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Giordano Wosgrau Calloni
Estudos in vitro da influência do microambiente nas
potencialidades mesenquimais dos progenitores da crista neural
Rio de Janeiro
2007
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Instituto de Ciências Biomédicas
Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas
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1
Giordano Wosgrau Calloni
Estudos in vitro da influência do microambiente nas potencialidades
mesenquimais dos progenitores da crista neural.
Tese de Doutorado apresentada ao programa
de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas,
Instituto de Ciências Biomédicas,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, como
parte dos requisitos necessários para a
obtenção do título de Doutor em Ciências
Morfológicas.
Orientadora: Prof. Andréa Gonçalves Trentin
(Universidade Federal de Santa Catarina)
Co-orientadora: Dr. Elisabeth Dupin (Institut
de Neurobiologie Alfred Fessard, França)
Rio de Janeiro
2007
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2
FOLHA DE APROVAÇÃO
Giordano Wosgrau Calloni
Estudos in vitro da influência do microambiente nas potencialidades
mesenquimais dos progenitores da crista neural.
Rio de Janeiro, ....... de ...... de 2007
_________________________________
Prof. Dr. José Garcia R. de Abreu Júnior
Departamento de Anatomia – UFRJ
_________________________________
Prof. Dr. Marcelo Felippe Santiago
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho - UFRJ
_________________________________
Prof. Dr. José Xavier Neto
Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina – USP
________________________________
Profa. Dra. Silvana Allodi
Departamento de Histologia e Embriologia, UFRJ; Revisor e Suplente
__________________________________
Prof. Dr. Mauro Eduardo Neyne Ferreira da Costa
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho – UFRJ;
____________________________________
Prof. Dra. Andréa G. Trentin - Departamento de Biologia Celular, Embriologia e Genética
UFSC; Orientadora
______________________________________
Prof. Dr. Vivaldo Moura Neto
Departamento de Anatomia – UFRJ; Coordenador do PCM.
3
RESUMO
CALLONI, Giordano Wosgrau. Estudos in vitro da influência do microambiente nas
potencialidades mesenquimais dos progenitores da crista neural. Rio de Janeiro, 2007.
Tese de Doutorado em Ciências Morfológicas - Pos-Graduação em Ciências Morfológicas,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2007.
No corpo de vertebrados, a crista neural (CN) está na origem de uma ampla diversidade de
tipos celulares, incluindo neurônios e células gliais do sistema nervoso periférico, os
melanócitos da pele e certas células endócrinas no tronco. Além disso, as células da CN
cefálica dão origem a células mesenquimais que formam cartilagens, ossos, musculatura lisa
vascular, derme, tecido adiposo e conectivo. Experimentos in vivo têm mostrado que o destino
das células da CN é plástico antes e durante sua migração e que a escolha dos seus fenótipos
finais é em grande parte dependente de sinais externos encontrados em seus sítios finais de
diferenciação. Na primeira parte desta tese, exploramos a influência de moléculas da matriz
extracelular (MEC) no comportamento das células da CN troncal (CNT). Observamos
pequenas diferenças na migração, proliferação e morte quando as células dissociadas da CN
foram levadas a crescer sobre três diferentes moléculas da MEC: laminina I, fibronectina e
colágeno IV. Entretanto, observamos em culturas clonais que a fibronectina promove
significativamente o desenvolvimento de progenitores da CN dotados com o potencial
miofibroblástico em comparação ao colágeno IV. Em contraste, o desenvolvimento de
progenitores melanocíticos é favorecido sobre o colágeno IV. Na segunda parte, pesquisamos
os efeitos do morfogeno Sonic hedgehog (Shh) no repertório de desenvolvimento das células
da CN cefálica (CNC) in vitro, incluindo sua habilidade em submeter-se à condrogênese.
Observamos que a adição da proteína recombinante de Shh em culturas de células da CN
durante uma janela de tempo específica favorece fortemente a diferenciação das células da
CNC em condrócitos e miofibroblastos sem nenhuma alteração nas linhagens neuronal e
melanocítica. Pela primeira vez, também descrevemos a presença de um progenitor altamente
multipotente dotado com os potenciais glial, neuronal, melanocítico, miofibroblástico e
condrocítico. O número desses progenitores multipotentes aumenta significativamente após o
tratamento com Shh, sugerindo que durante a morfogênese crânio-facial, Shh é um fator
essencial para a manutenção de células multipotentes da CNC dotadas com o potencial
esqueletogênico. Além disso, observamos que Shh é efetivo em aumentar o número de
condrócitos a partir de células da crista neural troncal (CNT). Pela primeira vez, detectamos
um raro progenitor contendo condrócitos, miofibroblastos e células gliais em culturas clonais
da CNT. Esses dados sugerem que as células da CNT de vertebrados retêm escondido um
certo potencial de diferenciação mesênquimal que não se expressa durante o desenvolvimento
in vivo. Entretanto, as bases celulares e moleculares para a inibição do destino mesênquimal
na CNT dos vertebrados superiores permanecem elusivas. Concluindo, nossos resultados
suportam um papel decisivo para os sinais produzidos localmente e temporalmente no
ambiente embrionário da CN em controlar seus destinos: tanto fatores solúveis (como Shh)
como componentes da matriz extracelular (como fibronectina e colágeno IV) podem atuar
garantindo a sobrevivência e dirigindo a diferenciação de tipos particulares de progenitores da
CN.
CRISTA NEURAL, MATRIZ EXTRACELULAR, SONIC HEDGEHOG.
4
ABSTRACT
CALLONI, Giordano Wosgrau. Estudos in vitro da influência do microambiente nas
potencialidades mesenquimais dos progenitores da crista neural. Rio de Janeiro, 2007.
Tese de Doutorado em Ciências Morfológicas - Pos-Graduação em Ciências Morfológicas,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2007.
In the vertebrate body, the neural crest (NC) is at the origin of a large diversity of cell types,
including neurons and glial cells of the peripheral nervous system, skin melanocytes and
certain endocrine cells in the trunk. In addition, the cephalic NC cells generate mesenchymal
cells forming cartilages, bones, vascular smooth muscles, dermis, adipose and connective
tissues. In vivo experiments have shown that the fate of NC cells is plastic before and during
their migration, and the choice of their final phenotype is largely dependent upon the external
cues founded in their final sites of differentiation. In the first part of this thesis, we explored
the influence of extracellular matrix molecules (EMC) on trunk NC cell behavior. We
observed little differences in cell migration, proliferation and death when dissociated NC cells
are grown on three different EMC molecules: laminin I, fibronectin and collagen IV.
However, we observed in clonal cultures that fibronectin significantly promotes the
development of NC progenitors endowed with myofibroblastic potential as compared to
collagen type IV. By contrast, the development of melanocyte progenitors is favoured on
collagen IV. In the second part, we have investigated the effects of the morphogenic factor
Sonic hedgehog (Shh) on the developmental repertoire of cephalic quail NC cells in vitro,
including their ability to undergo chondrogenesis. We found that the addition of the
recombinant Shh to NC cell cultures during a specific time window strongly favours
differentiation of cephalic NC cells in chondrocytes and myofibroblasts without any change in
neuronal and melanocytic lineages. For the first time, we also described the presence of a
highly multipotent progenitor endowed with glial, neuronal, melanocytic, myofibroblastic and
chondrocytic potentials. The number of these multipotent progenitors is highly increased after
treatment with Shh, suggesting that during cranio-facial morphogenesis, Shh is an essential
factor for the maintenance of multipotent cephalic NC cells endowed with skeletogenic
potential. We also observed that Shh is effective to increase the number of chondrocytes from
trunk NC cells (TNC). For the first time, we detected a rare progenitor containing
chondrocytes, myofibroblasts and glial cells in clonal trunk neural crest cultures. These
findings suggest that trunk NC cells of higher vertebrates retain some cryptic mesenchymal
differentiation potential, which fails to be expressed during development in vivo. However,
the cellular and molecular basis for inhibition of mesenchymal fate in the trunk NC of higher
vertebrates remains elusive. In conclusion, our results support a decisive role of signals
produced locally ad temporally in the embryonic environment of NC cells to control their
fate: both soluble growth factors (like Shh) and extracellular matrix components (like
fibronectin and collagen IV) can act by ensuring the survival and directing the differentiation
of particular types of NC progenitors.
NEURAL CREST, EXTRACELLULAR MATRIZ, SONIC HEDGEHOG.
5
PREFÁCIO
Esta Tese de Doutorado esta dividida em duas partes:
Parte I – Efeitos das Moléculas da Matriz Extracelular sobre as células da crista neural
troncal de codornas:
Todos os experimentos foram desenvolvidos no laboratório de Neurobiologia e
Hematologia Celular e Molecular, do Departamento de Biologia Celular, Embriologia e
Genética na Universidade Federal de Santa Catarina. Este trabalho foi realizado sob a
Orientação da Prof. Dra. Andréa Gonçalves Trentin. Grande parte dos experimentos foram
realizados pelos alunos Bruno da Costa e Silva, Cynara Mendes Neves, Denise Bittencourt e,
sobretudo pela aluna Meline Coelho da Costa. Abaixo estão referidas as contribuições
respectivas de cada estudante ao projeto:
• Instalação e manutenção de aviário de codornas para obtenção de embriões: Bruno
Costa da Silva, Meline Coelho da Costa e Giordano Calloni.
• Padronização de culturas da crista neural troncal: Bruno Costa da Silva, Cynara
Mendes Neves, Denise Avani Bittencourt, Giordano Calloni e Meline Coelho da
Costa.
• Analise dos Derivados da crista neural troncal sobre os diferentes substratos da
MEC: Cynara Mendes Neves, Giordano Calloni e Meline Coelho da Costa.
6
• Analise de Migração das Células da crista neural troncal: Bruno Costa da Silva,
Cynara Mendes Neves e Meline Coelho da Costa.
• Analise da Proliferação, Sobrevida e RGDS: Meline Coelho da Costa.
• Ensaios Clonais da crista neural troncal: Bruno Costa da Silva e Meline Coelho da
Costa.
Estes resultados em conjunto fazem parte de um artigo cientifico em preparação
(apresentado em Apêndices).
Parte II – Efeitos de Sonic Hedgehog sobre as células da crista neural cefálica e troncal.
Este trabalho foi inteiramente desenvolvido nos laboratórios: “Embryologie Cellulaire
e Moléculaire” em Nogent-sur-Marne e “Développement et Evolution de la Crête Neurale”
em Gif-sur-Yvette, França, sendo ambos chefiados por Nicole Le Douarin. Este trabalho foi
orientado pela Dra. Elisabeth Dupin e pela Prof. Nicole Le Douarin. Todos os experimentos
foram realizados pelo aluno Giordano Calloni com auxilio técnico nas culturas da crista
neural troncal de Corrine Glavieux-Pardanaud.
Estes resultados fazem parte do artigo cientifico (apresentado em Apêndices) aceito
para publicação na revista PNAS U.S.A, intitulado “Sonic Hedgehog promotes the development
of multipotent neural crest progenitors endowed with both mesenchymal and neural phenotypes” de
autoria de
Giordano W. Calloni, Corinne Glavieux-Pardanaud, Nicole M. Le Douarin e
Elisabeth Dupin.
7
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................21
1.1 A CRISTA NEURAL DO EMBRIÃO DE VERTEBRADOS – BREVE HISTÓRICO....21
1.2 AS ROTAS MIGRATÓRIAS DA CN ...............................................................................24
1.3 POTENCIALIDADE MESECTODERMAL DA CNC: A ORIGEM DA CABEÇA DOS
VERTEBRADOS.....................................................................................................................29
1.4
AS PRIMEIRAS EVIDÊNCIAS DA MULTIPOTENCIALIDADE DA CN....................31
1.5
ESTUDOS IN VITRO DA MULTIPOTENCIALIDADE DA CN....................................32
1.6 FATORES DE CRESCIMENTO E CITOCINAS QUE ATUAM SOBRE OS
PROGENITORES DA CN .......................................................................................................35
1.7 SONIC HEDGEHOG (SHH) E A CN .................................................................................38
1.7.1 Shh um Morfógeno de Múltiplas Funções...................................................................38
1.7.2 Shh um Candidato para a Regulação da Condrogênese das Células da CNC
..................................................................................................................................................41
1.8 OBJETIVOS ....................................................................................................................46
1.8.1 Objetivo Geral ..............................................................................................................46
1.8.2 Objetivos Específicos....................................................................................................46
2 MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................................48
2.1 PARTE I-EFEITOS DA MATRIZ EXTRACELULAR SOBRE AS CÉLULAS DA CNT
..................................................................................................................................................48
2.1.1 Animais...........................................................................................................................48
2.1.2 Culturas de Células da CNT de Codorna....................................................................48
2.1.2.1 Culturas primárias ........................................................................................................48
8
2.1.2.2 Culturas secundárias.....................................................................................................49
2.1.3 Análise da Migração Celular........................................................................................50
2.1.4 Análise da Proliferação Celular ...................................................................................50
2.1.5 Análise da Morte Celular............................................................................................. 51
2.1.6 Análise Imunocitoquímica ............................................................................................52
2.1.7 Análise Estatística..........................................................................................................53
2.2 PARTE II–EFEITOS DE SHH SOBRE AS CÉLULAS DA CNC E CNT .........................54
2.2.1 Embriões de Codorna....................................................................................................54
2.3 CULTURA DE CÉLULAS DA CNC E CNT DE CODORNAS .......................................54
2.3.1 Culturas Primárias........................................................................................................54
2.3.2 Culturas Secundárias de Massa e Clonais...................................................................55
2.4 IMUNOCITOQUÍMICA E DETECÇÃO DE NÓDULOS DE CARTILAGEM...............56
2.5 IMUNOCITOQUÍMICA DE CULTURAS CLONAIS......................................................58
2.6 HIBRIDIZAÇÃO IN SITU............................................................................................... 59
2.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA................................................................................................61
3 RESULTADOS...................................................................................................................62
3.1 PARTE I - EFEITOS DA MEC SOBRE AS CÉLULAS DA CNT ....................................62
3.1.1 Análise in vitro da Migração das Células da CNT Sobre Diferentes Moléculas da
MEC.........................................................................................................................................62
3.1.2 Análise dos Tipos Celulares Originados da Diferenciação da CNT Sobre
Diferentes Moléculas da MEC...............................................................................................63
3.1.3 Análise da Proliferação das Células da CNT Sobre as Diferentes Moléculas da
MEC.........................................................................................................................................65
3.1.4 Análise da Sobrevivência das Células da CNT Cultivadas Sobre as Diferentes
Moléculas da MEC. ................................................................................................................68
9
3.1.5 A Fibronectina Exerce seus Efeitos sobre os Miofibroblastos Via os Domínios
RGDS.......................................................................................................................................70
3.1.6 Análise dos Efeitos da Fibronectina Sobre a Diferenciação de Progenitores da
CNT em Culturas Clonais......................................................................................................70
3.2 PARTE II –EFEITOS DE SHH SOBRE AS CÉLULAS DA CN........................................73
3.2.1 Padronização de Culturas Objetivando Promover a Condrogênese a Partir de
Células Indiferenciadas da CNC...........................................................................................73
3.2.2 Os Efeitos de Shh Sobre a Diferenciação de Condrócitos Derivados da CNC em
Culturas de Massa ..................................................................................................................75
3.2.3 Diferenciação de Condrócitos a 4 Dias de Cultura Secundária de Massa ...............76
3.2.4 Diferenciação de Condrócitos a 6 e 10 Dias em Culturas Secundárias de Massa ...77
3.2.5 Análise de Fenótipos não Condrocíticos em Culturas Tratadas com Shh ...............80
3.2.6 Caracterização da Resposta Condrogênica da CNC ao Tratamento de Shh em
Culturas de Massa ..................................................................................................................82
3.2.6.1 Período de resposta das células condrocíticas.............................................................82
3.2.7 Quantificação de Células Condrocíticas Responsivas a Shh em Função de suas
Posições ao Longo do Eixo Rostro-Caudal...........................................................................83
3.2.8 Efeito do Tempo de Migração das Células da CN Sobre a Condrogênese..............85
3.2.9 Shh Exerce seus Efeitos Sobre os Progenitores Sox9
+
Via Smoothened
..................................................................................................................................................87
3.2.10 Análise do Efeito de Shh Sobre o Desenvolvimento de Progenitores da CNC em
Culturas Clonais .....................................................................................................................88
3.3 EFEITOS PRÓ-CONDROGÊNICOS DE SHH SOBRE A CNT........................................93
3.3.1 Efeito de Shh Sobre as Culturas de Massa da CNT..................................................93
3.3.2 Efeito de Shh em Culturas Clonais da CNT ..............................................................96
10
4 DISCUSSÃO .......................................................................................................................98
4.1 PARTE I - EFEITO DA MEC SOBRE OS PROGENITORES DA CNT ...........................98
4.2 PARTE II - EFEITOS DE SHH SOBRE AS CÉLULAS DA CRISTA NEURAL...........103
4.2.1 Novo Modelo de Segregação de Linhagem e Multipotencialidade da CNC..........103
4.2.2 Efeitos de Shh sobre a Multipotencialidade e Condrogênese da CNC..................110
4.2.3 Efeitos de Shh Sobre a CNT ......................................................................................117
4.2.3.1 A CNT possui potencial condrogênico.......................................................................117
4.2.3.2 Shh estimula a condrogênese nas células da CNT .....................................................120
4.2.4 Potencialidade, Destino e Evolução da CN................................................................123
5 CONCLUSÕES..................................................................................................................128
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...............................................................................130
APÊNDICES.........................................................................................................................147
11
Je dédie cette thèse à la mémoire d’Edouard
Camprasse, sa sagesse et douceur seront
perpétuées pour l’éternité.
12
AGRADECIMENTOS/REMERCIEMENTS
Je voudrais remercier a Madame le Docteur Elisabeth Dupin pour son soutien au long de ces
travaux et de cette thèse. Je tiens à exprimer toute ma gratitude pour sa disponibilité et
encouragement constants dans plusieurs aspects du travail et surtout de ma vie.
Je tiens à exprimer ma gratitude à Madame le Professeur Nicole Le Douarin, pour m’avoir
accueillie dans son laboratoire et pour me soutenir dans tous les aspects de ces travaux.
Je tiens a vivement remercier Corinne Glavieux-Pardanaud non seulement pour m’avoir
enseigné plain de techniques utilisées au laboratoire. mais surtout pour sa gentillesse et
amitié.
Je tiens à remercier Marie-Aimé Teillet non seulement pour m’avoir donné la suggestion
d’utilisation de la molécule Sonic Hedgehog, mais aussi pour sa gentillesse et sympathie.
Je tiens à remercier Sophie Creuzet pour me accueillie dans son laboratoire en Gif-sur-Yvette
et permettre que cette thèse puisse arriver a la fin.
Je tiens à remercier Josselyne Salün pour m’aider avec des questions administratives et pours
ses efforts en résoudre des problèmes pratiques du quotidien toujours avec sympathie.
A Prof. Dr. Andréa Gonçalves Trentin, pelo suporte e apoio ao longo dos anos em seu
laboratório.
Ao Prof. Dr. Vivaldo Moura Neto, por seu apoio constante ao longo de minha formação
cientifica.
Aos alunos Bruno Costa da Silva e Meline Coelho da Costa pelo trabalho realizado com
dedicação e entusiasmo. Grande parte dos trabalhos que constam nesta tese são o fruto do
aprendizado e do interesse constante destes dois alunos durante a iniciação científica.
As alunas Cynara Mendes Neves, Denise Bittencourt e Fernanda Melo por participarem e
contribuírem ativamente no decorrer destes trabalhos.
Ao compatriota José Brito, pelas discussões, trocas de idéia, pela ajuda constante, sempre com
bom humor e simpatia e sobretudo por me apresentar ao universo de Sonic Hedgehog.
A Carla Real e Nuno Afonso pela amizade e pela ajuda indispensável nas fases em que este
trabalho apenas parecia promissor.
A amiga Hélia Neves, que sempre fez o possível e impossível para me ajudar.
Aos colegas de laboratório no Brasil, Claudia Nedel Mendes de Aguiar, Marco Augusto
Stimamiglio e Ricardo Garcez, pela amizade e companheirismo ao longo dos anos.
13
A minha família e a família de minha esposa pelo constante encorajamento e suporte ao longo
dos anos A todos meus amigos que muito pouco tempo consagrei ultimamente, sintam-se
aqui.
Je voudrais aussi remercier à ma famille française: Edouard, Simone, Fabienne, Fréderic,
Jean et Typhen. C’est grâce à vous qu’on était moins solitaire hors de notre pays. Vous avez
nous accueilli comme votre fils, frères et sœurs. Je vous remercie de toute mon Coeur.
A todos aqueles que contribuíram de alguma forma para este trabalho, e foram muitos, desde
os secretários das pós-graduações facilitando muitos dos aspectos burocráticos até os
professores que estimularam minha vida acadêmica e pessoal.
A minha esposa, pelo companheirismo e amor incondicional, pelas limitações que se impôs
em meu beneficio para que este trabalho pudesse ser realizado. Jamais será possível te
agradecer por toda tua força e compreensão.
14
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: A indução da CN ocorre durante o processo da neurulação. ....................................21
Figura 2: Esquema de realização de quimeras de codorna-galinha..........................................22
Figura 3: O mapa de Destino das Células da Crista Neural .....................................................24
Figura 4: Mapa das rotas migratórias da Crista Neural............................................................26
Figura 5: A fibronectina esta presente nas rotas migratórias da CN ........................................27
Figura 6: Os efeitos in vitro da fibronectina sobre a migração das células da CN...................28
Figura 7: Contribuição da CN para o esqueleto crânio-facial de aves. ....................................29
Figura 8: Mapa de destino da crista neural cefálica .................................................................30
Figura 9: Modelo de segregação dos derivados da crista neural cefálica (CNC) e troncal
(CNT). ......................................................................................................................................35
Figura 10: A via de sinalização Hedgehog (Hh). .....................................................................41
Figura 11: O primeiro camundongo mutante de Shh. ..............................................................42
Figura 12: Papel de Shh no desenvolvimento facial.................................................................44
Figura 13: Esquema representativo da Parte I da Metologia....................................................53
Figura 14: Esquema Representativo da Metodologia da Parte II.............................................61
Figura 15: Efeito das moléculas da MEC sobre a migração das células da CNT. ...................62
Figura 16: Análise fenotípica e respectiva quantificação dos derivados da CNT....................64
Figura 17: Quantificação de miofibroblastos em função dos substratos utilizados nas culturas
primárias e secundárias da CNT...............................................................................................65
Figura 18: Os efeitos de FN, LN e Col IV sobre a proliferação celular total e de
miofibroblastos em culturas secundárias de 6 dias da CNT.....................................................66
Figura 19: Análise temporal do número e proliferação de miofibroblastos.............................68
Figura 20: Os efeitos das moléculas da MEC sobre a morte celular em culturas da CNT ......69
15
Figura 21: O papel dos RGDS na expressão de miofibroblastos sobre a FN...........................70
Figura 22: Shh estimula a condrogênese em culturas da CNC. ...............................................75
Figura 23: Análise de condrócitos aos 4 dias de cultura secundária da CNC ..........................77
Figura 24: Análise da condrogênese a 6 e 10 dias em culturas da CNC..................................78
Figura 25: Identificação de condrócitos a 6 dias de cultura secundária.. .................................80
Figura 26: Análise do efeito do tratamento com 10 e 100 ng/ml de Shh sobre o número e a
proliferação de miofibroblastos em culturas de 6 dias da CNC. ..............................................81
Figura 27: Análise do efeito de Shh sobre a proporção de células gliais, melanócitos e
neurônios em culturas de 6 dias da CNC..................................................................................82
Figura 28: Gráfico do número de nódulos de cartilagem registrados após 6 dias de cultura
secundária em função do tratamento precoce com Shh ...........................................................83
Figura 29: Esquema da mudança metodológica.......................................................................84
Figura 30: Análise do número de nódulos de cartilagem gerados em culturas secundárias de 6
dias a partir da nova metodologia.............................................................................................85
Figura 31: Análise do número de nódulos de cartilagem originados a 6 dias de cultura a partir
de células da CN obtidas de 3 estruturas cefálicas distintas e que passaram diferentes tempos
em cultura primária: 15 e 24 horas...........................................................................................86
Figura 32: Shh atua especificamente sobre o número de células Sox9+.................................87
Figura 33: Gráfico da porcentagem de diferentes fenótipos obtidos em culturas clonais da
CNC..........................................................................................................................................88
Figura 34: Imagem de um clone Pentapotente (GNMFC). ......................................................90
Figura 35: Representação esquemática dos diferentes tipos de progenitores da CN ...............91
Figura 36: A CNT exibe potencialidade em gerar condrócitos em culturas de Massa. ...........95
Figura 37: Gráficos da quantificação da taxa de condrogênese em culturas da CNT..............95
16
Figura 38: Análise do efeito do tratamento de diferentes doses de Shh sobre a porcentagem de
células gliais, miofibroblastos, melanócitos e neurônios em culturas de 8 dias da CNT.........96
Figura 39: O primeiro e único clone descrito até o momento na CNT contendo cartilagem...97
Figura 40: Representação esquemática da molécula de fibronectina.....................................100
Figura 41: Novo modelo de segregação das linhagens derivadas da CNC ............................105
Figura 42: Modelo dos papéis exercidos por Sox9 durante o curso do desenvolvimento da
CNC........................................................................................................................................117
Figura 43: Novo modelo de segregação das linhagens da CNT.............................................122
Figura 44: Mapa de destino e potencialidade da CN..............................................................124
Figura 45: Graduação decrescente do poder condrocítico das células da CN ao longo do eixo
rostro-caudal ...........................................................................................................................125
17
LISTA DE TABELAS
TABELA 1: OS DERIVADOS DA CRISTA NEURAL.........................................................................23
TABELA 2: SHH EXERCE DIFERENTES FUNÇÕES EM DIVERSOS CONTEXTOS CELULARES DURANTE
O DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO
.........................................................................................39
TABELA 3: ANÁLISE DA PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS GLIAIS E DE MELANOCITÓS......................66
TABELA 4: FREQÜÊNCIA (% TOTAL) DOS TIPOS CLONAIS DERIVADOS DE CULTURAS DA CNT
REALIZADAS SOBRE FIBRONECTINA E COLÁGENO
IV. ................................................................71
T
ABELA 5: EFEITO DA DENSIDADE DA MONOCAMADA DE FIBROBLASTOS EMBRIONÁRIOS (3T3)
NA OBTENÇÃO DE NÓDULOS DE CARTILAGEM DA
CNC..............................................................74
TABELA 6: EFEITO DE SHH NA FREQÜÊNCIA DA OBTENÇÃO DE NÓDULOS DE CARTILAGEM .......78
TABELA 7: ORDEM DE GRANDEZA DAS POPULAÇÕES GERADAS A PARTIR DOS CLONES DA CN
MESENCEFÁLICA EM PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE
SHH...............................................................89
TABELA 8: SOMATÓRIA DOS PORCENTUAIS DE CLONES MULTIPOTENTES E UNIPOTENTES
DERIVADOS DAS CULTURAS CLONAIS CONTROLES E TRATADAS COM
SHH . ...............................92
18
LISTA DE ABREVIATURAS
Ao longo do texto escrito em língua portuguesa encontram-se alguns termos técnicos anglo-
saxônicos. Essa opção prende-se ao fato de os mesmos pertencerem a um glossário
consagrado na literatura internacional.
3T3-NIH
Linhagem de fibroblastos embrionários provenientes do Instituto Nacional
de Saúde (National Institute of Health).
α Mem-Gibco
Minimum Essential Medium Alpha Médium
α SMA
α Actina do músculo liso
AO
Aorta
A-P
eixo ântero-posterior
BA1
primeiro arco branquial
BA2
segundo arco branquial
BA3
terceiro arco branquial
BA4
quarto arco branquial
BCIP/NBT
5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/nitro blue tetrazolium
BMPs
Bone Morphogenic Proteins (Proteínas Morfogênicas do Osso)
BMP2
Bone Morphogenic Protein 2 (Proteina Morfogênica do Osso 2)
BMP2
Bone Morphogenic Protein 4 (Proteina Morfogênica do Osso 4)
BrdU
5-bromo-2-dioxiuridina
C
Condrócitos
Cad7
Caderina 7
CN
Crista Neural
CNC
Crista Neural Cefálica
CNT
Crista Neural Troncal
CO2
gás carbônico
Col IV
Colágeno de tipo IV
d0-d2
dia zero a dia dois
d2-d6
dia dois a dia 6
DAPI
4’,6-diamidino-2 finilidol dihidro clorido
Dhh
Desert hedgehog
19
Di-Mes
Diencefálica-Mesencefálica
dig-UTP
digoxigenina-UTP
DMEN
Dulbeco Modified Eagle’s Minimal Essential Medium
DRG
Gânglio da Raiz Dorsal
EDTA
Ácido etileno-dinitrilo-tetra-acético
EGF
Epidermal Growth Factor (Fator de Crescimento Epidermal)
ET3
Endotelina 3
ETRB
Receptor da Endotelina B
ETRB/B2
Receptor da Endotelina B2
F
Miofibroblastos
FGF2
Fibroblast Growth Factor2 (Fator de Crescimento de Fibroblastos 2)
FGF8
Fibroblast Growth Factor8 (Fator de Crescimento de Fibroblastos 8)
FGFs
Fibroblast Growth Factors (Fatores de Crescimento de Fibroblastos)
FITC
Isotiocianato de fluorosceína
FN
Fibronectina
G
Glia
GDNF
Glial Derived Neurotrophic Factor
Gli
proteínas da família Gli
HCl
Ácido Clorídrico
hh
família de genes hedgehog
HNK1
Human Natural Killer 1
HPE
Holoprosencefalia
Ihh
Indian hedgehog
Kb
kilo-bases
LN
Laminina I
LNH
Laboratório de Neurobiologia e Hematologia Celular e Molecular
M
Melanócitos
M
Miótomo
M1C1
Meio de clonagem
MEC
Matriz extracelular
MelEM
Melanoblast-melanocyte Early Marker
mes
mesencéfalo
N
Neurônios
NF
Neurofilamento
20
ng/ml
nanograma/mililitro
PA
Artéria Pulmonar
PBS
Tampão Fosfato Salina
PDGF
Platelet Derived Growth Factor
pH
potencial Hidrogênionico
Ptch1
proteína transmenbranar Patched
QCPN
Quail non Chick Perinuclear Antigen
QT6
Fibroblastos de codorna
r1-r2
rombômeros 1 e 2
r3 a r8
rombômeros 3 a 8
RNA
Ácido ribonucléico
SBF
Soro Bovino Fetal
SC
Esclerótomo
SCF
Stem Cell Factor
Shh
Sonic hedgehog
Smo
Smoothened
SMP
Schwann Myelin Protein
SNE
Sistema Nervoso Entérico
SNP
Sistema Nervoso Periférico
ss
somitos
SY
Gânglio Simpático
T3
triiodotironina
T7
(RNA polimerase)
TGFβ
Transforming Growth Factor β
TXRD
Texas Red
UFSC
Universidade Federal de Santa Catarina
UFRJ
Universidade Federal do Rio de Janeiro
UV
Ultravioleta
VR
fibras ventrais da raiz motora
v/v
volume/volume
WS
Septo Interventricular
21
1 INTRODUÇÃO
1.1 A CRISTA NEURAL DO EMBRIÃO DE VERTEBRADOS – BREVE HISTÓRICO
A crista neural (CN) é uma estrutura transitória presente no embrião dos vertebrados
que foi descoberta em 1868 pelo embriologista Suíço Wilhelm His (His, 1868). Ele descreveu
esta estrutura no embrião de galinha como sendo uma banda de células presente entre o tubo
neural e o futuro ectoderma superficial (Fig. 1). As células que compõem a CN possuem
propriedades migratórias e distruibuem-se ao longo de todo o embrião.
Figura 1: A indução da CN ocorre durante o processo da neurulação. Durante a neurulação, a placa
neural (azul claro) dobra-se progressivamente para formar o tubo neural (A-C). As pregas neurais
(amarelo) formam-se na interface entre a placa neural (azul claro) e o ectoderma epidérmico (azul escuro)
e a interação entre estes dois tecidos é necessária para a indução da CN. Diferentes moléculas como BMPs,
FGFs e Wnts estão envolvidas durante este processo. As pregas neurais unem-se progressivamente de
maneira a formar o aspecto mais dorsal do tubo neural e a CN (Adaptado de Graham, 2003).
Um pré-requisito para o pleno desenvolvimento do estudo do comportamento das
células da CN foi a descoberta de marcadores que permitissem “rastrear” as células por um
longo período durante a ontogenia. A utilização de marcadores celulares como a timidina
tritiada nos anos de 1960 por Chibon (Chibon, 1964) e Weston (Weston, 1963) permitiu a
visualização da CN de anfíbios e aves. Entretanto, este método de marcação permitia apenas
uma visualização transitória das células, uma vez que a divisão celular seqüencial diluía o
isótopo radioativo. Esta limitação pôde ser superada graças à observação realizada por Nicole
Placa
Neural
Prega
Neural
notocorda
Crista
Neural
22
Le Douarin de que as células de codorna apresentavam um nucléolo desproporcionalmente
grande comparado ao de galinha (Le Douarin, 1969). Ao analisar o nucléolo de células de
codornas através da reação de Feulgen, Le Douarin descobriu que este grande nucléolo era
devido à presença de uma massa de heterocromatina que estava associada ao RNA nucleolar
durante todo o desenvolvimento do embrião de codorna. Em contraste, a cromatina de
galinhas era distribuída no nucleoplasma como uma fina rede com alguns cromocentros
dispersos.
Tirando proveito desta observação (e mais tarde com o advento de anticorpos
monoclonais específicos de um determinado tipo celular de uma das espécies, como o QCPN
- Quail non Chick Perinuclear Antigen, Nicole Le Douarin pôs em pratica uma técnica que
permitiu estudar de forma dinâmica o destino das células da CN: o sistema de quimeras
codorna-galinha, nas quais uma região particular do tubo neural é retirada da galinha antes da
migração da CN e substituída por um tubo neural equivalente da região e estado de
desenvolvimento de um embrião de codorna (Fig. 2).
.
Figura 2: Esquema de realização de quimeras de codorna-galinha ortotópicas e ortocrônicas (o tubo
neural que é retirado do doador é implantado no mesmo nível e tempo de desenvolvimento de onde se
encontrava o tubo neural receptor). Um embrião de galinha é operado in ovo e microcirurgicamente
deprivado do seu tubo neural ao nível dos últimos somitos. O fragmento correspondente do tubo neural de
Embrião Galinha
Receptora do transplante
Embrião Codorna
Doadora do transplante
Tubo Neural
retirado do embrião
de codorna
para ser transplantado
no embrião de galinha
23
um embrião de codorna é retirado e dissociado enzimaticamente, sendo ortotopicamente e
ortocronicamente transplantado no embrião de galinha. Em (A) um embrião de galinha de raça branca no
final do período de incubação. Este embrião recebeu um transplante de uma porção de um tubo neural de
codorna implantado no nível presuntivo das asas. (B) Uma galinha de dois meses que foi sujeita a um
transplante codorna-galinha. O único sinal de que se trata de uma quimera é o fato de algumas penas
serem pigmentadas, devido à presença de melanócitos de codorna que provieram da região transplantada.
(C) Quando o transplante se realiza ao nível do cérebro anterior, as galinhas quiméricas resultantes
possuem penas pigmentadas ao nível da cabeça. Podemos observar dois pintos quiméricos e um pinto
normal ao centro (Adaptado de Le Douarin & Kalcheim, 1999).
A realização destas quimeras permitiu não só colocar em evidência as rotas de
migração da CN (ver seção 1.2) como também possibilitou a identificação e a construção de
um mapa de destino dos derivativos da CN (Tabela 1, Fig. 3) (revisado por Le Douarin &
Kalcheim, 1999; Dupin et al., 2006).
Tabela 1: Os derivados da Crista Neural
Neurônios
• Gânglios Sensoriais e Autonômicos (incluindo sistema nervoso
simpático, parassimpático e entérico).
Células Gliais
• Células Satélites dos Gânglios do sistema nervoso periférico
• Células de Schwann associadas aos nervos periféricos
• Células Gliais do sistema nervoso entérico
Melanócitos
• Presentes na Pele
Células Endócrinas
• Células da medula da glândula Adrenal
• Células C da tireóide (produtoras de Calcitonina)
Células Mesenquimais
“mesectoderma”
• Cartilagem e osso
• Derme
• Tecido Conectivo
• Células lisas musculares de vasos sanguíneos
• Adipócitos
24
Figura 3: O mapa de Destino das Células da Crista Neural
1.2 AS ROTAS MIGRATÓRIAS DA CN
No embrião de aves, a migração das células da CN ocorre primeiramente nos níveis
mais anteriores e progressivamente estende-se aos níveis mais caudais. As células da CN
passam inicialmente por uma transição epitélio-mesenquimal, em que perdem suas interações
célula-célula. Este fenômeno é dependente da diminuição de moléculas de adesão da família
das caderinas e da atividade do gene Snail (Newgreen & Thiery, 1980; Akitaya & Bronner-
Fraser, 1992). Mecanismos similares da transição epitélio-mesenquimal são observados em
células tumorais durante as metástases. Após deixarem o tubo neural, as células da CN
Mesectoderma
Gânglio Entérico
Gânglio Sensorial
Gânglio Simpático
Gânglio Parassimpático
Melanócitos
A Figura 3 representa o mapa de destino das Células
da Crista Neural e evidencia que os derivados da CN
diferem ao longo do eixo antero-posterior do tubo
neural. Alguns tipos celulares derivam de
praticamente todos os níveis, enquanto outros estão
restritos a uma pequena área. Por exemplo,
enquanto os melanócitos são gerados por células da
CN provenientes de praticamente todo o eixo do
embrião (linha roxa), a cartilagem e o osso são
derivados exclusivamente da região cefálica
(hachurado em verde). As células nervosas do SNP
provem de diferentes regiões do eixo (Adaptado Le
Douarin et al., 2004).
Nivel Cefálico
Nivel Troncal
25
seguem rotas migratórias bem definidas, essenciais para a geração dos tipos celulares
adequados, nos lugares apropriados.
Os caminhos migratórios adotados pelas células da crista neural cefálica (CNC)
diferem em relação aos adotados pelas células da crista neural troncal (CNT). Na região
cefálica, a migração celular é essencialmente subectodermal para gerar o esqueleto facial e
cranial. Este aspecto será abordado com mais riqueza de detalhes nos próximos tópicos, mas
em resumo, bandas de células da CN migram para região frontal e também lateralmente
através dos arcos branquiais a fim de originarem as estruturas maxilares e mandibulares (Fig.
4A) (Couly et al., 1996; Kontges & Lumsden, 1996). Células da CN provenientes dos últimos
rombômeros (mais especificamente, ao nível do 1° ao 5° par de somitos) também apresentam
uma migração dorso-ventral, mas desta vez em direção à faringe e ao tubo digestivo anterior
gerando o sistema nervoso entérico (Le Douarin & Teillet, 1973). Outras células provenientes
desta mesma região migram ao longo dos arcos aórticos, gerando parte do trato cardíaco.
Na região troncal (do 5° par de somitos em diante), dois caminhos de migração são
adotados pelas células da CN: o caminho dorso-ventral e o caminho médio-lateral (Fig. 4B e
5). No caminho dorso-ventral, as células da CN penetram pela parte rostral dos somitos
seguindo a formação do dermomiotoma e do esclerotoma (Fig. 4B1) (Bronner-Fraser, 1986a);
(Teillet et al., 1987). Estas células colonizam o gânglio da raiz dorsal, o gânglio simpático e
as fibras nervosas (Fig. 4B2). Outras células da CN, que permanecem entre o tubo neural e o
dermomiotoma por aproximadamente 24 horas, em uma área designada como “área de parada
da migração”, começam então a migrar abaixo do ectoderma (Fig 4B3). Este constitui o
caminho médio-lateral e é utilizado pelos melanoblastos que colonizam o mesênquima
subectodermal e após entram na epiderme (Teillet & Le Douarin, 1970; Weston, 1971;
Erickson et al., 1992).
26
Figura 4: Mapa das rotas migratórias da Crista Neural Cefálica (CNC) (A) e da Crista Neural
Troncal (CNT) (B) no embrião de ave. (A) A migração das células da CNC ocorre essencialmente numa
camada situada sob a ectoderme: a CN originada a partir do mesencéfalo anterior (laranja) contribui
para a massa nasofrontal e periocular. A CN proveniente do mesencéfalo posterior (vermelho) também
participa na formação destas estruturas e migra para a parte anterior e distal do primeiro arco branquial
(BA1). Outra parte do BA1 é povoada por células da CN provenientes dos rombômeros 1 e 2 (r1-r2,
amarelo/azul escuro, respectivamente) e também por uma pequena contribuição da CN originada de r3
(azul claro). A maior contribuição para o segundo arco branquial (BA2) vem da CN do r4 (rosa). As
células da CNC originadas de r3 e r5 dividem-se em feixes e participam de dos dois arcos adjacentes:
células provenientes de r3 (azul claro) migram para o primeiro e segundo arcos branquiais (BA1 e BA2) e
as provenientes de r5 (verde) migram para o segundo e terceiro arcos branquiais (BA2 e BA3). As células
derivadas de r7 (marrom) migram para o terceiro e quarto arcos branquiais (BA3 e BA4). As células
derivadas de r8 (roxo) contribuem sobretudo para as estruturas conotruncais do coração (Adaptado de Le
Douarin & Kalcheim, 1999). (B) As células da CNT, seguem dois caminhos distintos de migração,
mostrados aqui em esquemas de secções transversais: inicialmente migram ventralmente entre o tubo
neural e o somito (B). Uma vez que chegam aos somitos, elas entram na interface entre o miotomo (M) e o
esclerotomo (SC) e migram lateralmente atravessando o somito (B1). As células que se localizam perto da
aorta dorsal formam o gânglio simpático (SY), as que se alinham ao longo das fibras ventrais da raiz
motora (VR) diferenciam-se em células gliais, outras permanecem próximas do tubo neural dorsal e
constituem o gânglio da raiz dorsal (DRG) (B3). Cerca de 24 horas após a migração ter iniciado, as células
da CN começam a invadir o caminho dorso-lateral (células em azul no esquema), o qual constitui a
segunda rota de migração adotada pelas células da CNT cujo destino será formar os melanócitos da pele
(B3) (Adaptado de Erickson, 2001).
Crista neural diencefalica e mesencefalica anterior
Crista neural mesencefalica posterior
r1 CN
r2 CN
r3 CN
r4 CN
r5 CN
r6 CN
r7 CN
r8 CN
A B
1
2
Massa Naso-frontal
Arcos branquiais
3
CN
CN
27
A migração diferencial das células da CN depende significativamente dos
microambientes encontrados durante este processo, definidos principalmente por moléculas
da matriz extracelular composta de glicoproteínas e proteoglicanos específicos, bem como
pelos ligantes e receptores para estas moléculas presentes nas células da CN. A exemplo disto,
Faraco e colaboradores, demonstraram que a migração de melanoblastos na galinha mutante
Sedosa Japonesa, além de ocorrer pela via dorso-lateral (como observado em galinhas
normais) também ocorre pela via ventral. Esta diferença é ocasionada pela ausência da lectina
PNA ao longo da rota ventral em galinhas mutantes (Faraco et al., 2001).
Estudos ultraestruturais e bioquímicos indicam que membranas basais e intersticiais
estão presentes ao longo das rotas migratórias das células da CN. Estudos imunocitoquímicos
das membranas basais indicam a expressão precoce no embrião de aves de componentes de
matriz incluindo laminina, colágeno tipo IV e proteoglicanos de sulfato de heparina,
associados com constituintes de membrana intersticial, tais como a fibronectina e vários
outros tipos de colágenos. Uma das funções da fibronectina na matriz intersticial é de
organizar em redes os colágenos e vários tipos de proteoglicanos. (Perris, 1997; Martins-
Green & Erickson, 1987; Duband et al., 1987). Em particular, o trabalho realizado no
laboratório de Nicole Le Douarin, por Newgreen & Thiery nos anos de 1980, chamou a
atenção para o possível papel da fibronectina, na migração celular. A fibronectina é produzida
por todas as estruturas que se encontram no caminho migratório das células da CN, tais como
o ectoderma, somitos, tubo neural, notocorda e endoderma (Fig. 5).
Figura 5: A fibronectina esta presente nas rotas migratórias
da CN. Nesta secção transversal ao nível do 17° par de
somitos de um embrião de galinha, podemos observar que
algumas células da CN troncal (CNT) migram ventralmente
entre os somitos e o tubo neural (pontos negros indicados
pela flecha branca), enquanto outras adotam o caminho
dorso-lateral entre o ectoderma e o somito (ponto negro
indicado pela flecha vermelha). A imunofluorescência para
fibronectina (a qual aparece em branco ao longo do tubo
neural, somito e notocorda) demonstra que esta proteína
esta presente ao longo de toda a rota migratória das células
da CN
(
Ada
p
tado de New
g
reen & Thier
y,
1980
)
.
Notocorda
Somito
Tubo Neural
CN migrando dorso-lateralmente
CN migrando
ventralmente
28
Quando utilizada como substrato para a cultura de células da CN, a fibronectina
favorece a adesão e migração celular (Rovasio et al., 1983) (Fig. 6A e B). Está bem
estabelecido que as células da CN ligam-se através de um receptor integrina à seqüência de
aminoácidos Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS) presentes na fibronectina (Hynes, 1987; Ruoslahti &
Pierschbacher, 1987). Em particular, a orientação das fibrilas de fibronectina sugere que estas
definem a direção de migração das células da CN. In vitro, fibroblastos em cultura apresentam
microfilamentos de actina que se orientam paralelamente ao padrão de distribuição de
fibronectina, sugerindo que esta molécula pode desempenhar ainda um papel na organização
do citoesqueleto das células (Willingham et al., 1977; Hynes & Destree, 1978).
Figura 6: Os efeitos in vitro da fibronectina sobre a migração das células da CN. Quando o tubo neural é
colocado em cultura, as células da CN destacam-se e migram, e no caso de o substrato ser homogêneo
(vidro), formam uma camada uniforme (A). Se esta superfície (vidro) for recoberta por uma camada de
fibronectina (FN) disposta em bandas paralelas, as células migram preferencialmente por cima das
bandas de fibronectina (B) (Adaptado de Rovasio et al., 1983).
Apesar dos diversos estudos concernentes ao papel das moléculas de matriz
extracelular na migração e adesão das células da CN, raros estudos abordam a influência que
estas moléculas teriam diretamente sobre a diferenciação destas células, sendo esta, portanto,
a primeira problemática evocada nesta tese.
Vidro
Tubo Neural
Células migratorias da CN
A
Notocorda
B
29
1.3 POTENCIALIDADE MESECTODERMAL DA CNC: A ORIGEM DA CABEÇA DOS
VERTEBRADOS
O mapa de destino da CN revelou que o potencial de desenvolvimento das células da
CNC é maior que o das células da CNT, uma vez que as primeiras provêem a cabeça dos
vertebrados com uma enorme gama de células mesenquimais (rever Tabela 1 e Fig. 4). Estas
células foram designadas como “mesectoderma” por Julia Platt em 1893, de maneira à
distingui-las do mesênquima que é derivado da camada germinativa do mesoderma (Plat,
1893).
O transplante da CNC de codornas por sua contraparte no embrião de galinha mostrou
que a maior parte dos elementos cartilaginosos e ósseos da face são derivados das células da
CN (Fig. 7). Apenas as regiões occipital e ótica (parcialmente) do crânio são de origem
mesodermal (Fig. 7C mesoderma cefálico e somítico) (Le Lievre & Le Douarin, 1975;
Johnston et al., 1973; Noden, 1975; Noden, 1978a; Couly et al., 1993; Couly et al., 1996;
Kontges & Lumsden, 1996).
Figura 7: Contribuição da CN para o esqueleto crânio-facial de aves. Vista lateral do esqueleto cefálico de
embrião de 14 dias de ave, mostrando a contribuição da Crista Neural Cefálica para cartilagem (A) e osso
(B) no crânio dos vertebrados. Em (C), podemos observar que o mesoderma cefálico (azul) e o mesoderma
somítico (verde) contribuem apenas com uma pequena porção para o crânio dos Vertebrados. (D)
Embrião de galinha com 11-12 dias evidenciando a contribuição cartilaginosa (coloração azul de alcian) e
óssea (coloração Alizarin Red) da CNC para face dos vertebrados (Retirado de Couly et al., 1993;
Abzhanov et al., 2007; Brito et al., 2006).
Grande parte da derme e componentes conectivos da musculatura facial (tendões) e o
conjuntivo de glândulas (como o timo) são derivados da CN. A CNC também origina
adipócitos, os quais contribuem na formação da orelha e do pescoço (Le Lievre & Le
Osso
C
A
B
Cartilagem
D
30
Douarin, 1975; Billon et al., 2007). A CN fornece ainda miofibroblastos, os quais revestem a
parede de vasos sangüíneos que irrigam a face e os hemisférios cerebrais. É importante
ressaltar, entretanto, que as células da CN não contribuem diretamente para a parede dos
endotélios vasculares (Etchevers et al., 1999) (Fig. 8D). A CNC também provê as meninges
dos hemisférios cerebrais e participa das estruturas conotruncais do coração (Le Lievre & Le
Douarin, 1975; Etchevers et al., 2001) (Fig. 8A-C). A CN do coração tem sido estudada em
detalhe por Margaret Kirby e colaboradores, que designaram a CN dos últimos rombômeros
como Crista Neural Cardíaca (Kirby et al., 1983; Kirby et al., 1985; Kirby & Waldo, 1995).
Em mamíferos, a contribuição da CNC para o esqueleto crânio-facial e estruturas
cardiovasculares foi demonstrada recentemente, através da utilização da estratégia Wnt1 e
Cre-recombinase em camundongos transgênicos (Yamauchi et al., 1999; Jiang et al., 2002;
Chai et al., 2000).
Figura 8: Mapa de destino da crista neural cefálica (CNC) no estágio embrionário de cinco somitos (A) e
sua contribuição para a parede músculo-conectiva na árvore vascular da cabeça (B). As meninges do
prosencéfalo (rosa em B) derivam da CN mesencefálica-diencefálica (Di-Mes), enquanto as meninges do
mesencéfalo e mais caudais do sistema nervoso central (cinza em B) derivam do mesoderma (cinza externo
ao tubo neural em A). (C) Contribuição relativa da crista neural cardíaca (r6 a r8) para as estruturas
conotruncais do coração. (D) Corte transversal da aorta, mostrando a contribuição dos miofibroblastos no
revestimento da aorta (Ao: aorta; PA: artéria pulmonar; WS: septo interventricular) (Retirado de
Etchevers et al., 1999; Etchevers et al., 2001).
A
B
C
D
Ao
Ao
31
1.4 AS PRIMEIRAS EVIDÊNCIAS DA MULTIPOTENCIALIDADE DA CN
Os derivados da CN que contribuem para o sistema nervoso periférico (SNP) e para o
sistema nervoso entérico (SNE) são originados de apenas algumas áreas do eixo neural (ver
mapa de destino na Fig. 3). Entretanto, quando apresentadas a um novo ambiente, as células
da CN apresentam uma grande plasticidade. Por exemplo, a região vagal da CN, localizada
entre os somitos 1 e 7, que normalmente não produz neurônios simpáticos e células
cromafins, é capaz de gerar ambos derivativos quando transplantada heterotopicamente para o
nível troncal entre os somitos 18 e 24 (Le Lievre & Le Douarin, 1975). Em contraste, a CNT é
incapaz de gerar osso ou cartilagem, mesmo quando transplantada para a região cefálica (Le
Lievre et al., 1980). Na época, a conclusão retirada a partir destes experimentos de
transplantes heterotópicos foi a de que o destino de diferenciação das células da CN que
formam o SNP e o SNE não é completamente determinado antes que estas células migrem,
mas ao contrário, permanece plástico até que elas recebam sinais de diferenciação ao final e
possivelmente durante a migração. Estes resultados levantaram a seguinte questão: todas as
células precursoras do SNP tornam-se completamente comprometidas e/ou diferenciadas logo
após encontrarem seus sítios finais, ou algumas permanecem quiescentes indiferenciadas?
Para responder a esta questão, fragmentos dos gânglios sensorial e autonômico de
embriões de codornas de quatro dias foram implantados nos caminhos de migração da CN de
embriões de galinha de dois dias (portanto, no momento em que suas próprias células da CN
estavam migrando). Os neurônios transplantados morreram (provavelmente devido à
necessidade de fatores de crescimento não presentes nos hospedeiros mais jovens). Entretanto,
as células não neuronais dos gânglios implantados migraram e povoaram os gânglios
sensoriais e autonômicos do hospedeiro, onde se diferenciaram em tipos de neurônios e glia
correspondendo ao seu novo ambiente (Ayer-Le Lievre & Le Douarin, 1982; Schweizer et al.,
32
1983; Dupin, 1984; Fontaine-Perus et al., 1988). Estes resultados mostram que após o término
da gangliogênese, a população não-neuronal do gânglio periférico contém células
multipotentes indiferenciadas que podem ser levadas a proliferar, reiniciar a migração e
diferenciar-se no novo ambiente de um embrião mais jovem. Estas células podem ser
consideradas células tronco putativas, uma interpretação que tem sido confirmada por
experimentos in vitro realizados nos últimos anos pelo grupo de Nicole Le Douarin no
modelo de aves e também por outros grupos no modelo de mamíferos (Trentin et al., 2004;
Dupin et al., 2007; Youn et al., 2003).
1.5 ESTUDOS IN VITRO DA MULTIPOTENCIALIDADE DA CN
Apesar dos estudos in vivo terem fornecido muitas pistas no estudo da questão da pré-
determinação versus plasticidade da CN, esta técnica estava restrita a compreender o
comportamento de populações da CN. Portanto, saber como células individuais da CN eram
capazes de integrar sinais que alterassem seu programa de diferenciação e conseqüentemente
seu destino não podia ser revelado por estes estudos, surgindo, desta forma a necessidade de
experimentos clonais in vitro.
O trabalho pioneiro do estudo das capacidades de desenvolvimento da CN através de
clonagem foi desenvolvido por Cohen e Könisberg em 1975. Estes pesquisadores
desenvolveram um método para cultivar clones de células de codorna da CN e demonstraram
que estas células são heterogêneas no que diz respeito ao seu potencial em darem origem a
progenitores pigmentados e não-pigmentados (Cohen & Konigsberg, 1975). Nas ultimas
décadas diversos trabalhos seguiram-se a este, sendo que o grupo de Nicole Le Douarin
especializou-se e tornou-se um dos mais conceituados nesta técnica no modelo de codornas.
Grande parte dos estudos realizados até o momento foi feita com células da CNT de
aves, em condições que permitissem a expressão do pleno repertório proliferativo e de
33
diferenciação destas células. Estes estudos revelaram que a CN é uma estrutura altamente
heterogênea quanto ao seu potencial de desenvolvimento, possuindo uma variedade de
progenitores multipotentes assim como progenitores de potencialidade mais restrita, tais como
os bipotentes (contendo apenas células-gliais e miofibroblastos, por exemplo) ou os
unipotentes, comprometidos desde a emergência do tubo neural a um fenótipo determinado. A
partir da análise de milhares de colônias, um modelo hierárquico da diversificação das
linhagens da CNT surgiu (Fig. 9, à direita) (Sieber-Blum & Cohen, 1980; Sieber-Blum, 1989;
Sieber-Blum, 1991; Dupin & Le Douarin, 1995; Lahav et al., 1998). Juntos, estes estudos
demonstraram que a CNT possui progenitores que podem dar origem a melanócitos, células
gliais e diversos tipos de neurônios do SNP, portanto, recapitulando o repertório dos
derivativos da CNT in vivo. Além disso, demonstraram que quando submetidos a um
ambiente artificial in vitro, podem expressar novas potencialidades que “normalmente” não
estão presentes in vivo, como é o caso dos miofibroblastos. Entretanto, este conceito tem sido
revisto pelo grupo de Sean Morrison, o qual demonstrou que o endoneuro, camada que
participa do revestimento de nervos, é composto de miofibroblastos derivados da crista neural
troncal (Joseph et al., 2004).
Ensaios clonais também foram conduzidos com a CNT de ratos e camundongos, onde
progenitores multipotentes capazes de darem origem à glia, a neurônios autonômicos e a
miofibroblastos foram identificados (Stemple & Anderson, 1992; Ito et al., 1993; Rao &
Anderson, 1997; Paratore et al., 2001). Stemple & Anderson demonstraram pela primeira vez,
através de subclonagens, que as células da CN são capazes de se auto-renovarem in vitro
(gerarem elas mesmas e também uma progênie diferenciada). É importante salientar que a
auto-renovação é uma característica fundamental para a definição de célula-tronco (Stemple
& Anderson, 1992).
34
Estudos clonais também foram desenvolvidos com células da CNC e demonstraram
que assim como observado nos estudos realizados com a CNT, formam uma população
altamente heterogênea quanto às suas capacidades de desenvolvimento Além disso,
recentemente foi demonstrado pela primeira vez no modelo de aves que tanto as células da
CNT quanto da CNC são capazes de se auto-renovarem in vitro (Trentin et al., 2004). No
entanto, em culturas de massa, apenas a CNC é capaz de originar derivados mesectodermais
(cartilagem e osso) como observado in vivo (Baroffio et al., 1988). Portanto, considera-se que
a potencialidade da CNC seja superior ao da CNT, uma visão que também tem sido revisitada
depois da descoberta de condrócitos em culturas da CNT (McGonnell & Graham, 2002) e que
será aprofundada nesta tese.
A análise de milhares de colônias em ensaios clonais também permitiu a construção
de um modelo hierárquico de diversificação das linhagens da CNC (Fig. 9 à esquerda).
Células altamente multipotentes capazes de darem origem tanto a derivados mesectodemais
(cartilagem) quanto a células neuronais, gliais e pigmentares foram observadas pela primeira
vez em 1991 pelo grupo de Nicole Le Douarin (Baroffio et al., 1991). Entretanto a quantidade
obtida destes progenitores sempre foi muito baixa (2,5%), não permitindo um estudo
aprofundado dos mecanismos que poderiam regular a diferenciação da CN para o destino
mesenquimal (Baroffio et al., 1991; Trentin et al., 2004). Experimentos in vitro utilizando
diferentes condições de cultivo e diferentes marcadores celulares também revelaram a
existência de progenitores comuns para neurônios, melanócitos, miofibroblastos e condrócitos
na CN cardíaca de codornas (Ito & Sieber-Blum, 1991; Ito & Sieber-Blum, 1993) e
camundongos (Youn et al., 2003).
Entretanto, a baixa proporção encontrada destes progenitores levantou uma grande
questão: existe realmente um precursor comum para as linhagens mesectodermal e neural ou a
linhagem mesectodermal é segregada das outras linhagens da CN no neuroepitélio? Existindo
35
um progenitor comum, seria possível incrementar a quantidade destes clones in vitro de
maneira a se realizar um estudo profundo destes precursores? Esta é a principal problemática
que será evocada na segunda parte desta tese.
Figura 9: Modelo de segregação dos derivados da crista neural cefálica (CNC) e troncal (CNT). Os
progenitores identificados na CN de codornas através de culturas clonais estão classificados de acordo
com o seu número de potencialidades. Os dados obtidos nos últimos 20 anos pelo grupo de Nicole Le
Douarin suportam um modelo hierárquico para a segregação das linhagens da CN, na qual restrições
progressivas de uma hipotética célula tronco (circulo cinza em linhas pontilhadas no topo do modelo da
CNC) dão origem a progenitores oligopotentes e finalmente a progenitores destinados a cada um dos
principais derivados da CN: glia (G); neurônios (N), melanócitos (M), miofibroblastos (F) e condrócitos
(C). Todos os progenitores capazes de darem origem à cartilagem (em azul) estão presentes na CNC, mas
não na CNT. Certos progenitores oligopotentes exibem a capacidade de se auto-renovarem in vitro
(flechas curvas vermelhas) de acordo com Trentin et al., 2004 (Adaptado de Trentin et al., 2004).
1.6 FATORES DE CRESCIMENTO E CITOCINAS QUE ATUAM SOBRE OS
PROGENITORES DA CN
As informações acima discutidas suscitam a questão: qual é a natureza dos fatores
(intrínseca ou extrínseca) que regula a escolha ou destino final de diferenciação das células da
CN? Em outros termos: como uma célula particular da CN decide se tornar um neurônio
sensorial ao invés de um melanócito, ou dar origem a um miofibroblasto ao invés de um
neurônio entérico?
GN
GNF GNM
GM
GF
N G M
F
GMF
GN
MF
GN
MFC
GN
MC
GN
MF
GN
GNF
GNM
GM
FC
GM
GF
N
G M F
GNC GMC
GC
C
CNT
CNC
36
Sendo a CN heterogênea em sua potencialidade, podemos supor a existência e a ação
de fatores “instrutivos”, dirigindo a escolha da diferenciação destas células multipotentes. Por
outro lado, podemos supor também a existência de fatores “seletivos” que permitam a
sobrevivência e a diferenciação de determinados precursores. Uma grande quantidade de
estudos in vitro bem como análise de mutações em camundongos têm levado à identificação
de diversos fatores de crescimento e moléculas (ou receptores) sinalizadoras implicadas no
desenvolvimento de derivados específicos da CN.
De uma maneira geral, estes fatores encontram-se nos ambientes migratórios e de
diferenciação da CN, exercendo um papel parácrino sobre aquelas que possuem seu receptor
especifico. Um primeiro exemplo é a diferenciação dos melanócitos da pele, extensamente
estudada graças à existência de camundongos mutantes apresentando o fenótipo de manchas
brancas na pelagem (“white-spotted”). Este estudo demonstrou que a melanogênese é
estimulada por SCF (“Stem Cell Factor”) e ET3 (“Endotelina 3”) os quais ativam
respectivamente os receptores c-kit e ETRB/B2 presentes na superfície das células da CN.
ET3 e SCF são sintetizados pelo ectoderma superficial em estágios precoces do
desenvolvimento agindo desta forma sobre as células da CNT desde a sua migração (Barsh,
1996; Opdecamp et al., 1998; Yoshida et al., 2001). Em culturas, SCF promove a
sobrevivência de células indiferenciadas e de precursores melanocíticos (Lahav et al., 1994;
Sieber-Blum, 1998). Os melanócitos também dependem das proteínas Wnt, produzidas pelo
tubo neural, tanto para expansão do precursor como para a especificação da linhagem
(Patapoutian & Reichardt, 2000; Hari et al., 2002; Yanfeng et al., 2003). Em culturas de
células da CN, a presença de Wnt3a estimula diferenciação de melanócitos às expensas de
fenótipos neurais (Jin et al., 2001).
Existem também diversos estudos concernentes à determinação do fenótipo glial: a
formação dos gânglios entéricos pelas células da CN é dependente do fator GDNF (“Glial
37
Derived Neurotrophic Factor”) bem como de seus transdutores C-Ret e o receptor GFRα1, e
também da via de sinalização envolvendo o peptídeo (ET3) e seu receptor B (ETRB). Em
camundongos mutantes para estes genes e em humanos com a doença de Hirschsprung’s
(onde estes sinais estão ausentes), a colonização do intestino posterior pelas células da CN é
anormal, provocando a agangliogênese e megacólon (Gershon, 1999; McCallion &
Chakravarti, 2001). Ambos, GDNF e ET3 são produzidos pelo mesênquima do intestino, onde
as células da CN migram e se diferenciam. GDNF provê sinais de sobrevivência/diferenciação
e quimiotaxia para as células da CN que expressam C-Ret (Natarajan et al., 2002; Young et
al., 2001), enquanto ET3 retarda a maturação neuronal precoce, permitindo desta forma a
colonização rostro-caudal completa do intestino por precursores da CN (Wu et al., 1999). A
diferenciação de vários tipos de neurônios entéricos também é regulada pela neurotrofina 3
(NT3) (Chalazonitis et al., 2001) e BMP (Chalazonitis et al., 2004).
A gliogênese no SNP é regulada pela neuroregulina HER1 (um fator de crescimento
da família EGF “Epidermal Growth Factor”), que age através da família dos receptores ErbB
(Jessen & Mirsky, 2002). Her1 promove instrutivamente a gliogênese das células da CNT de
mamíferos, in vitro (Morrison et al., 1999; Hagedorn et al., 1999; Shah et al., 1994; Paratore
et al., 2001).
Finalmente, podemos considerar a diferenciação neuronal da CN, na qual os BMPs
(Bone Morphogenetic Proteins) e o TGFβ (Transforming Growth Factor β) são os principais
reguladores. Foi demonstrado, in vitro, que BMP2, BMP4 e TGFβ, dirigem as células da CN
para o destino neuronal-simpático neuroadrenérgico. In vivo, estas moléculas são expressas na
região da aorta dorsal e instruem as células da CN a adotarem o destino neural-simpático,
quando da sua agregação próxima a aorta dorsal (Hagedorn et al., 1999; Hagedorn et al.,
2000; Shah et al., 1994). Evidências sugerem que isto também é valido para os neurônios
parassimpáticos colinérgicos e entéricos (Muller & Rohrer, 2002). Além disso, apenas
38
recentemente foi demonstrado que Wnt possui um papel instrutivo sobre neurônios sensoriais
(Lee et al., 2004a).
Como podemos observar, a maioria dos estudos relacionando
especificação/determinação do destino das células da CN está relacionada com os fenótipos
neurais e melanocíticos, inclusive porque grande parte destes trabalhos foi realizado com
células da CNT, onde não se observam derivados condrocíticos. Alguns trabalhos
demonstram o papel das BMPs e TGFβ no aparecimento in vitro de miofibroblastos a partir
de células multipotentes da CNT, (Shah et al., 1994; Shah et al., 1996; Jain et al., 1998).
Portanto, apesar de alguns trabalhos demonstrarem que algumas moléculas sinalizadoras, tais
como FGF2 e Notch promovem a condrogênese a partir de células da CNC, em culturas de
massa (Sarkar et al., 2001; Nakanishi, 2007), não existe nenhum estudo clonal até o momento
no qual um fator de crescimento ou molécula sinalizadora poderia especificar as células da
CN em favor do fenótipo condrocítico.
1.7 SONIC HEDGEHOG (Shh) E A CN
1.7.1 Shh um Morfógeno de Múltiplas Funções
Como muitos dos avanços em nossa compreensão atual do desenvolvimento animal, a
família de genes hedgehog (hh), deve sua descoberta aos estudos em Drosophila, neste caso
particularmente ao trabalho pioneiro de Nüsslein-Volhard e Wieschaus em 1980 (Nusslein-
Volhard & Wieschaus, 1980). Em vertebrados, os hh foram descritos pela primeira vez apenas
13 anos mais tarde, graças à colaboração de três grupos trabalhando em modelos animais
distintos (peixe, galinha e camundongo) (Krauss et al., 1993; Riddle et al., 1993 ; Echelard et
al., 1993). Em camundongos, três genes foram identificados: Desert hedgehog (Dhh), Indian
hedgehog (Ihh) e Sonic hedgehog (Shh) (Echelard et al., 1993).
39
Os efeitos precisos da sinalização hh sobre as células estão sob constante e minuciosa
investigação. Entretanto, a última década de estudos evidenciou claramente que as proteínas
hh podem evocar diferentes respostas dependendo do contexto em que operam (ver Tabela 2).
No caso de Shh, tem sido demonstrada sua função vital não só no desenvolvimento crânio-
facial e cerebral, mas também na diferenciação, proliferação e sobrevência de diferentes tipos
celulares, inclusive de células-tronco em diferentes órgãos (revisado por Ingham &
McMahon, 2001). Além disso, distúrbios na sinalização Shh têm demonstrado exercer um
papel fundamental no desenvolvimento de diversos tipos de câncer, entre os quais de
pâncreas, próstata, cólon, intestino, pele e sistema nervoso (Wetmore, 2003). Recentemente o
grupo de Ruiz y Altaba, demonstrou que gliomas humanos e suas respectivas células-tronco
cancerígenas requerem a ativação da via de sinalização de Shh para proliferação, sobrevida,
auto-renovação e tumorogenicidade (Clement et al., 2007).
Tabela 2: Shh exerce diferentes funções em diversos contextos celulares durante o desenvolvimento
embrionário
Tecido/tipo celular ou órgão Função
Angiogênese/vasculogênese
Indução da angiogênese.
Células sanguíneas
Proliferação de células-tronco, modulação hematopoiética e
diferenciação de timócitos.
Osso e Cartilagem
Indução de fatores condrocíticos precoces durante a proliferação de
somitos e sobrevivência de precursores condrogênicos.
Cerebelo
Proliferação de precursores das células granulares, diferenciação da
Glia de Bergmann.
Olho
Estimula e inibe a neurogênese retiniana, proliferação astrocitária no
nervo óptico e proliferação de células precursoras da retina.
Vísceras
Separação da traquéia e esôfago, padronização do eixo ântero-posterior
do tubo do intestino. Proliferação do mesênquima, inibição da
diferenciação do mesênquima, padronização radial do tubo do intestino.
Gônadas/Genitália Externa
Desenvolvimento das células peritubulares, maturação dos testículos,
interações das células Sertoli-Leydig, desenvolvimento da linhagem
germinativa masculina; masculinização.
40
Cabelos/pêlos
Morfogênese do pêlo/cabelo, polaridade do pêlo.
Coração
Morfogênese cardíaca.
Assimetria Lateral
Regulação da assimetria direita-esquerda.
Membros
Padrão ântero-posterior do esqueleto, crescimento do broto dos
membros.
Pulmão
Arborização do epitélio, proliferação e sobrevivência do mesênquima.
Músculo
Indução/proliferação/sobrevivência de precursores do músculo,
identidade do tipo de fibra muscular, regulação da diferenciação do
músculo liso.
Crista Neural
Sobrevivência de Crista Neural Cefálica, morfogênese crânio-facial,
proliferação/diferenciação de células simpáticas.
Neurônios
Indução de tipos neuronais ventrais específicos da medula espinhal
proliferação/sobrevivência/morte de precursores neurais e gênese de
neurônios dopaminérgicos na substância negra.
Oligodendrócitos
Proliferação/diferenciação/sobrevivência de precursores
Olfatorio
Formação da via respiratória
Pâncreas
Indução da formação do anlageno pancreático, produção de insulina.
Hipófise
Proliferação e determinação do tipo celular.
Próstata
Crescimento e morfogênese do ducto.
Dente
Crescimento, polaridade e morfogênese.
Língua
Manutenção/renovação das papilas gustativas.
FONTE: Adaptado Ingham & McMahon, (2001)
O morfógeno Shh pode atuar a curta ou a longa distância e dependendo da
concentração, pode evocar respostas moleculares distintas nas células. O processamento e a
41
via de sinalização das proteínas Hedgehog é altamente conservada desde Drosophilas até
mamíferos e envolve numerosos cofatores, como mostrado na figura 10:
Figura 10: A via de sinalização Hedgehog (Hh). A clivagem auto-catalítica da proteína presursora de Hh
dá origem a um peptídio sinalizador (HhN) o qual apresenta uma molécula de colesterol modificado. Este
peptídeo é palmitolado por Skinny Hedgehog (Ski) e é exocitado das células por Disp (Drosophila) ou
Disp1 (mamíferos). Em Drosophila, o peptídeo lipofílico HhN é incorporado em complexos de lipoporina
(não mostrados) e distribuídos para outras células com a ajuda de proteoglicanos de heparan sulfato
(Dlp/Gpc). Na ausência de Hh, a proteína transmembranar Ptc (Drosophila) ou Ptch1 (mamíferos) exerce
um papel repressor sobre outra proteína transmembranar – Smoothened (Smo). Membros da família de
receptores CDO/BOC, incluindo Ihog/Boi facilitam a ligação de Hh e a inibição de Ptc ou Ptch1,
permitindo a ativação de Smo. Em Drosophila, Dlp também parece facilitar a resposta a Hh. Smo media
através da regulação de Costal2, Fu e Su(fu) a ativação ou o processamento proteolítico de Ci (Drosophila)
ou Gli (mamíferos). As proteínas da família Ci/Gli ativam (Ci
A
/Gli
A
) ou reprimem (Ci3
R
/Gli3
R
) a
transcrição de genes específicos (Adaptado de Varjosalo & Taipale, 2007).
1.7.2 Shh um Candidato para a Regulação da Condrogênese das Células da CNC
Sonic Hedgehog pode ser considerado um fator de sinalização fundamental para o
desenvolvimento crânio-facial. Shh é expresso em um padrão preciso no epitélio do primórdio
facial, bem como no ectoderma e endoderma dos arcos branquiais durante a migração das
células da CNC. No homem, uma das anormalidades crânio-facial mais estudadas é a
holoprosencefalia (HPE), uma malformação congênita que é associada com perturbações na
via de sinalização de Shh e que ocorre quando o prosencéfalo falha em se separar em dois
Célula Secretora
Célula Alvo
Degradação
Proteolítica
42
hemisférios cerebrais distintos (Marcucio et al., 2005). Esta síndrome apresenta-se das mais
variadas formas, desde a mais extrema na qual os indivíduos são cíclopes, podendo apresentar
uma probóscide e uma única vesícula prosencefálica, até uma forma menos severa, em que os
indivíduos apresentam uma aparência facial quase normal.
O papel de Shh no desenvolvimento da cabeça foi evidenciado pela primeira vez em
camundongos mutantes do gene Shh, que apresentam holoprosencefalia, ciclopia e ausência
do esqueleto cefálico. A mutação de Shh é tão drástica que os camundongos Shh
-/-
apresentam
uma probóscide no lugar da cabeça e vários elementos cartilaginosos e ósseos estão faltando
ao longo do corpo, tais como a coluna espinal (Chiang et al., 1996) (Fig. 11).
Figura 11: O primeiro camundongo mutante de Shh. Coloração para evidenciar cartilagem (azul) e ossos
(marrom) de um embrião normal de camundongo ao estágio embrionário de 18,5 dias (A, vista lateral) e
de um camundongo mutante nulo para Shh
-/-
(B, vista dorsal) (Adaptado de Chiang et al., 1996).
Para investigar o papel da sinalização de Shh sobre as células da CNC durante o
desenvolvimento crânio-facial sem interromper o padrão de desenvolvimento neural inicial,
Jeong e colaboradores retiraram a habilidade especificamente das células da CNC em
responder a Shh através da criação de camundongos mutantes condicionais nulos para a
proteína Smoothened (Wnt-1-Cre; Smo
N/C
). Embriões carregando a mutação condicional para
Smoothened exibiram extensa perda de estruturas crânio-faciais. Esta estratégia experimental
demonstrou a importância do requerimento de Shh para as células pré-migratórias da CNC e
A
B
43
dos papéis da sinalização hh no desenvolvimento crânio-facial durante a embriogênese (Jeong
et al., 2004).
Em 1999, Bronner-Fraser e colaboradores demonstraram que a injeção de anticorpos
contra Shh no mesênquima crânio-facial de aves afeta drasticamente o desenvolvimento do
tubo neural cefálico e dos arcos branquiais, causando uma redução generalizada no tamanho
da cabeça dos embriões. Este efeito demonstrou na verdade ser resultado do aumento da
morte das células da CNC (Ahlgren & Bronner-Fraser, 1999). Em 2004, o mesmo grupo
demonstrou que a aplicação exógena de Shh, pode resgatar a morte celular e a conseqüente
perda da massa fronto-nasal ocasionada pela exposição de embriões de galinha ao etanol
(Ahlgren et al., 2002).
Recentemente, em seu pós-doutoramento no laboratório de Nicole Le Douarin, José
Brito investigou os efeitos da retirada de Shh das fontes mais anteriores deste morfógeno
(como a placa pré-cordal e o endoderma ventral do intestino anterior), antes do início da
migração das células da CN para o primeiro arco branquial (Brito et al., 2006). Brito realizou
a ablação cirúrgica do cérebro anterior (incluindo o endoderma do intestino anterior) do
embrião de galinha entre os estágios de 5 a 10 somitos. Quando a operação é realizada no
estágio de 6 somitos, leva à ausência da mandíbula inferior, devido à morte massiva por
apoptose das células da CN (Fig 12B). Quando a operação é realizada entre 8-10 somitos,
apenas um bico inferior desenvolve-se (Fig 12C). A implantação de bilhas impregnadas de
Shh próximas do endoderma faringeal após a excisão do cérebro anterior realizada no estágio
de 6 somitos resgata a morte celular da CN no primeiro arco faringeal e permite o
desenvolvimento de um bico inferior, bem como da maxila e seus elementos esqueléticos (Fig
12D).
44
Figura 12: Papel de Shh no desenvolvimento facial e na esqueletogênese do bico de aves a 11-12 dias de
desenvolvimento. (A) Embrião de galinha normal (B) Embrião de galinha que sofreu ablação das células
da CN no estágio de 6 somitos (C) Embrião de galinha que sofreu ablação das células da CN no estágio de
8 somitos (D) Embrião de galinha que sofreu ablação das células da CN no estágio de 6 somitos e
concomitantemente recebeu o implante (no endoderma faringeal) de uma bilha de Shh (Adaptado de Brito
et al., 2006).
Este tratamento ainda mostrou induzir (de forma retro-alimentadora) a expressão de
Shh no endoderma do primeiro arco branquial e conseqüentemente a expressão pelo
ectoderma de genes fundamentais para o desenvolvimento facial tais como FGF8, BMP4 e
Pitx1 (Brito et al., 2006). Além disso, mais recentemente em resultados ainda não publicados,
José Brito conseguiu induzir a formação de um bico suplementar em embriões de galinha
simplesmente transplantando células produtoras de Shh em regiões específicas do primórdio
facial (comunicação pessoal).
Juntos, estes estudos demonstram a importância crucial de Shh em promover a
sobrevivência e proliferação das células da CN cefálica e conseqüentemente o
desenvolvimento crânio-facial e nos levou a considerá-lo como um excelente candidato para o
estudo in vitro da condrogênese a partir das células da CNC.
A potencialidade mesênquimal da CN é uma questão que resta muito mal explorada
até o momento. A falta de um sistema de cultivo propício é um dos principais entraves ao
estudo desta potencialidade. Este trabalho busca sanar este problema e compreender aspectos
da segregação e multipotencialidade da CN desconhecidos até o momento. Questões
essenciais restam em aberto a respeito do desenvolvimento da CN: existe realmente um
progenitor comum para derivados tão distintos como células neuronais e condrocíticas? Que
Controle Ablação 6 somitos Ablação 8 somitos Ablação 6 somitos + Shh
A
B
C
D
45
fatores poderiam regular o destino de diferenciação das células da CN em direção aos
derivados mesênquimais, particularmente os cartilaginosos? A multipotencialidade da CN é
constante ao longo do eixo rostro-caudal do embrião? Quais as implicações evolutivas da
multipotencialidade da CN?
Estes aspectos serão abordados nas diferentes partes desta tese e tentarão fornecer
novas pistas ao entendimento atual que possuímos a respeito desta estrutura tão complexa,
que por vezes é considerada como sendo o quarto folheto germinativo, devido a sua
contribuição e importância aos diversos órgãos e tecidos dos vertebrados.
46
1.8 OBJETIVOS
1.8.1 Objetivo Geral
Análise in vitro da multipotencialidade das células da CNT e da CNC com ênfase no
papel de fatores do microambiente sobre os derivados mesenquimais.
1.8.2 Objetivos Específicos
a) Implantação de um sistema de cultura de células da CN a partir de embriões de
codorna no laboratório de Neurobiologia e Hematologia Celular e Molecular, na
Universidade Federal de Santa Catarina;
b) Caracterizar os efeitos de diferentes moléculas de matriz extracelular (fibronectina,
laminina e colágeno IV) sobre a proliferação, sobrevivência e diferenciação dos
diversos derivados da CNT obtidas a partir de embriões de codornas, tais como:
células gliais, neurônios, melanócitos e miofibroblastos. Identificar os tipos de
progenitores gerados em culturas clonais a partir de células da CNT cultivadas
sobre diferentes substratos da matriz extracelular (MEC);
c) Estabelecer um método de cultivo através da utilização de diferentes condições de
microambiente, tais como monocamadas de 3T3 e fatores de sinalização celular,
tais como FGF-2, BMP2, BMP4 e Shh, capazes de favorecer e estimular o
aparecimento de condrócitos em culturas de células da CNC e da CNT;
d) A partir do estabelecimento deste método de cultivo, realizar culturas clonais, com
ênfase na obtenção de derivados altamente multipotentes, bem como
mesenquimais, particularmente condrócitos. A potencialidade dos progenitores
47
(célula fundadora da colônia) será identificada “a posteriori” pela presença de
marcadores celulares e moleculares precoces e de diferenciação fenotípica da CN;
e) Investigar possíveis fatores de sinalização celular que possam agir sobre a escolha
do destino de diferenciação de progenitores multipotentes da CN, com ênfase nos
derivados mesenquimais, particularmente condrócitos. Os estudos de moléculas
sinalizadoras que possam estimular a condrogênese a partir de células da CN são
raros, sobretudo devido à falta de uma metodologia que permita esta abordagem.
48
2 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 PARTE I-EFEITOS DA MATRIZ EXTRACELULAR SOBRE AS CÉLULAS DA CNT
2.1.1 Animais
Todo o trabalho experimental foi realizado com embriões de codornas (Coturnix
coturnix japonica). Utilizamos ovos fecundados obtidos no biotério do Laboratório de
Neurobiologia e Hematologia Celular e Molecular (LNH) da Universidade Federal de Santa
Catarina. Os procedimentos foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animal –
UFSC, protocolo 338/CEUA e 23080.007342/2005-26/UFSC. Foram utilizados, em média,
30 embriões por experimento nos estágios de desenvolvimento de 18-25 somitos para a
obtenção das células da CNT (estágios 15/16 Hamburger & Hamilton, 1992). O período de
incubação dos ovos para obtenção dos embriões nos estágios de desenvolvimento acima
mencionados foi de 48 horas a 37,8ºC em chocadeira com umidade relativa de 65%.
2.1.2 Cultura de Células da CNT de Codornas
2.1.2.1 Culturas primárias
As culturas primárias de células da CN provenientes de embriões de codornas foram
realizadas como descrito previamente por Trentin et al. 2004, com algumas modificações.
Inicialmente, foram isolados explantes de tubo neural no seguinte estágio: 18-25 somitos
(estágios 15/16 de Hamburger & Hamilton, 1992) para obtenção de células da CN da região
troncal de embriões de codorna. Os tubos neurais foram inicialmente dissociados em solução
49
de pancreatina diluída em tampão fosfato salina (PBS) (1:4 v/v) (Sigma) com o objetivo de
remover todo o ectoderma, mesoderma, endoderma e somitos circundantes. Os tubos foram,
então, colocados em placas de cultura (Corning - 35mm) revestidas com colágeno IV (Sigma),
fibronectina (Invitrogen) ou laminina (Invitrogen), todos na concentração de 20 μg/ml,
conforme instruções dos fabricantes. Os tubos neurais foram mantidos no meio de cultura
Minimum Essential Medium Alpha Medium (αMEM - Gibco) suplementado com 10% de soro
bovino fetal (SBF), 2% de extrato de embrião de galo, acrescido de hormônios e fatores de
crescimento [Transferrina (10 mg/ml), Hidrocortizona (0,1 mg/ml), Glucagon (0,01 ng/ml),
Insulina (1 ng/ml), T
3
(triiodotironina) (0,4 ng/ml), EGF (Fator de Crescimento Epidérmico)
(0,1 ng/ml), FGF2 (Fator de Crescimento de Fibroblastos) (1 ng/ml)], em estufa úmida (95%)
a 37
o
C, 5% CO
2
. Este meio rico em hormônios e fatores de crescimento é comumente
chamado de meio de clonagem (Baroffio et al., 1991; Trentin et al., 2004) e será referido
desta forma posteriormente – MlCl.
2.1.2.2 Culturas secundárias
As culturas secundárias das células da CN foram realizadas após as 24 horas de
migração da CN na cultura primária. Os tubos neurais foram removidos e descartados e as
células da CN remanescentes foram descoladas com solução de tripsina (0,25%) e EDTA
(0,02%) em PBS, pH 7,4 e recuperadas através de bloqueio em meio de cultura contendo 10%
SBF seguido de centrifugação (500 X g, 5 minutos). Nas culturas secundárias, foram
semeadas 450 ou 600 células por poço em “LabTek” de plástico de 8 poços (Nunc) revestidos
com os substratos de matriz extracelular: fibronectina, laminina ou colágeno IV, todos na
concentração de 20 μg/ml, conforme instruções dos fabricantes. As culturas foram mantidas
por 3, 6 ou 9 dias nas condições acima com trocas do meio de cultivo (MlCl) a cada 3 dias.
50
2.1.3 Análise da Migração Celular
A medida do halo de migração das células da CN foi analisada após 24 horas de
cultura primária sobre os substratos de fibronectina, laminina e colágeno IV. A análise da
migração foi efetuada pela medição da área ocupada pelo explante de tubo neural e as células
migradas em volta dele, subtraído pela área ocupada pelo tubo neural, usando o software
Universal Desktop ruler 2.8 (Avpsoft.com). A morfologia das células foi analisada por
observação em microscópio de contraste de fase, comparando a morfologia das células
cultivadas nas diferentes condições de MEC.
2.1.4 Análise da Proliferação Celular
A proliferação celular foi analisada por incorporação com BrdU (5-bromo-2-
dioxiuridina), um análogo da timina que, quando acrescido ao meio, serve como um substituto
da timidina em células que estão em divisão celular. Foram realizadas culturas primárias e
secundárias como exposto anteriormente e mantidas igualmente nas mesmas condições acima
descritas por 3, 6 ou 9 dias. Foi acrescentado ao meio 1 μg/ml de BrdU, e mantido durante as
últimas 24 horas de cada cultura. As células foram fixadas com paraformoldeído (4%) em
PBS por 20 min. As culturas foram lavadas duas vezes com água destilada e incubadas com
HCl (2N) a 37% por 30 min. Em seguida, as culturas foram lavadas uma vez com água
destilada e mais 3 vezes com PBS, todas a temperatura ambiente. Após essas últimas
lavagens, as células foram incubadas com o anticorpo monoclonal IgG1 anti-
Bromodioxiuridina na diluição de 1:1000 (Martinez & Gomes, 2005) e o conjugado
fluorescente para visualização em microscópio epifluorescente. As células totais foram
marcadas com o corante nuclear fluorescente 4’,6- diamidino-2-fenilindol dihidrocloride
51
(DAPI - Sigma). As marcações foram visualizadas e fotografadas em microscópio
epifluorescente (Olympus BX40). O índice mitótico foi calculado contando-se a porcentagem
de células marcadas em pelo menos 20 fotografias de diferentes campos (ampliação de 10x)
por condição.
2.1.5 Análise da Morte Celular
O efeito da MEC sobre a mortalidade das células foi analisado por incorporação do
marcador de morte celular, Sytox green (Sigma). O corante fluorescente verde Sytox é uma
molécula altamente reativa que se liga ao material genético de células com membrana
plasmática rompida sem atravessar a membrana das células vivas e possui acoplada uma
molécula de fluoresceína isotiocianato que quando excitada pela luz UV emite fluorescência
verde. Foram realizadas culturas primárias e secundárias com duração de 6 dias, como
descrito acima. As culturas foram lavadas com tampão HEPES, pH 7,4 e incubadas com Sytox
green (Invitrogen) diluído 1:20.000 em tampão HEPES durante 10 min, em câmara escura.
Após duas lavagens com PBS, as culturas foram fixadas com paraformoldeído (4%) diluído
em PBS e marcadas com DAPI. As marcações foram visualizadas e fotografadas em
microscópio epifluorescente (Olympus BX40). A mortalidade celular foi calculada pela
proporção das células Sytox positivas em relação às células totais (marcadas com DAPI), pela
contagem de pelo menos 20 fotografias de diferentes campos por condição (ampliação de
10x).
52
2.1.6 Análise Imunocitoquímica
As culturas secundárias foram fixadas com paraformaldeído 4% durante 20 min,
lavadas 3 vezes com PBS e mantidas por 15 min com PBS-Triton X100 (0,3%). A biotina
endógena das células foi bloqueada com tampão TNB (Roche) por 20 min, e em seguida o
núcleo das células foi visualizado com o corante fluorescente DAPI (diluído 1:10.000 em
H2O MiliQ) incubado por 1 minuto. Posteriormente, as células foram submetidas à reação
imunocitoquímica utilizando-se marcadores específicos para diferentes fenótipos que a CN
pode originar. Para identificação de melanoblastos/melanócitos as culturas foram incubadas
durante 12 horas, à 4°C com o anticorpo MelEM (Melanoblast-melanocyte early marker)
desenvolvido em camundongo (IgG1) e que se liga a células pré-melanocíticas (Nataf et al.,
1993). Além disso, os melanócitos são facilmente identificáveis em microscopia de contraste
de fase pela presença do pigmento melanina. As células gliais foram identificadas com o
anticorpo IgG1 desenvolvido em camundongo contra proteína mielínica, específico para
célula de Schwann de aves (Schwann myelin protein - SMP) (Dulac et al., 1992). Para o
reconhecimento das células miofibroblásticas, foi utilizado um anticorpo monoclonal IgG2a
anti-actina de músculo liso (α-Smooth muscle actin – α-SMA) (Sigma) na diluição de 1:300.
Foram utilizados anticorpos secundários anti-imunoglobulinas específicas de
camundongo ou coelho ligados ao isotiocianato de fluoresceína (FITC), ao Texas Red
(TXRD) ou à biotina, nas diluições de 1:75 a 1:100. Quando utilizados anticorpos secundários
ligados à biotina, foi utilizado o kit de amplificação Tiramida segundo procedimento descrito
pelo fabricante (Tyramide Signal Amplification – TSA™ Fluorescein System NEN). As
marcações fluorescentes da expressão fenotípica dos derivados da CN foram observadas e
fotografadas em microscópio de epifluorescência Olympus BX 40. Foram analisadas pelo
menos 20 fotografias de diferentes campos por condição por experimento. O número total de
53
células foi obtido por contagem direta dos núcleos das células marcadas. As proporções da
expressão dos marcadores específicos foram analisadas pela porcentagem de células marcadas
em relação às células totais, nas diferentes condições de culturas analisadas.
2.1.7 Análise Estatística
As diferenças entre os valores médios por campo obtidos nas culturas analisadas
(média de 3 à 5 experimentos ou, em alguns casos, apenas o valor médio de um experimento)
foram avaliadas por ANOVA de uma via, seguido do teste de Bonferroni. Foi também
utilizado o teste t de student, em determinadas análises. Todos as análises estatísticas foram
realizadas através de software estatístico GraphPad Prism 4
®
.
Figura 13: Esquema representativo da Parte I da Metologia
Culturas Primárias
sobre diferentes
moléculas da matriz
extracelular
Embriões
de Codorna
15-25 somitos
Células da CNT
recuperadas
Imunocitoquímica para
observação de células
gliais, melanócitos e
miofibroblastos
Culturas Secundárias sobre
diferentes moléculas da matriz
extracelular
Culturas de massa
450 células/poço
Culturas Clonais
Meio de Clonagem
54
2.2 PARTE II–EFEITOS DE SHH SOBRE AS CÉLULAS DA CNC E CNT
2.2.1 Embriões de Codorna
Ovos galados, obtidos na empresa “Cailles de Chanteloup” foram colocados a incubar
por 33 horas a 37,8ºC em chocadeira com umidade relativa de 65%. Foram utilizados, em
média, 20-30 embriões por experimento nos estágios de desenvolvimento de 6-9 somitos para
a obtenção das células da crista CNC (estágios 8/9, segundo Hamburger & Hamilton, 1992).
2.3 CULTURA DE CÉLULAS DA CNC E CNT DE CODORNAS
2.3.1 Culturas Primárias
Com o objetivo de realizar experimentos com a CNC, tubos neurais no estágio de 6-9
somitos foram isolados entre a região mesencefálica até o 4° par de somitos (ao nível do
rombômero 8). Estes explantes foram dissociados em solução de pancreatina e colocados em
placas de cultura (Corning – 35mm) revestidas com colágeno I (BD Biosciences), na
concentração de 20 μg/ml, conforme instruções do fabricante. Os tubos neurais foram
mantidos por 15 ou 24 horas em meio de cultura DMEM (Dulbecco Modified Eagle's
Minimal Essential Medium) suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF), em estufa
úmida (95%) à 37
o
C, 5% CO
2
. Para as culturas de CNT, os mesmos estágios embrionários e
procedimentos de isolamento foram adotados, tal como descrito na parte I dos Materiais e
Métodos (2.1.2.1). Os tubos isolados foram colocados diretamente sobre placas de plástico
(Corning - 35 mm) e mantidos em DMEM 10% SBF por 24 horas.
55
2.3.2 Culturas Secundárias de Massa e Clonais
Após os períodos de migração em culturas primárias acima descritos para cada
estrutura, os tubos neurais foram removidos e descartados e as células da CN remanescentes
foram descoladas com solução de tripsina (0,25%) e EDTA (0,02%) em PBS, pH 7,4 e
recuperadas através de bloqueio em meio de cultura contendo 10% SBF seguido de
centrifugação (500 X g, 5 minutos). Subseqüentemente, para as culturas de massa, 400 (para
CNC) ou 800 (para CNT) células por poço foram semeadas sobre monocamadas de
fibroblastos 3T3 de camundongos Swiss (Barrandon & Green, 1985). A densidade de células
3T3 por poço variou conforme os experimentos entre 12.000 e 24.000 células/poço em placas
de 96 poços (TPP). As células 3T3 tiveram a proliferação inibida pela adição do antibiótico
mitomicina (4 µg/ml) por 3 horas e 30 minutos a 37°C (Baroffio et al., 1988), este tratamento
foi realizado cerca de 24 horas antes da semeadura das células da CN.
As células da CN foram mantidas em meio de cultura controle: DMEM 10% SBF ou
tratadas com 1, 10 e 100 ng/ml da proteína recombinante de camundongo N-Sonic Hedgehog
- Shh (R&D Systems). Com o objetivo de bloquearmos a sinalização de Shh, adicionamos o
alcalóide ciclopamina (5 µM/ml) (Toronto Research Chemicals) em algumas culturas da
CNC. Esta droga inibe a sinalização hedgehog, ligando-se especificamente ao receptor
Smoothened (Taipale et al., 2000). Alguns experimentos da CNC foram realizados com o
meio condicionado contendo Shh obtido a partir do cultivo da linhagem de fibroblastos de
codorna (QT6), transfectada com o gene de camundongo de Shh (Brito et al., 2006). Ainda
em culturas iniciais da CNC adicionamos as proteínas FGF2, BMP2 e BMP4 todos na
concentração de 10 ng/ml e adicionadas ao meio de clonagem (MlCl) descrito na parte I dos
materiais e métodos (seção 2.1.2.1.).
56
Ensaios de proliferação celular foram realizados adicionando a molécula BrdU
(Sigma) em meio de cultura (v/v 1:1000) e mantido em intervalos variando de 1 a 4 horas.
Para realização das culturas clonais, pipetas de vidro (Pipetas Pasteur) tiveram suas
pontas afinadas sob a chama de bico de Bunsen com o objetivo de produzir as chamadas
“micropipetas”. Acoplamos borrachas de silicone a estas micropipetas com o objetivo de
controlar a força de sucção realizada sobre as células da CN. As células da CN isoladas e
colocadas numa densidade extremamente baixa (cerca de 1000 células em placas de 35 mm)
foram clonadas sob controle microscópico com auxilio destas micropipetas. Nas culturas
clonais, foi adicionado ainda 2% de extrato de embrião de galinha ao meio de cultivo, para
permitir a sobrevivência dos clones.
As culturas foram mantidas em estufa úmida (95%) a 37
o
C, 5% CO
2
no intervalo de
tempo de 2 a 10 dias, com trocas periódicas do meio de cultivo a cada 2-3 dias. Após estes
diferentes períodos as culturas foram fixadas com 4% de paraformaldeido para a realização de
imunocitoquimica ou hibridização in situ.
2.4 IMUNOCITOQUÍMICA E DETECÇÃO DE NÓDULOS DE CARTILAGEM
As reações imunocitoquímicas foram realizadas como já exposto na parte I dos
materiais e métodos (seção 2.1.6), entretanto a identificação de novos fenótipos e
conseqüentemente a utilização de novos anticorpos não listados na referida seção foram
empregados nestes experimentos. Inicialmente, o núcleo das células foi visualizado com o
corante fluorescente Hoescht (Sigma), o qual permite distinguir o núcleo das células de
codorna do núcleo das células de camundongo (3T3). As células gliais além de serem
identificadas com o anticorpo SMP (Dulac et al., 1992), também foram identificadas com o
anticorpo monoclonal IgM anti-HNK1 (Human Natural Killer 1) (Abo & Balch, 1981). Os
57
neurônios e células adrenérgicas foram detectados através dos anticorpos monoclonais IgG1
β-tubulina III (Chemicon) na diluição 1:1000 e IgG2a Tirosina Hidroxilase (Fauquet & Ziller,
1989), respectivamente. Melanoblastos e miofibroblastos, foram identificados através do
anticorpo MelEM e αSMA, respectivamente como já descrito anteriormente (parte I, seção
2.1.6). Para o reconhecimento de condrócitos foi utilizada a simples microscopia de fase uma
vez que os nódulos de cartilagem podem ser facilmente reconhecidos devido às suas
estruturas tridimensionais, presentes a partir de 5-6 dias de cultivo. A observação destes
nódulos pode ser facilitada através do corante azul de alcian (3%), pH 2,5. Para uma maior
especificidade na detecção da cartilagem, sobretudo condrócitos individuais ou agregados em
pequenos grupos, foi realizada imunocitoquímica com os anticorpos monoclonais IgM sulfato
de condroitina (Sigma) diluição de 1:1.600 e IgG2a colágeno tipo II (Chemicon) na diluição
de 1:100. Para a identificação das células em proliferação, foi utilizado o anticorpo
monoclonal IgG1 anti- BrdU (Sigma; 1:1000) e o anticorpo policlonal desenvolvido em
coelho anti-fosfo histona H3 (Sigma; 1:1000). A fosfo-histona H3 marca as células na fase M
da mitose. Foram utilizados anticorpos secundários anti-imunoglobulinas específicas de
camundongo ou coelho ligados ao isotiocianato de fluoresceína (FITC), Texas Red (TXRD)
ou biotina (Southern Biotechnologies) na diluição de 1:75 a 1:100. Quando utilizados
anticorpos secundários ligados à biotina, foi utilizado o kit de amplificação Tiramida segundo
procedimento descrito pelo fabricante (Tyramide Signal Amplification – TSA™ Fluorescein
System NEN). As marcações fluorescentes foram observadas e fotografadas em microscópio
de epifluorescência Olympus BX 40. O número total de células foi obtido pela contagem
direta dos núcleos das células marcadas. As proporções da expressão dos marcadores
específicos foram analisadas pela porcentagem de células marcadas em relação às células
totais, nas diferentes condições de culturas analisadas. As quantificações da quantidade e
58
freqüência de nódulos de cartilagem foram realizadas a 6 e 10 dias de cultura através da
microscopia de fase.
2.5 IMUNOCITOQUÍMICA DE CULTURAS CLONAIS
Para identificação dos clones foram realizas reações imunocitoquímicas seqüenciais
com os anticorpos primários e secundários detalhados anteriormente. Inicialmente foram
identificados os poços positivos para clones (os poços nos quais os clones sobreviveram e
proliferaram) através da visualização do núcleo das células com o corante fluorescente
Hoescht. Todos os poços positivos foram permeabilizados com PBS-Triton X100 (0,3%) por
20 min e logo em seguida foram incubados por 12 horas a 4°C com o anticorpo monoclonal
MelEM (IgG1) para a identificação de melanoblastos. Após este período, as culturas foram
lavadas 3 vezes com PBS-Tween 0,05% e incubadas por 1 hora à temperatura ambiente com
anticorpo secundário anti-IgG1 (na diluição de 1:75 em PBS) ligado ao isotiocianato de
fluoresceina (FITC). As culturas foram lavadas 3 vezes com PBS-Tween 0,05% e
imediatamente observadas e fotografadas em microscópio de epifluorescência. A utilização de
MelEM como primeiro anticorpo não é aleatória, mas sim baseada no fato de que esta
marcação esta restrita a região perinuclear e portanto de difícil visualização. O segundo
fenótipo analisado foi o neuronal, para isto todos os clones foram incubados por 12 horas a
4°C com os anticorpos monoclonais IgG1 β-tubulina III e IgG2a Tirosina Hidroxilase. Após
este período, as culturas foram lavadas 3 vezes com PBS-Tween 0,05% e incubadas por 1
hora, à temperatura ambiente com anticorpo secundário anti-IgG1 e anti-IgG2, (ambos
diluídos em PBS 1:100) ligados ao TXRD, o que permitiu a visualização dos neurônios em
cor vermelha, diferenciando-os dos melanoblastos marcados em verde. Os clones positivos
para neurônios foram fotografados em microscópio de epifluorescência e partimos para
59
incubação com os próximos anticorpos: anti-αSMA (IgG2a) diluído na concentração de 1:300
no hibridoma anti-HNK1 (IgM) para reconhecimento de miofibroblastos e células gliais,
respectivamente. Os anticorpos foram mantidos por 12 horas a 4°C ou por 2 horas a
temperatura ambiente obtendo-se a mesma eficiência. Os clones foram lavados 3 vezes com
PBS-Tween 0,05% e incubados por 1 hora, à temperatura ambiente com os anticorpos
secundários anti-IgG2a (ligado ao TXRD) e anti-IgM (ligado ao FITC) sendo ambos diluídos
em PBS (1:75). As culturas foram lavadas 3 vezes com PBS-Tween 0,05% e os clones
positivos para miofibroblastos (em vermelho) e para células gliais (em verde) foram
fotografadas em microscópio de epifluorescência. O último fenótipo analisado foi o
condrocítico, por ser o mais facilmente visualizável devido a suas dimensões e
tridimensionalidade. O anticorpo anti-sulfato de condroitina (IgM) foi colocado em todos os
clones durante 12 horas a 4°C. Posteriormente as culturas foram lavadas 3 vezes com PBS-
Tween 0,05% e incubadas com anti-IgM (ligado ao FITC). Os condrócitos marcados em
verde foram fotografados em microscópio de epifluorescência. É imporante salientar que
apesar de se utilizar a mesma imunoglobulina (IgM ligada ao FITC) tanto para células gliais e
condrócitos, os fenótipos são morfologicamente tão distintos, que torna impossivel confundir-
se. Além disso, como a cada observação é realizada uma seqüência de fotos, próximas aos
nódulos de cartilagem (previamente detectados pela coloração Hoescht), é possível reconstruir
a imagem de cada poço clonal observada na figura 34 da seção Resultados.
2.6 HIBRIDIZAÇÃO IN SITU
A detecção do fator de transcrição Sox9 que é expresso em células engajadas no
caminho de diferenciação condrocítico e também em condrócitos diferenciados (Marcucio et
al., 2005), foi realizada através da hibridização in situ a 2, 4 e 6 dias de culturas secundárias
da CNC e a 8 dias em culturas da CNT.
60
As sondas do RNA anti-sense de Sox9 foram preparadas a partir do plasmídeo
(gentilmente cedido pelo Dr.Paul Scotting) contendo a seqüência do cDNA do gene Sox9 de
galinha. O DNA foi linearizado com a enzima XbaI (Promega). Em seguida, as seqüências
foram submetidas a transcrição reversa usando a RNA polimerase (T7) e foram marcadas pela
incorporação com digoxigenina (dig)-UTP (Roche), através de um kit de transcrição in vitro
(Promega).
O protocolo da hibridização in situ foi adaptado de Henrique et al., 1995 com algumas
modificações. As culturas fixadas com paraformaldeido (4%) diluido em PBS/EGTA, pH 7,5
foram inicialmente desidratadas em 50% de metanol (Merck), diluído em PBS-Tween (0,2%)
(Merck). Estas culturas podem ser guardadas em metanol 100% a -20°C por alguns meses.
Antes de iniciar as hibridizações, as culturas foram reidratadas em banhos contendo
75%, 50% e 25% de metanol diluído em PBS-Tween (0,2%). A hibridização com a sonda
Sox9 marcada com dig foi realizada em condições adstringentes (1,3XSSC, 50% formamida a
70°C, pH 5) em um tampão contendo 0,2% Tween-20 e 0,5% de Chaps (Sigma); este tampão
é comumente chamado hyb-mix. Após incubação de 12 horas com a sonda, as culturas foram
lavadas com hyb-mix e incubadas com anticorpo anti-dig conjugado à fosfatase alcalina
(1:2.000 Roche). Após incubação de 12 horas, o anticorpo foi retirado e foram realizadas 3
lavagens de 1 hora com MABT (Ácido maléico 0,1M; NaCl 0,15M; Tween-20 0,1%). Os
híbridos são revelados pelo método colorimétrico, através da incubação com solução de
BCIP/NBT (Sigma) diluída em NTM (Tris-HCl 100 mM pH 9,5; 100 mM NaCl; 50mM
MgCl2; 1% Tween-20) por 3-4 horas a 37°C.
61
2.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Em culturas de massa da CN, as diferenças entre os derivados gerados em culturas-
controle e em culturas tratadas com as várias doses de Shh foram avaliadas através do teste t
de student. Em culturas clonais, estas diferenças foram analisadas através do teste qui-
quadrado. Todas as análises estatísticas foram realizadas através de software estatístico Excel.
Diferenças foram consideradas significativas se P<0,05.
Figura 14: Esquema Representativo da Metodologia da Parte II
Imunocitoquímica e
hibridização in situ
para observação dos
diferentes derivados
da CN
Cultura Massa
400 ou 800 células/poço
Células da CN
recuperadas
Culturas Secundarias
DMEM 10% + SBF
+/- Shh
CNC
Embrião
codornas
CNT
6-7 somitos
15-25 somitos
Culturas Secundárias
sobre 3T3
Culturas Primárias
(Meio de Clonagem)
Cultura Clonal
62
3 RESULTADOS
3.1 PARTE I - EFEITOS DA MEC SOBRE AS CÉLULAS DA CNT
3.1.1 Análise in vitro da Migração das Células da CNT Sobre Diferentes Moléculas da
MEC.
Comparamos o comportamento migratório das células da CN sobre três diferentes
moléculas de MEC: fibronectina, laminina I e colágeno IV. A área do halo de migração foi
calculada a partir das células da CN que migraram por 24 horas de explantes de tubos neurais
provenientes da região troncal de embriões de codorna. Não observamos diferenças
significantes no halo de migração das células da CN entre as três diferentes moléculas de
MEC (Fig. 15).
Figura 15: Efeito das moléculas da MEC sobre a migração das células da CNT. A área de migração foi
calculada a partir de células da CN que migraram de explantes da região troncal de embrião de codornas
durante 24 horas sobre fibronectina (FN), laminina I (LN) e colágeno IV (ColIV). Os valores foram
obtidos a partir da análise da migração da área de pelo menos 9 explantes em cada condição. Dados
expressos como média ± erro padrão médio. Estatística calculada pelo teste ANOVA, P<0,05.
Area de migração (mm
2
)
63
3.1.2 Análise dos Tipos Celulares Originados da Diferenciação da CNT Sobre
Diferentes Moléculas da MEC.
Em seguida partimos para análise da expressão dos derivados da CNT cultivados
sobre as diferentes proteínas da MEC. Com este objetivo, as células da CN que migraram por
24 horas sobre um substrato “neutro” de plástico, foram tripsinizadas e replaqueadas (na
densidade de 1.200 células por poço) sobre as três diferentes moléculas de MEC utilizadas no
estudo. Após sete dias, estas culturas secundárias foram analisadas, através de marcadores
celulares específicos, quanto à presença de células gliais, miofibroblastos, neurônios e
melanócitos (Fig. 16 A, B, C e D, respectivamente). Não observamos nenhuma diferença na
quantidade de células gliais, neurônios e melanócitos entre as 3 condições de MEC analisadas
(Fig. 16 E, G e H, respectivamente). Entretanto, observamos um aumento significativo na
proporção de miofibroblastos sobre fibronectina, o qual não foi observado sobre laminina e
colágeno IV (Fig 16 F).
Miofibroblastos %
Células gliais %
64
Figura 16: Análise fenotípica e respectiva quantificação dos derivados da CNT após 6 dias de cultura
secundária sobre três diferentes moléculas de matriz extracelular: (FN) fibronectina, LN (laminina) e
ColIV (colageno IV). (A-D) Os diversos derivados da CNT foram identificados através da presença de
marcadores celulares especificos: SMP (A) para células gliais, αSMA (B) para miofibroblastos, NF200 (C)
para neurônios e MelEM ou melanina (D) para melanoblastos/melanócitos. (E-H) Quantificação das
células conforme a molécula de matriz extracelular empregada; (E) células gliais, (F) miofibroblastos, (G)
neurônios, (H) melanocitos. Os valores foram obtidos a partir da análise de 60 campos aleatórios de 3
experimentos independentes para cada substrato utilizado. Dados expressos como média ± erro padrão
médio. Estatística calculada pelo teste ANOVA,
**
P<0,01,
***
P< 0,001.
Com o objetivo de analisarmos mais precisamente os efeitos das moléculas da MEC
sobre a diferenciação de miofibroblastos, realizamos ainda uma série de experimentos
combinatórios de substratos de MEC entre as culturas primárias e secundárias (Fig 17). Estes
experimentos revelaram que a fibronectina é uma molécula extremamente eficiente em manter
e promover particularmente o número elevado de miofibroblastos. Células da CNT mantidas
sobre culturas primárias cujo substrato era laminina e colágeno IV e que após 24 horas eram
transferidas para uma cultura secundária cujo substrato era fibronectina, apresentaram o
mesmo número elevado de miofibroblastos de uma cultura feita inteiramente (primária e
secundária) sobre fibronectina. Estes dados parecem indicar que o destino das células da CNT
não está determinado durante as primeiras 24 horas de cultura primária e que a fibronectina
pode promover, a proliferação, a sobrevida ou a diferenciação das células indiferenciadas da
CN em prol do fenótipo miofibroblastico em culturas secundárias. Estes dados ficam mais
Neurônios % Mielanócitos %
65
claros quando analisamos as culturas secundárias sobre laminina e colágeno IV. Em ambos os
casos, a quantidade de miofibroblastos gerados nas culturas secundarias era extremamente
baixa quando comparada com as culturas mantidas sobre fibronectina como substrato nas
culturas secundárias. Este resultado é independente do substrato utilizado na cultura primária
(mesmo que o substrato utilizado seja fibronectina). Podemos concluir que os efeitos de
fibronectina sobre o fenótipo miofibroblástico ocorrem principalmente após as primeiras 24
horas de cultura primária.
FN LN CLIV FN LN CLIV FN LN CLIV
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
LN COLIVFN
**
**
*
*
***
*
Figura 17: Quantificação de miofibroblastos em função de substratos utilizados em culturas primárias e
secundárias da CNT. Explantes de tubo neural foram cultivados sobre fibronectina (FN), laminina (LN) e
colágeno IV (col IV) em culturas primárias durante 24 horas. As células da CN que emigraram a partir
dos explantes foram tripsinizadas e replaqueadas em culturas secundárias sobre diferentes combinações
de substratos como indicado no gráfico. Estas células foram mantidas por 6 dias em culturas secundárias,
fixadas e analisadas quanto a presença de miofibroblastos através do anticorpo anti-αSMA. Os valores
foram obtidos a partir da analise de 60 campos aleatorios de 3 experimentos independentes para cada
substrato utilizado. Dados expressos como média ± erro padrão médio. Foram comparadas
estatísticamente (teste ANOVA,
*
P<0,05;
**
P<0,01 e
***
P<0,001), apenas as colunas apresentando as
mesmas cores entre si.
3.1.3 Análise da Proliferação das Células da CNT Sobre as Diferentes Moléculas da
MEC.
O aumento do número de miofibroblastos sobre a fibronectina poderia estar ocorrendo
por um determinado conjunto de fatores atuando isoladamente ou em combinação, entre eles:
1°) o aumento significativo nas taxas proliferativas dos progenitores e/ou de miofibroblastos
Cultura Sec
undária
Cultura Primária
Células SMA
+
(%)
66
já diferenciados; 2°) a sobrevivência seletiva de miofibroblastos ou 3°) uma diferenciação em
prol do fenótipo miofibroblástico às expensas de algum outro derivado da CN.
Para tentarmos elucidar esta questão, inicialmente realizamos uma análise da taxa de
proliferação das células da CNT sobre as diferentes moléculas de MEC. Observamos, que
independentemente do substrato utilizado, cerca de 60% das células da CNT incorporaram
BrdU a 6 dias de cultura secundária (Fig 18A). Entretanto, a proporção de miofibroblastos
proliferando (i.e, αSMA
+
BrdU
+
) aumentou significativamente quando o substrato utilizado
foi a fibronectina (3%), em comparação com laminina (0,5%) e colágeno IV (0,6%) (Fig
18B). Por outro lado, a análise da incorporação com BrdU, indicou valores similares na taxa
proliferativa de células gliais e melanoblastos nos três substratos utilizados, evidenciando que
os efeitos de fibronectina foram específicos para a linhagem miofibroblástica (Tabela 3).
Figura 18: Os efeitos de FN, LN e Col IV sobre a proliferação celular total e de miofibroblastos em
culturas secundárias de 6 dias da CNT. (A) Gráfico de porcentagem do total de células que incorporaram
BrdU (B) gráfico da porcentagem de miofibroblastos que incorporaram BrdU (células SMA
+
/BrdU
+
).
Estatística calculada pelo teste ANOVA,
**
P<0,01.
Tabela 3: Análise da proliferação de células gliais e de melanócitos
A incorporação de BrdU por células gliais e melanócitos (SMP
+
BrdU
+
e Pig
+
BrdU
+
, respectivamente), foi
analisada após 6 dias de culturas secundárias sobre fibronectina (FN), laminina (LN) e colágeno IV (Col
IV). Dados expressos como média ± erro padrão médio de 3 experimentos independentes realizados em
triplicata. Estatística calculada pelo teste ANOVA.
MEC (% de células)
Marcador
Celular
FN LN Col IV
SMP
+
BrdU
+
37,87 ± 10,34 38,11 ± 19,89 32,86 ± 8,922
Pig
+
BrdU
+
4, 156 ± 2, 141 1,86 ± 0, 549 3, 292 ± 1, 277
A
B
FN LN Col IV
FN LN Col IV
% de células BrdU
+
% de células SMA
+
BrdU
+
67
Realizamos também uma análise temporal da expressão e proliferação de
miofibroblastos. O aparecimento de miofibroblastos ocorre entre os dias 1 e 3 de cultura
secundária em ambas condições: fibronectina e colágeno IV. Após 3 dias, os miofibroblastos
apresentam um aumento progressivo até o 9° dia, se mantidos sobre a fibronectina, entretanto
permanecem com um número praticamente constante quando mantidos sobre colágeno IV
(Fig 19A). A análise temporal da incorporação de BrdU, entretanto, demonstra um declínio
gradual na proliferação celular total durante os 9 dias de experimento, sem diferenças
significativas entre fibronectina e colágeno IV (Fig 19B). Foi realizada então uma análise da
proporção de miofibroblastos (células SMA
+
) que estavam proliferando (SMA
+
BrdU
+
) a cada
dado momento da cultura (3, 6 e 9 dias) (Fig 19C). Observamos um aumento significativo no
número de células SMA
+
BrdU
+
sobre fibronectina em relação a col IV em todos os tempos
experimentais analisados. Entretanto, quando analisada a freqüência de células SMA
+
BrdU
+
sobre o número total de células SMA
+
presentes nas culturas sobre fibronectina, verificamos
na verdade que a proporção de miofibroblastos em proliferação diminui ao longo dos
diferentes tempos de cultivo (particularmente entre o 3° e o 6° dia). Isto também foi
observado sobre o col IV, não sendo estatisticamente diferentes em relação à fibronectina
(Fig 19D).
Portanto, estes dados mostram que existe uma mesma proporção de células SMA
+
em
divisão sobre fibronectina e col IV, sugerindo que somente os efeitos proliferativos não
conseguem explicar o incremento no numero de miofibroblastos ao longo de todo o período
da cultura quando as células da CNT são cultivadas sobre fibronectina.
68
36
9
0
10
20
COLIV
A
***
***
***
Dias de cultura
% total de células SMA
+
3
6
9
0
20
40
60
80
100
B
COLIV
FN
Dias de cultura
% total de células BrdU+
3
6
9
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
COLIV
C
**
**
***
Dias de cultura
% de células SMA+Brdu+
3 6 9
0
10
20
30
40
50
60
70
80
FN
CLIV
D
Dias de cultura
% de células SMA+BrdU+/SMA+
Figura 19: Análise temporal do numero e proliferação de miofibroblastos nos dias 1, 3, 6 e 9 de cultura
secundária sobre FN e Col IV. (A) Quantidade total (%) de células αSMA
+
nas culturas (B) Análise do
número total (%) de células na cultura que incorporam BrdU. (C) Análise do número de miofibroblastos
incorporando BrdU (células αSMA
+
BrdU
+
). (D) Este gráfico é o resultado da relação entre a quantidade
total de miofibroblastos (células SMA
+
, gráfico A) pela quantidade de miofibroblastos que incorporaram
BrdU (células SMA
+
BrdU
+
, gráfico C) em cada momento da cultura. Os valores foram obtidos a partir da
análise de 60 campos aleatórios de 3 experimentos independentes para cada substrato utilizado. Dados
expressos como (%) média ± erro padrão médio. Estatística calculada pelo teste ANOVA,
**
P<0.01,
***
P<
0.001.
3.1.4 Análise da Sobrevivência das Células da CNT Cultivadas Sobre as Diferentes
Moléculas da MEC.
Analisamos então a taxa da morte celular da CNT em culturas secundárias sobre a
fibronectina, laminina e colágeno IV. Esta análise foi feita através da incorporação de sytox
green (que permite evidenciar as células mortas marcadas em cor verde) ou pelo marcador
■ FN
■ FN
69
nuclear DAPI (o qual permite a visualização de núcleos picnóticos, característico da
fragmentação nuclear de células no processo de morte celular). Os dois tipos de análises
mostraram que a porcentagem de células em processo de morte é muito baixa, sendo similar
nas três moléculas de matriz extracelular analisadas, com uma ligeira diminuição (embora não
significativa) sobre a laminina (Fig 20A). A análise de núcleos picnoticos sobre fibronectina e
colágeno IV, durante três momentos diferentes (3, 6 e 9 dias) de cultura secundária, mostrou
não haver diferenças significativas na proporção total de células da CN mortas em qualquer
um dos momentos analisados entre os dois substratos (Fig 20B).
Em conclusão, a reduzida taxa de morte celular da CN verificada em todas as
moléculas da MEC utilizadas, parece não suportar a possibilidade de que a fibronectina esteja
selecionando positivamente a sobrevivência do fenótipo miofibroblástico. Entretanto esta
hipótese não pode ser totalmente desconsiderada, uma vez que uma quantificação da morte
celular especificamentte do fenótipo miofibroblástico não foi realizada.
Figura 20: Os efeitos das moléculas da MEC sobre a morte celular em culturas da CNT. A morte celular
sobre diferentes moléculas da MEC foi analisada em culturas secundárias de 6 dias através da
incorporação de sytox green (A) ou em culturas independentes de 3, 6 e 9 dias através da quantificação de
núcleos picnóticos detectáveis com o marcador nuclear DAPI. Dados expressos como (%) média ± erro
padrão médio. Estatística calculada pelo teste ANOVA.
% de células marcadas com
sytox green
A
substrato
% de células com
núcleo picnótico
dias da cultura
B
70
3.1.5 A Fibronectina Exerce seus Efeitos sobre os Miofibroblastos Via os Domínios
RGDS.
Alguns estudos demonstram que as células da CN interagem com diversos sítios da
fibronectina, entre eles os domínios RGDS (Arg-Gly-Asp-Sr). Uma das maneiras de
demonstrar in vitro os efeitos destes domínios sobre as células é através da adição de
peptídeos GRGDS no meio de cultura, com o objetivo de criar uma “inibição competitiva”
entre estes e os domínios RGDS da fibronectina utilizada como substrato (Takano et al.,
2002). Os peptídeos (GRGDS) foram adicionados na concentração de 125 a 500 µg/ml nas
culturas da CNT realizadas sobre fibronectina. Observou-se uma redução dose-dependente na
proporção de células SMA
+
quando da adição de GRGDS nas culturas, evidenciando um
papel destes domínios em mediar os efeitos de fibronectina sobre o fenótipo miofibroblástico
(Fig 21).
Figura 21: O papel dos RGDS na expressão de miofibroblastos sobre a FN. Células da CNT foram
cultivadas sobre poços revestidos com FN como descrito em materiais e métodos. Os peptideos (GRGDS,
125 a 500 μg/ml)
foram adicionados as culturas secundarias e a proporção de miofibroblastos (células
SMA
+
) foi determinada no 6° dia. Dados expressos como (%) média ± erro padrão médio de 3
experimentos independentes. Estatística calculada pelo teste ANOVA,
**
P<0.01,
***
P< 0.001.
3.1.6 Análise dos Efeitos da Fibronectina Sobre a Diferenciação de Progenitores da
CNT em Culturas Clonais.
A fim de estabelecermos se a fibronectina poderia estar exercendo um papel direto na
diferenciação de miofibroblastos, realizamos culturas clonais de células da CNT sobre
% de células SMA
+
71
fibronectina e colágeno IV. O colágeno IV serviu como “controle”, para estes experimentos,
uma vez que não mostrou exercer qualquer efeito sobre os miofibroblastos em culturas de
“massa” da CNT. Em resumo, explantes de tubo neural foram colocados inicialmente sobre
um substrato de fibronectina e após 24 horas, as células da CN que migraram a partir destes
explantes foram plaqueadas clonalmente sobre poços de cultura revestidos com fibronectina
ou colágeno IV. Esta condição de cultura primária pode ser considerada uma condição
“neutra” uma vez que observamos que os efeitos de fibronectina sobre o fenótipo
miofibroblástico ocorrem principalmente após as primeiras 24 horas de cultura primária. Após
10 dias, as culturas clonais foram analisadas e comparadas em relação aos tipos, bem como à
freqüência de progenitores gerados (Tabela 4).
Tabela 4: Freqüência (% total) dos tipos clonais derivados de culturas da CNT realizadas sobre
fibronectina e colágeno IV.
Cada letra significa um fenótipo celular específico: G-glia, N-neurônio, M-melanócito; F-miofibroblasto.
Dados obtidos a partir de 6 experimentos independentes (n=116 para culturas sobre fibronectina e n=79
para culturas sobre colágeno IV). Estatística calculada através do teste qui-quadrado,
***
P<0,001). (n.d=
fenótipo não determinado.
Analisando a tabela 4 podemos observar que a quantidade de clones contendo
miofibroblastos (F, GF, MF e GMF) é significativamente superior sobre a fibronectina (84%)
comparada a colágeno IV (21,5%). Estes resultados indicam claramente que a fibronectina
exerce um papel em favor da diferenciação de progenitores com o potencial miofibroblástico,
% de clones gerados
Precursor Fibronectina Colágeno IV
G
1.7 8.8
M
13
47 ***
F
35.3 ***
11.4
GM
5.2 12.7
GF
26.7 ***
5
MF
2.6 0
GMF
9.5 5
n.d
6 10.1
72
particularmente F e GF. Entretanto, a quantidade de clones contendo melanócitos (M, GM,
MF e GMF) é significativamente superior sobre colágeno IV (64,7%) em comparação a
fibronectina (30,3%). Os clones comprometidos desde a emergência do tubo neural com a
linhagem melanocítica (M) são particularmente numerosos nas culturas realizadas sobre col
IV.
Analisamos também a eficiência clonal sobre cada molécula da MEC: observamos que
dos 288 clones plaqueados sobre fibronectina, 116 sobreviveram (40%), já sobre colágeno IV,
este número passou a 79 (27,5%). Portanto, a eficiência clonal é significativamente maior
sobre a fibronectina do que sobre colágeno IV (P=0,001, teste estatístico qui-quadrado).
Analisamos também que a eficiência clonal especificamente dos progenitores GF e F e
observamos que a sobrevida destes progenitores é significativamente aumentada na
fibronectina em relação ao col IV (P=0,0001 e 0,0002, respectivamente). Contrariamente a
sobrevida do progenitor M é estimulada no col IV em relação a fibronectina (P=0,04). Estes
resultados indicam que a fibronectina é uma molécula que estimula tanto a sobrevida celular
geral quanto a sobrevida particularmente de progenitores miofibroblásticos. Desta maneira um
dos mecanismos mais prováveis pelos quais a fibronectina poderia estar aumentando o
número de miofibroblastos seria na verdade através de um incremento na sobrevivência de
progenitores destinados a originar este fenótipo. Em contrate, a diminuição do número de
progenitores melanocíticos na fibronectina em comparação ao col IV, sugere que a
fibronectina poderia também agir favorecendo a diferenciação de miofibroblastos às expensas
de melanócitos.
73
3.2 PARTE II –EFEITOS DE Shh SOBRE AS CÉLULAS DA CN.
3.2.1 Padronização de Culturas Objetivando Promover a Condrogênese a Partir de
Células Indiferenciadas da CNC
No protocolo de cultivo desenvolvido pelo laboratório de Nicole Le Douarin, as
células da CN são cultivadas sobre monocamada alimentadora de fibroblasto embrionário
3T3-Swiss (previamente tratado com mitomicina para inibir a proliferação celular) a uma
densidade de 12.000 células/poço em placa de 96 poços em meio de cultura suplementado
com SBF, extrato de embrião de galinha e diversos fatores de crescimento e hormônios
(descrito nos materiais e métodos). Estas condições de cultura foram estabelecidas para
permitir a diferenciação da maioria dos tipos celulares derivados da CN, tais como as células
gliais, neurônios, melanócitos, miofibroblastos e condrócitos. Porém, o número e a freqüência
dos nódulos de cartilagem obtidos com essa metodologia é muito baixo, impossibilitando uma
análise consistente da multipotencialidade da CN. Desse modo, o objetivo inicial do trabalho
foi desenvolver condições de cultivo das células da CNC que permitissem a obtenção de
nódulos de cartilagem em maior número e freqüência.
Inicialmente testamos diversos lotes de SBF e fatores de crescimento sem alteração na
obtenção de cartilagem. Verificamos, entretanto, que certos trabalhos evocavam a necessidade
de um bom molde tridimensional e de uma alta densidade de células inicial para permitir a
emergência de condrócitos em diversos outros sistemas de cultura (Rodgers et al., 1989;
Tsonis & Goetinck, 1990). Desse modo, dobramos a densidade da monocamada de
fibroblastos embrionários 3T3 de 12.000 para 24.000 células/poço (em placas de 96 poços).
Nestas novas condições passamos a obter nódulos de cartilagem em cerca de 50% dos
poços em todos os experimentos realizados, enquanto que anteriormente o fenótipo era obtido
74
apenas em 1 a cada 4 dos experimentos realizados, sendo que em média 20% dos poços
contavam com condrócitos (Tabela 5).
Tabela 5: Efeito da densidade da monocamada de fibroblastos embrionários (3T3) na obtenção de nódulos
de cartilagem da CNC
As células de fibroblasto embrionário (3T3) foram cultivadas como descrito em materiais e métodos a
uma densidade de 12.000 ou 24.000 células/poço (placas de 96 poços). As células da CNC foram isoladas e
plaqueadas numa densidade de 400 células/poço sobre as monocamadas de 3T3. Os resultados
representam 4 experimentos independentes. Em cada experimento foram feitos 40 poços (placas de 96
poços).
Após o aperfeiçoamento das condições de cultura de massa das células da CN para o
fenotipo de cartilagem, analisamos o efeito de diversos fatores de crescimento que pudessem
estimular ainda mais a condrogênese. Utilizamos para isto alguns candidatos que na literatura
já haviam sido demonstrados favorecer a condrogênese in vitro, tais como FGF2 (Fibroblast
Growth Factor 2) (Sarkar et al., 2001), BMP2 (Bone Morphogenetic Protein 2) (Zhang et al.,
2002b), BMP4 (Bone Morphogenetic Protein 4) (Shum et al., 2003), e Shh (Sonic Hedgehog)
(Abzhanov & Tabin, 2004).
Observamos que FGF2 na concentração utilizada (10 ng/ml) foi tóxico para as células
do fibroblasto 3T3, ocasionando morte celular, por isso não prosseguimos com a utilização
deste fator. A adição das moléculas BMP2 e BMP4 (ambas a 10 ng/ml) promoveram os
mesmos níveis de condrogênese observadas na condição controle (cerca de 1 nódulo/poço).
No entanto, o meio condicionado, produzido por uma linhagem celular de fibroblastos de
codorna secretora de Shh (QT6), promove um aumento significativo no número de nódulos de
cartilagem em relação à condição controle. Verificamos ainda, que a utilização de um meio de
N° de nódulos cartilagem/poço Experimento
12.000 Células 3T3 24.000 Células 3T3
1 5/20 14/19
2 8/30 19/35
3 0/10 4/10
4 7/40 20/40
Total 4 Exper. 20/100 = 20% 57/104 = 54%
75
cultura simples, tal como DMEM acrescido de 10% de SBF foi suficiente para gerar todos os
derivativos da CNC, evitando assim a utilização desnecessária dos fatores de crescimento que
eram adicionados ao meio de clonagem (MlCl, descrito em materiais e métodos) (Fig.22).
0
1
2
3
4
5
6
7
MlCl controle DMEM 10% MlCl + BMP4 MlCl + BMP2 Shh meio cond.
n° de nodulos de cartilagem/poço
Figura 22: Shh estimula a condrogênese em culturas da CNC. Culturas secundárias de células da CNC
(400 células/poço) foram realizadas sobre monocamadas de fibroblastos embrionário (3T3) em alta
densidade (24.000 células/poço). O número de nódulos de cartilagem observado após 6 dias de cultura foi
comparado entre os meios-controle: Meio de Clonagem (MlCl - descrito em materiais e métodos) e
DMEM + 10% SBF. As culturas foram submetidas ao tratamento com: BMP2 (10 ng/ml) ou BMP4 (10
ng/ml) adicionadas ao meio de clonagem. O meio condicionado de Shh foi produzido por uma linhagem
fibroblástica de codorna (QT6) transfectada com o gene Shh (a linhagem foi mantida em de DMEM +
10% SBF). Dados obtidos de 3 experimentos independentes (n=30). Resultados expressos como média ±
erro padrão médio. Estatística calculada através do teste t de Student, **P < 0,01.
3.2.2 Os Efeitos de Shh Sobre a Diferenciação de Condrócitos Derivados da CNC em
Culturas de Massa
Uma vez verificado que o meio condicionado de Shh era efetivo em promover a
condrogênese, passamos a trabalhar com a proteína purificada, o que nos permitiria trabalhar
com doses diferentes e precisas do morfógeno (1, 10 e 100 ng/ml de Shh). Passamos também
a analisar os condrócitos em diferentes períodos de tempo (4, 6 e 10 dias de cultura)
utilizando diversos marcadores celulares e moleculares, tais como: hibridização in situ para o
fator de transcrição Sox9, o qual é considerado um marcador precoce de diferenciação
condrocítica (Eames et al., 2004), e imunocitoquímica para colágeno2a1 e condroitin sulfato,
dois marcadores específicos de condrócitos e nódulos de cartilagem (Linsenmayer & Hendrix,
1980; Avnur & Geiger, 1984).
**
76
3.2.3 Diferenciação de Condrócitos a 4 Dias de Cultura Secundária de Massa
Inicialmente analisamos o aparecimento de condrócitos aos 4 dias de cultura
secundária utilizando os marcadores colágeno2a1 e Sox9, pois a presença de verdadeiros
nódulos de cartilagem raramente é observada neste momento da cultura. Na figura 23A-C,
podemos observar que o número de células marcadas para colágeno 2a1 é aumentado em
cerca de 3,5 vezes nas culturas tratadas com 100 ng/ml de Shh. Este resultado foi confirmado
através da realização de hibridização in situ para o gene Sox9. Em culturas tratadas com 100
ng/ml de Shh, verificamos um aumento no número de células Sox9 positivas, as quais
participam na formação de aglomereados de células, acusando o aparecimento futuro de
nódulos de cartilagem (Fig. 23D-E). Este tipo de aglomerados ao fim de apenas 4 dias de
cultura secundária, raramente foi detectado na condição controle e sugere que Shh poderia
estar exercendo um papel na diferenciação deste tipo celular. O tratamento das culturas com
10 ng/ml de Shh aumentou o número de células Colágeno 2a1, mas não de maneira
significativa (Fig. 23A).
Analisamos a seguir se o aumento do número de condrócitos era resultado de um
efeito proliferativo de Shh sobre estas células. Não detectamos diferenças na quantidade de
células positivas para Colágeno 2a1 e que concomitantemente expressavam Fosfo-Histona 3
(um marcador para células em mitose) em culturas tratadas com Shh em relação às culturas-
controle (Fig 23B e C). Desta forma, concluímos que Shh não estimula a proliferação de
condrócitos aos 4 dias de cultura.
77
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Controle 10 100
Shh (ng/ml)
N° de células Col2a1+
Figura 23: Análise de condrócitos aos 4 dias de cultura secundária da CNC (A) Gráfico da análise do
número de células colágeno2a1 positivas controle e tratadas com 10 e 100 ng/ml de Shh. (B e C)
Imunocitoquímica para colágeno 2a1 e Phospho-Histona H3 em culturas-controle e em culturas tratadas
com 100 ng/ml de Shh, respectivamente. (D e E) Hibridização in situ para o fator de transcrição Sox9 em
culturas controle e em culturas tratadas com 100 ng/ml de Shh, respectivamente. Dados obtidos a partir
de 2 experimentos independentes (n=4 para cada experimento). Resultados expressos como média ± erro
padrão médio. Estatística calculada através do teste t de Student, *P ≤ 0,05.
3.2.4 Diferenciação de Condrócitos a 6 e 10 Dias em Culturas Secundárias de Massa
Partimos então para a análise dos efeitos de Shh sobre a condrogênese em culturas de
6 e 10 dias da CNC. A partir de 6 dias de cultura a identificação dos condrócitos pode ser
facilmente realizada pela microscopia de contraste de fase, uma vez que já existe a formação
de verdadeiros nódulos tridimensionais de cartilagem (Fig 24A). Observamos que o
A
C
*
Controle
+Shh 100 ng/ml
Fosfo-H3
+
Col2a1
+
B
D
Sox9
E
Fosfo-H3
+
Col2a1
+
C
Sox9
78
tratamento com 100 ng/ml de Shh causa um aumento significativo na quantidade de nódulos
de cartilagem tanto aos 6 (3,5 vezes) quanto aos 10 dias de cultura (1,8 vezes), em relação à
condição controle. A dose de 10 ng/ml também é efetiva (aumento de 1,8 vezes), mas apenas
aos 6 dias de cultura (Fig 24B). Em ambas as culturas (6 e 10 dias) quando submetidas ao
tratamento com 100 ng/ml de Shh, verificamos ainda um aumento significativo na freqüência
de poços positivos para nódulos de cartilagem em comparação as culturas controles (Tabela
6).
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Controle 10 100
Shh (ng/ml)
N° de nodulos de cartilagem/poço
6 Dias 10 Dias
**
*
*
Figura 24: Análise da condrogênese a 6 e 10 dias em culturas da CNC. (A) Nódulo de cartilagem aos 6 dias
de cultura secundária visualizado por microscopia de contraste de fase. (B) Gráfico da analise da
quantidade de nódulos de cartilagem a partir de culturas-controle e culturas tratadas com 10 e 100 ng/ml
de Shh aos 6 e 10 dias de cultura. Dados obtidos a partir de 8 experimentos independentes (o número total
de poços de cultura está indicado acima de cada coluna). Dados expressos como média ± erro padrão
médio. Estatística calculada através do teste t de Student *P<0,05; **P<0,001.
Tabela 6: Efeito de Shh na freqüência da obtenção de nódulos de cartilagem
Os resultados estão expressos como o numero de poços contendo nódulos de cartilagem sobre o total de
poços de cultura. As respectivas porcentagens estão entre parênteses. Resultados obtidos a partir de
culturas secundárias de 6 e 10 dias da CNC, controles e tratadas com 10 e 100 ng/ml de Shh. Estatística
calculada através do teste qui-quadrado**P<0,001.
Além da observação dos nódulos de cartilagem através da microscopia de contraste de
fase, detectamos os condrócitos através da coloração com azul de alcian (Fig. 25A), da
Número e porcentagem de poços positivos para cartilagem
Controle Shh 10 ng/ml Shh 100 ng/ml
6 dias
79/119 (58%) 87/138 (63%) 116/135 (86%)**
10 dias
29/39 (74%) 45/54 (83%) 55/57 (96%) **
119
135
138
39
54
57
AB
Contraste de Fase
79
imunocitoquimica para condroitin sulfato (Fig. 25B-D) e da hibridização in situ para o fator
de transcrição Sox9, o qual permanece expresso durante toda a condrogênese (Fig. 25G-H).
Verificamos ainda que o aumento no número de nódulos de cartilagem nas culturas de
6 dias tratadas com 100 ng/ml de Shh não era devido a um aumento na proliferação dos
condrócitos, pois o numero de células condroitin sulfato positivas e que incorporaram BrdU
não se mostrou diferente entre as culturas-controle e as tratadas com Shh (Fig. 25E-F,
respectivamente).
Condroitin Sulfato
Controle
+ Shh 100ng/ml
Azul de Alcian
A
C
D
Condroitin Sulfato
B
Condroitin Sulfato/Hoescht
80
Figura 25: Identificação de condrócitos a 6 dias de cultura secundária. (A) Coloração de nódulos de
cartilagem com azul de alcian em culturas-controle. (B) Detalhe de uma imunocitoquímica para
condroitin sulfato (vermelho), demonstrado a presença de nódulos “achatados” nas culturas (C-D).
Imunocitoquímica para condroitin sulfato em culturas-controle e em culturas tratadas com 100 ng/ml
Shh, respectivamente; observar a presença de nódulos tridimensionais e “achatados” nestas culturas. (E-
F) Imunocitoquímica para condroitin sulfato (vermelho) e para incorporação de BrdU (verde) pelas
células da CN em culturas-controle e em culturas tratadas com 100 ng/ml Shh, respectivamente. (G-H)
Hibridização in situ para o fator de transcrição Sox9 em culturas-controle e em culturas tratadas com 100
ng/ml Shh, respectivamente.
3.2.5 Análise de Fenótipos não Condrocíticos em Culturas Tratadas com Shh
A seguir, analisamos se Shh poderia estar exercendo seu efeito sobre outros derivados
da CN, além do cartilaginoso em culturas de 6 dias da CN.
Observamos que o tratamento com 100 ng/ml de Shh promove o aumento do número
de miofibroblastos (células positivas para actina de músculo liso, αSMA). Verificamos que
Shh estimula a proliferação de miofibroblastos em culturas secundárias de 6 dias, uma vez
que a proporção de células que expressam αSMA e concomitantemente incorporaram BrdU
Sox9
BrdU
+ +
A
G
Condroitin Sulfato
+
/BrdU
+
Sox9
H
E
F
Condroitin Sulfato
+
/BrdU
+
Controle
+ Shh 100ng/ml
81
(durante 4 horas) aumenta significativamente (Fig 26A-C). É interessante observarmos que
mesmo não havendo aumento significativo no número de miofibroblastos em culturas tratadas
com 10 ng/ml de Shh, há um aumento significativo na proliferação destas células (Fig 26A,
coluna central).
Figura 26: Análise do efeito do tratamento com 10 e 100 ng/ml de Shh sobre o número e a proliferação de
miofibroblastos em culturas de 6 dias da CNC. (A) Gráfico da porcentagem de células αSMA+ totais
(colunas brancas) e da porcentagem destas células αSMA+ que incorporaram BrdU (colunas negras). (B-
C) Imunocitoquímica para αSMA (vermelho) e BrdU (verde) em culturas-controle e em culturas tratadas
com 100 ng/ml de Shh. Estatística de 3 experimentos independentes (n=25), através do teste t de Student
*P<0,05; **P<0,001).
Analisamos ainda os fenótipos não-mesenquimais derivados da CNC, tais como as
células gliais, neurônios e melanócitos (denominados em conjunto de “neurais”). Para isto,
após 6 dias de cultura secundária utilizamos anticorpos específicos para detecção destes
derivados (como descrito em materiais e métodos) e realizamos contagens do número total
destas células em culturas-controle e em culturas tratadas com 1, 10 e 100 ng/ml de Shh.
Nenhuma diferença significativa foi encontrada em qualquer um destes derivados da CN
0
2
4
6
8
10
12
14
Controle Shh 10ng/ml Shh 100 ng/ml
% de células SMA +
Total
BrdU+
**
**
*
0
2
4
6
8
10
12
14
Controle Shh 10ng/ml Shh 100 ng/ml
% de células SMA +
Total
BrdU+
**
**
*
0
2
4
6
8
10
12
14
Controle Shh 10ng/ml Shh 100 ng/ml
% de células SMA +
Total
BrdU+
**
**
*
Controle + Shh 100 ng/ml
C
αSMA
+
/BrdU
+
αSMA
+
/BrdU
+
B
A
82
quando submetidos aos diferentes tratamentos com Shh (Fig 27). É importante ressaltar que
através da contagem dos núcleos marcados com Hoescht não detectamos aumento
significativo no número total de células da CNC entre as culturas-controle (6.243±3.399) e as
culturas tratadas com 100 ng/ml de Shh (6.205±3.450).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Glia Melanoblasto Neurônio
% de células da CNC
0 1 10 100
Figura 27: Análise do efeito de Shh sobre a proporção de células gliais, melanócitos e neurônios em
culturas de 6 dias da CNC. Estatística calculada a partir de 3 experimentos independentes (n=8), através
do teste t de Student.
Em conjunto, estes resultados mostram que Shh parece exercer seus efeitos
exclusivamente sobre os fenótipos “mesenquimais” (i.e. condrócitos e miofibroblastos) sem
alterar os derivados “neurais” (i.e. células gliais, neuronais e melanócitos) em culturas de
massa da CNC.
3.2.6 Caracterização da Resposta Condrogênica da CNC ao Tratamento de Shh em
Culturas de Massa
3.2.6.1 Período de resposta das células condrocíticas
Partimos então para uma análise mais detalhada dos efeitos de Shh, sobretudo sobre o
fenótipo cartilaginoso e a primeira questão que surgiu foi: existiria uma janela de tempo
especifica na qual Shh estaria agindo? Para responder esta questão, comparamos a ação de
Shh (ng/ml)
83
Shh durante um tratamento iniciado nos 2 primeiros dias de cultura secundária (d0-d2) com
um tratamento realizado após os 2 primeiros dias da cultura secundária (d2-d6).
Observamos que o tratamento de culturas da CN com 100 ng/ml Shh por 48 horas (d0-
d2) é necessário e suficiente para o aumento do número de nódulos de cartilagem após 6 dias
(Fig. 28). Ao contrário, a adição de 100 ng/ml de Shh apenas 48 horas após o inicio da cultura
secundária (d2-d6) não exerce nenhum efeito sobre a condrogênese. Este resultado indica que
o efeito de Shh é precoce e parece agir sobre os progenitores mesenquimais da CN.
0
2
4
6
8
10
12
14
123
N° de nodulos cartilagem/poço
Figura 28: Gráfico do número de nódulos de cartilagem registrados após 6 dias de cultura secundária em
função do tratamento precoce (apenas as primeiras 48 horas da cultura secundária [d0-d2]) ou tardio (48
horas após o inicio da cultura secundária [d2-d6]) com 100 ng/ml de Shh. Estatística calculada a partir de
3 experimentos independentes (n=8), através do teste t de Student, **P<0,001.
3.2.7 Quantificação de Células Condrocíticas Responsivas a Shh em Função de suas
Posições ao Longo do Eixo Rostro-Caudal
Até este momento, o trabalho havia sido realizado com células da CNC obtidas a partir
de explantes de tubos neurais retirados desde a região do mesencéfalo até o rombômero 8 (até
o nível do 4° par de somitos incluso) do embrião de codornas. Entretanto, analisando
cuidadosamente a literatura, percebemos que Sarkar e colaboradores demonstraram que
apesar da condrogênese a partir de células da CN poder ser obtida a partir de todos os níveis
Controle +Shh +Shh
d0-d2 d2-d6
**
84
cefálicos, sua incidência é fortemente enriquecida quando as células da CN eram obtidas
especificamente a partir do nível mesencéfalico (Sarkar et al., 2001).
Portanto, este trabalho nos conduziu a uma mudança metodológica: ao invés de
colocarmos o explante de tubo neural desde o mesencéfalo até o 8° rombômero para migrar e
assim obter as células da CN que seriam utilizadas nas culturas secundárias, passamos a
dividir o tubo neural cefálico em três partes: a parte mesencéfalica, a região dos rombômeros
1 e 2 (r1-r2) e a região mais posterior entre os rombômeros 3-8 (r3-r8). Após 24 horas de
cultura primária, retiramos as células de cada explante e as plaqueamos em culturas
secundárias tratadas com 100 ng/ml de Shh (Fig 29).
Figura 29: Esquema da mudança metodologica
O resultado deste experimento é mostrado na Fig. 29 e corroborou o que Sarkar já
havia demonstrado em 2001: o mesencéfalo é a região mais rica em prover células
cartilaginosas, seguida da região posterior imediatamente subjacente, ou seja, r1-r2 e
finalmente a região mais pobre na potencialidade em gerar condrócitos: r3-r8. Este
experimento demonstrou ainda que Shh é eficaz em estimular a condrogênese ao longo de
todo o eixo cefálico, uma vez que a quantidade de nódulos de cartilagem aumentou
significativamente em 2 níveis (mesencéfalo e r1-r2) quando estes foram submetidos ao
tratamento com 100 ng/ml de Shh por 48 horas. Quanto ao nível r3-r8 observamos uma
r1-r2
r3-r8
mes
Cultura Secundária
+ 100 ng/ml Shh por 48 hrs
hrs
Embriões de
Codorna
6-7 somitos
Crista Neural (24 hrs migração)
A
P
Dissecação do tubo neural de embriões de
codorna a fim de obter células da CNC a
partir de 3 regiões distintas ao longo do
eixo ântero-posterior (A-P): mesencéfalo
(mes), rombencéfalo anterior (r1-r2) e
rombencéfalo posterior (r3-r8). Após 24
horas de migração em placas de cultura
revestidas com colágeno I, as células da
CN eram tripsinizadas e cerca de 400
células por poço eram colocadas sobre
monocamadas densas de 3T3 (24.000
células por poço), submetidas ou não ao
tratamento com 100 ng/ml de Shh durante
48 horas. A análise da quantidade de
nódulos de cartilagem gerados a partir de
cada estrutura era realizada após 6 dias de
cultivo.
85
tendência de aumento na quantidade de nódulos de cartilagem nas culturas submetidas ao
tratamento com Shh, entretanto, este aumento não foi significativo, talvez as células da CN
obtidas desta região exibiram níveis de condrogênese muito baixos, dificultando uma análise
mais precisa dos efeitos de Shh.
0
5
10
15
20
25
30
mesen r1-r2 r3-r8
nivel rostro-caudal
N° de nodulos de cartilagem/poço
Contr ole
+ 100 ng/ml Shh (d0-d2)
*
*
Figura 30: Análise do número de nódulos de cartilagem gerados em culturas secundárias de 6 dias a
partir da nova metodologia. As células da CN foram obtidas a partir de 3 níveis rostro-caudais cefálicos
distintos do embrião de codorna, como explicado na Fig. 29. Estatística calculada a partir de 3
experimentos independentes (n=15, 23 e 23 para mesencéfalo, r1-r2 e r3-r8, respectivamente), através do
teste t de Student *P<0,05).
3.2.8 Efeito do Tempo de Migração das Células da CN Sobre a Condrogênese
Experimentos anteriores do laboratório indicavam que não era possível obter
cartilagens a partir de células da CN que migravam durante 48 horas de cultura primária.
Confirmamos estes resultados e observamos que mesmo as células que migram por apenas 36
horas nas culturas primárias falham em originar nódulos de cartilagem quando colocadas nas
melhores condições de cultura para condrócitos. Por esta razão o protocolo foi padronizado
em 24 horas de migração. Estes resultados sugeriam que o tempo da cultura primária poderia
influenciar direta e decisivamente na obtenção de progenitores da CN capazes de originar
cartilagem. Portanto, seguimos a lógica inversa e isolamos células da CNC que migraram por
apenas 15 horas a partir de explantes de mesencéfalo, r1-r2 e r3-r8. Neste momento há uma
pequena população de células da CNC existente que permite realizar uma cultura de massa
Mes
86
reduzida e um número razoável de culturas clonais. Estas células foram então submetidas ao
tratamento com 100 ng/ml de Shh por 48 horas e após 6 dias verificamos aparecimento de
nódulos de cartilagem. O resultado das culturas de massa foi excelente: obtivemos um
aumento de cerca de 2,5 vezes na quantidade de nódulos de cartilagem por poço de cultura,
quando comparado com os mesmos experimentos obtidos a partir de células da CN que
migraram por 24 horas (Fig. 31). E isto era válido tanto para CN originada a partir de
mesencéfalos quanto originadas de r1-r2. Observamos novamente que as células da CN que
migraram a partir de mesencéfalos, exibiram as mais altas taxas de condrogênese, sendo que
quando tratadas com Shh, exibiram em média 40 nódulos de cartilagem por poço, um
aumento muito significativo comparado aos 16 nódulos de cartilagem por poço em média
obtidos nas mesmas condições, entretanto a partir de células da CN que migraram durante 24
horas em cultura primária, como mostrado previamente na Fig. 31.
Figura 31: Análise do número de nódulos de cartilagem originados a 6 dias de cultura a partir de células
da CN obtidas de 3 estruturas cefálicas distintas e que passaram diferentes tempos em cultura primária:
15 e 24 horas. Dados a partir de 3 experimentos independentes (n=28, 12 e 12 para mesencéfalos, r1-r2 e
r3-r8, respectivamente, em culturas primárias de 15 horas e n=15, 23 e 23 para mesencéfalos, r1-r2 e r3-
r8 respectivamente em culturas primárias de 24 horas). Estatística calculada através do teste t de
Student *P<0,05; **P<0, 001).
0
10
20
30
40
50
60
Mes(15hrs) Mes(24hrs) R1-R2(15hrs) R1-R2(24hrs) R3-R8(15hrs) R3-R8(24hrs)
% of cartilage nodules/well
**
*
*
*
**
**
N° de nódulos de cartila
g
em/
p
oço
Controle
+Shh
15 hrs de cultura primaria
24 hrs de cultura primaria
+
Shh
Controle
87
3.2.9 Shh Exerce seus Efeitos Sobre os Progenitores Sox9
+
Via Smoothened
Com o objetivo de verificar se o aumento das linhagens mesectodermais em culturas
de massa eram realmente específicos da sinalização de Shh, utilizamos a ciclopamina, um
alcalóide que se liga a proteína Smoothened, agindo, portanto, como um inibidor especifico
da via de sinalização hedgehog (Taipale et al., 2000).
Inicialmente observamos que o tratamento de células mesencefálicas da CN com 100
ng/ml de Shh durante 48 horas de cultura secundária é suficiente em aumentar em cerca de 4
vezes a porcentagem de células Sox9
+
(Fig 32A). Este aumento não parece ser resultado de
um efeito proliferativo sobre estas células, pois a porcentagem de células incorporando BrdU
e expressando Sox9 concomitantemente (BrdU
+
/Sox9
+
) não se mostrou diferente entre as
culturas tratadas (10,4% ± 5,4) e controles (6,4% ± 2,1; P=0,2). Além disso, o tratamento com
Shh, não promoveu aumento significativo no tamanho total da população de células da CN
(Fig 32B). O tratamento concomitante de 100 ng/ml de Shh com 5µM de ciclopamina reduz a
porcentagem de células Sox9
+
aos níveis observados na condição controle (Fig 32A), sem
diminuição significativa do número total de células na cultura (Fig 32B). Este resultado indica
claramente que Shh atua via o seu receptor Smoothened especificamente sobre as células da
CNC que expressam Sox9.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Control Control + Cyclop Shh Shh + Cyclop
% de células Sox9 +
0
500
1000
1500
2000
2500
Controle +Shh Controle + Cyc Shh+Cyc
N° total de células
Figura 32: Shh atua especificamente sobre o número de células Sox9+. (A) Análise da porcentagem de
células Sox9
+
após 48 horas em culturas de massa da CN mesencefálica submetidas ao tratamento com 100
ng/ml de Shh e tratamento com 100 ng/ml de Shh concomitantemente com adição de 5µM de cyclopamina.
(B) Análise do número total de células nestas culturas utilizando o marcador nuclear Hoescht. Resultados
expressos como média ± erro padrão médio (n=4). Estatística calculada através do teste t de Student; **P
< 0,001).
**
A B
88
3.2.10 Análise do Efeito de Shh Sobre o Desenvolvimento de Progenitores da CNC em
Culturas Clonais
Após conseguirmos aumentar consideravelmente a taxa de condrogênese nas culturas
de massa, iniciamos as culturas clonais com células da CN que migraram por apenas 15 horas
a partir de explantes de mesencéfalos. Estas células foram plaqueadas sobre monocamadas de
alta densidade de 3T3 (24.000 células/poço) e sob tratamento com 100 ng/ml de Shh por 48
horas.
Este sistema de cultivo mostrou-se eficiente para obtenção de cartilagem. Na condição
controle, conseguimos obter cerca de 15% de clones positivos para condrócitos, um resultado
bastante satisfatório, comparado com a média de 3% obtida nos trabalhos anteriores
realizados pela equipe de Nicole Le Douarin (Baroffio et al., 1991; Trentin et al., 2004).
Quando tratados com 100 ng/ml de Shh durante 48 horas, a quantidade de clones contendo
nódulos de cartilagem passou para 43% (Fig. 33). O tratamento com Shh também aumentou a
porcentagem de clones contendo miofibroblastos de 39% para 75%. Entretanto, a
porcentagem de clones contendo melanócitos, células gliais e neurônios não foi alterada com
o tratamento de Shh (Fig. 33).
Figura 33: Gráfico da porcentagem de diferentes fenótipos obtidos em culturas clonais da CNC mantidos
em meio controle ou tratados por 48 horas (d0-d2) com 100 ng/ml de Shh. Os clones foram realizados com
células da CN que migraram por 15 horas a partir de mesencéfalos de embriões de codorna. Dados
obtidos a partir de 3 experimentos independentes (n=126 para culturas-controle e n=150 para culturas
tratadas com Shh 100 ng/ml). Estatística calculada através do teste qui-quadrado **P<0,001).
Condr+ Miofibr+
Melan+
Neurô+
Glia+
20
40
60
80
100
% de Clones
**
**
Controle
+Shh (d0-d2)
89
Estes resultados clonais confirmaram os dados obtidos a partir das culturas de massa,
nos quais Shh era efetivo apenas em promover os fenótipos mesenquimais. Partimos então
para análise destas colônias, quanto ao número de células geradas a partir de cada clone e a
eficiência clonal (porcentagem de clones gerados sobre o total de células plaqueadas) entre a
condição controle e a submetida ao tratamento com Shh.
Encontramos uma proporção similar de eficiência clonal entre culturas-controle e
culturas tratadas com Shh (47%, n=126 e 55%, n=150, respectivamente; P=0,2). Além disso,
o tamanho da população dos clones tratados com Shh não variou significativamente quando
comparada à condição controle. A Tabela 7 mostra o agrupamento dos clones em 6 categorias
conforme a quantidade total de células geradas nas colônias. Podemos observar que existem
desde clones pequenos contendo entre 10 e 100 células, até clones bastante numerosos, com
mais de 10.000 células. Entretanto, cerca de 90% dos clones-controle e 84% dos clones
tratados com Shh encontram-se distribuídos numa faixa intermediária, compreendendo entre
100-5.000 células (Tabela 7). Estes números estão de acordo com os resultados obtidos em
culturas de massa, nos quais não observamos uma diferença significativa entre o tamanho das
populações-controle e tratadas com Shh.
Tabela 7: Ordem de grandeza (expressa em 6 categorias) das populações geradas a partir dos clones da
CN mesencefálica em presença ou ausência de Shh.
% de Clones dispersos em 6 categorias (conforme a quantidade de células gerada)
10-100 100-500 500-1.000 1.000-5.000 5.000-10.000 >10.000
Controle
8,30% 30,45% 10,80% 42,00% 7,40% 1%
Shh
14,60% 29,60% 12,95% 37,20% 4,83% 0,90%
O número total de células foi contado após a marcação nuclear com Hoescht. Os clones estão classificados
em 6 categorias, de acordo com o número de células encontrado, o espectro varia de 10-10.000 células por
clone.
Finalmente partimos para análise dos tipos de progenitores encontrados nos clones da
CNC na ausência e na presença de Shh. Através de uma combinação de reações
imunocitoquímicas (descritas detalhadamente na seção materiais e métodos), nas quais
90
anticorpos secundários acoplados a fluoresceína (verde) ou ao Texas Red (vermelho) são
alternativamente utilizados, podemos identificar nas culturas a presença dos diversos
derivados da CN: células gliais, neurônios, melanócitos, miofibroblastos e cartilagem (Fig.
34). Após análise de cada fenótipo individualmente, podemos reconstituir a combinação dos
derivados presentes em cada clone e assim estabelecer o tipo de progenitor gerado. Os
resultados desta análise em culturas-controle e em culturas tratadas com Shh estão expostos
no esquema da Fig 35.
Figura 34: Imagem de um clone Pentapotente (GNMFC). (A) Células gliais (em verde), identificadas pelo
anticorpo HNK1, distribuem-se em volta de um nódulo de cartilagem (em azul identificado pelo marcador
nuclear Hoescht). Observar a agregação de núcleos gerando a tridimensionalidade do nódulo
cartilaginoso. (B) O nódulo de cartilagem marcado especificamente pelo anticorpo sulfato de condroitina
(em verde) e acima dois neurônios (em vermelho) identificados pelos anticorpos Tirosina-Hidroxilase e β-
tubIII. (C) Miofibroblastos (em vermelho) identificados pelo anticorpo αSMA em volta do nódulo de
cartilagem (verde). (D) Melanoblastos (em verde) identificados pelo anticorpo MelEM; em vermelho
podemos observar os neurônios, acima do nódulo central tridimensional de cartilagem, que está em azul
marcada com Hoescht.
A
B
C
D
91
Figura 35: Representação esquemática dos diferentes tipos de progenitores da CN, construído a partir do
combinatorial de diferentes fenótipos encontrados em culturas clonais controles e tratadas com 100 ng/ml
de Shh por 48 hrs. Cada letra significa um fenótipo celular especifico: G-glia, N-neurônio, M-melanócito;
F-miofibroblasto, C-condrócito. Os círculos brancos representam os progenitores neurais (incluindo
células gliais, neurônios e/ou melanócitos) excluindo totalmente os derivativos mesectodermais (C
-
F
-
). Os
círculos amarelos incluem os progenitores que podem dar origem a fenótipos mesenquimais, neste caso
miofibroblastos, excluindo os condrócitos (C
-
F
+
). Os círculos azuis representam os progenitores que
podem dar origem a fenótipos mesenquimais, incluindo neste caso todos os condrócitos e eventualmente os
miofibroblastos (C
+
F
+/-
). Os gráficos em pizza representam o balanço entre os progenitores puramente
neurais (em branco) e os progenitores que dão origem a derivados neurais e mesenquimais ao mesmo
tempo (azul-amarelo) em culturas-controle e em culturas tratadas com Shh. Os espaços negros em ambos
os gráficos representam os progenitores que contém exclusivamente derivados mesenquimais: 2,5% no
controle, correspondendo à somatória dos derivados FC e C e 5% no tratado com Shh, correspondendo à
somatória dos derivados FC e F. Dados obtidos a partir de 3 experimentos independentes (n=126 para
culturas-controle e n=150 para culturas tratadas com Shh 100 ng/ml). Estatística calculada através do
teste qui-quadrado *P<0,05; **P<0,001).
Um dos resultados mais importantes desta análise foi a observação pela primeira vez
de um clone multipotente que pode dar origem a células gliais, neurônios, melanócitos,
miofibroblastos e cartilagem (GNMFC) (Fig. 34). Este clone pentapotente encontra-se no
A
**
*
**
*
**
**
**
**
92
topo da hierarquia dos progenitores da CN e até o presente trabalho era considerado apenas
hipotético na literatura. Conseguimos obter uma quantidade razoável deste clone na condição
controle (6,5%), sendo que este número é aumentado em cerca de 3 vezes, quando as culturas
são tratadas com Shh, chegando a 18,5% (Fig 35).
Pode-se observar ainda no esquema representativo da figura 35, que um total de 18
tipos de clones foram gerados nestas culturas, sendo que destes, 9 tipos contém cartilagem e 9
tipos não contém cartilagem. Na condição controle, cerca de 64% dos clones são compostos
de clones tri, tetra e pentapotentes. Este número chega a 75,5% quando as culturas são tratadas
com Shh. Já a quantidade de clones bi e unipotentes é reduzida, sendo de 36% na condição
controle e 24,5% quando tratadas com Shh. A tabela 8 resume estes dados e mostra que na
verdade Shh favorece o aumento no número de clones pentapotentes (GNMFC) e
tetratapotentes, em detrimento dos clones tri, bi e unipotentes, os quais são observados em
maior quantidade nas culturas-controle.
Tabela 8: Somatória dos porcentuais de clones multipotentes e unipotentes derivados das culturas clonais
controles e tratadas com Shh 100 ng/ml.
A quantidade de clones pentapotentes e tripotentes é estatisticamente diferente entre as culturas-controle
e as culturas tratadas, como indicado pelo P obtido a partir do teste qui-quadrado. Dados obtidos como
indicado na Fig 35.
Detectamos ainda o aparecimento de dois tipos de clones contendo cartilagem que
nunca haviam sido observados até hoje: um deles contendo células gliais, neurônios,
miofibroblastos e cartilagem (GNFC) e outro contendo células gliais, miofibroblastos e
% dos tipos de clones
Controle Shh P
Pentapotente (GNMFC) 6,5 18,5 0,005
Tetrapotentes 19,5 29 0,06
Tripotentes 38 28 0,03
Bipotentes 28 19,5 0,18
Unipotentes 8 5 0,5
93
cartilagem (GFC). Estes dois clones foram observados exclusivamente em culturas tratadas
com Shh (Fig 35).
O segundo aspecto importante destas análises clonais é que a freqüência geral dos
progenitores que podem dar origem a ambas as linhagens, neural e mesenquimal, perfazem
69,5% das culturas clonogênicas em presença de Shh, comparado com 39% obtido na
condição controle (P<0,001) (gráficos em pizza na Fig 35). Por outro lado, os progenitores
capazes de originarem apenas fenótipos neurais (células gliais, neurônios, melanócitos)
mostraram-se significativamente aumentados na condição controle (58,5%), quando
comparada aos clones sob tratamento com Shh (25,5%). Este resultado é particularmente
evidente com o precursor capaz de gerar células gliais, neurônios e melanócitos (GNM), o
qual representou o progenitor mais freqüente nas culturas-controle (28,5%), comparado às
culturas tratadas com Shh (11,5%) (Fig 35).
Juntos, estes resultados mostram que Shh aumenta a freqüência de progenitores que
podem dar origem tanto as linhagens neurais quanto mesenquimais e este aumento ocorre às
expensas de progenitores que podem dar origem apenas às linhagens neurais, uma vez que a
eficiência clonal não se mostra alterada sob o tratamento com Shh.
3.3 EFEITOS PRÓ-CONDROGÊNICOS DE Shh SOBRE A CNT
3.3.1 Efeito de Shh Sobre as Culturas de Massa da CNT
As condições de cultura desenvolvidas para a obtenção de nódulos de cartilagem a
partir de células da CNC estimularam-nos a investigar se células da CN obtidas a partir da
região troncal poderiam também dar origem a condrócitos. Em 2002, McGonell e
94
colaboradores demonstraram pela primeira vez que a CNT de aves é capaz de originar
condrócitos in vitro (McGonnell & Graham, 2002).
Portanto, com o objetivo de testarmos a potencialidade condrogênica da CNT,
colocamos explantes de tubo neural de codornas removidos do nível toráxico para migrar
durante 24 horas. Após este período, as células da CN obtidas foram recuperadas e colocadas
em culturas secundárias (800 células por poço) sobre monocamadas alimentadoras densas de
3T3 (24.000 células por poço). Estas culturas foram mantidas na ausência ou presença de
diferentes doses de Shh durante 10 dias, de acordo com os procedimentos já descritos para a
CNC.
Verificamos após 8 dias, a presença de condrócitos nestas culturas secundárias,
mesmo na ausência de Shh. A identificação destes nódulos foi feita através dos marcadores
específicos utilizados para identificar condrócitos nas culturas da CNC, tais como o fator de
transcrição Sox9, a coloração com azul de alcian e a imunocitoquímica para condroitin sulfato
(Fig 36A-C).
O tratamento com as doses de 1 e 10 ng/ml de Shh aumentaram significativamente o
número de nódulos de cartilagem por poço e também a freqüência de culturas contendo
condrocitos (Figs 36C,D e 37A,B), após 8 dias de culturas secundárias sobre monocamadas
densas de 3T3. Curiosamente, a dose de 100 ng/ml de Shh, a qual se mostrou a mais efetiva
em promover a condrogênese em culturas da CNC, não produziu nenhum efeito sobre as
culturas da CNT.
95
Figura 36: A CNT exibe potencialidade em gerar condrócitos em culturas de massa. Detecção de
condrócitos através de hibridização in situ para o fator de transcrição Sox 9 (A), coloração com azul de
alcian (B) e imunocitoquímica para condroitin sulfato na ausência (C) ou presença (D) de Shh.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
controle 1 10 100
Shh (ng/ml)
n° de nodulos de cartilagem/poço
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Controle 1 10 100
Shh (ng/ml)
% de poços contendo cartilagem
Figura 37: Gráficos da quantificação da taxa de condrogênese em culturas da CNT na condição controle
ou sob tratamento com 1, 10 e 100 ng/ml de Shh após 8 dias de cultura secundária. (A) O número de
nódulos de cartilagem é expresso como média ± erro padrão médio (n=56) (B) A freqüência (%) de
culturas positivas para condrócitos foi calculada a partir destes mesmos experimentos. Estatística
calculada a partir de 3 experimentos independentes, através do teste t de Student; *P < 0,05).
Controle
1 n
g
/ml Shh
*
*
*
*
A
B
96
Analisamos ainda se Shh poderia estar agindo sobre outros derivados da CNT, tais
como as células gliais, neurônios, melanócitos e miofibroblastos. Realizamos contagens do
número total destes fenótipos (através de anticorpos específicos tal como descrito para CNC)
em culturas de 8 dias controles e tratadas com 1, 10 e 100 ng/ml de Shh. Nenhuma alteração
significativa foi encontrada em qualquer um destes derivados em culturas tratadas com as
diferentes doses de Shh em relação às culturas-controle (Fig 38). Mesmo o número de
miofibroblastos, o qual é aumentado sob tratamento com 100 ng/ml de Shh na CNC, não se
mostrou alterado nas culturas da CNT. É importante ressaltar que através da contagem dos
núcleos com marcador Hoescht não detectamos aumento no número total de células da CNT
entre as culturas-controle (2.229±150) e as tratadas com 1 ng/ml (2.032±297) e 10 ng/ml
(1.742±197) de Shh.
0
10
20
30
40
50
60
70
Glia Miofibroblasto Melanoblasto Neurônio
% de células da CNT
Controle 1 10 100
Figura 38: Análise do efeito do tratamento de diferentes doses de Shh sobre a porcentagem de células
gliais, miofibroblastos, melanócitos e neurônios em culturas de 8 dias da CNT. Estatística calculada a
partir de 3 experimentos independentes (n=8), através do teste t de Student.
3.3.2 Efeito de Shh em Culturas Clonais da CNT
Face aos resultados de massa obtidos, realizamos também clonagens com células da
CNT, objetivando identificar o potencial de desenvolvimento condrogênico das células da
CNT, submetidas ou não ao tratamento com 10 ng/ml de Shh. A partir de 4 experimentos
independentes, nos quais 225 células da CNT foram clonalmente plaqueadas na situação
controle, não identificamos nenhum clone contendo cartilagem. Entretanto, das 225 células
Shh (ng/ml)
97
plaqueadas sob tratamento com 10 ng/ml de Shh, conseguimos identificar um clone contendo
células gliais, miofibroblastos e cartilagem (GFC) (Fig 39).
Figura 39: O primeiro e único clone descrito até o momento na CNT contendo cartilagem. (A)
Condrócitos identificados pelo imunocitoquímica com sulfato de condroitina (em verde) e superpostos
com o marcador nuclear Hoescht (em azul). (B) os mesmos condrócitos marcados com condroitin sulfato
sem a superposição com Hoescht. (C) Miofibroblastos (vermelho) identificados com o anticorpo αSMA e
superpostos com Hoescht (em azul). (D) Células gliais (verde) identificadas com o anticorpo HNK1 e
superpostas com Hoescht. Observar que os grandes núcleos correspondem às células 3T3 da monocamada
alimentadora, diferindo dos pequenos núcleos das células de codorna.
Em conclusão, a capacidade condrogênica da CNT pode ser revelada por condições
particulares de cultura, sendo que estas células são responsivas a Shh igualmente como
observado nas células obtidas a partir da CNC, exceto pelo fenótipo miofibroblástico, o qual
não se mostrou alterado. Entretanto, contrariamente ao observado pelas células da CNC, a
resposta a Shh pelas células da CNT ocorre em concentrações baixas do morfógeno.
A
B
C
D
98
4 DISCUSSÃO
4.1 PARTE I - EFEITO DA MEC SOBRE OS PROGENITORES DA CNT
Durante as décadas de 80 e 90 do século passado, diversos estudos foram realizados
envolvendo moléculas da MEC e as células da CN (para uma revisão ver Le Douarin &
Kalcheim, 1999). Estes estudos focalizaram, sobretudo, os efeitos migratórios exercidos pelas
diferentes moléculas da MEC sobre as células da CN. De maneira geral, os componentes da
MEC são divididos em dois grupos: permissivos e inibitórios em relação a sua habilidade em
suportar a adesão e locomoção dos progenitores da CN. Por exemplo, as moléculas utilizadas
neste estudo, fibronectina, laminina e colágeno IV, são consideradas moléculas permissivas à
migração das células da CN, sendo encontradas ao longo de todas as rotas migratórias da CN
(Perris, 1997 ; Thiery et al., 1982 ; Le Douarin & Kalcheim, 1999). Entretanto, condroitin 6-
sulfato, colágeno tipo IX, tenascina, agregan, versican são exemplos de moléculas da MEC
inibitórias à migração da CN (Perris, 1997). Em nosso estudo in vitro não observamos
diferenças na migração das células da CNT quando cultivadas sobre os três diferentes
substratos. Este resultado está de acordo com o resultado obtido por Perris et al., 1989, no
qual não foram encontradas diferenças significativas na migração das células da CNT quando
cultivadas sobre diferentes concentrações de fibronectina e laminina (Perris et al., 1989).
Por outro lado, são raros os estudos que se preocupam em relacionar as moléculas da
MEC sobre a diferenciação das células da CN. Este trabalho teve como objetivo principal
estudar os efeitos da molécula fibronectina (FN) sobre a diferenciação de precursores
multipotentes da CNT.
Ao analisarmos os derivados gerados a partir de células da CNT cultivadas sobre as
diferentes moléculas da MEC, observamos que a única alteração foi um aumento significativo
99
do número de miofibroblastos (células αSMA+) quando cultivados sobre a molécula FN.
Através de estudos temporais observamos que este aumento significativo não poderia ser
explicado simplesmente por uma estimulação da proliferação especificamente destas células
(Fig. 19D). Entretanto, através dos estudos clonais observamos um aumento significativo na
proporção de clones contendo os progenitores GF e F. Além disso, observamos que a
fibronectina estimula a sobrevida destes clones, indicando que na verdade esta molécula atua
seletivamente sobre progenitores que irão se diferenciar em miofibroblastos. Este efeito de
sobrevida sobre miofibroblastos não ficou evidente nas análises realizadas em culturas de
massa da CNT através da incorporação de Sytox Green ou dos núcleos picnóticos (Fig. 20),
pois a análise foi realizada sobre a população total de células da CNT e não especificamente
sobre as células αSMA+. Este mecanismo de ação sobre a diferenciação através da sobrevida
de progenitores específicos pode ser correlacionado com os resultados clonais obtidos
utilizando a molécula Endotelina 3 (ET3). A ET3 mostrou promover a sobrevivência e
conseqüentemente um aumento do número de clones contendo melanócitos, este efeito foi
particularmente evidente sobre os progenitores GM e M (Lahav et al., 1998).
Além de favorecer o desenvolvimento dos progenitores F e GF, a fibronectina também
causou uma diminuição significativa na freqüência de progenitores melanocíticos
(particularmente M) quando comparada com o colágeno IV. Isto sugere que a fibronectina
pode também estar exercendo uma ação distinta sobre as diferentes sublinhagens da CNT,
promovendo a diferenciação de miofibroblastos às expensas do destino melanocítico.
A regulação da sobrevida, e conseqüentemente da diferenciação dos progenitores de
miofibroblastos, pode estar sendo mediada através da seqüência tetrapeptididica Arg-Gly-
Asp-Ser (RGDS) presente na região central da fibronectina. Evidenciamos nas culturas de
massa que os efeitos de FN sobre os miofibroblastos ocorrem através desta seqüência (Fig.
21). Trabalhos anteriores já demonstraram que as células da CN ligam-se através de seus
100
receptores integrinas na região RGDS da fibronectina. Estes trabalhos demonstraram que esta
ligação é essencial para mediar os efeitos de adesão e migração das células da CN (Boucaut et
al., 1984; Dufour et al., 1988). Além disso, experimentos inibitórios através da utilização dos
peptídeos GRGDS (tais como utilizados neste trabalho) também demonstraram interferir
drasticamente sobre a adesão e propagação das células da CN de maneira dose dependente
(Dufour et al., 1988; Takano et al., 2002). Entretanto, a presença de outros domínios de
ligação na fibronectina evidenciam que os domínios RGDS não são capazes de responder
sozinhos por todas as funções exercidas pela molécula e que na verdade o sítio RGDS precisa
de um sítio sinergístico de adesão (ver Fig. 40) para mediar seus efeitos sobre a adesão e
migração das células da CN (Dufour et al., 1988).
Figura 40: Esta representação esquemática, modificada a partir de Dufour e colaboradores, 1988, mostra
a localização de diferentes sítios de ligação (sítio sinergístico de adesão, sítio RGDS, sítios CS1 e CS5 no
domínio IIICS) ao longo da molécula de fibronectina e seus possíveis papéis na adesão, propagação e
migração das células da CN. Os outros domínios principais (colágeno, fibrina I e II e heparina I e II)
também estão indicados. O domínio de motilidade é mostrado cobrindo os vários sítios, os quais não
podem ser excluídos como possíveis sítios colaboradores para a adesão e migração celular.
Nossos resultados sugerem que os sítios RGDS (e os sítios sinergísticos de adesão)
possam estar seletivamente promovendo a adesão e conseqüentemente a sobrevida
preferencial de progenitores da CN que expressem tipos de integrinas específicas para o
reconhecimento destes sítios. Se levarmos em conta nossos resultados clonais, o destino
destes progenitores pode ser o de se tornarem miofibroblastos.
Adesão
Propagação
Adesão
Motilidade
Sítio
sinergístico
de Adesão
101
Apenas recentemente foi demonstrado que a CNT in vivo pode originar
miofibroblastos, os quais contribuem para o endoneuro, a camada mais interna dos nervos
periféricos (Joseph et al., 2004). A reduzida contribuição da CNT in vivo para os derivados
mesênquimais em comparação à CNC pode ser o reflexo da regulação diferencial de
integrinas ao longo do eixo rostro-caudal do embrião. As integrinas são uma família de
glicoproteínas heterodiméricas transmembrana que medeiam as interações entre as células e
as moléculas da MEC. A subunidade α confere especificidade para as moléculas da MEC e a
subunidade β interage intracelularmente com o citoesqueleto (von der Mark et al., 1999).
Strachan & Condic em 2003 demonstraram que a mobilidade e a regulação de integrinas é
distinta entre as células da CNT e da CNC (Strachan & Condic, 2003). As células da CNC
regulam mais eficientemente os níveis das integrinas α6 e α4, utilizadas pelas células para
reconhecerem a laminina e FN, respectivamente. Isto poderia explicar, porque mesmo a FN
estando onipresente ao longo das rotas migratórias das células da CN, tanto a nível cefálico
quanto troncal (Newgreen & Thiery, 1980), poderia exercer um efeito diferencial in vivo
sobre estas distintas populações de células da CN.
O grupo de Marianne Bronner-Fraser também observou que as células da CNC
diferem das células da CNT em relação aos receptores utilizados para a adesão a diferentes
moléculas da MEC (Lallier & Bronner-Fraser, 1992). Por exemplo, para aderir à FN as
células da CNC utilizam uma integrina que é independente da presença de cátions divalentes,
já as células da CNT utilizam uma integrina dependente de cátions divalentes. Para se ligarem
à laminina, as células da CNC usam uma integrina dependente da presença de um cátion
divalente, em contraste, as células da CNT aderem a laminina através de mecanismos distintos
dos exibidos pelas células da CNC. No caso dos colágenos, as células da CNC falham em
aderir aos colágenos tipos I e IV, enquanto as células da CNT ligam-se a ambos colágenos
através de integrinas dependentes de cátion divalente (Lallier & Bronner-Fraser, 1992). Estes
102
resultados mostram que tanto as células da CNC quanto da CNT possuem diversas integrinas
as quais podem ser distinguidas pela sua dependência a cátions. Portanto, estas duas
populações não se sobrepõem no que diz respeito às suas propriedades adesivas e, isto pode
refletir nas diferentes potencilidades exibidas in vivo por estas estruturas, em particular
concernente às suas capacidades de diferenciação mesenquimais.
Um outro aspecto diferencial entre as populações da CNC e da CNT é que um grande
número de células da CNC são capazes de expressar a proteína fibronectina in vitro. Por outro
lado, poucas são as células da CNT que em cultura exibem esta característica (Newgreen &
Thiery, 1980). Em 1990, Rogers e colaboradores analisaram o comportamento de células da
CNT sobre as moléculas laminina e fibronectina. Na época, os autores não dispunham de
marcadores fenotípicos específicos, entretanto observaram um número maior de células
pigmentadas (melanócitos) sobre a laminina em comparação a fibronectina (algo que
detectamos em alguns de nossos experimentos, mas que não ficou absolutamente claro,
provavelmente devido as diferentes condições experimentais utilizadas, nomeadamente, o
meio de cultura). Por outro lado, sobre a fibronectina foi verificado, sobretudo, o
aparecimento de células apresentando uma morfologia larga e achatada (“large and flatted”,
segundo os autores) (Rogers et al., 1990). Estas descrições morfológicas parecem
corresponder às células miofibroblásticas observadas em nossas culturas e que são positivas
para a α-actina de músculo liso (αSMA). Em 1992, Rogers adicionou TGFβ sobre estas
culturas da CNT realizadas sobre FN e observou que este tratamento estimulou
significativamente a expressão da proteína FN por esta população de células largas e
achatadas. É interessante ressaltar que na época, os autores referiram estas células FN-
positivas derivadas da CNT como “assemelhando-se a células derivadas da CNC” (Rogers et
al., 1992). Estes dados foram confirmados mais tarde por Leblanc e colaboradores, 1995, os
quais mostraram que o tratamento de culturas da CNT com TGFβ estimula estas células a
103
expressarem tanto FN quanto pró-colágeno I (também utilizado como marcador de células
mesodermais) a níveis comparados àqueles normalmente vistos nas células da CNC.
Contrariamente, o bloqueio de TGFβ em culturas de células da CNC inibe o desenvolvimento
de células imunorreativas para FN e estimula o aparecimento de melanócitos (Leblanc et al.,
1995).
Quando utilizado em culturas clonais, o TGFβ “instrui” as células multipotentes da
CNT de mamíferos a adotarem o fenótipo miofibroblástico (Shah et al., 1996). É interessante
observar que estes ensaios clonais foram realizados utilizando a FN como substrato, a qual
poderia estar atuando sinérgicamente com TGFβ em favor da diferenciação do fenótipo
miofibroblástico. Além disso, a estimulação da expressão da molécula FN pelos próprios
progenitores tratados com TGFβ pode estar envolvida neste mecanismo de instrução dos
progenitores em direção ao fenótipo mesenquimal, embora este aspecto não tenha sido
explorado pelos autores.
Em conclusão, este é o primeiro trabalho na literatura que demonstra através de
ensaios clonais uma influência da MEC, especificamente a FN sobre a diferenciação seletiva
de progenitores mesenquimais da CNT.
4.2 PARTE II - EFEITOS DE SHH SOBRE AS CÉLULAS DA CRISTA NEURAL
4.2.1 Novo Modelo de Segregação de Linhagem e Multipotencialidade da CNC
Durante os últimos 20 anos o laboratório de Nicole Le Douarin esteve interessado em
estudar os mecanismos de diversificação, segregação e multipotencialidade das células da CN.
Grandes avanços foram realizados nas ultimas décadas, tal como a observação de que as
células da CN tanto a nível cefálico quanto troncal são altamente heterogêneas quanto ao seu
104
potencial de desenvolvimento em culturas clonais. Alguns destes progenitores seriam
altamente multipotentes e outros, compreendendo a grande maioria, teriam uma
potencialidade mais restrita, ou estariam mesmo comprometidos com um destino único de
diferenciação desde o momento de sua emergência a partir do tubo neural. Ainda mais
recentemente, a Prof.
a
Andréa Gonçalves Trentin em seu pós-doutoramento no laboratório de
Nicole Le Douarin, demonstrou que algumas células bipotentes da CN em aves possuem a
capacidade de se auto-renovarem in vitro, uma característica fundamental para considerar um
tipo celular como célula tronco (Trentin et al., 2004).
Em 1991, Anne Baroffio e Elisabeth Dupin no laboratório de Nicole Le Douarin,
demonstraram pela primeira vez em vertebrados a existência de raros progenitores na CNC
que poderiam dar origem tanto a linhagens neurais quanto mesenquimais. Entretanto, a
quantidade destes progenitores era extremamente baixa, tornando muito difícil uma análise
aprimorada dos mecanismos de segregação de linhagem da CN. Portanto, a grande questão
evocada nestes estudos sobre a existência de um progenitor comum para as linhagens neurais
e mesectodermais restava mal respondida e susceptível a críticas. Acreditava-se que os
progenitores mesenquimais já estavam segregados dos precursores neurais nos estágios pré-
migratórios da CN (Noden, 1978b; Weston et al., 2004).
Após o trabalho pioneiro de 1991, os derivados condrocíticos permaneceram sempre
raramente observados, suscitando outra grande questão: são estes derivados realmente raros e
correspondem apenas a uma pequena parcela dos progenitores da CNC ou na verdade,
estávamos trabalhando com um sistema in vitro não favorável em permitir a expressão do
fenótipo condrocítico?
Partindo do princípio que praticamente 90% da estrutura cartilaginosa da cabeça dos
vertebrados é proveniente de derivados condrogênicos da CN (Couly et al., 1993), parecia
improvável que estes progenitores pudessem ser raros, portanto partimos do pressuposto que
105
nosso sistema in vitro precisava ser modificado objetivando incrementar a expressão do
fenótipo cartilaginoso.
Através de todas as melhorias desenvolvidas no sistema de cultivo, (as quais estão
bem detalhadas na segunda parte dos Resultados desta Tese) conseguimos realizar pela
primeira vez um estudo completo da segregação e multipotencialidade celular da CNC em
aves.
Propomos abaixo (Fig. 41) o novo modelo de segregação das linhagens derivadas da
CNC que irá substituir o modelo vigente mostrado na Introdução (Fig. 9).
Figura 41: Novo modelo de segregação das linhagens derivadas da CNC
Com o objetivo de mostrar todo o repertório dos progenitores identificados a partir das
culturas clonais da CNC, construímos este modelo com as informações retiradas de todas as
culturas clonais realizadas durante este trabalho, independentemente de serem tratadas ou não
com Shh. A primeira diferença em relação ao modelo anterior é o fato de que o progenitor
altamente multipotente no topo da árvore GNMFC deixou de ser uma entidade hipotética e
passa a constituir uma entidade real e quantificável. Além deste progenitor, identificamos pela
Baroffio et al, 1991
Trentin et al., 2004
Calloni et al., 2007
F
-
C
-
Neural 77% 25,5%
F
+
C
+:/-
Miofibroblastico 20% 31,5%
F
+/-
C
+
Condrocitico 3% 43%
GM
N
M
G
F
GNC GMC
GC
GMF
MC
GFC
FC
C
GN
GN
MC
GN
MF
GM
FC
GN
FC
GN
MFC
GNM
GNF
GF
106
primeira vez o aparecimento de novos progenitores condrocíticos que passam a constar neste
esquema: GNFC, GFC, MC e FC (envoltos por um circulo negro no esquema).
A segunda diferença importante em relação aos trabalhos anteriores é que cerca de
70% dos clones obtidos podem dar origem a ambas as linhagens: mesenquimal (cartilagem
e/ou miofibroblastos) e neural (células gliais, neurônio e/ou melanócitos). Graças a nossa
nova metodologia, destes 70%, cerca de 40% são clones contendo cartilagem e algum
fenótipo neural. É interessante observarmos que a grande quantidade de clones contendo
miofibroblastos em culturas tratadas com Shh está diretamente relacionada com a grande
quantidade de clones contendo condrócitos. Verificamos que não existe uma diferença
significativa quando comparamos a proporção de progenitores miofibroblásticos, não
condrocíticos (F
+
C
-
) em culturas controles (26%) e tratadas com Shh (31,5%) (Fig. 35). Estes
dados sugerem que na verdade Shh exerce um efeito na diferenciação de progenitores comuns
que darão origem a ambos: cartilagem e miofibroblastos. Num segundo momento, Shh
também é capaz de estimular a proliferação de miofibroblastos. Pelo nosso conhecimento,
este é o primeiro trabalho na literatura que demonstra o papel de Shh sobre a proliferação e
regulação da diferenciação de miofibroblastos.
Considerando todos os trabalhos anteriores da equipe de Nicole Le Douarin, a
quantidade de clones contendo cartilagem e algum derivado neural, chegava em média a
apenas 3% (para uma revisão ver Le Douarin et al., 2004). Este número tão baixo de
derivados condrocíticos e neurais, tornava o modelo de multipotencialidade da CN
susceptível a críticas. Por exemplo, James Weston sugere que a CN e as células
mesectodermais possuem origens embriológicas distintas, argumentando que o mesectoderma
não seria originado a partir da CN mas diretamente do ectoderma não-neural. Este
pesquisador considerava que sendo rara a observação de progenitores comuns para as
linhagens neural e mesenquimal, na verdade estes progenitores neuro-mesenquimais
107
consistiam num erro experimental por parte dos pesquisadores que teriam plaqueado 2 células
por poço ao invés de apenas 1 nos ensaios clonais (Weston et al., 2004). Portanto, estamos
demonstrando que a existência de progenitores comuns para as linhagens neural e
mesenquimal não é tão rara quanto suposto. Face a estes resultados, excluímos
definitivamente a possibilidade de que as células mesectodermais não sejam derivadas da CN,
refutando completamente as críticas e o modelo alternativo de segregação proposto por James
Weston. Este modelo alternativo é apenas hipotético (através da correlação da expressão da
molécula E-caderina e do receptor de PDGF - Platelet Derived Growth Factor) e nunca foi
experimentalmente comprovado.
Um terceiro aspecto deste novo modelo é que a multipotencialidade das células da
CNC é muito maior do que suspeitada. Por exemplo, o trabalho de Trentin et al., 2004,
demonstrou que 86% dos clones são compostos de progenitores uni e bipotentes e, portanto,
os progenitores tri, tetra e pentapotentes constituem apenas 14% da população total de clones
encontrada. O trabalho de Baroffio et al., 1991 atingia resultados semelhantes, cerca de 70%
dos clones eram uni e bipotentes. Neste trabalho nós praticamente invertemos esta equação e
passamos a observar que até 75% dos clones são tri, tetra ou pentapotentes, sendo apenas 25%
uni ou bipotentes. Este resultado tem uma importância fundamental na redefinição dos
conceitos de multipotencialidade e do momento de segregação das células da CN, pois inverte
completamente o paradigma atual, no qual progenitores altamente multipotentes
corresponderiam a apenas uma pequena parcela da população. Entretanto, é preciso considerar
que para atingirmos estes resultados foi necessária a modificação de diversas condições
experimentais em relação aos trabalhos anteriores. Por exemplo, este trabalho clonal foi
realizado exclusivamente com a CN mesencefálica, enquanto outros trabalhos foram
realizados com as células da CN mesencefálica e romboencefálica. Além disso, foi reduzido o
108
tempo de duração das culturas primárias, algo que até então nunca havia sido experimentado e
que era estabelecido como mínimo de 24 horas.
Portanto, os trabalhos antigos do grupo de Le Douarin não chegaram a estas
conclusões, provavelmente porque estavam trabalhando com uma grande parte da população
da CN já comprometida com um destino de diferenciação, ou pelo menos com as capacidades
de desenvolvimento mais restritas. Estes resultados concordam com o modelo no qual
subpopulações da CN tornam-se rapidamente (entretanto, não sincrônicamente)
comprometidas a um destino de diferenciação enquanto migram e se dividem (Le Douarin et
al., 2004). Isto é evidente pelo fato de que apenas conseguimos obter uma grande quantidade
de progenitores multipotentes a partir do momento que passamos a recolher as células da CN
que migraram por apenas durante 15 horas em culturas primárias. Isto significa que entre as 9
horas que separam estes experimentos e os experimentos precedentes de Trentin et al., 2004
(nos quais as células da CN migravam durante 24 horas em culturas primárias), as células da
CNC tornam-se progressivamente “menos” multipotentes e mais “restritivas” em relação ao
seu potencial de desenvolvimento. Isto torna-se mais evidente ainda se levarmos em conta os
experimentos citados na parte dos resultados nos quais as células da CN obtidas a partir de
explantes que migraram durante 36 e 48 horas em culturas primárias falham em originar o
fenótipo cartilaginoso, revelando que a potencialidade para este fenótipo foi “perdida” e
portanto a multipotencialidade restringida.
Face aos nossos resultados, algumas hipóteses poderiam explicar a perda da
multipotencialidade ou da potencialidade condrôgenica quando a duração das culturas
primárias é aumentada:
1°) As células da CN multipotentes são mortas entre o período de 15 a 24 horas, talvez
devido à ausência de fatores (substrato, solúveis e/ou secretados pelo tubo neural) necessários
a sobrevida. Portanto, ao retirarmos mais precocemente as células da cultura primária (antes
109
de sua morte) elas re-encontrariam este fator necessário a sobrevida quando transplantadas
para a monocamada de fibroblastos 3T3. Neste caso, Shh parece ser um excelente candidato e
poderia exercer um papel fundamental na manutenção da multipotencialidade, este aspecto
será discutido com mais detalhes posteriormente.
2°) As células da CN obtidas a partir de culturas que migraram por 24 horas
sobrevivem, mas perdem seu potencial condrogênico. Podemos imaginar que células
multipotentes mesenquimais (C
+
) continuam multipotentes, mas apenas dão origem aos
fenótipos neurais (C
-
).
3°) Sonic Hedgehog pode estar retardando o comprometimento das células da CN,
mantendo-as multipotentes ou em estado indiferenciado.
4°) Outra hipótese (embora menos provável) é de que as células que estamos
observando em nossas culturas tenham se reprogramado. Neste caso, quer dizer que células da
CN obtidas a partir de 15 horas de culturas primárias, seriam mais plásticas do que as células
obtidas a partir de 24 horas. Neste cenário, poderíamos imaginar que ao entrarem em contato
com Shh, certos progenitores, que já estariam mais restritos em sua potencialidade (por
exemplo, um progenitor GNMF) poderiam se reprogramar e voltarem a ser progenitores
altamente multipotente GNMFC. Este tipo de reprogramação tem sido demonstrado em
progenitores oligodendrocíticos, os quais podem retornar ao estado mais pluripotente (célula
tronco) em cultura (Kondo & Raff, 2000). O grupo de Le Douarin, demonstrou que este
mecanismo ocorre em células diferenciadas derivadas da CN, tais como em melanócitos e
células de Schwann. Estas células podem se converter umas nas outras quando estimuladas a
proliferarem em cultura sob tratamento com Endotelina 3 (Dupin et al., 2000; Dupin et al.,
2003). Este mecanismo ocorre através da desdiferenciação em um precursor multipotente
capaz de se auto-renovar ( Real et al., 2005; Real et al., 2006).
110
Podemos argumentar que se por um lado os estudos in vitro evidenciam uma redução
da multipotencialidade das células da CN, é difícil compreendermos até que ponto (ou qual a
extensão) esta mesma restrição ocorre in vivo. Há evidências de que as restrições da
potencialidade da CN também ocorrem rapidamente in vivo (Ito et al., 1993). Entretanto,
outros estudos demonstram a persistência de células altamente multipotentes até estados
tardios do desenvolvimento embrionário. Por exemplo, células pós-migratórias da CN
cardíaca mesmo após terem colonizado os arcos faríngeos posteriores, ao serem clonadas num
ambiente in vitro são capazes de reter progenitores comuns para neurônios e condrócitos e/ou
miofibroblastos (Sieber-Blum et al., 1993). Além disso, estudos de transplantes dos gânglios
do SNP nas rotas de migração da CN de embriões jovens, evidenciam a persistência de
células tronco dentre a população não-neuronal dos gânglios do SNP e SNE (Duff et al.,
1991; Sextier-Sainte-Claire Deville et al., 1992; Hagedorn et al., 2000; Hagedorn et al.,
1999). Progenitores multipotentes foram evidenciados nestes sítios até o desenvolvimento
tardio e mesmo nos estágios pós-natal e adulto (Kruger et al., 2002). Alguns deles, são
inclusive capazes de se auto-renovarem (Morrison et al., 1999; Bixby et al., 2002; Kruger et
al., 2002) e portanto, podem ser considerados verdadeiras células-tronco a constituírem um
“reservatório” que asseguraria a renovação de células gliais e neurônios no SNP. Acredita-se
inclusive que estas células-tronco poderiam estar na origem de vários tipos de tumores, tais
como neurofibromas, schwanomas, melanomas e neurofibrosarcomas, os quais afetam várias
linhagens de derivados da CN (Le Douarin, 2004).
4.2.2 Efeitos de Shh sobre a Multipotencialidade e Condrogênese da CNC
Neste trabalho demonstramos que o tratamento de Shh numa janela extremamente
precisa de tempo (as primeiras 48 horas de cultura secundária) estimula a obtenção de
111
progenitores altamente multipotentes (GNMFC). Além disso, a quantidade de clones penta e
tetrapotentes chega a quase 50% nas culturas tratadas com Shh, comparada com cerca de 25%
nas culturas-controle (Tabela 8). Estes resultados sugerem que Shh exerça um papel
fundamental na manutenção da multipotencialidade das células da CNC. O efeito de Shh
sobre células multipotentes pode ser observado na CN e no sistema nervoso central. Shh é
capaz de manter as propriedades de célula-tronco da CN entérica in vitro, promovendo a
proliferação e inibindo a diferenciação destas células em direção ao destino neuronal (Fu et
al., 2004). No sistema nervoso, Shh estimula a proliferação e a manutenção do pool de
progenitores neurais no cérebro adulto (Machold et al., 2003). A super-expressão de Shh
próximo ao giro denteado, aumenta a proliferação e neurogênese das células hipocampais da
zona subgranular (Lai et al., 2003). In vitro, Shh mantém a proliferação de progenitores
neuronais provenientes do hipocampo adulto e também aumenta a proliferação das células da
zona subventricular (Lai et al., 2003; Palma et al., 2005).
De que forma Shh poderia estar mantendo a multipotencialidade em nosso sistema de
estudo?
Nós propomos aqui um modelo em que Shh exerceria dois efeitos sobre as células da
CNC: um primeiro efeito precoce, sobre a manutenção da multipotencialidade destas células e
um segundo efeito mais tardio sobre a diferenciação ou escolha de destino das células da CN
em favor do fenótipo condrocítico. Ambos os efeitos estariam interligados e seriam uma
conseqüência direta da regulação de Shh sobre o fator de transcrição Sox9.
Sox9 é um fator de transcrição pertencente à grande família dos fatores de transcrição
Sox, entre os quais incluem-se também Sox8 e Sox10. Juntos, Sox8, Sox9 e Sox10,
constituem o chamado grupo E da família dos fatores de transcrição Sox e estão intimamente
relacionados como reguladores da CN (Bowles et al., 2000).
112
Em Xenopus, ainda no estágio de placa neural, Sox9 e Sox10 são expressos por todas
as células precursoras da CN, entretanto a expressão de Sox9 precede a expressão de Sox10
(Aoki et al., 2003; Lee et al., 2004b). Mais tarde a expressão destes fatores de transcrição
pelas células da CN não se sobrepõem, sendo que a expressão de Sox9 é mantida nas células
que irão contribuir para a cartilagem facial e a expressão de Sox10 é mantida nos precursores
de melanoblastos e células gliais (Spokony et al., 2002; Aoki et al., 2003). In vivo, Sox9 e
Sox10 parecem exercer papéis divergentes no controle transcripcional destes diferentes
destinos; entretanto a extensão pela qual isto ocorre devido a atividades intrínsecas de cada
fator resta obscuro.
Outros estudos, ainda em Xenopus, demonstram que Sox9 exerceria inicialmente um
papel precoce na determinação e manutenção da identidade da CN e um papel mais tardio na
condrogênese destas células (Hong & Saint-Jeannet, 2005). A indução de progenitores da CN
é regulada pela sinalização Wnt e este processo parece ser amplamente dependente da função
de Sox9, pois embriões de Xenopus nos quais Sox9 foi depletado a indução da CN mediada
por Wnt é inibida (Lee et al., 2004b). Além disso, Sox9 exerceria ainda um papel na
manutenção de marcadores precoces da CN tais como Slug, Snail, Pax3, FoxD3 e Twist
(Spokony et al., 2002). Na embriogênese tardia, a perda de progenitores da CN observada em
embriões submetidos ao tratamento com morfolino para Sox9 é correlacionada com um
grande número de defeitos em elementos esqueléticos derivados da CN.
No embrião de aves, Cheung e Briscoe, 2003, demonstraram que Sox9 exerce 2 papéis
cruciais no desenvolvimento da CN: 1) no tecido neural em formação, Sox9 especifica os
progenitores a se tornarem células da linhagem da CN; 2) subseqüentemente Sox9 influencia a
diferenciação das células da CN em direção a fenótipos específicos (Cheung & Briscoe,
2003).
113
Em resumo, Cheung e Briscoe tranfectaram através da eletroporação in ovo, o tubo
neural com o gene Sox9, o que acarretou rapidamente e transientemente a indução de fatores
de transcrição característicos da CN pré-migratória, tais como Slug e Cad6B (Nieto et al.,
1994). Marcadores da CN migratória tais como Sox10 (Nakagawa & Takeichi, 1998), HNK1 e
Cad7 (Cheng et al., 2000 ; Bronner-Fraser, 1986b; Nakagawa & Takeichi, 1998) foram
induzidos mais lentamente e mantidos por cerca de 24 horas. Estes dados são consistentes
com a idéia de que a expressão de Sox9 é uma resposta precoce da sinalização para indução da
CN iniciando na verdade o próprio programa de diferenciação das células da CN. Os autores
demonstraram que Sox9 é expresso nos progenitores de todos os derivativos da CN e que as
células exprimindo Sox9 migram ao longo das rotas migratórias especificas da CN, sendo
subseqüentemente encontradas nos gânglios simpáticos e da raiz dorsal, nervos periféricos e
abaixo da ectoderme. A permanência de expressão do gene Sox9, entretanto, desvia os
caminhos de diferenciação adotados por estas células. Células Sox9 positivas não dão origem
a nenhum tipo neuronal, sugerindo que sua expressão é incompatível com a diferenciação
neuronal. Já as células que mantém a expressão de Sox9 diferenciam-se em células gliais e
melanócitos (Cheung & Briscoe, 2003). Como este trabalho foi realizado ao nível troncal, os
autores não se preocuparam em analisar o fenótipo condrocítico, no qual certamente a
manutenção de Sox9 é requerida.
Em nosso trabalho, observamos que o tratamento com 100 ng/ml de Shh nas primeiras
48 horas de cultura secundária, é capaz de aumentar significativamente o número de células
Sox9 positivas cerca de 4 vezes. Entretanto, Shh não estimula nem a proliferação celular total,
nem a proliferação especificamente de células Sox9 positivas. Através da utilização da
ciclopamina, comprovamos que este efeito é especifico da via de sinalização hedgehog, pois
em culturas tratadas com este alcalóide, observamos uma redução do número de células Sox9
positivas aos níveis observados na condição controle. O aumento do número de células Sox9
114
positivas sob o tratamento com Shh poderia ser explicado de duas maneiras: 1°) estimulando a
sobrevida especificamente destas células e, portanto, a manutenção de células expressando
este gene (este efeito poderia ocorrer por uma expressão diferencial e específica de receptores
hedgehog nestas células em relação a outras células da CNC; 2°) Shh poderia estar
estimulando a expressão de Sox9 em células que não o expressariam normalmente, na
ausência de Shh.
Na verdade as duas hipóteses são possíveis e podem estar ocorrendo simultaneamente.
Os efeitos de Shh sobre a sobrevida das células da CNC que formarão as estruturas
esqueléticas da face já são bem conhecidos: a injeção de anticorpos contra Shh no
mesênquima crânio-facial de aves causa apoptose das células da CNC (Ahlgren & Bronner-
Fraser, 1999). Além disso, a apoptose causada pela administração do etanol em embriões de
galinha, pode ser resgatada através da administração exógena de Shh (Ahlgren et al., 2002).
Mais recentemente, Brito et al., 2006 também demonstraram que Shh é essencial para a
sobrevivência das células da CNC no primeiro arco branquial.
Por outro lado, existem algumas evidências que demonstram que Shh é capaz de atuar
diretamente sobre a expressão de Sox9. A administração de Shh no mesoderma somítico
mostrou induzir a expressão de Sox9 e como conseqüência, desencadear o programa de
diferenciação da linhagem condrocitica nesta região (Zeng et al., 2002). Experimentos com
camundongos transgênicos in vivo e in vitro, também demonstraram a habilidade de Shh em
aumentar a expressão de Sox9, atuando sobre um promotor de Sox9 de 6,8 kb (Tavella et al.,
2004). Recentemente foi demonstrado que Shh estimula o aparecimento de condrócitos em
culturas de células pré-condrocíticas humanas. Nestes experimentos, Shh aumenta e expressão
endógena de Sox9 cerca de 3 vezes, sendo Gli1 a molécula efetora capaz de se ligar a um sítio
promotor de Sox9, chamado Sox9cre1 contando com 2,1 kb (Bien-Willner et al., 2007).
115
Portanto, propomos um mecanismo no qual Shh agiria em dois momentos temporais
sobre as células clonogênicas da CNC: em um primeiro momento, as células da CNC que
migraram durante apenas 15 horas a partir de mesencéfalos seriam, em sua grande maioria,
altamente multipotentes e manteriam seu estado indiferenciado ao entrarem em contato com
Shh durante as primeiras horas de cultura secundária; este estado poderia ser preservado
através da manutenção da expressão de genes, tal como Sox9. Isto explicaria porque
observamos tantos progenitores multipotentes quando as culturas são tratadas com Shh. Em
um segundo momento, Shh exerceria um papel “instrutivo”, pois além da manutenção da
expressão de Sox9 pelas células multipotentes, também estimularia a expressão de Sox9 por
outros progenitores da CN, os quais na ausência da sinalização hedgehog não expressariam
Sox9. A expressão de Sox9 instruiria estas células para o caminho de diferenciação
condrocítico às expensas de outros fenótipos, como o neuronal. A hipótese de que Shh
“instruiria” as células da CN em direção aos fenótipos mesenquimais às expensas dos
fenótipos neuronais é suportada pelo fato de que não observamos diferença na eficiência
clonal entre as culturas-controle e as tratadas com Shh, portanto, não parece que Shh esteja
exercendo um efeito de sobrevida sobre as células e mesmo que o esteja, sua influência é tão
pequena que não poderia explicar a elevada quantidade de derivados condrocíticos em relação
às culturas-controle.
Podemos também hipotetizar como este mecanismo poderia estar ocorrendo in vivo,
através de algumas evidências moleculares da regulação de Sox9 no embrião de aves (ver Fig.
42 na p.114). Para compreendermos isto, é importante ressaltar que a linha divisória que
separa a regulação de Sox9 entre multipotencialidade e diferenciação condrocítica é muito
tênue e ainda mal compreendida. In vivo, todos os progenitores pré-migratórios da CNC
expressam o gene Sox9 (Cheung & Briscoe, 2003). Entretanto, a partir do momento que
começam a migrar, estas células não expressam Sox9, pois na verdade o fator de transcrição
116
Msx2 exerce uma regulação negativa sobre a expressão de Sox9 neste momento (Takahashi et
al., 2001). Hipoteticamente, este mecanismo serviria para reprimir a diferenciação precoce e a
manutenção da fase migratória em estado indiferenciado até a chegada das células da CN nos
devidos sítios para início do programa de diferenciação. A repressão de Msx2 sobre Sox9 pode
ainda permitir que um número adequado de células chegue ao sítio final de diferenciação e
mantenha-se no estado indiferenciado antes de iniciar o programa de diferenciação para a
linhagem condrocítica (Takahashi et al., 2001). Subseqüentemente, ao chegarem no seu
destino de migração, as células da CNC responderiam a sinais presentes no primeiro arco
branquial, tal como Shh, o qual é expresso no ectoderma e endoderma dos arcos branquiais
(Brito et al., 2006). Nos arcos branquiais, Shh estimularia a re-expressão de Sox9 num
primeiro momento com o objetivo de manter a sobrevida e a auto-renovação dos progenitores
altamente multipotentes da CNC (progenitores GNMFC). Portanto, estes progenitores
passariam por diversas divisões assimétricas gerando mais progenitores multipotentes e
também progenitores que seriam instruídos por Shh a adotar o destino de diferenciação
condrocítico, novamente através da regulação do gene Sox9. Shh poderia neste momento
também direcionar outros progenitores presentes nos arcos-branquiais, a expressarem Sox9 e
desta forma entrarem no programa condrocítico de diferenciação.
Estes diversos estudos reunidos sugerem que os progenitores da CN alteram sua
competência ao longo do tempo. Progenitores mais precoces respondem a Sox9 através da
indução da CN, enquanto os progenitores tardios perdem a habilidade para fazerem isto. A
regulação transcriptional dos genes Sox normalmente requer a ligação no DNA de cofatores (o
qual, hipotetiza-se, conferem especificidade ao alvo), os quais diferem entre os tecidos.
Portanto, é possível que existam cofatores necessários para a indução da CN em progenitores
e mais tarde, que cofatores mudem de identidade conforme o tecido no qual as células Sox9
positivas se encontram. Briscoe e colaboradores (2003) sugerem que estes cofatores sejam
117
expressos ao longo dos progenitores neurais precoces, sendo subseqüentemente reprimidos e
mantidos apenas em populações específicas da CN, tais como os condrócitos na face e as
células gliais e melanócitos no tronco.
Figura 42: Modelo dos papéis exercidos por Sox9 durante o curso do desenvolvimento da CNC.
4.2.3 Efeitos de Shh Sobre a CNT
4.2.3.1 A CNT possui potencial condrogênico
Um dos resultados mais interessantes observados durante este trabalho foi
verificarmos a presença de nódulos de cartilagem em nossas culturas a partir da CNT. Este
Células da CN
migratórias
Sox9
-
/Msx2
+
Células da CN pré-
migratorias Sox9
+
Células da CN
migratórias
Sox9
-
/Msx2
+
Células da CN pós-
migratórias Sox9
+
Sh
A
uto-renovação
Diferenciação para cond
r
ócitos -
manutenção de Sox9 ?
1
2
3
4
(1) A expressão de Sox9 nas células da
CN pré-migratórias é necessaria para
indução da CN no tubo neural. (2 e 3)
Durante a migração as células da CNC
perdem a expressão de Sox9, sob a
influência inibitória de Msx2. (4) As
células pós-migratórias da CNC
atingem o primeiro arco-branquial e
começam a re-expressar Sox9 sob
influência de Shh que é produzido pelo
ectoderma local. Shh/Sox9 exerceriam
um papel chave na manutenção da
multipotencialidade das células da CNC
e na diferenciação condrocítica.
118
resultado somente foi possível após a melhoria do nosso sistema de cultivo, ou seja, após a
utilização de monocamadas densas de 3T3.
A primeira observação de que a CNT poderia dar origem a condrócitos in vitro, foi
realizada por Imelda Mcgonnel e Antony Graham em 2002. Este resultado causou certa
polêmica na época, uma vez que classicamente a principal diferença entre as células da CNC
e da CNT em Amniotas é de que esta última não seria capaz de originar condrócitos in vivo.
Esta diferença é verificada tanto durante o desenvolvimento embrionário normal como em
experimentos nos quais a CNT transplantada nos níveis cefálicos falham em originar
condrócitos (Nakamura & Ayer-le Lievre, 1982).
Para obter este resultado, os autores realizaram culturas da CNT em um meio
comumente utilizado para o crescimento de osso e cartilagem, o qual inclui dexametasona,
acido ascórbico e β-glicerolfosfato. Após 4-5 semanas foi verificada a presença de
condrócitos e osteoblastos nestas culturas (McGonnell & Graham, 2002).
Em 2003, Abzhanov e colaboradores também conseguiram obter condrocitos em
culturas de longo período (12 a 15 dias) a partir de células da CNT de aves. Estes autores
sugeriram uma possível explicação para o surgimento de condrócitos em suas culturas: uma
diminuição ou perda da expressão do gene Hoxb4 pelas células da CNT, as quais as tornariam
“parecidas” com as células da CNC (uma vez que as células da CNC que originam
condrócitos são Hox negativas). De maneira oposta, as taxas de condrogênese são reduzidas
quando as células da CNC são transplantadas para regiões Hox positivas do embrião. Isto
explicaria porque nas culturas de células da CNT o aparecimento de condrócitos ocorreria
apenas após um longo período de cultura, pois existiria um tempo mínimo necessário para que
as células da CNT “perdessem” a expressão dos genes Hox (Abzhanov et al., 2003).
Entretanto, em nosso modelo conseguimos obter nódulos de cartilagem muito mais
rapidamente, no maximo em até 8 dias, não diferindo muito neste aspecto em relação às
119
culturas a partir da CNC, nas quais os nódulos de cartilagem aparecem entre os 5-6° dias.
Além disso, partimos de uma quantidade muito pequena de células da CNT (800
células/poço) enquanto os outros trabalhos foram realizados com o total de células que
migraram a partir explantes de tubos neurais ou das pregas neurais da região troncal.
Finalmente, não utilizamos nenhum meio propício em estimular a condrogênese, tal como
utilizado por Graham. Portanto, nossos dados sugerem que somente a diminuição ou perda
dos genes Hox não tornaria as células da CNT competentes a originarem condrócitos.
Entretanto, não analisamos este aspecto em detalhes e talvez a expressão do gene Hox em
nossas culturas também esteja diminuída, um fenômeno que, portanto, poderia ocorrer mais
rapidamente do que o suposto.
O trabalho de Graham (2002) ainda mostrou que quando agregados de células da CNT
(provenientes de codornas) foram implantados diretamente no primórdio maxilar e
mandibular do embrião de galinhas, acabaram por gerar alguns condrócitos, os quais estavam
esparçamente distribuídos entre os elementos cartilaginosos do embrião hospedeiro. Uma das
explicações utilizadas pelos autores, é que os experimentos realizados por Nakamura & Le
Lièvre (1982) falharam em obter cartilagem devido a diferenças migratórias das células da
CNT em relação a CNC: as células que originariam condrocitos a partir da CNT falhariam em
migrar quando colocadas no ambiente da CNC. Antony Graham conseguiu, portanto, obter
este resultado graças a evitar que as células tivessem que migrar num ambiente não
permissivo, transplantando-as diretamente num ambiente permissível à condrogênese (maxila
e mandíbula).
Em 2004, Marianne Bronner-Fraser lançou-se à questão. Seu grupo resolveu refazer
alguns clássicos experimentos realizados no laboratório de Nicole Le Douarin há cerca de 25
anos, entretanto agora disponibilizando de novos traçadores celulares e marcadores
moleculares, inexistentes na época (Lwigale et al., 2004). Quando realizados transplantes
120
heterotópicos da CNT na região cefálica, estes pesquisadores chegaram às mesmas conclusões
de Noden, 1978 e Nakamura & Le Lievre, 1982, ou seja, a CNT não é capaz de originar
condrócitos in vivo. Na tentativa de resolver a questão da migração diferencial entre as células
da CNC e da CNT, como sugerido por Antony Graham, o grupo isolou a parte dorsal de tubos
neurais retirados da região mesencefálica e da região troncal de embriões de codornas e
transplantou-os diretamente no primeiro arco branquial de galinhas. As células da CN que
migraram a partir dos transplantes de mesencéfalos povoaram a maior parte dos processos
mandibulares, incluindo a cartilagem de Meckel. Já as células da CN que migraram a partir
dos explantes da região troncal, migraram para o primeiro arco branquial normalmente e
formaram agregados adjacentes à cartilagem de Meckel, mas nunca contribuíram diretamente
para formação desta estrutura. Estes experimentos revelaram que não é por um problema na
migração, nem por um efeito de comunidade que as células da CNT falham em originar
cartilagem in vivo.
Estes dados sugerem que as pistas que estão presentes in vivo (ao contrário da indução
in vitro) não são suficientes em induzir a CNT a formar cartilagem.
4.2.3.2 Shh estimula a condrogênese nas células da CNT
Outro resultado surpreendente em nosso trabalho foi a observação que Shh também é
capaz de estimular a condrogênese nas células da CNT. A princípio, a resposta evocada por
estas células é muito similar aquela observada pelas células da CNC, pois observamos um
aumento tanto no número quanto na freqüência de nódulos de cartilagem gerados por poço de
cultura. Entretanto, de maneira diferencial, as doses mais baixas de Shh (1 e 10 ng/ml)
evocaram as melhores respostas nas células da CNT. Curiosamente, a dose de 100 ng/ml, a
qual se mostrou a mais efetiva na condrogênese para as células da CNC, não estimulou a
121
formação de nódulos de cartilagem. Estes dados sugerem que possa existir uma regulação
e/ou expressão diferencial de receptores e/ou moléculas sinalizadoras da via de Shh entre as
células da CNC e da CNT. Talvez estas diferenças sejam importantes em determinar a
ausência de condrogênese exibida pelas células da CNT in vivo. Este aspecto resta ser
estudado.
Além disso, diferentemente da CNC, não observamos efeito de Shh sobre
miofibroblastos na CNT. Entretanto, de certa forma, estes dados parecem confirmar aquilo
que havíamos observado para os progenitores derivados da CNC: Shh na verdade estimula os
progenitores comuns de condrócitos e miofibroblastos (F
+
C
+
). Como a potencialidade
condrogênica é fracamente expressa na CNT (em comparação à CNC) mesmo sob tratamento
com Shh, uma possível diferença na quantidade de miofibroblastos é mais difícil de ser
percebida. A presença de miofibroblastos in vitro foi largamente documentada em
experimentos de massa e clonais da CNT de aves (Sieber-Blum & Ito, 1995; Trentin et al.,
2004) e de camundongos (Shah et al., 1994; Anderson, 1997; Hagedorn et al., 1999; Sieber-
Blum et al., 2004). É interessante percebermos que moléculas classicamente envolvidas na
diferenciação de condrócitos, tais como BMPs e TGFβ, também já foram relatadas estar
envolvidas na diferenciação de miofibroblastos (Zhang et al., 2002a; Shum et al., 2003;
Anderson, 1997), sugerindo uma vez mais um papel de Shh sobre os progenitores comuns
para condrócitos e miofibroblastos. Entretanto, in vivo, apenas recentemente foi demonstrado
que a CNT pode dar origem a miofibroblastos. Em camundongos, esta contribuição é muito
pequena e está restrita ao endoneuro (Joseph et al., 2004).
Finalmente, este trabalho demonstra pela primeira vez a existência de um progenitor
comum nas células provenientes da CNT, que pode dar origem às linhagens neurais e
condrocíticas. Conseguimos detectar um único clone contendo células gliais, miofibroblastos
e cartilagem (GFC) em nossas culturas. Este clone foi encontrado em culturas tratadas com 10
122
ng/ml de Shh. A existência deste único clone não nos permite afirmar categoricamente que
apenas na presença de Shh esta multipotencialidade possa ser expressa, pois este resultado
pode ser atribuído ao acaso. Entretanto, levando em conta os resultados clonais obtidos a
partir das células da CNC, nada impede que Shh possa também estimular o aparecimento de
progenitores comuns para as linhagens mesenquimal e neural a partir das células da CNT.
Este resultado permite uma reavaliação do modelo de segregação e
multipotencialidade das células da CNT e está proposto abaixo:
Figura 43: Novo modelo de segregação das linhagens da CNT
Neste modelo inserimos o clone GFC, o qual foi descoberto neste trabalho (único
progenitor em azul fora do limite pontilhado). A existência deste clone pode preconizar a
existência de todos os outros precursores descritos na CNC, incluindo o progenitor
multipotente GNMFC (todos os progenitores contidos dentro do limite pontilhado). Observe
que este esquema leva em conta nosso mais novo modelo de segregação de linhagens e
multipotencialidade proposto nesta Tese para a CNC. Entretanto, também é possível que o
progenitor altamente multipotente (GNMFC), bem como os progenitores tetrapotentes, sejam
GC
MC
GMC
GNC
FC
C
GN
MC
GM
FC
GN
FC
GNM
FC
GM
N
M
G
F
GFC
GMF
GN
GN
MF
GNM
GNF
GF
123
exclusivos da CNC e que, portanto, as células da CNT possam revelar suas potencialidades
condrogênicas “adormecidas” in vitro apenas até um determinado limite, sendo assim talvez
jamais encontraremos estes progenitores. Assumindo que cada nódulo de cartilagem nas
culturas de massa é originado de uma única célula com potencial condrogênico, na CNT a
proporção de células plaqueadas que são condrogênicas na ausência de Shh pode ser avaliada
em cerca de 0,04% (correspondendo ao numero médio de 0,3 nódulos por 800 células) e 4%
(16 nódulos por 400 celulas) na crista neural mesencefálica, respectivamente. Levando em
conta estas cálculos, a probabilidade de obtermos um clone com cartilagem na CNT é cerca
de 100 vezes inferior à probabilidade de obtermos um tal clone (com potencial condrogênico)
na CNC. Precisaríamos, portanto realizar cerca de 22.500 clonagens para talvez conseguirmos
criar um modelo como o acima proposto (uma vez que o clone GFC foi encontrado após 225
clonagens).
Por fim, uma hipótese menos provável (mas que merece ser considerada), pode
explicar o aparecimento deste progenitor com potencialidade condrocítica a partir de células
da CNT. Talvez um processo de reprogramação esteja ocorrendo nestas células, neste caso,
podemos imaginar que um progenitor GF, por exemplo, possa se reverter em um progenitor
GFC.
4.2.4 Potencialidade, Destino e Evolução da CN
Em conjunto, estes resultados demonstram que as células da CNT possuem a
potencialidade para dar origem a condrócitos quando colocados num ambiente propício in
vitro. A partir desta evidência, podemos pensar num mapa de potencialidades da CN, o qual
não é sobreponível totalmente com o mapa de destino das células da CN. Isto significa que a
potencialidade das células da CN não difere ao longo de todo o eixo rostro-caudal, entretanto
124
o seu destino sim. O mapa de destino e o mapa de potencialidade mostrado na próxima
página expressam claramente esta idéia:
Figura 44: Mapa de destino e potencialidade da CN
Nestes dois mapas podemos verificar que a CN possui a potencialidade de gerar
melanócitos ao longo de todo o eixo rostro-caudal. Esta potencialidade corresponde
completamente ao seu destino, pois efetivamente, in vivo, a CN é capaz de originar
melanócitos ao longo de todo o eixo ântero-posterior. A CN também exibe a potencialidade
ao longo de todo eixo rostro-caudal em originar condrócitos, entretanto, in vivo, apenas a
região cefálica da CN capaz de dar origem a condrócitos, portanto o seu destino não
correspondente completamente a sua potencialidade.
S4
S7
S18
S24
S28
POTENCIAL
CEFÁLICO
TRONCO
MESECTODERMA (condrócitos, adi
p
ócitos, miofibroblastos)
S24
S28
DESTINO
S1
Gânglio
Entérico
Gânglio
Sensorial
Gânglio
Simpático
Gânglio
Parassimpático
Melanócitos
125
Além disso, esta potencialidade não é equivalente ao longo de todo o eixo ântero-
posterior. Existe uma graduação decrescente do poder condrogênico das células da CN a
partir da região cefálica até a região mais caudal do embrião. Esta graduação é refletida
através do número de nódulos de cartilagem gerados a partir de 400 células da CN por poço
de cultura. A figura 45 mostra a comparação do número de nódulos de cartilagem obtidos a
partir de um mesmo número de células da CN (400) retiradas de diferentes níveis: desde o
mesencéfalo (mes) até a crista neural troncal (somitos 15-25). Esta comparação foi realizada a
partir de células da CN que migraram por 24 horas em culturas primárias e foram mantidas
em culturas secundárias densas de 3T3 apenas com meio de cultura controle.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Mes r1-r2 r3-r8 r15-r25
N° de nodulos de cartilagem/poço
Figura 45: Graduação decrescente do poder condrocítico das células da CN ao longo do eixo rostro-caudal
Portanto, poderíamos eleger um grau de probabilidade em obter células condrogênicas
partir dos níveis rostro-caudais das quais elas são originadas. Células obtidas a partir dos
mesencéfalos (Mes) exibiriam o grau máximo de condrogênese, seguida pelas células da CN
dos rombômeros 1 e 2 (r1-r2); subseqüentemente pelos rombômeros 3-8 (r3-r8) e finalmente
as células da CN originadas do nível troncal (somitos 15-25). Desta forma fica claro porque a
probabilidade de se obter um clone contendo cartilagem a partir das células da CNT é tão
baixa em relação às células da CNC, sobretudo se estas forem obtidas a partir de
mesencéfalos.
ss15-ss25
126
As diferenças entre o destino e a potencialidade exibida pelas células da CN em
relação à condrogênese, nos fazem questionar de que forma poderíamos conciliar estes
resultados de um ponto de vista evolutivo.
As estruturas esqueléticas mais primitivas de vertebrados consistiam de tecido dermal
calcificado composto de dentina, sendo por esta razão classificados como de origem da CN
(Smith et al., 1990; Donoghue & Sansom, 2002). Esta estrutura esquelética podia envolver
todo o corpo do animal, como nos peixes fósseis heterostracan, formando desta forma uma
espécie de armadura. Atualmente, o esqueleto craniofacial dos vertebrados superiores e a
barbatana caudal de teleósteos são estruturas remanescentes desta armadura (Smith et al.,
1994). De maneira interessante, Quint e colaboradores (2002) demonstraram que a adição de
ciclopamina impede a regeneração das barbatanas caudais no peixe zebra, indicando que Shh
exerce um papel na proliferação e/ou diferenciação de células ósseas das barbatanas caudais
no peixe zebra (Quint et al., 2002).
Portanto, o potencial esqueletogênico da CNT estava presente em vertebrados
inferiores. Estas observações sugerem que durante a evolução dos vertebrados, a supressão do
potencial esqueletogênico por parte das células da CNT reflete uma redução gradual na
extensão do exoesqueleto troncal. Entretanto, à medida que este exoesqueleto foi
desaparecendo, uma contribuição crescente do endoesqueleto passou a ocorrer, tornando-se o
suporte esquelético predominante em anfíbios, aves e mamíferos. Isto certamente envolveu
um aumento do papel dos somitos e particularmente do esclerótoma ao longo da evolução.
Portanto, parece que as pistas do ambiente que suprimiram a diferenciação
esqueletogênica a partir das células da CNT, estão expressas ou relacionadas com a formação
do esclerótoma. O esclerótoma também é induzido por Shh, evidenciando que a sinalização
hh possui um papel no desenvolvimento esquelético, seja ele mesodermal ou mesectodermal.
O que levou o esclerótoma a substituir a CN na contribuição esqueletogênica do tronco
127
durante a evolução dos Amniotas resta obscuro, entretanto pode estar relacionado de alguma
forma com alterações na sinalização hh.
É importante considerar que de uma perspectiva evolutiva, a separação da CN em
populações cefálica versus troncal parece ser uma característica derivada em que a CNC
representaria o estado primitivo. Neste ponto de vista, não seria o desenvolvimento da cabeça
que é distinto devido ao papel exercido pelas células da CN, mas antes o tronco que difere,
pois é nesta região do embrião, que o mesoderma tornou-se predominante e substituiu as
funções de suporte antes exercidas pelas células da CN (Graham et al., 2004).
Assim, nós consideramos que os progenitores mesenquimais-neurais encontrados na
CN de aves são mais primitivos que os progenitores apenas neurais, sendo, portanto estes
últimos derivados dos primeiros. Em alguns destes progenitores, a sinalização de Shh é capaz
de revelar a potencialidade que eles não perderam completamente em dar origem a derivados
mesenquimais. Logo, nós hipotetizamos que a maioria (senão toda) CN era originalmente do
tipo mesenquimal-neural.
128
5 CONCLUSÕES
• Nossos resultados in vitro evidenciam um papel decisivo de fatores solúveis (como
Shh) e de componentes da matriz extracelular (como fibronectina e colágeno IV) em
controlar o destino de diferentes derivados da CN.
• A fibronectina é responsável por aumetar a sobrevida e influenciar a diferenciação de
progenitores da CNT em direção ao fenótipo miofibroblástico. Este efeito pode ser
correlacionado com a presença dos sítios de ligação RGDS presentes na fibronectina.
• Por outro lado, o colágeno IV favorece a expressão de melanócitos, sugerindo que
estas diferentes moléculas da matriz exercem um papel fundamental na orientação dos
destinos finais dos progenitores da CN.
• Observamos pela primeira vez o aparecimento de um progenitor altamente
multipotente da CNC, capaz de dar origem a células gliais, neurônios, melanócitos,
miofibroblastos e condrócitos. Sonic Hedgehog estimula o aparecimento e/ou
manutenção deste progenitor.
• Shh é capaz de direcionar ou “instruir” as células da CNC a adotarem
preferencialmente fenótipos mesenquimais às expensas de fenótipos neurais.
• As células da CNT in vitro são capazes de diferenciarem-se em condrócitos e Shh
estimula a condrogênese exibida por estas células.
129
• Observamos pela primeira vez um raro progenitor capaz de dar origem a células
gliais, miofibroblastos e condrócitos em culturas da CNT. Portanto, a potencialidade
“perdida” das células da CNT em originarem condrócitos in vivo pode ser revelada
através de determinadas condições do microambiente in vitro.
130
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147
APÊNDICES
APÊNDICE A – “Fibronectin promotes myofibroblast differentiation in quail and
mouse neural crest”. Artigo científico em fase final de preparação;
APÊNDICE B – “Sonic Hedgehog promotes the development of multipotente neural
crest progenitors endowed with both mesenchymal and neural potentials”. Artigo disponível
on-line, a partir da semana de 03/12/2007.
APÊNDICE C – “Neural crest progenitors and stem cells”. Artigo Publicado.
148
Title: Fibronectin promotes myofibroblast differentiation in quail and mouse neural crest
Running Title: fibronectin and neural crest-derived myofibroblast
Authors: Meline Coelho da Costa
1#
; Bruno Costa-Silva
1#
; Fernanda Rosene Melo
1
; Cynara
Mendes Neves
1
; Márcio Alvarez-Silva
1
; Giordano Wosgrau Calloni
1,2
;
Andréa Gonçalves
Trentin
1
#
MCC and BC-S contributed equally to this work.
Affiliations:
1
Departamento de Biologia Celular, Embriologia e Genética, Centro de Ciências Biológicas,
Universidade Federal de Santa Catarina, Campus Universitário - Trindade, 88040-900,
Florianópolis, S.C., Brazil.
2
Programa de Pós-graduação em Ciências Morfológicas, Instituto de Ciências da Saúde,
Universidade Federal do Rio de Janeiro – Ilha do Fundão, 21949-590, Rio de Janeiro, R.J.;
Brazil.
Corresponding Author’s address:
Dr. Andréa Gonçalves Trentin, Dept. Biologia Celular, Embriologia e Genética,
Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Santa Catarina,
Campus Universitário, 88040-900, Trindade, Florianópolis, S.C., Brazil.
Phone: 55 48 3721 6905 ; Fax: 55 48 3721 5148 ; e-mail: [email protected]sc.br
23 pages
8 figures
1 tables
Supplements:
3 tables
2 figures
149
Abstract
The influence of extracellular matrix (ECM) proteins such as fibronectin (FN), laminin (LN) and type IV
collagen (CLIV) has been broadly described in neural crest (NC) cell migration. Nevertheless, little is known
about their function in NC cell differentiation and proliferation. In the present work, we observed that FN
significantly stimulates the myofibroblast expression in cephalic and trunk NC cell cultures from mouse and
quail, respectively. Inhibition assays using the GRGDS peptide resulted in a significant decrease in the FN-
induced myofibroblast expression, attesting that FN-integrin interactions play an important role in this process.
Experiments using combinations of ECM proteins in primary and secondary cultures showed that the increased
myofibroblast proportion in FN is not due to a differential migration of NC progenitors from the neural tube.
The overall cell death was low in every tested condition and at any experimental time point, being considered
irrelevant to the observed phenomenon. The time course analysis revealed that FN promotes the NC cells
differentiation into myofibroblast without affecting its proliferation rate. In addition, in vitro cloning
experiments of trunk quail NC cells demonstrated increased proportion of unipotent and oligopotent progenitors
endowed with myofibroblastic potential at the expense of progenitors without this potentiality on FN in
comparison to CLIV. Taken together, our results demonstrate that FN, in addition to its well documented effect
on NC cell migration, has an important role on NC cell differentiation into myofibroblasts. We also suggest that
this mechanism is similar in quail and mouse at both cephalic and trunk levels.
Key words: fibronectin, myofibroblast, neural crest, extracellular matrix, cell differentiation
Introduction
The neural crest (NC) is a transient structure of the vertebrate embryos formed by the lateral borders of
the closing neural tube. After migration, during early embryogenesis, NC cells differentiate into different sets of
derivatives according to their location in the embryo. The NC comprises a heterogeneous population of
progenitors endowed with the potentiality to give rise to a variety of cell types such as melanocytes, neurons and
associated glial cells of the peripheral nervous system and endocrine cells such as the adrenomedullary cells. At
the cephalic level, the NC also originates myofibroblasts, chondrocytes, adipocytes and osteocytes. Very recently
a subset of adipocytes has been described as originated from the NC (Billon et al., 2007). It has been
demonstrated by in vitro clonal assays that avian NC cells is a collection of highly pluripotent and intermediate
progenitors, suggesting a model of progressive restrictions in the multiple potentialities of a multipotent cell as in
the hematopoietic system (Le Douarin, 2004; Le Douarin and Kalcheim, 1999). In addition, the bipotent
precursors that produce glial and melanocytes (GM) or glial and myofibroblasts (GF) are able to self-renew in
vitro along successive rounds of subcloning, demonstrating that quail NC presents true stem cell properties
(Trentin et al., 2004).
It has been demonstrated that the extracellular matrix (ECM) components influence NC cell behavior, by
virtue of their particular adhesive characteristics. Separation of NC cells from the dorsal neural tube and
migration thought the embryo involves cell-cell adhesion alterations, cell-matrix interactions and re-
organization of the ECM components (Le Douarin and Kalcheim, 1999; Perris and Perissinotto, 2000). A
number of ECM molecules presenting permissive or inhibitory influences on NC migration have been identified
in their migratory pathways. Permissive ECM molecules include fibronectin (FN) (Newgreen and Thiery, 1980),
150
laminin (LN) (Duband and Thiery, 1987), type I collagen and type IV collagen (CLIV) (Perris et al., 1993), and
tenascin (Bronner-Fraser, 1988). FN, which is able to form complexes with both collagens and proteoglycans, is
ubiquitous in regions through which NC cells migrate and that contain both interstitial and basement membrane
type matrices (Newgreen and Thiery, 1980). NC migration on these substrates has been shown to involve
members of both the β1 and β3 subfamilies of integrins (Delannet et al., 1994; Desban and Duband, 1997; Kil et
al., 1998). Thus, many different integrins are used to mediate NC cell adhesion and migration through the
surrounding ECM (Alfandari et al., 2003). In contrast, non-permissive cues are present in regions where NC
cells fail to migrate and may act as barriers to migratory NC. Inhibitory ECM components include aggrecan,
versican (Landolt et al., 1995; Perris et al., 1996) and type IX collagen (Ring et al., 1996).
In addition to the well known effect on NC migration, ECM proteins have also been suggested to
influence NC differentiation (Loring et al., 1982; Perris et al., 1988). FN promotes quail NC cells differentiation
to the adrenergic phenotype (Sieber-Blum et al., 1981). FN and LN differently affect melanogenesis in cultures
of avian NC cells (Rogers et al., 1990). More recently, FN in combination with stem cell factor was also
demonstrated to affect the migration, proliferation and differentiation of melanocytes in mouse NC (Takano et
al., 2002). Despite the variety of studies evaluating the ECM distribution along the NC migratory routes, it is
still poorly understood the contribution of these molecules on NC cells proliferation and differentiation.
In the present work, we studied the influence of the ECM proteins FN, LN and CLIV in the migration,
differentiation, proliferation and survival of quail and mouse NC cells at the trunk and cephalic levels,
respectively. We show that FN stimulates NC differentiation to a myofibroblastic fate involving its RGD
binding site. Our results demonstrate that FN, in addition to its well documented effect on NC cell migration,
has an important role on NC cell differentiation into myofibroblasts.
Materials and Methods
Neural crest (NC) cell cultures
Neural tubes obtained from quail embryos (18-25 somite stage) were dissected at trunk level and plated
into plastic culture dishes (Corning) coated with different ECM proteins: human plasma fibronectin (FN), natural
mouse laminin (LN), or mouse type IV collagen (CLIV) (all from Gibco-BRL; 20µg/mL). After 24 hours,
emigrated NC cells were harvested and subsequently seeded in culture dishes coated with the referred ECM
proteins. Cultures were maintained for additional 3, 6, or 9 days in the complex media: α-minimum essential
medium (α-MEM; Gibco-BRL), enriched with 10% of fetal bovine serum (Cultlab), 2% chicken embryonic
extract, hydrocortisone (0,1μg/mL), transferrin (10μg/mL), insulin (1ng/mL), 3-3'-5 triiode-L-thironine (T
3
)
(0,4ng/mL), glucagon (0,01ng/mL), EGF (0,1ng/mL), FGF (0,2ng/mL), penicillin (200 U/mL) and streptomycin
(10 µg/mL) (all from Sigma) (Lahav et al., 1996; Trentin et al., 2004). Clonal cultures of quail NC cells were
performed by micromanipulation as described (Baroffio et al., 1988; Trentin et al., 2004). Briefly, individual
cells obtained from 24 hours primary cultures performed in FN were seeded under microscopic control in 96-
well culture plates (Corning) previously coated with FN or CLIV and maintained during 8 days. Cultures were
incubated at 37
o
C in a humidified 5% CO2, 95% air atmosphere. The media was replaced every 3 days.
Primary cell cultures of mouse cephalic NC cells were prepared as previously described (Ito and
Morita, 1995) using 8.5 days C57BL/6 mouse embryos. Neural folds at the mesencephalic level were dissected
151
and explanted into culture dishes previously coated with FN, LN or CLIV as described above for quail cultures.
The epithelial components in primary explants were removed mechanically with a tungsten needle after 24
hours of culture and the emigrated NC cells were cultured for additional 2, 5, 8 or 11 days. In some experiments,
the emigrated NC cells were trypsinized after 48 hours of primary culture and subcultured on ECM-coated
dishes. Cells were maintained in the complex media, as described above.
Analysis of NC cell migration
The migration of NC on ECM substrates was analyzed at 24 hours of primary culture. The area of NC
outgrowths from the neural tube explants was measured using the Universal Desktop Ruler
program (AVPSoft).
Migration value was obtained subtracting the explant area from the total migration area (Huang et al., 1998).
Immunofluorescence staining and phenotypic analysis
Cell phenotypes were analyzed as previously described using lineage-specific markers (Dupin et al.,
2000; Trentin et al., 2004). Mature melanocytes were recognized by the presence of melanin and unpigmented
melanocytes by staining with the melanoblast/melanocyte early marker (MelEM) monoclonal antibody
(mAb)(Nataf et al., 1993). Glial cells were identified by the use of Schwann cell myelin protein (SMP) mAb
(Dulac et al., 1988) or glial fibrillary acidic protein (GFAP) polyclonal antibody (pAb) (Dako). Neurons were
labeled using antibodies against quail tyrosine hydroxylase mAb (Fauquet and Ziller, 1989), mouse β-III-
Tubulin mAb (Promega) and/or rabbit neurofilament pAb (Sigma). Myofibroblasts were identified by
immunoreactivity to alfa-smooth muscle actin (α-SMA, Sigma). Detailed procedures are described elsewhere
(Dupin et al., 2000; Dupin et al., 2003; Lahav et al., 1998; Trentin et al., 2003). The cell nuclei were stained
with 4´,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI; Sigma). Fluorescence labeling was observed under
an epifluorescent microscope (Olympus).
5-bromo-2’-deoxyuridine (BrdU) incorporation and detection
The cell proliferation was analyzed by 5-bromo-2’-deoxyuridine (BrdU, Invitrogen) incorporation as
previously described (Aguiar et al., 2005; Mendes de Aguiar et al., 2002) with modifications. NC cells were
incubated with BrdU for 24 hours. Cells were then fixed with 4% paraformaldehyde, permeabilized with 0.25%
Triton X100 (Sigma), washed in distilled water and next incubated with 2N HCl (15 minutes/37
o
C). After
washing in PBS, the cultures were immunoreacted with mouse anti-BrdU (Calbiochem) and subsequently with
rabbit anti-mouse IgG1-FITC (Southern Biotechnology). Cell nuclei were stained with DAPI. Cells were
visualized as described above.
Cell death assay
Cell death was quantified by assessing the characteristic nuclear changes of apoptosis (i.e. chromatin
condensation and nuclear fragmentation) using the nuclear binding dye DAPI (Villegas et al., 2006) and
fluorescence microscopy. Alternatively, cultures were washed with HEPES buffer (5 mM HEPES; 125 mM
NaCl; 5.5mM KCl; 1.0 mM MgCl
2
.6H
2
0; 1.8 mM CaCl
2
.2H
2
0) pH 7.4 and incubated during 10 minutes with
SYTOX
®
green nucleic acid stain according to the manufacturer’s instructions (Molecular Probes) and
visualized as described above.
152
Evaluation of RGDS site of FN
Neural tube explants were cultured on FN-coated dishes for 24 (quail) or 48 hours (mouse) as described
above. Cells were then subcultured on FN-coated culture dishes. After 12hours, GRGDS peptides (Sigma) at the
concentration of 125, 250, 350 or 500μg/ml were added to the media. Complex media containing GRGDS
peptide was replaced every 3 days. SMA
+
cells were counted after 6 (quail) or 10 days (mouse).
Statistical analysis
The significance of the differences was evaluated by means of one-way ANOVA with Bonferroni's post-
test or by χ
2
test using the GraphPad InStat program. The level of significance was set at P < 0.05 in all cases.
Results
The effect ECM proteins on the phenotype expression of NC cells
In order to evaluate if isolated ECM molecules could directly influence the cell phenotype expression in
NC, we performed cultures of quail and mouse NC at the trunk and cephalic levels, respectively. Figure 1 shows
representative pictures of the cell phenotypes present in quail (Fig. 1A-D) and mouse (Fig. 1I-K) NC cell
primary cultures and the corresponding quantification at the 6th (to quail - Fig. 1E-H) and 12th (to mouse - Fig.
1L-N) days of culture. In quail, glial cells corresponded to the most frequent phenotype (~60%), followed by
melanocytes (~10%) and neurons (~2%). Differences in the proportion of these phenotypes between the
analyzed ECM substrates were not observed. On the other hand, myofibroblast represented 14.6% of cells on
FN, a value 12 and 6-folds higher than those obtained on LN and CLIV, respectively (Fig 1 A-H).
In mouse NC (Fig.1I-N), glial cells were also the most frequent phenotype, displaying similar
proportions on FN and LN (31% and 29.6%, respectively), values significantly higher than the obtained on
CLIV (18%). On the other hand, the proportion of neurons was reduced in every evaluated condition. The
highest proportions were obtained on CLIV (3.3%) and LN (0.7%). As for quail NC, the highest proportion of
myofibroblast was obtained on FN (23.5%), proportion 3.5-fold and 5.4-fold higher than those observed on LN
(6.6%) and CLIV (4.3%), respectively.
Analysis of RGDS binding site of FN
NC cells have been reported to interact with several binding sites of FN, among them the RGDS (Arg-
Gly-Asp-Sr) domain, in order to attach, spread and locomove (Dufour et al., 1988). To further investigate the
effect of FN in the myofibroblast expression, we cultured NC cells in the presence of the GRGDS peptide (Fig.
2). We observed a dose-dependent reduction in the proportion of SMA
+
cells in trunk quail NC (Fig. 2A). In
cephalic mouse NC, statistically significant reduction in the number of SMA
+
cells was detected in the 350
μg/ml GRGDS concentration (Fig. 2B). The overall cell death was insignificant in these experiments (Data not
shown). These results indicate the involvement of the RGDS domain of FN in the myofibroblast expression in
NC cell cultures.
The effect of ECM on NC cell migration
153
In order to verify whether ECM proteins affect the NC cell migration from the neural tube, we measured the
area occupied by this cell population after 24 hours of primary culture (Fig. 3A and B). The results revealed no
statistical differences in trunk quail NC migration among the substrates (around 5 mm
2
) (Fig. 3A), whereas in
cephalic mouse NC, CLIV and FN displayed similar values of migration area (2 and 1.8 mm
2
, respectively),
significantly higher than that observed on LN (1.3
mm
2
) (Fig. 3B).
To evaluate a possible influence of FN in the migration of myofibroblastic progenitors from neural tube at
the first 24 hours, we performed experiments combining ECM substrates in primary and secondary cultures
(Fig. 3C and D). Independent of the substrate used in the primary culture, increased proportions of
myofibroblast were observed in all substrate combinations that used FN in the secondary culture. These results
were similar in both trunk quail (Fig. 3C) and cephalic mouse NC (Fig. 3D) and suggest that the influence of FN
on myofibroblast expression is not due to the initial NC cell migration from the neural tube. In addition, no
significant differences were observed in the proportion of glial cells, melanocytes and neurons at any
combination of ECM substrate in trunk quail NC, indicating a specific effect of FN in the myofibroblast
expression (Table1 - Supplement).
Effect of ECM proteins on the NC cell survival and proliferation
The increased myofibroblast expression on FN could be due to a combination of factors that stimulate
events such as survival of myofibroblasts and/or their progenitors, proliferation of differentiated myofibroblast,
and/or differentiation of progenitor cells into myofibroblasts. To assess this question, we first investigated if a
possible selective decrease in the death of myofibroblasts could explain their increased proportion on FN. We
evaluated cell death by SYTOX
®
green incorporation (to identify necrotic cells) or by DAPI staining (to
visualize picnotic nuclei) (Fig. 4). These assays revealed a reduced percentage of dead cells in all tested
substrates, in both trunk quail and cephalic mouse NC cultures. In quail NC cell cultures, the lowest values of
cell death were observed on LN (0.14%), although not statistically different from those obtained on FN (0.3%)
and CLIV (0.3%) (Fig. 4A). Similarly, mouse NC cells displayed low proportions of dead cells with minor
differences among the tested substrates (Fig. 4B). In addition, the time course analysis of apoptotic cells in trunk
quail NC (Fig. 4C) revealed constant and similar proportions of cell death between FN and CLIV at any time
examined. We also observed a small and stable proportion of dead cells in mouse NC during the time course of
the experiment (Fig 4D). The insignificant cell death observed in our experiments discards an eventual role of
selective cell survival in the differential expression of myofibroblasts.
Afterward, we investigated the effect of FN on cell proliferation. Experiments of BrdU incorporation
revealed that about 60% of trunk quail NC cells proliferate at day 6 of culture on any analyzed ECM protein
(Fig. 5A). In cephalic mouse NC, the highest value for cell proliferation was found on LN (69%), 2-fold and 7-
fold higher than those obtained on FN and CLIV, respectively (Fig. 4B). In quail trunk NC similar values of
glial cell and melanocyte proliferation were observed in every analyzed condition (Table 2 - Suplement).
However, in both quail (Fig. 5C) and mouse (Fig. 5D) NC cultures, the proportion of proliferating
myofibroblasts (SMA
+
BrdU
+
) in relation to the total number of cells was significantly higher on FN (about 4-
fold), when compared to LN and CLIV. However, the proportion of SMA
+
BrdU
+
cells (Data in Fig. 5 C and D)
in relation to the total number of myofibroblasts (Data in 1B and Figure 1S) was similar in all evaluated ECM
proteins (Fig. 5 E and F, to quail trunk and mouse cephalic NC, respectively). These results suggest that the
154
enhanced proportion of SMA
+
BrdU
+
cells observed on FN is a mere consequence of the dimension of the
myofibroblasts cell population.
FN induces myofibroblast differentiation
In order to investigate the role of cell differentiation in FN-induced myofibroblast expression, time course
analyses were performed. In quail NC myofibroblasts were observed after the first day of culture, increasing
progressively thereafter on FN, but remaining constant on CLIV (Fig. 6A). In mouse NC cultures, the
myofibroblasts differentiation also starts after day 1, increasing progressively by day 6, and stabilizing thereafter
(Fig. 6B).
The time course analysis of BrdU incorporation in quail and mouse NC revealed a gradual decline in total
cell proliferation on FN through the 9 days of experiment. Additional analysis in trunk quail NC revealed similar
values on CLIV (Fig. 6C). Percentages of SMA
+
BrdU
+
cells increased progressively on FN. Differently, the
values obtained on CLIV remained constant and significantly lower than those observed on FN (Fig. 6E). In
mouse NC, we also observed a gradual decline in total cell proliferation through the analyzed days (Fig. 6D).
SMA
+
BrdU
+
cells also emerged after day 1 of culture, increasing by day 6, and declining thereafter (Fig. 6F).
Afterward, we asked if the enhanced proportion of SMA
+
BrdU
+
cells observed through the analyzed
period of culture on FN is a mere consequence of the dimension of the myofibroblasts cell population. We
analyzed the proportion of SMA
+
BrdU
+
cells (Data in Fig. 6E, F) in relation to the total proportion on
myofibroblasts at each time point (Data in Fig 6A, B, for quail and mouse NC, respectively). No differences
were observed between FN and CLIV in trunk quail NC (Fig. 6G). In addition, the same analysis in mouse NC
showed a progressive decline of values through the experimental time course on FN (Fig. 6H). Taken together,
these results reinforce the statement that FN stimulates NC cell differentiation into myofibroblast without
affecting the proliferation of this cell phenotype.
The influence of FN on NC Progenitors
In order to analyze whether FN affects the developmental potential of NC cells, we analyzed the
progeny of individual trunk quail NC cells cloned on FN or CLIV. The cloning efficiency, given by the total
number of clonogenic cells (119 on FN and 79 on CLIV) in relation to the total number of plated cells (288
cells), was significantly higher on FN than on CLIV (Table 1). This suggests an effect of FN in the survival of
NC progenitors.
Generated trunk quail NC clones were heterogeneous in relation to the size (1 to 5000 cells), being
classified in small, medium or large according to the number of cells (Table 3S). This analysis showed similar
distribution of clone size groups in both CLIV and FN.
In addition, colonies were classified according to the presence of myofibroblasts (F), glial cells (G), and
melanocytes (M). It was found unipotent clones containing only one of these phenotypes (F, G and M clones)
and oligopotent clones containing a combination of them (GM, GF, MF, GMF clones). Clones negative to the
analyzed cell phenotypes were termed unidentified clones (U). Table 1 shows the detailed distribution of the
different types of clones, and Figure 7 the representative pictures of GMF (Fig. 7A and B), GF (Fig. 7C and D)
and MF (Fig. 7E) clones. On FN, the number of F clones and GF clones were significantly higher than on CLIV.
155
MF clones were only found on FN. Furthermore, on CLIV the number of M clones was significantly higher than
the observed on FN (Table 1).
Myofibroblast-potent clones (F, MF, GF and GMF) represented the majority of clones on FN (74%),
value 3.5-folds higher than the observed on CLIV (Fig. 7F). On the contrary, CLIV presented a significantly
higher amount of myofibroblast-negative clones (G, M, GM and U) (78.5%) when compared to FN (Fig. 7F).
Furthermore, quantitative phenotypic analysis considering the sum of each cell phenotype in all clones
(Fig. 2S) showed that the frequency of each of them was similar to the observed in mass cultures (Fig.1E, F and
H), demonstrating that the sample token in clonal cultures represented the mass culture population.
Discussion
In the present study, we demonstrated that ECM proteins play an important role in NC cell
differentiation in addition to their already well known effect on NC cell migration. Our results show that FN
stimulates the NC cells specification to myofibroblast at both cephalic and trunk levels of NC in mammals and
avian, respectively.
A distinguishing feature of NC development is that different anterior-posterior regions of the NC
normally generate different sets of derivatives. The cephalic region produces ectomesenchymal tissues, including
connective tissue, cartilage, myofibroblast and bone (Darland and Leblanc, 1996) in contrast to the trunk region
that produces little or no ectomesenchymal tissue (Le Douarin and Kalcheim, 1999; Nakamura and Ayer-le
Lievre, 1982). However, it has been described that perineural fibroblasts are originated from trunk NC in vivo
(Joseph et al., 2004). Furthermore, NC contains oligopotent myofibroblast progenitors with the potential to
differentiate into this cell phenotype in culture, in both mammals (Shah et al., 1996; Stemple and Anderson,
1992) and avian (Trentin et al., 2004) or after unilateral transplantation into the embryonic cephalic region
(Nakamura and Ayer-le Lievre, 1982). Regional differences in NC fates appear to be determined in part by
signals that act on the cells after their migration from the neural tube (Darland and Leblanc, 1996; Le Douarin
and Kalcheim, 1999). It has been reported that ECM promotes or permits the differentiation of NC cells into
certain phenotypes in vitro, although the mechanisms by which the specific ECM component exerts its effect
remains elusive (Loring et al., 1982; Rogers et al., 1990; Takano et al., 2002). The expression of pigment cells
and catecholamine-containing cells is affected by FN or collagen coated substrates, whereas glycosaminoglycans
do not affect them (Loring et al., 1982). FN and LN have been reported to differently influence melanogenesis of
avian NC cell in vitro (Rogers et al., 1990). In mouse NC cells, FN combined with stem cell factor influences
melanocyte differentiation, proliferation and migration (Takano et al., 2002).
Here, we investigated the effects of the isolated ECM proteins LN, FN and CLIV on NC cell phenotype
expression at the cephalic and trunk regions of mouse and quail, respectively. The most significant observed
effect was related to the increased expression of myofibroblast on FN when compared to the other ECM
proteins, in both animal models and NC levels. The specificity of this effect was evidenced by inhibition assay
using GRGDS peptide (Fig. 2). It has been demonstrated that NC cells interact with several binging sites of FN,
including the RGDS domain, through integrin receptors that promote attachment, spreading and locomotion
(Dufour et al., 1988). In this way we may suggest that FN/integrin interaction plays a fundamental role in the
FN-induced myofibroblast expression.
156
Deposition of FN by early migrating cephalic NC cells was observed in vivo during their
individualization from the neural tube, and during their subsequent migration into branchial arches. It was
suggested that FN could act as an autocrine factor that initially is deposited by cephalic NC cells, providing
themselves with a substrate for their own migration. In contrast, in the trunk the space available for crest-cell
migration is small and contains ECM produced by neighboring tissues (Newgreen and Thiery, 1980). Cephalic
and trunk NC cells developing in vitro differ in their patterns of FN expression. While a significant proportion of
cephalic and sacral NC cells synthesize FN in vitro, almost all trunk NC cells lack this ability. Nevertheless, they
are responsive to FN-rich ECM (Leblanc, 1994; Newgreen and Thiery, 1980). Interestingly, Newgreen and
Thiery (1980) found in their in vitro experiments that most of the FN-producing cells presented a flat and spread
morphology, and are located at the periphery of the neural tube explants and suggested that the earliest cephalic
NC cells to migrate contain the FN-producing sub-population. In fact, in our cultures, most cells with this
morphology and location were SMA-producing cells, identified as myofibroblasts (data not shown). It was also
described that cephalic NC cells have two distinct phases of FN expression: first there is a transient period of FN
synthesis and deposition that occurs during the initial migration of cells from explants onto the culture dish and a
second that is associated with the cell differentiation period of in vitro development (Leblanc, 1994). As trunk
NC cells lack the ability to form mesenchymal cells in vivo, and since FN was related to this phenotype in vitro,
it was suggested that FN-producing cephalic NC cells could be endowed with the mesectodermal fate (Newgreen
and Thiery, 1980). In this context it is possible that a FN-rich microenvironment stimulates the expression of NC
derivates such as myofibroblasts. In fact, it is well accepted that the differentiation of mesoderm-derived
myofibroblasts is regulated by cooperation among cytokines (such as the transforming growth factor beta) and
ECM molecules (such as the ED-A splice variant of FN) (Desmouliere et al., 2005; Serini and Gabbiani, 1999;
Shah et al., 1996).
The higher expression of myofibrobasts on FN, in relation to LN and CLIV observed in the present
study, could be due to alterations of cellular mechanisms such as cell migration, proliferation, death and/or
differentiation. First, we addressed the question whether FN could be favoring the migration of NC cells
endowed with myofibroblast potential. Analysis of cell migration area revealed that despite the difference of cell
migration observed on mouse cephalic NC (Fig 3B), the migration area of quail trunk NC was similar in all
analyzed ECM (Fig. 3A). This result, together with data from experiments where EMC substrates in primary and
secondary cultures were combined (Fig 3C and D), indicates that the principal effect of FN on myofibroblast
expression is not related to the initial NC cell migration.
Next, we addressed if a selective survival of myofibroblasts or an increased death of other cell
phenotypes could be responsible for the myofibroblast expression on FN. SYTOX® green incorporation and
picnotic nuclei analyses (Fig. 4) revealed that the overall cell death was reduced, constant and similar (or with
minor differences) in all evaluated ECM. This suggests that the increased expression of myofibroblast on FN is
not due to differences related to cell death/survival. Subsequently, we analyzed the cell proliferation. Differently
to the observed on mouse cephalic NC, where proliferation on LN was higher that on FN and CLIN (Fig. 5B),
quail trunk NC displayed similar values on every evaluated ECM at the 6
th
day of culture (Fig. 5A). In addition,
the analysis of proliferating myofibroblasts in relation to the total number of this cell phenotype at the same time
point, revealed similar values on every evaluated ECM, in both animal models and NC levels (Fig. 5E and F).
Time course analysis of myofibroblast expression and proliferation on FN revealed reduction in the proportion of
157
proliferating NC along the evaluated period (Fig. 6C and D). Meanwhile, it was observed a progressive increase
of myofibroblast expression, which in quail trunk NC cultures was significantly higher on FN than on CLIV
(Fig. 6A and B). In addition, the proportion of proliferating myofibroblasts in relation to the total population of
this cell phenotype decreased along the experimental period in both animal models, being similar to the values
observed on CLIV in quail trunk NC (Fig. 6G and H). These results provide evidences that cell differentiation —
but not cell proliferation — is the main factor regulating the myofibroblast expression promoted by FN.
Finally, we addressed if FN could be influencing the developmental potential of NC progenitors. When
compared to CLIV, FN displayed a significant higher number of monopotent myofibroblast (F) and bipotent
glial-myofibroblast (GF) progenitors at the expenses of a significant lower number of monopotent melanocytic
(M) progenitors (Table 1). Although the gliogenic potential has been reported as common to all oligopotent NC
cell before become fully committed (Dupin et al., 2007), in the present study we observed the presence of
bipotent melanocyte-myofibroblast (MF) progenitor, which was only obtained on FN. Moreover, myofibroblast-
potent cells (F, GF, MF and GMF) represented the majority of NC progenitors found on FN, conversely to the
pattern observed on CLIV, where most of progenitors did not present this potential (G, M, GM and U)(Fig 7F).
Taken together, our results demonstrate a direct role of FN in the expression of NC-derived myofibroblasts (Fig.
8). We thus propose that cell differentiation — but not cell migration, survival or proliferation — plays a
significant role in this process, and suggest a possible effect of FN instructing NC cells to the myofibroblastic
fate.
Acknowledgments
We would like to thank Professor Nicole Le Douarin and Professor Vivaldo Moura Neto for their
constant encouragement. We also thank Dr. Elisabeth Dupin for the careful reading in the manuscript. This work
was supported by the Ministério da Ciência e Tecnologia/Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (MCT/CNPq/Brazil) and CNPq/PIBIC (Brazil), MCT/INFRA (Brazil), PRONEX/CNPq,
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Brazil) and Fundação de Amparo à
Pesquisa do Estado de Santa Catarina (FAPESC, SC, Brazil).
158
Legends:
Figure 1. Phenotypic analysis NC cells. Trunk quail (A-H) and cephalic mouse (I-N) NC cells were cultured as
described in materials and methods. Cell phenotypes were identified by the presence of specific cell markers:
SMP (A) or GFAP (I) to glial cells, SMA to myofibroblasts (B, J), NF (C) or β-III-Tub (K) to neurons; and
melanin or MelEM to melanocytes/melanoblasts (D). Quantification of the phenotypic markers at 6-day trunk
quail NC cultures (E-H) and at 12-day cephalic mouse NC cultures (L-N). Values were obtained from the
analysis of 60 random fields of three independent experiments in each ECM substrate. Results are expressed as
the mean ± S.E.M. ** P < 0.01, *** p < 0.001 by one-way ANOVA with Bonferroni post hoc test. Bar = 50 µm.
Figure 2. The role of RGDS in FN-induced myofibroblast expression. Trunk quail (A) and cephalic mouse (B)
NC cells were cultured on FN-coated wells as described in material and methods. The GRGDS peptide (125 to
500 μg/ml) were added at the secondary culture as indicated and the proportion of SMA
+
cells determined at
days 6 (quail) or 10 (mouse). Results are the mean ± S.E.M. of three independent experiments performed in
triplicate. ** P < 0.01 and *** p < 0.001 vs. control (without GRGDS) by one-way ANOVA with Bonferroni's
post hoc test.
Figure 3. The effects of ECM proteins on NC cell migration (A, B) and myofibroblast expression (C, D). Trunk
quail (A, C) and cephalic mouse (B, D) NC cell cultures were performed as described in materials and methods.
(A, B) NC cell migration from explanted neural tubes after 24 hours in cultures. Values were obtained from the
analysis of migration area of at least 9 explants in each condition and expressed as the mean ± S.E.M. *** P <
0.001, ** p < 0.01 by one-way ANOVA with Bonferroni post hoc test. (C, D) The effects of FN on
myofibroblast expression occur mainly in the post-migratory phase of cell culture. Explants of the neural tubes
were cultured on FN, CLIV (quail and mouse) or LN (quail) coated dishes in the primary culture during 24
(quail) or 48hs (mouse). The explants were then removed and the remaining cells (NC cells that have emigrated
from the neural tube) trypsinized and re-plated in different combinations of substrate as indicated. These cells
were cultured for additional 6 (quail) or 10 days (mouse), fixed and stained with anti-SMA antibodies as
described in materials and methods. Values were obtained from the analysis of 60 random fields of three
independent experiments in each culture condition. Results are expressed as the mean ± S.E.M. ** P < 0.01 vs.
FN in both primary and secondary cultures; # p < 0.05 vs. LN in the primary culture and FN in the secondary
culture; @@@ p < 0.001 and @ p < 0.05 vs. CLIV in the primary culture and FN in the secondary culture by
one-way ANOVA with Bonferroni's post hoc test.
Figure 4. The effects of ECM proteins on trunk quail (A, C) and cephalic mouse (B, D) NC cell death. Cell
death was determined by SYTOX
®
green incorporation (A) or by nuclear binding dye DAPI and quantification
of the picnotic nuclei (B, C, D). NC cells cultures were performed as described in materials and methods and
analyzed at day 6 of secondary (A) or primary culture (B). Cell death assays on secondary (C) and primary
cultures (D) were also performed at days 3, 9 or 12 as indicated. Results are expressed as the mean ± S.E.M. * P
< 0.05 by one-way ANOVA with Bonferroni's post hoc test.
159
Figure 5. The effects of ECM proteins on myofibroblast proliferation and differentiation in both trunk quail (A,
C, E) and cephalic mouse (B, D, F) NC. NC cells cultures were performed as described in materials and
methods, and analyzed at day 6 of the secondary (quail) or primary (mouse) culture. BrdU incorporation and
staining was followed by SMA labeling in order to assess the total cell proliferation (BrdU
+
cells) (A, B) and
myofibroblast proliferation (SMA
+
BrdU
+
cells) (C, D). Proportion of SMA
+
BrdU
+
cells (data in C and D) in
relation to SMA
+
cells (data in Fig. 1F and Fig.1 of supplement, respectively) in trunk quail (E) and cephalic
mouse (F) NC. Values were obtained from the analysis of 60 random fields of three independent experiments in
each ECM substrate. Results are expressed as the mean ± S.E.M. N.S. Non Significant, ** P < 0.01 and *** p <
0.001 by one-way ANOVA with Bonferroni's post hoc test.
Figure 6. FN promotes the differentiation of trunk quail (A, C, E, G) and cephalic mouse (B, D, F, H) NC cells
into myofibroblasts. NC cells were cultured on FN or CLIV during 1, 3, 6 and 9 days, as described in materials
and methods. Cell proliferation was assessed by BrdU incorporation followed by SMA staining to analyze the
proportion of myofibroblasts (A, B), total cell proliferation (C, D) and the proliferating myofibroblasts (E-F).
(G-H) Proportion of SMA
+
BrdU
+
cells (data in E and F) in relation to SMA
+
cells (data in A and B, respectively)
for each time point. Inserts in E and F represents SMA
+
BrdU
+
(SMA in red and BrdU in green) cells in quail
and mouse cultures, respectively. Values were obtained from the analysis of 60 random fields of three
independent experiments in parallel cultures. Results are expressed as the mean ± S.E.M. # P < 0.05 and ## P <
0.01 vs. the previous day of culture or as indicated; ** P < 0.01 and *** p < 0.001 vs. CLIV at the same time
point by one-way ANOVA with Bonferroni's Multiple Comparison Test.
Figure 7. ECM effects on multilineage clonal progeny. Primary culture of trunk quail NC was realized on FN,
and then cloned on FN or CLIV coated plates as described in materials and methods. Clones were classified
according to the presence of SMP
+
glial cells (green), SMA
+
myofibroblasts (red d) and MelEM
+
melanocytic
cells (red ). (A-E) Epifluorescence micrographs of clones: (A, B, same field) GMF clone; (C, D) GF clone; (E)
MF clone. Scale bar = 20µm. (F) Quantification of the total of clones with (GMF, GF, MF, F) or without (GM,
G, M) the presence of myofibroblasts. Values were obtained from nine independent experiments (116 FN and
79 CLIV colonies, from 288 plated cells in each ECM). Statistically significant differences between the absolute
number of clones in FN and CLIV cultures are indicated. *** P < 0.001 by χ
2
test.
Figure 8. Model of the FN effects on NC cell differentiation. FN stimulates the NC cell specification into
myofibroblast in both cephalic and trunk levels of NC, being this process conserved on mammals and avian.
160
Fig. 1
Fig. 2
Fig 3.
161
Fig 4.
Fig 5.
Fig 6.
162
Fig 7.
Fig 8.
163
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