usada com sucesso no
monitoramento de populações expostas a agentes mutagênicos. E as aberrações
cromossômicas têm sido de grande importância, por avaliarem a possibilidade da
ocorrência de câncer na população (AU et al., 2001). O teste de aberrações
cromossômicas em culturas de células de mamíferos é um dos métodos mais sensíveis
30
para a detecção de agentes mutagênicos e/ou carcinogênicos, sendo complementar ao
teste de Ames em Salmonella (RIBEIRO et al., 2003).
As aberrações cromossômicas representam a parte visível de um grande espectro
de alterações no DNA, resultantes da atuação de diferentes mecanismos de reparação
das quebras nas cadeias do DNA (OBE et al., 2002). As quebras nas cadeias dupla do
DNA são as lesões primárias fundamentais para a formação de aberrações
cromossômicas, podendo ser induzidas ou podem ocorrer espontaneamente, sendo que
os mecanismos de reparo dessas lesões em células eucarióticas envolvem uma variedade
de tipos de mecanismos, levando na maioria das vezes, à reunião não homóloga do
DNA lesado, causando aberrações cromossômicas (PFEIFFER et al., 2000). As quais
estão intimamente relacionadas às doenças como neoplasias, na qual se verifica uma
correlação positiva entre a freqüência de aberrações cromossômicas nos linfócitos e o
desenvolvimento do câncer (NATARAJAN, 2002).
As aberrações cromossômicas dividem-se em numéricas e estruturais. As
numéricas são habitualmente classificadas em duas categorias: as euploidias (múltiplos
de monoplóides) e as aneuploidias (perda ou ganho de um ou poucos cromossomos).
Essas anomalias numéricas resultam, essencialmente, da interferência do agente
mutagênico sobre o aparelho mitótico ou meiótico. As aberrações estruturais podem ser
divididas em dois grupos principais: as cromossômicas (as duas cromátides-irmãs são
quebradas) e as cromatídicas (uma das duas cromátides irmãs é quebrada).
As substâncias químicas, em sua ação sobre o DNA, podem ser divididas em
duas classes: as que produzem aberrações em todas as fases do ciclo celular (S-
independentes), e as que dependem da síntese de DNA para manifestar seu efeito (S-
dependentes). As S-independentes como o antineoplásico bleomicina induzem, tal como
a radiação ionizante, quebras nas duas cadeias do DNA produzindo aberrações
cromossômicas em G
1
, cromatídicas em G
2
e uma mistura dos dois tipos em S. As S-
dependentes (por exemplo, agentes alquilantes) produzem, tal como a luz ultra-violeta,
seu efeito na fase S ou quando as células passam por uma fase de síntese entre a
exposição e a observação do efeito. Nesse caso, as aberrações cromossômicas surgem
devido a erros na duplicação do DNA. As aberrações induzidas em G
1
e S (observadas
na mitose subseqüente) bem como em G
2
(observadas na segunda mitose após a
exposição), são do tipo cromatídico (NATARAJAN; OBE, 1980, 1986).
Nos ensaios de citogenética, os linfócitos do sangue periférico de mamíferos é
um ótimo sistema para se testar uma substância quanto a sua capacidade em produzir
31
aberrações cromossômicas (NATARAJAN; OBE, 1980). Supondo-se que haja uma
correlação entre o dano induzido no sangue e em outras células somáticas, os linfócitos
serviriam como um sistema sentinela para grupos de alto risco (NORDENSON et al.,
1984).
1.4.1.5 Teste de Mutagenicidade
Mutações são definidas como alterações no material genético de uma célula que
não resulta de segregação ou recombinação genética. As mutações podem ocorrer
devido a processos espontâneos ou podem ser induzidas por agentes químicos, físicos
ou biológicos. Mutações em células somáticas estão muito bem correlacionadas com
processos carcinogênicos, enquanto mutações que acometem células da linhagem
germinativa estão correlacionadas com doenças hereditárias.
Os testes de mutagenicidade têm-se mostrado muito adequado na triagem
rotineira de produtos químicos e são considerados parte essencial dos testes
toxicológicos a serem realizados em amostras onde se deseja conhecer a sua atividade
mutagênica (NATARAJAN; OBE, 1986).
Vários ensaios para identificação de agentes mutagênicos vêm sendo
desenvolvidos (MacGREGOR et al., 2000). As mutações são detectadas frequentemente
através da expressão fenotípica, causada por uma mudança súbita e hereditária no
genótipo de um organismo, alterando suas características. A ocorrência de mutações, no
entanto, depende da natureza da lesão e das respostas celulares aos danos no DNA.
Basicamente, as mutações são divididas em duas grandes categorias: mutações gênicas e
cromossômicas. As mutações gênicas são alterações que ocorrem na seqüência de
nucleotídeos do DNA e as cromossômicas são as que produzem alterações no número
ou na estrutura dos cromossomos e são detectadas através de análises citogenéticas
(FRIEDBERG et al., 1995).
Bactérias como Salmonella typhimurium e Escherichia coli são utilizadas nos
métodos mais amplamente empregados para detecção de mutações gênicas (AMES et
al., 1973; MARON; AMES, 1983; GEE et al., 1994; MORTELMANS; ZEIGER, 2000;
UMBUZEIRO et al., 2001). Mas, como estas bactérias são organismos simples
(procariontes), os resultados obtidos nem sempre são válidos para células animais e
outros eucariontes. Portanto, para se obter dados sobre mutação gênica em eucariotos
existem testes de mutagenicidade em leveduras (Saccharomyces cerevisiae), em
32
Drosophila melanogaster ou mesmo mutações somáticas em células de mamíferos, pelo
teste de HGPRT (gene de hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase, ligado ao
cromossomo X dos mamíferos) (MacGREGOR et al., 2000).
1.4.1.5.1 A levedura Saccharomyces cerevisiae como modelo de estudo eucarioto
A S.cerevisiae pertence ao grupo das leveduras anaeróbias facultativas. Isso
significa que ela fermenta hexoses, como a glicose e a frutose, independente da
concentração de oxigênio. A glicose é a principal fonte de carbono de S. cerevisiae, uma
preferência que é mediada por um complexo processo de repressão e ativação de genes
e de proteínas, usualmente conhecida como repressão da glicose ou repressão
catabólica. Quando a concentração de glicose é muito baixa no meio, há a desrepressão
das enzimas mitocôndriais e de genes necessários para o crescimento respiratório (De
WINDE et al., 1997; GANCEDO, 1998).
O crescimento respiratório apresenta diferentes características metabólicas e
cinéticas (Figura 5). Em condições in vitro, por exemplo, após um breve período de
adaptação em meio de cultura rico em nutrientes com alta concentração de glicose,
chamado de fase Lag, as células aumentam sua taxa proliferativa (fase exponencial de
crescimento) com energia proveniente da fermentação da glicose. A depleção de glicose
no meio induz a desrepressão catabólica (transição diáuxica) resultando numa parada
transiente da divisão celular, enquanto as células se preparam para o metabolismo
respiratório. Após esse período, a levedura retoma seu crescimento, em um rítmo mais
lento, utilizando o etanol como fonte de carbono produzido durante a fermentação (fase
pós-diáuxica). Quando todas as fontes de carbono forem exauridas, as células entram na
fase estacionária de crescimento, na qual podem sobreviver durante muito tempo na
ausência de nutrientes (PRINGLE; HARTWELL, 1982; FUGE; WERNER, 1997).
1.4.1.5.2 Mutagênese
A levedura Saccharomyces cerevisiae é um organismo eucarioto amplamente
estudado em pesquisas sobre mutagênese, reparo de DNA e mecanismos envolvidos no
estresse oxidativo (COSTA; FERREIRA, 2001).
33
Os ensaios com leveduras têm sido de grande utilidade na determinação de
agentes mutagênicos ambientais ou farmacológicos, servindo para complementar os
ensaios de mutagenicidade realizados em bactérias (HENRIQUES et al., 1987; POLI et
al., 1999; TERZIYSKA et al., 2000). Estes ensaios são rápidos, sensíveis, econômicos e
reprodutíveis. Além disso, a levedura possui um sistema endógeno de ativação
metabólica constituído por um complexo enzimático (citocromo P450) e de
detoxificação, sem a necessidade da adição de um sistema exógeno, sendo desta forma,
uma vantagem sobre os ensaios bacterianos (PAULA-RAMOS et al., 1991; MORENO
et al., 1991; POLI et al., 1999).
Experimentos de mutações reversas são os mais comumente utilizados. Estes
ensaios se baseiam na restauração ou compensação de um defeito gênico responsável
por um requerimento nutricional (ZIMMERMANN, 1975). A restauração se deve a uma
reversão exata do defeito original, enquanto que a compensação pode ser devido a uma
mutação secundária dentro do gene (mutação supressora interna) ou por uma mutação
externa, como no caso dos alelos sem sentido (nonsense – mutação que resulta na
alteração de um códon que determina um aminoácido para um códon de terminação da
síntese protéica) (ATKIN et al., 1993). A reversão de auxotrofia para prototrofia pode
ser causada por uma substituição, inserção ou deleção de pares de bases, ou ainda uma
mutação induzida por supressor do gene mutante original (HENRIQUES et al., 1987).
Para que seja identificada a mutação reversa é necessária a utilização de uma
linhagem com alterações genéticas adequadas, como por exemplo, a linhagem haplóide
de S. cerevisiae XV185-14c, isolada por Von Borstel (PARRY; PARRY, 1984). Esta
linhagem permite a detecção de dois tipos de mutações lócus específicas: reversões do
alelo ocre lys1-1 (alteração no códon UAA de término de cadeia) ou do alelo missense
his1-7 (códon alterado codifica um aminoácido diferente), e reversões por deslocamento
do quadro de leitura do DNA (frameshift) verificadas no lócus hom3-10 (BOEIRA et
al., 2002). As células revertentes podem ser detectadas pela semeadura em placas
contendo meio de cultura seletivo no qual o fator de crescimento inicialmente requerido
não está presente ou está em quantidades muito pequenas.
34
Figura 5 - Curva de crescimento de S. cereviseae
Fonte: Fuge e Werner (1997)
35
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Estudar o potencial genotóxico e mutagênico do ácido caurenóico, um diterpeno
isolado do óleo-resina da planta Copaifera langsdorffii em modelos in vitro e in vivo.
2.2 Objetivos Específicos
• Determinar e comparar o potencial genotóxico in vitro do ácido
caurenóico em linfócitos humanos e células tumorais leucêmicas
(HL60) através do Teste do Cometa;
• Avaliar a cinética de reparo do dano ao DNA induzido pelo ácido
caurenóico em linfócitos humanos através do Teste do Cometa;
• Determinar o potencial de indução de micronúcleos in vitro e in
vivo induzido pelo ácido caurenóico, em linfócitos humanos e
células da medula óssea de camundongos, respectivamente;
• Estimar a indução de aberrações cromossômicas induzidas pelo
ácido caurenóico sobre linfócitos humanos;
• Avaliar o potencial mutagênico do ácido caurenóico em modelo de
mutagênese em Saccharomyces cerevisiae.
36
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Materiais Utilizados
3.1.1 Equipamentos
• Agitador magnético (DONNER, Modelo AD8850)
• Balança para pesagem de animais (FILIZOLA, Modelo ID-1500)
• Banho maria (Dellta Modelo 105DI)
• Centrífuga de placas (Eppendorf, Modelo Centrifuge 5403)
• Cuba horizontal de eletroforese (BioRad)
• Estufa de secagem e esterilização (FANEM, Modelo 315SE)
• Fluxo laminar vertical (VECO)
• Fonte para eletroforese (Life Technologies, Modelo 250)
• Incubadora com agitação orbital (LABLINE)
• Incubadora de células (CO
2
Water-Jacket Incubator NUAIRE TS
Autoflow)
• Microscópio de fluorescência (Olympus, Modelo BX41)
• Microscópio óptico (Metrimpex Hungary/PZO-Labimex, Modelo Studar
lab)
• Microscópio óptico de inversão (Nikon Diaphot)
3.1.2 Soluções e Reagentes
• Ácido acético P.A. (MERCK)
• Ácido clorídrico 0,1 N (VETEC)
• Agarose de baixo ponto de fusão (Invitrogen)
• Agarose de ponto de fusão normal (Invitrogen)
• Álcool etílico P.A. (VETEC)
• Bacto-ágar (VETEC)
37
• Ciclofosfamida (Genexual 1000 mg, ASTA MÉDICA)
• Citocalasina B (SIGMA)
• Colchicina (SIGMA)
• Corante de Leishman (MERCK)
• DMSO (VETEC)
• Doxorrubicina (ZODIAC)
• EDTA (PROQUÍMICOS)
• Entellan (MERCK)
• Extrato de levedura a 1% (Difco)
• Fitohemaglutinina (CULTILAB)
• Histopaque (SIGMA)
• Meio de cultura celular RPMI 1640 (CULTILAB)
• Metanol P.A. (MERCK)
• Metil-metano-sulfonado (SIGMA)
• NaOH 10M (VETEC)
• Nitroquinoleína-1-óxido (SIGMA)
• Penicilina-estreptomicina (CULTILAB)
• Solução de acridina laranja (100 µg/mL) em água destilada (FLUKA)
• Solução de Azul de Tripan a 4% em água destilada (SIGMA)
• Solução de bactopeptona a 2% (Difco)
• Solução de Brometo de etídio (20µg/mL) em água destilada (GIBCO)
• Solução de Giemsa a 5% em tampão fosfato (PBS) (SIGMA)
• Solução de glicose a 2% (Difco)
• Solução de KCl (0,075 M) em água destilada (LABSYNTH)
• Solução de Triton X-100 a 1% (Vetec)
• Solução salina 0,9% (LABSYNTH)
• Solução tampão fosfato pH 6,8 (NaHPO
4
.7H
2
0 + NaHPO
4
.H
2
O,
LABSYNTH)
• Soro fetal bovino (CULTILAB)
• Tripsina 0,25% (CULTILAB)
• Tris (PROQUÍMICOS)
38
3.2 Isolamento do Ácido Caurenóico
O isolamento do ácido caurenóico foi realizado no Laboratório de Química
Orgânica e Inorgânica da Universidade Federal do Ceará sob a supervisão do professor
Edilberto da Rocha Silveira, de acordo com Costa-Lotufo et al. (2002).
3.3 Linhagens Celulares
3.3.1 Isolamento dos Linfócitos
Os linfócitos foram isolados através de um gradiente de densidade. Uma amostra
de 3mL de sangue periférico foi diluída em 5mL de PBS. Essa solução foi adicionada a
um tubo Falcon contendo 2mL de histopaque e, posteriormente, centrifugada por 30
minutos a 1500 rpm. Após a centrifugação, a solução foi separada, em virtude da
densidade do histopaque, em três camadas visíveis. Uma superior (soro), uma
intermediária (linfócitos e histopaque) e uma inferior (hemácias). Em seguida, a região
intermediária entre as hemácias e o soro, chamada “nuvem de linfócitos” foi aspirada e
adicionada a um terceiro tubo contendo PBS, o qual foi centrifugado por 20 minutos a
1000 rpm. O sobrenadante foi descartado e o pellet de linfócitos foi ressuspendido em
2mL de PBS. Os linfócitos foram utilizados imediatamente após o processo de
isolamento.
3.3.2
Manutenção e Cultivo da Linhagem Celular Tumoral HL60
A linhagem celular tumoral HL60 (leucemia pró-mielocítica humana) foi obtida
pelo Children’s Mercy Hospital em Kansas City – EUA. A linhagem foi cultivada em
frascos plásticos para cultura (75 cm
2
, volume de 250 mL) em meio de cultura RPMI
1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibióticos. As células
foram incubadas em estufa a 37°C com atmosfera de 5% de CO
2
, tendo sido observado
o crescimento celular com ajuda do microscópio de inversão a cada 24 horas. Quando
39
necessário, as células foram repicadas em meio de cultura novo, numa concentração de
0,5 – 1,0 x 10
6
células/mL (BUTLER; DAWSON, 1992).
3.4 Estudo de Mecanismos de Ação
3.4.1 Viabilidade Celular – Exclusão pro Azul de Tripan
O teste de exclusão por azul de tripan permite quantificar separadamente as
células viáveis das células mortas pela substância testada. O corante penetra em todas as
células, porém somente as células viáveis conseguem bombear o azul de tripan para
fora, sendo possível, dessa maneira, observar uma coloração azulada nas células mortas.
Linfócitos (0,5 x 10
5
células/mL) e células da linhagem HL60 (0,3 x 10
6
células/mL) foram incubadas durante 4 e 24 horas com ácido caurenóico (10, 30 e 60
µg/mL) e examinados ao microscópio de inversão. Foi retirado 90 µL da suspensão
celular e adicionado a 10 µL de azul de tripan. As células viáveis e as não viáveis foram
diferenciadas e contadas em câmara de Newbauer. A doxurrubicina (0,3 µg/mL) foi
utilizada com controle positivo (VERAS et al., 2004).
3.4.1.1 Análise estatística
Os dados foram analisados a partir da média e do erro padrão da média de três
experimentos independentes. Para verificação da ocorrência de diferenças significativas
entre os diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de variância
(ANOVA) seguida de Student Newman Keuls (p<0,05).
3.4.2 Análise Morfológica – Coloração Diferencial por Brometo de Etídio/Acridina
Laranja
O método de coloração pelo brometo de etídio/acridina laranja (McGAHON et
al., 1995) permite diferenciar células viáveis daquelas em processo de morte por
apoptose ou necrose, através da coloração diferencial por fluorescência. Este método
40
baseia-se na revelação das células (controle e tratadas) com a coloração por brometo de
etídio (BE) e acridina laranja (AL) no núcleo. A acridina laranja intercala-se ao DNA,
conferindo aparência verde ao núcleo celular, sendo capaz de atravessar membranas
intactas. O brometo de etídio é incorporado, majoritariamente, por células não viáveis
(com instabilidade de membrana), intercalando-se ao DNA corando-o de laranja;
ligando-se fracamente ao RNA, que se mostrará com uma coloração vermelha.
As células viáveis com membrana intacta apresentam núcleo uniformemente
corado de verde pela AL. As células em apoptose inicial (membrana ainda intacta)
apresentam manchas verdes brilhantes presentes no núcleo (condensação de cromatina)
e não são marcadas por BE. Morfologicamente observam-se alterações da membrana
em decorrência da formação de corpúsculos apoptóticos. As células em necrose (lesão
de membrana) apresentam um padrão de coloração uniforme, laranja-avermelhada e não
há formação de corpúsculos apoptóticos. Possivelmente, as membranas plasmáticas
permaneçam intactas durante o fenômeno apoptótico até os últimos estágios quando se
tornam permeáveis aos solutos normalmente retidos (KUMMAR et al., 2005).
Linfócitos (0,5 x 10
5
células/mL) e células da linhagem HL60 (0,3 x 10
6
células/mL) foram incubadas durante 24 horas com ácido caurenóico (10, 30 e 60
µg/mL). As suspensões de células foram transferidas para tubos eppendorf e
centrifugadas por 5 minutos em baixa rotação. Os sobrenadantes foram descartados e as
células ressuspendidas em 20µL de solução de PBS. Em seguida, 1µL da solução
BE/AL foi adicionado a cada tubo e uma alíquota dessas células transferida para
lâminas e montadas com lamínulas. E em seguida, as lâminas foram analisadas ao
microscópio de fluorescência para observação dos eventos celulares. A doxurrubicina
(0,3 µg/mL) foi utilizada como controle positivo (GENG et al., 2003).
3.4.2.1 Análise Estatística
Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes
grupos, os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida de
Student Newman Keuls (p<0,05).
41
3.4.3 Avaliação da Inibição da Atividade da Enzima Topoisomerase I pelo Método
de Relaxamento do DNA
O efeito inibitório do ácido caurenóico sobre a enzima topoisomerase-I foi
avaliado através de um kit comercial enzimático (Topo I Drug Screening Kit da
TopoGen, Inc.). O plasmídio de DNA (250 e 500 ng) super-compactado foi incubado
com a enzima purificada humana topoisomerase I (4 unidades) a 37°C por 30 minutos
em solução de relaxamento (10mM Tris, pH 7,9; 1mM EDTA, 0,15 M NaCl, 0,1%
BSA, 0,1 mM espermidina, 5% glicerol) na ausência ou presença de 10 e 30 µg/mL de
ácido caurenóico. Camptotecina (0,1 mM) foi utilizada como controle positivo. A
reação foi finalizada mediante a adição de 10% de SDS (2µL) e proteinase K (50
µg/mL). Amostras de DNA foram coradas com azul de bromofenol e submetidas a
eletroforese em gel de agarose a 1% durante 2 horas a temperatura ambiente. Após a
eletroforese, o gel de corrida foi corado com brometo de etídio para ser analisado.
3.5 Teste do Cometa
3.5.1 Seleção de Voluntários e Obtenção do Material para Análise
Para o estudo com linfócitos humanos, foi utilizado sangue periférico de quatro
doadores voluntários, obedecendo aos seguintes critérios:
- ter entre 18 e 25 anos;
- estar em bom estado clínico de saúde;
- não fumante e não etilista;
- não estar fazendo uso de algum medicamento.
A coleta do material (sangue periférico retirado da veia cefálica ou basílica) foi
realizada por profissionais capacitados, nas dependências da UNIFAC (Unidade de
Farmacologia Clínica da Universidade Federal do Ceará - UFC), utilizando seringa
esterilizada e descartável.
42
3.5.2 Tratamentos
3.5.2.1 Avaliação Comparativa do Potencial Genotóxico sobre Linfócitos e HL60
Os linfócitos (0,5 x 10
5
células/mL), assim como a linhagem HL60 (0,3 x 10
6
células/mL) foram cultivados em RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal
bovino e 1% de antibióticos, na presença de concentrações crescentes de ácido
caurenóico (10, 30 e 60 µg/mL) durante 4 e 24 horas a 37°C em atmosfera de 5% de
CO
2
. A doxurrubicina (0,3µg/mL) foi utilizada como controle positivo e o DMSO
(0,1%) como controle negativo (BAUMGARTNER et al., 2004). Neste experimento, os
linfócitos não foram estimulados com nenhum agente mitogênico externo.
3.5.2.2 Reparo do DNA em Linfócitos
Para o estudo de reparo de lesões no DNA, os linfócitos foram cultivados nas
mesmas condições do ensaio anterior (3.5.2.1.). O estudo do potencial genotóxico
avaliado pelo ensaio do cometa, não, necessariamente, requer o uso de células em
proliferação. Porém, para se estudar a cinética de reparo das lesões no DNA, o efeito
mitogênico é importante devido a expressão de uma gama de enzimas envolvidas nos
processos de reparo (KAMINSKAS; LI, 1992). Portanto, neste ensaio, os linfócitos
foram estimulados com fitohemaglutinina para induzir sua proliferação. Dois dias após
o estímulo mitogênico, os linfócitos foram incubados com ácido caurenóico (10, 30 e 60
µg/mL) por 4 horas. Após o tempo de tratamento, as células foram lavadas como RPMI
1640, centrifugadas (1000 rpm por 5 minutos) e re-incubadas, na ausência do ácido
caurenóico. Alíquotas da suspensão celular foram analisadas depois de 2, 4, 6, 24 e 48
horas para avaliar a cinética de reparo das lesões induzidas pelo ácido caurenóico.
3.5.3
Execução do Teste do Cometa
1) Preparação das Lâminas
43
As lâminas foram previamente cobertas com agarose de ponto de fusão normal
(0,5%) a uma temperatura de 60°C em solução de PBS livre de Ca
2+
e Mg
2+
, mantidos
a temperatura ambiente até a solidificação. As células tratadas foram embebidas em
uma solução de agarose de baixo ponto de fusão (1,5%) a 37°C e adicionadas as
lâminas pré-cobertas com agarose de ponto de fusão normal. Posteriormente, as lâminas
foram cobertas com lamínulas para uniformizar a distribuição do material na lâmina e
mantidas a 4°C para solidificação da agarose.
2) Lise Celular
Após a solidificação da agarose, a lamínula foi delicadamente removida e as
lâminas imersas na solução de lise (5 M NaCl, 100 mL EDTA, 10mM Tris, 1% N-
Lauroyl sarcosine, 1% Triton X-100, 10% DMSO, pH 10,0), abrigada da luz a 4°C por
no mínimo 1 hora.
3) Neutralização e Eletroforese
Após o procedimento anterior, as lâminas foram imersas em uma solução de
neutralização (0,4 M Tris, pH 7,5) por 15 minutos. Posterior a esta etapa, as lâminas
foram dispostas horizontalmente na cuba de eletroforese e preenchida com uma solução
alcalina a 4°C (1mM Na
2
EDTA, 300 mM NaOH, pH > 13,0). As lâminas repousaram
por 20 minutos para permitir o relaxamento do DNA e a conversão de sítios álcali-
lábeis em quebra de fitas simples. A eletroforese (25 V; 300 mA) foi conduzida a baixa
temperatura (4°C) durante 20 minutos. Todos esses passos foram realizados na ausência
de luz. Após a eletroforese, as lâminas foram novamente neutralizadas por 5 minutos e
fixadas em etanol a 100%.
4) Coloração e Análise
Para coloração das lâminas, foi utilizada uma solução de brometo de etídio
(20µg/mL). As lâminas foram analisadas com o auxílio de microscópio de
fluorescência. A análise foi realizada de acordo com o padrão de escores previamente
determinados pelo tamanho e intensidade da cauda do cometa (Figura 6). Foram
contados 100 cometas por lâmina (LOVELL et al., 1999) e classificados, por análise
44
visual, dentre cinco categorias (0, 1, 2, 3 e 4) que representam a percentagem de DNA
na cauda do cometa, indicando o grau de lesão sofrido pela célula.
O índice de dano (ID) foi obtido pela seguinte fórmula: ID =
in
i
i
×
∑
=
4
0
, onde
i
n
é
o número de células com nível de dano
i
(0, 1, 2, 3 ou 4). A freqüência de dano (FD)
representa a porcentagem de células que sofreram danos no DNA.
3.5.4 Análise Estatística
Para análise estatística dos experimentos, foram utilizados os testes ANOVA e
Tukey no software Prism
versão 4.0 (GraphPad Prism Software), sendo os resultados
considerados significantes quando p < 0,05.
Figura 6 - Tipos de cometa. Classificação por categoria de dano: (0) sem dano (< 5%); (1) Baixo nível de
dano (5 - 20%); (2) médio nível de dano (20 - 40%); (3) alto nível de dano (40 – 95%); (4) dano máximo
(> 95%)
Fonte: Collins (2004)
3.6 Teste do Micronúcleo in vivo
3.6.1 Animais e Ambiente de Experimentação
45
Os animais utilizados neste estudo, camundongos machos Swiss, com 6 a 8
semanas de idade foram oriundos e mantidos no Biotério da Universidade Federal do
Ceará. Os animais permaneceram em gaiolas plásticas (5 animais/gaiola), forradas com
maravalha autoclavada, em ambiente controlado com temperatura de 22°C ± 2°C,
umidade em torno de 60%, ciclo de luz de 12 horas claro/escuro, recebendo água e
ração sem restrição.
3.6.2
Grupos amostrais
O estudo incluiu cinco grupos de animais (camundongos machos), subdivididos
em dois subgrupos (A e B), de acordo com o tempo de sacrifício após o tratamento.
Todos os animais foram pesados, marcados, divididos aleatoriamente e distribuídos de
acordo com o tratamento ao qual foram submetidos. Divisão dos grupos:
1) Grupo Controle Negativo
Subgrupo A
1
formado por oito animais, os quais foram sacrificados 24 horas
após o tratamento com solução de DMSO a 0,1%, por via intraperitoneal (0,1 mL/10 g
de peso);
Subgrupo B
1
formado por oito animais, os quais foram sacrificados 48 horas
após o tratamento com solução de DMSO a 0,1%, por via intraperitoneal (0,1 mL/10 g
de peso).
2) Grupo Controle Positivo
Subgrupo A
2
formado de oito animais, os quais foram sacrificados 24 horas após
o tratamento com ciclofosfamida na dose de 20 mg/kg, por via intraperitoneal (0,1
mL/10 g de peso);
Subgrupo B
2
formado de oito animais, os quais foram sacrificados 48 horas após
o tratamento com ciclofosfamida na dose de 20 mg/kg, por via intraperitoneal (0,1
mL/10 g de peso).
3) Grupo Ácido Caurenóico 25 mg/kg
46
Subgrupo A
3
formado de oito animais, os quais foram sacrificados 24 horas após
o tratamento com ácido caurenóico (DMSO, 0,1%) na dose de 25 mg/kg, por via
intraperitoneal (0,1 mL/10 g de peso);
Subgrupo B
3
formado de oito animais, os quais foram sacrificados 48 horas após
o tratamento com ácido caurenóico (DMSO, 0,1%) na dose de 25 mg/kg, por via
intraperitoneal (0,1 mL/10 g de peso).
4) Grupo Ácido Caurenóico 50 mg/kg
Subgrupo A
4
formado de oito animais, os quais foram sacrificados 24 horas após
o tratamento com ácido caurenóico (DMSO, 0,1%) na dose de 50 mg/kg, por via
intraperitoneal (0,1 mL/10 g de peso);
Subgrupo B
4
formado de oito animais, os quais foram sacrificados 48 horas após
o tratamento com ácido caurenóico (DMSO, 0,1%) na dose de 50 mg/kg, por via
intraperitoneal (0,1 mL/10 g de peso).
5) Grupo Ácido Caurenóico 100 mg/kg
Subgrupo A
5
formado de oito animais, os quais foram sacrificados 24 horas após
o tratamento com ácido caurenóico (DMSO, 0,1%) na dose de 100 mg/kg, por via
intraperitoneal (0,1 mL/10 g de peso);
Subgrupo B
5
formado de oito animais, os quais foram sacrificados 48 horas após
o tratamento com ácido caurenóico (DMSO, 0,1%) na dose de 100 mg/kg, por via
intraperitoneal (0,1 mL/10 g de peso).
3.6.3 Obtenção e Preparação do Material para Análise
Todos os animais foram sacrificados por deslocamento cervical 24 e 48 horas
após o tratamento. Os fêmures foram retirados, limpos e as epífises proximais foram
seccionadas. A medula óssea foi retirada fazendo uso de seringas de 5 mL previamente
preenchida com 0,5 mL de soro fetal bovino. Posteriormente, a agulha foi firmemente
inserida na abertura do fêmur e o soro fetal bovino foi injetado de modo a deslocar a
medula para dentro de um tubo de centrífuga contendo 3 mL de soro fetal bovino. Após
a obtenção do material medular, este foi centrifugado (1000 rpm por 5 minutos), o
47
sobrenadante foi descartado e o precipitado foi homogeneizado. Uma gota da suspensão
de células foi transferida para uma lâmina limpa e seca, sendo, em seguida, realizado o
esfregaço. Foram preparadas duas lâminas para cada animal, correspondente aos
subgrupos tratados. Vinte e quatro horas após a confecção das lâminas, o material foi
fixado e corado pelo método de Leishman. As lâminas foram montadas com entellan
(SCHIMID, 1975).
3.6.4 Análise de Micronúcleo
Toda a análise foi realizada em teste cego, utilizando microscópio óptico
binocular, com objetivas de 20X e 40X. Os critérios adotados de identificação dos
micronúcleos foram os descritos por Schimid (1976) e Heddle
et al
., (1983). Assim,
foram considerados micronúcleos as estruturas tipicamente arredondadas, com diâmetro
de 1/20 a 1/5 do diâmetro dos eritrócitos jovens identificados pela coloração azulada
(RABELLO-GAY, 1991). Um total de 1000 eritrócitos policromáticos (EPC) foi
analisado, através da leitura de duas lâminas por animal (HEDDLE
et al
., 1983).
3.6.5 Análise Estatística
A análise estatística, referente à ocorrência de micronúcleo nos grupos controle e
expostos às diferentes doses de ácido caurenóico, foi feita com o uso do Teste t de
Student. Sendo os resultados considerados significantes quando p<0,05.
Figura 7 -. Eritrócito normocromático (A), eritrócito policromático (B) e eritrócito policromático
micronucleado (C)
Fonte: Ribeiro et al.( 2003)
48
3.7 Teste do Micronúcleo in vitro
3.7.1 Tratamento
Os linfócitos (0,5 x 10
5
células/mL) foram cultivados em frascos de cultura
contendo RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 1% de antibióticos e
3% de fitohemaglutinina durante 72 horas a 37°C em atmosfera de 5% de CO
2
.
Decorridas 24 horas de cultivo, ácido caurenóico (10, 30 e 60 µg/mL) foi adicionado as
culturas. Após 44 horas do início do cultivo, citocalasina B (3 µg/mL) foi acrescida as
culturas. Metil-metano-sulfonado (MMS) foi utilizado como controle positivo (4 x 10
-
5
M) e o DMSO (0,1%) como controle negativo.
3.7.2 Fixação das Células
Ao final das 72 horas de incubação, as culturas foram centrifugadas (1000 rpm
durante 5 minutos). Posteriormente, o sobrenadante foi desprezado e o pellet foi
ressuspendido em solução hipotônica de cloreto de potássio 0,075M (37°C), tendo
permanecido na incubadora por 20 minutos a 37°C. Após o tratamento hipotônico, a
suspensão celular foi centrifugada (1000 rpm por 5 minutos), sendo o sobrenadante
desprezado em seguida.
O pellet foi fixado com uma solução fixadora (metanol/ácido acético, 3:1)
mantida previamente gelada (4°C). O processo de fixação foi realizado três vezes. Na
última, o pellet foi ressuspendido em 1mL da solução de fixação gelada até a preparação
das lâminas.
3.7.3 Preparação das Lâminas
Duas a quatro gotas (dependendo da quantidade do material) da suspensão
celular foram transferidas para lâminas limpa e seca. Após a montagem das lâminas,
estas foram coradas com uma solução de Giemsa (5%) por 7 minutos. Foram montadas
cinco lâminas para cada cultura.
49
3.7.4 Análise de Micronúcleo
As lâminas previamente codificadas foram analisadas em teste cego, em
microscópio óptico binocular com aumento de 1000 vezes.
Os critérios adotados de
identificação dos micronúcleos foram os descritos por Fenech (2000). Assim, somente
células binucleadas (1000 células/lâmina) com núcleos intactos, com tamanhos
aproximadamente iguais e com o mesmo padrão de coloração foram analisadas (Figura
8).
3.7.5 Análise Estatística
Para análise estatística dos experimentos, foi utilizado os testes ANOVA e
Tukey no software Prism
versão 4.0 (GraphPad Prism Software), sendo os resultados
considerados significantes quando p<0,05.
Figura 8 - Fotomicrografia de linfócitos binucleados portando micronúcleos
Fonte: Fenech et al. (2003)
3.8 Aberrações Cromossômicas
Os linfócitos (0,5 x 10
5
células/mL) foram cultivados em frascos de cultura
contendo RPMI 1640 suplementado com 20% de soro fetal bovino, 1% de antibióticos e
3% de fitohemaglutinina durante 72 horas a 37°C em atmosfera de 5% de CO
2
. Duas
horas antes do término do tempo de incubação, foi adicionada em todas as culturas uma
solução de colchicina (0,0016%) para a obtenção de metáfases. Posterior ao tempo de
cultivo, as culturas foram fixadas com uma solução fixadora (metanol/ácido acético,
3:1) mantida previamente gelada (4°C).
A capacidade do ácido caurenóico em induzir aberrações cromossômicas foi
avaliada em diferentes fases do ciclo celular (G
1
, S e G
2
) (Tabela 1) de acordo com
50
Pessoa
et al
., (2003). Em todos os experimentos, o ácido caurenóico foi testado nas
concentrações de 10, 30 e 60 µg/mL.
3.8.1 Tratamentos
1) Para avaliar o efeito do ácido caurenóico na fase G
1
do ciclo celular, o
ácido caurenóico foi adicionado no início da cultura (tempo zero).
2) Para avaliar a fase de transição G
1
-S, o ácido caurenóico foi adicionado a
cultura 24 horas após o início de cultivo.
3) Com a finalidade de verificar de forma mais específica o efeito do ácido
caurenóico sobre a fase S, foi realizado testes de pulso. Nos quais os linfócitos, após 24
horas de cultivo, foram expostos ao ácido caurenóico em intervalos de 1 e 6 horas em
meio RPMI 1640 sem soro fetal bovino e sem antibióticos. Após os testes de pulso, as
culturas foram centrifugadas (1000 rpm por 5 minutos) e o sobrenadante descartado.
Posteriormente as células foram recultivadas nas mesmas condições das outras culturas.
4) Para avaliar o efeito do ácido caurenóico na fase G
2
do ciclo celular, as
culturas foram tratadas por 3 horas após 69 horas do início do cultivo.
Tabela 1 - Protocolo de tratamento de linfócitos com ácido caurenóico nas fases do ciclo celular
Tratamento PHA AC s/SFB Lavagem Col Fix
G
1
0h 0h - - 70h 72h
G
1
-S 0h 24h - - 70h 72h
S – 1 hora 0h 24h 24h 25h 70h 72h
S – 6 horas 0h 24h 24h 30h 70h 72h
G
2
0h 69h - - 70h 72h
Obs: PHA – fitohemaglutinina; AC – ácido caurenóico; s/SFB – meio sem soro fetal bovino; Col –
colchicina (0,0016%); Fix – fixação.
3.8.2 Preparação das Lâminas
Duas a quatro gotas (dependendo da quantidade do material) da suspensão
celular foram transferidas para lâminas limpa e seca. Após a montagem das lâminas,
51
estas foram coradas com uma solução de Giemsa (5%) por 7 minutos. Foram montadas
cinco lâminas para cada cultura.
3.8.3 Análise Citogenética
A análise das lâminas foi realizada em microscópio óptico, com a finalidade de
se detectar possíveis alterações cromossômicas estruturais ou numéricas nas metáfases
dos linfócitos. Os cromossomos foram analisados com a objetiva de imersão (100 x),
em lâminas codificadas, observando-se a posição do centrômero, alterações no grau de
ploidia e aberrações estruturais segundo Rabelo-Gay
et al
. (1991).
3.8.3.1 Critérios de análise
Os parâmetros analisados foram a frequência de células com aberrações
cromossômicas em 100 metáfases/cultura e o índice mitótico (IM), determinado pela
contagem do número de metáfases em 2000 linfoblastos/cultura (MOORHEAD
et al
.,
1960). O IM foi calculado usando-se a seguinte fórmula:
100
os
linfoblast
de
total
Número
metáfases de Número
IM ×=
3.8.4 Análise Estatística
Para análise estatística do índice mitótico, foi utilizado os teste ANOVA e o
teste t de Student foi utilizado para comparar as freqüências de células aberrantes em
relação aos controles, no software Prism
versão 4.0 (GraphPad Prism Software),
sendo os resultados considerados significantes quando p<0,05.
3.9 Teste de Mutagenicidade em Saccharomyces cerevisiae
3.9.1 Linhagem e Meios de Cultur
a
52
Para o ensaio de mutagenicidade foi utilizada a linhagem haplóide de
S.
cerevisiae
XV185-14c (R.C. von Borstel, Edmonton, Canadá), cujo genótipo relevante
é: MAT
α
ade
2-2
arg
4-17
his
1-7
lys
1-1
trp
5-48
hom
3-10.
Meios, soluções e tampões foram preparados de acordo com Burke
et al
., 2000.
O meio líquido completo (YPD) contendo 0,5% de extrato de levedura, 2% de
bactopeptona e 2% de dextrose, foi utilizado, rotineiramente, para o crescimento celular.
Para o plaqueamento, o meio YPD foi solidificado com 2% de bactoagar. Para o estudo
de toxicidade celular (teste de sobrevivência), foi utilizado o meio sintético completo
(SC). O meio SC é formado pelo meio mínimo de cultura (MM – 0,67% de base
nitrogenada de levedura sem aminoácidos, 2% de glicose e 2% de bactoagar)
suplementado com aminoácidos (adenina, arginina, lisina, histidina, leucina, metionina,
uracila, triptofano e treonina). Para o ensaio de mutagênese, foi utilizado meio de
cultura incompleto contendo baixas concentrações de lisina, histidina e metionina.
Para todos os tratamentos, as células foram ressuspendidas e diluídas em solução
salina (NaCl 0,9%). A solução de PBS (Na
2
HPO
4
, 20 mM, pH 5,8) foi utilizada para a
incubação celular nas fases exponencial e estacionária sem crescimento.
3.9.2 Condições de Crescimento de
S. cerevisiae
Culturas de células em fase estacionária foram obtidas por inoculação de uma
colônia isolada em meio líquido YPD. Após 72 horas de incubação a 30°C sob agitação,
as culturas continham em torno de 2 a 3 x 10
8
células/mL.
Culturas em fase exponencial de crescimento, foram obtidas pela inoculação de
5 x 10
5
células em fase estacionária/mL e cultivadas em meio líquido YPD. Após 18
horas de incubação a 30°C sob agitação, as culturas apresentavam um densidade celular
em torno de 1 a 2 x 10
7
células/mL, com 20 a 30% de leveduras em divisão celular
(brotamento). As células foram lavadas em PBS e a densidade celular e a percentagem
de brotamento na cultura, foi determinada mediante contagem, usando-se microscópio
óptico e câmara de Neubauer.
3.9.3 Teste de Sobrevivência
53
O teste de sobrevivência foi determinado pela inoculação de 5 x 10
5
células/mL
em fase exponencial de crescimento em meio líquido YPD na presença de
concentrações crescentes de ácido caurenóico (0,1; 0,25; 0,5; 1; 2 mg/mL) a 30°C sob
agitação por 18 horas. O número de células foi determinado por contagem com o auxílio
de microscópio óptico e a capacidade formadora de colônias, foi determinada através de
uma pequena alíquota semeada em meio sólido YPD. As placas foram incubadas a 30°C
por 3 a 5 dias antes da contagem.
Para avaliação do efeito do ácido caurenóico em condições de não crescimento,
as células em fases estacionária e exponencial de crescimento foram cultivadas em PBS
numa densidade de 2 x 10
8
células/mL e tratadas da mesma maneira como descrito
acima. O composto óxido de nitroquinolina (4-NQO) foi utilizado como controle
positivo. Todos os experimentos foram feitos em triplicata.
3.9.4 Detecção da Atividade Mutagênica induzida pelo Ácido Caurenóico
Uma suspensão celular (2 x 10
8
células/mL) em fase exponencial ou estacionária
de crescimento foi incubada por 18 horas com diferentes concentrações de ácido
caurenóico (0,1; 0,25; 0,5; 1; 2 mg/mL). A sobrevivência foi determinada através da
semeadura em meio sintético completo (SC) após 3 a 5 dias de crescimento a 30°C e a
indução de mutações (reversões nos lócus LYS, HIS ou HOM) foi determinada através
da semeadura em meio de cultura incompleto apropriado após 7 a 10 dias de
crescimento a 30°C. A mutação
his1-7
é um alelo de sentido incorreto (
missense
) do
tipo não supressiva, e, portanto, as reversões são resultantes de mutações no próprio
lócus (SNOW, 1978). Entretanto, o alelo
lys1-1
corresponde a uma mutação do tipo
supressiva ocre sem sentido (
nonsense
), a qual pode ser revertida de forma lócus
específico ou através de uma mutação para frente (
forward mutation
) em um gene
supressor. A diferença entre as reversões verdadeiras e mutações supressoras (
forward
)
no lócus
lys1-1
está bem descrita por Schüller & Von Borstel (1974), onde o conteúdo
de adenina reduzido no meio SC sem lisina (SC-lys) mostra reversão no lócus quando
as colônias são vermelhas e mutações supressoras quando as colônias ficam brancas.
Acredita-se que
hom3-10
contenha mutação do tipo deslocamento do quadro de leitura
(
frameshift
), devido a sua resposta a uma série de agentes, sabidamente, mutagênicos
54
(Von BORSTEL
et al
., 1971). O composto óxido de nitroquinolina (4-NQO) foi
utilizado como controle positivo. Todos os experimentos foram feitos em triplicata.
3.9.5 Análise Estatística
Para análise estatística da mutagênese e teste de sobrevivência, foram utilizados
os testes ANOVA e o teste de Dunett, no software Prism
versão 4.0 (GraphPad Prism
Software), sendo os resultados considerados significantes quando p<0,05.
55
4 RESULTADOS
4.1 Viabilidade Celular – Exclusão Por Azul De Tripan
A análise da viabilidade celular em linhagens leucêmicas e em linfócitos humanos
foi avaliada após dois tempos de tratamento diferentes (4 e 24 horas). Depois de 4 horas de
exposição, o ácido caurenóico causou uma significante redução no número de linfócitos
viáveis apenas na maior concentração avaliada (p<0,05) e nas concentrações de 30 e
60µg/mL em HL60 (p<0,05). Foi observado para os dois tipos de células, um aumento
significante no número de células não viáveis nas concentrações de 30 e 60µg/mL. Após 24
horas de tratamento, o ácido caurenóico reduziu de modo significativo o número de células
viáveis, assim como, induziu um aumento no número de células não viáveis, em todas as
concentrações, tanto para linfócitos como para HL60 (p<0,001; p<0,01). Não houve
diferença estatística entre os grupos de linfócitos e de HL60 tratados durante 4 horas e nem
com os grupos tratados por 24 horas, em todas as concentrações avaliadas (10, 30 e 60
µg/mL). O ácido caurenóico induziu efeitos similares em ambas as linhagens celulares.
Porém, houve diferença significativa entre os grupos (linfócitos e HL60) expostos durante 4
e 24 horas, em todas as concentrações de ácido caurenóico avaliadas (p<0,05) (Figura 9).
DMSO DOXO 10 30 60
0
25
50
75
Linfócitos - viáveis
Linfócitos - não viáveis
HL-60 - viáveis
HL - 60 - não viáveis
**
**
*
*
*
*
*
*
*
*
**
**
**
**
**
***
Ácido Caurenóico
µg/mL
B
DMSO DOXO 10 30 60
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Linfócitos - viáveis
Linfócitos -não viáveis
HL-60 - viáveis
HL-60 - não viáveis
**
*
***
**
*
***
**
**
**
***
*
Ácido Caurenóico
µg/mL
A
Figura 9 - Efeito do ácido caurenóico sobre a viabilidade celular de linfócitos humanos e células leucêmicas
HL60 após 4 horas de (A) e 24 horas (B) de exposição determinada por exclusão de azul de tripan. O veículo
utilizado para diluir a droga, DMSO (0,1%), foi utilizado como controle negativo e a doxorrubicina
(0,3µg/mL) foi utilizada como controle positivo. Os dados correspondem à média ± DP de três experimentos
independentes. *p<0,001; **p<0,01 e ***p<0,05 comparado com o controle negativo por ANOVA seguido
por Student Newman Keuls
56
4.2 Análise Morfológica – Coloração Diferencial por Brometo de Etídio/Acridina
Laranja
Após as células (linfócitos e HL60) terem sido tratadas com ácido caurenóico por 24
horas, foi observado um significante aumento no número de células apoptóticas e necróticas
(Figura 10) para ambas as linhagens, em todas as concentrações testadas. Os processos
apoptótico e necrótico induzidos pelo ácido caurenóico ocorreram de forma dependente de
concentração (p<0,01; p<0,001). Os efeitos induzidos pelo ácido caurenóico apresentaram o
mesmo perfil para ambas as linhagens.
DMSO DOXO 10 30 60
0
50
100
150
200
250
viavel
apoptose
necrose
Ácido Caurenóico
µg/mL
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*
A
DMSO DOXO 10 30 60
0
50
100
150
200
250
viavel
apoptose
necrose
**
*
*
*
**
*
*
**
*
*
*
Ácido Caurenóico
µg/mL
B
Figura 10 - Efeito do ácido caurenóico em linfócitos humanos (A) e células leucêmicas HL60 (B) analisados
pela coloração diferencial por brometo de etídio/acridina laranja após 24 horas de exposição. O veículo
utilizado para diluir a droga, DMSO (0,1%), foi utilizado como controle negativo e a doxorrubicina
(0,3µg/mL) foi utilizada como controle positivo. Os dados correspondem à média ± DP de três experimentos
independentes. *p<0,001 e **p<0,01 comparado com o controle negativo por ANOVA seguido por Student
Newman Keuls
4.3 Efeito do Ácido Caurenóico Sobre a Enzima Topoisomerase I
57
Neste ensaio, a enzima topoisomerase I foi incubada com ácido caurenóico (10 e 30
µg/mL) na presença DNA super-compactado (plasmídio circular), após o tempo de
incubação, os produtos dessa reação foram submetidos a eletroforese para separar o DNA
circular aberto (relaxado) ou fechado (compactado). Após a eletroforese pôde-se verificar
que o ácido caurenóico inibiu o relaxamento do DNA nas concentrações testadas (Figura 11
A).
Para averiguar se o ácido caurenóico interage diretamente com a enzima ou com o
DNA, a concentração do DNA no sistema de reação foi dobrada. Após o aumento na
concentração do DNA, foi observada a recuperação da atividade da enzima (Figura 11).
Estes achados sugerem que o ácido caurenóico interage ou intercala com o DNA e não com
a enzima.
AC – – + +
µg/ml – – 10 30
TOPO I (4U) + – + +
DNA Relaxado
DNA Compactado
DNA Relaxado
DNA Compactado
A
B
AC – – + +
µg/ml – – 10 30
TOPO I (4U) – + + +
Figura 11 - Efeito do ácido caurenóico sobre a ação da enzima topoisomerase I (TOPO I). A. 250 ng de DNA
supercompactado foi incubado com 4 unidades de topoisomerase I na presença e na ausência de ácido
caurenóico (10 e 30 µg/mL). B. 500 ng de DNA supercompactado foi incubado com 4 unidades de
topoisomerase I na presença e na ausência de ácido caurenóico (10 e 30 µg/mL). O relaxamento do DNA foi
analisado após eletroforese em gel de agarose a 1%. O gel foi corado com brometo de etídio e revelado com
auxílio de luz ultravioleta
4.4 Avaliação do Teste do Cometa
58
4.4.1 Avaliação Comparativa do Potencial Genotóxico do Ácido Caurenóico sobre
Linfócitos Humanos e HL60
Para a análise comparativa, o índice de dano (ID) ao DNA foi utilizado. O ID reflete
a extensão de DNA lesionado. Os valores para o ID podem variar de 0 a 400 (unidades
arbitrárias). Foi observado um aumento significativo no ID após o tratamento, tanto para 4
como para 24 horas de exposição, ao ácido caurenóico (Figuras 12 e 13) para linfócitos e
HL60, nas concentrações 30 e 60 µg/mL (p<0,01). O tratamento de 24 horas resultou em um
maior índice de dano em relação aos grupos expostos ao ácido caurenóico por um período
de exposição de 4 horas . Porém, comparando-se os grupos tratados pelo mesmo período de
exposição, não houve diferença significativa entre eles.
DMSO DOXO 10 30 60
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0
1
2
3
4
Ácido Caurenóico
µg/mL
A
DMSO DOXO 10 30 60
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0
1
2
3
4
Ácido Caurenóico
µg/mL
B
DMSO DOXO 10 30 60
0
10
20
30
40
50
60
70
0
1
2
3
4
Ácido Caurenóico
µg/mL
C
DMSO DOXO 10 30 60
0
10
20
30
40
50
60
70
0
1
2
3
4
Ácido Caurenóico
µg/mL
D
Figura 12 - Distribuição das classes de cometas (0 – sem danos a 4 – dano máximo) em linfócitos humanos
expostos durante 4 (A) e 24 horas (B) e células leucêmicas HL60 expostas por 4 (C) e 24 horas (D) ao ácido
caurenóico analisados pelo teste do cometa
59
DMSO DOXO 10 30 60
0
100
200
Linfcitos
HL-60
Ácido Caurenóico
µg/mL
*
*
*
*
A
DMSO DOXO 10 30 60
0
50
100
150
200
250
Linfócitos
HL-60
Ácido Caurenóico
µg/mL
*
*
*
*
B
Figura 13 - Índice de dano ao DNA de linfócitos humanos e células leucêmicas HL60 tratadas com ácido
caurenóico durante 4 (A) e 24 horas (B) determinado pelo teste do cometa. O veículo utilizado para diluir a
droga, DMSO (0,1%), foi utilizado como controle negativo e a doxorrubicina (0,3µg/mL) foi utilizada como
controle positivo. Os dados correspondem à média ± DP de três experimentos independentes. *p<0,001
comparado com o controle negativo por ANOVA seguido por Tukey
4.4.2 Reparo do DNA
Com o objetivo de investigar se as lesões ao DNA induzidas pelo ácido caurenóico
são passíveis de reparo, os linfócitos foram incubados com diferentes concentrações de
ácido caurenóico por 4 horas e, posteriormente, re-cultivadas na ausência da droga.
Pequenas alíquotas celulares foram analisadas em diferentes tempos (2, 4, 6, 24 e 48 horas)
de reparo. Nesta análise, o ID e a freqüência de dano (FD) ao DNA foram utilizados como
parâmetros para avaliar a cinética de reparo das lesões no material genético.
Nas culturas de linfócitos tratadas com 10 e 30µg/mL de ácido caurenóico, os índices
e as freqüências de dano ao DNA foram reduzidos significativamente após as primeiras 4
horas do tempo de reparo (p<0,05). O início do reparo das lesões induzidas pelo ácido
caurenóico na concentração de 60µg/mL foi mais tardio. Somente após 6 horas foi
observada uma redução significante de ID e FD (p<0,01). As figuras 14 e 15 mostram a
60
cinética de reparo das lesões induzidas no DNA por diferentes concentrações de ácido
caurenóico. Após 48 horas de cultivo na ausência da droga, mais de 80% das lesões foram
reparadas, em todas as culturas expostas (p<0,01; p<0,001).
0h 2h 4h 6h 24h 48h
0
5
10
15
20
25
30
35
*
*
*
**
A
0h 2h 4h 6h 24h 48h
0
100
200
*
***
***
***
B
0h 2h 4h 6h 24h 48h
0
50
100
150
200
250
**
***
***
C
Figura 14 - Redução do índice de dano ao DNA em linfócitos humanos tratados durante 4 horas (tempo 0 h)
com ácido caurenóico nas concentrações de 10 (A), 30 (B) e 60 µg/mL (C) e re-cultivados na ausência da
droga (2 a 48h). Os dados correspondem à média ± DP de três experimentos independentes. *p<0,05;
**p<0,01 e ***p<0,001 comparado com o controle (tempo 0h) por ANOVA seguido por Tukey.
0h 2h 4h 6h 24h 48h
0
10
20
30
*
*
**
***
A
0h 2h 4h 6h 24h 48h
0
25
50
75
100
***
***
***
***
B
0h 2h 4h 6h 24h 48h
0
25
50
75
100
***
***
***
C
Figura 15 - Redução da freqüência de dano ao DNA em linfócitos humanos tratados durante 4 horas (tempo 0
h) com ácido caurenóico nas concentrações de 10 (A), 30 (B) e 60 µg/mL (C) e re-cultivados na ausência da
droga (2 a 48h). Os dados correspondem à média ± DP de três experimentos independentes. *p<0,05;
**p<0,01 e ***p<0,001 comparado com o controle (tempo 0h) por ANOVA seguido por Tukey
4.5 Análise de Micronúcleo em Medula Óssea de Camundongo
Para a análise de indução de micronúcleos em células da medula óssea, foi
administrada, em uma única dose, ácido caurenóico nas concentrações de 25, 50 e
100mg/mL, por via intraperitoneal. Para a verificação da ocorrência de micronúcleos, foram
analisados tanto eritrócitos policromáticos (EPC) quanto os normocromáticos (ENC) de
camundongos sacrificados 24 e 48 horas após a administração da droga (Tabela 2).
O ácido caurenóico induziu a formação de micronúcleos em todas as doses testadas
nos grupos sacrificados 24 e 48 horas após o tratamento. Contudo, no grupo de animais
sacrificados após 48 horas de tratamento, a média de micronúcleos por 1000 EPC analisados
61
foi relativamente menor em comparação a média do grupo sacrificado 24 horas após o
tratamento com ácido caurenóico nas doses de 50 e 100 mg/mL. Comparando-se a razão
EPC/ENC dos grupos sacrificados 48 horas após o tratamento em relação a mesma razão do
grupo controle, observa-se uma diminuição dessa razão para valores abaixo de 1, nas doses
de 50 e 100 mg/mL, observando-se portanto, uma toxicidade do ácido caurenóico na medula
óssea, de modo dose - dependente.
Tabela 2 - Freqüência de Micronúcleos em eritrócitos policromáticos (EPC) da medula óssea de camundongos
após o tratamento com ácido caurenóico (AC) e a relação entre EPC e ENC (eritrócitos normocromáticos) em
diferentes doses e tempos pós-tratamento
Dose
mg/mL
T
c
N°
Micronúcleos/1000 EPC/animal
Relação
EPC/ENC
Dados individuais
Média ±
DP
d
24h 8 1 0 0 5 0 3 6 0 1,87±2,45 0,86
DMSO
a
48h 8 1 0 1 1 0 2 3 0 1,00±1,06 0,91
24h 8 23
16
19
12
20
15
18
17
17,50±3,33 0,62
Ciclofosfamida
b
48h 8 15
26
29
15
21
18
23
17
20,50±5,18 0,58
24h 8 11
8 11
5 0 4 9 7 6,87±3,75
*
0,82
25
48h 8 8 1 1 12
14
8 5 13
7,75±5,12
***
0,75
24h 8 12
14
16
7 10
5 8 10
10,25±3,65
**
0,68
50
48h 8 11
7 7 9 13
17
11
4 9,87±4,05
**
0,54
24h 8 15
21
16
10
18
6 10
13
13,62±4,86
**
0,60
AC
100
48h 8 9 9 12
8 15
11
14
7 10,62±2,87
**
0,51
a
Controle negativo (0,1%),
b
Controle positivo (20mg/mL);
c
Tempo de sacrifício após o tratamento;
d
Os
dados correspondem à média ± DP de três experimentos independentes. *p<0,05; **p<0,001 e ***p<0,01
comparado com o controle negativo por ANOVA seguido por Dunett
4.6 Análise de Micronúcleo em Linfócitos Humanos
Após o tratamento dos linfócitos com ácido caurenóico, observou-se um aumento
significativo no número de células binucleadas micronucleadas nas culturas tratadas com 30
e 60 µg/mL (p<0,01 e p<0,001, respectivamente). O agente alquilante metil-metano-
sulfonado (MMS) foi utilizado como controle positivo na concentração de 4 x 10
-5
M
(Figura 16).
62
DMSO MMS 10 30 60
0
25
50
75
100
Ácido Caurenóico µg/mL
*
**
MN por 1000 células
Figura 16 - Efeito do ácido caurenóico sobre a incidência de micronúcleos em linfócitos humanos. O veículo
utilizado para diluir a droga, DMSO (0,1%), foi utilizado como controle negativo e o agente alquilante metil-
metano-sulfonado (MMS) a 4 x 10
-5
M foi utilizado como controle positivo. Os dados correspondem à média ±
DP de três experimentos independentes. *p<0,01 e **p<0,001 comparado com o controle negativo por
ANOVA seguido por Tukey
4.7 Aberrações Cromossômicas
Os linfócitos tratados nas fases G
1
e na fase de transição G
1
/S com ácido caurenóico
nas doses de 30 e 60 µg/mL apresentaram um aumento no número de células com
aberrações cromossômicas (p<0,001) e uma redução significativa do índice mitótico
(p<0,05) (IM). Porém, nenhuma evidência de citotoxicidade foi observada nas outras fases
do ciclo e, do ponto de vista estatístico, o ácido caurenóico não foi genotóxico quando as
células foram tratadas em S e G
2
(Tabela 3).
63
Tabela 3 - Efeito do ácido caurenóico sobre a proliferação e indução de aberrações cromossômicas nas diferentes fases do
ciclo celular de linfócitos humanos
Número de Aberrações
b
Tratamento IM (%)
a
Gaps
RUP
c
POL
d
ENDO
e
Células
Aberrantes
(%)
f
DMSO 3.4 ± 0.3 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0.0
AC 10 µg/mL 1.4 ± 0.7
*
1 1 0 0 0 0 2 0 1 0
0 0 0.5 ± 0.4
AC 30 µg/mL 0.8 ± 0.1
*
3 0 1 4 2 4 1 0 0 1
0 0 2.5 ± 0.2
**
AC 60 µg/mL 0.3 ± 0.4
*
1 0 0 9 5 7 3 1 1 0
0 0 3.1 ± 0.7
**
G
1
Doxorrubicina
g
0.6 ± 0.1
*
2 1 1 0 3 2 1 1 0 0
0 0 2.1 ± 0.1
**
DMSO 3.0 ± 0.6 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0
0 0 0.2 ± 0.0
AC 10 µg/mL 1.9 ± 0.3
*
2 1 1 0 1 1 0 0 0 2
0 1 0.3 ± 0.1
AC 30 µg/mL 1.1 ± 0.2
*
1 0 0 3 2 2 2 1 1 0
0 0 2.2 ± 0.3
**
AC 60 µg/mL 0.5± 0.1
*
5 1 4 7 9 5 2 0 0 0
1 1 2.9 ± 0.1
**
G
1
/S
Doxorrubicina 0.7 ± 0.2
*
5 2 0 2 2 1 0 0 0 0
0 0 1.9 ± 0.3
**
DMSO
3.2 ± 0.8 0 1 0 0 1 1 2 0 0 0
0 0 0.2 ± 0.1
AC 10 µg/mL 3.0 ± 0.6 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0
0 0 0.2 ± 0.1
AC 30 µg/mL 2..7 ± 0.2 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0
0 0 0.5 ± 0.4
AC 60 µg/mL 2.2 ± 0.1 0 0 2 0 2 0 0 0 0 0
0 0 0.5 ± 0.2
S (1hour)
Doxorrubicina 0.8 ±0.1
*
0 1 1 3 0 3 1 1 0 0
0 0 1.5
*
± 0.3
DMSO 3.1 ± 0.4 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0.0
AC 10 µg/mL 2.5 ± 0.1 1 2 1 0 1 1 3 1 1 0
0 0 0.5 ± 0.4
AC 30 µg/mL 2.1 ± 0.3 1 0 2 1 1 2 2 0 0 0
1 0 0.4 ± 0.1
AC 60 µg/mL 1.8 ± 0.3 2 0 0 3 3 1 1 1 1 1
0 0 0.7 ± 0.3
S (6 hours)
Doxorrubicina 0.5 ± 0.3
*
3 2 0 3 2 2 4 2 0 3
1 1 1.7 ± 0.1
**
DMSO 3.5 ± 0.5 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0
0 0 0.2 ± 0.0
AC 10 µg/mL 2.9 ± 0.5 3 0 0 0 0 0 2 0 0 0
0 0 0. 3 ± 0.1
AC 30 µg/mL 2.2 ± 0.1 2 1 2 0 0 1 4 1 1 1
0 0 0.7 ± 0.3
AC 60 µg/mL 1.7 ± 0.3 3 0 0 1 1 1 3 0 1 0
0 0 0.5 ± 0.1
G
2
Doxorrubicina 0.5 ± 0.3
*
4 1 1 1 0 2 0 1 0 0
0 0 1.4
*
± 0.5
a
Índice mitótico;
b
Número de aberrações em 100 metáfases analisadas;
c
rupturas na cromatina dos
cromossomos (quebras cromatídicas ou cromossômicas);
d
Células poliplóides;
e
Endoduplicação;
f
Freqüência de células aberrantes. DMSO (0,1%) foi utilizado como controle negativo e a doxorrubicina
(0,3µg/mL) serviu como controle positivo. Os dados correspondem à média ± DP de três experimentos
independentes. *p<0,05 e **p<0,001 comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste t de
Student
4.8 Atividade Mutagênica do Ácido Caurenóico em S. cereviseae
4.8.1 Efeito Citotóxico
As células de levedura foram tratadas com ácido caurenóico em condições de
crescimento em meio completo (YPD) e em condições de não crescimento em PBS. O efeito
64
citotóxico induzido pelo ácido caurenóico foi observado em todas as culturas de
S.
cereviseae
, independente das condições de crescimento. A citotoxicidade foi mais acentuada
em culturas de leveduras em fase de crescimento exponencial em meio YPD. Além disso,
foi observada uma elevada toxicidade em leveduras, em fase exponencial de crescimento
cultivdas em PBS. E uma citotoxicidade moderada em células em fase de crescimento
estacionário cultivadas em PBS. A ação citotóxica do ácido caurenóico foi independente do
estágio metabólico da levedura (Tabelas 4 e 5).
4.8.2 Efeito Mutagênico
A ação mutagênica do ácido caurenóico foi observada tanto em culturas cultivadas
em condições de crescimento (YPD) como naquelas cultivadas em condições de não
crescimento (PBS). O ácido caurenóico induziu um aumento nas freqüências de mutações
pontuais (HIS1
+
, LYS1
+
) e mutações do tipo deslocamento do quadro de leitura (HOM3
+
)
durante a fase exponencial de crescimento em leveduras cultivadas em YPD na presença de
altas concentrações de ácido caurenóico. Em condições de não crescimento, as freqüências
de mutações dos locis
his1
e
hom3
foram significativas apenas nas concentrações a partir de
0,5mg/mL, porém não foi observado aumento significativo na freqüência de mutação para o
lócus
lys1
(Tabelas 4 e 5).
65
Tabela 4 - Reversão da mutação pontual para (his1-7), alelo ocre (lys1-1) e mutações do tipo deslocamento do
quadro de leitura (hom3-10) em linhagem haplóide XV185-14c de S.cerevisieae após tratamento com ácido
caurenóico durante 18 horas em condições de não crescimento (PBS)
a
Revertentes lócus específico;
b
revertentes lócus não específico;
c
média ± DP de três experimentos independentes;
d
controle positivo (óxido de nitroquinolina); AC – ácido caurenóico; *p<0,05; **p<0,01 e ***p<0,001 comparado
com o controle negativo (DMSO) por ANOVA
Agente Tratamento Sobrevivência (%)
HIS1/10
7
sobreviventes
a
LYS1/10
7
sobreviventes
b
HOM3/10
7
sobreviventes
a
0 µg/ml 100 3.1 ± 1.0
c
8.3 ± 0.9
c
1.0 ± 0.3
c
4NQO
d
0.5 µg/ml 62.0 118.0 ± 2.6*** 48.9 ± 2.22*** 24.0 ± 6.12***
0 100 3.0 ± 0.0 7.0 ± 0.5 1.5 ± 0.4
0.1 mg/mL 91.5 5.1 ± 2.4 7.4 ± 0.1 2.2 ± 1.0
0.25mg/mL 88.7 8.6 ± 0.9 6.8 ± 0.5 3.9 ± 1.9
0.5 mg/mL 60.6 9.2± 1.7* 10.4 ± 2.3 4.2 ± 0.0**
1 mg/mL 45.9 14.0 ± 3.9** 5.3 ± 0.6 6.6 ± 0.1**
Fase Estacionária em
PBS
AC
2 mg/mL 30.8 22.0 ± 1.8** 6.8 ± 2.4 9.6 ± 0.3**
0 µg/ml 100 3.3 ± 1.9
c
8.1 ± 0.5
c
3.6 ± 0.4
c
4NQO
d
0.5 µg/ml 57.8 112.5 ± 10.0* 34.6± 2.1*** 28.9 ± 0.3***
0 100 5.0 ± 0.4 9.8 ± 1.2 3.6 ± 0.6
0.1 mg/mL 81.9 9.7 ± 2.7 7.3 ± 1.9 3.9 ± 0.5
0.25mg/mL 63.2 7.3 ± 2.0 8.8 ± 0.1 4.2 ± 2.7
0.5 mg/mL 45.4 9.0 ± 0.4* 9.1 ± 0.7 6.2 ± 0.6
1 mg/mL 29.5 24.7 ± 0.5** 10.5 ± 0.3 7.8 ± 0.4
Fase Exponencial em PBS
AC
2 mg/mL 7.1 35.7 ± 6.5* 14.5 ± 2.3* 8.8 ± 0.6*
66
Tabela 5 - Reversão da mutação pontual para (his1-7), alelo ocre (lys1-1) e mutações do tipo deslocamento do quadro
de leitura (hom3-10) em linhagem haplóide XV185-14c de S.cerevisieae após tratamento com ácido caurenóico em
condições de crescimento
a
Revertentes lócus específico;
b
revertentes lócus não específico;
c
média ± DP de três experimentos independentes;
d
controle positivo (óxido de nitroquinolina); AC – ácido caurenóico; *p<0,05; **p<0,01 e ***p<0,001 comparado com
o controle negativo (DMSO) por ANOVA
Agente Tratamento
Sobrevivência
(%)
HIS1/10
7
sobreviventes
a
LYS1/10
7
sobreviventes
b
HOM3/10
7
sobreviventes
a
4NQO
d
0 µg/ml 100 13.3 ± 0.4
c
6.2 ± 1.5
c
4.8 ± 1.4
c
0.5 µg/ml 61.2 191.3 ± 0.3
d
*** 64.9 ± 0.9
d
*** 40.2 ± 2.3
d
***
AC 0 100 15.0 ± 1.8 5.1 ± 1.9 6.0 ± 1.4
0.1 mg/mL 64.2 18.3 ± 0.4 7.0 ± 0.2 9.7 ± 0.7
0.25mg/mL 41.1 11.2 ± 0.1 4.0 ± 0.1 12.8 ± 2.5*
0.5 mg/mL 19.6 22.4 ± 0.6* 15.8 ± 2.4 18.1± 0.7**
1 mg/mL 6.7 45.7 ± 4.6** 18.5 ± 4.3* 21.7 ± 3.1**
2 mg/mL 0.5 74.1 ± 1.9*** 19.5 ± 0.7* 34.6 ± 0.4**
67
5 DISCUSSÃO
As descobertas de substâncias ativas em plantas medicinais impulsionaram uma
revolução científica e tecnológica e os medicamentos vegetais foram sendo substituídos
por fármacos sintéticos (KOROLKOVAS, 1996; RATES, 2001). Nas últimas décadas,
porém, tem-se verificado uma tendência mundial de aumento na demanda por plantas e
preparações de origem vegetal como recurso terapêutico, influenciado por fatores
econômicos, sociais e culturais (MAHADY, 2001; ABU-IRMAILEH; AFIFI, 2003;
BENT; KO, 2004; De SMET, 2004). A maior industrialização e comercialização de
medicamentos naturais tornou o seu uso um problema de saúde pública. O aumento na
demanda associado à falta de fiscalização efetiva que garanta desde a exploração
racional dos recursos naturais empregados como matéria-prima, até a dispensação do
produto acabado, contribuem para a disponibilidade e acesso a produtos muitas vezes
sem condições adequadas ao uso, sem garantia de qualidade, segurança e eficácia,
fundamentais para a recuperação ou preservação da saúde do consumidor (CALIXTO,
2000; ELVIN-LEWIS, 2001; CHAN, 2003; GIVEON
et al
., 2004).
Dentre as 250 mil espécies vegetais estimadas no planeta, apenas uma pequena
porcentagem foi estudada quanto a sua composição micromolecular. Quando se
considera o número de plantas submetidas a ensaios biológicos ou farmacológicos, esse
porcentual é ainda menor (HAMBURGER; HOSTETTMANN, 1991; RATES, 2001;
NEWMAN
et al
., 2003). Estima-se que cerca de 5 a 15% do total de plantas superiores
já tenham sido avaliadas na busca de substâncias biologicamente ativas (SOERJATO,
1996), sendo que, no Brasil, esse percentual é muito menor (OLIVEIRA; BRAGA,
2003).
No Brasil, o uso de plantas medicinais vem crescendo nas últimas décadas.
Apenas 20% da população brasileira é responsável por 63% do consumo dos
medicamentos disponíveis. O restante encontra nos produtos de origem natural,
especialmente as plantas medicinais, a única fonte de recursos terapêuticos (SIMÕES,
2000). Entretanto, existe pouca informação quanto ao seu potencial de risco à saúde. Em
países desenvolvidos, as drogas vegetais são testadas e avaliadas seguindo-se normas e
critérios similares àqueles estabelecidos para medicamentos sintéticos. No entanto, há
pouca informação sobre a genotoxicidade de drogas vegetais (MOREIRA
et al
., 2002).
68
Em geral, as espécies do gênero
Copaifera
são importantes econômica e
medicinalmente. Essas espécies são particularmente conhecidas devido à produção de
um óleo resinoso extraído de seu caule (óleo de copaíba) detentoras de um amplo
espectro de propriedades medicinais (ALMEIDA
et al
., 1998; VEIGA-JÚNIOR;
PINTO, 2002; LIMA
et al
., 2003). O interesse pela química desse gênero evoluiu
bastante ao longo dos anos, devido ao grande número de espécies estudadas e
compostos isolados com importante valor farmacológico. Algumas espécies desse
gênero têm sido bem investigadas do ponto de vista fitoquímico e farmacológico
(GRAMOSA
et al
., 1996; MAÍSTRO
et al
., 2005). Nos estudos fitoquímicos realizados
com o óleo-resina das espécies do gênero
Copaifera
, verificou-se a presença de várias
classes de metabólitos secundários. Dentre esses, os diterpenos tetracíclicos da série
caurano, como os ácidos caurenóico e cauranóico, e clerodanos como o ácido
hardwíckiico
, os quais são compostos farmacologicamente ativos (OHSAKI
et al
.,
1994; COSTA-LOTUFO
et al
., 2002; PAIVA
et al
., 2003).
Alguns gêneros de plantas destacam-se pelos elevados teores de diterpenos
caurânicos, como
Copaifera
,
Xylopia
,
Annona
e
Mikania
spp. (OLIVEIRA; BRAGA,
2003). O presente trabalho avaliou a atividade genotóxica
in vitro
do ácido caurenóico
isolado de
Copaifera langsdorffii
em dois tipos celulares sanguíneos: linfócitos
humanos e células leucêmicas (HL60) humanas. Assim como, o potencial genotóxico
in
vivo
em células da medula óssea de camundongos. Também foi avaliado o efeito
mutagênico do ácido caurenóico em modelo experimental com
Saccharomyces
cereviseae
. Posteriormente, foi avaliado o possível mecanismo de ação pelo o qual o
ácido caurenóico exerce seu efeito genotóxico e mutagênico.
A exclusão por azul de tripan é um ensaio de viabilidade celular que quantifica
as células capazes de drenar o corante ácido azul de tripan para fora da célula em
contraposição àquelas que não possuem essa capacidade. A absorção desse corante é um
forte indicativo de dano na membrana plasmática que culmina na morte celular
(HYNES
et al
., 2003; MINERVINI
et al
., 2004).
O ácido caurenóico induziu, nas maiores concentrações, uma redução no número
de células viáveis, tanto para linfócitos como para células leucêmicas, após 4 horas de
exposição. O mesmo efeito, embora mais acentuado, foi observado nas células expostas
a droga durante 24 horas, em todas as concentrações. Em ambos os tratamentos, a
redução do número de células viáveis foi acompanhada pelo aumento do número de
células não viáveis. Os danos à membrana celular induzidos pelo ácido caurenóico
69
foram similares para as duas linhagens celulares utilizadas. A redução da viabilidade
celular pode ser explicada, em parte, pelo potencial hemolítico do ácido caurenóico
sobre eritrócitos humanos e de camundongos (COSTA-LOTUFO
et al
., 2002; VIEIRA
et al
., 2002). Já que algumas substâncias isoladas de plantas como polifenóis,
epicatecinas, glicosídeos, saponinas, terpenos e outros podem causar alterações na
membrana de eritrócitos e induzir hemólise (AKI;YAMAMOTO, 1991).
Entretanto, a morte celular é um fenômeno essencial na homeostase do
organismo e sua ocorrência tem sido documentada durante o desenvolvimento
embrionário e pós-embrionário. Esta não é apenas importante para o desenvolvimento
normal, mas também para a vida adulta de muitos organismos vivos (GERCHENSON;
ROTELLO, 1992; WEIL
et al
., 1996). Desse modo, a redução da viabilidade celular
pode ter sido, também, em decorrência da indução da apoptose ou necrose.
Apoptose é definida por alterações morfológicas incluindo diminuição do
volume celular, perda de contato, condensação da cromatina, expulsão de vesículas,
fragmentação nuclear e formação de corpos apoptóticos (NAKAMURA
et al
., 2002;
KUMMAR
et al
., 2005). O processo apoptótico induz morte celular de forma altamente
regulada que elimina células ou tecidos indesejados, protegendo o organismo contra a
formação de neoplasmas. O mecanismo defeituoso de apoptose pode ocasionar diversas
patologias, inclusive câncer (OPALKA
et al
., 2002).
Enquanto, necrose tem sido considerada um processo de degeneração
completamente diferente da apoptose. Entretanto, tem sido demonstrado que a
magnitude da injúria inicial e a variação do tipo de estímulo decidirão se a morte celular
será por meios apoptóticos ou necróticos (HETTS, 1998). A necrose ocorre por uma
ação rápida da droga na célula e é caracterizada pelo aumento do volume celular inicial
e perda da integridade da membrana plasmática (DARZYNKIRWICZ
et. al
., 1992),
sendo freqüentemente atribuída a diversas perturbações metabólicas ou mesmo oriunda
de injúrias mecânicas, onde há uma rápida desestabilização da membrana plasmática,
sendo relacionada com a resposta inflamatória sem atentar à sua função fisiológica.
Drogas que induzem morte celular por apoptose em linhagens de células
tumorais podem ser úteis na quimioterapia (ZAMAI
et al.
2001; BRADY, 2004). Dessa
maneira, o ácido caurenóico, como observado pela coloração por BE/AL, induziu
apoptose e necrose, tanto em linfócitos como em células leucêmicas, de modo dose
dependente. Esses resultados corroboram com os achados previamente reportados sobre
70
os efeitos pró-apoptóticos de diterpenos caurânicos nas células leucêmicas da linhagem
HL60 (NAGASHIMA
et al
., 2003; SUZUKI
et al
., 2004; KONDOH
et al
., 2005b).
Em geral, o desencadeamento do processo apoptótico envolve a ativação de uma
família de enzimas composta, pelo menos, de 14 proteases diferentes conhecidas como
caspases. As caspases são sintetizadas como precursores inativos (pró-caspases). A
clivagem e ativação das pró-caspases podem ocorrer devido a uma série de estimulações
incluindo os danos induzidos ao DNA. Kondoh
et al
. (2004, 2005a) estudaram os
mecanismos de apoptose de alguns diterpenos caurânicos na linhagem leucêmica HL60
e concluíram que eles induzem apoptose em células leucêmicas mediante ativação da
caspase-8. Assim, a falta de seletividade do ácido caurenóico e a indução de apoptose
em linfócitos humanos sugere que as vias de ativação dos processos apoptóticos em
linfócitos, poderão ser mediadas via ativação de caspase-8.
As topoisomerases são enzimas celulares essenciais para a manutenção da
estrutura do DNA. Atuando no relaxamento do estresse gerado pela torção do DNA
durante a transcrição, replicação e divisão celular (mitose/meiose). Essas enzimas atuam
através da quebra e religação seqüenciais de uma fita (topoisomerase I) ou das duas fitas
do DNA (topoisomerase II) (GODARD
et al
., 2002; SOE
et al
., 2006).
Vários agentes químicos capazes de atuar como inibidores enzimáticos têm
demonstrado respostas efetivas no tratamento do câncer – particularmente aquelas
substâncias que inibem a atuação da enzima topoisomerase I. Os compostos capazes de
inibir a ação da topoisomerase I podem ser divididos em dois grupos: os que agem
diretamente sobre a enzima e os que impedem a ligação da enzima ao DNA (supressores
de topoisomerase I). Até o presente momento, não existe evidências claras
demonstrando que os supressores de topoisomerase I são específicos para esta enzima
(Da SILVA
et al
., 2003).
Foi observado uma inibição do relaxamento do DNA após a eletroforese. Essa
inibição do relaxamento do DNA mostrou ser dependente de concentração. Uma vez
que a quantidade de DNA que migrou durante a eletroforese foi maior em baixa
concentração e muito menor na concentração mais alta de ácido caurenóico. Na
tentativa de obter informações sobre como a ação da topoisomerase I pode ser inibida
pelo ácido caurenóico, a concentração de DNA foi dobrada. O aumento da quantidade
de substrato no sistema de teste foi acompanhado pelo aumento da quantidade de DNA
relaxado em virtude da ação da topoisomerase I. Esses dados sugerem que o ácido
71
caurenóico parece não interagir diretamente com a enzima, mas, sim, com o DNA, uma
vez que, o efeito da enzima foi recuperado.
Vale ressaltar que, para diterpenos caurânicos não foi encontrada nenhuma
referência na literatura a respeito da atividade sobre a inibição da ação da
topoisomerases. Porém, Mizushina
et al
. (2005) demonstrou que diterpenos tetracíclicos
são capazes de inibir a atividade da ação topoisomerases sobre o DNA.
Agentes intercalantes como os corantes de acridina e a quinacrina, bem como os
agentes anti-neoplásicos, podem induzir aberrações cromossômicas e quebras de fitas
no DNA de células de mamíferos (De MARINI; LAURENCE, 1992; SUZUKI
et al
.,
1995; ARAÚJO
et al
., 1998; PALITTI, 1998; HAMMONDS
et al
., 2000;
SORTIBRÁN
et al
., 2006). O anti-neoplásico camptotecina, inibidor específico para a
topoisomerase I, induz altas freqüências de aberrações cromossômicas e processos
mutacionais como a deleção de alguns genes (HASHIMOTO
et al
., 1995; PINERO
et
al
., 1996). O etoposide, inibidor seletivo para topoisomerase II, induz a formação de
micronúcleos em células meióticas de ratos e em células da medula óssea de
camundongos (LAHDETIE
et al
., 1994; BOOS; STOPPER., 2000; TURNER
et al
.,
2001).
As mutações podem ocorrer em três níveis: gênica, cromossômica e mutações
genômicas, como a mudança no número de cromossomos originando as aneuploidias e
poliploidias. Um único método de genotoxicidade não pode fornecer informações sobre
todos os indicadores de toxicidade genética. Consequentemente, é necessário que cada
agente químico seja avaliado em diferentes ensaios para que se possa colher
informações adequadas a respeito de seu potencial genotóxico. Em geral, apenas dois
ensaios
in vitro
, um a nível gênico em bactérias e o outro a nível cromossômico em
células de mamífero, são considerados necessários em caso de agentes químicos cuja
exposição ao homem seja limitada ou nula. No caso de agentes químicos cuja exposição
ao ser humano seja direta (aditivos alimentares e farmacêuticos, por exemplo), um
ensaio
in vivo
se torna necessário e complementar aos outros ensaios referidos acima
(CARERE
et al
., 2002; DEARFIELD
et al
., 2002; MULLER
et al
., 2003).
O teste do cometa não tem por finalidade detectar mutações a nível gênico, mas
pode ser aplicado ao estudo de lesões genômicas. Estas lesões, a depender de sua
natureza, podem ser reparadas mediante expressão de vários genes envolvidos nos mais
variados mecanismos de reparo do DNA (SLUPPHAUG
et al
., 2003).
72
De acordo com a análise dos resultados do ensaio do cometa, o ácido
caurenóico, em altas concentrações, induziu danos no DNA de linfócitos e HL60 nos
dois tempos de exposição (4 e 24 horas) na mesma magnitude. Não houve diferença
entre as células tratadas no mesmo período de exposição. Porém, as culturas tratadas
com ácido caurenóico durante 24 horas apresentaram maiores valores de índice de dano
(ID). Em relação à citotoxicidade, Hartmann e Speit (1997) reportaram que a ocorrência
de cometas sem cabeça e com quase todo o DNA presente na cauda (cometas da classe
4) após a eletroforese é uma provável indicação de efeito citotóxico. A ocorrência de
cometas da classe 4 tem sido descrita como o aspecto mais indicativo de células
apoptóticas dentro dos parâmetros do teste do cometa. A fragmentação de DNA durante
a apoptose é caracterizada pela geração de quebras de fitas-dupla do DNA, o que
resultará em uma maior quantidade de DNA que irá migrar para a cauda do cometa
durante a eletroforese (FAIRBAIRN
et al
., 1995; HARTMANN; SPEIT, 1997). Esses
achados reforçam os dados encontrados recentemente por Cavalcanti
et al
., (2006) em
fibroblastos de pulmão de hamster chinês (linhagem V79) tratados com ácido
caurenóico. Os dados obtidos sobre a indução de apoptose através da coloração por
BE/AL corroboram com os achados do ensaio do cometa. No qual o aumento das
concentrações de ácido caurenóico e do tempo de exposição, resulta no aumento do
número de células apoptóticas e dos valores de ID para ambas as linhagens testadas.
O balanço entre os efeitos terapêuticos e toxicológicos de um composto químico
é um parâmetro importante quando se quer verificar a aplicabilidade farmacológica do
composto. Muitas drogas citotóxicas não tendem a serem seletivas em suas ações,
agindo e danificando as células saudáveis (ANAZETTI
et al
., 2003). O ácido
caurenóico induziu danos ao DNA tanto em células normais (linfócitos) como em
células leucêmicas (HL60) na mesma magnitude.
Diante desses dados, as lesões induzidas no DNA dos linfócitos foram avaliadas
quanto ao seu potencial de reparação pela própria maquinaria celular. Em nosso estudo,
os linfócitos foram tratados com ácido caurenóico durante a fase G
0
(quiescência), sem
estímulo mitogênico. Após o tratamento e a remoção da droga das culturas,
fitohemaglutinina foi adicionada para estimular a proliferação celular. Alguns estudos
têm estabelecido que linfócitos em proliferação são capazes de reparar as lesões no
DNA mais rapidamente do que linfócitos quiescentes (baixo metabolismo), indicando
que o número de enzimas envolvidas no reparo de lesões no DNA são maiores em
linfócitos em divisão (KAMINSKAS; LI, 1992). Os parâmetros utilizados para avaliar a
73
cinética de reparo das lesões, índice e frequência de dano (ID e FD), mostraram que as
lesões começaram a ser reparadas nas primeiras horas após a remoção da droga nas
culturas. Após 48 horas, mais de 80 % das lesões haviam sido reparadas. Mas nada
podemos afirmar sobre a fidedignidade do reparo dessas lesões.
Boerrigter
et al
. (1991) demontrou que a estimulação mitogênica de linfócitos
pode resultar em um aumento da taxa de remoção de lesões específicas no DNA. Essa
observação pode ser explicada pela regulação do ciclo celular dependente de enzimas
específicas de reparo de lesões no DNA (SIROVER, 1990). A rápida redução dos
valores de ID após o tempo de reparo estipulado, nos permite afirmar que a grande
maioria das lesões presentes no DNA dos linfócitos tratados com ácido caurenóico
podem ser quebras de fita simples. A indução de apoptose e necrose em células tratadas
com ácido caurenóico analisados através da coloração por BE/AL e a presença
significativa de cometas da classe 4 (dano máximo) no ensaio do cometa, sugere a
presença de quebras de fitas duplas no DNA, porém numa menor ocorrência.
As quebras de fita dupla representam umas das mais severas lesões ao DNA,
devido a perda da continuidade cromossômica. Levando a geração de fragmentos
cromossômicos acêntricos (sem centrômero) comprometendo a segregação
cromossômica durante a mitose (KAYE
et al
., 2004). Adicionalmente, lesões de fita
dupla tendem a ser reparadas erroneamente devido a falta de segmentos
complementares de DNA (molde) que possam ser utilizados pelas enzimas envolvidas
no processo (PFEIFFER
et al
., 2000).
O ácido caurenóico induziu a formação de micronúcleos
in vitro
em linfócitos
humanos e em EPC de camundongos. A ocorrência de micronúcleos foi observada tanto
no grupo de animais sacrificados 24 horas como no de 48 horas após o tratamento.
Porém, foi observada uma menor incidência de EPC micronucleados no grupo
sacrificado tardiamente. Segundo Mavournin
et al
. (1990) a razão entre a frequência de
eritrócitos policromáticos e normocromáticos (ENC) decresce quando a substituição de
EPC originados dos eritroblastos é diminuída. Portanto, a diminuição da relação
EPC/ENC pode revelar a citotoxicidade do composto no ensaio. A freqüência de
micronúcleos em linfócitos está de acordo com os achados de Cavalcanti
et al
. (2006)
em fibroblastos de pulmão de hamster chinês (linhagem V79) em concentrações
similares.
Poucos estudos de mutagenicidade foram realizados com óleo de copaíba. Sena
e Chen (2002) demonstraram que a administração oral em camundongos do óleo-resina
74
de copaíba extraído de
C. langsdorffii
, induziu efeitos mutagênicos somente em altas
doses (25%, 50% e 80% da DL
50
). Contudo, o óleo-resina extraído de
C. duckei
,
segundo Maístro
et al
. (2005), apresentou atividade citotóxica contra células da medula
óssea, mas, do ponto de vista estatístico, não apresentou indícios de mutagenicidade em
ratos Wistar em altas doses (10%, 25% e 50% da DL
50
).
Os testes citogenéticos são importantes para o monitoramento de agentes
farmacêuticos. Muitas drogas mutagênicas são capazes de induzir aberrações
cromossômicas (BRITO
et al
., 1996). O índice mitótico (IM) representa a proporção de
células em divisão. Uma redução nos valores de IM pode refletir a inibição da
progressão do ciclo celular e/ou uma perda da capacidade proliferativa. Durante os
testes de aberrações cromossômicas (
in vivo
e
in vitro
), o IM é muito importante no
monitoramento da toxicidade celular (AMORIM
et al
., 2000).
O ácido caurenóico reduziu significantemente o IM e aumentou o número de
células aberrantes nas fases iniciais do ciclo celular (G
1
e G
1
/S). Por outro lado, o
tratamento não afetou a taxa de proliferação celular e a freqüência de células aberrantes
nas fases S e G
2
. Esses achados sugerem que o ácido caurenóico é citotóxico para os
linfócitos no momento em que eles são estimulados mitogênicamente. Durante o início
do ciclo celular os linfócitos são mais sensíveis do que nas outras fases (LIMA
et al
.,
2003). As freqüências dos diferentes tipos de aberrações observadas nas metáfases de
linfócitos tratados nas fases S e G
2
não foram significativas quando comparadas com as
aberrações produzidas em G
1
e na fase de transição G
1
/S. Não foi observado aumento de
células poliplóides em nenhuma fase do ciclo celular, o que indica, dentro das condições
do teste, que o ácido caurenóico não interfere nas fibras do fuso mitótico. Zhang
et al
.,
(2005) demonstrou que linfócitos tratados com alguns diterpenos caurâncicos
promovem aumento no número de células na fase G
1
e, consequentemente, uma redução
significativa na proporção de células nas fases S e G
2
. Sugerindo que esses diterpenos
inibem a replicação do DNA na fase de transição G
1
/S. A toxicidade celular exercida
pelo ácido caurenóico nas fases G
1
e G
1
/S pode estar relacionadas com a inibição da
replicação do material genético.
Nos ensaios de mutagênese com
S. cereviseae
, o efeito mutagênico do ácido
caurenóico não parece estar relacionado com o estágio metabólico da levedura. Porém,
o potencial citotóxico do ácido caurenóico foi mais pronunciado nas células tratadas
durante a fase exponencial de crescimento. Dentre essas, a sensibilidade ao composto
foi maior em células incubadas em meio de cultivo rico em nutrientes (YPD). O ácido
75
caurenóico é um diterpeno caurânico tetracíclico e sabe-se que diterpenos tetracíclicos
são capazes de inibir a ação da topoisomerase sobre o DNA (MIZUSHINA
et al
., 2005).
É possível que a citotoxicidade do ácido caurenóico, em parte, esteja relacionada com
esse tipo de interação com a molécula de DNA, uma vez que a citotoxicidade elevada só
foi observada durante a fase exponencial de crescimento. Onde, devido a replicação do
DNA, este se torna mais acessível à droga.
O ácido caurenóico gerou mutações pontuais lócus específicas e de
deslocamento do quadro de leitura (
frameshift
) tanto na fase estacionária como na
exponencial de crescimento. Mutações do tipo deslocamento do quadro de leitura
induzidas por drogas intercalantes de DNA têm sido correlacionadas com as quebras de
fitas de cadeia de DNA induzidas pela inibição de topoisomerases (SUNG
et al
., 2000).
Em todos os ensaios, o ácido caurenóico exerceu efeitos mutagênicos em
leveduras. Porém, não foi possível sugerir uma correlação de concentração entre os
ensaios com levedura e os outros ensaios de genotoxicidade realizados nesse estudo.
Uma vez que, nem todo agente genotóxico é, necessariamente, mutagênico, pelo
fato das lesões geradas no DNA poderem ser reparadas ou evoluírem para mutações. O
ensaio de mutagênese em levedura nos permite estudar as mutações e, assim, propor a
natureza do dano ao DNA induzidos. O ácido caurenóico foi genotóxico em células V79
induzindo quebras no DNA e a formação de micronúcleos (CAVALCANTI
et al
.,
2006) e em linfócitos humanos. O aumento na freqüência de mutação do tipo
deslocamento do quadro de leitura e a inibição da ação da topoisomerase I pelo ácido
caurenóico, sugere que as quebras de fitas no DNA podem ser originadas através de um
efeito intercalante do ácido caurenóico no DNA. A não observação de células
poliplóides após o tratamento com o ácido caurenóico, sugere que os micronúcleos
presentes tanto em linfócitos como em EPC são resultantes do efeito clastogênico do
ácido caurenóico e não de sua atuação sobre o aparelho mitótico celular (efeito
aneugênico). A ocorrência de micronúcleos em ensaios
in vitro
e
in vivo
nos permite
afirmar que o ácido caurenóico é um composto que não precisa ser metabolizado para
exercer seus efeitos tóxicos e mutagênicos.
76
6 CONCLUSÃO
O ácido caurenóico, um diterpeno caurânico tetracíclico isolado de
C
.
langsdorffii
, não mostrou seletividade entre linfócitos e células leucêmicas (HL60) e
induziu efeitos genotóxico e mutagênico em sistemas
in vitro
e
in vivo
. O ácido
caurenóico não interfere sobre o aparelho mitótico celular, sendo os micronúcleos
originados de fragmentos cromossômicos acêntricos. Seu mecanismo de toxicidade
parece estar relacionado com a inibição da replicação do DNA devido ao intercalamento
da molécula no material genético.
77
REFERÊNCIAS
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